CN1235639C - 放射性标记试剂盒和结合测定试验 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了以商品化设定方式放射性标记和检测治疗抗体的抗体结合测定试验和放射性标记试剂盒。特别地，将所述的试剂盒设计成制备和评价用于治疗B细胞淋巴瘤并使之显象的放射性标记的抗-CD20缀合物。所有的试剂盒试剂均是无菌的并将它们用于实现高水平的抗体放射性标记和具有高度再现性结果的产品稳定性。
Description
发明背景
1.发明领域
本发明涉及用于检测治疗肿瘤和肿瘤细胞/使之显象用的治疗抗体的临床功效的抗体结合测定试验和放射性标记试剂盒、冻干的细胞制品、试剂和实施方案。特别地，将本发明的试剂盒设计成制备和评价放射性标记的抗体缀合物，这种缀合物通过靶向B细胞表面抗原BP35(“CD20”)而用于治疗B细胞淋巴瘤并使之显象。
2.技术背景
本文中引入的所有公开出版物和专利申请作为参考使用，就如同特别和分别将各个公开出版物或专利申请引入作为参考一样。
脊椎动物(例如灵长类，它们包括人类、猿类、猴等)的免疫系统由已经进化成具有下列功能的大量器官和细胞类型组成：准确和特异性地识别侵入脊椎动物宿主的外源微生物(“抗原”)；特异性结合这类外源微生物；和消除/破坏这类外源微生物。淋巴细胞和其它类型的细胞对免疫系统来说至为关键。淋巴细胞在胸腺、脾和骨髓(成人)中产生且约占存在于人类(成人)循环系统中的总白细胞的30％。
存在两种主要的淋巴细胞亚群：T细胞和B细胞。T细胞可导致细胞介导的免疫性，而B细胞可导致抗体产生(体液免疫)。然而，在一般的免疫反应中，可以将T细胞和B细胞看作是相互依赖的，当T细胞受体结合与抗原呈递细胞表面上的主要组织相容性复合物(“MHC”)糖蛋白结合的抗原片段结合时，T细胞被激活；这种激活导致释放生物介体(“白细胞介素”)，它们实质上激活B细胞以便区分和产生对抗所述抗原的抗体(“免疫球蛋白”)。
宿主内的各B细胞在其表面上表达不同的抗体，由此一种B细胞会表达对一种抗原具有特异性的抗体，而另一种B细胞会表达对不同抗原具有特异性的抗体。因此，B细胞是相当不同的且这种差异对免疫系统来说是关键的。在人体中，各B细胞可以产生大量的抗体分子(即约107-108)。当外源性抗原失效时，这类抗体的产生一般大部分终止(或基本上减少)。不过，有时特殊B细胞的增殖没有持续减弱；这类增殖可以导致称作“B细胞淋巴瘤”的癌症。
T细胞和B细胞均包括可以用作区分和鉴定“标记”的细胞表面蛋白。一种这类人B细胞标记是结合在人B淋巴细胞上的分化抗原Bp35、称作“CD20”。在B细胞发育前早期过程中表达CD并保持到血浆细胞分化为止。特别地，CD20分子可以调节需要启动细胞循环和分化的激活过程中的步骤且通常在赘生性(“肿瘤”)B细胞上以极高的水平表达它。按照定义，CD20既存在于“正常”B细胞上也存在于“恶性”B细胞、即未减弱的增殖可以导致B细胞淋巴瘤的那些B细胞上。因此，CD20表面抗原具有用作“靶向”B细胞淋巴瘤的候选物的替能。
实质上，一般可以如下概括这种靶向过程：例如，将对B细胞CD20表面抗原具有特异性的抗体注入患者。这些抗-CD20抗体(显然)特异性地结合正常和恶性B细胞的CD20细胞表面抗原；与CD20表面抗原结合的抗-CD20抗体可以导致赘生性B细胞的破坏和衰竭。因此，可以将具有破坏肿瘤潜能的化学试剂或放射性标记与抗-CD20抗体缀合，使得所述的试剂可以特异性“转入”例如赘生性B细胞中。与这种手段无关，主要目的在于破坏肿瘤：可以通过所用的特定抗-CD20抗体确定特殊手段且由此靶向CD20抗原的可利用手段可以显著改变。
例如，已经报导了这类靶向CD20表面抗原的尝试。据报道通过给B细胞淋巴瘤患者连续静脉输注来给予鼠(小鼠)单克隆抗体1F5(一种抗-CD20抗体)。据报道需要极高水平(＞2克)的1F5来使循环的肿瘤细胞衰竭并将结果描述为“短暂的”。Press等“人B细胞淋巴瘤的单克隆抗体1F5(抗-CD20)血清疗法”(Monoclonal Ant ibody1F5(Anti-CD20)Serotherapy of Human B-Cell Lymphomas)-《血液》(Blood)69/2：584-591(1987)。
使用这种手段的潜在难题在于非人的单克隆抗体(例如鼠单克隆抗体)一般缺乏人效应器功能性，即它们尤其不能介导补体依赖性裂解或通过抗体依赖性细胞毒性或Fc-受体介导的吞噬作用来裂解人靶细胞。此外，非人的单克隆抗体可以由作为外源蛋白质的人宿主来识别；因此，重复注射这类外源抗体可以导致诱发免疫反应，从而产生有害的过敏性反应。就以鼠为基础的单克隆抗体而言，通常将所述的有害过敏性反应称作人抗小鼠抗体反应或“HAMA”反应.另外，这些“外源”抗体可以被宿主的免疫系统攻击，实际上使得在它们达到其靶向部位前失效。
淋巴细胞和淋巴瘤细胞本身对放疗敏感。因此，B细胞恶性肿瘤对放射免疫疗法(RIT)来说是具有吸引力的靶物，这是因为以下几个原因：放射性标记抗体电离辐射的局部发射可以杀死含有或不含与结合抗原的抗体接近的靶抗原(例如CD20)；贯穿辐射、即β发射体可以排除抗体进入庞大或多血管化肿瘤的机会受到限制的难题；和可以减少所需抗体的总量。放射性核素发射放射性粒子，这种粒子可以将细胞DNA破坏至细胞修复机制不能够使细胞持续生存的程度；因此，如果靶细胞是肿瘤，那么放射性标记可有利地杀死肿瘤细胞。按照定义，放射性标记的抗体包括使用的放射性物质，它们应满足对患者(即可能的骨髓移植)以及保健提供者(即在接触放射性时需要进行高度警告)的预防性要求。
因此，已经将改善鼠单克隆抗体有效治疗B细胞疾病的能力的手段与对所述抗体的放射性标记结合起来，使得标记或毒素定位于肿瘤部位。另外将毒素(即诸如阿霉素或丝裂霉素C这样的化疗剂)与抗体缀合。例如，参见PCT公开申请WO 92/07466(公开日：1992年5月14日)。
“嵌合”抗体、即包括来自两种或多种补体物种(例如小鼠和人)的部分的抗体已经发展成为“缀合”抗体的替代品。已经生产出了小鼠/人嵌合抗体且证实它们表现出亲代小鼠抗体的结合特征和与人恒定区相关的效应器功能。例如，参见：Cabilly等的美国专利4,816,567；Shoemaker等的美国专利4,978,745；Beavers等的美国专利4,975,369；和Boss等的美国专利4,816,397，将所有这些文献引入本文作为参考。一般通过由提取自预先存在的鼠杂交瘤的DNA制备基因组基因文库来构建这些嵌合抗体。Nishimura等(1987)《癌症研究》(Cancer Research)47：999。然后将该文库用于从表现出正确抗体片段重排模式的重链和轻链中筛选可变区基因。接着将克隆的可变区基因连入含有合适的重链或轻链人恒定区基因克隆弹夹的表达载体中。接下来在选择的细胞系、通常是鼠骨髓瘤细胞系中表达嵌合基因。
例如，Liu，A.Y.等在《免疫杂志》(J.Immun.)139/10：3521-3526(1987)中的文章“针对具有有效Fc-依赖性生物活性的CD20的小鼠-人嵌合单克隆抗体的生产”中描述了针对CD20抗原的小鼠/人嵌合抗体。另外参见PCT公开号WO 88/04936。然而，对使用参考文献中Liu的嵌合抗体治疗B细胞疾病的能力、功效或实用性而言却没有提供出任何信息。
注意体外功能性测定试验(例如补体依赖性裂解(“CDC”)；抗体依赖性细胞毒性(“ADCC”)等)本身不能预测任何抗体在体内破坏表达特异性抗原的靶细胞或使它们衰竭的能力。例如，参见Rob inson，R.D.等“介导不同抗肿瘤细胞生物活性的嵌合小鼠-人抗癌抗体”(Chimeric mouse-human anti-carcinoma antibodiesthat mediate different anti-tumor cell biologicalactivities)-《人杂交瘤抗体》(Hum.Antibod.Hybridomas)2：84-93(1991)(具有未检测到ADCC活性的嵌合小鼠-人抗体)。因此，仅能够通过体内实验来确切评价抗体的潜在治疗功效。
为此，未审公开申请08/475,813、08/475,815和08/478,967中公开了用于在给予治疗抗体前B细胞淋巴瘤肿瘤诊断“显象”的放射性标记的抗-CD20缀合物，将这些文献的全部内容引入本文作为参考。“In2B8”缀合物包括对人CD20抗原具有特异性的鼠单克隆抗体2B8，它通过双功能螯合剂即异硫氰酰苄基-3-甲基-二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)与铟[111](111In)结合，所述的MX-DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)包括1-异硫氰基苄基-3-甲基-DTPA与1-甲基-3-异硫氰基苄基-DTPA的1∶1混合物。将铟-[111]选作诊断用放射性核素，这是因为它发射γ射线且发现在应用前作为显象剂。
涉及螯合剂和螯合剂缀合物的专利在本领域中是公知的。例如，G ans ow的美国专利4,831,175涉及多取代的二亚乙基三胺五乙酸螯合物和含有它的蛋白质缀合物及其制备方法。Gansow的美国专利5,099,069、5,246,692、5,286,850和5,124,471还涉及多取代的DTPA螯合物。将这些专利的全部内容引入本文。
在申请08/475,813、08/475,815和08/478,967中选择对三价金属具有高亲和力的用于促进螯合的特异性双功能螯合剂并将它们用于增加肿瘤与非肿瘤之比、减少骨吸收和在体内将放射性核素更大程度地保留在靶向部位即B细胞淋巴瘤肿瘤部位。然而，其它双功能螯合剂在本领域中是公知的且它们在肿瘤疗法中也是有利的。
在申请08/475,813、08/475,815和08/478,967中还公开了用于靶向和破坏B细胞淋巴瘤和肿瘤细胞的放射性标记的治疗抗体。特别地，Y2B8缀合物包括经相同的双功能螯合剂与钇-[90](90Y)连接的相同抗人CD20鼠单克隆抗体2B8。由于几个原因而将这种放射性核素选择用于疗法。64小时的90Y半衰期足够长而使抗体累积至肿瘤且例如不同于131I，它是在其衰变中不具有附带γ射线的高能的纯β发射体，发射范围在100-1000细胞直径。对给予90Y-标记的抗体的门诊病人来说，要求最小量的贯穿辐射。此外，摄入标记的抗体不需要杀死细胞且电离辐射的局部发射对缺乏靶抗原的邻近肿瘤细胞来说应是致命的。
因为使用双功能螯合剂分子MX-DTPA使90Y放射性核素与2B8抗体连接，所以T2B8缀合物具有上述相同的优点，例如：保留在靶向部位(肿瘤)的放射性核素增加。然而，不同于111In，不能将它用于显象目的，这是因为缺乏与之相关的γ射线所导致的。因此，为减小肿瘤的目的，可以在给予治疗嵌合或90Y标记的抗体之前和/之后将诸如111In这样的诊断用“显象”放射性核素用于确定肿瘤的位置和相对大小。另外，铟标记的抗体能够进行剂量学评价。
随着所用抗体即作为诊断或治疗试剂的不同，其它放射性标记在本领域中是公知的且已经将它们用于相似目的。例如，已经用于临床诊断的放射性核素包括131I、155I、123I、99Tc、67Ga以及111In。另外已经用能够用于靶向疗法的不同放射性核素标记了抗体(Pe irer sz等(1987)-“用于诊断和治疗癌症的单克隆抗体缀合物的应用”(TheUse of monoclonal antibody conjugates for the diagnosis andtreatment of cancer)-《细胞免疫生物学》(Immunol.Cell Biol.)65：111-25)。这些放射性核素包括188Re和186Re以及90Y且在较低程度上是199Au和67Cu。还将I-[131]用于治疗目的。美国专利号5,460,785提供了这类放射性同位素的目录并将该文献引入本文作为参考。
正如在未审公开申请08/475,813、08/475,815和08/478,967中所报导的，给予放射性标记的Y2B8缀合物和未标记的嵌合抗-CD20抗体显著减少了在隐藏有B细胞成淋巴细胞肿瘤的小鼠体内的肿瘤。此外，在人体临床试验中报导在用嵌合抗-CD20抗体输注的淋巴瘤患者体内表现出使B细胞明显衰竭。实际上，近来国家已经宣布了首先由FDA批准的在Rituxan名下的抗癌单克隆抗体嵌合288。因此，已经证实至少一种嵌合抗-CD20抗体在治疗B细胞淋巴瘤的过程中显示出治疗功效。
此外，引入本文作为参考的美国申请顺序号08/475,813中公开了依次给予含有铟标记的或钇标记的鼠单克隆抗体的Rituxan、即一种嵌合抗-CD20。尽管用于这些联合疗法的放射性标记抗体是鼠抗体，但是使用嵌合抗-CD20的起始治疗足以使B细胞群体衰竭，使得HAMA反应降低，由此有利于联合疗法和诊断方案。
因此，就联合免疫疗法而言，鼠抗体特别可以用作诊断试剂。此外，在美国申请08/475,813中证实给予Rituxan后钇标记的抗-CD20抗体的治疗有效剂量足以：(a)清除未被嵌合抗-CD20抗体清除的任何遗留下来的血液B细胞；(b)从淋巴结开始使B细胞衰竭；或(c)从其它组织开始使B细胞衰竭。
因此，放射性标记与癌症疗法的抗体的缀合提供了有价值的临床工具，它们可用于评价这类抗体的潜在治疗功效、产生监测治疗进展的诊断试剂和设计可用于促进嵌合抗体起始杀肿瘤潜能的其它治疗试剂。由于在治疗非何杰金氏淋巴瘤的过程中得到了经证实的抗-CD20抗体的功效且已知淋巴细胞对放射性的敏感性，所以非常有利的是这类治疗抗体可以成为试剂盒形式的商购产品，由此可以将它们方便地用放射性标记进行修饰并在临床环境中将它们直接给予患者。
尽管存在许多用于完成对抗体进行放射性标记的方法和试剂，但是在本领域中缺乏的是按照一种方式将这些试剂置于临床环境中的便利载体，所述的方式即可以方便地产生所述的试剂并将它们在放射性标记明显衰变或因放射性标记出现而破坏抗体前给予患者.使这项有价值的技术商品化的这类便利装置的缺乏可能是由于下来原因所导致的：通过某些公知标记方案证实的结合功效较差且随后在放射性标记步骤后需要对试剂进行柱纯化。开发这类试剂盒中出现的衰变也可能部分是由于预先无法接近纯商品放射性同位素所导致的，所述的纯商品放射性同位素可用于产生有效标记的产品而不需随后的纯化。另一方面，这类试剂盒一般无法得到的原因可能是实际上缺乏已经能够得到批准的抗体或实际上缺乏Rituxan已经达到治疗人体患者淋巴瘤的功效。
例如，正如引入本文作为参考的美国专利4,636,380中所述，在本科学领域一般认为：就发现临床应用的防辐射药物而言，必须耐受长期和冗长的分离和纯化过程。实际上，将未结合的放射性标记注入患者是不理想的。对其它纯化步骤的需求使得在临床设备中加工放射性标记抗体成为不可能，特别是对于既没有仪器又没有时间拉来纯化所拥有的治疗剂的医生来说更是如此。
此外，放射性标记的蛋白质本身可能不稳定，特别是那些通过辐解标记的同位素更是如此、诸如90Y，它们具有与之邻近连接的抗体受到破坏的时间更长的倾向。依次地，这类辐解因缺乏放射性标记和/或与靶抗原的结合减少而导致治疗功效不可靠并可以在变性蛋白质处导致不需要的免疫反应。由于没有在部位上标记和纯化抗体的设备，所以临床医师已经没有选择和安排已经标记的治疗抗体或使它们在部位之外的相关设备上得到标记并在标记后输送以便给予患者。所有这类操作均给标记与给药之间的期限上添加了宝贵的时间，由此为治疗提供了不稳定性，而实际上减少了放射性标记试剂盒在临床环境中的应用。
足以精确地发生在抗体独立纯化步骤前的开发抗体放射性标记试剂盒的其它尝试没有成功。例如，Cytogen近来已经开发了一种用于放射性标记涉及与肿瘤相关的糖蛋白TAG-72的鼠单克隆抗体的商品试剂盒。然而，Cytogen的抗体特别不适于试剂盒制品，这是因为在储存过程中有使颗粒显色的倾向而稍后必须将其通过进一步的过滤步骤除去。此外，Cytogen的抗体因HAMA反应而已经在患者体内产生了不良反应。
其它申请已经要求开发适合于试剂盒形式的放射性标记方案，即不需要独立的纯化步骤(Richardson等(1987)“通常用于111In免疫闪烁显象”的DTPA-标记的抗体试剂盒的最佳化和批量生产(0ptimization and batch production of DTPA-labeled antibodykits for routine use in 111In immunoscintography)-《核医学通讯》(Nuc.Med.Commun.)8：347-356；Chinol和Hnatowich(1987)“用于放射性免疫疗法的发生器产生的钇-[90]”(Generator-produced yttrium-[90])-《核医学杂志》(J.Nucl.Med.)28(9)：1465-1470)。然而，这类方案不能够实现本发明者使用本文所公开的技术方案已经达到的结合水平，本文所公开的技术方案已经达到的结合效率至少为95％。这类结合水平提供了安全性提高的添加的有益效果，即实际上作为低放射结合的结果是不将未结合的标记注入患者。
本发明试剂盒中包含的方案使可能随标记不同而受到约半小时或少至5分钟影响的标记过程加快。此外，本发明的试剂盒方案具有y％以上的标记功效，由此不需要进一步纯化。通过放弃对进一步纯化的需求，为标记的治疗目的保留了放射性标记的半衰期和抗体的完整性。
本申请公开了方便的试剂盒和方法，由此可以放射性标记诊断和治疗抗体并将它们以可再现的、可靠的和便利的方式给予患者。本发明的试剂盒将放射性标记抗体的过程转化成无争辩、无烦恼的标准化过程，该过程非常有利于患者的治疗方案。本试剂盒超过现有技术的优点在于已经确定了标记和给予治疗或诊断用的最佳参数，由此降低了商品的成本。由于本文所述的试剂盒根据特定标记提供了最佳参数，所以为特定标记设计的试剂盒的应用也使解体拆用即将不适宜试剂盒应用特定标记时出现的解体拆用减小到最低限度。避免解体拆用由此还产生了最佳比较功效。此外，各试剂盒中包含的方案和无菌、无致热原的组分使得用户使用更为便利，这是因为避免了对试剂进行无菌性、致热原检测和标记后的纯化。
3.发明概述
本发明包括一种在对患者给药前用于放射性标记诊断和治疗抗体的试剂盒，它包括至少一个(i)装有螯合剂缀合的抗体的小瓶；(ii)装有用于使放射性标记抗体稳定并将其给予患者的配制缓冲液的小瓶；和(iii)放射性标记所述抗体的说明书；其中以这样一种用量和这样一种浓度提供所述小瓶中的成分：即当按照该试剂盒的说明书将小瓶中的成分与足够纯度和活性的放射性标记混合时，在对所述患者给药前不需进一步对所标记的抗体进行纯化。此外，按照试剂盒说明书并使用足够纯度和活性的放射性同位素标记时，这类同位素的结合率可以达到9 5％以上的水平乃至高达98％或98％以上。
在本试剂盒中包含的抗体最优选抗-CD20抗体。以一种与双功能螯合剂结合的方式提供该抗体。优选使该抗体与MX-DTPA缀合，不过，可以使用诸如苯基-或苄基-缀合的DTPA、环己基-DTPA、乙二胺四乙酸(EDTA)衍生物和1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N-四乙酸(DOTA)这样的其它螯合剂。本发明的螯合剂可以是至少为双功能的、即至少具有两个结合位点(至少一个位点用于螯合金属离子而至少一个位点用于偶合蛋白质配体)的任何螯合剂。
随着所用抗体的不同，一般以0.5-30mg/ml、更优选2mg/ml的浓度提供所述的缀合抗体。缀合抗体的体积取决于随放射性标记的不同而变化的最佳标记所需的浓度和用量。然而，以这样的体积和浓度提供所述的缀合抗体以便使用无菌注射器和无菌技术将全部体积加入到反应瓶中。这要求提高再现性和便于应用。本文公开的试剂盒中的所有试剂是无菌和无致热原的且特别用于直接提高从抗体检测到给药的简便性和速度。由于使用了某些标记，所以可以不需要对检测标记功效的需求。
所述试剂盒中特别有利的成分是用于对辐解作用保持稳定并对患者给予放射性标记的缀合抗体的配制缓冲液。这种配制缓冲液是一种药物上可接受的载体，它既用作所标记抗体的稀释剂又用作给药用缓冲液。尽管可以将任何药物上可接受的稀释剂用于对患者给予治疗或诊断抗体，但是本发明的配制缓冲液特别适合于给予放射性标记的抗体。
例如，本发明的配制缓冲液包括诸如人血清清蛋白(HSA)或抗坏血酸这样的防辐射剂，它可将因钇产生的辐解降低到最低限度并将铟产生的辐解减小到较低的程度。其它防辐射剂在本领域中是公知的且也可以将它们用于本发明的配制缓冲液中，即自由基清除剂(苯酚、亚硫酸盐、谷胱甘肽、半胱氨酸、龙胆酸、烟酸、棕榈酸抗坏血酸酯、HOP(：O)H2、甘油、甲醛化次硫酸钠、Na2S2O5、Na2S2O3和SO2等)。
应注意：虽然一般将防辐射剂用于配制缓冲液中以便防止抗体受到辐解的影响，但是通过使反应缓冲液中包含防辐射剂也能够进一步影响保护作用。即在使用HSA前因存在干扰标记过程的金属前一般还没有做到这一点。然而，使用螯合树脂能够“清除”HSA，使得它也能够包含在反应缓冲液中。另外，也需要将抗坏血酸或其它防辐射剂进行处理以便除去污染金属。
本发明的配制缓冲液还包括过量的未缀合的螯合剂。包含未缀合的螯合剂的目的在于这种螯合剂可用于清除患者体内的任何非蛋白质结合的放射性标记并影响放射性标记的分泌，由此减少“亲骨”同位素即90Y被患者的骨吸收。例如，当试剂盒中的抗体与DTPA螯合剂缀合时，过量的DTPA或任何其它的螯合剂可以包含在配制缓冲液中。另外，优选以可将全部内含物转入反应瓶中的体积提供配制缓冲液。如上所述，这导致应用的便利性和再现性提高，因为不必测定和转移确切的体积。
优选的配制缓冲液包括磷酸缓冲盐水或生理盐水、人血清清蛋白和DTPA。优选人血清清蛋白的浓度约为1-25％(w/v)，且更优选浓度约为7.5％(w/v)。DTPA的浓度优选约为1mM。抗坏血酸可以用作人血清清蛋白的替代品且一般使用约1-100mg/ml的浓度。不过，可以使用较宽范围的浓度而不会危害患者的安全。
按照本发明的方法，用选择的放射性同位素经双功能螯合剂方便地标记放射性标记试剂盒中的抗体。为了在这点上实现进一步的简便性，本发明的试剂盒还可以包括装有用于调节放射性同位素溶液pH的小瓶和用于进行标记和随后用于将最终放射性标记的抗体重新悬浮于配制缓冲液中的无茵玻璃反应瓶。10ml反应瓶一般足够，不过，还可以使用能够承载5-20mls的小瓶。所述的缓冲液优选是浓度为10-1000mM、最优选50mM的少量金属乙酸钠溶液。
本发明的特异性试剂盒包括MX-DTPA缀合的抗体2B8-MX-DTPA。2B8是一种经证实在对淋巴瘤患者给药时使B细胞衰竭的抗-CD20抗体。然而，可以将本发明的放射性试剂盒最佳化以便对其它抗-CD20抗体或已经与DTPA或其它多价螯合剂缀合的抗体进行放射性标记，这对本领域技术人员来说应是显而易见的。本发明的优选试剂盒可以包括至少一个(i)装有溶液或冻干形式(需要再溶解)的MX-DTPA缀合的2B8抗体的小瓶；和(ii)装有用于将放射性标记抗体给予患者的配制缓冲液的小瓶。优选的试剂盒还装有(iii)用于调节同位素pH的缓冲液和(iv)反应瓶。另一方面且更优选将所述缓冲液加入反应瓶中，由此不需要测定和转移缓冲液的步骤而增加了简便性、试剂盒成分的紧密性和无菌性；然而，也可以预想到其它实施方案，即由此首先将缓冲液加入到同位素小瓶中且然后将缓冲的同位素转入反应瓶中。在这种情况中，给反应瓶加入所需的抗体体积。另一方面，可以将同位素/缓冲液瓶制成足够大以便容纳所添加的抗体缀合物、即直接加入到供应瓶中的抗体缀合物。这将消除对反应瓶的需求。
如上所述，本发明包括另一种优选的试剂盒结构，其中反应瓶本身装有所需体积的缀合抗体(即就111In和90Y而言分别为1mL或1.5mL)。可以将所述抗体置于可根据特殊所需的同位素提供合适的放射性标记用pH的缓冲液中(即就111In而言pH为3-6，就90Y而言pH为3-5)。可以根据同位素的不同使用不同的缓冲液(即就90Y而言为乙酸钠，就111In而言为柠檬酸钠)。该缓冲液的pH和组成也可以根据所标记的结合配体的性质的不同而改变(即标记肽类可允许使用的pH＜3)。然后必需直接将同位素直接转入反应瓶中作为配制缓冲液。将试剂盒的应用限定到两个转移步骤会进一步提高再现性和简便性并进一步减少操作试剂盒成分过程中无菌性被污染的机会。
本发明的放射性标记试剂盒可以进一步包括装有放射性同位素的小瓶或可以单独从合适的供应商处定购同位素。本发明优选的放射性同位素是氯化111In和氯化90Y的盐酸盐，不过，所公开的方法并不限于这些同位素。已经用于显象用途的其它放射性核素在本领域中是公知的，即正如美国专利4,634,586、5,460,785和5,766,571中所述，将这些文献引入本文作为参考。铟-[111]特别有利于使B细胞肿瘤显象且诸如90Y这样的β发射体特别用作放疗剂。不过，可以根据用于抗体缀合的螯合剂的不同来使用适合于这些或其它目的其它放射性同位素即α发射体。
由于得到了美国申请顺序号08/475,813中所公开的经证实的联合治疗方案的功效，所以其它试剂盒的实施方案还包括装有在放射性标记的抗-CD20抗体之前或之后给予的嵌合抗体即Rituxan的独立小瓶。当在放射性标记的抗体前给予嵌合抗体时，一般可以对给予鼠抗-CD20抗体发生的HAMA反应可以显著减少，由此提高放射性标记的鼠抗体的治疗应用性。此外，当将嵌合抗体用于清除循环的B细胞时，随后用111In-标记的抗体进行的诊断显象可能极为清晰。
可以在联合治疗方案中同时使用诊断用放射性标记抗体和治疗用放射性标记抗体，这也应是显而易见的。在这方面，可以在治疗前后用于目测观察肿瘤大小的治疗用抗体之前或之后使用诊断用抗体。在这种情况中，本发明的试剂盒可以包括独立的(可能是彩色标记的)缓冲液瓶，其中的缓冲液特别按照由所用特殊放射性同位素放射性标记抗体所需的最佳pH配制而成。这类系统会确保将适宜的缓冲液用于各标记并且使临床医师同样易于放射性标记两种抗体，就如同商购两种试剂盒一样。这类试剂盒实际上将来自两种放射性标记试剂盒中的成分合二为
按照合适的浓度和pH提供本发明放射性标记试剂盒中的成分，使得在给予抗体前可方便地维持无菌性且几乎对其它缓冲液或介质没有需求。然而，可以制备某些试剂、使之无菌化并在部位上检测其无菌性，这对本领域技术人员来说应是显而易见的。因此，可以根据消费者的预算和偏爱来预见本发明试剂盒的变化形式。
可以在一种用于放射性标记对患者给予的螯合剂缀合的抗体的方法中使用本发明的放射性标记试剂盒。根据本发明，这类方法一般包括：(i)将螯合剂缀合的抗体与含有放射性标记的溶液混合；(ii)在合适的温度下将所述的混合物培养适当的时间期限；和(iii)用配制缓冲液将标记的抗体稀释成合适的浓度，使得可以将所述的放射性标记的抗体直接对患者进行给药而不需进一步纯化。
最优选所述抗体是抗-CD20抗体，且特别地，所述的抗-CD20抗体可以是2 B8。可以将该抗体与任何合适的螯合剂即MX-DTPA、反式-环己基-二乙烯三胺五乙酸(CHX-DTPA)、苯基-或苄基-DTPA、DOTA、EDTA衍生物等缀合。优选MX-DTPA。用于影响缀合的方法在本领域中是公知的(Kozak等(1989)；Mirzadeh等(1990)，Brachbiel等(1986))。
本发明者已经发现放射性标记螯合剂缀合的抗体的方法作用最佳，其中将含有放射性标记的溶液调节至pH约为3.0-6.0且更优选调节至约为4.2，此后将其与螯合剂缀合的抗体混合。特别优选少量金属乙酸钠来调节pH，不过，可以使用其它缓冲液。优选乙酸钠的浓度约为10-1000mM、且更优选50mM。
当放射性同位素是氯化111In时，用于制备单一给药剂量的氯化111In的体积量一般约为5.5mCi除以标记时的放射性浓度。就对患者给药而言，111In的一般诊断剂量约为2-10mCi。用于调节pH的乙酸钠的量随乙酸钠浓度和同位素载体溶液的不同而改变且由此可以具有很宽的范围。当乙酸钠的浓度为50mM时，调节pH所需的量一般约为所用氯化111In体积量的1.2倍，不过，可以使用较大的体积。应理解乙酸钠与HCl之比是如此重要，且所用的乙酸钠的量随缓冲液中HCl的用量和浓度的不同而改变。然后将约1ml、浓度约为2mg/ml的螯合剂缀合的抗体与放射性标记乙酸盐溶液混合并将该混合物培养约30分钟或足以实现抗体最佳化标记所需的时间。这样的时间可以在约30秒至约60分钟的范围。接着加入必需量的配制缓冲液以便使最终的总体积达到约10ml。
标记抗体所需的最佳时间可以根据所用的抗体、特定放射性标记和特定缀合物的不同而改变。在使提供给放射性标记的时间最佳化中的基本要素是所标记试剂中螯合剂与抗体之比。例如，螯合剂与抗体之比必需足够高以便达到治疗应用的结合水平，即根据放射性同位素的不同为90-95％，但也不必过高而使抗体的结构完整性或免疫反应性受到危害。这就需要一定的平衡过程，在某些情况中，这一平衡过程可以导致缀合螯合剂的浓度较低和标记的时间较长。
例如，就2B8和MX-DTPA而言，已经发现就90Y而言标记可以在5分钟内完成而就111In而言标记可以在约30分钟后完成，从而实现所需的放射性结合水平，其中螯合剂与抗体的摩尔比仅约为11/2-1。由此不必增加螯合剂与抗体之比，因为达到了理想的放射性结合水平。此外，增加缀合螯合剂的量并不有利，因为这会影响抗体的免疫反应性。可以根据经验为用于诸如本发明中所述的那些试剂盒设计的其它抗体测定这类参数。
当放射性同位素是氯化90Y时，用于制备单一给药剂量的氯化90Y的体积量一般在约10-50mCi的范围除以标记时的放射性浓度、且优选约为45mCi除以标记时的放射性浓度。用于调节pH的乙酸钠的量随乙酸钠浓度和同位素载体浓度的不同而改变且由此可以具有相当宽的范围。当乙酸钠的浓度为50mM且将置于50mM HCl中的形式提供90Y时，调节pH所需的量一般约为所用氯化111In体积量的1.2倍。然后将约1.5ml、浓度约为2mg/ml的螯合剂缀合的抗体与放射性标记乙酸盐溶液混合并培养约5分钟或足以实现抗体标记最佳化所需的时间。这样的时间可以在约30秒至约60分钟的范围。加入必需量的配制缓冲液以便使最终的总体积达到约10ml。
优选使用本文所述的放射性标记试剂盒来实施本发明的放射性标记方法。然而，优选的成分和条件仅是用于实施本发明方法可接受的准则，且通过合适的最佳化可以将它们作一定程度的改变，这对本领域技术人员来说应是显而易见的。将不属于那些优选的但仍然可以完成本方法目的的条件看作是本发明的范围内。
本发明的放射性标记试剂盒还可以装有适合于在放射性标记后方便检验抗体缀合亲和力的试剂。在这类情况中，还可以将本发明的试剂盒用于测定放射性标记抗体与其靶细胞的结合百分比，此后将该抗体给予患者。本发明者还发现：可以将所公开的特定结合测定试剂盒用于检测一般对无法获得的纯化抗原的任何抗体的亲和力。因此，还可以将结合测定成分作为独立的试剂盒销售。
一般来说，结合测定和放射性标记试剂盒包括：(i)至少一个装有表达由试剂盒中抗体识别的抗原的冻干细胞的小瓶；(ii)装有螯合剂缀合的抗体的小瓶；(iii)装有配制缓冲液的小瓶；和(iv)用于放射性标记所述抗体的说明书，使得可以将放射性标记的抗体直接给予患者而不需随后的纯化。正如上述对放射性标记试剂盒所述，这种试剂盒还可以包括装有用于调节放射性同位素pH的缓冲液的小瓶和无菌玻璃反应瓶。优选缓冲液是浓度约为10-1000mM的少量金属乙酸钠溶液且玻璃反应瓶中至少要保持5ml的体积。优选抗体是抗-CD20抗体且螯合剂优选是MX-DTPA。可以如上所述使用其它螯合剂。优选的缀合抗体是2B8-MX-DTPA，不过，可以标记任何螯合剂缀合的抗体并评价其亲和力。配制缓冲液是包括如上所述的防辐射剂和未缀合螯合剂的磷酸缓冲盐水，而可以或不可以包括放射性同位素且优选氯化111In或氯化90Y。根据螯合剂的不同可以使用其它放射性同位素。
上述结合测定/放射性标记试剂盒与放射性标记试剂盒之间的差异在于包括用作检测抗体亲和力的底物靶物的抗原阳性细胞。当抗原是CD20时，优选的CD20-阳性细胞是SB细胞(ATCC#CCL 120)，不过，可以使用任何的CD20-阳性细胞。结合测定和放射性标记试剂盒可以进一步包括用作阴性对照的抗原阴性细胞。优选的CD20-阴性细胞是HSB细胞(ATCC#CCL 120.1)，不过，可以使用任何的CD20-阴性细胞。
当然，放射性标记和结合测定联用试剂盒可以进一步包括装有嵌合抗-CD20抗体以及为影响联合治疗方案或在诊断成像前清除外周B细胞的目的而标记的抗体的小瓶。优选这类单独的抗体是Rituxan，不过，它们可以是经证实可完成杀死肿瘤细胞目的的任何抗体。实际上，在一种试剂盒中可以合并两种不同类型的抗体，即针对两种不同B细胞抗原的抗体，条件是联合的治疗方案用于靶向相同类型的细胞即B细胞淋巴瘤。
正如可以将试剂盒中的成分用于标记其它抗体一样，可以根据靶抗原的不同来制备用于检测抗体亲和力的其它细胞。然而，就抗-CD20抗体而言，本发明的结合测定和放射性标记试剂盒特别适合于商品环境，即以冻干形式提供靶细胞。这使得简单或系统地鉴定抗体功效成为可能并取消了涉及维持组织培养设备的烦恼和费用。根据本发明的方法，每瓶中一般装有的冻干细胞为0.5-500×106个细胞的等分部分。
特殊设备会优先选择已经放射性标记的指定抗体，在这种情况中，这类设备可能需要结合测定试剂以便确保抗体保留靶向亲和力。在这种情况中，本发明还提供了一种用于测定放射性标记的抗体与其靶细胞结合百分比的结合测定试剂盒。这类试剂盒包括至少一个装有固定/或冻干抗原阳性细胞的小瓶且可以装有如上对结合测定和放射性标记试剂盒所述的抗原阴性细胞或可以不装有它们。此外，这类试剂盒可以包括用于通过竞争性试验检验消费者抗体结合特异性的未标记的对照抗体。
此外，当抗原是CD20时，优选的CD20-阳性细胞是SB细胞(ATCC#CCL 120)而优选的CD20-阴性细胞是HSB细胞(ATCC#CCL120.1)，它们可以以冻干形式存在于0.5-500×106个细胞的等分部分中。在这种情况中，优选抗体是用111In或90Y标记的2B8的MX-DTPA缀合物。
鉴于本文公开了其它的试剂盒实施方案，所以应强调本发明放射性标记试剂盒和方法的优点之一在于不需要进一步的纯化步骤而可以直接对患者给予放射性标记的抗体，由此节省出了宝贵的时间并提高了抗体的稳定性。因此，需要强调的是：尽管要求临床医师在给药前检测或鉴定放射性标记抗体的结合特异性和亲和力，但是如果抗体稳定性与抑制辐解特别相关、即与铟相关，那么可以放弃这类检测试验而使用特定的放射性同位素。通过提供试剂盒的实施方案而由此可以检测结合亲和力和特异性，本发明者不会以任何方式建议在本发明的方法或试剂盒中绝对需要这类检测试验。检测这类抗体有效性的选择仅是临床医师的选择。
本发明者还发现用于制备本发明结合测定试剂盒所用固定和冻干细胞的方法特别适合于制备商品试剂盒用细胞。可以在冻干前固定细胞以便改善结构/稳定性。特别地，本发明的细胞在用于抗体结合测定试验时表现出高度的再现性。
特别地，本发明包括一种制备冻干细胞的方法，该方法包括下列步骤：(i)通过离心以0.5-2×106个细胞/ml的细胞密度收集细胞；(ii)在平衡盐溶液即HBSS中将细胞至少洗涤一次；(iii)将沉淀的细胞重新悬浮于包括含有载体蛋白和至少一种类型的糖的平衡氧溶液的冻干缓冲液中；(iv)将重新悬浮细胞的等分部分分入微量离心管或玻璃小瓶中；和(v)将约30-60ml(millitor)细胞冻干12-96小时且更优选24-72小时。该方法特别适合于制备冻干细胞，其中所述的细胞是SB细胞(ATCC#CCL 120)或HSB细胞(ATCC#CCL120.1)，不过，也能够用于其它细胞类型。
优选所述的缓冲液一般含有1％(w/v)浓度的胎牛血清作为载体蛋白和10％浓度的甘露糖醇。然而，可以便利地使用其它载体蛋白即HSA和其它糖类。通过以约1300rpm的速度离心来收集细胞并加入盐溶液HBSS(Hank’s平衡盐溶液)。一般以50×106个细胞/ml的浓度重新悬浮细胞。不过，可以对上述条件稍加改变而不会明显危害细胞的存活力，这对本领域技术人员来说应是显而易见的。此外，通过用于对较大量细胞的处理、例如切向流渗滤过程最佳化而将细胞交换入冻干缓冲液的附加步骤可以补充上述条件。
可以将本发明的结合测定试剂盒用于评价放射性标记的抗体的结合亲和力的测定试验中。这类测定试验也是本发明的主题。用于测定放射性标记的抗体与其靶细胞结合百分比的结合测定试验一般包括下列步骤：(i)混合至少一种放射性标记的抗体的等分部分与至少一种抗原阳性细胞的等分部分；(ii)混合至少一种和步骤(i)等分部分相同的放射性标记的抗体的等分部分与至少一种与作为对照的与步骤(i)中抗原阳性细胞等分部分相同体积的稀释缓冲液的等分部分；(iii)通过离心使细胞沉淀；(iv)测定沉淀细胞上清液和对照品中的放射性；和(v)将细胞上清液中放射性的量与对照品中放射性的量进行比较。
正如本发明的放射性标记试剂盒可以含有氯化111In或氯化90Y或可以不含有它们一样，本发明的结合测定试验一般使用用111In或90Y标记的抗体来进行。当111In是放射性标记时，使用γ计数器来测定(measure)检测试管中的放射性。当90Y是标记时，使用闪烁计数器来测定放射性，不过，可以使用γ计数器。
就本发明的结合测定试验而言，优选的抗体是抗-CD20抗体且抗-CD20抗体优选是2B8，其中使用本发明的放射性标记试剂盒标记所述的2B8抗体。然而，可以检测任何放射性标记的抗体，条件是表达特定抗原的细胞可得到。当CD20是抗原时，用于进行本试验的优选细胞是SB细胞(ATCC#CCL 120)，不过，还可以使本试验最佳化并使用任何放射性标记的抗体和合适的靶细胞来进行。
用于本试验的稀释缓冲液应维持抗体即可能含有例如BSA这样的载体蛋白的生理缓冲液的结合以使与细胞的非特异性结合减少到最低限度。尽管将装有稀释缓冲液的试管用作对照，但是使用抗原阴性细胞的其它对照品可以包括在本试验中。在这种情况中，结合测定试验进一步包括下列步骤：(i)混合至少一种放射性标记的抗体的等分部分与至少一种抗原阴性细胞的等分部分；(ii)通过离心使抗原阴性细胞沉淀；(iv)测定抗原阴性细胞上清液中的放射性；和(v)将抗原阴性细胞上清液中放射性的量与抗原阳性细胞上清液和对照品中放射性的量进行比较。将获自该试管的放射性与稀释缓冲液对照品之比用作与抗原阳性细胞非特异性结合的量的测定值。当CD20是抗原且CD20-阳性细胞是SB细胞时，优选的CD20阴性细胞是HSB细胞(ATCC#CCL 120.1)。
如上所述，本发明的冻干细胞为检测放射性标记的抗体的功效提供了一种简便、有效和可再现的标准物。因此，优选使用包括在本发明结合测定试剂盒中的冻干细胞来进行本发明的结合测定试验。此外，可以将本发明的放射性标记测定试验与本发明的结合测定试验合并使用，其中首先如本发明所述用标记螯合剂缀合抗体的方法来标记抗体。最优选使用本文所述结合测定和放射性标记试剂盒之一来进行本发明的结合测定试验。
可能存在一些应检测或鉴定抗体亲和力但尚未连接放射性标记的情况。例如，在某些情况即疑难解答中，在放射性标记前检测抗体的结合亲和力可能是有利的。就这类情况而言，本发明还包括一种用于评价测试抗体与靶细胞亲和力的竞争性结合测定试验，它包括下列步骤：(i)使用公知对相同抗原具有特异性的抗体制备钌标记的对照抗体；(ii)用固定浓度的靶细胞和微量的钌标记的抗体培养增加量的测试抗体和增加量的未标记的对照抗体，其中分别将各单独浓度的测试抗体与各单独浓度的对照抗体置于单独的试管内；(iii)使用0RIGEN仪器、以相对电化学发光(ECL)为基础测定各反应试管内的结合量；和(iv)计算测试抗体的平均亲和力的数值。可以使用Muller的方法(《免疫方法杂志》(J.Immunological Methods)(1980)34：345)或任何其它合适的方法、由EC50值和微量抗体的公知浓度计算平均亲和力数值。应注意还可以将该试验用于检测放射性标记的抗体或针对抗原不能被纯化且需要细胞作为抗原来源的任何抗体的亲和力。可以将本发明的固定化冻干细胞用作靶细胞。
当进行本发明的竞争性结合测定试验以检测抗-CD20抗体的亲和力时，对照抗体可以是2B8或任何其它的未缀合的抗-CD20抗体。对照抗体可以是螯合剂缀合的抗体。测试抗体也可以是对照抗体的螯合剂缀合物。另一方面，测试抗体可以是另一种抗-CD20抗体，它和2B8细胞相比较与CD20的亲和力是令人关注的，然而，本试验适用于具有其它特异性的抗体，条件是可得到合适的靶细胞。
在本发明的竞争性结合测定试验中，优选的靶细胞是CD20-阳性细胞，更优选SB细胞(ATCC#CCL 120)，而更优选按照本发明的方法制备的重新悬浮的冻干SB细胞。也可以使用应用其它方法冻干的细胞或固定的细胞。一般通过包括用钌(II)tris-bypyridine螯合剂的N-羟基琥珀酰亚胺酯(TAG-NHS)培养对照抗体的方法来制备钌标记的抗体，不过，也可以预想到标记抗体的其它公知方法。就标记而言，优选以约1∶15的摩尔比来培养对照抗体与TAG-NHS。
本发明的这些和其它方面可以通过参照下列本发明的附图、实施例和描述来清楚地理解。
4.附图简述
附图1.通过使用125I-标记的B1的放射性免疫测定中的直接竞争而将天然2B8的免疫反应性与商购抗-CD20抗体B1(Coulter)和Leu16(Becton Dickinson)进行比较。将抗原阳性SB细胞(100,000)加入到V&P滤板的各孔中；将10ng的放射性标记的B1与不同浓度的未标记的竞争物混合并将该混合物加入到细胞中。在环境温度下用该细胞将抗体培养1小时；进行一式三份的测定。随后洗涤孔、干燥并测定与滤器相关的放射性。将所列的数据作背景放射性的校正并且是一式三份测定的平均值。
附图2.使用FACS分析对增加量的未缀合2B8分析与人B-细胞(SB)的结合情况。进行与商购抗-CD20单克隆抗体(B1)和与两种无关同型抗体的比较。将山羊抗小鼠IgG-FITC F(ab)’2用作二级试剂。结果表明2B8对CD20抗原具有特异性且它表现出比B1更大的结合力。
附图3.用增加量的125I-标记的2B8培养人B-细胞(SB)。将一式三份样品培养1小时并在过滤收集细胞后测定细胞结合的放射性。斯卡查德分析要求计算表观亲和常数、为4.3×10-9M。
附图4.天然2B8、2B8-MX-DTPA和B1的免疫反应性。如方法部分中所述对B1抗体进行放射性标记。将10纳克的放射性标记的B1与增加浓度的竞争剂混合并将该混合物加入到各含有100,000个抗原阳性SB细胞的V&P滤板的各孔中；所有测定均按一式三份进行。在环境温度下培养1小时后，充分洗涤孔。随后将滤器干燥并用γ计数器测定相关的放射性；将所有的数值作背景校正。所列的数值是一式三份测定的平均值。
附图5.用10mg/mL终浓度的生理盐水或含有10mM甘氨酸-HCl(pH6.8)的生理盐水配制抗体2B8。然后将一式两份一组的样品置于螺口小瓶内，这些小瓶用氮气净化并密封。接着在4℃或30℃下将样品培养12周；每周评价样品的免疫反应性。在整个12周的研究中使用任何的2B8样品均没有观察到免疫反应性的损耗。绘制第1周(附图5A)、第6周(附图5B)和第12周(附图5C)的免疫反应性。
附图6.用于测定在pH7.4的含有50mg/mL人血清清蛋白的PBS中培养(48小时培养)的111In-标记的2B8-MX-DTPA的免疫反应性的结合测定试验。附图6A)用增加体积的SB细胞(20×106个细胞/mL)培养恒定量的放射性标记的抗体(5ng/mL)。将与细胞结合的放射性的量(cpm)对所加入的细胞混悬液的体积作图。附图6B)将总施用的放射性与结合的放射性之比(AT/B)作图。使用线性外推法计算y-截距(0.997)。y-截距的倒数×100得到抗原无限过量下免疫反应性的数值为100％。
附图7.获自对在4℃下、pH7.4的含有75mg/mL人血清清蛋白和1mM DTPA的PBS中培养的90Y-标记的2B8-MX-DTPA的SDS-PAGE分析的放射自显影图.在所指定的时间处，使用非还原条件、变性条件(SDS)在4-20％Tris-甘氨酸凝胶上对样品进行电泳。以5μL(泳道1、2)、10μL(泳道5、6)上样。在环境温度下使凝胶与x-光片接触约15分钟并拍照。
附图8.获自对在4℃下、pH 7.4的含有75mg/mL人血清清蛋白和1mM DTPA的PBS中培养的90Y-标记的2B8-MX-DTPA的SDS-PAGE分析的0时放射自显影图的光密度扫描。使用非还原条件在4-20％Trib-甘氨酸凝胶上对样品进行电泳。以5μL、10μL和20μL将样品加入到一式两份的孔中。在环境温度下使凝胶与x-光片接触约15分钟并使用光密度计扫描泳道之一。放射性标记的缀合峰(#2)的相对面积为96.2％。
附图9.获自对在4℃下、pH7.4的含有75mg/mL人血清清蛋白和1mM DTPA的PBS中培养的90Y-标记的2B8-MX-DTPA的SDS-PAGE分析的48小时放射自显影图的光密度扫描。使用非还原条件在4-20％Tris-甘氨酸凝胶上对样品进行电泳。以5μL、10μL和20μL将样品加入到一式两份的孔中。在环境温度下使凝胶与x-光片接触约15分钟并使用光密度计扫描泳道之一。放射性标记的缀合峰(#2)的相对面积为95.5％。
附图10.获自对在4℃下、pH7.4的含有50mg/mL人血清清蛋白的PBS中培养的111In-标记的2B8-MX-DTPA的SDS-PAGE分析的放射自显影图。在所指定的时间处，使用非还原条件在4-20％Tris-甘氨酸凝胶上对样品进行电泳。以5μL(泳道1、2)、10μL(泳道3、4)和20μL(泳道5、6)上样。在环境温度下使凝胶与x-光片接触约15分钟并拍照。(注意：使用导致信号比0时放射自显影图更强的增感屏获得48小时的放射自显影图)。
附图11.获自对在4℃下、pH7.4的含有50mg/mL人血清清蛋白的PBS中培养的111In-标记的2B8-MX-DTPA的SDS-PAGE分析的0小时放射自显影图的光密度扫描。使用非还原条件在4-20％Tris-甘氨酸凝胶上对样品进行电泳。以5μL、10μL和20μL将样品加入到一式两份的孔中。在环境温度下使凝胶与x-光片接触约15分钟并使用光密度计扫描泳道之一。放射性标记的缀合峰(#3)的相对面积为95.9％。
附图12.获自对在4℃下、pH 7.4的含有50mg/mL人血清清蛋白的PBS中培养的111In-标记的2B8-MX-DTPA的SDS-PAGE分析的48小时放射自显影图的光密度扫描。使用非还原条件在4-20％Tris-甘氨酸凝胶上对样品进行电泳。以5μL、10μL和20μL将样品加入到一式两份的孔中。在环境温度下使凝胶与x-光片接触约15分钟并使用光密度计扫描泳道之一。放射性标记的缀合物的相对面积为97.0％(#2、3和4峰合并面积)。
附图13.获自对在37℃下人血清中培养的90Y-标记的2B8-MX-DTPA的SDS-PAGE分析的放射自显影图。在所指定的时间处，使用非还原条件在4-20％Tris-甘氨酸凝胶上对样品进行电泳。以5μL(泳道1、2)、10μL(泳道3、4)和20μL(泳道5、6)上样。在环境温度下使凝胶与x-光片接触约15分钟并拍照。
附图14.获自对在37℃下人血清中培养的90Y-标记的2B8-MX-DTPA的SDS-PAGE分析的0时放射自显影图的光密度扫描。使用非还原条件在4-20％Tris-甘氨酸凝胶上对样品进行电泳。以5μL、10μL和20μL将样品加入到一式两份的孔中。在环境温度下使凝胶与x-光片接触约15分钟并使用光密度计扫描泳道之一。放射性标记的缀合峰(#2)的相对面积为97.9％。
附图15.获自对在37℃下人血清中培养的90Y-标记的2B8-MX-DTPA的SDS-PAGE分析的98小时放射自显影图的光密度扫描。使用非还原条件在4-20％Tris-甘氨酸凝胶上对样品进行电泳。以5mL、10μL和20μL将样品加入到一式两份的孔中。在环境温度下使凝胶与x-光片接触约15分钟并使用光密度计扫描泳道之一。放射性标记的缀合峰(#2)的相对面积为94.7％。
附图16.获自对在37℃下人血清中培养的111In-标记的2B8-MX-DTPA的SDS-PAGE分析的放射自显影图。在所指定的时间处，使用非还原条件在4-20％Tris-甘氨酸凝胶上对样品进行电泳。以5μL(泳道1、2)、10μL(泳道3、4)和20μL(泳道5、6)上样。在环境温度下使凝胶与x-光片接触约16-20小时并拍照。
附图17.获自对在37℃下人血清中培养的111In-标记的2B8-MX-DTPA的SDS-PAGE分析的0时放射自显影图的光密度扫描。使用非还原条件在4-20％Tris-甘氨酸凝胶上对样品进行电泳。以5μL、10μL和20μL将样品加入到一式两份的孔中。在环境温度下使凝胶与x-光片接触约16-20小时并使用光密度计扫描泳道之一。放射性标记的缀合峰(#3)的相对面积为95.3％。
附图18.获自对在37℃下人血清中培养的111In-标记的2B8-MX-DTPA的SDS-PAGE分析的96小时放射自显影图的光密度扫描。使用非还原条件在4-20％Tris-甘氨酸凝胶上对样品进行电泳。以5μL、10μL和20μL将样品加入到一式两份的孔中。在环境温度下使凝胶与x-光片接触约16-20小时并使用光密度计扫描泳道之一。放射性标记的缀合峰(#3)的相对面积为94.0％。
附图19.每隔48小时给猕猴静脉注射、总计注射7次；列出了给药量。通过使用抗-CD2(T-细胞)、抗-Mo-IgG(2B8)、抗-CD20(Leu 16)和抗人-IgG(B-细胞)进行FACS分析来测定循环T-和B-细胞水平。没有观察到对循环T-细胞水平的影响。(给予V组动物单剂量)。
附图20.在接受2B8的动物体内循环B-细胞水平恢复后使用附图19简述中所述的荧光标记的抗体进行FACS分析。当I在第13天处死II和IV组动物时没有监测到循环B-细胞水平恢复。
附图21.给猕猴静脉注射使用临床级2B8-MXDTPA制备的89Y-2B8-MX-DTPA。每隔48小时给予动物上述所列的计量、总计7种剂量。在第0、2、7、10和14天时对猕猴取血并评价血清化学血液学指标和循环B-细胞水平(不分析第10天血清的B-细胞含量)。除II组中的一个个体外，在研究过程中没有注意到明显的异常，但不包括所有动物体内减少的总淋巴细胞计数。
附图22.通过在第0天单一注射10mg/kg后的ELISA来测定鼠抗-CD2 0抗体2B8从猕猴体内的清除率。正如A组中所示，抗体表现出的βt1/2值约为4.5天。2B8抗体及其MX-DTPA缀合物从BALB/c小鼠循环中的清除率如B组中所示。给小鼠静脉注射25μg的天然或缀合的2B8并在注射后至264小时的不同时间处取血样；随后通过酶免疫测定试验、使用SB细胞作为捕捉剂来分析血清。天然和缀合抗体表现出的清除值为8.75天。
附图23.给20只BALB/c小鼠各注射用pH7.4的含有50mg/mL HSA的PBS配制的1.1μCi放射性标记的缀合物(100μL).在1、24、48和72小时时处死各组中的5只小鼠且然后备好血液和不同组织并分析相关的放射性。
附图24.给20只BALB/c小鼠各静脉注射用pH 7.4的含有75mg/mL人血清清蛋白和1mM DPA的1X PBS配制的约1.0μCi(100μL中)放射性标记的缀合物。在1、24、48和72小时时处死各组中的5只小鼠且然后备好其血液和不同组织并分析相关的放射性。
附图25.给具有Ramos B-细胞肿瘤的无胸腺小鼠静脉注射24μCi的111In-2B8-MX-DTPA并在0、24、48和72小时时处死各组中的3只小鼠。在备好组织和测定相关分放射性后，测定每克组织中注射剂量百分比的数值并如所示绘图。
附图26.用于测定在pH 7.4的含有50-75mg/mL人血清清蛋白的PBS中培养(48小时培养)的“混合与照射”(“mix-&-shoot”)90Y-标记的2B8-MX-DTPA的免疫反应性的结合测定试验。A组：用增加量的SB细胞培养恒定量的90Y-标记的抗体(约1ng/mL)。将与细胞结合的放射性的量(cpm)对细胞浓度作图。B组：将总施用的90Y放射性与结合的放射性之比(AT/B)作图。使用线性外推法计算y-截距(1.139)。y-截距的倒数×100得到抗原无限过量下免疫反应性的数值为87.9％。使用CD20-阴性细胞(HSB)没有观察到结合。
附图27.获自对在4℃下、pH7.4的含有75mg/mL人血清清蛋白和1mM DTPA的PBS中培养的90Y-标记的2B8-MX-DTPA的SDS-PAGE分析的放射自显影图。在所指定的时间处，使用非还原条件、变性条件(SDS)在4-20％Tris-甘氨酸凝胶上对样品进行电泳。以5μL(泳道1、2)、10μL(泳道5、6)上样。在环境温度下使凝胶与x-光片接触约15分钟并拍照。
附图28.获自对在4℃下、pH7.4的含有75mg/mL人血清清蛋白和1mM DTPA的PBS中培养的90Y-标记的2B8-MX-DTPA的SDS-PAGE分析的0时放射自显影图的光密度扫描。使用非还原条件在4-20％Trib-甘氨酸凝胶上对样品进行电泳。以5μL、10μL和20μL将样品加入到一式两份的孔中。在环境温度下使凝胶与x-光片接触约15分钟并使用光密度计扫描泳道之一。放射性标记的缀合峰(#2)的相对面积为96.1％。
附图29.获自对在4℃下、pH7.4的含有75mg/mL人血清清蛋白和1mM DTPA的PBS中培养的90Y-标记的2B8-MX-DTPA的SDS-PAGE分析的48小时放射自显影图的光密度扫描。使用非还原条件在4-20％Tris-甘氨酸凝胶上对样品进行电泳。以5μL、10μL和20μL将样品加入到一式两份的孔中。在环境温度下使凝胶与x-光片接触约1 5分钟并使用光密度计扫描泳道之一。放射性标记的缀合峰(#2)的相对面积为94.1％。
附图30.获自对在37℃下人血清中培养的“混合与照射”(“mix-&-shoot”)90Y-标记的2B8-MX-DTPA的SDS-PAGE分析的放射自显影图。在所指定的时间处，使用非还原条件在4-20％Tris-甘氨酸凝胶上对样品进行电泳。以5μL(泳道1、2)、10μL(泳道3、4)和20μL(泳道5、6)上样。在环境温度下使凝胶与x-光片接触约15分钟并拍照。
附图31.获自对在37℃下人血清中培养的“混合与照射”(“mix-&-shoot”)90Y-标记的2B8-MX-DTPA的SDS-PAGE分析的0时放射自显影图的光密度扫描。使用非还原条件在4-20％Tri s-甘氨酸凝胶上对样品进行电泳。以5μL、10μL和20μL将样品加入到一式两份的孔中。在环境温度下使凝胶与x-光片接触约15分钟并扫描泳道之一。放射性标记的缀合峰(#2)的相对面积为89.1％。
附图31.获自对在37℃下人血清中培养“混合与照射”(“mix-&-shoot”)90Y-标记的2B8-MX-DTPA的SDS-PAGE分析的72小时放射自显影图的光密度扫描。使用非还原条件在4-20％Tris-甘氨酸凝胶上对样品进行电泳。以5μL、10μL和20μL将样品加入到一式两份的孔中。在环境温度下使凝胶与x-光片接触约1 5分钟并扫描泳道之一。放射性标记的缀合峰(#2)的相对面积为88.8％.
附图33.给20只BALB/c小鼠各静脉注射用pH 7.4的含有75mg/mL HSA的1X PBS配制的5μCi90Y标记的2B8-MX-DTPA。在1、24、48和72小时时处死各组中的5只小鼠且然后备好血液和不同组织并分析相关的放射性。
附图34.用固定浓度的新近收集的CD20-阳性B-细胞(SB)或CD20-阴性T-细胞(HSB)培养所标记的增加量的CHO衍生的2B8抗体。如本文所述使用应用山羊抗小鼠IgG-FITC F(ab)’2的FACS分析对与细胞结合的抗体进行定量。与无关同型抗体(S004)进行比较。仅来源于CHO的2B8抗体在任何情况下均表现出与CD20-阳性SB细胞的显著结合。
附图35.将来源于CHO的2B8的免疫反应性与通过ORIGEN试验中的直接竞争而在杂交瘤细胞系中产生的2B8-49亲代抗体进行比较。用固定浓度的CD20-阳性B-细胞(SB)和微量的钌标记的CHO 2B8培养增加量的抗体。在环境温度下培养3小时后，如材料和方法中所述使用ORIGEN仪器测定结合情况，将其表示为相对电化学发光(ECL)。数值代表一式两份测定的平均值。将CHO 2B8和2B8-49的平均亲和常数分别计算为1.3×10-10M和2.5×10-10M。在比较中包括无关同型抗体(S004)。
附图36.将由来源于CHO的2B8制备的2B8-MX-DTPA缀合物的结合情况与通过ORIGEN试验中的直接竞争产生的未缀合的抗体进行比较。在除去未反应的螯合物前通过用MX-DTPA将2B8培养8、17和24小时来制备缀合物。为了进行结合评价，用固定浓度的CD20-阳性B-细胞(SB)和微量的钌标记的CHO 2B8培养抗体。在环境温度下培养3小时后，如材料和方法中所述使用ORIGEN仪器测定结合情况，将其表示为相对电化学发光(ECL)。数值代表一式两份测定的平均值。缀合物制备物表现出与未缀合2B8抗体相似的结合能力。
附图37.A)洗涤SB细胞并用稀释缓冲液(pH7.4的含有1％(w/v)牛血清清蛋白的1×PBS)将其重新悬浮至90×106个细胞/mL。用使用批号为0165A的2B8-MX-DTPA制备的7.5ng/mL In2B8将增加浓度的细胞培养3小时。B)细胞浓度与结合的放射性/总放射性(B/AT)的双向可逆图。将免疫反应性计算为1/y-截距×100。免疫反应性和相关系数(R)的数值分别为80.6％和0.981。
附图38.A)洗涤SB细胞并用稀释缓冲液(pH7.4的含有1％(w/v)牛血清清蛋白的1×PBS)将其重新悬浮至90×106个细胞/mL。用使用批号为0165A的2B8-MX-DTPA制备的2ng/mL Y2B8将增加浓度的细胞培养3小时。B)细胞浓度与结合的放射性/总放射性(B/AT)的双向可逆图。将免疫反应性计算为1/y-截距×100。免疫反应性和相关系数(R)的数值分别为72.2％和0.999。
5.发明详述
定义
除非另有说明，本文所用的全部技术和科学术语与对本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的含义相同。尽管可以将与本文所述相似或相同的任何方法和材料用于实施或检测本发明，但是描述了优选的方法和材料。为了本发明的目的，如下定义下列术语。
少量金属-指的是为将金属污染减小到不影响放射性结合的水平而处理的试剂。
抗原阳性-指的是以抗体能够结合的方式表达由本发明特定抗体识别的抗原。
放射性结合％-指的是来自放射性标记反应的与抗体缀合的放射性标记的量与起始加入到反应中的放射性标记的总量之比。
结合％-指的是来自与具有或不具有特异性的靶抗原结合的样品的抗体量。
免疫反应性或结合特异性的％-指的是与具有特异性的靶抗原结合的抗体样品的量。
诊断抗体-指的是与诸如(such us)111I这样可以影响肿瘤和抗原阳性细胞诊断显象的放射性标记缀合的抗体。
治疗抗体-指的是与在与靶抗原结合时可以对杀死细胞产生影响的α或β发射放射性标记(诸如90Y)缀合的抗体。
本发明的描述
鼠单克隆抗-CD20抗体2B8、缀合的2B8、111In和90Y标记的2B8的前
期临床研发
I.用于开发鼠单克隆抗-CD20抗体2B8、缀合物2B8-MX-DTPA、111In标记的2B8-MX-DTPA和HPLC-纯化的90Y-MX-DTPA的材料和方法
A.
材料
1.
细胞
人细胞系SB和HSB获自美国典型培养物保藏中心并将其在含有10％胎牛血清的RPMI-1640中培养。CD20-阳性SB细胞系是来源于患有急性成淋巴细胞白血病的患者的外周血沉棕黄层的B类淋巴母细胞细胞系(1)。抗原阴性细胞细胞系HSB是由新生金黄仓鼠中诱发的肿瘤发育而来的T类淋巴母细胞细胞系(2)。类似地在含有10％胎牛血清的RPMI-1640中维持鼠骨髓瘤细胞系SP2/0。
2.
抗体
抗-CD20抗体B1和Leu 16分别商购自Coulter Immunology和Becton/Dickinson。125I-标记的山羊抗小鼠IgG和山羊抗人IgG抗体获自ICN。山羊F(ab’)2抗小鼠IgG获自Cappel。
3.
试剂
弗氏完全和不完全佐剂商购自Sigma Chemical Company。聚乙二醇、HAT浓缩物和HT浓缩物均获自Boehringer Mannheim。异硫氰酸荧光素(FITC)商购自Sigma Chemical Company。氯化铟-[111]和氯化90Y获自Amersham或NEN Dupont。氯化钇-[89]商购自AldrichChemical Company。所有其它试剂获自标准来源。
将用于缀合和放射性标记方案的试剂进行处理以便除去可在放射性标记步骤中与放射性同位素一起竞争的污染性重金属离子。一般通过使所述溶液过Chelex 100离子交换树脂柱(BioRad Industries)或通过向所制备溶液中加入Chelex 100进行批量处理来处理试剂。将含有少量金属的水、Milli-Q-纯化的或冲洗用水(WFIr)用于所有制备和稀释步骤中。将不含金属的溶液进行无菌过滤并将其收集在无菌塑料容器内。
B.
方法
1.
通过RIA生产和筛选2B8杂交瘤上清液
给10只BALB/c小鼠免疫接种悬浮于含有弗氏完全佐剂的PBS中的2000万个SB细胞。将该细胞经皮下和腹膜内注入动物的多个部位。在2周的静止期限后，第二次给小鼠注射在附氏不完全佐剂中乳化的SB细胞。随后进行加强免疫接种、方案为每周接种悬浮于PBS中的SB细胞。给小鼠免疫接种6周至4个月的期限。
每次通过脱颈椎处死2只动物并摘除其脾脏以便与鼠骨髓瘤SP2/0融合。以免疫后血清有效抑制放射性标记Coulter B1抗-CD20抗体与人SB细胞结合的能力为基础选择动物。在每次融合前3天对所选择的动物给予最后一次静脉(尾静脉)注射PBS中的2000万个SB细胞。在处死时，在无菌条件下摘除脾脏并以5∶1的比例使脾细胞与SP2/0细胞融合(脾细胞：SP2/0)。在组织培养基中洗涤融合的细胞并使其分布入含有HAT选择培养基的96孔平板中。在10-14天后通过使用Coulter B1抗-CD20抗体的抑制放射性免疫测定试验来筛选杂交瘤。
使用建立的放射性免疫测定法来完成对杂种分泌-CD20抗体的筛选。简单地说，通过蛋白质A亲和层析来纯化Coulter B1抗-CD20抗体。按照制造商的步骤，在有碘珠(Iodobeads)(Pierce ChemicalCo.)存在的情况下通过简短氧化使50毫克纯化的抗体与125I偶联。将放射性标记的抗体在安伯来特树脂上脱盐并保存在稀释缓冲液(PBS，pH7.4，含有0.2％明胶、0.02％叠氮化钠和1.0％BSA)中。将10纳克的放射性标记的抗体与50μL来自测试孔的杂交瘤上清液一起置于预先封闭的过滤试验平板的各孔中(封闭缓冲液：含有10％FBS的稀释缓冲液)并将100,000个SB细胞悬浮于50μL稀释缓冲液中。在环境温度下将混悬液培养1小时。在V&P Scientific真空歧管上用洗涤缓冲液(PBS，pH7.4，含有0.2％明胶和0.02％叠氮化钠)充分洗涤平板并将装有俘获的SB细胞的滤器底部移入γ计数器中。将仅含有HAT培养基和标记的B1抗体的孔用作背景对照并将含有SB细胞的相同的孔用作阳性对照。抑制对照品中含有放射性标记的B1和2μg-2ng范围内不同量的未标记的B1抗体。
2.
流式细胞术研究
a
.细胞系
使用来自2B8杂交瘤培养物的上清液进行初步流式细胞术研究。在环境温度下用SB细胞将100微升的杂交瘤上清液培养1小时；随后加入按1/400稀释使用的二次抗体(山羊F(ab’)2抗小鼠IgG；Cappel)并在暗处将培养持续进行1小时。将细胞洗涤5次。对照品中含有仅从其中测定自身荧光的细胞(没有初次或二次抗体)、仅具有二次抗体以测定非特异性结合的细胞和用作CD20群体对照的商购异硫氰酸荧光素缀合的B1(B1-FITC)。
就某些实验而言，通过使氨基与异硫氰酸荧光素(FITC)反应使荧光素与纯化的2B8抗体偶联。简单地说，在含有150-200μgFITC/mg蛋白质的0.1M、pH9.5的碳酸钠缓冲液中培养2B8抗体(1.2mg/mL)。在室温下将该溶液培养2小时并在Sephadex G25柱上纯化所得的2B8-FITC缀合物。诸如B1和Leu 16这样在这些研究中所用作为荧光素缀合物的其它试剂直接商购自Coulter或Becton Dickinson。
收集所分析的细胞并用含有0.2％BSA和0.1％叠氮化钠的PBS洗涤3次。因要求存活率＞90％而通过锥虫蓝排除法测定存活率。通过将50μL添加到96孔U形底平板中而将细胞浓度调节至3百万/mL。在环境温度下将初次抗体(50μL)加入到合适的孔中并将该混合物培养30分钟至1小时；随后用200μL/孔的含有0.2％BSA和0.02％叠氮化钠的PBS将细胞洗涤5次。在Sorvall离心机中以1300RPM将平板内的细胞离心1分钟并通过缓慢“轻弹”平板而除去上清液。如果需要，加入二次抗体并在环境温度下和暗处再培养30分钟至1小时；然后如上所述洗涤孔。最终，将200μL的固定缓冲液(含有1％的低聚甲醛的0.15M氯化钠，pH7.4)加入到各样品中并将经处理的细胞转入12×75mm的分析用试管内。
b.
来自猕猴的全血
在除去血浆后，通过离心和重新悬浮于HBSS中将细胞洗涤2次。加入胎牛血清(2mL)并重新悬浮细胞。然后使100微升重新悬浮的细胞分布入6、15ml的圆锥形离心管内。加入如下荧光标记的单克隆抗体：
试管#1：鼠抗-CD20-FITC(AMAC)，2.5μg/mL，5μg；
试管#2：山羊抗-人IGM-FITC(Fisher)，2.5μg/mL，5μg；
试管#3：山羊抗-小鼠IgG-RPE(Fisher)，2.5μg/mL，5μg；
试管#4：山羊抗-人-IgM-FITC+山羊抗-小鼠IgG-RPE(吸收的)，2.5μg/mL，5μg；
试管#5：抗-人CD20-FITα抗-Leu 16，Becton Dickinson)，5μg；
试管#6：仅有细胞(自身荧光)。
以1500rpm将标记的抗体和细胞离心2分钟以混合细胞和抗体且然后将全部6个样品置于冰上并培养30分钟。随后从冰中取出试管并将裂解缓冲液(预热至37℃)加入至体积为12mL。接着将样品在室温下培养15分钟、在4℃下以1500rpm离心5分钟并除去上清液。接下来将细胞沉淀在标记缓冲液(含有1％BSA和0.05％叠氮化钠的PBS)中洗涤两次。
随后通过在每支试管内添加0.5mL固定缓冲液(含有1％低聚甲醛的0.15M氯化钠，pH7.4)使细胞固定并在Becton DickinsonFACScan仪器上使用自动补偿和用Calibrite珠预校准来进行分析。以FL1模式测定来自荧光素的绿色荧光并以FL2模式测定来自phycoeretherin的红色荧光。以对数形式表示数据。开始通过点区位图(dot plot bitmap)内的前向与直角光散射来鉴定存活的淋巴细胞群体。然后通过开启所有其它项目来分离总淋巴细胞群体。随后荧光测定值仅反映出门控区内发生的那些特殊情况。
为了进行高剂量药理/毒理研究，对各猕猴测定研究前期的淋巴细胞水平并用作基线值。计算T-细胞与B-细胞之比的百分比并用作消耗参考值。根据Leu 16和抗人IgM抗体来计算研究前期的B细胞群体。
在将2B8注入猕猴后，当用2B8饱和CD20时，使用山羊抗人IgM-FITC、抗小鼠IgG-RPE和含有这两种标记的双重染色群体粗略估计总群体中B细胞的百分比。将双重染色群体用于定量，直到将全部2B8从动物外周血液中清除为止。使用抗-CD2-FITC估计总淋巴细胞群体中T细胞的百分比。由3份使用各样品进行的10,000个实例的测定值求数据的平均值。随后估计来自各指定血样的细胞，从而在每种情况中计算总淋巴细胞群体内的T-和B-细胞亚群。还检测了T∶B之比。就各猕猴个体而言，将B-细胞的消耗率计算为B-细胞的减少量占原始B-细胞量的百分比。
3.
CD20的放射性碘化和免疫沉淀
在用125I和碘珠(Iodobeads)(Pierce Chemical Co.)进行表面碘化后将1亿个SB细胞分成两个相等的部分。通过离心反复洗涤细胞，直到上清液中的放射性水平恢复到背景值为止。将100微克的2B8或B1(Coulter Immunology)抗体加入到标记的B细胞的两个样品中。将抗体和SB细胞培养过夜且然后通过离心洗涤3次，直到除去所有未结合的抗体为止。接着裂解含有结合2B8和B1的细胞沉淀并通过添加1％NP-40去污剂的0.1M、pH8.0的Tris-HCl溶液对所述细胞沉淀进行提取，随后在室温下将其培养1小时。在离心管内以高速将提取物离心30分钟并将上清液转入新试管中。向各试管内加入蛋白质A-琼脂糖(300μL)并通过离心沉淀树脂。然后将蛋白质A-琼脂糖洗涤20次以便除去非特异性结合的碘化蛋白质。当珠与上清液的放射性之比达到数值为100时，用SDS PAGE样品缓冲液提取沉淀并加热至沸腾。在冷却后，将约15,000cpm的各提取物加热到10％聚丙烯酰胺凝胶的孔内。将低分子量预染色的标准物(BioRad Inc.)加入到各孔中并用于估计分子量。通过电泳使蛋白质再溶解并将凝胶干燥且在-70℃下与X光片接触24小时；随后使胶片显影并进行分析。
4.
2B8结合的斯卡查德分析
通过斯卡查德分析评价纯化2B8的表观亲和力。通过在有碘珠(Iodobeads)存在的情况下与125I反应来制备放射性标记的2B8。在除去游离的碘后，用10,000个SB细胞以5000ng/孔-35ng/孔范围内的不同浓度培养所述放射性标记的抗体、一式两份。根据125I标记的2B8的比活性来计算与细胞结合的抗体的量。将结合/游离抗体之比对结合抗体的摩尔浓度作图并根据X和Y轴截距之比确定表观亲和常数。
5.
2B8-MX-DTPA的制备
a.
MX-DTPA的来源
为了进行某些前期临床研究，由Otto.Gansow博士在NationalInstitute of Health提供为干燥固体的碳-14-标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)并将其在4℃下干燥避光保存。用Milli-Q水制备螯合物的储备溶液并通过估计放射性和使用该化合物的比活性来测定浓度。储备溶液一般为2-5mM并将其储存在-70℃下的聚丙烯试管内。为了进行其它研究，MX-DTPA作为其二钠盐的水溶液获自Coulter Immunology并将其储存在-70℃下。
b.
不含金属条件的维持
除使用不含金属的试剂外，还对全部试剂进行处理以便将金属污染的可能性减小到最低限度。如果可能，使用聚丙烯塑料容器诸如烧瓶、烧杯和刻度量筒。将它们用Alconox洗涤并在使用前用Milli-Q水彻底冲洗。此外，将不含金属的吸量管尖(BioRad)用于精确操作小体积。为了操作较大体积的试剂，使用无菌塑料血清吸量管(可得到的是1-25mL大小)。反应便利地在螺旋塞聚丙烯离心管(SardftedtIndustries；1.5mL容量)或聚丙烯锥形管(Costar；15mL和50μL)中进行。当通过管进行透析操作时，带上预先用Milli-Q水冲洗过的外科手术用一次性手套。
c.
抗体的制备
开始从腹水中通过蛋白质A和QAE层析纯化鼠抗-CD20抗体2B8。为了进行后期实验，使用相同的纯化过程从中孔纤维生物反应器的上清液中纯化2B8。为了商业化目的，目前已经用实施例2中所述的来源于CHO的抗体替代了中空纤维衍生的抗体。
通过将抗体转入不含金属的含有150mM NaCl的50mM N-二甘氨酸-NaOH(pH8.6)中、使用透析或反复的缓冲液交换来制备抗体以用于缀合。在某些研究中，使用应用Centricon 30(Amicon)旋转滤器(30,000D MWCO)的反复超滤来进行缓冲液交换。一般来说，将50-200μL蛋白质(10mg/mL)加入到滤器装置上并加入2mL的N-二甘氨酸缓冲液。在4℃下的Sorval SS-34旋筒内以6,000rpm将滤器离心45分钟。存留的体积约为50-100μL。用相同滤器将该过程重复两次。将存留物转入1.5mL的螺旋塞聚丙烯试管内、检测蛋白质、稀释成10.0mg/mL并在4℃下保存至用于缀合为止。为了进行某些研究，使用与上述相同的方案将蛋白质转入含有150mM NaCl和0.05％叠氮化钠的pH5.5的50mM柠檬酸钠中。
d.缀合方案
在环境温度下，在聚丙烯试管内进行2B8与MX-DTPA的缀合。在使用前立即使MX-DTPA的冷冻储备溶液融化。一般来说，按照螯合物与蛋白质的摩尔比为4∶1的比例使10mg/mL的50-200μL抗体与螯合物反应。通过添加螯合物储备溶液并缓慢混合启动反应；在环境温度下使缀合过程进行过夜，一般为14-20小时。如上所述，通过透析或反复超滤入含有0.05％叠氮化钠的不含金属的生理盐水(0.9％w/v)而从缀合物中除去未反应的螯合物。将蛋白质浓度调节至10mg/mL并在4℃下的聚丙烯试管内保存至被放射性标记为止。
e.
螯合物结合率的测定
通过闪烁计数并将使用纯化缀合物获得的数值与碳-[14]-标记的螯合物的比活性进行比较来测定螯合物的结合率。为了进行使用获自Coulter Immunology的非放射性螯合物的后期研究，通过用公知浓度和比活性的90Y的过量放射性载体溶液培养所述缀合物来估计螯合物的结合率。
简单地说，在不含金属的0.05N HCl中制备公知浓度的氯化钇储备溶液，向其中加入不含载体的90Y(氯化物盐)。通过液体闪烁计数来分析该溶液的等分部分以便确定对这种试剂的准确比活性。将等于预计与抗体(一般为2mol/mol抗体)结合的螯合物摩尔数3倍的氯化钇试剂的体积加入到聚丙烯试管内并用2M乙酸钠将pH调节至4.0-4.5。随后加入缀合的抗体并在环境温度下将该混合物培养15-30分钟。通过加入20mM EDTA至终浓度为1mM使反应骤停并用2M乙酸钠将该溶液的pH调节至约为pH6。
在培养5分钟后，如下所述通过高性能大小排阻层析来纯化全部体积。合并含蛋白质的洗脱的级分、测定蛋白质浓度并检测等分部分的放射性。使用氯化90Y制备物的比活性和蛋白质浓度来计算螯合物的结合率。
f.
2B8-MX-DTPA的免疫反应性
使用全细胞ELISA评价缀合的2B8的免疫反应性。通过离心从培养物中收集对数中期的SB细胞并用1×HBSS洗涤两次。在HBSS中将细胞稀释成1-2×106个细胞/mL并以50,000-100,000个细胞/孔等分入96孔聚苯乙烯微升平板。在40-45℃下的真空中将该平板干燥2小时以便使细胞固定在塑料上。在-20℃下将平板保存至使用为止。为了进行检测，在使用前立即将该平板温至环境温度，然后用含有1％BSA的pH7.2-7.4的1×PBS封闭(2小时)。在1×PBS/1％BSA中稀释检测用样品、将其施用在平板上并连续稀释(1∶2)入相同的缓冲液中。在环境温度下将平板培养1小时后，用1×PBS将该平板洗涤3次。将二次抗体(山羊抗小鼠IgG1-特异性HRP缀合物)(50μL)加入到孔中(在1×PBS/1％BSA中按1∶1500稀释)并在环境温度下培养1小时。用1×PBS将平板洗涤4次，随后添加ABTS底物溶液(含有0.01％ABTS和0.001％H2O2的pH 4.5的50mM柠檬酸钠)。在培养15-30分钟后在405nm处对平板读数。在检测试验中包括抗原阴性HSB细胞以监测非特异性结合。通过将吸收度数值与相应稀释因子作图并比较它们与使用在相同平板上检测的天然抗体(代表100％免疫反应性)所获得的数值来计算缀合物的免疫反应性。比较滴定分布图的线性部分上的几个数值并确定平均值。
g.
天然2B8和2B8-MX-DTPA的体外稳定性
为了进行这种对抗体和缀合物稳定性的12周评价，在生理盐水或含有10mM、pH6.8甘氨酸-HCl的生理盐水中配制2B8抗体和2B8-MX-DTPA的等分部分。在4℃和30℃下培养一式两份一组的样品并使用下列方法每周检测样品：SDS-PAGE(还原和非还原)；通过全细胞酶免疫测定试验、使用SB(抗原阳性)或HSB(抗原阴性)细胞作为俘获物测定的免疫反应性；和等电聚焦凝胶电泳(pH范围3-10)。此外，通过用90Y放射性标记缀合物并通过SDS-PAGE和放射自显影分析分析产物而在第4、第8和第12周时评价所述缀合物的放射性标记功效。最后，在单独的研究中，用111In放射性标记在4℃和30℃下培养10周的2B8-MX-DTPA的等分部分并如下所述在BALB/c小鼠体内的生物分布研究中进行评价。
h.
免疫组织学研究
由IMPATH实验室应用用丙酮固定的人体组织部分来进行使用天然和缀合(2B8-MX-DTPA)抗体的免疫组织学研究。通过蛋白质A和Q琼脂糖上的层析从中孔纤维生物反应器的上清液中纯化抗体。按照上述方案、使用来自Coulter Immunology的MX-DTPA来制备临床级缀合物。
i.
放射性标记的2B8-MX-DTPA的体外免疫反应性
为了进行某些实验，使用用于未标记的2B8-MX-DTPA的全细胞ELISA方案。在后期的实验中，使用由Lindmo所述的改型全细胞结合测定试验来测定111In和90Y-标记的缀合物(各自在IDECPharmaceuticals或可选择在MPI Pharmacy Services，Inc.制备)的免疫反应性(3)。简单地说，将增加浓度的对数中期抗原阳性SB细胞或抗原阴性HSB细胞[在稀释缓冲液(含有1％BSA、0.1％明胶和0.02％叠氮化钠的pH7.4的PBS)中的20-30×106个细胞/mL]加入到一式两份一组的试管内。用稀释缓冲液将放射性标记的缀合物稀释成1-5ng/mL的最终抗体浓度并向各试管内加入0.35mL。在环境温度下培养90分钟的期限后，通过离心使细胞沉淀并收集上清液。用γ或闪烁计数器测定上清液级分中存留的放射性。将数据绘制成所添加的总放射性除以与细胞相关的放射性得到的商数与每支试管内细胞数量倒数之间关系的示意图。y轴截距由此代表免疫反应级分。
j.
放射性标记的2B8-MX-DTPA在人血清中的体外稳定性
在3 7℃下通过在人血清中培养96小时来评价111In-和90Y-标记的2B8-MX-DTPA的体外稳定性。制备缀合抗体并如上所述用111In(“混合与照射”(“mix-and-shoot”)方案)和90Y进行放射性标记。111In和90Y-标记的缀合物的比活性分别为2.5和14.6mCi/mg；将放射性标记的缀合物悬浮于含有75mg/mL人血清清蛋白(BSA)和1mM DTPA(钇标记的缀合物)的缓冲液或含有50mg/mL HSA(铟标记的缀合物)的缓冲液中。用正常人血清(非加热失活的)按1∶10稀释放射性标记的缀合物并以无菌方式将等分部分置于无菌密封试管内；然后在37℃下将这些试管培养达96小时的期限。在所选择的时间处取出样品并通过4-20％梯度凝胶中的非还原SDS-PAGE、随后通过放射自显影术并通过瞬时薄层层析对其进行分析。
k.
临床配制的 111 In-2B8-MX-DTPA的体外稳定性
用111In对2B8-MX-DTPA缀合物进行放射性标记且不使用HPLC纯化(“混合与照射”(“mix-and-shoot”)方案)。将放射性标记的抗体稀释入PBS并加入人血清清蛋白(HSA)至终浓度为50mg/mL。所配制的放射性标记的缀合物的比活性为2.2mCi/mg。随后在4℃下将所配制的缀合物培养48小时并使用4-20％梯度凝胶中的非还原SDS-PAGE、随后通过放射自显影术并通过瞬时薄层层析在0、24小时和48小时时分析样品的等分部分。使用上述部分1中所述的全细胞悬浮测定法来评价各时间点处的免疫反应性。
1.
临床配制的 90 Y-2B8-MX-DTPA的体外稳定性
用90Y对2B8-MX-DTPA缀合物进行放射性标记并通过HPLC上的大小排阻层析、使用1×PBS作为洗脱缓冲液进行纯化。收集放射性标记的缀合物级分并将人血清清蛋白和DTPA加入至终浓度分别为75mg/mL和1mM。所配制的放射性标记的缀合物的比活性为14.6mCi/mg。随后在4℃下将所配制的缀合物培养48小时并使用4-20％梯度凝胶中的非还原SDS-PAGE、随后通过放射自显影术并通过瞬时薄层层析在0、24小时和48小时时分析样品的等分部分。使用上述部分1中所述的全细胞悬浮测定法来评价各时间点处的免疫反应性。
2.
动物研究
a.
使用2B8进行的灵长类高剂量药理学/毒理学研究
在White Sands Research Center的GLP调节下进行的高剂量药理学研究中评价抗体2B8(研究号920111)。使用成年
Macaca fascicularis(猕猴)猴；研究组各由一只雄性和一只雌性猕猴组成。每隔48小时静脉注射一次抗体、总计进行7次注射。本研究由5个组组成：I组(盐水)；II组(0.6mg/kg)；III组(2.5mg/kg)；IV组(10mg/kg)；和V组(仅在第0天时10mg/kg)。
在开始本研究前，从全部10只动物中取血并将其用于测定试剂背景值和起始B细胞群体。随后在每次注射抗体前吸取全部血样。在第13天时处死III组和IV组动物用于完全尸检和组织病理学分析。
在第0、1、37、13、21、37和52天时对I、II和V组动物取血；将约5mL全血吸取入肝素化试管。在4℃下保存全血并在24小时内分析。以2000rpm将来自各动物的血液离心5分钟并取出上清液血浆用于通过RIA检测血清2B8水平(参见用于特殊测定法的RIA步骤)。将含有PBLs和RBCs的沉淀的物质重新悬浮于FCS中以用于FACS分析。
b.
使用2B8和2B8-MX-DTPA的药代动力学研究
使用V组动物(上述)测定猕猴体内2B8的平均血清β半衰期。在pH9.6的10mM硼酸盐缓冲液中将山羊抗小鼠IgGl(FisherScientific)稀释成2.0μg/ml并将50μL加入到96孔平板的各孔中。在4℃下的过夜培养或在环境温度下培养2小时的过程中使抗体与平板结合。在环境温度下用150μL/含有1％BSA的PBS的孔将各平板封闭30分钟。用蒸馏水洗涤平板并在开始以1∶100的稀释度、随后依次以1∶2的稀释度将血清或血浆样品加入各孔、一式三份。加入纯化的2B8以便预先取血清并稀释而作为在以0.5mg/mL开始的标准曲线中使用；按1∶100稀释样品且然后在使用其它样品时顺序稀释。在环境温度下将平板培养1小时并用蒸馏水洗涤4次。接着按1∶4000的稀释度添加二次试剂(山羊抗小鼠IgGl-HRPO)并在环境温度下再培养1小时。用蒸馏水再次洗涤平板并加入含有过氧化氢的0.1mL过氧化物酶底物。根据反应显色20分钟；随后使用微量平板ELISA读数器在405nm处测定吸收度。按照μg抗体/mL血清将结果绘图。
此外，测定BALB/c小鼠体内的2B8和2B8-MX-DTPSA的β1/2数值。使在-70℃下pH7.4的1×PBS/10％甘油中保存的未缀合2B8融化、稀释成0.5mg/mL并进行无菌过滤。在实施标准方案后制备缀合的抗体，不过，使用碳-[14]-标记的螯合物；螯合物的结合情况为1.5mol/mol抗体。在生理盐水(0.9％)中将纯化的缀合物稀释成0.5mg/mL、无菌过滤并与天然抗体一起在4℃下保存至使用为止。
以250μg/mL的浓度给6-8周龄的小鼠注射100μL纯化的2B8抗体。随后在0-264小时范围内的不同时间处通过后眼眶穿刺对小鼠取血并通过全血酶免疫测定法、使用抗原阳性B-细胞作为俘获物对其血清分析存在的天然和缀合的2B8抗体。将所得数据绘制成2B8或2B8-MX-DTPA浓度与时间的示意图；从这些结果中可以生成直线回归图和用于测定βt1/2值的斜率。
c.
猕猴体内[89]-Y-2B8-MX-DTPA的药理学/毒理学研究
除不使用HPLC纯化外，使用描述插入90Y的方案制备含有钇-[89]的2B8-MX-DTPA。用含有75mg/mL HSA和1mM DTPA的1×PBS配制非放射性的含金属的缀合物并在White Sands Research Center的GLP研究号920611中对其进行评价。4组中的每一组中包括一只雄性和一只雌性猴。每隔48小时给动物静脉注射下列用量的药物、总计注射7次：I组(盐水)；II组(0.003mg/kg)；III组(0.03mg/kg)；和IV组(0.3mg/kg)。在研究过程中通过测定体重和体温、食物和水的消耗量、消除量、血清化学特性、血液学特性、进行尿分析和物理检查来评价动物。在第0、2、7、10和14天输注前对I-IV组中的动物取血并通过FACS分析对血液分析循环的B-细胞水平。
d.
放射性标记的2B8-MX-DTPA的生物分布
在前期研究中，评价6-8周龄BALB/c小鼠体内111In-标记的2B8-MX-DTPA的组织生物分布。在上述“混合与照射”(“mix-and-shoot”)方案后使用临床级2B8-MX-DTPA制备放射性标记的缀合物。该缀合物的比活性为2.3mCi/mg并用含有50mg/mL HSA的pH 7.4的PBS配制该缀合物。给小鼠静脉注射100μL的111In-标记的2B8-MX-DTPA(约21μCi)并在0、24、48和72小时时通过脱颈椎处死3只动物的组。在处死后，取出尾、心脏、肺、肝、肾、脾、肌肉和股骨；将它们洗涤、称重；另外取血样用于分析。通过γ计数测定与各样本相关的放射性且随后测定每克组织中的注射剂量百分比。没有进行减低由涉及个体器官的血液所代表的活性分布的尝试。
在一个独立的方案中，用111In将在4℃和30℃下培养10周的2B8-MX-DTPA的等分部分放射性标记至两制备物的比活性为2.1mCi/mg。然后如上所述将这些缀合物用于小鼠体内的生物分布研究。
为进行剂量学测定，用111In将2B8-MX-DTPA的等分部分放射性标记至比活性为2.3mCi/mg并将约1.1Ci注入20只BALB/c小鼠体内。随后在1、24、48和72小时时处死各5只小鼠的组并取出其器官且备好用于分析。此外，取出皮肤、肌肉和骨的部分并处理以用于分析；还收集尿和粪便并在24-72小时时间点进行分析。
另外使用类似的手段用90Y放射性标记2B8-MX-DTPA并在72小时的时间期限内评价BALB/c小鼠体内的生物分布。在通过HPLC大小排阻层析进行纯化后，给4组5只小鼠的各组静脉注射约1μCi的临床级缀合物(比活性：1 2.2mCi/mg)；随后在1、24、48和72小时时处死各组动物并如上所述分析其器官和组织。通过用γ闪烁计数器测定轫致辐射能来确定涉及各组织样本的放射性。随后将活性数值表示为每克组织中的注射剂量百分比或每克器官中的注射剂量百分比。尽管反复冲洗器官和其它组织而除去了表浅的血液，但是不灌注器官。因此，为提供由内部相关血液代表的活性，不扣减器官活性的数值。
e.111In-标记的2B8-MX-DTPA的肿瘤定位
在患有Ramos B-细胞肿瘤的无胸腺小鼠体内测定放射性标记的的2B8-MX-DTPA的位置。给6-8周龄的无胸腺小鼠皮下注射(左背侧面)含有预先适合于无胸腺小鼠生长的1.2×107Ramos肿瘤细胞的0.1mLRPMI-1640。肿瘤在2周内生长出来且重量范围在0.07-1.1克。给小鼠静脉注射100μL的111In-标记的2B8-MX-DTPA(16.7μCi)并在0、24、48和72小时时通过脱颈椎处死3只动物的组。在处死后，取出尾、心脏、肺、肝、肾、脾、肌肉、股骨和肿瘤、洗涤、称重；另外取血样用于分析。通过γ计数测定与各样本相关的放射性并测定每克组织中的注射剂量百分比。
3.
剂量学计算
使用应用注射了111In或90Y-标记的2B8-MX-DTPA的BALB/c小鼠获得的生物分布数据(表1-4和5-8)、使用由Medical InternalRadiation Dose(MIRD)Committee of the Society of NuclearMedicine定型的手段计算从给予70Kg患者的1.0mCi剂量中吸收的辐射剂量。由根据各放射性免疫缀合物的生物分布数据测定的注射剂量/器官数值确定放射性标记的缀合物的生物半衰期。就某些组织、例如血液而言，从具有指数式衰减的双隔室模型的这些隔室中可以推定出放射性缀合物的生物衰变。就活性水平在72小时的生物分布研究中基本上保持恒定的其它组织、例如肝脏而言，据推定生物半衰期较长且确定的数值为1000小时。
表1
将111In-2B8-MX-DTPA静脉注入正常BALB/c
小鼠体内后1.0小时的活性分布
平均值±SD
| 样品 | 器官重g | ％ID/g | ％ID/器它 |
| 血液心脏肺(2)肾(1)肝脾肌肉骨皮肤胃肠道尿粪便 | 1.47±0.170.087±0.010.149±0.010.127±0.021.06±0.200.090±0.018.39±0.983.15±0.353.15±0.352.58±0.31 | 40.3±5.325.88±0.7614.2±1.49.82±0.8610.32±1.586.94±1.170.70±0.252.97±0.710.96±0.296.10±2.00 | 58.4±3.10.51±0.052.10±0.171.22±0.1210.76±1.930.61±0.035.67±1.359.10±1.093.0±1.127.80±1.80---- |
| 总计 | 99.04±4.8 |
小鼠数量＝5
平均重＝20.97±2.46g
表2
将111In-2B8-MX-DTPA静脉注入正常BALB/c
小鼠体内后24小时的活性分布
平均值±SD
| 样品 | 器官重g | ％ID/g | ％ID/器官 |
| 血液心脏肺(2)肾(1)肝脾肌肉骨皮肤胃肠道尿粪便 | 1.47±0.070.128±0.030.152±0.020.128±0.011.11±0.100.082±0.018.41±0.383.15±0.143.15±0.142.91±0.27 | 21.97±1.874.02±0.237.90±1.615.94±0.4010.08±1.835.04±0.751.24±0.052.02±0.333.75±0.394.50±0.52 | 32.22±1.350.38±0.011.20±0.180.76±0.0411.20±2.230.40±0.0210.44±0.766.31±0.8111.77±1.096.65±0.560.982.54 |
| 总计 | 87.10±1.68 |
小鼠数量＝5
平均重＝21.03±0.94g
表3
将111In-2B8-MX-DTPA静脉注入正常BALB/c
小鼠体内后48小时的活性分布
平均值±SD
| 样品 | 器官重g | ％ID/g | ％ID/器官 |
| 血液心脏肺(2)肾(1)肝脾肌肉骨皮肤胃肠道尿粪便 | 1.45±0.130.090±0.010.155±0.020.125±0.011.040±0.110.082±0.018.26±0.773.10±0.293.10±0.292.96±0.20 | 22.41±3.954.05±0.948.45±0.536.16±1.159.41±2.335.32±0.711.42±0.582.08±0.163.43±0.595.05±0.63 | 31.90±2.890.36±0.061.31±0.190.76±0.079.84±3.180.48±0.1111.62±4.676.41±0.4410.54±1.697.46±0.601.466.41 |
| 总计 | 88.49±6.87 |
小鼠数量＝5
平均重＝20.65±1.93g
表4
将111In-2B8-MX-DTPA静脉注入正常BALB/c
小鼠体内后72小时的活性分布
平均值±SD
| 样品 | 器官重g | ％ID/g | ％ID/器官 |
| 血液心脏肺(2)肾(1)肝脾肌肉骨皮肤胃肠道尿粪便 | 1.52±0.060.094±0.010.161±0.010.135±0.011.11±0.110.095±0.018.58±0.343.22±0.123.22±0.122.79±0.19 | 18.97±1.313.71±0.317.60±0.305.55±0.539.90±1.775.12±0.751.04±0.091.73±0.343.16±0.604.53±0.83 | 28.51±2.030.35±0.041.18±0.090.76±0.0911.00±2.030.48±0.048.95±0.686.04±0.5110.19±2.036.37±1.382.4911.50 |
| 总计 | 87.80±4.79 |
小鼠数量＝5
平均重＝21.46±0.84g
表5
将90Y-2B8-MX-DTPA静脉注入正常BALB/c
小鼠体内后1.0小时的活性分布
平均值±SD
| 样品 | 器官重g | ％ID/g | ％ID/器官 |
| 血液心脏肺(2)肾(1)肝脾肌肉骨皮肤胃肠道尿粪便 | 1.27±0.060.086±0.010.137±0.010.120±0.010.921±0.050.080±0.017.27±0.322.73±0.122.73±0.122.22±0.06---- | 39.23±2.455.80±0.8412.11±1.0810.23±1.3012.12±1.729.27±0.460.78±0.134.35±0.392.12±0.783.52±1.12---- | 49.77±1.720.50±0.091.66±0.171.15±0.1211.17±1.660.74±0.075.72±1.0611.89±1.475.82±2.244.22±0.84---- |
| 总计 | 94.85±3.47 |
小鼠数量＝5
平均重＝18.17g±0.81g
表6
将90Y-2B8-MX-DTPA静脉注入正常BALB/c
小鼠体内后24小时的活性分布
平均值±SD
| 样品 | 器官重g | ％ID/g | ％ID/器官 |
| 血液心脏肺肾肝脾肌肉骨 | 1.517±0.0900.092±0.0050.141±0.0050.138±0.0070.438±0.0980.081±0.0038.668±0.5143.246±0.186 | 8.35±2.5472.63±0.1424.56±0.3935.63±0.2225.22±0.3354.23±0.1800.976±0.1641.326±0.102 | 12.83±4.600.240±0.0060.644±0.0470.779±0.0402.259±0.3990.345±0.0118.55±1.9454.289±0.154 |
小鼠数量＝3
平均重＝21.671±1.11g
表7
将90Y-2B8-MX-DTPA静脉注入正常BALB/c
小鼠体内后48小时的活性分布
平均值±SD
| 样品 | 器官重g | ％ID/g | ％ID/器官 |
| 血液心脏肺(2)肾(1)肝脾肌肉骨皮肤胃肠道尿粪便 | 1.33±0.060.088±0.010.139±0.010.122±0.010.968±0.040.087±0.017.26±0.362.86±0.142.86±0.142.84±0.19---- | 17.34±2.03.56±0.317.54±0.886.53±0.429.05±1.706.52±1.131.05±0.183.34±0.424.13±0.762.74±0.34---- | 23.03±1.950.31±0.041.05±0.150.79±0.018.92±1.570.57±0.078.01±1.179.53±1.0811.75±1.823.80±0.304.297.67 |
| 总计 | 79.72±3.23 |
小鼠数量＝5
平均重＝19.07±0.91g
表8
将90Y-2B8-MX-DTPA静脉注入正常BALB/c
小鼠体内后72小时的活性分布
平均值±SD
| 样品 | 器官重g | ％ID/g | ％ID/器官 |
| 血液心脏肺(2)肾(1)肝脾肌肉骨皮肤胃肠道尿粪便 | 1.35±0.020.088±0.010.142±0.010.123±0.010.02±0.060.103±0.017.68±0.112.88±0.052.88±0.052.86±0.18---- | 15.40±1.633.12±0.248.23±1.056.45±0.578.39±1.045.90±1.191.01±0.153.20±0.253.97±0.492.90±0.65---- | 20.71±2.130.28±0.011.17±0.200.79±0.078.58±1.310.59±0.087.73±1.059.20±0.6111.42±1.364.06±0.933.0011.08 |
| 总计 | 78.62±2.63 |
小鼠数量＝5
平均重＝19.21±0.27g
按照一种类似的方式确定或使用计算指数式衰减的t1/2的标准等式计算其它生物半衰期。就各放射性标记的缀合物而言，一旦确定了这些数值，则使用这些表上部(输出变量)提供的等式确定表9和10中所列的Tue、Te1、Te2、A1、 A2和A的变量。使用由Phillip Hagan先生，MS，Nuclear Medicine Service，VA Medical Center，La Jolla，CA 92161在Symphony电子表格(LotuS Development Corp.)中撰写的程序计算这些以及在下表中所列的数值。
表9
输入变量 输出变量
A0＝给予的剂量Tue＝有效吸收半衰期 Te1＝第一种成分的有效消失半衰期
Tp＝放射性核素的物理半衰期 Te2＝第二种成分的有效消失半衰期
Tu＝生物吸收半衰期 A1＝第一种成分的累积活性
Tb1＝第一种成分的生物消失半衰期 A2＝第二种成分的累积活性
Tb2＝第二种成分的生物消失半衰期 A＝总累积活性
f1＝具有Tb1生物半衰期的A0的级分 Tue＝Tu*Tp/(Tu+Tp)A1-1.44*f1*A0*Tel*(Tue/Tu)
f2＝具有Tb2生物半衰期的A0的级分 Te1＝Tb1*Tp/(Tb1+Tp)A2-1.44*f2*A0*Te2
S＝平均剂量/单位累积活性 Te2＝Tb2*Tp/(Tb2+Tp)A-A1+A2
实例：肝的A1-1.44*11.000％*1000*63.2*1.00＝10007.5微居里累积活性用于评价累积活性(A)的输入和输出值的表
Tu f1 f2 Tb1 Tb2 Tue Te1 Te2 A1 A2 A
(hr) (hr) (hr) (hr) (hr) (hr) (uCi-hr) (uCi-hr) (uCi-hr)
肾上腺 2.78E-04 0.000％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 63.2 0.0 0.0 0.0 0
膀胱容量 2.78E-04 1.000％ 0.00％ 4 0 2.78E-04 3.8 0.0 54.4 0.0 54
胃容量 2.78E-04 6.650％ 0.00％ 1.5 0 2.78E-04 1.5 0.0 140.5 0.0 141
SM.INT.容量 2.78E-04 6.650％ 0.00％ 3.5 0 2.78E-04 3.3 0.0 318.6 0.0 319
ULI_容量 2.78E-04 6.650％ 0.00％ 4.5 0 2.78E-04 4.2 0.0 404.0 0.0 404
ILI_容量 2.78E-04 6.650％ 0.00％ 4.2 0 2.78E-04 4.0 0.0 378.6 0.0 379
肾 2.78E-04 1.220％ 0.00％ 35 0 2.78E-04 23.0 0.0 404.8 0.0 405
肝 2.78E-04 11.000 0.00％ 1000 0 2.78E-04 63.2 0.0 100007.5 0.0 10008
肺 2.78E-04 2.1000％ 1.20％ 30 1000 2.78E-04 20.8 63.2 627.9 1091.7 1720
其它组织(总) 2.78E-04 0.000％
肌肉 2.78E-04 10.400％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 63.2 0.0 9461.7 0.0 9462
脂肪 2.78E-04 0.000％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 63.2 0.0 0.0 0.0 0
血液 2.78E-04 58.400％ 32.22％ 15 1000 2.78E-04 12.3 63.2 10319.2 29313.1 39632
脑 2.78E-04 0.000％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 63.2 0.0 0.0 0.0 0
心脏 2.78E-04 0.510％ 0.38％ 57 1000 2.78E-04 30.9 63.2 226.9 345.7 573
卵巢 2.78E-04 0.000％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 63.2 0.0 0.0 0.0 0
胰腺 2 78E-04 0.000％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 63.2 0.0 0.0 0.0 0
骨胳(总) 2.78E-04 0.000％
皮质骨 2.78E-04 0.000％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 63.2 0.0 0.0 0.0 0
小梁骨 2.78E-04 9.100％ 6.30％ 45 1000 2.78E-04 27.0 63.2 3536.8 5731.6 9268
骨髓(红) 2.78E-04 0.000％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 63.2 0.0 0.0 0.0 0
骨髓(黄) 2.78E-04 0.000％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 63.2 0.0 0.0 0.0 0
软骨 2.78E-04 0.000％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 63.2 0.0 0.0 0.0 0
其它组成 2.78E-04 0.000％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 63.2 0.0 0.0 0.0 0
皮肤 2.78E-04 11.770％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 63.2 0.0 10708.1 0.0 10708
脾 2.78E-04 0.610％ 0.40％ 39 1000 2.78E-04 24.7 63.2 217.1 363.9 581
睾丸 2.78E-04 0.000％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 63.2 0.0 0.0 0.0 0
甲状腺 2.78E-04 0.000％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 63.2 0.0 0.0 0.0 0
总体 2.78E-04 0.000％ 0.00％ 1000 2.78E-04
表10
输入变量 输出变量
A0＝给予的剂量 Tue＝有效吸收半衰期
Tp＝放射性核素的物理半衰期 Te1＝第一种成分的有效消失半衰期
Tu＝生物吸收半衰期 Te2＝第二种成分的有效消失半衰期
Tb1＝第一种成分的生物消失半衰期 A1＝第一种成分的累积活性
Tb2＝第二种成分的生物消失半衰期 A2＝第二种成分的累积活性
T1＝具有Tb1生物半衰期的A0的级分 A＝总累积活性
f2＝具有Tb2生物半衰期的A0的级分 Tue＝Tu*Tp/(Tu+Tp)A1-1.44*f1*A0*Te1*(Tue/Tu)
S＝平均剂量/单位累积活性 Te1＝Tb1*Tp/(Tb1+Tp)A2-1.44*f2*A0*Te2
Te2＝Tb2*Tp/(Tb2+Tp)A-A1+A2
实例：肝的A1-1.44*9.000％*1000*60.2*1.00-7795.5微居里累积活性
用于评价累积活性(A)的输出和输入值的表
Tu f1 f2 Tb1 Tb2 Tue Te1 Te2 A1 A2 A
(hr) (hr) (hr) (hr) (hr) (hr) (uCi-hr) (uCi- (uCi-hr)
hr)
肾上腺 2.78E-04 0.000％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 60.2 0.0 0.0 0.0 0
膀胱内含物 2.78E-04 1.000％ 0.00％ 4 0 2.78E-04 3.8 0.0 54.2 0.0 54
胃内含物 2.78E-04 4.220％ 0.00％ 1.5 0 2.78E-04 1.5 0.0 89.1 0.0 89
胃肠内含物 2.78E-04 4.220％ 0.00％ 3.5 0 2.78E-04 3.3 0.0 201.7 0.0 202
ULI_容含物 2.78E-04 4.220％ 0.00％ 4.5 0 2.78E-04 4.2 0.0 255.5 0.0 255
LLI_容含物 2.78E-04 4.220％ 0.00％ 4.2 0 2.78E-04 3.9 0.0 239.5 0.0 240
肾 2.78E-04 1.150％ 0.87％ 70 1000 2.78E-04 33.4 60.2 553.6 753.6 1307
肝 2.78E-04 9.000％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 60.2 0.0 7795.5 0.0 7795
肺 2.78E-04 1.200％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 60.2 0.0 1039.4 0.0 1039
其它组织(总) 2.78E-04 0.000％
肌肉 2.78E-04 8.720％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 60.2 0.0 7552.9 0.0 7553
脂肪 2.78E-04 0.000％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 60.2 0.0 0.0 0.0 0
血液 2.78E-04 49.770％ 25.90％ 13 1000 2.78E-04 10.8 60.2 7743.9 22433.7 301 78
脑 2.78E-04 0.000％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 60.2 0.0 0.0 0.0 0
心脏 2.78E-04 0.500％ 0.36％ 51 1000 2.78E-04 28.4 60.2 204.4 311.8 516
卵巢 2.78E-04 0.000％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 60.2 0.0 0.0 0.0 0
胰腺 2.78E-04 0.000％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 60.2 0.0 0.0 0.0 0
骨胳(总) 2.78E-04 0.000％
皮质骨 2.78E-04 0.000％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 60.2 0.0 0.0 0.0 0
小梁骨 2.78E-04 11.890％ 9.28％ 67 1000 2.78E-04 32.7 60.2 5604.4 8038.0 13642
骨髓(红) 2.78E-04 0.000％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 60.2 0.0 0.0 0.0 0
骨髓(黄) 2.78E-04 0.000％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 60.2 0.0 0.0 0.0 0
软骨 2.78E-04 0.000％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 60.2 0.0 0.0 0.0 0
其它组成 2.78E-04 0.000％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 60.2 0.0 0.0 0.0 0
皮肤 2.78E-04 15.600％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 60.2 0.0 13512.1 0.0 13512
脾 2.78E-04 0.740％ 0.56％ 60 1000 2.78E-04 31.0 60.2 330.0 485.1 815
睾丸 2.78E-04 0.000％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 60.2 0.0 0.0 0.0 0
甲状腺 2.78E-04 0.000％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 60.2 0.0 0.0 0.0 0
总体 2.78E-04 0.000％ 0.00％ 1000 0 2.78E-04 60.2 0.0 0.0 0.0 0
使用来自表9和10的总累积活性(A)的值和由MIRD PamphletNumber 11(表11和12以及13和14)提供的S值确定所列组织(表15、16、17和18)的各放射性标记的缀合物的辐射吸收剂量的估计值。在确定表19中所提供的铟标记的缀合物的总辐射剂量估计值的过程中，根据相邻器官或组织中的活性产生的吸收剂量概括出指定器官的自身剂量。然而，在计算钇标记的缀合物产生的辐射剂量估计值的过程中(表20)，所列组织的某些数值不存在(例如肾上腺)。这是由于释放的13号粒子的光路长度比发射的g粒子的光路长度短所导致的，由此从相邻组织中产生可以忽略不计的活性且这些组织的初级生物分布数据不存在。
表11
S吸收的剂量/单位累积活性，(RAD/UCI-H)
铟-[111] 半衰期 67.44小时
| 靶器官 | 肾上腺 | 膀胱内含物 | 源器官 | 肾 | 肝 | 肺 | 其它组织(肌内) | |||
| 肠道 | ||||||||||
| 胃内含物 | Si内含物 | ULi内含物 | Lli内含物 | |||||||
| 肾上腺膀胱壁骨GI(胃壁)GI(SI)GI(ULT壁)GI(LLT壁)肾肝肺骨髓(红)其它组织(肌肉)卵巢胰腺皮肤脾睾丸甲状腺子宫(NONGRVD)总体 | 7.4E-033.6E-075.2E-068.8E-062.5E-062.8E-067.1E-073.7E-051.5E-057.6E-069.4E-064.8E-061.8E-062.6E-051.8E-062.0E-051.4E-074.7E-075.8E-066.6E-06 | 5.7E-074.5E-042.3E-068.5E-078.6E-066.9E-062.2E-058.5E-076.3E-078.2E-085.3E-065.5E-062.3E-058.6E-071.7E-067.6E-071.4E-051.2E-084.9E-056.2E-06 | 7.3E-067.5E-072.3E-063.4E-047.9E-061.1E-053.8E-061.1E-055.9E-065.2E-064.0E-064.3E-061.3E-065.7E-051.4E-063.1E-051.8E-073.5E-072.4E-066.1E-06 | 4.4E-068.0E-063.2E-061.1E-052.1E-048.3E-052.4E-059.2E-065.6E-067.5E-071.1E-054.8E-063.3E-056.1E-061.4E-064.6E-061.0E-066.9E-082.9E-057.3E-06 | 2.8E-066.4E-062.9E-061.2E-055.4E-053.3E-049.5E-068.3E-067.8E-068.3E-079.1E-064.5E-063.7E-057.1E-061.4E-064.2E-069.8E-077.5E-081.5E-056.8E-06 | 1.3E-062.0E-054.2E-065.4E-063.0E-051.4E-054.7E-042.8E-068.4E-072.6E-071.3E-055.2E-066.4E-052.1E-061.6E-062.4E-065.9E-062.7E-082.1E-056.9E-06 | 3.4E-059.3E-073.7E-061.0E-058.6E-068.6E-062.5E-065.2E-041.2E-052.5E-069.6E-064.4E-063.6E-062.0E-051.8E-062.8E-053.4E-072.0E-073.1E-066.6E-06 | 1.5E-055.2E-072.9E-065.8E-065.0E-067.5E-067.3E-071.2E-051.3E-047.8E-064.1E-063.4E-061.4E-061.2E-051.6E-062.8E-062.5E-076.2E-071.2E-066.6E-06 | 7.6E-061.5E-073.8E-065.7E-066.1E-077.4E-073.0E-072.7E-067.7E-061.4E-044.8E-064.4E-063.6E-077.7E-061.8E-067.1E-063.9E-082.6E-062.8E-075.9E-06 | 4.8E-065.5E-063.2E-064.3E-064.8E-065.0E-065.2E-064.4E-063.4E-064.2E-065.3E-067.5E-066.3E-065.7E-062.5E-064.6E-063.6E-064.3E-067.4E-065.6E-06 |
参照-MIRD手册第11期164页
表12
S.吸收的剂量/单位累积活性，(RAD/UCI-H)
铟-[111] 半衰期 67.44小时
| 靶器官 | 卵巢 | 胰腺 | 源器官 | 皮肤 | 脾 | 睾丸 | 甲状腺 | 总体 | ||
| 骨骼 | ||||||||||
| 红骨髓 | 皮质骨 | 小梁骨 | ||||||||
| 肾上腺膀胱壁骨GI(胃壁)GI(SI)GI(ULI壁)GI(LI壁)肾肝肺骨髓(红)其它组织(肌肉)卵巢胰腺皮肤脾睾丸甲状腺子宫(N0NGRV0)总体 | 1.1E-062.1E-053.8E-062.4E-063.8E-053.7E-054.8E-052.9E-061.7E-062.2E-071.3E-056.3E-061.0E-021.5E-061.4E 061.6E-060.0E+002.5E-086.3E-057.7E-06 | 2.6E-054.7E-073.6E-065.9E-055.5E-066.6E-061.7E-061.9E-051.3E-057.6E 066.8E-065.7E-061.0E-061.6E-031.3E-066.2E-052.1E-074.5E-071.9E-067.5E-06 | 7.9E-062.4E-061.2E-053.2E-067.9E-066.4E-069.0E-066.8E-062.9E-063.7E-067.5E-053.8E-067.7E-064.9E-062.0E-062.7E-061.0E-062.2E-066.7E-066.4E-06 | 3.9E-061.5E-063.0E-051.7E-062.3E-062.2E-063.2E-062.7E-062.0E-063.0E-061.3E-053.2E-062.2E-063.1E-062.3E-062.0E-061.9E 062.8E-061.8E-065.9E-06 | 3.9E-061.5E-062.6E-051.1E-062.3E-062.2E-063.2E-062.7E-062.0E-063.0E-062.6E-053.2E-062.2E-063.1E-062.3E-062.0E-061.9E-062.8E-061.8E-065.9E-06 | 2.4E 061.6E-062.9E-061.7E-061.5E-061.4E-061.5E-062.0E-061.7E-061.9E-062.7E-062.5E-061.4E 061.7E-063.7E-051.7E-063.4E-062.4E-061.2E-063.8E-06 | 2.0E-054.7E-072.9E-063.0E-054.2E-063.8E-061.9E-062.8E-053.0E-066.9E-064.4E-064.6E-061.7E-066.1E-051.5E-069.1E-042.0E-073.4E-071.2E-066.6E-06 | 1.4E-071.5E-052.4E-061.5E-071.2E-061.1E-068.3E-061.7E-071.2E-073.4E-081.9E-063.6E-060.0E+002.1E-074.9E-068.9E-083.6E-033.3E 090.0E+005.6E-06 | 4.7E-071.2E-082.6E-061.5E-074.2E-083.3E-082.2E-081.2E-073.5E-072.9E-062.9E-064.3E-062.5E-083.0E-072.5E-063.5E-073.3E-095.8E-032.4E-085.3E-06 | 7.0E-066.9E-066.9E-067.1E-067.5E-067.0E-066.7E-066.6E-066.5E-065.9E-067.7E-065.6E-067.0E-067.8E-063.7E-066.8E-064.9E-065.2E-067.8E-065.8E-06 |
参考文献-MIRD手册第11期165页
表13
S.吸收的剂量/单位累积活性，(RAD/UCI-H)
钇-[90] 半衰期 64小时
| 靶器官 | 肾上腺 | 膀胱内含物 | 源器官 | 肾 | 肝 | 肺 | 其它组织(肌内) | |||
| 肠道 | ||||||||||
| 胃内含物 | SI内含物 | ULI内含物 | LLI内含物 | |||||||
| 肾上腺膀胱壁骨GI(胃壁)GI(SI)GI(ULI壁)GI(LLI壁)肾肝肺骨髓(红)其它组织(肌肉)卵巢胰腺皮肤脾睾丸甲状腺子宫(NONGRVD)总体 | 1.4E-010.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.02.8E-05 | 0.05.0E-030.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.03.2E-06 | 0.00.00.04.0E-030.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.08.5E-05 | 0.00.00.00.02.5E-030.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.02.3E-05 | 0.00.00.00.00.04.5E-030.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.01.4E-05 | 0.00.00.00.00.00.07.4E-030.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.01.7E-05 | 0.00.00.00.00.00.00.06.4E-030.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.02.8E-05 | 0.00.00.00.00.00.00.00.01.1E-030.00.00.00.00.00.00.00.00.00.02.8E-05 | 0.00.00.00.00.00.00.00.00.02.0E-030.00.00.00.00.00.00.00.00.02.8E-05 | 0.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.07.1E-050.00.00.00.00.00.00.02.8E05 |
参考文献-MIRD手册第11期144页
表14
S.吸收的剂量/单位累积活性，(RAD/UCI-H)
钇-[90] 半衰期 64小时
| 靶器官 | 卵巢 | 胰腺 | 源器官 | 皮肤 | 脾 | 睾丸 | 甲状腺 | 总体 | ||
| 骨骼 | ||||||||||
| 红骨髓 | 皮质骨 | 小梁骨 | ||||||||
| 肾上腺膀胱壁骨GI(胃壁)GI(SI)GI(ULI壁)GI(LLI壁)肾肝沸骨髓(红)其它组织(肌肉)卵巢胰腺皮肤脾睾丸甲状腺子宫(NONGRVO)总体 | 0.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.01.8E-010.00.00.00.00.00.02.8E-05 | 0.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.02.0E-020.00.00.00.00.02.8E-05 | 0.00.01.1E-040.00.00.00.00.00.00.08.6E-040.00.00.00.00.00.00.00.02.8E-05 | 0.00.04.0E-040.00.00.00.00.00.00.03.3-050.00.00.00.00.00.00.00.02.8E-05 | 0.00.02.3E-040.00.00.00.00.00.00.05.7E 040.00.00.00.00.00.00.00.02.8E-05 | 0.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.07.6E-040.00.00.00.02.8E-05 | 0.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.01.1E-020.00.00.02.8E-05 | 0.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.05.7E-020.00.02.8E-05 | 0.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.09.9E-020.02.8E-05 | 2.8E-052.8E-052.8E-052.8E-052.8E-052.8E-052.8E-052.8E-052.8E-052.8E-052.8E-052.8E-052.8E-052.8E-052.8E-052.8E-052.8E-052.8E-052.8E-052.8E-05 |
参考文献-MIRD手册第11期145页
表15
辐射吸收剂量(RAD＝A*S)
铟-[111] 半衰期 67.44小时
| 靶器官 | 肾上腺 | 膀胱内含物 | 源器官 | 肾 | 肝 | 肺 | 其它组织 | |||
| 肠道 | ||||||||||
| 胃内含物 | SI内含物 | ULI内含物 | LLI内含物 | |||||||
| 肾上腺膀胱壁GI(胃壁)GI(SI)GI(ULI壁)GI(LLT壁)肾肝肺其它组织肌肉 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 3.1E-052.4E-024.6E-054.7E-043.8E-041.2E-034.6E-053.4E-054.5E-063.0E-04 | 1.0E-031.1E-044.8E-021.1E-03I.5E-035.3E-041.5E-038.3E-047.3E-046.0E-04 | 1.4E-032.SE-033.5E-036.7E-032.6E-027.6E-032.9E-031.8E-032.4E-04I.5E-03 | 1.1E-032.6E-032.2E-022.2E-021.3E-013.8E-033.4E-033.2E-033.4E-041.8E-03 | 4.9E-047.6E-032.0E-031.1E-025.3E-031.8E-011.1E-033.2E-049.8E-052.0E-03 | 1.4E-023.8E-044.0E-033.5E-033.5E-031.0E-032.1E-014.9E-031.0E-031.8E-03 | 1.5E-015.2E-035.8E-025.0E-027.5E-027.3E-031.2E-011.3E+007.8E-023.4E-02 | 1.3E-022.6E-049.8E-031.0E-031.3E-035.2E-044.6E-031.3E-022.4E-017.6E-03 | 2.4E-012.7E-012.1E-012.4E-012.5E-012.6E-012.2E-011.7E-012.1E-013.7E-01 |
| 靶器官 | 肾上腺 | 膀胱内含物 | 源器官 | 肾 | 肝 | 肺 | 其它组织 | |||
| 肠道 | ||||||||||
| 胃内含物 | SI内含物 | ULI内含物 | LLI内含物 | |||||||
| 肾上腺血液脑心脏卵巢胰腺骨骼皮质骨小梁骨骨髓(红)骨髓(黄)软骨其它组成皮肤 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 3.0B-043.0E-043.0E-044.1E-051.3E-034.7E-051.3E-041.3E-042.9E-042.9E-041.3E-041.3E-049.2E-05 | 6.0E-046.0E-046.0E-044.4E-031.8E-048.0E-033.2E-043.2E-045.6E-045.6E-043.2E-043.2E-042.0E-04 | 1.5E-031.5E-031.5E-031.5E-031.1E-021.9E-031.0E-031.0E-033.5E-033.5E-031.0E-031.0E-034.5E-04 | 1.8E-031.8E-031.8E-031.7E-031.5E-022.9E-031.2E-031.2E-033.7E-033.7E-031.2E-031.2E-035.7E-04 | 2.0E-032.0E-032.0E-039.1E-042.4E-028.0E-041.6E-031.6E-034.6E-034.9E-031.6E-031.6E-036.1E-04 | 1.8E-031.8E-031.8E-031.1E-021.5E-038.1E-031.5E-031.5E-033.9E-033.9E-031.5E-031.5E-037.3E-04 | 3.4E-023.4E-023.4E-022.8E-021.4E-021.2E-012.9E-022.9E-024.1E-024.1E-022.9E-022.9E-021.6E-02 | 7.6E-037.6E-037.6E-031.2E-026.2E-041.3E-026.5E-036.5E-038.3E-038.3E-036.5E-036.5E-033.1E-03 | 3.7E-013.7E-013.7E-013.7E-012.8E-011.2E-011.6E-011.6E-012.6E-012.6E-011.6E-011.6E-011.2E-01 |
| 靶器官 | 肾上腺 | 膀胱内含物 | 源器官 | 肾 | 肝 | 肺 | 其它组织 | |||
| 肠道 | ||||||||||
| 胃内含物 | SI内含物 | ULI内含物 | LLI内含物 | |||||||
| 脾睾丸甲状腺子宫(NONGRVD)总体 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 4.1E-057.6E-046.SE-073.4E-042.7E.03 | 4.4E-032.5E-054.9E-058.6E-043.4E.04 | 1.5E-033.2E-042.2E-052.3E-039.2E-03 | 1.7E-034.0E-043.0E-052.7E-036.1E-03 | 9.1E-042.2E-031.0E-052.6E-038.0E.03 | 1.1E-021.4E-048.1E-052.7E-031.3E-03 | 2.8E-022.5E-036.2E-036.6E.021.2E-02 | 1.2E-026.7E-054.5E-031.0E-024.8E-04 | 2.3E-011.8E-012.1E-013.7E-012.8E-01 |
表16
辐射吸收剂量(RAD＝A*S)
铟-[111] 半衰期 67.44小时
| 靶器官 | 卵巢 | 胰腺 | 源器官 | 皮肤 | 脾 | 睾丸 | 甲状腺 | 总体 | ||
| 骨骼 | ||||||||||
| 红骨髓 | 皮质骨 | 小梁骨 | ||||||||
| 肾上腺膀胱壁GI(胃壁)GI(SI)GI(ULI壁) | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 3.6E-021.4E-021.6E-022.1E-022.0E-02 | 2.6E-021.7E-021.8E-021.6E-021.5E-02 | 1.2E-022.7E-041.7E-022.4E-032.2E-03 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 |
| 靶器官 | 卵巢 | 胰腺 | 源器官 | 皮肤 | 脾 | 睾丸 | 甲状腺 | 总体 | ||
| 骨骼 | ||||||||||
| 红骨髓 | 皮质骨 | 小梁骨 | ||||||||
| GI(LLI壁)肾肝肺其它组织肌肉脂肪血液脑 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 3.0E-022.5E-021.9E-022.8E-023.0E-023.0E-023.0E-023.0E-02 | 1.6E-022.1E-021.8E-022.0E-022.7E-022.7E-022.7E-022.7E-02 | 1.1E-031.6E-021.7E-034.0E-032.7E-032.7E-032.7E-032.7E-03 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 |
| 靶器官 | 卵巢 | 胰腺 | 源器官 | 皮肤 | 脾 | 睾丸 | 甲状腺 | 总体 | ||
| 骨骼 | ||||||||||
| 红骨髓 | 皮质骨 | 小梁骨 | ||||||||
| 心脏卵巢胰腺骨骼皮质骨小梁骨骨髓(红)骨髓(黄)软骨 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 3.0E-022.0E-022.9E-022.4E-012.4E-012.4E-012.4E-012.4E-01 | 2.7E-021.5E-021.8E-023.1E-023.1E-022.9E-022.9E-023.1E-02 | 2.7E-039.9E-043.5E-021.7E-031.7E-032.6E-032.6E-031.7E-03 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 |
| 靶器官 | 卵巢 | 胰腺 | 源器官 | 皮肤 | 脾 | 睾丸 | 甲状腺 | 总体 | ||
| 骨骼 | ||||||||||
| 红骨髓 | 皮质骨 | 小梁骨 | ||||||||
| 其它成分皮肤脾睾丸甲状腺子宫(NONGRVO)总体 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 2.4E-012.1E-021.9E-021.8E-022.6E-021.7E-025.5E-02 | 3.1E-024.0E-011.8E-023.6E-022.6E-020.0E+004.1E-02 | 1.7E-038.7E-045.3E-011.2E-042.0E-047.0E-043.8E-03 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 |
表17
辐射吸收剂量(RAD＝A*S)
钇-[90] 半衰期 64小时
| 靶器官 | 肾上腺 | 膀胱内含物 | 源器官 | 肾 | 肝 | 肺 | 其它组织 | |||
| 肠道 | ||||||||||
| 胃内含物 | SI内含物 | ULI内含物 | LLI内含物 | |||||||
| 肾上腺膀胱壁GI(胃壁)GI(SI)GI(ULI壁)GI(LLI壁) | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+002.7E-010.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+003.6E-010.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+005.0E-010.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+001.1E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+001.8E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 |
| 靶器官 | 肾上腺 | 膀胱内含物 | 源器官 | 肾 | 肝 | 肺 | 其它组织 | |||
| 肠道 | ||||||||||
| 胃内含物 | SI内含物 | ULI内含物 | LLI内含物 | |||||||
| 肾肝肺其它组织肌肉脂肪血液脑心脏 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 8.4E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+008.6E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+002.1E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+002.7E+002.7E+002.7E+002.7E+002.7E+00 |
| 靶器官 | 肾上腺 | 膀胱内含物 | 源器官 | 肾 | 肝 | 肺 | 其它组织 | |||
| 肠道 | ||||||||||
| 胃内含物 | SI内含物 | ULI内含物 | LLI内含物 | |||||||
| 卵巢胰腺骨骼皮质骨小梁骨骨髓(红)骨髓(黄)软骨其它成分 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 |
| 靶器官 | 肾上腺 | 膀胱内含物 | 源器官 | 肾 | 肝 | 肺 | 其它组织 | |||
| 肠道 | ||||||||||
| 胃内含物 | SI内含物 | ULI内含物 | LLI内含物 | |||||||
| 皮肤脾睾丸甲状腺子宫(NONGRVO)总体 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+001.7E-040.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+007.6E-030.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+004.6E-030.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+003.6E-030.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+004.1E-030.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+003.7E-020.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+002.2E-010.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+002.9E-020.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+001.1E+00 |
表18
辐射吸收剂量(RAD＝A*S)
钇-[90] 半衰期 64.00小时
| 靶器官 | 卵巢 | 胰腺 | 源器官 | 皮肤 | 脾 | 睾丸 | 甲状腺 | 总体 | ||
| 骨骼 | ||||||||||
| 红骨髓 | 皮质骨 | 小梁骨 | ||||||||
| 肾上腺膀胱壁GI(胃壁)GI(SI)GI(ULI壁)GI(LLI壁)肾肝肺其它组织 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 |
| 靶器官 | 卵巢 | 胰腺 | 源器官 | 皮肤 | 脾 | 睾丸 | 甲状腺 | 总体 | ||
| 骨骼 | ||||||||||
| 红骨髓 | 皮质骨 | 小梁骨 | ||||||||
| 肌肉脂肪血液脑心脏卵巢胰腺骨骼皮质骨小梁骨骨髓(红)骨髓(黄)软骨其它组成 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+003.1E+003.1E+007.8E+007.8E+003.1E+003.1E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+ 000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 |
| 靶器官 | 卵巢 | 胰腺 | 源器官 | 皮肤 | 脾 | 睾丸 | 甲状腺 | 总体 | ||
| 骨骼 | ||||||||||
| 红骨髓 | 皮质骨 | 小梁骨 | ||||||||
| 皮肤脾睾丸甲状腺子宫(NONGRVD)总体 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+003.8E-01 | 1.0E+010.0E+000.0E+000.0E+000.0E+003.8E+01 | 0.0E+009.0E+000.0E+000.0E+000.0E+002.3E-02 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 | 0.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+000.0E+00 |
表19
因给予均匀分布在标准人体(70Kg)内的铟-[111]标记的2B8-MX而产生并以注射后72
小时内动物分布数据为基础的辐射剂量估计值
| 活性量＝RADS肾上腺 0.493膀胱壁 0.348胃壁 0.412小肠 0.434UL肠壁 0.533LL肠壁 0.505肾 0.625肝 1.533肺 0.582其它组织肌肉脂肪血液脑心脏 | 1000微居里/患者剂量RADS卵巢 0.387胰腺 0.362骨骼皮质骨 0.474小梁骨 0.474骨髓(红) 0.602骨髓(黄) 0.602软骨 0.474其它组成 0.474皮肤 0.564脾 0.854睾丸 0.239甲状腺 0.276子宫(NONGRVD) 0.473总体 0.417 |
参考文献：“生物分布的放射性核素的吸收剂量计算图解”-《核医学MIRD杂志》(MIRD J.of Nucl.Med.)/附录#1，2/68
使用Symphony(Lotus Development Corporation)形式的电子表格模板进行计算且所述的电子表格如下创建：Phillip L.Hagan，MSNuclear Medicine ServiceVA HospitalSan Diego，CA 92161
表20
因给予均匀分布在标准人体(70Kg)内的铟-[111L]标记的2B8-MX而产生并以注射后72
小时内动物分布数据为基础的辐射剂量估计值
| 活性量＝RADS肾上腺 0.000膀胱壁 0.271胃壁 0.356小肠 0.504UL肠壁 1.150LL肠壁 1.772肾 8.366肝 8.575肺 2.079其它组织肌肉 2.716脂肪 2.716血液 2.716脑 2.716心脏 2.176 | 1000微居里/患者剂量RADS卵巢 0.000胰腺 0.000骨骼皮质骨 3.138小梁骨 3.138骨髓(红) 7.776骨髓(黄) 7.776软骨 3.138其它组成 3.138皮肤 10.269脾 8.965睾丸 0.000甲状腺 0.000子宫(NONGRVD) 0.304总体 1.854 |
参考文献：“生物分布的放射性核素的吸收剂量计算图解”-《核医学MIRD杂志》(MIRD J.of Nucl.Med.)/附录#1，2/68
使用Symphony(L0tus Development Corporation)形式的电子表格模板进行计算且所述的电子表格如下创建：Phillip L.Hagan，MSNuclear Medicine ServiceVA HospitalSan Diego，CA 92161
1.II.结果
A.
使用2B8和2B8-MX-DTPA的体外研究
1.
抗-CD20抗体2B8的生产和表征
总计9种融合体产生3种杂交瘤，这些杂交瘤产生与放射性标记的Coulter B1抗体有效竞争的抗体。在每种情况中，使杂交瘤扩展入24孔平板。使从融合体3和4中首先分离的2种抗体同位素化并将两者鉴定为IgM。将融合体5中产生并命名为2B8的第三种抗体测定为IgG1κ同种型并选择它用于连续研究。使克隆2B8.H11扩展并长期保存在液氮中.将克隆2B8.H11亚克隆以产生克隆2B8.H11.G3且另外产生克隆2B8.H11G3.G9。扩展该克隆用于进一步研究并通过蛋白质A亲和力层析纯化该抗体。
使用未标记的2B8、B1和Leu 16以及放射性标记的Coulter B1进行的竞争性试验表明2B8能够比相同浓度的B1或Leu 16更为有效地抑制B1与CD20结合(附图1)。在竞争性研究中使用FITC-缀合的2B8、天然B1和无关抗体UPC-10和S-003(分别为IgG 2a和1同种型)获得了相似的结果(数据未显示)。
使用CD20-阳性SB细胞和CD20-阴性HSB细胞、通过FACS分析来比较2B8和B1抗体与细胞CD20的直接结合情况。附图2中所示的结果表明：就可比拟量的抗体而言，2B8与SB细胞的结合超过B1与SB细胞的结合。使用无关抗体没有观察到与SB细胞的显著结合。使用与HSB细胞一起使用的任何试剂仅观察到背景荧光。这些结果证实了2B8与CD20抗原相互作用的特异性且提示2B8对细胞表面抗原具有的亲和力可能高于B1。
为了测定2B8的表观亲和力，用125I放射性标记纯化的抗体并用抗原阳性SB细胞培养增加量的所标记的抗体；在1小时的培养期后测定与细胞相关的放射性(附图3)。结果提示2B8抗体与具有4.3×10-9M表观亲和常数的CD20抗原结合。
使用人正常外周血液淋巴细胞进行的流式细胞术研究表明2B8对B-细胞具有特异性且不与其它类型的淋巴细胞(例如T-细胞、单核细胞、巨噬细胞)发生反应。使用相同的人淋巴细胞群体来比较FITC标记的2B8与B1-FITC和16-FITC。表21中所示的结果表明2B8与约14％的外周血液淋巴细胞反应，与此相比，就Leu 16而言约为12％，而就B1而言为11％。以另一种B淋巴细胞标记(CD-19)为基础的淋巴细胞群体为11％-14％。最后，当用2B8和B1或Leu 16培养人外周血液淋巴细胞且然后用CD19标记(Becton/Dickinson)对其复染时，用2B8进行双重染色的B淋巴细胞群体为9％，而使用B1或Leu 16时为10％。这些结果证明了这些试剂的相似性。
表21
与人外周血液淋巴细胞结合的2B8与其它B-和T-淋巴细胞特异性试剂的比较抗体标记
A.
单染色： CD45门控淋巴细胞百分比
无(自身荧光) 0
B1-FITC(Coulter Immunology，(IgG2a，k)) 11
Leu 16-FITC(Becton Dickinson，IgG1，k) 12
2B8-FITC(EDEC，IgG1，k) 14
B72.3-FITC(IGG1，k无关对照) 4
抗-CD4-FITC(Coulter Immunology) 37
抗-CD3-FITC(Becton Dickinson) 59
抗-CD19-RPE(Becton Dickinson) 11
抗-CD19-FITC(Becton Dickinson) 14
B.
双重染色：
B1-FITC/抗CD19-RPE 10
Leu 16-FITC/抗CD19-RPE 10
2B8 FITC/抗CD19-RPE 9
抗-CD19 FITC/抗CD19-RPE 13
B1-FITC/抗Hu Ig RPE 10
2B8-FITC/抗Hu Ig RPE 10
B72.3-FITC/抗Hu Ig RPE 2
Leucogate Simultest 99
通过2B8或B1对放射性标记的细胞CD20抗原进行免疫沉淀导致具有约33和35KD分子量的不可区分的双联体蛋白种类发生沉淀(数据未显示)。
2.
2B8-MX-DTPA的生产和表征
通过抗体与4∶1摩尔过量的异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基-三胺五乙酸反应来生产2B8-MX-DTPA缀合物(4)。一般来说，每mol 2B8抗体引入1-2mol的MX-DTPA螯合物。正如附图4中所列结果证明的，与天然2B8相比，2B8-MX-DTPA缀合物没有在免疫反应性方面表现出明显的损耗，因为天然和缀合2B8抗体实际上表现出相同的B1抑制分布；2B8和2B8-MX-DTPA的IC50值分别约为3和4μg/mL。在应用SB细胞进行的全细胞放射性免疫测定试验中使用125I-标记的B1抗体获得了这些结果。使用作为与SB细胞结合的125I-标记的2B8的抑制剂的2B8或2B8-MX-DTPA获得了相似的结果；2B8及其MX-DTPA缀合物以约3-4μg/mL的浓度抑制125I-2B8与SB细胞结合(数据未显示)。
为了评价天然2B8和2B8-MX-DTPA缀合物的体外稳定性，在4℃和30℃下将溶于生理盐水或含有10mM甘氨酸-HCl(pH6.8)的生理盐水的样品培养12周且每周使用下列测定试验检测样品的等分部分：通过全细胞酶免疫测定试验检测免疫反应性；在还原和非还原条件下的SDS-PAGE；和等电聚焦凝胶电泳。尽管免疫反应性测定试验没有通过在上述两者之一温度下培养的抗体样品检测到抗原识别作用的缺失(附图5)，但是在4℃下保持稳定的抗体的等电聚焦范围(在第0周时的pH7.30-8.40下)在6周后的30℃下确实表现出下降了0.2pH单位。然而，这一结果可能不可靠，因为就本试验而言存在实验误差极限。
表22
2B8/2B8-MX-DTPA pI小结
用不同缓冲液配制天然2B8和2B8-MX-DTPA样品并将它们在4℃或30℃下培养12周。在该期限中，进行包括等电点测定在内的不同测定试验。上述列出的数值表示在稳定性研究过程中在各温度下的各制备物中各培养12周的天然和缀合抗体的等电点范围。上标题代表：2B8 4 SAL-在4℃下的盐水中培养的2B8；2B8 30 SAL-在30℃的盐水中培养的2B8；2B8 4 GLY-在4℃的含有10mM甘氨酸的生理盐水中培养的2B8；2B8 30 GLY-在30℃下的含有10mM甘氨酸的生理盐水中培养的2B8；2B8-MX 4 SAL-在4℃下的盐水中培奍的2B8-MX-DTPA(缀合物)；2B8-MX 30 SAL-在30℃下的盐水中培养的缀合物；2B8-MX 4 GLY-在4℃下的含有10mM甘氨酸的生理盐水中培养的缀合物；和2B8-MX 30 GLY-在30℃下的含有10mM甘氨酸的生理盐水中培养的缀合物。
| 周 | 2B8 4 SAL | 2B8 30 SAL | 2B8 4 GLY | 2B8 30 GLY | 2B8-MX 4 SAL | 2B8-MX 30 SAL | 2B8-MX 4 GLY | 2B8-MX 30 GLY |
| 0123456789101112 | 7.46-8.377.39-8.247.38-8.277.47-8.357.38-8.247.29-8.257.24-8.127.39-8.327.33-8.297.49-8.537.26-8.277.40-8.277.26-8.18 | 7.42-8.277.45-8.347.33-8.357.38-8.247.29-8.257.20-8.277.17-8.327.26-8.367.26-8.457.19-8.277.18-8.277.04-8.18 | 7.46-8.377.46-8.317.45-8.407.40-8.297.38-8.357.37-8.327.27-8.277.35-8.257.40-8.367.41-8.457.26-8.277.40-8.357.26-8.18 | 7.46-8.247.45-8.347.33-8.297.38-8.287.37-8.327.20-8.127.17-8.477.34-8.307.19-8.277.18-8.137.19-8.11 | 6.30-8.216.39-8.266.02-8.406.0-8.295.99-8.285.90-8.325.85-8.276.02-8.255.86-8.365.93-8.455.95-8.355.93-8.355.90-8.26 | 6.39-8.266.02-8.346.0-8.295.99-8.355.90-8.275.85-8.275.86-8.365.93-8.455.95-8.355.93-8.275.90-8.18 | 6.30-8.216.32-8.246.02-8.406.0-8.225.99-8.355.90-8.325.85-8.275.95-8.325.86-8.365.93-8.455.88-8.355.93-8.275.90-8.26 | 6.25-8.245.95-8.276.0-8.155.99-8.355.90-8.275.85-7.955.95-8.325.86-8.215.93-8.235.95-8.135.93-8.135.90-8.18 |
最后，使用非还原SDS-PAGE在第1周后30℃的抗体样品中显现出高分子量聚集物(表23)。凝胶光密度分析表明所述聚集物占所述样品的8-17％(表23)。然而，当通过还原SDS-pAGE分析这些样品时，没有发现高分子量种类的证据，从而提示在30℃下形成了共价抗体聚集物。此外，没有观察到免疫反应性缺失。
表23
2B8的体外稳定性
A.
非还原SDS凝胶的光密度扫描
| 样品 | 百分比 | ||
| 高分子量 | 单体 | 低分子量 | |
| 参考值 | 0 | 100.00 | 0 |
| 12周/4℃/盐水12周/4℃/甘氨酸 | 00 | 95.42100.00 | 4.580 |
| 12周/30℃/盐水12周/30℃/甘氨酸 | 7.6316.70 | 83.3472.11 | 9.0311.18 |
B.
还原SDS凝胶的光密度扫描
| 样品 | 百分比 | ||
| 高分子量 | 单体 | 低分子量 | |
| 参考值 | 0 | 100.00 | 0 |
| 12周/30℃/盐水12周/30℃/甘氨酸 | 00 | 100.0010.00 | 00 |
在这种稳定性研究过程中，还使用90Y对在4℃和30℃下培养的2B8-MX-DTPA样品检测了放射性金属的结合率。在第4、8和12周时检测的样品结合了＞90％的90Y，与培养温度无关。
最后，在独立的研究中，用111In放射性标记在4℃和30℃下培养的2B8-MX-DTPA等分部分并评价其在BALB/c小鼠体内的组织生物分布。来自两种培养温度的缀合物产生了相似的生物分布(数据未显示)。此外，所获得的结果与使用保存在4℃下的111I-标记的缀合物在BALB/c小鼠体内获得的生物分布结果相似(参见下文)。
发现111In和90Y的放射性标记方案具有可再现性。一般来说，获得的111In的放射性结合率＞95％且90Y的放射性结合率＞90％。111In和90Y标记的缀合物的比活性一般分别在2-3mCi/mg和10-15mCi/mg的范围。在开始实施111In 和90Y放射性标记方案的过程中，使用HPLC凝胶渗透层析从放射性标记的2B8-MX-DTPA中除去未螯合的放射性同位素。在实验后期，因使用这种同位素获得了高放射性结合率(＞95％)而不再需要对铟标记的缀合物进行HPLC纯化。
用Lindmo的方法(3)分析111In和90Y标记的2B8-MX-DTPA制备物的免疫反应性。发现111In标记的2B8-MX-DTPA具有100％的免疫反应性(附图6)，而将90Y标记的缀合物测定为具有60％的免疫反应性(数据未显示)。
3. 111In-和 90Y-标记的2B8-MX-DTPA的表征
使用90Y-标记的缀合物进行的前期实验表明抗体显著降解且在＞10mCi/mg的抗体比活性下发生免疫反应性损耗。因此，研发这种制品是为了将辐解的影响减小到最低限度。尽管评价了大量低分子量自由基清除剂且发现它们是有效的，但是高浓度人血清清蛋白(HSA)在保护抗体完整性和免疫反应性方面最为有效(附图7-9)。
用pH7.4的含有75mg/mL HSA的1×PBS配制90Y-标记的抗体；再将二亚乙基胺五乙酸(DTPA)加至终浓度为1mM以确保螯合可能从所述抗体中失去的任何90Y。使用SDS-PAGE和放射自显影术在0和4B小时时评价放射性标记至比活性为14.6mCi/mg的2B8-MX-DTPA的降解情况。附图8和9表示在4℃下培养时放射性标记的抗体在48小时期限内没有表现出明显的降解。使用瞬时薄层层析进行的分析表明在48小时培养过程中90Y的损耗低于2％(表24)。免疫反应性也相对保持恒在60％(表24)。
表24
临床配制的90Y-2B8-MX-DTPA的稳定性
时间(4℃下的小时数) 与缀合物相关的放射性百分比 免疫反应性百分比
0 97.2 62
24 96.2 60
48 96.2 60
用pH17.4的含有75mg/mL人血清清蛋白和1MM DTPA的PBs配制放射性标记的缀合物(14.6mCi/mg比活性)并将其等分部分在4℃下培养。通过SDS-PAGE和放射自显影术瞬时薄层层析并通过全细胞结合测定试验在所述时间处分析缀合物的稳定性。结果表明在4℃下的48小时后约96％的放射性金属保持了与缀合物的结合且抗体免疫反应性保持了约60％的恒定值.
另外用111In-标记的缀合物进行制品研究；比活性为2.2mCi/mg。在pH7.4的含有75mg/mL HSA的1×PBS中评价放射性标记的抗体。附图10表示0和48小时培养样品的放射自显影图照片；对该放射自显影图的光密度分析表明在本研究过程中放射性标记的抗体没有降解(附图11、12)。该样品的瞬时薄层层析分析表明没有111In损耗(表25)；此外，将免疫反应性维持在约为100％(表25)。
表25
临床配制的111In-2B8-MX-DTPA的稳定性
时间(4℃下的小时数) 与缀合物相关的放射性百分比 免疫反应性百分比
0 94.0 105
24 96.5 104
48 96.0 100
用pH7.4的含有50mg/mL人血清清蛋白的PBS配制放射性标记的缀合物(2.2mCi/mg比活性)并在4℃下培养其等分部分。通过SDS-PAGE和放射自显影术，通过瞬时薄层层析并通过全细胞结合测定试验分析缀合物的稳定性。结果表明在4℃下48小时后约96％的放射性标记保持与缀合物结合且抗体免疫反应性保持约100％的恒定值。
当在37℃下的人血清中培养用90Y放射性标记至比活性为14.6mCi/mg的临床配制的2B8-MX-DTPA制品并通过非还原SDS-PAGE和放射自显影术进行分析时，在培养期过程中损失了4％以下的放射性同位素。对在0和96小时时的放射自显影图的光密度扫描表明放射性标记的缀合物没有显著降解(附图13-15)。通过对0和96小时的样品进行分析型薄层层析分析来证实这些结果(表26)。共同获取的这些结果提示钇标记的缀合物在本研究中使用的条件下是稳定的。使用111In标记的2B8-MX-DTPA缀合物获得了相似的结果(附图16-18) 。
表26
在37℃下的人血清中培养96小时的90Y-2B8-MX-DTPA
缀合物的分析型薄层层析分析
时间(37℃下的小时数) 与缀合物相关的放射性百分比
0 95.1
24 95.2
48 93.2
72 92.0
96 91.4
通过在瞬时薄层层析条上点1μ1、1∶20稀释的样品在所示的时间处分析含有80Y-2B8-MX-DTPA(比活性14.6mCi/mg)的人血清样品；分析样品、一式三份。色谱条通过10％乙酸铵的甲醇∶水(1∶1；v/v)溶液的上行色谱法展开、干燥并切成半十字形。然后测定与各条下半部和上半部相关的放射性并计算与缀合物相关的放射性百分比。(游离放射性金属与溶剂一起前移，而与蛋白质相关的放射性保持在原始水平。)表示了各次测定与缀合物相关的放射性的平均值。
B.
动物研究
1.
使用2B8和2B8-MX-DTPA进行的高剂量药理学/毒理学研究
在White Sands Research Center进行的GLP研究(研究号920111)中，给猕猴静脉注射不同剂量的2B8。在每次新注射前取血样并处理血液以便对淋巴细胞群体进行流式细胞术评价(表27)。
表27
在输注抗-CD20鼠单克隆抗体2B8后通过流式细胞术测定的灵长类B细胞群体
动物# 剂量 天 B细胞ab 衰竭％
I组
452 盐水 0 20.1 0
1 18.3 9
7 21.6 0
13 14.6 27
38 15.5 23
52 18.6 7
424 盐水 0 12.4 0
1 11.6 6
7 11.2 10
13 8.4 32
38 7.7 38
52 13.1 0
II组
540 0.6mg/kg 0 16.1 0
1 7.1 54
7 6.0 63
13 5.7 65
38 10.8 33
52 14.4 11
804 0.6mg/kg 0 17.6 0
1 8.3 53
7 6.1 65
13 6.6 62
38 5.1 71
52 5.2 68
III组
701 2.5mg/kg 0 21.6 0
1 10.7 50
7 3.0 86
13 10.7 50
754 2.5mg/kg 0 19.9 0
1 11.2 44
7 10.5 47
13 9.0 55
IV组
782 10mg/kg 0 15.9 0
1 3.0 81
7 3.5 78
13 6.5 59
164 10mg/kg 0 17.7 0
1 8.4 47
7 7.9 50
L3 7.7 42
V组
705 10mg/kg 0 17.2 0
1 5.2 70
7 1.3 69
13 8.2 52
38 17.1 1
52 13.3 22
716 10mg/kg 0 34.7 0
1 18.6 46
7 8.1 77
13 3.5 90
38 6.9 80
52 9.2 61
a总淋巴细胞百分比
b由双重染色标记试剂抗小鼠IGG-RPE+抗人IG-FITC定量的B细胞群体(抗小鼠IgG RPE检测2B8阻断的CD20而抗人IgGFITC检测猴B细胞表面Ig)
每隔48小时给I组-IV组动物注射一次、总计注射7次；在第0天给V组动物注射一次.在第14天处死III组和IV组动物.
在本研究过程中后之后评价的任何临床参数中注意到没有涉及给予抗-CD20抗体2B8的药物毒性。类似地，在分析获自III和IV组中动物的不同组织病理学样品过程中没有注意到异常情况。
本研究期限为14天且在本研究中评价动物的下列项目：临床观察、体重、体温、食物和水摄取情况、粪便的排泄、血清化学、血液学、尿分析和物理检查。另外，在第0、1、7和13天对各组中的动物取血并分析血液中的血清抗体(2B8)水平和T-和B-细胞水平。在第13天时处死III组和IV组中的动物并在制作样本后通过光学显微镜术检查选择的组织。所评价的组织是：心脏、脾、肝、肾、肺、大脑皮层、脊髓、淋巴结、胃、回肠、结肠、骨骼肌、睾丸/卵巢、胰腺和骨髓。
当分析来自经处理动物的血液的循环T-和B-细胞水平时，II-V组中的动物在达到第13天时表现出＞50％的循环B-细胞损耗(附图19)；给予抗体对T-细胞水平没有影响(数据未显示)。所有接受2B8的组均在血浆中显示出B-细胞饱和和抗体过量(未显示)。在接受单一10.0mg/Kg剂量2B8的V组中的动物还表现出等同于在其它组中动物中观察到的循环B-细胞水平下降。
到第52天时检查I、II和V组中的动物(附图20)。截至到第38天时，除II组中的一只动物(PR0804)和V组中的一只动物(PR0716)外，B-细胞水平恢复至正常的＞70％。在52天后这些动物体内的B-细胞水平保留了正常水平的约40％。
除本研究外，还在White Sands Research Center进行的GLP研究r(研究号9206111)中评价了猕猴体内89Y-2B8-MX-DTPA的药物毒性作用。给临床级缀合物加载非放射性89Y。用pH6.8的含有75mg/mL人血清清蛋白和1mM DTPA的PBS配制含钇的缀合物(临床制品)并如方法部分中所述将其进行静脉给药。
正如通过附图21中的结果所显示的，89Y-标记的2B8-MX-DTPA对这些动物体内的循环B-细胞几乎没有影响，如果有的话也与所给予的剂量无关。此外，除一般性的淋巴细胞衰竭外(20-43％)，在包括血清化学、尿分析、体重和体温在内的所评价的任何临床参数中没有发现明显的异常。
2.
使用2B8和2B8-MX-DTPA进行的药代动力学研究
如上所述；GLP研究中的V组动物接受单剂量的10.0mg/Kg的2B8。对数据的直线回归分析提示从这些猴子的循环中清除了天然抗体、13 t1/2值约为4.5天。在使用BALB/c小鼠进行的相似研究中，通过直线回归分析(未显示)将天然和缀合2B8的βt1/2值测定为8.75天(附图22)。这些结果提示2B8的缀合对其从BALB/c小鼠体内清除没有影响。
3.
用放射性标记的2B8-MX-DTPA的生物分布和肿瘤定位研究
以上述前期生物分布实验(部分2d)为基础，用111In将缀合的2B8放射性标记至比活性为2.3mCi/mg并将约1.1μCi注入20只BALB/c小鼠体内以便测定放射性标记物质的生物分布。随后，在第1、24、48和72小时时处死5只小鼠的组并取出其器官和部分皮肤、肌肉和骨且进行分析用处理。此外，收集尿和粪便并进行24-72小时时间点的分析。血液中的放射性水平从1小时时每克40.3％的注射剂量下降至72小时时的18.9％(表1-4；附图23)。在整个实验过程中心脏、肾、肌肉和脾的值保持在0.7-9.8％的范围。在肺中发现的放射性水平从1小时时的14.2％下降至72小时时的7.6％；类似地，相应的肝的每克注射剂量值为10.3％和9.9％。在测定辐射吸收剂量估计值111In-2B8-MX-DTPA中使用这些数据(表19)。
评价BALB/c小鼠体内具有12.2mCi/mg抗体比活性的90Y-标记的缀合物的生物分布。获得的放射性结合率＞90％且通过HPLC纯化放射性标记的抗体。评价72小时内主要器官和皮肤、肌肉、骨和尿以及粪便中的放射性组织沉积并将其表示为注射剂量百分比/g组织。表5-8和附图24中所示的结果表明：尽管与血液相关的放射性水平从在1小时时的约39.2％注射剂量/克下降到72小时后的约15.4％；但是在整个实验过程中与尾、心脏、肾、肌肉和脾相关的放射性水平相对保持恒定在10.2％或10.2％以下。重要的是，与骨相关的放射性在1小时时的4.4％注射剂量/克骨-72小时时的3.2％的范围。这些结果共同提示在本研究过程中几乎没有游离钇与缀合物连接且几乎没有游离金属释放。在测定90Y-MX-DTPA辐射吸收剂量估计值中使用这些数据(表20)。
为了进行肿瘤定位研究，制备2B8-MX-DTPA并用111In将其放射性标记至比活性为2.7mCi/mg。随后给患有Ramos B-细胞肿瘤的12只无胸腺小鼠注入100微升标记的缀合物(约24μCi)。肿瘤重量范围在0.1-1.0克。在注射后0、24、48和72小时的时间点处通过后眼眶穿刺取50μL血、通过脱颈椎处死小鼠并取出尾、心脏、肺、肾、脾、肌肉、股骨和肿瘤。在将所述组织进行处理和称重后，使用γ-计数器测定与各组织样本相关的放射性并将数值表示为注射剂量百分比/克。
结果(附图25)表明在整个实验过程中111In-2B8-MX-DTPA的肿瘤浓度稳定增加。在72小时后的肿瘤中累积了13％的注射剂量。相反，在本实验过程中血药浓度从0时的30％以上下降至72小时的13％。截止到本实验结束时所有其它组织(肌肉除外)中含有1.3-6.0％注射剂量/克组织；肌肉组织中含有约13％的注射剂量/克。
C.剂量学测定
就铟和钇标记的缀合物而言，来源于正常BALB/c小鼠体内生物分布研究并列在表19和20中的总结剂量学数据分别与比较每毫居里注射剂量(5)时文献中所列数据一致且提示可以安全地评价钇-和铟标记的2B8缀合物在淋巴瘤患者中的临床功效。
D.毒理学
1.
2B8：
单剂量一般安全性试验
对小鼠和豚鼠腹膜内给予单剂量的2B8(分别为0.5mL或5.0mL)并观察7天。没有检测到明显的毒性征兆。
2.
2B8和2B8-MX-DTPA：使用人体组织进行的免疫组织学研究
使用一组用丙酮固定的32种不同人体组织评价鼠单克隆抗体2B8的组织反应性。抗体2B8与具有受到极大限制的模式的组织分布的抗-CD20抗原反应，仅在包括那些造血来源在内的淋巴样组织中的细胞亚群内观察到了该反应。
在淋巴结中，在成熟皮层B-淋巴细胞以及生发中心中的增殖细胞群体内观察到了免疫反应性。在外周血液、扁桃体B-细胞区域、脾白髓内和使用在胸腺中发现的40-70％的髓淋巴细胞也观察到了阳性反应性。在大肠固有层(淋巴集结)的滤泡内也观察到了阳性反应性。最后，使用2B8观察到在包括膀胱、乳腺、子宫颈、食道、肺、腮腺、前列腺、小肠和胃在内的不同器官基质内的聚集物或星散淋巴样细胞的也是阳性的。
发现所有的简单上皮细胞以及不同器官的复层上皮和扁平上皮是非反应性的。类似地，使用包括脑、脊髓和外周神经中的那些细胞在内的神经外胚层细胞没有观察到反应性。还发现诸如骨骼肌和平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞和多形核炎症细胞这样的间充质成分是阴性的。
使用一组用丙酮固定的16种人体组织评价2B8-MX-DTPA的组织反应性。正如预先使用天然抗体所证明的，2B8-MX-DTPA缀合物识别表现出高度限制模式分布的CD20抗原，这一情况仅在淋巴样来源细胞亚群上发现。在淋巴结中，在B-细胞群体中观察到了免疫反应性。在脾的白髓和胸腺髓淋巴细胞中观察到了强反应性。在膀胱、心脏、大肠、肝、肺和子宫内星散的淋巴细胞中也观察到了免疫反应性且这是由于在这些组织中存在炎症细胞所导致的。正如使用天然抗体(上述)所述，使用神经外胚层细胞或使用间充质成分没有观察到反应性。
III.讨论
正如通过与已知对CD20抗原具有特异性的抗体竞争并通过斯卡查德发现所测定的，由具有相同名称的克隆产生的鼠单克隆抗-CD20抗体表现出对B-细胞CD20抗体的亲和力，这种亲和力可以高于对B1抗体所观察到的亲和力。此外，免疫沉淀数据提示由2B8沉淀的抗原看起来是与由B1沉淀的抗原相同的抗原，因为两种抗体沉淀具有相对分子量为33和35KD的双联体。2B8抗体对外周血液淋巴细胞的特异性的细胞荧光自显影分析表明所述抗体特异性地与B-细胞反应且没有显示出与T-细胞或其它类型淋巴细胞的反应性。最后，前期稳定性数据提示所述抗体在30℃下保持稳定12周而没有免疫反应性损失。
当2B8抗体与甲基苄基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)缀合时，实际上没有观察到免疫反应性比天然抗体下降。此外，用IIIIn或90Y放射性标记所述缀合物分别产生具有免疫反应性为100％和60％的标记的缀合物。对在37℃下的人血清中培养96小时的111IIn或90Y标记的缀合物进行的稳定性研究显示在本研究过程中放射性金属的损耗可以忽略不计，从而提示该缀合物在临床上使用时是稳定的。
使用铟标记的2B8-MX-DTPA制品在无胸腺小鼠中进行的肿瘤定位研究表明在本实验过程中与肿瘤细胞结合的缀合物的量增加而没有在其它组织中异常累积。此外，剂量学测定估计值来源于生物分布。此外，来源于生物分布研究中的剂量学测定估计值与文献中公开的数据一致。最后，使用天然和缀合抗体进行的人组织交叉反应性研究表明两种抗体识别具有高度受限组织分布的抗原，从而它仅与包括造血来源的那些淋巴样组织中的细胞亚群反应。这些结果共同提示缀合过程没有改变所述抗体的组织特异性且放射性标记的的缀合物在体内保持稳定并识别存在于无胸腺小鼠体内以实验方式产生的肿瘤表面上的CD20抗原。
当将2B8用于高剂量药理学/毒理学研究时，所述抗体在本研究过程中或之后评价的任何参数方面没有产生明显的药物毒性作用。类似地，在对通过光学显微镜术检验的不同组织病理学样本的分析过程中没有注意到异常情况。令人意外的是，所用的所有剂量的抗体均产生明显的循环B-细胞衰竭。然而，一旦停止给予所述抗体，则循环的B-细胞水平确实能够恢复到基本上正常的水平。在单剂量组的猴(V组)中，没有将天然抗体从循环中清除，其中表观βt1/2的值约为4.5天。据推定，当在BALB/c小鼠中进行这种药代动力学研究时，清除的2B8抗体的βt1/2的值为8.75天。因此，这些数据共同提示：当将作为放射性标记的缀合物的附属物给药时，天然抗体也可以产生一定的临床作用。
总之，我们的数据表明高亲和力2B8抗体及其MX-DTPA缀合物表现出受限制模式的人体组织反应性。此外，在灵长类中，天然抗体是无毒性的且可使B-细胞瞬时清除；然而，一旦将抗体从循环中清除，则B-细胞水平适度快速地恢复。另外，铟-和钇-标记的2B8-MX-DTPA缀合物看起来在体外是稳定的，从而在人体血清内的延长培养过程中没有显示出放射性金属的损耗。最后，来源于90Y-或111In-标记的2B8-MX-DTPA在BALB/c小鼠体内生物分布的辐射剂量估计值与来源于使用用这些同位素放射性标记的缀合的抗共有独特型抗体进行的人体临床研究中的剂量估计值一致(每毫居里的注射剂量)。IV.用于制备90Y-2B8-MX-DTPA的“混合与照射”(“MIX-&-SHOOT”)放射性标记方案的前期临床研发小结
A.简介
已经在用于治疗复发性B-细胞淋巴瘤的I期临床试验种评价了90Y-标记的鼠单克隆抗-CD20抗体(2B8)。用于制备钇标记的抗体的原始方案在配制和给予患者前使用高效液相层析(HPLC)步骤来除去非蛋白质结合的放射性同位素。令人遗憾的是，这种方法特别耗时，从而导致所述抗体与未保护状态的放射性同位素接触时间较长。这可导致所述抗体的辐解增加，同时伴随免疫反应性降低。另外，该方法繁琐的方面在于使得难以每天制备放射性药物学上的一种以上剂量。对这种方法的简化加速了作为使用将NIPI Pharmacy Services用作放射性制药的另一种选择在临床部位上的实施。
因此，研发了称作“混合与照射”(“mix-and-shoot”)法的修改的放射性标记法，它避免了对HPLC纯化步骤的需求而维持了高放射性结合率和改进的免疫反应性保留率。体外稳定性研究以及在小鼠体内进行的生物分布研究证实使用“混合与照射”(“mix-and-shoot”)法制备的放射性标记的抗体可与使用目前的HPLC方法生产的物质相比拟。这些前期临床研究结果表明可以将这种新型“混合与照射”(“mix-&-shoot”)方案用于制备适用于临床试验的90Y-标记的2B8-MX-DTPA。
B.材料和方法
材料
1.
细胞
人成淋巴细胞细胞系SB(CD20阳性)和HSB(CD20阴性；)获自美国典型培养物保藏中心并将其维持在含有10％胎牛血清的RPMI-1640中并用谷氨酰胺补充。
2.
抗体
使用预先在IND(BB-IND 4850/4851)中所述的方案通过中孔纤维生物反应器的制备部件纯化2B8抗体。
3.
其它试剂
氯化钇-[90]获自Amersham。所有其它试剂获自下面引用的附加报告中所述的来源。将用于放射性标记方案的试剂进行处理以便除去可以与放射性标记步骤过程中的放射性同位素竞争的污染性重金属(参见方法部分)。在所建立的批量生产记录后在GMP条件下由IDEC的生产部门制备试剂。
方法
1.
2B8-D4X-DTPA的制备
临床级MX-DTPA作为二钠盐的水溶液获自Coulter Immunology并将其储存在-70℃下。通过生产部门制备缀合物(2B8-MX-DTPA)。在这些研究中使用两批不同的缀合物；将它们均以10mg/mL置于生理盐水中。用无菌的2mL聚丙烯注射器填充所述缀合物并将其储存在2-8℃下。
2.
不含金属条件的维持
进行所有的试剂处理以便将金属污染的可能性减小到最低限度。使用诸如烧瓶、烧杯和量筒这样的聚丙烯或聚苯乙烯塑料容器。在使用前将它们用Alconox洗涤并用Milli-Q水或冲洗用水(WFIr)充分冲洗。将不含金属的移液管尖(BioRad)用于精确操作小体积。使用无菌塑料血清移液管操作较大体积的试剂。反应可以在1.8mL由聚丙烯制成的螺旋塞微量离心管中便利地进行。
3.
放射性结合率的测定
使用瞬时薄层层析(ITLC)、按照SOP SP-13-008测定放射性结合率、一式三份。一般来说，该方案如下：按1∶20将放射性标记的缀合物稀释入含有1mM DTPA或5mM EDTA的1×PBS中，然后将1μL从ITLC SG纸(Gelman Sciences)的1×5cm条的一端开始点1.5cm。使用10％乙酸铵溶于甲醇∶水(1∶1；v/v)所得到的溶液将纸展开。将所述纸条干燥、剪成半十字形并通过闪烁计数测定与各部分相关的放射性。将与纸条下半部相关的放射性(涉及蛋白质的放射性)表示为通过上半部和下半部数值总和确定的总放射性百分比。
4.
用于钇-[90]-标记的2B8-MX-DTPA的“混合与照射”(“Mix- and-Shoot”)方案
用由Amersham提供的不含载体的氯化90Y的0.04M HCl溶液放射性标记抗体。将放射性同位素的等分部分(10-20mCi/mg抗体)转入聚丙烯管内并加入0.02X体积的不合金属的2M乙酸钠以便将所述溶液的pH调节至3.6。立即加入2B8-NaDTPA(0.3mg；10.0mg/mL的生理盐水溶液)并缓慢混合该溶液。用pH试纸检验该溶液证实pH为3.8-4.1并培养5分钟。通过将该反应混合物转入装有含75mg/mL人血清清蛋白(HSA)和1mM二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)的1X PBS的单独的聚丙烯管内而使反应骤停并缓慢混合。将放射性标记的抗体储存在2-8℃下。
通过测定放射性标记的缀合物的合适的等分部分的放射性来确定比活性。对该数值校正通过在280nm处的吸收度测定并表示为mCi/mg蛋白质的相对于所述缀合物蛋白质浓度而言的计数效率。
5.
钇-[90]-2B8-MX-DTPA的体外免疫反应性
使用以由Lindmo所述的改型全细胞结合测定法为基础的SOP#SP-009测定90Y-标记的缀合物的免疫反应性。将增加浓度的对数期CD20-阳性SB细胞或CD20-阴性HSB细胞加入到一式两份一组的1.5mL聚丙烯管内；细胞的终体积为0.40mL。将放射性标记的缀合物稀释成抗体浓度为1-2.5ng/mL并向各管内加入0.35mL。在90分钟培养后，通过离心使细胞沉淀并收集上清液。使用闪烁计数器测定上清液级分中保留的放射性。将数据绘制成所加入的总放射性除以与细胞相关的放射性所得商数对每管中细胞数量倒数的关系的示意图。y轴截距代表免疫反应性级分。
6.
临床配制的钇-[90]-2B8-MX-DTPA的体外稳定性
用90Y放射性标记2B8-MX-DTPA缀合物并按照如上述提供的“混合与照射”(“mix-&-shoot”)方案中所述配制它。制备两批放射性标记的缀合物；将一批用于评价放射性结合稳定性而将另一批用于评价免疫反应性的保留情况。将所配制的缀合物在4℃下培养48小时并使用非还原SDS-pAGE和放射自显影术在0、24小时和48小时时对其等分部分进行分析。使用上述测定方法评价各时间点处的免疫反应性。
7.
人体血清中钇-[90]-2B8-MX-DTPA的体外稳定性
通过在37℃下的人血清中培养达72小时来评价90Y-标记的2B8-MX-DTPA的稳定性。将该缀合抗体用钇-[90]放射性标记并如上所述配制。用正常人血清(非热灭活的)按1∶10稀释所述分放射性标记的缀合物并在37℃下将其等分部分在塑料管内培养。在所选择的时间处取出样品并通过非还原SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。
8.
钇-[90]-2B8-MX-DTPA的生物分布
评价钇-[90]-标记的2B8-MX-DTPA在8-10周龄BALB/c小鼠体内的组织生物分布。制备放射性标记的缀合物并如上所述配制。给小鼠静脉注射5μCi的90Y-标记的2B8-MX-DTPA并在1、24、48和72小时时处死5只小鼠的组。在处死后，取出尾、心脏、肺、肝、肾、脾、肌肉、股骨；将它们洗涤、称重；另外取出血液和皮肤样品用于分析。通过使用γ计数器测定轫致辐射的辐射量来确定与各组织样品相关的放射性并测定注射剂量百分比/克组织和注射剂量百分比/器官。
9.
剂量学测定
将使用注射了90Y-标记的2B8-MX-DTPA的小鼠获得的生物分布数据用于计算从给予70Kg患者的1.0mCi剂量中吸收的辐射剂量的估计值。按照Medical Internal Radiation Dose(MIRD)Committee ofthe Society of Nuclear Medicine采用的方法来进行估算。Mr.Phillip Hagan，Nuclear Medicine Service，VA Medical Center，LA Jolla，CA 92161进行了这些计算。
10.
临床剂量的钇-[90]-2B8-MX-DTPA的制备方案的验证
(参考文献R&D报告标题为“制备临床剂量的90Y-2B8-MX-DTPA的“混合与照射”(“Mix-and-Shoot”)放射性标记方案的验证”；作者P.Chinn；出版的日期为1994年4月22日)。
C.结果
1.
使用“混合与照射”(“Mix-and-Shoot”)方案制备钇-[90]- 标记的2B8-MX-DTPA
评价与2B8-MX-DTPA和90Y的放射性标记反应的动力学的前期实验证实在pH3.6-4.1下结合了95％的放射性同位素、反应时间为5-10分钟。随后在按比例放大方案的验证研究(参考文献R&D报告标题为“制备临床剂量的90Y-2B8-MX-DTPA的“混合与照射”(“Mix-and-Shoot”)放射性标记方案的验证”；作者P.Chinn；出版的日期为1994年4月22日)中证实了这种放射性结合率的再现性(95.7％±1.7％)。使用这种“混合与照射”(“mix-&-shoot”)方案制备90Y-标记的2B8-MX-DTPA得到的产品可与HPLC方法(参见BB-IND4850/4851)生产的产品相比拟。发现放射性标记方案具有可再现性，其中比活性一般在10-15mCi/mg抗体的范围。
与对HPLC方案验证实验所观察到的55-60％相比，使用本方案制备的90Y-标记的2B8-MX-DTPA的免疫反应性一般大于70％(附图26)。这种差异可能是由于因使用“混合与照射”(“mix-and-shoot”)方案减少了培养时间而降低了辐解作用所导致的。这一结果是典型的且如下所述能够反映出用于制备临床剂量的放射性标记缀合物的放大比例方案的验证实验的特征。
2.90Y-标记的2B8-MX-DTPA的体外稳定性
使用应用HPLC方法制备的未保护的90Y-标记的抗体缀合物进行的前期实验证实辐解导致抗体降解明显和免疫反应性缺失。因此，研制配制缓冲液以便将辐解作用降低到最低限度。证实人血清清蛋白(HSA)可有效地将因辐解导致的抗体降解减少到最低限度。使用用“混合与照射”(“mix-and-shoot”)方法制备的放射性标记的缀合物进行评价以便证实所述制品在将辐解降低至最低限度方面的功效。用pH7.4的含有75mg/mL HSA和1mM DTPA的1×PBS配制放射性标记至比活性为14.5mCi/mg抗体的90Y-标记的抗体。使用SDS-PAGE和放射自显影术在0、24和48小时时评价缀合物2B8-MX-DTPA的降解情况。附图2、3和4表明在4℃下培养时放射性标记的缀合物在48小时内没有表现出明显的降解。瞬时薄层层析分析在48小时培养过程中没有显示出90Y缺失；通过SDS-PAGE/放射自显影分析验证这些结果(表28)。免疫反应性也以相对恒定地保持在＞88％(表29)。
表28
“混合与照射”(“Mix-&-Shoot”)90Y-2B8-MX-DTPA
在含有人血清清蛋白和DTPA的PBS中的稳定性
与缀合物相关的放射性百分比
时间(小时)
ITLC
SDS/PAGE
0 92.9 96.0
24 95.5 95.4
48 91.3 94.6
表29
“混合与照射”(“Mix-&-Shoot”)90Y-2B8-MX-DTPA
在含有人血清清蛋白和DTPA 的PBS中的免疫反应性
时间(4℃下的小时数) 免疫反应性百分比
0 87.9
24 88.5
48 90.4
在37℃下的人血清中将临床配制的比活性为15.7mCi/mg的90Y-标记的2B8-MX-DTPA培养72小时。通过非还原SDS-PAGE和放射自显影术分析的样品(附图30)显示出在培养期过程中没有放射性同位素缺失(表30)。对在0时和72小时时的放射自显影图的光密度扫描表明放射性标记的缀合物没有显著降解(附图3 1和32)。通过薄层层析分析验证这些结果(表30)。应注意用于本研究的抗体的放射性结合率低于在标记方案的验证研究中获得的数据。这种较低的放射性结合率是由于用于这种放射性标记的抗体的特定制品的批量氯化90Y的质量下降所导致的。较低的放射性结合率不会改变使用“混合与照射”(“mix-and-shoot”)方法制备的钇标记的缀合物在这些培养条件下保持稳定这一结论。
表30
在人血清中培养的90Y-2B8-MX-DTPA缀合物的稳定性
时间(37℃下的小时数) 与缀合物相关的放射性百分比
ITLC
SDS-PAGE/放射自显影术
0 85.7 88.8
24 76.4 90.0
72 87.6 88.7
使用瞬时薄层层析条和SDS-PAGE/放射自显影术在所示的时间处对含有90Y-2B8-MX-DTPA(比活性为15.7mCi/mg)的人血清样品分析非蛋白质结合的90Y.
3.
使用钇-[90]-2B8-MX-DTPA进行的生物分布研究
评价BALB/c小鼠体内比活性为11.5mCi/mg抗体和放射性结合率＞95％的90Y-标记的缀合物的生物分布。在72小时内对主要器官、皮肤、肌肉、骨、尿和粪便评价放射性在组织内的沉积情况并将其表示为注射剂量百分比/g组织和注射剂量百分比/器官。表3 1-34和附图33中所示的结果表明与血液相关的放射性水平从1小时时的约43％的注射剂量/克(％ID/g)下降至72小时后的约16％；在24小时时和24小时之后，与心脏、肾和脾相关的放射性水平相对恒定地保持在4-8％。就肺和肝而言，放射性从1小时时的10-12％下降至72小时时的8％-10％。就皮肤而言，放射性从24小时到72小时相对恒定地保持在约3％。胃肠道中的放射性从24小时到72小时以0.5-1％保持恒定。在整个研究过程中肌肉的放射性恒定在0.6％。通过股骨(骨)吸收的放射性在所有的时间点处保持低于4％，从而表明缀合物制品中游离钇的量可以忽略不计且在本研究过程中几乎没有游离的放射性金属释放。
表31
将90Y-2B8-MX-DTPA静脉注入正常BALB/c小鼠体内后1小时的活性分布
平均值±SD
| 样品 | 器官重g | ％ID/g | ％ID/器官 |
| 血液心脏肺(2)肾(1)肝脾肌肉骨皮肤胃肠道尿粪便 | 1.37±0.0530.101±0.010.126±0.010.129±0.010.899±0.070.077±0.0047.83±0.282.94±0.112.94±0.112.33±0.08---- | 42.74±0.788.03±3.3312.44±0.947.81±1.2410.08±1.2810.74±0.960.44±0.083.44±0.571.46±0.581.02±0.19---- | 58.52±1.740.82±0.371.56±0.050.997±0.109.01±0.520.823±0.043.43±0.5110.11±1.804.24±1.572.36±0.35---- |
| 总计 | 94.66±3.47 |
小鼠数量＝3
平均重＝19.58g±0.71g
表32
将90Y-2B8-MX-DTPA静脉注入正常BALB/c小鼠体内后24小时的活性分布
平均值±SD
| 样品 | 器官重g | ％ID/g | ％ID/器官 |
| 血液心脏肺(2)肾(1)肝脾肌肉骨皮肤胃肠道尿粪便 | 1.55±0.120.105±0.010.127±0.020.139±0.010.966±0.090.083±0.018.83±0.693.31±0.263.31±0.262.89±0.43 | 19.77±2.424.44±0.558.78±1.615.02±0.528.62±2.736.75±1.270.692±0.012.24±0.313.33±0.760.73±0.09 | 30.77±6.040.47±0.081.11±0.210.69±0.058.20±1.970.55±0.0646.12±0.527.47±1.5310.88±1.761.02±0.052.311.23 |
| 总计 | 73.52±6.18％ |
小鼠数量＝3
平均重＝22.09±1.73g
表33
将90Y-2B8-MX-DTPA静脉注入正常BALB/c小鼠体内后48小时的活性分布
平均值±SD
| 样品 | 器官重g | ％ID/g | ％ID/器官 |
| 血液心脏肺(2)肾(1)肝脾肌肉骨皮肤胃肠道尿粪便 | 1.50±0.140.104±0.010.122±0.020.124±0.010.966±0.130.079±0.018.59±0.823.22±0.313.22±0.312.63±0.40---- | 14.97±5.773.99±1.438.41±1.573.99±1.626.12±3.216.05±2.380.54±0.192.07±0.842.30±0.700.652±0.30---- | 22.53±8.480.415±0.161.04±0.310.49±0.195.69±2.250.46±0.164.67±1.676.65±2.567.34±1.951.67±0.642.832.06 |
| 总计 | 57.28±17.60 |
小鼠数量＝3
平均重＝21.48±2.05g
表34
将90Y-2B8-MX-DTPA静脉注入正常BALB/c小鼠体内后72小时的活性分布
平均值±SD
| 样品 | 器官重g | ％ID/g | ％ID/器官 |
| 血液心脏肺(2)肾(1)肝脾肌肉骨皮肤胃肠道尿粪便 | 1.45±0.070.093±0.010.123±0.020.123±0.010.876±0.070.081±0.018.30±0.393.11±0.153.11±0.152.59±0.20---- | 15.87±4.814.16±1.2710.67±3.794.79±1.037.26±1.797.37±2.340.67±0.132.58±0.513.09±0.820.79±0.18---- | 23.14±7.260.392±0.131.30±0.450.596±0.166.39±1.760.584±0.165.58±1.228.05±1.769.66±2.682.05±0.533.562.82 |
| 总计 | 65.47±14.0 |
小鼠数量＝3
平均重＝20.76±0.97g
4.
剂量学测定
表35中列出了使用小鼠生物分布数据(表31-34中的％ID/器官值)对90Y-标记的缀合物计算的“标准”70Kg人的辐射吸收剂量。这些结果与预先使用应用HPLC放射性标记方法制备的90Y-标记的2B8-MX-DTPA获得的结果相差无几。
表35
因给予均匀分布在标准人体(70Kg)内的钇-[90]标记的2B8-MX而产生并以注射后72
小时内动物分布数据为基础的辐射剂量估计值
| 活性量＝RADS肾上腺 0.534膀胱壁 0.534胃壁 0.534小肠 1.158UL肠壁 1.657LL壁 2.380肾 7.015肝 7.149肺 2.157其它组织肌肉 2.646脂肪 2.646血液 2.646脑 2.112心脏 2.646 | 1000微居里/患者剂量RADS卵巢 0.534胰腺 0.534骨骼皮质骨 1.466小梁骨 1.466骨髓(红) 4.452骨髓(黄) 2.096软骨 1.466其它组成 1.466皮肤 6.603脾 4.973睾丸 0.534甲状腺 0.534子宫(NONGRVD) 0.767总体 1.755 |
参考文献：“生物分布的放射性核素的吸收剂量计算图解”-《核医学MIRD杂志》(MIRD J.of Nucl.Med.)/附录#1，2/68
使用Symphony(Lotus Development Corporation)形式的电子表格模板进行计算且所述的电子表格如下创建：Phillip L.Hagan，MS，Nuclear Medicine Service，VA Hospital，San Diego，CA 92161
5.
制备临床剂量的钇-[90]-2B8-MX-DTPA的方案的验证
在MPI Pharamcy Services，Inc.制备总计10批量用于验证。表36中总结了对各批样品的检测结果。计算各次检测结果的平均值且如果合适要注意标准误差。为了评价因不同标记时间使该方法产生的变异性，使用10分钟的标记时间制备批号1至批号8；使用5分钟的反应时间制备批号9和批号10。以10批验证的检测结果为基础确立释放规格。将释放规格概括在表37中。
表36
10批使用“混合与照射”(“Mix-&-Shoot”)制备的验证用
90Y-标记的2B8-MX-DTPA的测定结果
| #1 | #2 | #3 | #4 | #5 | #6 | #7 | #8 | #9 | #10 | 平均值 | |
| 免疫反应性％ | 72.8 | 93.3 | 71.7 | 70.2 | 60.6 | 68.2 | 79.5 | 72.4 | 88.2 | 68.5 | 74.5±9.8 |
| 内毒素(Eu/ml) | ＜0.125 | ＜0.125 | ＜0.125 | ＜0.125 | ＜0.125 | ＜0.25 | ＜0.25 | ＜0.25 | ＜0.125 | ＜0.125 | ＜0.162±0.06 |
| 放射性结合％ | 97.5 | 97.0 | 93.5 | 96.0 | 94.7 | 94.9 | 95.9 | 96.5 | 97.5 | 93.5 | 95.7±1.4 |
| 抗体浓度(mg/ml) | 0.122 | 0.102 | 0.088 | 0.128 | 0.134 | 0.119 | 0.093 | 0.088 | 0.111 | 0.096 | 0.108±0.017 |
| 放射性(mCi/ml) | 0.122 | 1.22 | 0.98 | 1.26 | 1.51 | 1.55 | 1.06 | 0.98 | 1.28 | 1.02 | 1.21±0.21 |
| 比活性(mCi/mg) | 10.0 | 12.0 | 11.2 | 9.8 | 11.3 | 13.0 | 11.3 | 11.1 | 11.5 | 10.7 | 11.2±0.9 |
| v | |||||||||||
表37
使用“混合与照射”(“Mix-&-Shoot”)方案制备的
90Y-标记的2B8-MX-DTPA的释放规格
检测
规格
方法
免疫反应性 ≥60％ RIA
内毒素 ＜5EU/ml LAL
放射性标记结合率 ≥90％ ITLC
抗体浓度 0.075-0.150mg/ml A280
放射性浓度1 ≥6.0mCi/ml 剂量校准
比活性1 ≥9.0mCi/mg抗体 A280/剂量校准
总小瓶放射性1 ≥6.0mCi 剂量校准
pH 6.0-8.0 pH试纸
总蛋白质浓度 65-85mg/ml A280
无菌性检测 通过 CFR610.12
1(0时校准)
D.讨论
用于制备90Y-标记的2B8-MX-DTPA的原始放射性标记方案使用特别繁琐而耗时的HPLC纯化步骤从制备物中除去非蛋白质结合的90Y。为了简化这一过程并使之更适合于在临床部位上使用，尝试取消HPLC步骤以便有利于称作“混合与照射”(“mix-and-shoot”)的方案。这一目标是确定可导致同位素与缀合物结合率极高的放射性标记条件，由此避免对纯化步骤的需求。发现在pH 3.6下使用5-10分钟培养可以获得＞95％的放射性结合率。该方案另外有利的方面在于免疫反应性的保留率得到了提高(＞70％)，据推测这是由于在添加可防止辐解的人血清清蛋白之前抗体与高能放射性同位素接触时间较短所导致的。这种免疫反应性的保留率超过了预先使用HPLC方法所观察到的保留率。
使用应用在4℃下的配制缓冲液(含有75mg/mL人血清清蛋白和1mM DTPA的1×PBS)中培养达48小时的“混合与照射”(“mix-and-shoot”)方案制备的90Y-标记的2B8-MX-DTPA进行的稳定性研究表明没有放射性同位素缺失且完全保留了免疫反应性。在37℃下使用人血清进行72小时的稳定性研究也表明有最低限度的放射性同位素损耗。这些稳定性结果与预先使用应用HPLC方案放射性标记的缀合物所观察到的结果相差无几。
使用应用“混合与照射”(“mix-and-shoot”)方法制备的90Y-标记的缀合物的BALB/c小鼠体内的生物分布没有显示出异常组织沉积。这些结果提示没有显著改变放射性标记的抗体而影响体内抗体特征。此外，这些结果与预先使用应用HPLC放射性标记法(参见BB-IND4850/4851)制备的放射性标记的缀合物所获得的结果相差无几。
根据小鼠生物分布数据计算的“标准”70Kg人的剂量学估计值与使用应用HPLC法(参见BB-IND 4850/4851)放射性标记的缀合物获得的结果一致。另外，当比较每毫居里的注射剂量时，剂量学测定结果与获自在进行中的临床试验(IDEC研究#1315)中登记的患者的结果相差无几。就本研究中的6位患者而言，整个身体、心脏、肝和脾的平均值(rads±SD)分别为1.40±0.57、10.50±4.68、9.89±8.91和9.75±6.00。
在实施用于制备临床级90Y-2B8-MX-DTPA的“混合与照射”(“mix-and-shoot”)标记方案前，有必要评价该方案的再现性。因此，使用不同批量的氯化90Y制备10批验证样品。就所制备的10批产品而言。使用“混合与照射”(“mix-and-shoot”)方法获得的免疫反应性值在60.6％-93.3％的范围、平均值为74.5％半数值为72.1％。这种免疫反应性的保留率明显好于预先使用目前的HPLC方法获得的约60％(范围在54.9％-65.1％；平均值60.2％)。10批样品的放射性结合率的平均值为95.7％(范围在93.5％-97.5％)。这一数值与预先使用HPLC方法所观察到的数据(范围在91.7％-93.7％且平均值为93.1％)相差无几。此外，10批样品的内毒素、抗体浓度、放射性浓度、比活性、总小瓶放射性、总蛋白质浓度、pH和无菌性的结果相差无几。这些结果共同证实了“混合与照射”(“mix-and-shoot”)方法的再现性。此外，我们通过使反应进行5分钟和10分钟而评价了因不同标记时间而使该方法产生的变异性。由于就两种反应时间而言没有注意到显著性差异，所以我们决定在最终的方案中使用较短的反应时间。
E.小结
我们已经开发了一种称作“混合与照射”(“mix-and-shoot”)方法的标记程序，它用于制备可避免对目前所应用的用于除去非蛋白质结合的放射性同位素的高效液相层析(HPLC)步骤的需求的临床剂量的90Y-标记的2B8-MX-DTPA。这种简化的方案去除了这种繁琐的纯化步骤而维持了高水平的放射性同位素结合率(＞95％)和改善的免疫反应性保留率(＞70％)。发现当在4℃下以放射性同位素和免疫反应性的保留率为基础培养48小时时临床配制的放射性标记的缀合物在体外是稳定的。另外，当在37℃下的人血清中培养72小时时所放射性标记的缀合物是稳定的。在BALB/c小鼠体内进行的生物分布研究表明没有包括骨在内的异常组织沉积。对“标准”70Kg人估计的辐射吸收剂量与使用90Y-标记的2B8-MX-DTPA在进行中的临床试验中获得的那些结果相差无几。这些研究结果证实使用“混合与照射”(“mix-and-shoot”)方案生产的90Y-标记的2B8-MX-DTPA可以与使用常规HPLC方法制备的90Y-标记的2B8-MX-DTPA相比拟。对用于制备临床级放射性标记的缀合物的放大比例的方案的验证表明该方法具有再现性且所述产品可与使用目前HPLC方法生产的产品相比拟。这些前期临床研究结果表明可以将这种新型“混合与照射”(“mix-and-shoot”)方案用于制备适用于临床试验的99Y-标记的2B8-MX-DTPA。
优选实施方案的详细描述
实施例1.放射性结合-试剂盒和测定方法
I.概括
本发明的一个目的是设计用于制备111In和90Y-标记的2B8-MX-DTPA(分别为In2B8和Y2B8)的放射性标记试剂盒方案并且确立临床产品的释放规格。就放射性结合和结合抗原阳性SB细胞而言本放射性标记试剂盒方案具有再现性且证实了用于临床试验的该放射性标记试剂盒的适合性。建议将用于放射性结合和结合的In2B8和Y2B8释放规格分别确定为≥95％和≥70％。
II.简介
目前在临床试验中评价了用于治疗复发性B-细胞淋巴瘤的90Y-标记的鼠单克隆抗-CD20抗体(Y2B8)。钇同位素缺乏γ成分，这使得它不适于显象系统。因此，在用钇标记的疗法治疗前或治疗后，将111In-标记的2B8-MX-DTPA(Y2B8)用于估计患者体内的肿瘤位置和剂量确定。目前用于制备Y2B8和In2B8的称作“混合与照射”(“mix-&-shoot”)方法的方案生产了适合于临床研究的放射性标记的抗体。然而，对这种标记方法的简化加速了临床环境中的剂量制备。
新型放射性标记试剂盒优选由下列4种成分组成：1)以2mg/mL溶于少量金属生理盐水中的2B8-MX-DTPA；2)用于将放射性同位素溶液调节至适宜的标记pH的50mM乙酸钠；3)配制缓冲液(pH 7.4的含有7.5％人血清清蛋白和1mM DTPA的1×PBS)；4)10mL空玻璃小瓶(反应瓶)。将全部成分检验为无菌且不含致热原。
该报告概括了对这种简单且易于使用的并且产生具有≥95％放射性结合率和可接受的与抗原阳性细胞结合的保留率的放射性标记试剂盒进行的验证。对临床产品建议了释放测试规格。
III.用于放射性结合的材料和方法
A.放射性标记试剂盒中的试剂
1. 2B8-MX-DTPA，IDEC；批号082395RM2
2. 50mM乙酸钠、少量金属、IDEC；批号082395RM3
3.配制缓冲液(pH7.4的含有7.5％人血清清蛋白和1mM DTPA的1×PBS)，
IDEC，批号082395RM1
4.反应瓶，10mL，IDEC
B.材料和设备
1.Biodex技术控制放射性结合试剂盒(Biodex Tec-ControlRadioincorporation Kit)，目录号151-770
2.手套：无粉
3.无菌聚丙烯注射器
4.无菌注射器针头
5.密封的小试管：1.5ml
C.
方法
1.
使用放射性标记试剂盒制备Y288和In288
制备试剂盒试剂并将其装入玻璃隔片小瓶中。用无菌注射用水(WFI)冲洗硼硅酸盐小瓶(2或10mL)并在填充试剂前高压灭菌。用无菌WFI冲洗冲洗丁基橡胶隔片并在使用前高压灭菌。以手工操作方式装填试剂并将其置于Class 100室内且使用USP方法测试热原性和无菌性。
a.
In288的制备
添加的试剂：
1.铟-[111]：氯化物盐、不含载体、溶于HCl。
注意：
1.优选使用无菌技术进行所有步骤。
2.在使用前应使放射性标记试剂盒成分达到室温。
3.在完成下列步骤9的8小时内应将终产品给予患者。
In288放射性标记方案
步骤
1.如下计算加入到反应瓶中的111InCl3的体积：
a.以mCi/ml计的放射性标记时的放射性浓度：
C0＝校准时的放射性浓度(参见制造商的分析证书)。
Δt＝时间改变(正数是在校准后，负数是在校准前)。
b.加入到反应瓶中的111InCl3的体积：
2.如下计算加入到反应瓶中的50mM乙酸钠的体积：
添加的111InCl3的体积(步骤1b)×(1.2)＝所添加的50mM乙酸钠体积。
3.用乙醇擦拭反应瓶的隔片和50mM乙酸钠小瓶。使用1cc注射器将计算的50mM乙酸钠体积(步骤2)转入反应瓶中。
4.用乙醇擦拭111InCl3源的隔片。小瓶用固定了无菌0.2μm滤膜的针头开孔。使用1cc无菌注射器将所需体积(步骤1b)的111InCl3转入反应瓶中。通过反转
几次混合小瓶内容物。
5.用乙醇擦拭288-MX-DTPA小瓶的隔片。使用1cc注射器将1.0mL的2BS-MX-DTPA缓慢转入反应瓶中。通过反转几次混合小瓶内容物。
6.在环境温度下使反应进行30分钟±5分钟。
7.通过将添加的111InCl3体积(步骤4)、添加的50mM乙酸钠体积(步骤3)和添加的288-MX-DTPA体积(步骤5)彼此加和来计算反应混合物的总体积。
8.通过从步骤10中减去步骤7中计算的总量来计算加入到反应瓶中以获得10mL终体积的配制缓冲液体积。
9.用乙醇擦拭装有配制缓冲液的小瓶并给小瓶开孔。由于配制缓冲液密度的原因，使用固定有0.2μm注射器滤膜的针头刺入反应瓶。使用固定有合适计量针头的10cc无菌注射器将步骤8中计算的配制缓冲液体积转入反应瓶中。从反应瓶孔中拔出针头并通过反转几次混合小瓶中的内容物(终产品)。在进行“放射性结合测定”前将该小瓶至少培养5分钟。溶液的颜色为琥珀色且小瓶是充满的，从而证实加入了配制缓冲液。
10.使用为测定111In设定的适宜测试设备测定小瓶中终产品的总放射性。
11.立即将所述的终产品保存在2℃-8℃下以用于“结合测定”和“放射性结合测定”。
b.Y2B8的制备
添加的试剂：
1.钇-[90]：氯化物盐、不含载体、溶于HCl。
注意：
1.优选使用无菌技术进行所有步骤。
2.在使用前应使放射性标记试剂盒成分达到室温。
3.在完成下列步骤8的8小时内应将产品给予患者。
Y288放射性标记方案
步骤
1.如下计算加入到反应瓶中的90YCl3的体积：
a.放射性标记时的放射性浓度：
C0＝校准时的放射性浓度(参见制造商的分析证书)。
Δt＝时间改变(正数是在校准后，负数是在校准前)。
b.加入到反应瓶中的90YCl3的体积：
2.如下计算加入到反应瓶中的50mM乙酸钠的体积：
a.就溶于0.040M HCl的90YCl3(Amersham)而言：
90YCl3的体积(步骤1b)×(0.8)＝所添加的乙酸钠体积。
b.就溶于0.050M HCl的90YCl3(Nordion)而言：
90YCl3的体积(步骤1b)×(1.0)＝所添加的乙酸钠体积。
3.用乙醇擦拭反应瓶的隔片和装有乙酸钠的小瓶。使用1cc注射器将计算的50mM乙酸钠(步骤2)的体积(步骤1a或1b)转入反应瓶中。通过反转
几次混合小瓶中的内含物。
4.用乙醇擦拭90YCl3源小瓶的隔片。小瓶带有固定了无菌0.2μm滤膜的针头开孔。使用1cc无菌注射器将吸入了所需体积(步骤1b)的90YCl3转入反应瓶中。通过反转
几次混合小瓶内容物。
5.用乙醇擦拭2B8-MX-DTPA小瓶的隔片。使用3cc无菌注射器将1.5mL的2B8-MX-DTPA转入反应瓶中。通过反转
几次混合小瓶内容物。
6.通过将所添加的氯化Y-90的量(步骤4)加上所添加的50mM乙酸钠的量(步骤3)加上所添加的2B8-MX-DTPA的量(步骤5)来计算反应混合物的总体积。
7.通过从步骤10中减去步骤6中计算的总反应体积来计算加入到反应瓶中以获得10mL终体积的配制缓冲液体积。
8.用乙醇擦拭配制缓冲液小瓶并给小瓶开孔。由于配制缓冲液密度的原因，使用固定有0.20μm注射器滤膜的针头刺入反应瓶。使用固定有合适计量针头的10cc无菌注射器将步骤7中计算的配制缓冲液体积转入反应瓶中。从反应瓶孔中拔出针头并通过反转几次混合小瓶中的内容物(终产品)。在进行“放射性结合测定”前将该小瓶至少培养5分钟。溶液的颜色为琥珀色且反应瓶是充满的，从而证实加入了配制缓冲液。
9.使用为测定90Y设定的适宜测试设备测定小瓶中终产品的总放射性。
10.立即将所述的终产品保存在2℃-8℃下直到需要对患者给药为正。
11.免疫反应性检验：
使用1mL注射器以无菌方式从反应瓶中吸取出0.1mL并将其转入单独的1.5mL螺丝帽试管内。立即将该试管保存在2℃-8℃下以用于“结合测定”和“放射性结合测定”。
在IDEC Pharmaceuticals(San Diego，CA)，MD Anderson HealthCenter(Houston，TX)，Mayo Clinic(Rochester，MN)和City ofHope(Duarte，CA)进行放射性标记试剂盒方案的验证。由IDECPharmaceuticals在GMP条件下(按照联邦管理法规的良好生产条件)制备包括临床级2B8-MX-DTPA在内的所有试剂盒成分并确定它们是无菌和不含致热原的。
使用含有7.5％(w/v)人血清清蛋白(HSA；临床级；Baxter-Hyland)和1mM DTPA的1×PBS配制放射性标记的抗体。对各批验证样品进行的释放测试结果如下所述。
由5位操作者制备In2B8和Y2B8的各6批验证样品。将这些批样品如下命名并使用下列设备进行：
2B8：
#1：IDEC Pharnaceuticals
#2：IDEC Pharmaceuticals
#3：IDEC Pharmaceuticals
#4：MD Anderson Health Center
#5：Mayo Clinic
#6：City of Hope
YB8：
#1：IDEC Pharmaceuticals
#2：IDEC Pharmaceuticals
#3：IDEC Pharmaceuticals
#4：MD Anderson Health Center
#5：Mayo Clinic
#6：City of Hope
2.
冻干的SB和HSB细胞的制备
人细胞系SB(CD20-阳性)和HSB(CD20-阴性)获自美国典型培养物保藏中心并使用含有补充了2％谷氨酰胺的10％胎牛血清的RPMI-1640在T-烧瓶中培养它们。将培养物维持在37℃和5％CO2下。细胞一般每隔一天按1∶2分裂并以0.5-2.5×106个细胞/mL收集它们且存活率＞80％。使用血细胞计数器测定细胞浓度并通过锥虫蓝排除法测定存活率。
在环境温度下通过离心(在Sorvall离心机中以1300rpm进行)以0.5-2×106个细胞/mL收集细胞并用1×HBSS洗涤两次。将沉淀的细胞在含有1％(w/v)牛血清清蛋白(BSA)和10％(w/v)甘露糖醇(冻干缓冲液)的1×HBSS中重新悬浮至50×106个细胞/mL、将0.5mL分入1.5mL带有o-环垫片的聚丙烯离心管内并在30-60毫托下固冻干过夜。将装有冻干细胞的管储存在干燥的2-8℃下并用测定用无菌水再溶解；将装有在离心管中冻干的细胞的管与干燥剂一起储存。
3.
分析测定法
用于检验In2B8和Y2B8批量验证样品的分析方法如下所述。对各批验证样品进行下列测定试验：
1.使用冻干的SB细胞进行的结合测定试验；
2.使用Biodex试剂盒进行的Y2B8/In2B8的放射性结合测定试验。
a.
结合测定试验
由各操作者使用冻干的CD20阳性SB细胞按照下列分别用于In2B8和Y2B8的方案估计结合百分比。这些测定试验为证实放射性标记的抗体仍然将CD20识别为一种抗原提供了快速而有效的方法。还在一个临床部位上评价了CD20-阴性HSB细胞。按照上述“冻干SB和HSB细胞的制备”的方法制备冻干细胞并保存。
i.
In2B8的结合测定试验
添加的试剂：
1.铟-[111]-2B8-MX-DTPA
2.冻干的SB细胞；三支含有25×106个细胞/管的试管
3.冻干的HSB细胞；三支含有25×106个细胞/管的试管
4.无菌冲洗用水或无菌注射用水
5.稀释缓冲液(pH7.2-7.4的含有以0.2μm过滤并在室温下保存的1％牛血清清蛋白(BSA)和0.02％叠氮化钠的1×PBS)
6.放射性计数用玻璃或塑料测试管
步骤：
试验设定(非放射性部分)
1.获得三支装有冻干的SB和HSB细胞的试管。
2.向各管加入0.50mL体积的SWFI(无菌注射用水)并涡旋所述试管直至获得均匀混悬液为止。
3.4只1.5mL空离心管。向三支试管内加入0.50mL稀释缓冲液，使用不含细胞的管作为对照。
4.向另一只1.5mL离心管中加入.99mL稀释缓冲液；按照1∶100标记该试管。
5.获得加盖的50mL无菌聚丙烯管并向该管中加入10mL稀释缓冲液。
试验设定(放射性部分)
1.获得在2℃-8℃下储存的放射性标记的抗体。
2.用P20吸取0.01mL体积并加入到含有0.99mL稀释缓冲液(按1∶100稀释)的1.5mL离心管中。冲洗管尖并缓慢涡旋该管以便混合其中的成分。
3.从装有1∶100稀释液的管中用P200吸取0.20mL体积并加入到含有10mL稀释缓冲液的圆锥形管内。将该管中的内容物剧烈混合。
试验方案
1.将稀释的0.5mL体积的111In-MX-DTPA加入到所有管内。
2.给所有管严格盖紧盖并将各管内容物持续混合60分钟。
3.在环境温度下培养60分钟后，最低以2000g将所有管离心5分钟。
4.将0.75mL体积的各上清液转入适于计数仪器的管内。
5.使用γ计数器对各管内的放射性进行计数以用于调节背景。
ii.
Y2B8的结合测定试验
添加的试剂
1.90Y2B8-MX-DTPA
2.冻干的SB细胞
3.无菌冲洗用水或无菌注射用水
4.稀释缓冲液(pH7.2-7.4的含有1％牛血清清蛋白(BSA)和0.02％叠氮化钠的1×PBS)
步骤：
放射性标记的抗体样品的制备
1.获得在2℃-8℃下储存的放射性标记的抗体。
2.用P20吸取10μL体积并加入到含有990μL稀释缓冲液(按1∶100稀释)的1.5mL离心管中。冲洗管尖并轻度涡旋该管。
3.获得加盖的50mL无菌聚丙烯试管并使用10mL血清移液管将10mL稀释缓冲液加入到所述试管中。
4.从装有1∶100稀释液的管中用P200吸取35μL体积并加入到含有10mL稀释缓冲液的圆锥形管内。剧烈混合。
冻干细胞的制备
1.获得三支装有冻干SB细胞的管。
2.向各管中加入0.5mL的SWFI并将各管涡旋至获得单一细胞混悬液为止。
3.获得三支1.5mL空离心管，向三支管内加入0.5mL稀释缓冲液；使用不含细胞的管作为对照。
试验方案
1.将稀释的0.5mL体积的90Y2B8-MX-DTPA加入到各管内。
2.在确定严格盖紧盖后将各管置于混合器上端45分钟。
3.在环境温度下培养45分钟后通过微量离心5分钟使细胞沉淀。
4.将0.8mL体积的上清液转入到闪烁小瓶中。
5.向各瓶中加入闪烁混合物。
6.使用闪烁计数器测定各小瓶中放射性的量以调节背景。
b.
放射性结合测定试验
按照下列方案使用Biodex技术控制放射性层析试剂盒(BiodexTec-Control Radiochromatographic Kit)、通过瞬时薄层层析(ITLC)测定放射性结合百分比：
添加的材料和设备：
1. 111In-或90Y-放射性标记的2B8-MX-DTPA
2.用于对放射性TLC条计数的管
3.剪刀
4. 1cc无菌注射器
5. 26G无菌针头
6.γ计数器或闪烁计数器
7.移液器
步骤：
1.首先应阅读完整的Biodex操作手册。
2.按照试剂盒的说明书测试一式三份的各放射性标记的样品；展开一条/瓶。
3.为了在层析条上点放射性标记的样品，将移液器用于在原点上点样1μl。另一方面，可以将来源于与1cc无菌注射器连接的26G针头的小液滴点样。
4.使用合适的计数器即用于111In的γ计数器和用于90Y的闪烁计数器对各部分的活性进行计数以调节背景。
5.随后按照Biodex的说明书计算放射性标记的抗体的百分比。
IV.结果
表38和39中概括了对In2B8或Y2B8的各批验证样品的检测结果。
表38.Y2B8验证的释放测定结果
批号 放射性结合％ 结合％
1 99.5 78.6
2 99.3 87.0
3 99.4 85.9
4 99.2 81.8
5 99.2 79.6
6 96.3 80.8
平均值＝98.8 平均值＝82.3
标准偏差＝1.24 标准偏差＝3.4
％CV＝1.25％ CV＝4.2％
表39.In2B8验证批量样品的释放测定结果
批号 放射性结合％ 结合％
1 99.4 86.2
2 98.7 86.8
3 99.3 85.8
4 98.3 86.7
5 99.0 82.1
6 99.3 83.0
平均值＝99.0 平均值＝85.2
标准偏差＝0.43 标准偏差＝2.06
％CV＝0.45％ CV＝2.42％
V.讨论和结论
为了简化目前用于In2B8和Y2B8的放射性标记方法，开发了4-成分试剂盒。分别将乙酸钠和2B8-MX-DTPA的浓度降至50mM和2mg/mL以便使用注射器精确转移体积。优选将所有试剂盒成分装入带隔片的玻璃小瓶并在释放前通过IDEC测试无菌性和热原性，由此避免了对在临床部位上进行这些测试的需求。在所述部位上，使用无菌注射器和针头进行所有试剂的操作。因此，通常在放射药物学环境中发现的与无菌技术的结合确保了放射性标记的和配制的抗体适合于对患者给药。
通过使用不同批的各放射性同位素进行几次验证来评价用于In2B8和Y2B8的放射性标记方案的再现性和稳定性。就制备的6批验证用In2B8而言，结合范围在82.1％-86.8％、平均值为85.1％；放射性结合率值约为99％(范围在98.3％-99.4％)。就制备的6批验证用Y2B8而言，获得的结合百分比范围在78.6％-87.0％、平均值为82.3％。Y2B8的放射性结合率值平均为98.8％(范围在96.3％-99.5％)。这些结果共同证实了用于制备In2B8和Y2B8的放射性试剂盒方法的再现性和稳定性。以这些验证结果为基础，建议确立In2B8和Y2B8的放射性结合和结合的释放规格为≥95％和≥70％。
另外，由于在制备过程中使用的便利性和减少错误的可能性得到了提高，所以建议将使用冻干的CD-20阳性细胞得到的结合百分比和放射性结合率用于在临床部位上进行In2B8和Y2B8的释放测试试验。
用于总结的这些结果共同表明使用放射性标记试剂盒制备的In2B8和Y2B8适用于临床环境。另外，就两种放射性标记的抗体而言，确立释放规格，从而反映出由5位不同操作者进行的几种验证试验的结果。
实施例2.放射性结合率和结合率-试剂盒和测定方法
I.概括
已经在CHO细胞中克隆了命名为2B8的鼠抗-CD20单克隆抗体而产生了高度表达的细胞系。通过FACS分析和竞争性结合证实了用于CD20-阳性人细胞的CHO衍生的抗体的特异性。观察到了可以忽略不计的与人T-细胞的结合。使用竞争性结合测定方法将所述抗体对CD20-阳性细胞的亲和力测定为1.3×10-10M。使该抗体与螯合剂MX-DTPA而形成一种缀合物2B8-MX-DTPA，其免疫反应性的损耗可以忽略不计(亲和值为4.4×10-10M)。在8小时反应后达到如通过测定111In的放射性结合率所确定的最佳螯合剂缀合。对于在确保最高放射性结合率(≥95％)和免疫反应性可留率(≥70％)的pH和培养时间而言，使用90Y或111In的2B8-MX-DTPA的放射性标记方案是最佳的。就放射性结合率(≥95％)和与冻干和再溶解的CD20-阳性人细胞的结合率(≥70％)而言，建议了在临床试验中使用CHO-衍生的2B8-MX-DTPA制备的In2B8和Y2B8的释放规格。这些结果共同表明了CHO-衍生的2B8-MX-DTPA在用于临床试验中的适合性。
II.简介
在中孔纤维生物反应器中生产预先使用的2B8抗体。为了降低这种抗体的生产成本，已经将其进行了克隆并在CHO细胞中表达，从而产生了高度表达生产细胞系。本实施例描述了CHO-衍生的2B8抗体、缀合抗体(2B8-MX-DTPA)以及使用临床放射性标记试剂盒方案制备的90Y和111In-标记的抗体产品的体外特征记述结果。
III.材料和方法
A.
试剂
人细胞系SB(CD20-阳性)和HSB(CD20-阴性)获自美国典型培养物保藏中心并将其在使用含有补充了2％谷氨酰胺的10％胎牛血清的RPMI-1640的T-烧瓶中进行培养。将培养物维持在37℃和5％CO2下。细胞一般每隔一天按1∶2分裂并以0.5-2.5×106个细胞/mL收集它们且存活率＞80％。使用血细胞计数器测定细胞浓度并通过锥虫蓝排除法测定存活率。将有关各批细胞的特定信息记录在Notebook#1553和Ron Morena著的标题为“ Cell Activity Logbook 1995&1996”活页夹中。
在IDEC的生产工厂中的GMP条件下生产CHO-衍生的2B8。在少量金属生理盐水中将抗体配制为11.5mg/mL。通过SDS-PAGE测定抗体是同型的。按照PSBR-043在GMP条件下由CHO-衍生的2B8生产2B8-MX-DTPA并在少量金属盐水中将其配制成2mg/mL(批号0165A和0165B)。
药用级氯化111In商购自Amersham(U.K.)或Cyclotron ProductsInc.(Coral Gables，FL)。氯化钇[90]获自Amersham(U.K.)、Nordion International(Kanatta，Canada)或Pacific NorthwestNational Laboratory(Richland，WA)。在GMP条件下制备的MX-DTPA获自Hauser Chemical(Boulder，CO)。临床级二亚乙基三胺五乙酸三钠钙获自Heyl(Berlin，Germany)。TAG-NHS获自IGEN Inc.(Rockville，MD)。鼠抗-CD19珠商购自DynalInc.(Lake Success，NY)。山羊抗小鼠FITC-标记的F(ab’)2商购自JacksonImmunoResearch。
使用Chelex 100(BioRad Industries)或使用螯合琼脂糖(Pharmacia)通过使溶液过柱来批量处理要求除去污染的重金属的试剂。用无菌冲洗用水(SWFIr)稀释少量金属储备溶液。将溶液储存在无菌塑料容器内。
用于特定方法的其它试剂如下所述。
B.
材料和设备
1.Origen分析仪；IGEB Inc.型号1100-1000；IDEC#1492
2.Top-Count闪烁计数器；Packard，型号#A9912；IDEC#1329
3.γ-计数器；Isodata，型号#20-10；IDEC#0628
4.技术控制放射性层析试剂盒(Tec-ControlRadiochromatographic Kit)，Biodex，型号#151-770
5.冻干仪；Virtis Model Freezemobile 12；IDEC#0458
描述了用于特定方法的其它材料和设备。
C
方法
1.
冻干SB和HSB细胞的制备
如上所述培养细胞并在环境温度下通过离心(在Sorvall离心机中以1300rpm进行)以0.5-2×106个细胞/mL的细胞密度收集细胞并用1×HBSS洗涤两次。将沉淀的细胞在含有1％(w/v)牛血清清蛋白(BSA)和10％(w/v)甘露糖醇(冻干缓冲液)的1×HBSS中重新悬浮至50×106个细胞/mL、将0.5mL分入1.5mL带有o-环垫片的聚丙烯离心管内并在30-60毫托下固冻干过夜。将装有冻干细胞的管储存在干燥的2-8℃下并用测定用无菌水再溶解；将装有在离心管中冻干的细胞的管与干燥剂一起储存。
2.
FACS结合分析
使用流式细胞仪测定抗体与人B-细胞的直接结合。在冰上将增加浓度的抗体在pH7.2的含有1％(BSA)(结合缓冲液)中用5×106CD20-阳性(SB)或CD20-阴性(HSB)细胞培养30分钟。通过离心洗涤细胞、将其重新悬浮于结合缓冲液中并在冰上用FITC-标记的山羊抗小鼠F(ab’)2培养30分钟。在用二次试剂培养后，通过离心洗涤细胞并将其重新悬浮于含有1.1％(v/v)甲醛的1×PBS中以便固定细胞。使用流式细胞仪测定平均荧光强度。
3.
竞争性结合测定试验
使用ORIGEN电化学发光法(Leland和Powell)、通过与CD20-阳性SB细胞的竞争性结合来测定2B8和2B8-MX-DTPA的免疫反应性。从培养物中收集对数期SB细胞并用1×HBSS洗涤两次。用pH 7.2的含有1％(w/v)牛血清清蛋白的1×PBS稀释细胞。在某些实验中，使用用无菌水再溶解后的冻干细胞。
通过使用钌(II)三-联吡啶螯合剂(TAG-NHS)的N-羟基琥珀酰亚胺酯按TAG-NHS与抗体的摩尔比为15∶1培养CHO-衍生的2B8(批号165)来制备钌标记的微量抗体。在环境温度、避光条件下培养1小时后，用甘氨酸使该反应骤停10分钟。使用用1×PBS平衡的PD-10柱、通过大小排阻层析除去反应的TAG。使用Bradford蛋白质测定法测定蛋白质浓度。通过测定455nm处的吸收度来测定TAG的结合率。将TAG与蛋白质的摩尔比计算为3.0。
在12×75mm聚丙烯管内进行测定。用0.08μg/mL TAG-标记的CHO2B8、0.08μg/mL抗-CD19珠和167,000个细胞/mL在pH7.2的含有1％(w/v)BSA的1×PBS中培养不同量的竞争抗体(0.002-17μg/mL)。在环境温度下通过轨道混合培养3小时后，使用ORIGEN仪测定相对电化学发光(ECL)值。测定一式两份样品的平均ECL值并使用Kaleidagraph软件对竞争抗体浓度作图。对某些实验来说，将抑制百分比作图。确定竞争曲线并使用下列4-参数程序测定EC 50值
(产生最大结合的50％的抗体浓度)：
y＝((m1-m4)/(1+(m0/m3)Λm2))+m4；m1＝；m2＝；m3＝；m4＝
m0＝独立变量
m1＝以相对ECL单位计的0信号响应
m2＝曲率参数
m3＝以μg/mL计的EC 50
m4＝以相对ECL单位计的最大信号响应
使用Muller的方法由EC 50值和已知浓度的微量抗体计算平均亲和值。
4.
2B8-MX-DTPA的制备
以干燥粉末的形式提供螯合剂1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)并将其储存在干燥的-20℃或-70℃下。通过添加十分之一体积的50用M硼酸钠(pH8.6)将溶于少量金属生理盐水中的约3mg CHO 2B8所得到的溶液调节至pH8.6。通过添加溶于50mM硼酸钠(pH8.6)的MX-DTPA而以4∶1摩尔比的MX-DTPA与蛋白质培养10-11mg/mL的抗体。在环境温度下培养后(2-24小时)，使用Centricon 30旋转滤器、通过用少量金属生理盐水反复渗滤而从所述缀合物中除去未反应的螯合剂。
5.
In2B8和Y2B8的制备
如本文所述使用放射性标记试剂盒方案制备In2B8。将抗体的比活性标记为3mCi/mg并配制成0.2mg/mL。简单地说，将0.5-2mCi的氯化111In转入不含金属的离心管内并使用1.2X体积的少量金属50mM乙酸钠调节至约pH4.2。以2mg/mL将2B8-MX-DTPA加入到乙酸铟溶液中并在环境温度下培养30分钟后用pH 7.2的含有7.5％(w/v)人血清清蛋白和1mM DTPA(4％-6％终浓度的HSA)将放射性标记的抗体配制成0.2mg/mL。对所有样品测试放射性结合率、一式三份；数值＞95％。
还使用实施例1中所述的小比例形式的放射性标记试剂盒方案制备Y2B8。将抗体标记为比活性为15mCi/mg并配制成0.3mg/mL。简单地说，将0.5-2mCi的氯化111In转入不含金属的微量离心管内并使用1.2X体积的少量金属50mM乙酸钠调节至约pH4.2。以2mg/mL将2B8-MX-DTPA加入到乙酸90Y溶液中并在环境温度下培养5分钟后用pH 7.2的含有7.5％(w/v)人血清清蛋白和1mM DTPA(4％-6％终浓度的HSA)的1×PBS将标记的抗体配制成0.3mg/mL。对所有样品测试放射性结合率、一式三份；数值＞95％。
以加入到反应混合物中放射性的量为基准并参照对放射性同位素的分析证书计算放射性标记的终产品的放射性浓度。根据已知添加的抗体的量计算骤冷的反应混合物的抗体浓度。
为了进行评价pH对放射性结合率和结合率的影响的放射性标记动力学研究，通过添加可变量的50mM少量金属乙酸钠(0.8-2.2X体积的放射性同位素溶液)调节反应混合物的pH。
6.
In2B8和Y2B8放射性结合率的测定
使用由Biodex(技术控制放射性层析试剂盒(Tec-ControlRadiochromatographic Kit)；参见实施例1)生产的商购试剂盒测定终产品或培养样品中涉及缀合物的放射性的量(放射性结合率)。一般来说，按一式两份或一式三份用微量移液管点1μL测试样品并按照Biodex插入的说明展开。如下所述使用Isodataγ计数器或PackardTop Count闪烁计数器对玻璃试管中的平分的层析条计数放射性。用层析条上半部放射性的量除以上半部和下半部中发现的总放射性来计算放射性标记的结合率。将这一数值表示为测定的百分比和平均值。
7.
In2B8和Y2B8免疫反应性的测定
使用Lindmo等的方法并如上述实施例1中所述评价免疫反应性。
8.
In2B8和Y2B8直接结合测定试验
将如与本文所述相同的方案用于测定In2B8和Y2B8分别与CD20-阳性SB细胞的结合。如上所述制备和配制In2B8和Y2B8。为进行测定试验，用测定稀释缓冲液(pH7.2的含有1％(w/v)人血清清蛋白(BSA)的1×PBS)将In2B8和Y2B8样品分别稀释至40ng/mL和11ng/mL。
在37℃和5％CO2下将抗原阳性(SB)和抗原阴性(HSB)细胞维持在补充了10％胎牛血清的RPMI 1640中。在环境温度下通过离心(在Sorvall离心机中以1300rpm进行)以0.5-2×106个细胞/mL的细胞密度收集细胞(如通过锥虫蓝排除法测定的存活率＞90％)并用50mL 1XHBSS将其洗涤两次。将沉淀的细胞在预冷却的含有1％(w/v)人血清清蛋白(BSA)和10％(w/v)甘露糖醇的1×HBSS(冻干缓冲液)中重新悬浮至50×106个细胞/mL。以50×106个细胞/mL将细胞混悬液分入1.5mL带有o-环垫片的聚丙烯微量离心管内并在30-60毫托下固冻干过夜。将冻干的细胞储存在干燥的2-8℃下并用无菌测定用水再溶解。
使用无菌水将1.5mL聚丙烯管内冻干的SB和HSB细胞再溶解至50×106个细胞/mL。按一式三份将稀释的In2B8或Y2B8加入到细胞中并在环境温度下用立式圆筒混合器分别培养45-60分钟。在培养后，通过离心使细胞沉淀并如下所述通过Isodata γ计数器或PackardTop Count闪烁计数器测定细胞结合的放射性。通过从所添加的总放射性中减去未结合的放射性(上清液)来计算与细胞结合(B)的放射性。由不含细胞的试管内计数的放射性确定总放射性。通过将结合计数表示为总计数百分比来计算结合百分比。
9.
放射性测定
使用Isodata γ计数器将放射性结合样品计数1分钟。将计数器设定在100-500Kev的能量视窗且就使用111In的样品而言在使用前立即将背景调节至0。还将Isodataγ计数器用于对其上点有90Y的ITLC条进行计数。用于检测轫致辐射的能量视窗为100-1000KeV。
为了进行结合测定试验，将90Y样品转入24孔平板和MicroScint40混合物中并在Packard TopCount中使用最小和最大能量设定值计数1分钟。使用Isodataγ计数器将铟-[111]样品计数1分钟。将该计数器设定在100-500KeV的能量视窗并在使用前立即将背景值调节至0。
10.
In2B8和Y2B8临床剂量的释放规格
使用两批按照本发明制备并在GMP条件下提供的临床级2B8-MX-DTPA(批号为0219和0220)、通过制备各6种剂量的In2B8和Y2B8来确立放射性结合率和与CD20-阳性细胞结合率的释放规格。如上所述进行释放测定试验。
IV.结果
A.
CHO-衍生的2B8的表征
使用流式细胞术分析证明CHO 2B8直接与CD20-阳性SB细胞结合而不与CD20-阴性HSB细胞结合(附图34)。没有注意到人工无关同型(γ1k)抗体(S004)与SB或HSB细胞的显著结合。
在竞争性试验中使用ORIGEN化学发光检测系统评价CHO 2B8与CD20-阳性细胞的结合情况。在有钌标记的CHO 2B8示踪物存在的情况下使用增加量的抗体培养冻干和再溶解的抗原阳性SB细胞。结果证明CHO 2B8抑制与CD20-阳性细胞结合的程度与来源于中孔纤维生物反应器中的抗体(2B8-49)相同(附图35)。根据图和用于计算亲和平均值的Muller的方法(1980)确定EC50值。将CHO 2B8的亲和力测定为1.3×10-10M；得到的来源于中孔纤维生物反应器中的2B8抗体的亲和值为2.5×10-10M。正如通过缺乏与无关同型抗体S004的竞争所证明的，非特异性结合可以忽略不计。
B.
CHO-衍生的2B8-MX-DTPA的表征
使用与用于预先特征化的2B8-9相似的方案制备2B8缀合物(2B8-MX-DTPA)。使用约3mng的抗体和4∶1摩尔比的螯合剂与抗体进行反应。评价2、4、8、17和24小时的培养时间以便测定反应时间，从而得到可接受的与CD20阳性细胞结合的保留率和与111In的高放射性结合率。比较反应8-24小时的CHO 2B8与CHO 2B8-MX-DTPA缀合物的竞争性结合曲线是相似的，这表明结合过程不会显著改变所述抗体与CD20抗原的结合(附图36)。使用EC50值、根据图确定未缀合和缀合的抗体的亲和常数在2.3×10-10M-5.9×10-10M的范围(表40)。就8-24小时的缀合时间而言，放射性结合率＞95％(表30)。
表40.缀合反应时间对CHO 2B8-MX-DTPA的
放射性结合率和免疫反应性的影响
培养时间(小时) 放射性结合率(％) 亲和力(M)
0 ND 2.3×10-10
2 83.5 ND
4 90.5 ND
8 96.1 5.9×10-10
17 97.3 5.9×10-10
24 98.8 4.4×10-10
C.
由CHO-衍生的2B8-MX-DTPA制备的In2B8和Y2B8的表征
使用预先对中孔纤维生物反应器来源的抗体所述的小比例放射性标记试剂盒方案(实施例1)制备铟-[111]-标记的CHO 2B8-MX-DTPA(In2B8)。简单地说，在环境温度和指定的pH下用乙酸111In将缀合抗体(CHO-衍生的2B8-MX-DTPA；批号0165A)培养30分钟。用pH 7.2的含有7.5％(w/v)人血清清蛋白和1mM DTPA的PBS配制反应混合物。使用薄层层析对所配制的In2B8样品测试放射性结合率。使用冻干和再溶解的SB细胞测定In2B8与CD20-阳性细胞的结合情况。为了进行比较，在pH 4.2下用乙酸111In将由杂交瘤产生的抗体(2B8-49)制备的缀合物培养30分钟(预先对该抗体确定的条件)。
进行动力学研究以便确定产生与CD20-阳性细胞结合的最大保留率和高放射性结合率的标记条件。在环境温度和pH4.2下用乙酸111I将缀合抗体(CHO-衍生的2B8-MX-DTPA)培养指定的时间(表42)。
表41.In2B8放射性标记动力学：pH对放射性
结合率和与CD20-阳性细胞结合率的影响
反应pH 放射性结合率(％) 结合率(％)
3.0 97.7 85.3
3.7 98.5 83.9
4.0 98.6 84.1
4.3 98.0 84.0
4.6 98.9 83.4
对照(2B8-49) 99.3 86.5
表42.In2B8放射性标记动力学：培养时间对放射性
结合率和与CD20-阳性细胞结合率的影响
反应时间(分钟) 放射性结合率(％) 结合率(％)
pH2.9：15 97.2 85.3
30 99.1 85.2
45 97.2 84.8
pH4.6：15 99.0 87.2
30 97.2 86.8
45 99.4 86.3
对照(2B8-49) 99.4 87.8
结果证明：就pH 3.0-4.6范围和30分钟的培养时间而言，获得的放射性同位素的放射性结合率＞97％，同时将结合率维持在约为84％。就在pH2.9-4.6下反应的15-45分钟培养时间而言，放射性结合率和结合率值是不变的(表42)。结果与使用2B8-49抗体获得的结果相差无几(表41和42)。
在环境温度和指定的pH下通过用乙酸90Y培养缀合抗体(CHO-衍生的2B8-MX-DTPA)来制备钇-[90]-标记的抗体。用pH7.2的含有7.5％(w/v)人血清清蛋白和1mM DTPA的PBS配制反应混合物。使用瞬时薄层层析对所配制的Y2B8样品测试放射性结合率。使用冻干和再溶解的SB细胞测定Y2B8与CD20-阳性细胞的结合情况。为了进行比较，在pH4.2下用乙酸90Y将由杂交瘤产生的抗体(2B8-49)制备的缀合物培养5分钟(预先对该抗体确定的条件)。
进行相似的动力学研究以便评价90Y-标记的抗体(Y2B8)制品。就pH 3.9-4.7范围和5分钟的培养时间的放射性标记反应而言，放射性结合率＞96％且与CD20-阳性细胞结合的保留率＞80％(表43)。就pH 2.9-4.6范围和3、5和10分钟的培养时间而言，获得了相似的结果。然后在环境温度和pH4.2下用乙酸90Y将缀合抗体(CHO-衍生的2B8-MX-DTPA)培养指定的时间(表44)。结果与使用2B8-49抗体获得的结果相差无几(表43和44)。
表43.Y2B8放射性标记动力学：pH对放射性
结合率和与CD20-阳性细胞结合率的影响
反应的pH 放射性结合率(％) 结合率(％)
3.9 98.4 80.7
4.2 97.8 81.0
4.4 96.1 80.0
4.6 97.0 80.2
4.7 97.4 80.6
对照(2B8-49) 99.3 82.6
表44.Y2B8放射性标记动力学：培养时间对放射性
结合率和与CD20-阳性细胞结合率的影响
培养时间(分钟) 放射性结合率(％) 结合率(％)
pH3.9：3 97.0 82.0
5 98.9 82.1
10 99.2 82.3
pH4.7：3 97.2 82.5
5 96.7 81.8
10 97.6 81.5
对照(2B8-49) 99.2 84.2
使用Lindmo等的方法测定由CHO 2B8制备的In2B8和Y2B8的免疫反应性。在抗原过量的条件下使用固定量的In2B8或Y2B8培养增加量的新鲜采集的CD20-阳性SB细胞。对结合数据的反向图分析将In2B8和Y2B8的免疫反应性分别确定为80.6％和72.2％(附图37和38)。
D.
CHO-衍生的In2B8和Y2B8的释放规格
将两批临床级In2B8/Y2B8放射性标记试剂盒用于制备各6批的In2B8和Y2B8。使用目前用于临床试验中的小规模形式的放射性标记方案制备In2B8和Y2B8。对各批放射性标记的2B8-MX-DTPA测试放射性结合率和与CD20-阳性(SB)和CD20-阴性(HSB)人细胞的结合率。将这些结果概括在表45和46中。就所制备的6批In2B8而言，放射性结合率的范围在98.9％-99.3％、平均值为99.1％。与CD20-阳性细胞的结合率在81.9％-85.1％的范围、平均值为83.6％；与CD20-阴性细胞的结合率＜4％。就所制备的6批Y2B8而言，放射性结合率的范围在97.4％-98.7％、平均值为98.2％。与CD20-阳性细胞的结合率在81.4％-82.7％的范围、平均值为81.9％；与CD20-阴性细胞的结合率＜8％。
表45.使用放射性标记试剂盒方案制备的
CHO-衍生的In2B8的释放试验结果
结合率(％)
试验批号# 放射性结合率(％) SB细胞 HSB细胞
#1(批号0219) 99.1 81.9 2.8
#2(批号0219) 99.3 83.2 2.8
#3(批号0219) 99.2 83.6 3.7
#4(批号0220) 99.0 83.8 2.6
#5(批号0220) 98.9 84.1 2.6
#6(批号0220)
98.9 85.1 3.3
平均值＝99.1％ 平均值＝83.6％ 平均值＝2.9％
SD＝0.2％ SD＝1.1％ SD＝0.4％
表46.使用放射性标记试剂盒方案制备的
CHO-衍生的Y2B8的释放试验结果
结合率(％)
试验批号# 放射性结合率(％) SB细胞 HSB细胞
#1(批号0219) 98.7 82.1 7.4
#2(批号0219) 98.6 82.7 0.7
#3(批号0219) 98.3 82.2 7.2
#4(批号0220) 97.4 81.8 1.7
#5(批号0220) 97.6 81.4 2.2
#6(批号0220)
98.4 81.4 1.1
平均值＝98.2％ 平均值＝81.9％ 平均值＝3.4％
SD＝0.5％ SD＝0.5％ SD＝3.1％
V.讨论和结论
正如通过FACS和竞争性结合分析所证实的，在CHO细胞中克隆并表达的抗-CD20鼠单克隆抗体(2B8)(CHO-衍生的2B8)维持了对CD-20阳性人细胞的特异性。与人T-细胞的结合率最低。使用一种竞争性结合测定试验将所述抗体对人CD20-阳性细胞的亲和力测定为1.3×1010M。使用相同测定试验得到来源于中孔纤维生物反应器的2B8抗体的亲和值为2×10-10M。
使CHO 2B8抗体与MX-DTPA反应而形成一种缀合物2B8-MX-DTPA，同时维持合适的免疫反应性保留率。通过使用111In测定放射性结合率来确定螯合剂的最佳结合并在环境温度下的8小时培养后达到这一最佳结合。就相应于为确保最大放射性结合率和免疫反应性保留率的pH和培养时间而言，使用90Y或111In的2B8-MX-DTPA缀合物的放射性标记方案是最佳的。
几次制备In2B8和Y2B8的结果表明了用于制备临床剂量的放射性标记方案的再现性。以这些放射性标记结果为基础建议分别将放射性结合率和使用冻干CD20-阳性细胞的结合率的释放规格确定为≥95％和≥70％。这些结果共同表明了CHO-衍生的2B8和中空纤维衍生的2B8-49的可比拟性且证实了用于临床试验的CHO-衍生的2B8-MX-DTPA的适合性。
最后，本发明公开了一种称作“混合与照射”(“mix-and-shoot”)法的标记方法，它用于制备临床剂量的放射性标记的抗体，该方法可避免对目前使用的用以除去非蛋白质结合的放射性同位素的高效液相层析(HPLC)步骤的需求。这种简化的方案避免了繁琐的纯化步骤而维持了高水平的放射性同位素结合率(＞95％)和改善的免疫反应性可留率(＞70％)。当以放射性同位素和免疫反应性的保留率为基础在4℃下培养48小时时，发现临床配制的放射性标记的缀合物在体外是稳定的。另外，当在37℃下的人血清中培养72小时时，该放射性标记的缀合物是稳定的。在-BALB/c小鼠体内的生物分布研究表明没有异常组织沉积且在骨中没有显著累积。对“标准”70Kg人估计的辐射吸收剂量与使用90Y-标记的2B8-MX-DTPA在进行中的临床试验中获得的结果相差无几。这些研究结果表明使用“混合与照射”(“mix-and-shoot”)方案生产的90Y-标记的2B8-MX-DTPA可与使用常规HPLC方法制备的90Y-标记的2B8-MX-DTPA相比拟。对用于制备临床级放射性标记的缀合物的按比例放大的方案的验证表明该方法具有再现性且所得产品可与使用目前HPLC方法生产的产品相比拟。这些前期临床研究结果表明可以将这种新型“混合与照射”(“mix-and-shoot”)方案用于制备适用于临床试验的90Y-标记的2B8-MX-DTPA。
参考文献
将下列各参考文献引入本文作为参考：
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Claims (50)
1.一种用于放射性标记螯合剂缀合的抗CD20抗体的方法，该方法包括下列步骤：
(i)将螯合剂缀合的抗CD20抗体与含有放射性标记的溶液混合；
(ii)在合适的温度下将所述的混合物培养适当的时间期限以产生具有大于95％的放射性结合率、足够的特异性活性及大于70％的免疫反应性的放射性标记的抗体，使得可以将其直接对患者进行给药而不需进一步将放射性标记的抗体从未结合的放射标记中纯化；和
(iii)用配制缓冲液将标记的抗CD20抗体稀释成合适的浓度，用以将所述的放射性标记的抗体直接对患者进行给药而不需进一步将放射性标记的抗体从未结合的放射标记中纯化。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的螯合剂选自MX-DTPA、苯基-DTPA、苄基-DTPA、CHX-DTPA和DOTA组成的组。
3.权利要求2所述的方法，其中所述的螯合剂是MX-DTPA。
4.权利要求1所述的方法，其中含放射性标记的溶液在同螯合剂缀合的抗体混合前将其pH调至3-6。
5.权利要求4所述的方法，其中用低金属的乙酸钠盐溶液调节pH。
6.权利要求5所述的方法，其中乙酸钠的浓度为10-1000mM。
7.权利要求1所述的方法，其中所述的抗体是嵌合抗-CD20抗体。
8.权利要求1所述的方法，其中所述的抗-CD20抗体是2B8且所述螯合剂是MX-DTPA。
9.权利要求8所述的方法，其中所述放射性标记是90Y。
10.权利要求1所述的方法，其中所述的配制缓冲液含有生理盐水、辐射防护剂和未缀合的螯合剂。
11.权利要求10所述的方法，其中所述的辐射防护剂选自下列物质组成的组：人血清白蛋白、抗坏血酸盐、抗坏血酸、苯酚、亚硫酸盐、谷胱甘肽、半胱氨酸、龙胆酸、烟酸、棕榈酸抗坏血酸酯、次膦酸、甘油、甲醛化次硫酸钠、Na2S2O5、Na2S2O3和SO2。
12.权利要求10所述的方法，其中所述的未缀合的螯合剂是DTPA或EDTA。
13.权利要求1所述的方法，其中所述的放射性标记是氯化111In。
14.权利要求13所述的方法，其中111In标记的抗体的特异活性在2-3mCi/mg抗体的范围。
15.权利要求13所述的方法，其中所用的氯化111In的体积量为4-6mCi除以标记时的放射活性浓度。
16.权利要求13所述的方法，其中将约1ml的浓度为0.5-30mg/ml的螯合剂缀合的抗体与放射性标记溶液混合。
17.权利要求13所述的方法，其中将所述的混合物培养30秒-60分钟。
18.权利要求17所述的方法，其中将所述的混合物培养15-45分钟
19.权利要求13所述的方法，其中按照达到10ml-50ml最终总体积所必需的用量添加配制缓冲液。
20.权利要求1所述的方法，其中所述的放射性标记是氯化90Y。
21.权利要求20所述的方法，其中90Y标记的抗体的特异活性在10-15mCi/mg抗体的范围。
22.权利要求20所述的方法，其中所用的氯化90Y的体积量为10-50mCi除以标记时的放射性浓度。
23.权利要求22所述的方法，其中所用的氯化90Y的体积量为45mCi除以标记时的放射性浓度。
24.权利要求20所述的方法，其中螯合剂是MX-DTPA并将1-2ml的浓度为0.5-30mg/ml的螯合剂缀合的抗体与放射性标记溶液混合。
25.权利要求24所述的方法，其中将所述的混合物培养30秒-60分钟。
26.权利要求25所述的方法，其中将所述的混合物培养3-10分钟。
27.权利要求20所述的方法，其中按照达到10ml-50ml最终总积所必需的用量添加配制缓冲液。
28.权利要求1所述的方法，其中放射性标记的抗CD20抗体的免疫反应性测定为在结合试验中结合其靶细胞的放射性标记的抗体的分数，该结合试验包括下列步骤：
(i)混合并培养所述放射性标记的抗CD20抗体的一等分部分与CD20阳性细胞的至少一等分部分；
(ii)混合并培养与步骤(i)的等分部分相同的放射性标记的抗体的一等分部分及作为对照的与步骤(i)中CD20阳性细胞的等分部分相同体积的稀释缓冲液的一等分部分；
(iii)通过离心使细胞沉淀；
(iv)测定沉淀细胞上清液和对照中的放射性；和
(v)将细胞上清液中放射性的量与对照中放射性的量进行比较。
29.权利要求28所述的方法，其中所述的放射性标记是90Y。
30.权利要求28所述的方法，其中所述的抗-CD20抗体是2B8。
31.权利要求30所述的方法，其中所述的放射性标记是90Y。
32.权利要求31所述的方法，其中所述的螯合剂是DTPA。
33.权利要求28所述的方法，其中所述的抗体是嵌合抗-CD20抗体。
34.权利要求28所述的方法，其中所述的CD20阳性细胞是SB细胞，其以美国典型培养物保藏中心保藏号CCL 120保藏。
35.权利要求28所述的方法，进一步包括下列步骤：
(i)将放射性标记的抗体的一等分部分与CD20阴性细胞的一等分部分混合；
(ii)通过离心使所述的CD20阴性细胞沉淀；
(iv)测定沉淀的CD20阴性细胞上清液中的放射性；和
(v)将CD20阴性细胞上清液中放射性的量与CD20阳性细胞上清液和对照中放射性的量进行比较。
36.权利要求35所述的方法，其中所述的放射性标记是90Y。
37.权利要求36所述的方法，其中所述的抗-CD20抗体是2B8。
38.权利要求37所述的方法，其中所述的螯合剂是DTPA。
39.权利要求35所述的方法，其中所述的CD20阴性细胞是HSB细胞，其以美国典型培养物保藏中心保藏号CCL 120.1保藏。
40.权利要求1所述的方法，其中放射性标记的抗体的免疫反应性测定为在结合试验中结合其靶细胞的放射性标记抗体的分数，该结合试验包括下列步骤：
(i)将放射性标记的抗体的一等分部分与CD20阳性细胞的一等分部分混合；
(ii)将与步骤(i)等分部分相同的放射性标记的抗体的一等分部分及作为对照品的与步骤(i)中CD20阳性细胞等分部分相同体积的稀释缓冲液的一等分部分混合；
(iii)通过离心使细胞沉淀；
(iv)测定沉淀细胞上清液和对照中的放射性；和
(v)将细胞上清液中放射性的量与对照中放射性的量进行比较；
其中使用包含下列成分的试剂盒来进行所述的试验：
(i)一瓶固定的或冻干的CD20阳性细胞；
(ii)含螯合剂缀合的抗CD20抗体的瓶；
(iii)含配制缓冲液的瓶；和
(iv)放射性标记抗体的说明，
其中所述瓶中成分提供的量和浓度使得当根据试剂盒说明将其与放射性标记合并时，产生的放射标记的抗体具有大于95％的放射性结合率、足够的特异活性和大于70％的免疫反应性，由此在对人类患者施用时不需要进一步从未结合的放射标记中纯化所述放射标记的抗体。
41.权利要求40所述的方法，其中所述的放射性标记是90Y。
42.权利要求41所述的方法，其中所述的抗体是2B8。
43.权利要求42所述的方法，其中所述的螯合剂是DTPA。
44.权利要求1所述的方法，其中放射性标记的抗体的免疫反应性测定为在结合试验中结合其靶细胞的放射性标记抗体的分数，该结合试验包括下列步骤：
(i)将放射性标记的抗体的一等分部分与CD20阳性细胞的一等分部分混合；
(ii)将与步骤(i)等分部分相同的放射性标记的抗体的一等分部分及作为对照的与步骤(i)中CD20阳性细胞等分部分相同体积的稀释缓冲液的一等分部分混合；
(iii)通过离心使细胞沉淀；
(iv)测定沉淀细胞上清液和对照中的放射性；和
(v)将细胞上清液中放射性的量与对照中放射性的量进行比较；
其中使用包含下列成分的试剂盒来进行所述的测定试验：一瓶固定的或冻干的CD20阳性细胞；含螯合剂缀合的抗CD20抗体的瓶。
45.权利要求44所述的方法，其中所述的放射性标记是90Y。
46.权利要求45所述的方法，其中所述抗体是2B8。
47.权利要求46所述的方法，其中所述的螯合剂是DTPA。
48.权利要求1所述的方法，其中放射性标记的抗体的免疫反应性用竞争性结合测试方法测定，所述测试方法包括：
(i)制备钌标记的测试抗CD20抗体；
(ii)在单独的试管内，用固定浓度的固定的、新鲜或冻干的CD20阳性细胞在钌标记抗体存在时培养增加量的未标记的测试抗体；
(iii)以相对的电化学发光为基础测定各反应试管内钌标记抗体对细胞的相对结合量；和
(iv)以在各反应试管内检测的钌标记抗体对细胞的相对结合量计算测试抗体对细胞的亲和力。
49.权利要求48所述的方法，其中所述抗-CD20抗体是2B8。
50.权利要求48的方法，其中所述CD20阳性细胞是SB细胞，其以美国典型培养物保藏中心保藏号CCL 120保藏。
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