CN116064400A - 具有增强的细胞毒性的修饰的天然杀伤细胞和天然杀伤细胞系 - Google Patents

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Abstract

对NK细胞和NK细胞系进行修饰以增加细胞毒性，其中细胞及其组合物用于治疗癌症。产生修饰的NK细胞和NK细胞系是通过基因修饰以除去检查点抑制性受体表达和/或添加突变(变体)TRAIL配体表达。

Description

具有增强的细胞毒性的修饰的天然杀伤细胞和天然杀伤细胞系
本申请是申请日为2016年7月28日、中国专利申请号为201680049392.8且发明名称为“具有增强的细胞毒性的修饰的天然杀伤细胞和天然杀伤细胞系”的中国专利申请的分案申请，并且本申请要求享有EP 15178899.9、GB 1603655.0、GB 1605457.9和GB1610164.4的优先权。
技术领域
本发明涉及修饰天然杀伤(NK)细胞和NK细胞系以产生具有更多细胞毒性表型的衍生物。此外，本发明涉及生产修饰的NK细胞和NK细胞系的方法、含有所述细胞和细胞系的组合物以及所述组合物在治疗癌症中的用途。
背景技术
通常，免疫细胞在触发导致靶细胞死亡的免疫应答之前需要靶细胞经由主要组织相容性复合体(MHC)呈递抗原。这使得不呈递MHC I类的癌细胞能够逃避大部分免疫应答。
然而，NK细胞能够在不存在MHC I类表达的情况下识别癌细胞。因此，它们在人体对抗癌症的防御中发挥着关键作用。
另一方面，在某些情况下，癌细胞通过表达结合NK细胞膜上的抑制性受体的配体表现出抑制NK细胞的细胞毒活性的能力。对癌症的抵抗可以涉及这些和其他因素之间的平衡。
细胞毒性在本文中是指免疫效应细胞(例如，NK细胞)通过例如释放溶细胞的化合物或通过结合癌细胞膜上的受体以及诱导所述癌细胞的凋亡来诱导癌细胞死亡的能力。细胞毒性不仅受到诱导溶细胞化合物的释放的信号的影响，而且受到抑制其释放的信号的影响。因此，如上所述，细胞毒性的增加将导致更有效地杀死癌细胞，癌细胞抑制NK的细胞毒活性的可能性更小。
作为增加NK细胞对缺乏MHC I类表达但能够抑制NK细胞毒性的癌细胞的细胞毒性的方法，已经提出了去除NK细胞上的抑制性受体功能的基因修饰(Bodduluru etal.2012)。NKG2A已被确定为在这些情况下值得沉默的抑制性受体，因为已知某些癌细胞表达结合NKG2A并在不存在MHC I类表达的情况下抑制NK细胞的细胞毒性的MICA(Shook etal.2011；WO2006/023148)。
在NK-92细胞中已经显示了下调NKG2A表达的另一种方法，其中用编码IL-15的基因转染显示与NKG2A表达的降低相关(Zhang et al.2004)。然而，尽管观察到NK细胞的细胞毒性增加，但该增加可能是活化受体NKG2D的表达伴随增加的结果。这得到NK-92细胞上阻断NKG2A受体与对多发性骨髓瘤细胞的细胞毒性增加无关的观察结果的支持(Heidenreichet al.2012)。尽管如此，值得注意的是NK-92细胞系是具有非常低抑制性受体表达的高细胞毒性细胞系。因此，与NKG2A表达降低有关的细胞毒性的任何增加可能太小而无法检测。
类似的研究已经在小鼠中进行。例如，小鼠在NK细胞上表达称为Ly49的受体，其类似于人类抑制KIR受体。已经表明，通过用抗体片段阻断Ly49受体，NK细胞具有更强的细胞毒性，并且能够在体外和体内杀死鼠白血病细胞(Koh et al.2001)。
这是减少抑制性受体功能的结果，然而，体内的“正常”细胞也更容易受到修饰的NK细胞的攻击，因为修饰的NK细胞不能区分“正常”细胞和癌细胞。这是减少“经典”抑制性受体功能的重大缺点。
已知NK细胞杀死癌细胞的另一种方式是通过在其表面上表达TRAIL。TRAIL配体能够结合癌细胞上的TRAIL受体并诱导所述癌细胞的凋亡。一种推测方法描述了在NK细胞上过度表达TRAIL，以利用这种抗癌机制(EP1621550)。此外，据报道IL-12上调TRAIL在NK细胞上的表达(Smyth et al.2001)。
尽管如此，癌细胞已经发展出处理表达TRAIL的NK细胞的回避和保护机制。诱饵TRAIL受体经常在癌细胞膜上表达，并且TRAIL与这些诱饵受体的结合不能诱导凋亡；还没有找到克服这种机制的方法。
急性骨髓性白血病(AML)是一种造血系统恶性肿瘤，涉及到致力于髓细胞发育的前体细胞，在成人(90％)和儿童(15-20％)的急性白血病中占相当比例(Hurwitz,Mounceet al.1995；Lowenberg,Downing et al.1999)。尽管80％的患者通过标准化疗获得缓解(Hurwitz,Mounce et al.1995；Ribeiro,Razzouk et al.2005)，但由于微小残留病(MRD)的高复发率，存活率仍不令人满意。五年存活率与年龄有关：儿童(Rubnitz 2012)占60％，65岁以下成年人(Lowenberg,Downing et al.1999)占40％，65岁以上成年人占10％(Ferrara和Schiffer，2013)。如果患者有合适的造血细胞供体，这些结果可以得到改善，但许多人并没有强调需要一种替代的治疗方法。
天然杀伤(NK)细胞是细胞毒性淋巴细胞，具有不同的表型和与例如天然杀伤T(NK-T)细胞不同的效应功能。例如，尽管NK-T细胞表达CD3和T细胞抗原受体(TCR)，但是NK细胞不能。通常发现NK细胞表达标志物CD16和CD56，其中CD16起Fc受体的作用并介导下文讨论的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。KHYG-1在这方面是一个明显的例外。尽管NK细胞天然具有细胞毒性，但已经开发出具有增强的细胞毒性的NK细胞系。NK-92和KHYG-1代表两种NK细胞系，已被广泛研究并在癌症治疗中显示出前景(Swift et al.2011；Swiftet al.2012)。
用于癌症治疗的过继细胞免疫疗法通常涉及向患者施用天然和修饰的T细胞。可以以各种方式修饰T细胞，例如基因修饰，从而表达特异性结合某些靶癌细胞的受体和/或配体。用特异于癌细胞抗原的高亲和性T细胞受体(TCR)和嵌合抗原受体(CAR)转染T细胞可产生高度反应性的癌症特异性T细胞应答。这种免疫治疗方法的一个主要限制是必须从患者获得T细胞用于自体离体扩增，或者必须使用MHC匹配的T细胞以在细胞转移给患者后，或者在一些情况下移植物抗宿主病(GVHD)发作后立即避免免疫性根除。另外，成功转移的T细胞通常在循环中长时间存活，使得难以控制由治疗引起的持续副作用。
在单体型移植中，当存在KIR抑制性受体-配体错配时，认为移植物抗白血病作用是由NK细胞介导的，这可能导致AML治疗的生存率提高(Ruggeri,Capanni et al.2002；Ruggeri,Mancusi et al.2005)。此外，在经历了对AML进行的单体型T-去除造血细胞移植(HCT)的患者中，快速的NK恢复与更好的结果和更强的移植物抗白血病(GVL)效应相关(Savani,Mielke et al.2007)。其他试验使用体外扩增的单倍体相合的NK细胞来治疗成人(Miller,Soignier et al.2005)和儿童(Rubnitz,Inaba et al.2010)的AML。
已经建立了几种永久性NK细胞系，最显著的是NK-92，其来源于表达典型NK细胞标志物的非霍奇金淋巴瘤患者，除了CD16(Fcγ受体III)之外。与活化的NK细胞和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)相比，NK-92经历了广泛的临床前试验，并对广泛的肿瘤表现出优良的溶胞作用(Gong,Maki et al.1994)。已经建立了NK-92细胞对初级AML的细胞毒性(Yan,Steinherz et al.1998)。
另一种NK细胞系KHYG-1已经被确定为临床应用的潜在竞争者(Suck etal.2005)，但具有降低的细胞毒性，因此受到的关注比NK-92少。已知KHYG-1细胞被预激活。与内源性NK细胞不同，KHYG-1细胞在任何时候都可极化，增加其细胞毒性并使其更快地响应外部刺激。NK-92细胞比KHYG-1细胞具有更高的基线细胞毒性。
因此清楚的是，目前的过继免疫治疗方案受到供体在效应细胞数量和质量方面的变化性的影响，以及受到如果有效的细胞系可用于提供更标准化的治疗则可被消除的变量的影响。
已使用小鼠模型对NK细胞的细胞毒性进行了大量的研究。一个例子是穿孔素和粒酶B mRNA在小鼠NK细胞中组成型转录的发现，但是直到NK细胞的刺激或激活才检测到最小水平的蛋白质(Fehniger等，2007)。虽然这项工作和其他使用小鼠NK细胞的工作是有意义的，但它不能作为人类NK细胞细胞毒性的确凿证据。与上述实例形成对照，人类NK细胞在刺激之前表达高水平的穿孔素和粒酶B蛋白(Leong et al,2011)。其结果是，当在从培养物中新分离小鼠或人NK细胞时，小鼠NK细胞具有弱的细胞溶解活性，而人NK细胞表现出强烈的细胞溶解能力。
小鼠和人NK细胞在其表达标志物、信号级联和组织分布中也有很大不同。例如，CD56被用作人NK细胞的标志物，而小鼠NK细胞根本不表达该标志物。此外，调节NK细胞细胞毒性的公认机制是通过配体结合NK激活受体和抑制性受体。已知两种最突出的人类NK激活受体是NKp30和NKp44，它们都不在小鼠NK细胞上表达。关于NK抑制性受体，尽管人类NK细胞表达识别I类MHC并抑制细胞毒性活性的KIR，但是小鼠NK细胞根本不表达KIR，而是表达Ly49s(Trowsdale et al,2001)。总而言之，尽管小鼠NK细胞在其自然生理环境中实现与人类NK细胞相同的功能，但是发挥这种作用的机制在物种之间差异显著。
因此，需要具有更多的细胞毒素谱的可选择的和优选改进的人NK细胞和人NK细胞系。
本发明的目的是提供具有更多细胞毒性表型的NK细胞和NK细胞系。另一个目的是提供用于产生修饰的NK细胞和NK细胞系的方法、含有所述细胞或细胞系的组合物以及所述组合物在治疗癌症中的用途。更具体的实施方案旨在为鉴定的癌症(例如，血癌，如白血病)提供治疗。具体实施方案旨在组合NK细胞和NK细胞系的两种或更多种修饰以进一步增强经修饰细胞的细胞毒性。
发明内容
本文提供了具有更多细胞毒性表型的修饰的NK细胞和NK细胞系，以及制备所述细胞和细胞系的方法。还提供了修饰的NK细胞和NK细胞系的组合物，以及所述组合物用于治疗癌症的用途。
本发明提供了使用例如基因工程来敲除编码抑制性受体的基因、表达编码TRAIL配体和变体的基因以及表达编码嵌合抗原受体(CAR)和/或Fc受体的基因的修饰NK细胞和NK细胞系的方法。
此外，本发明的组合物包括具有两种或更多种修饰的NK细胞和NK细胞系，其中多种修饰进一步增强组合物的细胞毒活性。
根据本发明，还提供了使用修饰的NK细胞系(例如KHYG-1细胞的衍生物)治疗癌症(例如，血癌)的方法，其中修饰的NK细胞系被工程化为缺乏检查点抑制受体的表达、表达TRAIL配体变体和/或表达CAR和/或Fc受体。
根据本发明可特别治疗的疾病包括癌症、血癌、白血病和特别是急性骨髓性白血病。尤其可以治疗人类的肿瘤和癌症。本文提及的肿瘤包括赘生物。
具体实施方式
因此，本发明提供了经过基因修饰以增加其细胞毒性的天然杀伤(NK)细胞或NK细胞系。
如以下实施例中详细描述的，已经对NK细胞和NK细胞系进行了基因修饰，以增加其对癌症的细胞毒活性。
总之，本发明的NK细胞和NK细胞系将被称为NK细胞(除非上下文另有要求)。
在本发明的某些实施方案中，提供的NK细胞具有降低的或缺失的检查点抑制受体功能。因此，在下面的例子中，产生了一个或多个检查点抑制受体基因被敲除的NK细胞。优选地，这些受体是特定的检查点抑制受体。优选地，这些检查点抑制受体是CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG-3)、CD279(PD-1)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9、TIGIT和/或TIM-3中的一个、多个或全部。
在其他实施方案中，提供NK细胞，其中一种或多种抑制性受体信号传导途径被敲除或表现出降低的功能-结果再次是抑制性受体功能降低或缺失。例如，由SHP-1、SHP-2和/或SHIP介导的信号传导途径通过细胞的基因修饰被敲除。
由此产生的NK细胞表现出改善的细胞毒性，因此在癌症治疗、尤其是血癌治疗、尤其是白血病和多发性骨髓瘤治疗方面具有更大的用途。
在一个实施方案中，基因修饰发生在细胞分化成NK细胞之前。例如，多能干细胞(例如iPSC)可以被基因修饰以失去表达一个或多个检查点抑制受体的能力。然后将修饰的iPSC分化以产生具有增强的细胞毒性的基因修饰的NK细胞。
由于NK细胞活化后检查点抑制受体的表达，优选降低检查点抑制受体相对于其他抑制性受体的功能。正常的或“传统的”抑制性受体(例如KIR家族的大部分、NKG2A和LIR-2)与MHC I类结合，因此主涉及与减少自我靶向的问题。因此，优选地，检查点抑制受体被敲除。根据本发明，这些受体的功能降低或缺失防止了癌细胞抑制免疫效应功能(如果受体完全发挥功能，该功能原本可能发生)。因此，本发明这些实施方案的关键优势在于NK细胞对癌细胞抑制其细胞毒性活性较不敏感；因此它们在癌症治疗中是有用的。
如本文所用，提及的抑制性受体通常是指在免疫效应细胞(例如NK细胞)的质膜上表达的受体，因此结合其互补配体产生细胞内信号负责降低所述免疫效应细胞的细胞毒性。这些抑制性受体在免疫效应细胞的“静息”和“活化”状态下表达，并且通常与为免疫系统提供“自身耐受”机制有关，该机制抑制对身体细胞和组织的细胞毒性反应。一个例子是在NK细胞上表达的抑制性受体家族“KIR”，并识别身体健康细胞上表达的MHC I类。
同样如本文所用，通常认为检查点抑制受体是上述抑制性受体的子集。然而，与其它抑制性受体不同，检查点抑制受体在免疫效应细胞(例如NK细胞)的延长激活和细胞毒性期间以较高水平表达。这种现象对于抑制例如炎症部位的慢性细胞毒性是有用的。实例包括检查点抑制受体PD-1、CTLA-4和CD96，所有这些都在NK细胞上表达。
因此，本发明还提供了缺失编码选自以下的检查点抑制受体的基因的NK细胞：CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG-3)、CD279(PD-1)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9、TIGIT和TIM-3。
缺失基因的NK细胞可以指全部或部分缺失、突变或其他导致没有功能性基因产物被表达的情况。在实施方案中，NK细胞缺失编码两种或更多种抑制性受体的基因。
更具体的实施方案包括缺失编码选自CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)和CD279(PD-1)的检查点抑制受体的基因的NK细胞。优选的实施方案包含作为KHYG-1的衍生物的NK细胞。
在下述实施例中，发明人已经可靠地显示了使用siRNA敲低KHYG-1细胞中检查点抑制受体CD96的表达的细胞毒性效应。CD96敲低(KD)KHYG-1细胞在多个效应物:靶标(E:T)比下表现出对白血病细胞的增强的细胞毒性。
在本发明的其他实施方案中，提供表达TRAIL配体或优选突变体(变体)TRAIL配体的NK细胞。如以下实施例中进一步描述的，NK细胞的细胞毒性增强修饰因此还包括TRAIL配体和/或突变的TRAIL配体变体两者的增强的表达。
所产生的NK细胞表现出与TRAIL受体的结合增强，结果增加了对癌症、特别是血癌、特别是白血病的细胞毒性。
相比于野生型TRAIL与“诱饵”受体的结合，突变体/变体优选对诱饵受体具有较低的亲和力(或者实际上没有亲和力)。这种诱饵受体代表一类结合TRAIL配体的TRAIL受体，但不具有启动细胞死亡的能力，并且在一些情况下，能够拮抗死亡信号传导途径。突变/变体TRAIL配体可根据WO 2009/077857制备。
突变体/变体可以分别对TRAIL受体(例如DR4和DR5)具有增强的亲和力。典型地已知野生型TRAIL对DR4的KD>2nM，对DR5的KD>5nM，对诱饵受体DcR1的KD>20nM(WO2009/077857；通过表面等离子体共振测量)，或对DR4的KD约为50-100nM，对DR5的KD为1-10nM，对DcR1的KD为175-225nM(Truneh,A.et al.2000；通过等温滴定量热法和ELISA测量)。因此，对DR4的增强的亲和力分别适当地定义为KD<2nM或KD<50nM，而对DR5的增强的亲和力分别适当地定义为KD<5nM或KD<1nM。将诱饵受体DcR1的降低的亲和力分别适当地定义为KD>50nM或KD>225nM。在任何情况下，TRAIL变体/突变体表现出的亲和力的增强或降低均是相对于野生型TRAIL表现的基线亲和力。与野生型TRAIL表现的亲和力相比，亲和力优选增强至少10％，更优选增强至少25％。
与其对DR4、DcR1和DcR2的亲和力相比，TRAIL变体优选对DR5具有增强的亲和力。优选地，对DR5的亲和力为对DR4、DcR1和DcR2中的一个或多个的亲和力的至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍或甚至1000倍或更大。更优选地，对DR5的亲和力为对DR4、DcR1和DcR2中的至少两个(优选全部)的亲和力的至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍或甚至1,000倍或更高。
本发明的这些实施方案的关键优势在于在杀伤癌细胞方面具有更高效力的NK细胞。
其他具体实施方案包括表达突变体TRAIL配体的NK细胞，其对TRAIL诱饵受体具有降低的亲和力或不具有亲和力。优选地，该NK细胞是KHYG-1的衍生物。其他具体实施方案包括表达突变体TRAIL配体的NK细胞，所述突变体TRAIL配体对TRAIL诱饵受体的亲和力降低或者不具有对DR4和/或DR5的增强的亲和力。
在下文更详细描述的本发明的实例中，NK细胞经基因修饰以表达突变体TRAIL。修饰的KHYG-1细胞表达突变体TRAIL，NK-92表达突变体TRAIL。修饰的KHYG-1细胞在体外表现出对癌细胞系的提高的细胞毒性。KHYG-1细胞表达TRAIL受体(例如DR4和DR5)，但处于低水平。修饰的NK细胞的其他优选实施方案不表达或基本上不表达TRAIL受体，或者仅以低水平表达-足够低以至于修饰的NK细胞的生存力不受突变体TRAIL表达的不利影响。
在任选的实施方案中，通过向患者施用能够上调癌细胞上的TRAIL死亡受体表达的药剂，增强使用表达TRAIL或TRAIL变体的修饰的NK细胞进行的癌症治疗。该药剂可以在施用修饰的NK细胞之前施用，与其组合施用或随后施用。然而，优选在施用修饰的NK细胞之前施用所述药剂。
在一个优选的实施方案中，所述药剂上调DR5在癌细胞上的表达。该药剂可以任选地是化疗药物，例如硼替佐米，并以能够上调DR5在癌症上的表达的低剂量施用。
本发明不限于能够上调DR5表达的任何特定药剂，但DR5诱导剂的实例包括硼替佐米、吉非替尼、哌龙明、阿霉素、α-生育酚琥珀酸酯和HDAC抑制剂。
根据本发明的一个优选实施方案，突变/变体TRAIL配体连接至一个或多个NK细胞共刺激结构域，例如41BB/CD137、CD3zeta/CD247、DAP12或DAP10。因此变体与其在靶细胞上的受体的结合促进靶细胞内的凋亡信号以及刺激NK细胞中的细胞毒性信号。
根据本发明进一步优选的实施方案，提供了NK细胞，其具有降低的检查点抑制受体功能并且还表达突变体TRAIL配体，关于这些各自的NK细胞修饰，如上文中所详细描述的。在更加优选的实施方案中，表达突变体TRAIL配体的NK细胞对TRAIL诱饵受体具有降低的亲和力或不具有亲和力，其可以是KHYG-1的衍生物，并且进一步缺失编码选自以下的检查点抑制受体的基因：CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG-3)、CD279(PD-1)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9、TIGIT和TIM-3。
本发明还提供经修饰以表达一种或多种CAR的NK细胞和NK细胞系，优选KHYG-1细胞及其衍生物。
适于癌症治疗用途的CAR特异性结合癌细胞上的一种或多种配体(例如骨髓瘤细胞上的CS1(SLAMF7))。为了用于治疗特定的癌症，例如多发性骨髓瘤，CAR可以与CD38结合。例如，CAR可以包括例如可变区的结合性质，所述可变区衍生自已知单克隆抗体达雷木单抗，与其结合性质相似或相同。这样的NK细胞可以与抑制血管生成的药剂(例如，来那度胺)组合用于癌症治疗中。为了用于癌症治疗，尤其是白血病的治疗，特别是AML的治疗，CAR可以结合CLL-1。
CAR-NK可以是双特异性的，其中它们的亲和力针对两种不同的配体/抗原。双特异性CAR-NK可以用于增加癌细胞上潜在结合位点的数目，或者用于将癌细胞定位于其它免疫效应细胞，所述其它免疫效应细胞表达对NK-CAR有特异性的配体。为了用于癌症治疗，双特异性CAR可以结合靶肿瘤细胞和效应细胞，例如T细胞、NK细胞或巨噬细胞。因此，例如，在多发性骨髓瘤的情况下，双特异性CAR可以结合T细胞抗原(例如CD3等)和肿瘤细胞标志物(例如CD38等)。双特异性CAR可以可选地与两个分开的肿瘤细胞标志物结合，增加了NK细胞对靶肿瘤细胞的总体结合亲和力。这可以通过下调靶抗原之一来降低癌细胞产生耐药性的风险。在多发性骨髓瘤中这种情况的实例是与CD38和CS-1/SLAMF7结合的CAR。CAR适合靶向的另一种肿瘤细胞标志物是肿瘤上的“不要吃我”型标志物，例如CD47。
本发明任选的特征包括对上述NK细胞和NK细胞系提供进一步的修饰，其中例如Fc受体(其可以是CD16、CD32或CD64，包括亚型和衍生物)在细胞表面表达。在使用中，这些细胞可以增强对抗体包被的癌细胞的识别并且改善对细胞毒性应答的激活。
本发明的其他任选特征包括使修饰的NK细胞和NK细胞系更好地适应身体的特定目标区域。本发明的NK细胞可以靶向特定的癌细胞位置。在治疗血癌的优选实施方案中，本发明的NK效应物适于归巢至骨髓。通过岩藻糖基化和/或唾液酸化将特定的NK细胞修饰以归巢至骨髓。这可以通过基因修饰NK细胞以分别表达合适的岩藻糖基转移酶和/或唾液酸转移酶来实现。通过破坏肿瘤脉管系统来增加NK效应细胞向肿瘤部位的归巢，例如，通过节拍化疗或通过使用靶向血管生成的药物(Melero et al,2014)来使通过癌症血管的NK细胞浸润正常化。
本发明的另一个任选特征是提供在培养物中快速生长和增殖的固有能力得到提高的修饰的NK细胞和NK细胞系。这可以通过例如转染细胞以过表达诱导生长的细胞因子IL-2和IL-15来实现。而且，这种任选的改变提供了一种以连续方式向生长培养基补充细胞因子的经济有效的替代方法。
本发明进一步提供了制备修饰的NK细胞或NK细胞系的方法，其包括对本文所述的细胞或细胞系进行基因修饰以增强其细胞毒性。这种基因修饰可以是基因的稳定敲除，例如通过CRISPR，或基因的瞬时敲低，例如通过siRNA。
在一个优选的实施方案中，使用稳定的基因修饰技术(例如CRISPR)以提供具有增强的细胞毒性的新的NK细胞系，例如KHYG-1细胞的衍生物。
在实施方案中，该方法用于制备已经被修饰的NK细胞或NK细胞系以减少抑制性受体功能。优选地，这些抑制性受体是检查点抑制受体。
更具体的实施方案包括制备抑制性受体功能降低的NK细胞或NK细胞系的方法，其中检查点抑制受体选自CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG-3)、CD279(PD-1)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9、TIGIT和TIM-3。
在优选的实施方案中，该方法包括修饰NK细胞以减少两种或更多种抑制性受体的功能。
本发明还提供了制备经修饰的NK细胞或NK细胞系的方法，其包括对细胞或细胞系进行基因修饰以表达TRAIL配体或突变体TRAIL(变体)配体。
在实施方案中，所述方法包括修饰NK细胞或NK细胞系以表达突变体TRAIL配体，所述突变体TRAIL配体对TRAIL受体具有增强的亲和力。优选地，TRAIL受体是DR4和/或DR5。优选的实施方案提供了修饰NK细胞或NK细胞系以表达对诱饵TRAIL受体具有降低的亲和力的突变体TRAIL配体的方法。
在其他优选的实施方案中，所述方法包括修饰NK细胞或NK细胞系以去除检查点抑制受体的功能，并且也表达对诱饵TRAIL受体具有降低的结合亲和力或不具有结合亲和力的突变体TRAIL配体。
其他典型实施方案提供了制备NK细胞或NK细胞系的方法，其中一种或多种检查点抑制受体的功能已经被去除和/或突变体TRAIL配体被表达，该突变体TRAIL配体对诱饵TRAIL受体的结合亲和力降低或不具有结合亲和力，并且细胞被进一步修饰以表达CAR或双特异性CAR。CAR的性质任选地如上所述。
在实施方案中，所述方法包括制备NK细胞或NK细胞系，其中一种或多种检查点抑制受体的功能已被除去和/或突变体TRAIL配体被表达，所述突变体TRAIL配体对诱饵受体具有降低的结合亲和力或不具有结合亲和力，并且任选地对细胞进行修饰以表达CAR或双特异性CAR，并且对细胞进行进一步的修饰以表达一种或多种Fc受体。合适的Fc受体选自CD16(FcRIII)、CD32(FcRII)和CD64(FcRI)。
以上全部的优选实施方案包括制备作为KHYG-1的衍生物的NK细胞和NK细胞系的方法。
根据本发明的目的，具有增强的细胞毒性的修饰的NK细胞、NK细胞系或其组合物可用于治疗患者的癌症，特别是血癌。
在优选的实施方案中，修饰的NK细胞、NK细胞系或组合物用于治疗血癌，包括急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(包括T细胞淋巴瘤和B细胞淋巴瘤)、无症状骨髓瘤、阴燃多发性骨髓瘤(SMM)、活动性骨髓瘤或轻链骨髓瘤。
在更加优选的实施方案中，本发明是用于治疗血癌的NK细胞系，该细胞系作为KYHG-1衍生物通过降低KHYG-1细胞中的检查点抑制受体功能或在KHYG-1细胞中表达突变体TRAIL配体或两者来获得。
上文和下文中描述的修饰的NK细胞、NK细胞系及其组合物适用于治疗癌症，特别是人类的癌症，例如用于治疗血细胞的癌症或实体癌症。NK细胞和衍生物优选是人NK细胞。对于人类治疗，优选使用人NK细胞。
本领域技术人员已知将活性剂及其组合递送至有需要的患者的各种施用途径。本发明的实施方案用于血癌治疗。修饰的NK细胞和/或NK细胞系的施用可以是全身的或局部的，例如通过腹膜内途径。
在其它实施方案中，将活性剂更直接地施用。因此，可以直接在肿瘤内施用，尤其适用于实体瘤。
通常认为NK细胞适用于本发明的方法、用途和组合物。根据本文某些实例中使用的细胞，NK细胞可以是从癌细胞系获得的NK细胞。有利的是，可从血癌细胞系中获得NK细胞，优选经过处理(例如通过使其死亡和/或不能分裂)以降低其致肿瘤性的NK细胞，并将其用于本发明的方法中以治疗血癌。
为了使将癌症来源的细胞用于治疗用途更容易接受，通常以某种方式对其进行处理或预处理以降低或消除其在患者中形成肿瘤的倾向。实施例中使用的特定的经修饰的NK细胞系是安全的，因为它们已经不能分裂；它们被照射并保持其杀伤能力，但会在约3-4天内死亡。因此，例如作为照射的结果，特定的细胞和细胞系不能增殖。用于本文方法中的潜在NK细胞的治疗包括辐射以防止它们在体内分裂和形成肿瘤，以及基因修饰以降低致肿瘤性，例如，插入编码可以被激活的自杀基因的序列以防止细胞在体内分裂和形成肿瘤。自杀基因可以通过在表达该基因的细胞中引起细胞死亡的外源性(例如循环)药剂启动。另一种选择是使用靶向治疗用的特定NK细胞的单克隆抗体。例如，CD52在KHYG-1细胞上表达，并且单克隆抗体与该标志物的结合可导致抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和KHYG-1细胞死亡。
正如Suck等人2006年发表的一篇文章中所讨论的那样，使用辐照器例如Gammacell 3000Elan可以容易地照射癌症来源的NK细胞和细胞系。使用铯-137源来控制辐射的剂量，并且可以使用例如1Gy-50Gy之间的剂量-响应曲线来确定消除细胞增殖能力的最佳剂量，同时维持增强的细胞毒性的益处。这是通过在施用每个辐射剂量之后测定细胞的细胞毒性来实现的。
使用经照射的NK细胞系进行过继细胞免疫疗法相对于已建立的自体或MHC匹配的T细胞方法具有显著的益处。首先，使用具有高度增殖性的NK细胞系意味着修饰的NK细胞系的扩增可以在商业水平上更容易地实现。然后可以在将细胞施用于患者之前进行修饰的NK细胞系的照射。这些保留了有用的细胞毒性的被照射的细胞具有有限的寿命，并且与修饰的T细胞不同，其将不会长时间地循环引起持久的副作用。
此外，使用同种异体修饰的NK细胞和NK细胞系意味着患者中表达MHC I类的细胞不能以与自体NK细胞毒性应答相同的方式抑制NK细胞毒性应答。使用同种异体NK细胞和细胞系杀死癌细胞得益于之前提到的GVL效应，并且与T细胞不同，同种异体NK细胞和细胞系不刺激GVHD的发作，使得它们成为通过过继细胞免疫疗法治疗癌症的更优选的选择。
如权利要求及其他地方所述，本发明提供以下实施方案：
1.天然杀伤(NK)细胞或NK细胞系，其被基因修饰以增强其细胞毒性。
2.根据实施方案1所述的NK细胞或NK细胞系，其被基因修饰以减少一种或多种抑制性受体的表达。
3.根据实施方案2所述的NK细胞或NK细胞系，其中所述抑制性受体为检查点抑制受体。
4.根据实施方案3所述的NK细胞或NK细胞系，其中所述检查点抑制受体选自CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG-3)、CD279(PD-1)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9、TIGIT和TIM-3。
5.根据实施方案2-4中任一项所述的NK细胞或NK细胞系，其被修饰以减少两种或更多种抑制性受体的表达。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的NK细胞或NK细胞系，其被修饰以表达TRAIL配体。
7.根据实施方案6所述的NK细胞或NK细胞系，其中TRAIL配体为突变体TRAIL配体。
8.根据实施方案7所述的NK细胞或NK细胞系，其中所述突变体TRAIL配体对诸如DR4和/或DR5的TRAIL受体具有增强的亲和力。
9.根据实施方案7-8中任一项所述的NK细胞或NK细胞系，其中所述突变体TRAIL配体对诱饵TRAIL受体具有降低的亲和力。
10.根据前述实施方案中任一项所述的NK细胞或NK细胞系，其被修饰以去除检查点抑制受体的功能，并且被修饰以表达对诱饵TRAIL受体具有降低的亲和力或不具有结合亲和力的突变体TRAIL配体。
11.根据前述实施方案中任一项所述的NK细胞或NK细胞系，其表达嵌合抗原受体(CAR)。
12.根据实施方案11所述的NK细胞或NK细胞系，其中所述CAR为双特异性CAR。
13.根据实施方案12所述的NK细胞或NK细胞系，其中所述双特异性CAR在一种细胞类型上结合两种配体。
14.根据实施方案12所述的NK细胞或NK细胞系，其中所述双特异性CAR在两种不同细胞类型中的每一种上结合一种配体。
15.根据实施方案11和12所述的NK细胞或NK细胞系，其中所述CAR或双特异性CAR的配体在癌细胞上表达。
16.根据实施方案13所述的NK细胞或NK细胞系，其中所述双特异性CAR的配体均在癌细胞上表达。
17.根据实施方案14所述的NK细胞或NK细胞系，其中所述双特异性CAR的配体在癌细胞和免疫效应细胞上表达。
18.根据前述实施方案中任一项所述的NK细胞或NK细胞系，其经修饰以表达一种或多种Fc受体。
19.根据实施方案18所述的NK细胞或NK细胞系，其中所述Fc受体选自CD16(FcRIII)、CD32(FcRII)和CD64(FcRI)。
20.根据前述实施方案中任一项所述的NK细胞或NK细胞系，其中所述细胞系是KHYG-1细胞系的衍生物。
21.NK细胞，其缺失编码选自以下的检查点抑制受体的基因：CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG-3)、CD279(PD-1)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9、TIGIT和TIM-3。
22.根据实施方案21所述的NK细胞，其缺失编码选自以下的两种或更多种抑制性受体的基因：CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG-3)、CD279(PD-1)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9、TIGIT和TIM-3。
23.根据实施方案21或22所述的NK细胞，其中所述检查点抑制受体选自CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)和CD279(PD-1)。
24.根据实施方案21-23中任一项所述的NK细胞，其为KHYG-1的衍生物。
25.NK细胞，其表达对TRAIL诱饵受体具有降低的亲和力或不具有亲和力的突变体TRAIL受体。
26.根据实施方案25所述的NK细胞，其为KHYG-1的衍生物。
27.根据实施方案25或26所述的NK细胞，其缺失编码选自以下的检查点抑制受体的基因：CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG-3)、CD279(PD-1)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9、TIGIT和TIM-3。
28.根据前述实施方案中任一项所述的NK细胞或NK细胞系，其不能增殖，例如因照射而增殖。
29.制备修饰的NK细胞或NK细胞系的方法，其包括对细胞或细胞系进行基因修饰以增强其细胞毒性。
30.根据实施方案29所述的方法，其中对NK细胞或NK细胞系进行修饰以减少其抑制性受体功能。
31.根据实施方案30所述的方法，其中抑制性受体为检查点抑制受体。
32.根据实施方案31所述的方法，其中所述检查点抑制受体选自CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG-3)、CD279(PD-1)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9、TIGIT和TIM-3。
33.根据实施方案25-32中任一项所述的方法，其包括修饰所述NK细胞以减少两种或更多种检查点抑制受体的表达。
34.根据实施方案29-33中任一项所述的方法，其包括修饰所述NK细胞或NK细胞系以表达TRAIL配体或突变体TRAIL配体。
35.根据实施方案34所述的方法，其中所述突变体TRAIL配体对TRAIL受体具有增强的亲和力。
36.根据实施方案35所述的方法，其中所述TRAIL受体为DR4和/或DR5。
37.根据实施方案34-36中任一项所述的方法，其中所述突变体TRAIL配体对诱饵TRAIL受体具有降低的亲和力。
38.根据实施方案29-37中任一项所述的方法，其中NK细胞或NK细胞系被修饰以去除检查点抑制受体的功能，并且被修饰以表达对诱饵TRAIL受体具有降低的亲和力或不具有结合亲和力的突变体TRAIL配体。
39.根据实施方案38所述的方法，其中所述NK细胞或NK细胞系被修饰以表达CAR或双特异性CAR。
40.根据实施方案39所述的方法，其中所述双特异性CAR在一种细胞类型上结合两种配体。
41.根据实施方案39所述的方法，其中所述双特异性CAR在两种不同细胞类型中的每一种上结合一种配体。
42.根据实施方案39所述的方法，其中所述CAR或双特异性CAR的配体在癌细胞上表达。
43.根据实施方案40所述的方法，其中所述双特异性CAR的配体均在癌细胞上表达。
44.根据实施方案41所述的方法，其中所述双特异性CAR的配体在癌细胞和免疫效应细胞上表达。
45.根据实施方案29-44中任一项所述的方法，其中所述NK细胞或NK细胞系被修饰以表达一种或多种Fc受体。
46.根据实施方案45所述的方法，其中所述Fc受体选自CD16(FcRIII)、CD32(FcRII)和CD64(FcRI)。
47.根据实施方案29-46中任一项所述的方法，其中所述细胞系是KHYG-1细胞系的衍生物。
48.NK细胞或NK细胞系，其通过实施方案29-47中任一项所述的方法获得。
49.KHYG-1衍生物，其通过实施方案28-48中任一项所述的方法获得。
50.具有增强的细胞毒性的修饰的NK细胞、NK细胞系或其组合物用于治疗患者的癌症的用途。
51.根据实施方案1-28中任一项所述的NK细胞或NK细胞系、或根据实施方案29-49中任一项获得的NK细胞或NK细胞系用于实施方案50中所述的用途。
52.根据实施方案50或51所述的修饰的NK细胞、NK细胞系或组合物的用途，其中所述癌症是血癌。
53.根据实施方案52所述的修饰的NK细胞、NK细胞系或组合物的用途，其中所述血癌是急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(包括T细胞淋巴瘤和B细胞淋巴瘤)、无症状骨髓瘤、阴燃多发性骨髓瘤(SMM)、活动性骨髓瘤或轻链骨髓瘤。
54.通过减少KHYG-1细胞中的检查点抑制受体表达或在KHYG-1细胞中表达突变体TRAIL配体或二者获得的作为KYHG-1衍生物的NK细胞系用于治疗血癌的用途。
实施例
现在更详细地描述与NK细胞系KHYG-1衍生物的制备相关的本发明，所述NK细胞系KHYG-1衍生物被修饰成表现出更多的细胞毒活性，因此显示导致人体中白血病细胞死亡的能力。
附图说明
现在参照附图以具体实施方案的形式说明本发明，其中：
图1显示了LIR2基因靶区域的DNA序列并标记了gRNA侧翼区域；
图2显示了CTLA4基因靶区域的DNA序列并标记了gRNA侧翼区域；
图3显示了用于转染的gRNA构建体(表达载体)；
图4显示了转染前后亲本和突变LIR2 DNA的凝胶电泳条带；
图5显示转染前后亲本和突变CTLA4 DNA的凝胶电泳条带；
图6A是显示使用电穿孔成功进行CD96敲低的FACS图；
图6B是显示使用电穿孔成功进行CD96敲低的FACS图；
图7是显示CD96敲低KHYG-1细胞在不同E:T比例下对K562细胞具有增强的细胞毒性的条形图；
图8显示NK-92细胞中CD328(Siglec-7)的敲低；
图9显示具有CD328(Siglec-7)敲低的NK细胞的增强的细胞毒性；
图10显示TRAIL在KHYG-1细胞上的基线表达的FACS图；
图11显示了转染KHYG-1细胞后TRAIL和TRAIL变体的表达的FACS图。
图12显示了转染KHYG-1细胞后的CD107a的表达的FACS图。
图13显示了用TRAIL和TRAIL变体转染KHYG-1细胞对细胞活力的影响；
图14显示了KHYG-1细胞和NK-92细胞上DR4、DR5、DcR1和DcR2的基线表达的FACS图；
图15、16和17分别显示TRAIL或TRAIL变体在KHYG-1细胞中表达对三种靶细胞群K562、RPMI8226和MM1S的凋亡的作用；
图18分别显示RPMI8226细胞和MM1.S细胞上的DR5表达的两个FACS图，其中显示了硼替佐米治疗对DR5表达的作用；
图19显示与具有/不具有TRAIL变体的KHYG-1细胞共培养的硼替佐米预处理/未处理的MM1.S细胞的细胞凋亡的FACS图；
图20显示了用100nM CMA处理2小时的KHYG-1细胞中穿孔素表达水平的FACS图。
图21显示用100nM CMA或赋形剂处理后的KHYG-1细胞活力的FACS图；
图22显示与具有/不具有TRAIL变体的KHYG-1细胞共培养并且用/不用CMA预处理的MM1.S细胞的细胞凋亡的FACS图；
图23显示了与具有CD96-siRNA和/或TRAIL变体表达的KHYG-1细胞共培养的K562细胞的细胞凋亡的FACS图；和
图24显示了与具有CD96-siRNA和/或TRAIL变体表达的KHYG-1细胞共培养的MM1.S细胞的细胞凋亡的FACS图。
下文中提到DNA、RNA和氨基酸序列，其中：
SEQ ID NO:1是完整的LIR2 DNA序列；
SEQ ID NO:2是LIR2氨基酸序列；
SEQ ID NO:3是LIR2 g9 gRNA序列；
SEQ ID NO:4是LIR2 g18 gRNA序列；
SEQ ID NO:5是LIR2正向引物序列；
SEQ ID NO:6是LIR2反向引物序列；
SEQ ID NO:7是完整的CTLA4 DNA序列；
SEQ ID NO:8是CTLA4氨基酸序列；
SEQ ID NO:9是CTLA4 g7 gRNA序列；
SEQ ID NO:10是CTLA4 g15 gRNA序列；
SEQ ID NO:11是CTLA4正向引物序列；和
SEQ ID NO:12是CTLA4反向引物序列。
实施例1抑制性受体功能的敲除
CRISPR/Cas9
按照如下方式制备细胞，其抑制性受体功能被去除。设计并制备了gRNA构建体以靶向NK细胞的人类基因组中编码“经典”抑制性受体LIR2和“检查点”抑制受体CTLA4的基因。然后使用CRISPR/Cas9基因组编辑敲除LIR2和CTLA4靶基因。
为每个靶基因选择两个gRNA候选物，并确定它们在K562细胞中的切割效率。表1中显示了gRNA候选序列，而原型间隔序列毗邻基序(Protospacer Adjacent Motif，PAM)涉及该序列的最后3个碱基。LIR2基因(SEQ ID NO:1)和CTLA4基因(SEQ ID NO:7)上的gRNA序列的侧翼区分别显示在图1和图2中。
Figure BDA0003802652020000211
Figure BDA0003802652020000221
表1.gRNA候选物和序列
用制备的gRNA构建体转染K562细胞(图3)，随后收获用于PCR扩增。使用存在GFP表达来报告gRNA构建体被成功并入K562细胞中。这证实了Cas9基因的表达，从而证实敲除LIR2和CTLA4基因的表达的能力。
使用体外错配检测测定来确定gRNA构建体的切割活性。T7E1核酸内切酶I识别并切割非完全匹配的DNA，使得能够将亲本LIR2和CTLA4基因与CRISPR/Cas9转染和非同源末端连接(NHEJ)后的突变基因进行比较。
图4显示了用g9和g18 gRNA序列敲除LIR2基因后，琼脂糖凝胶电泳后产生的条带。对应于每种突变的三条带与转染后在DNA序列中检测到错配后的亲本基因和两条所得的链相关。g9 gRNA序列导致11％的转染成功率，而g18 gRNA导致10％的转染成功率。
图5显示了在用g7和g15 gRNA序列敲除CTLA4基因后，琼脂糖凝胶电泳后产生的条带。g7 gRNA序列导致32％的转染成功率，而g15 gRNA导致26％的转染成功率。
在K562细胞中成功敲除LIR2和CTLA4之后，用gRNA构建体转染KHYG-1细胞。
选择具有纯合缺失的KHYG-1衍生克隆。为此使用Cas9/嘌呤霉素乙酰转移酶(PAC)表达载体。根据它们对抗生素嘌呤霉素的抗性选择成功转染的细胞。
Cas9 RNP
另一种用于在NK细胞中敲除检查点抑制受体的方案是Cas9 RNP转染。使用该方案的优点是与使用CRISPR/Cas9方案的DNA质粒相比，可以实现类似的转染效率，但是具有显著较低的毒性。
每个转染实验收获1×106个KHYG1细胞。用PBS洗涤细胞并在离心机中旋转离心。弃去上清液。然后按照如下方法制备CRISPR RNP(RNA结合蛋白)材料：
(1)制备所需的合成的crRNA和tRNA(购自Dharmacon)的20μM溶液。
(2)将4μl crRNA(20μM)和4μl tRNA(20μM)混合在一起。
(3)然后将混合物加入到2μl Cas9蛋白质(5μg/μl)中。
(4)将所有组分混合并在室温下孵育10分钟。
Figure BDA0003802652020000231
转染系统之后，将细胞与Cas9 RNP混合，使用以下参数进行电穿孔：
电压：1450V
脉冲宽度：30ms
脉冲数：1
然后将细胞转移到含有生长培养基(包括IL-2和IL-15)的12孔板的一个孔中。
48-72小时后收获细胞以通过T7核酸内切酶测定和/或Sanger测序确认基因编辑效率。确认了插入缺失(indel)的存在，表明在KHYG1细胞中成功地敲除了CTLA4、PD1和CD96。
位点特异性核酸酶
另一种用于在NK细胞中敲除检查点抑制受体的方案是XTN TALEN转染。使用该方案的优点是与野生型CRISPR相比可以实现特别高水平的特异性。
步骤1：试剂的制备
测定KHYG-1细胞的某些属性，包括转染效率、单细胞克隆效率和核型/拷贝数。然后根据供应商的建议培养细胞。
取决于检查点抑制受体被敲除，通过定制设计至少2对XTN TALEN来制备核酸酶。定制设计的步骤包括评估基因位点、拷贝数和功能评估(即同系物、脱靶评估)。
步骤2：细胞系工程
用步骤1的核酸酶转染细胞；为了获得高水平的切割，将该步骤重复多达3次，在每次转染之前将培养物分开并保持中间培养物。
每次转染后几天进行初次筛选；通过Cel-1测定法测试细胞池的切割效率。在重复转染后切割水平达到可接受的水平或平台期之后，认为细胞准备进行单细胞克隆。
将混合的细胞在96孔板中每孔分选一个细胞；用于每个池的板数取决于在步骤1中确定的单细胞克隆效率。将板孵育3-4周。
第3步-筛选和扩增
一旦细胞在96孔板中汇合，将培养物合并并分成三块96孔板；将一块板冷冻作为备份，将一块板重新铺板以继续克隆的扩增，并将最后一块板用于基因型确认。
分析基因型板中的每个克隆的qPCR信号的丢失，表明所有的等位基因已被修饰。将阴性克隆进行PCR扩增并克隆以确定插入缺失片段的性质以及任何野生型缺失或框内插入缺失片段。
将具有被证实的敲除的克隆合并到仅一个24孔板，并进一步扩增；对于每个敲除，通常制备5-10个冷冻小瓶，每个小瓶含有1×106个细胞，用于最多5个个体克隆。
第4步-验证
细胞在无菌条件下储存。
所有储存的细胞的基本释放标准包括活细胞数量(预冷冻和解冻后)，通过STR确认身份，基本无菌保证和支原体检测；在必要时应用其他释放标准(核型、表面标志物表达、高水平无菌、转录物或蛋白质的敲除评估等)。
实施例2通过RNAi敲除检查点抑制受体CD96功能
KHYG-1细胞中CD96的siRNA敲低通过电穿孔进行。一起使用Nucleofection Kit T与来自龙沙(Lonza)的Amaxa Nucleofector II，因为其适用于细胞系，可以成功转染分裂细胞和非分裂细胞，实现高达90％的转染效率。
对照siRNA(目录号：sc-37007)和CD96 siRNA(目录号：sc-45460)获自圣克鲁斯生物技术(Santa Cruz Biotechnology)。使用含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺的无抗生素RPMI-1640进行细胞核转染后培养。从Biolegend获得小鼠抗人CD96-APC(目录号：338409)用于染色。
制备20μM的siRNA储备溶液。将33μl无RNA酶的水(siRNA稀释缓冲液：sc-29527)中的冻干siRNA双链体重悬于在165μl无RNA酶的水中的用于靶基因siRNA(siRNA CD96)的FITC-对照/对照-siRNA。。将管加热至90℃1分钟，然后在37℃下孵育60分钟。然后将siRNA储备溶液储存在-20℃直至需要的时候。
因为细胞必须处于对数生长期，所以核转染前1-2天对KHYG-1细胞进行传代。
将Nucleofector溶液升温至室温(每个样品100ul)。将含有血清和补充物的培养基的等分试样也在37℃下在50ml试管中预热。通过加入1.5ml含有血清和补充物的培养基来制备6孔板。将板在潮湿的37℃/5％CO2培养箱中预孵育。
100μl细胞核转染溶液中的2×106个细胞与4μl 20μM siRNA溶液(1.5μg siRNA)轻轻混合。混合过程中避免气泡。将混合物转移到Amaxa认证的比色皿中，并放入Nucleofector比色皿支架并选择U-001程序。
使程序完成，立即取出比色皿中的样本。然后将500μl预先平衡的培养基添加到每个比色皿中。然后将每个比色皿中的样品轻轻转移到制备的6孔板的相应孔中，以确定每孔2ml的最终体积。
然后将细胞在加湿的37℃/5％CO2培养箱中孵育直至进行转染分析。电穿孔后16-24小时进行流式细胞术分析，以测量CD96表达水平。将该电穿孔方案进行多次，发现在KHYG-1细胞中可靠地导致CD96敲低(参见例如图6A和6B)。
实施例3具有CD96敲低的NK细胞的增强的细胞毒性
将具有和不具有CD96敲低的KHYG-1细胞与K562细胞以不同的效应物:靶标(E:T)比例共培养。
在共培养4小时后使用来自珀金埃尔默(PerkinElmer)的DELFIA EuTDA细胞毒性试剂盒(目录号：AD0116)测量细胞毒性。
将靶细胞K562在含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和抗生素的RPMI-1640培养基中培养。从SARSTEDT购买96孔V型底板(目录号：83.3926)。使用艾本德(Eppendorf)离心机5810R(带有板转子)对板进行离心。使用VARIOSKAN FLASH(使用ScanIt软件2.4.3)来测量由溶解的K562细胞产生的荧光信号。
用培养基洗涤K562细胞，用培养基将细胞数调节至1×106细胞/mL。将2-4mL的细胞加入到5μl的BATDA试剂中并在37℃下孵育10分钟。在细胞内，酯键被水解形成不再穿过膜的亲水性配体。将细胞在1500RPM下离心5分钟以洗涤加载的K562细胞。用含有1mM丙磺舒(Sigma P8761)的培养基重复3-5次。最后一次洗涤后，将细胞沉淀重新悬浮于培养基中并调整至约5×104个细胞/mL。
设置孔用于检测背景、自发释放和最大释放。将100μL负载的靶细胞(5,000个细胞)转移至V型底的板的孔中，并且以不同的细胞浓度添加100μL效应细胞(KHYG-1细胞)，以使效应物与靶标比例在1:1到20:1的范围内。将板以100×g离心1分钟，并在37℃于潮湿的5％CO2气氛中孵育4小时。对于最大释放孔，在收获培养基之前15分钟将10μL细胞溶解缓冲液加入到每个孔中。将平板以500×g离心5分钟。
将20μL上清液转移到平底96孔板中，加入200μL预热的铕溶液。使用板振荡仪将其在室温下孵育15分钟。由于K562细胞被KHYG-1细胞溶解，它们释放配体到培养基中。然后该配体与铕溶液反应形成荧光螯合物，该荧光螯合物与溶解的细胞量直接相关。
然后使用VARIOSKAN FLASH在时间分辨荧光计中测量荧光。具体释放是用下面的公式计算的：
％具体释放＝实验释放-自发释放/最大释放-自发释放
使用Graphpad Prism 6.04软件进行统计分析。使用配对t检验来比较siRNA CD96敲低KHYG-1细胞与对照组(n＝3)之间的差异。
发现在含有CD96敲低KHYG-1细胞的共培养物中特异性释放显著增加。所有的E:T比例都是如此(见图7)。
由于荧光与细胞溶解直接相关，证实敲低KHYG-1细胞中的CD96表达使其杀死K562癌靶细胞的能力增强。
实施例4具有CD328(Siglec-7)敲低的NK细胞的增强的细胞毒性
在NK-92细胞中SiRNA介导的CD328敲低
材料、试剂和仪器
对照siRNA(目录号：sc-37007)和CD328siRNA(目录号：sc-106757)购自圣克鲁斯生物技术。为了使用NucleofectorTM装置(Nucleofector II，龙沙)在NK-92细胞中以高细胞存活率(>75％)获得高达90％的转染效率，使用来自龙沙的NucleofectorTM试剂盒T。含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺且不含抗生素的RPMI-1640用于核转染后(post-Nucleofection)培养。小鼠抗人CD328-APC(目录号：339206)购自Biolegend。
方案
制备10μM的siRNA储备液
·，将66μl无RNA酶的水(siRNA稀释缓冲液：sc-29527)中的冻干siRNA双链体重悬于在330μl无RNA酶的水中的用于靶基因siRNA(siRNA CD328)的FITC-对照/对照-siRNA。
·将试管加热至90℃1分钟。
·37℃孵育60分钟。
·如果不直接使用，将siRNA储备液在-20℃下保存。
·一个核转染样品包含(对于100μl标准比色皿)
·细胞数量：2×106个细胞
·siRNA：4μl的10μM储备液
Nucleofector溶液：100μl
核转染
·培养所需数量的细胞。(核转染前一天或两天进行传代，细胞必须处于对数生长期)。
·为每个样品准备siRNA。
·将Nucleofector溶液预热至室温(每个样品100μl)。
·于50ml试管中在37℃下预热含有血清和补充物的培养基的等分试样。通过填充1.5毫升包含血清和补充物的培养基制备6孔板，并在加湿的37℃/5％CO2培养箱中对板进行预先孵育。
·取一小份细胞培养物并计数细胞以确定细胞密度。
·以1500rpm离心所需数量的细胞5分钟。完全丢弃上清液，使残留的培养基覆盖细胞沉淀。
·将细胞沉淀重悬于室温Nucleofector溶液中至最终浓度为2×106个细胞/100μl。避免将细胞悬液在Nucleofector溶液中储存超过15-20分钟，因为这会降低细胞活力和基因转移效率。
·将100μl细胞悬液与siRNA混合。
·将样品转移到amaxa认证的比色皿中。确保样品覆盖比色皿的底部，避免移液时产生气泡。用蓝色盖子关闭比色皿。
·选择合适的Nucleofector程序(A-024用于NK-92细胞)。将比色皿插入比色皿支架(Nucleofector II：顺时针旋转转盘至最终位置)，然后按下“x”按钮启动程序。
·为避免损伤细胞，程序结束(显示屏显示“OK”)后立即从比色皿中取出样品。将500μl预热的培养基添加到比色皿中，并将样品转移到制备好的6孔板中。
·在潮湿的37℃/5％CO2培养箱中孵育细胞。16-24小时后进行流式细胞分析和细胞毒性测定。
结果：我们遵循上述方案，并对NK-92细胞中的CD328表达水平进行流式细胞分析。一个代表性实验的结果显示在图8中，其证实了成功的敲低。
敲低CD328增强细胞毒性
材料、试剂和仪器
基于荧光增强配体的DELFIA EuTDA细胞毒性试剂盒(目录号：AD0116)购自珀金埃尔默。将靶细胞K562在含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和抗生素的RPMI-1640培养基中培养。从SARSTEDT购买96孔V型底的板(目录号：83.3926)。使用Eppendrof离心机5810R(带有板转子)对板进行离心。使用VARIOSKAN FLASH(使用ScanIt软件2.4.3)来测量由溶解的K562细胞产生的荧光信号。
方案
·用荧光增强配体DELFIA BATDA试剂加载K562细胞
·用培养基清洗K562细胞，用培养基将细胞数调节至1×106个细胞/mL。添加2-4毫升的细胞到5微升的BATDA试剂中，在37℃孵育10分钟。
·在1500RPM下离心5分钟以用含有1mM丙磺舒(Sigma P8761)的培养基洗涤装载的K562细胞3-5次。
·最后一次洗涤后，将细胞沉淀重悬在培养基中，并调节至约5×104细胞/mL。
细胞毒性测定
·设置孔用于检测背景、自发释放和最大释放。
·将100μL加载的目标细胞(5,000个细胞)吸移到V型底的板。
·加入100μL不同细胞浓度的效应细胞(NK-92)。效应物与靶标的比例范围为1:1到20:1。
·以100×g的RCF将板离心1分钟。
·在37℃下于潮湿的5％CO2环境中孵育2小时。对于最大释放孔，在收获培养基之前15分钟向每个孔中加入10μL细胞溶解缓冲液。
·以500×g将板离心5分钟。
·将20μL上清液转移至平底96孔板中，加入200μL预热的铕溶液，使用板振荡仪在室温下孵育15分钟。
·使用VARIOSKAN FLASH在时间分辨荧光计中测量荧光。用下面的公式计算具体释放：
·％具体释放＝实验释放-自发释放/最大释放-自发释放
结果：我们按照上述操作确定CD328敲低对细胞毒性的影响。一个代表性实验的结果显示在图9中。显然，在具有CD328敲低的细胞中针对靶细胞的细胞毒性增强。
实施例5通过检查点抑制受体的敲低/敲除进行的血癌治疗方案
如上述实施例所示，检查点抑制受体功能可以通过多种方式敲低或敲除。开发了以下方案用于治疗血癌患者：
在诊断出患者患有适合使用本发明治疗的癌症后，可以将修饰的NK细胞的等份试样解冻并培养，然后施用于患者。
或者，如上所述，可以使用例如siRNA在一天或两天内进行瞬时突变。MaxCyteFlow电穿孔平台为实现快速大规模临床转染提供了一个合适的解决方案。
某些检查点抑制受体的去除可能比其他方法更有利。这可能取决于患者和癌症。出于这个原因，任选地对癌症进行活检，并使癌细胞在离体培养物中生长。因此，可以测试具有不同检查点抑制受体修饰的一系列NK细胞对特定癌症的细胞毒性。该步骤可用于选择最适合的NK细胞或其衍生物用于治疗。
在成功修饰之后，将细胞重悬于合适的载体(例如生理盐水)中，用于静脉内和/或瘤内注射到患者体内。
实施例6 KHYG-1敲入TRAIL/TRAIL变体
用TRAIL和TRAIL变体转染KHYG-1细胞，以评估它们在转染后杀死癌细胞的生存力和能力。
所使用的TRAIL变体是在WO 2009/077857中描述的变体。它由含有D269H/E195R突变的野生型TRAIL基因编码。该突变显著增强TRAIL变体对DR5的亲和力，同时降低对两种诱饵受体(DcR1和DcR2)的亲和力。
基线TRAIL表达
使用流式细胞术测定KHYG-1细胞中的基线TRAIL(CD253)表达。
使用小鼠抗人CD253-APC(Biolegend目录号：308210)和同种型对照(Biolegend目录号：400122)染色细胞样品，并在BD FACS Canto II流式细胞仪上进行分析。
将KHYG-1细胞在含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、青霉素(100U/mL)/链霉素(100mg/mL)和IL-2(10ng/mL)的RPMI 1640培养基中培养。通过离心(1500rpm×5分钟)收集0.5-1.0×106个细胞/试验，并吸出上清液。用4mL冰冷的FACS缓冲液(PBS，0.5-1％BSA，0.1％NaN3叠氮化钠)洗涤细胞(单细胞悬浮液)。将细胞重悬于100μL冰冷的FACS缓冲液中，向每个管中加入5μL抗体并在冰上孵育30分钟。通过在1500rpm离心5分钟将细胞洗涤3次。然后将细胞重新悬浮在500μL冰冷的FACS缓冲液中并在冰上临时避光保存。
随后在流式细胞仪(BD FACS Canto II)上分析细胞，使用FlowJo 7.6.2软件处理生成的数据。
如图10所示，FACS分析显示TRAIL在KHYG-1细胞表面的弱基线表达。
通过电穿孔敲入TRAIL/TRAIL变体
野生型TRAIL mRNA和TRAIL变体(D269H/195R)mRNA由TriLink BioTechnologies合成，等分并在-80℃下保存。小鼠抗人CD253-APC(Biolegend目录号：308210)和同种型对照(Biolegend目录号：400122)、与小鼠抗人CD107a-PE(eBioscience目录号：12-1079-42)和同种型对照(eBioscience目录编号：12-4714)抗体用于染色细胞样品，并在BD FACSCanto II流式细胞仪上分析。使用DNA染料SYTOX-绿色(生命技术公司(LifeTechnologies)目录号：S7020；5mM的DMSO溶液)。为了使用NucleofectorTM装置(Nucleofector II，龙沙)在KHYG-1细胞中以高细胞存活率获得高达90％的转染效率，使用来自龙沙的NucleofectorTM试剂盒T。使用含有10％FBS、L-谷氨酰胺(2mM)和IL-2(10ng/mL)的不含抗生素的RPMI 1640进行核转染后培养。
核转染前1或2天对KHYG-1和NK-92细胞进行传代，因为细胞必须处于对数生长期。将Nucleofector溶液(每个样品100μl)连同含有血清和补充物的培养基的等分试样在37℃下在50mL试管中预先温热至室温。通过填充1.5mL含有血清和补充物的培养基制备6孔板，并在潮湿的37℃/5％CO2培养箱中预孵育。制备等分的细胞培养物并计数细胞以确定细胞密度。将所需数量的细胞以1500rpm离心5分钟，然后完全丢弃上清液。将细胞沉淀物重新悬浮于室温Nucleofector溶液至最终浓度为2×106个细胞/100μl(最大悬浮时间＝20分钟)。将100μl细胞悬液与10μg mRNA(RNA体积<10μL)混合。样品被转移到Amaxa认证的比色皿(确保样品覆盖比色皿底部，避免气泡)。选择适当的Nucleofector程序(即用于KHYG-1细胞的U-001)。然后将比色皿插入比色皿支架。将500μl预热的培养基添加到比色皿中，并在程序结束后立即将样品转移到制备好的6孔板中，以避免损伤细胞。细胞在潮湿的37℃/5％CO2培养箱中孵育。电穿孔后12-16小时进行流式细胞分析和细胞毒性测定。按照上述操作进行流式细胞术染色。
从图11和图12中可以看出，TRAIL/TRAIL变体和CD107a(NK激活标志物)的表达在转染后增加，证实TRAIL基因成功敲入KHYG-1细胞。
图13提供了通过电穿孔转染之前和之后的KHYG-1细胞活力的证据。可以看出，在用TRAIL/TRAIL变体转染细胞后没有观察到细胞存活率的统计学上的显著差异，证实野生型或变体TRAIL的表达对细胞无毒性。该观察结果与NK-92细胞中的相应发现相矛盾，NK-92细胞中的相应发现显示TRAIL变体基因敲入对细胞有毒性(数据未显示)。尽管如此，这可能是通过NK-92细胞表面TRAIL受体DR4和DR5相对较高的表达水平来解释(见图14)。
TRAIL/TRAIL变体对KHYG-1细胞的细胞毒性的影响
使用小鼠抗人CD2-APC抗体(BD Pharmingen目录号：560642)。使用膜联蛋白V-FITC抗体(ImmunoTools目录号：31490013)。使用DNA染料SYTOX-绿色(生命技术公司目录号：S7020)。使用24孔细胞培养板(SARSTEDT AG目录号：83.3922)。使用骨髓性白血病细胞系K562、多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226和MM1.S作为靶细胞。K562、RPMI8226、MM1.S在含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和青霉素(100U/mL)/链霉素(100mg/mL)的RPMI 1640培养基中培养。
如上所述，用TRAIL/TRAIL变体转染KHYG-1细胞。
将靶细胞洗涤并通过在1500rpm下离心5分钟沉淀。将转染的KHYG-1细胞稀释至0.5×106/mL。然后在预热的RPMI 1640培养基中调节靶细胞密度，以使效应物:靶标(E:T)比例为1:1。
然后将0.5mL KHYG-1细胞和0.5mL靶细胞在24孔培养板中混合，并置于潮湿的37℃/5％CO2培养箱中12小时。然后用流式细胞术分析测定KHYG-1细胞的细胞毒性；洗涤共培养的细胞(在不同的时间点)，然后用CD2-APC抗体(5μL/测试)、Annexin V-FITC(5μL/测试)和SYTOX-绿色(5μL/测试)以及Annexin V结合缓冲液染色。
使用FlowJo 7.6.2软件进一步分析数据。设置CD2阳性和CD2阴性门(gate)，分别代表KHYG-1细胞和靶细胞群体。然后分析CD2阴性群体中的膜联蛋白V-FITC和SYTOX-绿色阳性细胞的TRAIL诱导的凋亡。
图15、16和17分别显示了表达TRAIL或TRAIL变体的KHYG-1细胞对三种靶细胞系K562、RPMI8226和MM1.S的凋亡的作用。对于所有靶细胞群体而言，与正常KHYG-1细胞(未用TRAIL转染)相比，TRAIL在KHYG-1细胞上的表达增加了凋亡水平。此外，与用野生型TRAIL转染的KHYG-1细胞相比，KHYG-1细胞上的TRAIL变体表达进一步增加了所有靶细胞系中的细胞凋亡。
表达TRAIL变体的本发明的细胞由于表现出对死亡受体DR5的更高亲和力而在癌症治疗中具有显著优势。当癌细胞受到本发明的这些细胞的攻击时，通过某种途径防止了癌细胞发展防御策略以规避死亡。因此，癌症不能通过上调TRAIL诱饵受体来有效地规避TRAIL诱导的细胞死亡，因为本发明的细胞被修饰以便在那些情况下仍然保持细胞毒性。
实施例7使用敲入TRAIL变体的NK细胞进行血癌治疗的方案
如以上实施例6中所述，用TRAIL变体转染KHYG-1细胞。开发了用于治疗血癌患者的以下方案：
在诊断患者患有适合用本发明治疗的癌症后，在施用修饰的NK细胞之前可以施用DR5诱导剂硼替佐米，因此以低剂量使用DR5诱导剂以上调DR5在癌症上的表达，使得修饰的NK细胞疗法更有效。
然后将等分试样的修饰的NK细胞解冻、培养并施用于患者。
由于与野生型TRAIL相比，用于治疗的NK细胞表达的TRAIL变体对诱饵受体的亲和力较低，因此死亡受体在癌细胞表面上的结合增加，因此导致更多的癌细胞凋亡。
在实施上述方案之前的另一种选择是离体活检癌症并培养癌细胞。该步骤可用于鉴定表达特别高水平的诱饵受体和/或低水平的死亡受体的癌症，以帮助确定DR5诱导剂是否适合给定患者。该步骤也可以在采用上述方案进行治疗期间进行，因为给定的癌症可能能够适应以例如减少DR5的表达，因此可能适合于部分使用DR5诱导剂进行治疗。
实施例8低剂量硼替佐米使癌细胞对表达TRAIL变体的NK细胞敏感
硼替佐米(Bt)是一种蛋白酶体抑制剂(化疗样药物)，用于治疗多发性骨髓瘤(MM)。已知硼替佐米在几种不同类型的癌细胞(包括MM细胞)上上调DR5表达。
如上文实施例6中所述，用TRAIL变体转染KHYG-1细胞，然后用于靶向MM细胞，其暴露或不暴露于硼替佐米。
硼替佐米诱导的DR5表达
硼替佐米是从千禧制药(Millennium Pharmaceuticals)公司购买的。小鼠抗人DR5-AF647(目录号：565498)购自BD Pharmingen。在BD FACS Canto II上分析染色的细胞样品。
(1)MM细胞系RPMI8226和MM1.S在补充有2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES、24mM碳酸氢钠、0.01％抗生素和10％胎牛血清(西格玛(Sigma)，圣路易，MO，美国)的RPMI1640培养基(西格玛，圣路易，MO，美国)在37℃下于5％CO2气氛中生长。
(2)将MM细胞以1×106/mL、2mL/孔接种在6孔板中。
(3)然后将MM细胞用不同剂量的硼替佐米处理24小时。
(4)然后通过流式细胞术分析经硼替佐米处理/未处理的MM细胞中的DR5表达(图18)。
发现低剂量硼替佐米处理增加了两种MM细胞系中的DR5表达(图18)。DR5上调与细胞凋亡的少量诱导有关(数据未显示)。然而，发现高剂量的硼替佐米不能上调DR5表达，这是由于高毒性导致大部分MM细胞死亡。
硼替佐米诱导的癌细胞敏化
如以上实施例6中所述，用TRAIL变体(TRAIL D269H/E195R)转染KHYG-1细胞。
(1)将硼替佐米处理/未处理的MM1.S细胞用作靶细胞。将MM1.S细胞用2.5nM的硼替佐米或赋形剂(对照)处理24小时。
(2)TRAIL变体mRNA电穿孔6小时后，在12孔板中用MM细胞培养KHYG-1细胞。洗涤后，将细胞浓度调节至1×106/mL，然后以1:1的比例混合KHYG-1和MM1.S细胞以培养12小时。
(3)进行KHYG-1细胞的细胞毒性的流式细胞分析。收集共培养的细胞，洗涤，然后用膜联蛋白V结合缓冲液以及CD2-APC抗体(5uL/测试)、膜联蛋白V-FITC(5uL/测试)和SYTOX-绿色(5uL/测试)染色。
(4)使用FlowJo 7.6.2软件进一步分析数据。CD2阴性群体代表MM1.S细胞。KHYG-1细胞对CD2显示强阳性。最后，分析CD2阴性群体中的膜联蛋白V-FITC和SYTOX-绿色阳性细胞。
在硼替佐米预处理的/未处理的MM1.S细胞中进行细胞凋亡的流式细胞分析，所述MM1.S细胞与用/未用TRAIL变体电穿孔的KHYG-1细胞共培养(图19)。
发现硼替佐米诱导MM细胞对表达TRAIL变体的KHYG-1细胞的敏感性。因此，数据表明诱导DR5表达的试剂在增加对癌细胞的细胞毒性的模型中是有效的，因此可用于增强本发明的癌症治疗。
实施例9 TRAIL变体诱导细胞凋亡的证实
尽管先前实施例中有由TRAIL变体表达引起的NK细胞细胞毒性增加的确凿证据，但是我们希望确认增强的细胞毒性是由诱导癌细胞凋亡(最可能)所致还是由于无意中激活NK细胞以表现出更多的细胞毒性表型并因此通过穿孔素分泌杀死癌细胞所致。
已证明可卡因霉素A(CMA)能抑制穿孔素介导的NK细胞的细胞毒活性，这主要是由于细胞溶解颗粒的pH上升导致穿孔素加速降解。我们研究了当穿孔素介导的细胞毒性被CMA部分消除时，是否突出了表达TRAIL变体的KHYG-1细胞的细胞毒性。
CMA诱导的穿孔素表达降低
从BD pharmingen购买小鼠抗人穿孔素-AF647(目录号：563576)。刀豆素A(目录号：SC-202111)购自圣克鲁斯生物技术。使用BD FACS Canto II分析染色的细胞样品。
(1)将KHYG-1细胞在含10％FBS(胎牛血清)、2mM L-谷氨酰胺，青霉素(100U/mL)/链霉素(100mg/mL)和IL-2(10ng/毫升)的RPMI1640培养基中培养。
(2)进一步用100nM CMA或等体积的载体(DMSO)处理KHYG-1细胞(电穿孔后6小时，在不含青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中培养)2小时。
(3)通过离心(1500rpm×5分钟)收集细胞(1×106个细胞/测试)，吸出上清液。
(4)将细胞在室温下在4％多聚甲醛的PBS溶液中固定15分钟。
(5)将细胞用4mL FACS缓冲液(PBS、0.5-1％BSA、0.1％叠氮化钠)洗涤两次。
(6)将细胞用1mL PBS/0.1％皂角苷缓冲液在室温下透化30分钟。
(7)将细胞用4mL PBS/0.1％皂角苷缓冲液洗涤。
(8)将细胞重新悬浮于100μL PBS/0.1％皂角苷缓冲液中，然后向每个管中加入5μL抗体并在冰上孵育30分钟。
(9)将细胞通过在1500rpm的转速下离心5分钟用PBS/0.1％皂角苷缓冲液洗涤3次。
(10)将细胞重新悬浮于500μL冰冷的FACS缓冲液中，并在冰上避光保存，或在4℃冰箱中短暂保存直至分析。
(11)在流式细胞仪(BD FACS Canto II)上分析细胞。使用FlowJo 7.6.2软件处理数据。
CMA处理显著降低了KHYG-1细胞中的穿孔素表达水平(图20)，并且对KHYG-1细胞的存活率没有负面影响(图21)。
在CMA存在下NK细胞TRAIL变体的细胞毒性
如以上实施例6中所述，用TRAIL变体(TRAIL D269H/E195R)转染KHYG-1细胞。
(1)将MM1.S细胞用作靶细胞。
(2)TRAIL mRNA电穿孔6小时后，用100mM CMA或等体积的载体处理KHYG-1细胞2小时。
(3)用RPMI1640培养基离心洗涤KHYG-1细胞，重悬于含有IL-2的RPMI1640培养基中，调节细胞浓度至1×106/mL。
(4)将MM1.S细胞重悬于含IL-2的RPMI1640培养基中，调节细胞浓度为1×106/mL。
(5)将KHYG-1和MM1.S细胞以1:1的比例混合并共培养12小时。
(6)进行KHYG-1细胞的细胞毒性的流式细胞分析。将共培养的细胞洗涤并用CD2-APC抗体染色(5μL/测试)。
(7)洗涤后，使用膜联蛋白V结合缓冲液以及膜联蛋白V-FITC(5uL/测试)和SYTOX-绿色(5uL/测试)进一步染色。
(8)使用FlowJo 7.6.2软件进一步分析数据。CD2阴性群体代表MM1.S细胞。KHYG-1细胞对CD2显示强阳性。然后分析CD2阴性群体中的膜联蛋白V-FITC和SYTOX-绿色阳性细胞。
再次显示，表达TRAIL变体的NK细胞显示出比缺乏TRAIL变体表达的对照细胞更高的细胞毒性(图22)。然而，在该实施例中，进一步显示CMA不能显著降低表达TRAIL变体的NK细胞的细胞毒活性，与用CMA处理的对照NK细胞获得的发现相反。
显示没有TRAIL变体的NK细胞(对照或模拟NK细胞)在不存在CMA的情况下诱导48％癌细胞死亡，在CMA存在的情况下诱导35.9％癌细胞死亡(图22)。与对照NK细胞相比，表达TRAIL变体的NK细胞能够在CMA存在和不存在的情况下诱导更多的癌细胞死亡。事实上，即使在CMA存在的情况下，表达TRAIL变体的NK细胞也能诱导比CMA不存在的情况下对照NK细胞更多的癌细胞死亡。
因此，该数据显示了TRAIL变体通过不易受穿孔素相关下调影响的机制增加NK细胞对癌细胞的细胞毒性的重要性。由于穿孔素通常被NK细胞用于杀死靶细胞，并且许多癌细胞已经发展了减少NK细胞穿孔素表达的机制，为了逃避细胞毒性攻击，本发明的NK细胞代表了重要的替代方案，其不易受癌细胞引起的毒性减弱的影响。
实施例10在KHYG-1细胞中突变体TRAIL变体与检查点抑制受体CD96敲低的联合表达
当敲低检查点抑制受体CD96表达时，以及当表达TRAIL变体时，观察到NK细胞的细胞毒性增强。我们还测试了两种基因修饰的组合，以激发其对NK细胞的细胞毒性的协同作用。
如实施例2中所述，在KHYG-1细胞中敲低CD96表达。
如以上实施例6中所述，用TRAIL变体(TRAIL D269H/E195R)转染KHYG-1细胞。
(1)电穿孔后12小时将KHYG-1细胞与靶细胞(K562或MM1.S)以1×106/mL的浓度在12孔板(2mL/孔)中共培养12小时。E:T比例为1:1。
(2)共培养12小时后，收集细胞，洗涤，用CD2-APC染色，再次洗涤，进一步用膜联蛋白V-FITC(5uL/测试)和SYTOX-绿色(5uL/测试)以及膜联蛋白V结合缓冲液染色。
(3)使用BD FACS canto II流式细胞仪分析细胞样品。使用FlowJo 7.6.2软件进一步分析数据。CD2阴性群体代表MM1.S细胞。KHYG-1细胞对CD2显示强阳性。然后分析CD2阴性群体中的膜联蛋白V-FITC和SYTOX-绿色阳性细胞。
发现同时敲低CD96表达和在KHYG-1细胞中表达TRAIL变体协同增强了细胞对K562靶细胞(图23)和MM1.S靶细胞(图24)的细胞毒性。这表明，在这两个靶细胞组中，由同时的基因修饰导致的细胞死亡比单独进行的单个修饰导致更多的细胞死亡。
同时，除了获得表明TRAIL突变体/变体的表达增强NK细胞的细胞毒性的进一步证据(图23和24)之外，还获得了表明敲低CD96增强NK细胞的细胞毒性的进一步证据(图23和24)。
因此，本发明提供了用于血癌治疗的NK细胞和细胞系及其制备。

Claims (21)

1.人类天然杀伤(NK)细胞或NK细胞系，其被基因修饰以减少一种或多种检查点抑制受体的表达，所述检查点抑制受体选自CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG-3)、CD279(PD-1)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9、TIGIT和TIM-3。
2.根据权利要求1所述的人类NK细胞或NK细胞系，其中所述检查点抑制受体选自CD96(TACTILE)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9和TIGIT。
3.根据权利要求1或2所述的人类NK细胞或NK细胞系，其被修饰以减少两种或更多种检查点抑制受体的表达。
4.根据权利要求1所述的人类NK细胞或NK细胞系，其被修饰以表达突变TRAIL配体。
5.根据权利要求4所述的人类NK细胞或NK细胞系，其中所述突变TRAIL配体对TRAIL受体具有增强的亲和力。
6.根据权利要求5所述的人类NK细胞或NK细胞系，其中所述TRAIL受体为DR4和/或DR5。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的人类NK细胞或NK细胞系，其中所述突变TRAIL配体对诱饵TRAIL受体具有降低的亲和力。
8.根据权利要求1或2所述的人类NK细胞或NK细胞系，还表达嵌合抗原受体(CAR)。
9.根据权利要求8所述的人类NK细胞或NK细胞系，其中所述CAR为双特异性CAR。
10.根据权利要求9所述的人类NK细胞或NK细胞系，其中所述双特异性CAR在一种细胞类型上结合两种配体。
11.根据权利要求9所述的人类NK细胞或NK细胞系，其中所述双特异性CAR在两种不同细胞类型中的每一种上结合一种配体。
12.根据权利要求8所述的人类NK细胞或NK细胞系，其中所述CAR结合CD38。
13.根据权利要求8所述的人类NK细胞或NK细胞系，其中所述CAR结合CLL-1。
14.根据权利要求8所述的人类NK细胞或NK细胞系，其中所述CAR结合SLAMF7。
15.根据权利要求1或2所述的人类NK细胞或NK细胞系，其被进一步修饰以表达选自CD16(FcRIII)、CD32(FcRII)和CD64(FcRI)的一种或多种Fc受体。
16.根据权利要求1或2所述的人类NK细胞或NK细胞系，其中所述细胞系是KHYG-1细胞系的衍生物。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的人类NK细胞或NK细胞系在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
18.根据权利要求17所述的应用，其中所述癌症是实体癌。
19.根据权利要求17所述的应用，其中所述癌症是血癌。
20.根据权利要求19所述的应用，其中所述血癌是急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、霍奇金淋巴瘤、包括T细胞淋巴瘤和B细胞淋巴瘤的非霍奇金淋巴瘤、无症状骨髓瘤、阴燃多发性骨髓瘤(SMM)、活动性骨髓瘤或轻链骨髓瘤。
21.人类NK细胞或NK细胞系在制备用于治疗急性淋巴细胞性白血病(ALL)或多发性骨髓瘤(MM)的药物中的应用，其中所述人类NK细胞或NK细胞系已被基因修饰以减少CD96(TACTILE)或CD328(SIGLEC7)的表达。
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