JP2021505207A - Ｎｋｇ２ｄベースの受容体を発現する免疫細胞のフラトリサイドの減少 - Google Patents

Abstract

本願は、免疫療法の分野に関し、より具体的には、養子細胞療法のための細胞の製造に関する。本明細書では、このような細胞、具体的には、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体を発現する細胞の製造時におけるフラトリサイドを防止および／または減少する方法を提供する。また、フラトリサイドが防止および／または減少された細胞を含む細胞および組成物も提供する。【選択図】なし

Description

本願は、免疫療法の分野に関し、より具体的には、養子細胞療法のための細胞の製造に関する。本明細書では、このような細胞、具体的には、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体を発現する細胞の製造時におけるフラトリサイドを防止および／または減少する方法を提供する。また、フラトリサイドが防止および／または減少された細胞を含む細胞および組成物も提供する。

免疫系に対する理解が深まるにつれて、進行がん患者に客観的な臨床反応をもたらす免疫に焦点を当てた治療法が多く開発されるようになった。これらアプローチの１つは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞であり、患者のＴ細胞は、腫瘍を標的とするＣＡＲを発現するように遺伝子改変された後、患者に多数戻される（１）。この養子細胞療法は、血液悪性腫瘍患者における客観的な臨床反応を通した検証レベルを達成しており、より広範ながん適応症の治療法についてさらに探索されている（２―７）。ＣＡＲの概念も、ナチュラルキラー細胞を含む様々な細胞型に対して探索されているＣＡＲを有するＴ細胞にとどまらない（８）。

ＣＡＲは、大まかに、細胞外スペーサドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインに融合された膜貫通領域を含む構造ドメインに連結された標的結合ドメインとからなるモジュール型タンパク質受容体である。リガンドが結合すると、ＣＡＲから開始された下流シグナル伝達はＴ細胞のエフェクター機能を活性化し、それによって腫瘍細胞の直接的な殺傷と免疫動員サイトカイン産生を促す。

ＣＡＲＴ産生における問題は、自己殺傷（またはフラトリサイド）である。この現象は、ＣＡＲ標的がＴ細胞集団上で発現されるときに起こる。Ｔ細胞のフラトリサイドは、Ｔ細胞の恒常性を維持する機構としてよく理解されている（１３）。しかし、治療状況では、Ｔ細胞のフラトリサイドは、臨床利用に要望されるＣＡＲＴ細胞集団を産生する能力を妨げる。これは、Ｔ細胞白血病の標的化を可能とするために、標的自体が、ＣＤ７（１４）またはＣＤ５（１５）などのＴ細胞系統特異性のために選択される状況に特に関連する。しかし、この問題はＣＡＲＴ細胞の治療法に限らない。サバイビン（ＢＩＲＣ５）に特異的なＴ細胞受容体に対して高い親和性を有するＴＣＲで武装化されたＴ細胞は、標的抗原（１６，１７）の発現によりフラトリサイドを起こす。同様に、ＮＫ受容体のリガンドを発現するＮＫ細胞もフラトリサイド（２４）を起こすことがわかっている。
結論として、人工的な細胞表面キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を用いて、あらかじめ定義した標的特異性を免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）に付与することにより、いかなる腫瘍細胞も推定的に標的化するアプローチが提供される。このアプローチの成功は、ほとんどの既知の腫瘍抗原が腫瘍に特異的ではなく、非腫瘍性細胞上で発現する可能性がある標的抗原自体のプロファイルに大きく依存する。特定の状況下において、標的抗原は、免疫細胞上で恒常的または一過性的に発現され得る。すなわち、ＣＡＲ修飾細胞が自己殺傷またはフラトリサイドを起こし得る。

ここでは、ナチュラルキラー細胞群２のメンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）タンパク質によって標的化されるストレスリガンドに対する特異性で遺伝子操作されたＣＡＲＴ細胞に注目する。完全長のＮＫＧ２Ｄ配列とＣＤ３ξの細胞質ドメインとの融合によりＣＡＲ構築物が生成され、ＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインによりリガンドが結合すると、ＣＤ３ξドメイン（１８）を介してＴ細胞が活性化される。ＮＫＧ２Ｄは、主要組織適合抗原複合体クラスＩ関連遺伝子ＡおよびＢ（ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ）やＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）ファミリー（ＵＬＢＰ１―６）（１９）を含む８つの既知のリガンドを有する。これらＮＫＧ２Ｄリガンドの発現は、細胞損傷、感染、酸化ストレスや熱ストレス、または、悪性転化などの「ストレス」条件下で誘導され、ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する多様なヒト腫瘍が発生し、ＣＡＲの状況（１９，２０）で利用されるべき受容体としてのＮＫＧ２Ｄの魅力を強調することが知られている。実際、マウスＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲを持つマウスＴ細胞は、同系のモデル系で確立された様々な血液系腫瘍および固形腫瘍を効果的に根絶し、このアプローチの概念の証明を示している（１８）。

ヒトＮＫＧ２ＤＣＡＲ（ＮＫＲ―２とも呼ばれる）を持つヒトＴ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで様々な腫瘍細胞に対してエフェクター細胞の機能を果たし、ＮＳＧマウスモデルで確立されたヒト腫瘍に挑むことができる（２１）。しかし、ＮＫＲ―２細胞の産生をアップスケーリングして臨床に利用するため細胞の数を増やすと、活性化Ｔ細胞によるＮＫＧ２Ｄリガンドの一過性発現の原因として特定されたＴ細胞のフラトリサイドに非常に問題になることが証明された。

このため、ＮＫＧ２Ｄタンパク質とＣＤ３ξ（ＮＫＲ―２）との融合からなるＣＡＲは、ＮＫＧ２Ｄリガンドに対して幅広い特異性をＴ細胞に付与する。しかし、Ｔ細胞は、活性化中にこれらリガンドを一過性的に発現するため、ＮＫＲ―２Ｔ細胞にフラトリサイドが発生し、これにより、治療法としてＮＫＧ２Ｄを利用する能力が実質的に妨害される。さらに、臨床環境で治療法を使うためには、必要な投与スケジュールを提供するために、著しいアップスケーリングおよび凍結保存が必要となる。凍結保存および凍結解凍サイクルは、細胞にストレスを与え、これにより、ＮＫＧ２Ｄリガンドなどのストレス誘導性タンパク質の発現が増加することが知られている。実際、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体を発現するＴ細胞をアップスケーリングと凍結保存の両方に供したところ、細胞収率の悪化が観察され、これは、おそらく自己殺傷またはフラトリサイドによるものと思われる。

このため、これら細胞におけるフラトリサイドの発生を防止または減少することが有益であると思われる。これにより、細胞収率の増加だけでなく、製造コストの削減およびこれら細胞の治療効果を高めることができると思われる。つまり、実用的および商業的観点から、臨床利用に必要なアップスケーリングおよび凍結保存の実現が可能になると思われる。

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ＮＫＧ２Ｄタンパク質とＣＤ３ξ（ＮＫＧ２Ｄ―ＣＡＲＴ細胞）との融合を発現する改変免疫細胞、特にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞は、血液癌および固形癌に発現するストレス誘導リガンドに対する特異性を獲得する。しかし、これらストレスリガンドは、活性化した免疫細胞またはＴ細胞によっても一過性発現する。これにより、ＮＫＧ２Ｄベースの免疫細胞が、患者に注入する前の細胞製造中または凍結解凍サイクル中に自己殺傷（フラトリサイド）を起こす可能性があることが示唆される。

本発明の目的は、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体を発現する免疫細胞の製造中におけるフラトリサイドを減少および／または防止する方法であって、前記細胞の製造プロセス中のＮＫＧ２Ｄシグナル伝達の機能阻害を備えた方法を提供することにある。本発明の目的はまた、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体を発現する凍結免疫細胞の凍結および／または解凍中におけるフラトリサイドを減少および／または防止する方法であって、前記細胞の凍結および／または解凍プロセス中のＮＫＧ２Ｄシグナル伝達の機能阻害を備えた方法を提供することにある。

ＮＫＧ２Ｄ発現の標的阻害、ＮＫＧ２Ｄリガンド発現または酵素機能、特にＰＩ３Ｋ機能の阻害によって、標的駆動型ＣＡＲＴフラトリサイドを解消することができる。ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達の機能阻害は、以下の１つ以上によって達成され得ることが特に想定される：
‐前記免疫細胞の１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドの永続的または一過性阻害；
‐前記キメラＮＫＧ２Ｄ受容体の一過性阻害；
‐前記キメラＮＫＧ２Ｄ受容体の下流シグナル伝達の一過性阻害。

１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンド永続的阻害が想定される実施形態によれば、これは特に遺伝子ノックダウンによって達成することができる。この目的のため、限定されるものではないが、Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、ＭｅｇａＴＡＬヌクレアーゼを含む遺伝子編集技術を使うことができる。

下流シグナル伝達の一過性阻害が想定される特定の実施形態によれば、これは、ＰＩ３Ｋシグナル伝達の一過性阻害である。さらに特定の実施形態によれば、ＰＩ３Ｋシグナル伝達は、様々なＰＩ３Ｋ阻害剤を用いて阻害することができる。そのような阻害剤の一例として、ＬＹ２９４００２が挙げられる。他の適切な阻害剤として、イデラリシブ（Ｃａｌ―１０１）が挙げられる。

特定の実施形態によれば、受容体またはリガンドの機能阻害は、阻害性ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡやｓｉＲＮＡなど）または、ＮＫＧ２Ｄ受容体に対する抗体やそのリガンドの１つ以上に対する抗体を用いて達成することができる。

さらに特定の実施形態によれば、機能阻害は、受容体レベルで達成され、阻害性ＲＮＡまたはＮＫＧ２Ｄ受容体に対する抗体を介して行われる。一態様によれば、ＮＫＧ２Ｄ受容体に対する抗体が使われる。この態様の特定の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄ受容体に対する抗体は、キメラ受容体（すなわち、遮断抗体またはアンタゴニスト抗体）を活性化することなく受容体に結合する抗体である。最も特定の実施形態によれば、ＮＫＧ２Ｄ受容体に対する抗体は、市販の１Ｄ１１抗体（それが単離されたクローンに基づいて命名）である。

別の特定の実施形態によれば、機能阻害は、リガンドレベルで達成され、阻害性ＲＮＡまたは１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する抗体を介して行われる。リガンドは、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢの一方または両方であることが特に想定される。一態様によれば、１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対するｓｈＲＮＡが使われる。

特定の実施形態によれば、製造される免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、幹細胞またはｉＰＳＣなどの養子細胞移植用の細胞である。

さらなる態様において、養子移植用に製造される際にフラトリサイドが起こりにくい細胞が提供される。この態様によれば、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体をコードする核酸分子と、以下の少なくとも１つとを含む遺伝子操作された免疫細胞が提供される：
‐不活性化するように遺伝子操作されたＮＫＧ２Ｄリガンドをコードする１つ以上の内在性遺伝子；
‐キメラＮＫＧ２Ｄ受容体および／または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する１つ以上のｓｈＲＮＡ。

これらの免疫細胞において、ＮＫＧ２Ｄリガンドは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５およびＵＬＢＰ６から選択される。特に想定されるリガンドは、ＭＩＣＡおよび／またはＭＩＣＢである。

さらに特定の実施形態によれば、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体をコードする核酸分子と、以下の少なくとも１つとを含む遺伝子操作された免疫細胞が提供される：
‐不活性化するように遺伝子操作されたＮＫＧ２Ｄリガンドをコードする１つ以上の内在性遺伝子；
‐１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する１つ以上のｓｈＲＮＡ。

さらなる態様によれば、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体をコードする核酸分子を含む免疫細胞を含有する組成物が提供され、
ａ）前記細胞は、
‐不活性化するように遺伝子操作されたＮＫＧ２Ｄリガンドをコードする１つ以上の内在性遺伝子と；
‐キメラＮＫＧ２Ｄ受容体および／または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する１つ以上のｓｈＲＮＡとをさらに含み；
および／または
ｂ）前記組成物は、
‐キメラＮＫＧ２Ｄ受容体および／または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する１つ以上の抗体と；
‐キメラＮＫＧ２Ｄ受容体の下流シグナル伝達の阻害剤、具体的には、ＰＩ３Ｋ阻害剤とをさらに含有する。

この態様の特定の実施形態によれば、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体をコードする核酸分子を含む免疫細胞を含有する組成物が提供され、
前記組成物は、
‐キメラＮＫＧ２Ｄ受容体および／または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する１つ以上の抗体；
および／または
‐キメラＮＫＧ２Ｄ受容体の下流シグナル伝達の阻害剤、具体的には、ＰＩ３Ｋ阻害剤を含有する。

またさらなる特定の実施形態によれば、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体をコードする核酸分子を含む免疫細胞を含有する組成物が提供され、
前記組成物は、
‐キメラＮＫＧ２Ｄ受容体に対する１つ以上の抗体；
および／または
‐ＰＩ３Ｋ阻害剤、具体的に、ＬＹ２９４００２またはイデラリシブを含有する。

またさらなる態様によれば、本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞または組成物は、医薬品として使用するために提供される。これらは癌の治療に特に適している。

これは、癌の治療方法を提供すると記載することと同等であり、当該癌の治療方法は、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体をコードする核酸分子と、以下の少なくとも１つとを含む遺伝子操作された免疫細胞を、それを必要とする被検体に投与することを含む：
‐不活性化するように遺伝子操作されたＮＫＧ２Ｄリガンドをコードする１つ以上の内在性遺伝子と；
‐キメラＮＫＧ２Ｄ受容体および／または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する１つ以上のｓｈＲＮＡ。

同様に、組成物を、それを必要とする被検体に投与することを含む癌の治療方法であって、前記組成物は、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体をコードする核酸分子を含む免疫細胞を含有し、
ａ）前記細胞は、
‐不活性化するように遺伝子操作されたＮＫＧ２Ｄリガンドをコードする１つ以上の内在性遺伝子と；
‐キメラＮＫＧ２Ｄ受容体および／または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する１つ以上のｓｈＲＮＡをさらに含み、
および／または
ｂ）前記組成物は、
キメラＮＫＧ２Ｄ受容体および／または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する１つ以上の抗体と；
キメラＮＫＧ２Ｄ受容体の下流シグナル伝達の阻害剤、具体的には、ＰＩ３Ｋ阻害剤を含有する、癌の治療方法が提供される。

上記治療方法は、自己由来の方法（被検体が自身の体に由来する細胞を受け取る）であってもよく、または、同種異系由来の方法（免疫細胞が被検体ではないドナーに由来）であってもよい。

代表的なＮＫＲ―２Ｔ細胞プロセスにおけるＰＢＭＣ、ｔＣＤ１９およびＮＫＧ２Ｄ―ＣＡＲＴ細胞のフローサイトメトリーの特性評価。 密度勾配法を使って血液から精製した単核細胞を、ＮＫＲ―２Ｔ細胞プロセスの前（ＰＢＭＣ）と後（ｔＣＤ１９およびＮＫＲ―２Ｔ細胞）に分析した。獲得後、ＳＳＣ／ＦＳＣ上で細胞をゲートしてリンパ球を得た。その後、リンパ球をＣＤ３上でゲートした。その後、すべてのＣＤ３陽性細胞を以下のように表示した。（Ａ）ＣＤ４／ＣＤ８分布。（Ｂ）ＮＫＧ２Ｄ（ＣＤ３１４）の表面発現。 （Ｃ）記憶表現型。ナイーブ（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋）、セントラルメモリー（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ―）、エフェクターメモリー（ＣＤ６２Ｌ―ＣＤ４５ＲＡ―）、および、ＣＤ４５ＲＡを発現する最終分化Ｔ細胞（ＣＤ６２Ｌ―ＣＤ４５ＲＡ＋）を識別するためのＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡ。（Ｄ）ＣＤ２２３（Ｌａｇ―３）およびＣＤ２７９（ＰＤ―１）について染色された消耗表現型。３つのうち、１つの代表的なドナーが示されている。 ＣＤ３１４の平均蛍光強度（ＭＦＩ）。Ａ〜Ｂ）非形質導入Ｔ細胞、ＭｏｃｋＣＤ１９による形質導入Ｔ細胞、または、ＮＫＲ２による形質導入Ｔ細胞を採取した際のＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＣＤ３１４のＭＦＩ。非形質導入Ｔ細胞の場合はｎ＝９の平均値、ＭｏｃｋＣＤ１９による形質導入Ｔ細胞の場合はｎ＝ｌｌの平均値、および、ＮＫＲ２による形質導入Ｔ細胞の場合はｎ＝１６の平均値を示す。有意性の評価には、ウェルチ補正を備えた両側対応のないｔ検定を用いた（＊＊＊ｐ＝０．０００３．＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。Ｃ）少なくとも９名の異なるドナーに由来する非形質導入Ｔ細胞、ＭｏｃｋＣＤ１９による形質導入Ｔ細胞、または、ＮＫＲ２による形質導入Ｔ細胞の平均蛍光強度値。ＭＦＩとＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞の標準誤差を示す。 ＮＫＲ―２Ｔ細胞は、慢性骨髄性白血病（Ｋ５６２）および膵癌（ＰＡＮＣ―１）を認識するが、ＮＫＧ２ＤＬ発現によるフラトリサイド効果を示す。（Ａ）健常ドナー由来のＴ細胞をｔＣＤ１９ベクター（ｔＣＤ１９Ｔ細胞）またはＮＫＲ―２Ｔ細胞ベクター（ＮＫＧ２Ｄ―ＣＡＲＴ細胞）で形質導入し、適応細胞株で共培養または単独培養（―）した。一晩共培養した後、ＥＬＩＳＡでＩＦＮ―γ分泌（ｎｇ／ｍｌ）を定量した。各データ点は、独立した実験からの複製ウェルの平均値を表す。図は（Ｎ＝３）を示している。（Ｂ）ＮＫＲ―２Ｔ細胞は、細胞溶解活性を示す。ＰＡＮＣ―１を、解凍したＮＫＧ２Ｄ―ＣＡＲＴ細胞と１：１のＥ：Ｔ比で共培養した。２０時間後、アラマーブルー指標を決定した。未処理癌細胞（ＰＡＮＣ―１）と吸光度を比較することにより細胞溶解率を決定した。データは、独立したＴ細胞ドナー（ＰＡＮＣ―１細胞単独、ＮＫＲ―２Ｔ細胞：ＮＫＲ―２Ｔ細胞とＰＡＮＣ―１細胞との共培養、ｔＣＤ１９：対照ｔＣＤ１９Ｔ細胞とＰＡＮＣ―１細胞との共培養）のＮ＝３の場合の平均±標準偏差を示す。（Ｃ）形質導入されたＴ細胞を、完全Ｘ―ｖｉｖｏ（１００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ―２）で４日間培養した。播種９６時間後にＴ細胞を分析し、初期細胞播種密度に対する増殖率を分析した。データは、独立したＴ細胞ドナーのＮ＝３の場合の平均±標準偏差を示す。 （Ｄ）代表的な共培養実験（３つのうち）。ＧＦＰ陽性Ｔ細胞を、単独培養（Ｍｏｃｋ―ＧＦＰ）または同じドナー由来のＮＫＲ―２Ｔ細胞で（Ｍｏｃｋ ＧＦＰ＋ＮＫＲ―２Ｔ細胞）共培養した。インキュベーション開始時（Ｔ＝０ｈ）またはインキュベーション２４時間後（Ｔ＝２４ｈ）にフローサイトメトリー分析のＧＦＰ陽性を獲得した。 （Ｅ〜Ｆ）ＰＢＭＣを４０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３と１００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ―２とで活性化し、通常の製造プロトコルに従い合計８日間培養した。２日ごとに細胞サンプルを採取し、ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を、ＲＮＡ（Ｅ）または細胞表面上のタンパク質（Ｆ）のいずれかにより分析した。統計的有意性の評価には、両側対応のないｔ検定を用いた。ｐ＜０．０５を有意（＊）、ｐ＜０．０１を（＊＊）と判定した。ｑＰＣＲ法およびフローサイトメトリー比較の両方において、対応のある両側ｔ検定を用いた。 ＮＫＲ―２Ｔ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ遮断抗体またはＰＩ３Ｋ阻害剤によって阻害され得るＮＫＧ２Ｄ媒介性フラトリサイドを示す。（Ａ）ＬＹ２９４００２の濃度を増加させてまたは増加させずに処理したＮＫＲ―２Ｔ細胞上のＮＫＧ２Ｄ発現のＭＦＩ。データは、独立したドナーＮ＝３の場合の平均±標準偏差を示す。（Ｂ）形質導入されたＴ細胞を、ＬＹ２９４００２の濃度を増加させてまたは増殖させるために増加させずに補充した完全Ｘ―ｖｉｖｏ（１００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ―２）で培養した。播種９６時間後にＴ細胞を分析し、初期細胞播種密度に対する増殖率を分析した。データは、独立したドナーＮ＝３の場合の平均±標準偏差を示す。（Ｃ）凍結保存後の細胞の生存率。ＬＹ２９４００２の濃度を増加させてＮＫＲ―２Ｔ細胞を産生した。産生後、細胞を採取し、洗浄し、凍結保存用に処方した。凍結保存後、細胞を、水浴を用いて解凍し、プラズマライト／ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）５％において再懸濁させた。解凍直後（ＴＯｈ）またはプラズマライト／ＨＳＡ５％において４℃で６時間経った後（Ｔ６ｈ）、細胞生存率を評価した（Ｎ＝７１５ ３）。（Ｄ）ＬＹ２９４００２の濃度を増加させてＮＫＲ―２Ｔ細胞を産生した。産生後、細胞を採取し、洗浄し、プラズマライト／ＨＳＡ１％（５０×１０６ＮＫＲ―２Ｔ細胞／ｍｌ）に移して、４℃で４８時間保存した。４８時間後、細胞生存率を、トリパンブルー染色（Ｎ＝３）を用いて評価し、凍結保存時の細胞数について正規化した。（Ｅ）遮断Ａｂの濃度を増加させて（０（―）〜１０μｇ／ｍｌ）、ｔＣＤ１９ Ｔ細胞を同じドナー由来のＮＫＲ―２Ｔ細胞で共培養した。インキュベーション４４時間後、ＣＤ１９陽性率および生存率のフローサイトメトリー分析をした。データは、ＮＫＲ―２Ｔ細胞なしで培養したＭｏｃｋのＣＤ１９陽性率で正規化している（Ｎ＝３）。（Ｆ）解凍したＮＫＲ―２Ｔ細胞を、ＣＤ３１４遮断Ａｂ存在下、アイソタイプ・コントロール存在下、または、Ａｂ不存在下で、ＰＡＮＣ―１細胞またはＫ５６２細胞のいずれかと１：１の比で共培養した。２４時間インキュベーションした後、上清を回収し、ＩＦＮ―γ測定を行った（Ｎ＝３）。（Ｇ）解凍したＮＫＲ―２Ｔ細胞を、アイソタイプ・コントロール存在下、ＣＤ３１４遮断Ａｂ存在下（またはＡｂ不存在下）で２４時間培養し、ＩＦＮ―γレベルの測定を行った。データは、独立したドナーＮ＝３の場合の平均±標準偏差を示す。統計的有意性の評価には、両側対応のないｔ検定を用いた。ｐ＜０．０５を有意（＊）、ｐ＜０．０１を（＊＊）と判定した。 ＬＹ２９４００２の濃度を増加させてまたは増加させずに処理したＮＫＲ―２Ｔ細胞上のＮＫＧ２Ｄ発現のＭＦＩ。 ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下または不存在下におけるｔＣＤ１９細胞の増殖率。 ＰＩ３Ｋ阻害剤を用いて産生したＮＫＲ―２Ｔ細胞は、より大量のＩＦＮ―γを生成し（Ａ）、 記憶表現型の増加をを示す（Ｂ）。 抗体遮断がある場合とない場合のＮＫＲ―２Ｔ細胞の増殖率。 ＮＫＲ―２Ｔ細胞Ａｂ遮断プロセスへの適応により、ＣＤ４／ＣＤ８比が回復する。（Ａ）３つのなかで代表的な殺傷アッセイである細胞溶解活性動態。ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２または遮断Ａｂで処理された解凍済みの対照ｔＣＤ１９Ｔ細胞またはＮＫＲ―２Ｔ細胞を、ＮｕｃＬｉｇｈｔ陽性ＰＡＮＣ―１の存在下で培養した。２時間ごとにＩｎｃｕＣｙｔｅＳ３装置でＰＡＮＣ―１の生存率を評価した。（Ｂ）採取時のＣＤ４／ＣＤ８の分布。増殖段階において、ＮＫＲ―２Ｔ細胞を、５μＭのＬＹ２９４００２または５μｇ／ｍＬの遮断Ａｂのいずれかで９６時間培養し、採取して、ＣＤ４とＣＤ８の集団についてフローサイトメトリーで測定した。データは、対照ｔＣＤ１９比に対する独立したＴ細胞ドナーのＮ＝４の場合の平均±標準偏差を示す。（Ｃ）遮断Ａｂを遅れて添加して採取した場合のＣＤ４／ＣＤ８の分布。増殖段階において（４〜８日目）、ＮＫＲ―２Ｔ細胞を、５μＭの遮断Ａｂで直後に（４日目）または４８時間時間後に処理した（６日目）。採取の際（８日目）、Ｔ細胞を採取して、ＣＤ４とＣＤ８の集団についてフローサイトメトリーで分析した。データは、対照ｔＣＤ１９のＣＤ４／ＣＤ８比に対する、独立したＴ細胞ドナーのＮ＝３の場合の平均±標準偏差を示す。（Ｄ）増殖率の比較。ＮＫＲ―２Ｔ細胞を、８日間または１０日間、ＬＹまたは遮断Ａｂ（４日目または６日目に添加）の存在下で培養した。初期細胞播種密度に対する増殖率について、Ｔ細胞を採取時に分析した。（Ｅ）ＩＦＮ―γ分泌による分化能アッセイ。上記２つの方法で処理した解凍済みのＮＫＲ―２Ｔ細胞を、ＰＡＮＣ―１細胞の存在下で共培養した。共培養の４４時間後、ＥＬＩＳＡでＩＦＮ―γ分泌を測定した。データは、独立したＴ細胞ドナーのＮ＝４の場合の平均±標準偏差を示す。（Ｆ）３つのなかで代表的な殺傷アッセイである細胞溶解活性動態。ＰＩ３Ｋｉまたは遮断抗体で処理された解凍済みの対照ｔＣＤ１９Ｔ細胞またはＮＫＲ―２Ｔ細胞を、ＮｕｃＬｉｇｈｔ陽性ＰＡＮＣ―１細胞の存在下で培養した。２時間ごとにＩｎｃｕＣｙｔｅＳ３装置でＰＡＮＣ―１の生存率を評価した。統計的有意性の評価には、両側対応のないｔ検定を用いた。ｐ＜０．０５を有意（＊）、ｐ＜０．０１を（＊＊）、ｐ＜０．００１を（＊＊＊）と判定した。 イデラリシブ（Ｃａｌ１０１）とＮＫＧ２Ｄ遮断抗体の関係。遮断ＮＫＧ２Ｄ抗体または５μＭのＣＡＬ１０１の存在下で培養された細胞の、Ｋ５６２細胞で共培養された後ＩＦＮ―γ分泌で測定された細胞増殖率（Ａ）と、生存率（Ｂ）と、分化能の比較。 ＣＤ４＋（Ａ）およびＣＤ８＋（Ｂ）Ｔ細胞の表面上でのＮＫＧ２Ｄリガンドの発現。 ｓｈＲＮＡを標的とするＭＩＣＡ／Ｂの共発現は、フラトリサイドを減少する。 フラトリサイドの減少により、癌細胞の殺傷が増加する。

定義
本発明を特定の実施形態に基づいて、いくつかの図面を参照しながら説明するが、本発明はこれら実施形態に限定されず、特許請求の範囲のみによって限定される。特許請求の範囲に記載の参照符号は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。図面は、単に概略を示すものであって限定するものではない。図面では、例示のために、構成要素の大きさが強調されている場合があり、厳密に図示したものではない。本明細書および本発明の範囲で使われる「備える」という用語は、他の構成要素やプロセスを排除するものではない。数量が特定されていない名詞は、特に明記されていない限り、その名詞の複数を含むものとする。「本質的に・・・からなる」という表現は、記載された要素が必ず含まれ、当該記載された要素の基本的かつ新規な特性に実質的な影響を及ぼす要素は除外され、その他の要素は任意に含まれ得ることを意味する。「からなる」という表現は、記載された要素以外の要素すべてが除外されることを意味する。これら用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本発明の範囲に包含される。

さらに、明細書および特許請求の範囲に記載の「第１」、「第２」、「第３」などの用語は、類似の要素を区別するのに用いられるのであって、必ずしも順序や時系列を表すものではない。このように用いられる用語は適切な状況下で交換可能であり、本明細書に記載の発明の実施形態は、本明細書に記載または図示されるものとは別の順序で実施可能であることを理解されたい。

下記の用語または定義は、本発明の理解を助けることを目的として提示しているだけである。

本明細書で特に定義されない限り、本明細書で用いられる用語はすべて、本発明の技術における当業者が理解するのと同じ意味を持つ。当該技術の定義および用語について、実務者は、具体的に下記文献を参照されたい。

ＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋ著『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第４版』，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１２）

Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ著『Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １１４まで）』，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１６）

本明細書で提示される定義は、当業者が理解する範囲よりも狭い範囲に解釈されるべきではない。

本明細書で用いられる「フラトリサイド」という用語は、遺伝子的に同一の細胞、最も具体的には、免疫細胞による細胞の殺傷を指す。

本明細書で用いられる「フラトリサイドを減少および／または防止する」という用語は、適切な対照細胞集団（典型的には、必ずしもそうではないが、ＮＫＧ２Ｄリガンドの阻害が発生しない同一細胞の集団）と比較した、細胞集団におけるフラトリサイド発生の減少に関する。減少は、対照細胞集団と比較した減少率で表され、例えば、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、さらには１００％もフラトリサイドが減少する。フラトリサイドの減少は、最終の細胞収率または数の増加によっても評価することができる（殺傷される細胞が少ないと、生き残る細胞が増えて増殖するため）。よって、例えば、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、さらには１００％以上の細胞収率の増加によって評価することができる。重要なことは、本明細書で定義されたフラトリサイドの減少は、抗原特異的サイトカイン産生の増加（例えば、インターフェロンγ分泌）および／または、Ｔ細胞の場合、Ｔ細胞の記憶表現型における頻度の増加（ＣＤ６２Ｌ^＋／ＣＤ４５ＲＡ）によっても評価することができる。これら対策は、絶対細胞収率と直接関連しないかもしれないが、もし抗原特異的サイトカイン産生が増加した場合、これは、製造プロセスの最後には多くの治療活性細胞が存在することを意味し、治療細胞においてフラトリサイドが少ないということである。Ｔ記憶細胞の頻度の増加についても同様である。このため、フラトリサイドの減少は、例えば、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、さらには１００％以上の抗原特異的サイトカイン産生の増加によって、あるいは、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、さらに１００％以上の記憶Ｔ細胞の頻度の増加によって評価することができる。

フラトリサイドを減少させる対策は、フラトリサイドプロセスが始まる前（この方がより効果的であるため一般的に好ましい）またはフラトリサイド殺傷の間に行うことができる。フラトリサイドの防止とは、フラトリサイドプロセスが始まる前に行われる対策を指す。特定の実施形態によれば、フラトリサイドの絶対的防止は、ＮＫＧ２Ｄ誘導性のフラトリサイドが発生しない（理想的には、フラトリサイドが全く発生しない）こと、すなわち、フラトリサイドの１００％減少を意味する。

本明細書で用いられる「免疫細胞」という用語は、免疫系（適応免疫系または自然免疫系のいずれかであり得る）の一部である細胞を指す。特に想定される免疫細胞として、リンパ球、単球、マクロファージおよび樹状細胞を含む白血球細胞（白血球）が挙げられる。特に想定されるリンパ球として、Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＢ細胞が挙げられ、最も特に想定されるのはＴ細胞である。本明細書で用いられる免疫細胞は、典型的には、養子細胞移植用に製造される免疫細胞（自己由来移植または同種異系由来移植のいずれか）である。養子移植の状況において、免疫細胞は、典型的には、初代細胞（すなわち、ヒトまたは動物の組織から直接単離された後、培養されていないまたは短時間培養された細胞）であり、細胞株（すなわち、長期間にわたって継続的に継代され、ホモ接合体遺伝子型特性および表現型特性を獲得した細胞）ではない点に留意されたい。特定の実施形態によれば、免疫細胞は初代細胞である。別の特定の実施形態によれば、免疫細胞は、細胞株由来の細胞ではない。

本明細書で用いられる「キメラＮＫＧ２Ｄ受容体」という表現は、ＮＫＧ２Ｄリガンドに対する特異性を有する非自然発生の受容体を指す。結合部が、１つ以上の異なる部分（少なくとも１つのシグナル伝達部分を含む）に融合され、そのうち、少なくとも１つの部分が、当該結合部とは異なる由来（例えば、異なるタンパク質）であるため、キメラである。特に想定されるキメラＮＫＧ２Ｄ受容体の例として、ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲ、すなわち、ＮＫＧ２Ｄ受容体由来の結合部を有するキメラ抗原受容体が挙げられる。このようなＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲは、例えば、Ｗ０２００６／０３６４４５およびＷＯ２０１４／１１７１２１に開示されている。本明細書におけるキメラＮＫＧ２Ｄ受容体の定義には、ＮＫＧ２Ｄ受容体由来ではない１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンド、例えば、１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する抗体または抗体様部分（例えば、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、ｓｄＡｂなど）を認識する結合部を有するＣＡＲも含まれる。これは、その後、典型的には、免疫細胞、具体的には、Ｔ細胞（ＣＤ３ゼータ鎖またはＦｃエプシロン受容体ガンマ鎖など）においてシグナルを形質導入するシグナル伝達部分に融合される。

本願で用いられる「ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達の機能阻害」という用語は、ＤＮＡレベル（ＮＫＧ２Ｄ遺伝子産物または１つ以上のそのリガンドの形成を阻害することにより、すなわち、転写を防ぐまたは干渉することにより）、ＲＮＡレベル（ｍＲＮＡを中和または不安定化して翻訳を防ぐまたは干渉する―ｍＲＮＡは、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体および／または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドのものであってもよい）、または、タンパク質レベル（キメラＮＫＧ２Ｄタンパク質および／または１つ以上のそのリガンドを中和または阻害することにより）のいずれかで、ＮＫＧ２Ｄ遺伝子産物（すなわち、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体遺伝子の産物）の機能を妨害することを指す。タンパク質レベルでの中和は、細胞表面で（例えば、受容体リガンド相互作用を阻害することによって）、または、タンパク質が表面で発現する前（例えば、細胞内小器官にタンパク質を保持することにより）に達成することができる。典型的には、ＮＫＧ２Ｄ誘導性シグナル伝達の阻害の最終的な機能的効果は、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体によって生成されるシグナルを介した免疫細胞活性化の阻害であるが、これは、間接的に（例えば、ＤＮＡレベルで、すなわち、１つ以上のリガンドを阻害することにより）達成することができる。

ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達の機能阻害は、必ずしも、ＮＫＧ２Ｄ誘導シグナルの完全な除去を意味するわけではないが、これも同様に想定される。特に、アンチセンスＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ、また、抗体でも同様に、阻害は、多くの場合、完全な阻害ではなく部分的な阻害であることが知られている。しかし、機能性ＮＫＧ２Ｄ遺伝子産物またはＮＫＧ２Ｄリガンドレベルを下げることは、 完全な阻害が達成されない場合であっても有益な効果を奏する可能性がある-特に、フラトリサイドは、典型的には、細胞密度依存であるため、機能性リガンドまたは受容体の利用性が低下すると、細胞密度の低下が認識される可能性がある（今後の臨床試験に必要な多数の細胞を考慮して適切なプロダクトを作成するために培養希釈を用いて実際の細胞密度を下げることは、実現可能ではない点に留意されたい）。

このため、特定の実施形態によると、阻害により、機能性キメラＮＫＧ２Ｄ受容体遺伝子産物または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドが、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％または最大で１００％減少する。機能性ＮＫＧ２Ｄ受容体遺伝子産物またはリガンドのレベルを測定する方法は、当業者に公知であり、これらを阻害剤の添加前と後に測定して、機能性遺伝子産物のレベルの減少を評価することができる。

本明細書で用いられる「一過性阻害」という用語は、阻害が一時的であり（または一時的に調節され）、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体の機能が、後の時点で回復することを意味する。典型的には、ＮＫＧ２Ｄ誘導性シグナル伝達は、免疫細胞の製造中（すなわち、医薬品として使われる前）に阻害されるが、シグナル伝達能力は、細胞が患者に投与されると回復する。これは、ＮＫＧ２Ｄを介したシグナル伝達が治療効果に重要であるからである。

本願で用いられる「ＮＫＧ２Ｄリガンド」という用語は、ヒト遺伝子ＭＩＣＡ（遺伝子ＩＤ：１００５０７４３６）、ＭＩＣＢ（遺伝子ＩＤ：４２７７）、ＵＬＢＰ１（遺伝子ＩＤ：８０３２９）、ＵＬＢＰ２（遺伝子ＩＤ：８０３２８）、ＵＬＢＰ３（遺伝子ＩＤ：７９４６５）、ＵＬＢＰ４またはＲＡＥＴ１Ｅ（遺伝子ＩＤ：１３５２５０）、ＵＬＢＰ５またはＲＡＥＴ１Ｇ（遺伝子ＩＤ：３５３０９１）、ＵＬＢＰ６またはＲＡＥＴ１Ｌ（遺伝子ＩＤ：１５４０６４）、およびこれらの遺伝子産物（または、他の種の細胞が用いられる場合、関連相同体）を指す。

キメラＮＫＧ２Ｄ受容体を発現する免疫細胞のフラトリサイドを、この受容体の機能を阻害することによって（この受容体または１つ以上のそのリガンドのいずれか一方または両方を阻害することによって）、防止または減少できることを示すのは本願が最初である。このようなフラトリサイドの減少により、細胞の収率が向上し、治療法のコストが低下するため、臨床環境における治療法の利用性を促進することができる。前記阻害は、一過性（患者への投与時ではない、免疫細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ製造プロセス中―キメラＮＫＧ２Ｄ受容体が前記細胞の治療的免疫細胞機能に必要であるため）または、永続的（免疫細胞のリガンドのみが阻害される場合、これは、治療効果を妨害しないため）であってもよい。

このため、本発明の目的は、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体を発現する免疫細胞の製造中におけるフラトリサイドを減少および／または防止する方法であって、前記細胞の製造プロセス中のＮＫＧ２Ｄシグナル伝達の機能阻害を備えた方法を提供することにある。これら製造方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行われる。また、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体を発現する免疫細胞の凍結解凍サイクル中におけるフラトリサイドを減少および／または防止する方法であって、前記凍結解凍サイクル中のＮＫＧ２Ｄシグナル伝達の機能阻害を備えた方法が提供される。これら凍結解凍方法もｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行われる。

以下の点に留意されたい。ＮＫＧ２Ｄは、誘導性自己抗原の認識に関与する受容体の中で最もよく研究された受容体であるが、このファミリーにおいて、この受容体だけが、ストレス誘導リガンド（または誘導性自己抗原または異常な自己のマーカー、本明細書ではすべて同じものとして使われている）を認識するのではない。誘導性自己抗原に結合可能な他の受容体は、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫＧ２Ｈ（ＮＫＧ２Ｄ同様、すべてＣＤ９４分子）またはＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４などの天然細胞毒性受容体（ＮＣＲ）であり、上記方法および組成物は、必要な変更を加えて、このようなキメラ受容体に対しても使用可能であることが想定される。このため、本願でＮＫＧ２Ｄが使われる場合は必ず、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫＧ２Ｈ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４にも適用される。ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２ＦおよびＮＫＧ２Ｈ用のリガンドは、非古典的ＭＨＣグリコプロテインのクラスＩ（ヒトではＨＬＡ―Ｅ）である点に留意されたい。

これら方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法である（細胞の製造と一致するため）。ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達の機能阻害は、以下の１つ以上によって達成される：
‐免疫細胞の１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドの永続的または一過性阻害；
‐キメラＮＫＧ２Ｄ受容体の一過性阻害；
‐キメラＮＫＧ２Ｄ受容体の下流シグナル伝達の一過性阻害。

阻害は、複数の方法で起こり得る。
いくつか例示すると、接触阻害（競合阻害または非競合阻害）、リガンドまたは受容体の発現を妨害することによる阻害、リガンドまたは受容体の局在（例えば、細胞表面への移動を妨げる）の妨害、リガンドまたは受容体に結合することによる阻害あるいは両者の相互作用を妨げることによる阻害、下流シグナル伝達の阻害が挙げられる。

１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドの永続的阻害は、典型的には、遺伝子ノックダウンによって達成される。実際、遺伝子編集は、遺伝子操作されたＴ細胞（１４）における標的抗原の発現を特異的に排除する可能性のある方法であることがわかっている。しかし、８つの異なるリガンドの起こり得る発現を考慮すると、これら多型標的すべてを排除する遺伝子編集技術は課題であるため、１つだけまたは少数のリガンドを永続的に不活性化する必要がある場合が、特に想定される。発現するリガンドが多い場合、代替案の１つとして、フラトリサイドの制御に適するようにすることが考えられる。本発明者らは、８つのＮＫＧ２Ｄリガンドのうち、ＭＩＣＡとＭＩＣＢは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ヒトＴ細胞の細胞表面で主に発現するものであることを見出した。このため、特定の実施形態によると、具体的に、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢの阻害が想定される。

一般に、機能阻害は３つのレベルで達成することができる。１つ目は、ＤＮＡレベルで、例えば、前記免疫細胞における遺伝子（典型的には、ＮＫＧ２Ｄリガンド遺伝子）を除去または破壊することにより、あるいは、転写の発生を防ぐ（いずれの場合も、遺伝子産物の合成を妨げる）ことにより達成することができる。２つ目は、ＲＮＡレベルで、例えば、効率的な翻訳の発生を防ぐことにより（これは、ｍＲＮＡの不安定化を介して行われるため、転写から翻訳が起こる前に分解される）、あるいは、ｍＲＮＡにハイブリダイズすることにより達成することができる。３つ目は、タンパク質レベルで、例えば、タンパク質に結合する、その機能を阻害する、タンパク質を異なる細胞位置で保持する、および／または、分解のためにタンパク質をマーキングすることにより達成することができる。

阻害がＤＮＡレベルで達成される場合、遺伝子治療法を使って遺伝子をノックアウトまたは破壊することによって行うことができる。これは、典型的には、永続的阻害になるため、免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドの阻害が特に想定される。本明細書で用いられる「ノックアウト」は、遺伝子ノックダウン、すなわち、限定されるものではないが、レトロウイルス遺伝子移植を含む当該技術において既知の技術による、点突然変異、挿入、欠失、フレームシフトまたはミスセンス突然変異などの突然変異によって遺伝子をノックアウトできることである。遺伝子をノックアウトできる別の方法は、遺伝子操作されたヌクレアーゼを使用することである。このような遺伝子操作されたヌクレアーゼとしては、限定されるものではないが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ｍｅｇａＴＡＬおよびＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが挙げられる。

微生物種でよく見られるメガヌクレアーゼは、核酸において部位特異的二本鎖切断を生じるための非常に長い認識配列（＞１４ｂｐ）を持つという特有の特性を有する。これにより、メガヌクレアーゼは、自然に標的配列に対して非常に特異的になり、突然変異誘発およびハイスループットスクリーニングを介して、特有の配列を認識するハイブリッドメガヌクレアーゼ変異体が得られる。メガヌクレアーゼとは対照的に、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ技術の背景にある概念は、非特異的ＤＮＡ切断酵素に基づいており、これはその後、ジンクフィンガーおよび転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）などのペプチドを認識する特異的ＤＮＡ配列に連結され得る。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することにより生成される人工制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、所望のＤＮＡ配列を標的にするよう遺伝子操作することができ、これにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、複雑なゲノム内の特有の配列を標的にすることができる。内在性ＤＮＡ修復機構を利用することにより、これら試薬を使って、高等生物のゲノムを正確に改変することができる。ＴＡＬＥＮは、ジンクフィンガーと似た働きをするが、ＤＮＡ認識用転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）。ＴＡＬＥは、アミノ酸と認識ヌクレオチド対との１対１の認識率を有する繰り返し単位である。ＴＡＬＥは繰り返しパターンで発生するため、異なる組み合わせを試して、多種多様な配列特異性を創出することができる。

ＭｅｇａＴＡＬは、２つの異なるクラスのＤＮＡ標的酵素の組み合わせに由来する。メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼともいう）は、同じドメインでＤＮＡ認識およびヌクレアーゼ機能の両方の利点を有する単一ペプチド鎖である。しかし、メガヌクレアーゼ標的認識は、修飾が難しく、他のゲノム標的エンドヌクレアーゼよりも特異性が低下しオンターゲット切断効率が低いことが多い。転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターは、標的ＤＮＡ二本鎖切断を達成するために、別々のＤＮＡエンドヌクレアーゼドメインに連結されたＤＮＡ認識タンパク質である。メガヌクレアーゼとは対照的に、ＴＡＬは、特異的ＤＮＡ配列を標的にするよう容易に遺伝子操作される。現在のプラットフォームは、各ＴＡＬエフェクターが非特異的ＤＮＡ切断ドメインに共役している１対のＴＡＬエフェクターに依存しており、ＤＮＡ切断は、両方のＴＡＬエフェクターがそれぞれの配列に結合し、２つのエンドヌクレアーゼドメインが二量化してＤＮＡを切断する場合にのみ起こる。しかし、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、オフターゲット活性をもたらすことが可能であり、メガヌクレアーゼよりもはるかに大きく、２つの別々のタンパク質の送達を必要とする。ｍｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬエフェクターとメガヌクレアーゼとが一体化したものである。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ ／ Ｃｒｉｓｐｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、原核細胞の防御機構の改定版を用いたゲノム編集技術であり、生体内の遺伝子の永続的な組み換えが可能となる。合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合化したＣａｓ（典型的にはＣａｓ９）ヌクレアーゼを細胞に送達することにより、細胞のゲノムを所望の位置で切断することができ、既存遺伝子の除去および／または新たな遺伝子の追加が可能となる。

１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンド遺伝子の遺伝子ノックダウンによる永続的阻害は、典型的には、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体も存在する免疫細胞において行われる。１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンド遺伝子は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５およびＵＬＢＰ６の任意の組み合わせの阻害を意味し得るため、１、２、３、４、５、６、７または８つの遺伝子のノックアウトを意味し得る。

ＮＫＧ２Ｄリガンドの永続的阻害とは別に、ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達の機能阻害は、一過性阻害によっても達成することができる。一過性阻害は、免疫細胞上の１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドの阻害であってもよいが、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体の阻害または下流シグナル伝達の阻害であってもよい。

一過性阻害の時間枠は、典型的には、製造の時間枠と一致する。キメラＮＫＧ２Ｄ受容体を発現する免疫細胞の製造は、いくつかの工程を含み、プロトコルは様々であるが、基本的に、形質導入工程（キメラＮＫＧ２Ｄ受容体を、単離された免疫細胞に導入する）と、増殖工程（細胞を培養して増殖させる）と、採取工程（患者に投与する前または（凍結）保存のために、細胞を単離して再処方または濃縮する）とが常に含まれる。一過性阻害は、具体的に、増殖工程中（フラトリサイドが最も発生しやすいため）の阻害を意味するが、一過性は、製造プロセス全体の間（形質導入工程またはその前から採取工程またはそれ以降まで）であってもよい。典型的には、外部の阻害剤（例えば、抗体）が使用される場合、これらは、採取／再処方プロセス中に除去される。このため、この方法は、使用された阻害剤を除去する活性工程を含んでいてもよい。しかし、他の例では、阻害剤は、本質的に一過性であったり（例えば、半減期が短いため）、製造プロセス後は活性しなくなる誘導プロモーターの制御下にある場合があり、機能性ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達の阻害を終わらせるのに活性工程が必要ない場合がある。典型的な設定では、一過性阻害は、およそ形質導入工程から投与／注入工程まで阻害を必然的に伴うが、それよりも短いまたは長い時間枠も想定され得る。

一過性阻害の１つの形態は、一過性の遺伝子不活性化による。一過性の遺伝子不活性化は、例えば、免疫細胞におけるアンチセンスＲＮＡの発現を介して、または、前記細胞にアンチセンスＲＮＡを投与することにより達成し得る。アンチセンス構築物は、例えば、発現プラスミドとして送達することができ、細胞で転写されると、標的ｍＲＮＡ（ここでは、ＮＫＧ２ＤリガンドのｍＲＮＡまたはキメラＮＫＧ２Ｄ受容体のｍＲＮＡ）の少なくとも特有の部分に相補するＲＮＡを産生する。

遺伝子発現のより迅速な阻害方法は、ＤＮＡからなるより短いアンチセンスオリゴマーの使用、または、ホスホロチエート、２’―Ｏ―アルキルリボヌクレオチドキメラ、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルフォリノなどの他の合成構造型の使用に基づく。ＲＮＡオリゴマー、ＰＮＡおよびモルフォリノを除いて、他のアンチセンスオリゴマーはすべて、ＲＮａｓｅ Ｈ媒介性標的切断の機構を介して、真核細胞で作用する。ＰＮＡおよびモルフォリノは、相補ＤＮＡおよびＲＮＡ標的に高い親和性と特異性で結合するため、単純な立体遮断を介して作用し、ヌクレアーゼの攻撃に対して完全な耐性を持つようになる。「アンチセンスオリゴマー」は、長さが少なくとも約１０ヌクレオチドのオリゴマーを含むアンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、少なくとも１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０または５０ヌクレオチドを含む。アンチセンスアプローチは、ＦＭＲ１のポリヌクレオチド配列によってコードされるｍＲＮＡに相補されるオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか、あるいはその誘導体）の設計を含む。アンチセンスＲＮＡを細胞に導入し、相補ｍＲＮＡと塩基対形成して翻訳機構を物理的に妨害することにより相補ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。このため、この効果は化学量論的である。絶対相補性が好ましいが、必要ではない。本明細書で用いられるＲＮＡの一部に「相補する」配列は、ＲＮＡとハイブリダイズ可能であり安定した二本鎖を形成するのに十分な相補性を有する配列を意味し、二本鎖アンチセンスポリヌクレオチド配列の場合、二本鎖ＤＮＡの一本鎖をテストしてもよく、または、三本鎖形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度と、アンチセンスポリヌクレオチド配列の長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズするポリヌクレオチド配列が長いほど、それが含み得るＲＮＡとの塩基ミスマッチが増え、安定した二本鎖（または場合によっては三本鎖）が形成された状態になる。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を求めるための標準的な手順を用いることにより、ミスマッチの許容可能な程度を確認することができる。メッセージの５’末端（例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）からＡＵＧ翻訳開始コドンを含む）に相補されるオリゴマーは、翻訳を阻害するのに最も効率的に作用するはずである。しかし、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに相補する配列も、ｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに効果的であることが最近わかった（Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７２，３３３〜３３５）。このため、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲのいずれか、すなわち、標的遺伝子の非コード領域に相補するオリゴマーをアンチセンスアプローチに用いて、標的遺伝子によりコードされる前記内在性ｍＲＮＡの翻訳を阻害できる可能性がある。前記ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに相補するオリゴマーは、ＡＵＧ開始コドンの補体を当然含む。ｍＲＮＡコード領域に相補されるアンチセンスオリゴマーは、効率の悪い翻訳阻害剤であるが、本発明で用いることができる。前記ｍＲＮＡの５’３’または非コード領域のどちらかにハイブリダイズするよう設計する際、アンチセンスオリゴマーは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有する必要があり、好ましくは、１５〜約５０ヌクレオチドの長さを有するオリゴマーである。特定の実施形態では、オリゴマーは、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも３５ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドの長さを有する。関連する方法では、アンチセンスＲＮＡの代わりにリボザイムを使用する。リボザイムは、標的特異的ＲＮＡ配列に設計され得る酵素様切断特性を有する触媒ＲＮＡ分子である。マウス、ゼブラフィッシュおよびショウジョウバエにおいて、リボザイムを用いた一時的かつ組織特異的遺伝子不活性化を含む標的遺伝子不活性化の成功が報告されている。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、転写後遺伝子抑制の一形態である。ＲＮＡ干渉の減少が最初に観察され記載されたのは、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）であり、外在性二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、標的ＲＮＡの急速な分解を誘導する機構を介して相同配列を含む遺伝子の活性を特異的かつ強力に破壊することが示された。いくつかの報告において、遺伝子不活性化の空間的および／または時間的制御を実証する実験を含む、植物（シロイヌナズナ）、原生動物（ブルーストリパノソーマ）、無脊椎動物（ショウジョウバエ）および脊椎動物種（ゼブラフィッシュおよびアフリカツメガエル）を含む他の生物における同じ触媒現象が記載されている。配列特異的メッセンジャーＲＮＡ分解のメディエーターは、より長いｄｓＲＮＡからのリボヌクレアーゼＩＩＩ切断によって生成される低干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。一般的に、ｓｉＲＮＡの長さは、２０〜２５ヌクレオチドの間である（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１１、４９４〜４９８）。ｓｉＲＮＡは、典型的には、センスＲＮＡ鎖と、標準Ｗａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対相互作用（以下「塩基対形成」という）によって一緒にアニーリングされた相補アンチセンスＲＮＡ鎖とを含む。センス鎖は、標的ｍＲＮＡに含まれる標的配列と同一の核酸配列を含む。本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、２つの相補一本鎖ＲＮＡ分子を含むことができ、または、２つの相補部分が塩基対を形成し、一本鎖の「ヘアピン」領域（しばしば「ｓｈＲＮＡ」と呼ばれる）によって共有結合された単一分子を含むことができる。「単離される」という用語は、人間の介入を介して自然状態から改変または除去されることを意味する。例えば、生きている動物に自然に存在するｓｉＲＮＡは、「単離されない」が、合成ｓｉＲＮＡや、その自然状態の共存物質から部分的または完全に分離されたｓｉＲＮＡは、「単離される」。単離されたｓｉＲＮＡは、実質的に精製された形態で、または、例えば、ｓｉＲＮＡが送達された細胞などの非自然環境で存在することができる。

本発明のｓｉＲＮＡは、部分的に精製されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡまたは 組換え産生されたＲＮＡ、ならびに、１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって改変され、自然発生のＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡを含むことができる。このような改変として、例えば、ｓｉＲＮＡの末端やｓｉＲＮＡの１つ以上の内部ヌクレオチドへの非ヌクレオチド物質の付加（ｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化耐性にする改変を含む）が含まれ得る。

本発明のｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖は、３’オーバーハングも含むことができる。「３’オーバーハング」は、ＲＮＡ鎖の３’末端から延出する少なくとも１つの非対ヌクレオチドを指す。このため、一実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡは、長さが１〜約６ヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを含む）、好ましくは、長さが１〜約５ヌクレオチド、より好ましくは、長さが１〜約４ヌクレオチド、特に好ましくは、長さが約１〜約４ヌクレオチドである少なくとも１つの３’オーバーハングを含む。

ｓｉＲＮＡ分子の両方の鎖が３’オーバーハングを含む実施形態において、オーバーハングの長さは、各鎖で同じであっても異なってもよい。最も好ましい実施形態では、３’オーバーハングは、ｓｉＲＮＡの両方の鎖に存在し、長さは２ヌクレオチドである。本発明のｓｉＲＮＡの安定性を高めるため、３’オーバーハングを分解に対して安定化させることもできる。一実施形態では、オーバーハングは、アデノシンヌクレオチドまたはグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドを含めることにより安定化される。

あるいは、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、３’オーバーハングにおける２’デオキシチミジンによるウリジンヌクレオチドの置換は、許容範囲内であり、ＲＮＡｉ分解の効率に影響を及ぼさない。具体的には、２’デオキシチミジンに２’ヒドロキシルが存在しないことにより、組織培養培地における３’オーバーハングのヌクレアーゼ耐性が著しく高められる。

ｓｉＲＮＡは、複数の当業者に既知の技術を使って得ることができる。例えば、ｓｉＲＮＡは、当該技術において既知の方法で化学的に合成または組換えて産生することができる。好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトと、従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置とを使って化学的に合成される。ｓｉＲＮＡは、２つの別個の相補ＲＮＡ分子または２つの相補領域を有する単一のＲＮＡ分子として合成することができる。合成ＲＮＡ分子または合成試薬の商業サプライヤーとして以下が挙げられる。

Ｐｒｏｌｉｇｏ（ハンブルグ、ドイツ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ラファイエット、コロラド州、米国）、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅの一部、ロックフォード、イリノイ州、米国）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（スターリング、バージニア州、米国）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（アッシュランド、マサチューセッツ州、米国）およびＣｒｕａｃｈｅｍ（グラスゴー、英国）。

あるいは、ｓｉＲＮＡは、適切なプロモーターを使って、組み換え環状または線状ＤＮＡプラスミドから発現させることもできる。プラスミドから本発明のｓｉＲＮＡを発現するのに適切なプロモーターとして、例えば、Ｕ６またはＨＩ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列およびサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。他の適切なプロモーターの選択は、当業者の技量の範囲内である。本発明の組み換えプラスミドは、特定の組織または特定の細胞内環境においてｓｉＲＮＡを発現させるための誘導または調節可能なプロモーターも含むことができる。組み換えプラスミドから発現されるｓｉＲＮＡは、標準的な技術で、培養細胞発現系から単離可能であり、または、細胞内、例えば、乳房組織やニューロンで発現可能である。

本発明のｓｉＲＮＡは、組み換えウィルスベクターから細胞内で発現させることもできる。組み換えウィルスベクターは、本発明のｓｉＲＮＡをコードする配列と、ｓｉＲＮＡ 配列を発現するのに適切なプロモーターとを含む。適切なプロモーターとして、例えば、Ｕ６またはＨＩ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列およびサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。他の適切なプロモーターの選択は、当業者の技量の範囲内である。本発明の組み換えウィルスベクターは、腫瘍が局在する組織においてｓｉＲＮＡを発現させるための誘導または調節可能なプロモーターも含むことができる。

本明細書で用いられるｓｉＲＮＡの「有効量」は、標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介分解を生じるのに十分な量、または、ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達を減少するのに十分な量である。標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介分解は、上述したようなｍＲＮＡまたはタンパク質を単離および定量するための標準的な技術を使って、被検体の細胞にある標的ｍＲＮＡまたはタンパク質の量を測定することによって検出することができる。

ゼブラフィッシュおよびカエルにおけるモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅ Ｈの厳格性が低い要件によってもたらされる他のｍＲＮＡ分子の非標的特異的切断による多数の非特異的効果を含むＲＮａｓｅ Ｈコンピテントアンチセンスオリゴヌクレオチドの限定を解消することがわかっている。このため、モルフォリノオリゴマーは、アンチセンス分子の重要な新しいクラスを表す。本発明のオリゴマーは、標準的な当該技術において既知の方法で合成し得る。例えば、ホスホロチオアートオリゴマーは、Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．による（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６，（３２０９〜３０２１）に記載の方法で合成し得る。メチルホスホナートオリゴマーは、制御された細孔ガラスポリマー支持体を用いて調製され得る（Ｓａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）米国科学アカデミー紀要８５、７４４８〜７４５１）。モルフォリノオリゴマーは、ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒによる米国特許第５，２１７，８６６号および第５，１８５，４４４号に記載の方法で合成し得る。

阻害、具体的に、一過性阻害は、タンパク質レベルで阻害剤によって達成することもできる。その典型的な例として、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体に対する抗体、または、１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する抗体がある。

「抗体」という用語は、ＮＫＧ２Ｄ受容体、ＮＫＧ２Ｄリガンドまたはその機能性誘導体に対して特異的であることを特徴とする抗体に関し、前記抗体は、モノクローナル抗体；または、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）または一本鎖Ｆｖ型のその抗原結合フラグメント、または、それに由来する組み換え抗体であることが好ましい。本発明のこれら抗体（標的タンパク質に対して調製された特異的ポリクローナル抗血清やその機能性誘導体を含む）は、他のタンパク質に対する交差反応性を有しない。本発明のモノクローナル抗体は、例えば、古典的な方法で、動物、具体的には、標的タンパク質またはその機能性誘導体に対して免疫化されたマウスやラットの脾細胞および骨髄腫細胞株の細胞から形成されやすく、動物を免疫化するのに最初に用いた標的タンパク質またはその機能性誘導体を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの能力によって選択されるハイブリドーマによって産生することができる。本発明のこの実施形態に係るモノクローナル抗体は、Ｈ鎖およびＬ鎖をコードするマウスおよび／またはヒトゲノムＤＮＡ配列またはＨ鎖およびＬ鎖をコードするｃＤＮＡクローンから逸脱した、組み換えＤＮＡ技術を用いて作成されたマウスモノクローナル抗体をヒト化したものであってもよい。あるいは、本発明のこの実施形態に係るモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体であってもよい。このようなヒトモノクローナ抗体は、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３６０５に記載の重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスのヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）再増殖により、または、米国特許第５，５４５，８０６号に記載のヒト抗体の産生が可能な遺伝子導入非ヒト動物を使って調整される。また、これらモノクローナル抗体に由来するフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２およびｓｃＦｖ（「一本鎖可変フラグメント」）は、本来の結合特性を保持するのであれば、本発明の一部を形成する。このようなフラグメントは、通常、例えば、パパイン、ペプシン、または、他のプロテアーゼによる抗体の酵素消化によって生成される。モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、様々な用途のために改変できることが当業者に知られている。本発明に関与する抗体は、酵素型、蛍光型または放射性型の適切な標識で標識することができる。特定の実施形態では、標的タンパク質、または、その機能性フラグメントに対する前記抗体は、ラクダ由来である。ラクダ抗体は、ＷＯ９４／２５５９１、ＷＯ９４／０４６７８およびＷＯ９７／４９８０５に十分に記載されている。

タンパク質レベルでのＮＫＧ２Ｄシグナル伝達の他の阻害剤としては、限定されるものではないが、ＮＫＧ２Ｄリガンドのペプチド阻害剤、キメラ受容体のペプチド阻害剤、ＮＫＧ２Ｄリガンドのペプチドアプタマー（Ｔｏｍａｉ ｅｔ ａｌ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００６）阻害剤、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体のＮＫＧ２Ｄリガンドのペプチドアプタマー、およびタンパク質干渉剤やＰｅｐｔ−ｌｎｓ（商標）が挙げられ、これらは、ＷＯ２００７／０７１７８９やＷＯ２０１２／１２３４１９に記載されており、その内容を参照により本明細書に援用するものとする。

タンパク質レベルの別の阻害方法は、分泌輸送を干渉することである。これにより、受容体および／またはリガンドが細胞膜に輸送されない。典型的には、これは一時的な阻害の形態であり、細胞に適切なシグナルが与えられると、正常な細胞位置に戻すことができる。この原理に基づいた方法の一例として、ＲＵＳＨ（選択的フックを用いた保持）システム（Ｂｏｎｃｏｍｐａｉｎ ｅｔ ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ２０１２およびＷＯ２０１０１４２７８５）が挙げられる。これは、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体の一過性阻害を特に想定している。

小分子阻害剤（例えば、小有機分子）および他の薬物候補は、例えば、組み合わせ産物および天然産物ライブラリから得ることができる。

機能性ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達の一過性阻害について、特に想定されるのは、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体を介した下流シグナルの阻害である。観察されたフラトリサイドの重要な部分は、ＮＫＧ２Ｄ／ＤＡＰ１０複合体の主要なシグナル伝達経路であるＮＫＧ２Ｄ誘導性ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路を介して媒介されることが本明細書において実証された。このため、ＰＩ３Ｋシグナル伝達の阻害は、リガンド受容体結合の機能的効果を減少させるため、事実上、ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達の機能阻害である。よって、下流シグナル伝達の一過性阻害は、ＰＩ３Ｋシグナル伝達の一過性阻害によって達成することができる。阻害剤の例として、市販のＰＩ３Ｋ阻害剤が挙げられる。特に想定される阻害剤の１つとして、広範囲のＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２がある。特に想定される他の阻害剤は、Ｃａｌ１０１（イデラリシブ）である。その他、例えば、コパンリシブ、タセリシブ、ブパルリシブ、デュベリシブ、アルペリシブおよびアンブラリシブが例示される。

本明細書に記載の方法は、ＮＫＧ２Ｄ発現する免疫細胞の製造中に適用可能である。典型的には、細胞が養子移植のために調製または培養されると、免疫細胞の製造が起こる。これは、自己由来養子移植（被検体が、修飾および／または増殖された自身の細胞を受け取る）、または、同種異系由来養子移植（被検体が、異なる個体から細胞を受け取る）で有り得る。

養子療法には多くの異なる種類の免疫細胞が使われるため、本明細書に記載の方法でも使われることが想定される。免疫細胞としては、限定されるものではないが、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、リンパ球、幹細胞、ｉＰＳＣが挙げられる。後者の２つは免疫細胞ではないが、免疫療法のための養子細胞移植に使うことができる（例えば、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ、Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ２０１４；Ｔｈｅｍｅｌｉ ｅｔ ａｌ、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ２０１５参照）。典型的には、製造は、幹細胞またはｉＰＳＣで始まる（または免疫細胞からｉＰＳＣへの脱分化工程で始まることもある）が、製造には、投与前に免疫細胞に分化する工程が必然的に伴う。本発明の方法は、製造プロセス（すなわち、投与前の工程）に関するため、本明細書では、養子移植のための免疫細胞の製造に使われる幹細胞およびｉＰＳＣｓは、免疫細胞であるとみなされる。特定の実施形態によれば、当該方法で想定される幹細胞は、ヒト胚の破壊工程に関与しない。

本発明の方法で使われる細胞として、Ｔ細胞およびＮＫ細胞が特に想定される。

さらなる態様によれば、フラトリサイドが減少および／または防止される遺伝子操作された免疫細胞が提供される。これら細胞は、例えば、ＮＫＧ２Ｄリガンドのノックアウトを介した細胞内のＮＫＧ２Ｄシグナル伝達の機能阻害、ＮＫＧ２Ｄリガンドの永続的または一過性阻害、または、キメラ受容体の一過性阻害（例えば、一過性阻害剤の発現、阻害剤の一過性発現、または、受容体やリガンドの一時的な保持による一過性阻害）によって特徴付けられる。

このため、これら細胞は、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体をコードする核酸分子と、以下の少なくとも１つとを含む：
‐不活性化するように遺伝子操作されたＮＫＧ２Ｄリガンドをコードする１つ以上の内在性遺伝子；
‐キメラＮＫＧ２Ｄ受容体および／または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する１つ以上の阻害剤；
‐キメラＮＫＧ２Ｄ受容体および／または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに融合される結合タグ。

ＲＵＳＨ（選択的フックを用いた保持）システム（Ｂｏｎｃｏｍｐａｉｎ ｅｔ ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１２およびＷＯ２０１０１４２７８５）のような方法では、結合タグ（例えば、ストレプトアビジン）を使うことができ、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体の一過性阻害が特に想定される。

キメラＮＫＧ２Ｄ受容体をコードする核酸分子と、以下の少なくとも１つとを含む細胞が特に想定される：
‐不活性化するように遺伝子操作されたＮＫＧ２Ｄリガンドをコードする１つ以上の内在性遺伝子；
‐キメラＮＫＧ２Ｄ受容体および／または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する１つ以上の阻害剤。

内在性遺伝子の不活性化は、上述したように、例えば、ゲノム編集、遺伝子操作されたヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＭｅｇａＴＡＬヌクレアーゼなど）、または他の適切な方法（限定されるものではないがＣｒｅ／ＬｏｘまたはＦｌｐ／ＦＲＴに基づいたシステムを含む）を使って行うことができる。必須条件ではないが、ほとんどの場合、不活性化された内在性遺伝子は、永続的に不活性状態になる（すなわち、不活性化の明らかな逆転がない）。この理由により、この方法は、（免疫細胞が、免疫療法の効果を発揮するのに必要としない）リガンドの不活性化には特に適しているが、ＮＫＧ２Ｄ受容体の不活性化にはあまり適していない（免疫療法では受容体の機能が必要となるため）。

阻害剤を含む細胞は、典型的には、阻害剤をコードするプラスミドを含む。これが、阻害剤が細胞に確実に含まれるようにする最も便利な方法である。このため、阻害剤はプラスミドから発現できることが特に想定される。これは、抗体またはペプチドで行うことができるが、最も特に想定されるのは、核酸阻害剤、例えば、ＲＮＡ干渉技術（ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなど）である。阻害剤（ＲＮＡ阻害剤など）は、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体および／または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドを対象とすることができる。これらＮＫＧ２Ｄリガンドは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５およびＵＬＢＰ６からなる群から選択される。

細胞は、そのまま、または、組成物として提供され得る。提供され得る組成物は、（外部）阻害剤が細胞に添加されることによりＮＫＧ２Ｄシグナル伝達が機能的に阻害される―細胞によって取り込まれる、または、その阻害機能を細胞外で行う。このため、さらなる態様によれば、組成物は、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体を発現する免疫細胞と、さらに、阻害剤とを含む。これら細胞は、不活性化するように遺伝子操作されたＮＫＧ２Ｄリガンドをコードする１つ以上の内在性遺伝子および／または細胞において核酸としてコードされるキメラＮＫＧ２Ｄ受容体および／または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する１つ以上の阻害剤および／またはキメラＮＫＧ２Ｄ受容体および／または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに融合される結合タグ（上記で詳述した「内部阻害剤」）を含み得る。

追加的または代替的に、組成物は、（細胞において核酸としてコードされない）キメラＮＫＧ２Ｄ受容体および／または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する１つ以上の阻害剤および／またはキメラＮＫＧ２Ｄ受容体の下流シグナル伝達の阻害剤（「外部阻害剤」）を含み得る。

キメラＮＫＧ２Ｄ受容体および／または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する阻害剤としては、これらタンパク質に対する抗体が特に想定される。キメラＮＫＧ２Ｄ受容体の下流シグナル伝達の阻害剤としては、ＰＩ３Ｋ阻害剤が特に想定される。

いずれの場合も、阻害剤は細胞内に含まれ得る。または、組成物は、別個の構成成分（すなわち細胞外）として、免疫細胞と、阻害剤とを含む。但し、組成物は別個の構成成分として提供可能であるが、阻害剤が、免疫細胞によって取り込まれ得る。例えば、ＰＩ３Ｋ阻害剤などの下流シグナル伝達の阻害剤は、大抵の場合、細胞によって容易に取り込まれる小分子である。抗体は、細胞によって取り込まれてもよく、取り込まれなくてもよいが、ＮＫＧ２Ｄ受容体とそのリガンドとの相互作用が、細胞外で発生するため、細胞の取り込みは、阻害の必須条件ではない（例えば、競合阻害剤は細胞外で機能し得るため）。

さらなる態様によれば、本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞または組成物は、医薬品として使用するために提供される。またさらなる態様によれば、本明細書に記載の遺伝子操作された免疫細胞または組成物は、ＮＫＧ２Ｄリガンド発現により特徴付けられる疾患の治療に使用するために提供される。ＭＩＣＡやＭＩＣＢなどのＮＫＧ２ＤリガンドまたはＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰファミリーのものは、誘導性自己抗原である、すなわち、異常な条件下または細胞ストレスの条件下、最も具体的には、ストレスを受けた（例えば、炎症を起こした）、変換されたまたは感染した細胞で発現される細胞リガンドであることが、多くの文書で立証されている。このため、細胞または組成物は、炎症性疾患、癌、または、感染症（例えば、ウィルス性、細菌性、真菌性感染症）から選択される疾患の治療に使用するために提供される。細胞治療法はかなり高額であるため、生命を脅かす疾患が特に想定される。このため、最も具体的には、本明細書に記載の細胞および組成物は、癌治療に使用するために提供される。原則的に、すべての癌を治療することができる。限定されるものではないが、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、食道癌、膠芽細胞腫、頭部および頸部癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、胃癌および甲状腺癌が含まれる。最も特に想定される癌として、白血病（ＡＭＬを含む）、多発性骨髄腫、膀胱癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌および膵臓癌が挙げられる。これら７つの癌は、典型的に、高いＮＫＧ２Ｄリガンド発現を有するからである。

「細胞および組成物は、治療に使用するために提供される」は、これら細胞または組成物を、それ粗必要とする被検体に投与する工程を備えた疾患治療方法を提供がされるというのと同じ意味である。よって、細胞を投与することを備えた、炎症性疾患、癌または感染症を治療する方法が提供される。

特に想定されるのは、遺伝子操作された免疫細胞を被検体に投与する工程を備えた、それを必要とする被検体における癌の治療方法であって、前記免疫細胞は、非天然キメラＮＫＧ２Ｄ受容体をコードする核酸分子と、以下の少なくとも１つとを含有する、癌の治療方法である：
‐不活性化するように遺伝子操作されたＮＫＧ２Ｄリガンドをコードする１つ以上の内在性遺伝子；
‐キメラＮＫＧ２Ｄ受容体および／または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する１つ以上の阻害剤；
‐キメラＮＫＧ２Ｄ受容体および／または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに融合される結合タグ。

より一層特に想定されるのは、遺伝子操作された免疫細胞を被検体に投与する工程を備えた、それを必要とする被検体における癌の治療方法であって、前記免疫細胞は、非天然キメラＮＫＧ２Ｄ受容体をコードする核酸分子と、以下の少なくとも１つとを含む、癌の治療方法である：
‐不活性化するように遺伝子操作されたＮＫＧ２Ｄリガンドをコードする１つ以上の内在性遺伝子；
‐キメラＮＫＧ２Ｄ受容体および／または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する１つ以上の阻害剤。

同様に、組成物を被検体に投与することを備えた、それを必要とする被検体における癌の治療方法であって、前記組成物は、キメラＮＫＧ２Ｄ受容体を発現する免疫細胞と、以下の１つ以上とを含む、癌の治療方法が提供される：
‐不活性化するように遺伝子操作されたＮＫＧ２Ｄリガンドをコードする１つ以上の内在性遺伝子；および／または
‐細胞において核酸としてコードされるキメラＮＫＧ２Ｄ受容体および／または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する１つ以上の阻害剤、および／または
‐キメラＮＫＧ２Ｄ受容体および／または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに融合された結合タグ； および／または
‐（細胞において核酸としてコードされない）キメラＮＫＧ２Ｄ受容体および／または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する１つ以上の阻害剤； および／または
‐キメラＮＫＧ２Ｄ受容体の下流シグナル伝達の阻害剤。

免疫細胞は、この細胞が投与される被検体の自己由来であってもよく、または、同種異系由来、すなわち、別の被検体に由来してもよい。

本発明に係る細胞および方法について、特定の実施形態、特定の構成、ならびに物質および／または分子について説明したが、本発明の範囲および趣旨を逸脱することなく、形態および詳細において様々な変更や変形が可能である。以下の実施例は、特定の実施形態をさらに説明するために提示するのであって、本願を限定解釈するものではない。本願は、請求項の範囲によってのみ限定される。

実施例
序文
Ｔ細胞で発現可能なＮＫＧ２Ｄリガンドが多数存在すると考えると、すべてのリガンド発現を排除するための遺伝子編集が、最も効率的な選択肢であると考えられなかった。従って、ＮＫＧ２Ｄ標的ＣＡＲＴ細胞治療の送達を促進するため、フラトリサイド制御の代替案が検討されている。シグナル伝達阻害剤または抗体に基づいたアプローチを使って、２つの異なるアプローチが探索された。いずれも、程度は異なるが、フラトリサイドの阻害がもたらされた。

ホスホイノシトール―３―キナーゼ阻害剤（ＬＹ２９４００２）の含有は、フラトリサイド効果を鈍らせ、ＮＫＲ―２ＣＡＲＴ細胞を生成する一般的な手段を提供した。ＰＩ３Ｋ阻害剤の使用により、ＮＫＲ―２駆動型分化能がさらに高められ、細胞が記憶表現型にシフトした。ＣＡＲ自体の抗体遮断を伴う標的特異的アプローチは、分化能の減少およびＣＤ４／ＣＤ８比の変化と共に、ＮＫＲ―２ＣＡＲＴ細胞収率のさらなる向上を誘発した。これら因子は、遮断Ａｂの添加を遅らせることにより、分化能を高め、細胞表現型を変化させるためにｉｎ ｖｉｔｒｏでうまく偏らせることができた。アプローチの違いにもかかわらず、阻害剤または抗体に基づいたアプローチにより、非常に類似した表現型およびｉｎ ｖｉｖｏ活性を有するＮＫＲ―２ＣＡＲＴ細胞が生成された。最後に、すべてのＮＫＧ２Ｄリガンドを阻害するのは現実的ではなかったが、一過性（ｓｈＲＮＡ）または永続的（Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ）アプローチを使って２つの最も重要なリガンドを阻害した際も、非常に類似した表現型を有するＮＫＲ―２ ＣＡＲＴ細胞が生成された。

これらの結果は、標的リガンドの自己発現が、制限因子となっているＴ細胞治療法の開発を可能にする異なるアプローチを用いることにより、標的駆動型フラトリサイドの解消が可能であることを示している。

材料および方法
抗体およびフローサイトメトリー
標準プロトコルに従い、蛍光色素標識したＣＤ３（ＢＤ、３４５７６６）、ＣＤ４（ＢＤ、３４５８０９）、ＣＤ８（ＢＤ、３４５７７２）、ＣＤ３１４（ＢＤ、５５８０７１）、ＣＤ４５ＲＡ（ＢＤ、５５０８５５）、ＣＤ６２Ｌ（ＢＤ、５５５５４４）、ＣＤ２７９（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１２―２７９９―４２）、ＣＤ１９（ＢＤ、３４５７９１、ＣＤ２２３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、２５―２２３９―４１）、ＭＩＣＡ／Ｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＦＡＢ１３００１Ｇ―１００）、ＭＩＣＢ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＦＡＢ１５９９Ｇ）、ＵＬＢＰ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＦＡＢ１３８０Ｃ）、ＵＬＢＰ２／５／６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＦＡＢ１２９８Ａ）、ＵＬＢＰ３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＦＡＢ１５１７Ｐ）、ＵＬＢＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ：ＦＡＢ６２８５Ａ）および対応するアイソタイプで細胞を染色した。簡単に説明すると、細胞を採取し、５％のヒト血清アルブミン（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ、６８２０９―６３３―０２）と０．０１％のＮａＮ３（Ｓｉｇｍａ、Ｓ２００２）とが添加されたＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ１２８５８０１）含有緩衝液において再懸濁させた。細胞を抗体と４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ６ＨＴサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で分析した。実験で使用する前に、抗体をすべて滴定した。ＦＳＣ／ＳＳＣに基づいて生存細胞を選択した。すべての例において、未標識コントロールおよびアイソタイプ・コントロールを用いた。分析は、ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０を用いて行った。

プラスミドおよびベクターの産生
先に説明した方法（Ｚｈａｎｇ、Ｂａｒｂｅｒ、＆ Ｓｅｎｔｍａｎ、２００６）でキメラＮＫＧ２Ｄ（ｃｈＮＫＧ２Ｄ）構築物を作製し、Ｎｃｏｌ制限部位とＸｈｏｌ制限部位の間のＭｏ―ＭＬＶベースのオンコレトロウイルスベクターＳＦＧにクローニングした。ｐＳＦＧ ＧＦＰプラスミドおよびｐＳＦＧ ｈｔＣＤ１９．１（ヒトＣＤ１９（ｔＣＤ１９）の切断型をコードする）は、Ｃｅｌｄａｒａ Ｍｅｄｉｃａｌ ＬＬＣ（レバノン、ニューハンプシャー州、米国）からの贈答物であった。ＧＰ２―２９３パッケージング細胞を、ＶＳＶ―Ｇ エンベローププラスミドと共に、一過性的にトランスフェクションした。ＰＧ２―２９３細胞で生成したレトロウイルス懸濁液を用いて、ＰＧ１３細胞をスピン形質導入し、安定したプロデューサー細胞株を得た。ヒトＴリンパ球を形質導入するのに用いたベクター粒子は、培養がコンフルエントな状態に達した後、ＰＧ１３安定プロデューサー細胞から採取した。Ｒｅｔｒｏ―ＸＴＭ ｑＲＴ―ＰＣＲ滴定キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＬ ６３１４５３）を用いてベクター力価を測定した。

ＮＫＧ２Ｄ―ＣＡＲＴ細胞の産生
標準的な手順に従い、フィコール密度勾配（ＶＷＲ、１７―５４４２―０３）により、健常ドナー（ＩｍｍｕｎｅＨｅａｌｔｈ、ＣＨＵ、Ｔｉｖｏｌｉ）の全血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。簡単に説明すると、全血をＤＰＢＳで３回希釈し、５０ｍｌの試験管内のフィコール層に慎重に加えた。試験管を５００ｇで遠心分離し、中間層を慎重に除去した。続いて、ＤＰＢＳでＰＢＭＣを３回洗浄し、採取し、続いて、５％のヒト血清（Ａｃｃｅｓｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、５１５―ＨＩ）を含有し、４０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１７０―０７６―１２４）と１００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ―２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１７０―０７６―１４６）が添加されたＸ―Ｖｉｖｏ１５培地（Ｗｅｓｔｂｕｒｇ、ＢＥ０２―０６１Ｑ）で活性化させた。３７℃で５％ＣＯ２に維持されたインキュベーターで細胞を２日間インキュベートした。続いて、８μｇ／ｍｌのレトロネクチン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔ１００Ｂ）でコーティングした２４ウェル（１×１０^６細胞／ウェル）プレートで、細胞を採取し、異なるウィルスベクターで形質導入し、２日間インキュベートした。その後、２４ウェルプレートから細胞を採取し、ＨＢＳＳ（Ｗｅｓｔｂｕｒｇ、ＢＥ１０―５４３Ｆ）で洗浄し、Ｇ―Ｒｅｘ容器（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、８００４０Ｓ）に移し、さらに４日間、血清とＩＬ―２とを含有する完全Ｘ―Ｖｉｖｏ１５において、または、本文に記載されているように増殖段階に入れた。増殖段階の終わりに、細胞を採取して適宜用いた。

細胞株および培養試薬
ＡＴＣＣから慢性骨髄性白血病癌細胞株Ｋ５６２および膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ―１を購入し、使用時まで、１７８ １０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、１６１４００７１）および１％ ペニシリン／ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１５１４０１２２）をそれぞれ含有するＩＭＤＭ（Ｗｅｓｔｂｕｒｇ、ＬＯ ＢＥ１２―７２２Ｆ）またはＤＭＥＭ（Ｗｅｓｔｂｕｒｇ、ＬＯ ＢＥ１２―６０４Ｆ）に保存した。ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２は、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓ１１０５）から購入した。ＮＫＧ２Ｄまたは対応するアイソタイプに対する阻害抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（阻害抗体（ＵｌｔｒａｌｅａｆＣＤ３１４）クローン：１Ｄ１１、ＩｍＴｅｃ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＮＶ、３２０８１４）から購入した。

細胞溶解アッセイ
５％のヒト血清（ＨＳ）を含有するフェノールレッド非含有Ｘ―Ｖｉｖｏ１５において、接着ＰＡＮＣ―１細胞を、解凍されたＮＫＲ―２Ｔ細胞またはｔＣＤ１９形質導入細胞の存在下または非存在下、１：１の比率で、フラットボトムの９６ウェルプレートで２０時間培養した。Ｔ細胞を洗浄し、残りの接着しているＰＡＮＣ―１細胞を、アラマーブルー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＤＡＬ１０２５）で４時間標識した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、５３０ｎｍの蛍光で生存細胞を測定し、相対細胞溶解活性率を算出した。

サイトカイン放出アッセイ
新鮮なＮＫＲ―２Ｔ細胞および／または対照ｔＣＤ１９細胞を、５％のＨＳを含有するＸ―Ｖｉｖｏ１５において、１：１の比率でＫ５６２またはＰＡＮＣ―１細胞と、インキュベートした。２４時間インキュベートした後、上清を回収し、製造業者のプロトコルに従い、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＳＩＦ５０）でＩＦＮ―γを測定した。ポジティブコントロールとして、細胞を、ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ８１３９―５ＭＧ）とイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉ０６３４―１ＭＧ）とで活性化した。活性化のバックグラウンドレベルを評価するために、細胞は刺激を受けなかった。

抗体阻害アッセイ
ＮＫＲ―２Ｔ細胞を、１μｇ／ｍＬのＮＫＧ２Ｄ遮断抗体、アイソタイプ・コントロールまたは無抗体で２４時間インキュベートし、続いて、ＮＫＲ―２Ｔ細胞が媒介するＩＦＮ―γの分泌を測定した。同様に、抗体の存在下でＮＫＲ―２細胞を癌細胞と共培養し、サイトカイン分泌を測定した。

ＲＮＡ抽出およびｑＰＣＲ法
４０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３とＩＬ―２（１００ＩＵ／ｍＬ）で２日間ＰＢＭＣを刺激し、４０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３とＩＬ―２（１００ＩＵ／ｍＬ）でさらに２日間形質導入し、培養し、その後、本文で詳述されているようにＩＬ―２（１００ＩＵ／ｍＬ）の存在下で８日目または１０日目まで増殖させた。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、７４１０４）を用いて２日ごとに全ＲＮＡを単離した単離した。ＮＫＧ２Ｄリガンド用に予め設計されたＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（Ｈｓ０４１８７７５２＿ｍＨ、Ｈｓ０１０２６６４２＿ｍｌ、Ｈｓ００６０７６０９＿ｍＨ、Ｈｓ００９０６２６２＿ｍｌ、Ｈｓ００７４１２８６＿ｍｌ、Ｈｓ０１５８４１１１＿ｍＨ、Ｈｓ０４１９４６７１＿ｓｌ、Ｈｓ００３６０９４１＿ｍｌ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０ＲＮＡ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ、０４９９１８８５００１）を用いて、定量ＰＣＲ反応を行った。相対発現は、社内設計されたプライマ―（５’―ＧＡＣＧＧＣＧＡＧＣＣＣＴＴＧＧ―３’および５’―Ｇ Ｃ ＡＣＧ Ａ ＡＡ ＡＴＴＴＴ ＣＴＧ ＣＴＧＴ ＣＴＴ―３’）およびプローブ（５’ＴＥＸ６１５―ＴＣＴＣＣＴＴＴＧＡＧＣＴＧＴＴＴＧＣＡＧＡＣＡＡＧＧＴ―３’ＢＨＱ（商標））を用いて、ハウスキーピング遺伝子シクロフィリンに基づいた。結果は、０日目（２＾―ΔΔＣＴとして算出）と比較した誘導倍率で示されている。すべての遺伝子発現アッセイは、リガンドを発現することで知られている癌細胞株で行った。

動物実験
すべてのｉｎ ｖｉｖｏ実験をＶｏｘｃａｎ（Ｍａｒｃｙ Ｉ’Ｅｔｏｉｌｅ、フランス）で行った。簡単に説明すると、腫瘍を注入する２４時間前に、ＮＯＤ／ｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスを照射した（１日目）。０日目に、マウス一匹あたり５×１０^６ＴＨＰ―ｌｕｃ―ＧＦＰ細胞を含有するＰＢＳ２００ｍｌのＩＶ注入によってＴＨＰ―ｌ―ｌｕｃ―ＧＦＰ細胞を生着させた。７日目に、ＴＨＰ―ｌ―ｌｕｃ―ＧＦＰ陽性マウスを次の４つの治療グループに分けた：
（ｉ）ビヒクル（２００ｍｌのＨＢＳＳ）のＩＶ注入を１回受けた対照
（ｉｉ）１０×１０^６Ｍｏｃｋ ｔＣＤ１９Ｔ細胞（２００μＬ）のＩＶ注入を１回受けたＭｏｃｋ ｔＣＤ１９
（ｉｉｉ）１０×１０^６ＮＫＲ―２―ＬＹ Ｔ細胞（２００ｍｌ）の注入を１回受けたＮＫＲ―２ＬＹ
（ｉｖ）１０×１０^６ＮＫＲ―２―最適化抗体（２００ｍｌ）のＩＶ注入を１回受けたＮＫＲ―２―最適化Ａｂ。

４日目、８日目、１５日目、２２日目、２８日目および３５日目に、生物発光イメージングで腫瘍の進行を評価した。同様に、６日目から１週間に３回、各動物の体重を測定した。

統計分析
可能な場合、対応のないｔ検定、対応のあるｔ検定、または、ノンパラメトリックなマン・ホイットニーのＵ検定を用いて、統計的有意性を評価した。ｐ＜０．０５の場合、統計的有意性があると判断した。

《実施例１》
ＮＫＲ―２ＣＡＲＴ細胞は、遺伝子操作されたＴ細胞集団の表現型および増殖を駆動するフラトリサイドを起こす。

形質導入およびｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の後、フラトリサイドを制御する方法がない場合、ＮＫＲ―２Ｔ細胞集団は、対照ベクター（切断型ＣＤ１９（ｔＣＤ１９）、図１Ａ）で形質導入されたＴ細胞と比較して、主にＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット組成を示している。ＮＫＧ２Ｄ発現は、ＮＫＲ―２Ｔ細胞に限らず、対照ｔＣＤ１９Ｔ細胞でも明らかに見られたが、内在性ＮＫＧ２Ｄの結合により、ＣＡＲＴ細胞（３２）の治療反応を送達できない。しかし、ＮＫＧ２Ｄの相対的な細胞表面発現は、ＣＡＲ構築物によるＴ細胞の形質導入を示すＮＫＲ―２Ｔ細胞集団において非常に増加した（図１Ｂ）。ＮＫＧ２Ｄ（ＣＤ３１４）の平均蛍光強度は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセットのいずれにおいても、ＮＫＲ―２Ｔ細胞集団で著しく高く、両サブセットにおいてＣＡＲの発現が確認された（図２Ａ〜図２Ｃ）。

興味深いことに、エフェクター細胞表現型の増加を示すｔＣＤ１９対照Ｔ細胞集団と比較した場合、ＮＫＲ―２Ｔ細胞集団は、ナイーブ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋のＣＤ６２Ｌ＋細胞の二重陽性により定義される）の相対頻度の減少およびＣＤ２７９（ＰＤ―１）とＣＤ２２３（Ｌａｇ―３）の頻度の増加を示した（図１Ｃ〜図１Ｄ）。ＮＫＲ―２Ｔ細胞は、癌細胞株と共培養されると、高レベルの標的細胞誘導性ＩＦＮ―γ分泌（図３Ａ）および細胞溶解活性（図３Ｂ）を示し、ＮＫＲ―２Ｔ細胞の機能性が確認された。しかし、培養中および採取時のＮＫＲ―２Ｔ細胞の収率／増殖率（図３Ｃ）および生存率（データは図示せず）は、ｔＣＤ１９ 対照Ｔ細胞と比較して、一貫して減少した。

ＮＫＧ２Ｄ受容体結合の結果、ナチュラルキラー細胞のフラトリサイドが発生し得ることが知られているが（２３、２４）、マイトジェン活性化中のＴ細胞のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現が文書で立証されている（２２）。これと共に、ＮＫＲ―２Ｔ細胞のフラトリサイドは形質導入の後に起こり、これにより、低い細胞収率と生存率、ＣＤ４／ＣＤ８比の偏りおよびエフェクターメモリー分化の増大がもたらされたのかもしれないという疑問が提起された。これを検証するため、ドナー由来のＴ細胞を、ｅＧＦＰ発現ベクターで形質導入し、同じドナー由来のＮＫＲ―２Ｔ細胞と混合し、通常のＴ細胞殺傷が起こったかどうか調べた。２４時間後、ＮＫＲ―２Ｔ細胞共培養においてｅＧＦＰ Ｔ細胞の明らかな減少があり、ＮＫＲ―２Ｔ細胞による自己由来Ｔ細胞の標的殺害が暗示された（図３Ｄ）。

活性化Ｔ細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドの発現プロファイルを理解するために、形質導入せず活性化させるＴ細胞源として、３人の健常ドナーを使ってｑＰＣＲ分析を行い、ＮＫＧ２ＤリガンドのｍＲＮＡ発現プロファイルの動態を検査した（図３Ｅ）。Ｔ細胞活性化の２日以内に、ＭＩＣＡおよびＵＬＢＰ２ｍＲＮＡレベルにおいて急速な増加が検出された。しかし、さらなる２日以内では、ＵＬＢＰ２ｍＲＮＡは高レベルのままであったが、ＭＩＣＡは、急速にベースラインまで減少した。ＵＬＢＰ３のｍＲＮＡは、経時的に徐々に増加したが、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ１またはＵＬＢＰ６では、転写の相対的な増加はなかった。逆に、ＵＬＢＰ４のｍＲＮＡは、４日目に、わずかに増加したが、その後、基準レベルまで再度減少した。細胞表面のタンパク質レベルで、２日目にＭＩＣＡが一過性的に存在し、ＭＩＣＡ／Ｂが、対応するｍＲＮＡと同様の発現パターンになり、その後、減退した（図３Ｆ）。残念ながら、適切な抗体が入手できなかったため、個々のＵＬＢＰ２／５および６タンパク質を検出することはできなかったが、３つのファミリーメンバーすべてを認識する抗体で観察された免疫反応性は、２日目後に唯一増加したｍＲＮＡ発現プロファイルに基づいたＵＬＢＰ２によるものである可能性が高い。ｍＲＮＡ２９５レベルで高度に誘導されたが、細胞表面のＵＬＢＰ３は検出できなかった。ＵＬＢＰ４＋細胞は、６日目までに陽性のピークに達し、８日目までにベースラインに戻ったが、ｍＲＮＡ発現のパターンの２日遅れであった（図３Ｆ）。これら監察結果を、平均蛍光強度の並行動態に反映した（表１）。

表１：製造プロセス後の３名の異なるドナーすべてのリガンドの平均蛍光強度（ＭＦＩ）と、その対応ＳＤ（０、２、４、６および８日目にサンプルを分析）

まとめると、これらデータは、発現の動態は異なるが、タンパク質レベルで優勢になるＮＫＧ２ＤリガンドであるＭＩＣＡ、ＵＬＢＰ４および推定的にＵＬＢＰ２でマイトジェン活性化した後のＮＫＧ２ＤリガンドのＴ細胞調節発現を暗示している。

《実施例２》
ＰＩ３Ｋ阻害は、凍結保存時のＮＫＲ―２Ｔ細胞の生存率を向上させ、ＮＫＲ―２抗原特異的サイトカイン産生の増加および記憶表現型の増加を駆動する。

リガンドが結合すると、ＮＫＧ２Ｄおよびそれに伴うＤＡＰ１０は、ＣＤ２８と同じようにＰＩ３Ｋ経路を介したシグナル形質導入を開始する（２５、２６）。このため、我々は、ＰＩ３Ｋシグナル伝達の阻害が、Ｔ細胞培養中のＮＫＲ―２媒介性フラトリサイドを妨げることができるかどうか疑問を抱いた。この目的のため、ＮＫＲ―２産生の形質導入および増殖段階に濃度高めたＬＹ２９４００２（広義に、ＰＩ３Ｋ阻害剤）を添加した。

ＬＹ２９４００２の添加によって、いくつかの観察結果が得られた。最初に、ＮＫＲ―２Ｔ細胞上のＮＫＧ２Ｄの細胞表面発現は、投与に依存して減少し、１０μＭで対照ｔＣＤ１９Ｔ細胞のレベルに達した（図４Ａおよび図５）。培養からＬＹを除去すると、ＮＫＧ２の発現が、未処理ＮＫＲ―２Ｔ細胞（データは図示せず）のレベルまで増加したため、この減少は、さらに可逆的であった。しかし、阻害剤による細胞収率の向上は認められなかったため、これは、培養中のフラトリサイドが完全に行われなかった、または、ＰＩ３Ｋ阻害剤が増殖に悪影響を及ぼしたことを示唆している（図３Ｂ）。ＬＹ２９４００２が、抗増殖効果を有するかどうか評価するために、培養中に、対照ｔＣＤ１９Ｔ細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤で処理した。これら対照Ｔ細胞の増殖能力において、未処理ｔＣＤ１９細胞と比較して、明らかな減少が観察された（図６）。

予想通り、ＰＩ３Ｋ阻害剤を用いて製造したＮＫＲ―２Ｔ細胞は、凍結保存した後および４℃で４８時間保存した場合のいずれにおいても細胞生存率の増加を示した（図３Ｃ、図３Ｄ）。ＰＩ３Ｋ阻害剤を用いて産生したＮＫＲ―２Ｔ細胞は、ＬＹ２９４００２の投与に依存して、大量のＩＦＮ―γを産生した（図７Ａ）。最後に、ＬＹ２９４００２で培養したＮＫＲ―２Ｔ細胞も、Ｔ細胞の記憶表現型を調節するために阻害剤を用いた以前公開した研究（２７、２８）と一致して、ＣＤ６２Ｌ^＋／ＣＤ４５ＲＡ表現型が増加したように思われる。（図７Ｂ）

全体的に、ＰＩ３Ｋ阻害剤の添加には、治療用途に魅力的であると思われるＮＫＲ―２Ｔ細胞の生存率に有益な効果があった。

《実施例３》
抗体媒介性ＮＫＧ２Ｄの遮断は、ＮＫＲ―２ＣＡＲＴ細胞のフラトリサイドを防止する。

ＮＫＲ―２Ｔ細胞の培養中に抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（クローン１Ｄ１１）を含む初期実験により、培養終了時のＮＫＲ―２Ｔ細胞収率は、対照Ｔ細胞のものと同等である（ＮＫＲ―２Ｔ細胞では増殖率は２．６、これに対し、抗体遮断したＮＫＲ―２Ｔ細胞では増殖率は１３．８）ことがわかった（図８）。これにより、抗体遮断には、ＮＫＧ２Ｄ標的駆動型フラトリサイドを妨げる可能性があることが示唆された。用量滴定実験から、抗体濃度を２．５μｇ／ｍＬ以上にすることにより、ｔＣＤ１９Ｔ細胞３５８が、ＮＫＲ―２Ｔ細胞標的殺傷から保護されることがわかった（図４Ｅ）。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体も、標的細胞結合の間、完全にＩＦＮ―γ放出を効果的に遮断した（図４Ｆ）。これにより、ＮＫＲ―２Ｔ細胞の特異性が確認された。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を用いたフラトリサイドの効果的な遮断は、Ｔ細胞のフラトリサイドによるものと思われるＮＫＲ―２Ｔ細胞の産生中に観察されたＩＦＮ―γの放出が、遮断抗体の添加によって大幅に減少した（図４Ｇ）ことによってさらに裏付けられた。マウス遮断抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）による毒性を引き起こす可能性が潜在的にあるため、採取後、徹底的な洗浄工程を行った。ＩｇＧ ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリー実験により、採取（データは図示せず）後、上清または細胞表面で汚染抗体を検出できないことがわかった。ＡＤＣＣを評価するため、ＡＤＣＣの所見なしに、５μｇ／ｍＬのＡｂの存在下で、ＮＫ細胞を自己由来ＮＫＲ―２細胞と共培養した（データは図示せず）。これと共に、これらデータは、抗ＮＫＧ２Ｄ遮断抗体の添加により、ＮＫＲ―２Ｔ細胞ＣＡＲ駆動型フラトリサイドが制御されることを示している。

《実施例４》
抗体媒介性ＮＫＧ２Ｄの遮断およびＮＫＧ２Ｄシグナル伝達のＰＩ３Ｋ阻害は、ＮＫＲ―２発現細胞の製造において機能的に同等である。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＮＫＲ―２細胞増殖中におけるＡｂ遮断プロセスの適応により、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて同等の活性で収率が増加できた。

抗体を用いて産生されたＮＫＲ―２Ｔ細胞と、ＰＩ３Ｋ阻害剤を用いて産生したＮＫＲ―２Ｔとを比較したところ、異なる細胞溶解動態が示された。これは、Ａｂプロセスに伴うＴ細胞特性の変化を暗示している（図９Ａ）。この２つのプロセスを比較したところ、観察された主な差異は、ＣＤ４／ＣＤ８比であった。ＰＩ３Ｋ阻害剤を添加した場合、８日目に、ＣＤ８集団に一貫して偏った。興味深いことに、ＮＫＲ―２Ｔ細胞の遮断により、ＣＤ４＋集団が救済された。これは、観察された偏ったＣＤ４／ＣＤ８比が、フラトリサイドに依存していることを示唆している（図９Ｂ）。この比の差異に関する最も説得力のある説明として、ＣＤ４Ｔ細胞の増殖による比の相対的増加、または、ＣＤ８Ｔ細胞によるＣＤ４Ｔ細胞の除去が挙げられる。

我々は、ＰＩ３Ｋ阻害剤を用いて産生されたＮＫＲ―２Ｔ細胞の溶解作用の増大はＣＤ４／ＣＤ８比の低下によるものではないかという仮説を立てた。これに取り組むため、形質導入直後（４日目）ではなく６日目に遮断抗体を添加して遮断抗体プロセスを行った。この変更により、ＰＩ３Ｋ阻害剤を用いて産生した細胞と同様のＣＤ４／ＣＤ８比を示すＮＫＲ―２Ｔ細胞が産生され（図９Ｃ）、同時に、対照Ｔ細胞に匹敵する増殖率が維持された（図９Ｄ）。 続いて、活性化マーカーＣＤ２５および記憶表現型の発現などの特定のパラメータにおいて２つのプロセス間で軽微な差異（データは図示せず）があったにもかかわらず、機能性サイトカイン分泌および標的癌細胞に対するＮＫＲ―２Ｔ細胞の細胞溶解活性は、両プロセス間で同等であった（図９Ｅ、図９Ｆ）。

ＬＹおよびＡｂプロセスで生成されたＮＫＲ―２細胞が投与されたＮＯＤ ＳＣＩＤガンママウスを用いた事前のｉｎ ｖｉｖｏ実験では、確立された急性骨髄性白血病（ＴＨＰ―１）腫瘍モデル（生物発光により可視化された注入８日後；ｔＣＤ１９：５．７６Ｅ１０＋／―４．４６Ｅ１０；ＮＫＲ―２ＬＹ：７．１５Ｅ０８＋／―１．０１Ｅ０９；ＮＫＲ―２Ａｂ：６．４３Ｅ０８＋／―１．２５Ｅ０８；データは図示せず）において、同様の抗腫瘍活性が示された。Ｔｕｋｅｙ事後検定による一元配置分散分析法により、ｔＣＤ１９（ｐ＝０．０３）と比較して、ＬＹとｔＣＤ１９対照細胞（ｐ：０．０２）とＡｂ産生ＮＫＲ―２との間で著しい差異が認められた。ＬＹグループとＡｂグループとの間で差異は観察されなかった（ｐ＝０．９５）。加えて、２４時間後、ＮＫＲ―２ＬＹグループとＡｂグループの両方で同様の生着が観察され（ＬＹグループ：１．８３８＋／―１．０７％；Ａｂグループ：１．７９２＋／―０．５６％；データは図示せず）、短期間の生着ではこの２つのグループ間の著しい差異が検出できなかったことを示している。

まとめると、これら総合データから、適応遮断抗体プロセスで産生されたＮＫＲ―２Ｔ細胞は、ＰＩ３Ｋ阻害剤を使って産生した細胞に対して、同様の短期間生着および分化能を示すことがわかった。

ＮＫＲ２製造に対する効果は、ＰＩ３Ｋを介したものであり、特定の阻害剤によるものではない。

ＬＹ２９４００２の効果が実際にそのＰＩ３Ｋ阻害剤活性と関連しているのかどうかさらに確認するため、ウォルトマンニンおよびＣＡＬ―１０１（イデラリシブ）を含む、いくつかの他のＰＩ３Ｋ阻害剤を試験した。図１０に、ＣＡＬ―１０１の代表的なデータを示す。ＣＡＬ―１０１は、増殖率（図１０Ａ）および細胞生存率（Ｂ）の点で遮断抗体と同様に機能する。他のＰＩ３Ｋ阻害剤と同様に、細胞は、より多くのインターフェロンを産生するように思われる（図１０Ｃ）。これが、高い分化能に貢献しているのかもしれない。ＰＩ３Ｋ経路の下流阻害剤（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ阻害剤ＴＷＳ１１９やｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンなど）も試験した。得られた結果は同様で（データは図示せず）、ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達を阻害しない細胞と比較して増殖は増加するが、ＰＩ３Ｋ阻害は、最も望ましい特性を有する細胞をもたらすように思われる。これは、少なくとも、例えば、ラパマイシンの毒性によるものであると思われる。

《実施例５》
ＮＫＧ２Ｄリガンドの阻害も、細胞収率および細胞溶解活性の向上をもたらす。

ＮＫＧ２Ｄは、腫瘍には広く存在するが、健常組織にはほとんど存在しない８つの異なるストレス誘導リガンド（ＮＫＧ２ＤＬ）に結合することが知られている。我々は、活性化時にＴ細胞で発現する鍵となるＮＫＧ２ＤＬを特定することを目的とした。０日目に、ＯＫＴ３と抗ＣＤ３ 抗体で、ＰＢＭＣを活性化した。一日おきに、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の表面の８つのＮＫＧ２ＤＬの発現を評価した（図１１）。

活性化時、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の細胞表面上でＭＩＣＡ／ＢおよびＭＩＣＢをアップレギュレートした。活性化後２〜４日目に発現がピークに達した。その後、１０日目まで発現は低下した。ＵＬＢＰ１およびＵＬＢＰ２が低レベルで発現したが、ＵＬＢＰ２はＣＤ４＋Ｔ細胞に限定されていた（図１１）。Ｔ細胞上での他のリガンドの発現の証拠はほとんどなかった。

並行して行われた研究により、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢが、ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲの主要な刺激因子であることが特定され（データは図示せず）、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢが、Ｔ細胞のフラトリサイドの原因となる主要なＮＫＧ２ＤＬであることを示した。

次に、配列の類似性が高いため、単一のｓｈＲＮＡによるＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ両方の特異的標的化が実現可能であることを調べた。初期Ｔ細胞に異なるｓｈＲＮＡを形質導入し、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢタンパク質の発現を評価した。このスクリーニングにより、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢの細胞表面発現を減少させる２つのｓｈＲＮＡが特定された（データは図示せず）。次に、ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲをコードし、候補ｓｈＲＮＡを共発現する単一のレトロウィルスベクターを遺伝子操作した。細胞増殖率を用いて、ＮＫＧ２ＤベースのＣＡＲまたはｓｈＲＮＡを共発現するＴ細胞で遺伝子操作されたＴ細胞におけるフラトリサイドのレベルを評価した（図１２）。ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲおよびｓｈＲＮＡをコードする単一レトロウィルスベクターの遺伝子操作により、ｓｈＲＮＡなしの細胞と比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏフラトリサイドがかなり減少したＴ細胞が生成され（図１２）、ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲＴ細胞の増殖率が上がり、対照Ｔ細胞のものに近づいた。続いて、ＭＩＣＡ／Ｂを標的とするｓｈＲＮＡｓを有するＮＫＧ２ＤベースのＣＡＲＴ細胞と有さないもののｉｎ ｖｉｔｒｏ抗腫瘍効果を評価した。ｓｈＲＮＡを有さない細胞は、異なる標的に対するＴＡＬエフェクター（Ｅ：Ｔ）の比で、ＡＭＬ ＨＬ６０細胞の特異的殺傷を示した。しかし、ＭＩＣＡ／Ｂ ｓｈＲＮＡ＃２または＃４の共発現は、特にＥ：Ｔ比が低い場合、癌細胞の殺傷を改善した（図１３Ａ）。共培養の２４時間後、ｓｈＲＮＡ発現がＴ細胞の回復を改善したため、改善された標的細胞の殺傷は、フラトリサイドの減少によるものである可能性が高い（図１３Ｂ）。

結論として、Ｔ細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドのノックダウンは、ＮＫＧ２Ｄ阻害またはＰＩ３Ｋ阻害で観察されたのと同じ向上した製造結果を示した。
Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓを用いてＭＩＣＡおよびＭＩＣＢを永続的に不活性化した場合でも同様のデータが得られた（データは図示せず）。特筆すべき差異は、ｓｈＲＮＡ阻害は一時的（例えば、製造プロセス中のみ）であるが、遺伝子ノックアウト（ここでは、Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓを用いた）は永続的である点である。これは、状況により望ましい場合とそうでない場合がある。

考察
Ｂ細胞性急性リンパ芽球性白血病（ｂＡＬＬ）およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞治療法が最近承認されたことにより、このアプローチの強力な臨床検証が行われるようになり、ＣＤ１９^＋Ｂ悪性腫瘍を超えたＣＡＲＴ細胞治療法の開発に弾みを与えている。標的の選択は、この治療法の成功に必要不可欠である。今まで、腫瘍専用の抗原を特定することは困難であった。急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）のプロテオミクスアプローチとゲノムアプローチを組み合わせた最近のバイオインフォマティクス研究により、腫瘍特異的細胞表面抗原は存在せず、ＡＭＬを標的とする抗体ベースのＣＡＲＴアプローチには複合組合せ標的戦略が必要かもしれないこととがわかった（２９）。結果的に、現時点で試験された標的抗原のほとんどは、標的の発現が正常で健常な細胞にも起こり得る腫瘍関連抗原である。Ｂ細胞悪性腫瘍のＣＤ１９（３、４）、ＡＭＬのＣＤ１２３（３０）、様々な固形腫瘍のＣＤ７（１４）およびＣＥＡを含む例が数多くある（３１）。しかし、標的抗原がＴ細胞上に永続的または一過性的に発現する場合、問題が起こる。ＣＡＲで遺伝子操作されたＴ細胞は、その後、培養でＴ細胞自身とそれ以外の細胞を標的にしてＴ細胞のフラトリサイドをもたらし、実際に細胞収率を減少または事実上０にする可能性が高くなるからである。

現在の遺伝子編集は、特定のタンパク質の発現を防止しする臨床的に関連した方法を提供しており、これにより、ＣＤ７特異的ＣＡＲＴ細胞など、そうでなければフラトリサイドを起こす可能性のあるＣＡＲＴ細胞の増殖を可能にしている（１４）。しかし、ＮＫＧ２ＤベースのＣＡＲの多標的特異性は、一見、効果的に発現するＣＡＲ構築物と共に初期Ｔ細胞の８つの異なるタンパク質を排除するための遺伝子編集を、臨床に実用化することは、可能ではあるものの、困難であることを意味する。このため、本明細書では、細胞培養中に発生するフラトリサイドを回避して、ＮＫＧ２Ｄに焦点を当てたＣＡＲＴ細胞治療法の生成および送達を可能にする他の戦略を提示する。

これら実施例では、ＰＩ３Ｋ阻害剤が、細胞表面上のＮＫＧ２Ｄの発現を減らすことによりフラトリサイドを制御するという一般的なアプローチを提供した。我々が知る限り、このような観察結果が報告されたのはこれが最初である。ＰＩ３Ｋ阻害剤治療の後に細胞表面上のＮＫＧ２Ｄの減少を引き起こすメカニズムは現在知られていない。わかっていることは、ＮＫＧ２Ｄの細胞表面の局在は、それとＤＡＰ１０との結合によって媒介されることである（Ｕｐｓａｈｗ ｅｔ ａｌ．２００６）。細胞表面上のＮＫＧ２Ｄが減少する仮説の１つとして、ＤＡＰ１０が、ＮＫＧ２ＤとＤＡＰ１０の結合に必要である、ＰＩ３Ｋ阻害剤治療（例えば、ＲＮＡレベルの減少、転写の阻害、または、グリコシル化などの翻訳後修飾の阻害）によって影響されることが考えられる（Ｐａｒｋ ＹＰ ｅｔ ａｌ、２０１１、Ｂｌｏｏｄ））。これらにより、最終的に、細胞表面上のＮＫＧ２Ｄ―ＤＡＰ１０複合体の発現の防止がもたらされ、フラトリサイドの阻害につながる。しかし、ＰＩ３Ｋ阻害は、細胞増殖の減少にも関連している（Ａａｇａａｒｄ−Ｔｉｌｌｅｒｙ ＫＭ， Ｊｅｌｉｎｅｋ ＤＦ． Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３−ｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９６；１５６：４５４３− ４５５４． １１． Ｆｒｕｍａｎ ＤＡ， Ｓｎａｐｐｅｒ ＳＢ， Ｙｂａｌｌｅ ＣＭ， ｅｔ ａｌ． Ｉｍｐａｉｒｅｄ Ｂ ｃｅｌｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ ｐ８５ａｌｐｈａ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９９９；２８３：３９３−３９７． １２． Ｓｈｉ Ｊ， Ｃｉｎｅｋ Ｔ， Ｔｒｕｉｔｔ ＫＥ， Ｉｍｂｏｄｅｎ ＪＢ． Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ， ａ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３−ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ， ｂｌｏｃｋｓ ａｎｔｉｇｅｎ− ｍｅｄｉａｔｅｄ， ｂｕｔ ｎｏｔ ＣＤ３ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ， ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７；１５８：４６８８−４６９５． １３． Ｔｒｕｉｔｔ ＫＥ， Ｓｈｉ Ｊ， Ｇｉｂｓｏｎ Ｓ， Ｓｅｇａｌ ＬＧ， Ｍｉｌｌｓ ＧＢ， Ｉｍｂｏｄｅｎ ＪＢ． ＣＤ２８ ｄｅｌｉｖｅｒｓ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ｉｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３−ｋｉｎａｓｅ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９５；１５５：４７０２− ４７１０）。このため、この阻害剤アプローチは、比較的低用量のＣＡＲＴ細胞が必要であるが、多数の細胞が必要であるより限定的な使用の状況において、Ｔ細胞のフラトリサイドを制御する効果的な解決策を提供する。

ＮＫＲ―２Ｔ細胞製造中のフラトリサイドを阻害する別のアプローチは、増殖段階において特定の遮断抗体を用いることであった。これにより、Ｔ細胞のフラトリサイドの制御 および対照ｔＣＤ１９Ｔ細胞と同等レベルのＴ細胞の増殖が可能となった。この方法は、ＣＡＲ活性化自体を誘発せずにフラトリサイドを遮断する（標的抗原が存在しない培養の間のサイトカイン産生のレベルが大幅に減少していることにより示される）ことを必要とするため、用いられる抗体に大きく左右される。特定の遮断抗体の添加により、ＮＫＲ―２Ｔ細胞の大規模な増殖を可能にする解決策が提供される。

遮断抗体プロセスに関する大きな懸念は、増殖したＮＫＲ―２ＣＡＲＴ細胞が抗体で装飾され、それにより、抗体依存性除去メカニズムを介して注入時に細胞の急速な排除を引き起こす可能性が高いことであった。しかし、分析により、ＮＫＲ―２細胞には、再発現による抗ＣＤ３１４抗体のコーティングがないことが明確に示され、抗体結合は、細胞表面からのＮＫＧ２ＤおよびＮＫＲ―２ＣＡＲの減少をもたらすようであることが示唆された。内在性ＮＫＧ２Ｄが、標的リガンドに結合すると、ＮＫ細胞活性化を制御するメカニズムとして、急速なインターナリゼーションを生じることが示されている。ここで得られた観察結果は、ＮＫＲ―２の場合、ＣＡＲもインターナリゼーションされるようであることを示唆している。養子Ｔ細胞治療法の観点から、これは、結合した抗体を除去する特定のプロセスを開発する必要がないため、有益である。

プロセス間で観察された差異およびＰＩ３Ｋ阻害剤の影響に加え、これら臨床前のデータは、ＮＫＲ―２が、ＡＭＬマウスモデルにおいて効力のある治療法であることを確認した最初のデータである。さらに、これら結果は、プレコンディショニングの欠如およびＮＫＲ―２の複数回の注入は、腫瘍の根絶および治療マウスの長期生存をもたらす評価基準であった他の研究とも一致している。（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００７；６７（２２）：１１０２９―３６；Ｂａｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１；１８（５）：５０９―１６）。

さらに、すべてのＮＫＧ２Ｄリガンドをノックダウンまたはノックアウトするのに実現可能または実用的であると考えられていなかったが、Ｔ細胞において最も一般的な２つのリガンドをｓｈＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲを介して阻害したところ、同様の製造収率の向上が達成され、ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達の一部を阻害することによっても、フラトリサイドを既に向上できることが示された。

まとめると、本願は、ＰＩ３Ｋ阻害などの一般的な方法（例えば、下流シグナル伝達に作用する）、または、遮断抗体や受容体リガンド除去などの受容体特異的アプローチによって、Ｔ細胞のフラトリサイドを管理できることを開示している。具体的に、ＰＩ３Ｋ阻害剤アプローチおよび遮断抗体アプローチは、フラトリサイドが減少した免疫細胞プロダクトを生成するのに用いることができ、各アプローチは、遺伝子編集など、Ｔ細胞集団で標的を除去する他の手段が困難である、または、現在実現可能や望ましくない場合、Ｔ細胞プロダクトを生成するのに用いることができる潜在的利点を与える。

Claims (14)

1. キメラＮＫＧ２Ｄ受容体を発現する免疫細胞の製造中のフラトリサイドを減少および／または防止する方法であって、前記細胞の製造プロセス中にＮＫＧ２Ｄシグナル伝達の機能阻害をすることを備えた方法。
2. ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達の機能阻害は、以下の１つ以上によって達成される：
   ‐前記免疫細胞の１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドの永続的または一過性阻害；
   ‐前記キメラＮＫＧ２Ｄ受容体の一過性阻害；
   ‐前記キメラＮＫＧ２Ｄ受容体の下流シグナル伝達の一過性阻害
   請求項１に記載の方法。
3. 前記１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドの永続的阻害は、遺伝子ノックダウンによって達成される、請求項２に記載の方法。
4. 前記下流シグナル伝達の一過性阻害は、ＰＩ３Ｋシグナル伝達の一過性阻害である、請求項２または３に記載の方法。
5. 前記ＰＩ３Ｋシグナル伝達は、ＬＹ２９４００２およびイデラリシブから選択されるＰＩ３Ｋ阻害剤を用いて阻害される、請求項４に記載の方法。
6. 前記機能阻害は、ｓｈＲＮＡ、または、ＮＫＧ２Ｄ受容体に対する、もしくは、１つ以上のそのリガンドに対する抗体を用いて達成される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、幹細胞、またはｉＰＳＣなどの養子細胞移植用細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. キメラＮＫＧ２Ｄ受容体をコードする核酸分子と、以下の少なくとも１つとを含む遺伝子操作された免疫細胞：
   ‐不活性化するように遺伝子操作されたＮＫＧ２Ｄリガンドをコードする１つ以上の内在性遺伝子；
   ‐キメラＮＫＧ２Ｄ受容体および／または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する１つ以上のｓｈＲＮＡ。
9. 前記ＮＫＧ２Ｄリガンドは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５およびＵＬＢＰ６から選択される、請求項８に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
10. キメラＮＫＧ２Ｄ受容体をコードする核酸分子を含有する免疫細胞の組成物であって、
    前記細胞は、以下をさらに含み、
    ‐不活性化するように遺伝子操作されたＮＫＧ２Ｄリガンドをコードする１つ以上の内在性遺伝子；
    ‐前記キメラＮＫＧ２Ｄ受容体および／または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する１つ以上のｓｈＲＮＡ；
    および／または、前記組成物は、以下をさらに含む。
    ‐前記キメラＮＫＧ２Ｄ受容体および／または１つ以上のＮＫＧ２Ｄリガンドに対する１つ以上の抗体；
    ‐前記キメラＮＫＧ２Ｄ受容体の下流シグナル伝達の阻害剤、具体的には、 ＰＩ３Ｋ阻害剤。
11. 医薬品として使用される請求項８または９に記載の遺伝子操作された免疫細胞、または、請求項１０に記載の組成物。
12. 癌治療に使用される請求項８または９に記載の遺伝子操作された免疫細胞、または、請求項１０に記載の組成物。
13. 請求項８の遺伝子操作された免疫細胞を、それを必要とする被検体に投与することを含む、癌を治療する方法。
14. 請求項１０の組成物を、それを必要とする被検体に投与することを含む、癌を治療する方法。