JP2007532549A - Nkg2dの調節 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、特に、自己反応性T細胞の拡大および機能を障害することによって、炎症性症候群を治療および/または予防するための方法および組成物、およびそれに関連するいずれかのさらなる発明的特徴に関する。加えて、本発明は、NK細胞媒介移植片拒絶反応を予防するための方法および組成物を提供する。
NKG2Dは、NK細胞およびある種のタイプのT細胞でヒトおよびマウスにおいて発現される活性化受容体である。NKG2Dは、ヒトにおいて、UL16結合タンパク質(ULBP1)、ULBP2、ULBP3、ULBP4、およびMHCクラスI鎖関連分子(MICAおよびMICB)を、およびマウスにおいて、重要でない組織適合性抗原60(H60)、レチノイン酸初期誘導性転写物(RAE-1)、およびネズミULBP様転写物1(MULT-1)を認識する。NKG2Dホモダイマーは、コンセンサスp85ホスファチジルイノシトール-3-キナーゼ(PI3-K)結合モチーフTyr-Ile-Asn-Met(配列番号:9に記載されたYINM)を含有する、アダプター分子DAP10と会合する。NKG2DおよびDAP10はそれらの生合成経路において初期に相互作用し、この相互作用が細胞表面へのNKG2Dの輸送に必要である。
本発明は、NKG2D媒介活性化に関連する症候群を治療または予防する方法および組成物を提供する。
本発明は、部分的には、NKG2D、CD8+T細胞、NK細胞上の活性化受容体、およびある種の活性化されたCD4+T細胞の調節が、自己免疫および炎症性症候群を予防および/または治療するための効果的な手段であるという驚くべき知見に基づく。1つの局面において、本発明者らは、NKG2Dの内部化を刺激するための薬剤および方法を見出し、NKG2D活性化に関連する症候群を治療するための有用な治療的様式としてのそのような薬剤を同定した。本薬剤および方法は、天然の可溶性NKG2Dリガンドが内部化を刺激することができない(例えば、慢性炎症性症候群に存在すると信じられているもののような)条件下で特に有用である。本発明は、さらに、そのような炎症性症候群を治療するためにNKG2Dの機能的発現を低下させるためのいずれの手段も含む。いくつかの態様において、本発明の方法および組成物は、主としてNKG2Dに対するそれらの活性化に依存する白血球のサブセットのみに影響する。
別途記載または明瞭に文脈上示されない限り、本発明を実施するにおいて、NKG2D媒介細胞活性化を低下させるいずれの薬剤も用いることができる。そのような薬剤の非限定的例は、NKG2Dリガンド、またはNKG2D結合断片、変種、またその誘導体;(例えば、NKG2D結合活性のような)抗体、またはその断片、変種または誘導体;細胞においてNKG2DまたはDAP10生産を阻害する核酸(またはその変種または誘導体)、または小分子;NKG2D-DAP10複合体の形成または機能に干渉するペプチドまたは小分子;NKG2Dシグナル変換を変化させる小分子、および前述のいずれかの組合せを含む。例示的なNKG2Dリガンドは、例えば、米国特許第6,653,447号;Carayannopoulos et al., J Immunol,169(8):4079-83,2002;Carayannopoulos et al., Eur J Immunol,32(3):597-605,2002: Sutherland et al., J Immunol, 168(2):671-9,2002;Sutherland et al., Immunol Rev,181:185-92,2001;およびCosman et al., Immunity, 14(2):123-33,2001)に見出すことができる。
本発明による1つのタイプのNKG2D調節剤は、NKG2Dリガンドを含む。典型的には、そのようなリガンドは、天然可溶性リガンドが効果的でない条件下で、NKG2D内部化を刺激するにおいてそれらを効果的とする、(例えば、MICA、MICB、およびULBPの可溶性形態のような)天然可溶性NKG2Dリガンドに対していくつかの修飾を呈する。例えば、(すなわち、膜貫通および細胞質ドメインを欠く;例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願US2003/0165835参照)MICAおよびMICBタンパク質の可溶性形態、またはNKG2D結合活性を保有するそれらの断片は慣習的な方法を用いて化学的に架橋して、複数のNKG2D分子に結合することができ、それにより、内部化を刺激する多量体NKG2Dリガンドを形成することができる。NKG2D結合活性は、例えば、競合結合、フローサイトメトリーなどを含むいずれかの手段を用いてアッセイすることができる。他の一連の態様において、多量体NKG2Dリガンドは、MICA、MICB、またはULBPに由来するNKG2D結合ドメインの(適当なスペーサーによって分離された)タンデムリピートを有するポリペプチドをコードする核酸の発現によって生産することができる。もう一連の態様において、リガンドは、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)のようなさらなる化学基を取り込むことができる。
本発明は、NKG2D媒介シグナル伝達経路を介して、有意な活性化なしで、例えば、NKG2Dの内部化を刺激するもののような、NKG2D媒介活性化を減少させるのに用いることができるいずれかの抗体の使用を含む。そのような抗体の非限定的例は、NKG2Dのいずれかの適当な細胞外または膜内エピトープに対して産生される抗体;DAP10のいずれかの適当な細胞外または膜内エピトープに対して産生される抗体;および可溶性NKG2DリガンドまたはNKG2D-NKG2Dリガンド複合体に対して産生される抗体を含む。また、二特異的抗体、すなわち、2つの結合ドメインの各々が異なる結合エピトープを認識する抗体が含まれる。NKG2Dのアミノ酸配列は、例えば、米国特許第6,262,244号に開示され、DAP10のアミノ酸配列は Wu et al., Science 285:730,1999に開示されており、MICAおよびMICBポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、米国特許出願US 2003/0165835に開示されており、それらの全てを、その全体を参照により本明細書に組み入れる。
本発明は、転写、翻訳または翻訳後レベルにおいてNKG2D細胞表面発現の調節を含む。いくつかの態様において、モジュレーターは、非限定的に、DNA、RNA、キメラRNA/DNA、タンパク質核酸、および他の核酸誘導体を含む核酸ベースのものである。
および
NKG2Dの細胞表面発現を低下させることができるいずれの配列も本発明を実施するのに用いることができると理解される。
本発明は、種々の炎症性自己免疫疾患およびNKG2D活性化に関連する症候群を含む、炎症性疾患を予防および/または治療する方法を提供する。そのような症候群は、非限定的に、ストレス関連NKG2Dリガンド(例えば、MICA、MICB、およびULBP)の誘導の結果、自己反応性T細胞および/またはNK細胞の過剰な活性化および/または拡大をもたらす臨床的状況を含み、これは、IL-2、TNF-α、およびIL-15のようなサイトカインの増大したレベルに反映され得る。
本発明は、一つまたは複数の薬学的に許容される担体を含むこともできる、NKG2Dモジュレーターを含む薬学的製剤を含む。薬学的に許容される担体はいずれかのおよび全ての適当な溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤、ならびに本発明によって提供されるNKG2Dモジュレーターもしくは関連組成物またはその組合せに生理学的に適合する他の物を含む。薬学的に許容される担体の例は水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにその組合せの一つまたは複数を含む。多くの場合、そのような組成物に、等張剤、例えば、糖、マンニトールまたはソルビトールのようなポリアルコール、あるいは塩化ナトリウムを含むのが望ましい。薬学的に許容される物質は、NKG2Dモジュレーター、関連組成物または組合せの貯蔵寿命または有効性を望ましくは増強させることができる、湿潤剤または乳化剤、保存剤または緩衝液のような補助的物質の少量を含む。薬学的組成物の担体および他の成分についての適当性は、NKG2Dモジュレーター、関連組成物または組合せの所望の生物学的特性に対する有意な負のインパクトの欠如に基づいて決定される。
NKG2D活性化についてのアッセイ法
IL-2活性化ヒトNK細胞を、MICAポリペプチドが発現される条件下でヒトMICAをコードするcDNAでトランスフェクトされているマウスBa/F3細胞のような適当な51Cr標識標的細胞培養物;および対照細胞としての、トランスフェクトされていない同一標的細胞と共に培養する。51Crの放出をモニターして、細胞溶解を示す。対照を超えるレベルにおいて、活性化されたNK細胞によるMICA発現細胞の溶解は、NKG2D特異的活性化を示す。
NKG2D内部化についてのアッセイ法
ヒトNKG2Dを発現する細胞を、ビオチン標識抗NKG2D抗体の存在下で1時間以上37℃にて培養する。対照として、NKG2D+細胞を、0.05%アジ化ナトリウムの存在下で4℃にてビオチン標識抗NKG2Dと共に培養して、内部化を妨げる。細胞を洗浄して、過剰の抗体を除去し、および、蛍光色素標識ストレプトアビジンで染色して、ビオチン結合NKG2D抗体を検出する。および、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーによって内部化を評価する。4℃にてビオチン標識抗NKG2D抗体と共にインキュベートした細胞と比較した、37℃にてビオチン標識抗NKG2D抗体との共培養後における細胞表面のNKG2Dの量の減少は内部化の1つのインジケーターである。これは、細胞の固定および浸透化、および一次抗NKG2D抗体を検出する蛍光色素標識第二工程抗体での染色によってさらに確認することができる。内部化されれば、第二工程抗体は、蛍光顕微鏡によって目視されるように、37℃で培養した細胞の内側の一次抗NKG2D抗体を検出するであろう。
NKG2D遮断はマウスにおいて自己免疫疾患を予防する
以下の実験は、動物モデル系、NODマウスにおけるI型糖尿病の発症に対するNKG2D遮断の効果をテストするために行った(Ogasawara et al., Immunity,20:757-767,2004)。
NODマウスはTaconic(Germantown,NY)から購入した。NOD.scidマウスはJackson Laboratory(Bar Harbor,ME)から購入した。8.3 TcR-トランスジェニックNODマウスは記載されている(Verdaguer et al., J Exp Med,186:1663-1676,1997)。全てのマウスはUCSF動物施設において特異的病原体フリー条件下で維持し、実験は、UCSF動物研究委員会のガイドラインに従って行った。2連続測定で血糖レベルが300mg/dLより大きくなると糖尿病と診断した。血糖レベルは血糖モニター(Walgreen's,Deerfield,IL)を用いることによって測定した。
マウス島は以下のように単離した。簡単に述べれば、0.3mg/mlコラゲナーゼP(Roche Molecular Biochemicals,Indianapolis,IN)を膵臓管に注射した。膨張した膵臓を摘出し、37℃にて13〜17分インキュベートした。4つの異なる密度(1.108、1.096、1.069および1.037)を含むEurocollin-Ficoll勾配での遠心によって島を精製した。遠心の後、1.069/1.096における組織断片を集め、洗浄した。その後、単一細胞を得るために、非酵素的細胞解離溶液によって島細胞を解離させた(Sigma,St.Louis,MO)。
NKG2Dの検出のために、細胞(〜1×106)を0.25μgビオチニル化またはPE標識抗NKG2D mAb(クローン191004)で染色した。細胞をFITC結合抗CD8、APC結合抗CD8、FITC結合抗CD44、またはFITC結合抗Ly-6Cで共染色した。RAE-1を検出するために、細胞を、全ての5つの公知のRAE-1タンパク質を認識するビオチニル化抗汎用RAE-1 mAb(Londoen et al.,J Exp Med.197:1245-1253,2003)または抗RAE-1mAb(クローンCX1)(Ogasawara et al.,前記,2003)で染色した。PE結合ストレプトアビジンまたはAPC結合ストレプトアビジンを用いて、ビオチニル化mAbを検出した。細胞をmAbと共に20分間インキュベートし、0.01%NaN3を含有するPBSで洗浄した。細胞はFACSCalibur(Becton Dickinson, San Jose, CA)またはGuava ViaCount(商標)およびGuava Express(商標)ソフトウェアを備えた小デスクトップGuava(登録商標)Personal Cytometer(Hayward,CA)を用いることによって分析した。目に見えるリンパ球集団は前方および側方散乱プロフィールに基づき、ヨウ化プロピジウム染色の欠如によってゲートした。免疫組織化学のために、器官をOCT媒体中にスナップ凍結させ、切片を調製し、慣習的な技術によって染色した。イメージはDeltavision顕微鏡(Applied Precision,Issaquah,WH)を用いて獲得し、計算デコンボリューションはsofdWoRxソフトウェア(Applied Precision)を用いて行った。
定量的(リアル-タイム)PCRは、製造業者の指示に従って、ABI 7700(Applied Biosystems)を用いて行った。プローブはApplied Biosystemsから購入した。RAE-1特異的プローブおよびプライマーは従前に記載されている(Ogasawara et al.,前記,2003)。全ての公知のRAE-1転写物を検出するのに用いるユニバーサルプライマーは:センス、5'-ctagtgccac ctgggaattc a-3'(配列番号:6);アンチセンス5'-catcattage tgatctccag ctca-3'(配列番号:7)であり、プローブは5'-6-FAM-catcagtgac agttacttct tcaccttcta cacagaga-Tamra-3'(配列番号:8)であった。全RNAをDNase Iで処理し、および、ランダムへキサマープライマーを用いて第一ストランドcDNAを合成した。リアル-タイムPCRについてのサイクリング条件は:50℃10分間、続いて、95℃30秒間および60℃2分間の50サイクルであった。データは、Sequence Detector v1.7 Analysis Software(Applied Biosystems)を用いて分析した。統計学的解析は2標本t検定を用いて行った。
T細胞は、MACS(Miltenyi Biotec Inc.,Germany)を用いる磁性細胞ソーティングによって、糖尿病16週齢NODマウスの脾臓およびリンパ節から単離した。T細胞(純度>98%)はCD19+、CD24+、およびMHCクラスII+細胞の枯渇での陰性選択によって濃縮した。尾静脈への注射によって、約7.5×106T細胞は4〜5週齢NOD.scidマウスに導入した。養子免疫伝達マウスにおける血糖レベルは毎週調べた。
養子T細胞導入は従前に記載されているように行った(Serra et al., Proc Natl Acad Sci USA,99:15566-15571,2002)。簡単に述べれば、8.3 TcR-トランスジェニックリンパ球はリンパ節および脾臓から単離した。T細胞(純度>95%)は、MACSを用いる磁性ソーティングによって陰性選択によって濃縮した。CFSE(5μM)で標識した約1×107T細胞は、0日での尾静脈への注射によって10週齢NODマウスに導入した。抗NKG2D mAb(CX5)またはcIg(200μg/注射)は-1、+1、および+5日に受容体NODマウスに注射した。
NKG2DとRAE-1との相互作用が自己免疫糖尿病の発症に関連するか否かを調べるために、全ての公知のRAE-1遺伝子の転写物を検出するために定量的RT-PCRアッセイ法を開発した。豊富なRAE-1転写物が後期前糖尿病NODマウス(12〜16週齢)の膵臓で検出されたが、週齢を適合させたBALB/cマウスの膵臓には検出されなかった(図1a)。比較的より顕著ではないが、RAE-1転写物もまた4〜6週齢NODマウスの膵臓で検出された。RAE-1もまた(BおよびT細胞を欠く)成体NOD.scidマウスの膵臓で検出された(図1b)。統合すると、これらの結果は、RAEの発現が継続する自己免疫応答と無関係であることを示した。RAE-1が年齢と共に膵臓において選択的にアップレギュレートされるか否かを調べるために、若いNODマウスからの特別な器官におけるRAE-1転写物のレベルを、後期前糖尿病NODマウスにおける同一器官におけるものと比較した。この基準により、RAE-1は、肝臓、脾臓、腎臓および胸腺と比較して、年齢と共に前糖尿病マウスの膵臓において比較的より増加した(図1c)。
NODマウスにおける糖尿病の発症はCD4+およびCD8+T細胞双方を必要とするので、NKG2D発現は、末梢免疫組織から単離されたT細胞で、およびNODマウスの膵臓における浸潤白血球で分析した。図2aに示すように、NKG2Dは10および5週齢NODマウスにおける膵臓に浸潤するCD8+T細胞のサブセットで検出された。膵臓-浸潤NKG2D+CD8+T細胞のパーセンテージは病気進行と共に増加する(図2a)。より小さな割合のNKG2D+CD8+T細胞はPLNおよび脾臓で検出された(図2a,b)。さらに、膵臓およびPLNにおけるNKG2D+CD8+T細胞は高レベルのCD44を発現するが、Ly-6Cはそうでないことが見出された(図2b)。(CD3を発現しない)CD8-NKG2D+白血球の集団もまたNOD膵臓に浸潤する白血球で観察され(図2a)、これらの細胞の多くはK細胞および骨髄様細胞抗原で共発現した。正常な非糖尿病マウス株についての報告(Jamieson et al., Immunity,17:19-29,2002)として、NKG2Dは、10週齢または25週齢NODマウスいずれかの膵臓または末梢リンパ様組織ではCD4+T細胞または220+B細胞で検出されなかった。
前糖尿病島での浸潤CD8+T細胞およびNKG2Dリガンド上のNKG2Dの発現は、糖尿病形成におけるこれらの分子に対する役割を示した。前糖尿病NODマウスを中和抗NKG2D mAbで処理することによってこの仮説を検定した。CX5抗マウスNKG2D mAbはNKG2Dのそのリガンドへの結合をブロックし、CX5とのNKG2D保有細胞のインキュベーションの結果、受容体が調節され内部化された。重要なことには、CX5でのインビボでのマウスの処理は、NKG2D+NK細胞またはCD8+T細胞を枯渇させなかった。NODマウスを7〜25週齢において抗NKG2D mAbで処理した。希釈剤のみで処理したマウスは糖尿病を発症し、15週齢で開始し、全て(n=7)28週までに病気を有した(図3a,b)。対照的に、抗体処理は5週間前に停止したが、抗NKG2Dで処理したNODマウス(n=7)はいずれも30週齢で糖尿病を発症しなかった(図3a,b)。
NKG2D遮断がエフェクターCD8+T細胞に影響するか否かに取り組むために、糖尿病16週齢NODマウスから単離したT細胞を(T細胞を欠くが、糖尿病を発症しない)NOD.scid受容体に養子免疫伝達した。導入の時点において、CD8+T細胞の小さなパーセンテージのみがNKG2Dを発現した(図5a)。しかしながら、導入から5週間後に、実質的な数のNKG2D+CD8+T細胞が、受容体マウスにおいて膵臓、PLNおよび脾臓で検出され(図5a)、これは、予め存在するNKG2D+T細胞の拡大、または導入されたCD8+T細胞でのNKG2Dの獲得を示唆する。cIg処理受容体マウスにおける膵臓に浸潤するCD8+T細胞の約15%はNRP-V7/H-2Kdテトラマー陽性であり、他方、抗NKG2D mAb処理マウスで見出されたのは有意に少なかった(図5b,c)。NKG2Dは対照Ig処理NODマウスにおけるほとんどのNRP-V7/H-2Kdテトラマー陽性自己反応性CD8+T細胞にNKG2Dが存在したが、抗NKG2D mAb療法を受領するマウスでは検出されなかった(図5c)。糖尿病NODマウスからのT細胞を受領する全ての対照Ig処理NOD.scidマウスにおいて糖尿病は発症しなかったが、療法を受けつつ糖尿病を発症した抗NKG2D mAb処理マウスはなかった(図5d)。
抗NKG2D処理マウスの膵臓におけるより少数のNRP-V7/H-2Kdテトラマー陽性CD8+T細胞の発見は、mAb療法が自己反応性T細胞の拡大をブロックした可能性と合致した。この仮説を直接的に検定するために、8.3TcR-トランスジェニックT細胞をCSFEで標識し、10週齢NOD受容体に養子免疫伝達し、対照Igまたは抗NKG2D mAbいずれかで処理した(図6)。導入前に、8.3TcR-トランスジェニックNODマウスのリンパ節および脾臓からのドナーCD8+T細胞は>90%NRP-V7/H2Kdテトラマー陽性であったが、NKG2Dを発現しなかった(図6a)。2日後に、対照Igで処理したマウスの膵臓に浸潤する導入されたCSFE標識8.3TcR-トランスジェニックNOD CD8+T細胞はNKG2Dを発現し(図6b)、すでに増殖していた;しかしながら、膵臓または腸間膜リンパ節に存在する導入されたT細胞でCSFEの希釈は観察されなかった(図6c)。導入から4および8日後、対照Igで処理したマウスの、腸間膜リンパ節ではなく、膵臓および膵臓リンパ節におけるCFSE標識8.3TcR-トランスジェニックT細胞は、かなりの増殖を示した(図6c)。驚くべき対照的に、NKG2Dは、抗NKG2D mAbで処理したNODマウスの膵臓における導入されたCSFE標識8.3TcR-トランスジェニックCD8+T細胞の細胞表面で検出されなかった(図6b)。さらに、膵臓におけるこれらの細胞の拡大は、対照Igで処理したマウスと比較して実質的に阻害された(図6c)。興味深いことには、抗NKG2D mAbでの処理は、リンパ節における細胞と比較して、膵臓に浸潤するCSFE標識8.3TcR-トランスジェニックT細胞の増殖に対してかなり顕著な効果を有した。NRP-V7/H2Kdテトラマーで検出された膵臓における内因性CSFE-未標識T細胞の拡大もまた、対照Ig処理マウスと比較して、抗NKG2D mAbでの処理によってやはり減少した。対照Igおよび抗NKG2D mAb処理NODマウスにおける膵臓に浸潤する養子免疫伝達8.3TcR-トランスジェニックT細胞の増殖の定量は、自己反応性抗原-特異的CD8+T細胞の拡大に対して抗NKG2D療法の顕著な効果を示した(図6d)。
shRNAによるNKG2Dの細胞表面発現の調節
以下の実験を行って、NKG2D発現に対する阻害性RNAの効果を調べた。IRES-eGFPエレメントを含有するベクターにおけるヒトNKG2DをコードするDNAは安定にCHO細胞にトランスフェクトされた。および、マウスCD8(mCD8)をコードするcDNAで、および(shDNA03と命名される)ヒトNKG2Dのセグメントと相同な22塩基対(bp)cDNA(配列番号:10に記載された5'-ggatgggact agtacacatt cc-3')を含有するプラスミド(InVitroGenからのpCR2.1-TOPOベクター)で、安定にトランスフェクトされたNKG2D発現細胞を(リポフェクタミンおよび標準的方法を用いて)トランスフェクトした。特異性を示す対照として、NKG2D発現CHO細胞を、mCD8で、およびヒトNKG2Dと同様であるが、3つの突然変異したヌクレオチド(配列番号:13に記載された5'-ggatgggatt agtatagatt cc-3')を持つ22bp cDNAで二重にトランスフェクトした。左側パネルにおける細胞は、マウスCD8 cDNA(mCD8)を含有するプラスミドでのみトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、マウスCD8に対する、およびヒトNKG2Dに対するモノクローナル抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。二変量ドットプロットが得られ、これは、(i)マウスCD8対-ヒトNKG2D、および(ii)eGFP(ヒトNKG2D-IRES-eGFPベクターの拡大から得られる固有の緑色蛍光)対-ヒトNKG2Dを表す蛍光を呈する。
抗NKG2Dモノクローナル抗体の使用による細胞表面NKG2Dの調節
以下の実験を行って、NKG2Dに向けられたモノクローナル抗体の、NKG2Dの細胞表面発現を調節する能力を評価した。
NKG2D遮断は、F1マウスにおいて非経口骨髄移植片拒絶反応を予防する
以下の実験を行って、動物モデル系、(C57BL/6×BALB/c)、F1(CB6F1)マウスにおける、ハイブリッド耐性の発生に対するNKG2D遮断の効果をテストした(F1受容体による非経口骨髄移植片の拒絶)。
約6〜8週齢のC57BL/6、BALB/c、およびCB6F1マウスは、National Cancer Institute Animal Program(Frederick,MD)から購入した。RAE-1εトランスジェニックマウスを作成し、C57BL/6バックグラウンドに戻し交配させた(Ehrlich et al.,未公表観察)。C57BL/6バックグラウンドでのDAP12-/-マウス(戻し交配9世代)は従前に記載されており(Bakker et al.,Immunity,13:45-353,2000)、DAP10-/-はC57BL/6胚性幹細胞から作成した(Phillips et al.,未公表観察)。全ての実験は、UCSF Committie on Animal Researchのガイドラインに従って行った。
抗マウスNKG2D mAb、クローンCX5(ラットIgG1イソタイプ)は、従前に記載されたように、精製されたマウスNKG2Dタンパク質でラットを免疫化することによって作成した(Ogasawara et al.,Immunity,18:41-51,2003)。抗マウスNKG2D、クローン191004(ラットIgG2aイソタイプ)は、組換えマウスNKG2D細胞外ドメイン(R&D Systems, Minneapolis,MN)で免疫化したラットからのB細胞とマウス骨髄腫との融合から得られたハイブリドーマーから生産した。全ての抗NKG2D mAbは、NKG2D細胞外ドメインを認識し、NKG2Dのそのリガンドへの結合を効果的にブロックする。インビボ注射では、検出可能なエンドトキシン(<0.3pg注射)を含有しない精製された抗NKG2D mAb CX5および抗NK1.1 mAb PK136を用いた。抗NKG2D mAb CX5は、インビボで注入された場合に、NKG2D保有NK細胞またはT細胞を枯渇させないブロッキング抗体である(Ogasawara et al.,Immunity,20,757-7567,2004;Lodoen et al.,J Exp Med,197:1245-1253,2003;およびLodoen et al.,J Exp Med,200:1075-108,2004)。対照ラットIgGはSigma(St.Louis,MO)から購入した。抗マウス汎用-RAE-1 mAb(クローン186107、ラットIgG2bイソタイプ)、抗マウスH60 mAb(クローン205310)および抗マウスMULT1 mAb(クローン237104)は記載されているように作成した(Lodoen et al.,前記,2003;)およびLodoen et al.,前記、2004)。他の抗体はBD PharMingenまたはeBioscience(San Diego,CA)から購入した。
ネズミ骨髄は従前に記載されているように移植した(George et al.,J Immunol,163:1859-1867,1999)。簡単に述べれば、骨髄導入の2日前にmAb処理(200μg/マウス)を行い、受容体をポリI:C(Sigma、200μg/マウス)で処理して、骨髄細胞の注入から1日前にNK細胞媒介移植片拒絶をブーストした(Murphy et al.,J Exp Med,166:1499-1509,1987)。0日に、マウスを致死量(11Gy)の137Csγ照射に暴露することによって照射し、および、4×106BM細胞を静脈内注射した。導入から5日後に、マウスに26μgの5-フルオロ-2'-デオキシウリジン(Sigma,St.Louis,MO)を静脈内投与して、内因性チミジン合成を抑制した(George et al.,前記,1999)。30分後に、マウスに3μ Ciの5-[125I]ヨード-2'-デオキシウリジン(Amersham Life Science,Arlington Heights IL)を静脈内投与した。6日に、脾臓を受容体マウスから摘出し、ガンマカウンターでカウントした。
簡単に述べれば、1×107 Ly5.2 B6 BM細胞をNK細胞-枯渇した照射した受容体マウス(照射の吸収された量=11Gy)に従前に記載されているように静脈内導入した(Ogasawara et al.,Nature,391:701-703,1998)。再構成の間に、マウスを抗生物質に維持した。
NK細胞は従前に記載されているように濃縮した(Ogasawara et al.,J Immunol,169:3676-3685,2002)。簡単に述べれば、脾臓細胞を抗マウスCD4 mAb(クローンGK1.5)および抗マウスCD8 mAb(クローン53-6.7)と共にインキュベートし、その後に、これらの細胞を、ヤギ抗マウスIgおよびヤギ抗ラットIg(Advanced Magnetic,Inc,Cambridge,MA)で被覆した磁性ビーズと混合した。CD4、CD8、および表面Ig(sIg)陽性細胞は、磁性細胞ソーティングによって取り出した。
ヒトIgG1 Fcに融合したマウスNKG2D(mNKG2D-Ig)の細胞外ドメインを含有する融合タンパク質を用いて、NKG2Dリガンドを検出した(Cerwenka et al.,Immunity,12:721-727,2000)。PE結合ヤギ抗ヒトIgG Fcγ断片(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)を第二工程の試薬として用いた。細胞(1×106)を0.5μgのmNKG2D-Igで、および0.25μgの他のmAbで染色した。いずれのNKG2Dリガンドが発現されたかを判断するために、細胞を、全ての5つの公知のRAE-1タンパク質(すなわち、RAE-1α、β、γ、δ、およびε)を認識するビオチニル化抗汎用RAE-1 mAb、ビオチニル化抗H60 mAbまたは抗MULT1 mAbで染色した。PE結合ストレプトアビジンまたはAPC結合ストレプトアブジンを用いて、ビオチニル化mAbsを検出した。NKG2Dの検出のために、細胞(〜1×106)を0.25μgのビオチニル化またはPE標識抗NKG2D mAb(クローン191004)で染色した。細胞を抗CD43、抗Ly6C/G、抗CD11c、抗B220、抗CD3、抗TER119、抗NK1.1および抗CD49d(DX5) mAbで共染色した。細胞をmAbと共に20分間インキュベートし、0.01%NaN3を含有するPBSで洗浄した。細胞はFACS Calibur(Becton Dickinson,San Jose,CA)フローサイトメーターを用いて分析した。目に見えるリンパ球集団を、前方および側方散乱プロフィールに基づいて、かつヨウ化プロピジウム染色の欠如によってゲートした。
モノクローナル抗体媒介再指向性細胞障害アッセイ法は従前に記載されているように行った(Lanier et al.,J Immunol,141:3478-3485,1988)。標的細胞を、10%FCSを含有するRPMI-1640培地中で、50μCiのNa2(51Cr)O4で37℃にて2時間標識し、培地で3回洗浄し、細胞障害アッセイ法で用いた。51Cr標識標的細胞(5×103)およびエフェクター細胞を、三連にて、示されたエフェクター/標的(E/T)比率にて、96ウェルマイクロタイタープレートのU底ウェル中で混合した。4時間のインキュベーション時間の後、細胞を含まない上清を集め、Micro-betaカウンター(Wallac,Turku,Finland)にて放射能を測定した。自然発生放出は最大放出の15%未満であった。特異的51Cr放出のパーセンテージは以下の式に従って計算した:%特異的溶解=(実験-自然発生)放出×100/(最大-自然発生)放出。
NKG2Dリガンドをコードする遺伝子は多形であり;BLAB/c(B/c)マウスはRAE-1α、βおよびγ遺伝子を有し、他方、C57BL/6(B6)マウスはRAE-1δおよびε遺伝子を保有する(Cerwenka and Lanier,Tissue Antigens,61:335-343,2003)。同様に、B/cマウスはH60を発現するが、B6マウスは発現しない(Malarkannan et al.,J Immunol,161:3501-3509,1998)。B/c、B6および(BALB/c x C57BL/6)F1(CB6F1)マウスから単離したBM細胞を分析して、NKG2DリガンドはBM細胞で発現されるか否かを判断した。細胞をマウスNKG2D-IgG Fc融合タンパク質で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。低レベルのNKG2Dリガンドは新たに単離されたB/c BM細胞の表面で検出されたが、B6 BM細胞の表面では検出されなかった(図13a)。いずれのNKG2Dリガンドが発現されたかを判断するために、BM細胞を抗汎用RAE-1、抗H60および抗MULT1モノクローナル抗体(mAb)で染色した。RAE-1およびH60は新たに単離されたB/c BM細胞は低レベルで発現され、他方、MULT1は検出されなかった(図13b)。対照的に、RAE-1は、B/c、B6またはCB6F1マウスからの新たに単離された脾臓細胞で検出されなかった。
本発明の開発の間に、RAE-1が、B/c骨髄で再構成されたCB6F1マウスの脾臓における増殖する先祖細胞で発現されたという知見は、本発明者らに対して、NKG2Dがハイブリッド抵抗性に関与することを示唆した。これは、対照抗体(cIg)、中和非枯渇抗NKG2D mAb(CX5)(Ogasawara et al.,Immunity、20:757-767,2004)、またはNK細胞-枯渇抗NK1.1 mAb(PK136)で予め処理した照射CB6F1マウスへのB/c BM細胞の導入によって確認した。受容体マウスの造血系細胞再構成は、7日に脾臓を収穫するのに12時間先立って、125IUdRを注射することによって評価した。cIg処理マウスはB/c BM細胞を拒絶し、これは以前の報告と合致し(Lotzova et al.,Transplantation,35:490-494,1983)、CB6F1マウスにおけるNK細胞の枯渇はB/c骨髄細胞の拒絶を効率的に妨げ、その結果、脾臓における放射性標識の取込が実質的に増加した(図14a)。非枯渇中和抗NKG2D mAbもまた、NK細胞を枯渇する効果と匹敵して、125IUdRの取込を劇的に増加させた。
F1受容体における非経口骨髄移植の拒絶をブロックする抗NKG2D mAb処理能力は、F1 NK細胞による非経口H-2の認識がNKG2D依存性拒絶に必要であるか否か、またはNK細胞もまた同系骨髄細胞を拒絶できるかの問題を生起し、但し、RAE-は十分に高レベルで発現されるものとする。同系照射CB6F1受容体に再度定着するCB6F1骨髄細胞(図13c,e)、および同系照射B6受容体に再度定着するB6骨髄細胞は、B/cの再度定着する骨髄細胞(図13d,e)と比較して、非常に低いレベルのRAE-1を発現したに過ぎなかった。従って、B6またはCB6F1骨髄細胞でのRAE-1の発現が、同系骨髄移植片の拒絶を引き起こすか否かを調べるために、ヒトβ-アクチンプロモーターによって駆動されるRAE-1εを発現し、その結果、全ての組織においてRAE-1εが発現されるトランスジェニックマウスを作成した。図15aに示すように、B6 RAE-εトランスジェニックマウスからの新たに単離された骨髄細胞でのRAE-1εの発現レベルは、再度定着するB/c骨髄細胞に存在するRAE-1のレベルと同様である(図13d,e)。
マウスにおいて、NKG2D転写物の別のRNAスプライシングは、NKG2D-SおよびNKG2D-Lと呼ばれる2つのタンパク質イソ形態を作成する。NKG2D-Lは休止NK細胞において圧倒的に発現され、DAP10アダプタータンパク質と会合し、他方、NKG2D-SはNK細胞の活性化によって誘導され、DAP10またはDAP12いずれかと会合する(Diefenbach et al.,Nat Immunol、3:1142-1149,2002)。RAE-1εトランスジェニックB6マウスからの骨髄細胞を照射された野生型、DAP10-/-、およびDAP12-/-C57BL/6受容体に移植して、DAP10またはDAP12または双方のアダプターがNKG2D媒介拒絶に関与するか否かを判断した。マウスに5日に125IUdRを注射し、脾臓を収穫し、6日にカウントした。野生型B6マウスと比較して、DAP-10-/-B6マウスは、RAE-1εトランスジェニックB6骨髄移植片を拒絶するにおいてかなりの欠乏を示した(図16a)。対照的に、野生型B6マウスよりはわずかによくないが、DAP12-/-B6受容体はDAP10-/-B6マウスよりも効果的にRAE-1εトランスジェニックB6骨髄細胞を拒絶した(図16b)。野生型、DAP10-/-およびDAP12-/-B6マウスは、全て、枯渇抗NK1.1 mAbで、または非枯渇中和抗NKG2D mAbで処理した場合、RAE-1εトランスジェニックB6骨髄移植片を拒絶しなかった。これらの結果は、NKG2D依存性骨髄細胞拒絶における、DAP10の圧倒的な役割、およびDAP12のより少ない役割を示す。それにも拘らず、本発明を製造し、使用するためには、メカニズムの理解は必要でない。
NODマウスからのNK細胞の活性化はRAE-1の発現を誘導し、その結果、NK細胞でNKG2Dのリガンド依存性調節がもたらされる(Ogasawara et al.,Immunity,18,41-51,2003)。RAE-1εトランスジェニックB6からのNK細胞の表面でのNKG2Dの発現の分析は、野生型マウスからのNK細胞と比較して、NKG2Dの低下した発現を明らかにした(図17a)。RAE-1εトランスジェニックB6でのNKG2Dの量は実質的に減少したが、脾臓におけるNK細胞の数、およびNK細胞でのNK1.1、Ly-49D、Ly-49A、Ly-49C/I,Ly-49F/I/C/H、およびLy-49G2の発現は、野生型NK細胞と同様であった。NKG2Dの機能がRAE-1εトランスジェニックNK細胞で損なわれるか否かを調べるために、cIg、抗NKG2D mAbおよび抗NK1.1 mAbを用いて、抗体-再指向性細胞障害アッセイ法を行った。RAE-1εトランスジェニックNK細胞のNK1.1依存性細胞傷害性活性は野生型B6 NK細胞のそれと同一であったが、NKG2D依存性細胞傷害性はRAE-1εトランスジェニックNK細胞で損なわれた(図17b)。
慢性関節リウマチの予防および治療のためのNKG2D遮断
これは、NKG2Dが炎症の部位に存在することを示すことができる関節炎の慢性動物モデルでテストすることができる。そのようなモデルの例は、慢性コラーゲン誘導関節炎である(Malfait et al.,Arthritis and Rheumatism 44:1215-1224,2001)。
セリアック病の予防および治療のためのNKG2D遮断
MICはセリアック病(CD)患者における腸上皮表面で強く発現され、これは、今度は、NKG2Dを介して上皮内Tリンパ球(IEL)を共活性化し、上皮細胞標的の細胞溶解に導く(Meresse et al.,Immunity,21:357-366,2004;およびHeu et al.,Immunity,21:367-377,2004)。本発明者らは、本明細書において記載したNKG2Dを遮断する組成物および方法もまたセリアック病の予防および治療に適当であると考える。炎症性腸病(IBD)の発生に対するNKG2D遮断の効果は、例えば、以下の2つの結腸のネズミモデルのいずれかの1つのような適当な小さな動物のモデルでテストされるであろう:SCIDマウスにおけるTNB誘導(Chin et al.,Digestive Diseases and Sciences 39:513-525,1994)またはT-細胞導入モデル(Powrie et al.,Int Immunol 5:1461 et seq.,1993)。
Claims (44)
- NKG2D媒介活性化に関連する症候群を治療または予防する方法であって、該症候群を治療または予防するのに適した条件下で、NKG2Dを発現する白血球を、細胞のリガンド誘導NKG2D活性化を低下させる薬剤と接触させる工程を含む方法。
- 接触の結果、リガンド誘導NKG2D活性化が、少なくとも30%低下される、請求項1記載の方法。
- 薬剤がNKG2DとDAP10との相互作用を低下させる、請求項1および2のいずれか一項記載の方法。
- 薬剤が細胞の表面のNKG2Dの量を低下させる、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、またはULBP4の一つまたは複数が細胞表面NKG2Dの量を減少させることができない条件下で、細胞表面NKG2Dの量の低下が起こる、請求項4記載の方法。
- 薬剤が、細胞表面NKG2Dが内部化される速度を増大させる、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、またはULBP4の一つまたは複数がNKG2D内部化の速度を増大させることができない条件下で、NKG2Dの内部化の速度の増大が起こる、請求項6記載の方法。
- 接触がNKG2D-NKG2Dリガンド複合体を通じてのシグナル伝達を低下させる、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
- 白血球がNKG2D+CD8+T細胞、NKG2D+CD4+T細胞、NKG2D+γδT細胞、NKG2D+NK細胞、およびマクロファージからなる群より選択される、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
- 接触の結果、対照に対して、NKG2D発現白血球の数が約10%未満低下する、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
- 薬剤が、NKG2Dに結合する抗体、またはそのNKG2D結合断片を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- 抗体がモノクローナル抗体である、請求項11記載の方法。
- モノクローナル抗体がヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、請求項12記載の方法。
- 薬剤が、NKG2Dコーディング核酸の転写または翻訳を低下させる核酸を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- 症候群がI型真性糖尿病である、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
- 症候群が移植片拒絶反応である、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
- 症候群がI型真性糖尿病でない、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
- 症候群が慢性関節リウマチである、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
- 症候群がセリアック病である、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
- 症候群が多発性硬化症である、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
- NKG2Dリガンド発現が、症候群によって侵された器官または組織の細胞で上昇する、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
- 条件の結果、症候群によって侵された器官または組織に浸潤するリンパ球が低下する、請求項1〜21のいずれか一項記載の方法。
- 条件の結果、症候群によって侵された器官または組織におけるインターフェロンγのレベルが低下する、請求項1〜22のいずれか一項記載の方法。
- 薬剤が白血球の増殖を低下させる、請求項1〜23のいずれか一項記載の方法。
- 症候群を有すると診断されたヒト患者を治療する工程を含む、請求項1〜24のいずれか一項記載の方法。
- ヒト患者においてNKG2D媒介活性化に関連する症候群を治療または予防する方法であって、NKG2D発現白血球のリガンド誘導NKG2D活性化を低下させる薬剤を、該症候群を治療または予防するのに有効な量にて且つそれに適した条件化でヒト患者に投与する工程を含む方法。
- NKG2Dモジュレーター、および白血球のNKG2D媒介活性化に関連する症候群を治療または予防するのに適した条件下で白血球をNKG2Dモジュレーターと接触させるための説明書を含むキット。
- i)NKG2D+白血球をテスト薬剤と接触させる工程;および
ii)該白血球によるNKG2D発現を測定する工程
を含む、NKG2D調節剤を同定する方法。 - NKG2D発現の測定が、NKG2D転写、翻訳、および内部化の測定の一つまたは複数を含む、請求項28記載の方法。
- i)NKG2D+白血球をテスト剤と接触させる工程;および
ii)該白血球のリガンド誘導NKG2D活性化を測定する工程;
を含む、NKG2D調節剤を同定する方法。 - リガンド誘導NKG2D活性化の測定が、DAP10リン酸化、p85 PI3キナーゼ活性、Aktキナーゼ活性、IFN-γの生産、およびNKG2D+標的細胞の細胞溶解の測定の一つまたは複数を含む、請求項30記載の方法。
- NKG2D媒介活性化に関連する自己免疫疾患の治療用の医用薬剤の調製における、NKG2Dに結合し、且つNKG2D+T細胞またはNK細胞の拡大をそのような細胞を枯渇させることなく障害することができる抗体または抗体断片の使用。
- 抗体または抗体断片が、細胞表面NKG2Dが内部化される速度を増大させる、請求項32記載の使用。
- 抗体がヒトまたはヒト化抗体である、請求項32および33のいずれか一項記載の使用。
- 自己免疫疾患が慢性関節リウマチである、請求項32〜34のいずれか一項記載の使用。
- 自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項32〜34のいずれか一項記載の使用。
- 自己免疫疾患がI型真性糖尿病でない請求項32〜34のいずれか一項記載の使用。
- 移植片拒絶反応の治療用の医用薬剤の調製における、NKG2Dに結合し、かつNKG2D+T細胞またはNK細胞の拡大を、そのような細胞を枯渇させることなく障害することができる抗体または抗体断片の使用。
- NKG2Dに特異的に結合し、NKG2D+T細胞またはNK細胞の拡大を 、そのような細胞を有意に枯渇させることなく障害する能力について抗体または抗体断片をスクリーニングする工程を含む、NKG2D媒介活性化に関連する炎症状態の治療剤または予防剤を同定する方法。
- 抗体または抗体断片が、NKG2D+T細胞またはNK細胞の表面のNKG2Dの内部化を誘導する能力についてさらにスクリーニングされる、請求項39記載の方法。
- 抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項39または40記載の方法。
- 細胞を有意に枯渇させることなく、NKG2Dに結合し細胞表面NKG2Dの内部化を誘導する能力について抗体または抗体断片をスクリーニングする工程を含む、NKG2D媒介活性化に関連する炎症状態の治療剤または予防剤を同定する方法。
- 哺乳動物宿主においてNKG2D+細胞の拡大を障害する条件下で且つ障害するのに有効な量にて、NKG2Dに対して特異的であって、かつNKG2D+T細胞またはNK細胞の拡大をそのような細胞を有意に枯渇させることなく障害することができる抗体を、哺乳動物宿主に送達する工程を含む、NKG2D活性に関連する炎症状態に罹った、または該炎症状態を発症する実質的な危険性がある哺乳動物宿主においてNKG2D+細胞の拡大を障害する方法。
- NKG2D発現細胞においてNKG2Dの細胞内部化を刺激する条件下にて且つ刺激するのに有効な量にて、NKG2D媒介シグナル伝達経路を介して有意な活性化なしで、NKG2Dに特異的に結合し、かつNKG2Dの細胞内部化を刺激することができる抗体または抗体断片を宿主に送達する工程を含む、炎症状態および/またはNKG2D活性に関連する自己免疫疾患に罹った、またはそれらを発症する実質的な危険性がある宿主においてNKG2D発現細胞におけるNKG2Dの細胞内部化を刺激する方法。
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