KR20180028530A - 증가된 세포독성을 갖는 변형된 자연 살해 세포 및 자연 살해 세포주 - Google Patents
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Abstract
NK 세포 및 NK 세포주는 세포독성을 증가시키도록 변형되며, 상기 세포 및 이의 조성물은 암치료에 있어 용도를 갖는다. 변형된 NK 세포 및 NK 세포주의 생산은 체크포인트 억제 수용체 발현을 제거하고/하거나 돌연변이(변이) TRAIL 리간드 발현을 추가하는 유전자 변형을 통해 이루어진다.
Description
본 발명은 세포독성이 더 큰 표현형을 갖는 자연 살해(NK: natural killer) 세포 및 NK 세포주의 유도체를 생산하기 위한 NK 세포 및 NK 세포주의 변형에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 변형된 NK 세포 및 NK 세포주의 제조 방법, 상기 세포 및 세포주를 포함하는 조성물 및 암 치료에 있어 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.
전형적으로, 면역 세포는 표적 세포의 사멸을 결과로 일으키는 면역 반응을 유발하기 전에 표적 세포가 주요 조직 적합성 복합체(MHC: major histocompatibility complex)를 통해 항원을 제시할 것을 요구한다. 이는 MHC I형을 나타내지 않는 암세포가 대다수의 면역 반응을 피할 수 있게 한다.
그러나, NK 세포는 MHC I형의 발현이 없는 경우 암세포를 인식할 수 있다. 따라서, 그 NK 세포는 암에 대한 신체 방어에 중요한 역할을 수행한다.
한편, 특정 상황에서, 암세포는 NK 세포막 상의 억제 수용체에 결합하는 리간드의 발현을 통해 NK 세포의 세포독성 활성을 약화시키는 능력을 나타낸다. 암에 대한 저항성은 이들 요인과 다른 요인 사이의 균형을 수반할 수 있다.
이러한 맥락에서, 세포독성은 면역 이펙터 세포, 예를 들어 NK 세포가, 예를 들어 세포 용해성 화합물을 방출함으로써, 또는 암세포 막 상의 수용체에 결합하여 상기 암세포의 아폽토시스를 유도함으로써, 암세포 사멸을 유도하는 능력을 언급한 것이다. 세포독성은 세포 용해성 화합물의 방출을 유도하는 신호뿐만 아니라 그의 방출을 억제하는 신호에 의해서도 영향을 받는다. 따라서, 세포독성의 증가는, 상기에 언급한 바와 같이, 암세포가 NK의 세포독성 활성을 약화시킬 가능성이 보다 적도록 하면서, 암세포를 더 효과적으로 살해하게 유도할 것이다.
NK 세포 상의 억제 수용체 기능을 제거하는 유전자 변형은 MHC I형 발현이 없지만 NK 세포독성을 약화시킬 수 있는 암세포에 대한 NK 세포의 세포독성을 증가시키는 방법으로서 제안되었다(Bodduluru et al. 2012). NKG2A는 이러한 상황에서 조용하게 할 만한 가치가 있는 억제 수용체로서 확립되었는데, 이는 특정한 암세포가 MHC I형 발현이 없이 NKG2A에 결합하고 NK 세포의 세포독성을 억제하는 MICA를 발현하는 것으로 알려져 있기 때문이다(Shook et al. 2011; WO 2006/023148).
NKG2A 발현을 하향조절하는 또 다른 방법이 NK-92 세포에서 제시되었는데, 상기 세포에서 IL-15를 코딩하는 유전자에 의한 트랜스펙션이 NKG2A 발현의 감소와 관련되는 것으로 제시되었다(Zhang et al. 2004). 그러나, NK 세포의 세포독성의 증가가 관찰되었음에도 불구하고, 그 증가는 활성화 수용체 NKG2D의 발현의 부수적인 증가의 결과일 가능성이 있었다. 이는 NK-92 세포 상의 NKG2A 수용체를 차단하는 것이 다발성 골수종 세포에 대한 세포독성의 증가와 관련되지 않았다는 관찰에 의해 지지된다(Heidenreich et al. 2012). 그럼에도 불구하고, NK-92 세포주가 매우 낮은 발현의 억제 수용체를 지닌 높은 세포독성의 세포주라는 점은 주목할 만한 가치가 있다. 따라서, NKG2A 발현 감소와 관련된 세포독성의 임의의 증가는 너무 미미하여 검출될 수 없었다.
비슷한 연구가 마우스에서 수행되었다. 예를 들어, 마우스는 인간 억제 KIR 수용체와 유사한 NK 세포 상의 Ly49라고 불리는 수용체를 발현한다. 항체 단편으로 Ly49 수용체를 차단함으로써, NK 세포는 세포독성이 더 커서 시험관 내에서 및 생체 내에서 뮤린 백혈병 세포를 살해할 수 있는 것으로 밝혀졌다(Koh et al. 2001).
그러나, 억제 수용체 기능을 감소시킨 결과로, 체내에서 '정상' 세포도 변형된 NK 세포에 의한 공격에 더 민감해지는데, 이는 변형된 NK 세포가 '정상' 세포와 암세포를 더 적게 구별할 수 있기 때문이다. 이것은 '고전적' 억제 수용체 기능을 감소시키는 유의적인 단점이다.
NK 세포가 암세포를 살해하는 것으로 알려진 또 다른 방법은 그의 표면에 TRAIL을 발현하는 것에 의한다. TRAIL 리간드는 암세포 상의 TRAIL 수용체에 결합하여 상기 암세포의 아폽토시스를 유도할 수 있다. 추측에 근거한 한가지 접근법은 이러한 항암 기전을 이용하기 위해서 NK 세포 상에 TRAIL을 과발현하는 것을 기재한다(EP1621550). 또한, IL-12는 NK 세포 상의 TRAIL 발현을 상향조절하는 것으로 보고되었다(Smyth et al. 2001).
그럼에도 불구하고, 암세포는 TRAIL을 발현하는 NK 세포를 상대하기 위한 회피적이고 방어적인 기전을 발전시켰다. 디코이(Decoy) TRAIL 수용체는 종종 암 세포막 상에 발현되며, 이러한 디코이 수용체에 대한 TRAIL의 결합은 아폽토시스를 유도할 수 없다. 이러한 기전을 극복하는 방법은 아직 추구되지 않았다.
급성 골수성 백혈병(AML)은 골수 발생에 관여하는 전구 세포와 관련된 조혈계 악성종양이며, 성인(90%)과 아동(15-20%) 모두에서 급성 백혈병의 유의적인 비율을 차지한다(Hurwitz, Mounce et al. 1995; Lowenberg, Downing et al. 1999). 표준 화학 요법으로 80%의 환자가 완화를 보였지만(Hurwitz, Mounce et al., 1995; Ribeiro, Razzouk et al 2005), 미세 잔존 질환(MRD: minimal residual disease)으로 인한 높은 재발률 때문에 생존은 만족스럽지 못하게 유지된다. 5년 생존은 연령에 따라 다르다; 아동에서 60%(Rubnitz 2012), 65세 미만의 성인에서 40%(Lowenberg, Downing et al. 1999), 65세 이상의 성인에서 10%(Ferrara and Schiffer 2013). 이러한 결과는 환자가 적절한 조혈 세포 기증자를 갖게 되면 개선될 수 있지만, 많은 경우가 그렇게 될 수 없는데, 이는 치료법에 대한 대안적인 접근법이 필요하다는 것을 강조한 것이다.
자연 살해(NK) 세포는, 예를 들어, 자연 살해 T(NK-T) 세포와 구별되는 특징적인 표현형과 이펙터 기능을 가진 세포독성 림프구이다. 예를 들어, NK-T 세포는 CD3과 T 세포 항원 수용체(TCR: T cell antigen receptor) 모두를 발현하지만, NK 세포는 그렇지 않다. NK 세포는 일반적으로 마커 CD16 및 CD56을 발현하는 것으로 밝혀졌으며, 여기서 CD16은 Fc 수용체로서 작용하고 하기에서 논의되는 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC: antibody dependent cell-mediated cytotoxicity)을 매개한다. KHYG-1은 이와 관련하여 주목할만한 예외이다. NK 세포가 자연적으로 세포독성이 있음에도 세포독성이 증가된 NK 세포주가 개발되었다. NK-92와 KHYG-1은 광범위하게 연구되어 암 치료제로서 유망한 2가지 NK 세포주를 대표한다(Swift et al. 2011; Swift et al. 2012).
암 치료에 사용하기 위한 입양 세포 면역요법은 보편적으로 환자에게 자연 및 변형된 T 세포의 투여를 수반한다. T 세포는 특정 표적 암세포에 특이적으로 결합하는 수용체 및/또는 리간드를 발현하기 위해서 다양한 방법으로, 예를 들어 유전적으로 변형될 수 있다. 암세포 항원에 특이적인 고친화도 T 세포 수용체(TCR) 및 키메라 항원 수용체(CAR)에 의한 T 세포의 트랜스펙션은 반응성이 높은 암 특이적 T 세포 반응을 일으킬 수 있다. 이 면역 치료 접근법의 주된 한계는 T 세포가 자가 생체외 증폭을 위해 환자로부터 얻어져야 하거나, 또는 MHC 매칭된 T 세포가 환자에 또는 일부 경우 이식편 대 숙주 질환(GVHD)의 발병에 그 세포를 이식한 직후에 면역학적 제거를 피하기 위해 사용되어야 한다는 것이다. 또한, 성공적으로 이식된 T 세포는 종종 순환에서 장기간 동안 생존하는데, 이는 치료로부터 초래되는 지속적인 부작용을 제어하는 것을 어렵게 만든다.
일배체형 이식에서, 이식편 대 백혈병 효과는 AML의 치료에서 개선된 생존을 유도할 수 있는 KIR 억제 수용체-리간드 미스매치가 존재할 때 NK 세포에 의해 매개되는 것으로 생각된다(Ruggeri, Capanni et al. 2002; Ruggeri, Mancusi et al. 2005). 더욱이, 신속한 NK 회복은 AML에서 일배체형 T-고갈 조혈 세포 이식(HCT: hematopoietic cell transplantation)을 받는 환자에서 더 우수한 결과와 더 강력한 이식편 대 백혈병(GVL: graft-vs-leukemia) 효과와 관련이 있다(Savani, Mielke et al. 2007). 다른 시험에서는 성인(Miller, Soignier et al. 2005) 및 아동(Rubnitz, Inaba et al. 2010)에서 AML을 치료하기 위해 생체외 증폭된 일배체 동종 NK 세포를 사용하였다.
몇몇 영구 NK 세포주가 확립되었고, 가장 주목할만한 것은 CD16(Fc 감마 수용체 III)을 제외하고 전형적인 NK 세포 마커를 발현하는 비호지킨 림프종 환자에서 유래한 NK-92이다. NK-92는 광범위한 전임상 시험을 수행하였으며, 활성화된 NK 세포 및 림포카인-활성화 살해(LAK) 세포와 비교하여 광범위한 종양에 대해 우수한 용해를 나타내었다(Gong, Maki et al. 1994). 원발성 골수성 백혈병에 대한 NK-92 세포의 세포독성이 확립되었다(Yan, Steinherz et al. 1998).
또 다른 NK 세포주인 KHYG-1은 임상적 용도에 가능한 도전자로서 확인되었지만(Suck et al. 2005), 감소된 세포독성을 보여 NK-92보다 관심을 더 적게 받아왔다. KHYG-1 세포는 사전 활성화되는 것으로 알려져 있다. 내인성 NK 세포와는 달리 KHYG-1 세포는 항상 분극화되어 있어 세포독성을 증가시키고 외부 자극에 더 빠르게 반응하게 만든다. NK-92 세포는 KHYG-1 세포보다 높은 기준선 세포독성을 갖는다.
따라서, 현재의 입양 면역요법 프로토콜은 효과적인 세포주가 더욱 표준화된 치료법을 제공하는데 이용가능하다면 제거될 수 있는 변수인 이펙터 세포의 양과 질에서의 기증자 변동성에 의해 영향을 받는 것으로 명백하다.
NK 세포의 세포독성에 대해 상당한 양의 연구가 마우스 모델을 이용하여 수행되었다. 한가지 예는 퍼포린 및 그랜자임 B mRNA가 마우스 NK 세포에서 구성적으로 전사되지만, NK 세포의 자극 또는 활성화까지 최소 수준의 단백질이 검출된다는 발견이다(Fehniger et al, 2007). 마우스 NK 세포를 이용하는 이 연구 및 다른 연구가 관심 받고 있긴 하지만, 그것은 인간에서 NK 세포의 세포독성에 대한 결정적인 증거로서 신뢰받을 수는 없다. 상기 예와는 대조적으로, 인간 NK 세포는 자극 전에 퍼포린 및 그랜자임 B 단백질을 고 수준으로 발현한다(Leong et al, 2011). 그 결과, 마우스 또는 인간 NK 세포가 배양액에서 새롭게 단리될 때, 마우스 NK 세포는 세포 용해 활성이 약하지만, 인간 NK 세포는 강한 세포 용해 성능을 나타낸다.
마우스 및 인간 NK 세포는 또한 이들의 발현 마커, 신호 전달 캐스케이드 및 조직 분포에서 크게 다르다. 예를 들어, CD56은 인간 NK 세포에 대한 마커로서 사용되는 반면, 마우스 NK 세포는 이 마커를 전혀 발현하지 않는다. 또한, NK 세포의 세포독성을 조절하기 위한 잘 확립된 기전은 리간드 결합 NK 활성화 및 억제 수용체를 통한 것이다. 가장 유명한 인간 NK 활성화 수용체 중 2가지는 마우스 NK 세포 상에서 모두 발현되지 않는 NKp30 및 NKp44인 것으로 알려져 있다. NK 억제 수용체와 관련하여, 인간 NK 세포는 MHC I형을 인식하고 세포독성 활성을 약화시키는 KIR을 발현하고, 반면에 마우스 NK 세포는 KIR을 전혀 발현하지 않지만, 그 대신에, Ly49s를 발현한다(Trowsdale et al, 2001). 전반적으로, 마우스 NK 세포가 자연 생리학적 환경에서 인간 NK 세포와 동일한 기능을 달성함에도 불구하고, 그러한 역할을 수행하는 기전은 종간에 상당히 다르다.
따라서, 대안적이고 바람직하게 개선된, 예를 들어 더 큰 독성 프로파일을 지닌, 인간 NK 세포 및 인간 NK 세포주가 요구된다.
본 발명의 목적은 더 큰 세포독성 표현형을 갖는 NK 세포 및 NK 세포주를 제공하는 것이다. 추가의 목적은 변형된 NK 세포 및 NK 세포주의 제조 방법, 상기 세포 또는 세포주를 포함하는 조성물 및 암 치료에 있어 상기 조성물의 용도를 제공하는 것이다. 더 구체적인 실시양태는 확인된 암, 예를 들어 백혈병과 같은 혈액암을 위한 치료를 제공하는 것을 목표로 한다. 특정 실시양태는 변형된 세포의 세포독성을 더 향상시키기 위해서 NK 세포 및 NK 세포주의 2가지 이상의 변형을 조합하는 것을 목표로 한다.
발명의 개요
본원에서 더 큰 세포독성 표현형을 갖는 변형된 NK 세포 및 NK 세포주, 및 상기 세포 및 세포주의 제조 방법이 제공된다. 또한, 변형된 NK 세포 및 NK 세포주의 조성물, 및 암 치료를 위한 상기 조성물의 용도가 제공된다.
본 발명은, 예를 들어 억제 수용체를 코딩하는 유전자를 녹아웃시키고, TRAIL 리간드 및 변이체를 코딩하는 유전자를 발현시키며, 그리고 키메라 항원 수용체(CAR) 및/또는 Fc 수용체를 코딩하는 유전자를 발현시키는 유전자 조작을 이용하여, NK 세포 및 NK 세포를 변형시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 조성물은 2가지 이상의 변형이 제공되는 NK 세포 및 NK 세포주를 포함하며, 다수의 변형은 조성물의 세포독성 활성을 더 상승시킨다.
본 발명에 따르면, 변형된 NK 세포, 예를 들어 KHYG-1 세포의 유도체를 사용하여, 암, 예를 들어 혈액암을 치료하는 방법으로서, 변형된 NK 세포주는 체크포인트 억제 수용체의 발현이 결여되고, TRAIL 리간드 변이체를 발현하고/하거나 CAR 및/또는 Fc 수용체를 발현하도록 조작되는 것인 방법을 추가로 제공한다.
본 발명에 따라 특히 치료 가능한 질병은 암, 혈액암, 백혈병, 특히 급성 골수성 백혈병을 포함한다. 특히 인간에서의 종양과 암이 치료될 수 있다. 본원에서 종양에 대한 언급은 신생물에 대한 언급을 포함한다.
따라서, 본 발명은 세포독성을 증가시키기 위해 유전자 변형된 자연 살해(NK) 세포 또는 NK 세포주를 제공한다.
하기 실시예에서 상세히 기재되는 바와 같이, NK 세포 및 NK 세포주는 암에 대한 그의 세포독성 활성을 증가시키기 위해 유전자 변형된다.
본 발명의 NK 세포 및 NK 세포주 모두는 NK 세포로서 언급될 것이다(문맥 상 달리 요구되지 않는 한).
본 발명의 특정 실시양태에서, 체크포인트 억제 수용체 기능이 감소되거나 없는 NK 세포를 제공한다. 따라서, 하기 실시예에서는 하나 이상의 체크포인트 억제 수용체 유전자가 녹아웃된 NK 세포를 생산한다. 바람직하게는, 이러한 수용체는 특정 체크포인트 억제 수용체이다. 바람직하게는, 이러한 체크포인트 억제 수용체는 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT 및/또는 TIM-3 중 하나 이상 또는 전부이다.
다른 실시양태에서는, 하나 이상의 억제 수용체 신호 전달 경로가 녹아웃되거나 감소된 기능을 나타내며, 즉 결과로 억제 수용체 기능이 다시 감소되거나 없는 NK 세포를 제공한다. 예를 들어, SHP-1, SHP-2 및/또는 SHIP에 의해 매개된 신호 전달 경로는 세포의 유전자 변형에 의해 녹아웃된다.
결과로 얻어지는 NK 세포는 향상된 세포독성을 나타내므로 암 치료법, 특히 혈액암 치료법, 특히 백혈병 및 다발성 골수종의 치료에서 훨씬 더 유용하다.
한 실시양태에서, 유전자 변형은 세포가 NK 세포로 분화되기 전에 일어난다. 예를 들어, 다기능성 줄기세포(예를 들어, iPSC: pluripotent stem cell)는 하나 이상의 체크포인트 억제 수용체를 발현하는 능력을 상실하도록 유전자 변형될 수 있다. 이어서, 그 변형된 iPSC는 분화되어 세포독성이 증가된 유전자 변형된 NK 세포를 생산하게 된다.
NK 세포 활성화 후에 체크포인트 억제 수용체가 발현되기 때문에, 다른 억제 수용체보다 체크포인트 억제 수용체의 기능을 감소시키는 것이 바람직하다. 대다수의 KIR 부류, NKG2A와 LIR-2와 같은 정상 또는 '고전적' 억제 수용체는 MHC I형에 결합하므로 주로 자가 표적화의 문제를 감소시키는데 관여한다. 따라서, 체크포인트 억제 수용체가 녹아웃되는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 이러한 수용체의 기능이 감소되거나 결여되는 것은 암세포가 면역 이펙터 기능(이것은 달리 수용체가 완전하게 기능을 하는 경우에 발생할 수 있음)을 억제하는 것을 방지한다. 따라서, 본 발명의 이러한 실시양태의 주요 이점은 암세포에 의한 세포독성 활성의 억제에 덜 민감한 NK 세포에 있다; 결과적으로, 그 NK 세포는 암 치료에 유용하다.
본원에 사용되는 바와 같이, 억제 수용체에 대한 언급은 일반적으로 면역 이펙터 세포, 예를 들어 NK 세포의 원형질막 상에 발현된 수용체로서, 세포내 신호를 결과로 생성하는 그의 상보적 리간드에 대한 결합이 상기 면역 이펙터 세포의 세포독성을 감소시키는 원인이 되는 것인 수용체를 언급한다. 이러한 억제 수용체는 면역 이펙터 세포의 '휴지' 및 '활성화' 상태 모두에서 발현되며 종종 면역계에 신체의 세포 및 조직에 대한 세포독성 반응을 억제하는 '자가 내성' 기전을 제공하는 것과 관련된다. 한 예로는 NK 세포 상에서 발현되고 신체의 건강한 세포 상에서 발현되는 MHC I형을 인식하는 억제 수용체 부류 'KIR'이 있다.
또한, 본원에서 사용되는 바와 같이, 체크포인트 억제 수용체는 일반적으로 상기 억제 수용체의 부분집합으로서 간주된다. 그러나, 다른 억제 수용체와는 달리, 체크포인트 억제 수용체는 면역 이펙터 세포, 예를 들어 NK 세포의 장기적인 활성화 및 세포독성 과정에서 더 높은 수준으로 발현된다. 이 현상은 예를 들어 염증 부위에서 만성 세포독성을 약화시키는데 유용하다. 예로는 체크포인트 억제 수용체 PD-1, CTLA-4 및 CD96이 포함되며, 이들 모두는 NK 세포 상에서 발현된다.
따라서, 본 발명은 또한 D96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT 및 TIM-3으로부터 선택된 체크포인트 억제 수용체를 코딩하는 유전자가 결여된 NK 세포를 제공한다.
유전자가 결여된 NK 세포는 기능적 유전자 산물이 결과적으로 발현되지 않게 하는 완전 또는 부분 결실, 돌연변이 또는 기타를 언급할 수 있다. 실시양태에서, NK 세포는 2가지 이상의 억제 수용체를 코딩하는 유전자가 결여된다.
더 구체적인 실시양태는 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4) 및 CD279(PD-1)로부터 선택된 체크포인트 억제 수용체를 코딩하는 유전자가 결여된 NK 세포를 포함한다. 바람직한 실시양태는 KHYG-1의 유도체인 NK 세포를 포함한다.
하기 기재된 실시예에서, 본 발명자는 KHYG-1 세포에서 체크포인트 억제 수용체 CD96의 발현을 녹다운하는 siRNA를 사용하여 세포독성 효과를 확실하게 보였다. CD96 녹다운(KD: knockdown) KHYG-1 세포는 다양한 이펙터;표적(E:T) 비율에서 백혈병 세포에 대해 상승된 세포독성을 보였다.
본 발명의 다른 실시양태에서, TRAIL 리간드 또는 바람직하게는 돌연변이(변이) TRAIL 리간드를 발현하는 NK 세포를 제공한다. 따라서, 하기 실시예에서 추가로 기재되는 바와 같이, NK 세포의 세포독성을 상승시키는 변형은 또한 TRAIL 리간드 및/또는 돌연변이된 TRAIL 리간드 변이 모두의 증가된 발현을 포함한다.
결과로 생성된 NK 세포는 TRAIL 수용체에 대한 결합의 증가를 나타내고, 결과로서, 암, 특히 혈액암, 특히 백혈병에 대한 세포독성의 증가를 나타낸다.
돌연변이체/변이체는 바람직하게는 디코이 수용체에 대한 야생형 TRAIL의 결합과 비교하여, '디코이' 수용체에 대한 친화도가 더 낮다(또는 실제로 친화력이 없다). 이러한 디코이 수용체는 TRAIL 리간드에 결합하지만 세포 사멸을 개시하는 능력을 갖지 않으며, 경우에 따라, 사멸 신호전달 경로에 길항하는 역할을 하는 TRAIL 수용체의 부류를 나타낸다. 돌연변이/변이 TRAIL 리간드는 WO 2009/077857에 따라 제조될 수 있다.
돌연변이/변이체는 별도로 TRAIL 수용체, 예를 들어 DR4 및 DR5에 대해 친화도가 증가될 수 있다. 야생형 TRAIL은 전형적으로 DR4의 경우 > 2 nM, DR5의 경우 > 5 nM, 및 디코이 수용체 DcR1의 경우 > 20 nM(WO 2009/077857; 표면 플라스 몬 공명에 의해 측정됨), 또는 DR4의 경우 약 50 내지 100 nM, DR5의 경우 1 내지 10 nM, 및 DcR1의 경우 175 내지 225 nM(Truneh, A. et al. 2000; 등온 적정 열량계 및 ELISA로 측정됨)의 KD를 갖는 것으로 알려져 있다. 따라서, DR4의 경우 증가된 친화도는 적합하게는 각각 < 2 nM 또는 < 50 nM의 KD로 정의되는 한편, DR5의 경우 증가된 친화도는 적합하게는 각각 < 5 nM 또는 1 nM <의 KD로 정의된다. 디코이 수용체 DcR1의 경우 감소된 친화도는 적합하게는 각각 > 50 nM 또는 > 225 nM의 KD로서 정의된다. 임의의 경우에서, TRAIL 변이체/돌연변이체가 나타내는 친화도의 증가 또는 감소는 야생형 TRAIL이 나타내는 기준선 친화도에 대하여 상대적인 것이다. 그 친화도는 바람직하게는 야생형 TRAIL에 의해 나타나는 것과 비교하여 적어도 10%, 더 바람직하게는 적어도 25% 증가된다.
TRAIL 변이체는 바람직하게는 DR4, DcR1 및 DcR2에 대한 그의 친화도와 비교하여 DR5에 대해 증가된 친화도를 갖는다. 바람직하게는, 친화도는 DR4, DcR1 및 DcR2 중 하나 이상의 경우보다 DR5의 경우 적어도 1.5배, 2배, 5배, 10배, 100배 또는 심지어는 1000배 이상이다. 더 바람직하게는, 친화도는 DR4, DcR1 및 DcR2 중 적어도 둘의 경우, 바람직하게는 모든 경우보다 DR5의 경우 적어도 1.5배, 2배, 5배, 10배, 100배 또는 심지어는 1000 배 이상 크다.
본 발명의 이들 실시양태의 주요 이점은 암세포를 살해하는데 더 큰 효능을 갖는 NK 세포에 있다.
추가의 특정 실시양태는 TRAIL 디코이 수용체에 대한 친화도가 감소되거나 또는 전혀 없는 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현하는 NK 세포를 포함한다. 바람직하게는, 이 NK 세포는 KHYG-1의 유도체이다. 추가의 특정 실시양태는 TRAIL 디코이 수용체에 대한 친화도가 감소되거나 전혀 없고 DR4 및/또는 DR5에 대한 친화도가 증가된 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현하는 NK 세포를 포함한다.
하기에서보다 상세하게 기재되는 본 발명의 실시예에서, NK 세포는 돌연변이 TRAIL을 발현하도록 유전자 변형되었다. 변형된 KHYG-1 세포는 돌연변이 TRAIL을 발현하였고, NK-92는 돌연변이 TRAIL을 발현하였다. 변형된 KHYG-1 세포는 시험관 내에서 암 세포주에 대해 향상된 세포독성을 보였다. KHYG-1 세포는 낮은 수준이지만 TRAIL 수용체(예를 들어, DR4 및 DR5)를 발현한다. 변형된 NK 세포의 다른 바람직한 실시양태는 TRAIL 수용체를 전혀 또는 실질적으로 발현하지 않거나, 단지 낮은 수준으로만 - 변형된 NK 세포의 생존도가 돌연변이 TRAIL의 발현에 의해 악영향을 받지 않도록 충분히 낮게 발현한다.
선택적 실시양태에서, TRAIL 또는 TRAIL 변이체를 발현하는 변형된 NK 세포를 사용한 암치료는 암세포 상의 TRAIL 사멸 수용체의 발현을 상향조절할 수 있는 제제를 환자에게 투여함으로써 향상된다. 이 제제는 변형된 NK 세포의 투여 전에, 투여와 함께 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 그러나, 상기 제제는 변형된 NK 세포를 투여하기 전에 투여되는 것이 바람직하다.
바람직한 실시양태에서, 상기 제제는 암세포 상의 DR5의 발현을 상향조절한다. 상기 제제는 경우에 따라 화학치료제, 예를 들어 보르테조밉일 수 있으며, 암에서 DR5 발현을 상향조절할 수 있는 낮은 용량으로 투여될 수 있다.
본 발명은 DR5 발현을 상향조절할 수 있는 임의의 특정 제제로 제한되지 않지만, DR5 유도제의 예로는 보르테조밉, 제피티닙, 파이퍼롱구민, 독소루비신, 알파-토코페릴 숙시네이트 및 HDAC 억제제가 포함된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 돌연변이/변이 TRAIL 리간드는 하나 이상의 NK 세포 보조자극(costimulatory) 도메인, 예를 들면, 41BB/CD137, CD3제타/CD247, DAP12 또는 DAP10에 결합된다. 따라서, 표적 세포 상의 이의 수용체에 대한 변이체의 결합은 표적 세포 내에서 아폽토시스 신호뿐만 아니라 NK 세포에서 세포독성 신호 자극을 촉진한다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에 따르면, 감소된 체크포인트 억제 수용체 기능을 가지며 돌연변이 TRAIL 리간드를 또한 발현하는 NK 세포가, 이러한 각각의 NK 세포 변형과 관련하여 상기에서 보다 상세히 기재되는 바와 같이, 제공된다. 더욱더 바람직한 실시양태에서, TRAIL 디코이 수용체에 대해 친화도가 감소되거나 전혀 없는 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현하는 NK 세포는 KHYG-1의 유도체 일 수 있고, 추가로 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT 및 TIM-3으로부터 선택되는 체크포인트 억제 수용체를 코딩하는 유전자가 결여된다.
본 발명은 또한 하나 이상의 CAR을 발현하도록 변형된 NK 세포 및 NK 세포주, 바람직하게는 KHYG-1 세포 및 이의 유도체를 제공한다.
암 치료법 사용에 적합하게는, CAR은 암세포 상의 하나 이상의 리간드, 예를 들어 골수종 세포 상의 CS1(SLAMF7)에 특이적으로 결합한다. 특정 암, 예를 들어. 다발성 골수종 치료에 사용하기 위해, CAR은 CD38에 결합할 수 있다. 예를 들어, CAR은, 예를 들어, 공지된 단클론 항체인 다라투무맙으로부터 유래하거나, 이와 유사하거나 이와 동일한 가변 영역의 결합 특성을 포함할 수 있다. 이러한 NK 세포는 혈관 신생을 저해하는 제제, 예를 들어 레날리도미드와 병용하여 암 치료법에 사용될 수 있다. 암, 특히 백혈병, 특히 AML의 치료법에 사용하기 위해 CAR은 CLL-1에 결합할 수 있다.
CAR-NK는 이들의 친화도가 2가지 상이한 리간드/항원에 대한 것인 이중 특이적일 수 있다. 이중 특이적 CAR-NK는 암세포 상의 가능한 결합 부위의 수를 증가시키거나, 별법으로, NK-CAR에 특이적인 리간드를 발현하는 다른 면역 이펙터 세포로 암세포를 국소화하는데 사용될 수 있다. 암 치료법에 사용하기 위해, 이중 특이적 CAR은 표적 종양 세포 및 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포, NK 세포 또는 대식세포에 결합할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 다발성 골수종 경우, 이중 특이적 CAR은 T 세포 항원(예를 들어, CD3 등) 및 종양 세포 마커(예를 들어, CD38 등)에 결합할 수 있다. 이중 특이적 CAR은 표적 종양 세포에 대한 NK 세포의 전체 결합 친화력을 증가시키는 두 개의 별개의 종양 세포 마커에 선택적으로 결합할 수 있다. 이는 표적 항원 중 하나를 하향조절함으로써 암세포가 내성을 발생시킬 위험을 감소시킬 수 있다. 이 경우의 예는 다발성 골수종에서 CD38과 CS-1/SLAMF7 모두에 CAR 결합이다. CAR에 의해 적절하게 표적화되는 또 다른 종양 세포 마커는 CD47에 의해 예시되는 종양 상에 "나를 먹지 마" 유형 마커이다.
본 발명의 선택적인 특징은, 예를 들어, (아형 및 유도체를 포함하여 CD16, CD32 또는 CD64 일 수 있는) Fc 수용체가 세포의 표면에 발현되는, 상기에 기재된 NK 세포 및 NK 세포주에 추가의 변형을 제공하는 단계를 포함한다. 사용 시, 이러한 세포는 항체가 코팅된 암세포의 인식을 증가시키고 세포독성 반응의 활성화를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 선택적인 특징은 변형된 NK 세포 및 NK 세포주를 신체의 특정 표적 영역에 더 잘 유도되도록 조정하는 단계를 포함한다. 본 발명의 NK 세포는 특정 암세포 위치에 표적화될 수 있다. 혈액암 치료에 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 NK 이펙터는 골수에 유도되도록 조정된다. 특정 NK 세포는 골수에 유도되도록 푸코실화 및/또는 시알릴화에 의해 변형된다. 이는 적절한 푸코실트랜스퍼라제 및/또는 시알릴트랜스퍼라제를 각각 발현하도록 NK 세포를 유전자 변형시킴으로써 달성될 수 있다. 종양 부위로 NK 이펙터 세포의 유도 증가는 또한 암 혈관을 통한 NK 세포 침윤을 정상화하도록 종양 혈관계의 파괴에 의해, 예를 들어 메트로놈 화학요법에 의해, 또는 혈관 신생을 표적화하는 약물을 사용하여(Melero et al, 2014) 가능해질 수 있다.
본 발명의 또 다른 선택적인 특징은 배양액에서 신속한 성장 및 증식의 내인성 능력이 증가된 변형된 NK 세포 및 NK 세포주를 제공하는 것이다. 이는 예를 들어, 성장 유도성 사이토타인 IL-2 및 IL-15를 과발현하도록 세포를 트랜스펙션시킴으로써 달성될 수 있다. 더욱이, 이러한 선택적인 변경은 연속적으로 사이토카인으로 성장 배지를 보충하는 것에 대한 비용 효율적인 대안을 제공한다.
본 발명은 추가로 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주의 제조 방법으로서, 본원에 기재된 세포 또는 세포주의 세포독성을 증가시키기 위해서 그 세포 또는 세포주를 유전자 변형시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 이 유전자 변형은, 예를 들어 CRISPR에 의한, 유전자의 안정된 녹아웃(knockout), 또는 예를 들어 siRNA에 의한, 유전자의 일시적인 녹다운일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 안정한 유전자 변형 기술, 예를 들어 CRISPR은 증가된 세포독성을 갖는 새로운 NK 세포주, 예를 들어 KHYG-1 세포의 유도체를 제공하기 위해서 이용된다.
실시양태에서, 상기 방법은 억제 수용체 기능을 감소시키기 위해서 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주를 제조하기 위한 것이다. 바람직하게는, 이들 억제 수용체는 체크포인트 억제 수용체이다.
더 구체적인 실시양태는 억제 수용체 기능이 감소된 NK 세포 또는 NK 세포주의 제조 방법으로서, 상기 체크포인트 억제 수용체는 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT 및 TIM-3으로부터 선택되는 것인 방법을 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 억제 수용체 중 2가지 이상의 기능을 감소시키도록 변형시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주의 제조 방법으로서, TRAIL 리간드 또는 돌연변이 TRAIL(변이) 리간드를 발현하도록 세포 또는 세포주를 유전자 변형시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
실시양태에서, 상기 방법은 TRAIL 수용체에 대해 친화도가 증가된 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현하도록 NK 세포 또는 NK 세포주를 변형시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, TRAIL 수용체는 DR4 및/또는 DR5이다. 바람직한 실시양태는 디코이 TRAIL 수용체에 대해 친화도가 감소된 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현하도록 NK 세포 또는 NK 세포주를 변형시키는 방법을 제공한다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 체크포인트 억제 수용체의 기능을 제거하고 또한 디코이 TRAIL 수용체에 대한 결합 친화도가 감소되거나 전혀 없는 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현하도록 NK 세포 또는 NK 세포주를 변형시키는 단계를 포함한다.
추가의 전형적인 실시양태는 하나 이상의 체크포인트 억제 수용체의 기능이 제거되고/되거나 돌연변이 TRAIL 리간드가 발현되고, 디코이 TRAIL 수용체에 대한 결합 친화도가 감소되거나 전혀 없는 NK 세포 또는 NK 세포주의 제조 방법을 제공하며, 상기 세포는 CAR 또는 이중 특이적 CAR을 발현하도록 추가로 변형된다. CAR의 특성은 선택적으로 상기한 바와 같다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 체크포인트 억제 수용체의 기능이 제거되고/되거나 돌연변이 TRAIL 리간드가 발현되고, 디코이 TRAIL 수용체에 대한 결합 친화도가 감소되거나 전혀 없는 NK 세포 또는 NK 세포주의 제조 단계를 포함하며, 상기 세포는 CAR 또는 이중 특이적 CAR을 발현하도록 선택적으로 변형되고, 상기 세포는 하나 이상의 Fc 수용체를 발현하도록 추가로 변형된다. 적합한 Fc 수용체는 CD16(FcRIII), CD32(FcRII) 및 CD64(FcRI)로부터 선택된다.
상기 모든 바람직한 실시양태는 KHYG-1의 유도체인 NK 세포 및 NK 세포주의 제조 방법을 포함한다.
본 발명의 목적에 따라, 증가된 세포독성을 갖는 변형된 NK 세포, NK 세포주 또는 이의 조성물은 환자의 암, 특히 혈액암을 치료하는데 사용하기 위한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 변형된 NK 세포, NK 세포주 또는 조성물은 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 호지킨 림프종, T 세포 림프종 및 B 세포 림프종을 포함하는 비호지킨 림프종, 무증상 골수종, 스몰더링 다발성 골수종(SMM: smoldering multiple myeloma), 활성 골수종 또는 경쇄 골수종을 포함하는 혈액암을 치료하는데 사용하기 위한 것이다.
더욱더 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 KHYG-1 세포에서 체크포인트 억제 수용체 기능을 감소시킴으로써, 또는 KHYG-1 세포에서 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현시킴으로써, 둘 다를 수행함으로써 KHYG-1 유도체로서 수득된, 혈액암 치료에 사용하기 위한 NK 세포주이다.
본원에 상기 및 하기에서 기재된 변형된 NK 세포, NK 세포주 및 이의 조성물은 암, 특히 인간의 암 치료에, 예를 들어 혈액 세포 암 또는 고형암 치료에 적합하다. NK 세포 및 유도체는 바람직하게는 인간 NK 세포이다. 인간 치료법을 위해, 인간 NK 세포가 바람직하게 사용된다.
당업자는 활성제 및 이들의 조합물을 필요로 하는 환자에게 전달하기 위한 여러 투여 경로를 알 것이다. 본 발명의 실시양태는 혈액암 치료를 위한 것이다. 변형된 NK 세포 및/또는 NK 세포주의 투여는 예를 들어 복막 내 경로와 같이 전신적이거나 국소적일 수 있다.
다른 실시양태에서, 활성제는 더 직접적으로 투여된다. 따라서 투여는 직접적으로 종양 내에서 이루어질 수 있으며, 이는 특히 고형 종양에 적합하다.
NK 세포는 일반적으로 본 발명의 방법, 용도 및 조성물에 적합할 수 있다고 생각된다. 본원의 특정 실시예에서 사용되는 세포에 따라, NK 세포는 암세포주로부터 수득한 NK 세포일 수 있다. 유리하게는, 예를 들어 NK 세포를 치명적이고/치명적거나 분열할 수 없게 함으로써 이의 종양원성을 감소시키도록 바람직하게 처리된 NK 세포는 혈액암 세포주로부터 수득할 수 있고 혈액암을 치료하기 위한 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
암 유래 세포를 치료용으로보다 허용 가능하게 하기 위해, 일반적으로 환자에서 종양을 형성하는 성향을 감소시키거나 제거하는 어떤 방법으로 이를 처리하거나 전처리한다. 실시예에서 사용되는 특정 변형된 NK 세포주는 분열 할 수 없게 만들었기 때문에 안전하다; 이들은 방사선을 조사받고 이들의 살해 능력을 유지하지만 약 3-4 일 이내에 사멸한다. 따라서 특정 세포 및 세포주는 예를 들어 방사선 조사의 결과로서, 증식할 수 없다. 본원의 방법에 사용하기 위한 가능한 NK 세포의 처리는 생체 내에서 종양을 분열 및 형성하는 것을 방지하는 방사선 조사 및 종양 형성을 감소시키는 유전자 변형, 예를 들어 생체 내에서 종양을 분열 및 형성하는 것을 방지하도록 활성화될 수 있는 자살 유전자를 코딩하는 서열을 삽입하는 유전자 변형이 포함된다. 자살 유전자는 외인성 제제, 예를 들어 순환하는 제제에 의해 발현된 후 유전자를 발현하는 세포에서 세포 사멸을 일으킬 수 있다. 추가의 대안은 치료법의 특정 NK 세포를 표적화하는 단클론 항체의 사용이다. 예를 들어 CD52는 KHYG-1 세포에서 발현되며 이 마커에 단클론 항체가 결합하면 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 및 KHYG-1 세포 사멸을 일으킬 수 있다.
문헌(Suck et al, 2006)에 발표된 논문에서 논의된 바와 같이, 암 유래된 NK 세포 및 세포주는 감마셀 3000 엘란(Gammacell 3000 Elan)과 같은 방사선 조사장치를 사용하여 쉽게 방사선 조사된다. 세슘-137의 공급원을 사용하여 방사선 조사의 투여량을 조절하며, 예를 들어 1 Gy와 50 Gy 사이의 용량 반응 곡선을 이용하여 증가된 세포독성의 이점을 유지하면서 세포의 증식능을 제거하기 위한 최적의 용량을 결정할 수 있다. 이는 방사선 조사의 각 용량을 투여한 후 세포독성에 대해 세포를 분석함으로써 달성된다.
입양 세포 면역요법에 방사선 조사된 NK 세포주를 사용하면 잘 확립된 자가 또는 MHC 매칭된 T 세포 접근법에 비해 상당한 이점이 있다. 첫째, 높은 증식 성질을 지닌 NK 세포주를 사용하는 것은 변형된 NK 세포주의 증폭이 더 쉽게 그리고 상업적 수준으로 달성될 수 있다는 것을 의미한다. 이어서, 변형된 NK 세포주의 방사선 조사는 세포를 환자에게 투여하기 전에 수행될 수 있다. 유용한 세포독성을 유지하는 이 방사선 조사된 세포는 수명이 한정되어 있으며, 변형된 T 세포와 달리 장기간 순환하여 지속적인 부작용을 유발하지 않을 것이다.
추가로, 동종이형의 변형된 NK 세포 및 NK 세포주를 사용하는 것은 환자에서 MHC I형 발현 세포가 자가 NK 세포독성 반응에 할 수 있는 바와 동일한 방식으로 NK 세포독성 반응을 억제할 수 없다는 것을 의미한다. 암세포 살해에 동종이형의 NK 세포 및 NK 세포주를 사용하는 것은 이전에 언급한 GVL 효과로 인해 유익하며, T 세포의 경우와 달리, 동종이형의 NK 세포와 세포주는 GVHD의 발병을 촉진하지 않으므로, 그것이 입양 세포 면역요법을 통해 암 치료에 훨씬 바람직한 선택이 되게 한다.
본 명세서에서 청구범위 및 그 이외의 다른 부분에 기술되어 있는 바와 같이, 본 발명은 다음의 실시양태를 제공한다:
1. 세포독성을 증가시키도록 유전자 변형된 자연 살해(NK) 세포 또는 NK 세포주.
2. 실시양태 1에 있어서, 하나 이상의 억제 수용체의 기능이 감소되도록 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주.
3. 실시양태 2에 있어서, 억제 수용체는 체크포인트 억제 수용체인 NK 세포 또는 NK 세포주.
4. 실시양태 3에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT 및 TIM-3으로부터 선택되는 것인 NK 세포 또는 NK 세포주.
5. 실시양태 2 내지 4 중 어느 한 실시양태에 있어서, 2가지 이상의 억제 수용체의 기능이 감소되도록 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주.
6. 실시양태 1 내지 5 중 어느 한 실시양태에 있어서, TRAIL 리간드를 발현하도록 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주.
7. 실시양태 6에 있어서, TRAIL 리간드는 돌연변이 TRAIL 리간드인 NK 세포 또는 NK 세포주.
8. 실시양태 7에 있어서, 돌연변이 TRAIL 리간드는 TRAIL 수용체, 예를 들어 DR4 및/또는 DR5에 대한 친화도가 증가된 것인 NK 세포 또는 NK 세포주.
9. 실시양태 7 또는 8에 있어서, 돌연변이 TRAIL 리간드는 디코이 TRAIL 수용체에 대한 친화도가 감소된 것인 NK 세포 또는 NK 세포주.
10. 실시양태 1 내지 9 중 어느 한 실시양태에 있어서, 체크포인트 억제 수용체의 기능을 제거하도록 변형되고, 또한 디코이 TRAIL 수용체에 대한 결합 친화도가 감소되거나 전혀 없는 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현하도록 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주.
11. 실시양태 1 내지 10 중 어느 한 실시양태에 있어서, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 NK 세포 또는 NK 세포주.
12. 실시양태 11에 있어서, CAR은 이중 특이적 CAR인 NK 세포 또는 NK 세포주.
13. 실시양태 12에 있어서, 이중 특이적 CAR은 하나의 세포 유형 상의 2가지 리간드에 결합하는 것인 NK 세포 또는 NK 세포주.
14. 실시양태 12에 있어서, 이중 특이적 CAR은 2가지 상이한 세포 유형의 각 유형 상의 한가지 리간드에 결합하는 것인 NK 세포 또는 NK 세포주.
15. 실시양태 11 또는 12에 있어서, CAR 또는 이중 특이적 CAR에 대한 리간드(들)는 암세포 상에 발현되는 것인 NK 세포 또는 NK 세포주.
16. 실시양태 13에 있어서, 이중 특이적 CAR에 대한 리간드는 둘 다 암세포 상에 발현되는 것인 NK 세포 또는 NK 세포주.
17. 실시양태 14에 있어서, 이중 특이적 CAR에 대한 리간드는 암세포 및 면역 이펙터 세포 상에 발현되는 것인 NK 세포 또는 NK 세포주.
18. 실시양태 1 내지 17 중 어느 한 실시양태에 있어서, 하나 이상의 Fc 수용체를 발현하도록 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주.
19. 실시양태 18에 있어서, Fc 수용체는 CD16(FcRIII), CD32(FcRII) 및 CD64(FcRI)로부터 선택되는 것인 NK 세포 또는 NK 세포주.
20. 실시양태 1 내지 19 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포주는 KHYG-1 세포주의 유도체인 NK 세포 또는 NK 세포주.
21. CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT 및 TIM-3으로부터 선택된 체크포인트 억제 수용체를 코딩하는 유전자가 결여된 NK 세포.
22. 실시양태 21에 있어서, CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT 및 TIM-3으로부터 선택된 2가지 이상의 체크포인트 억제 수용체를 코딩하는 유전자가 결여된 NK 세포.
23. 실시양태 21 또는 22에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4) 및 CD279(PD-1)로부터 선택되는 것인 NK 세포.
24. 실시양태 21 내지 23 중 어느 한 실시양태에 있어서, KHYG-1의 유도체인 NK 세포.
25. TRAIL 디코이 수용체에 대한 친화도가 감소되거나 전혀 없는 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현하는 NK 세포.
26. 실시양태 25에 있어서, KHYG-1의 유도체인 NK 세포.
27. 실시양태 25 또는 26에 있어서, CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT 및 TIM-3으로부터 선택된 체크포인트 억제 수용체를 코딩하는 유전자가 결여된 NK 세포.
28. 실시양태 1 내지 27 중 어느 한 실시양태에 있어서, 예를 들어 조사(irradiation)의 결과로서, 증식할 수 없는 NK 세포.
29. 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주를 제조하는 방법으로서, 세포 또는 세포주의 세포독성을 증가시키기 위해서 세포 또는 세포주를 유전자 변형시키는 단계를 포함하는 방법.
30. 실시양태 29에 있어서, NK 세포 또는 NK 세포주는 억제 수용체 기능을 감소시키기 위해서 변형되는 것인 방법.
31. 실시양태 30에 있어서, 억제 수용체는 체크포인트 억제 수용체인 방법.
32. 실시양태 31에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT 및 TIM-3으로부터 선택되는 것인 방법.
33. 실시양태 29 내지 32 중 어느 한 실시양태에 있어서, 2가지 이상의 억제 수용체의 기능을 감소시키도록 NK 세포를 변형시키는 단계를 포함하는 방법.
34. 실시양태 29 내지 33 중 어느 한 실시양태에 있어서, TRAIL 리간드 또는 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현하도록 NK 세포 또는 NK 세포주를 변형시키는 단계를 포함하는 방법.
35. 실시양태 34에 있어서, 돌연변이체 TRAIL 리간드는 TRAIL 수용체에 대한 친화도가 증가된 것인 방법.
36. 실시양태 35에 있어서, TRAIL 수용체는 DR4 및/또는 DR5인 방법.
37. 실시양태 34 내지 36 중 어느 한 실시양태에 있어서, 돌연변이 TRAIL 리간드는 디코이 TRAIL 수용체에 대해 친화도가 감소된 것인 방법.
38. 실시양태 29 내지 37 중 어느 한 실시양태에 있어서, NK 세포 또는 NK 세포주는 체크포인트 억제 수용체의 기능을 제거하도록 변형되고, 또한 디코이 TRAIL 수용체에 대한 결합 친화도가 감소되거나 전혀 없는 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현하도록 변형되는 것인 방법.
39. 실시양태 38에 있어서, NK 세포 또는 NK 세포주는 CAR 또는 이중 특이적 CAR을 발현하도록 변형되는 것인 방법.
40. 실시양태 39에 있어서, 이중 특이적 CAR은 하나의 세포 유형 상의 2가지 리간드에 결합하는 것인 방법.
41. 실시양태 39에 있어서, 이중 특이적 CAR은 2가지 상이한 세포 유형의 각 유형 상의 한가지 리간드에 결합하는 것인 방법.
42. 실시양태 39에 있어서, CAR 또는 이중 특이적 CAR에 대한 리간드(들)는 암세포 상에 발현되는 것인 방법.
43. 실시양태 40에 있어서, 이중 특이적 CAR에 대한 리간드는 둘 다 암세포 상에 발현되는 것인 방법.
44. 실시양태 41에 있어서, 이중 특이적 CAR에 대한 리간드는 암세포 및 면역 이펙터 세포 상에 발현되는 것인 방법.
45. 실시양태 29 내지 44 중 어느 한 실시양태에 있어서, NK 세포 또는 NK 세포주는 하나 이상의 Fc 수용체를 발현하도록 변형되는 것인 방법.
46. 실시양태 45에 있어서, Fc 수용체는 CD16(FcRIII), CD32(FcRII) 및 CD64(FcRI)로부터 선택되는 것인 방법.
47. 실시양태 29 내지 46 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포주는 KHYG-1 세포주의 유도체인 방법.
48. 실시양태 29 내지 47 중 어느 한 실시양태에 따른 방법에 의해 수득된 NK 세포 또는 NK 세포주.
49. 실시양태 29 내지 48 중 어느 한 실시양태에 따른 방법에 의해 수득된 KHYG-1 유도체.
50. 환자에서 암 치료에 사용하기 위한, 증가된 세포독성을 지닌 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주 또는 이의 조성물.
51. 실시양태 50에 따라 사용하기 위한, 실시양태 1 내지 28 중 어느 한 실시양태에 따른 NK 세포 또는 NK 세포주, 또는 실시양태 29 내지 49 중 어느 한 실시양태에 따라 수득된 NK 세포 또는 NK 세포주.
52. 실시양태 50 또는 51에 따라 사용하기 위한 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주 또는 이의 조성물로서, 암이 혈액암인 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주 또는 이의 조성물.
53. 실시양태 52에 있어서, 혈액암은 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 호지킨 림프종, T-세포 림프종 및 B-세포 림프종을 포함하는 비호지킨 림프종, 무증상 골수종, 스몰더링 다발성 골수종(SMM), 활성 골수종 또는 경쇄 골수종인 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주 또는 이의 조성물.
54. KHYG-1 세포에서 체크포인트 억제 수용체 기능을 감소시킴으로써, 또는 KHYG-1 세포에서 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현시킴으로써, 또는 둘 다를 수행함으로써 KHYG-1의 유도체로서 수득되는, 혈액암 치료에 사용하기 위한 NK 세포주.
실시예
본 발명은 이제 더 큰 세포독성 활성을 나타내어 인간에서 백혈병 세포 사멸을 일으키는 능력을 나타내도록 변형된 NK 세포주 KHYG-1 유도체의 생산과 관련하여 더 상세하고 구체적으로 기술한다.
본 발명은 이제 수반되는 도면을 참조하여 특정 실시예들에 예시된다:
도 1은 LIR2 유전자 표적 영역의 DNA 서열을 나타내고, gRNA 측면 영역을 표시한다.
도 2는 CTLA4 유전자 표적 영역의 DNA 서열을 나타내고, gRNA 측면 영역을 표시한다.
도 3은 트랜스펙션에 사용된 gRNA 구조물(발현 벡터)을 나타낸다.
도 4는 트랜스펙션 전후의 부모 및 돌연변이된 LIR2 DNA에 대한 겔 전기영동 밴드를 보여준다.
도 5는 트랜스펙션 전후의 부모 및 돌연변이된 CTLA4 DNA에 대한 겔 전기영동 밴드를 보여준다.
도 6a는 전기천공을 사용하여 성공적인 CD96 녹다운을 나타내는 FACS 플롯이다.
도 6b는 전기천공을 사용하여 성공적인 CD96 녹다운을 나타내는 FACS 플롯이다.
도 7은 다양한 E:T 비율에서 K562 세포에 대한 CD96 녹다운 KHYG-1 세포의 증가된 세포독성을 나타내는 막대 차트이다.
도 8은 NK-92 세포에서 CD328(Siglec-7)의 녹다운을 보여준다.
도 9는 CD328(Siglec-7) 녹다운을 가진 NK 세포의 상승된 세포독성을 보여준다.
도 10은 KHYG-1 세포 상 TRAIL의 기준선 발현의 FACS 플롯을 나타낸다.
도 11은 KHYG-1 세포의 트랜스펙션 후의 TRAIL 및 TRAIL 변이체의 발현의 FACS 플롯을 나타낸다.
도 12는 KHYG-1 세포의 트랜스펙션 후 CD107a의 발현의 FACS 플롯을 나타낸다.
도 13은 TRAIL 및 TRAIL 변이체로 KHYG-1 세포의 트랜스펙션의 세포 생존도에 대한 효과를 나타낸다.
도 14는 KHYG-1 세포와 NK-92 세포 모두에서 DR4, DR5, DcR1 및 DcR2의 기준선 발현의 FACS 플롯을 나타낸다.
도 15, 16 및 17은 3개의 표적 세포 집단, 즉 K562, RPMI8226 및 MM1.S 각각의 아폽토시스에 대한 KHYG-1 세포에서 TRAIL 또는 TRAIL 변이체 발현의 효과를 나타낸다;
도 18은 DR5 발현에 대한 보르테조밉 처리의 효과를 보여주는 RPMI8226 세포 및 MM1.S 세포 각각에서 DR5 발현의 2개의 FACS 플롯을 나타낸다.
도 19는 TRAIL 변이체를 가지거나 가지지 않는 KHYG-1 세포와 동시 배양된 보르테조밉 사전처리/미처리 MM1.S 세포에서 아폽토시스의 FACS 플롯을 나타낸다.
도 20은 100 nM CMA로 2시간 처리된 KHYG-1 세포에서 퍼포린 발현 수준의 FACS 플롯을 나타낸다.
도 21은 100 nM CMA 또는 비히클로 처리 후 KHYG-1 세포 생존도의 FACS 플롯을 나타낸다.
도 22는 TRAIL 변이체를 가지거나 가지지 않는 CMA로 전처리/미처리 KHYG-1 세포와 동시 배양된 MM1.S 세포의 아폽토시스의 FACS 플롯을 나타낸다.
도 23은 CD96-siRNA 및/또는 TRAIL 변이체가 발현된 KHYG-1 세포와 동시 배양된 K562 세포의 아폽토시스의 FACS 플롯을 나타낸다.
도 24는 CD96-siRNA 및/또는 TRAIL 변이체가 발현된 KHYG-1 세포와 동시 배양된 MM1.S 세포의 아폽토시스의 FACS 플롯을 나타낸다.
DNA, RNA 및 아미노산 서열은 하기를 나타낸다:
서열 번호 1은 전체 LIR2 DNA 서열이고,
서열 번호 2는 LIR2 아미노산 서열이고,
서열 번호 3은 LIR2 g9 gRNA 서열이고,
서열 번호 4는 LIR2 g18 gRNA 서열이고,
서열 번호 5는 LIR2 정방향 프라이머 서열이고,
서열 번호 6은 LIR2 역방향 프라이머 서열이고,
서열 번호 7은 전체 CTLA4 DNA 서열이고,
서열 번호 8은 CTLA4 아미노산 서열이고,
서열 번호 9는 CTLA4 g7 gRNA 서열이고,
서열 번호 10은 CTLA4 g15 gRNA 서열이고,
서열 번호 11은 CTLA4 정방향 프라이머 서열이고,
서열 번호 12는 CTLA4 역방향 프라이머 서열이다.
실시예 1 - 억제 수용체 기능의 녹아웃
CRISPR
/
Cas9
억제 수용체 기능이 제거된 세포는 다음과 같이 제조하였다. gRNA 구조물은 NK 세포의 인간 게놈에서 '고전적' 억제 수용체 LIR2 및 '체크포인트' 억제 수용체 CTLA4를 코딩하는 유전자를 표적화하도록 설계하여 제조하였다. 그 후, CRISPR/Cas9 게놈 편집을 이용하여 LIR2 및 CTLA4 표적 유전자를 녹아웃시켰다.
각각의 표적 유전자에 대해 2개의 gRNA 후보 물질을 선택하고 K562 세포에서 그의 절단 효능을 결정하였다. gRNA 후보 물질의 서열은 표 1에 나타내고, 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)는 서열의 마지막 3개의 염기와 관련된다. LIR2 유전자(서열 번호 1) 및 CTLA4 유전자(서열 번호 7)상의 gRNA 서열의 측면 영역은 각각 도 1 및 2에 나타낸다.
<표 1>
K562 세포를 제조된 gRNA 구조물로 트랜스펙션시키고(도 3), 이어서 PCR 증폭을 위해 수거하였다. GFP 발현의 존재를 이용하여 gRNA 구조물이 K562 세포에 성공적으로 혼입됨을 보고하였다. 이는 Cas9 유전자의 발현 및 이에 따른 LIR2 및 CTLA4 유전자의 발현을 녹아웃시키는 능력을 확인하였다.
gRNA 구조물의 절단 활성은 시험관내 미스매치(mismatch) 검출 분석을 이용하여 측정하였다. T7E1 엔도뉴클레아제 I은 완벽하게 일치하지 않는 DNA를 인식하고 절단하여 부모 LIR2와 CTLA4 유전자를 CRISPR/Cas9 트랜스펙션 및 비상동 말단 결합(NHEJ: non-homologous end joining) 후에 돌연변이된 유전자와 비교되도록 하였다.
도 4는 g9 및 g18 gRNA 서열로 LIR2 유전자의 녹아웃 후 아가로오스 겔 전기영동 후 생성된 밴드를 보여준다. 각 돌연변이에 해당하는 3개의 밴드는 트랜스펙션 후 DNA 서열의 미스매치를 검출한 후 부모 유전자 및 2개의 생성된 가닥과 관련된다. g9 gRNA 서열은 11%의 트랜스펙션 성공률을 얻는 한편, g18 gRNA는 10%의 결과를 가져왔다.
도 5는 g7 및 g15 gRNA 서열로 CTLA4 유전자의 녹아웃 후 아가로오스 겔 전기영동 후 생성된 밴드를 나타낸다. g7 gRNA 서열은 32%의 트랜스펙션 성공률을 얻는 한편, g15 gRNA는 26%의 결과를 가져왔다.
K562 세포에서 LIR2 및 CTLA4의 성공적인 녹아웃 후, KHYG-1 세포를 gRNA 구조물로 트랜스펙션시켰다.
동형접합 결실을 갖는 KHYG-1 유도체 클론을 선별하였다. 상기 목적을 위해 Cas9/푸로마이신 아세틸트랜스퍼라아제(PAC) 발현 벡터를 사용하였다. 성공적으로 트랜스펙션된 세포는 항생제 푸로마이신에 대한 내성을 기준으로 하여 선별하였다.
Cas9
RNP
NK 세포에서 체크포인트 억제 수용체의 녹아웃에 사용된 또 다른 프로토콜은 Cas9 RNP 트랜스펙션의 프로토콜이었다. 이 프로토콜을 사용하면 CRISPR/Cas9 프로토콜의 DNA 플라스미드를 이용하는 것과 비교하여 유사한 트랜스펙션 효율을 달성할 수 있지만 독성이 현저히 낮다는 이점이 있다.
각각의 트랜스펙션 실험을 위해 1x106 KHYG1 세포를 수거하였다. 세포를 PBS로 세척하고 원심분리기에서 회전시켰다. 그 후, 상등액을 버렸다. 이어서, CRISPR RNP(RNA 결합 단백질) 물질을 하기와 같이 제조하였다:
1) 필요한 합성된 crRNA와 tRNA(다마콘(Dharmacon)에서 구입)의 20 μM 용액을 제조하였다.
(2) 4 ㎕의 crRNA(20 μM)와 4 ㎕의 tRNA(20 μM)를 함께 혼합하였다.
(3) 그 후, 혼합물을 2㎕의 Cas9 단백질(5㎍/㎕)에 첨가하였다.
(4) 모든 성분을 혼합하고 실온에서 10분간 인큐베이션하였다.
네온® 트랜스펙션 시스템(Neon® Transfection System)에 따라, 세포를 Cas9 RNP와 혼합하고, 하기 파라미터를 사용하여 전기천공을 수행하였다:
전압 : 1450v
펄스 폭: 30ms
펄스 수: 1
그 후, 세포를 성장 배지(IL-2 및 IL-15 포함)를 포함하는 12 웰 플레이트 중 하나의 웰로 옮겼다.
48-72 시간 후에 세포를 수거하여 T7 엔도뉴클레아제 분석 및/또는 생거(Sanger) 서열분석에 의해 유전자 편집 효율을 확인하였다. indel의 존재는 KHYG1 세포에서 CTLA4, PD1 및 CD96의 성공적인 녹아웃을 나타내는 것으로 확인하였다.
부위 특이적 뉴클레아제
NK 세포에서 체크포인트 억제 수용체의 녹아웃에 사용된 또 다른 프로토콜은 XTN TALEN 트랜스펙션의 프로토콜이었다. 이 프로토콜을 사용하는 이점은 야생형 CRISPR에 비해 특히 높은 수준의 특이성이 달성될 수 있다는 것이었다.
1단계 : 시약 제조
KHYG-1 세포는 트랜스펙션 효율, 단일 세포 클로닝 효율 및 핵형/복제 수를 포함한 특정 특성에 대해 분석하였다. 그 후, 세포를 공급자의 권고에 따라 배양하였다.
녹아웃 아웃되는 체크포인트 억제 수용체에 따라, 뉴클레아제는 적어도 2 쌍의 XTN TALEN을 맞춤 설계하여 준비하였다. 맞춤 설계의 단계는 유전자 좌의 평가, 복제 수 및 기능적 평가(즉, 상동체, 표적 외(off target) 평가)를 포함한다.
2단계 : 세포주 조작
세포를 1단계의 뉴클레아제로 트랜스펙션시켰다; 이 단계는 높은 수준의 절단을 얻기 위해 최대 3회 반복하였고 배양액을 나누고 각 트랜스펙션 전에 중간 배양액을 유지하였다.
각 트랜스펙션 며칠 후에 초기 스크리닝을 하였으며, 세포 풀은 Cel-1 분석을 통해 절단 효율에 대해 시험하였다. 트랜스펙션을 반복한 후 절단 수준이 허용 가능한 수준 또는 평형에 도달한 후에, 세포는 단일 세포 클로닝을 위해 준비된 것으로 간주하였다.
세포를 모아 96 웰 플레이트에 웰당 하나의 세포로 분류하였다; 각각의 풀에 대한 플레이트의 수는 1단계에서 결정된 단일 세포 클로닝 효율에 따라 결정하였다. 플레이트를 3-4주간 인큐베이션하도록 두었다.
3단계 - 스크리닝 및 증폭
세포가 96 웰 플레이트에서 전면 성장하면, 배양액을 합하고 3중의 96 웰 플레이트로 나누었다. 하나의 플레이트는 백업으로 동결하고, 한 플레이트는 다시 플레이팅하여 클론의 증폭을 계속하였고, 최종 플레이트는 유전자형 확인에 사용하였다.
유전자형 플레이트의 각 클론을 qPCR 신호의 소실에 대해 분석하여, 모든 대립 형질이 변형되었음을 나타냈다. 음성 클론을 PCR 증폭 및 클로닝하여 indel의 성질 및 임의의 야생형의 결여 또는 프레임 내 indel을 결정하였다.
확인된 녹아웃을 갖는 클론을 하나의 24 웰 플레이트로 합하고 추가로 증폭시켰다; 전형적으로, 녹아웃당 최대 5개의 개별 클론에 대해 바이알당 약 1x106 세포를 포함한 5-10개의 냉동된 냉동 바이알을 생산하였다.
4단계 - 유효성 검사
세포를 무균 조건하에 은행에 보관하였다.
모든 은행에 보관된 세포의 기본 배포 기준은 생존 세포 수(동결 전 및 해동 후), STR을 통한 동일성 확인, 기본 무균 보증 및 마이코플라스마 검사를 포함하였다; 필요할 때마다 다른 배포 기준을 적용하였다(핵형, 표면 마커 발현, 높은 수준의 무균, 전사체 또는 단백질의 녹아웃 평가 등).
실시예
2 - 체크포인트 억제 수용체 CD96 기능의
RNAi를
통한 녹다운
KHYG-1 세포에서 CD96의 siRNA 녹다운을 전기천공에 의해 수행하였다. 론자(Lonza)의 아막사 뉴클레오펙터 II(Amaxa Nucleofector II)와 함께 뉴클레오펙션 키트 T(Nucleofection Kit T)를 사용하였으며, 이는 세포주와 함께 사용하기에 적합하고 분열 세포와 비분열 세포 모두를 성공적으로 트랜스펙션시킬 수 있고 최대 90%의 트랜스펙션 효율을 달성하기 때문이다.
대조군 siRNA(카탈로그 번호: sc-37007) 및 CD96 siRNA(카탈로그 번호: sc-45460)는 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)로부터 구입하였다. 10% FBS, 2mM L-글루타민을 함유한 항생제 무첨가 RPMI-1640을 뉴클레오펙션 후 배양에 사용하였다. 마우스 항-인간 CD96-APC(카탈로그 번호: 338409)는 염색을 위해 바이오레전드(Biolegend)로부터 구입하였다.
20μM의 siRNA 저장 용액을 제조하였다. 동결건조된 siRNA 이중 가닥은 FITC-대조군/대조군-siRNA에 RN아제가 제거된 물(siRNA 희석 완충액: sc-29527) 33㎕, 표적 유전자 siRNA(siRNA CD96)에 RNA아제가 제거된 물 165㎕에 재현탁하였다. 튜브를 90℃로 1분간 가열한 후 37℃에서 60분간 인큐베이션하였다. 그 후 siRNA를 필요할 때까지 -20℃에서 보관하였다.
세포는 로그 성장 단계에 있어야 하기 때문에 KHYG-1 세포는 뉴클레오펙션 1 내지 2일 전에 계대하였다.
뉴클레오펙터(Nucleofector) 용액을 실온으로 가온하였다(샘플당 100㎕). 또한, 혈청과 보충제를 함유하는 배양 배지의 분액을 50ml 튜브에서 37℃로 예열하였다. 혈청 및 보충제를 함유하는 배양 배지 1.5ml를 첨가하여 6 웰 플레이트를 준비하였다. 플레이트를 가습된 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 미리 인큐베이션하였다.
100㎕의 뉴클레오펙션 용액에 2x106 세포를 4㎕ 20μM siRNA 용액(1.5μg siRNA)와 부드럽게 혼합하였다. 혼합하는 동안 기포를 방지하였다. 혼합물을 아막사 인증 큐벳으로 옮기고 뉴클레오펙터 큐벳 홀더에 넣고 프로그램 U-001을 선택하였다.
프로그램을 종료시키고 큐벳 내 샘플을 즉시 꺼냈다. 그 후, 500㎕의 미리 평형화된 배양 배지를 각 큐벳에 첨가하였다. 각 큐벳 내의 샘플을 웰 당 2ml의 최종 부피를 확립하기 위해 준비된 6 웰 플레이트의 상응하는 웰로 부드럽게 옮겼다.
그 후, 세포를 트랜스펙션 분석을 수행할 때까지 가습된 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. CD96 발현 수준을 측정하기 위해서 전기 천공 16-24시간 후에 유세포 측정 분석을 수행하였다. 이 전기천공 프로토콜을 여러 번 수행하고 KHYG-1 세포에서 CD96 녹다운을 확실하게 일으킨 것을 확인하였다(도 6a 및 6b 참조).
실시예
3 - CD96 녹다운을 갖는
NK
세포의
상승된
세포독성
CD96 녹다운을 갖거나 갖지 않는 KHYG-1 세포를 다양한 이펙터:표적(E:T) 비율로 K562 세포와 동시 배양하였다.
세포독성은 퍼킨엘머(PerkinElmer)의 델피아(DELFIA) EuTDA 세포독성 키트(카탈로그 번호: AD0116)를 사용하여 동시 배양 4시간 후에 측정하였다.
표적 세포 K562를 10% FBS, 2mM L-글루타민 및 항생제를 함유하는 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 살스테드(SARSTEDT)로부터 96 웰 V 바닥 플레이트(카탈로그 번호: 83.3926)를 구입하였다. 에펜도르프(Eppendorf) 원심분리기 5810R(플레이트 로터가 구비됨)을 사용하여 플레이트를 회전시켰다. 바리오스캔 플래시(VARIOSKAN FLASH)(ScanIt 소프트웨어 2.4.3가 구비됨)을 사용하여 용해된 K562 세포에 의해 생성된 형광 신호를 측정하였다.
K562 세포를 배양 배지로 세척하고 세포 수를 배양 배지로 1x106 세포/mL로 조정하였다. 2 내지 4mL의 세포를 5㎕의 BATDA 시약에 첨가하고 37℃에서 10분간 인큐베이션하였다. 세포 내에서 에스테르 결합은 가수분해되어 더 이상 막을 통과하지 않는 친수성 리간드를 형성한다. 세포를 1500RPM에서 5분간 원심분리하여 로딩된 K562 세포를 세척하였다. 이를 1mM 프로베네시드(Probenecid)(시그마 P8761)를 함유하는 배지로 3 내지 5회 반복하였다. 최종 세척 후 세포 펠렛을 배양 배지에 재현탁하고 약 5x104 세포/mL로 조정하였다.
배경, 자연 방출 및 최대 방출의 검출을 위한 웰을 설정하였다. 100 ㎕의 로딩된 표적 세포(5,000 세포)를 V 바닥 플레이트의 웰에 옮기고, 1:1 내지 20:1 범위의 이펙터 대 표적 비율을 만들기 위해 100 ㎕의 이펙터 세포(KHYG-1 세포)를 다양한 세포 농도로 첨가하였다. 플레이트를 100xg에서 1분간 원심분리하고 37℃에서 가습된 5% CO2 대기에서 4시간 인큐베이션하였다. 최대 방출 웰을 위해, 10㎕의 용해 완충액을 각 웰에 첨가하고 15분 후에 배지를 수거하였다. 플레이트를 500xg에서 5분간 원심분리하였다.
상등액 20㎕를 편평한 바닥 96 웰 플레이트로 옮기고, 200㎕의 예열된 유로퓸 용액을 첨가하였다. 이것을 플레이트 쉐이커를 사용하여 실온에서 15분간 인큐베이션하였다. K562 세포는 KHYG-1 세포에 의해 용해될 때, 배지로 리간드를 방출한다. 그 후 이 리간드는 유로퓸 용액과 반응하여 용해된 세포의 양과 직접적으로 관련이 있는 형광 킬레이트를 형성한다.
그 후 바리오스캔 플래시를 사용하여 시분해 형광 측정기에서 형광도를 측정하였다. 특이적 방출은 다음 식을 사용하여 계산하였다.
% 특이적 방출 = 실험 방출 - 자연 방출/최대 방출 - 자연 방출
통계 분석은 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism) 6.04 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 양측 t 검정을 이용하여 siRNA CD96 녹다운 KHYG-1 세포와 대조군(n = 3) 사이의 차이를 비교하였다.
CD96 녹다운 KHYG-1 세포를 함유하는 동시 배양액에서 특이적 방출이 유의하게 증가하는 것으로 확인되었다. 이는 모든 E:T 비율에서의 경우였다(도 7 참조).
형광이 세포 용해와 직접적으로 관련되기 때문에 KHYG-1 세포에서 CD96 발현을 녹다운시키면 K562 암 표적 세포를 살해할 수 있는 능력이 증가하는 것을 확인하였다.
실시예
4 - CD328(
Siglec
-7) 녹다운을 갖는
NK
세포의
상승된
세포독성
NK
-92 세포에서 CD328의
siRNA
매개된
녹다운
재료, 시약 및 장치
대조군 siRNA(카탈로그 번호: sc-37007) 및 CD328 siRNA(카탈로그 번호: sc-106757)는 산타 크루즈 바이오테크놀로지로부터 구입하였다. 뉴클레오펙터™ 디바이스(Nucleofector™ Deivce)(Nucleofector II, Lonza)로 NK-92 세포에서 높은 세포 생존도(> 75%)로 최대 90%의 트랜스펙션 효율을 달성하기 위해서, 론자의 뉴클레오펙터™ 키트 T를 사용하였다. 10% FBS, 2mM L-글루타민을 함유하는 항생제 무첨가 RPMI-1640을 뉴클레오펙션 후 배양에 사용하였다. 마우스 항-인간 CD328-APC(카탈로그 번호: 339206)는 바이오레전드에서 구입하였다.
프로토콜
10 μM의 siRNA 저장 용액을 만들기 위해서
- 동결건조된 siRNA 이중 가닥을 FITC-대조군/대조군-siRNA에 RN아제가 제거된 물(siRNA 희석 완충액: sc-29527) 66㎕에, 표적 유전자 siRNA(siRNA CD328)에 RNA아제가 제거된 물 330㎕에 재현탁한다.
- 튜브를 90℃로 1분간 가열한다.
- 37℃에서 60분간 인큐베이션한다.
- siRNA 저장 용액을 바로 사용하지 않을 경우 -20℃에 보관한다.
- 하나의 뉴클레오펙션 샘플(100㎕ 표준 큐벳에 대해)은 하기를 포함한다.
- 세포 수 : 2x106 세포
- siRNA : 4㎕의 10 μM 저장 용액
- 뉴클레오펙터 용액: 100㎕
뉴클레오펙션
- 필요한 수의 세포를 배양한다(뉴클레오펙션 1 내지 2일 전에 계대하며, 세포는 대수 성장 단계에 있어야 한다).
- 각 샘플에 대한 siRNA를 제조한다.
- 뉴클레오펙터 용액을 실온으로 예열한다(샘플당 100㎕).
- 혈청과 보충제를 함유하는 배양 배지의 분액을 50ml 튜브에서 37℃에서 예열한다. 혈청과 보충제를 함유한 1.5ml의 배양 배지를 채워 6 웰 플레이트를 준비하고 플레이트를 가습된 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 미리 인큐베이션한다.
- 세포 배양액의 분액을 취해 세포를 계수하여 세포 밀도를 결정한다.
- 필요한 수의 세포를 1500rpm에서 5분간 원심분리한다. 상등액을 완전히 버려 잔여 배지가 세포 펠렛을 덮지 않도록 한다.
- 세포 펠렛을 최종 농도 2x106 세포/100㎕로 실온의 뉴클레오펙터 용액에 재현탁한다. 세포 현탁액을 뉴클레오펙터 용액에 15-20분 이상 보관하지 않는데, 이는 세포 생존도와 유전자 전달 효율이 저하되기 때문이다.
- 100㎕의 세포 현탁액을 siRNA와 혼합한다.
- 샘플을 아막사 인증 큐벳에 옮긴다. 반드시 샘플이 큐벳 바닥을 덮고 피펫팅 중에 기포를 방지한다. 파란색 캡으로 큐벳을 닫는다.
- 적절한 뉴클레오펙터 프로그램(NK-92 세포일 경우 A-024)을 선택한다. 큐벳을 큐벳 홀더에 넣고(뉴클레오펙터 II: 회전 장치를 시계 방향으로 최종 위치까지 돌림) "X" 버튼을 눌러 프로그램을 시작한다.
- 세포 손상을 피하기 위해, 프로그램이 완료된 후("OK"가 표시됨) 즉시 큐벳에서 샘플을 꺼낸다. 예열된 배양 배지 500㎕를 큐벳에 첨가하고 샘플을 준비된 6 웰 플레이트에 옮긴다.
- 세포를 가습된 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션한다. 16-24시간 후에 유세포 측정 분석 및 세포독성 분석을 수행한다.
결과 : 본 발명자는 상기 프로토콜을 따랐으며 NK-92 세포에서 CD328 발현 수준의 유세포 측정 분석을 수행하였다. 하나의 대표적인 실험 결과를 도 8에 나타내며, 이는 성공적으로 녹다운되었음을 확인해준다.
CD328을
녹다운시켜
세포독성을
상승시킨다
재료, 시약 및 장치
형광 증강 리간드(카탈로그 번호: AD0116)를 기반으로 한 델피아 EuTDA 세포독성 키트는 퍼킨 엘머에서 구입하였다. 표적 세포 K562를 10% FBS, 2mM L-글루타민 및 항생제를 함유하는 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 살스테드로부터 96 웰 V 바닥 플레이트(카탈로그 번호: 83.3926)를 구입하였다. 에펜도르프 원심분리기 5810R(플레이트 로터가 구비됨)을 사용하여 플레이트를 회전시켰다. 바리오스캔 플래시(ScanIt 소프트웨어 2.4.3가 구비됨)를 사용하여 용해된 K562 세포에 의해 생성된 형광 신호를 측정하였다.
프로토콜
- 형광 증강 리간드 델피아 BATDA 시약을 표적 K562 세포에 로딩한다.
- K562 세포를 배지로 세척하고, 배양 배지로 세포 수를 1x106 세포/mL로 조정한다. 세포 2 내지 4 mL를 5 ㎕의 BATDA 시약에 첨가하고 37℃에서 10분간 인큐베이션한다.
- 1500RPM에서 5분간 회전시키고 로딩된 K562 세포를 1mM 프로베네시드(시그마 P8761)를 함유하는 배지로 3 내지 5회 세척한다.
- 최종 세척 후 배양 배지에 세포 펠렛을 재현탁하고 약 5x104 세포/mL로 조정한다.
세포독성 분석
- 배경, 자연 방출 및 최대 방출의 검출을 위한 웰을 설정한다.
- 100 ㎕의 로딩된 표적 세포(5,000 세포)를 V 바닥 플레이트에 피펫팅한다.
- 다양한 세포 농도의 이펙터 세포(NK-92) 100 ㎕를 첨가한다. 이펙터 대 표적 비율은 1:1 내지 20:1 범위이다.
- 플레이트를 100xg의 RCF에서 1분간 회전시킨다.
- 가습된 5% CO2 대기에서 37℃에서 2시간 인큐베이션한다. 최대 방출 웰을 위해, 10㎕의 용해 완충액을 각 웰에 첨가하고 15분 후에 배지를 수거한다.
- 플레이트를 500xg에서 5분간 회전시킨다.
- 상등액 20㎕를 편평한 바닥 96 웰 플레이트로 옮기고, 200㎕의 예열된 유로퓸 용액을 첨가하고, 플레이트 쉐이커를 사용하여 실온에서 15분간 인큐베이션한다.
- 바리오스캔 플래시 사용하여 시분해 형광 측정기에서 형광도를 측정한다. 특이적 방출은 다음 식을 사용하여 계산하였다.
- % 특이적 방출 = 실험 방출 - 자연 방출/최대 방출 - 자연 방출
결과 : 본 발명자는 상기에 따라 CD328 녹다운의 세포독성에 대한 효과를 측정하였다. 하나의 대표적인 실험 결과를 도 9에 나타낸다. 나타낸 바와 같이, 표적 세포에 대한 세포독성은 CD328 녹다운을 갖는 세포에서 증가하였다.
실시예
5 - 체크포인트 억제 수용체의 녹다운/녹아웃에 의한 혈액암 치료법을 위한 프로토콜
상기 실시예에서 입증된 바와 같이, 체크포인트 억제 수용체 기능은 다양한 방식으로 녹다운되거나 녹아웃될 수 있다. 혈액암 환자 치료에 사용하기 위해 다음 프로토콜을 개발하였다.
본 발명으로 적절하게 치료되는 암 환자를 진단한 후, 변형된 NK 세포의 분액을 해동시켜 배양한 후 환자에게 투여할 수 있다.
별법으로, 일시적인 돌연변이는 예를 들어, siRNA를 이용하여 상기한 바와 같이 1 내지 2일 내에 제조할 수 있다. 맥스사이트 유동 전기천공(Maxcyte Flow Electroporation) 플랫폼은 병원에서 신속하고 대규모의 트랜스펙션을 달성하는데 적합한 해결책을 제공한다.
특정 체크포인트 억제 수용체의 제거는 다른 것들보다 더 유익할 수 있다. 이것은 아마도 환자와 암에 따라 좌우되기 쉽다. 이러한 이유로, 경우에 따라 암을 생검하고 암세포를 생체 외에서 배양액에 배양한다. 따라서, 각각 다른 체크포인트 억제 수용체 변형을 갖는 다양한 NK 세포를 특정 암에 대한 세포독성에 대해 시험할 수있다. 이 단계는 치료법을 위해 가장 적절한 NK 세포 또는 이의 유도체를 선택하는 데 사용할 수 있다.
성공적으로 변형시킨 후에, 세포를 환자에게 정맥 주사 및/또는 종양 내 주입에 적절한 담체(예를 들어, 식염수)에 재현탁한다.
실시예
6 - TRAIL/TRAIL
변이체의
KHYG
-1 녹인(knock-in)
트랜스펙션 후 생존도와 암세포를 살해할 수 있는 능력을 평가하기 위해 TRAIL 및 TRAIL 변이체 둘 다로 KHYG-1 세포를 트랜스펙션시켰다.
사용된 TRAIL 변이체는 WO 2009/077857호에 기재된 것이다. 이는 D269H/E195R 돌연변이가 포함하는 야생형 TRAIL 유전자에 의해 코딩된다. 이 돌연변이는 DR5에 대한 TRAIL 변이체의 친화도를 현저하게 증가시키는 반면, 디코이 수용체(DcR1 및 DcR2) 둘 다에 대한 친화도를 감소시킨다.
기준선 TRAIL 발현
KHYG-1 세포에서 기준선 TRAIL(CD253) 발현은 유세포 측정법을 사용하여 분석하였다.
마우스 항-인간 CD253-APC(바이오레전드 카탈로그 번호: 308210) 및 아이소형 대조군(바이오레전드 카탈로그 번호: 400122)을 사용하여 세포 샘플을 염색하고 BD FACS 칸토 II(BD FACS Canto II) 유세포 측정기로 분석하였다.
KHYG-1 세포를 10% FBS, 2mM L-글루타민, 페니실린(100U/mL)/스트렙토마이신(100mg/mL) 및 IL-2(10ng/mL)를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 0.5-1.0x106 세포/시험을 원심 분리(1500rpm × 5 분)에 의해 수집하고 상등액을 흡인하였다. 세포(단일 세포 현탁액)를 4 mL의 얼음 냉각 FACS 완충액(PBS, 0.5-1% BSA, 0.1% NaN3 아지드화나트륨)으로 세척하였다. 세포를 100㎕의 얼음 냉각 FACS 완충액에 재현탁하고, 5㎕의 항체를 각 튜브에 첨가하고 얼음 위에서 30분간 인큐베이션하였다. 세포를 1500rpm에서 5분간 원심분리하여 3회 세척하였다. 그 후 세포를 500㎕의 얼음 냉각 FACS 완충액에 재현탁하고 어두운 곳에 얼음 위에 일시적으로 보관하였다.
이어서, 세포를 유세포 측정기(BD FACS 칸토 II)에서 분석하고, 생성된 데이터를 플로우조(FlowJo) 7.6.2 소프트웨어를 사용하여 처리하였다.
도 10에서 볼 수 있는 바와 같이, FACS 분석은 KHYG-1 세포 표면상의 TRAIL의 약한 기준선 발현을 보였다.
전기천공에 의한 TRAIL/TRAIL
변이체
녹인
야생형 TRAIL mRNA 및 TRAIL 변이체(D269H/195R) mRNA는 트리링크 바이오테크놀로지(TriLink BioTechnologies)에 의해 합성하고, 소분하여 -80℃에 보관하였다. 마우스 항-인간 CD253-APC(바이오레전드 카탈로그 번호: 308210) 및 아이소형 대조군(바이오레전드 카탈로그 번호: 400122) 및 마우스 항 인간 CD107a-PE(이바이오사이언스(eBioscience) 카탈로그 번호: 12-1079-42) 및 아이소형 대조군(이바이오사이언스 카탈로그 번호: 12-4714) 항체를 사용하여 세포 샘플을 염색하고 BD FACS 칸토 II 유세포 측정기로 분석하였다. DNA 염료 사이톡스-그린(SYTOX-Green)(라이프 테크놀로지스(Life Technologies) 카탈로그 번호: S7020; DMSO 중의 5mM 용액)을 사용하였다. 뉴클레오펙터™ 장치(Nucleofector II, Lonza)로 KHYG-1 세포에서 높은 세포 생존도로 최대 90%의 트랜스펙션 효율을 달성하기 위해, 론자의 뉴클레오펙터™ 키트 T를 사용하였다. 10% FBS, L-글루타민(2mM) 및 IL-2(10ng/mL)를 함유한 항생제 무첨가 RPMI 1640을 뉴클레오펙션 후 배양에 사용하였다.
세포가 대수적 성장 단계에 있어야 하기 때문에 KHYG-1과 NK-92 세포를 뉴클레오펙션 1 내지 2일 전에 계대하였다. 50 mL 튜브에 37℃에서 혈청과 보충제를 함유하는 배양 배지의 분액과 함께 뉴클레오펙터 용액을 실온으로 예열하였다(샘플당 100㎕). 혈청 및 보충제를 함유한 1.5ml의 배양 배지를 채워 6 웰 플레이트를 준비하고 가습된 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 미리 인큐베이션하였다. 세포 배양액의 분액을 준비하여 세포를 계수하여 세포 밀도를 결정하였다. 필요한 수의 세포를 1500rpm에서 5분간 원심분리한 후 상등액을 완전히 버렸다. 세포 펠렛을 최종 농도 2x106 세포/100㎕로 실온의 뉴클레오펙터 용액에 재현탁하였다(현탁 최대 시간 = 20분). 100㎕의 세포 현탁액을 10㎍ mRNA(RNA의 부피 <10㎕)와 혼합하였다. 샘플을 아막사 인증 큐벳으로 옮겼다(반드시 샘플이 큐벳 바닥을 덮고 기포를 방지한다). 적절한 뉴클레오펙터 프로그램을 선택하였다(즉, KHYG-1 세포일 경우 U-001). 그 후 큐벳을 큐벳 홀더에 넣었다. 예열된 배양 배지 500 ㎕를 큐벳에 첨가하고 세포의 손상을 피하기 위해서 프로그램 완료 후 즉시 샘플을 준비된 6 웰 플레이트로 옮겼다. 세포를 가습된 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 전기천공 12-16시간 후에 유세포 측정 분석 및 세포독성 분석을 수행하였다. 유세포 측정법 염색은 상기와 같이 수행하였다.
도 11 및 도 12에서 볼 수 있듯이, TRAIL/TRAIL 변이체 및 CD107a(NK 활성화 마커)의 발현은 트랜스펙션 후 증가하였으며, TRAIL 유전자의 KHYG-1 세포로의 성공적인 녹인을 확인하였다.
도 13은 전기천공을 통한 트랜스펙션 전후의 KHYG-1 세포 생존도의 증거를 제공한다. TRAIL/TRAIL 변이체로 세포의 트랜스펙션 후 세포 생존도에서 통계적으로 유의한 차이가 관찰되지 않음을 알 수 있으며, 이는 야생형 또는 변이 TRAIL의 발현이 세포에 독성이 없음을 확인해 준다. 이 관찰은 TRAIL 변이 유전자 녹인이 세포에 독성이 있음을 시사하는 NK-92 세포에서의 상응하는 결과와 모순된다(데이터는 미제시). 그렇지만, 이는 아마도 NK-92 세포 표면에서 TRAIL 수용체 DR4 및 DR5의 상대적으로 높은 발현 수준에 의해 설명된다(도 14 참조).
KHYG
-1 세포의 세포독성에 미치는 TRAIL/TRAIL
변이체의
효과
마우스 항-인간 CD2-APC 항체(BD 파민젠(BD Pharmingen) 카탈로그 번호: 560642)를 사용하였다. 아넥신(Annexin) V-FITC 항체(이뮤노툴스(ImmunoTools) 카탈로그 번호: 31490013)를 사용하였다. DNA 염료 사이톡스-그린(라이프 테크놀로지스 카탈로그 번호: S7020)을 사용하였다. 24 웰 세포 배양 플레이트(살스테드 AG 카탈로그 번호: 83.3922)를 사용 하였다. 골수성 백혈병 세포주 K562, 다발성 골수종 세포주 RPMI8226 및 MM1.S를 표적 세포로 사용하였다. K562, RPMI8226, MM1.S를 10% FBS, 2mM L-글루타민 및 페니실린(100U/mL)/스트렙토마이신(100mg/mL)을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 배양하였다.
상기에 설명한 바와 같이, KHYG-1 세포를 TRAIL/TRAIL 변이체로 트랜스펙션시켰다.
표적 세포를 세척하고 1500rpm에서 5분간 원심분리하여 펠렛화하였다. 트랜스펙션된 KHYG-1 세포를 0.5x106/mL로 희석하였다. 그 후, 이펙터: 표적(E:T) 비율을 1:1로 만들기 위해 표적 세포 밀도를 예열된 RPMI 1640 배지로 조정하였다.
그 후, 0.5 mL의 KHYG-1 세포와 0.5 mL의 표적 세포를 24 웰 배양 플레이트에서 혼합하고 가습된 37℃/5% CO2 인큐베이터에 12시간 두었다. 유세포 측정 분석을 이용하여 KHYG-1 세포의 세포독성을 분석하였다; 동시 배양된 세포(다양한 시점에서)를 세척한 후 아넥신 V 결합 완충액을 사용하여 CD2-APC 항체(5 ㎕/시험), 아넥신 V-FITC(5 ㎕/시험) 및 사이톡스-그린(5 ㎕/시험)으로 염색하였다.
데이터는 플로우조 7.6.2 소프트웨어를 사용하여 추가로 분석하였다. KHYG-1 세포 및 표적 세포 집단 각각을 나타내는 CD2 양성 및 CD2 음성 게이트를 정하였다. 그 후, CD2 음성 집단에서 아넥신 V-FITC와 사이톡스-그린 양성 세포를 TRAIL 유도된 아폽토시스에 대해 분석하였다.
도 15, 16 및 17은 3가지 표적 세포주, K562, RPMI8226 및 MM1.S 각각의 아폽토시스에 대한 TRAIL 또는 TRAIL 변이체를 발현하는 KHYG-1 세포 모두의 효과를 나타낸다. 모든 표적 세포 집단에서 KHYG-1 세포 상 TRAIL 발현은 정상 KHYG-1 세포(TRAIL로 트랜스펙션되지 않음)와 비교했을 때 아폽토시스 수준을 증가시켰음이 명백하다. 또한, KHYG-1 세포 상 TRAIL 변이체 발현은 야생형 TRAIL로 트랜스펙션된 KHYG-1 세포와 비교할 때, 모든 표적 세포에서 아폽토시스를 더욱 증가시켰다.
TRAIL 변이체를 발현하는 본 발명의 세포는 사망 수용체 DR5에 대해 더 높은 친화도를 나타내기 때문에 암치료법에서 중요한 이점을 제공한다. 본 발명의 이들 세포에 의해 공격받을 때, 암세포는 특정 경로를 통해 사멸을 회피하는 방어 전략을 발생하는 것이 방지된다. 따라서, 암은 TRAIL 디코이 수용체를 상향조절함으로써 TRAIL 유도된 세포 사멸을 효과적으로 회피할 수 없는데, 본 발명의 세포가 그러한 환경에서 세포독성을 유지하도록 변형되기 때문이다.
실시예
7 -
녹인된
TRAIL
변이체를
가진
NK
세포를 이용한 혈액암 치료법을 위한 프로토콜
KHYG-1 세포를 실시예 6에 상기한 바와 같이 TRAIL 변이체로 트랜스펙션시켰다. 혈액암 환자의 치료에 사용하기 위해 다음의 프로토콜을 개발하였다:
본 발명에 따라 적절하게 치료되는 암 환자를 진단한 후, DR5 유도제, 예를 들면, 보르테조밉을 변형된 NK 세포의 투여 전에 투여하며, 이에 따라 저용량으로 사용하여 암에서 DR5의 발현을 상향조절하며, 이는 변형된 NK 세포 치료법을 더 효과적으로 만든다.
그 후, 변형된 NK 세포의 분액을 해동하고 배양하고 환자에게 투여한다.
치료법에 사용되는 NK 세포에 의해 발현되는 TRAIL 변이체가 야생형 TRAIL보다 디코이 수용체에 대한 친화도가 낮기 때문에 암세포 표면상 사멸 수용체의 결합이 증가하므로 결과적으로 암세포의 세포 아폽토시스가 증가한다.
위의 프로토콜을 구현하기 전에 또 다른 옵션은 암을 생검하여 암세포를 생체외에서 배양하는 것이다. 이 단계는 주어진 환자에게 DR5 유도제가 적절한지를 결정하는데 도움을 주기 위해서, 특히 높은 수준의 디코이 수용체 및/또는 낮은 수준의 사멸 수용체를 발현하는 암을 확인하는데 사용될 수 있다. 이 단계는 또한 상기 프로토콜을 이용한 치료법 중에 수행할 수 있는데, 주어진 암이 예를 들어 DR5의 발현을 감소시키는데 적응할 수 있어서, 치료법 도중에 DR5 유도제로 치료하는 것이 적합해질 수 있기 때문이다.
실시예
8 - 낮은 용량의
보르테조밉은
TRAIL
변이체를
발현하는
NK
세포에 암세포를
감작시킨다
보르테조밉(Bt: Bortezomib)은 다발성 골수종(MM: Multiple Myeloma)의 치료에 유용한 프로테아좀 억제제(화학요법 유사 약물)이다. 보르테조밉은 MM 세포를 포함한 여러 다양한 유형의 암세포에서 DR5 발현을 상향조절하는 것으로 알려져 있다.
KHYG-1 세포를 실시예 6에서 상기한 바와 같이 TRAIL 변이체로 트랜스펙션시킨 후, 보르테조밉에 노출하거나 노출하지 않고 MM 세포를 표적화하는데 사용하였다.
보르테조밉
유도 DR5 발현
보르테조밉은 밀레늄 파마슈티칼스(Millennium Pharmaceuticals)에서 구입하였다. 마우스 항-인간 DR5-AF647(카탈로그 번호: 565498)은 BD 파민젠에서 구입하였다. 염색된 세포 샘플을 BD FACS 칸토 II에서 분석하였다.
(1) MM 세포주 RPMI8226 및 MM1.S를 2 mM L-글루타민, 10 MM HEPES, 24 mM 중탄산나트륨, 0.01% 항생제 및 10% 소 태아 혈청(시그마(Sigma), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)를 보충한 RPMI1640 배지(시그마, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)에서 37℃, 5% CO2 대기에서 배양하였다.
(2) MM 세포를 6 웰 플레이트에 1x106/mL, 2mL/웰로 접종하였다.
(3) 그 후, MM 세포를 다양한 용량의 보르테조밉으로 24시간 처리하였다.
(4) 그 후, 보르테조밉 처리/미처리 MM 세포에서 DR5 발현을 유세포 측정법으로 분석하였다(도 18).
낮은 용량의 보르테조밉 처리는 MM 세포주 모두에서 DR5 발현을 증가시키는 것으로 확인되었다(도 18). DR5의 상향조절은 약간의 아폽토시스 유도와 관련되었다(데이터 미제출). 그러나, DR5 발현은 높은 용량의 보르테조밉에 의해 상향조절될 수 없었고 높은 독성으로 인해 대부분의 MM 세포의 사멸을 일으켰다는 것이 밝혀졌다.
보르테조밉이
유도한 암세포의
감작화
KHYG-1 세포를 실시예 6에서 상기한 바와 같이 TRAIL 변이체(TRAIL D269H/E195R)로 트랜스펙션시켰다.
(1) 보르테조밉 처리/미처리 MM1.S 세포를 표적 세포로 사용하였다. MM1.S 세포를 2.5nM의 보르테조밉 또는 비히클(대조군)로 24시간 처리하였다.
(2) TRAIL 변이체 mRNA의 전기천공 6시간 후, 이어서 KHYG-1 세포를 12 웰 플레이트에서 MM 세포와 함께 배양하였다. 세척 후 세포 농도를 1x106/mL로 조정한 후 KHYG-1과 MM1.S 세포를 1:1의 비율로 혼합하여 12시간 배양하였다.
(3) KHYG-1 세포의 세포독성에 대한 유세포 측정 분석을 수행하였다. 동시 배양된 세포를 수집하고 세척한 후, 아넥신V 결합 완충액을 사용하여 CD2-APC 항체(5 ㎕/시험), 아넥신V-FITC(5 ㎕/시험) 및 사이톡신-그린(5 ㎕/시험)으로 염색하였다.
(4) 데이터는 플로우조 7.6.2 소프트웨어를 사용하여 더 분석하였다. CD2 음성 집단은 MM1.S 세포를 나타낸다. KHYG-1 세포는 CD2에 대해 강한 양성이다. 마지막으로, CD2 음성 집단에서 아넥신V-FITC 및 사이톡스-그린 양성 세포를 분석하였다.
TRAIL 변이체로/TRAIL 변이체 없이 전기천공된 KHYG-1 세포와 동시 배양된 보르테조밉 예비처리/미처된 MM1.S 세포에서 아폽토시스의 유세포 측정 분석을 수행하였다(도 19).
보르테조밉은 TRAIL 변이체를 발현하는 KHYG-1 세포에 대한 MM 세포의 감수성을 유도한다는 것을 확인하였다. 따라서, DR5 발현을 유도하는 제제는 암세포에 대한 세포독성을 증가시키는 모델에 효과적이므로, 본 발명의 암 치료법을 향상시키는데 유용할 수 있다.
실시예
9 - TRAIL
변이체에
의해 유도된
아폽토시스의
확인
이전 실시예에서 TRAIL 변이체 발현으로 인한 NK 세포의 세포독성 증가의 결정적인 증거에도 불구하고, 본 발명자는 증가된 세포독성이 암세포 아폽토시스의 유도에 의한 것인지(가장 가능성이 큼) 또는 NK 세포를 우연히 활성화하여 더 큰 세포독성 표현형을 나타내고 이에 따라 퍼포린 분비를 통해 암세포를 살해함으로 인한 것인지 확인하고자 하였다.
콘카나마이신 A(CMA: Concanamycin)는 주로 용해성 과립의 pH가 증가하여 퍼포린의 분해가 가속화되어, NK 세포의 퍼포린 매개된 세포독성 활성을 억제하는 것으로 입증되었다. 본 발명자는 퍼포린 매개 세포독성이 CMA로 부분적으로 차단될 때 TRAIL 변이체를 발현하는 KHYG-1 세포의 세포독성이 뚜렷이 나타날 수 있는지 조사하였다.
퍼포린
발현의 CMA-유도된 감소
마우스 항-인간 퍼포린-AF647(카탈로그 번호: 563576)은 BD 파민젠에서 구입하였다. 콘카나마이신 A(카탈로그 번호: SC-202111)는 산타 크루즈 바이오테크놀로지에서 구입하였다. 염색된 세포 샘플은 BD FACS 칸토 II를 사용하여 분석하였다.
(1) KHYG-1 세포를 10% FBS(소 태아 혈청), 2mM L-글루타민, 페니실린(100U/mL)/스트렙토 마이신(100mg/mL) 및 IL-2(10ng/mL)를 함유하는 RPMI1640 배지에서 배양하였다.
(2) KHYG-1 세포(전기천공 6시간 후, 페니실린/스트렙토마이신 무첨가 RPMI1640 배지에서 배양)를 100nM CMA 또는 동일 부피의 비히클(DMSO)로 2시간 추가로 처리하였다.
(3) 세포를 원심 분리(1500rpm × 5 분)에 의해 세포를 수집하고(1×106 세포/시험) 상등액을 흡인하였다.
(4) 세포를 PBS 용액 중 4% 파라포름알데히드에서 실온에서 15분간 고정하였다.
(5) 세포를 4 mL의 FACS 완충액(PBS, 0.5-1% BSA, 0.1% 아지드화나트륨)으로 2회 세척하였다.
(6) 세포를 1mL의 PBS/0.1% 사포닌 완충액으로 실온에서 30분간 투과성으로 만들었다.
(7) 세포를 4 mL의 PBS/0.1% 사포닌 완충액으로 세척하였다.
(8) 세포를 100㎕의 PBS/0.1% 사포닌 완충액에 재현탁한 후, 5㎕의 항체를 각 튜브에 첨가하고 얼음에서 30분간 인큐베이션하였다.
(9) 세포를 1500rpm에서 5분간 원심 분리하여 PBS/0.1% 사포닌 완충액으로 3회 세척하였다.
(10) 세포를 얼음 냉각 FACS 완충액 500㎕에 재현탁하고 분석할 때까지 얼음에서 또는 냉장고에 4℃에서 잠시 보관하였다.
(11) 세포를 유세포 측정기(BD FACS 칸토 II)에서 분석하였다. 데이터는 플로우조 7.6.2 소프트웨어를 사용하여 처리하였다.
CMA 처리는 KHYG-1 세포에서 퍼포린 발현 수준을 유의하게 감소시켰으며(도 20), KHYG-1 세포(도 21)의 생존도에 부정적인 영향을 미치지 않았다.
CMA의 존재하에
NK
세포 TRAIL
변이체의
세포독성
KHYG-1 세포를 실시예 6에서 상기한 바와 같이 TRAIL 변이체(TRAIL D269H/E195R)로 트랜스펙션시켰다.
(1) MM1.S 세포를 표적 세포로 사용하였다.
(2) TRAIL mRNA의 전기천공 6시간 후, KHYG-1 세포를 100mM CMA 또는 동일 부피의 비히클로 2시간 처리하였다.
(3) KHYG-1 세포를 원심 분리에 의해 RPMI1640 배지로 세척하고, IL-2를 함유하는 RPMI1640 배지에 재현탁하고, 세포 농도를 1×106/mL로 조정하였다.
(4) MM1.S 세포를 IL-2를 함유하는 RPMI1640 배지에 1x106/mL로 세포 농도를 조정하여 재현탁하였다.
(5) KHYG-1 및 MM1.S 세포를 1:1의 비율로 혼합하고 12시간 동안 동시 배양하였다.
(6) KHYG-1 세포의 세포독성에 대한 유세포 측정 분석을 수행하였다. 동시 배양된 세포를 세척하고 CD2-APC 항체(5㎕/시험)로 염색하였다.
(7) 세척 후, 아넥신V 결합 완충액을 사용하여 아넥신V-FITC(5㎕/시험) 및 사이톡스-그린(5㎕/시험)으로 추가 염색을 수행하였다.
(8) 데이터는 플로우조 7.6.2 소프트웨어를 사용하여 추가로 분석하였다. CD2 음성 집단은 MM1.S 세포를 나타낸다. KHYG-1 세포는 CD2에 대해 강한 양성이다. 이어서, CD2 음성 집단에서 아넥신V-FITC와 사이톡스-그린 양성 세포를 분석하였다.
TRAIL 변이체를 발현하는 NK 세포가 TRAIL 변이체의 발현이 결여된 대조군 세포보다 높은 세포독성을 나타냄을 다시 한번 보였다(도 22). 그러나, 이 실시예에서, CMA로 처리된 대조군 NK 세포에 대한 결과와는 대조적으로, CMA가 TRAIL 변이체를 발현하는 NK 세포의 세포독성 활성을 현저하게 감소시킬 수 없음을 추가로 보였다.
TRAIL 변이체가 없는 NK 세포(대조군 또는 모의 NK 세포)는 CMA의 부재하에서 48% 암세포 사멸을 유도하고 CMA의 존재하에서 35.9% 암세포 사멸을 유도하는 것으로 나타났다(도 22). TRAIL 변이체를 발현하는 NK 세포는 CMA의 존재 및 부재하에서 모두 대조군 NK 세포보다 더 많은 암세포 사멸을 유도할 수 있었다. 실제로, CMA가 존재하더라도, TRAIL 변이체를 발현하는 NK 세포는 CMA의 부재하에서 대조군 NK 세포보다 더 많은 암세포 사멸을 유발하였다.
따라서, 이 데이터는 퍼포린이 관련된 하향조절에 덜 민감한 기전을 통해 암세포에 대한 NK 세포의 세포독성을 증가시키는데 있어 TRAIL 변이체의 중요성을 보여준다. 퍼포린은 표적 세포를 살해하는 NK 세포에 의해 일반적으로 사용되고, 많은 암세포는 세포독성 공격을 회피하기 위해 NK 세포 퍼포린 발현을 감소시키는 기전을 발전시켰기 때문에, 본 발명의 NK 세포는 암세포에 의한 약화에 대한 감수성이 더 적은 강력한 대안이다.
실시예
10 -
KHYG
-1 세포에서의 돌연변이 TRAIL
변이체와
체크포인트 억제 수용체 CD96의 녹다운의 조합된 발현
체크포인트 억제 수용체 CD96 발현을 녹다운시킬 때와 TRAIL 변이체를 발현 할 때에도 NK 세포의 세포독성의 증가가 관찰되었다. 본 발명자는 NK 세포의 세포독성에 대한 상승 효과를 유발하기 위해 2가지 유전자 변형을 조합하여 시험하였다.
CD96 발현은 실시예 2에서 기재된 바와 같이 KHYG-1 세포에서 녹다운되었다.
KHYG-1 세포를 실시예 6에서 상기한 바와 같이 TRAIL 변이체(TRAIL D269H/E195R)로 트랜스펙션시켰다.
(1) 전기 천공 12시간 후 KHYG-1 세포를 12 웰 플레이트(2mL/웰)에서 1x106/mL의 농도로 12시간 동안 표적 세포(K562 또는 MM1.S)와 동시 배양하였다. E:T 비율은 1:1이었다.
(2) 동시 배양 12시간 후, 세포를 수집하고, 세척하고, CD2-APC로 염색하고, 다시 세척하고 아넥신V 결합 완충액을 사용하여 아넥신V-FITC(5㎕/검사) 및 사이톡스-그린(5㎕/검사)으로 추가로 염색하였다.
(3) 세포 샘플은 BD FACS 칸토 II 유세포 측정기를 사용하여 분석하였다. 데이터는 플로우조 7.6.2 소프트웨어를 사용하여 추가로 분석하였다. CD2 음성 집단은 MM1.S 세포를 나타낸다. KHYG-1 세포는 CD2에 대해 강한 양성이다. 이어서, CD2 음성 집단에서 아넥신V-FITC와 사이톡스-그린 양성 세포를 분석하였다.
KHYG-1 세포에서 동시에 CD96 발현을 녹다운시키고 TRAIL 변이체를 발현하는 것은 K562 표적 세포(도 23) 및 MM1.S 표적 세포(도 24) 모두에 대한 세포의 세포독성을 상승적으로 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 이는 두 표적 세포군 모두에서 개별 유전자 변형 단독으로 인한 것보다 동시의 유전자 변형으로 인해 세포 사멸이 더 많았다는 사실로 나타났다.
동시에, CD96의 녹다운이 NK 세포의 세포독성을 증가시킨다는 추가의 증거(도 23 및 24), 게다가 TRAIL 돌연변이체/변이체의 발현이 NK 세포의 세포독성을 증가시킨다는 추가적인 증거를 얻었다(도 23 및 24).
따라서, 본 발명은 혈액암 치료법에 사용하기 위한 NK 세포 및 세포주 및 이의 생산을 제공한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Onkimmune Limited
<120> MODIFIED NATURAL KILLER CELLS AND NATURAL KILLER CELL LINES
HAVING INCREASED CYTOTOXICITY
<130> P40153EP
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9540
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ctctggcctc tgttctttct tgtgagtccg tctacacttg gggtttccac atgtcttttt 60
ctgctcatga ccttgatact ctgggtattt cagaaatgct acacatacgt ttctccatta 120
cggtcagatg tgacatcttg agtggactca tcaatcacct acagaatgtg gagtccaaca 180
gcaagatcct ctcacgtccc aaagcctcag gtcttaccct ggtctggaaa tcaagcacaa 240
atgagcccct cccaatgtcc caggcaccac tgaccccaca accactgtga cgagtgggat 300
tcatgacaac aatctgcaaa ggaagaaact gaggctcagt gatgggacat tacaaaccaa 360
ggtcacgtag gcagcggatg ataaccagtc atcaaataaa tatcaactcc ctcccccact 420
ccccaaatca aagctcaaac ataagtcatt gttcccaaaa tgttgaccag gaattgaggt 480
gcagagggac ggctaaggac gcaatgggca ccgaggaggc aggaaagact cagaggtttc 540
ttcccggggg ggagggagtg gacgctggag caaaaacatt taaaaagggg aagttaagag 600
gggactattt ggttgaaaga aaacccacaa tccagtgtca agaaagaagt caacttttct 660
tcccctactt ccctgcattt ctcctctgtg ctcactgcca cacacagctc aacctggaca 720
gcacagccag aggcgagatg cttctctgct gatctgagtc tgcctgcagc atggacctgg 780
gtcttccctg aagcatctcc agggctggag ggacgactgc catggtaagg accccacaac 840
gctgtgctga tggatgggct gaaggaggga gggtgaccat gtgggaagct gtgagaagga 900
aggggaagcc actgctaccc tcatcaggaa gggcagacac aagaagcacc agttctattt 960
gctgctacat cccggctctc ggtgagacga ggagaaacca gacagacagt ggctgggggt 1020
caggaaagac cccattacag tctgaaatgt ctgcagaggg cccagtgcct gcccccacct 1080
cagctctaaa agaatgagag tcaggctcct gggagggcag ttccgcttct tgtgtggctg 1140
cagatgacaa caccccatga gaaggaccca gcctctgagt gtccacacag ggtgggaagg 1200
aggggaggct atttctctct gtgtgtctct gtcccgccag caccgagggc tcatccatcc 1260
gcagagcagg gcagtgggag gagacgccat gacccccatc gtcacagtcc tgatctgtct 1320
cggtgagatt tgaagagaga ggggagcttc taacctagga gggacctcac cccacagcca 1380
aactctggtc cctaaggaga ccccaggggc tcacaaagat cccagggagg ggaggacctg 1440
ctcaggcttc agggggcaaa tccctcacag ggaactctct tccagggctg agtctgggcc 1500
ccaggacccg cgtgcagaca ggtgagtctg tccccagctc tcccaggtcc ctcctcctca 1560
ctggggacaa ggggccacct ccgtgcagct ggggatgggg attagaagtt ctggactgac 1620
tgatgggggc atctggaggg tcctgggctg agagctgaga tctgttgggt gggaaatgac 1680
ttcgaatctg acctttgatt tccttccagg gaccatcccc aagcccaccc tgtgggctga 1740
gccagactct gtgatcaccc aggggagtcc cgtcaccctc agttgtcagg ggagccttga 1800
agcccaggag taccgtctat atagggagaa aaaatcagca tcttggatta cacggatacg 1860
accagagctt gtgaagaacg gccagttcca catcccatcc atcacctggg aacacacagg 1920
gcgatatggc tgtcagtatt acagccgcgc tcggtggtct gagctcagtg accccctggt 1980
gctggtgatg acaggtgaga ggacactcag ggatcccagc cccaggctct gccctcagga 2040
aggaggctct caggggtgtc tccctctcac agcccagccc tggggatgat gtgggaggtg 2100
ggagccccat ttaacacgat gcctccttct ctcctaggag cctacccaaa acccaccctc 2160
tcagcccagc ccagccctgt ggtgacctca ggaggaaggg tgaccctcca gtgtgagtca 2220
caggtggcat ttggcggctt cattctgtgt aaggaaggag aagatgaaca cccacaatgc 2280
ctgaactccc agccccatgc ccgtgggtcg tcccgcgcca tcttctccgt gggccccgtg 2340
agcccgaatc gcaggtggtc gcacaggtgc tatggttatg acttgaactc tccctatgtg 2400
tggtcttcac ccagtgatct cctggagctc ctggtcccag gtgagaaatt cacagcattg 2460
tctggagttc cctgagtctc cctgagtctc caggcaggtg gggagcagcc gtgtctcagg 2520
gcagttccag gtgggatgat gttggggcga gagggctcag gggtcctggg gccagagaca 2580
caggaagatc agcagtggtg aggcaccggg ggagagggag ggtttgtggg gaagcctgag 2640
ggtcggctcc tggaaaccat gagcaccttt tcccaggtgt ttctaagaag ccatcactct 2700
cagtgcagcc gggtcctgtc atggcccctg gggaaagcct gaccctccag tgtgtctctg 2760
atgtcggcta tgacagattt gttctgtaca aggaggggga acgtgacctt cgccagctcc 2820
ctggccggca gccccaggct gggctctccc aggccaactt caccctgggc cctgtgagcc 2880
gctcctacgg gggccagtac agatgctacg gtgcacacaa cctctcctct gagtgctcgg 2940
cccccagcga ccccctggac atcctgatca caggtgagga gcccagcggg ttcagtcagg 3000
gacccagact ctgcacaggc cctgccgggg gaatccaatt agtgatggcc aggatgaggc 3060
ggggggtggt cccaagggag ggagagacag agagagagac aggggatggg tggggagggg 3120
aagactcaga gaaaacagag acagaggctc ctagagaggc ctggggaggt ctcagctcag 3180
agcaaggtgg ggcagcccct cacccatcct tcttctctcc aggacagatc cgtggcacac 3240
ccttcatctc agtgcagcca ggccccacag tggcctcagg agagaacgtg accctgctgt 3300
gtcagtcatg gcggcagttc cacactttcc ttctgaccaa ggcgggagca gctgatgccc 3360
cactccgtct aagatcaata cacgaatatc ctaagtacca ggctgaattc cccatgagtc 3420
ctgtgacctc agcccacgcg gggacctaca ggtgctacgg ctcactcaac tccgacccct 3480
acctgctgtc tcaccccagt gagcccctgg agctcgtggt ctcaggtggg ggccttgacc 3540
ctgtcctctc tgagctcaaa ggctcagctc aggccctgcc ccccaggaga gctctgggct 3600
gggatggagt gagcgggggt ctgagcgggg ctcagccagt gggagactca ccctcagagg 3660
gaaggaggac aacaggccct cccaggcctg cgcacactca gcggcatcgc cagcatcatg 3720
gacaggagag gcgggtggag ggaggggcct ggggaggcca cagggcccat gtagagaaat 3780
ttggtttgag gtggagactt caggaaagcc ccagctcctc accctcctct cattctttca 3840
cccaggaccc tccatgggtt ccagcccccc acccaccggt cccatctcca cacctggtga 3900
gtccctgagg cctctggctc gaagggagcg cagcgacccc cagggcagct ttgagtgtcc 3960
aggaggatcc cattcccttc agggactcaa tcaagggctt ctgtccaggg agctgggcag 4020
agccagagga ggggccacag ggtccccagg gctctgaggc tgggctggtg aggggtgggg 4080
ggtcaaggca gagagaaatg ttggggccca gcctggggga ggagcagccg ggctgatgtg 4140
gggagcaggg cagccccagc cctcacctcc ccgtcctgac ccagcaggcc ctgaggacca 4200
gcccctcacc cccactgggt cggatcccca aagtggtgag tgaggggctc tgagtgggag 4260
gtgggcgggg tcccggggag gcaggggtgg gttctgtcct aggttcaggc tcctctggag 4320
gtggtgatgt agacaggctc ctcccctgcc tgggcctcag tttctccaag tgtaaaggag 4380
agaggcctgc aggtgggaaa gttcctttca gctctcactc ccagctgtga cctcctggga 4440
gaggaggccc ctcagggaag actccaagac tcgattccgc gggggcctgt cccgtcccac 4500
ctgcagcaga gacggtgacc tggggcaggg gaggggagca gagtcgtggt tcaggacggt 4560
aaggctcttt ccctgcagct ccggggctcg gctctggtgc aggaacaagg gctgcaggtc 4620
agactcccag gctcccttcc cagctctgcc gcttcctggc tgggggcccg gggcaggcga 4680
ttcccctctc tgagcgtcag tttttcatct gtagagtggg tggggtggat gtttgtgtgc 4740
tgcacgactg ttgtgggggt tggaggtggt gaacagaagg tccagcagtc acctgcacac 4800
agtaggcgct catttcaatg acatcacccc catccctgac atcatcgtgc tcaaggtctg 4860
ggaaggcacc tgggggttgt gatcggcatc ttggtggccg tcgtcctact gctcctcctc 4920
ctcctcctcc tcttcctcat cctccgacat cgacgtcagg gcaaacactg gacatcgagt 4980
gagtagggaa ggggaaaccc tgtgggccga ccgagggtgg gctcagggca cagccaaaga 5040
gaatccaaac cactgggcaa atgcagcttt gagaaactgt tccagcattt ctcaccaggt 5100
gaatggagaa agcacttaac gtcagtccca tctacaaata taaagtgtcc tccgggctca 5160
gtcccatcta caaatgtaaa gtgtccttcg gactctgtcc atctcatgag gcatttggaa 5220
catggaggca ggagtgtttt taggtttcct tccttacctt cgagctgtgt gtgcagggca 5280
gggggctcca atgttcccag ggctgaggct ctgtccttct tcccccagcc cagagaaagg 5340
ctgatttcca acatcctgca ggggctgtgg ggccagagcc cacagacaga ggcctgcagt 5400
ggaggtaatt ctgcccgaag accccagact cccacctgct cgtggcccat acactgcccc 5460
taaagctccc attcctcccc caggtccagc ccagctgccg acgcccagga agaaaacctc 5520
tgtgagtgag aggaagaggt gaccagccag gagggagata ggggccccga agtttccgta 5580
gcaatgggga aaggggcacc ggctggaaag ggtctggggc tcagggtgag atcatctcac 5640
cccacactgt gggacctcag ggacattgca gcccctccct gcatctcagt agccccatct 5700
gggagcaggg caggggctgg caggactcag aggtcccagg gaaccttccc aagagacgaa 5760
ccccttgctc tgccccagca gatgctgccg tgaaggacac acagcctgaa gatggggtgg 5820
agatggacac tcgggtgaga ccccgcccct gtcccaggca ccaaaggcct cctggtgcca 5880
gatctaatcc agcaggactt ctctgtcctc cttcccccgg ctctcagcat cgtcacggtg 5940
gacccctcct tgtccagcac gctgcctccc gcctgctgtg acctcactct ctcctgctgt 6000
cctgggacct cgtgggcctc ctcccgggtc cccttcctgc tcctcatcct ctgtttggcc 6060
gtctggttgt tagagcgctc cccaggcctc tggaggatga ggaataaatg aaccaccccg 6120
gtcccctggg ctccccttca ttcattcaac cagtgagtgt tcccagggag ctcactgtgg 6180
atcaggctcc ccatgggagc tgcagacaca gcagggagca aagccgcccc cgcctcctga 6240
gctcacctca tggtgggaga caaaatgcaa ataaatgcgc catgtccagg agtgcaacgt 6300
gcttaaagga acatacacca gggaaagggc agagagtgtg gggcagtggg gccagtctga 6360
atggaagggg agggctgtct gctcagctgt catctgagaa gcctggacag agtggggcac 6420
acgatcctct aatggacgag cccctgcagg cagaggaaac agccgtgcaa aggccccgag 6480
gcagcagcga gctcttgcgg gaaggcccat gaggctgcag ccaaatgggc aaggtcaaag 6540
tgaggagcag aggccagaac cacaggaagg gagcggccag accctccacg gccttagggc 6600
gtccctgaga ttccatcggg aaagggatgt aatcggatca ccccgggaac agtgaggaaa 6660
attgactcca ggaggtcagg gggactcaag gacacccccc accactgtct ctctccagca 6720
gagcccacat gatgaagacc cccaggcagt gacatatgcc ccggtgaaac actccagacc 6780
taggagagaa atggcctctc ctccctcccc actgtccggg gaattcctgg acacaaagga 6840
cagacaggca gaagaggaca gacagatgga cactgagaga gtcctttcct ctccaggccc 6900
ccaggcctcc cccaccccca ccacgttcct tacctctcac tctcccccgc tgcaggctgc 6960
tgcatctgaa gccccccagg atgtgaccta cgcccagctg cacagcttga ccctcagacg 7020
gaaggcaact gagcctcctc catcccagga aagggaacct ccagctgagc ccagcatcta 7080
cgccaccctg gccatccact agcccggagg gtacgcagac tccacactca gtagaaggag 7140
actcaggact gctgaaggca cgggagctgc ccccagtgga caccaatgaa ccccagtcag 7200
cctggacccc taacaaagac catgaggaga tgctgggaac tttgggactc acttgattct 7260
gcagtcgaaa taactaatat ccctacattt tttaattaaa gcaacagact tctcaataat 7320
caatgagtta accgagaaaa ctaaaatcag aagtaagaat gtgctttaaa ctgaatcaca 7380
atataaatat tacacatcac acaatgaaat tgaaaaagta caaaccacaa atgaaaaaag 7440
tagaaacgaa aaaaaaaaac taggaaatga atgacgttgg ctttcgtata aggaatttag 7500
aaaaagaata accaattatt ccaaatgaag gtgtaagaaa gggaataaga agaagaagag 7560
ttgctcatga ggaaaaacca aaacttgaaa attcaacaaa gccaatgaag ctcattcttg 7620
aaaatattaa ttacagtcat aaatcctaac tacattgagc aagagaaaga aagagcaggc 7680
acgcatttcc atatgggagt gagccagcag acagcccagc agatcctaca cacattttca 7740
caaactaacc ccagaacagg ctgcaaacct ataccaatat actagaaaat gcagattaaa 7800
tggatgaaat attcaaaact ggagtttaca taatgaacgt aagagtaatc agagaatctg 7860
actcatttta aatgtgtgtg tatgtgtgtg tatatatatg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 7920
tgtgtgtgaa aaacattgac tgtaataaaa atgttcccat cgtatcaact ccagttcagg 7980
aagtttcact ggtgatttct tacaaatatt gacgcactaa tgaaacacac aaacacaccc 8040
agagcatcac aaatgtttct tgagaataga aaaagaggca atgtgcccgg gtgcggtggc 8100
tcacgcctgt aatctcaaca cctagggagg cagaggccac agattacttg aggccgggag 8160
ttcaagacca gcatggccaa caaggcaaaa ccccatctct actaaaaata caaaaattag 8220
ctggacatgg tggcgcacgc tgcaatccca gctacttggg aggcagaggc aggaggatca 8280
cttgaatgaa cccgggaggt ggaggttgaa gtgagcaaaa acaaaccccc tacaattcag 8340
cctaggatat gtttattaaa tttacatttg tctttttgct taagattgct ttggtattca 8400
tcctcttttt ggttccatat gaattttagg atttttttct aattctgtga aaaaaatgat 8460
gttgatattt tgatgggaat tgcattgaac ctaaatattg ctttgggaag tgtgatcatt 8520
ttcacaatat tgattctgcc aatccatgag catgggatat atttctattt tgctgtgtca 8580
tctacgattt ctttctgcag cattttgttg ttcttcttgt agagatcttt cacctcctca 8640
gttaggtata ttcttagata tttttaattt tttgcaactg atgtacaagg gattgagttt 8700
tgcagcaacc tggatgagct ggaggccatt attcatgaca ccacatccag ctaatttttg 8760
tatttcttgt agagatgagg ttttgccatg ttgcccaggc tggtcttgaa ctcctgggcc 8820
caagtgaccc gcccgccttg acctcccaaa gtgctgggac tgcaggcatg agccacggtg 8880
cctggcccat catagcactt ttgatcatta ggataattcc ttctccttgt catttttgga 8940
cacatgcttc ccacatgcct catcttccag agagggtttc caccagggct gtgctgggag 9000
ttaaggctgg aaaaggggag atggttccac ctgccagtgc cacatgagtc tactcagggc 9060
tgtaaccagc agggagggtc cagtgtgagc ctcagactcg catgtgggac agacgcccat 9120
gtgtgacaac gctgcagtga atctgtttca cacacatgga ggaggcggct cagggctgac 9180
catggacctg agtcaatgag cagagatatc ccagtgccat ccacaaacac aggggagaag 9240
gagccacaac ttcccacttt catccaaaac cccgacccct ccctgtctgt gagggccctg 9300
gggttctcct ctgtctcata cagaggcaga aacctccccc ttagtgaccc ccagctttgc 9360
aagtcaccag cagcccctcg gcgctggcat cttctgcttc ttaaggtttc ctgcctatga 9420
caggaagtct catttctcat tttcttcatt ggaccatggc tacatatttc agacacatta 9480
taagtaggtt ttcccagtgt taggagcaga tgtgggctgt tgagcacata agtcactcac 9540
<210> 2
<211> 101
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Gly Ala Tyr Pro Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val Val
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Arg Val Thr Leu Gln Cys Glu Ser Gln Val Ala Phe
20 25 30
Gly Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln Cys
35 40 45
Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser
50 55 60
Val Gly Pro Val Ser Pro Asn Arg Arg Trp Ser His Arg Cys Tyr Gly
65 70 75 80
Tyr Asp Leu Asn Ser Pro Tyr Val Trp Ser Ser Pro Ser Asp Leu Leu
85 90 95
Glu Leu Leu Val Pro
100
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
gagtcacagg tggcatttgg cgg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
cgaatcgcag gtggtcgcac agg 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
gggagcccca tttaacacga 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
gggagactca gggaactcca 20
<210> 7
<211> 7375
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
ctttggacct tcttcaactc tgttttgtct ctgttgagtt aaggctttta agaacacctg 60
aattctttcc ttctgcaaaa ccagaggcag cttcttttcc gcctattttc agtttatttc 120
ttgtgatttt agtttttttc tcttaaccaa atgctaaatg gatttaggag aaataaactt 180
atttgtaaag ctgtcaaggg accattagaa ggatggtgct tcacagatag aatacagttt 240
ttattaatga tgcctagaca aatcctgcca ttagcccaag ggctcagaaa gttagcagcc 300
tagtagtttt ggagttgtca atgaaatgaa ttggactgga tggttaagga tgcccagaag 360
attgaataaa attgggattt aggaggaccc ttgtactcca ggaaattctc caagtctcca 420
cttagttatc cagatcctca aagtgaacat gaagcttcag tttcaaattg aatacatttt 480
ccatccatgg attggcttgt tttgttcagt tgagtgcttg aggttgtctt ttcgacgtaa 540
cagctaaacc cacggcttcc tttctcgtaa aaccaaaaca aaaaggcttt ctattcaagt 600
gccttctgtg tgtgcacatg tgtaatacat atctgggatc aaagctatct atataaagtc 660
cttgattctg tgtgggttca aacacatttc aaagcttcag gatcctgaaa ggttttgctc 720
tacttcctga agacctgaac accgctccca taaagccatg gcttgccttg gatttcagcg 780
gcacaaggct cagctgaacc tggctaccag gacctggccc tgcactctcc tgttttttct 840
tctcttcatc cctgtcttct gcaaaggtga gtgagacttt tggagcatga agatggagga 900
ggtgtttctc ctacctgggt ttcatttgtt tcagcagtca aaggcagtga tttatagcaa 960
agccagaagt taaaggtaaa actccaatct ggcttggctg gctctgtatt ccagggccag 1020
cagggagcag ttgggcggca gcaaataagg caaagagata gctcagaaca gagcgccagg 1080
tatttagtag gggcttcatg aatgcatgtg agttggttta gtagagagac acaggcaatt 1140
tcagaccctt ctatgagact ggaagtgatt taagagggaa aggatagcca tagtcctgaa 1200
tacatttgag ctgggtttca ggatgagctc acaagttcct ttaaaaaaaa ttgacttaag 1260
caaatcctgg gaagagtttt tttgctatac aattcaaggt tttaaggtcc tcggattcat 1320
atactttata aatgaattag ccagcttgtt taaaatgtag ggaaattgtg ggaagaatgc 1380
cttctttact taattcaagg ttttaaggtt ctcttaatca attctactag ctaattagcc 1440
aattatttaa aaataaaagt ttgaaattgc caaaaaaaaa agacaaggaa aaggaaagaa 1500
agaaagccac cagtctgttt ggcatacaat acttaattgt tgcctgacct acgtgtgggt 1560
ttcagatgca gatcctcagt tttcagctct tcagagactg acaccaggtt tgttacacgg 1620
cttaaaatga tgagtatatc cattgaatct caaccttatc tctctctaga ccttcttggt 1680
taagaaacca tgtagtttgt atgaagtagg tactcaaaag atatttgatg atttaatttt 1740
tactggagaa gaaatattca tatatgtttt cttattttta catgttttaa atatgtaaag 1800
attaaataaa cactcttaga agtatttaaa tttcctaaag taaatttatc tcaaccagta 1860
acaggaccct cccaatactg gaaagttgag tgtgaccgca tttagtggtg atgagtgtga 1920
gcttgcttgg ggagagggca ggacatttag gatttcttaa gcttagagtc aatacaataa 1980
agattattga gtgctcactt gggtgggcta taatcactgc tcacaggagt tcatgaacca 2040
caagtaaaag agtgaggaga tatgattagc tcacaaataa ctttaataca gagcagaaag 2100
taatgaacta ctgcaatgga gttatcacag tgctaaggat gctcagaggg catctctgat 2160
aggcagaggt gagggttagg gaaggaagct gtagtctagc tagctagagc tgctggaata 2220
gacatgacaa tggctgctgc caaactgttt tctcttctga ggacagatgt cccgtgcaag 2280
tggcttggtg gaagggacta gtgtctctaa tatagggtga tttataagca ggaaagtgtg 2340
tcctagaaat tcagaccaga gtgatagatt ggaattggat catgggggac tcattgaatg 2400
ttatttattg tatttgtttt tgcgatcagt gttagtaaag tgtcaaaggg attgagcaga 2460
tgagtgacat catgcaacac aagttttgag tttcacttgt cagactgact ggagaggggc 2520
ctggttagtt acaggaaggt aatttggcat gcagccacta tttttgagtt gatgcaagcc 2580
tctctgtatg gagagctggt ctcctttatc ctgtgggaaa agagaacaaa ggagcatggg 2640
agtgttcaag ggaaggagaa ataaagggca gagaggcagc ggtggtgtca ggggaagccc 2700
acaggagtta acagcagggt tgcctcaacc tagagaggaa gcgacctggt gccctcggct 2760
ctgtggcttc cttcatctaa caacatcttc cactctacaa caatgccagg gaaggcggag 2820
gctggtacag tgcatcaaga cacagctact cctgggtgac agaggttcag ggccagctca 2880
ctaagtaggc agaagttttt gacatatact ttgagagata aagcaagatt ctgtacctca 2940
accttcagaa tttcccctac cactcattat agttccggag ctatatagct cctatcattc 3000
tatcataacc ttagaatacc agagaacata tcatctcatc taattatctc ttactatatg 3060
tgaaaaaaat gaaggacatg ggggaagtgt gacttgcccc aaatcacata tttcatggta 3120
gagccaggtc ttctgtttgt catatcagtg ttcttcctgc cacaaccatc ttgaagaatc 3180
tatttctcag taagaaaata tctttatgga gagtagctgg aaaacagttg agagatggag 3240
gggaggctgg gggtgtggag aggggaaggg gtaagtgata gattcgttga aggggggaga 3300
aaaggccgtg gggatgaagc tagaaggcag aagggcttgc ctgggcttgg ccatgaagga 3360
gcatgagttc actgagttcc ctttggcttt tccatgctag caatgcacgt ggcccagcct 3420
gctgtggtac tggccagcag ccgaggcatc gccagctttg tgtgtgagta tgcatctcca 3480
ggcaaagcca ctgaggtccg ggtgacagtg cttcggcagg ctgacagcca ggtgactgaa 3540
gtctgtgcgg caacctacat gatggggaat gagttgacct tcctagatga ttccatctgc 3600
acgggcacct ccagtggaaa tcaagtgaac ctcactatcc aaggactgag ggccatggac 3660
acgggactct acatctgcaa ggtggagctc atgtacccac cgccatacta cctgggcata 3720
ggcaacggaa cccagattta tgtaattggt gagcaaagcc atttcactga gttgacacct 3780
gttgcattgc agtcttctat gcacaaaaac agttttgttc cttaatttca ggaggtttac 3840
ttttaggact gtggacattc tctttaagag ttctgtacca catggtagcc ttgcttattg 3900
tgggtggcaa ccttaatagc attctgactg taaaataaaa tgatttgggg aagttggggc 3960
tctcgctctg gagtgctaac catcatgacg tttgatctgt acttttgata tgatatgatg 4020
ctcctgggga agtagtccca aatagccaaa cctattggtg ggctacccat gcaatttagg 4080
ggtggacctc aaggcctgga agctctaatg tccttttttc accaatgttg gggagtagag 4140
ccctagagtt taaaactgtc tcagggaggc tctgctttgt tttctgttgc agatccagaa 4200
ccgtgcccag attctgactt cctcctctgg atccttgcag cagttagttc ggggttgttt 4260
ttttatagct ttctcctcac agctgtttct ttgagcaaaa tggtgagtgt ggtgctgatg 4320
gtgcaccatg tctgatgggg atacctttag tggtatcaac tggccaaaag atgatgttga 4380
gtttagtgtt cttgagatga gatgaggcaa taaatgaaga ggaaggacag tggtaaagaa 4440
cgcactagaa ccgtaggcat tggcatttga ggtttcagaa tgactaatat tttagatgaa 4500
tttgtttgac attgaatgtt catgtgcttc tgagcagggt ttcaatttga gtaaccgttg 4560
caataacatg gggcagctgt tttgctcttt gtcttcatga caactgtact taagctaaca 4620
gccctgaaac atgagattag gctgggcaga atgctgctag agaggaccac ttggatggtc 4680
tttattctcc ttctccatgt ccctctccat cacctggaag tcacctctgg gtgccactct 4740
ggtgccttcc ttgtcgaagc tgtagctgct cacatgacac ctatccctgt tatccagttt 4800
gcttgactgg gacgttttgc cttccccttc agccaggaag tgaaagtccc agtttttatt 4860
tatcacaggt gttggtattg gtggtagaag aggtagaatt atggaatcag gcctcctgtc 4920
aggatttctt tttgacagtc cctctcagac acctctgcct aaggccagct ttgccattac 4980
aaactctccc ttctccctct ctcccttctt ctcttcctct tccttcttct cgctctttct 5040
ctctctctct ttctccctct ctgtctctta tacacataca caaagatata ctctattcca 5100
acatcctcta cccaacctga cagagatgtc ctttgctgta ggttcagcag tggggatgag 5160
aaatacagct ctcaaacagg ataactaaag cttattatct tatcaagctt gttcccttgc 5220
agacaagatt gatcaattat cataggcttt ctgggtgttc tttctgaagc tttctcaaag 5280
tctctttctc ctatcttcca ttcaaggcaa atgattgcca tttaacatca aaatcacagt 5340
tatttatcta aaataaattt taatagctga atcaagaaaa tctcctgagg tttataattc 5400
tgtatgctgt gaacattcat ttttaaccag ctagggaccc aatatgtgtt gagttctatt 5460
atggttagaa gtggcttccg tattcctcag tagtaattac tgtttctttt tgtgtttgac 5520
agctaaagaa aagaagccct cttacaacag gggtctatgt gaaaatgccc ccaacagagc 5580
cagaatgtga aaagcaattt cagccttatt ttattcccat caattgagaa accattatga 5640
agaagagagt ccatatttca atttccaaga gctgaggcaa ttctaacttt tttgctatcc 5700
agctattttt atttgtttgt gcatttgggg ggaattcatc tctctttaat ataaagttgg 5760
atgcggaacc caaattacgt gtactacaat ttaaagcaaa ggagtagaaa gacagagctg 5820
ggatgtttct gtcacatcag ctccactttc agtgaaagca tcacttggga ttaatatggg 5880
gatgcagcat tatgatgtgg gtcaaggaat taagttaggg aatggcacag cccaaagaag 5940
gaaaaggcag ggagcgaggg agaagactat attgtacaca ccttatattt acgtatgaga 6000
cgtttatagc cgaaatgatc ttttcaagtt aaattttatg ccttttattt cttaaacaaa 6060
tgtatgatta catcaaggct tcaaaaatac tcacatggct atgttttagc cagtgatgct 6120
aaaggttgta ttgcatatat acatatatat atatatatat atatatatat atatatatat 6180
atatatatat atatatattt taatttgata gtattgtgca tagagccacg tatgtttttg 6240
tgtatttgtt aatggtttga atataaacac tatatggcag tgtctttcca ccttgggtcc 6300
cagggaagtt ttgtggagga gctcaggaca ctaatacacc aggtagaaca caaggtcatt 6360
tgctaactag cttggaaact ggatgaggtc atagcagtgc ttgattgcgt ggaattgtgc 6420
tgagttggtg ttgacatgtg ctttggggct tttacaccag ttcctttcaa tggtttgcaa 6480
ggaagccaca gctggtggta tctgagttga cttgacagaa cactgtcttg aagacaatgg 6540
cttactccag gagacccaca ggtatgacct tctaggaagc tccagttcga tgggcccaat 6600
tcttacaaac atgtggttaa tgccatggac agaagaaggc agcaggtggc agaatggggt 6660
gcatgaaggt ttctgaaaat taacactgct tgtgttttta actcaatatt ttccatgaaa 6720
atgcaacaac atgtataata tttttaatta aataaaaatc tgtggtggtc gttttccgga 6780
gttgtcttta tcatccttgc atttgaatat tgtgttcaaa tttttgattg attcattcag 6840
tatctggtgg agtctccaat attagaaata ctggaaacaa actgaaaaac cacaaaagga 6900
caaataatgc ttcatgagtc agctttgcac cagccattac ctgcaagtca ttcttggaag 6960
gtatccatcc tctttccttt tgatttcttc accactattt gggatataac gtgggttaac 7020
acagacatag cagtccttta taaatcaatt ggcatgctgt ttaacacagg ttcttcacct 7080
cccctttctt accgcctgct ttctcagctc aactatcaca ggcattacag ttgtcatggc 7140
aaccccaatg ttggcaacca cgtcccttgc agccattttg atctgccttc ctgaaatata 7200
gagcttttcc ctgtggcttc caaatgaact attttgcaaa tgtggggaaa acacacacct 7260
gtggtcctat gttgctatca gctggcacac ctaggcctgg cacactaagc cctctgtgat 7320
tcttgcttaa ccaatgtata gtctcagcac atttggtttc cacttaaggt ttcct 7375
<210> 8
<211> 36
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala
1 5 10 15
Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Cys Lys
35
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
cactcacctt tgcagaagac agg 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
ccttgtgccg ctgaaatcca agg 23
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
aggacccttg tactccagga aattctcca 29
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
agcccctact aaatacctgg cgctct 26
Claims (54)
- 하나 이상의 체크포인트 억제 수용체의 발현이 감소되도록 유전자 변형된 자연 살해(NK) 세포 또는 NK 세포주.
- 제1항에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT 및 TIM-3으로부터 선택되는 것인 NK 세포 또는 NK 세포주.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 2가지 이상의 체크포인트 억제 수용체의 발현이 감소되도록 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현하도록 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주.
- 제4항에 있어서, 돌연변이 TRAIL 리간드는 TRAIL 수용체, 예를 들어 DR4 및/또는 DR5에 대한 친화도가 증가된 것인 NK 세포 또는 NK 세포주.
- 제4항 또는 제5항 있어서, 돌연변이 TRAIL 리간드는 디코이(decoy) TRAIL 수용체에 대한 친화도가 감소된 것인 NK 세포 또는 NK 세포주.
- 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현하도록 유전자 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주.
- 제7항에 있어서, 돌연변이 TRAIL 리간드는 TRAIL 수용체, 예를 들어 DR4 및/또는 DR5에 대한 친화도가 증가된 것인 NK 세포 또는 NK 세포주.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 돌연변이 TRAIL 리간드는 디코이 TRAIL 수용체에 대한 친화도가 감소된 것인 NK 세포 또는 NK 세포주.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 NK 세포 또는 NK 세포주.
- 제10항에 있어서, CAR은 이중 특이적 CAR인 NK 세포 또는 NK 세포주.
- 제11항에 있어서, 이중 특이적 CAR은 하나의 세포 유형 상의 2가지 리간드에 결합하는 것인 NK 세포 또는 NK 세포주.
- 제11항에 있어서, 이중 특이적 CAR은 2가지 상이한 세포 유형의 각 유형 상의 한가지 리간드에 결합하는 것인 NK 세포 또는 NK 세포주.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, CAR 또는 이중 특이적 CAR에 대한 리간드(들)는 암세포 상에 발현되는 것인 NK 세포 또는 NK 세포주.
- 제12항에 있어서, 이중 특이적 CAR에 대한 리간드는 둘 다 암세포 상에 발현되는 것인 NK 세포 또는 NK 세포주.
- 제13항에 있어서, 이중 특이적 CAR에 대한 리간드는 암세포 및 면역 이펙터 세포 상에 발현되는 것인 NK 세포 또는 NK 세포주.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 Fc 수용체를 발현하도록 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주.
- 제17항에 있어서, Fc 수용체는 CD16(FcRIII), CD32(FcRII) 및 CD64(FcRI)로부터 선택되는 것인 NK 세포 또는 NK 세포주.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 세포주는 KHYG-1 세포주의 유도체인 NK 세포 또는 NK 세포주.
- CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT 및 TIM-3으로부터 선택된 체크포인트 억제 수용체를 코딩하는 유전자가 결여된 NK 세포.
- 제20항에 있어서, CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT 및 TIM-3으로부터 선택된 2가지 이상의 억제 수용체를 코딩하는 유전자가 결여된 NK 세포.
- 제20항 또는 제21항에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4) 및 CD279(PD-1)로부터 선택되는 것인 NK 세포.
- 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, KHYG-1의 유도체인 NK 세포.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 예를 들어 조사(irradiation)의 결과로서, 증식할 수 없는 NK 세포 또는 NK 세포주.
- 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주를 제조하는 방법으로서, 체크포인트 억제 수용체 발현을 감소시켜 세포 또는 세포주의 세포독성을 증가시키기 위해서 세포 또는 세포주를 유전자 변형시키는 단계를 포함하는 방법.
- 제25항에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT 및 TIM-3으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제25항 또는 제26항에 있어서, 2가지 이상의 체크포인트 억제 수용체의 발현을 감소시키도록 NK 세포를 변형시키는 단계를 포함하는 방법.
- 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현하도록 NK 세포 또는 NK 세포주를 변형시키는 단계를 포함하는 방법.
- 제28항에 있어서, 돌연변이 TRAIL 리간드는 TRAIL 수용체에 대한 친화도가 증가된 것인 방법.
- 제29항에 있어서, TRAIL 수용체는 DR4 및/또는 DR5인 방법.
- 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이 TRAIL 리간드는 디코이 TRAIL 수용체에 대한 친화도가 감소된 것인 방법.
- 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주를 제조하는 방법으로서, 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현시켜 세포 또는 세포주의 세포독성을 증가시키기 위해서 세포 또는 세포주를 유전자 변형시키는 단계를 포함하는 방법.
- 제32항에 있어서, 돌연변이 TRAIL 리간드는 TRAIL 수용체에 대한 친화도가 증가된 것인 방법.
- 제33항에 있어서, TRAIL 수용체는 DR4 및/또는 DR5인 방법.
- 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이 TRAIL 리간드는 디코이 TRAIL 수용체에 대한 친화도가 감소된 것인 방법.
- 제25항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포 또는 NK 세포주는 CAR 또는 이중 특이적 CAR을 발현하도록 변형되는 것인 방법.
- 제36항에 있어서, 이중 특이적 CAR은 하나의 세포 유형 상의 2가지 리간드에 결합하는 것인 방법.
- 제36항에 있어서, 이중 특이적 CAR은 2가지 상이한 세포 유형의 각 유형 상의 한가지 리간드에 결합하는 것인 방법.
- 제36항에 있어서, CAR 또는 이중 특이적 CAR에 대한 리간드(들)는 암세포 상에 발현되는 것인 방법.
- 제37항에 있어서, 이중 특이적 CAR에 대한 리간드는 둘 다 암세포 상에 발현되는 것인 방법.
- 제38항에 있어서, 이중 특이적 CAR에 대한 리간드는 암세포 및 면역 이펙터 세포 상에 발현되는 것인 방법.
- 제25항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포 또는 NK 세포주는 하나 이상의 Fc 수용체를 발현하도록 변형되는 것인 방법.
- 제42항에 있어서, Fc 수용체는 CD16(FcRIII), CD32(FcRII) 및 CD64(FcRI)로부터 선택되는 것인 방법.
- 제25항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 세포주는 KHYG-1 세포주의 유도체인 방법.
- 제25항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 NK 세포 또는 NK 세포주.
- 제25항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 KHYG-1 유도체.
- 환자에서 암 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주, 또는 제25항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따라 수득되는 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주.
- 제47항에 따라 사용하기 위한 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주 또는 이의 조성물로서, 암이 혈액암인 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주 또는 이의 조성물.
- 제48항에 있어서, 혈액암은 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 호지킨 림프종, T 세포 림프종 및 B 세포 림프종을 포함하는 비호지킨 림프종, 무증상 골수종, 스몰더링 다발성 골수종(SMM), 활성 골수종 또는 경쇄 골수종인 변형된 NK 세포, NK 세포주 또는 조성물.
- KHYG-1 세포에서 체크포인트 억제 수용체 발현을 감소시킴으로써, 또는 KHYG-1 세포에서 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현시킴으로써, 또는 둘 다를 수행함으로써 KHYG-1의 유도체로서 수득되는, 혈액암 치료에 사용하기 위한 NK 세포주.
- 제50항에 있어서, 암세포 상의 TRAIL 사멸 수용체의 발현을 상향조절할 수 있는 제제와 병용되는 NK 세포주.
- 제51항에 있어서, 암세포 상의 TRAIL 사멸 수용체의 발현을 상향조절할 수 있는 제제는 치료 전에, 치료와 동시에, 또는 치료 후에 투여되는 것인 NK 세포주.
- 제51항 또는 제52항에 있어서, 제제는 DR5 발현을 상향조절하는 것인 NK 세포주.
- 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 보르테조밉, 제피티닙, 파이퍼롱구민, 독소루비신, 알파-토코페릴 숙시네이트 및 HDAC 억제제로부터 선택되는 것인 NK 세포주.
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