CN1237910A - 可溶性β－淋巴毒素受体和抗淋巴毒素受体的抗体以及抗淋巴毒素配体的抗体的用途 - Google Patents

可溶性β－淋巴毒素受体和抗淋巴毒素受体的抗体以及抗淋巴毒素配体的抗体的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN1237910A
CN1237910A CN97199906A CN97199906A CN1237910A CN 1237910 A CN1237910 A CN 1237910A CN 97199906 A CN97199906 A CN 97199906A CN 97199906 A CN97199906 A CN 97199906A CN 1237910 A CN1237910 A CN 1237910A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sealer
antibody
cell
receptor
solubility
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN97199906A
Other languages
English (en)
Other versions
CN100382844C (zh
Inventor
J·布朗宁
P·S·霍克曼
P·D·伦纳特
F·麦凯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biogen Inc
Original Assignee
Biogen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Inc filed Critical Biogen Inc
Publication of CN1237910A publication Critical patent/CN1237910A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100382844C publication Critical patent/CN100382844C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

包含阻断β－淋巴毒素受体信号传导的“β－淋巴毒素受体封闭剂”并用于改变免疫学疾病，尤其是抗体介导的免疫应答的组合物和方法。

Description

可溶性β-淋巴毒素受体和抗淋巴毒素受体的抗体 以及抗淋巴毒素配体的抗体的用途
发明技术领域
本发明涉及包含封闭β-淋巴毒素受体信号传导的“β-淋巴毒素受体封闭剂”的组合物和方法。β-淋巴毒素受体封闭剂可用于治疗免疫性疾病，更具体地用于抑制抗体介导的免疫反应，调节地址素的表达和细胞运输，以及影响小结树突细胞的分化。本发明也涉及可溶形式的β-淋巴毒素受体胞外域，以及针对β-淋巴毒素受体或其配体、表面淋巴毒素产生的抗体，它们可作用为β-淋巴毒素受体的封闭剂。
发明背景
获得性免疫由两部分组成，它们能够联合作用以达到清除抗原的共同目标，但它们受免疫系统的不同部分介导以达到不同的效果。获得性免疫反应的一部分，体液免疫，主要是由B细胞和循环抗体介导。另一部分，被称为细胞的或细胞介导免疫，由合成和释放细胞因子以影响其它细胞的T细胞介导。
B细胞对大多数抗原应答活化和分化需要(1)B细胞通过它们抗原特异的受体、膜免疫球蛋白接受抗原信号，并且(2)B细胞接受来自活化T细胞的接触依赖型和非依赖型信号。B细胞CD40受体与活化的T辅助细胞上表达的CD40配体的连接产生接触依赖型共刺激信号。(Laman等，Crit.Rev.Immunol.,16，第59-108页(1996)；Van Kooten和Banchereau，免疫学进展，61，第1-77页(1996))。非接触依赖型信号是由活化的T细胞合成和释放的细胞因子介导的。接触依赖型和非依赖型信号共同驱动B细胞分化为(1)记忆B细胞，当第二次接触抗原时，它将介导更快的反应，或(2)分泌抗体的浆细胞。浆细胞是B细胞的终末分化阶段，合成和分泌抗体。
T辅助细胞(“Th”)在免疫系统中起多种作用。已表明免疫攻击开始时由Th细胞释放的细胞因子影响了随后活化的免疫效应途径。Th细胞的活化是通过其抗原特异的受体与呈现于抗原呈递细胞(APCs)表面的多肽片段相互作用实现的，这些多肽片段是与主要组织相容性复合体Ⅱ类分子结合的经加工后的外来抗原。反过来，活化的Th细胞分泌细胞因子(淋巴因子)以活化合适的免疫效应机制。
根据其细胞因子的分泌形式，Th细胞可分成三个亚群：Tho,Th1和Th2(Fitch等，免疫学年鉴，11，第29-48页(1993))。在小鼠中，未经刺激的“天然”T辅助细胞合成IL-2。Th细胞的短期刺激可使Tho前体细胞合成包括IFN-α,IL-2,IL-4,IL-5和IL-10的多种细胞因子。Tho细胞的慢性刺激可使之分化成Th1或Th2细胞，于是细胞因子的表达形式发生了改变。某些细胞因子如IL-3,GM-CSF和TNF可由Th1和Th2细胞共同释放。其它细胞因子只能由一种Th细胞亚群合成(Romagnani等，免疫学年鉴，12，第227-57页(1994))。Th1细胞合成LT-α、IL-2和IFN-γ以活化巨噬细胞和与细胞免疫相关的炎症反应并抵抗细胞内感染。
Th2细胞合成细胞因子IL-4,IL-5,IL-6和IL-10以增加嗜酸性粒细胞和肥大细胞并促进B细胞的扩展和成熟。(Howard等，“T-细胞起源的细胞因子及其受体”，基础免疫学，第3版；RavenPress,New york(1993))。Th2细胞也参与了产生B细胞记忆的产生、体细胞突变以及亲和性成熟，并参与了调节从头免疫球蛋白同种型转换。例如，Th2细胞因子IL-4使活化的B细胞转换成IgG1同时抑制其它同种型。IL-4也刺激Ⅰ型超敏反应中IgE的过量合成。Th2细胞因子IL-5诱导粘膜免疫中重要的IgA。
次级淋巴组织如淋巴结(LN)、脾和粘膜淋巴组织可有效地捕捉和富集外来物质，因此是T和B淋巴细胞的抗原驱动活化和分化的主要部位。这些过程依赖于这些组织中细胞的多样性和组成，提供了体液免疫反应诸多方面的框架如T/B细胞相互作用、生发中心(GC)形成、亲和性成熟，免疫球蛋白类别转换和细胞运输(Klein,J.，免疫学，JohnWiley和Sons(1982))。还未完全弄清外周淋巴组织发育、结构和功能维持的分子机制。
尽管次级淋巴组织的整体结构明显不同并且哺乳动物纲的不同种之间有差异，这些次级淋巴组织的精细结构有些共同特征，如：<1>抗原可接近性，<2>结构特征保证抗原与淋巴细胞持续接触，<3>T细胞富集区围绕着B细胞，<4>B细胞富集的滤泡，<5>边缘区型位点，<6>特化的内皮细胞，以及<7>抗体合成位点，这一点将在下文进一步详述。
次级淋巴组织可接触到系统中的抗原。例如，抗原可通过窦状血供应与脾接触，通过输入淋巴管与LN接触，并可通过特化的上皮细胞运送到粘膜淋巴组织。
各种物种中的次级淋巴组织也有某些共同的结构特征如小结树突细胞(FDC)和交错突细胞(IDC)，它们保证组织中淋巴细胞富集区域抗原的持续呈递。
另一共同特征是T细胞富集区域围绕着B细胞。T细胞富集区域包括，例如，脾脏白髓的动脉周围淋巴鞘和LN的皮质，它们包含大量的循环T细胞和IDC，继而作为T和B细胞的附属细胞。
另外，通常情况下，淋巴组织在脾的白髓和LN的皮质内有B细胞富集的初级和次级滤泡。这些淋巴组织中的次级滤泡也被称为生发中心(GC)并且有一个浓密的FDC网络以捕捉和呈递抗原。
边缘区型区域定义为鼠脾的组织学区域和人次级淋巴器官中较为弥散的位点。这些区域主要包括边缘区巨噬细胞(MZM)、噬金属性巨噬细胞(MM)、边缘区B细胞和网状细胞，但也可包括T细胞和树突细胞(Kraal,Int.Rev.Cytol,132，第31-74页(1992))。动脉血流入边缘区域使抗原与这些细胞直接接触并促进这个部位对抗原的细胞反应(Kraal,Int.Rev.Cytol.,132，第31-74页(1992))。MZM的存在对于B细胞在脾白髓中的最佳运输是必需的(Kraal,1992；Kraal等，免疫学，68，第227-232页(1989))。
通常，血淋巴细胞通过特化的内皮细胞进入次级淋巴组织，如淋巴结的微静脉内皮衬(毛细血管后微静脉-HEV)和边缘区样结构中的脾血窦状隙的内皮衬。这种内皮细胞表达粘附分子和地址素，在细胞向次级淋巴组织的运输中发挥作用。例如，外周淋巴结地址素(PNAd)与粘膜淋巴结地址素、MAdCAM-1不同，参与了淋巴细胞向粘膜淋巴组织包括肠系膜淋巴结、淋巴集结以及固有层的运输。
并非所有的地址素都得到清楚地鉴定，例如将淋巴细胞定位于脾脏的地址素仍未得到鉴定。地址素的重量作用包括促进合适的抗原特异的淋巴细胞参与到免疫反应中，以及随后的免疫反应在整个身体内的传播。
最后，可在与由抗原活化的前体B不同的部位检测到产生抗体的浆细胞。例如，脾红髓内由浆细胞产生的抗体源自T细胞区B细胞的活化，淋巴结髓质的浆细胞起源于同一节内T细胞区内活化的B细胞。同样，骨髓内浆细胞产生的抗体是脾和淋巴结内活化的B细胞的衍生物，肠道固有层的浆细胞主要来源于肠系膜淋巴结或肠道淋巴组织内活化的B细胞。
见例如，ICM Maclennan，“次级淋巴组织的结构和功能”ClinicalAspects of Immunology第五版，P.J.Lachman,Sir D.K.Peters,F.S.Rosen,M.J.Walport，编，Blackwell Scientific Publications第13-30页(1993)。
总的来说，对T依赖型抗原的体液免疫反应的细胞/组织事件如下(Toellner，等，实验医学杂志，183，第2303-2312页(1996))：
在诱发期，抗原进入身体的最初几天，天然B和T细胞被活化并参加到免疫反应中。在脾脏中，例如，在二次反应免疫后的12小时内，记忆B细胞在边缘区遇到来自血液的抗原然后离开边缘区进入T细胞区。24小时内可在T细胞区检测到B细胞。在第二次接触抗原后12小时内可检测到免疫球蛋白转换转录子，这表明已经发生了T-B细胞相互作用。然后B细胞转移至出口区和红髓内增殖以形成B细胞母细胞并分化成浆细胞。B细胞也在IDC丰富的T细胞区继续增殖。免疫后的4天内，在生发中心增殖后，B记忆细胞形成开始。在初次应答中，发育好的生发中心在免疫后第10天比较明显，14天时达到最大。
免疫后48-72小时，T细胞区内T细胞增殖明显，7天时达到高峰。T细胞的增殖归因于T细胞依赖的B细胞的活化。随着生发中心形成，T细胞区的增殖水平下降。T细胞也在生发中心增殖，同时，暗区的中心细胞(centrocytes)(B细胞)从IDC获取抗原并将抗原呈递至明区的T细胞。
T细胞依赖的抗原能够活化边缘区B细胞，地址素和粘附分子能够将新产生的天然B细胞和再循环淋巴细胞吸引至并保留在次级淋巴器官。天然B细胞与活化的B细胞在到达T细胞等方面具同样的动力学。T细胞依赖的反应建成期
次级淋巴器官滤泡中记忆B细胞的持续活化维持T细胞依赖反应的建成期。在这个阶段几乎没有天然B细胞的加入，这时的反应主要是由保留于FDC上的抗原推动。生发中心对于产生最佳记忆、同种型转换、体细胞突变以及免疫球蛋白的亲和性成熟是必需的。
淋巴细胞反应的封固产生能够以多种途径在体内循环的抗体，例如，抗体通过血液离开脾脏，通过输出淋巴管离开淋巴结。抗体由此遇到并与入侵的病原体结合。这种识别事件引发了一系列免疫效应机制，包括补体级联的活化以及针对病原体对宿主进行间接保护的细胞反应。
抗体在某些病理反应中也起一定的作用，如超敏反应-与原来接触过的抗原接触后引发的不适当的或不相称的免疫反应。超敏反应有四种类型。
Ⅰ型“即发型超敏反应”涉及过敏原诱发的Th2细胞活化以及Th2细胞因子释放。Th2细胞因子IL-4刺激B细胞进行同种型转换以产生IgE，继而活化肥大细胞以产生急性炎症反应从而导致湿疹、哮喘和鼻炎。
Ⅱ型和Ⅲ型超敏反应是由，针对细胞表面抗原或特异的组织抗原(Ⅱ型)或形成循环免疫复合物的可溶性血清抗原(Ⅲ型)产生的IgG和IgM引起的。
Ⅳ型“迟发性”超敏反应(DTH)是由Th1细胞介导的反应并可通过Th1细胞的转移在小鼠间转移，但不能仅通过转移血清实现转移。这一特征可将Ⅳ型超敏反应与其它三类超敏反应区分开，后者需要主要由抗体引起的体液免疫反应并可通过无细胞血清转移。(Roitt等，免疫学，第19.1-22.12页(Mosby-Year Book Europe Ltd，第三版1993))。
病理体液免疫反应与多种器官特异的和系统自身免疫条件有关，如系统性红斑狼疮，韦格内氏肉芽肿病，结节性多动脉炎(PAN)，快速进行性新月形肾小球型肾炎和自发性血小板减少紫癜，以及慢性炎症疾病如突眼性甲状腺肿和南美洲锥虫病。体液免疫反应也参与移植组织和移植器官的排斥。
目前，利用免疫调节剂和免疫抑制剂治疗多种免疫疾病。通常使用的三种免疫抑制剂是类固醇，环磷酰胺和咪唑硫嘌呤。
类固醇是多效抗炎剂，它可逆转许多病理T细胞效应以抑制活化的巨噬细胞和抗原呈递细胞的活性。环磷酰胺是烷化剂，通过抑制DNA复制和修复介导细胞死亡。咪唑硫嘌呤是抗增殖剂，可抑制DNA合成。这些非特异性免疫抑制剂需要的用量高因此增加了毒性(如肾和肝毒性)并带来副作用。因此它们不适于长期治疗。
由此，需要其它的试剂和治疗方法以克服由常规治疗带来的问题。
发明概述
本发明通过提供用于治疗免疫疾病的药物组合物和方法来解决上述问题，其中使用β-淋巴毒素受体封闭剂抑制β-淋巴毒素受体(LT-β-R)信号传导。更详细地说，此组合物和方法包含LT-β-R封闭剂，它可有效抑制抗体介导的免疫反应，调节地址素表达水平和细胞运输，影响小结树突细胞分化以及改变病理条件如系统性红斑狼疮和自发性血小板减少紫癜时产生的次级淋巴组织和相似淋巴结构的结构组成。另外，在某些实施方案中，本发明可用于改变免疫复合物和B细胞的结合性。更具体地，本发明的方法可阻止抗原在细胞上的呈递或沉积，或换言之，基本上溶解或清除已在细胞上呈递的抗原。
在另一实施方案中，LT-β-R封闭剂选自由可溶性淋巴毒素-β-R、直接针对LT-β-R产生的抗体和针对表面LT配体产生的抗体组成的群体。
在一个实施方案中，提供可溶形式的淋巴毒素-β受体胞外结构域作为LT-β-R封闭剂。此实施方案的优选组合物和方法包含的，具有与免疫球蛋白恒定区重链区域融合的LT-β-R胞外配体结合结构域的重组淋巴毒素-β受体融合蛋白。更优选地，LT-β-R配体结合结构域与人的IgG Fc区域融合。
在本发明的另一实施方案中，提供了作为LT-β-R封闭剂的抗体。此实施方案的优选组合物和方法包含一个或多个针对β-淋巴毒素受体产生的抗体。更优选地，此抗体为单克隆抗体。此实施方案的其它优选组合物和方法包含一个或多个针对表面淋巴毒素产生的抗体。更优选地，此抗体是针对β-淋巴毒素产生的单克隆抗体。优选的抗体包括抗人BT-β-RmAb BDA8和抗人LT-βmAb B9。
在其它实施方案中，本发明涉及通过施用含有治疗有效剂量的LT-β-R封闭剂的药物组合物以改变动物体液免疫反应的方法。在某些其它实施方案中，药物组合物以足够包被LT-β-R阳性细胞的剂量施用1-14天。此药物组合物可在某些实施方案中进一步包含药学上可接受的载体或佐剂。
在其它实施方案中，本发明的方法使用上述LT-β-R封闭剂抑制LT-β-R信号而不抑制TNF-R信号。治疗、预防或消除哺乳动物中人免疫缺陷病毒的方法也包含在本发明中，包括单独或与药物载体、佐剂或其它本领域技术人员已知的用于治疗或减轻HIV或AIDS的药物结合使用LT-β-R封闭剂。
另外，本发明涉及移植领域，即移植排斥的治疗方法。具体地，某些实施方案涉及了CD40途径的封闭剂与LT途径封闭剂的联合使用。
附图简述
图1是编码人LTβ受体胞外区，即配体结合区域的序列。
图2是对接受了LT-R-Ig或LFA-3-Ig融合蛋白和抗原多次注射后的小鼠脾的免疫组织化学分析。
图3是免疫组织化学分析，表明LT-R-Ig处理以及MR-1(抗CD40配体的抗体)处理的小鼠脾中缺乏生发中心，并且MR-1而不是LT-β-R-Ig处理的小鼠脾中出现小结树突细胞。以图2中描述的方法注射融合蛋白和SRBC抗原。
图4是免疫组织化学分析，表示了以LT-β-R-Ig连续处理子宫内及出生后的小鼠淋巴结中地址素表达的改变。
图5是对以LT-β-R-Ig连续处理子宫内及出生后的小鼠(同图4)的肠系膜淋巴结中淋巴细胞定位及巨噬细胞标记表达的免疫组织化学分析。
图6是免疫组织化学分析，表示了用LT-β-R-Ig处理小鼠抑制了针对SRBC的抗体反应。
图7表示了捕捉于FDC上的免疫复合物。
发明详述
为了使在此所述的发明被完全理解，先进行以下详细的描述。
此处所用的术语“免疫球蛋白应答”或“体液应答”指动物对外来抗原的免疫应答，由此动物产生针对外来抗原的抗体。T辅助细胞中的Th2类对于有效产生高亲和性的抗体是重要的。
此处所用的术语“生发中心”指抗原免疫后形成的次级B细胞滤泡。这个组织位点与抗体反应中产生最佳记忆，型别转换，体细胞超突变及亲和性成熟相关。
术语“边缘区”或“边缘-区型区域”指组织学上描述的次级淋巴组织的部分，主要包括边缘区巨噬细胞(MZM)，嗜金属巨噬细胞(MM)，边缘区B细胞和网状细胞，以及T细胞和树突细胞。动脉血流开口于边缘窦从而使抗原与这些细胞直接接触以促进此位点针对抗原的细胞反应。
此处所用的术语“地址素”指参与淋巴细胞定位于次级淋巴器官的分子。这样的分子表达于内皮细胞，尤其是淋巴结中的毛细血管后微静脉。脾地址素还未确定。MAdCAM-1是粘膜地址素，PNAd是外周地址素。
此处所用的术语“T辅助(Th)细胞”指T细胞的功能性亚类，它有助于产生细胞毒性T细胞并与B细胞合作以刺激产生抗体。辅助T细胞与Ⅱ类主要组织相容性复合物联合识别抗原并向效应细胞提供接触依赖型或非接触依赖型(细胞因子)信号。
此处所用的术语“细胞因子”，指在细胞间传递信号的分子。“淋巴因子”指由淋巴细胞释放的细胞因子。
术语“Th2”指T辅助细胞的一个亚类，它产生LTα,γ干扰素和IL-2(及其它细胞因子)；它与细胞即非免疫球蛋白应答联合引发针对攻击的炎症反应。
术语“Th2”指T辅助细胞的一个亚类，它产生细胞因子，如IL-4,IL-5,IL-6和IL-10从而与针对攻击的免疫球蛋白(体液)应答联合作用。
术语抗体的“Fc区域”指分子的一部分，包括绞链区，CH2和CH3区，但缺少抗原结合位点。此术语也包括IgM或其它抗体同种型的相应区域。
术语“抗LTβ受体的抗体”指能够与LTβ受体的至少一个表位特异结合的任何抗体。
术语“抗LT的抗体”指能够与LTα,LTβ或LTα/β复合物的至少一个表位特异结合的任何抗体。
术语“LTβ-R信号传导”指与LTβ-R途径相关的分子反应以及由此产生的随后的分子反应。
术语“LTβ-R封闭剂”指一种因子，它可减少配体与LTβ-R结合、细胞表面LTβ-R成簇或LTβ-R信号传导，或能够影响LTβ-R信号在细胞内的解释。
在配体-受体结合步骤起作用的LTβ-R封闭剂能抑制配体与LTβ-R的结合至少20％。Tβ-R封闭剂的例子包括可溶性LTβ-R-Fc分子及抗LTα、LTβ、LTα/β和LTβ-R的抗体。优选地，这些抗体不与分泌形式的LTα发生交叉反应。
术语“LTβ-R生物学活性”指：1)LTβ-R分子或其衍生物与可溶的或表面LTβ-R分子竞争与可溶的或表面LT配体结合的能力；或2)天然LTβ活性如刺激免疫调节应答或细胞毒性活性的能力。
术语“LT配体”指能够与LTβ受体特异性结合的LTα/β异源复合物或其衍生物。
术语“LTβ-R配体结合区域”指参与特异地识别并与LT配体相互作用的LTβ-R部分。
术语“表面LT”和“表面LT复合物”指包含LTα和展示于细胞表面的膜结合的LTβ亚单位-包括突变、改变的以及一个或多个亚单位的嵌合形式-的复合物。“表面T配体”指能够与LTβ受体特异结合的表面LT复合物或其衍生物。
术语“受试者”指动物或来自动物的一个或多个细胞。优选地，此动物是哺乳动物。细胞可以任何形式出现，包括但不限于保留于组织中的细胞，细胞簇，固定的、转染的或未转染的细胞，以及来自生理或表型改变的动物的细胞。β淋巴毒素：TNF家族的成员
肿瘤坏死因子(TNF)相关的细胞因子是宿主防御和免疫调节的大家族。此家族的成员可以膜结合形式通过细胞-细胞接触局部作用，或以分泌蛋白的形式对远距离目标起作用。TNF相关受体的平行家族与这些细胞因子反应从而引发包括细胞死亡、细胞增殖、组织分化和促炎反应在内的多种途径。
TNF,α-淋巴毒素(LTα，也称作TNFβ)和β-淋巴毒素(LTβ)是TNF配体家族的成员，此家族也包括Fas,CD27,CD30,CD40,OX-40和4-1BB受体的配体(Smith等，细胞，76，第959-62页(1994))。TNF家族几个成员-包括TNF,LTα,LTβ和Fas-的信号传导能够通过坏死或凋亡(程序细胞死亡)诱导肿瘤细胞死亡。在非致瘤细胞中，TNF和许多TNF家庭配体-受体相互作用影响免疫系统发育和对多种免疫攻击的应答。
多数膜相关的LTα/β复合物(“表面LT”)具有LTα1/β2化学计量。(Browning等，细胞，72，第847-56页(1993)；Browning等，免疫学杂志，154第33-46页(1995))。表面LT配体不与TNF-R以高亲和力结合也不活化TNF-R信号通路。LTβ受体(LTβ-R)并不以高亲和力与这些表面淋巴毒素复合物结合(Crone等，科学，264，第707-10页(1994))。
LTβ-R信号传导与TNF-R信号传导一样，具抗增殖效应并对肿瘤细胞有毒性。在申请人共同未决的美国申请序号08/378,968中，公开了用LTβ-R活化因子选择性地刺激LTβ-R的组合物和方法。LTβ-R活化因子可用于抑制肿瘤细胞生长，而不同时活化TNF-R诱导的促炎症或免疫调节途径。
最近的基因打靶研究证明LTα/β在次级淋巴器官发育中起作用(Banks等，免疫学杂志，155，第1685-1693页(1995)；De Togni等，科学，264，第703-706页(1994))。的确，缺失LTα的小鼠缺失淋巴结(LN)和淋巴集结(PP)。而且，其脾结构遭到破坏，脾边缘区细胞上功能标记的表达也改变了(Banks等，1995；De Togni等，科学，264，第703-706页(1994),Matsumoto等，科学，271，第1289-1291页(1996))。TNF受体敲除小鼠中未发现这些特征的任何一个(Erickson等，自然372，第560-563页(1994)；Pfeffer等，细胞，73，第457-467页(1993)；Rothe等，自然，364，第798-802页(1993))。申请人通过表明在怀孕期间注射与人IgG1Fc部分融合的可溶形式的鼠LTβ-R(LTβ-R-Ig)产生的子代小鼠缺乏大部分的淋巴结并有破坏的脾结构，从而确定了膜LTα/β复合物在次级淋巴器官发育中的作用(Rennert等，1996，“表面淋巴毒素α/β复合物是周围淋巴器官发育所必需的”实验医学杂志，184,1999-2006)。在另一个研究中，含有相似LTβ-R-Ig构建体的转基因小鼠在出生后三天开始表达LTβ-R-Ig，表明具有LN。然而，其脾结构遭到破坏并且脾边缘区细胞的几个标记未得到表达。(Ettinger等，“表达可溶性LTβ-R/IgG1融合蛋白的小鼠中脾结构被破坏而淋巴结发育正常”美国国家科学院院报93:13102-7)。这些数据综合表明膜LT对次级淋巴器官发育的调节效应有时间要求，但对脾结构的效应没有时间要求。
TNF系统在脾的发育中也起作用。TNF缺失小鼠的脾边缘区细胞不表达巨噬细胞标记或MAdCAM-1(Alexopoulou等，第60届国际TNF会议，欧洲细胞因子网络，第228页(1996)；Pasparakis等，第60届国际TNF会议，欧洲细胞因子网络，第239页(1996))。TNF-R75缺失小鼠也缺失脾边缘区的MAdCAM-1(但不缺失MOMA-1)。(Neumann等，实验区学杂志，184，第259-264页(1996),Matsumoto等，科学，271，第1289-1291页(1996))。这些标记在TNF-R75缺失小鼠中的表达正常(Matsumoto等，科学，271，第1289-1291页(1996))。
淋巴样组织不仅在发育过程中出现，而且也在某些病理条件下如在被称为新淋巴器发生过程的慢性炎症中出现(Picker和Butcher，免疫学年签，10，第561-591页(1992),Kratz等，实验医学杂志，183，第1461-1471页(1996))。显然，TNF家族成员影响了这些过程。由大鼠胰岛素启动子驱动的TLα基因转基因小鼠出现了LT诱导的有组织的淋巴组织特征的慢性炎症病变(Kratz等，实验医学杂志，1183，第1461-1471页(1996)；Picarella等，美国国家科学院院报，89，第10036-10040页(1992))。
用LTα缺失小鼠评估T细胞依赖的免疫反应的功能，表明LT对于GC的形成，有组织的小结树突细胞(FDCs)结构的维持，以及体液应答是必需的(Banks等，免疫学杂志，155，第1685-1693页(1995)；Matsumoto等，自然，382，第462-466页(1996))。TNF-R55缺失小鼠也缺失FDCs，不能产生生发中心以及不能够产生针对绵羊红血细胞(SRBC)的最佳抗体应答。这表明TNF-R55也许是由引起这些反应的可溶性LT或TNF信号引发的(Le Hir等，实验医学杂志，183，第2367-2372页(1996),Alexopoulou等，第60届国际TNF会议，欧洲，细胞因子网络，第228页(1996)；Pasparakis等，第60届国际TNF会议，欧洲，细胞因子网络，第239页(1996))。至今还未阐明表面LT/LTβ-R通路在体液免疫反应中的作用。
LTβ受体是TNF受体家族的成员，特异地与表面LT配体结合。LTβ-R与LT异源复合物结合(主要是LTα1/β2和LTα2/β1)但不与TNF或LTα结合(Crowe等，科学，264，第707-10页(1994))。LTβ-R mRNA存在于人的脾，胸腺以及参与免疫系统的一般器官中。
尽管对于LTβ-R表达的研究尚处于早期，LTβ-R表达方式与TNF-R55相似，只是在外周血T和B细胞以及T和B细胞系上缺乏LTβ-R。
已在高水平表达LT的CD4+T细胞杂交瘤细胞(Ⅱ-23.D7)中鉴定了细胞表面淋巴毒素(LT)复合物(Browning等，免疫学杂志，147，第1230-37页(1991)；Androlewicz等，生物化学杂志，267,第2542-47页(1992)，两者在此引用作为参考)。LTβ-R,LT亚基和表面LT复合物的表达及其生物学作用在C.F.Ware等，“淋巴毒素系统的配体和受体”，细胞溶解途径，现代微生物学和免疫学专题，Springer-Verlag，第175-218页(1995)中进行综述，特地在此引用作为参考。
LTα表达的诱导及LTα的分泌主要是由活化的T和B淋巴细胞以及自然杀伤(NK)细胞完成的。在T辅助细胞中，LTα是由Th1而不是由Th2细胞合成的。在黑色素细胞中也可检测到LTα。多发性硬化病人病灶中的小胶质细胞和T细胞可被抗LTα抗血清染色(Selmaj等，临床研究杂志，87，第949-954页(1991))。
β淋巴毒素(也称为P33)在人和鼠T淋巴细胞，T细胞系，B细胞系和淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞的表面表达。LTβ是申请人共同未决的以WO92/00329公布于1992年1月9日的国际申请PCT/US91/04588和以WO94/13808公布于1994年6月23日的国际申请PCT/US93/11669的主体，在此引用作为参考。
表面LT复合物主要是由活化的T和B淋巴细胞以及自然杀伤(NK)细胞表达，这可通过FACS分析或用抗LTα抗体或可溶性LTβ-R-Ig融合蛋白作的免疫组织学确定。在于1995年7月21日申请的申请人共同未决的美国申请序号08/505,606中，公开了用可溶性LTβ受体以及抗LTβ受体和配体的特异抗体作为治疗方法用于由Th1细胞介导的免疫性疾病。在人细胞毒性T淋巴细胞(CTL)克隆活化的外周单核淋巴细胞(PML)、IL-2活化的外周血淋巴细胞(LAK细胞)商陆有丝分裂剂活化的或抗CD40活化的外周淋巴细胞(PBL)以及多种T和B细胞系的淋巴瘤上的表面LT也得到描述。具同种抗原的靶细胞参与特异地诱导CD8+和CD4+CTL克隆表达表面LT。
申请人在此描述了表面LT的几种免疫学功能，以及LTα/β结合剂对免疫球蛋白反应的产生和特征的影响，对次级淋巴组织的细胞组成的维持包括对小结树突细胞分化状态和生发中心形成的影响，对影响细胞运输的地址素的表达水平的影响。因此，申请人将治疗性的申请定义为表面LTα/β和LTβ受体结合剂。
到目前，还未完全弄清楚LT-β-R信号通路对体液或免疫原性反应的影响。本发明人首次发现阻断LT途径。LT-β或LT-β-R可改变动物的体液免疫反应。因此，本专利申请的发明在广泛实施方案中涉及了改变动物体液免疫反应的方法，包括使用包含治疗有效量的LT途径封闭剂，特别优选地LT-β-R封闭剂的药物组合物。
任何封闭剂可用于本发明，本领域技术人员很容易确定封闭LT-β-R的试剂。例如，这样的封闭剂可包括小分子受体抑制剂、可溶性β-淋巴毒素受体、针对LT-β-R的抗体以及针对表面LT配体的抗体。在优选实施方案中，封闭剂包括具有可选择性地与表面LT配体结合的配体结合区的可溶性LT-β-R，更优选地可溶性LT-β-R包括人免疫球蛋白Fc区。
在其它实施方案中，优选的封闭剂包括针对LT-β-R的单克隆抗体，优选地包括抗人LT-β-R的单抗BDA8和抗人LT-β的单抗B9。更优选的抗体包括A1.D5.18、AO.D12.10和BB-F6。在某些情况下，用针对鼠表面LT配体的单克隆抗体更可取。
FDC的长期抗原呈递对自身免疫疾病可能很重要，内源或自身抗原导致的免疫系统的持续活化可使疾病长期发作。捕获于FDC上的免疫复合物列于图7。将免疫复合物从FDC去掉可减少免疫活化的数量并使疾病减轻甚至阻断疾病发展。涉及异常抗体应答的自身免疫疾病显然是LT通路抑制剂的目标，尽管其它更“经典的”T细胞介导的自然免疫疾病或许具未被识别的体液成分，所以也可受到有益的影响。
同样，在移植领域，移植排斥，即受体对移植疾病和移植对受体疾病需要抗原持续呈递。在此所述的控制FDC的机制可运用于与非自身即移植识别相关的问题。
另外，抗原的持续呈递或抗原记忆的维持在由分子模拟引起的自身免疫疾病中起作用。例如，对于Lyme氏疏螺旋体病感染因子Borreliaburgdorferi的免疫反应可导致关节炎样病，可能的原因是此细菌的Saome抗原决定簇与正常的关节组成成分相似。去掉FDC保留的Lyme氏细菌抗原可减轻Lyme氏疏螺体病诱发的关节炎。这样的治疗方法可用于其它与感染因子相关的摸拟病例。
申请人惊奇地发现使用LT-β-R的封闭剂能够干扰抗原在小结树突细胞上的呈递和/或沉积。通常，B细胞将抗原看作是结合于小结树突细胞表面的免疫复合物。小结树突细胞可将抗原保留一段未特别指出的时间。与保留于FDC上的抗原的周期性接触与B细胞记忆保持有关。因此，本专利申请的方法包括多种依赖于抗原在树突细胞呈递的疾病状态。本发明的封闭剂可在抗原引入动物前使用，在这种情况下，封闭剂将阻止所有或一部分抗原在小结树突细胞上的积累，由此阻止，或减少预料中的免疫原性反应。选择性地，本发明的封闭剂可在小结树突细胞与抗原发生关联后的某一点对动物施用。申请人专利申请的方法可破坏这种关联，以使预料中的免疫原性反应减小或消失。因此，本发明的治疗方法涉及清除已捕获于B细胞滤泡上的全部或部分免疫复合物，或全部或部分地阻止免疫复合物捕获在B细胞滤泡上。
破坏呈递于小结树突细胞的这些抗原与免疫复合物结合的能力是LT-β通路所特有的。例如，抗CD4OL(MR-1)是TNF家族的另一成员并且也在小结树突细胞上表达。与LT-β-R/Ig一样，MR-1可阻止生发中心形成但不影响FDC标记的表达。抗CD40-L不同于LT-β-R，不能阻止免疫复合物捕获于小结树突细胞上，也不能清除已捕获于小结树突细胞上的免疫复合物。另外，申请人已表明抗CD40-L不能影响原来产生的记忆B细胞的存活/维持。
尽管还不明确抗CD-40L和LT-β-R封闭剂的效果差异的精确基础，推测CD40可向B细胞提供存活信号。然而，LT系统对于小结树突细胞维持完全的分化和功能状态是至关重要的。这种状态是生发中心反应以及记忆B细胞的产生和维持所必需的。因此，封闭CD40/CD40L途径可阻止记忆B细胞的产生，但不会影响已建成的记忆B细胞库。另一方面，封闭LT途径不仅阻止记忆B细胞的产生和维持，而且也影响了原来产生的记忆B细胞的维持。
抑制LT途径进一步的应用在于治疗在小结树突细胞(FDC)区室中形成储存库的病毒。HIV病毒是一个恰如其分的例子。病毒感染后，大量的病毒滞留于次级淋巴器官B细胞滤泡的FDC上(Heathe等，1995，“小结树突细胞和人免疫缺损病毒”，自然，377:740-4)。据猜测，病毒与补体或免疫球蛋白形成复合物并与Fc受体、补体受体或两者结合。这样，病毒可利用免疫系统的正常机制使抗原记忆保留很长时期。在发病过程中，淋巴细胞的主动侵染主要发生在这些部位。据计算，在感染的无症状期，在此小室内的病毒库比T细胞和单核细胞含有的病毒多10位以上(Cavert等，1997，“淋巴组分对HIV-1感染的抗病毒治疗反应的动力学”，科学276:960-4)。目前的HIV治疗模式联合运用多种抗病毒因子以减少病毒量并防止抗性突变体的逃逸。这种治疗方法的可能限制在于这种治疗的非应变性并且在间隔中残留病毒任意突变以产生抗性突变体从而逃避了治疗过程。尽管FDC小室中病毒量在多药治疗受到很大影响，药物本身主要是针对病毒复制机制并不针对FDC表面的非复制病毒。因此，FDC的病毒库可作为药物治疗终止后的再接种物。而且，FDC能够将中和的病毒转变成感染形式从而进一步加强了这些细胞在HIV发病中的重要性。
因为抑制LT通路能够使FDC释放细胞表面的免疫复合物，以免疫组合物形式出现的HIV也被释放。紧接多重治疗体系之前应该将此区室内的HIV病毒全部释放出来，因为病毒应被加工并从体内或在感染开始时清除掉，它对于药物治疗敏感。这样的联合可使病毒量减小至影响治疗的最小量。在这种情况下，LTβ-R/Ig或针对配体或受体的封闭抗体是有效的。有力的治疗方法涉及开始进行药物治疗，然后在几天后，以LT通路抑制剂进行一次或几次治疗以释放任何结合状态的病毒。一旦降低了病毒量，进一步的治疗不需要针对LT的试剂。
尽管HIV是经特别详尽地研究的例子，其它病毒很可能以静止状态滞留或藏在FDC上，等待可以导致大量附加抗原产生的免疫紊乱一类的事件，随后释放结合于FDC的病毒，这样病毒重新出现。因此，本发现涉及任何抑制LT通路避免FDC结合病毒发作的方法。
此发现对于依赖于抗原在树突细胞上呈递和记忆B细胞产生应答的多种疾病有重要意义。LTα1/β2有效地传递信号并且是抗LTb封闭单克隆抗体有效治疗的例子。另外，被命名为AOD12的抗人LTα的单克隆抗体能够很好地封闭LTα1/β2信号通路，然而与大多数抗人LTα的单克隆抗体相比，对LTα的作用效果较差。以可溶性LTα1/β2配体免疫小鼠后得到的这些单克隆抗体发现了具独特特异性的单克隆抗体。而且，我们认为只有经这种免疫方式而不是单独用LTα免疫才能得到优先对LTα1/β2复合物具特异性的抗LTα单克隆抗体，由此包括了一群独特的抗LTα抗体。
实施例材料和方法
小鼠
控制时间受孕的Bal b/c小鼠购自Jackson Laboratory(BarHarbor,ME)，饲养于常规隔栅屏障内，并以指导性说明管理。通过带孕小鼠的尾静脉(静脉内)注射受体-Ig蛋白或单克隆抗体。通过腹膜途径(腹膜内)将融合蛋白注射给这些小鼠的子代以及5周龄雌性Balb/c小鼠(购自Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)。
融合蛋白和抗体
按(Force等，免疫学杂志，155，第5280-5288页(1995)；Miller等，实验医学杂志，178，第211-222页(1993))描述的方法制备包含有与人IgG1的铰链区，CH2和CH3区融合的鼠LTβ-R，人TNF-R55或人LFA-3(不与鼠CD2结合)的胞外区融合蛋白。用作对照的纯化的人IgG1购自Protos Immunorsearch(San Fran Cisco,CA)。MR1，抗小鼠CD40配体抗体购自Pharmingen(San Diego,CA)。
由小鼠嗜金属巨噬细胞(MM)表达的标记特异的抗体(MPMA-1,ED3),(ED3识别唾酸粘附素)，或小鼠网状纤维母细胞特异的抗体(ER-TR-7)购自Serotec(Oxon,UK)。小鼠B220,CD4和MadCAM-1特异的抗体(MECA367)购自Pharmingen(SanDiego,CA)。小鼠边缘区巨噬细胞表达的标记特异的抗体(ER-TR-9)由Reina Mebins博士惠赠(Vrje Universiteit,Amsterdam)。小鼠小结树突细胞(FDC)特异的抗体(FDC-M1和FDC-M2)已被描述过(Maeda等，免疫学杂志，148，第2340-2347页(1992))。抗小鼠CR1抗体(也可将FDC染色)由Randolph J.Noelle博士惠赠(Dartmonth Medical School)。利用抗体MECA 79检测周围淋巴结地址素(PNAD)(细胞上清来自购自ATCC,Rockville,MD的细胞)。
抗原和免疫
以100μl 10％的SRBC悬液腹膜内免疫小鼠(购自Colorado SerumCompany)。每次免疫物相当于1-5×108个SRBC。
免疫组织化学
将脾和淋巴结冷冻于OCT包埋剂(Miles,Elkhart,IN)并封固以进行恒冷箱切片。7-10mm厚的切片干燥后以丙酮固定。切片与经Tris缓冲盐溶液A稀释(TBS-A,0.05M Tris,0.15M Nacl,0.05％Tween-20(v/v),0.25％牛血清白蛋白(BSA))的偶联抗体于室温下的湿室中温育1小时，以TBS-B(0.05M Tris,0.15M NaCl,0.05％Tween-20)洗涤，在起始酶反应以前在甲醇中固定1分钟。分别用DAB片剂底物盒(Sigma,st.Louis,MO)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/硝基蓝四氮唑(BCIP/NBT,Sigma)分别显现辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶活性。组织切片在甲醇中固定5分钟后以Giemsa(Fluka,Buchs,Switzerland)进行复染。
荧光图像分析
为了进行免疫荧光染色，用丙酮固定冷冻切片，令其空气干燥；用以5μg/ml的浓度溶解于含0.25％BSA,0.05％Tween-20和10％热凝集兔血清的Tris缓冲盐水的抗CD16/CD32 Fc封闭剂(Pharmingen,San Diego；CA)预封闭。用下列单克隆抗体和检测试剂在相同缓冲液中对切片进行染色：10μg/ml生物素化的抗B220的单克隆抗体(pharmingen)，然后是20μg/ml链亲和素-FITC(SouthernBiotechnology Associates,Birmingham,AL)；10μg/ml MECA 367；然后是10μg/ml PE-山羊F(ab’)2抗大鼠IgG(Southern BiotechnologyAssociates)；MECA 79培养上清，然后是20μg/ml FITC-小鼠抗大鼠IgM(pharmingen)；20μg/ml抗唾酸粘附素单克隆抗体，然后是10μg/ml PE-山羊F(ab’)2抗大鼠IgG(Southem BiotechnologyAssociates),50μg/ml生物素化的PNA(Vector Laboratiories,Burlingame,CA)，然后是10μg/ml链亲和素-PE(SouthernBiotechnology Associates)；以1∶5稀释的单克隆抗体MOMA-1细胞培养上清，然后是20μg/mL FITC-小鼠抗大鼠IgM(pharmingen)。有些切片以多种单克隆抗体同时染色以进行图像遮盖分析。所有的切片在50X光学显微镜下观察并用Ektachrome P 1600拍照(Kodak,Rochester,NY)或用(Rennert等，实验医学杂志，(1996年11月，出版中))描述的方法将其捕捉为单独的红色和绿色图像文件。
血细胞凝集实验
以PBS/1％葡萄糖在96孔微量滴定板上(Costar,Cambridge；M)连续稀释血清。向每一孔中加入25μl 10％的SRBC悬液并将此板在潮湿的37℃孵箱中温育1小时以测定SRBC特异的IgM的滴度。对于SRBC特异的IgG，每孔中加入20μl 1％2-巯基乙醇(体积/体积)(Bio-Rad,Richmond,CA)后将血清于37℃温育30分钟以清除IgM五聚体。然后每孔加入25ul 10％SRBC悬液，随后每孔加入25ul山羊抗小鼠IgG(Southern Biotechology,Birmingham,AL)的10mg/ml溶液(PBS/1％葡萄糖)作为血细胞凝集的交联剂。最后血细胞凝集明显时的血清稀释度的倒数确定为滴度。
ELISA
将鼠LTβ-R(Browning等，底稿在准备中)、LFA-3(Miller等，实验医学杂志；178；第211-222页(1993))或人IgG1的CH3特异的单克隆抗体直接固定于(10μg/ml)96孔微量滴定板上用于捕捉，用驴抗人IgG1-辣根过氧化物酶(HRP)检测(Jackson Immuno Research,West Grove PA,1∶4000稀释)，以分析血浆中受体Ig。
可溶性LTβ-R分子的制备
本发明一个实施例中的LTβ-R封闭剂包括可溶性LTβ受体分子。图1表示了人LTβ-R胞外部分的序列，它编码配体结合区。运用图1中的序列信息和本领域中众所周知的重组DNA技术，将编码LTβ-R配体结合区域的功能片段将克隆到载体中并在合适的宿主中表达以合成可溶性LTβ-R分子。根据申请人共同未决的美国申请序号08/505,606,1995年7月21日提交中描述的测定，与天然LTβ受体竞争结合LT配体的可溶性LTβ-R分子可选作LTβ-R封闭剂。
包含选自图1所示的氨基酸序列的可溶性受体可与一个或多个异源蛋白区域(“融合区域”)相连接以提高受体结合蛋白在体内稳定性或调节其生物学活性或定位。
优选地，稳定的血浆蛋白质-通常其在循环中的半衰期在20小时以上-可用于构建受体融合蛋白。这样的血浆蛋白质包括但不限于：免疫球蛋白，血清白蛋白，脂蛋白，载脂蛋白和转铁蛋白。能够将可溶性LTβ-R分子定位于特定细胞或组织类型，也可连接到LTβ-R配体结合区域以产生特定定位的可溶性LTβ-R融合蛋白。
包含LTβ-R受体结合区域的LTβ-R胞外区(图1)的全部或部分可与人IgG1重链Fc区域一类的免疫球蛋白融合(Browning等，免疫学杂志，154，第33-46页(1995))。可溶性受体IgG融合蛋白是优选的，是普通的免疫试剂，它们的构建方法在本领域中为人所知(见如，美国专利号5,225,538，在此引入作为参考)。
功能性的LTβ-R配体结合区域可与IgG1以外的免疫球蛋白群或亚群的免疫球蛋白(Ig)Fc区域相融合。属于不同Ig群或亚群抗体的Fc区能活化不同的次级效应功能。活化发生于Fc区与同源Fc受体结合时，次级效应物功能包括活化补体系统的能力，通过胎盘的能力，与各种微生物蛋白结合的能力。不同免疫球蛋白群和亚群的特征在Roitt等，免疫学，第48页(Mosby-Year BookEurope Ltd.，第3段1993)中有所描述。
补体系统的活化引发介导炎症的级联酶促反应。补体系统的产生具有多种功能，包括与细菌结合、内吞作用、吞噬作用、细胞毒性、自由基形成和免疫复合物的溶解。
补体酶级联由结合抗原的抗体IgG1,IgG3和IgM的Fc区活化。IgG2的Fc区效果较差，IgG4,IgA,IgD和IgE的Fc区不能活化补体。因此，可根据其相关的次级效应物功能对于特定的免疫反应或以LTβ-R-Ig融合蛋白治疗的疾病是否可取来选择Fc区。
如果损害或杀死具有LT配体靶细胞是有利的，可选择具特别活性的Fc区(IgG1)以制备LTβ-Ig融合蛋白。替代地，如果将LTβ-R-Fc融合蛋白而不引发补体系统，则应选择无活性的IgG4 Fc区。
已描述了降低或清除与Fc受体结合和补体活化的Fc区中的突变(S.Morrison，免疫学年鉴，10，第239-65页(1992))。可单独或联合使用这些或其它突变，以使用于构建LTβ-R-Ig融合蛋白的Fc区的活性最佳。
包含与人免疫球蛋白Fc区融合的配体结合序列的可溶性人LTβ-R融合蛋白(hLTβ-R-Ig)的产生描述于实施例1。一个根据实施例1制备分泌h LTβ-R-Fc的CH0系被称为“hLTβ-R；hG1CHO#14”。根据Bidapest条约的规定，这个细胞系的样品于1995年7月21日贮存于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Rockville,MD)并指定其ATCC注册号CRL11965。
可溶性鼠LTβ-R融合蛋白分子(LTβ-R-Ig)的产生在实施例2中进行了描述。一个根据实施例2制备的CHO系被称为“mLTβ；R-hG1 CHO#1.3.BB。”根据Budapest条约的规定，这个细胞系的样品于1995年7月21日贮存于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Rockville,MD)并指定其ATCC注册号CRL11964。
一旦本申请被授予专利，上述ATCC保存物对公众可得到性的所有限制将不可挽回地被撤消。
形成受体-Ig融合蛋白连接点的不同氨基酸残基可改变可溶性融合蛋白的结构，稳定性及其最终的生物学活性。可将一个或多个氨基酸添加到所选LTβ-R片段的C末端从而用所选的融合区修饰连接点。
改变所选LTβ-R DNA片段插入重组表达载体时5’末端的切割位置可改变LTβ-R融合蛋白的N末端。可用常规实验和此处所述的选择LTβ-R封闭剂的实验检测和优化每一LTβ-R融合蛋白的稳定性和活性。
利用图1中所示的胞外区内的LTβ-R配体结合区的序列，可构建氨基酸变异体以修饰可溶性受体或融合蛋白对LT配体的亲和力。本发明的可溶性LTβ-R分子可与内源性细胞表面LTβ受体竞争与表面LT配体结合。可以预想，任何包含能与细胞表面LTβ受体竞争与LT配体结合的可溶性分子是本发明范围内的LTβ-R封闭剂。
抗LTβ-R抗体的来源
在本发明中的另一实施方案中，针对人LTβ受体的抗体(抗-LTβ-R抗体)可作为LTβ-R封闭剂。本发明的抗LTβ-R抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体(mAbs)并且可被修饰以优化其封闭LTβ-R信号通路的能力，其体内生物可利用性，稳定性或其它希望的特征。
用常规技术通过用皮下注射方式将完全弗氏佐剂中的人LTβ受体-Ig融合蛋白(实施例1)注射山羊，兔子，大鼠，仓鼠或小鼠一类的动物，然后以不完全弗氏佐剂通过腹膜内或皮下注射加强，以制备针对人LTβ受体的多克隆抗体血清。用常规免疫学方法对包含有希望的针对LTβ受体抗体的多克隆抗血清进行筛选。
针对人LTβ受体-Ig融合蛋白的小鼠单克隆抗体(mAb)可用申请人共同未决于1995年7月21日提交的美国申请序号08/505,606中所述的制备。根据Budapest条约的规定，合成小鼠抗人LTβ-R mAb BDA8的杂交瘤细胞系(BD.A8.AB9)于1995年1月12日贮存于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Rockville,MD)，并指定了注册号HB11798。一旦本申请被授予专利，上述ATCC保存物对公众可得到性的所有限制将不可挽回地被撤消。
用标准重组DNA技术(Winter和Milstein，自然，349，第293-99页(1991))，可制备各种形式的抗LTβ-R抗体。例如，将动物抗体的抗原结合区与人恒定区连接以构建“嵌合”抗体(如，Cabilly等，美国4,816,567；Morrison等，美国国家科学院院报，81，第6851-55页(1984))。当用于人类临床治疗时，嵌合抗体减少了由动物抗体引发的免疫反应。
另外，可合成识别LTβ-R的重组“人源化抗体”。人源化抗体是主要包含插入有特定抗原结合区人IgG序列的嵌合体(如，WO94/04679)。以希望的抗原免疫动物，分离相应的抗体，移掉特异抗原结合的可变区序列。来自动物的抗原结合区克隆到删除了抗原结合区的人抗体基因合适的位置。人源化抗体使人抗体中异源(种间)序列的使用降低至最小，在受治疗对象中不可能引发免疫应答。
制备包含有抗LTβ-R可变区和从不同免疫球蛋白群分离的人恒定区(CH1,CH2,CH3)的嵌合或人源化抗体可构建不同类的重组抗LTβ-R抗体。例如，将抗原结合位点克隆到携带人μ链恒定区的载体中可用重组方法制备具有提高了的抗原结合位点效价的抗LTβ-RIgM抗体(Arunlanandam等，实验医学杂志，177，第1439-50页(1993)；Lane等，欧洲免疫学杂志，22，第2573-78页(1993)；Traunecker等，自然，339，第68-70页(1989))。
另外，通过改变抗原结合位点附近的氨基酸残基，标准重组DNA技术可用于改变重组抗体与其抗原的结合亲和力。根据分子模型进行的突变可提高人源化抗体的抗原结合亲和力(Queen等，美国国家科学院院报，86，第10029-33页(1989)；WO94/04679)。
依据靶组织类型或预想的特定治疗计划，也许希望提高或降低抗LTβ-R对LTβ-R的亲和力。例如，对于半预防性治疗而言，用LT-β路通传递信号能力低而具恒定水平的抗LTβ-R抗体治疗病人是有利的。同样，对LTβ-R有亲和力增加的抑制性抗LTβ-R抗体对于短期治疗是有利的。
抗表面LT配体抗体的来源
本发明的另一优选的实施方案涉及了包含有针对作为LTβ-R封闭剂的LT配体的抗体的组合物和方法。如上所述制备抗LTβ抗体的方法，作为LTβ-R封闭剂的抗LT配体抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，可根据常规方法调节其抗原结合特征及其免疫原性对其进行修饰。
本发明的抗LT抗体可以是针对两个LT亚单位中的任何一个，包括可溶性的，突变的，改变的和嵌合形式的LT亚单位。如果将LT亚单位作为抗原，优选地是LTβ亚单位。如果使用LTα亚单位，优选的与表面LT配体结合的抗LTα抗体不与分泌的LTα发生交叉反应或不调节TNF-R活性(根据1995年7月21日提交的申请人共同未决的美国申请序号08/505,606所述的实验)。
替代地，可制备针对包含一个或多个LT亚单位的同源(LTβ)或异源(LTα/β)复合物并筛选作为LTβ-R封闭剂活性。优选地，将LTAα1/β2复合物作为抗原。如上文所讨论的，优选的抗LTα1/β2抗体与表面LT配体结合而不与分泌的LTα结合也不影响TNF-R活性。
抗人LTα多克隆抗体的制备在申请人共同未决申请(WO94/13808)中有所描述。抗LTα和抗LTβ的单克隆抗体在(Browning等，免疫学杂志，154，第33-46页(1995))中描述。
按1995年7月21日提交的申请人共同未决的美国申请序号08/505,606所述制备小鼠抗人LTβ单克隆抗体。根据Budapest条约的规定，合成小鼠抗人LTβ-R单克隆抗体B9的杂交瘤细胞系(B9、C9.1)于1995年7月21日贮存于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Rockville,MD)并指定了ATCC注册号HB11962。
按1995年7月21日提交的申请人共同未决的美国申请序号08/505,606所述制备仓鼠抗小鼠LTα/β的单克隆抗体。根据Budapest条约的规定，合成仓鼠抗小鼠LTα/β的单克隆抗体BB.F6的杂交瘤细胞系(BB.F6.1)于1995年7月21日贮存于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Rockville,MD)并指定了ATCC注册号HB11963。
一旦本申请被授予专利，上述ATCC保存物对化从可得到性的所有限制将不可挽回地被撤消。
用可溶性LTβ-R-Ig抑制表面LT复合物的免液功能。
我们表明了表面LT结合剂，由小鼠LTβ-R的胞外区和人IgG1的铰链区，CH2及CH3组成的融合蛋白(LTβ-R-Ig)对于免疫球蛋白应答的产生和特征的影响，以于包括对小结树突细胞分化状态和生发中心形成影响的次级淋巴组织细胞结构维持的影响，对于影响细胞运输的地址素表达水平的影响。
用LTβ-R-Ig多次注射改变脾淋巴细胞的结构以及脾边缘区细胞功能标记的表达。
连续将LTβ-R-Ig注射小鼠六周；每周一次，以观察表面LT阻断对脾结构的影响。然后以SRBC免疫小鼠；4天后再注射一次LTβ-R-Ig。注射SRBC后10天将小鼠处死。冷冻脾切片的免疫组织化学染色揭示了几种组织变化。组成正常小鼠脾B细胞室的滤泡经LTβ-R-Ig处理后不再是分立的。相反，B细胞围绕T细胞区形成弥散的带(图2B),T和B细胞之间的界限遭到破坏(图2B)。相反，作为对照的LFA-3-Ig处理小鼠脾B细胞滤泡是分立的并且T和B细胞区之间有明显的界限(图2A)。
LTβ-R-Ig处理小鼠的脾边缘区的两种不同巨噬细胞群不表达被单克隆抗体ER-TR-9和MOMA-1识别的细胞表面标记。ER-TR-9染MZM上的标记(Dijkstra等，免疫学，55,23-30(1985),MOMA-1染嗜金属巨噬细胞上的标记(Krael和Janse，免疫学，58,665-669,(1986))(分别是图2D,F)。这些标记在对照(LFA-3-Ig)处理小鼠的细胞上表达(图2C,E)。LTβ-R-Ig处理小鼠的鼠脾边缘区MOMA-1阳性巨噬细胞的另一标记，唾酸粘附素，也不表达(数据未显示)。
抗体EMCA-367与最初表达于淋巴集结，肠系膜淋巴结；肠粘膜和固有层内皮细胞的粘附分子和粘附地址素MAdCAM-1结合(Briskin等，自然，363，第461-464页(1993)；Nakache等，自然，337，第179-181页(1989))。MAdCAM-1也在脾边缘区(假定在开口于边缘窦的小终端微动脉的内皮细胞上表达)和生发中心内的网眼上表达(Kraal等，美国病理学杂志，147，第763-771页(1995))(图2G)。LTβ-R-Ig处理的小鼠切片用MECA 367染色，表明脾不再表达MAdCAM-1(图2H)。
同样，分辨边缘区网状上皮细胞的ER-TR-7抗体染色(Van,vliet等，细胞化学，34，第883-890页(1986))(图2I)异常分化且LTβ-R-Ig处理后的动物白髓比LFA-3-Ig处理的动物白髓染色强(图2J)。LTβ-R-Ig处理小鼠中观察到的变化不依赖于抗原，因为染色模式与LTβ-R-Ig处理的未经免疫小鼠的染色模式相同(数据未显示)。
LTβ-R-Ig处理的小鼠脾中不再形成生发中心，也检测不到小结树突细胞
为了在组织水平上检测多次给小鼠注射LTβ-R-Ig是否影响对SRBC的免疫反应，对抗原引发下生发中心(GC)的形成和小结树突细胞(FDC)的分布进行了分析。用商陆凝集素(PNA)对以图2描述的方法经LTβ-R-Ig或LFA-3-Ig多次预理的小鼠冷冻脾切片进行染色以显现GC，以FDC-M1抗体染色以检测FDC,FDC-M1是GC形成必需的细胞组分(Scrhriever和Nadter，免疫学进展，51，第243-284页(1992)；Tew等，免疫学评述115，第185-211页(1990))。CD40与CD40配体的相互作用对于GC形成也是至关重要的(Foy等，实验医学杂志，180，第157-163页(1994))。因此为了进行比较，用抗小鼠CD40配体抗体MR1处理一组小鼠，然后进行可抑制GC形成的注射方法处理小鼠(Han等，免疫学杂志，155，第556-567页(1995))。SRBC攻击后10天，以对照LFA-3-Ig蛋白处理的小鼠脾中有很多PNA染亮的GC(图3A)。LTβ-R-Ig或MR1-处理的小鼠脾中未检测到GC(分别是图3B、C)。然而，MR-1和LTβ-R-Ig的作用可由另外的两项观察区分开。LTβ-R-Ig处理小鼠脾中(图3E)缺少GC内FDCS(FDC-M1)染色(图3D)然而MR1-处理小鼠内仍有这种染色(图3F)。用FDC-M2抗体对FDCS进行染色得到相似的结果(数据未显示)。因此，LTβ-R-Ig处理导致了脾中FDC表型改变并且不能形成GC。
除了染GC外，PNA也可对正常小鼠脾的边缘区进行染色。LFA-3-Ig处理小鼠(图3A)和MR1处理小鼠(图3C)中也观察到这种染色；而LTβ-R-Ig处理小鼠脾中没有这种染色(图3B)。
MR1处理小鼠的脾可正常表达唾酸粘附素，MOMA-1,ER-TR-9,ER-TR-7和MAdCAM-1(数据未显示)，进一步区分干扰CD40和LTβ-R信号通路的分子效应。
LTβ-R-Ig诱导脾淋巴细胞组织和边缘区细胞标记表达改变的动力学
分析了影响脾淋巴细胞组织和边缘区细胞标记表达所需的注射LTβ-R-Ig的次数。用LTβ-R-Ig通过腹膜内一次或多次注射小鼠，如表1所示。在末次注射LTβ-R-Ig的当天，以SRBC免疫部分小鼠。分别检测了经处理小鼠的冷冻脾切片上B220和CD40的表达，以PNA(针对GC)和MECA367(针对MAdCAM-1),MOMA-1,ER-TR-9以及FDC-M1进行染色。对嗜金属巨噬细胞，边缘区巨噬细胞，MAdCAM-1,GCS以及FDCs染色消失的动力学是不同的。
注射1次LTβ-R-Ig足以使MAdCAM-1染色在一周后消失。每周一次，注射三次LTβ-R-Ig后，检测不到GCs和FDCs染色，T/B淋巴细胞室被破坏。清除嗜金属巨噬细胞染色至少需要注射4次LTβ-R-Ig。注射LTβ-R-Ig六次也不能完全清除用ER-TR-9抗体对边缘区巨噬细胞进行的染色(如图2D所示)。
在缺少抗原的情况下，对注射1次LTβ-R-Ig后，MOMA-1,MAdCAM-1,FDC-M1。FDC-M2和CR1染色的快速抑制进行了精确分析(表2)。表1成年小鼠对SRBC作出反应时，LTβ-R-Ig对脾组织和生发中心形成的影响
注射LTβ-R-Ig的次数 T/B细胞结构 嗜金属巨噬细胞* 边缘区巨噬细胞* MAdCAM-1表达* 生发中心§ FDC*
    0 正常 +++ +++   +++ +++ +++
    1 正常 ++ +++   - + +
    2 轻微异常 + +++   - + +/-
    3≠ 破坏 + ++   - ND ND
    4≠ 破坏 +/- ++   - ND ND
    5≠ 破坏 - +   - ND ND
    6 破坏 - +/-   - - -
每周注射一次，每次100ug LTβ-R-Ig腹膜内注射小鼠1-5周然后处死。除非特别说明，腹膜内注射SRBC(100ul10％的悬液)之前使用LTβ-R-Ig，最后一次LTβ-R-Ig与抗原注射在同一天进行。注射SRBC后10天处死动物。用生物标记的大鼠抗小鼠B220和大鼠抗小鼠CD4双染冷冻脾切片，然后分别使用链亲和素碱性磷酸酶和小鼠抗大鼠Ig过氧化物酶。也用下列抗鼠抗体对脾切片进行染色：大鼠抗边缘区巨噬细胞(ER-TR9)，大鼠抗嗜金属巨噬细胞(MOMA-1)；大鼠抗MAdCAM-1(MECA:367)和大鼠抗FDC(FDC-M1)，然后使用鼠抗大鼠Ig过氧化物酶。用生物素化的商陆凝集素(PNA-生物素)然后用链亲和素过氧化物酶对另一套冷冻切片染色以检测生发中心。每项观察在每组至少3只动物的切片上进行。
*观察染色强度用肉眼：正常染色：+++，染色减弱：++，染色弱+，以及无色-。未处理动物和以LFA-3-Ig处理动物的切片的染色强度作为正常染色参照。
§每张脾切片中生发中心的数目记录如下：＞10：+++；5-10：++；1-5：+；没有-。
≠未接受SRBC的动物。
ND：未做。表2:LTβ-R-Ig对MOMA-1,MAdCAM-1,CR1,FDC-M1和FDC-M2染色影响的精确计时单一注射LTβ-R-Ig后的天数
        0      1       3      5     7      10   14MOMA-1*    +++    +++    +++    +++           ++   ++   +MAdCAM-1*  +++    +/-    -      -      -      -    -CR1*       +++    +++    +-     ++     ++     ++   +FDC-M1*    +++    +/-    -             -      -    -    -FDC-M2*    +++    +/-    -      -      -      -    -
Balb/c小鼠，5-6周接受1剂腹膜内注射的100ug LTβ-R-Ig或人Ig。每组的小鼠在第0,1,3,5,7,10和14天被处死。冷冻脾切片以下列抗体染色：大鼠抗小鼠嗜金属巨噬细胞(MOMA-1)，大鼠抗小鼠MAdCAM-1(MECA 367)，大鼠抗小鼠FDC(FDC-M1)，大鼠抗小鼠FDC(FDC-M2)以及生物素标记的大鼠抗小鼠CR1，然后用小鼠抗大鼠Ig-过氧化物酶(MOMA-1,MAdCAM-1,FDC-M1和FDC-M2)或过氧化物酶标记的链亲和素(CR1)。
*用肉眼观察染色强度：正常染色；+++，染色减弱：++，染色弱+，以及无染色-。未处理动物和以人Ig处理动物的切片染色强度作为正常染色参照。分析了每组至少两只动物的切片。
注射后，每天处死接受了单一腹膜内注射LTβ-R-Ig的Balb/c小鼠，进行14天，移取并冷冻它们的脾。用MOMA-1，抗MAdCAM-1(MECA-367，以及FDC特异的试剂：FDC-M1,FDC-M2和抗CR1抗体对冷冻脾切片染色。LTβ-R-Ig注射后一天，用抗MAdCAM-1,FDC-M1和FDC-M2试剂进行的染色大幅度减弱(表2)。与表1中描述的结果相比，这个实验中FDC-M1染色的快速抑制可能是由于经过免疫的动物中FDC-M1染色比较强的原因。第14天时还可检测到对CR1的染色，表明LTβ-R-Ig处理后3天FDC仍存在而FDC-M1和FDC-M2所检测的标记则不再表达。由此LTβ-R-Ig处理改变了FDC表型。最后，MOMA-1染色减弱但在第14天仍可检测到。
多次LTβ-R-Ig处理抑制了淋巴结中地址素的表达
我们检测了定时受孕的Balb/c小鼠子代淋巴结中地址素的表达，这些受孕小鼠在怀孕的第14天和第17天静脉注射了200ug受体-Ig蛋白。出生后，子代小鼠未被处理或每周通过腹膜内注射100ug LTβ-R-Ig,TNF-R.55-Ig；或LFA-3-Ig。ELISA检测表明在整个生命过程中，融合蛋白水平保持在或高于10ug/mL(数据未显示)。用MECA 367和MECA 79进行免疫组织化学染色表明整个生命过程中以LTβ-R-Ig处理的小鼠的肠系膜淋巴结中完全没有MAdCAM-1和外周淋巴结地址素(图4A,B)。这些小鼠的骶淋巴结缺乏所有地址素的表达，颈和髂淋巴结不显示周围神经节(PHAD染色)(数据未显示)。地址素表达下调是可逆的，因为只在子宫内经处理的动物的表达可恢复到正常水平(图4G,H)。在整个生命过程中以100ug/周TNF-R-55-Ig或LFA-3-Ig处理的小鼠的淋巴结中地址素表达与未处理小鼠相近(图4C,D,E,F)。
LTβ-R-Ig处理小鼠的淋巴结中B淋巴结定位和巨噬细胞标记表达被改变
与LN被膜下淋巴窦(类似于脾边缘区)中巨噬细胞群标记结合的抗体被用于对小鼠的LN进行免疫组织化学分析，这些小鼠经上这述图4描述的方法在怀孕期间和出生后以LTβ-R-Ig,TNF-R55-Ig，或LFA-3-Ig连续处理。用图像分析软件对荧光图象进行分析。唾酸粘附素的表达在以可溶性LTβ-R-Ig处理的小鼠淋巴结减弱(图5B)，而在以下TNF-R55-Ig或LFA-3-Ig处理的小鼠淋巴结中没有减弱(图5E,H)。在以LTβ-R-Ig处理的小鼠淋巴结中仍可检测到MOMA-1在被膜下淋巴窦内巨噬细胞上的表达(图5C)。
也评介了连续的LTβ-R-Ig处理对淋巴结中淋巴细胞组织的影响。以B细胞标记B220和T细胞标记CD4特异的单克隆抗体对LN切片进行染色。图像分析用以确定T和B细胞区的交叉。以LTβ-R-Ig处理可导致B细胞滤泡溶解从而使B细胞以弥散的带呈现出T细胞区外围(图5A)。尽管B细胞滤泡结构溶解了，B细胞不出现于淋巴结的T细胞区内，相反，它们出现于正常情况下没有淋巴细胞的区域。在小鼠的整个生命过程中在以100ug/周TNF-R55-Ig而非LFA-3-Ig处理的小鼠中可观察到相似的T和B细胞染色模式(图5D)。B细胞滤泡再次被破坏并且B细胞出现于淋巴结中通常情况下不包含淋巴细胞的区域。未观察到B细胞与T细胞的重叠。
LTβ-R-Ig处理小鼠抑制了IgM和IgG抗体应答
用LTβ-R-Ig多次处理的小鼠经SRBC引发后不能形成生发中心(如图3中)，表明这些小鼠的体液免疫应答发生了改变。为了直接验检这一点，成年小鼠接受六次LTβ-R-Ig或LFA-3-Ig注射，每周一次，然后以SRBC引发。在免疫后的第7天和第14天对小鼠采血，用血细胞凝集实验分析血清中SRBC特异的IgM和IgG的存在情况。与经人Ig或PBS处理的小鼠相比，用LTβ-R-Ig处理的小鼠经SRBC免疫后的第7天，IgM的滴度正常而IgG应答降低较多(图6A)。与经人Ig或PBS处理的小鼠相比，LTβ-R-Ig处理的小鼠血清中仍检测不到SRBC特异的IgG，而且这些小鼠中SRBC特异的IgM的滴度也降低了一半多(图6A)。
SRBC引发10天后，可在以LTβ-R-Ig处理一次或两次的小鼠脾中检测到GC，然而与对照相比，GC的数量减少很多(表1)。当小鼠接受两次LTβ-R-Ig注射，第一次在SRBC引发前一周，第二次注射在SRBC注射的当天，在第7天和第14天时，检测到的针对SRBC的IgM和IgG抑制情况(图6B)与当小鼠接受多次LTβ-R-Ig注射时检测到的相似(图6A)。在免疫后第30天，检测不到SRBC特异的IgG，与对照相比IgM的水平降低了80％(图6B)。因此，与对照相比，LTβ-R-Ig处理方法导致IgG应答全部受抑制，IgM应答减弱/减小。
若小鼠在SRBC引发的当天只接受一次LTβ-R-Ig注射，第7天时针对SRBC的IgG和IgM应答水平与对照组的相似(图6C)。然而，在免疫后的第24天，IgM和IgG的滴度都降低了30％。在SRBC引发后第34天，与对照组相比SRBC特异的IgM滴度降低了50％而检测不到SRBC特异的IgG(图6C)。这些数据表明LTβ-R-Ig处理方法可导致已存在的IgM和IgG应答水平的减弱/减小，即LTβ-R-Ig处理可抑制已启动的体液应答。
抗体介导的疾病
许多器官特异的多系统自身免疫状况涉及了病理性的抗体应答。这样的状况包括：重症肌无力，自身免疫性溶血性贫血，南美洲锥虫病，突眼性甲状腺肿，自发性血小板减少紫癜(ITP)，系统性红斑狼疮(SLE)，结节性多动脉炎，以及快速进行性新月形肾小球性肾炎。(来自Benjamini等，免疫学，简易教程，(Wiley-Liss,New York第3版，(1996))。
尽管还未确定SLE的病原学，对于产生这种病理现象的免疫学机制有相当的了解。由于未知的原因，SLE患者产生针对身体核组分的抗体(抗核抗体，NAA)，值得注意的是针对天然双链DNA。临床上，这些抗体的出现与SLE中肾牵连的病理有较大的相关性。这些包含DNA抗体复合物显然来自正常组织的降解，与任何免疫聚集病疾，这样的复合物被捕捉于肾小球基底膜上，微动脉壁上和关节滑液空间内形成沉积。这些复合物活化补体级联从而吸引粒细胞。随后的炎症反应特征是肾小球性肾炎，伴随的肾破坏可导致蛋白尿和血尿。
已通过鼠模型对狼疮性肾炎进行了几十年的研究。最近，在这样的一个模型中评价了针对鼠CD40配体的具治疗效果的试剂(Mohan等，免疫学杂志，154，第1470-1480页(1995))，使用阻断CD40/CD40配体相互作用的单克抗体可抑制由于体内转移了诱导致病性抗体产生的细胞导致的狼疮加速。而且，用抗体CD40配体抗体短期治疗狼疮小鼠，在抗体被系统清除后的很长时间内，对自发疾病有持续且有利的影响。实验表明甚至在治疗后9个月后，病理性B细胞不能产生抗体，暗示存在可导致长期治疗效益的自身免疫记忆B细胞扩展的延迟。正如我们所表明的，体内阻断LTα/β/LTβ-R相互作用抑制抗体应答的产生，改变FDC表型及参与优化B细胞记忆的生发中心的形成，本发明的LTα/B/LTβ-R封闭剂可用于治疗或预防SLE。
针对某些致病性感染因子的正常免疫应答也诱发过分的自身抗体应答从而造成医学问题。一个例子是南美洲锥虫病，在人和实验动物发展为伴随慢性克氏锥虫感染的炎性心肌病。在参与人Chagas心肌炎的所有可能机制中，心脏特异的自身免疫应答的诱导最近得到了大量实验的支持。最近的研究(Tibbetts等，免疫学杂志，152，第1493-1499页(1994))明确在T.Cruzi感染的患心脏疾病的C57B1/6小鼠中产生了心脏抗原特异的抗体。一旦被克氏锥虫Brazil株感染，C57B1/6小鼠发展为组织学上与慢性感染的人相似的心肌炎。这些小鼠的抗血清与三种心脏抗原反应，而感染了克氏锥虫Guayas株的C57B1/6小鼠不发展为心肌炎也不产生这样的抗体。这些数据表明这些抗体是心肌炎特有的标记。因此可在这样的啮齿动物模型中评价LTβ-R封闭剂抑制自身抗体介导的破坏的能力。
由某些感染疾病或其它未知原因产生的自身抗体导致的细胞破坏的另一例子是自发性血小板减少性紫癜(ITP)。在这种情况下，针对血小板的抗体导致了血小板破坏(由补体或具Fc或C3b受体的吞噬细胞)可导致出血。体内抑制这样的抗体介导的自身免疫反应的治疗方法，如本发明的LT-β-R封闭剂-抑制抗体的产生-也可用于治疗或预防这些自身免疫疾病。
针对某些致病性感染因子的正常免疫应答也诱发过分的超敏反应从而其本身成为医学问题。Ⅰ型超敏反应最多的例子是变态反应。它们是由通过Fc部分与肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的受体结合的IgE抗体介导以引发释放介导过敏反应的药学活性因子。有时认为ITP和古德帕斯彻综合症是Ⅱ型反应，Ⅱ型反应是当IgM或IgG抗体与细胞表面抗原结合然后活化补体级联反应时反生的。粒细胞被吸引到活化位点，其颗粒体中释放的分解酶导致的破坏使细胞破坏。据认为风湿性关节炎是Ⅲ型超敏反应的结果，Ⅲ型超敏反应是由与正常IgG的Fc部分结合的抗原(在这种情况是风湿因子，IgM自身抗体)免疫复合物介导的。这些免疫复合物参与了关节的炎症及此病特有的损坏。因为这些病理部分是由抗体介导的，抑制抗体产生的治疗方法，如本发明的LT-β-R封闭剂-也可用于治疗或预防这类疾病。
用LTβ-R封闭剂治疗
将以有效剂量使用本发明的组合物治疗谈到的特定临床状况。确定给定应用的优选药物制剂和治疗有效剂量属于本领域的技术，例如，要考虑病人的状态和体积，希望的治疗程度以及病人对此治疗的耐受性。
期望可溶性LTβ-R以1mg/kg剂量适合作为优化治疗剂量的起点。
可通过体外实验评价确定治疗有效剂量，这种实验测定包被靶细胞(LTβ-R或LT配体阳性细胞，依封闭剂而定)1-14天所需的LTβ-R封闭剂的浓度。在以往的于1995年7月21日提交的申请人共同未决的美国申请序号08/505,606描述的受体配体结合实验可用于监控细胞包被反应。用FACS可以活化的淋巴细胞群中分离LTβ-R或LT配体阳性细胞。根据体外结合实验的结果，可选择适合的LTβ-R封闭剂浓度范围在动物中检验。
本发明的可溶性LTβ-R分子、抗LT配体和抗LTβ-R的抗体包括分离纯化形式的抗体或复合物及其药学上可接受的盐或衍生物，单独或联合使用可通过传统已接受的施用具有免疫抑制活性的因子的方式来完成。
在这些治疗方法中施用的药物组合物可以各种形式存在，包括例如固体、半固体和液体剂量形式如片剂，丸剂，粉剂，液体溶液或悬液，栓剂；以及可注射和可灌注的溶液。优选的方式依赖于预期的施用方式和治疗应用。施用方式可包括口腔，肠胃外，皮下，静脉内，病灶内或局部施用。
本发明的可溶性LTβ-R分子，抗LT配体和抗LTβ-R抗体可以，例如，单独或与促进吸收或稳定性的辅因子放入无菌的等渗制剂中。优选地，制剂是液体，或是干燥的粉末。例如，本发明的可溶性LTβ-R分子，抗LT配体和抗LTβ-R抗体可用包含5.0mg/ml柠檬酸-水合物，2.7mg/mL柠檬酸三钠，41mg/mL甘露醇，1mg/ml甘氨酸和1mg/ml多聚山梨酸酯20的制剂缓冲液稀释。这种溶液也被干燥；贮存于冷冻条件下，在使用前重新溶于无菌注射用水(USP)。
优选地，组合物也可包含本领域众所周知的传统的药学上可接受的载体(见例如Remington药物科学，第16版，1980,Mac PublishingCompany)。这样的药学可接受载体包括其它药用剂，载体，基因载体，佐剂，赋形剂等，如人血清白蛋白或血浆制品。优选地，此组合物以单位剂量形式且通常一天使用一次或多次。
本发明的药物组合物可通过微球体，脂质体，其它微颗粒运送系统使用或将制剂置于受损组织或血流内、附近或以某种方式使它们相联系从而使组合物持续释放。合适的持续释放载体包括以有形物品如栓剂或微胶囊形式出现的半透性多聚体基质。植入性-或微胶囊性持续释放基质包括polyactides(美国专利号3,773,319；EP58,481)L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸共聚体(Sidman等，生物多聚体，22，第547-56页(1985))；多聚(2-羟乙基-异丁烯酸)或ethyleme Vinyl acetate(Lanager等，生物医学材料研究杂志，15，第167-277页(1981)；Langer，化学技术，12，第98-105页(1982))。
可用众所周知的方法(见如，DE3,218,121；Epstein等，美国国家科学院院报，82，第3688-92页(1985)；Hwang等，美国国家科学院院报，77，第4030-34页(1980)；美国专利号4,485,045和4,544,545)，制备包含本发明的可溶性LTβ-R分子，抗LT配体和抗LTβ-R抗体的脂质体。通常，脂质体是小的(约200-800A)单层，其中脂含类高于30mol％胆固醇。选择胆固醇的比例以控制可溶性LTβ-R分子，抗LT配体和抗LTβ-R抗体的最佳释放速度。
本发明的可溶性LTβ-R分子，抗LT配体和抗LTβ-R抗体可与包含其它LTβ-R封闭剂，免疫抑制剂或细胞因子的脂质体相连以调节LTβ-R封闭活性。可用任何已知的交联剂如广泛用于将毒素或化疗剂与抗体偶联从而定向运送的异双功能交联剂将LTβ-R分子，抗LT配体和抗LTβ-R抗体与脂质体相连。运用糖类定向的交联剂4-(4-马来酰苯)丁酸肼(MPBH)可完成与脂质体的偶联(Duzgunes等，细胞生物学杂志，摘要，增补；16E77(1992))。
包含LTβ-R封闭剂的治疗组合物的优点
本发明的LTβ-R封闭剂能选择性地抑制免疫效应物机制。抗体介导的免疫抑制受多种机制抑制，包括通过影响FDC功能调节GC形成。通过调节地址素表达从而影响淋巴细胞运输，抗体和细胞介导的免疫都部分受到抑制。因而，LTβ-R封闭剂可用于治疗由于抗体活性或地址素异常表达恶化的状况。选择性抑制这样的免疫介导的反应的能力可用以治疗包括各种自身免疫和慢性炎症状况在内的异常。如上文所讨论的，运用对于多种细胞和免疫应答具多重效应的免疫调节剂和免疫抑制剂治疗这样的由免疫介导的病理状况。通常，非特异性的免疫抑制剂需要量很大，常常是导致副作用的细胞毒性剂量。
试剂的抑制抗体应答以减轻病理性免疫应答的能力得到最近的对于小鼠狼疮性肾炎的研究的支持。在后一个研究中，使用阻断CD40/CD40L通路的抗体可抑制由于体内转移了诱导致病性抗体产生细胞导致的狼疮性肾炎的加速，在抗体被系统清除后的很长时间内，对自发疾病有持续且有利的影响。这些数据表明本发明的LTβ-R封闭剂通过抑制导致抗体应答产生的过程可用于抑制组织移和器官移植中的细胞排斥。
根据受治疗的状况，异常或疾病，本发明组合物和方法中的LTβ-R封闭剂可被修饰以得到希望的LTβ-R信号传导水平。可以预想，通过控制LTβ-R封闭剂针对其各自的分子靶所需的浓度和亲和力使LTβ-R信号传导的绝对水平得到精细调节。
例如，本发明中的一个实施方案中，将包含可溶性LTβ-R分子的组合物运用于受试对象。可溶性的LTβ受体可有效地与细胞表面LTβ受体竞争表面LT配体。与表面LT配体竞争的能力依赖于可溶性和细胞表面LTβ-R分子的相对浓度，以及它们对于配体结合的相对亲和力。
根据本领域技术人员熟知的标准重组DNA技术，可产生具有突变的可溶性LTβ-R分子，从而提高或降低突变的可溶性LTβ-R与表面LT配体的结合亲和力。用常规实验和在此所述的技术，检测大量的具定点或随机突变分子作为LTβ-R封闭剂的能力。
相似地，在本发明的另一实施方案中，针对LTβ受体或LT配体一个或多个亚基的抗体可作为LTβ-R封闭剂。突变，化学修饰或通过其它能改变对受试对象所用抗体有效浓度和活性的方法修饰这些抗体封闭LTβ受体信号传导的能力。
减弱而不完全抑制LTβ-R信号传导的能力对于建立或维持降低了的信号传导的水平，它可支持正常免疫功能而抑制夸大的或不正常的抗体或细胞介导的应答。
小鼠LTα基因的破坏导致外周淋巴器官发育异常(De Togni等，科学，264，第703-707页(1994))。这样的小鼠缺乏淋巴结和脾滤泡中的T和B细胞丰富区之间缺乏清析的界限。我们认为这种表型与表面LT诱导的LTβ-R信号传导的丢失相关，因为调节TNF-α活性观察不到相似的表型。选择性地或特异阻断LTβ-R通路的能力可用于治疗由与LTβ-R通路中信号的误表达或过表达相关的慢性炎症引起的淋巴样结构的异常发育。
抗体在针对致病因子的免疫反应中是关键介导者。因此，在某些情况下并不希望完全抑制抗体应答。例如，抵抗细胞外细菌如肺炎球菌和嗜血杆菌感染需要由抗体介导。
阻断LTβ-R信号传导影响抗体产生水平的能力于对用本发明的LTβ-R封闭剂治疗时有益效果达到最大是重要的。
本发明的治疗方法涉及选择性地抑制全部或部分依赖于LT-β通路的应答。本权利要求的发明的特定治疗作用依赖于抑制病原机制，还是促进医学上希望的过程，这一点对于本领域熟练技术人员显而易见。因此在各种实施方案中，本发明的方法涉及使用治疗有效量的LT-β-R或LT-β封闭剂。这些方法所用的蛋白可以是全长蛋白，蛋白片段或融合片段。在其它实施方案中，此方法涉及使用可溶性片段，如可溶性β-淋巴毒素受体。在其它优选实施方案中，此权利要求的发明涉及使用针对LT-β-R或LT-β的抗体。本发明的封闭剂可与治疗有效量的产生医学上希望效果的第二种复合物同时使用。
例如，在某些治疗艾滋病和/或HIV的方法中，人们喜欢同时使用本领域熟悉的另外的抗病毒物质。例如，AZT或蛋白酶抑制剂。特别优选的本发明封闭剂，更优选地，LTβ-R/IgG融合蛋白可与艾滋病“鸡尾酒”治疗方案联合使用。药物“鸡尾酒”涉及给病人多种药物以降低病人系统中病毒的数量。
按照标准操作，本发明的组合物可制成制剂，如制备于载体中。术语药学上可接受的载体指一种或多种有机或无机成分，天然的或合成的，它可促进病人使用本发明封闭剂。本领域技术人员熟知合适的载体。
可用医学上可接受的方式使用本发明的任一组合物。这包括注射，非肠道途径如静脉内，血管内，动脉内，皮下，肌肉，肿瘤内，腹膜内，intraentriculare，硬膜内或其它的方式，以及口的，鼻的，眼的，直肠的或局部途径。本发明也特别包括通过贮存注射或植入产生的持续释放用药。也可采用局部运送。本领域技术人员很容易确定用药方式。
用于此申请专利的发明中的LT通路的抑制剂欲包括在此申请专利的可溶性LT-β-R，抗体的功能衍生物。功能衍生物包括分子片段，变异体，类似物或化学衍生物。分子片段，如本发明任何抗原起源与分子的任何多肽。这样分子的变异体指与全长分子或其片段基本相似的天然分子。分子类似物指与全长分子或其片段基本相似的非天然分子。
本发明封闭剂的变异体与天然因子的区别在于氨基酸序列，或不涉及序列的方式，或两者皆具备。当天然分子的一个或多个氨基酸被不同的天然氨基酸，氨基酸衍生物或非天然氨基酸替代时，产生了氨基酸序列变异体。特别优选的变异体包括天然蛋白，或天然蛋白的生物活性片段，其序列与野生型序列的区别在于一个或多个保守氨基酸的替代。这样的替代为本领域技术人员熟知，典型地对封闭剂的次级结构和疏水性有最小的影响。
在其它实施方案中，具保守性差的氨基酸替代的变异体可产生希望的衍生物，如通过导致电荷，构象和其它生物特征的变化。这样的替代包括，例如，用亲水残基代替疏水残基，用半胱氨酸或脯氨酸替代另一个残基，用具小侧链的残基替代具大侧链的残基，或用具净正电荷的残基替代具净负电荷的残基。当不能确定预测给定替代的结果时，可用此处公开的方法确定希望特征的存在或缺失以测定此衍生物。
本发明范围内的变异体包括与本发明的封闭剂的氨基酸有至8％同源性的蛋白质和多肽。更优选地，序列同源性至少为90％，或至少95％。为了测定同源性，比较序列的长度一般至少为8个氨基酸序列，通常至少20个氨基酸残基。本发明范围内的变异体包括任何封闭剂，它1)具有与封闭剂序列有至少40％同源性的氨基酸序列，也包括2)与本发明封闭剂序列以最佳排列放在一起时，其80％的半胱氨酸与本发明封闭剂的半胱氨酸排列。
与本发明的封闭剂特异结合的本发明内的因子包括配体和抗体。
下面说明本发明的LTβ受体，抗LT配体和抗LTβ-R抗体的例子和确定它们的方法。这些例子不应有限制性：这些例子是起说明作用而且本发明只由权利要求书定义。
实施例1
制备与免疫球蛋白Fc形成融合蛋白的可溶性人LTβ受体
从人12p转录序列库中分离的来自体细胞杂种人cDNA克隆的序列(Baens等，基因组，16，第214-18页(1993)，被输入基因文库，后来被确定为编码人LTβ-R的序列。从1992年，全长人LTβ-R cDNA克隆序列可以得到，其基因库进入号为LO 4270。
用5’端和3’端分别有NotⅠ和SalⅠ限制性酶位点的引物扩增至穿膜区LTβ-R的胞外区(图1)(Browning等，免疫学杂志，154，第33-46页(1995))。用NotⅠ和SalⅠ切割扩增片段，纯化并将之与用编码人IgG1 Fc区的SalⅠ-NotⅠ片段连接到经NotⅠ线型化的载体PMDR 901中。最终的载体包含由各自启动子推动的二氢叶酸还原酶基因和LTβR-Ig融合蛋白。
按照标准方法，将载体电转入CHO dhfr细胞并分离具氨甲蝶呤抗性的克隆。LTβ-R-Ig被分泌到培养基中，用ELISA实验筛选合成受体融合蛋白水平最高的细胞系。将合成水平的高细胞大量培养并收集条件培养基。用蛋白A琼脂糖快流速亲和层析(pharmaria)分离纯的LTβ受体融合蛋白。
实施例2
制备与免疫球蛋白Fc形成融合蛋白的可溶性鼠LTβ受体。
将来自两个部分cDNA分离物的5’NotⅠ/ApalⅠ和3’ApalⅠ/NotⅠ片段连接到PCDNA 3的NotⅠ位点(Invitrogen,San Diego,CA)以制备鼠LTβ-R的全cDNA克隆。此cDNA克隆的序列可通过基因库进入号U29173得到。与已输入的基因库进入号L38423的另一鼠LTβ-R序列比较，未发现编码序列的差异。
以全长的m LTβ-R cDNA克隆作为模板，用引物5’AACTGCAGCGGCCGCCATGCGCCTGCCC3’和5’GACTTTGTCGACCATTGCTCCTGGCTCTGGGGG 3’通过PCR扩增合成可溶性鼠LTβ-R/人IgG1融合蛋白。纯化并以NotⅠ和SalⅠ切割扩增片段后与人IgG1 Fc的SalⅠ/NotⅠ片段一起连接到NotⅠ线性化并经磷酸酶处理的SAB 132以形成JLB122。为了稳定表达，将包含鼠LTβ-R-Ig片段的Not盒转到PMDR 901的NotⅠ位点从而形成PSH 001，按照(Browning等，免疫学杂志，154，第33-46页(1995))所述的方法，将此载体转染到CHO细胞中。用ELISA分析鉴定分泌鼠LTβ-R-Ig的细胞克隆。用蛋白A琼脂糖快流速层析(pharmacia)从CHO细胞上清中分离纯的受体融合蛋白以用于下述的实施例中。
实施例3
以LTβ-R-Ig多次注射小鼠后对脾进行免疫组织化学分析
4-5周龄的小鼠接受6次LTβ-R-Ig或LFA-3-Ig注射(100ug，腹膜内)，每周一次，在第6次注射融合蛋白的当天用SRBC免疫这些小鼠。以SRBC攻击后的第4天；再注射一次LTβ-R-Ig或LFA-3-Ig。在SRBC攻击后的第10天处死小鼠并收集器官以分析其结构。图2中的左列代表来自LFA-3-Ig处理动物的脾切片(A,C,E,G,I)；右列代表来自LTβ-R-Ig处理动物的脾切片(B,D,F,H,J)。以生物素化的抗鼠B220标记的和抗小鼠CD40抗体双染丙酮固定的冷冻脾切片(A和B)，然后分别用相应的碱性磷酸标记的链亲和素(紫蓝，暗染色)和辣根过氧化物酶标记的小鼠抗大鼠Ig(浅棕染色)进行第二次染色。用抗体ER-TR-9(检测M2M,C和D),MOMA-1(检测嗜金属噬细胞，E和F),MECA-367(针对MAdCAM-1,G和H)，以及ER-TR-7(染网状成纤维细胞，I和J)对另一套冰冻切片染色，然后用辣根过氧化物酶标记的小鼠抗大鼠Ig进行第二次染色(棕色染色)。这些图片代表了最少6只动物的切片染色。放大倍数10×。
实施例4
LTβ-R-Ig和抗CD40配体对GC形成和FDC染色的影响按实施例3所述的方法，以LTβ-R-Ig或LFA-3-Ig处理动物，以MR1(抗小鼠CD40配体，250ug/注射，腹膜内)在第-1天，第1天和第三天处理另一组动物，在第0天接受SRBC，第10天处死动物，用生物素标记的商陆凝集素(PNA，上排，A,B和C)或FDC M1(下排，D,E和F)对用LFA-3-Ig(图3左列；A和D)，或LTβ-R-Ig(中列；B和E)；或MR1(右列，C和F)处理动物的丙酮固定的脾切片进行染色，然后分别用辣根过氧化物酶标记的链亲和素和辣根过氧化物酶标记的小鼠抗大鼠Ig进行第二次染色(棕色染色)。用箭头指示A和C中的边缘区的PNA染色。用白星指示A中GC的形成；黑箭头指示D和F中FDC染色。这些图片代表了至少4只动物的切片染色。放大倍数10×。
实施例5
子宫内和出生后连续用LTβ-R-Ig处理的小鼠淋巴结中地址素的表达
这些实验使用了定时受孕Balb/c小鼠的子代，在怀孕的第14天和第17天静脉注射200ug受体-Ig蛋白。出生后，每周腹膜内注射一次100ugLTβ-R-Ig,TNF-R 55-Ig或LFA-3-Ig。ELISA测定的表明在整个生命过程中，融合蛋白的水平保持或高于10ug/ml(数据未显示)。图4：系列A,B,G,H是对以LTβ-R-Ig处理小鼠的淋巴结染色。系列C,D是对以LFA-3-Ig处理的小鼠淋巴结的染色。系列E,F是对以TNF-R55-Ig处理的小鼠淋巴结的染色。系列A,C,E,G是用抗体MECA 367对肠系膜淋巴结染色以检测粘膜地址素；MAdCAM-1。系列B,D,F,H是用针对外周淋巴结地址素(PNAdS)的抗体MECA9进行染色。系列G,H是只在子宫内经LTβ-R-Ig处理的6周龄小鼠淋巴结，所有图象的放大倍数为50×。
实施例6
子宫内和出生后经LTβ-R-Ig连续处理小鼠的淋巴结中淋巴细胞的定位及巨噬细胞标记的表达。按实施例5所述，以LTβ-R-Ig,TNF-R55-Ig，或LFA-3-Ig在子宫内和出生后连续处理小鼠。用针对巨噬细胞表达的标记的抗体或针对B细胞标记B220及T细胞标记CD4的单克隆抗体对LN切片进行染色。用图象分析鉴定T和B细胞区的重叠。图5：系列A,D,G分别是用B220/CD4对经LTβ-R-Ig,LFA-3-Ig和TNF-R 55-Ig处理小鼠的淋巴结进行染色。用图象分析软件分析荧光图象。系统B,E,H对唾酸粘附素进行染色，系列C,F,I是对MOMA-1进行染色。
实施例7
LTβ-R-Ig处理对针对SRBC的抗体应答的影响，按下面所述以LTβ-R-Ig，人Ig或PBS注射Balb/c小鼠：图6A：小鼠接受如图2，实施例所述的六次注射。在SRBC免疫后第7天(黑棒)和第14天(条形棒)给动物放血。6B：动物在第-7天和第0天接受融合蛋白。SRBC在第0天给予；在第7天(黑棒)，第14天(条形棒)和第30天(白棒)给动物放血。6C：动物在第0天接受一次融合蛋白，与SRBC免疫的时间相同。在第7天(黑棒)，第14天(条形棒)和第34天(灰棒)收集血。
以血细胞凝集实验分析血清中SRBC特异的IgM和IgG的滴度。滴度定义为可检测到血细胞凝集的血清最后稀释度的倒数并用底数为2的对数代表(1=血清稀释15倍)。结果以每组4只不同动物标准方差平均数代表。

Claims (50)

1．一种改变动物体液免疫应答的方法，包括以下步骤：
a)使用包含治疗有效量的LT-β-R封闭剂的药物组合物。
2．根据权利要求1所述的方法，其中LT-β-R封闭剂选自由可溶性β-淋巴毒素受体、针对LT-β受体产生的抗体和针对表面LT配体产生的抗体组成的群体。
3．根据权利要求1所述的方法，其中动物是哺乳动物。
4．根据权利要求3所述的方法，其中哺乳动物是人。
5．根据权利要求2所述的方法，其中LT-β-R封闭剂包括具有能选择性地与表面LT配体结合的配体结合区的可溶性β-淋巴毒素受体。
6．根据权利要求5所述的方法，其中可溶性β-淋巴毒素受体包括人免疫球蛋白Fc结构域。
7．根据权利要求2所述的方法，其中LT-β-R封闭剂包括针对LT-β受体产生的单克隆抗体。
8．根据权利要求7所述的方法，其中组合物以足够覆盖LT-β-受体阳性细胞的量施用1-14天。
9．根据权利要求7所述的方法，其中LT-β-R封闭剂包括抗人LT-β-R的单克隆抗体BDA8。
10．根据权利要求2所述的方法，其中LT-β-R封闭剂包括针对表面LT配体产生的单克隆抗体。
11．根据权利要求10所述的方法，其中组合物以足够覆盖表面LT配体阳性细胞的量施用1-14天。
12．根据权利要求10所述的方法，其中抗体是针对LT配体的亚基产生的。
13．根据权利要求12所述的方法，其中LT-β-R封闭剂包括抗人LT-β的单克隆抗体B9。
14．根据权利要求10所述的方法，其中LT-β-R封闭剂包括针对鼠表面LT配体产生的单克隆抗体。
15．权利要求1的方法，进一步包括药学上可接受的载体或佐剂。
16．根据权利要求1所述的方法，其中体液免疫应答受到抑制。
17．一种药物组合物，包含治疗有效量的LT-β-R封闭剂和药学上可接受的载体。
18．根据权利要求38所述的组合物；其中LT-β-R封闭剂选自由可溶性β-淋巴毒素受体、针对LT-β受体产生的抗体和针对表面LT配体产生的抗体组成的群体。
19．一种抑制LT-β-R信号传导但不抑制TNF-R信号传导的方法，包括对处理对象施用有效量的LT封闭剂的步骤。
20．根据权利要求19所述的方法，其中LT-β-R封闭剂选自由可溶性β-淋巴毒素受体、针对LT-β受体产生的抗体和针对表面LT配体产生的抗体组成的群体。
21．根据权利要求19所述的方法，其中处理对象包括哺乳动物的一个或多个细胞。
22．根据权利要求21所述的方法，其中哺乳动物是人。
23．根据权利要求19所述的方法，其中LT-β-R封闭剂包括具有能选择性地与表面LT配体结合的配体结合区的可溶性β-淋巴毒素受体。
24．根据权利要求23所述的方法，其中可溶性β-淋巴毒素受体进一步包含人免疫球蛋白Fc结构域。
25．根据权利要求19所述的方法，其中LT-β-R封闭剂包括针对LT-β-受体产生的单克隆抗体。
26．根据权利要求22所述的方法，其中LT-β-R封闭剂包括抗人LT-β-R的单克隆抗体BDA8。
27．根据权利要求19所述的方法，其中LT-β-R封闭剂包括针对表面LT配体产生的单克隆抗体。
28．一种改变病人免疫复合物和B细胞滤泡结合的方法，包括给该病人施用一定量的LT-β-R封闭剂。
29．权利要求28的方法，其中所述的病人感染了人免疫缺损病毒。
30．权利要求28的方法，其中所述的封闭剂选自由可溶性LT-β-R，针对LT-β-R产生的抗体，针对表面LT配体产生的抗体组成的群体。
31．权利要求30的方法，其中所述的可溶性LT-β-R具有可选择性地与表面LT配体结合的配体结合区。
32．权利要求31的方法，其中所述的可溶性受体包含人免疫球蛋白Fc结构域。
33．权利要求28的方法，其中LT-β-R封闭剂包括针对LT-β-R产生的单克隆抗体。
34．权利要求33的方法，其中所述的抗体是抗人LT-β-R的单克隆抗体BDA8。
35．权利要求28的方法，进一步包括药学上可接受的载体或佐剂。
36．一种治疗、预防或清除哺乳动物中人免疫缺损病毒的方法，包括施用含有治疗有效量的LT-β-R封闭剂和药学上有效的载体的药物组合物这一步骤。
37．权利要求36的方法，其中LT-β-R封闭剂选自由可溶性β-淋巴毒素受体、针对LT-β-R产生的抗体和针对表面LT配体产生的抗体组成的群体。
38．权利要求37的方法，其中封闭剂包括具有能选择性地与表面LT配体结合的配体结合区的可溶性β-淋巴毒素受体。
39．权利要求38的方法，其中可溶性受体包含人免疫球蛋白Fc结构域。
40．权利要求36的方法，其中LT-β-R封闭剂包括针对LT-β-R产生的单克隆抗体。
41．权利要求40的方法，其中封闭剂包括抗人LT-β-R的单克隆抗体BDA8。
42．权利要求36的方法，其中封闭剂包括针对表面LT配体产生的单克隆抗体。
43．权利要求36的方法，进一步包括同时施用其它抗病毒剂。
44．权利要求28的方法，其中B细胞是小结树突细胞。
45．一种治疗移植排斥的药物组合物，包含治疗有效量的LT-β-R封闭剂和治疗有效量的CD40L封闭剂。
46．权利要求45的组合物，其中LT-β-R封闭剂是LT-β-R/IgG，而CD40L封闭剂是抗CD40L的化合物。
47．一种治疗AIDS或HIV的药物组合物，包含AZT、蛋白酶抑制剂和LT-β-R封闭剂。
48．权利要求47的组合物，其中封闭剂是LT-β-R/IgG融合蛋白。
49．权利要求46的组合物，其中抗CD40L的化合物是单克隆抗体。
50．权利要求49的组合物，其中抗体是5c8。
CNB971999066A 1996-10-25 1997-10-24 可溶性β-淋巴毒素受体和抗淋巴毒素受体的抗体以及抗淋巴毒素配体的抗体的用途 Expired - Fee Related CN100382844C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2906096P 1996-10-25 1996-10-25
US60/029,060 1996-10-25

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA200810082273XA Division CN101239186A (zh) 1996-10-25 1997-10-24 可溶性β-淋巴毒素受体(LT-β-R)融合蛋白的用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1237910A true CN1237910A (zh) 1999-12-08
CN100382844C CN100382844C (zh) 2008-04-23

Family

ID=21847003

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB971999066A Expired - Fee Related CN100382844C (zh) 1996-10-25 1997-10-24 可溶性β-淋巴毒素受体和抗淋巴毒素受体的抗体以及抗淋巴毒素配体的抗体的用途
CNA200810082273XA Pending CN101239186A (zh) 1996-10-25 1997-10-24 可溶性β-淋巴毒素受体(LT-β-R)融合蛋白的用途

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA200810082273XA Pending CN101239186A (zh) 1996-10-25 1997-10-24 可溶性β-淋巴毒素受体(LT-β-R)融合蛋白的用途

Country Status (26)

Country Link
EP (1) EP0954333B1 (zh)
JP (1) JP4299887B2 (zh)
KR (1) KR100584704B1 (zh)
CN (2) CN100382844C (zh)
AT (1) ATE331531T1 (zh)
AU (1) AU726357B2 (zh)
BG (1) BG63565B1 (zh)
BR (1) BR9712670A (zh)
CA (1) CA2269614A1 (zh)
CZ (1) CZ142899A3 (zh)
DE (1) DE69736244T2 (zh)
DK (1) DK0954333T3 (zh)
EA (1) EA002983B1 (zh)
EE (1) EE05213B1 (zh)
ES (1) ES2268727T3 (zh)
HK (1) HK1025500A1 (zh)
HU (1) HU226467B1 (zh)
IL (1) IL129527A (zh)
IS (1) IS5031A (zh)
NO (1) NO328540B1 (zh)
NZ (1) NZ335353A (zh)
PL (1) PL190617B1 (zh)
PT (1) PT954333E (zh)
SK (1) SK55399A3 (zh)
TR (1) TR199901636T2 (zh)
WO (1) WO1998017313A2 (zh)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5925351A (en) 1995-07-21 1999-07-20 Biogen, Inc. Soluble lymphotoxin-β receptors and anti-lymphotoxin receptor and ligand antibodies as therapeutic agents for the treatment of immunological disease
US6998108B1 (en) 1997-07-07 2006-02-14 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Antibodies to p30 polypeptides and methods making and using same
US7118742B2 (en) 1997-07-07 2006-10-10 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Ligand for herpes simplex virus entry mediator and methods of use
US6140467A (en) * 1997-07-07 2000-10-31 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Ligand for herpes simplex virus entry mediator and methods of use
AU777492C (en) * 1998-10-09 2005-05-26 Biogen Ma Inc. Reversal of viral-induced systemic shock and respiratory distress by blockade of the lymphotoxin beta pathway
TR200504220T2 (tr) * 1998-12-17 2007-04-24 Biogen Idec Ma Inc. Aktif limfotoksin-beta reseptör imunoglobülin şimeAktif limfotoksin-beta reseptör imunoglobülin şimerik proteinlerinin yüksek düzey ifadesi ve saflaştrik proteinlerinin yüksek düzey ifadesi ve saflaştırılması için bir yöntem.ırılması için bir yöntem.
JP3822822B2 (ja) * 1999-06-28 2006-09-20 ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト 腫瘍の成長を予防する方法
DE19939653A1 (de) * 1999-08-13 2001-02-22 Thomas Huenig Verwendung CD28 spezifischer monoklonaler Antikörper zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung
WO2001079496A2 (en) * 2000-03-13 2001-10-25 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Ligand for herpes simplex virus entry mediator and methods of use
DE60143231D1 (de) * 2000-04-12 2010-11-18 Jolla Inst Allergy Immunolog Ligand des zelleintritt-vermittelnden Proteins von Herpes Simplex und Methoden zu dessen Verwendungen
PL377611A1 (pl) * 2002-12-20 2006-02-06 Biogen Idec Ma Inc. Czynniki dla receptora limfotoksyny beta w połączeniu z czynnikami chemioterapeutycznymi
NZ576032A (en) 2006-10-12 2012-03-30 Genentech Inc Antibodies to lymphotoxin-alpha
EP2073833A2 (en) 2006-10-20 2009-07-01 Biogen Idec MA Inc. Treatment of demyelinating disorders with soluble lymphotoxin-beta-receptor
US8338376B2 (en) 2006-10-20 2012-12-25 Biogen Idec Ma Inc. Compositions comprising variant LT-B-R-IG fusion proteins
CA2763439A1 (en) * 2009-05-28 2010-12-02 Glaxo Group Limited Antigen-binding proteins
US20210253723A1 (en) * 2018-06-15 2021-08-19 Universität Bern LIGANDS TO LIGHT OR ITS RECEPTOR LTßR FOR USE IN HAEMATOLOGIC MALIGNANCIES
KR102360196B1 (ko) 2019-10-30 2022-02-08 주식회사 친환경테크 다용도 시트 조성물

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69334224D1 (de) * 1992-12-04 2008-07-17 Biogen Idec Inc Lymphotoxin-beta, lymphotoxin-beta komplexe, pharmazeutische zubereitungen und therapeutische verwendungen davon
US5925351A (en) * 1995-07-21 1999-07-20 Biogen, Inc. Soluble lymphotoxin-β receptors and anti-lymphotoxin receptor and ligand antibodies as therapeutic agents for the treatment of immunological disease

Also Published As

Publication number Publication date
DE69736244T2 (de) 2007-05-31
KR100584704B1 (ko) 2006-05-30
WO1998017313A2 (en) 1998-04-30
EE9900146A (et) 1999-12-15
NZ335353A (en) 2000-09-29
IS5031A (is) 1999-04-21
HUP9904516A3 (en) 2002-09-30
EP0954333A2 (en) 1999-11-10
JP4299887B2 (ja) 2009-07-22
HK1025500A1 (en) 2000-11-17
NO991926D0 (no) 1999-04-22
EA002983B1 (ru) 2002-12-26
PL190617B1 (pl) 2005-12-30
HUP9904516A2 (hu) 2000-05-28
AU5089698A (en) 1998-05-15
KR20000052800A (ko) 2000-08-25
WO1998017313A3 (en) 1998-07-30
CA2269614A1 (en) 1998-04-30
BR9712670A (pt) 1999-10-19
SK55399A3 (en) 2000-10-09
PT954333E (pt) 2006-10-31
DK0954333T3 (da) 2006-10-23
PL332972A1 (en) 1999-10-25
BG103416A (en) 2000-01-31
CN101239186A (zh) 2008-08-13
TR199901636T2 (xx) 1999-09-21
CZ142899A3 (cs) 1999-07-14
ATE331531T1 (de) 2006-07-15
JP2001502697A (ja) 2001-02-27
IL129527A (en) 2006-12-10
NO328540B1 (no) 2010-03-15
BG63565B1 (bg) 2002-05-31
HU226467B1 (en) 2008-12-29
AU726357B2 (en) 2000-11-02
EP0954333B1 (en) 2006-06-28
ES2268727T3 (es) 2007-03-16
IL129527A0 (en) 2000-02-29
EE05213B1 (et) 2009-10-15
CN100382844C (zh) 2008-04-23
EA199900409A1 (ru) 2000-02-28
DE69736244D1 (de) 2006-08-10
NO991926L (no) 1999-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1291757C (zh) 炎性肠疾病的治疗剂
CN1237910A (zh) 可溶性β－淋巴毒素受体和抗淋巴毒素受体的抗体以及抗淋巴毒素配体的抗体的用途
CN1317301C (zh) Il－2－和il－15－介导的t细胞应答的调节
CN100340292C (zh) Baff,其封闭剂以及它们在b细胞应答的调节中的应用
CN1379815A (zh) Baff受体(bcma),一种免疫调节剂
CN1195849C (zh) April－具有生长效应的新的蛋白质
Fava et al. A role for the lymphotoxin/LIGHT axis in the pathogenesis of murine collagen-induced arthritis
CN1146442C (zh) 作为抗肿瘤剂的淋巴毒素-α/β复合体和抗淋巴毒素-β受体抗体
CN1891714A (zh) 单纯疱疹病毒进入介体的配体和使用方法
CN1787837A (zh) 防止和治疗癌转移以及与癌转移相关的骨质损失的方法
CN1692127A (zh) Taci抗体及其用途
US5556947A (en) Monoclonal antibody recognizing a surface molecule on a subset of antigen-stimulated T cells and on certain malignancies of T and B cell origin
CN1585778A (zh) 修饰的抗－TNFα抗体
CN1359302A (zh) 治疗免疫性疾病的药用组合物
JPH07508179A (ja) ヒトインターロイキン−１３
CN1599754A (zh) 抗trail－r抗体
CN1342202A (zh) 可溶性受体br43×2和应用方法
CN1051393A (zh) 细胞激动素合成抑制因子、其拮抗物及其使用方法
CN1404400A (zh) Il－18抑制剂的应用
US6994976B1 (en) Tr3-specific binding agents and methods for their use
US20050282223A1 (en) TR3-specific binding agents and methods for their use
CN101080420A (zh) 胸腺特异性蛋白质
CN1202200A (zh) Fas配体融合蛋白
CN1317046A (zh) 新型受体蛋白及应用其的炎症疾病诊断方法
CN1835769A (zh) Kim－1拮抗剂及其在免疫系统调节中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20080423

Termination date: 20131024