WO2023136435A1

WO2023136435A1 - 인지질 외피 보유 바이러스 사멸기능을 가지는 친환경 방역 조성물

Info

Publication number: WO2023136435A1
Application number: PCT/KR2022/016667
Authority: WO
Inventors: 박종목; 황태규; 서봉국; 정가영; 정민주; 김성철
Original assignee: 주식회사 유이케미칼; 한국화학연구원
Priority date: 2022-01-17
Filing date: 2022-10-28
Publication date: 2023-07-20
Also published as: KR102420201B1

Abstract

본 발명은 전체 100중량%를 기준으로, 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르 10~40중량%, 폴리옥시에틸렌 2-에틸헥실 에테르 0.01~10중량%, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 알킬 에테르 0.01~10중량%, 및 잔량의 용매를 포함하는 인지질 외피 보유 바이러스 사멸기능을 가지는 친환경 방역 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 세정제 조성물은 본 발명에 따른 환경친화적인 방역 조성물은 SARS-CoV-2 바이러스 제거율이 1분에서 100%이고, 고병원성 조류인플루엔자 바이러스를 1분~10분에서 100% 사멸시키는 효과를 가지며, 인간 피부각질세포주(human epithelial keratinocyte cells, HaCaT), 인간 기관지 상피세포주(human, Bronchial epithelial cells, BEAS-2B), 및 인간 단세포주(human monocyte cells, THP-1) 세포에 대한 IC₅₀ value (%)가 0.003~0.0045 범위로 낮은 세포 독성을 가지며, 비병원성 균주, 병원성 균주에 대한 항균 활성을 가지는 효과를 가진다.

Description

인지질 외피 보유 바이러스 사멸기능을 가지는 친환경 방역 조성물

본 발명은 인지질 외피 보유 바이러스 사멸기능을 가지는 친환경 방역 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 코로나-19, 조류 인플루엔자, 아프리카 돼지 열병, 중증급성호흡기증후군과 같은 인지질 외피를 보유한 다양한 바이러스를 효과적으로 제거할 수 있는 친환경 방역 조성물에 관한 것이다.

바이러스는 RNA나 DNA의 유전물질과 그것을 둘러싸고 있는 단백질 껍질(capsid, 캡시드)로 구성되는 매우 간단한 구조를 가진다. 어떤 바이러스는 단백질 껍질 이외에 지질로 이루어진 막을 가지기도 하는데, 이러한 지질로 이루어진 층(지질층, 지질막)을 가지는 것이 외피로 둘러싸인 외피 보유 바이러스(Enveloped Virus)이다.

이러한 지질층은 외피 보유 바이러스에만 존재하며 에테르나 다른 유기 용매에 노출 시 불활성화 되어 감염성이 소실되는 것으로 알려져 있다. 외피 보유 바이러스의 지질막이 숙주의 유전체에 자신의 유전자를 도입시키는데 큰 역할을 한다고 한다. 이 기작을 막는다면 여러 종류의 바이러스에 효과적으로 대처하면서도 불필요한 부작용은 발생하지 않을 것으로 기대되고 있다.

현재 이러한 바이러스를 제거하기 위한 세정제로 많이 사용되는 알코올계 세정제는 바이러스의 외피(인지질)을 녹여 소독 효과를 나타내는 에탄올을 주성분으로 포함하는 것으로, 현재 우리나라에서 광범위하게 사용되고 있다.

에탄올은 이러한 인지질층과 단백질로 구성된 외피 보유 바이러스의 외피를 녹여서 외피가 없는 바이러스가 외부에서 죽거나, 운 좋게 숙주에 들어간다 해도 세포에 침투해 증식하지 못하게 하는 역할을 한다.

한편, 인플루엔자 바이러스는 호흡기에 감염되어 전신증상을 일으키고, 주기적으로 모습을 바꿀 뿐 아니라, 숙주를 죽이지 않고 숙주가 죽기 전에 다른 숙주로 이동하기 때문에 과학자들은 인플루엔자 바이러스는 인류의 종말까지 살아남는 바이러스일 것으로 추측한다. 인류에게 가장 큰 경제적 손실을 가져오는 바이러스이며 예방백신이 개발되어 있기는 하지만 바이러스의 변이를 따라 잡지는 못하고 있는 실정이며, 아직 근본적인 바이러스 치료는 이루어지지 않고 있다.

이 중에서 조류 인플루엔자(Avian Influenza, AI)는 조류 인플루엔자 바이러스 감염에 의하여 발생하는 급성 전염병으로 닭, 칠면조, 오리 등 가금류에서 피해가 심하게 나타난다. 바이러스의 병원성 정도에 따라 저병원성과 고병원성 조류 인플루엔자로 크게 구분된다.

이러한 인플루엔자는 4번의 대유행 바이러스가 1918년부터 2009년 사이 발생하였는데, 가장 많은 사망자를 발생시킨 스페인 독감(A/H1N1), 아시아 독감(A/H2N2), 홍콩 독감(A/H3N2)을 거쳐 2009년 돼지 독감(A/H1N1)pdm09은 우리나라에서도 260명의 사망자를 발생시켰다.

5번째 대유행을 일으킬 가능성이 가장 높은 조류인플루엔자 바이러스의 발생은 지속적으로 보고되고 있다. 2003년부터 발견되기 시작한 조류인플루엔자 A/H5N1는 야생 조류와 가금류에서 발병하여 사람에게 전파되어 2017년 9월까지 총 16개국에서 454명의 사망자를 발생시켰고, 2013년 중국에서 발생한 조류인플루엔자 A/H7N9의 경우는 2017년 현재까지 599명의 사망자를 발생시켰다.

한편, 사스(중증급성호흡기증후군, Severe Acute REspiratory Syndrom, SARS)는 2002년 겨울 중국에서 발생이 시작된 이래 수개월 만에 홍콩, 싱가포르, 캐나다 등 전 세계적으로 확산되었던 신종전염병으로, 원인 병원체는 사스 코로나 바이러스(SARS-associated coronavirus, SARS-coV)이다. SARS-coV는 동물 숙주 코로나바이러스의 변종에 의해 동물로부터 사람으로 종간의 벽을 넘어 감염이 일어나는 것으로 알려져 있다.

사스의 기본적인 전파 경로는 호흡기의 비말이나 오염된 매개물을 통해 점막의 직, 간접 접촉에 의한 것으로 알려져 있고, 발열, 권태감, 근육통, 두통 오한 등의 증상이 나타나고 전염은 주로 두 번째 주에 발생하는 것으로 보고되고 있다.

사스가 의심되거나 추정되는 환자는 격리되어 입원치료를 받게 되며, 전염을 차단하기 위해 엄격한 관리가 요구된다. 그러나 아직까지는 이를 예방할 수 있는 백신이나 예방약이 개발되어 있지 않기 때문에 감염위험지역으로의 여행을 자제하거나, 손 씻기 등을 철저히 하여 직접 접촉으로 인한 감염을 예방하는 수준에 머물고 있다.

코로나 바이러스의 구조를 투과전자현미경(TEM)으로 관찰하면, 이중의 인지질막으로 이루어져 있고, 상기 인지질막은 C₁₀~C₁₈의 긴 탄소 사슬을 가진 구조를 가지고 있다.

본 출원인은 이러한 바이러스 방역을 위한 항바이러스 조성물로서 한국특허출원번호 2020-0137611에서는 전체 100중량%를 기준으로, C₁₃H₂₇(OCH₂CH₂)_nOH(여기서 n=2~15) 10~30중량%, 2-에틸헥실 알콜 에톡실레이트 0.1~5중량%, 에틸렌옥사이드-프로필렌옥사이드의 블록 공중합체 0.1~5중량%, 및 잔량의 물을 포함하는 세정제 조성물을 제시하였다.

상기 특허에서 주성분으로 사용된 C₁₃H₂₇(OCH₂CH₂)_nOH는 13개의 탄소 사슬이 선형 구조가 아니라 브랜치 구조를 가지기 때문에 코로나 바이러스의 인지질 이중막에 포함된 긴 탄소 사슬로 이루어진 소수성 부분과 잘 결합시킬 수 있어 회합수(aggregation number)가 증가하여 상기 코로나 바이러스의 인지질막의 가용화도를 증가시킬 것이라는 작용을 이용하여 세정제 조성물을 제조하였다.

상기 특허에서는 브랜치 구조를 가지는 물질을 이용하여 복잡한 인지질 이중막 구조와 마이셀 형성시 소수성 탄화수소 간의 반발력으로 인해 마이셀에서의 패킹 밀도(packing density)를 낮출 수 있기 때문에 인지질 이중막을 녹여내는 데 훨씬 유리한 구조를 형성할 수 있도록 한 것이나, 상기 주성분으로 포함된 C₁₃H₂₇(OCH₂CH₂)_nOH는 석유화학으로부터 합성된 물질로서 브랜치 구조가 많아 이용 쓰임새는 많으나, 생분해가 잘 되지 않아 환경적으로 불리한 문제가 있다.

또한, 본 출원인의 한국특허출원번호 2020-0137612에서는 전체 100중량%를 기준으로, 옥틸페놀 에톡실레이트(에톡실레이트에 포함된 에틸렌옥사이드의 개수(n)은 2~15임) 10~30중량%, 2-에틸헥실 알콜 에톡실레이트 0.1~5중량%, 에틸렌옥사이드-프로필렌옥사이드의 블록 공중합체 0.1~5중량%, 및 잔량의 물을 포함하는 세정제 조성물을 제시하였다.

상기 특허에서는 코로나 바이러스를 제거 및 억제시키는 역할을 담당하는 주성분으로 옥틸페놀 에톡실레이트를 포함하는데, 상기 옥틸페놀 에톡실레이트에서 옥틸페놀 그룹은 방향족 페놀기를 포함하는 C8의 알킬기로서 코로나 바이러스의 인지질막에 포함된 긴 탄소 사슬로 이루어진 소수성 부분과 잘 결합됨과 동시에, 에틸렌옥사이드 부분은 상기 긴 탄소 사슬의 소수성에 친수성을 부여하도록 하는 역할을 하도록 하였다. 동시에, 에틸렌옥사이드의 개수를 나타내는 n은 2~15, 바람직하기로는 5~10로 조절하여 상이한 n의 개수를 가지는 물질을 2종 이상 혼합하여 소정의 친수성을 조절하여 사용하도록 하였다.

그러나 상기 주성분으로 포함된 옥틸페놀 에톡실레이트는 인지질 이중막을 깨뜨리는 데는 효과적이나 알킬기가 브랜치 구조를 가지고, 분해됐을 때 페놀 성분이 잔류되어 환경적으로 치명적인 단점을 가진다.

이밖에도 사스 바이러스 및 인플루엔자 바이러스를 포함하는 바이러스, 세균 및 곰팡이류에 대한 살균 및 항균력을 갖도록 한 종래기술을 살피면, 한국 공개특허 2006-0079388에서는 나노 크기 은 입자 콜로이드를 제조한 후 일정한 농도범위 내에서 증류수를 포함하는 물, 알코올류 및 계면활성제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매와 혼합한 용액을 원료물질로 하여 나노크기의 이산화티탄 광촉매를 합성방법에 의해 제조한 무기항균제 용액 및 이를 희석한 물질을 용액, 바이얼, 스프레이, 에어로졸 등의 형태로 사용할 수 있는 기술을 제시하였다.

또한, 한국등록특허 10-1317318에서는 건조된 오배자를 세절하여 건조 중량의 10 내지 20배의 70 내지 80% 에탄올 혼합용매로, 20 내지 100℃ 추출온도에서 2시간 내지 5시간동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출 또는 환류냉각 추출방법을 이용하여 수득한 1 내지 5회 반복 추출한 후 감압 농축하는 단계의 제조방법으로부터 수득됨을 특징으로 하는 갈산(1), 파라 디갈산과 메타 디 갈산의 복합물(2), 에틸 갈레이트(4) 및 에틸 파라 디 갈레이트와 에틸 메타 디 갈레이트의 복합물(5)의 함유비(4.3:1:7.2:16.3)로 구성되는 70 내지 80% 에탄올 혼합용매 추출물 또는 이로부터 분리된 팬타 오-갈로일 글루코스(penta-O-galloyl glucose), 에틸 갈레이트(ethyl gallate) 또는 에틸파라 디갈레이트와 에틸메타디갈레이트의 복합물(a mixture of ethyl p-digallate and ethyl m-digallate)을 유효성분으로 함유하는 A/H1N1 계절 독감 바이러스에 기인한 계절 독감 또는 신종인플루엔자; A/H9N2 (A/Chicken/Korea/MS96/1996), 또는 A/H1N1으로부터 선택된 조류인플루엔자바이러스에 기인한 조류인플루엔자의 예방 및 치료를 위한 항균조성물을 제시하였다.

현재까지의 기술로는 다양한 바이러스 제거를 위한 제품이나 백신 개발이 요원한 실정일 뿐만 아니라, 인지질 이중막의 외피를 보유한 다양한 바이러스를 효과적으로 사멸시킬 수 있으면서도 인체나 동물에 사용 시 자극이 없는 환경친화적인 방역 제품의 개발이 시급한 실정이다.

본 발명은 외피 보유 바이러스에서 이들 바이러스에 포함된 인지질막을 깨뜨려 바이러스로 인한 전염이나 감염을 효과적으로 차단할 수 있는 인지질 외피 보유 바이러스 사멸기능을 가지는 친환경 방역 조성물을 제공하는 데 그 목적이 있다.

이러한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 인지질 외피 보유 바이러스 사멸기능을 가지는 친환경 방역 조성물은 전체 100중량%를 기준으로, 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르 10~40중량%, 폴리옥시에틸렌 2-에틸헥실 에테르 0.01~10중량%, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 알킬 에테르 0.01~10중량%, 및 잔량의 용매를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 조성물을 0.1중량% 이내로 포함하는 희석액에서의 SARS-CoV-2 바이러스 제거율이 1분내에 100%인 데 특징이 있다.

또한 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 조성물을 0.1중량% 이내로 포함하는 희석액에서의 고병원성 조류인플루엔자 바이러스를 1분~10분에서 100% 사멸시키는 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 조성물은 인간 피부각질세포주(human epithelial keratinocyte cells, HaCaT), 인간 기관지 상피세포주(human, Bronchial epithelial cells, BEAS-2B), 및 인간 단세포주(human monocyte cells, THP-1) 세포에 대한 IC₅₀ value (%)가 0.003~0.0045 범위로 낮은 세포 독성을 가지는 데 특징이 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 조성물은 비병원성 균주, 병원성 균주에 대한 항균 활성을 가지는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 조성물은 pH 6~8의 중성을 유지하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 조성물을 물에 0.01% ~ 0.05%의 함량으로 희석하여 사용되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 추가로 상기 잔량의 물에는 에탄올을 20중량% 이내로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 조성물에는 필요에 따라 전체 중량 중 0.1wt% 이내로 보존제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 환경친화적인 방역 조성물은 0.1중량% 이내로 포함하는 희석액에서의 SARS-CoV-2 바이러스 제거율이 1분내에 100%이고, 고병원성 조류인플루엔자 바이러스를 1분~10분에서 100% 사멸시키는 효과를 가진다.

또한, 인간 피부각질세포주(human epithelial keratinocyte cells, HaCaT), 인간 기관지 상피세포주(human, Bronchial epithelial cells, BEAS-2B), 및 인간 단세포주(human monocyte cells, THP-1) 세포에 대한 IC₅₀ value (%)가 0.003~0.0045 범위로 낮은 세포 독성을 가지며, 비병원성 균주, 병원성 균주에 대한 항균 활성을 가지는 효과를 가진다.

도 1은 실시예 2(본 발명), 비교예 1(특허문헌 1의 조성) 및 비교예 2(특허문헌 2의 조성)에 따른 각 조성물의 SARS-CoV-2 바이러스 제거율 측정 결과이고,

도 2와 3은 실시예 2(본 발명, Neutra Best L)에 따른 조성물의 고병원성 조류인플루엔자 바이러스 사멸 효과를 측정한 결과이고,

도 4~5는 실험예 3와 동일한 시료에 대한 각 조성물의 항균 활성을 측정한 결과이다.

이하에서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 다른 경우를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 경우 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는 (comprising)"은 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 하나 이상의 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다.

본 발명은 인지질 외피를 보유한 다양한 바이러스 사멸 기능을 가지는 친환경 방역 조성물에 관한 것이다.

이러한 본 발명에 따른 조성물은 전체 100중량%를 기준으로, 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르 10~40중량%, 폴리옥시에틸렌 2-에틸헥실 에테르 0.01~10중량%, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 알킬 에테르 0.01~10중량%, 및 잔량의 용매를 포함하는 구성을 가진다.

본 발명의 조성물은 주성분(조성물 중 용매를 제외하고 가장 많은 양으로 포함되는 성분을 의미함)으로 선형 구조로만 이루어진 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르를 주성분으로 포함하는 것이 바람직하다. 상기 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르는 음이온계 및 양이온계 계면활성제와 상용성이 우수하고, 산, 알칼리, 염 등이 공존하는 수용액에서도 우수한 계면활성을 나타내는 비이온계 계면활성제이다.

본 출원인은 최근 실험에서 선형 구조로만 이루어진 상기 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르를 주성분으로 사용한 결과 기존에 브랜치 구조를 가지는 다른 성분을 주성분으로 포함할 때(선행특허 1, 2)보다 외피 보유 바이러스의 외피를 보다 효과적으로 제거하는 것을 확인하였다.

이는 외피 보유 바이러스에 포함된 인지질 이중막을 구성하고 있는 인지질의 알킬기가 직쇄 형태이기 때문에, 본 발명에서도 주성분으로 이와 유사한 직쇄 형태를 가지는 구조를 사용함으로써 인지질 이중막과의 친화력을 높여 인지질 이중막으로 침투할 때 침투력을 향상시킬 수 있을 것으로 기대하였다.

뿐만 아니라, 인지질 이중막을 효과적으로 제거시킨 다음에는 물 속에서 에멀젼 상태로 안정하게 존재할 수 있어야 되는데, 이때에도 안정화도를 향상시킬 수 있으며, 선형 구조로만 이루어진 상기 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르는 사용 후에는 생분해 되기 때문에 환경친화적인 조성물 제조가 가능하다.

이러한 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르는 전체 조성물 중 10~40중량%로 포함되는 것이 바람직하며, 10중량% 미만에서는 인지질 이중막의 제거하는 효과가 부족하고 40중량%를 초과하는 경우에는 다른 구성 성분의 함량이 상대적으로 적고 친환경적인 항바이러스 조성물 제조에 불리할 수 있다.

본 발명의 조성물에는 외피 보유 바이러스의 인지질막 사이로 들어갈 때 침투력을 상승시키는 침투 보조제로서 작용하도록 폴리옥시에틸렌 2-에틸헥실 에테르를 전체 조성물 중 0.01~10중량%로 포함할 수 있다. 상기 폴리옥시에틸렌 2-에틸헥실 에테르는 측쇄에 탄화수소가 치환된 덜 규칙적인 구조를 가지기 때문에, 상기 인지질 이중막 사이로 들어갈 때 간격을 이격시킬 수 있어 침투력을 상승시킬 것으로 기대할 수 있다.

이러한 폴리옥시에틸렌 2-에틸헥실 에테르는 전체 조성물 중 0.01~10중량%로 포함되며, 0.01중량% 미만인 경우 원하는 효과를 얻을 수 없고, 10중량%를 초과하는 경우에도 부가적으로 침투력을 증가시키는 효과를 얻을 수 없으므로 바람직하지 못하다.

또한 본 발명의 조성물에는 에틸렌옥사이드와 프로필렌옥사이드를 공중합하여 제조된 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 알킬 에테르를 전체 조성물 중 0.01~10중량%로 포함한다.

상기 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 알킬 에테르는 본 발명의 인지질 외피 보유 바이러스 사멸기능을 가지는 친환경 방역 조성물 제조 시 생길 수 있는 기포 발생을 억제시키기 위하여 첨가되며, 전체 조성물 중 0.01~10중량%로 포함되는 것이 기포 제거에 효과적이다.

또한, 본 발명에 따른 상기 세정제 조성물은 pH 6~8 정도의 중성인 것을 특징으로 한다. 따라서 본 조성물이 사용되는 용도의 물질이 훼손되거나 변질되는 것을 최소화시킬 수 있는 장점이 있으면서도, 바이러스 사멸 효과는 우수한 특징을 가진다.

또한, 본 발명의 조성물에는 상기 구성을 제외한 잔량의 용매 포함하여 이루어진다. 상기 용매는 물이나 유기용제를 포함할 수 있으며, 물은 일반 수돗물이나, 일반 물에 함유되어 있는 용해된 이온, 고체입자, 미생물, 유기물 등의 모든 불순물을 제거한 정제수 등 특별히 한정되지 않는다.

또한, 필요에 따라 유기용제로서 에탄올이나 이소프로필알코올과 같은 알콜계 용매를 전체 용매 중 20중량% 이내로 포함되도록 하여 최종 제조되는 조성물의 점도를 낮추거나, 조성물 제조 시 발생되는 기포를 제거시키거나, 겨울철과 같이 낮은 온도에서 사용 시 조성물의 보존 특성을 향상시킬 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물의 보존 시 곰팡이가 피거나 하는 문제를 예방하여 저장안정성을 향상시키기 위하여 공지의 보존제를 전체 조성물 중 0.1중량% 이내로 포함할 수 있으며, 보존제의 종류가 특별히 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 인지질 외피 보유 바이러스 사멸기능을 가지는 친환경 방역 조성물은 상기 각 구성성분을 실온(r.t.)에서 잘 혼합하는 방식으로 용이하게 제조할 수 있으며, 상기 제조된 조성물은 소수성 친수성 밸런스(HLB) 값이 12~15의 범위를 가짐으로써 다양한 용도의 친환경 방역 조성물로 사용될 때 물 속에서 적절한 마이셀들을 형성하여 세정 효과를 높일 수 있다.

이 중에서도 특별히 본 발명에 따른 조성물은 코로나-19, 조류 인플루엔자, 사스(SARS, 중증급성호흡기증후군), 메르스(MERS, 중동호흡기증후군), 신종 코로나-19 바이러스, 아프리카 돼지 열병과 같은 인지질 이중막의 외피를 보유한 다양한 바이러스를 효과적으로 사멸시키는 효과를 가진다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 주성분으로 선형 구조의 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르를 사용함으로써 사용 후 효과적으로 생분해되어 기존의 브랜치 구조를 가지는 계면활성제의 독성 유기물질이 잔류되는 문제를 해결할 수 있어 환경 친화적인 조성물을 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 인체에 분무되거나 손을 소독하는 등의 용도로 사용할 때 또는 다양한 동물에 적용할 때 다른 부작용 없이 안전하게 사용할 수 있다.

이러한 본 발명에 따라 제조된 상기 친환경 방역 조성물은 물에 희석하여 분무용, 소독용, 세정용 등 소정의 원하는 용도로 다양하게 사용할 수 있다.

그 희석 농도는 100% 기준으로 0.01% ~ 0.05%일 수 있으나, 이에 한정되지 않고 소정의 용도에 맞도록 그 희석 농도를 조절할 수 있음은 당업자들에게 있어 자명하다.

이하에서 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 이하의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 이하의 실시예에서는 특정 화합물을 이용하여 예시하였으나, 이들의 균등물을 사용한 경우에 있어서도 동등 유사한 정도의 효과를 발휘할 수 있음은 당업자에게 자명하다.

실시예 및 비교예 : 조성물 제조

다음 표 1의 조성에 따라, 각 조성을 정제수에 넣고 18℃에서 혼합하고 충분히 교반시켜 각 방역 조성물을 제조하였다. 다음 표 1에서, 비교예 1은 본 출원인의 특허문헌 1의 실시예 2의 조성, 비교예 2는 특허문헌 2의 실시예 2의 조성으로서 각각 브랜치 구조를 가지는 성분을 주성분으로 포함하는 조성물을 제조하여 본 발명과 비교하였다.

함량 (중량%)	폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르	폴리옥시에틸렌 2-에틸헥실 에테르	폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 알킬 에테르	C₁₃H₂₇(OCH₂CH₂)_n5OH	옥틸페놀 에톡실레이트	물
실시예 1	10	0.1	0.2	-	-	89.7
실시예 2	27	0.5	0.5	-	-	72.0
실시예 3	40	5.5	3.5	-	-	51.0
비교예 1⁽¹⁾	1.0	0.5	0.5	27	-	72.0
비교예 2⁽²⁾	1.0	0.5	0.5	-	17	81.0
(1)특허문헌 1의 실시예 2의 조성 (2)특허문헌 2의 실시예 2의 조성 (3)실시예 1은 pH 6, 실시예 2는 pH 7, 실시예 3은 pH 8의 조성임

실험예 1 : SARS-CoV-2 항바이러스 효과 측정

상기 실시예 2(본 발명, Neutra Best L), 비교예 1(특허문헌 1의 조성, Neutra Best), 및 비교예 2(특허문헌 2의 조성, Clean V)에 따른 각 조성물의 SARS-CoV-2 바이러스 제거율을 다음과 같이 측정하였으며, 그 결과를 다음 도 1에 나타내었다.

96 well Cell plate에 Vero cell(원숭이 신장 상피 세포)를 well 당 1 X 10⁴ 개를 배양시켰다. 그 다음, 1x10³~5x10³개의 감염성 바이러스를 EP tube에 분주한 후 조성물의 농도가 0.1% 농도가 되도록 바이러스-세포 배양액(Gibco DMEM-0% FBS)을 혼합한 후 30초, 1분, 5분, 10분의 반응 시간 동안 반응시켰다.

반응이 끝난 세포 배양액은 드라이아이스를 이용하여 급속 냉동한 후, -80℃의 Deep freezer에서 샘플을 보관하였다. 준비된 샘플은 96 well U-bottom plate에서 세포 배양액을 이용하여, 10배 단계로 희석시켰다. 96 well Cell plate에서 배양이 끝난 세포는 1x Phosphate buffered saline (PBS)를 이용하여 1회 세척하고, 상기 단계 희석된 샘플을 세척이 끝난 세포로 옮기고, 1시간 30분 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 기존에 담겨있는 세포 배양액을 제거하고 적정 농도의 TPCK trypsin을 포함한 세포 배양액으로 교체하였다.

2~3일 동안 세포의 변형 상태 및 SARS-CoV-2 바이러스 증식 상태를 현미경을 통해 육안으로 관찰하였으며, 감염 후 3일에 10% Crystal violet 염색약으로 이용하여 생존한 세포를 염색하였으며, 그 결과를 다음 표 2와 도 1에 나타내었다.

	Clean V(0.01%)			Neutra Best (0.01%)			Neutra Best L (0.01%)
percentage (%)	1min	5min	10min	1min	5min	10min	1min	5min	10min
0.0500	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND
0.0375	ND	50%	25%	ND	ND	ND	ND	ND	ND
0.0281	ND	ND	ND	25%	100%	100%	ND	ND	ND
0.0211	ND	ND	ND	25%	75%	75%	ND	ND	ND
0.0158	ND	ND	ND	ND	ND	25%	100%	75%	100%
0.0119	ND	ND	ND	ND	ND	ND	25%	75%	50%
0.0089	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND
0.00067	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND

상기 표 2는 세포 생존율을 측정한 결과로서, 비교예 2(특허문헌 2의 조성, Clean V)에 따른 각 조성물은 0.0375%의 희석 농도에서 5min에서 50%, 10min에서 25%의 세포 생존율을 나타냈다. 비교예 1(특허문헌 1의 조성, Neutra Best)은 0.0211%의 희석 농도에서 대체로 세포 생존율을 나타냈다.

다음 도 1의 결과를 참조하면, 바이러스에 의해 사멸된 세포나 세정제 독성에 의해 사멸된 세포는 염색되지 않아 투명하게 관찰되며, 생존한 세포는 Crystal violet에 의해 염색되어 짙은 보라색으로 관찰되었다. 본 발명에 따른 실시예 1에 따른 Neutra Best L은 0.0158%의 희석 농도에서 1min과 10min에서 바이러스를 다 사멸시켜 세포가 100% 생존율을, 5분에서 75%의 생존율을 나타냄을 확인할 수 있다.(도 1 참조) 즉, 본 발명에 따른 조성물은 매우 짧은 시간인 1min 만에 SARS-CoV-2 바이러스를 100% 제거함을 확인할 수 있다.

또한, 0.0089%의 희석 농도 이하에서는 바이러스에 의해 세포가 다 죽어 ND(Not Detected)로 측정되었음을 알 수 있는데, 이러한 결과로부터 본 발명에 따른 조성물은 0.0158% 이하의 농도에서는 바이러스를 다 죽일 수 있다.

이러한 결과로부터 본 발명에 따른 Neutra Best L은 더 낮은 농도에서도 세포가 살아 있을 수 있으면서, 바이러스는 효과적으로 사멸시킬 수 있음을 알 수 있다.

실험예 2 : 고병원성 조류인플루엔자(AI) 바이러스 사멸 효과 및 세포 독성 측정

상기 실시예 2(본 발명, Neutra Best L)에 따른 조성물의 고병원성 조류인플루엔자 바이러스 사멸 효과와 세포 독성(실험예 1과 동일)를 다음과 같이 측정하였으며, 그 결과를 다음 도 2~3에 나타내었다.

고병원성 조류인플루엔자 바이러스 사멸 효과는 적혈구(Red Blood Cell, RBC)를 이용한 Hemagglutinin Assay라는 방법을 사용하였다. 구체적으로는 인플루엔자 바이러스의 Hemagglutinin이라는 단백질에 의해 RBC가 용혈작용을 일으키는 원리를 이용한 것으로, 인플루엔자 바이러스가 생존해 있다면 RBC를 이용하여 용혈작용이 일어나서 RBC가 터져 붉은 색이 전체적으로 보이고, 바이러스가 사멸되거나 바이러스가 자라기 위한 세포가 사멸이 된다면 바이러스가 존재하지 않기 때문에 붉은 색 점을 형성한다. 이는 사용하는 플레이트가 U bottom이므로 중력에 의해 RBC가 바닥으로 모이기 때문에 하나의 점처럼 형성되어 나타나는 것이다.

고병원성 조류인플루엔자 바이러스 사멸 효과를 나타낸 다음 도 2를 참조하면, 시료의 농도를 0.0375%로 희석시켰을 때 적혈구들이 잘 살아남아서 1min, 5min, 10min에서 모두 빨간색 점으로 모인 것을 확인할 수 있으며, 0.0281% 농도에서는 1min에서는 50%, 5min에서는 25%, 10min에서는 75%의 적혈구들이 살아 남은 것을 확인할 수 있다. 결과적으로 0.0375% 이상의 농도에서는 매우 짧은 시간인 1min 만에 100% AI 바이러스를 모두 사멸시킬 수 있음을 확인할 수 있다.

세포 독성 실험 결과인 도 3을 참조하면, 0.0500%로 희석시킨 농도에서는 감염 여부(○, ×)에 상관없이 본 발명의 조성물에 의해 세포가 모두 죽어 하얀 색을 띄는 것을 확인할 수 있다. 그러나, 0,0375%의 희석 농도 이하에서는 세포가 다 살아남아 보라색을 띄는 것을 알 수 있으므로, 이러한 결과로부터 0,0375% 이하의 농도에서는 세포독성이 없음을 확인하였다.

실험예 3 : 세포 독성 측정

상기 실시예 2(본 발명, NB-3), 비교예 1(특허문헌 1의 조성, NB-1), 및 비교예 2(특허문헌 2의 조성, NB-2), 및 기존 시판 중인 제품과 다양한 계면활성제를 이용한 다음 표 3에 따른 각 조성물의 인간 피부각질세포주(human epithelial keratinocyte cells, HaCaT), 인간 기관지 상피세포주(human, Bronchial epithelial cells, BEAS-2B), 및 인간 단세포주(human monocyte cells, THP-1)의 3가지 세포에 대한 독성 평가를 다음과 같이 진행하였다.

시료명	이름	비고
P-1	차아염소산 나트륨	유한락스, 코로나 사멸 희석비 (물:락스=50:1)
P-2	염화벤잘코늄	잡스그린퓨어액, 코로나 사멸 희석비 (물:약제=65:1)
P-3	Sodium stearate	Dissolved in D.W (단, 높은 온도에서만 녹는다)
NB-1	뉴트라베스트 원액	보존제 x
NB-2	뉴트라베스트 클린V	보존제 x
NB-3	NB-L 원액	보존제 x
NB-4	뉴트라베스트 BC	pH 7.77
NB-5	뉴트라베스트 BS	pH 9.93
NB-6	뉴트라베스트 ES	pH 9.83
NB-7	뉴트라베스트 LB	pH 6.57
NB-8	뉴트라베스트 QC	pH 5.13
NB-9	뉴트라베스트 SB	pH 3.92
P1 : 유한락스(시판 중인 타사 소독제) P2 : 양이온성 계면활성제를 포함하는 시판 중인 제품 P3 : 고체 시료로 된 계면활성제를 사용한 조성 NB-1 : 특허문헌 1의 조성 NB-2 : 특허문헌 2의 조성 NB-3 : 본 발명 실시예 2의 조성 NB-4, NB-8 : 양이온성 계면활성제를 주성분으로 포함하는 조성 NB-5, NB-6 : 음이온성 계면활성제를 주성분으로 포함하는 조성 NB-7, NB-9 : 양쪽성 계면활성제를 주성분으로 포함하는 조성

1. Cell seeding 96 well cell culture plate에 각각의 HaCaT, BEAS-2B, THP-1 세포를 0.5x10⁴ cells/well, 0.5x10⁴ cells/well, 3x10⁴ cells/well 세포주로 깔아주었다. 세포수가 다른 이유는 처음에 세포 수 조건을 잡을 때 Vehicle (Veh, 약물의 용매만 처리한 그룹)의 OD(optical density 570 nm)가 1.0 정도 되는 것을 기준으로 잡았기 때문이다.

2. Treatment

세포를 96 well cell culture plate에 깔고 24 시간 뒤에 약물을 처리하였다. 약물의 점적양은 배지 부피의 1/100 정도 희석(배지 100㎕ 안에 약물을 1㎕ 점적)되게 처리하였다. 예를 들어 96 well plate에선 세포를 깔 때 배지를 100㎕로 하였다. 따라서 만약 최종 농도가 0.0075%로 약물을 처리하고 싶다면 최초 농도는 0.75%의 약물을 준비하여야 한다는 것을 의미하며, 0.75% 농도의 약물을 100㎕ 배지에 1㎕ 점적하면, 세포에 실제로 작용하는 농도는 0.0075%가 된다는 것이다.

3. MTT solution

앞서 세포에 약물을 처리하여 24 시간 뒤, MTT solution (1 mg/ml)을 배지 부피의 동량으로 첨가하여 인큐베이터에서 2~3시간 반응시킨다. 여기서 배지 부피의 동량이라 함은 배지가 100㎕이므로 MTT solution을 배지에 100㎕를 넣는 것을 의미한다.

4. Insoluble formazan

상기 반응이 끝나면, 96 well cell culture plate 바닥에 청자색의 녹지 않는 물질이 만들어지는데 이것이 바로 미토콘드리아에 의한 세포호흡으로 MTT tetrazolium이 비수용성인 MTT formazan으로 환원되어 나타나는 현상이다.

따라서 반응 후 상등액을 모두 제거한 다음, 바닥에 비수용성의 MTT formazan을 유기용매인 DMSO에 녹여 OD₅₇₀ nm로 microplate reader를 이용해 색의 진하기를 수치화시켰다.

생물 저해농도를 나타낸 IC ₅₀ value(%) 값은 각각의 농도에 따라 regression 그래프를 그려 추세선을 통한 y=ax+b라는 수식을 얻어 y=50에 대한 x의 농도를 계산하였으며, 그 결과를 다음 표 4에 나타내었다.

IC₅₀ value (%)
	HaCaT	BEAS-2B	THP-1
P1	0.001951	0.00243	0.00142
P2	0.000412	0.00038	0.00119
P3	0.005292	0.00969	0.4165
NB-1	0.003644	0.00301	0.00413
NB-2	0.003711	0.00319	0.00526
NB-3	0.003608	0.00343	0.00419
NB-4	0.000797	0.00394	0.00277
NB-5	0.003953	0.0032	0.00517
NB-6	0.005083	0.0031	0.00339
NB-7	0.000907	0.00279	0.00286
NB-8	0.005061	0.00039	0.00438
NB-9	0.014485	0.00293	0.01497

상기 표 4의 결과를 참조하면, 생물 저해농도인 IC ₅₀ value(%)는 세포독성 값을 확인한 것으로 그 값이 적을수록 세포독성을 가진다. 본 발명에 따른 NB-3의 경우 가습기 살균제에 들어있는 성분으로 양이온성 계면활성제를 이용한 시판 중인 제품(P2)에 비해서는 세포독성이 적은 것으로 확인되었다. 즉, 인체 정상세포에 유의적인 영향을 미치지 않아 세포독성이 낮은 것으로 볼 수 있다.

실험예 4 : 항균 활성

상기 실험예 3과 동일한 시료에 대한 각 조성물의 항균 활성을 평가하기 위하여 다음과 같이 진행하였다. 항균 활성 실험은 paper disc method를 이용하였고, 사용 균주와 배지는 다음 표 5에 나타내었다.

Microorganisms	KCTC No.	Media
Bacillus subtilis	1021	Nutrient broth (Becton and Dickinson, BD, NJ, USA)
Candida albicans	7965	Yeast Malt broth (BD, NJ, USA)
Lactobacillus plantarum	3108	MRS broth (BD, NJ, USA)
Lactobacillus sakeisubsp. Sakei	3598
Leuconostocmesenteroidessubsp. dextranicum	3530
Escherichia coli	1924	Luria Bertani broth (LPS, Korea)
Pseudomonas aeruginosa	1750
Salmonella typhimurium	1926
Staphylococcus aureus	1927
Staphylococcus epidermidis	1917
Streptococcus mutans	3065

각 균주는 24시간 동안 진탕 배양하여, 그 균액을 종배양액으로 사용하였다. 각 균주에 적합한 배지를 제조하여 1.5%의 agar (Becton and Dickinson, BD, NJ, USA)에 첨가하여 멸균하고, 멸균된 배지를 식혀 약 40℃일 때 종배양액을 1% 첨가하여 20㎖씩 분주하여 항균활성 평판배지를 제작하였다. 각 시료를 농도 1, 10, 100㎍/50㎕로 8 mm (Advantec Ltd, Tokyo, Japan)에 흡수시켜 항균활성 배지표면에 가볍게 놓은 다음 37℃에서 18-24시간 배양한 후 생육저해환 (clear zone) 생성 유무를 확인하고 지름을 측정하였으며, 그 결과를 다음 표 6~7과 도 4~5에 나타내었다.

	비병원성 균주
	그람양성 균주								그람음성 균주
	*Bacillus subtilis*				*Staphylococcus epidermidis*				*Escherichia coli*
μg/ 50μl	1	10	100	MIC	1	10	100	MIC	1	10	100	MIC
P-1	-	-	12	50	-	-	(12)	50	-	-	12	50
P-2	-	-	(11)	50	-	12	20(30)	5	-	-	14	50
P-3	-	-	-	≥100	-	-	-	≥100	-	-	-	≥100
NB-1	-	-	-	≥100	-	-	(12)	50	-	-	-	≥100
NB-2	-	-	-	≥100	-	-	-	≥100	-	-	(13)	50
NB-3	-	-	-	≥100	-	-	(11)	50	-	-	-	≥100
NB-4	-	-	15	50	10	18	21(30)	≤1	-	-	14	50
NB-5	-	-	-	≥100	-	-	13	50	-	-	-	≥100
NB-6	-	-	-	≥100	-	-	12	50	-	-	-	≥100
NB-7	-	-	-	≥100	-	-	10	50	-	-	-	≥100
NB-8	-	-	(12)	50	10	17	25	≤1	-	-	11(17)	50
NB-9	-	-	-	≥100	-	-	-	≥100	-	-	-	≥100

	병원성균주
	그람양성 균주								그람음성 균주
	*Staphylococcus aureus*				*Streptococcus mutans*				*Pseudomonas aeruginosa*				*Salmonella typhimurium*
μg/ 50μl	1	10	100	MIC	1	10	100	MIC	1	10	100	MIC	1	10	100	MIC
P-1	-	-	11	50	-	-	12	50	-	-	13	50	-	-	12	50
P-2	-	14	25	5	-	(10)	12 (24)	5	-	11	24	5	-	-	(11)	50
P-3	-	-	-	≥100	-	-	-	≥100	-	-	-	≥100	-	-	-	≥100
NB-1	-	-	12	50	-	-	19	50	-	-	13	50	-	-	(12)	50
NB-2	-	-	-	≥100	-	-	12	50	-	-	(10)	50	-	-	(12)	50
NB-3	-	-	(12)	50	-	-	(11)	50	-	-	10	50	-	-	-	≥100
NB-4	9	22	26	≤1	-	(14)	14 (26)	5	-	16	26	5	-	-	(10)	50
NB-5	-	-	16	50	-	-	18	50	-	11	22	5	-	-	(11)	50
NB-6	-	-	-	≥100	-	-	11	50	-	-	11	50	-	-	-	≥100
NB-7									-	-	10	50	-	-	-	≥100
NB-8									-	16	31	5	-	-	15	50
NB-9									-	-	-	≥100	-	-	-	≥100

상기 표 6~7과 다음 도 4~5의 결과를 참조하면, 본 발명에 따른 조성물(NB-3)는 비병원성 균주 중 그람양성 균주인 Bacillus subtilis와 그람음성 균주, 및 병원성 균주 중 Salmonella typhimurium에서는 MIC(minimum inhibitory concentration) 값이 100 이상인 것으로, 나머지는 50 이상인 것으로 측정되었다.

병원성 균주의 경우 MIC 농도가 낮을수록 항균활성이 좋다고 판단될 수 있으나, 대체적으로 비병원성 균주에서는 항균 활성이 없는 것이 양호한 것으로 본 발명에 따른 조성물은 다소 차이는 있으나 이러한 효과에 부합하는 결과를 보였다.

본 발명에 따른 항바이러스 조성물은 주성분으로 선형 구조를 가지는 물질을 사용함으로써 외피 보유 바이러스에 포함된 인지질막과의 친화력을 높일 수 있어 인지질 이중막으로 침투할 때 침투력을 향상시켜 효과적으로 녹여냄으로써 다양한 외피 보유 바이러스를 효과적으로 제거할 수 있다.

또한, 외피 보유 바이러스의 인지질 이중막을 깨뜨린 후에는 물 속에서 에멀젼 상태로 안정하게 존재할 수 있어야 되는데, 이때에도 주성분으로 포함된 물질의 선형 구조로 인해 안정화도를 향상시킬 수 있다.

또한, 사용 후에는 생분해 가능성이 높기 때문에 기존의 브랜치 구조를 가지는 물질을 사용할 때에 비해 환경친화적인 방역 조성물을 제공할 수 있다.

따라서 이러한 본 발명에 따른 환경친화적인 방역 조성물은 코로나-19, 조류 인플루엔자, 사스, 아프리카 돼지 열병 바이러스 등을 포함하는 외피 보유 바이러스를 제거하는 데 효과적으로 사용할 수 있다.

Claims

전체 100중량%를 기준으로,

폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르 10~40중량%, 폴리옥시에틸렌 2-에틸헥실 에테르 0.01~10중량%, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 알킬 에테르 0.01~10중량%, 및 잔량의 용매를 포함하는 인지질 외피 보유 바이러스 사멸기능을 가지는 친환경 방역 조성물.
제1항에 있어서,

상기 조성물을 0.1중량% 이내로 포함하는 희석액에서의 SARS-CoV-2 바이러스 제거율이 1분에서 100%인 것인 조성물.
제1항에 있어서,

상기 조성물을 0.1중량% 이내로 포함하는 희석액에서의 고병원성 조류인플루엔자 바이러스를 1분~10분에서 100% 사멸시키는 것인 조성물.
제1항에 있어서,

상기 조성물은 인간 피부각질세포주(human epithelial keratinocyte cells, HaCaT), 인간 기관지 상피세포주(human, Bronchial epithelial cells, BEAS-2B), 및 인간 단세포주(human monocyte cells, THP-1) 세포에 대한 IC₅₀ value (%)가 0.003~0.0045 범위로 낮은 세포 독성을 가지는 것인 조성물.
제1항에 있어서,

상기 조성물은 비병원성 균주, 병원성 균주에 대한 항균 활성을 가지는 것인 조성물.
제1항에 있어서,

상기 조성물은 pH 6~8을 유지하는 것인 조성물.
제1항에 있어서,

상기 조성물을 물에 0.01% ~ 0.05%의 함량으로 희석하여 사용되는 것인 조성물.
제1항에 있어서,

추가로 상기 잔량의 물에는 에탄올을 20중량% 이내로 포함할 수 있는 것인 조성물.
제1항에 있어서,

상기 조성물에는 전체 중량 중 0.1wt% 이내로 보존제를 더 포함하는 것인 조성물.