KR20190110531A - 개선된 nk 세포 기반 치료법 - Google Patents

개선된 nk 세포 기반 치료법 Download PDF

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마이클 이몬 피터 오드와이어
진송 후
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온키뮨 리미티드
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Abstract

암의 치료 방법은, 특히 IL-6 수용체를 발현하는 암, 및 체크포인트 억제 수용체, 예를 들어 PDL-1 및/또는 PDL-2가 질환 중에 발현/상향조절되는 암의 치료를 위한, IL-6 또는 이의 수용체에 대한 항체와 같은 IL-6 길항제와 병용된 자연 살해(NK) 세포 또는 세포주의 투여를 포함한다.

Description

개선된 NK 세포 기반 치료법
본 발명은 암 치료를 위한, 자연 살해(NK) 세포 또는 세포주를 이펙터로서 사용하는 치료법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 혈액암 치료를 위한 병용 요법, 치료 방법 및 조성물에 관한 것이다.
다양한 물리적 요법, 약학적 요법 및 기타 요법에 있어 상당한 투자에 불구하고, 인간 암은 모든 연령층에서 사망률의 중요한 원인으로 남아 있다.
일례로, 급성 골수성 백혈병(AML: acute myeloid leukemia)은 골수 발생에 관여하는 전구 세포와 관련된 조혈계 악성종양이며, 성인(90%)과 아동(15-20%) 모두에서 급성 백혈병의 상당한 부분을 차지한다(Hurwitz, Mounce et al. 1995; Lowenberg, Downing et al. 1999). 표준 화학 요법(Hurwitz, Mounce et al. 1995; Ribeiro, Razzouk et al. 2005)으로 80%의 환자가 완화를 보였지만, 미세 잔존 질환(MRD: minimal residual disease)으로 인한 재발률이 높기 때문에 생존율이 만족스럽지 못하게 유지된다. 5년 생존은 아동에서 60%(Rubnitz 2012), 65세 미만의 성인에서 40%(Lowenberg, Downing et al. 1999), 65세 이상의 성인에서 10%(Ferrara and Schiffer 2013)로 연령에 따라 다르다. 이러한 결과는 환자에게 적절한 조혈 모세포 기증자가 생기면 개선될 수 있지만, 많은 경우 그렇지 못하여, 치료법에 대한 대안적인 접근법의 필요성이 강조된다.
자연 살해(NK) 세포는 자연 살해 T(NK-T) 세포와 구별되는 특징적인 표현형과 이펙터 기능을 가진 세포독성 림프구이다. 예를 들어, NK-T 세포는 CD3과 T 세포 항원 수용체(TCR: T cell antigen receptor) 모두를 발현하지만, NK 세포는 그렇지 않다. NK 세포는 일반적으로 마커 CD16 및 CD56을 발현하는 것으로 밝혀졌으며, 여기서 CD16은 Fc 수용체로서 기능을 하고 하기에 논의되는 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC: antibody dependent cell-mediated cytotoxicity)을 매개한다. KHYG-1은 이와 관련하여 주목할 만한 예외이다.
NK 세포가 자연적으로 세포독성이 있음에도 세포독성이 증가한 NK 세포주가 개발되었다. NK-92와 KHYG-1은 광범위하게 연구되어 암 치료제로서 유망한 2가지 NK 세포주를 대표한다(Swift et al. 2011; Swift et al. 2012).
암 치료에 사용하기 위한 입양 세포 면역 요법은 보편적으로 환자에게 천연 및 변형된 T 세포의 투여를 수반한다. T 세포는 특정 표적 암세포에 특이적으로 결합하는 수용체 및/또는 리간드를 발현하기 위해서 다양한 방식으로, 예를 들어 유전자적으로 변형될 수 있다. 암세포 항원에 특이적인 고친화성 T 세포 수용체(TCR) 및 키메라 항원 수용체(CAR: chimeric antigen receptor)를 갖는 T 세포의 트랜스펙션은 반응성이 높은 암 특이적 T 세포 반응을 일으킬 수 있다. 이 면역 치료 접근법의 주된 한계는 T 세포를 자가 생체 외 증식을 위해 환자로부터 얻어야 만하거나, 세포를 환자에게 전달한 직후 또는 일부 경우 이식편대 숙주 질환(GVHD: graft-vs-host disease)의 발병 후에 면역학적 제거를 피하기 위해 MHC 일치 T 세포를 사용해야 한다는 것이다. 또한, 성공적으로 전달된 T 세포는 종종 순환 과정에서 장기간 생존하여 치료로 인해 생기는 지속적인 부작용을 제어하기가 어렵게 만든다.
일배체형 이식에서, 이식편 대 백혈병 효과는 AML의 치료에서 생존율을 향상시킬 수 있는 KIR 억제 수용체-리간드 미스매치가 존재할 때 NK 세포에 의해 매개되는 것으로 생각된다(Ruggeri, Capanni et al. 2002; Ruggeri, Mancusi et al. 2005). 더욱이, 신속한 NK 회복은 AML에서 일배체형 T-고갈 조혈 세포 이식(HCT:
hematopoietic cell transplantation)을 받은 환자에서 더 우수한 결과와 더 강력한 이식편 대 백혈병(GVL: graft-vs-leukemia) 효과와 관련이 있다(Savani, Mielke et al 2007). 다른 시험에서는 성인(Miller, Soignier et al 2005) 및 아동(Rubnitz, Inaba et al 2010)에서 AML을 치료하기 위해 생체 외 증식된 일배체동종 NK 세포를 사용하였다.
몇몇 영구 NK 세포주가 확립되었고, 가장 주목할만한 것은 CD16(Fc 감마 수용체 III)을 제외하고 전형적인 NK 세포 마커를 발현하는 비호지킨 림프종 환자에서 유래한 NK-92(상기 언급됨)이다. NK-92는 광범위한 전임상 시험을 거쳤으며, 활성화된 NK 세포 및 림포카인 활성화 살해(LAK: lymphokine-activated killer) 세포와 비교하여 광범위한 종양에 대해 우수한 용해를 나타낸다(Gong, Maki et al. 1994). 원발성 AML에 대한 NK-92 세포의 세포독성이 확립되었다(Yan, Steinherz et al. 1998).
또 다른 NK 세포주인 KHYG-1은 임상적 용도에 가능한 도전자로서 확인되었지만(Suck et al 2005), 세포독성이 감소하여 NK-92보다 더 적은 관심을 받아왔다. KHYG-1 세포는 사전 활성화되는 것으로 공지되어있다. 내인성 NK 세포와는 달리 KHYG-1 세포는 항상 분극화되어 있어, 이는 세포독성을 증가시키고 외부 자극에 더 빠르게 반응하도록 만든다. NK-92 세포는 KHYG-1 세포보다 높은 기준선 세포독성을 갖는다.
문헌[Cifaldi et al. Arthritis Rheumatol. 2015 Nov;67(11):3037-46)]은 IL-6이 마우스 및 인간 관절염 환자에서 NK 세포의 세포독성을 감소시킨다고 보고하였다. 문헌[Kang et al. Hum Reprod. 2014 Oct 10; 29(10): 2176-89)은 IL-6 중화 항체를 사용하여 자궁내막증 환자의 복강액에서의 NK 세포독성이 역전될 수 있음을 보였다. 문헌[Wang et al.(PLoS One, 2013 Oct 7; 8(10): e75788)에서는 지지 데이터 제공 없이 암 치료법에서 IL-6/STAT3 경로의 표적화가 추측되었다. IL-6이 특정 골수종 세포주 상에서 PD-L1 발현을 상향 조절하는 역할을 하는 것이 또한 앞서 밝혀졌다(Tamura et al., Leukemia, 2013 Feb;27(2):464-72). 이와는 별도로, 다른 문헌은 IL-6 길항제가 종양 조절을 감소시켰다고 보고하고 있다(Idorn et al. Cancer Immunol Immunother. 2017 May;66(5):667-671).
이러한 NK 세포를 사용하고, 일반적으로 NK 세포를 사용하는 대안적이고 바람직하게 개선된 암 치료법에 대한 요구가 존재한다.
본 발명의 목적은 NK 세포에만 의존하는 요법보다 효과가 더 큰, 예를 들어 세포독성이 더 큰 NK 세포 및 NK 세포주를 사용하는 병용 요법을 제공하는 것이다. 더 구체적인 실시양태는 확인된 암, 예를 들어 백혈병과 같은 혈액암에 대한 치료법을 제공하는 것을 목표로 한다.
본원에서는 NK 세포와 병용하여 IL-6에 대한 길항제를 사용하는 암의 치료 방법을 제공한다. 세포는 환자의 것일 수 있으며, 이 경우 중재는 길항제를 투여하는 단계를 포함할 수 있으며, 따라서 환자의 이미 존재하는 NK 세포에 의존한다. 세포는 치료법의 일부로서 투여될 수 있으며, 이 경우 자가의 동종이형 1차 세포 또는 세포주 등일 수 있다. 이들 치료법을 합쳐서 NK 세포 및 길항제 모두가 필요하다는 점에서 병용법으로 지칭된다.
본 발명은 길항제를 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법으로서, 길항제 및 세포를 투여하는 단계 및 세포(예를 들어 관련된 치료법의 일부로서, 항체가 별도로 존재함)를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 암 치료에 사용하기 위한 조합물을 제공한다. 또한, 본 발명은 세포 및 길항제 모두를 포함하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 IL-6 수용체의 발현이 감소하거나 결핍되도록 변형된 NK 세포를 제공한다.
잘환, 특히 본원에 기재된 NK 세포를 사용하여 본 발명에 따라 치료 가능한 질환은 암, 예를 들어 혈액암, 예를 들어, 백혈병, 특히 급성 골수성 백혈병 및 골수종을 포함한다. 특히 인간의 종양과 암이 치료될 수 있다. 본원에서 종양에 관한 언급은 신생물에 관한 언급을 포함한다.
따라서, 본 발명은 병용 요법에서 자연 살해(NK) 세포 또는 NK 세포주를 사용한다. 아래에서 상세히 기재되는 바와 같이, NK 세포 및 NK 세포주는 또한 이러한 치료법에서 암에 대한 세포독성 활성을 증가시키도록 유전자 변형될 수 있다. 1차 NK 세포와 NK 세포주를 모두 합쳐 NK 세포라고 지칭한다(문맥상 달리 요구하지 않는 한). 본원에 기재된 NK 세포는 또한 IL-6 신호전달의 길항제를 단독으로 또는 NK 세포와 병용한다.
따라서, 본 발명은 그 중에서도 암 치료에 사용하기 위한 IL-6 길항제와 병용된 자연 살해(NK) 세포 또는 세포주를 제공한다. 암은 IL-6 수용체를 적절하게 발현하고/거나 하나 이상의 체크포인트 억제 수용체 리간드, 예를 들어, PDL-1 및/또는 PDL-2를 발현한다.
유사하게, 본 발명은 유효량의 NK 세포와 IL-6 길항체의 조합물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다. 또한, 암은 IL-6 수용체를 적절하게 발현하고/거나 하나 이상의 체크포인트 억제 수용체 리간드, 예를 들어, PDL-1 및/또는 PDL-2를 발현한다.
NK 세포 또는 세포주에는 경우에 따라 사전 결합된 IL-6 길항제가 제공된다. 길항제 및 세포는 또한 사전 결합되지 않고, 단일 제제 또는 별도의 제제로 제공될 수 있다.
이 병용 요법은 또한 면역 이펙터 세포로서 내인성 NK 세포를 사용하는 것과 같은 다른 별개의 항암 치료법의 보조로서 사용될 수 있다. 따라서, 항체 의존 세포 매개 세포독성(ADCC)을 포함하는 암 치료법은 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 보완될 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 NK 세포 또는 세포주는 IL-6 수용체의 발현이 감소하도록 유전자 변형될 수 있다. 이와 별도로, NK 세포주는 하기 실시예에서 사용되는 바와 같이 공지된 계열, 예를 들어, NK-92, 또는 KHYG-1로부터 선택될 수 있다. 세포 또는 세포주는 세포 표면 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준의 발현을 나타낼 수 있다. E-셀렉틴 리간드 발현은 HECA-452 항체를 사용하여 결정된다. 특정 실시양태에서, NK 세포 또는 세포주는 E-셀렉틴 리간드의 높은 수준의 세포 표면 발현을 나타낸다. 바람직하게는, E-셀렉틴 리간드의 높은 수준의 세포 표면 발현은 아이소형 대조군 항체 결합과 비교하여 HECA-452 항체 결합에서 적어도 2, 4, 6, 8 또는 10배 증가로 나타난다. 이 발현은 예를 들어 유세포 분석법으로 측정될 수 있다. KHYG-1 세포주는 NK-92 세포와 같이, 다른 NK 세포주와 비교하여 높은 수준의 HECA-452 항원을 발현하는 그러한 한 세포주이다. 높은 수준의 E-셀렉틴 리간드를 발현하도록 세포를 변형시키는 다른 방법은 예를 들어, 1) GDP-푸코오스 기질 및 알파 1,3 푸코실 트랜스퍼라제-VI 효소에 의한 화학적 처리; 2) FUT6 또는 FUT7의 발현 또는 과발현을 포함한다. 또한, 세포주는 TRAIL 수용체, 예를 들어 DR4 또는 DR5의 낮은 수준의 세포 표면 발현을 나타낼 수 있다. 예를 들어, KHYG-1 세포주는 NK-92 세포에 비해 낮은 수준의 DR4 또는 DR5를 발현한다. 세포 표면 TRAIL 수용체 발현은 예를 들어 실시예에 상술한 바와 같이 유세포 분석법을 사용하여 정량될 수 있다.
또한, 본원에서 NK 세포가 환자에 이미 존재하는 치료법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 암 치료에 사용하기 위한 IL-6 길항제로서, 암의 세포는 IL-6 수용체를 발현하는 것인 IL-6 길항제, 그리고 유효량의 IL-6 길항제를 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다.
실시예에서 보다 상세하게 기재되는 바와 같이, 조합물은 시험관 내 암 모델, 특히 암이 IL-6 수용체를 발현하는 암 모델에서 효과적이라는 것이 밝혀졌다. 예를 들어, 치료에 반응하여 또는 치료 과정에서, 하나 이상의 체크포인트 억제 수용체 리간드를 발현하는 암이 본 발명에 의해 치료될 수 있음이 또한 주목된다. 구체적인 실시예에서, PDL-1 및/또는 PDL-2가 본 발명의 조합물을 사용하여 치료된 암에 의해 발현되었다.
또한, 본 발명은 NK 세포 또는 세포주 및 IL-6 길항제를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물에서, 세포는 본원의 다른 곳에서 기재된 하나 이상 또는 모든 변형에 따라 경우에 따라 변형된다.
본 발명을 수행함에 있어, IL-6의 길항제는 IL-6 신호전달을 차단함으로써 작용하여 IL-6 활성을 억제한다.
본 발명에서 유용한 IL-6 길항제의 예로는 적합하게는 하기에 정의된 바와 같은 항체가 포함된다. 이들은 예를 들어, IL-6 항체, IL-6R 항체 및 gp130 항체가 포함한다. 이들 항체는 IL-6, IL-6R 또는 gp130에 결합하여 IL-6과 IL-6R, 또는 IL-6R과 gp130 사이의 결합을 억제한다.
따라서 항체는 IL-6 신호전달을 차단하고 IL-6 활성을 억제하여 NK 세포 및/또는 표적(암) 세포에서 IL-6 신호전달을 감소시킨다.
그러므로 유용한 항체는 IL-6 신호뿐만 아니라 NK 세포/표적에 대해 하류 효과를 감소시키거나 중지시킨다. 본 발명의 특정 실시양태의 특징은 NK 세포에 대한 직접적인 IL-6 작용을 차단하는 데 있어 첫 번째 효과(그렇지 않으면 IL-6은 NK 활성을 감소시킬 것임)뿐만 아니라 표적(암) 세포에 대한 IL-6 작용의 효과를 차단하는 데 있어 두 번째 효과가 있다는 것이다. 그렇지 않으면 IL-6은 NK 세포의 세포독성 활성을 약화시키는 표적에서의 반응을 향상시키거나 촉진할 것이다. 구체적으로, 표적 세포에 대한 IL-6 작용을 차단하는 것은 표적 상에 체크포인트 억제 수용체 리간드의 발현을 방지하는 것으로 나타났으며, 따라서 표적은 NK 세포의 세포독성에 더 취약하다.
본 발명의 병용 요법에 사용하기에 적합한 IL-6 항체의 예는 실툭시맙(FDA 승인된 항체), 올로키주맙(CDP6038), 엘실리모맙, BMS-945429(클라자키주맙/ALD518), MH-166 및 시루쿠맙(CNTO 136)을 포함한다. IL-6R 항체의 예로는 토실리주맙(FDA 승인 항체), 사릴루맙, PM-1 및 AUK12-20이 포함된다. gp130 항체의 예는 AM64이다.
본 발명의 병용 요법에서 사용하기에 적합한 IL-6 길항제는 mAb 1339(OP-R003), PF-04236921, MEDI 5117, C326(AMG-220), 6a, sgp130Fc(FE301), ALX-0061, NRI, SANT-7, ERBF, ERBA, MDL-A, SC144, 랄록시펜(케옥시펜(Keoxifene)/LY156758/에비스타(Evista)), 바제독시펜(비비안트(viviant)) 및 LMT-28을 포함한다.
단클론 항체는, 예를 들어, IL-6, IL-6R 또는 gp130을 면역화를 위한 감작 항원으로 사용하여 통상적인 기술을 통해 제조된다.
IL-6R에 특이적인 항체는 존재하는 2가지 유형의 IL-6R, 즉 막 결합 IL-6 및 세포막으로부터 분리된 가용성 IL-6R(sIL-6R) 중 하나 또는 모두에 결합할 수 있다. sIL-6R은 세포막에 부착된 IL-6R의 세포 외 도메인으로 주로 이루어지며, 이는 막 횡단 도메인 및/또는 세포 내 도메인이 결여된 점에서 막 결합 IL-6R과 상이하다.
IL-6, IL-6R 또는 gp130에 특이적인 항체는 본 발명의 NK 세포 또는 NK 세포주와 별도로 또는 동시에 투여될 수 있다. NK 세포와 NK 세포주의 최적의 약물 동태학은 항체의 최적의 약물 동태학과 상이할 수 있으므로, NK 세포와 NK 세포주는 IL-6, IL-6R 또는 gp130 항체와는 상이한 일정으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 매주 투여될 수 있는 한편, NK 세포 및 세포주는 주 2회 투여될 수 있다. 또 다른 예는 본 발명의 항체는 2주 마다 투여될 수 있는 한편, NK 세포 및 세포주는 매주 투여될 수 있다는 것이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 달리 명시하지 않는 한, 용어 "항체"는 항체의 항원 결합 단편, 즉 전장의 항체에 의해 결합된 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편, 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역을 보유하는 단편을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자, 예를 들어 단쇄 가변 영역 단편(scFv), 나노바디 및 별개의 특이성을 갖는 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체, 예를 들어 이중 특이적 항체를 포함한다. 바람직하게는, 항체는 항체에 대한 개체의 면역 반응을 감소시키는 방식으로 인간화된다. 예를 들어, 항체는 키메라 항체, 예를 들어 인간 불변 영역을 갖는 비인간 가변 영역, 또는 CDR 이식된 항체, 예를 들어 인간 불변 영역 및 가변 영역 골격 서열을 갖는 비인간 CDR 영역일 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발견 내용은 NK 세포에 대한 활성 이외에, 암세포에서의 IL-6 신호전달이 암세포 막 상에 체크포인트 억제 수용체(cIR) 리간드를 상향 조절함으로써 NK 세포의 세포독성을 간접적으로 억제하며, IL-6 신호전달의 이러한 다른 효과가 또한 방지되거나 감소될 수 있다는 것이다. 이들 cIR 리간드는 NK 세포 상 cIR에 결합하고 NK 세포의 세포독성을 약화시킨다.
IL-6R 발현 암에 의해 발현되는 체크포인트 억제 수용체 리간드는 cIR CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT 및 TIM-3에 대한 리간드를 포함한다.
본 발명에 따른 IL-6 길항제는 환자에게 유효량으로 단독 투여될 수 있다. IL-6 길항제는 암세포 및 내인성 NK 세포에서 IL-6 신호전달을 방지할 수 있다. NK 세포의 세포독성에 대한 IL-6의 억제 효과는 NK 세포에서의 신호전달을 통해 직접적으로, 암세포에서의 신호전달을 통해 간접적으로 IL-6 길항제에 의해 방지된다.
따라서, 본 발명은 암, 예를 들어 IL-6R을 발현하는 암을 치료하는데 사용하기 위한 IL-6 길항제를 제공한다. 치료되는 암은 고형 조직 종양, 예를 들어, 간세포 암종을 포함하는 간 종양; 폐 종양; 비소세포 폐암; 췌장 선암종 또는 췌장의 선포 세포 암종을 포함하는 췌장 종양; 결장암, 위암, 신세포 암종(RCC: renal cell carcinoma) 및 이행 세포 암종(TCC(transitional cell carcinoma), 요로 상피세포 암종으로도 알려짐)을 포함한 신장암; 난소암; 전립선암; 유방암; 또는 자궁 경부암일 수 있다. 치료되는 암은 바람직하게는 백혈병, 골수종 및 림프종을 포함하는 혈액암(blood cancer)으로도 지칭되는 혈액암(hematological cancer)이다. 더 바람직하게는, 치료되는 암은 급성 림프구성 백혈병(ALL: acute lymphocytic leukemia), 급성 골수성 백혈병(AML: acute myeloid leukemia), 만성 림프구성 백혈병(CLL: chronic lymphocytic leukemia), 만성 골수성 백혈병(CML: chronic myeloid leukemia), 모양 세포성 백혈병, T 세포 전림프구성 백혈병, 거대 과립 림프구성 백혈병, 호지킨 림프종, T 세포 림프종 및 B 세포 림프종을 포함하는 비호지킨 림프종, 무증상 골수종, 무증상 다발성 골수종(SMM: smoldering multiple myeloma), 다발성 골수종(MM: multiple myeloma) 또는 경쇄 골수종으로부터 선택된다.
본 발명의 병용 요법은 일반적으로 자가 세포 또는 동종이형 세포 또는 특정 계열, 예를 들어 NK92 또는 KHYG-1 또는 기타를 포함하나 이에 제한되지는 않는 NK 세포로 수행될 수 있다. 아래의 구체적인 실시예는 단지 예시적인 목적으로, 선택된 NK 세포를 이용한다. 치료법은 지금 기재된 바와 같이 변형된 NK 세포를 이용할 수 있다.
상기 변형된 세포의 첫 번째 실시예에서, 체크포인트 억제 수용체(cIR) 기능이 감소하거나 없는 NK 세포가 제공/사용된다. 따라서 아래의 실시예에서, 하나 이상의 cIR 유전자가 녹아웃된 NK 세포가 생산된다. 바람직하게는, 이들 수용체는 특이적 cIR이다. 바람직하게는, 이들 체크포인트 억제 수용체는 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT 및/또는 TIM-3 중 하나 이상 또는 전부이다.
하나 이상의 억제 수용체 신호전달 경로가 녹아웃되거나 감소한 기능을 나타내며, 그 결과 다시 억제 수용체 기능이 감소하거나 없는 NK 세포를 또한 제공/사용한다. 예를 들어, SHP-1, SHP-2 및/또는 SHIP에 의해 매개되는 신호전달 경로는 세포의 유전자 변형에 의해 녹아웃된다.
결과로 얻은 NK 세포는 향상된 세포독성을 나타내므로, 암 치료법, 특히 혈액암 치료법, 특히 백혈병 및 다발성 골수종의 치료에서 훨씬 더 유용하다.
한 실시양태에서, 유전자 변형은 세포가 NK 세포로 분화되기 전에 일어난다. 예를 들어, 다기능성 줄기세포(pluripotent stem cell)(예를 들어, iPSC)는 하나 이상의 체크포인트 억제 수용체를 발현하는 능력을 상실하도록 유전자 변형될 수 있다. 그런 후, 변형된 iPSC는 분화되어 세포독성이 증가한 유전자 변형된 NK 세포를 생산한다.
NK 세포 활성화 후 체크포인트 억제 수용체가 발현되기 때문에, 다른 억제 수용체보다 체크포인트 억제 수용체의 기능을 감소시키는 것이 바람직하다. 대부분의 KIR 부류, NKG2A 및 LIR-2와 같은 정상 또는 '고전적' 억제 수용체는 MHC I에 결합하기 때문에 주로 자가 표적화의 문제를 줄이는데 관여한다. 따라서, 체크포인트 억제 수용체가 녹아웃되는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 이러한 수용체의 기능이 감소하거나 결여됨으로써 암세포가 면역 이펙터 기능(그 외 수용체가 완전히 기능을 할 경우 발생할 수 있음)을 억제하는 것을 방지한다. 따라서, 본 발명의 이러한 실시양태의 핵심 이점은 암세포에 의한 세포독성 활성의 억제에 덜 민감한 NK 세포에 있으며; 결과적으로 암 치료에 유용하다.
본원에 사용되는 바와 같이, 억제 수용체에 대한 언급은 일반적으로 면역 이펙터 세포, 예를 들어, NK 세포의 원형질막 상에 발현되는 수용체로서, 세포 내 신호를 야기하는 그의 상보적 리간드에의 결합이 상기 면역 이펙터 세포의 세포독성을 감소시키는 원인이 되는 수용체를 지칭한다. 이러한 억제 수용체는 면역 이펙터 세포의 '휴지' 및 '활성화' 상태 모두에서 발현되며 종종 면역계에 신체의 세포 및 조직에 대한 세포독성 반응을 억제하는 '자기 관용(self-tolerance)' 기전을 제공하는 것과 관련된다. 한 예로는 NK 세포 상에 발현되고 신체의 건강한 세포 상에 발현되는 MHC I형을 인식하는 억제 수용체 부류 'KIR'이다.
또한, 본원에서 사용되는 바와 같이, 체크포인트 억제 수용체는 일반적으로 상기 억제 수용체의 부분집합으로서 간주한다. 그러나 다른 억제 수용체와는 달리, 체크포인트 억제 수용체는 면역 이펙터 세포, 예를 들어 NK 세포의 장기적인 활성화 및 세포독성에서 더 높은 수준으로 발현된다. 이 현상은 예를 들어 염증 부위에서 만성 세포독성을 약화시키는데 유용하다. 예로는 체크포인트 억제 수용체 PD-1, CTLA-4 및 CD96이 포함되며, 이들 모두는 NK 세포 상에 발현된다.
따라서, 본 발명은 또한 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT 및 TIM-3으로부터 선택된 체크포인트 억제 수용체를 코딩하는 유전자가 결여된 NK 세포를 사용할 수 있다. 특정 실시양태에서, NK 세포 또는 세포주는 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT 및 TIM-3 중 2가지 이상이 결여된다. 특정 실시양태에서, NK 세포 또는 세포주는 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD279(PD-1), 또는 CD328(SIGLEC7) 중 2가지 이상이 결여된다. 특정 실시양태에서, NK 세포 또는 세포주는 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD279(PD-1), 또는 CD328(SIGLEC7) 중 3가지 이상이 결여된다. 특정 실시양태에서, NK 세포 또는 세포주는 CD96(TACTILE) 및 CD328(SIGLEC7)이 결여된다.
다르게는, NK 세포는 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT 및 TIM-3으로부터 선택된 체크포인트 억제 수용체의 발현 감소를 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, NK 세포 또는 세포주는 D96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT 및 TIM-3 중 2가지 이상의 발현 감소를 나타낸다. 특정 실시양태에서, NK 세포 또는 세포주는 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD279(PD-1), 또는 CD328(SIGLEC7)) 중 2가지 이상의 발현 감소를 나타낸다. 특정 실시양태에서, NK 세포 또는 세포주는 D96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD279(PD-1), 또는 CD328(SIGLEC7) 중 3가지 이상의 발현 감소를 나타낸다. 특정 실시양태에서, NK 세포 또는 세포주는 CD96(TACTILE) 및 CD328(SIGLEC7)의 발현 감소를 나타낸다. NK 세포는 예를 들어 siRNA, shRNA 구조물(플라스미드 또는 바이러스 벡터), 또는 안티센스 기술을 사용하여 체크포인트 억제 수용체의 발현을 감소시키도록 변형될 수 있다.
유전자가 결여된 NK 세포는 기능적 유전자 산물이 결과적으로 발현되지 않게 하는 완전 또는 부분 결실, 돌연변이 또는 기타를 의미할 수 있다. 실시양태에서, NK 세포는 2가지 이상의 억제 수용체를 코딩하는 유전자가 결여된다.
더 구체적인 양태는 D96(TACTILE), CD152(CTLA4) 및 CD279(PD-1)로부터 선택되는 체크포인트 억제 수용체를 코딩하는 유전자가 결여된 NK 세포를 포함한다. 이하에서 더 상세히 설명되는 특정 실시양태는 KHYG-1의 유도체인 NK 세포를 포함한다.
하기 기재된 실시예에서, 본 발명자는 KHYG-1 세포에서 체크포인트 억제 수용체 CD96의 발현을 녹아웃하는 siRNA를 사용하여 세포독성 효과를 확실하게 보였다. CD96 녹아웃(KD: knockdown) KHYG-1 세포는 다양한 이펙터:표적(E:T) 비율에서 백혈병 세포에 대해 상승된 세포독성을 보였다.
다른 실시양태에서, TRAIL 리간드 또는 바람직하게는 돌연변이(변이) TRAIL 리간드를 발현하는 변형된 NK 세포를 제공/사용한다. 따라서, 하기 실시예에서 추가로 기재되는 바와 같이, NK 세포의 세포독성을 상승시키는 변형은 또한 TRAIL 리간드 및/또는 돌연변이된 TRAIL 리간드 변이체 모두의 발현 증가를 포함한다.
결과로 생성된 NK 세포는 TRAIL 수용체와의 결합 증가를 나타내며, 결과적으로 암, 특히 혈액암, 특히 백혈병에 대한 세포독성의 증가를 나타낸다.
돌연변이체/변이체는 바람직하게는 야생형 TRAIL의 유인(decoy) 수용체와의 결합과 비교하여, '유인' 수용체에 대해 친화도가 더 낮다(또는 실제로 친화력이 없다). 이러한 유인 수용체는 TRAIL 리간드에 결합하지만 세포 사멸을 개시하는 능력을 보이지 않으며, 경우에 따라, 사멸 신호전달 경로에 길항하는 역할을 하는 TRAIL 수용체의 부류를 나타낸다. 돌연변이/변이 TRAIL 리간드는 WO 2009/077857호에 따라 제조될 수 있다.
돌연변이체/변이체는 별도로 TRAIL 수용체, 예를 들어 DR4 및 DR5에 대해 친화도가 증가할 수 있다. 야생형 TRAIL은 전형적으로 DR4에 대해 > 2nM, DR5에 대해 > 5nM, 및 유인 수용체 DcR1에 대해 > 20nM의 KD(WO 2009/077857호; 표면 플라스몬 공명에 의해 측정됨), 또는 DR4에 대해 약 50 내지 100 nM, DR5에 대해 1 내지 10 nM, DcR1에 대해 175 내지 225 nM(Truneh, A. et al. 2000; 등온 적정 열량계 및 ELISA로 측정됨)의 KD를 갖는 것으로 공지되어 있다. 따라서, DR4에 대해 증가한 친화도는 적합하게는 각각 < 2 nM 또는 < 50 nM의 KD로서 정의되는 한편, DR5에 대해 증가한 친화도는 적합하게는 각각 < 5 nM 또는 < 1 nM의 KD로서 정의된다. 유인 수용체 DcR1에 대해 감소한 친화력은 적절하게는 각각 > 50 nM 또는 > 225 nM의 KD로서 정의된다. 어떤 경우에는, TRAIL 변이체/돌연변이체가 나타내는 친화도의 증가 또는 감소는 야생형 TRAIL이 나타내는 기준 친화도와 관련이 있다. 친화도는 바람직하게는 야생형 TRAIL에 의해 나타나는 것과 비교하여 적어도 10%, 더 바람직하게는 적어도 25%, 적어도 50% 또는 100% 증가한다.
TRAIL 변이체는 바람직하게는 DR4, DcR1 및 DcR2에 대한 그의 친화도와 비교하여 DR5에 대한 증가한 친화도를 갖는다. 바람직하게는, 친화도는 DR4, DcR1 및 DcR2 중 하나 이상에 대해보다 DR5에 대해 적어도 1.5배, 2배, 5배, 10배, 100배 또는 심지어는 1000배 이상이다. 더 바람직하게는, 친화도는 DR4, DcR1 및 DcR2 중 적어도 둘, 바람직하게는 모두에 대해보다 DR5에 대해 적어도 1.5배, 2배, 5배, 10배, 100배 또는 심지어는 1000배 이상 크다.
본 발명의 이들 실시양태의 주요 이점은 암세포를 살해하는데 더 큰 효능을 갖는 NK 세포에 있다.
병용 요법은 암에 대한 효과가 더욱 향상될 가능성을 제공한다.
추가의 특정 실시양태는 TRAIL 유인 수용체에 대한 친화도가 감소하거나 없는 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현하는 NK 세포를 포함/사용한다. 바람직하게는, 이 NK 세포는 KHYG-1의 유도체이다. 추가의 특정 실시양태는 TRAIL 유인 수용체에 대해 친화도가 감소하거나 없고 DR4 및/또는 DR5에 대해 친화도가 증가한 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현하는 NK 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, TRAIL 수용체 변이체는 인간 TRAIL, D269H 및 E195R의 2가지 아미노산 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, TRAIL 수용체 변이체는 인간 TRAIL, G131R, N199R, 및 K201H의 3가지 아미노산 돌연변이를 포함한다.
하기에서보다 상세하게 설명되는 본 발명의 실시예에서, NK 세포는 돌연변이 TRAIL을 발현하도록 유전자 변형되었다. 변형된 KHYG-1 세포는 돌연변이 TRAIL을 발현하였고, NK-92는 돌연변이 TRAIL을 발현하였다. 변형된 KHYG-1 세포는 시험관 내에서 암세포주에 대해 향상된 세포독성을 나타내었다. KHYG-1 세포는 TRAIL 수용체(예를 들어, DR4 및 DR5)를 낮은 수준이지만 발현한다. 변형된 NK 세포의 다른 바람직한 실시양태는 TRAIL 수용체를 전혀 또는 실질적으로 발현하지 않거나, 단지 낮은 수준으로만 - 변형된 NK 세포의 생존도가 돌연변이 TRAIL의 발현에 의해 부정적인 영향을 받지 않도록 충분히 낮은 수준으로 발현한다.
선택적인 실시양태에서, TRAIL 또는 TRAIL 변이체를 발현하는 변형된 NK 세포를 사용한 암 치료는 암세포 상의 TRAIL 사멸 수용체의 발현을 상향조절할 수 있는 제제를 환자에게 투여함으로써 향상된다. 이 제제는 변형된 NK 세포의 투여 전에, 투여와 함께 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 그러나 상기 제제는 변형된 NK 세포를 투여하기 전에 투여하는 것이 바람직하다.
바람직한 실시양태에서, 상기 제제는 암세포 상에 DR5의 발현을 상향 조절한다. 상기 제제는 경우에 따라 화학 치료제, 예를 들어 보르테조밉일 수 있으며, 암에서 DR5 발현을 조절할 수 있는 낮은 용량으로 투여된다.
본 발명은 DR5 발현을 상향 조절할 수 있는 임의의 특정 제제로 제한되지 않지만, DR5 유도제의 예로는 보르테조밉, 제피티닙, 파이퍼롱구민, 독소루비신, 알파-토코페릴 숙시네이트 및 HDAC 억제제가 포함된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 돌연변이체/변이체 TRAIL 리간드는 하나 이상의 NK 세포 보조 자극 도메인, 예를 들어, 41BB/CD137, CD3제타/CD247, DAP12 또는 DAP10에 결합된다. 따라서, 표적 세포 상의 이의 수용체와 변이체의 결합은 표적 세포 내에서 아폽토시스 신호를 촉진할 뿐 아니라 NK 세포 내에서 세포독성 신호를 자극한다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에 따르면, 이러한 각각의 NK 세포 변형과 관련하여 상기에 더 상세히 기재된 바와 같이, 체크포인트 억제 수용체 기능이 감소하고 돌연변이 TRAIL 리간드를 또한 발현하는 NK 세포가 제공 및/또는 사용된다. 더욱더 바람직한 실시양태에서, TRAIL 유인 수용체에 대해 친화도가 감소하거나 없고 KHYG-1의 유도체일 수 있는 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현하는 NK 세포는 추가로 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT 및 TIM-3으로부터 선택된 체크포인트 억제 수용체를 코딩하는 유전자가 결여된다. .
또한, 본 발명은 하나 이상의 CAR을 발현하도록 변형된 NK 세포 및 NK 세포주, 바람직하게는 KHYG-1 세포 및 이의 유도체를 제공 및/또는 사용한다. 일반적으로, CAR은 CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, Her2/Neu, 표피 성장 인자 수용체(EGFR: epidermal growth factor receptor), CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, EpCAM, MUC1, MUC16, Tn 항원, NEU5GC, NeuGcGM3, GD2, CLL-1, HERV-K와 같은 암 관련 항원에 특이적으로 결합한다. 또한, CD38, CD319/SLAMF-7, TNFRSF17/BCMA, SYND1/CD138, CD229, CD47, CD123/IL3-RA, CD19, CD20, CD22, GD2, CLL-1, HERV-K와 같은 혈액암 항원에 특이적으로 결합하는 CAR이 고려된다.
암 치료법 사용에 적합하게는, CAR은 암세포 상의 하나 이상의 리간드, 예를 들어, 골수종 세포 상의 CS1(SLAMF7)에 특이적으로 결합한다. 특정 암, 예를 들어. 다발성 골수종 치료에 사용하기 위해, CAR은 CD38에 결합할 수 있다. 예를 들어, CAR은 예를 들어, 공지된 단클론 항체인 다라투무맙의 것으로부터 유래하거나, 이와 유사하거나 동일한 가변 영역의 결합 특성을 포함할 수 있다. 이러한 NK 세포는 혈관 신생을 억제하는 제제, 예를 들어 레날리도미드와 병용하여 암 치료법에 사용될 수 있다. 암, 특히 백혈병 및 AML의 치료법에 사용하기 위해, 특히 CAR은 CLL-1에 결합할 수 있다.
CAR-NK는 친화도가 2가지 상이한 리간드/항원에 대한 것으로 이중 특이적일 수 있다. 이중 특이적 CAR-NK는 암세포 상의 가능한 결합 부위의 수를 증가시키거나, 다르게는 NK-CAR에 특이적인 리간드를 발현하는 다른 면역 이펙터 세포에 암세포를 국소화하는데 사용될 수 있다. 암 치료법에 사용하기 위해, 이중 특이적 CAR은 표적 종양 세포 및 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포, NK 세포 또는 대식 세포에 결합할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 다발성 골수종 경우, 이중 특이적 CAR은 T 세포 항원(예를 들어, CD3 등) 및 종양 세포 마커(예를 들어, CD38 등)에 결합할 수 있다. 이중 특이적 CAR은 2가지의 별개의 종양 세포 마커에 선택적으로 결합할 수 있으며, 이는 표적 종양 세포에 대한 NK 세포의 전체 결합 친화도를 증가시킨다. 이는 표적 항원 중 하나를 하향조절함으로써 암세포가 내성을 발생할 위험을 감소시킬 수 있다. 이 경우의 예는 다발성 골수종에서 CD38과 CS-1/SLAMF7 모두에 대한 CAR 결합일 것이다. CAR에 의해 적절하게 표적화되는 또 다른 종양 세포 마커는 CD47에 의해 예시되는 종양 상 "나를 먹지마(don't eat me)" 유형 마커이다.
본 발명의 선택적인 특징은, 예를 들어, (아형 및 유도체를 포함하여 CD16, CD32 또는 CD64일 수 있는) Fc 수용체가 세포의 표면상에 발현되는 상기 기재된 NK 세포 및 NK 세포주에 대해 추가의 변형을 제공하는 단계를 포함한다. 사용시, 이러한 세포는 항체가 코팅된 암세포의 인식을 증가시키고 세포독성 반응의 활성화를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 선택적인 특징은 변형된 NK 세포 및 NK 세포주를 신체의 특정 표적 부위로 더 잘 유도되도록 조정하는 단계를 포함한다. 본 발명의 NK 세포는 특정 암세포 위치에 표적화될 수 있다. 혈액암 치료에 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 NK 이펙터는 골수로 유도되도록 조정된다. 특정 NK 세포는 골수로 유도되도록 푸코실화 및/또는 시알릴화에 의해 변형된다. 이는 적절한 푸코실트랜스퍼라제 및/또는 시알릴트랜스퍼라제를 각각 발현하도록 NK 세포를 유전자 변형시킴으로써 달성될 수 있다. 종양 부위로 NK 이펙터 세포의 유도 증가는 또한 암 혈관을 통한 NK 세포 침윤을 정상화하도록 종양 혈관계의 파괴에 의해, 예를 들어 메트로놈 화학요법(metronomic chemotherapy)에 의해, 또는 혈관 신생을 표적화하는 약물을 사용함(Melero et al, 2014)으로써 가능해질 수 있다.
본 발명의 또 다른 선택적인 특징은 배양시 신속한 성장 및 증식을 위해 내재적 능력이 증가된 변형된 NK 세포 및 NK 세포주를 제공/사용하는 것이다. 이는 예를 들어, 성장 유도성 사이토카인 IL-2 및 IL-15를 과발현하도록 세포를 트랜스펙션시킴으로써 달성될 수 있다. 또한, 이러한 선택적인 변경은 연속적으로 성장 배지에 사이토카인을 보충하는 것에 대한 비용 효율적인 대안을 제공한다.
본 발명은 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주를 제조하는 방법으로서, 세포독성을 증가시키기 위해서 본원에 기재된 바와 같이 세포 또는 세포주를 유전자 변형시키는 단계를 포함하는 방법을 추가로 제공/사용한다. 이 유전자 변형은 예를 들어, CRISPR에 의한, 유전자의 안정적인 녹다운, 또는 예를 들어, siRNA에 의한, 유전자의 일시적인 녹다운일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 예를 들어, 세포독성이 증가한 새로운 NK 세포주, 예를 들어, KHYG-1 세포의 유도체를 제공하기 위해서 안정한 유전자 변형 기술, 예를 들어, CRISPR가 사용된다.
실시양태에서, 상기 방법은 억제 수용체 기능을 감소시키도록 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주를 제조하기 위한 것이다. 바람직하게는, 이들 억제 수용체는 체크포인트 억제 수용체이다.
더 구체적인 실시양태는 억제 수용체 기능이 감소한 NK 세포 또는 NK 세포의 제조 방법으로서, 체크포인트 억제 수용체는 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT 및 TIM-3으로부터 선택되는 것인 방법을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 2가지 이상의 억제 수용체의 기능을 감소시키도록 NK 세포를 변형시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주의 제조 방법으로서, TRAIL 리간드 또는 돌연변이 TRAIL(변이) 리간드를 발현하도록 세포 또는 세포주를 유전자 변형시키는 단계를 포함하는 방법을 제공/사용한다.
실시양태에서, 상기 방법은 TRAIL 수용체에 대해 친화도가 증가한 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현하도록 NK 세포 또는 NK 세포주를 변형시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, TRAIL 수용체는 DR4 및/또는 DR5이다. 바람직한 실시양태는 유인 TRAIL 수용체에 대해 친화도가 감소한 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현하도록 NK 세포 또는 NK 세포주를 변형시키는 방법을 제공한다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 체크포인트 억제 수용체의 기능을 제거하고, 또한 유인 TRAIL 수용체에 대해 결합 친화도가 감소하거나 없는 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현하도록 NK 세포 또는 NK 세포주를 변형시키는 단계를 포함한다.
추가의 전형적인 실시양태는 하나 이상의 체크포인트 억제 수용체의 기능이 제거되고/거나 유인 TRAIL 수용체에 대해 결합 친화도가 감소하거나 없는 돌연변이 TRAIL 리간드가 발현되며, 세포는 CAR 또는 이중 특이적 CAR을 발현하도록 추가로 변형된 NK 세포 또는 NK 세포주의 제조 방법을 제공한다. CAR의 특성은 경우에 따라 상기에 기재한 바와 같다.
실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 체크포인트 억제 수용체의 기능이 제거되고/거나 유인 TRAIL 수용체에 대해 결합 친화도가 감소하거나 없는 돌연변이 TRAIL 리간드가 발현되며, 세포는 경우에 따라 CAR 또는 이중 특이적 CAR을 발현하도록 추가로 변형되고, 세포는 하나 이상의 Fc 수용체를 발현하도록 추가로 변형되는 NK 세포 또는 NK 세포주를 제조하는 단계를 포함한다. 적합한 Fc 수용체는 CD16(FcRIII), CD32(FcRII) 및 CD64(FcRI)로부터 선택된다.
상기 모든 바람직한 양태는 KHYG-1의 유도체인 NK 세포 및 NK 세포주의 제조 방법을 포함한다.
본 발명의 목적에 따라, 세포독성이 증가한 변형된 NK 세포, NK 세포주 또는 이의 조성물은 환자의 암, 특히 혈액암을 치료하는데 사용하기 위한 것이다.
더욱더 바람직한 양태에서, 본 발명은 KHYG-1 세포에서 체크포인트 억제 수용체 기능을 감소시킴으로써 또는 KHYG-1 세포에서 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현시킴으로써, 또는 이들 모두를 수행함으로써 KYHG-1 유도체로서 수득한, 혈액암 치료에 사용하기 위한 NK 세포주이다
본원의 상기 및 하기에 기재된 변형된 NK 세포, NK 세포주 및 이의 조성물은 암, 특히 인간의 암 치료에, 예를 들어 혈액 세포 암 또는 고형암의 치료에 적합하다. NK 세포 및 유도체는 바람직하게는 인간 NK 세포이다. 인간 치료법을 위해, 인간 NK 세포가 바람직하게 사용된다.
본 발명은 또한 IL-6R 기능이 감소하거나 없는 NK 세포 그 자체, 예를 들어 IL-6 수용체 기능이 결여된 유전자 변형된 NK 세포를 제공한다. 또한, 본 발명의 NK 세포는 하나 이상의 cIR의 기능이 감소하거나 없거나, 돌연변이 TRAIL을 발현하거나, 이들 3가지 변형 모두를 갖도록 본원에 기재된 바와 같이 변형될 수 있다.
당업자는 활성제 및 이들의 조합물을 필요로 하는 환자에게 전달하기 위한 다양한 투여 경로를 알 것이다. 본 발명의 실시양태는 혈액암 치료를 위한 것이다. 변형된 NK 세포 및/또는 NK 세포주의 투여는 전신적이거나, 예를 들어 복막 내 경로와 같이 국소적일 수 있다.
다른 실시양태에서, 활성제는 더 직접적으로 투여된다. 따라서 투여는 직접적으로 종양 내에서 이루어질 수 있으며, 이는 특히 고형 종양에 적합하다.
NK 세포는 일반적으로 본 발명의 방법, 용도 및 조성물에 적합하다고 여겨진다. 본원의 특정 실시예에서 사용된 세포에 따라, NK 세포는 암세포 주로부터 수득 한 NK 세포일 수 있다. 유리하게는, 예를 들어 NK 세포를 치명적이고/거나 분열할 수 없게 만듦으로써, 바람직하게는 종양원성을 감소시키도록 처리된 NK 세포를 혈액암 세포주로부터 수득할 수 있고 혈액암을 치료하는 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.
암 유래 세포가 치료 용도에 더 허용 가능하게 하기 위해, 일반적으로 환자에서 종양을 형성하는 성향을 감소시키거나 제거하는 어떤 방법으로 처리하거나 전처리한다. 실시예에서 사용되는 특정의 변형된 NK 세포주는 분열할 수 없게 만들어졌기 때문에 안전하다; 이들은 방사선을 조사받아 이들의 살해 능력을 유지하지만 약 3 내지 4일 이내에 사멸한다. 따라서, 특정 세포 및 세포주는 예를 들어, 방사선 조사의 결과로서, 증식할 수 없다. 본원의 방법에 사용하기 위해 가능한 NK 세포의 처리는 생체 내에서 종양이 분열하고 형성하는 것을 방지하는 방사선 조사 및 종양원성을 감소시키는 유전자 변형, 예를 들어 세포들이 생체 내에서 종양을 분열하고 형성하는 것을 방지하도록 활성화될 수 있는 자살 유전자를 코딩하는 서열을 삽입하는 유전자 변형을 포함한다. 자살 유전자는 외인성, 예를 들어 순환하는 제제에 의해 발현된 후 이 유전자를 발현하는 세포에서 세포 사멸을 일으킬 수 있다. 또 다른 대안은 치료법의 특정 NK 세포를 표적화하는 단클론 항체의 사용이다. 예를 들어, CD52는 KHYG-1 세포 상에 발현되며 이 마커에 단클론 항체가 결합하면 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC: antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) 및 KHYG-1 세포 사멸을 일으킬 수 있다.
문헌[Suck et al, 2006]에 발표된 논문에서 논의된 바와 같이, 암 유래 NK 세포 및 세포주는 감마셀 3000 엘란(Gammacell 3000 Elan)과 같은 방사선 조사 장치를 사용하여 쉽게 방사선 조사된다. 세슘-137의 공급원을 사용하여 방사선량을 조절하며, 예를 들어 1 Gy와 50 Gy 사이의, 용량 반응 곡선을 이용하여 증가된 세포독성의 이점을 유지하면서 세포의 증식 능력을 제거하기 위한 최적의 선량을 결정할 수 있다. 이는 방사선의 각 선량을 투여한 후에 세포독성에 대해 세포를 분석함으로써 달성된다.
입양 세포 면역 요법에 방사선 조사된 NK 세포주를 사용하면 잘 확립된 자가 또는 MHC 일치 T 세포 접근법에 비해 상당한 이점이 있다. 첫째, 증식성이 높은 NK 세포주의 사용은 변형된 NK 세포주의 증식이 더 쉽고 상업적 수준으로 달성될 수 있음을 의미한다. 이어서, 변형된 NK 세포주의 방사선 조사는 환자에게 세포를 투여하기 전에 수행될 수 있다. 유용한 세포독성을 유지하는 이 방사선 조사된 세포는 수명이 한정되어 있으며, 변형된 T 세포와 달리 장기간 순환되지 않아 지속적인 부작용을 유발하지 않을 것이다.
추가로, 동종이형의 변형된 NK 세포 및 NK 세포주의 사용은 환자에서 MHC I형 발현 세포가 자가 NK 세포독성 반응에 할 수 있는 동일한 방식으로 NK 세포독성 반응을 억제할 수 없음을 의미한다. 암세포 살해에 동종이형 NK 세포와 세포주의 사용은 이전에 언급된 GVL 효과로 인해 유익하며, T 세포 경우와 달리, 동종이형 NK 세포와 세포주는 GVHD의 발병을 자극하지 않으므로 이들을 양자 세포 면역 요법을 통한 암 치료에 훨씬 바람직한 옵션이 되게 한다.
변형된 NK 세포는 약 1x106 세포/kg, 약 1x107 세포/kg, 약 1x108 세포/kg, 약 1x109 세포/kg, 및 약 1x1010 세포/kg 초과의 양으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 NK 세포는 약 1x106 내지 약 1x1011 세포/kg의 양으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 변형된 NK 세포는 약 1x107 내지 약 1x1010 세포/kg의 양으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 변형된 NK 세포는 약 1x108 내지 약 1x1010 세포/kg의 양으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 변형된 NK 세포는 약 1x109 내지 약 1x1010 세포/kg의 양으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 변형된 NK 세포는 약 1x107 세포/kg 내지 약 1x109 세포/kg의 양으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 변형된 NK 세포는 약 1x107 내지 약 1x108 세포/kg의 양으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 변형된 NK 세포는 약 1x108 내지 약 1x109 세포/kg의 양으로 투여된다. 혈액암일 경우 세포는 정맥 내 투여될 수 있다. 고형 조직 암일 경우, 세포는 종양 내 또는 복강 내 투여될 수 있다.
IL-6 길항제 항체 및 이의 조합물은 약 0.1 내지 30 mg/kg , 예를 들어 약 0.4 mg/kg, 약 0.8 mg/kg, 약 1.6 mg/kg, 또는 약 4 mg/kg 체중의 농도로 대상체에게 투여될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 기재된 IL-6 길항제 항체 및 이의 조합물은 매 26주 이내 1회, 예를 들어 매 16주 이내 1회, 매 8주 이내 1회, 또는 매 4주 이내 1회의 빈도로 수여 대상체에게 투여된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, IL-6 길항제 항체는 약 1주일의 기간에 약 1회, 약 2주일의 기간에 1회, 약 3주일의 기간에 1회 또는 약 4주일의 기간에 1회의 빈도로 수여 대상체에게 투여된다.
유효 투여량은 예를 들어, 연령, 성별, 임신 상태, 체질량지수, 제지방 체중, 조성물이 제공되는 병태 또는 병태들, 그 밖에 조성물의 대사 또는 관용, 수여 대상체의 IL-6 수준, 및 조성물에 대한 내성(예를 들어, 조성물에 대한 항체를 생성하는 환자로부터 기인함)에 영향을 줄 수 있는 수여 대상체의 건강 상태와 같은 수여 대상체의 속성에 따라 결정될 것으로 이해된다.
IL-6 길항제와 함께 투여되는 변형된 NK 세포는 또한 특정 보조제인 인터루킨 -2(IL-2), 인터루킨 8(IL-8), 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-15(IL- IL-15), 또는 프로테아좀 억제제, 예를 들어 보르테조밉, 카필조밉, 익사조밉, 또는 이들의 조합과 함께 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, IL-2, IL-8, IL-12, IL-15, 또는 프로테아좀 억제제 중 임의의 것을 변형된 NK 세포의 투여 전에 환자에게 투여할 수 있다. 특정 실시양태에서, IL-2, IL-8, IL-12, IL-15, 또는 프로테아좀 억제제 중 임의의 것을 변형된 NK 세포의 투여 중에 환자에게 투여할 수 있다. 특정 실시양태에서, IL-2, IL-8, IL-12, IL-15, 또는 프로테아좀 억제제 중 임의의 것을 변형된 NK 세포의 투여 후에 환자에게 투여할 수 있다. 특정 실시양태에서, IL-2, IL-8, IL-12, IL-15의 활성은 IL-2, IL-8, IL-12, 및 IL-15 수용체에 대한 비-인터루킨 작용제에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어 인터루킨-12 작용제는 ALT-803 또는 ALT-801일 수 있다. 인터루킨-15 작용제는 NIZ985일 수 있다.
또한, 특정 치료 보조제는 주로 메트로놈 사이클로포스파미드 또는 테트라 사이클린 항생제의 사용이 본원에서 고려된다. 이들 보조제 중 하나는 변형된 NK 세포로 치료하기 전이나 도중에 투여될 수 있다. 이들은 또한 변형된 NK 세포 및 IL-6 항체와 같은 IL-6 길항제를 이용한 치료 과정 중에 동시에 투여될 수 있다.
테트라사이클린 항체, 예를 들어 독시사이클린은 하루에 약 50 mg 내지 약 300 mg의 농도로, 또는 하루에 약 100 mg 내지 200 mg의 농도로, 경구 또는 정맥 내 투여될 수 있다. 테트라사이클린, 독시사이클린, 미노사이클린, 티제사이클린, 데메클로사이클린, 메타사이클린, 클로로테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 라임사이클린, 메클로사이클린, 또는 롤리테트라사이클린과 같은 기타 동등한 테트라사이클린 항생제도 사용될 수 있다.
시클로포스파미드는 경구 또는 정맥 내 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 시클로포스파미드는 메트로놈 방식, 예를 들어, 지속된 저용량의 시클로포스파미드로 투여된다. 특정 실시양태에서, 시클로포스파미드는 하루에 또는 하루걸러 약 100 mg 내지 약 25 mg의 용량으로 1, 2, 3, 4주 이상 동안 경구 투여된다. 특정 실시양태에서, 시클로포스파미드는 하루에 약 50 mg의 용량으로 1, 2, 3, 4주 이상 동안 경구 투여된다. 특정 실시양태에서, 시클로포스파미드는 1주일에 약 1000 mg 내지 약 250 mg의 용량으로 1, 2, 3, 4주 이상 동안 정맥 내 투여된다. 특정 양태에서, 시클로포스파미드는 1주일에 약 750 mg, 500 mg, 250 mg 이하의 용량으로 1, 2, 3, 4주 이상 동안 정맥 내 투여된다.
본 발명에 따라, 유효량의 NK 세포와 IL-6 길항제의 조합물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법이 추가로 제공된다. 상기 방법은 본원에 기재된 본 발명의 다른 양태의 바람직하고 선택적인 특징을 포함한다.
본 발명에 따라, 본원에서 유효량의 (a) NK 세포 및 (b) IL-6 길항제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법이 제공된다. NK 세포와 IL-6 길항제는 경우에 따라 별도로 투여된다. 또한, 경우에 따라, 환자는 NK 세포의 투여 전에 IL-6 길항제로 전처리받는다.
본 발명에 따르면, NK 세포 또는 세포주 및 IL-6 길항제를 포함하는 약학 조성물이 추가로 제공된다. 약학 조성물은 본원에 기재된 본 발명의 다른 양태의 바람직하고 선택적인 특징을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "하나의"("a" 또는 "an")과 같은 단수 관사는 문맥에 달리 명학하게 지시하지 않는 한 복수를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 언급된 양에 약 10%, 5% 또는 1%로 가까운 양을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 달리 명시하지 않는 한, 용어 "항체"는 항체의 항원 결합 단편, 즉 전장 항체에 의해 결합된 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편, 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역을 보유하는 단편을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자, 예를 들어 단쇄 가변 영역 단편(scFv), 나노바디 및 별개의 특이성을 갖는 항체 단편에 의해 형성된 다중 특이적 항체, 예를 들어 이중 특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 항체는 항체에 대한 개체의 면역반응을 감소시키는 방식으로 인간화된다. 예를 들어, 항체는 키메라 항체, 예를 들어 인간 불변 영역을 갖는 비인간 가변 영역, 또는 CDR 이식된 항체, 예를 들어 인간 불변 영역 및 가변 영역 골격 서열을 갖는 비인간 CDR 영역일 수 있다.
청구 범위 및 본 명세서의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 본 발명은 다음의 실시양태를 제공한다:
1. 암 치료에 사용하기 위한 IL-6 길항제와 병용되는 자연 살해(NK) 세포 또는 세포주.
2. 실시양태 1에 있어서, 암은 IL-6 수용체를 발현하는 것인 NK 세포 또는 세포주.
3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 암은 PDL-1 및/또는 PDL-2를 발현하는 것인 NK 세포 또는 세포주.
4. 실시양태 1 내지 3중 어느 한 실시양태에 있어서, IL-6 길항제는 IL-6, IL-6R 또는 gp130 중 하나에 결합하는 항체인 NK 세포 또는 세포주.
5. 실시양태 4에 있어서, IL-6 항체는 실툭시맙, 올로키주맙(CDP6038), 엘실리모맙, BMS-945429(ALD518), MH-166 및 시루쿠맙(CNTO 136)으로부터 선택되는 것인 NK 세포 또는 세포주.
6. 실시양태 5 또는 6에 있어서, IL-6R 항체는 토실리주맙, 사릴루맙, PM-1 및 AUK12-20으로부터 선택되는 것인 NK 세포 또는 세포주.
7. 실시양태 4에 있어서, gp130 항체는 AM64인 NK 세포 또는 세포주.
8. 실시양태 1 내지 7중 어느 한 실시양태에 있어서, 별개의 항암 치료법과 병용되는 NK 세포 또는 세포주.
9. 실시양태 8에 있어서, 별개의 항암 치료법은 면역 이펙터 세포로서 내인성 NK 세포를 사용하는 것인 NK 세포 또는 세포주.
10. 실시양태 8 또는 9에 있어서, 별개의 항암 치료법은 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)인 NK 세포 또는 세포주.
11. 실시양태 1 내지 10중 어느 한 실시양태에 있어서, 암은 혈액암인 NK 세포 또는 세포주.
12. 실시양태 11에 있어서, 혈액암은 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 호지킨 림프종, T 세포 림프종 및 B 세포 림프종을 포함하는 비호지킨 림프종, 무증상 골수종, 무증상 다발성 골수종(SMM), 다발성 골수종(MM) 또는 경쇄 골수종인 NK 세포 또는 세포주.
13. 실시양태 1 내지 12중 어느 한 실시양태에 있어서, NK 세포 또는 세포주는 하나 이상의 체크포인트 억제 수용체의 발현이 감소하도록 유전자 변형된 NK 세포 또는 세포주.
14. 실시양태 13에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT 및 TIM-3으로부터 선택되는 것인 NK 세포 또는 세포주.
15. 실시양태 1 내지 14중 어느 한 실시양태에 있어서, NK 세포 또는 세포주는 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현하도록 유전자 변형된 NK 세포 또는 세포주.
16. 실시양태 15에 있어서, 돌연변이 TRAIL 리간드는 TRAIL 수용체, 예를 들어 DR4 및/또는 DR5에 대해 친화도가 증가한 것인 NK 세포 또는 세포주.
17. 실시양태 15 또는 16에 있어서, 돌연변이 TRAIL 리간드는 유인 TRAIL 수용체에 대해 친화도가 감소한 것인 NK 세포 또는 세포주.
18. 실시양태 1 내지 17중 어느 한 실시양태에 있어서, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 NK 세포 또는 세포주.
19. 실시양태 18에 있어서, CAR은 이중 특이적 CAR인 NK 세포 또는 세포주.
20. 실시양태 19에 있어서, 이중 특이적 CAR은 하나의 세포 유형 상의 두 리간드에 결합하는 것인 NK 세포 또는 세포주.
21. 실시양태 19에 있어서, 이중 특이적 CAR은 2가지 상이한 세포 유형의 각 유형 상의 한 리간드에 결합하는 것인 NK 세포 또는 세포주.
22. 실시양태 11 또는 22에 있어서, CAR 또는 이중 특이적 CAR에 대한 리간드(들)는 암세포 상에 발현되는 것인 NK 세포 또는 세포주.
23. 실시양태 22에 있어서, 이중 특이적 CAR에 대한 리간드는 둘 다 암세포 상에 발현되는 것인 NK 세포 또는 세포주.
24. 실시양태 22에 있어서, 이중 특이적 CAR에 대한 리간드는 암세포 및 면역 이펙터 세포 상에 발현되는 것인 NK 세포 또는 세포주.
25. 실시양태 1 내지 24중 어느 한 실시양태에 있어서, NK 세포 또는 세포주는 IL-6 수용체의 발현이 감소하도록 유전자 변형된 NK 세포 또는 세포주.
26. 실시양태 1 내지 25중 어느 한 실시양태에 있어서, NK 세포주는 KHYG-1인 NK 세포 또는 세포주.
27. 암 치료에 사용하기 위한 IL-6 길항제로서, 암의 세포는 IL-6 수용체를 발현하는 것인 IL-6 길항제.
28. 실시양태 27에 있어서, 암은 PDL-1 및/또는 PDL-2를 발현하는 것인 IL-6 길항제.
29. 실시양태 27 또는 28에 있어서, IL-6 길항제는 IL-6, IL-6R 또는 gp130 중 하나에 결합하는 항체인 IL-6 길항제.
30. 실시양태 29에 있어서, IL-6 항체는 실툭시맙, 올로키주맙(CDP6038), 엘 실리모맙, BMS-945429(ALD518), MH-166 및 시루쿠맙(CNTO 136)으로부터 선택되는 것인 IL-6 길항제.
31. 실시양태 29에 있어서, IL-6R 항체는 토실리주맙, 사릴루맙, PM-1 및 AUK12-20으로부터 선택되는 것인 IL-6 길항제.
32. 실시양태 29에 있어서, gp130 항체는 AM64인 IL-6 길항제.
33. 실시양태 27 내지 32중 어느 한 실시양태에 있어서, IL-6 길항제는 별개의 항암 치료법과 병용되는 IL-6 길항제.
34. 실시양태 33에 있어서, 별개의 항암 치료법은 면역 이펙터 세포로서 내인성 NK 세포를 사용하는 것인 IL-6 길항제.
35. 실시양태 33 또는 34에 있어서, 별개의 항암 치료법은 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)인 IL-6 길항제.
36. 실시양태 27 내지 36중 어느 한 실시양태에 있어서, 암은 혈액암인 IL-6 길항제.
37. 실시양태 36에 있어서, 혈액암은 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 호지킨 림프종, T 세포 림프종 및 B 세포 림프종을 포함하는 비호지킨 림프종, 무증상 골수종, 무증상 다발성 골수종(SMM), 다발성 골수종(MM) 또는 경쇄 골수종인 IL-6 길항제.
38. 암의 치료 방법으로서, 유효량의 NK 세포와 IL-6 길항제의 조합물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
39. 실시양태 38에 있어서, 암은 IL-6 수용체를 발현하는 것인 방법.
40. 실시양태 38 또는 39에 있어서, 암은 PDL-1 및/또는 PDL-2를 발현하는 것인 방법.
41. 실시양태 38 내지 40중 어느 한 실시양태에 있어서, NK 세포 또는 세포주는 사전 결합된 IL-6 길항제와 함께 제공되는 것인 방법.
42. 실시양태 38 내지 41중 어느 한 실시양태에 있어서, IL-6 길항제는 IL-6, IL-6R 또는 gp130 중 하나에 결합하는 항체인 방법.
43. 실시양태 42에 있어서, IL-6 항체는 실툭시맙, 올로키주맙(CDP6038), 엘 실리모맙, BMS-945429(ALD518), MH-166 및 시루쿠맙(CNTO 136)으로부터 선택되는 것인 방법.
44. 실시양태 42에 있어서, IL-6R 항체는 토실리주맙, 사릴루맙, PM-1 및 AUK12-20으로부터 선택되는 것인 방법.
45. 실시양태 42에 있어서, gp130 항체는 AM64인 방법.
46. 실시양태 38 내지 45중 어느 한 실시양태에 있어서, 별개의 항암 치료법과 병용되는 방법.
47. 실시양태 46에 있어서, 별개의 항암 치료법은 면역 이펙터 세포로서 내인성 NK 세포를 사용하는 것인 방법.
48. 실시양태 46 또는 47에 있어서, 별개의 항암 치료법은 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)인 방법.
49. 실시양태 38 내지 48중 어느 한 실시양태에 있어서, 암은 혈액암인 방법.
50. 실시양태 49에 있어서, 혈액암은 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 호지킨 림프종, T 세포 림프종 및 B 세포 림프종을 포함하는 비호지킨 림프종, 무증상 골수종, 무증상 다발성 골수종(SMM), 다발성 골수종(MM) 또는 경쇄 골수종인 방법.
51. 실시양태 38 내지 50중 어느 한 실시양태에 있어서, NK 세포 또는 세포주는 하나 이상의 체크포인트 억제 수용체의 발현이 감소하도록 유전자 변형된 것인 방법.
52. 실시양태 51에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT 및 TIM-3으로부터 선택되는 것인 방법.
53. 실시양태 38 내지 52중 어느 한 실시양태에 있어서, NK 세포 또는 세포주는 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현하도록 유전자 변형된 것인 방법.
54. 실시양태 53에 있어서, 돌연변이 TRAIL 리간드는 TRAIL 수용체, 예를 들어 DR4 및/또는 DR5에 대해 친화도가 증가한 것인 방법.
55. 실시양태 53 또는 54에 있어서, 돌연변이 TRAIL 리간드는 유인 TRAIL 수용체에 대해 친화도가 감소한 것인 방법.
56. 실시양태 38 내지 55중 어느 한 실시양태에 있어서, NK 세포 또는 세포주는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 것인 방법.
57. 실시양태 56에 있어서, CAR은 이중 특이적 CAR인 방법.
58. 실시양태 57에 있어서, 이중 특이적 CAR은 하나의 세포 유형 상의 두 리간드에 결합하는 것인 방법.
59. 실시양태 58에 있어서, 이중 특이적 CAR은 2가지 상이한 세포 유형의 각 유형 상의 한 리간드에 결합하는 것인 방법.
60. 실시양태 58 또는 59에 있어서, CAR 또는 이중 특이적 CAR에 대한 리간드(들)은 암세포 상에 발현되는 것인 방법.
61. 실시양태 60에 있어서, 이중 특이적 CAR에 대한 리간드는 둘 다 암세포 상에 발현되는 것인 방법.
62. 실시양태 60에 있어서, 이중 특이적 CAR에 대한 리간드는 암세포 및 면역 이펙터 세포 상에 발현되는 것인 방법.
63. 실시양태 38 내지 62중 어느 한 실시양태에 있어서, NK 세포 또는 세포주는 IL-6 수용체의 발현이 감소하도록 유전자 변형된 것인 방법.
64. 실시양태 38 내지 63중 어느 한 실시양태에 있어서, NK 세포주는 KHYG-1인 방법.
65. NK 세포 또는 세포주 및 IL-6 길항제를 포함하는 약학 조성물로서, NK 세포는 본원에 기재된 바와 같이 경우에 따라 변형된 것인 약학 조성물.
66. IL-6 수용체의 기능이 감소하거나 없도록 변형된 NK 세포 또는 세포주.
67. 실시양태 66에 있어서, IL-6R의 발현이 감소하거나 없도록 유전자 변형된 NK 세포 또는 세포주.
실시예
이제 더 큰 세포독성 활성과 그로 인해 인간에서 백혈병 세포 사멸을 일으키는 능력을 나타내도록 변형된 NK 세포주 KHYG-1 유도체의 생산과 관련하여 그리고 NK 세포의 세포독성을 증가시키고 표적(암) 유도된 항-NK 세포의 세포독성 반응을 감소시키기 위해 IL-6 길항제의 사용과 관련하여 본 발명을 더 상세하고 구체적으로 기술한다.
[도면의 간단한 설명]
본 발명은 이제 수반되는 도면을 참조하여 구체적인 실시양태로 예시된다:
[도 1]은 LIR2 유전자 표적 영역의 DNA 서열을 나타내고 gRNA 측면 영역을 표시한다;
[도 2]는 CTLA4 유전자 표적 영역의 DNA 서열을 나타내고, gRNA 측면 영역을 표시한다;
[도 3]은 트랜스펙션에 사용된 gRNA 구조물(발현 벡터)를 나타낸다;
[도 4]는 트랜스펙션 전후의 부모 및 돌연변이된 LIR2 DNA에 대한 겔 전기영동 밴드를 보여준다;
[도 5]는 트랜스펙션 전후의 부모 및 돌연변이된 CTLA4 DNA에 대한 겔 전기영동 밴드를 보여준다;
[도 6a]는 전기천공을 이용한 성공적인 CD96 녹다운을 나타내는 FACS 플롯이다;
[도 6b]는 전기천공을 이용한 성공적인 CD96 녹다운을 보여주는 FACS 플롯이다;
[도 7]은 다양한 E:T 비율에서 K562 세포에 대한 CD96 녹다운 KHYG-1 세포의 세포독성의 증가를 나타내는 막대 차트이다;
[도 8]은 NK-92 세포에서 CD328(Siglec-7)의 녹다운을 보여준다;
[도 9]는 CD328(Siglec-7)이 녹다운된 NK 세포의 세포독성의 상승을 보여준다;
[도 10]은 KHYG-1 세포 상의 TRAIL의 기준선 발현의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 11]은 KHYG-1 세포의 트랜스펙션 후 TRAIL 및 TRAIL 변이체의 발현의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 12]는 KHYG-1 세포의 트랜스펙션 후 CD107a의 발현의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 13]은 TRAIL 및 TRAIL 변이체로의 KHYG-1 세포의 트랜스펙션이 세포 생존도에 미치는 효과를 나타낸다;
[도 14]는 KHYG-1 세포 및 NK-92 세포 모두에서 DR4, DR5, DcR1 및 DcR2의 기준선 발현의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 15, 16 및 17]은 KHYG-1 세포에서 TRAIL 또는 TRAIL 변이체의 발현이 3가지 표적 세포 집단, 즉 각각 K562, RPMI8226 및 MM1.S 각각의 아폽토시스에 미치는 효과를 나타낸다;
[도 18]은 DR5 발현에 미치는 보르테조밉 처리의 효과를 보여주는 RPMI8226 세포 및 MM1.S 세포 각각에서 DR5 발현의 2가지 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 19]는 TRAIL 변이체를 갖거나 갖지 않는 KHYG-1 세포와 동시 배양된 보르테조밉 전처리/미처리된 MM1.S 세포의 아폽토시스의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 20]은 100 nM의 CMA로 2시간 처리한 KHYG-1 세포에서의 퍼포린 발현 수준의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 21]은 100 nM CMA 또는 비히클로 처리한 후 KHYG-1 세포 생존도의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 22]는 TRAIL 변이체를 갖거나 갖지 않으며 CMA로 전처리/미처리된 KHYG-1 세포와 동시 배양된 MM1.S 세포의 아폽토시스의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 23]은 CD96-siRNA 및/또는 TRAIL 변이체가 발현된 KHYG-1 세포와 동시 배양된 K562 세포의 아폽토시스의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 24]는 CD96-siRNA 및/또는 TRAIL 변이체가 발현된 KHYG-1 세포와 동시 배양된 MM1.S 세포의 아폽토시스의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 25]는 KHYG-1 세포 또는 이전에 IL-6에 12시간 노출된 KHYG-1 세포와 동시 배양된 RPMI8226 세포의 아폽토시스의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 26]은 KHYG-1 세포와 동시 배양된, IL-6에 12시간 사전 노출되거나 되지 않은 RPMI8226 세포의 아폽토시스의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 27]은 KHYG-1 세포 또는 이전에 IL-6에 12시간 노출된 KHYG-1 세포와 동시 배양된 MM1.S 세포의 아폽토시스의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 28]은 KHYG-1 세포와 동시 배양된, IL-6에 12시간 사전 노출되거나 되지 않은 MM1.S 세포의 아폽토시스의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 29]는 KHYG-1 세포 또는 이전에 IL-6에 12시간 노출된 KHYG-1 세포와 동시 배양된, K562 세포의 아폽토시스의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 30]은 KHYG-1 세포와 동시 배양된, IL-6에 12시간 사전 노출되거나 되지 않은 K562 세포의 아폽토시스의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 31 및 32]는 KHYG-1 세포 상의 IL-6R(CD126) 발현의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 33 및 34]는 KHYG-1 세포 상의 gp130(CD130) 발현의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 35]는 NK-2 세포 상의 IL-6R(CD126) 발현의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 36]은 NK-92 세포 상의 gp130(CD130) 발현의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 37]은 U266 세포 상의 IL-6R(CD126) 발현 및 gp130(CD130) 발현의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 38]은 RPMI8226 세포 상의 IL-6R(CD126) 발현 및 gp130(CD130) 발현의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 39]는 NCI-H929 세포 상의 IL-6R(CD126) 발현 및 gp130(CD130) 발현의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 40]은 KMS11 세포 상의 IL-6R(CD126) 및 gp130(CD130) 발현의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 41]은 MM1.S 세포 상의 IL-6R(CD126) 및 gp130(CD130) 발현의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 42 및 43]은 K562 세포 상의 IL-6R(CD126) 발현의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 44]는 K562 세포 상의 gp130(CD130) 발현의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 45]는 48시간 동안 IL-6의 존재 또는 부재하에 RPMI8226 세포 상의 PD-L1 발현의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 46]은 48시간 동안 IL-6의 존재 또는 부재하에 RPMI8226 세포 상의 PD-L2 발현의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 47]은 48시간 동안 IL-6의 존재 또는 부재하에 NCI-H929 세포 상의 PD-L1 발현의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 48]은 48시간 동안 IL-6의 존재 또는 부재하에 NCI-H929 세포 상의 PD-L2 발현의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 49] 및 [도 50]은 48시간 동안 IL-6의 존재 또는 부재하에 MM1.S 세포 상의 PD-L1 발현의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 51] 및 [도 52]는 48시간 동안 IL-6의 존재 또는 부재하에 MM1.S 세포 상의 PD-L2 발현의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 53] 및 [도 54]는 48시간 동안 IL-6의 존재 또는 부재하에 U266 세포 상의 PD-L1 발현의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 55] 및 [도 56]은 48시간 동안 IL-6의 존재 또는 부재하에 U266 세포 상의 PD-L2 발현의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 57] 내지 [도 60]은 48시간 동안 IL-6 차단 항체의 존재 또는 부재하에 U266 세포 상의 PD-L1 발현의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 61] 내지 [도 64]는 48시간 동안 IL-6 차단 항체의 존재 또는 부재하에 U266 세포 상의 PD-L2 발현의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 65]는 IL-2에 KHYG-1 세포 노출 후 STAT3-S727, STAT3-Tyr705, 전체 STAT3, SHP-1, SHP-2 및 P44/42의 겔 전기영동을 나타낸다;
[도 66]은 IL-6에 KHYG-1 세포 노출 후 STAT3-S727, STAT3-Tyr705, 전체 STAT3, SHP-1, SHP-2, P44/42 및 전체 p44/42의 겔 전기영동을 나타낸다;
[도 67]은 IL-2 및 IL-6에 KHYG-1 세포 노출 후 P44/42, 전체 p44/42 및 액틴의 겔 전기영동을 나타낸다;
[도 68]은 단독으로 배양된 KHYG-1 세포 및 K562, U937, HL60, Raji, RPMI8226, U266 또는 MM1.S 세포와 24시간 동시 배양한 후 KHYG-1 세포 상의 PD-1 발현의 FACS 플롯을 나타낸다;
[도 69]는 중화 IL-6이 U266 세포에 대한 KHYG-1 세포의 세포독성을 향상시킴을 나타낸다;
[도 70]은 IL-6이 NKG2D 발현(70A)을 감소시키고 NKG2A 발현(70B)을 증가시킴으로써 KHYG-1 세포의 세포독성을 직접적으로 억제함을 보여준다.
DNA, RNA 및 아미노산 서열은 하기에서 언급된다:
서열 번호 1은 전체 LIR2 DNA 서열이고;
서열 번호 2는 LIR2 아미노산 서열이고;
서열 번호 3은 LIR2 g9 gRNA 서열이고;
서열 번호 4는 LIR2 g18 gRNA 서열이고;
서열 번호 5는 LIR2 정방향 프라이머 서열이고;
서열 번호 6은 LIR2 역방향 프라이머 서열이고;
서열 번호 7은 전체 CTLA4 DNA 서열이고;
서열 번호 8은 CTLA4 아미노산 서열이고;
서열 번호 9는 CTLA4 g7 gRNA 서열이고;
서열 번호 10은 CTLA4 g15 gRNA 서열이고;
서열 번호 11은 CTLA4 정방향 프라이머 서열이고;
서열 번호 12는 CTLA4 역방향 프라이머 서열이다.
실시예 1 - 억제 수용체 기능의 녹아웃
CRISPR / Cas9
억제 수용체 기능이 제거된 세포는 다음과 같이 제조하였다. gRNA 구조물은 NK 세포의 인간 게놈에서 '고전적' 억제 수용체 LIR2 및 '체크포인트' 억제 수용체 CTLA4를 코딩하는 유전자를 표적화하도록 설계하여 제조하였다. 그 후, CRISPR/Cas9 게놈 편집을 이용하여 LIR2 및 CTLA4 표적 유전자를 녹아웃시켰다.
각각의 표적 유전자에 대해 2개의 gRNA 후보 물질을 선택하고 K562 세포에서 그의 절단 효능을 결정하였다. gRNA 후보 물질의 서열은 표 1에 나타내고, 프로토스페이서 인접 모티프(PAM: Protospacer Adjacent Motif)는 서열의 마지막 3개의 염기와 관련된다. LIR2 유전자(서열 번호 1) 및 CTLA4 유전자(서열 번호 7) 상의 gRNA 서열의 측면 영역은 각각 도 1 및 2에 나타낸다.
<표 1>
Figure pct00001
K562 세포를 제조된 gRNA 구조물로 트랜스펙션시키고(도 3), 이어서 PCR 증폭을 위해 수거하였다. GFP 발현의 존재를 이용하여 gRNA 구조물이 K562 세포에 성공적으로 혼입됨을 보고하였다. 이것으로 Cas9 유전자의 발현 및 이에 따른 LIR2 및 CTLA4 유전자의 발현을 녹아웃시키는 능력을 확인하였다.
gRNA 구조물의 절단 활성은 시험관 내 미스매치(mismatch) 검출 분석을 이용하여 측정하였다. T7E1 엔도뉴클레아제 I은 완벽하게 일치하지 않는 DNA를 인식하고 절단하여 부모 LIR2와 CTLA4 유전자를 CRISPR/Cas9 트랜스펙션 및 비상동 말단 결합(NHEJ: non-homologous end joining) 후에 돌연변이된 유전자와 비교할 수 있다.
[도 4]는 g9 및 g18 gRNA 서열로 LIR2 유전자의 녹아웃 후 아가로오스 겔 전기영동 후 생성된 밴드를 보여준다. 각 돌연변이에 해당하는 3개의 밴드는 트랜스펙션 후 DNA 서열의 미스매치를 검출한 후 2개의 생성된 가닥 및 부모 유전자와 관련된다. g9 gRNA 서열은 11%의 트랜스펙션 성공률을 얻은 한편, g18 gRNA는 10%의 결과를 가져왔다.
[도 5]는 g7 및 g15 gRNA 서열로 CTLA4 유전자의 녹아웃 후 아가로오스 겔 전기영동 후 생성된 밴드를 나타낸다. g7 gRNA 서열은 32%의 트랜스펙션 성공률을 얻은 한편, g15 gRNA는 26%의 결과를 가져왔다.
K562 세포에서 LIR2 및 CTLA4의 성공적인 녹아웃 후, KHYG-1 세포를 gRNA 구조물로 트랜스펙션시켰다.
동형접합 결실을 갖는 KHYG-1 유도체 클론을 선별하였다. 상기 목적을 위해 Cas9/푸로마이신 아세틸트랜스퍼라아제(PAC: puromycin acetyltransferase) 발현 벡터를 사용하였다. 성공적으로 트랜스펙션된 세포를 항생제 푸로마이신에 대한 내성을 기준으로 하여 선별하였다.
Cas9 RNP
NK 세포에서 체크포인트 억제 수용체의 녹아웃에 사용된 또 다른 프로토콜은 Cas9 RNP 트랜스펙션의 프로토콜이었다. 이 프로토콜을 사용하면 CRISPR/Cas9 프로토콜의 DNA 플라스미드를 이용하는 것과 비교하여 독성이 현저히 낮다는 점을 제외하고는 유사한 트랜스펙션 효율을 달성할 수 있다는 이점이 있다.
각각의 트랜스펙션 실험을 위해 1x106 KHYG1 세포를 수거하였다. 세포를 PBS로 세척하고 원심분리기에서 회전시켰다. 그 후, 상등액을 버렸다. 이어서, CRISPR RNP(RNA 결합 단백질) 물질을 하기와 같이 제조하였다:
(1) 필요한 합성 crRNA와 tRNA(다마콘(Dharmacon)에서 구입)의 20 μM 용액을 제조하였다.
(2) 4 ㎕의 crRNA(20 μM)와 4 ㎕의 tRNA(20 μM)를 함께 혼합하였다.
(3) 그 후, 혼합물을 2㎕의 Cas9 단백질(5㎍/㎕)에 첨가하였다.
(4) 모든 성분을 혼합하고 실온에서 10분간 인큐베이션하였다.
네온® 트랜스펙션 시스템(Neon® Transfection System)에 따라, 세포를 Cas9 RNP와 혼합하고, 하기 파라미터를 사용하여 전기천공을 수행하였다:
전압 : 1450v
펄스 폭: 30ms
펄스 수: 1
그 후, 세포를 성장 배지(IL-2 및 IL-15 포함)를 포함하는 12 웰 플레이트 중 하나의 웰로 옮겼다.
48 내지 72시간 후에 세포를 수거하여 T7 엔도뉴클레아제 분석 및/또는 생거(Sanger) 서열분석에 의해 유전자 편집 효율을 확인하였다. KHYG1에서 CTLA4, PD1 및 CD96의 성공적인 녹아웃을 나타내는 indel의 존재를 확인하였다.
부위 특이적 뉴클레아제
NK 세포에서 체크포인트 억제 수용체의 녹아웃에 사용된 또 다른 프로토콜은 XTN TALEN 트랜스펙션의 프로토콜이었다. 이 프로토콜을 사용하는 이점은 야생형 CRISPR에 비해 특히 높은 수준의 특이성이 달성될 수 있다는 것이었다.
1단계 : 시약 제조
KHYG-1 세포는 트랜스펙션 효율, 단일 세포 클로닝 효율 및 핵형/복제 수를 포함한 특정 특성에 대해 분석하였다. 그 후, 세포를 공급자의 권고에 따라 배양하였다.
녹아웃되는 체크포인트 억제 수용체에 따라, 뉴클레아제는 적어도 2쌍의 XTN TALEN을 맞춤 설계하여 준비하였다. 맞춤 설계의 단계는 유전자 좌의 평가, 복제 수 및 기능적 평가(즉, 상동체, 표적 외(off target) 평가)를 포함한다.
2단계 : 세포주 조작
세포를 1단계의 뉴클레아제로 트랜스펙션시켰다; 이 단계는 높은 수준의 절단을 얻기 위해 최대 3회 반복하였고 배양액을 나누고 각 트랜스펙션 전에 중간 배양액을 유지시켰다.
각 트랜스펙션 며칠 후에 초기 스크리닝을 하였으며, 세포 풀은 Cel-1 분석을 통해 절단 효율에 대해 시험하였다. 트랜스펙션을 반복한 후 절단 수준이 허용 가능한 수준 또는 평형에 도달한 후에, 세포는 단일 세포 클로닝을 위해 준비된 것으로 간주하였다.
세포를 모아 96 웰 플레이트에 웰당 하나의 세포로 분류하였다; 각각의 풀에 대한 플레이트의 수는 1단계에서 결정된 단일 세포 클로닝 효율에 따라 결정하였다. 플레이트를 3 내지 4주간 인큐베이션하도록 두었다.
3단계 - 스크리닝 및 증폭
세포가 96 웰 플레이트에서 전면 성장하면, 배양액을 합하고 3중의 96 웰 플레이트로 나누었다. 한 플레이트는 백업으로 동결하고, 한 플레이트는 다시 플레이팅하여 클론의 증폭을 계속하였고, 마지막 플레이트는 유전자형 확인에 사용하였다.
유전자형 플레이트의 각 클론을 qPCR 신호의 소실에 대해 분석하였으며, 이는 모든 대립 형질이 변형되었음을 나타냈다. 음성 클론을 PCR 증폭 및 클로닝하여 indel의 성질 및 임의의 야생형의 결여 또는 프레임 내 indel을 결정하였다.
녹아웃이 확인된 클론을 하나의 24 웰 플레이트로 합하고 추가로 증식하였다; 전형적으로, 녹아웃당 최대 5개의 개별 클론에 대해 바이알당 약 1x106 세포를 포함한 5 내지 10개의 냉동된 냉동 바이알을 생산하였다.
4단계 - 유효성 검사
세포를 무균 조건하에 은행에 보관하였다.
은행에 보관된 모든 세포의 기본 배포 기준은 생존 세포 수(동결 전 및 해동 후), STR을 통한 동일성 확인, 기본 무균 보증 및 마이코플라스마 검사를 포함하였다; 필요할 때마다 다른 배포 기준을 적용하였다(핵형, 표면 마커 발현, 높은 수준의 무균, 전사체 또는 단백질의 녹아웃 평가 등).
실시예 2 - 체크포인트 억제 수용체 CD96 기능의 RNAi를 통한 녹다운
KHYG-1 세포에서 CD96의 siRNA 녹다운을 전기천공에 의해 수행하였다. 론자(Lonza)의 아막사 뉴클레오펙터 II(Amaxa Nucleofector II)와 함께 뉴클레오펙션 키트 T(Nucleofection Kit T)를 사용하였는데, 이는 세포주와 함께 사용하기에 적합하고 분열 세포와 비분열 세포 모두를 성공적으로 트랜스펙션시킬 수 있고 최대 90%의 트랜스펙션 효율을 달성하기 때문이다.
대조군 siRNA(카탈로그 번호: sc-37007) 및 CD96 siRNA(카탈로그 번호: sc-45460)는 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)에서 구입하였다. 10% FBS, 2mM L-글루타민을 함유한 항생제 무첨가 RPMI-1640을 뉴클레오펙션 후 배양에 사용하였다. 마우스 항-인간 CD96-APC(카탈로그 번호: 338409)는 염색을 위해 바이오레전드(Biolegend)에서 구입하였다.
20μM의 SiRNA 저장 용액을 제조하였다. 동결 건조된 siRNA 이중 가닥을 FITC-대조군/대조군-siRNA에 RN아제가 제거된 물(siRNA 희석 완충액: sc-29527) 33㎕에, 표적 유전자 siRNA(siRNA CD96)에 RNA아제가 제거된 물 165㎕에 재현탁하였다. 튜브를 90℃로 1분간 가열한 후 37℃에서 60분간 인큐베이션하였다. 그 후 siRNA 저장 용액을 필요할 때까지 -20℃에서 보관하였다.
세포는 대수 성장 단계에 있어야 하기 때문에 KHYG-1 세포는 뉴클레오펙션 1 내지 2일 전에 계대하였다.
뉴클레오펙터 용액을 실온으로 가온하였다(샘플당 100㎕). 또한, 혈청과 보충제를 함유하는 배양 배지의 분액을 50ml 튜브에서 37℃로 예열하였다. 혈청 및 보충제를 함유하는 배양 배지 1.5ml를 첨가하여 6 웰 플레이트를 준비하였다. 플레이트를 가습된 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 미리 인큐베이션하였다.
100㎕의 뉴클레오펙션 용액에 2x106 세포를 4㎕ 20μM siRNA 용액(15μg siRNA)과 부드럽게 혼합하였다. 혼합하는 동안 기포를 방지하였다. 혼합물을 아막사 인증 큐벳으로 옮기고 뉴클레오펙터 큐벳 홀더에 넣고 프로그램 U-001을 선택하였다.
프로그램을 종료시키고 큐벳 내 샘플을 즉시 꺼냈다. 그 후, 500㎕의 미리 평형화된 배양 배지를 각 큐벳에 첨가하였다. 각 큐벳 내의 샘플을 웰당 2ml의 최종 부피를 정하기 위해 준비된 6 웰 플레이트의 상응하는 웰로 부드럽게 옮겼다.
그 후, 세포를 트랜스펙션 분석을 수행할 때까지 가습된 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. CD96 발현 수준을 측정하기 위해서 전기천공 16 내지 24시간 후에 유세포 측정 분석을 수행하였다. 이 전기천공 프로토콜을 여러 번 수행하고 KHYG-1 세포에서 CD96 녹다운이 확실하게 일어났음을 확인하였다(도 6a 및 6b 참조).
실시예 3 - CD96이 녹다운된 NK 세포의 상승된 세포독성
CD96가 녹다운되거나 되지 않은 KHYG-1 세포를 다양한 이펙터:표적(E:T) 비율로 K562 세포와 동시 배양하였다.
세포독성은 퍼킨엘머(PerkinElmer)의 델피아(DELFIA) EuTDA 세포독성 키트(카탈로그 번호: AD0116)를 사용하여 동시 배양 4시간 후에 측정하였다.
표적 세포 K562를 10% FBS, 2mM L-글루타민 및 항생제를 함유하는 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 살스테드(SARSTEDT)에서 96 웰 V 바닥 플레이트(카탈로그 번호: 83.3926)를 구입하였다. 에펜도르프(Eppendorf) 원심분리기 5810R(플레이트 로터가 구비됨)을 사용하여 플레이트를 회전시켰다. 바리오스캔 플래시(VARIOSKAN FLASH)(ScanIt 소프트웨어 243이 구비됨)을 사용하여 용해된 K562 세포에 의해 생성된 형광 신호를 측정하였다.
K562 세포를 배양 배지로 세척하고 세포 수를 배양 배지로 1x106 세포/mL로 조정하였다. 2 내지 4mL의 세포를 5 ㎕의 BATDA 시약에 첨가하고 37℃에서 10분간 인큐베이션하였다. 세포 내에서, 에스테르 결합은 가수분해되어 친수성 리간드를 형성하여, 더 이상 막을 통과하지 않는다. 세포를 1500RPM에서 5분간 원심분리하여 로딩된 K562 세포를 세척하였다. 이를 1mM 프로베네시드(Probenecid)(시그마(Sigma) P8761)를 함유하는 배지로 3 내지 5회 반복하였다. 최종 세척 후 세포 펠렛을 배양 배지에 재현탁하고 약 5x104 세포/mL로 조정하였다.
배경, 자연 방출 및 최대 방출의 검출을 위한 웰을 설정하였다. 100 ㎕의 로딩된 표적 세포(5,000 세포)를 V 바닥 플레이트의 웰에 옮기고, 1:1 내지 20:1 범위의 이펙터 대 표적 비율을 만들기 위해 100 ㎕의 이펙터 세포(KHYG-1 세포)를 다양한 세포 농도로 첨가하였다. 플레이트를 100xg에서 1분간 원심분리하고 37℃에서 가습된 5% CO2 대기에서 4시간 인큐베이션하였다. 최대 방출 웰을 위해, 10㎕의 용해 완충액을 각 웰에 첨가하고 15분 후에 배지를 수거하였다. 플레이트를 500xg에서 5분간 원심분리하였다.
상등액 20㎕를 편평한 바닥 96 웰 플레이트로 옮기고, 200㎕의 예열된 유로퓸(Europium) 용액을 첨가하였다. 이것을 플레이트 쉐이커를 사용하여 실온에서 15분간 인큐베이션하였다. K562 세포는 KHYG-1 세포에 의해 용해될 때, 배지로 리간드를 방출한다. 그 후 이 리간드는 유로퓸 용액과 반응하여 용해된 세포의 양과 직접적으로 관련이 있는 형광 킬레이트를 형성한다.
그 후 바리오스캔 플래시를 사용하여 시분해 형광 측정기에서 형광도를 측정하였다. 특이적 방출은 다음 식을 사용하여 계산하였다.
% 특이적 방출 = 실험 방출 - 자연 방출/최대 방출 - 자연 방출
통계 분석은 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism) 6.04 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 양측 t 검정을 이용하여 siRNA CD96 녹다운 KHYG-1 세포와 대조군(n = 3) 사이의 차이를 비교하였다.
CD96 녹다운 KHYG-1 세포를 함유하는 동시 배양액에서 특이적 방출이 유의하게 증가하는 것으로 확인되었다. 이는 모든 E:T 비율에서의 경우였다(도 7 참조).
형광도가 세포 용해와 직접적으로 관련되기 때문에 KHYG-1 세포에서 CD96 발현을 녹다운시키면 K562 암 표적 세포를를 살해할 수 있는 능력이 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 4 - CD328( Siglec - 7)이 녹다운된 NK 세포의 상승된 세포독성
NK -92 세포에서 CD328의 siRNA 매개된 녹다운
재료, 시약 및 장치
대조군 siRNA(카탈로그 번호: sc-37007) 및 CD328 siRNA(카탈로그 번호: sc-106757)는 산타 크루즈 바이오테크놀로지에서 구입하였다. 뉴클레오펙터™ 디바이스(Nucleofector™ Deivce)(Nucleofector II, Lonza)로 NK-92 세포에서 높은 세포 생존도(> 75%)로 최대 90%의 트랜스펙션 효율을 달성하기 위해서, 론자의 뉴클레오펙터™ 키트 T를 사용하였다. 10% FBS, 2mM L-글루타민을 함유하는 항생제 무첨가 RPMI-1640을 뉴클레오펙션 후 배양에 사용하였다. 마우스 항-인간 CD328-APC(카탈로그 번호: 339206)는 바이오레전드에서 구입하였다.
프로토콜
10 μM의 siRNA 저장 용액을 만들기 위해서
- 동결건조된 siRNA 이중 가닥을 FITC-대조군/대조군-siRNA에 RN아제가 제거된 물(siRNA 희석 완충액: sc-29527) 66㎕에, 표적 유전자 siRNA(siRNA CD328)에 RNA아제가 제거된 물 330㎕에 재현탁한다.
- 튜브를 90℃로 1분간 가열한다.
- 37℃에서 60분간 인큐베이션한다.
- siRNA 저장 용액을 바로 사용하지 않을 경우 -20℃에 보관한다.
- 하나의 뉴클레오펙션 샘플(100㎕ 표준 큐벳에 대해)은 하기를 포함한다.
- 세포 수 : 2x106 세포
- siRNA : 4㎕의 10 μM 저장 용액
- 뉴클레오펙터 용액: 100㎕
뉴클레오펙션
- 필요한 수의 세포를 배양한다(뉴클레오펙션 1 내지 2일 전에 계대하며, 세포는 대수 성장 단계에 있어야 한다).
- 각 샘플에 대한 siRNA를 제조한다.
- 뉴클레오펙터 용액을 실온으로 예열한다(샘플당 100㎕).
- 혈청과 보충제를 함유하는 배양 배지의 분액을 50ml 튜브에서 37℃에서 예열한다. 혈청과 보충제를 함유한 1.5ml의 배양 배지를 채워 6 웰 플레이트를 준비하고 플레이트를 가습된 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 미리 인큐베이션한다.
- 세포 배양액의 분액을 취해 세포를 계수하여 세포 밀도를 결정한다.
- 필요한 수의 세포를 1500rpm에서 5분간 원심분리한다. 상등액을 완전히 버려 잔여 배지가 세포 펠렛을 덮지 않도록 한다.
- 세포 펠렛을 최종 농도 2x106 세포/100㎕로 실온의 뉴클레오펙터 용액에 재현탁한다. 세포 현탁액을 뉴클레오펙터 용액에 15 내지 20분 이상 보관하지 않는데, 이는 세포 생존도와 유전자 전달 효율이 저하되기 때문이다.
- 100㎕의 세포 현탁액을 siRNA와 혼합한다.
- 샘플을 아막사 인증 큐벳에 옮긴다. 반드시 샘플이 큐벳 바닥을 덮고 피펫팅 중에 기포를 방지한다. 파란색 캡으로 큐벳을 닫는다.
- 적절한 뉴클레오펙터 프로그램(NK-92 세포일 경우 A-024)을 선택한다. 큐벳을 큐벳 홀더에 넣고(뉴클레오펙터 II: 회전 장치를 시계 방향으로 최종 위치까지 돌림) "X" 버튼을 눌러 프로그램을 시작한다.
- 세포 손상을 방지하기 위해, 프로그램이 완료된 후("OK"가 표시됨) 즉시 큐벳에서 샘플을 꺼낸다. 예열된 배양 배지 500㎕를 큐벳에 첨가하고 샘플을 준비된 6 웰 플레이트에 옮긴다.
- 세포를 가습된 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션한다. 16 내지 24시간 후에 유세포 측정 분석 및 세포독성 분석을 수행한다.
결과: 본 발명자는 상기 프로토콜을 따랐으며 NK-92 세포에서 CD328 발현 수준의 유세포 측정 분석을 수행하였다. 하나의 대표적인 실험 결과를 [도 8]에 나타내며, 이는 성공적으로 녹다운되었음을 확인해준다.
CD328의 녹다운은 세포독성을 상승시킨다
재료, 시약 및 장치
형광 증강 리간드(카탈로그 번호: AD0116)를 기반으로 한 델피아 EuTDA 세포독성 키트는 퍼킨 엘머에서 구입하였다. 표적 세포 K562를 10% FBS, 2mM L-글루타민 및 항생제를 함유하는 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 살스테드로부터 96 웰 V 바닥 플레이트(카탈로그 번호: 83.3926)를 구입하였다. 에펜도르프 원심분리기 5810R(플레이트 로터가 구비됨)을 사용하여 플레이트를 회전시켰다. 바리오스캔 플래시(ScanIt 소프트웨어 243이 구비됨)를 사용하여 용해된 K562 세포에 의해 생성된 형광 신호를 측정하였다.
프로토콜
- 형광 증강 리간드 델피아 BATDA 시약과 함께 표적 K562 세포를 로딩한다.
- K562 세포를 배지로 세척하고, 배양 배지로 세포 수를 1x106 세포/mL로 조정한다. 세포 2 내지 4 mL를 5 ㎕의 BATDA 시약에 첨가하고 37℃에서 10분간 인큐베이션한다.
- 1500RPM에서 5분간 회전시키고 로딩된 K562 세포를 1mM 프로베네시드(시그마 P8761)를 함유하는 배지로 3 내지 5회 세척한다.
- 최종 세척 후 배양 배지에 세포 펠렛을 재현탁하고 약 5x104 세포/mL로 조정한다.
세포독성 분석
- 배경, 자연 방출 및 최대 방출의 검출을 위한 웰을 설정한다.
- 100 ㎕의 로딩된 표적 세포(5,000 세포)를 V 바닥 플레이트에 피펫팅한다.
- 다양한 세포 농도의 이펙터 세포(NK-92) 100 ㎕를 첨가한다. 이펙터 대 표적 비율은 1:1 내지 20:1 범위이다.
- 플레이트를 100xg의 RCF에서 1분간 회전시킨다.
- 가습된 5% CO2 대기에서 37℃에서 2시간 인큐베이션한다. 최대 방출 웰을 위해, 10㎕의 용해 완충액을 각 웰에 첨가하고 15분 후에 배지를 수거한다.
- 플레이트를 500xg에서 5분간 회전시킨다.
- 상등액 20㎕를 편평한 바닥 96 웰 플레이트로 옮기고, 200㎕의 예열된 유로퓸 용액을 첨가하고, 플레이트 쉐이커를 사용하여 실온에서 15분간 인큐베이션한다.
- 바리오스캔 플래시 사용하여 시분해 형광 측정기에서 형광도를 측정한다. 특이적 방출은 다음 식을 사용하여 계산하였다.
- % 특이적 방출 = 실험 방출 - 자연 방출/최대 방출 - 자연 방출
결과 : 본 발명자는 상기에 따라 CD328 녹다운의 세포독성에 대한 효과를 측정하였다. 하나의 대표적인 실험 결과를 [도 9]에 나타낸다. 나타낸 바와 같이, 표적 세포에 대한 세포독성은 CD328이 녹다운된 세포에서 증가하였다.
실시예 5 - 체크포인트 억제 수용체의 녹다운/녹아웃에 의한 혈액암 치료법을 위한 프로토콜
상기 실시예에서 입증된 바와 같이, 체크포인트 억제 수용체 기능은 다양한 방식으로 녹다운되거나 녹아웃될 수 있다. 혈액암 환자 치료에 사용하기 위해 다음 프로토콜을 개발하였다.
본원에 기재된 방법으로 치료되기에 적합한 암 환자를 진단한 후, 변형된 NK 세포의 분액을 해동시켜 배양한 후 환자에게 투여할 수 있다.
다르게는, 일시적인 돌연변이는 상기한 바와 같이 예를 들어, siRNA를 이용하여 1 내지 2일 내에 제조할 수 있다. 맥스사이트 유동 전기천공(Maxcyte Flow Electroporation) 플랫폼은 병원에서 신속하고 대규모의 트랜스펙션을 달성하는데 적합한 해결책을 제공한다.
특정 체크포인트 억제 수용체의 제거는 다른 것들보다 더 유익할 수 있다. 이것은 아마도 환자와 암에 따라 좌우된다. 이러한 이유로, 경우에 따라 암을 생검하고 암세포를 생체 외에서 배양액에 배양한다. 따라서, 각각 다른 체크포인트 억제 수용체가 변형된 다양한 NK 세포를 특정 암에 대한 세포독성에 대해 시험할 수 있다. 이 단계는 치료법을 위해 가장 적절한 NK 세포 또는 이의 유도체를 선별하는 데 사용할 수 있다.
성공적으로 변형시킨 후에, 세포를 환자에게 정맥 내 및/또는 종양 내 주입에 적절한 담체(예를 들어, 식염수)에 재현탁한다.
실시예 6 - TRAIL/TRAIL 변이체의 KHYG -1 녹인(knock-in)
트랜스펙션 후 생존도와 암세포를 살해할 수 있는 능력을 평가하기 위해 TRAIL 및 TRAIL 변이체 둘 다로 KHYG-1 세포를 트랜스펙션시켰다.
사용된 TRAIL 변이체는 WO 2009/077857호에 기재된 것이다. 이는 D269H/E195R 돌연변이를 포함하는 야생형 TRAIL 유전자에 의해 코딩된다. 이 돌연변이는 DR5에 대한 TRAIL 변이체의 친화도를 현저하게 증가시키는 반면, 유인 수용체(DcR1 및 DcR2) 둘 다에 대한 친화도를 감소시킨다.
기준선 TRAIL 발현
KHYG-1 세포에서 기준선 TRAIL(CD253) 발현은 유세포 측정법을 사용하여 분석하였다.
마우스 항-인간 CD253-APC(바이오레전드 카탈로그 번호: 308210) 및 아이소형 대조군(바이오레전드 카탈로그 번호: 400122)을 사용하여 세포 샘플을 염색하고 BD FACS 칸토 II(BD FACS Canto II) 유세포 측정기로 분석하였다.
KHYG-1 세포를 10% FBS, 2mM L-글루타민, 페니실린(100U/mL)/스트렙토마이신(100mg/mL) 및 IL-2(10ng/mL)를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 0.5 내지 1.0x106 세포/시험을 원심 분리(1500rpm × 5 분)에 의해 수집하고 상등액을 흡인하였다. 세포(단일 세포 현탁액)를 4 mL의 얼음 냉각 FACS 완충액(PBS, 0.5-1% BSA, 0.1% NaN3 아지드화나트륨)으로 세척하였다. 세포를 100㎕의 얼음 냉각 FACS 완충액에 재현탁하고, 5㎕의 항체를 각 튜브에 첨가하고 얼음에서 30분간 인큐베이션하였다. 세포를 1500rpm에서 5분간 원심분리하여 3회 세척하였다. 그 후 세포를 500㎕의 얼음 냉각 FACS 완충액에 재현탁하고 어두운 곳에서 얼음에 일시적으로 보관하였다.
이어서, 세포를 유세포 측정기(BD FACS 칸토 II)에서 분석하고, 생성된 데이터를 플로우조(FlowJo) 7.6.2 소프트웨어를 사용하여 처리하였다.
[도 10]에서 볼 수 있는 바와 같이, FACS 분석은 KHYG-1 세포 표면상의 TRAIL의 약한 기준선 발현을 보였다.
전기천공에 의한 TRAIL/TRAIL 변이체 녹인
야생형 TRAIL mRNA 및 TRAIL 변이체(D269H/195R) mRNA는 트리링크 바이오테크놀로지(TriLink BioTechnologies)에서 합성하고, 소분하여 -80℃에 보관하였다. 마우스 항-인간 CD253-APC(바이오레전드 카탈로그 번호: 308210) 및 아이소형 대조군(바이오레전드 카탈로그 번호: 400122), 및 마우스 항-인간 CD107a-PE(이바이오사이언스(eBioscience) 카탈로그 번호: 12-1079-42) 및 아이소형 대조군(이바이오사이언스 카탈로그 번호: 12-4714) 항체를 사용하여 세포 샘플을 염색하고 BD FACS 칸토 II 유세포 측정기로 분석하였다. DNA 염료 사이톡스-그린(SYTOX-Green)(라이프 테크놀로지스(Life Technologies) 카탈로그 번호: S7020; DMSO 중의 5mM 용액)을 사용하였다. 뉴클레오펙터™ 디바이스(Nucleofector II, Lonza)로 KHYG-1 세포에서 높은 세포 생존도로 최대 90%의 트랜스펙션 효율을 달성하기 위해, 론자의 뉴클레오펙터™ 키트 T를 사용하였다. 10% FBS, L-글루타민(2mM) 및 IL-2(10ng/mL)를 함유한 항생제 무첨가 RPMI 1640을 뉴클레오펙션 후 배양에 사용하였다.
세포가 대수 성장 단계에 있어야 하기 때문에 KHYG-1과 NK-92 세포를 뉴클레오펙션 1 내지 2일 전에 계대하였다. 50 mL 튜브에 37℃에서 혈청과 보충제를 함유하는 배양 배지의 분액과 함께 뉴클레오펙터 용액을 실온으로 예열하였다(샘플당 100㎕). 혈청 및 보충제를 함유한 1.5ml의 배양 배지를 채워 6 웰 플레이트를 준비하고 가습된 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 미리 인큐베이션하였다. 세포 배양액의 분액을 준비하여 세포를 계수하여 세포 밀도를 결정하였다. 필요한 수의 세포를 1500rpm에서 5분간 원심분리한 후 상등액을 완전히 버렸다. 세포 펠렛을 최종 농도 2x106 세포/100㎕로 실온의 뉴클레오펙터 용액에 재현탁하였다(현탁 최대 시간 = 20분). 100㎕의 세포 현탁액을 10㎍ mRNA(RNA의 부피 < 10㎕)와 혼합하였다. 샘플을 아막사 인증 큐벳으로 옮겼다(반드시 샘플이 큐벳 바닥을 덮고 기포를 방지한다), 적절한 뉴클레오펙터 프로그램을 선택하였다(즉, KHYG-1 세포일 경우 U-01). 그 후 큐벳을 큐벳 홀더에 넣었다. 예열된 배양 배지 500 ㎕를 큐벳에 첨가하고 세포의 손상을 피하기 위해서 프로그램 완료 후 즉시 샘플을 준비된 6 웰 플레이트로 옮겼다. 세포를 가습된 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 전기천공 12 내지 16시간 후에 유세포 측정 분석 및 세포독성 분석을 수행하였다. 유세포 측정법 염색은 상기와 같이 수행하였다.
[도 11] 및 [도 12]에서 볼 수 있듯이, TRAIL/TRAIL 변이체 및 CD107a(NK 활성화 마커)의 발현은 트랜스펙션 후 증가하였으며, TRAIL 유전자의 KHYG-1 세포로의 성공적인 녹인을 확인하였다.
[도 13]은 전기천공을 통한 트랜스펙션 전후의 KHYG-1 세포 생존도의 증거를 제공한다. TRAIL/TRAIL 변이체로 세포의 트랜스펙션 후 세포 생존도에서 통계적으로 유의한 차이가 관찰되지 않음을 알 수 있으며, 이는 야생형 또는 변이 TRAIL의 발현이 세포에 독성이 없음을 확인해 준다. 이 관찰은 TRAIL 변이 유전자 녹인이 세포에 독성이 있음을 시사하는 NK-92 세포에서의 상응하는 결과와 모순된다(데이터는 미제출). 그렇지만, 이는 아마도 NK-92 세포 표면에서 TRAIL 수용체 DR4 및 DR5의 상대적으로 높은 발현 수준으로 설명된다(도 14 참조).
KHYG -1 세포의 세포독성에 미치는 TRAIL/TRAIL 변이체의 효과
마우스 항-인간 CD2-APC 항체(BD 파민젠(BD Pharmingen) 카탈로그 번호: 560642)를 사용하였다. 아넥신(Annexin) V-FITC 항체(이뮤노툴스(ImmunoTools) 카탈로그 번호: 31490013)를 사용하였다. DNA 염료 사이톡스-그린(라이프 테크놀로지스 카탈로그 번호: S7020)을 사용하였다. 24 웰 세포 배양 플레이트(살스테드 AG 카탈로그 번호: 833922)를 사용하였다. 골수성 백혈병 세포주 K562, 다발성 골수종 세포주 RPMI8226 및 MM1.S를 표적 세포로 사용하였다. K562, RPMI8226, MM1.S를 10% FBS, 2mM L-글루타민 및 페니실린(100U/mL)/스트렙토마이신(100mg/mL)을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 배양하였다.
상기에 설명한 바와 같이, KHYG-1 세포를 TRAIL/TRAIL 변이체로 트랜스펙션시켰다.
표적 세포를 세척하고 1500rpm에서 5분간 원심분리하여 펠렛화하였다. 트랜스펙션된 KHYG-1 세포를 0.5x106/mL로 희석하였다. 그 후, 이펙터: 표적(E:T) 비율을 1:1로 만들기 위해 표적 세포 밀도를 예열된 RPMI 1640 배지로 조정하였다.
그 후, 0.5 mL의 KHYG-1 세포와 0.5 mL의 표적 세포를 24 웰 배양 플레이트에서 혼합하고 가습된 37℃/5% CO2 인큐베이터에 12시간 두었다. 그 후, 유세포 측정 분석을 이용하여 KHYG-1 세포의 세포독성을 분석하였다; 동시 배양된 세포(다양한 시점에서)를 세척한 후 아넥신 V 결합 완충액을 사용하여 CD2-APC 항체(5 ㎕/시험), 아넥신 VFITC(5 ㎕/시험) 및 사이톡스-그린(5 ㎕/시험)으로 염색하였다.
데이터는 플로우조 7.6.2 소프트웨어를 사용하여 추가로 분석하였다. KHYG-1 세포 및 표적 세포 집단 각각을 나타내는 CD2 양성 및 CD2 음성 게이트를 정하였다. 그 후, CD2 음성 집단에서 아넥신 V-FITC와 사이톡스-그린 양성 세포를 TRAIL 유도된 아폽토시스에 대해 분석하였다.
[도 15, 16 및 17]은 3가지 표적 세포주, K562, RPMI8226 및 MM1.S 각각의 아폽토시스에 대한 TRAIL 또는 TRAIL 변이체를 발현하는 KHYG-1 세포 모두의 효과를 나타낸다. 모든 표적 세포 집단에서 KHYG-1 세포 상 TRAIL 발현은 정상 KHYG-1 세포(TRAIL로 트랜스펙션되지 않음)와 비교했을 때 아폽토시스 수준을 증가시켰음이 명백하다. 또한, KHYG-1 세포 상 TRAIL 변이체 발현은 야생형 TRAIL로 트랜스펙션된 KHYG-1 세포와 비교할 때, 모든 표적 세포에서 아폽토시스를 더욱 증가시켰다.
TRAIL 변이체를 발현하는 본 발명의 세포는 사멸 수용체 DR5에 대해 더 높은 친화도를 나타내기 때문에 암 치료법에서 중요한 이점을 제공한다. 이들 세포에 의해 공격받을 때, 암세포가 특정 경로를 통해 사멸을 회피하는 방어 전략을 발생하는 것이 방지된다. 따라서, 암은 TRAIL 유인 수용체를 상향조절함으로써 TRAIL 유도된 세포 사멸을 효과적으로 회피할 수 없는데, NK 세포가 그러한 환경에서 세포독성을 유지하도록 변형되기 때문이다.
실시예 7 - 녹인된 TRAIL 변이체를 가진 NK 세포를 이용한 혈액암 치료법을 위한 프로토콜
KHYG-1 세포를 실시예 6에 상기한 바와 같이 TRAIL 변이체로 트랜스펙션시켰다. 혈액암 환자의 치료에 사용하기 위해 다음의 프로토콜을 개발하였다:
IL-6, IL-6R 또는 gp130을 발현하는 암 환자를 진단한 후, DR5 유도제, 예를 들면, 보르테조밉을 변형된 NK 세포의 투여 전에 투여하며, 따라서 암에서 DR5의 발현을 상향조절하는데 저용량으로 사용되며, 이는 변형된 NK 세포 치료법을 더 효과적으로 만든다.
그 후, 변형된 NK 세포의 분액을 해동하고 배양하고 환자에게 투여한다.
치료법에 사용되는 NK 세포에 의해 발현되는 TRAIL 변이체가 야생형 TRAIL보다 유인 수용체에 대한 친화도가 낮기 때문에 암세포 표면상 사멸 수용체의 결합이 증가하므로 결과적으로 암세포의 세포 아폽토시스가 증가한다.
위의 프로토콜을 구현하기 전에 또 다른 옵션은 암을 생검하여 암세포를 생체 외에서 배양하는 것이다. 이 단계는 주어진 환자에게 DR5 유도제가 적절한지를 결정하는데 도움을 주기 위해서, 특히 높은 수준의 유인 수용체 및/또는 낮은 수준의 사멸 수용체를 발현하는 암을 확인하는데 사용될 수 있다. 이 단계는 또한 상기 프로토콜을 이용한 치료법 중에 수행할 수 있는데, 주어진 암이 예를 들어 DR5의 발현을 감소시키는데 적응할 수 있어서, 치료법 도중에 DR5 유도제로 치료하는 것이 적합해질 수 있기 때문이다.
실시예 8 - 낮은 용량의 보르테조밉은 TRAIL 변이체를 발현하는 NK 세포에 암세포를 감작시킨다
보르테조밉(Bt: Bortezomib)은 다발성 골수종(MM:)의 치료에 유용한 프로테아좀 억제제(화학요법 유사 약물)이다. 보르테조밉은 MM 세포를 포함한 여러 다양한 유형의 암세포에서 DR5 발현을 상향조절하는 것으로 알려져 있다.
KHYG-1 세포를 실시예 6에서 상기한 바와 같이 TRAIL 변이체로 트랜스펙션시킨 후, 보르테조밉에 노출되거나 노출되지 않은 MM 세포를 표적화하는데 사용하였다.
보르테조밉 유도 DR5 발현
보르테조밉은 밀레늄 파마슈티칼스(Millennium Pharmaceuticals)에서 구입하였다. 마우스 항-인간 DR5-AF647(카탈로그 번호: 565498)은 BD 파민젠에서 구입하였다. 염색된 세포 샘플을 BD FACS 칸토 II에서 분석하였다.
(1) MM 세포주 RPMI8226 및 MM1.S를 2 mM L-글루타민, 10 MM HEPES, 24 mM 중탄산나트륨, 00.1% 항생제 및 10% 소 태아 혈청(시그마, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)를 보충한 RPMI1640 배지(시그마, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)에서 37℃, 5% CO2 대기에서 배양하였다.
(2) MM 세포를 6 웰 플레이트에 1x106/mL, 2mL/웰로 접종하였다.
(3) 그 후, MM 세포를 다양한 용량의 보르테조밉으로 24시간 처리하였다.
(4) 그 후, 보르테조밉 처리/미처리 MM 세포에서 DR5 발현을 유세포 측정법으로 분석하였다(도 18).
낮은 용량의 보르테조밉 처리는 MM 세포주 모두에서 DR5 발현을 증가시키는 것으로 확인되었다(도 18). DR5의 상향조절은 약간의 아폽토시스 유도와 관련되었다(데이터 미제출). 그러나, DR5 발현은 높은 용량의 보르테조밉에 의해 상향조절될 수 없었는데, 그 이유는 높은 독성이 대부분의 MM 세포의 사멸을 일으켰기 때문으로 밝혀졌다.
보르테조밉이 유도한 암세포의 감작화
KHYG-1 세포를 실시예 6에서 상기한 바와 같이 TRAIL 변이체(TRAIL D269H/E195R)로 트랜스펙션시켰다.
(1) 보르테조밉 처리/미처리 MM1.S 세포를 표적 세포로 사용하였다. MM1.S 세포를 25nM의 보르테조밉 또는 비히클(대조군)로 24시간 처리하였다.
(2) TRAIL 변이체 mRNA의 전기천공 6시간 후, 이어서 KHYG-1 세포를 12 웰 플레이트에서 MM 세포와 함께 배양하였다. 세척 후 세포 농도를 1x106/mL로 조정한 후 KHYG-1과 MM1.S 세포를 1:1의 비율로 혼합하여 12시간 배양하였다.
(3) KHYG-1 세포의 세포독성에 대한 유세포 측정 분석을 수행하였다. 동시 배양된 세포를 수집하고 세척한 후, 아넥신V 결합 완충액을 사용하여 CD2-APC 항체(5 ㎕/시험), 아넥신V-FITC(5 ㎕/시험) 및 사이톡신-그린(5 ㎕/시험)으로 염색하였다.
(4) 데이터는 플로우조 7.6.2 소프트웨어를 사용하여 추가로 분석하였다. CD2 음성 집단은 MM1.S 세포를 나타낸다. KHYG-1 세포는 CD2에 대해 강한 양성이다. 마지막으로, CD2 음성 집단에서 아넥신V-FITC 및 사이톡스-그린 양성 세포를 분석하였다.
TRAIL 변이체로/TRAIL 변이체 없이 전기천공된 KHYG-1 세포와 동시 배양된 보르테조밉 전처리/미처된 MM1.S 세포에서 아폽토시스의 유세포 측정 분석을 수행하였다(도 19).
보르테조밉은 TRAIL 변이체를 발현하는 KHYG-1 세포에 대한 MM 세포의 감수성을 유도한다는 것을 확인하였다. 따라서, 데이터는 DR5 발현을 유도한 제제가 암세포에 대한 세포독성을 증가시키는 모델에 효과적이므로, 암 치료법을 향상시키는데 유용할 수 있음을 나타내었다.
실시예 9 - TRAIL 변이체에 의해 유도된 아폽토시스의 확인
이전 실시예에서 TRAIL 변이체 발현으로 인한 NK 세포의 세포독성 증가의 결정적인 증거에 불구하고, 본 발명자는 증가된 세포독성이 암세포 아폽토시스의 유도에 의한 것인지(가장 가능성이 큼) 또는 NK 세포를 우연히 활성화하여 더 큰 세포독성 표현형을 나타내고 이에 따라 퍼포린 분비를 통해 암세포를 살해함으로 인한 것인지 확인하고자 하였다.
콘카나마이신 A(CMA: Concanamycin)는 주로 용해성 과립의 pH가 증가하여 퍼포린의 분해가 가속화되어, NK 세포의 퍼포린 매개된 세포독성 활성을 억제하는 것으로 입증되었다. 본 발명자는 퍼포린 매개 세포독성이 CMA로 부분적으로 차단될 때 TRAIL 변이체를 발현하는 KHYG-1 세포의 세포독성이 뚜렷이 나타날 수 있는지 조사하였다.
퍼포린 발현의 CMA-유도된 감소
마우스 항-인간 퍼포린-AF647(카탈로그 번호: 563576)은 BD 파민젠에서 구입하였다. 콘카나마이신 A(카탈로그 번호: SC-202111)는 산타 크루즈 바이오테크놀로지에서 구입하였다. 염색된 세포 샘플은 BD FACS 칸토 II를 사용하여 분석하였다.
(1) KHYG-1 세포를 10% FBS(소 태아 혈청), 2mM L-글루타민, 페니실린(100 U/mL)/스트렙토마이신(100 mg/mL) 및 IL-2(10 ng/mL)를 함유하는 RPMI1640 배지에서 배양하였다.
(2) KHYG-1 세포(전기천공 6시간 후, 페니실린/스트렙토마이신 무첨가 RPMI1640 배지에서 배양)를 100nM CMA 또는 동일 부피의 비히클(DMSO)로 2시간 추가로 처리하였다.
(3) 세포를 원심 분리(1500rpm × 5 분)에 의해 세포를 수집하고(1×106 세포/시험) 상등액을 흡인하였다.
(4) 세포를 PBS 용액 중 4% 파라포름알데히드에서 실온에서 15분간 고정하였다.
(5) 세포를 4 mL의 FACS 완충액(PBS, 0.5-1% BSA, 0.1% 아지드화나트륨)으로 2회 세척하였다.
(6) 세포를 1mL의 PBS/0.1% 사포닌 완충액으로 실온에서 30분간 투과성으로 만들었다.
(7) 세포를 4 mL의 PBS/0.1% 사포닌 완충액으로 세척하였다.
(8) 세포를 100㎕의 PBS/0.1% 사포닌 완충액에 재현탁한 후, 5㎕의 항체를 각 튜브에 첨가하고 얼음에서 30분간 인큐베이션하였다.
(9) 세포를 1500rpm에서 5분간 원심 분리하여 PBS/0.1% 사포닌 완충액으로 3회 세척하였다.
(10) 세포를 얼음 냉각 FACS 완충액 500㎕에 재현탁하고 분석할 때까지 얼음에서 또는 냉장고에 4℃에서 잠시 보관하였다.
(11) 세포를 유세포 측정기(BD FACS 칸토 II)에서 분석하였다. 데이터는 플로우조 7.6.2 소프트웨어를 사용하여 처리하였다.
CMA 처리는 KHYG-1 세포에서 퍼포린 발현 수준을 유의하게 감소시켰으며(도 20), KHYG-1 세포(도 21)의 생존도에 부정적인 영향을 미치지 않았다.
CMA의 존재하에 NK 세포 TRAIL 변이체의 세포독성
KHYG-1 세포를 실시예 6에서 상기한 바와 같이 TRAIL 변이체(TRAIL D269H/E195R)로 트랜스펙션시켰다.
(1) MM1.S 세포를 표적 세포로 사용하였다.
(2) TRAIL mRNA의 전기천공 6시간 후, KHYG-1 세포를 100mM CMA 또는 동일 부피의 비히클로 2시간 처리하였다.
(3) KHYG-1 세포를 원심 분리에 의해 RPMI1640 배지로 세척하고, IL-2를 함유하는 RPMI1640 배지에 재현탁하고, 세포 농도를 1×106/mL로 조정하였다.
(4) MM1.S 세포를 IL-2를 함유하는 RPMI1640 배지에 1x106/mL로 세포 농도를 조정하여 재현탁하였다.
(5) KHYG-1 및 MM1.S 세포를 1:1의 비율로 혼합하고 12시간 동안 동시 배양하였다.
(6) KHYG-1 세포의 세포독성에 대한 유세포 측정 분석을 수행하였다. 동시 배양된 세포를 세척하고 CD2-APC 항체(5㎕/시험)로 염색하였다.
(7) 세척 후, 아넥신V 결합 완충액을 사용하여 아넥신V-FITC(5㎕/시험) 및 사이톡스-그린(5㎕/시험)으로 추가 염색을 수행하였다.
(8) 데이터는 플로우조 7.6.2 소프트웨어를 사용하여 추가로 분석하였다. CD2 음성 집단은 MM1.S 세포를 나타낸다. KHYG-1 세포는 CD2에 대해 강한 양성이다. 이어서, CD2 음성 집단에서 아넥신V-FITC와 사이톡스-그린 양성 세포를 분석하였다.
TRAIL 변이체를 발현하는 NK 세포가 TRAIL 변이체의 발현이 결여된 대조군 세포보다 높은 세포독성을 나타냄을 다시 한번 보였다(도 22). 그러나 이 실시예에서, CMA로 처리된 대조군 NK 세포에 대한 결과와는 대조적으로, CMA가 TRAIL 변이체를 발현하는 NK 세포의 세포독성 활성을 현저하게 감소시킬 수 없음을 추가로 보였다.
TRAIL 변이체가 없는 NK 세포(대조군 또는 모의 NK 세포)는 CMA의 부재하에서 48% 암세포 사멸을 유도하고 CMA의 존재하에서 35.9% 암세포 사멸을 유도하는 것으로 나타났다(도 22). TRAIL 변이체를 발현하는 NK 세포는 CMA의 존재 및 부재하에서 모두 대조군 NK 세포보다 더 많은 암세포 사멸을 유도할 수 있었다. 실제로, CMA가 존재하더라도, TRAIL 변이체를 발현하는 NK 세포는 CMA의 부재하에서 대조군 NK 세포보다 더 많은 암세포 사멸을 유발하였다.
따라서, 이 데이터는 퍼포린이 관련된 하향조절에 덜 민감한 기전을 통해 암세포에 대한 NK 세포의 세포독성을 증가시키는데 있어 TRAIL 변이체의 중요성을 보여준다. 퍼포린은 표적 세포를 살해하는 NK 세포에 의해 일반적으로 사용되고, 많은 암세포는 세포독성 공격을 회피하기 위해 NK 세포 퍼포린 발현을 감소시키는 기전을 발전시켰기 때문에, 본 발명의 NK 세포는 암세포에 의한 약화에 대한 감수성이 더 적은 강력한 대안이다.
실시예 10 - KHYG -1 세포에서의 돌연변이 TRAIL 변이체와 체크포인트 억제 수용체 CD96의 녹다운의 조합된 발현
체크포인트 억제 수용체 CD96 발현을 녹다운시킬 때와 TRAIL 변이체를 발현 할 때에도 NK 세포의 세포독성의 증가가 관찰되었다. 본 발명자는 NK 세포의 세포독성에 대한 상승 효과를 유발하기 위해 2가지 유전자 변형을 조합하여 시험하였다.
CD96 발현은 실시예 2에서 기재된 바와 같이 KHYG-1 세포에서 녹다운시켰다.
KHYG-1 세포를 실시예 6에서 상기한 바와 같이 TRAIL 변이체(TRAIL D269H/E195R)로 트랜스펙션시켰다.
(1) 전기천공 12시간 후 KHYG-1 세포를 12 웰 플레이트(2mL/웰)에서 1x106/mL의 농도로 12시간 동안 표적 세포(K562 또는 MM1.S)와 동시 배양하였다. E:T 비율은 1:1이었다.
(2) 동시 배양 12시간 후, 세포를 수집하고, 세척하고, CD2-APC로 염색하고, 다시 세척하고 아넥신V 결합 완충액을 사용하여 아넥신V-FITC(5㎕/검사) 및 사이톡스-그린(5㎕/검사)으로 추가로 염색하였다.
(3) 세포 샘플은 BD FACS 칸토 II 유세포 측정기를 사용하여 분석하였다. 데이터는 플로우조 7.6.2 소프트웨어를 사용하여 추가로 분석하였다. CD2 음성 집단은 MM1.S 세포를 나타낸다. KHYG-1 세포는 CD2에 대해 강한 양성이다. 이어서, CD2 음성 집단에서 아넥신V-FITC와 사이톡스-그린 양성 세포를 분석하였다.
KHYG-1 세포에서 동시에 CD96 발현을 녹다운시키고 TRAIL 변이체를 발현하는 것은 K562 표적 세포(도 23) 및 MM1.S 표적 세포(도 24) 모두에 대한 세포의 세포독성을 상승적으로 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 이는 두 표적 세포군 모두에서 개별 유전자 변형 단독으로 인한 것보다 동시의 유전자 변형으로 인해 세포 사멸이 더 많은 것으로 나타났다.
동시에, TRAIL 돌연변이체/변이체의 발현이 NK 세포의 세포독성을 증가시킴을 보여주는 추가적인 증거뿐 아니라 CD96의 녹다운이 NK 세포의 세포독성을 증가시킴을 보여주는 추가의 증거(도 23 및 24)를 얻었다(도 23 및 24).
실시예 11 - NK 세포의 세포독성에 미치는 IL-6의 직접 및 간접 효과
재료 및 방법
재조합 인간 IL-2(카탈로그: 200-02)와 IL-6(카탈로그: 200-06)은 페프로테크(PEPROTECH)에서 구입하였다. IL-2는 100mM 아세트산 용액에 재구성하고, 소분하여 -80℃에 보관하였다. IL-6은 0.1% BSA를 함유한 PBS로 재구성하고, 소분하여 -80℃에 보관하였다.
RPMI1640 배지(카탈로그: R8758)는 시그마-알드리치(SIGMA-ALDRICH)에서 구입하였다. 소 태아 혈청은 시그마-알드리치(카탈로그: F7524)에서 구입하였다. 10,000 단위 페니실린 및 10mg 스트렙토마이신/mL(카탈로그: P4333)로 안정화된 100X 페니실린-스트렙토마이신 용액은 시그마-알드리치에서 구입하였다. 세포 배양용 말 혈청(카탈로그: H1138-500ML)은 시그마-알드리치에서 구입하였다. 알파 MEM 배지(카탈로그: 12561056)는 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)에서 구입하였다.
PE 표지된 마우스 항-인간 CD130(IL-6 수용체 알파 사슬)(카탈로그: 551850), PE 표지된 마우스 항-인간 CD130(gp130, IL-6 수용체 관련 신호전달 인자)(카탈로그#: 555757), PE 표지된 마우스 IgG1 k 아이소형 대조군(카탈로그: 555749), APC-표지된 마우스 항-인간 CD2(카탈로그: 560642), FITC-표지된 마우스 항-인간 CD2(카탈로그: 555326), APC-표지된 마우스 항-인간 PD-L1(카탈로그: 563741) 및 APC-표지된 마우스 항-인간 PD-L2(카탈로그: 557926)는 BD 파민젠에서 구입하였다. APC-표지된 마우스 항-인간 PD1 항체(카탈로그: 329907)는 바이오레전드에서 구입하였다. 포스포(Phosphor)-Stat3(Ser727) 마우스 mAb(카탈로그: 9136), 포스포-Shp-1(Tyr564) 토끼 mAb(카탈로그: 8849), 포스포-Shp-2(Tyr580) 토끼 mAb(카탈로그: 5431), 포스포-p44/42 MAPK (Erk1/2)(Thr202/Tyr204) 토끼 mAb(카탈로그: 4370) 및 p44/42 MAPK (Erk1/2) 토끼 mAb는 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)에서 구입하였다. 포스포-Stat3(Tyr705) 마우스 mAb(카탈로그: sc-81523) 및 토끼 항-인간 Stat3 다클론 항체(카탈로그: sc-7179)는 산타 크루즈 바이오테크놀로지에서 구입하였다. 마우스 항-베타 액틴(카탈로그: A5441)은 시그마-알드리치에서 구입하였다. 기능성 IL-6 차단 항체(카탈로그: 501110) 및 관련 아이소형 대조군 항체(카탈로그: 400414)는 바이오레전드에서 구입하였다.
죽은 세포의 유세포 측정 분석을 위한 DNA 염료 사이톡스® 그린(카탈로그: s34860)은 라이프 테크놀로지스에서 구입하였다. 아폽토시스 세포의 유세포 측정 분석을 위한 아넥신 V-FITC 항체(카탈로그: 556419)는 BD 파민젠에서 구입하였다.
NK 세포주 KHYG-1을 10% FBS, 100U/mL의 페니실린/100㎎/mL의 스트렙토마이신 및 10ng/mL의 IL-2를 함유하는 RPMI1640 배지에서 배양하고 유지시켰다. NK 세포주 NK-92를 10% 말 혈청, 10% FBS, 100U/mL의 페니실린/100mg/mL의 스트렙토마이신 및 10ng/mL의 IL-2를 함유하는 알파 MEM에서 배양하였다. 2 내지 3일마다, KHYG-1 및 NK-92 세포를 배양하기 위한 배지를 교환하거나 세포를 1:2 또는 1:3 희석하여 나누었다.
K562, U937, HL60, Raji, RPMI8226, U266, MM1.S, NCI-H929 및 KMS11 세포를 10% FBS 및 100U/mL 페니실린/100mg/mL 스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640에서 배양하였다.
IL-6 수용체 발현
유세포 분석법을 사용하여 다양한 이펙터 및 표적 세포 상의 IL-6 수용체 및 gp130의 발현 수준을 정량하였다.
세포(대수 단계)를 원심분리(1500 rpm에서 5분간)에 의해 수거하고, 100만 세포/시험의 밀도를 사용하였다. 세포를 0.1% BSA 및 0.1% 아지드화나트륨을 함유하는 얼음 냉각 PBS로 세척하였다. 마지막으로, 세포를 얼음에서 0.1% BSA 및 0.1% 아지드화나트륨을 함유하는 50μL의 PBS 중 PE 표지된 CD126, CD130 또는 아이소형 대조군 항체(2.5μL/시험)에 30분 동안 노출시켰다. 얼음 냉각 PBS로 세포를 2회 세척한 후, 샘플을 FACS 칸토 II(BD Biosciences)에서 수득하였다. 결과는 플로우조 7.6.1 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
[도 31] 내지 [도 44]는 KHYG-1, NK-92, RPMI8226, MM1.S, NCI-H929, U266, KMS11 및 K562 세포 상의 IL-6 수용체(CD126) 및 gp130(CD130) 발현을 나타낸다.
KHYG-1 세포는 낮은 수준의 CD126(도 31 및 32)과 CD130(도 33 및 34)을 발현하였다.
NK-92 세포는 낮은 수준의 CD126(도 35) 및 CD130(도 36)을 발현하였다.
MM 세포(U266, RPMI8226, NCI-H929, KMS11 및 MM1.S)는 상대적으로 높은 수준의 CD126 및 CD130을 발현하였다(각각 도 37 내지 41).
그러나 백혈병 K562 세포는 CD126 음성이었지만(도 42 및 43) 상대적으로 높은 수준의 CD130을 발현하였다(도 44).
IL-6에 의한 NK 세포의 세포독성의 직접적인 억제
KHYG-1, RPMI8226, MM1.S 및 K562 세포를 상기한 바와 같이 배양하고 유지시켰다. 세포를 대수 단계에서 수거하고, 세척하고 예열된 적절한 배지에 재현탁한 다음, 세포 농도를 1 백만/mL로 조정하였다. 표적 세포의 농도는 E:T(이펙터: 표적) 비율에 따라 조정하였다. 24 웰 플레이트의 한 웰에 0.5 mL의 KHYG-1 세포 및 0.5 mL의 표적 세포를 첨가하였다. IL-6을 100ng/mL의 최종 농도로 웰에 첨가하였다. 그 후, 플레이트를 가습된 37℃/5% CO2 인큐베이터에 12시간 동안 두었다(K562 세포일 경우 6 또는 4시간). 0시간 시점에서의 KHYG-1과 표적 세포의 동일한 혼합물을 대조군으로 사용하였다.
유세포 분석법을 사용하여 KHYG-1 세포의 세포독성을 측정하였다. 동시 배양된 세포를 수집하고(상이한 시점에서), 세척한 후 먼저 CD2-APC 항체(2.5 ㎕/시험)로 염색한 다음 아넥신V 결합 완충액을 사용하여 아넥신V-FITC(2.5 ㎕/시험) 및 사이톡스-그린(0.5 ㎕/시험)으로 염색하였다. 플로우조 7.6.1 소프트웨어를 사용하여 데이터를 추가로 분석하였다. KHYG-1 세포 및 표적 세포를 각각 나타내는 CD2 양성 및 CD2 음성 게이트를 각각 정하였다. KHYG-1 세포는 CD2에 대해 100% 양성이었지만, K562, RPMI8226 및 MM1.S 세포는 CD2 음성이었다. 마지막으로, CD2 음성 집단에서 아넥신V-FITC 및 사이톡스-그린 양성 세포(죽은 세포)의 비율을 분석하였다.
[도 25] 내지 [도 30]은 IL-6이 1:1의 E:T 비율에서 RPMI8226, MM1.S 및 K562 표적 세포에 대한 KHYG-1 세포의 세포독성을 억제함을 보여준다.
IL-6(100ng/mL)의 존재하에서, KHYG-1 세포와 동시 배양되었을 때, 죽은 표적 세포의 비율이 감소하였다. 이것은 12시간 인큐베이션 후 RPMI8226 세포(도 25 및 26), 12시간 인큐베이션 후 MM1.S 세포(도 27 및 28) 및 6시간 인큐베이션(도 29) 또는 4시간 인큐베이션(도 30) 후 K562 세포의 경우였다.
K562 세포는 CD126 음성이기 때문에, 결과는 KHYG-1 세포의 세포독성에 미치는 억제 효과가 KHYG-1 세포 상의 IL-6 수용체를 통해 직접적으로 매개되었음을 보여준다.
KHYG-1 세포독성의 관찰된 IL-6 유도된 억제 뒤에 기전을 더 조사하기 위해서, KHYG1 세포를 IL-2 존재하에 50ng/mL의 IL-6으로 24시간 동안 자극한 후 NKG2D(활성화 수용체) 및 NKG2A(억제 수용체) 발현 수준을 유세포 측정법으로 분석하였다. 음성 대조군은 FMO를 의미한다. APC 항-인간 NKG2D 항체(카탈로그 번호 # 320807)는 바이오레전드에서 구입하였다. APC 항-인간 NKG2A 항체(카탈로그 번호 FAB1059A)는 R&D 시스템즈에서 구입하였다.
[도 70]에서 볼 수 있듯이, IL-6은 활성화 수용체인 NKG2D(70A)의 발현 수준을 감소시키는 반면 억제 수용체인 NKG2A(70B)의 발현을 증가시킴으로써 KHYG-1 세포의 세포독성을 직접적으로 억제한다.
IL-6에 의한 NK 세포의 세포독성의 간접적인 억제
대수 단계의 MM 세포를 10% FBS를 함유하는 RPMI1640 배지에서 5십만/ml로 접종하였다. 최종 농도 100ng/mL의 IL-6 또는 동일한 부피의 비히클(PBS)을 사용하여 MM 세포를 48시간 동안 처리하였다. 그 후 MM 세포를 수거하고, 세척하고 PD-L1 및 PD-L2 항체(2.5 ㎕/시험)로 염색하였다. FACS 칸토 II를 사용하여 유세포 분석 데이터를 수득하고 결과를 FACSDIVA 8.0.1 소프트웨어로 추가로 분석하였다.
[도 45 내지 56]은 IL-6가 RPMI8226, NCI-H929, MM1.S 및 U266 세포 상의 PD-L1 및 PD-L2의 발현을 증가시켰음을 보여준다.
RPMI8226 세포(도 45), NCI-H929 세포(도 47), MM1.S 세포(도 49 및 50) 및 U266 세포(도 53 및 54)에서 IL-6 유도된 PD-L1의 상향 조절이 관찰되었다.
RPMI8226 세포(도 46), NCI-H929 세포(도 48), MM1.S 세포(도 51 및 52) 및 U266 세포(도 55 및 56)에서 IL-6 유도된 PD-L2의 상향 조절이 관찰되었다.
PD-L1과 PD-L2는 NK 세포 상의 체크포인트 억제 수용체(cIR) PD-1에 결합하는 것으로 잘 알려져 있기 때문에, 이 데이터는 IL-6가 암세포에도 작용함으로써 NK 세포의 세포독성을 억제하는 두 번째(간접적인) 기전을 명확히 보여준다.
이 두 가지 설명된 기전은 암세포 생존에 관여하는 주요 사이토카인으로서 IL-6을 나타냈다.
IL-6 길항 작용의 효과
대수 단계의 U266 세포를 10% FBS를 함유하는 RPMI1640 배지에서 5십만/ml로 접종하였다. 최종 농도 10μg/mL의 래트 항-인간 IL-6 mAb 또는 아이소형 대조군 항체를 첨가하여 U266 세포에 의해 분비되는 IL-6을 차단하였다. 48시간의 시점에서, U266 세포를 수거하고, 세척하고, PD-L1 및 PD-L2 항체(2.5 ㎕/시험)로 염색하였다. FACS 칸토 II를 사용하여 유세포 측정 데이터를 수득하고 결과를 FACSDIVA 8.0.1 소프트웨어를 사용하여 추가로 분석하였다.
[도 57] 내지 [도 60]은 IL-6 차단 항체의 존재하에서 U266 세포 상의 PD-L1 발현이 유의하게 감소하였음을 보여준다.
[도 61] 내지 [도 64]는 IL-6 차단 항체의 존재하에 U266 세포 상의 PD-L2 발현이 유의하게 감소하였음을 보여준다.
따라서, IL-6 신호전달의 길항 작용은 IL-6 차단 항체를 사용함으로써 달성될 수 있는 것으로 보인다.
이 데이터는 IL-6 신호전달이 암세포 상의 PD-L1 및 PD-L2의 발현 조절에 관여함을 확인해준다.
따라서, 본 발명에 따른 IL-6 신호전달 차단은 NK 세포의 세포독성의 직접 및 간접적인 IL-6 유도된 억제를 방지하기 때문에 암 치료에서의 용도를 갖는다. 또한, IL-6 신호전달을 차단함으로써 암세포에 미치는 IL-6의 직접적인 증식 또는 항-아폽토시스 효과가 방지된다.
이를 더 입증하기 위해, 2 μg/mL의 IL-6 차단 단클론 항체(리프(LEAF)™ 정제된 항-인간 IL-6 항체, 바이오레전드, 카탈로그 번호 #501110) 또는 동일한 용량의 아이소형 대조군 항체(바이오레전드, 카탈로그 번호 #400413)의 존재하에 상기와 같이 U266 세포로 KHYG-1 세포를 자극하였다.
[도 69]에서 볼 수 있듯이, 단클론 항체를 사용한 IL-6의 차단으로 U266 세포에 대한 KHYG-1 세포독성을 회복시켰다(E:T 비율 1:1, 12시간 인큐베이션). 따라서, RPMI8226, MM1.S 및 K562 표적 세포에 대한 상기 데이터 이외에, 이는 IL-6 신호전달의 억제로 kHYG-1 세포가 다른 암세포 주에서 표적 암세포를 살해하는 능력을 증가시키는 것을 보여주었다.
NK 세포에서의 IL-6 신호전달
KHYG-1 세포를 상기한 바와 같이 배양하고 유지시켰다. IL-6 단독의 효과를 시험할 때, KHYG-1 세포를 10% FBS가 보충된 RPMI160 배지(IL-2 미함유)에서 6시간 동안 굶긴 후, 10ng/mL의 IL-2 및/또는 100ng/mL의 IL-6으로 자극하였다.
정상적인 조건에서 성장하는 KHYG-1 세포는 세포 증식을 촉진하고 세포독성을 유지하기 위해 IL-2를 필요로 한다.
[도 65]에 나타난 바와 같이, IL-2 단독으로 p-STAT3 및 p-P44/42를 활성화하지만 p-SHP1 및 p-SHP2의 발현을 감소시키는 것이 확인되었다.
[도 66]에 나타난 바와 같이, IL-6 단독으로 p-STAT3, p-SHP1 및 p-SHP2를 활성화시키지만 p-P44/42의 발현을 감소시켰다.
[도 67]에 나타난 바와 같이, IL-2의 존재하에, IL-6은 p-P44/42 발현을 감소시키고 p-SHP1 및 p-SHP2 발현을 증가시킬 수 있었다.
p-STAT3이 IL-6 신호전달 경로의 주요 하류 이펙터이고 p-P44/42의 수준이 NK 세포의 세포독성과 양의 상관관계가 있음이 모델(NK 세포 포함)에서 입증되었다.
상기 데이터는 p-SHP1 및 p-SHP2가 p-P44/42의 수준을 조절하는데 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다. 또한, 본원에서 IL-6 항-세포독성 신호전달은 IL-2 세포독성 촉진(pro-cytotoxic) 신호전달을 극복하여 NK 세포의 세포독성의 전체적인 감소를 유도하고, 효과적으로 역전될 수 있으며, 따라서 IL-6 길항 작용이 암 치료법으로서 제공될 수 있음을 보여준다.
암세포는 NK 세포 상에 PD-1 발현의 상향 조절을 유도하였다
10% FBS, 100U/mL 페니실린/100mg/mL 스트렙토마이신 및 10ng/mL IL-2를 함유하는 RPMI1640 배지에서 KHYG-1 세포를 배양하고 유지시켰다. K562, U937, HL60, Raji, RPMI8226, U266 및 MM1.S 세포를 10% FBS 및 100U/mL 페니실린/100mg/mL 스트렙토마이신이 보충된 RPMI1640에서 배양하였다. 세포를 대수 단계에서 수거하고, 세척하고, IL-2를 함유하는 예열된 RPMI1640 배지(KHYG-1 세포 배양용 배지)에서 재현탁한 후, 세포 농도를 1 백만/mL로 조정하였다. 표적 세포의 농도는 E:T(이펙터:표적) 비율에 따라 조정하였다. 24 웰 플레이트의 한 웰에 0.5 mL의 KHYG-1 세포 및 0.5 mL의 표적 세포를 첨가하고 24시간 동안 배양하였다. 세포를 수거하고, 세척하고 CD2-FITC(2.5 ㎕/시험) 및 PD1-APC(2.5 ㎕/시험) 항체로 염색하였다. 샘플을 FACS 칸토 II를 사용하여 수득하고 FACSDiva 8.0.1 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. CD2 양성 및 CD2 음성 게이트는 각각 KHYG-1 세포 및 표적 세포를 나타낸다. KHYG-1 세포는 CD2에 대해 100% 양성이지만 MM 세포 및 다른 악성 혈액암 세포주는 CD2 음성이다. 따라서, CD2 양성 집단(즉, KHYG-1 세포)에서의 PD-1 발현을 분석하였다.
[도 68]에서 볼 수 있듯이, 상이한 혈액암 세포주(E:T 비율 = 1:1)와 동시 배양된 KHYG-1 세포 상에 PD-1 발현의 유세포 측정 분석은 검사된 모든 혈액암 세포주에 의해 PD-1 발현이 유의하게 유도되었음을 밝혔다.
이 데이터는 NK 세포 상에 더 높은 PD-1 발현으로 PD-L1 및/또는 PD-L2를 발현하는 암에 의해 더 큰 정도의 세포독성 억제를 일으키기 때문에 NK 세포의 세포독성에 미치는 암세포의 억제 효과를 뚜렷이 나타낸다.
따라서 본원에서 암세포가 NK 세포 상에 cIR PD-1의 발현을 상향조절하는 한편, IL-6이 NK 세포의 세포독성을 직접적으로 감소시키고 암세포 상에 PD-L1 및 PD-L2의 발현을 상향조절함을 보여준다. NK 세포 상의 PD-1 발현 증가와 암세포 상의 PD-L1 및 PD-L2 발현 증가는 함께 작용하여 NK 세포독성을 유의하게 억제한다. 또한, IL-6은 암세포 증식을 직접적으로 촉진한다.
상기에 나타낸 바와 같이 IL-6 신호전달의 차단은 암세포, 특히 IL-6 수용체를 발현하는 암세포의 생존을 감소시키는데 있어 치료 용도를 갖는다.
IL-6 길항제 치료 프로토콜
다발성 골수종 환자 치료에 사용하기 위해 다음 프로토콜을 개발하였다. 그렇지만, 본 발명이 IL-6R-발현 암을 비롯한 다수의 다양한 암 환자를 치료하기에 적합하다는 것은 명백하다.
IL-6R 양성 암 환자, 이 경우 다발성 골수종 환자를 진단한 후, NK 세포의 분액을 해동하고 배양하고 나서, 유효량으로 환자에게 투여한다. 소분된 세포는 본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같이 변형될 수 있다. 다르게는, 예를 들어, 바이러스 방법, 전기천공 등을 사용하여 일시적인 트랜스펙션을 준비할 수 있다. 전기천공일 경우, 맥스사이트 유동 전기천공 플랫폼은 병원에서 신속하고 대규모의 트랜스펙션을 달성하는데 적합한 해결책을 제공한다. NK 세포를 트랜스펙션시킨 후, 이들을 변형을 발현할 수 있도록 배양한 후 환자에게 정맥 내 투여한다.
NK 세포의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 IL-6 길항제를 환자에게 유효량으로 투여한다. 이 IL-6 길항제는 하나의 길항제 또는 이들의 조합일 수 있다. 결합 결과가 IL-6 신호전달을 감소시킨다면(길항한다면), IL-6 길항제(들)는 IL-6, IL-6R, gp130 등에 결합할 수 있다.
따라서, 본 발명은 NK 세포 기반 암 치료법에서 IL-6 신호전달의 길항 작용을 제공한다.
SEQUENCE LISTING <110> Onkimmune Limited <120> IMPROVED NK-BASED CELL THERAPY <130> P40309WO <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9540 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctctggcctc tgttctttct tgtgagtccg tctacacttg gggtttccac atgtcttttt 60 ctgctcatga ccttgatact ctgggtattt cagaaatgct acacatacgt ttctccatta 120 cggtcagatg tgacatcttg agtggactca tcaatcacct acagaatgtg gagtccaaca 180 gcaagatcct ctcacgtccc aaagcctcag gtcttaccct ggtctggaaa tcaagcacaa 240 atgagcccct cccaatgtcc caggcaccac tgaccccaca accactgtga cgagtgggat 300 tcatgacaac aatctgcaaa ggaagaaact gaggctcagt gatgggacat tacaaaccaa 360 ggtcacgtag gcagcggatg ataaccagtc atcaaataaa tatcaactcc ctcccccact 420 ccccaaatca aagctcaaac ataagtcatt gttcccaaaa tgttgaccag gaattgaggt 480 gcagagggac ggctaaggac gcaatgggca ccgaggaggc aggaaagact cagaggtttc 540 ttcccggggg ggagggagtg gacgctggag caaaaacatt taaaaagggg aagttaagag 600 gggactattt ggttgaaaga aaacccacaa tccagtgtca agaaagaagt caacttttct 660 tcccctactt ccctgcattt ctcctctgtg ctcactgcca 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gggtctatgt gaaaatgccc ccaacagagc 5580 cagaatgtga aaagcaattt cagccttatt ttattcccat caattgagaa accattatga 5640 agaagagagt ccatatttca atttccaaga gctgaggcaa ttctaacttt tttgctatcc 5700 agctattttt atttgtttgt gcatttgggg ggaattcatc tctctttaat ataaagttgg 5760 atgcggaacc caaattacgt gtactacaat ttaaagcaaa ggagtagaaa gacagagctg 5820 ggatgtttct gtcacatcag ctccactttc agtgaaagca tcacttggga ttaatatggg 5880 gatgcagcat tatgatgtgg gtcaaggaat taagttaggg aatggcacag cccaaagaag 5940 gaaaaggcag ggagcgaggg agaagactat attgtacaca ccttatattt acgtatgaga 6000 cgtttatagc cgaaatgatc ttttcaagtt aaattttatg ccttttattt cttaaacaaa 6060 tgtatgatta catcaaggct tcaaaaatac tcacatggct atgttttagc cagtgatgct 6120 aaaggttgta ttgcatatat acatatatat atatatatat atatatatat atatatatat 6180 atatatatat atatatattt taatttgata gtattgtgca tagagccacg tatgtttttg 6240 tgtatttgtt aatggtttga atataaacac tatatggcag tgtctttcca ccttgggtcc 6300 cagggaagtt ttgtggagga gctcaggaca ctaatacacc aggtagaaca caaggtcatt 6360 tgctaactag cttggaaact ggatgaggtc 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attttgcaaa tgtggggaaa acacacacct 7260 gtggtcctat gttgctatca gctggcacac ctaggcctgg cacactaagc cctctgtgat 7320 tcttgcttaa ccaatgtata gtctcagcac atttggtttc cacttaaggt ttcct 7375 <210> 8 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala 1 5 10 15 Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro 20 25 30 Val Phe Cys Lys 35 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 cactcacctt tgcagaagac agg 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 ccttgtgccg ctgaaatcca agg 23 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 aggacccttg tactccagga aattctcca 29 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 agcccctact aaatacctgg cgctct 26

Claims (70)

  1. 암 치료에 사용하기 위한 IL-6 길항제와 병용되는 자연 살해(NK) 세포 또는 세포주.
  2. 제1항에 있어서, 암은 IL-6 수용체를 발현하는 것인 NK 세포 또는 세포주.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 암은 PDL-1 및/또는 PDL-2를 발현하는 것인 NK 세포 또는 세포주.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, IL-6 길항제는 IL-6, IL-6R 또는 gp130 중 하나에 결합하는 항체인 NK 세포 또는 세포주.
  5. 제4항에 있어서, IL-6 항체는 실툭시맙, 올로키주맙(CDP6038), 엘실리모맙, BMS-945429(ALD518), MH-166 및 시루쿠맙(CNTO 136)으로부터 선택되는 것인 NK 세포 또는 세포주.
  6. 제5항 또는 제6항에 있어서, IL-6R 항체는 토실리주맙, 사릴루맙, PM-1 및 AUK12-20으로부터 선택되는 것인 NK 세포 또는 세포주.
  7. 제4항에 있어서, gp130 항체는 AM64인 NK 세포 또는 세포주.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 별개의 항암 치료법과 병용되는 NK 세포 또는 세포주.
  9. 제8항에 있어서, 별개의 항암 치료법은 면역 이펙터 세포로서 내인성 NK 세포를 사용하는 것인 NK 세포 또는 세포주.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 별개의 항암 치료법은 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)인 NK 세포 또는 세포주.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 혈액암인 NK 세포 또는 세포주.
  12. 제11항에 있어서, 혈액암은 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 호지킨 림프종, T 세포 림프종 및 B 세포 림프종을 포함하는 비호지킨 림프종, 무증상 골수종, 무증상 다발성 골수종(SMM: smoldering multiple myeloma), 다발성 골수종(MM) 또는 경쇄 골수종인 NK 세포 또는 세포주.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 체크포인트 억제 수용체의 발현이 감소하도록 유전자 변형된 NK 세포 또는 세포주.
  14. 제13항에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT 및 TIM-3으로부터 선택되는 것인 NK 세포 또는 세포주.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현하도록 유전자 변형된 NK 세포 또는 세포주.
  16. 제15항에 있어서, 돌연변이 TRAIL 리간드는 TRAIL 수용체, 예를 들어 DR4 및/또는 DR5에 대해 친화도가 증가한 것인 NK 세포 또는 세포주.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 돌연변이 TRAIL 리간드는 유인(decoy) TRAIL 수용체에 대해 친화도가 감소한 것인 NK 세포 또는 세포주.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 NK 세포 또는 세포주.
  19. 제18항에 있어서, CAR은 이중 특이적 CAR인 NK 세포 또는 세포주.
  20. 제19항에 있어서, 이중 특이적 CAR은 하나의 세포 유형 상의 두 리간드에 결합하는 것인 NK 세포 또는 세포주.
  21. 제19항에 있어서, 이중 특이적 CAR은 2가지 상이한 세포 유형의 각 유형 상의 한 리간드에 결합하는 것인 NK 세포 또는 세포주.
  22. 제11항 또는 제22항에 있어서, CAR 또는 이중 특이적 CAR에 대한 리간드(들)는 암세포 상에 발현되는 것인 NK 세포 또는 세포주.
  23. 제22항에 있어서, 이중 특이적 CAR에 대한 리간드는 둘 다 암세포 상에 발현되는 것인 NK 세포 또는 세포주.
  24. 제22항에 있어서, 이중 특이적 CAR에 대한 리간드는 암세포 및 면역 이펙터 세포 상에 발현되는 것인 NK 세포 또는 세포주.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, IL-6 수용체의 발현이 감소하도록 유전자 변형된 NK 세포 또는 세포주.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포주는 KHYG-1인 NK 세포 또는 세포주.
  27. 암 치료에 사용하기 위한 IL-6 길항제로서, 암의 세포는 IL-6 수용체를 발현하는 것인 IL-6 길항제.
  28. 제27항에 있어서, 암은 PDL-1 및/또는 PDL-2를 발현하는 것인 IL-6 길항제.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, IL-6, IL-6R 또는 gp130 중 하나에 결합하는 항체인 IL-6 길항제.
  30. 제29항에 있어서, IL-6 항체는 실툭시맙, 올로키주맙(CDP6038), 엘실리모맙, BMS-945429(ALD518), MH-166 및 시루쿠맙(CNTO 136)으로부터 선택되는 것인 IL-6 길항제.
  31. 제29항에 있어서, IL-6R 항체는 토실리주맙, 사릴루맙, PM-1 및 AUK12-20으로부터 선택되는 것인 IL-6 길항제.
  32. 제29항에 있어서, gp130 항체는 AM64인 IL-6 길항제.
  33. 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 별개의 항암 치료법과 병용되는 IL-6 길항제.
  34. 제33항에 있어서, 별개의 항암 치료법은 면역 이펙터 세포로서 내인성 NK 세포를 사용하는 것인 IL-6 길항제.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 별개의 항암 치료법은 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)인 IL-6 길항제.
  36. 제27항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 혈액암인 IL-6 길항제.
  37. 제36항에 있어서, 혈액암은 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 호지킨 림프종, T 세포 림프종 및 B 세포 림프종을 포함하는 비호지킨 림프종, 무증상 골수종, 무증상 다발성 골수종(SMM), 다발성 골수종(MM) 또는 경쇄 골수종인 IL-6 길항제.
  38. 암의 치료 방법으로서, 유효량의 NK 세포와 IL-6 길항제의 조합물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 암은 IL-6 수용체를 발현하는 것인 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 암은 PDL-1 및/또는 PDL-2를 발현하는 것인 방법.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포 또는 세포주는 사전 결합된 IL-6 길항제와 함께 제공되는 것인 방법.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, IL-6 길항제는 IL-6, IL-6R 또는 gp130 중 하나에 결합하는 항체인 방법.
  43. 제42항에 있어서, IL-6 항체는 실툭시맙, 올로키주맙(CDP6038), 엘실리모맙, BMS-945429(ALD518), MH-166 및 시루쿠맙(CNTO 136)으로부터 선택되는 것인 방법.
  44. 제42항에 있어서, IL-6R 항체는 토실리주맙, 사릴루맙, PM-1 및 AUK12-20으로부터 선택되는 것인 방법.
  45. 제42항에 있어서, gp130 항체는 AM64인 방법.
  46. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 별개의 항암 치료법과 병용되는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 별개의 항암 치료법은 면역 이펙터 세포로서 내인성 NK 세포를 사용하는 것인 방법.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 별개의 항암 치료법은 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)인 방법.
  49. 제38항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 혈액암인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 혈액암은 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 호지킨 림프종, T 세포 림프종 및 B 세포 림프종을 포함하는 비호지킨 림프종, 무증상 골수종, 무증상 다발성 골수종(SMM), 다발성 골수종(MM) 또는 경쇄 골수종인 방법.
  51. 제38항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포 또는 세포주는 하나 이상의 체크포인트 억제 수용체의 발현이 감소하도록 유전자 변형된 것인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 체크포인트 억제 수용체는 CD96(TACTILE), CD152(CTLA4), CD223(LAG-3), CD279(PD-1), CD328(SIGLEC7), SIGLEC9, TIGIT 및 TIM-3으로부터 선택되는 것인 방법.
  53. 제38항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포 또는 세포주는 돌연변이 TRAIL 리간드를 발현하도록 유전자 변형된 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 돌연변이 TRAIL 리간드는 TRAIL 수용체, 예를 들어 DR4 및/또는 DR5에 대해 친화도가 증가한 것인 방법.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 돌연변이 TRAIL 리간드는 유인 TRAIL 수용체에 대해 친화도가 감소한 것인 방법.
  56. 제38항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포 또는 세포주는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 것인 방법.
  57. 제56항에 있어서, CAR은 이중 특이적 CAR인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 이중 특이적 CAR은 하나의 세포 유형 상의 두 리간드에 결합하는 것인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 이중 특이적 CAR은 2가지 상이한 세포 유형의 각 유형 상의 한 리간드에 결합하는 것인 방법.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, CAR 또는 이중 특이적 CAR에 대한 리간드(들)은 암세포 상에 발현되는 것인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 이중 특이적 CAR에 대한 리간드는 둘 다 암세포 상에 발현되는 것인 방법.
  62. 제60항에 있어서, 이중 특이적 CAR에 대한 리간드는 암세포 및 면역 이펙터 세포 상에 발현되는 것인 방법.
  63. 제38항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포 또는 세포주는 IL-6 수용체의 발현이 감소하도록 유전자 변형된 것인 방법.
  64. 제38항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포주는 KHYG-1인 방법.
  65. NK 세포 또는 세포주 및 IL-6 길항제를 포함하는 약학 조성물로서, NK 세포는 본원에 기재된 바와 같이 경우에 따라 변형된 것인 약학 조성물.
  66. IL-6 수용체의 기능이 감소하거나 없도록 변형된 NK 세포 또는 세포주.
  67. 제66항에 있어서, IL-6R의 발현이 감소하거나 없도록 유전자 변형된 NK 세포 또는 세포주.
  68. 인간 환자에서 (i) IL-6 수용체 발현 다발성 골수종, 및 (ii) IL-6 수용체 발현 백혈병으로부터 선택된 암을 치료하는 방법으로서, 유효량의, NK 세포와 IL-6을 중화시키는 항체의 조합물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 항체는 실툭시맙, 올로키주맙(CDP6038), 엘실리모맙, BMS-945429(ALD518), MH-166 및 시루쿠맙(CNTO 136)으로부터 선택되는 것인 방법.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, NK 세포는 KHYG-1인 방법.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112708675A (zh) * 2020-12-25 2021-04-27 中山大学肿瘤防治中心 骨髓nk细胞联合mcl1抑制剂在抗白血病中的应用
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CN114605560B (zh) * 2022-03-30 2024-02-20 江苏蒙彼利生物科技有限公司 一种car-nk细胞及其制备方法与应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0724532D0 (en) 2007-12-17 2008-01-30 Nat Univ Ireland Trail variants for treating cancer
US20130058921A1 (en) * 2009-10-30 2013-03-07 Frits VAN RHEE Use of autologous effector cells and antibodies for treatment of multiple myeloma
US9775921B2 (en) * 2009-11-24 2017-10-03 Alderbio Holdings Llc Subcutaneously administrable composition containing anti-IL-6 antibody
SG11201402611WA (en) * 2011-11-25 2014-06-27 Singapore Health Serv Pte Ltd Natural-killer/t-cell lymphoma (nktcl) susceptibility prediction, diagnosis and therapy
EP3286211A1 (en) * 2015-04-23 2018-02-28 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker

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