CN112708675A - 骨髓nk细胞联合mcl1抑制剂在抗白血病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了骨髓NK细胞联合MCL1抑制剂在抗白血病中的应用。具体地，本发明公开了一种检测试剂的用途，用于预测急性髓细胞性白血病(AML)的预后，其中，所述检测试剂为NK细胞抑制性受体KIR和/或NK细胞检测试剂。此外，本发明还公开了上述检测试剂与MCL1抑制剂在联合治疗AML中的应用，以及一种NK细胞联合MCL1抑制剂的药物组合物在治疗AML中的应用。本发明的试剂组合和药物组合可有效提高AML的治疗效率，为抗白血病治疗提供了新方法。

Description

骨髓NK细胞联合MCL1抑制剂在抗白血病中的应用
技术领域
本发明涉及肿瘤免疫治疗领域，具体地涉及骨髓NK细胞联合MCL1抑制剂在抗白血病中的应用。
背景技术
急性髓细胞性白血病(AML)是一种具有高死亡率且易于复发的侵袭性疾病。经典的诱导化疗方案(3+7，蒽环类和阿糖胞苷)十余年来基本保持不变，但其预后和存活率仍不理想。最近，细胞免疫疗法在急性淋巴细胞性白血病(ALL)和多发性骨髓瘤(MM)中取得了重大成功。因此，它被认为是AML潜在的有效治疗方法，可能是与髓系白血病细胞抗衡的新武器。
天然杀伤(NK)细胞是一种细胞毒性免疫细胞，其可以快速有效地识别和杀死癌细胞。近年来，越来越多的研究揭示了NK细胞的生物学特性及其直接识别癌细胞的能力。尽管免疫疗法在激活免疫系统对抗血液系统恶性肿瘤方面取得了重大突破，但目前基于NK细胞免疫疗法的研究很少。
因此，本领域亟待开发一种治疗效率更高的AML的细胞免疫疗法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过骨髓NK细胞预测AML患者预后和治疗AML的方法。
本发明的第一方面，提供了一种检测试剂的用途，其特征在于，用于制备一诊断试剂盒，所述诊断试剂盒用于预测急性髓细胞性白血病(AML)的预后，
其中，所述的检测试剂选自下组：NK细胞抑制性受体KIR检测试剂、NK细胞检测试剂、或其组合。
在另一优选例中，所述检测试剂为NK细胞抑制性受体KIR检测试剂。
在另一优选例中，所述的NK细胞抑制性受体KIR检测试剂用于检测受试对象的NK细胞抑制性受体KIR的相对表达量。
在另一优选例中，所述的相对表达量为mRNA相对表达量或蛋白相对表达量。
在另一优选例中，所述的预后是将来自受试对象样品的NK细胞抑制性受体KIR的相对表达量(A1)与正常人群的平均NK细胞抑制性受体KIR的相对表达量(A0)相比较，若A1显著高于A0，则说明受试对象的预后差。
在另一优选例中，所述的预后是将来自受试对象样品的NK细胞抑制性受体KIR的相对表达量与FLT3突变状态相结合，并如下进行分层预后：
当所述KIR的相对表达量为“高表达”且伴有FLT3突变，则表明预后非常差(IV级)；
当所述KIR的相对表达量为“高表达”但不伴有FLT3突变，则表明预后差(III级)；
当所述KIR的相对表达量为“中/低表达”但不伴有FLT3突变，则表明预后优于III级(II级)；
当所述KIR的相对表达量为“中/低表达”且伴有FLT3突变，则表明预后优于II级(I级)；
其中，所述“高表达”是指相对表达量大于TCGA数据库中KIRs最高表达量的66.7％，“中/低表达”是指相对表达量≤TCGA数据库中KIRs最高表达量的66.7％。
在另一优选例中，所述的受试对象为人类或非人类哺乳动物。
在另一优选例中，所述的受试对象患有或疑似患有急性髓细胞性白血病。
在另一优选例中，所述的样品为骨髓穿刺液。
在另一优选例中，所述的检测试剂为NK细胞检测试剂。
在另一优选例中，所述的NK细胞检测试剂为检测NK细胞表面标志物的检测试剂。
在另一优选例中，所述的NK细胞检测试剂用于检测来自受试对象样品的NK细胞的数量(包括相对数量、绝对数量、或相对比例)。
在另一优选例中，所述的NK细胞检测试剂用于检测受试对象样品的骨髓浸润细胞群中的NK细胞的数量或水平，或者用于检测骨髓浸润细胞群中的NK细胞/淋巴细胞的相对比例。
在另一优选例中，所述的预后是将来自受试对象的样品中骨髓NK细胞/淋巴细胞比例(B1)与急性髓细胞性白血病患者的平均骨髓NK细胞/淋巴细胞比例(B0)相比较，若B1显著低于B0，则说明受试对象预后差。
在另一优选例中，所述的受试对象为人类或非人类哺乳动物。
在另一优选例中，所述的受试对象患有或疑似急性髓细胞性白血病。
在另一优选例中，所述的样品为骨髓穿刺液。
在另一优选例中，所述NK细胞为CD45+CD3-CD56+CD16+的细胞。
本发明的第二方面，提供了一种试剂组合，所述的试剂组合包括：
(a)检测试剂，所述的检测试剂选自下组：NK细胞抑制性受体KIR检测试剂、NK细胞检测试剂、或其组合；和
(b)MCL1抑制剂。
在另一优选例中，所述的NK细胞抑制性受体KIR检测试剂用于检测受试对象的NK细胞抑制性受体KIR的相对表达量。
在另一优选例中，所述的NK细胞抑制性受体KIR检测试剂选自下组：测序引物、qPCR引物、抗体或其组合。
在另一优选例中，所述的NK细胞检测试剂用于检测来自受试对象样品的骨髓NK细胞的数量或NK细胞/淋巴细胞的相对比例。
在另一优选例中，所述的NK细胞检测试剂选自下组：测序引物、抗体、细胞染料、核酸芯片、蛋白芯片或其组合。
在另一优选例中，所述的NK细胞检测试剂是细胞表面抗原抗体，所述抗体包括抗CD45抗体、抗CD3抗体、抗CD56抗体、抗CD16抗体或其组合。
在另一优选例中，所述的MCL1抑制剂选自下组:Maritoclax、AZD5991、S63845或其组合。
在另一优选例中，所述的MCL1抑制剂为Maritoclax。
在另一优选例中，所述的受试对象为人类或非人类哺乳动物。
在另一优选例中，所述的受试对象患有或疑似急性髓细胞性白血病。
在另一优选例中，所述的样品为骨髓穿刺液。
本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括：
(Y1)检测试剂，所述的检测试剂选自下组：NK细胞抑制性受体KIR检测试剂、NK细胞检测试剂、或其组合；和
(Y2)MCL1抑制剂。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括标签和/或说明书。
在另一优选例中，所述的检测试剂为NK细胞抑制性受体KIR检测试剂，用于检测受试对象的NK细胞抑制性受体KIR的相对表达量。
在另一优选例中，所述的检测试剂为NK细胞检测试剂，用于检测NK细胞的数量或相对比例。
在另一优选例中，所述的MCL1抑制剂选自下组:Maritoclax、AZD5991、S63845或其组合。
在另一优选例中，所述的MCL1抑制剂为Maritoclax。
本发明的第四方面，提供了本发明第三方面所述的试剂组合的用途，用于制备治疗急性髓细胞性白血病的药物组合物或试剂盒。
在另一优选例中，当使用所述的NK细胞检测试剂检测的受试对象样品的骨髓NK细胞/淋巴细胞的相对比例≤20％，较佳地≤10％，则对受试对象施用MCL1抑制剂。
本发明的第五方面，提供了一种急性髓细胞性白血病(AML)预后系统，所述系统包括：
(a)预后特征输入模块，所述预后特征输入模块被配置为用于输入某一对象的预后特征；其中所述的预后特征包括选自下组：
(F1)所述对象的NK细胞抑制性受体KIR的相对表达数据；
(F2)所述对象的样品中骨髓NK细胞的数量、或NK细胞/淋巴细胞的相对比例；
(F3)F1和F2的组合；
(b)预后处理模块，所述预后处理模块被配置为对于输入的预后特征，按预定的判断标准进行评分处理，从而获得风险度评分；并且将所述风险度评分与急性髓细胞性白血病的风险度阈值进行比较，从而得出预后结果，其中，当所述风险度评分高于所述风险度阈值时，则提示该对象的急性髓细胞性白血病的预后劣于急性髓细胞性白血病患者的平均预后；当所述风险度评分低于所述风险度阈值时，则提示对象的急性髓细胞性白血病的风险预后优于急性髓细胞性白血病患者的平均预后；和
(c)预后结果输出模块，所述输出模块用于输出所述的预后结果；
其中，所述的对象为急性髓细胞性白血病患者或疑似患者。
在另一优选例中，所述的预后特征输入模块选自下组：流式细胞仪、实时荧光定量PCR仪、基因测序仪、扫描仪、键盘、平板电脑(PAD)、智能手机、或其组合。
在另一优选例中，所述的预后判别处理模块包括一处理器，以及一储存器，其中所述的储存器中存储有基于预后特征的急性髓细胞性白血病的风险度阈值数据；和/或
所述的输出模块包括显示器、打印机、平板电脑(PAD)、智能手机。
在另一优选例中，在所述处理模块中，如下进行风险度评分处理：
当对象样品的NK细胞抑制性受体KIR的相对表达量(A1)与正常人群的平均NK细胞抑制性受体KIR的相对表达量(A0)相比较，A1显著高于A0，和/或
对象的样品中骨髓NK细胞/淋巴细胞比例(B1)与急性髓细胞性白血病患者的平均骨髓NK细胞/淋巴细胞比例(B0)相比较，B1显著低于B0，则风险度高于阈值，患者预后差。
在另一优选例中，所述的评分包括(a)单个预后特征的评分；和/或(b)多个预后特征的评分之和。
本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：
(i)NK细胞；
(ii)MCL1抑制剂；和
(iii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述药物组合物用于治疗急性髓细胞性白血病。
在另一优选例中，所述的MCL1抑制剂选自下组:Maritoclax、AZD5991、S63845或其组合。
在另一优选例中，所述的MCL1抑制剂为Maritoclax。
在另一优选例中，当使用NK细胞检测试剂检测的受试对象样品的骨髓NK细胞/淋巴细胞的相对比例≤20％，较佳地≤10％，则对受试对象施用所述药物组合物。
在另一优选例中，所述的受试对象为人类或非人类哺乳动物。
在另一优选例中，所述的受试对象患有或疑似急性髓细胞性白血病。
在另一优选例中，所述的样品为骨髓穿刺液。
本发明的第七方面，提供了一种治疗急性髓细胞性白血病的方法，所述方法包括向需要的对象施用本发明第二方面所述的试剂组合，或本发明第三方面所述的试剂盒，或本发明第六方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述的需要的对象患有或疑似急性髓细胞性白血病。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了基于BM浸润的NK细胞及其受体KIR，AML患者的总生存期(OS)。(a)具有或不具有FLT3突变的患者的KIRs表达水平。(b)分别根据KIR的表达水平为患者提供的OS的Kaplan-Meier图。(c)KIRs因素与FLT3突变状态相结合的预后价值。(d)在训练组(4例失踪)和验证组(10例失踪)中根据BM浸润的NK细胞患者的OS。
图2显示了NK细胞增强了与MCL1抑制剂协同作用的抗白血病活性。(a)使用单细胞RNA序列数据在诊断时和化疗后对AML样品中的NK细胞进行UMAP分析。进一步比较了其中NK细胞的百分比。(b)通过CD45+CD3-CD56+CD16+门控对BM浸润的NK细胞进行流式细胞术分析。(c)淋巴瘤，ND-AML和R/R AML患者的BM中淋巴细胞和NK细胞亚群的比例。(d)淋巴瘤，ND-AML和R/R AML患者的BM中KIRs的表达水平。(e)ND-AML患者中高NK组和低NK组之间KIRs表达水平的比较。(f)通过与UCB-NK细胞共培养，用Venetoclax或maritoclax处理的OCI-AML3和MOLM13的细胞活力测试。(g)OCI-AML3和MOLM13细胞中MCL1 siRNA的敲低效率的蛋白质验证。(h-i)用MCL1 siRNA或加扰siRNA处理的OCI-AML3和MOLM13的细胞生存力(h)，并与UCB-NK细胞共培养(i)。(j)正常对照和NK细胞低或高的ND-AML样品中BCL2和MCL1的RNA和蛋白表达水平。(k)通过使用AML患者的主要样本进行细胞生存力分析的方案。(l)采用venetoclax或maritoclax处理的高或低NK细胞的BM细胞的细胞活力。(m-n)NK细胞高或低的AML患者细胞中抑制剂诱导的细胞凋亡，显示了平均值±SEM值，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图3显示了AML样本中KIR的表达水平。
图4显示了有或没有RAS激活的患者中的KIRs表达水平。
图5显示了训练组和验证组中BM中BCL2或MCL1的表达与NK细胞之间的相关分析。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入研究，首次意外地开发了一种预测AML患者预后和治疗AML的新方法。实验数据表明，骨髓(BM)中NK细胞的淋巴细胞占比、KIR基因多态性及表达水平可以预测患者的预后，并且NK细胞可以与MCL1抑制剂协同杀死白血病细胞，从而提高治疗效率，为探索新的白血病治疗靶点提供了新的手段和理论依据。在此基础之上，完成了本发明。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文使用的，术语“受试者”、“需要的对象”指任何哺乳动物或非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、脊椎动物诸如啮齿类、非人类灵长类、牛、马、狗、猫、猪、绵羊、山羊。
杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)
杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)是主要在人类NK细胞和部分活化的T细胞表面表达的一种受体。KIR基因高度多态，通过不同的组合形成具有结构和功能多样性的基因家族。从功能上讲，KIR基因可以分为抑制型和激活型，它们可以特异性识别并结合靶细胞表面的HLA I类分子。具有长(L)胞质尾巴的KIR(KIR2DL和KIR3DL)包含免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)并调节抑制信号，而具有短(S)胞质尾巴的KIR(KIR2DS和KIR3DS)包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)并介导激活信号。它们在有效的开关系统中调节活性细胞的杀伤功能，并在抗感染和抗肿瘤方面发挥重要作用(4)。
如本文所用，术语“NK细胞抑制性受体KIR”是指具有长(L)胞质尾巴的KIR，其调节抑制信号，抑制NK细胞活性。
近年来，异基因造血干细胞移植(Allo-HSCT)中NK细胞的同种异体反应性对同种异体造血的影响越来越受到关注。大量研究表明，AML患者异基因骨髓移植(BMT)期间的KIR失配不仅可以减少移植排斥和移植物抗宿主反应(GVHD)，而且可以增强移植物抗白血病(GVL)的作用并降低白血病的复发率。另外，表达低或缺乏HLA I类分子的白血病细胞也可以被NK细胞杀死。KIR2DS1是HLA-C2的特异性NK细胞活化配体。Allo-HSCT在AML患者中的作用与供体中KIR2DS1调节的NK细胞反应性密切相关。白血病细胞免疫逃逸的机制是这些细胞可以上调HLA和/或抑制性KIR受体的表达，从而抑制NK细胞的反应性。抑制性KIR受体和HLA-B之间不同的抑制率会影响NK细胞对白血病细胞的反应性。
试剂组合
本发明提供了一种试剂组合，所述的试剂组合包括：
(a)检测试剂，所述的检测试剂选自下组：NK细胞抑制性受体KIR检测试剂、NK细胞检测试剂、或其组合；和
(b)MCL1抑制剂。
在另一优选例中，所述的NK细胞抑制性受体KIR检测试剂用于检测受试对象的NK细胞抑制性受体KIR的相对表达量。
在另一优选例中，所述的NK细胞检测试剂用于检测来自受试对象样品的骨髓NK细胞的数量或NK细胞/淋巴细胞的相对比例。
如本文所用，术语“相对表达量”包括mRNA相对表达量和蛋白相对表达量。
如本文所用，术语“NK细胞检测试剂”是指能够根据NK细胞的形态、基因谱、表面蛋白表达特点反映NK细胞存在，并能对NK细胞进行绝对或相对定量的试剂。所述检测试剂可以是包括(但不限于)测序引物、抗体、细胞染料、核酸芯片、蛋白芯片或其组合。
在本发明的一个优选例中，所述NK细胞检测试剂是细胞表面抗原抗体，所述抗体包括抗CD45抗体、抗CD3抗体、抗CD56抗体、抗CD16抗体或其组合。
如本文所用，术语“MCL1抑制剂”是指抑制肿瘤细胞表面的MCL1活性的制剂(如化合物、抗体等)。MCLl(myeloid cell leukemia 1)是一组基因，定位于染色体lq21，编码蛋白分子量为42 000D，含有350个氨基酸。MCLl基因在许多正常组织中广泛表达，对维持多种细胞的成熟与分化有重要的意义，如T细胞，B细胞和巨噬细胞等，而MCLl表达上调提示了肿瘤的发生。
在本发明的一个优选例中，所述MCL1抑制剂选自下组：Maritoclax、AZD5991、S63845或其组合。在另一优选例中，所述的MCL1抑制剂为Maritoclax。
试剂盒
本发明还提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括：
(Y1)诊断试剂，所述的检测试剂选自下组：NK细胞抑制性受体KIR检测试剂、NK细胞检测试剂、或其组合；和
(Y2)MCL1抑制剂。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括标签和/或说明书，所述的说明书注明所述试剂盒用于治疗急性髓细胞性白血病。
药物组合物
本发明还提供了一种可用于治疗急性髓细胞性白血病药物组合物，所述药物组合物包括：
(i)NK细胞；
(ii)MCL1抑制剂；和
(iii)药学上可接受的载体。
通常，可将本发明的NK细胞，或MCL1抑制剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。
如本文所用，“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物和/或细胞产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、聚山梨酯、乙醇及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
此外，本发明的活性成分组合还可与其他治疗剂(如抗肿瘤剂或化疗剂)一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的活性成分组合(包括NK细胞(或其制剂)和/或MCL1抑制剂(或其制剂))施用于哺乳动物。
应理解，本发明所述活性成分组合中NK细胞(或其制剂)和/或MCL1抑制剂(或其制剂)的有效量，可随给药的模式和肿瘤的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；肿瘤的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
典型地，对于NK细胞，其治疗有效量通常为0.5×106/kg(体重)个细胞至10×106/kg(体重)个细胞，当然，具体剂量还应依据临床试验的数据调整，同时还应考虑肿瘤严重程度、转移情况、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
对于MCL1抑制剂(如Maritoclax)，其治疗有效量通常为约0.1至30mg/kg体重，而且在大多数情况下不超过约20mg/kg体重，较佳地该剂量是约0.5mg/kg体重至10mg/kg体重。当然，具体剂量还应考虑所用药物的种类、剂型、给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明所述的药物组合物的给药方式没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：腹腔注射、静脉注射。
急性髓细胞性白血病(AML)预后系统
本发明的急性髓细胞性白血病(AML)预后系统可以是一体机的形式，也可以是分散式的。例如，预后特征输入模块可以独立的，并且将采集或输入的预后特征数据通过有线或无线的方式传递到本地的处理模块，或通过无线或通讯方式上传到非本地的处理模块(例如，远程中心的服务器)，从而实现远程检测。
在一个实施例中，当位于远程的处理模块对预后特征进行判别后，可以将辅助筛查结果通过无线方式回传给连接于网络的输出设备，例如平板电脑(PAD)、智能手机，从而实现快速的预后判断。
在本发明的一个优选例中，当采用预后数据采集仪等设备，并通过输入端进行数据上传时，则基本上或根本无需依赖人工进行特征读取，从而大幅度解放人力，且大幅降低甚至消除了对医护人员掌握的预后知识水平的要求，并且也有助于提高判断准确性。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次提出KIR的表达水平可预测AML患者的预后，并且可将高危FLT3突变患者进一步进行预后分层。
(2)本发明提出根据RNA测序数据转化的NK细胞值也可预测AML患者预后。
(3)本发明还提出骨髓中NK细胞/淋巴细胞相对比例可预测AML患者预后，且NK细胞/淋巴细胞相对比例低的患者对MCL1抑制剂更为敏感，为指导AML临床用药提供了新标准。
(4)本发明提出的基于NK细胞的免疫疗法联合MCL1抑制剂可以有效提高AML的治疗效率，为探索白血病治疗的新靶点提供新的见识和理论基础。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实验方法
(1)研究对象
在这个研究中，从中山大学肿瘤中心和上海交通大学医学院附属瑞金医院的两个中心收集了95例新诊断的AML(ND-AML)，30例淋巴瘤和25例难治/复发(R/R)AML的临床数据。根据中山大学肿瘤中心和瑞金医院的机构审查委员会的规定，所有参加研究的受试者均应提供书面知情同意书，并同意《赫尔辛基宣言》。本研究中使用的人类癌症组织的伦理代码为中山大学肿瘤防治中心伦理委员会批准的代码GZR2020-152。
(2)免疫细胞类型转换
使用Cibersort对来自713名ND-AML患者的数据库进行反卷积，并生成了具有10种以上免疫细胞亚型签名的基因矩阵。然后，将病例分为“低NK细胞”和“高NK细胞”亚组。用Kaplan-Meier法分析了AML患者NK细胞的预后。
(3)流式细胞仪分析
将BM细胞悬浮在FACS缓冲液(含1％FBS的PBS)中，并用荧光染料偶联的抗体染色：CD45-Krome Orange(Beckman A96416)，CD56-FITC(BD 340410)，CD3-APC(BD 340440)，CD138-APC(贝克曼A87787)，CD16-FITC(贝克曼IM0814U)。使用LSR II流式细胞仪(BectonDickinson)收集流式细胞仪数据，并使用FlowJo软件(TreeStar)进行分析。
(4)实时定量PCR
通过定量RT-PCR测量KIR的表达。GAPDH用作内部对照，公式2-ΔΔCt用来分析数据，根据制造商的说明(ESscience；QP002)进行测定。所有引物列下表A中。
表A qPCR引物
引物 序列(5'to 3') SEQ ID NO：
KIR2DL1-F GTCGCATGACGCAAGACCT 1
KIR2DL1-R GAGCTGACACCTGATAGGGG 2
KIR2DL3-F CCCTCAGGAGGTGACATATG 3
KIR2DL3-R GCAGGAGACAACTTTGGATCA 4
KIR2DL4-F GTGGGTTTAACATCTTCACGCT 5
KIR2DL4-R AGCATCTGTAGGTCTCTCCGT 6
KIR2DS4-F CAGTTGTCAGCTCCCAGTGA 7
KIR2DS4-R CCTGGAATGTTCCGTTGATG 8
KIR3DL1-F CCTGGTGAAATCAGGAGAGAG 9
KIR3DL1-R TGTAGGTCCCTGCAAGGGCAA 10
KIR3DL2-F CAGAACAGTGAATAGGCAGGAC 11
KIR3DL2-R AAAACCCCCTCAAGACCTGAC 12
KIR3DL3-F AGAAGACGGGATGCCTGTC 13
KIR3DL3-R GTGAACTGCAACATCTGTAGGT 14
BCL2-F GGTGGGGTCATGTGTGTGG 15
BCL2-R CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC 16
MCL1-F TGCTTCGGAAACTGGACATCA 17
MCL1-R TAGCCACAAAGGCACCAAAAG 18
(5)单细胞RNA序列分析
将AML的患者和化疗后的匹配样本的单细胞RNA序列数据用于免疫细胞亚型分析。UMAP分析表明，在治疗前和在化疗后匹配的样品中，NK细胞在AML样品的BM细胞中可见的比例。
(6)脐带血来源的NK细胞(UCB-NK)
UCB-NK样本来自山东省中国脐带血库。不同数量的UCB-NK细胞在RPMI-1640(Gibco，NY)和10％FBS(Biochrom AG，Berlin，Germany)和人白介素12(IL-12，PeproTech)和白介素15(IL-15，PeproTech)，并与OCI-AML3和MOLM13细胞在96孔板中共培养。
(7)细胞活力和凋亡测定
BCL2抑制剂Venetoclax(S8048)和MCL1抑制剂Maritoclax(S7126)来自SelleckChemicals LLC(德克萨斯州休斯顿)。OCI-AML3和MOLM13细胞(由王大威实验室提供)，使用含10％FBS(Biochrom AG，柏林，德国)的RPMI-1640(Gibco，NY)培养在96孔板中(105个细胞/孔)。孵育48小时后，通过细胞计数试剂盒8(CCK-8，Dojindo Laboratories，熊本，日本)通过450nm的吸光度进行测量，确定Venetoclax和Maritoclax的细胞毒性。接下来，FITC/PI凋亡试剂盒(FA111-02，Transgen Biotech)检测由Venetoclax或Maritoclax诱导的凋亡细胞数量和比例。
(8)siRNA转染测定
将白血病细胞系OCI-AML3和MOLM13在含10％FBS且无抗生素的RPMI-1640中培养24小时。然后，按照制造商的说明，使用Lipofectamine 3000Transfection Reagent(Invitrogen)用MCL1或干扰的siRNA寡聚物转染细胞。八小时后，更换了含10％FBS和抗生素的新鲜培养基，并将这些细胞在37℃下孵育48小时。所有siRNA序列列入下表B中：
表B MCL1及阴性对照siRNA序列
SiRNA名称 序列(5'to 3') SEQ ID NO：
NCsiRNA-F ACGUGACACGUUCGGAGAATT 19
NCsiRNA-R UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 20
hMCL1-1#-F UUGAUGUCCAGUUUCCGAAGCTT 21
hMCL1-1#-R GCUUCGGAAACUGGACAUCAATT 22
hMCL1-2#-F UAUGGUCUUCAAGUGUUUAGCTT 23
hMCL1-2#-R GCUAAACACUUGAAGACCAUATT 24
hMCL1-3#-F UUAGAUAUGCCAAACCAGCUCTT 25
hMCL1-3#-R GAGCUGGUUUGGCAUAUCUAATT 26
(9)蛋白质印迹分析
抗体购自Cell Signaling Technology(anti-BCL2)，Abcam(anti-MCL1)和SantaCruz(anti-GAPDH)。
(10)KIR的表达水平和预后价值
通过癌症微阵列网站Oncomine和ENCORI分析了KIR在不同类型癌症中的表达水平。此外，通过使用癌症基因组图谱(TCGA)和基因型组织表达计划(GTEx)的RNA测序数据，比较了AML和正常样品中的KIRs表达水平。R studio使用“edgeR”软件包分析了肿瘤和正常样品之间的KIR的详细表达水平。此外，通过使用UALCAN数据库确认了KIR的转录表达水平。临界值是使用“survminer”软件包计算的。通过UALCAN数据库，通过Kaplan-Meier方法分析了AML患者中KIRs根据相应表达水平的预后。所有统计数据均通过student t检验进行了分析。
(11)共表达关系分析
“Corrplot”软件包用于通过R studio通过Pearson分析来分析KIRs表达水平与NK细胞之间的共表达指数。此外，使用GraphPad Prism 8软件通过Spearman和Pearson分析来分析BCL2或MCL1表达水平与NK细胞的关系。
实施例1
AML中KIR的表达水平和预后
分析Oncomine和ENCORI数据库的相关数据，发现KIR在诸如肾上皮细胞癌、肾透明细胞癌和肺癌的实体瘤中起重要作用。此外，在AML中KIR的表达水平也显著高于正常样品(图3)。FLT3突变已被证实与AML预后密切相关，FLT3-ITD突变患者预后较差。此次研究发现，具有FLT3-ITD的患者KIR2DL组(KIR2DL1，KIR2DL3和KIR2DL4)的表达显著下调，而KIR2DS4和KIR3DL组(KIR3DL1和KIR3DL2，除KIR3DL3除外)的表达上调(图1a)。而RAS激活状态与AML中的KIRDS表达无关(图4)。
接下来，进一步探讨了KIR表达水平预测AML患者生存的关键效率。Kaplan-Meier曲线分析表明KIR2DL1(p＝0.0043)，KIR2DL3(p＝0.0028)，KIR2DL4(p＝0.0092)，KIR3DL1(p＝0.013)和KIR3DL2(p＝0.0088)mRNA水平升高与AML患者总生存期(OS)不良预后显著相关(图1b)。而KIR2DS4 mRNA水平没有预测预后的效能(P＝0.33)。此外，当联合FLT3-ITD突变分析时，KIRs表达水平可进一步将FLT突变组预后进一步分层，其中KIR高表达且伴有FLT3突变的患者最后最差(图1c)。
实施例2
BM中的NK细胞提示AML预后不良
免疫功能异常最近被认为是AML的危险因素之一(5)。接下来，使用Cibersort反卷积分析713名新诊断的AML(ND-AML)患者(140名训练组和573名验证组)的基因表达数据，并生成具有10个以上免疫细胞特征的基因矩阵。将患者分为“低NK细胞亚组(NK转换值≤0.075，)”和“高NK细胞(NK转换值>0.075)”亚组。预后分析表明低NK细胞预测AML不良预后(图1d)。
此外，进一步对AML患者在治疗前和化疗后的单细胞RNA测序数据进行免疫细胞亚型分析(6)。UMAP(均匀流形近似和投影)分析表明，在治疗前AML患者的BM细胞中NK细胞的比例远低于化疗后匹配样品中的NK细胞比例(图2a)。
进一步分析血液系统恶性肿瘤患者(30例无BM浸润的淋巴瘤病例作为对照；95例ND-AML病例和25例难治/复发患者(R/R))的BM细胞中淋巴细胞的NK细胞比例(CD45+CD3-CD56+CD16+)(图2b)。与正常样本相比，ND-AML样本中NK细胞/淋巴细胞比例显着降低，并且比率在R/R AML病例中达到最低(图2c)。这些结果与NK细胞可作为抗白血病免疫的重要介质的理论相一致，并表明BM的NK细胞在白血病发生中具有一定的抗白血病作用(7、8)。R/RAML患者具有治疗难且预后差的特点，在这三组中R/R AML样品中的KIRs表达要高得多(图2d)。当根据BM中NK细胞/淋巴细胞比例将ND-AML样本分为高NK细胞组和低NK细胞组时，发现两组的一般临床特征无显着差异(表1)。但是，KIR主要表达于低NK细胞组(图2e)。
表1 骨髓中高/低比例NK细胞的ND-AML患者一般临床特征
Figure BDA0002861320360000161
Figure BDA0002861320360000171
注：
ns，无统计学差异。通过非参数Wilcoxon秩和检验(连续变量)和x平方检验(分类变量)计算P值。
*肝异常由ALT 2.53倍正常值或AST 2.53倍正常值定义，而肾异常由肌酐2.53倍正常值定义。
Figure BDA0002861320360000172
CN-AML:没有细胞遗传学可识别异常的病例
§预后不佳:inv(3)/t(3；3),t(9；22),11q23异常,25,27,del(5q),del(7p)和复杂核型。
实施例3
NK细胞可与MCL1抑制剂协同作用杀死白血病细胞
先前的研究表明，BCL-2和MCL1蛋白可以控制体内NK细胞的存活(9)。因此，探讨了这两种分子在BM中的表达与NK细胞之间的关系。发现MCL1表达水平与NK细胞呈现负相关性，而BCL2表达水平与NK细胞无相关性(图5)。众所周知，BCL2和MCL1抑制剂目前被认为是白血病的新疗法，在患者中显示出令人鼓舞的治疗结果(10)。因此，寻求NK细胞是否与这些新抑制剂具有协同作用，以达到更好的治疗效果。
为了检验以上假设，用BCL2抑制剂(Venetoclax)或MCL1抑制剂(Maritoclax)处理AML细胞OCI-AML3和MOLM13，然后与梯度数目的脐带血的NK细胞(UCB-NK)共培养。细胞活力数据表明，UCB-NK与maritoclax可协同更高效的杀死白血病细胞，但与venetoclax不具有协同作用(图2f)。
此外，在OCI-AML3和MOLM13细胞中应用了MCL1 siRNA敲低MCL1的表达，然后与不同梯度数目的UCB-NK共培养。结果发现，用MCL1 siRNA处理的OCI-AML3和MOLM13细胞的细胞活力于对照相比显著降低，且随着UCB-NK梯度增加杀死白血病细胞效应更强(图2g-i)。
接下来，从ND-AML患者的BM中分离出的白血病细胞在原代水平验证效果。根据BM中NK细胞/淋巴细胞比例将样品分为高NK细胞组和低NK细胞组(图2k)，并检查BCL2和MCL1的RNA/蛋白质表达水平。无论在转录水平还是翻译水平，MCL1在低NK细胞组中表达较高(图2j)。与细胞系的结果一致，用maritoclax处理的低NK患者样本比高NK患者样本的细胞活力更低(图2l)。此外，在低NK比例的样品中maritoclax诱导的细胞凋亡显著增强，而vencoclax处理的高NK和低NK样品在细胞活力和凋亡方面无显着差异(图2m-n)。
讨论
通过分析与肿瘤细胞表达的NK功能有关的配体的类型和表达丰度，本发明首先提出KIR的表达水平可预测AML患者的预后，且可将高危FLT3突变患者进一步进行预后分层。此外，通过对RNA测序数据转换的免疫细胞矩阵中的NK细胞也可预测AML患者的预后。其中，NK细胞越低，预后越差。因此，通过小分子化合物或细胞因子如白介素15或白介素2等增加NK细胞的数量可能是抗白血病的一种新方法。根据MCL1在不同NK比例的BM的表达结果，提示可根据ND-AML骨髓中NK细胞/淋巴细胞比例预测患者对BCL2抑制剂以及MCL1抑制剂的敏感性。低NK细胞/淋巴细胞比例患者选择MCL1抑制剂可能更好的治疗效果。此外，实验数据表明，基于NK细胞的免疫疗法联合MCL1抑制剂而非BCL2抑制剂可以有效提高AML的治疗效率。这些发现可能为探索白血病治疗的新靶点提供新的见识和理论基础。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中山大学肿瘤防治中心
上海交通大学医学院附属瑞金医院
<120> 骨髓NK细胞联合MCL1抑制剂在抗白血病中的应用
<130> P2020-2713
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
gtcgcatgac gcaagacct 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
gagctgacac ctgatagggg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
ccctcaggag gtgacatatg 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
gcaggagaca actttggatc a 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
gtgggtttaa catcttcacg ct 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
agcatctgta ggtctctccg t 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
cagttgtcag ctcccagtga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
cctggaatgt tccgttgatg 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
cctggtgaaa tcaggagaga g 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
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<400> 10
tgtaggtccc tgcaagggca a 21
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
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<400> 11
cagaacagtg aataggcagg ac 22
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aaaaccccct caagacctga c 21
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<400> 13
agaagacggg atgcctgtc 19
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<211> 22
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<400> 15
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cggttcaggt actcagtcat cc 22
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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tgcttcggaa actggacatc a 21
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<211> 21
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 18
tagccacaaa ggcaccaaaa g 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 19
acgugacacg uucggagaat t 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 20
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 21
uugaugucca guuuccgaag ctt 23
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 22
gcuucggaaa cuggacauca att 23
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 23
uauggucuuc aaguguuuag ctt 23
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 24
gcuaaacacu ugaagaccau att 23
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 25
uuagauaugc caaaccagcu ctt 23
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 26
gagcugguuu ggcauaucua att 23

Claims (10)

1.一种检测试剂的用途，其特征在于，用于制备一诊断试剂盒，所述诊断试剂盒用于预测急性髓细胞性白血病(AML)的预后，
其中，所述的检测试剂选自下组：NK细胞抑制性受体KIR检测试剂、NK细胞检测试剂、或其组合。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测试剂为NK细胞抑制性受体KIR检测试剂，所述的NK细胞抑制性受体KIR检测试剂用于检测受试对象的NK细胞抑制性受体KIR的相对表达量。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的预后是将来自受试对象样品的NK细胞抑制性受体KIR的相对表达量(A1)与正常人群的平均NK细胞抑制性受体KIR的相对表达量(A0)相比较，若A1显著高于A0，则说明受试对象的预后差。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测试剂为NK细胞检测试剂，所述的NK细胞检测试剂用于检测受试对象样品的骨髓浸润细胞群中的NK细胞的数量或水平，或者用于检测骨髓浸润细胞群中的NK细胞/淋巴细胞的相对比例。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的预后是将来自受试对象的样品中骨髓NK细胞/淋巴细胞比例(B1)与急性髓细胞性白血病患者的平均骨髓NK细胞/淋巴细胞比例(B0)相比较，若B1显著低于B0，则说明受试对象预后差。
6.一种试剂组合，其特征在于，所述的试剂组合包括：
(a)检测试剂，所述的检测试剂选自下组：NK细胞抑制性受体KIR检测试剂、NK细胞检测试剂、或其组合；和
(b)MCL1抑制剂。
7.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：
(Y1)检测试剂，所述的检测试剂选自下组：NK细胞抑制性受体KIR检测试剂、NK细胞检测试剂、或其组合；和
(Y2)MCL1抑制剂。
8.权利要求6所述的试剂组合的用途，其特征在于，用于制备治疗急性髓细胞性白血病的药物组合物或试剂盒。
9.一种急性髓细胞性白血病(AML)预后系统，其特征在于，所述系统包括：
(a)预后特征输入模块，所述预后特征输入模块被配置为用于输入某一对象的预后特征；其中所述的预后特征包括选自下组：
(F1)所述对象的NK细胞抑制性受体KIR的相对表达数据；
(F2)所述对象的样品中骨髓NK细胞的数量、或NK细胞/淋巴细胞的相对比例；
(F3)F1和F2的组合；
(b)预后处理模块，所述预后处理模块被配置为对于输入的预后特征，按预定的判断标准进行评分处理，从而获得风险度评分；并且将所述风险度评分与急性髓细胞性白血病的风险度阈值进行比较，从而得出预后结果，其中，当所述风险度评分高于所述风险度阈值时，则提示该对象的急性髓细胞性白血病的预后劣于急性髓细胞性白血病患者的平均预后；当所述风险度评分低于所述风险度阈值时，则提示对象的急性髓细胞性白血病的风险预后优于急性髓细胞性白血病患者的平均预后；和
(c)预后结果输出模块，所述输出模块用于输出所述的预后结果；
其中，所述的对象为急性髓细胞性白血病患者或疑似患者。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括：
(i)NK细胞；
(ii)MCL1抑制剂；和
(iii)药学上可接受的载体。
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