HU230516B1

HU230516B1 - Radioaktív jelölő készlet és kötési mérőeljárás

Info

Publication number: HU230516B1
Application number: HU1300275A
Authority: HU
Inventors: Paul Chinn; Ronald Morena; Michael Labarre; John E Leonard
Original assignee: Biogen Idec Inc
Priority date: 1999-03-01
Filing date: 2000-02-29
Publication date: 2016-10-28
Also published as: BRPI0008719B1; EE05650B1; UA78484C2; HK1131208A1; CZ20013126A3; AU3505200A; DK2112512T3; HK1045730A1; ME00782B; CA2362119C; YU61601A; CZ303262B6; IL145109A0; SK287745B6; DK1192463T3; PL352531A1; PL205780B1; EP2112512B1; NZ513788A; BG105957A

Description

Radioaktív j találmány antitest kötési mérőéijárásokra és radioaktív Ιοί ö 1 ö k é s z le bekre , . 1 i o f i 11 z á 1t sejt kész i t mén y e k re, reagense k r e és eljárásokra vonátkozik terápiás antitestek klinikai hatásos sasának tesztelésére tumorok és tumorsejtek kezeisse/leképzése célBB . Specifikusan a találmány szerinti készleteket olyan radicaktívan. jelölt antitest kenjugátumok előállítására és kiértékelésére használjuk, melyeket a BP35 B-sejt felszíni antigén („CD20·') megoélzásával B~.sa.jt limfóma tumorok kezelésére és leképzésére alkalmazunk.

Az összes publikáció és szabadalmi bejelentés referenciaként a találmány részét képezi ugyanolyan terjedelemben, mintha mindegyik publikációnál. vagy szabadalmi be jelentésnél spécifikusan -'s egyenként megjelöltük volna, hogy az referenciaként, a leírásba épül.

A gerincesek immunrendszere (például a főemlősöké, melybe az emberek, felmajmok, majmok, seb. tartoznak), számos szervből és sejttípusból áll, melyek abba az irányba fejlődtek, hogy hibátlanul és fajlagosan felismerjék az idegen miknocrganizmusokat („antigén'), melyek megtámadják a gerinces gazdát;, specifikusan kötőd fenek a z ilyen: idegen: miiroorgani ζη© sokhoz; és .megsemtsisat sék/eipusctit sah a.z: íIgen idegen mi kroorganizniusukaf..

A l.imföc-iták valami.at más sejttípusok alapvető: fentossásgüak^ az immunrendszer számára. A limfocíiákat a csecsemőmirigy, lép. ás a csontvelő (.felnőtt) termeli, és az emberek (felnőttek; keringési rendszerében jelen lévő összes fehérvérsejt körülbelül 30%—át képviselik.

A limfocipáknak, két fő szcbpopulációja van; a T-sejtek és a B-sejtek. A T-sejtek a felelősek a sejtközvetitett immunitásért, míg a B-sejtek az antitest-termelésért felelősek (humoraiis immunitás) . Mindeméi lett a T-sejbekre és a B-sejtekre úgy tekinthetünk, hegy azok kölcsönösen függnek egymástól - egy jellemző imreunválaszban a T-sejtek akkor aktiválódnak, amikor a T-sejt<. v €3 a»ü '-i t' i n i -’-mz v a _K a f<$ hisz: t o k ampa t1 b i 1 i t á sí. k omp 1 ez (Μ H C) g 11 kép r o t e i n j: e i h e z k öt o dn e k egy antigénprezentáló sejt felszínén; az ilyen aktivácié biológiai médiatárok (,<interleukinek’) felszabadulását okozza, mely a B-sejteuet lényegében arra stimulálja, hogy differenciálódjanak, és az antigén ellen antitesteket („immunglobulinok; termeljenek.

A gazdában minden B-sejt különböző antitestet expresszál a felszínén ~ tehat egy B-sejt egy antigénre specifikus antitestet fog kifejezni, míg egy másik B-sejt egy eltérő antigénre specifikus antitestet fog expresszálni. Következésképpen a B-sejtek meglehetősen sokfélék, és ez a sokféleség alapvető fontosságú az immunrendszer számára. Emberekben mindegyik B-sejt az antitest molekulák hatalmas számát (azaz körülbelül lü~löm képes termelni. fe ilyen antitest-termelés jellemzően megszűnik (vagy jelentősen leesökkenj , amikor az idegen antigén sereiegesitődött. Esetenként azonban egy adott B-sejt proliferáeiója változatlanul folytatódik; az ilyen prolíferáció „B-sejt limfemánafe nevezett iá kot ere óményez hét

A T sejtek és B sejtek is tartalmaznak sejtfelszíni fehérjékét,; melyeket, a differenciáciö és az azonosítás „markerei - ként.

d„- no . γ m humán S-sejt markét a csak a humán Βlimfccitákra kori át o z c dió antigén, melyre „CD2ö-ként.

ία vetkezünk.

A CD20 a körai-pre-B-sejt-fej lőidés alatt fejeződik ki, és a p1a zma s e jt-d iffe r®nelá sióig fe nnma rád.

A CD2ü molekula az aktivációs folyamaiban különösen egy olyan lépést szabályoz, mely a sejtciklus beindításához és a deftereno iá ci óha z szükséges, és általában nagy mértékben fejezőóik ki a neopla.szt.ikus („tumoros } B-sejvekben. A definíció szerint a CD20 a „normális B-sejteken valamint a „malígnus B~ sejteken is jelen van, azaz azokon a B-sejteken, me X ye kn e k. nem proliferációja B-sejt lim.f ómához vezet.

Tehát a CBzÖ felszíni antigén magában foglalja annak a lehetőségét, hogy Bsejt límfómák „megcélzósara szolgáljon.

Lényegében az ilyen célbavétel a következűképpen általánosítható: A S-sejtek CD2 0 felszíni antigénjére specifikus antitesteket egy betegbe például beoltjuk. e- az and-C > in, . specifikusan kötődnek a (látszólag} normális és malignus Bsejtek CD2Ő sejtfelszíni antigénjéhez; a CD2B felszíni antigénhez kötött suti-022 antitest a neopíasztikus B-sejtek megsemmi sítéséhez és kimerítéséhez vezethet. Továbbá, olyan kémiai szerek és radioaktív jelek konjugálhatők az anti-CDÍO antitesthez, melyek magsam isitik a tumort, úgy hogy a szert specifikusan például á heoplasztikus B-sejtekhez „szállítja . A módszertől függetlenül az elsődleges cél a tumor megsemmisítése: a spéci fi kas módszert az adott, alkalmazott anti-CL2C antitest határozhatja

X meg, és Így a CU2G antigén megcé 1 sásárak lehetséges módszerei j e 1 e n t ő s en vá 1t o z ha t n a k.

Például mar beszámoltak ilyen, a CD2C felszíni antigén célbavételére tett kísérletekről. állítólag 155 egér monokInná 11 s antitestet (egy anti-CDit antitestet; adtak be a B-sejt limfómás betegeknek folyamatos intravénás infúzióval. Arról számoltak be, hogy az 1F5 rendkívül nagy mennyisége (2 gramm) volt szükséges a keringő tumoráé jtek kimerítéséhez, és az eredményekről azt írták, hogy ,, átmenetik voltak. [ éress et al., „Monoc lónál. Antibgdy 1F5 {Antl-CD2G) áerotherapy of Humán B-Cell Lympkomas ₍. Blood S9/2, 584-591 (1981)).

Evvel a módszerrel kapcsolatban az a potenciális probléma áll fenn, hogy a nesz-humán monoklcnális antitesteknek (például egérfélék mumpklónál is antitestjelnek) jellemzően hiányzik az effektor funkciójuk. Azaz ezek többek között, képtelenek komplementtől függő 1 isist közvetíteni, vagy lizalni a humán célsej beket az anti.testfuggő^; sejtes toxioitáson vagy az Fc-receptor által közvetített fagocitózison keresztül. Továbbá a nem humán monoklonális antitesteket a humán gazdaszervezet idegen fehérjeként ismeri fel; ezért az ilyen antitestek ismételt beadása immunválaszok kiváltásához vezethet, melyek káros hiperszenzitivitásí reakciókhoz. vezetnek. Az egérféléken alapuló monoklonális antitesteknél azt gyakran Humán Anti-Egér Antitest válasznak vagy „Ö..AMA válasznak rievezrk. Továbbá ezeket az idegen antitesteket a o vm uctx m ' r ~ »t~ a ' ) x. g ezek végeredményben semlegesítődnek, mielőtt elérnék a célhslyükét, A llmfociták és limfómasejtek velük szUl.etet.ten érzékenyek a radiotsráprára. Tehát a rosszindulatú E-sejtek vonzö célpont~ ja.·. a radlGimmunteráplának ÍRIT) több okcöl is; a rádloaktIván jelölt antiteste.k ionizáló sugárzásának lokális emissziója elpusztíthatja a célantigénnel (például CDzO-szal: rendelkező vagy anélküli sejteket az. antigénhez kötött antitest közvetlen, közelében·; a mélyre hatold sugárzás, azaz a béta-sugárzók megakadályozhatják azt a problémát, hegy az antitestek korlátozottan tudnak bejutni a vastag vagy véretekkel gazdagon ellátott tumorokba; és így a teljes antitest-mennyiség szükségletet lecsökkent hetik. A rádiósuk1idők radioaktív részecskéket tócsáiénak ki, melyek a celluláris I)NS-t azon a ponton károsíthatják, ahol, a sejtes javító mechanizmusok képtelenek a sejt életének folytatását lehetővé tenni,, ha a célsejtek tumorok, a radioaktív jel gyógyító hatással elpusztítja a tumorsajteket. A radioaktívon jelölt antitestek,, a definíció szerint, egy radioaktív anyag alkalmazását foglalják magákban, mely óvintézkedéseket kíván a betegtől (azaz a lehetséges csontvelő transzplantáció a lányátólí valamint az egészségügyi dolgozótól (azaz nagyfokú óvatosságra vau szükség, amikor radioaktivitással dolgoznak? .

Tehát az egyik módszernél az egérféle monoklonális antitesten azon képességének javítására, hogy a B-sejt rendellenességekre hatással legyenek, egy radioaktív jelet konjugáltak az antitesthez úgy, hegy a jel vagy a tozin a tumor helyére íokalízálódjon. Tozinokat (azaz kemoterápiás szereket, mint például dnz.e>rnbie.in.t vagy mítomicin C-ü; szintén konjugáltak már az antitestekhez. Lásd például a WO Si/ülílíó számú nemzetközi közzétételi iratot (1992. május 14-én publikálva) .

A ,,kenjugált antitestek altemativáj aként „kínéra antitesteket, azaz olyan antitesteket fe j késztettek ki, melyek két vagy β

X több faj (például egér és -ember | részeit tartalmazzák. Bgér/humán kínéra antitesteket hoztak létre, és kimutatták a szül-5 egér antitest kötési jellemzőit és a humán konstans régióhoz kapcsolódó effektor funkciókat. Lásd például Cabilly et. al., 4 816 567 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírását; Shoemaker et al., 4 978 745 számé amerikai egyesült -államokbeli szabadalmi leírását; Seavers et al... 4. 97 5 369 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírását, és Boss et al. 4

816 397 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírását, melyek mindegyike referenciaként a leírásba apui. Altalánosságba n ezeket a kínéra antitestekül, úgy állítják elő, hogy egy már létezd egérféle hibridómákból kivont öNS-böl genomlális génkönyvtárat készítenek íNishimura et al., Cancer P.esearch 47, 999(1987)]. A könyvtárat ezután olyan nehéz- és kcnnyáláncokból származó variábilis régió génekre szűrik, melyek helyes antitestfragmantum újrarendeződés! mintázatot mutatnak. A klónozott variábilis régió géneket ezután egy, a megfelelő nehéz- vagy könnyűlánc humán konstans régió gén klónozó kazettáit tartalmazó expressziós vektorba ligálják. A kimére géneket ezután egy kiválasztott se j tvonalban, általában egérféle ni.elómato r a1ban fejez i k ki.

Például Liu A. Y. és munkatársai az dny CDlü elleni, hatásos Fc-öcpendens biológiai aktivitással rendelkező, egér-humán kiméra monoklónál is antitest előállítása című művében hú. Immun. 139/12, 3521-3526 19877] egy CD2ö antigén ellen irányuló egér/humán kínéra antitestet írnak le. Lásd még például a WQ 88/94936 számú nemzetközi közzétételi Iratot is. Azonban nem közeitek információkat ezen ez irodalmi helyen a Liu-féle kínéra antitestek alkalmazásának sem a hatásosságáról som a praktikusságáról a B-sejt rendellenességek kezelésénél.

Megjegyzendő, hogy az ?.z vitro funkcionális mérőeljárások (például komplement-függő lizís („CDC), antitest-függő sejtes oitotozicltás ·„ADCC-, stb.) nem képesek eredendően megjósolni semelyik antitestnek sem azt a képességét, nagy ín vivő elpusztítják-e vagy kimeritik-e a specifikus antigént kifejező célsejtet. Lásd például Robinson és munkatársai munkáját [„Chimexlmouse-human suti-carcinoma antibodías that mediate differemt anti-tumer cell bíol.ogical activitles (Kiméra egér-humán anxíkareínóma antitestek, melyek eltérő anti-tumorsajt biológiai aktivitást közvetítenek}, Rum. Antlbon. Hybrídomas 2, 84-92 (1991;

(nem kimutatható ADEC aktivitással rendelkező kimére egér-humán antitestH. Ezért az antitestek potenciális terápiás hatékonyságát valójában csak in vivő kisér létezéssel lehet mérni.

Ebből a célból a CS/4-5 313, Öd/475 815 és 08/478 697 számú függő amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentések, melyek referenciaként teljes Perjede2műkben a leírásba épülnek, radioaktivan jelölt aazi-7D20 konjogát unokát ismertetnek B-sejt li.mfóma tumorok dfagncsztkaí „leképzésére a terápiás antitest beadása előtt. A. „In238 konjugátum egy humán CD20 antigénre specifikus egér mcnoklonális antitestet, a 288-t tartalmazza, * 7: <: mely az índium[111Ϊ-hez tln¹'} egy hl funkcionál is kelátképzőn, azaz az MX-DTEA-n (dietiléh-triamin^pentaecetsav} át kapcsolódik, mely az 1-í zctíocianáto-bamzil··· 3-metí l-ETEA. és az 1-metil-

3-'izutioö:ianáto-benzil-DTrA 1:1 arányú elegyér tartalmazza. Diagnosztikai radiönuklídként azért választották az inidiumí 111 } t, mert az gamma ^sugarakat bocsát ki, és elsődlegesen, leképző szárként történ© slkalmszasár fedezték fel.

A kelátképzőkre és kelátképző-konjugáiunckra vonatkozó szabadalmi leírások a szakterületen jól ismertek. Például Ganzom 4 331 175 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírása zabosa eressz szubsvtituált dietilén-triamin-pentaeeetsav kelátokra és ezt tartalmazó fehérjakonjugátumokra és az előállítási eljárásaira vonatkozik. Gansow 5 öö'9 053, 5 245 692, 5 286 350 és 3 .1.2.4 4 71 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírása szintén, többszörösen szubszti tuált DTPA. kelét okra vonatkozik. Ezek a szabadalmi leírások referenciaként teljés terjedelmükben a leírásba épülnek.

A 08/405 813, 08/4'75 815 és 88/478 367 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelöntésekben a kelátképzés elősegítésére specifikus bifunkcionális kelátképzőt választottak, mivel ennek nagy az affinitása a három vegyértékű fémek iránt, és megnővekedett tumor/nem tumor arányokat, csökkent osont általi felvételt és a radionuklíd nagyobb mértékű in vivő fennmaradását biztosítja a ©élhelyeken, azaz a δ-sejt limfóma tumor helyein. Mindemellett más bifunkcionális kelátképzők is ismertek a. szakterületen, és ezek szintén jótékony hatásúak lehetnek a tumorterápia során.

A 08/47 51 813, 08/475 815. és 08/478 367 számú ameri.kai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésekben radioaktívat jelölt terápiás antitesteket is ismertetnek a B-sejt limfómák és tumorsejtek elpusztítására. Pontosabban, s^v 3 P8 ugyanezt a 2B8 auti-humán CD20 egérféle monoklonális antitestet tartalmazza az ittrium-[9G] {^?'ó;-hoz kapcsolva ugyanezzel a bifunkcionális kelátképzövel. Ezt a rádión©ki időt hasonló okok bői választottak ki a terápiára. A.z 'Ύ €4 órás fé lélet ideje elegendően hosszú ahhoz, hogy lehetővé tegye az antitest felhalmozódását a: tumornál, és a ^T-töl eltérően, ez egy tiszta, na-gy energiájú bátasugarzó, melyhez lecsengésekor nem kapcsolódik gammasugárzás, és lúO-lööO sejt átmérő tartománnyal rendelkezik, A kiszűrődő sugárzás minimális mennyisége lehetővé teszi az jelölt antitestek ambuláns beadását. Továbbá a sejt elpusztításához nem szükséges a jelölt antitestek bejutása, és az ionizáló sugárzás lokális kisugárzása letál is a cél-antigén nélküli szomszédos tumorsejtekre.

Mivel a ' 1 rad-ionuklidot ugyanazt a hí funkcionális kelátképnő molekulát, az MX-DTPA.-t alkalmazva kapcsolták a 2BB antitesthez, az ¥2Bú kenj agátum ugyanazokkal az előnyökkel rendelkezik, mórit amiket tettebb tárgyaltunk, például a radionuklid meghosszabbodott fennmaradásával a célhelynél {tumorj. Szemben a ''''Tn-nel ezt nem lehet -z-' “^Τκ.⁹ . í <.... r, z ‘-t jár vele gammasugárzás. Tehát egy diagnosztikai „leképző radionukiid, mint például a Tn egy tumor elhelyezkedésének és relatív méretének meghatározására alkalmazható a terápiás kimére

O.;T vagy “'d-jelölt antitestek tumorcsökkentés céljából történő beadás előtt és/vagy követően. Továbbá az indium-jelölt antitest lehetővé teszi dozimetriás mérés elvégzését.

Attól függően, hegy az antitestet mire kívánjuk felhasználni., azaz diagnoszcikai vagy terápiás reagensként,· más-más radioaktív jelek ismerték a szakterületen, és már hasonló célókra felhaszaálfák er eket. Tóidéul a klinikai diagnózis ben már alkuimazo11 radionuklidok köze tartozik a ^1, •j-rs ^s® ^:P .

I, I, Te, Ga valamint '‘la. Az antitesteket máz agy sor különbözei radionuklicdal is felölték a célzott immunterúpiában történő potenciális alkalma zás céljából [Reirersz et al.The nse of moncclcnai antibcdiy conjugates fór the diagnosis and tteatment of táncét (bönuklonális antitest könjugátumok alkalmazása rák diagnosztizál ásóra és kezelésem: Immunéi. leli. Bioi. 65, 111-1.25 (IS 87) j: ·. Ezek közé a rád ionok 11 dók közé tartoznak a ^;R« és ^0ί'6β valamint a ” Ύ, és kisebb mértékben a ^ΛΑ és a Cu. Az 1[131 l-t szintén alkalmazták már terápiás: célokra- Az 5 46ö 785 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi. leírás az ilyen radiolzotópok listáját biztosítja, és referenciaként a leírásba épül.

Ahogy a 06/475 813, 18/473 815 és 03/478 967 számú függő amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentések beszimolzsz róla, a radioaktíven jelölt Ϊ1Β8 kenjugátűm valamint a jelöletlen kimére anti-CDIG antitest jelentős tumorcsőkkenést okozott B-sejt 1 írniobiászt tumort hordozó egerekben. Továbbá az itt ismertetett humán klinikai kísérletek jelentőé E-sejt. kimerülést, mutattak a limfómás betegekben,· melyekbe infúzióval kirnéra antíCD20 antitestét juttattak be. valójában a kirnéra 268-t a közeimül t ben a nemzet első FEA által jóváhagyott rákellenes monoklönális antitestjének kiáltották ki Rltuxan' néven. Tehát legalább egy kiméri anti-CDSO antitestről kimutatták már, hogy eraptos 'ysag-'t ,%ζ„⁺ a 3-sejt llmfóma kezeléséiben.

Továbbá a 08/475 313 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, mely referenciaként a leírásba épül, a Ri tuxan'b egy kirnéra an.t.i-CD;20 egymás utáni beadasat ismerted, Indiámmal jelölt vagy Idríummal jelölt egérféle mcncklonális antitesttel, vagy mindkettővel. Bár az ezekben a kombinált tara piákban aikalmazdtt radioaktívat jelölt antitestek egérfélék antitestei, a. kiméra. anti-CDiO-szal történő késelés elegendően kimeríti a B-sejt populációt, égy, hogy csökken a MAMA válasz, ezáltal kombinált terápiás és diagnosztikai beadási módot tesz 1 ehetővé:.

Tehát a kombinált immunterápiának ebben az értelmezésében az egérféle antitestek különösen alkalmasak lehetnek díagnosztlkai reagensként. Sőt a 08/475 813 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben kimutatták, hogy az ittxiunsTtal jelölt - an ti -CDI 0 antitest hatásos dózisa a RituxarT beadása után elegendő (a? a megmaradt perifériás vér B~sejtek eltávolítására, melyeket a kínéra antí-CDzO antitest nem távoli tett el? jó} Esejt kimerítést indít el a nyirokcsomókból ; vagy ·;ο) B-sejt kimerülést indít sl a más szövetekből, lehat a radioaktív jeleknek a rákterápiás antitestekhez való konjugálása egy értékes klinikai eszközt biztosit, mely az ilyen antitestek potenciális terápiás hatékonyságának .mérésére, a kezelés lefolyásának nyomon követésére szolgáló diagnosztikai reagensek létrehozására és további olyan terápiás reagensek tervezésére használható fel, melyeket a kimére antitest kezdeti tumor-pusztító potenciái iának fokozására, alkalmazhatunk. Figyelembe véve egy anti-CDSö antitest bizonyított hatékonyságát a nemHodgkin limfóma kezelésében, és a lim.fociták érzékenységét, a radioaktivitással szemben, nagyon előnyös lenne, ha az ilyen terápiás antitestek kereskedelemben készlet formájában beszerezhetőek lennének, melyek egy radioaktív jellel gyorsan módosíthatók, és közvetlenül beadhatók a betegnek klinikai körülmények között.

Bár számos módszer és reagens létezik az antitestek radioak tiv jelölésének végrehajtására, hiányzik a szakterületen egy hagyományos hordozó ezeknek a reagenseknek a klinikai környezetbe vizesére, olyan módon, hogy azok könnyen előáilíthatóak és headhatóak legyenek a betegnek mielőtt a radioaktív jel jelentős le3' 7 · - -< v a: antitest radioaktív jel miatti jelentős lebomlása: megtörténne. Az értékes technológia kereskedelmi forgalomba hozása céljára szolgáló megfelelő eszközök hiányának az oka az, hogy gyenge a beépülés1 hatékonyság, ezt több ismert jelölő eljárással kimutattak már, és hogy utólagos oszlopon történő tisztításra van szükség a radioaktív jelölési eljárás után. Annak az oka, hogy késlekednek az ilyen készletek kifejlesztésével, részben az lehet, hogy korábban nem lehetett beszerezni tiszta, kereskedelmi forgalomban lévő radioizotőpokat, melyeket hatásosan, alkalmazhattak volna jelölt termékek létrehozására utólagos tisztítás nélkül. Másik lehetőségként talán az az oka annak, hogy ilyen készletek általában nem hozzáférhetőek, hogy jelenleg hiányoznak azok az antitestek, melyek képesek elérni a Rituzan'^::'-nak a limfómák kezelésére a humán betegekben: elért hozzájárulását vagy hatékonyságé t.

Például, ahogy a 4 63% 360 számú amerikai egyesült államokbeli .szabadalmi leírásban ismertetik, mely referenciaként a leírásba épül, a tudományos világban általánosságban úgy gondolják, hogy ahhoz, hogy egy radioaktív gyógyszer klinikai falhasználását felfedezzék, hosszú és fáradságos szeparációs és tisztítási eljárást kell végrehajtani. Valóban nem kívánatos a nem kötött radioaktív jel beinjektálása a hetesbe. A további tisztítási lépések szüksége miatt az antitestek radioaktív jelölési eljárása lehetetlen klinikai környezetben, különösen azoknak az orvosuknak a számára, akiknek sem felazereléstlk sem idejük nincs a saját gyógyszereik tisztítására.

Továbbá a radioaktívon jelölt fehérjék eredendően instabilak eh e t n e k, k ü 1 ö n ö 5 e n a z 0 k, ma 1 y a k e t rádió üti kas i z 01 óp o k k a 1, g<

mint például ''Y-naj jelöltek, melyek annál inkább hajlamosak károsítani az antitestet, minél közelebb kapcsolódnak ahhoz. Viszont ez a radiolízis a gyógyszer megbízhatatlan hatékonyságát okozza a radioaktív jel elvesztése és/vagy a cél antigén lecsökkent kötése miatt, és a denaturált fehérjére Irányuló nem kívánt .immunválaszukhoz vezethet. Az antitestek helyben történő jelölésére é s 11 s z t í t á s á r a s z c 1 g á 1 ó esz k Ö z ö k h 1 g n y a o a n a ki in i k a i o r vonóknak nem volt választásuk, vagy megrendelték a már jelölt terápiás antitestet, vagy nem a helyszínen jelöltették meg egy megfeleld berendezéssel, és a jelölést követően átszállították a betegbe történd beadáshoz. Az összes ilyen manipuláció megnöveli a jelölés és a beadás közötti, értékes időt, ezáltal hozzájárul a gyógyszer instabilitásához, igy tulajdonképpen csökkenti a radioaktív jelölő: készlet hasznosíthatóságát a klinikai környezetMások sikertelenül próbálkoztak olyan antitest radioaktív jelölési készlet kifejlesztésével, mely elég szakszerű lett volna ahhoz, hogy elkerülhető legyen vele az antitest külön tisztítási lépése. Például a_: Cytogen a. közelmúltban kibocsátott egy kereskedem eniben kapható készletet a I’AG-óz tumor-asszociált ollkcprcueln elleni egérféle monokiorális antitest radioaktív jelölésére. Azonban a Cytogen antiteste különösen alkalmatlan készlet készítményként, annak, köszönhetően, hogy hajlamos részecskéket kialakítunt a tárolás alatt, melyeket később egy te-X vábbi szűrési lépessel kell eltávolítani. Továbbá a Cytogen antiteste káros reakciókat okozott a bezagekben a HAMA immuuválaszoknak köszönhetőim.

Masok olyan radioaktív jelölő eljárásokat fejlesztettek ki, melyek alkalmasak olyan készlet formára, melyben nincs szükség egy külön tisztítási lépésre ÍR!chanson et al. , „OptImi zárion and batch produetiem of üTRA-labaled antibody kits tor routine őse xn “In inmunoscantogrsphy'' (DTPA-jelölt antitest készletek optimalizálása és nagy tételben történő előállítása ^‘In imeunszcintográfiábari való .rut in alkalmazáshoz; , Nuc. Med, Commun, 8, 347-356 (1987); Chinol és Hnatowlch, „Generatorproduosd ytzrium-(90j fór radioinmuntherapy (Generátor által előállított ittrium-(9G4 radioámmunterápíához) >31 Muci. Meo. 28 ( 9) , 1465-1470 (19S7:; ] , Azonban ezek az eljárások nem: képesek a beépülésnek azt a szintjét elérni, mint amit mi. elértünk a bejelentésben ismertetett élpárások alkalmazásával, melyek legalább 95%-os beepulági hatékonyságot eredményeznek. Egy Ilyen szinté beépülés pozitív irányban járul hozzá a megnovekedett biztonsághoz, mert gyakorlatilag· nem fogunk nem kötött, jelet bejuttatni a betegbe a kismértékű radínaktí.vitás-beépulés következtében .

A találmány szerinti készlettel végzett eljárások gyors jelölést tesznek lehetővé, mely hozzávetőleg fél óra alatt elvégezhető vagy egészen kevés idő, akár Öt perc alatt is, a jeltől függően. Mindeméilett a találmány szerinti, készlethez tartozó eljárás, több mint 95%-os jelölési hatékonyságú, ezáltal elkerüljük azt, hogy további tisztitásra legyen szükség. A további, tiszti tás elkerülésével a radioaktív jel féléletideje és az anÍA’⁵'*¹ .. -nme βά a :: Rím, Ή; m, m : a elólést végeztük,

A bejelentés olyan hagy»á.nyo-« készleteket és eljárásokat ismertet, melyekkel a diagnosztikai és terápiás antitestek repródukálható, megbízható és kényelmes módon ranioakttvan megjelölhetek és beadhatók egy betegnek, A találmány szerinti készletek az antitestek radioaktív jelölési eljárását egy zavarmentes, kellemetlenségek nélküli standardizált eljárássá változtatják, mely nagyban. segíti a betegek kezelési eljárását. Ezek a készletek a technika állásához képest előnyösebbek, mivel a terápeutikunok vagy diagnosztikunok jelölésére és beadására szolgáló: optimális paramétereket meghatároztuk, így a termékek árát lecsökkentettük, kivel a bejelentésben ismertetett készletek az adott jelnek megfelelő: optimális paramétereket biztosítják, egy adott jelhez tervezett készlet alkalmazása minimálisra csökkenti a kenniballrációt, mely például akkor fordul aló, amikor egy nem megfelelő készletez alkalmazunk egy adott jelhez. A k an.n i .b a 1 í z á c í 6 e 1. ke r ü 1 é s év a 1 visz on t op t ima 1 i s i e 1 ö I é s i :h.a t é konyságot is biztosítunk., di.ndemellezt a mindegyik készletben megtalálható eljárási útmutatók és a steril, pirogénmentes összetevők sekkel, jobban felhasználóbaráttá teszik az eljárást, mivel a reagensek sterilitásának, pixogenitásának vizsgálata, és a jelölés utáni tisztítás sikerülhető.

A találmány tárgya egy készlet, egy diagnosztikai vagy terápiás antitest radioaktív jelölésére egy betegbe történő beadás előtt, mely tartalmaz fii egy kelét képzővel kenj agáit antitestet tartalmazó fiolát, fi.i'j egy, a xadioaktivan jelölt antitest aha billzálására és beadáséra szolgáló késeitménypuffart tartalmazó fiolát, és (ili) használati útmutatót az antitest radioaktív jelöléséhez, ahol az említett fiola alkotórészeiét olyan mennyiségben és koncentrációban biztosítjuk, hogy amikor ezeket egy megfelelő tisztasági és aktivitású radioaktív jellel összekeverjük a készlet használati útmutatójának megfelelően, nincs szükség a jelölt antitest további tisztítására azelőtt, hogy azt az említett betegnek beadjuk. Továbbá na a készlet használati útmutatójának megfelelően és egy megfelelő tisztaságú és aktivitású rádióizotóppal végezzük a jelölést, ennek az izotópnak a beépülése több mint 95%-os mértéket érhet el, akár 93·%—et vagy többet .

A készletben lévő antitest legelőnyösebben egy antl-CD2ü antitest. Az antitestet olyan formában biztosítjuk, melyben egy bifunkelőnálla kelátképzőhöz kapcsolódik. Előnyösen az antitest MX-OTPA-hoz van kcnjugálva, de más kelátképzőket, mint például fenil- vagy benzil-konjugált úTPA-t, ciklche?:íl~OTPA-t, EDTA származékokat és DOTA-t is alkalmazhatunk.. Egy találmány szerinti kelát képző bármilyen kelátképző lehet, mely legalább bifunkcionális, azaz legalább két kötési hellyel rendelkezik (legalább egy hely egy fémion kelátképzésére és legalább egy hely egy fehérjeligandum kapcsolásához),

Az alkalmazott antitesttől függően a konjogait antitestet jellemzően Q,5-30 mg/ml koncentrációban, előnyösebben 2 mg/ml koncentrációban biztosítjuk. A koujugált antitest mennyisége az optimális: jelöléshez szükséges koncentrációtól és mennyiségtől függ majd a radioaktív jeltől függően. Mindemellett a konjugált antitestet egy olyan mennyiségben és koncentrációban biztosit17 *

juk, hogy a teljes mennyiséget uagyúk majd bele a reakcióiiolába. egy steril fecskendőt és fertőzésmentes módszert alkalmazva. Ez megnővekedett repxodukáíhatoságoü és könnyű alkalmazást tess lehetővé. Az itt ismertetett készletek összes reagense steril és pirogéneol mentes, és spécitikusan az egyszerű használathoz és ahhoz terveztük, hogy az antitest tesztelésétől közvetlenül gyorsan eljussunk a beadásig. Bizonyos jelek esetében a jelölés hatékonyságának vizsgálata lehet, hogy nem szükséges.

A készlet egyik különösen előnyös alkotórésze a. rádióiízis hatásaival szembeni stabilitást és a radioaktív jellel ellátott konjagáit antitest egy betegbe történő beadását szolgáló kész!tménypuffez. A készitménypuffer egy olyan gyógyászat ilag elfogadható hordozó, mely a jelölt antitest oldószereként és beadási pofférőként is szolgál. Noha bármilyen gyógyászatilag elfogadható oldószert alkalmazhatunk a terápiás vagy diagnosztikai antitestek betegbe történő beadására, a találmány szerinti készitménypuffer különösen alkalmas: radioaktivan jelölt antitestek beadására.

Például. a találmány szerinti készitménypnffer egy radioprotektiv anyagot, ment például humán szérumaIbumint (HSA) vagy aszkorbátet tartalmaz, mely minimálisra csökkenti az ittriunnak, és kisebb mértékben az Indiámnak köszönhétó zadiolizist. Egyéb radioprotektív anyagok is ismertek a szakterületen, és a találmány szerinti készítménypuffőrben alkalmazhatók, például szabadgyökkel rendelkező mentesítő anyagok (fenol, szulfátok, glutation, eisztein, gentizinsav, nikotinsav, aszkorbilpalettát, HGP(:0): H_g, g1í ner í η, n át rlom-forma 1de hi d-szu1f. οκ11át, NajMCy, NsíSjOj és SCb, stbi .

h-eg kell jegyesnűπk, hogy m ig a radioprotek1i v anyagakat az antitest megvédésére a rsdíollzissei szemben a készitménypofferben általánosan alkalmazzuk, lehetőség van további védelem elérésére: úgy, hogy rádlőerőtaktív anyagot teszünk a reakciőpufferbe is. Ezt általában nem tesszük meg előre, például a HSA-val, mert a fémek jelenléte miatt meggátolhatja a jelölési eljárást. Azonban „megzisztíthatjuk a HSA-t kelátképző gyantát alkalmazva, melyet szintén a reakciópuffar tartalmazhat. Az aszkorbát vagy más radioprotektiv anyag esetén szintén szükség lehet kezelésre a szennyező fémek eltávolítására.

A találmány szerinti kész 1tménypcffér a nem konjngált kelátképzőt feleslegben is tartalmazhatja. A. nem: konjógáit kelátképző--- tartalom célja, hogy ez a keiátképzo arra szolgáljon, hogy kiürítse a betegből a fehérje által nem kötött radioaktív jelet, és elérje a radioaktív jel kiválasztását, ezáltal csökkentve hogy a beteg csontjai a „csont-kereső' izotópokat, például a -t felvegyék. Például amikor a készlet antitestét egy DTPA. kaiátképzőhöz konjógái jak, a késsítménypuffér DTPA vagy más kólátképző feleslegét tartalmazhatja. A készítményppftért szintén olyan mennyiségben biztosítjuk, hogy a teljes mennyiséget lehessük be a reakcióilólába. Ahogy fentebb tárgyaltuk, ez az_: alkalmazást még inkább megkönnyíti, és növeli a reprodukálhatóságot, mivel a pontos mennyiségeket nem kell kimérni és bevinni.

Az egyik előnyös készítménypuffér foszfáttal pufferolt vagy fiziológiás sóoldatot, mely humán száramaIbumint és DTPA-t tartalmaz. A humán szérumalbumin előnyösen 1-zSl jtömeg/térfogat), előnyösebben körülbelül 7,5% (tömeg/térfogat? koncentrációjú, A DTBA koccantrációja előnyösen körülbelül 1 mM. A humán szérumai burain alternatívájaként aszkorbinsavat alkalmazhatunk, és ezt jellemzően körülbelül 1-100 mg/ml koncert rációba» használjuk. Mindeme llett a koncentrációk agy szélesebb tartományban is alkalmazhatők a beteg biztonságának veszélyeztetése nélkül.

A radioaktív jelöld készlet antiteste könnyen megjelölhető egy választott radioizctöppal egy bifunkcionális ke'lát képzőn keresztül a találmány szerinti eljárásokat alkalmazva. Ebben a tekintetben az egyszerűség érdekében a találmány szerinti késelet egy a radioizotóp oldat pH-jónak beállítására szolgáló puffért tartalmazó fiolát és a jelölés és a végsó xadioaktívan jelölt antitest készitménypufferbe történő újra szuszgenoálására szolgáló steril üveg reakciőcsövet tartalmaz. Jellemzően egy 10 mles reakciócső elegendő, de 5-.20 ml tárolására alkalmas csöveket is alkalmazhatunk. A puffén előnyösen egy fémben szegény nátriüm-aostar oldat 10-1000 mM, legelőnyösebben 50 mM koncentrációba».

A találmány szerinti specifikus készlet a 2B8-MA-DT5A MXDTPA-konjugált antitestet tartalmazza. A 2B8 egy anti-CD20 antitest, melyről kimutatták,, hogy hatással van a S-sejt kimerülésre a ümfómás betegeknek való: beadáskor. Azonban a szakterületen jártasak számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti radioaktív jelölő készlet optimalizálható más anti-CDIO antitestek vagy más olyan antitest radioaktív jelölésére, melyeket őTPA-hcz vagy más polivalens kelátképzőhöz konjuqéltünk, Az előnyös találmány szerinti készlet tartalmazhat legalább ti) egy olyan fiolát, mely MÉ-bTPA-kohjugált 235 antitestet tartalmaz oldatban vagy liöfilizálva (helyreállítás szükséges); és (íi) egy, a radíoaktívan jelölt antitest egy betegnek történő· beadásra szolgáló készítménypuffért tartalmazó fiolát. Az előnyben részesített készlet még tartalmazni fog (Ili! az izotóp pH-jának beállítására szolgáló paffért, és (ív) egy reakciócsövet. Alternatív lehetőségként és előnyösebben, a puffért a resket ócsőben biztosítjuk, ezáltal kiiktatjuk a puffét mérését és átvitelét, és megnöveli a készlet alkotórészek egyszerűségét, kenzisztencíáját és a sterilitását. Azonban más megvalósítási módokat is említhetünk, azaz, melynél, a paffért először .az izotóp fiolába tesszük, be, és a puffero.lt izotópot ezután visszük át a reakciócsőbe. Ebben az esetben a reakciöcsöben biztosíthat j uk a szükséges antitest mennyiséget. Alternatív lehetőségként az izotőp/puffer fiolája készíthető el olyan nagyra, hogy az megfelelő legyen ahhoz, hogy az antitestkenjugatúrnőt beletegyük, azaz közvetlenül a gyártó fiolájába. Ezzel elkerülhető, hegy reakclőcscre legyen szükség.

Ahogy fentebb leírtuk, egy másik előnyös készlet-elrendezés is a találmány körébe tartozik, melynél a reakció-cső· maga tartalmazza. a konjugált antitest szükséges mennyiségét (azaz 1 m.l a ⁴ mn-nél illetőleg 1,5 ml a ^Y-nál). Az antitestet egy olyan pufferben adhatjuk, mely biztosítja a specifikus kívánt izetöp szerinti megfelelő radioaktív jelölési pH-t (azaz 3-6-os értékű pH a '''In-nél és 3-ő-os értékű pH a ”''Y-nál; . Különoözó puffere··· két alkalmazhatunk az izotóptól függően (Így nátrium—acetácot a· ~^<;i-nál, nátrium-citrátot a ^In-nél) . A puffét pH-ja és összetétele szintén változhat a jelölendő ligandum kötésének természetétől függően (azaz a jelölő pepiidet ρΗ-3-nál kisebb alkalmazható pH-t is lehetővé tesznek). Lényegében ezután az izotópot közvetlenül a reakciócsőbe vihetjük, ahogy a készitménypuffért. A készlet alkalmazását két átviteli lépésre korlátozva tovább rtő a reprodukálhatóság^ és az egyszerűség, és tovább csökken a sterilitás· elvesztésének kockázata a készlet alkotórészeivel történő munka alatt.

A. találmány szerinti radioaktív jelölő készletek továbbá tartalmazhatnak egy ra. din izotópos fiolát, vagy a rádió izotópot egy megfeleld forgalmazótól külön. rendelhetjük meg. A találmány szerinti, előnyben részesített radíoizotópok a ^AxiIn-klo.rid^;. és a ^9v¥klorld HCl-ben, bár az ismertetett eljárásokat nem korlátozzuk ezekre az izotópokra. Egyéb, a leképzési alkalmazásokban használt raoionuklidok ismertek a szakterületen, például melyeket a. 4 -634 536, 5 460 785 és 5766 71 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások Írtak le, melyek referenciaként a leírásba épülnek,. AZ indium- [lllj különösen előnyös a B-sejt tumoafi.

rok leképzésére, és a bétasugárzók, mint például a különösen hasznosak radioterápiás: szerként. Más, erre és más célokra alku Ima s radlo i zo t óp okat, pé1dá u1 a1fa-súgá r zóka t i s a1 kaIma zha. o^k a_ ναι. 11 tol n. nj .ig-,ο^-1 chc r na-rna z ke ár\ep’. p'n<r-z.

A 087'475 §13 sorozatszámű amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bej elöntésben, ismertetett kombinált terápiás beadási mód megfelelő hatékonyságát figyelembe véve egy további készlet kiviteli alak a radioaktivan jelölt anti-CD2O antitest előtt, vagy után beadandó kimére antitest, úgy mint a Rituxan⁵' egy külön fioláját is tartalmazza. Araikor a kiméra antitestet a radioaktivan jelölt antitest előtt adjuk be, a HAHA immunválasz, mely általában: egy egérféle anti-CD20 antitest beadására adott válaszban fordulhat elő, jelentősen lecsökkenhet, ezáltal megnövelve a rac.i.caktivan megjelölt egérféle antitestek, terápiás alkalmazhatóságát. Sőt, amikor óiméra anti-CD20-t alkalmazunk a keringő b22 ►

sejtek kimerítésére, a ^χ^ίη-jelölt antitestekkel elért diagnosztikai képek sokkal tisztábbak lehetnek.

Az is nyilvánvaló, hogy á diagnosztikai radioaktívan jelölt antitest és egy terápiás radioaktívon jelölt antitest együtt a 1 kelme zható egy kombinált terápiás beadási módban. Ezt tekintve a diagnosztikai antitest a terápiás antitest előtt vagy után alkalmazható, hogy láthatóvá tegyük a tumor méretét, a kezelés élői; es Fboen a? esetben a találmány szerinti készlet a radioaktív jelölő antitestek és az alkalmazandó: specifikus radíuízötópók optimális pH igényeinek megfelelően spécitikusan kiszerelt. elkülönített, esetleg színkódolt puffért Idákat tartalmazhat. Egy ilyen, rendszer biztosítaná, hegy a megfelelő puffért alkalmazzuk mindegyik jelnél, és lehetővé tenné, hogy a klinikai orvos ugyanolyan könnyen végezze el a két antitest jelölését, mintha két készletet vett volna. Egy ilyen készlet hatásában két radioaktív készlet komponenseit egyesíti.

A találmány sz.eri.nti radioaktív jelölő készlet komponenseit megfelelő koncentrációban és pH-η biztosítjuk, úgy, hogy a sterilitás könnyen fenntartható legyen az antitest beadása előtt, és kevésbé legyen szükség további poffezekre vagy médiumokra. Mindemellett a szakterületen jártasaknak nyilvánvaló, hogy a reagensek néhánya helyben előállítható, sterilizálható és a sterilitásra teszd_ '*>-<·. -» . ·, ad ’án_? szerinti készlet több változata elképzelhető a vásárló anyagi lehetőségeitől, és kiváns á g á t ó 1 f ü g g ő e n .

A találmány szerinti készletet egy kelétképzővel konjugált antitest radioaktív jelölésére alkalmazhatjuk egy betegbe történő beadásra. A találmány szerint, egy ilyen eljárás általában a *

következőkből áll: (i) egy kelátképzővel kenjagáit antitestet egy nádiéizdöpot tartalmazó antitesttel keverünk össze; U-U ez elegyet megfelelő hosszú ideig megfelelő hőmérsékleten in subái jd: és (ül) a jelölt antitestet megfelelő kententrációjura hígítjuk Készítményedserben azért, hogy a radloaktivan jelölt antitestet közvetlenül be lehessen adni egy betegnek további tisztítás nélkül.

Legelőnyösebben az antitest egy anti-CDIO antitest, ás az a· - Tő’ vdest^- j d XIp* . Rt antitestet ?αεΓι.^^η megfelelő kelát.képzöhöz kenjugálhat jnk, azaz MX-DTPA-hoz, CHX9T?á-hoz, fenil- vagy banzil-OTrá-hez, DOTá-hcz, EöTA származékokhoz, síd, melyek közül az MX-DTPA-t részesítjük előnyben. Az. antitestkonjugáció elvégzésének módszerei a szakterületem jól ismertek fKozák et al ;19d); Mírzedeh et al. :(1990) ; Bxachbiel et al. (1966)].

ügy találtuk, hogy egy keIátképzőhóa konjugált antitest radioaktív jelölési eljárása jobban működik ott, ahol a radioaktív jelet tartalmazó oldat körülbelül 3,0 és 6,0 közötti pH értékre van beállítva, és előnyösebben körülbelül 1,2-es érzékre, mielőtt a kelátképző-konjógáit antitesttel összekeverjük. A pH beállítására különösen előnyös a ki s-fémtartalmh nátr ium-acet át, bár poffarokat is: alkalmazhatunk. Előnyösen a nátrium-acetát körülbelül lü-lOOO mb közötti koncentrációjó, és előnyösebben 59 mM kοncantráoíód.

Amikor a radiolzotőp In-klotid, az In-kíorid azon mennysege, mely egyetlen beadási dózis elöállitásáza alkalmazható, jellemzően körülbelül 5,5 mCl osztva a radioaktivitás koncénrrációval a jelölés időpontjában, A betegnek történő beadásra az *

^li:Ia jsllazző diagnosztikai dózisa körülbolüi 2-10 mCi. A pH beállítására alkalmazott nátrium—acetát mennyisége változik a nátrium- acetát koncentrációtól és az izotóp hordozó oldattól függően, és azért meglehetősen tág tartományban mozoghat. amikor a nátrium-acetán koncentrációba 5Θ mM, á pH beálló sásához szükséges mennyiség jel.lemzőan az alkalma zott '^dn-klorld mennyiségének 1,2-szerese, bár nagyobb mennyiségek is használhatók. Tisztában kell lenni azzal, hogy a nátrium-acetát HC1-hez vuszonyitott aránya számit, és az alkalmazott, nátrium-aeetát mennyisége a pufferben levő Hói mennyiségétől és koncentrációjától függően változik. Körülbelül 1 ml, körülbelül 2 mg/ml koncentrációjú kelátképzo-kunjugáit antitestet elegyítünk ezután a radioaktív jel - acetát oldattal, és az elegyet körülbelül 30 percen át, ca•'i srn ~α~Ί _ . k, re, -> ^oe i-· a antitest optimális: jelölésének eléréséhez. Ez az idő körülbelül 3Q másodperctől körülbelül 60 percig terjedhet. Ezután készítménypaffért adunk hozzá, olyan mennyiségben, mely a körülbelül 1Ü ml—es teljes végső térfogat eléréséhez szükséges.

Az antitest jelöléséhez szükséges optimális ide az antitesttől, az adott radioaktív jeltől és az adott alkalmazott konjégáramtól függően változik. A radíoaktivitási jelölésre biztosított idő optimál1 tálasában egy alaptényező a jelölendő reagens kalátképző/antitest aránya. Például a kelátképző/antltest aránynak elég nagynak kell lennie, hogy a beépülés terápiásán hatásos mennyiségét elérjük, azaz 20-95%-ot, a rádióizotéptől függően, de tűi magas sem lehet, mert az az antitest épségét és ímmunreaktivitását veszélyezteti. Ehhez agy bizonyos kiegyensülyozási eljárásra van szükség, mely néhány esetben, a kenj agáit kelátxépzö kzsebo mannyisécehez és hosszabb jelölési adóhoz vezethet .

Például a 2S9~nál és az MX-ETPá~uál felfedeztük, hogy a je.iö-

V.» A $ j: v lés a Y-nál Öt. perc alatt és az “‘In-nél harminc perc alatt hajtható végre ügy, hogy a radioaktivitás kívánt mértékű beépülését elérjük, a kelén képző és antitest csupán egy lá-1 mólarányánál. Ezért nem volt szükséges a kelét képzó-antitest arányt megnövelni, mivel a radioaktivitás egy kívánt, mértékét értük el. Sót nem volt előnyős a koháugált kelátképző mennyiségnek megnövelése, mivel ez hatással lehet az antitest imeunreaktivitására. Ezek a paraméterek más antitesteknél empirikusan meghatározhatók, hogy készleteket, úgymint a találmányban leírt, készleteket megtervezzük.

Amikor a radioaktív izotóp '“'l-klorid, az egyetlen beadási dózis előállítására alkalmazott '“'v-klorid mennyisége jellemzőéi; 10-50 műi közötti, és előnyösen 45 mCi osztva a jelölés időpontjában lévő radioaktivitás koncentrációval. A pH beállítására használt, nátrium-acetát mennyisége a nátrium-aoetát koncentrációtól és az izotóp hordozó koncentrációjától függ, és ezért széles tartományban mozoghat. Amikor a nátrium-acetát koncentrációja 50 mX és a ''“i-t 50 vií HC1 tartalmazza, a pH beállításához szükséges mennyiség jellemzően 1,2-sz.erese az alkalmazott klórra mennyiségének. körülbelül 1,5 ml, körülbelül 2 mg/ml kcncentráoiójü kelátképző-konjugált antitestet elegyítünk ezután a radioaktív jel ecetét oldatával, és az ehc,xot körülbelül 5 perese át, vagy annyi lómig infcubáljuk, mely elegendő az antitest, optimális jelölésének eléréséhez. Ez az idő körülbelül 30 másodperctől körülbelül 60 percig terjedhet. Ezután készitménypuffért adunk. hozzá olyan mennyiségben, mely a körülbelül lő _:ml-es telJ'··'· cl ->^r- < * - s: -'í>w_v

Előnyösen a találmány szerinti radioaktív jelölési eljárást az itt leírt készletet használva hajtjuk végre. Mindeme1 lets a szakterületen jártasak számára nyilvánvaló kell hogy lenyen, hogy az előnyben részesített komponensek és körülmények csupán elfogadható iránymutatók a találmány szerinti eljárás megvalósításához, és bizonyos mértékben megfelelő optimalizálással megváltoztathatók. Azok a körülmények, melyek eltérnek az előnyöstől, de még az eljárás célját megvalósítják, a találmány oltalmi körébe tartozónak tekintendők.

A találmány szerinti, radioaktív jelölő készletet együtt óiztosítbatjak azokkal a reagensekkel, melyek alkalmasak arra, hogy a radioaktív jelölés után az antitest kötési affinitását kényelmesen ellenőrizzük. Ebben az esetben a találmány szerinti készletet egy radíoaktívan jelölt antitest célsejtjével szembeni kötési százalékának meghatározására is felhasználhatjuk mielőtt az antitestet egy betegnek beadnánk. Azt is felismertük, hogy az ismertetett kötési mérőeljárási készlet általánosan felhasználható bármely antitest affinitásának vizsgálatára, melynél a tisztított antitest nem áll rendelkezésre.. Következésképpen a kötési mérőeljárás komponenseit egy külön készletként árusíthatjak.

Általánosságban egy kötési mérőéi járási és radioaktív jelölési készlet tartalmaz (i) legalább egy, a készletben lévő antitest által felismert antigént kifejező liofilíaált sejtek fioláját; (11) egy kelátképzővel konjugált antitestet tartalmazó fiolát; (fii; készítménypuffért tartalmazó fiolát, és (ív) hasznalati útmutatót az antitest radioaktív jelöléséhez, oly módon, hogy a radioaktívan jelölt antitest közvetlenül beadható .legyen soy betegnek, anélkül, hogy szükség lenne azt kővető tisztításra. Ahogy fentebb leírtuk, a radioaktív jelölési készletnél a készlet tartalmashat egy radioizotóp pH-ját beállító puffért tartalmazó fiolát és egy steril, üveg reakcióödövet, Előnyösen a puffan egy kis fémtartalmú nátrium-acetat oldat, körülbelül 10lüöOu m.l közötti koncentrációban, és az üveg reakciócső legalább 5 ml térfogatú.. Az antitest előnyösen egy anti-CDzü antitest, és a kelét képző előnyösen MX-DTPA. Más kelátképzőkei is alkalmazhatunk, ahogy korábban leírtuk. Az előnyben részesített konjugált antitest a 2.B8-MY-DTPA, bár bármilyen kelátképző-konjugált antitestet megjelölhetünk, és affinitását mérhetjük. A készítménypoffar foszfáttal pofférőit sóoldat, mely egy .radioprotekti v anyagot és nem kenj agáit kelátképzőt tartalmaz, ahogy fentebb leírtuk, és a rádióizotóp vagy benne van vagy γ V' Q··'.

rnrics, és előnyösen és 'Tn-klóríd vagy ''Y-klorzd, Más .rádió izotópokat is alkalmazhatunk a kelátképzőtől függően.

A ku) önhség a fentebb leírt kötési mérőéijárási/radioaktív jelölési készlet és a radioaktív jelölési készlet között az, hogy előbbi antigéu-pozitiv sejteket tartalmaz, melyek cálszuöszzrétként szolgálnak az ant.itest-affinitás tesztelésére. Amikor az antigén CDIT, előnyben részesített CDÜC-pczihív sejtek az SB sejtek TTCC CLL 120), de bármilyen CD20~pozitív sejtet alkalmazhatunk. A kötési mérőéijárási és radioaktív jelölési készlet továbbá antigén-negatív sejteket is tartalmazhat egy negatív kontroliként történő alkalmazás céljából. Előnyben részesített CD2Ö-negatív sejtek a HSB sejtek (ATCC CLL 120,1;, de bármilyen CT20-n«gstív sejtet alkalmazhatunk.

Természetesen a kombinált radioaktív jelölési és kötési mérőélj ár esi készlet tartalmazhatja még a klóéra aut.i-Cü20 antitest egy fioláját a jelölendő antitest mellett egy kombinált terápiás beadási mód. céljából, vagy a diagnosztikai leképzés előtt a perifériás E-sejtek kiürítésére. Ez a különálló antitest előnyösen Rituxan\ de bármilyen antitest lehet, melyről kimutatták, hogy tumorsejt pusztítást hajt végre. Valójában két eltérő típusú antitestet kombinálhatunk egy készletben, azaz két eltérő B-sejt antigén elleni antitestet, aszal a feltétellel, hogy a kombinált terápiás beadási .mód ugyanolyan típusú sejtek, azaz a B-sejt limföma megeelsására szolgál.

Ahogy a készlet komponenseit más antitestek jelölésére alkalmazhatjuk, az antitest affinitás tesztelésére más sejteket is készíthetünk a cél—antigéntöl függően. Azonban az anti-Cblű antitesteknél a találmány szerinti kötési mérőéijárási és radioaktív jelölési készlet különösen alkalmas olyan kereskedelmi készletként, melyben a célsejteket liofilizált formában biztosítjuk. Ez lehetővé: teszi az antitest hatékonyság ellenőrzősének egyszerű és rendszeres elvégzését, és nincsenék a szövettenyészet feltételeinek fenntartásával járó bonyodalmak és költségek. A licfiíizálh sejteket általában ü,ő és 50ü X 10^c sejt/fíoía alikvotokcan biztosítjuk a találmány szerint.

Az is lehetséges, hogy bizonyos helyzetekben előnyös, ha már radioaktívat jelölt antitesteket rendelünk meg, mely esetben kötési mérőéijárási reagensekre van szükség, hogy ellenőrizzük, hogy az antitestek megtartották-e kötési affínifásukat. Ebben az esetben a találmány egy kötési mérőeljárási készletet is bittó sít egy radioaktivan jelölt antitestnek a célsejtjéhez való százalékos kötésének meghatározására. Egy ilyen készlet tartalmaz legalább egy rögzített és/vagy Xiofilizált antígén-pozítív sejtet tartalmazó fiolát, és adott esetben antigén-negatív sejteket is tartalmaz, ahogy fentebb ismertettük, a kötési nérőeljáráshoz és a radioaktív jelölési készlethez. Másfelől nyilvánvaló tégy egy ilyen készlet változatai egy jelöletlen kontroll antitestet tartalmazhatnak a vásárló antiteste kötési speoifáfásának igazolására egy kompetitív mérőéijáráson keresztül.

Ismételten, amikor az antigén CD2Ö, a CDÜO-pozitív sejtek előnyösen EB sejtek ÍATCC CCL 120} és a CDzQ-negatív sejtek előnyösen MSE sejtek (ATCC CCL120.11 , melyeket líofilizált formában Cő .5-50 z ΓΟ'* sejt mennyiségű aiíkvotok formájában biztosítunk. Ebben az esetben az antitest előnyösen a In-nel vagy ^Y-nal jelölt 2BB MX-DTPA egy kon j aga túrna,

Tekintettel az itt tárgyalt további készlet kiviteli alakokra, hangsúlyozni kell, hoay a találmány szerinti radioaktív jelölési készlet és eljárás egyik előnye, hogy nincs szükség további tisztítási lépésre, és a radioaktivan jelölt antitest közvetlenül. beadható a betegnek, ezáltal értékes időt és me gnöve ke de 11 a n t itest-stabilitást nye rve, Ezé rt ki h a ng s ú1y e zzuk, hogy bár a. klinikai orvos számára kívánatos lehet a rádióaktívan jelölt antitest kötési speciflfásának és affinitásának tesztelése vagy ellenőrzése a beadást megelőzően, egy ilyen teszt előre elvégezhető az adott radíoizotópokkal, ha az antitest stabilitása és a radiolízis gátlása különösen fontos, mint például az ittriumnál. Azzal, hogy olyan készlet kiviteli alakokat biztosítunk, mellyel a kötési affinitás és speoifitás tesz->

telhető, semmiképpen sem állítjuk azt, Hogy az ilyen tesztek alapvetően szükségesek a találmány szerinti eljárásokban vagy készletekben. Egy ilyen antitest válídáciős tesztelése csupán egy választható lehetőség a klinikai orvos számára.

Úgy találtuk, a találmány szerinti kötési mérőéigárási készletekhez használt rögzített és Heti líráit sejtek előállítására a?: ka xtiatc·:z eljárás különösen alkalmas a sejtek kereskedelmi készletekhez történő előállítására. A sejteket a líofilízálás előtt rögzíthetjük, hogy javítsuk a szerkezetet/stabílátást. Nevezetesen, a találmány szerinti sejtek nagy reprodukálvitást mutatnak, amikor az antitest kötési mérőéijárásokban alkalmazzuk őket...

A találmány pontosabban liofilizált sejtek előállítási eljárását foglalja magában, mely során [íj centrifugálással sejteket gyűjtünk össze 0,5-2 x ló” ssjt/ml sejcsűrüségbeu; a sejteket legalább egyszer mossuk egy kiegyensúlyozott sóolóatban, úgymint HSSS-bén; (Ili) a pelletízált sejteket egy licfilizáciős puffétheh, mely egy hordozófehérjét és legalább egy oükortipust tartalmazó kiegyensúlyozott sóoldat, újra szuszpendáljuk; iív; az új raszuszpendált sejtek egy alikvutját egy mikrofugacsőbe vagy egy üvegfiolába_: kimérjük, és (v) a sejteket 12-96 órán át, előnyösebben 24-72 órán át körülbelül 20-60 mtorr-nál llofilzzálu. A e, garas tnlc^ta.u'' ^_cu\o^ olyan liofilizált sejtek előállítására, ahol az említett sejtek SB sejtek {ATCC COL Ízű) vagy HSE sejtek jATCC CCL 120.1),, de valószínűen más sejttipusüknál is alkálmáihátó. Előnyösen puffét bordozofehérjeként marha szérumaidamint tartalmaz 1% (tömeg/térfogat) koccant rációban, és mannítot tartalmaz 19% koncentrációban. mindemellett lehetsé31 geo, hogy más hordozótehérjék, úgymint a HSA, és más cukrok is alkalmazhatóak. .A sejteket körülbelül 1110 rpm-en végett ceritrifugálással gfújtjük össze, és HBSS-t Bank-féle kiegyensúlyozott séoldarj adunk hozzá. A sejteket általánosságban 5 κ 10⁶ sejt/ml koncentrációban szcsspendáljuk újra. Mindemellett a szakterületen jártasak számára nyilvánvaló, hogy a fenti körülményeket nemileg módosíthatjak a sejt életképességének jelentős veszélyeztetése nélkül. Mindemellett a fenti körülmények további, az eljárásnak a. sejtek nagyobb mennyiségét szolgáló optimalizálásával kiégészithetők, például tangenoiális áramlásos diari1trácxöval a sejtek liofilízácios pafférben történő kicserélésére.

A találmány szerinti kötési mérőéijárási készletet bármilyen, egy radioaktívon jelölt antitest kötési affinitásának mérésére szolgáló mérőeljárásban alkalmazhatjuk. Egy ilyen mérőeljárás szintén a találmány tárgyát képezz. Egy radioaktív antitestnek a célsejthez való százalékos kötődését meghatározó kötési mérőeljárás általánosan a következő lépéseket tartalmazza.: (1) egy radioaktívan jelölt antitestnek legalább egy alikvotját antigénpozitiv sejtek legalább egy alikvotjával keverünk össze; ξ 1 i; a radioaktivan jelzett antitest legalább egy, az ii) lépés alikvotjával azonos alikvotját kontrollként legalább egy, az. fíj lépés anti.gén-pozitiv sejtjeinek alikvotjával egyező mennyiségű higltási puffezzel keverünk össze; (ifi) a sejteket oentrifugálással pelletízáljuk; íiv) a pelietizált sejtek és a kontroll felülúszöjában mérjük a radioaktivitást; és ;.v) összehasonlítjuk a sejtfelülúszóban levő radioaktivitás mennyiségét és a kontroliban mért radioaktivitás: mennyisen., t <

Éppen ügy, ahogy a találmány szerinti radioaktív jelölési i ·;'ί . 'φ·γ készletek adott esetben In-kloridöt vagy Ή-kiéridőt tártálmaznak, a találmány szerinti kötési vétőéijárást jellemzően g 7 1

ΉζηΗ vagy .....Y-nal jelelt antitestekkel hajtjuk végre. Amikor a jel, a radioaktivitást gamma-számiálót alkalmazva mérjük. Amikor 'i a jel, a radioaktivitást szelne clláncos számlálót alkalmazva mérjük, bár gamma-számláló is használható.

A találmány szerinti kötési mérőeljáráshoz az előnyös antitest egy amti-CÓiö antitest, az antí-CDxö antitest előnyösen 2B8, ahol a 238 antitestet a találmány szerinti radioaktív jelölési készlettel jelöltünk meg. Azonban: bármilyen radioaktívat jelölt antitest tesztelhető, ha biztosítjuk, hogy az adott antigént expresszáló sejtek hozzáférhetőek legyenek. Amikor Cö20 az antigén, a mérőéijárás végrehajtására az előnyös sejtek az SB sejtek íATCC CCL 120), azonban a mérőéi járás bármilyen radioaktívan jelölt antitesttel ss megfelelő célsejttel is optímalízálható és végrehajtható,

A. mérőéijáráshoz alkalmazott hlgdrási p.mfernek fenn kell tartania az antitest kötődését, így az egy olyan fiziológiai puffét, mely egy hordozó fehérjét, például BSA-t tartalmazhat, hogy minimálisra csökkentsük a sejtekhez való nem specifikus kötődést. Sár egy hígítást puffért tartalmazó esd szolgál kontrollként., egy további kontrollt is hanta Imazhat az. assay, melynél antígén-negativ sejteket használunk. Ebben az esetben a kötési mérőeljárás a következő lépéseket is tartalmazza: (1) egy radioaktívan jelölt antitest legalább egy alí.kvot j át antigénnegatív sejtek legalább egy alikvotjával keverjük össze; (ii} centrifugái ácsai pelletizáljak az antigén-negatív sejteket; (ívj mérjük a radioaktivitást az antigén-negatív pelletizéit sejtek felülíiszógában; és (v) összehasonlítjuk az antigén-negatív sejtfeiülúszóban lévő radioaktivitás mennyiséget az antigén-pozitlv sejtfelölüszó radioaktivitásának mennyiségével és a kontrollal. Ebből a csőből kapott radioaktivitás összehasoul.itása a hígítása, puffét kontrollal az antigén-pozitív sejtekhez való w specifikus kötés mennyiségének mérésére szolgál.. Amikor CD20 az antigén, és a CD2Q-pozitív sejtek SB sejtek, a CD2u-negatlv sejtek előnyösen HSB sejtek (ATIC Cd 12Q . 1} .

Ahogy fentebb leírtuk, a találmány szerinti liofilizált sejtek egy egyszerű, hatékony és reproőukáIható standardot biztosítanak egy radioaktívan jelölt antitest hatékonyságának tesztelésére. Tehát a találmány szerinti kötési mérőéijárást előnyösen a kötési mérőeljárási készletben lévő liofilizált sejteket alkalmazva hajtjuk végre. Továbbá találmány szerinti radioaktív jelölési készlet a találmány szerintii kötési mérőéijázásokkal kombi nálható, ahol az antitestet először egy ke1átképző-konjagáit antitest jelölési eljárásával jelöljük, anouy a találmányban ismertetjük. Előnyösen a találmány szerinti czlsi mérőéig érést az itt leírt kötési mérőéijárási ás radioaktív jelölési készletek egyikét alkalmazva hajtjuk végre.

Lehet néhány eset, ahol az antitest affinitását tesztelni vagy ellenőrizni kell, amikor a radioaktív jelet meg nem kapcsoltuk hozzá.. Például bizonyos körülmények között, így hibakeresésnél, előnyös lehet az antitest kötési affinitásának a tesztelése a radioaktív jelölés előtt. Egy ilyen esetben a találmány magában foglal egy kompétitív kötési mérőéijárást egy tesztantitest egy célsejthez való affinitásának, mérésére, mely a következő lépéseket tartalmazza; (í) egy ruménlommal jelölt kont> A roll antitestet készítünk egy ugyanarra a:z antigénre specifikus ismert antitesttel; (ií) a tesztantitestet növekvő mennyiségben és a jdéletlen kontroll antitestet növekvő mennyiségben ínkubáljuk a rögzített koncentrációjú célsejtekkel és a rutén!un-jelölt antitest nyomnyi mennyiségével; ahol a teszt-antitest mindegyik tormentre dónál és a kontroll antitest mindegyik koncentrációnál kaiön-külön csövekben van; {111} meghatározzuk a kötés mennyiségét mindegyik reakciócsőoen relatív elektrokemilumineszcencia (EGL) alapján ORIGEN készüléket alkalmazva; és (ív) kiszámoljuk a teszt-antitant átlagos affinitás·! értékét. Az átlagos afflnitási értéket az EC5Ó értékekből és a: nyomnyi mennyiségű antitest ismert koncentrációiból számoljuk ki Mellár módszerével [J. Ixmnunologícal Methods 34, 345 (1980)] vagy más magfelelő módszerrel. Megjegyzendő, hogy ezt a mérőeljárást a radíuaktivan jelölt antitestek affinitásának tesztelésére is alkalmazhat juk, vagy bármilyen antitest tesztélésére;, ahal az antigént nem tudjuk tisztítani, és antigénforrásként sejtek szükségesek. A találmány rögzített, liofillzált sejtjeit használhatjuk célse jtekkéa t.

Amikor a találmány szerinti kenyéritív kötési mérőéijárást hajtunk végre az anti-CDzO antitestek affinitásának tesztelésére, a kontroll antitest 2B8 vagy más nem konjugált anti-CD2C> antitest lehet. A kontroll antitest egy kdátképzővel konjugált antitest lehat. A teszt-antitest szintén a kontroll antitest egy ke lát képző-kenj agát urna. lehet. Alternatív lehetőségként a tesztantitest egy másik anti-CDzO antitest lehet, melynek a zEú-cal összehasonlított,. CDkO-szal szembeni kötési affinitása számít. Mindemellett a mérési eljárás más spéciiÍrással rendelkező anti35 testek alkalmazására is átalakítható, feltéve hogy a megfelelő célsejt hozzáférhető.

A találmány szerije ti kompétitív kötési mércéi járásban az előnyben részesített célsejtek a CDiO-pozitiv sejtek, előnyösebbek az SS sejtek (ATCC oCL 120), és még előnyösebbek a találmány szerinti eljárással előállított újraszuszpendált líofilizált SB sejtek. Más módszerek alkalmazásával liofilizáit sejtek vagy rögzített sejtek is alkalmazhatóak. A rutániammal jelölt antitestet jellemzően egy olyan eljárással .állítjuk elé, mely során a kontroll antitestet a ruténium(Ili-tris-biplridin kelátképző d-nidroxi-szukcinimld észterével (TAG-KHS) inkubáijnk, bár az antitestek jelölésének más ismert eljárása is elképzelhető. A jelöléshez a kontroll antitestet és a TAG-MHS-z előnyösen körűibe isi 1:15 mó 1 a r á n y b an i nkubá 1 j ·.; k.

A találmánynak ezek és más aspektusai a kővetkező ábrákra, példákra és a találmány leírására hivatkozva világosan érthetővé válnak.

Az ábrák rövid issse etetése

1, ábra: A natív 238 iramunreaktivitását hasonlítottuk össze a kereskedelemben, beszerezhető B1 (Coulterj és a Len 16 (Bantun Dichanson) anti-CD2C antitesttel egy radiaimmun mérőéijárásban közvet len kompét falóval '~'L-vel jelölt Bl-t alkalmazva. Antigénporit ív SB sejteket (100 óOv'i adtunk V&B szűrőlemezek mindegyik férőhelyére; 10 ng radioaktivan jelölt Bl-t összekevertünk a jelöletlen kompét1tor különböző koncentrációival, és az elegyet adtuk a sejtekhez. Az antitesteket a sejtekkel inknbáltuk egy órán át környezeti hőmérsékleten; a meghatározásekat három példányban hajtattuk végre. Ezt követően a mérőhelyeket mostuk.

6 szárítottuk és a. -- ro z..o ^t roztuk. A bemutatott adatokat a háttér aktivitáshoz korrigáltuk, és a meghatározások három példányának átlagát vettük.

2. ábra: A nem konjugált 2BB-t növekvő mennyiségben analizáltuk a humán B-sejbekhez (SB; velő kötődésre FACS analízist alkalmazva. összehasonlításokat végeztünk agy kereskedelemben hozzáférhető auti-CDHü mpnukloíiális antitesttel (Bl'l és két irreleváns izotípusú antitesttel. Egér anti-egér Igd-FTTC Ffabin-t slkalmaztunk második reagensként, Az eredmények azt mutatják, hogy a 2B8 specifikus a CB20 antigénre, és nagyobb kötcoést mutat, mint a B1.

3. ábra; Humán B-sej tűket (SB) inkubáltunk növekvő mennyiségű

I-vei jelölt EBS-cal. Házon példányban mintákat inkubáltönk egy órán át, és a sejt kötött radioaktivitást meghatároztuk, miután a sejtek összegyűjtése céljából szűrtük a mintát. A Scatchard analízis lehetővé tette egy 4,3 x 10* M-ös látszólagos affinitás! kons tans kis zárni t ását,

4. ábra:: p natív 2B8, 2B8-Mh-DTPA és Bt immunreaktivitása. .A B1 antitestet radioaktívon jelöltük, ahogy azt a „Módszered részben ismertetjük. Tíz uanogramm radioaktlvan jelölt Bl-t összekevertünk « kompétltot növekvő koncentrációival, és az elegyet 100 000 antigén-poaitív SE sejtet tartalmazó V & P szűrőiémezek mérőhelyeihez adtuk; mindegyik meghatározást három példányban hajtottuk végre. Egyórás környezeti hőmérsékleten végzett inkubálás után a sejteket erőteljesen mostuk. Ezt követően a szűrőket szárítottuk és a hozzájuk, kapcsolódott radioaktivitást gamma-számlálóval határoztuk meg. Mindegyik értéket a háttérhez korrigáltok. Az értékek a három m&gnarározás átlagát tátják.

5. ábra: A 288 antitestet 10 mg/ml végső koncentrációra formuláitok normál sóoldatban, vagy ló mM glicin-nCl-t tartalmazó, 5,® pH érteké normál sóoldattan, /1 minták két példányát csa~ varkupakos fiolákba helyeztük, a fiolákat nitrogénnel túráztuk át, és lezártuk. A mintákat ezután 4*C-on vagy 3ö*C-on inkubáltük 12 héten át; a minták immunreaktivitását hetenként értékeltük ki. Nem figyeltük amg az; immunreaktivitás elvesztését egyik 2B8 mintánál sem a teljes 12 hetes vizsgálat során. Az 1. héten (5A. ábra;,, a 6, hétét (5B,. árra; és a 12, héten (5C. áb ra; mért iwunreaktlvitást ábrázoljuk.

H, ábra: Kötési mérőéi j?árás a ^In-nel jelölt 2B8-MX-D1BA immunreaktivá kásának meg ha tarozására, melyet 5ű mg/ml humán: szé-

ruraalfoumint	tartalmazó PBS-ben (pH—7,4) inkubáltunk (48 órás
inkábái ás) .	6A. ábra: A radicaktivan jelölt antitest konstans
mennyiségét	(ing/ml) ír<zcóitok az SB sejtek növekvő mennyisége-

ivei (20 x lö^O sejt/ml). A sejtekhez kötött radioaktivitás mennyiségét ícpm) a hozzáadott sejtssuszpenzió térfogatának függvényében ábrázoltuk. úB. ábra: A kötött radioaktivitás fe letti teljes, alkalmazott radioaktzvrzást ábrázoltuk. A lineáris extrapoláció lehetővé tette az. y-metszet kiszámit, ását (0,997).

Az y-metszet x löd reciproka egy lüő Bős immunreaktlvitási ér téket eredményezett nagyon nagy antigénfeieslegnél.

7. ábra: 'Ύ-nal jelölt 2B8-MX-DTPA SDS-PAG.P analíziséből kapott autoradiogrammok, mely mintát 4^:>C-on 7 5 mg/ml humán szérum·· albumint és 1 ml DTPa-t tartalmazó PBS-ben (pH^:::-7,4} inkubáltunk. A megjelölt időpontokban a mintákat 1-20%-os Trís-gliuin géleken elektroferet izéitűk nem redukáló körülményeket, és denaturáló h>

St rrr: t a '.k ik jz'u . A íuq;a\·?: ' u'. -uel 1-, 2.

és 10. μΐ-nél (5., 6. sáv) vittük fel. A géleket röntgenfilmze exponáltuk hozzávetőleg 15 percig környezeti hőmérsékleten, és le fény képe ztük.

8. ábra: '%-nal jelölt 2BS-MX-DTPA SpS-PAGE analíziséből kapott 0. időpontban vett autoradiogzamok denzitometriás: letapogatása, mely mintát 4“C-on 7 5 mg/ml humán szérumaIbumlnt és 1 ml DTPA-t tartalmazó PBS-ban. (pb-7,4) inkubáltunk. A mintát 4-201os Tris-gllcin gélen elektrofcretízáltuk nem redukáló körülményeket alkalmazva. A mintákat 5 pl-ben, 10 μΐ-ben és 20 μΐ-ben vittük fel a mérőhelyek két példányában. A gélt röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percen át környezeti hőmérsékleten, és a sávok egyikét egy denziturnékért használva szkenneltűk. .A radioaktivan jelölt konjugátüm csúcs 12. számé) relatív területe

96,2 1 volt.

s .·>

9. ábra: --γ-nal jelölt 2BB-MX-BTPA. SDS-PAGE analíziséből ka- pott 4S órás autoradlogrammok denzitometriás letapogatása, mely mintát i^C-on 75 mg/ml humán szérumaIbumínt és 1 ml DTPA-t tartalmazó PBS-ben. (pö=7,4) 1okúnál tünk. A mintát 4-202-os Trisglicin gélen elektroforetizáltuk nem redukáló körülményeket alkalmazva. A mintákat 5 pl-ben, 10 pl-ben és 20 μΐ-ben vittük fel a mérőhelyek, két példányában. A gélt röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percen át környezeti hőmérsékleten, és a sávok egyikét egy denzltométért használva szkenneltűk. A radloaktivan jelölt konjugátum csúcs (x. számú} relatív területe 11,5 % volt.

ló. ábra: ^mIn-nel jelölt 2BS-MX-DTPA SDS-PAGE analíziséből kapott sutoradicgrammok, mely mintát 4*C-on 50 mg/ml humán szérumai bum int tartalmazó PBO-ben (pH^7,Z: inkubaitünk. A mintát 4-

S· ·>

20i-os Tris-gllcin gélen alektroforet 1 zártuk nem redukáló körülményeket alkalmazva. A mintákat 5 pl-ben íl., 2. sáv) , 1G μΐ-ben \3., 4.. sav) és 2v pl-ben (5. és 6. sáv) vittük fel a mérőhelyek két példányában. A gélt röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percen át környezeti hőmérsékleten, és lefényképeztük. tMegjegyzés; 48 órás autaradiogrammot kantunk intene ifikáló: letapogatásokat alkaImáévá, mely egy intenzivebb jelet eredményez öaszehasonlitva a ü. időpontban felvett autoradiogramm-mal.,)

11. ábra: ^liJIn-nsl jelölt 2BG-MX-DTPA SbS-BAGB analíziséből kapott 0. időponté autoradiogrammok denzltometriás letapogatása, mely sántát 4°C-on FBS-ben (pn-7,4) 1.okúból tank, ami 50 mg/ml humán szárurnaIbumint tartalmazott. A mintát 4-20%-os Trls-glicin gélen elektrofesetizáltűk nem redukáló körülményeket alkalmazva, A mintákat 5 ul-ben, 10 μΐ-ben és 20 μΐ-ben vittük fel a mérőhelyek két példányában. A gélt röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percen át környezeti hőmérsékleten, és a sávok egyikét egy denzitométert használva szkenneltük. A radioaktívat jelölt konjngátum csúcs {3. számú) relativ területe 95,9 % volt.

12. ábra: ^án-nel jelölt 2B9-MX-DTBA SDS-PAGE analíziséből kapott C. időpontú autótadiogrammok danzitometriás letapogatása, mely mintát 4 °C-on BBS-ben ípH~7,4j inkubáltunk, ami. 50 mg/ml humán szérumaibumint tartalmazott. A mintát 4-20%-os Tris-glicin gélen elektroforetizaltuk nem redukáld körülményeket alkalmazva:. A mintákat 5 al-ben, 1G μΐ-ben és .20 μΐ-ben vittük fel a mérőhelyek két példányában. A gélt röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percen át környezeti hőmérsékleten, és a sávok egyikét egy denzitométert használva szkenneltük. A radioaktivan jelölt konjugátum relatív területe 96,.2 % volt (2., 3. és 4. számú osú csők egyesit ett t e x ül a t e 1p.

13. ábra: Humán szérumban 37'C-on inkubait '^í-nal jelölt 258-HX-OTrA SCS-rAGE-ool kapott attoradiögrawiok. A megjelölt időpontokban a mintákat 4-20% Tri s-gllcin géleken elektroforetiaáltnk nem redukáló körülményeket alkalmazva. A mintákat 5 pl-ben (1_:., 2. sáv?, 10 pl-ben (3., 4. sáv) és 20 altén (5. ás 6. sáv) vittük fel a mérőhelyek két példányában. A gélt röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percen át kornyez e t i hőmé r s é kie ten, é s 1e f ényképezt ük.

14. ábra: Humán szérumban 37C-on inkubált “''A-nal jelölt. 2S8-MX-ŐTPA SDS-ráGE-böl kapott 0. időpillanatban felvett autoradiogramm denzitomet rlá.s letapogatása. A mintákat 4-20% lris-g.li.cin géleken ele kor ufó réti zártuk nem redukáló körülményeket alkalmazva. A mintákat 5 ginben, 10 ul-ben és 20 pl-ben vittük fel a mérőhelyek két példányában. A gélt röntgen filmre exponáltuk hozzá vet őleg IS percen át környezeti hőmérsékleten, és a sávok egyikét denzitómétart alkalmazva szkenneltük. A. radioaktívat jelölt konjugátum csúcs (2. számú) relatív területe 97,9 % voi1.

15. ábra: Humán .szérumban Sl^C-on inkubált ^il0¥~nal jelölt 2B8-MX-D1PA 3DS-PASE analíziséből kapott 98 órás aútoradiogramm: denzitometriás letapogatása. A mintát 4-3ül-os Tris-glicin gélen elektroforetizáltuk. nem redukáló körülményeket alkalmazva. A mintákat 5 μΙ-ben, 10^: ul-beu és 20 μΐ-ben vittük fel a mérőhelyek két példányában. A gélt röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percen át környezeti hőmérsékleten, és a. sávok egyikét egy denzltoméiért alkalmazva szkenneltük. A radioaktív konjugátum csúcs )2. számú) relatív területe 94,74 volt.

'* i-

16. ábra: Humán szérumban 37°C~on inkubált “Ingnél jelölt 288 -MX-dPA SOS-dGZ-ből kapott autGradiogrammok. A megjelölt időpontokban a mintákat 4-20% Tr ís-glidn géleken ded rd eret dúltuk nem redukáló kőm élménye: két alkalmazva. A mintákat 5 μ 1-ben (d, 2. sáv;, IC μΐ-ben d, 4. sáv) és 20 pihen (5. és 6. sáv) vittük fel. A gélt röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percen át környezeti hőmérsékleten, és lefényképe ztúk.

17. ábra: Humán szérumban 37d-on inkubált *ⁱⁱIn-nel jelölt 2B8-MX-DTPA GDG-EAGE-ből kapott 0. időpillanatban felvett autoradiogramm dendtometríás letapogatása. A mintákat 4-20% Tris-glidn géleken elektröfcretizáltuk nem redukáló körülményeket. alkalmazva. A mintákat 8 pl-ben, 1G pl-ben és 20 pl-ben vittük fel a mérőhelyek két példányában. A gélt röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 1S-20 érán át környezeti hőmérsékleten, és a sávok egyikét denzltométett alkalmazva .szkennel tűk. A radioaktívon jelölt konjugátum csúcs (3. számé) rálátd területe 95,3 % vd t.

18. ábra: Humán szérumban 37^cC-on inkubált dn-nel jelölt 2B8-MX-DTFA SbS-PAGE analízíséből kapott 98 őrás autoradiogrammok densirometriás letapogatása. A mintát 4-28%-cs Tds-glidn gélen elektroforetizáltuk nem redukáló körülményeket alkalmazva. A mintákat 5 pl-beu, 10 μΐ-ben és 20 pl-ben vittük fel a mérőhelyek két példányában. A gélt röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 10-20 órán ár. környezeti hőmérsékleten, és a sávok egyikét egy denzitőrzésért alkalmazva szkenndtük> A radioaktív konjugátum csúcs ·3< számúd relatív területe 94,0% volt.

19. ábra: Jávái makákő majmoknak intravénásán minden 4d őrá bán injekciót adtunk, összesen hét injekciót; a beadott mennyiségeket bemutatjuk, A keringő T~ és B-sejtuk mennyiségét antiCDG-t (T-.se.jt), antl-Mc-igG-t (238), anzi-CDzO-t (Len 16), és anti-humán-Igő-t (B-sejt) alkalmazó EACS analízissel határoztuk meg. Semmilyen hatást nem figyeltünk meg a keringő T-sejtek mértékére, (a V csoport állatai egyetlen dózist kaptak).

20., ábra: A keringd 3-sejt mennyiségének megállapítása olyan állatukban, melyek 2B2-t kaptak, amit a 12. ábra rövid leírásában ismertetett f lucreszoenci.ásan jelölt antitesteket alkalmazó FAGS analízis követett. A IXI. és TV. csoport állatait nem követtük nyomon, mivel ezeket a 13. napon fájdaiommentesen megöltük.

21. ábra: Javai makákö majmoknak intravénásán *'T-2B8-MX ói Hol injekciót adtunk be, melyet klinikai minőségű 2BS-MA-DTFA-PÓ1 készítettünk, Az állatoknak minden 48. órában a fentebb bemutatott dózisokat adtuk be, összesen hét dózist., A 0., 2., 7., 10.,

14. napon a majmoktól vért vettünk, és kiértékeltük szérumkérniára, pematológiáru és a keringd S-sejt mennyiségére (a 10. napi szérumokat a B—sejt tartalomra nem elemeztük ki).

22.. ábra: A .2'0'8 egérféle anti-CD20 antitest kitisztulását a javai makákő majmokból ELISA-val határoztuk meg, miután egyetlen 10 mg/kg dózist tartalmazó injekciót adtunk be nekik, Ahogy az A mezőben bemutatjuk, az antitest hozzávetőleg a 4,5. nap fejeződött ki ú ti.-del. A 2&8 antitest és az MX-DTPA kon j u.gáturnának kitisztulását a BABB/c egerek keringéséből a B mezőben mutatjuk be. Az egereknek Írtra vénásan 25 pg natív vagy kenj egált 238-t adtunk be injekcióban, és vérmintákat vettünk különböző időpontokban az injekciót követően 264 órán át; a szérumot ezután ki-

3 elemeztük befogószerként SB sejteket alkalmazó enzimimmunoassayvei. A natív és a ken jógáit antitestek is S/75 napos kitisztulási értékeket mutattak.

33. ábra: IC BALB/o egér mindégyíkének 50 mg/ml HSA-t tartalmazó PBS-ben (pH-7,4) kiszerelt, 1,1 pór radioaktívan jelölt konjagázumct Í10Ö pl) adtunk be injekcióban. Az öt egérből álló csoportokat az X._r 24., 48. és 72. órában f áj<ialomm.entésen. megöltük, majd kívéreztettük, és különböze szöveteket preparáltunk, és a kopot-o.r rootoakí v.casra krelemeztuk.

24. ábra: 25 BALB/c egér mindegyikének 75 mg/ml humán szérumalbumint tartalmazó PBS-ben (pB-7,4} kiszerelt, hozzávetőleg 1,5 pCi radioaktivan jelölt korija gát úrnőt ílöO pl) adtunk be intravénás injekcióban. Az öt egérből álló csoportokat az 1., 24., 48. és 72. órában fájdalommentesen megöltük, és a vérüket és különböző szöveteiket kipreparáltunk, és a kapcsolt radioaktivitásra kielemeztük.

25. ábra.: Rumos B-sejt tumorokat norcozó tímusz nélküli egereknek 24 pCl ^!'“''ⁱTn~2S8eMX-“DTtA-t. adtunk be injekcicsban, és a három egérből álló csoportokat £ájdalommentesen megöltük a 0.,

24., 48. és 72. órában. A szövetpreparálás és a kapcsolt radioaktivitás meghatározását követően meghatáx®. zt.uk a százalékos beadott dózis per gramm szövet értéket, és ábrázoltuk, ahogy bemutatjuk .

26. ábra: Kötési msrőeljárás 56-75 mg/ml humán szérumaIbumáut tartalmazó PBS-ben (pH-7_;.i) ínkobalt (4 8 órán át) ..miz-h-sbonV' ^0......

''1-jelölt 2B3-MX-DTPA immunreaktivitásának meghat érozására. A '’.y mező: A ”'1-jelölt antitest egy állandó mennyiségét (hozzávetőleg .1 ng/ml-r) inkubáltunk az SS sejtek növekvő mennyiségével. A sejzeknez kötött radioaktivitás mennyiségét ícpm} ábrázoltuk a , .· . cv·-.

sejtkonoentráczö függvényében. S mező: A teljes alkalmazott ''f radioaktivitás per kötött radioaktivitást láT/Bj ábrázolták. A lineáris extrapolálás lehetővé tette az y-metszet kiszámolását (1.,139). Az y-metszet. reciproka X 100 egy 87,9 %-os immunreaktivitási értéket eredményezett nagyon nagy antigén feleslegnél. Nem figyeltünk meg kötést a CD20~uegativ sejtekkel ;HBB? .

27. ábra: 75 mg/ml humán szárurnáihumánt és 1 mM DTPA-n tar- talmazó PBS-ben jpH-7,4) 4°C—on inkuöálz, ^9,?¥-nal. jelölt 2B8-MX·PTPA S1S-PAGE analíziséből kapott autoradiogrammok, A megjelölt időpontokban a mintákat 4-20 % Tris-gllcixz géleken elektródoretizáltuk nem-redukálö körülményeket, denaturáló körülményeket alkalmazva. A mintákat. 5 μΙ-ben (1. , 2.. sáv) , 10 pihen (ö.< 6. sávi vittük fel. A géleket röntgen, filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percen át környeztéti hőmérsékleten, és· lefényképeztük.

28. ábra: 75 mg/ml humán szérumalbuminc és 1 X OTPA-t tartalmazó PBB-ben (pH^:::7,4; 4^!X-on ínkubait, 'X-nal jelölt 2B8-MXBTPA SDS-PAGE analíziséből kapott 0. időpontban felvett autoradlogrammok denmi.tnmstriás letapogatása, A mintákat 4-20 '% Tris-glicín géleken elektroromét1záltűk nem-redukáló: körülményeket alkalmazva. A mintákat 5 ul-ben, 10 pl-ben és 20 μΐ-ben vittük fel. A géleket röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percen át környeztéül hőmérsékleten, és a sávok egyikét egy denzitométsrt alkalmazva szkenneltük. A radioaktívon jelölt konjagátum relatív területe í2. számú) 96,1 % volt.

29. ábra: 75 mg/ml humán szár urna Ibumint és 1 mM DTPA-t tar talmaző 333-nsn f, 4) 4^;'C-ön inkubált, Ύ-nal jelölt 2B8-MXDTPA 32S-8AGE analíziséből kapott 48.. órában felvett auturadíogrammok denzitömetriás letapogatása,. A mintákat 4-20 % Tris-glioin géleken elektmoforetizáltuk nem-redukáló körülményeket alkalmazva. A mintákat 5 μΐ-όηη. 10 μΐ-ban és 20 μΐ-ben vittük fel, A géleket röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percen át környeztet 1 hőmérsékleten, és a sávok egyikét egy dénzitométert alkalmazva szkenneltűk. A radioaktíven jelölt konjugátum relatív területé 12. számú; 94,1 4 volt.

3'0. ábra: Humán szérumalbuminban 37°C-on inkubált ,,miz-tshoot jelölt 2B3-MX-DTPA SDS-PAGE analíziséből kapott autoradiogrammok. A megjelölt időpontokban a mintákat 4-20 % Tris-glicih géleken elektroforetizáltuk nem-redukáló körülményeket alkalmazva, A mintákat 5 ul-ben íl., 2. sávi, 10 μΐ-ben (3.,

4. sáv; és 20 μΐ-ben (5., S. sáv; vittük fel. A géleket röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percen át környerteti hőmérsékleten, és lefényképeztük.

31. ábra: Humán szérumalbuminban 3-7^ö:€~.on inkubált ö;-_; shoot 'i-jelölt 2B8-HX-ÜTPA SDS-PAGE analíziséből kapott 0. időpontban felvett autoradiogrammok denzitometriás letapogatása. A. mintákat 4-20% Tris-glicin géleken elektroforetizáltuk nemredukáló körülményeket alkalmazva. A mintákat 5 μΐ-ben, 10 μ'1-ben és 20 μΐ-ben vittük fel a mérőhelyek két példányában. A géleket röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percen át környeztet! hőmérsékleten, és a sávok egyikét egy denzitométsrt alkalmazva szkennel tök. A radioaktívon jelölt konjugátum relatív területe [2. számú) 89,1 4 volt.

32. ábra: Humán szérumalbumd.nban 37'C-on inkabált „mix-t- €<

.shö-ot '’Υ-,jelölt. 2B8-MX-DTPA SDS-PAGE analíziséből kapott 7'2'.· érában felvett autoradiogrammok denzitömetríás letapogatása, A mintákat 4-20% írls-glidn géleken elektxoforetizáltuk nemredukáló körülményeket alkalmazva. A mintákat 5 μΐ-be.n, 10 μΐ-ben és 20 ul-ben vittük fel a mérőhelyek két példányában. A géleket röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percen át környeztet! hőmérsékleten, és a sávok egyikét egy denzitcmétert alkalmazva szkenneltük- A radioaktívon jelölt konjugázum relatív területe ;z. számú; 88,8 % volt,

33. ábra: 20 BALB/c egér mindegyikének 75 mg/d humán szérum- albumínt és 1 mb D2PA~t tartalmazó 1 X PBB-ben kísze•Q: A.

relé, 5 uCí d-nal radioaktívon jelölt konjagátumot (100 μΐ) adtunk be intravénás injekcióban. Az: ©t egérből álló csoportokat az 1., 24., 48. és 72. órában fájdalommentesen megöltük, és a vérüket és küiónodző szöveteiket kipreparáltunk, és a kapcsolt ra dl oa k.t í v 11 á sx a k 1 e 1 eme z. t υ k.

34. ábra: CHC-rerdetü jelölt 288 antitesteket növekvő mennyiségben frissen begyűjtött, rögzíte tt koncontrációdú CD2Θ-por.Ibiv B-sejtekkel (SB) vagy CD20-negatív T-sejvekkel· (HSS) inkubáltuk. A sejtekhez való antitest kötést kecske anti-egér IgG-FTTC F(ab}');··” alkalmazó ”AC8 analízissel mennyiségileg meghatároztuk az itt ismerteteit módon, összehasonlítottok egy írreleváns izotipusü antitesttel (S004) . Csak .A. CHQ-eredctű 288 antitest mutatott észlelhető kötődést a CüzO-pozitív GB sejtekhez.

35. ábra: A. CHO-eredetű 288 immünreaktívitását hasonlítottuk Össze egy hibridóma sajtvonalban termelt 288-49 szülő antitesttel egy DR1GEN assay-ben végzett közvetlen kompetídóval. Az. antitestet növekvő^ mennyiségben ínkubáltuk a rögzített konoedrá cíójú CulO-pczitlv B-sej tökkel és ruténrumma 1 jelölt CHO 2B3 nyomnyi mennyiségével. Miután három órán át környezeti hőmérsék™ Isten inkubáltuk, a kátéét relatív elektrckemzlumlneszcenclábsn kifejezve (SCL) ŐRIBEN berendezést alkalmazva határoztuk meg az „Anyagok és Módszerek fejezetben leírt módon. Az értékek két meghatározás átlagát képviselik. A 000 2B8 és 2B8-49 átlagos affinitási állandóját kiszámítva az 1,3 X 10 ' illetőleg 2,5 X 10 ·{ Π

M volt. Egy irreleváns izotípusú antitestet (SGG4) alkalmaztunk az összehasonlításhoz.

36. ábra: A. CHQ-eredstű 2BB~ból készített 2B8-MX-DTPA konjugátumok kötését összehasonlítottuk a nem konjugál.t antitesttel kő a vet. len kompot! óiéval egy ŐRIGÉN assayben. hónjugarumökát készítettünk oly módon, hogy a 2B8-t MX-DTBA-val inkuPáltuk 8, 17 és 24 órán át mielőtt a nem reagáló ke látót eltávolítottuk. A kötési méréshez az antitesteket a CB20-pozitív B-sejtek iSBj egy rögzített koncentrációjával és ruténiummal jelölt CHO 2B3 nyomnyi mennyiSágéval inkubáltuk. Miután három órán át. hőmérsékleten inkubáltuk, a kötést relatív e lektrokemilumineszcencíaként (ECId kifejezve határoztuk meg QRIGEN készüléket alkalmazva, ahogy az „Anyagok és Módszerek részben leírtuk. Az értékek két meghatározás átlagát képviselik. A konjugátum készítmények hasonló kötődést mutatnak mint a nem kon jogait 2B8 antitest.

37. ábra: A) SB sejteket mostunk, és 90 X 10^!' sejt/ml koncentrációig újra szuszpendáltuk hígításl pufferről (1% (tömeg /térfogat} marha szérumalbumint tartalmazó 1 X ABS, pH-7, 4}.. A sejteket növekvő Koncentrációban 3 órán át. 7,5 ng/ml InzBS-cal inkubáltuk 283-MX-0Grl 0265A jelű tételét alkalmazva. B) A sejt-

8 koncentráció kétszeresen inverz grafikonja a kötött radioaktivitás/ teljes radioaktivitás fö/TA· függvényében. Az immunreaktivitáti 1/y-metszet %. 100 képlettel számoltuk ki, Az immunreaktívitás 83,6% és a korrelációs koefficiens ül) értéke 0,981 volt.

38. ábra: A) S.B sejteket mostunk, és 99 X lő* sejt/ml koncent rációban higitásf puffer.rel (1% (tömeg/térfogat) marha s*é~ rümalbumint. tartalmazó 1 X ?BS, pHM, 4; újra szuszöendáltuk. A sejteket növekvő koncentrációban 3 órán át 2: ng/ml Y2B8-o;al inkubáltok,· melyet 238-MX-DTPA 016SA számú tételét alkalmazva késnitettünk el. 3} A sejtkoncentráció kétszeresen inverz grafikonja a kötőét radioaktivitás/teljes radioaktivitás ;B/TA) függvényében. Az immunreaktivitást 1/y-metszet x 100 képlettel, számoltuk ki. Az immunreaktivitás 72,2 % és a korrelációs koefficiens (Bú értéke 0,999 volt.

A találmány részletes ismertetése

H.a. másképpen nem határozzuk meg, az Összes leírásban használt műszaki és tudományos kifejezés ugyanolyan jelentéssel bír, ahogy egy azon a szakterületen szokásosan jártas személy értené, mely szakterületbe a találmány tartozik. .Bár akármilyen, a® itt Τ,ίΚακΓι.’ sc'^„o ' „.m eg; --eke ef?rag cs ζ.^ζο alkalmazható a találmány megvalósításúban vagy tesztelésénél, az előnyös eljárásokat és anyagokat ismerhetjük. A találmány céljából a következő kifejezéseket határoz rak meg a következőkben:.

Kis fémtartalmú - olyan reagensekre vonatkozik, melyeket kezeltünk, hogy lacsökkentsük a ,fémszennyeződést egy olyan szintre,· mely nincs hatással a radioaktivitás beépülésére..

ént igén •pozitív - olyan, antigént fejez ki, amit az adott találmány szerinti antitest felismer oly módon, hogy az antitest képes a kötésére.

% radíoktiv beépülés - egy radioaktív jelölési reakcióból származó antitesthez kunjegelődött radioaktív jel mennyisége, a xeakcróelsgyhez kezdetben adott radioaktív jel teljes mennyiségété a vi s zonyitva.

% kötés - egy mintából származó antitest azon mennyiségére vonatkozik, mely .a cél-antigénhez kötődik specifikusan vagy nem spécii ikusan..

% inmunreaktivitás vagy kötési speoifitás - egy mintából .származó antitest azon mennyiségére vonatkozik, mely specifikusan kötődik a cé1-antigénhez.

diagnosztikai antitest - egy olyan antitestre vonatkozik, mely egy radioaktív jelhez van konjugálva, mint például '^:'^;I-hez, mely a tumorok és antigén-positiv sejtek diagnosztikai leképezését képes végrehajtani.

Terápiás antitest - egy alfa- vagy bétasugárzó radioaktív jelhez (mint például d-hoz) kenjagáit antitestre vonatkozik, mely képes sejtpusztulást okozni, amikor a megcélzott antigénhez kötődik.

A taXálmány ismertetése ggéyf'éi® arái-CDi0 antíteet, koajugéllfc ZB8,

I. Anyagok: és módszerek a 2SS egérféle sKencklonális anti-CDSÖ antitest, 2B8-MX-PTPA, ^In-jelölt 2B8-MX-DTPA és KPLC-vel tisztitett X-ÍCk-DTPA kialakxtaséra

A. Any a gmk

1. Sej t.e.k

Az SB és HSB humán sejtvonalaiat az Amerscan Type Soltúra Cólleotion-tól szereztük be, és 10% magzati borjüszáramon tartalmazó RPMI-1640-ben tenyésztettük. A CEiO-pozítiv SB sejtvonal egy akut limfohlaszt leukémiás beteg perifériás vér ,,bu. ffy .m at~jaből származó B-limfoblasztoid sejtvonal (1) . A hSB sutigen-negatív sejtvonal egy újszülött szírlai hörcsögökben indukált tumorokból kifejlesztett T-limfömlesztőid rajtvonal -2). Az egérféle SF2/S m lel óma. sejtvonalat hasonló máidon 10% magzati borjüszéramot tartalmazó RPHI-l64-0-ben tartottuk fenn.

2. Antitestek

A B1 anti-~CD2:0 antitesteket a zeniten Immunoiegy-tói és a Leu ántl-CDzO antitesteket a Becton/Diakinsöntól vásároltuk. A jelölt kecske anti-sgér EgG-t és a kecske auti-humán IgG antitesteket az ICN-től szereztük be. A kecske F^ab·*)^ antl-egér IgG-t a Ceppeltől szereztük be.

3.. Reagensek

A Ereund komplett és inkomplett adjutánst a Sigrna Chemícal Company-tól vásároltuk. A polietilén-glikol, HAT-kcricentrátum és a Hl koncentrákom mindegyikét a Boehringer Mannheimtől szereztük be. Az ludium-[Ili]-klorídot és a 1-klor időt az Amershamtól vagy a NEN Duponttól szereztük be. Az ittrium-[3$j-kloridot az Aldrich Chemícal Company-tól vásároltuk. Minden más reagenst szokásos forrásokból szereztünk be.

?í konjugációs és radioaktív jelölési el járásokhoz használt reagenseket feldolgoztuk, hogy eltávolitsuk a szennyező nehézfém-ionokat, melyek konpeticróba lépnek a rablóizotópokkal a ra őioaktiv jelzés alatt. .1 reagenseket jellemzően úgy dolgozzuk fel, hogy az oldatokat egy Chelen 101 ioricserélő gyantán <BioRad Industri.es> visszük keresztül vagy Gneisz 100 hozzáadásával, adagonként feldolgozzuk egy preparált oldattá, Hilli-Q-val tisztított vagy Mater tor Irrígatícn (WFIr; kis fémtartalmú vizet alkalmaztunk az összes készítménynél és oldatnál. A fémmentes oldatokat sterilre szúrtuk, és steril műanyag tartályokban gyűjtöttük össze.

B. KZjáxáxok

1. 2B8 hibridóma felüiúszók előállítása és szkrínelése Rí Α- ν cl .1

Tíz BALB/o egeret 20 millió, Freund féle komplett adjuvánst tartalmazó FBS-be szuszpendált S8 sejttel immunizáltunk. A sejteket szubkután és intraperiton.eálisan is, az állat több helyére feni tortok. Egy kéthetes várakozási Időszak után az egereket másodszor is beoltottuk Freund féle ínkomplett adjuvansban emulgeált SB sejtekkel. Az immunizálás után emlékeztető oltásokat adtunk be hetenkénti üzemezésben FBS-ben szuszpendált EB sejtekkel . Az egereket G hetes - 4 hónapos időszakon át immunizáltuk..

Időpontonként két állatot eervikális diszlokáoiőval fájdalommentesen megöltünk, és a légeket eltávolitottuk az SPú/ű egér mié lóméval történő fúzió céljából. Az állatokat azon képességük alapján választottuk ki, hogy a poszt-immuniszérum. hatásosan gátolta-e a radioaktivan jelölt Coul.ter El anti-CEEQ antitest kötődését az SB sejtekhez. Három nappal mindegyik fúzió előtt a kiválasztott állatoknak egy utolsó intravénás (farokvénáöa történő) injekciót adtunk, mely 20 millió SB sejtet, tartalmazott FBE—ben. A f á joalommentes megélés után a lépőket f eredzésmentes körülmények kozott kivettük, és a lépsejteker SP2/0 sejtekkel fuzionáltuk 5:1 arányban (lépsejtek:522/0). A fuzionált sejteket szövettenyésztő tápközegben mostuk, és BAT szelekciós tápközeget tartalmazó 3€ mérőhelyes lemezekre osztottuk szét. A hlbridómákat 10-14 nap múlva inhibíciós radioimmunassay-vel szűrtök Coultex 31 antitestet alkalmazva.

Az anti-CD20 antitestet szekretáló hibridek szűrését ismert radiciwunassay módszerekkel hajtottuk végre. Röviden, Coulter 31 anti-CD2G antitestet tisztítottunk Protein A affinitáskromatográfiával. ötveu mikrogramm tisztított antitestet kap·;· g g csoltunk 1-hsz rövid oxidációval lodobeads iPierce Cnemlcai Co.} jelenlétében a gyártó el járását követve . A radioaktlvan jelölt antitestet szintetikus ámbra gyantán sómentesitettük, és Kígitási puff erben tároltuk (ESS, pH-7,1; mely tartalmaz 0,2% zselatint és 0,02% nátrium—azidót és 1,0% BSA-t). A radioaktív jel 10 nanogrammját helyeztük a korábban blokkolt szűrő assay lemez mindegyik mérőhelyére (blokkoló poffér: 10% FBS-ü tartalmazó hígitási puffét) a teszt-mérőhelyekről származó 50 pl hibridőma feiülúszők 50 μί-ével. és 50 pl hígítá.si pufferben szuszpendált 100 000 SS sejttel együtt. A szuszpenziót egy órán át. környezeti hőmérsékleten inkubáltuk., A lemezeket mosópuff erre! í?BS, mely 0,2% zselatint és 0,02% nátrium-azidot tartalmazott) erőteljesen mostuk egy V&P Scien.ilfic vákuum-elosztón, és a befogott SB sejteket tartalmazó filteraljakat egy gammaszámialóba tettük át. A csak HAT tápközeget és jelölt B1 antitestet tartalmazó mérőhelyeket használtuk háttérkontrollként és az azonos, SB sejteket tartalmazó mérőhelyeket alkalmaztuk pozitív kontroliként. A radioaktívat jelölt gátlás!

kontrollok a radioaktívan jelölt Bl-és a jelöletlen B1 különböző, 2 mg-tól 2 ng-ig terjedő mennyiségét tartalmazták.

2» Áramláscs öltömet riás vizsgálatok

a. Sej tonnalak

Előzetes áramláson eltemetriás vizsgálatokat hajtottunk végre 2B3 hi.bridőma tenyészetekből származó felülűszőtkal. A hibridóma felűlüszó száz mikről!terét SB sejtekkel inknbáltuk egy órán át környezeti hőmérsékleten; egy második, 1/400-as hígításban használt antitestet (kecske F{át/')2 anti-egér IgG; Cappel) adtunk, ezután hozzá, és az ínkubálást 1 órán át sötétben folytattuk. A sejteket ötször mostuk. A kontrollok a következőkből álltak; olyan sejtek (első és második antitestet nem}, melyekből csak az autóiluoreszcenciát határoztuk meg, csak második antitest és sejtek a nem specifikus kötés meghatárazására, és kereskedelemben hozzáférhető· fluoreszcein i zotiocranác-konj egált 81 (81FTTC; egy CD20 populációs kontrollként.

Néhány kísérletben a fluoreszceint tisztított 2B8 antitesthez kapcsoltuk az amiuGCsoportok fluoreszceín-izoticcíanáttal (FITC) végzett reakciójával. Röviden, 233 antitestet (1,2 mg/ml) inkubáltunk 9,5-ös pH értékű. 0, 1M nátrium-karbonát puftérben, mely 150-200 ag FITC/ng fehérjét tartalmazott. Az oldatot szobahőmérsékleten in kábái tűi 2 órán át, és a kapott 2BB-FI1C konjugátumot egy Sephadex 8-25 oszlopon tisztítottuk. A többi, ezekben a vizsgáiétokban használt reagenst, mint például a Bl-t és a Len IS-t fi önrészéé in kon jugá tűmként közvetlenül a Coultértől vagy a Becton Biokinsontél vásároltuk meg.

Az analizálandó sejteket összegyűjtöttük, és háromszor 0,2% BSA-t és 0/1% nátrium-azidőt tartalmazó PES-ben mostuk. Az élet képességet tripáu-kékes kizárással határoztuk meg, az élez képesrégi követelmény >90% volt. A sejtkoncentrációkat 3 mi Ilié/ml-re ál.Ütöttek he mérőhelyenként 50 pl hozzáadásával a 96 mérőhelyes ü-aljú lemezeken, hozzáadtuk az első antitestet (50 pl) a megfelelő mérőhelyekre, és az slegyer 30 percen - X órán át környezeti hőmérsékleten inkubáltuk; ezt · követően a sejteket ötször 200 pl/mérőhely 0,2%· BSA-t és 0,02 % nátrium-szádot tartalmazó PBSben mostuk, A lemezekben lévő sejteket lecentrifugáituk 1300 Rtdí-rael 1 percen át egy Sorvall centrifugán, és a felúlúszókat a lemezek óvatos „megpöckölésevei eltárolltottűk. A szükséges esetekben második antitestet adtunk hozzá, és további 30 percen ~1 órán ás inkubáltuk környezeti hőmérsékleten., sötétben; majd a mérőhelyeket fenti módon mostuk. Végül 206 pl rőgzftőpuffext (0,15 M nátrlum-klorid, mely 1% páraformaldehidet ípH™7_:,4) tartalmaz) adtunk mindegyik mintához, és a kezelt sejteket 12X75mm-es csövekbe vittük át az elemzéshez.

b. Jávái maiákö majmokból származó teljes vér

A. plazma eltávolítása után a sejteket centrifugálással kétszer mostuk, és HBSS-ben újra szuszpendáltuk. Az. újraszuszpendált sejtekhez magzati borjúszéxuraot (zml) adtunk. Az újraszuszpandáit sejtek száz mikroliterét ezután 1 darab 15 ml-es kúpos ce n t r i f u ga c s; ö be s zár o s z.t o 11 u. k. F1 u o r e s z c e n s e n j e 1 ő 11 monoklnnális antitesteket adtunk, hozzá a. követ kezeképpen:

1. cső: egérféle ant1-CD2-FITC IMI, 2,5 ug/mü 5 pg;

2. C&ő: kecske anti-huumán TGM-FüC (Fisher), 2,5 pg/ml; 5 ü

3. Cső: kecske ant i-egér üG-R.FE {kisbér}, 2,5 mg /ml, 5 pg;

s. Cső: kecske anti-humán IgM-FITC a kecske anti-egér IgG-RPE

c.

(abszorbeált), 2,5 pg/ml, 5 ug;

5. Cső: anti-humán CC22-F1TC ianti-Een 15, Becton Dickinson), pg;

5. Csó: csak sej t e k (auto.fl. uor- s zcen c i a)

A jelölt antitesteket és sejteket 2 percig 1500 rpm-nél centrifugáltuk, hogy összekeverjük a sejteket és az antitesteket, és ezután mind a hat mintát jégre tettek, és 32 percen át inkubáltuk. Ezt követően a csöveket kivettük a jégről, és finis puffért (37^eC-ra előmelegítve} adtunk hozzá 12 ml mennyiségben. A mintákat ezt követően 15 percen át szobahőmérsékleten inkubáltuk, 5 percen át 4^cC-on 15ÖO· rpm-mel centrifugáltuk, és a felülüszőkai eltávolltottűk. A sejtpeileteket ezután jelölőpufferben (1% BSA-c és 2,25% nát rium-azídot tartalmazó PBS) két s ze r mo stu k.

Ezt követően a sejteket csövenként 2,5 ml röqzítópuffer (1% paraformaldehídet tartalmazd 0,15 M nátrium-korié, pH~7,4) hozzáadásával rögzítettük, és Bect.cn pickjmsgn BACSoan készüléken elemeztük autokompenzáciöt és Calibrite gyöngyökkel történő előkalibrálást alkalmazva. A. fluoreszceinből származó zöld fluoreszcenciát Ebi módban mértük, és a fikoeritrinbői származó vörös fluoreszcenciát F1.2 módban mértük. Az adatokat logaritmikus alakban fejeztük ki. Először az életképes limfocita populációkat azönosíróttuk menetirány ve.rsus jobb· szöget bezáró fényszórással agy pontsor ábrázolása (dob biot) bittérképen. Ezután a teljes limfocitapöpuláclót. izoláltuk az összes egyéb eset kizárásával. Az ezt követó fluoreszcencia mérések csak azokra a specifikus eseményekre világítottak rá, melyek a kőrülhazároit területen belül történtek meg.

A nagy dózisos farmakológiái/toxikológiai, tanulmányokhoz az elővizsgáinál límfocita mennyiségeket minden egyes javai makákó maiomná.1 meghatároztuk, és alapértékként felhasználtuk.

A T~ és B-sejtek százalékát és a TdB arányokat kiszámoltuk, és kimeritési referenciákként használtuk.. Az eluvízsgá.1 a ti i Bsejt populációt Leuli-tal és anti-humán IgM antitestekkel számoltuk.

Miután a majmokba 2B8-t oltottunk be, amikor a CD20 antigén 2Bá~oal telítődött, a B-sejtek százalékát a teljes populációban kecske anti-humán IpM-FITC-et, anti-egér IgG-RPE-t és ezt a két. markert tartalmazó kétszeresen festődé populációt alkalmazva becsültük meg. A kétszeresén festődó populációt alkalmaztuk a mennyiségi meghatározáshoz addig, amíg az összes 2B8 ki mn tisztult az állatok perifériás véréből, A T-sejtek százalékát a teljes límfocita populációban anti-CDB-FITG-et alkalmazva, becsültük meg. Az adatokat három, minden mintánál 10 00Ö esetet tartalmazó mérésből átlagoltuk.. A megjelölt vérminták mindegyikéből a sejteket ezután értékeltük., kiszámolva a T- és B-sejt szobpopulációt a teljes limfoci.ta populáción belül. Szintén megvizsgáltuk a T: B arányokat. A B-sejtek kimerülését a B-sejtek eredeti. B-sejt mennyiségéhez viszonyított százalékos csökkenéseként számoltuk ki mindegyik majomnál,

3. Radioaktiv jódozás és a CDié immunprecipitáoiója

Százmillió SB sejtet két egyenlő részre osztottunk a ^1.--ve 1 és lodubead-dal (Fierce Chemical Co<) történő felszíni jódozás után. A sejteket centrí.fugáiássál többször mostuk, amíg a radioaktivitás mértéke a felülúszóban vissza nem állt a háttér értékre. löd míkrogramm 2B8 vagy B1 íGöditer Imm.inology) antitestet adtunk a jelölt B-sejtek két mintájának egyikéhez. Az antitesteket és ez SB sejteket egy éjszakán át in kubai tűk, majd háromszor oentrifugálással mostuk, míg az összes nem kötött antitestet el. nem távolítottak. A kötött 2BÚ-t és Bl-t tartalmazó sej tpei leteket ezután 1 izéi tűk, és 1·% HP4ü detergenst tartalmazó 0,1 M Tris-HCl (pH^::::S,0j hoz ráadás óval extraháltak, majd szobahőmérsékleten 1 órán át inkubáltnk. Az extra ktumct egy mikrofagában nagy sebességnél centrifugáltuk 30 percen át, és a telölászokat új csövekbe tértük át. Bindegyik csőbe Protein ASepharose-t (.300 pl) adtunk, és a gyantát cent rifugá lássál pelletízáltuk. A proteiz-A-Sephaross-t ezután 20-szor mostuk, hogy eltávolítsák a nem specifikusan kötődött jódozoft fehérjét. Amikor a gyöngy-felülúszó radioaktívitási arány elérte a lOö-as értéket , a pelletet .SOS PAGE mihtapuffértél kivontuk, és forrásig hevítettük. Mintán lehűtöttük, mindegyik eztraktum hozzávetőleg 15 üGO cpm-jét adtuk egy .10 %-os pollakrilamid gél mérőhelyeire.. Egy kis nolekülatömegű előfestett standardot (BicRad. Inc.) adtunk egy külön mérőhelyre, és ezt használtuk a molekulatömeg megbecslésére. A fehérjéket elektrofozézíssel feloldottuk, és a gélt szárítottuk és egy rö.ngenfilm lapra exponáltuk 24 órán át -ItÜC-on; ezt követően a filmet előhívtuk és kielemeztük,

4. A 238 kötés Scatohard analízise

A tisztított 2B8-t Scatchard analízissel látszólagos affinitásra értékeltük ki. Radioaktívat jelölt 2138-t állítottunk elő ^I-vel végzett reakcióval lodobeads jelenlétében. A szabad jód eltávolítását követően a radíoaktívan jelölt antitestet különböző, 5000 ng/méröhely-töl 35 ng/méróhelyrg terjedő koncentrációkban in kábáitok két példányban ]. 0 000 SB sejttel. A sejtekhez kő tödő antitest mennyiségét a ^mI-val jelolt 23$ .specifikus aktivitásból számoltuk ki. A kötött/szabad antitest arányát a kötött antitest moláris koncentráciojával szemben ábrázoltuk, és a látszólagos affinitás! állandót az X és ’f teng©lemetszetek arányából számé link ki.

5.. 2BA-MX BT FA előállítása

a. Az Ab-DTEA forrása

Bizonyos preklinikai vizsgálatokhoz a 14-es szénnel jelölt 1i zot ioclanáto-benz11-3-matil-diéti1én-1riamin-pentaecetsavat (MX-DTPA) szárított szilárd anyagként a Hational Institute of Eealtf-kn_f Ottó .bn'<w. szereztav be< es szárított állapotban jÓC-on tároltuk fénytől védve. A kelét törgsoldataiu Hilli-Q vízben állítottuk elő, és a koncentrációt a radioaktivitás mérésével és a vegyület specifikus aktivitását alkalmazva határoztuk meg. A torz sóidatok általában 2-5 mM koncentráció jvak voltak, és -7ö^cQ-ion polipropilén csövekben tároltuk. Más vizsgálatokban, MA-DTPA-t dínátrium-sóként a Coulter Immunologytól szereztük be, és -7 ö⁰ C-o.n tároltuk.

b. .. f’emmen tes köz élmények fenn tarts se

Fémmentes reagensek alkalmazása mellett a reagensekkel végzett összes munkát úgy hajtottuk végre, hogy minimalizáljuk a fémszennyeződés lehetőségét. Amikor lehetséges, polipropilén műanyag tartályokat, mint például lombékokat, főzőpoharakat és mérőhengereket alkalmaztunk. Ezeket Alconox-szal mostuk, és alaposan kiöblítettük Milli-Q vízzel a használat előtt. Továbbá fémmentes pipettahegyeket (SioFad) használtunk a kis mennyiségek pontos kezelésére. A reagensek nagyobb mennyiségeinek kimérésére műanyag szerclőgiai pipettákat il-25 ml-es méretekben szerezhető be· alkalmaztuuk. A reukelókat kényelmesen csavaros tetejű po1 ipropilén mi.krofuga csövekben fSardtedt Industries:; 1,5 ml befogadóképessség) vagy polipropilén kúpos csövekben (Costar; 15 ml és 50 pl) hajtottuk végre. Amikor dialíoiscsővel dolgoztunk, egyszer használatos: sebészeti kesztyűt viseltünk, melyet előtte Eilli-0: vízzel leöblítettünk.

su _?'^{n í;} -iír - ^c -·’öá 11i fása

A 2B8 egérféle anti-CPSŰ antitestet előszűr aszeiteszfeől tisztítottuk Pronein A-val és QAE kromatográfiával. A későbbi kisenletekhez: a 2SS-t üreges szál bioreaktur félűlúszókből ülszvitettük ugyanezt a tisztítási eljárást alkalmazva. Az üregesszál eredetű antiestet a kereskedelmi forgalomba hozatal céljából a 2. példában leírt CHO-eredetű antitesttel, helyettesítettük. Az antitestet a konjugációhoz úgy készítettük elő, hogy dialízist vagy többszöri puffercserét alkalmazva féwentes, 50 mM bíuzn-NAOH-bs vittük át (pH—8,6?, mely ISO mb: NaCl-t tartalmazott . Bizonyos vizsgálatokban a. puffercserét Centrícon 30 (Amicon): spin filtereken (30 050 D MWCO3 végzett Ismételt ultraszűrés alkalmazásával hajtottuk végre. Általában 50-2000 pl fehérjét (1Θ mg/ml) adtunk a szűrőegységhez·, és 2 ml bicihpuffert adtunk hozzá. A szűrőt 4C-on centrifugáltuk egy Sorval SS-34 rotorban 6 OOm rpm-nél. 4 5 percig. A retencíós mennyiség hozzávetőleg 50-100 pl volt . Szt az eljárást kétszer megismétel tűk ugyanazzal a szűrővel. A retentátumot egy 1,5 ml-es polipropilén csavaros tetejű ősébe tettük, a fehérjére mértük, 10, ö mg/mí koncentrációig hígítottuk, és: 4’ε-ο.η tároltuk amíg a centrifugálázhoz nem használtuk fel. Bizonyos vizsgálatokban a fehérjét 50 mb nátrium-nitrátba ípu===5,5; vittük át, mely 15ö m baCl-t és ο

*

0,00% nátrlum-azldot tartalmazott, a fentebb leírt eljárást alkalmazva .

d. fenj a gá cl ős eljárás

A. 2B8 MX-DTEA-val történő konjugációját polipropilén csövekben hajtottuk végre környezeti hőmérsékleten., Az EX-DTPA fagyasztott törzsoldatait közvetlenül a fölhasználás előtt olvasztottuk fel. Jellemzően 50-200 pl, 10 mg/ml antitestet reagáltattünk a keléttel 4:1 kelét,: fehérje mólaránybanA reakciókat a kelát-törzsoldat hozzáadásával és élénk keveréssel indítöttük be; hagytuk, hogy a konjugáció egy éjszakán át folytatódjék; általában 14-20 őrén át, környezeti hőmérsékleten,. A nem reagált kelátot dialízissel vagy ismételt ultraezüréssel eltávolitottuk a konjugátumból a fent leint módon, 0,051 nátrium-azidőt tartalmazó fémmentes normál sóoldatba <0, 09%) . A fehérjekoruentrációt 10 mg/ml-re állítottuk be, és Vl-on egy polipropilén csőben tároltuk .

&. A kelátbeépölés .Ítegha tározása

A kelátbeépülést szcintillácics számlálással és a. tisztított kunjugatummal kapott értéket a szén-Γ14)-jelölt kelét specifikus aktivitásával összehasonlítva határoztuk meg,. A későbbi vizsgálatokhoz, melyekben δ Coulter Immunologytól kapott nemradíoaktív kelátot alkalmaztunk, a 1 artop... _wqy ;a;arc_:u':

meg, hogy a honi agát umot a Ή ismert koncentráció jú és specifikus aktivitású radioaktív hordozó oldatának feleslegével ír; kubainak.

Rövidéh, egy ismert koncentrációjú ittríum-klurid törzsoldatot készítettünk fémmentes 0,05 N HCl-ben, melyhez hordozómentes

Ai-p;.

'fe-t (klcrid-sd) adtunk. Ennek az oldatnak az allkvetját folyadékszcintlllációs számlálással analizáltuk, hogy meghatározzuk a reagens pontos specifikus aktivitását. Az izx.rlumklófid reagens egy olyan mennyiséget, mely egyenlő a várhatóan az antitesthez kapcsolódó lelátok mőlszámának háromszorosával, jellemzően 2 mól/mól antitestet tettunk egy polipropilén csőbe, és a pE-t 4,0-4,5-rs állítottuk be 2 M. nátríum-acetáttal. Ezután kongegált antitestet adtunk hozzá, és az elegyek 15—30 peróig környezeti hőmérsékleten ínkubáltuk, A. reakciót 2ö ni 00.001 Ϊ mM végső koncentrációban való hozzáadásával állítottuk le, és az oldat: pü-ját hozzávetőleg $-ra állítottuk be 2M nátriumacetáttal.

ötperces inkubálás után a teljes térfogatot nagyteljesítményű méretkisárásos kromatográfiával tisztítottuk a lentebb: leírt módon. Az eluált fehérje-tartalmú frakciókat egyesítettük, a fehérgekoncentrációt meghatároztuk, és egy alikvotot radioaktivifásra mértünk.. A keIátbeépülest a ' Y~készítmény specifikus aktivitását és a fehérjskanzent rációt alkalmazva határoztuk meg.

f. A 2^?BS -Afk-ETBA ÍMunreaktivitása

A kenj .gélt 2B8 immunreakti vitását teljes sejtes ELISA-t alkalmazva mértük. Tenyészetből közepes log-fázisü 23 sejteket gyűjtöttünk össze centrifugálássál., és kétszer 1 X HBSS-ben mostuk. A sejteket 1-2 X 1G* sejtZm.l-re hígítottuk üBSS-ben, és 9B mérőhelyes mikrotitráló lemezekbe szétosztottuk 50 /00 -100 OQO sejt/mérőhely koncent rációban. A lemezeket vákuum alatt 2 órán át szári tót tűk 4 0-d'C-on, hogy a sajté két a műanyaghoz rögzítsük. A lemezeket -2ö°C-on szárazon tartottuk a felhasználásig. A méréshez a lemezeket környezeti hőmérsékletre felmeiegítettük közvetlenül a felhasználás előtt, majd lí BSA~t tartalmazó IX

BSS-sel (pH-7,.2-7, 4} blokkoltuk (2 óra). A mintákat az. merőül járáshoz 1 X PBS/11 BSA-oan hígítottuk; a lemezekre felvittük és ugyanabban a poftőrben sorazathígításokat hajtódtunk végre (1:2; . Miután a lemezeket 1 Órán át környezeti hőmérsékleten inkukáituk< a lemezeket háromszor 1 X BBS-sal mostuk. A mérőhelyekre második antitestet (kecske an ti -egér IgGl-speulf i.kus HRRkongugátum) (Sű μΐ) adtunk j1;1500-as hígítás IX PfeS/1% BSAben), és 1 órán át környezeti hőmérsékleten inkubáltuk. A lemezeket négyszer 1 X PBS-sel mostuk, majd ÁRTS szubsztrátoldatot (50 sX nátríum-citrár, pH-#,5, xnely 0X1 i ATBS-t és 0,001% H₂O₂-t tartalmazott/ adtunk hozzá. A lemezeket 4G5 nm-en olvastuk le 15-30 perces ínkubálás után. Az assay-k antígén-negatív HSB sejteket tartalmaztak a nem specifikus kórós nyomon követésére. A konjugátum imrsunreaktivitását az abazorbanci aért éke két a megfelelő hígítási faktorral szemben, ábrázolva számöltük ki, és összehasonlítottuk az ugyanazon a lemezen tesztelt natív antitestet alkalmazva. kapott értékekkel (ezek a 1001-os immunreaktívitást. képviselik) . A titrálási görbe lineáris részén több értéket összehasonló.tettunk, és kiszámoltuk az átlagot.

g. A natív 238 és a 2B8-MX-PTPA in vit.ro stabilitása

Az antitest és a konjagátum stabilitásának ehhez a 12.-hetes méréséhez a 2B8 antitest és a 2B8-MX-DTPA. aíikvotjaít normál sóoldatban vagy 10 mM giloín-HCl-t (pH-6,8) tartalmazó normál sőoldatban készítettük el. A mintasorozatok két példányát ÜC-or; és 30'C-on inkubáltuk, es a mintákat hetente mértük a következő módszereket alkalmazva: SDS-RAGE (redukáló és nem redukáló is) , immunraekivitás teljes-sejt immunnássay-vei,, melyhez, befogóként SB (antigén-pozitív) vagy MSB (antigén-negatív) sejteket hassoáltunk, és izselektromös fókuszáló gél-elektxoférésis (pH érték tartomány: 3-10j ,. Továbbá a kanjugátum radioaktív jelölési hatékonyságát is mértük a 4., 8., és 12. hétén a konjugátum ^^uY-na.l történő radioaktív jelölésével, és a termék SES-PAGE-n végzett analízisével és autoradíográfiás elemzéssel. Végül egy külön vizsgálatban a 2BB-M>i-üTA alikvotjait, melyeket 4^eC~on és 3ö^aCon lukubáltok 10 héten át, ¹'“'Tn~n.el radíoaktivan jelöltük, és egy biológiai megoszlási vizsgálatban BALB/o egerekben kiértékeltük a lentebb ismertetett módon.

h. Izmi und i sző ο 1 őgi a 1 ví z sgá 1 a t ok

Az IMRÁTH. habáratőries-szel immumhisetológiái vizsgálatokat hajtottunk végre mind a natív mind a kenj agáit (3B8-W-ÖTPA) antitest ekkel árutonnái rögzített humán szövetmetszeteket alkalmazva. Az antitesteket üreges szál bioreaktor felülúszokból tisztítottuk protein. A-h és Q Sepharose~n végzett kromatográfiával. Klinikai minőségű konjugátumot állítottunk elő a Cmilten Xnmunology-tól származó MX-DTEA-t alkalmazva, « fentebb leírt eljárásnak megfelelően.

1.. _________A rádióaktivar jelöl t______________ΕΕΒ-ΜΧ-ΡΓΒΑ i n yl t r o ijwur?reaktá vitása

Bizonyos kísérletekhez teljes-^sejt EETSA eljárást alkalmaz-

tünk a jelöletlen 2	Bís-Mk-DTsÁ-nax < A későbbi kísérletekben a
^UTn.-nel és “Y-nal	jelölt kenjugatumok (mindegyiket az IDEG
Pha rmao auti o a1s-n ál	vagy alternatív lehetőségként az M:PT
Pharmaoy Servicas,	Ina.. -cél kész 1 tették) immun reá kti vitása t

Eirdmö által leírt teljes-sejt kötési mérőéijárás (3j módosított változatát használva, határoztuk meg. Röviden, növekvő kcnoentrációkban középső log-fázisú antIgén-pozítiv SB sejteket vagy antigén-negatív HSB sejteket [20-30 xlö^<s sejt/ml hígítás.! puffarben (PBS mely 1% BSA-t 0,11 zselatint és 0, 02% nátrium-azídot tartalmaz),] adtunk két példányban a csövek s-crozatába.. A radioaktivan jelölt konjugátum ot 1-5 ng/ml. végen antitestkoncentrációra hígítottuk hígítási puffezrei, és 0,35 ml-t adtunk mindegyik csőbe. 75-90 perces inkubálási idő után környezeti hőmérsékleten a: sejteket centrízugálássai pelletízáltuk, és a felülúszót összegyűjtöttük, á felülúszó frakcióban megmaradó radioaktivitást egy gammaszámlálóval vagy egy szcintíllácíós számlálóval határoztuk meg, Az adatokat a teljes hozzáadott radibaktívitás osztva a sejthez kapcsolt radioaktivitás hányadosként ábrázoltuk a sej tszáxi/cső reciprokávai szemben. Az y tengely metszete így az immunreaktív frakciót képviseli.

j._: A radioaktívon jelelt lAg-MX-DTPA in ültre stabilitása a húraán,szérumban j 1 '· Í!í)

A ~In- és jelölt 2B8-MX-D1 PA in vitro stabilitását úgy határoztuk meg, hogy humán szérumban inkubáltuk 37*C-on 96 órán át. Kenj egált antitestet állítottunk elő, és ^In-nel ·,,ο1.χ~4~ shoot^w eljárással) vagy a fent leirt módon ^ávf-nai rád: o akti van jelöltük, .A *^l’Iu és ^Y-jelölt konjugátumok koncentrációja 2,5 illetőleg 14,6 mCi/mg veit; a radioaktivan jelölt konjugátumokat 75 mg/ml humán szár urna Ibumint (HSA.) és 1 mM DTPA-t (ittriamjelölt kongugátum) tartalmazó pufferbe vagy 50 mg/ml HSA-t tartalmazó puffeste [Indiámmal jelölt konjugátumj szuszpendáltuk. A radioaktívan jelölt, konjagátumokat 1:10 arányban hígítottuk normál hunián szérummal ínam hőinaktivált) , és alákvotokát helyeztünk fertőzésmentes körülmények között steril zárható csövekbe; ezeket a csöveket ezután. 37°C-on inkubáltük maximum 96 óráig tartó időtartamig:. A kiválasztott időpont okban a mintákat kivettük, és nem redukáló SDS-PAGE-vel 4-20%-os gradiens géleken analizáltuk, melyet autoradiográfia és instant vékonyréteg kromatográfia követett.

i. A klinikailag· formulázctt j'^i:; Jn-áBS-m-ETPA in ültre a tahi 1i tasa

A 2S8-XX-DTPA konjugátűnőt ^ín-nel radioakt!van jelöltük, és HPBC tisztítás nélkül alkalmaztuk („mix-and shoot' eljárás) . A radioaktivan jelölt antitestet PBB-ben hígítottuk, és humán szérumalbumint (HSA) adtunk hozzá 50 rag/ral végső koncentrációban. A formulázott radioaktIván jelölt konjugátum specifikus aktivitása 2,2 mCi/mg volt, A formulázott konjugátumot ezt követően é^C-on inkubáltuk 4 8 órán át, és az alikvotokat a 0., 24.,

4S. órában. elemeztük nem-redukáló SDS-PAGE-t alkalmazva 4-203—os gradiens géleken, majd autoradiográfiával, és instant vékonyréteg kromatográf iával... Az immun reaktivitást mindegyik időpontban teljes-sejt asuszpenziós assay-t alkalmazva mértük az 1. fejezetben fentebb leírt módon.

1. A 2.1í nzkailag .fórjául ázó ti ^In-lBg-éfX-öBFA ín vitro stabil ifása

A 2B8-MX-DTPA koníugatumot radioaktívat jelöltük., és méret ki záráscs kromatográ.fiával HPLC-n tisztítottuk IX ?SS-t alkalmazva elúuiós puftérként. A radioaktivan jelölt konjugátumfrakclókat összegyűjtöttük, és humán szérumalbumint íHSA) és BTPA-t adtunk, hozzá 5 mg/ml. illetőleg 1 mM végső koncentrációban. A formulázott radioaktívat jelölt konjugátum. specifikus aktivitása 14,6 mCi/mg volt. A formulázott kongugátumot ezt követően 4^cC-on inkubáltuk 48 órán át,. és az alikvotokat a 0., 24., «

48« órában elemeztük nem-redukáló SDS-PAGE-t alkalmazva 4-20%-os gradiens géleken, majd autcxadiográfiával, és instant vékonyréteg kromatográfiával. Az immunreaktivihást mindegyik időpontban teljes-sejt szuszpanziós assay-t alkalmazva mértük az 1, fejezetben fentebb leírt, módon..

2. Állatokon végzett vizsgálatok a ♦.....Főemlős nagy dozisos farmakológíai/toki kológi ad. víz a gála t

2BŐ-t alkalmazva

A 2B8 antitestet egy nagydózisú farmakológiái vizsgálatban értékeltük ki a G.L.? szabályzásnak .megfelelően a White Sanda Research Centernél (Vizsgálati szám:· 920111} «. Felnőtt Ma daca fásoícola.rís (jávai makákó) irajmokat használtunk; mindegyik vizsgálati csoport egy nőstényből és egy hímből állt. Antitestet adtunk:, be intravénás injekcióval 48 óránként, összesen hét. injekciót. A vizsgálatban ót csoport volt: I. csoport, (sóoldat'} ; Ili csoport (0,5 mg/kg); III. csoport (2,5 mg/kg) ; IV. csoport (10 mg/kgj ; és V. csoport (10 mg/kg csak a <E. napon).

A vizsgálat megkezdése előtt vért vettünk mind a '10 állattól, és arra használtuk fel, hegy meghatározzuk a reagens-háttereket és a kezdeti B-sejt populációkat- Az összes ez utáni vérmintát mindegyik antitest-injekciót megelőzően vettük le. A III. és

IV. csoportot a 13, napon a teljes boncolás és hisztopatológia előtt fájdalommentesen megöltük.

Az. I., II. és VI. csoport állataitól a 0«, 1«, 3«, 7. , 13.,

21., 37. és 52. napon vért vettünk, és hozzávetőleg 5 ml teljes vért vettünk le a heparinnal kezelt csövekbe. A teljes vért 4/C-on tároltuk, és 24 órán belül, analizáltuk. Mindegyik állat vérét 2000 rpm-nél 5 percen át centrifugáltuk, és a felülúszó plazmát a RIA-val végzett szérum 238 szintek mérőeljárásahoz kivettük (lásd. a RIA eljárást a specifikus assay módszereknél) . A FBI-eket és RBC-ket tartalmazó palit tízéit anyagot FCS-ben újra szuszpendáltuk a FACS analízishez.

b.......Fa rm a k o ki n e 11 A~a z vl z s oá lato k a 233-cal és a 2A6-W-DTPAval

A 2B8 átlagos szérum béta féléletidejét, javai makáké majmokban határoztuk meg az V. csoport állatait (fentebb) használva. Fecske anti-egér IgGl-t (Fisher Scientlfic) hígítottunk 2,0 pg/ml koncentrációra 10 mM borát-puzferben :(pH^:::-P, 6), és 5ú pl-t adtunk egy 96 mérőhelyes lemez, mindegyik mérőhelyére. Hagytuk, hogy az antitest a lemezhez kötődjön egy éjszakás 4^C-on történd inkubálással, vagy 2 órán át környezeti hőmérsékIsten történő inkubálással. Mindegyik lemezt blokkoltuk 30 percen át környezeti hőmérsékleten 150 ul/mérőhely, 1% BSA-t tartalmazd PBSsel. A lemezeket desztillált vízzel mostuk, és a. szérum- vagy plazmamintákat három példányban vittük fel külön-kúlön mérőhelyre 1:100 kezdeti hígításnál, melyet 1:2 sorozathígatás követett. Tisztított 2BS-t adtunk az élővérvételi szérumhoz, és standard görbeként való alkalmazáshoz hígítottuk 0,5 mg/ml-rel kezdve; a mintákat 1:100 arányban hígítottuk, majd sorozatáig!tárokat hajtottunk végre úgy, mint a többi mintánál. A. lemezeket 1 órán ár. inkubaltuk környezeti hőmérsékleten, és négyszer mostuk desztillált vízzel. A második reagenst (kecske anti-egér Igúl-HRPO) ezután l:400-a» hígításban adónk hozzá, és környezeti hőmérsékleten inkubáltuk további egy órán át. A lemezeket újra mostuk desztillált, vízben, és 0,1 ml, hidrogén-peroxidot tartalmazó peroxidáz-szubsztrátot adtunk hozzá. Hagytuk, hogy a szín kialakuljon a reakciótól számított percig; az abszorbanoíát. ezután 405 wea meghatároztuk egy mikro lemez

EL1SA leolvasót használva. Az eredményeket pej antitest/ml szérum értékként ábrázο11uk

Továbbá meghatároztuk: a 2B8 és a 2S8-MX-DTPA β 1: értékeit BABB/c egerekben. A. nem konjugált 2B3~t -70*0-00 1 X ABS: (pH-?, 4} /glicerinben lefagyasztottuk, 0, 5 mg/ml-re hígítottuk, és sterilre szűrtük. Konjugált antitestet készítettünk szokásos eljárási módokat követve, de szén-[14]-jelölt keláttal; a kel átbeépülés 1,5 mol/mol antitest volt. A tisztított kongugátűmet 0,5 mg/ml-re hígítottuk normál sóoldatban :2,9¾}, sterilre .szűrtük, és 4*C-on tároltuk a natív antitesttel a. felhasználásig.

Hat-nyolc hetes egereket oltottunk be 100 μΐ tisztított 2B8 antitesttel 250 pg/rnl koncentrációnál. Az egerektől ezután szemöreg mögötti punkciósai vért vettünk különböző, 0-264 óra közé eső időpontokban, és a szérumaikat natív és konjugált 2.B.S antitest jelenlétére elemeztük teljes sejt enzím-immunoassay-vel, befogóként SB antigén-pozitív B-sejtvonalat alkalmazva,. A. kapott adatokat a 2B8 vagy 2B8-MX-DTPA koncentrációjaként ábrázoltuk az idő függ vényében,' ezekből az eredményekből egy lineáris regressziós görbét hoztunk létre, és a meredekséget használtuk a β fB értékek meghatározására.

c._A. /'Báj-y-zBS-Mk-RlRá fármakölóglai/rtxfkolőg.iaf vizsgálata javai mákáko majmukban

Ittrium- [89]-t hordozó 2B8-.MX-DT.AA-t állítottunk elő a beépítésére leírt eljárást alkalmazva, kivéve, hogy HBLC tisztítást nem alkalmaztunk. A nem radioaktív, fémet hordozó •τ' τ \ ö s konjugátumot 1 x PBS-ben formuláztok, ami 75 mg/ml HSA-t és 1 mM BTF.A-t tartalmazott, és 920611 száMú GLP vizsgálatban értékeltük ki a Whí.te Sands Researth Center-nél. Egy hím és egy nőstény majmot tartalmazctt mind a négy csoport., Az állatok intravénás injekciót kaptak 4§ éránként, összesem 7 injekciót, a hevet késő gyógyszer mennyiségekkel: 1. csoport - seoldat, II. csoport - 0,003 mg/kg; II.I: csoport - 0,03 mg/kg; és IV. csoport - 0,3 mg/kg. Az álaltokat a vizsgálat alatt kiértékeltük, meghatározva a testtömegeket és a hőmérsékleteket, a táplálékés a vízfogyasztást, kiválasztást, széxumkémlai elemzést, hemátelogiát, vizelet analízist, és fizikai vizsgálatokat. Az I-I'V. csoportok állataitól az infúzió előtt a 0., 2., 7., 10. és 14. napon vért vettünk, és a keringő B-sejtek mennyiségére analizáltuk FACS Analízissel.

d. A realgakélvan jelelt 2W-7KX-ÓTBA biológiai megoszlása

Egy elővizsgálatban a ^J'^lxIn-nel jelölt 2BS-MX-DTPA-t a szöveti eloszlásra értékeltük ki 6—8 hetes 8ALB/C egerekben. A xadioaktívan jelölt konjuqátumokat a klinikai minőségű 2B8-MX-DTÖAt alkalmazva állítottuk elő a fentebb ismertetett „mix-andshoot eljárást, alkalmazva. A konjugátom specifikus aktivitása 2,3 mCi/mg volt, és a konjugátumot 50 mg/ml HSA.--t tartalmazó PB.S-ben ípE-7,4; formai áztok. A2 egereknek intravénás injekcióval 100 μΐ ⁿ4n-jelölt 2B8“MX-DTPA-t ^hozzávetőleg 21 mCi) adtunk be, és a hárem egérből álló csoportokat cervíkálís diszlc'kációval fájdalormnentesen megöltük a 0., 24., 48. és 72. órában. Bhután megöltük őket, a farkat, szivet, tüdőket, májat, ve?sét, lápét, izmot és combcsontot kivettük, mostuk, lemértük; és vérmintát is vettünk az elemzéshez. Mindegyik mintához kap c s ő i ó dó r ad i o a k t i v 11 á s t g amm a - s- zárnia 1 á s s a 1 me g ha t á rost u k _f é s ezután .s beadott dózis/gramm szövet százalékát meghatároztuk. Sem tettünk kísérletet arra, hogy a különböző szervekkel járó vér által hordozott aktidtásmegcsdást ne vegyük számításba. Egy külön eljárásban a 2:B8~MX-DTBA alikvntjait inkubáltuk. dCon, és 3dC-on 10 héten át radíoaktivan jelöltük ^dn-nel 2,1 mCi/mg specifikus aktivitásig mindegyik készítménynél. Ezeket a konjugátumökat ezután egerekben végzett biológiai eloszlási vizsgálatokban használtuk fel a fentebb leírt módon.

A dozimetriás meghatározásokhoz a 2B8-MX~bTPA-t *Tn-nel radloaktívan jelöltük 2,3 mCi/mg specifikus aktivitásig, és hozzávetőleg 1,1 pCi-t injektáltunk mind a 20 BAÓB/c: égerbe. Ezután öt egérből álló csoportok mindegyikét az 1., 24. , 48. és 72.

öian-m f 1^; zalomnedesen megöltük, és a szerveiket kivettük, és az elemzéshez kipreparáltuk:, Továbbá bor-, izom- és csontdarabokat vettünk ki, és dolgoztunk fel az elemzéshez; vizeletet és ürüléket is gyűjtöttünk, és a 24-72 órás időpontokban elemeztük.

S.· A

Hasonló módszert alkalmazva a 2B8-MX-0TPA-t szintén ' Ύ-nal xadioaktivan jelöltük, és a biológiai megoszlását BALB/ö egerekben kiértékéltük .egy 72 órás időszakon át. A HPLC méretkizáxásos kromatográfiával végzett tisztítás után négy, öt egérből álló csoportnak intzavénás injekcióban hozzávetőleg 1 üCl klinikai Ing formuláit kcnjugátümct (specifikus aktivitás: 12,2 mCl/mg; adtunk be, a csoportokat ezután az 1., 24., 48. és 72. órában fájdalommontesen megöltük, és a szerveiket és szöveteiket a fentebb Isirt módon kielemeztük. Mindegyik szövetmintához kapcsolódó radioaktivitást meghatároztuk a fékezéséi sugárzód energiát egy ga«a szointlllációs számlálóval. Az aktivitási értékeket ezután beadott dózis/gramm szövet százalékaként vagy beadott dózis/szerv százalékként fejeztük ki, Mg a szerveket és más szöveteket többször átöblitettük a felületi vér eltávolítására, a szerveket :ez áramoltattuk át. Tehát a szerv aktivitási értékekből; nem vontuk le a belsőleg kapcsolódó vér által képviselt aktivitási szennyeződést.

e. Az '^In-jelölt zBé-M-g-TPá tumcrloka 1 irációja

A radioaktívon jelölt 288-MXDTBA lokalizációját Ramos B-sejt tumorokat hordozó támasz nélküli, egerekben határoztuk meg. Hatnyolc hetes tim.usz nélküli egerekbe szab kút án injekcióval (jobb hátsó horgász) 0,-1 ml., 1,2 X 10' Romos tumor sej tét tartalmazó RPMő-1640-t adtunk be, mely tumorsajbeket előzőleg tímusz nélküli egerekben való növekedésre adaptáltuk. Tumorok keletkeztek két héten belül, és a tömegük 0,07-1,1 gramm közötti volt. AZ egereknek intravénáson 100 μΐ ^luIn-jelölt 2B8-MX-DTPA-t (16,7 m€i) adtunk be, és a három egérből álló csoportokat cervíkális di.szlökáciőval fájdalommenteséh megöltük a 0., 24«, 48. és 72.. órában. Miután megöltük, a farkat, szívet, tüdőket, májat, vesét, léget, izmot, conbcsontot és a. tumort kivettük, mostuk, lemértük, és egy vérmintát is vettünk az elemzéshez. Gammaszámlálással meghatároztuk mindegyik mintához kapcsolt radioaktivitást, és a százalék beinjekált dózis/gramm szövet értéket meghatároztuk.

3. Duciméóriás számításók

T'T 1 ^:^Í-Y ·

A ~dn-hel vagy 'l-nal jelölt :2S8-MX-DTRA-val injekciózott BALB/c egereket alkalmazva kapott biológiai megoszlási adatok (1-4. és 5-8. táblázat) felhasználásával a Medical Internál

Radiatron Bőse (MTRD) CűíKml.ttee of the Socisty of Muolear Medicina által kialakított módszert alkalmazva kiszámoltuk egy 70 kg-os betegnek beadott 1,0 mCi dózisból abszorbeált sugárzási dózis becsült értékeket. A radioaktívon jelölt konjugátumok biológiai féléletidejét a biológiai megoszlási adatokból meghatározott beinjektált dózis/szerv értékekből határoztuk meg mindegy i k radioiúUEun-kon j ugá tómnál. Bizonyos szöveteknél., például a vérnél feltételeztek, hogy a radiokonjugátum biológiai lebomlása egy kétrészes modellt követ, melynél, egy exponenciális hanyatlás van ezekben a részekben. Más szövetekben, például a májban az aktivitási szintek durván állandók maradnak a. 72 órás biológiai megoszlási, vizsgálatban, feltételezve, hogy a. biológiai. félélatidő nagyon hosszú, és az lööO órának megfelelő értéket határozzuk meg.

I. táblázat «lás· X órával a intravénás

cioga után normál BALS/c egerekben

Átlagos tömeg

20,97 1 2,46 g

Minta

Vér

Szív

Vese (1)

Csont

_f 4 v, 12 ö í

0,04

2,23 ; rtöxs.

0., 0 3

υ .< * j.		0,	38	ΐ n	y 2 4	i	0,05	10, 44 ±	f>: 7 * v / t w :

3, IS	±	U /	14	} ϋ	,02	•'l·	0, 33	5, 3 0 ±	0,81 j
ü, 15		ö.	14	r λ	7 f '	±	0,39	•\|: 1 γ-γ	1,09 \|
I; 9 &-S í ..* u.	4·	^:-^!··	21	: 4	ςη y	X	0,52	6, 65 1	^? i 0,55 j

Minta	Szerv tömege grammm	% ID/gramm	% XD/szerv
Vér	1,45 ± 0,13	22,41 ± 3,95	31,90 ± 2,8 9
Ssiv	0,030 1 0,01	4,05 ± 0,94	0,36 1 0,06
'Tüdő (2)	0,155 ± 0,02	8,4 5 ± 0/53	1,31 ± 0,19
Vese (1)	0,125 ± 0,01	5,15 ± 1,15	0.76 ± 0,07
Máj	1,040 ± 0,11	9.41 1 2/33	9,84 1 3.18 :
Lép	0,082 ± 0,01	5,32 ± 0,71	0,48 ± 0,11
XsBpm	8,26 ± 0/7 7	1,42: ± 0,53	11,62 1 4,67 \|
Csont	3,10 ± 0.29	2,08 ± 0,16	6,41 i 0,4.4
Sőt	3,10 1 0.29	3,43 ± 0,59	20.54 ± 1.69
Gyomor-faél rendez.	2,96 i 0,20	5,05 i 0,63	7,46 1 0.60
Vizelet			1,4 6
Széklet			6,41
Teljes	88,4 9 ±: 5,87

Egerek száma 5

Átlagos tömeg ~ 20,65 ± 1,93 g

Minta	— .................~'~~ Szerv tömege	% XD/grasm	% XD/szerv
Ver	1,52 1 0,06	18,97 ± 1,31	28,51 ± 2,03
Szív	0,094 ±0,02	3,71 ± 0,31	0,3 5 :5 0,04
Tüdő (2)	0,161 ± 0,01	7,60 ± 0,30	1,18 ± 0,09
Vese (1)	0,135 i 0,01	S, 55 10,53	0,7 6 1 0,09
Máj	1,11 ,t 0,11	9,90 1 1,77	11,00 ± 2,03
Lép	0.095 ± 0,01	5,12 ± 0,7 5	0,48 x 0_t04
Izosn	8,58 ±. 0,34	1,04 ± 0,09	8, 95 t 0 , 68
:Csont	3,22 1 0,12	1,73 1 0,34	6,04 ± 0,51
Bőr	3,22 ± 0,12	316 ± 0,60	10,19 ± 2,03
Gyomor-bél rends z.	2,79 ± 0,19	4,53 ,±. 0,83	6, 37 ± 1,38
Viselet			2,49
Széklet			11,50
Teljes	87,80 ± 4,79

Egerek száma ~ 5

Átlagos tömeg ^:::: 21,46 ± 0,84

7

Minta	Szerv tömege gramm®	% XD/gram®	% XD/szsrv
Ver	1,27 ±	0,06	39,23 ±	2,4 5	49,77 ±	1,72
Ssiv	0,086 ±	0,01	5,80 á	0,94	0,50 1	0,0 9
Tüdő (2)	0,137 ±	0,01	12,11 ±	1,03	1,66 ±	0, 17
Vese (1)	0,120 ±	0,01	10,23 ±	1,30	** í Í.7 lé	0, 12
Máj	0,921 i	0,05	12,12 ±	.1,72	11,17 ±	1, 66
Lép	0,030 ±	0,01	9,27 .1	0,46	0,74 1	0,07
Izom	7,27 1	0,32	0,7 8 1	0,13	5,72 ±	1,05
Csont	2,73 ±	0, 12	4,35 ±	0,39	Í 11,89 ±	1,47
Bár	2,73 :t	0, 12	2,12 1 0,75	í 5,32 i	2,24
Gyomor-bél rsndss.	”> ”> O X	0,06	3, 52 i	1,12	4,22 ±	0,8'4
Vizelet	-
Széklet
Teljes	j 94,8 5 ±	3,47

Egerek száma - 5

Átlagos tömeg « 13,17 g ± 0,84 g

Átlagértékek ± SD (standard hiba)

Minta	Sxew tömege grammm	% XD/gramm	% ID/szsrv
Vér	1,517 1 0,099	8,35 ± 2,54 7	12,83 ± 4,60
Sssiv	0,092 ± 0,005	2,63 ± 0,142	0,240 ± 0,006
Tüdő (2)	0,141 i 0,005	4,56 ± 0,393	0,644 ± 0,047
Vese (1)	0,138 ± 0,007	5,63 ± 0,222	0,77 9 ± 0,040
Máj	\| 0,438 ± 0,098	5,22 ± 0,335	- ............. 2,259 ± 0,399
Lép	; 0,081 1 0,003	4,23 ± 0,180	_: 0,345 i 0,011
laom	8,668 1 0,514	0,97 6 1 0,164	8,55 i 1,945
Csont.	3,24 0 i: 0,15 6	;1,326 1 0,102	4,239 ± 0,154

egerek száma - 3

Átlagos tömeg = 21,671 g t 1,11 g

Minta	Szerv tömege grasmma	% XÖ/grasssm	% ID/szerv
Vér	1,33 ± 0,06	17,34 ± 2,0	23,03 ± 1,95
Szív	0,088 ± 0,01	3,56 ± G,31	0,31 1 0,04
Tüdő (2>	0,139 ± 0,01	7,54 ± 0,88	1,05 ± 0,15
Vés® (1>	0,122 ± 0,01	6,53 ± 0,42	0,79 ± 0,01
Még	0,9 SS ± 0,04	9,05 : 1,70	8,92 ± 1,57
Lép	0,087 ± 0,01	6,52 ± 1,13	0,57 ± 0,07
Izom	7,2 0 ± 0,36	1,05 ± 0,18	8,01 ± 1,17
Csont	2, S6 1 0,14	) 3,34 1 0,4 2	9,53 ή 1,08
Bőr	2,86 ± 0,14	4,13 5 0,78	11,75 i 1,82
iGyomor-bél rendsz.	2,84 i 0,19	2,74 ± 0,34	3,80 ± 0,30
Vizelet	-	....	4,2 9
Széklet			7,67
Teljes	79,72 1 3,23

Egerek száma - 5

Átlagos tömeg ~ 19,97 g ± 0,91 g

3. táblázat

Aktivátásmegcszlás 72 órával a ' X-SBS-MK-DTPA intravénás

Minta	Szerv tömege graxsmm	% W/gramss	% XD/szerv
Vér	1,35 ±	0,02	15,40 ±	1,63	20,71 ±	2,13 '
Szív	0,088 i	0,01	3,12 ±	0,24	0,28 ±	0,01
Tüdő (2)	0,142 i	0, 01	8,23 1	2,05	1,17 ±	0,2 0
Vess (1)	0,123 i	0,01	6,45 ±	0,57	0,7 9 ±	0,07
Máj	0,02 i 0,06	8,39 ±	1,14 ^:	8,58 i	1,31
Láp	0,103 1	0,01	5,90 ±	1,19 :	0,57 1	0,08 7
Xzom	7,68 1 0,11	1,01 ±	Ö, 13	7,73 1	1,05
Csont	2,88 i	0, 0 5	3,20 ±	0,25	9, 20 ±	0,61
Bőr	2,88 ±	0, 0 5	3,97 1	0, 4 9	11,42 i	1,3 6 ;
Gyomor-bél rendez.	2,86 ±	0, 18	2,90 z	0,65	4,0 6 x.	0,9 3
Vizelet	—	-	3,00
Széklet	-	-	31,	08
Teljes	78,62 i	2₁ 63 (

Egerek száma - 5

Átlagos tömeg « 19,21 g ± 0,27 g g 1

Hasonló módon más biológiai félélatidő értékeket is meghatároztunk vagy kiszámoltuk az exponenciális csökkenés tk értékének kiszámolására szolgáló standard egyenlettel. Metán ezeket az értékeket meghatároztuk, a ΊΜ, M_lf T_e:2, A₂, A?, és A-nak a változóit, melyeket a 9. és 10, táblázatban soroltunk lel, meghatároztok. mindegyik, radloakt Iván jelölt konjugátwmál, ezeknek a táblázatoknak a tetején megadott egyenleteket használva (kimenő változók). Ezeket az értékeket, valamint a következő táblázatokban bemutatott értékeket a Symphcny spreadsheet-ben (Lotus Oevelopment Corp. leírt programot (MR. Pnillip Hágán, MS, Knclear Medicina Service, VA Mdical Center, La Jolla, Cl 92151) alkalmazva számoltuk ki.

Cv-

rrt co aí—r íl> í~i~ rt

Μ*

	1	>-r-xi s	£	<rt	¹	-	r& cor=-
	r->	í>->		ΐ-Λ	f-3	*-/?	e-j>
		>-5 ÍZO C^í			*KO CJ5	oro	í-V:
i	s	J <CT*		ó <f=s	<sr<		<Z>
zz		Ví>		<ó>	>-'	Γ-	Z
	<p=			£5			f-á
	S=	§		zz		<is>
L· «-»	<--> B	<3? -'..		s	<rri	íCp -Ó
ζζ	<í>	t		Zi	g	Ϊ—ci *>-·
:----------	: <>	<-'-=
	#---KX				f--->		r-c-
1?ΐ	«> C=O				§	<X> fcr=3	í?3
ά	i	$ >S-.			<L->	<Xtí	ϊ.Ί'>
F	rz	O'·.			gg____	CTi	r->-3
<_^/.	«·->	r--_:--			cs>	y<i	íxu>
Ρ ί-ο	<cr>	<'_c>		p		<> <o
C~2~J					Κϊ	d>	<T>
*-J>	o	<S-			_: k£>	_'Z'~'	<χ-ϊ
í>-_-i
Γ^·> ^SZ> U>		<í>			Sr>		£T>
\^·		<LZ>				$zz>

		X>-				s _>
				- — 5 e--> <c->	<z?í <í>'	CT> o>

£ S « V»

ϊΆ s' 9

Ϊ

¹

fé'

P

1

8*

p

P

S

:. : Í-X -

i <x> ; z'·!' í <-ΡΎ í <Γ;- í í <?-x I |

<^S

<->

05 s <ZZ·'

r-x «* C'Z eb ÓÚ>

—-i « £•*3 Ϊ <15

Γ--5 <~r> r=^ eb Z

---„ —Ϊ

£·-> ά

Í--J t ><=»

C--5 «? Si

J-’ g Si

ff~ ; ...-i

—-5 «> eb ;r=>

ox

í i^--> 1 > 5 VO 2 ?72

—> ryi <Í5

Ζ^> i

ff

-.O ;^e=r

O <15 <XA-

p:

1-

<c

<=> cx-í-

<1>

<-Z>

<15 <15

o « <15 •>>P‘

<15

O”⁶ «*

<Χ'

<Χλ CO. >3k=5

<1> CT> «c->>

; <xb :

ÍZ

§

e:>

—-

<15

«> <1> <x<

<&

yo

cx< <_<> <O

<X' So

<ο <ir<

ts>

l·-—

>—ζ

<ü

ff-

H

f

§

a

isi

s

g

--yí

<>> -~^í

<15: <Í3(

K

Z-Z

i

<--

<1>

<z>

: i-^!

v>

. <X ^:

Sí O

o <15

-

>sO

Γ--.5 >ΞΞ £2^-3 í <15

i^3 sá X s

Í'C —-J <=> S Ϊ O

r--ó -—-· 2

«> t<3 i 22

?o --^: P s

~-S Ϊ

F-O <*íó ÍKÍ $

e--_> -a-3 P á

-i P5 Λ

E>-> -H «> $

£-Ί> ---- <7Λ r<i <15 Λ^=*

É5_> -•-^ CX3 r^i' if . go

3Ϊ o·-

- P

fi

í^__>

P

ΐ-_>

P <--->

p t-..ΐ

Ül ^: -5 «Ο

X r--->

CT'< . í.5->

<1>

<n> «5

s- fO

“ö< a>

<L· -Sr C?3

: : ~ *~>

P í>>

<b <=>

-<x- ei*

; <SS

-S~~' <ZZ3

i ff- ? v.->

p '-

<-:.< <=>

Í->R-

Ϊ1

-?ζ

*-s £ o^:s

z.'-;

-->

--:-5

ΐ“-' 5—-*

ffí?

<<*< <S> Ί J

?------: <-· ez>

ff> <=>

«t <rs £35 .«?.

o

X-

<JX>

<ϊί -jO

xí> ex-

£ P Á'

<Ξ3 -—-

--> ->·.

P <-£>

ex- <15

o <xc

: <s>

e:>

X-

^: -> «Pv

<=?

: _: )

<í>

<Ύ5 —-5

<1> <1>

*Ύ oΆ

-.

-

<-í> <i?

: É <i> | <íí

<o

<15

-X> =>-_> So

-

-—3

Α5> ,<^_?:·'

<-

vl' ΐΓ> fr-*s &S

v e

'Λ sxs.

r— <r&

t~ -« .R:

<&

í?

*:í

V>

fi i

Ohí^; p-?·<

r-r

'._____ <V r-

«Ο

g f

K

ΓΓ’-

r-s-

P>' iss £» «>

SS ö

e

Ίχ Ά

l

S£5 &

h^:

ff-

< g>

ff

P 1

P

s

1

..........11

s:

- ;

s*

Γ-Ο

t-->

í· -.-'

í-o

eo

d

Í3

d³

Γ---7

r-_? :

z-o

t--'

ΪΌ-

2o

<x?

—3 W CT?

g

-—.3 <X$

·— -3 <_X'> í^>

ZÁ

§

E .co

s

g?

ΟΓ1

-._-= 0.-3 í^i

'oO

έ

i C7<

ás

sb

<i<

iz

É

±

<!-'

s

ii

'Έ

<-> ; <.·

<-

<ZZ'

<zz< d>w <Z>

s

<~f <zz> £?

<d7

« zz

C7>

3Í> ~^·

<>

Z^^: o

<-'--=

^:3~

·&*>

-='->

<<*<>

.== =

^----=-

<17

d-

zz*

_γ>

<17

zz*

<~³

-&

=~>

>-> d'

-<

C-S7: -s '

o

g

s

zz?

§

s

CS> Sí

§

g

§

zz

a

s

>-d

>--

0-3 .--3

fg

á

§

gr^

^sr_

§

d-

s

íd

g

I

3—

θ

<£»

g

CÍS

<--->

<s>

<.---

g

s

<-S>

i

d

*·--<

í-~-_>

-íd

í>>

d³

í'-d

l^-J>

-d

dl

r-o

r-d;

_

g

s

ε>5

g>___

g

07 C=3

07 £

OTí £>lí

•_-rE Z^Zí

s

-|_:

ά

é

í

I —

é

sr

έ

é

s

1 5Z

i ^zz>

á

se

M

gs____

®

>_

d

-Ξ-

?s___

d

g>____

d__

d>

g 1' |

íd-v

f--J>

£Ξ>

r--3

: *--z?

-—j

^;-ó

£-d*

r--->

θ

*rr>

d*

©

: d

..-—·

g?

d³

d=

s-

tíö

K

θ

<£&

=-'>

f*d

az>

•o>

; <'·

<-=

r-o

c>

cs

ϊί->

r-C

<S3

§'

ö>

ís> d

g

'V/- d

o

d³

^: <íi

g

o>

<a>

víz--

os Se

<s

<s>

<-->

ös

<.-.·

θ

--'

<~y

<z>

-s>

*·

<Ξ3

í

-^j

1

_o->

d'

i ; gí

z~

z>

07 <13 <-o

Z'

d³

-d

i—

O>

<'->

<d=

<l->

-:>

<---'

<^

<zz>

<->

—

<~Z>

i

: »-=->,.

OS

03

Ϊ

:

'

•íZ>

h c-->

Q

^: && ^:: J-:-:>

<*3 <_><

f-l>

>—>

&

do

o

\ <zz>

d 0-3

<zzi

s

r--.>

d--7

1' 1

A 9. és a 10

Λ f > «8 táblázatból származó teljes összesített aktivitás. értékeket {A) és a_: MISD rámpáiét 11-ből íll. és 12 >, és 13, és 14. táblázat) származó S értékeket alkalmazva a felsorolt szöveteknél a radioaktívon jelölt konjugátumok mindegyikénél kiszámoltak a sugárzás adssorbeált dózis becsült értekeket (lát,

16. # 17. és 18. táblázatok) . A 19 . táblázatból származó összes sugárzás dózis becslések megnatározásábars az irídium- jelölt kenjugaromnál egy adott szerv saját dózisát a szomszédos szervekbe vagy szövetekben, lévő aktivitás által létrehozott abszorbeált dózissal együtt összegezzük. Mindemellett az íttriumjelölt konjhgátamnak tulajdonítható sugárzás dózis becsült értékek. kiszámolásában (20. táblázat) bizonyos értékek hiányoznak a felsorolt szöveteknél •például a mellékveséknél).. Az a kibocsátott 13 részecske rövidebb úthosszának köszönhető az amithált g részecskéhez képest, mely így egy jelentéktelen szomszédos szövetekből származó aktivitásszermyeződést eredményez, valamint az elsődleges biológiai megoszlási adatok hiányának köszönhető ezeknél a szöveteknél.

Ma

P g. SÍ I

B

s

í.

1

t*í B g

fr-a ϊ Β

ϊ

< Β

í

-—;-í

*-*

--

: <r> '

¢---.5

í--_>

<Ό

X³

E

Fa

©

Ki

Árt

bfb

Fi

?F

Fi

&

s

Á

&

é

OO

<-£>

S^'

<ÚO

VXÍ'

X

_

£'

Fi

rM

Fi

R

Fi

&

cF

fej

'

Fi

é

iz

Fí

é

ώ

53

r-

ν'¹

-$<*

>--<

X“*

c-³

ζ·>

~^-ι-ί

—Λ

w

t = í

Fi

hí?

Fa

ΟΓ5iéa

SZ

Xj

Κ£

Fi

Si

§?

^é'

s?

áí

s?

ά

<L> &~>

ÍR

á?

s

:

Ϊ.-ΓΪ

:---

X-^

S*>

-'^

<x?

>£^

¢-

Fa

&

Ka

Fi

£%

Fj

Fa

Fá

Pr

W'

á

53

Fi

ír

&

52

Sí

<F <5>

ar ' s

1

^_3

0-1

.yo

x^

fc-t—>

Ζ>

Λ^·

_

B

πί

íí'i

Φ

Fi

px

&

F'

ϊ^

5>

S

ée

i

ώ

Γ3

§?

i<

1

.-

<<£>

-F'

^--

>->_____

<->=

E

Fs

glj

gg

ίΞ*^

X';

<^ζ·

φ

ώ

éi

Λ

á?

ά

ώ

Fi

ά

á?

s ?

í'-z>

-^-

i.>

CO

<-í>

*-->

_ίχ>

X‘^

I2j

|=A

Fi

Fj

φ

Φ

φ

Fa

FJ

Fi

gx

&

&<

&

ÍF

z.

έΐ

ÍR

ώ

á

--

é—¹

-¾

ίο>

S-'

«:

,--

~F

fi

FT

F|

φ

Ki

&

Fí‘

Fi

B-

s-<

S

S3

Á

Fi

ζ.

53

iz

X¹

b-^:-

*F

b'^J

<5.

Ο>

--^--________

-~j

Fi

Φ

íá

B

F5

Φ

>χ

*

ZZ

&

Á

ΖΆ

É5

Ώ

S?

é

s?

Cj-J-

->i>i . '

_

E

Fi

Fa

í?3

FÍ

Fi

χ-<

F?

F

o>

&

á?

1^ώ

gz

á?

S?

Sí

ír

M

S¹

S ö

f s	Ϊ Ϊ	: : <	1	>	ff> ϊ	ΐ	t	í 5.	í
	_*y.			R	'---*	£-=*	»->	>£»		F
FP		ÉS	Φ	Φ	S?	í^-r-·	es
				o>	Sí	é?	ss	s		r
¢33	<í^--	>->		—3		á-		py-3	<r»<	B
	ÉS	ξ-i^	&5			s?	lyj	8?	ff	54
	ás	ώ	é	é	é.	á	é	Sí
				<^í
	JVA		ÉS		st	is	rS
s?	*	é	-	é	ás	á?
zr-	r-o										g
rí?		<<:>	R	es	ÁS	^3			&		í*-
s		S ^~jc^>	Á	Sí	ás	á?	&	sí	1	B-	i
	t.-	s>	j-JCZ				Z'-'		í~?		3
ÉS		jHJ	ÉS			&		w.	íd
SS		é	&	A	Sí	Ói	é	sí	I
^--	í-	4>'^J			_x—		<5^______	CJT5	jg K
	ki			sí	8?			s?
é	éí	θ 00	Sí	SS	Sí	Sí		Sí
				z-		£*	jyví	u^=*_______			: ί·
Hií						ÍS	85	ÁS	>
é		: .......	<J>	&	á<		ά	Sí
fj		T	í--^	i--_3	í	5	z-
SS	&			SS	á?	Si	Si	á?
		;........^:					... . ..... ... .	'		'-'.......E
	ΐ-.^	r-		'-X	g>	z^__	g			ff
Sí	t3	á?	&.	á?	Sí	Á	s	?k
;„ΓΪ		><r=--						--3 . '—ς..	kW	»
Ss	ÉS		R	í?7	íA		w		g
	é		á?	s?		Sí	J=-^	-57¾	M-	i	l·

Cb

B

S:

Γ

«' 5C5 k

f B

Γ*

feTBffi) 'JI«HB&

f B

⁸

Ϊ

ΐ~Ο -

£“-<

k-³

í-o

ő;-<

z->

fő)

&

Wi

fi?

85>

z£k

&k

g?&

w

-

Sí

ΪΆ

k

Sí

Á

Sí

8'

C^J

i-

í-^

&*

ik^f

r~>

ff

είί

Wk

cH

MJ

<0?

^3-

*8

á?

&

<É->

S;

áí

sí

áí

é-

ϊ

í>-_’r

-<J&:

ért

-—-?

<->>

-ír'

-£^

<í

&

Φ

s?

b<

Sí

K

rb

í ά

Si

Sí

áí

ék

*

ά

á

*

Sí

n

í-->

k:-³

ΐ_^_ϊ

Sr'

ζ--^______j

k.-^

S-

Φ

&k

s>

[ρΟ

rS

θ

fi?

8 δ

ii

Sí

St

Á

é

Sí

&

*

Sí

9

§

r--->

£-<.>

Λ'

r-

3

rk~

j?4

ts

Pb'

S5

£>>

S7

‘^k

i É

ά

&

Ά

Sí

d?

&

g< <3TV

p\

Λ~

ir-

í-->

Λ¹

Sr>

£--^_______:

S?

φ

rS

-ís

kki

íí*j

Sí

&

Sí

ék

&

*

é;

k.³

tk<>

s~>

>£=-

<-

x

g?

&k

f^h?· C<3

Si

Sí

ŐS?

dí

ék

SS

Sí

s;

Sí

ds

ά

»e

*?>

>--

5~<*

<-<>

í-^> >*-

t->

Cf

b£

fei

^fí^'i

yő;

^S

ff

ώ

é,

s?

Sí

é

Sí

*3

í'-y

k~

Jr--->

~~

>fec

fep

&k

Si

ΐ^

Sí

ÍS

ds

SS

&

-

és

áí

s

Ώ

í>3

-^--

<7·.

s : --^

—Jí

O-í

Cí>

sr

R3

i^l

H3

bő

s?

í&

¢.

Sí

d?

Sí

d;

s?

s<

Sí

é;

®

η-*

s<s

ι

» J

<-

ff

í

f

&

¹

zz*

/

fe

<=>

ί*~

-/

Λ/;

<3-< R

Z- R

s?

&

sa

Β

&

h

á?

é

ζ-³

Η

i**-·

*>>

ζ^

zz*

z '

*—i

ΖΖ^Ύ

Z'

R

&

/1

/Ϊ

hH

R

S?

íh

Á

ά

&á

R

dk

&

<?--.

Ζ^

Z^J

Z^

z'^:

z^

έ^

£/

ed

~ζζ2 £<3

rZí

g»

R

& i^:

_: R

*

:Χ-

s?

θ

z.

s?

z.

R

ζ^

ϊ~>

ζ·^

Λτ*

<---->

Z'-²¹

z^

Z^

{Ζ·

ΐζ

φ

Om

ζζ

ZZ.

Ed

R

>z

8 &

&

/

<ι>

s?

-

R

&

p?

ΖΖ'

ζ~*

r-d

?—*

£'->

Zz>

Z^

X=

<-^->

ro

0?

ti?

R

H

ά

&

Á

ífe

ώ

z.

E

2d^J

ζ^ζζ

<-< Jf

.<a> :

Z-*

Z-

€^_7

r->

ΖΖ.

£η

Γ-Ζ*.

Ad

zZ

£=ΐ?

|

S^

sh

&

R

Á

5

z

ϊ

ι¹

Í---J

<Ο

Z-:*

Z*'

Z^

^=-

Ζζί

φ

d?

ο

ZZ

líp

ÍTS? £?5

R

fcí.

&

mi

é

ίβ

Éh

&

T^

R

á?

ύί

<ζ>

ζ~

Cí>

z-

t-->

<15

<_í->

í

35

ί/

&

1¾

tp

ZZ

R

I

g

S?

&

mi

&

é

R

z

í

ί -Γ ^

Η Ζ'

ζ^

ü-a

z-*

Z^

ZzZ——

φ

Φ

j/;

zz

R

5¾

S

S3

ífe

é

R

5'

Ζ~”

ζ^

Ϊ^Γ-

<’-

--Í

Z^

l-fi

R

Φ

ód

íd

R

bs·

S

*

?k

&

<Ξ? <z>y

R

s?

á?

Z

z

V

1

Ά

t

B

g

i*

ét Ϊ £~v,i

e

fel-léteik

Ϊ

<^>

<=> <3S

<=~>

£Ξ>

s*

^: <rt> <->

22* <»

22* <^>

-2*

JT* *** *2222

1

: C'«

<?> '2~>

g

22

-2

e

-5^ <0

s* <Z3.

22* <^>

2*~·

2* _:^z-<

⁹ f

-S=>

22* <=>

2* <r-s

θ <'->

fe <í> i_<J

·.*>

22*

θ <—>

f «

s

£*· '---->

<~2>

4'í

22* i <->

s-O

g

: <?>

¢ér 1

22=> ez

•'V

s

s* <->

8 <X5

·''>

-- <0

22^ c^>

<Σ>

e í

J52* <S>

Z-*

~S

—-'i

2*

θ »5Vf

: <~s

2* <~Ά

£2> <X>

g

I

<22* <~>

22* <.y.·

θ <=>

~z

e

cz>

22*

<^>

-5-> <^>

í

22*

<-> lz>

22* £

~Í~S

<V

<~z

2** *2>

<:> cs>

^2* <r.->

<Γ1-ί

<- CLi

í

~* z~-í>

\ »r :................................5

<~>

4F* <=>

θ

<-221 <zzz<

2r~>

22* <.-->

c~>

C/ ^: -- CL>

B

22* : <'v

θ <:>

<© <-<

< <~> <3

2':>

-2

<2> 2~í

22' <=>

2*

s

r g M H=

ι

*Λί·

*	ϊ I		ϊ	*1	Βκ ί			» ϊ	¹
	<ΖΆ	ο <:'>	<ζ>	-Í^J <'3	ϋ- <->	, ^íSⁱ*	S	<- «5	Ι·
ϊ>ϊ	<2>	<£>	<η>	s	-2	g	<=> θ	S	5 f
%	<=> ζ->	<χ> <Τ3 Η- - --		¢^-	C~3 j CS3	^: <Ξ-7ί CSO	θ e—i	^Ζ>	f κ
	<ζ> ~ϋ	g	<ζ>	<=> <::	<=> C3	<ο <—	>Ζ~>	<	Β 5
7<<^; ^£ί^ θ	2	⁽·'·>	<-ζ·	θ ; <~>	Ί «τ> ϋ>	,$'> <Ξ>	<=>	<ζζ> ϋ.	g e
3Ü	ί=» <η>		<ο	<~> >Ζ'·	<Γ2>		‘ZZ-t	ο	1 Ρ
	$=> <ή>		5=> : C3	<=> *ζ~·	yr> ~<Ζ3 :	θ	*ζζ>	ϋ'' <c>		ί
r-> I	<Χ> <r>	^ζζ>	<ζ= 7ϋ	ΑϋΛ	-------1 ϋ³ <cC3 :	S	ζ=* 'ΖΖ·	cá> <ζζ>	&
S < )	<=> <:3		<-3	ys- <ο	g	<=ζ>		ζ: =	Β
		Sr^' CSŐ	θ <ΰ>	<?Tj	-2		g	S	-£Jí a j

		í	í-í £ E	*-.' B E	**/	f e		í	^E	í
		cm	c· <Zf>	g	cm	c:> g	<^>	cm	F- cm	1
		£=>	<Z';>	í Z-' ; c-	<m <:.:<	<=~>	S	cm	cm <s_z	1
s				<Zz>	-ü^>	g	fe ó	cm	cm cm	t f “' a	®espjsTO
g	g	<z>	θ cm	-=	<rr> <^=	<m	ÉS s	cm	cm	¹ I
g	cm		<=> cm	cm <m	cm	g	s		<c> <^>	1 í
	cm cm	cm	θ	cm cm	cm	g	Ο	c:z	<=^	ff
«3 o	s	s	<zz>	cm ' cm	£=> cm	g- θ	cm	<x> C3	<-'->	<-
o < <r.>		g	cm	cm -- <m	-ξ’ C3	c=> cm	• <=> <so	s	z=> r.	s
'.Z'y		<->	&=*	cm	~s>	sp*	cm cm	g	im	f
mm	ΐ'-.ζ i	Cí	C<-j <ΞΞ>.		s	ssm Pf é:	í'C- é=	8		í f

S, abszorbeált dózis per egység összesített aktivitás, (rad/UCI-H)

Sljss test	1		í	M	ff	^f		ÍWH) ·Λβφ®3: i· :	í. Ss	¹
í--.; éá φ	<x=		<sz>	gxv <Ξ>	<2>	<^-3 —< «->	»-·-·> K t·—*	_<2> <r>	s^·	1
s	θ <2	g	<25	<r-->		'-> R <35	<25 <25	<:5 <37	£=* CZ3á	í
8	<3-	<z^	&*	&*		<=> <:>	<2> <25	£=> <2>	<?< tp	„ ff M> 8^: R
r>	<.~S - ~- <2>		g			<=>	JF> <25		Í-- 8	t \|
rs> >í é?	: θ	-í^::> <-'·>	&> o		'£- *-->		<3> «>	<2>	cii άΐ	s 1
	g	;-'2. <:>	<->	<---'			<35 <33	s=> >---->	O	ff·
i		<2>	<G~>	fs	*£>		g		,<2> <2>	¥
i	S^' <35	<~z		<^:> <^>	Í2>	<2'-·	<2> l cz> :	£=* <zr>	g	l
Ϊ	<z^ <z^	S	=C~	<~> <5	c:> ·>*. ; <:>	θ	j2> co	<35	<p* *zz»	f
	<3> <?5	£* &	s	í>-'> ~éS &	i	f-> ÉH f	?o i	£	1	Ϊ #

iá β

-i—i 0¾

ϊ

<-

% &jy

-----^-- —

i

Ϊ

^f

ÍF

ff

^:. Γ :/ ; i i /

ί=* 1

<e>

Jld-7< 1

θ 1

1

i

<r>

CT·

d;

<z^ cg

El g

-Zr-¹ 1

1

xd

W5

: ?-'

Ϊ—

-₅^->-

d-^;

z-^

Εί

£T3

fi?

IZ

Hí

&

Ra

Hí

rE

&

έι

ά

é

áí

sk

&Ϊ

E3

é

ÍS

'

>3^

í'->

<»

_

-------

<ro

_r-.

/3ώ=-

a~-·.

í

Ηϊ

$5

H?

Hí

>íu

ÉH

fZ

E?

pz

&s

Φ

&

ώ

s

sh

5

s

SS

é

<z

s

5---* Hl

izs

Ea

iX

JH—>

E5

?

Z IZi

fe'

-t^

s

F

í

ώ

s

ii

é

ώ

á:

s

El

E3

f3

ÉS

£S

I

g

d-

a- - ·-<

Z'^s^

Z'

Jddt

4.-¹

d

z^

-d

s

zz

Hl

é<í

ε^

ΐΖ

Hl

Eí

ΐ^

Hí

Ε1

é

£>

s

E3

é,

ώ

&

Ml

©

éz

<±> ΐ-<>

s

-d

^jc-j

<^

d

ϊ--^

Z-

Z'~'

vo

í-o

Ζ-ϊ

B

ΖΖ

ÍZZ

1E

Φ

fii

Ef

Φ

Hí

&Ά

F*

Γ ^:;

έ:

É

E=-

ώ

é

<1>

s

ώ

i

é

έ

h

d

d-¹

-2

i'

ZZ

z

--

oo

-d

z ¹

Z-

Z

tíl

Hí

H?

R3

Hí

rp

i/j-

Ép

ífe

SS

ífe

El

ώ

S

é

É3

a

ώ

Ó

s

ώ

C-J>

Y--

-d

-Λ->

ZZ

<<_>

:

_~« :

r-.>

_____

R3

H?

d

r'R

Hl

Hí

&í

S'

á?

ώ

é

s

&3

íb

é

<z>

8

Ei

é

tó->

2d

Z-^

_'8-

-d

<5\

CT-.

>--

~-_s

&3

K

ípj

&

HS

H7

έΗ

El

Φ

Ri

íU

é

&

s

Si

ώ

El

é

5

ES

s

El

,______t

z-

r-

-d

z-

_í?.

4d

Λ-

Z'^

z^

i_<>

z^

ff

í^

H?

Bz

gj

RÍ

R3

>E

Hi

ZZ

jg

El

&

íb

s

S3

8

E?

A

Cí>

C7>

E->

3

__________

8í?

ί	ί 1	tatóeg!	¹
	>χ>	O		ffi
	9	Φ		B
	?Γ$	ss		*
		<—---			^: ;
	ks	le	s	*n.
	Si	s	w-
	CC	f >2^	f
	⁷Τ
	s	<7i	5
	i-.í	•>-d			gf
Μ	fei	fer	fcr		15-
é	eb íb<>	ά	<	\|	i
Μ		m	g	H	g
ríj	bi	S2	<e~
ώ	s	?b	»	:
	z->	r—	' g -
μ	<TA c=5	9	AT
ώ	u3	Ü	1
J---S		M
W	έ?ί	~b		gf
	fi—	el>		Pl-
		<
		<?.	:		^: ;
	Φ
	ίβ	£5			<
^-	-Τ'	---------—-.----- -S*>-	: ...........	-/::..........
	Ij3	έΟ		fgí
*	é	6
X-		r-j?	-£7:	>
	bf	z <i	g
^2.	eb	<b	<

ί	Β			Γ⁴g g	í~s B 1	íí	i	Í	¹
		ΐ	CSS~J B	lg	cu cB	<—>	cső 1	<:> 1	£		1
		1	d?	<-J	<~s		^CSO	<;'^	£		1
	CSO §	<?ο íg		§ íí>		CSO i	S~-'^:	4~>	£	_a Ϊ - a
	CSO lg	CSO S	s	<zz> i	-Γ'	cső	.7lg	<=> 1	c:>	¹ i	[:
	<-Ο á<	S	ás	dj	>—* KS	éz		s	JC_*J3	1 t
	idő: S	i		: >-'—	-í^ s	in fö	£»> Oí>	S	o- Φ BS		» j
	ώ	g		ϊ:<· ds	J-o	3>O i	-íd	£<-·	Λ--⁴s		<-
		cső fe	S			&	>?	cső	£		Ϊ
	<— ϊβ S	i	<x> BS i?	1	CSO lg	cső lg á		'2	J=> s		f
	ctí 1	<:·> lg	<s> ®	<s> lg	í-> .........	cső -7	CSŐ la is	£	C'j I	g	t

οοτ

τοτ

s	..............—’’-’’’v’””·. . . . ® (na tata)	^!	Ϊ		ff.	f	r
		<.r> 63 á?	1	zz-->	^:€_S>'^: B	w	I
<=>	<S> w	/'> la g	<s>	<z> > 3	1	<S3 s	I
1	-g	I	<x> 8» 3	θ i	s	<~> 1	g. í - G
ο	ess? 23	8	5d SS	1	ess s	<ÍS 1	I \|
	Aűí é	s	g	í—‘	Ϊ--Ο s	ro 0Í έί	i í
	-3 1	<^ΐ í-b	R £i	0? ώ	£ ¢-->	i™*-' εΏ	ff.
	2	É-'-st 68 &	i :	Λ-° 1	^rí	-r;	<§·.
i	; <SS>	es> w		s	i	<SS s	l
ú--*	S-^ 1 :; ^:	1	<r> fe ; έ	<:>	1?	<s> 63 é	I
_£	w	J3S> .........	s	ess-	<~>	Í3 BÉ S a

ίο τ

Β

|

8

Μ

w

** '- Έ2 F- E ~ES

s B

w 1

I 1

í

^s

⁵

-'“>

o

<£—>

<o

cs>

=-—

<=>

SS

θ

R

SS

?

SS

s§

s

&

é

§

-&

§

3

§

3

&

< -

<C7-

<:>

<~~>

d':·

<i>

^-

*é%

zs

gg

SS

zz

&3

ZZ

é

S

a

3

ώ

SS

<.:>

</->

c:>

<z>

<T>

í>c

θ

-1~^>

R

S?

R

zz

R

SÍ

gg

fl

te*

3

S

§

&

é

é·

é

δ

s

1

-ί'''*

. . .....

<ΤΓ>

<o

θ

cz>

ne

5^

pú

ríj

SS

ggt

&

s

é

^s

3

&

é

3

M

i

CCO

<-!>

J——i

€Clőt

<SSr

X~'

g

ί^

SS¹

gg

gíg

§?

SS

gg

>'ίϊ

3

δ

é

§

SS

&

3

.3

S

θ

<τ-·>

tt-

c:>

»---‘

c~>

>--

<s>

<CS

Kí

θ

SS

Só

m

í^r.

S

s

s?

fe <.>_>

s

Is

1

θ

<T£>

<o

<~>

g

£Ϊ?

R

£3

SS

rz

Síi

SS

é

~á— SS

SS

s

Só

<~Σ>

<x>

<~>

<zz>

C2Ü

<zz>

g-·

s

<ν?

8?

ep

SS

gg

'&

δ

3

&

s

3

*ρ,

Cí>

tíz»

O

<r>

C2->

&>

o

*ry~

Su

R

SS

s>

S

&

3

sb

3

Ss

a

<:s

<-~i

<:>

<?>

_<::>

<z->

<zz>

<_>

H

<

gg·

gg

gsg

zz

>

§

&

é

3

—·— --r-7—:><·

&

e οτ

Ιΐ οη ί~» —2

C3-

®

ρκί I Ε~3

t

fc. 1

í

R

n*

1 .....

K rx

o i&^!--* &3 ESS fö

W s <ί ξ j \

<~>

R

C3 R

o R

c>

<•75

g

f

9

<'CS §i

<-Z> R

K

S3

8

ás

R

8

ii

8

s

<s

8

_

<ζζ>

-g

<v>

<~>

<s>

csz>

<:>

<zz>

R

i

1

g

i

R

§ SS

i

<->

<23

<ΖΞ>

~R

<-í->

c:ss

<z>

<Ci

θ

<zr.í

<~>

P'

<—?

R

θ

R

Á?;

w

&

8

^r

R

g

r?-

t

<ο

<=>

g

C7^

JCÍZ>

<S3

*r>

<τ>

<u-=

<r*

R

M

R

r*

8

rg

ás

&

8

é

R

M 1

&3' í&

Ζζ'-'·

<τ>

4=*

c~>

ÍSSÍ

i—.-'________

<i>

z-~-

cr»

¢^-

R

&s

^3

R

δ

8

s

§

8

&

8

kti

8

_

-Μ

C*X<

<τ>

jCL'j

<»

<z>

s=>

<-*

-<^

-iTíj

R

£g

R

£’/

gg

9

í->-

&

§

&

r

a

δ

8

§

<-ζΐϊ

<zz>

<:>

<r?>

<ZZ>

po»

: cv>

C-L>

<z:.'

<MO

w

§T

R

xS'

gg

Φ

9

R

In?

á

&

gj

§

8

R

15

R

g§

§

£7=ϊ

i~3

<>

<:>

<zz

<>

<zz>

C3

R

5ϊ1

R

ίεί

R

Μ

§

&

8

s

R

r

8

ír-

8

zzvf

<?.->

cv*

M

>x~-

<3-.

<~>

zz

X'-'

rg

R

ΐ?3

&

zás

R

t’2

R

&3

R

F=s

r?í

R

&

R

§

&

8

^:<; I

8

>χϊ:<

<ο

<ο___

θ

<:>

<o

<x>

<=>

£->

M-

J-⁷

Ííí

R

/g

R

*w

&

S

gr-

8

&

'

&

s

8

g?

ο τ

» «Η

¹		> ~	ί	ί-ί £	ί~ί Β β	»<	iri í g	í	^E	^s
	-g		9 §3	g	ζ:> t'm &	c> ί® á	i	^! s	jp	1
	ϊ	ί	<ζζ>		zr-> ία &.	tr--> Ια §	g	<zz>	<=» i	1
	θ	<:> gr	_ρ	g		<Γ~ι ί® &	<τ> w		1	* I
	e:- Í	ο g	<ζ^- S3 S			1	<::^;w		<:> w s	a \|
	>	JCL3 1	1	1		<_;> 8ϊ S	_θ Ég s	tg é	<iz>	1 1
	1	ϊ	W	g	<ζζ>		*i'L> gr	1		ff ..: - .. ...
	-ί'^> S	C'3 1		g	S	r_í 1	<:z I	s	£	<-
	1	Ο g		g	«Ι> 1	g	> -SCS	jcz> I	-θ fg	t
	ί	<> 1	<^> I	<?> && &	<τ> ÍS	<=> fe é	ez- i	<X7 SJ &	gz>
	-ζ~' S	1	g		g	fe §	I		o Ϊ	— —— .. - - -.- - — ... . . . . ^ -

d ο τ

Í3&

L. Ο Τ

V fi	É	<ü-	í	&		^3 1 t	1

tó-			tó? s	<z:>	-g	<tó	Γ
í:> s	i	s	tó? Ég	<ü> 9	tó.·	£	1
tó>	c:> fe ás	i	£= 1		tó? w	£	. Ϊ - * ö
tó? fe s	i	.tói 1	tó? S gg	cz> a é	.tó? 1	£	i \|	1
	2		>-\-·	.tó? i	s 8	Λ-^>Λ	8 í
g	íX2> @	<-->	i	R S	£	tó? R	ff·
« ώ	θ	é	e:> 1	-v 9	9	<zz> 8	>
8 a	tó? s	i	£	<^r	tó-? ~éS 8	tó? w Ító	s
<G> R	tó>	θ	s^	Jtó? s	tó? R s	i
	s	B	í~ s	tó? 1	tó?	c:> P -........	s í

8ΟΤ

19, táblását egységesen szétö&slatott indxum- [1111 -gyei jelölt 2B8-MX beadásából származnak,. és az Injekció beadása után 72 óra eltel tével mért állati megoszlási adatokon alapulnak

Aktivitás mennyisége s~	RAS	1000 μθχ/bateg dózis	MD
Mellékvésék	0, 493	Petefészkek	0,337
Húgyhólyagfal	0, 348	Hasnyálmirigy	0, 362
Gyomor fa1	0,412	Csontváz
Vékonybél	0,434	Körte csont	0,47 4
31. bélfal	0, 53 3	trab. osont	0,47 4
11. bélfal	0, 505	Ca o n t ve lö fvö r ös)	0,602
' Vesék	0,625	Csontvelő (sárga)	0,602 (
Háj	1,533	Porc	0,474
Tudok	0,582	Egyéb alkotórészek	0,474
Egyéb s zö ve tok.		Sör	0,564
I zom		Lép	: 0,854
Zsírszövet		Herék	: G,239
Véx		Pajzsmirigy	0,27 6
Agy		Méh (nem terhes)	0, 4 73
Szív		Teljes test	0,417

Hivatkozás: MIRD Öl of Náci, Med. ZSuppl. 1, 2/68, „A Schema fór Absorbed-dose Calculatíon fór Biolcgically Distríbuted

R a d i ο n u c .1. 1 de s

A számításokat egy Spreadsheet Template in Symphony (Latos Development Corpűration) segítségével hajtottuk végre, melyet Phillip L. .Hagan alkotott meg (MS Nuclear Médl ciné Service, VA Hospital San Diego, CA 92161)<

19. táblásat dozimatxiás becslések ,

emberben (70 kg) egységesen szétoszlatott ittrium~ [90} ·*η®1 jelölt 2S8-MK beadásából származnak, és az injekció beadása után 72 óra elteltével mért állati megoszlási adatokon alapulnak

Aktivitás mennyisége -	AAO	1000 tiCi/beteg dózis	RÁD
Mellékvesék	0,000	Petefészkek	Ö,0&0
Húgyhólyagra1	0,271	Ha snyáImi r 1gy	0,000
Gyomozfal	0,356	Csontváz
Vékonybél	0,504	Kortikális csont	3,138
ül. bélfal.	1,1.50	Trabekuláris csont	3,138
11. .bélfal	1,772 i	C s on tv e1ő (v őrös)	7,776
Vesék	8,366	Csontvelő (sárga)	7,776 [
Máj	8,575	Porc	3,138
Tüdők	2,07:9	Egyéb alkotórészek	3,318 J
Egyéb szövetek		Be;	10,269
: I zom	2,716	lép	8,965
isirez övét	2,716	Herék	0,000
Vér	2₁ 716	rájzsmírigy	0,000
Agy	2,716	Méh (nem terhes)	0, 304
Szív	2,716	Teljea rest	1,854

Hivat közás: MIRE J . of Hucl... Med./Suppl. 1, 2/68 ,,A Seherna fór Absnrbed-dcse Calculétion főt Biologieally ülstr 1 büted Hadion imlidss

A számításokat egy Sprsadshset Terápiáké in Symphony (Lotus Development Cozporatíord segítségével hajtottuk végre, melyet Phillip L. Hágán alkotott meg (MS Nuclear Medicine Service:, VA Hospital San Diego, CA 92161).

A* dn vitro vizsgálatok a 2B8-cal és a 2B8-bX-DT?A-val

1. A anti.-CI?2Q antitest előállftá'sa és iellemzése

Az összesen kilenc, fúzió három c*ya^v' a n fit estékét termelő hiórídómát eredményezett, melyek hatásosan versengtek a radioáktívan jelölt Coulter ΒΊ antitesttel. Mindegyik esetben a hibridomát egy 24 mérőhelyes lemezre szélesztettük. Az első kettő, 3. és 4. fúzióból izolált antitestet izotóposát meghatároztuk, és mindkettőről megállapítottuk, hogy IgM. A harmadik antitestről, melyet az 5. fúzió termelt, és 2B8~nak neveztük el, meghatározzuk, hogy Igéi kappa izotípusú, és ezt választottuk ki a további, vizsgálatokhoz.. A 2B8.H11 kiónt szaporítottuk, és a hosszan tartó tároláshoz folyékony nitrogénbe helyeztük. A 2B8.Hll-t szubklonoztuk, .hogy előállitsuk a 288.Bll.G3-t, és ismét szubklónoztuk, hogy létrehozzuk a 2BS.Hll,G3.G9 kiónt. Ezt a kiónt. szaporítottuk a további vizsgálatokhoz, és az antitestet protein A affinitás kromatcgráfiával tisztítottuk.

A. jelöletlen 2B8_:, 81 és Leu 16—t és radioaktívan jelölt Coulter Bl-t alkalmazó kompetíciós mérőéijárásokkal kimutattuk, hogy a 2B8 hatásosabban volt képes meg gáté.Ind. a B1 kötődését >a CD2 0-hoz, mint az azonos koncentrációjú SÍ vagy Len 16 (1. ábra) . Hasonló eredményeket kaptunk (adatokat nem mutatunk bej a FITC-konjugált zBt-t, a natív Bl-t és az ÜPC-13 és 3-003 irreleváns antitesteket (IgG 2 a illetve 1 izctipuack) alkalmazó kompotleiős mérőéijárásban.

A 2B8 és El antitestek közvetlen kötődését a CD20 antigénhez €D20-pozítív SB sejteket és Cb2ő-negatíyv HSB sejteket alkalmazó FACS analízissel hasonlítottuk össze. A 2.

áb rán bemutatót1

112 eredmények azt mutatják, hogy az antitestek hasonló mennyiségénél a B1 helyett inkább a 2B8 kötődött az SB sejtekhez. Nem figyeltünk mag szignifikáns kötődést az irreleváns antitesteknél. Csak háttér fluoreszcenciát figyeltünk meg mindegyik HSB sejtekkel alkalmazott reagensnél. Ezek az eredmények igazolják a 238 CD20 antigénnel való kölcsönhatásának spéciiírását, és azt sugallják, hogy lehetséges, hogy a 2S8-nak nagyobb az affinitása a sejt felszí ni. antigén iránt, mint a Bl-nek.

Abból a célból, hogy meghatározzuk a 2.B8 látszólagos affinitását, a tisztított antitestet '^'I-vel .radioaktívat jelöltük, és a jelölt antitestet növekvő koncentrációban antigén-pozítiv SB sejtekkel inkubáltuk; a sejthez kapcsolódó radioaktivitást egy egyórás inkubációs időszak után határoztuk meg (3,. ábra) . Az eredmények azt mutatják, hogy a 288 antitest a CD20 antigénhez egy 4,3 X IQ M látszólagos affinitási konstanssal kötődik.

A humán normál perifériás vér limf ocitákkal. végzett áramlásos cltömetriás vizsgálatok azt jelezték, hogy a 2B8 specifikus a Bsejtekre, és nem reagál más limfoclta típusokkal fpéldául Tsejtekkel, monocítákkal, makrofágokkal).. A F1TC- jelölt 2B8~t Összehasonlíróttuk a Bl-FTTC-cel és a len 16-FTTC-cel a humán limfocitáknak ugyanazt a populációját alkalmazva. Az eredmények, melyeket a 21. táblázatban mutatunk be, azt. jelzik, hogy a 2BB a perifériás vér limfoeitáknak hozzávetőleg 14 százalékával reagál, szemben a Leu 16-tal, mely hozzávetőleg 12%-ka.l magái, és szemben a Bl-gyel, mely hozzávetőleg 11%-kai reagál. Egy másik limfoclta marker (€D~18V alapján a limiocíta populáció 11 és 14 százalék között volt. Végezetül, amikor humán perifériás vér Irmfoeitákat inkubáltunk a 2B8~cal ás vagy a Bl-gyel vagy a Len raarkerrsl

f e s u. ódét t popul á c 1 c· j a a 8-liröfociták kétszeresen

volt a Bl-nyel

1.14

21. táblázat

A 2B8 humán perifériás vér limfocatákhuz való kötődésének bs^eihasenlxtása »ás B~ és

Ax

A. Egy ssexes festés

S emm i (autót!uo re stceno i a)

Bl-FITC (Goultér Immunolégy.

CDéS-tal szűrt liss.f'ooitak százaléka

IgGla,ki 11

Len lő-FITC (Becton Dicklnson, IgGl/k) 1.2 2B8-FITC (EDEC, IgGl_fk) 14 .8:72.3-FI TG (IgGlk irreleváns kontroll) 4 anti-^:CD4“FITC (Coolter Immunology) 37 anti-Cüő-FITC fBeeton-DickinsQnJ 59 anti-CDl9-RPE (Becton Diokinson) 11 antí-CDI 9-EITC (Becton Dlokio.son) '14 B. Kettős festés:

pl-FIIC/anti CD19-RPE 10 Let iG-FTTC/anti CD19-RPE 10 2B8 FITC/anti CD19-RPE 9 anti-CDlS FITC/anti CB19-8BE 13 81-FITC/anti Hu lg RFE 10 2BS-FITC/anti Hu lg RPE 10 1 e un o g a t a S l .mu. 1t e ® t .9 9

11S

A íedioáktiya.n jelölt: sejtes CD2Ö antigén iBB-cal vagy 81gyei végzett immunpreoípitációja hozzávetőleg 33 és 35 kDA molekulatomegű megkülönböztethetetlen kettes fehérje precipitáeiőját erédmenyezt® (adatokat nem. mutatunk be} ..

2. A zAg-m-DTPA előállítása és jellemzése

A 2B8-MA-DTPA konjugátumot ügy állítottuk elő, hogy az antitestet az izotiocianátö-benzil-d-íseti 1-dietíl.én-tr íaminpentaeoetsav 4:1 arányú moláris feleslegével reagaltattuk H) . űellemzöen 1-2 mól MÁ-DTPA kelétót vittünk be a 288 antitest egy móljára nézve. Ahogy a 4. ábrán bemutatott eredmények mutatják, a 2B8-MX-DTPA kon jogát un nem mutatott látható irmsunreaktivitáscsökkenést, szemben a natív 2B8-cal, míg a natív és konjógáit 2B8 antitest is látszólag azonos B1 inhibíccós profilt fejezett ki; az IC5Ö érték a 2B8:-nál és a 2B8-MX-DTPA-nál hozzávetőleg 3 pg/ml illetőleg 4 volt. Ezeket az eredményeket -jelölt .81 antitest alkalmazásával kaptuk egy teljes sejt radáoirsmunöansayvei, melyet SB-sejteket alkalmazva hajtottuk végre. Hasonló eredményeket kaptunk a 2B8-at vagy 2B8-MX-DTBA-t alkalmazva a ^:2'·’! -jelölt 2B8 SB sejtekhez való kötődésének inhibitoraként, és a 288 és MX-STPA kon jogatorna is gátolta a ^l -2B8 SB sejthez való kötődését hozzávetőleg 3-4 μΐ/ml koncentrációnál (adatokat nem mutatunk be),

A natív 2B3 antitest és a 2Β3-ΜΧ-ΠΤΒΑ konjugátum in vitzo stabilitásának mérésére a mintákat normál sóoldatban vagy 1G mM glicin-HCl-t tartalmazó normál sóoldatban (ρΗ=δ,B) inkuháltuk 4^<;C~on és 30^:'C-on 12 héten át, és az a liánotokat hetenként kiértékeltük a következd mérőéi járásokat alkalmazva:: ímmunreaktvitás mérése teljes sejt enzdm-immunoassay-vel, SDS-BAGS redukáló ós rie.n’i redukáló körülmények között

ele ktroforézis. X	1 g az .	immun.r ea ki	11 yi t a s i as s a y k m	sm mutatta	k ki
az antitestridnt ák	; sut lg:	in fel isme:	résében csökkenést	egyik ink	ubá-
oiós hömérséklets	:r- sem.	a . ab r a i	_f az. antitest izo«	elektromos	£O~

kaszálási tartománya

30-8

O

.U csökkenést

fí'Hí'S 1IWí 81 Wí : ΙΣ'ΗΙ'ί ΓΠ*Ηΐ'ί |8íW< KldÖ’í |§ΓΗ£ ί

z. τ τ

A natív 2.B3 és 2B8-bX-LEBA mintáit eltérő pufferekben formuláttuk, és vagy 40 vagy 39°C-on ínkubáltuk 12 héten át. Ezalatt az időszak alatt különböző assay-ket hajtottunk végre., ezek közé tartoztak az izoelektromos pont meghatározások. A fentebb bemutatott értékek a natív és a konjegált antitest izoelekt romos: pont tartományát mutatják be, mely antitest eket mindegyik, hőmérsékleten mindegyik készítményben, és a tizenkét hét mindegyikében inkubáltuk a stabilitási vizsgálat alatt.

A. fejléc feliratai: 2B8 4 SÁL: 4°C“On sóoldatban inkubált

2B8; 2B8 30 SÁL: Bu’C-on sóoldatban inkubált 2B8; 2B8 4 GL¥:

4^Λ0-οη 10 mM glleint tartalmazó normál, sóoldatban inkubált 2B6; 2B8 30 GL¥: 30°C~on 10 md glicint tartalmazó normál söoldatban inkubált 2B8; 2B8-:MK 4 SÁL: kPC-on sőöldátbán inkubált 2B8--WDTkü (konjugátum); 288-MX 30 SÁL: 3ü⁰C-on sóoldatban inkubált konjugátum; 2»8-MX 4 3LY: 4^vC-on 10 mM glicint tartalmazó normái sóoldathan inkubált konjugátum; 2B8-MX 30 GL¥: 3Ö*C-on :1Ö mM glicint tartalmazó normál sóoldatban inkubált konjugátum.

Végezetül, nem redukáló SDS-PAGE-t alkalmazva 3Q^eC'-on az antitestminták nagy molekulatömegű aggregátumokat mutattak egy hét múlva {23. táblázat).

A gélek denzitemetriás analízise azt mutatta, hogy az aggregátumok a minták 8-17i-ában mutatkoznak. (23. táblázat}. Mindemellett, amikor ezeket a mintákat redukáló SDS-BAGE-vel elemeztük, nem találtuk meg a nagy molekulatömegű típus bizonyítékát, mély az antitest aggregátumok. 30^cC-on történő képződését sejteti. .Az immunreaktivitás csökkenése megint nem volt megfigyelte··· A αλ V >:

3, báblázat & 2S8 in Mtrc stabilitása

A: A nsa redukáló SDS gélek duuzitosietriás vizsgálata

Minta	Százalék
	Hagy molekula tömsgű	Monomer	Kis molekulatömegű
Referencia	0	100,00	0
Az hát/4ⁿC/ssóidat	0	95,42	4,58 *
12 hét/4C/glicrn	0	100,00	Ö
12 hét/30³C/sóoldat	7,63	83,34	9,03
1.2 hét/30*C/gllc.lri	16, 7 0	72,11	11,18

B. Redukáló SDS-gélek deuzifcometriás vizsgálatai

Minta	Százalék
Nagy molekulatömegé.	Monomer	Kis molekulatömege
Referencia	0	100,00	0
12 hét/30^q C/sóoldat	0	100,00	0
12 hét/30^aC/glicin	o	10,00	0

Ezalatt a stabilitási vizsgálat alatt a 4⁰C-cn és SO-C-on inkubait 2BB-EX-ÜTRA mintáit is teszteltük a radioaktív fém be<A f.

épülésére ''l-t alkalmazva. A mintákat a 4., 8. és 12 héten mértűk a 90%-nál nagyobb Y-ra, tekintet nélkül az inkubációs hőmérsékletre.

Végül egy különálló vizsgálatban a 4^:®C-on és 30^;öC-on 10 héten át inknbált 2B8-EX-DTBA alikvotjait radioaktivan jelöltük ~'^ίΛIntel, és á szöveti biológiai megoszlást EALB/c egerekben vizsgáitok meg. Mindkét inkubációs hőmérsékletnél az. előállított kcnjugátum hasonló biológiai megoszlást mutatott (adatokat nem mutatunk be). Sőt a kapott adatok hasonlóak voltak azokhoz a bi

120 oldgiai megoszlási adatokhoz, melyeket BALE/d egerekben 4^aC>on k: h 1 tárolt “I-jelölt kenj:ugátumokát alkalmazva kaptunk (lásd lentebb) .

Ügy találtuk, begy a radioaktív jelölési eljárás a ^iJ'Tn-nél és az ⁹'^i!Y-nái is reprodukálható volt. Jellemzően, az “In-nél >95% és az ^'l-nál >90A beépülést kaptunk. A ^In- és elölt kon3ugátumok specifikus aktivitása szokásosan 2-3 mEi/mg antitest illetőleg 10-15 mCi/mg antitest tartományba esett. A ^1:UInés “¥ radioaktív jelölési eljárás kezdeti kifejlesztésekor a komplexbe nem vitt radioizotópokat eltávolítottuk a radio-ektívan jelölt: 2S:8-CíTPA-ból HPLC gélpermeációs kromatográfiát alkalmazva* A későbbi kísérletekben az indium-jelölt konjugátura HPLC tisztítását kihagytuk, mivel igen nagy radioaktivitás-beépülést kapó un k ez z e 1 a ,z i z o t ó pp a 1 (>95%),

A 2B8-MX-DTBA ^^Xn- és *'*¥- jelölt kései tményeinek az. immunreaktivitását Lindmo eljárásával {3} elemeztük. A 'ⁱⁱⁱIn-nel jelölt BBS-MXXTBA-rél úgy találtuk, hogy 100%-osan immunreaktiv

Cv-T (6. ábra), és a 'Y-jelölt konjugátum. esetében 60%-os iazvunreaktivitást határoztunk meg (adatokat nem mutatónk be) .

Ú. A ^{J J} .rn- ss {'*E-jelől t ζΒΒ-ΧΥ-ΡΤΑΑ gel 1 emzése !ΐρ·>·

A ''Y-jelölt konjugátómmal végzett elővizsgálatok bebizonyították, hogy jelentős antitest-lebomlás és az immunreaktivitás: elvesztése fordul elő 10 mCi/mg antitestnél nagyobb specifikus: aktivitásnál. Ezért egy késnitmnényt fejlesztettünk ki, hogy minimálisra csökkentsük a radiolizis hatásait. Bár számos kis molekulatömegú szabadgybkös mentesítőanyagct értékeltünk ki és hatásosnak találtunk, a humán szérumalbumin (HSA; nagy koncentrá

121 elől. voltak a leghatásosabbak az antitest épségének és immun tea kt i vi t á s á n a k me g ő r a é s é b e n (7 - 9, ab r a) .

A ^><?y-jelÖlt antitestet 75 mg/ml HSA-t tartalmazó 1 X PBS-ben (pfi»7,4) formai áztak; diétáién-triara.in-pentaecetsavat (DTPA) is adtunk nesszé 1 mM végkoncentrációban, hogy biztosítsuk, hogy valamennyi *00 mely az antitestről elveszhetett, keletté alakul^ jón. A 2Β8-ΧΧ-ΟΤΈΑ degradációját, mely 14,6 mCi/mg specifikus aktivitásig radicaktívan jelölt, a 0, és 48, órában kiértékeltük SPS-PAGE-t és autcradlográriát alkalmazva, A 8. és 9. ábra, azt; matatja, hogy a radioaktívat jelölt antitest nem mutat szignifikáns lebomlást egy 48 órás időszakon át, amikor 4°C~on inkubálttk. Az instant vékonyréteg kromatográfiát alkalmazó analízis azt matatta, hogy az ^3l0-veszteség kevesebb mint 2% a 48 órás inkubálás alatt (24, táblázat}, Az imraunreaktivitás szintén viszonylag állandó, 6Q%_: (24. táblázat),

24. táblázat

Kliníkailag fomúlásott ^§®X~2BB~MX~DTPA stabilitása

Idő (óra 4C~on)	S zázalé k <<~>njugátumho z kap á so lt radí oakt ivít ás	Százalék iram unre a. kt i v i t á s
ö	97,2	62
2 4	96, 2	0 0
48	96,2	60

A radioaktívat jelölt konjugátumot (14,6 mCi/mg specifikus aktivitás) PBS-ben (pH-7,4) formuláztunk, mely 75 mg/ml humán szérum, albumint és 1 mM DTPA-t tartalmazott, és az alikvotokat. 4^öC-on inknháltuk. A konjugátum stabilitását a bemutatott időpontokban SDS-PAGE-yel és autoradícgtáfláva 1, instant vékonyréteg kromatográfiával és teljes sejt kötési assay-vel analizál tok. Az eredmények azt mutatják, hogy a radioaktív fém hozzávetőleg 96%-a kenjúgátűmhez kapcsolódva marad 4 5 óra múlva fC-on, és az antitest immunreaktivitása állandó, hozzávetőleg 60% maradt .

Λ 7 <

Fovmulál.ási vizsgálatokat is végrehajtettunk a jelölt konjugá búmmal; a specifikus aktivitás 2,2 mCí/mg volt> A rádióaktívan jelölt, antitestet 50 mg/ml. HSA-t. tartalmazó 1 X PBS-ben (pH^:-7, 4) értékeltük: ki. A 10. ábra az autoradiogrammok fényképeit mutatja a 0. időpillanatban és 48. órás inkubálási mintáknál; az autoradiogrammok denzitomerriás analízise azt jelzi, hogy a radioaktivan jelölt antitest nem bomlik le a vizsgálat folyamán (11., 12. ábra.: A minták Instant vékonyréteg kromatográfiás

1 ·'.

analízise igazolta, hogy nem veit ^'In-veszteség (25. táblázat); sőt az immunreaktivítás hozzávetőleg 100 %~ban fennmaradt (25. táblázat).

> táblázat;

Klinikeilag försíulázott stabilitása

r ......... . .........*................ \| Idő; (ára 4’^:'C-on)	Százalék koujugát mához	Százalék
j	kapcsolt radioaktivitás	immun re a ktiv i t ás
0:	94,0	105
24	96,5	104
\| 4 8	96, 0	100

A radicaktívan jelölt kenjugátumot (2,2 mCi/mg specifikus aktivitás) 931-ben (pH-7,4) formuláztunk, mely 50 mg/ml masán szérum albumint tartalmazott, és az alikvotokat Vc-on inkubáltuk. A konjugatom stabilitását a bemutatott időpontokban SDS-PAGE-vel és autoradiográfiával, azonnali vékonyréteg kromatográfiával és teljes sejt kötési assay-vel analizáltuk.. Az eredmények azt mu

123 tátják, hogy a radioaktív fém hozzávetőleg 96% a kenjugátumhoz kapcsolódva marad 48 óra múlva 4 ’Cos, és az antitest immunteaktívitása konstans, hozzávetőleg 100 % maradt...

•Π.Λ .......

Amikor egy d-nai 14,6 mCi/mg specifikus aktivitásig rádióaktívan jelölt 2B8~HX~üTPA egy klinikai lég formuláit készítményét inkubáltuk 96 órán át 37*C-on humán szérumban, és nemredukáló SDS-PAGE-vel és autpradi.ográfiával analizáltuk, a radiöi.zotóp kevesebb, mint 4%-a veszett el az inkubációs idő alatt. Az autogramnak denzitomatriás vizsgálatai a 0. időpontban és a 96. órában azt mutatták, hogy a radioaktIván jelölt konjugátum nem bomlott le szignifikánsan (13-15. ábra). Ezeket a 0. időpont szerinti és a 96 órás minták analitikai vékonyréteg kromatográfiás analízise igazolta (26. táblázat).. Összegezve ezekét az eredményeket, feltételezhető , hogy az ittrium-jelölt konjugátum stabil az ebben a vizsgálatban használt körülmények között. Hasonló eredményeket kaptunk a '^J ^tAIn~nel jelölt 2B8-MX-DTFA hon i ·. g á t nme a 1 (16-18. á b r a)

26. táblásat·;· A hw&án sséamaban .96 öráa át 37°C~-on .xaksxbált:

¥-2B8~Mk-DTPA analitikai vékonyréteg kromatográfiás analízise

idő (óra ll^C-oni	S zúzalék konjugátumho z kapcsolt r ad io a kt ivi tás
0	95,1
24	9:5,2
48	93, 2
72	92,0
96	91, 4

G· 0

A Y-zBP-MX-ElPA-t (14,6 mGi/mg specifikus aktivitás^ tartalmazó humán szérummintákat a bemutatott időpontokban elemeztük a minták 1:20—as hígításának 1 μΐ-ét azonnali vékonyréteg kromatográfiás csíkokra pöttye zve; a mintákat három: példányban elemeztük. A kromatográf íás csíkokat ügy fejlesztettük ki, hogy a kromatográf.iát metanol: vízben (1:1, tf/tf) lévő 10% ammöniumacetátban végeztük, szárítottuk, és keresztbe félbevágtuk. Mindegyik esik alsó és felső feléhez kapcsolt radioaktivitást ezután meghatároztuk, és a százalékos kongapátomhoz kapcsolódó radioaktivitást kiszámoltuk.. (A szabad radioaktív fém az oldószerfronttal mozog, míg a fehérjéhez kapcsolt radioaktivitás a kiindulási ponton maradt. A konjugátumhoz kapcsolódott radioaktivitás meghatározásának átlagát mutatjuk be.

B. Alaltökön végzett vizsgálatok

1. Fagy dózisé farmaholőgfai/toxicítási vizsgálatok a 2B8 -cal és a 2B8-MX-DTPA-val

Egy Whits Sanda Research Centerben végrehajtott GLP vizsgálatban (vizsgálati szám: 92.0111), iával makákó majatoknak intravénás injekcióban különböző dózisé 2B8-t adtunk be. Mindenegyes újabb- injekció előtt vérmintát vettünk, és a vért a lim.focita populációk áramláson cítometriás kiértékeléséhez feldolgoztuk (27. táblázat).

27. táblázat

Áramláson citörnetriával meghatározott főemlős B~sejt populációk .2BS anti~CD2Q egér monoklonális antitest infúziója után

Á	Hat száma	Dózis	Kap	B~sejték^a'^b	% kimerülés
X. csoport
	4 8 2	sóöldet	0	20,1	n xz
			·%		Λν
			1.	J. b f
				ff f
				/ ·	.»: a

			’₍...	1 á	•pjT
				X tí y	-0.» .
			ο·ε>	•1 £ x
			J^:5	í. f 'k	XxZ*
				1 8 6	-v

	424	sóoldat	Q	12,4	0
			η	11,6	£x
			a-v		< A
					1U
					f f.
			: 7	>* <4

			38	/ *. ?	38
			ο·:·ζ%		A
				xv Ζλ f xi-	U
XX. esopot
	34 0	ö,6 mg/kg	0	16, i	<x V
			_A.	-? X-	C Λ
			1.	• <· X.
			*<	_/r Λ
				C' y U	'b-sS
			. .
					a 3
				f ·
			7Q	ί n &
			s$:-O	X U f <5
			52	14^ *Í:	11

	8 0 *3.	löt mg/kg	ü	1 f > o	0
					_ V,
				ö _? *	<
			*

			J	8,1	no
			'i 7	K &
			.a.	ö , V	QZ
			38	5,1	> Á.
			C/>		> Λ\
			jZ	3 y Z-	v O
XXX. osop.
	70^		r.	ni F	Π
			”	,<.. .1. f
			_A.	*· ÍV
				-1 ^λ-^} ,' 6	CrQ·

Kap b~sejtek³·'*⁵ % kimerülés

3,0 86

Állat száma Dózis

	13	10,7	50
7 54 2,5 mg/kg	0	13, 9	0
	i	11,2	44
	7	10, s	47
	13	8,0	55
IV. csop.
7«2 10 mg/kg	0	13, 9	0
	1 '7	3, Ö 75 C.	81 ο ο
	13	-1 f 6, 5	59
164 10- mg/kg	........6....................	17,7	a
	1	8,4	47
	7	7,9	50
	13	7,7	42
V. csoport:
705 10 mg/ kg	0	17,2	0
	1	5,2	70
	7	1,3	€9
	13	8,2	52
	38	17, 1	1
	52	13, 3	22
716 10 mg/kg	ö	34,7	0
	1	18, 6	46
	7	8,1	7'7
	13	3,5	90
	38	6,· 9	30
	52	9,2	61
Az ossz limfociták százaléka
^υ anti-egér IGG-RPE 1 anti-h;	zman cG~	FI TG kétszeresen festő
markor reagensekkel mért S-sejt populáció	(az anti-egér LgG RrB
a CD20-.szal blokkolt 2B8-t és az	anti-bum	án ígG	FITC a magom B-
sejtiélszíni Ig-t mutatja ki).
Az I—IV, csoport állatai minden 48. órában,	ö s s ze se n hé t s ze r
kaptak injekciót; Az V. csoportba	. tartczö	állatok egyszer, a 0.

127 napon kaptak injekciót. A. III. és IV. csoport állatait a 14. napon fajdal os®en t e s en me g öl t ű k.

bem jegyeztünk fel a 288 anti-CD20 antitest beadásához kapcsolódó szignifikáns farmakotcxikus hatást semilyen, a vizsgálat alatt vagy után értékelt klinikai paraméternél sem. Hasonlóan semmilyen abnoriaa.litást sem figyeltünk meg a III. és XV. csoport állataiból kapott különböző hisztopatológiai minták elemzése sorát.

A vizsgálat 14 napon át tartott, és az állatokat a vizsgálat alatt a következő kategóriákban értékeltük: klinikai megfigyelések, testtömegek,. testhőmérséklet, táplálék és víz-felvétel; bélsár kiürítés, szer cm.-vég yelemzés, 'hem&tolőgia> vizeletanalízis és fizikai, vizsgálatok. Továbbá az álaltoktól mindegyik csoportban vért vettünk a 0., 1., ?.. és 13. napon,· és a vért a szérumantitestek (2B3; mennyiségére és a T- és B-sejtek mennyiségére kielemeztük. A 13, napon a III. és IV. csoportba tartozó állatokat fájdalommentesen megöltük, és a kiválasztott szöveteket mint a prepa rá cl őt kö ve tő f ény mi k .r o s z kópé s v i z s g á lattal meg v i z s gáltuk. A kiértékelt szövetek a következők voltak; szív, lép, máj, vese, tüdő, agykéreg, gerincvelő, nyirokcsomó, gyomor, ileum, vastagbél, vázizom, here/petefeszek, hasnyálmirigy, és csontvelő..

Amikor a kezelt állatokból származó vért a keringő T- ás Bsejtek mennyiségére elemeztük .ki, a II-V. csoportba: tartozó állatok >Sö% keringő B~sejt veszteséget mutattak a 13. napig (19. ábra); az antitest beadása nem volt hatással a T-sejt mennyiségére (adatokat nem mutatunk bej . Az összes 2BB-t kapó: csoport a B-sejtek telítődését és a plazmában az antitestek nagy mennyisé

128 get mutatta, (nem mutatjuk be) Az V. csoportba tartozó állatok, melyek a B8 egyszeri 18,8 mg/kg~os dózisát kapták, szintén csökkenést mutattak a keringő B-sejtek mennyiségében, mely azonos volt a más csoportokba tartozó állatoknál megfígyelttel.

.Az I'. , II. és V. csoportokba tartozó állatokat 52 napon át vizsgáltuk tzO. ábra). B sejtek mennyisége a normálisnál 70%—nál nagyobb mennyiségre tért vissza a 38. napra, kivéve egy állatot a II csoportban (BRO554) és egy állatot az V. csoportban (PRO716). A keringő B-sejtek mennyisége ezekben az állatokban a normális mennyiség hozzávetőleg 40%-a maradt 52 nap után.

E mellett a vizsgálat mellett a -E-zES-MX-DTBA faxma kot oxikus hatásait: is mértük, jóval makákó majmokban a ebire Sands Raseareh Centernél végrehajtott GÉP vizsgálatban (Vizsgálat száma: 920611) . Klinikai minőségű kenjugátumot nem: radioaktiv “Ύ-nal telítettük. Az ittrlom-hordozó konjugátumot 75 mg/m.l humán szérumalbumint és ImM DTPA-t (klinikai készítmény) tartalmazó PBS-ben ξ'ρΗ==6, 8) formalástuk, és intravénásán adtuk be a Módszerek fejezetben leírtak szerint.

Ahogy a 21. ábrán lévő eredmények mutatják, a *'Y-jelelt 2B8MX-BTPA-nak kicsi hatása van, ha egyáltalán van, a keringő Bsejtekre ezekben az állatokban, függetlenül a beadott dózistól. Továbbá a limfociták általános kimerülésén :(20-43 5) kívül semmilyen szignifikáns abnormalitást nem találtunk semelyik becsült klinikai paraméterben, ide értve a szérum vegyelemzését, vize1 e f a n a 1 í z i. s t test t örn e g e ke t é s h őmé r s é k 1 e t e ke t <

2. rarmakokinet-íkaí vizsgája tok a 2.88-cal és a 2B8-MX-21TA·vei.

Ahogy fentebb leírtuk, sz V. csoportba tartozó állatok egyetlen 10,0 mg/kg 2B8 dózert kaptak. Az adatok lineáris^ regressziós analízise azt sugallják, hogy a natív antitest kiürült ezeknek a majmoknak a keringéséből hozzávetőleg 4.,5 napos β tb-s értékkel.. Egy hasonló vizsgáiatban BALB/c egereket alkalmazva a β té-s értéket lineáris regressziós analízissel meghatároztuk a natív és a konjagáit 21B8~ra is (nem mutatjuk be), ami 8,75 nap volt (22. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a 2B8 konjogáéiónak minős hatása a BALB/c egerekből való kiürülésre.

3......Biológiai megoszlási és tumor! oka 11 záoi.ős vizsgálatok ra^ díoakfi van jel ό 11 2B8 -MX-ΰTPA~y<a 1

A fentebb leírt előzetes biológiai megoszlási, kísérletekre építve (2:d. fejezeti, konjugált 2Bá-t ^ΛΪ:Ιη-ηοί jelöltük 2,3 mCl/mg specifikus aktivitásig, és durván 1,1 gCÍ-t oltottunk be húsz BALB/c egér mindegyikébe, hogy meghatározzuk a radioaktívan jelölt anyag biológiai megoszlását. Ezt követően öt egérből álló csoportok mintegy! két az 1., 24., 48. és 72. órában fáj: dal cementesen megöltük, és a. szerveiket és a bőr, izem, és csont egy részét kivettük, és az elemzéshez feldolgoztuk. Továbbá 24-72 órás időpontokban vizeletet és ürüléket gyűjtöttünk össze, és elemeztük. A radioaktivitás mértéke a vérben az első órában mért a

40,3 % beadott dózis/gramm-ról a 72. órára 18,9%~za esett, vissza (1-4. táblázat.; 23. ábra) . A szív, vese, izom és lép értékei 0,7-4,8 % tartományban maradtak a kísérlet folyamán. A tüdőkben található radioaktivitás mértéke az 1 órás 14,21—ról a 72. órára 7,0%···ra csökkent; hasonló módon a megfelelő májba injektált dózis /graa® érték lő,3% és 9,91 volt. Ezeket az adatukat alkalmaz-

13ö tűk a *' sugárzás abszorbeált dózis becslések meghatározására (19. ábra}.

A 12,2 mCi/mg antitest specifikus aktivitásé ^:ί'Ύ- jelölt konjugátum biológiai megoszlását BALB/c egerekben értékeltük ki.. 90%-ná.l nagyobb radioaktív beépülést kaptunk, és a radioaktivan jelölt antitestet üPLC-vel tisztítottuk. A radioaktivitás szöveti lerakódását kiértékeltük a fő szervekben, és a bőrben, csontban:, és a vizeletben és a bélsárban ?.2 érán át, és százalékos beinjektált dézis/szövet értékként fejeztük ki. Az 5-S. táblázatban és a 24. ábrán bemutatott eredmények azt mutatják, hogy míg a. vérhez kapcsolt radioaktivitás mértéke hozzávetőleg az 1. óránál mért 39,2 1 injektált dózis/grammról 15,4%-ra csökken 72 óra múlva; a farokhoz, szívhez, izomhoz és léghez kapcsolódó radioaktivitás mértéke közel állandó 10,22, vagy kevesebb a kísérlet alatt. Lényeges, hogy a csonthoz kapcsolódó radioaktivitás az egy óra múlva mért 4,4% beadott dózís/gramm-tól 3,2'%-ig változott a 72, órára, összességében ezek az eredmények, azt sejtetik, hogy kevés szabad íttrium kapcsolódik a koniugátumhoz, és ez a kevés szabad radioaktív fém szabadult fel a vizsgálat folyamán. Ezeket az adatokat alkalmaztuk a sugárzás abszorbeált dózis becsült értékek meghatározására a 20Y-2B9-B?2-BTzA-nál {20. táblázat).

A turaorlokalizáoids vizsgálatoknál a 2B8-MX-DTPA-Ü elkészítettük, és *^In-ne.l radioaktívan jelöltük 2,7 möi/mg specifikus aktivitásig. A jelölt konjugátum száz mikroliterét (hozzávetőleg 24 pöl) oltottuk ezután 12 tímusz nélküli egér mindegyikébe, melyek Rumos B-sejt tumorokat hordoztak. A tumorok tömege 0,1-1,0 gramm között változott. Az injekció utáni 0., 24., 48. és 72.

131 órában 5Ö μΐ vért vettunk szemüveg mögötti púnkélévai, az egereket cervíkálls diszlokáciöval fájdalommentesen megöltük, és a farkát, szivet, tüdőket, májat, vesét, lápét, izmot, combcsontot és tumort kivettük. Mintán előkészítettük és leisértük a szövete..... két, mindegyik szövetfajtához 'kspcéolő-dó radioaktivitást egy gamma számlálót alkalmazva meghatároztuk, és: az értékeket százalék beoltott dóris/gramm értékként fejeztük ki.

Az eredmények. {2'5, ábra) azt mutatják, hogy ^lj'¹ln-2BB-MX-DTPA. tumor koncentrációi egyenletesen nőnek a kísérlet elejétől a végéig. A beoltott dózis bárminő százaléka a tumorban halmozódik fel 7.2 óra múlva. A vérszíntek ezzel szemben, a kísérlet alatt a 0. .időpont szerinti 30% feletti értékről a 72, órára 13%-ra ősökként, Az. összes más szövet (kivéve, az izmot) a beinjektált dózis/gramm 1,3-6%-át tartalmazta a kísérlet végére; az izomszövet hozzávetőleg a beinjektált dózis/gramm 13%-át tartalmazta.

C. Dozimetria

Az összesített. dozimetriás adatok, melyek a normál. BALB/o egerekből származó biológiai megoszlási vizsgálatokból származtak, és a. lé. és 10. táblázatban mutatjuk be az índiummal illetőleg ittríurnái jelölt konjugátumok esetében, összhangban állnak a szakirodalomban megtalálható adatokkal mC.l. beoltott dózisonként összehasonlítva (5), és azt sejtetik, hogy a 2BS ittriummal és indlommal jelölt kenjugaturnái is biztonságosan kiértékelhetők á límfómás betegekben a klinikai hatékonyságra.

1,.....288: Egydózisos általános biztonsági teszt

Egereknek és tengeri malacoknak egyetlen intraperltoneális 2B8 dózist ( 0,5 ml. illetőleg 5, Ö ml) adtunk be, és hét napön át nem

132 megfigyeltük őket. A tcxícitásnak szemmel látható tüneteit figyeltük meg.

2. 2BS és 2B8~hIX-DTBA: Immanhísztológia 1 vjzsgáLatok humán szövetekkel

A 288 egér monoklonálís antitest szóveti reaktivitását különböző humán szövet 32 acetonnal rögzített paneljét alkalmazva becsültük meg. A 2B8 antitest az anti-CD2ö antigénnel reagál, mely szöveti megoszlásának nagyon ko r I átozott. mintázata van, a nyírokszöveteknek csak egy kicsi, néma topod etikus eredetű csoportjában figyelhető meg.

A. nyirokosomában immunreaktxvitást figyeltünk meg érett kéxgi B-limfociták populációjában valamint a germánéiis központok prolíferáló sejtjeiben. Szintén pozitív reaktivitást figyeltünk meg a perifériás vérben a mandulák B-sejt területein, a lép fehér velőállományában, és a timuszban található velőállományi limfociták 40-7ü%~ában. Szintén pozitív reaktivitást figyeltünk meg a vastag bél lazulna p.vopria jóban íFeyer plakkok follzkulusaiban}. Végezetül különböze szervek, így a húgyhólyag, mell, tüdő, méh, nyelőcső, tüdő, fültőmirigy, prosztata, vékonybél és gyomor támasztószövetében, lévő sejtek szintén pozitívak voltak a 238 antitestre.

Az összes egyedülálló epitéliális sejtet valamint a réteges epitéliumokat és a különböző szervek pikkelyes epitéliumát nem. találtuk reaktívnak. Hasonló módon nem figyeltünk meg reaktivitást a neurcektodermália sejtekkel, ide tarosnak az agyban, gerincvelőben és perifériás idegekben, lévő neüroektcdermális sejtek. A moss no air.il í,- elemeket, úgymint a váz és száj!zömrejteket, fibroblasztokat, endotéliális sejteket és a p e 1 1 mr fon u. ki e á r i s g y ul 1 a dá sós s e j t e ke t s z i n t én neg a t 1 vna k t a iáitok.

A 2B8-MX-DTBA kenjugátum szöveti reáktivllázát tizenhat humán szövetből állő panelt alkalmazva értékeltük ki, melyet acetennal rögzítettünk- Ahogy korábban azt a natív antitesttel kimutattuk., 8 2BŐ-MX-DTPA konjugátum felismerte a. CD20 antigént, ami a biológiai megoszlás igen korlátozott mintázatát rüatta, csak a nyíroleredetű sejtek egy kis csoportjában. volt megfigyelhető, A nyirokcsomóban immunxeakzivitást figyeltünk meg a B-sejt populációban. Erős reaktivitást találtunk a lép fehér velőéiloményábán és a csecsemőmirigy valőállományi limfocitáiban. Szintén immunreaktivitást figyeltünk meg a húgyhólyag, szív, vastagbél, máj, tüdő és méh szétszórt, límf oeitáiban, és ez az ezekben a szövetekben lévő gyulladásos sejtek jelenlétének tulajdonítható* Ahogy a natív antitestnél leírtuk (fentebb), nem figyeltünk meg reaktivitást a neuroektodermális sejtekkel vagy a mezeneháznális elemekkel.

A 2.BS egér monoklcnális an.ti-CB-20 antitest, melyet egy ugyanilyen elnevezésű klőnnal termeltettünk, af finitásssl. rendelkezik a B-sejt CD2ö antigénnel szemben, és ez magasabb lehet mint a SÍ antitestnél megfigyelt, melyet ismert CD20 aztágénspécii itásü antitestek. kompétíciójavai és Scatchard analízissel határoztunk meg. Továbbá az imunprecipitációs adatok azt sejtetik, hogy a IBB-cal kicsapott antigén ugyanaz, mint a Bl-gyel kicsapott antigén, mivel mindkettő antitest egy 33 és- 35 kD-os relatív molekulatömegü dublettet csap ki. A 2S8 antitest specifitásának citof luorogzáf lés analízise a perifériás vár limfocitáknál igazolta, hogy az antitest specifikusan reagál a B-sejtekkel, és w mutatható ki reaktivitás a limfociták T~ sejtjeivel vagy más sejttípusaival. Végezetül az előzetes stabilitási adatok alapján feltételezhető, hogy az antitest 3D°C-o.n. 12 héten át stabil az immunreaktivitás csökkenése nélkül.

Amikor a 2B8 antitestet metil-henzil-dietilén-tríaminpentaecet savhoz (HX-DTFA.J kenj ágáltuk, gyakorlatilag nem figyeltünk meg immunraktivitás-GSŐkkenést a natív antítesthez képest. Továbbá a koniugátnmnak 'Ίη-nel vagy ' Y-nal való radioaktív jelölése 100% illetőleg 60% immunraktáritássa! rendelkező jelelt kong ugaturnákat hozott létre. A. humán szérumban 96 órán át Síden inkubált Έο- vagy 'Ύ-jelölt konjugátcsmok stabilitási vizsgálatai a radioaktív fém elhanyagolható veszteségét mutatták a vizsgálat során, mely alapján feltételezhető,. hogy a kenj agátűrnek stabilak lesznek, amikor klinikailag alkalmazzák majd őket.

A timusz nélküli egerekben végzett tumorlokalizácíós vizsgálatok egy indiummal jelölt 2S8-MX-DTPA készítményt alkalmazva igazolta, hogy a konjugátum növekvő mennyisége kötődik a tumorsej lekhez a kísérlet időtartama alatt anélkül, hogy a többi szövetnél a szokásostól eltérő felhalmozódás megfigyelhető lett volna. Sőt., a biológiai megoszlásból származó dozimetriáé értékek összhangban álltak a szakirodalomban publikált adatokkal. Végezetül a natív és a kcnjugált antitestekkel végzett humán szöveti kexesztreaktivitási vizsgálátok azt mutatták, hogy az antitestek mindegyike egy olyan antigént ismer fel., mely nagyon korlátozott szöveti megoszlású, és a nyirokszövetekben csak egy kis csoporttal reagál, melyek, kézé a hematopoetikus eredetű sej-

5 tek tateznak.. összességében ezek az eredmények ezt. sugallják, hogy a konjugáció· nem változtatja meg az antitest szövetspecif itását, és hogy a radioaktívat· jelölt kon j ugat.ummk stabilak in vivő, és felismerik a timusz nélküli egerekben létrehozott tumorok felszínén jelenlévő CD20 antigént.

Araikor 2S8-t használtunk egy nagydózisú farmakológi ai/toxikológiai vizsgálatokban, a termelt antitest nem. hozott létre szignifikáns farmakotoxikus hatást egyik mért paraméternél, sem a vizsgálat alatt, sem, utána. Hasonló módon nem jegyeztünk fel rendellenességet a fénymikroszkóppal megvizsgált különböző hisztopatológi.ai minták elemzése .során» Meglepő módon az alkalmazott antitest összes dózisa a keringő B-sejtek feltűnő kimerülését okozta. A keringő B-sejt mennyisége azonban durván a normális szintre tér vissza, amikor az antitest beadását abbahagyjuk. A majmok egydózisos csoportjóban <V1 csoport) a natív antitest a keringésből, egy hozzávetőleg 4,5 napos látszólagos β tk értékkel ürült ki. Megjósolható módon, amikor ezt a farmakokinetikai vizsgálatot BALB/c egerekben hajtottuk végre, a 2B§ antitest egy 8,7 5 napos | tk értékkel ürült ki. így együttesen ezek áz. adatok alapján, feltételezhet©, hogy a natív antitest is hasonló klinikai hatást biztosít, amikor járulékos anyagként a radioaktivan jelölt kenj apátomhoz adjuk.

Általánosságban az adataink azt. jelzik, hogy a. nagy affinitása 2BS antitest és MX-DTPA konjugátuma a humán szöveti reaktivitás korlátozott mintázatát fejezi ki. Mridemellett a főemlősökben a natív antitest nem: toxikus:, és a B-sejtek átmeneti kiürülését okozza; azonban ha egyszer az antitest kiürült a keringésből, a B-sejt mennyisége meglehetősen gyorsán visszatér. Továbbá

	13 6
az 1ódiummal és it	zulummal jelölt 3S3-EX-DTPA kenj agát úrnők sta-
bilnak -unnék ín v	ítro, nem mutatják a radioaktív fém csökke.ué-
sét a meg hosszabbá:	áot.t ínkubálás alatt a. humán szérumban. Vége-

Gf'. Τ': T cetül a ''¥- vagy In-jelölt 2B8-MX-DTPA biológiai megoszlásából származó sugárzásúd?ts becslései a üALB/c egerekben mCi injektált dózisonként egyezik a humán klinikai vizsgálatckból származó dózisbecslésekkel, melyekhez ezekkel az izotópokkal radioak-

ti van jelölt, kon	j agáit ant i- i diótípus antitesteket a 1 ka Imaz -
IV. A ,,ΜΙχ	-shoot radioaktív jelölő ©Ijárás pxekliníkaá

, «ft glesubésenek összfogXalasa T-2BS-W DTPA előállítására

A. Bevezetés

Egy '^vY-jelölt	egér monoklonális anti-CD20 antitestet (2B8)
értékeltünk ki egy	11. fázisú klinikai kísérletben egy súlyosbodó

B-sejt limfóma kezelésére. Az ittrium-jelölt antitest előállítására alkalmazott eredeti eljárás egy nagy teljesítményű .folyadékkromatográfiás iHPLC) lépést használt a nem. fehérjéhez kötött rádiói zotóp eltávolítására a formulá.zás előtt és a betegeknek való beadás előtt. Sajnos ez az eljárás nagyon időigényes, mely azt eredményezi., hogy az antitest hosszabb ideig van kitéve a radioizötópnak védetlen állapotban. Ez az antitest megnövekedett radiolízisét eredményezi, melyet az immunreaktivítás csökkenése kísér. Továbbá az eljárás fárasztó: volta nehézzé teszi, hogy egynél több adagot készítsünk el naponta a radioaktív gyógyszergyártásban. . Az eljárás egyszerűsítését elősegítené, ha a NI Pl

Pharmacy Servicas

rád ioa k t ív g y ó gy s ze r gyá r t á s á na k a 11 éra a t í vá -

ként a .megvalósítás klinikai körülmények között történne.

137

Következésképpen egy javított radioaktív jelöld eljárást fejlesztettünk ki, melyre „mix-and-shout eljárásként hivatkozunk, mellyel kikerülhető a HPLC tisztítás szükségessége, míg megmarad a magas radioaktivitás beépülés, és a jó immunreaktivitás. Egerekben végzett ín vitro stabilitási vizsgálatok valamint biológiai megoszlási vizsgálatok kimutatták, hogy a ,,mix-&—shoot^w eljárást alkalmazva készített radioaktívat jelölt antitest össze™ hasonlítható az elterjedt HPLC eljárást alkalmazva létrehozott anyaggal. Ennek a prekliníkai vizsgálatnak az eredményei azt jelzik, hogy ez az új „miz-í-shoot eljárást alkalmazhatjuk klini kai kísérletekben való használatra alkalmas ''ί- jelölt 2B8-MXDTPA előállítására.

S. Anyagok és móds serek toyag.o.k

1. Sejteh

Az 53 és HSB (CD2Ö—negatív} humán, limíoblaszt Sejtvonalakat az Amexican Type Culture Colleotlontól szereztük be, és 1-Q t magzati borjúszérumot tartalmazó RPMI-1640-ben tartottuk fenn, melyet glutaminnal egészítettük ki.

.?. ám t i t e s t e k

A 238 antitestet a Manufactureíng üepartmen tiezíttotta üreges szál bioxeaktor felülüszóból a korábban az IhD-ben (B.B-IW 4850/051} leírt protokollt alkalmazva.

3. További reá gén sek

Az íttrium-{93]:-klonidot az .Amershamtól szereztük be. Az összes többi reagenst a lentebb hivatkozott irodalmi helyeken leírt .forrásokból szereztük be. A radioaktív jelölési eljáráshoz használt reagenseket kezeltük, hogy eltávölírsuk a szennyezd ne hézfém ionokat, melyek kompétlóiéba léphetnének a radioizotópokkai a radioaktív jelölési. eljárás alatt flásd a Módszerek fejezetet) . .¾ reagenseket GMP körülmények között az IDEG Gyártási Osztálya készítette el az igazolt Batch Production Records-ot követve.

Módszerek

11.....rgg-Ala-ÜTAA előállítása

Klinikai minőségű MX-uTPA-t szereztünk be vízben -oldott, dínétriumsóként a Goultar Immunology-tól, és -7Q°C-on tároltuk. A kon.jugátumot (2 Bő-MX-DTPA) a Gyártási osztály készítette el. A kongugátűm két különböző tételét, használtuk ezekben a vizsgálatokban; mindkettőit normál sőoldatban 10 mg/ml koncentrációban biztosítottuk. A kon jugátumokat steril 2 ml-es polipropilén fecskendőbe töltöttük, és 2-B°C-ön tároltuk.

R......A féwemt ea körülmények f enn tartása

A reagensekkel végzett összes tevékenységet úgy hajtottuk végre, hogy minimálisra csökkentsük a fémszennyezödéaek lehetőségét. Polipropilén és polisztírén műanyag tárolóedényeket, ügy mint .lombikokat, főzőpoharakat és mérőhengereket használtunk. Ezeket Alconou-szal mostuk, és a használat előtt alaposan kiöblítettük Mílli-Q vízzel vagy öblítővízzel (Water fór ír rí gat ion, MBIr). Fémmentes pipettahegyeket (BioRad) alkalmaztunk a kis mennyiségek pontos kezelésére. A reagensek nagyobb mennyiségeinél. steril, műanyag szerolőgíaí pipettákkal dolgoztunk,. A reakciókat 'kényelmesén ί,ΰ ml-es csavaros tetejű, polipropilén mikrofugacaövekbén hajtottuk végre.

.3 A z adfoaktív 11 á s be ép ü lésének__meghatár o z asa

139:

A radloktivitás beépülését instant vékonyréteg krcraatográfiával (ITCL) határoztuk meg három példányban a SO? SP-13-0Ö8 szerint. általánosságban, az eljárás a következő volt:: a radioaktívat jelölt kenj agát üstöt 1:20 arányban 1 mM őTBA-t vagy 5 mM EDTA-t tartalmazó 1 x PSS-ben hígítottuk, majd 1 ml-t 1 x 5 esés ITLC SG papírcsík (Selmán Scienoes) egyik végétől 1,5 cm-re cseppentettünk. A papírt metanol:víz ©legyében (1:1; tf/tf} lévő 10%-os ammóniám acetáttal hívtuk elő. A csíkot szárltottűk, keresztbe kettévágtuk, és mindegyik darabhoz kapcsolt radioaktivitást szcintillációs számlálással meghatároztuk. A csík alsó feléhez kapcsolódó; radioaktivitást (fehérjéhez kapcsolt radioaktivitást) a felső és alsó fél értékének összeadásából meghatározott teljes radioaktivitás százalékaként fejeztük ki.

2. ,,Mí x - & -shoot^JZ élj ára sír tri ura - f - j elől t zPg-M-DT.PA-hoz

Az antitiesteket az Amershamtól beszerzett, 0,04 M HCl-bsn lévő, hordozótól mentes ''^v-kluriddal radipakt Iván jelöltük. A radloizotőp egy alikvotját (10-20 mCi/mg antitest) egy polipropilén csőbe vittük át, és 0,02-szeres térfogatú fémmentes 2M-os nátrium-acetatot adtunk hozzá, hogy az oldat pH-ját 3,S-ra állítsuk be. 2B8-NaDT?A-t (0,3 mg;10,0 mg/ml normál sóoldatban) adtunk hozzá azonnal, és az oldatot óvatosan kevertük. Az oldat pH-jáfc pH papírral ellenőriztük, hogy biztosan a pH érték 3,8-

4,1 legyen, és 5 percig inkubáltuk. A reakciót ügy állítottuk le, hogy az elegyek egy különálló, 75 mg/ml humán szérumalbumint (HSA) és 2mH diatilén-tríamin-psutaecetsavat (DTPA) tartalmazó IXHBS-t tartalmazó polipropilén csőbe vittük át, és óvatosan összekevertük. A radíoaktívan jelölt antitestet 2-8°C~on tárol tuk.

A specifikus aktivitást úgy határoztuk meg, hogy a radíoaktivan jelölt konjugátum megfelelő alikvetjának radioaktivitását mertük. Ezt az értéket a számláié hatékonyságával korrigáltuk, a kenj:ugatom f éhér jekonoentrációiához viszuny í t va, m 1 yet 280 nmen az abszorfeanoiával határoztuk meg, és nCi/mg fehérje éxtkéként fejeztük ki,

5» Az i.ttríum-fPüj-kBg-HX-DTkA in vitvo fmmunreaktivá fása

A ''Z-jelölt kenjugátűm imraunraktivitását SOP#SP13“COB~t alkalmazva határoztuk meg a Lindmo által leírt teljes sejt kötési assay módosított változata alapján. A lóg fázis kuncentrációit növelve CD20-pozit 1 v SBB sejteket vagy CDl.O-negatiív HSS sejteket adtunk kér. sorozatban .1,5 ml—es polipropilén csőbe; a sejtek, végső térfogata 0,40 ml volt. A radioaktíven jelölt konjugátumot

1-2,5 ng/1 végső antitestkoncentrációra hígítottuk, és ö,35 ml-t adtunk mindegyik csőbe. .90 perces ínkubálás után a sejteket centrifugálásgal pelletízáltuk, és a felülószct összegyűjtöttük, A felülúszó frakcióban megmaradó radioaktivitást egy szcintil.ládós számlálóval határoztuk meg.

Az adatokat az összes bevitt radioaktivitás per a sejtkapcsolt radioaktivitás hányadosként ábrázoljuk a sejtszám/ cső reciprokának függvényében. Az y-tengelymetszét az immunreaktív frakciót képviseli, g<_______A klíníi'aúlag fprmulázött f ttrium-/fúl -ΑΒβ-ΜΧ'-ΟΤΑΑ in vit.ro stabilitása

A 2B8-W-DTPA konjugátumot ^i-r-al radiuaktívan jelöltük, és úgy forma Iá zt.uk, ahogy a „Miz-l-shoot eljárásban fentebb leírtuk. A radioaktív koojugátum két tételét készítettük el; az egyik tételt a radioaktív beépülés stabilitásának mérésére, és a másik tételt az immunzeaktivitás fennmaradásának mérésére alkalmaztuk. A készítménnyé alak.! tett konjugátumokat 4®C-oü 48 órán át inkubaituk, és az a1ikantokat a 0,, 24.,és 48. órában kielemeztük nem redukáló SDS-PAGE—t és autoradiográfiát alkalmazva. Mindegyik időpontban ez immunreaktivitást a fentebb leírt mérőeljárást alkalmazva határoztuk meg.

- Az.......ittxlüm-fíC./-2BS-MX-DTPA ín vftro______s tabi 11 kása h urna η azárűrben

A ' ϊ-jelölt 2B8-MX-DTPA stabilitását úgy mértük, hogy humán szérupban. inkubáltuk 37^cC-on 72 órán át. A konjógáit antitestet, itt rima-[30]-nel radioaktívon jelöltük, és a fentebb leírt módén formuláttuk. A radioaktívat jelölt konjugátumot 1:10 arányban normál humán szérummal (nincs hővel rnaktiválva) hígítottuk, és az alikvotokar műanyag csövekben inkubáltuk 37*C-on. A kiválasztott időpontúkban a mintákat kivettük, és nem redukáló SbS-EAGEvei és autoradiográfiával analizáltuk.

. Az i.ttríum- f 90} -2B8~MX-DTrA b 1 ölógiaí megoszlása

Az íttrium-[9Q]-nel jelölt 238-MX-öf ÍA-t szöveti megoszlásra vizsgáltuk 8-10 hetes BALB/c egerekben. A radioaktivan jelölt konjogátúrnőt a fentebb leírt módon készítettük el és formuláttűk. Az. egereknek intravénás injekcióban 5mCi 'l-jelölt 238-MXDTBA-t adtunk, és öt egérből álló csoportokat az 1., 24., 48. és 72. órában fá jdulozureuteser· megöltük. Miután elpusz ti tettük őket, a farkat, szivet, tüdőket, májat, vesét, lépet, izmot, és oembesöntet kivettük, mostuk, lemértük; és vér- és bőrmintát is vettünk áz elemzéshez. Mindegyik mintához kapcsolódó radioaktivitást a fékezési sugárzás gamma-számlálóval történő mérésével

2 meghatároztuk, és a százalék beadott dózis/gramm szóvet értéket és a. százalék beadott dózis per szerv értéket megha.táro-ztuk.

9. Pozlmeεrϊa

A jelölt 2B8-MK-bTPA-val beoltott egereket alkalmazva kapott biológiai megoszlási adatokat használtuk fel egy 70 kg-os betegnek beadott 1,0 mCi dózisból a.bszorbeálódött sugárzásdózis becsült értékeinrek kiszámítására. A becsléseket a Society of Nuclear Medicíne Medinai Internál Radiation Dósa (MIRE)) Committee által elfogadott módszerek szerint hajtottuk végre. Ezeket a szánütásókat Philip Hágán űr végezte el (Nuclear Medicina Service, VA Medical Center, LA collá, CA 92161) , lő. Az ittrium-fPüj-éBd-Mk-gfPá klinikai dózisainak előállításává ezcigálő eljárás valfdácidja [Irodalmi hivatkozás: RéD beszámoló, címe:: „Validat ion. of „Mix-and Shoot radiolabeling Protocol fór the Preparation o.f Clznrcal Doses of ^3öy-288-MX-DTPA^z;P. Chinn;19íM. április 22.].

1. Ittri um-ÍZ01 - j elöl t-MX PIPA al oá 11 i tá sa „fiz x- £ Shoot eljárással

Az 2B8-MX-DTPA-val és Aval végzett radioaktív jelölés kinetikájának értékelésére szolgáló előkiserietek azt mutatták, hogy pH™3,6-4,Q-nál a radioizctóp 95t-a épült be 5-10 perces reakcióidő alatt. Ennek a radioaktivitás-beépülésnek (95,7% 1 1,7 %) a reprodukálhatóságát ezután, egy scale-up eljárás validációs vizsgálatában igazoltuk [Irodalmi hivatkozás: RiD beszámoló, clme:: „Vei Idát ion cf „Miz-and Shoct^íz radiolabeling Protocol far the Preparation cf Clinioal Doses of ^-zBS-MX-DTPA*; P. Chinn? 1964. április 22. j. A W-jelölt 2BS-MX-DTPA előállítása ezzel a „mix-k-shoot eljárással egy olyan terméket eredményezett, mely összshasordítható a HFLC eljárással előállítottal (lásd a BE-IND 4850/4851). Ügy találtuk, hogy a radioaktív jelölési eljárás jellemzően 10-15 m.Ci/mg antitest közötti specifikus aktivitással rop rodú káIható.

A .·>

Az ezzel az eljárással készített 'Y-jelölc 2B8-bX~DTBA immunreaktivítása jellemzően nagyobb, mint 70-1, összehasonlítva HELC eljárásnál a validációs .meneteknél, megfigyelt 55-60 %-kal (26.. ábra) , Ez az eltérés valószínűleg a radiolizis lecsökkent hatásának köszönhető, melyet a „mix-s-shcot eljárással járó lecsökkent inkubációs idő okoz. Ez az eredmény jellemző volt, és ahogy lentebb tárgyaltuk, a radioaktivan jelölt konjugátűm klinikai dózisainak. élőéi látására szolgáló s-calemup eljárás valídációs meneteire reprezentatív volt.

á.j..... .....

2. Az 'X-jelőlt 2.Β8-ΜΧ-ΡΓΡΑ in vf fro stabilitása

A H.PLC eljárást alkalmazva előállított nem védett ⁹⁰ Y-jelölt antitestkonjugárummal végzett előzetes kísérletek azt igazolták, hogy a radiolizis jelentős antitestlebomlást és az immuer«aktivitás elveszítését okozza. Ezért egy késnitménypuffért fejlesztettünk ki, hogy a radiolizis hatásait minimálisra csökkentsük. Kimutattuk, hogy a humán szérnmalbumin (HSA) hatásos az radiolizis miafti antitestlebomlás minimalizálásában. Egy becslést végeztünk a „mix-S-shoot módszerrel előállított radioaktivan jelölt, konjugétummal, hogy igazoljuk a készítmény hatásosságát a radiolizis minimálisra csökkentésében. A

14,5 mCi/mg antitest specifikus aktivitásig radioaktivan jelölt tiyl ....

'Eí-jelölt antitestet 75 mg/ml HSA-t és 1 mb DTPA-t tartalmazó 1 X PBS-ben formuláttűk. A 2B8-MX-DT2A kcnjugátum lebomlását a 0.,

24., 48. órában értékeltük ki SDG~EAGE~t és autóz adiog táti át alkalmazva. A 2., 3., 4. ábrák azt mutatják, hogy s radioaktívan jelölt, kenjugátűm nem mutat szignifikáns lebomlást egy 48 őrás időszakon át, amikor 4t-cn inkubáljuk.. Az instant, vékonyrétegte;-}· kromatográfiás analízis azt mutatta, hogy nem volt ''Ύ veszteség a 4 8 őrás inkubá.lás alatt; ezeket az eredményeket alátámasztotta az SDS-PAGE/autoradiogzáf iás: analízis (28. táblázat?. Az immunreaktivitás is viszonylag állandó volt, >88% {29< táblása 7. ? .

28. táblásat: A _í,Mix~&~Sh.oot^{,f S}®X~2B8>M3C^DTEA. stabilitása hujsán. azér'nsialbuí&int és ©O®L~t tartalra&zó PBS—ben.

	A konjugátummal asszociált radioaktivitás sz áza1é ka
idd (óra)	ITCL	SES/PAGE
Ö	92,9	96, 0
24	95,5	95,4
49	91,3	94,6

29. táblázat

A ^SuY~2B8~M3S~íiTFA immunreaktivitása humán, szérum albumint és WBA~t tartalmazó PBS-ben

Idő (óra 4^cG-on)	Százalék immuureaktivitás
jő	87,9
24	88,5
48	90,4

Egy kli.nl kailag formaiázott, 13,7 mCi/mg specifikus aktivitásé ''°k-jelölt 2B8-MX-DTPA-1 72 órán át 37°Ε-οη inkubáltunk. A nem redukáló SDS-PAGE-vsi és autoradíográfiával elemezett minták azt

5 mutatták, hogy nincs radiuizotop veszteség az inkubációs idő alatt (36. táblázat) , A 0. és 72. órában mért autoradíogrammök denzitomatriás letapogatása azt jelezte, hogy a radioaktívon jelölt konjugáium jelentősen nem bomlott le (31. és 32. ábrák).

Ezeket az eredményeket alátámasztották a vékonyrétegkromatográfiás elemzések (.30.. táblázat) , Meg kell jegyeznünk, hogy a radioaktivitás beépülése az ebben a vizsgálatban alkalmazott antitestnél kisebb volt, mint amit a jelölési eljárás valídációs vizsgálataiban kaptunk. Ennek az alacsonyabb radioaktivitás”beépülé.snek az volt az oka, hogy a radioaktívan. jelölt, antitestnek ebhez az elkészítéséhez a klorid használt adagja gyengébb minőségű volt. A kisebb radioaktivitás-beépülési érték nem változat ja meg azt a következtetésünket, hogy a „mix-űs.hoo.V^z eljárással előállított ittriummal jelölt konjugátum stabil ezek között az inkubációs körülmények között.

30. táblázat: A humán szértööbáá inkubált ^δδ¥~2Β8~Μ3Μ>^Α k<s»jwábma stabilitása

idő (óra 37°C-ou)	Százalék konjegétumhoz kapcsolt rad.ioakti.~j vitás \|
o	85,7	88,8 \|
24	76, 4	............................. 90,0 \|
72	87,6	88,7 \| J---------— .. i

A '^Y-lBü-MX-ETPA-t [specifikus aktivitása 15,7 mCi/mg) tar~ talmaző humán szárawaintákát nem fehérje-kötött Ύ-re elemeztük kia bemutatott időpontokban instant vékonyréteg kromatográfíás csíkokat és SDS-PáGE/autoradiográfiát alkalmazva.

.3. i tériem - [90] ~2B8-MX~öTPA~va 1 végzett biológiai megoszlási vizsgá1 a tok

146

Az ‘'Ύ-jelölt konjugátum biológiai megoszlását, melynek a specifikus aktivitása 11,5 mCi/mo antitest és a rádióaktivitásbeépülés >95%-nál, BALB/c egerekben értékeltük ki> A radioaktivitás felhalmozódását a szövetekben a fő szervekre, bőrre, izomra, csontra, vizeletre és bélsárra 72 óra múlva értékeltük ki, és százalék beoltott dózls/g szövet értékben és százalék beadott dózis/szerv értékben fejeztük ki. A 31-34. táblázatban és a 33. ábrán bemutatott eredmények azt mutatják, hogy a vérhez kapcsolódó radioaktivitás mennyisége az 1 óra múlva mért hozzávetőleg 43% be injektált dózis/gram (% I.D/g) mennyiségről hozzávetőleg 16%-ra csökken 72 óra múlva; a 24. órában és később, a szívhez, veséhez és léphet kapcsolt radioaktivitás mértéke meglehetősen állandó, 4-8%. A tüdőnél és a szívnél az egy Óra múlva mért radioaktivitás lü-12%-ról a 72. órára 8-10%~ra csökkent. A bőrnél a .radioaktivitás viszonylag állandó, hozzávetőleg 3% a 24. órától a 72. óráig. A gyomor-bél-rendsperben a radioaktivitás állandó, 0,5-1% volt a 24. órától a 72. óráig. A radieaktivitás az izomnál hozzávetőleg 6% a vizsgálat egész serén., A combcsont általi radioaktivitás felvétel kevesebb, mint 4% az összes Időpontban, ami azt jelzi, hogy a szabad ittrium mennyisége a konjugatum-készitményben jelentéktelen völt, és kevés szabad xadioaktiv fém szabadult fel a vizsgálat alatt.

147

31. táblázat: Az aktivitás megoszlása egy órával a normál /c egereknek- 'beadott. X-SBS-MX-DTBA intravénás in jekció ja után

Átlagértékek ± SD

Minta	Szerv tömege gramm	1 XD/gramm	% ID/szerv
Vér	1,37 ± 0,053	42,74 ± ,078	58,52 i 1,74 j
3 z Ív	0,101 i 3,01	8,03 ± 3,33	0,3 2 1 0:,37
Tüdő (2)	0,12 6 ± 0,01	12,44 t 0,94	1,-56 ±0,05
Vese (1)	0,129 i 0,01	7,81 ± 1,24	0,997 ± 0,10
Máj	0, 899 ± 0,07	10,08 ± 1,28	9,01 1 0,52
Lép	0, 07 7 ± 0,004	10,74 ± 0,96	0,8.2 3 ± 0,04
Izom	7,33 i 0,28	0,4 4 1 0,08	3,43 ± 0,51
Csont	2,94 ± 0,11	3,4 4 ± 0,57	10,11 ± 1,80
Bőr	2,94 1 0,11	1,46 ± 0,58	4,24 ± 1,57
Gyomor-bél r.	2,33 + 0,03	1,02 1 0,19	2,36 ± 0,35
Vizelet	-		: -
Bélsár	**	—	—
		Összesen	94,66 ± 3,47

Egerek száma - 3

Átlagos- tömeg - 19,58 g 1 0,71 g

148 . táblázat

Átlágerfékek ± SD

Minta	Szerv tömege	% 1.0/ gramm.	% ID/szerv
	graim
Vér	1,55 ± .0,12	19,77 ± 2,42	30,77 ± 6,04
Szív	0,105 ± 0,01	4,4 4 ± 0,55	0,47 ± 0,08
Tüdő (2)	0,12? ± 0,02	8,78 ± 1,61	1,11 ± 0,21
Vese (1)	0,139 i 0,01	5,02 + 0.52	0,69 ± 0,05
Ház	0,966 ± 0,09	8, 62 ±2,73	8,20 ± 1,97
lép	0,33 1 0,01	5,75 ± 1,27	0,55 i 0,064
Izom	8,83 r 0,69	0,692 .1 0,01	6,12 ± 0,52
: Csont	3,31 1 0,26	2,24 ± 0,31	7,47 ± 1,53
Sör	3,31 1 0,26	3,33 ± 0,76	10,88 ± 1,76
Gyomor-bél r.	2,39 x 0,43	0,7 3 ± 0,09	1,02 ± 0,05
VIzelet		-	2,31
Bélsár		-	1,23
		Cssz e s en	73,52 1 6,18%

Egerek száma - 3

Átlagos tömeg ^::: .22,99 ± 1,7 3 g

33. táblázat

Az aktivitás megoszlása 48 órával a normál BALB/c ®g« beadott Y~2B8~MX~pTFA intravénás injekciója ntán Átlagértékek ± SD

Minta	Szerv tömege gramm
Vér	1,50 r 0,14
Szív	0,104 ± 0,01
Tüdő (2)	0,122 ± 0,02
Vese ())	0,124 1 0,01
Máj	0,966 ± 0,13
Lég	0,071 1 0,01
(Izom	8,59 ± 0,82
Csont	3,22 ± 0,31
Sor	3,22 ± 0,31
: Gyomor-bél r ..	2,63 ±. 0,40
Vizelet	7-
Bélsár	l·-
	.....................

% 1D/gramm.	’l 3 ID/szerv
14,97 ± 5,77	22,5.3 ±. 8,4 8
3,39 i 1,43	0,415 ± 0,16
8,41 1 1,57	1,04 ± 0, 31
3,99 ± 1,62	0,49 ± 0,19
6,12 ± 3,21	5,69 1 2,25
6,05 1 2,38	0,46 ± 0,16
0,54 ± 0,19	4,67 ± 1,67
2,07 ± 0,8 4	6,65 ± 2,56
2,30 ± 0,70	7,34 ±1,95
0,652 ± 0,30	1,67 ± 0,64
	2,83
-	2,06
\|összesen	57,28 ± 17,60%

Egerek száma ~ 3 .Átlagos tömeg - 21,4 8 ± 2,05 g

34. táblázat

Az aktivitás 72 órával a normál BALS/c eg«

SÓ _z beadott íff288-W£~DTPA intravénás injekciója után

Átlagértékek 1 SD

Minta	Szerv tömege g-raiíffi	% 19/gramm	% Ib/szerv
Vér	1,4 5 ± 0,07	15,87 ±4,81	23,14 ± 7,26
Szív	0,093 ± 0,01	4,16 i 1,27	0,392 ± 0,13
Tüdő (2)	0,123 i 0,02	10,67 ± 3,7 9	1,30 i 0,45
Vese (1)	0,123 ± 0,01	4,78 i 1,03	0,596 1 0,18
Máj	0,876 ± 0,07	7,26 ± 1,79	6.39 ± 1,76
ló Áb p	0,081 ± 0,01	7,37 ± 2,34	0,584 ± 0,16
Izom	8,30 ±0,39	0,67 ± 0,13	5,58 ± 1,22
Csont	3,11 ± 0,15	2,58 ± 0,5.1	8,05 ± 1,76
Bőr	3,11 ± 0,15	3,09 i 0,82	9,66 ± 2,680
Gyomor-bél r.	2,59 1 0, 20	0,79 ± 0,18	2,05 ± 0,53
Vizelet	—	. -	3,56
Bélsár	: -	-	2,82
		összesen	65,47 ± 14,0

Egerek száma - 3

Átlagos tömeg « 20,76 i 0,97 g

151

4, Dozijsetria

A sugárzás-abszorbeált dózisokat sgy átlagos 70 kg-os embérnél, melyet a ''E-jelölt konjugaromra egér biológiai megoszlási adatokat alkalmazva (% lo/szsrv értékek a 31-34. táblázatokban; számol tok ki,, a 35.. táblázatban mutatjuk be. Szék az eredmények összevethetők a korábban R1LC rádiónkéivitás! jelölési eljárást alkalmazva előállított '''Y-nal jelölt 2BS-MX-bTPÁ~t alkalmazva kapott eredményekkel.

35. táblázat.

Egy átlagos emberben egyenletesen eloszlatott ittrínm™130]jelölt 2B8-PÍX beadásából származó, és az állati megoszlási adatokon alapuló sugárzás dozímetriás becslések az injekció után 72 órával

Aktivitás mennyisége =	1000 pCi/bct.eg dózis
	RADS		RADS
mellékvesék	0,534	petefészkek	0,534
húgyhólyagra1	0, 534	hasnyálmirigy	0,534
gyomorral	0, 534	csontváz
vékonybél	1,158	kortikális. csont	1,466
u^:l. bélfal	1, 657	trabékeJáris csont	1,466
11. bélfal	2,380	cső nt vei ő (vőr ö s >	4,452
vesék	7,015	c sóntveiő (sárga)	2,0 96
má. ή	7,149	porc	1,4 66
tüdők	2,157	má s alkotó része k	1,4 66
más szövetek		bőr	6,603
izom	2,646	lép	4,97 3
zsírszövet	2, 646	herék	0,534
vér	2,646	pajzsmirigy	0, 534
sgy	2,112	méh (nem terhes)	0,7 67
s ziv	2, 646	tel es rest	1,755

Bet : Mire) duci.» Med. /Scppi. L 2/68, A Scherna fór

Absorbed-dose calculatlon fór Biologicall y Di st.ributed

Radi.onuciides

A számításokat Spreadsheet Template in Symphony (Lotus oevelopment Corporation) alkalmazásával hajtottuk végre, és Philílp L. Hágán M. S, (Nnolear Mediclne Service, VA Hospital, San Elégő, CA, 92161; hajtotta végre.

>: Γ F 3

5. 100^1^-790/-209-942-1)72¾ ki in lka i dózisainak előállitására szFgálő eljárás valídációja

Összesen tíz validációs tételt készítettünk az HPI Pharm.acy Services, Inc.-nél. Mindegyik tétel tesztelésének eredményeit a

36... táblázatban foglaltuk. össze. .Mindegyik teszt eredmény átlagértékét kiszámoltuk, és a standard hibákat a megfelelő helyen jelezzük. A különböző· jelölési idők miatt az eljárás variabilitásának becslésére az 1-8. számé: tételt egy lö perces jelölési időt alkalmazva, a 9. és 10. számú tételt egy 5 perces reakcióidőt alkalmazva állítettük elő. A tíz validációs tétel teszteredményei alapján a forgalomba hozatali előírásokat meghatároztuk. A forgalomba hozatali előírásokat a 37. táblázatban foglaljuk össze.

Vjpds	€2> ^: <:< 5Λ3 3 r4-	£ií íuí t-J- <£> €X> i- -í-	<&> £X * <5 CJ	fü ΪΖ- C? >.' : ^--	ír:
C-á <o	>-' -	>y^	?<r-	£>	<0 P> z<
	£-r		^: έί '	Ifi
>'	o>
£ <Λ	s £	Jo i^:			K><Λ-
l· >->
z· \ <ΖΆ		S		f-o
	-c—<	<-S>	?5	Z>_	*-x?	r.3
f -		<Z>	<~2>
<- - <·					zz	ΐ>4
c—->- <'--3		§	:^: <jrs:	r<> í~t>	-~-
			>-O		í x£>	lí±>>
: *f·	Ϊ£	r^_> <ro	<r>		f·--:-?:
	:►>·>·>			Z<	C3'SCS2	cr^:
	i ·----	E		ΐχ> v>?	<>·
ü	z-	>—*	>-X>	•ZK<£X< isii	o·-.
		-ÍZ>				1
O-			uo	ύ>		--- i
>--*-	<5Í	<Á~> <-Λ>		ζθ ov	í._r-
K -r-'		E OTr	z ff'·	/-, <í-> €O	£	©C3 > :
	Z-'	ZZ>	<xz —>»	&		<o
	>xo		cr·	to
:í ír—·-: <=> J ---'	Z-	*xo ίΛ--,	VC?	A <2A E	ÍJ^
Γ---5 í .+.-	— r<-o : ¹—* -·-	CS3: -ZZ> ex:·	& í-é-		—? 4/: < :	£T
<X2e		W- &> H —*	i-^	ϊήΐk

JádBöCB altelwva eWMt ^-jelölt Wi-DB ta validációs télslésd vizsgálati

37. táblázat ,Λ.χ-S-.''rcot: alkalmazva alaa-l .rőt*· jo.olt 238MX-DTPA forgalomba hozat all előírásai

Teszt	Előírás	Eljárás
I min re a k t1 vi t á s	> sa%	RIA
Endotoxín	5 Wml	EAL
Radioaktív tel beépülés	>90%	TTLC
An t i t e s t - ko ace n t ráció	0, Ü 7 5 - 0,0150: mg /ml
Radioaktivitás konc.l	>6,0 mCl/ml	dóriskalíbráció
Specifikum aktivitási	>9,0 ®Ci/.mg antitest	Αχ § q / d ór i s ka 11 b.
Teljes fiola radioakt. 1	>6,0 mCi	déri s ka11b rácio
pH	5,0-8,0	pH papír
t eljes f e hé r j e konc.	65-8 5 mg/ml	&28Ö
sterilitás vizmg.	megfelelő	\|CFR 610.12

(C. időpont szerinti kalibrálás) ö 6

D. Eredmények megvitatása

Az eredeti radioaktív jelölési eljárás a. jelölt 2S3-íSDTFA előállítására egy különösen fárasztó és időigényét HPLC

..... Cf·» tisztítási lépést használ a fehérjéhez nem kötött 'i eltávolítására a készítményből, Abból a célból_f hegy egyszerűsítsük ezt az eljárást, és alkalmassá tegyük a klinikai helyen történő alkalmazásra, a kísérletek arra irányultak:, hogy megszüntessük a HPLC lépést , ennek érdekében egy „mix-.&—shót* -nak nevezett el.járást hajtottunk végre, A cél az volt, hogy megállapítsuk azokat a radioaktivitási jelölési körülményekét, melyek az. izotóp nagyon nagy mzrtok^ radioaktivitás beépülését eredményezi a konjugátumba, ezáltal elkerülve a tisztítási lépés szükségességét. Felfedeztük, hogy >9S% radioaktivitás—beépülés érhető el p.H-3, &~on. öt-tíz perces inkubálással. Ennek az eljárásnak egy további előnye az imwnreaktívitás megnövekedétt fennmaradása <> 701) , mely valószínűleg annak köszönhető, hogy rövidebb az az idő, ameddig az antitestet a nagy energiájú rádióizotcpnak ki van téve a humán .s':z.é.rujnal.bamíin hozzáadása előtt, mely védelmet nyújt a rádiói1Issei szemben. Az immunreaktivitás fennmaradása nagyobb, mint amit a HPLC módszert alkalmazva korábban, megfigyeltek ,

Ά „mix-á-shoot eljárást alkalmazva előállított és készítménypufférben (75 mg/ml humán szérumaIbumínt és 1 L’TPAt tartalmazó 1 X PsS) inkubált jelölt kon j ag á t ússzá l végzett stabilitási vizsgálatok azt mutatják, hogy nincs radíoízctóp veszteség, és az immunreakti vitás teljesen megmarad. A humán szérummal 72 órán át 37^cC-on végzett stabilitási vizsgálatok szintén minimális tadíoizotóp veszteséget jeleztek. Ezek a sta157 bi.litási eredmények összevethetőek azokkal az eredményekkel, melyeket a HPLC eljárást alkalmazva kaptunk a radioaktiva.n jelölt kon j ugátummal.

A biológiai megoszlási vizsgálat olyan BALB/u egerekben, melyhez „míx-a-shnot eljárással előállított R-jelölt konjugátumot alkalmaztunk, nem mutatott a szokásostól eltérő .szöveti felhalmozódást. Ereknek, az eredményeknek az alapján feltételezhető, hogy a radioaktívat. jelölt antitest nem. változik meg annyira jelentősen, hogy drámai hatással, lenne az antitest in vivő jellemzőire. Szintúgy, ezek az eredmények hasonlóak azokhoz az eredményekhez, melyeket korábban a radioaktív jelöléshez HPLC eljárást alkalmazva előállított radioaktívan jelölt konjuqátummal kaptunk (lásd BB-IND 4850/4851) .

Egy „átlagos 78 kg-os· ember esetében a biológiai megoszlási adatokból számított dozimstriás becslések összhangban állnak azokkal az eredményekkel., melyeket a HPLC eljárást alkalmazva kaptunk, a radioaktivaa jelölt ken jugá turnékkal (lásd BB-IND 4850/4851). Továbbá a dezimetriás adatok összevethetőek azokkal az eredményekkel, melyeket egy jelenleg folyó klinikai kísérletbe tartozó betegeknél kaptunk (IBIS, számú IBEC vizsgálat), ha az eredményeket beadott dózis mCi-nként összehasonlítjuk. Ebben a vizsgálatban hat betegnél az átlagérték (.rád f SD) a teljes testnél 1,4 0 ± 0,57, a szívnél. 10,50 ± 4,68, a májnál 9,8 9 ± 8,91 és a lépnél 9,75 ± 6/00 volt.

Mielőtt, a „Aülr-k-shoot jelölési eljárást klinikai minőségű ^wY-2Bh-MX-DTPA előállításához kidolgoztuk volna, szükség volt az: eljárás reprodukálhatóságának vizsgálatára. Tehát tíz validációs tételt hoztunk létre a •^jS'’^,Y-klorid különbűző tételeit alkalmazva.

158

Az előállított tíz tételnél a „mix-&-shoot^M eljárást alkalmazva, kapott immunreaktlvitási értékek 60,6-93,3% között voltak., az átlag 74,5%, és a középérték 72,1% volt, Az iríímunreaktivitásnak az ilyen mértékű fennmaradása szignifikánsan jobb, mint a korábban a használatos HPLC módszert alkalmazva kapott 80%-os érték (54,9-65,1%: között; átlaga 60,2 %). Az átlagos radioaktivitás beépülés a tíz tételnél 85,7% volt (93,5-97,5·% között). Ez az érték összevethető azzal az értékkel, mélyet korábban, a HPAQ módszernél láttunk (91,7-93,7% közötti tartomány, és az átlag 93,1%), Úgyszintén az endotoxinra kapott eredmények, a koncentráció, radioaktivitás koncentráció, specifikus aktivitás, teljes fiola radioaktivitás, teljes fehérjekoncentráoiő, pH, és a sterilitás összevethető: volt a fiz tételnél, összességében, ezek az eredmények a „mix-ü-shoot eljárás reprodukálhatóságát igazolták, Továbbá 5 eá 15 perces reakciókkal kiértékeltük, az eljárás különböző jelölési időknek köszönhető variabilitását. Mivel nem volt, szignifikáns: különbség a két reakcióidőnél, úgy határoztunk, hogy a rövidebb inkubációs időt fogjuk használni a véglege s e.1 j á r á sba n.

E. Össbefoglalás •ó ö

A jelölt 2B8-MX-DTTA klinikai dózisainak előállítására kif ej leértettünk egy jelölési eljárást, amit: „mi.x-á-shoot eljárásnak nevezünk, méllyé! elkerülhető a jelenleg alkalmazott nagyteljesítményű folyadék kromatográfiás (HPICj lépés a nem. fehérje-kötött radíulzctóp eltávolítására. Az egyszerűsített eljárás kiiktatja ezt a fáradságos tisztítási lépést, míg fenntartja a radioizotóp nagymértékű beépülését {> 90%), és az immunreaktivitás jobb fennmaradását (,v 70%) biztosítja. A radío— izotóp fennmaradása és az immunreaktivitás alapján úgy találtuk, hogy a kllnikailag formulázott radioaktívat jelölt kcngugátum. stabil ín vitro, amikor 4°C-on 48 órán át inknháljnk, továbbá a radioaktívan jelölt konjogátum stabil, amikor humán szérumban 37°C~on 7 2 órán át inkufcáljuk. A BAlB/o egerekben végzett biológiai megoszlási vizsgálatok azt igazolták, hogy nincs a szokottól eltérd felhalmozódás, ide értve a csontot is. Egy „átlagos 70 kg-os embernél a sugárzás abszorbeált dózisok becsült értékei összehasonlíthatóak voltak azokkal az. értékekkel, melyeket a 'ljelölt 2B8-MX-DTPA-t egy jelenleg folyó klinikai kísérletben alkalmazva kaptunk. Ezeknek a vizsgálatoknak az eredményei, azt muζ.ϊ'Ί tatták, hogy a „mix-&-shoot eljárást alkalmazva előállított 'Ύjelölt 2B8-MX-DTBA összehasonlíthatö azokkal az eredményekkel, melyeket a hagyományos HPXC eljárásokat alkalmazva kaptunk. A klinikai minőségé radioaktivan jelölt konjugatum előállítására alkalmazott scale~up eljárás validációja azt mutatta, hogy az eljárás reprodukálható volt, és a termék összehasonlítható az-

< <A 1 ,	melyét a	jj: e é ~ 1~ g	8PLC eljárást	alkalmazva	állítottunk
elő.	Ezeknek az	előzetes	vi z. s qá .1 a t o kna k	az eredmény	el azt jel-
zi k.	hogy ez az	új „mix-1	-shooV eljárás	a klinikai	kisérletek-
ben	használható	^S0Y-jelölt	2 B 8-EX-BT PA elóállít ásóra	alhalmazéa-

tó.

Ax előnyös megválóeltásx módok részletes leírása

1. példa :Radioaktivitás-beépülés - Készletek ás mérőéi járások

A. találmány egyik célja az volt, hogy radioaktívitásí jelölési készleteket tervezzünk. a ^!·^;''^:'Ιη- és ''’Y-jelölt 2Bs-MX-ETPA elő

160 állítására (Ιπ2Β8 illetőleg Υ2Β8), és megállapítsuk a forgaloxabahozatali előírásokat a klinikai termékeknél. A radioaktív jelölési készlet eljárások reprodukálhatók a radioaktív beépülés és az ahtigén-pozitiv SB sejtek kötése tekintetében, és jelzi a radioaktív jelölési készlet alkalmasságát a klinikai kísérletekben való alkalmazásra. Javasoljuk, hogy az Tn2B8 és ¥2B8 .radioaktivitás beépülés és a kötődés forgalombahozatali előírását >95%~hau illetőleg >7ü%-ban határozzuk meg.

IX. Bevezetés

Egy jelölt egér monoklomális anti-Cú20 antitestet (Y2B8) jelenleg értékelnek ki a súlyosbodó B-sejt limfóma kezelésére. Az ittrium izotópnak hiányzik a gamma-komponense, mely ezt az elemet alkalmatlanná teszi a leképző rendszereknél váló· alkalmazásra. Tehát a In-jelölt zBS-MX-DTPA-1 (In2B8) fogjuk alkalmazni a tumor elhelyezkedésének vizsgálatára és dozimetriára a betegekben, mielőtt vagy „miután azokat ittriummal jelölt texápeutikommal kezeljük. Az 22BS és In2S8 előállítására jelenleg alkalmazott eljárásokkal, melyeket „mix-&-shoot eljárásoknak nevezünk, klinikai vizsgálatokra alkalmas radioaktivan jelölt antitesteket állítunk elő., Hindemellett a jelölési folyamat egyszerűsítése elősegíti a klinikai körülmények' közötti dózisélőéllíxást.

Az új radioaktív jelölési készlet előnyösen négy alkotórészt tartalmaz: 1) 2 mg/ml 2B8-hX-DTPA~t kis fémtartalmú normál sóoldatban 2) a radioizotöp oldatot a megfelelő jelölési pH~ra beállító SG mM nátríom-acetátot 3) készítménypuffezt (IX BBS, ρην7,4, mely 7,5% humán szérumalbumint és 1 md DTBA-t tattalAz összes kompo®azj, 4) üres 10 ml-es üvegcsövet {reakciócső) nenst a sterilitásra és a pirogém-mentfísségrs teszteltük.

Ez az ismertetés összefoglalja ennek a radioaktív jelölési készlétnek a valídádóját, mely készlet egyszerű és könnyen használhatói és ami 95% .. scioaktivitás .beépülés! értékkel és az antigén-pozi.tiv sejtekhez való kötés elfogadható fennmaradásával rendelkező radioaktívan jelölt antitesteket eredményez... A forgalombahozatalt vizsgáló előírásokat javaslunk a klinikai termékekhez.

XIII Anyagok és tódszarek a radioaktivitás beépítéséhez

A. A xadxoaktáv jelölési készletben lévő reagensek

1. 2B8-MX-DTPA, IDEG; 08-2395« számé tétel

2. 5Ö mM nátrium-acetát, kis fémtartalmú, IDEG, Ó82395RM3. számú tetei

3. Készitmenypuffér -7,5 % (tömeg/térfogat) humán szérum albumint és 1 mM DTPA-t tartalmazó In PBS, pH-7,4), IDEG, 0 8 23 95RMI s2ám ú t été1)

4. reaköíócsÖ, 1.0 m.l-is, IDEG

S. Anyagok és eszközök

1. Biodex Tee-Control Radíóiricorporation Készlet, katalógusszám: 151-770

2. kesztyű: pormentes

3. Steril polipropilén fecskendők

4. Steril fess kendetűk

5. kis zárható csövek;1,5 ml

C. Módszerek

1. Y2B3 és.....InlBS elkész i.t és e radioaktív jelölő készlettel

A készletreagenseket elkészítettük, és üveg terelőlemezes fiolákba töltöttük. Az I. típusú horoszílíkát fiolákat (2 vagy 10 ml-és) injekcióhoz való steril vízzel (hFI) kiöblítettük, és a feltöltés előtt autöklávoztuk. Sutilkaucsuk terelőlemezeket öblítettünk steril WFI-vel, és használat előtt autcklávoztuk. A reagenseket manuálisan megtöltöttük, és egy Class 100 szobába összegyűjtöttük, és USP módszereket alkalmazva pírogenitásra és stexi1i ta sra. leteszteltük.

a. InfBá előállítása

További reagensek:

.1. Indium- (.111]^::: kloridsó , hordozómentss, HCl-ben

El ó i.rá so k.:

1. Mindegyik lépést előnyösen .fertőzésmentes módszereket alkalmazva végezzük.

2. A radioaktív jelölő készlet komponenseit hagyni kell, hogy szobahőmérsékletűvé váljanak a használat előtt.

3. A végterméket a betegnek a lentebb leírt 9. lépés után 8 órán belül be kell adni.

In2B8 radioaktív jelölő eljárás

1. A reakciócsőbe adandó: ^InCXS mennyiségét a kővetkezőképpen számoltuk ki:

a. Radioaktivitás koncentráció mCi/ml-ben a radioaktív jelölés időpont j ában:

C<j - Radioaktivitás koncentráció a kalibrálás időpont iában (lásd a gyártó Analízis tanúsítványát)

At - időbeli változás (pozitív szám kalibrálás: után, negatív szám, a kalibrálás előtti .

Radioaktivitás koncentráció a jelölés időpontjában =

C₈ / e-0,0103 (Át)

b. A reakciócsőbe adandó InC13 térfogata:

3,5 mól / radioaktivitás konc - a reakcióesőbe adandó mennyiség a jelöléskor

2. x A raakciócsőbe adandó 50 mM nátxium-acetát mennyiségét a következőképpen számoltuk ki:

A hozzáadott '^luCla mennyiség® db lépés) X (1,2) a hozzáadandó 50 mM nátrium-acetát mennyisége

3. A reakcióosö terel ©lemezeit és 50 d) nátrlum-acetátos fiolát alkohollal letöröltük. Egy 1 cc fecskendőt alkalmazva az 50 só? nátrium?-ecetét mennyiségét (2. lépés? a reakoióosőbe tettük át.

4. A '‘^'InCls-forrás terelőlemezét alkohollal letöröltük. A fiolát agy steril 0,2 μζι-es: szűrővel töltött tűvel csapoltuk meg. Egy steril 1 cc fecskendőt alkalmazva az InClg kívánt mennyiségét (lb. lépés) átvittük a reakclöesőbe. A fiola tartalmát összekevertük többször megforgatva.

5. A SBO-KX-DTPA fiola terelőlemezét alkohollal letöröltük. Egy 1 cc-s fecskendőt alkalmazva 1,0 ml 2B8-MX-DTPA~t vittünk át lassan a reakcióasőbe. A csövet összekevertük többször megforgatva.

í>. A reakciót 30 perc ± 5 percig hagytuk lejátszódni környezeti hőmérsékleten.

7. A reakcióéi egy teljes térfogatát úgy számoltuk ki, hogy Összeadtuk a hozzáadott '“‘IaCli mennyiségét (4. lépés) a hozzáadott 50 mM nátrium-aoetát mennyiségét (3. lépés) és a hozzáadott 2BÜ-ΜΧ-ΏΤΒΑ mennyiségét (5, lépés)

8. A reakciócsőbe adandó készitménypuffe.r .mennyiségét, ahhoz, hogy 10 ml végtér fogatot kapjunk, úgy számoltuk ki, hogy 10-hői kivontuk a 7. lépésben kiszámolt teljes mennyiséget.

9. A készitménypuf teres fiolát alkohollal letöröltük, és a fiolát megcsapoltuk. A. készítménypuffer viszkozitása miatt a reakciócsővet egy 0,2 ul-es fecskendőfiIkerrel töltött tűt alkalmazva csapoltuk meg. Egy megfelelő méretű tűvel ellátott 10 cc steril fecskendőt alkalmazva a készitménypuffer 8. lépésben kiszámított mennyiségét vittük át a reakoiócsőbe. A csapolótűt el— távolítottak: a reakciócsőből, és a csövet többször megforgatva összekevertük (végtermék) . Ezt a csövet legalább 5 percig inkubálLuk a „Radioaktivitás beépülés! mérőéijárás elvégzése előtt. Az oldat színe sárga volt, és a eső tele volt, igazolva hogy a készítménypuff ért hozzáadtuk.

10. A végtermék teljes radioaktivitását megfelelő, Inmérésre beállított berendezéssel mértük.

11. A végterméket a „Kötési mérőeljárás-hoz és a „Radioaktivitás beépülés mérőeljárás-hoz azonnal 2-S°C-ra helyeztük.

b. iÓBő el oá 11 í t ás a

További reagensek:

1. Ittrlum-[901: kloridsó , hordozómentes, HCl-ben

Előírások.:

1. Miöeqwx. lépést fertőzésmentes módszereket alkalmazva kell elvégezni.

2. A radioaktív jelölő készlet komponenseit hagyni kell, hogy s oLaher'-u'sek .erűvé val-n^ak a uasznaiaz előtt.

3. A végterméket a betegnek a lentebb leírt 9. lépes után 8 órán belül be kell adni.

Y2SS radioaktív jelöld eljárás:

1. A. reakció-csőbe adandó YClj mennyiségét a következőképpen számoltuk ki:

a. . Radioaktivitás kan cent ráció mCl/ml-ben a radioaktív jelölés időpont j áhan:.

C-o “ Radioaktivitás koncentráció a kalibrálás időpontjában (lásd a gyártó Analízis tanúsítványát) őt ~ időbeli változás (pozitív szám kalibrálás után, negatív szám a kalibrálás előtt).

Radioaktivitás koncentráció a jelölés időpontjában C-_; / eO, 0108 (őt)

b. A. reakció-csőbe adandó térfogata::

mól / radioaktivitás konc., a. jelöléskor «= a r-eakclőcsőbe adandó mennyiség

2. A reakciócsőbe_: adandó 50 mM nátrium-acetát mennyiségét a következőképpen számoltuk ki:

a. 0,040 :M ACl-ben lévő ⁹dGl₃-nél ÍAmersham) :

dci; mennyisége (1b lépés) X (0,8) a hozzáadandó 50 női n á t r i w-acet át menny i sége

b. 0,050 M HCl-ben lévő ^ICl^'-nél (Motdion) :

YClj mennyisége (1b lépés) X (1,-0} - a. hozzáadandó 50 mM nátrium-aoetát mennyisége

3. A reakció-cső terelőlemezéít és nátrlum-acetátos fiolát alkohollal letöröltük. Egy 1 cc-s fecskendőt: alkalmazva az 50 md nátrium-acetát (2. lépés) számított mennyiségét (la. vagy 1b. lépés) a reakgióosöba tettük át. A cső tartalmát, többször megfő r g a tv a ö s szer á zzuk..

166

4.. A ^'¥01-3 forrás te.relölem.ezét. alkohollal letöröltük. A. fiólát egy steril 8,2 pm-es szűrővel töltött tűvel csapoltuk meg. Bgy steril 1 cc fecskendőt alkalmazva az TftCl.3 kívánt mennyiségét (Ih. lépés) átvitték a reakcíóesőbe. A fiola tartalmát összekevertük többször megforgatva.

5. A 2S8-MX-DTPA fiola terelőlemezét alkohollal letöröltük. Egy 3 cc-s fecskendőt alkalmazva 1,5 ml 2B8-MX-D?FA~t vittünk át a reakcíóosöbe. A csövet összekevertük, többszőr megf orgatva .

6. A reakciőelegy teljes térfogatát úgy számoltuk ki, hogy összeadtuk a hozzáadott Y-ÁQ-klorid mennyiségét (4. lépés) a hozzáadott 50 md nátrium-acélát mennyiségét 13. lépés) és a hozzáadott 2B8-MX-DTEA mennyiségét (5. lépés).

7. A zeakuiócsöbe adandó készítménypuffer mennyiségét, ahhoz, hogy 18 ml végtérfogatot kapjunk, ügy számoltuk ki, hogy 10-ből kivontuk a 6. lépésben: kiszámolt teljes mennyiséget.

9. A kés z ítmény puf. férés fiolát alkohollal letöröltük, és a fiolát megcsapoltuk. A készítménypuffer viszkozitása, miatt a reakciőcsövet egy 0,20 μΐ-es fecskendofíltezrcX töltött tűt alkalmazva csapoltuk meg. Egy megfelelő méretű tűvel ellátott 10 cc steril fecskendőt alkalmazva, a készitménypuffér 7. lépésben kiszámított mennyiségét vit tük át a. reá keióesőbe. A csapolótüt eltávoli tettük a rsakoiőcsoből, és a csövet többször megforgatva összekevertük (végtermék) . £zt a csövet legalább 5 percig inkubáltuk a „Radioaktivitás beépülés.! mérőéi járás elvégzése előtt. Az oldat színe sárga volt, és a cső tele volt, igazolva hogy a készitménypuffezt hozzáadtuk.

9. A végtermék teljés radioaktivitását megfelelő, ^Inmérésre beállított berendezéssel mértük.

IS 7

IQ. A végterméket, azonnal i-EőC-on tároltuk, amíg a .betegnek való beadáshoz nincs szükség rá.

11. Az immunreaktivitás tesztelése:

Egy 1 ml-es· fecskendőt alkalmazva 0,1 ml-t kivettünk a reakcíócsőből, és egy külön 1,5 ml-es csavaros tetejű csőbe, vittük, át. A csövet rögtön 2-3^öC-ra helyeztük a „Kötési mérőeljárásúhoz és a „Radioaktivitás beépülés! mérőeljárás-hoz.

A radioaktív jelölési készlet eljárások validáciőját az IDEG Pharmsceuticals-nál (San. Elégő, GA) , MD Andersen Bealth Centernél (Houston, TX}, a Maya Clinic-nél (Rochester, MN) , és a City of Hope-nél (öuarte, Ca) hajtottuk végre. Az összes készletkompotenst, ide értve a klinikai minőségű 2BS-MX-DTPA-t, az XEEC Pharmaceutical készítette el GMP körülmények (A Szövetségi Előírások kódjának xoegfelelő gyártási körülmények) között, és meghatároztuk, hogy steril és pirogén-mentes-e.

A radioaktívan jelölt antitesteket 7,51 (tömeg/térfogat) humán szérumaIbumínnal (HSA, klinikai minőségű, Eaxter-Hyland) és 1 níM DTPA-t tartalmazó 1 X PBS-ben f Oau.liz.tuk. Minden egyes valídációs tételnél a végrehajtott kibocsátási teszt eredményeit lentebb ismertetjük, öt operátorral az In2B8-nál és az ¥2B8-nál is hat validáciős tételt készítettünk. Ezeket a tételeket a következőképpen jelöltük meg, és a következő berendezésnél hajtottuk végre a vizsgálatot:

In2B8i

1. számú tétel í: IDEG Pharmacentical

2<. számú tétel: IDEG PharmaoeutIcai .3, számú tétel: IDEG Ehamaceutical

4. számú tétel: MD Andersen Health Centre 1

5.	számú	tétel:	bayo	Cliníc
6.	s zámú	tétel:	City	of Hope
Y2B8:
1.	számú	tétel:	1 DEC	?harmaceúti ca1
3.	számú	tétel:	IDEG	Pharmaceut ital
3.	számú	tétel:	IDEG	Bhaxmaoe utIcai
4.	számú.	tétel::	MD Ar	iharson Hsaith Csatra!
5.	számú	tétel:	Mayo	Clin1c
6.	számú	tétel:	City	of Hope
?.	bio.fl l.izá.2t	SB és	/-/58 sejtek előállítása

Az. SB {CD20--gozitív0 és HSB (CD20-negatív) humán sejtvonala— kát az tasrican Type Culture CGllectíon-től szereztük be, és T~ lcmbj.kokoan tenyésztettük .10 % magzati borjúszérumot tartalmazó és 2% glutamínnal kiegészített RPMX-1640-t alkalmazva. A tenyészeteket 37⁰C-cn és 5% CCg-ben tartottuk fenn.. A sejtek jellemzően minden második, nap kettéosztódtak, és 0,5-2,5 x 10⁶ sejt/mlnél és >80% életképességnél gyűjtöttük össze éket. A sej tkoncent.zációkat egy hamocitornétert alkalmazva határoztuk meg, és az élet képessége c. tripán-kékes ki zárással határoztuk: meg.

A sejteket környezeti hőmérsékleten 0,5-2 x 10^ sejt /.ml sejtsűrűségnél centrífugálással összegyűjtöttük (1300 rpm egy Sorral1 centrifugában), és kétszer 1 X nBSS-ben mostuk. A pelletizéit sejteket 50 x 10° sejt/ml koncentrációig 1% (tőmeg/térí.) marha széruma Ibumint (BSA) és 101 f tömeg/térf.) mannitot tartalmazó' 1 X HBSS-be (liofilizáló puffén újraszuszpendáltuk, 0,5 ml~t 1,5 ml-es, o-alakü tömitőgyűrűkkel rendelkező polipropilén mikrofugacsövekbe osztottunk szét, és -IvFc-on tároltuk,, és 30-60 militorr-on egy éjszakán, át líofilízáltuk. A liofilizál c sejteket tartalmazó csöveket 2-8^öC-on szárítva tároltuk, és a mérőéijárásokhoz steril vízben állítottuk helyre. A sejteket, tartalmazó csöveket mi krof ugacsövekben szárítós serrel együtt tároltuk.

3_ Analitikai mérőéijárások

Az Xn2B3 és 1258 valídációs tételeinek tesztelésére használt analitikai eljárásokat ismertetjük a továbbiakban. A következő mérőeljárásokat hajtottuk végre mindegyik validáciős tételnél:

1. Kötési méréeljárás liofilizált SE sejteket alkalmazva.

2. t2B8/ín2BB radioaktivitás-beépülési mérőeljárás Biodex Készletet alkalmazva

a. Kötési mérőéijárások

Mindegyik operátor mérte a százalékos kötést az In2B8-nál illetőleg a 12B8~nál liofilizált CD20-pozitív SS sejteket alkalmazva a következő eljárások szerint. Ezek a mérőéijárások gyors és hatásos módszerét biztosítják annak igazolására, hogy a radioaktívat jelölt antitest még felismeri antigénként a CD2Q-t. A CD20-negativ 5SB sejteket klinikai környezetben is kiértékeltük. Llofilizált sejteket készítettünk, és a fenti Liofilizált SB és HSB sejtek készítése módszer szerinti állítottuk elő, és tároltuk.

1. Xn2B8 kö m-^{s r ö e} 1 j á rá s

További reagensek:

1. Indiám-(1X1}-2B8-MX-STBA

2. Liofilizált 5B sejtek; három, 25 X 1.0^!> sejt/cső mennyiséget tartalmazó csövek.

3. Liofilizált HSB sejtek; három, 25 X 10' sejt/cső mennyiséget ta r t alma ző csöve k.

4-, Steril, víz az öblítéshez, vagy steril víz az injekcióhoz

5, Hígítás! puffét (1% Marha szérum albumint (BSA) , és 0,02% nátrium-azidót tartalmazó 1 X PBS-ben (pH-7,2-7,4), 0,2 pm-es vágási ér terű szűrőn átszűrve, és szobahőmérsékleten tárol va.

6. Üveg vagy műanyag csövek a radioaktivitás mérésére.

eljárás:

Mérőeljárás beállítása (bem radioaktív rész)

1» Három cső liofilíráit SB és HS8 sejtet kaptunk.

2. 0,50 ml mennyiségű SWFI-t (injekcióhoz szolgáló steril víz) adtunk mindegyik csőbe, és a csöveket vcrtexeltök amíg homogén .szuszpenziót nem kaptunk.

3. Mégy üres 1,5 ml-es mikrofugacsö, A csövek közül háromba. 0,50 m higitási puffért adtunk, melyek sejtek nélküli kontrol lókat képviselték.

4. A másik 1,5 ml-es mikrofugacsebe 0,99 ml higitási puffért adtunk; ezt a csövet Ír 100 aranyban jelölték.

5. Egy tetővel rendelkező 50 ml-es steril polipropilén csövet vettünk, és 10 ml higitási puffért tettünk a csőbe.

Mérőéi járás beállítása (Radioaktív rész)

1. 2”8^oC-en tárolt, radioaktivan jelölt antitestet vettünk.

2. Egy P20-szal 0,01 ml mennyiséget kiszívtunk, és 1,5 ml-es mikrofugacsőbe tettünk, mely 0,99 ml higitási puffért (IrlOO-as hígítás) tartalmazott. A hegyet leöblítettük és a csövet, óvatosan. vortexeltük, hogy összekeverjük.

3. Az l:löű-as higitási csőből PiOO-as pipettával 0,20 ml-t kiszívtunk, és 10 ml higitási puffért tartalmazó kúpos csőbe tettük,. A. csövet alaposan összekevertük.

Mérővézsgálati el járás

1. A hígított In2B8-MX-DTPA 0,58 ml mennyiségét, adtuk az összes csőhöz.

2. A kupakokat erősen becsavartuk' az összes csövön, és a csöveket 60 percen át folyamatosan kevertük.

3. 60 perc környezeti hőmers?ékleten történő inkuhálás után az összes csövet 5 percig minimum 2-Q.QO g-nél centrifugáltuk.

4. Mindegyik felülúszó 0,75 ml~es mennyiségét a számi, álóké szüléknek megfelelő csövekbe vittük át.

5. .A csövekben lévő radioaktivitást egy gammaszámiélóval számoltuk, a háttérhez beállítva.

í1. Y2B8 kötési mérőéijáras

További reagensek:

1. ^3OY2B8-MX“DTPA

2. Liofilizált SB sejtek

3. Steril víz az öblítéshez, vagy steril víz az injekcióhoz

4. Hígítást puffer (1% Harha szérum album.iut (BSA) , és 0,02% nátrium-ezidőt tartalmazó 1 X ΓΒ3 (pH-?, 2-7,4) .

Eljárás:

RádióaEbivan jelölt antitest minta készítése:

1. 2-8’C-on tárolt, radioaktívon jelölt antitestet vettunk.

2. Egy P20-as pipettával 10 pl mennyiséget kiszívtunk, és 1,5 ml-es mikrcfugacsőbe tettünk., mely 900 pl hígitási puffért (1:100-as hígítási tartalmazott. A hegyet leöblítettük és a csövet óvatosan vortezeltük.

3. Egy 50 ml-es, kupakos Stefii, polipropilén csövet vettünk, és ml hígítás! puffért tettünk a csőbe egy 10 ml-es szexológiai pipettát alkalmazva.

4. Az 1:1Q-O'~as hlgitási csőből PzQU-as pipettával 35 pl-t ki- szívtunk, és 10 ml higixási puffért tartalmazó kúpos csőbe tettük. A csövet alaposan összekevertük.

Llei 11 i.zált sej t-prepátátum

1. Három, liöfilizált SS sejtet tartalmazó csövet vettünk.

2. 0,5 ml SWFI-t tettünk mindegyik csőbe, és a csöveket addig vcrtexeltük, míg egysejt-szaszpenziökai nem kaptunk.

3., Három üres 1,5 ml-es mikrofugacsövet vettünk elő, a három csőbe 0,5 ml hlgitási puffért adtunk, melyek sejtek nélküli kontrollókat képviselték,

Mércvi zsgálati a1jórás

1. A hígított ' ¥2BS-MX-DTiA 0,5 ml mennyiségét adtuk az összes csőhöz.

2. A csöveket a végükkel felfelé egy keverőre helyeztük 45 percre, miután megbizonyosodtunk arról, hogy a kupakokat erősen becsavartuk.

3. 45 perc környezeti hőmérsékleten történő inkubálás után a sejteket 5 percig tartó mikrocentrifugálással pelletizáltuk.

4.. A felúlúsző 0,8 ml-es mennyiségét szcintillániós csövekbe vittük át,

5. Mindegyik csőbe szelniillációa koktélt tettünk.

6. A csövekben lévő radioaktivitást egy szelniillációs számlálóval számoltuk, a háttérhez beállítva.

b......Ha dl oak tivi tás-beépülesi mérbeljárás

A százalékos radioaktivitás beépülést instant vékonyréteg kromatográfiával (ITLC) határoztuk meg Biodex Tec-Control Badiochromatographic Hitet alkalmazva a következő eljárás szerint :

További anyagok és felszerelés:

1., ^1UIn~ vagy ^-jelölt 2B8-MX-DTPA

2. Csövek a radioaktív T1C csíkok számlálására

3·. Olló

4. Steril fecskendő, 1 cc

5.. Steril, tűk, 26G

6. Gamma-számláló vagy szcínt.íllációs számláló

7. Pipetta

Eljárás:

1. Először el kell olvasni a teljes Biodex Működési kézikönyvet.

2. Mindegyik radioaktívan jelölt mintát három példányban teszteltük a készlet használati útmutatója szerint: csövenként egy csíkot hívtunk elő.

3. _; A radioaktívan jelölt minta kromatográfiás csíkra történő pöttyözéséhez, egy pipettát alkalmaztunk, hogy 1 ul~t cseppentsünk az eredeti sávra. Alternatív lehetőségként egy steril 1 cc fecskendőhöz kapcsolt 26G-s tűből kiadagolt kis c s e pp et pött y i nta ttünk.

4. Mindegyik darabot az: aktivitásra kiértékeltük egy megfelelő számlálót, azaz a ^x’rn-nél egy gammaszámlálót, és a 'í-nál egy szcintíllácíós számlálót alkalmazva, a háttérhez beállít-

5. Követtük a rádIcáktivan jelölt antitest százalékának kiszámolására szolgáló Biodex útmutatót.

Az IníES vagy Y2B8 mindegyik valid.áciős tételének tesztelési, eredményeit a 33. és 39. táblázatban összegezzük.

. az

38. táblázat:

valldáció3ánal

Téte l szán	% radioaktivitás beépülés	% kötés
1	99,5	78,6
2	99,3	87,0
.3	99,4	85, 9
4	99,2	81,8
5	99,2	79, 6
6	96, 3	80, 8

Átlag - 98,8 Átlag: 82,3

Standard hiba ® 1,24 Standard hiba - 3,4 % CV - 1,25 % CV - 4,2 % valxdáaáö jánál

Tétele zárs	% radioaktivitás beépülés	% kötés
1	99,4	8 6,2
.-y	98,7	8 6, 8
3	99, 3	85,8
4	98,3	8 6,7
⁵	93,0	82,1
s	99,3	8 3,0

Standard hiba - Q,43·

Standard hiba - 2,08

C'V - 2,42 %

V. Elemsés és következtetések

A jelenleg használatos radloaktivitási jelölési eljárások egyszerűsítésére az I.n2B8~nál. és az i2B8-nál, egy négykomponensű készletet rejkésztettünk ki. A nátrínm-acetát koncentrációját 50 mM-ra és a 2B8-MX-DYPA konceatrációját 2 wg/td-re csökkentettük, hogy lehetővé tegyük a pontos mennyiségétvite.lt fecskendőket alkalmazva.. Az összes készletkomponenst előnyösen üveg terelelemezés fiolákba töltöttük, ás az IDEG sterilitásra és pirogenitásra letesztelte ezeket, mielőtt forgalomba, hozta, így nincs szükség arra, hogy ezeket a teszteket a klinikai környezetben elvégezzük. Helyben az összes reagenssel végzett műveletet steril fecskendőket és csöveket alkalmazva hajtjuk' végre. Ezért a radiefarmakolégiai környezetben szokásosan megtalálható fertőzésben ~.es körülmények betartása biztos ltja, hogy a rád inakéi van jelelt és formulázott antitestek alkalmasak legyenek arra, hogy a betegeknek beadjuk.

Az In2S8~nál és Y2B8-nál a radioaktív jelölési eljárások reprodukálhatóságát és stabilitását több validációs mérés végrehajtásával értékeltük ki mindegyik radíoizotóp különböző tételeit alkalmazva. Az előállított InzBS hat validáoiós tételénél a kötés 82,1%-tól 86,8%-ig terjedt, az átlag 85,1 % volt; a radioaktivitás beépülés! érték hozzávetőleg 99% volt (98,31-161 99,álig terjedt) . Az előállított Y2B8 hat validációs tételénél a kapott százalékos kötés 78,5%-töl 87,ő%-ig terjedt, az átlag 82,3% volt. A radioaktivítási beépülés! érték az Y2B8-nál átlagosan. 98,8% volt {96,3%-tól 99,51-ig terjedt)< összességében ezek az eredmények igazolják a radioaktív jelölési készlet eljárások repodukálhatöságát és stabilitását az In2B8-nl és az Y2B8-nál is. Ezeknek a validációs eredményeknek az alapján javasolt, hogy a radioaktivitás beépülés és kötés forgalomba hozatali előírását á 95%-bán illetőleg >70%-bán határozzuk meg az InBEB-nál és az Y2B8~nál is.

Továbbá mivel az alkalmazás könnyebbé vált, és csökkent a hibalehetőség az előállítás alatt, javasoljuk, hogy íiofilizált Cö20~pozitiv sejteket alkalmazó százalékos kötést és radioaktivitás -beépülést használjunk az In2S8 és F1S8 forgalomba hozatali tesztelésére a klinikai körülmények között.* összefoglalva, ezek az eredmények együttesen azt jelzik, hogy a radioaktív jelölő: készletet alkalmazva előállított InSBv és T2B8 alkalmasak arra, hogy klinikai körülmények között használjuk fel azokat. Továbbá mindkét radioaktivan. jelölt antitestnél, forgalomba hozatali előírásokat határozunk meg öt különböző operator által végzett több validáoiös mérés eredményére támasztod-

2. példajseépúles é^: kötődés jgéssstlebek és

X.

ben klónoztuk, hogy egy eresen szprásszá16 sejtvonalat kapjunk.

A CHO-eredetű antitest CD2:0-pozitív humán sejtekkel szemben.!

spéciiikusságát FáCS analizissel és kompetitív kötéssel igazol tuk. Jelentéktelen kötődést, figyeltünk meg a humán T-sejtekkel szemben. Az: antitest CDlO-pozitív sejtekkel szembeni affinitását

1,3 x lö'^la M értékként határoztuk meg egy kompetitív kötési mérőeljárást alkalmazva. Az antitestet MX-BTBA kelátképző szerrel reagáltattuk, hogy egy konjugátumot, a 2B8-MX-DTi?A-t hozzuk lét re, az ijíwunraaktivitás jelentéktelen vesztesége mellett (az affinitás! érték 4, 4 X lö M volt).. A ......In radioaktív beépülésé nek mérésével meghatározva, a kelátképző optimális konjugációját nyolcórás reakció után értük le. A radioaktív jelölési eljáráso kát a 2S8-MX-DTPA-nál a vagy az ^Ω'^;Ιη esetében a pH és az inkubációs idő tekintetében optimalizáltuk, hogy maximális radioaktív beépülést (>95%) és az iimounreaktivitás fennmaradását (>70%) biztosítsuk. Az In2B§-nál és az VzBS-nál, melyeket CH0eredetű 288-MX-D?FA-t alkalmazva állítottunk elő, fomgalombahotatali előírásokat javasoltunk a radioaktivitás beépülésére (X 95%) és a liofilizált. és helyreállított GhSö-pozitiv humán sejtek kötésére (>7ö%). Együttesen ezek az eredmények azt jelzik, hogy a CHQ-eredetű 2B8-MX-DTBA alkalmas a klinikai kísérletekben való falhasználásra.

XX. Bevezetés

A korábban alkalmazott 2B8 antitestet üreges szál, bioreaktorokban termeltük. .Hogy lecsökkentsük ennek az antitestnek a gyártási költségeit, CHO sejtekben klónoztuk, és fejeztük ki, hogy -egy erősen expresszáló termelő sejtvonalat kapjunk. Ez a példa a CHO-eredetű 2B8 antitestnek, a konjugált antitestnek (2B8-XX-D72A) és a klinikai radioaktív jelölési készlet eljárásait alkalmazva elkészített ^Φ>'- és ^In-jelölt antítesttermékek in vitte jellemzésének eredményeit írja le.

XXX. Agyagok és módszerek

A. Reagensek

Az SB íCDlO-pozitÍv) és HSB (CD2ö-negatív) humán sejtvonalakát az .Amer Icán Type Culture Collentiontdl szereztük be, és T~ lombikokban tenyésztettük 10 % magzati borjúszérumot tartalmazó és 2% glutamínnal kiegészített RüMI-164D~t alkalmazva. A tenyészeteket 37°'C«on és 5%_: CQg-ben tartottuk fenn. A sejtek jellemzően minőén második nap kettéosztodtak, és 0,5-2,5 x 10 sejt/minél és >80% életképességnél arattuk le. A sejt koncentráoi ókat égy hemacifóméiért alkalmazva határoztuk meg, és az élet képesseget: tripán-kékes: kizárással határoztuk meg.

A sejt sarzsokra vonatkozó specifikus információkat a 1553. számú jegyzetfüzetbe és a Ron Moréna által írt „Sejtaktivitási jegyzőkönyv 1595 1 1995^í? cimű iratgyűjtőbe irtuk fel,

CHO-eredetü 2B8-t állítottunk elő GMP körülmények között IDEG gyártó berendezésben. Az antitestet kis fémtartalmú normál sóoldatbari fötmuláztuk 11,5 mg/ml koncentrációban. Az antitestekről SDG-PAGE-vel megállapítottuk, hogy homogének. 2B8-MX-ETEA-t állítottunk elő a P5BR-043 szerinti GMP körülmények között CHOersdetű 2δ8-bél, és kis fémtartalmú sédIdátben 2 mg/ml koncentrációban farmulástuk (tételszámok: 0165A és 0165B).

A gyógyszerminőségü ⁴‘^tiIn~klor időt az Amershamtól (IÍ.K, > vagy a Cyclotran Producer Inc.-tói (Gorái Gables, FL) vásároltuk. Az ittrium.[90]'-klaridat az Amershamtól (U.K.}, Nordian Internatíönal-tol (Kanatta, Kanada? vagy a. Pacifíc Nortwest fetional Inboratory-tól (Richland, WA} szereztük be. A GMP szerint előállított MX-DTBA~t a Hanser Chemicaltól (Boulder, Co) szereztük be. A klinikai minőségű káloium-trinátrium-diat iléntziamin-pentaeoetsavat (DTBA) a Regitől (Berlin, Németország} szereztük be. A TAG~NHS~t az IGEN Inc.-töl (Rockevílle, MD) vásároltuk. Egérféle anti-CDI9 gyöngyöket vásároltunk a Dynal Inc .-tői (Laké Süccees, RY'í .

Kecske anti-egér FITG-jelölt F'Cab'* J a-t a Jackson Immuno Research-tői vásároltünk.

A szennyező: nehézfémek eltávolítását igénylő reagenseket adagonként Chalen 190-zal (BioRad Industries? vagy Chelating Bepharose-zal (Pharmaoia· kezeltük, az oldatokat egy oszlopon áteresztve. A kis fémtartalmú törzsoldatokat öblítésre szolgáló steril vízzel (BWEIr) hígítottuk. Az oldatokat steril műanyag tárolóedénye kben tartótt uk.

További, a specifikus módszerekhez való reagenseket írunk le lentebb.,

B. Anyagok és felszerelés

1. Origen Analizáló; IGEN Inc. ModeíIszám: IIQO-IOQO; IDEG Szám:

1492 .21. Top-€ount szcintílláoiós számláló; Packard, Modellszám:

A9912; IDEG szám: 1329

3. Gamma' számláló, Isodata, modell szám: 20-1ö; IDEG szám: 06-28

4. Tec-Control Rádió kromatográ f iás készlet, Blodex, modell szám:

151-770

5. Liofilizáló; Virtis, Hodel Ereezemobil 12; IDEG szám: B458

A további anyagokat és berendezéseket a specifikus módszereknél ltjuk is.

C. Módszerek

1. Liofilizált SB és HSB_sejtek előállítása

A sejtekét a .fentebb leírt módon tenyésztettük, és környezeti hőmérsékleten 0,5-2 x ItT sejt/ml sejt sűrűségnél. centrifugálással learattuk (13D0 rpm egy Sorvall centrifugában) , és kétszer 1 X BBSS-hen mostuk. A pelletizált sejteket 50 x 10 sejt/ml koncentrációig 1% (tömeg/térf,) marha szérumalbumint (BSA) és 10 % {tömeg/térf.; mannitat taralmázó 1 X HBSS-'be (liofílizáló puffer) üjraszuszpendáltok. 0,5 ml-t 1,5 ml o-alakú tömítőgyűrűkké 1 téridéi kezd polipropilén míkrofugacsövekbe osztottunk szét, és Tű^C-on tároltuk, és 30-60 milltorr-on egy éjszakán át liofilizáltuk. A liofilizált sejteket tartalmazó csöveket 2-8*0on szárítva zároltuk, és a mérőéijárásokhoz steril vízben

180 vá tároltuk, és a mérőéijárásokhoz steril vízben állítottuk helyre. A sejteket tartalmazó csöveket mikrofngacsövekben szárítószerrel együtt tároltuk.

2. FA C S kötési analízis

Az antitestet humán B-sejtekhez való közvetlen kötődését áramlásos citcmatriával határoztuk meg. Az antitestet növekvő koncén krédóban 1% (tömeg/térf.) BSA-t tartalmazó IX BBS-ben isid' 2) (kötési püffed inkubáltuk 5 X 10“' CD20-pozitiv (SB) vagy CD2ö~negatív (HSB) sejtekkel 30 percig jégen. A sejteket oentrif ugálással mostuk, kötési pufferben újra szuszpsndáltuk, és FITC-jelölt kecske anti-egér F(ab')y-vei 30 percen át jégen inkubáltuk. Miután a második reagenssel inkubáltuk, a sejteket centrifugálással mostuk, és 1,1% (.térfogat/térfogat) formaldehidet tartalmazó 1 X PES-ben újra szuszpendáltuk, hogy rögzítsük a sejteket,. Az átlagos fluoreszcencia intenzitást áramláson citometri.át alkalmazva határoztuk meg.

3.Kompstitlv kötési mérőeljárás

A 2BB és a 2S8-MX-DTPA immunreaktivitását CD20 -pozitív SB sejtekhez való kompétítív kötéssel határoztuk meg ORIGEN elektrokemilumineszcenclás eljárást (Leland and Powellj alkalmazva. A log-fázisü SB-sejteket a tenyészetből összegyűjtöttük, és kétszer mostuk 1 X BBBS-sel.. A. sejteket Iá (tömeg/térfogat) marha szérumaibumint tartalmazó IX PBS-ben hígítottuk. Bizonyos kísérletekben liofilizált sejteket alkalmaztunk, miután azokat steril vízzel helyreállítottuk.

Ruténiummal jelölt nyomjelző antitestet állítottunk elő a CHG-eredetü 2B8-t (165. számú tétel) 1 X PBS-ben (pH—7,2) rutéβίι»{II)“tris-bipiridin kelátor M-hídroxi-szukci.nimid észterével •X·

181 (TAG-MüS) inkubal. va 15 :1 TAG-^SH: antitest mól arányban - Környezeti hőmérsékleten végzett 1 órás inkubálás után fénytől védve, a reakciót glicínnel 10 pert alatt. leAllítottak. A nem reagált TAG-ot .méretkizárásos kxomatográfiával eltávolitottuk egy 1 X PBS-sel kiég yen súl yozot t üharmacia ED-10 oszlopot alkalmazva. A fehérjeköncentrációt Bradford fehérje assay-t alkalmazva, határoztuk meg. A TAG beépülést az abszo.rbancia 455 hm-e.n val.ő mérésével határoztuk megy Kiszámoltuk, hogy a TAG/fehérje mólaránya 3,0.

Mérővizsgálatokat hajtottunk végre 12 X 75 mm-es polipropilén csövekben. A kompeticióba lépő antitestek különbözöl mennyiségeit (0,002- 17 pg/mlj inkubáltúk 1 X PBS-ben fpÜ-7,2, mely 1% ítömeg/térf.) BSA-t tartalmazott) 0,08 pg/ml TAG-jelölt GEO 2B8vel, 0,03 mg /ml anti-CDlS gyöngyökkel és 167 000 sejt/ml-rel. Miután környezeti hőmérsékleten inkubáltuk 3 órán át orbitálisan keverve, meghatároztuk a relatív elektrokemilumineszcencíát (ECL) CRTGEN .készüléket alkalmazva. Meghatároztuk az átlagos ECL értékeket a két példányos mintákban, és a kompét le lóban álló antitest koncentrációjának függvényében ábrázcltuk Kaleldagraph szoftvert alkalmazva. Bizonyos kísérletekben a százalékos gátlást ábrázoltuk, A kompetíciós görbéket hozzáillesztettük, és az E€ 5-S értékeket (50 % maximális kötést adó antitestkoncentráció) meghatároztuk a következő ^-paraméteres programot alkalmazva:

y - ( (ml-m4) / (m0/m3) ^Λη2) )-0-4;ml^;má~;m3-;m4e mö - független változó ml ~ nulla jelválasz relatív ECL egységekben m2 - görbületi paraméter m3 — EC50 pg/ml-ben kifejezve

132 mű maximális jelválasz relatív £CL egységekben * Az átleges affinitási értékeket az: EC50 értékekből és a nyomjelző antitest ismert koncentrációiból számoltuk ki, Müller móds z eré t a1kaIrmaz va.

4, 2B3-m-DTbA előállítása

A belátképző szert, az l-izotiocianátu-benzil-ü-metildietilén-triamin-pentaecetsavat (XX-DTPA) száraz porként (szabad sav) szereztük be_:, és szárítva tárultuk -20'^c'C-on vagy -7>3⁰C-bn. Hozzávetőleg 3 mg €W 288 antitestet kis fémtartalmú normál sóoldatban ρΗ-δ,β-cs értékre állítottuk be 1-10 térfogatnyi, 8,S pü érétkű: 50 mM nátrium-borát hozzáadásával. Az antitestet 10-31 mg/ml koncentrációban 4:1 :MX-DTPA:fehérje mólarányban inkubáltuk 50 mM nátrium-bórákban (pH-8,€) oldott MX-DTPA hozzáadásával. Környezeti hőmérsékleten történő inkubálás után (.2-24 éra) a nem reagált kelátképzőt eltávolítottuk a konjugátombol kis fémtartalmú sóoldatban végzett ismételt diafiltrációval Centricon 30 spin-fi1tereket a1kalmazva.

5. InSBB és Ϊ2Β8 előállítása

In2B8-t állítottunk elő a radioaktív jelölési készlet eljárást alkalmazva az itt leírt módon. Az antitestet 3 mCi/mg specifikus aktivitásnál jelöltük, és 0,2 mg/ml-re formuláztuk. Róviden, Q,5-2 mCí In-klóridőt vittünk át egy fémmentes mikrofugacsőbe, és hozzávetőleg pHM,2 értékre állítottuk be 1,2 X térfogatévá kis fémtartalmú 50 mkl nátrium-acetátot alkalmazva. 2 mg/ml BBS-XX-DTBA-t adtunk az índium-acetát oldathoz, és miután környezeti hőmérsékleten 30 percen át inkubáltuk, a jelölt antitestet 0,2 mg/ml-re formuláztuk 7,5% (tömeg/térf.) humán szérum albumint és 1 mM DTPA-t tartalmazó 1 X PBS-ben (pH-7,2) (a HSA végső koncentrációja 4-6%) Az összes mintát, teszteltük a .radioaktivitás beépülésére három példányban; a? értékek 95%-nál nagyabbak voltak.

Az 12,B8-t az I. példában leírt radioaktív jelölési készlet eljárás egy kisméretben végzett változatával is előállítottak.. Az antitestet .15 mCi/mg specifikus aktivitásnál jelöltük, és 0,3 mg/ml koncentrációjúra formuláztuk. Röviden, 0,5-2 mCí ^:!VYklóridőt tettünk egy femmentes mikrofugacsöbe, és a pb-t hozzávetőleg 4,2 érékre állítattuk be 1,2 X térfogatnyí kis fémtartalmú 50 mM nátrium-acetátot alkalmazva. 2 mg/ml 2B8-MX-DTPA-t adtunk az ”''X-ecetét oldathoz, és mintán környezeti riőmérsékleten 30 percen át inkubáltuk, a jelölt antitestet 0,2 mg/ml—re fonauláztuk 7,5 % (tömeg/térf. ) humán szérum albumint és 1 mb DTBA-t tartalmazó 1 X PBS-ben tpH-7,2j (a HSA végső koncentrációja 46%). Az összes mintát teszteltük a radioaktivitás beépülésére három példányban; az értékek 95%-nál nagyobbak voltak.

A végsó radioaktivan jelölt termékek radioaktivitáskoncentrációit a reákelóélégyhez adott radioaktivitás mennyisége alapján és a radiaizotóp Analízis Tanúsítványát figyelembe véve számítottuk ki. A leállított reakcióélegyek antitestkoncentrációját a hozzáadott antitest ismert mennyiségéből számítottuk ki .

A radioaktív jelölési kinetikai vizsgálatokhoz, melyek a pH hatását vizsgálják, a radioaktivitás beépülésre és a kötésre, a reakcióelegyek ρΗ-ját különbőzé mennyiségű kis fémtartalmú 50 mM nátrium-acetát (0,8-2,2 X a rádióizotóp oldat térfogata) hozzáadásával állítottuk be.

6. A Radioaktivitás-beépüiés méghatározás a a z In2 B8-nal és az YlEO-riál

A. végtermékekben vagy az inkubációs mintákban a konjngátumokhoz kapcsolódó radioaktivitás mennyiségét (radioaktivitás beépülés) egy kereskedelemben beszerezhető Bíodex által gyártott készletet (Tec-Control Radiochrcaíatogzaphic Kit; lásd az 1. példát) határoztuk: meg. Általánosságban 1 pl tesztmintát viszünk fel két vagy három példányban egy mikropipettávnl és a Bíodex útmutatójának megfelelően^. A félbevágott csikókat radioaktivitásra mértük üvegcsövekben egy Isndata gamma-számlálót vagy egy Fackard Top Cunt szcintillácíós számlálót alkalmazva , ahogy lentebb leírjuk. A radioaktív jel beépülését úgy számoltuk ki, hogy a esik felső felében lévő radioaktivitás mennyiségét osztottuk a felsó és alsó félben található teljes radioaktivitással. Ezt az értéket százalékban fejeztük ki, és az átlagértéket meghatároztuk.

7. Az In2B8 és Y2B8 immunreaktivitásának meghatározása

Az immunreaktivitást tíndmo és munkatársai eljárását alkalmazva és az 1. példában fentebb leírt módon mértük.

8. Kőzvetien körési mérőéijárás az In2B8-hoz és az ¥2B8-hoz

Ugyanazokat az eljárásokat, melyeket itt leírtunk, alkalmaztuk a CDEO—pozit.ív SB sejtekhez való kötődés meghatározására az In2Bv-nál illetőleg az ¥2B8-nál. Az Xn2B8-t és az i2B8-t a fentebb leírt módon állítottuk elő és formula ztuk. A mérőéi járáshoz az Xn2B8 vagy Y2B8 mintákat assay higitási puffoméi (1XPBS, pH^7,2, mely 1% (tömeg/téri.} marha szérumalbumint (BSA) tártál— mázott) 40 ng/ml-re illetőleg 11 ng/ml-re hígítottuk.

Az antigén-pocitiv (SB) és antígén-negatív (HS3) sejteket 10% magzati borjúszérummal kiegészített RPMI 1640—ben tartottuk fenn

37*0-00 és 5% CO_2; tartalom mellett. A sejteket (90%-nál nagyobb életképesség tripán-kékes kizárással meghatározva) környezeti hőmérsékleten 0,5-2 X 10* sejt/ml sűrűségnél centri.fugálássál F13ÖÖ rpm egy Sorvall centrifugában): összegyűjtöttük, és kétszer 50 ml IX HBSS-sel mostuk. A pelletizált sejteket 50 X: 10* sejt/ml koncentrációig újra szuszpendáltuk 1% (tömeg/térfogat j marha szérumalbumint (BSA) és 10% (tömeg/térf.) mannitot tartalmazó előhűtött IX HBSS-beu (liofilizálő puffén). A sejtszcszpenziókat

1,5 ml-es, tömitőgyűrús polipropilén mikrofugacs0vek.be osztottuk szét 50 X 10* sejt/ml (koncentrációban (0,5 ml/cső) , és egy éjszakán át 30-50 mílitorr-nál liofilizáltuk.. A liofilizált sejteket szárítva tároltuk 2-8^öC-on, és steril vízben állítottuk helyre a mérőéijárásokhoz.

A liofilizált SB és HSB sejteket 1,5 ml-es polipropilén csővekben állítottuk helyre 50 X 10 sejt/ml koncentrációban, steril vizet használva. A hígított In2B8 vagy Y2B8-t a sejtekhez adtuk három példányban, és 45-60 percig függőleges dobkeverővei környez tét i hőmérsékleten kevertük. Az ínkubálás után a sejteket centrifugálással peíletizáltuk, és a sejthez kötött radioaktivitást a minták egy Isodata Gamma Számlálóban vagy egy Packard Top Couht szcintillációs számlálóban való mérésével a lentebb leírt módon meghatároztuk. A sejtekhez kötött radioaktivitást (B) úgy számoltuk ki, hogy kivontuk a nem kötött .radioaktivitást (felülúszó) a teljes hozzáadott radioaktivitásból. A teljes radioaktivitást a csövekben sejtek nélkül mért radioaktivitásból határoztuk meg» A százalékos kötődést a kötött értéknek teljes érték százalékában kifejezve számoltuk ki.

9. Radioaktivitás »érés

A radioaktivitás beépülés! mintákat 1 percig mértük egy Tsodata gamma-számlálót alkalmazva. A számlálót 100-500 ReV energiaablakokra állítottuk be, és a hátteret nullára állítottuk

s. ·Χ -V közvetlenül a .minták alkalmazása előtt In-t alkalmazva. Szintén az Isodata gamma-számlálót alkalmaztuk az ITLC csíkok számlátására, melyekre Ü-t cseppentettünk. A fékezési sugárzás kimutatására szolgáló energiaablakok 100-1000 Kék értékűek voltak.

Oh

A kötési mérőéi járásokhoz az Υ-mintákat 2 4 mérőhelyes lemezekre és MicroScint 40 koktélba vittük át, és egy üackard TopCount-ban számoltuk egy percen át minimum és maximum energiaibeállításokat használva. Indiám-[111) mintákat számoltunk 1 percen át Isödata gammaszámlálóva.l. A számlálót 100-500^ KéV energiaablakokra állítottuk be, és a hátteret közvetlenül az alkalmazás előtt nullára állítottuk be.

10. Az In2B8 és Ϊ2Β8 klinikai, dózisainak forgalombahczatali előírásai

A radioaktivitás beépülés és a CD20-pozitív sejtekhez való kötődés forgalombahözatali előírásait ügy állapítottuk meg, hogy az In2B8 és Y2B8 eindegyi kéből. hat dózist készítettünk klinikai minőségű 2B8-MX-DTFA két tételéből (0219 és 0220:. számú tételek) , melyeket a találmány szerint állítottunk elő, és GMP körülmények között töltöttük. A forgalombahözatali mérőéijárásokat· a fentebb leírt módon hajtottuk végre.

A. A CW-ersdeid <2B8

Áramláscs cltömetrlés analízist alkalmazva kimutattuk, hogy a CHö 2.B8 közvetlenül kötődik a Cü20-pozitív SB sejtekhez, anélkül, hegy a CD20-negativ ÜSS sejteket kötné {34. ábra), bem. ja

187 győztünk fel szignifikáns SB vagy H’3B .sejthez. való kötődést az irreleváns izotípusü <γ1κ1 antitestnél (SOO4) ..

A CHQ 2BB-nak a CD20-pozitiv sejtekhez való kötődését kompetíciós mérőeijárásokban értékeltük ki ORIGEN kérnilumineszcens kimutatási rendszert használva. Líofi Lizáit és helyreállított antigén-pcszitív 2B sejteket inkubáltunk az antigén növekvő mennyiségeivé!. rutén!ummal jelölt CHO 238 nyomkövető jelenlétében. Az eredmények azt mutatják, hogy a CHO 2B8 gátolja a CD..20-pozitiv sejtekhez való kötődést ugyanolyan mértékben, mint a üreges-szál bioreaktorokhól származó^: antitest (2B8-49) 35. ábra>. Az EC5G értékeket grafikusan és határoztuk meg, és Mnller eljárását (1980} használtuk az átlagos affinitás! értékek kiszámítására. Meghatároztuk, hogy a CHO 2B8 affinitása 1,3 X 10 X; az üreges szál biureaktorokból származó 2'88 antitest egy

2,5 X 10-*- M affinitási értéket adott. A nem specifikus kötés elhanyagolható volt, melyet az S004 irreleváns izotipusú antitesttel végzett, kompét toló hiánya igazolt.

B. A CSŐ-MK-PAPA jellessítés®

2B8 kcnjugatumot (2B8-MX-DTPA) készítettünk egy hasonló eljárással, mint amit a korábban jellemzett 2B8-49-nél alkalmaztunk. A reakciókat hozzávetőleg 3 ág antitestet és a 4:1 kelátor:antitest arányt alkalmazva hajtottuk végre. >. 2, 4, 3, és 24 órás inkubációs időket értékeltük ki, hogy meghatározzuk azokat a reakcióidőket, amik a CD20-pozitív sejtek kötésének elfogadható fennmaradását és magas radioaktivitás-beépülést eredményeznek a “'‘in-nel. A kompétitlv kötési görbék, melyek a 8-24 órán át reagál hatott CHO 2 δ 8-t hasonlították össze a CHO 2B8-MX-DTPA konjugátummal, azt jelezték, hogy a konjugációs el- járás n® változtatta meg jelentősen az antitest kötődését a CD20 antigénhez (36. ábra). Grafikusan meghatározott EC50 értékeket alkalmazva [38. ábra),· a konjugált és nem konjúgált antitestek affinitási konstansai 2,3 X 1O''⁰ M-tól 5,9 X M-ig változtak (40. táblázat).

A radioaktivitás-beépülés 95%-nál nagyobb volt a 8—24 órás konjugációs időnél (40. táblázat).

40. táblázat: A konjugációs reakcióidő hatása a CSŐ 2B8-MXDTPA radioaktivitásának beépülésére és aa ismunrsektxvitására

In k u b á ciós i d ó (óra)	í Radioaktxvmtas-beépu- kies (%)	(Affinitás (M) - ( 1 j
G	\|Nincs meghatározva	í — U*í (2,3 X 10	) ΐ
2	:ö η V 5 f -i	\|nIncs meghat.~va	] (
4	Qf( ts \| -2 *.· jr —	ΐ n 1 n c s me gh a t. - v a
8	9 6 , 1	ο Q χ :p'^!
17	í; : .··}> — í V Í , O	< -1 Λ j5,9 X lő ^JO	i
24	í q s $ ·: Z? xj _f xj	—1·................................................................. i # 4 A xO ____________

C. CW-eredstn já3S~M3f-ÍWA~Ml. sléállitott IaW és E2S» lemsése indíum-(1111-jelölt CHC· 2B8-MXDTPA-t (In2BS) állítottunk elő a korábban az üreges szál hioreaktor eredetű antitestre leirt kisméretű radioaktív jelölő készlet eljárás szerint (1. példa). Röviden, konjugált antitestet (CHG-eredetű 2B8-MX-DERA.; 0155A számú tétel) in kubait un k ^‘'dn-acetáttal a megjelölt pH-n 39 percig környezeti hőmérsékleten. A reákeibelegyet 7,5% (tomeg/térfogat) humán szérumaIbumint és 1 mM DTPA-t tartalmazó PBS-sel formuláztuk:. Az InlBS formnlázott mintáit radioaktivitás - be é p u lésre v i z s g á 11 u k 1 n s t a nt. v é k ο n y r é t e g kr óra a t o g r á f i á v a 1

9

Az In2BB kötődését a CDlö-pozítiv sejtekhez 1 io.fi 1. izéit és helyreállított Sfö sejteket alkalmazva határoztuk meg. Az összehasonlításhoz a hibridómatermelő antitestből (2B8-49) előállított, konjugátumot '““‘Xn-acetáttal inkubáltuk 30 percen át pH-4,2-n (a körülmények erre ez antitestre korábban határoztuk meg).

Kinetikai vizsgálatokat hajtottunk végre, hogy meghatározzuk a CD20-pozitív sejtek kötődésének maximális fennmaradását és a nagy radi oakt iv11á s-béépülést b1z tos í tó jeIölés í körü_: lmén yekét Hl- és 42. táblázat). .A konjugált antitestet (CHO-eredetü 2B8HX-DTPA) környezeti hőmérsékleten ⁱⁱ'¹’In~acetá-tta.l indukáltuk pH=4,2-n a megjelölt időkig (42. táblázat;.

41. táblázat.., In2B8 radioaktív jelölési kinetika. A pH hatása a radiöakta vitás-beépülésre és a C3d2Ó-pozitív sejtekhez való kötődésre

Reakció pH-ja	Radioaktivitás beépülés	Kötés (!)
3, 0	97,7	85,3
3,7	98,5	83,9
4,0	98,6	8 4,1
4,3	98,0	84,0
4,6	98,9	83,4
Kontroll Í2BB-49)	99, 3	86, 5

42. táblázat: Σ-2Β8 radioaktív jelölési kinetika: Az inkubációs idő hatása a. radioaktív jelölésre és a CD2ö-pczítiv sejtekhez való kötésre

Xnkubáui.ós	idő	Radioaktivitás beépülés (%)	Kötés (%j
pH-2,9	15	97,2	85, 3
	30	99,1	85, 2
	45	97,2	84,8

190

pH-4,β	........... .......... 15 \| 99,0	8'7,2
30	97,2	8 6, 8
45	99,4	96, 3
Kontroll	(288-49)	99,4 —~—_____________________________	87,8 .....

Az eredmények azt mutatják, hogy a 3,0-4,6 pH-tartományban és 3ü perces inkubációs időnél a rádióizotép 97%-nál nagyobb radioakzivítás-beépül ését értük él, míg a. kötés hozzávetőleg 34%-ba.n maradt meg. A. radioaktivitás beépülése és a kötési értékek nem változtak a reakciók 15-45 perces inkubációs időinél pH~2,9-4,βοή (42, táblázat). Az eredmények hasonlóak a 2'88-4'9 antitestet alkalmazva kapott eredményekhez (41, és 42. táblázat).

Ittrium-(90j-nel jelölt antitestet állítottunk elő úgy, hogy a kenjagáit antitestet (CHO-eredetű 2B8-MX-DTPA) ^S0Y-acetáttal iukubáltuk a megjelölt pH~n 5 percen át környezeti hőmérsékleten. A reakcíőelegyet 7,5% (tömeg/térfogat) humán szérumalbumint és 1 mi BTPA-t tartalmazó FBS-ben formuláztuk. Az Y2B8 formulázott mintáit radioaktivitás beépülésére mértük instant vékonyréteg kromatográfiát alkalmazva. Az Y2B8 kötődését a CD20-pozitív sejtekhez liofilízálz és helyreállított SS sejteket, alkalmazva határoztuk meg. Az összehasonlításhoz a hibrídómatermelő anti$<y testből (288-4 9) előállított konjugatnmet ’Y-aeetáttal in kubaiunk 5 percen át. pB^:::4, 2-n (a körülmények erre az antitestre korábban határoztuk meg).

Hasonló kinetikai vizsgálatokat hajtottunk végre, hogy meghatározzuk az *''Y-jelölt antitest (Y288) előállítását. A radioaktív jelölési reakcióknál 3,9-4,7 pH tartományban 5 perces inkubációs időnél a radioaktivitás beépülés 96%-nál nagyobb volt a CB20pozitív sejtek kötésének 80%-ná.l nagyobb megmaradásával. (43.

táblázat) . Hasonló eredményeket kaptunk a 3, S, és lö perces inkubációs időknél, 2,9-4,6 pH tartománynál (44. táblázat}. Ezután a kenj egált antitestet (CHö-exedetű 2B8-HX-DTPA) környeztet! hőmérsékleten ''ϊ-acetáttal inkubáltuk pH-4,2-n a megjelölt időkig (44. táblázat). Az. eredmények hasonlóak a 2B8-49 antitestet alkalmazva kapott eredményekhez(43. és 44. táblázat).

43. táblázat. Y2B8 radioaktív jelölési kinetika. A pH hatása a radioaktív beépülésre és a CD2G-pozitív sejtekhez veié kötődésre

Reakció pH-ja	Hadi cakt i vitás—beepu.l es	Köti és í % hí
3, 0	98,4	80,7
4,2	97,8	81,0
4,4	96,1	80,0
4 r;	q 7 n
		q v / a-
4,7	97 , 4:	80,6
K o.n troli (2B8 -4 9)	99, 3	82,6

42. táblázat: Y2BS radioaktív jelölési kinetika: Az ink-abáoiös idő hatása a radioaktív jelölésre és a CD20—pozitív sejtekhez való kötésre

Inkubációs idő (perc)	Radioak11vitás beépülés (%)	Kötés(%) )
pH—3,9	3	97,0	82,0 \|
5	98,9	.......................................J
10	99,3	Ί 82,3
pH—4,7'	3	97,2	82,5
5	96,7	81,8
10	97,6	81,5
Kontroll	(2B8-49)	99, 2	84,2

192

Az .ImunísaHivitást a CHO 2B8-böl előállított InlBS-nál és Y2B8~nál Lindmc és munkatársai eljárását, alkalmazva határoztuk meg. Frissen begyűjtött CD2ö-pozítív SB sejteket növekvő mennyiségben ínkubáltunk az fnz.BB vagy Í2BB rögzített mennyiségével antigén feleslegében.. A kötési adatok recíprok gráfíhonos analízise lehetővé tette az immunreaktívitások meghatározását, mely 80,6% volt az In2B8-nál és 72,2 % volt az Y2B8-nál. (37. és 38. ábrák) ..

D. Fox'ga.loxrbahuzatalí eldxrásök a CHO-eredetű IíüSS~n.aI és YŐBB-nál

Két tétel klinikai minőségű Tn2BS/¥2B8 radioaktív jelölési készletet alkalmaztunk arra, hogy az In2B8 és Y2B8 Mindegy! kéből hat tételt elkészítsünk. In2S8 és Y2B8-t állítottunk elő a jelenleg a klinikai kísérletekben alkalmazott radioaktív jelölési eljárások kisméretű változatait alkalmazva. A radi©aktívan, jelölt 2B8-MX-DTFA mindegyik tételét a radioaktivitás beépülésére és a CD20-pozítív (SB) és a CD20-negatív (HSB) sejtekhez való kötődésre vizsgáltuk. Ezeket az eredményeket a «5.. és 46. táblázatban· foglaljuk össze. Az In2B8 előállított hat tételénél a radioaktivitás beépülés 98, 9%-tői 99,3%-ig terjedt,: az átlag 9:9,1 %. A Cb2ö“pözítiv sejtekhez való kötődés 81,9%-tói 85,1%-ig terjedt, az átlag 83:,6% volt; a CD2G-negatív sejtekhez való kötődés 4%~nál kisebb volt. A hat előállított ¥2S8 tételnél a radioaktivitás beépülés :97,4%-tól 98,7%-ig terjedt, az átlag 98,2%volt. A CD2ü-pozitiv sejtekhez való kötődés 81,4%-tól 82,71-ig terjedt, az átlag 81, y % volt; a CB2D—negatív sejtekhez való kötődés 8%hál kisebb volt.

a radioaktivitás! jelölési készlet eljárást alkalmazva előállítstfc

CHO~éáédétű In2BS-nál

Kötés (%)

Fu	itatás	s z ain a	Badiöaktiu	itás beépülés (!) SB sejtek	HSB .sejtek
á	(0219.	tétel;		99,1 81,9	2,S
	00219.,	tétel)		99,3 8 3,2:	2,8
3\	(0219.	tétel)		99,2 8 3,6	3,7
	(0220.	tjét.1. 'í		99, 0 8 3,8	'>
C> Λ	(0220.	tétel)		98,9 84,1	2, 6
6..	(0220.	tétel)		98,9 85,1	a a . J f
			Átlag =	~ 99,1 % Atlag-33,6% Át	lag - 2,9%
			SD~	; A <rr\—í 3 -ji X·' γ <1. C< O 1'-J. y .1 )>	SD—0,4%
	46. tábláza t:	Kibocsátási mérőéijárási eredmények	a ra&sak-

tivitási x·:

:t alkalmazva előállátott CHO1<«U 1.£>: \ 12 J

$> X	u 11 a t a s	száma	Radioaktivitás
y	(0219.,	tétel)	98,
2.	.. (0219.	tétel)	98,
J.	(0219.	tétel)	98,
4	/0220	f* ctjé- £Zz ! \
~3 <	\ vA 4. V *	W A· i	a .< ,
<* C^J <.·	(0220.	tétel)	97,
6.	(0220.	tétel)	98,

i k<

Λ a:

/*· C·

SB sültek HSB

M <. jr

31, 'z u. _z η a ·”: π a Wk·' / X.' V

0, »*

1, 'ί;

3,4%

V.

lés

194

A klsnczott e^ kifejezett anti-CDlö egér meno-klonális .antitest (2B8) .fenntartja a CD2üpozitív humán sejtekkel szembeni spéciiitását, melyet FACS analízissel és kompetitív kötési mérőéi járás analízissel mutattunk ki. A humán T-sejtekhez való kötődés minimális volt. A humán CD20-pozitív sejteknél az antitest affinitást, meghatároztuk, az

1,3 X M volt egy kompetitáv kötési mérőeljárást alkalmazva. Ugyanezzel a mérőeljárással az üreges szál biureaktorokból szár- ~ j fY mazó 2B8 antitest egy 2,5 X 10 affínitásí értéket adott.

A CBG 2B8 antitestet MX-DTB A-val reagálhattuk, hogy egy konjugátumot, a 2BS-MX-DTPA-t hozzuk létre, míg az ímmunreaktivitás megfelelő fennmaradását megőrizzük.

Az optimális kelátképző beépülést, a radioaktivitás beépülés ^u'^AIn-nál végzett mérésével határoztuk mag, és nyolc órás környezeti hőmérsékleten történő inkubálás után értük el. A radioaktív jelölési eljárást a 2S8-MX-DTPA-nál optimalizáltuk a ^Y-nál vagy a ·^!·^ηΙ:η-πό1 a pH és az inkubációs idő tekint etében, hogy biztosi hsuk a. maximális radioakt i vitás beépülést és az immunreaktivitás fennmaradását..

Az InlSS és Y2B8 különböző készítményeinek eredményei, igazolták a radioaktív jelölési eljárás reprodukálhatóságát, abból a óéiból, hogy klinikai dózisokat állítsunk elő. Ezeknek a radioaktivitásí eredmények azt sugallják, hogy a forgalombahozatali. előírás a radioaktivitás-beépülésnél >901 és a kötődésnél >70%, liof'ilizált CDBO-pozitiv sejteket alkalmazva, összességében ezek az eredmények azt demonstrálják, hogy a CHO-eredetű 2B8 és az üreges szál-eredetű 2Β8-49 összevethető, és azt jelzik, hogy a

CHO—eredetű 2B8-MX-DTPA alkalmas a klinikai kísérletekben való alkalmazásra.

Végezetül a találmány egy jelölési eljárást, agy ügynevezett „mix-and-shoot eljárást ismertet a radioaktivan jeléit antitestek klinikai dózisainak előállítására, melyhez nincs szükség a jelenleg alkalmazott nagy teljesítményű folyadék. kromatográfiás ('M'PWj lépésre a nem fehérjéhez kötött radíoizctóp eltávolítására. Az egyszerűsített eljárás megszűnteti a fáradságos tisztítási lépést, míg fenntartja a rádióizotóp beépülés magas szintjét >95%) és az immunreaktivítás jobb fennmaradását eredményezi (>70%). A radiorzotóp recenziója és az immunreaktívitás alapján ügy találtuk, hogy a klinikailag formuláit radioaktivan jelölt konjugátum in ültre stabil, amikor 4ⁿC-on 48 órán át inkubáljuk. Továbbá á radioaktivan jelölt konjugátum stabil volt, amikor humán szérumban inkubáltuk 37^eC-on 72 órán át. A BALB/e egerekben végzett biológiai megoszlási vizsgálatok azt igazoltak, hogy nincs a megszokottól eltérő szöveti, lerakódás, és nincs jelentős felhalmozódás a csontban. A sugárzás abszorbeált dózisok becsült értékei egy „átlagos 79 kg-os embernél összevethetőek a bolyamaiban lévő, jelölt 2B8-MX-bTPA-vat alkalmazó klinikai kísérletben kapott értékekkel. Ezeknek a vizsgálatoknak az eredményei azt mutatják, hogy a „miz-and-shoot eljárást alkalmazva előál-

1. í t o 11 Y—na 1 j e 1 ö 11 2 B 8 -MX-DT PA ö s s z eh a s ón láthat ó a ha g yomá n y o s HP IC eljárást alkalmazva előállítottal. A klinikai minőségű radiöaktívan jelölt konjugátum scale-up eljárásának validációja azt mutatta., hogy a módszer reprodukálható, és hogy a. termék összehasonlítható azzal, melyet a jelenlegi ü.P'LC módszert alkalmazva állítanak elő. Ezeknek a preklinikai vizsgálatoknak az áredménvei

Claims

igémypcmWk

1. Eljárás egy kelátképzőhöz konjugált antitest ^mIrh«d való radioaktív jelölésére ahol cí) a kelátképzővel konjugált antitestet egy ^iUIn~t tartalmazó oldattal keverjük Össze és így egy elegyet képzőnk;

(í.í) az elegyat megfelelő hőmérsékleten kb. 30 percig inkubáljuk, amellyel egy radioaktivan jelzett antitestet állítunk elő, ahol a radioaktívon jelzett antitest rádióin korporációja 95 W-nál nagyobb; és

Ilii} a jelölt antitestet egy készítménypufferben megfeleled koncentrációra hígítjuk oly módon, hogy az a páciensnek a nem inkorporált ^mIn~ tói való további tisztítás nélkül közvetlenül beadható, ahol a készítménypoffer egy fiziológiás sóoidatpt, egy radioprptektánst és egy nem konjugáít kelátképzőt tartalmaz.
2... Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a keátképzőhöz konjugált antitest egy anti”CD20 antitestet tartalmaz.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, ahol az antl-CDZO antitest 2B8HMX-DTPA.
4. Az 1-3, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a ^mIh-t tartalmazó oldatot körülbelül 3-5-ös pH érékre állítjuk be, mielőtt a kelátképzőhőz konjugált a ntitestte I össze kevern én k.
5. A 4. Igénypont szerinti eljárás, ahol a pH-t egy alacsony fémtartalmú nátrium-acetát oldattal állítjuk be.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, ahol a nátriom-acetát oldat koncentrál o;a 10100Ö mM.
7. Az 1~6. Igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az alkalmazott ^Uiln mennyisége 4-8 mCi osztva a jelölés időpontjában lévő radioaktivitás koncentrációval.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, ahol az alkalmazott ^!iiIn mennyisága 5,5 mCi osztva a jelölés időpontjában lévő radioaktivitás-koncentrációval.

§. Α 0, igénypont szerinti eljárás, ahöl körülbelül 1 ml-nyl, 0,5-30 mg/ml koncentrációjú MX-DTPA konjugáit antitestet keverünk össze a ^mIn-t. tartalmazó oldattal·
10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a készltménypuffert olyan mennyiségben adjuk, amennyi ahhoz szükséges, hogy 10-50 ml végtérfegatot érjünk el,
11. A 10,. igénypont szerinti eljárás, ahol a radioprotektáns a humán szérum albumin (HSA), aszkorbát, aszkorbinsav, fenéi, szulfstok, gfetatíon, tisztein, gentizinsav, nikotinsav, aszkorbíl-palmitát, ΗΟΡ(:Ο)Η>. glicerin, nátrium formaldehid szulfoxilát, Na₂SzOs, Na^Oa vagy SO,.
12. A 11. Igénypont szerinti eljárás, ahol a radioprutektáns a HSA.
13,. A 12. igénypont szerinti eljárás, ahol a HSA koncentrációja 1*25 tömeg/térfogat %.
14. A 13. igénypont szerinti eljárás, ahol a HSA koncentrációja körülbelül 7,5 tömeg/térfegat %.
15. A 14, igénypont szerinti eljárás, ahol a radioprotektáns aszkorbát.
16. A 15. igénypont szerinti .eljárás,, ahol az aszkorbát koncentrációja 1-100 mg/ml.
17. A 16. igénypont szerinti eljárás, ahol a nem konjugáit kelátképző DTPA vagy EDTA,
18, A 17. igénypont szerinti eljárás, ahol a DTPA koncentrációja körülbelül