본 발명은 부분적으로는 CD8+ T 세포, NK 세포, 및 특정 활성화된 CD4+ T 세포 상의 활성화 수용체인 NKG2D의 조절이 자가면역 및 염증성 증후군의 예방 및/또는 치료에 효과적인 수단이라는 놀라운 발견에 기초한다. 한 측면에서, 본 발명자들은 NKG2D의 내재화를 자극하는 작용제 및 방법을 발견하고, 상기 작용제가 NKG2D 활성화와 관련된 증후군을 치료하는데 유용한 작용제임을 확인하였다. 상기 작용제 및 방법은 천연 가용성 NKG2D 리간드가 내재화를 자극할 수 없는 조건 (예를 들어 만성 염증성 증후군에 존재하는 것으로 생각되는 것) 하에서 특히 유용하다. 본 발명은 추가로 상기 염증성 증후군을 치료하기 위해 NKG2D의 기능적 발현을 감 소시키기 위한 임의의 수단을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 그의 활성화를 위해 주로 NKG2D에 의존하는 백혈구의 서브세트에만 영향을 준다.
본 발명은 백혈구의 NKG2D-매개 활성화와 관련된 증후군을 치료하거나 예방하는데 효과적인 방법 및 조성물을 포함한다. 상기 방법은 NKG2D를 발현하는 백혈구를 증후군의 예방 또는 치료에 적합한 조건 하에 세포의 NKG2D-매개 활성화를 감소시키는 작용제와 접촉시킴으로써 수행한다. 접촉은 임의의 적합한 방법, 예를 들어 작용제 또는 작용제를 포함하는 조성물을 NKG2D 경로(들)에 의해 활성화된 세포를 포함하는 환자 또는 숙주에게 환자 또는 숙주 내의 세포에 작용제 전달을 허용하는 조건 하에 투여하는 것에 의해 수행할 수 있다. NKG2D 활성화는 본 발명에 따라 (i) 세포 표면 상에 기존재하는 NKG2D 분자의 세포 표면을 고갈시키고; (ii) NKG2D와 DAP10의 기능적 상호작용을 저해하거나 NKG2D의 신호전달 기능을 차단하고; (iii) NKG2D의 생산을 전사, 번역, 또는 번역후 수준에서 저해하는 것을 포함하여, NKG2D 분자가 세포 표면에 도달하는 것을 방지하는 것 중 하나 이상에 의해 감소될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 NKG2D-보유 백혈구의 효과기 기능을 촉발시킬 유의한 활성화를 동시에 유발시키지 않으면서 그들의 내재화를 자극함으로써 기존재하는 세포-표면 NKG2D 분자를 감소시키는 것을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "NKG2D", "NKG2-D", "D12S2489E", "KLRK1" 및 "킬러 세포 렉틴-유사 수용체 서브패밀리 K, 멤버 1"은 야생형 및 돌연변이체 산물을 포함하여 인간 킬러 세포 활성화 수용체 유전자, cDNA (예를 들어, 호모 사피엔스 (Homo sapiens) - GENBANK 기탁 번호 NM-007360) 및 그의 유전자 산물, 및 그의 포유동물 대응물을 의미한다. 인간 NKG2D 코딩 영역은 서열 3에 제시되고, 인간 NKG2D 단백질 서열은 서열 4에 제시된다. NKG2D의 포유동물 대응물은 마우스 NKG2D (예를 들어 무스 무스쿨루스 (Mus musculus) - GENBANK 기탁 번호 NM-033078), 래트 NKG2D (예를 들어 라투스 노르베기쿠스 (Rattus norvegicus) - GENBANK 기탁 번호 NM-133512), 돼지 NKG2D (예를 들어 수스 스크로파 (Sus scrofa) - GENBANK 기탁 번호 AF285448), 원숭이 NKG2D (예를 들어 마카카 물라타 (Macaca mulatta) - GENBANK 기탁 번호 AJ554302) 및 오랑우탄 NKG2D (예를 들어 폰고 피그마에우스 (Pongo pygmaeus) - GENBANK 기탁 번호 AF470403)를 들 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 바람직한 실시태양은 NKG2D 조절제, 예를 들어 NKG2D 길항제 및 부분 길항제를 포함한다.
달리 언급되지 않으면, 본 발명의 방법은 임의의 종류의 NKG2D 활성과 관련된 염증성 질환, 예를 들어 NKG2D 활성과 관련된 임의의 염증성 자가면역 질환의 치료 (예를 들어 그 증상/상태가 존재하는 시기, 상기 상태/증상의 전파, 상기 상태/증상의 심도 등의 측면에서 병의 원인이 되는 것으로 생각되는 상태와 관련되고(되거나) 그 상태의 기초가 되는 증상을 감소시킴) 또는 예방 (예를 들어 발병 가능성 감소, 발병 지연, 발병후 심도의 지연, 발병시의 심도의 감소 등)의 측면에서 실시될 수 있다. 그러나, 상기 상태는 다양한 상태의 치료 방법이 본 발명의 특유한 측면으로 간주될 수 있도록 상당히 변경될 수 있음을 알 수 있을 것이다.
I. NKG2D 조절제
본원에서 달리 언급되지 않거나 분명하게 제시되지 않으면, 본 발명의 실시에 있어서, NKG2D-매개 세포 활성화를 감소시키는 임의의 작용제를 사용할 수 있다. 상기 작용제의 비제한적인 예는 NKG2D 리간드 또는 그의 NKG2D-결합 단편, 변이체 또는 유도체; 항체, 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체 (예를 들어 NKG2D-결합 항체); 세포에서 NKG2D 또는 DAP10 생산을 억제하는 핵산 (또는 그의 변이체 또는 유도체), 또는 소분자; NKG2D-DAP10 복합체의 형성 또는 기능을 저해하는 펩티드 또는 소분자; NKG2D 신호 전달을 변경시키는 소분자, 및 상기 작용제의 임의의 조합물을 포함한다. 예시적인 NKG2D 리간드는 예를 들어 미국 특허 6,653,447; 문헌 [Carayannopoulos et al., J Immunol, 169(8):4079-83, 2002]; [Carayannopoulos et al., Eur J Immunol, 32 (3):597-605, 2002]; [Sutherland et al., J Immunol, 168(2):671-9, 2002]; [Sutherland et al., Immunol Rev, 181:185-92, 2001]; 및 [Cosman et al., Immunity, 14(2):123-33, 2001]에서 볼 수 있다.
본 발명은 외부로부터의 NKG2D-발현 세포와 접촉하고 NKG2D-리간드 보유 세포 또는 재조합 NKG2D 리간드에 추후 노출시에 NKG2D-보유 세포의 활성화를 감소시키는 작용제를 포함한다. DAP10 포스포릴화의 자극, p85 PI3 키나제의 자극, Akt의 활성화, 인터페론-감마 (IFN-γ) 또는 다른 시토킨 또는 케모킨의 NKG2D-의존 생산, NKG2D-리간드 함유 표적 세포의 NKG2D-의존 치사 등을 비제한적으로 포함하는 상기 활성화의 임의의 표시를 모니터링할 수 있다. NKG2D 활성화 수준을 평가 하는 한 수단은 NKG2D 리간드 보유 표적 세포 (예를 들어 하기 실시예 1 참조)의 인간 NK 세포 치사를 측정하는 것이다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 유용한 NKG2D 조절제는 예를 들어 실시예 1에서 설명하는 모델 시스템에서 NKG2D 리간드-유도 NKG2D 활성화의 약 20% 이상의 감소를 야기하는 것이고, 다른 실시태양에서 작용제는 리간드-유도 NKG2D 활성화를 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 그 이상으로 감소시킨다. 예를 들어, NKG2D 리간드-유도 활성화는 대조군에 비해 작용제의 존재 하에 약 30% 이상 감소할 수 있다. 대조군은 예를 들어 (a) 개체, (b) 대조군으로서 평균값을 사용하는, 실질적으로 유사한 유기체의 집단, 또는 (c) 둘 모두에서 실질적으로 동일한 조건 하에서 작용제의 부재 하에서의 NKG2D-활성화일 수 있다. NKG2D 활성화 수준을 평가하는 다른 수단은 NKG2D 리간드, 예를 들어 MICA 또는 ULBP의 존재 또는 부재 하에 IFN-γ 생산을 측정하는 것이다. 비제한적으로 면역분석 또는 IFN-γ 단백질을 측정하는 다른 분석; IFN-γ 활성을 측정하는 생물학적 분석 등을 포함하여 IFN-γ 생산을 측정하는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 유용한 NKG2D 조절제는 NKG2D-매개 IFN-γ 생산을 약 20% 이상 감소시키는 것이고, 다른 실시태양에서, 작용제는 NKG2D-매개 IFN-γ 생산을 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 그 이상으로 감소시킨다.
한 일련의 실시태양에서, 본 발명에 따른 NKG2D 조절제는 NKG2D의 세포 내재화를 자극한다. 내재화는 임의의 적합한 수단, 예를 들어 유동 세포측정 (예를 들어 하기 실시예 2 참조); 면역형광 현미경 검사 (예를 들어 공초점 현미경 검사에 의한 항체 내재화의 모니터링); 세포-표면 NKG2D를 검출하는 결합 분석 등에 의해 평가할 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 유용한 NKG2D 조절제는 예를 들어 실시예 2에 설명된 모델 시스템에서 시험될 때 대조군에 비해 NKG2D의 세포-표면 수준의 적어도 약 10% 감소 또는 세포 표면으로부터 NKG2D의 소실율의 10% 증가를 야기하는 것이다. 다른 실시태양에서, 작용제는 세포-표면 수준의 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 초과의 감소 또는 NKG2D 소실율의 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 증가를 야기한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 NKG2D 조절제는 예를 들어 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, γδ-TcR+ T 세포 및 CD56/16+ NK 세포 중 1종 이상을 포함하는 NKG2D-발현 세포의 유의한 세포용해 또는 고갈을 야기하지 않는다. NKG2D-발현 세포를 치사시키는 물질의 능력은 임의의 적합한 수단, 예를 들어 아넥신 V 또는 프로피듐 요오다이드 염색을 이용하는 유동 세포측정 또는 현미경 검사에 의한 사멸 세포의 검출, 트리판 (Trypan) 블루의 도입, 유로퓸 분석 또는 크롬 방출 분석을 사용하여 평가할 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 유용한 NKG2D 조절제는 NKG2D-발현 세포의 약 90% 이상의 생존성을 보존하는 조건 하에서 검출가능한 치료상 이점을 보이는 것이다. 다른 실시태양에서, 작용제는 NKG2D-발현 세포의 수를 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 80% 미만으로 감소시킨다.
하기 표는 본 발명에 따른 NKG2D 조절제의 특징의 비제한적 예를 포함한다.
NKG2D 조절제의 특징
NKG2D 내재화의 자극 (대조군에 비교시 NKG2D 표면 수준의 감소% 또는 소실율의 증가%) |
NKG2D 활성화 (NKG2D-리간드 보유 세포에 노출한 후 NKG2D-보유 세포의 활성화 감소%) |
NKG2D-발현 세포의 고갈 (대조군에 비교시 NKG2D 발현 세포의 감소%) |
20% |
30% |
<5% |
20 |
50 |
<5 |
20 |
70 |
<5 |
20 |
90 |
<5 |
20 |
70 |
10 |
20 |
70 |
20 |
20 |
70 |
30 |
20 |
70 |
50 |
40 |
30 |
<5 |
40 |
50 |
<5 |
40 |
70 |
<5 |
40 |
90 |
<5 |
40 |
70 |
10 |
40 |
70 |
20 |
40 |
70 |
30 |
40 |
70 |
50 |
90 |
30 |
<5 |
90 |
50 |
<5 |
90 |
70 |
<5 |
90 |
90 |
<5 |
90 |
70 |
10 |
90 |
70 |
20 |
90 |
70 |
30 |
90 |
70 |
50 |
본 발명은 NKG2D의 천연 가용성 리간드 (예를 들어, MICA 또는 ULBP)가 만성 염증이 없는 개체에서 발생할 수 있는 내재화와 유사한 방식으로 만성 염증 환자에서 NKG2D의 내재화를 자극할 수 없는 것에 관한 것이고; 이론에 매이기를 바라지 않지만, 상기 현상은 적어도 부분적으로 만성 염증 상태를 동반하는 고수준의 시토킨으로 인한 것으로 생각된다. (상기 현상은 만성 염증 환자 및 건강한 환자에서 T 세포 또는 NK 세포 상의 NKG2D 수준을 비교함으로써 증명될 수 있고; 만성 염증에 NKG2D 리간드의 높은 순환 수준이 동반한다는 사실에도 불구하고, 2개의 군에서 유사한 NKG2D 수준은 NKG2D 내재화의 결함을 반영한다). 본 발명은 천연 가용성 NKG2D 리간드가 그렇게 하기에 효과적이지 않거나 덜 효과적일 조건 하에 NKG2D의 내재화를 자극하는 작용제, 및 본원에 제공된 본 발명의 다양한 방법에서 상기 작용제의 용도를 포함한다. 상기 효과를 조사하기 위한 임의의 적합한 모델 시스템이, 예를 들어 NKG2D-발현 세포가 내재화에 대한 천연 가용성 리간드의 효과를 방해하는 것으로 알려진 조건 하에 시토킨 (예를 들어 비제한적으로 인터루킨-2, 인터루킨-15, 종양 괴사 인자, 또는 이들의 조합물)에 노출되는 조건 하에 천연 가용성 리간드 및 본 발명에 따른 조절제의 NKG2D 내재화에 대한 효과를 비교함으로써, 상기 특징을 갖거나 나타내는 특정 작용제를 증명하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 NKG2D 조절제는 내재화를 매개하는 천연 가용성 리간드의 능력을 저해하는 조건 하에 (예를 들어, 1종 이상의 시토킨의 존재 하에) 내재화가 측정될 때, 천연 가용성 NKG2D 리간드에 의한 표면 NKG2D 수준 감소보다 적어도 10% 더 크게 표면 NKG2D 수준을 감소시킬 수 있다. 다른 실시태양에서, NKG2D 조절제는 NKG2D 내재화를 매개하는데 있어서 천연 가용성 NKG2D 리간드보다 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 초과로 더 효과적이다.
A. NKG2D 리간드
본 발명에 따른 한 종류의 NKG2D 조절제는 NKG2D 리간드를 포함한다. 전형적으로, 상기 리간드는 천연 가용성 리간드가 무효한 조건 하에 NKG2D 내재화를 자극하는데 효과적으로 만드는 천연 가용성 NKG2D 리간드 (예를 들어 가용성 형태의 MICA, MICB 및 ULBP)에 비해 몇몇 변형을 나타낸다. 예를 들어, 가용성 형태의 MICA 및 MICB 단백질 (즉, 막관통 및 세포질 도메인이 결핍되는, 예를 들어 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 US2003/0165835 참조), 또는 NKG2D-결합 활성을 보유하는 그로부터의 단편은 하나 이상의 NKG2D 분자에 결합하여 내재화를 자극할 수 있는 다량체성 NKG2D 리간드를 형성하기 위해 통상적인 방법을 이용하여 화학적으로 가교결합될 수 있다. NKG2D-결합 활성은 임의의 수단, 예를 들어, 경쟁적 결합, 유동 세포측정 등을 이용하여 평가될 수 있다. 다른 일련의 실시태양에서, 다량체성 NKG2D 리간드는 MICA, MICB, 또는 ULBP로부터 유래된 NKG2D-결합 도메인의 직렬 반복체 (tandem repeat) (적절한 스페이서로 분리된)를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현에 의해 생산될 수 있다. 다른 일련의 실시태양에서, 리간드는 추가의 화학기, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다.
B. 항체
본 발명은 NKG2D-매개 활성화를 감소시키는데 사용될 수 있는 임의의 항체, 예를 들어, NKG2D-매개 신호전달 경로를 통한 유의한 활성화 없이 NKG2D의 내재화를 자극하는 것의 사용을 포함한다. 상기 항체의 비제한적인 예는 NKG2D의 임의의 적합한 세포외 또는 세포내 에피토프에 대해 작용하는 항체; DAP10의 임의의 적합한 세포외 또는 세포내 에피토프에 대해 작용하는 항체; 및 가용성 NKG2D 리간드 또는 NKG2D-NKG2D 리간드 복합체에 대해 작용하는 항체를 포함한다. 이중특이적 항체, 즉, 2개의 결합 도메인이 각각 상이한 결합 에피토프를 인식하는 항체도 또한 포함된다. NKG2D의 아미노산 서열은 예를 들어 미국 특허 6,262,244에 개시되고, DAP10의 아미노산 서열은 문헌 [Wu et al., Science 285:730, 1999]에 개시되고, MICA 및 MICB 폴리펩티드의 아미노산 서열은 예를 들어 미국 특허 출원 공개 US 2003/0165835에 개시되며, 상기 문헌들은 그 전부가 본원에 참고로 포함된다.
일반적으로, 기본 항체 구조 단위는 테트라머를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각각의 테트라머는 각 쌍이 하나의 "경쇄" (약 25 kDa)와 하나의 "중쇄" (약 50 내지 70 kDa)를 갖는, 폴리펩티드 사슬의 2개의 동일한 쌍을 포함한다. 각 사슬의 아미노-말단부는 주로 항원 인식을 하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함할 수 있다. 각 사슬의 카르복시-말단부는 주로 효과기 기능을 하는 불변 영역을 규정할 수 있다.
전형적으로, 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 또한, 인간 중쇄는 전형적으로 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 이소형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 규정한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역과 연결되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다 (일반적으로 문헌 [Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, ed., 2nd ed. Raven Press, NY, 1989)] 참조).
각각의 경쇄/중쇄쌍의 가변 영역은 전형적으로 항체-결합 부위를 형성한다. 따라서, 일반적으로, 무손상 IgG 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 이중관능성 또는 이중특이적 항체를 제외하고는, 2개의 결합 부위는 일반적으로 동일하다. 정상적으로, 사슬은 모두 3개의 초가변영역 (또한, 상보성 결정 영역 또는 CDR로 불림)에 의해 연결된 비교적 보존된 프레임워크 영역 (FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각 쌍의 중쇄 및 경쇄의 CDR은 보통 특이적 에피토프에 결합할 수 있도록 프레임워크 영역에 의해 정렬된다. 일반적으로, N-말단부터 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄는 모두 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인에 대한 아미노산의 지정은 일반적으로 문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat et al., National Institutes of Health, Bethesda, MD, 5th ed., NIH Publ. No. 91-3242, 1991]; [Kabat, Adv Prot Chem, 32:1-75, 1978; Kabat et al., J Biol Chem, 252:6609-6616, 1977]; [Chothia et al., J Mol Biol, 196:901-917, 1987]; 및 [Chothia et al., Nature, 342:878-883, 1989]의 정의에 따른다.
본 발명의 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 이중특이적 항체, Fab 항체 단편, F(ab)2 항체 단편, Fv 항체 단편 (예를 들어, VH 또는 VL), 단쇄 Fv 항체 단편 및 dsFv 항체 단편을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 분자는 완전 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체일 수 있다. 일부 실시태양에서, 항체 분자는 모노클로날, 완전 인간 항체이다. 모노클로날 항체는 실질적으로 균질 항체의 집단으로부터 얻은 항체를 포함하고, 즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 집단을 구성하는 개별 항체가 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대해 작용하여 고도로 특이적이다. 모노클로날 항체는 다른 면역글로불린에 의해 본질적으로 오염되지 않는 하이브리도마 배양에 의해 합성될 수 있는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적인 균질 집단으로 존재하는 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않는다.
본 발명의 항체는 임의의 면역글로불린 불변 영역에 연결된 (성숙 또는 가공되지 않은) 임의의 항체 가변 영역을 포함한다. 경쇄 가변 영역이 불변 영역에 연결되면, 바람직하게는 카파 사슬이다. 중쇄 가변 영역이 불변 영역에 연결되면, 바람직하게는 인간 감마 1, 감마 2, 감마 3 또는 감마 4 불변 영역, 보다 바람직하게는 감마 1, 감마 2 또는 감마 4, 훨씬 더 바람직하게는 감마 1 또는 감마 4이다.
일부 실시태양에서, 예를 들어, NKG2D 또는 DAP10에 대해 작용하는 완전 인간 모노클로날 항체는 마우스 면역계보다는 인간 면역계의 일부를 갖는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 생성된다. 이들 트랜스제닉 마우스 (본원에서 "HuMAb" 마우스로 칭할 수 있음)는 내인성 뮤린 뮤 및 카파 사슬 좌위를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄 (뮤 및 감마) 및 카파 경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 소좌위 (minilocus)를 포함한다. 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 카파의 감소된 발현을 보이고, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진은 면역화에 반응하여 클래스 스위칭 (class switching) 및 체세포 돌연변이를 거쳐 고친화도 인간 IgG/카파 모노클로날 항체를 생성시킨다. HuMAb 마우스에서 완전 인간 항체의 생성은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.
모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495, 1975]에 처음 설명된 하이브리도마 방법을 이용하여 또는 다른 공지의 후속적으로 개발된 방법에 의해 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물은 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 면역화된다. 별법으로, 림프구는 시험관 내에서 면역화될 수 있다. 이어서 림프구는 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다. 이렇게 제조된 하이브리도마 세포는 융합되지 않은 모골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 바람직하게 함유하는 적합한 배양 배지에 접종하여 성장시킨다. 예를 들어, 모골수종 세포에 효소 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결핍된 경우, 하이브리도마 배양용 배지는 전형적으로 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제하는 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이다.
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를, 항원에 대해 작용하는 모노클로날 항체의 생산에 대해 분석한다. 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 분석, 예를 들어 방사선 면역분석 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA) 또는 면역형광 및 유동 세포측정 또는 웨스턴 블롯에 의해 결정할 수 있다. 요구되는 특이성, 친화도 및/또는 활성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후에, 희석 과정을 제한함으로써 클론을 서브클로닝하여 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다. 상기 목적을 위한 배양 배지는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체 내에서 성장시킬 수 있다. 서브클론에서 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 방법, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
모노클로날 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여 쉽게 단리되고 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 원료로서 기능한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터 내로 넣어질 수 있고, 이어서 숙주 세포, 예를 들어 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 이. 콜리 (E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 인간 293T 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포 내로 형질감염되어, 재조합 숙주 세포에서 합성된 모노클로날 항체를 얻는다.
항체 또는 항체 단편은 또한 매우 큰 파지 라이브러리를 제작하기 위한 전략으로서 사슬 셔플링 (shuffling) 및 조합적 감염 및 생체 내 재조합을 사용하거나 사용하지 않으면서 공지의 기술을 이용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체의 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 대안이다.
아미노산 서열의 변동이 서열의 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 90%, 95%, 가장 바람직하게는 99%를 유지한다면, 항체 또는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열의 근소한 변동이 본 발명에 포함된다. 특히, 보존적 아미노산 교환이 고려된다. 보존적 교환은 그들의 측쇄에 관련된 아미노산의 패밀리 내에서 일어나는 것이다. 아미노산 변화가 기능적 펩티드를 초래할 수 있는지 여부는 폴리펩티드 유도체의 특이적인 활성을 분석함으로써 쉽게 결정될 수 있다. 항체 또는 면역글로불린 분자의 단편 (또는 유사체)은 당업계의 통상의 기술자에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 단편 또는 유사체의 바람직한 아미노 말단 및 카르복시 말단은 기능적 도메인의 경계 가까이에 발생한다. 구조적 및 기능적 도메인은 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 데이타를 공공 또는 사유 서열 데이타베이스와 비교함으로써 확인될 수 있다. 바람직하게는, 공지의 구조 및/또는 기능을 갖는 다른 단백질에서 발생하는 서열 모티프 또는 예측된 단백질 형태 도메인을 확인하기 위해 컴퓨터화된 비교 방법이 사용된다. 공지의 3차원 구조로 접히는 단백질 서열을 확인하는 방법은 공지되어 있다. 서열 모티프 및 구조적 형태는 본 발명에 따른 구조적 및 기능적 도메인을 규정하는데 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, (1) 단백질 분해에 대한 감수성을 감소시키고(시키거나), (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키고(시키거나), (3) 단백질 복합체를 형성하는데 대한 결합 친화도를 변경시키고(시키거나), (4) 결합 친화도를 변경시키고(시키거나) (4) 상기 유사체의 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 조절하는 아미노산 치환이 이루어진다.
일반적으로, 본 발명에 따른 유용한 항-NKG2D 항체는 가용성 NKG2D 리간드의 친화도와 적어도 동일한 인간 NKG2D에 대한 친화도 (Kd)를 나타낸다. 일부 실시태양에서, 항체는 인간 NKG2D에 나노몰 친화도, 또는 훨씬 더 바람직하게는 피코몰 친화도로 결합한다. 일부 실시태양에서, 항체는 인간 NKG2D에 약 100 nM, 50 nM, 20 nM, 20 nM 또는 1 nM 미만의 Kd로 결합한다.
일부 실시태양에서, 유용한 항체는 인간 NKG2D와, 1종 이상의 MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3 및 ULBP4 사이의 상호작용을 감소시키는 것을 포함한다. 상기 차단 항체는 통상적인 경쟁 분석을 이용하여 확인할 수 있다.
C. 핵산 조절자
본 발명은 전사, 번역, 또는 번역후 수준에서 NKG2D 세포 표면 발현의 조절을 포함한다. 일부 실시태양에서, 조절자는 핵산계, 예를 들어 비제한적으로 DNA, RNA, 키메릭 RNA/DNA, 단백질 핵산 및 다른 핵산 유도체이다.
일부 실시태양에서, NKG2D 조절자는 NKG2D-발현 세포 내로 도입될 때 NKG2D 생산을 억제할 수 있는 RNA 분자 (RNAi로 부름), 예를 들어 짧은 헤어핀 이중가닥 RNA (shRNA)를 포함한다. NKG2D 발현을 조절하기 위한 유용한 RNAi 서열의 비제한적인 예는 서열 5'-GGATGGGACT AGTACACATT CC-3' (서열 10); 5'-TGGCAGTGGG AAGATGGCTC C-3' (서열 11); 및 5'-CAGAAGGGAG ACTGTGCACT CTATGCCTC-3' (서열 12)에 의해 코딩되는 것을 포함한다. NKG2D의 세포 표면 발현을 감소시킬 수 있는 임의의 서열이 본 발명의 실시에 있어서 사용될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
RNAi 구성체의 생산은 화학적 합성 방법에 의해 또는 재조합 핵산 기술에 의해 수행될 수 있다. 처리된 세포의 내인성 RNA 폴리머라제는 생체 내에서 전사를 매개할 수 있거나, 클로닝된 RNA 폴리머라제는 시험관 내에서 전사에 사용될 수 있다. RNAi 구성체는 예를 들어, 세포 뉴클레아제에 대한 감수성을 감소시키고(시키거나), 생체이용성을 개선시키고(시키거나), 제제 특징을 개선시키고(시키거나), 다른 약물운동학적 특성을 변화시키기 위해 인산염-당 주쇄 또는 뉴클레오시드에 대한 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 천연 RNA의 포스포디에스테르 결합은 적어도 하나의 질소 헤테로원자 또는 황 헤테로원자를 포함하도록 변형될 수 있다. RNA 구조에서 변형은 dsRNA에 대한 일반적인 반응을 피하면서 특이적인 유전적 억제를 허용하도록 맞추어질 수 있다. 마찬가지로, 염기는 아데노신 데아미나제의 활성을 차단하도록 변형될 수 있다. RNAi 구성체는 효소적으로 또는 부분적/완전 유기 합성에 의해 생산될 수 있고, 임의의 변형된 리보뉴클레오티드는 시험관 내에서 효소적 또는 유기 합성에 의해 도입될 수 있다.
RNA 분자를 화학적으로 변형하는 방법이 RNAi 구성체를 변형하기 위해 채택될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Heidenreich et al., Nucleic Acids Res, 25:776-780, 1977]; [Wilson et al., J Mol Recog, 7:89-98, 1994]; [Chen et al., Nucleic Acids Res, 23:2661-2668, 1995]; 및 [Hirschbein et al., Antisense Nucleic Acids Res Drug Dev, 7:55-61, 1997] 참조). 예를 들어, RNAi 구성체의 주쇄는 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스포디티오에이트, 키메릭 메틸포스포네이트-포스포디에스테르, 펩티드 핵산, 5-프로피닐-피리미딘 함유 올리고머 또는 당 변형체 (예를 들어, 2'-치환 리보뉴클레오시드, a-형상)으로 변형될 수 있다.
이중가닥 구조는 단일 자가-상보성 RNA 가닥 또는 2개의 상보성 RNA 가닥으로부터 형성될 수 있다. RNA 이중나선 형성은 세포 내에서 또는 밖에서 개시될 수 있다. RNA는 세포당 적어도 1 카피의 전달을 허용하는 양으로 도입될 수 있다. 보다 고 용량 (예를 들어, 세포당 적어도 5, 10, 100, 500 또는 1000 카피)의 이중가닥 물질은 보다 효과적인 억제를 일으킬 수 있는 반면, 보다 낮은 용량이 또한 특수한 용도에 유용할 수 있다. RNA의 이중나선 영역에 대응하는 뉴클레오티드 서열이 유전적 억제에 표적화된다는 점에서, 억제는 서열-특이적이다.
특정 실시태양에서, 대상 RNAi 구성체는 "소 간섭 RNA" 또는 "siRNA"이다. 이들 핵산의 길이는 보다 긴 이중가닥 RNA의 뉴클레아제 "다이싱 (dicing)"에 의해 생성된 단편의 길이에 대응하는 약 19 내지 30 뉴클레오티드, 예를 들어, 약 21 내지 23 뉴클레오티드이다. siRNA는 뉴클레아제 복합체를 모으고 특이적인 서열과 페어링시켜 복합체를 표적 mRNA에 유도하는 것으로 이해된다. 그 결과, 표적 mRNA는 단백질 복합체 내의 뉴클레아제에 의해 분해된다. 특정 실시태양에서, 21 내지 23개 뉴클레오티드의 siRNA 분자는 3' 히드록실 기를 포함한다.
본 발명에 사용하기 위한 siRNA는 당업자에게 공지된 많은 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 예를 들어, siRNA는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성되거나 재조합 방법으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 짭은 센스 및 안티센스 RNA 올리고머는 합성되고 어닐링되어 각 말단에서 2-뉴클레오티드 오버행을 갖는 이중가닥 RNA 구조체를 형성할 수 있다 ([Caplen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 98:9742-9747, 2001]; 및 [Elbashir et al., EMBO J, 20:6877-88, 2001]). 이들 이중가닥 siRNA 구조체는 이어서 선택되는 수동적인 흡수 또는 전달 시스템에 의해 세포에 직접 도입될 수 있다.
특정 실시태양에서, siRNA 구성체는 예를 들어 효소 다이서 (dicer)의 존재 하에 보다 긴 이중가닥 RNA의 프로세싱을 통해 생성될 수 있다. 한 실시태양에서, 초파리 시험관내 시스템이 사용된다. 상기 실시태양에서, dsRNA는 초파리 배아로부터 유도된 가용성 추출물과 조합되어 조합체를 생성시킨다. 조합체는 dsRNA가 약 21 내지 약 23 뉴클레오티드의 RNA 분자로 프로세싱되는 조건 하에 유지된다.
siRNA 분자는 통상적인 기술을 사용하여 정제할 수 있다. 예를 들어, 겔 전기영동을 사용하여 siRNA를 정제할 수 있다. 별법으로, 비-변성 방법, 예를 들어 비-변성 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 siRNA를 정제할 수 있다. 또한, 크로마토그래피 (예를 들어 크기 배제 크로마토그래피), 글리세롤 구배 원심분리, 항체를 사용한 친화도 정제를 사용하여 siRNA를 정제할 수 있다.
일부 실시태양에서, 플라스미드는 예를 들어, 전사 생성물로서 이중가닥 RNA를 전달하기 위해 사용된다. 상기 실시태양에서, 플라스미드는 RNAi 구성체의 각각의 센스 및 안티센스 가닥에 대한 "코딩 서열"을 포함하도록 설계된다. 코딩 서열은 예를 들어 역전된 프로모터에 인접된 동일한 서열일 수 있거나, 각각 별개의 프로모터의 전사 제어 하의 2개의 별개의 서열일 수 있다. 코딩 서열이 전사된 후, 상보성 RNA 전사체는 염기쌍을 지어 이중가닥 RNA를 형성한다. PCT 출원 공개 WO01/77350에서는 진핵 세포에서 동일한 트랜스진의 센스 및 안티센스 RNA 전사체를 얻기 위해 트랜스진의 양방향 전사를 위한 예시적인 벡터를 설명하고 있다.
II. 치료 방법
본 발명은 염증성 질환, 예를 들어 NKG2D 활성화와 관련된 다양한 염증성 자가면역 질환 및 증후군의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 증후군은 스트레스-관련 NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA, MICB 및 ULBP)의 유도가 자가반응성 T 세포 및/또는 NK 세포의 과도한 활성화 및/또는 팽창을 일으키는 (이는 시토킨, 예를 들어 IL-2, TNF-α 및 IL-15의 증가된 수준으로 반영될 수 있다) 임상 상황을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
따라서, 특정 측면에서, 본 발명은 류마티스성 관절염 (RA)의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다. 상기 방법은 리간드-유도 NKG2D 활성화를 감소시키는 작용제의 유효량을 RA에 걸리거나 RA가 발병할 실질적인 위험이 있는 것으로 확인되거나/진단된 환자에게 RA가 치료되거나 예방되도록 전달하는 것을 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명의 RA 치료/예방 방법은 NKG2D에 "대한" (즉, NKG2D"에 특이적인" 또는 NKG2D"에 특이적으로 결합하는" 또는 NKG2D"에 우선적으로 결합하는") 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체 단편의 사용에 의해 실시된다. 한 측면에서, 작용제 (예를 들어 항-NKG2D mAb 또는 mAb 단편)은 예를 들어 미국 특허 6,414,218 및 미국 특허 출원 공개 20030005469에 설명된 바와 같이 RA의 허용되는 모델에서 RA를 개선시키는데 효과적인 것으로 증명된 작용제이다 (관련 원리 및 모델은 예를 들어 문헌 [Wooley, P. H., Animal Models of Arthritis, eds. J. H. Klippel and P. A. Dieppe, Mosby Publishers (London), 1998]; [Eming et al., Arthritis Res, 4 Suppl 3:S 133-40, 2002]; [Holmdahl et al., Ageing Res Rev, 1(1):135-47, 2002]; [Anthony et al., Clin Exp Rheumatol, 17(2):240-4, 1999]; [Durie et al., Clin Immunol Immunopathol, 73(1):11-8, 1994]; 및 [Muller-Ladner et al., Drugs Today (Barc), 35(4-5):379-88, 1999]에 기재되어 있다). 다른 측면에서, 작용제는 NKG2D-발현 백혈구의 리간드-유도 NKG2D 활성화를 검출가능하게 감소시키고(시키거나) NKG2D+ T 세포 또는 NK 세포의 팽창을 상기 세포를 유의하게 고갈시키지 않으면서 (예를 들어, 적합한 대조군에 비교할 때 상기 세포를 약 10% 이하로 감소시키면서) 손상시킬 수 있는 (예를 들어 자가반응성 CD8+ T 세포의 팽창 및/또는 기능을 손상시킬 수 있는) 항체이다 (예를 들어 미국 특허 출원 공개 20040115198에 설명된 항체의 적어도 일부에 대조적으로). 한 측면에서, 방법은 RA의 치료 또는 예방 (적용가능한 경우)과 일치하는 방식으로 1종 이상의 바이오마커의 조절을 일으킨다 (예를 들어, 혈청 IL-6, TNF R, IL-2R, shed CD4, shed CD8, 및/또는 C 반응성 단백질). 다른 측면에서, 방법의 실시는 환자/숙주의 말초 관절에서 활막염의 검출가능한 감소를 일으킨다. 한 측면에서, 방법은 예를 들어, 환자 또는 숙주에서 방사선촬영 진행의 감소, 붓고 아픈 관절의 감소 (허용되는 분석 기준에 의해 결정), 및/또는 유의하게 개선된 삶의 질 (예를 들어, RA Health Assessment Questionnaire 상의 장애 점수의 감소로 결정됨)로 나타나는 바와 같이 환자 또는 숙주에서 방사선 촬영에 의한 쇠약을 예방하고 신체 기능을 개선시킨다.
다른 예시적인 특정 측면에서, 본 발명은 다발성 경화증 (MS)의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다. 방법은 리간드-유도 NKG2D 활성화를 감소시키는 작용제의 유효량을 MS에 걸리거나 MS가 발병할 실질적인 위험이 있는 것으로 확인되거나/진단된 인간 환자 또는 포유동물 숙주에게 환자 또는 숙주에서 MS가 치료되거나 예방되도록 전달하는 것을 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명의 MS 치료/예방 방법은 NKG2D에 대한 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체 단편 ("항-NKG2D 항체")을 사용하여 실시된다. 보다 구체적인 측면에서, 작용제는 NKG2D-발현 백혈구의 리간드-유도 NKG2D 활성화를 검출가능하게 감소시키고(시키거나) NKG2D+ T 세포 또는 NK 세포의 팽창을 상기 세포를 유의하게 고갈시키지 않으면서 손상시킬 수 있는 항-NKG2D 모노클로날 항체이다.
또다른 예시적인 측면에서, 본 발명은 염증성 장질환 (IBD), 예를 들어 크론병 또는 궤양성 대장염의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다. 방법은 리간드-유도 NKG2D 활성화를 감소시키는 작용제의 유효량을 IBD에 걸리거나 IBD가 발병할 실질적인 위험이 있는 것으로 확인되거나/진단된 인간 환자 또는 포유동물 숙주에게 환자 또는 숙주에서 IBD가 치료되거나 예방되도록 전달하는 것을 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명의 IBD 치료/예방 방법은 NKG2D에 대한 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체 단편을 사용하여 실시된다. 보다 특정한 측면에서, 작용제는 NKG2D-발현 백혈구의 리간드-유도 NKG2D 활성화를 검출가능하게 감소시키고(시키거나) NKG2D+ T 세포 또는 NK 세포의 팽창을 상기 세포를 유의하게 고갈시키지 않으면서 손상시킬 수 있는 항-NKG2D 모노클로날 항체이다.
다른 면에서, 본 발명은 건선의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다. 방법은 리간드-유도 NKG2D 활성화를 감소시키는 작용제의 유효량을 건선에 걸리거나 건선이 발병할 실질적인 위험이 있는 것으로 확인되거나/진단된 인간 환자 또는 포유동물 숙주에게 환자 또는 숙주에서 건선이 치료되거나 예방되도록 전달하는 것을 포함한다. 전형적으로, 방법은 NKG2D에 대한 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체 단편의 유효량을 환자에게 전달하여 수행된다. 보다 특정한 측면에서, 작용제는 NKG2D-발현 백혈구의 리간드-유도 NKG2D 활성화를 검출가능하게 감소시키고(시키거나) NKG2D+ T 세포 또는 NK 세포의 팽창을 상기 세포를 유의하게 고갈시키지 않으면서 손상시킬 수 있는 항-NKG2D 모노클로날 항체이다.
또다른 면에서, 본 발명은 이식 거부반응의 가능성을 감소시키는 (또는 이식 거부반응-관련 상태의 심도 또는 발병 시간을 감소시키는) 방법을 제공한다. 방법은 리간드-유도 NKG2D 활성화를 감소시키는 작용제의 유효량을 조직/기관 이식편의 수여자가 될 예정이거나, 수여자이거나, 최근에 수여자였던 인간 환자 또는 포유동물 숙주에게 거부반응의 가능성이 검출가능하게 감소되도록 (예를 들어 대조군에 비해) 전달하는 (예를 들어, 직접 투여하거나 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물에 의해 투여하는 등) 것을 포함한다. 특정 측면에서, 방법은 항-NKG2D mAb 또는 항-NKG2D mAb 단편의 전달에 의해 실시된다. 보다 특정한 측면에서, 작용제는 NKG2D-발현 백혈구의 리간드-유도 NKG2D 활성화를 검출가능하게 감소시키고(시키거나) NKG2D+ T 세포 또는 NK 세포의 팽창을 상기 세포를 유의하게 고갈시키지 않으면서 손상시킬 수 있는 항-NKG2D mAb 또는 단편이다.
다른 측면에서, 본 발명에 따른 작용제, 예를 들어 항-NKG2D mAb 또는 항-NKG2D mAb 단편은 I형 당뇨병에 걸리거나 I형 당뇨병이 발병할 실질적인 위험이 있는 환자 또는 숙주에게 환자 또는 숙주에서 상태를 치료하거나 예방하기 위해 충분한 양으로 충분한 조건 하에 전달된다.
본 발명의 방법은 유사하게 NKG2D와 관련된 다양한 다른 자가면역 질환 및 염증성 질환, 예를 들어 전신성 홍반성 루푸스, 하시모토 갑상선염, 중증 근육무력증, 길랑 바레 증후군, 자가면역 포도막염, 원발성 담즙성 간경변, 자가면역 간염, 자가면역 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 자가면역 저혈소판증, 그레이브스병, 자가면역 난소염, 자가면역 고환염, 측두동맥염, 항-인지질 증후군, 베게너 육아종증, 베체트병, 공피증, 다발성 근염, 피부근육염, 강직척추염, 쇼그렌 증후군, 포진피부염, 심상성 천포창, 백반증, 건선 관절염, 골관절염, 스테로이드-내성 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 및 아테롬성 동맥경화증에 적용될 수 있다. 몇몇 바람직한 실시태양에서, 이식편은 골수 (BM) 또는 말초 혈액 줄기세포 (PBSM) 이식편이다. 일부 실시태양에서, BMT 또는 PBSCT 이식편은 백혈병 또는 림프종의 치료제로서 투여되는 반면, 다른 실시태양에서, 이식편은 다른 종류의 암, 예를 들어 신경모세포종 또는 다발 골수종에 대한 치료제로서 투여된다.
본 발명의 실시에 있어서, NKG2D 조절자는 환자에게 염증성 또는 자가면역 증후군을 예방하거나 치료하기 위해 단일 투여 유효량을 포함하는 단일 용량으로서, 또는 함께 증후군을 예방하거나 치료하기 위한 유효량을 포함하는 일련의 단계적 용량으로 투여될 수 있다. NKG2D 조절자의 유효량은 단일 용량 또는 다수 용량의 집합체로 또는 임의의 다른 종류의 규정된 치료 방식의 일부로서 투여될 때 증후군과 관련된 적어도 하나의 임상 파라미터에 의해 입증되는 바와 같이 성과에서 측정가능한 통계학적 개선을 생성시키는 조절자의 양을 의미한다. NKG2D 조절자의 유효량은 NKG2D 조절자를 투여받지 않는 환자와 비교할 때 질환의 진행을 느리게 할 수 있다 .
NKG2D 조절자의 유효량과 전체 투여량 방식은 질환 및 환자의 임상 상태에 따라 변할 수 있고, 이는 다시 하나 이상의 임상 파라미터, 예를 들어 임상적으로 인정되는 질환 점수로 반영될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 류마티스성 관절염에 대해, 질환의 심도 및/또는 치료의 성과는 부은 관절; 통증; 이동성; 및/또는 공식적 질환 점수 ACR 20/50 또는 70의 수치를 모니터링함으로써 평가할 수 있다. I형 당뇨병에 대해, 질환의 심도 및/또는 치료의 성과는 혈당 수준 또는 그의 변형, Hb1C 수준 등을 측정함으로써 평가할 수 있다. 다발성 경화증에 대해, 뇌 염증은 뇌를 스캐닝하여 평가할 수 있다. 조혈 이식 거부반응에 대해, 질환의 심도 (융합의 실패) 및/또는 치료의 성과는 골수 소멸성 조건화를 겪은 환자에서 연장된 호중구감소, 저혈소판증, 및 적혈구 수혈 의존의 증거에 의해, 및 골수 비소멸성 조건화를 겪은 환자에서 키메라증을 관찰하지 못한 것에 의해 평가할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하는 치료 성과에 대한 검출가능한 효과는 다른 치료에 대한 필요성의 감소 (예를 들어, 다른 약물 또는 치료의 양 및/또는 지속기간의 감소), 입원 횟수 및/또는 기간의 감소, 병으로 인한 작업일 손실의 감소 등을 포함한다. 유효량은 당업계의 통상의 기술자가 일상적인 실험에 의해 값의 매트릭스를 작성하고 매트릭스 내에 상이한 지점을 시험함으로써 결정할 수 있음이 추가로 이해될 것이다.
본 발명은 NKG2D 조절자와 1종 이상의 추가의 작용제의 조합 투여를 포함한다. NKG2D 조절자와 다른 작용제의 조합물의 투여를 포함하는 실시태양에서, NKG2D 조절자의 투여량은 그 자체 상에 유효량을 포함할 수 있고, 추가의 작용제(들)은 환자에게 치료상 이점을 추가로 증대시킴이 이해될 것이다. 별법으로, NKG2D 조절자 및 제2 작용제의 조합물은 함께 증후군을 예방하거나 치료하기 위한 유효량을 포함할 수 있다. 유효량은 구체적인 치료 방식의 맥락에서, 예를 들어, 투여의 시기 및 횟수, 투여 방식, 제제화 등에서 규정될 수 있음이 또한 이해될 것이다
NKG2D-관련 증후군이 I형 당뇨병인 일부 실시태양에서, 추가의 작용제는 췌장 베타 세포의 성장을 촉진하거나 베타 세포 이식, 예를 들어, 베타 세포 성장 또는 생존 인자 또는 면역조절 항체를 증강시키는 1종 이상의 작용제를 포함한다. NKG2D-관련 증후군이 류마티스성 관절염인 일부 실시태양에서, 추가의 작용제는 메토트렉세이트; 항-TNF-α 항체; TNF-α 수용체-Ig 융합 단백질, 항-IL-15 항체, 비-스테로이드성 소염 약물 (NSAID), 및 질환 조절 항-류마티스 약물 (DMARD) 중 하나 이상이다. 예를 들어, 추가의 작용제는 생물학적 작용제, 예를 들어 항-TNF제 (예를 들어 ENBREL(등록상표)), 인플릭시맙 (REMICADE(등록상표)) 및 아달리무맙 (HUMIRA(등록상표)) 또는 리툭시맙 (RITUXAN(등록상표))일 수 있다. NKG2D-관련 증후군이 조혈 이식 거부반응인 일부 실시태양에서, 조혈 성장 인자(들) (예를 들어, 에리트로포이에틴, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-11, 트롬보포이에틴 등) 또는 항미생물제(들) (예를 들어, 항생제, 항바이러스제, 항진균제)가 보조 치료로서 투여될 수 있다. NKG2D-관련 증후군이 건선인 일부 실시태양에서, 추가의 작용제는 1종 이상의 타르 및 그의 유도체, 광선요법, 코르티코스테로이드, 시클로스포린 A, 비타민 D 유사체, 메토트렉세이트, p38 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK) 억제제, 및 생물학적 작용제, 예를 들어 항-TNF-알파제 및 RITUXAN(등록상표)이다. NKG2D-관련 증후군이 염증성 장질환 (IBD), 예를 들어 크론병 또는 궤양성 대장염인 일부 실시태양에서, 추가의 작용제는 1종 이상의 아미노살리실레이트, 코르티코스테로이드, 면역조절자, 항생제, 또는 생물학적 물질, 예를 들어 REMICADE(등록상표) 및 HUMIRA(등록상표)이다.
III. 제약 제제 및 투여 방식
본 발명은 또한 1종 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있는, NKG2D 조절자를 포함하는 제약 제제를 포함한다. 제약상 허용되는 담체는 본 발명에 의해 제공되는 NKG2D 조절자 또는 관련 조성물 또는 조합물과 생리학적으로 적합한 임의의 모든 적합한 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 제약상 허용되는 담체의 예는 물, 염수, 인산염 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 이들의 조합물 중 1종 이상을 포함한다. 많은 경우에, 상기 조성물 내에 등장제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 제약상 허용되는 물질은 또한 바람직하게 NKG2D 조절자, 관련 조성물 또는 조합물의 저장 수명 또는 효과를 향상시킬 수 있는 소량의 보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 버퍼이다. 제약 조성물의 담체 및 다른 성분에 대한 적합성은 NKG2D 조절자, 관련 조성물 또는 조합물의 목적하는 생물학적 특성에 대한 유의한 부정적 효과의 결여를 기준으로 결정된다.
본 발명에 따른 NKG2D 조절자 조성물, 관련 조성물 및 조합물은 다양한 적합한 형태로 존재할 수 있다. 상기 형태는 예를 들어, 액체, 반-고체 및 고체 투여 형태, 예를 들어 액체 용액 (예를 들어, 주사가능 및 주입가능 용액), 분산액 또는 현탁액, 에멀젼, 마이크로에멀젼, 정제, 환제, 분말, 리포좀, 덴드리머 (dendrimer) 및 다른 나노입자 (예를 들어, 문헌 [Baek et al., Methods Enzymol, 362:240-9, 2003]; 및 [Nigavekar et al., Pharm Res, 21:476-83, 2004 참조), 마이크로입자, 및 좌제를 포함한다. 최적 형태는 의도된 투여 방식, 조성물 또는 조합물의 성질, 및 치료 용도에 따른다. 제제는 또한 예를 들어 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질 (양이온성 또는 음이온성) 함유 소포, DNA 컨쥬게이트, 무수 흡수 페이스트, 수중유성 및 유중수성 에멀젼, 에멀젼 카르보왁스 (각종 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반-고체 겔, 및 카르보왁스를 포함하는 반-고체 혼합물을 포함할 수 있다. 제제 내의 활성 성분이 제제에 의해 불활성화되지 않고 제제가 투여 경로에서 생리학적으로 적합하고 인용가능하다면, 임의의 상기한 혼합물은 본 발명에 따른 처리 및 치료에 적절할 수 있다 (또한 예를 들어 문헌 [Powell et al. "Compendium of exipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol, 52:238-311, 1998] 및 제약 화학자에게 잘 공지된 부형제 및 담체에 관한 추가 정보에 대한 상기 문헌의 인용문을 참조한다).
NKG2D 조절자 조성물은 또한 NKG2D 조절자 펩티드 및 그의 적합한 염의 임의의 적합한 조합물을 포함하는 조성물을 포함한다. 임의의 적합한 염, 예를 들어 임의의 적합한 형태 (예를 들어, 완충 염)의 알칼리 토금속염이 NKG2D 조절자의 안정화에 사용될 수 있다 (바람직하게는 염의 양은 NKG2D 조절자의 산화 및/또는 침전을 방지하는 양이다). 적합한 염은 전형적으로 염화나트륨, 숙신산나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, 황산마그네슘, 및 염화칼슘을 포함한다. 염기 및 NKG2D 조절자를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 다른 측면에서, 본 발명은 등장(tonicifying) 양의 임의의 염이 결핍된 NKG2D 조절자 조성물을 제공한다.
제약 용도의 조성물은 또한 희석제, 충전제, 염, 완충액, 세정제 (예를 들어, 비이온성 세정제, 예를 들어 Tween-80), 안정화제 (예를 들어 당 또는 단백질-부재 아미노산), 보존제, 조직 고정액, 가용화제, 및/또는 제약 조성물에 포함시키기 적합한 다른 물질을 포함할 수 있다. 적합한 성분의 예는 또한 예를 들어, 문헌 [Berge et al., J Pharm Sci, 6661:1-19, 1977]; [Wang and Hanson, J Parenteral Sci Tech, 42:S4-S6, 1988], 미국 특허 6,165,779 및 6,225,289; 및 이들에서 언급되는 다른 문헌에 설명되어 있다. 상기 제약 조성물은 또한 보존제, 항산화제, 또는 당업자에게 공지된 다른 첨가제를 포함할 수 있다. 추가의 제약상 허용되는 담체는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Urquhart et al., Lancet, 16:367, 1980]; [Lieberman et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS-DISPERSE SYSTEMS, 2nd ed., vol. 3, 1998]; [Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS & DRUG DELIVERY SYSTEMS, 7th ed., 2000]; [Martindale, THE EXTRA PHARMACOPEIA, 31st ed.]; [Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16th-20th editions]; [THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, Goodman and Gilman, eds., 9th ed., 1996]; [Wilson and Gisvolds' TEXTBOOK OF ORGANIC MEDICINAL AND PHARMACEUTICAL CHEMISTRY, Delgado and Remers, eds., 10th ed., 1998]; 및 미국 특허 5,708,025 및 5,994,106에 설명된다. 제약상 허용되는 조성물을 제제화하는 원리는 또한 예를 들어, 문헌 [Platt, Clin Lab Med, 7:289-99, 1987]; [Aulton, PHARMACEUTICS: THE SCIENCE OF DOSAGE FORM DESIGN, Churchill Livingstone, NY, 1988]; [EXTEMPORANEOUS ORAL LIQUID DOSAGE PREPARATIONS, CSHP, 1998], 및 ["Drug Dosage," J Kans Med Soc, 70(1):30-32, 1969]에 설명된다. 벡터의 투여에 특히 적합한 추가의 제약상 허용되는 담체는 예를 들어 국제 특허 공개 WO 98/32859에 설명된다. 한 예시적인 측면에서, 활성 화합물 또는 조합물은 제어 방출 제제, 예를 들어 임플란트 (implant), 경피 패치, 및 마이크로캡슐화 전달 시스템과 같은, 화합물을 신속한 방출에 대해 보호할 담체와 함께 제조된다. 생분해성 생체적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드리드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 상기 제제의 제조를 위한 많은 방법은 특허받았거나 당업계의 숙련인에게 일반적으로 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [SUSTAINED AND CONTROLLED RELEASE DRUG DELIVERY SYSTEMS, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., NY, 1978] 참조).
다른 측면에서, 경구 투여용으로 의도된 본 발명의 조성물은 예를 들어 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 함께 제제화될 수 있다. 화합물 (및 원하는 경우 다른 성분)은 또한 경질 또는 연질 외피 젤라틴 캡슐 내로 포함되거나, 정제로 압축되거나, 대상환자의 음식 내로 직접 포함될 수 있다. 경구 치료 투여를 위해, 화합물은 부형제가 포함되고 섭취가능한 정제, 구강 정제, 트로키제, 캡슐, 엘릭서제, 현탁액, 시럽, 웨이퍼제 (wafer) 등의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여 외의 방법으로 본 발명의 화합물을 투여하기 위해, 화합물을 그의 불활성화를 방지하기 위한 물질로 코팅하거나 동시투여하는 것이 필요할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 NKG2D 조절자, 관련 조성물 또는 조합물, 제약학적 담체, 및 임의로 다른 제약 조성물 성분을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 NKG2D 조절자 외에 진단 또는 치료제를 포함할 수 있다. 키트는 또한 진단 또는 치료 방법에서 사용하기 위한 지시서를 포함할 수 있다. 한 일련의 실시태양에서, 키트는 NKG2D 조절자, 관련 화합물, 또는 조합 조성물을 고안정성 형태로 (예를 들어 동결건조된 형태로), 고도로 안정된 조성물과 혼합하여 주사가능한 조성물을 형성할 수 있는 제약상 허용되는 담체(들)과 조합하여 포함한다.
NKG2D 조절자 조성물, 관련 조성물 및 조합 조성물은 임의의 적합한 경로, 예를 들어 경구, 점막, 구강, 비내, 흡입, 정맥내, 피하, 근육내, 비경구, 종양내, 종양외 또는 국소 경로를 통해 투여될 수 있다. 이들은 또한 미니펌프 (minipump) 또는 다른 적합한 장치를 통해 연속 투여될 수 있다. 항체 또는 다른 NKG2D 조절자는 항체가 질환 상태가 악화되는 것을 중단시키거나 개선시킨다면 일반적으로 질환 상태가 존재하는 만큼 오랫동안 투여될 것이다. 항체 또는 다른 NKG2D 조절자는 일반적으로 본원에서 설명된 바와 같이 제약상 허용되는 조성물의 일부로서 투여될 것이다. 항체는 임의의 적합한 경로로 투여될 것이지만, 전형적으로 통상적인 제약상 허용되는 담체, 보조제 등 (안정화제, 붕해제, 항산화제 등)을 함유하는 투여 단위 제제로 비경구 투여된다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구"는 피하, 정맥내, 동맥내, 근육내, 흉골내, 주두건내 (intratendinous), 척수강내, 두개내, 흉곽내, 주입 기술 및 복강내 전달을 포함한다. 가장 일반적으로, 항체는 정맥내 또는 피하 투여될 것이다. 주사 경로는 또한 근육 내 주사 (근육내, IM); 피부 하 주사 (피하, SC); 정맥 내 주사 (정맥내, IV); 복강 내 주사 (복강내, IP); 및 피부 내/통한 다른 전달 (피내, ID, 보통 다수 주사에 의한)를 포함한다.
본 발명은 임의의 상기하거나 본원에 설명된 측면에서 인용된 임의의 상태 또는 상태들의 조합의 예방 또는 치료에서 화합물의 사용에 관한 정보를, 잠재적으로 관심대상인 임의의 사람 또는 존재 (예를 들어, 제약회사 체인, 규정 관리자, 보험 회사, HMO, 병원 및 병원 체인, 다른 의료 회사, 약국 관리자, 잠재적인 환자, 완화 중의 환자, 일차 의료 치료자, 간호사, 약국의 의사, 및/또는 오피니언 리더)에게 배포하는 (예를 들어, 분배되거나, 우송되는 등의 인쇄물에 의해; 광고 신호에 의해; 텔레비전 프로그램 및 광고에 의해; 라디오 프로그램 및 광고에 의해; 인터넷 사이트 포스팅에 의해; 이메일에 의해; 통신판매에 의해; 방문 또는 개별 판매에 의해; 회의, 패널, 포럼 등에 자금을 제공하고(하거나) 주최함으로써, 판매원 및/또는 의학/학술 연락자의 서비스를 고용하고(하거나) 계약함으로써, 상기 용도에 관련된 학술 연구 및 출간에 자금을 제공하고(하거나) 주최함으로써) 것을 포함하는, 임의의 선행하는 측면에 따르거나 또는 달리 본원에 설명된 화합물의 판매 및/또는 사용을 촉진하는 방법을 추가로 제공한다.
하기 실시예는 본 발명의 특정 바람직한 실시태양 및 측면을 증명하고 추가로 설명하기 위해 제공되고, 그의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않는다.