CN104884071B - 流感病毒和i型糖尿病 - Google Patents

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Abstract

I型糖尿病的特征为胰岛素产生β细胞的缺失，导致胰岛素缺乏。该β细胞缺失的常规病因是自身免疫破坏。本发明提供了流感病毒感染和I型糖尿病和/或胰腺炎发生之间因果关系的第一证据。该流感病毒感染和I型糖尿病和/或胰腺炎之间的因果关系提供了多种治疗、预防和诊断机会。

Description

流感病毒和I型糖尿病
技术领域
本发明涉及I型糖尿病中病毒的参与，且本发明的目的是提供可用于诊断、预防、治疗和预测患者(尤其是儿童)中I型糖尿病的其他改善的材料和方法。
背景技术
I型糖尿病(先前称作IDDM)的特征为胰岛素产生β细胞的缺失，导致胰岛素缺乏。该β细胞缺失的常规病因是自身免疫破坏。
已提出自身免疫破坏可能与病毒感染相关。对于作为自身免疫β细胞破坏诱因的病毒，已提出多种机制。例如，可能发生β细胞的溶细胞性感染，导致其破坏和/或释放正常情况下被掩蔽的抗原，随后诱发病原性自体反应性T细胞应答。或者，病毒所显示的表位可能引发自身反应性抗体和/或T细胞，从而提供自身免疫的基础。
全球范围内I型糖尿病发病率的快速增长表明其病因中环境因素的重要作用。根据I型糖尿病患者和/或前驱糖尿病个体的代表性和远景研究，病毒感染可以是其中之一。已证明多种病毒与I型糖尿病相关[1]。例如，参考文献2在2001年指出，已报道的13种不同病毒与糖尿病在人和多种动物模型中的发展相关，包括流行性腮腺炎病毒、风疹病毒、巨细胞病毒和柯萨奇病毒B。
发明内容
发明人首次鉴定到了甲型流感病毒感染与I型糖尿病之间的因果关系。发明人还鉴定到了甲型流感病毒感染与胰腺炎之间的因果关系。基于这些因果关系，发明人总结，在至少一些病例中，I型糖尿病和/或胰腺炎的发生是由于先前的甲型流感病毒感染，例如儿童时的感染。
非全身性甲型流感病毒是哺乳动物和鸟类中甲型流感病毒感染的最常见原因。非全身性流感病毒通常不会发现于内部器官中。虽然先前的研究已报道了哺乳动物中某些甲型流感病毒(IAV)感染与胰腺损伤之间的关系[3]，但未确定是否存在因果关系[3,4]。实际上，参考文献5使用甲型流感病毒接种哺乳动物并且没有在胰腺中鉴定到任何甲型流感病毒抗原，所以目前的观点是甲型流感病毒感染可能不是胰腺损伤的直接原因。
非全身性甲型流感病毒只能够在胰蛋白酶或胰蛋白酶样酶存在的情况下进行复制，所以其复制被认为限于呼吸道和肠道。实际上，没有现有技术在事实上证明IAV甚至能够在胰腺细胞中生长，且没有数据涉及胰腺中IAV复制的直接结果。发明人证明，出乎意料地，非全身性甲型禽流感病毒引发严重的胰腺炎，导致与在鸟类中发生的糖尿病相当的反代谢状态(dismetabolic condition)。发明人还发现，人甲型流感病毒能够在人胰腺原代细胞和细胞系中生长，表示甲型流感病毒感染与I型糖尿病和/或胰腺炎之间存在因果关系。
甲型流感病毒感染与I型糖尿病之间直接因果关系的鉴定提供了用于预防、治疗、诊断和预测I型糖尿病的多种机会。类似地，甲型流感病毒感染与胰腺炎之间直接因果关系的鉴定提供了用于预防、治疗、诊断和预测胰腺炎的多种机会。在给予本发明的组合物时，患者优选是儿童。因此，向患者(例如儿童)给予本发明的组合物有助于预防I型糖尿病和/或胰腺炎此后在患者生命中(例如成人时)的发生。类似的，在获自患者(例如儿童)的样品上进行本发明的诊断方法以测定例如患者是否倾向于在之后生命中(例如成人时)发生I型糖尿病和/或胰腺炎。因此，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含甲型流感病毒免疫原，用于预防或治疗患者(优选是儿童)中的I型糖尿病和/或胰腺炎。本发明还提供了一种免疫原性组合物，其包含有效地针对甲型流感病毒的抗病毒化合物，用于预防或治疗患者(优选是儿童)中的I型糖尿病和/或胰腺炎。本发明还提供了一种免疫原性组合物，其包含甲型流感病毒免疫原和抗病毒化合物，用于预防或治疗患者(优选是儿童)中的I型糖尿病和/或胰腺炎。在一些实施方式中，该组合物还包含免疫调节化合物，其能够有效地抑制天然杀伤细胞活性。在一些的实施方式中，该组合物还包含药学上可接受的运载体。
在一些的实施方式中，该组合物是疫苗组合物，可选地还包含佐剂，优选是水包油乳液。在一些实施方式中，该组合物用作药物。
本发明还提供了一种预防或治疗患者中I型糖尿病和/或胰腺炎的方法，包括向患者给予本发明的组合物的步骤。
在一些的实施方式中，本发明还提供了用于鉴定患者(优选是儿童)在此后的生命中是否倾向于发生I型糖尿病和/或胰腺炎的试验方法，该方法包括检测患者样品中是否存在(i)甲型流感病毒或其表达产物和/或(ii)针对甲型流感病毒的免疫应答。在一些实施方式中，在患者样品中检测到(i)甲型流感病毒或其表达产物和/或(ii)针对甲型流感病毒的免疫应答表明她/他倾向于在之后生命中发生I型糖尿病和/或胰腺炎，特别是当患者已经具有前驱糖尿病症状(如胰岛炎)时。在其他实施方式中，在患者样品中不存在(i)甲型流感病毒或其表达产物和/或(ii)针对甲型流感病毒的免疫应答表明该患者未感染甲型流感病毒。这类流感阴性(flu-negative)患者是使用本发明的组合物进行治疗的理想候选者。通常，这类患者是年轻的儿童，例如年龄小于5岁。
在一些的实施方式中，本发明还提供了用于预测I型糖尿病和/或胰腺炎的试验方法，该方法包括检测患者样品中是否存在(i)甲型流感病毒或其表达产物和/或(ii)针对甲型流感病毒的免疫应答。任选地，该试验方法还包括以下步骤：(a)鉴定患者样品中(i)甲型流感病毒或其表达产物和/或(ii)针对甲型流感病毒的免疫应答的水平；(b)比较患者样品中的水平与参考水平；其中：(i)患者样品中水平较高表示较差的预后；(ii)患者样品中水平较低表示较好的预后。
在一些实施方式中，该样品是血液样品或气管拭子。
在一些实施方式中，该试验方法用于筛选过程，例如儿科筛选。例如，儿童的患者样品中(i)甲型流感病毒或其表达产物和/或(ii)针对甲型流感病毒的免疫应答的测试为阴性的鉴定结果表明该患者未受甲型流感病毒感染，且该患者因此是使用本发明的组合物进行治疗的理想候选者。
在一些实施方式中，患者的年龄为不超过70岁，且优选是0-15岁。
任何甲型流感病毒都可用于本发明的诊断、预后和/或预防方法。适用于本发明的诊断、预后和/或预防方法的甲型流感病毒可具有任何血凝素类型，例如H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16，以及任何神经氨酸酶类型，例如N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9。
用于本发明的流感病毒毒株可随季节变化并可以是大流行性或非大流行性的。在目前的大流行间期，疫苗一般包括两种甲型流感毒株(H1N1和H3N2)和一种乙型流感毒株，且一般是三价疫苗。本发明可采用来自大流行病毒株(即患者和普通人群没有与其发生过免疫接触的毒株，特别是甲型流感病毒)的抗原，如H2、H5、H7或H9亚型毒株，且大流行毒株的流感疫苗可以是单价疫苗或者可以基于补充有大流行毒株的正常三价疫苗。根据流行的流感病毒毒株和抗原特性，本发明可使用以下一种或多种HA亚型：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。本发明可使用以下一种或多种甲型流感病毒NA亚型：N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9。
可能引起大流行爆发的流感毒株的特征是：(a)与目前流行的人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即十年以上在人群中未见的血凝素(如H2)，或者从未在人群中发现的血凝素(如通常只出现在鸟群体中的H5、H6或H9)，以至于人群未曾免疫接触过该毒株的血凝素；(b)它能够在人群中横向传播；和(c)它对人有致病性。含有H5血凝素类型的病毒优选用于获得对大流行流感，如H5N1毒株的免疫。其它可能的毒株包括H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，以及任何其它可能出现的大流行株。
优选地，该甲型流感病毒是H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3或H10N7；更优选地，该甲型流感病毒是H1N1或H3N2。优选地，该甲型流感病毒是非全身性甲型流感病毒。最优选地，该甲型流感病毒是H1N1、H3N2、H2N2。
可有用地包含其抗原的其它毒株是对抗病毒治疗有耐受性(例如对奥塞米韦[6]和/或扎那米韦有耐受性)的毒株，包括耐药性大流行毒株[7]。
抗病毒化合物的给药
本发明提供了一种预防或治疗患者中I型糖尿病和/或胰腺炎的方法，包括向患者给予有效地针对甲型流感病毒的抗病毒化合物的步骤。在一些实施方式中，将抗病毒化合物给予已被甲型流感病毒感染的患者。在优选实施方式中，将抗病毒化合物给予未被甲型流感病毒感染的患者。确定患者先前是否已被甲型流感病毒感染的方法是本领域熟知的，例如通过ELISA检测患者样品中的抗甲型流感病毒抗体的存在。
在一些实施方式中，将抗病毒化合物给予具有甲型流感病毒感染症状的患者，或者近期具有甲型流感病毒感染症状、但在给药时(例如症状消退后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14等天)不具有症状的患者。在这类病例中，给予抗病毒化合物通常减少了流感感染和症状的持续时间和/或严重程度。考虑到发明人所证明的甲型流感病毒感染与I型糖尿病之间的因果关系，在一些情况下，甲型流感病毒感染的抗病毒治疗将作为预防I型糖尿病或治疗I型糖尿病的方法。
多种有效地针对流感病毒的抗病毒化合物是本领域已知的，如奥塞米韦和/或扎那米韦。这些抗病毒化合物包括，例如，神经氨酸酶抑制剂，如(3R,4R,5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸或5-(乙酰基氨基)-4-[(氨基亚氨基甲基)-氨基]-2,6-脱水-3,4,5-三脱氧-D-甘油-D-半乳糖壬-2-烯酮酸，包括它们的酯(如乙酯)和盐(如磷酸盐)。优选的抗病毒化合物是(3R,4R,5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸的乙酯和磷酸盐(1:1)，也称为磷酸奥塞米韦(达菲(TAMIFLU))。另一种优选的抗病毒化合物是(2R,3R,4S)-4-胍基-3-(丙-1-烯-2-基氨基)-2-((1R,2R)-1,2,3-三羟基丙基)-3,4-二羟基-2H-吡喃-6-羧酸，也称为扎那米韦(乐感清(RELENZA))。达菲已得到FDA批准用于预防1岁以上患者中的甲型和乙型流感病毒。乐感清已得到FDA批准用于预防5岁以上患者中的甲型和乙型流感病毒。因此，当患者的年龄是1-5岁时，达菲是优选的抗病毒化合物。当患者的年龄是5岁以上时，优选达菲和/或乐感清。达菲和乐感清也得到了FDA批准分别用于治疗在1岁以上和7岁以上的患者中由甲型或乙型流感病毒感染引起的不复杂急性疾病，其中患者的症状持续了不超过两天。因此，当具有症状的患者年龄是1-7岁时，达菲是优选的抗病毒化合物。当具有症状的患者年龄是7岁以上时，优选达菲和/或乐感清。盐酸金刚烷胺(SYMMETREL)已得到儿科批准用于年龄为1-12岁的儿科患者。可使用这些和其他抗病毒化合物。
可用于本发明的其他抗病毒化合物包括但不限于：高良姜精(3,5,7-三羟基黄酮)、高氏柴胡(bupleurum kaoi)、新蝶呤、小紫金牛提取物(Ardisia chinensisextract)、没食子酰基五羟黄酮(galloyltricetifavan)(如7-O-没食子酰基五羟黄酮和7,4'-二-O-没食子酰基五羟黄酮)、嘌呤和嘧啶顺式取代的环己烯基和环己基核苷、苯并咪唑衍生物、哒嗪基肟醚、恩韦肟、二恶沙利、阿立酮、PTU-23、HBB、S-7、2-(3,4-二氯-苯氧基)-5-硝基苯甲腈、6-溴-2,3-二取代-4(3H)-喹唑酮、3-甲硫基-5-芳基-4-异噻唑腈、苦木素类化合物(如夸斯苦木内酯(simalikalactone))、5'-正碳环5'-脱氧-5'-(异丁基硫)腺嘌呤及其2',3'-双脱氧-2',3'-双脱氢衍生物、氧硫杂环己二烯甲酰苯胺(oxathiincarboxanilide)类似物、恩韦肟的乙烯基乙炔类似物、脱氢表雄甾酮(5-雄烷-3β-醇-17-酮，DHEA)、黄烷(fiavan)、异黄烷和被氯、氰基或脒基取代的异黄烷(如在氧合环中携带双键的取代的3-(2H)-异黄烷，例如4'-氯-6-氰基黄烷和6-氯-4'-氰基黄烷)、4-重氮基-5-烷基砜酰氨基吡唑、天然杂环碱的3'-脱氧-3'-氟-和2'-叠氮基-3'-氟-2',3'-双脱氧-D-呋喃核糖苷等。
可以使用两种或多种抗病毒化合物的混合物。例如，参考文献8报道了某些组合显示协同活性。
除小有机抗病毒化合物外，还可使用细胞因子治疗，例如使用干扰素。也可使用引发干扰素α应答的化合物，例如含肌苷的核酸，如安普利近。
核酸方法也可针对流感病毒使用，如反义或小抑制RNA，以转录后调控病毒产生。参考文献9证明了使用甲型流感病毒诱导的实验性呼吸道感染中向小鼠静脉内给予反义化合物的体内抗病毒活性。可通过给予患者特异性针对甲型流感病毒核酸序列的核酸(如反义或小抑制RNA)来治疗或预防I型糖尿病。这类核酸可以游离的核酸、包封的核酸(例如脂质体包封的核酸)等形式给予。
免疫
本发明还提供了一种预防或治疗患者中I型糖尿病和/或胰腺炎的方法，该方法包括向患者给予免疫原性组合物的步骤。该免疫原性组合物包含甲型流感病毒免疫原。优选地，该免疫原性组合物包含甲型流感病毒免疫原。最优选地，该免疫原性组合物包含非全身性甲型流感病毒免疫原。可将本发明的疫苗与抗病毒化合物(具体是对甲型流感病毒有活性的抗病毒化合物)基本同时给予患者(在对健康护理专业人员进行的同一用药咨询或访问期间)。
目前通常使用的流感疫苗描述于参考文献10的第17和18章。其基于活病毒或灭活病毒，且灭活疫苗可以基于完整病毒、'裂解'病毒或纯化的表面抗原(包括血凝素和神经氨酸酶)。
本发明使用甲型流感病毒抗原(通常包含血凝素)来免疫患者(优选是儿童)。该抗原一般由流感病毒颗粒制备，但作为另一种方式，可以在重组宿主中表达(例如在昆虫细胞系中用杆状病毒载体表达)抗原如血细胞凝集素，并以纯化形式使用[11,12]。然而，抗原通常来自病毒颗粒。
该抗原可以采取灭活病毒或者活病毒的形式。灭活病毒的化学方法包括用有效量的以下一种或多种试剂处理：去污剂、甲醛、福尔马林、β-丙内酯或UV光。用于灭活的其他化学方法包括使用亚甲蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)或其任意组合处理。其他病毒灭活的方法是本领域已知的，例如二元乙胺、乙酰基乙烯亚胺或γ射线辐射。INFLEXALTM产品是全病毒颗粒灭活疫苗。
采用灭活病毒时，该疫苗可包含全病毒、裂解病毒颗粒或纯化的表面抗原(包括血凝素，且通常也包括神经氨酸酶)。
灭活但非完整的细胞疫苗(如裂解病毒疫苗或纯化的表面抗原疫苗)可包括基质蛋白，以获益于位于此抗原内部的其它T细胞表位。因此，包含血细胞凝集素和神经氨酸酶的非完整细胞疫苗(特别是裂解疫苗)还可包含M1和/或M2基质蛋白。参考文献13公开了有用的基质片段。也可存在核蛋白。
可通过各种方法从含病毒液体中收获病毒颗粒。例如，纯化方法可包括用线性蔗糖梯度溶液(含有去污剂以破坏病毒颗粒)进行区带离心。任选稀释后，可通过渗滤纯化抗原。
通过去污剂和/或溶剂处理纯化的病毒颗粒获得裂解病毒颗粒以产生亚病毒颗粒制剂，包括“吐温-醚”裂解法。裂解流感病毒的方法是本领域熟知的，例如参见参考文献14-19等。一般使用破坏浓度的裂解剂破坏或片段化完整病毒来裂解病毒，无论该病毒有无感染性。这种破坏导致病毒蛋白的完全或部分溶解，改变病毒的完整性。优选的裂解剂是非离子型和离子型(例如阳离子型)表面活性剂。合适的裂解剂包括但不限于：乙酸乙酯、聚山梨酯80、脱氧胆酸盐、三正丁基磷酸盐、烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯烷基醚、N,N-二烷基-葡糖酰胺、Hecameg、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季铵化合物、肌氨酰、CTAB(溴化十四烷基三甲铵)、三正丁基磷酸酯、塞塔隆(Cetavlon)、十四烷基三甲铵盐、脂质转染试剂、利非他明(lipofectamine)和DOT-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通表面活性剂，如曲通X-100或曲通N101)、壬苯聚醇9(NP9)Sympatens-NP/090、聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一种有用的裂解方法利用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，并且裂解可在病毒颗粒初始纯化期间进行(例如在蔗糖密度梯度溶液中)。因此，裂解工艺可包括：澄清化含病毒颗粒的物质(以去除非病毒颗粒物质)，浓缩收获的病毒颗粒(例如使用吸附方法，如CaHPO4吸附)，从非病毒颗粒物质分离全病毒颗粒，用裂解剂在密度梯度离心步骤中裂解病毒颗粒(例如，用含有裂解剂如脱氧胆酸钠的蔗糖梯度)，然后过滤(例如超滤)以去除不需要的物质。可将裂解病毒颗粒重悬于磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。BEGRIVACTM、FLUARIXTM、FLUZONETM和FLUSHIELDTM产品是裂解疫苗。
纯化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，一般还包含神经氨酸酶。制备这些纯化形式的蛋白质的方法是本领域熟知的。FLUVIRINTM、AGRIPPALTM和INFLUVACTM产品是亚基疫苗。
另一种形式的灭活流感抗原是病毒体[20](不含核酸的病毒样脂质体颗粒)。可通过用去污剂溶解流感病毒，然后去除核衣壳并重建含病毒糖蛋白的膜来制备病毒体。一种用于制备病毒体的替代性方法包括将病毒膜糖蛋白加入过量磷脂中，得到膜中具有病毒蛋白质的脂质体。INFLEXAL VTM和INVAVACTM产品使用病毒体。
该流感抗原可以是活减毒流感病毒(LAIV)。LAIV疫苗可通过鼻腔喷雾给予且每剂量每个毒株中通常含有106.5-107.5FFU(荧光病灶单位)的活减毒病毒。LAIV毒株还可为冷适应的("ca")，即其可在25℃有效复制，该温度对许多野生型流感病毒的复制有限制性。其还可为温度敏感性的("ts")，即其复制限于许多野生型流感病毒有效生长的温度(37-39℃)。其可以是减毒的("att")，例如从而在人流感病毒感染的雪貂模型中不产生流感样疾病。抗原性特性与ca、ts和att表型的累积作用是减毒疫苗中的病毒可以在鼻咽中复制以在典型的人患者中诱导保护性免疫但不导致疾病，即对于通常向目标人群体的给药，其是安全的。FLUMISTTM是LAIV疫苗。
HA是现有灭活流感疫苗中的主要免疫原，且参照一般由SRID测定的HA水平来标准化疫苗剂量。现有的疫苗一般含有约15μg HA/毒株，但也可使用更低的剂量，例如用于儿童或大流行状况，或者是使用佐剂时。分数剂量如1/2(即7.5μg HA/毒株)、1/4和1/8以及较高剂量(如3x或9x剂量[21,22])已有应用。因此，疫苗可包含0.1-150μg HA/流感毒株，优选0.1-50μg，例如0.1-20μg、0.1-15μg、0.1-10μg、0.1-7.5μg、0.5-5μg等。具体剂量包括例如，约45、约30、约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约1.9、约1.5μg/毒株等。对儿童而言，理想的剂量是7.5μg/毒株。
对于活疫苗，利用组织培养感染剂量中值(TCID50)而非HA含量来衡量剂量，且TCID50一般为106至108(优选为106.5-107.5)/毒株。
用于疫苗的流感病毒株随季节而变。在目前的大流行间期，疫苗一般包含两种甲型流感毒株(H1N1和H3N2)和一种乙型流感毒株，且本发明中通常使用三价疫苗。优选地，本发明的组合物包含来自甲型流感病毒的抗原。任选地，本发明的组合物包含来自乙型流感病毒的抗原。当本发明的组合物包含来自甲型流感病毒的抗原时，本发明可使用季节性和/或大流行毒株。根据季节和疫苗中包含的抗原特性，本发明可包括一种或多种甲型流感病毒血凝素亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16(或保护免受上述病毒的感染)。该疫苗还可包含来自任何NA亚型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9的神经氨酸酶。
在一些实施方式中，本发明的组合物包含来自大流行甲型流感病毒的免疫原。大流行毒株的特征是：(a)与目前流行的人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即十年以上在人群中未见的血凝素(如H2)，或者从未在人群中发现的血凝素(如通常只出现在鸟群体中的H5、H6或H9)，以至于疫苗接受者和普通人群未曾免疫接触过该毒株的血凝素；(b)它能够在人群中横向传播；和(c)它对人有致病性。大流行毒株包括但不限于H2、H5、H7或H9亚型毒株，例如H5N1、H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7毒株。在H5亚型中，病毒可属于多个进化支，例如进化支1或进化支2。已鉴定到进化支2的6个亚进化支，其中亚进化支1、2和3具有不同的地理分布且由于其在人感染中的应用而特定相关。
在一些实施方式中，本发明的组合物包含乙型流感病毒免疫原。乙型流感病毒目前不显示不同的HA亚型，但乙型流感病毒毒株属于两种不同的谱系。这些谱系出现于1980年代晚期，并且具有在抗原/遗传上可彼此区分的HA[23]。当前乙型流感病毒毒株是B/Victoria/2/87-样或B/Yamagata/16/88-样。通常可从抗原性区分这些毒株，但氨基酸序列的差异也可以区分这两种谱系，例如B/Yamagata/16/88-样毒株常常(但并非总是)具有氨基酸残基164缺失(相对'Lee40'HA序列进行编号)的HA蛋白[24]。本发明可以使用来自两种谱系中任一乙型病毒的抗原。
疫苗包含一种以上流感毒株时，一般单独培养不同毒株，并在收获病毒和制备抗原后将它们混合在一起。因此，本发明的生产方法可包括混合一种以上流感毒株的抗原的步骤。
本发明使用的流感病毒可以是再分类毒株，并可通过反向遗传学技术获得。反向遗传学技术[如25-29]能够用质粒在体外制备含有所需基因组区段的流感病毒。该技术一般涉及表达(a)编码所需病毒RNA分子的DNA分子(例如由polI启动子或噬菌体RNA聚合酶启动子)和(b)编码病毒蛋白的DNA分子(例如由polII启动子)，从而在细胞中表达两种类型的DNA，导致组装成完整的感染性病毒颗粒。DNA优选提供所有病毒RNA和蛋白质，但也可能用辅助病毒提供一些RNA和蛋白质。可以采用不同质粒产生各病毒RNA的质粒方法[30-32]，这些方法也包括使用质粒表达所有或一些(例如仅PB1、PB2、PA和NP蛋白)病毒蛋白，一些方法中至多使用12种质粒。为了降低所需的质粒数量，最新方法[33]将多个RNA聚合酶I转录盒(用于合成病毒RNA)合并到同一质粒(如编码1、2、3、4、5、6、7或所有8种甲型流感vRNA区段的序列)上，并且将多个蛋白编码区与RNA聚合酶II启动子合并到另一个质粒(如编码1、2、3、4、5、6、7或所有8种甲型流感mRNA转录物的序列)上。参考文献33方法的优选方面涉及：(a)单一质粒上的PB1、PB2和PA mRNA编码区域；和(b)单一质粒上的所有8种vRNA编码区段。一个质粒上包含NA和HA区段而位于另一质粒上的另外六个区段也可能是有利的。
作为使用polI启动子来编码病毒RNA区段的另一种替代方式，可利用噬菌体聚合酶启动子[34]。例如，可方便地使用SP6、T3或T7聚合酶的启动子。因为polI启动子的物种特异性，对于许多细胞类型(例如MDCK)更宜使用噬菌体聚合酶启动子，但也必须用编码外源性聚合酶的质粒转染细胞。
在其它技术中，可能使用polI和polII双启动子由一个模板同时编码病毒RNA和可表达的mRNA[35,36]。
因此，甲型流感病毒可包含来自A/PR/8/34病毒(一般是来自A/PR/8/34的6个区段，HA和N区段来自疫苗毒株，即6:2重配毒株)的一个或多个RNA区段。也可包含来自A/WSN/33病毒、或用于产生疫苗制剂的重配病毒的任何其它毒株的一个或多个RNA区段。甲型流感病毒可包括不到6个(即0、1、2、3、4或5个)来自AA/6/60流感病毒(A/Ann Arbor/6/60)的病毒区段。乙型流感病毒可包括不到6个(即0、1、2、3、4或5个)来自AA/1/66流感病毒(B/AnnArbor/1/66)的病毒区段。本发明一般保护免受能够在人之间传播的毒株的感染，因此该毒株的基因组通常包含在哺乳动物(如人)流感病毒中起源的至少一个RNA区段。它可包含在禽流感病毒中起源的NS区段。
其抗原可包含在组合物中的毒株可能对抗病毒治疗具有抗性(例如对奥塞米韦[37]和/或扎那米韦有抗性)，包括抗性大流行毒株[38]。
本发明所用HA可以是天然HA，如病毒中发现的天然HA，或者可以是经修饰的HA。例如，已知修饰HA以去除能使病毒在禽类动物中具有高度致病性的决定簇(如HA1与HA2直接切割位点周围的超碱性区域(hyper-basic region))，因为这些决定簇可防止病毒在鸡蛋中生长。
可以在鸡蛋(如无特定病原体的鸡蛋)或细胞培养物上培养用作抗原来源的病毒。目前培养流感病毒的标准方法采用含胚的鸡蛋，从鸡蛋内容物(尿囊液)中纯化病毒。然而，更近一段时间以来，已经在动物细胞培养物上培养病毒，出于速度和患者变态反应的原因，优选这种培养方法。
细胞系通常是哺乳动物来源。合适的哺乳动物细胞来源包括但不限于仓鼠、牛、灵长类动物(包括人类和猴)，以及犬细胞，但不优选使用灵长类动物细胞。可以使用多种细胞类型，如肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、肺细胞等。合适的仓鼠细胞的示例是名为BHK21或HKCC的细胞系。合适的猴细胞是例如，非洲绿猴细胞，如Vero细胞系中的肾细胞[39-41]。合适的犬细胞是(例如)肾细胞，例如CLDK和MDCK细胞系中。
因此，合适的细胞系包括但不限于：MDCK、CHO、CLDK、HKCC、293T、BHK、Vero、MRC-5、PER.C6[42]、FRhL2、WI-38等。合适的细胞系可广泛获得，例如来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)[43]、Coriell细胞库[44]或欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。例如，ATCC提供各种不同Vero细胞，目录号为CCL-81、CCL-81.2、CRL-1586和CRL-1587；并提供MDCK细胞，目录号为CCL-34。PER.C6可获自ECACC，保藏号为96022940。
最优选的细胞系是具有哺乳动物类糖基化的细胞系。哺乳动物细胞系的次优选替代方案是可以在禽细胞系上培养病毒[例如参考文献45-47]，这些细胞系包括来源于鸭(如鸭视网膜)或母鸡的细胞系。禽细胞系的示例包括禽胚胎干细胞[45,48]和鸭视网膜细胞[46]。合适的禽胚胎干细胞包括来源于鸡胚胎干细胞的Ebx细胞系，EB45、EB14和EB14-074[49]。也可使用鸡胚成纤维细胞(CEF)。然而，与使用禽类细胞相比，使用哺乳动物细胞系意味着该疫苗可能不含禽类DNA和鸡蛋蛋白质(如卵清蛋白和卵类粘蛋白)，从而降低变应原性。
用于培养流感病毒的最优选的细胞系是来自马-达二氏犬肾的MDCK细胞系[50-53]。原始MDCK细胞系可获自ATCC(CCL-34)，但也可利用该细胞系的衍生细胞系。例如，参考文献50公开了适合悬浮培养的MDCK细胞系('MDCK 33016'，保藏号DSM ACC 2219)。类似地，参考文献54公开了在无血清培养基中悬浮培养的MDCK衍生细胞系('B-702'，保藏号FERMBP-7449)。参考文献55公开了非致瘤性MDCK细胞，包括'MDCK-S'(ATCC PTA-6500)、'MDCK-SF101'(ATCC PTA-6501)、'MDCK-SF102'(ATCC PTA-6502)和'MDCK-SF103'(PTA-6503)。参考文献56公开了非常容易感染的MDCK细胞系，包括‘MDCK.5F1’细胞(ATCC CRL-12042)。可使用任何这些MDCK细胞系。
可以在贴壁或悬浮培养的细胞中培养病毒。也可使用微载体培养。在一些实施方式中，细胞可能适合悬浮培养。
优选在无血清培养基和/或无蛋白培养基中培养细胞系。在本发明中，培养基是指无血清培养基，其中没有人或动物来源血清的添加剂。这类培养基中生长的细胞天然包含蛋白质本身，但无蛋白培养基应理解成表示细胞增殖不包括蛋白质、生长因子、其他蛋白质添加剂和非血清蛋白质的培养基，但可任选地包含病毒生长所必需的蛋白质(如胰蛋白酶或其他蛋白酶)。
在病毒复制过程中，支持流感病毒复制的细胞系优选在37℃以下[57](如30-36℃，或约30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃)培养。
在培养的细胞中增殖流感病毒的方法通常包括以下步骤：用待培养毒株接种物接种培养的细胞；将感染细胞培养所需时间以增殖病毒，并根据病毒效价或抗原表达进行测定(例如在接种后培养24至168小时)；以及收集增殖的病毒。用1:500-1:1，优选1:100-1:5，更优选1:50-1:10的病毒(由PFU或TCID50测定)与细胞比接种培养的细胞。将病毒加入细胞悬液，或应用于单层细胞，病毒在25-40℃，优选28-37℃吸附到细胞上至少60分钟，但通常短于300分钟，优选90-240分钟。可通过冻融或酶作用除去感染的细胞培养物(例如单层)，以提高所收获培养物上清中的病毒含量。然后，可灭活或冷冻储存收获的液体。可以约0.0001-10、优选0.002-5、更优选0.001-2的感染复数("m.o.i.")感染培养的细胞。更优选地，以约0.01的m.o.i.感染细胞。可以在感染后30-60小时收获感染的细胞。优选在感染后34-48小时收获细胞。更优选在感染后38-40小时收获细胞。通常在细胞培养期间加入蛋白酶(一般为胰蛋白酶)以释放病毒，可在培养期间任何合适的阶段加入蛋白酶，例如接种前、接种同时或接种后[57]。
在优选实施方式中，尤其是使用MDCK细胞时，来自主工作细胞库中的细胞系传代不超过40次群体倍增水平。
病毒接种物和病毒培养基优选不含(即经测试且得到阴性污染结果)单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、SARS冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、多瘤病毒、双RNA病毒、环病毒和/或细小病毒[58]。特别优选不存在单纯疱疹病毒。
当病毒在细胞系上生长时，标准实践是最小化最终疫苗中残留的细胞系DNA含量，以最小化该DNA的任何致癌活性。
因此，按照本发明制备的疫苗组合物优选含有每剂量低于10ng(优选低于1ng，更优选低于100pg)的残留宿主细胞DNA，但可能存在痕量宿主细胞DNA。
优选每15μg血凝素中宿主细胞DNA含量<10ng(如<1ng、<100pg)的疫苗，以及每0.25ml体积中宿主细胞DNA含量<10ng(如<1ng、<100pg)的疫苗。更优选每50μg血凝素中宿主细胞DNA含量<10ng(如<1ng、<100pg)的疫苗，以及每0.5ml体积中宿主细胞DNA含量<10ng(如<1ng、<100pg)的疫苗。
任何残留宿主细胞DNA的平均长度优选小于500bp，例如小于400bp、小于300bp、小于200bp、小于100bp等。
在疫苗制备过程中可采用标准纯化方法(如色谱法等)以除去污染的DNA。可通过核酸酶处理，例如使用DNA酶处理来提高对残留宿主细胞DNA的移除。参考文献59和60公开了一种减少宿主细胞DNA污染的便捷方法，该方法包括两步处理，先使用DNA酶(如Benzonase)处理(可以在病毒生长过程中使用)，然后使用阳离子去污剂(如CTAB)处理(可以在病毒颗粒破坏过程中使用)。还可通过β-丙内酯处理进行去除。
残留宿主细胞DNA的测定是目前生物制品的常规管理要求，它在技术人员的普通能力范围内。用于测定DNA的试验一般是已验证的试验[61,62]。可通过数学和可量化的条件来描述经验证试验的性能特征，并鉴定其可能的误差来源。通常测试该试验的某些特征，如精确性、准确性、特异性。一旦试验经校正(例如相对已知标准量的宿主细胞DNA校正)并测试，则可按常规进行定量DNA测定。可采用三种DNA定量的主要技术：杂交方法，如Southern印迹或狭线印迹[63]；免疫测定方法，如ThresholdTM系统[64]；和定量PCR[65]。本领域技术人员熟悉这些方法，尽管各方法的准确特征(例如杂交探针的选择、引物的选择和/或用于扩增的引物等)可能取决于所研究的宿主细胞。来自分子设备公司(MolecularDevices)的ThresholdTM系统是皮克水平总DNA的定量实验，已用于监测生物药品中污染DNA的水平[64]。典型试验包括生物素化ssDNA结合蛋白、脲酶偶联的抗ssDNA抗体和DNA之间以非序列特异性方式形成反应复合物。购自生产商的总DNA测定试剂盒(Total DNA AssayKit)中包含所有试验组分。多个商业生产商均提供用以检测残留宿主细胞DNA的定量PCR实验，例如AppTecTM实验室服务公司(AppTecTM Laboratory Services)、BioRelianceTM公司、奥西科技公司(Althea Technologies)等。对测定人病毒疫苗的宿主细胞DNA污染的化学发光杂交实验和总DNA ThresholdTM系统的比较参见参考文献66。流感病毒免疫原可采取多种形式。
作为递送基于多肽的免疫原本身的替代方法，可给予编码多肽的核酸，使得在递送至体内后原位表达多肽。核酸免疫通常利用载体，如质粒，其包含：(i)启动子；(ii)可操作连接于所述启动子的免疫原编码序列；以及(iii)选择性标记物。载体通常还包含(iv)复制起点；以及(v)位于(ii)下游并与其可操作连接的转录终止子。组分(i)和(v)通常是真核的，而(iii)和(iv)是原核的。
用于免疫原性组合物的多肽可具有天然流感多肽(前体或成熟形式)的氨基酸序列，或者其可以是人造的，例如其可以是融合蛋白或其可包含天然流感序列的片段(例如包含表位)。
佐剂
本发明的疫苗和组合物优选包含佐剂，佐剂的作用是增强在接受组合物的患者中引起的免疫应答(体液免疫和/或细胞免疫)。曾经描述过将佐剂与流感疫苗一起使用。在美国专利6,372,223和WO00/15251中，使用了氢氧化铝，且在WO01/22992中，使用了氢氧化铝和磷酸铝的混合物。Hehme等(2004)Virus Res.103(1-2):163-71还描述了铝盐佐剂的用途。来自诺华疫苗公司(Novartis Vaccines)的FLUADTM产品包含水包油乳液。VaccineDesign:The Subunit and Adjuvant Approach(《疫苗设计：亚基和佐剂方法》)(Powell和Newman编)，普莱努出版社(Plenum Press)1995[ISBN 0-306-44867-X]和VaccineAdjuvants:Preparation Methods and Research Protocols(《疫苗佐剂：制备方法和研究方案》)(《分子医学方法》丛书第42卷)O'Hagan编[ISBN:1-59259-083-7]中更详细地讨论了佐剂活性物质。
可用于本发明的佐剂包括但不限于WO2008/068631中描述的那些。组合物可包含两种或多种所述佐剂。组合物中的抗原和佐剂通常相混。
水包油乳液佐剂
水包油乳液是用于本发明的优选佐剂，因为发现其特别适用于作为流感病毒疫苗的佐剂。已知多种这类乳液，它们通常包含至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是可生物降解(可代谢)和生物相容的。乳剂中的油滴直径通常小于5μm，乳剂宜包含具有亚微米直径的油滴，通过微流化床实现这种小尺寸以提供稳定乳剂。优选尺寸小于220nm的液滴，因为其可进行过滤灭菌。
本发明可使用例如动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的坚果油的示例有花生油、大豆油、椰子油和橄榄油。可以采用例如获自霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。甘油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯虽然不天然存在于种籽油中，但可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质来制备。来源于哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可以用于实施本发明。获得动物来源的纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程是本领域中熟知的。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，可用于本文的鱼油的几种示例有鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油(诸如鲸蜡)。通过生化途径以5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，其总称为萜类。鲨鱼肝油含有称为角鲨烯的支链不饱和萜类化合物，2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯，其是本文特别优选的。角鲨烯的饱和类似物角鲨烷也是优选的油。包括角鲨烯和角鲨烷在内的鱼油易于从市售来源获得，或可以通过本领域已知的方法获得。其它优选的油是生育酚(参见下文)。可以使用油的混合物。
可通过“HLB”值(亲水/亲脂平衡值)对表面活性剂分类。本发明优选的表面活性剂的HLB值为至少10，优选至少15，更优选至少16。可用于本发明的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWFAXTM出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EO/PO嵌段共聚物；重复乙氧基(氧-1,2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬酚乙醇酯，如TergitolTM NP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽(Brij)表面活性剂)，如三乙二醇单月桂基醚(苄泽30)；以及脱水山梨糖醇酯(通常称为司盘(SPAN))，如脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。优选非离子型表面活性剂。乳液中包含的优选表面活性剂是吐温80(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(脱水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。
可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80))和辛苯聚醇(如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100))的组合也是适用的。另一种有用的组合包括月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。
优选的表面活性剂含量(重量百分比)为：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐温80)0.01-1％，特别是约0.1％；辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100或曲通系列的其它去污剂)0.001-0.1％，特别是0.005-0.02％；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0.1-20％，优选0.1-10％，特别是0.1-1％或约0.5％。
可用于本发明的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：
·角鲨烯、吐温80(Tween 80)和司盘(Span)85的亚微米乳液。该乳液组合物的体积组成可以是约5％角鲨烯、约0.5％聚山梨酯80和约0.5％司盘85。以重量计，这些比例为4.3％角鲨烯、0.5％聚山梨酯80和0.48％司盘85。这种佐剂称为‘MF59’(WO90/14837；Podda和Del Giudice(2003)Expert Rev Vaccines 2:197-203；Podda(2001)Vaccine 19:2673-2680)，更详细的描述参见Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach(《疫苗设计：亚基和佐剂方法》)的第10章(Powell和Newman编)，普莱努出版社(Plenum Press)1995[ISBN 0-306-44867-X]和Vaccine Adjuvants:Preparation Methods and ResearchProtocols(《疫苗佐剂：制备方法和研究方案》)的第12章(《分子医学方法》丛书第42卷)O'Hagan编[ISBN:1-59259-083-7]。MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，如10mM柠檬酸钠缓冲液。
·角鲨烯、生育酚和聚山梨酯80的乳剂。该乳剂可包含磷酸盐缓冲盐水。其还可包含司盘85(例如1％)和/或卵磷脂。这些乳液可含有2-10％角鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％聚山梨酯80，且角鲨烯:生育酚的重量比优选小于等于1，因为这能使乳液更稳定。角鲨烯和聚山梨酯80可以约5:2的体积比或者约11:5的重量比存在。因此这三种组分(角鲨烯、生育酚、聚山梨酯80)可以1068:1186:485或约55:61:25的重量比存在。可通过以下方法制备一种这类乳液(“AS03”)：将吐温80溶解于PBS产生2％溶液，然后将90ml该溶液与5g DL-α-生育酚和5ml角鲨烯的混合物相混合，然后使该混合物微流体化。所得乳液可含有如平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。该乳液也可含有3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3d-MPL)。此种类型的另一有用乳液可包含(每人剂量)0.5-10mg角鲨烯、0.5-11mg生育酚和0.1-4mg聚山梨酯80(WO2008/043774)，例如，以上述比例。
·角鲨烯、生育酚和曲通去污剂(如曲通X-100)的乳液。该乳液还可包含3d-MPL(见下文)。该乳液可包含磷酸盐缓冲液。
·含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污剂(如曲通X-100)和生育酚(如琥珀酸α-生育酚)的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75:11:10(例如，750μg/ml聚山梨酯80、110μg/ml曲通X-100和100μg/ml琥珀酸α-生育酚)，且这些浓度应包括来自抗原的这些组分的任何贡献。该乳液还可包含角鲨烯。该乳液还可包含3d-MPL(见下文)。水相可包含磷酸盐缓冲液。
·角鲨烯、聚山梨酯80和泊洛沙姆401(“PluronicTM L121”)的乳液。该乳液可用pH7.4的磷酸盐缓冲盐水配制。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，已与用"SAF-I"佐剂(0.05-1％Thr-MDP、5％角鲨烷、2.5％普流罗尼克L121和0.2％聚山梨酸酯80)配制的苏氨酰基-MDP(Allison和Byars(1992)Res Immunol 143:519-25)联用。也可不与Thr-MDP联用，例如用"AF"佐剂(5％角鲨烷、1.25％普流罗尼克L121和0.2％聚山梨酸酯80)(Hariharan等(1995)Cancer Res 55:3486-9)。优选微流体化。
·含有角鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(如聚氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(如去水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如去水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。该乳剂优选为热可逆的和/或其中至少90％油滴(以体积计)尺寸小于200nm(US2007/014805)。该乳剂也可含有一种或多种以下物质：糖醇；低温保护剂(例如糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。可将这类乳剂冻干。该乳液还可包含质量比为330:63:49:61的角鲨烯:聚氧乙烯十六十八醚:脱水山梨糖醇油酸酯:甘露醇。
·角鲨烯、泊洛沙姆-105和Abil-Care的乳液(Suli等(2004)Vaccine22(25-26):3464-9)。含佐剂疫苗中这些组分的终浓度(重量)是5％角鲨烯、4％泊洛沙姆-105(普流罗尼克多元醇)和2％Abil-Care 85(双-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16二甲硅油；辛酸/癸酸甘油三酯)。
·含有0.5-50％油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子型表面活性剂的乳液。如WO95/11700所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。
·不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂体偶联物(诸如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷上而产生的GPI-0100，如美国专利6,080,725所述)、二甲基二-十八烷基溴化铵和/或N,N-二-十八烷基-N,N-双(2-羟乙基)丙二胺。
·包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液(WO2006/113373)。
·包含矿物油、非离子亲水性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液(WO2006/113373)。
·皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液(WO2005/097181)。
通常在向患者递送时混合组合物中的抗原和佐剂。可以在生产期间混合乳液与抗原，或者在递送时临时混合。因此，在包装或出售的疫苗中佐剂和抗原可以分开保存，当使用时可以配制成最终制剂。该抗原通常采用水性形式，从而最终通过混合两种液体来制备疫苗。两种待混合液体的体积比可变(例如5:1-1:5)，但一般是约1:1。
在抗原与佐剂混合后，血凝素抗原通常保留在水溶液中，但其本身可分布于油/水界面附近。通常，很少(如果有)血凝素会进入该乳液的油相。
当组合物包含生育酚时，可采用α、β、γ、δ、ε或ξ生育酚中的任何一种，但优选α-生育酚。生育酚可取多种形式，例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，例如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。可同时采用D-α-生育酚和DL-α-生育酚。用于老年患者(如年龄在60岁以上的患者)的疫苗中宜包含生育酚，因为据报道维生素E在此患者群体中对免疫应答有积极作用(Han等(2005)Impact of Vitamin E on Immune Function and Infectious Diseasesin the Aged(维生素E对老年人中免疫功能和感染性疾病的影响)，营养、免疫功能和健康欧洲会议，巴黎，2005年6月9-10日)。它们也具有协助稳定该乳液的抗氧化特性(US6630161)。优选的α-生育酚是DL-α-生育酚，此种生育酚的优选盐是琥珀酸盐。发现琥珀酸盐在体内可以与TNF相关配体协作。此外，已知琥珀酸α-生育酚与流感疫苗相容，并且是有用的替代含汞化合物的防腐剂(WO02/097072)。
如上所述，包含角鲨烯的水包油乳液是特别优选的。在一些实施方式中，疫苗剂量中的角鲨烯浓度可以是5-15mg(即10-30mg/ml的浓度，假设是0.5ml剂量体积)。然而，可以减少鲨烯浓度(WO2007/052155；WO2008/128939)，例如包含<5mg/剂量，或甚至<1.1mg/剂量。例如，人剂量可包括9.75mg角鲨烯/剂量(例如在FLUADTM产品中：9.75mg角鲨烯，1.175mg聚山梨酯80，1.175mg去水山梨糖醇三油酸酯，剂量体积为0.5ml)，或可以包括其部分量，例如3/4、2/3、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9或1/10。例如，组合物可包括7.31mg角鲨烯/剂量(因此是各0.88mg聚山梨酯80和去水山梨糖醇三油酸酯)、4.875mg角鲨烯/剂量(因此是各0.588mg聚山梨酯80和去水山梨糖醇三油酸酯)、3.25mg角鲨烯/剂量、2.438mg/剂量、1.95mg/剂量、0.975mg/剂量等。本发明可使用任何的这些FLUADTM-强MF59的部分稀释物。
如上所述，可在递送时临时进行抗原/乳液混合。因此，本发明提供了包含易混的抗原和佐剂组分的试剂盒。该试剂盒可将佐剂和抗原单独保存，直到使用。在试剂盒中，这些组分在物理上相互分离，这种分离可通过多种方式实现。例如，这两种组分可以装在两个不同的容器，如药瓶中。可通过(例如)取出一个药瓶的内容物并将其加入另一个药瓶，或者分别取出两个药瓶的内容物并在第三个容器中将它们混合在一起，来混合两个药瓶的内容物。在优选的配置中，试剂盒的一种组分在注射器中，另一种组分在容器如药瓶中。可使用该注射器(例如装有针头的注射器)将其内容物注入第二个容器中混合，然后将该混合物抽回注射器中。然后，一般通过新的无菌针头将该注射器中的混合内容物给予患者。将一种组分包装到注射器中无需用单独注射器对患者给药。在另一优选配置中，这两种试剂盒组分在同一注射器，例如双室注射器，中分开保存(如WO2005/089837、美国专利6,692,468、WO00/07647、WO99/17820、美国专利5,971,953、美国专利4,060,082、EP-A-0520618、WO98/01174所述)。操作注射器时(例如给予患者时)，将这两室中的内容物混合。这种配置在使用时无需单独的混合步骤。
NK调节
NK细胞是一类淋巴细胞，其功能是针对肿瘤细胞和病毒感染细胞的初始免疫防御。有证据表明NK细胞功能障碍在I型糖尿病的发展过程中起重要作用(参见例如参考文献67和68)。因此，在受感染患者中抑制NK细胞可能具有治疗潜能。因此，本发明提供了一种预防或治疗患者中I型糖尿病的方法，该方法包括给予本发明的免疫原性组合物和/或抗病毒化合物以及有效抑制天然杀伤细胞活性的免疫调节化合物。然而，通常不需要全部抑制。
有效地抑制NK功能的化合物包括但不限于：类固醇(如甲泼尼龙)、三丁基锡、Ly49配体(如H-2D(d))、可溶性HLA-G1、CD94/NKG2A、CD244配体等。
化合物可直接或间接作用于NK细胞。例如，三丁基锡直接作用于NK细胞。相反地，CD4+CD25+ T调节细胞可抑制NK细胞，因此可向患者给予化合物以促进这类CD4+CD25+ T细胞并从而间接抑制NK细胞。
用于诊断和/或预后的试验
应理解，本发明中“诊断”涉及鉴定患者(如儿童)在之后的生命中发生I型糖尿病和/或胰腺炎的倾向，而非该患者中I型糖尿病和/或胰腺炎的明确临床诊断。当患者被鉴定为在之后的生命中具有发生I型糖尿病和/或胰腺炎的倾向时，I型糖尿病和/或胰腺炎的症状通常出现在诊断后至少一年，例如诊断后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60年或更久。然而，在一些情况下，当患者被鉴定为在之后的生命中具有发生I型糖尿病和/或胰腺炎的倾向时，I型糖尿病和/或胰腺炎的症状通常出现在1年内，例如诊断的1个月内、2个月内、3个月内、6个月内或9个月内。本文所述检测可在体内或体外进行。
I型糖尿病的症状是熟知的且通常包括感觉非常渴、感觉饥饿、感觉疲劳或乏力、视力模糊、丧失脚部感觉或脚部有麻刺感、在不试图减肥的情况下体重降低、尿频、深呼吸、呼吸促迫、脸红、呼吸有水果气味、恶心、呕吐、无法吞咽流体、胃痛、头痛、神经过敏、心悸、出汗、摇晃和/或虚弱等。胰腺炎的症状也是熟知的且通常包括疼痛(特别是从腹部前方至背部辐射的疼痛)、恶心、发热和/或寒颤、腹水病、心动过速、乏力、头晕、虚晃、嗜睡易怒、意识错乱、注意力难以集中、头痛、体重降低、出血和/或黄疸等。
因此，本发明提供了诊断试验方法，包括检测患者样品中是否存在(a)甲型流感病毒或其表达产物和/或(b)针对甲型流感病毒的免疫应答的步骤。检测到存在表明患者被甲型流感病毒感染并因此处于下游糖尿病相关和/或胰腺炎相关结果的风险中。因此，本发明的试验可用于测定患者在之后的生命中发生I型糖尿病的风险是否升高，即测定患者(如儿童)是否具有发生I型糖尿病的倾向。类似地，本发明的试验可用于测定患者在之后的生命中发生胰腺炎的风险是否升高，即测定患者(如儿童)是否具有发生胰腺炎的倾向。因此，在一个实施方式中，检测到存在甲型流感病毒或其表达产物和/或针对甲型流感病毒的免疫应答表明具有发生I型糖尿病和/或胰腺炎的倾向。
检测到患者样品中不存在(i)甲型流感病毒或其表达产物和/或(ii)针对甲型流感病毒的免疫应答表明该患者(通常是儿童)未感染甲型流感病毒。这类患者是使用本发明的组合物进行治疗的优选候选者。
发明人发现，甲型流感病毒感染与胰腺损伤相关。因此，甲型流感病毒感染的水平可表明I型糖尿病和/或胰腺炎的预后。例如，较高水平的甲型流感病毒感染导致较严重的胰腺损伤并因此导致出现较严重的I型糖尿病和/或胰腺炎。通常，患者中I型糖尿病和/或胰腺炎的预后涉及比较患者样品中甲型流感病毒或其表达产物和/或针对甲型流感病毒的免疫应答的水平与参考水平。该参考水平优选是另一名患者上观察到的水平，所述另一名患者中确定I型糖尿病和/或胰腺炎的严重程度。
因此，在一些实施方式中，检测到高水平的甲型流感病毒或其表达产物和/或针对甲型流感病毒的免疫应答表明I型糖尿病和/或胰腺炎的预后较差(例如与参考水平相比)。相反地，在患者样品中检测到低水平的甲型流感病毒或其表达产物和/或针对甲型流感病毒的免疫应答表明I型糖尿病和/或胰腺炎的预后较好(例如与参考水平相比)。
本发明的试验方法可用作筛选过程的一部分，并对阳性样品进行进一步分析。通常，本发明用于检测甲型流感病毒感染，特别是与胰腺β细胞有关的感染，并且存在感染会单独或与其他测试结果联用作为诊断或预后的基础。优选地，本发明的试验方法是用于鉴定患者是否具有发生I型糖尿病的倾向和/或用于确定预后。
本发明的试验方法可检测流感病毒(例如其单链RNA基因组、前病毒颗粒(provirion)、病毒颗粒)、流感病毒的表达产物(例如其反基因组(anti-genome)、病毒mRNA转录本、编码的多肽，例如NS1、PB-1-F2、血凝素、神经氨酸酶、基质蛋白(M1和/或M2)、核糖核蛋白、核蛋白、聚合酶复合物(PB1、PB2、PA)或其亚基、核输出蛋白等)或针对流感病毒的免疫应答产物(例如针对病毒多肽的抗体、识别病毒多肽的T细胞)。
用于检测RNA的有用方法是聚合酶链式反应，特别是RT-PCR(反转录酶PCR)。下文给出了核酸扩增方法的其他细节。
可使用多种技术来检测样品中是否存在多肽。这些技术通常是基于抗体与多肽中抗原性氨基酸序列之间特异性相互作用的免疫试验技术。合适的技术包括标准免疫组化方法、ELISA、RIA、FIA、免疫沉淀、免疫荧光等。通常是夹心试验。针对各种流感病毒的抗体是市售可得的。
还可通过功能性试验(例如检测结合活性或酶活性的试验)来检测多肽。另一种检测本发明多肽的方法是使用标准蛋白组学技术，例如纯化或分离多肽并随后使用肽测序。例如，可使用2D-PAGE分离多肽并对多肽点进行测序(例如通过质谱)以鉴定序列是否存在于目标多肽中。这些技术中的一些可能需要在检测前富集目标多肽；其他技术可直接使用，无需这类富集。
针对流感病毒的抗体可存在于样品中并可通过常规的免疫试验技术检测，例如使用流感病毒多肽，其通常是固定的。
预防和治疗
本发明可用于预防患者中的I型糖尿病和/或胰腺炎。这类患者不是已经患有I型糖尿病和/或胰腺炎，但其处于发生I型糖尿病和/或胰腺炎的风险中。这类患者可能具有前驱糖尿病症状，如胰岛炎。预防包括(i)降低患者发生I型糖尿病的风险和(ii)延长患者发生I型糖尿病前的时间。由于已发现甲型流感病毒感染导致胰腺炎，本发明还可用于预防或治疗前驱糖尿病患者和/或前驱胰腺炎患者(pre-pancreatitis patient)中的胰腺炎。这类治疗或预防是可以避免I型糖尿病和/或胰腺炎的发生和开始的其他方法。
在一些实施方式中，本发明还可用于治疗患者中的I型糖尿病和/或胰腺炎。例如，可使用治疗性免疫或抗病毒治疗以去除流感病毒感染并随后允许β细胞再生(可选与I型糖尿病自身免疫方面的治疗联用)。该方法可与胰岛移植或β细胞前体或干细胞的移植联用。“疗法”、“治疗”、“处理”等通常指获得所需的药理学和/或生理学作用。在I型糖尿病和/或I型糖尿病所致不良作用的部分或完全稳定化或治愈的方面，该作用可以是治疗性的。“治疗”包括抑制疾病症状(即阻止其发生)和缓解疾病症状(即导致疾病或症状的消退)。
上文所述治疗性免疫或抗病毒治疗可用于在患有前驱糖尿病症状(如胰岛炎)并因此存在较高的发生I型糖尿病风险的患者中清除流感病毒感染并随后允许β细胞再生(可选与I型糖尿病自身免疫方面的治疗联用)。
本发明可与I型糖尿病预防和/或治疗的方法联用。治疗I型糖尿病的方法包括例如给予环孢菌素A、给予抗CD3抗体(如特普利组单抗(teplizumab)和/或奥特力昔组单抗(otelixizumab))、给予抗CD20抗体(如利妥昔单抗)、胰岛素治疗、使用GAD65(I型糖尿病中涉及的自身抗原)进行疫苗接种、胰腺移植、胰岛细胞移植等。目前没有预防I型糖尿病的方法。然而，认为糖尿病发生与婴儿时摄取牛奶之间存在联系(参见参考文献69)，因此一些医生建议对父母或兄弟姐妹患有I型糖尿病的儿童进行母乳喂养，并限制该儿童摄取牛奶。
本发明可用于各种患者，但一些实施方式对特定患者组更为有用。例如，一些实施方式通常仅应用于具有确定流感病毒感染的患者，而其他实施方式关注已知存在较高发生I型糖尿病风险的患者(例如具有该疾病的家族史、具有HLA-DR3单倍型和/或HLA-DR4单倍型等)。例如，给予抗病毒化合物通常用于具有病毒感染的前驱糖尿病患者，而预防性免疫得到更广泛地使用(例如用于高风险组，如对患者样品中(i)甲型流感病毒或其表达产物和/或(ii)针对甲型流感病毒的免疫应答测试为阴性的儿童，或用于整个群体)。
使用本发明的诊断、预后和预防方法的优选患者类型是具有胰岛炎但尚未发生I型糖尿病的患者。
患者
发明人指出，IAV感染可能在任何年龄时影响胰腺，因此对于本发明的预防、诊断、治疗和/或预后实施方式，患者可以是任何年龄。通常，该患者可以是不超过70岁，例如70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1岁或更小。
通常，该患者至少是1月龄，例如1月龄、3月龄、6月龄、9月龄，且优选至少1岁，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70岁或更大。优选地，该患者至少5岁。更优选地，该患者至少7岁。最优选地，该患者至少12岁。
发明人证明了患者中甲型流感病毒感染与胰腺炎和/或I型糖尿病发生之间的联系。发明人因此提出，患者中甲型流感病毒感染的频率和/或严重程度影响了之后的生命中发生胰腺炎和/或I型糖尿病的风险，并且还影响了症状严重程度(即高频率和/或严重的感染可能导致之后的生命中发生胰腺炎和/或I型糖尿病的风险上升，且还可能提高症状的严重程度)。因此，为最小化之后的生命中发生胰腺炎和/或I型糖尿病的风险，并且为最小化症状严重程度，患者优选是未感染流感的，或者对流感具有最低接触。
因此，对于本发明的预防性实施方式，具体而言，患者优选是儿童，因为儿童与甲型流感病毒感染的接触通常低于成人。对于本发明的实施方式，该儿童优选0-15岁，例如0-10岁、5-15岁、0-5(例如0-3或3-5岁)、5-10岁(例如5-7或7-10岁)或10-15岁(例如10-13或13-15岁)。通常，该儿童至少是6月龄，例如6-72月龄(包括端值)或6-36月龄(包括端值)，或36-72月龄(包括端值)。在一些实施方式中，这些年龄范围内的儿童可以是小于30月龄，或者小于24月龄。例如，可在6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35月龄时，或者在37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70或71月龄时，或者在36或72月龄时给予其组合物。该儿童优选是0-72月龄，且理想情况下是0-36月龄。因此，该儿童可在第3或第6个生日前进行免疫。
患者样品
本发明的多个实施方式需要已从患者处获得的样品。这些样品通常包含细胞(例如胰腺细胞，包括β细胞)。这些细胞可以存在于组织样品(例如活检样品)中，或者可以是逃逸至循环的细胞。然而，在一些实施方式中，该样品可以是无细胞的，例如来自可能含有流感病毒颗粒且不含患者细胞的体液，或者可能含有抗病毒抗体的纯化的无细胞血液样品。
因此，通常，患者样品是组织样品或血液样品。在一些实施方式中，该样品是气管拭子。其他可能的患者样品来源包括分离的细胞、全组织或体液(例如血液、血浆、血清、尿液、胸腔积液溢液、脑脊液等)。
表达产物可在患者样品自身中检测，或这可在来源于该样品的材料中检测(例如细胞样品的裂解物、这类细胞裂解物的上清液、细胞样品的核酸提取物、由RNA样品逆转录的DNA、由RNA样品翻译的多肽、来源于提取自患者的培养细胞的细胞等)。这些衍生物也是本发明含义内的“患者样品”。
本发明的试验方法可在体外或体内进行。
在本发明的一些实施方式中，可使用对照，可针对该对照比较患者样品中的流感病毒水平。对照样品的分析给出了基线水平，可针对该基线水平比较患者样品。阴性对照可以是来自未感染患者的样品，或者其可以是非来源于患者的材料(如缓冲液)。阳性对照可以是具有已知水平分析物的样品。其他合适的阳性和阴性对照对本领域技术人员而言显而易见。
可与患者样品同时评估对照中的分析物。或者，可以单独评估患者样品(较早或较晚)。然而，与实际比较两种样品不同，对照可以是绝对值，即从先前的样品中通过经验确定的分析物水平(例如标准状态下)。
本发明提供了一种免疫试验方法，包括使患者样品接触本发明的多肽或抗体的步骤。
核酸
编码甲型流感病毒的核酸序列是本领域已知的并可用于本发明的组合物和/或方法。本发明还提供了包含这类核苷酸序列的互补体(包括反向互补体)的核酸，其用于本发明的组合物和/或方法。核酸可用于本发明的预防或治疗实施方式，例如针对反义核酸和/或用于基于DNA的流感疫苗以预防患者在之后的生命中发生I型糖尿病和/或胰腺炎。核酸还可用于本发明的检测方法，例如进行探针探测、用作引物等，其用于鉴定样品中的甲型流感病毒RNA并确定患者在之后的生命中是否具有发生I型糖尿病和/或胰腺炎的倾向。
本发明还提供了编码本发明多肽的核酸，优选甲型流感病毒聚蛋白的蛋白水解产物，其用于本发明的组合物和/或方法。
本发明的引物和探针，以及用于杂交的其它核酸的长度优选为10-30个核苷酸(如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸)。
本发明提供一种检测生物样品(如血液)中流感病毒的方法，该方法包括在杂交条件下使本发明核酸接触生物样品的步骤。该方法可包括核酸扩增(如PCR、SDA、SSSR、LCR、TMA、NASBA等)或杂交(如微阵列、印迹、与溶液中的探针杂交等)。例如，本发明提供了一种检测样品中流感病毒核酸的方法，包括以下步骤：(a)在形成双链体的杂交条件下使本发明核酸探针接触生物样品；和(b)检测所述双链体。
多肽
编码甲型流感病毒的多肽序列是本领域已知的并可用于本发明的组合物和/或方法。优选地，用于本发明的多肽序列包含该序列的至少一个T细胞表位，优选B细胞表位。可凭经验确定T和B细胞表位(如利用PEPSCAN[70,71]或相似方法)，或可预测这些表位(如利用Jameson-Wolf抗原性指数[72]、基于矩阵的方法[73]、T表位(TEPITOPE)[74]、神经网络[75]、OptiMer和EpiMer[76,77]、ADEPT[78]、T位点(Tsites)[79]、亲水性[80]、抗原性指数[81]或参考文献82中公开的方法等)。这类多肽可用于本发明的免疫原性组合物，例如用于预防或治疗患者中的I型糖尿病和/或胰腺炎。这类多肽还可用于诊断，例如用于检测样品中的抗甲型流感病毒抗体，并因此确定患者在之后的生命中是否具有发生I型糖尿病和/或胰腺炎的倾向。
本发明多肽的长度通常为至少7个氨基酸(如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300个氨基酸或更长)。
对于本发明的某些实施方式，多肽的长度优选为最多500个氨基酸(例如450、400、350、300、250、200、150、140、130、120、110、100、90、80、75、70、65、60、55、50、45、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15个氨基酸或更短)。
抗体
本发明提供了与本发明的多肽结合的抗体，其用于本发明的组合物和/或方法。在一些实施方式中，这类抗体是用于预防或治疗I型糖尿病和/或胰腺炎，例如通过针对甲型流感病毒感染的被动免疫。在其他实施方式中，这类抗体是用于诊断方法，例如用于检测样品中的抗甲型流感病毒，并因此确定患者在之后的生命中是否具有发生I型糖尿病和/或胰腺炎的倾向。本发明的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
本发明的抗体可包含标签。该标签可以直接检测，如放射性或荧光标签。或者，该标签可以间接检测，如生成可检测产物的酶(例如荧光素酶、β-半乳糖苷酶、过氧化物酶等)。本发明的抗体可连接于固体支持物。
核酸扩增方法
通过核酸扩增技术(如PCR、SDA、SSSR、LCR、TMA、NASBA、T7扩增等)可以方便并灵敏地检测样品中的核酸。这些技术优选地进行指数扩增。用于RNA的优选技术是RT-PCR(参见参考文献83的第15章)。该技术可以是定量和/或实时的。
扩增技术通常涉及使用两条引物。当流感病毒靶序列是单链时，这些技术通常涉及制备互补链的初级步骤以生产双链靶标，从而促进指数扩增。两条引物与双链靶标的不同链进行杂交并随后延伸。延伸的产物可作为进一步杂交/延伸轮次的靶标。净作用是扩增靶标内的模板序列，该模板的5’和3’末端由靶标中两条引物的位置所定义。
本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包含用于扩增流感病毒核酸靶标中含有的模板序列的引物，该试剂盒包含第一引物和第二引物，其中第一引物包含与所述模板序列某部分基本互补的序列且第二引物包含与所述模板序列某部分基本互补的序列，所述引物中具有上述基本互补性的序列定义待扩增的模板序列的末端。
第一引物和/或第二引物可包括可检测标记(如荧光标记、放射性标记等)。
各引物可包括不与所述模板核酸互补的序列。这类序列优选是引物序列的上游(即靠近其5'端)，且可包含限制性位点[84]、启动子序列[85]等。
本发明的试剂盒还包含与模板序列和/或其互补体基本互补并可与其杂交的探针。该探针可用于杂交技术以检测扩增的模板。
本发明的试剂盒还包含引物和/或探针，其用于生成并检测内部标准品，以辅助定量测量[86]。
本发明的试剂盒还包含一对以上的引物(例如用于巢式扩增)，且一条引物可以是一对以上引物对共有的。该试剂盒还可包含一条以上的探针。
该模板序列的长度优选为50个核苷酸(例如60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、2000、3000个核苷酸或更长)。模板的长度固有地受其位置处靶标的长度所限，但模板长度优选小于500个氨基酸(例如450、400、350、300、250、200、175、150、125、100、90、80、70或更短)。
该模板序列可以是流感病毒基因组序列的任何部分。
本发明提供一种制备靶序列的片段的方法，其中该片段是通过延伸核酸引物制备的。该靶序列和/或引物是本发明核酸。引物延伸反应可包括核酸扩增(如PCR、SDA、SSSR、LCR、TMA、NASBA等)。
药物组合物
本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的抗病毒化合物、核酸、多肽和/或抗体。本发明的组合物任选地还包含免疫调节化合物，其能够有效地抑制天然杀伤细胞活性。本发明还提供了其作用药物的应用(例如用于预防和/或治疗I型糖尿病和/或胰腺炎)，以及各成分在制造用于治疗I型糖尿病和/或胰腺炎的药物中的应用。本发明还提供了一种引发免疫应答的方法，包括向动物(例如向患者)给予免疫原性剂量的本发明的核酸和/或多肽。
本发明的药物组合物包含治疗有效量的本发明所公开的活性剂、抗病毒化合物、核酸、多肽、抗体和/或免疫调节化合物，其能够有效地抑制天然杀伤细胞活性。“有效量”是足以产生有益或所需结果(包括临床结果)的量。可在一次或多次给药中给予有效量。对于本发明的目的，有效量是足以减轻、缓解、稳定、逆转、延缓或延迟I型糖尿病和/或胰腺炎的症状和/或进展的量。
本文所用的术语“治疗有效量”指治疗、改善或预防所需疾病或病症，或显示可检测治疗或预防效果的治疗剂用量。该效果可以通过例如化学标记(如胰岛素生产)来检测。治疗性效果可包括身体症状的减少。对象的准确有效量取决于对象的大小和健康，病症的本质和程度，和给药选定疗法或组合疗法。给定情况的有效量能用常规实验测定，并在临床医生判断范围内。对于本发明的目的，有效量通常是在给予的个体中约0.01mg/kg至约5mg/kg，或约0.01mg/kg至约50mg/kg，或约0.05mg/kg至约10mg/kg的本发明组合物。
药物组合物还可含有药学上可接受的运载体。对这类运载体的充分讨论参见参考文献87。
一旦配制，即可将本发明的组合物(1)直接给予对象(例如作为核酸、多肽、小分子抗病毒化合物等)或(2)离体递送至来源于对象的细胞(例如作为离体基因治疗)。通常通过胃肠道外注射，例如皮下、腹膜内、静脉内或肌肉内，瘤内或者递送至组织间隙来完成该组合物的直接递送。其他给药方式包括口服和肺部给药，栓剂，和透皮应用，针和基因枪或无针注射器。剂量治疗可采用单剂方案或多剂方案。
概述
术语“包含”涵盖“含有”以及“由……组成”，例如“包含”X的组合物可仅由X组成或可含有其它物质，例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”是任选的并表示例如x±10％。
词语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。因此在必要时，词语“基本上”可从本发明的定义中省略。
附图说明
图1显示了组A(接受H7N1 A/火鸡/意大利/3675/1999，图1A)、组B(接受H7N3A/火鸡/意大利/2962/2003，图1B)和组K(对照，图1C)的葡萄糖和脂肪酶血浆浓度。ID：编号；n.d.：未完成；eut：处死以收集样品以在感染后指定日或实验终点处进行组织学和免疫组化分析；以深灰色突出显示的柱：使用
Figure GDA0002794378750000301
条带(上限34mmol/L)仅检测具有高脂肪酶浓度对象的各天；以浅灰色突出显示的柱：特别相关的数据。
图2显示了模拟、H7N1和H7N3感染的火鸡之间高脂血症(A)和高血糖症(B)(血浆葡萄糖大于27.78mmol/L)出现的卡普兰-迈耶分析。使用对数秩统计测试差异。柱状图：与高脂血症、高血糖症和病毒血症相关的事件频率。
图3显示了火鸡胰腺切片(正常组织)。在其胞质中含有酶原粒的腺泡细胞是明显的，与两组正常胰岛细胞和导管结构相连。
图4显示了感染后7天的火鸡胰腺切片。具有严重炎性浸润(*)的腺泡细胞(箭头)的弥漫性和严重坏死。
图5显示了火鸡胰腺切片。大多数胰腺被淋巴结和具有一些胆管增生的淋巴结和纤维结缔组织所代替。
图6显示了感染后4天的火鸡胰腺切片。禽流感核蛋白(NP)的免疫组化。阳性细胞核和细胞质在坏死的腺泡细胞和导管上皮中明显。
图7显示了hCM和HPDE6细胞中A/New Caledonia/20/99(H1N1)和A Wisconsin/67/2005(H3N2)的胰腺细胞系的复制动力学。使用各种病毒以MOI＝0.001感染hCM和HPDE6细胞。在感染后第24、48和72小时，收获来自三个感染的和一个模拟感染的对照孔的上清液用于病毒分离和qRRT-PCR分析。图A显示了hCM和HPDE6中H1N1的病毒分离结果。图B显示了hCM和HPDE6中H1N1的qRRT-PCR结果。图C显示了hCM和HPDE6中H3N2的病毒分离结果。图D显示了hCM和HPDE6中H3N2的qRRT-PCR结果。所有结果都表示三个独立实验的平均值加标准差。
图8显示了hCM和HPDE6细胞中H1N1(a,b)和H3N2(e,f)流感病毒NP表达(56KDa)的Western印迹分析。在感染前(t0)和感染后24(t24)、48(t48)和72(t72)小时收集样品。β-肌动蛋白(42KDa)用作加样对照以确保对各样品(c、d、g和h)测试相同量的蛋白。
图9显示了HPDE6阴性对照的细胞核染色(20X)(图A)。对细胞进行DAPI染色以显示与DNA的结合并使用伊文思蓝(Evans Blue)作为对比。图B显示了感染后24小时的HPDE6(20X)。观察了来源于病毒感染的流感病毒NP蛋白(图像中央)。图C显示了HCM阴性对照。图D显示了感染后24小时的hCM(20X)，在图像中央观察到色彩鲜艳的来源于病毒感染的流感病毒NP蛋白。
图10显示了人胰岛中M基因的RRT-PCR数据：具有CI(置信区间)的双向二次预测图，其针对胰岛中获自H1N1和H3N2的RRT-实时Ct值，4.8x103PFU/孔胰岛细胞感染。对于各病毒，显示了存在TPCK(第一栏)或不存在TPCK(第二栏)的情况下胰岛团块和上清液中从感染日(t0)至第10天(t5)的Ct趋势以及先前两种情况的平均值(第三栏)。
图11显示了胰岛中具有胰蛋白酶(TPCK+)或不具有胰蛋白酶(TPCK-)的情况下H1N1感染的Western印迹NP结果。流感病毒核蛋白显示为56KDa的条带。
图12.在人胰岛中通过原位杂交检测病毒RNA。使用H1N1和H3N2感染胰岛，添加含有4.8x103pfu/孔的病毒稀释物的100μl病毒悬浮液。模拟的未感染胰岛作为阴性对照。图A：感染后两天，添加快速红碱性磷酸酶底物后，由于形成有色沉淀物，在细胞包埋的胰岛上检测到存在病毒RNA分子。随后使用标准明场或荧光显微镜(40X)观察结合的病毒mRNA。箭头：病毒mRNA阳性细胞。图B-C，感染后五天，进行基于多重荧光的原位杂交并在裂解后将胰岛细胞涂布在载玻片上。使用卡尔蔡司Axiovert 135TV荧光显微镜评估病毒RNA、胰岛素、淀粉酶和CK19阳性细胞。使用IN细胞评估软件进行定量。各点代表一个系统性随机视野上定量的阳性细胞百分比。显示了来自两个实验的结果。使用秩和U检验(Mann-Whitney Utest)进行统计分析。
图13.病毒RNA和胰岛素/淀粉酶/CK19定位。该图显示了多重组织学数据。使用H1N1和H3N2感染胰岛，添加含有4.8x103pfu/孔的病毒稀释物的100μl病毒悬浮液。感染后五天，如上文所述进行基于多重荧光的原位杂交。左图：红色信号对应于存在流感病毒RNA，绿色信号对应于存在胰岛素、淀粉酶或CK18转录本(63x)。白色箭头：双重阳性细胞。右图：使用卡尔蔡司Axiovert 135TV荧光显微镜评估病毒RNA、胰岛素、淀粉酶和CK19阳性细胞。使用IN细胞评估软件进行定量。各点代表一个系统性随机视野上定量的阳性细胞百分比。显示了来自两个实验的结果。
图14.使用人甲型流感病毒感染后的胰岛存活和胰岛素分泌。使用H1N1和H3N2感染胰岛，添加含有4.8x103pfu/孔的病毒稀释物的100μl病毒悬浮液。模拟的未感染胰岛作为阴性对照。在感染后第2、5和7天评价胰岛的活力。图A显示了感染后5天石蜡包埋的胰岛的光学显微镜照片(20x)(上图)。使用活/死试验评估活力(下图)。使用IN细胞评估软件进行定量。各点代表一个随机视野上定量的死细胞百分比。显示了来自两个实验的结果(各自10个视野)。图B显示了在存在或不存在人甲型流感病毒的情况下培养两天后分离的胰岛的胰岛素分泌。该图显示了使用葡萄糖(2-20mM)刺激后胰岛素释放，数据以胰岛素分泌指数显示，其计算方法为高葡萄糖孵育终点处胰岛素浓度与低葡萄糖孵育终点处胰岛素浓度之比，n＝2。
图15.人甲型流感病毒感染诱导的细胞因子/趋化因子表达概况修饰。使用H1N1和H3N2感染胰岛，添加含有4.8x103或4.8x102pfu/孔的两种病毒稀释物的100μl病毒悬浮液。模拟的未感染胰岛作为阴性对照。从感染日(t0)开始每48小时收集一次样品直至第10天(t10)。收集上清液并对50种细胞因子进行试验。图A显示了胰岛细胞因子/趋化因子概况中病毒诱导的修饰。数据表示为培养期间检测的各因子相对于模拟感染胰岛的最大增加倍数(n＝2)。虚线：5倍增加阈值。图B显示了在存在或不存在H1N1和H3N2的情况下十天培养期间IFN-γ诱导的趋化因子CXCL9/MIG、CXCL10/IP-10浓度。
图16.在受感染鸟类的胰腺和肺中通过RRT-PCR检测流感病毒M基因。
图17.胰岛素的免疫组化。胰腺，火鸡。不同时间点处H3N7感染前后的代表性胰岛结构。
图18.受体分布概况。hCM、HPDE6和MDCK细胞上α-2,3和α-2,6-连接的唾液酸受体的表达。阴影区域代表使用α-2,3或α-2,6-特异性凝集素标记的细胞，而未填充的区域代表未标记的对照细胞。每个细胞系记录最少5000个事件。
图19.胰腺细胞系中的禽流感病毒复制动力学。hCM和HPDE6细胞中A/火鸡/意大利/3675/1999(H7N1)和A/火鸡/意大利/2962/2003(H7N3)的复制动力学。使用MOI＝0.01的各禽病毒在感染后第24、48和72小时感染hCM和HPDE6细胞，收获来自三个感染孔和一个模拟感染对照孔的感染后上清液用于病毒分离和qRRT-PCR。(A)hCM和HPDE6中H7N1的qRRT-PCR结果。(B)hCM和HPDE6中H7N3的qRRT-PCR结果。(C)hCM和HPDE6中H7N1的病毒分离结果。(D)hCM和HPDE6中H7N3的病毒分离结果。所有结果都表示为三个独立实验的平均值加标准差。
图20.胰腺细胞系中靶向病毒NP蛋白的免疫荧光。(A)hCM阴性对照。(B)感染后24小时的hCM(20X)。(C)HPDE6阴性对照的细胞核染色(20X)。蓝色对应于与DNA结合的DAPI染料，而红色是由于伊文思蓝对比。(D)感染后24小时的HPDE6(20X)。绿色信号对应于存在来源于病毒感染的流感病毒NP蛋白。
图21.选择的细胞因子/趋化因子，检测限和变异系数(试验内％CV和试验间％CV)。
图22.病毒脱落和病毒血症数据。
具体实施方式
下文的非限制性实施例中更详细地描述了本发明的某些方面。提供以下实施例的目的是向本领域普通技术人员公开和描述如何制备和使用本发明，这些实施例不意在限制发明人认为的发明范围，也不代表下述实验是所进行的所有或仅有的实验。努力保证所用数值(如含量、温度等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。
在该研究中，发明人探索了动物模型中病毒感染对于胰腺内分泌功能的作用，并进行了体外实验以建立胰腺起源的人细胞中甲型流感病毒感染的发生、程度和作用。对于体内研究，发明人选择火鸡作为模型，因为火鸡对流感感染高度易感且通常观察到作为死后损伤的胰腺损伤。对于体外研究，发明人选择了A/New Caledonia/20/99(H1N1)和A/Wisconsin/67/05(H3N2)，因为这些病毒已在人中长期流行并且现有的流行病学数据适用于回顾性研究。这些毒株用于感染已建立的人胰腺细胞系(包括人胰岛素瘤和胰腺导管细胞系)和人胰岛的原代培养物。
体内实验
甲型流感病毒起源于野生鸟类储主并感染多种宿主(包括野生和家养的鸟类)。这些病毒也可感染相当数量的哺乳动物，其中这些病毒不会被建立。后者中包括猪科动物、马科动物、鼬科动物、海洋哺乳动物、犬科动物、猫科动物和人。取决于所涉及的毒株，IAV引起全身性或非全身性感染。这些全身性疾病大部分出现在鸟类中并称作高致病性禽流感(HPAI)。其特征是，在大部分受感染动物中，生命器官中具有广泛的病毒复制并在临床迹象出现的数天内死亡。迄今为止最普遍地出现在鸟类和哺乳动物中是非全身性形式，且其特征是轻度的呼吸和肠迹象。为将其与HPAI区分，在鸟类中其称为低致病性禽流感(LPAI)。该不同的临床表现是，非全身性甲型流感病毒只能够在胰蛋白酶或胰蛋白酶样酶存在的情况下进行复制，所以其复制被认为限于呼吸道和肠道。
禽类来源的IAV具有胰腺取向[5,88,89,90]。坏死性胰腺炎常见于感染了HPAI的野生和家养鸟类中[91,92,93,94]并且HPAI的全身性性质与这些发现相符。相反地，难以解释LPAI病毒的胰腺建群，其常见于经历感染的鸡和火鸡[95,96,97]。
本研究的目的是确定在没有先前适应的情况下，获自疫情现场的两种天然非全身性禽流感病毒在年轻火鸡的实验性感染后是否会导致内分泌或外分泌胰腺损伤。
动物
本研究中使用了68只一天龄时购自商业农场的雌性肉火鸡。实验期间，鸟类饲养在负压、高效微粒空气(HEPA)过滤的隔离箱中。进行感染前，将动物饲养3周以允许适应和生长、自由采食食物和水并通过翼标签来鉴定。
病毒
使用两种意大利流行期间分离的低致病性禽流感病毒(LPAI)进行实验感染：A/火鸡/意大利/3675/1999(H7N1)和A/火鸡/意大利/2962/2003(H7N3)。两种病毒都显示在天然感染的鸟类中引起胰腺损伤。经由尿囊腔接种9天龄胚胎无特定病原(SPF)鸡蛋来生产禽流感病毒的原料。在接种后48小时收获尿囊液，分装并在-80℃下储存直至使用。对于病毒效价，在SPF胚胎鸡蛋中接种100μl 10倍稀释的病毒悬液并根据Reed和Muench公式计算胚胎感染剂量中值(EID50)。
实验设计
将动物分成三个实验组(A(H7N1)、B(H7N3)和K(对照))。组A和B各自包含24只动物，经由口鼻途径使用0.1ml的分别含有106.83EID50的A/火鸡/意大利/3675/1999(H7N1)和106.48EID50的A/火鸡/意大利/2962/2003(H7N3)的尿囊液对其进行感染。组K包含20只动物，其经由口鼻途径接受0.1ml的阴性尿囊液作为阴性对照。所有的鸟均每天观察两次临床迹象。在感染后第0、3、6、9、13、15、20、23、27、31、34、41和45天时使用肝素化注射器从所有动物的肱静脉中收集血液以测定血浆中的葡萄糖和脂肪酶水平。在感染后(p.i.)第2和3天，收集气管拭子以评价病毒复制。在感染后第3天，同样收集血液以测定血液中是否存在病毒RNA。在感染后第4和7天，人道地处死来自各感染组的两只鸟并检测胰腺和肺中是否存在病毒RNA并对其进行组织病理学和免疫组化分析。类似地，在感染后第8和17天，处死来自各实验组的一个对象并收集胰腺以进行组织学和免疫组化研究。为此，发明人选择了同样显示脂肪酶水平增加的高血糖症对象。
生物化学分析
在含有作为抗凝血剂的冻干的肝素锂的Gas
Figure GDA0002794378750000361
23G儿科注射器中收集血液样品。在各取样点，收集0.3ml的血液并在4℃下冷藏直至使用。为获得血浆，立即对样品在4℃下1500xg离心15分钟。为测定血浆中葡萄糖和脂肪酶的水平，将市售可得的试剂盒(葡萄糖HK和LIPC(Glucose HK and LIPC)，德国曼海姆的罗氏诊断公司(Roche DiagnosticsGmbH))应用于计算机化系统Cobas c501(瑞士巴塞尔的H-R有限公司(F.Hoffmann-LaRoche Std))。葡萄糖HK测试是基于己糖激酶酶促反应。该反应的线性是0.11-41.6mmol/L(2-750mg/dL)，且其分析灵敏度是0.11mmol/L(2mg/dL)。LIPC测试是基于线性为3a 300U/L且分析灵敏度为3U/L的比色酶促反应。
分子测试
通过用于鉴定流感病毒基质(M)基因的RRT-PCR的方式测试气管拭子、血液样品和器官(胰腺和肺)的病毒RNA。
RNA提取
使用市售可得的试剂盒“NucleoSpin RNA II(MN公司(Macherey-Nagel))”从100μl血液中并使用用于自动提取的Ambion MagMax-96 AI-ND病毒RNA分离试剂盒从50μl含磷酸盐缓冲盐水(PBS)的气管拭子悬液中提取病毒RNA。对150mg匀浆的肺和胰腺组织进行离心并使用NucleoSpin RNA II(MN公司)从100μl澄清的悬液中提取病毒RNA。
一步法RRT-PCR
使用参考文献98中公开的靶向甲型流感病毒中保守的基质(M)基因的引物和探针扩增分离的RNA。向由300nM正向引物和反向引物(分别是M25F和M124-R)和100nM荧光标记探针(M+64)组成的反应混合物中添加5μl的RNA。使用商业试剂盒QuantiTect MultiplexRT-PCR试剂盒(德国希尔敦的凯杰公司(Qiagen))在25μl的终体积中进行扩增反应。使用以下实验方案进行PCR反应：50℃20分钟，95℃15分钟，随后40个循环的94℃45秒和60℃45秒。根据生产商的说明使用Mega Short Script 7(高产量转录试剂盒，安碧公司(Ambion))获得体外转录的目标RNA，通过NanoDrop 2000(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))进行定量并用于创建标准曲线以进行病毒RNA定量。为检测分离的RNA的完整性，还使用一组内部设计的引物扩增β-肌动蛋白基因(引物序列可根据要求提供)。反应混合物由300nM的正向和反向引物和1X的EvaGreen(意大利耶西的埃克斯普莱拉公司(Explera))组成。使用市售试剂盒Superscript III(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen))在25μl的终体积中进行扩增反应。使用以下实验方案进行PCR反应：55℃30分钟，94℃2分钟，随后45个循环的94℃30秒和60℃1分钟。
组织学和免疫组化
切割福尔马林固定、石蜡包埋的胰腺切片(厚度为3μm)。使用H&E(马里兰州德国镇的希斯托瑟夫公司(Histoserv,Inc.))对载玻片进行染色。使用SPOT ADVANCED软件(4.0.8版，密歇根州斯特灵海茨的诊断仪器公司(Diagnostic Instruments,Inc.))拍摄代表性照片。流感IHC的试剂和方法是：多克隆抗体抗甲型流感病毒核蛋白、PBS/2.5％BsA中1:100稀释的小鼠抗甲型流感(NP亚型A，克隆EVS 238，欧洲兽医实验室)，室温下反应1小时；PBS/2.5％BsA中1/200稀释的二抗山羊抗小鼠IgG2a HRP(南方生物技术公司(SouthernBiotech))，室温下反应1小时；将载玻片在37℃下在胰蛋白酶(试剂盒消化-全部；英杰公司)中孵育10分钟以进行抗原修复；内源性过氧化酶用3％H2O2封闭，室温下反应10分钟，在与一抗孵育前，使用PBS/5％BSA进行封闭步骤，室温下反应20分钟。DAB用作发色团(DC公司(Dakocytomation)，参考编码K3468)。胰岛素和胰高血糖素的IHC：多克隆豚鼠抗猪科动物胰岛素，1:50(A0564，加利福尼亚卡平特里亚的大科公司(Dako))；多克隆兔抗胰高血糖素，1:200(NCL-GLUC，英国纽卡斯尔的徕卡公司(Novocastra))用作检测系统，En Vision Ap(K1396，加利福尼亚卡平特里亚的大科公司)和核固红(大科公司K1396)用于甲型流感染色；En Vision+系统-HRP标记的聚合物抗兔(K4002，加利福尼亚卡平特里亚的大科公司)和DAB(K3468，加利福尼亚卡平特里亚的大科公司)用于胰岛素和胰高血糖素染色。
体外试验
这些实验的目的是确立人流感病毒是否能够在人胰腺来源的人原代和已建立的细胞系上生长，以及其复制对原代细胞的作用。
细胞系
将马达二氏犬肾(MDCK)细胞维持在附加有10％胎牛血清(FBS)、1％200mM L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素/制霉菌素(pen-strep-nys)溶液的阿氏改良伊格尔培养基(AMEM，西格玛公司(Sigma))中。人胰岛素瘤细胞系CM[99]和永生化人导管上皮细胞系HPDE6[100]维持在附加有1％L-谷氨酰胺、1％抗生素和FBS(分别为5％和10％)的RPMI(吉布可公司(Gibco))中。MDCK和HPDE6以1:10和1:4的移种比例每周传代两次，而CM以1:4的比例每周分裂三次。所有细胞都在37℃、5％CO2下维持在潮湿培养箱中。
原代细胞
根据Ricordi的方法在圣拉斐尔科学研究所(San Raffaele ScientificInstitute)中从多器官供体的胰腺分离并纯化胰岛。不适用于移植的纯度大于80％±8％(平均值±SD，n＝6)的胰岛制备物在得到当地伦理委员会批准后使用。以150个胰岛/ml将细胞接种于24孔板和25cm2烧瓶并在37℃、5％CO2下维持在最终清洗培养基中(弗吉尼亚州玛纳萨斯的密迪亚泰克公司(Mediatech,Inc.))。
CM和HPDE6细胞上的唾液酸受体表征
通过流式细胞术确定是否存在α-2,3和α-2,6-连接的唾液酸残基。胰蛋白酶消化后，使用PBS-10mM HEPES(PBS-HEPES)对1x106个细胞清洗两次，1200RPM下5分钟，随后根据生产商说明书使用亲和素/生物素封闭试剂盒(美国载体实验室公司(VectorLaboratories))处理，其中细胞与100μl的各溶液孵育15分钟。通过将细胞与100μl的生物素化山槐素凝集素II(载体实验室公司)(5ug/ml)孵育30分钟随后与100μl的PE-链霉亲和素(BD生物科学公司(BD Biosciences))孵育30分钟(4℃下黑暗中)，或者与100μl荧光素偶联的欧洲接骨木凝集素(载体实验室公司)(5ug/ml)孵育30分钟，分别检测α-2,3和α-2,6-唾液酸连接。在所有封闭和染色步骤之间使用PBS-HEPES对细胞清洗两次，并在分析前将细胞重悬于含有1％福尔马林的PBS中。为确定凝聚素的特异性，在亲和素/生物素封闭前使用1U/mL来自产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的神经氨酸酶(西格玛公司)对细胞预处理一小时。在BD Facscalibur或BD LSR II(BD生物科学公司)上分析样品并记录最少5000个事件。
病毒和病毒效价
分别称作H1N1和H3N2的A/New Caledonia/20/99(HlNl)和A/Wisconsin/67/05(H3N2)的原料在细胞培养物或胚胎鸡蛋中生产。通过标准空斑试验对病毒进行滴定。
为增殖IAV，使用PBS对单层培养的MDCK细胞清洗两次并使用A/NewCaledonia/20/99(H1N1)或A/Wisconsin/67/05(H3N2)以0.001的MOI进行感染。在35℃下进行病毒吸附1小时后，将细胞清洗两次并与附加有TPCK处理的胰蛋白酶(1μg/ml，美国新泽西州雷克伍德的沃明顿生物化学公司(Worthington Biochemical Corporation))的不具有血清的DMEM在35℃下孵育。在感染后48小时回收上清液。将在意大利流行期间分离的低致病性禽流感病毒(LPAI)H7N1 A/火鸡/意大利/3675/1999和H7N3 A/火鸡/意大利/2962/2003生长在2.1.2部分所述的9天龄胚胎无特定病原体(SPF)鸡蛋中。对于病毒效价，如先前所述进行空斑试验[101]。简言之，对以2.5x105个细胞/孔置于24孔板中的MDCK单层细胞使用不含血清的DMEM清洗两次，并使病毒的连续稀释物吸附至细胞上，持续1小时。使用附加有TPCK处理的胰蛋白酶(1μg/ml)的MEM 2X-艾维素(美国宾夕法尼亚州费城的FMC生物聚合物公司(FMCBiopolymer))混合物覆盖细胞。在感染后48小时进行结晶紫染色并对可见的空斑进行计数。
胰腺细胞系中的病毒复制动力学
对接种在24孔板上的半融合单层HPDE6和CM细胞使用PBS清洗两次，随后使用200μl接种物/孔以0.001的MOI进行感染。
吸附一小时后移除接种物并使用1ml含有0.05μg/ml TPCK-胰蛋白酶(西格玛公司)的无血清培养基代替。在感染后第1、24、48和72小时，收获来自三个感染孔和一个对照孔的上清液，并通过使用50％组织培养感染剂量(TCID50)试验进行病毒分离以及通过对基质基因的实时RT-PCR检测来测定病毒效价。所有复制动力学实验都重复三次。
TCID50
对接种至96孔板上的融合单层MDCK细胞在无血清培养基上清洗两次并使用无血清MEM中50μl的10倍连续稀释样品进行接种。在吸附一小时后，向各孔添加另外50μl含有2μg/ml TPCK-胰蛋白酶的无血清培养基。在37℃下孵育三天后，通过光学显微镜对感染的细胞进行目视检查来测定CPE评分。使用Reed和Muench的方法测定TCID50值。
胰岛中的生长试验
使用H1N1和H3N2流感病毒感染胰岛，添加4.8x102或4.8x103pfu/孔。在添加和不添加TPCK胰蛋白酶(西格玛公司)(1μg/ml)的情况下进行病毒生长。未感染的胰岛作为阴性对照。从感染日(t0)开始每48小时收集一次样品直至第10天(t5)。对各样品150g离心5分钟。收集上清液并在-80℃下储存以用于定量实时PCR、病毒效价和细胞因子表达概况。对团块使用PBS清洗两次，在-80℃下储存并随后进行实时PCR、Western印迹和MDCK细胞中的病毒效价，参见上文。所有团块和上清液都以三次重复进行实时PCR测试。
检测来自胰腺组织的病毒RNA
根据生产商说明书使用市售的试剂盒“NucleoSpin RNA II”(MN公司)分离来自胰岛团块和上清液的总RNA。在60μl的洗脱缓冲液中洗脱RNA并使用用于流感基质基因的一步法RRT-PCR(参见下文)进行测试以评估病毒生长。
使用针对各病毒和试样的二次回归模型(Ct＝β0+β1TPCK-胰蛋白酶+β2时间+β3时间2+β4时间·TPCK-胰蛋白酶+β5时间2·TPCK-胰蛋白酶)以分析随时间变化的Ct值趋势。评估了TPCK存在的影响以及其存在与时间点之间的相互作用。该回归模型考虑了置信区间(CI)计算中各观察时间的重复测量之间组内关联的影响。进行残留物预测后分析以验证模型的有效性。
一步法RRT-PCR
根据上文2.1.5部分所述的实验方案应用靶向保守的甲型流感病毒基质(M)基因的定量实时PCR。为检查分离的RNA的完整性，还使用先前所述的引物和探针扩增β-肌动蛋白基因[102]。反应混合物由400nM的正向和反向引物(分别是引物-β作用内含子(Primer-beta act intronic)和引物-β作用反向(Primer-beta act reverse))和200nM的荧光标记探针(5'-Cy5 3'-BHQl)组成。使用商业试剂盒QuantiTect
Figure GDA0002794378750000401
RT-PCR试剂盒(德国希尔敦的凯杰公司(Qiagen))在25μl的终体积中进行扩增反应。使用以下实验方案进行PCR反应：50℃20分钟，95℃15分钟，随后45个循环的94℃45秒和55℃45秒。
Western印迹分析
将细胞团块重悬在裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8；1.0％SDS；350mM NaCl；0.25％曲通-X；蛋白酶抑制剂混合物)中，随后混合并在冰上孵育30分钟。将悬浮液超声三次，每次5分钟，随后最高速离心10分钟。进行Bradford测试以计算各样品的总蛋白浓度。基于该计算，96℃下在分离缓冲液(50mM Tris-Cl；pH 6.8；5％β-巯基乙醇，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)中处理等量的蛋白/样品5分钟，随后使用电泳缓冲液(25mM Tris，250mM甘氨酸，0.1％SDS)在12％聚丙烯酰胺凝胶中电泳。SDS-PAGE后，使用转移缓冲液(39mM甘氨酸，48mM Tris碱，0.037％SDS，20％甲醇)通过电印迹法将蛋白从凝胶转移至免疫印迹PVD膜(伯乐公司(Bio-rad))上。使用PBS对膜清洗两次，随后在含5％奶粉的PBS中4℃孵育过夜。使用PBS清洗后，将膜在含0.05％吐温-20(西格玛公司)、5％印迹级封闭物脱脂奶粉(伯乐公司)和小鼠单克隆甲型流感病毒核蛋白抗体(阿柏堪穆公司(Abcam))的PBS中室温下振荡孵育1小时。β肌动蛋白抗体(阿柏堪穆公司)用作加样对照。在与一抗孵育后，将膜与针对小鼠IgG的辣根过氧化物酶-(HRP)兔多克隆二抗(阿柏堪穆公司)接触1小时，随后使用HyperfilmTM ECL(安法玛西亚生物科技公司(Amersham Biosciences))通过ECL显示阳性条带。
胰腺细胞系中病毒生长的观察
在盖玻片中生长HPDE6和hCM细胞至80％融合，并使用含0.05mg/ml TPCK的H1N1或H3N2病毒以0.1的M.O.I.进行感染。固定细胞并在感染后0、24、48和72小时使用冰冷的丙酮(80％)透化细胞。在使用含有1％BSA的PBS进行封闭后，将细胞在潮湿培养箱中与FITC偶联的针对甲型流感病毒核蛋白的小鼠单克隆抗体(阿柏堪穆公司)在含有1％BSA和0.2％伊文思蓝的PBS中37℃孵育1小时。倒出染色溶液并对细胞清洗三次。使用DAPI(西格玛公司)对阴性对照细胞的细胞核进行染色，随后使用PBS清洗并在UV光下观察。
胰岛中病毒RNA的原位观察
为观察定位在细胞内的病毒RNA，在感染后第2、5和7天收获纯化的人胰岛。随后将胰岛在不含甲醇的10％福尔马林中孵育24小时，沉积在平底试管底部，包埋在琼脂中以将其固定，脱水并最终包埋在石蜡中。以4mm对胰岛样品进行切片。对于共定位实验，在感染后5天收获胰岛，使用胰蛋白酶样酶(12605-01，TrypLETM Express，加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)进行酶促消化至单细胞并涂布在载玻片上。根据生产商说明书，使用Quantigene ViewRNA技术进行原位杂交，其基于多个寡核苷酸探针和支链DNA信号扩增技术(美国加利福尼亚州圣克拉拉市的昂飞公司(Affymetrix))。对使用的探针组进行设计以与H1N1/A/New Caledonia/20/99病毒(GenBank序列：DQ508858.1)杂交。由于探针所覆盖区域的序列特异性，相同的组也识别H3N2病毒RNA，如预实验中所确认的那样。为鉴定胰岛中的细胞类型，使用以下Quantigene探针：β细胞的胰岛素(INS基因，NCBI参考序列：NM_000207)；内分泌细胞的α-淀粉酶1(AMY1A基因，NCBI参考序列：NM_004038)；导管细胞的细胞角蛋白19(KRT19基因，NCBI参考序列：NM 002276)。使用IN细胞评估软件(GE医疗保健英国有限公司(GE Healthcare UK Ltd))在8个随机选定的视野内对各探针阳性的细胞进行定量。
测定感染的胰岛中的胰岛素分泌
将每柱100个胰岛等同物的等分试样(未感染的或被H1N1/A/New Caledonia/20/99和H3N2/A/Wisconsin/67/05感染)加载至具有低葡萄糖浓度(2mM)培养基的Sephadex G-10柱上并在37℃下预孵育1小时。预孵育后，使胰岛依次接触低(2mM)和高(20mM)葡萄糖浓度，各孵育1小时。在各孵育终点处收集上清液，添加蛋白酶抑制剂混合物(印第安纳州印第安纳波利斯的罗氏生物化学公司(Roche Biochemicals))并在-80℃下储存。根据生产商说明书，使用胰岛素酶连免疫测定试剂盒(瑞典乌普萨拉的莫克迪亚AB公司(Mercodia AB))测定胰岛素内容物。以高葡萄糖孵育终点处胰岛素浓度与低葡萄糖孵育终点处胰岛素浓度之比计算胰岛素分泌指数。
细胞因子表达概况
使用基于xMAP技术的多重珠基试验测量H1N1和H3N2病毒诱导人胰岛中胰岛素表达的能力(Bio-Plex；美国加利福尼亚州赫克里斯的伯乐实验室公司(BioradLaboratories))。使用病毒感染或模拟感染胰腺的平行孔。在感染前和感染后2、4、6、8、10天收集培养基上清液并测试48种细胞因子。图21显示了选定的细胞因子、细胞因子/趋化因子的变异系数(试验内％CV和试验间％CV)和检测限。
感染后细胞死亡的评估(活/死试验)
使用活/死细胞试验试剂盒(L-3224，荷兰莱顿的分子探针公司(MolecularProbes,Inc.))测量感染后胰岛细胞的活力。该试验基于使用两种荧光探针同时测定活细胞和死细胞。利用黄绿素的酯酶活性将活细胞染成绿色，通过溴乙啡锭二聚体-1将死细胞的细胞核染成红色。使用胰蛋白酶样酶(12605-01，TrypLETM Express，加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)将培养五天后收获的胰岛进一步酶促消化至单细胞。根据生产商说明书，将单细胞与标记溶液在室温下和黑暗中孵育30分钟，涂布在载玻片上并使用卡尔蔡司Axiovert 135TV荧光显微镜进行评估。使用IN细胞评估软件(GE医疗保健英国有限公司)在细胞离心涂片制备物上进行死细胞的分析。使用10个系统性随机视野对各类中的阳性细胞进行定量。
统计分析
数据通常表示为平均值±标准差或中值(最小值-最大值)。当参数正态分布时，使用斯氏T检验评价参数之间的差异，当参数非正态分布时，使用秩和U检验。卡普兰-迈耶和/或Cox回归分析用于分析期间事件的发生。p值小于0.05被认为表示统计学上显著。使用用于Windows的SPSS统计数据包(美国伊利诺伊州芝加哥的SPSS公司)进行数据分析。
结果
体内实验
临床疾病
在感染后第2天，来自H7N1[A]和H7N3[B]攻击的组的火鸡显示典型的LPAI感染临床迹象，如结膜炎、鼻窦炎、腹泻、羽毛褶皱和抑郁。轻度症状在感染后第20天复原。仅有两个来自组A的对象直至感染后第30天仍显示鼻窦炎。两组中的死亡率都较低。组A的一个对象在感染后第8天死亡，而组B的一个对象在感染后第19天死亡。
病毒RNA的检测
对感染后第2天时收集自感染H7N1的17/20个对象和感染H7N3的19/20个对象以及感染后第3天时收集自所有动物的气管拭子进行病毒RNA检测。还在感染后第3天时从组AH7N1的两个对象和组B H7N3的四个对象处检测病毒RNA(图22)，并在感染后第4和7天收集的胰腺和肺中检测病毒RNA(图16)。从未感染的对照中没有检测到病毒RNA。
生物化学分析
在用以显示代谢变化的维生素间(intra-vitam)收集的血液样品中，在感染后第3和第9天之间，H7N1(12/20)和H7N3(10/20)攻击的火鸡中血浆脂肪酶水平显著升高(对照动物数值的10-100倍)(图2)，而未感染的对照中无一显示脂肪酶水平的变化(20/20；p<0.001，皮尔森X2检验(Pearson Chi-Square))。在受感染的动物中，第3天时血液中存在病毒RNA与脂肪酶增加之间存在明确的趋势(危险比2.51，95％置信区间0.92-6.81；p 0.07)。在所有病例中正常范围内的脂肪酶水平都迅速重新建立，感染后第23天的理由，决定在第23天时不再评价该参数(图1)。在感染后9天，A组的5只动物和B组的5只动物发生高血糖症(图2)。其中，两个对象在整个实验期间都维持高血糖症状态，而其他所有动物中的血糖水平都恢复到与对照水平相似(图1)。感染后第3与第9天之间脂肪酶的增加与感染后第9天高血糖症发生之间存在明显的联系。实际上，高血糖症仅存在于感染后出现高脂肪酶值的对象中，而从未出现在具有正常脂肪酶水平的对象中(分别为10/22和0/18，p＝0.001)，其中发生高脂血症与高血糖症之间的时间间隔中值是4.5天(最小-最大：3-7)。
组织病理学和免疫组化
对照火鸡中无一出现显著的组织学变化或针对AIV的阳性免疫组化反应(图3)。在所有受感染的鸟中，组织病理学损伤是明显的，但在感染后不同时间收集的样品中存在显著差异。在早期(感染后4-8天)，具有坏死的腺泡细胞、严重炎性浸润的急性胰腺炎(由巨噬细胞、异嗜白细胞、淋巴细胞和浆细胞组成)在健康/未涉及/未感染的组织区域上占优势(图4)。从感染后第8天开始，这些坏死的炎性损伤逐渐被具有轻度纤维素增生的淋巴浸润和导管代替。在较后阶段(感染后第17天)出现广泛的纤维化，其中淋巴结被胰腺实质代替，且器官正常结构的破坏是显著的(图5)。在所有实验阶段期间观察到可变数目的坏死腺泡细胞。在任何病例和阶段中均未观察到阻塞性导管损伤。
实验期间，通过免疫组化染色，变性和坏死的腺泡细胞显示与病毒核蛋白抗原抗体的特异性反应(图6)。一些血管内皮细胞还显示阳性反应，以及偶尔的导管上皮细胞。在未感染的对照中，胰腺的胰岛素阳性组织单个地或以多种形状和尺寸的小胰岛组的形式分布在外分泌部分的间质(intersititium)中(图17A)。在感染后第8天，胰岛的正常结构被部分破坏且胰岛细胞数目减少。剩余的胰岛较小且扭曲，具有不规则轮廓或扩张的胰岛内毛细血管；胰岛素的细胞染色数目也减少：这些细胞显示扩大的细胞质并有时似乎具有粒状变性甚至坏死。纤维带出现在胰岛内，此时胰岛片段化且内分泌细胞的小簇和大簇移位(图17B)。在感染后第17天，分离的大簇内分泌胰岛素阳性细胞明显地包埋在代替腺泡组分的广泛纤维化之中或周围(图17C)。感染后第17天前，具有主要胰岛素免疫反应性的非常大(直径大于200μm)、通常不规则的胰岛样区域组明显地分布在广泛的坏死纤维化中(图17D、E)。
体外实验
人胰腺细胞系对人甲型流感病毒的易感性
研究了内分泌(hCM，胰岛素瘤)和导管(HPDE6)细胞系对H1N1/A/New Caledonia/20/99和H3N2/A/Wisconsin/67/05感染的易感性。
受体分布
hCM和HPDE6细胞系的凝集素染色显示了高水平的α-2,6唾液酸连接的唾液酸分子(人回归性病毒(human-tropic virus)所需要)以及α-2,3连接的残基(禽回归性病毒(avian-tropic virus)所使用)。hCM与山槐素凝集素II(α-2,3特异性)和欧洲接骨木凝集素(α-2,6特异性)孵育的平均峰强度大致相同，对两种受体都是约2.6x104。HPDE6也具有两种受体类型的高表达水平，其中SNA为3.7x104且MAA为1.6x104。还将MDCK细胞包括为两种受体类型的阳性对照系，因为这些细胞广泛用于人和禽来源病毒的分离。FACS分析显示MDCK表达的α-2,3受体水平与HPDE6类似，平均峰值强度接近1.8x104，而α-2,6表达等于hCM，平均荧光为2.5x104。因此，两种胰腺细胞系都可被认为以与MDCK相当的水平表达唾液酸受体，而对于hCM，人病毒受体的表达水平甚至更高(图18)。使用lU/ml来自产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的NA对所有细胞进行预处理导致两种凝集素类型的荧光下降，这确认了特异性(数据未显示)。
胰腺细胞系中的病毒复制动力学
使用H1N1和H3N2病毒以MOI＝0.001感染hCM和HPDE6细胞。通过光学显微镜观察受感染细胞，显示在hCM或HPDE6上感染后任意时间点处都没有细胞病变效应。TCID50结果显示72小时内HPDE6中病毒效价的持续增加，但H1N1病毒效价在感染后72小时时仅略高于感染后48小时。相反地，对于H1N1和H3N2分离物，hCM细胞中的病毒效价从感染后48小时至72小时期间非常接近(图7，A和C)。通过qRRT-PCR对病毒RNA复制进行检查发现，对于全部两种测试的病毒，两种细胞系中病毒复制在最多感染后72小时期间都持续增加(图7，B和D)。
虽然与人病毒相比使用了较高的M.O.I进行感染(M.O.I＝0.01)，但禽流感病毒在两种胰腺细胞系中都显示较低的复制水平(图19)，并且最多感染后48小时期间具有稳定的病毒RNA水平且感染后72小时时两种细胞系的病毒RNA水平都出现下降。基于RRT-PCR结果，hCM似乎对禽病毒更加敏感，因为“M基因”RNA的总量平均比HPDE6高2log(图19A，B)。这也得到了TCID50结果的确认(图19C，D)，其中两种病毒在hCM都达到了较高的效价。然而，在后者中，与H7N3相比，H7N1毒株显示了较高的复制效力。该结果未反映在RRT-PCR结果中，其中两种病毒都检测出相当的病毒RNA量。HPDE6中未观察到两种禽病毒之间病毒复制的显著差异。
用于病毒核蛋白检测的Western印迹
图8中报道了hCM和HPDE6细胞系中H1N1和H3N2流感病毒核蛋白的结果(a、b、e和f)。取决于病毒毒株或细胞类型，NP表达的趋势上未显示任何差异。在hCM以及HPDE6中，对于两种病毒，t0(感染前)时都未观察到预期的流感病毒核蛋白，而在感染后24小时(t24)、48小时(t48)和72小时(t72)时可以检测到。比较获自t24时与获自t48和t72时样品的条带，可观察到NP表达的升高。另一方面，用作上样对照的β肌动蛋白量在所有测试的样品中处于相同水平(图8c、d、g和h)。
靶向NP蛋白的免疫荧光
对于全部两种测试的病毒，在感染后24小时时，还通过来源于FITC偶联物的荧光信号在hCM中检测到了人流感病毒复制(图20A、B)，并且其在感染后48和72小时时随时间增加。没有观察到测试的病毒染色之间存在差异。HPDE6细胞中在感染后24小时时观察到两种病毒的荧光信号(图20，C，D)。同样，在这种情况下，标记的细胞数目在感染后48和72小时时持续增加，表明核蛋白表达随时间增强(数据未显示)。
人胰岛对人甲型流感病毒的易感性
回归模型显示在TPCK-胰蛋白酶存在或不存在的情况下，在团块或上清液试样中测试的两种病毒的Ct值都随时间显著下降(p<0.05)(图10)。统计学分析显示病毒效价随时间上升，其独立于病毒亚型和样品类型(团块或上清液)。有趣的是，对于在TPCK-胰蛋白酶存在的情况下生长的病毒，仅H1N1团块和上清液样品Ct值的下降程度显著高于没有外源性蛋白酶情况下获得的结果(p<0.01)(图10)。TPCK-胰蛋白酶似乎增强了H3N2病毒生长，但该差异未达到统计学显著性(p>0.10)(图11)。残留物预测后分析表明所用模型是适当的(数据未显示)。
进行原位杂交以显示胰岛细胞中定位的病毒RNA。该结果清楚地显示H1N1和H3N2感染后存在病毒RNA(图12A)。由于人胰岛原代培养物含内分泌和外分泌细胞，因此应用了基于荧光的多重原位杂交策略以测定胰岛中何种细胞受到感染和受感染细胞的数量。为此，合并不同标记的探针以同时分析病毒RNA和胰岛素、淀粉酶或细胞角蛋白19转录本，并且在杂交后，分解人胰岛并对细胞阳性进行定量。感染后五天，全部细胞中的0％、10.8％和4.3％分别在模拟、H1N1和H3N2感染的胰岛中显示对病毒RNA的阳性结果(p<0.001)(图12，B)。在H1N1阳性细胞中，49±27％对胰岛素染色呈阳性，26±16％对淀粉酶呈阳性，1.6±2.4％对CK19呈阳性，而25±21％对测试的转录本呈阴性。在H3N2阳性细胞中，40±23％对胰岛素染色呈阳性，20±20％对淀粉酶呈阳性，2.3±5％对CK19呈阳性，而41±45％对测试的转录本呈阴性(图12，C)。另一方面，在胰岛素阳性细胞中，H1N1和H3N2感染后5天，分别有14±10％和8±8％的胰岛素阳性细胞对病毒RNA呈阳性(p＝0.023)。在淀粉酶阳性细胞中，H1N1和H3N2感染后，分别有27±9％和9±6％的细胞对病毒RNA呈阳性(p<0.001)。在CK19阳性细胞中，H1N1和H3N2感染后，分别有3±4％和1.3±3％的细胞对病毒RNA呈阳性(p＝0.36)(图13)。
体外感染人甲型流感病毒的人胰岛中存活、胰岛素分泌和先天免疫的调节通过光学显微镜观察受感染胰岛并且活/死试验表明，在感染后任意时间点(第0-7天)都没有显著的细胞病变效应。感染后五天，未感染的细胞显示3.26％的总死亡率，H3N2为5.21％且H1N1为7.38％(p＝ns对比模拟感染的细胞)(图14)。此外，胰岛与H1N1和H3N2的接触都没有影响其对高葡萄糖应答的能力，如静态灌流系统中所测试的那样(图14)。
使用基于xMAP技术的多重珠基试验测量了H1N1和H3N2在人胰岛中诱导细胞因子/趋化因子表达的能力。以102 103pfu/孔用H1N1和H3N2感染人胰岛的平行孔(150个胰岛/孔)，或者进行模拟感染。在感染后五个时间点(0、4、6、8、10天)收集培养基上清液并对50种细胞因子进行试验。除三个例外(IL-1b、IL-5、IL-7)以外，所有细胞因子都显示可检测的表达。在模拟感染中，对于以下细胞因子检测到了最高浓度：CCL2/MCP1(最高25,558pg/ml，第4天)、ICAM-1(最高14,063，第10天)、CXCL8/IL-8(最高11,635pg/ml，第10天)、IL-6(8,452pg/ml，第4天)、CXCLl/GRO-a(最高8,581pg/ml，第4天)、VCAM-1(最高5,566pg/ml，第6天)、VEGF(最高3,225pg/ml，第10)、SCGF-b(最高1,427pg/ml，第6天)、HGF(最高1,195pg/ml，第6天)。MIF(最高806pg/ml，第6天)、G-CSF(最高794pg/ml，第6天)、CXCL9/MIG(最高448pg/ml，第6天)、GM-CSF(最高280pg/ml，第4天)、IL-2Ra(最高230pg/ml，第6天)、IL-12p40(最高215pg/ml，第6天)、M-CSF(最高212pg/ml，第10天)、LIF(最高185pg/ml，第6天)、CXCL4/SDF1(最高121pg/ml，第6天)显示较低但恒定的表达。CXCL10/IP-10、PDGF-BB、IL-IRa、IL-12p70、CCL11/嗜伊红粒细胞趋化蛋白、FGFb、CCL5/RANTES、CCL4/MIP-ip、CCL7/MCP-3、IL-3、IL-16、SCF、TRAIL、INFa2、INFg、CCL27/CTAK显示低但恒定的表达(最高10-100pg/ml)。非常低(最高<10pg/ml)但可检测的表达存在于IL-2、IL-4、IL-9、IL10、IL-13、IL-15、CCL3/MIP-1a、TNF-α、IL-17、IL-18、IL1a、β-NGF、TNF-β。与模拟感染的对照相比，在受流感病毒感染的细胞上清液中，两种炎性细胞因子(IL-6、TNFα)和六种炎性趋化因子(CXCL8/IL-8、CXCLl/GRO-α、CXCL9/MIG、CXCL10/IP-10、CCL5/RANTES、CCL4/MIP-1P)显示超过五倍的增加(图15，A)。在此之间，IFN-γ可诱导的趋化因子CXCL9/MIG、CXCL10/IP-10表现出对H1N1或H3N2感染的最强应答(超过100倍增加)。两种都在感染后6-8天达到峰值并显示对较高剂量病毒的较强应答(图15，B)。
结果总结
这项工作的目的是在体外细胞水平和体内组织水平评估胰腺细胞中的IAV复制并评价其结果。这些研究首次证明，人甲型流感病毒能够在人胰腺原代细胞和细胞系中生长。添加外源性胰蛋白酶似乎增强了病毒复制，但出乎意料地并非人胰腺原代细胞和细胞系中病毒复制所必需。发明人的体内结果确认了这些发现，其中两种非全身性IAV毒株能够在实验感染的幼禽胰腺中建群并具有反映内分泌和外分泌损伤的代谢结果。
在对动物，特别是经历全身性和非全身性感染的鸟类的多种天然和实验感染之后，已报道了IAV的胰腺建群(参见上文参考文献)。然而，没有人中胰腺感染的直接证据。本文中，发明人首次证明，出乎意料地，非全身性禽流感病毒引发严重的胰腺炎，导致与在鸟类中发生的糖尿病相当的反代谢状态(dismetabolic condition)。关于鸟类(包括幼禽)中胰腺内分泌和外分泌功能障碍的临床意义，可参见文献。关于内分泌功能，若干研究表明全部胰腺切除的鸟类患有严重的高血糖症，导致死亡[103]。如果小至1％胰腺质量的胰腺残留部分在原位残留，则可在食谷类鸟类中观察到瞬时(或可逆的)高血糖症状态，其中正常血糖在数周内重建[104,105]。这表明鸟类的胰腺组织具有显著的补偿潜能并且还受到以下事实的影响，即存在证据表明一些内分泌组织能够向胰腺外分泌胰岛素[106]。胰岛素是营养充足的鸟类中主要的激素，而胰高血糖素是禁食鸟类中主要的激素。本实验在自由进食的条件下进行，胰腺内分泌组分的损伤可能使其本身具有高血糖症。
关于外分泌功能，鸟类中胰腺炎的特征是不适、食欲不振、肠炎和抑郁。维生素内(intra-vitam)研究基于增加的血液脂肪酶浓度[105]。在该研究中，通过测量血流中的脂肪酶浓度并通过在不同时间点收集的胰腺中进行组织病理学检查来评价胰腺炎。正如其在哺乳动物中发生的那样，胰腺损伤确定了血液脂肪酶水平的快速增加，其是瞬时的且数值在感染后第15天恢复正常。有趣的是，显示血液中脂肪酶水平增加并因此可能出现最严重胰腺损伤的鸟类在随后的几天中表现出高血糖水平，其仅在一些情况下维持至实验终点。这与鸟类中糖尿病的临床和代谢表现一致。组织学研究清楚地显示胰腺外分泌部分的病毒复制，导致器官结构的纤维化和破坏。虽然清楚地显示研究中的两种分离物都在胰腺的腺泡组分中广泛复制，发明人无法确定胰岛中是否发生病毒复制。基于这些结果，发明人提出，流感病毒感染导致了严重的急性胰腺炎，其同时损伤了内分泌和外分泌功能。
目前关于流感病毒复制的知识显示，不具有HA蛋白的多碱基(multibasic)切割位点的流感病毒不会成为全身性。然而，在体内实验中病毒到达胰腺，且发明人出乎意料地在感染后第3天从2/20(组A-H7N1)和4/20(组B-H7N3)受感染火鸡中检测到病毒RNA。发明人假定，在靶器官(如肺和肠)中复制后，在一些个体中，少量病毒到达血液并因此到达胰腺。虽然检测的Ct值显示低水平的病毒RNA，但这通常导致发生胰腺炎(通过高脂血症在体内检测)。这转而在实验模型这导致高血糖症状态，与食谷类鸟类中出现的糖尿病一致。
该体外实验的结果显示，所有测试的IAV(禽来源(H1N1和H7N3)和人来源(H1N1Caledonia/20/99和H3N2 A/Wisconsin/67/2005))都能够在建立的胰腺细胞系和胰岛中生长。在内分泌和外分泌来源的细胞中都出现了病毒复制。这些研究还显示，胰腺细胞中存在α-2-3和α-2-6受体，表明人和禽流感病毒都可以在该器官中发现合适的受体。该研究中使用的人病毒不会诱导显著的胰岛细胞死亡，且该系统中胰岛素分泌似乎不受感染的影响。另一方面，细胞因子表达概况清楚地显示IAV感染能够在人胰岛中诱导强的促炎程序(pro-inflammatory program)。感染后，INF-γ可诱导的细胞因子MIG/CXCL9/和IP-10/CXCL10显示最高的增长。还释放了大量的RANTES/CCL5、MIPlb/CCL4、Groa/CXCLl、IL8/CXCL8、TNFα和IL-6。有趣地是，许多这些因子被描述为I型糖尿病发病机理中的关键调节因子[107]。最近，IP10/CXCL10被鉴定为前驱糖尿病动物和I型糖尿病患者的胰岛环境中体内表达的主要趋化因子，而RANTES/CCL5和MIG/CXCL9蛋白以较低水平存在于两种物种的胰岛中[108]。趋化因子IP-10/CXCL10吸引单核细胞、T淋巴细胞和NK细胞，且病毒[大鼠胰岛素启动子(RIP)-LMCV]导致的自身免疫型糖尿病的小鼠模型中胰岛特异性CXCL10表达加速了通过增强抗原特异性淋巴细胞的迁移进行的自身免疫[109]。这与某些发现一致，其中IP-10/CXCL10[110]或其受体(CXCR3)[111]的中和在相同的小鼠模型(RIP-LCMV)中预防了自身免疫疾病。NOD小鼠的研究表明前驱糖尿病阶段期间胰岛中IP-10/CXCL10，mRNA和/或蛋白的表达升高[112]。MIPlb/CCL4和IP-10/CXCL10水平的升高存在于最近经诊断患有I型糖尿病的患者血清中[113,114]。
发明人提出，如果流感病毒找到了前往胰腺的途径(通过人患者中检测到的病毒血症[115,116,117]或通过通过胰腺导管从肠道回流)，则病毒会发现允许的环境(permissive environment)。此时，病毒会遭遇属于器官的内分泌和外分泌组分的适当细胞受体和易感细胞。病毒复制会导致由于细胞因子风暴激活而产生的细胞损伤，这与糖尿病相关多种病症相关的损伤类似。因此，发明人相信，流感病毒感染会导致胰腺损伤，从而引起急性胰腺炎和/或I型糖尿病的发生。
结论
这些结果提供了流感病毒感染与I型糖尿病和/或胰腺炎发生之间因果关系的第一证据。该流感病毒感染与I型糖尿病和/或胰腺炎之间的因果关系提供了多种治疗、预防和诊断机会。
上述本发明优选实施方式的描述通过说明和示例表示，其目的是清楚和理解。其不旨在将本发明穷尽或限制至公开的精确形式。本领域普通技术人员通过本方面的教授应容易理解，本文可进行某些改变和修改而不背离本发明的精神和范围。应理解本发明的范围是由所附权利要求及其等同形式限定的。
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Claims (13)

1.包含甲型流感病毒免疫原的免疫原性组合物在制备用于预防或减少患者流感病毒感染以预防或减少流感病毒感染对所述患者I型糖尿病和/或胰腺炎症状的影响的药物中的应用，其中所述甲型流感病毒选自：H7N1、H7N3和H3N2。
2.如权利要求1所述的免疫原性组合物的应用，其中，所述组合物还包含抗病毒化合物。
3.如权利要求1所述的免疫原性组合物的应用，其中，所述免疫原性组合物预防或减少所述患者由流感病毒感染引起的胰腺的损伤。
4.如权利要求3所述的免疫原性组合物的应用，其中，预防或减少患者胰腺的损伤包括在胰腺中预防或减少流感病毒的复制。
5.如权利要求3所述的免疫原性组合物的应用，其中，预防或减少患者胰腺的损伤包括预防或减少胰岛细胞的损伤。
6.如权利要求1所述的免疫原性组合物的应用，其中，预防或减少患者胰腺的损伤包括在胰腺中预防或减少流感病毒的复制以及预防或减少胰岛细胞的损伤。
7.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物的应用，其中，所述组合物包含甲型流感病毒血凝素抗原。
8.如权利要求7所述的免疫原性组合物的应用，其中，所述组合物还包含药学上可接受的运载体。
9.如权利要求8所述的免疫原性组合物的应用，其中，所述组合物还包含佐剂。
10.如权利要求9所述的免疫原性组合物的应用，其中，所述佐剂是水包油乳液。
11.如权利要求1所述的免疫原性组合物的应用，其中，所述甲型流感病毒是H3N2。
12.如权利要求7所述的免疫原性组合物的应用，其中，所述患者的年龄不超过70岁。
13.如权利要求7所述的免疫原性组合物的应用，其中，所述患者的年龄为0-15岁。
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