KR102619716B1 - 저온에서도 우수한 항균활성을 갖는 항진균용 조성물 - Google Patents
저온에서도 우수한 항균활성을 갖는 항진균용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 저온에서도 우수한 항균활성을 갖는 항진균용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 카프릴산(caprylic acid) 및 카바크롤(carvacrol)을 유효성분으로 포함하는 항진균용 조성물 및 바이오필름 형성 억제 또는 제거용 조성물에 관한 것이며, 또한 본 발명은 본 발명의 조성물을 진균에 처리하는 단계를 포함하는 진균의 항균방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤을 유효성분으로 포함하는 저온에서도 우수한 항균활성을 갖는 새로운 항진균용 조성물에 관한 것이다.
진균증은 인체에 기생하는 진균에 의해 발생하는 질병으로, 칸디다(Candida spp.), 방선균(Actinomyces), 아스퍼질러스(Aspergillus), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 무코르(Mucor), 노카르디아(Nocardia) 등 약 40종류의 진균에 의해 발병한다.
진균증 대부분은 주위 환경으로부터 인체에 침입하여 병을 일으키지만, 킨디다와 방선균은 건강한 사람의 입속이나 그 밖의 점막 등에 상재하여 어떤 유인이 생기면 병원성을 발휘하여 진균증을 일으키게 된다. 이러한 진균증은 증상이 경미한 것부터 중대한 것까지 다양하며, 노령자와 면역저하 환자들에게 심각한 문제를 야기할 수 있다. 건강한 성인의 경우 진균증에 대한 강한 면역력을 가지고 있지만, 어린이와 노인, 에이즈 감염자, 이식 수술 환자, 화학 요법제 투여 환자 및 면역억제제의 장기간 사용 환자 등 면역력이 약하거나 약화된 상태는 진균증에 취약하다.
다양한 진균 중에서 칸디다 알비칸스(Candida albicans)는 인체 내의 상피세포에서 주로 번식한다. 칸디다 알비칸스(Candida albicans)는 정상적인 피부, 점막, 분변, 객담, 소변 등에 존재하며 인체에는 해가 없지만, 항생물질이나 부신피질 호르몬을 사용한 경우나, 인체의 면역력이 저하된 경우에는 이상증식을 유도하여 병을 일으킨다. 또한, 구내염 및 질염과 같은 국소 점막염을 일으키거나 전신성 감염으로 진행될 수 있다. 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 의해 발생하는 칸디다증의 종류로는 구강, 혀, 외음부, 질 등이 짓무르고 통증이 발생하는 점막 칸디다증, 피부의 주름 사이나 손가락 사이, 항문 부근이나 유방 등이 붉게 짓무르는 피부 칸디다증, 설사, 복통, 황달 등을 일으키는 소화관 칸디다증, 패혈증과 같은 증세를 나타내며 수막염이나 심내막염을 수반하는 전신성 칸디다증이 있다.
한편, 칸디다 알비칸스(Candida albicans)를 비롯한 인체 유해 미생물들은 바이오필름을 형성하여 저온 또는 추운 환경과 같은 스트레스 환경에 대한 내성을 가지고 있다. 바이오필름(biofilm)이란, 세균 또는 진균의 집합체로서, 그 형태가 얇게 필름처럼 형성되어 바이오필름이라고 불리우며, 세균 또는 진균으로 인해 생성되며, 다시 그것은 세균 또는 진균에게 서식처를 제공할 수 있고, 세균 증식을 가속화하는 원인이 되기도 한다.
그런데 칸디다 알비칸스(Candida albicans)를 포함하는 다양한 유해 미생물에 의해 형성되는 바이오필름은 냉장 온도에서도 식품 금속의 표면 또는 의약품의 제조 공정에서 종종 발견된다. 이러한 진균성 바이오필름은 특정 항진균 방법 외에는 표면에서 이것을 제거하기가 어렵다.
현재, 이러한 진균의 성장을 억제하고 바이오필름을 제거하기 위한 방법으로 항진균제가 사용되고 있으며 항진균제로는 Azole 계, Polyene 계 및 Allyamines 계 등 다양한 종류의 항진균제가 개발되어 사용되고 있다. 그러나 이러한 항진균제는 간독성을 포함한 다양한 종류의 부작용을 나타내는 문제점이 있고, 특히 가장 많이 사용되는 Azole 계 약물의 경우, 내성 발생이 급격히 증가하는 부작용을 나타낸다.또한, 현재까지 개발된 항진균제는 바이오필름 내부까지 항생제가 효과적으로 침투하지 못해, 유해 진균들을 완전히 제거하지 못하는 문제점이 있다.
따라서 항진균 활성 및 바이오필름 억제 활성이 우수하면서 부작용이 적고 독성이 적은 천연물질을 이용한 새로운 항진균제의 개발이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 항진균 활성 및 바이오필름 억제 활성이 우수한 새로운 항진균제를 개발하기 위해 연구하던 중, 프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤을 모두 포함하는 조성물이 저온 및 상온에서 우수한 항진균 활성을 가지며 바이오필름 억제 효과가 우수하다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은, 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 카프릴산(caprylic acid) 및 카바크롤(carvacrol)을 유효성분으로 포함하는, 항진균용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 프로필렌 글리콜(propylene glycol) 카프릴산(caprylic acid) 및 카바크롤(carvacrol)을 유효성분으로 포함하는, 바이오필름 형성 억제 또는 제거용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 항진균용 조성물을 진균에 처리하는 단계를 포함하는, 진균의 항균 방법을 제공하는 것이다.
그러므로 본 발명은, 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 카프릴산(caprylic acid) 및 카바크롤(carvacrol)을 유효성분으로 포함하는 항진균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 상온 및 0~5℃의 저온에서 항진균 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 칸디다 균에 대한 항균 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 칸디다 균은 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candidan tropicalis), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 크루제(Candida krusei) 및 칸디다 파라피실로시스(Candida parapsilosis)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤은 상기 조성물에 0.5~1.5 mM 농도로 각각 함유되어있는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 카프릴산(caprylic acid) 및 카바크롤(carvacrol)을 유효성분으로 포함하는, 바이오필름 형성 억제 또는 제거용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤은 상기 조성물에 0.5~1.5 mM의 농도로 각각 함유되어있는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 바이오필름은 칸디다 균이 형성하는 바이오필름일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 칸디다 균은 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candidan tropicalis), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 크루제(Candida krusei) 및 칸디다 파라피실로시스(Candida parapsilosis)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 항진균용 조성물을 진균에 처리하는 단계를 포함하는, 진균의 항균 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 진균은 칸디다 균일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 칸디다 균은 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candidan tropicalis), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 크루제(Candida krusei) 및 칸디다 파라피실로시스(Candida parapsilosis)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 처리는 상온 또는 0~5℃의 저온에서 수행하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤을 모두 함유한 항균 조성물은 상온에서 뿐만 아니라 5℃의 저온에서도 5분 안에 진균에 대한 높은 살균 활성을 갖는 효과가 있고, 바이오필름의 형성 억제 및 제거 활성을 갖는 효과가 있다. 따라서 본 발명에 따른 프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤을 모두 함유한 항균 조성물은 칸디다 알비칸스(Candida albicans)를 포함하는 유해 진균에 대한 새로운 항진균제로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 침투증강제의 종류에 따른 항진균 활성을 분석한 것으로, 카프릴산(1.2 mM) 및 카바크롤(1.2 mM)을 함유한 조성물에 침투증강제로서 프로필렌 글리콜(PG: propylene glycol) 또는 라우로카프람(LCM: laurocapram)을 농도별로 첨가하고 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 바이오필름에 대한 억제 활성을 나타낸 것이다.
도 2는 프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤을 각각 단독으로 포함하는 조성물, 2가지를 조합하여 포함한 조성물, 3가지 모두를 조합하여 포함한 조성물들에 대하여 저온(5℃)에서 칸디다 알비칸스에 대한 항진균 활성을 분석한 결과이다.
도 3은 프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤을 각각 단독으로 포함하는 조성물, 2가지를 조합하여 포함한 조성물, 3가지 모두를 조합하여 포함한 조성물들에 대하여 상온(22℃)에서 칸디다 알비칸스에 대한 항진균 활성을 분석한 결과이다.
도 4 및 도 5는 본 발명의 프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤을 함유한 항균 조성물에 대한 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 바이오필름 형성 억제 활성을 공초점 현미경으로 분석한 사진을 나타낸 것으로, 도 4는 저온(5℃)에서 수행한 결과를 나타낸 것이고, 도 5는 상온(22℃)에서 수행한 결과를 나타낸 것이며, A는 아무것도 처리하지 않은 군을, B는 프로필렌 글리콜(1.2 mM)을 단독으로 처리한 군, C는 프로필렌 글리콜(1.2 mM) 및 카프릴산(1.2 mM)을 함께 처리한 군, D는 프로필렌 글리콜(1.2 mM) 및 카바크롤(1.2 mM)을 함께 처리한 군, E는 카프릴산(1.2 mM) 및 카바크롤(1.2 mM)을 함께 처리한 군, F는 프로필렌 글리콜(1.2 mM), 카프릴산(1.2 mM) 및 카바크롤(1.2 mM)을 모두 함께 처리한 군을 나타낸 것이다.
도 2는 프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤을 각각 단독으로 포함하는 조성물, 2가지를 조합하여 포함한 조성물, 3가지 모두를 조합하여 포함한 조성물들에 대하여 저온(5℃)에서 칸디다 알비칸스에 대한 항진균 활성을 분석한 결과이다.
도 3은 프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤을 각각 단독으로 포함하는 조성물, 2가지를 조합하여 포함한 조성물, 3가지 모두를 조합하여 포함한 조성물들에 대하여 상온(22℃)에서 칸디다 알비칸스에 대한 항진균 활성을 분석한 결과이다.
도 4 및 도 5는 본 발명의 프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤을 함유한 항균 조성물에 대한 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 바이오필름 형성 억제 활성을 공초점 현미경으로 분석한 사진을 나타낸 것으로, 도 4는 저온(5℃)에서 수행한 결과를 나타낸 것이고, 도 5는 상온(22℃)에서 수행한 결과를 나타낸 것이며, A는 아무것도 처리하지 않은 군을, B는 프로필렌 글리콜(1.2 mM)을 단독으로 처리한 군, C는 프로필렌 글리콜(1.2 mM) 및 카프릴산(1.2 mM)을 함께 처리한 군, D는 프로필렌 글리콜(1.2 mM) 및 카바크롤(1.2 mM)을 함께 처리한 군, E는 카프릴산(1.2 mM) 및 카바크롤(1.2 mM)을 함께 처리한 군, F는 프로필렌 글리콜(1.2 mM), 카프릴산(1.2 mM) 및 카바크롤(1.2 mM)을 모두 함께 처리한 군을 나타낸 것이다.
본 발명은 저온에서도 우수한 항균 활성을 갖는 항진균용 조성물을 제공하는 것으로, 구체적으로 본 발명은 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 카프릴산(caprylic acid) 및 카바크롤(carvacrol)을 유효성분으로 포함하는 항진균용 조성물을 제공함에 특징이 있다.
상기 프로필렌 글리콜은 피부 침투증강제로 사용되는 액체 물질로, 상온에서 투명하고, 무색, 무취, 무미인 액체로 가열되거나 활발하게 흔들려야 하지만 공기 중에 증기 형태로 존재할 수 있다. 또한, 프로필렌 글리콜은 ‘일반적으로 안전하다고 인정된 물질(Generally Recognized as Safe; GRAS)’로 분류되고 있으며 식품, 제약, 화학 산업 등에서 사용되고 있다. 실제로 인간이 프로필렌 글리콜의 증기가 함유된 공기를 호흡하거나 프로필렌 글리콜이 함유된 제품을 먹거나 피부를 통해 직접 접촉하게 되면 약 48시간 만에 체내에서 분해되는 것으로 알려져 있어 비교적 안전한 물질이다.
또한 중쇄 지방산 중에서 카프릴산은 탄소 10개로 구성된 중쇄지방산(CH3(CH2)8COOH)으로 코코넛 오일, 종자유 및 포유동물의 모유 등에서 발견된다. 향미가 좋아 향수 등 화장품 및 식품 첨가제(향미제)로 활용되고 있으며, 약물 전달 효율을 높이기 위한 지질 입자로서 의약품에 첨가되고 있다.
또한 카바크롤은 항산화 효과가 있음이 알려져 있는 에센셜 오일 중 하나이며, 영양가나 치료 잠재력을 가지고 있음이 시사된 바 있다. 또한, 많은 에센셜 오일이 ‘일반적으로 안전하다고 인정된 물질(GRAS)’에 나열되어 있기에 합성 화합물보다 안전한 물질이므로 소비자에게 더 선호되고 있다.
본 발명자들은 항진균 활성 및 바이오필름 억제 활성이 우수하면서 부작용이 적고 독성이 적은 천연물질을 이용한 새로운 항진균제를 개발하기 위해 연구하던 중, 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 카프릴산(caprylic acid) 및 카바크롤(carvacrol)을 유효성분으로 모두 포함하는 조성물이 상기 성분들을 단독 또는 2종으로 조합한 경우에 비해 월등히 우수한 항균 활성을 갖는다는 것을 확인하였다.
뿐만 아니라 본 발명에서는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 카프릴산(caprylic acid) 및 카바크롤(carvacrol)을 유효성분으로 모두 포함하는 조성물이 상온 뿐만 아니라 0~5℃의 저온에서도 우수한 항균 활성을 갖는다는 것을 확인하였다.
유해 진균 및 세균의 경우, 냉장 온도와 같은 저온에서도 활성을 유지하며 지속적으로 생존하고 있으며 병원성 진균 바이오필름을 추운 환경과 같은 스트레스 조건에 대한 내성을 가지고 있다. 특히 칸디다 균을 포함한 곰팡이성 바이오필름은 저온에 노출된 식품 또는 의약품의 제조 과정에서 형성 및 성장할 수 있어 저온에서도 우수한 항균 활성을 갖는 항진균제의 개발이 필요하다.
한편, 본원의 일실시예에서는 프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤을 유효성분으로 모두 포함하는 조성물이 저온에서 항진균 활성이 있는지를 확인하기 위해, 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 바이오필름에 본 발명의 조성물을 상온 및 저온(5℃)에서 5분 동안 처리한 후, 항진균 활성을 분석하였는데, 상기 3가지 성분을 모두 포함하는 조성물이 가장 우수한 항진균 활성을 보였고, 매우 단시간 안에 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 항진균 활성을 보였다.
또한 본 발명의 일실시예에서는 침투증강제로서 프로필렌 글리콜 및 라우로카프람의 서로 다른 침투증강제를 카프릴산 및 카바크롤과 함께 칸디다 알비칸스에 처리하고 항진균 활성을 분석하였는데, 그 결과 FDA 인증 침투증강제인 프로필렌 글리콜을 처리한 군이 라우로카프람을 처리한 군에 비해 칸디다 알비칸스 바이오필름을 5분 이내에 완전히 사멸시키는 것으로 나타났다.
따라서 본 발명자들은 항진균 활성의 효과를 최대화하기 위한 성분으로 프로필렌 글리콜을 선택하여 사용하는 것이 중요하다는 것을 알 수 있었다.
또한 본 발명의 다른 일실시예에서는 프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤을 유효성분으로 모두 포함하는 본원발명의 항진균용 조성물이 바이오필름을 억제하는 활성이 있는지를 공초점 현미경 분석을 통해 확인하였다. 즉, 스테인리스 스틸 표면상에 형성된 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 바이오필름에 본 발명의 조성물을 처리한 경우, 형성된 바이오필름에 현저한 막 손상과 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 세포분리가 관찰되었다. 또한 이러한 항바이오필름 효과는 상온 및 저온 조건에서 5분 안에 이루어지는 것을 확인할 수 있었다.
그러므로 본 발명은 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 카프릴산(caprylic acid) 및 카바크롤(carvacrol)을 유효성분으로 포함하는, 항진균용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 조성물은 상온 및 0~5℃의 저온에서 매우 단시간 안에 항진균 활성을 갖는 특징이 있다. 본 발명의 일실시예에서는 5℃의 저온에서 5분 만에 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 항진균 활성을 나타내었고, 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 바이오필름 형성을 억제하는 것을 확인하였다.
또한 본 발명의 조성물은 유해 진균에 대한 항진균 활성을 가질 수 있으며, 상기 진균은 바람직하게는 칸디다 균일 수 있다.
상기 칸디다 균은 이에 제한되지는 않으나, 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candidan tropicalis), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 크루제(Candida krusei) 및 칸디다 파라피실로시스(Candida parapsilosis)을 포함할 수 있다.
또한 본 발명에 함유된 상기 프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤은 상기 조성물에 0.5~1.5 mM 농도로 포함될 수 있다.
만일 프로필렌 글리콜, 카프릴산 또는 카바크롤 각각의 성분이 0.5mM 미만의 농도로 포함되면 항진균 활성이 미비한 문제점이 있으며, 반면 1.5mM을 초과하게 되면 처리 농도 의존적으로 항진균 활성이 지속적으로 증가하지 않아 비경제적인 문제점이 발생한다.
바람직하게 상기 프로필렌 글리콜, 카프릴산 또는 카바크롤은 상기 조성물에 1.2 mM의 농도로 포함될 수 있다.
또한 본 발명은 프로필렌 글리콜(propylene glycol) 카프릴산(caprylic acid) 및 카바크롤(carvacrol)을 유효성분으로 포함하는, 바이오필름 형성 억제 또는 제거용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서, "바이오필름(biofilm)"은 고형(solid)의 생물학적 표면(biological surface)인 세균집락과 비생물학적 표면(non-biological surface)인 외막으로 구성된 복합체이다. 또한, 항생제를 포함한 여러 환경 스트레스(environmental stresss)에 대해서 저항성을 나타내고, 만성 감염에 대한 세균 또는 진균의 내성에 기여한다. 바이오필름을 형성하는 세포는 부유세포보다 항생제에 대한 저항성이 1000배 이상 높으며, 바이오필름 형성은 여러 질병의 발병(pathogenesis)에 중요한 역할을 한다.
바이오필름 형성에 따른 항생제에 대한 저항성의 증가 원인은 아직 정확하게 밝혀져 있지는 않으나, 바이오필름이 형성됨으로써 주위 환경과 교환 작용에 대한 의존성이 낮아지고, 점액성 다당류로 구성된 외막이 항생물질이 개개의 세균 또는 진균까지 전달되는 것을 방해하기 때문이며, 바이오필름이 형성되면 그 바이오필름 속에 존재하는 내성이 없던 세균 또는 진균들도 주위의 내성을 가진 미생물로부터 수평 유전자 전이(horizontal gene transfer)를 통하여 내성인자 관련 유전자를 획득할 수 있다. 따라서 바이오필름이 형성되게 되면 이는 항생제 내성 상태가 되었다고 볼 수 있고, 감염증 치료에 널리 사용되던 항생제의 작용이 어렵게 되어 결과적으로 항생제에 의한 치료 효과가 약화되는 문제점이 생기게 된다.
본 발명에서, “바이오필름 형성 억제”는 상기와 같이 진균, 세균 또는 미생물에 의해 생성된 구조체의 형성을 감소시키거나, 형성을 불가능하게 하는 것을 말한다. 이러한 바이오필름의 형성 억제 효과는 진균, 세균 또는 미생물의 생육, 증식을 억제하거나 사멸시키는 효과뿐만 아니라 고체 표면에 들러붙는 혼합체의 형성을 저해하는 효과를 포함한다.
본 발명에서, “바이오필름 제거”는 이미 형성된 바이오필름을 제거하는 것을 의미하는 것으로, 바이오필름에 존재하고 있는 진균, 세균 또는 미생물의 생육, 증식을 억제하거나 사멸시켜 이들을 바이오필름에서 분리 또는 떨어져 나오게 함으로써 궁극적으로 바이오필름이 제거되는 것을 말한다. 바람직하게 상기 바이오필름은 칸디다 균이 형성하는 바이오필름일 수 있다.
나아가 본 발명은 본 발명의 항진균 조성물을 진균에 처리하는 단계를 포함하는, 진균의 항균 방법을 제공한다.
상기 처리는 상온 또는 0~5℃의 저온에서 본 발명의 항진균 조성물을 세균, 진균 또는 유해 미생물에 처리하여, 상기 세균, 진균 또는 유해 미생물을 단시간에 살균 또는 사멸시킬 수 있다.
이상 본 발명에 따른 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 카프릴산(caprylic acid) 및 카바크롤(carvacrol)을 유효성분으로 모두 포함하는 조성물은 소량의 처리만으로도 칸디다 균 등의 진균 및 상기 진균의 바이오필름을 저온과 상온에서 단시간 내에 모두 효과적으로 억제할 수 있으며, 상기 유효성분들은 모두 인체 안전성을 가지고 있는 바, 종래 항진균제를 대체할 수 있는 우수한 항진균 활성과 안전성을 모두 갖는 새로운 항진균제로 사용될 수 있다.
이하 본 발명은 하기의 실시예를 통해 보다 상세히 설명한다.
<준비예 및 실험방법>
① 진균의 준비
본 발명의 조성물이 항진균 활성이 있는지를 확인하기 위한 실험에 사용될 인체 유해 진균으로 칸디다증의 주요 원인균인 칸디다 알비칸스(ATCC 10231, 18804, 11006)를 준비하였다. 상기 균주들은 ATCC(American Type Culture Collection)와 고려대학교 Food Microbiology Culture Collection(서울, 한국)으로부터 입수하여 사용하였다. 각 균주는 20% 글리세롤을 함유한 SDB(sabouraud dextrose broth; Difco, Becton Dickinson, Sparks, MD, USA) 저장 배양액의 상태로 -80℃에서 보관하였고 매월 계대 배양하였다. 또한 각 균주는 실험에 사용하기 전에 24시간 동안 30℃에서 3ml SDB 증균배지를 이용하여 별도 배양하였다. 그런 뒤, 10 ml SDB 증균배지에 100 ul 씩 3종류의 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 균주를 분주하고 30℃에서 24시간 배양하였으며 배양한 균을 3,000×g에서 15분간 원심분리하였다(CentraCL2, Needham Heights, MA, USA). 이후 상등액을 제거하고 0.85% 멸균 생리식염수를 이용하여 침전된 균주 펠렛을 3회 세척하였고, 다시 동량의 0.85% 멸균 생리식염수를 첨가한 후, 균질화시키고 50 ml 플라스틱 튜브(Becton Diskinson, Franklin Lakes, NJ, USA)로 옮겨 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 혼합균액을 준비하였다.
② 바이오필름 형성
칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 바이오필름을 스테인리스강(stainless steel) 쿠폰에 형성시켰는데, 구체적으로 스테인리스강 쿠폰(1.5 x 1.0 cm2)의 오염제거를 위해 90%(v/v) 에탄올에 30분 동안 담그고 멸균 증류수로 세척하였다. 이후 스테인리스강 쿠폰을 4.95 ml SDB 증균배지가 함유된 12웰 조직 배양 플레이트에 넣은 후, 알비칸스의 혼합균액을 50 ul씩 분주하여 30℃에서 48시간 동안 배양하여 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 바이오필름을 형성시켰다. 각 쿠폰에 바이오필름을 형성시킨 뒤, 0.85% 멸균 생리식염수를 이용하여 바이오필름이 아닌 약하게 부착된 세포를 분리하였다.
③ 시약준비
침투증강제인 프로필렌 글리콜(PG: propylene glycol) 및 라우로카프람(LCM: laurocapram)은 시그마 케미칼사(Sigma Chemical Co. ; St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였고, 카프릴산(CA: caprylic acid) 및 카바크롤(CAR: carvacrol)도 시그마 케미칼사로부터 구입하여 사용하였다.
④ 서로 다른 침투증강제와 카프릴산 및 카바크롤의 혼합액에 대한 항진균 활성분석
침투증강제 저장 용액(PG 및 LCM; 20, 40, 60, 80, 100 및 120 mM), 카프릴산 저장 용액(120 mM) 및 카바크롤 저장 용액(120 mM)을 98% 에탄올을 이용하여 준비하였다. 일반적으로 카프릴산 및 카바크롤 저장 용액을 멸균 유리관(최종 CA 농도: 1.2 mM, 최종 CAR 농도: 1.2 mM)에 첨가하고 9.7 ml의 멸균 0.85% 식염수를 첨가하였다. 침투증강제 종류에 따른 항진균 활성의 효능의 비교를 위해, 침투증강제 저장 용액을 0.1 ml씩 첨가하여 각각 멸균 튜브에 첨가하였다(최종 PG 및 LCM 농도: 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 또는 1.2 mM). 각기 다른 침투증강제를 포함하는 항균용액은 100 rpm 진탕 수조(VS-1205SW1, Vision science Co. Ltd., 대전, 한국)에서 20분 동안 5℃로 평형화시켰고, 이후 칸디다 알비칸스(Candida albicans)가 포매된 바이오필름 쿠폰을 첨가하였다. 이때 상기 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 초기 균수는 6 log CFU/cm2의 수가 되도록 하였고, 모든 실험은 3번 반복 수행하였다.
⑤ 프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤의 혼합액에 대한 항진균 활성분석
프로필렌 글리콜 저장 용액(PG; 60 및 120 mM), 카프릴산 저장 용액(CA; 60 및 120 mM) 및 카바크롤 저장 용액(CAR; 60 및 120 mM)을 98% 에탄올을 이용하여 준비하였다. 이들 각각의 저장 용액을 0.1 ml씩 첨가하여 멸균 유리관에 첨가하고 0.85%의 생리식염수를 9.9 ml 첨가하여 상기 프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤 각각의 최종농도가 0.6 또는 1.2 mM이 되도록 하였다.
그런 뒤, 0.6 또는 1.2 mM의 프로필렌 글리콜, 카프릴산 또는 카바크롤을 단독으로, 또는 2종으로, 또는 3종 모두를 포함하는 각기 다른 조합의 항균용 혼합액을 제조하였다. 이때 0.85% 생리식염수를 이용하여 총 부피가 10 ml이 되도록 하였다. 이후 상기 항균용 혼합액을 5℃ 또는 22℃의 온도에서 30분 동안 100 rpm의 속도로 교반하면서 평형화시켰다. 그런 뒤, 여기에 칸디다 알비칸스(Candida albicans)가 포매된 바이오필름 쿠폰을 첨가하여 상기 항균용 혼합액에 대한 항진균 활성을 분석하였고, 모든 실험은 6번 반복 수행하였다.
⑥ 미생물의 분석
항균제를 중화하기 위해 바이오필름 쿠폰을 10 ml의 Dey/Engley 중화 완충액(Difco)에 첨가하였다. 바이오필름은 수정된 유리 비드 방법(Trachoo 및 Frank 2002)을 사용하여 스테인리스 강 쿠폰 표면으로부터 분리하였다. 스테인리스 강 쿠폰은 중화 후 1 g의 멸균 유리 비드(425~600 μm, G8772; Sigma Aldrich Co., Llc.)를 포함하는 0.85% 식염수에 첨가하고 볼텍스 믹서(KMC-1300 V)를 사용하여 1분 동안 교반하였다. 이후 부유 세포를 수집하고 0.85% 식염수에서 10배 연속 희석하였다. 이후 희석액 100 ㎕을 SDA(sabouraud dextrose agar)에 도말하고, 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양물의 완전한 비활성화가 확인되면 30 ml의 SDB 증균배지에 옮기고 30℃에서 48시간 동안 배양하여 손상된 세포를 회복시켰다.
⑦ 공초점 레이저 스캐닝 현미경 분석
본 발명의 항균용 혼합액에 대한 항균활성을 공초점 레이저 스캐닝 현미경 분석을 통해 확인하였는데, 각 항균용 혼합액으로 처리된 칸디다균의 바이오필름에 대해 녹색형광 SYTO®9(S-34854, Molecular Probes™, Thermo Fisher Scientific Inc., Pittsburgh, PA, USA, 최종농도: 6.7 μM, excitation: 488 nm, emission: 498/501 nm)으로 온전한 세포(intact cell)를 염색하여 검출하였고, 적색 형광 요오드화 프로피듐(PI; P3566, Molecular Probes™, 최종농도: 15 μM, excitation: 555 nm, emission: 617 nm)로 손상된 세포를 염색하여 검출하였다. 30℃의 암실에서 30분간 염색 후, ZEN 소프트웨어(Carl Zeiss Microscopy GmbH)로 제어되는 반전 CLSM(LSM 700; Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany)으로 Z-stack 이미지를 얻어서 확인하였다.
<실시예 1>
침투증강제 종류별 항균 조성물의 항진균 활성 분석
프로필렌 글리콜(PG: propylene glycol) 및 라우로카프람(LCM: laurocapram)의 서로 다른 침투증강제에 다른 항진균 활성의 차이를 확인하기 위해, 1.2 mM의 카프릴산 및 1.2 mM 카바크롤을 각 농도별(0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 mM) 다른 종류의 침투증강제와 혼합한 항균 조성물을 제조하고, 이를 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 바이오필름에 처리한 후, 바이오필름의 억제 활성을 분석하였다. 이때 상기 항균 조성물의 바이오필름 억제 활성분석은 저온인 5℃ 및 상온인 22℃에서 5분 동안 수행하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 침투증강제로서 프로필렌 글리콜을 사용한 군이 라우로카프람을 사용한 군에 비해 더 우수한 바이오필름 억제 효과가 있는 것으로 나타났다. 특히, 1.2 mM의 카프릴산, 1.2 mM 카바크롤 및 1.2 mM 프로필렌 글리콜을 혼합한 항균 조성물은 다른 조합의 조성물에 비해 가장 우수한 항바이오필름 활성을 갖는 것으로 나타났고, 저온인 5℃ 및 상온인 22℃ 모두에서 5분 이내에 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 바이오필름이 완전히 사멸되는 것으로 나타났다(6.6 log 이상 저감).
<실시예 2>
프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤을 함유한 항균 조성물의 제조
상기 실시예 1의 결과를 통해 침투증강제로서 프로필렌 글리콜의 사용이 가장 우수한 항진균 활성을 나타낸다는 것을 확인함에 따라, 본 발명자들은 프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤에 대해 하기 표 1과 같이 각기 다른 조합의 항균 조성물을 제조하였다.
| 실험군 | 프로필렌 글리콜(mM) | 카프릴산(mM) | 카바크롤(mM) | 처리시간(분) |
| 비교예 1 | 0.6 | - | - | 5 |
| 비교예 2 | 1.2 | - | - | 5 |
| 비교예 3 | 0.6 | - | 5 | |
| 비교예 4 | - | 1.2 | - | 5 |
| 비교예 5 | - | - | 0.6 | 5 |
| 비교예 6 | - | - | 1.2 | 5 |
| 제조예 1 | 0.6 | 0.6 | - | 5 |
| 제조예 2 | 0.6 | 1.2 | - | 5 |
| 제조예 3 | 1.2 | 0.6 | - | 5 |
| 제조예 4 | 1.2 | 1.2 | - | 5 |
| 제조예 5 | - | 0.6 | 0.6 | 5 |
| 제조예 6 | - | 0.6 | 1.2 | 5 |
| 제조예 7 | - | 1.2 | 0.6 | 5 |
| 제조예 8 | - | 1.2 | 1.2 | 5 |
| 제조예 9 | 0.6 | - | 0.6 | 5 |
| 제조예 10 | 0.6 | - | 1.2 | 5 |
| 제조예 11 | 1.2 | - | 0.6 | 5 |
| 제조예 12 | 1.2 | - | 1.2 | 5 |
| 제조예 13 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 5 |
| 제조예 14 | 0.6 | 1.2 | 0.6 | 5 |
| 제조예 15 | 0.6 | 0.6 | 1.2 | 5 |
| 제조예 16 | 0.6 | 1.2 | 1.2 | 5 |
| 제조예 17 | 1.2 | 0.6 | 0.6 | 5 |
| 제조예 18 | 1.2 | 1.2 | 0.6 | 5 |
| 제조예 19 | 1.2 | 0.6 | 1.2 | 5 |
| 제조예 20 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 5 |
<실시예 3>
저온에서 항균 조성물의 제조 항진균 활성 분석
상기 실시예 2의 각 실험군에 대한 항균 조성물에 대한 항진균 활성을 분석하기 위해, 상기 항균 조성물을 5℃의 온도가 유지되도록 하면서 스테인리스강 쿠폰에 부착된 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 바이오필름에 상기 항균 조성물을 5분 동안 처리한 후, 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 바이오필름에 대한 억제 활성을 분석하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤을 각각 단독 함유한 조성물(비교예 1~6)은 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 바이오필름에 대한 억제 효과가 최대 0.50 log CFU/cm2보다 낮은 것으로 나타났다. 또한, 상기 3가지 성분들 중에서 2가지 성분을 포함하는 조성물들은 비교예들에 비해 항진균 활성이 높은 것으로 나타났으나 비교적 낮은 수준의 억제 효과(1.0 log CFU/cm2 미만)을 보였다(제조예 5~8 및 제조예 9~12). 한편, 프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤을 모두 함유한 조성물들은 단독 함유 조성물 및 2종 조합의 조성물에 비해서 더 높은 항진균 활성이 있는 것으로 나타났고, 특히 1.2 mM의 프로필렌 글리콜, 1.2 mM의 카프릴산과 1.2 mM의 카바크롤을 함유한 조성물(제조예 20)이 가장 우수한 항바이오필름 활성이 있는 것으로 나타났는데, 6 log 이상의 저감효과(99.9999% 살균; 약 6.19 log 살균)를 보였고, 접종한 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 바이오필름이 거의 회생불가능한 수준까지 제어하는 것으로 나타났다.
<실시예 4>
상온에서 항균 조성물의 제조 항진균 활성 분석
본 발명자들은 상기 실시예 3의 항진균 활성분석을 5℃가 아닌 상온(22℃)에서 수행하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.
분석결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤을 각각 단독으로 함유한 항균 조성물(비교예 1~6) 및 2가지 성분을 조합한 항균 조성물(제조예 1~12)에 비해 3가지 성분을 모두 함유한 항균 조성물이 더 우수한 항진균 활성이 있는 것으로 나타났다. 또한 제조예 17 및 19에서 4.5 log 이상의 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 저감효과(4.74~5.07 log 살균)를 보였고, 1.2 mM의 프로필렌 글리콜과 1.2 mM의 카프릴산, 1.2 mM의 카바크롤을 함유한 제조예 20의 항균 조성물은 6.5 log 이상의 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 저감효과(99.9999% 살균; 약 6.60 log 살균)를 보였으며, 접종한 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 바이오필름이 회생불가능한 수준까지 제어되는 것으로 나타났다.
<실시예 5>
공초점 현미경 분석을 통한 본 발명의 항균 조성물에 대한 바이오필름 억제 활성 분석
나아가 본 발명자들은 본 발명의 항균 조성물이 실질적으로 바이오필름 억제 활성이 있는지를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 스테인리스 강에 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 바이오필름을 형성하도록 한 후, 본 발명의 항균 조성물을 상온(22℃) 및 저온의 5℃을 유지하도록 하면서 5분 동안 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 바이오필름에 처리한 후, 바이오필름의 억제 활성 여부를 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 이용하여 분석하였다. 바이오필름에 존재하는 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 세포는 세포의 생존 및 손상 정도를 확인할 수 있도록 SYTO®9(녹색) 및 PI(빨간색)로 염색하여 확인하였다. 이때 녹색 염색은 생존 세포를 나타내는 반면 노란색, 주황색 또는 빨간색 염색은 손상된 세포를 나타낸 것이다.
그 결과, 도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 군(A), 프로필렌 글리콜(1.2 mM)을 단독 처리한 군(B), 프로필렌 글리콜과 카프릴산을 함께 처리한 군(C) 및 프로필렌 글리콜과 카바크롤을 함께 처리한 군(D)은 5℃ 및 22℃에서 바이오필름에서 진균 세포막에 유의한 손상이 나타나지 않는 것으로 나타난 반면, 카프릴산과 카바크롤을 함께 처리한 군(E)에서는 노란색 및 주황색의 형광 신호가 검출되어 바이오필름에서 진균 세포막이 손상된 것으로 나타났다. 특히 프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤을 모두 함께 처리한 군(F)은 다른 모든 실험군에 비해 대부분의 세포가 강력한 적색 형광 신호를 방출하는 반면 녹색 형광을 방출하지 않거나 거의 방출하지 않는 것으로 나타나, 바이오필름을 형성하는 진균을 효과적으로 사멸시키는 것을 알 수 있었다.
이러한 본 발명의 조성물에 대한 항바이오필름 효과는 상온에서 뿐만 아니라 5℃의 저온에서도 거의 동일한 수준으로 나타남을 알 수 있었다.
이상의 결과를 통해, 프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤을 모두 함유한 본 발명의 항균 조성물은 상온에서 뿐만 아니라 5℃의 저온에서도 5분 안에 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 바이오필름에 대한 높은 항균 활성을 보이며, 우수한 바이오필름 형성 억제 및 제거 활성을 갖는다는 것을 알 수 있었다.
따라서 본 발명에 따른 프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤을 모두 함유한 조성물은 칸디다 알비칸스(Candida albicans)를 포함하는 유해 진균에 대한 항진균제로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
Claims (13)
- 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 카프릴산(caprylic acid) 및 카바크롤(carvacrol)을 유효성분으로 포함하는, 항진균용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 상온 및 0~5℃의 저온에서 항진균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항진균용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 칸디다 균에 대한 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항진균용 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 칸디다 균은 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candidan tropicalis), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 크루제(Candida krusei) 및 칸디다 파라피실로시스(Candida parapsilosis)로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 항진균용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤은 상기 조성물에 0.5~1.5 mM 농도로 각각 함유되어있는 것을 특징으로 하는, 항진균용 조성물. - 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 카프릴산(caprylic acid) 및 카바크롤(carvacrol)을 유효성분으로 포함하는, 바이오필름 형성 억제 또는 제거용 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 프로필렌 글리콜, 카프릴산 및 카바크롤은 상기 조성물에 0.5~1.5 mM의 농도로 각각 함유되어있는 것을 특징으로 하는, 바이오필름 형성 억제 또는 제거용 조성물. - 제6항에 있어서,
상기 바이오필름은 칸디다 균이 형성하는 바이오필름인 것을 특징으로 하는, 바이오필름 형성 억제 또는 제거용 조성물. - 제8항에 있어서,
상기 칸디다 균은 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candidan tropicalis), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 크루제(Candida krusei) 및 칸디다 파라피실로시스(Candida parapsilosis)로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 바이오필름 형성 억제 또는 제거용 조성물. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 진균에 처리하는 단계를 포함하는, 진균의 항균 방법.
- 제10항에 있어서,
상기 진균은 칸디다 균인 것을 특징으로 하는, 진균의 항균 방법. - 제11항에 있어서,
상기 칸디다 균은 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candidan tropicalis), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 크루제(Candida krusei) 및 칸디다 파라피실로시스(Candida parapsilosis)로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 진균의 항균 방법. - 제10항에 있어서,
상기 처리는 상온 또는 0~5℃의 저온에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 진균의 항균 방법.
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