CN1016647B - 抗前s抗体检测法 - Google Patents

抗前s抗体检测法

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Abstract

公开了使用生物素-抗生物素蛋白系统以酶免疫检测法检测人血清中抗前S抗体的方法。这些检测法包括抑制法、夹心法、竞争法及固相蛋白A或抗人IgG抗体法。这些检测法可在不使用放射性物质的情况下高度灵敏而简便地测定人血清中的抗前S抗体的效价。

Description

本发明涉及检测人血清中抗前S抗体的方法，更具体地说，本发明涉及使用生物素-抗生物素蛋白系统、以酶免疫检测法检测针对乙型肝炎病毒（HBV）env蛋白中L蛋白或M蛋白的N末端前S区的抗体的方法。
已经知道，在患有因感染HBV引起的急性肝炎并表现有相应症状的病人血清中，在诱导HBs抗原-抗HBs抗体系统、HBs抗原-抗HBc抗体系统及HBe抗原-抗HBe抗体系统之前，就已诱导了前S抗原-抗前S抗体系统[A.Robert    Neurath，et    al，Nature，315，154（1985）]。已引起关注的问题有，前S抗原和抗前S抗体在完成HBV感染中所起的作用、引起乙型肝炎症状的机制、以及乙型肝炎的预防等。特别是，目前已通过在黑猩猩身上进行的实验证实，抗前S区中前S2肽的抗血清可中和HBV[A.Robert    Neurath    et    al.，Vaccine，4，35，（1986）]，而且可用前S2肽疫苗预防由HBV引起的急性肝炎症状的产生[Y.Itohet    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，83，9174（1986）]。另外有报道指出，抗前S区中前S1肽的抗体可阻止HBV与肝癌细胞的结合[A.Robert    Neurathet    al.，Cell，46，429（1986）]。鉴于已认识到了抗S抗体的重要性，所以期望建立一个能特异而灵敏地检测乙型肝炎病人或接种乙型肝炎疫苗者的血清内抗前S抗体的系统。
当使用通常的酶免疫检测法（EIA）检测人血清中的抗体时，常常出现明显的非特异性反应，与用实验动物血清检测时的情况有很大差异。所以必须使用高度稀释的血清。因此，酶免疫检测法所具有的高度敏感性的优点常常得不到充分利用。这样一来，当所测定的人血清中的抗体效价很低时，则使用放射免疫测定法，其中使用了一种抗原和一种用放射性物质标记的抗体。事实上亦可使用放射免疫测定法来检测人的抗前S抗体。例如，已用抗球蛋白方法，通过检测与固相中前S肽结合的抗体来测定急性乙型肝炎病人血清中的抗前S抗体[A.Robert    Neurath    et    al.，Nature，315，154（1985）]。已使用抑制法，以人血清与含有一定量前S抗原的HBs抗原溶液反应，然后使含未反应的前S抗原的HBs抗原结合到用抗前S抗体包被 的小球上，并用125I标记的抗HBs抗体检测之，从而检测人血清中的抗前S抗体[A.Budkowska etal.，Hepatology，6，360（1986）]。另外，就人的抗前S2区中聚合的清蛋白受体（PAR）的抗体来说，已用抑制方法检测了抗PAR抗体，其中包括使血清与固相中含PAR的HBs颗粒反应，然后使聚合的人血清清蛋白（聚HSA）结合到未反应的PAR上并用125I标记的单克隆抗聚HSA抗体检测之[H.Okamoto et al.，Hepatology，6，354（1986）]。
可见，放射免疫测定法是一种灵敏地检测人血清中抗前S抗体的仅有的已知方法。然而，从安全性和实用性角度来看，使用放射性物质检测抗体效价受到许多限制。因此，急待发展一种使用非放射性物质的、高度灵敏的检测系统。
基于这一背景，本发明人着手建立一个不使用放射性物质，而又能高度灵敏且简便地检测人血清中抗前S抗体的系统。
已提出的不使用放射性物质检测抗体效价的高度灵敏的检测法，有酶免疫测定法（EIA）和酶联免疫吸附测定法（ELISA）。但是用常规的EIA或ELISA法检测人血清中的抗前S抗体时，观察到非特异性反应。为防止出现非特异反应，必须使用稀释到100至400倍的血清。相反地，本发明人发现，当使用生物素-抗生物素蛋白系统（BAS）以EIA和ELISA法检测人血清中的抗体时，便可抑制非特异性反应，并能够很灵敏地检测抗前S抗体，从而完成了本发明。
根据本发明，提供了（1）一种检测人血清中抗前S抗体的方法，包括使人血清样品、生物素化的前S肽及抗生物素蛋白化的酶与一种结合到载体上的抗前S抗体反应，并测定载体上的酶活性（抑制法）;（2）一种检测人血清中抗前S抗体的方法，包括使人血清样品与结合到载体上的前S肽反应，然后向其中加入一种生物素化的前S肽及一种抗生物素蛋白化的酶，并测定载体上的酶活性（夹心法）;（3）一种检测人血清中抗前S抗体的方法，包括使人血清样品、生物素化的抗前S抗体及抗生物素蛋白化的酶与结合于载体上的前S肽反应，并测定载体上的酶活性（竞争法）;（4）一种检测人血清中抗前S抗体的方法，包括使人血清样品、生物素化的前S肽及抗生物素蛋白化的酶与一种结合到载体上的抗人免疫球蛋白G抗体或蛋白A反应，并测定载体上的酶活性（蛋白A或抗人IgG抗体固相法）。
图1显示检测抗前S抗体的程序。其中（1）、（2）、（3）和（4）分别显示以抑制法、夹心法、蛋白A或抗人IgG抗体固相法及竞争法进行检测的操作程序。
作为上述的前S肽，可以使用HBV亚型如adr、adw、ayw和ayr中，前S区内含有一保守区的肽。最好使用下列肽：前S1区域内从第21至47位含下列氨基酸序列的肽：
PLGFX1PDHQLDPAFX2ANX3X4NPDWDFNP
其中X1代表F或L，X2代表G或R，X3代表S或T，X4代表N、T或A;
前S1区内从第25至42位含下列氨基酸序列的肽：
X1PDHQLDPAFX2ANX3X4NPD
其中X1、X2、X3和X4与上面限定的意义相同;
前S2区内从节8至34位含有下列氨基酸序列的肽：
X5HQX6LX7DPRVRGLYX8PAGGSSSGTVNP
其中X5代表F、L或P，X6代表A或T，X7代表L或Q，X8代表F或L;以及
一个或多个这样的肽与牛血清清蛋白、甲状腺球蛋白和钥孔
Figure 88102419_IMG1
形血蓝蛋白等载体蛋白的结合物。亦可使用含上述前S1和/或前S2的多肽。可以用化学合成方法或基因工程方法来合成前S1肽、前S2肽以及含有前S1和前S2的多肽。
可以在动物如兔、马或牛身上接种含有前S2抗原决定簇的抗原，并由动物血清中制得诱导产生的抗前S抗体。给动物接种抗原以诱导抗体、制备血清及由血清中制备抗体等操作均可按已知方法进行。可使用上述前S1肽、前S2肽或载体蛋白与上述肽的结合物作为含前S抗原决定簇的抗原。亦可使用以基因工程方法制备的含前S的抗原[M.L.Michel    et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，7708（1984）;Y.Fujisawa    et    al.，Gene，40，23（1985）;Y.Itoh    and    Y.Fujisawa，Biochem.Biophys.Res.Commun.141，942 （1986）;P.Dehoux    et    al.，Gene，48，155（1986）及日本专利申请193833号/86的说明书和附图]。生物素化的前S肽和生物素化的抗前S抗体很容易通过以上述前S肽或抗前S抗体与NHS-生物素（生物素基-N-羟基琥珀酰亚胺）、硫代-NHS-生物素或NHS-亚氨基生物素（Vector    Laboratories，Inc.）等生物素化试剂反应制得。
作为载体，可提到的如聚苯乙烯、聚碳酸酯和琼脂糖（Sepharose）的颗粒和微片。可使含前S肽、抗前S抗体、蛋白A或抗人IgG抗体的水溶液或缓冲液与载体接触，而将上述肽、抗体或蛋白A结合到载体上。
蛋白A、抗人IgG抗体和抗生物素蛋白化的酶均可使用市售产品。抗生物素蛋白化的酶包括辣根过氧化物酶抗生物素蛋白D、碱性磷酸酯酶抗生物素蛋白D、β半乳糖苷酶抗生物素蛋白D和葡萄糖氧化酶抗生物素蛋白D（Vector    Laboratories，Inc.）。
下文将描述依据本发明检测抗前S抗体的程序。
（Ⅰ）抑制法
步骤1
使人血清样品（或其稀释液）生物素化的前S肽及抗生物素蛋白化的酶的混合物与结合到载体上的抗前S抗体反应。
如果血清样品中没有抗前S抗体，便形成载体-抗前S抗体-生物素化的前S肽-抗生物素蛋白化的酶的复合物。如果血清样品中存在抗前S抗体，则生物素化的前S肽首先与血清标本中的抗前S抗体反应，从而减少上述载体上复合物的形成。
血清样品（或其稀释液）与生物素化的前S肽混合后，混合物即可与结合到载体上的抗前S抗体及抗生物素蛋白化的酶反应。
可用常规方法收集血液并从中制备所用的血清。也可以使用由血清中制得的IgG组分。通常在4至45℃下将血清、生物素化的前S肽及抗生物素蛋白化的酶的混合物放置或搅拌1至20小时。混合物与结合于载体上的抗前S抗体的反应条件与上述反应条件相似。
步骤2
由反应混合物中分离出载体，并使结合于载体上的酶与底物反应。
如果载体是颗粒状的，可以用过滤或离心法很容易地由反应混合物中分离出来;如果载体是片状的，则可用洗涤液洗掉反应混合物。然后洗涤载体以除去游离的抗生物素蛋白化的酶或生物素化的前S肽、与血清中抗前S抗体反应的生物素化的前S肽以及抗生物素蛋白化的酶。洗涤剂可使用水、氯化钠溶液和磷酸盐缓冲液，它们都不影响酶活性。
作为酶底物，可提到的有：
A、辣根过氧化物酶
（1）5-氨基水杨酸-H2O2
反应的pH：5.6
检测法：吸光测定法（A450）
（2）邻苯二胺-H2O2
反应的pH：4.0
检测法：吸光测定法（A492）
（3）酷胺-H2O2
反应的pH：8
检测法：荧光光度法（λex320nm;λem450nm）
（4）ABTS[2，2′-连氮基二（3-乙基苯基噻唑啉）-6′-磺酸]-H2O2
反应的pH：4.0
检测法：吸光测定法（A405、A578）
B、碱性磷酸酯酶
（1）对硝基苯酚磷酸
反应的pH：8.2
检测法：吸光测定法（A410）
（2）苯磷酸-4-氨基安替比林
反应的pH：10.5
检测法：吸光测定法（A500）
C、β半乳糖苷酶
（1）邻-硝基苯酚-β-D-半乳糖苷
反应的pH：7.8
检测法：吸光测定法（A420）
（2）4-甲基7-羟基香豆素基-β-半乳糖苷
反应的pH：7.8
检测法：荧光光度法（λex330nm;λem453nm;检测pH为10.3）
D、葡萄糖氧化酶
（1）葡萄糖
用葡萄糖作底物，并加鲁米诺-过氧化物酶（pH8.5）使所形成的H2O2发光，然后用化学发光法检测。
上述各种检测酶活性的方法均可按已知方法进行。反应终止剂可使用叠氮钠、硫酸等。
（Ⅱ）夹心法
步骤1
使人血清样品（或其稀释液）与结合于载体上的前S肽反应。
如果血清中有抗前S抗体，可在载体上形成前S肽与抗前S抗体的复合物。反应通常在4-45℃下进行1至20小时。
步骤2
向步骤1的反应混合物内加入生物素化的前S肽及抗生物素蛋白化的酶。
如果血清中存在抗前S抗体，则形成载体-前S肽-抗前S抗体-生物素化前S肽-抗生物素蛋白化的酶的复合物。该反应通常在4至45℃下进行1至20小时。
步骤3
由反应液中分离出载体，并使结合于载体上的酶与底物反应。
该步骤可按照抑制法中步骤2的同样方法进行。
（Ⅲ）竞争法
步骤1
以人血清样品（或其稀释液）、生物素化抗前S抗体及抗生物素蛋白化酶的混合物与结合于载体是的前S肽反应。
在该反应中，如果血清样品中存在抗前S抗体，则血清中的抗前S抗体和生物素化抗前S抗体便竞争性地与结合于载体上的前S肽反应，形成载体-前S肽-抗前S抗体的复合物。以及载体-前S肽-生物素化抗前S抗体-抗生物素蛋白化酶的复合物。
血清中存在的抗前S抗体越多、与载体结合的酶就越少。反应通常是在4-45℃下进行1至20小时。
步骤2
由反应混合物中分离出载体，并使结合于载体上的酶与底物反应。
该步骤是按抑制法中步骤2所用的同样方法完成的。
（Ⅳ）固相蛋白A或抗人IgG抗体法
步骤1
以人血清样品（或其稀释液）、生物素化前S肽及抗生物素蛋白化酶的混合物与结合于载体上的抗人IgG抗体或蛋白A反应。
在该反应中，抗人IgG抗体或蛋白A与血清中的IgG反应。如果血清中存在抗前S抗体，抗前S抗体可进一步与生物素化前S肽及抗生物素蛋白化酶反应，形成载体-抗人IgG抗体（或蛋白A）-抗前S抗体-生物素化前S肽-抗生物素蛋白化酶的复合物。该反应在4至45℃下进行1至20小时。
步骤2
由反应混合物中分离出载体，并使结合于载体上的酶与底物反应。
该步骤按抑制法中步骤2的同样方法进行。
在抑制法中，用同样方法处理作为对照的正常人血清，测定其酶活性并将该活性定为100%，并以使所得活性抑制50%的人血清样品的最大稀释度来表示抗前S抗体的效价。亦可将人血清样品的活性与上述对照进行比较来表示（抑制率）。因为抑制法具有很高的灵敏度，所以适用于测定低水平的人抗前S抗体的效价。除抑制法外的另外三种方法则可用于测定相对较高水平的人抗前S抗体的效价。
在夹心法和固相蛋白A或抗人IgG抗体法中，可按与上面相似的方法来处理各含不同浓度的人抗前S抗体的某些血清，以测定酶活性并可进而测定血清中抗前S抗体的量。
在竞争法中，可按与抑制法相似的程序测定抗前S抗体的效价。
根据本发明，可以简便而又高度灵敏地检测人血清样品中的抗前S抗体。
本说明书中以单字母形式给出的氨基酸缩写符号均为本领域中惯用的，下面列出了一些例子。除非另外指出，所有氨基酸均代表L型。
A：丙氨酸
C：半胱氨酸
D：天冬氨酸
E：谷氨酸
F：苯丙氨酸
G：甘氨酸
H：组氨酸
I：异亮氨酸
K：赖氨酸
L：亮氨酸
M：蛋氨酸
N：天冬酰胺
P：脯氨酸
Q：谷氨酰胺
R：精氨酸
S：丝氨酸
T：苏氨酸
V：缬氨酸
W：色氨酸
Y：酪氨酸
下面将通过下列参考实施例和实施例详细描述本发明。应明确的是，这些实施例并不限制发明范围。
参考实施例1
前S2肽FHQA    LLDP    RVRG    LYFP    AGGS    SSGTVNP的合成
使用430A型肽合成仪（Applied    Biosystems    Inc.，U.S.A.），以固相法合成上述前S2肽。
从600mgBoc.Pro.Pam树脂（Pam：4-羟甲基（oxymethyl）苯基乙酰胺）起始，按产品说明书进行反应得到2.5g肽树脂。然后在0.6ml苯甲醚存在下以612mg如此得到的树脂与6ml无水氟化氢于0℃下反应1小时。用PD-10柱（Pharmacia    Inc.，Sweden）、Amberite    IRA-400（醋酸盐型）（Rohm    and    Haas    Inc.，U.S.A），然后再用反相高效液相层析A347-7（S-70DS）YMC（Yamamura    Chemical    Co.）纯化所得到的游离肽。产量为50mg。
分析酸水解产物（6NHCl、110℃、24小时）得到的氨基酸值如下：
Asp，1.9（2）;Thr，0.9（1）;Ser，2.7（3）;Glu，1.1（1）;Gly，4.3（4）;Ala，2.2（2）;Val，2.1（2）;Leu，3.0（3）;Tyr，1.1（1）;Phe，2.0（2）;His，1.0（1）;Arg，2.0（2）;Pro，2.8（3）。回收率78.9%。理论值在括号内示出。
[α]25 D-69.8（C＝0.1，在5%醋酸中）
参考实施例2
前S1肽PLGF    FPDHQ    LDPAF    GANS    NNPD    WDFNP的合成
按照与参考实施例1中所述相似的方法制备上述的前S1肽。
实施例1
用抑制法检测抗前S2抗体
ⅰ）抗前S2抗体的制备
用日本专利申请61-193833号（1986）说明书的实施例19中所描述的纯化并经修饰的P31（M-P31c）颗粒接种兔，得到具有高抗体效价的抗前S2区血清。三只兔（日本白种兔，雄性，3kg）每只背部皮下接种100μg加有弗氏完全佐剂（DIFCO    Inc.）的纯化并经修饰的P31（M-P31c）颗粒。其后以两周间隔进行两次类似的追加免疫。第三次免疫后一周，自耳缘静脉收集50ml血，得到约25ml血清。向10ml血清内加入6.7ml饱和硫酸铵溶液，并在搅拌下将该混合物于室温放置1小时。然后离心（10000g，10分钟）并收集沉淀物。将沉淀物溶解于2ml蒸馏水中并对15mM磷酸钠缓冲液（pH6.3）透析。随后用以同一缓冲液平衡过的DEAE-纤维素柱（1.6cm×12cm）分级分离透析后的溶液，并收集没有被吸附而洗脱出的免疫球蛋白G（IgG），得到71mgIgG。该IgG含有大量抗M-P31c颗粒的抗体，特别是富含抗前S2抗体。
ⅱ）固相的制备
以每孔100μl将上述抗体溶液[IgG20μg，0.1M碳酸钠缓冲液（pH9.6）]分别加到微量滴定板（Nunc Inc.I型免疫滴定板）的各孔内，并于4℃放置过夜。用PBS-T（NaCl 29.2g、KCl0.2g、KH2PO40.2g、Na2HPO41.45g、吐温-20 0.5ml、蒸馏水1升）将板洗两次后，向其中加入120μl封闭缓冲液（牛血清清蛋白（BSA）5g、乙基汞硫代水杨酸钠0.05g、NaCl29.2g、KCl0.2g、KH2PO40.2g、Na2HPO41.45g、蒸馏水1升，将该板于4℃放置过夜。该微量滴定板即可用作检测抗前S2抗体的固相。
ⅲ）生物素化的合成前S2肽的制备
将3mg生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯（Polyscience    Inc.）溶解于1mlN，N-二甲基甲酰胺中，取0.1ml该溶液加到将935μg参考实施例1 所述的合成前S2肽溶解于1ml0.1MNaHCO3中制得的溶液中，并将混合物于室温下放置2小时，从而将生物素引入合成的前S2肽的N末端。为除去未反应的生物素，将混合物加到预先用0.1M磷酸钠缓冲液（pH6.8）平衡过的Sephadex G-25柱（1.6cm×80cm）上，在洗脱接近外水体积时收集生物素化的合成的前S2肽。该生物素化的合成的前S2肽可迅速地结合到抗生物素蛋白化的辣根过氧化物酶（HRP）上，形成用HRP标记的合成的前S2肽。
ⅳ）检测
将30μl标本加到200μl液相反应混合物[4000倍稀释的生物素化合成前S2肽、16000倍稀释的抗生物素蛋白化HRP（HRP-抗生物素蛋白D，Vector Inc.）、3%胎牛血清（FCS）、0.005%乙基汞硫代水杨酸钠、PBS-T]中，使混合物于37℃反应3小时。然后将100μl反应混合物移到ⅱ）中制备的固相载体（用抗前S2抗体包被的微量滴定板）上并于37℃继续反应3小时。各小孔用PBS-T洗涤4次，向其中加入100μlHRP底物溶液[24.3mM柠檬酸、51.4mM Na2HPO4（pH5.0）、0.04%邻苯二胺、0.0013%H2O2]、然后使反应于室温下进行30分钟。其后向其中加入100μl2NH2SO4以终止反应，用Titertek Multiskan MC（Flow Laboratories）测定A492。如果标本中存在抗前S2抗体，则依据抗体的量使显色受到抑制。因此，可通过测定标本的A492值并与正常样品的A492值相比较（抑制率）来确定抗前S2抗体的量。图1（1）显示了抑制法的实验程序。用抑制率来表示时，HB Globulin-Nichiyaku（为一种免疫球蛋白制剂，Nippon Seiyaku公司生产）中含有的抗前S2抗体量为95%。用这种方法测定人血清中的抗前S2抗体。结果示于表1。
实施例2
用抑制法检测抗前S1抗体
ⅰ）抗前S1抗体的制备
将1mg参考实施例2中所述的合成的前S1肽和5mg钥孔
Figure 88102419_IMG2
形血蓝蛋白溶解于2ml0.2M磷酸钠缓冲液（pH7.3）中，并向其中加入200μl2.5%戊二醛。反应于4℃进行3小时，然后将反应混合物装在透析管内对蒸馏水透析以除去戊二醛。由这一操作得到一种合成的前S1肽共价结合到钥孔
Figure 88102419_IMG3
形血蓝蛋白上的结合物。用这一结合物作免疫原，按实施例1，ⅰ）中所述的方法免疫三只兔。接种量为每只兔每次接种100μg。第三次接种后一周采血，按实施例1，ⅰ）中所述方法得到85mgIgG组分。该IgG组分含有大量的抗前S1肽抗体。
ⅱ）固相的制备
使用上述IgG组分，按实施例1，ⅱ）中所述方法制备用抗前S1抗体包被的固相（微量滴定板）。该微量滴定板即可用作检测抗前S1抗体的固相。
ⅲ）生物素化合成前S1肽的制备
按实施例1，ⅲ）所述方法，用1mg参考实施例2所述的合成的前S1肽制备生物素化的合成的前S1肽。该生物素化的合成的前S1肽可迅速地结合到抗生物素蛋白化的HRP上，形成用HRP标记的合成的前S1肽。
ⅳ）检测
按照实施例1，ⅳ）中所述的方法，用ⅱ）中所述的固相（微量滴定板）和ⅲ）中所述的生物素化的前S1肽检测抗前S1抗体。如用抑制率表示，HB    Globulin-Nichiyaku（一种免疫球蛋白制剂）中含有的抗前S1抗体的效价为92%。
用这种方法检测人血清中的抗前S1抗体。结果示于表2。
实施例3
用夹心法检测抗前S2抗体
ⅰ）固相的制备
将500μg参考实施例1中所述的合成的前S2肽和750μg甲状腺球蛋白溶解于0.2M磷酸钠缓冲液（pH7.3）中，向其中加入200μl2.5%戊二醛，反应于4℃下进行3小时，将反应混合物对蒸馏水透析以除去戊二醛。经这一操作得到一种合成的前S2肽共价结合到甲状腺球蛋白上的结合物。按照实施例1，ⅱ）中所述的方法，用该结合物溶液[20μg结合物、0.1M碳酸钠缓冲液（pH9.6）]制得用该结合物包被的固相（微量滴定板）。
ⅱ）检测
将100μl样品或用稀释液（3%FCS、0.005%乙基汞硫代水杨酸钠、PBS-T）稀释的样品加在ⅰ）中制备的固相的小孔内，并于室温下反应过夜。每小孔用PBS-T洗涤4次后，向其中加入 100μl第二抗原溶液（10000倍稀释的生物素化的合成前S2肽、4000倍稀释的抗生物素蛋白化的HRP、3%FCS、0.005%乙基汞硫代水杨酸钠、PBS-T），混合物于37℃反应2小时。小孔用PBS-T洗涤4次后，向其中加入100μlHRP底物溶液并于室温下反应30分钟。然后向其中加入100μl2NH2SO4以终止反应，测定A492。图1（2）中示出了夹心法的操作程序。当用这种方法检测抗前S2抗体时，正常人血清的值为0.15，HB Globulin-Nichiyaku的值为0.32。
实施例4
用夹心法检测抗前S1抗体
ⅰ）固相的制备
将500μg参考实施例2中所述的合成的前S1肽和750μg甲状腺球蛋白溶解于0.2M磷酸钠缓冲液（pH7.3）中，按实施例3，ⅰ）中所述方法制备合成的前S1肽共价结合于甲状腺球蛋白上的结合物。然后按实施例1，ⅱ）中所述的方法制备用该结合物包被的固相（微量滴定板）。
ⅱ）检测
按照与实施例3，ⅱ）所述相似的方法，用ⅰ）中制备的固相检测抗前S1抗体。其中用含有10000倍稀释的生物素化的合成的前S1肽、4000倍稀释的抗生物素蛋白化的HRP、3%FCS、0.005%乙基汞硫代水杨酸钠和PBS-T的溶液作为第二抗原溶液。正常血清的值为0.1时，HBGlobulin-Nichiyaku的值为0.35。
实施例5
使用结合于固相上的蛋白A或抗人IgG抗体检测抗前S2抗体
ⅰ）固相的制备
按照实施例1，ⅱ）中所述的方法，使用蛋白A溶液[25μg/ml蛋白A（Sigma    Inc.）、0.1M碳酸钠缓冲液（pH9.6）]或抗人IgG抗体溶液[25μg/ml抗人IgG抗体（Kirkegaard    ant    Perry    Laboratories，Inc.）、0.1M碳酸钠缓冲液（pH9.6）]，制备用蛋白A或抗人IgG抗体包被的固相（微量滴定板）。
ⅱ）检测
用与实施例3，ⅱ）中所述相似的方法，使用ⅰ）中制备的固相检测抗前S2抗体。图1（3）中示出了该方法的操作程序。正常血清的值为0.1时，HB    Globulin-Nichiyaku的值为0.35（蛋白A）。
实施例6
使用结合于固相上的蛋白A或抗人IgG抗体检测抗前S1抗体
ⅰ）检测
按照与实施例4，ⅱ）中所述相似的方法，使用实施例5，ⅰ）中制备的固相检测抗前S1抗体。
正常血清的值为0.08时，HB    Globulin-Nichiyaku的值为0.41（蛋白A）。
实施例7
用竞争法检测抗前S2抗体
ⅰ）生物素化抗前S2抗体的制备
使用1mg实施例1，ⅰ）中所述的含抗前S2抗体的IgG部分，按照实施例1，ⅲ）中所述的方法制备生物素化的抗前S2抗体。这种生物素化的抗前S2抗体可以迅速地结合到抗生物素蛋白化的HRP上，形成用HRP标记的抗前S2抗体。
ⅱ）检测
将30μl样品加到200μl反应混合物[40000倍稀释的生物素化抗前S2抗体、16000倍稀释的抗生物素蛋白化HRP、3%FCS、0.005%乙基汞硫代水杨酸钠、PBS-T]中，然后立即将100μl所得混合物分别加到实施例3，ⅰ）中制备的、用合成前S2肽和甲状腺球蛋白的结合物包被的固相的各小孔内，于37℃反应3小时。小孔用PBS-T洗涤4次后，向其中加入100μlHRP底物溶液并于室温下反应30分钟。然后向其中加入100μl2NH2SO4以终止反应，测定A492。如果标本中存在抗前S2抗体。则显色依据抗体的量而受到抑制。因此，可通过检测样品的A492并与正常样品的A492值进行比较，求得抑制率来确定抗前S2抗体的量。图1（4）示出了竞争法的操作程序。如用使活性降低至50%的稀释度来表示，HBGlobulin-Nichiyaku中所含的抗前S2抗体的效价为32。
实施例8
用竞争法检测抗前S1抗体
ⅰ）生物素化抗前S1抗体的制备
使用1mg实施例2，ⅰ）中所述的含抗前S1抗体的IgG部分，依照实施例1，ⅲ）中所述的方法得到生物素化的抗前S1抗体。该生物素化的抗前 S1抗体可以迅速地与抗生物素蛋白化的HRP结合，形成用HRP标记的抗前S1抗体。
ⅱ）检测
按照实施例7，ⅱ）中所述的方法检测抗前S1抗体。其中使用了含有40000倍稀释的生物素化抗前S1抗体、16000倍稀释的抗生物素蛋白化HRP、3%FCS、0.005%乙基汞硫代水杨酸钠和PBS-T的溶液作为反应溶液。如用使活性抑制到50%的稀释度来表示，HB    Globlin-Nichiyaku中含有的抗前S2抗体的效价为64。
表1    人血清中抗前S2抗体的检测
样品 抑制率（%）＊
抗HRs抗体阴    A    3.4
性的健康人    B    5.5
血清    C    2.0
抗HBs抗体    D    45.0
阳性的人    E    82.5
血清    F    85.2
＊将稀释液的值定为抑制率0%，并将由反应系统中除去生物素化前S2肽时所测得的值定为抑制率100%。
表2    人血清中抗前S1抗体的检测
样品 抑制率（%）＊
抗HBs抗体    G    1.0
阴性的健康    H    1.3
人血清    I    3.7
抗HBs抗体    J    51.8
阳性的人    K    76.1
血清    L    72.0
＊将稀释液的值定为抑制率0%，并将由反应系统中除去了生物素化前S1肽时所测得的值定为抑制率100%。

Claims (6)

1、一种检测在人血清样品中的抗前S2抗体的方法，该方法包括：
(1)使人血清样品、一种具有以下氨基酸序列的生物素化的前S2肽
FHQALLDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNP
和一种抗生物素蛋白化的酶与结合于载体上的抗前S2抗体反应，以及
(2)测定载体上的酶活性。
2、一种检测人血清样品的抗前S抗体的方法，该方法包括：
（1）使人血清样品与一种具有以下氨基酸序列并结合于载体上的前S2肽反应，
FHQALLDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNP
然后向其中加入一种具有以下氨基酸序列的生物素化的前S2肽和抗生物素蛋白化的酶，
FHQALLDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNP
以及
（2）测定载体上的酶活性。
3、一种检测人血清样品中的抗前S抗体的方法，该方法包括
（1）使人血清样品一种生物素化的抗前S2抗体及一种抗生物素蛋白化的酶与结合于载体上的并具有以下氨基酸序列的前S2肽反应，
FHQALLDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNP
以及
（2）测定载体上的酶活性。
4、一种检测人血清样品中的抗前S2抗体的方法，该方法包括：
（1）使人血清样品、一种生物素化的并具有以下氨基酸序列的前S2肽
FHQALLDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNP
和一种抗生物素蛋白化的酶与结合于载体上的抗人免疫球蛋白G抗体或蛋白A反应，以及
（2）测定载体上的酶活性。
5、根据权利要求1、2、3、4之一的检测法，其中的酶是辣根过氧化物酶。
6、根据权利要求1、2、3、4之一的检测法，其中的载体是颗粒或片状物。
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