CN1198845C - 诱导编程性细胞死亡的单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

一种单克隆抗体，其是特异识别人整联蛋白相关蛋白的单克隆抗体，是能诱导含整联蛋白相关蛋白的具核血细胞编程性细胞死亡的抗原。因此，该抗体可用于特异性识别人整联蛋白相关蛋白，并用于区分和鉴定这些蛋白质。由于也具有诱导具核血细胞编程性细胞死亡的作用，上述抗体也可应用于治疗如髓样白血病和淋巴样白血病的领域中治疗剂。

Description

诱导编程性细胞死亡的单克隆抗体
技术领域
本发明涉及具有诱导含整联蛋白相关蛋白(IAP)的具核血细胞编程性细胞死亡特性的新型单克隆抗体，以及它们的片段、肽和低分子量化合物，并涉及产生所述单克隆抗体的杂交瘤。该新型抗体可用作髓样白血病和淋巴样白血病的治疗剂。
背景技术
粒细胞集落刺激因子，例如重组粒细胞集落刺激因子(rG-CSF)，在现有技术中公知可作为刺激粒细胞分化和增殖的体液因子。根据小鼠体内实验的报道显示，rG-CSF的施用，不仅引起骨髓中髓细胞加速生成，而且导致脾脏外髓的血细胞显著生成，并造成脾脏中包括造血干细胞在内的所有造血祖细胞增殖。这种脾脏外髓血细胞生成的机制据信为rG-CSF的刺激改变了脾脏的造血微环境，促进其血细胞生成的维持能力，因而诱导其血细胞生成。
为了阐明脾脏的造血功能，本发明人一直集中研究反复施用rG-CSF后的脾脏基质细胞。发明人努力研究重组粒细胞集落刺激因子如何经由基质细胞促进造血功能，并且通过反复施用rG-CSF建立了小鼠脾脏造血基质细胞系(CF-1细胞)。发明者研究了造血基质细胞的血细胞生成支持能力，确证其体外集落刺激能力和体内的造血干细胞支持能力[血液(Blood)，80，1914(1992)]。
然而，尽管建立了一种脾基质细胞细胞系(CF-1细胞)，并且研究了它的细胞学特征，但能够识别这些细胞表面抗原的特异抗体尚未制备，其特征更未见任何形式的阐述。
发明内容
根据前面提到的有关脾基质细胞的发现和现有研究结果，本发明人急切做出进一步研究，旨在开发能够识别脾基质细胞的特异抗体，应用上述的脾基质细胞系作为致敏抗原致力于制备单克隆抗体，最终成功获得新型的单克隆抗体。
发明人进一步研究了如上述方法获得的单克隆抗体的特性，发现该单克隆抗体具有诱导骨髓细胞编程性细胞死亡的性质。这些单克隆抗体被命名为“BMAP-1抗体”，后面提及可参考此名。
发明人还研究了BMAP-1抗体识别的抗原，通过直接表达克隆发现该抗原是小鼠整联蛋白相关蛋白(小鼠IAP)(Genbank，保藏号Z25524)。
运用小鼠整联蛋白相关蛋白(IAP)基因导入的重组细胞对BMAP-1抗体的作用进行研究。特别地，通过常规方法将小鼠IAP基因导入不表达小鼠IAP的Jurkat细胞中，建立一种表达小鼠IAP的细胞系(重组Jurkat细胞)，并且BMAP-1抗体对表达小鼠IAP细胞的作用也通过MTS实验研究，且通过流式细胞术进行DNA分段获得检验(日本专利申请号HEI9-67499)。
通过这些发现可以预计，针对人整联蛋白相关蛋白(后面均为人IAP，氨基酸序列和碱基序列可见细胞生物学杂志(J.Cell Biol.)，123，485-496，1993；也可见细胞科学杂志(J.Cell.Sci.)，108，3419-3425，1995)抗原的单克隆抗体应具有诱导表达该抗原的具核血细胞(骨髓细胞和淋巴细胞)编程性细胞死亡的作用，发明人已努力制备了抗人整联蛋白相关蛋白抗原的单克隆抗体，并且成功获得诱导表达该抗原的人具核血细胞编程性细胞死亡的单克隆抗体。
换言之，本发明的目标是提供具有诱导具核血细胞(骨髓细胞和淋巴细胞)编程性细胞死亡性质的新型单克隆抗体、其抗体片段以及产生该单克隆抗体的杂交瘤，其中该具有血细胞含人整联蛋白相关蛋白(人IAP)。
这种新型单克隆抗体可用作髓样白血病和淋巴样白血病的治疗剂。
整联蛋白相关蛋白已报道的功能有，与整联蛋白αvβ3的β链结合以支持αvβ3与它的配体玻连蛋白(细胞生物学杂志，123，485-496(1993))之间的结合，通过嗜中性白细胞与血管内皮粘附诱导Ca2+流入血管内皮(生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，268，19931-19934(1993))，支持嗜中性白细胞穿过血管内皮迁移(美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，92，3978-3982(1995))，但是尚未有公开报道该整联蛋白相关蛋白具有与具核血细胞的编程性细胞死亡相关的功能。
本发明的单克隆抗体是特异识别人整联蛋白相关蛋白的抗体。因此该抗体表现出识别和鉴定人整联蛋白相关蛋白的功能。
此外，本发明的单克隆抗体显示出诱导含人整联蛋白相关蛋白的具核血细胞(骨髓细胞和淋巴细胞)编程性细胞死亡的性质。编程性细胞死亡是指细胞核染色质DNA被剪切为核小体单元(称作“序列梯形成”)，从而导致细胞死亡的现象，也称为细胞自杀。
到目前为止，已知的具有诱导具核血细胞(骨髓细胞和淋巴细胞)编程性细胞死亡性质的单克隆抗体包括：抗-Fas抗体(细胞(Cell)，66，233-243，1991)、抗-CD43抗体(血液，86，502-511，1995)和抗-HLA家族Iα1结构域抗体(血液，90，726-735，1997)，但是通过识别整联蛋白相关蛋白的本发明的抗体诱导具核血细胞编程性细胞死亡的性质尚未见报道。因此，本发明的单克隆抗体可定义为包括任何能够特异地识别整联蛋白相关蛋白并具有诱导含整联蛋白相关蛋白的具核血细胞(骨髓细胞和淋巴细胞)编程性细胞死亡性质的单克隆抗体。
本发明的抗体并不仅仅局限于可诱导一切具核血细胞编程性细胞死亡的抗体。它们也包括那些诱导至少一种类型具核血细胞编程性细胞死亡的抗体。特别是对于髓样白血病的情况，抗体至少能够诱导骨髓细胞编程性细胞死亡就足够了。
更特别地，本发明提供了诱导含整联蛋白相关蛋白(IAP)的具核血细胞编程性细胞死亡的单克隆抗体。
本发明进一步提供诱导含整联蛋白相关蛋白的具核血细胞编程性细胞死亡的单克隆抗体之片段、肽和低分子量化合物。
本发明还进一步提供产生这种单克隆抗体的杂交瘤。
本发明还进一步提供一种抗白血病剂，它包含一种可与IAP结合并促进IAP作用，以诱导具核血细胞编程性细胞死亡的物质。
本发明还进一步提供一种抗白血病剂，其特征为该物质是一种单克隆抗体。
本发明还进一步提供一种抗白血病剂，其特征为该物质是单克隆抗体的片段、肽或一种低分子量化合物。
附图简述
图1是电泳图样，显示了利用从HL-60细胞系mRNA制备的cDNA通过PCR扩增获得的人IAP条带。从左至右依次为分子量标记(M)、人IAP(1)和β-肌动蛋白(2)。
图2是用抗-CD47抗体显示已表达人IAP的L1210细胞之人IAP的表达水平的图。峰代表仅用对照pCOS1基因转染的L1210细胞。
图3是用抗-CD47抗体显示已表达人IAP的L1210细胞之人IAP的表达水平的图。峰表示用人IAP基因转染的L1210细胞中人IAP的表达已显著增加。
图4是显示免疫小鼠中抗体滴度的图。左边峰代表完整的L1210细胞。右边峰代表经人IAP转染的L1210细胞，表明用于细胞融合的小鼠血清很明显地识别人IAP。
图5的条形图显示用杂交瘤培养上清液对Jurkat细胞进行生长抑制实验的结果。
图6的条形图显示用杂交瘤培养上清液对ARH77细胞进行生长抑制实验的结果。
图7是显示用作为对照的8G2培养上清液(经PI染色分析)诱导Jurkat细胞编程性细胞死亡效果的图。R1表示编程性细胞死亡的百分比(％)为7.43％。
图8是显示用7D2-E3培养上清液(经PI染色分析)诱导Jurkat细胞编程性细胞死亡效果的图。R1表示细胞编程性细胞死亡的百分比(％)为9.84％。
图9是显示用11C8培养上清液(经PI染色分析)诱导Jurkat细胞编程性细胞死亡效果的图。R1表示细胞编程性细胞死亡的百分比(％)为15.32％。
图10是显示用作为对照的8G2培养上清液(经PI染色分析)诱导HL-60细胞编程性细胞死亡效果的图。M1表示细胞编程性细胞死亡的百分比(％)为6.94％。
图11是显示用11C8培养上清液(经PI染色分析)诱导HL-60细胞编程性细胞死亡效果的图。M1表示细胞编程性细胞死亡的百分比(％)为12.16％。
图12A是单色显微照片，显示了用作为对照的9C5培养上清液对KM-102和HL-60细胞的共培养系统编程性细胞死亡的分析结果(TUNEL方法)。编程性细胞死亡的细胞被染成黑色或棕色。核是用甲基绿染色的，放大倍数为100倍(100×)。
图12B是彩色显微照片，显示了用作为对照的9C5培养上清液对KM-102和HL-60细胞的共培养系统编程性细胞死亡的分析结果(TUNEL方法)。编程性细胞死亡的细胞被染成黑色或棕色。核是用甲基绿染色的，放大倍数为100倍(100×)。
图13A是黑白显微照片，显示了用11C8培养上清液对KM-102和HL-60细胞的共培养系统编程性细胞死亡的分析结果(TUNEL方法)。比图12看到更多TUNEL阳性细胞。编程性细胞死亡的细胞被染成黑色或棕色。核是用甲基绿染色的，放大倍数为100倍(100×)。
图13B是彩色显微照片，显示了用11C8培养上清液对KM-102和HL-60细胞的共培养系统编程性细胞死亡的分析结果(TUNEL方法)。比图12看到更多TUNEL阳性细胞。编程性细胞死亡的细胞被染成黑色或棕色。核是用甲基绿染色的，放大倍数为100倍(100×)。
图14是电泳图，显示了从杂交瘤系7D2-E3和11C8纯化的IgG之SDS-PAGE分析结果。图示为分子量标记(M，M’)，非还原条件下的小鼠IgG(标准样品)(1)、7D2-E3(2)、11C8(3)，还原条件下的小鼠IgG(标准样品)(4)、7D2-E3(5)和11C8(6)。
图15显示了利用HL-60细胞以流式细胞术分析CD47表达的结果。
图16显示了利用Jurkat细胞以流式细胞术分析CD47表达的结果。
图17显示用mIgG(10μg/ml)作对照证明其诱导人IAP基因转染的L1210细胞(L1210-hIAP)编程性细胞死亡的效果(温育时间72小时)。
图18显示MABL-1(10μg/ml)诱导人IAP基因转染的L1210细胞编程性细胞死亡的效果(温育时间72小时)。
图19显示MABL-2(10μg/ml)诱导人IAP基因转染的L1210细胞编程性细胞死亡的效果(温育时间72小时)。
图20显示用mIgG(10μg/ml)作对照证明其诱导Jurkat细胞编程性细胞死亡的效果(温育时间48小时)。
图21显示MABL-1(10μg/ml)诱导Jurkat细胞编程性细胞死亡的效果(温育时间48小时)。
图22显示MABL-2(10μg/ml)诱导Jurkat细胞编程性细胞死亡的效果(温育时间48小时)。
图23显示用mIgG(10μg/ml)作对照证明其诱导经人IAP基因导入转染的L1210细胞(L1210-hIAP)编程性细胞死亡的效果(温育时间72小时)。
图24显示MABL-2 Fab片段(10μg/ml)诱导人IAP基因转染的L1210细胞编程性细胞死亡的效果。
图25是MABL-2抗体Fab片段的SDS电泳图。
图26显示了经MABL-2处理后明显延长的存活期。
图27显示了实施例5(2)的ELISA结果。
图28显示了经MABL-2 F(ab′)2片段处理后明显延长的存活期。
图29是MABL-1抗体和MABL-2抗体F(ab′)2片段SDS电泳图。
图30显示了MABL-1和MABL-2治疗组小鼠血清的人IgG水平显著降低，证明了这些抗体的抗肿瘤效果。
实施本发明的最佳模式
单克隆抗体的制备
本发明的单克隆抗体一般可按照以下方法制备。举例来说，通过用人整联蛋白相关蛋白作为致敏抗原，用本领域中已知的免疫方法用该抗原免疫动物，用本领域已知的细胞融合方法进行细胞融合，和用本领域已知的克隆方法克隆从而获得本发明的单克隆抗体。
更为特别地，本发明制备单克隆抗体的优选方法是这样一种方法，例如，其中小鼠白血病细胞系L1210重组细胞表达人整联蛋白相关蛋白，该细胞可用作致敏抗原，而用该致敏抗原免疫的哺乳动物浆细胞(免疫细胞)与哺乳动物如小鼠骨髓瘤细胞融合，克隆所得融合的细胞(杂交瘤)，从所得的克隆中筛选出能够识别前面所述的细胞系并产生本发明的抗体的克隆，进而培养获得目的抗体。
以上方法仅仅是本发明一种可能的实施例，例如，致敏抗原并不局限于前面所述的L1210重组细胞，也可以是人整联蛋白相关蛋白(IAP)本身，或者可溶形式的人IAP；诱导具核血细胞(骨髓细胞和淋巴细胞)编程性细胞死亡的目的单克隆抗体可以按照如上述L1210重组细胞同样的方法制备。
噬菌体展示技术也可以用作从抗体的cDNA文库制备目的单克隆抗体的方法。
在制备单克隆抗体的方法中致敏抗原免疫的哺乳动物并不特别限定，但优先选择的动物应考虑它们与用作细胞融合的骨髓瘤细胞的相容性，小鼠、大鼠、仓鼠等一般比较适宜。
优选的是用一种标准方法进行免疫。例如，表达人整联蛋白相关蛋白的L1210重组细胞通过腹膜内注射或类似方法施于动物。更特别地，优选地每间隔10天数次施用PBS或生理盐水适当稀释的细胞悬液。末次施用细胞以后，优选的提取脾细胞作为所用免疫细胞。
用作与免疫细胞融合的亲本细胞的哺乳动物的骨髓瘤细胞，可采用本领域中已知的多种细胞系中任一种，如P3(P3X63Ag8.653)[免疫学杂志(J.Immunol.)，123，1548(1978)]、P3-U1[微生物免疫学论题(CurrentTopics in Microbiology and Immunology，81，1-7(1978)]，NS-1[欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)，6，511-519(1976)]，MPC-11[细胞，8，405-415(1976)]，Sp2/0-Ag14[自然(Nature)，276，269-270(1978)]，FO[免疫学方法杂志(J.Immunol.Meth.)，35，1-21(1980)]，S194[实验方法杂志(J.Exp.Med.)，148，313-323(1978)]和R210[自然，277，131-133(1979)]。
免疫细胞和骨髓瘤细胞之间的细胞融合可基本按照常规方法进行，例如Milstein等人的方法[酶学方法(Methods Enzymol.)，73，3-46(1981)]。
更特别地，例如细胞融合在一种含融合促进剂的普通营养培养基中进行。例如，采用的融合促进剂可以是聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，如果需要也可适当地添加如二甲基亚砜的佐剂以增加融合效率。免疫细胞优选地是采用1-10倍于骨髓瘤细胞的量。用作细胞融合的培养基可以是例如RPMI-1640培养基、MEM培养基等适合骨髓瘤细胞系生长的培养基，或者其它普遍用于这类细胞培养的培养基，并且也可与如胎牛血清(FBS)之类的血清添加剂结合使用。
进行细胞融合时在培养基中彻底混匀预定量的免疫细胞和骨髓瘤细胞，培养基中加入并混匀预热至大约37℃的PEG溶液，其平均分子量约1,000-6,000，通常终浓度约30-60％(w/v)，然后加入适宜培养基，离心去除所得上清液。重复数次该步骤以产生目的杂交瘤。
通过在普通选择培养基中培养筛选杂交瘤，例如HAT培养基(一种包含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基)。在HAT培养基中持续培养足够的时间，通常为几天或几星期，使所有除了目的杂交瘤以外的细胞(所有非融合细胞)死亡。通常运用有限稀释法筛选并单克隆产生目的抗体的杂交瘤。
以这种方式制备的能产生本发明单克隆抗体的杂交瘤可在普通培养基中传代培养，也可以置于液氮中长期保存。
为了从杂交瘤中获得本发明的单克隆抗体，可采用任何适宜的方法，例如这样的方法，按标准方法培养杂交瘤并从培养上清液中获得单克隆抗体；或另外一种方法，将杂交瘤施于相容的哺乳动物中增殖，然后从其腹水液中获得抗体。前面一种方法适合获得高纯度抗体，而后面一种方法适合大量生产抗体。
通过上述方法获得的抗体可用如盐析、凝胶过滤、亲和层析等标准纯化方法进行高度纯化。
单克隆抗体片段
本发明的单克隆抗体可以是上述的完整抗体，或者是其片段。也就是说，它们可以是本发明的单克隆抗体的任何片段，所述片段能够特异识别人整联蛋白相关蛋白并诱导含人整联蛋白相关蛋白的具核血细胞(骨髓细胞和淋巴细胞)编程性细胞死亡。这些片段包括Fab、F(ab′)2、Fab′等等。这些片段可通过用诸如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、无花果蛋白酶等酶消化获得。所获得片段的特性可以上述的同样方式进行确定。
具有与单克隆抗体相同功能的肽和低分子量化合物
上述识别人整联蛋白相关蛋白并诱导具核血细胞编程性细胞死亡的单克隆抗体，也包含同样识别IAP和诱导具核血细胞编程性细胞死亡的肽和低分子量化合物。
本发明单克隆抗体的性质
正如后面实施例中的具体描述，本发明的单克隆抗体特异识别人整联蛋白相关蛋白。
本发明的单克隆抗体也诱导含人整联蛋白相关蛋白的具核血细胞(骨髓细胞和淋巴细胞)编程性细胞死亡。
这些性质可用于获得治疗髓样白血病和淋巴样白血病领域中有用的治疗剂。
因此，将容易理解的是，一种特定系统的构建，包括本发明的单克隆抗体作为特异识别能引起具核血细胞编程性细胞死亡的抗原的抗体，区分和鉴定该抗原的用途，或者单克隆抗体作为髓样白血病和淋巴样白血病的治疗剂这一特有性质的用途，而对该系统的任意修饰和应用，也都在本发明范围之内。因为就该系统构建而言，可通过运用对本领域中技术人员显而易见的标准方法实施。
抗白血病剂
根据本发明的抗白血病剂是基于如下事实：可通过与本发明的或类似的抗体结合促进IAP的作用。虽然对发明抗体的剂量并没有特别的限制，其优选范围为5μg-500mg/kg。
实施例
现在通过以下的实施例对本发明进行更详细的解释；但本发明并不局限于这些实施例。
实施例1(单克隆抗体的制备)
(1)致敏抗原和免疫方法
抗原致敏是用重组细胞系作为致敏抗原完成的，重组细胞系为人IAP基因转染的且高效表达产物的L1210细胞。L1210来自DBA小鼠衍生的白血病细胞系(ATCC No.CCL-219，国家癌症研究所杂志(J.Natl.CancerInst.)，10：179-192，1949)。
人IAP基因是采用人IAP特异序列设计的引物(有义引物：GCAAGCTTATGTGGCCCCTGGTAGCG，反义引物：GCGGCCGCTCAGTTATTCCTAGG AGG)通过PCR扩增的，模板cDNA由HL-60细胞系mRNA制备(Clontech Laboratories.Inc.)(图1)。
将PCR产物亚克隆入pGEM-T克隆载体(Promega公司)，转化大肠杆菌(E.coli)JM109(TaKara Shuzo Co.Ltd.)，通过DNA测序仪(373ADNA Sequencer，ABI)鉴定插入DNA的核苷酸序列后，亚克隆至表达载体pCOS1。
表达载体pCOS1是由pEF-BOS(核酸研究(Nucleic AcidsResearch)，18，5322，1990)衍变而来的，该载体通过亚克隆使用人延伸因子-1α作为启动子/增强子的新霉素抗性基因而获得。这种亚克隆人IAP的表达载体用于将基因导入DMRIE-C(GIBCO/BRL)培养的L1210细胞系，并由遗传霉素(终浓度1mg/ml，GIBCO/BRL公司)进行筛选，转入基因的L1210细胞通过有限稀释法克隆。
采用识别人IAP的抗-CD47抗体(PharMingen)对所获得克隆的抗原表达进行检测，筛选出高水平表达的克隆作为致敏抗原的细胞(图2，3)。培养重组L1210细胞采用含10％胎牛血清(FBS，Moregate Inc.)的Iscove改进的Dulbecco培养基(IMDM)(GIBCO/BRL)，在含5％CO2温度为37℃的温箱中传代培养。
采用的免疫动物为与L1210细胞属同一株系的DBA/2小鼠(养殖于Charles River，日本)。用作致敏抗原的人整联蛋白相关蛋白(IAP)基因转染的L1210细胞，与终浓度200μg/ml的丝裂霉素C(Kyowa HakkoKogyo Co.，Ltd.)共温育30分钟，待细胞悬浮生长后，丝裂霉素C在PBS重悬之前被彻底洗去。
以约10天的间隔分3次将细胞腹膜内注入小鼠，每次大约5×106个细胞。免疫3次后，眼框采血，血清用含1％BSA的PBS稀释50倍，稀释血清与用作致敏抗原的重组L1210细胞结合的情况通过FACScan(Becton Dickinson and company)(图4)鉴定；具有最佳抗血清活性的小鼠在第4次免疫5天后腹膜内注入1×107细胞加强免疫。末次免疫4天后，处死小鼠取出脾脏。
(2)细胞融合
取出的小鼠脾脏切成薄片后，分离的脾细胞离心并重悬于IMDM培养基，使其漂浮，彻底冲洗。另一方面，小鼠骨髓瘤细胞系P3-U1(微生物与免疫学论题(Current topics in Microbiology and Immunology)，81，1-7(1978))培养于含10％胎牛血清(FBS，Moregate Inc.)的IMDM培养基，以相似方法用MDM培养基冲洗后，在离心管中将1×107骨髓瘤细胞与5×107脾细胞混合，按标准方法(临床实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)，42，458-462(1980))用聚乙二醇4000(NakaraiChemical co.，Ltd)进行细胞融合。
所得融合的细胞重悬于含10％FBS和融合细胞生长刺激剂(BM-condimed H1，Boehringer Mannheim Biochemicals)的IMDM培养基，分散至96孔板培养于含5％CO2的37℃温箱。随后几天，细胞置于HAT选择培养基，然后于含生长刺激剂的10％FBS/IMDM培养基中培养以维持其生长。
为检测这些融合细胞培养上清液对白血病细胞系的作用效果，用于融合细胞的培养基可用含10％FBS的IMDM培养基替换，以继续培养维持其生长。
(3)筛选
采用前面所述的融合细胞培养上清液进行以下筛选。
【1】初次筛选
经人整联蛋白相关蛋白(IAP)基因转染的小鼠脾基质细胞系(CF-1)细胞(该重组细胞中亚克隆的质粒与制备用作致敏抗原的表达人IAP的L1210细胞所用的质粒相同)接种于96孔板过夜培养，每孔1×104细胞，然后用2％PLP(高碘酸-赖氨酸-低聚甲醛)固定制备ELISA板。冲洗后，板条用1％BSA溶液室温封闭1小时，再次冲洗，加入每个杂交瘤培养上清液50μl室温温育1小时。
冲洗后，加入碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgGA+M(H+L)(ZymedLaboratories Inc.)，再室温温育1小时。冲洗后，加入终浓度1mg/ml的SIGMA104底物(Sigma-Aldrich Corpration)，继续室温温育，然后用微孔板阅读仪(Model3550，Biorad Laboratories Inc.)测定比活性。
结果，初次筛选对2880孔杂交瘤中的2089孔进行鉴定，其中187孔阳性。室温温育1小时前每孔加入50μl小鼠IgG1作为阴性对照，50μl抗人CD47抗体(BD PharMingen)作为阳性对照，终浓度3μg/ml。
【2】二次筛选
为了筛选杂交瘤产生的抗体是否特异识别人IAP，可用表达人整联蛋白相关蛋白(IAP)的CF-1细胞对初次筛选判断为阳性的克隆进行ELISA检测，该系统的阴性对照为仅转染表达载体pCOS1的CF-1细胞。
结果，初次筛选阳性的187孔中21孔鉴定为阳性。表1以ELISA中光吸收值形式显示了与人IAP特异结合的7D2和11C8作为代表性范例。
(表1)杂交瘤培养上清液与人IAP特异结合的ELISA分析
                             表1
<原始值>         PBS       αHCD47(3μg/ml)      7D2        11C8
CF1-pCOS1        0.185          0.160            0.189      0.149
CF1-hIAP-55-8    0.192          0.456            0.568      0.812
<差减值>         PBS       αHCD47(3μg/ml)      7D2        11C8
特异结合         0.007          0.296            0.379      0.663
【3】三次筛选
二次筛选中判断为阳性的克隆用Jurkat细胞(人T淋巴细胞系)和ARH77细胞(人骨髓瘤细胞系)进行生长抑制实验。每孔100μl5×103Jurkat细胞和每孔1×104 ARH77细胞接种于96孔板的每一孔中，细胞悬液中加入5或10μl杂交瘤培养上清液。培养约2天后，通过MTS实验测定细胞数目。每孔加入5或10μl含10％FBS的IMDM培养基以及初次筛选为阴性克隆(8G2和9C5)的培养上清液作为对照。
图5和6显示4株代表克隆11C8、7D2-E3(7D2的亚克隆)、13F1和2F12的生长抑制效应的结果。
(4)抗体特性
【1】用ELISA系统检测11C8、7D2-E3、13F1和2F12的培养上清液之免疫球蛋白类型
特别地，表达人整联蛋白相关蛋白(IAP)的CF-1细胞接种到96孔板以制备ELISA板，然后加入50μl每份培养上清液，碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgG抗体(Zymed Laboratories Inc)或抗-小鼠IgM抗体(BiosourceIntl，Inc.)作为二抗进行反应，用微孔板阅读仪测定活性。结果，11C8和7D2-E3鉴定为IgG，而13F1和2F12鉴定为IgM。
【2】上述4个克隆中11C8和7D2-E3 2个克隆的DNA片段采用Jurkat细胞和HL-60细胞通过流式细胞术(FACScan，获自Becton，Dickinsonand Company)分析。Jurkat细胞用来分析11C8和7D2-E3，HL-60细胞用来分析11C8。
Jurkat细胞和HL-60细胞分别种入12孔板，每孔2ml约4×104细胞，然后加入200μl 7D2-E3和11C8培养上清液。细胞培养2天后测定。加入等体积的8G2培养上清液作为对照。细胞从培养板上收集，在2ml冰冷的70％乙醇中4℃下200×g离心60分钟固定细胞沉淀。离心细胞后用1mlPBS洗涤再重悬于0.5mlPBS。0.5ml细胞样品中加入0.5mlRNase(I-A型，Sigma-Aldrich公司，St.Louis，MO，美国；1mg/ml溶于PBS)，然后与1ml二碘化丙锭(PI，Sigma，100μg/ml溶于PBS)溶液混合。混合的细胞在暗室中37℃温育60分钟后，暗室4℃保存，用流式细胞术测定。
如图7-9和10-11所示，7D2-E3和11C8的培养上清液增加了Jurkat细胞编程性细胞死亡的比例，11C8的培养上清液增加了HL-60细胞编程性细胞死亡的比例。
【3】11C8培养上清液与HL-60细胞用于共培养系统，用人骨髓瘤基质细胞系KM102作饲喂细胞层，以确定这些培养上清是否诱导HL-60细胞的编程性细胞死亡。
特别地，KM102细胞接种于2孔的Lab-Tek Chamber玻片(NalgeNunc Intl。Corporation)，培养至亚铺满状态，在上面接种1×105HL-60细胞，约培养1天，去除未粘附的HL-60细胞。然后同时加入上述培养上清液达终浓度10％，细胞培养2天。培养后，用10％福尔马林固定细胞，诱导的编程性细胞死亡的HL-60细胞用TUNEL方法(Apop Tag plus，可获自Oncor Inc.)检测。如图12和13所示，11C8培养上清液比9C5培养上清液增加更多的编程性细胞死亡HL-60细胞，9C5培养上清液是用作对照的人IAP非反应活性的杂交瘤克隆的培养上清液。
(5)抗体纯化
为了纯化杂交瘤产生的抗体，将上述杂交瘤中产生IgG的克隆7D2-E3和11C8细胞系按照标准方法腹膜内注入预先施用了降植烷的BALB/C/AnNCrj小鼠(雄性，购自Charles River，日本)。几星期后，抽取产生的腹水并按标准方法分离纯化抗体。特别地，用Polos蛋白A塑料柱(prceptive Biosystem Inc.)从所得腹水中纯化抗体，用PBS(Dulbecco Inc.)透析，并用SDS-PAGE分析确定条带。如图14所示，在非还原和还原条件下，选用小鼠IgG(Cappel Inc.)标准样作对照条带的电泳证实7D2-E3和11C8克隆的IgG条带，与小鼠IgG标准样处于相同位置。
在本实施例中，将表达人整联蛋白相关蛋白(IAP)的L1210细胞用作致敏抗原是为了举例说明，但是同样可能用其它表达人IAP的细胞或人IAP本身作致敏抗原以相同方法制备单克隆抗体，并且也可能用噬菌体展示方法从抗体文库中制备单克隆抗体；本发明并不局限于前面所述的单克隆抗体，而是包括一切具有与其性质相似的单克隆抗体及一切产生那些单克隆抗体的杂交瘤。
此外，本发明中的这些单克隆抗体也包括人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、单链抗体、灵长类动物化抗体和由多种酶(木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、无花果蛋白酶等)消化抗体获得的抗体片段。
本发明中产生抗人整联蛋白相关蛋白(IAP)单克隆抗体的杂交瘤是一种新型的融合细胞，产生于亲本细胞DBA小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞系P3-U1；抗-IAP抗体(鼠杂交瘤11C8-F8(11C8亚克隆)，命名为“MABL-1”)的保藏号为FERM BP-6100；抗-IAP抗体(鼠7D2-E3(7D2亚克隆)，命名为“MABL-2”)的保藏号为FERM BP6101，已于1997年9月1日保藏于作为公共微生物授权保藏单位的国立生命科学和人体技术研究所、工业科学技术管理处和国际贸易工业部，位于日本1-3Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本。
实施例2(MABL-1和MABL-2抗体的亚类鉴定)
为鉴定以上获得的MABL-1和MABL-2抗体的亚类，各取500μl调至100ng/ml的MABL-1和MABL-2点在同型试剂盒上(Stratagene)，结果MABL-1显示为IgG1、κ，MABL-2显示为IgG2a、κ。
实施例3(表达人IAP的人白血病细胞)
用识别人IAP的抗-CD47抗体(商业化产品)，通过流式细胞术检测IAP在不同人白血病细胞系中的表达。因为认为人LAP与CD47(生物化学杂志，304，525-530，1994)相同，所以该抗体可用于检测。采用的细胞系为Jurkat和HL-60细胞(K562细胞、ARH77细胞、Raji细胞和CMK细胞)。每份样品使用2×105个细胞，终浓度5μg/ml的抗-CD47抗体与细胞温育，FITC标记的抗-小鼠IgG抗体(Becton Dickinson andCompany)用作二抗。小鼠IgG1抗体(Zymed Laboratories Inc.)用作对照。流式细胞术检测结果如图15(HL-60)和图16(Jurkat)所示，证明两种细胞均表达IAP。
实施例4(体外编程性细胞死亡效果)
(1)采用膜联蛋白-V(Boehringer Mannheim)检测抗体MABL-1和MABL-2对人IAP基因转染的L1210细胞、Jurkat细胞和HL-60细胞之诱导编程性细胞死亡的活性。图17-22显示了膜联蛋白-V的分析结果，图中左下方区域的点表示活细胞，右下方区域的点表示编程性细胞死亡的细胞，右上方区域的点表示坏死细胞。用作对照的小鼠IgG(ZymedLaboratories Inc.)抗体和抗体MABL-1、MABL-2，浓度为10μg/ml，当转染有人IAP基因的4×103 L1210细胞培养72小时以及6×104Jurkat细胞培养48小时后，用膜联蛋白-V进行分析。如图17-22所示，可观察到细胞死亡。对于1×105HL-60细胞，采用10μg/ml的MABL-1，经膜联蛋白-V分析，同样显示了细胞死亡。
(2)检验了MABL-2抗体Fab片段诱导人IAP基因转染的L1210细胞编程性细胞死亡的活性。特别地，人IAP基因转染的L1210细胞培养数为4×103细胞，所用的MABL-2抗体Fab片段和对照小鼠IgG浓度为10μg/ml。细胞培养72小时后经膜联蛋白-V测定。结果观察到相当大量的细胞死亡(图23，24)。实验使用的MABL-2抗体Fab片段是通过木瓜蛋白酶(Pierce Laboratories，Inc.)消化抗体并纯化而获得的。MABL-2抗体Fab片段采用SDS电泳分析(图25)。
实施例5(体内编程性细胞死亡研究)
(1)MABL-1和MABL-2(完整IgG)的药效
表达人IAP的KPMM2细胞(人骨髓瘤细胞系)移植入SCID小鼠，移植后第10天，MABL-1和MABL-2(完整IgG)分别各自以5μg/只和50μg/只的剂量单次静脉注射(n＝5)；KPMM2移植后第28天，用ELISA检测证实来源于KPMM2细胞的人IgG水平消失。并且测定了生存期。结果显示用MABL-1和MABL-2处理组小鼠血相中人IgG水平明显抑制，表明其抗肿瘤效果(图30)存活期也显示明显延长(图26)。
(2)MABL-1和MABL-2(F(ab′)2)的药效
经胃蛋白酶消化和蛋白A(Pierce Laboratories，Inc.)纯化制备的MABL-1和MABL-2抗体F(ab′)2片段，用于检测除Fc区介导的细胞毒效应以外的抗肿瘤效果。特别地，表达人IAP的KPMM2细胞(人骨髓瘤细胞系)移植入SCID小鼠，部分组在移植后第6天和第10天，静脉注射MABL-1和MABL-2F(ab′)2片段，剂量为100μg/只；部分组在移植后第6、8、10天注射MABL-1和MABL-2F(ab′)2片段，剂量分别为10和30μg/只；移植后第30天用ELISA测定源自KPMM2的人IAP水平(图27)。生存期测定直到移植细胞后90天。结果，在用MABL-1和MABL-2处理过的组发现血中人IgG水平有显著抑制，该结果表明其抗肿瘤效果。生存期也得到显著延长(图28)。图29显示了抗体MABL-1和MABL-2的F(ab′)2片段的SDS电泳图。
工业应用
本发明的单克隆抗体是这样一种抗体，其是能特异识别人整联蛋白相关蛋白，以及能特异性诱导含整联蛋白相关蛋白的具核血细胞编程性细胞死亡的抗原。因此，该抗体可用于识别人整联蛋白相关蛋白并进行区分和鉴定，同时也具有诱导具核血细胞编程性细胞死亡的作用；这些性质可用于制备治疗髓样白血病和淋巴样白血病的领域中有用的治疗剂。
                       序列表
<110>CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA
<120>诱导编程性细胞死亡的单克隆抗体
<130>CGS98-03PCT
<160>2
<210>1
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>1
GCAAGCTTAT GTGGCCCCTG GTAGCG 26
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>PCR引物
<400>2
GCGGCCGCTC AGTTATTCCT AGGAGG 26

Claims (5)

1.一种单克隆抗体，其结合于人整联蛋白相关蛋白并诱导含有人整联蛋白相关蛋白的具核血细胞编程性细胞死亡。
2.根据权利要求1的单克隆抗体的片段。
3.一种杂交瘤，其能产生根据权利要求1的单克隆抗体。
4.一种抗白血病剂，包括权利要求1的单克隆抗体或权利要求2的片段。
5.一种通过结合人整联蛋白相关蛋白的抗体诱导具有人整联蛋白相关蛋白的具核血细胞编程性细胞死亡的方法。
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