JP6974681B2 - 細胞傷害性が増加した改変ナチュラルキラー細胞及びナチュラルキラー細胞株 - Google Patents

Description

本発明は、より強い細胞障害性表現型をもつ誘導体を作製するためのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＮＫ細胞株の改変に関する。さらに、本発明は、改変ＮＫ細胞及びＮＫ細胞株を作製する方法、細胞及び細胞株を含む組成物、並びにがん治療における前記組成物の使用に関する。

免疫細胞は典型的に、標的細胞の死をもたらす免疫応答を誘発する前に、標的細胞が主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）介して抗原を提示することを必要とする。これはＭＨＣクラスＩを提示していないがん細胞が大部分の免疫応答を回避することを可能にする。

しかし、ＮＫ細胞はＭＨＣクラスＩ発現のないがん細胞を認識することができる。それゆえに、ＮＫ細胞はがんに対する生体の防御の非常に重要な役割を果たす。

一方で、ある特定の状況では、がん細胞は、ＮＫ細胞膜上の阻害受容体と結合するリガンドの発現を通してＮＫ細胞の細胞傷害性活性を弱める能力を示す。がんに対する耐性はこれらと他の要因との間のバランスを伴いうる。

これに関連して、細胞傷害性は、例えば、細胞溶解性合成物を放出すること又はがん細胞膜上の受容体に結合すること、及び前記がん細胞のアポトーシスを誘導することによってがん細胞死を誘導する、免疫エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞）の能力を指す。細胞傷害性は、細胞溶解性合成物の放出を誘導するシグナルによってだけでなく、それらの放出を阻害するシグナルによっても影響される。したがって、細胞傷害性の増加は、上記のように、がん細胞がＮＫ細胞の細胞傷害性活性を弱める可能性を少なくして、より効率的にがん細胞を死滅させることにつながることになる。

ＮＫ細胞の阻害受容体機能を除去する遺伝子改変が、ＭＨＣクラスＩ発現を欠いているが、ＮＫ細胞傷害性を弱めることができるがん細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を増加させる方法として提案されてきた（Bodduluru et al. 2012）。ある特定のがん細胞が、ＭＨＣクラスＩ発現の非存在下において、ＮＫＧ２Ａと結合し、且つＮＫ細胞の細胞傷害性を阻害するＭＩＣＡを発現することが知られているので、ＮＫＧ２Ａはこの状況下においてサイレンシングに値する阻害受容体として確立されている（Shook et al. 2011；国際公開第２００６／０２３１４８号）。

ＮＫＧ２Ａ発現を下方制御する別の方法がＮＫ−９２細胞で示されており、ＩＬ−１５をコードする遺伝子のトランスフェクションがＮＫＧ２Ａ発現の減少と関連することが示された（Zhang et al. 2004）。しかし、ＮＫ細胞の細胞傷害性増加が観察されたにもかかわらず、その増加は、おそらく活性化受容体ＮＫＧ２Ｄの発現の付随的な増加の結果であった。これは、ＮＫ−９２細胞上のＮＫＧ２Ａ受容体をブロックすることが多発性骨髄腫細胞に対する細胞傷害性の増加と関連しなかったという観察によって支持される（Heidenreich et al. 2012）。それでもなお、ＮＫ−９２細胞株が、阻害受容体の発現が非常に低くて細胞障害性が高い細胞株であることは注目に値する。したがって、ＮＫＧ２Ａ発現の減少を伴った細胞傷害性のいかなる増加も、あまりにも小さすぎて検出できなかったかもしれない。

同様の研究がマウスで行われてきた。例えば、マウスはＮＫ細胞上のＬｙ４９と呼ばれる受容体を発現する。その受容体はヒト阻害ＫＩＲ受容体に類似している。抗体断片でＬｙ４９受容体をブロックすることによって、ＮＫ細胞は細胞障害性がより強くなり、インビトロ及び生体内でマウス白血病細胞を死滅させることができることが示されている（Koh et al. 2001）。

しかし、改変ＮＫ細胞が「正常」細胞とがん細胞を区別する能力が減退するにつれて、体内の「正常」細胞も改変ＮＫ細胞による攻撃の影響を受けやすくなることは、阻害受容体機能を下げることの影響である。これは、「古典的」阻害受容体機能を下げるという大きなデメリットである。

ＮＫ細胞のがん細胞を死滅させることが知られている別の方法は、その表面上にＴＲＡＩＬを発現させることによるものである。ＴＲＡＩＬリガンドはがん細胞上のＴＲＡＩＬ受容体を結合し、前記がん細胞のアポトーシスを誘導することができる。この抗がん機構を利用するために、１つの推測的な方法は、ＮＫ細胞上にＴＲＡＩＬを過剰発現させることを記述する（欧州特許第１６２１５５０号）。さらに、ＩＬ−１２はＮＫ細胞上のＴＲＡＩＬ発現を上方制御することが報告されている（Smyth et al. 2001）。

それでもなお、がん細胞は、ＴＲＡＩＬを発現するＮＫ細胞に対処するための回避及び防御の機構をもつようになっている。デコイＴＲＡＩＬ受容体はがん細胞膜上に発現していることが多く、これらのデコイ受容体へのＴＲＡＩＬの結合はアポトーシスを誘導できなくし、そのような機構を克服する方法は今までのところ追求されていなかった。

急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、骨髄発達に関与する前駆細胞に関わる造血器悪性腫瘍であり、成人（９０％）及び小児（１５〜２０％）の急性白血病のかなりの割合を占める（Hurwitz, Mounce et al. 1995; Lowenberg, Downing et al. 1999）。標準的な化学療法を用いて８０％の患者が寛解を達成するにもかかわらず（Hurwitz, Mounce et al. 1995; Ribeiro, Razzouk et al. 2005）、微小残存病変（ＭＲＤ）からの再発率が高いため、生存は依然として満足のいくものではない。５年生存は年齢依存的であり、小児では６０％（Rubnitz 2012）、６５歳未満の成人では４０％（Lowenberg, Downing et al. 1999）、及び６５歳以上の成人では１０％（Ferrara and Schiffer 2013）である。これらの結果は、患者に適切な造血細胞ドナーがいれば改善できるが、多く患者には適切なドナーがおらず、治療への代替的なアプローチの必要性を際立たせている。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、細胞障害性リンパ球であり、例えば、ナチュラルキラーＴ（ＮＫ−Ｔ）細胞とは異なる特徴的な表現型及びエフェクター機能をもつ。例えば、ＮＫ−Ｔ細胞はＣＤ３及びＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）を発現する一方で、ＮＫ細胞はそれらを発現しない。ＮＫ細胞は一般に、マーカーＣＤ１６及びＣＤ５６を発現することが見出されており、ＣＤ１６はＦｃ受容体として機能し、後述する抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。ＫＨＹＧ−１はこの点に関して注目すべき例外である。ＮＫ細胞はもともと細胞障害性であるが、細胞傷害性が増加したＮＫ細胞株が開発された。ＮＫ−９２及びＫＨＹＧ−１は、広範に研究されてきて、がん治療学において有望である２つのＮＫ細胞株である（Swift et al. 2011; Swift et al. 2012）。

がんの治療に用いられる養子細胞免疫療法は、通常、患者に自然のＴ細胞及び改変されたＴ細胞を患者に投与することを含む。Ｔ細胞は、ある特定の標的がん細胞に特異的に結合する受容体及び／又はリガンドを発現するように、さまざまな方法で、例えば、遺伝的に改変することができる。がん細胞抗原に特異的な高アフィニティーＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をＴ細胞にトランスフェクションすることは、反応性が高いがん特異的Ｔ細胞応答を生み出すことができる。この免疫療法アプローチの主な制限は、Ｔ細胞が自己由来細胞外増殖のために患者から得られなければならないか、又は患者への細胞の移入直後の免疫学的根絶若しくは場合によっては、対宿主性移植片疾患（ＧＶＨＤ）の発症を回避するためにＭＨＣがマッチしたＴ細胞が用いられなければならないということである。加えて、うまく移入されたＴ細胞は循環中で長期にわたって生存することが多く、治療から生じる持続的副作用を制御することを困難にする。

ハプロタイプ移植において、ＫＩＲ抑制受容体−リガンドのミスマッチがある場合、移植対白血病効果はＮＫ細胞によって媒介され、ＡＭＬ治療における生存の改善につながりうると考えられている（Ruggeri, Capanni et al. 2002; Ruggeri, Mancusi et al. 2005）。さらに、急速なＮＫ回復は、ＡＭＬにおいてハプロタイプＴ細胞除去造血細胞移植（ＨＣＴ）を経験する患者における良好な結果及びより強い移植対白血病（ＧＶＬ）効果と関連する（Savani, Mielke et al. 2007）。他の治験では、成人（Miller, Soignier et al. 2005）及び小児（Rubnitz, Inaba et al. 2010）のＡＭＬを治療するために生体外で増やしたハプロタイプ一致のＮＫ細胞が用いられている。

いくつかの永久ＮＫ細胞株が確立されてきた。最も注目に値するものは、ＣＤ１６（Ｆｃγ受容体ＩＩＩ）を除く典型的なＮＫ細胞マーカーを発現する非ホジキンリンパ腫患者に由来するＮＫ−９２である。ＮＫ−９２は広範な臨床前試験を経てきており、活性化ＮＫ細胞及びリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞と比較して幅広い範囲の腫瘍に対して優れた溶解を示す（Gong, Maki et al. 1994）。初発ＡＭＬに対するＮＫ−９２細胞の細胞傷害性が確立されている（Yan, Steinherz et al. 1998）。

別のＮＫ細胞株、ＫＨＹＧ−１が、臨床用途の潜在的な候補として同定されている（Suck et al. 2005）が、細胞傷害性が低いためＮＫ−９２に比べて注目を集めていない。ＫＨＹＧ−１細胞は予め活性化されていることが知られている。内在性ＮＫ細胞と違って、ＫＨＹＧ−１細胞は常に極性をもち、その細胞傷害性を増加させ、且つ外部の刺激により速く反応する。ＮＫ−９２細胞は、ＫＨＹＧ−１細胞に比べてベースライン細胞傷害性が高い。

したがって、現在の養子免疫治療プロトコールが、エフェクター細胞の量及び質のドナー間変動性によって影響を受けることが明らかであり、その変動は、有効な細胞株が利用できてより標準的な治療を提供する場合には解消されうる。

相当な量のＮＫ細胞の細胞傷害性研究がマウスモデルを用いて行われてきた。１つの例は、パーフォリン及びグランザイムＢ ｍＲＮＡがマウスＮＫ細胞において恒常的に転写されているが、検出されるタンパク質のレベルはＮＫ細胞の刺激又は活性化まで最小限であるという発見である（Fehniger et al, 2007）。この研究及びマウスＮＫ細胞を用いた他の研究は興味深いが、ヒトのＮＫ細胞の細胞傷害性に関する決定的証拠として依拠することはできない。上記例とは対照的に、ヒトのＮＫ細胞は、刺激前に、パーフォリン及びグランザイムＢタンパク質を高いレベルで発現する（Leong et al, 2011）。マウスでもヒトでもＮＫ細胞が培養において単離される場合、結果は、マウスＮＫ細胞は弱い細胞溶解活性をもつ一方でヒトＮＫ細胞は強い細胞溶解能力を示す。

また、マウスＮＫ細胞とヒトＮＫ細胞は、それらの発現マーカー、シグナルカスケード、及び組織分布において大きく異なる。例えば、ＣＤ５６はヒトのＮＫ細胞のマーカーとして用いられるが、マウスＮＫ細胞は全くこのマーカーを発現しない。さらに、確立されたＮＫ細胞の細胞傷害性調節機序は、リガンド結合性ＮＫ活性化及び阻害受容体を介する。最もよく知られたヒトのＮＫ活性化受容体の２つは、ＮＫｐ３０及びＮＫｐ４４であり、どちらもマウスＮＫ細胞には発現していないことが知られている。ＮＫ阻害受容体に関して、ヒトのＮＫ細胞がＭＨＣクラスＩを認識し、細胞傷害性活性を弱めるＫＩＲを発現する一方で、マウスＮＫ細胞は全くＫＩＲを発現せず、その代わりに、Ｌｙ４９を発現する（Trowsdale et al, 2001）。総じて、マウスＮＫ細胞はその自然の生理的環境においてヒトＮＫ細胞と同じ機能を達成しているにもかかわらず、この役割を成し遂げる機序は種の間で著しく異なる。

よって、例えば、より多くの細胞障害性プロフィールを有する、代替となる及び好ましくは改良されたヒトＮＫ細胞及びヒトのＮＫ細胞株が必要とされている。

本発明の目的は、より強い細胞障害性表現型を有するＮＫ細胞及びＮＫ細胞株を提供することにある。さらなる目的は、改変ＮＫ細胞及びＮＫ細胞株を作製する方法、細胞又は細胞株を含む組成物、並びにがんの治療における前記組成物の使用である。より具体的な実施形態は、特定されたがん、例えば、白血病などの血液がんに対する治療を提供することを目的とする。特定の実施形態は、改変細胞の細胞傷害性をさらに増強するようにＮＫ細胞及びＮＫ細胞株の２つ以上の改変を組み合わせることを目的とする。

より強い細胞障害性表現型を有する改変ＮＫ細胞及びＮＫ細胞株並びに該細胞及び細胞株を作製する方法が本明細書で提供される。さらに、改変ＮＫ細胞及びＮＫ細胞株の組成物及びがんを治療するための前記組成物の使用も提供される。

本発明は、例えば、阻害受容体をコードする遺伝子をノックアウトし、ＴＲＡＩＬリガンド及びバリアントをコードする遺伝子を発現し、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／又はＦｃ受容体をコードする遺伝子を発現するように遺伝子工学を利用してＮＫ細胞及びＮＫ細胞株を改変する方法を提供する。

さらに、本発明の組成物は、２つ以上の改変が施されているＮＫ細胞及びＮＫ細胞株を含み、複数の改変は組成物の細胞傷害性活性をさらに増強する。

本発明によれば、改変ＮＫ細胞株、例えば、ＫＨＹＧ−１細胞の誘導体を用いてがん、例えば、血液がんを治療する方法がさらに提供され、改変ＮＫ細胞株は、チェックポイント阻害受容体の発現が欠き、ＴＲＡＩＬリガンドバリアントを発現し、且つ／又はＣＡＲ及び／若しくはＦｃ受容体を発現するように遺伝子操作されている。

本発明によって特に治療可能な疾患は、がん、血液がん、白血病、及び具体的に急性骨髄性白血病を含む。ヒトの腫瘍及びがんが特に治療可能である。本明細書における腫瘍への言及は、新生物への言及を含む。

したがって、本発明は、その細胞傷害性を増加させるように遺伝子改変されているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又はＮＫ細胞株を提供する。

後述の例中で詳細に記載されるように、ＮＫ細胞及びＮＫ細胞株は、がんに対するその細胞傷害性活性を増加させるように遺伝子改変されている。

本発明のＮＫ細胞及びＮＫ細胞株は合わせて、（文脈上別段の解釈が必要でない限り）ＮＫ細胞と呼ばれることになる。

本発明のあるいくつかの実施形態では、チェックポイント阻害受容体機能が低下又は欠損したＮＫ細胞が提供される。よって下記の例において、１つ以上のチェックポイント阻害受容体遺伝子がノックアウトされたＮＫ細胞が作製される。好ましくは、これらの受容体は特定のチェックポイント阻害受容体である。さらに好ましくは、これらのチェックポイント阻害受容体は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴ、及び／又はＴＩＭ−３のうちの１つ以上又はすべてである。

他の実施態様では、１つ以上の阻害受容体シグナル伝達経路がノックアウトされるか、低下した機能を呈し、結果としてやはり阻害受容体機能が低下又は欠損するＮＫ細胞が提供される。例えば、ＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２、及び／又はＳＨＩＰによって媒介されるシグナル伝達経路が細胞の遺伝子改変によってノックアウトされる。

結果として生じるＮＫ細胞は、細胞傷害性が向上し、したがって、がんの治療、とりわけ、血液がんの治療、特に、白血病及び多発性骨髄腫の治療の非常に有用である。

ある実施例では、遺伝子改変は、細胞がＮＫ細胞に分化する前に行われる。例えば、多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）は、１つ以上のチェックポイント阻害受容体を発現する能力を失うように遺伝子改変することができる。そのあと、改変ｉＰＳＣは分化して、細胞傷害性が増加した遺伝子改変ＮＫ細胞を産生する。

ＮＫ細胞活性化前のチェックポイント阻害受容体の発現に起因して、他の阻害受容体よりチェックポイント阻害受容体の機能を下げることが好ましい。大部分のＫＩＲファミリー、ＮＫＧ２Ａ、及びＬＩＲ−２などの正常又は「古典的」阻害受容体は、ＭＨＣクラスＩと結合するので、自己を標的にするという問題を減らすことに主に関わる。したがって、チェックポイント阻害受容体がノックアウトされることが好ましい。本発明による受容体の機能の低下又は欠損は、（受容体が完全に機能的である場合には生じるかもしれない）免疫エフェクター機能をがん細胞が抑制するのを防ぐ。よって、本発明のこれらの実施形態の非常に重要な利点は、がん細胞による細胞傷害性活性の抑制に左右されないＮＫ細胞にあり、結果として、それらのＮＫ細胞はがんの治療に有用である。

本明細書で使用される場合、阻害受容体への言及は一般に、免疫エフェクター細胞、例えば、ＮＫ細胞の細胞膜上に発現する受容体を指し、相補的リガンドと結合して細胞内シグナルをもたらすことが前記免疫エフェクター細胞の細胞傷害性を減らす役割を果たす。これらの阻害受容体は、免疫エフェクター細胞の「休止」状態の間にも、「活性化」状態の間にも発現し、多くの場合、体内の細胞及び組織に対する細胞障害性応答を阻害する「自己寛容」機構を免疫系に提供することに関連している。一例として、ＮＫ細胞上に発現し、体内の健康な細胞に発現するＭＨＣクラスＩを認識する阻害受容体ファミリー「ＫＩＲ」がある。

また、本明細書で使用される場合、チェックポイント阻害受容体は通常、上記の阻害受容体のサブセットとみなされている。しかし、他の阻害受容体と異なり、チェックポイント阻害受容体は、免疫エフェクター細胞、例えば、ＮＫ細胞の持続する活性化及び細胞傷害の間に、より高いレベルで発現する。この現象は、例えば、炎症の部位で慢性細胞傷害性を弱めるのに有用である。例としては、チェックポイント阻害受容体ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、及びＣＤ９６が挙げられ、それらはすべてＮＫ細胞上に発現する。

したがって、本発明はさらに、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴ、及びＴＩＭ−３から選択されるチェックポイント阻害受容体をコードする遺伝子を欠いているＮＫ細胞を提供する。

遺伝子を欠いているＮＫ細胞は、機能的な遺伝子産物が発現しないという結果をもたらす完全若しくは部分的な欠失、変異、又はそれ以外のものに関連することができる。実施形態では、ＮＫ細胞は、２つ以上の阻害受容体をコードする遺伝子を欠いている。

より具体的な実施例は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、及びＣＤ２７９（ＰＤ−１）から選択されるチェックポイント阻害受容体をコードする遺伝子を欠いているＮＫ細胞を含む。好ましい実施例は、ＫＨＹＧ−１の誘導体であるＮＫ細胞を含む。

下記の例において、発明者らは、ＫＨＹＧ−１細胞のチェックポイント阻害受容体ＣＤ９６の発現をノックダウンするｓｉＲＮＡを使用する細胞障害効果を確かに示している。ＣＤ９６ノックダウン（ＫＤ）ＫＨＹＧ−１細胞は、さまざまなエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で白血病細胞に対する細胞傷害性の増強を示した。

本発明の他の実施形態では、ＴＲＡＩＬリガンド、又は、好ましくは、変異体（バリアント）ＴＲＡＩＬリガンドを発現するＮＫ細胞が提供される。したがって、下記の例でさらに記載されるように、ＮＫ細胞の細胞傷害性を増強する改変はまた、ＴＲＡＩＬリガンド及び／又は変異ＴＲＡＩＬリガンドバリアントの発現の増加を含む。

結果として生じるＮＫ細胞は、ＴＲＡＩＬ受容体への結合の増加、及び結果として、がん、とりわけ、血液がん、特に、白血病に対する細胞傷害性の増加を呈する。

好ましくは、変異体／バリアントは、「デコイ」受容体に対するアフィニティーが、野生型ＴＲＡＩＬのデコイ受容体との結合と比較して低い（又は事実上アフィニティーがない）。そのようなデコイ受容体は、ＴＲＡＩＬリガンドと結合するＴＲＡＩＬ受容体の類を表すが、細胞死を引き起こす能力をもたず、場合によっては、細胞死シグナル伝達経路に拮抗するように作用する。変異体／バリアントＴＲＡＩＬリガンドは、国際公開第２００９／０７７８５７号に従って作製されうる。

変異体／バリアントは個々に、ＴＲＡＩＬ受容体、例えば、ＤＲ４及びＤＲ５に対するアフィニティーを増加させうる。野生型ＴＲＡＩＬは典型的に、Ｋ_Ｄが、ＤＲ４に対して＞２ｎＭ、ＤＲ５に対して＞５ｎＭ、デコイ受容体ＤｃＲ１に対して＞２０ｎＭ（国際公開第２００９／０７７８５７号；表面プラズモン共鳴によって測定）又はＤＲ４に対して約５０〜１００ｎＭ、ＤＲ５に対して１〜１０ｎＭ、ＤｃＲ１に対して１７５〜２２５ｎＭ（Truneh, A. et al. 2000；等温滴定熱量測定及びＥＬＩＳＡによって測定）であることが知られている。したがって、ＤＲ４に対する増加したアフィニティーは、Ｋ_Ｄがそれぞれ＜２ｎＭ又は＜５０ｎＭとして適宜定義され、一方でＤＲ５に対する増加したアフィニティーは、Ｋ_Ｄがそれぞれ＜５ｎＭ又は＜１ｎＭとして適宜定義される。デコイ受容体ＤｃＲ１に対する減少したアフィニティーは、Ｋ_Ｄがそれぞれ＞５０ｎＭ又は＞２２５ｎＭのＫ_Ｄとして適宜定義される。いずれの場合も、ＴＲＡＩＬバリアント／変異体によって示されるアフィニティーの増加又は減少は、野生型ＴＲＡＩＬによって示されるベースラインアフィニティーに相対的なものである。アフィニティーは、野生型ＴＲＡＩＬによって示されるものと比較して、好ましくは、少なくとも１０％、より好ましくは、少なくとも２５％増加する。

好ましくは、ＴＲＡＩＬバリアントは、ＤＲ４、ＤｃＲ１、及びＤｃＲ２に対するそのアフィニティーと比較して、ＤＲ５に対する増加したアフィニティーを有する。好ましくは、アフィニティーは、ＤＲ４、ＤｃＲ１、及びＤｃＲ２のうちの１つ以上と比べて、ＤＲ５に対して少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、又はさらに１，０００倍以上強い。より好ましくは、アフィニティーは、ＤＲ４、ＤｃＲ１及びＤｃＲ２のうちの少なくとも２つ、好ましくは、すべてと比べて、ＤＲ５に対して少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、又はさらに１，０００倍以上強い。

本発明のこれらの実施例の非常に重要な利点は、がん細胞を死滅させる効力がより大きいＮＫ細胞にある。

さらなる具体的な実施例は、ＴＲＡＩＬデコイ受容体に対するアフィニティーが減少した、又はアフィニティーが無い変異体ＴＲＡＩＬリガンドを発現するＮＫ細胞を含む。好ましくは、このＮＫ細胞はＫＨＹＧ−１の誘導体である。さらなる具体的な実施例は、ＴＲＡＩＬデコイ受容体に対するアフィニティーが減少し、又はアフィニティーが無く、且つＤＲ４及び／又はＤＲ５に対するアフィニティーが増加した変異体ＴＲＡＩＬリガンドを発現するＮＫ細胞を含む。

下でより詳細に記載されている発明の例では、ＮＫ細胞はＴＲＡＩＬ変異体を発現するように遺伝子改変された。改変ＫＨＹＧ−１細胞はＴＲＡＩＬ変異体を発現し、ＮＫ−９２はＴＲＡＩＬ変異体を発現した。改変ＫＨＹＧ−１細胞は、インビトロでがん細胞株に対する向上した細胞傷害性を呈した。ＫＨＹＧ−１細胞はＴＲＡＩＬ受容体（例えば、ＤＲ４及びＤＲ５）を発現するが、そのレベルは低い。改変ＮＫ細胞の他の好ましい実施形態は、ＴＲＡＩＬ受容体を発現しない、又は実質的に発現しない、又は、十分に低く、改変ＮＫ細胞の生存が変異体ＴＲＡＩＬの発現による悪影響を受けない低いレベルでのみで発現する。

任意選択の実施形態では、ＴＲＡＩＬ又はＴＲＡＩＬバリアントを発現する改変ＮＫ細胞を用いるがんの治療は、がん細胞上のＴＲＡＩＬデスレセプターの発現を上方制御可能な薬剤を患者に投与することによって増強される。この薬剤は、改変ＮＫ細胞の投与前、投与と併せて、又は投与後に投与されうる。しかし、薬剤は改変ＮＫ細胞を投与する前に投与されることが好ましい。

好ましい実施例では、薬剤はがん細胞上のＤＲ５の発現を上方制御する。薬剤は任意に、化学療法薬（例えば、ボルテゾミブ）であり、がん上のＤＲ５発現を上方制御可能な低い投与量で投与されうる。

本発明は、ＤＲ５発現を上方制御可能な特定の薬品のいずれにも限定されないが、ＤＲ５誘導剤としては、例えば、ボルテゾミブ、ゲフィチニブ、ピペルロングミン、ドキソルビシン、アルファ−トコフェロールコハク酸エステル、及びＨＤＡＣ抑制剤が挙げられる。

本発明の好ましい実施形態によれば、変異体／バリアントＴＲＡＩＬリガンドは、１つ以上のＮＫ細胞共刺激ドメイン、例えば、４１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ３ゼータ／ＣＤ２４７、ＤＡＰ１２、又はＤＡＰ１０などに結合する。よって、バリアントが標的細胞上のその受容体に結合することは、標的細胞内でのアポトーシスのシグナルを増進し、ＮＫ細胞の細胞障害性シグナルを刺激する。

本発明のさらなる好ましい実施形態によれば、チェックポイント阻害受容体機能が低下し、且つＴＲＡＩＬリガンド変異体を発現するＮＫ細胞が提供され、これらのＮＫ細胞改変に関してはそれぞれ、上でより詳細に記載された通りである。さらにより好ましい実施形態では、ＴＲＡＩＬデコイ受容体に対するアフィニティーが減少した、又はアフィニティーが無く、ＫＨＹＧ−１の誘導体でありうる、ＴＲＡＩＬリガンド変異体を発現するＮＫ細胞はさらに、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴ、及びＴＩＭ−３から選択されるチェックポイント阻害受容体をコードする遺伝子を欠いている。

本発明はまた、１つ以上のＣＡＲを発現するように改変されたＮＫ細胞及びＮＫ細胞株、好ましくは、ＫＨＹＧ−１細胞及びその誘導体を提供する。

がん治療に適して、ＣＡＲは、がん細胞上の１つ以上のリガンド例えば、骨髄腫細胞上のＣＳ１（ＳＬＡＭＦ７）と特異的に結合する。特定のがん（例えば、多発性骨髄腫）の治療に使用の場合、ＣＡＲはＣＤ３８と結合しうる。例えば、ＣＡＲは、例えば、既知のモノクローナル抗体ダラツムマブのものに由来する、類似する、又は同一の可変領域の結合特性を含みうる。そのようなＮＫ細胞は、血管新生を阻害する薬剤、例えば、レナリドマイドと併用してがんの治療に使用されうる。がん、とりわけ、白血病、及び特に、ＡＭＬの治療に使用の場合、ＣＡＲはＣＬＬ−１と結合しうる。

ＣＡＲ−ＮＫは、そのアフィニティーが２つの異なるリガンド／抗原を対象とする二重特異性であってもよい。二重特異性ＣＡＲ−ＮＫは、がん細胞上の潜在的な結合部位の数を増加させるために、又は代替的に、がん細胞をＮＫ−ＣＡＲに特異的なリガンドを発現する他の免疫エフェクター細胞に限局するため使用することができる。がんの治療に使用の場合、二重特異性ＣＡＲは、標的腫瘍細胞及びエフェクター細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、又はマクロファージに結合しうる。よって、例えば、多発性骨髄腫の場合、二重特異性ＣＡＲは、Ｔ細胞抗原（例えば、ＣＤ３など）及び腫瘍細胞マーカー（例えば、ＣＤ３８など）と結合しうる。代替的に、二重特異性ＣＡＲは２つの別々の腫瘍細胞マーカーと結合し、ＮＫ細胞の標的腫瘍細胞に対する総合的な結合アフィニティーを増加させうる。これにより、標的抗原の１つを下方制御することによってがん細胞が耐性をもつようになるリスクを減らしうる。この場合の例は、多発性骨髄腫において、ＣＤ３８とＣＳ−１／ＳＬＡＭＦ７の両方に結合するＣＡＲであろう。ＣＡＲによって好適に標的とされる他の腫瘍細胞マーカーは、腫瘍上の「ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ」タイプのマーカーであり、ＣＤ４７がその例である。

本発明の任意選択の特徴は、さらなる改変を上記のＮＫ細胞及びＮＫ細胞株に与えることを含み、例えば、Ｆｃ受容体（サブタイプ及び誘導剤を含む、ＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４であることができる）を細胞の表面上に発現させる。使用にあたって、これらの細胞は、抗体で被覆されたがん細胞の認識の増加を示し、細胞障害性応答の活性化を向上することができる。

本発明のさらなる任意選択の特徴は、改変ＮＫ細胞及びＮＫ細胞株が、身体の特定の標的領域に、より良好にホーミングするように適合されることを含む。本発明のＮＫ細胞は、特定のがん細胞の位置に向けることができる。血液がんの治療に関する好ましい実施例において、本発明のＮＫエフェクターは骨髄にホーミングするように適合される。特定のＮＫ細胞は、フコシル化及び／又はシアリル化によって改変されて骨髄にホーミングする。これは、それぞれ、適切なフコシル基転移酵素及び／又はシアル酸転移酵素を発現するようにＮＫ細胞を遺伝的に改変することによって達成することができる。また、腫瘍部位へのＮＫエフェクター細胞のホーミングの増加は、例えば、メトロノミック化学療法による腫瘍血管系の破壊によって、又は血管新生を標的とする薬（Melero et al, 2014）を用いてがん血管を介するＮＫ細胞浸潤を正常化することによって可能となりうる。

本発明のさらに別の任意選択の特徴は、培養において速く成長及び増殖する固有の能力が増加した改変ＮＫ細胞及びＮＫ細胞株を提供することである。これは、例えば、成長誘導サイトカインＩＬ−２及びＩＬ−１５が過剰発現するように細胞にトランスフェクションすることによって達成することができる。さらに、この任意選択の変更は、連続的に成長培地にサイトカインを補充することに代わる費用効果の高い代替手段を提供する。

本発明はさらに、改変ＮＫ細胞又はＮＫ細胞株を作製する方法を提供し、その方法は、細胞傷害性を増加させるように、本明細書に記載のように細胞又は細胞株を遺伝子改変することを含む。この遺伝子改変は、例えば、ＣＲＩＳＰＲによる遺伝子の安定的なノックアウト又は例えばｓｉＲＮＡによる遺伝子の一過性ノックダウンであることができる。

好ましい実施形態では、細胞傷害性が増加した新しいＮＫ細胞株、例えば、ＫＨＹＧ−１細胞の誘導体を提供するために、安定的な遺伝子改変技術、例えば、ＣＲＩＳＰＲが用いられる。

実施形態では、本発明の方法は、阻害受容体機能を下げるように改変されているＮＫ細胞又はＮＫ細胞株を作製するためのものである。好ましくは、これらの阻害受容体はチェックポイント阻害受容体である。

より具体的な実施形態は、阻害受容体機能が低下したＮＫ細胞又はＮＫ細胞株を作製する方法を含み、そこにおいて、チェックポイント阻害受容体は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴ、及びＴＩＭ−３から選択される。

好ましい実施形態では、本発明の方法は、２つ以上の阻害受容体の機能を下げるようにＮＫ細胞を改変することを含む。

本発明はさらに、ＴＲＡＩＬリガンド又は変異体ＴＲＡＩＬ（バリアント）リガンドを発現するように細胞又は細胞株を遺伝子改変することを含む改変ＮＫ細胞又はＮＫ細胞株を作製する方法を提供する。

実施形態では、本発明の方法は、ＴＲＡＩＬ受容体に対するアフィニティーが増加したＴＲＡＩＬリガンド変異体を発現するようにＮＫ細胞又はＮＫ細胞株を改変することを含む。好ましくは、ＴＲＡＩＬ受容体はＤＲ４及び／又はＤＲ５である。好ましい実施形態は、デコイＴＲＡＩＬ受容体に対するアフィニティーが減少したＴＲＡＩＬリガンド変異体を発現するようにＮＫ細胞又はＮＫ細胞株を改変する方法を提供する。

さらなる好ましい実施形態では、本発明の方法は、チェックポイント阻害受容体の機能を除去し、且つさらにデコイＴＲＡＩＬ受容体に対する結合アフィニティーが減少した又は結合アフィニティーが無いＴＲＡＩＬリガンド変異体を発現するようにＮＫ細胞又はＮＫ細胞株を改変することを含む。

さらなる典型的な実施形態は、１つ以上のチェックポイント阻害受容体の機能が除去され、且つ／又はデコイＴＲＡＩＬ受容体に対するアフィニティーが減少した若しくはアフィニティーが無いＴＲＡＩＬリガンド変異体が発現するＮＫ細胞又はＮＫ細胞株を作製する方法を提供し、その細胞はＣＡＲ又は二重特異性ＣＡＲを発現するようにさらに改変される。ＣＡＲの特性は任意の上記の通りである。

実施形態では、本発明の方法は、１つ以上のチェックポイント阻害受容体の機能が除去され、且つ／又はデコイＴＲＡＩＬ受容体に対するアフィニティーが減少した、又はアフィニティーが無いＴＲＡＩＬリガンド変異体が発現するＮＫ細胞又はＮＫ細胞株を作製することを含み、細胞はＣＡＲ又は二重特異性ＣＡＲを発現するように任意に改変され、細胞は１つ以上のＦｃ受容体を発現するようにさらに改変される。適切なＦｃ受容体は、ＣＤ１６（ＦｃＲＩＩＩ）、ＣＤ３２（ＦｃＲＩＩ）、及びＣＤ６４（ＦｃＲＩ）から選択される。

上記すべての好ましい実施形態は、ＫＨＹＧ−１の誘導体であるＮＫ細胞及びＮＫ細胞株を作製する方法を含む。

本発明の目的のとおり、細胞傷害性が増加した改変ＮＫ細胞、ＮＫ細胞株、又はその組成物は、患者のがん、とりわけ、血液がんの治療での使用向けである。

好ましい実施形態では、改変ＮＫ細胞、ＮＫ細胞株、又は組成物は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞性リンパ腫及びＢ細胞性リンパ腫を含む非ホジキンリンパ腫、無症候性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫（ＳＭＭ）、活動性骨髄腫、又は軽鎖骨髄腫を含む血液がんの治療での使用向けである。

さらにより好ましい実施形態において、本発明は、血液がんの治療に使用するために、ＫＨＹＧ−１細胞のチェックポイント阻害受容体機能を下げること又はＫＨＹＧ−１細胞又はＴＲＡＩＬリガンド変異体を発現すること又はそれらの両方によってＫＹＨＧ−１の誘導体として得られるＮＫ細胞株である。

本明細書に上記又は下記の改変ＮＫ細胞、ＮＫ細胞株、及びその組成物は、がん、特に、ヒトのがんの治療、例えば、血液細胞のがん又は固形癌の治療に適している。ＮＫ細胞及び誘導体は好ましくはヒトＮＫ細胞である。ヒトの治療の場合、ヒトＮＫ細胞が好ましくは使用される。

必要としている患者に活性薬剤及びそれらの組み合わせを送達するために、投与のさまざまな経路が当業者に公知であろう。本発明の実施形態は血液がんの治療向けである。改変ＮＫ細胞及び／又はＮＫ細胞株の投与は、全身性であるか、又は例えば、腹膜内経路を介してなど局所的であることができる。

実施形態では、活性薬剤はより直接的に投与される。よって、投与は直接腫瘍内に施すことができ、とりわけ固形腫瘍に適している。

ＮＫ細胞は一般に、本発明の方法、使用、及び組成物に適していると考えられている。本明細書のある特定の例で用いられる細胞のとおり、ＮＫ細胞は、がん細胞株から得られるＮＫ細胞であることができる。有利には、ＮＫ細胞、好ましくは、その細胞を致死及び／又は分裂不能にすることによって腫瘍形成能を減らすように処理されるＮＫ細胞は、血液がん細胞株から得ることができ、血液がんを治療するために本発明の方法で使用することができる。

がん由来細胞を治療用途に対してより許容可能にするためには、その細胞は、通常、患者において腫瘍を形成する性質を減らすか又は除去するように何らかの方法で処理又は前処理される。例で用いられる特定の改変ＮＫ細胞株は分裂不能になっているので安全である。該細胞株は照射されて、殺作用能力を保持するが、約３〜４日以内に死滅する。したがって、例えば、照射の結果として、特定の細胞及び細胞株は増殖することができない。本明細書の方法で用いられる潜在的なＮＫ細胞の処理としては、生体内でそれらが分裂して腫瘍を形成するのを妨げる照射及び腫瘍形成能を減らす、例えば、生体内で細胞が分裂して腫瘍を形成するのを妨げるために活性化できる自殺遺伝子をコードする配列を挿入するような遺伝子改変が挙げられる。自殺遺伝子は、遺伝子を発現する細胞の細胞死をのちに引き起こす外因性作用物質、例えば循環作用物質によって活性化することができる。さらなる代替手段は、治療の特異的ＮＫ細胞を標的とするモノクローナル抗体の使用である。例えば、ＣＤ５２はＫＨＹＧ−１細胞上に発現し、モノクローナル抗体がこの標識に結合することにより、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及びＫＨＹＧ−１細胞死が結果としてもたらされる可能性がある。

Suck et al, 2006によって発表された論文で述べられるように、がんに由来するＮＫ細胞及び細胞株は照射装置、例えば、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ ３０００ Ｅｌａｎを使用して容易に照射される。セシウム１３７源が放射線の線量を調節するのに使用され、例えば、１Ｇｙと５０Ｇｙの間の線量応答曲線を使って、増加した細胞傷害性の利点を維持する一方で細胞の増殖能力を取り除くために最適な線量を決定することができる。これは、放射線の各線量が施された後に細胞を細胞傷害性について分析することによって達成される。

確立した自己由来Ｔ細胞又はＭＨＣがマッチしたＴ細胞による方法と比べて、養子細胞免疫療法用に照射されたＮＫ細胞株を使用することには大きな利点がある。まず、増殖性が高い性質をもつＮＫ細胞株の使用は、改変ＮＫ細胞株の増殖がより容易に且つ商業レベルで達成できることを意味する。次に、改変ＮＫ細胞株の照射は患者に細胞を投与する前に行うことができる。これらの照射された細胞は、その有用な細胞傷害性を保持し、寿命が限られ、改変Ｔ細胞とは異なり、長期間循環して持続的副作用を生じさせない。

加えて、同種異系改変ＮＫ細胞及びＮＫ細胞株の使用は、患者のＭＨＣクラスＩ発現細胞は、自己由来ＮＫ細胞障害性応答に対して阻害できるのと同じ方法で、ＮＫ細胞障害性応答を阻害できないことを意味する。がん細胞を死滅させるための同種異系ＮＫ細胞及び細胞株の使用は、前述のＧＶＬ効果に利点があり、Ｔ細胞と違って、同種異系ＮＫ細胞及び細胞株はＧＶＨＤの発症を刺激せず、養子細胞免疫療法を介するがん治療のための非常に好ましい選択肢となる。

請求項及び本明細書の他の箇所に述べられているように、本発明は以下の実施形態を提供する。
１．その細胞傷害性を増加させるために遺伝子改変されているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又はＮＫ細胞株。
２．１つ以上の阻害受容体の機能を下げるように改変された実施形態１に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
３．阻害受容体がチェックポイント阻害受容体である実施形態２に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
４．チェックポイント阻害受容体が、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴ、及びＴＩＭ−３から選択される実施形態３に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
５．２つ以上の阻害受容体の機能を下げるように改変された実施形態２〜４のいずれかに記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
６．ＴＲＡＩＬリガンドを発現するように改変された実施形態１〜５のいずれかに記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
７．ＴＲＡＩＬリガンドがＴＲＡＩＬリガンド変異体である実施形態６に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
８．ＴＲＡＩＬリガンド変異体が、ＴＲＡＩＬ受容体（例えばＤＲ４及び／又はＤＲ５）に対する増加したアフィニティーを有する実施形態７に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
９．ＴＲＡＩＬリガンド変異体が、デコイＴＲＡＩＬ受容体に対する減少したアフィニティーを有する実施形態７〜８のいずれかに記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
１０．チェックポイント阻害受容体の機能を除去するように改変され、さらにデコイＴＲＡＩＬ受容体に対する結合アフィニティーが減少した、又は結合アフィニティーが無いＴＲＡＩＬリガンド変異体を発現するように改変されている前述の実施形態いずれかに記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
１１．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する前述の実施形態いずれかに記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
１２．ＣＡＲが二重特異性ＣＡＲである実施形態１１に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
１３．二重特異性ＣＡＲが１つの細胞型上の２つのリガンドと結合する実施形態１２に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
１４．二重特異性ＣＡＲが２つの異なった細胞型各々の上の１つのリガンドと結合する実施形態１２に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
１５．ＣＡＲ又は二重特異性ＣＡＲに対するリガンドが、がん細胞上に発現する実施形態１１及び１２に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
１６．二重特異性ＣＡＲに対するリガンドが両方ともがん細胞上に発現する実施形態１３に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
１７．二重特異性ＣＡＲに対するリガンドが、がん細胞及び免疫エフェクター細胞上に発現する実施形態１４に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
１８．１つ以上のＦｃ受容体を発現するように改変された前述の実施形態いずれかに記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
１９．Ｆｃ受容体が、ＣＤ１６（ＦｃＲＩＩＩ）、ＣＤ３２（ＦｃＲＩＩ）、及びＣＤ６４（ＦｃＲＩ）から選択される実施形態１８に記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
２０．細胞株がＫＨＹＧ−１細胞株の誘導体である前述の実施形態いずれかに記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
２１．ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴ、及びＴＩＭ−３から選択されるチェックポイント阻害受容体をコードする遺伝子を欠いているＮＫ細胞。
２２．ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴ、及びＴＩＭ−３を選択される２つ以上のチェックポイント阻害受容体をコードする遺伝子を欠いている実施形態２１に記載のＮＫ細胞。
２３．チェックポイント阻害受容体が、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、及びＣＤ２７９（ＰＤ−１）から選択される実施形態２１又は２２に記載のＮＫ細胞。
２４．ＫＨＹＧ−１の誘導体である実施形態２１〜２３のいずれかに記載のＮＫ細胞。
２５．ＴＲＡＩＬデコイ受容体に対するアフィニティーが減少した、又はアフィニティーが無いＴＲＡＩＬリガンド変異体を発現するＮＫ細胞。
２６．ＫＨＹＧ−１の誘導体である実施形態２５に記載のＮＫ細胞。
２７．ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴ、及びＴＩＭ−３から選択されるチェックポイント阻害受容体をコードする遺伝子を欠いている実施形態２５又は２６に記載のＮＫ細胞。
２８．例えば、照射の結果として、増殖ができない前述の実施形態いずれかに記載のＮＫ細胞又は細胞株。
２９．その細胞傷害性を増加させるように細胞又は細胞株を遺伝的に改変することを含む改変ＮＫ細胞又はＮＫ細胞株を作製する方法。
３０．ＮＫ細胞又はＮＫ細胞株が、阻害受容体機能を下げるように改変されている実施形態２９に記載の方法。
３１．阻害受容体がチェックポイント阻害受容体である実施形態３０に記載の方法。
３２．チェックポイント阻害受容体が、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴ、及びＴＩＭ−３から選択される実施形態３１に記載の方法。
３３．２つ以上の阻害受容体の機能を下げるようにＮＫ細胞を改変することを含む実施形態２９〜３２のいずれかに記載の方法。
３４．ＴＲＡＩＬリガンド又はＴＲＡＩＬリガンド変異体を発現するようにＮＫ細胞又はＮＫ細胞株を改変することを含む実施形態２９〜３３のいずれかに記載の方法。
３５．ＴＲＡＩＬリガンド変異体がＴＲＡＩＬ受容体に対する増加したアフィニティーを有する実施形態３４に記載の方法。
３６．ＴＲＡＩＬ受容体がＤＲ４及び／又はＤＲ５である実施形態３５に記載の方法。
３７．ＴＲＡＩＬリガンド変異体がデコイＴＲＡＩＬ受容体に対する減少したアフィニティーを有する実施形態３４〜３６のいずれかに記載の方法。
３８．ＮＫ細胞又はＮＫ細胞株が、チェックポイント阻害受容体の機能を除去するように改変され、さらにデコイＴＲＡＩＬ受容体に対する結合アフィニティーが減少した、又は結合アフィニティーが無いＴＲＡＩＬリガンド変異体を発現するように改変されている実施形態２９〜３７のいずれかに記載の方法。
３９．ＮＫ細胞又はＮＫ細胞株がＣＡＲ又は二重特異性ＣＡＲを発現するように改変されている実施形態３８に記載の方法。
４０．二重特異性ＣＡＲが１つの細胞型上の２つのリガンドと結合する実施形態３９に記載の方法。
４１．二重特異性ＣＡＲが２つの異なった細胞型各々の上の１つのリガンドと結合する実施形態３９に記載の方法。
４２．ＣＡＲ又は二重特異性ＣＡＲに対するリガンドが、がん細胞上に発現する実施形態３９に記載の方法。
４３．二重特異性ＣＡＲに対するリガンド両方が、がん細胞上に発現する実施形態４０に記載の方法。
４４．二重特異性ＣＡＲに対するリガンドが、がん細胞及び免疫エフェクター細胞上に発現する実施形態４１に記載の方法。
４５．ＮＫ細胞又はＮＫ細胞株が１つ以上のＦｃ受容体を発現するように改変されている実施形態２９〜４４のいずれかに記載の方法。
４６．Ｆｃ受容体が、ＣＤ１６（ＦｃＲＩＩＩ）、ＣＤ３２（ＦｃＲＩＩ）、及びＣＤ６４（ＦｃＲＩ）から選択される実施形態４５に記載の方法。
４７．細胞株がＫＨＹＧ−１細胞株の誘導体である実施形態２９〜４６のいずれかに記載の方法。
４８．実施形態２９〜４７のいずれかに記載の方法によって得られたＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
４９．実施形態２９〜４８のいずれかに記載の方法によって得られたＫＨＹＧ−１誘導体。
５０．患者のがんの治療に用いられる細胞傷害性が増加したＮＫ細胞、ＮＫ細胞株、又はその組成物。
５１．実施形態５０に記載の使用のための、実施形態１〜２８のいずれか又は実施形態２９〜４９のいずれかに記載のＮＫ細胞又はＮＫ細胞株。
５２．がんが血液がんである、実施形態５０又は５１の記載の使用のための改変ＮＫ細胞、ＮＫ細胞株、又は組成物。
５３．血液がんが、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞性リンパ腫及びＢ細胞性リンパ腫を含む非ホジキンリンパ腫、無症候性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫（ＳＭＭ）、活動性骨髄腫、又は軽鎖骨髄腫である、実施形態５２に記載の使用のための改変ＮＫ細胞、ＮＫ細胞株又は組成物。
５４．血液がんの治療に用いられる、ＫＨＹＧ−１細胞のチェックポイント阻害受容体機能を下げること又はＫＨＹＧ−１細胞のＴＲＡＩＬリガンド変異体を発現させること又は両方によってＫＹＨＧ−１の誘導体として得られたＮＫ細胞株。

以下の添付の図面を参照して、次に本発明を特定の実施形態において説明する。
ＬＩＲ２遺伝子標的領域のＤＮＡ配列を示し、そのｇＲＮＡ隣接領域を示す。 ＣＴＬＡ４遺伝子標的領域のＤＮＡ配列を示し、そのｇＲＮＡ隣接領域を示す。 トランスフェクションに用いたｇＲＮＡコンストラクト（発現ベクター）を示す。 トランスフェクションの前後の親ＬＩＲ２ ＤＮＡ及び変異ＬＩＲ２ ＤＮＡのゲル電気泳動バンドを示す。 トランスフェクションの前後の親ＣＴＬＡ４ ＤＮＡ及び変異ＣＴＬＡ４ ＤＮＡのゲル電気泳動バンドを示す。 エレクトロポレーションを用いたＣＤ９６ノックダウンの成功を示すＦＡＣＳプロットである。 エレクトロポレーションを用いたＣＤ９６ノックダウンの成功を示すＦＡＣＳプロットである。 さまざまなＥ：Ｔ比におけるＫ５６２細胞に対するＣＤ９６ノックダウンＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害性の増加を示す棒グラフである。 ＮＫ−９２細胞のＣＤ３２８（Ｓｉｇｌｅｃ−７）のノックダウンを示す。 ＣＤ３２８（Ｓｉｇｌｅｃ−７）ノックダウンを有するＮＫ細胞の細胞傷害性の増強を示す。 ＫＨＹＧ−１細胞上のＴＲＡＩＬのベースライン発現のＦＡＣＳプロットを示す。 ＫＨＹＧ−１細胞のトランスフェクション後のＴＲＡＩＬ及びＴＲＡＩＬバリアントの発現のＦＡＣＳプロットを示す。 ＫＨＹＧ−１細胞のトランスフェクションの後のＣＤ１０７ａ発現のＦＡＣＳプロットを示す。 ＴＲＡＩＬ及びＴＲＡＩＬバリアントをＫＨＹＧ−１細胞にトランスフェクションすることの細胞生存率に対する効果を示す。 ＫＨＹＧ−１細胞とＮＫ−９２細胞の両方のＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１、及びＤｃＲ２のベースライン発現のＦＡＣＳプロットを示す。 ＫＨＹＧ−１細胞のＴＲＡＩＬ又はＴＲＡＩＬバリアントの発現の、標的細胞集団、Ｋ５６２のアポトーシスに対する効果を示す。 ＫＨＹＧ−１細胞のＴＲＡＩＬ又はＴＲＡＩＬバリアントの発現の、標的細胞集団、ＲＰＭＩ８２２６のアポトーシスに対する効果を示す。 は、ＫＨＹＧ−１細胞のＴＲＡＩＬ又はＴＲＡＩＬバリアントの発現の、標的細胞集団、ＭＭ１．Ｓのアポトーシスに対する効果を示す。 ＲＰＭＩ８２２６細胞及びＭＭ１．Ｓ細胞のＤＲ５発現の２つＦＡＣＳプロットをそれぞれ示し、そこにおいて、ＤＲ５発現に対するボルテゾミブ処理の効果が示されている。 ＴＲＡＩＬバリアントを有する／有しないＫＨＹＧ−１細胞と共培養した、ボルテゾミブで前処理したＭＭ１．Ｓ細胞／未処理ＭＭ１．Ｓ細胞のアポトーシスのＦＡＣＳプロットを示す。 １００ｎＭ ＣＭＡで２時間処理したＫＨＹＧ−１細胞のパーフォリン発現レベルのＦＡＣＳプロットを示す。 １００ｎＭ ＣＭＡ又は媒体で処理した後のＫＨＹＧ−１細胞生存率のＦＡＣＳプロットを示す。 ＴＲＡＩＬバリアントを有する／有しないＫＨＹＧ−１細胞と共培養し、ＣＭＡで前処理した／しなかったＭＭ１．Ｓ細胞のアポトーシスのＦＡＣＳプロットを示す。 ＣＤ９６−ｓｉＲＮＡ及び／又はＴＲＡＩＬバリアント発現を有するＫＨＹＧ−１細胞と共培養したＫ５６２細胞のアポトーシスのＦＡＣＳプロットを示す。 ＣＤ９６−ｓｉＲＮＡ及び／又はＴＲＡＩＬバリアント発現を有するＫＨＹＧ−１細胞と共培養したＭＭ１．Ｓ細胞のアポトーシスのＦＡＣＳプロットを示す。

次に、改変されてより強い細胞傷害性活性及びそれ故にヒトの白血病細胞死を引き起こす能力を示すＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１誘導体の作製に関して、本発明をさらに詳しく且つ具体的に記載する。

ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、及びアミノ酸配列は下記に言及される。
配列番号１は、完全長ＬＩＲ２ ＤＮＡ配列である；
配列番号２は、ＬＩＲ２アミノ酸配列である；
配列番号３は、ＬＩＲ２ ｇ９ ｇＲＮＡ配列である；
配列番号４は、ＬＩＲ２ ｇ１８ ｇＲＮＡ配列である；
配列番号５は、ＬＩＲ２フォワードプライマー配列である；
配列番号６は、ＬＩＲ２リバースプライマー配列である；
配列番号７は、完全長ＣＴＬＡ４ ＤＮＡ配列である；
配列番号８は、ＣＴＬＡ４アミノ酸配列である；
配列番号９は、ＣＴＬＡ４ ｇ７ ｇＲＮＡ配列である；
配列番号１０は、ＣＴＬＡ４ ｇ１５ ｇＲＮＡ配列である；
配列番号１１は、ＣＴＬＡ４フォワードプライマー配列である；及び
配列番号１２は、ＣＴＬＡ４リバースプライマー配列である。

実施例１−阻害受容体機能のノックアウト
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９
細胞を以下の通り調製し、阻害受容体機能を除去した。ｇＲＮＡコンストラクトを、ＮＫ細胞のヒトゲノムにおける「古典的」阻害受容体ＬＩＲ２及び「チェックポイント」阻害受容体ＣＴＬＡ４をコードする遺伝子を標的とするように設計及び調製した。次いで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集を利用して、ＬＩＲ２及びＣＴＬＡ４標的遺伝子をノックアウトした。

各標的遺伝子に対して２つの候補ｇＲＮＡを選び、Ｋ５６２細胞におけるそれらの切断効率を決定した。候補ｇＲＮＡの配列を表１に示す。プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）は配列の最後の３つの塩基に関わる。ＬＩＲ２遺伝子（配列番号１）及びＣＴＬＡ４遺伝子（配列番号７）のｇＲＮＡ配列の隣接領域をそれぞれ、図１及び２に示す。

Ｋ５６２細胞に、調製したｇＲＮＡコンストラクト（図３）をトランスフェクションした後、ＰＣＲ増幅のために集めた。ＧＦＰ発現の有無を利用してｇＲＮＡコンストラクトのＫ５６２細胞への組み込みの成功が分かるようにした。これにより、Ｃａｓ９遺伝子の発現、つまり、ＬＩＲ２遺伝子とＣＴＬＡ４遺伝子の発現をノックアウトする能力を確認した。

ｇＲＮＡコンストラクトの切断活性は、インビトロミスマッチ検出アッセイを用いて決定した。Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼＩは完全にマッチしないＤＮＡを認識して切断し、親ＬＩＲ２及びＣＴＬＡ４遺伝子をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９トランスフェクション及び非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の後に変異遺伝子と比較することができる。

図４は、ｇ９及びｇ１８ ｇＲＮＡ配列をもつＬＩＲ２遺伝子をノックアウトした後、アガロースゲル電気泳動して、結果として生じたバンドを示す。各変異に対応する３つのバンドは、トランスフェクションの後のＤＮＡ配列のミスマッチの検出に続く、親の遺伝子及び２つの結果として生じた鎖に関する。ｇ９ ｇＲＮＡ配列はトランスフェクションの成功率が１１％という結果になった一方でｇ１８ ｇＲＮＡは１０％の結果となった。

図５は、ｇ７及びｇ１５ ｇＲＮＡ配列をもつＣＴＬＡ４遺伝子のノックアウトの後、アガロースゲル電気泳動をして、結果として生じたバンドを示す。ｇ７ ｇＲＮＡ配列はトランスフェクションの成功率が３２％という結果になった一方でｇ１５ ｇＲＮＡは２６％の結果となった。

Ｋ５６２細胞におけるＬＩＲ２とＣＴＬＡ４のノックダウンが成功した後、ＫＨＹＧ−１細胞にｇＲＮＡコンストラクトをトランスフェクションした。

ホモ欠失をもつＫＨＹＧ−１誘導体クローンを選んだ。Ｃａｓ９／ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＣ）発現ベクターをこの目的のために使用した。抗生物質ピューロマイシンに対するそれらの耐性に基づいて、トランスフェクションが成功した細胞を選んだ。

Ｃａｓ９ ＲＮＰ
ＮＫ細胞のチェックポイント阻害受容体のノックアウトのために使用した別のプロトコールは、Ｃａｓ９ ＲＮＰトランスフェクションのプロトコールであった。このプロトコールを使用することの利点は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プロトコールのＤＮＡプラスミドの使用と比較して著しく低い毒性で、同程度のトランスフェクション効率が達成できるということであった。

１×１０^６個のＫＨＹＧ１細胞をトランスフェクション実験ごとに集めた。細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離機で遠沈した。次いで、上清を破棄した。次いで、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰ（ＲＮＡ結合タンパク質）材料を以下のように調製した。
（１）必要な合成ｃｒＲＮＡ及びｔＲＮＡ（ダーマコン社から購入）の２０μＭ溶液を調製した。
（２）４μｌのｃｒＲＮＡ（２０μＭ）及び４μｌのｔＲＮＡ（２０μＭ）を混合した。
（３）次いで、混合物を２μｌのＣａｓ９タンパク質（５μｇ／μｌ）に加えた。
（４）構成成分のすべてを混合し、室温で１０分間インキュベーションした。

Ｎｅｏｎ（登録商標）トランスフェクションシステムの後、細胞をＣａｓ９ ＲＮＰと混合し、以下のパラメータでエレクトロポレーションを行った。
電圧：１４５０ｖ
パルス幅：３０ｍｓ
パルス数：１

次いで、（ＩＬ−２及びＩＬ−１５を含む）成長培地の入った１２ウェルプレートの１ウェルに細胞を移した。

細胞を４８〜７２時間後に集めて、遺伝子編集効率をＴ７エンドヌクレアーゼアッセイ及び／又はサンガー法シークエンシングによって確認した。インデルの存在が確認され、ＫＨＹＧ１細胞のＣＴＬＡ４、ＰＤ１、及びＣＤ９６のノックアウトの成功が示された。

部位特異的ヌクレアーゼ
ＮＫ細胞のチェックポイント阻害受容体のノックアウトのために使用した別のプロトコールは、ＸＴＮ ＴＡＬＥＮトランスフェクションのプロトコールであった。このプロトコールを使用することの利点は、野生型ＣＲＩＳＰＲと比較して、特に高いレベルの特異性が達成できるということであった。

ステップ１：試薬の調製
ＫＨＹＧ−１細胞を、トランスフェクション効率、シングルセルクローニング効率、及び核型／コピー数を含む特定の属性について分析した。次いで、細胞を供給社の推奨事項に従って培養した。

ノックアウトされるチェックポイント阻害受容体に応じて、少なくとも２対のＸＴＮ ＴＡＬＥＮのカスタムデザインによってヌクレアーゼを調製した。カスタムデザインのステップは、遺伝子座、コピー数、及び機能評価（すなわちホモログ、オフターゲット評価）の評価を含む。

ステップ２：細胞株操作
細胞にステップ１のヌクレアーゼをトランスフェクションした。高いレベルの切断を得るためにこのステップを最高３回繰り返し、各トランスフェクションの前に培養物を分け、中間培養物を維持した。

各トランスフェクションの数日後に最初のスクリーニングを行った。細胞のプールをＣｅｌ−１アッセイによって切断効率について調べた。トランスフェクションを繰り返して切断のレベルが許容可能なレベル又はプラトーに達した後、細胞はシングルセルクローニングをする状態にあると見なした。

プールした細胞を９６ウェルプレートの１つのウェル当たり１つの細胞にソートした。各プールのプレート数は、ステップ１において決定したシングルセルクローニングの効率に依存した。プレートを３〜４週間インキュベーションした。

ステップ３−スクリーニング及び増殖
一旦細胞が９６ウェルプレートでコンフルエントになると、培養物をまとめ、全く同じ３枚の９６ウェルプレートに分けた。１枚のプレートはバックアップとして凍らせ、１枚のプレートは再播種してクローンの増殖を続け、最後のプレートは遺伝子型確認のために使用した。

遺伝子型プレートの各クローンをｑＰＣＲシグナルの損失について分析し、すべての対立遺伝子が改変されたことが示された。ネガティブクローンをＰＣＲで増幅し、クローン化してインデルの性質及び野生型又はインフレームのインデルの欠損を決定した。

ノックアウトを確認したクローンを２４ウェルプレート１枚だけにまとめ、さらに増幅させた。典型的には、最大５つの個別クローンに対して１本のバイアル当たり１×１０^６細胞が入っている５〜１０本の冷凍クライオバイアルを、１つのノックアウト当たり作製した。

ステップ４−検証
細胞は無菌条件下で貯蔵した。

すべての貯蔵細胞に関する基本的なリリース判定基準には、生細胞数（凍結前及び解凍後）、ＳＴＲによるアイデンティティーの確認、基本的な無菌性の保証、及びマイコプラズマ検査が含まれた。必要に応じて、他のリリース判定基準が適用された（核型、表面マーカー発現、高レベル無菌性、転写物又はタンパク質のノックアウト評価など）。

実施例２−ＲＮＡｉを介したチェックポイント阻害受容体ＣＤ９６の機能のノックダウン
ＫＨＹＧ−１細胞のＣＤ９６のｓｉＲＮＡノックダウンをエレクトロポレーションによって行った。細胞系の用途に適し、分裂細胞及び分裂していない細胞をうまくトランスフェクションすることができ、最高９０％のトランスフェクション効率が達成されることから、ロンザ社製のヌクレオフェクションキットＴをＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩとともに使用した。

対照ｓｉＲＮＡ（カタログ番号：ｓｃ−３７００７）及びＣＤ９６ ｓｉＲＮＡ（カタログ番号：ｓｃ−４５４６０）は、サンタクルーズバイオテクノロジー社から入手した。１０％ＦＢＳ及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含み、抗生物質を含まないＲＰＭＩ−１６４０を、ヌクレオフェクション後の培養のために用いた。マウス抗ヒトＣＤ９６−ＡＰＣ（カタログ番号：３３８４０９）は、染色のためにバイオレジェンド社から入手した。

２０μＭのｓｉＲＮＡストック溶液を調製した。凍結乾燥された二本鎖ｓｉＲＮＡは、ＦＩＴＣ対照／対照ｓｉＲＮＡについては３３μｌのＲＮＡｓｅを含まない水（ｓｉＲＮＡ希釈バッファー：ｓｃ−２９５２７）に再懸濁し、標的遺伝子ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ
ＣＤ９６）については１６５μｌのＲＮＡｓｅを含まない水に再懸濁した。チューブを９０℃に１分間加熱した後、３７℃で６０分間インキュベーションした。その後、ｓｉＲＮＡストックを−２０℃で必要になるまで保存した。

ＫＨＹＧ−１細胞は対数増殖期になければならないので、ヌクレオフェクションの１〜２日前に細胞を継代した。

Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液を室温に温めた（１試料あたり１００ｕｌ）。血清及び補助剤を含む培養培地のアリコートも５０ｍｌ容チューブで３７℃にて予め温めた。１．５ｍｌの血清及び補助剤を含む培養培地を加えることによって６ウェルプレートを準備した。プレートを加湿した３７℃／５％ＣＯ_２インキュベーター中で予めインキュベーションした。

１００μｌのヌクレオフェクション溶液中の２×１０^６細胞を４μｌの２０μＭ ｓｉＲＮＡ溶液（１．５μｇのｓｉＲＮＡ）と穏やかに混ぜた。混合中、気泡が生じないようにした。混合物をＡｍａｘａ認定キュベットに移し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキュベットホルダーに置いてプログラムＵ−００１を選択した。

プログラムの終了後、キュベットの試料を直ちに取り出した。次いで、５００μｌの予め平衡化した培養培地を各キュベットに加えた。次いで、１ウェルあたり２ｍｌの最終体積を確立するために、各キュベットの試料を、用意した６ウェルプレートの対応するウェルに穏やかに移した。

トランスフェクション分析を行うまで、細胞を加湿した３７℃／５％ＣＯ_２インキュベーター中でインキュベーションした。ＣＤ９６発現レベルを測定するために、エレクトロポレーションの１６〜２４時間後にフローサイトメトリー分析を行った。このエレクトロポーレーションプロトコールを複数回実施して、ＫＨＹＧ−１細胞のＣＤ９６ノックダウンが確実に生じたことが認められた（例えば、図６Ａ及び６Ｂを参照されたい）。

実施例３−ＣＤ９６ノックダウンを有するＮＫ細胞の細胞傷害性の増強
ＣＤ９６ノックダウンを有する／有しないＫＨＹＧ−１細胞を、異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でＫ５６２細胞と共培養した。

パーキンエルマー社のＤＥＬＦＩＡ ＥｕＴＤＡ 細胞傷害性キット（カタログ番号：ＡＤ０１１６）を用いて共培養の４時間後に細胞傷害性を測定した。

１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び抗生物質を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地で、標的細胞Ｋ５６２を培養した。９６ウェルＶ底プレート（カタログ番号：８３．３９２６）はザルスタット社から購入した。プレートを遠沈するために（プレートローターを備えた）エッペンドルフ遠心分離機５８１０Ｒを使用した。溶解したＫ５６２細胞によって生じる蛍光信号を測定するためにＶＡＲＩＯＳＫＡＮ ＦＬＡＳＨ（ＳｃａｎＩｔソフトウェア２．４．３付属）を使用した。

Ｋ５６２細胞を培養培地で洗浄し、培養培地を用いて細胞数を１×１０^６細胞／ｍＬに調節した。２〜４ｍＬの細胞を５μｌのＢＡＴＤＡ試薬に加え、３７℃で１０分間インキュベーションした。細胞内でエステル結合が加水分解されて親水性リガンドを形成し、そのリガンドは膜を通れなくなる。細胞を１５００ＲＰＭで５分間遠心分離し、ロードしたＫ５６２細胞を洗浄した。これを１ｍＭ プロベネシド（シグマＰ８７６１）を含む培地を用いて３〜５回繰り返した。最後の洗浄の後、細胞ペレットを培養培地に再懸濁し、約５×１０^４細胞／ｍＬに調節した。

バックグランド、自発的放出、及び最大放出を検出するためにウェルを準備した。１００μＬのロードした標的細胞（５，０００個の細胞）をＶ底プレートのウェルに移し、エフェクター対標的の比を１：１〜２０：１の範囲のとするために、１００μＬのエフェクター細胞（ＫＨＹＧ−１細胞）をさまざまな細胞濃度で加えた。プレートを１００×ｇで１分間遠心分離し、加湿した５％ＣＯ_２雰囲気で３７℃にて４時間インキュベーションした。最大放出ウェルについては、培地を集める１５分前に１０μＬの溶解バッファーを各ウェルに加えた。プレートを５００×ｇで５分間遠心分離した。

２０μＬの上清を平底９６ウェルプレートに移し、２００μＬの予め温めたユウロピウム溶液を加えた。これを、プレートシェーカーを用いて室温で１５分間インキュベーションした。Ｋ５６２細胞がＫＨＹＧ−１細胞によって溶解するにつれて、Ｋ５６２細胞は培地にリガンドを放出する。次いで、このリガンドはユウロピウム溶液と反応して、溶解した細胞の量と直接相関する蛍光キレートを形成する。

次に、蛍光をＶＡＲＩＯＳＫＡＮ ＦＬＡＳＨを用いて時間分解蛍光光度計で測定した。次式を用いて特異的放出を算出した。

％特異的放出＝実験放出−自発的放出／最大放出−自発的放出

グラフパッドプリズム６．０４ソフトウェアを使用して統計分析を行った。ｓｉＲＮＡ
ＣＤ９６ノックダウンＫＨＹＧ−１細胞と対照群（ｎ＝３）との違いを比較するために対応のあるｔ検定を用いた。

特異的な放出が、ＣＤ９６ノックダウンＫＨＹＧ−１細胞を含む共培養において著しく増加することがわかった。Ｅ：Ｔ比のすべてにおいてこれが当てはまった（図７を参照されたい）。

蛍光は細胞溶解と直接相関するので、ＫＨＹＧ−１細胞におけるＣＤ９６発現のノックダウンがＫ５６２がん標的細胞を死滅させる能力の増加をもたらしたことが確認された。

実施例４−ＣＤ３２８（Ｓｉｇｌｅｃ−７）ノックダウンを有するＮＫ細胞の細胞傷害性の増加
ＮＫ−９２細胞におけるＣＤ３２８のｓｉＲＮＡによって媒介されるノックダウン
材料、試薬、及び機器
対照ｓｉＲＮＡ（カタログ番号：ｓｃ−３７００７）及びＣＤ３２８ ｓｉＲＮＡ（カタログ番号：ｓｃ−１０６７５７）は、サンタクルーズバイオテクノロジー社から購入した。ＮＫ−９２細胞において高い細胞生存率（＞７５％）とともに最高９０％のトランスフェクション効率を得るために、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｄｅｖｉｃｅ（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ、ロンザ社）を用いてロンザ社のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）キットＴを使用した。１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含み、抗生物質を含まないＲＰＭＩ−１６４０をヌクレオフェクション後の培養のために用いた。マウス抗ヒトＣＤ３２８−ＡＰＣ（カタログ番号：３３９２０６）はバイオレジェンド社から購入した。

プロトコール
１０μＭのｓｉＲＮＡストック溶液を作製する。
・ 凍結乾燥二本鎖ｓｉＲＮＡを６６μｌのＲＮＡｓｅを含まない水（ｓｉＲＮＡ希釈バッファー：ｓｃ−２９５２７）に再懸濁してＦＩＴＣ対照／対照ｓｉＲＮＡとし、標的遺伝子ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ ＣＤ３２８）はＲＮＡｓｅを含まない水３３０μｌに再懸濁する。
・ チューブを９０℃で１分間熱する。
・ ３７℃で６０分間インキュベーションする。
・ すぐに使用しない場合は、ｓｉＲＮＡストックを−２０℃で保存する。
・ １つのヌクレオフェクション試料（１００μｌ標準キュベット用）は以下を含む。
・ 細胞数：２×１０^６細胞
・ ｓｉＲＮＡ：４μｌの１０μＭストック
・ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液：１００μｌ

ヌクレオフェクション
・ 必要な数の細胞を培養する。（継代数１又はヌクレオフェクションの２日前に細胞は対数増殖期になければならない）。
・ 各試料に対してｓｉＲＮＡを調製する。
・ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液（１試料あたり１００μｌ）を予め室温に温める。
・ 血清及び補助剤を含んでいる培養培地のアリコートを５０ｍｌ容チューブ中で予め３７℃に温める。血清及び補助剤を含む、１．５ｍｌの培養培地を入れることよって６ウェルプレートを調製し、加湿した３７℃／５％ＣＯ_２インキュベーター中でプレートを予めインキュベーションする。
・ 細胞培養物のアリコートをとり、細胞をカウントして細胞密度を決定する。
・ 必要な数の細胞を１５００ＲＰＭで５分間遠心分離する。残留培地が細胞ペレットを覆わないように、完全に上清を捨てる。
・ 細胞ペレットを、室温のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液中に、２×１０^６細胞／１００μｌの最終濃度に再懸濁する。細胞生存率及び遺伝子導入効率を低下させるので、細胞懸濁液を１５〜２０分より長くＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液中に保存することは避ける。
・ １００μｌの細胞懸濁液をｓｉＲＮＡと混ぜる。
・ 試料をａｍａｘａ認定キュベットに移す。試料がキュベットの底を覆うことを確認し、ピペットで取りながら気泡の発生を防ぐ。キュベットを青いキャップで閉じる。
・ 適切なＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒプログラムを選択する（ＮＫ−９２細胞についてはＡ−０２４）。キュベットをキュベットホルダーに挿入し（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ：回転台を最終位置へ時計回りに回転し）、「ｘ」ボタンを押してプログラムを開始させる。
・ 細胞への損傷を避けるために、（ディスプレイが「ＯＫ」を示して）プログラムが完了した直後に試料をキュベットから取り出す。５００μｌの予め温めた培養培地をキュベットに加えて、試料を準備した６ウェルプレートに移す。
・ 加湿した３７℃／５％ＣＯ_２インキュベーター中で細胞をインキュベーションする。１６〜２４時間後にフローサイトメトリー分析及び細胞傷害性アッセイを行う。

結果：我々は上記プロトコールに従って、ＮＫ−９２細胞のＣＤ３２８発現レベルのフローサイトメトリー分析を行った。１つの代表的な実験の結果を図８に示し、ノックダウンの成功を裏付けている。

ＣＤ３２８をノックダウンすることは細胞傷害性を増強する
材料、試薬、及び機器
蛍光増強リガンド（カタログ番号：ＡＤ０１１６）に基づくＤＥＬＦＩＡ ＥｕＴＤＡ細胞傷害性キットはパーキンエルマー社から購入した。標的細胞Ｋ５６２を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び抗生物質を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。９６ウェルＶ底プレート（カタログ番号：８３．３９２６）はザルスタット社から購入した。プレートを遠沈するために（プレートローターを備えた）エッペンドルフ遠心分離機５８１０Ｒを使用した。溶解したＫ５６２細胞によって生じる蛍光信号を測定するためにＶＡＲＩＯＳＫＡＮ ＦＬＡＳＨ（ＳｃａｎＩｔソフトウェア２．４．３付属）を使用した。

プロトコール
・ 標的Ｋ５６２細胞に蛍光増強リガンドＤＥＬＦＩＡ ＢＡＴＤＡ試薬をロードする。・ Ｋ５６２細胞を培地で洗浄し、培養培地で細胞数を１×１０^６細胞／ｍＬに調節する。２〜４ｍＬの細胞を５μｌのＢＡＴＤＡ試薬に加えて、３７℃で１０分間インキュベーションをする。
・ １ｍＭ プロベネシド（シグマＰ８７６１）を含む培地を用いて３〜５回、１５００ＲＰＭで５分間遠心分離してロードしたＫ５６２細胞を洗浄した。
・ 最後の洗浄の後、細胞ペレットを培養培地に再懸濁し、約５×１０^４細胞／ｍＬに調節した。

細胞傷害性アッセイ
・ バックグランド、自発的放出、及び最大放出を検出するためにウェルを準備した。
・ １００μＬのロードした標的細胞（５，０００個の細胞）をＶ底プレートにピペットで移す。
・ １００μＬのさまざまな細胞濃度のエフェクター細胞（ＮＫ−９２）を加える。エフェクター対標的の比は１：１〜２０：１の範囲である。
・ プレートを１００×ｇのＲＣＦで１分間遠沈する。
・ 加湿した５％ＣＯ_２雰囲気で３７℃にて２時間インキュベーションする。最大放出ウェルについては、培地を集める１５分前に１０μＬの溶解バッファーを各ウェルに加える。
・ プレートを５００×ｇで５分間遠沈する。
・ ２０μＬの上清を平底９６ウェルプレートに移し、２００μＬの予め温めたユウロピウム溶液を加え、プレートシェーカーを用いて室温で１５分間インキュベーションする。・ 蛍光をＶＡＲＩＯＳＫＡＮ ＦＬＡＳＨを用いて時間分解蛍光光度計で測定する。次式を用いて特異的放出を算出する。

・ ％特異的放出＝実験放出−自発的放出／最大放出−自発的放出

結果：我々は上記に従って、ＣＤ３２８ノックダウンの細胞傷害性に対する効果を決定した。１つの代表的な実験の結果を図９に示す。図に示されるように、標的細胞に対する細胞傷害性は、ＣＤ３２８がノックダウンされた細胞において増加した。

実施例５−チェックポイント阻害受容体のノックダウン／ノックアウトによる血液がん治療のためのプロトコール
上記の実施例において示されたように、チェックポイント阻害受容体機能は、さまざまな方法でノックダウン又はノックアウトすることができる。以下のプロトコールは、血液がん患者を治療するために開発された。

本発明を用いて適切に治療されるがんをもつ患者の診断に続いて、改変ＮＫ細胞のアリコートを解凍及び培養した後に患者に投与することができる。

代替的に、上記にように、一過性の変異は、例えばｓｉＲＮＡを用いて１日又は２日以内に作製することができる。ＭａｘＣｙｔｅ Ｆｌｏｗ エレクトロポレーションプラットフォームは、診療所における迅速な大量トランスフェクションを成し遂げるための適切な解決策を提供する。

ある特定のチェックポイント阻害受容体の除去は他と比べて有益でありうる。おそらくこれは患者及びがんによると思われる。このために、任意にがんを生検して、がん細胞を生体外で培養して増殖させる。よって、相異なるチェックポイント阻害受容体の改変を有するさまざまなＮＫ細胞を、特異的ながんに対する細胞傷害性について検査することができる。このステップは、治療に最も適したＮＫ細胞又はその誘導体を選択するために用いることができる。

改変が成功した後、患者への静脈内注射及び／又は腫瘍内注射のために細胞を適切な担体（例えば、生理食塩水）に再懸濁する。

実施例６−ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬバリアントのＫＨＹＧ−１ノックイン
トランスフェクション後にその生存率及びがん細胞を死滅させる能力を評価するために、ＫＨＹＧ−１細胞にＴＲＡＩＬとＴＲＡＩＬバリアントの両方をトランスフェクションした。

使用したＴＲＡＩＬバリアントは、国際公開第２００９／０７７８５７号に記載されているものである。このＴＲＡＩＬバリアントは、Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ変異を含む野生型ＴＲＡＩＬ遺伝子にコードされる。この変異は、ＴＲＡＩＬバリアントのＤＲ５に対するアフィニティーを著しく増加させ、一方で両デコイ受容体（ＤｃＲ１及びＤｃＲ２）に対するアフィニティーを減少させる。

ベースラインＴＲＡＩＬ発現
ＫＨＹＧ−１細胞のベースラインＴＲＡＩＬ（ＣＤ２５３）発現をフローサイトメトリー用いてアッセイした。

マウス抗ヒトＣＤ２５３−ＡＰＣ（バイオレジェンド社カタログ番号：３０８２１０）及びアイソタイプ対照（バイオレジェンド社カタログ番号：４００１２２）を用いて細胞試料を染色し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターで分析した。

ＫＨＹＧ−１細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）、及びＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。０．５〜１．０×１０^６個の細胞／試験を遠心分離（１５００ＲＰＭ×５分）によって集め、上清を吸引した。細胞（単一細胞懸濁液）を４ｍｌの氷冷したＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．５〜１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３アジ化ナトリウム）で洗浄した。細胞を１００μＬの氷冷ＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、５ｕＬの抗体を各チューブに加え、氷上で３０分間インキュベーションした。１５００ＲＰＭで５分間の遠心分離で細胞を３回洗浄した。次いで、細胞を５００μＬの氷冷ＦＡＣＳバッファーに再懸濁して、一時的に暗所で氷上に保った。

その後、細胞をフローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ）で分析し、生成されたデータを、ＦｌｏｗＪｏ ７．６．２ソフトウェアを用いて処理した。

図１０に見られるように、ＦＡＣＳ分析はＫＨＹＧ−１細胞表面上のＴＲＡＩＬの弱いベースライン発現を示した。

エレクトロポレーションによるＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬバリアントノックイン
野生型ＴＲＡＩＬ ｍＲＮＡ及びＴＲＡＩＬバリアント（Ｄ２６９Ｈ／１９５Ｒ）ｍＲＮＡはＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社によって合成された。分注して−８０℃として保存した。マウス抗ヒトＣＤ２５３−ＡＰＣ（バイオレジェンド社カタログ番号：３０８２１０）及びアイソタイプ対照（バイオレジェンド社カタログ番号：４００１２２）並びにマウス抗ヒトＣＤ１０７ａ−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社カタログ番号：１２−１０７９−４２）及びアイソタイプ対照（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社カタログ番号：１２−４７１４）抗体を使用して細胞試料を染色し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターで分析した。ＤＮＡ染料ＳＹＴＯＸ−グリーン（ライフテクノロジーズ社カタログ番号：Ｓ７０２０；ＤＭＳＯ中の５ｍＭ溶液）を用いた。ＫＨＹＧ−１細胞において高い細胞生存率とともに最高９０％のトランスフェクション効率を得るために、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｄｅｖｉｃｅ（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ、ロンザ社）を用いてロンザ社のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）キットＴを使用した。１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、及びＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）を含み、抗生物質を含まないＲＰＭＩ１６４０をヌクレオフェクション後の培養のために用いた。

細胞は対数増殖期になければならないので、ＫＨＹＧ−１細胞及びＮＫ−９２細胞はヌクレオフェクションの１日前又は２日前に継代した。５０ｍＬ容チューブ中で、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液（１試料あたり１００μｌ）を、３７℃の血清及び補助剤を含む培養培地のアリコートとともに予め室温に温める。血清及び補助剤を含む１．５ｍＬの培養培地を入れることよって６ウェルプレートを調製し、加湿した３７℃／５％ＣＯ_２インキュベーター中でプレートを予めインキュベーションした。細胞培養のアリコートを作り、細胞をカウントして細胞密度を決定した。上清を完全に捨てる前に、必要な数の細胞を１５００ＲＰＭで５分間遠心分離した。細胞ペレットを、室温のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液中に、２×１０^６細胞／１００μｌの最終濃度に再懸濁した（懸濁液中での最長時間＝２０分）。１００μｌ細胞懸濁液を１０μｇのｍＲＮＡ（ＲＮＡの体積＜１０μＬ）を混ぜた。試料をＡｍａｘａ認定キュベットに（試料がキュベットの底を覆っていることを確認し、気泡の発生を防ぎつつ）移した。適切なＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒプログラムを選択した（すなわち、ＫＨＹＧ−１細胞にはＵ−００１）。次いで、キュベットをキュベットホルダーに挿入した。５００μｌの予め温めた培養培地をキュベットに入れ、細胞への損傷を避けるために、プログラムが完了した直後に試料を用意した６ウェルプレートに移した。細胞を加湿した３７℃／５％ＣＯ_２インキュベーター中でインキュベーションした。フローサイトメトリー分析及び細胞傷害性アッセイをエレクトロポレーションの１２〜１６時間後に行った。フローサイトメトリー染色を上記のように実施した。

図１１及び図１２に見られるように、ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬバリアント及びＣＤ１０７ａ（ＮＫ活性化標識）の発現はトランスフェクション後に増加し、ＴＲＡＩＬ遺伝子のＫＨＹＧ−１細胞へのノックインが成功したことを裏付けている。

図１３は、エレクトロポレーションを介するトランスフェクションの前後のＫＨＹＧ−１細胞生存率の証拠を提供する。ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬバリアントの細胞へのトランスフェクションの後に、細胞生存率の統計的に有意な差が認められないことがわかり、野生型又は変異ＴＲＡＩＬの発現が細胞にとって有害であることを裏付けている。この観察結果はＮＫ−９２細胞における対応する所見と矛盾し、ＴＲＡＩＬバリアント遺伝子ノックインが細胞にとって有害であることを示唆する（データ示さず）。それでもなお、これはおそらくＮＫ−９２細胞表面上のＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ４及びＤＲ５の比較的高い発現レベルによって説明されるであろう（図１４を参照されたい）。

ＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害性に対するＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬバリアントの効果
マウス抗ヒトＣＤ２−ＡＰＣ抗体（ＢＤファーミンジェン社カタログ番号：５６０６４２）を使用した。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ抗体（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ社カタログ番号：３１４９００１３）を使用した。ＤＮＡ染料ＳＹＴＯＸ−グリーン（ライフテクノロジーズ社カタログ番号：Ｓ７０２０）を使用した。２４ウェル細胞培養プレート（ザルスタットＡＧ社カタログ番号：８３．３９２２）を使用した。骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２、多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６及びＭＭ１．Ｓを標的細胞として使用した。Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６、ＭＭ１．Ｓは、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、及びペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。

上記で説明したように、ＫＨＹＧ−１細胞にＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬバリアントをトランスフェクションした。

標的細胞を１５００ＲＰＭで５分間遠心分離することによって洗浄し、ペレット化した。トランスフェクションしたＫＨＹＧ−１細胞を０．５×１０^６／ｍＬに希釈した。次いで、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比を１：１にするために、予め温めたＲＰＭＩ１６４０で標的細胞密度を調節した。

その後、０．５ｍＬのＫＨＹＧ−１細胞及び０．５ｍＬの標的細胞を２４ウェル培養プレート中で混ぜ、加湿した３７℃／５％ＣＯ_２インキュベーターに１２時間置いた。次いで、フローサイトメトリー分析を用いてＫＨＹＧ−１細胞傷害性を分析した。共培養した細胞を（相異なる時点で）洗浄した後、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ結合バッファーを用いて、ＣＤ２−ＡＰＣ抗体（５μＬ／試験）、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ（５μＬ／試験）、及びＳＹＴＯＸ−グリーン（５μＬ／試験）で染色した。

データをＦｌｏｗＪｏ ７．６．２ソフトウェアを使用してさらに解析した。ＣＤ２陽性ゲート及びＣＤ２陰性ゲートを設定した。それらはそれぞれＫＨＹＧ−１細胞及び標的細胞集団を表わす。次いで、ＣＤ２陰性集団のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ陽性細胞及びＳＹＴＯＸ−グリーン陽性細胞を、ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスについて解析した。

図１５、図１６、及び図１７は、３つの標的細胞株、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６、及びＭＭ１．Ｓに対する、ＴＲＡＩＬ又はＴＲＡＩＬバリアントを発現する両方のＫＨＹＧ−１細胞のアポトーシスへの効果を示す。（ＴＲＡＩＬをトランスフェクションしなかった）正常ＫＨＹＧ−１細胞と比較して、ＫＨＹＧ−１細胞上のＴＲＡＩＬ発現がアポトーシスのレベルを増加させたことが、すべての標的細胞集団に関して明らかである。そのうえ、野生型ＴＲＡＩＬをトランスフェクションしたＫＨＹＧ−１細胞と比較して、ＫＨＹＧ−１細胞上のＴＲＡＩＬバリアント発現は、すべての標的細胞株のアポトーシスをさらに増加させた。

ＴＲＡＩＬバリアントを発現する本発明の細胞は、デスレセプターＤＲ５に対するより高いアフィニティーを呈するため、がんの治療において大きな利点を提供する。がん細胞は、本発明のこれらの細胞によって攻撃された場合に、ある特定の経路を介して死を迂回するために防御戦略をもつようになることを妨げられる。よって、本発明の細胞がそれらの環境で細胞傷害性を保つように改変されているので、がんは、ＴＲＡＩＬデコイ受容体を上方制御することによってＴＲＡＩＬ誘導細胞死を効果的に回避することができない。

実施例７−ＴＲＡＩＬバリアントがノックインされたＮＫ細胞を用いる血液がん治療のためのプロトコール
実施例６で上に記載した通りに、ＫＨＹＧ−１細胞にＴＲＡＩＬバリアントをトランスフェクションした。以下のプロトコールは血液がん患者の治療用に開発された。

本発明を用いて適切に治療されるがんをもつ患者の診断に続いて、改変ＮＫ細胞の投与前に、ＤＲ５誘導剤、例えば、ボルテゾミブが投与され、したがって、低投与量で用いられてがん上のＤＲ５の発現を上方制御し、改変ＮＫ細胞治療をより効果的にする。

次いで、改変ＮＫ細胞のアリコートを解凍し、培養して、患者に投与した。

治療で使用するＮＫ細胞が発現するＴＲＡＩＬバリアントは、アフィニティーが野生型よりデコイ受容体に対してのほうが低いので、がん細胞表面上のデスレセプターの結合が増加し、したがってその結果としてより多くのがん細胞アポトーシスが起こる。

別の選択肢は、上記プロトコールの実行前に、がんを生検して及びがん細胞を生体外で培養することである。ＤＲ５誘導剤が所与の患者に適切かどうかについて決定するのを助けるために、このステップは、特に高いレベルのデコイ受容体及び／又は低いレベルのデスレセプターを発現するがんを同定するために用いることができる。また、所与のがんが順応して、例えばそのＤＲ５発現を減らしうるかもしれないので、このステップは上記のプロトコールを含む治療の間に実行されてもよく、したがって、治療の途中でＤＲ５誘導剤での治療に適するようになりうる。

実施例８−低投与量ボルテゾミブはＴＲＡＩＬバリアントを発現するＮＫ細胞に対するがん細胞の感受性を増加させる
ボルテゾミブ（Ｂｔ）は、多発性骨髄腫（ＭＭ）の治療に有用なプロテアソーム阻害剤（化学療法様薬）である。ボルテゾミブは、ＭＭ細胞を含むいくつかの異なるタイプのがん細胞上のＤＲ５発現を上方制御することが知られている。

ＫＨＹＧ−１細胞を、実施例６で上に記載した通りにＴＲＡＩＬバリアントをトランスフェクションした後に、ボルテゾミブへの曝露の有り無しでＭＭ細胞を標的とするのに使用した。

ボルテゾミブ誘導ＤＲ５発現
ボルテゾミブはミレニアム・ファーマシューティカルズ社から購入した。マウス抗ヒトＤＲ５−ＡＦ６４７（カタログ番号：５６５４９８）は、ＢＤファーミンジェン社から購入した。染色した細胞試料はＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで分析した。

（１）ＭＭ細胞株ＲＰＭＩ８２２６及びＭＭ１．Ｓを、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２４ｍＭ 重炭酸ナトリウム、０．０１％の抗生物質、及び１０％ ウシ胎仔血清（シグマ、セントルイス、ミズーリ州、米国）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ、セントルイス、ミズーリ州、米国）で、３７℃にて５％ＣＯ２雰囲気中で培養した。
（２）ＭＭ細胞を１×１０^６／ｍＬ、２ｍＬ／ウェルで６ウェルプレートに播種した。
（３）次いで、ＭＭ細胞を相異なる投与量のボルテゾミブで２４時間処理した。
（４）次いで、ボルテゾミブ処理／未処理のＭＭ細胞のＤＲ５発現をフローサイトメトリーで分析した（図１８）。

低投与量ボルテゾミブ処理は両方のＭＭ細胞株においてＤＲ５発現を増加させることがわかった（図１８）。ＤＲ５情報制御はアポトーシスの軽微な誘導と関連した（データ示さず）。しかし、ＤＲ５発現は、大部分のＭＭ細胞が死滅するという結果をもたらす高い毒性に起因して、高投与量のボルテゾミブによって上方制御することができないことがわかった。

がん細胞のボルテゾミブによって誘導される感受性の増加
実施例６で上に記載した通りに、ＫＨＹＧ−１細胞にＴＲＡＩＬバリアント（ＴＲＡＩＬ Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ）をトランスフェクションした。

（１）ボルテゾミブ処理／未処理ＭＭ１．Ｓ細胞を標的細胞として使用した。ＭＭ１．Ｓ細胞を、２．５ｎＭのボルテゾミブ又は溶媒（対照）で２４時間処理した。
（２）ＴＲＡＩＬバリアントｍＲＮＡのエレクトロポレーションの６時間後に、ＫＨＹＧ−１細胞をＭＭ細胞と１２ウェルプレートで培養した。洗浄後、細胞濃度を１×１０^６／ｍＬに調節した後、ＫＨＹＧ−１とＭＭ１．Ｓ細胞を１：１の比で混合し、１２時間培養した。
（３）ＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害性のフローサイトメトリー分析を実施した。共培養した細胞を集めて洗浄した後、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ結合バッファーを用いて、ＣＤ２−ＡＰＣ抗体（５μＬ／試験）、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ（５μＬ／試験）、及びＳＹＴＯＸ−グリーン（５μＬ／試験）で染色した。
（４）データをＦｌｏｗＪｏ ７．６．２ソフトウェアを使用してさらに解析した。ＣＤ２陰性集団はＭＭ１．Ｓ細胞を表わす。ＫＨＹＧ−１細胞は強いＣＤ２陽性である。最後に、ＣＤ２陰性集団のＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣ及びＳＹＴＯＸ−グリーン陽性細胞を分析した。

ＴＲＡＩＬバリアントの有り無しでエレクトロポレーションしたＫＨＹＧ−１細胞と共培養した、ボルテゾミブで前処理した／未処理のＭＭ１．Ｓ細胞において、アポトーシスのフローサイトメトリー分析を行った（図１９）。

ボルテゾミブは、ＴＲＡＩＬバリアントを発現するＫＨＹＧ−１細胞に対するＭＭ細胞の増感を誘導することがわかった。したがって、データは、ＤＲ５発現を誘導した薬剤は、がん細胞に対する細胞傷害性を増加させる点で該モデルにおいて効果的で、それゆえに、本発明のがん治療を増強するのに有用でありうることを示した。

実施例９−ＴＲＡＩＬバリアントによる誘導アポトーシスの確認
ＴＲＡＩＬバリアント発現からＮＫ細胞の細胞傷害性の増加が生じるという前述の実施例における決定的証拠にもかかわらず、我々は、細胞傷害性の増加が、がん細胞アポトーシスを誘導することから生じたのか（可能性が最も高い）、又はＮＫ細胞が意図せず活性化されて、より強い細胞障害性表現型を呈し、よってパーフォリン分泌を介してがん細胞を死滅させることによるのかを確認したいと望んだ。

コンカナマイシンＡ（ＣＭＡ）は、溶解性顆粒のｐＨの増加によってパーフォリンの分解が加速されることに主に起因して、パーフォリンによって媒介されるＮＫ細胞の細胞傷害性活性を阻害することが示されている。我々は、パーフォリンによって媒介される細胞傷害性がＣＭＡで部分的に消滅するときに、ＴＲＡＩＬバリアントを発現するＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害性が際立ちうるか否かを調べた。

パーフォリン発現のＣＭＡ誘導減少
マウス抗ヒトパーフォリン−ＡＦ６４７（カタログ番号：５６３５７６）は、ＢＤ ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入した。コンカナマイシンＡ（カタログ番号：ＳＣ−２０２１１１）は、サンタクルーズバイオテクノロジー社から購入した。染色した細胞試料は、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩを使用して分析した。

（１）ＫＨＹＧ−１細胞を、培養した。１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）、及びＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。
（２）ＫＨＹＧ−１細胞（エレクトロポレーション後の６時間、ペニシリン／ストレプトマイシンを含まないＲＰＭＩ１６４０培地で培養）をさらに、１００ｎＭ ＣＭＡ又は等量の溶媒（ＤＭＳＯ）で２時間処理した。
（３）細胞を遠心分離（１５００ＲＰＭ×５分）によって集め（１×１０^６細胞／試験）、上清を吸引した。
（４）細胞をＰＢＳ溶液中の４％パラホルムアルデヒドで室温にて１５分間固定した。
（５）細胞を４ｍＬのＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．５〜１％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム）で２回洗浄した。
（６）細胞を１ｍＬのＰＢＳ／０．１％サポニンバッファーで室温にて３０分間透過処理した。
（７）細胞を４ｍＬのＰＢＳ／０．１％サポニンバッファーで洗浄した。
（８）細胞を１００μＬのＰＢＳ／０．１％サポニンバッファーに再懸濁した後、５ｕＬの抗体を各チューブに加えて、氷上で３０分間インキュベーションした。
（９）細胞を１５００ＲＰＭでの５分間遠心分離によって、ＰＢＳ／０．１％サポニンバッファーで３回洗浄した。
（１０）細胞を５００ｕＬの氷冷ＦＡＣＳバッファーに再懸濁して、分析まで一時的に暗所で氷上又は冷蔵庫内に４℃で置いた。
（１１）細胞をフローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ）で分析した。データをＦｌｏｗＪｏ ７．６．２ソフトウェアを使用して処理した。

ＣＭＡ処理は、著しくＫＨＹＧ−１細胞におけるパーフォリン発現レベルを減少させ（図２０）、ＫＨＹＧ−１細胞の生存率に悪影響を及ぼさなかった（図２１）。

ＣＭＡの存在下におけるＮＫ細胞ＴＲＡＩＬバリアントの細胞傷害性
実施例６で上に記載した通り、ＫＨＹＧ−１細胞にＴＲＡＩＬバリアント（ＴＲＡＩＬ
Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ）をトランスフェクションした。

（１）ＭＭ１．Ｓ細胞を標的細胞として使用した。
（２）ＴＲＡＩＬ ｍＲＮＡのエレクトロポレーションの６時間後に、ＫＨＹＧ−１細胞を１００ｍＭ ＣＭＡ又は等量の溶媒で２時間処理した。
（３）ＫＨＹＧ−１細胞を遠心分離によってＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、ＩＬ−２を含むＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、細胞濃度を１×１０^６／ｍＬに調節した。
（４）ＩＬ−２を含むＲＰＭＩ１６４０培地にＭＭ１．Ｓ細胞を再懸濁し、細胞濃度を１×１０^６／ｍＬに調節した。
（５）ＫＨＹＧ−１とＭＭ１．Ｓ細胞を１：１の比で混合し、１２時間共培養した。
（６）ＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害性のフローサイトメトリー分析を実施した。共培養した細胞を洗浄し、ＣＤ２−ＡＰＣ抗体（５ｕＬ／試験）で染色した。
（７）洗浄後、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ結合バッファーを用いてＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣ（５ｕＬ／試験）及びＳＹＴＯＸ−グリーン（５ｕＬ／試験）でさらなるなる染色を行った。
（８）さらに、データをＦｌｏｗＪｏ ７．６．２ソフトウェアを使用して解析した。ＣＤ２陰性集団はＭＭ１．Ｓ細胞を表す。ＫＨＹＧ−１細胞は強いＣＤ２陽性である。次いで、ＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣ及びＣＤ２陰性集団中のＳＹＴＯＸ−グリーン陽性細胞を解析した。

ここでもやはり、ＴＲＡＩＬバリアントを発現するＮＫ細胞は、ＴＲＡＩＬバリアントの発現を欠いている対照細胞と比べて高い細胞傷害性を示すことが示された（図２２）。しかし、この実施例では、ＣＭＡで処理した対照ＮＫ細胞の結果とは対照的に、ＣＭＡは、ＴＲＡＩＬバリアントを発現するＮＫ細胞の細胞傷害性活性を著しく減少できないことがさらに示された。

ＴＲＡＩＬバリアントのないＮＫ細胞（対照又は擬似ＮＫ細胞）は、ＣＭＡの非存在下で４８％のがん細胞死を誘導し、ＣＭＡの存在下で３５．９％のがん細胞死を誘導することが示された（図２２）。ＴＲＡＩＬバリアントを発現するＮＫ細胞は、ＣＭＡの存在下でも非存在下でも対照ＮＫ細胞と比べて多くのがん細胞死を誘導することが可能であった。実際のところ、ＣＭＡが存在しても、ＴＲＡＩＬバリアントを発現するＮＫ細胞は、ＣＭＡの非存在下での対照ＮＫ細胞と比べてより多くのがん細胞死を誘導した。

したがって、このデータは、パーフォリンに関連する下方制御の影響をより少なく受ける機構を介してがん細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を増加させる点でＴＲＡＩＬバリアントの重要性を示す。パーフォリンは一般にＮＫ細胞によって利用されて標的細胞を死滅させ、多くのがん細胞はＮＫ細胞パーフォリン発現を減じるための機構をもつようになっているので、細胞障害性攻撃を避けるために、本発明のＮＫ細胞はがん細胞による減衰の影響をより少なく受ける強力な代替手段を表す。

実施例１０−ＫＨＹＧ−１細胞における変異ＴＲＡＩＬバリアントの発現とチェックポイント阻害受容体ＣＤ９６のノックダウンとの組み合わせ
チェックポイント阻害受容体ＣＤ９６発現をノックダウンした場合及びＴＲＡＩＬバリアントを発現した場合にＮＫ細胞の細胞傷害性の増加が観察された。我々は２つの遺伝子改変を組み合わせてＮＫ細胞の細胞傷害性の相乗効果を起こすことをさらに試した。

実施例２に記載した通りに、ＣＤ９６発現をＫＨＹＧ−１細胞においてノックダウンした。

実施例６で上に記載した通りに、ＫＨＹＧ−１細胞にＴＲＡＩＬバリアント（ＴＲＡＩＬ Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ）をトランスフェクションした。

（１）エレクトロポレーションの１２時間後に、ＫＨＹＧ−１細胞を標的細胞（Ｋ５６２又はＭＭ１．Ｓ）とともに１×１０^６／ｍＬの濃度にて１２ウェルプレート（２ｍＬ／ウェル）で１２時間共培養した。Ｅ：Ｔ比は１：１であった。
（２）共培養の１２時間後に、細胞を集め、洗浄し、ＣＤ２−ＡＰＣで染色し、再度洗浄し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ結合バッファーを用いてＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣ（５ｕＬ／試験）及びＳＹＴＯＸ−グリーン（５ｕＬ／試験）でさらに染色した。
（３）細胞試料を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター）を使用して分析した。データをＦｌｏｗＪｏ ７．６．２ソフトウェアを使用してさらに解析した。ＣＤ２陰性集団はＭＭ１．Ｓ細胞を表す。ＫＨＹＧ−１細胞は強いＣＤ２陽性である。次いで、ＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣ及びＣＤ２陰性集団中のＳＹＴＯＸ−グリーン陽性細胞を解析した。

ＫＨＹＧ−１細胞においてＣＤ９６発現のノックダウン及びＴＲＡＩＬバリアントの発現を同時にすることは、Ｋ５６２標的細胞（図２３）及びＭＭ１．Ｓ標的細胞（図２４）双方に対する該細胞の細胞傷害性を相乗的に増強することがわかった。このことは、両標的細胞群において、個々の改変単独から生じた細胞死と比べて、同時遺伝子改変から生じた細胞死のほうが多かったという事実によって示された。

同時に、ＴＲＡＩＬ変異体／バリアントの発現がＮＫ細胞の細胞傷害性を増加させるというさらなる証拠（図２３及び２４）に加えて、ＣＤ９６のノックダウンがＮＫ細胞の細胞傷害性を増加させるというさらなる証拠（図２３及び２４）が得られた。

したがって、本発明は、血液がん治療で用いるＮＫ細胞及び細胞株並びにその作製を提供する。

Claims (6)

1. ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）及びＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）から成る群から選択される何れかのチェックポイント阻害受容体の発現をノックアウトする又はノックダウンするように遺伝子改変されたヒトＮＫ細胞又はＮＫ細胞株を含む、血液がんを治療するための医薬組成物。
2. 前記ＮＫ細胞又はＮＫ細胞株が、骨髄を標的とするものである、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記ＮＫ細胞又はＮＫ細胞株が、フコシル基転移酵素又はシアル基転移酵素を発現する改変をさらに含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
4. 前記ＮＫ細胞株が、ＫＨＹＧ−１の誘導体である細胞株である、請求項１〜３の何れか一項に記載の医薬組成物。
5. 前記ＮＫ細胞又はＮＫ細胞株が、ＩＬ−２又はＩＬ−１５の発現をさらに改変されたものである、請求項１〜４の何れか一項に記載の医薬組成物。
6. 前記血液がんが、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞性リンパ腫及びＢ細胞性リンパ腫を含む非ホジキンリンパ腫、無症候性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫（ＳＭＭ）、活動性骨髄腫、又は軽鎖骨髄腫である、請求項１〜５の何れか一項に記載の医薬組成物。

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