KR102551061B1

KR102551061B1 - Saha를 유효성분으로 포함하는 살모넬라 속 균주에 의한 바이오필름 생성 저해용 조성물

Info

Publication number: KR102551061B1
Application number: KR1020220064644A
Authority: KR
Inventors: 하상도; 김유경
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2022-05-26
Filing date: 2022-05-26
Publication date: 2023-07-03

Abstract

본 발명은 SAHA(Suberoylanilide hydroxamic acid, vorinostat)의 살모넬라 속 항바이오필름(antibiofilm) 용도에 관한 것으로, 히스톤 탈아세틸화효소(HDACs) 억제제이면서, 트리코스타틴 A(TSA)의 유사체인 SAHA를 이용하여 살모넬라 속 균주의 바이오필름 형성을 억제함을 확인하였고, 이를 통해 가금류 산업에서의 가공공장, 식품 접촉 표면 및 식품 표면에서의 바이오필름 형성을 방지할 수 있다.

Description

SAHA를 유효성분으로 포함하는 살모넬라 속 균주에 의한 바이오필름 생성 저해용 조성물 {A composition comprising SAHA as an active ingredient for inhibiting the formation of biofilm generated by Salmonella spp.}

본 발명은 SAHA의 살모넬라 속 균주에 의한 바이오필름 생성 저해용 용도에 관한 것이다.

살모넬라 속(Salmonella spp.) 균은 Salmon과 Smith(1886)에 의해 Hog Cholera에 감염된 돼지로부터 S. cholerasuis를 처음 분리한 것을 보고한 이래 전세계적으로 분포되어 있으며, 사람을 포함한 포유동물에 감염되어 패혈증, 설사, 폐렴 등을 야기시키는 인수공통 전염병의 병원체이다. Salmonella 속 균의 전파는 식육, 오염된 환경을 통하여 건강한 동물과 사람의 감염되고 있으며, 항생제 오용과 남용에 따른 내성균(S. typhimurium DT104)의 출현이 증가되어 가축질병의 치료예방과 사람의 공중보건상 중요시되고 있다.

한편, 현대 의학과 식생활의 발달로 여러가지 의료장치, 식품 가공 및 조리 기기의 사용이 급증하고 있으며, 이러한 장치 및 기기 중에는 세균이 정착하여 바이오필름을 형성하기 쉬운 스테인레스 스틸, 플라스틱, 고무 등의 재료가 많아 바이오 필름 관련 감염증이 빠르게 증가하고 있다. 선진국의 경우 치료를 요하는 세균 감염증의 60% 이상이 바이오필름 형성과 관련되어 있는 것으로 보고되고 있다.

바이오필름(biofilm)은 세균들이 서로 뭉쳐 하나의 점액질 막을 형성해 외부환경에 대항하는 것으로, 세균뿐만 아니라, 진균도 포함해 덩어리를 이룬다. 바이오필름에는 정상적으로는 공존할 수 없는 여러 종류의 세균이 서식하고, 영양공급이나 노폐물의 배출을 담당하는 수로까지 갖추어져 있는 것으로 알려져 있다. 바이오필름 내에 존재하는 미생물은 항균제 치료로도 제거가 어려워 큰 문제가 되고 있다.

현재까지 바이오필름 제어를 위해, 전기장(electric fields), 초음파(ultrasound), 고압(high pressure), 자동 세척기(automatic scrubbers), 산/염기 워시액(acid/alkali wash), 염소계 소독제(chlorine), 과산화 살균제(peracid sanitizer) 등이 연구되어 왔다. 하지만, 전기적 저항에 의한 발열을 이용하는 전기장(electric fields), 초음파 진동을 이용하여 균을 탈리시키는 초음파(ultrasound), 압력을 높여 세포막을 파괴하는 고압처리(high pressure) 기술의 경우에는 균의 살균 효과가 미미하고, 살균처리 가능 면적이 좁아 실제적 적용이 어려우며, 설치 및 처리 비용이 높은 문제점이 있다.

또한, 화학적 방법인 산/염기 워시액(acid/alkali wash), 염소계 소독제(chlorine), 과산화 살균제(peracid sanitizer)는 금속재료에 사용할 경우 부식의 위험성을 갖고 있다. 특히 살균처리에 빈번하게 사용되고 있는 염소계 살균 소독제의 경우 트리할로메탄과 같은 발암물질의 생성이 보고되고 있다. 또한, 살균 후, 세척과정에서 대량의 세척수를 필요로 하며, 세척수를 재사용함으로써 살균 및 소독된 식품공정기기에 병원성 미생물이 재오염 되는 문제점이 생길 수 있다.

따라서, 심각한 문제인 바이오필름의 살균에 실제 적용이 용이하고, 바이오필름 형성균의 저감화 효과가 뛰어나며, 살균처리 후, 재오염의 문제가 없으며, 인체에 해를 미치지 않는 바이오필름 제어 기술의 개발 필요성이 부각되고 있다.

이에, 본 발명은 미국 식품의약국(FDA)에서 승인한 피부 T세포 림프종의 치료제인 SAHA(Suberoylanilide hydroxamic acid, Vorinostat)를 이용하여 항균(antimicrobial) 및 항바이오필름(antibiofilm) 효과를 확인하고자 하였다.

SAHA(Suberoylanilide hydroxamic acid, Vorinostat)는 세포주기를 멈추고, 세포 자멸사를 유발하며, 세포분화를 중지시킬 수 있다.

SAHA를 이용한 종래의 기술로는 대한민국 공개특허공보 제10-2008-0086514호(항진균제의 활성을 증가시키기 위한 히스톤 데아세틸라제억제제)에서 아스페르길루스(Aspergillus) 종에서의 SAHA의 항진균(antifungal) 효과를 개시하고 있고, 대한민국 등록특허공보 제 10-2331206호(히스톤 탈아세틸효소 억제 활성을 갖는 신규 화합물 및 이의 의학적 용도)에서 SAHA 및 세포 생존도에 대한 영향을 개시한 바 있다. 그러나 SAHA의 항바이오필름에 대한 역량과 그 효과는 아직 잘 알려져 있지 않았다.

이에, 본 발명자들은 SAHA의 항바이오필름 효과를 연구하던 중, SAHA가 식품 접촉면(플라스틱, 실리콘 고무, 고무 장갑) 및 식품 표면(닭 껍질, 달걀 껍질)에서 살모넬라 속 균에 의해 형성된 바이오필름을 감소시킬 뿐만 아니라, 이의 병원성 및 QS(quorum sensing)과 관련된 유전자 발현을 억제한다는 점을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid, vorinostat)를 유효성분으로 포함하는 바이오필름(biofilm) 형성 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 SAHA를 유효성분으로 포함하는 바이오필름 형성 억제용 코팅조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 SAHA를 유효성분으로 포함하는 바이오필름 형성 억제방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명의 일 측면은, SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid, vorinostat)를 유효성분으로 포함하는 바이오필름(biofilm) 형성 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에서 상기 SAHA는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이다:

[화학식 1]

.

또한 본 발명의 다른 측면은, SAHA를 유효성분으로 포함하는 바이오필름 형성 억제용 코팅조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 측면은 바이오필름이 형성되었거나 바이오필름 형성이 예상되는 표면에 처리하는 단계;를 포함하는 바이오필름 형성 억제방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 SAHA가 식품 접촉면(플라스틱, 실리콘 고무, 고무 장갑) 및 식품 표면(닭 껍질, 달걀 껍질)에서 S. enterica 혈청형 Kentucky 칵테일에 의해 형성된 바이오필름을 감소시킬 뿐만 아니라, 이의 병원성 및 QS(quorum sensing)과 관련된 유전자 발현을 억제한다는 점을 확인하여, SAHA의 항균 및 항바이오필름 용도를 가금류 가공공장 및 식품산업에 적용할 수 있어 관련 산업에 발전을 도모할 수 있다.

도 1a는 식품 접촉 표면(플라스틱, plastic, PLA)에서 S. enterica 혈청형 Kentucky의 바이오필름에 대한 SAHA의 효과를 나타낸 도이다. 반복 수(n=3) 각기 다른 알파펫(a-d)은 대조군에 비해 p<0.05에서 유의미한 차이가 있음을 나타낸다.
도 1b는 식품 접촉 표면(실리콘 고무, silicon rubber, SR)에서 S. enterica 혈청형 Kentucky의 바이오필름에 대한 SAHA의 효과를 나타낸 도이다. 반복 수(n=3). 각기 다른 알파펫(a-d)은 대조군에 비해 p<0.05에서 유의미한 차이가 있음을 나타낸다.
도 1c는 식품 접촉 표면(고무 장갑, rubber, RG)에서 S. enterica 혈청형 Kentucky의 바이오필름에 대한 SAHA의 효과를 나타낸 도이다. 반복 수(n=3). 각기 다른 알파펫(a-d)은 대조군에 비해 p<0.05에서 유의미한 차이가 있음을 나타낸다.
도 2a는 식품 표면(닭 껍질)에서 S. enterica 혈청형 Kentucky의 바이오필름 세포에 대한 SAHA의 효과를 나타낸 도이다. 반복 수(n=3). 각기 다른 알파펫(a-d)은 대조군에 비해 p<0.05에서 유의미한 차이가 있음을 나타낸다.
도 2b는 식품 표면(달걀 껍질)에서 S. enterica 혈청형 Kentucky의 바이오필름 세포에 대한 SAHA의 효과를 나타낸 도이다. 반복 수(n=3). 각기 다른 알파펫(a-d)은 대조군에 비해 p<0.05에서 유의미한 차이가 있음을 나타낸다.
도 3a는 다양한 농도의 SAHA 처리 시 S. enterica 혈청형 Kentucky의 swimming 운동성(motility)을 확인한 도이다. 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 나타낸다. 각 처리 내에서 다른 알파벳(a-d)으로 표시된 값은 Ducan's 다중범위실험에 따라 큰 차이를 보였다(p<0.05).
도 3b는 다양한 농도의 SAHA 처리 시 S. enterica 혈청형 Kentucky의 swarming 운동성(motility)을 확인한 도이다. 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 나타낸다. 각 처리 내에서 다른 알파벳(a-d)으로 표시된 값은 Ducan's 다중범위실험에 따라 큰 차이를 보였다(p<0.05).
도 4는 표면에 다양한 농도의 SAHA가 존재할 때 S. enterica 혈청형 Kentucky의 바이오필름 형성을 나타낸 FE-SEM 현미경 사진이다(고무 장갑: (A) Blank; (B) 대조군(0% SAHA); (C) 1/8 MIC; (D) 1/4 MIC; (E) 1/2 MIC).
도 5는 표면에 다양한 농도의 SAHA가 존재할 때 S. enterica 혈청형 Kentucky의 바이오필름 형성을 나타낸 FE-SEM 현미경 사진이다(닭 껍질: (F) Blank; (G) 대조군(0% SAHA); (H) 1/8 MIC; (I) 1/4 MIC; (J) 1/2 MIC).
도 6은 다양한 농도의 SAHA 조건 속에서 S. enterica 혈청형 Kentucky의 바이오필름 형성 시 생/사를 나타내는 공초점 레이저 스캐닝 현미경 사진이다. 녹색은 살아있는 세포를 나타내고, 빨간색은 죽은 세포를 나타낸다((A) 대조군(0% SAHA); (B) 1/8 MIC; (C) 1/4 MIC; (D) 1/2 MIC).
도 7은 다양한 농도의 SAHA를 첨가한 S. enterica 혈청형 Kentucky의 현탁액에서 rpoS, avrA, hilA 및 luxS 유전자의 상대적인 발현 수준을 나타낸 도이다. 위 첨자(^a-d)는 세번의 독립적인 반복실험에서의 유의한 차이를 나타낸다(p<0.05).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid, vorinostat)를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오필름(biofilm) 형성 억제용 조성물을 제공한다.

상기 SAHA는 하기의 화학식 1료 표시되는 화합물로, 미국 식품의약국(FDA)에서 승인한 피부 T세포 림프종의 치료 옵션이자, 기생충의 난모세포로 인한 용량 의존적 죽음을 겪는 쥐로부터 항-크립토스포리디얼(anti-cryptosporidial) 특성을 갖는 것으로 밝혀진 항암제이다:

[화학식 1]

.

또한, 현재까지 SAHA는 생체 내 이종이식 모델에서 carfilzomib과 같은 프로테아좀 억제제와 시너지 효과를 보여 T세포 백혈병/림프종의 세포 증식을 감소시키는 효과를 가진다고 알려져 있다.

본 발명의 다른 측면은 SAHA를 유효성분으로 포함하는 바이오필름 형성 억제용 코팅조성물을 제공한다.

상기 코팅조성물은 식품 표면, 식품 접촉 표면, 의료기기, 의료용 재료 또는 의료용 이식물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상에 코팅되는 것을 특징으로 한다.

상기 식품 표면은 바람직하게는 가금류이고, 더욱 바람직하게는 닭 껍질 또는 달걀 껍질 일 수 있다.

상기 식품 접촉 표면은 통상적으로 식품 가공을 위해 사용되는 기구는 유리, 스테인레스강, 고무, 실리콘 또는 다양한 소재의 플라스틱 등을 포함한다.

상기 바이오필름은 살모넬라 (Salmonella) spp.에 의해 형성되는 바이오필름이다. 살모넬라 속(Salmonella spp.) 균은 우유, 달걀, 닭을 포함한 가금류, 육류 등에서 잘 자라며, 저온 및 냉동 상태에서뿐만 아니라 건조에도 강해서 6~9월에 가장 많이 발생한다. 또한, 산발적 설사병의 원인균으로 알려져 있다. 또한, Salmonella 속 균은 가장 중요한 식중독균의 하나이며, 분류방법에 따라 다양하게 세분되고 있다. Salmonella 균은 크게 S. enterica 및 S. bongori 2종(species)으로 분류되고, 5개 group, 6 subspecies로 구분된다. 구체적으로, Group I S. enterica subsp. enterica, Group II S. enterica subsp. salamae, Group IIIa S. enterica subsp. arizona, Group IIIb S. enterica subsp. diarizona, Group IV S. enterica subsp. houtenae, Group V S. enterica subsp. bongori으로 세분된다.

본 발명의 다른 측면은 SAHA를 유효성분으로 포함하는 바이오필름 형성 억제용 조성물 또는 코팅조성물 을 바이오필름이 형성되었거나 바이오필름 형성이 예상되는 표면에 처리하는 단계;를 포함하는 바이오필름 형성 억제방법을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실험예에서, S. enterica 혈청형 Kentucky 칵테일에 대한 SAHA의 MIC를 측정하였으며, MIC(Minimum Inhibitory Concentrations, 최소 억제 농도: 일정한 환경에서 특정 미생물의 성장을 가로막는 항생제의 최소 농도)는 120μg/mL였다. Sub-MIC는 박테리아의 증식에는 활성이 없지만, 박테리아의 병원성 저하에는 활성이 있는 농도로, 본 연구에서는 sub-MIC(60μL/mL) 미만의 병원성 및 QS(quorum sensing) 유전자 발현에 대한 SAHA의 억제효과를 확인하였다.

식품 접촉 표면(플라스틱, 실리콘 고무 및 고무 장갑)에서 S. enterica 혈청형 Kentucky의 바이오필름에 대한 SAHA의 억제 효과를 분석하였다. sub-MIC(60μL/mL) 미만의 병원성 및 QS(quorum sensing) 유전자 발현에 대한 SAHA의 억제효과를 확인하였다(도 1).

또한, 식품 표면(닭 껍질 및 달걀 껍질)에서 S. enterica 혈청형 Kentucky의 바이오필름에 대한 억제 효과를 분석한 결과, 대조군 대비 sub-MIC SAHA 처리군에서의 유의미한 바이오필름 억제 효과가 나타났다(도 2).

또한, SAHA의 농도별 S. enterica 혈청형 Kentucky의 swimming 및 swarming 운동성(motility) 분석한 결과, swimming 운동성 및 swarming 운동성 각각에 대하여 1/2 MIC SAHA 처리군이 대조군 대비 3배 이상의 억제 효과를 보였다(도 3).

또한, S. enterica 혈청형 Kentucky의 바이오필름에 대한 SAHA의 억제 효과를 FE-SEM 이미지 및 CLSM 이미지를 통해 시각화하여 분석하였다. FE-SEM 이미지를 통해 식품 표면(닭 껍질) 및 식품 접촉 표면(고무 장갑)에서 S. enterica 혈청형 Kentucky의 바이오필름 억제 효과를 시각화하여 분석한 결과, 식품 표면에서는 1/4 MIC 및 1/2 MIC에서 유의적인 바이오필름 구조 감소 효과가 나타났고, 식품 접촉 표면에서는 SAHA의 농도가 높아질수록 바이오필름 구조 감소하는 효과가 나타났다(도 4 및 도 5). 살모넬라 균 바이오필름의 생존율을 CLSM 이미지를 통해 확인한 결과, SAHA를 sub-MIC 수준으로 처리하였을 경우 유의미하게 억제할 수 있다는 것을 확인하였다(도 6).

마지막으로, 다양한 농도의 SAHA를 첨가하였을 때 S. enterica 혈청형 Kentucky의 현탁액에서 병원성 인자(avrA, hilA 및 rpoS) 및 QS인자(luxS)의 상대적인 발현 수준을 Real-Time PCR 시스템을 통해 분석하였다. 그 결과, 상기 병원성 인자는 1/2 MIC에서 유의하게 감소하였고, QS인자인 luxS 역시 병원성 인자와 유사하게 sub-MIC에서 유의미하게 감소하였다. 이는, SAHA가 살모넬라 균의 바이오필름 형성을 억제할 수 있다는 것을 시사한다.

이하 본 발명을 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

<실험예 1> 식품 접촉 표면(플라스틱, 실리콘 고무 및 고무 장갑)에서 Salmonella enterica 혈청형 Kentucky의 바이오필름에 대한 SAHA의 효과

원료 식품 가공 및 조리공장에서 사용되는 주요 식품 접촉 표면인 플라스틱(plastic, PLA), 실리콘 고무(silicon rubber, SR) 및 고무 장갑(rubber, RG)에서 SAHA(Suberoylanilide hydroxamic acid, Vorinostat)의 S. enterica 혈청형 Kentucky의 바이오필름에 대한 억제 효과를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 진행하였다.

본 발명에서는 살모넬라(Salmonella) 균 혈청형 Kentucky 균주를 사용하였다. 박테리아 균주(세포밀도: 10⁸- 10⁹ CFU/mL)는 스탁(stock) 바이알(vial)에 30% 글리세롤(glycerol)을 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS; Oxoid, Basigstoke, England)와 함께 -80℃의 냉동고에 보관하였다. 모든 실험은 표준화된 박테리아 농도(0.1% buffer peptone water 안에 10⁵ CFU/mL)를 사용하였다.

식품 접촉 표면에는 고무장갑(Rubber glove, RG; Komax Industrial Co., Ltd., Seoul, Korea), 실리콘 고무(Silicon rubber, SR; Komax Industrial Co., Ltd., Goyang-ro, Korea) 및 플라스틱 쿠폰(2 X 2 X 0.5 cm) (P; Ultra High Modular Weight Polyethylene; JINIL Tec-PLA Co., Seoul, Korea)이 사용되었다. 고무 장갑은 멸균된 가위를 사용하여 2 X 2 cm로 잘랐다. 그런 다음 모든 쿠폰(RG, SR 및 P)을 70% 에탄올에 밤새 담그고, 그 후 에탄올이 완전히 건조될 때까지 UV광(Sankyo UV Co. Ltd., Seoul, Korea)에서 건조시켰다. 모든 샘플을 1,000μW/cm²의 UV 광으로 15분 동안 건조시켰다.

SAHA (CAS no. 149647-78-9) 는 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) 에서 구입했다. 쿼세틴(quercetin) 원액 농도가 1mg/mL 가 되도록 디메틸설폭사이드(DMSO, Sigma-Aldrich)에 용해한 후 사용하였다.

MIC(Minimum Inhibitory Concentrations, 최소 저지 농도: 일정한 환경에서 특정 미생물의 성장을 가로막는 항생제의 최소 농도) 테스트 결과, S. enterica 혈청형 Kentucky 칵테일에 대한 SAHA의 MIC는 120μg/mL이다. Sub-MIC는 박테리아의 증식에는 활성이 없지만, 박테리아의 병원성 저하에는 활성이 있는 농도로 정의될 수 있다. 본 연구에서는 sub-MIC(60μL/mL) 미만의 병원성 및 QS(quorum sensing) 유전자 발현에 대한 SAHA의 억제효과를 확인하였다.

본 연구에서의 SAHA의 바이오필름의 억제 효과는 sub-MIC에서 관찰되었으며 박테리아를 죽일 순 없었지만 발병인자에 영향을 미쳤다. 이 연구에서 사용된 농도는 각각 대조군(0 MIC), 1/8 MIC, 1/4 MIC 및 1/2 MIC이다.

준비된 샘플을 10mL TSB(tryptic soy broth), SAHA 및 100μL의 박테리아 용액(10⁵log CFU/mL)을 포함하여 50mL의 원추형 튜브에 넣었다. 그리고 vortex mixer(Scientific industries, SI-0256, USA)를 사용하여 잘 혼합하고 37℃ 인큐베이터에서 24시간 동안 보관하였다.

바이오필름 형성 후, 쿠폰을 증류수(DW)로 2회 세척하여 표면에 약하게 부착된 박테리아를 제거하였다. 세척된 쿠폰을 10개의 멸균 유리 비즈를 포함한 10mL의 PW에 담그고 2분 동안 vortex 하였다. 이 박테리아 용액을 단계적으로 희석한 후, 접종하고 Xylose lysine deoxycholate (XLD) 플레이트에 퍼트렸다. 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양한 후, 플레이트에서 콜로니의 수를 세었다.

S. enterica 혈청형 Kentucky 칵테일의 바이오필름 억제 효과는 대조군에 비해 1/2 MIC에서 유의한 차이를 보였다(P < 0.05). S. enterica 혈청형 Kentucky 칵테일 바이오필름의 억제 수치는 SAHA의 농도가 각각 1/8, 1/4, 1/2 MIC일 때 PLA에서 0.58, 1.50, 그리고 3.98 log CFU/cm², SR에서 0.53, 1.38, 그리고 3.84 log CFU/cm², RG에서 0.53, 1.59, 그리고 4.11 log CFU/cm²로 나타났다. 그러나 SAHA가 바이오필름을 억제할 경우, 박테리아의 억제효과는 1/2 MIC에서 RG 표면(도 1C)이 4.11 log CFU/cm² 로 PLA 표면(도 1A) 3.98 log CFU/cm² 및 SR 표면(도 1B) 3.84 log CFU/cm² 보다 더 좋았다.

원료 식품의 가공 및 조리에 사용되는 PLA 도마는 살모넬라 균이 PLA 표면에 부착하여 바이오필름을 형성할 수 있기 때문에 교차오염의 영향을 받기 매우 쉽다. 더 나아가 PLA는 소수성 재료이기 때문에 살모넬라 균은 다른 식품접촉재질보다 PLA에 더 쉽게 부착할 수 있다. 따라서 잠재적인 살모넬라증의 전파를 막기 위해서는 식품 가공 또는 조리에 사용되는 PLA 도마의 오염을 방지하는 것이 필수적이다. 원료 식품의 가공 및 조리에 사용되는 PLA, SR 및 RG에 SAHA를 처리하였을 경우, 살모넬라 균 바이오필름의 형성을 절반 이하로 억제하는 것을 확인하였다.

이는 SAHA가 원료 식품 가공 및 조리 산업에 사용되는 식품 접촉 표면으로부터 오염, 전파되는 살모넬라 균을 효과적으로 억제할 수 있음을 나타낸다.)

<실험예 2> 식품 표면(닭 껍질 및 달걀 껍질)에서 Salmonella enterica 혈청형 Kentucky의 바이오필름에 대한 SAHA의 효과

식품 표면인 닭 껍질(chicken shell) 및 달걀 껍질(egg shell)에서 SAHA(Suberoylanilide hydroxamic acid, Vorinostat)의 S. enterica 혈청형 Kentucky의 바이오필름에 대한 억제 효과를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 진행하였다.

본 실험에서 닭 껍질 및 달걀 껍질 샘플은 현지 시장(Anseong, Korea)에서 구입하였다. 닭 껍질 및 달걀 껍질 샘플을 멸균된 가위로 2 ⅹ 2cm 로 잘랐다. 이어서 70% 에탄올에 5분간 담그고 증류수(DW)로 충분히 헹구었다. 마지막으로, 모든 샘플을 1,000μW/cm²의 UV 광으로 15분 동안 건조시켰다.

식품 접촉 표면 대신 식품 표면(닭 껍질 및 달걀 껍질)을 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1과 실험 재료 및 조건을 모두 동일하게 진행하였다.

S. enterica 혈청형의 Kentucky 칵테일의 바이오필름 억제 효과는 대조군에 비해 1/2 MIC에서 유의한 차이를 보였다(P<0.05). 초기 바이오필름의 형성은 닭 껍질이 달걀 껍질에 비해 더 잘 되었지만, 대조군 대비 1/2 MIC SAHA 처리군에서의 바이오필름 억제 효과는 상기 두가지 식품 표면에서 모두 유의미하게 우수했다(도 2A 및 2B).

식품 접촉 표면뿐만 아니라, 닭 껍질 및 달걀 껍질 같은 식품 표면에서도 SAHA가 살모넬라 균 바이오필름의 형성을 유의미하게 억제할 수 있음을 확인했다.

이는 소비량이 많고 살모넬라증의 주요 원인 중 하나인 닭고기 및 달걀에 대하여 SAHA가 식품 가공 및 조리 중에 살모넬라 균에 오염되는 것을 효과적으로 억제할 수 있음을 나타낸다.

<실험예 3> 다양한 농도의 SAHA 처리 시 Salmonella enterica 혈청형 Kentucky의 swimming 및 swarming 운동성(motility) 분석

<실험예 3-1> Swimming 운동성

다양한 농도의 SAHA 처리 시 S. enterica 혈청형 Kentucky의 swimming 운동성(motility)을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다.

실험에 사용된 각각의 배지는 TSB에 각각 0.3% 및 0.5 bacto agar (Dicfo, Detroit, USA)를 첨가하여 만들었다. 그런 다음 배지를 고압멸균처리 후 각 플레이트에 부었다. 배지가 굳기 전에 SAHA를 넣고 조심스럽게 섞었다. Swimming 실험에서는 4 μL의 희석된 박테리아 용액(10⁵ log CFU/mL)을 반고체 배지에 투과시키는 방식으로 접종하였다. 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 24시간 동안 보관하고, 10시간 후에 swimming 플레이트를 관찰하여 수평 및 수직 직경을 측정하였다.

Swimming 실험 결과, 각 1/4 및 1/2 MIC SAHA 처리군은 대조군에 비해 S. enterica 혈청형 Kentucky 칵테일의 swimming 운동성을 유의미하게 억제하였다(p < 0.05). 특히, 1/2 MIC SAHA 처리군은 대조군 대비 3배 이상의 swimming 운동성 억제 효과를 보였다(도 3A).

이는 SAHA가 살모넬라 균의 swimming 운동성을 억제하여 바이오필름 형성을 효과적으로 억제할 수 있음을 나타낸다.

<실험예 3-2> Swarming 운동성

다양한 농도의 SAHA 처리 시 S. enterica 혈청형 Kentucky의 swarming 운동성(motility)을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다.

Swarming은 반고체 표면상의 세포군의 운동성이다. Swarming은 병원성 인자에서 중요한 역할을 하는 박테리아의 바이오필름 형성과 관련이 있다.

실험에 사용된 각각의 배지는 TSB에 각각 0.3% 및 0.5 bacto agar (Dicfo, Detroit, USA)를 첨가하여 만들었다. 그런 다음 배지를 고압멸균처리 후 각 플레이트에 부었다. 배지가 굳기 전에 SAHA를 넣고 조심스럽게 섞었다. Swarming 실험에선 4 μL의 박테리아 용액을 배지의 중앙에 안착시켰다. 플레이트를 37°C 인큐베이터에서 24시간 동안 보관하고, 33시간 후에 swarming 플레이트를 관찰하여 수평 및 수직 직경을 측정하였다.

Swarming 실험 결과, 각 1/4 및 1/2 MIC SAHA 처리군은 대조군에 비해 S. enterica 혈청형 Kentucky 칵테일의 swarming 운동성을 유의미하게 억제하였다(p < 0.05). 특히, 1/2 MIC SAHA 처리군은 대조군 대비 3배 이상의 swarming 운동성 억제 효과를 보였다(도 3B).

이는 SAHA가 살모넬라 균의 swarming 운동성을 억제하여 바이오필름 형성을 효과적으로 억제할 수 있음을 나타낸다.

<실험예 4> 고무 장갑 및 닭 껍질에서 Salmonella enterica 혈청형 Kentucky의 바이오필름 FE-SEM 이미지

<실험예 4-1> 고무 장갑

고무 장갑 표면에 다양한 농도의 SAHA를 처리하였을 때 S. enterica 혈청형 Kentucky의 바이오필름 형태를 전계 방출 주사 전자 현미경(Field Emission Scanning Electron Microscope, FE-SEM) 이미지를 통해 확인하였다.

모든 샘플을 백금(Pt)으로 코팅하였고 FE-SEM(Hitachi/Baltec, Hitachinaka, Japan)으로 관찰하였다. FE-SEM은 7~10mm의 작동 거리에서 5Kv의 가속전압으로 촬영되었다.

각 (A) 아무것도 처리하지 않은 고무 장갑(Blank), (B) 살모넬라 균을 처리한 대조군(control, 0% SAHA), (C) 살모넬라 균 처리 후 1/8 MIC SAHA 처리군, (D) 살모넬라 균 처리 후 1/4 MIC SAHA 처리군 및 (E) 살모넬라 균 처리 후 1/2 MIC SAHA 처리군에 대한 FE-SEM 촬영 결과를 도 4에 나타냈다.

고무 장갑 표면만 관찰되는 (A) blank 대비 (B) 대조군에서 살모넬라 균의 형태가 있음을 관찰하였다. 그리고 상기 살모넬라 균이 (C) 1/8 MIC SAHA 처리군에서는 유의미하게 감소하지 않았지만, (D) 1/4 MIC SAHA 처리군 및 (E) 1/2 MIC SAHA 처리군에서는 유의미하게 감소한 것을 확인하였다.

이를 통해, 살모넬라 균 바이오필름의 형태를 FE-SEM 통해 확인하였고, SAHA를 sub-MIC 수준으로 처리하였을 경우 상기 바이오필름을 유의미하게 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.

<실험예 4-2> 닭 껍질

닭 껍질 표면에 다양한 농도의 SAHA를 처리하였을 때 S. enterica 혈청형 Kentucky의 바이오필름 형태를 전계 방출 주사 전자 현미경(Field Emission Scanning Electron Microscope, FE-SEM) 이미지를 통해 확인하였다.

각 (F) 아무것도 처리하지 않은 닭 껍질(Blank), (G) 살모넬라 균을 처리한 대조군(control, 0% SAHA), (H) 살모넬라 균 처리 후 1/8 MIC SAHA 처리군, (I) 살모넬라 균 처리 후 1/4 MIC SAHA 처리군 및 (J) 살모넬라 균 처리 후 1/2 MIC SAHA 처리군에 대한 FE-SEM 촬영 결과를 도 5에 나타냈다.

닭 껍질 표면의 고르지 않은 지방 부분에 주로 바이오필름이 다량 형성되었다(그림 4B, G). 그러나 SAHA의 농도가 높아짐에 따라 바이오필름 구조가 감소하였고, 결국 바이오필름이 덜 관찰되었다. 특히 바이오필름 억제는 관찰된 두 표면 모두에서 1/8 MIC(그림 4C, H)보다 1/2 MIC(그림 4E, J)에서 훨씬 컸다.

<실험예 5> Salmonella enterica 혈청형 Kentucky의 바이오필름 CLSM 이미지

다양한 농도의 SAHA를 처리하였을 때 S. enterica 혈청형 Kentucky의 바이오필름 형성 시 생균/사균을 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Confocal Laser Scanning Microscope, CLSM) 이미지를 통해 확인하였다.

수침대물렌즈(40, NA 1.2mm)가 장착된 공초점 레이저 스캐닝 현미경(LSM800Airy, Carl Zeiss, Overcochen, Germany)을 사용하여 SYTO　9 녹색 및 요오드화 프로피듐(propidium iodide, PI)으로 염색된 바이오필름의 구조와 생균/사균을 확인하였다.

각 (A) 살모넬라 균을 처리한 대조군(control, 0% SAHA), (B) 살모넬라 균 처리 후 1/8 MIC SAHA 처리군, (C) 살모넬라 균 처리 후 1/4 MIC SAHA 처리군 및 (D) 살모넬라 균 처리 후 1/2 MIC SAHA 처리군에 대한 CLMS 촬영 결과를 도 6에 나타냈다. 녹색은 살아있는 세포(생균)를 나타내고, 빨간색은 죽은 세포(사균)를 나타낸다.

SAHA를 처리하지 않은 (A) 대조군 대비 (B) 1/8 MIC SAHA 처리군, (C) 1/4 MIC SAHA 처리군 및 (D) 1/2 MIC SAHA 처리군에서 생균(녹색)이 감소하고 사균(빨간색)이 증가한 것을 확인하였다. 특히, (C) 1/4 MIC SAHA 처리군 및 (D) 1/2 MIC SAHA 처리군에서는 생균이 유의미하게 감소한 것을 확인하였다(도 6).

이를 통해, 살모넬라 균 바이오필름의 생존율을 CLSM을 통해 확인하였고, SAHA를 sub-MIC 수준으로 처리하였을 경우 상기 바이오필름을 유의미하게 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.

<실험예 6> S. enterica 혈청형 Kentucky의 현탁액에서 rpoS , avrA , hilA 및 luxS 유전자의 발현 수준 분석

다양한 농도의 SAHA를 첨가하였을 때 S. enterica 혈청형 Kentucky의 현탁액에서 rpoS, avrA, hilA 및 luxS 유전자의 상대적인 발현 수준을 Real-Time PCR 시스템을 통해 분석하였다.

상기 살모넬라 균을 배양하고 RNeasy Mini 키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 원심분리를 한 후 얻은 펠렛으로부터 총 RNA를 추출하였다. RNA의 수율과 순도는 260/280 nm 및 260/230 nm 분광광도계 (NanoDrop, Bio-Tek Instruments, USA)로 측정하여 결정하였다.

cDNA는 Maxime RT PreMix(Random Primer) 키트 (iNtRON Biotechnology Co., Ltd., Gyeonggi-do, Korea)를 이용해 합성하였다. 프라이머 서열 및 하우스 키핑 유전자인 16S rRNA의 서열은 표 1에 기재되어 있다.

본 발명에 사용된 병원성 및 쿼럼 센싱 유전자와 관련된 프라이머 서열

Target primers	Sequence (5'-3')	Product size (bp)
16S rRNA	F: CAGAAGAAGCACCGGCTAAC R: GACTCAAGCCTGCCAGTTTC	167
rpoS	F: GAATCTGACGAACACGCTCAR: CCACGCAAGATGACGATATG	171
avrA	F: GAGCTGCTTTGGTCCTCAACR: AATGGAAGGCGTTGAATCTG	173
hilA	F: ATTAAGGCGACAGAGCTGGAR: GCAGAAATGGGCGAAAGTAA	134
LuxS	F: CGGGTTGCAAAAACGATGA R: GTTGAGGTGGTCGCGCATA	150

Real-time PCR 분석은 CFX Real-Time PCR 시스템(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 수행되었다. PCR 반응 프로토콜은 95℃, 50℃, 72℃에서 각각 20초 동안 초기 변성으로 시작하였다. PCR을 통한 반응주기 완료 후 특이성을 검증하기 위해 용해 곡선을 얻었다.

sub-MIC (0-60 μg/mL)조건의 SAHA에서 S. enterica 혈청형 Kentucky 칵테일의 병원성 인자(avrA, hilA 및 rpoS) 및 QS인자(luxS)의 발현은 RT-PCR을 사용하여 측정하였다(도 7).

rpoS는 다양한 환경적 스트레스에 대한 내성과 연관된 유전자의 정지상 발현을 조절한다. 환경적 스트레스에는 낮은 pH, 부족한 영양분, 온도의 변화, 산화 스트레스를 포함한다. ROS가 세포안에 축적되면 산화 스트레스의 영향을 받기 쉽다. 산화 스트레스는 적응성을 향상하고 미생물 집단의 생존을 보호함으로써 바이오필름 형성에 중요한 역할을 한다. rpoS 유전자 발현을 측정한 실험 결과에서는 1/2 MIC에서 유의하게 감소하였다(p<0.05). 이는 살모넬라 균의 산화 스트레스가 SAHA의 자유 라디칼 제거 기능에 의해 감소하고, rpoS 유전자의 발현이 감소한 것을 시사한다.

살모넬라의 SPI-1은 상피세포의 침윤과 대식 세포의 결핍을 유발하는 여러 병원성 인자가 모여있기 때문에 살모넬라속의 병원성에 중요한 역할을 한다. SPI-1 병원성 유전자는 avrA, hilA, hilC, hilD, sipA, sipC, sopB, sopD, sopE2 및 sptP를 포함한다. 그 중 하나인 hilA는 전사 조절 인자를 부호화하고 S. typhimurium 균의 침입에 중요한 역할을 한다. 또 다른 SPI-1 병원성 유전자인 avrA는 염증을 억제하는 역할을 하며, 병원체가 숙주 내에서 충분히 생존할 수 있도록 한다. hilA 및 avrA의 유전자 발현을 분석한 결과, 두 유전자 모두 1/2 MIC에서 유의한 감소를 보였다(p<0.05). 이는 SAHA가 살모넬라 균의 침입 및 생존을 억제할 수 있다는 것을 시사한다.

QS(quorum sensing)는 세포 밀도에 의존하는 매커니즘으로 박테리아 집단을 동기화하여 집단적인 의사 결정을 통해 다세포 생물처럼 기능을 할 수 있게끔 한다. 많은 박테리아 종에서 잠재적인 QS 신호인 AI-2 신호는 바이오필름 형성에 중요한 역할을 한다. luxS는 AI-2 분자를 합성하고 QS를 유도한다. luxS의 유전자 발현을 분석한 결과, sub-MIC에서 유의미하게 감소하였다(p<0.05). 이는 SAHA가 살모넬라 균의 바이오필름 형성을 억제할 수 있다는 것을 시사한다.

Claims

SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid, vorinostat)를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 살모넬라(Salmonella) spp.에 의해 형성되는 바이오필름(biofilm) 형성 억제용 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 살모넬라는 S. enterica 종(species)인 것을 특징으로 하는, 살모넬라(Salmonella) spp.에 의해 형성되는 바이오필름 형성 억제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 SAHA의 MIC(최소억제농도)는 120 μg/mL인 것을 특징으로 하는, 살모넬라(Salmonella) spp.에 의해 형성되는 바이오필름 형성 억제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 바이오필름은 식품 표면, 식품 접촉 표면, 의료기기, 의료용 재료 또는 의료용 이식물을 포함하는 표면에 생성된 것을 특징으로 하는, 살모넬라(Salmonella) spp.에 의해 형성되는 바이오필름 형성 억제용 조성물.
제5항에 있어서,
상기 식품 표면은 닭 껍질 및 달걀 껍질인 것을 특징으로 하는, 살모넬라(Salmonella) spp.에 의해 형성되는 바이오필름 형성 억제용 조성물.
제5항에 있어서,
상기 식품 접촉 표면은 유리, 고무, 실리콘 및 플라스틱인 것을 특징으로 하는, 살모넬라(Salmonella) spp.에 의해 형성되는 바이오필름 형성 억제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 바이오필름 억제용 조성물은 세균의 수영 운동성(swimming motility) 또는 유주 운동성(swarming motility)를 억제하는 것을 특징으로 하는, 살모넬라(Salmonella) spp.에 의해 형성되는 바이오필름 형성 억제용 조성물.
SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid, vorinostat)를 유효성분으로 포함하는, 살모넬라(Salmonella) spp.에 의해 형성되는 바이오필름 형성 억제용 코팅조성물.
삭제
제9항에 있어서,
상기 살모넬라는 S. enterica 종(species)인 것을 특징으로 하는, 살모넬라(Salmonella) spp.에 의해 형성되는 바이오필름 형성 억제용 코팅조성물.
제9항에 있어서,
상기 코팅조성물은 식품 표면, 식품 접촉 표면, 의료기기, 의료용 재료 또는 의료용 이식물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상에 코팅되는 것을 특징으로 하는, 살모넬라(Salmonella) spp.에 의해 형성되는 바이오필름 형성 억제용 코팅조성물.
제12항에 있어서,
상기 식품 표면은 닭 껍질 및 달걀 껍질인 것을 특징으로 하는, 살모넬라(Salmonella) spp.에 의해 형성되는 바이오필름 형성 억제용 코팅조성물.
제12항에 있어서,
상기 식품 접촉 표면은 유리, 고무, 실리콘 및 플라스틱인 것을 특징으로 하는, 살모넬라(Salmonella) spp.에 의해 형성되는 바이오필름 형성 억제용 코팅조성물.
제1항 또는 제9항의 조성물을 바이오필름이 형성되었거나 바이오필름 형성이 예상되는 표면에 처리하는 단계;를 포함하는, 살모넬라(Salmonella) spp.에 의해 형성되는 바이오필름 형성 억제방법.