CN1175958A - 单克隆抗独特型抗体(ab2)和其用途 - Google Patents

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Abstract

与免疫网络相关的单克隆抗独特型抗体IgG型,其能够与T、B淋巴细胞相互作用,并且能够发挥免疫调节作用(免疫刺激作用或免疫抑制作用),这种作用可以用于自身免疫病、传染病和癌症的免疫疗法中。

Description

单克隆抗独特型抗体(AB2)和其用途 发明所属技术领域
本发明涉及免疫学领域，具体地说涉及选择和使用抗独特型单克隆抗体(AB2)IgG型，其具有与独特型网络高度相关和识别免疫应答中主要参与者人类T、B淋巴细胞的主要特征。
因此，本发明的目的是提供与免疫网络相关的与T、B淋巴细胞相互作用并产生免疫调节作用的抗独特型单克隆抗体IgG型。
现有技术描述
免疫应答反应主要基于特定抗原刺激一些特定B淋巴细胞克隆，这种淋巴细胞表面具有该抗原的特异性受体。T细胞能产生阳性或阴性的信号来调节这一过程。然而，免疫调节的机理十分复杂，正如Jerne(Jerne NK(1974)免疫学年刊，巴斯德研究所，125，c：373：389)的假说：免疫系统可以被“看作”一个由抗体分子和由独特的相互反应所连接的淋巴细胞组成的有组织的结构。
抗体的独特型是指可变区内的一组表位，每种抗体有自己独特的决定簇，其中包含了抗原-抗体识别区。特异性免疫网络理论基于下列已证明的事实而形成(Urbain J(1976)免疫学年刊1237 C；357)，即免疫球蛋白分子(AB1)中的这些独特型决定簇，能被专门针对这种分子的抗独特型抗体(AB2)所识别。
在免疫应答中，独特型决定簇与对应的抗体动态结合，这个过程可以被扰乱。
在七十年代由Jerne提出的特异性免疫网络理论指出，免疫系统包括和识别所有可能的抗原，而不区分是自身的还是外界的抗原。因此，在一定的生理状态下会存在淋巴细胞的自身活性克隆。
过去十年的研究证实，在正常个体中存在天然的自身活性抗体(Avrameas S.S.，(1991)免疫学132C：231：236，Antin et al(1986)，免疫学杂志136，505：510，Lundkvist.(1989)，PNAS USA 86：5074-5078，Longtenberg.T(1989)实验医学杂志170：1347.1335)
这些实验事实提示我们，免疫系统可以看作是一个由特殊受体组成的密切连系的网络。它是自然选择的结果，是通过个体发生过程中的自身识别而组织起来的。不仅用于抵抗外界的病菌，而更多的是为了维持生理功能的稳定。在这种意义上来说，自身识别是正常的。而对自身的耐受和记忆不再象Burnet的“克隆选择说”(Burnet F.M.(1956)伦敦剑桥大学出版社)中那样被认为是克隆的特性。但从整体上来看，它是免疫网络的形成特性(Cout inho.(1984)免疫学综述79：151-168，Coutinho.(1989)免疫学综述110：63-87)。
这种有关免疫系统新理论影响了对自身免疫病机制的理解和新的治疗方法(ZanettiM.(1985)当今免疫学6：299-302；Kaveri等(1991)临床实验免疫学86：192-198；Kazatchine.D.M(1994)免疫学综述139：79-107。)
在对各种不同的全身性和器官性特异性自身免疫病的治疗中，使用不同的免疫球蛋白复合物，获得了非常好的疗效。从而在临床上确认了这种新理论的适用性(Kazatchine等(1993)自身免疫性：生理学和疾病Wiley-Liss，Inc.，纽约)。
IgG免疫球蛋白制剂是从健康供体的血库中获取的，它们代表了抗体的生理性自身活性网络。对这些制剂的活性分析证明了抗体和独特型之间相互作用的存在，它在自身抗体和本质上的自身抗体表达(Rossi，等(1988)临床实验免疫学74：311-316；Rossi等(1989)免疫学杂志143：4104-4109)。两种活性分析均选用高浓度的IgG分子，这些IgG分子与免疫网络的连系较血库中其它分子更为紧密(Dietrich等(1992)欧州免疫学杂志22：1701-1706)。通过这种方法，这些制剂的免疫调节作用证实，这种新的治疗手段确能恢复自身免疫病患者抗体的结合和多样性。而这些临床实验结果和在有关抗体可变区内调节网络的失调证实了这种关于自身免疫病观点的必要性。
在先前的研究中，获得了一组针对与神经节苷酯有关的肿瘤的单克隆抗体，这种抗原归为依赖T淋巴细胞自身抗原(EPO：No：0 657 471 Al)。这些Mabs是具有独特型的IgM型，它们能在无抗原存在的情况下，激活整个独特型免疫网络，从而产生抗体反应，即，它们是再发的独特型。这些抗体先前被描述为是特异识别NeucAc GM2神经节苷酯的(Alfonso.M等(1995)Hibridoma 14(3)：209-216)。
本发明提供了产生和选择一组针对原IgM抗体识别的神经节苷酯的抗独特型(antiidiotypic)单克隆抗体(AB2)的新方法。
对这组抗体的进一步鉴定发现一种名为B7的抗体，它是一种IgG2a，对抗原(Kd 10 E-8)有中度的亲和力，它的α型(尽管也是这种类型)能在单源(singeneic)模型(Balb/c)中诱导产生抗体依赖性(AB1)反应。
在对抗独特型抗体B7的研究中发现它具有一些令人惊奇的性质：与不同物种的人类T、B淋巴细胞识别中的免疫球蛋白的高度独特相关性(idiotypic connectivity)和对先前激活的T、B淋巴细胞的免疫调节作用。
迄今为止，还未见在自身免疫病、传染病和癌症的治疗中利用抗独特型抗体的这种性质的治疗前景。
本发明的新颖性表现在对抗独特型单克隆抗体IgG型的选择上。
被认为相关的抗独特型单克隆抗体识别来源于不同物种的抗体，它们还能识别从健康供体获得的人类库IgG，这表明识别这些Mabs的独特型在其它物种免疫球蛋白可变区的高度相关性。独特相关抗独特型Mabs(AB2)IGG型识别不同种B、T淋巴细胞的评价方法
用间接荧光免疫分析法在流动式细胞计数器中，评价独特相关(idiotipically connected)抗独特型Mabs(AB2)IGG型识别不同物种(小鼠、大鼠、猴和人)B、T淋巴细胞。
用Ficoll梯度法从不同种动物的外周血液和其它淋巴器官(脾、淋巴结和腹膜，视研究种类而定)中分离B、T淋巴细胞。分离细胞环(cellring)，并由Neubauer室进行细胞计数。
将细胞悬液(200μl)与抗独特型单克隆抗体(AB2)一起放入湿培养箱中培养30分钟。在规定的条件下同时做阳性对照(ior3或ior4)和阴性对照。在培养的30分钟中，加入一种可以是抗小鼠FITC或RPE的缀合物。培养后，样品用流式血细胞计数器进行测定。B、T淋巴细胞独特相关抗独特型Mabs(AB2)IGG型的生物作用的体外评价方法
为了评价任一哺乳动物种B、T淋巴细胞独特相关抗独特型Mabs(AB2)IGG型的生物作用，用3H胸腺嘧啶合剂进行细胞增殖测定。
用Ficoll梯度法分离外周单核细胞。在含有10％血清的适宜培养基的微平板上，以100000个细胞/孔对细胞进行培养。当开始出现不同浓度的抗独特型Mabs(15μg-300μg/mL)，加入淋巴细胞激活剂PHA、Con A、PWM，浓度均为5μg/ml。
对照组也进行测定，它们或只含激活剂、或只含淋巴细胞。培养物放入含5％CO2、温度37℃的潮湿环境中培养72小时。
在收获样品前6小时，于每个孔中滴加3H胸腺嘧啶(1uCi，23uCi/mmol)，收获细胞并用beta计数器(LKB Sweden)进行测定。
这种相关抗独特型mabs能抑制或增强被激活的任何B、T淋巴细胞受激反应。而不相关抗独特型Mabs则没有这种功能。在不同动物的自身免疫病、传染病和恶性肿瘤模型中，B、T淋巴细胞独特相关抗独特型Mabs(AB2)IGG型体内生物学作用的评价方法
使用不同的自身免疫病、传染病和恶性肿瘤动物模型，对和B、T淋巴细胞IgG型独特相关抗独特型Mabs(AB2)在体内生物学作用进行评价，MRL/lpr/lpr小鼠作为实验模型用于评价抗体B7对自身免疫病的生物学作用，这种动物表现出红斑狼疮(DSL)的症状。
按下述方法，对MRL/lpr/lpr小鼠腹膜注射大剂量的特异性抗B7抗体：1mg/鼠，每周三次，从出生24小时开始，持续4周。
低剂量组，出生时给100μg抗独特型Mabs。
治疗效果通过以下几个方面进行评价：临床症状(如皮肤损伤、淋巴结)出现的延迟时间；小鼠存活数量的增加以及任何作为考虑指标的生物学参数(如蛋白尿、抗DNA自身抗体等)。用未加任何处理的动物作对照组。
抗肿瘤作用测定是在实验动物模型中进行的，经异体移殖肺肿瘤细胞(RL-67)的小鼠(C57BL/C)，用不同剂量的抗独特型Mab进行治疗，1mg/每鼠，3次/周。
治疗效果的评价是通过比较实验组和对照组小鼠的存活曲线得出的。
这种抗独特型Mabs对传染病的生物学作用是从预先注射一个克隆的Pladmodium Chabaudi的小鼠(Balb/C)模型中得到的(Conquy-Adib.M等(1993)Mo1.Immunology 30(2)：119-127)。接种后三天的小鼠，用下述治疗方案进行处理：
1)注射总剂量为800μg，在一周内以300、100、200和200μg连续腹腔注射。
2)总量高达3ml的剂量，分4周进行注射(其中两周各1ml，另外两周各0.5ml)。对照组按同样的方案每次注射0.2ml生理盐水溶液。
比较实验组和对照组，评价延迟临床症状出现的能力。降低鼠B7 Mabs的免疫原性及其人源化的方法
B7单克隆通过一种方法(欧洲专利公报#1996/10出版号0699755)修饰抗体，这种方法能在保持抗体原有的亲和特性的同时，降低啮齿内动物单克隆抗体的免疫原性。因为一个免疫球蛋白的免疫原性依赖于T细胞抗原肽连在其序列中的表达，异种抗原或同种异型抗原性可通过取代T细胞序列中与常见其它哺乳动物抗体中不同的残基得到降低。当然，取代并不包括位于规范结构或Vernier区中的残基。这种明智的取代并不影响结构决定簇或内部结构域触点，因为可变区的框架残基的序列变更有限，所以配体结合特性不应受到影响。
(1)-对可变区同源性的分析。
本方法使用的可以得到的序列数据是人类抗体可变区序列，取自Kabat等主编的《免疫学兴趣蛋白序列》第五版(Bethesda，Maryland；国家健康研究所(1994))。
第一步，比较鼠B7的可变区的重链或轻链与人类的相应可变区序列。
使用一种自动-计算机化的方法进行比较(PC-DOS HIBIO PROSIS 06-00，Hitachi.)。将最具同源的人类可变区与鼠的对应区域逐个残基进行比较，这样就能限定与每个小鼠最相似的人亚群。
(2)T-表位的预测
第二步，分析小鼠以及人类两种同源可变区序列，预测T抗原序列。
AMPHI算法(Bersofsky等，免疫学杂志138：2213-2229，1987)预测到一种α螺旋状序列。SOHHA算法(Elliott等，免疫学杂志138：2949-2952，1987)预测到带状疏水性序列。这些算法表明，T细胞含有抗原性蛋白片段。
(3)免疫原性衰减分析
用人类抗体中框架残基取代小鼠中与人类不同的框架结构残基。
最后，取代那些与规范结构或Vernier区有关的残基会对抗体的三级结构产生显著的影响，所以它们不能取代。关于取代对三级结构和结合位点的影响更多的知识，可以从可变区分子模型中获得。
(4)改变抗体的构筑和表达方法
以下列方法用于制备重组DNA序列，将鼠的mAb的CDRs区(包括轻链和重链)掺入人类的抗体中。以这种框架(方法)转染哺乳动物细胞，使重组的抗体得到表达，并且可以降低免疫原性和得到有抗原特异性的动物单克隆抗体。a.-)对包括CDRs和FRs区可变区结构域进行诱变和重组。采用PCR诱变法(Kamman等，核酸研究，17：5404-5409，(1989))可以较好地引导不同位点上的变化。b.-)用上述方法使细胞分泌一种包含一个可变区和相应人类的恒定区的表达载体，这种蛋白质具有良好的亲和性和特异性的决定簇。c.-)在适当的细胞系中共转染重链和轻链的表达载体。在大约2周之后，用ELISA法检查细胞上清液中人类IgG产生。用任何方法检查样品中可以结合特异性抗原的人类IgG。
实施例1：在同源模型中产生与免疫网络高度相关的
       针对E1 Mab的抗独特型Mabs(AB2)
将针对神经节苷酯的Mab(E1 Mab)用作抗原免疫Balb/C小鼠(6-8周龄)。免疫方法其它文献(EP No：0 667 471 A1)中有叙述。
当小鼠血清中的抗独特型抗体效价较高时，再次对小鼠进行接种，三天后解剖脾脏，获取脾脏细胞。
将这些细胞与骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞，融合方法根据Kholer和Milstaein的方法(自然(1975)256：495-497)略作修改。在0.5ml含有PEG(3000-5000)的融合介质中，将鼠脾脏细胞与非分泌型骨髓瘤细胞(P3/X63Ag66.5.3)融合两者比例为10∶1。
抗体产物的鉴定采用免疫学方法，通过上清液中的成份对合适抗原的特异识别能力来评价。将另一种抗体用酶标记后，可以观察到抗体-抗体之间的结合。
上清液是根据其阻碍抗神经节苷酯Mab(E1)与抗原(Neu Ac GM2)的结合能力来选择的，将足够浓度的上清液和E1 Mab及其抗原一起培养。
选择能识别不同的抗相关或不相关神经节苷酯的和具有不阻止抗神经节苷酯Mab与相应抗原结合特征的Mabs(图1)。杂交株经两次克隆后得到一种属于IgG2a的抗独特型Mab B7。
实施例2：抗独特型Mabs(IgG型)的独特相关性评价方法
采用PVC平板(96孔，高结合Costar)间接酶免疫分析法来评价针对抗神经节苷酯Neuc Ac GM2的单克隆抗体E1的抗独特型单克隆抗体(IgG型)的特异性结合。将平板置于碳酸盐——碳酸氢盐缓冲液中，涂覆特异性抗神经节苷酯Mabs(包含作为免疫原的E1 Mab)和非特异性Mabs，小孔在室温1小时封闭后，加入PBS和牛血清白蛋白(1％)，然后加入浓度范围在10μg-250μg/ml抗独特型单克隆抗体，37℃湿培养室培养2小时。平板至少用PBS洗4次，在以后的4小时中加入用碱性磷酸酶标记的抗小鼠Fc抗体。然后加入底物，在波长为405nm下读取OD值。
同时做阴性对照，即用其它不与独特型免疫网络相关的抗独特型单克隆抗体。
不同杂交株的上清液产生的抗独特型Mabs识别和抗神经节苷酯相关的Mabs的可变区、识别与Balb/C系Mabs无关的IgM及新生的Mabs(如图1)。
抗独特型单克隆抗体B7 IgG2a型对相关的抗神经节苷酯Mabs的可变区、Balb/C系Mabs无关的IgM及新生的Mabs表现出很高的识别独特型能力，其亲和力为10-8M(见图2)。实施例3：人类骨髓瘤免疫球蛋白(IgG)独特型识别特征及由独特相关抗独
                  特型Mabs制备治疗用IgG
由B7 Mab评价人类骨髓瘤免疫球蛋白(IgG)的独特型识别能力。
为此，采用间接免疫测定法(96孔，高度亲和Costar)。平板用不同的IgG组分或其它片段涂覆(根据Colligan E.J.等Eds(1995)《现代免疫学操作流程》)。小孔浸于碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中，用骨髓瘤蛋白质涂覆，室温封闭1小时后，加入PBS和牛血清白蛋白(1％)，然后加入浓度范围在11μg-380μg/ml抗独特型单克隆抗体，37℃湿室培养2小时。平板至少用PBS洗涤4次，以后加入用碱生磷酸酶标记的抗山羊Fc抗体并培养4小时。加入底物，在波长为405nm下读取取OD值。
B7抗独特型单克隆抗体能识别人类骨髓瘤免疫球蛋白可变区(独特型)(图3)，其它没有独特相关鼠Mabs则未对这种IgG组分表现出任何反应活性(图4)。
其它杂交株产生的高度相关抗Mabs的上清液能识别IgG人类骨髓瘤蛋白质的可变区。而对每一种IgG人类骨髓瘤蛋白质的识别方式也不同(图5)。
B7抗独特型单克隆抗体还能识别人类骨髓瘤免疫球蛋白片段中可变区(图6)。
通过一种感受态分析法来评价B7抗体识别人类骨髓瘤IgG的识别特异性和进行不同浓度的治疗用人类IgG实验，方法如下：
不同浓度的治疗用人类IgG接种于固定浓度(95μg/ml)的B7单克隆抗体中过夜，然后这种混合物与人类骨髓瘤IgG一起培养，并用本实例中所述的免疫分析法进行分析。
逐渐增加的治疗用人类IgG的浓度抑制B7单克隆抗体对人类骨髓瘤IgG的识别(图7)。
鼠源性B7单克隆抗体能识别人类骨髓瘤IgG可变区和治疗用人类IgG的现象表现出高度独特的结合能力，并且也说明了被识别的可变区的区域在不同物种之中是高度保守的。实施例4：IgG型独特相关抗独特型单克隆抗体(AB2)识别人类B和T淋巴
                      细胞的评价
在流式血细胞计数器中使用间接荧光免疫分析法，评价IgG型独特相关抗独特型单克隆抗体(AB2)对人类B、T淋巴细胞的识别。
用Ficoll梯度法从外周血中分离B、T淋巴细胞，分离细胞环，由Neubauer室进行细胞计数，并且测定浓度和细胞的存活力。
将调整至107细胞的细胞悬液(200μl)与抗独特型单克隆抗体(AB2)一起在湿室中培养30分钟，并在浓度范围10-250μl内增加一条标准曲线。相同条件下做阳性对照(ior t3或ior t4)和阴性对照(ior r3)。培养后小孔中的混悬液用PBS BSA Azide洗涤，然后离心除去上清液，再离心四次；加入一种抗小鼠TITC缀合物在湿室中培养30分钟；然后样品再次洗脱、离心四次；最后将细胞悬液再悬浮于100μl PBS中，用流式血细胞计数进行测定。
图(8A)显示流动式血细胞计数器中B7单克隆抗体识别人类B、T淋巴细胞的分析结果。图(8B)示阴性对照(Ior r3单克隆抗体，非特异性结合性单克隆抗体)。
B7单克隆抗体能够识别正常供体53％的人类淋巴细胞(外周血淋巴细胞)。因此，这种具有特殊反应活性的单克隆抗体能够识别T、B淋巴细胞中的分子结构。实施例5：独特相关B7抗独特型单克隆抗体(AB2)IgG型对B、T淋巴细
                胞的体外生物学作用评价
用3H胸腺嘧啶掺入细胞增殖法评价与任一动物独特相关B7抗独特型单克隆抗体(AB2)IgG型对B、T淋巴细胞的体外生物学作用。
用Ficoll梯度法分离外周血淋巴细胞，分离细胞在含10％血清的RPMI1640培养基的微板(microplate)中培养，每孔100000个细胞。当开始出现不同浓度的抗独特型单克隆抗体(15μg-300μg/mL)时，加入淋巴细胞激活剂PHA、Con A、PWM，浓度均为5μg/ml。对照组也进行测定，它们或只含激活剂、或只含淋巴细胞。培养物放入含5％C02、温度37℃的潮湿环境中培养72小时。
在收获培养物前6小时，于每个孔中滴加3H胸腺嘧啶(1 uCi，23uCi/mmol)，收获细胞并用beta计数器(LKB Sweden)进行测定。
这种B7高度相关单克隆抗体能够抑制激活状态的B、T淋巴细胞的应激反应(图9A和B)。治疗用人类IgG也能抑制细胞分裂应激(图10A和B)。而不相关抗独特型单克隆抗体则无这种功能。
B7单克隆抗体对激活态B、T淋巴细胞的抑制，说明这种高度相关的抗独特型单克隆抗体有免疫调节作用。实施例6：在不同的自身免疫病、传染病和恶性肿瘤的动物模型中，独特相关抗独特型单克隆抗体(AB2)IgG型对B、T淋巴细胞的体内生物学作用
                        评价
使用不同动物模型评价独特相关抗独特型单克隆抗体(AB2)IgG型对B、T淋巴细胞的体内生物学作用。实验选用MRL/1pr/1pr小鼠评价B7单克隆抗体对自身免疫病的影响。这种实验动物表现为全身性红斑狼疮(DSL)。
该MRL/1pr/1pr小鼠按下述方法大剂量腹腔注射B7：1mg/小鼠，每周三次，初次注射于出生后24小时，持续4周。
低剂量组于出生时注射，剂量为100μg。
治疗效果通过以下几个方面进行评价临床症状(如皮肤损伤、淋巴结)出现的延迟时间；小鼠存活数量的增加以及任何作为考虑指标的生物学参数(如蛋白尿、抗DNA自身抗体等)。用未加任何处理的动物作对照组。
该抗独特型单克隆抗体的抗肿瘤作用测定是在实验动物模型中进行的，经异体移殖肺肿瘤细胞(RL-67)的小鼠(C57BL/C)，用不同剂量的抗独特型单克隆抗体进行治疗，1mg/鼠，3次/周。
治疗效果的评价是通过比较实验组和对照组小鼠的存活曲线得出的。
这种抗独特型单克隆抗体对传染病的生物学作用是从预先注射一个克隆的Pladmodium Chabaudi的小鼠(Balb/C)模型中得到的(Conquy-Adib.M等(1993)Mol.Immunology 30(2)：119-127)。接种三天的小鼠，用下述治疗方案进行处理：
1)注射总剂量为800μg，在一周内以300、100、200和200μg连续腹腔注射。
2)总量高达3ml的剂量，分4周进行注射(其中两周各1ml，另外两周各0.5ml)。对照组按同样的方案每次注射0.2ml生理盐水溶液。
比较实验组和对照组，得出延迟临床症状出现的能力。
实施例7：包含抗独特型单克隆抗体的药物组合物
一种药物组合物包含有效量的高度独特相关抗独特型单克隆抗体和它们的复合物，其药物载体由9.0mg磷酸氢二钠、2.55mg磷酸二氢钠、43.00mg氯化钠、1mg polisorbato及5.00ml WFI组成。这种药物组合物用于治疗自身免疫病、传染病和癌。
实施例8：鼠单克隆抗体B7的可变区的DNA测序
用Faloro等的方法(Faloro，J等《酶学方法》65：718-749，(1989)从106个杂交瘤细胞中分离出细胞质RNA。
cDNA合成反应物由5μg RNA；50mM Tris-HCl(pH值7.5)；75mM KCl；10mM DDT；3mM MgCl2；25 pmol重链可变区引物CG2AFOR(5 GGAAGCTTAGACCGATGGGGCCTGTTGTTTTG3)或轻链可变区引物CK2FOR(5 GGAAGCTTGAAGATGGAT ACAGTTGGTGCAGC3)；dATP、dTTP、dCTP、dGTP各250μM；15U核糖核酸抑制剂(RNA guard，Pharmacy)组成，总体积为50μl。样品加热至70℃，10分钟。在30分钟内缓慢冷却至37℃。然后加入100U MMLV反转录酶(BRL)37℃培养1小时。
按Orlandi等所述的方法(Orlandi R.等美国国家科学院学报86：3833-3837，(1989))，用PCR将VH和VK cDNA扩增。对于VH的PCR扩增，DNA/引物混合物由5μl cDNA、25 pmol CG2AFOR(5 GGAAGCTTAGACCGATGGGGCC TGTTGTTTTG3)和VHlBACK引物(5 AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C))AGTC(A/T)GG3)组成。对于VK的PCR扩增，DNA/引物混合物由5μl cDNA，25pmol CK2FOR(5 GGAAGCTTGAAGATGGATACAGTTGGTGCAGC3)和VK1OBACK引物(5 TTGAATTCCAG TGATGTTTTGATGACCCA3)。向这些混合物中加入dATP、dCTP、dTTP和dGTP各2.5mM，5μl 10X缓冲液thermolase组份和1单位的Thermolase(IBI)，最后定容为50μl。样品循环变温加热25个循环，94℃30秒、50℃30秒、72℃1分钟、最后在72℃培养5分钟。扩增后的VH cDNA用Prep.A基因纯化试剂盒(BioRad)进行纯化。
把纯化的VH克隆到M13载体。通过双脱氧法用T7 DNA Pol(Pharmacy)对克隆进行测序。见图11。
实施例9：修饰B7鼠单克隆抗体的可变结构域重链序列
         使预测的T-细胞抗原序列人源化
应用AMPHI算法进行计算机分析B7重链可变区的T淋巴细胞抗原序列，结果显示，11个氨基酸长度序列片段呈两亲性螺旋状，其一侧为疏水基，另一侧为亲水基，用于与MHC II分子结合。
在重链可变区序列中，测得3个片段如下(采用Kabat s法编号)：
1.FR1位于8-20氨基酸之间
2.FR1、CDR 1和FR2位于第28-54氨基酸之间
3.FR3、CDR 3和FR4位于第88-109氨基酸之间
图11示出与重链相应的序列。
用这种鼠的序列与基因库和EMBL数据库中所包括的免疫球蛋白序列相比较，得出了最具同源性的人类可变区序列，还确定了与小鼠序列最相近的人类亚群，在这种情况下发现的人类序列是一种TH9 Kabat s亚群1。
对人类和鼠的可变区序列的残基进行逐个比较，找出FR中不涉及Venier区和规范结构的残基。这样它们就可被相应的人类的氨基酸序列所取代。
对于鼠B7的重链，我们提出了13处取代：
1.用ALA取代位置9的PRO
2.用VAL取代位置11的LEU
3.用LYS取代位置12的VAL
4.用THR取代位置16的ALA
5.用VAL取代位置20的ILE
6.用VAL取代位置37的MET
7.用ARG取代位置38的GLU
8.用ALA取代位置40的SER
9.用PRO取代位置41的HIS
10.用GLN取代位置43的LYS
11.用GLY取代位置44的SER
12.用MET取代位置48的ILE
13.用VAL取代位置109的SER
       实施例10：PCR诱变构建B7突变重链可变区
使用PCR诱变(Kammann，M.美国科学院学报，86，4220-4224，(1989))构建突变重链可变区氨基酸序列的改变。
简而言之，经过两个PCR扩增。反应混合物为：0.5μl在M13中克隆的单链DNA的VH上清液、25pmol诱变引物oligo1或2、25pmol诱变引物oligo 3或4(序列于下)。在这些混合物中加入dAT P，dCT P，dTT P和dGTP各2.5mM、5μl 10X的Vent聚合酶缓冲液(NEB)和1U Vent聚合酶(NEB)，最后定容为50μl。样品循环变温加热12-15个循环，94℃30秒、50℃30秒、75℃1分钟、最后在75℃培养5分钟。两个PCR的产物，并入第二次PCR，只使用外部引物(3或4)。扩增后的VH cDNA用Prep.A基因纯化试剂盒(BioRad)进行纯化。
在位点9、11、12、16和20的改变，采用以下引物：
引物1：
5 CTTGCAGGATACCTTGACTGAAGCCCCAGGCTTCTTCACCTCAGCTCC 3
引物3：5 GTAAAACGACGGCCAGT 3
这些引物在一个PCR中组合。
引物2：5 GGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCTTCAGTCAAGGTATCCTGCAAG 3
引物4：5 ACTGGCCGTCGTTTTAC 3
这些引物在一个PCR中组合。
然后，两个PCR的产物在使用引物3和4的PCR中合并。
对于在位点37、38、40、41、43、44和48上的改变，所设计使用的引物是：
引物1：
5 AACACCTCCCATCCACTCAAGGCCCTGTCCAGGGGCCTGCCTCACCCAGTGCATGGT3
引物3：5 GTAAAACGACGGCCAGT 3
这些引物在一个PCR中组合。
引物2：5 ATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATGGGAGGT 3
引物4：5 ACTGGCCGTCGTTTTAC 3
这些引物在一个PCR中组合。
然后，两个PCR的产物在使用引物3和4的PCR中合并。
在诱变后，把VH基因克隆到表达载体(pSVgpt)中得到B7-mut VH-pSVgpt质粒。
                     附图简要说明
图1：显示高度相关抗独特型杂交瘤由不同单克隆抗体识别的识别模式。
图2：显示B7 Mab对不同单克隆抗体的结合。
图3：显示B7单克隆抗体对不同的人类骨髓瘤细胞蛋白质和人类静脉
     IgG的识别。
图4：显示人类骨髓瘤蛋白质(#2)与不同的鼠单克隆抗体的结合。
图5：显示不同的IgG人类骨髓瘤蛋白质识别IgG高度相关抗独特型单
     克隆抗体的模式。
图6：显示B7单克隆抗体与未消化的人类骨髓瘤IgG及其Fab2片段结
合。
图7：显示由与人类骨髓瘤IgG蛋白质结合的人类静脉内B7单克隆抗
   体IgG引起的竞争性抑制作用。
图8：显示用流式血细胞计数器对不同正常人类供体外周血淋巴细胞的
     分析结果。
A-B7单克隆抗体与不同正常人类供体淋巴细胞结合(B7单克隆抗体50
μg/ml)
B-阳性对照(CD3单克隆抗体)
C-阴性对照(R3单克隆抗体)
图9：显示B7单克隆抗体对CONA、PWM和PHA诱导的人类淋巴细胞增
   值反应的影响
A-人类淋巴细胞+CONA和PWM。
B-人类淋巴细胞+PHA。
图10：显示人类静脉内IgG对CONA和PHA诱导的人类淋巴细胞的增殖
    反应的影响。
结果用三个独立实验的三个值的平均cpm表示。
A-单独静脉注射IgG+静脉注射IgG和CONA。
B-静脉注射IgG+PHA。
图11：对通过抗体B7重链可变区人源化方式产生的修饰的分析。
A：鼠B7单克隆抗体的可变区序列。
B：最同源的人类免疫球蛋白的可变区序列。
C：经过修饰的B7的可变区序列。阴影：预测的T-细胞抗原序列。下划线的氨基酸残基和三级结构有关的氨基酸。粗体字：互补决定区。方框中的氨基酸残基：提出的取代。

Claims (11)

1.与独特型网络高度相关的抗独特型单克隆抗体(AB2)IgG型，其作为免疫应答的免疫调节剂是有用的。
2.按照权利要求1的抗独特型单克隆抗体，其是从同名杂交瘤(保藏号E.C.A.C.C.94113324)获得的鼠单克隆抗体B7以及由此获得的任何人源化变体。
3.按照权利要求1和2的单克隆抗体，其是从单克隆抗体B7获得的人源化变体，其具有以下序列的重链可变区：GLN VAL GLN LEU GLN GLN SER GLY ALA GLU VAL LYSLYS PRO GLY ALA SER VAL LYS VAL SER CYS LYS THRSER GLY TYR THR PHE THR GLU TYR THR MET HIS TRPVAL ARG GLN ALA PRO GLY GLN GLY LEU GLU TRP METGLY GLY VAL SER PRO ASN ASN GLY GLY ALA SER TYRASN GLN LYS PHE LYS GLY LYS ALA THR LEU THR VALASP LYS SER SER ASN THR ALA TYR MET GLU LEU ARGSER LEU THR SER ASP ASP SER ALA VAL TYR TYR CYSALA ARG ARG LEU GLY ARG GLY TYR ASP LEU ALA SERTYR TRP GLY GLN GLY THR LEU VAL LEU SER LEU GLN
4.权利要求1-3的单克隆抗体在制造治疗自身免疫病有效之药物上的用途。
5.权利要求1-3的单克隆抗体在制造治疗传染病有效之药物上的用途。
6.权利要求1-3的单克隆抗体在制造治疗癌症有效之药物上的用途。
7.权利要求1-3的单克隆抗体在制造体内或体外诊断自身免疫病、传染病和癌症有效之反应剂上的用途。
8.治疗自身免疫病的药物组合物，该组合物包含任何权利要求1-3的单克隆抗体。
9.治疗传染病的药物组合物，该组合物包含任何权利要求1-3的单克隆抗体。
10.治疗癌症的药物组合物，该组合物包含任何权利要求1-3的单克隆抗体。
11.可用于诊断自身免疫病、传染病和癌症的反应剂，其包含任何权利要求1-3的单克隆抗体。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU22702A1 (es) * 1997-10-21 2001-07-31 Centro Inmunologia Molecular Anticuerpos monoclonales anti - idiotipo, su uso en la inmunoterapia activa de tumores malignos, hibridoma que los produce y composiciones que los contienen
WO2006102687A1 (en) * 2005-03-22 2006-09-28 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York A liposome-based microarray and methods of use thereof
US7534595B2 (en) * 2006-06-12 2009-05-19 Biomarin Pharmaceutical Inc. Compositions of prokaryotic phenylalanine ammonia-lyase and methods of using compositions thereof
US7560263B2 (en) * 2007-08-17 2009-07-14 Biomarin Pharmaceutical Inc. Compositions of prokaryotic phenylalanine ammonia-lyase and methods of treating cancer using compositions thereof
EP2193145A4 (en) * 2007-08-28 2011-05-18 Abbott Biotech Ltd COMPOSITIONS AND METHODS COMPRISING BINDING PROTEINS FOR ADALIMUMAB
WO2010014225A2 (en) * 2008-07-30 2010-02-04 Biomarin Pharmaceutical Inc. Assays for detection of phenylalanine ammonia-lyase and antibodies to phenylalanine ammonia-lyase
AU2011212929B2 (en) 2010-02-04 2016-10-27 Biomarin Pharmaceutical Inc. Compositions of prokaryotic phenylalanine ammonia-lyase variants and methods of using compositions thereof
WO2015037569A1 (ja) * 2013-09-12 2015-03-19 国立大学法人 岡山大学 インターロイキン１０産生促進剤

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0287226A1 (en) 1987-03-23 1988-10-19 Hiver Limited Novel vaccines
WO1991004055A1 (en) 1989-09-15 1991-04-04 Tanox Biosystems, Inc. Treatment of autoimmune disease
US5208146A (en) * 1990-11-05 1993-05-04 The Regents Of The University Of California Murine monoclonal anti-idiotype antibodies
WO1995007096A1 (en) * 1993-09-06 1995-03-16 La Trobe University Treatment of autoimmune disease
ES2166770T3 (es) * 1993-12-09 2002-05-01 Centro Inmunologia Molecular Anticuerpos monoclonales contra gangliosidos y sus utilizaciones en la inmunoterapia activa especifica de tumores malignos.

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