SK3232000A3 - MONOCLONAL ANTIBODY, FRAGMENT, PEPTIDE OR LOW MOLECULAR COMPOUNDì (54) FROM MONOCLONAL ANTIBODY, HYBRIDOMA PRODUCING MONOCL - Google Patents

MONOCLONAL ANTIBODY, FRAGMENT, PEPTIDE OR LOW MOLECULAR COMPOUNDì (54) FROM MONOCLONAL ANTIBODY, HYBRIDOMA PRODUCING MONOCL Download PDF

Info

Publication number
SK3232000A3
SK3232000A3 SK323-2000A SK3232000A SK3232000A3 SK 3232000 A3 SK3232000 A3 SK 3232000A3 SK 3232000 A SK3232000 A SK 3232000A SK 3232000 A3 SK3232000 A3 SK 3232000A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
cells
human
monoclonal antibody
iap
antibody
Prior art date
Application number
SK323-2000A
Other languages
English (en)
Inventor
Naoshi Fukushima
Shinsuke Uno
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chugai Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Publication of SK3232000A3 publication Critical patent/SK3232000A3/sk

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • A61P35/02Antineoplastic agents specific for leukemia
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Monoklonálna protilátka, fragment, peptid alebo nízkomolekulová zlúčenina z monoklonálnej protilátky, hybridóm produkujúci monoklonálnu protilátku a antileukémický prípravok
Oblasť techniky
Vynález sa týka nových monoklonálnych protilátok, ktoré majú schopnosť indukovať apoptózu krviniek s jadrom s proteínom pripojeným k integrínu (IAP); vynález sa ďalej týka tiež fragmentov uvedených monoklonálnych protilátok, peptidov a nízkomolekulových zlúčenín z uvedených monoklonálnych protilátok, a hybridómov, ktoré produkujú uvedené monoklonálne protilátky. Nové monoklonálne protilátky sú užitočné ako terapeutické látky pri myeloidnej leukémii a lymfoidnej leukémii.
Doterajší stav techniky
Granulocytové, kolóny stimulujúce faktory, ako je rekombinantný granulocytový, kolóny stimulujúci faktor (rG-CSF) sú v odbore známe ako humorálne faktory, ktoré stimulujú diferenciáciu a proliferáciu granulocytov. V správach, založených na pokusoch in vivo s použitím myší sa poukazuje na výsledky, ktoré ukazujú, že podávanie rG-CSF spôsobuje nielen zrýchlenú krvotvorbu v kostnej dreni, ale tiež významnú extramedulárnu krvotvorbu v slezine, proliferáciu všetkých hemopoietických prekurzorových buniek v slezine, vrátane hemopoietických kmeňových buniek. Mechanizmus extramedulárnej hemopoiézy v slezine sa považuje za pochod, v ktorom stimulácia rG-CSF mení hemopoietické mikroprostredie sleziny, zosilňuje hemopoiézu a podporuje jej schopnosť a tak indukuje krvotvorbu.
V snahe riešiť krvotvornú funkciu sleziny sa autori tohto vynálezu pri výskume sústredili na stromálne bunky sleziny po opakovanom podávaní rG-CSF. Autori vynálezu vyvinuli pri skúškach značné úsilie zistiť, ako je hemopietická funkcia zosilňovaná rG-CSF cez stromálne bunky a zistili, že opakovaným podávaním rGCSF možno zo sleziny myši získať hemopoietickú stromálnu bunkovú líniu (CF-1
-2bunky). Autori vynálezu študovali podpornú krvotvornú schopnosť hemopoietických stromálnych buniek a potvrdili stimulačnú účinnosť na kolónie in vitro a podpornú krvotvornú schopnosť kmeňových buniek in vivo (Blood, 80,1914 (1992)).
Hoci sa podarilo pripraviť uvedenú bunkovú líniu slezinových stromálnych buniek (CF-1 bunky) a študovali sa jej cytologické vlastnosti, nikdy neboli doteraz pripravené špecifické protilátky, ktoré by rozpoznávali povrchové antigény týchto buniek a doteraz neboli vyriešené ani ich vlastnosti.
Z hľadiska uvedených zistení, týkajúcich sa slezinových stromálnych buniek a predtým získaných výsledkov autori vynálezu v ďalšom výskume najskôr skúmali možnosť vyvinúť špecifické protilátky, ktoré môžu rozpoznávať slezinové stromálne bunky, pripravovali monoklonálne protilátky s použitím uvedených slezinových stromálnych bunkových línií ako scitlivujúcim antigénom a nakoniec boli úspešní v získaní nových mnokolonálnych protilátok.
Autori vynálezu ďalej študovali vlastnosti pripravených uvedených monoklonálnych protilátok, a zistili, že monoklonále protilátky majú schopnosť indukovať apoptózu myeloidných buniek. Tieto monoklonálne protilátky sa označili protilátky BMAP-1 a toto označenie sa používa ďalej v opise vynálezu.
Pôvodcovia vynálezu vyšetrovali tiež antigén, rozpoznávaný protilátkou BMAP-1 a klonovaním (s priamou expresiou) zistili, že uvedený antigén je proteín pripojený k integrínu myši (Integrin Associated Protein, IAP, myši) (GenBank, prístupové číslo Z25 524).
Účinok BMAP-1 protilátok sa študoval použitím rekombinantných buniek, do ktorých sa vložil gén pre IAP myši. Podrobnejšie, IAP gén myši sa vložil do Jurkatových buniek myši, ktoré neexprimujú myší IAP; na vytvorenie bunkovej línie, exprimujúcej IAP (rekombinantné Jurkatove bunky) sa použil bežný postup; účinok protilátky BMAP-1 na bunky exprimujúce myší IAP sa skúmal MTS analýzou a DNA fragmentáciou a s použitím prietokovej cytometrie (prihláška japonského patentu HEI 9-67 499).
Podľa uvedených poznatkov sa predpokladalo, že monoklonálne protilátky pre antigén ľudského proteínu pripojeného k integrínu (v ďalšom označovaného ako ľudský IAP; aminokyselinová sekvencia a sekvencia báz sú opísané v J. Celí Biol.
123. 485 až 496 (1993); pozri tiež Journal of Celí Science 108, 3419 až 3425
-3(1995)) majú mať účinok indukovať apoptózu krviniek s jadrom, ktoré exprimujú tento antigén (myeloidné bunky a lymfocyty); pôvodcovia tohto vynálezu ďalej vyvinuli úsilie, aby pripravili monoklonálne protilátky k antigénu ľudského proteínu pripojeného k integrínu; v tejto príprave boli nakoniec úspešní a získali monoklonálne protilátky, ktoré indukujú apoptózu ľudských krviniek s jadrom, exprimujúcich uvedený antigén.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu sú monoklonálne protilátky, ktorých vlastnosťou je, že indukujú apoptózu krviniek s jadrom (myeloidných buniek a lymfocytov) s ľudským proteínom pripojeným k integrínu (ľudský IAP), ďalej fragmenty týchto monoklonálnych protilátok ako aj hybridómy, ktoré produkujú uvedené monoklonálne protilátky.
Tieto monoklonálne protilátky sú užitočné ako terapeutické látky pri myeloidnej leukémii a lymfoidnej leukémii.
Uvedené funkcie proteínu pripojeného k integrín sú: účinok väzby s β reťazcom integrínového α\/β3 na podporu väzby medzi α\/β3 a jeho liganda vitronectínu (J. Celí. Biol. 123. 485 až 496 (1993)), účinok indukujúci prítok Ca2+do cievneho endotelu na základe adhézie neutrofilov s cievnym endotelom (J. Biol. Chem. 268. 19931 až 19934 (1993)) a účinok podporujúci migráciu neutrofilov cievnym endotelom (Proc. natl. Acad. Sci. USA 92, 3978 až 3982 (1995)); neboli ale zverejnené žiadne údaje o jeho funkcii, týkajúcej sa apoptózy krviniek s jadrom.
Monoklonálne protilátky podľa tohto vynálezu sú protilátky, ktoré špecificky rozpoznávajú ľudský protein pripojený k integrínu. Preto majú schopnosť rozlišovať a identifikovať ľudský protein pripojený k integrínu.
Monoklonálen protilátky podľa tohto vynálezu sú protilátky, ktoré majú ďalej vlastnosť indukovať s ľudským proteínom pripojeným k integrínu apoptózu krviniek s jadrom (myeloidných buniek a lymfocytov). Apoptóza je jav, pri ktorom sa štiepi jadrová chromatínová DNA na nukleozómové jednotky (známy ako ladder formát i on), následkom čoho bunky hynú, čo je často označované tiež ako bunková samovražda.
-4Doteraz známe protilátky, ktoré majú schopnosť vyvolať apoptózu krviniek s jadrom (myeloidných buniek a lymfocytov) zahŕňajú anti-Fas protilátku ( Celí 66, 233 až 243 (1991)), anti-CD43 protilátku (Blood 86, 502 až 511 (1955)) a anti-HLA Ia1 doménovú protilátku (Blood 90, 726 až 735 (1997)), ale doteraz schopnosť indukovať apoptózu krviniek s jadrom vplyvom protilátok podľa tohto vynálezu rozpoznávajúcich proteín pripojený k integrínu nebola známa. Monoklonálne protilátky podľa tohto vynálezu sú preto určené tak, že zahŕňajú akúkoľvek monoklonálnu protilátku, schopnú špecificky rozpoznávať proteín pripojený k integrínu a schopnú proteínom pripojeným k integrínu indukovať apoptózu krviniek s jadrom (myeloidných buniek a lymfocytov).
Protilátky podľa tohto vynálezu nie sú obmedzené iba na tie protilátky, ktoré indukujú apoptózu všetkých krviniek s jadrom. Protilátky podľa tohto vynálezu zahŕňajú tiež protilátiky, ktoré indukujú apoptózu najmenej jedného typu krviniek s jadrom. Bližšie, v prípade myeloidnej leukémie je postačujúce, ak protilátky indukujú apoptózu najmenej myeloidných buniek.
Podrobnejšie, tento vynález zahŕňa protilátky, ktoré indukujú apoptózu krviniek s jadrom, ktoré majú proteín pripojený k integrínu (IAP).
Vynález ďalej zahŕňa fragmenty, peptidy a nízkomolekulové zlúčeniny monoklonálnych protilátok, ktoré indukujú apoptózu krviniek s jadrom, ktoré majú protein pripojený k integrínu (IAP).
Vynález ďalej zahŕňa hybridómy, ktoré produkujú uvedené monoklonálne protilátky.
Vynález ďalej zahŕňa prípravok proti leukémii, ktorý obsahuje látku, ktorá sa viaže k IAP a podporuje účinok IAP pri indukcii apoptózy krviniek s jadrom.
Vynález ďalej zahŕňa prípravok proti leukémii, vyznačujúci sa tým, že uvedená látka je monoklonálna protilátka.
Vynález ďalej zahŕňa prípravok proti leukémii, vyznačujúci sa tým, že uvedená látka je fragment, peptid alebo nízkomolekulová zlúčeniny uvedených monoklonálnych protilátok.
-5Príprava monoklonálnej protilátky
Monoklonálne protilátky podľa tohto vynálezu možno vo všeobecnosti pripraviť ďalej uvedeným spôsobom. Monoklonálna protilátka podľa tohto vynálezu sa dá pripraviť napríklad použitím ľudského proteínu pripojeného k integrínu ako senzibilizujúceho antigénu, imunizáciou zvierat antigénom spôsobom imunizácie, ktorý je v odbore známy, vykonaním fúzy buniek spôsobom fúzovania buniek, ktorý je v odbore známy, a klonovaním spôsobom klonovania, ktorý je v odbore známy.
Výhodný spôsob prípravy monoklonálnych protilátok podľa tohto vynálezu je napríklad spôsob, v ktorom sa ako senzibilizujúci antigén použijú rekombinantné bunky myšej leumickej bunkovej línie L1210, ktorá exprimuje ľudský proteín pripojený k integrínu, plazmové bunky (imunocyty) cicavca, imunizované s uvedeným senzibilizujúcim antigénom sa fúzujú s myelómovými bunkami cicavcov, napríklad myši; výsledné fúzované bunky (hybridómy) sa klonujú, klony produkujúce protilátky podľa tohto vynálezu ktoré rozpoznávajú hore uvedené bunkové línie sa selektujú z výsledných klonov a kultivujú, čím sa získajú cieľové protilátky.
Uvedený spôsob je iba jeden z možných príkladov uskutočnenia podľa tohto vynálezu; senzibilizujúci antigén nie je napríklad obmedzený iba na uvedenú bunkovú líniu L1210 rekombinantných buniek, ale môže to byť tiež samotný ľudský proteín pripojený k integrínu (IAP), alebo ľudský IAP v rozpustnej forme; cieľové monoklonálne protilátky, ktoré indukujú apoptózu krviniek s jadrom (myeloidné bunky a lymfocyty) možno pripraviť rovnakým spôsobom ako v uvedenom prípade L1210 rekombinantných buniek.
Na prípravu cieľovej monoklonálnej protilátky možno použiť tiež fágový spôsob, vychádzajúc z cDNA knižnice pre protilátku.
Cicavci na imunizáciu senzibilizujúcim antigénom nie sú v spôsobe prípravy monoklonálnych protilátok osobitne vymedzení, ale výhodne sa vyberú s ohľadom na ich kompatibilitu s myeloidnými bunkami vybranými pre fúziu; vo všeobecnosti sú vhodné myši, potkany, škrečok a podobné.
Imunizácia sa výhodne vykoná bežným spôsobom. Napríklad sa rekombinantné bunky L1210 exprimujúce ľudský integrínový združený proteín podávajú zvieraťu intraperitonálne injekciou alebo podobným spôsobom. Bližšie, príslušné zriedenie alebo suspenzia s PBS alebo fyziologickým roztokom soli sa
-6výhodne podáva zvieraťu niekoľko krát v 10 dňových intervaloch. Ako imunocyty sa výhodne použijú bunky sleziny, extrahované po poslednom podaní buniek.
Myelómové bunky cicavca, použité ako rodičovské bunky pre fúziu s imunocytmi môžu byť rôzne bunky, známe v danom odbore; napríklad sa môžu použiť P3 (P3x63Ag8.653) [J. Immunol. 123. 1548 (1978)], P3-U1 [Current Topics in Microbiolgy and Immunology 81, 1 až 7 (1978)], NS-1 [Eur. J. Immunol. 6, 511 až 519 (1976)], MPC-11 [Celí, 8, 405 až 415 (1976)], Sp2/0-Ag14 [Náture 276, 269 až 270 (1978)], FO [J. Immunol. Meth. 35, 1 až 21 (1980)], S194 (J. Exp. Med. 148, 313 až 323 (1978)] a R210 [Náture 277,131 až 133 (1979)].
Bunková fúzia medzi imunocytmi a myelómovými bunkami sa môže uskutočniť v podstate bežnými spôsobmi, ako je napríklad spôsob Milsteina et al. [Methods Enzymol. 73, 3 až 46 (1991)].
Podrobnejšie, bunková fúzia sa vykoná napríklad v bežnom výživnom prostredí v prítomnosti fúzového promótora. Ako fúzový promótor sa môže použiť napríklad polyetylénglykol (PEG), vírus Sendai (HVJ) alebo podobné, a ak sa vyžaduje, možno použiť pomocnú látku ako je napríklad dimetylsulfoxid, aby sa zvýšila účinnosť fúzie. Imunocyty sa použijú výhodne v množstve 1 až 10 krát väčšom ako myelómové bunky. Na fúziu možno použiť prostredie napríklad prostredie RPMI-1640, prostredie MEM a podobné, ktoré sú vhodné pre rast myelómových bunkových línií, alebo ďalšie prostredia, bežne používané na kultiváciu uvedených buniek; prostredia sa môžu použiť tiež v kombinácii so sérovým doplnkom ako je fetálne bovinné sérum (PBS).
Fúzia buniek sa vykoná dokonalým zmiešaním predpísaných množstiev imunocytov a myelómových buniek v prostredí, pridaním roztoku PEG predhriateho na približne 37 °C (pričom PEG má strednú molekulovú hmotnosť napríklad približne 1 000 až 6 000), do prostredia, zvyčajne v koncentrácii okolo 30 až 60 % (hmotnosť/objem). Vhodné prostredie sa potom pridáva postupne a vzniklý supernatant sa oddelí odstredením. Tento postup sa opakuje až do získania vyžadovaných hybridómov.
Uvedené hybridómy sa selektujú kultiváciou v bežnom selekčnom prostredí, napríklad v prostredí HAT (prostredie obsahujúce hypoxantín, aminopterín a tymidín). V kultivácii v prostredí HAT sa pokračuje dostatočne dlhý čas, aby všetky
-7ostatné bunky okrem vyžadovaných hybridómov (všetky nefúzované bunky) uhynuli, na čo zvyčajne treba niekoľko dní až niekoľko týždňov. Na skríning a monoklonovanie hybridómov, produkujúcich vyžadované protilátky sa potom použije zaužívaný spôsob limitného zriedenia.
Uvedeným spôsobom pripravené hybridómy, ktoré produkujú monoklonálne protilátky podľa tohto vynálezu sa môžu subkultivovať v bežnom prostredí a môžu sa dlhdobo skladovať v tekutom dusíku.
Na získanie monoklonálnych protilátok podľa tohto vynálezu z hybridómov možno použiť ktorýkoľvek z vhodných postupov; možno použiť napríklad postup, v ktorom sa hybridómy môžu kultivovať bežným postupom a uvedené protilátky sa získajú z kultivačných supernatantov; v alternatívnom postupe sa hybridómy môžu podávať kompatibilnémi cicavcovi na proliferáciu a protilátky sa potom môžu získať z jeho ascitnej tekutiny. Prvý postup je vhodný na prípravu vysoko čistých protilátok, zatiaľ čo druhý postup je viac vhodný na hromadnú výrobu protilátok.
Uvedenými postupmi pripravené protilátky sa môžu čistiť na vysoký stupeň čistoty využitím bežných spôsobov čistenia ako je vysoľovanie, gélová filtrácia, afinitná chromatografia a podobné.
Fragmenty monoklonálnych protilátok
Monoklonálne protilátky podľa tohto vynálezu môžu byť úplné protilátky ako sa opisujú hore, alebo ich fragmenty. To znamená, že to môžu byť ktorékoľvek fragmenty monoklonálnej protilátky podľa tohto vynálezu, ktoré špecificky rozpoznávajú ľudský proteín pripojený k integrínu a indukujú apoptózu krviniek s jadrom (myeloidných buniek a lymfocytov), ktoré majú ľudský proteín pripojený k integrínu. Také fragmenty zahŕňajú Fab, F(ab')2, Fab' a ďalšie. Tieto fragmenty možno pripraviť digesciou s enzýmom ako je papaín, pepsín, ficín alebo podobný enzým. Vlastnosti pripravených fragmentov možno overovať rovnakým spôsobom ako sa uvádza hore.
Peptidy a nízkomolekulové zlúčeniny, ktoré majú rovnakú funkciu ako monoklonálne protilátky
-8Doteraz uvedené monoklonálne protilátky, ktoré rozpoznávajú ľudský proteín pripojený k integrínu a indukujú apoptózu krviniek s jadrom zahŕňajú tiež peptidy a nízkomolekulové zlúčeniny, ktoré podobne rozpoznávajú IAP a indukujú apoptózu krviniek s jadrom.
Vlastnosti monoklonálnych protilátok podľa tohto vynálezu
Monoklonálne protilátky podľa tohto vynálezu špecificky rozpoznávajú ľudský proteín pripojený k integrínu, ako sa podrobnejšie opisuje v ďalej uvedených Príkladoch.
Monoklonálne protilátky podľa tohto vynálezu ďalej indukujú apoptózu krviniek s jadrom (myeloidných buniek a lymfocytov) s ľudským protelnom pripojeným k integrínu.
Tieto vlastnosti možno využiť na získanie užitočného terapeutického prípravku pre oblasť liečby myeloidnej leukémie a lymfoidnej leukémie.
Je zrejmé, že konštrukcia špecifických systémov, zahŕňajúcich použitie uvedených monoklonálnych protilátok podľa tohto vynálezu ako protilátok na špecifické rozpoznávanie antigénu, ktorý spôsobuje apoptózu krviniek s jadrom na rozlíšenie a identifikáciu uvedených antigénov, alebo na využitie jedinečných vlastností uvedených monoklonálnych protilátok ako terapeutických látok pri myeloidnej leukémii a lymfoidnej leukémii, ako aj akékoľvek modifikácie a aplikácie uvedeného systému sú zahrnuté tiež v rozsahu tohto vynálezu, pokiaľ môžu byť vykonané použitím bežných spôsobov, ktoré sú známe odborníkom, skúseným v danej oblasti.
Protileukémické látky
Protileukémická látka podľa tohto vynálezu je založená na skutočnosti, že účinok IAP je podporovaný viazaním protilátky podľa tohto vynálezu. Pretože nejestvujú žiadne podrobné obmedzenia dávok uvedených protilátok podľa tohto vynálezu, je výhodné, ak dávky budú v rozmedzí 5 pg až 500 mg.kg'1.
V ďalšom texte sa vynález podrobnejšie objasňuje pomocou Príkladov.
Uvedené Príklady ale neznamenajú nijaké obmedzenie rozsahu a podstaty tohto vynálezu.
-9Prehrad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 je záznam z elektroforézy, znázorňujúci pás ľudského IAP, amplifikovaného spôsobom PCR s použitím cDNA, pripravenej z mRNA z HL-60 bunkovej línie. Z ľavej strany je znázornený marker molekulovej hmotnosti (M), IAP človeka (1) a β-aktín (2).
Obr. 2 je grafické znázornenie úrovne expresie ľudského IAP s použitím antiCD47 protilátky. Pík predstavuje L1210 bunky transfektované iba s pCOS1 génom ako kontrolný pokus.
Obr. 3 je ďalší graf, znázorňujúci hladinu expresie ľudského IAP bunkami L1210, ktoré s použitím anti-CD4 protilátky exprimovali ľudský IAP. Pík ukazuje, že v bunkách L1210, transfektovaných ľudským IAP génom sa expresia ľudského IAP celkom určite zvýšila.
Obr. 4 je graf, znázorňujúci protilátkové titre v imunizovanej myši. Ľavý pík predstavuje inaktné bunky L1210. Pravý pík predstavuje bunky L1210, transfektované ľudským IAP a ukazuje, že sérum myši vystavené fúzii buniek celkom zreteľne rozpoznáva ľudský IAP.
Obr. 5 je stĺpcový graf, znázorňujúci výsledky pokusu inhibície rastu (Jurkatove bunky) s použitím supernatanta hybridómovej kultúry.
Obr. 6 je stĺpcový graf, znázorňujúci výsledky pokusu inhibície rastu (bunky ARH77) s použitím supernatanta hybridómovej kultúry.
Obr. 7 znázorňuje apoptózovo-indukčný účinok supernatanta kultúry (ako bol stanovený PI farbením) na Jurkatove bunky; výsledky sú vzťahované vzhľadom na kontrolný supernatant kultúry 8G2. Rí vyznačuje percento (%) apoptózy, ktoré je 7,43 %.
Obr. 8 znázorňuje apoptózovo-indukčný účinok supernatanta kultúry (ako bol stanovený PI farbením) na Jurkatove bunky; výsledky sú vzťahované vzhľadom na kontrolný supernatant kultúry 7D2-E3. Ri vyznačuje percento (%) apoptózy, ktoré je 9,84 %.
Obr. 9 znázorňuje apoptózovo-indukčný účinok supernatanta kultúry (ako bol stanovený PI farbením) na Jurkatove bunky; výsledky sú vzťahované vzhľadom na
-10kontrolný supernatant kultúry 11C8. Ri vyznačuje percento (%) apoptózy, ktoré je 15,32%.
Obr. 10 znázorňuje apoptózovo-indukčný účinok supernatanta kultúry (ako bol stanovený PI farbením) na bunky HL-60; výsledky sú vzťahované vzhľadom na kontrolný supernatant kultúry 8G2. Mí vyznačuje percento (%) apoptózy, ktoré je 6,94 %.
Obr. 11 znázorňuje apoptózovo-indukčný účinok supernatanta kultúry (ako bol stanovený PI farbením) na bunky HL-60; výsledky sú vzťahované vzhľadom na kontrolný supernatant kultúry 11C8. Mi vyznačuje percento (%) apoptózy, ktoré je 12,16 %.
Obr. 12A je jednofarebná mikrofotografia, znázorňujúca výsledky analýzy apoptózy (spôsobom TUNEL) v ko-kultivovanom systéme KM-120 a HL-60 buniek, pričom sa ako kontrola použil supernatant kultúry 9C5. Apoptotické bunky sú vyfarbené načierno alebo nahnedo. Farbenie jadra sa vykonalo metylovou zelenou a použilo sa 100 násobné zväčšenie.
Obr. 12B je farebná mikrofotografia, znázorňujúca výsledky analýzy apoptózy (spôsobom TUNEL) v ko-kultivovanom systéme KM-102 a HL-60 buniek, pričom sa ako kontrola použil supernatant kultúry 9C5. Apoptotické bunky sú vyfarbené načierno alebo nahnedo. Farbenie jadra sa vykonalo metylovou zelenou a použilo sa 100 násobné zväčšenie.
Obr.13A je jednofarebná mikrofotografia, znázorňujúca výsledky analýzy apoptózy (spôsobom TUNEL) v ko-kultivovanom systéme KM-102 a HL-60 buniek, pričom sa ako kontrola použil supernatant kultúry 11C8. Na obraze je vidieť viac TUNEL-pozitívnych buniek ako na Obr. 12. Farbenie jadra sa vykonalo metylovou zelenou a použilo sa 100 násobné zväčšenie.
Obr.13B je farebná mikrofotografia, znázorňujúca výsledky analýzy apoptózy (spôsobom TUNEL) v kokultivovanom systéme KM-102 a HL-60 buniek, pričom sa ako kontrola použil supernatant kultúry 11C8. Na obraze je vidieť viac TUNELpozitívnych buniek ako na Obr. 12. Apoptické bunky sú vyfarbené na čierno alebo hnedo. Farbenie jadra sa vykonalo metylovou zelenou a použilo sa 100 násobné zväčšenie.
-11 Obr. 14 je záznam z elektroforézy, znázorňujúci výsledky SDS-PAGE analýzy IgG, čisteného z línie hybridómu 7D2-E3 a 11C8. Znázornené sú značkovače molekulovej hmotnosti (M, M'), IgG myši (autentická vzorka) v neredukčných podmienkach (1), 7D2-E3 (2), 11C8 (3), myší IgG (autentická vzorka) v redukčných podmienkach (4) a 11C8 (6).
Obr. 15 znázorňuje výsledky analýzy expresie CD4 prietokovou cytometriou s použitím buniek HL-60.
Obr. 16 znázorňuje výsledky analýzy expresie CD4 prietokovou cytometriou s použitím Jurkatových buniek HL-60.
Obr. 17 znázorňuje výsledky pre mlgG (10 pg.mľ1) ako kontrolu na dôkaz apoptózovo-indukčného účinku na bunky L1210, transfektované ľudským IAP génom (L1210-hlAP) (inkubácia 72 hodin).
Obr. 18 znázorňuje výsledky pre MABL-1 (10 pg.ml1) na bunky L1210, transfektované ľudským IAP génom (L1210-hlAP) (inkubácia 72 hodín).
Obr. 19 znázorňuje výsledky pre MABL-2 (10 pg.mľ1) na bunky L1210, transfektované ľudským IAP génom (L1210-hlAP) (inkubácia 72 hodín).
Obr. 20 znázorňuje výsledky pre mlgG (10 pg.mľ1) ako kontrolu na dôkaz apoptózovo-indukčného účinku na Jurkatove bunky (inkubácia 48 hodín).
Obr. 21 znázorňuje apoptózovo-indukčný účinok MABL-1 na Jurkatove bunky (inkubácia 48 hodín).
Obr. 22 znázorňuje apoptózovo-indukčný účinok MABL-2 (10 pg.mľ1 ) na Jurkatove bunky (inkubácia 48 hodín).
Obr. 23 znázorňuje výsledky pre mlgG (10 pg.mľ1) ako kontrolu na dôkaz apoptózovo-indukčného účinku na bunky L1210, transfektované ľudským IAP génom (L1210-hlAP) (inkubácia 72 hodín).
Obr. 24 znázorňuje výsledky apoptózovo-indukčný účinok Fab fragmentov MABL-2 (10 Mg.ml'1) na bunky L1210, transfektované ľudským IAP génom.
Obr. 25 je záznam SDS elektroforézy pre pre Fab fragmenty MABL-2 protilátky.
Obr. 26 znázorňuje významne väčšie obdobie prežitia po liečbe s MABL-2.
Obr. 27 znázorňuje výsledky analýzy spôsobom ELISA pre Príklad (2).
-12Obr. 28 znázorňuje významne väčšie obdobie prežitia po liečbe s F(ab')2 fragmentárni MABL-2.
Obr. 29 je záznam SDS eletroforézy pre protilátku MABL-1 a fragmenty F(ab')2 protilátky MABL-2.
Obr. 30 znázorňuje, ako sa hladiny ľudského IgG myšieho séra významne znižujú v skupine liečenej s MABL-1 a MABL-2, čo znamená protinádorové účinky týchto protilátok.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1 - Príprava monoklonálnej protilátky (1) Senzibilizujúci antigén a spôsob imunizácie
Antigénová senzibilizácia sa vykonala použitím rekombinantnej bunkovej línie ako senzibilizujúceho antigénu, ktorou boli L1210 bunky, transfektované ľudským IAP génom a vysoko exprimujúcich produkt. Bunky L1210 sa získali z DBA bunkovej línie leukémickej myši (ATCC No. CCL-219, J. Natl. Cancer Inst. 10, 179 až 192 (1949)).
Ľudský IAP gén sa amplifikoval spôsobom PCR s použitím primeru s ľudskou ΙΑΡ-špecifickou sekvenciou (primer v smere: GCAAGCTTATGTGGCCCCTGGTAGCG, protismerný primer: GCGGCCGCTCAGTTATTCCTAGGAGG) a cDNA, pripravenej z mRNA bunkovej línie HL-60 (Clontech Laboratories, Inc.) ako templát (Obr. 1).
Produkt PCR sa subklonoval do klonovacieho vektora pGEM-T (Promega Corporation) a použil sa na transformáciu E. coli JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.); po potvrdení nukleotidovej sekvencie vkladanej DNA pomocou sekvencera DNA (373A DNA Sequencer, dostupný od ABI) sa produkt subklonoval expresným vektorom pCOS1.
Expresný vektor pCOS1 je derivát pEF-BOS (Nucleic Acid Research 18,
5322 (1990)) a získal sa subklonovaním génu, odolného voči neomycinu, s použitím ľudského elongačného faktora-1a (elongation factor-1a) ako promótora/enhancera.
Tento ľudský ΙΑΡ-subklonovaný expresný vektor sa použil na vloženie génu do
-13bunkovej línie L1210 s DMRIE-C (Gibco/BRL); selekcia sa vykonala s Geneticínom (výsledná koncentrácia: 1 mg.dm'3, dostupný od Gibco/BRL); uvedené L1210 bunky s vloženým génom sa klonovali spôsobom obmedzeného riedenia.
Expresia antigénu pripravených klonov sa hodnotila s použitím OAP-rozpoznávajúcej anti-CD47 protilátky (PharMingen) a ako antigén-senzibilizujúce bunky sa vybrali klony s vysokými hladinami expresie (Obr. 2 a 3). Na kultiváciu uvedených rekombinantných buniek L1210 sa použilo 10 % bovinné fetálne sérum (FBS, dostupné od Moregate Inc.) a Iscovenom modifikované Dulbeccovo prostredie (Gibco/BRL); bunky sa subkultivovali v inkubátore s 5 % CO2 pri teplote 37 °C.
Ako imunizované zvieratá sa použili DBA/2 myši (druh od Charles River, Japonsko), ktoré boli z rovnakého kmeňa ako bunky L1210. Bunky L1210 transfektované génom ľudského proteínu pripojeného k proteínu (IAP), použité na antigénovú senzibilizáciu, sa inkubovali asi 30 minút s mitomycinom C (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) v koncentrácii 200 gg.mľ1; po potlačení rastu buniek sa mitomycín C dôkladne vymyl pred suspendovaním do PBS.
Uvedené bunky sa trikrát intraperitoneálne injektovali myší v intervaloch 10 dní, vždy približne 5.106 buniek. Po tretej imunizácii sa z očnice odobrala krv, sérum sa 50 násobne zriedilo s PBS, obsahujúcom 1 % BSA a pomocou zariadenia FACScan (Becton Dickinson and Co.) sa overovala väzba medzi zriedeným sérom a rekombinantnými bunkami L1210, použitými na antigénovú senzibilizáciu (Obr. 4); myš s najlepšou antisérovou akivitou sa podrobila posiľňovacej dávke imunizácie intraperitoneálnou injekciou 1.107 buniek 5 dní po štvrtej imunizácii. Štyri dni po poslednej imunizácii sa myš utratila a extrahovala sa slezina.
(2) Bunková fúzia
Po nakrájaní extrahovanej sleziny na tenké plátky sa disociované slezinné bunky odstredili a potom suspendovali v IMDM prostredí; bunky sa v prostredí dobre rozmiešali a starostlivo sa potom opláchli. Oddelene sa kultivovala myelómová bunková línia P3-U1 [Current Topics in Microbiology and Immunology 81. 1 až 7 (1978)] v prostredí IMDM, obsahujúcom 10 % fetálneho bovinného séra (FBS, od Moregate Inc.) a po premytí obdobne prostredím IMDM sa do odstredivkovej kyvety
-14odobralo 1.107 buniek a pridalo sa 5.107 slezinových buniek; zmes sa bežným spôsobom podrobila bunkovej fúzii [Clin. Exp. Immunol. 42, 458 až 462 (1980)] s použitím polyetylénglykolu 4 000 (Nakrai Chemical Co., Ltd.).
Výsledné fúzované bunky sa potom dispergovali v prostredí IMDM, obsahujúcom 10 % FBS a stimulačnú prísadu na rast fúzovaných buniek(BMCondimed H1, od Boehringer Mannheim Biochemicals) a rozdelili do 96 jamkovej kultivačnej platne na kultiváciu pri 37 °C v inkubátore s 5 % CO2. Nasledujúci deň sa bunky vložili do selekčného HAT prostredia a potom do 10 % FBS/IMDM prostredia, obsahujúceho stimulačnú rastovú látku; v kultivácii sa pokračovalo až do vyžadovaného rastu.
Na zhodnotenie účinku kultivačného supernatanta z týchto fúzovaných buniek na leukémické bunkové línie sa prostredie fúzovaných buniek nahradilo prostredím IMDM, obsahujúcim 10 % FBS a v kultivácii sa pokračovalo až do dostatočného rastu.
(3) Skríning
Vykonalo sa ďalej uvedené hodnotenie a výber (skríning) z kultivačného supernatanta hore uvedených fúzovaných buniek.
[1] Primárny skríning
Bunky línie slezinových stromálnych buniek myši (CF-1 bunky), transfektované génom ľudského proteínu pripojeného k integrínu (IAP) (rekombinantné bunky, do ktorých bol subklonovaný rovnaký plazmid ako bol plazmid použitý na prípravu ľudský IAP exprimujúcich L1210 buniek, použitých na antigénovú senzibilizáciu) sa očkovali na 96 jamkovej platni vždy 1.104 buniek na jamku a kultivovali sa cez noc; potom sa fixovali 2 % PLP (jodistan-lyzínparaformaldehyd); tak sa pripravili ELISA platne. Po premytí sa platne hodinu blokovali pri teplote miestnosti s použitím 1 % roztoku BSA a po ďalšom premytí sa pridalo vždy po 50 μΙ kultivačného supernatanta z každého hybridómu na hodinovú inkubáciu pri teplote miestnosti.
Po premytí sa pridal alkalickou fosfatázou značený proti-myší IgG+A+M (H+L) (Zymed Laboratoties Inc.); potom nasledovala hodinová inkubácia pri teplote
-15miestnosti. Po premytí sa pridal substrát Sigma 104 (Sigma-Aldrich Corporation) tak, aby sa dosiahla výsledná koncentrácia 1 mg.ml1; v inkubácii sa pokračovalo pri teplote miestnosti a merala sa špecifická aktivita čítačom mikroplatní (Model 3550, dostupný od BioRad Laboratories inc.).
Výsledkom bolo potvrdenie výskytu hybridóm v 2 089 jamkách z 2 880 jamiek očkovaných hybridómami, pričom v primárnom skríningu bolo pozitívnych 187 jamiek. Pred hodinovou kultiváciou pri teplote miestnosti sa ako negatívna kontrola pridalo vždy 50 μΙ myšieho lgG1 a ako pozitívna kontrola sa pridala anti-ľudská CD47 protilátka (BD PharMingen) v koncentráciách 3 pg-mľ1.
[2] Sekundárny skríning
Klony, ktoré sa hodnotili ako pozitívne v primárnom skríningu sa podrobili hodnoteniu spôsobom ELISA s použitím CF-1 buniek, exprimujúcich ľudský proteín pripojený k integrínu (IAP); ako negatívna kontrola sa použili CF-1 bunky transfektované iba expresným vektorom pCOS-1, aby sa rozlíšilo, či protilátky produkované hybridómami môžu špecificky rozpoznávať ľudský IAP.
Výsledkom bolo 21 pozitívnych z uvedených 187 jamiek, ktoré boli pozitívne pri primárnom skríningu. Tab. 1 ukazuje špecifickú väzbu ľudského IAP s 7D2 a 11C8 ako typické príklady pozitívnych jamiek, vyjadrované v jednotkách absorbancie pri spôsobe ELISA.
Tabuľka 1
(Surové údaje) PBS ahCD47 7D2 11C8
3 pg.mľ1
CF-1-pCOS1 0,185 0,160 0,189 0,149
CF1-hlAP-55-8 0,192 0,456 0,568 0,812
(Po odčítaní) PBS ahCD47 7D2 11C8
3 μg.mľ1
Špecifická väzba 0,007 0,296 0,379 0,663
-16[3] Terciárny skríning
Klony, ktoré boli v sekundárnom skríningu hodnotené ako pozitívne sa podrobili inhibičnej rastovej skúške s použitím Jurkatových buniek (línia ľudských lymfómových T buniek) a buniek ARH77 (línia ľudských myelómových buniek). Do každej jamky 96 jamkovej platne sa očkovalo 100 μΙ Jurkatových buniek, po 5.103 buniek na jamku a ARH77 bunky, 1.104 buniek na jamku a k bunkovej suspenzii sa pridalo 5 alebo 10 μΙ kultivačného supernatanta hybridómových klonov. Po približne dvojdňovej kultivácii sa spôsobom MTS stanovovali počty buniek. Ako kontrolné vzorky sa použilo 5 alebo 10 μΙ IMDM prostredia obsahujúceho 10 % FBS a rovnaké objemy kultivačných supernatantov klonov, ktoré boli v primárnom skríningu hodnotené ako negatívne (BG2 a 9C5).
Obr. 5 a 6 znázorňujú výsledky inhibičného účinku na rast štyroch reprezentatívnych klonov 11C8, 7D2-E3 (subklon 7D2), 13F1 a 2F12.
(4) Vlastnosti protilátok [1] Elisa systémom sa skúšali imunoglobulínové typy kultivačných supernatantov 11C8, 7D2-E3, 13F1 a 2F12.
Podrobnejšie, CF-1 bunky, exprimujúce ľudský proteín pripojený k integrínu (IAP) sa očkovali na 96 jamkovú platňu, aby sa pripravila platňa na systém skúšky ELISA. Potom sa do každej jamky pridalo 50 μΙ z každého kultivačného supernatanta; ako sekundárne protilátky sa nechali reagovať alkalickou fosfatázou značená antimyšia IgG protilátka (Zymed Laboratories Inc.) alebo anti-myšia IgM protilátka (Biosource Intl., Inc.) a merala sa aktivita mikroplatňovým čítačom. Výsledky potvrdili, že 11C8 a 7D2-E3 sú IgG, zatiaľ čo 13F1 a 2F12 sú IgM.
[2] DNA fragmentácia dvoch klonov 11C8 a 7D2-E3 z hore uvedených štyroch klonov sa hodnotila spôsobom prietokovej cytometrie (FACScan, dostupný od Becton, Dickinson and Company) s použitím Jurkatových buniek a HL-60 buniek. Jurkatove bunky sa použili pre 11C8 a 7D2-E3, HL-60 bunky sa použili pre11C8.
Jurkatove bunky a HL-60 bunky sa očkovali do 12 jamkovej platne pri 4.104 buniek na jamku/2 ml, a pridalo sa 200 μΙ kultivačných supernatantov 7D2-E3 a
-1711C8. Bunky sa kultivovali 2 dni a merali. Ako kontrola sa pridal rovnaký objem kultivačného supernatanta BG2. Bunky sa oddelili od kutivačnej platne a bunkové pelety sa fixovali 60 minút pri 200 x g pri 4 °C v 2 ml 70 % vychladeného etanolu. Potom sa bunky odstredili, premyli v 1 ml PBS a znova dispergovali v 0,5 ml PBS. Do 0,5 ml vzorky buniek sa pridalo 0,5 ml RNAázy (Typ l-A, Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA; 1 mg.ml'1 v PBS) a do zmesi sa pridal 1 ml roztoku propídiumjodidu (PI, Sigma, 100 pg.mľ1 v PBS). Rozmiešané bunky sa inkubovali 60 minút v tmavej miestnosti pri 37 °C a uchovávali sa v tmavej miestnosti pri 4 °C; vykonalo sa meranie prietokovou cytometriou.
Ako je zrejmé z Obr. 7až9a10až11, kultivačné supernatanty 7D2-E3 a 11C8 zvýšili podiel apoptóznych buniek z Jurkatových buniek a kultivačný supernatant 11C8 zvýšil podiel apoptóznych buniek z HL-60 buniek.
[3] Kultivačné supernatanty 11C8 sa použili v ko-kultivačnom systéme s bunkami HL-60 a s použitím výživnej vrstvy buniek bunkovej línie KM 102 ľudských myeloidných stromálnych buniek, aby sa stanovilo, či tieto kultivačné supernatanty indukujú apoptózu HL-60 buniek.
Podrobnejšie, bunky KM102 sa očkovali do 2 jamkovej komôrky (Lab-Tek Chamber Slide, Nalge Nunc Intl. Corporation) a priviedli sa do subkonfluentného stavu; na vrstvu buniek KM102 sa naočkovalo 1.103 buniek HL-60 a systém sa kultivoval približne jeden deň; potom sa nepripojené bunky HL-60 odstránili. Súčasne sa pridali hore uvedené kultivačné supernatanty až do konečnej koncentrácie 10 % a bunky sa 2 dni kultivovali. Po kultivácii sa bunky fixovali 10 % roztokom formaldehydu a apoptózne indukované bunky HL-60 sa určovali spôsobom TUNEL (ApopTaq Plus, dostupný u Oncor Inc.). Z Obr. 12 a 13 je zrejmé, že podiel apoptóznych buniek z HL-60 buniek zvyšuje viac kultivačný supernatant 11C8 ako kultivačný supernatant 9C5, pričom kultivačný supernatant 9C5 je ľudský IAP nereagujúci hybridómový kloň, ktorý sa použil ako kontrolný.
(5) Čistenie protilátky
Na čistenie protilátok produkovaných hybridómami sa bunkové línie IgGprodukujúcich klonov 7D2-E3 a 11C8 bežným spôsobom intraperitoneálne
-18injektovali myšiam, ktorým bol podávaný pristaň, BALB/c/AnNCrj (samčeky, od Charles River, Japonsko). Po niekoľkých týždňoch sa odobrala ascitová tekutina a protilátky sa bežným spôsobom oddelili a čistili. Podrobnejšie, protilátky sa čistili od odobratej ascitovej tekutiny pomocou plastickej kolóny Polos Protein A (Perceptive Biosystems Inc.) a dialyzovali s PBS (Dulbecco Inc.); pásy sa overovali analýzou SDS-PAGE. Z Obr. 14 je zrejmé, že aj v redukčných aj v neredukčných podmienkach sa pri elektroforéze potvrdili pásy pre IgG klonov 7D2-E3 a 11C8 v rovnakých polohách ako pásy autentickej vzorky myšieho IgG (Cappel Inc.), použitej ako kontroly.
V tomto príklade sa pre názornosť ako senzibilizujúci antigén použili bunky L1210, ktoré exprimujú ľudský proteín pripojený k integrínu (IAP), ale je možné pripraviť monoklonálne protilátky rovnakým spôsobom s použitím ďalších, ľudský IAP exprimujúcich buniek, alebo samotný IAP, a pripraviť monoklonálne protilátky z protilátkovej knižnice fágovým spôsobom (phage display method); tento vynález nie je obmedzený na hore uvedené monoklonálne protilátky, ale zahŕňa všetky monoklonálne protilátky s podobnými vlastnosťami ako majú uvedené protilátky a všetky hybridómy, ktoré produkujú také monoklonálne protilátky.
Vynález týchto monoklonálnych protilátok zahŕňa ďalej tiež humanizované protilátky, humánne protilátky, chimérne protilátky, jedno-reťazcové protilátky, primátované protilátky a fragmenty protilátok, získané digerovaním protilátok s rôznymi enzýmami (papaín, pepsín, ficín a podobné).
Uvedené hybridómy, produkujúce monoklonálne protilátky podľa tohto vynálezu, ktoré obsahujú anti-humánny proteín pripojený k integrínu (IPA), sú nové fúzované bunky, vytvorené z DBA slezinových buniek myši a z myšej myelómovej bunkovej línie P3-U1 ako rodičovských buniek; anti-IAP protilátka (myší hybridom 11C8-F8 (subklon z 11C8), označený ako MABL-1) bola uložená ako FERM BP6 100; a anti-IAP protilátka (myší hybridom 7D2-E3 (subklon z 7D2), označený ako MABL-2) bola uložená ako FERM BP-6 101 dňa 1. septembra 1997 v Národnom Ústave biologických vied a humánnych technológií (The National Inštitúte of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, na adrese 1 - 3 Higashi 1-chome,
- 19Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko) ako autorizovaného orgánu na ukladanie verejných mikroorganizmov.
Príklad 2 - Identifikácia podskupiny protilátok MABL-1 a MABL-2
Aby sa identifikovali podskupiny pripravených MABL-1 a MABL-2 protilátok sa z každej odobralo 500 μί (MABL-1 a MABL-2 ) a upravilo na objem 100 ng.mľ1 a nakvapkalo na súpravu Isotyping Kit (Stratagen), pričom sa MABL-1 prejavil ako lgG1,K a MABL-2 sa prejavil ako lgG2a,K.
Príklad 3 - Ľudské IAP exprimujúce ľudské leukémické bunky
IAP expresia v rôznych ľudských leukémických bunkových líniách sa zisťovala prietokovou cytometriou s anti-CD47 protilátkou rozpoznávajúcou ľudský IAP (komerčne dostupný výrobok). Táto protilátka sa použila na detekciu, pretože sa usudzuje, že ľudský IAP je identický s CD47 (Biochem. J. 304, 525 až 530 (1994)). Použili sa bunkové línie Jurkatových buniek a bunky HL-60 (K562 bunky, ARH77 bunky, Raji bunky a CMK bunky). Koncentrácia použitých buniek bola 2.105 buniek na vzorku; uvedená anti-DC47 protilátka sa inkubovala s uvedenými bunkami pri konečnej koncentrácii 5 pg.mľ1; ako sekundárna protilátka sa použila FITC-značená anti-myšia IgG protilátka (Becton, Dickinson and Company). Ako kontrolná vzorka sa použila myšia lgG1 protilátka (Zymed Laboratories Inc.). Výsledky z prietokovej cytometrie sú znázornené na Obr. 15 (pre HL-60) a na Obr. 16 (pre Jurkatove bunky) a potvrdzujú, že obidve bunkové línie exprimujú IAP.
Príklad 4 - Apoptózny účinok in vitro (1) Apoptózo-indukčná aktivita protilátok MABL-1 a MABL-2 na bunky L1210, transfektované ľudským IAP génom, na Jurkatove bunky a na bunky HL-60 sa skúšala spôsobom s Annexínom-V (Boehringer Mannheim). Výsledky analýz s
Annexínom-V sú znázornené na Obr. 17 až 22, v ktorých bodky v ľavej spodnej oblasti znázorňujú živé bunky, bodky v pravej spodnej oblasti vyznačujú apoptózne
-20bunky a bodky v pravej hornej oblasti vyznačujú odumreté bunky. Ako protilátky sa v pokusoch použili: v kontrolnom pokuse myšie IgG (Zymed Laboratories Inc.), ďalej sa použili protilátky MABL-1 a MABL-2 v 10 pg.mľ1; a 4.103 buniek L1210, transfektovaných ľudským IAP génom; vzorky sa inkubovali 72 hodín; 6.104 Jurkatových buniek sa inkubovalo 48 hodín; potom sa vykonala analýza s Annexínom-V. Pozorovalo sa uhynutie buniek, ako je to zrejmé z Obr. 17 až 22. Pre bunky L1210 sa použilo 10 pg.mľ1 MABL-1 a analýza s Annexínom-V pri 1.105 buniek opäť preukázala hynutie buniek.
(2) Skúšala sa apoptózo-indukčná aktivita Fab fragmentov protilátky MABL-2 na L1210 bunky transfektované ľudským IAP génom. Podrobnejšie, L1210 bunky transfektované ľudským IAP génom sa kultivovali pri 4.103 buniek a použili sa fragmenty protilátky MABL-2 a ako kontrolná vzorka myší IgG v koncentráciách 10 pg.mľ1. Bunky sa 72 hodín kultivovali a hodnotili s Annexínom-V. Výsledky hodnotenia preukazujú, že sa zistilo významné hynutie buniek (Obr. 23 a 24). Fab fragmenty protilátky MABL-2, použité v tomto pokuse sa získali digesciou protilátky s papaínom (Pierce Laboratories, Inc.) a čistením získaného produktu. Fab fragmenty protilátky MABL-2 sa analyzovali spôsobom SDS elektroforézy (Obr. 25).
Príklad 5 - Výskum apoptózy in vivo (1) Farmakologická účinnosť MABL-1 a MABL-2 (úplný IgG)
Ľudské IAP-exprimujúce bunky KPMM2 (bunková línia ľudského myelómu) sa transplantovali myši SCID a na 10 deň po transplantácii sa intravenóznou injekciou podali MABL-1 a MABL-2 (úplný IgG), každý v dávke 5 pg/hlavu a 50 pg/hlavu (n= 5); 28. deň po transplantácii KPMM2 sa spôsobom ELISA stanovili hladiny ľudského IgG, odvodené z KPMM2 a potvrdil sa úbytok ľudského IgG. Hodnotila sa tiež doba prežitia. Výsledky ukázali na významné potlačenie krvných hladín ľudského IgG v skupinách liečených s MABL-1 a MABL-2, čo predstavuje ich protinádorový účinok (Obr. 30). Ukázalo sa, že sa významne predĺžila aj doba prežitia (Obr. 26).
-21 (2) Farmakologická účinnosť fragmentov (F(ab')2) protilátok MABL-1 a MABL-2 (F(ab')2) fragmenty sa pripravili digesciou protilátok MABL-1 a MABL-2 s pepsínom a čistením s proteínom A (Pierce Laboratories, INC.). Pripravené fragmenty sa použili na skúšky protinádorových účinkov s vylúčením cytotoxického účinku cez Fc oblasti. Podrobnejšie, KPMM2 bunky, exprimujúce ľudský IAP (bunková línia ľudského myelómu) sa transplantovali SCID myši; šiesty a desiaty deň po transplantácii sa skupinám podali fragmenty F(ab')2 z MABL-1 a MABL-2 v dávke 100 pg/hlavu; ďalším skupinám sa podali fragmenty F(ab')2 z MABL-1 a MABL-2 v dávke 10 pg/hlavu a 30 pg/hlavu šiesty, ôsmy a desiaty deň po transplantácii. 30. deň po transplantácii sa spôsobom ELISA stanovovali hladiny ľudského IgG, odvodené z KPMM2 (Obr. 27). Sledovala sa tiež doba prežitia až do 90 dní po transplantácii. V skupinách liečených MABL-1 a MABL-2 sa zistil významný potláčaci účinok na hladiny ľudského IgG v krvi, čo znamená protinádorový účinok uvedených látok. Významne sa predĺžila aj doba prežitia (Obr. 28). Na Obr. 29 je zrejmý záznam SDS elektroforézy pre fragmenty F(ab')2 protilátok MABL-1 a MABL-2.
Priemyselné využitie
Monoklonálne protilátky podľa tohto vynálezu sú protilátky, ktoré špecificky rozpoznávajú ľudský proteín pripojený k integrinu a uvedené antigény indukujú apoptózu krviniek s jadrom, obsahujúcich ľudský proteín pripojený k integrinu. Podľa uvedeného sú tieto látky užitočné ako protilátky, ktoré rozpoznávajú ľudský proteín pripojený k integrinu na ich rozlišovanie a identifikáciu, pričom majú aj schopnosť indukovať apoptózu krviniek s jadrom; tieto vlastnosti sa môžu využiť na prípravu užitočných terapeutických prípravkov v oblasti liečby myeloidnej leukémie a lymfoidnej leukémie.

Claims (6)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Monoklonálna protilátka, ktorá indukuje apoptózu krviniek s jadrom, obsahujúcich proteín pripojený k integrínu - IAP.
  2. 2. Fragment, peptid alebo nízkomolekulová zlúčenina z monoklonálnej protilátky, ktoré indukujú apoptózu krviniek s jadrom, obsahujúcich proteín pripojený k integrínu - IAP.
  3. 3. Hybridom produkujúci monoklonálnu protilátku podľa nároku 1.
  4. 4. Protileukémický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje látku, ktorá sa viaže k IAP a stimuluje účinok IAP indukovať apoptózu krviniek s jadrom.
  5. 5. Protileukémický prípravok podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že uvedenou látkou je monoklonálna protilátka.
  6. 6. Protileukémický prípravok podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že uvedenou látkou je fragment monoklonálnej protilátky, peptid monoklonálnej protilátky, alebo nízkomolekulová zlúčenina monoklonálnej protilátky.
SK323-2000A 1997-09-11 2000-03-07 MONOCLONAL ANTIBODY, FRAGMENT, PEPTIDE OR LOW MOLECULAR COMPOUNDì (54) FROM MONOCLONAL ANTIBODY, HYBRIDOMA PRODUCING MONOCL SK3232000A3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP26485397 1997-09-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK3232000A3 true SK3232000A3 (en) 2000-09-12

Family

ID=17409137

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK323-2000A SK3232000A3 (en) 1997-09-11 2000-03-07 MONOCLONAL ANTIBODY, FRAGMENT, PEPTIDE OR LOW MOLECULAR COMPOUNDì (54) FROM MONOCLONAL ANTIBODY, HYBRIDOMA PRODUCING MONOCL

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20030157100A1 (sk)
EP (1) EP1035132B1 (sk)
KR (2) KR20040106585A (sk)
CN (1) CN1198845C (sk)
AT (1) ATE395362T1 (sk)
AU (1) AU740225B2 (sk)
CA (1) CA2303072A1 (sk)
DE (1) DE69839492D1 (sk)
HU (1) HUP0003513A3 (sk)
NO (1) NO20001238L (sk)
PL (1) PL339265A1 (sk)
RU (1) RU2212413C2 (sk)
SK (1) SK3232000A3 (sk)
WO (1) WO1999012973A1 (sk)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU222989B1 (hu) * 1993-09-03 2004-01-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Apoptózist kiváltó monoklonális ellenanyagok
US7531643B2 (en) 1997-09-11 2009-05-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Monoclonal antibody inducing apoptosis
AU2940900A (en) * 1999-03-10 2000-09-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Single-stranded fv inducing apoptosis
US7696325B2 (en) 1999-03-10 2010-04-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide inducing apoptosis
TWI242043B (en) * 2000-03-10 2005-10-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Polypeptide inducing apoptosis
US20040058393A1 (en) * 2000-04-17 2004-03-25 Naoshi Fukishima Agonist antibodies
AU2001246934A1 (en) * 2000-04-17 2001-10-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Agonist antibodies
RU2408606C2 (ru) 2000-10-20 2011-01-10 Тугаи Сейяку Кабусики Кайся Соединение - агонист тро
WO2002033073A1 (fr) 2000-10-20 2002-04-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anticorps agoniste degrade
EP1327680B1 (en) * 2000-10-20 2008-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified tpo agonist antibody
KR100870123B1 (ko) * 2000-10-20 2008-11-25 츄가이 세이야꾸 가부시키가이샤 저분자화 아고니스트 항체
EP2075256A2 (en) 2002-01-14 2009-07-01 William Herman Multispecific binding molecules
EP1561759B9 (en) 2002-10-11 2009-08-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell death-inducing agent
JP2004279086A (ja) 2003-03-13 2004-10-07 Konica Minolta Holdings Inc 放射線画像変換パネル及び放射線画像変換パネルの製造方法
EP1609803A4 (en) * 2003-03-31 2006-05-24 Chugai Pharmaceutical Co Ltd MODIFIED ANTIBODY AGAINST CD22 AND ITS USE
US8613922B2 (en) 2003-04-24 2013-12-24 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods for inhibiting diabetic retinopathy with an antibody against integrin associated protein (IAP)
CA2545166A1 (en) * 2003-11-11 2005-05-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Humanized anti-cd47 antibody
JP4767016B2 (ja) * 2003-12-12 2011-09-07 中外製薬株式会社 細胞死誘導剤
TW200530266A (en) * 2003-12-12 2005-09-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method of reinforcing antibody activity
TW200530269A (en) 2003-12-12 2005-09-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Mpl antibodies
WO2005056602A1 (ja) * 2003-12-12 2005-06-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha アゴニスト活性を有する改変抗体のスクリーニング方法
JP5057967B2 (ja) 2005-03-31 2012-10-24 中外製薬株式会社 sc(Fv)2構造異性体
EP1927367A4 (en) * 2005-05-18 2009-08-12 Univ Tokushima NOVEL PHARMACEUTICAL AGENT BASED ON AN ANTI-HLA ANTIBODY
KR101367544B1 (ko) 2005-06-10 2014-02-26 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 메글루민을 함유하는 단백질 제제의 안정화제, 및 그의이용
JP5085322B2 (ja) 2005-06-10 2012-11-28 中外製薬株式会社 sc(Fv)2を含有する医薬組成物
WO2007033221A2 (en) * 2005-09-13 2007-03-22 The General Hospital Corporation Methods and compositions for inhibition of immune responses
CA2657385A1 (en) * 2006-07-13 2008-01-17 Naoki Kimura Cell death inducer
CL2008000719A1 (es) * 2007-03-12 2008-09-05 Univ Tokushima Chugai Seiyaku Agente terapeutico para cancer resistente a agentes quimioterapeuticos que comprende un anticuerpo que reconoce hla de clase i como ingrediente activo; composicion farmaceutica que comprende dicho anticuerpo; y metodo para tratar cancer resistente a
DK3056514T3 (da) * 2008-01-15 2019-07-01 Univ Leland Stanford Junior Fremgangsmåder til at manipulere fagocytose medieret af cd47
EP3722317A1 (en) 2008-01-15 2020-10-14 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Markers of acute myeloid leukemia stem cells
CA2732102C (en) 2008-08-07 2018-01-02 Jeffrey S. Isenberg Radioprotectants targeting thrombospondin-1 and cd47
HUE13746964T2 (hu) * 2012-02-06 2020-01-28 Inhibrx Inc CD47 antitestek és alkalmazási eljárásaik
WO2014093678A2 (en) 2012-12-12 2014-06-19 Frazier William A Therapeutic cd47 antibodies
US9221908B2 (en) 2012-12-12 2015-12-29 Vasculox, Inc. Therapeutic CD47 antibodies
AU2016324316B2 (en) 2015-09-18 2023-02-09 Arch Oncology, Inc. Therapeutic CD47 antibodies
EP3484448A4 (en) 2016-07-13 2020-04-01 President and Fellows of Harvard College MIMETIC SCAFFOLDS OF CELLS HAVING ANTIGEN AND METHODS OF PREPARING AND USING THEM
EP3529276A4 (en) 2016-10-21 2020-06-17 Arch Oncology, Inc. CD47 THERAPEUTIC ANTIBODIES
US11180552B2 (en) 2017-12-01 2021-11-23 Seagen Inc. CD47 antibodies and uses thereof for treating cancer
CN110066336B (zh) * 2019-05-12 2021-11-09 杭州科兴生物科技有限公司 抗cd47单克隆抗体、片段及其医药用途
WO2023076511A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Lyell Immunopharma, Inc. Methods of generating cells
WO2024077174A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE199392T1 (de) * 1992-12-04 2001-03-15 Medical Res Council Multivalente und multispezifische bindungsproteine, deren herstellung und verwendung
HU222989B1 (hu) * 1993-09-03 2004-01-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Apoptózist kiváltó monoklonális ellenanyagok
US6719972B1 (en) * 1994-06-03 2004-04-13 Repligen Corporation Methods of inhibiting T cell proliferation or IL-2 accumulation with CTLA4- specific antibodies
US5885574A (en) * 1994-07-26 1999-03-23 Amgen Inc. Antibodies which activate an erythropoietin receptor
EP0903149A4 (en) * 1996-03-06 2002-02-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd METHOD FOR SCREENING SUBSTANCES INDUCING APOPTOSIS
US7531643B2 (en) * 1997-09-11 2009-05-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Monoclonal antibody inducing apoptosis
US7696325B2 (en) * 1999-03-10 2010-04-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide inducing apoptosis

Also Published As

Publication number Publication date
EP1035132B1 (en) 2008-05-14
HUP0003513A2 (hu) 2001-02-28
WO1999012973A1 (fr) 1999-03-18
NO20001238D0 (no) 2000-03-09
CN1198845C (zh) 2005-04-27
AU9002898A (en) 1999-03-29
EP1035132A1 (en) 2000-09-13
AU740225B2 (en) 2001-11-01
PL339265A1 (en) 2000-12-04
HUP0003513A3 (en) 2004-05-28
KR20040106585A (ko) 2004-12-17
EP1035132A4 (en) 2005-02-09
ATE395362T1 (de) 2008-05-15
NO20001238L (no) 2000-05-11
CA2303072A1 (en) 1999-03-18
KR20010023866A (ko) 2001-03-26
US20030157100A1 (en) 2003-08-21
RU2212413C2 (ru) 2003-09-20
CN1276798A (zh) 2000-12-13
DE69839492D1 (de) 2008-06-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK3232000A3 (en) MONOCLONAL ANTIBODY, FRAGMENT, PEPTIDE OR LOW MOLECULAR COMPOUNDì (54) FROM MONOCLONAL ANTIBODY, HYBRIDOMA PRODUCING MONOCL
US7531643B2 (en) Monoclonal antibody inducing apoptosis
KR100795745B1 (ko) 인슐린-유사 성장 인자 ⅰ 수용체에 대한 항체 및 그의용도
KR100919915B1 (ko) Nkg2d의 조절
Uno et al. Antitumor activity of a monoclonal antibody against CD47 in xenograft models of human leukemia
RU2177805C2 (ru) Средство, применяемое при лечении опухолей лимфатической ткани
KR101783907B1 (ko) CD66c에 대한 항체와 화학치료제를 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 약학조성물
JP3568398B2 (ja) アポトーシスを誘起するモノクローナル抗体
JP2023546743A (ja) 抗cd73抗体及びその使用
CZ2000907A3 (cs) Monoklonální protilátka indukující apoptózu
Wallén‐Öhman et al. A cell surface antigen (BAL) defined by a mouse monoclonal antibody inducing apoptosis in a human lymphocytic leukemia cell line