PL190617B1

PL190617B1 - Zastosowanie czynnika blokującego LT-beta-R, zastosowania kompozycji farmaceutycznej i kompozycja farmaceutyczna

Info

Publication number: PL190617B1
Application number: PL97332972A
Authority: PL
Inventors: Jeffrey Browning; Paula Susan Hochman; Paul D. Rennert; Fabienne Mackay
Original assignee: Biogen Idec Inc
Priority date: 1996-10-25
Filing date: 1997-10-24
Publication date: 2005-12-30
Also published as: IL129527A0; ATE331531T1; WO1998017313A3; BG63565B1; PT954333E; JP2001502697A; HU226467B1; IS5031A; BR9712670A; CN101239186A; CN1237910A; EE05213B1; SK55399A3; NZ335353A; EP0954333B1; CA2269614A1; CZ142899A3; HUP9904516A3; AU5089698A; KR20000052800A

Abstract

1. Zastosowanie czynnika blokujacego LT-ß-R do wytwarzania kompozycji farma- ceutycznej do hamowania humoralnej reakcji odpornosciowej u zwierzecia. 2. Zastosowanie wedlug zastrz. 1, znamienne tym, ze czynnik blokujacy LT -ß-R jest wybrany z grupy skladajacej sie z rozpuszczalnego receptora limfotoksyny-ß, przeciw- ciala skierowanego przeciwko receptorowi LT-ß i przeciwciala skierowanego przeciwko powierzchniowemu ligandowi LT. 77. Zastosowanie kompozycji farmaceutycznej do wytwarzania leku do leczenia ukladowego tocznia rumieniowatego (SLE) u zwierzecia, przy czym kompozycja farmaceu- tyczna zawiera skuteczna ilosc polipeptydu obejmujacego rozpuszczalna wiazaca ligand domene receptora limfotoksyny-ß (L T-ß-R) polaczona z domena Fc ludzkiej IgG1 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nosnik. 79. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, ze obejmuje ilosc polipeptydu skuteczna do hamowania humoralnej reakcji odpornosciowej u zwierzecia oraz farmaceu- tycznie dopuszczalny nosnik, przy czym polipeptyd obejmuje rozpuszczalna, wiazaca li- gand domene receptora limfotoksyny-ß (LT-ß-R) polaczona z domena Fc ludzkiej IgG1. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są zastosowania czynnika blokującego ΙΤ-β-R, zastosowania kompozycji farmaceutycznej i kompozycja farmaceutyczna. W ogólności wynalazek dotyczy rozwiązań obejmujących „czynniki blokujące receptor limfotoksyiy-β”, które blokują sygnalizację przez receptor limfotoksyny-β. Środki blokujące receptor limfotoksyny-β są przydatne w leczeniu chorób immunologicznych, bardziej szczegółowo do hamowania przeciwciał pośredniczących w odpowiedzi odpornościowej, do regulacji wyrażania adresyn i do kierowania ruchem komórek i do wpływania na komórki dendrytyczne grudek. Wynalazek dotyczy rozpuszczalnych postaci domeny zewnątrzkomórkowej receptora limfotoksyiy—β i przeciwciał skierowanych przeciwko receptorowi limfotoksyny-β albo jego ligandowi, limfotoksyme powierzchniowej, które działająjako środki blokujące receptor limfotoksyny-β.

Podstawa wynalazku

Istnieją dwa rodzaje nabytej odporności, w których pośredniczą odrębne składowe układu odpornościowego wywołując różne efekty mimo, że są one zdolne do współdziałania w osiąganiu wspólnego celu jakim jest wyeliminowanie antygenu. Jednym rodzajem nabytej odporności jest odpowiedź humoralna, w której pierwotnie pośredniczą limfocyty B i krążące przeciw ciała. W innym rodzaju, określanym jako odporność komórkowa, albo odporność za pośrednictwem komórek, pośredniczą limfocyty T, które syntetyzują i opracowują cytokiny wpływające na inne komórki..

Aktywacja i różnicowanie limfocytów B w odpowiedzi na większość antygenów wymaga tego, aby (1) limfocyty B otrzymały sygnał antygenowy przez swój receptor swoisty dla antygenu, błonowe Ig i (2) doszło do kontaktu limfocytów B z sygnałami zależnymi i niezależnymi od aktywowanych limfocytów T. Sygnał zależny od współpobudzającego sygnału jest wynikiem ligacji receptora CD40 na limfocytach B z wyrażanym na limfocytach T pomocniczych ligandem CD40 (Uiman i in., Crit. Rev. Immunol. 16, str 59-108 (1996); Van Kooten i Banchereau, Adv. Immunol. 61, str 1-77 (1996)). W sygnalizowaniu niezależnym od kontaktu pośredniczą cytkiny syntetyzowane i opracowywane przez aktywowane limfocyty T. Wspólnie, sygnały zależne i niezależne od kontaktu prowadzą do różnicowania limfocytów B w kierunku zarówno (1) limfocytów B pamięci utrzymywanych w spoczynku, które pośredniczą w szybszej odpowiedzi w trakcie ponownej ekspozycji na antygen, albo (2) komórek plazmatycznych wydzielających przeciwciała. Komórki plazmatyczne, będące końcowym etapem różnicowania limfocytów B, syntetyzują, i wydzielają przeciwciała.

Umfocyty T pomocnicze („Th”) grają różnorodne role w układzie odpornościowym. Wykazano, ze cytokiny opracowywane przez limfocyty Th w trakcie początku prowokacji układu odpornościowego mogą wpływać na to, który ze szlaków efektorowych odporności zostanie następnie aktywowany·'. Ιimfocyty Th są aktywowane przez oddziaływanie ich receptorów swoistych antygenowe z komórkami prezentującymi antygen (APC), które pokazują na swej powierzchni fragmenty peptydowe przetworzonego obcego antygenu w powiązaniu z cząsteczkami MHC klasy II. Aktywowane limfocyty Th z kolei, wydzielają odpowiednie cytokiny (limfokiny), które aktywują odpowiednie mechanizmy efektorowe odporności.

Umfocyty Th dzielą się na trzy podgrupy, w zależności od ich profilu wydzielania cytokin (Fitch i in., Ann. Rev Immunol., 11:29-48 (1993)). U myszy, niepobudzone „naiwne” limfocyty Th wydzielają U-2. Krótkotrwałe pobudzenie prowadzi do powstania komórek prekursorowych Th0, które wytwarzają szeroką gamę cytokin, w tym BFN-γ, U-2, U-4, U-5 i U-10. Przewlekle pobudzane limfocyty Th0 mogą różnicować się w rodzaj Th1 albo Th2, przy czym zmienia się profil wyrażanych cytokin. Niektóre cytokiny są uwalniane z przez zarówno Th1 jak i Th2, na przykład U-3, GM-CSF i TNF. Inne cytokiny są wytwarzane wyłącznie przez jedną albo drugą podgrupę limfocytów Th. (Romagnani i in., Ann. Rev. Immunol., 12, str. 227-57 (1994)).

Umfocyty Th1 wytwarzają ΙΤ-α, U-2 i EFN-γ, które aktywują makrofagi i odpowiedzi zapalne związane z odpornością komórkową i opornością na zakażenia wewnątrzkomórkowe.

Umfocyty Th2 wytwarzają cytokiny ζΙ-4, U-5, JL-6 i U-10. Cytokiny Th2 zwiększają tworzenie granulocytów kwaso-chłonnych i komórek tucznych i ułatwiają pełną ekspansję i dojrzewanie limfocytów B (Howard i in., „T-cell derived cytokines and their receptora”, Fundamental Immunology, wyd. 3, Raven Press, New York (1993)). Umfocyty Th2 mogą również brać udział w wytwarzaniu limfocytów B pamięci, ich mutacji somatycznej i przez to dojrzewaniu powinowactw, i w regulacji przełączali de novo izo typów immunoglobulin Przykładowo, cytokma Th2, IL-4, może przełączać aktywowane limfocyty B w kierunku izotypu IgG1 i hamować inne izotypy IL-4 aktywuje również nadprodukcję IgE w reakcjach nadwrażliwości typu I Cytokina Th2, IL-5, indukuje izotyp IgA istotny w odporności błon śluzowych

Obwodowe narządy limfatyczne takie jak, węzły limfatyczne (LN), śledziona i tkanka limfatyczna błon śluzowych wysoce skutecznie zatrzymujące i magazynujące obce substancje są głównymi miejscami aktywacji wywoływanej przez antygen i różnicowania limfocytów T i B Procesy te są zależne od różnorodności i zorganizowania komórek w tych tkankach, zapewniającego zrąb dla wielu aspektów humoralnych odpowiedzi immunologicznych, takich jak wzajemne oddziaływania limfocyt T/B, tworzenie ośrodka rozmnażania (GC), dojrzewanie powinowactwa, przełączanie klas immunoglobulin i kierowanie mchem komórek (Klem J , Immunology. John Wiley and sons, (1982)) Nie w pełni są poznane mechanizmy molekularne odpowiedzialne za rozwój, utrzymanie struktury i funkcji obwodowych narządów limfatycznych.

Mimo ze, ogólna struktura obwodowych tkanek limfatycznych znacznie się rózni i wykazuje zróżnicowanie między gatunkami ssaków, to zasadnicza struktura tych obwodowych narządów limfatycznych wykazuje istotne cechy takie jak, na przykład: (1) dostępność antygenu, (2) strukturalne cechy pozwalające na ciągły kontakt antygenu z limfocytami, β) obszary bogate w limfocyty T otoczone przez limfocyty B, (4) grudki bogate w limfocyty B, (5) miejsca typu zatoki brzeznej, (6) specjalistyczne komórki śródbłonkowe, i (7) miejsca produkcji przeciwciał, opisane szczegółowo poniżej.

Obwodowe narządy limfatyczne są dostępne dla antygenów występujących w organizmie Na przykład, antygen osiąga śledzionę dzięki zatokowemu układowi dostarczania, LN przez dośrodkowe naczynia limfatyczne i jest transportowany przez charakterystyczne komórki śródbłonkowe do grudek limfatycznych błony śluzowej.

U różnych gatunków obwodowe narządy limfatyczne wykazują również istotne cechy strukturalne takie jak grudkowe komórki dendrytyczne (FDC) i komórki splatające się (IDC), zapewmające stałą obecność antygenu w obszarach tych narządów bogatych w limfocyty

Inną stałą cechą jest obecność obszarów bogatych w limfocyty T otoczone przez limfocyty B. Obszary bogate w limfocyty T obejmują, na przykład limfatyczne otoczki okołowłośniczkowe miazgi białej śledziony, strefę przykorową LN, zawierającą dużą ilość wracających do krążenia, limfocytów T i IDC, które z kolei działająjako komórki pomocnicze dla limfocytów T i B.

Dodatkowo, narządy limfatyczne zawierają zwykle pierwotne i wtórne grudki bogate w limfocyty B w miazdze białej śledziony i w korze LN. Wtórne grudki takich narządów limfatycznych zwane są również ośrodkami rozmnazama (GC) i posiadają gęstą sieć FDC do wyłapywania i prezentowania antygenów.

Obszary typu zatoki brzeznej są również opisywane jako zdefiniowane obszary histologiczne w mysiej śledzionie i jako bardziej rozproszone obszary w ludzkich obwodowych narządach limfatycznych Obszary te zawierają pierwotne makrofagi zatoki brzeznej (MZM), makrofagi metalofilowe (MM), limfocyty B zatoki brzeznej i komórki siateczki, lecz mogą również zawierać limfocyty T i komórki dendrytyczne (Kraal, Int Rev Cytol 132, str 31-74 (1992)) Wpływanie krwi tętniczej do obszarów zatoki brzeznej daje antygenom bezpośredni dostęp do tych komórek i wzbudza w tym miejscu reakcje komórkowe na antygeny (Kraal, Int. Rev Cytol 132, str 31-74 (1992)). Obecność MZM jest również wymagana do optymalnego kierowania ruchem limfocytów B w miazdze białej śledziony (Kraal, 1992, Kraal i in., Immunology 68, str 227-232 (1989))

Zwykle limfocyty krwi dostają się do obwodowych narządów limfatycznych przekraczając specjalistyczny śródbłonek, na przykład śródbłonek wyścielający żyłki pozawłośniczkowe LN (żyłki pozawłośniczkowe o wyspecjalizowanym nabłonku - HEV) i śródbłonek wyścielający śledzionowe zatoki żylne struktur podobnych do zatoki brzeznej Śródbłonek ten wyraża cząsteczki adhezyjne i adresyny, których zadaniem jest kierowanie limfocytów do obwodowych narządów limfatycznych. Na przykład, adresyny obwodowych LN (PNAd) róznią się od

190 617 adresyn LN błon śluzowych, MAdCAM-1, które są włączone w kierowanie limfocytów do narządów limfatycznych błon śluzowych, takich jak krezkowe LN, kępki Peyer'a i grudki hmfatyczne samotne.

Nie wszystkie adresyny są dokładnie zdefiniowane, na przykład niezidentyfikowana pozostaje adresyna limfocytów powracających do śledziony. Fizjologiczne role tych adresyn obejmują ułatwianie włączania odpowiednich populacji antygenów swoistych dla danego antygenu w odpowiedź odpornościową i następnie szerzenie odpowiedzi odpornościowej w organizmie

Na końcu w innych miejscach, niż te, w których macierzyste limfocyty B są aktywowane przez antygeny wykrywa się komórki plazmatyczne, które są komórkami f^lacmatyccnynn produkującymi przeciwciała. Na przykład, przeciwciała produkowane przez komórki plazmatyczne w miazdze czerwonej śledziony zwykle są wynikiem aktywacji w obszarach bogatych w limfocyty T i komórki plazmatyczne w rdzeniu LN pochodzą z limfocytów B aktywowanych w obszarach bogatych w limfocyty T tego samego węzła. Podobnie, przeciwciała produkowane przez komórki zlacmatyccne w szpiku kostnym są pochodnymi aktywacji limfocytów B w śledzionie i węźle limfatycznym i komórki plazmatyczne grudek chłonnych przewodu pokarmowego zwykle pochodzą z limfocytów B aktywowanych w krezkowych LN albo tkanki chłonnej związanej w przewodem pokarmowym

Patrz np , ICM MacLennan, „The Structure and Function of Secondary Lymphoid Tissue” w Clinical Aspects of Immunology, edycja piąta, eds. P.J. Łachman, Sir D K Peters, F.S. Rosen, M.J. Walport, Blackwell Scleetific Publications stir. 13-30 (1993).

Ogólnie, komórkowo/histologiczne zjawiska lezące u podstaw zaleznej od limfocytów T odpowiedzi immunologicznej na antygeny są następujące (Toellner i in., J. Exp med, 183, str. 2303-2313 (1996))

W fazie indukcji, naiwne limfocyty T i B są aktywowane i włączane do odpowiedzi odpornościowej w dniach bezpośrednio następujących po wtargnięciu antygenu do organizmu Na przykład w śledzionie w ciągu 12 godzm immunizacji w trakcie odpowiedzi wtórnej, limfocyty B pamięci w zatokach brzeznych napotykają przenoszone przez krew antygeny i opuszczają zatoki brzezne przechodząc do obszarów bogatych w limfocyty T. W ciągu 24 godzin można wykryć limfocyty B w obszarach bogatych w limfocyty T. Transkrypty przełączające antygeny można wykryć w ciągu 12 godzin ponownej ekspozycji na antygen, co wskazuje na to, ze wystąpiły juz oddziaływania limfocyty T-B. Następnie limfocyty B migrują w kierunku obszarów wyjścia i miazgi czerwonej, gdzie zrollferują tworząc ogniska limfoblastów B i różnicują się w kierunku komórek plazmatycznych. Limfocyty B kontynuują również proliferację w obszarach IDC bogatych w limfocyty T. W ciągu czterech dni po immunizacji i po proliferacji w GC, rozpoczyna się produkcja limfocytów B pamięci. W odpowiedzi pierwotnej, dobrze rozwinięte GC są obecne od 10 dnia i osiągają maksymalną wielkość 14 dnia po immumzacji

Proliferacja limfocytów T w obszarach bogatych w limfocyty T staje się wyraźna w 48-72 godzm i osiąga szczyt 7 dnia po immunizacji. Ta proliferacja limfocytów T bierze udział w zaleznej od limfocytów T aktywacji limfocytów B. Poziomy prellferacyJne w obszarach bogatych w limfocyty T zmniejszają się tak jak w GC. Proliferacja limfocytów T występuje również w GC, gdzie centrocyty (limfocyty B) w obszarze ciemnym wyłapuiją antygeny od IDC i prezentują antygen limfocytom T w obszarze jasnym

Antygen zalezny od limfocytów T może aktywować limfocyty B zatoki brzeznej, świeżo wyprodukowane, naiwne limfocyty B i dzięki adresynom i cząsteczkom adhezyjnym przyciągane są i utrzymywane w obwodowych narządach limfatycznych krążące limfocyty. Naiwne limfocyty B wykazują tą samą kinetykę, co aktywowane limfocyty B w przechodzeniu do obszarów bogatych w limfocyty T ltd.

Faza efektorowa odpowiedzi zaleznych od limfocytów T.

Faza efektorowa odpowiedzi zaleznych od limfocytów Th jest utrzymywana przez ciągłą aktywację limfocytów B pamięci w grudkach obwodowych narządów limfatycznych, na tym etapie istnieje bardzo mała rekrutacja naiwnych limfocytów B, i odpowiedź jest pierwotnie wzbudzana przez antygen utrzymywany na FDC. GC wymagane są do optymalnego

190 617 wytworzenia pamięci, przełączania izotypu, mutacji somatycznej i przez to dojrzewania powinowactwa immunoglobulm.

Zebranie takich odpowiedzi limfocytów prowadzi do wytwarzania przeciwciał zdolnych do krążenia w organizmie różnymi drogami, na przykład przeciwciała opuszczają śledzionę wraz z krwią i opuszczają LN odśrodkowymi naczyniami limfatycznymi. Tak więc przeciwciała spotykają się i bezpośrednio wiążą z atakującym czynnikiem chorobotwórczym To zjawisko rozpoznawania zapoczątkowywuje kaskadę odpornościowych mechanizmów efektorowych, w tym aktywacje układu dopełniacza i reakcje komórkowe pośredniczące w ochronie gospodarza przez patogenem.

Przeciwciała również odgrywają rolę w pewnych patologicznych odpowiedziach takich jak reakcje nadwrażliwości - nieodpowiednich albo nieproporcjonalnych reakcjach odpornościowych wywołanych przez kontakt z uprzednio spotkanym antygenem. Istnieją cztery uznane typy nadwrażliwości.

Typ I „nadwrażliwości natychmiastowej” obejmuje wywołaną alergenem aktywację limfocytów Th2 i wydzielanie cytokin Th2. Cytokina Th2, IL-4, pobudza limfocyty B do przełączenia izotypów w kierunku wytwarzania IgE, które aktywują komórki tuczne do wywoływania ostrych reakcji zapalnych, takich jak prowadzące do wyprysku, astmy albo kataru.

Typ II i III nadwrażliwości są powodowane przez IgG i IgM skierowane przeciwko antygenom powierzchniowym komórki lub tkankowo swoistym (Typ II) albo antygenom rozpuszczonym w surowicy (Typ III).

Typ IV nadwrażliwości „typu późnego” (DTH) zachodzi przez limfocyty Thl i może być przekazana pomiędzy myszami przez przetoczenie samych limfocytów Thl, a nie przez przetoczenie samej surowicy. Ta cecha odróżnia typ IV DTH od innych trzech typów nadwrażliwości wymagających humoralnych odpowiedzi odpornościowych powodowanych przede wszystkim przez przeciwciała, które mogą być przekazywane przez surowicę bezkomórkową (Roitt i in., Immunology, str. 19.1-22.12 (Mosby-Year Book Europę Ltd., 3 wydanie, 1993)).

Patologiczne humoralne odpowiedzi odpornościowe związane są z licznymi stanami autoagresyjnymi narządowo-swoistymi i układowymi, takimi jak toczeń układowy trzewny, ziarniniak Wegenera, guzkowate zapalenie tętnic (PAN), gwałtownie postępujące, schyłkowe kłębuszkowe zapalenie nerek i samoistna plamica małopłytkowa, jak również z przewlekłymi schorzeniami zapalnymi takimi jak choroba Graves'a i Chagas'a. Humoralne odpowiedzi odpornościowe przyczyniają się również do reakcji komórkowych prowadzących do odrzucania przeszczepów tkankowych i narządowych.

Do leczenia tych różnych stanów odporności zależnych od limfocytów Th1 do tej pory stosowano środki immunomodulujące i immunosupresyjne. Obecnie stosuje się zasadniczo trzy leki immunosupresyjne: steroidy, cyklosporynę i azatioprynę.

Steroidy sąplejotropowymi lekami przeciwzapalnymi, które hamują makrofagi i hamują aktywność komórek prezentujących antygen, w sposób odwracający większość działań patologicznych limfocytów T. Cyklofosfamid, czynnik alkilujacy, pośredniczy w śmierci komórek przez, zahamowanie replikacji DNA i naprawy DNA. Azatiopryna jest środkiem antyproliferacyjnym, który hamuje syntezę DNA. Te nieswoiste środki immunosupresyjne są zwykle wymagane w dużych dawkach, co zwiększa ich toksyczność (np. nefro-1 hepatotoksyczność) i powoduje szkodliwe efekty uboczne Są więc nieprzydatne do długotrwałego leczenia..

Tak więc, istnieje potrzeba dodatkowych czynników i sposobów leczenia, które przezwyciężą problemy wywoływane przez klasyczne leczenie.

Streszczenie wynalazku

Rozwiązania według wynalazku rozwiązują problemy opisane wyżej umożliwiając hamowanie sygnalizacji przez receptor limfotoksyny-β (ΕΓ-β-R) przy użyciu czynników blokujących receptor li rufo toksyn y-fi. Szczegółowo, rozwiązania według wynalazku są przydatne do hamowania reakcji odpornościowych, w których pośredniczą przeciwciała, do regulacji poziomów wyrażanych adresyn i do kierowania ruchem komórek, do wpływania na różnicowanie grudkowych komórek dendrytycznych i do zmiany strukturalnej organizacji obwodowych narządów limfatycznych i podobnych struktur limfatycznych rosnących w stanach patologicznych takich jak, na przykład toczeń układowy trzewny i samoistna plamica małopłytkowa. Bardziej

190 617 szczegółowo, rozwiązania według wynalazku są przydatne do zmiany związków zachodzących pomiędzy kompleksami immunologicznymi a limfocytami B. Konkretniej możliwe jest zapobieganie prezentacji i magazynowaniu antygenów na komórkach, albo ewentualnie zasadmczo rozpuszczanie albo usuwanie antygenów, które juz są prezentowane na komórkach.

Czynnik blokujący LT-(-R znajdujący zastosowanie w rozwiązaniach według wynalazku jest wybrany z grupy składającej się z rozpuszczalnej limfotoksyny-p-R, przeciwciała skierowanego przeciwko LT-(-R i przeciwciała skierowanego przeciwko powierzchniowemu ligandowi LT

Niniejszym opisane zostały rozpuszczalne postaci domeny zewnątrzkomórkowej receptora limfotoksyny-p działające jako środki blokujące receptor limfotoksjyny-p, rekombinowane białko fuzyjne receptora limfotoksyny-p, które posiada zewnątrz-komórkową domenę ΕΓ-β-R wiążącą ligand poddaną fuzji z domeną stałą łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, przy czym domena wiążąca ligand LT-(-R jest poddana fuzji z domeną Fc ludzkiej IgG.

Opisane zostały również przeciwciała, które działają jako środki blokujące LT-(-R. Przeciwciała te są skierowane przeciwko receptorowi limfotoksyny-P i korzystnie, są przeciwciałami monoklonalnym. Opisane są również przeciwciała skierowane przeciwko limfotoksynie powierzchniowej, które korzystnie są przeciwciałami monoklonalnymi. Przeciwciała znajdujące zastosowanie według wynalazku obejmują przeciwciało przeciwko ludzkiej BTp-R mAb BDA8 i Lt-β mAb B9.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie czynnika blokującego ΤΤ-β^ do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania humoralnej reakcji odpornościowej u zwierzęcia.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie czynnika blokującego ΙΤ-β-R wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia, zapobiegania albo eliminowania ludzkiego wirusa niedoboru odporności u ssaka. Korzystnie, kompozycja otrzymywana zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczona do współpodawania z dodatkowym czynnikiem antywirusowym.

Ponadto przedmiotem wynalazku jest zastosowanie czynnika blokującego LT-(-R do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do przerywania wiązania się kompleksów immunologicznych z grudkami limfocytów B u zwierzęcia.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie czynnika blokującego Ι.Τ-β-R do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia chorób autoagresyjnych przebiegających za pośrednictwem przeciwciał. Korzystnie choroba autoagresyna wybrana jest z grupy składającej się z miastenii, autoagresyjnej anemii hemolitycznej, samoistnej plamicy małopłytkowej (ITP), układowego tocznia rumieniowatego (SLE), ziaminiaka Wegenera, guzkowego zapalenie wielonaczyniowego, gwałtownie postępującego zapalenia kłębuszków nerkowych, oraz przewlekłych chorób zapalnych. Korzystniej, przewlekłą chorobą zapalną jest choroba Chagasa lub choroba Gravesa.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie czynnika blokującego receptor limfotoksyny-β (LT-(-R) do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania humoralnej reakcji odpornościowej u osobnika cierpiącego na reakcje nadwrażliwości. Korzystnie reakcja nadwrażliwości jest reakcją typu I. Również korzystnie reakcja nadwrażliwości jest reakcją typu II lub typu III.

Ponadto przedmiotem wynalazku jest zastosowanie czynnika blokującego receptor limfotoksyny-β (LT· β-R) do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania reakcji humoralnej związanej z odrzuceniem przeszczepu.

W korzystnej postaci wykonania zwierzęciem jest ssak, a korzystniej ssakiem jest człowiek. Również korzystnie zwierzę jest zakazone ludzkim wirusem niedoboru odporności. Ponadto korzystnie czynnik blokujący LT-(-R jest wybrany z grupy składającej się z rozpuszczalnego receptora limfotoksyny-β, przeciwciała skierowanego przeciwko receptorowi LT-β i przeciwciała skierowanego przeciwko powierzchniowemu ligandowi LT. Korzystniej czynnik blokujący LT-jl-R obejmuje rozpuszczalny receptor limfotoksyny-p posiadający domenę wiążącą ligand, która może wybiórczo wiązać się z powierzchniowym ligandem LT. Najkorzystniej domena wiążąca ligand obejmuje SEK. NR ID: 1

190 617 lub jej funkcjonalny fragment, a rozpuszczalny LT-L-R obejmuje ponadto jedną lub więcej heterologiczną domenę białkową

Szczególnie korzystnie heterologiczną domena białkowa jest wybrana z grupy składającej się z immunoglobulin, albumin surowicy, lipoprotein, apolipoprotein i transferyn Również korzystnie rozpuszczalny receptor limfotoksyny-β obejmuje domenę Fc ludzkiej lmmunoglobuliny Ponadto korzystnie czynnik blokujący LT-L-R obejmuje przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko receptorowi LT-β albo przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko powierzchniowemu ligandowi LT Korzystniej kompozycja jest przeznaczona do podawania w ilości wystarczającej do pokrycia komórek pozytywnych względem receptora LT-β przez około 1 do około 14 dni

Korzystnie czynnik blokujący LT-L-R obejmuje przeciwciało monoklonalne BDA8 przeciwko ludzkiemu LT- -β-R Również korzystnie przeciwciało jest skierowane przeciwko podjednostce ligandu LT, a w szczególności czynnik blokujący LT--β-R obejmuje przeciwciało monoklonalne B9 przeciwko ludzkiej LT-β Ponadto w korzystnej postaci wykonania czynnik blokujący LT-L-R obejmuje przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko mysiemu ligandowi powierzchniowemu LT. Również korzystnie kompozycja farmaceutyczna otrzymana zgodnie z zastosowaniem według wynalazku obejmuje ponadto dopuszczalny farmaceutycznie nośnik albo adiuwant.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie kompozycji farmaceutycznej do wytwarzania leku do hamowania humoralnej reakcji odpornościowej u zwierzęcia, przy czym kompozycja farmaceutyczna zawiera skuteczną ilość polipeptydu obejmującego rozpuszczalną, wiążącą ligand domenę receptora limfotoksyny-β ('LT β-R) połączoną z domeną Fc ludzkiej IgG1 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie humoralną reakcją odpornościową jest układowy toczeń rumieniowaty (SLE), a rozpuszczalna, wiążąca ligand domena LT-L-R obejmuje SEK. NR ED:1.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie kompozycji farmaceutycznej do wytwarzania leku do leczenia układowego tocznia rumieniowatego (SLE) u zwierzęcia, przy czym kompozycja farmaceutyczna zawiera skuteczną ilość polipeptydu obejmującego rozpuszczalną, wiążącą ligand domenę receptora limfotol^i^^y^^^-L (LT-L-R) połączoną z domeną Fc ludzkiej IgG1 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie rozpuszczalna, wiążąca ligand domena LT-L-R obejmuje SEK. NR ID:1.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna obejmująca ilość polipeptydu skuteczną do hamowania humoralnej reakcji odpornościowej u zwierzęcia oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, przy czym polipeptyd obejmuje rozpuszczalmą wiążącą ligand domenę receptora limfotoks^yiy-L (LL-jRR) połączoną z domeną Fc ludzkiej IgG1. Korzystnie, humoralną reakcją odpornościową jest układowy toczeń rumieniowaty (SLE), a rozpuszczalna, wiążąca ligand domena LT-L-R obejmuje SEK. NR ID: 1

Niniejszym opisano również sposoby hamowania sygnalizacji przez LT-L-R bez zahamowania sygnalizacji przez TNF-R wykorzystując czynniki blokujące LT β-R opisane powyżej oraz sposoby leczenia, zapobiegania albo eliminacji ludzkiego wirusa niedoboru odporności u ssaków

Krótki opis rysunków

Figura 1. Sekwencja części zewnątrzkomórkowej ludzkiego receptora LT-β, która koduje domenę wiążącą ligand

Figura 2 przedstawia analizę immunohistochemiczną śledziony myszy, która otrzymała wielokrotne wstrzyknięcia LTL-R-Ig albo białka fuzyjne LFA-3-Ig i antygen

Figura 3 przedstawia analizę immunohistochemiczną pokazującą brak ośrodków rozmnażania w śledzionie myszy po leczeniu LTL-R-Ig i MR-1 (przeciwciało przeciwko ligandowi CD40) i obecność grudkowych komórek dendrytycznych w śledzionach myszy leczonych MR-1, a nie LTL-R-Ig. Białko fuzyjne i antygen SRBC podawano w sposób opisany na figurze 2

Figura 4 przedstawia analizę immunohistochemiczną pokazującą zmienione wyrażanie adresyny w LN myszy leczonych LTL-R-Ig wewnątrzmaciczme i w sposób ciągły po urodzeniu

190 617

Figura 5 przedstawia analizę immunohistochemiczną rozmieszczenia limfocytów i wyrażania markerów makrofagowych w krezkowych LN myszy leczonych (jak na figurze 5) wewnątrzmacicznie i w sposób ciągły po urodzeniu.

Figura 6 przedstawia analizę immunohistochemiczną pokazującą, ze leczenie myszy ΕΓβ-R-Ig hamuje odpowiedź przeciwciał na SRBC.

Figura 7 przedstawia wychwyt kompleksów immunologicznych na FDC.

Szczegółowy opis wynalazku

W celu lepszego zrozumienia wynalazku dołączono poniższy szczegółowy opis.

Określenie „odpowiedź immunoglobulinowa” albo „odpowiedź humoralna” dotyczy odpowiedzi odpornościowej zwierzęcia na obcy antygen, podczas której zwierzę wytwarza przeciwciała przeciwko obcemu antygenowi. Limfocyty T pomocnicze klasy Th2 są kluczowe dla wydajnego wytwarzania przeciwciał o wysokim powinowactwie.

Określenie „ośrodek rozmnażania” w sposób tu użyty odnosi się do grudek wtórnych limfocytów B, które powstaje po immunizacji antygenem. Występowanie tych histologiczne określanych obszarów koreluje z optymalnym powstawaniem pamięci, przełączaniem izotypu, hipermutacja somatyczną i przez to dojrzewaniem powinowactwa odpowiedzi przeciwciał.

Termin „zatoka brzezna” albo „obszar typu zatoki brzeznej” histologicznie opisuje przedziały obwodowych narządów limfatycznych obejmujące przede wszystkim makrofagi zatoki brzeznej (MZM), makrofagi metalofilne (MM), limfocyty B zatoki brzeznej i komórki siateczki, jak również limfocyty T i komórki dendrytyczne. Prąd krwi tętniczej dociera do zatok brzeznych dając w ten sposób bezpośredni dostęp antygenom do tych komórek i wzbudzając w tym miejscu reakcje komórkowe na antygen.

Określenie „adresyna” w sposób tu użyty odnosi do cząsteczki włączonej w kierowanie limfocytów do obwodowych narządów limfatycznych. Cząsteczki te są wyrażane na komórkach śródbłonka, szczególnie na wysoce specjalistycznych komórkach śródbłonkowych żyłek pozawłośniczkowych węzłów chłonnych. Adresyna śledzionowa nie została zidentyfikowana. MAdCAM-1 jest adresynąbłony śluzowej, PNAd jest adresyną obwodową.

Określenie „limfocyt T pomocniczy (Th)” oznacza funkcjonalną podklasę limfocytów T, która pomaga generować limfocyty T cytotoksyczne, i która kooperuje z limfocytami B w celu pobudzenia wytwarzania przeciwciał Limfocyty T pomocnicze rozpoznają antygen w połączeniu z cząsteczkami MHC klasy II i zapewniają komórkom efektorowym sygnały zależne od kontaktu i sygnały niezależne od kontaktu (cytokina).

Określenie „cytokina” dotyczy cząsteczki zapewniającej oddziaływanie pomiędzy komórkami. „Limfokina” jest cytokiną wydzielaną przez limfocyty.

Określenie „Th1” dotyczy podklasy limfocytów T pomocniczych, które wytwarzają LT--α, interferon-γ i IL-2 (oraz inne cytokiny), oraz które wywołują reakcje zapalne związane z komórkową, tj. nie-immunoglobulinową reakcją na ekspozycję.

Określenie ,,Th2” dotyczy podklasy limfocytów T pomocniczych, które wytwarzają cytokiny, w tym IL-4, IL-5, IL-6 i IL-10, które są związane z immunoglobulmową (humoralną) reakcją na ekspozycję immunologiczną.

Określenie „domena Fc” przeciwciała oznacza część cząsteczki obejmującą zawias, domeny CH2 i CH3, ale pozbawioną miejsc wiązania antygenu. Określenie obejmuje również równo ważne regiony IgM albo innego izotypu przeciwciał.

Określenie „przeciwciało przeciwko receptorowi LT- β dotyczy każdego przeciwciała, które swoiście wiąże się z przynajmniej jednym epitopem receptora LT-- β

Określenie „przeciwciało przeciwko LT” dotyczy każdego przeciwciała, które swoiście wiąże się z przynajmniej jednym epitopem LT-α, LT-β albo kompleksu LT-α/β.

Określenie „sygnalizacja przez LT-β-Κ” dotyczy reakcji cząsteczkowych związanych ze szlakiem ΚΓ-β-R i następującymi potem reakcjami cząsteczkowymi, które z nich wynikają

Określenie „środek blokujący LT-e-R” dotyczy czynnika, który może zmniejszać wiązanie ligandu z LT β-R, grupowanie ΤΤ-β-R na powierzchni komórki albo może wpływać na to jak będzie w komórce interpretowany sygnał z ί.Τ-β-R

Środek blokujący Ι.Τβ-R, który działa na etapie wiązania się ligandu z receptorem może hamować wiązanie ligandu LT z Ι.Τβ-R, o co najmniej 20% Przykłady środków blokujących

190 617

ΕΓ-β-R obejmują rozpuszczalne cząsteczki ΕΓ-β-υ-ΙΤ i przeciwciała przeciwko ΕΓα, przeciwko LT-β, przeciwko LT-α/β i przeciwko ΕΓ-β-ίΕ Korzystnie, przeciwciała nie reagują krzyzowo z wydzielniczą postacią LT--α.

Określenie „aktywność biologiczna ΕΓ-β-ΙΕ' dotyczy· 1) zdolności cząsteczki -1-(.3-1/ albo pochodnej do współzawodniczenia z rozpuszczalnymi albo powierzchniowymi cząsteczkami ΕΓ-β-R o wiązanie z rozpuszczalnym albo powierzchniowym ligandem lT; albo 2) aktywności natywnego ΕΤβ, takiej jak zdolność do pobudzania regulującej odpowiedzi odpornościowej albo reakcji cytotoksycznej.

Określenie „ligand LT” dotyczy kompleksu heteremeryczeego LT-α/β albo jego pochodnej, które mogą się wiązać swoiście z receptorem LT-β.

Określenie „domena wiążąca ligand ΕΤ-β-^’ dotyczy jednej albo wielu części ΕΓ-β-R, które są związane ze swoistym rozpoznawaniem ligandu LT i oddziaływaniem z nim.

Określenia „powierzchniowy LT” oraz „kompleks powierzchniowy LT” dotyczą kompleksu obejmującego podjednostki LT-α i związane z błoną LT-β, w tym zmutowane, zmienione albo chimeryczne postaci jednej albo wielu podjedno-stek, które są ujawnione na powierzchni komórki. „Ligand powierzchniowy LT” dotyczy kompleksu powiercchniewego LT albo jego pochodnej, które mogą wiązać się swoiście z receptorem LT-β.

Określenie „osobnik” dotyczy zwierzęcia, albo jednej lub wielu komórek pochodzących ze zwierzęcia Korzystnie, zwierzęciem jest ssak. Komórki mogą występować w dowolnej postaci, w tym, choć nie wyłącznie, komórek zawartych w tkance, skupiska komórek oraz komórek pochodzących od zwierzęcia, które zostało zmienione fizycznie albo fenotypowo. Limfotoksyyni-β: członek rodziny TNF

Cytokmy pokrewne czynnikowi martwicy nowotworu (TNF) występują jako wielka rodzina plejotropowych mediatorów regulacji odporności i obrony gospodarza. Członkowie tej rodziny występują w postaci związanej z błoną, gdzie działają miejscowo przez oddziaływanie komórki z komórką, albo jako białka wydcielnicce, które działają na odległe cele. Równoległa rodzina receptorów TNF oddziaływa z tymi cytokinami i wyzwala wiele różnych szlaków, w tym śmierci komórkowej, proliferacji, różnicowania tkanek i reakcji zrecazalnych.

TNF, lnnfotoksyna-α (LT-α, zwana również TNF-β) i liτmfot^tek^s^na b (LT-β) są członkami rodziny ligandów TNF, która obejmuje również ligandy receptorów Fas, CD27, CD30, CD40, OX-40 i 4-1BB (Smith i in., Cell, 76:959-62 (1994)). Sygnalizacja przez niektórych z członków rodziny TNF, w tym TNF, LT-α, LT-β i Fas, może wywołać śmierć komórki nowotworowej przez martwicę albo apeptozę (zaprogramowaną śmierć komórki). W komórkach eie-newetworewych, oddziaływanie TNF i wielu ligandów z rodziny TNF wpływa na rozwój układu odpornościowego i reakcje wobec różnych ekspozycji.

Większość kompleksów LT-α/β związanych z błoną („LT powierzchniowa”) ma stosunek stechiometryczny ΕΤ-α1/β2 (Browning i in., Cell, 72:847-56 (1993); Browning i in., J. Immuol., 154.33-46 (1995)). Ligandy powierzchniowe LT nie wiążą TNF-R z wysokim powinowactwem, i nie aktywują sygnalizacji przez TNF-R. Inny receptor pokrewny TNF, zwany receptorem LT-β (ΕΓ-β-R) wiąże te kompleksy limfotoksyny powierzchniowej z wysokim powinowactwem (Crowe. i in., Science, 264:707-10 (1994)).

Sygnalizacja przez LT-beR, podobnie jak sygnalizacja przez TNF-R, działa antyproliferacyjme i może być cytetoksyczna dla komórek nowotworowych. W równoległym zgłoszeniu patentowym USA, nr 0 /378,968/ ujawnione są kompozycje i sposoby wybiórczego pobudzania EE-fER przy użyciu środków aktywujących ΕΓ-βΤ/.. Środki aktywujące ΙΤ-(3-Ι/ są przydatne do hamowama wzrostu komórek nowotworowych bez równoczesnej aktywacji prozapalnych albo szlaków immunoregulujk^^cych.

Ostatnie badania nad „nokautowaniem genu” sugerują rolę LTα/Z w rozwoju obwodowych narządów limfatycznych. (Banks i in., J. Immunol, 155, str. 1685-1693 (1995); De Togni i m., Science, 264, str. 703-706 (1994)). Istotnie, myszy pozbawio ne LT-α nie posiadają węzłów limfatycznych (LN) i kępek Peyera (PP). Ponadto ich śledziony wykazują zaburzoną architekturę i jest zmienione wyrażanie znaczników czynnościowych na komórkach w zatokach brzeznych śledziony. Banks i in., 1995; De Togni i in., Science, 264, str. 703-706 (1994); Matsumoto i in., Science 271, str. 1289-1291 (1996)). Żadna z takich charakterystyk nie została

190 617 opisana dla żadnego z nokautowanych receptorów dla TNF myszy (Erickson i in., Natura, 372, str. 560-563 (1994); Pfeffer i in., Cell, 73, str. 457-467 (1993); Rothe i in., Nature, 364, str. 798-802 (1993)). Zgłaszający ostatnio zdefiniowali rolę błonowych kompleksów ΙΤ α/β w rozwoju obwodowych narządach limfatycznych przez wykazanie, ze potomstwo myszy nastrzykiwanych w trakcie ciąży rozpuszczalna postacią mysiego ΙΤβ-R poddanego fuzji z fragmentem Fc ludzkiego IgG1 (U^-R-Ig) nie posiada większości węzłów chłonnych i wykazują zaburzoną architekturę śledziony. (Rennert i in., 1996,: Surface Ιymphotoxin alpha/beta complex is reąuired for the development of peripheral lymphoid organs.” J. Exp. Med 184: 1999-2006). W innym badaniu, myszy transgeniczne pod względem tego samego konstruktu, który zaczyna być wyrażany trzy dni po urodzeniu, posiadają węzły chłonne. Jednakże, architektura ich śledzion została zaburzona i wiele znaczników śledzionowej zatoki brzeznej nie było wyrażanych (Ettinger i in., „Disrupted spienić archtecture, but normal lymph node development in mice expressing a soluble ΙTβ-R/IgG1 fusion protein”., Proc Natl. Acad. Sci. USA 93.13102-7). Wspólnie dane te wskazują, ze istnieją czasowe wymogi dla funkcji błonowego ET, by mógł on pośredniczyć we wpływach na rozwój obwodowych narządów limfatycznych, a nie na architekturę śledziony.

Układ TNF może również współdziałać przy rozwoju śledziony. Komórki zatoki brzeznej śledziony myszy z niedoborem TNF nie wyrażają znaczników makrofagowach, ani MAdCAM-1 (Alexopoulou i in., 60th Int. TNF Congress, Eur. Cytokine Network, str. 228 (1996); Pasparakis i in., 60th Int. TNF Congress, Eur. Cytokine Network, str. 239 (1996)). Również u myszy z niedoborem TNF-R55 nie wykazano barwieniem w śledzionowej zatoce brzeznej MAdCAM-1 (lecz nie MOMA-1) (Neumann i in., J. Exp. Med., 184, str. 259-264 (1996), Matsumoto i in , Science, 271, str. 1289-1291 (1996)). Jak wykazano u myszy z niedoborem TNF-R75 wyrażanie tych znaczników jest prawidłowe (Matsumoto i in., Science, 271, str. 1289-1291 (1996)).

Wzrost tkanek limfatyczno-podobnych następuje nie tylko jako część procesów rozwojowych, lecz również pojawia się w pewnych patologicznych stanach takich jak, przewlekłe zapalenia, proces zwany ostatnio neolimfoorganogenezą. (Picker and Butcher, Annu. Rev. Immunol. 10, str. 561-591 (1992), Kratz i in., J. Exp. Med., 183, str·. 1461-1471 (1996)) Na tego typu procesu najwyraźniej mają wpływ członkowie rodziny TNF. Myszy transgeniczne pod względem genu ΙΤα napędzanego przez szczurzy promotor insuliny (REP-ET) rozwijają wywołane ΙT przewlekłe zmiany zapalne z charakterystycznie zorganizowaną tkanką limfatyczną (Kratz i m., J Exp. Med., 1183, str·. 1461-1471 (1996); Picarella i in., Proc. Natl. Acad. Sci. 89, srt. 10036-10040 (1992)).

Badanie na myszach z niedoborem ΙΤ-α funkcji ET w trakcie zależnej od komórek T odpowiedzi odpornościowej wykazało niezbędność Ι' w tworzeniu GC, być może do utrzymywania zorganizowanej struktury grudkowych komórek dendrytycznych (FDC) i do powstania odpowiedzi odpornościowej (Banks i in., J. Immunol., 155, str. 1685-1693 (1995); matsumoto i in., Science, 271, str. 1289-1291 (1996); Matsumoto i in., Nature, 382, str. 462-466 (1996)). Myszy z niedoborem TNF-R55 również nie posiadają FDC, wykazują brak rozwoju GC i brak rozwoju optymalnej odpowiedzi przeciwciał na owcze krwinki czerwone (SRBC). Wskazuje to na to, ze mechanizmem wyzwalającym TNF-R55 dla większości z tych odpowiedzi jest sygnalizacja rozpuszczalną U' albo TNF (Ιο Hir i in., J. Exp. Med., 183, str. 2367-2372 (1996); Alexopoulou i in., 60th Int. TNF Congress, Eur. Cytokine Network, str. 228 (1996); Pasparakis i in., 60th Int. TNF Congress, Eur. Cytokine Network, str. 239 (1996)). Do dziś nie określono czynnościowej roli szlaku powierzchniowego ΙΤ/ΙΤβ-R w humoralnej odpowiedzi odpornościowej.

Receptor Ι'β, jeden z rodziny receptorów TNF swoiście wiąże się z ligandami powierzchniowej ΙΕ E^-R wiąże heteromeryczne kompleksy ET (przede wszystkim ΙΤα1/β2 i LTα2/β1), lecz nie wiąże TNF albo ΕΙ'α (Crowe i m., Science, 264, str. 707 = 10 (1994)). mRNA λ β- znaleziono w ludzkiej śledzionie, grasicy i ogólnie w narządach układu odpornościowego. Mimo ze, badania nad wyrażaniem ΙΤβ-R są na wczesnym etapie to wzorce ekspresji ΙΤβ-R wydają się być podobne do tych, które opisuje się dla TNF-R55, za wyjątkiem

190 617 tego, ze ίΤβ-R nie występuje w limfocytach T i B krwi obwodowej i w liniach komórkowych limfocytów T i B

Kompleksy limfotoksyny (LT) powierzchniowej scharakteryzowano u komórek hybrydoma CD4+ (II-23 D7), które wyrażają LT na wysokim poziomie (Browning i in , J Immunol, 147 1230-47 (1991), Androlewicz i in , J. Biol. Chem , 267 2542-47 (1992), oba włączone tu przez odnośniki). Ekspresja i działanie biologiczne LT-P-R, podjednostek LT i kompleksów powierzchniowych LT opisano ostatnio w Ware i in, „The ligands and receptors of the lymphotoxin system”, w Pathways for Cytolysis, Current Topics Microbiol. Im^uac^l, Sprmger-Verlag, str 175-218 (1995) szczególnie włączone tu przez odnośniki

Ekspresja LT-α i jej wydzielenie indukowane są głównie w aktywowanych limfocytach T i B oraz naturalnych komórkach mszczących (NK). Wśród podklas limfocytów T pomocniczych, LT-α wydaje się być wytwarzana przez limfocyty Th1, ale nie Th2 LT-α wykryto również w melanocytach Mikroglej i limfocyty T w zmianach u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym mogą być również znakowane surowicą odpornościową przeciwko LT-α (Selmaj i in., J Clin Invest., 87, str 949-954 (1991)).

Limfotoksyna-β (zwana również p33) jest wyrażana na powierzchni ludzkich i mysich limfocytów T, linii limfocytów T, linii limfocytów B i komórkach niszczących aktywowanych limfokiną (LAK) LT-β jest przedmiotem równoległego zgłoszenia międzynarodowego PCT/US91/04588, opublikowanego 9 stycznia 1992 jako WO 92/00329 i pCt/US93/11669, opublikowanego 23 czerwca 1994 jako WO 94/13808, które załączono tu jako odnośnik

Kompleksy powierzchniowe LT są głównie wyrażane przez aktywowane limfocyty B i T oraz naturalne komórki niszczące (NK), co stwierdzono analizą FACS oraz immunohistologią przy użyciu przeciwciał przeciwko LT-α albo rozpuszczalnych białek fuzyjnych ΕΤβ-R-Ig W równolegle rozpatrywanym zgłoszeniu amerykańskim nr 08/505606, zgłoszonym 21 czerwca 1995 ujawniono kompozycje i sposoby wykorzystania rozpuszczalnych receptorów LTP i receptora przeciwko LT-β i przeciwciał swoistych w stosunku do ligandu jako substancji terapeutycznych do leczenia chorób układu odpornościowego, w których pośredniczą limfocyty Thl LT powierzchniowa opisana została na klonach ludzkich limfocytów T cytotoksycznych (CTL), aktywowanych jednojądrzastych limfocytach obwodowych (PML), limfocytach krwi obwodowej aktywowanych IL-2 (LAK), obwodowych limfocytach B aktywowanych mitogenem barwinka albo przeciwciałem przeciwko CD40 (PBL) oraz różnych limach nowotworów limfoidalnych z limfocytów T i B. Zastosowanie komórek docelowych niosących alloantygen wywołuje ekspresję powierzchniową LT na powierzchni klonów CTL CD8 i CD4+

Zgłaszający opisali tu kilka funkcji odpornościowych dla powierzchniowej LT i wykazali wpływ reagentów wiążących LTα/β na tworzenie i charakter reakcji przeciwciał, utrzymywanie organizacji komórkowej wtórnych tkanek limfatycznych, w tym wpływ na stan zróżnicowania grudkowych komórek dendrytycznych i tworzenia centrów namnażania oraz poziom ekspresji adresyn, które wpływają na kierowanie komórek Tak więc, Zgłaszający określili zastosowanie terapeutyczne powierzchniowej LTα/β i czynników wiążących receptor LTβ.

Do chwili obecnej, wpływ sygnalizacji przez ΙΓ-β-R na reakcje humoralne albo odpornościowe nie był w pełni zrozumiały Twórcy po raz pierwszy ujawnili, ze blokowanie szlaku LT, czy to LT-β czy ΤΤ-β-R może zmieniać reakcję humoralną u zwierząt. Tak więc, rozwiązania według wynalazku w szerszym wykonaniu dotyczą sposobów zmieniania reakcji humoralnej u zwierzęcia obejmujący etapy podawania kompozycji farmaceutycznej, która zawiera skuteczną terapeutycznie ilość czynnika blokującego szlak LT, szczególnie korzystnie, blokerów ΤΤ-β-R

W rozwiązaniach według wynalazku można zastosować dowolny czynnik blokujący, zaś specjalista w dziedzinie może łatwo określić czynniki, które blokują LT-P-R Przykładowo, takie czynniki blokujące mogą obejmować inhibitory drobnocząsteczkowe receptora, rozpuszczalne receptory limfotoksyny β, przeciwciała skierowane przeciwko LT-p-R i przeciwciała skierowane przeciwko powierzchniowemu ligandowi LT-P-R. W korzystnych wykonaniach, czynniki blokujące obejmują rozpuszczalne υΤ-β-R posiadające domenę wiążącą ligand, która swoiście wiąże powierzchniowy ligand LT, zaś korzystniej, gdzie LT-P-R obejmuje domenę FC ludzkiej immunoglobuliny

190 617

Korzystne środki blokujące obejmują również przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko LT--β-R, w tym, korzystnie, przeciwciało monoklonalne przeciwko ΕΓ-β-R BDA8 i przeciwciało monoklonalne przeciwko ΚΓ-β-R B9. Jeszcze korzystniejsze przeciwciała obejmują A1.D5 18 i A0D12.10 oraz BB-F6. W pewnych przypadkach, może być pożądane zastosowanie przeciwciała monoklonalnego przeciwko mysiemu ligandowi powierzchniowemu LT

Długotrwała prezentacja antygenu przez FDC jest prawdopodobnie istotna w chorobach autoagresyjnych, gdzie ciągła aktywacja układu odpornościowego przez antygeny endogenne albo autoantygeny prowadzi do choroby. Wychwyt kompleksów immunologicznych przez FDC pokazano na fig. 7. Zdolność do usuwania tych kompleksów immunologicznych z FDC powinna służyć zmniejszaniu wielkości aktywacji odporności i osłabiać chorobę albo nawet zatrzymywać postęp choroby Choroby autoagresyjne, które obejmują zaburzoną reakcję odpornościową są oczywistym celem dla inhibitorów szlaku LT, jakkolwiek bardziej „klasyczne” choroby autoagresyjne, w których pośredniczą limfocyty T mogą obejmować nierozpoznane składowe humoralne, a więc można na nie również pozytywnie wpływać.

Podobnie, w dziedzinie przeszczepiania, odrzucanie przeszczepu, tj choroba gospodarz przeciwko przeszczepowi oraz choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi, wymaga do rozwoju prezentacji antygenu. Opisany mechanizm manipulowania FDC można również zastosować w przypadku problemów związanych z rozpoznawaniem obcych antygenów, tj z przeszczepem.

Oprócz tego, ciągła prezentacja antygenu albo utrzymywanie pamięci antygenu może odgrywać rolę w chorobach autoagresyjnych spowodowanych mimikrą molekularną. Przykładowo, reakcja odpornościowa wobec czynnika zakaźnego choroby z Lyme, Borreha burgdorferi, prowadzi do zapalenia stawów prawdopodobnie z tego powodu, ze niektóre epitopy antygenowe na bakterii przypominają normalne składniki stawów. Usunięcie zalegających w FDC antygenów bakteryjnych choroby z Lyme może łagodzić zapalenie stawów spowodowane tą chorobą Terapia taka powinna być również odpowiednia w innych przypadkach mimikry związanej z czynnikami zakaźnymi

Zgłaszający nieoczekiwanie ujawnili, ze podawanie czynników blokujących Ι..Τ β-R zakłóca prezentację i/lub odkładanie się kompleksów immunologicznych związanych z powierzchnią grudkowych komórek dendrytycznych. Grudkowe komórki dendrytyczne mogą zachowywać antygen przez czas nieokreślony. Okresowy kontakt z antygenem zatrzymywanym na FDC może być związany z zachowaniem pamięci przez limfocyty B. Tak więc, opi sywane mniejszym sposoby obejmują liczne stany chorobowe, które są zależne od prezentacji antygenu na komórkach dendrytycznych Podawanie czynników blokujących można prowadzić przed wprowadzeniem antygenu do organizmu zwierzęcia, kiedy to czynniki blokujące powinny zapobiec całkowicie albo w części odkładaniu się antygenu na grudkowych komórkach dendrytycznych, zapobiegając w ten sposób albo zmniejszając oczekiwaną reakcję odpornościową. Alternatywnie, czynniki blokujące można podawać w momencie po związaniu antygenu z komórkami dendrytycznymi. Możliwe jest rozerwanie tego wiązania, tak, ze oczekiwana reakcja odpornościowa powinna być zmniejszona albo zniesiona. Tak więc, sposoby leczenia mogą obejmować eliminację całości albo części kompleksów immunologicznych przechwyconych przez limfocyty B grudek albo zapobieganie w całości albo w części wychwytowi kompleksów immunologicznych przez grudki limfocytów B.

Zdolność do rozerwania połączenia pomiędzy tymi komórkami prezentującymi antygen i kompleksami immunologicznymi wydaje się być unikalna dla szlaku LT-β. Przykładowo, ligand CD40L (MR-1) jest innym członkiem rodziny TNF i jest również wyrażany na komórkach dendrytycznych grudek Podobnie jak w przypadku LT-e-R/Ig, wykazano ze MR-1 zapobiega tworzeniu komórek zarodkowych. Jednakże nie wpływa na ekspresję znaczników FDC Ligand CD40-L, w przeciwieństwie do LT~e-R, nie zapobiega wychwytowi kompleksów immunologicznych na komórkach dendrytycznych, ani nie jest zdolny do eliminacji kompleksów immunologicznych związanych na komórkach dendrytycznych Oprócz tego, Zgłaszający wykazali, ze ligand CD40-L nie wpływa na przetrwanie/utrzymywanie uprzednio wywołanej pamięci limfocytów B.

190 617

Mimo iz nie jest znana dokładna podstawa różnicy pomiędzy wpływem ligandu CD-40L i czynników blokujących LT-p-R, podejrzewa się, ze CD40 może dostarczać sygnałów przetrwania limfocytom B. Jednakże, układ LT jest kluczowy dla utrzymania komórek dendrytycznych grudek w pełni zróżnicowanym i funkcjonalnym stanie, stanie, który wydaje się być konieczny dla reakcji centrów namnazania i tworzenia i utrzymywania limfocytów B pamięci. Tak więc, blokowanie szlaku CD40/CD40L może zapobiegać tworzeniu limfocytów B pamięci, ale nie powinno wpływać na juz ustaloną pulę limfocytów B. Blokowanie szlaku LT z jednej strony zapobiega nie tylko tworzeniu i utrzymywaniu limfocytów B pamięci, ale również wpływa na utrzymywanie uprzednio wytworzonych limfocytów B pamięci.

Dalsze zastosowanie zahamowania szlaku LT polega na traktowaniu wirusów, które tworzą rezerwuary w przedziale komórek dendrytycznych grudek (FDC). Wirus HIV jest dobrym przykładem takiego przypadku. Po zakazeniu wirusowym, znaczne ilości zakaźnego wirusa zalegają w FDC w grudkach limfocytów B wtórnych narządów limfatycznych. (Heathe i in., 1995, „Follicular dendritic cells and human immunodeficiency vims mfectivity”, Nature 377:740-4). Uważa się, ze wirus jest skompleksowany dopełniaczem albo immunoglobulmami i związany z receptorami Fc albo receptorami dopełniacza albo z oboma. Tak więc, wirus wykorzystuje normalny mechanizm układu odpornościowego do zachowania pamięci antygenu przez czas dłuzszy. W przebiegu choroby czynne zakazenie limfocytów zachodzi głównie w tych miejscach Obliczono, ze w trakcie fazy bezobjawowej zakażenia pula wirusa w tym przedziale jest ponad 10-krotnie większa niż zawarta w limfocytach T i monocytach. (Cavert i in., 1997 „Kinetics of response in lymphoid tissues to antiretroviral therapy of HIV-1 infection” Science 276 960-4). W współczesnych schematach leczenia HIV łączy się liczne środki przeciwwirusowe w celu zmniejszenia ilości wirusa i uniemożliwienia ucieczki odmian opornych. Prawdopodobne ograniczenie tej terapii polega na braku tolerancji tej terapii i podczas takich przerw pozostały wirus może mutowaó umożliwiając powstawanie odmian opornych, które unikają procesu leczenia. O ile ładunek wirusa w przedziale FDC ulega znacznemu zmniejszeniu podczas terapii wielolekowej, same leki skierowane są głównie przeciwko mechanizmom replikacji wirusa, nie zaś przeciwko nie replikującemu wirusowi na powierzchni FDC. Stąd, rezerwuar wirusa na FDC może służyć do ponownego zakazania po przerwaniu leczenia. Ponadto, FDC mogą przekształcać zneutralizowanego wirusa w postać zakaźną, co ponownie uwidacznia znaczenie tych komórek w patogenezie HIV.

Ponieważ zahamowanie szlaku LT może powodować uwalnianie kompleksów immunologicznych z FDC, HIV w postaci kompleksów immunologicznych może się również uwalniać. Mozę być pożądane uwolnienie całości ładunku HIV w tym przedziale bezpośrednio przed rozpoczęciem terapii wielolekowej, ponieważ uwolniony wirus powinien ulec obróbce i usunięciu z organizmu, albo po zakazeniu powinien być wrazliwszy na terapię lękową. Taka kombinacja powinna zmniejszyć zalegający ładunek wirusa do bardzo niskiego poziomu, co prawdopodobnie może spowodować wyleczenie. W tym przypadku przydatne powinny być LTP-R/Ig albo przeciwciała blokujące przeciwko ligandowi albo receptorowi. Potencjalny protokół leczenia powinien obejmować zapoczątkowanie terapii lękowej, a następnie w ciągu kilku dni uwolnienie wszelkiego związanego wirusa pojedynczym albo kilkoma cyklami leczenia inhibitorami szlaku LT. Po zmniejszeniu ilości wirusa, dalsze leczenie czynnikami skierowanymi przeciwko LT nie będzie konieczne.

O ile HIV jest s zczególnie dobrze zbadany, mozliwejest, ze inne wirusy iezydują albo ukrywają się na FDC w stanie uśpienia oczekując na jakieś wydarzenie takie jak zaburzenia odporności, co prowadzi do znacznych ilości dodatkowego antygenu, a w konsekwencji do uwolnienia związanego wirusa z FDC i ponownego się pojawienia. Stąd, rozwiązania według wynalazku dotyczą dowolnego sposobu zahamowania szlaku LT w celu uniknięcia powikłań wirusa związanego z FDC.

Ujawnienie to ma istotne znaczenie dla wielu chorób, które polegają na prezentacji antygenu na komórkach dcneratzceozch i reakcji wytworzonej przez limfocyty B pamięci. LT(3l/p2 sygnalizuje skutecznie i służy jako przykład skutecznych terapeutycznie przeciwciał moookizoaloach przeciwko LTb. Oprócz tego, przeciwciało monoklonaloe skierowane przeciwko ludzkim LT alfa, zwane AOD12 może zablokować sygnalizację LTal/p2 w przeciwieństwie do

190 617 większości przeciwciał przeciwko ludzkim LT alfa, które są mało skuteczne przeciwko LTa. Przeciwciała te otrzymano po immunizacji myszy rozpuszczalnym ligandem LT(x^^(2, co doprowadziło do ujawnienia przeciwciał monoklonalnych o unikalnej swoistości. Ponadto, utrzymuje się, ze przeciwciała monoklonalne przeciwko LTa o swoistości skierowanej potencjalnie przeciwko kompleksowi LT^1/(2 spotykane będąjedyrne w tej postaci immunizacji, nie zaś po immunizacji samym LT alfa, stąd obejmują unikalną klasę przeciwciał przeciwko LTa.

Przykłady

Materiały i metody

Myszy

Myszy Balb/c w zaawansowanej ciąży zakupione w Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME), trzymano w warunkach konwen cjonalnej ochrony i traktowano zgodnie z instrukcją rządową. Białka receptora Ig albo przeciwciała monoklonalne wstrzykiwano do żyły ogonowej (iv) ciężarnych myszy. Potomstwu tych myszy oraz 5-tygodniowym samicom myszy Balb/c (zakupionym w Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) wstrzykiwano białka fuzyjne drogą dootrzewnową (ip).

Białka fuzyjne i przeciwciała

Białka fuzyjne obejmujące domenę zewnątrzkomorkową mysiej ΤTβ-R, ludzkiego TNF-R55 albo ludzkiej LFA-3 (która nie wiąże się z mysią CD2) poddane fuzji z regionem zawiasowym, Ch2 i Ch3 ludzkiej IgG1 wytworzono w opisany sposób (Force i in., J. Immunol. 155, 5280-5288 (1995); Miller i in., J. Exp. Med. 178, 211-222 (1993)). Oczyszczone ludzkie IgG1 zastosowane jako kontrole zakupiono w Protos Immunoresearch (San Francisco, CA). MR1, przeciwciało przeciwko mysiemu ligandowi CD40 zakupiono w Pharmingen (San Diego, CA).

Przeciwciała (MOMA-1, ED3) swoiste wobec znaczników wyrażanych przez mysie makrofagi metalofilowe (MM), (ED3 rozpoznaje sialoadhezynę) albo swoiste wobec mysich fibroblastów siateczkowych (ER-TR-7) zakupiono w Serotec (Cocon, UK). Przeciwciała swoiste wobec mysiego B220, CD4 i MadCAM-1 (MECA 367) zakupiono w Pharmingen (San Diego, CA). Przeciwciało (ER-TR-9) swoiste wobec znacznika wyrażanego przez mysie makrofagi strefy brzeznej dostarczył Dr Reina Mebius (Vrije Universiteit, Amsterdam). Przeciwciała (FDC-M1 i FDC-M2) swoiste wobec mysich komórek dendrytycznych grudek (FDC) opisano uprzednio (Maeda i in., J. Immunol. 148, 2340-2347 (1992)). Przeciwciało przeciwko mysim CR1 (które również znakowały FDC) otrzymano dzięki uprzejmości Dr Randolpha J. Noelle (Dartmouth Medical School). Wykrywanie adresyn obwodowych węzłów chłonnych (PNAd) wykorzystywało przeciwciało MECA 79 (nadsącz hodowli komórkowej pochodzący z komórek zakupionych w ATCC, Rockville, MD).

Antygeny i immunizacje

Myszy immunizowano ip przy użyciu 100 μΐ 10% zawiesiny SRBC (zakupionych w Colorado Serum Company). Jest to równoważnik 1-5x10⁸ SRBC na immunizację.

Immunohistoehemia

Śledziony i węzły chłonne zamrażano w OTC (Miles, Elkhart, IN) i umocowywano do skrawania na kriostacie. Skrawki 7-10 mm suszono i utrwalano w acetonie. Skrawki inkubowano z niesprzęgniętymi przeciwciałami przez godzinę w temperaturze pokojowej w nawilżanym pojemniku po rozcieńczeniu w buforze A soli buforowanej Tris (TBS-A, 0,05 M Tris, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween-20 (obj.), 0,25% albumina surowicy bydlęcej (BSA)), płukano w TBS-B (0,05 M Tris, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween-20) i utrwalano przez minutę w metanolu przed rozpoczęciem reakcji enzymatycznej. Aktywności peroksydazy chrzanowej (HRP) i fosfatazy alkalicznej (AP) wywoływano stosując, odpowiednio, zestaw tabletkowanego substratu DAB (Sigma, St. Louis. MO) i 5-bromo-4-chloro-3-indolilo fosforan/błękit nitrotertrazolowy (BCIP/NBT, Sigma). Skrawki tkanek utrwalano przez 5 minut w metanolu i podbarwiano odczynnikiem Giemsy (Fluka, Buchs, Szwajcaria).

Analiza obrazów fluorescencyjnych

Do znakowania lmmunofluoreseeneyjnego, zamrożone skrawki utrwalano acetonem, suszono na powietrzu i wstępnie blokowano 5 μg/ml odczynnika Fc przeciwko CD16/CD32 (Pharmingen, San Diego, CA) w roztworze soli buforowanym Tris z 0,25% BSA, 0,05%

190 617

Tween-20 i 10% surowicy króliczej agregowanej ciepłem. Skrawki barwiono w tym samym buforze stosując następujące przeciwciała monoklonalne i odczynniki do wykrywania 10 pg/ml biotynowanego przeciwciała monoklonalnego przeciwko B220 (Phaimmgen). a następnie 20 pg/ml FITC-streptawidyny (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL), 10 pg/ml MECA 367, a następnie 10 pg/ml kozich F(ab') przeciwko szczurzym IgG sprzęgniętych z PE (Southern Biotechnology Associates), nadsącz hodowlany MECA 79, a następnie 20 pg/ml mysich przeciw-szczurzych IgM sprzęgniętych z FITC (Pharmmgen), 20 pg/ml przeciwciał przeciwko sialoadhezynie, a na stępnie 10 pg/ml kozich F(ab')₂ przeciwko szczurzym IgG sprzęgniętych z PE (Southern Biotechnology Associates); 50 pg/ml biotynowanej PNA (Vector Laboratories, Burlingame, CA), a następnie 10 pg/ml PE-streptawidyny (Southern Blbtechlblogy Associates); rozcieńczenie 1 5 nadsączu hodowlanego przeciwciał monoklonalnych MOMA-1, a następnie 20 pl/ml mysich przeciwszczurzych IgM sprzęgniętych z FITC (Pharmmgen) Niektóre skrawki znakowano kilkoma przeciwciałami równocześnie w celu analizy nakładania się obrazu. Wszystkie skrawki oglądano pod 50X powiększeniem i fotografowano stosując Ektachrome P1600 (Kodak, Rochester, NY) albo pobierano jako osobne pliki obrazów czerwonych albo zielonych jako to opisano (Rennert i in., J. Exp. Med. (listopad 1996, w druku)).

Analiza hemaglutynacji

Wykonano kolejne rozcieńczenia surowic w 96-studzienkowych płytkach do mikromiareczkowania (Costar, Cambridge, MA) w PBS/1% glukozie. Miano IgM swoistych wobec SRBC określono przez dodanie 25 pl 10% zawiesiny SRBC do każdej studzienki i inkubowan nie płytki przez godzinę w nawilżanym inkubatorze 37°C Dla surowic swoistych wobec SRBC, surowice mkubowano przez 30 minut w 37°C z 20 pl/studzienkę 1% 2-merkaptoetanolu (obj ) (BioORad, Richmond, CA) w celu wyeliminowania pentamerów IgM. Następnie, dodawano 25 pl/studzienkę 10% zawiesiny SRBC, a następnie 25 pl/studzienkę 10 mg/ml roztworu (w PBS/1% glukozie) kozich przeciw-mysich IgG (Southern Biotechnolog)/, Birmingham, AL) jako czynnika sieciującego do hemaglutynacji. Miano określono jako odwrotność ostatniego rozcieńczenia surowicy, w którym widoczna była hemaglutynacja..

ELISA

Analizy receptora-Ig w osoczu wykorzystywały swoiste przeciwciała monoklonalne przeciwko mysim LT-LR (Browning i in., rękopis w przygotowaniu), LFA-3 (Miller i in , J Exp Med 178, 211-222 (1993)) albo domenę Ch3 ludzkich IgG1 (CDG5, Biogen) bezpośrednio unieruchomionych (10 pl/ml) na 96-studzienkowych płytkach w celu wychwytu i ośle przeciwludzkie IgG1 sprzęgnięte z peroksydazą chrzanową (HRP) w celu wykrywania (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA; rozcieńczenie 1.4000).

Wytwarzanie rozpuszczalnych cząsteczek LT-L-R

Środki blokujące LT-L-R w rozwiązaniach według wynalazku obejmują rozpuszczalne cząsteczki receptora LT-β Figura 1 pokazuje sekwencję części zewnątrzkomórkowej ludzkiego LT-L-R, która koduje domenę wiążącą ligand. Przy użyciu informacji o sekwencji na figurze 1 i technik rekombinacji DNA znanych dobrze w stanie techniki, można klonować funkcjonalne fragmenty kodujące domenę wiążącą ligand LT β-R do wektora i poddawać ekspresji w odpowiednim gospodarzu, w celu wytwarzania rozpuszczalnej cząsteczki LT β-R. Rozpuszczalne cząsteczki LT-L-R, które mogą współzawodniczyć z natywnymi receptorami LT P o wiązanie ligandu LT w oparciu o opisane tu testy są selekcjonowane jako środki blokujące lt-P-r

Rozpuszczalny receptor LT β obejmujący sekwencję aminokwasowe wybrane z sekwencji pokazanej na figurze 1, może być przyłączony do jednej albo wielu heterologicznych domen białkowych („domeny fuzyjne”) w celu zwiększenia stabilności in vivo białka fuzyjnego receptora, albo w celu modulowania jego aktywności biologicznej albo lokalizacji

Korzystnie, stabilne białka osocza, które zwykle mają okres półtrwama w krążeniu powyżej 20 godzin, są stosowane do konstruowania fuzyjnych białek receptora. Takie białka osocza obejmują, choć nie są ograniczone do immunoglobulin, albumin surowicy, lipoprotein, apoipoprotein i transferyn

190 617

Sekwencje, które mogą kierować rozpuszczalną cząsteczką LT-(TR do konkretnego rodzaju komórki albo tkanki mogą być również przyłączone do domeny wiążącej ligand ΕΤ-β-R, tworząc swoiście zlokalizowane rozpuszczalne białko fuizyjne LT-β-R

Wszystkie albo funkcjonalne części regionu cewnątrckemórkewego ΤΤ-β-R (fig 1) obejmujące domenę wiążącą ligand ΕΤ-β-R mogą być poddane fuzji z regionem stałym immueoglebuhny, takim jak domena Fc łańcucha ciężkiego ludzkiej IgG1 (Browning i in , J Immunol , 154 33-46 (1995)) Rozpuszczalne białka fuzyjne receptora z IgG są korzystne, i są powszechnymi odczynnikami immunolegicznymi, zaś metody ich konstruowania są znane w stanie techniki (patrz, patent USA nr 5,225,538, załączony tu jako odnośnik).

Funkcjonalne domena wiążąca ligand ΕΤ^β-R może być poddana fuzji z domeną Fc ramu^g^^i^ (Ig) pochodzącą z klasy albo podklasy lmmunoglebulin innej niż IgG1 Domeny Fc przeciwciał należących do różnych klas albo podklas Ig mogą aktywować inne wtórne funkcje efekterewe Aktywacja zachodzi, gdy domena Fc związana jest przez receptor Fc Wtórne funkcje efektorowe obejmują zdolność do aktywacji układu dopełniacza, przekraczanie łożyska oraz wiązania różnych białek drobnoustrojów, właściwości różnych klas i podklas ramu^g^^m opisano w Roitt i in., Immunelogy, str. 4.8 (Mosby-Year Book Europe Ltd., wyd. 3, 1993).

Aktywacja układu dopełniacza zapoczątkowuje kaskady reakcji enzymatycznych, które biorą udział w zapaleniu. Produkty układu dopełniacza maja szereg działań, w tym wiązanie bakterii, eedecytoza, fagocytoza, cyteteksyczneść, wytwarzanie wolnych rodników i rozpuszczalność kompleksów immunologicznych

Kaskada enzymów dopełniacza może być aktywowana przez domeny Fc przeciwciał IgG1, IgG3 albo IgM. Domena Fc IgG2 wydaje się być najmniej skuteczna, zaś domeny Fc przeciwciał IgG4, IgA, Igd i IgE są nieskuteczne pod względem aktywacji dopełniacza. Tak więc można wybrać domenę Fc w oparciu o to czy wtórne funkcje immunologiczne są pożądane dla konkretnej odpowiedzi odpornościowej albo choroby leczonej białkiem fuzyjnym LT β-R.

Jeżeli mogłoby być korzystne uszkadzanie albo niszczenie komórek niosących ligand LT, można wybrać szczególnie aktywną domenę Fc (IgG1), tworząc białko fuzyjne ΕΤ-β-R-Fc Alternatywnie, jeżeli byłoby pożądane kierowanie fuzji ΕΤ^β-R-Fc na komórki bez wyzwalania układu dopełniacza, powinna być wybrana nieczynna domena Fc IgG4.

Opisano mutacje domen Fc, które zmniejszają albo eliminują wiązanie z receptorem Fc i aktywację dopełniacza (Mom^n i in., Annu. rev. Immunol., 10:239-65 (1992)) Można zastosować te i inne mutacje, same i w kombinacji, w celu optymalizacji aktywności domeny Fc stosowanej do konstruowania białka fuzyjnego ΕΤ-β-Ε^α

Wytwarzanie rozpuszczalnego ludzkiego białka fuzyjnego ΤΤ-β-R obejmującego sekwencję domeny wiążącej ligand poddana fuzji z domeną Fc ludzkiej lmmueoglebulmy (hLr-(TR-Fc) opisano w przykładzie 1. Jedną z wytworzonych linii komórek CHO, według przykładu 1, która wydzielała 1ι-.Τ-β-υ-Ι·Τ nazwano „hLτβ;-R-hGl CHO#14” Próbkę tej linii zdeponowano 21 lipca 1995 w American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD), według postanowień Traktatu Budapeszteńskiego i oznaczono ją numerem ATCC CRL11965

Wytwarzanie rozpuszczalnej cząsteczki fuzyjnej mysiego LT-jTR (mLT-β-R-Fc) opisano w przykładzie 2 Linia CHO wytworzona według przykładu 2, która wydzielała mLT- β -R-Fc nazwana była ,,teLTβ;R-hGl CHO#1.3.BB”. Próbkę tej linii zdeponowano 21 lipca 1995 w American Type Culture Colle^ion (ATCC) (Rockville, MD), według postanowień Traktatu Budapeszteńskiego i oznaczono ją numerem ATCC CRE11964.

Wszystkie ograniczenia dostępności publicznej do depozytów ATCC zostaną niezwłocznie usunięte po udzieleniu patentu na to zgłoszenie.

Różne reszty ammekwasewe tworzące punkt łączenia białka fuzy-jnego receptora z Ig mogą zmieniać strukturę, stabilność i aktywność biologiczną rozpuszczalnego białka fucyjnego receptora LT-β Jeden lub wiele aminokwasów można dodać na końcu C wybranego fragmentu ΤΤ-β-R ^w celu zmodyfikowania punktu połączenia z wybraną domeną fuzyjną

190 617

Koniec N białka fuzyjnego ΙΤ-β-R może również być zmieniany przez zmianę pozycji, w której wybrany fragment DNA ΙΤ-β-R odcina się na końcu 5' w celu wprowadzenia do rekombinowanego wektora ekspresyjnego. Stabilność i aktywność każdego z białek fuzyjnych może być badana i optymalizowana przy użyciu rutynowych doświadczeń i testów w celu selekcji środków blokujących TT-β-R.

Stosując sekwencje domeny wiążącej hgand ΙΤ-β-R w domenie zewnątrzkomórkowej pokazanej na figurze 1, odmiany sekwencji ammokwasowej mogą być również konstruowane w celu modyfikacji powinowactwa rozpuszczalnego receptora ΙΤ-β albo białka fuzyjnego dla ligandu TT Rozpuszczalne cząsteczki ΙΤ-β-R mogą współzawodniczyć o wiązanie ligandu powierzchniowego z endogennymi receptorami powierzchniowymi ΙΤ-β. Przewiduje się również, ze dowolna cząsteczka rozpuszczalna obejmująca domenę wiążącą ligand ΙΤ-β-R jest środkiem blokującym ΙΤ-β-R, który znajduje zastosowanie w rozwiązaniach według wynalazku. Rozpuszczalne cząsteczki ΙΤ-β-R jako środki blokujące ΙΤ-β-R

Rozpuszczalne ludzkie białko fuzyjne receptora ΙΤ-β i immunoglobuliny (hTT-p-R-Fc) zostało wytworzone według procedur w przykładzie 1 i badane na zdolność blokowania cytotoksyczności wobec ludzkich komórek HT29. Tabela 1 (przykład 3) porównuje zdolność białek fuzyjnych rozpuszczalnego receptora ΙΤ-β (hLT-p-R-Fc) i receptora TNF (p55-TNF-R-Fc) do blokowania efektów hamujących różnych TNF i rozpuszczalnych ligandów TT wobec wzrostu komórek nowotworowych.

Dane w tabeli 1 wskazują, ze stężenie, przy którym rozpuszczalny receptor ΙΤ-P (hTT-p-R-Fc) może blokować śmierć komórkową wywołaną przez oddziaływanie pomiędzy hgandem TT-al/p2 i receptorom powierzchniowym ΙΤ-β o 50%. Zdolność do blokowania wzrostu komórek nowotworowych, o co najmniej 20% identyfikuje ten rozpuszczalny receptor ΙΤ-β jako środek blokujący ΙΤ-β-R. Jak oczekiwano, rozpuszczalne białko fuzyjne TNF-R (p55-TNF-R-Fc) całkowicie blokowało zahamowanie wzrostu wywołane TNF przez wiązanie z TNF i zapobieganie jego oddziaływania z receptorem powierzchniowym. Rozpuszczalne białko fuzyjne TNF-R nie wykazywało efektu na wpływ antyproliferacyjny wywołany ligandem TT (TT-al/p2). W przeciwieństwie, białko fuzyjne ΙΤ-β-R blokowało wpływ wywołany ligandem TT, ale nie TNF albo ΙΤ-α. Tak więc rozpuszczalne ludzkie białka fuzyjne ΙΤ-β-R nie zakłócają aktywacji TNF-R przez TNF i ligandy ΙΤ-α.

W celu określenia czy sygnalizacja przez ΙΤ-β-R jest również cytotoksyczne wobec komórek nowotworowych myszy, oraz czy rozpuszczalne białka fuzyjne ΙΤ-β-R mogą blokować cytotoksyczność wywołaną ΙΤβ-R, wykonano podobny eksperyment na myszach. Rozpuszczalne mysie białko fuzyjne ΙΤ-β-R-Fc (mLT-p-R-Fc; patrz przykład 2) badano na jego zdolność do blokowania śmierci mysich komórek WEHI 164 traktowanych ligandem TT (przykład 4).

Figura 2 pokazuje wpływ rozpuszczalnego mysiego ΙΤ-β-R-Fc (mTT-P-R-Fc) na sygnalizację przez ΙΤ-β-R wywołaną ligandem TT w mysich komórkach WEHI 164. Jak pokazuje to test, komórki WEHI 164 są niszczone przez traktowanie rozpuszczalnym hgandem ΙΤ-αΙ^. Dodanie mTT-P-R-Fc blokuje śmierć komórek wywołaną hgandem TT. Kontrolne białko fuzyjne receptora TNF (p55TNF-R-Fc) wykazywało niewielki wpływ na blokowanie śmierci komórek

Dane te pokazują, ze rozpuszczalne białko fuzyjne ΙΤ-β-R może skutecznie współzawodniczyć z cząsteczkami powierzchniowymi ΙΤ-β-R o wiązanie ligandu TT. Rozpuszczalne białko fuzyjne mTT-P-R-Fc działa więc jako środek blokujący ΙΤ-β-R u myszy.

Źródło przeciwciał przeciwko ludzkiej ΙΤ-β-R

Przeciwciała skierowane przeciwko ludzkiemu receptorowi TT-P (przeciwciała przeciwko ΙΤ-β-R) działająjako środki blokujące ΙΤ-β-R. Przeciwciała przeciwko ΙΤ-β-R mogą być poliklonalne albo monoklonalne (mAb) i mogą być modyfikowane w celu optymalizacji ich zdolności do blokowania sygnalizacji ΙΤ-β-R, ich dostępności biologicznej in vivo, stabilności i mnych pożądanych cech.

Surowice poliklonalne skierowane przeciwko ludzkiemu receptorowi Ι,Τ-β są wytwarzane przy użyciu konwencjonalnych technik przez wstrzyknięcie podskórne zwierzętom, takim jak kozy, króliki, szczury, chomiki albo myszy, białka fuzyjnego ludzkiego receptora

190 617

LT-β z Fc (przykład 1) w kompletnym adiuwancie Freund'a, a następnie wstrzyknięcie dawki przypominającej dootrzewnowej albo podskórnej w kompletnym adiuwancie Freund'a. Poliklonalne surowice odpornościowe zawierające pożądane przeciwciała skierowane przeciwko receptorowi LT-β są badane przesiewowe konwencjonalnymi procedurami immunologicznymi

Mysie przeciwciała monoklonalne (mAb) skierowane przeciwko białku fuzyjnemu ludzkiego receptora LT-P i Fc, są wytwarzane jak to opisano w przykładzie 5 Linia komórkowa hybrydoma (BD.A8 AB9), która wytwarza mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkim ΤΤ-β-R, BDA8, zdeponowano 12 stycznia 1995 w American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD), według postanowień Traktatu Budapeszteńskiego i oznaczono ją numerem ATCC HB11798. Wszystkie ograniczenia dostępności publicznej do depozytów ATCC zostaną niezwłocznie usunięte po udzieleniu patentu na to zgłoszenie.

Różne postaci przeciwciał przeciwko LT-(-R mogą być również wytworzone przy użyciu standardowych technik rekombinacji DNA (Winter i Milstein, Nature 349:193-99 (1991)). Przykładowo, mogą zostać skonstruowane „chimeryczne” przeciwciała, w których domena wiążąca antygen z przeciwciała zwierzęcego jest połączona z ludzką domeną stałą (np. Cabilly i in., US 4,816,567; Morrison i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-55 (1984)). Przeciwciała chimeryczne zmniejszają obserwowaną odpowiedź odpornościową wywoływaną przez przeciwciała zwierzęce, podczas stosowania w ludzkim leczeniu klinicznym.

Oprócz tego, mogą być syntetyzowane rekombinowane „przeciwciała humanizowane” które rozpoznają LT-P-r. Przeciwciała humanizowane są chimerami obejmującymi większość sekwencji ludzkiej IgG, w której wprowadzono region odpowiadający za swoiste wiązanie antygenu (np.WO 94/04679). Zwierzęta immunizuje się pożądanym antygenem, izoluje się odpowiednie przeciwciała i usuwa się z nich część sekwencji regionu zmiennego odpowiedzialnego za wiązanie antygenu. Następnie uzyskany ze zwierzęcia region wiążący antygen klonuje się w odpowiednim położeniu w genach ludzkiego przeciwciała, w których usunięto miejsce wiązania antygenu. Przeciwciała humanizowane mimmalizują zastosowanie sekwencji heterologicznych (międzygatunkowych) w przeciwciałach ludzkich i raczej nie wywołują odpowiedzi odpornościowej u leczonych osobników.

Konstruowanie różnych klas rekombinowanych przeciwciał przeciwko υΤ-β-R może być również osiągnięte przez wytwarzanie przeciwciał chimerycznych albo humanizowanych obejmujących domeny zmienne przeciwko LT-(-R i ludzkie domeny stałe (CHI, CH2 i CH3) izolowane z różnych podklas immunoglobulin. Przykładowo, przeciwciała IgM przeciwko LT-(-R o podwyższonej wartościowości miejsc wiązania może być wytworzone rekombmacyjnie przez klonowanie miejsca wiązania antygenu do wektorów niosących ludzkie regiony stałe łańcucha μ (Arulanandam i in., J. Exp. Med., 177:1439-50 91993); Lane i in., Eur. J. Immunoi, 22:2573-78 (1993); Trauneckeri in., Nature 339:68-70 (1989)).

Oprócz tego, standardowe techniki rekombinowanego DNA mogą być zastosowane w celu zmienienia powinowactwa rekombinowanych przeciwciał do ich antygenów, przez zmianę reszt aminokwasowych w sąsiedztwie miejsc wiązania antygenu. Powinowactwo wiązania antygenu przeciwciał humanizowanych może być zwiększone przez mutagenezę w oparciu o modelowanie molekularne (Queen i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86'10029-33 (1989); WO 94/04679).

Może być pożądane zwiększenie albo zmniejszenie powinowactwa przeciwciał przeciwko ΕΤ-β-έ do LT-P-R. zaleznie od docelowego rodzaju tkanek albo konkretnych przewidywanych schematów leczenia. Przykładowo, może być korzystne leczenie pacjenta stałym poziomem przeciwciał przeciwko ύΤ-β-R o zmniejszonej zdolności do sygnalizacji przez szlak LT-β dla celów semi-profilaktycznych. Podobnie, hamujące przeciwciała przeciwko LT-(-R o zwiększonym powinowactwie mogą być korzystniejsze w krótkotrwałym leczeniu.

Przeciwciała przeciwko jako środki blokujące ^-β^

Przeciwciała przeciwko które działaaąjako środki blokujące LT-(LR mogą być wyselekcjonowane przez badanie ich zdolności do hamowania cytotoksyczności wobec komórek nowotworowych wywołanej LT-(-R (przykład 5).

W najkorzystniejszym wykonaniu wynalazku, kompozycje i zastosowania obejmują mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko BDA8. Figura 3 pokazuje ze BDA8

190 617 działają jako środki blokujące LT^P-R jak to zdefiniowano w mniejszym opisie Komórki WiDr przestają rosnąć w obecności IFN-γ i rozpuszczalnego ligandu LT-a1/e2 Przeciwciała kontrolne (IgG1) nie wykazują wpływu na to zahamowanie wzrostu W przeciwieństwie, przeciwciała przeciwko ΕΕ-β-R, BDA8, blokują zdolność rozpuszczalnego ligandu ΕΤ-α1/β2 do hamowania wzrostu komórek WiDr. Tak więc przeciwciało skierowane przeciwko ludzkiemu ΕΤ-β-R może działać jako środek blokujący LT-W-R jak to określono w rozwiązaniach według wynalazku.

Przez badanie innych przeciwciał skierowanych przeciwko ludzkiemu receptorowi LT-β, oczekuje się, ze można zidentyfikować dodatkowe przeciwciała pizeciwko LI' β-R, które działająjako środki blokujące Ι.Τ-β-Κ u ludzi stosując rutynowe doświadczenia i opisane tu testy

Źródło przeciwciał przeciwko powierzchniowemu ligandowi LT

Inne korzystne wykonanie wynalazku obejmuje kompozycje i zastosowania, które wykorzystują przeciwciała skierowane przeciwko ligandowi LT, które działająjako środki blokujące LT-P-R Jak to opisano wyżej dla przeciwciał przeciwko LT-P-R, przeciwciała przeciwko ligandowi LT które dzi^^i^jako środki blokujące LT-P-R mogą być poliklonalne albo monoklonalne, i mogą być modyfikowane według rutynowych procedur w celu modulowania ich zdolności wiązania antygenu i ich immunogenności

Przeciwciała przeciwko LT mogą być wywołane przeciwko jednej z dwóch podjednostek LT osobno, w tym przeciwko rozpuszczalnym, zmutowanym, zmienionym i chimerycznym postaciom podjednostki LT. Jeżeli podjednostki LT stosowane są jako antygen, korzystnie są podjednostkami LT-β. Jeżeli stosowane są podjednostki LT-α, korzystne jest, aby powstałe przeciwciała przeciwko Ι.Τ-α wiązały się z ligandem powierzchniowym LT i nie reagowały krzyzowo z wydzielniczą LT-α albo nie modulowały aktywności TNF-R (w oparciu o testy opisane w przykładzie 3).

Alternatywnie, przeciwciała skierowane przeciwko homomerycznym (LT β) albo heteromerycznym (LT-α/β) kompleksom obejmującym jedną lub wiele podjednostek LT skierowane były przeciwko i badane przesiewowe na aktywność jako środki blokujące LT-P-R. Korzystnie, kompleksy ΕTααl/β2 są stosowane jako antygen. Jak to dyskutowano powyżej, korzystne jest aby powstałe przeciwciała przeciwko ίΤ-αΐ/βΟ wiązały się z powierzchniowym ligandem LT bez wiązania się z wydzielniczą l.T-o i bez wpływu na aktywność TNF-R

Wytwarzanie poliklonalnych przeciwciał przeciwko ludzkiej LT-a opisane jest w równoległym zgłoszeniu (WO 94/13808). Opisano również przeciwciała monoklonalne przeciwko υ'-α i LT-β (Browning i m., J Immunol., 154.33-46 (1995)).

Mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiej LT-β wytworzono jak to opisano w przykładzie 6. Lima komórkowa hybrydoma (B9.C9 1), która wytwarza mysie przeciwciała monoklonalne B9 przeciwko ludzkiemu LT-P-R została zdeponowana 21 lipca 1995 w American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD), według postanowień Traktatu Budapeszteńskiego i oznaczono ją numerem ATCC HB11962.

Chomicze przeciwciała monoklonalne przeciwko mysiej LT-a/p wytworzono jak to opisano w przykładzie 7. Linia komórkowa hybrydoma (BB.F6.1), która wytwarza chomicze przeciwciała monoklonalne BB F6 przeciwko mysiej LT-α/β została zdeponowa na 21 lipca 1995 w American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD), według postanowień Traktatu Budapeszteńskiego i oznaczono jąnumerem ATCC HB11963.

Wszystkie ograniczenia dostępności publicznej do depozytów ATCC zostaną niezwłocznie usunięte po udzieleniu patentu na to zgłoszenie

Zastosowanie rozpuszczalnych LTp-R-Ig do hamowania funkcji immunologicznej powierzchniowych kompleksów LT

Następnie zostanie wykazany wpływ reagenta wiążącego powierzchniowe LT, białka fuzyjnego obejmującego domenę zewnątrzkomórkową mysiego LtP-R i regionu zawiasowego, domen Ch2 i Ch3 ludzkiej IgG1 (LTP-R-Ig) na wywołanie i charakter reakcji przeciwciał, na utrzymywanie organizacji komórkowej wtórnych tkanek limfatycznych, w tym wpływ na stan zróżnicowania komórek dendrytycznych grudek i tworzenie centrów namnażania oraz na ekspresję adresyn, które kierują ruchem komórek.

190 617

Wielokrotne wstrzykiwanie myszy LTp-R-Ig zmienia organizację limfocytów śledzionowych i ekspresję znaczników funkcjonalnych przez komórki strefy brzeznej śledziony

Wpływ blokady powierzchniowej LT oa budowę śledziony badano przez podanie myszy sześciu kolejnych cotygodniowych wstrzyknięć LTP-R-Ig. Następnie, myszy lmmumezwaoz SRBC i podawano im dodatkowe wstrzyknięcie LTa-R-Ig w 4 doi później Myszy zabito 10 dnia po wstrzyknięciu SRBC. Barwienie immuozhiztochemlczne mrożonych skrawków śledzion wykazało kilka zmian histologicznych. Grudki, które obejmowały przedział śledzionowych limfocytów B u myszy normalnych nie oddzielały się po traktowaniu LTP-R-Ig. Zamiast tego, limfocyty B zorganizowane były jako rozmyty pas otaczający obszary limfocytów T (fig 2B), zaś granice pomiędzy obszarami limfocytów B i T były przerwane (fig 2B) W przeciwieństwie, u kontrolnych myszy traktowanych LFA-3-Ig śledzionowe grudki limfocytów B są oddzielone i występuje wyraźna granica pomiędzy obszarami limfocytów T i B ^(fig. ^2A). ,

Ekspresja znaczników powierzchniowych rozpoznawanych przez przeciwciała moooklonalne ER-TR-9 i MOMA-1 oie występowała oa dwóch osobnych populacjach makrofagów rezydujących w strefie brzeznej śledziony myszy traktowanych LT(3-R-Ig. Wiadomo, ze ERTR-9 barwi znacznik oa MzM (Dijkstra i io., Immunol. 55, 23-30 (1985)), zaś MOMA-1 barwi znacznik oa makrofagach metalofilowach (Kraal i Jaose, Immunol. 58, 665-669 (1986)) (odpowiednio, fig. 2 D, F). Znaczniki te ulegają ekspresji oa komórkach u myszy kontrolnych (traktowanych LFA-3-Ig) (fig. 2 C, E). U traktowanych LTR-R-Ig myszy oie występuje również ekspresja innego znacznika na makrofagach MOMA-1 + w strefie brzeznej mysiej śledziony (dane oie pokazane).

Przeciwciało MECA-367 wiąże cząsteczkę jUrezyną i adresynę śluzówkową MadCAM-1, opisaną oryginalnie na komórkach śróeyłznka w kępkach Peyera, węzłach chłonnych krezki, śluzówce jelit i blaszce właściwej (Briskm i in , Nature, 363, 461-464 (1993), Nakache i in , Nature 337, 179-181 (1989)). Ekspresję MadCAM-1 opisano również w strefie brzeznej śledziony (prawdopodobnie wyrażana oa komórkach śródbłznka małych tętmczek końcowych otwierających się do zatoki brzeznej) oraz oa siateczce w centrach oamoazama (Kraal i io., Am. J. Pathol., 147, 763-771 (1995)) (fig. 2G). Barwienie MECA 367 skrawków od myszy traktowanych LTR-R-Ig wykazuje, ze ekspresja MadCAM-1 zanikła w śledzionie (fig. 2H)

Podobnie, znakowanie przeciwciałem ER-TR-9 (Vao Vliet i in., Cytochem i 34'883-890 (1986)), które rozdziela populacje fibeoblastdw siateczkowych w strefie brzeznej (fig. 21) uległa nienormalnemu rozmieszczeniu i wzmocnieniu w miazdze białej zwierząt traktowanych LTR-R0Ig w porównaniu ze zwierzętami traktowanymi LFA-3 (fig. 2J) Obserwowane zmiany były niezależne od ekspozycji na antygen, podobnie jak wzorzec znakowania był identyczny jak u oicimmumóowαnach zwierząt LTR-R-Ig (daoe niepokazane).

Tworzenie centrów oamoażania jest zniesione, zaś komórki deneratycene nie są wykrywalne w śledzionach myszy traktowanych LTR-R-Ig.

W celu określenia oa poziomie histolzgii czy wielokrotne wstrzykiwanie myszom LTR-R-Ig wpływa na reakcję odpornościową SRBC, przeprowadzono analizę tworzenia ośrodków oamoazaoia (GC) i rozmieszczenie grudkowych komórek deodrataceoach (FDC) w reakcji oa uczulanie antygenem Mrożone skrawki śledziony od myszy traktowanych wielokrotnie LtR-R-Ig albo LFA-3-Ig jak to opisano dla fig. 2, barwiono aglutyoioą orzeszków ziemnych (PNA) w celu wykazania GC i przeciwciałem FDC-M1 w celu wykrycia FDC, składnika komórkowego koniecznego do tworzenia GC (Schnever i Nadler, Adv Immunol 51.243-284 (1992), Tew i io., Immunol. Rev. 117:185-211 (1990)). Oddziaływanie CD40-ligane CD40 wykazano również jako krytyczne do tworzenia GC (Foy i in., J. Exp Med 180.157-163 (1994)). Tak więc, dla porównania, grupę myszy traktowano MR1, przeciwciałem przeciwko ligandowi CD40, w oparciu o protokół, który jak wcześniej wykazano przy użyciu kontrolnego białka LFA-3-Ig wykazuje liczne GC wyznakowane pNa w śledzionie (fig 3A) GC oie wykryto w śledzionie myszy traktowanych LTR-R-Ig albo MR1 (fig. 3 B, C, odpowiednio) Jednakże, wpływ MR1 i LTp-R-Ig można odróżnić dwiema dodatkowymi obserwacjami Znakowanie w kierunku FDC (FDC-M1) w GC (fig. 3D) oie występuje w śledzionie myszy traktowanych LTp-R-Ig (fig 3E) ale wciąż występuje w śledzionach myszy traktowanych MR1

190 617 (fig. 3F). Podobnych obserwacji dokonano przy użyciu przeciwciała FDC-M2, barwiąc FDC (dane nie pokazane). Tak więc, traktowanie LT(3-R-Ig powoduje zmiany fenotypowe FDC w śledzionie oraz brak tworzenia GC.

Oprócz barwienia GC, PNA barwi również strefę brzezną w śledzionie normalnych myszy. Takie barwienie zaobserwowano również u myszy traktowanych LFA-3-Ig (fig 3A.) i myszy traktowanych MR1 (fig. 3C), ale nie występowało w śledzionie myszy traktowanych ΤTβ-R-Ig (fig 3B).

Ekspresja sialoadhezyny, MOMa-1, ER-TR-9, ER-TR-7 i Mad-CAM-1 w śledzionie myszy traktowanych MR1 była również normalna (dane nie pokazane), co dalej odróżnia molekularny wpływ zakłócania sygnalizacji CD40 i LTp-R.

Kinetyka zmian wywołanych LTP-R-Ig w organizacji limfocytów śledzionowych i ekspresja znaczników komórek strefy brzeznej

Badano liczbę wstrzyknięć I TIRR-Ig konieczna do wpływu na organizację limfocytamą i ekspresję znaczników komórek strefy brzeznej. Myszom wstrzykiwano ip LT-AR-Ig raz albo wielokrotnie jak to zaznaczono na tabeli 1. Następnie, niektóre myszy immumzowano SRBC na dzień przed ostatnim wstrzyknięciem LTP-R-Ig. Ekspresję B220 i CD4 na, odpowiednio, limfocytach B i T oraz znakowanie PNA (w kierunku GC) i MECA367 (w kierunku MadCAM-1), MOMA-1, ER-TR-9 i FDC-M1 oceniano na mrożonych skrawkach traktowanych myszy Wykazano różną kinetykę zanikania znakowania makrofagów metalofilowych, makrofagów strefy brzeznej, MadCAM-1, GC i FDC.

Jedno wstrzyknięcie LTP-R-Ig jest wystarczające do wyeliminowania znakowania MadCAM-1 w tydzień później. Po trzech cotygodniowych wstrzyknięciach LTP-R-Ig, nie wykrywano znakowania w kierunku GC i FDC, zaś przedziały limfocytów T/B były przerwane Konieczne były minimum cztery wstrzyknięcia, aby znieść znakowanie makrofagów metalofilowych. Sześć wstrzyknięć LTP-R-Ig nie znosiły całkowicie znakowania makrofagów strefy brzeznej przez przeciwciało ER-TR-9 (patrz, fig. 2D).

Bardziej precyzyjna analiza gwałtownego zahamowania MOMA-1, MadCAM-1, FDC-M1, FDC-M2 i CR1 po pojedynczym wstrzyknięciu LTp-R-Ig przeprowadzono pod nieobecność antygenu (tabela 2).

Tabela 1

Wpływ LTp-R-Ig na organizację śledziony i centrów namnażania w reakcji na SRBC u dorosłych myszy

Liczba wstrzyknięć LT^-Ig	Organizacja limfocytów T/B	Makiofagi metalo- filowe*	Makrofagi strefy brzeznej*	Ekspresja MadCAM-1*	Centra namnazania $	FDC*
0	normalna	+++	+++	+++	+++	+++
1	normalna	++	+++	-	+	+
2	nieco nieprawidłowa	+	+++	-	+	+/-
i 0	zniszczona	+	++	-	ND	ND
4	zniszczona	+/-	++	-	ND	ND
5	zniszczona	-	+	-	ND	ND
6	zniszczona	-	+/-	-	-	-

Myszom wstrzykiwano ip 100 μξ LT-P-R-Ig co tydzień przez 1 do 5 tygodni, a następnie zabijano LT-β-R-Ig podawano pized wstrzyknięciem SRBC ip (100 μl zawiesiny 10%), o ile nie zaznaczono inaczej, zaś ostatnie wstrzyknięcie LTP-R-Ig podawano w tym samym dniu co antygen Zwierzęta zabijano 10 dni po wstrzyknięciu SRBC Mrożone skrawki śledzionowe znakowano podwójnie biotynowanym szczurzym przeciwciałem przeciwko mysiemu B220 i szczurzymi przeciwciałami przeciwko mysim CD40, a następnie fosfatazą alkaliczną

190 617 sprzęgniętą ze streptawidyną i mysimi przeciwciałami przeciwko szczurzym Ig, sprzęgniętymi z zereksydacą Skrawki śledziony znakowano również następującymi przeciwciałami przeciw-mysimi· szczurzymi przeciwciałami przeciwko mysim makrofagom strefy brzeżnej (ER-Ti-9), szczurzymi przeciwciałami przeciwko makiofagom metalefilewym (MOMA-1), szczurzymi przeciwciałami przeciwko MadCAM-1 (MECA367) i szczurzymi przeciwciałami przeciwko FDC (FDC-M1), a następnie mysim przeciw-szczurzym przeciwciałem przeciwko Ig sprzęgniętym z zereksydacą Dodatkowy zestaw skrawków mrożonych barwieee bietyeewaną aglutyniną o^eszków ziemnych (βNAebie0yna), a następnie peroksydazą sprzęgniętą ze streptawidyną, w celu wykrywania centrów namnażania Obserwacje prowadzono na skrawkach od przynajmniej 3 zwierząt na grupę * Intensywność barwienia oceniano wizualnie: normalne znakowanie, +++, zmniejszone znakowanie, ++, słabe znakowanie, + i biak znakowania - Intensywność znakowania na skrawkach od zwierząt nie traktowanych LFA-3-Ig uznawano jako odnośnik normalnego znakowania $ liczba centrów namnażania na skrawek śledziony rejestrowana w następujący sposób > 10, +++, 5-10, ++, 1-5, +, brak, -.

# Zwierzęta z tej grupy nie otrzymywały SRBC

ND nie wykonano

Tabela 2

Dokładna zależność czasowa wpływu LT P-R-Ig na znakowanie MOMA-1, MadCAM-1, CR1, FDC-M1 i FDC-M2 Dni po pojedynczym ws0rcyknięciuLTb-R-Ig

	0	1	3	5	7	10	14
MOMA-1*	+++	+++	+++	+++	-	++	++	+
NadCAM-1*	+++	+/-	-	-	-	-	-	-
CR1*	+++	+++	++	++	++	++	+	-
FDC-M1*	+++	+/-	-	-	-	-	-	-
FDC-M2*	+++	+/-	-	-	-	-	-	-

Myszy Balb/c, 5-6 tygodniowe otrzymały jedno wstrzyknięcie lp 100 ąg L-P-R-Ig albo ludzkiej Ig Myszy z każdej grupy zabito w dmu 0, 1, 3, 5, 7, 10 i 14. Mrożone skrawki śledziony znakowano następującymi przeciw ciałami szczurzymi przeciwciałami przeciwko makrefagem metalefilewym (MOMA-1), szczurzymi przeciwciałami przeciwko MadCAM-1 (MECA367) i szczurzymi przeciwciałami przeciwko FDC (FDC-M1), szczurzymi przeciwciałami przeciwko FDC (FDC-M2) i biotynowanym szczurzym przeciwko mysim CR1, a następnie mysim zrzeciwscccurc:ym przeciwciałem przeciwko Ig sprzęgniętym z zereksydacą (MOMA-1, MadCAM-1, fDC-M1 i FDC-M2) albo streptawidyną znakowaną peroksydazą (CR1) * intensywność znakowania oceniano wizualnie, normalne znakowanie, +++, zmniejszone znakowanie, ++, słabe znakowanie, + i brak znakowania - Intensywność znakowania na skrawkach od zwierząt nie traktowanych LFA-3-Ig uznawano jako odnośnik normalnego znakowania. Intensywność znakowania od zwierząt nietrak0ewanych zwierząt traktowanych ludzkimi Ig przyjęto jako normalne znakowanie. Analizowano skrawki od przynajmniej zwierząt.

Myszy Balb/c, które otrzymały pojedyncze wstrzyknięcie ip L'^^^ zabijano codziennie przez 14 dni po wstrzyknięciu i pobierano śledziony i mrożono. Mrożone skrawki barwiono reagentami swoistymi wobec MOMA-1, MadCAM-1 (MECA367) i FDC: przeciwciałami przeciwko FDC-M1, FDC-M2 i CR1. W dzień po wstrzyknięciu LT-T-R-Ig, znakowanie reagentami przeciwko MadCAM-1 FDC-M1 i FDC-M2 było znacznie zmniejszone (tabela 2). Szybsze zahamowanie znakowania FDC-M1 w tym doświadczeniu w porównaniu z wynikami opisanymi w tabeli 1 może być spowodowane intensywnością znakowania FDC-M1, które jest silniejsze u lmmunicowanych zwierząt. Znakowanie na CR1 było wciąż wykrywalne w dniu 14, co wskazuje, ze FDC były wciąż obecne w dniu 3 po traktowaniu LTP-R-Ig, ale ekspresja znaczników wykrywanych FDC-M1 i FDC-M2 była zmniejszona. Tak więc, traktowanie Ετβ-R-Ig zmieniało fenotyp FDC. Na koniec, znakowanie MOMA-1 było zmniejszone, ale wciąż wykrywalne w dniu 14.

190 617

Wielokrotne traktowanie LTL-R-Ig hamuje ekspresję adresyn w LN

Badano ekspresję adresyn w LN potomstwa ciężarnych myszy Balb/c, którym wstrzyknięto iv w dniu 14 i 17 ciąży 200 pg białek receptora-Ig Po urodzeniu, potomstwo pozostawiono bez tiaktowama albo traktowano raz w tygodniu 100 pg LT(3-]R-Ig, TNF-R55-Ig albo LFA-3-Ig ip Poziom białek fuzyjnych pozostawał w okolicy 10 pg/ml albo, powyżej co stwierdzono przez ELISA (dane nie pokazane).

Znakowanie immunohistochemiczne przy użyciu MECA367 i MECA 79 wykazało, ze MadCAM-1 i adresyny obwodowych LN były całkowicie nieobecne w LN krezkowych u myszy traktowanych przez całe życie LTL-R-Ig (fig. 4 A, B). LN krzyzowe od tych myszy również pozbawione były ekspresji wszystkich adresyn, zaś szyjne i biodiowe LN nie wykazywały znakowania obwodowych węzłów chłonnych (PNAd) (dane nie pokazane) Ujemna regulacja ekspresji adresyn była odwracalna, ponieważ ekspresja powracała do normalnych wartości u zwierząt, które traktowano wyłącznie in utero (fig 4 G, H). U myszy traktowanych przez całe życie 100 pg/tydzień TNF-R55-Ig albo LFA-3-Ig, ekspresja adresyn w LN pozostawia porównywalna do myszy metraktowanych (fig. 4 C, D, E, F)

Położenie limfocytów B i ekspresja znaczników makro fagów jest zmieniona w LN myszy traktowanych LTL-R-Ig

Przeciwciała, które wiążą znaczniki na populacji makrofagów w zatokach podtorebkowych LN (analogicznych do zatok brzeznych śledziony) zastosowano do analizy immunohistochemcznej LN pobranych od myszy, które traktowano podczas życia płodowego i po urodzeniu jak to opisano dla figury 4 wyżej przy użyciu LTL-R-Ig, TNF-R55-Ig albo LFA-L-Ig Obrazy fluorescencyjne analizowano stosując oprogramowanie do analizy obrazu. Ekspresja sialoadhezyny jest, jak wykazano, zmniejszona w LN myszy traktowanych rozpuszczalnym LTL-R-Ig (fig 5 B), ale nie w LN myszy traktowanych TNF-R55-Ig albo LFA-3-Ig (fig. 5 E, H). Ekspresję MOMA-1 na makrofagach w zatoce podtorebkowej wykrywano w LN myszy traktowanych LTL-R-Ig (fig. 5C)

Badano również wpływ ciągłego leczenia LT--RTg na organizację limfocytów w LN Skrawki LN znakowano przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko znacznikowi limfocytów B B220 i znacznikowi limfocytów T CD4 W celu identyfikacji obszarów nakładania się zasięgu limfocytów T i B zastosowano analizę obrazu. Traktowanie LTL-R-Ig powodowało rozmycie się grudek limfocytów B w taki sposób, ze limfocyty B obecne były w rozmytym pasie na zewnętrznym brzegu obszaru limfocytów T (fig. 5A). Mimo rozmycia się struktury grudkowej, limfocyty B nie występowały w obszarach limfocytów T LN, zamiast tego występowały w obszarach nie zajmowanych normalnie przez limfocyty. Bardzo podobny wzorzec znakowania na limfocyty B i T obserwowano u myszy traktowanych przez całe życie 100 pg/tydzień TNF-R55-Ig, ale nie LFA-3-Ig (fig. 5D). Ponownie, grudki limfocytów B były przerwane, zaś limfocyty B występowały w obszarach LN normalnie nie zajmowanych przez limfocyty. Nie obserwowano nakładania się limfocytów b i T

Traktowanie LTL-R-Ig myszy hamuje reakcję przeciwciał IgM i IgG.

Niezdolność do tworzenia GC po uczulaniu SRBC myszy traktowanych wielokrotnie LTL-R-Ig (jak na fig 3) sugeruje zmiany w reakcji humoralnej tych myszy. W celu zbadania tego, dorosłym myszom podawano sześć wstrzyknięć, po jednym tygodniowo, LTL-R-Ig albo LFA-L-Ig, a następnie uczulano SRBC. Myszy skrwawiano w 7 i 14 dni po lmmumzacji i badano obecność IgM i IgG swoistych wobec SRBC w surowicach testem hemaglutynacji Siedem dni po immumzacji SRBC miano IgM jest normalne, ale reakcja IgG jest znacznie zmniejszona u myszy traktowanych LTL-R-Ig w porównaniu z myszami traktowanymi ludzkimi Ig albo PBS (fig 6A) W 14 dni po immumzacji wciąż nie wykrywano IgG swoistych wobec SRBC, zaś miano IgM u tych myszy było również zmniejszone o ponad połowę w porównaniu z myszami traktowanymi ludzkimi Ig albo PBS (fig. 6A).

dni po uczulaniu SRBC wykrywano GC w śledzionach myszy traktowanych raz albo dwa razy LT-L-R-Ig, jednakże liczba GC była znacznie zmniejszona w porównaniu z kontrolą (tabela 1) Gdy myszy otrzymały dwa wstrzyknięcia LTL-R-Ig, pierwsze wstrzyknięcie na tydzień przed uczuleniem SRBC i drugie w dniu wstrzyknięcia SRBC, zahamowanie reakcji IgM i IgG w dniu 7 i 14 (fig 6B) jest podobne do wykrywanego, gdy myszy otrzymały wielokrotne

190 617 wstrzyknięcia ΙΙβ-R-Ig (fig 6A) W dniu 30 po immumzacji, nie wykrywa się IgG swoistych wobec SRBC, zaś poziom IgMjest zmniejszony ponad 80% w porównaniu z kontrolą (fig 6B). Tak więc, protokoły traktowania TTP-R-Ig powodowały całkowite zahamowanie reakcji IgG oraz osłabialy/zmniejszały reakcję IgM w porównaniu z kontrolą.

Gdy myszy otrzymywały pojedyncze wstrzyknięcie TTP-R-Ig w dniu uczulania SRBC, poziom reakcji IgG i IgM na SRBC w dniu 7 był porównywalny do grupy kontrolnej (fig 6C). Jednakże, w dniu 24 po immumzacji, miana IgG i IgM były zmniejszone o 30% W dniu 34 po uczulaniu SRBC, miano swoistych wobec SRBC IgM było zmniejszone o 50% w stosunku do grup kontrolnych, zaś IgG swoistych wobec SRBC nie można było wykryć (fig. 6C) Dane te pokazują ze protokół traktowania TTP-R-Ig powodował znaczne osłabienie/zmniejszenie poziomu reakcji IgM i IgG tzn., ze traktowanie ΙΤβ-R-Ig może zmniejszać reakcję humoralną która juz się rozpoczęła.

Choroby spowodowane przeciwciałami.

Wiele spośród narządowych oraz ogólnoustrójowych stanów autoagresyjnych obejmuje patologiczną reakcję przeciwciał. Takie stany obejmują: miastenię, autoagresyną anemię hemolityczną, chorobę Chagasa, chorobę Gravese, idopatyczną plamicę małopłytkową (ITP), układowy toczeń rumieniowaty (SU), ziarninak Wegenera, guzkowe zapalenie wielonaczyniowe i gwałtownie postępujące kłębuszkowe zapalenie nerek (na podstawie Benjamini i in., Immunology; A Short Course (Wiley-Uss), New York wyd. 3 (1996)).

Jakkolwiek etiologia SU nie została określona, dość dużo wiadomo o mechanizmie immunologicznym odpowiedzialnym za obserwowaną patologię Z nieznanych powodów, pacjenci z SU wytwarzają przeciwciała przeciwko jądrowemu składnikowi organizmu (przeciwciała przeciwjądrowe (ANA), co ciekawe, przeciwko natywnemu, dwuniciowemu DNA). Klinicznie obecność tych przeciwciał najlepiej koreluje z patologią zajęcia nerek w SU. Przeciwciała te wiążą się z DNA pochodzącym z rozkładu normalnej tkanki, po czym, jak we wszystkich chorobach kompleksów immunologicznych, kompleksy te tworzą złogi wychwytywane przez błonę podstawną kłębuszków, w ścianach tętniczek oraz przestrzeniach maziowych stawów. Kompleksy te aktywują kaskadę dopełniacza i przyciągają granulocyty. Następująca po tym reakcja zapalna jest określana jako kłębuszkowe zapalenie nerek, które powoduje uszkodzenie nerek, prowadzące do białkomoczu i krwiomoczu

Toczniowe zapalenie nerek badano na modelach mysich od wielu lat. Ostatnio, skuteczność terapeutyczną reagenta swoistego wobec mysiego liganda CD40 badano w takim modelu (Mohan i in , J Immunol. 154:1470-1480 (1995)). Wykazano, ze przyspieszenie tocznia przez przeniesienie komórek, które wywołują wytwarzanie przeciwciał in vivo może być hamowane przez podanie przeciwciała monoklonalnego, które blokuje oddziaływanie CD40-ligand CD40 Ponadto, krótkie leczenie myszy z toczniem przeciwciałem przeciwko ligandowi CD40 podtrzymywało korzystny efekt wobec choroby na długo po tym jak przeciwciało znikło z krążenia. Doświadczenia wykazały, że patogenne limfocyty B nie były w stanie wytwarzać przeciwciał nawet 9 miesięcy po leczeniu, co wskazuje, ze występowało opóźnienie ekspansji autoagresyjnych klonów limfocytów B. Jak wykazano, reagent, który blokuje oddziaływanie TT-a/p/TTp-R in vivo hamuje wytwarzanie reakcji przeciwciał, zmienia fenotyp FDC i tworzenia centrów namnazania związanych z optymalnym tworzeniem limfocytów B pamięci, reagent blokujący TT-a/β.·'ΙΤβ-R powinien być przydatny w leczeniu albo zapobieganiu STE.

Normalna reakcja odpornościowa na niektóre patogenne czynniki zakaźne również wywołuje reakcję autoprzeciwciał, która może stać się nadmierna i stanowić problem medyczny Jednym z przykładów jest choroba Chagasa, zapalna kardiomiopatia, która rozwija się u ludzi i zwierząt doświadczalnych z przewlekłym zakażeniem Trypanosoma cruzi. Wśród ewentualnych mechanizmów związanych z patogenezą ludzkiej kardiomiopatn Chagasa poważnie poparta doświadczeniami jest reakcja autoagresyjna. Ostatnie badania (Tibbetts i m., J. Immunol 152 1493-1499 (1994)) dowiodły, ze przeciwciała swoiste wobec serca są wytwarzane przez myszy C57B1/6 zarazone T. cruzi. Po zakazeniu brazylijskim szczepem T. cruzi, myszy C57B1/6 rozwijają kardiomiopatię, która histologicznie przypomina obserwowaną u przewlekle zarazonych ludzi. Surowice odpornościowe od tych myszy reagują z trzema antygenami

190 617 serca, podczas gdy myszy C57B1/6 zarazone szczepem Guayas T. cruzi, które nie rozwijają kardiomiopatii nie wytwarzają takich przeciwciał. Dane te wskazują, ze przeciwciała te są swoistym znacznikiem kardiomiopatii. Tak więc zdolność czynników blokujących LT(-R do zahamowania uszkodzenia spowodowanego autoprzeciwciałami można ocenić w takim modelu

Inny przykład uszkodzenia komórek przez autoprzeciwciała wytwarzane w następstwie pewnych chorób zakaźnych albo z innych nieznanych względów stanowi ldiopatyczna plamica małopłytkowa (ITP). W tej chorobie przeciwciała skierowane przeciwko płytkom powodują zniszczenie płytek (przez dopełniacz albo komórki fagocytujące z receptorami Fc albo C3b), co może prowadzić do krwawienia. Leki, które są zdolne do zahamowania takich reakcji autoprzeciwciał in vivo, takie jak czynniki blokujące LT-(-R - które hamują wytwarzanie przeciwciał - powinny być również przydatne do leczenia albo zapobiegania tym chorobom autoagresyjnvm.

Normalna reakcja odpornościowa na pewne czynniki patogenne rówmez wywołuje reakcje nadwrażliwości, które mogą stać się nadmierne i stanowić problem medyczny. Najczęstszym przykładem nadwrażliwości typu I są reakcje alergiczne. Są one spowodowane przeciwciałami IgE, które wiążą się przez część Fc z receptorami na komórkach tucznych i granulocytach zasadochłonnych wyzwalając uwalnianie czynników farmakologicznie czynnych, które wywołują anafilaksję. ITP i zespół Goodpastura uważane są czasem za reakcję typu II, która zachodzi, gdy IgM albo IgG związą się z antygenem na powierzchni komórki i aktywują kaskadę dopełniacza. Granulocyty są przyciągane do miejsca aktywacji, zaś uszkodzenie spowodowane uwolnieniem enzymów litycznych z ich ziarnistości powoduje uszkodzenie komórek. Reumatoidalne zapalenie stawów uważane jest za wynik reakcji nadwrażliwości typu III, która zachodzi przez kompleksy immunologiczne antygenu (w tym przypadku czynnika reumatoidalnego, autoprzeciwciała IgM), które wiążą się z fragmentem Fc normalnych IgG. Kompleksy te uczestniczą w reakcji zapalnej stawów i uszkodzeniu charakterystycznym dla tej choroby. Ponieważ reakcje te w części zachodzą przez przeciwciała, leki, które będą hamować wytwarzanie przeciwciał, takie jak czynniki blokujące LT-(-R - powinny być również skuteczne w leczeniu albo zapobieganiu tym chorobom.

Leczenie przy użyciu środków blokujących Ι.,Τ-β-R

Kompozycje według wynalazku podawane są w skutecznych dawkach do leczenia konkretnego stanu klinicznego. Określenie korzystnej farmaceutycznie postaci i skutecznego terapeutycznie schematu dawkowania dla danego zastosowania leży w zakresie biegłości w dziedzinie, przykładowo, stan i ciężar pacjenta, nasilenie pożądanego leczenia i tolerancja pacjenta na leczenie. Oczekuje się, ze dawki około 1 mg/kg rozpuszczalnego LT··^^ są odpowiednimi punktami wyjścia do optymalizacji dawki leczniczej.

Określenie dawki skutecznej terapeutycznie może być również osiągnięte przez wykonanie doświadczeń in vitro, które mierzą stężenie środka blokującego LT-(-R wymaganego do opłaszczema komórek docelowych (komórek LT-(-R- albo ligand LT-P pozytywnych zaleznie od środka blokującego) przez 1 do 14 dni. Opisane tu testy wiązania receptora z ligandem mogą być zastosowane do śledzenia reakcji opłaszczania komórek. Komórki LT-(-R- albo LT-pozytywne mogą być oddzielone od poburzonych limfocytów przy użyciu FACS. W oparciu 0 te wyniki testów in vitro, można wybrać szeroki zakres stężeń środków blokujących LT β-R do badania na zwierzętach w oparciu o opisane tu testy.

Podawanie rozpuszczalnych cząsteczek LT-β-R. przeciwciał przeciwko ligandowi LT 1 LT-(-R, samych albo w kombinacji, w tym izolowanych i oczyszczonych postaci przeciwciał albo kompleksów, ich soli albo pochodnych dopuszczalnych farmaceutycznie, może być osiągnięte przy użyciu dowolnego z konwencjonalnych sposobów podawania środków wykazujących aktywność immunosupresyjną.

Kompozycje farmaceutyczne zastosowane w tym leczeniu mogą być w różnych postaciach Obejmują one przykładowo, stałe, pół-stałe i ciekłe postaci dawkowania, takie jak, tabletki, pigułki, proszki, roztwory ciekłe i zawiesiny, czopki i roztwory do wstrzyknięć i wlewów Korzystne postaci zalezą od zamierzonego sposobu podawania i zastosowania terapeutycznego. Sposoby podawania mogą obejmować podawanie doustne, pozajelitowe, podskórne, dożylne, domiejscowe albo miejscowe.

190 617

Rozpuszczalne cząsteczki LT-P-R, przeciwciała przeciwko ligandowi LT i LT-P-R mogą być, przykładowo, umieszczone w sterylnych, izotonicznych postaciach dawkowania, z lub bez kofaktorów ułatwiających wychwyt albo stabilność. Postać jest korzystnie płynna albo może być liofilizowanym proszkiem. Przykładowo, rozpuszczalne cząsteczki LT-P-R, przeciwciała przeciwko ligandowi LT i LT-P-R mogą być rozcieńczone buforem zawierającym 5,0 mg/ml monohydratu kwasu cytrynowego, 2,7 mg/ml cytrynianu trisodu, 41 mg/ml mannitolu, 1 mg/ml glicyny i 1 mg/ml polisorbate 20. Roztwór może być liofilizowany, przechowywany w zamrożeniu i odtworzony przed podaniem sterylną wodą do wstrzyknięć (USP).

Kompozycje powinny również korzystnie zawierać konwencjonalne dopuszczalne farmaceutycznie nośniki dobrze znane w stanie techniki (patrz, przykładowo Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. 16, 1980, Mac Publishing Company). Takie dopuszczalne farmaceutycznie nośniki mogą obejmować inne środki medyczne, nośniki, nośniki genetyczne, adiuwanty, zarobki itp., takie jak albumina surowicy ludzkiej albo preparaty osocza. Kompozycje są korzystnie w postaci dawek jednostkowych i mogą być podawane raz albo wiele razy dziennie.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą być również podawane w postaci mikrosfer, liposomów albo układu podawania drobnocząsteczkowego albo w preparatach do przedłużonego uwalniania umieszczonych w, w pobliżu albo w innym połączeniu z zajętą tkanką albo w krwiobiegu. Odpowiednie przykłady nośników do przedłużonego uwalniania obejmują połprzepuszczalne matryce polimerowe w postaci ukształtowanych artykułów takich jak czopki albo mikrokapsułki. Możliwe do wszczepienia albo mikrokapsułkowe matryce do przedłużonego uwalniania obejmują polilaktydy (patent USA nr 3,773,319; EP 58,481), kopolimery kwasu L-glutaminowego i etylo-Ε-glutamlnianu (Sidman i in., Biopolymers 22:547-56 (1985); poli(2-hydroksyetylo-metakrylan) albo etylenooctan winylu (Langer i in., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981); Langer Chem. Tech., 12:98-105 (1982)).

Liposomy zawierające rozpuszczalne cząsteczki Ι.Τ-β-R, przeciwciała przeciwko ligandowi LT i LT-p-R same albo w kombinacji mogą być wytworzone znanymi sposobami (patrz, DE 3,218,121; Epstein i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, str. 4030-34 (1980); patent USA nr 4,485,045 i 4,544,545). Zwykle liposomy są typu małych (200-800 Aengstromów) jednobłonowych pęcherzyków, w których zawartość lipidu jest większa niż około 30% (mol.) cholesterolu. Proporcja cholesterolu jest dobrana w celu kontrolowania optymalnej prędkości uwalniania rozpuszczalnej cząsteczki LT-P-R, przeciwciała przeciwko ligandowi LT i LT-P-R.

Rozpuszczalna cząsteczka LT-P-R, przeciwciało przeciwko ligandowi LT i LT-P-R mogą być również przyłączane do liposomów zawierających środek blokujący LT-P-R, lek immunosupresyjny albo cytokiny w celu modulowania aktywności blokowania LT-P-R. Przyłączanie cząsteczek LT-p-R, przeciwciał przeciwko ligandowi LT i LT-P-R do liposomów można osiągnąć dowolnym znanym środkiem sieciującym takim jak środki sieciujące heterobifunkcjonalne, które szeroko się stosuje do sprzęgania toksyn albo środków chemoterapeutycznych do przeciwciał w celu ukierunkowanego podawania. Sprzęganie z liposomami może być również osiągnięte przy użyciu odczynnika sieciującego hydrazyd kwasu 4-(4-maleimidofenylo)-masłowego (MPBH) (Duzgunes i in., J. Cell. Biochem. Abst. Suppl. 16E 77 (1992)).

Zalety kompozycji terapeutycznych obejmujących środki blokujące LT-P-R

Środki blokujące LT-P-R są zdolne do wybiórczego hamowania mechanizmów efektorowych odporności. Zahamowanie odporności humoralnej jest zahamowane przez liczne mechanizmy obejmujące regulowanie tworzenia GC przez wpływ na funkcje FDC. Zarówno odporność komórkowa, jak i humoralna są częściowo zahamowane przez regulację ekspresji adresyn, a w ten sposób wpływ na krążenie limfocytów. Tak więc, czynniki blokujące LTp-R powinny być przydatne do leczenia stanów, które są zaostrzane aktywnością przeciwciał albo nieprawidłową ekspresją adresyn. Zdolność do wybiórczego hamowania takich reakcji odpornościowych powinna być przydatna do leczenia zaburzeń, w tym różnych stanów autoagresji i przewlekłych stanów zapalnych. Jak dyskutowano powyżej, leczenie takich patologicznych stanów odporności zwykle obejmuje podawanie środków immunomodulujących i immunosupresyjnych, które wywierają plejotropowy efekt na wiele rodzajów komórek i reakcji

190 617 odpornościowych. Nieswoiste środki immunosupresyjne są zwykle wymagane w wysokich, a często cytotoksycznych dawkach, które powodują niepożądane efekty uboczne

Zdolność reagentów, które hamują reakcje przeciwciał do łagodzenia patologicznej reakcji odpornościowej jest poparta ostatnim badaniem toczniowego zapalenia nerek u myszy W tym badaniu, podawanie przeciwciał, które blokują szlak CD40/CD40L hamuje przyspieszenie tocznia wywołanego przeniesieniem komórek, które wywołują wytwarzanie przeciwciał m vivo i wykazało przedłuzony korzystny efekt wobec choroby na długo po zniknięciu przeciwciał z organizmu. Dane te wskazują, ze czynniki blokujące Ετβ-R powinny być przydatne do hamowania reakcji komórkowej odrzucania przeszczepów tkankowych albo narządowych przez zahamowanie procesów prowadzących do wytwarzania reakcji przeciwciał

Środki blokujące ET -ER w kompozycjach i zastosowaniach według wynalazku mogą być modyfikowane w celu uzyskania pożądanego poziomu sygnalizacji przez LT---R calecnie od leczonego stanu, zaburzenia albo choroby Przewiduje się, ze absolutny poziom sygnalizacji przez ETE-R może być precyzyjnie dostrajany przez manipulację stężeniem i powinowactwem środków blokujących ΕΤ-β-R do ich celów cząsteczkowych.

Przykładowo, osobnikowi podaje się kompozycję zawierającą rozpuszczalne cząsteczki LT--β-R Rozpuszczalny receptor ET-- może skutecznie współzawodniczyć z powierzchniowymi receptorami LT o wiązame z powierzchniowym ligandem LT Zdolność do współzawodnictwa z zowlercchniewyml ligandami LT zalezy od względnego stężenia rocpιsszczalnych i powierzchniowych cząsteczek ΕΤ-β-R oraz ich względnych powinowactw do ligandu.

Rozpuszczalne cząsteczki ΕΤ-β-R niosące mutacje zwiększające albo zmniejszające powinowactwo wiązania tych mutantów rozpuszczalnych LT-jER z powierzchniowym hgandem LT można wytworzyć stosując standardowe techniki rekembmowanege DNA dobrze znane specjalistom w dziedzinie. Liczne cząsteczki o mutacjach kierowanych albo przypadkowych mogą być badane pod względem ich zdolności do działania jako środki blokujące LT^-b-R przy zastosowaniu standardowych doświadczeń i opisanych tu technik,.

Podobnie, przeciwciała skierowane przeciwko receptorowi LT-P albo jednemu albo wielu podJedeestkom ligandu LT dciałaJąjake środki blokujące ΕΤ-β-R Zdolność tych przeciwciał do blokowania sygnalizacji przez receptor ΙΤ -β-R może być modyfikowana przez mutację, modyfikację chemiczną albo innymi sposobami, które mogą zmieniać stężenie skuteczne albo aktywność przeciwciała podawanego osobnikowi.

Zdolność do zmniejszania sygnalizacji ΕΤ-β--R bez całkowitego zahamowania może być istotna dla ustalenia albo utrzymania cmnieJszoeere poziomu sygnalizacji przez ΕΤ—β-R, która podtrzymuje normalne funkcje odporności, hamując reakcje zalezne od limfocytów Thl, które są nadmierne albo nienormalne.

Zniszczenie genu LT-α. u myszy prowadzi do zaburzonego rozwoju obwodowych narządów limfatycznych (De Togni i in., Science 264:703-7 (1994)) Myszy takie nie posiadają węzłów chłonnych, zaś ich śledziony pozbawione są wyraźnego odgraniczenia pomiędzy regionami bogatymi w limfocyty T i limfocyty B w grudkach. Uważa się, ze ten fenotyp związany jest z utratą sygnalizacji przez ΕΤ-β-R indukowanego przez ET, ponieważ nie obserwowano podobnych fenotypów przy modulowaniu aktywności TNF-R Zdolność do wybiórczego albo częściowego blokowania szlaku ΕΤ-β-R może być więc przydatna w leczeniu nienormalnego rozwoju narządów limfatycznych, związanego z niewłaściwą albo nadmierną ekspresją sygnalizacji przez szlak ET {ER.

Przeciwciała są kluczowym mediatorem reakcji odpornościowych wobec czynników patologicznych Tak więc całkowite zahamowanie reakcji przeciwciał może nie być pożądane w pewnych okolicznościach Przykładowo, przeciwciała są konieczne dla zapewnienia odporności na zakazema przez bakterie zewnątrckemerkowe takie jak Pneumococcus i Hemophilus

Zdolność do wpływania na zeclem przeciwciał przez blokowanie sygnalizacji ΕΓ-β-R może być istotna dla maksymalizacji korzystnych wyników, które można osiągnąć przez leczenie środkami blokującymi LT-jER

Opisane mniejszym metody terapeutyczne obejmują wybiórcze hamowanie reakcji, które są zalezne w całości albo w części od szlaku ΕΤ-β. Konkretne zastosowania terapeutyczne

190 617 zalezą od odpowiedniego mechanizmu etiologicznego hamowanego procesu albo pożądanego medycznego procesu, który ma być przeprowadzony, co będzie oczywiste dla specjalistów Tak więc, sposoby obejmują, w różnych wykonaniach, podawanie terapeutycznie skutecznej ilości czynnika blokującego LT-β-Β albo LT-β. Białka stosowane w tych sposobach mogą być białkami pełnej długości, fragmentami białka albo fragmentami fuzajnaml. W innych wykonaniach, sposoby obejmują podawanie rozpuszczalnych fragmentów, takich jak rozpuszczalny receptor limfotoksyny β W iooych korzystnych wykonaniach, rozwiązania według wynalazku dotyczą podawania przeciwciał przeciwko LT-^-R albo LT-β. Czynniki blokujące można podawać równocześnie ze skuteczną terapeutycznie ilością drugiego związku, który wywiera efekt medycznie pożądany.

Przykładowo, w pewnych sposobach leczenia AIDS i/lub HIV może być pożądane równoczesne podawanie dodatkowego znanego środka peeeciwwiruszwego. Przykładowo, AZT albo inhibitorów βeoteaey. Szczególnie korzystne może być podawanie czynników blokujących, jeszcze korzystniej białka fueajnego LT^-RTgG, w kombinacji ze skojarzonym leczeniem ALDS Takie leczenie skojarzone obejmuje podawanie pacjentowi wielu leków w celu zmniejszenia ilości wirusa w organizmie pacjenta.

Kompozycje według wynalazku można formułować w oparciu o standardową praktykę, jak np. przygotowywać w nośniku. Określenie „nośnik dopuszczalny farmaceutycznie” dotyczy jedoego albo wielu składników organicznych albo nieorganicznych, naturalnych albo syntetycznych, które mogą wspomagać podawanie czynników blokujących pacjentowi. Odpowiednie nośniki są znane specjalistom.

Dowolną kompozycję według wynalazku można podawać w sposób dopuszczalny nieeacenle. Mozę to obejmować wstrzykiwanie, drogą pozajelitową, takąjak droga dożylna, dotętmcza, podskórna, domięśniowa, doguzowa, dootrzewnowa, dostawowa, dooponowa, albo inoe, jak również doustna, doozsowa, dzzcena, doodbytnicza albo w postaci wszczepów. Pożądane może być podawanie miejscowe Sposoby podawania są łatwe do określenia przez specjalistów.

Czynniki blokujące szlak LT, które są przydatne w rozwiązaniach według wynalazku obejmują pochodne funkcjonalne rozpuszczalnego ίΤ-β-Κ, w tym przeciwciała Funkcjonalne pochodne obejmują fragmenty, odmiany, analogi albo chemiczne pochodne cząsteczki. Fragment cząsteczki, taki jak dowolny z antygenów obejmuje dowolny podtyp polipeptydu cząsteczki Odmiana takiej cząsteczki obejmuje naturalnie występującą cząsteczkę zasadniczo podobną do całej cząsteczki albo jej fragmentu.

Odmiany czynników blokujących rózmą się od czaonikdw występujących naturalnie pod względem sekwencji ammokwasowej', albo w sposób nie dotyczący sekwencji albo jedno i drugie Odmiany sekwencji ammokwaszwej są wytwarzane, gdy jeden albo wiele ammokwa sów w naturalnie występujących cząsteczkach zostanie zastąpionych mnymi naturalnymi aminokwasami, pochodnymi aminokwasów, albo aminokwasem nie-oatawnam. Szczególnie korzystne odmiany obejmują białka występujące naturalnie, albo fragmenty biologicznie ceanne białek występujących naturalnie, których sekwencje różnią się jednym albo wieloma konserwatywnymi zastąpieniami aminokwasowymi. Zastąpienia takie są dobrze znane specjalistom i zwylke maaą minimalny wpływ na ssrukturę dirigoozędową i czynnika blokującego

W iooych wykonaniach, odmiany z zastąpieniami ammokwasowymi, które są moiej konserwatywne mogą również dać pożądane pochodne, op. przez spowodowanie zmian w ładunku, konformacji i innych właściwościach biologicznych. Zastąpienia takie obejmują, przykładowo, zastępowanie reszt hydrofobowych resztami hydrofitowymi, zastępowanie cysteiny albo prolmy mną resztą, zastępowanie reszty o małym łańcuchu bzcóoam resztą o wielkim łańcuchu bocznym albo zastępowanie reszty o całkowitym ładunku dodatnim resztą o całkowtym ładunku ujemn_vm J^^^ii nie można przewidzieć w sposób pewny wyniku takiego zastąpienia, pochodne można łatwo badać sposobami tu ujawnionymi w celu określenia obecności albo nieobecności pożądanej cechy.

190 617

Odmiany obejmują białka i peptydy, o sekwencjach aminokwasowych posiadających przynajmniej 80% homologię z czynnikami blokującymi. Jeszcze korzystniej, homologia sekwencji wynosi przynajmniej 90%, albo przynajmniej 95%. W celu określenia homologii długość porównywanej sekwencji powinna wynosić przynajmniej 8 reszt aminokwasowych, zwykle przynajmniej 20 reszt aminokwasowych. Odmiany obejmują również dowolny czynnik blokujący, który 1) ma sekwencję aminokwasową, która jest przynajmniej w 40% homologiczna z czynnikiem blokującym, jak również, która 2) po optymalnym porównaniu z sekwencją czynnika blokującego wykazuje przynajmniej 80% reszt cysternowych w analogicznym położeniu z cystematni czynnika blokującego według wynalazku.

Niniejszym opisano również czynniki, które swoiście wiążą czynniki blokujące, w tym ligandy i przeciwciała.

Poniżej zamieszczono przykłady, które ilustrują rozpuszczalne receptory 0-(-, przeciwciała przeciwko hgandowi LT i LT-β-Κ oraz sposoby stosowane do ich charakteryzacji. Przykłady te nie powinny być uważane za ograniczające: Przykłady zamieszczono w celu ilustracji, zaś wynalazek ograniczany jest jedynie zastrzezeniami.

Przykład 1

Wytwarzanie rozpuszczalnych ludzkich receptorów LT-β jako białek fuzyjnych z Fc immunoglobuliny

Sekwencję klonu ludzkiego cDNA wyizolowaną z biblioteki ludzkich sekwencji 12p pochodzących z hybrydy komórek somatycznych (Baens i in., Genomics 16:214-18 (1993)) wprowadzono do GenBank i stwierdzono, ze jest to sekwencja kodująca ludzki LT---R. Sekwencja tego klonu cDNA ludzkiego LT---R pełnej długości jest dostępna od 1992 roku jako nr dostępu L04270 GenBank.

Domenę zewnątrzkomórkową LT---R do regionu śródbłonowego (fig. 1) amplifikowano przez PGR z klonu cDNA przy użyciu starterów, które wbudowywały miejsca restrykcyjne NotI i SalI na końcach, odpowiednio, 5' i 3' (Browning i in., J. Immunol., 154:33-46 (1995)). Amplifikowany produkt cięto NotI i SalI, oczyszczono i poddano ligacji z wektorem pMDR901 linearyzowanym NotI wraz z fragmentem NotI-SalI kodującym region Fc ludzkiej IgG1. Powstały wektor zawierał gen reduktazy dihydrofolianowej oraz białko fuzyjne LT---R napędzane osobnym promotorem.

Wektor wprowadzono przez elektroporację do komórek CHO dhfr i wyizolowano klony oporne na metotreksat procedurami standartowymi. LT--β-R-Fc wydzielane było do pożywki i zastosowano test ELISA do selekcji linii komórkowych wytwarzających najwyzsze poziomy białka fuzyjnego Linie komórkową wytwarzającą znaczne ilości hodowano w znacznej liczbie i zbierano pożywkę uwarunkowaną. Czyste białko fuzyjne receptora LT-β wyizolowano przez chromatografię powinowactwa na kolumnie Sepharose-białko A Fast Flow (Pharmacia).

Przykład 2

Wytwarzanie rozpuszczalnego mysiego receptora LT-β jako białko fuzyjne z Fc immunoglobuliny

Kompletny klon cDNA mLT-P-R wytworzono przez poddanie hgacji fragmentów 5' NotI/ApaLI i 3' ApaLI/NotI z dwóch częściowych izolatów cDNA w miejscu NotI pCDNA3 (InVitrogen, San Diego, CA). Sekwencja tego klonu cDNA jest dostępna jako nr dostępu L38423 GenBank.

Białko fuzyne rozpuszczalnego mLT---R (hIgG1) wytworzono przez amplifikację klonu cDNA mLT---R pełnej długości jako matrycy i starterów 5'aAcTGCAGCGgCcGCCATGCGCCTGCCC3' i 5'GACTTTGTCGACCMTGCTCX:TGGCTCTGCrGGG3'. Amplifikowany produkt oczyszczono i cięto NotI i SalI i poddawano ligacji z fragmentem NotI/SalI Fc IgG1 do linearyzowanego NotI i traktowanego fosfatazą SAB132 tworząc JLB 122. W celu stabilnej ekspresji, kasetę NotI zawierającą fragment LT-e-R-Fc przeniesiono do miejsca NotI pMDR901 tworząc pSSH001 po czym wektor przeniesiono do komórek CHO jak to opisano (Browning i m., J Immunol., 154:33-46 (1995)). Klony komórek wydzielające LT-^e-R-Fc zidentyfikowano przez ELISA. Oczyszczone białko fuzyjne izolowano z nadsączu komórek CHO przez kolumnę chromatograficzną Białka A Sepharoza Fast Fkiw.

190 617

Przykład 3

Badanie immunohistochemiczne śledziony po wielokrotnych nastrzyknięciach myszy LTp-R-Ig.

4-5 tygodniowe myszy otrzymały 6 wstrzyknięć, jedno na tydzień, LTp-R-Ig albo LFA-3-Ig (100 pg ip), i zostały immunizowane SRBC w dniu szóstego wstrzyknięcia białka fuzyjnego Następnie myszy otrzymały dodatkowe wstrzyknięcie LTp-R-lg albo LFA-3-Ig czwartego dnia po prowokacji SRBC Zwierzęta zabijano 10 dnia po prowokacji SRBC i pobierano narządy w celu badania ich struktury. Lewa kolumna na figurze 2 odpowiada skrawkom śledziony zwierząt traktowanych LFA-3-Ig (A, C, E, G, I), a prawa kolumna odpowiada skrawkom śledziony zwierząt traktowanych LTβ-R-Ig (B, D, F, H, J). Utrwalone acetonem skrawki zamrożonej śledziony barwiono dwukrotnie wykorzystując przeciwciało znakowane biotynylowane przeciwko mysiej B220 i przeciwciało przeciwko mysiemu CD4 (A i B), po którym następowało odpowiadające drugie barwienie odpowiednio streptawidyną znakowana fosfatazą zasadową (fioletowe, ciemne zabarwienie) i mysim Ig przeciwko szczurzemu znakowane peroksydazą chrzanową (jasno-brązowe zabarwienie). Inny zestaw zamrożonych skrawków barwiono przeciwciałami ER-TR-9 (w celu wykrycia MZM, C i D), MOMA-1 (w celu wykrycia makro fagów metalofilnych, E i F), MECA-367 (swoiste dla MAdCAM-1, G i H) i ER-TR-7 (w celu barwienia fibroblastów siateczki, 11 J), po czym następuje drugie barwienie mysim Ig przeciwko szczurzemu znakowane peroksydazą chrzanową (jasno-brązowe zabarwienie). Obrazy te pokazują barwienie skrawków uzyskanych od przynajmniej sześciu zwierząt. Powiększenie x 10.

Przykład 4

Wpływ ΕΤβ-R-Ig i ligandu przeciwko CD40 na tworzenie GC i barwienie FDC.

Zwierzętom podawano LTp-R-Ig albo LFA-3-Ig jak opisano w przykładzie 3. Inna grupa zwierząt otrzymywała MR1 (ligand przeciwko mysiemu CD40, 250 pg/wstrzyknięcie, dootrzewnowe) dnia -1, dnia 1 i dnia 3, SRBC otrzymywały dnia 0 i zastały zabijane dnia 10. Utrwalone acetonem skrawki śledziony zwierząt traktowanych LFA-3-Ig (fig. 3, kolumna lewa, A i D), albo hT-I-R-Ig (kolumna środkowa, B i E), albo MR1 (prawa kolumna, C i F) barwiono aglutyniną orzeszków ziemnych znakowana biotyna (PNA, ścieżka wyższa, A, B i C), albo FDC-M1 (ścieżka niższa, D, E i F), po którym następowało drugie barwienie odpowiednio streptawidyną znakowaną fosfatazą peroksydazą chrzanową i mysim Ig przeciwko szczurzemu znakowane peroksydazą chrzanową (zabarwienie brązowe). PNA barwiące zatokę brzezną jest wskazane przez strzałkę w A i C. Tworzenie GC jest wskazane przez białą gwiazdkę w A. Barwienie w kierunku FDC jest wskazane przez czarną strzałkę w D i F. Obrazy te pokazują barwienie skrawków uzyskanych od przynajmniej czterech zwierząt. Powiększenie x 10.

Przykład 5

Wyrażanie adresyny w LN myszy leczonych LTβ-β-Ig wewnątrzmacicznie i w sposób ciągły po urodzeniu.

Doświadczenia te wykorzystują potomstwo jeszcze w okresie wewnątrzmacicznym myszy Balb/c, które nastrzykiwano iv 14 i 17 dnia ciąży 200 pg białka receptora Ig. Po urodzeniu potomstwo nastrzykiwano ip raz w tygodniu 100 pg LTp-R-Ig, TNF-R55-Ig albo LFA-3-Ig Poziom białka fuzyjnego utrzymywano na poziomie albo powyżej 10 pg/ml w tracie życia zwierząt, oceniano to testem ELISa (dane nie pokazane). Fig. 4: Panele A, B, G, H barwienie węzłów chłonnych myszy leczonych LTP-R-Ig. Panele C, D barwienie węzłów chłonnych myszy leczonych LFA-3-Ig. Panele E, F barwienie węzłów chłonnych myszy leczonych TNFR55-Ig. Panele A, C, E, G odpowiadają węzłom krezkowym barwionym przeciwciałem MECA367 w celu wykrycia adresyny dla błony śluzowej, MAdCAM-1. Panele B, D, F, H odpowiadają obwodowym (oskrzelowym) węzłom chłonnym barwionym przeciwciałem MECA79 swoistym w stosunku do adresyn dla obwodowych LN (PNAd). Panele G, H są węzłami chłonnymi 6 tygodniowych myszy poddanych ekspozycji na LTβ-β-Ig jedynie wewnątrzmacicznie. Wszystkie obrazy są w powiększeniu x 50.

190 617

Przykład 6

Rozmieszczenie limfocytów i wyrażanie znaczników makrofagowych w TN myszy leczonych TTP-R-Ig wewnątrzmacicznie i w sposób ciągły po urodzeniu

Myszy leczono TT-j-R-Ig, TMF-R55-Ig albo TFA-3-Ig we wnątrzmacicznie i kontynuowano to po urodzeniu jak to opisano w przykładzie 5 Skrawki RN barwiono następnie przeciwciałami swoistymi w stosunku do znaczników wyrażanych przez makro fagi albo mAbs swoistymi w stosunku do znacznika B220 limfocytów B i do znacznika CD4 limfocytów T Analizę obrazową wykorzystano w celu zidentyfikowania miejsc, gdzie nakładają się obszary bogate w limfocyty T i B Figuia 5 Panele A, D, G odpowiadają odpowiednio barwieniu B220/CD4 u myszy leczonych TTP-R-Ig, TNF-R55-Ig i RFA-3-Ig Obrazy fluorescencyjne analizowano wykorzystując urządzenia do analizy obrazowej Panele B, E, H odpowiadają barwieniu sialoadhezyny i panela C, F, I odpowiadają barwieniu MOMA-1

Przykład 7

Efekt leczenia TT(3-R-Ig na odpowiedź przeciwciał na SRBC

Myszy balb/c nastrzykiwano zarówno TTfJ-R-Ig, ludzka Ig albo PBS, w sposób następujący: fig. 6A: myszy otrzymały 6 wstrzyknięć jak to opisano dla figury 2, przykładu 3 Krew pobierano 7 dnia (ciemne słupki) i 14 dnia (prążkowane słupki) po immumzacji SRBC 6B Zwierzęta otrzymywały białka fuzyjne w dniu -7 i dniu 0 SRBC podawano w dniu 0, krwe pobierano w 7 dniu (ciemne słupki) po 14 dniu (prążkowane słupki) i 30 dniu (białe słupki) 6C. Zwierzęta otrzymywały białka fuzyjne jednorazowo w dniu 0 i tym samym czasie, co immunizację SRBC Krew pobierano w 7 dniu (czarne słupki), 14 dniu (prążkowane słupki) i 34 dniu (szare słupki).

Miano swoistych dla SRBC IgM i IgG określano badając surowicę testami hemaglutynacji Miano określano jako odwrotność ostatniego rozcieńczenia surowicy, dla którego wykrywana jest hemaglutynacja i przedstawione jest jako logarytm przy podstawie 2(1= rozcieńczenie surowicy 1/15) Wyniki odpowiadają średniej plus odchylenia standardowe czterech różnych zwierząt w grupie.

190 617

FIG. 2F

HG. 2t

190 617

FIG. 2J

FIG. 2I

190 617

FIG. 4A

FIG. 4G

190 617

FIG. 4B

FIG.4D

FiG. 4F

FIG. 4H

190 617

IgM IgG ⁶T

MIANO ₅.

(logarytm przy podstawie 2)

43210--

FIG.

FIG. 6C

190 617

ω co

Q_

LiJ

Q_

UJ

O LLĘ Z y > N (Z 1— ω

S =) uj 5 N O OJ 2> ο. S

CO >

H >O

O

G -Ό <Q ω <{3δ

5©<

or ω 3 o <

|E5§

—i

O

UJ o

w

UJ oc o

o _i

LL <

“3

O <

§

CL

LU ω

co

O

SQPQAVPPYA SENQTCRDQE KEYYEPQKRI CCSRCPPGTY VSAKCSRIRD 51 TVCATCAENS YNEHWNYLTI CQLCRPCDPV MGLEEIAPCT SKRKTQCRCQ 101 PGMFCAAWAL ECTHCELLSD CPPGTEAELK DEVGKGNHHC VPCKAGHFQN 151 TSSPSARCQP HTRCENQGLV EAAPGTAQSD TTCKNPLEPL PPEMSGT

FIG. 1

100

150

137

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 50 egz Cena 6,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie czynnika blokującego ΙΤ-β-R do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania humoralnej reakcji odpornościowej u zwierzęcia.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, ze czynnik blokujący ΙΤ-β-R jest wybrany z grupy składającej się z rozpuszczalnego receptora limfotoksyny-β, przeciwciała skierowanego przeciwko receptorowi ΙΤ-β i przeciwciała skierowanego przeciwko powierzchniowemu ligandowi LT.
3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, ze zwierzęciem jest ssak.
4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że ssakiem jest człowiek.
5. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że czynnik blokujący ΙΤ-β-R obejmuje rozpuszczalny receptor limfotoksyny-β posiadający domenę wiążącą ligand, która może wybiórczo wiązać się z powierzchniowym ligandem LT.
6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że domena wiążąca ligand obejmuje SEK NR.ED: 1 lub jej funkcjonalny fragment.
7. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że rozpuszczalny ΙΤ-β-R obejmuje ponadto jedną lub więcej heterologiczną domenę białkową.
8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że heterologiczną domena białkowa jest wybrana z grupy składającej się z immunoglobulin, albumin surowicy, lipoprotein, apolipoprotein i transferyn.
9. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że rozpuszczalny receptor limfotoksyny-p obejmuje domenę Fc ludzkiej immunoglobuliny.
10. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że czynnik blokujący ΙΤ-β-R obejmuje przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko receptorowi ΙΤ-β.
11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, ze kompozycja jest przeznaczona do podawania w ilości wystarczającej do pokrycia komórek pozytywnych względem receptora ΙΤ-β przez około 1 do około 14 dni.
12. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że czynnik blokujący ΙΤ-β-R obejmuje przeciwciało monoklonalne BDA8 przeciwko ludzkiemu ΙΤ-β-R.
13. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że czynnik blokujący ΙΤ-β-R obejmuje przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko powierzchniowemu ligandowi ET.
14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, ze kompozycja jest przeznaczona do podawania w ilości wystarczającej do pokrycia komórek pozytywnych względem powierzchniowego ligandu ΙΤ przez około 1 do około 14 dni.
15. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że przeciwciało jest skierowane przeciwko podjednostce ligandu ΙΓ.
16. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, ze czynnik blokujący ΙΤ-β-R obejmuje przeciwciało monoklonalne B9 przeciwko ludzkiej ΙΤ-β
17. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, ze czynnik blokujący ΙΤ-β-R obejmuje przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko mysiemu ligandowi powierzchniowemu Ιτ.
18. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna ponadto obejmuje dopuszczalny farmaceutycznie nośnik albo adiuwant.
19. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, ze zwierzę jest zakazone ludzkim wirusem niedoboru odporności.
20. Zastosowanie czynnika blokującego ΙΤ-β-R wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia, zapobiegama albo eliminowania ludzkiego wirusa niedoboru odporności u ssaka.

190 617
21 Zastosowanie według zastrz 20, znamienne tym, ze czynnik blokujący LT-P-R jest wybrany z grupy składającej się z rozpuszczalnego receptora limfotokssyiy-β, przeciwciała skierowanego przeciwko receptorowi LT-β i przeciwciała skierowanego przeciwko powierzchniowemu ligandowi LT
22 Zastosowanie według zastrz. 21, znamienne tym, ze czynnik blokujący zawiera rozpuszczalny receptor L:nLuoKsvny β obejmujący domenę wiązącą ligand, która może wybiórczo wiązać się z powierzchniowym ligandem LT
23. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, ze domena wiąząca ligand obejmuje SEK NR ID 1 lub jej funkcjonalny fragment
24 Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, ze rozpuszczalny LT-P-R obejmuje ponadto jedną lub więcej heterologiczną domenę białkową.
25 Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, ze heterologiczną domena białkowa jest wybrana z grupy składającej się z immunoglobulin, albumin surowicy, lipoprotem, apolipoprotein i transferyn.
26 Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, ze rozpuszczalny receptor obejmuje domenę Fc ludzkiej immunoglobuliny.
27. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, ze czynnik blokujący LT-P-R obejmuje przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko LT-p-R.
28 Zastosowanie według zastrz. 27, znamienne tym, ze czynnik blokujący obejmuje przeciwciało monoklonalne BDA8 przeciwko ludzkiemu LT-P-R.
29. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, ze czynnik blokujący obejmuje przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko powierzchniowemu ligandowi LT '
30. Zastosowanie według zastrz 20, znamienne tym, ze kompozycja jest przeznaczona do współpodawania z dodatkowym czynnikiem antywirusowym.
31 Zastosowanie czynnika blokującego LT-p-R do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do przerywania wiązania się kompleksów immunologicznych z grudkami limfocytów B u zwierzęcia..
32. Zastosowanie według zastrz. 31, znamienne tym, ze czynnik blokujący LT -fP-R jest wybrany z grupy składającej się z rozpuszczalnego receptora hmfotoksyiy-β, przeciwciała skierowanego przeciwko receptorowi LT-β i przeciwciała skierowanego przeciwko powierzchniowemu ligandowi LT
33 Zastosowanie według zastrz. 31, znamienne tym, ze zwierzęciem jest ssak
34 Zastosowanie według zastrz. 33, znamienne tym, ze ssakiem jest człowiek.
35. Zastosowanie według zastrz. 32, znamienne tym, ze czynnik blokujący ΕΤ-β-R obejmuje rozpuszczalny receptor hmfotoksyny-β posiadający domenę wiązącą ligand, która może wybiórczo wiązać się z powierzchniowym ligandem LT.
36. Zastosowanie według zastrz. 35, znamienne tym, ze domena wiąząca ligand obejmuje SEK NR ID 1 lub jej funkcjonalny fragment
37. Zastosowanie według zastrz. 35, znamienne tym, ze rozpuszczalny ΙΤ-β-R obejmuje ponadto jedną lub więcej heterologiczną domenę białkową
38 Zastosowanie według zastrz. 37, znamienne tym, ze heterologiczną domena białkowa jest wybrana z grupy składającej się z immunoglobulin, albumin surowicy, lipoprotem, apolipoprotein i transferyn.
39 Zastosowanie według zastrz 35, znamienne tym, ze rozpuszczalny receptor limfotoksyiy-β obejmuje domenę Fc ludzkiej immunoglobuliny.
40 Zastosowanie według zastrz 32, znamienne tym, ze czynnik blokujący LT--β-R obejmuje przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko receptorowi LT-β
41 Zastosowanie według zastrz 40, znamienne tym, ze kompozycja jest przeznaczona do podawania w ilości wystarczającej do pokrycia komórek pozytywnych względem receptora LT--β przez około 1 do około 14 dni.
42 Zastosowanie według zastrz. 40, znamienne tym, ze czynnik blokujący LT β-R obejmuje przeciwciało monoklonalne BDA8 przeciwko ludzkiemu ΤΤ-β-R
43. Zastosowanie według zastrz. 32, znamienne tym, ze czynnik blokujący LR-L-R obejmuje przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko powierzchniowemu ligandowi LT.

190 617
44 Zastosowanie według zastrz. 43, znamienne tym, ze kompozycja jest przeznaczona do podawania w ilości wystarczającej do pokrycia komórek pozytywnych względem powierzchniowego ligandu LT przez około 1 do około 14 dni.
45 Zastosowanie według zastrz. 43, znamienne tym, ze przeciwciało jest skierowane przeciwko podjednostce ligandu LT.
46 Zastosowanie według zastrz 45, znamienne tym, ze czynnik blokujący LT-P-R obejmuje przeciwciało monoklonalne B9 przeciwko ludzkiej LT-β
47 Zastosowanie według zastrz. 43, znamienne tym, ze czynnik blokujący LT-β-Κ obejmuje przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko mysiemu ligandowi powierzchniowemu LT.
48 Zastosowanie według zastrz 31, znamienne tym, ze kompozycja farmaceutyczna ponadto obejmuje dopuszczalny farmaceutycznie nośnik albo adiuwant.
49 Zastosowanie czynnika blokującego Ι'Τ-β-R do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia chorób autoagresyjnych przebiegających za pośrednictwem przeciwciał.

5θ Zastosowanie według zastrz. 49, znamienne tym, ze czynnik blokujący ΚΓ-β-R jest wybrany z grupy składającej się z rozpuszczalnego receptora limfotoksyny-β, przeciwciała skierowanego przeciwko receptorowi LT-β i przeciwciała skierowanego przeciwko powierzchniowemu ligandowi LT.
51. Zastosowanie według zastrz. 50, znamienne tym, ze rozpuszczalny Ι,.Τ-β-R obejmuje domenę wiązącą ligand, która może wybiórczo wiązać się z powierzchniowym ligandem LT.
52 Zastosowanie według zastrz. 51, znamienne tym, ze domena wiąząca ligand obejmuje SEK. NR ID: 1 lub jej funkcjonalny fragment.
53. Zastosowanie według zastrz. 51, znamienne tym, ze rozpuszczalny ΙΤ-β-R obejmuje ponadto jedną lub więcej heterologiczną domenę białkową.
54 Zastosowanie według zastrz. 53, znamienne tym, ze heterologiczną domena białkowa jest wybrana z grupy składającej się z immunoglobulin, albumin surowicy, lipoprotem, apolipoprotem i transferyn
55. Zastosowanie według zastrz. 50, znamienne tym, że rozpuszczalny receptor obejmuje domenę Fc ludzkiej immunoglobuliny.
56 Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 49 albo 50, albo 51, albo 52, albo 53 albo 54, albo 55, znamienne tym, ze choroba autoagresyjna wybrana jest z grupy składającej się z miastenii, autoagresyjnej anemii hemolitycznej, samoistnej plamicy małopłytkowej (ITP), układowego tocznia rumieniowatego (SLE), ziarniniaka Wegenera, guzkowego zapalenie wielonaczyniowego, gwałtownie postępującego zapalenia kłębuszków nerkowych, oraz przewlekłych chorób zapalnych
57. Zastosowanie według zastrz. 56, znamienne tym, ze przewlekłą chorobą zapalną jest choroba Chagasa lub choroba Gravesa.
58. Zastosowanie czynnika blokującego receptor limfotoksjyiy-β (LT-(-R) do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania humoralnej reakcji odpornościowej u osobnika cierpiącego na reakcje nadwrażliwości.
59. Zastosowanie według zastrz 58, znamienne tym, ze czynnik blokujący LT--β-Rjest wybrany z grupy składającej się z rozpuszczalnego receptora limfotoksyny-β, przeciwciała skierowanego przeciwko receptorowi LT-β i przeciwciała skierowanego przeciwko powierzchniowemu ligandowi LT
60. Zastosowanie według zastrz. 59, znamienne tym, ze rozpuszczalny LT β-R posiada domenę wiązącą ligand, która wybiórczo może wiązać się z powierzchniowym ligandem LT
61. Zastosowanie według zastrz. 60, znamienne tym, ze domena wiążąca ligand obejmuje SEK NR ID: 1 lub jej funkcjonalny fragment.
62. Zastosowanie według zastrz. 60, znamienne tym, ze rozpuszczalny LT-(.’-R. obejmuje ponadto jedną lub więcej heterologiczną domenę białkową..
63. Zastosowanie według zastrz. 62, znamienne tym, ze heterologiczną domena białkowa jest wybrana z grupy składającej się z immunoglobulin, albumin surowicy, lipoprotem, apolipoprotem i transferyn.

190 617
64. Zastosowanie według zastrz. 60, znamienne tym, ze rozpurzczalny υΓ-β-R obejmuje domenę Fc ludzkiej immunoglobuliny.
65 Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 58 albo 59, albo 60, albo 61, albo 62, albo 63, albo 64, znamienne tym, ze reakcja nadwrażliwości jest reakcją typu I.
66 Zastosowanie według dowolnego z zastrz 58 albo 59, albo 60, albo 61, albo 62, albo 63, albo 64, znamienne tym, ze reakcja nadwrażliwości jest reakcją typu II lub typu III.
67 Zastosowanie czynnika blokującego receptor limfotoksynyp (LT-β-·-!®) do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania reakcji humoralnej związanej z odrzuceniem przeszczepu.
68. Zastosowanie według zastrz. 67, znamienne tym, ze czynnik blokujący ΕΓ^β-R jest wybrany z grupy składającej się z rozpuszczalnego receptora limfotoksyny-(3, przeciwciała skierowanego przeciwko receptorowi LT-β i przeciwciała skierowanego przeciwko powierzchniowemu ligandowi LT.
69. Zastosowanie według zastrz. 68, znamienne tym, ze rozpuszczalny receptor limfotoksyny-P obejmuje domenę wiążącą ligand, która może wybiórczo wiązać się z powierzchniowym ligandem LT.
70. Zastosowanie według zastrz. 69, znamienne tym, że domena wiążąca ligand obejmuje SEK. NR ID: 1 lub jej funkcjonalny fragment.
71. Zastosowanie według zastrz. 69, znamienne tym, ze rozpuszczalny obejmuje ponadto jedną lub więcej hetero logiczną domenę białkową.
72. Zastosowanie według zastrz. 71, znamienne tym, że heterologiczna domena białkowa jest wybrana z grupy składającej się z immunoglobulin, albumin surowicy, llzoproteln, apollzoprotem i transferyn.
73. Zastosowanie według zastrz. 69, znamienne tym, ze rozpuszczalny receptor obejmuje domenę Fc ludzkiej immunogtobuliny.
74. Zastosowanie kompozycji farmaceutycznej do wytwarzania leku do hamowania humoralnej reakcji odpornościowej u zwierzęcia, przy czym kompozycja farmaceutyczna zawiera skuteczną ilość polizeptydu obejmującego rozpuszczalną, wiążącą ligand domenę receptora limfotoksyny -P (LT-beR) połączoną z domeną Fc ludzkiej IgG1 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
75. Zastosowanie według zastrz. 74, znamienne tym, ze humoralną reakcją odpornościowąjest układowy toczeń rumieniowaty (SLE).
76. Zastosowanie według zastrz. 74, znamienne tym, ze rozpuszczalna, wiążąca ligand domena obejmuje SEK. NR
77. Zastosowanie kompozycji farmaceutycznej do wytwarzania leku do leczenia układowego tocznia rumieniowatego (SLE) u zwierzęcia, przy czym kompozycja farmaceutyczna zawiera skuteczną ilość zolipeptydu obejmującego rozpuszczalną, wiążącą ligand domenę receptora limfotoksvny-|3 (ΤΤ-β-R) połączoną z domeną Fc ludzkiej IgG1 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
78. Zastosowanie według zastrz. 77, znamienne tym, że rozpuszczalna, wiążąca ligand domena LT-beR obejmuje SEK. NR
79. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że obejmuje ilość polipeptydu skuteczną do hamowania humoralnej reakcji odpornościowej u zwierzęcia oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, przy czym polipeztyd obejmuje rozpuszczalną, wiążącą ligand domenę receptora limfotoksyny-fl (ΤΤ-β-Κ) połączoną z domeną Fc ludzkiej IgG1.
80. Kompozycja według zastrz. 79, znamienna tym, ze humoralną reakcją odporniościowąjest układowy toczeń rumieniowaty (SLE).
81. Kompozycja według zastrz. 79, znamienna tym, ze rozpuszczalna, wiążąca ligand domena Ο'-β-ί^ obejmuje SEK. NR ID: 1.

190 617