JP2016511219A - インフルエンザウイルスおよび１型糖尿病 - Google Patents

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Abstract

１型糖尿病は、インスリン欠乏を結果としてもたらす、膵臓インスリン産生ベータ細胞の喪失を特徴とする。このベータ細胞喪失の通例の原因は、自己免疫性破壊である。本発明者らは、インフルエンザウイルス感染と、１型糖尿病および／または膵炎の発症との間の因果連関の最初の証拠を提供する。感染と１型糖尿病および／または膵炎との間のこの因果連関により、多様な治療的、予防的、および診断的機会がもたらされる。一局面において、患者における１型糖尿病および／または膵炎の防止または処置における使用のための、Ａ型インフルエンザウイルスに対して有効な抗ウイルス化合物を含む組成物が提供される。

Description

本発明は、１型糖尿病におけるウイルスの関与に関し、特に小児の患者における１型糖尿病の診断、防止、処置、および予後において使用されうるさらなる改善された材料および方法を提供することが本発明の目的である。
１型糖尿病（かつてはＩＤＤＭとして公知であった）は、インスリン欠乏を結果としてもたらす、膵臓インスリン産生ベータ細胞の喪失を特徴とする。このベータ細胞喪失の通例の原因は、自己免疫性破壊である。
自己免疫性破壊は、ウイルス感染と連関しうることが提起されている。ウイルスが自己免疫性のベータ細胞破壊の誘因として作用するための、多様な機構が提起されている。例えば、ベータ細胞の細胞溶解性感染が生じると、それらの破壊および／または通常は隔絶された抗原の放出がもたらされ、次いで、病原性自己反応性Ｔ細胞応答が引き起こされうる。代替的に、ウイルスにより提示されるエピトープは、自己反応性抗体および／または自己反応性Ｔ細胞を誘発し、これにより、自己免疫の基盤をもたらす可能性もある。
１型糖尿病の発症率の急速な世界的増大は、その病因における環境因子の主要な役割を示唆する。１型糖尿病患者および／または前糖尿病性個体についての横断的で前望的な研究によれば、ウイルス感染は、これらのうちの１つでありうる。多様なウイルスが、１型糖尿病と連関している［１］。例えば、参考文献２は、２００１年に、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、サイトメガロウイルスおよびＢ型コクサッキーウイルスを含む、１３の異なるウイルスが、ヒトおよび多様な動物モデルにおけるその発症と関連すると報告されていることに注目していた。
ＨｙｏｅｔｙおよびＴａｌｙｏｒ、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ（２００２）４５：１３５３〜６１ ＪｕｎおよびＹｏｏｎ、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ（２００１）４４（３）：２７１〜８５
本発明者らは、Ａ型インフルエンザウイルス感染と１型糖尿病との間の因果連関を初めて同定した。本発明者らはまた、Ａ型インフルエンザウイルス感染と膵炎との間の因果連関も同定した。これらの因果連関に基づき、本発明者らは、少なくともいくつかの場合において、１型糖尿病および／または膵炎の発生は、先行するＡ型インフルエンザウイルス感染、例えば、小児期におけるＡ型インフルエンザウイルス感染に起因すると結論付ける。
非全身性Ａ型インフルエンザウイルスは、哺乳動物および鳥類におけるＡ型インフルエンザ感染の最も一般的な原因である。非全身性インフルエンザウイルスは通例、内臓では見出されない。かつての研究は、哺乳動物におけるある種のＡ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）感染と膵臓損傷との間の相関について報告した［３］が、因果関係が存在するのかどうかは確立されていない［３、４］。実際、参考文献５では、哺乳動物に、Ａ型インフルエンザウイルスが接種されたが、膵臓ではＡ型インフルエンザウイルス抗原が同定されなかったので、Ａ型インフルエンザウイルス感染が膵臓損傷の直接的な原因である可能性は低いというのが現在の通説である。
非全身性Ａ型インフルエンザウイルスが複製されうるのは、トリプシンまたはトリプシン様酵素の存在下に限られるので、それらの複製は、気道および腸管に制約されると考えられる。実際、いかなる先行技術も、ＩＡＶが膵臓細胞内で成長することもなお可能であることを実際に裏付けてはおらず、膵臓におけるＩＡＶ複製の直接的な帰結についてのデータも入手可能ではない。本発明者らは驚くべきことに、非全身性トリＡ型インフルエンザウイルスが、重度の膵炎を引き起こし、鳥類において生じる糖尿病と同等な代謝異常状態を結果としてもたらすことを裏付けた。本発明者らはまた、ヒトＡ型インフルエンザウイルスは、ヒト膵臓初代細胞およびヒト膵臓初代細胞系において成長することが可能であることから、Ａ型インフルエンザウイルス感染と１型糖尿病および／または膵炎との間の因果連関が示されることも見出した。
Ａ型インフルエンザウイルス感染と１型糖尿病との間の直接的な因果連関を同定することにより、１型糖尿病の防止、処置、診断、および予後のための多様な機会がもたらされる。同様に、Ａ型インフルエンザウイルス感染と膵炎との間の直接的な因果連関を同定することにより、膵炎の防止、処置、診断、および予後のための多様な機会ももたらされる。本発明の組成物を投与する場合、患者は、小児であることが好ましい。したがって、本発明の組成物を患者（例えば、小児）へと投与することにより、患者の後年、例えば、成年期における１型糖尿病および／または膵炎の発症を防止する一助となる。同様に、本発明の診断法を、患者（例えば、小児）から得られる試料に実施して、例えば、患者が、後年、例えば、成年期において、１型糖尿病および／または膵炎を発症する素因を有するか否かも決定する。したがって、本発明は、患者、好ましくは小児における１型糖尿病および／または膵炎の防止または処置における使用のための、Ａ型インフルエンザウイルス免疫原を含む免疫原性組成物を提供する。本発明はまた、患者、好ましくは小児における１型糖尿病および／または膵炎の防止または処置における使用のための、Ａ型インフルエンザウイルスに対して有効な抗ウイルス化合物を含む組成物も提供する。本発明はまた、患者、好ましくは小児における１型糖尿病および／または膵炎の防止または処置における使用のための、Ａ型インフルエンザウイルス免疫原および抗ウイルス化合物を含む免疫原性組成物も提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、ナチュラルキラー細胞活性を阻害するのに有効な免疫調節化合物をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、任意選択で、アジュバント、好ましくは、水中油エマルジョンをさらに含む、ワクチン組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、医薬品としての使用のための組成物である。
本発明はまた、患者における１型糖尿病および／または膵炎を防止または処置するための方法であって、患者へと、本発明の組成物を投与するステップを含む方法も提供する。
いくつかの実施形態では、本発明はまた、患者、好ましくは小児が、後年において１型糖尿病および／または膵炎を発症する素因を有するか否かを同定するためのアッセイ法であって、患者試料中で、（ｉ）Ａ型インフルエンザウイルスもしくはその発現産物、および／または（ｉｉ）Ａ型インフルエンザウイルスに対する免疫応答の存在または非存在を検出するステップを含むアッセイ法も提供する。いくつかの実施形態では、特に、患者が、前糖尿病性症状、例えば、膵島炎を既に呈示しつつある場合における、患者試料中での、（ｉ）Ａ型インフルエンザウイルスもしくはその発現産物、および／または（ｉｉ）Ａ型インフルエンザウイルスに対する免疫応答の検出により、その患者に、後年において１型糖尿病および／または膵炎を発症する素因があることが示される。他の実施形態では、患者試料中での、（ｉ）Ａ型インフルエンザウイルスもしくはその発現産物、および／または（ｉｉ）Ａ型インフルエンザウイルスに対する免疫応答の非存在により、患者が、Ａ型インフルエンザウイルスに感染していないことが示される。このようなインフルエンザ陰性患者は、本発明の組成物による処置のための理想的な候補である。このような患者は、若齢の、例えば、５歳未満の小児であることが典型的である。
いくつかの実施形態では、本発明は、１型糖尿病および／または膵炎の予後のためのアッセイ法であって、患者試料中で、（ｉ）Ａ型インフルエンザウイルスもしくはその発現産物、および／または（ｉｉ）Ａ型インフルエンザウイルスに対する免疫応答の存在または非存在を検出するステップを含むアッセイ法を提供する。アッセイ法は任意選択で、（ａ）患者試料中での、（ｉ）Ａ型インフルエンザウイルスもしくはその発現産物、および／または（ｉｉ）Ａ型インフルエンザウイルスに対する免疫応答のレベルを同定するステップと、（ｂ）患者試料中のレベルを、基準レベルと比較するステップとをさらに含み、（ｉ）患者試料中のより高いレベルは、より悪い予後を示し、（ｉｉ）患者試料中のより低いレベルは、より良好な予後を示す。
いくつかの実施形態では、試料は、血液試料または気管スワブである。
いくつかの実施形態では、アッセイ法は、スクリーニングプロセス、例えば、小児科スクリーニングプロセスにおける使用のためのアッセイ法である。例えば、患者試料中での、（ｉ）Ａ型インフルエンザウイルスもしくはその発現産物、および／または（ｉｉ）Ａ型インフルエンザウイルスに対する免疫応答について陰性を示す小児の同定により、患者は、Ａ型インフルエンザウイルスにいまだ感染していないので、本発明の組成物による処置のための理想的な候補であることが示される。
いくつかの実施形態では、患者は、７０歳以下であり、好ましくは、０〜１５歳の間である。
本発明の診断法、予後診断法、および／または予防法では、任意のＡ型インフルエンザウイルスを使用することができる。本発明の診断法、予後診断法、および／または予防法における使用に適するＡ型インフルエンザウイルスは、任意のヘマグルチニン型、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６、および任意のノイラミニダーゼ型、例えば、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、またはＮ９を有しうる。
本発明を伴う使用のためのインフルエンザウイルス株は、季節ごとに変化することが可能であり、汎発性の場合もあり、非汎発性の場合もある。現在の流行間期において、ワクチンは、２つのＡ型インフルエンザ株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）および１つのＢ型インフルエンザ株に由来する抗原を含むことが典型的であり、三価ワクチンが典型的である。本発明では、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７、またはＨ９亜型株などの汎発性ウイルス株（すなわち、患者および一般のヒト集団が免疫的に未感作である、特に、Ａ型インフルエンザウイルスの株）に由来する抗原を使用することができる。汎発性株に対するインフルエンザワクチンは、一価の場合もあり、汎発性株を補充した、通常の三価ワクチンに基づく場合もある。どのインフルエンザウイルス株が広がっているのか、および抗原の性質に応じて、本発明では、ＨＡ亜型であるＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６のうちの１または複数を使用することができる。本発明では、Ａ型インフルエンザウイルスＮＡ亜型であるＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、またはＮ９のうちの１または複数も使用することができる。
それに汎発性のアウトブレイクを引き起こす潜在的可能性を与えるインフルエンザ株の特徴は、（ａ）ヒト集団が、この株のヘマグルチニンに対して免疫的に未感作であるように、現在広がっているヒト株におけるヘマグルチニンと比較して新規のヘマグルチニン、すなわち、１０年間にわたりヒト集団において顕性ではなかったヘマグルチニン（例えば、Ｈ２）またはヒト集団においてかつては全く見られなかったヘマグルチニン（例えば、一般に鳥類集団だけにおいて見出されたＨ５、Ｈ６、またはＨ９）を含有すること；（ｂ）ヒト集団において水平伝播することが可能であること；および（ｃ）ヒトに対して病原性であることである。Ｈ５型ヘマグルチニンを伴うウイルスは、Ｈ５Ｎ１株など、汎発性インフルエンザに対して免疫化するのに好ましい。他の可能な株は、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１、およびＨ７Ｎ７、ならびに汎発性株となることが潜在的に可能な他の任意の新興株を含む。
Ａ型インフルエンザウイルスは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、またはＨ１０Ｎ７であることが好ましく、Ａ型インフルエンザウイルスは、Ｈ１Ｎ１またはＨ３Ｎ２であることがより好ましい。Ａ型インフルエンザウイルスは、非全身性Ａ型インフルエンザウイルスであることが好ましい。Ａ型インフルエンザウイルスは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ２Ｎ２であることが最も好ましい。
それらの抗原を有用に組み入れうる他の株は、耐性汎発性株［７］を含む、抗ウイルス療法に対して耐性の株（例えば、オセルタミビル［６］および／またはザナミビルに対して耐性の株）である。
抗ウイルス化合物の投与
本発明は、患者における１型糖尿病および／または膵炎を防止または処置するための方法であって、患者へと、Ａ型インフルエンザウイルスに対して有効な抗ウイルス化合物を投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗ウイルス化合物を、Ａ型インフルエンザウイルスに感染した患者へと投与する。好ましい実施形態では、抗ウイルス化合物を、Ａ型インフルエンザウイルスに感染していない患者へと投与する。当技術分野では、患者がかつてＡ型インフルエンザウイルスに感染したのかどうかを、例えば、ＥＬＩＳＡによって、患者試料中での抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体の存在を検出することにより決定する方法が周知である。
いくつかの実施形態では、抗ウイルス化合物を、Ａ型インフルエンザウイルス感染に症候性であるか、またはＡ型インフルエンザウイルス感染に近年症候性であるが、投与時（例えば、症状が弱まった、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日後など）には無症候性である患者へと投与する。このような場合、抗ウイルス化合物の投与は、インフルエンザ感染およびインフルエンザ症状の持続期間を短縮し、かつ／またはインフルエンザ感染およびインフルエンザ症状の重症度を低下させることが典型的である。本発明者らにより裏付けられる、Ａ型インフルエンザウイルス感染と１型糖尿病との間の因果連関の観点から、Ａ型インフルエンザウイルス感染に対する抗ウイルス処置は、場合によって、１型糖尿病のための予防として、または１型糖尿病のための処置として作用するであろう。
当技術分野では、オセルタミビルおよび／またはザナミビルなど、インフルエンザウイルスに対して有効な多様な抗ウイルス化合物が公知である。これらの抗ウイルス剤は、例えば、そのエステル（例えば、エチルエステル）およびその塩（例えば、リン酸塩）を含む、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸または５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エノン酸などのノイラミニダーゼ阻害剤を含む。好ましい抗ウイルス剤は、オセルタミビルリン酸塩（ＴＡＭＩＦＬＵ）としてもまた公知の、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸のエチルエステル、リン酸（１：１）である。別の好ましい抗ウイルス剤は、ザナミビル（ＲＥＬＥＮＺＡ）としてもまた公知の、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−４−グアニジノ−３−（プロパ−１−エン−２−イルアミノ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２，３−トリヒドロキシプロピル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−６−カルボン酸である。タミフルは、１歳以上の患者におけるＡ型インフルエンザウイルスおよびＢ型インフルエンザウイルスの予防のためのＦＤＡの承認を受けている。リレンザは、５歳以上の患者におけるＡ型インフルエンザウイルスおよびＢ型インフルエンザウイルスの予防のためのＦＤＡの承認を受けている。したがって、患者が、１〜５歳の間である場合は、タミフルが、好ましい抗ウイルス剤である。患者が５歳以上である場合は、タミフルおよび／またはリレンザが好ましい。タミフルおよびリレンザはまた、患者が２日間以下にわたり症候性である場合の、１歳以上の患者および７歳以上の患者のそれぞれにおけるＡ型インフルエンザウイルス感染またはＢ型インフルエンザウイルス感染に起因する、合併症を伴わない急性疾病の処置についてもＦＤＡの承認を受けている。したがって、症候性患者が、１〜７歳の間である場合は、タミフルが、好ましい抗ウイルス剤である。症候性患者が、７歳以上である場合は、タミフルおよび／またはリレンザが好ましい。アマンタジン塩酸塩（ＳＹＭＭＥＴＲＥＬ）は、１〜１２歳の間の小児科患者のための小児科の承認を受けた。これらの抗ウイルス剤および他の抗ウイルス剤を使用することができる。
本発明と共に有用でありうる、さらなる抗ウイルス剤は、ガランギン（３，５，７−トリヒドロキシフラボン）；ｂｕｐｌｅｕｒｕｍ ｋａｏｉ；ネオプテリン；Ａｒｄｉｓｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ抽出物；７−Ｏ−ガロイルトリセチファバンおよび７，４’−ジ−Ｏ−ガロイルトリセチファバンなどのガロイルトリセチファバン；プリンおよびピリミジンをｃｉｓ置換したシクロヘキセニルヌクレオシドおよびシクロヘキサニルヌクレオシド；ベンズイミダゾール誘導体；ピリダジニルオキシムエーテル；エンビロキシム；ジソキサリル；アリルドン；ＰＴＵ−２３；ＨＢＢ；Ｓ−７；２−（３，４−ジクロロ−フェノキシ）−５−ニトロベンゾニトリル；６−ブロモ−２，３−二置換−４（３Ｈ）−キナゾリノン；３−メチルチオ−５−アリール−４−イソチアゾールカルボニトリル；シマリカラクトンＤなどのカシノイド、；５’−ノル炭素環式５’−デオキシ−５’−（イソブチルチオ）アデノシンおよびその２’，３’−ジデオキシ−２’，３’−ジデヒドロ誘導体；オキサチインカルボキサニリド類似体；エンビロキシムのビニルアセチレン類似体；デヒドロエピアンドロステロン（５−アンドロステン−３ベータ−オール−１７−オン；ＤＨＥＡ）；酸素化環内に二重結合を保有する置換３−（２Ｈ）−イソフラベン、例えば、４’−クロロ−６−シアノフラバンおよび６−クロロ−４’−シアノフラバンなど、クロロ基、シアノ基、またはアミジノ基で置換されたフラバン、イソフラバンおよびイソフラベン；４−ジアゾ−５−アルキルスルホンアミドピラゾール；天然の複素環式塩基の３’−デオキシ−３’−フルオロ−２’，３’−ジデオキシ−Ｄ−リボフラノシドおよび２’−アジド−３’−フルオロ−２’，３’−ジデオキシ−Ｄ−リボフラノシドなどを含むがこれらに限定されない。
２つ以上の抗ウイルス剤の混合物を使用することができる。例えば、参考文献８は、ある種の組合せが、相乗活性を示しうることについて報告している。
低分子有機抗ウイルス剤に加えて、例えば、インターフェロンを伴うサイトカイン療法も使用することができる。また、インターフェロンα応答を誘発する化合物、例えば、アンプリゲンなどのイノシン含有核酸も使用することができる。
また、アンチセンスＲＮＡまたは低分子阻害性ＲＮＡなど、インフルエンザウイルスに対する核酸法を使用して、ウイルス産生を転写後において制御することもできる。参考文献９は、Ａ型インフルエンザウイルスにより誘導された実験的気道感染における、マウスへと静脈内投与されたアンチセンス化合物の、ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗ウイルス活性を裏付けている。１型糖尿病は、患者へと、Ａ型インフルエンザウイルスの核酸配列に特異的なアンチセンスＲＮＡまたは低分子阻害性ＲＮＡなどの核酸を投与することにより処置または防止することができる。例えば、遊離核酸、封入核酸（例えば、リポソーム内に封入された）などとして、このような核酸を投与することができる。
免疫化
本発明は、患者における１型糖尿病および／または膵炎を防止または処置するための方法であって、患者へと、免疫原性組成物を投与するステップを含む方法を提供する。免疫原性組成物は、Ａ型インフルエンザウイルス免疫原を含む。免疫原性組成物は、Ａ型インフルエンザウイルス免疫原を含むことが好ましい。免疫原性組成物は、非全身性Ａ型インフルエンザウイルス免疫原を含むことが最も好ましい。本発明のワクチンは、患者へと、抗ウイルス化合物、特に、インフルエンザウイルスに対して活性の抗ウイルス化合物と実質的に同時に（例えば、医療ケア従事者への同じ医療相談時または医療ケア従事者への同じ来院時に）投与することができる。
現在一般に使用されているインフルエンザワクチンは、参考文献１０の１７および１８章において記載されている。それらは、生ウイルスまたは不活化ウイルスに基づき、不活化ワクチンは、全ウイルスに基づく場合もあり、「スプリット」ウイルスに基づく場合もあり、精製表面抗原（ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼを含む）に基づく場合もある。
本発明では、典型的にはヘマグルチニンを含むＡ型インフルエンザウイルス抗原を使用して、患者、好ましくは小児を免疫化する。抗原は、インフルエンザビリオンから調製されることが典型的であろうが、代替法として、ヘマグルチニンなどの抗原は、組換え宿主（例えば、バキュロウイルスベクターを使用する昆虫細胞系）内で発現させ、精製形態で使用することもできる［１１、１２］。しかし、一般に、抗原は、ビリオンに由来するであろう。
抗原は、不活化ウイルスの形態を取る場合もあり、生ウイルスの形態を取る場合もある。ウイルスを不活化するための化学的手段は、有効量の、以下の薬剤：洗浄剤、ホルムアルデヒド、ホルマリン、β−プロピオラクトン、またはＵＶ光のうちの１または複数による処置を含む。不活化のためのさらなる化学的手段は、メチレンブルー、ソラーレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、またはこれらの任意の組合せによる処置を含む。当技術分野では、例えば、二元エチルアミン、アセチルエチレンイミン、またはガンマ照射など、他のウイルス不活化法も公知である。ＩＮＦＬＥＸＡＬ（商標）製品は、全ビリオン不活化ワクチンである。
不活化ウイルスを使用する場合、ワクチンは、全ビリオンを含む場合もあり、スプリットビリオンを含む場合もあり、精製表面抗原を含む場合もある（ヘマグルチニンを含み、通例、ノイラミニダーゼも含む）。
不活化ワクチンであるが全細胞ワクチンではないワクチン（例えば、スプリットウイルスワクチンまたは精製表面抗原ワクチン）は、この抗原内に位置するさらなるＴ細胞エピトープから利益を得るために、マトリックスタンパク質を含みうる。したがって、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼを含む非全細胞ワクチン（特に、スプリットワクチン）は加えて、Ｍ１マトリックスタンパク質および／またはＭ２マトリックスタンパク質も含みうる。有用なマトリックス断片は、参考文献１３において開示されている。また、核タンパク質も存在させることができる。
ビリオンは、ウイルス含有流体から多様な方法で採取することができる。例えば、精製プロセスは、ビリオンを破壊する洗浄剤を含む直線スクロース勾配の溶液を使用するゾーン遠心分離を伴いうる。次いで、任意選択の希釈の後、透析濾過により抗原を精製することができる。
スプリットビリオンは、「Ｔｗｅｅｎエーテル」スプリット化プロセスを含めて、精製されたビリオンを、洗浄剤および／または溶媒で処理して、ビリオン未満の調製物を作製することにより得る。当技術分野では、インフルエンザウイルスをスプリット化する方法が周知である。例えば、参考文献１４〜１９などを参照されたい。ウイルスのスプリット化は、スプリット化剤の破壊濃度で感染性の場合であれ、非感染性の場合であれ、全ウイルスを破壊するかまたは断片化することにより実行することが典型的である。破壊は、ウイルスタンパク質の完全または部分的な可溶化、ウイルスの完全性の変化を結果としてもたらす。好ましいスプリット化剤は、非イオン性界面活性剤およびイオン性（例えば、カチオン性）界面活性剤である。適切なスプリット化剤は、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコール酸、トリ−Ｎ−ブチルリン酸、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）、トリ−Ｎ−ブチルリン酸、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびＤＯＴ−ＭＡ、オクチルフェノキシポリオキシエタノールまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎ Ｎ１０１などのＴｒｉｔｏｎ界面活性剤）、ノノキシノール９（ＮＰ９）（Ｓｙｍｐａｔｅｎｓ−ＮＰ／０９０）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステル（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｌｅｎｅ ｅｓｔｅｒｓ）などを含むがこれらに限定されない。１つの有用なスプリット化手順では、デオキシコール酸ナトリウムとホルムアルデヒドとの連続的効果を使用し、スプリット化は、初期のビリオン精製時に行う（例えば、スクロース密度勾配溶液中で）ことができる。したがって、スプリット化プロセスは、ビリオン含有材料の浄化（非ビリオン材料を除去するための）、採取されたビリオンの濃縮（例えば、ＣａＨＰＯ４吸着などの吸着法を使用する）、全ビリオンの非ビリオン材料からの分離、密度勾配遠心分離ステップにおいてスプリット化剤を使用する、ビリオンのスプリット化（例えば、デオキシコール酸ナトリウムなどのスプリット化剤を含有するスクロース勾配を使用する）、次いで、所望されない材料を除去するための濾過（例えば、限外濾過）を伴いうる。スプリットビリオンは、リン酸ナトリウムにより緩衝された等張性塩化ナトリウム溶液中に再懸濁させると有用でありうる。ＢＥＧＲＩＶＡＣ（商標）製品、ＦＬＵＡＲＩＸ（商標）製品、ＦＬＵＺＯＮＥ（商標）製品、およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤ（商標）製品は、スプリットワクチンである。
精製表面抗原ワクチンは、インフルエンザの表面抗原であるヘマグルチニンを含み、また、ノイラミニダーゼも含むことが典型的である。当技術分野では、これらのタンパク質を精製形態で調製するためのプロセスが周知である。ＦＬＵＶＩＲＩＮ（商標）製品、ＡＧＲＩＰＰＡＬ（商標）製品、およびＩＮＦＬＵＶＡＣ（商標）製品は、サブユニットワクチンである。
不活化インフルエンザ抗原の別の形態は、ウィロソーム（核酸非含有ウイルス様リポソーム粒子）［２０］である。ウィロソームは、洗浄剤によりインフルエンザウイルスを可溶化した後で、ヌクレオカプシドを除去し、ウイルス糖タンパク質を含有する膜を再構成することにより調製することができる。ウィロソームを調製するための代替法は、ウイルス膜の糖タンパク質を、過剰量のリン脂質へと添加して、それらの膜内にウイルスタンパク質を伴う、リポソームをもたらすステップを伴う。ＩＮＦＬＥＸＡＬ Ｖ（商標）製品およびＩＮＶＡＶＡＣ（商標）製品では、ウィロソームが使用されている。
インフルエンザ抗原は、生弱毒化インフルエンザウイルス（ＬＡＩＶ）でありうる。ＬＡＩＶワクチンは、鼻腔内スプレーにより投与することができ、投与１回当たり１株当たり１０６．５〜１０７．５ＦＦＵ（蛍光フォーカス単位）の間の生弱毒化ウイルスを含有することが典型的である。ＬＡＩＶ株は、低温適応（「ｃａ」）でありうる、すなわち、多くの野生型インフルエンザウイルスの複製に制限的な温度である２５℃で効率的に複製することができる。ＬＡＩＶ株は、温度感受性（「ｔｓ」）でありうる、すなわち、その複製が、多くの野生型インフルエンザウイルスが効率的に成長する温度（３７〜３９℃）で制約される。ＬＡＩＶ株は、例えば、ヒトインフルエンザ感染のフェレットモデルにおいてインフルエンザ様疾病をもたらさないように、弱毒化（「ａｔｔ」）することができる。抗原特性とｃａ表現型、ｔｓ表現型、およびａｔｔ表現型との累積効果は、弱毒化ワクチン内のウイルスが、鼻咽頭内で複製されて、典型的なヒト患者において防護的免疫を誘導しうるが、疾患を引き起こさない、すなわち、標的ヒト集団への一般の投与に安全であることである。ＦＬＵＭＩＳＴ（商標）は、ＬＡＩＶワクチンである。
ＨＡは、現在の不活化インフルエンザワクチンにおける主要な免疫原であり、ワクチン用量は、典型的には、ＳＲＩＤにより測定されるＨＡレベルを基準とすることにより標準化される。既存のワクチンは、１株当たり約１５μｇのＨＡを含有することが典型的であるが、低用量は、例えば、小児に使用することもでき、流行状況において使用することもでき、アジュバントを使用する場合に使用することもできる。高用量（例えば、３倍用量または９倍用量［２１、２２］）と同様に、２分の１用量（すなわち、１株当たり７．５μｇのＨＡ）、４分の１用量、および８分の１用量などの分割用量も使用されている。したがって、ワクチンは、インフルエンザ株１株当たり０．１〜１５０μｇの間のＨＡ、好ましくは、０．１〜５０μｇの間のＨＡ、例えば、０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇなどのＨＡを含みうる。特定の用量は、例えば、１株当たり約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９、約１．５などを含む。小児における使用には、１株当たり７．５μｇの用量が理想的である。
生ワクチンのためには、投与量を、ＨＡ含量ではなく、中央値組織培養物感染用量（ＴＣＩＤ５０）で測定し、１株当たり１０６〜１０８の間の（好ましくは、１０６．５〜１０７．５の間の）ＴＣＩＤ５０が典型的である。
ワクチンにおける使用のためのインフルエンザウイルス株は、季節ごとに変化する。現在の流行間期において、ワクチンは、２つのＡ型インフルエンザ株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）および１つのＢ型インフルエンザ株を含むことが典型的であり、本発明を伴う使用のためには、三価ワクチンが典型的である。好ましくは、本発明の組成物は、Ａ型インフルエンザウイルスに由来する抗原を含む。任意選択で、本発明の組成物は、Ｂ型インフルエンザウイルスに由来する抗原を含む。本発明の組成物が、Ａ型インフルエンザウイルスに由来する抗原を含む場合、本発明では、季節性株および／または汎発性株を使用することができる。季節およびワクチン内に組み入れられる抗原の性質に応じて、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン亜型であるＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６のうちの１または複数を含みうる（そして、これらに対して防護しうる）。ワクチンは加えて、ＮＡ亜型であるＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、またはＮ９のうちのいずれかに由来するノイラミニダーゼも含みうる。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、汎発性Ａ型インフルエンザウイルス株に由来する免疫原を含む。汎発性株の特徴は、（ａ）ワクチンのレシピエントおよび一般のヒト集団が、この株のヘマグルチニンに対して免疫的に未感作であるように、現在広がっているヒト株におけるヘマグルチニンと比較して新規のヘマグルチニン、すなわち、１０年間にわたりヒト集団において顕性ではなかったヘマグルチニン（例えば、Ｈ２）、またはヒト集団においてかつては全く見られなかったヘマグルチニン（例えば、一般に鳥類集団だけにおいて見出されたＨ５、Ｈ６、またはＨ９）を含有すること；（ｂ）ヒト集団において水平伝播することが可能であること；および（ｃ）ヒトに対して病原性であることである。汎発性株は、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７、またはＨ９亜型株、例えば、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１、およびＨ７Ｎ７株を含むがこれらに限定されない。Ｈ５亜型内で、ウイルスは、いくつかのクレード、例えば、クレード１またはクレード２に帰着しうる。異なる地理的分布を有するサブクレード１、２、および３を伴うクレード２の６つのサブクレードが同定されており、ヒト感染におけるそれらの関与に起因して、特に、関与性である。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、Ｂ型インフルエンザウイルス免疫原を含む。Ｂ型インフルエンザウイルスは現在、異なるＨＡ亜型を提示していないが、Ｂ型インフルエンザウイルス株は、２つの異なる系統に帰着する。これらの系統は、１９８０年代後半に出現し、互いに抗原的および／または遺伝子的に識別されうるＨＡを有する［２３］。現在のＢ型インフルエンザウイルス株は、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株またはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株である。これらの株は通例、抗原的に識別されるが、また、２つの系統を識別するために、アミノ酸配列の差異も記載されている。例えば、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株は、「Ｌｅｅ４０」ＨＡ配列［２４］に照らして番号付けされたアミノ酸残基１６４における欠失を伴うＨＡタンパク質を有することが多い（しかし、常にこれを有するわけではない）。本発明は、いずれの系統のＢ型ウイルスに由来する抗原と共に使用することもできる。
ワクチンが、複数のインフルエンザ株を含む場合、異なる株は、個別に成長させ、ウイルスを採取し、抗原を調製した後で混合することが典型的である。したがって、本発明の製造プロセスは、複数のインフルエンザ株に由来する抗原を混合するステップを含みうる。
本発明と共に使用されるインフルエンザウイルスは、再集合体株であることが可能であり、逆遺伝学法により得られている。逆遺伝学法［例えば、２５〜２９］は、プラスミドを使用して、所望のゲノムセグメントを伴うインフルエンザウイルスをｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて調製することを可能とする。逆遺伝学法は、細胞内のいずれの種類のＤＮＡの発現も、完全なインタクト感染性ビリオンのアセンブリーをもたらすように、（ａ）例えば、ｐｏｌＩプロモーターまたはバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーターに由来する、所望のウイルスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子および（ｂ）例えば、ｐｏｌＩＩプロモーターに由来する、ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子を発現させることを伴うことが典型的である。ＤＮＡは、全てのウイルスＲＮＡおよびウイルスタンパク質をもたらすことが好ましいが、また、ヘルパーウイルスを使用して、ＲＮＡおよびタンパク質のうちの一部をもたらすことも可能である。各ウイルスＲＮＡを産生させるために個別のプラスミドを使用する、プラスミドベースの方法を使用できる［３０〜３２］が、これらの方法はまた、ウイルスタンパク質のうちの全部または一部（例えば、ＰＢ１タンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＡタンパク質、およびＮＰタンパク質だけ）を発現させるプラスミドの使用も伴い、いくつかの方法では、最大で１２のプラスミドを使用する。必要とされるプラスミドの数を低減するため、近年の手法［３３］では、同じプラスミド上の複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（ウイルスＲＮＡを合成するための）（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つ全てのＡ型インフルエンザｖＲＮＡセグメントをコードする配列）と、別のプラスミド上のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを伴う複数のタンパク質コード領域（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つ全てのＡ型インフルエンザｍＲＮＡ転写物をコードする配列）とを組み合わせる。参考文献３３の方法の好ましい態様は、（ａ）単一のプラスミド上の、ＰＢ１ ｍＲＮＡコード領域、ＰＢ２ ｍＲＮＡコード領域、およびＰＡ ｍＲＮＡコード領域を伴い、（ｂ）単一のプラスミド上の８つのｖＲＮＡコードセグメント全てを伴う。また、１つのプラスミド上にＮＡセグメントおよびＨＡセグメントを含み、別のプラスミド上の６つの他のセグメントを含むことも、事態を容易にしうる。
ウイルスＲＮＡセグメントをコードするｐｏｌＩプロモーターを使用することに対する代替法として、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターを使用することも可能である［３４］。例えば、ＳＰ６ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、またはＴ７ポリメラーゼのためのプロモーターを使用しうると好都合である。ｐｏｌＩプロモーターの種特異性のために、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターは、多くの細胞型（例えば、ＭＤＣＫ）により好都合でありうるが、細胞には、外因性ポリメラーゼ酵素をコードするプラスミドもトランスフェクトしなければならない。
他の技法では、ｐｏｌＩプロモーターおよびｐｏｌＩＩプロモーターを二重に使用して、ウイルスＲＮＡおよび単一の鋳型から発現可能なｍＲＮＡを同時にコードすることも可能である［３５、３６］。
したがって、Ａ型インフルエンザウイルスは、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスに由来する１または複数のＲＮＡセグメントを含みうる（６つのセグメントは、Ａ／ＰＲ／８／３４に由来し、ＨＡセグメントおよびＮセグメントは、ワクチン株に由来する、すなわち、６：２の再集合体であることが典型的である）。Ａ型インフルエンザウイルスはまた、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルスに由来する１または複数のＲＮＡセグメントを含む場合もあり、ワクチンを調製するための再集合体ウイルスを作り出すのに有用な他の任意のウイルス株に由来する１または複数のＲＮＡセグメントを含む場合もある。Ａ型インフルエンザウイルスは、ＡＡ／６／６０インフルエンザウイルス（Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０）に由来する６つ未満（すなわち、０、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ）のウイルスセグメントを含みうる。Ｂ型インフルエンザウイルスは、ＡＡ／１／６６インフルエンザウイルス（Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６）に由来する６つ未満（すなわち、０、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ）のウイルスセグメントを含みうる。本発明は、ヒト間の伝播が可能な株に対して防護することが典型的であるので、この株のゲノムは通例、哺乳動物（例えば、ヒト）のインフルエンザウイルスに由来した少なくとも１つのＲＮＡセグメントを含むであろう。哺乳動物のインフルエンザウイルスに由来した少なくとも１つのＲＮＡセグメントは、トリインフルエンザウイルスに由来したＮＳセグメントを含みうる。
それらの抗原を組成物中に組み入れうる株は、耐性汎発性株［３８］を含む、抗ウイルス療法に対して耐性（例えば、オセルタミビル［３７］および／またはザナミビルに対して耐性）でありうる。
本発明と共に使用されるＨＡは、ウイルス内で見出される天然ＨＡの場合もあり、修飾されている場合もある。
例えば、これらの決定基は、除去しなければ、ウイルスが卵内で成長することを防止するので、ウイルスを鳥類種において高度に病原性とする決定基（例えば、ＨＡ１とＨＡ２との間の切断部位の近傍における超塩基性領域）を除去するようにＨＡを修飾することが公知である。
抗原の供給源として使用されるウイルスは、卵（例えば、特定病原体非含有卵）上で成長させることもでき、細胞培養物上で成長させることもできる。インフルエンザウイルスを成長させるための現在の標準的な方法では、卵の内容物（尿膜腔液）から精製されたウイルスと共に、孵化鶏卵を使用する。しかし、より近年では、ウイルスは、動物細胞培養物中で成長させており、速度および患者アレルギーの理由で、この成長法が好ましい。
細胞系は、哺乳動物由来であることが典型的であろう。適切な哺乳動物由来の細胞は、ハムスター細胞、畜牛細胞、霊長動物細胞（ヒト細胞およびサル細胞を含む）、およびイヌ細胞を含むがこれらに限定されないが、霊長動物細胞の使用は、好ましくない。腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞など、多様な細胞型を使用することができる。適切なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１細胞系またはＨＫＣＣ細胞系の名称を有する細胞系である。適切なサル細胞は、例えば、Ｖｅｒｏ細胞系内の腎臓細胞など、アフリカミドリザル細胞である［３９〜４１］。適切なイヌ細胞は、例えば、ＣＬＤＫ細胞系内およびＭＤＣＫ細胞系内などの腎臓細胞である。
したがって、適切な細胞系は、ＭＤＣＫ；ＣＨＯ；ＣＬＤＫ；ＨＫＣＣ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；Ｖｅｒｏ；ＭＲＣ−５；ＰＥＲ．Ｃ６［４２］；ＦＲｈＬ２；ＷＩ−３８などを含むがこれらに限定されない。適切な細胞系は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクション［４３］、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［４４］、またはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から広く入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、型番ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６、およびＣＲＬ−１５８７の下に、多様な異なるＶｅｒｏ細胞を供給しており、型番ＣＣＬ−３４の下に、ＭＤＣＫ細胞も供給している。ＰＥＲ．Ｃ６は、受託番号９６０２２９４０の下に、ＥＣＡＣＣから入手可能である。
最も好ましい細胞系は、哺乳動物型のグリコシル化を伴う細胞系である。哺乳動物細胞系に対するそれほど好ましくない代替法として、ウイルスは、カモ（例えば、カモ網膜）またはニワトリに由来する細胞系を含む、鳥類細胞系上で成長させることもできる［例えば、参考文献４５〜４７］。鳥類細胞系の例は、鳥類胚性幹細胞［４５、４８］およびカモ網膜細胞［４６］を含む。適切な鳥類胚性幹細胞は、ニワトリ胚性幹細胞に由来するＥＢｘ細胞系であるＥＢ４５、ＥＢ１４、およびＥＢ１４〜０７４を含む［４９］。また、ニワトリ胚性線維芽細胞（ＣＥＦ）も使用することができる。しかし、鳥類細胞を使用せず、哺乳動物細胞を使用することは、ワクチンが、鳥類ＤＮＡおよび鳥類卵タンパク質（オボアルブミンおよびオボムコイドなど）を含有せず、これにより、アレルギー原性を低減しうることを意味する。
インフルエンザウイルスを成長させるのに最も好ましい細胞系は、メイディンダービーイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞系［５０〜５３］である。元のＭＤＣＫ細胞系は、ＡＴＣＣから、ＣＣＬ−３４として入手可能であるが、この細胞系の派生細胞もまた、使用することができる。例えば、参考文献５０は、懸濁培養物中で成長させるために適応させたＭＤＣＫ細胞系（「ＭＤＣＫ ３３０１６」；ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託されている）について開示している。同様に、参考文献５４も、血清非含有培養物中に懸濁させて成長させたＭＤＣＫから派生させた細胞系（「Ｂ−７０２」；ＦＥＲＭ ＢＰ−７４４９として寄託されている）について開示している。参考文献５５は、「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０２）、および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）を含む、非腫瘍原性ＭＤＣＫ細胞について開示している。参考文献５６は、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２０４２）を含む、感染感受性が高いＭＤＣＫ細胞系について開示している。これらのＭＤＣＫ細胞系のうちのいずれも使用することができる。
ウイルスは、付着性培養物中の細胞上で成長させることもでき、懸濁液中の細胞上で成長させることもできる。また、マイクロ担体培養物も使用することができる。したがって、いくつかの実施形態では、細胞を、懸濁液中で成長させるように適応させることができる。
細胞系は、血清非含有培養培地中および／またはタンパク質非含有培地中で成長させることが好ましい。ヒト由来または動物由来の血清に由来する添加物を含まない本発明の文脈では、培地を、血清非含有培地と称する。このような培養物中で成長している細胞は、当然ながら、タンパク質自体を含有するが、タンパク質非含有培地とは、その中で、タンパク質、成長因子、他のタンパク質添加物、および非血清タンパク質を除外しても細胞の繁殖は生じるが、任意選択で、ウイルスの成長に必要でありうる、トリプシンまたは他のプロテアーゼなどのタンパク質も含みうる培地を意味することが理解される。
インフルエンザウイルスの複製を支援する細胞系は、ウイルスの複製時に、３７℃未満で（例えば、３０〜３６℃、または約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃で）成長させることが好ましい［５７］。
培養された細胞内でインフルエンザウイルスを増殖させるための方法は一般に、細胞培養物に、成長させる株の接種物を接種するステップと、感染細胞を、例えば、ウイルスの力価または抗原の発現により決定される時間など、ウイルスを増殖させるのに所望の時間にわたり（例えば、接種後２４〜１６８時間の間にわたり）培養するステップと、増殖させたウイルスを回収するステップとを含む。培養された細胞に、ウイルス（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ５０により測定される）を、１：５００〜１：１、好ましくは１：１００〜１：５、より好ましくは１：５０〜１：１０の細胞比まで接種する。ウイルスは、細胞懸濁液へと添加するか、または細胞の単層へと適用し、ウイルスは、少なくとも６０分間であるが、通例３００分間未満、好ましくは、２５℃〜４０℃、好ましくは、２８℃〜３７℃で９０〜２４０分間の間にわたり、細胞上で吸着させる。感染細胞培養物（例えば、単層）は、凍結−融解により除去することもでき、採取される培養物上清のウイルス含量を増大させる酵素作用により除去することもできる。次いで、採取された流体を、不活化または凍結させて保存する。培養された細胞は、約０．０００１〜１０、好ましくは０．００２〜５、より好ましくは０．００１〜２の感染多重度（「ｍ．ｏ．ｉ．」）で感染させることができる。さらにより好ましくは、細胞は、約０．０１のｍ．ｏ．ｉで感染させる。感染細胞は、感染の３０〜６０時間後に採取することができる。細胞は、感染の３４〜４８時間後に採取することが好ましい。細胞は、感染の３８〜４０時間後に採取することがさらにより好ましい。プロテアーゼ（典型的にはトリプシン）は一般に、細胞培養時に添加して、ウイルスの放出を可能とするものであり、プロテアーゼは、培養中の任意の適切な段階において、例えば、接種の前に、接種と同時に、または接種の後で添加することができる［５７］。
特に、ＭＤＣＫ細胞を伴う好ましい実施形態では、細胞系を、マスターの作業細胞バンクから、４０集団倍加レベルを超えては継代培養しない。
ウイルス接種物およびウイルス培養物は、単純ヘルペスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、リノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、および／またはパルボウイルスを含有しない（すなわち、これらについて調べ、これらによる夾雑について陰性結果を得る）ことが好ましい［５８］。単純ヘルペスウイルスの非存在は、特に好ましい。
ウイルスを細胞系上で成長させたら、ＤＮＡによる任意の発がん活性を最小化するために、最終ワクチン中の、細胞系からの残存ＤＮＡの量を最小化することが標準的な慣行である。
したがって、本発明に従い調製されるワクチン組成物が含有する、宿主細胞からの残存ＤＮＡは、投与１回当たり１０ｎｇ未満（好ましくは１ｎｇ未満であり、より好ましくは１００ｐｇ未満）であることが好ましいが、微量の宿主細胞ＤＮＡは存在しうる。
ワクチンが容量０．２５ｍｌ当たりに含有する宿主細胞ＤＮＡは、＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）であるので、ヘマグルチニン１５μｇ当たりに含有する宿主細胞ＤＮＡは、＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）であるワクチンが好ましい。ワクチンが容量０．５ｍｌ当たりに含有する宿主細胞ＤＮＡは、＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）であるので、ヘマグルチニン５０μｇ当たりに含有する宿主細胞ＤＮＡは、＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）であるワクチンがより好ましい。
任意の宿主細胞からの残存ＤＮＡの平均の長さは、５００ｂｐ未満、例えば、４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満などであることが好ましい。
夾雑ＤＮＡは、ワクチンの調製時に、例えば、クロマトグラフィーなどの標準的な精製手順を使用して除去することができる。宿主細胞からの残存ＤＮＡの除去は、ヌクレアーゼ処理により、例えば、ＤＮアーゼを使用することにより増強することができる。宿主細胞ＤＮＡの夾雑を低減するために好都合な方法は、参考文献５９および６０において開示されており、まず、ウイルスの成長時に使用しうるＤＮアーゼ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）を使用し、次いで、ビリオンの破壊時に使用しうるカチオン性洗浄剤（例えば、ＣＴＡＢ）を使用する、２ステップの処理を伴う。また、β−プロピオラクトン処理による除去も使用することができる。
宿主細胞からの残存ＤＮＡの測定は今や、生物学的薬剤についての規制機関による日常的な要求事項となっており、当業者の通常の能力の範囲内にある。ＤＮＡを測定するのに使用されるアッセイは、妥当性を確認されたアッセイであることが典型的であろう［６１、６２］。妥当性を確認されたアッセイの性能の特徴は、数学的かつ定量化可能な形で記載することができ、その可能な誤差の発生源も同定されているであろう。アッセイは一般に、確度、精度、特異度などの特徴について調べられているであろう。アッセイを較正（例えば、宿主細胞ＤＮＡについて公知の基準量に照らして）し、調べたら、定量的ＤＮＡの測定を日常的に実施することができる。
ＤＮＡを定量化するための３つの主要な技法：サザンブロットまたはスロットブロットなどのハイブリダイゼーション法［６３］；Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）Ｓｙｓｔｅｍなどのイムノアッセイ法［６４］；および定量的ＰＣＲ［６５］を使用することができる。当業者には、これらの方法全てが熟知されているが、例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブの選択、増幅のためのプライマーおよび／またはプローブの選択など、各方法の正確な特徴は、問題となる宿主細胞に依存しうる。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ製のＴｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）システムは、ピコグラムレベルの全ＤＮＡについての定量的アッセイであり、生物学的医薬品中の夾雑ＤＮＡのレベルをモニタリングするために使用されている［６４］。典型的なアッセイは、ビオチニル化ｓｓＤＮＡ結合性タンパク質、ウレアーゼコンジュゲート抗ｓｓＤＮＡ抗体、およびＤＮＡの間の反応複合体の非配列特異的形成を伴う。全てのアッセイ成分は、製造元から入手可能な完全なＴｏｔａｌ ＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔに組み入れられている。多様な市販製造元により、例えば、ＡｐｐＴｅｃ（商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ（商標）、Ａｌｔｈｅａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなど、宿主細胞からの残存ＤＮＡを検出するための定量的ＰＣＲアッセイが提供されている。ヒトウイルスワクチンへの宿主細胞ＤＮＡの夾雑を測定するための、化学発光ハイブリダイゼーションアッセイと、全ＤＮＡ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）システムとの比較については、参考文献６６において見出すことができる。インフルエンザウイルス免疫原は、多様な形態を取りうる。
ポリペプチドベースの免疫原自体の送達に対する代替法としては、体内への送達の後、ポリペプチドをｉｎ ｓｉｔｕで発現させるように、ポリペプチドをコードする核酸を投与することもできる。核酸による免疫化では、（ｉ）プロモーター；（ｉｉ）前記プロモーターに作動可能に連結された、免疫原をコードする配列；および（ｉｉｉ）選択用マーカーを含むプラスミドなどのベクターを活用することが典型的である。ベクターは、（ｉｖ）複製起点；および（ｖ）（ｉｉ）の下流にあり、これに作動可能に連結された転写ターミネーターをさらに含むことが多い。成分（ｉ）および（ｖ）が通例、真核細胞成分であるのに対し、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は、原核細胞成分であろう。
免疫原性組成物中で使用されるポリペプチドは、天然のインフルエンザポリペプチド（前駆体形態または成熟形態）のアミノ酸配列を有する場合もあり、人工アミノ酸配列の場合もある。例えば、免疫原性組成物中で使用されるポリペプチドは、融合タンパク質の場合もあり、天然のインフルエンザ配列の断片（例えば、エピトープを含む）を含む場合もある。
アジュバント
本発明のワクチンおよび組成物は、組成物を施される患者において誘発される免疫応答（体液性および／または細胞性）を増強するように機能しうる、アジュバントを含むと有利でありうる。インフルエンザワクチンを伴うアジュバントの使用については、既に記載されている。米国特許第６，３７２，２２３号およびＷＯ００／１５２５１では、水酸化アルミニウムが使用され、ＷＯ０１／２２９９２では、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムとの混合物が使用された。また、Ｈｅｈｍｅら（２００４年）、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．、１０３巻（１〜２号）：１６３〜７１頁でも、アルミニウム塩アジュバントの使用について記載されていた。Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｖａｃｃｉｎｅｓ製のＦＬＵＡＤ（商標）製品は、水中油エマルジョンを含む。アジュバント活性物質は、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ： Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ ＆ Ｎｅｗｍａｎ編）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９９５年［ＩＳＢＮ ０−３０６−４４８６７−Ｘ］およびＶａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ： Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅシリーズの４２巻）、Ｏ’Ｈａｇａｎ編［ＩＳＢＮ： １−５９２５９−０８３−７］においてより詳細に論じられている。
本発明と共に使用されうるアジュバントは、ＷＯ２００８／０６８６３１において記載されているアジュバントを含むがこれらに限定されない。組成物は、前記アジュバントのうちの２つ以上を含みうる。組成物中の抗原とアジュバントとは、混合することが典型的であろう。
水中油エマルジョンアジュバント
水中油エマルジョンは、インフルエンザウイルスワクチンのアジュバント処理における使用に特に適することが分かっているので、本発明を伴う使用のための好ましいアジュバントである。多様なこのようなエマルジョンが公知であり、少なくとも１つの油と、少なくとも１つの界面活性剤とを含むことが典型的であり、油および界面活性剤は、生体分解性（代謝性）および生体適合性である。エマルジョン中の油滴は一般に、直径が５μｍ未満であり、エマルジョンは、直径がミクロン未満の油滴を含むと有利であり、これらの微小サイズは、安定的なエマルジョンを提供するマイクロフルイダイザーにより達成される。フィルター滅菌にかけうるので、サイズが２２０ｎｍ未満の液滴が好ましい。
本発明は、動物（魚類など）または植物供給源に由来する油などの油と共に使用することができる。植物油のための供給源は、堅果、種子、および穀類を含む。最も一般に入手可能なラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油、およびオリーブ油が、堅果油を例示する。例えば、ホホバ豆から得られるホホバ油も使用することができる。種子油は、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油などを含む。穀類群では、トウモロコシ油が最もたやすく入手可能であるが、コムギ、オートムギ、ライムギ、コメ、テフ、ライコムギなど、他の穀物の油もまた使用することができる。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの、炭素６〜１０個の脂肪酸エステルは、種子油中では自然発生しないが、堅果油および種子油から出発する適切な材料を加水分解、分離、およびエステル化することにより調製することができる。哺乳動物のミルクに由来する油脂は、代謝性であるので、本発明を実施するのに使用することができる。当技術分野では、動物供給源に由来する純粋な油を得るために必要な、分離、精製、サポニン化のための手順、および他の手段が周知である。大半の魚類は、たやすく回収されうる代謝性油を含有する。例えば、肝油、サメ肝油、および鯨蝋などの鯨油は、本明細書で使用しうる魚油のうちのいくつかを例示する。いくつかの分枝状鎖油が、５炭素のイソプレン単位により生化学的に合成されており、テルペノイドと一般に称する。サメ肝油は、本明細書で特に好ましい、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンである、スクアレンとして公知の、分枝状の不飽和テルペノイドを含有する。また、スクアレンの飽和類似体であるスクアランも、好ましい油である。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、市販供給元からたやすく入手可能であるか、または当技術分野で公知の方法により得ることができる。他の好ましい油は、トコフェロールである（下記を参照されたい）。油の混合物も使用することができる。
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）により分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤のＨＬＢは、少なくとも１０であり、好ましくは、少なくとも１５であり、より好ましくは、少なくとも１６である。本発明は、ポリオキシエチレンソルビタンエステルによる界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎと称する）、とりわけ、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０；直鎖状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーなど、ＤＯＷＦＡＸ（商標）の商標名で販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変動しうるオクトキシノールであって、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）を特に対象とするオクトキシノール；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰシリーズなどのノニルフェノールエトキシレート；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）など、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、およびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪族エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知である）；ならびにソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）およびソルビタンモノラウレートなどのソルビタンエステル（ＳＰＡＮとして一般に公知である）を含むがこれらに限定されない界面活性剤と共に使用することができる。非イオン性界面活性剤が好ましい。エマルジョン中に組み入れるのに好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチン、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。
界面活性剤の混合物、例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０／Ｓｐａｎ ８５混合物も使用することができる。また、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）などのポリオキシエチレンソルビタンエステルと、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）などのオクトキシノールとの組合せも適する。別の有用な組合せは、ラウレス９に加えたポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。
好ましい量の界面活性剤（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ ８０など）が０．０１〜１％、特に、約０．１％であり；オクチルフェノキシポリオキシエタノールまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の洗浄剤など）が０．００１〜０．１％、特に、０．００５〜０．０２％であり；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）が０．１〜２０％、好ましくは、０．１〜１０％であり、特に、０．１〜１％、または約０．５％である。
本発明と共に有用な、具体的な水中油エマルジョンアジュバントは、以下を含むがこれらに限定されない：
・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ ８０、およびＳｐａｎ ８５によるミクロン未満のエマルジョン。エマルジョンの容量組成は、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０、および約０．５％のＳｐａｎ ８５でありうる。重量では、これらの比は、４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０、および０．４８％のＳｐａｎ ８５となる。このアジュバントは、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ： Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ ＆ Ｎｅｗｍａｎ編）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９５年［ＩＳＢＮ： ０−３０６−４４８６７−Ｘ］の１０章、およびＶａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ： Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅシリーズの４２巻）、Ｏ’Ｈａｇａｎ編［ＩＳＢＮ： １−５９２５９−０８３−７］の１２章においてより詳細に記載されている通り、「ＭＦ５９」（ＷＯ９０／１４８３７；Ｐｏｄｄａ ＆ Ｄｅｌ Ｇｉｕｄｉｃｅ（２００３年）、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、２巻：１９７〜２０３頁；Ｐｏｄｄａ（２００１年）、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９巻：２６７３〜２６８０頁）として公知である。ＭＦ５９エマルジョンは、クエン酸イオン、例えば、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液を含むと有利である；
・スクアレン、トコフェロール、およびポリソルベート８０によるエマルジョン。エマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩液を含みうる。エマルジョンはまた、Ｓｐａｎ ８５（例えば、１％の）および／またはレシチンも含みうる。これらのエマルジョンは、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のトコフェロール、および０．３〜３％のポリソルベート８０を有することが可能であり、スクアレン：トコフェロールの重量比は、これにより安定性の大きなエマルジョンがもたらされるので、≦１であることが好ましい。スクアレンおよびポリソルベート８０は、約５：２の容量比または約１１：５の重量比で存在しうる。したがって、３つの成分（スクアレン、トコフェロール、ポリソルベート８０）は、１０６８：１１８６：４８５または約５５：６１：２５の重量比で存在しうる。１つのこのようなエマルジョン（「ＡＳ０３」）は、Ｔｗｅｅｎ ８０をＰＢＳ中に溶存させて、２％の溶液をもたらし、次いで、９０ｍｌのこの溶液を、５ｇのＤＬ−α−トコフェロールと５ｍｌのスクアレンとの混合物と混合し、次いで、混合物をマイクロ流体化することにより作製することができる。結果として得られるエマルジョンは、例えば、平均直径を１００〜２５０ｎｍの間、好ましくは、約１８０ｎｍとする、ミクロン未満の油滴を有しうる。エマルジョンはまた、３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３ｄ−ＭＰＬ）も含みうる。この種類の別の有用なエマルジョンは、ヒト用量当たり、０．５〜１０ｍｇのスクアレン、０．５〜１１ｍｇのトコフェロール、および０．１〜４ｍｇのポリソルベート８０（ＷＯ２００８／０４３７７４）を、例えば、上記で論じた比で含みうる；
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）によるエマルジョン。エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬも含みうる（下記を参照されたい）。エマルジョンは、リン酸緩衝液を含有しうる；
・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、およびトコフェロール（例えば、α−トコフェロールスクシネート）を含むエマルジョン。エマルジョンは、これらの３つの成分を、約７５：１１：１０の質量比（例えば、７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および１００μｇ／ｍｌのα−トコフェロールスクシネート）で含むことが可能であるが、これらの濃度は、抗原からのこれらの成分の任意の寄与を含むものとする。エマルジョンはまた、スクアレンも含みうる。エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬも含みうる（下記を参照されたい）。水性相は、リン酸緩衝液を含有しうる；
・スクアレン、ポリソルベート８０、およびポロキサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ１２１」）によるエマルジョン。エマルジョンは、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩液中で製剤化することができる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドに有用な送達媒体であり、「ＳＡＦ−１」アジュバント中で、トレオニル−ＭＤＰと共に使用されている（Ａｌｌｉｓｏｎ ＆ Ｂｙａｒｓ（１９９２年）、Ｒｅｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４３巻：５１９〜２５頁）（０．０５〜１％のＴｈｒ−ＭＤＰ、５％のスクアラン、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）。このエマルジョンはまた、Ｔｈｒ−ＭＤＰを伴わずに、「ＡＦ」アジュバントで使用することもできる（Ｈａｒｉｈａｒａｎら（１９９５年）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、５５巻：３４８６〜９頁）（５％のスクアラン、１．２５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）。マイクロ流体化が好ましい；
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンモノオレエートまたは「Ｓｐａｎ ８０」など、ソルビタンエステルまたはマンニドエステル）を含むエマルジョン。エマルジョンは、熱可逆性であり、かつ／またはサイズが２００ｎｍ未満である、少なくとも９０％（容量で）の油滴を有することが好ましい（ＵＳ２００７／０１４８０５）。エマルジョンはまた、アルジトール；凍結防止剤（例えば、ドデシルマルトシドおよび／またはスクロースなどの糖）；および／またはアルキルポリグリコシドのうちの１または複数も含みうる。このようなエマルジョンは、凍結乾燥させることができる。エマルジョンは、３３０：６３：４９：６１の質量比で、スクアレン、ポリオキシエチレンセトステアリルエーテル、ソルビタンオレエート、およびマンニトールを含みうる；
・スクアレン、ポロキサマー１０５、およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅ（Ｓｕｌｉら（２００４年）、Ｖａｃｃｉｎｅ、２２巻（２５〜２６号）：３４６４〜９頁）によるエマルジョン。アジュバント処理されたワクチン中のこれらの成分の最終濃度（重量）は、５％のスクアレン、４％のポロキサマー１０５（ｐｌｕｒｏｎｉｃポリオール）、および２％のＡｂｉｌ−Ｃａｒｅ ８５（ビス−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリド）である；
・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。ＷＯ９５／１１７００において記載されている通り、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、およびカルジオリピンである。ミクロン未満の液滴サイズが有利である；
・非代謝性油（軽鉱物油など）および少なくとも１つの界面活性剤（レシチン、Ｔｗｅｅｎ ８０、またはＳｐａｎ ８０など）による、ミクロン未満の水中油エマルジョン。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン親油性コンジュゲート（グルクロン酸のカルボキシル基を介して、脂肪族アミンを、デスアシルサポニンへと付加することにより作製される、米国特許第６，０８０，７２５号において記載されているＧＰＩ−０１００など）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）、および／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンなどの添加剤を組み入れることもできる；
・鉱物油、非イオン性親油性エトキシル化脂肪族アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤を含むエマルジョン（例えば、エトキシル化脂肪族アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）（ＷＯ２００６／１１３３７３）；
・鉱物油、非イオン性親水性エトキシル化脂肪族アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤を含むエマルジョン（例えば、エトキシル化脂肪族アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）（ＷＯ２００６／１１３３７３）；
・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）とステロール（例えば、コレステロール）とが螺旋状ミセルとして会合したエマルジョン（ＷＯ２００５／０９７１８１）。
組成物中の抗原およびアジュバントは、患者へと送達するときに混合することが典型的であろう。エマルジョンは、抗原と、製造時に混合することもでき、送達時に即席で混合することもできる。したがって、アジュバントと抗原とは、使用時における最終的な調合の準備ができた、パッケージングまたは分配されたワクチンの形で個別に保存することができる。２つの液体を混合することにより、ワクチンを最終的に調製するように、抗原は一般に、水性形態となろう。混合のための２つの液体の容量比は、変動しうる（例えば、５：１〜１：５の間で）が、一般に約１：１である。
抗原とアジュバントとを混合した後で、ヘマグルチニン抗原は一般に、水性溶液中に残存するが、油／水間界面の近傍に分布するであろう。一般に、エマルジョンの油相に入るヘマグルチニンは、存在するとしてもわずかである。
組成物がトコフェロールを含む場合、αトコフェロール、βトコフェロール、γトコフェロール、δトコフェロール、εトコフェロール、またはξトコフェロールのうちのいずれも使用しうるが、α−トコフェロールが好ましい。トコフェロールは、いくつかの形態、例えば、異なる塩および／または異性体の形態を取りうる。塩は、コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩などの有機塩を含む。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールは、いずれも使用することができる。トコフェロールは、ビタミンＥは、この患者群における免疫応答に対して肯定的な効果を及ぼすことが報告されているため、老齢患者（例えば、６０歳以上）における使用のためのワクチン内に組み入れると有利である（Ｈａｎら（２００５年）、Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ ｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ａｇｅｄ ａｔ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、Ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ ＥｕｒｏＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、２００５年６月９〜１０日、パリ）。トコフェロールはまた、エマルジョンを安定化させる一助となりうる抗酸化特性も有する（ＵＳ６６３０１６１）。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールである。このトコフェロールの好ましい塩は、コハク酸塩である。コハク酸塩は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＴＮＦ類縁リガンドと協働作用することが分かっている。さらに、α−トコフェロールスクシネートは、インフルエンザワクチンと適合性であり、水銀化合物に対する代替物として有用な保存剤であることも公知である（ＷＯ０２／０９７０７２）。
上記で言及した通り、スクアレンを含む水中油エマルジョンが特に好ましい。いくつかの実施形態では、ワクチン用量中のスクアレン濃度は、５〜１５ｍｇの範囲（すなわち、０．５ｍｌの投与容量を仮定すると、１０〜３０ｍｇ／ｍｌの濃度）でありうる。しかし、スクアレンの濃度を、例えば、投与１回当たり＜５ｍｇ、なおまたは投与１回当たり＜１．１ｍｇを含むように低減することも可能である（ＷＯ２００７／０５２１５５；ＷＯ２００８／１２８９３９）。例えば、ヒト用量は、投与１回当たり９．７５ｍｇのスクアレン（ＦＬＵＡＤ（商標）製品において、０．５ｍｌの投与容量中に９．７５ｍｇのスクアレン、１．１７５ｍｇのポリソルベート８０、１．１７５ｍｇのソルビタントリオレエートである通り）を含む場合もあり、その部分量、例えば、３／４、２／３、１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、または１／１０を含む場合もある。例えば、組成物は、投与１回当たり７．３１ｍｇのスクアレン（および、したがって、０．８８ｍｇずつのポリソルベート８０およびソルビタントリオレエートの各々）、投与１回当たり４．８７５ｍｇのスクアレン（および、したがって、０．５８８ｍｇずつのポリソルベート８０およびソルビタントリオレエートの各々）、投与１回当たり３．２５ｍｇ、投与１回当たり２．４３８ｍｇ、投与１回当たり１．９５ｍｇ、投与１回当たり０．９７５ｍｇのスクアレンなどを含みうる。これらの、ＦＬＵＡＤ（商標）−ｓｔｒｅｎｇｔｈ ＭＦ５９の部分希釈液のうちのいずれも、本発明と共に使用することができる。
上記で言及した通り、抗原／エマルジョンの混合は、送達時に即席で実施することができる。したがって、本発明は、混合の準備ができた抗原成分およびアジュバント成分を含むキットを提供する。キットは、アジュバントと抗原とを、使用時まで個別に保存することを可能とする。成分は、キット内で互いから物理的に隔てられ、この隔離は、多様な様式で達成することができる。例えば、２つの成分は、２つの個別のバイアルなどの容器に入れることができる。次いで、例えば、一方のバイアルの内容物を取り出し、それらを他のバイアルへと添加するか、または両方のバイアルの内容物を個別に取り出し、それらを第３の容器内で混合することにより、２つのバイアルの内容物を混合することができる。好ましい配置では、キットの成分のうちの１つは、シリンジに入れ、他の成分は、バイアルなどの容器に入れる。シリンジを使用して（例えば、注射針と共に）、その内容物を、混合のために第２の容器へと挿入し、次いで、混合物をシリンジ内に吸引することができる。次いで、混合されたシリンジの内容物を、典型的には、未使用の滅菌注射針を介して、患者へと投与することができる。シリンジ内に１つの成分を封入することにより、患者への投与のために個別のシリンジを使用する必要を排する。別の好ましい配置では、２つのキット成分を併せて保持するが、同じシリンジ内、例えば、ＷＯ２００５／０８９８３７；米国特許第６，６９２，４６８号；ＷＯ００／０７６４７；ＷＯ９９／１７８２０；米国特許第５，９７１，９５３号；米国特許第４，０６０，０８２号；ＥＰ−Ａ−０５２０６１８；ＷＯ９８／０１１７４などにおいて開示されているシリンジなどのダブルチャンバー型シリンジ内に個別に保持する。シリンジを作動させる（例えば、患者への投与時に）と、２つのチャンバーの内容物が混合される。この配置は、使用時の個別の混合ステップに対する必要を回避する。
ＮＫの調節
ＮＫ細胞は、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞に対する初期の免疫防御として作用するリンパ球のサブセットである。ＮＫ細胞の機能障害は、１型糖尿病の発症において役割を果たすという証拠が認められる（例えば、参考文献６７および６８を参照されたい）。したがって、ＮＫ細胞の阻害は、感染した患者において、治療的可能性を有しうる。したがって、本発明は、患者における１型糖尿病を防止または処置するための方法であって、本発明の免疫原性組成物および／または抗ウイルス剤を投与するステップを含む方法を提供し、ならびにまた、ナチュラルキラー細胞活性を阻害するのに有効な免疫調節化合物も提供する。しかし、一般に、完全な阻害は所望されない。
ＮＫの機能を阻害するのに有効な化合物は、メチルプレドニゾロンなどのステロイド；トリブチルすず；Ｈ−２Ｄ（ｄ）などのＬｙ４９リガンド；可溶性ＨＬＡ−Ｇ１；ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ；ＣＤ２４４リガンドなどを含むがこれらに限定されない。
化合物は、ＮＫ細胞に直接的に作用する場合もあり、間接的に作用する場合もある。例えば、トリブチルすずは、ＮＫ細胞に直接的に作用する。これに対し、ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞は、ＮＫ細胞を阻害しうるので、このようなＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を促進し、これにより、ＮＫ細胞を間接的に阻害するために、化合物を患者へと投与することもできる。
診断および／または予後のためのアッセイ
本発明の文脈では、「診断」は、患者における１型糖尿病および／または膵炎それ自体についての決定的な臨床診断ではなく、患者、例えば、小児における、後年において１型糖尿病および／または膵炎を発症する素因の同定に関することが察知されるであろう。患者を、後年における１型糖尿病および／または膵炎の発症に対する素質を有すると同定する場合、１型糖尿病および／または膵炎の症状は、診断の少なくとも１年後、例えば、診断の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０年以上後に生じることが典型的である。場合によって、しかし、患者を、後年における１型糖尿病および／または膵炎の発症に対する素質を有すると同定する場合、１型糖尿病および／または膵炎の症状は、診断から１年以内、例えば、１カ月以内、２カ月以内、３カ月以内、６カ月以内、または９カ月以内に生じることが典型的である。本明細書で記載される検出は、ｉｎ ｖｉｖｏで実施することもでき、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施することもできる。
１型糖尿病の症状は周知であり、強い口渇感、空腹感、疲労感または倦怠感、霧視、脚部における感覚の喪失または脚部における疼き感、その意図を伴わない体重の減少、排尿頻度の増大、深呼吸、呼吸逼迫、顔面紅潮、甘い口臭、悪心、嘔吐、蓄尿不能、胃痛、頭痛、神経過敏、心臓の動悸、発汗、震え、および／または脱力感などを含むことが典型的である。また、膵炎の症状も周知であり、特に、腹部の前側から背部へと放射状に延びる疼痛、悪心、発熱および／もしくは悪寒、腹部膨満、頻拍、倦怠感、めまい感、卒倒感、嗜眠、易刺激性、錯乱、精神集中の困難、頭痛、体重減少、出血、ならびに／または黄疸などを含むことが典型的である。
したがって、本発明は、診断アッセイ法であって、患者試料中で、（ａ）Ａ型インフルエンザウイルスもしくはその発現産物、および／または（ｂ）Ａ型インフルエンザウイルスに対する免疫応答の存在または非存在を検出するステップを含む診断アッセイ法を提供する。存在の検出により、患者は、Ａ型インフルエンザウイルスに感染しており、したがって、続発性の糖尿病関連帰結および／または膵炎関連帰結の危険性があることが示される。したがって、本発明のアッセイは、患者が、後年において１型糖尿病を発症する危険性を増大させているのかどうかを決定するために使用することができる、すなわち、患者（例えば、小児）が、１型糖尿病を発症する素因を有するか否かを決定するために使用することができる。同様に、本発明のアッセイは、患者が、後年において膵炎を発症する危険性を増大させているのかどうかを決定するために使用することができる、すなわち、患者（例えば、小児）が、膵炎を発症する素因を有するか否かを決定するために使用することができる。したがって、一実施形態では、Ａ型インフルエンザウイルスもしくはその発現産物、および／またはＡ型インフルエンザウイルスに対する免疫応答の存在を検出することにより、１型糖尿病および／または膵炎を発症する素因が示される。
患者試料中で、（ｉ）Ａ型インフルエンザウイルスもしくはその発現産物、および／または（ｉ）Ａ型インフルエンザウイルスに対する免疫応答の非存在を検出することにより、患者（典型的には小児）は、Ａ型インフルエンザウイルスにいまだ感染していないことが示される。このような患者は、本発明の組成物による処置のための好ましい候補である。
本発明者らは、Ａ型インフルエンザウイルス感染が、膵臓損傷と関連することを見出した。したがって、Ａ型インフルエンザウイルス感染のレベルは、１型糖尿病および／または膵炎の予後を示しうる。例えば、Ａ型インフルエンザウイルス感染のレベルが高ければ、より重度の膵臓損傷がもたらされ、したがって、より重度の１型糖尿病および／または膵炎の提示がなされる。患者における１型糖尿病および／または膵炎の予後は、患者試料中での、Ａ型インフルエンザウイルスもしくはその発現産物、および／またはＡ型インフルエンザウイルスに対する免疫応答のレベルの、基準レベルとの比較を伴うことが典型的である。基準レベルは、１型糖尿病および／または膵炎の重症度が決定されている別の患者において観察されるレベルであることが好ましい。
したがって、いくつかの実施形態では、高レベルのＡ型インフルエンザウイルスもしくはその発現産物、および／またはＡ型インフルエンザウイルスに対する免疫応答の検出により、１型糖尿病および／または膵炎についての予後の、例えば、基準レベルと比較した不良が示される。逆に、患者試料中で検出されるＡ型インフルエンザウイルスもしくはその発現産物、および／またはＡ型インフルエンザウイルスに対する免疫応答のレベルが低ければ、１型糖尿病および／または膵炎についての予後の、例えば、基準レベルと比較した良好が示される。
本発明のアッセイ法は、陽性試料をさらなる解析にかける、スクリーニングプロセスの一部として使用することができる。一般に、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルス感染を、特に、膵臓ベータ細胞との関連で検出するのに使用され、感染の存在は、単独で、または他の検査結果と組み合わせて、診断または予後の基盤として使用されるであろう。本発明のアッセイ法は、患者が、１型糖尿病を発症する素因を有するか否かを同定し、かつ／または予後を決定するための方法であることが好ましい。
本発明のアッセイ法により、インフルエンザウイルス（例えば、その一本鎖ＲＮＡゲノム、プロビリオン、ビリオン）、インフルエンザウイルスの発現産物（例えば、そのアンチゲノム、ウイルスｍＲＮＡ転写物、例えば、ＮＳ１、ＰＢ−１−Ｆ２、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、マトリックスタンパク質（Ｍ１および／またはＭ２）、リボ核タンパク質、核タンパク質、ポリメラーゼ複合体（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ）またはそのサブユニット、核外輸送タンパク質など、コードされたポリペプチド）、またはインフルエンザウイルスに対する免疫応答の産物（例えば、ウイルスポリペプチドに対する抗体、ウイルスポリペプチドを認識するＴ細胞）を検出することができる。
ＲＮＡを検出するのに有用な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応であり、特に、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ＰＣＲ）である。核酸増幅法についてのさらなる詳細は、下記に示す。
試料中のポリペプチドの存在または非存在を検出するための、多様な技法が利用可能である。これらは一般に、抗体とポリペプチド内の抗原性アミノ酸配列との間の特異的相互作用に基づくイムノアッセイ法である。適切な技法は、標準的な免疫組織学法、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ、免疫沈降、免疫蛍光などを含む。サンドイッチアッセイが典型的である。多様なインフルエンザウイルスに対する抗体は、既に市販されている。
ポリペプチドはまた、機能的アッセイ、例えば、結合活性または酵素活性を検出するアッセイによっても検出することができる。本発明のポリペプチドを検出する別のやり方は、標準的なプロテオミクス法を使用することであり、例えば、ポリペプチドを精製または分離し、次いで、ペプチドシークエンシングを使用することである。例えば、ポリペプチドは、２Ｄ−ＰＡＧＥを使用して分離することができ、ポリペプチドスポットは、配列が標的ポリペプチド内に存在するのかどうかを同定するために、シークエンシングする（例えば、質量分析により）ことができる。これらの技法のうちの一部は、検出の前に、標的ポリペプチドの濃縮を要求する場合があり、このような濃縮に対する必要を伴わない他の技法を直接的に使用することもできる。
インフルエンザウイルスに対する抗体は、試料中に存在する可能性があり、例えば、固定化することが典型的なインフルエンザウイルスポリペプチドを使用する、従来のイムノアッセイ法により検出することができる。
防止および治療
本発明を使用して、患者における１型糖尿病および／または膵炎を防止することができる。このような患者は、１型糖尿病および／または膵炎を既に患っているわけではなく、１型糖尿病および／または膵炎の発症の危険性がある。このような患者は、前糖尿病性症状、例えば、膵島炎を呈示しつつある可能性がある。防止は、（ｉ）患者が１型糖尿病を発症する危険性の低減、および（ｉｉ）患者が１型糖尿病を発症する前の時間の延長の両方を包含する。
Ａ型インフルエンザウイルス感染は、膵炎をもたらすことが見出されているため、本発明はまた、前糖尿病性患者および／または前膵炎性患者における膵炎を防止または処置するのにも使用することができる。このような処置または防止は、１型糖尿病および／または膵炎の発症および発生を防止しうるさらなるやり方である。
いくつかの実施形態では、本発明はまた、患者における１型糖尿病および／または膵炎を処置するのにも使用することができる。例えば、治療のための免疫化または抗ウイルス処置を使用して、インフルエンザウイルス感染を除去し、次いで、ベータ細胞再生を可能とする（任意選択で、１型糖尿病の自己免疫性の側面の処置と組み合わせて）ことができる。方法は、膵島移植またはベータ細胞前駆体もしくは幹細胞の移植と組み合わせることができる。「処置」、「〜を処置すること」、「〜を処置する」などという用語は、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを指す。効果は、１型糖尿病および／または１型糖尿病に帰せられうる有害作用の部分的または完全な安定化または治癒との関係で治療的でありうる。「処置」は、疾患症状の阻害（すなわち、その発症の停止）および疾患症状の緩和（すなわち、疾患または症状の退縮をもたらす）を含む。
上記で記載した治療のための免疫化または抗ウイルス処置を使用して、前糖尿病性症状（例えば、膵島炎）を患っており、したがって、１型糖尿病を発症する危険性が高い患者におけるインフルエンザウイルス感染を除去し、次いで、ベータ細胞再生を可能とする（任意選択で、１型糖尿病の自己免疫性の側面の処置と組み合わせて）ことができる。
本発明は、１型糖尿病を防止および／または処置する方法と共に使用することができる。１型糖尿病を処置する方法は、例えば、シクロスポリンＡの投与、抗ＣＤ３抗体、例えば、テプリズマブおよび／またはオテリキシズマブの投与、抗ＣＤ２０抗体、例えば、リツキシマブの投与、インスリン療法、ＧＡＤ６５（１型糖尿病に関与する自己抗原）によるワクチン接種、膵臓移植、膵島細胞移植などを含む。現在のところ、１型糖尿病を防止するための方法は確立されていない。しかし、糖尿病の発症と乳児期における牛乳の摂取との間には連関が認められると考えられている（参考文献６９を参照されたい）ので、一部の医師は、１型糖尿病を伴う両親または兄弟姉妹を有する小児の母乳哺育および小児の牛乳の摂取の制限を推奨している。
本発明は、多種多様な患者と共に使用しうるが、いくつかの実施形態は、特異的な患者群により有用である。例えば、いくつかの実施形態が通例、決定的なインフルエンザウイルス感染を有する患者だけに対して適用されるのに対し、他の実施形態は、１型糖尿病を発症する危険性が高いことが分かっている患者（例えば、１型糖尿病の家族歴を伴う患者、ＨＬＡ−ＤＲ３ハプロタイプおよび／またはＨＬＡ−ＤＲ４ハプロタイプを伴う患者など）に焦点を当てることが可能である。例えば、抗ウイルス化合物の投与が、典型的に、ウイルス感染を有する前糖尿病性患者において使用されるのに対し、予防のための免疫化は、より広く（例えば、患者試料中または全体としての患者集団内の、（ｉ）Ａ型インフルエンザウイルスもしくはその発現産物、および／または（ｉｉ）Ａ型インフルエンザウイルスに対する免疫応答について陰性を示す小児など、危険性の高い群において）使用されるであろう。
本発明の診断法、予後診断法、および予防法を伴う使用に好ましい種類の患者は、膵島炎を有するが、１型糖尿病はいまだ発症していない患者である。
患者
本発明者らは、ＩＡＶ感染が、任意の年齢において膵臓に影響を及ぼしうるので、患者は、本発明の予防的、診断的、処置、および／または予後診断的実施形態のために、任意の年齢でありうることを提起する。患者は、７０歳以下、例えば、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１歳以下であることが典型的である。
患者は、少なくとも１カ月齢、例えば、１カ月、３カ月、６カ月、９カ月、好ましくは、少なくとも１歳、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０歳以上であることが典型的である。好ましくは、患者は、少なくとも５歳である。より好ましくは、患者は、少なくとも７歳である。最も好ましくは、患者は、少なくとも１２歳である。
本発明者らは、患者におけるＡ型インフルエンザウイルス感染と膵炎および／または１型糖尿病の発症との間の連関を裏付けた。したがって、本発明者らは、患者におけるＡ型インフルエンザウイルス感染の頻度および／または重症度が、後年において膵炎および／または１型糖尿病を発症する危険性に影響を及ぼし、また、症状の重症度にも影響を及ぼしうる（すなわち、高頻度および／または重度の感染は、後年において、膵炎および／または１型糖尿病を発症する危険性を増大させる可能性が高く、また、症状の重症度も増大させうる）ことを提起する。したがって、後年において膵炎および／または１型糖尿病を発症する危険性を最小化し、症状の重症度を最小化するために、患者は、インフルエンザに未感作であるか、またはインフルエンザに対する曝露が最小限であることが好ましい。
したがって、小児は、典型的に、成人よりＡ型インフルエンザウイルス感染に対する曝露が低度であるため、特に、本発明の予防的実施形態のためには、患者は、小児であることが好ましい。本発明の実施形態のためには、小児は、０〜１５歳の間、例えば、０〜１０、５〜１５、０〜５（例えば、０〜３または３〜５）、５〜１０（例えば、５〜７または７〜１０）、または１０〜１５（例えば、１０〜１３または１３〜１５）歳であることが好ましい。
典型的に、小児は、少なくとも６カ月齢、例えば、６〜７２カ月齢（両端を含む）の範囲にあるか、または６〜３６カ月齢（両端を含む）の範囲にあるか、または３６〜７２カ月齢（両端を含む）の範囲にある。いくつかの実施形態では、これらの年齢範囲にある小児は、３０カ月齢未満または２４カ月齢未満でありうる。例えば、組成物は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５カ月齢の小児に投与することもでき、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、または７１カ月齢の小児に投与することもでき、３６または７２カ月齢の小児に投与することもできる。小児は、０カ月〜７２カ月齢の間であることが好ましく、０カ月〜３６カ月齢の間であることが理想的である。したがって、小児は、３歳または６歳の誕生日の前に免疫化することができる。
患者試料
本発明の多様な実施形態は、患者から得られた試料を要求する。これらの試料は一般に、細胞（例えば、ベータ細胞を含む膵臓細胞）を含むであろう。これらの細胞は、組織（例えば、生検）試料中に存在する場合もあり、循環中に逸出した細胞の場合もある。しかし、いくつかの実施形態では、試料は、細胞を含まず、例えば、患者細胞の非存在下でインフルエンザビリオンを含有しうる体液、または抗ウイルス抗体を含有しうる、精製された細胞非含有血液試料に由来するであろう。
したがって、一般に、患者試料は、組織試料または血液試料である。いくつかの実施形態では、試料は、気管スワブである。患者試料の他の可能な供給源は、単離細胞、全組織、または体液（例えば、血液、血漿、血清、尿、胸水、脳脊髄液など）を含む。
発現産物は、患者試料自体において検出することもでき、試料に由来する材料（例えば、細胞試料の溶解物、このような細胞溶解物の上清、細胞試料の核酸抽出物、ＲＮＡ試料から逆転写されたＤＮＡ、ＲＮＡ試料から翻訳されたポリペプチド、患者から抽出された細胞培養物に由来する細胞など）中で検出することもできる。これらの派生物も、本発明の意味ではやはり、「患者試料」である。
本発明のアッセイ法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行うこともでき、ｉｎ ｖｉｖｏで行うこともできる。
本発明のいくつかの実施形態では、それに照らして患者試料中のインフルエンザウイルスレベルを比較しうる対照を使用することができる。対照試料を解析することにより、それに照らして患者試料を比較しうるベースラインレベルがもたらされる。陰性対照は、感染していない患者に由来する試料の場合もあり、患者に由来しない材料、例えば、緩衝液の場合もある。陽性対照は、既知のレベルの解析物を伴う試料となろう。当業者には、他の適切な陽性対照および陰性対照も明らかであろう。
対照中の解析物は、患者試料中の解析物と同時に評価することができる。代替的に、患者試料は、別個に（前もって、または遅らせて）評価することもできる。しかし、２つの試料を実際に比較するのではなく、対照は、絶対値、すなわち、かつての試料から経験的に決定された（例えば、標準的な条件下で）解析物のレベルでありうる。
本発明は、患者試料を本発明のポリペプチドまたは抗体と接触させるステップを含むイムノアッセイ法を提供する。
核酸
当技術分野では、Ａ型インフルエンザウイルスをコードする核酸配列が公知であり、本発明の組成物および／または方法において使用することができる。本発明はまた、本発明の組成物および／または方法における使用のための、このようなヌクレオチド配列の相補体（リバース相補体を含む）を含む核酸も提供する。本発明の防止または処置の実施形態では、例えば、患者の後年における１型糖尿病および／または膵炎の発症を防止するアンチセンスのための核酸、および／またはＤＮＡベースのインフルエンザワクチンにおける使用のための核酸を使用することができる。核酸はまた、本発明の検出法であって、試料中のＡ型インフルエンザウイルスＲＮＡの同定、ならびに患者が、後年において１型糖尿病および／または膵炎を発症する素因を有するか否かの決定における使用のための、例えば、プロービングのための本発明の検出法、プライマーとしての使用などのための本発明の検出法でも使用することができる。
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸、好ましくは、本発明の組成物および／または方法における使用のための、Ａ型インフルエンザウイルスポリタンパク質に対するタンパク質分解産物も提供する。
本発明のプライマーおよびプローブ、ならびにハイブリダイゼーションのために使用される他の核酸は、１０〜３０ヌクレオチドの間の長さ（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド）であることが好ましい。
本発明は、生物学的試料（例えば、血液）中のインフルエンザウイルスを検出するためのプロセスであって、本発明に従う核酸を、生物学的試料と、ハイブリダイズ条件下で接触させるステップを含むプロセスを提供する。プロセスは、核酸増幅（例えば、ＰＣＲ増幅、ＳＤＡ増幅、ＳＳＳＲ増幅、ＬＣＲ増幅、ＴＭＡ増幅、ＮＡＳＢＡ増幅など）または核酸ハイブリダイゼーション（例えば、マイクロアレイ、ブロット、溶液中のプローブとのハイブリダイゼーションなど）を伴いうる。例えば、本発明は、試料中のインフルエンザウイルス核酸を検出するためのプロセスであって、（ａ）本発明に従う核酸プローブを、生物学的試料と、ハイブリダイズ条件下で接触させて、二重鎖を形成するステップと、（ｂ）前記二重鎖を検出するステップとを含むプロセスを提供する。
ポリペプチド
当技術分野では、Ａ型インフルエンザウイルスをコードするポリペプチド配列が公知であり、本発明の組成物および／または方法において使用することができる。本発明を伴う使用のためのポリペプチド配列は、配列のうちの、少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、または、好ましくは、Ｂ細胞エピトープを含むことが好ましい。Ｔ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープは、経験的に同定する（例えば、ＰＥＰＳＣＡＮ［７０、７１］または類似の方法を使用して）こともでき、予測する（例えば、ジェイムソン−ウォルフ抗原性指数［７２］、マトリックスベースの手法［７３］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［７４］、ニューラルネットワーク［７５］、ＯｐｔｉＭｅｒ ＆ ＥｐｉＭｅｒ［７６、７７］、ＡＤＥＰＴ［７８］、Ｔｓｉｔｅｓ［７９］、親水性［８０］、抗原性指数［８１］、または参考文献８２において開示されている方法などを使用して）こともできる。このようなポリペプチドを、例えば、患者における１型糖尿病および／または膵炎の防止または処置における使用のための、本発明の免疫原性組成物中で使用することができる。このようなポリペプチドはまた、例えば、試料中の抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体を検出し、これにより、患者が、後年において１型糖尿病および／または膵炎を発症する素因を有するか否かを決定するための診断にも使用することができる。
本発明のポリペプチドは一般に、少なくとも７アミノ酸（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００アミノ酸以上）の長さである。
本発明のある種の実施形態では、ポリペプチドは、最大で５００アミノ酸（例えば、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５アミノ酸以下）の長さであることが好ましい。
抗体
本発明は、本発明の組成物および／または方法における使用のための本発明のポリペプチドに結合する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、このような抗体は、例えば、Ａ型インフルエンザウイルス感染に対する受動免疫化により、１型糖尿病および／または膵炎を防止または処置するための抗体である。他の実施形態では、このような抗体は、例えば、試料中の抗Ａ型インフルエンザウイルスを検出し、これにより、患者が、後年において１型糖尿病および／または膵炎を発症する素因を有するか否かを決定するための診断法のための抗体である。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体の場合もあり、モノクローナル抗体の場合もある。
本発明の抗体は、標識を含みうる。標識は、放射性標識または蛍光標識など、直接的に検出可能でありうる。代替的に、標識は、その産物が検出可能な酵素（例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼなど）など、間接的に検出可能でもありうる。本発明の抗体は、固体支持体へと付着させることができる。
核酸増幅法
試料中の核酸は、ＰＣＲ増幅、ＳＤＡ増幅、ＳＳＳＲ増幅、ＬＣＲ増幅、ＴＭＡ増幅、ＮＡＳＢＡ増幅、Ｔ７増幅などの核酸増幅法により、簡便、かつ、高感度に検出することができる。技法は、指数関数的増幅をもたらすことが好ましい。ＲＮＡを伴う使用に好ましい技法は、ＲＴ−ＰＣＲ（例えば、参考文献８３の１５章を参照されたい）である。技法は、定量法および／またはリアルタイム法でありうる。
増幅法は一般に、２つのプライマーの使用を伴う。インフルエンザウイルスの標的配列が、一本鎖である場合、技法は一般に、二本鎖標的をもたらし、これにより、指数関数的増幅を容易とするために、相補鎖を作製する予備ステップを伴う。２つのプライマーを、二本鎖標的の異なる鎖とハイブリダイズさせ、次いで、伸長させる。伸長させた産物は、さらなるハイブリダイゼーション／伸長ラウンドのための標的として用いられうる。正味の効果は、標的内の鋳型配列を増幅することであり、鋳型の５’末端および３’末端は、標的内の２つのプライマーの位置により規定される。
本発明は、インフルエンザウイルスの核酸標的内に含有される鋳型配列を増幅するためのプライマーを含むキットであって、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含み、第１のプライマーが、前記鋳型配列の一部と実質的に相補的な配列を含み、第２のプライマーが、前記鋳型配列の相補体の一部と実質的に相補的な配列を含み、実質的な相補性を有する前記プライマー内の配列により、増幅される鋳型配列の末端が規定されるキットを提供する。
第１のプライマーおよび／または第２のプライマーは、検出可能な標識（例えば、蛍光標識、放射性標識など）を含みうる。
プライマーは、前記鋳型核酸と相補的でない配列を含みうる。このような配列は、プライマー配列の上流（すなわち、５’側）であることが好ましく、制限部位［８４］、プロモーター配列［８５］などを含みうる。
本発明のキットは、鋳型配列および／またはその相補体と実質的に相補的であり、これらとハイブリダイズしうるプローブをさらに含みうる。このプローブは、増幅された鋳型を検出するハイブリダイゼーション法において使用することができる。
本発明のキットは、定量的測定の一助とするために、内部基準物質を作り出し、検出するためのプライマーおよび／またはプローブをさらに含みうる［８６］。
本発明のキットは、複数のプライマー対（例えば、ネステッド増幅のための）を含むことが可能であり、１つのプライマーは、複数のプライマー対と共通でありうる。キットはまた、複数のプローブも含みうる。
鋳型配列は、少なくとも５０ヌクレオチド長（例えば、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２５０、１５００、２０００、３０００ヌクレオチド以上）であることが好ましい。鋳型の長さは、それが位置する標的の長さにより固有に制限されるが、鋳型配列は、５００ヌクレオチド未満（例えば、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０以下）であることが好ましい。
鋳型配列は、インフルエンザウイルスのゲノム配列のうちの任意の部分でありうる。
本発明は、標的配列の断片を調製するためのプロセスであって、核酸プライマーを伸長させることにより断片を調製するプロセスを提供する。標的配列および／またはプライマーは、本発明の核酸である。プライマー伸長反応は、核酸増幅（例えば、ＰＣＲ増幅、ＳＤＡ増幅、ＳＳＳＲ増幅、ＬＣＲ増幅、ＴＭＡ増幅、ＮＡＳＢＡ増幅など）を伴いうる。
医薬組成物
本発明は、本発明の抗ウイルス剤、核酸、ポリペプチド、および／または抗体を含む医薬組成物を提供する。本発明の組成物は任意選択で、ナチュラルキラー細胞活性を阻害するのに有効な免疫調節化合物をさらに含む。本発明はまた、医薬（例えば、１型糖尿病および／または膵炎を防止および／または処置するための）としてのそれらの使用、ならびに１型糖尿病および／または膵炎を処置するための医薬の製造における成分の使用も提供する。本発明はまた、免疫応答をもたらすための方法であって、免疫原性量の、本発明の核酸および／またはポリペプチドを、動物へと（例えば、患者へと）投与するステップを含む方法も提供する。
本発明により包含される医薬組成物は、活性薬剤として、本明細書で開示される、本発明の抗ウイルス剤、核酸、ポリペプチド、抗体、および／またはナチュラルキラー細胞活性を阻害するのに有効な免疫調節化合物を、治療有効量で含む。「有効量」とは、臨床結果を含む、有益な結果または所望の結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回または複数回の投与により投与することができる。本発明の目的では、有効量とは、１型糖尿病および／もしくは膵炎の症状および／もしくは進行を緩和するか、改善するか、安定化させるか、逆転するか、緩徐化するか、または遅延させるのに十分な量である。
本明細書で用いられる「治療有効量」という用語は、所望の疾患もしくは状態を処置するか、改善するか、もしくは防止するか、または検出可能な治療効果もしくは防止効果を呈示する治療剤の量を指す。効果は、例えば、化学的マーカー（例えば、インスリン産生）により検出することができる。治療効果はまた、身体症状の軽減も含む。対象のための正確な有効量は、対象のサイズおよび健康、状態の性質および程度、ならびに投与のために選択される治療薬または治療薬の組合せに依存するであろう。所与の状況のための有効量は、日常的な実験により決定され、臨床医の判断の範囲内にある。本発明の目的では、それが投与される個体における本発明の組成物の有効用量は一般に、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、または約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇであろう。
医薬組成物はまた、薬学的に許容される担体も含有しうる。このような担体についての完全な議論は、参考文献８７において参照可能である。
製剤化したら、本発明により想定される組成物を、（１）対象へと直接的に投与する（例えば、核酸、ポリペプチド、低分子抗ウイルス剤などとして）こともでき、（２）ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、対象に由来する細胞へと送達する（例えば、ｅｘ ｖｉｖｏにおける遺伝子治療における通り）こともできる。組成物の直接的な送達は一般に、非経口注射、例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射もしくは筋内注射、腫瘍内注射、または組織の間質腔への注射により達成されるであろう。他の投与方式は、経口投与および肺内投与、坐剤、ならびに経皮適用、注射針、および遺伝子銃または皮下噴射器を含む。投与スケジュールは、単回投与スケジュールの場合もあり、複数回投与スケジュールの場合もある。
一般
「〜を含む」という用語は、「〜を含む」のほか、「〜からなる」も包含し、例えば、Ｘ「を含む」組成物は、Ｘからもっぱらなる場合もあり、何らかの付加物、例えば、Ｘ＋Ｙを含む場合もある。
数値ｘとの関連における「約」という用語は、任意選択であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
「実質的に」という語は、「完全に」を除外せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを全く含有しない可能性がある。したがって、必要な場合、「実質的に」という語を、本発明の定義から割愛することもできる。
図１は、Ａ群（Ｈ７Ｎ１Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｉｔａｌｙ／３６７５／１９９９を施される；図１Ａ）、Ｂ群（Ｈ７Ｎ３Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｉｔａｌｙ／２９６２／２００３を施される；図１Ｂ）、およびＫ群（対照、図１Ｃ）について、グルコースおよびリパーゼの血漿濃度を示す図である。ＩＤ：識別番号；ｎ．ｄ．：実施なし；ｅｕｔ：感染後または実験の終了により、表示日における組織学および免疫組織化学のために試料を回収するために安楽死させた；ダークグレーで強調された列：リパーゼ濃度の高い対象だけを、Ｇｌｕｃｏｃａｒｄ（登録商標）ストリップで調べた日（上限：１Ｌ当たり３４ミリモル）；ライトグレーで強調された列：特に、関与性のデータである。 図１は、Ａ群（Ｈ７Ｎ１Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｉｔａｌｙ／３６７５／１９９９を施される；図１Ａ）、Ｂ群（Ｈ７Ｎ３Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｉｔａｌｙ／２９６２／２００３を施される；図１Ｂ）、およびＫ群（対照、図１Ｃ）について、グルコースおよびリパーゼの血漿濃度を示す図である。ＩＤ：識別番号；ｎ．ｄ．：実施なし；ｅｕｔ：感染後または実験の終了により、表示日における組織学および免疫組織化学のために試料を回収するために安楽死させた；ダークグレーで強調された列：リパーゼ濃度の高い対象だけを、Ｇｌｕｃｏｃａｒｄ（登録商標）ストリップで調べた日（上限：１Ｌ当たり３４ミリモル）；ライトグレーで強調された列：特に、関与性のデータである。 図１は、Ａ群（Ｈ７Ｎ１Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｉｔａｌｙ／３６７５／１９９９を施される；図１Ａ）、Ｂ群（Ｈ７Ｎ３Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｉｔａｌｙ／２９６２／２００３を施される；図１Ｂ）、およびＫ群（対照、図１Ｃ）について、グルコースおよびリパーゼの血漿濃度を示す図である。ＩＤ：識別番号；ｎ．ｄ．：実施なし；ｅｕｔ：感染後または実験の終了により、表示日における組織学および免疫組織化学のために試料を回収するために安楽死させた；ダークグレーで強調された列：リパーゼ濃度の高い対象だけを、Ｇｌｕｃｏｃａｒｄ（登録商標）ストリップで調べた日（上限：１Ｌ当たり３４ミリモル）；ライトグレーで強調された列：特に、関与性のデータである。 図２は、模擬感染させたシチメンチョウ、Ｈ７Ｎ１を感染させたシチメンチョウ、およびＨ７Ｎ３を感染させたシチメンチョウの間における、高リパーゼ血症（Ａ）および高血糖症（Ｂ）（血漿グルコース＞１Ｌ当たり２７．７８ミリモル）の出現についてのカプラン−マイヤー解析を示す図である。差異は、ログランク統計を使用して検定した。棒グラフ：高リパーゼ血症、高血糖症、およびウイルス血症との関連における事象の頻度である。 図３は、シチメンチョウの膵臓切片（正常組織）を示す図である。それらの細胞質内にチモーゲン顆粒を含有する腺房細胞が明らかであり、正常な膵島細胞および膵管構造の２つのネストと関連している。 図４は、感染の７日後におけるシチメンチョウの膵臓切片を示す図である。重度の炎症性浸潤物（＊）を伴う腺房細胞（矢印）のびまん性で重度の壊死である。 図５は、シチメンチョウの膵臓切片を示す図である。膵臓の大半は、リンパ結節および線維性結合組織および何らかの膵管増殖を伴うリンパ結節による病巣で置きかえられている。 図６は、感染の４日後におけるシチメンチョウの膵臓切片を示す図である。トリインフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）についての免疫組織化学である。壊死性腺房細胞および膵管上皮では、陽性の核および細胞質が明らかである。 図７は、膵臓細胞系であるｈＣＭ細胞およびＨＰＤＥ６細胞における、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）の複製動態を示す図である。ｈＣＭ細胞およびＨＰＤＥ６細胞に、各ウイルスを、ＭＯＩ＝０．００１で感染させた。感染の２４、４８、および７２時間後において、ウイルス単離およびｑＲＲＴ−ＰＣＲ解析のために、３つの感染ウェルおよび１つの模擬感染対照ウェルに由来する上清を採取した。パネルＡは、ｈＣＭ内およびＨＰＤＥ６内のＨ１Ｎ１についてのウイルス単離結果を示す図である。パネルＢは、ｈＣＭ内およびＨＰＤＥ６内のＨ１Ｎ１についてのｑＲＲＴ−ＰＣＲ結果を示す図である。パネルＣは、ｈＣＭ内およびＨＰＤＥ６内のＨ３Ｎ２についてのウイルス単離結果を示す図である。パネルＤは、ｈＣＭ内およびＨＰＤＥ６内のＨ３Ｎ２についてのｑＲＲＴ−ＰＣＲ結果を示す図である。全ての結果を、３つの独立の実験の平均に標準偏差を加えて表す。 図８は、ｈＣＭ細胞およびＨＰＤＥ６細胞における、Ｈ１Ｎ１（Ａ、Ｂ）インフルエンザウイルスおよびＨ３Ｎ２（Ｅ、Ｆ）インフルエンザウイルスのＮＰ発現（５６ＫＤａ）についてのウェスタンブロット解析を示す図である。試料は、感染前（ｔ０）、ならびに感染の２４（ｔ２４）、４８（ｔ４８）、および７２（ｔ７２）時間後において回収した。ベータ−アクチン（４２ＫＤａ）を、各試料（Ｃ、Ｄ、Ｇ、およびＨ）について同じ量のタンパク質を調べたことを確認するためのローディング対照として使用した。 図９は、ＨＰＤＥ６陰性対照の核染色を示す図である（２０倍）（パネルＡ）。細胞は、ＤＮＡへの結合を明らかにするようにＤＡＰＩ染色し、対比染色としてＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅを伴った。パネルＢは、感染の２４時間後におけるＨＰＤＥ６を示す図である（２０倍）。ウイルス感染に由来するインフルエンザウイルスＮＰタンパク質が観察された（画像の中央部）。パネルＣは、ＨＣＭ陰性対照を示す図である。パネルＤは、感染の２４時間後におけるｈＣＭを示す図であり（２０倍）、ウイルス感染に由来するインフルエンザウイルスＮＰタンパク質は、画像の中央部における明色の細胞として観察された。 図１０は、ヒト膵島におけるＭ遺伝子についてのＲＲＴ−ＰＣＲデータを示す図である。膵島内のＨ１Ｎ１（パネルＡおよびＣ）およびＨ３Ｎ２（パネルＢおよびＤ）による、ウェル１つ当たり４．８×１０３ＰＦＵの膵島細胞感染から得られるＲＲＴ−リアルタイムＣｔ値についての、ＣＩ（信頼区間）を伴う二元二次予測プロットである。各ウイルスについて、膵島ペレット中および膵島上清中のＣｔトレンドが、感染日（ｔ０）〜１０日目（ｔ５）の、ＴＰＣＫの存在下（第１列）または非存在下（第２列）において、かつ、前出の２つの条件の平均（第３列）として表される。 図１１は、膵島内の、ＴＰＣＫで処理されたトリプシンを伴う（ＴＰＣＫ＋）またはＴＰＣＫで処理されたトリプシンを伴わない（ＴＰＣＫ−）Ｈ１Ｎ１感染についての、ウェスタンブロットによるＮＰ結果を示す図である。インフルエンザウイルス核タンパク質は、５６ＫＤａのバンドとして可視化した。 図１２は、ヒト膵島におけるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるウイルスＲＮＡ検出を示す図である。ウェル１つ当たり４．８×１０３ｐｆｕのウイルス希釈液を含有するウイルス懸濁液１００μｌを添加して、膵島に、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２を感染させた。模擬の非感染膵島は、陰性対照とした。パネルＡ：感染の２日後において、Ｆａｓｔ Ｒｅｄアルカリホスファターゼ基質を添加して、細胞内包埋された膵島上で、有色の沈殿物の形成により、ウイルスＲＮＡ分子の存在を検出したことを示す図である。次いで、標準的な明視野顕微鏡または蛍光顕微鏡（４０倍）を使用して、結合したウイルスｍＲＮＡを可視化した。矢印：ウイルスｍＲＮＡ陽性細胞。パネルＢ〜Ｃ：感染の５日後において、蛍光ベースのマルチプレックスｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施し、脱凝集化の後、膵島細胞を、スライドガラス上に細胞遠心分離したことを示す図である。ウイルスＲＮＡ陽性細胞、インスリン陽性細胞、アミラーゼ陽性細胞、およびＣＫ１９陽性細胞を、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ １３５ＴＶ蛍光顕微鏡で評価した。ＩＮ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウェアを使用して、定量化を実施した。各ドットは、系全体にわたりランダムな１つの視野において定量化された陽性細胞の百分率を表す。実施された２つの実験から得られた結果を示す。統計学的解析には、マン−ホイットニーＵ検定を使用した。 図１３は、ウイルスＲＮＡおよびインスリン／アミラーゼ／ＣＫ１９の局在化を示す図である。図は、マルチプレックス組織学データを示す。ウェル１つ当たり４．８×１０３ｐｆｕのウイルス希釈液を含有するウイルス懸濁液１００μｌを添加して、膵島に、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２を感染させた。上記で記載した通り、感染の５日後において、蛍光ベースのマルチプレックスｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施した。左パネル：赤色シグナルが、インフルエンザウイルスＲＮＡの存在に対応し、緑色シグナルが、インスリン転写物、アミラーゼ転写物、またはＣＫ１８転写物の存在に対応する（６３倍）ことを示す図である。白色矢印：二重陽性細胞である。右パネル：ウイルスＲＮＡ陽性細胞、インスリン陽性細胞、アミラーゼ陽性細胞、およびＣＫ１９陽性細胞を、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ １３５ＴＶ蛍光顕微鏡で評価したことを示す図である。ＩＮ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウェアを使用して、定量化を実施した。各ドットは、系全体にわたりランダムな１つの視野において定量化された陽性細胞の百分率を表す。実施された２つの実験から得られた結果を示す。 図１４は、ヒトＡ型インフルエンザウイルスによる感染の後における、膵島の生存およびインスリン分泌を示す図である。ウェル１つ当たり４．８×１０３ｐｆｕのウイルス希釈液を含有するウイルス懸濁液１００μｌを添加して、膵島に、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２を感染させた。模擬の非感染膵島は、陰性対照とした。膵島の生存率は、感染の２、５、および７日後において評価した。パネルＡは、感染の５日後における、光学顕微鏡法によるパラフィン包埋膵島の外見を示す図である（２０倍）（上）。生存率（下）は、生死アッセイを使用して評価した。ＩＮ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウェアを使用して、定量化を実施した。各ドットは、１つのランダム視野において定量化された死細胞の百分率を表す。２つの実験（各々１０ずつの視野）から得られた結果を示す。パネルＢは、ヒトＡ型インフルエンザウイルスの存在下または非存在下における、２日間にわたる培養の後で単離された膵島によるインスリン分泌を示す図である。図は、グルコースで刺激した後におけるインスリンの放出を示し（２〜２０ｍＭ）、データは、高グルコースインキュベーションの終了時におけるインスリン濃度と、低グルコースインキュベーションの終了時におけるインスリン濃度との間の比として計算されたインスリン分泌指数として表す（ｎ＝２）。 図１５は、ヒトＡ型インフルエンザウイルス感染により誘導されるサイトカイン／ケモカイン発現プロファイルの修飾を示す図である。ウェル１つ当たり４．８×１０３ｐｆｕまたは４．８×１０２ｐｆｕの２つのウイルス希釈液を含有するウイルス懸濁液１００μｌを添加して、膵島に、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２を感染させた。模擬の非感染膵島は、陰性対照とした。試料は、感染日（ｔ０）〜１０日目（ｔ１０）において、４８時間ごとに回収した。上清を回収し、５０のサイトカインについてアッセイした。パネルＡは、膵島サイトカイン／ケモカインプロファイルにおける、ウイルスにより誘導された修飾を示す図である。データは、それぞれの模擬感染膵島の培養時に検出される各因子について、最大の増加倍数として表す（ｎ＝２）。点線：５倍の増加の閾値である。パネルＢは、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２の存在下または非存在下における、１０日にわたる培養時の、ＩＦＮ−ガンマに誘導されるケモカインであるＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０の濃度を示す図である。 図１６は、感染させた鳥類の膵臓内および肺内の、ＲＲＴ−ＰＣＲによるインフルエンザウイルスＭ遺伝子の検出を示す図である。 図１７は、インスリンについての免疫組織化学を示す図である。シチメンチョウの膵臓である。Ｈ３Ｎ７の前および後の異なる時点における代表的な膵島構造である。 図１８は、受容体の分布プロファイルを示す図である。ｈＣＭ細胞上、ＨＰＤＥ６細胞上、およびＭＤＣＫ細胞上のアルファ−２，３連結シアル酸受容体およびアルファ−２，６連結シアル酸受容体の発現である。影を付した領域が、アルファ−２，３特異的レクチンまたはアルファ−２，６特異的レクチンで標識された細胞を表すのに対し、無地の領域は、非標識の対照細胞を表す。細胞系１つ当たり最小で５，０００の事象が記録された。 図１９は、膵臓細胞系内のトリインフルエンザウイルスの複製動態を示す図である。ｈＣＭ細胞およびＨＰＤＥ６細胞におけるＡ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｉｔａｌｙ／３６７５／１９９９（Ｈ７Ｎ１）およびＡ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｉｔａｌｙ／２９６２／２００３（Ｈ７Ｎ３）の複製動態である。ｈＣＭ細胞およびＨＰＤＥ６細胞に、各鳥類ウイルスを、ＭＯＩ＝０．０１で感染させ、感染の２４、４８、および７２時間後において、ウイルス単離およびｑＲＲＴ−ＰＣＲのために、３つの感染ウェルおよび１つの模擬感染対照ウェルに由来する上清を採取した。（Ａ）ｈＣＭ内およびＨＰＤＥ６内のＨ７Ｎ１についてのｑＲＲＴ−ＰＣＲ結果を示す図である。（Ｂ）ｈＣＭ内およびＨＰＤＥ６内のＨ７Ｎ３についてのｑＲＲＴ−ＰＣＲ結果を示す図である。（Ｃ）ｈＣＭ内およびＨＰＤＥ６内のＨ７Ｎ１についてのウイルス単離結果を示す図である。（Ｄ）ｈＣＭ内およびＨＰＤＥ６内のＨ７Ｎ３についてのウイルス単離結果を示す図である。全ての結果を、３つの独立の実験の平均に標準偏差を加えて表す。 図２０は、膵臓細胞系内のウイルスＮＰタンパク質をターゲティングする免疫蛍光法を示す図である。（Ａ）ｈＣＭ陰性対照を示す図である。（Ｂ）感染の２４時間後におけるｈＣＭを示す図である（２０倍）。（Ｃ）ＨＰＤＥ６陰性対照の核染色を示す図である（２０倍）。青色が、ＤＮＡに結合したＤＡＰＩ色素に対応するのに対し、赤色は、Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅ対比染色に起因する。（Ｄ）感染の２４時間後におけるＨＰＤＥ６を示す図である（２０倍）。緑色シグナルは、ウイルス感染に由来するインフルエンザウイルスＮＰタンパク質の存在に対応する。 図２１は、選択されたサイトカイン／ケモカイン、検出限界、および変動係数（アッセイ内のＣＶ％およびアッセイ間のＣＶ％）を示す図である。 図２２は、ウイルス排出およびウイルス血症についてのデータを示す図である。
本発明のある種の態様について、後続の非限定的な例においてより詳細に記載する。例は、当業者に、本発明をいかにして実施および使用するのかについての開示および記載をもたらすように示すものであり、本発明者らが本発明者らの発明として考えるものの範囲を限定することを意図するものでも、下記の実験が、実施される全ての実験であり、かつ、唯一の実験であることを表すように意図するものでもない。使用される数（例えば、量、温度など）に関する正確さを確実にするように努めてはいるが、ある程度の実験による誤差および偏差はやむを得ないものとする。
本研究では、本発明者らは、動物モデルにおいて、インフルエンザ感染の、膵臓の内分泌機能に対する関与について探索し、膵臓由来のヒト細胞におけるＡ型インフルエンザウイルス感染の発生、程度、および関与を確立することを目的とするｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を実施した。シチメンチョウは、インフルエンザ感染を非常に受けやすく、膵臓損傷が死後病変として観察されることが多いため、ｉｎ ｖｉｖｏ研究のために、本発明者らは、シチメンチョウを、モデルとして選択した。これらのウイルスは、ヒトにおいて長期間にわたり広まっており、既存の疫学的データが遡及的研究に適するので、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究のために、本発明者らは、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／０５（Ｈ３Ｎ２）を選択した。確立されたヒト膵臓細胞系（ヒト膵島細胞腫細胞系および膵管細胞系を含む）およびヒト膵島の初代培養物のいずれに感染させるのにもこれらの株を使用した。
ｉｎ ｖｉｖｏ実験
Ａ型インフルエンザウイルスは、保菌野鳥に由来し、野鳥および家禽を含む様々な宿主に感染する。これらのウイルスはまた、関与数の哺乳動物に感染し、哺乳動物において確立されうる。これらの哺乳動物としては、ブタ、ウマ、イタチ、海洋性哺乳動物、イヌ、ネコ、およびヒトが挙げられる。ＩＡＶは、関与する株に応じて、全身性感染または非全身性感染を引き起こす。全身性疾患は、多くの場合、鳥類種において生じ、高病原性トリインフルエンザ（ＨＰＡＩ）として公知である。ＨＰＡＩは、感染動物の大半における、死活臓器内の広範なウイルスの複製、および臨床徴候の発生から数日以内の死を特徴とする。はるかに一般的な非全身性形態は、鳥類および哺乳動物において生じ、軽度の呼吸器徴候および腸内徴候を特徴とする。非全身性形態をＨＰＡＩから差別化すると、鳥類では、低病原性トリインフルエンザ（ＬＰＡＩ）として公知である。この臨床症状の差異は、非全身性Ａ型インフルエンザウイルスは、トリプシンまたはトリプシン様酵素の存在下に限り複製が可能であり、したがって、それらの複製は、気道および腸管に制約されると考えられる事実にある。
鳥類由来のＩＡＶは、膵臓に対する指向性を有する［５、８８、８９、９０］。壊死性膵炎は、ＨＰＡＩに感染した野鳥および家禽における一般的な所見であり［９１、９２、９３、９４］、ＨＰＡＩの全身的性質は、これらの所見と符合している。これに対し、感染を経たニワトリおよびシチメンチョウにおける一般的な所見である［９５、９６、９７］、ＬＰＡＩウイルスによる膵臓におけるコロニー形成を説明することは困難である。
本研究の目的は、フィールドアウトブレイクから得られた２つの天然の非全身性トリインフルエンザウイルスが、実験による若齢のシチメンチョウの感染後において、事前の適応を伴わずに、内分泌性膵臓損傷または外分泌性膵臓損傷を引き起こしうるのかどうかを確立することであった。
動物
本研究では、商用農場から１日齢で得られた６８羽の雌の食肉用シチメンチョウを使用した。シチメンチョウは、陰圧下、高効率微粒子空気（ＨＥＰＡ）フィルター濾過隔離キャビネット内で、実験期間にわたり飼育した。感染を実行する前に、動物を３週間にわたり飼育して、適応および成長を可能とし、飼料および水を不断に施し、羽根のタグにより識別した。
ウイルス
イタリアでの流行時に単離された、２つの低病原性トリインフルエンザウイルス（ＬＰＡＩ）：Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｉｔａｌｙ／３６７５／１９９９（Ｈ７Ｎ１）およびＡ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｉｔａｌｙ／２９６２／２００３（Ｈ７Ｎ３）を、実験による感染のために使用した。いずれのウイルスも、自然感染した鳥類において膵臓病変を引き起こすことを示した。トリインフルエンザウイルスの原液は、９日齢の特定病原体非含有（ＳＰＦ）孵化鶏卵に、尿膜腔を介して接種することにより作製した。接種の４８時間後に尿膜腔液を採取し、アリコート分割し、使用まで−８０℃で保存した。ウイルス力価測定のために、１００μｌの１０倍希釈ウイルス懸濁液を、ＳＰＦ孵化鶏卵に接種し、リードおよびミュンヒの式に従い、中央値胚感染性用量（ＥＩＤ５０）を計算した。
実験デザイン
動物を、３つの実験群［Ａ群（Ｈ７Ｎ１）、Ｂ群（Ｈ７Ｎ３）、およびＫ群（対照）］に分けた。Ａ群およびＢ群の各々は、２４例ずつの動物からなり、これらに、口鼻腔内経路を介して、１０６．８３ＥＩＤ５０のＡ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｉｔａｌｙ／３６７５／１９９９（Ｈ７Ｎ１）ウイルスおよび１０６．４８ＥＩＤ５０のＡ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｉｔａｌｙ／２９６２／２００３（Ｈ７Ｎ３）ウイルスのそれぞれを含有する０．１ｍｌずつの尿膜腔液で感染させた。Ｋ群は、２０例の動物からなり、これらに、口鼻腔内経路を介して、陰性対照としての０．１ｍｌの陰性尿膜腔液を施した。全てのシチメンチョウを、毎日２回、臨床徴候について観察した。感染後０、３、６、９、１３、１５、２０、２３、２７、３１、３４、４１、および４５日目において、血漿中のグルコースレベルおよびリパーゼレベルを決定するために、ヘパリン処理されたシリンジを使用して、血液を、全ての動物の上腕静脈から回収した。感染後（ｐ．ｉ．）２および３日目において、気管スワブを回収して、ウイルスの複製を評価した。感染後３日目においてもまた、血液を回収して、血中のウイルスＲＮＡの存在を決定した。感染後４および７日目において、各感染群に由来する２羽ずつのシチメンチョウを、人道的配慮から屠殺し、ウイルスＲＮＡの検出ならびに組織病理学および免疫組織化学のために、膵臓および肺を処理した。同様に、感染後８および１７日目において、各実験群に由来する１例ずつの対象を安楽死させ、組織学的研究および免疫組織化学的研究のために、膵臓を回収した。この目的で、本発明者らは、リパーゼレベルの上昇もまた示した、高血糖性対象を選択した。
生化学的解析
血液試料は、凍結乾燥させたヘパリンリチウムを抗凝血剤として含有するＧａｓ Ｌｙｔｅ（登録商標）２３Ｇ小児科シリンジにより回収した。各回のサンプリングでは、０．３ｍｌの血液を回収し、処理するまで４℃で冷蔵した。血漿を得るため、４℃、１５００×ｇで１５分間にわたり、試料を速やかに遠心分離した。血漿中のグルコースレベルおよびリパーゼレベルを決定するため、市販のキット（Ｇｌｕｃｏｓｅ ＨＫ ａｎｄ ＬＩＰＣ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、コンピュータ化されたシステムであるＣｏｂａｓ ｃ５０１（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｓｔｄ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）へと適用した。Ｇｌｕｃｏｓｅ ＨＫ検査は、ヘキソキナーゼによる酵素反応に基づく。反応の直線性は、１Ｌ当たり０．１１〜４１．６ミリモル（２〜７５０ｍｇ／ｄＬ）であり、その解析感度は、１Ｌ当たり０．１１ミリモル（２ｍｇ／ｄＬ）である。ＬＩＰＣ検査は、直線性を３〜３００Ｕ／Ｌとし、解析感度を３Ｕ／Ｌとする比色酵素反応に基づく。
分子的検査
気管スワブ、血液試料、および臓器（膵臓および肺）を、インフルエンザウイルスのマトリックス（Ｍ）遺伝子を同定するためのＲＲＴ−ＰＣＲにより、ウイルスＲＮＡについて調べた。
ＲＮＡの抽出
ウイルスＲＮＡを、市販のキットである「ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ ＩＩ」（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用して、１００μｌの血液から抽出し、自動式抽出器のためのＡｍｂｉｏｎ ＭａｇＭａｘ−９６ ＡＩ−ＮＤ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、気管スワブ懸濁液を含有する５０μｌのリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）から抽出した。１５０ｍｇのホモジナイズされた肺組織および膵臓組織を遠心分離し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ ＩＩ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用して、ウイルスＲＮＡを、１００μｌの清明化された懸濁液から抽出した。
ワンステップＲＲＴ−ＰＣＲ
Ａ型インフルエンザウイルスの保存性マトリックス（Ｍ）遺伝子をターゲティングする、参考文献９８による、公表されたプライマーおよびプローブを使用して、単離ＲＮＡを増幅した。５μＬのＲＮＡを、３００ｎＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー（それぞれ、Ｍ２５ＦおよびＭ１２４−Ｒ）、ならびに１００ｎＭの蛍光標識プローブ（Ｍ＋６４）からなる反応混合物へと添加した。市販のキットＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、２５μＬの最終容量中で増幅反応を実施した。以下のプロトコール：５０℃で２０分間、および９５℃で１５分間に続いて、９４℃で４５秒間および６０℃で４５秒間にわたる４０サイクルを使用して、ＰＣＲ反応を実施した。製造元の指示書に従い、Ｍｅｇａ Ｓｈｏｒｔ Ｓｃｒｉｐｔ ７（Ａｍｂｉｏｎ製の高収率転写キット）を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写された標的ＲＮＡを得、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により定量化し、ウイルスＲＮＡを定量化するための検量線を創出するのに使用した。単離ＲＮＡの完全性を点検するため、自家デザインのプライマーセット（要望があれば入手可能なプライマー配列）を使用して、β−アクチン遺伝子もまた増幅した。反応混合物は、３００ｎＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、ならびに１倍濃度のＥｖａＧｒｅｅｎ（Ｅｘｐｌｅｒａ、Ｊｅｓｉ、Ｉｔａｌｙ）からなった。市販のキットであるＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、２５μＬの最終容量中で増幅反応を実施した。以下のプロトコール：５５℃で３０分間および９４℃で２分間に続いて、９４℃で３０秒間および６０℃で１分間にわたる４５サイクルを使用して、ＰＣＲ反応を実施した。
組織学および免疫組織化学
ホルマリン固定し、パラフィン包埋した膵臓切片を切った（厚さ３μｍ）。スライドを、Ｈ＆Ｅ（Ｈｉｓｔｏｓｅｒｖ，Ｉｎｃ．、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）で染色した。ＳＰＯＴ ＡＤＶＡＮＣＥＤソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０．８；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＭＩ）により、代表的な写真を撮影した。インフルエンザＩＨＣのための試薬および方法は、以下の通りであった：室温で１時間にわたる、ＰＢＳ／２．５％ＢＳＡ中に１：１００の、Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｎｔｉ−ｔｙｐｅ Ａ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、Ｍｏｕｓｅ−ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ（ＮＰ ｓｕｂｔｙｐｅ Ａ、Ｃｌｏｎｅ ＥＶＳ ２３８；Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）であり；室温で１時間にわたる、ＰＢＳ／２．５％ＢＳＡ中に１／２００の二次抗体である、ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）であり；抗原の回収は、トリプシン（Ｋｉｔ Ｄｉｇｅｓｔ−ａｌｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃で１０分間にわたりスライドをインキュベートして実施し；室温で１０分間にわたり、内因性ペルオキシダーゼを、３％のＨ２Ｏ２でブロッキングし、一次抗体スライドを伴うインキュベーションの前に、ＰＢＳ／５％のＢＳＡによるブロッキングステップを、室温で２０分間にわたり実施した。色原体としては、ＤＡＢ（Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ：参照コードＫ３４６８）を適用した。インスリンおよびグルカゴンのためのＩＨＣ：１：５０のＰｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｇｕｉｎｅａ Ｐｉｇ Ａｎｔｉ−Ｓｗｉｎｅ Ｉｎｓｕｌｉｎ（Ａ０５６４ Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）；１：２００のＰｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ−Ｇｌｕｃａｇｏｎ（ＮＣＬ−ＧＬＵＣ、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ、ＵＫ）であり；Ｅｎ Ｖｉｓｉｏｎ Ａｐ（ＤＡＫＯ Ｋ１３９６、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）およびＡ型インフルエンザを染色するためのｎｕｃｌｅａｒ ｆａｓｔ Ｒｅｄ（ＤＡＫＯ Ｋ１３９６）；Ｅｎ Ｖｉｓｉｏｎ＋Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ Ｌａｂｅｌｌｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ（Ｋ４００２；Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）、ならびにインスリンおよびグルカゴンを染色するためのＤＡＢ（Ｋ３４６８、Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）を検出システムとして使用する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
これらの実験の目的は、ヒトインフルエンザウイルスが、ヒト膵臓に由来するヒト初代細胞系および確立された細胞系上で成長しうるのかどうか、および、それらの複製の、初代細胞に対する効果を確立することであった。
細胞系
メイディンダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％の２００ｍＭのＬ−グルタミン、および１％のペニシリン／ストレプトマイシン／ナイスタチン（ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ−ｎｙｓ）溶液を補充した、アルファ改変イーグル培地（ＡＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ）中で維持した。ヒト膵島細胞腫細胞系であるＣＭ［９９］および不死化ヒト膵管上皮細胞系であるＨＰＤＥ６［１００］は、１％のＬ−グルタミン、１％の抗生剤、およびＦＢＳ（それぞれ、５％および１０％）を補充したＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中で維持した。ＭＤＣＫおよびＨＰＤＥ６を、毎週２回、１：１０および１：４の継代比率で継代培養する一方で、ＣＭは、毎週３回、１：４の比でスプリットした。全ての細胞は、５％のＣＯ２を伴う３７℃の加湿型インキュベーター内で維持した。
初代細胞
膵島は、Ｓａｎ Ｒａｆｆａｅｌｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおいて、リコルディの方法に従い、複数臓器ドナーの膵臓から単離および精製した。地域の倫理委員会による承認の後で、移植に適さない、純度を＞８０％の±８％（平均±ＳＤ；ｎ＝６）とする膵島調製物を使用した。細胞は、２４ウェルプレートおよび２５ｃｍ２のフラスコに、１ｍｌ当たり膵島１５０個で播種し、５％のＣＯ２を伴う３７℃の最終洗浄培養培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）中で維持した。
ＣＭ細胞およびＨＰＤＥ６細胞におけるシアル酸受容体の特徴付け
アルファ−２，３連結シアル酸残基およびアルファ−２，６連結シアル酸残基の存在は、フローサイトメトリーを介して決定した。トリプシン処理の後、１×１０６個の細胞を、ＰＢＳ−１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＰＢＳ−ＨＥＰＥＳ）により、１２００ＲＰＭで５分間ずつ、２回にわたり洗浄し、次いで、製造元の指示書に従い、アビジン／ビオチンブロッキングキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）で処理し、細胞を、１００μｌずつの各溶液と共に、１５分間にわたりインキュベートした。アルファ−２，３シアル酸連結およびアルファ−２，６シアル酸連結はそれぞれ、細胞を、１００μｌのＭａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓビオチニル化レクチンＩＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（５ｕｇ／ｍｌ）と共に３０分間にわたりインキュベートし、その後、１００μｌのＰＥ−ストレプトアビジン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（１０μｇ／ｍｌ）、または１００μｌのフルオレセインコンジュゲートＳａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａレクチン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（５μｇ／ｍｌ）と共に、暗所内、４℃で３０分間にわたりインキュベートすることにより検出した。細胞を、全てのブロッキングステップと染色ステップとの間において、ＰＢＳ−ＨＥＰＥＳで２回にわたり洗浄し、１％のホルマリンを伴うＰＢＳ中に再懸濁させてから解析した。レクチンの特異性を確認するため、細胞を、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓに由来する１ｍＬ当たり１Ｕのノイラミニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）で、１時間にわたり前処理してから、アビジン／ビオチンブロッキングにかけた。試料は、ＢＤ Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒ上またはＢＤ ＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で解析し、最小で５，０００の事象を記録した。
ウイルスおよびウイルス力価測定
それぞれ、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２として言及される、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／０５（Ｈ３Ｎ２）の原液は、細胞培養物中または孵化鶏卵内で作製した。標準的なプラークアッセイにより、ウイルス力価を決定した。
ＩＡＶを増殖させるため、単層培養ＭＤＣＫ細胞を、ＰＢＳで２回にわたり洗浄し、これらに、Ａ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）またはＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／０５（Ｈ３Ｎ２）を、０．００１のＭＯＩで感染させた。３５℃で１時間にわたりウイルスを吸着させた後、細胞を２回にわたり洗浄し、３５℃で、ＴＰＣＫで処理されたトリプシン（１μｇ／ｍｌ；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ、ＵＳＡ）を補充した無血清ＤＭＥＭと共にインキュベートした。感染の４８時間後において、上清を回収した。イタリアでの流行時に単離された低病原性トリインフルエンザウイルス（ＬＰＡＩ）である、Ｈ７Ｎ１ Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｉｔａｌｙ／３６７５／１９９９およびＨ７Ｎ３ Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｉｔａｌｙ／２９６２／２００３を、２．１．２節で記載した通りに、９日齢の特定病原体非含有（ＳＰＦ）孵化鶏卵内で成長させた。ウイルス力価測定のために、既に記載されている［１０１］通りに、プラークアッセイを実施した。略述すると、２４ウェルプレート内にウェル１つ当たり細胞２．５×１０５個で播種されたＭＤＣＫ単層細胞を、無血清ＤＭＥＭで２回にわたり洗浄し、ウイルスの系列希釈液を、細胞へと、１時間にわたり吸着させた。細胞を、ＴＰＣＫで処理されたトリプシン（１μｇ／ｍｌ）を補充した、２倍濃度のＭＥＭ：Ａｖｉｃｅｌ（ＦＭＣ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、ＵＳＡ）ミックスで覆った。感染の４８時間後において、クリスタルバイオレット染色を実施し、目視可能なプラークをカウントした。
膵臓細胞系内のウイルス複製動態
２４ウェルプレート上に播種されたＨＰＤＥ６細胞およびＣＭ細胞のセミコンフルエントの単層を、ＰＢＳで２回にわたり洗浄し、次いで、ウェル１つ当たり２００μｌの接種物を使用して、０．００１のＭＯＩで感染させた。接種物は、吸着の１時間後に除去し、０．０５μｇ／ｍｌのＴＰＣＫ−トリプシン（Ｓｉｇｍａ）を含有する１ｍｌの血清非含有培地で置きかえた。感染の１、２４、４８、および７２時間後、３つの感染ウェルおよび１つの対照ウェルから上清を採取した。ウイルス力価を、５０％組織培養物感染用量（ＴＣＩＤ５０）アッセイを使用するウイルス単離によるほか、マトリックス遺伝子をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで検出することによっても決定した。全ての複製動態実験は、３回にわたり繰り返した。
ＴＣＩＤ５０
９６ウェルプレートへと播種されたＭＤＣＫ細胞のコンフルエントの単層を、血清非含有培地中で２回にわたり洗浄し、これに、無血清ＭＥＭ中の５０μｌの１０倍系列希釈試料を接種した。吸着の１時間後に、２μｇ／ｍｌのＴＰＣＫ−トリプシンを含有する、さらなる血清非含有培地５０μｌを、各ウェルへと添加した。ＣＰＥスコアは、３日間の３７℃でのインキュベーション後において、光学顕微鏡上の感染ウェルに対する目視検査により決定した。ＴＣＩＤ５０値は、リードおよびミュンヒの方法を使用して決定した。
膵島内の成長アッセイ
ウェル１つ当たり４．８×１０２または４．８×１０３ｐｆｕを添加して、膵島に、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスおよびＨ３Ｎ２インフルエンザウイルスを感染させた。ＴＰＣＫトリプシン（ＳＩＧＭＡ（登録商標））（１μｇ／ｍｌ）の添加を伴うウイルス成長およびＴＰＣＫトリプシンの添加を伴わないウイルス成長を実施した。非感染膵島は、陰性対照とした。試料は、感染日（ｔ０）〜１０日目（ｔ５）において、４８時間ごとに回収した。各試料は、１５０ｇで５分間にわたり遠心分離した。上清を回収し、定量的リアルタイムＰＣＲ、ウイルス力価測定、およびサイトカイン発現プロファイルのために、−８０℃で保存した。ペレットを、ＰＢＳで２回にわたり洗浄し、−８０℃で保存し、その後、リアルタイムＰＣＲ、ウェスタンブロット、およびＭＤＣＫ細胞内のウイルス力価測定のために処理した（上記を参照されたい）。全てのペレットおよび上清を、リアルタイムＰＣＲにより３連で調べた。
ウイルスＲＮＡの膵臓組織からの検出
膵島ペレットおよび膵島上清に由来する全ＲＮＡは、製造元の指示書に従い、市販のキットである「ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ ＩＩ」（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用して単離した。ＲＮＡは、６０μｌの溶出緩衝液中に溶出させ、ワンステップＲＲＴ−ＰＣＲを使用して、インフルエンザマトリックス遺伝子について調べて（下記を参照されたい）、ウイルスの成長を評価した。
各ウイルスおよび検体のための二次回帰モデル（Ｃｔ＝β０＋β１ＴＰＣＫ−トリプシン＋β２時間＋β３時間２＋β４時間×ＴＰＣＫ−トリプシン＋β５時間２×ＴＰＣＫ−トリプシン）を使用して、経過時間にわたるＣｔ値のトレンドを解析した。ＴＰＣＫの存在の影響およびその存在と時点との相互作用を評価した。回帰モデルでは、信頼区間（ＣＩ）の計算において、各観察時間について反復された測定間の群内相関の影響を考慮に入れた。残差についての推定後解析を実施して、モデルの妥当性を検証した。
ワンステップＲＲＴ−ＰＣＲ
上記の２．１．５節で記載したプロトコールに従い、Ａ型インフルエンザウイルスの保存性マトリックス（Ｍ）遺伝子をターゲティングする定量的リアルタイムＰＣＲを適用した。単離ＲＮＡの完全性を点検するため、既に記載した［１０２］プライマーおよびプローブを使用して、β−アクチン遺伝子もまた、増幅した。反応混合物は、４００ｎＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー（それぞれ、Ｐｒｉｍｅｒ−ｂｅｔａ ａｃｔ ｉｎｔｒｏｎｉｃおよびＰｒｉｍｅｒ−ｂｅｔａ ａｃｔ ｒｅｖｅｒｓｅ）ならびに２００ｎＭの蛍光標識プローブ（５’−Ｃｙ５、３’−ＢＨＱ１）からなった。市販のキットであるＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、２５μＬの最終容量中で増幅反応を実施した。
ＰＣＲ反応では、以下のプロトコール：５０℃で２０分間および９５℃で１５分間に続いて、９４℃で４５秒間および５５℃で４５秒間にわたる４５サイクルを使用した。
ウェスタンブロット解析
細胞ペレットを、溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８；１．０％のＳＤＳ；３５０ｍＭのＮａＣｌ；０．２５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ；プロテアーゼ阻害剤カクテル）中で再懸濁させ、次いで、混合し、氷上で３０分間にわたりインキュベートした。懸濁液は、５分間ずつ３回にわたり超音波処理し、次いで、最大速度で１０分間にわたり遠心分離した。各試料についての総タンパク質濃度を計算するために、ブラッドフォード検査を実施した。この計算に基づき、試料１例当たり同じ量のタンパク質を、解離緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ６．８；５％のβ−メルカプトエタノール、２％のＳＤＳ、０．１％のブロモフェノールブルー、１０％のグリセロール）中、９６℃で５分間にわたり処理し、次いで、ランニング緩衝液（２５ｍＭのトリス、２５０ｍＭのグリシン、０．１％のＳＤＳ）を使用して、１２％のポリアクリルアミドゲル中で電気泳動させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、タンパク質を、転写緩衝液（３９ｍＭのグリシン、４８ｍＭのトリス塩基、０．０３７％のＳＤＳ、２０％のメタノール）を伴うエレクトロブロッティングにより、ゲルからイムノブロットＰＶＤ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）へと転写した。膜をＰＢＳで洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の５％の粉乳中、４℃で一晩にわたりインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、膜を、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（ＳＩＧＭＡ（登録商標））、５％のブロッティンググレードのブロッキング用脱脂粉乳（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、およびマウスモノクローナルＡ型インフルエンザウイルス核タンパク質抗体（Ａｂｃａｍ）を含有するＰＢＳ中の定常的な振とう下、室温で１時間にわたりインキュベートした。ベータアクチン抗体（Ａｂｃａｍ）を、ローディング対照として使用した。一次抗体を伴うインキュベーションの後、膜を、１時間にわたり、マウスＩｇＧに対する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ウサギポリクローナル二次抗体（Ａｂｃａｍ）へと曝露した後、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（商標）ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するＥＣＬにより、陽性バンドを可視化した。
膵臓細胞系内のウイルス成長の可視化
ＨＰＤＥ６細胞およびｈＣＭ細胞を、スライド内で、８０％コンフルエンスまで成長させ、これらに、０．０５ｍｇ／ｍｌのＴＰＣＫを伴い、０．１のＭ．Ｏ．Ｉ．で、Ｈ１Ｎ１ウイルスまたはＨ３Ｎ２ウイルスを感染させた。細胞は、感染の０、２４、４８、および７２時間後において、冷却アセトン（８０％）で固定および透過処理した。１％のＢＳＡを含有するＰＢＳでブロッキングした後、細胞を、加湿型チャンバー内、３７℃で１時間にわたり、１％のＢＳＡおよび０．２％のＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅを含有するＰＢＳ中の、Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質−ＦＩＴＣコンジュゲート（Ａｂｃａｍ）に対するマウスモノクローナル抗体と共にインキュベートした。染色溶液をデカントし、細胞を３回にわたり洗浄した。陰性対照細胞の核を、ＤＡＰＩ（ＳＩＧＭＡ）で染色し、次いで、ＰＢＳで洗浄し、ＵＶ光下で観察した。
膵島内のウイルスＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕにおける可視化
細胞内に局在化したウイルスＲＮＡを可視化するため、感染の２、５、および７日後において、精製されたヒト膵島を採取した。次いで、膵島を、メタノール非含有１０％のホルマリン中で２４時間にわたりインキュベートし、平底試験管の底部に沈殿させ、寒天中に包埋して、固定化、脱水し、最終的にパラフィン中に包埋した。膵島試料は、４ｍｍで切片化した。共局在化実験のために、膵島を、感染の５日後において採取し、トリプシン様酵素（１２６０５−０１、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により単一細胞へと酵素的に消化し、スライドガラス上で細胞遠心分離した。製造元の指示書（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）に従い、多重オリゴヌクレオチドプローブおよび分枝状ＤＮＡシグナル増幅技術に基づくＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ ＶｉｅｗＲＮＡ法を使用して、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施した。使用されるプローブセットは、Ｈ１Ｎ１／Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９ウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ配列：ＤＱ５０８８５８．１）とハイブリダイズするようにデザインした。プローブが対象とする領域内の配列相同性に起因して、同じセットは、パイロット実験で確認された通り、Ｈ３Ｎ２ウイルスＲＮＡもまた認識した。膵島内の細胞型を同定するため、以下のＱｕａｎｔｉｇｅｎｅプローブ：ベータ細胞のためのインスリンプローブ（ＩＮＳ遺伝子；ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿０００２０７）；外分泌細胞のアルファ−アミラーゼ１プローブ（ＡＭＹ１Ａ遺伝子；ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿００４０３８）；胆管細胞のためのサイトケラチン１９プローブ（ＫＲＴ１９遺伝子；ＮＣＢＩ基準配列：ＮＭ＿００２２７６）を使用した。ＩＮ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ）を使用して、８つのランダムに選択された視野内で、各プローブについて陽性の細胞の定量化を実施した。
感染膵島内のインスリン分泌の決定
カラム１本当たり１００膵島等量のアリコート（Ｈ１Ｎ１／Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９およびＨ３Ｎ２／Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／０５に感染していないか、または感染した）を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０カラムへと、低グルコース濃度（２ｍＭ）の培地と共にロードし、３７℃で１時間にわたりプレインキュベートした。プレインキュベーションの後、膵島を、低グルコース濃度（２ｍＭ）および高グルコース濃度（２０ｍＭ）で、１時間ずつにわたる、逐次的なインキュベーションへと曝露した。各インキュベーションの終了時において、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）と共に上清を回収し、−８０℃で保存した。インスリン含量は、製造元の指示書に従い、インスリン酵素連結イムノアッセイキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）により決定した。インスリン分泌指数は、高グルコースインキュベーションの終了時におけるインスリン濃度と、低グルコースインキュベーションの終了時におけるインスリン濃度との比として計算した。
サイトカイン発現プロファイル
ヒト膵島におけるサイトカイン発現を誘導するＨ１Ｎ１ウイルスおよびＨ３Ｎ２ウイルスの能力は、ｘＭＡＰ技術（Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ；Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）に基づく、ビーズベースのマルチプレックスアッセイを使用して測定した。膵島のパラレルウェルにウイルスを感染させるか、またはこれらを模擬感染させた。感染前および感染の２、４、６、８、１０日後において、培養培地上清を回収し、４８のサイトカインについてアッセイした。選択されたサイトカイン、サイトカイン／ケモカインの検出限界、および変動係数（アッセイ内のＣＶ％およびアッセイ間のＣＶ％）を、図２１に示す。
感染後における細胞死の評価（生死アッセイ）
感染後における膵島細胞の生存率は、生死細胞アッセイキット（Ｌ−３２２４；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して測定した。アッセイは、２つの蛍光プローブによる生細胞および死細胞の同時的な決定に基づく。生細胞は、カルセインにより、それらのエステラーゼ活性に起因して緑色に染色され、死細胞の核は、エチジウムホモ二量体１により赤色に染色される。５日間の培養後に採取された膵島は、トリプシン様酵素（１２６０５〜０１、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により、単一の細胞へとさらに酵素的に消化した。製造元の指示書に従い、単一の細胞を、標識化溶液と共に、暗所内、室温で３０分間にわたりインキュベートし、スライドガラス上で細胞遠心分離し、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ １３５ＴＶ蛍光顕微鏡で評価した。死細胞の解析は、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ）を使用して、サイトスピン調製物上で実施した。各範疇内の陽性細胞は、１０の体系的にランダムな視野により定量化した。
統計学的解析
データは一般に、平均±標準偏差または中央値（最小値−最大値間の）として表した。パラメータ間の差異は、パラメータが正規分布する場合は、スチューデントのＴ検定を使用して評価し、パラメータが正規分布しない場合は、マンホイットニーのＵ検定を使用して評価した。カプラン−マイヤー解析および／またはコックス回帰分析は、ある時間内の事象の発生率を解析するのに使用した。０．０５未満のｐ値を、統計学的有意性の指標と考えた。データの解析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＳＰＳＳ統計パッケージ（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、ＵＳＡ）を使用して行った。
結果
ｉｎ ｖｉｖｏ実験
臨床疾患
Ｈ７Ｎ１感作群［Ａ］およびＨ７Ｎ３感作群［Ｂ］のいずれに由来するシチメンチョウも、感染後２日目において、結膜炎、副鼻腔炎、下痢、逆毛、および抑うつなど、ＬＰＡＩ感染に典型的な臨床徴候を示した。軽度の症状は、感染後２０日目までに消褪した。Ａ群に由来する２例の対象だけが、感染後３０日目まで、副鼻腔炎を示した。いずれの群においても死亡率は低かった：Ａ群の１例の対象は、感染後８日目において死亡し、Ｂ群の１例の対象は、感染後１９日目において死亡した。
ウイルスＲＮＡの検出
感染後２日目には、Ｈ７Ｎ１に感染した２０例の対象のうちの１７例、およびＨ７Ｎ３に感染した２０例の対象のうちの１９例から回収された気管スワブからウイルスＲＮＡが検出され、感染後３日目には、全ての動物から回収された気管スワブからウイルスＲＮＡが検出された。ウイルスＲＮＡはまた、感染後３日目において、Ａ群のＨ７Ｎ１の２例の対象の血液およびＢ群のＨ７Ｎ３の４例の対象の血液からも検出され（図２２）、感染後４および７日目に回収された膵臓および肺からも検出された（図１６）。ウイルスＲＮＡは、非感染対照からは検出されなかった。
生化学的解析
代謝の変化を明らかにする、生存中に回収された血液試料中において、感染後３〜９日目の間の、Ｈ７Ｎ１で感作されたシチメンチョウ（２０例中１２例）、およびＨ７Ｎ３で感作されたシチメンチョウ（２０例中１０例）では、血漿中のリパーゼレベルの有意な増大（対照動物の値１０〜１００倍）が明らかであった（図２）のに対し、非感染対照のいずれも、リパーゼレベルの修飾を示さなかった（２０例中２０例；ｐ＜０．００１、ピアソンカイ二乗）。感染動物では、３日目における血中のウイルスＲＮＡの存在とリパーゼの増大との間で、明確なトレンドが明らかとなった（９５％の信頼区間を０．９２〜６．８１とするハザード比：２．５１；ｐ＝０．０７）。いずれの場合にも、正常範囲内のリパーゼレベルは、急速に再確立されたが、この理由で、感染後２３日目には、このパラメータをもはや評価しないことに決定した（図１）。感染後９日目以降において、Ａ群の５例の動物およびＢ群の５例の動物が、高血糖症を発症した（図２）。これらのうち、２例の対象が、実験全体を通して高血糖状態を維持したのに対し、他の全ての動物では、血中グルコースレベルは、対照の血中グルコースレベルと同様に回復した（図１）。感染後３〜９日目の間におけるリパーゼの増大と、感染後９日目以降における高血糖症の発症との間の明確な関連が明らかとなった。実際、高血糖症は、感染後に高リパーゼ値を発症した対象だけにおいて存在したのであり、リパーゼレベルが正常な対象では現れず（それぞれ、２２例中１０例および１８例中０例；ｐ＝０．００１）、高リパーゼ血症と高血糖症の発症との間の中央値時間は４．５日間（最小値−最大値間：３−７日間）であった。
組織病理学および免疫組織化学
対照シチメンチョウのうちのいずれも、ＡＩＶに対する、有意な組織学的変化または陽性の免疫組織学反応を示さなかった（図３）。全ての感染シチメンチョウにおいて組織病理学病変は明らかであったが、感染後の異なる時点で回収された試料では顕著に異なった。早期（感染後４〜８日目）には、壊死性腺房細胞を伴う急性膵炎、マクロファージ、偽好酸球、リンパ球、および血漿細胞からなる広範な炎症性浸潤が、健常／非関与／保全組織の領域を凌駕する（図４）。感染後８日目以降、これらの壊死性の炎症性病変は、徐々に、小導管および軽度の線維増殖症を伴うリンパ球浸潤で置きかえられた。後期（感染後１７日目）には、リンパ結節を伴う広範な線維症が、膵臓実質に置きかわり、臓器の正常な構築の破壊が明らかとなった（図５）。全ての実験期間において、多様な数の壊死性腺房細胞が観察された。閉塞性膵管病変は、いずれの場合にも見られず、いずれの段階でも見られなかった。
実験期間において、免疫組織学染色により、変性性腺房細胞および壊死性腺房細胞は、ウイルス核タンパク質抗原抗体に対して特異的な反応を示した（図６）。また、血管内皮細胞のうちの一部も、陽性反応のほか、偶発的な膵管上皮細胞を示した。非感染対照では、膵臓のインスリン陽性組織は、外分泌部分の間質内に、単独で、または多様な形状およびサイズの膵島の小さな群で散在した（図１７Ａ）。感染後８日目において、膵島の正常な構造は部分的に破壊され、膵島細胞の数は低減された。残りの膵島は、小型で、歪んでおり；輪郭が不規則であるか、または膵島内毛細管が拡張しており；インスリンについて染色された細胞の数もまた低減され：これらの細胞は、細胞質の肥大を提示し、場合によって、顆粒状変性なおかつ壊死も有すると考えられた。膵島内には、膵島の断片化および内分泌細胞の大小のクラスターの転位を伴う線維性バンドが出現した（図１７Ｂ）。感染後１７日目には、インスリン陽性内分泌細胞の隔離された大型のクラスターが、腺房細胞の構成要素に置きかわった広範な線維症内に、または広範な線維症に近接して包埋されることが明確となった（図１７Ｃ）。感染後１７日目以降、極めて大型（直径＞２００μｍ）の、通例不規則な、主にインスリン免疫反応性の膵島様領域の群が、広範な腺房線維症内に散在することが明確となった（図１７Ｄ、Ｅ）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験
ヒト膵臓細胞系のヒトＡ型インフルエンザウイルスに対する感受性
内分泌（ｈＣＭ；膵島細胞腫）細胞系および膵管（ＨＰＤＥ６）細胞系の、Ｈ１Ｎ１／Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９およびＨ３Ｎ２／Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／０５感染に対する感受性について探索した。
受容体の分布
ｈＣＭ細胞系およびＨＰＤＥ６細胞系の両方に対するレクチン染色により、高レベルの、アルファ−２，６シアル酸連結されたシアル酸分子（ヒト指向性ウイルスにより要求される）のほか、アルファ−２，３連結された残基（トリ指向性ウイルスにより使用される）が明らかとなった。Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓレクチンＩＩ（アルファ−２，３特異的）およびＳａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａレクチン（アルファ−２，６特異的）と共にインキュベートされたｈＣＭの平均ピーク強度は、いずれの受容体についても、約２．６×１０４でほぼ同一であった。ＨＰＤＥ６もまた、いずれの受容体型についても、ＳＮＡについての３．７×１０４およびＭＡＡについての１．６×１０４で高レベルの発現を示した。ＭＤＣＫ細胞もまた、ヒト由来および鳥類由来のウイルスを単離するために広く使用されているので、いずれの受容体型についても、陽性対照系として組み入れた。ＦＡＣＳ解析は、ＭＤＣＫが、ＨＰＤＥ６と同様なレベルのアルファ−２，３受容体を発現させ、平均ピーク強度は、約１．８×１０４であるのに対し、アルファ−２，６の発現は、ｈＣＭによるアルファ−２，６の発現と同等であり、平均蛍光は、２．５×１０４であることを示した。したがって、いずれの膵臓細胞系も、シアル酸受容体を、ＭＤＣＫと同等なレベルで発現させ、ｈＣＭの場合には、ヒトウイルス受容体の発現がなお高度であるということができる（図１８）。全ての細胞の、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓに由来する１Ｕ／ｍｌのＮＡによる前処理により、いずれのレクチン型についての蛍光も結果として減衰したことから、特異性が確認された（データは示さない）。
膵臓細胞系内のウイルス複製動態
ｈＣＭ細胞およびＨＰＤＥ６細胞に、Ｈ１Ｎ１ウイルスおよびＨ３Ｎ２ウイルスを、ＭＯＩ＝０．００１で感染させた。感染細胞を、光学顕微鏡法で目視検査することにより、感染後のいずれの時点においても、ｈＣＭまたはＨＰＤＥ６に対する細胞変性効果は見られないことが明らかとなった。ＴＣＩＤ５０結果により、ＨＰＤＥ６内のウイルス力価の持続的増大が、７２時間の経過にわたり明らかとなったが、Ｈ１Ｎ１ウイルス力価は、感染の７２時間後において、感染の４８時間後と比較してわずかに高いだけであった。これに対し、ｈＣＭ細胞内で達せられたウイルス力価は、Ｈ１Ｎ１分離株およびＨ３Ｎ２分離株のいずれの場合にも、感染の４８〜７２時間後においてほぼ同様に維持した（図７ＡおよびＣ）。ウイルスＲＮＡ複製をｑＲＲＴ−ＰＣＲで検討することにより、いずれの被験細胞系においても、いずれの被験ウイルスについても、感染の最大で７２時間後において、ウイルス複製の持続的増大が示された（図７ＢおよびＤ）。
感染を実施するのに使用されるＭ．Ｏ．Ｉが大きい（Ｍ．Ｏ．Ｉ＝０．０１）にもかかわらず、トリインフルエンザウイルスは、いずれの膵臓細胞系においても、ヒトウイルスと比較して低レベルの複製を示し（図１９）、トレンドは、感染の最大で４８時間後におけるウイルスＲＮＡレベルの安定を特徴とし、感染の７２時間後におけるいずれの細胞系についても、ウイルスＲＮＡレベルの低下を特徴とした。ＲＲＴ−ＰＣＲ結果に基づき、ｈＣＭは、「Ｍ遺伝子」ＲＮＡの総量が、結果として、平均で、ＨＰＤＥ６より、２ｌｏｇ大きかったので、鳥類ウイルスに対してより感受性であると考えられた（図１９Ａ、Ｂ）。これはまた、いずれのウイルスも、ｈＣＭ内でより高力価に達した、ＴＣＩＤ５０結果によっても確認された（図１９Ｃ、Ｄ）。しかし、後者では、Ｈ７Ｎ１株は、Ｈ７Ｎ３と比較してより大きな複製効率を呈示した。この結果は、いずれのウイルスについても、同等量のウイルスＲＮＡが検出されたＲＲＴ−ＰＣＲ結果では反映されていない。ＨＰＤＥ６では、２つの鳥類ウイルスの間におけるウイルス複製の有意差が観察されなかった。
ウイルス核タンパク質を検出するためのウェスタンブロット解析
ｈＣＭ細胞系およびＨＰＤＥ６細胞系におけるＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス核タンパク質およびＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス核タンパク質についての結果を、図８に報告する（Ａ、Ｂ、Ｅ、およびＦ）。ＮＰ発現のトレンドには、ウイルス株または細胞型に応じたいかなる差異も示されなかった。予測される通り、ｔ０（感染前）では、インフルエンザウイルス核タンパク質が観察されなかったのに対し、感染の２４時間後（ｔ２４）、４８時間後（ｔ４８）、および７２時間後（ｔ７２）では、ｈＣＭならびにＨＰＤＥ６において、いずれのウイルスについても、インフルエンザウイルス核タンパク質が検出された。ｔ２４における試料から得られるバンドを、ｔ４８およびｔ７２において得られるバンドと比較することにより、ＮＰ発現の増大が観察可能となった。他方、ローディング対照として使用されるベータアクチンの量は、全ての被験試料において同じレベルであった（図７Ｃ、Ｄ、Ｇ、およびＨ）。
ＮＰタンパク質の免疫蛍光ターゲティング
ヒトインフルエンザウイルスの複製はまた、感染の２４時間後におけるｈＣＭ内のＦＩＴＣコンジュゲートに由来する蛍光シグナルによっても、いずれの被験ウイルスについても検出され、感染の４８および７２時間後において、経過時間にわたり増大した（図２０Ａ、Ｂ）。被験ウイルス株の間では、いかなる差異も観察されなかった。ＨＰＤＥ６細胞では、いずれのウイルスに対する蛍光シグナルも、感染の２４時間後において観察された（図２０Ｃ、Ｄ）。また、この場合においても、細胞の数は、感染の４８および７２時間後において、顕著に増大し続けたことから、核タンパク質発現の経過時間にわたる増強が裏付けられる（データは示さない）。
ヒト膵島の、ヒトＡ型インフルエンザウイルスに対する感受性
回帰モデルは、ペレット検体または上清検体の両方において調べた、ＴＰＣＫ−トリプシン存在下または非存在下におけるいずれのウイルスについてのＣｔ値も、経過時間にわたり有意に低下することを指し示した（ｐ＜０．０５）（図１０）。統計学的解析は、ウイルス力価が、経過時間にわたり、ウイルス亜型および試料型（ペレットまたは上清）とは独立に増大することを示した。興味深いことに、Ｈ１Ｎ１のペレット試料および上清試料に限り、ＴＰＣＫ−トリプシンを伴って成長させたウイルスについてのＣｔ値が、外因性プロテアーゼを伴わずに得られるＣｔ値より有意に小さかった（ｐ＜０．０１）（図６Ａ、Ｃ）。ＴＰＣＫ−トリプシンは、Ｈ３Ｎ２ウイルスの成長を増強すると考えられたが、差異は、統計学的有意性に達しなかった（ｐ＞０．１０）（図１１）。推定解析後の残差により、使用されたモデルは適切であることが示される（データは示さない）。
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施して、膵島細胞内に局在化したウイルスＲＮＡを可視化した。結果により、Ｈ１Ｎ１感染およびＨ３Ｎ２感染のいずれの後においてもウイルスＲＮＡが存在することが明確に裏付けられた（図１２Ａ）。ヒト膵島初代培養物は、内分泌細胞および外分泌細胞のいずれも含有するので、蛍光ベースのマルチプレックスｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション戦略を適用して、膵島内のどの細胞が感染しており、膵島内でどのくらい多くの細胞が感染しているのかを決定した。この目的で、示差的に標識されたプローブを組み合わせて、ウイルスＲＮＡおよびインスリン転写物、アミラーゼ転写物、またはサイトケラチン１９転写物を同時に解析し、ハイブリダイゼーションの後、ヒト膵島を脱凝集化させ、細胞の陽性度を定量化した。感染の５日後において、全細胞のうちの０％、１０．８％、および４．３％が、模擬感染膵島、Ｈ１Ｎ１感染膵島、およびＨ３Ｎ２感染膵島のそれぞれにおけるウイルスＲＮＡについて、陽性の結果を示した（ｐ＜０．００１）（図１２Ｂ）。Ｈ１Ｎ１陽性細胞のうち、４９±２７％が、インスリンについて陽性染色を示し、２６±１６％が、アミラーゼについて陽性染色を示し、１．６±２．４％が、ＣＫ１９について陽性染色を示し、２５±２１％が、被験転写物について陰性であった。Ｈ３Ｎ２陽性細胞のうち、４０±２３％が、インスリンについて陽性染色を示し、２０±２０％が、アミラーゼについて陽性染色を示し、２．３＋５％が、ＣＫ１９について陽性染色を示し、４１±４５％が、被験転写物について陰性であった（図１２Ｃ）。他方、インスリン陽性細胞のうち、１４±１０％および８±８％が、Ｈ１Ｎ１感染およびＨ３Ｎ２感染のそれぞれの５日後において、ウイルスＲＮＡについて陽性であった（ｐ＝０．０２３）。アミラーゼ陽性細胞のうち、２７±９％および９±６％が、Ｈ１Ｎ１感染およびＨ３Ｎ２感染のそれぞれの後において、ウイルスＲＮＡについて陽性であった（ｐ＜０．００１）。ＣＫ１９陽性細胞のうち、３±４％および１．３±３％が、Ｈ１Ｎ１感染およびＨ３Ｎ２感染のそれぞれの後において、ウイルスＲＮＡについて陽性であった（ｐ＝０．３６）（図１３）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏの、ヒトＡ型インフルエンザウイルスに感染したヒト膵島における、生存、インスリン分泌、および自然免疫の調節
光学顕微鏡法および生死アッセイによる感染膵島の目視検査により、感染後のいずれの時点においても、有意な細胞変性効果は見られないことが明らかとなった（０〜７日目）。感染の５日後において、非感染細胞は、３．２６％の全死亡率を示し、Ｈ３Ｎ２感染細胞は、５．２１％の全死亡率を示し、Ｈ１Ｎ１感染細胞は、７．３８％の全死亡率を示した（模擬感染細胞と対比してｐ＝非有意）（図１４）。さらに、静態潅流系で調べた通り、膵島をＨ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２のいずれに曝露しても、高グルコースに応答するそれらの能力に影響が及ぶことはなかった（図１４）。
ヒト膵島におけるサイトカイン／ケモカイン発現を誘導するＨ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２の能力は、ｘＭＡＰ技術に基づくビーズベースのマルチプレックスアッセイを使用して測定した。ヒト膵島のパラレルウェル（ウェル１つ当たり１５０の膵島）に、ウェル１つ当たり１０２〜１０３ｐｆｕのＨ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２を感染させるか、または模擬感染させた。感染後の５つの時点（０、４、６、８、１０日後）において、培養培地上清を回収し、５０のサイトカインについてアッセイした。３つのサイトカイン（ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−５、ＩＬ−７）を例外として、全てのサイトカインは、検出可能な発現を示した。模擬感染ウェルでは、ＣＣＬ２／ＭＣＰ１（最大で２５，５５８ｐｇ／ｍｌ、４日目）、ＩＣＡＭ−１（最大で１４，０６３、１０日目）、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８（最大で１１，６３５ｐｇ／ｍｌ、１０日目）；ＩＬ−６（８，４５２ｐｇ／ｍｌ、４日目）、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯ−α（最大で８，５８１ｐｇ／ｍｌ、４日目）、ＶＣＡＭ−１（最大で５，５６６ｐｇ／ｍｌ、６日目）、ＶＥＧＦ（最大で３，２２５ｐｇ／ｍｌ、１０日目）、ＳＣＧＦ−ｂ（最大で１，４２７ｐｇ／ｍｌ、６日目）、ＨＧＦ（最大で１，１９５ｐｇ／ｍｌ、６日目）について最高濃度が検出された。ＭＩＦ（最大で８０６ｐｇ／ｍｌ、６日目）、Ｇ−ＣＳＦ（最大で７９４ｐｇ／ｍｌ、６日目）、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ（最大で４４８ｐｇ／ｍｌ、６日目）、ＧＭ−ＣＳＦ（最大で２８０ｐｇ／ｍｌ、４日目）、ＩＬ−２Ｒａ（最大で２３０ｐｇ／ｍｌ、６日目）、ＩＬ−１２ｐ４０（最大で２１５ｐｇ／ｍｌ、６日目）、Ｍ−ＣＳＦ（最大で２１２ｐｇ／ｍｌ、１０日目）、ＬＩＦ（最大で１８５ｐｇ／ｍｌ、６日目）、ＣＸＣＬ４／ＳＤＦ１（最大で１２１ｐｇ／ｍｌ、６日目）は、より低度ではあるが着実な発現を示した。ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１２ｐ７０、ＣＣＬ１１／エオタキシン、ＦＧＦｂ、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３、ＩＬ−３、ＩＬ−１６、ＳＣＦ、ＴＲＡＩＬ、ＩＮＦａ２、ＩＮＦｇ、ＣＣＬ２７／ＣＴＡＫは、低度ではあるが着実な発現（最大で１０〜１００ｐｇ／ｍｌの間）を示した。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ１ａ、β−ＮＧＦ、ＴＮＦ−βについては、極めて低度である（最大で＜１０ｐｇ／ｍｌ）が、検出可能な発現が存在した。２つの炎症性サイトカイン（ＩＬ−６、ＴＮＦα）および６つの炎症性ケモカイン（ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯ−α、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β）は、インフルエンザウイルス感染細胞上清において、模擬感染対照と比較して５倍を超える増大を示した（図１５Ａ）。これらの中で、ＩＮＦ−γ誘導性ケモカインであるＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０は、Ｈ１Ｎ１感染またはＨ３Ｎ２感染に対して最強の応答（１００倍を超える増大）を示した。いずれも、感染の６〜８日後においてピークを示し、高用量のウイルスに対してより強力な応答を示した（図１５Ｂ）。
結果の概要
本研究の目的は、膵臓細胞内のＩＡＶ複製を評価し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞レベルおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける組織レベルの両方でその帰結を評価することであった。これらの研究は、ヒトＡ型インフルエンザウイルスが、ヒト膵臓初代細胞およびヒト膵臓初代細胞系において成長しうることを初めて指し示す。外因性トリプシンの添加は、ウイルスの複製を増強すると考えられるが、驚くべきことに、ヒト膵臓初代細胞およびヒト膵臓初代細胞系におけるウイルスの複製に不可欠ではない。本発明者らによるｉｎ ｖｉｖｏにおける結果により、ＩＡＶの２つの非全身性株は、実験的に感染させた雛鳥の膵臓にコロニー形成することが可能であり、内分泌損傷および外分泌損傷を反映する代謝的帰結を伴うというこれらの所見が確認された。
ＩＡＶによる膵臓へのコロニー形成は、主に全身性感染および非全身性感染を経る鳥類において、動物のいくつかの天然の感染および実験的感染の後に報告されている（上記の参考文献を参照されたい）。しかし、ヒトにおける膵臓感染の直接的な証拠は見られない。本明細書において、本発明者らは、２つの非全身性トリインフルエンザウイルスが、重度の膵炎を引き起こすことから、鳥類において生じる糖尿病と同等な代謝異常状態を結果としてもたらすことを初めて裏付けた。家禽を含む鳥類における、膵臓の内分泌機能障害および外分泌機能障害の臨床的含意については、文献が入手可能である。内分泌機能に関して、いくつかの研究は、膵臓全切除術により、鳥類が、死をもたらす、重度の低血糖症の危険を患うことを指し示している［１０３］。膵臓重量の１％という少量の膵臓残存部分がｉｎ ｓｉｔｕに残されると、穀食性鳥類では、一過性の（または可逆性の）高血糖状態が観察され、この場合、数週間以内に通常の血糖症が再確立される［１０４、１０５］。これにより、鳥類の膵臓組織は、著明な補償可能性を有し、また、膵外にインスリンを分泌することが可能ないくつかの内分泌組織が存在する証拠が認められるという事実によっても影響を受けることが示される［１０６］。インスリンが、給餌が十分な鳥類において主要なホルモンであるのに対し、グルカゴンは、絶食状態の鳥類において主要なホルモンである。不断給餌により実行されたこの実験では、膵臓の内分泌性構成要素が損傷すれば、高血糖症が顕在化する可能性が高いであろう。
外分泌機能に関して、鳥類における膵炎は、不快感、食餌に対する忌避、腸炎、および抑うつを特徴とする。生存中の探索は、血中リパーゼ濃度の増大に基づく［１０５］。本研究では、膵炎は、血流中のリパーゼ濃度を測定することにより、かつ、異なる時点において回収された膵臓の組織病理学的検討により評価した。哺乳動物において生じる通り、膵臓損傷は、一過性であり、感染後１５日目までに通常の値に戻る、血中リパーゼレベルの急速な増大を決定した。興味深いことに、血中リパーゼレベルの上昇を示し、したがって、最も重度の膵臓損傷を示したと推定される鳥類は、その後、少数の場合に限り、実験の終結まで遷延する、高血中グルコースレベルを呈示した。これは、鳥類における糖尿病の臨床症状および代謝症状と符合する。組織学的探索により、膵臓の外分泌部分におけるウイルスの複製は、線維症および臓器構築の破壊を結果としてもたらすことが明確に示される。研究にかけられたいずれの分離株も、膵臓の腺房細胞性構成要素において広範に複製されたことは明確であるが、本発明者らは、ウイルスの複製がまた、膵島内でも生じるのかどうかを決定することはできなかった。これらの結果に基づき、本発明者らは、インフルエンザウイルス感染により、重度の急性膵炎が引き起こされ、これにより、内分泌機能および外分泌機能のいずれもが損なわれたことを示唆する。
インフルエンザの複製についての現在の知見では、ＨＡタンパク質の多塩基性切断部位を呈示しないインフルエンザウイルスは、全身性とならないことが指し示されている。しかし、ｉｎ ｖｉｖｏ実験では、ウイルスは膵臓に達し、本発明者らは、驚くべきことに、感染後３日目において、感染シチメンチョウ２０例中２例（Ａ群：Ｈ７Ｎ１）および２０例中４例（Ｂ群：Ｈ７Ｎ３）の血液からウイルスＲＮＡを検出した。本発明者らは、一部の個体では、肺および消化管など、標的臓器内の複製後において、少量のウイルスが、血流に達し、したがって、膵臓にも達することを仮定する。検出されたＣｔ値は、低レベルのウイルスＲＮＡを指し示すが、これは、膵炎の発症（ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、高リパーゼ血症により検出される）を結果としてもたらすことが多かった。実験モデルでは、これにより、穀食性鳥類における糖尿病の提示と符合する、高血糖状態が結果としてもたらされた。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験の結果は、全ての被験ＩＡＶが、トリ由来（Ｈ１Ｎ１およびＨ７Ｎ３）およびヒト由来（Ｈ１Ｎ１であるＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９およびＨ３Ｎ２であるＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５）のいずれも、確立された膵臓細胞系内および膵島内で成長することが可能であることを示す。ウイルスの複製は、内分泌由来の細胞内および外分泌由来の細胞内のいずれにおいても生じる。これらの探索はまた、膵臓細胞には、アルファ−２−３受容体およびアルファ−２−６受容体のいずれもが存在することも示し、これにより、ヒトインフルエンザウイルスおよびトリインフルエンザウイルスのいずれもが、この臓器内で適切な受容体を見出しうることが示される。本研究で使用したヒトウイルスは、膵島細胞の著明な死亡率を誘導せず、インスリン分泌が、この系内の感染の影響を受けるとは考えられなかった。他方、サイトカイン発現プロファイルからは、ＩＡＶ感染が、ヒト膵島における強力な炎症促進性プログラムを誘導しうることも明確であった。ＩＮＦ−ガンマに誘導されるケモカインであるＭＩＧ／ＣＸＣＬ９およびＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０は、感染後において最高の増大を示した。また、大量のＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５、ＭＩＰ１ｂ／ＣＣＬ４、Ｇｒｏａ／ＣＸＣＬ１、ＩＬ８／ＣＸＣＬ８、ＴＮＦａ、およびＩＬ−６も放出された。これらの因子の多くが、１型糖尿病の発症機序において鍵となるメディエーターとして記載されていることは興味深い［１０７］。近年、ＩＰ１０／ＣＸＣＬ１０が、前糖尿病性動物および１型糖尿病性患者の、ｉｎ ｖｉｖｏの膵島環境において発現する主要なケモカインとして同定される一方、ＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５タンパク質およびＭＩＧ／ＣＸＣＬ９タンパク質は、いずれの種の膵島内でも低レベルで存在した［１０８］。ケモカインであるＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０は、単球、Ｔリンパ球、およびＮＫ細胞を誘引し、ウイルスにより引き起こされる自己免疫性糖尿病のマウスモデル［ラットインスリンプロモーター（ＲＩＰ）−ＬＭＣＶ］では、ＣＸＣＬ１０が膵島特異的に発現し、抗原特異的リンパ球の遊走を増強することにより、自己免疫が加速化される［１０９］。これは、ＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０［１１０］またはその受容体（ＣＸＣＲ３）［１１１］を中和しても、同じマウスモデル（ＲＩＰ−ＬＣＭＶモデル）における自己免疫疾患が防止されるという面倒な所見と符合する。ＮＯＤマウスにおける研究では、前糖尿病性段階における、膵島内のＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現の上昇が裏付けられている［１１２］。ＭＩＰ１ｂ／ＣＣＬ４レベルおよびＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０レベルの上昇は、近年１型糖尿病を有すると診断されている患者の血清内で生じる［１１３、１１４］。
本発明者らは、インフルエンザウイルスが、ヒト患者において検出される［１１５、１１６、１１７］通り、ウイルス血症を介して、または膵管を通る消化管からの逆流を介して膵臓へと到達すれば、ウイルスに許容性の環境が見出されることを提起する。この場合、ウイルスは、臓器の内分泌性構成要素および外分泌性構成要素のいずれに属する適切な細胞受容体および感受性細胞にも遭遇するであろう。ウイルスの複製は、糖尿病と連関する多様な状態と関連するサイトカインストームの活性化と同様の活性化に起因する細胞の損傷を結果としてもたらすであろう。したがって、本発明者らは、インフルエンザ感染は、急性膵炎および／または１型糖尿病の発生を結果としてもたらす、膵臓損傷をもたらしうると考える。
結論
これらの結果は、インフルエンザウイルス感染と、１型糖尿病および／または膵炎の発症との間の因果連関の最初の証拠を提示する。感染と１型糖尿病および／または膵炎との間のこの因果連関により、多様な治療的、予防的、および診断的機会がもたらされる。
本発明の好ましい実施形態についての上記の記載は、明確さおよび理解を目的とする例示および例のために提示されるものである。本発明の好ましい実施形態についての上記の記載は、網羅的であることを意図するものでも、本発明を、開示される正確な形態へと限定することを意図するものでもない。本発明の教示に照らして、当業者には、本発明の精神から逸脱することなく、多くの変化および改変をそれらに施しうることがたやすく明らかとなろう。本発明の範囲は、付属の特許請求の範囲およびそれらの同等物により規定されることが意図される。
参考文献（それらの内容が参照により完全に本明細書に組み込まれる）

Claims (20)

  1. 患者における１型糖尿病および／または膵炎の防止または処置における使用のための、Ａ型インフルエンザウイルスに対して有効な抗ウイルス化合物を含む組成物。
  2. 患者における１型糖尿病および／または膵炎の防止または処置における使用のための、Ａ型インフルエンザウイルス免疫原を含む免疫原性組成物。
  3. 患者における１型糖尿病および／または膵炎の防止または処置における使用のための、Ａ型インフルエンザウイルス免疫原および抗ウイルス化合物を含む免疫原性組成物。
  4. 患者における１型糖尿病および／または膵炎の防止または処置における使用のための、ナチュラルキラー細胞活性を阻害するのに有効な免疫調節化合物をさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 薬学的に許容される担体をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  6. ワクチン組成物である、請求項２から５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. アジュバントをさらに含む、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記アジュバントが、水中油エマルジョンである、請求項７に記載の組成物。
  9. 医薬品としての使用のための、請求項５から８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 患者における１型糖尿病および／または膵炎を防止または処置するための方法であって、前記患者へと、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
  11. 患者が、１型糖尿病および／または膵炎を発症する素因を有するか否かを同定するためのアッセイ法であって、患者試料中で、（ｉ）Ａ型インフルエンザウイルスもしくはその発現産物、および／または（ｉｉ）Ａ型インフルエンザウイルスに対する免疫応答の存在または非存在を検出するステップを含む、アッセイ法。
  12. 前記患者試料中での、（ｉ）Ａ型インフルエンザウイルスもしくはその発現産物、および／または（ｉｉ）Ａ型インフルエンザウイルスに対する免疫応答の検出により、前記患者に、１型糖尿病および／または膵炎を発症する素因があることが示される、請求項１１に記載のアッセイ法。
  13. １型糖尿病および／または膵炎の予後のためのアッセイ法であって、患者試料中で、（ｉ）Ａ型インフルエンザウイルスもしくはその発現産物、および／または（ｉｉ）Ａ型インフルエンザウイルスに対する免疫応答の存在または非存在を検出するステップを含む、アッセイ法。
  14. （ａ）前記患者試料中での、（ｉ）Ａ型インフルエンザウイルスもしくはその発現産物、および／または（ｉｉ）Ａ型インフルエンザウイルスに対する免疫応答のレベルを同定するステップと、（ｂ）前記患者試料中の前記レベルを、基準レベルと比較するステップとをさらに含み、（ｉ）前記患者試料中のより高いレベルは、より悪い予後を示し、（ｉｉ）前記患者試料中のより低いレベルは、より良好な予後を示す、請求項１３に記載のアッセイ法。
  15. 前記試料が、血液試料または気管スワブである、請求項１０から１４のいずれか一項に記載のアッセイ法。
  16. スクリーニングプロセスにおける使用のための、請求項１１から１５のいずれか一項に記載のアッセイ法。
  17. 前記Ａ型インフルエンザウイルスが、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、およびＨ１０Ｎ７からなるリストから選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物または方法。
  18. 前記Ａ型インフルエンザウイルスが、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、またはＨ３Ｎ２である、請求項１７に記載の組成物または方法。
  19. 前記患者が、７０歳以下である、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物または方法。
  20. 前記患者が、０〜１５歳の間である、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物または方法。
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