TWI294969B

TWI294969B -

Info

Publication number: TWI294969B
Application number: TW089103582A
Authority: TW
Inventors: Chinn Paul; Morena Ronald; Labarre Michael; E Leonard John
Original assignee: Biogen Idec Inc
Priority date: 1999-03-01
Filing date: 2000-03-01
Publication date: 2008-03-21
Also published as: RU2251110C2; WO2000052473A9; AU776747B2; HUP1300275A2; HK1045730A1; EP2112512A2; DK2112512T3; CY1116265T1; HRP20010714A2; BRPI0017596B8; NO20014245L; CA2742153A1; BRPI0017596A2; NO20100717L; ZA200106943B; PT2112512E; CN1235639C; JP4704570B2; PL352531A1; PT1192463E

Description

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發明背景 1 ·發明領域本發明是# Μ抗•體結合分析及玫治瘆柹浐麯知5心晉組’用於測試席f生抗體6¾床效力的經冷凍乾怿治瘩/酿你# 靶々卞製劑，試劑及策略，以麇/ ”、、員像腫瘤及腫瘤細胞。特古+ 於制7 σ之’本發明的套纟且可用 ;1備及評估經放射標誌之抗體、、表面ϋ Μ ㈣共輛物，經由對準Β細胞衣面抗原BP35(”CD20，，）可治療瘤。、夂*、、、頁像出B細胞淋巴 2 .技術背景 :中所有的刊物及專利案均以如同各個刊物或專利案個 =特異地且個別地納人本案中之相同程度般列為本案參考。少脊椎動物之免疫系統（如靈長類包括人類，猿猴，猴子等）由許多器官及細胞型式組成，其涉及於：可正確及特異地確認外來的微生物（”抗原”），侵入脊椎動物_宿主之微生物’了特異地結合至此外來微生物；及消滅/破壞此外來的 U生物。淋巴細胞，以及其他型式的細胞，為免疫系中具關鑑性的。淋巴細胞由胸腺，脾臟及骨髓（成年）所產生，且占人類（成年人）循環系中總白血球細胞的約3 〇 %。此中有二大類淋巴細胞亞群：T細胞及B細胞。τ細胞負責細胞調介之免疫力，而B細胞負責抗體的產製（體液免疫）。然而，T細胞及B細胞可視為互相依賴-在典型的免疫反應中，當T細胞受體與結合至抗原呈現細胞表面上之主要組織相容複合物（” MHC，，）之抗原片段結合時，T細胞可活 _62862-960914.DOC___- 4 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CfjS) A4規格(210X297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（2 ) 化；此活化作用可造成生物介體（”間白素，，）之釋出，其本質上可刺激B細胞以分化並產生抗體（免疫球蛋白）拮抗抗原。宿主内各B細胞可在其表面上表現不同的抗體，因此一 B 細胞可表現與一抗原特異的抗體，而另一 B細胞可表現與不同抗原特異的抗體。因此，B細胞十分多樣化，且此多樣性疋免疫系統中具關鑑性的。於人類，各B細胞可產生無數的抗體分子（即約1〇7至10”。當外來的抗原被中和時，此抗體之產製大多會停止（或實質上減少）。然而通常特殊B細胞之增殖會繼續不減退；此增殖作用會導致癌症，稱之為，，B 細胞淋巴瘤’’。 T細胞及B細胞均含有細胞表面蛋白質，其可充作分化及鑑定之”標誌”。如人類B細胞標誌之一是類B淋巴細胞-受制之分化抗原BP35，稱之為，，CD2〇，、在早期前0細胞發展中CD20可表現，並保持直到血漿細胞分化。特言之， CD20分子可調控活化過程中的一步驟，此為細胞循環開啟及分化所必要的，且在贅生（”腫瘤”）的B細胞上通常以極高程度表現。就定義而言，CD20可在，，正常的”B細胞及 π惡性"B細胞二者中出現，此惡性即其不減退的增殖可導致Β細胞淋巴瘤之Β細胞。因此，CD2〇表面抗原具有可充作候選者以”對準”B細胞淋巴瘤之潛力。本質上而s ’此對準標的可歸納如下：將與對B細胞 CD20表面抗原具特異性之抗體注入病人體内。這些抗_ CD20抗體可與正常及惡性B細胞上之CD2〇細胞表面抗原 _62862-960914.DOC 麵 5 - 本紙張尺度適用中國國家標準(Ciis) A4規槔(210X297公爱) 1294969 A7 _— —____B7________ 五、發明説明（3 ) (表面的）特異地結合；結合至Cd2〇表面抗原之抗-CD20抗體可導致贅生之B細胞之破壞及耗盡。另外，具有破壞腫瘤潛力之化學劑或放射活性標誌，可共軛至抗_ CD2〇抗體，如此作用物可特異地”遞送”至如贅生的B細胞。估不論其途彳至’主要的目的即是破壞腫瘤··特異的途徑可由所利用的特殊抗-CD20抗體所決定，且因此對準cd20抗原之可運用途徑可有相當的變化。例如，針對此種CD2〇表面抗原之對準，已有許多報告。鼠類單株抗體丨F 5 (抗_ CD2〇抗體）據傳統方式是採連續靜脈内輸注至B細胞淋巴瘤病人。極高量（>2克）的丨F 5，據報告之方式需先耗盡循環之腫瘤細胞，且結果描述成，，過渡的 Press et al.? "Monoclonal Antibody 1F5 (Anti-CD20) Serotherapy of Human B-Cell Cymphomas", Blood 69/2 ： 584-591 (1987)。此途徑，的潛在問題是非人類的單株抗體（如鼠類單株抗體）通常缺乏人類效應物功能，即其尤其無法調介補體依賴型的/谷解作用，或經由抗體依賴型細胞毒性或F c _受體調介之吞噬作用來溶解標的細胞。再者，非人類單株抗體可為人類宿主視為外來蛋白質；因此，重複注入此外來抗體可誘生免疫反應，而導致有害的過敏反應。對以鼠類為準之單株抗體，此常被稱為是人類抗·老鼠抗體反應，或，，hama，，反應。另外，這些”外來，，的抗體可為宿主的免疫系統所侵襲，如此其在到達其標的位置之前實際會被中和掉。淋巴細胞及淋巴瘤細胞先天上對放射治療是敏感的。因 62862-960914.DOC _ β 本紙張尺度適用中國國家標準(Cf^s) Α4規格(21〇Χ297公羞) 1294969

，，基於許多理由可知，b細胞癌對放射性治療（RIT)而言是吸引人的標的：放射標誌抗體離子化輻射之局部發射，可在有或無標的抗原（wCD2〇)下於接近與抗原結合之抗體處殺死細胞；穿透性輻射，即々源，可排除在較大型或多重血管化腫瘤中不易趨近抗體等問題；且可減少所需之抗體總量。放射性核種射出放射活性粒子，其可損害細胞 DNA至細胞修復機制無法令細胞繼續生存之地步；因此，若標的細胞是腫瘤，則具放射活性之標誌可有益地殺死腫瘤。放射標途、之抗體，就定義而言包括放射活性物質之使用，其針對病人（即，可能的骨髓移植）以及提供健康看護者（即當以放射活性來進行時需高度小心）有小心之必要性。因此，改進鼠類單株抗體之能力以達成B細胞失調症之治療，其方式可將放射活性標誌共軛至抗體，如此標誌或毒素了集中’在腫瘤位置。毒素（即化療劑，如或放射線素C)也已共軛至抗體。如見，PcT發表之申請案w〇 92/07466(於1992年5月14日公告）。 ’’嵌合體’’抗體，即含有來自二種以上不同種類（如老鼠及人類）之部份之抗體，已發展成”共軛”抗體外另一類型。已生成老鼠/人類嵌合體抗體，且呈現親代老鼠抗體之結合特性’及與人類固定區有關之效應物功能。如具Cabilly et al.， U'S· Pat. 4,816,567 ; Shoemaker et al·, U.S. Pat· 4,978,745 ;Beavers et al·，U.S· Pat· 4,975,369 ;及 Boss et al，U.S.

Pat· 4，816，397，其均列為此中參考。大體上而言，這些嵌

62862-960914.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 1294969 五、發明説明（5 ) 合抗體之構築係自DNA中製備基因體基因庫，而DNA係萃取自既存之鼠類融合瘤。Nishimura et al. (1987) Cancer Research 47 : 999。再針對可變區基因對基因庫進行筛選，選自可呈現正確抗體片段重排型式之重及輕鏈。所選殖之可變區基因連接至表現載體内，其中含有適合的重或輕鏈人類固定區基因經選殖匣。嵌合基因再於所選定的細胞株中表現，通常是鼠類骨髓瘤細胞株。例如，Liu; A.Y·，et al·，’’Production of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Poteat Fc-Dependent Biologic Activity"，J. Immun. 139/10 : 3521 -3526( 1987)，描述一種直接拮抗CD20抗原的老鼠/人類嵌合抗體。也見，PCT案No· WO 88/04936。然而，在參考文獻中關於利用Liu的嵌合抗體來治療B細胞失調症方面，並無能力，效力或實行力上之資料可提供。應注意到，於試管内之功能分析（如補體依賴型溶解 (n CDC π);抗體依賴型細胞胞毒性（” ADCC ”）等）先天上即無法預知任何抗體在破壞或耗盡可表現特異抗原之標的細胞於活體内之能力。如見 Robinson，R.D.，et al.，，，Chimeric mouse-human anti-carcinoma antibodies that mediate different anti-tumor cell biological activities， MHum. 八肘比〇(1.1^1^€1〇111&3，2:84-93 (1991 )(具有未可測及之 ADCC活性之嵌合體老鼠-人類抗體）。因此，抗體的潛在治療效力，僅可經由活體内實驗真實地予以評估。至此，共有的申請案08/475,813 ，08/475,815及 _62862-960914.DOC _ 8 _ 本紙張尺度適用中國國家標準(Ci^rs) A4規格(210 X 297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（6 ) 08/478,967，在此已全文列為本案參考，揭示經放射標誌之抗-CD20共軛物，以在投予治療性抗體之前診斷地”顯像”出 B細胞淋巴瘤腫瘤。”Ιη2Β8π共軛物含有鼠類單株抗體， 2Β8，其與人類CD20抗原具特異性，並經由雙官能嵌合劑，即MX-DTPA(二乙三胺五醋酸），其含有1-異硫氰酸苄基-3-曱基-DTPA及1_甲基-3·異硫氰酸苄基-DTPA 1 : 1 之混合物，黏附至錮[111Κ11 hn)。銦-[111 ]被選為診斷用放射核種之原因是其可射出T輻射，且發現先前充作顯影劑使用。關於嵌合劑及嵌合劑共軛物方面的專利是技藝中已知的。例如，U.S· Pat. No. 4,831，175(Gansow)是有關多重取代之二乙三胺五醋酸嵌合物及含彼之蛋白質共軛物，及彼之製法。U.S. Pat. Nos. 5,099,069，5,246,692，5,286,850 及5，1245471 (〇&1^0\¥)也是有關多重取代的〇丁？八嵌合物。這些專利案已全文列為本案參考。在專利案 08/475,813，08/475,815 及 08/478,967 中用來促進嵌合之特異的雙官能嵌合劑，因對三價金屬具高親和力而被選用，且可用於高的腫瘤對非腫瘤比例，低的骨質吸收，及在標的位置上放射核種有更大的活體内滯留作用，即B -細胞淋巴瘤腫瘤位置。然而，技藝中已知的其他雙官能嵌合劑也有益於腫瘤治療。在 08/475,813，08/475,815 及 08/478,967 專利中也揭示可對準及破壞B細胞淋巴瘤及腫瘤細胞之經放射標誌之治療性抗體。特言之，Y2B8共軛物含有相同的抗-人類CD20鼠類 62862-960914.DQC - 9 -________ 本紙張尺度適用中國國家標準(Cfis) A4規格(210X 297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（單株抗體’經由相同的雙官能嵌合物黏附至紀_ [9 0](9ί)Υ)。此放射核種基於數個理由選用於治療中。9〇^ 64小時之半衰期已足以令抗體累積在腫瘤中，且和〗3 ^不同的，其是高能量的純/3源，在其衰退中並無附隨的7 = 射，範圍在100至1000細胞直徑。穿透輻射之最低量，可= 門診病人投予經9 G Υ -標諸之抗體。再者，於殺拭細胞時，經標諸抗體勿需中和，且局部的離子化輻射射出應對無標的抗原的鄰近腫瘤細胞是致死的。 ' 因為9GY放射核種利用相同的雙官能嵌合物分子Μχ_ DTPA黏附至2Β8抗體，Υ2Β8共軛物即具有如上述之相同優點，如放射核種在標的位置（腫瘤）上滯留時間增加。然而，和111 In不同的，由於缺少與之有關的γ輻射，因此其無法用於顯像目的。因此診斷性”顯像用”放射核種，如 11 hn，可在投予治療性嵌合物或經9標誌、之抗體之前及 /或之後，用來決定腫瘤之所在及相對尺寸，以減小腫瘤為目的。另外，以銦標誌之抗體可用於放射量測定評估方面。依據抗體欲求之用途，即作為診斷用或治療性試劑，其他放射標諸是技藝中已知的，且已應用於相似的目的。例如，已被應用於臨床診斷之放射核種包括：131 j，1 2 5 ；[， 123I，99Tc，67Ga，以及⑴比。抗體也已用各種放射核種標諸’以應用於標的免疫治療之可能用途（peirersz et ai. (1987) The use of monoclonal antibody conjugates for the diagnosis and treatment of cancer. Immunol. Cell. Biol. 65 ： -in -

DQC 本紙張尺度適用中國國家標準(C泣S) A4規格(210 X 297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（8 ) 111-125)。這些放射核種包括及186Re，以及9GY，及較少程度的199Au及67Cu。1-[131]也用於治療目的。 U.S. Pat. No. 5,460,785提出此種放射標誌名單，且已列為本案參考。如共有的專利案 08/475,813，08/475，81 5 及 08/478,967 中所報告的，投予經放射標誌之γ 2 B 8共軛物，以及未標誌之喪合抗體-CD20抗體，也有B細胞淋巴母細胞腫瘤之老鼠中’可造成腫瘤大量地減小。再者，此中報告的人類臨床試驗顯示，以嵌合體抗-CD20抗體灌注之淋巴瘤病人，其b 細胞會極大的耗盡。事實上，嵌合體2B 8近來已在 Rituxan®之名稱下被告知是國家第一個FDA·許可的抗癌甩單株抗體。因此，在治療B細胞淋巴瘤上，已至少有一個嵌合體抗-CD20抗體被證明具有治療效力。此外，U. S .申請案No· 08/475,813，已列為本案參考，揭示Rituxaii⑧，一種嵌合體抗_CD2〇，與銦標誌的或釔-標誌之鼠單株抗體之依序投藥。雖然用於這些綜合療法中之經放射標誌之抗體為鼠類抗體，以嵌合體抗-CD20初步治療足以耗盡B細胞族群，如此HAMA反應可減低，而可有助綜合療法及診斷療程。因此在此綜合免疫治療之環境中，鼠類抗體在充作診斷试劑上有特殊的利用價值。再者，於U · s ·專利案 08/475,813中顯示，在投予Rituxan®後給予治療有效劑量之經釔-標誌之抗·〇ϋ20抗體，足以（a)清除任何未被嵌合抗_ CD20抗體清除掉的留下的週邊血液b細胞；（b)耗盡淋巴結 62862-960914.DOC - 1 1 -__ 本紙張尺度適财Bl Η家鮮(CfiS) A4規格(21GX297公i) ： " ' A7 B7 1294969 五、發明説明（9 ) 中之良性B細胞；或（c )其他組織中良性B細胞之耗盡。因此，將放射標誌共軛至癌症治療用抗體，可提供一個可貴的臨床工具，其可用來評估此抗體潛在的治療效力，生成診斷用試劑以追腙治療過程，並想出額外的治療試劑，以用來加強嵌合抗體最初的殺死腫瘤能力。抗_ CD20 抗體在治療非霍金森氏淋巴瘤上已證知有效力，加上淋巴細胞對放射活性已知的敏感性，則此種治療性抗體成為商品化之套組型式將是高度有益的，由是其可容易地以放射標誌修飾，並直接投予至臨床定位下之病人。雖然完成抗體之放射標誌存在有許多方法及試劑，但在技藝中缺乏的是可將這些試劑置於臨床狀況下之合宜載體，此方式下使彼等在放射標誌顯著衰退之前，或由於放射標誌發生抗體顯著的破壞之前，可被容易地產生並投予至病人。缺乏此種合宜的方法可商品化此可貴的技術，可歸因於已知標諸策略不佳之納入效率，且在放射標誌步驟下需接續地進行管柱純化。此套組發展之延宕，有部份是歸因於先前對於純的商品化放射標誌缺乏可親性，而其係可在無需接續的純化下，用來產生有效的標誌產物。另外，此套組一般無法運用的可能原因是，確實缺乏抗體可應用於人類淋巴瘤之治療，如同Rituxan®所達到的許可或效力一般。例如，如U.S. Pat. 4,638,380中所討論的，在此已列為參考，針對放射性藥物為尋求臨床價值，在科學環境中大^ 上咸信其必需忍受長及沉悶的分離及純化過程。確實，將 62862-960914.DOC ___- 12 _ 本紙張尺度適财關家鮮_3) A4祕(21G χ 297公董） A7 ,B7 1294969 五、發明説明（未經結合之放射標誌、注入病人斯届人體内並非欲求的。放射標誌抗體在臨床狀況下額外纟φ ^卜半_ 只Γ純化步驟之需求是不可行的，特別

是對於無設備也無時間可1I J、、，电化其本身之治療劑之醫師而言。再者，經放射標誌之蛋白質先天上是不穩定的，特別是以放射分裂之同位素所標料，如9〇γ，其對於與之在近處黏附之抗體，黏附愈久造成傷害之傾向愈大。接著，此種放射分裂作用由於喪失放射標誌及/或與標的抗原之結合漸小，會造成治療劑不被信賴的效力，且直接針對變性蛋白質導致非欲求之免疫反應。在標誌及純化抗體無設備之下，醫師別無選擇只好訂購已標誌之治療抗體，或在相關之设備於非原處先行標誌，於標誌後再運送至該處以投予給病人。所有此種操作均使標誌及投藥間增加不少時間，由是使治療劑不穩定，且事實上使放射標誌套組在臨床定位中之科用價值減低。在發展抗體放射標諸套組上不成功的其他人士，應是太熟練以致未有抗體另外的純化步驟。例如，Cytogen近來著手參與一種商品化套組，以放射標誌直接相對於與腫瘤有關之糖蛋白TAG-72之鼠類單株抗體。然而，cytogen的抗體特別不易成為一種套組調和物，因為在貯存過程中其易發展生成一種微粒，而此微粒必須經由進一步過遽步驟被移去。再者，Cytogen的抗體因為HAMA反應之故，會在病人身上引起不良反應。其他已宣稱發展出放射標誌策略者，其易成為套組型 __62862-960914.DOC _- 13 本紙張尺度適用中國國家標準(C^S) A4規格(210 X 297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（11 ) 式，因為此中勿需另外的純化步驟。（Richardson et al. (1987) Optimization and batch production of DTPA-labeled antibody kits for routine use in 111 In immunoscintography. Nuc. Med. Commun. 8 ： 347-356 ; Chinol and Hnatowich (1987) Generator-produced yttrium-[90] for radioimmunotherapy. J· Nucl· Med. 28(9) : 1465-1470) 〇然而，此策略並無法達到本發明者利用此中所揭示之策略所達到之納入水平，其有至少9 5 %之納入效率。此納入程度有增加安全性之額外益處，因為低放射併入之結果，使得實質上未結合之標誌不會注入病人體内。本發明套組中所包括之策略，可使快速標誌成功，依標誌而定可在約半小時或少至5分鐘下達成。再者，本發明之套組策略有9 5 %以上之標誌效率，因而勿需進一步的純化。勿需進一步的純化，因而可保有放射標誌之半衰期及抗體之完，整性，用於其被標諸之治療目的。本發明揭示合宜的套組及方法，由是診斷及治療用抗體可被放射標誌之，並以可再現，可信賴及合宜的方式投予至病人。本發明之套組，可將放射標誌抗體之過程轉形為無爭論’無擔優之標準化過程，大大有助於病人之治療策略。本發明套組優於先前技藝之處在於有最適宜之變數，使得可決定標誌及投予治療劑或診斷劑，因而減低實用。由於此中所述之套組依據特定的標誌提供最佳之變數，因此針對特殊標幟所設計之套組用法也可將互相殘殺減至最低，有就是當針對特殊標誌使用不適宜套組時會發生之狀 62862-960914.DOC - 1 4 - 本紙張尺度適用中國國家襟準(CJJS) A4規格(210 X 297公釐） 1294969 A7 ___ B7 五、發明説明（12 ) 況。除了避免互相殘殺，接著也可提供最佳之標誌效率。再者，包括在各套組中之策略及無菌無熱原之組份，可使使用者有更友善之過程，因為省略了試劑消毒，熱原試驗及標誌後之純化過程。 3.發明要點本發明包括一種套組，可於投藥前放射標誌診斷用或治療用抗體，其中包括至少：（i)一個含有與嵌合體共軛之抗體之小瓶，（ii) 一個含有調和緩衝溶液之小瓶，以穩定化及投予此經放射標誌之抗體，及（iH)可於放射標誌抗體之操作指示，其中該小瓶組份以此劑量及濃度被提供，如此當其與具充份純度及活性之放射標誌依套組指示而混合時，於投予至病人前勿需進一步純化經標誌之抗體。再者，當依套組指示標誌'，且利用具有充份純度及活性之放射標誌時’此同位素納入程度可高達95%以上，甚至98%以上。包括在套組内之抗體最好是抗_ CD2〇抗體。抗體供應之型式使其可黏附至一個雙官能嵌合物。較好，抗體係共軛至MX-DTPA，但也可使用其他的嵌合物，如苯基-或苄基_ 共輛之DTPA，環己基-DTPA，EDTA衍生物及DOTA。依據本發明之嵌合劑可為任何的嵌合劑，其至少是雙官能的，即具有至少二個結合位置（至少一個位置是用於嵌合金屬離子，且至少一個位置用於偶合至蛋白質配體）。依據所使用之抗體，共輛的抗體通常以〇·5 - 3 0亳克/亳升之濃度供應’較好是2毫克/毫升。共軛抗體之容量依為得最佳標諸時所選擇之放射標誌所需之濃度及用量而定。然 62862-960914.DOC - 1 5 _ 本紙張尺度適用中國國家標準(C汾s) Α4規格(210 X 297公釐) '^

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而，共軛抗體以此容量及濃度供應，如此整個容量可利用無菌的注射器及無菌技術加至反應小瓶中。如此可有增加之再現性並易於使用。此中所揭示的套組，其所有的試劑均是無菌且無熱原的，且事先針對簡易性及速度特別設计’以直接由抗體射試到投藥。在應用某些標誌之下，標諸效率之測試並非必要的。 ^ 套組中特別有益的一個組份是調和緩衝溶液，其可穩定之以拮抗放射分解作用，並將經放射標誌之共軛抗體投予至病人。調和緩衝溶液是一種藥學上可接受之載劑，其不僅可充作標誌抗體之稀釋劑，也可充作投予用緩衝溶液。為投予治療性或診斷性抗體至病人，雖然可使用任何藥學上可接受之稀釋劑，然而仍以本發明之調和緩衝溶適合投予經放射標誌之抗體。

例如，本發明的調和緩衝溶液含有一種放射保護劑，如人類血清白蛋白（HSA)或抗壞血酸鹽，其可㈣所致之放射分解減至最低，及銦所致之放射分裂程度減少。其他，射保錢是技藝中已知的，且也可用於本發明之調和緩衝溶液中，即自由基清除劑（盼，亞硫酸鹽，穀胱甘肤胱胺酸，龍膽酸，菸鹼酸，棕櫚酸及抗壞血酸鹽， h〇p(:0)h2，甘油，甲駿次硫酸納，叫祕，N so2等）。 3 ^ 應注意到，雖然在調和緩衝溶液中經f應用放射保護來保護抗體使免於放射分裂，但也可將放射保護劑包括反應緩衝溶液中以達成進一步的保護。但此通常不預先

62862-960914.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CiJS) A4規格(210 X 297公 -16- 1294969

五、發明説明（14 程。秋而來進仃’因為有金屬之存在會干擾標誌過可被::：反Γ利用歲合樹脂來'，清潔掉"hsa，如此其也也可能必料。抗壞血酸鹽或其他放射保護劑、τ X處理，才可移去摻雜的金屬。有tc緩衝溶液也含有過量未共輛的嵌合物。納 “物之目的是其可用來清除病人體内任何非蛋貝之、、二…合的放射標誌，並達成放射標誌之排除，由是減少”覓骨性”同位辛 >、由疋 ^木反』位素如釔（γ)為病人骨質所吸收。例苴：套組之抗體共軛至DTPA嵌合物時，則過量的DTPA 或，、絲何嵌合物均可納人調和緩衝溶液之巾。調和緩衝 :液供應之容量，較好是可使整個内容物轉移至反應小瓶。如上文所討論的，因為確實的容量勿需要偵測及轉移，因此可使使用更容易及增加再現性。較佳的調和緩衝溶液含有磷酸鹽緩衝之生理食鹽水，人類血清白蛋白及DTPAe人類血清白蛋白的濃度較；介於約 1至25%(W/V)間，且較好是約7 5% (w/v)。DTpA之濃度較好約1 mM。抗壞血酸鹽也可以人類血清白蛋白自另/一二式來應用，且使用濃度通常是約1至1〇〇毫克/毫升。然而只要不危及病人安全，可使用更大範圍的濃度。放射標誌套組中之抗體，依據本發明方法，可容易地以首選之放射標誌經由雙官能嵌合物標誌之。為進一步簡化此方面，本發明套組也可包括含有緩衝溶液之小瓶以調整放射標誌溶液之pH值，以及無菌的玻璃反應小瓶，以進行標誌、及接下來將最終的放射標諸抗體再懸浮於調和緩衝溶

62862-960914.DOC -17- 本紙張尺度適用中國國家標準(CMS「A4規格(210 X 297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（15 ) 液中。1 0亳升之反應小瓶通常已足夠，但也可使用可容納 5 _ 2 0耄升之小瓶。緩衝溶液較好是低·金屬的醋酸納溶液，濃度由10-1000 mM，最好是50 mM。本發明的特異套組含有MX-DTPA共軛的抗體，238_ MX-DTPA。2B 8是一種抗- CD20抗體，一旦投予至淋巴瘤患者體内，可達成B細胞之耗盡。然而，精藝者顯而易見的，本發明之放射標誌套組可更臻完善以為其他抗_CD2〇抗體放射標誌之用，或為已共軛至DTPA或其他多價嵌合物之任何抗體之用。本發明之較佳套組可含有至少（丨）一種含有MX-DTPA共軛之2B8抗體之小瓶，或是在溶液中或經冷凍乾燥（需予以重組）；及（i i) 一種含有調和緩衝溶液之小瓶，用於將放射標誌抗體投予病人。較佳之套組也含有（丨Η) 用以調整同位素pH之緩衝溶液，及（iv)反應小瓶。另外，且較好的，緩衝溶液供應至反應小瓶内，由是可省去偵測及轉移緩衝溶液之步驟，並增加套組組份之簡易性，一致性及無菌程度。然而，也可檢視其他的具體實例，即緩衝溶液先加至同位素小瓶内，經緩衝之同位素再轉移至反應小瓶中。在此例子中，反應小瓶可以所要求之抗體容量來 i、應。另外，同位素/緩衝溶液小瓶可大些，以容納抗體共軛物之加入，即直揍加至供應者之小瓶内。此可省去反應小瓶之需。 ~ 如上所討論的，強調另一較佳的套組構型，由是反應小瓶本身含有所需量的共軛抗體（即於及9GY分別是i或 1 ·5笔升）。抗體可在緩衝溶液中供應，其依特異欲求的同 I 62862-960914.DOC ^ g ϋ張尺度適用中國國冢標準(Cfis) A4規格(210χ297公釐-—---- 1294969 A7 _— _ B7 五、發明説明（16 ) 位素有適合的放射標誌pH值（即U1ln pH3-6，9GY pH3_ 5) °依同位素而定可有不同的緩衝溶液（即於9〇γ採用醋酸納’於11 Un是檸檬酸鈉）。依欲標誌之結合配體本質，也可變化緩衝溶液組成及pH值（即標誌肽也可使用pH小於 3) °基本上，同位素再直接轉移至反應小瓶中，如調和緩衝溶液般。套組應用限制到二個轉移步驟可進一步增加再現性及簡易性，且可進一步減少套組組份操作中無菌程度受污染之機會。本發明之放射標誌套組可進一步含有放射標誌小瓶，或者放射標諸可自另一供應商處訂購。本發明較佳之放射標諸是lnIn氯化物及9〇γ氯化物於HC1，但所揭示之方法中並不限於這些同位素。其他已應用於顯像應用之放射性核種係技藝中已知的，即如U.S. pat· Nos. 4,634,586， 5,460,785及5,766,571中所揭示的，其已列為本案參考。在顯像B細胞腫瘤上，錮_ [丨丨丨]是特別有益的，而9 ο γ之θ源是特別有用的放射治療劑。然而，依用於抗體共軛之嵌合物而定’可使用適於這些或其他目的的放射標誌，如α 源。既已證知U.S·申請案No. 08/475,813中所揭示之綜合療程之效力，進一步的套組具體實例可包括另外的嵌合抗體小瓶，即Rituxan®，於投予經放射標誌之抗-CD20抗體之前或之後可再投予病人。當嵌合抗體在放射標誌抗體之前投予，則因反應鼠類抗· CD20抗體所發生之HAMA反應會顯著地減少，因而增加放射標誌之鼠類抗體之治療價值。再 62862-960914.DOC - 19 - -- 本紙張尺度適用中國國家標準(ci^S) A4規格(210X 297公釐） 1294969 A7 B7 五、發明説明（17 ^ §應用嵌合抗-CD20未清除循環中之B細胞時，以 _In -標誌抗體所完成之接續性診斷影像可更為清晰些。 ▲同樣报明顯的，診斷性放射標誌抗體及治療性放射標誌抗體，可一起被應用於綜合療程中。在此方面，診斷性抗體可在治療抗體之前或之後應用，以具象化治療前後之腫瘤大小。在此例子中，本發明套組可包括一個另外的，可月匕有色碼之緩衝溶液小瓶，依放射標誌抗體就特異放射標誌所要求之最佳pH值而特異地調和。此一系統可確保各標遠可彩用到適合的緩衝溶液，令醫師在放射標誌二種抗體時有如同購買二種套組般一樣地簡易。此一套組事實上是將二種放射標誌套組中的組份綜合成一組中。本發明放射標諸套組之組份，以適合的濃度及p Η值供應’如此在抗體投予前可容易地維持其無菌性，且對於額外緩衝溶液或介質之需求不多。然而，對精藝者顯而易見的’某些試劑是可無菌地製備，並在原位上測試其無菌度。因此’可依預算及消費者之喜好檢視本發明套組之變化。本發明之放射標誌套組可應用於放射標誌與嵌合物共轭之抗體方法中，以投予給病人。依據本發明，，此方法大體上包括： (i)將與共輛物共輛之抗體與含有放射標諸之溶液混合；（i i) 混合物培育在適當溫度下一段適量時間；及（iii)將經標誌之抗體稀釋在調和緩衝溶液中成適當濃度，如此經放射標誌之抗體可在勿需進一步純化下即直接投予給病人。 _62862-960914.DOC_ ___- 20 - 本紙張尺度適用中國國家標準(C校S) A4規格(210X 297公釐）

裝訂

A7 B7 1294969 五、發明説明（18 ) 較好此抗體是抗-CD20抗體，且特別的抗-CD20抗體可以是2B8。抗體可共軛至任何適合的嵌合物上，即MX-DTPA，CHX-DTPA，苯基-或爷基-DTPA，DOTA，EDTA 衍生物等，以MX-DTPA為較佳。達成抗體共軛之方法是技藝中已知的（Kozak et al. (1989) ; Mirzadeh et al. (1990)， Brachbiel et al. (1986)) o 本發明者頃發現，放射標誌與嵌合物共軛之抗體之方法運行的最佳狀況是其中含有放射標誌之溶液，其p Η值調整在約3.0及6.0之間，且在其與嵌合物共軛之抗體混合前較好在約4.2。調整ρΗ值以低金屬醋酸鈉之特佳，然而其他的緩衝溶液也可使用。醋酸鈉溶液較好介於約1 0及1000 mM之間，又較好是5 0 mM。當放射標誌是min氯化物，1 "In氯化物之容量在用來製成單一投予劑量時應該是約5.5 mCi除以標誌時放射活性之濃度。投予至病人時，^Ιη之典型診斷劑量約2-10 mCi。用於調整ρ Η值之醋酸鈉用量，依醋酸鈉濃度及同位素載劑溶液而定，因而十分廣泛。當醋酸鈉的濃度是50 mM，用來調整pH值之用量約ηιΙη氯化物用量的1.2倍，然也可使用較大量。應明白，醋酸鈉對HC1之比例十分重要，且醋酸鈉用量依緩衝溶液中HC1之含量及濃度而變化。濃度約2亳克/亳升之與嵌合物共軛之抗體，取約1毫升再與放射標誌醋酸鹽溶液混合，混合物培育約3 0分鐘，或是足以達到抗體最佳標誌之時間。此時間由約3 0秒至約6 0分鐘。再加入調和緩衝溶液，使達到約1 0亳升之最終總量。 62862-960914.DOC_ - 21 -___ 本紙張尺度適用中國國家標準(CSiS) Α4規格(210 X 297公釐） 1294969 A7 _______B7 五、發明説明（~ 標誌抗體之必要的最佳時間可依抗體而有所變化，也依特定放射標誌及特定共軛物而定。進行放射標誌時，使時門更臻元σ之基本因素在於欲標諸之試劑中嵌合物與抗體之比例例如，依放射標諸而定，後合物對抗體之比例必須足夠高，以致可達到治療有用之納入程度，如9〇_95%，但也不可過高而危及抗體之結才冓完整性或免疫反應性。此點需某些平衡過程，此在某些例子中會導致較低之共軛嵌合物程度及較長的標誌時間。例如，對2Β8及MX-DTPA而言，頃發現對9〇γ而言標誌可在5分鐘内完成，而對uiIn而言約3〇分鐘可達到欲求之放射併入程度，此僅有約丨丨/2至丨的嵌合物對抗體莫耳濃度比例。因此並沒有必要增加嵌合劑對抗體比例，因為可達到欲求之放射併入水平。再者，增加共軛嵌合物之量並無益處’因其為會影響抗體的免疫反應性。此變數可針對其他抗體，在實驗上決定，以設計如本發明中所述之套組。當放射標誌是9GY氯化物，用於製備單一投予劑量所需之〇Υ氣化物容量通常由1 〇至50 mCi，且較好約45 mCi，除以在標誌時之放射活性濃度。用於調整p Η值之醋酸鈉用里，依醋酸鈉濃度及同位素载劑濃度而定，且因此範圍很廣。當醋酸鈉濃度是50mM，且9❹γ是在5〇mM HCi中供應時，調整PH值所需之量通常是9〇γ氯化物用量的約12倍。在約2亳克/亳升濃度下約i.5亳升的嵌合物共軛抗體，再與經放射標誌、之醋酸鹽溶液混合，並培育約5分鐘，或足以達到抗體最佳標誌之充份時間。此時間可由約3 〇秒至約6 〇分 62862-960914.DOC - 22 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CiiS) A4规格(210X297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（2〇 ) 鐘。調和緩衝溶液之量係足以達到約1〇毫升最終總量。較好，利用此中所述之放射標誌套組來進行本發明之放射標誌方法。然而，精藝者應明白，較佳的組份及條件僅為實行本發明方法可接受之準則，且可有某程度的改變以更療70善。偏離這些較佳狀況但仍可完成本發明目的的條件，仍可視為是在本發明範圍之内。本發明的放射標誌套組也可添加有試劑，以供放射標誌後合宜地證實抗體之結合親和力。在此一例子中，本發明的套組也可用於投予抗體至病人前，決定經放射標誌抗體與其標的細胞結合之百分率。本發明者也發現，此中揭示之特殊結合分析套組，可用來測試任何抗體之親和力，而此通常是無法應用經純化之抗原。因此，結合分析組份也可以分別之套組出售。一般而言，結合分析法及放射標諸套組包括（丨）至少一個冷/東乾燥細胞小舨’其可表現可為套組中之抗體所確認之抗原；（ii) 一個含有與嵌合劑-共軛之抗體之小瓶；（in)一個含有調節缓衝溶液之小瓶，及（iv)放射標誌抗體之操作指示，如此經放射標誌之抗體可在勿需進一步純化下直接投予至病人。如上文對放射標誌套組之描述，套組也可包括含有缓衝溶液之小瓶，以調整放射標誌之p Η值，以及一個無菌的玻璃反應小瓶。較好緩衝溶液是低金屬的醋酸鈉溶液，濃度是介於約1 〇及1000 mM之間，且玻璃反應小瓶可容納至少5亳升之容量。抗體較好是抗_CD20抗體，且嵌合劑較好是Μ X - DTP A。其他的嵌合物也可如先前所述地使 62862-960914.DOC _ 23 ____. _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CiJS) A4規格(210 X 297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（21 ) 用。較佳之共軛抗體是2B8-MX-DTPA，雖然任何與嵌合物共軛之抗體均可標誌，並可評估其親和力。調和緩衝溶液是磷酸鹽缓衝之食鹽水，並如上述含有放射保護劑及未共軛之嵌合物，且放射標誌可或可不包括在内，且較好是 ηιΙη氯化物或9GY氯化物。依嵌合物而定也可使用其他的放射標諸。在結合分析/放射標誌套組及如上述放射標誌套組間之差異是其中納有抗原-陽性細胞充作受質標的以測試抗體親和力。當抗原是CD20，則較佳之CD20-陽性細胞是SB細胞 (ATCC # CCL 120)，但可使用任何的CD20-陽性細胞。結合分析法及放射標誌套組可進一步含有抗原-陰性細胞以充作陰性對照組。較佳的CD20-陰性細胞是HSB細胞（ATCC # CCC 120.1)，但也可使用任何CD20-陰性細胞。當然，綜合的放射標誌及結合分析套組可進一步含有嵌合的抗-CD20抗體，並加上欲標誌之抗體以達成綜合療程目的’或可在診斷顯像之前清除周邊B細胞。此不同的抗體較好是Rituxan®，但也可以是可實行腫瘤細胞殺拭之任何抗體。事實上，二種不同型式的抗體可組合在一個套組中，即直接相對於二種不同B細胞抗原之抗體，只要綜合的療程可對準相同型式的細胞，即B細胞淋巴瘤。就如同套組中之組份可用來標誌其他抗體，依標的抗原而定，也可製備其他測試抗體親和力的細胞。然而，就抗_ CD20抗體而言，本發明的結合分析法及放射標誌套組特別適於商品化定位，因標的細胞係以冷凍乾燥型式提供。此 62862-960914.DOC _- 24 - _ 本紙張尺度適用中國國家標準(Cfis) A4規格(210X 297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（22 ) 可使抗體簡易及系統性處理之效力被證實，並否定為維持組織培養設備所涉及之爭論及花費。經冷祕燥的細胞通常分裝供應，依據本發明每個小瓶有〇 5及5〇() X 1〇6細胞之間。也可能特殊的設備較喜訂購已放射標誌之抗體，在此例中此没備欲求結合分析試劑，以確保抗體保有標的親和力。在此例中，本發明也提供結合分析套組，以決定經放射標誌抗體與其標的細胞之百分結合率。此套組包括至少一個固定的及/或經冷凍乾燥的抗原_陽性細胞小瓶，且可視所需含有抗原·陰性細胞，如上述可用於結合分析及放射才示遠套組。再者，很明顯的此套組之變化型式可包括有未經標誌之對照抗體，以經由競爭分析法來證實消費者抗體之結合特異性。再次地，當抗原是CD20時，CD20-陽性細胞較好是SB細胞（ATCC # CCL 120)，且CD2〇_陰性細胞較好是hsb細胞 (ATCC # CCL 120.1)，其以冷凍乾燥型式供應，在〇.5及5〇 X 106細胞間分裝。在此例子中，抗體較好是2Β82Μχ_ 〇丁卩入共軛物，標以111111或9()丫。基於此中所揭示的額外的套組具體實例，應強調本發明放射標諸套組及方法的優點之一是勿需再進一步的純化步驟’且經放射標諸之抗體可直接投予至病人，因而節省寶貴的時間並增加抗體穩定性。因此，要強調的是，雖然在投藥前希望醫師可測試或證實經放射標誌抗體之結合特異性及親和力，但是若抗體穩定性及放射分裂之抑制i特別 __e2862-96Q914.DOC_____- 25 - 本紙張尺度適用中國國家標準(C负S) A4規格(210X297公釐） 1294969

=心的時’即如利用m試驗可能會放棄特殊的同及套組具體實狀提供，由是可測試結合親和力，本發明者決不建議此測試在本發明方法或套组中是絕對必要的。測試此抗體效力之選擇僅就醫師之選擇而定。、本發二者也發現，用於製備可用於本發明結合分析套組 :之固定的及經冷;東乾燥細胞之方法，特別適於製備供商品化套組之細胞。在冷凍乾燥之前細胞可固定之以改善結構/穩定性。特言之，本發明之細胞當用於抗體結合；：時，可證知有高的再現性。特言之，本發明包括製備經冷凍乾燥細胞之方法，此方法包括··（i)以離心回收每毫升〇·5_2χ1〇6細胞之細胞密度下之細胞，（ii)以平衡的鹽溶液洗滌細胞至少一次，即 HBSS ; (iii)將成團塊的細胞再懸浮於冷凍乾燥緩衝溶液中，包括平衡的鹽溶液，其含有載劑蛋白質及至少某一型式的糖；（iv)將一份再懸浮的細胞分裝至微量微心管或玻璃小瓶中；及（v)冷凍乾燥細胞12_96小時以上，較好在約 30-60亳托下24_72小時。方法特別適用於製備冷凍乾燥的細胞，其中該細胞是SB細胞（ATCC#CCL 12〇)或hsb細胞 (ATCC # CCL 120.1)，但似乎也可應用至其他細胞型式。較好，緩衝溶液中含有牛血清白蛋白為載劑蛋白質，濃度為ly❻（w/v)，及含有甘露醇濃度為10%。然而，想像得到其他的载劑蛋白質，即HSA，及其他的糖類也可使用。細胞以約1300 rpm之速度離心回收，並加入hbSS鹽溶液 fi7afi2=〇e〇fll4-DQ£l—____________ ________ 本紙張尺度適用中國國家標準(CSS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 1294969 五、發明説明（24 ) (Hank的平衡鹽溶液）。細胞再懸浮的濃度是每毫升5 〇 X丨〇6 細胞。然而，對於精藝者顯而易見的，在未顯著危及細胞存活下，上述的條件可些微修飾。再者，上述的條件可添加額外的步驟，以使較大量細胞之處理更臻完善，如切線方向之流動透析過濾以將細胞交換至冷凍乾燥緩衝溶液中〇本發明的結合分析套組可應用於分析中，以評估經放射標誌、抗體之結合親和力。此一分析法也為本發明之主題。決定經放射標誌抗體與其標的細胞結合百分率之結合分析法’包括大體上下列步驟··（ i)混合至少一份經放射標誌抗體與至少一份抗原陽性細胞；（Π)混合至少一份經放射標誌抗體（與上（i)步驟中的相同）與至少一份稀釋缓衝溶液（容量和上（i)之抗原-陽性細胞相同）作為對照組；（iH)以離心使細胞成團塊；（iv)偵測在成團塊細胞及對照組上清液中之放射活性；及（v)將細胞上清液中之放射活性與對照組中之放射活性做比較。就如同本發明之放射標誌套組視所需含有1 11 Iri氯化物或 90Y氯化物，本發明之結合分析法通常以標誌之抗體來進行。當111 In是放射標誌時，可利用7計數器來偵測分析管中之放射活性。當9〇γ是標誌時，利用液體閃爍計數器來偵測放射活性，但r計數器也可使用。關於本發明之結合分析法，較隹的抗體是抗-CD2〇抗體’而抗-CD20抗體較好是2B8，其中2B8抗體利用本發明之放射標誌套組標誌之。然而，任何放射標誌抗體均可測 nnr. 本紙張尺度適用中國國家標準(CSS) A4規格(210 X 297公釐) 1294969 __________B7 五、發明説明（25 ) 式八要細胞表現特定抗原是可運用的。當CD20是抗原，則進行刀析之較佳細胞是SB細胞（ATCC # ccl 12〇)，然而分析也可更臻完善，並以任何放射標諸抗體及適合的標的細胞來進行。用於分析中之稀釋緩衝溶液應可維持抗體之結合，及生理性緩衝溶液可能含有如BSa之載劑蛋白質，以將與細胞之非特異結合減至最小。雖然有稀釋緩衝溶液之試管可充作對照組，但在分析中也可利用抗原_陰性細胞充作進一步的對照組。在此例子中，結合分析法中進一步包括以下步驟·（1)混合至少一份的經標誌抗體與至少一份的抗原-陰 I*生細胞，（U)以離心使抗原_陰性細胞成團塊，（iv)偵測抗原-陰性之成團塊細胞上清液中之放射活性；及⑺比較抗原:陰性細胞上清液中之放射活性及抗原-陽性細胞上清液 ,Ί、、、、卫之放射活性。比較於此管中所得之放射活性與稀釋緩衝溶液對照組之放射活性，可用以偵測與抗原陽性細，非特異結合之量。tcD20是抗原時，且闇陽性細胞疋B、田胞則CD20陰性細胞較好是HSB|_ TCC # ccL 120.1) 〇如上述’本發明之冷;東乾燥細胞可對測試經放射標鍵抗合效力’提供-個“’有效且可再現之標準。因 ^ ’本發明的結合分析法較㈣用包括在本發明結合分析、，中之冷隸燥細胞來進行。此外，本發明的放射標諸 ^析法可組合以本發明之結合分析法，其中抗體先以如本發明所述之標結嵌合物共輛抗體之方法標結之。最好，本

1294969 at B7 五、發明説明（26 ) 發明之結合分析法利用此中所述的結合分析及放射標誌套組之一進行。

裝此中可有某些情況’其中抗體之親和力應予以測試或證實’但放射標諸未黏附上。例如，在某些狀況下，即解決紛爭，可在放射標諸前有益地測試抗體之結合親和力。在此例中，本發明也包括競爭性結合分析法，以評估受試抗體與標的細胞之親和力，此方法包括（i)製備以釕-標誌之對照抗體，利用與相同抗原特異之已知抗體；（ii)培育增量之受試抗體及增量的未標誌對照組抗體與固定濃度之標的細胞及痕量的以釕-標誌之抗體，其中受試抗體各分別濃度及對照抗體各分別濃度’係分別在個別試管中；（丨丨丨）依據相對電化螢光（ECL)利用ORIGEN設備，決定各反應試管中之結合量；及（iv)估算出受試抗體之平均親和力值。平均親和力值可依 Muller 的方法（J· immunological Methods (1980) 34 : 345 )或其他任何適合方法，估算自EC50值及痕畺抗體之已知濃度。應注意，此分析也可用來測試經放射標諸抗體之親和力，或任何以抗原無法純化之抗體，及作為抗原來源所需之細胞。本發明經固定且冷凍乾燥的細胞也可充作標的細胞。當進行本發明之競爭結合分析法以測試抗_ CD2〇抗體親和力時，對照用抗體可以是2B8，或其他任何未共軛之抗_ CD20仏體。對照用抗體可以是與嵌合物共輛之抗體。受試抗體也可以是與嵌合物共軛之對照抗體。另外，受試抗體可為另外的抗- CD20抗體，其與CD20的結合親和力與2B 8 62862-960914.DOC - 29 - 本紙張尺度適用中國Η家標準(C_ A4W(21GX297公ϊ) " 12949驗089103582號專利申請案 96.仏2 ft修正中文說明書替換頁(96年11月) 会;年男^補充五、發明説明（27 )

比較下十分令人感興趣。然而，分析可依其他特異性抗體使適用，只要有適合的標的細胞可運用即可。在本發明之競爭結合分析中，較佳的標的細胞是CD20-陽性細胞，較好是SB細胞（ATCC # CCL 120)，又更好是依本發明方法製備之再懸浮的冷凍乾燥S b細胞。也可使用利用其他方法冷凍乾燥之細胞或固定的細胞。以釕·標誌之抗體’其製備方法包括將對照抗體與釕（11)叁·雙嘧啶嵌合物之N-經基琥轴醯亞胺酯（TAG-NHS)共培育，然而也可檢視其他已知之標誌抗體方法。於標誌時，對照抗體及tag -NHS較好培育約1 : 15莫耳濃度比例。本發明的這些及其他方面參考以下圖片，實例及說明也更清楚明瞭。 4.附圖說明圖1在放射免疫分析法中利用I25〗·標誌之B 1行直接競爭作用，比較天然2B8與商品化抗_Cd20抗體Bl(Coulter) 及Leu 16(Becton Dickinson)之免疫反應性。在v&P過濾盤各孔洞中’加入抗原-陽性之S b細胞（丨〇〇,〇〇〇) ; 1 〇毫微克的經放射標諸的B 1，與各種濃度之未標誌競爭物混合，混合物再加至細胞中。抗體與細胞在環境溫度下培育1小時；進行三次數值之決定分析。接下來，孔洞洗滌，乾燥再決疋黏附在濾膜上之放射活性。所示出之數據係經背景放射活性校正過的，且為三次決定值之平均值。圖2表2B8與存在於人類B•細胞上之CD2〇抗原結合之 FACS分析。利用FACS分析增量之未共軛2B8與人類田胞（SB)之結合。利用商品化之抗_CD2〇單株抗體（B1)及二種不相關的同型抗體進行比較。以山羊抗-老鼠I g G _ fitc F(ab)’2為第二試劑。結果顯示，2B8與CD2〇抗原具特異

62862-961120.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公爱) 129496® _i〇3582號專利申請案中文說明書替換頁(96年11月）五、發明説明（28 ) A7 B7 年月曰補充性’且其呈現之結合力大於B 1。圖3表2B8結合至B-細胞之Scatchard分析。人類b_細胞 (SB)與增量的my票誌的2B8共培育。三組樣品培育卜】、時，而於過濾收集細胞後決定與細胞結合之放射活性。 Scatchard分析顯示4·3χ1(Γ9Μ表觀的親和力常數。圖4^表以未標記之Bi，2Β8及MX_DTp共軛之2Β8對放射標記之Β 1抗-C D 2 0 M ab之抑制作用。天然的2 Β 8， 2B8_MX-DTPA及Β1之免疫反應性。…抗體如上方法一段中所述地放射標誌。1 〇亳微克經放射標誌之B丨與增量競爭物混合，再將混合物加至v&p濾盤之孔洞中，其^各孔洞含有100,000抗原·陽性之SB細胞；所有的決定^進行三次。在環境溫度下培育丨小時，再充份洗滌孔洞。接下來丁將濾膜乾煉，再以r計數決定相關之放射活性；所有數值均以背景校正之。所示出之數值為三次決定之平均值。圖5表在及30°C下培育期間2B8之免疫反應性。抗體 2B8以10毫克/毫升之終濃度調和在生理食鹽水或含有1〇 mM甘胺酸-HC1，PH 6.8之生理食鹽水中。樣品一組兩份置於有螺蓋之小瓶中，小瓶内充入氮氣再加蓋。樣品再於4 C或3 0 C下培育1 2週；每週評估樣品之免疫反應性。在i 2 週之研究中，以任何的2B 8樣品未見免疫反應性之喪失。示出第1週（圖5A)，6週（圖5B)及12週（圖5C)之免疫反應性。 # 圖6表111 In -標記之2 B 8 - MX - DTPA與C D 2 0陽性人類細胞之結合。以"hn-標誌之2B8-MX-DTPA與含有50毫克/ 毫升人類血清白蛋白（48小時培育）之PBS (pH 7.4)培育後，行結合分析以決定免疫反應性。圖6 a )，固定量之經放射標諸抗體（5毫微克/亳升）與增量的s b細胞（2 0 X 1 0 6細

62862-961120.DOC -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)

裝訂； m

12949關〇89i〇3582號專利申請案中文說明書替換頁(96年11月）五、發明説明（29 ) 胞/亳升）培育。結合至細胞之放射活性量（cpm)對加入之細胞懸液量作圖。圖6 B)總放射活性對結合之放射活性 (AT/B )作圖。線性外插可計算出y -截矩（0.997)。y -截矩之倒數乘以100可得在不定抗原過量下100%之免疫反應性數值。圖7表90Y-標記之2B8-MX-DTPA於含有人類血清白蛋白及DTP Α之PBS中之試管内穩定性。經90 Υ-標誌之π 8 _ MX-DTPA在4°C下於含有75毫克/毫升人類血清白蛋白及1 mM DTPA之PBS中培育，由SDS-PAGE分析中得放射自顯圖。在所指示之時間下，樣品在非-還原條件下，變性條件下（SDS)，於4-20% Tris-甘胺酸凝膠上電泳。樣品以5微升（1，2列），10微升（5，6列）填加。凝膠在環境溫度下曝於X-射線底片下約15分鐘，並照相。圖8表90Y-標記之2B8-MX-DTPA在含有人類血清白蛋白及DTPA之PBS中之試管内穩定性。經90γ_標誌之2B8- MX-DTPA在4°C下於PBS中（pH 7.4)(含有75亳克/毫升人類血清白蛋白及1 mM DTPA)培育後行SDS-PAGE分析，所得之零時放射自顯圖再行密度分析。樣品利用非還原條件，在4-20% Tris-甘胺酸凝膠上電泳。樣品填加的量是$ 微升，1 0微升及2 0微升，二個孔洞一組。凝膠在環境溫度下曝於X -射線底片約1 5分鐘，且孔洞之一利用密度計掃描。經放射標誌之共軛物峰（#2)之相對面積是96.2%。圖9表90Y-標記之2B8-MX-DTPA在含有人類血清白蛋白及D Τ Ρ Α之P B S中之试管内穩定性。經9 0 γ -標誌、之2 β § _ MX-DTPA在4°C之PBS中培育（含有75毫克/亳升人類血清白蛋白及1 mM DTPA，pH 7.4)，其SDS-PAGE分析後所得之4 8小時放射自顯圖再行密度掃描。樣品在非還原條件

62862-961120.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐）裝訂 32- 12949觸〇89ι〇3582號專利申請案中文說明書替換頁(96年11月）五、發明説明（3〇 ) 日下，於4-2 0% Tris-甘胺酸凝膠上電泳。樣品填加量是5微升，1 〇微升及20微升，每二個孔洞一組。凝膠在環境溫度下曝於X-射線底片下約1 5分鐘，再利用密度計掃描一列。經放射標誌之共軛物峰（#2)相對面積是95 5%。圖10表11 hn-標記之2B8-MX-DTPA在含有人類血清白蛋白之PBS中之試管内穩定性。經ιηΙη-標誌之2Β8_Μχ_ DTPA在4°C之PBS中（ΡΗ 7·4)培育（含有50毫克/毫升人類血清白蛋白）其SDS_PAGE分析後所得之放射自顯圖。在所 =時間下，樣品利用非還原條件，在4_2〇% Tris_#胺酸凝膠上電泳。樣品填加量是5微升（丨，2列），丨〇微升㈠，4列）及2 0微升（5，6列）。凝膠在環境溫度下曝於^射線底片上約15分鐘，再照相。（註：利用加強之遮蔽板可得48小時放射自顯$，可生成較零時放射自顯圖更強之訊號）。圖1 1表luIn-標記之2B8-MX-DTPA在含有人類血清白蛋白之P B S中之試管内穩定性。經111 In -標誌之2 Β 8 · M X _ DTPA在4°C下與PBS (pH 7.4)共培育（含有50亳克/亳升人類血π白蛋白）其SDS-PAGE分析所得再行零時放射自顯圖之猎度掃描。樣品在非還原條件下，在4·2〇% Tris_甘胺酸减膠上電泳。樣品填加量是5微升，丨〇微升及2 〇微升，每一孔洞一組。凝膠在環境溫度下曝於射線底片約丨5分鐘，再以密度計掃描一列。經放射標誌之共軛物峰（#3)之相對面積是95.9%。圖12表"lln-標記之2B8_MX_DTPA在含有人類血清白蛋白之PBS中之試管内穩定性。經ιιιΙη-標誌之2Β8_Μχ· DT、PA ’在4°C下於PBS (pH 7·4)中培育（含有50毫克/亳升人，血清白蛋白）其SDS_PAGE分析之48小時放射自顯圖再行#度掃描。樣品在非還原條件下，在4_2〇% Tris_甘胺酸 62862-961120.DOC 〇〇 -<53 - 本紙張尺;ΐ適财s岭標準(c_ A4規格(_ 297公着) 修正

_補免; A7 B7 129496翁089103582號專利申請案中文說明書替換頁(96年11月）五、發明説明（31 ) 凝膠上電泳。樣品填加之量是5微升，1 0微升及2 0微升，每二孔洞一組。凝膠在環境溫度下曝於X-射線底片下約1 5 刀鐘’再以密度計掃描一列。經放射標誌、之共輛物峰相對面積是97.0% (#2，3及4峰之組合面積）。圖13表90γ·標記之2B8-MX_DTPA在人類血清中培育下之试管内穩定性。經9〇γ·標誌之2B8_Mx_dtpa，在37X：之人類A清中培育，其sDS-PAGE分析所得之放射自顯圖。在所示時間下’樣品利用非還原條件，在4 · 2 0 % Tris -甘胺酸凝膠上電泳。樣品填加之量是5微升（丨，2列），1 〇微升 (3 ’ 4列）及20徵升（5，6列）。凝膠在環境溫度下曝於χ —射線底片下約1 5分鐘，再照相。圖1 4表90 γ·標記之2b 8-MX-DTPA在人類血清中培育下之试官内穩定性。經90丫_標誌之2^8-]\4又-0丁？人，在37。0 之人類血清中培育，其SDS-PAGE分析所得之零時放射自顯圖搶度掃描。樣品在非還原條件下，於4 - 2 〇 % Tris _甘胺酸凝膠上電泳。樣品填加量是5微升，1 〇微升及2 〇微升，每一孔洞一組。凝膠在環境溫度下曝於χ_射線底片約15分鐘，再以密度計掃描一列。放射標誌之共軛物峰之相對面積是97.9%。圖15表90Υ·標記之2B8_MX_DTpA在人類血清中培育下之试f内穩定性。經9〇γ_標誌之2b 8-MX-DTPA，在3 7 °C 之人類血清中培育，其SDS-PAGE分析後之98小時放射自顯1再行密度掃描。樣品在非還原條件下，於4_2〇% Tris_ 甘胺，凝膠上電泳。樣品填加量是5微升，1 〇微升及2 0微升’ ^二孔洞一組。凝膠在環境溫度下曝於X-射線底片下約15分鐘’其中一列再利用密度計掃描。經放射標誌共軛物峰（#2)之相對面積是94 7〇/〇。 -34-

62862-961120.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 129496# 089103582號專利申請案中文說明書替換頁(96年11月）五、發明説明（32 ) A7 B7 修正補充月曰圖16表ulIn-標記之2B8-MX-DTPA在含有人類血清白蛋白之PBS中之試管内穩定性。經標誌之2B8-MX-DTPA，在37°C之人類血清中培育，其SDS-PAGE分析之放射自顯圖。在所指示之時間下，樣品利用非還原條件，在 4-2 0% Tris-甘胺酸凝膠上電泳。樣品填加量是5微升（1， 2列），10微升（3，4列）及20微升（5，6列）。凝膠在環境溫度下曝於X -射線底片下約1 6 - 2 0小時，並照相之。圖17表"hn-標記之2B8-MX-DTPA在含有人類血清白蛋白之PB S中之試管内穩定性。經11 標誌之2b 8-MX-DTPA，在3 7°C之人類血清中培育，其SDS_PAGE*析之零時放射自顯圖再行密度掃描。樣品在非還原條件下，於4 _ 20% Tris-甘胺酸凝膠上電泳。樣品填加量是5微升，1〇微升及20微升，每二孔洞一組。凝膠在環境溫度下曝於乂_射線底片下約1 6 - 2 0小時，再利用密度計掃描一列。經放射標誌之共軛物峰（#3)之相對面積是95.3%。圖18表"Un-標記之2B8-MX-DTPA在含有人類血清白蛋白之PBS中之試管内穩定性。經ηιΙη·標誌之2B8_mx_ DTPA，在37°C之人類血清中培育，其SDS-PAGE分析後之 9 6小時放射自顯圖再行密度掃描。樣品在非還原條件丁，於4-2 0 % Tris-甘胺酸凝膠上電泳。樣品填加量是5微升， 1 0微升及2 0微升，每二孔洞一組。凝膠在環境溫度下曝於 X -射線底片下約1 6 · 2 0小時、，並利用密度計掃描一列。經放射標誌之共軛物峰（#3)之相對面積是94.0%。圖1 9表2 B 8灌注對C y η 〇 m ο 1 g n s猴子B -淋巴細胞水平之影響，由第0天至第1 3天。恆河猿每4 8小時靜脈内注射，共七次注射。示出投予之劑量。利用抗_ CD2( Τ-細胞），抗-Mo_IgG(2B8)，抗 _CD20(Leu 16)及抗-人類 igG(B· -35-

62862-961120.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 129496989103582號專利申請案八7$11修手中文說明書替換頁(96年11月) B7丨補充五、發明説明（33 ) 細胞），經由FACS分析決定循環的丁_及3_細胞水平。在循環的T-細胞水平上未見影響。（v組動物給予單一劑量）。圖20表Cynomolgns猴子注入鼠單株抗-CD20抗體2B8 循環B細胞水平之恢復。以faCS分析回收接受2B8動物體内之循環B -細胞’採用圖1 9簡要說明之經螢光標誌、之抗體。第III及IV組之動物因為在第13天時犧牲故未追踪。圖2 1表2B 8 - MX-DTPA對Cynomolgns狼子中循環B細胞之影響。恆河猿靜脈内注入經89丫-268_14又-0丁？八，其係利用臨床級之26 8-]^又-0丁？八製備。動物以上示之劑量每4 8小時給予，共七劑。在第〇，2，7，1 0及1 4天時對動物採血，再評估血清化學血液學及循環的B -細胞水平（第 1 0天未分析血清中之B -細胞數目）。除了所有動物之總淋巴球數目降低外，11組中有一個體例外，於整個研究期間未有顯著不正常處。圖22表單一注入1〇亳克/公斤後2B8自Cynomolgns猴子之清除率以及2B8，2B8-MX-DTPA自BALB/c老鼠中之血液清除率。在第零天注入單一劑1 〇亳克/公斤後，以 ELISA決定猴子中鼠類抗-CD20抗體2B8之清除率。如A列中所示，抗體在約4.5天之11/2值處呈現。由BALB/c老鼠循環中之2B8抗體清除率及其MX-DTPA共軛物示於B 列。老鼠靜脈内注入2 5微克天然的或共軛的2B8，而於注射後再於各種時間點時採血，高達264小時；再以酵素免疫分析法分析血清，利用S B細胞為捕獲劑。天然的及共軛的抗體均呈現8.75天之清除值。圖 23 表 mindBS-MX-DTPA 生物分佈。20 隻 BALB/c 老鼠各注入1.1 //Ci經放射標誌之共軛物（100微升），其調和在PBS中，pH 7.4，含有50毫克/毫升HSA。每組各5隻 62862-961120.DOC - 36 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) Α7 Β7

12949#9咖3582號專利申請案中文說明書替換頁(96年η月）五、發明説明（34 老鼠，在第1，2 4，4 8及7 2小時時犧牲，再製備及分析血液及各種組織相關之放射活性。圖 24 表 90Y-2B8-MX-DTPA 生物分佈。20 隻 BALB/c 老鼠各靜脈内注入約1·〇 #Ci(於1〇〇微升中）經放射標誌之共軛物’其調和於lx PBS中，pH 7.4，其中含有75毫克/毫升人類血清白蛋白及1 mM MDPA。每組各五隻老鼠，於第 1 ’ 24，48及72小時時犧牲，再製備及分析其其血液及各種組織相關之放射活性。圖25表 111-268-^4乂-0丁？八腫瘤定位。有^^111〇3 6-細胞腫瘤之無胸腺老鼠，靜脈内注入24/^(^111111-238-MX-DTP A，且每組3隻老鼠於〇，24，48及72小時時犧牲。在準備組織並決定相關之放射活性後，決定每克組織中注入劑量百分率，並如所示地晝圖。圖26表90 Y -標記之2B8-MX-DTPA與CD20陽性人類細胞之結合。以結合分析法來決定”混合及掃射”之9 〇 γ —經標誌之2B8-MX-DTPA之免疫反應性，其培育在含有50-75 毫克/亳升人類血清白蛋白之PBS中（pH 7.4)(4 8小時的培育）。A)列：固定量之9GY-標誌之抗體（約i毫微克/亳升）與增量的SB細胞培育。結合至細胞之放射活性（cpm)對細胞濃度作圖。B )列：施加之總9Gy放射活性對結合之放射活性（AT/B)作圖。線性外插可估算出y_截矩（1139)。在不定的抗原過量下，y-截矩倒數乘以1〇〇可得87.9%之免疫反應性數值。以CD20-陰性細胞（HSB)未觀察到結合。圖27表 Y·標s己之2B8-MX - DTP A於含有人類血清白蛋白及DTPA之PBS中之試管内穩定性。經9〇γ_標誌之2B8-MX-DTPA培育在4°C之PBS中，pH 7.4並含有75毫克/亳升人類血清白蛋白及1 mM DTPA，其SDS-PAGE分析後之本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1294969891〇3582號專利申請案中文說明書替換頁(96年11月）五、發明説明（35 ) 放射自顯圖。在所示時間下，樣品在非還原變性（SDS)條件下，於4-2 0 % Tris-甘胺酸凝膠上電泳。樣品填加量為5 微升（1，2列），10微升（5，6列）。凝膠在環境溫度下曝於 X·射線底片下約1 5分鐘，再照相。圖28表90Y-標記之2B8-MX-DTPA在含有人類血清白蛋白及〇丁？八之？68中之試管内穩定性。經90丫_標誌之238_ MX-DTPA在4 °C之PBS中培育，pH 7.4並含有75毫克/毫升人類血清白蛋白及1 mM DTPA，其SDS-PAGE分析所得的零時放射自顯圖再行密度掃描。樣品在非還原條件丁，於4-2 0% Tris-甘胺酸凝膠上電泳。樣品填加量為5微升， 1 0微升及2 0微升，每二個孔洞一組。凝膠在環境溫度下曝於X -射線底片下約1 5分鐘，再以密度計掃描一列。經放射標誌之共軛物峰（# 2 )之相對面積是96.1 %。圖29表90 Y-標記之2B 8-MX-DTPA在含有人類血清白蛋白及D T P A之P B S中之試管内穩定性。經9 〇 γ -標誌之2 B 8 _ MX-DTPA在4°C之PBS中培育，pH 7.4並含有75亳克/毫升人類血’清白蛋白及1 DTPA，其SDS-PAGE分析所得之4 8小時放射自顯圖再行密度掃描。樣品在非還原條件下，於4-2 0% Tris-甘胺酸凝膠上電泳。樣品填加量是5微升，1 0微升及2 0微升，每二個孔洞一組。凝膠在環境溫度下曝於X-射線底片下約1 5分鐘，再以密度計掃描一列。經放射標誌之共軛物峰（#2)之相對面積是94.1%。

圖30表90Y-標記之2B8-MX_DTPA在人類血清培育下之試管内穩定性。”混合&掃描，，9〇γ_標誌之2B8_MX_DTpA 在37°C之人類血清中培育，其SDS_page分析所得之放射自顯圖。在所示之時間點下，樣品在非還原條件下，於4_ 20% Tris-甘胺酸凝膠上電泳。樣品填加量為5微升，2 -38-

62862-961120.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CSlS) A4規格(210X297公釐) A7 B7

129496細03582號專利申請案中文說明書替換頁(96年11月）五、發明説明（36 ) 列），10微升（3，4列）及20微升（5，6列）。凝膠在環境溫度下曝於X -射線底片下约1 5分鐘，再照相。圖31表9GY·標記之2B8-MX-DTPA在人類血清培育下之試管内穩定性。”混合&掃射”90γ-標誌之2B8_Mx_DTpA 培育在37 °C之人類血清中，其SDS-PAGE分析所得之零時放射自顯圖再行密度掃描。樣品利用非還原條件下，於4_ 20% Tris·甘胺酸凝膠上電泳'樣品填加量是5微升，1〇微升及20微升，每二個孔洞一組。凝膠在環境溫度下曝於χ_ 射線底片下約1 5分鐘，其中一列再以密度計掃描。放射標誌之共軛物峰（# 2 )之相對面積是89.1 %。圖3 2表 Υ -才示5己之2 Β 8 - Μ X - DTP Α在人類血清培育下之試管内穩定性。”混合&掃射，，90γ-標誌之2B8-MX-DTPA 培月在3 7 C之人類血清中’其SD S - P AGE分析所得之7 2小時放射自顯圖再行密度掃描。樣品在非還原條件下，利用 4-20% Tris-甘胺酸凝膠電泳。樣品填加量是5微升，1〇微升及2 0微升’每二個孔洞一組。凝膠在環境溫度下曝於χ _ 射線底片下約1 5分鐘，其中一列再以密度計掃描。經放射標誌之共軛物峰（#2)之相對面積是88.8%。圖33表9GY-標記之2B8-MX-DTPA在老鼠之生物分佈。 20 隻 BALB/c 老鼠以 5 #Ci 90Y-標誌之 2B8-MX-DTPA(調和在1 xPBS，pH 7.4，含有75亳克/亳升人類血清白蛋白及 1 mM DTPA)靜脈内注射。每組5隻，各自在1、24、48及 7 2小時時犧牲，再準備及分析其血樣及各種組織相關之放射活性。圖34表CHO-衍生之2B8與CD20-陽性及CD20-陰性人類細胞之直接結合。增量之CHO -衍生之2B8抗體，與固定濃度之新鮮收獲之CD20 陽性B -細胞（S B )或CD20 -陰性之 -39-

62862-961120.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CilS) A4規格(210X297公釐) 12949舊9s·3582號專利申請案中文說明書替換頁(96年11月） Α7 Β7 年五、發明説明（37 ) Μ T-細胞（HSB)共培育。利用FACS分析定量與細胞結合之抗體，並使用如此中所述之山羊抗_老鼠IgG_FITC F(ab)，2。以不相關之同型抗體（S004)作比較。僅CHO-衍生之2B 8抗體’可顯示與CD20-陽性SB細胞有任何感知之結合。圖3 5表CHO -付生之2 B 8對C D 2 0 ·陽性人類細胞之競爭性結合。CHO -竹生之2 B 8與在融合瘤細胞株產生之2 b 8 - 4 9 親代抗體，利用ORIGEN分析中之直接競爭比較其免疫反應性。增量之抗體與固定濃度之CD20 -陽性B -細胞（S B )及痕量的以釕-標諸之CHO 2B 8共培育。經過在環境溫度下培育 3小時後，利用材料及方法一段中所述之〇RIGEN儀器來決定以相對電化螢光（ECL)表示之結合。所示出之數值代表二次決定值之平均。CHO 2B8及2B8-49之平均親和力常數經估算分析是1·3χ10·10Μ及2.5χ1(Γ10Μ。在比較中包括一個不相關之同型抗體（S004 ：)。圖 36 表 CHO -衍生之2B8 與 2B8-MX-DTPA 對 CD20 -陽性人類細胞之競爭性結合。由CHO _衍生之2B 8中所準備之 2B8-MX-DTPA共輛物，與未共輛抗體在qrjgen分析中利用直接競爭法比較其結合。共軛物之準備係將2 B 8與 MX-DTPA在移去未反應之嵌合物之前，培育8，I?及24小時。於結合評估中，抗體與固定濃度之CD20 -陽性的B _細胞（SB)及痕量的以釕-標誌之CHO 2B8共培育。經過在環境溫度下培育3小時後，利用材料及方法中所述之〇rige^ 儀器決定以相對電化螢光（ECL)表示之結合。所示出之數值代表二次決定值之平均。與未共軛之2B8抗體比較下，共軛物製劑呈現相似之結合。圖 37 表自 CHO 2B8-MX-DTPA 製備之In2B8 與 CD20-陽性細胞之結合。A)SB細胞以稀釋緩衝溶液xPBS，pH 7.4，含有l%(w/v)牛血清白蛋白）洗滌並再懸浮成9〇χι〇6 40-

62862-961120.DOC 本紙張尺度適用中國國家檬準(C&s) Α4規格(210X 297公釐） 12949^9103582號專利申請案 A7 中文說明書替換頁(96年11月） B7 五、發明説明（38 ) 細胞/亳升。增量之細胞與7.5亳微克/毫升，ΐη2Β8共培育3 小時，後者利用2B8-MX-DTPA lot 0165A製備。B)細胞濃度對結合之放射活性/總放射活性（B/Aτ)之雙倒數作圖。免疫反應性以1/y-截矩X 1〇〇來計算。免疫反應性及校正係數（R)值分別是80.6%及0.981。圖 38 表自 CHO 2B8 - MX DTPA 製備之 Y2B8 與 CD20·陽性細胞之結合。a)sb細胞以稀釋緩衝溶液（i xPBS，pH 7.4，含有1%(W/V)牛血清白蛋白）洗滌及再懸浮至9〇><1〇6 細胞/毫升。增量之細胞與2亳微克/毫升Υ2Β8共培育3小時，其係利用2B8-MX-DTPA lot # 0165A製備。B)細胞濃度對結合之放射活性/總放射活性/ A 之雙倒數作圖。免疫反應性以Ι/y-截矩χ100來計算。免疫反應性及校正係數（R)值分別是72.2°/。及0.999。 5 .發明詳細說明定義除非另有所定義，此中所用的所有技術及科學術語，具有屬於本發明技藝之一般精藝者所了解-之相同定義。雖然和此中所述相似或相當之任何方法及材料均可用來實行或測試本發明，但所描述的仍是較佳之方法及材料。基於本發明目的，以下術語定義於下。低金屬-指試劑經處理可減少金屬摻雜至不致破壞放射併入之程度。抗原陽性-可表現可為本發明特殊抗體所確認之抗原，如此抗體可以結合。㈢放射併入百分率-指相較於最初加至反應中之放射標誌總量，放射標誌反應中可與抗體共軛之放射標誌之量。結合百分率❾/〇 -指樣^中抗體之量，其不論有或無特異性可與標的抗原結合。 -41 -

62862-961120.DOC 本紙張尺度it财@ S家標準(CSIS) A4規格(210X297公董) A7 B7 1294969 五、發明説明（39 ) 免疫反應性或結合特異性之百分率-指與標的抗原在有特異性下結合之抗體含量。診斷用抗體-指與放射標誌共軛之抗體，如1 1 11，其可達成腫瘤及抗原陽性細胞之診斷顯像。治療性抗體-指共輛至α或/3源放射標諸之抗體（如 9GY)，其當結合至標的抗原可達成細胞殺拭作用。發明說明鼠類單株抗-CD20抗體2B8，共軛之2B8，^Ιη及9GY-標誌之2B8之臨床前發展 I·發展鼠類單株抗-CD20抗體2B8，共軛物2Β8·ΜΧ_ DTPA，ιηΙη·標誌之2B8-MX-DTPA及 HPLC-純化之90Υ-MX-DTPA之材料及方法 Α材料 1 •細胞人類細胞株SB及HSB得自美國標準菌種收集所，並培育在含有10%胎牛血清之RPMI- 1640中。CD20-陽性之SB細胞株是B淋巴母細胞株，由急性淋巴母細胞白血病患者周邊血液黃層中衍生而來（1)。抗原-陰性細胞株HSB是一種T淋巴母細胞株，由新生之Syrian倉鼠所誘生之腫瘤中發展而來（2)。鼠類骨髓瘤細胞株SP2/0類似地維持在含有10%胎牛血清之RPMI-1640中。 2.抗體抗-CD20 抗體 B 1 及 Leu 16 分別購自 Coulter Immunology 及 Becton/Dickinson。經1 251 -標諸之山羊抗-老鼠I gG及山羊 _62862-960914.DOC_- 42 -__ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（40 ) 抗-人類IgG抗體購自ICN。山羊F(ab，)2抗-老鼠IgG得自 Cappel 〇 3 .試劑

FreuruTs完全及不完全佐劑購自sigma Chemical Company。聚乙二醇，HAT濃縮物，及HT濃縮物均得自 Boehringer Mannheim。異硫氰酸螢光素（FITC)購自 Sigma

Chemical Company。銦-[111]氣化物及9Gy氯化物購自 Amersham或NENDupont。釔-[8 9]氣化物購自sigma Chemical Company。其他所有試劑得自標準來源。用於共輛及放射標諸策略之試劑經處理可移去掺雜的重金屬離子，其在放射標誌步驟中可與放射標誌競爭。試劑之處理係將溶液通過Chelex 100離子交換樹脂管柱（Bi〇Rad Industries)或Chelex 100加至所製備之溶液中分批處理。在所有製備及稀釋中，使用含低金屬之水，或Milli· Q -純化的或灌注用水（WFIr)。無金屬的溶液無菌過濾，再收集在無菌塑質容器内。 B .方法 1 .ARIA產製及篩撰2B 8融合瘤上清碎 10隻BALB/c老鼠以20 X 1〇6 SB細胞，懸浮在含有 Freunds完全佐劑之PBS中，免疫接種之。細胞以s.c&ip· 注入動物多個部位。經2週休息後，老鼠以乳化在卜⑶以^ 不元王佐劑之S B細胞注入第一次。接下來在每週流程下，以懸浮在PBS中之SB細胞進行免疫接種之追加。老鼠免疫達6週至4個月。 _62862-960914.DOC _-43 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CSlS) A4規格(210X297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（41 ) 以斷頸法一次犧牲二隻動物，再移出脾臟與鼠類骨髓瘤 SP2/0融合。選擇動物之基礎在於免疫後之血清可有效抑制經放射標誌之Coulter B1抗-CD20抗體與人類SB細胞結合之能力。在各融合前的3天，所選定之動物給予20xl06 SB細胞於PBS最後一次靜脈内（尾靜脈）注射。一旦犧牲動物且取出脾臟後（在無菌條件下），脾細胞與S p 2 / 〇細胞以 5 : 1之比例融合（脾細胞：s P 2 / 0，5 : 1 )。經融合的細胞在組織培養基中洗滌，再分配在含有HAT選擇培養基之96 孔洞盤内。融合瘤以抑制放射免疫分析法篩選，於1 〇 _ i 4 天後利用Coulter B 1抗體進行。利用已發展之放射免疫分析方法，完成可分泌抗_CD2〇抗體之融合瘤之篩選。簡言之，Coulter B1抗-CD20抗體以 Protein A親和力層析純化。5 0微克的經純化抗體依循操作指示’在Iodobeads (Pierce Clemical Co.)存在下由簡要氧化作用偶’合至1251。經放射標誌之抗體在arnberlite樹脂上脫鹽’再貝丁於稀釋緩衝溶液中（PBS，pH 7.4，含有02%明膠’ 0.02%疊氮化鈉，及1·0% BSA)。1〇亳微克經放射標諸之抗體置於先前已阻斷之過濾分析盤之各孔洞中（阻斷緩衝溶液：稀釋緩衝溶液含有10% FBS)，並加上來自受試孔一^洞中50微升融合瘤上清液及1〇0,000 SB細胞懸浮在5〇微升稀釋緩衝溶液中。懸浮液在環境溫度下培育丨小時。盤以洗滌緩衝溶液（PBS，pH 7.4，含有0.2%明膠及0.02%疊氮化鈉）洗滌’在V & P Scientific吸空歧管上進行，截獲有SB 細胞之過濾底部再轉移至7計數器。僅含有HAT培養基及 62862-960914.DOC - 44 ·_ 本紙張尺度適用中國國家標準(Ciis) A4規格(210 X 297公釐) " ' 1294969

經標德體之孔洞充作背景對照值，含有sb細胞之相同孔洞充作陽性對照組。抑制對照組含有放射標誌之Μ，及由2微克至2毫微克_之各種劑量的未標狀bi抗體。. 2 ·流體細胞計數研突， a；細胞株以2B8融合瘤培養物上清液進行初步的流體細胞計數研究0 100微升的融合瘤上清液與⑽細胞在環境溫度下培妁小時，再加入二次抗體（山羊F(ab,)2抗老鼠ig(}; Cappel)，以1 /400稀釋下使用，並在暗處繼續培育t小時。細胞洗5次。對照組僅含有細胞（無一次或二次抗體），由此可決定自動螢光，有二次抗體之細胞僅用以決定非特異結合，且商品化之異硫氰酸螢光素共軛的61(81-1?11^)用於 CD20族群對照組。在某些實驗中，螢光素經由胺基與異硫氰酸螢光素（fitc) 反應而偶合至經純化之2B8抗體。簡言之，2B8抗體（1·2亳克/毫升）在pH 9.5，〇·1 Μ碳酸鈉緩衝溶液中與每毫克蛋白質150-200微克的FITC共培育。溶液在室溫下培育2小時，生成的2B8-FITC共輛物在Sephadex G-25管柱上純化。用於這些研究中的其他試劑，如B1及Leu 16，以螢光素共輛物型式直接講自Coulter或Becton Dickinson。欲分析之細胞回收，再以含有〇·2% BSA及0·1 %疊氮化納之PBS洗三次。以錐藍排擠法決定存活率，知存活率要求大於90%。在每96孔洞U底盤之各孔洞中加入50微升，以將細胞濃度調整為每毫升3χ106。在適合的孔洞中加入一 _62862-960914.DOC - 45 - 本紙張尺度適用中國國家標準(C泣s) Α4規格(210X297公釐） 1294969 A7 ______B7_ 1、發明説明（43 ) 級抗體（50微升），且混合物在環境溫度下培育3〇分鐘至i 小時。接下來細胞以200微升/孔洞之含有〇·2% bsa及 0.02%疊氮化鈉之PBS洗5次。細胞在sorvall離心機中以 1300 rpm離心1分鐘，再以緩緩，，輕彈，，盤子移出上清液。二次抗體若必要時可加入，並在暗處之環境溫度下再培育3 〇分鐘至1小時；之後孔洞再如上述地洗滌。最後，在各樣品中加入200微升固定鍰衝溶液（〇15 μ含有1 %仲醛之氣化鈉’ pH 7_4) ’經處理的細胞轉移至12><75毫米試管，以進行分析。

b ·來自Cvnomolgus猴手之令A 移去jk漿後，細胞以離心及再懸浮於HBSS中洗二次。加上胎牛血清（2亳升），再懸浮細胞。1 〇〇微升之再懸浮細胞再各分佈至6個1 5毫升之角錐離心管中。加入之螢光標誌之單株抗體如下： #1 管：.鼠類抗- CD2-FITC(AMAC)，2.5 微克 / 毫升，5 微克； #2管：山羊抗-人類IGM-FITC(Fisher)2.5微克/毫升，5 微克； #3管：山羊抗-老鼠1§〇_10^(?丨81^〇2.5微克/毫升，5 微克； #4管：山羊抗-人類lgM-FITC+山羊抗-老鼠IgG-RPE(已吸附的），2.5微克/亳升，5微克； #5 管：抗-人類 CD20-FITC(抗-Leu 16 ，Becton

Dickinson)，5 微克； 62862-960914.DOC _- 46 - 本紙張尺度適用中國國家標準(c拉s) A4規格(210 X 297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（44 ) #6管：僅有細胞（自動·榮光）。」經標諸之抗體及細胞以测rpm離心2分鐘以混合細胞及抗體，所有6個樣品再置冰上，並培育3〇分鐘。接下來，自冰中移出管子’再加人溶解緩衝溶液（預加溫至37。^至 12毫升。之後，樣品在室溫下培育15分鐘，於代下離心测rPm 5分鐘，再移出上清液。細胞圏塊再以標諸緩衝溶液洗二次（卩38含有1% BSA&〇〇5%疊氮化鈉）。接下來，細胞加G.5亳升@定緩衝溶液·定之（()i5M氯化納pH 7.4，合有！％仲酸），再於Bect〇n Dickin麵㈣s_儀器上分析，利用自動補整並以caiibrhe珠粒預先校正。在FL1模式上偵測出來自螢光素之綠色螢光，在 FL2模式中是來自藻紅蛋白之紅色螢光。數據以對數型式表示。存活的淋巴細胞族群由點繪圖錐形圖中向前對右角度光線散射而初步鑣定。再由限制其他所有狀況出現下分離出總淋巴細胞族群。接下來的螢光偵測所反映的僅是發生在限制區域内之特殊事件。於高劑量藥理學/毒物學研究中，對各料進行研究前淋巴細胞水平之研究，並以此為基準值。估算出丁_及B _細胞百刀率及T · B比例’並以此為耗盡參考。以乙⑶i 6及抗_ 人類IgM抗體列舉出研究前之B細胞族群。 2B8注入猴子體内之後，當CD20抗原以2B8飽和時，以山羊抗-人類IgM_FITC，抗-老鼠IgG/RPE及含此二標幟之雙重染色族群’概算出總族群中之細胞百分率。以雙重染色族群來定量，直到所有的2B8自動物周邊血液中清除完 -A7 62862-960914 ΡΟΗ 本紙張尺度適用中國國家標準(C汾S) A4規格(210X 297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（45 ) 為止。利用抗-CD2-FITC估算出總淋巴細胞族群中τ細胞之百分率。數據為三次之平均，而各樣品進行1〇,〇〇〇狀況偵 /貝J接下來3平估各指定血樣中之細胞，在各例子中列舉在總淋巴細胞族群内之T-及B-細胞亞族群。也檢視T : b比例。B_細胞耗盡之估算是針對各個別猴子，相較於原先B_ 細胞水平之B -細胞減少百分率。 3 · £D20之放射破化作用及条疫沉澱作用 100 X 1〇6 SB 細胞在表面以丨2]及 Iodobeads(pierce Chemical Co·)硪化後，分成二均等分。細胞以離心重複洗滌，直到上清液中之放射活性回至背景值為止。在經標誌之B細胞二個樣品中任一者加入j 〇〇微克的2 B 8或B i (Coulter Immunology)抗體。抗體及SB細胞培育一夜，再以離心洗滌三次，直到所有未結合抗體移去為止。含有經結合之2B 8及B 1之細胞團塊再溶解，並加Np_4〇去污劑於0·1 M Tris-HCl，pH 8.0萃取之，再於室溫下培育M、時。萃取物在微量離心機中高速離心3 〇分鐘，上清液再轉移至新管。於各種中加入Protein A-Sepharose(300微升），且以離心將樹脂成團塊。Protein A-Sepharose再洗2 0次以移去非特異結合之碘化蛋白質。當珠粒對上清液之放射活性比例到達100數值時，團塊以SDS PAGE樣品緩衝溶液萃取’再加熱至沸騰。於冷卻後，各萃取物約15,〇〇〇 cpm加至10%聚丙烯醯胺凝膠之孔洞中。低分子量預染色之標準品（BioRad Inc ·)加至分別之孔洞中，並作用分子量估算用。蛋白質以電泳解析’凝膠乾燥再曝於x _射線底片下， _62862-960914.DOC_______~ 48 - ____ 本紙張尺度顧中S B家標準(CfJS) A4祕(2l〇x 297公釐) "~ ' A7 B7 1294969 五、發明説明（46 ) 於-70 °C歷24小時；之後展開底片膜再分析之。 4.2 B 8結合之Scatchard分析以Scatchard分析評估經純化的2B 8之表觀親和力。經放射標誌之2B8係在Iodobeads存在下與1251反應而製備。移去自由態碘之後，經放射標誌之抗體以各種濃度（一種濃度二份）由每孔洞5000毫微克至35毫微克，與l〇,〇〇〇 SB細胞共培育。自1 2 51 _經標誌之2 B 8比活性中可估算出與細胞結合之抗體含量。經結合的/自由態抗體之比例對經結合抗體之莫耳濃度作圖，並由X及Y軸截矩中決定出表觀的親和力常數。 5.2B8-MX-DTPA 之絮備 a.MX-DTPA 來淚於某些臨症前研究中，C14-標誌之1-異硫氰酸；基-3-甲基二乙三胺五醋酸（MX-DTPA)以乾燥固體型式提供自

National Institute of Health 的Dr· Otto，並貯放在4°c 避光之乾燥箱中。嵌合物之貯液製備於Milli-Q水中，再評估放射活性以決定濃度，並利用化合物之比活性。貯液通常是 2-5 mM，並貯於-70 °C之聚丙烯試管中。於其他研究中， MX-DTPA得自Coulter Immunology，為二鈉鹽於水之型式，並貯於-7(TC下。 b·盔金屬狀況之维持除了使用無金屬試劑外，所有試劑之操作均係將金屬推雜之可能性減至最低狀況。可能時，使用聚丙烯之塑質容器’如燒瓶，燒杯及量筒。其以Alconox洗滌，並在使用前 _62862-960914 DQC - 49 A7 B7 1294969 五、發明説明（47 ) 以M1II1-Q水充份潤洗。此外，使用無金屬之吸量尖 (BioRad)以正確操作小容量。為操作較大量試劑時，使用塑質之血清學吸量管（可運用之尺寸為1至25毫升）。反應在有螺蓋之聚丙烯微量離心管中（Sardstedt lndustries : 1 5毫升谷畺）或聚丙烯圓錐試管（C〇star : 15亳升及50微升）中合宜地進行。當操作透析管時要戴上先前以MiUi_Q水潤洗之可丟棄式外科手術手套。 c.抗體之製借鼠類抗-CD20抗體2 B 8，以Protein A及QAE層析法最先純化自腹水。於往後實驗，2B8利用相同的純化過程自中空纖維之生物反應器上清液中純化。由中空纖維衍生之抗體目刖基於商品化目的，以實例2所述之ch〇 -衍生抗體取代。抗體做共軛之準備，係將之轉移至無金屬之5 〇 mM N -二 (沒乙基）甘胺酸-NaOH，pH 8·6中，含有150 mM NaCl，利用透析或重複緩衝溶液交換。在某些研究中，利用重複超過遽達成緩衝溶液之交換，以Centricon 30(Amicon)自旋濾、器（30,000 D MWCO)進行。一般而言，將5〇·2〇〇微升的蛋白質（10¾克/¾升）加至過濾、單位，再加入2毫升之ν·二 (經乙基）甘胺酸緩衝溶液。濾膜在4它之s〇rval SS-34轉子中，以6000 rpm離心45分鐘。滯留物體積約5〇-1〇〇微升。此過程以相同的濾膜重複二次。滯留物轉移至聚丙婦丨.5亳升有螺紋蓋之試管中，進行蛋白質分析，稀釋至1〇〇毫克/ 亳升，再貯於4 °C下直到用於共軛作用為止。在某些研究 62862-960914.DOC______________«50 - 本紙張尺度適用中國國家標準(C泣s) A4規格(210 X 297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（48 ) 中’蛋白質轉移至50 mM檸檬酸鈉中，pH 5.5，含有150 mM NaCl及〇.〇5 %疊氮化鈉，利用上述相同之策略。 d ·共軛作用第畋在聚丙烯試管及環境溫度下進行2B8與]V1X-DTPA之共軛作用。MX-DTPA之冷凍貯液在使用前才立即解凍。通常， 50-200微升之1〇毫克/毫升抗體與嵌合物在嵌合物—對-蛋白質4 : 1之莫耳濃度比例下反應。反應中加入嵌合物貯液以開始反應再緩緩混合；令共軛作用進行一夜，通常是在環境溫度下1 4 - 2 0小時。未反應之嵌合物自共輛物中移去，係如上述利用透析或重複超過濾至無金屬生理食鹽水中（0.9% w/v)，其内並含有0.05%疊氮化鈉。蛋白質濃度調至1 〇毫克/亳升，再貯於4 °C之聚丙烯管中直到進行放射標諸為止。 e ·嵌合物納入之決定以液體閃爍計數來決定叙合物之納入，並將以純以共輛物所得之數值與C· [ 1 4]-標諸之礙合物之比活性作比較。於往後之研究中，其中使用得自Coulter Immunology之非放射活性之嵌合物，嵌合物納入之評估係將共軛物與已知濃度及比活性之9GY放射活性載劑溶液在過量下培育。簡言之，將已知濃度之氯化釔貯液製備在無金屬之〇〇5 N HC1中’此中並加入無載劑之γ(氯化物鹽）。取此溶液一份以液體閃爍計數分析，以決定此試劑確實之比活性。與預期黏附至抗體之嵌合物莫耳數3倍相當之氣化釔試劑之量，通常2莫耳/莫耳抗體，加至聚丙烯管中，再以2 ]^醋 62862-960914.DOC - 51 - Ϊ紙張尺度適用中國國家標準(Cfis) A4規誇(210X297公釐)" ----- A7 B7 1294969 五、發明説明（49 ) 酸鈉將pH值調至4·〇 - 4.5。再加入共軛的抗體，且混合物在環境溫度下培育丨5_3〇分鐘。反應加2〇 mM EDTA至1 mM終濃度中止之，溶液之pH值再以2 Μ醋酸鈉調至約pH 6 〇經過5分鐘之培育，整個體積如下述以高性能大小排阻層析法純化。混合溶離出之含蛋白質流份，決定蛋白質濃度’再取一份分析放射活性。利用9〇γ氯化物製劑之比活性及蛋白質濃度估算出散合物之納入程度。 f. ^8-MX_DTPA之免痛反應性利用完整細胞ELIS A評估共軛的2B 8之免疫反應性。以離心回收培養中之中對數期SB細胞，再以1 XHBSS洗二次。細胞稀釋至1 - 2 x 1 〇 6細胞/毫升於hbss，再分裝至9 6孔洞聚苯乙稀微滴定盤，每孔洞有5〇,〇〇〇-1〇〇,〇〇〇個細胞。盤再於40-45 C下於真空中乾燥以將細胞與塑質固定。盤子貝丁於-2 0 °C下直到使用為止。於分析時，盤子於使用前立即加溫至環境溫度，再以含有1 % BSA之1 xPBS，pH 7.2 -7·4阻斷之（2小時）。欲分析之樣品稀釋於1 xPBS / 1% BSA 中；施於盤上再以相同緩衝溶液連續稀釋（1 : 2)。二次抗體（山羊抗·老鼠IgGl·特異的HRP共軛物）（5〇微升）加至孔洞（1 ·· 1500稀釋於lxPBS/1% BSA)再於環境溫度下培養1 J、時。盤子以1 xpBS洗4次，再加入ABTS受質溶液（5〇 mM 檸檬酸鈉，PH 4.5，含有〇·〇ι% ATBS 及〇〇〇1% h2〇2)。盤子在405亳微米波長下讀取培育15_3〇分鐘後之數值。在分析中包括有抗原-陰性之HSB細胞以追踪非特異的結合。吸 I紙張尺度適财關轉準(cHs) M規格(2·撕公爱) ~ - A7 B7 1294969 五、發明説明（5〇 ) 光度值對個別稀釋因子作圖以估算出共軛物之免疫反應性’並與在相同盤上測試之天然抗體（代表100%免疫反應性）數值比較。比較滴定概圖直線部份數個數值，再決定平均值。 g. A然2B8及2B8-MX-DTPA之訧營内穩定性於此抗體及共輛穩定性的此1 2週評估中，取一份2 B 8抗體及2B 8 - MX-DTPA調和於生理食鹽水，或含有1〇 mM甘胺酸-HC1，pH 6.8之生理食鹽水。二個一組的樣品在4 °C 及3 0 °C下培育，且利用以下方法每週評估樣品：SDS -PAGE (還原及非還原條件下），利用全細胞酵素免疫分析之免疫反應性，以SB(抗原-陽性）或HSB(抗原陰性）細胞為捕獲劑，及等電焦距凝膠電泳（pH 3-10)。此外，在第4， 8及1 2週時評估共軛物之放射標誌效率，係以9 〇 γ放射標誌共軛物，再以SDS-PAGE分析產物並放射自顯分析之。最後，在另外的研究中，一份2B8-MX-DTPA在4°C及30°C 下培育10週，以^1〗!!放射標誌，再如下於BALB/c老鼠中衍生物分佈研究。 h. 免疫組織學研究由IMPATH實驗室進行天然及共軛的（2B8-MX-DTPA)抗體之免疫學研究，利用以丙酮固定的人類組織切片進行。抗體自中空纖維生物反應器上清液中純化，係在蛋白質A 及Q Sepharose上層析。依上述策略，利用coulter Immunology之MX-DTPA製備臨床級的共軛物。 i. 經放射標誌之2B8-MX_DTPA之試營内免疫反應性 62862-960914.DOC____- - 本紙張尺度適用中國國家標準(Cfis) Α4規格(210 x 297公釐）

1294969 於某些實驗中，採用於未標誌2B8-MX-DTPA中所應用之全細胞ELISA策略。在晚一些實驗中，利用Lindm〇所述之全細胞結合分析法修飾版本（3)來決定11 ιΙη & γ_找，之共軛物之免疫反應性（各自在IDEC Pharmaceuticals製備，或在 MPI Pharmacy Services，Inc.)。簡言之，於二個一組之試管中’加入漸增濃度之半對數期，抗原-陽性之sb 細胞或抗原-陰性HSB細胞[2 0 - 3 Ο X 1 〇 6細胞/毫升於稀釋緩衝溶液（PBS，pH 7.4，含有1% BSA，0.1%明膠，及 0.02 %疊氮化鈉）]。經放射標誌之共軛物以稀釋緩衝溶液稀釋至1-5亳微克/毫升最終抗體濃度，再於各試管中加入 0 · 3 5毫升。在環境溫度下培育7 5 - 9 0分鐘，細胞以離心成團塊再收集上清液。以r或液體閃爍計數決定留於上清液中之放射活性。繪出之數據是所加入之總放射活性除以與細胞有關之放射活性之商，相對於每管中細胞數目之倒數而作圖。因此y轴截矩代表免疫反應性部份。 i·麗放射標誌之2B8-MX-DTPA於人_叔清中之μ管内啊定性評估11 Un-及90Υ -標誌之2B8-MX-DTPA試管内穩定性’係在3 7 °C下於人類金清中培育9 6小時。共輛的抗體製備好，再以混合及掃射”策略）或9〇γ如上述地放射標誌之。經11 hn及9GY-標誌之共軛物，其比活性分別是 2.5及14.6111(：丨/毫克。經放射標誌之共軛物懸浮在含有75 毫克/亳升人類血清白蛋白（HSA)及1 mM DTPA(經釔標誌之共輛物）之緩衝溶液中，或含有50亳克/毫升HS A (經銦標

62862-960914.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1294969 A7 B7 五、發明説明（52 )

4之共軛物）之緩衝溶液。經放射標誌之共軛物以正常人類血清（未加熱失活的）1 ·· 10稀釋，再取一份無菌下置於無菌之有蓋試管中；這些試管再於3 7艺下培育高達9 6小時。共軛物樣品在所選定之時間點下移出，再以非還原SDS-PAGE 於4-20%梯度凝膠上分析，再行放射自顯術，及立即薄層層析。 k·座立上調和又之試營内穩定性 2B8-MX-DTPA共軛物以⑴化放射標誌，且可在未行 HPLC純化下使用（”混合及掃射”策略）。經放射標誌之抗體稀釋至PBS中，再加入人類血清白蛋白（1^8八）至5〇毫克/毫升之終濃度。經調和之放射標誌共軛物，其比活性是2.2 mCi/亳克。經調和之共軛物再於下培育48小時，取一伤在0 ’ 24小時及48小時時利用非還原SDS-PAGE在4· 2 0 %梯度凝膠上電泳，再行放射自顯術，及立即的薄層層析。利用上文第1段中所述之全細胞懸液分析法，評估各時間點之免疫反應性。 1·座床上調和之90Υ-2Β8-ΜΧ·ΡΤΡΑ之試瞢肉辞企竹 2B8-MX-DTPA共軛物以9GY放射標誌之，再於HpL(^ 利用1 xPBS為溶離緩衝溶液，行大小排阻層析而純化之。匯集經放射標誌之共軛物部份，再加入人類血清白蛋白及 DTPA至終濃度分別是75亳克/亳升及1 mM。調和的放射標誌共軛物比活性是14.6 mCi/毫克。經調和的共輛物再於4 °C下培育4 8小時，再取一份於〇，2 4小時及4 8小時時利用非還原的SDS-PAGE在4-20%梯度凝膠上分析，再行放射 62862-960914.DOC - 55 - 本紙張尺度適用中國國家標準(C泣S) A4規格(210X 297公釐) ' - A7 B7 1294969 五、發明説明（53 自顯術及立即的薄層層析。利用上文第1段中所述之全細胞懸液分析法，來評估各時間點時之免疫反應性。 2.動物研究 a .利用2 B 8之靈長類高劑量藥理學/毒物學研究在 White Sands Resarch Center (Study Number 920111)之 GLP條例下，抗體2B 8於高劑量藥理學研究中進行評估。使用成年的 Macaca fascicularis (cynomolgus )猴子；研究組各有一隻雄的及一隻雌的。每4 8小時注入（靜脈内）抗體，共七次。研究中共有5組：I組（食鹽水）；Π組（〇·6亳克/公斤）；III組（2.5毫克/公斤）；IV組（10毫克/公斤）；及¥組 (1 〇亳克/公斤僅於第0天）。開始研究之前，採自1 〇隻動物所有血樣，先決定試劑背景值及最初之Β細胞族群。在各抗體注射之前，並再抽出所有血樣。III及IV組於第1 3天時犧牲以完成屍體解剖及組織病理學研究。第1、11及V組之動物在第〇，1，3，7，13，21，37及 5 2天時採jk ;抽出約5毫升之全血置於有肝素之試管中。全血保持在4°C下，再於24小時内分析。各動物的血樣以 2000 rpm離心5分鐘，上清液之血漿移出，以ria分析血清中2B8之水平（特異的分析方法見ria步驟）。含有pBLs及 RBCs之成團塊物質，再懸浮於FCS中以為FACS分析。利用第V組動物（上）決定猴子中2B8之平均血清石半衰期。山羊抗-老鼠IgG1(Fisher Scientific)稀釋於1〇祕硼

A7 B7 1294969 五、發明説明（54 ) 酸鹽缓衝溶液，pH 9.6，至2.〇微克/毫升，再於％孔洞盤之各孔洞中加入5 0微升。經過4 °C 一夜培育，或環境溫产下2小時，令抗體與盤子結合。各盤在環境溫度下，= 微升/孔洞之含有1% BSA之PBS阻斷3〇分鐘。盤以蒸餾水洗;條，且血π或血漿樣品以三份一組施加至個別孔洞中，先是1 : 100之最初稀釋度繼以連續的丨：2稀釋度。經純 2Β 8加至預抽出之血清中，並稀釋後充作標準曲線用，始自0.5毫克/毫升；樣品以1 : 1〇〇稀釋，再如同其他樣品般連續稀釋。盤子在環境溫度下培育1小時，再以蒸餾水洗4 次。之後加入1 : 4000稀釋度之二次試劑（山羊抗_老鼠 IgGl-HRPO)，並在環境溫度下再培育1小時。盤再次以蒸餘水洗滌’並加入含有過氧化氫之〇·1毫升過氧化物酶受質。令顏色自反應中展開2〇分鐘；之後在4〇5亳微米波長下利用被篁盤ELISA計讀器決定吸光度。結果以每毫升血清之微克抗體量作圖。此外，在BALB/c老鼠中決定2B8及2B8-MX-DTPA之/3 ti/2 值。未共轭的2B8貯於-70。〇下之lxPBS，pH 7.4/ 10%甘油，解凍後，稀釋至〇.5毫克/亳升再無菌過濾。依循標準策略製備共軛的抗體，但使用C_[14]-標諸之嵌合物；嵌入物納入程度為1.5莫耳/莫耳抗體。純化的共軛物稀釋至0.5毫克/毫升於生理食鹽水中（〇·9%),無菌過濾，再貯於4 °C下，加上天然抗體直到使用為止。 6至8週大之老鼠注入100微升濃度為250微克/毫升之經純化的2 B 8抗體。老鼠再由眼窩後穿刺採血，由〇至264小時 -57-

62862-960914.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（55 ) 各時間點下，且其血清進行有或無天然的及共軛的2R8抗體之分析，利用全細胞酵素免疫分析，並以抗原_陽性之B _ 細胞株SB為捕獲劑。生成的數據為以2B8或2B8-MX· DTPA濃度對時間作圖；由這些結果中可產生線性回歸圖，且以斜率來決定冷t1/2值。 c.Lg£J-Y-2B8j：MX:DTPA 於 Cvnomalgus猴 + 之藥理學/喜物學研究利用90Y嵌入之策略製備帶有釔-[89]之2B8-MX-DTPA。除了不採用HPLC純化步驟之外。無放射活性，帶有金屬之共軛物調和在含有75亳克/亳升及1 mM DTP Α之1 x PBS 中，再以 White Sands Research Center GLP 研究編號 92061 1評估。在4組中各自包含有一隻雄性及一隻雌性猴子。動物每4 8小時靜脈内注射，在以下等物劑量下共七次注射：I組（食鹽水）；II組（0.003亳克/公斤）；πΐ組（0.03 毫克/公斤）；及IV組（0.3亳克/公斤）。在研究期間由體重及溫度，食物及水之消耗，消去，血清化學，血液學，尿液分析及身體檢查來決定及評估動物。在輸注之前於第〇， 2，7，10及14天時對I至IV組動物採血，血清再以FACS 分析來分析循環中之B-細胞水平。 d .放射標誌之2 B 8 - Μ X - DTP A之生物分佈在初步研究中，^Ιη·標誌之2B8-MX-DTPA在6至8週大的BALB/c老鼠中評估組織之生物分佈。依循上述之”混合及掃射”策略，利用臨床級之2B8-MX-DTPA製備經放射標誌之共軛物。共軛物之比活性是2.3 mCi/亳克，且共軛 62862-960914.DOC_ ~ 58 ~ 本紙張尺度適用中國國家標準(c汾s) A4規格(210 X 297公爱) A7 B7 1294969 五、發明説明（56 ) 物調和在含有50毫克/亳升HSA之PBS，pH 7.4中。老鼠於靜脈内注入1〇〇微升"ιΙη_標誌之2B8-MX_DTPA (約21 // Ci) ’每組三隻老鼠在〇，24，48及72小時時以斷頸法犧牲。犧牲之後，取出尾，心臟，肺，肝，腎，脾，肌肉及腿月，洗務’稱重；也移出血樣分析之。以7計數決定各檢品有關之放射活性，並再決定每克組織注入之劑量百分率。並不企圖減低與個別器官有關之血液所代表之活性分佈之效果。在不同的策略中，取一份在4 °C及30 °C下培育1〇週之 2B8_MX_DTPA，以ηιΙη放射標誌至2」mCi/亳克之比活性。這些共輛物再應用於如上述老鼠之生物分佈研究中。於計量決定中，2B8-MX-DTPA以M1In放射標誌至2·3 mCi/亳克比活性，再取約丨1 "Ci注入老鼠各自體内。接下來，5隻一組之老鼠在1，24，4 8及72小時時犧牲’移出其器官再作分析準備。此外，移出部份皮膚，肌肉及骨骼，作分析之處理；也收集尿液及糞便，並分析 24-72小時時間點。利用類似的途徑，2B8-MX-DTPA也以90Y放射標誌，並在B ALB / c老鼠中评估生物分佈達7 2小時。經過hplc大小排阻層析純化後，4組各5隻老鼠靜脈内注入約丨# Ci化學調和的共軛物（比活性：12.2 mCi/亳克）；各組再於i， 24，48及72小時時犧牲，再如上述地分析其器官及組織。決定與各組織檢品有關之放射活性，係以广液體閃爍計數偵測bremstrahlung能量。接下來活性值以每克組織注入之 62862-960914.DOC _ gg β 本紙張尺度適财@ @家標準(CSlS) Α4規格(21GX 297公董） "" A7 B7 1294969 五、發明説明（57 ) 劑量百分率，或每器官注入劑量百分率表示。雖然器官及其他組織重複潤洗以移去表面之血液，但器官並不灌注。因此。器官活性值並不減低内部相關血液所代表之活性分佈之效果。 e ·-In -標vM之2 B 8 - Μ X - DTP A之腫瘤定位在有Ramos B-細胞腫瘤之無胸腺老鼠中決定經放射標誌之2B8-MX-DTPA之定位。6至8週大的無胸腺老鼠皮下注入（左责側）0· 1毫升含有1 ·2 X 1 〇 7 Ramos腫瘤細胞之rpmi _ 1640，其先前已經改變以適合在無胸腺老鼠中生長。在二週内生長之腫瘤重量範圍在0.07U」克之間。老鼠以1〇〇微升 In_標遠、之2B 8-MX-DTPA( 16.7 " Ci)靜脈内注射，每組三隻老鼠在0，24，48及72小時時斷頸犧牲之。犧牲後，取出尾，心臟，肺，肝，腎，脾，肌肉，腿骨及腫瘤’洗務再稱重；取出血樣分析之。以氕計數器決定各檢品之放射活性，並決定每次組織注入之劑量百分率。 3 ·劑量估計利用注射以"Qn或90Y-標誌之2B8-MX-DTPA (表1-4及 5-8)之BALB/c老鼠所得之生物分佈數據，利用Medicai Internal Radiation Dose (MIRD) Committee of the Society of Nuclear Medicine形式化之方式，可估算出7〇公斤病人投予 1 ·0 mCi劑量後所吸收之放射線劑量。由每器官注射量中可決定經放射標諸共輕物之生物半衰期，數值決定自各放射免疫共辆物之生物分佈數據。在某些組織中，如金液，可假設放射共輕物之生物衰退依循一種兩室模式，由這些室 _62862-960914.DOC - 60 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 一 A7 B7 1294969 五、發明説明（58 ) 在整個7 2小時的定，可推知生物中呈現指數衰退。對於其他組織，如肝，生物分佈研究中，其活性水平大多保持固半衰期十分強，且有1000小時之數值。 nnr - 本紙張尺度適用中國國家標準(CSiS) A4規格(210X297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（59) 表1 hn-SBS-MX-DTPA I.V.注入正常BALB/c老鼠後 1.0 小

時之活性分佈平均值±SD 樣品器官重量克數 %ID/克 %ID/器官血液 1·47±0·17 40.3±5.32 58.4±3.1 心臟 0.087±0.01 5.88±0.76 0.51±0.05 肺(2) 0.149±0.01 14.2±1.4 2.10±0.17 腎⑴ 0.127±0.02 9.82±0.86 1.22±0.12 肝 1.06±0.20 10.32+1.58 10.76±1.93 脾臟 0.090+0.01 6.94±1.17 0.61±0.03 肌肉 8.39±0.98 0.70±0.25 5.67±1.35 骨骼 3.15±0.35 2.97±0.71 9.10±1.09 皮膚 ^ 3·15±0·35 0.96±0.29 3.0+1.12 GI道 2.58±0.31 6.10±2.00 7.80±1.80 尿液 — 糞便讎_ 總計 99.04±4.8 老鼠數目=5 平均重量=20.97±2.46克 _62862-960914.DOC_- 62 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（60) 表2 111111-28 8-^1乂-0丁？八1.¥.注入正常6八1^/〇老鼠後2 4小

時，活性之分佈平均值±SD 樣品器官重量克數 %ID/克 %ID/器官血液 1.47±0.07 21.97±1.87 32.22±1.35 心臟 0.128±0.03 4.02±0.23 0.38±0.01 肺(2) 0.15210.02 7.90±1.61 1.20±0.18 腎⑴ 0.128±0.01 5.94±0.40 0.76±0.04 肝 1.11+0.10 10.08±1.83 11.20±2.23 脾臟 0.082±0.01 5.04±0.75 0.40±0.02 肌肉 8.41+0.38 1.24±0.05 10.44±0.76 骨骼 3.15±0.14 2.02±0.33 6.31±0_81 皮膚 3·15±0·14 3.75±0.39 11.77±1.09 GI道 2.91±0.27 4.50±0.52 6.65±0.56 尿液 0.98 糞便 2.54 總計 87.10±1.68 老鼠數目= =5 平均重量= :21.03±0.94 克 62862-960914.DOC -63- — 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1294969 A7 B7

五、發明説明（61 ) 表3 111111-28 8-]^又-0丁？人1.¥.注入正常6八1^/。老鼠後4 8小時，活性之分佈平均值± S D 樣品器官重量克數 %ID/克 %ID/器官血液 1.4510.13 22.41±3.95 31.90±2.89 心臟 0.090±0.01 4.05+0.94 0.36±0.06 肺(2) 0.155±0.02 8.45+0.53 1·31±0·19 腎⑴ 0.125+0.01 6.16+1.15 0·76±0·07 肝 1.040±0.11 9.41±2.33 9·84±3·18 脾臟 0.082+0.01 5.3210.71 0.48±0.11 肌肉 8.26+0.77 1.42+0.58 11.62±4.67 骨骼 3.10±0.29 2·08±0·16 6·41±0·44 皮膚 3.10±0.29 3.43+0.59 10.54±1.69 GI道 2.96+0.20 5.0510.63 7.46±0.60 尿液 1.46 糞便 6.41 總計 88.49±6.87 老鼠數目=5 平均重量=20.65±1.93克 _62862-960914.DOC___" 64 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CSlS) A4規格(210 X 297公釐）

裝 1294969 A7 B7

五、發明説明（62 ) 表4 ^IndBe-MX-DTPA I.V.注入正常BALB/c老鼠後72 小時，活性之分佈平均值± S D 樣品器官重量克數 %ID/克 %ID/器官血液 1.52+0.06 18.97+1.31 28.51±2.03 心臟 0.094±0.01 3.71±0.31 0·35±0·04 肺(2) 0.161±0.01 7.60+0.30 1.18+0.09 腎⑴ 0.135±0.01 5.55+0.53 0.76±0_09 肝 1.11+0.11 9.90±1.77 11.00±2.03 脾臟 0.095±0.01 5.12+0.75 0.48±0.04 肌肉 8.58+0.34 1.04+0.09 8.95±0.68 骨骼 3.22+0.12 1.73+0.34 6·04±0·51 皮膚 3.22+0.12 3.16±0.60 10.19±2.03 GI道 2.79+0.19 4.53±0.83 6.37±1.38 床液 2.49 糞便 11.50 總計 87.80±4.79 老鼠數目= =5 平均重量= :21·46±0·84 克

裝 f _62862-960914.DOC_- 65 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CiJS) A4規格(210 X 297公釐） 1294969 A7 B7 五、發明説明（63) 表5 90Y-2B8-MX-DTPA I.V.注入正常 BALB/c 時，活性之分佈平均值±SD 老鼠後1.0小樣品器官重量 %ID/克 %ID/器官克數血液 1.27+0.06 39.23±2.45 49.77+1.72 心臟 0.086+0.01 5.80±0.84 0.50±0.09 肺(2) 0.137+0.01 12.11±1.08 1.66±0.17 腎⑴ 0.120+0.01 10.23±1.30 1.15+0.12 肝 0.921+0.05 12.12±1.72 11.17±1.66 脾臟 0.080+0.01 9·27±0·46 0.74±0.07 肌肉 7.2710.32 0·78±0·13 5.72±1.05 骨骼 2.73±0.12 4.35±0.39 11·89±1·47 皮膚 2.73±0.12 2.12±0.78 5.82±2.24 GI道 2.22±0.06 3.52+1.12 4.22±0.84 尿液 — — — 糞便一 · 總計 94.85+3.47 老鼠數目= =5 平均重量= :18.17±0·81 克 62862-960914.DOC -66 - 裝訂本紙張尺度適用中國國家標準(C泣S) A4規格(210 X 297公釐)

f 1294969 A7 B7 五、發明説明（ 64 ) 表6 90Y-2B8 -MX-DTPA I.V. .注入正常BALB/c 老鼠後2 4小時，活性之分佈平均值±SD 樣品器官重量克數 %ID/克 %ID/器官血液 1.517±0.090 8.35±2.547 12.83±4.60 心臟 0.092±0.005 , 2.63±0.142 0.240±0.006 肺 0.141+0.005 4.56+0.393 0.644+0.047 腎 0.138±0.007 5.63±0.222 0.779±0.040 肝 0.438±0.098 5.2210.335 2.259±0.399 脾臟 0.081±0.003 4.23+0.180 0.345±0.011 肌肉 8.668+0.514 0.976+0.164 8.55±1.945 骨骼 3.246±0.186 1.326+0.102 4.289±0.154 老鼠數目= 3 平均重量= 21·671± 1.11 克 62862-960914.DOC -67-、本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1294969 B7 五、發明説明（ 65 ^ 表7 90Y-2B8 -MX- DTPA I.V .注入正常BALB/c 老鼠後4 8小時，活性之分佈平均值±SD 樣品器官重量克數 %ID/克 %ID/器官血液 1.33±0.06 17.34+2.0 23.03±1.95 心臟 0.088±0.01 3.56±0.31 0.31+0.04 肺(2) 0.139+0.01 7·54±0·88 1.05±0.15 腎⑴ 0.122+0.01 6.52±0.42 0.79±0.01 肝 0.968+0.04 9.05±1.70 8.92±1.57 脾臟 0.087±0.01 6.52±1.13 0.57±0.07 肌肉 7.26±0.36 1.05±0.18 8.01±1.17 骨骼 2.86±0.14 3·34±0·42 9.53±1.08 皮膚 2.86±0.14 4.13±0.76 11.75±1.82 2.84±0.19 2.74±0.34 3.80±0.30 尿液 — — 4.29 糞便 — __ 7.67 總計 79.72±3.23 老鼠數目= 5 平均重量= 19·07±0·91 克 62862-960914.DOC -68-, 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) A7 B7 1294969 五、發明説明（66 ) 表8 90Y-2B8-MX-DTPA I.V.注入正常BALB/c 老鼠後72 小

時，活性之分佈平均值±SD 樣品器官重量克數 %ID/克 %ID/器官血液 1.35±0.02 15.40±1.63 20.71±2.13 心臟 0.088+0.01 3.12±0.24 0.28±0.01 肺⑺ 0.142+0.01 8.23±1.05 1.17±0.20 腎⑴ 0.123+0.01 6.45±0.57 0·79±0·07 肝 0.02±0.06 8.39±1.04 8·58±1·31 脾臟 0.103±0.01 5.90±1.19 0.59±0.08 肌肉 7.68±0.11 1.01±0.15 7.73±1.05 骨骼 2.88±0.05 3.20±0.25 9.20±0.61 皮膚 2.88±0.05 3.97±0.49 11.42±1.36 GI道 2.86±0.18 2.9010.65 4.06±0.93 尿液 — — 3.00 糞便 — 一嶋 11.08 總計 78.62±2.63 老鼠數目=5 平均重量=19.21±0.27克 62862-960914.DOC - 69 - 、本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（67 ) 以相似方式，利用估算指數衰退t1/2之標準方程式，可設定或估算出其他的生物半衰期。一旦這些數值被決定，可針對各經放射標誌之共軛物，利用這些表上方提供之方程式（產品變數）決定出表9及1 0中所列之Tue，Tel，Te2， Αι，A2及A等變數。這些數據，以及接下各表中所示者，利用Symphony展片所寫之程式估算（Lotus Development Corp·)由 Mr. Phillip Hagan，MS，Nuclear Medicine Service， VA Medical Center，La Jolla，CA 92161 提供。 62862-960914.DOC - 70 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1294969 A7 B7 五、發明説明（68 ) ss^a-钤芽 382-料穿 ULI3-料穿rrr^l ί 4? 軲亥贫弟(箨)»)

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62862-960914.DOC -71 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1294969 A7 B7 五、發明説明（69) II •eft PVARIES 涣ft 砵赛(涪命) 錤碡(.'prs 35冰 s i S5t〇 SiS)S>KJK>K)K)Nit〇S)SJt〇l〇t〇S>i〇i〇 · ······_· ···_.«··«· OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOH CS wtnwwmwwwtiitTjttitiiwwwwcflwwwέέέέέέέδ会2SSSSS22S2 n ο·4_ 0.§9S 500.400 96 0.80^ p5§ 0.§决 P00096 P00096 p§96 9.1896 0.§冶 p§9&o.i^ 0.§治 11.77096 0.6讀 0_5& 0·§9δobi OOOOOOOOOOSO888§S88S8b8 B P8% P8% 32.22% pi 0.38% 0.8% 0.00% i 0 45 §0 1000 0 i 0 0 0 li 0 39 I 000 0 1000 0 i i1—

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Ob 9462 000 29313.1 39632 Ob 0 345·7 573 000 000 000 5731.6ss 000 000 000 000 0010708 363.9UI81 000 000

He2 A1 A2 Aihr) (uci-hr) {uci-hr) (uci—hr)

62862-960914.DOC -72- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1294969 A7 B7 五、發明説明（％砟h-择琢霁2-料芽別3-妗桊十舔Λ料穿 ULI2*衿穿 LLla-钭芽砩 Α/13- S贫 jk鲜 HC {hr) 2·7δ·04 2.78E-S 2.78E-S 2.78E-S 2.78Ε·04 2.78Ε-04 2J0OE 丨2 2·7οοΕ·04 2J8E-04 2.75— S 2·78Ε·2 2.75- S 2J8E-1S· fl 0·§9ί 1.§湞 5S 4.220 湞 4.220湞 4.220% U50湞 9.§湞 r2sro ρ§9δ 8.720湞 p§ro 49.770% 0.856 i 0 0.009& i 0 25.909¾ 13 i p 0.895 98 湞 0.8湞 oi 0.8^ 000 湞 P87 湞 o.i 1%

Tbl Tb2 w) {hr) li 0 私 0 L5 0 3UI0 产5 0 私·2 0 70 i i 0 i 0 碲令一:Al^;-M4*9b00%*1000*60.2*L00=7795.Mii5plN洲郐^择葬和烊较>3^If命掷郐砵详(A) >οπ^^ϊ* fl=和Tbli棼爷沐3i~A0者芩 Γ2" /VTb2 4:麥书姝s~A0 者岑 _10 2J8E.S 2·78Ε·04 2.7S-04 μ ^ ^ kj to to r〇 ,ρ ^ 5o So ko So 3o 5o ko So w r»mmtn

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Tue=斗涔^>卡沐盏is Te2=袖b贫岑涔兹斤+沐¾ A2=被卜贫麥^诔多^^' >=.%铖耸谇寐 Tuc =彡 * Tip /(Tu + TP) Al-L44*n*A0*Tcl*cruc/TU) Tc V Tbl * Tp /{Tbl + 分)A2-rt*f2*A0*TC2 Tc2 n Tb2 * 0 /CTb2 + τϊ>) A · A1 + A2 62862-960914.DOC - 73 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐）

1294969 A7 B7 五、發明説明（ 71 a斧产為和洋sta —奸f爵> έ s 择爹a)a續玲柏玲洛 C祖卜贫 5；^碎碑忠s 务 w

He 1 2·78Εέ 2.75— 04 2.700Ε 丨 04 2.7ΟΟΕ-04 2.7WE_S 2.78E-S 2.78Ε 丨2 2.78E 丨 s 2.75- S 2·7«Ε·04 2·78Ε·04 2.7ΟΘΕ-2 2·78Ε·04 2.7S.04 2.78E-S 2.7ΟΟΕ-04 η 0·§9& 0·5雲 0·§5& 9§湞 ρ§96 ρ§湞 1LS0 湞 0.00096 Pi96 0.00096, 0.§沴 15.60096 P740湞 0·§9δ 0.§湞 0.§%

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1294969 at B7 ___ 五、發明説明（72 ) 利用來自表9及10之總累積活性（A)值，及由MIRD Pamphlet第11號所提供之S值（表11，12，13及14)，對所列組織之各放射標誌共軛物決定所吸收之放射劑量。（表 15，16，17及18)。在對表19提供之銦-標誌之共軛物總和放射劑量中，特定器官之自身劑量以在鄰近器官或組織中活性所產之吸收劑量總和而得。然而，在估算由釔-標誌之共軛物所致之放射劑量估算值中（表2 0 )，對於所列的組織有些數值是不存在的（如腎上腺）。此是由於釋出的13粒子徑長較短之故，此乃是與射出之g粒子徑長比較而言，因此由相鄰組織所致之活性幾可忽略，故也無這些組織初步的生物分佈資料。 62862-960914.DOC_ _ 75 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1294969 A7 B7 五明説明發 73

ADRENALS cdLADDERWALL txJONE GI (STOM WALL) GI(SD GI (ULI WALL) GI (LLI WALL) KIDNEYS 7.4E-03 5.7E-07 7.3^05 4.4E-06 3.6E-07 4.5E-04 7.5E-07 8.0EI06 5.2E-S2·3Ε-06 13E-06 3.2E-06 oo.ooE-06 8.5E-07 3.4E.04 1.1E05 2.5E.06 8.6E-06 7.9E.06 11E-S 2.8E-06 6.9E-06 1.1E-05 8.3E-05 7」E-07 2.2E-05 3·8Ε-06ho夂W05 3·7Εο5 8.5E-07 1.1E-05 9.2E-06 3·:3Ε·04 9.5Ε.06 8.3Ε-06 i 4JE-04 2COE丨 06 2OOE.06 1·3Ε·06 6.4E-06 10S5 2VOE-06 4.2E.06 1.2E-05 5·4Ε-06 认.4护05 3.0Ε—05 3.4E-05r5E-s7·6^06 在.8Ε-06 SE-07 5·2Ε-07 L5EI07 5·5Ε.06 3.7Ε-06 2·9Ε-06 3ΟΟΕ-06 12Ε-06 loE-05 5.8Ε-06 5.7Ε-06 4.3Ε-06 Ο0.6Ε-06 5.0RO6 6.1Ε-07 4.οοΕ·06 8.6Ε-06 7.5Ε-06 7.4Ε-07 5.0Ε06 2.5Ε-06 7.3Ε.07 30Ε-07 5.2Ε-06 5·2ε,04 1ν>ε 丨05 2·7Ε·06 4·4Ε 丨 06

Target Organs

Adrenals

Bladder Contents somach Si Uli Lli Contents Contents oontsts Contents

Intestinal Tract

SOURCE ORGANS

Kidneys

Liver

Lungs

Other Tisse (Musdc) 寧【111】+^^67.44二>*令裝· -訂· .¾ _62862-960914.DOC_" 76 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1294969 A7 B7 五、發明説明（74 ) SPSEN 2.0E—05 TESTES ME 丨 07 THYROID 4.7E-07 UTE1NGRVD) 5.8E-06 MARROW (RED) 9— OTH TISS (Mcsc) 4·8Ε·06 OVARIES looE—06 PANCREAS N6E—05 SKIN looE—06

LIVER LUNGS 1.5^05 7.6E.06

Tar^t Organs

Adrenals 7.6E-07 3.1E-05 4.6E.G6 4.2E66 1— is SW.S 9bo§7 1.2E-08u>o,w—sgvom—oooH5W000 4.S05 2.4E.06 2COE.S 1.5E—05 2.4E-S2.8E-05 2.OOE-06 7.1E-06 4.6W06 5.9E-S3.4E-07 2.5ETS3.9S8 3.6E-06 2.7E-08 2.0E-07 6.2S7 2.6^06 4.3S6 2.1E-05 3woa\r2Eo6 2·827 7.4E-06 5.3E-06 4.0E-06 1.1E-05 9」^s 1.3E-05 9.6E-06 4.1W06 15Ε·06 产3E-06 产〇〇£-06 4.5E-06 5.2EI06 4.4E-06 3.4E—06 23炉05 1.3E-06 3.3Ε-05 3.7Ε-05 6.4^05 W.S.S 1.4E-S . 、· - οο·6Ε-07 5·7Ε-05 6.1Ε-06 7.1Ε-06 2.1Ε-06 20甲05 1.2Ε-05 1.7Ε-06 ΜΕ-06 1.4Ε-06 1.4Ε-06 1.6Ε-06 1.8Ε-06r6E-06 产 8Ε-06 5.3E-06 4.4E-06 7.5E-06 3.6E-07 SE-06 7.7E-06 5.7Ε·06 10ΟΕΌ6 i 6.3E.3 00.2E 丨 000 5COE—06 5·2Ε_06 y»6E-06 7.5E-07 7OOE-06 8.3E-07 8.4E-07 2.6E-07 1·2Ε丨 05 2.5E-06 L3E-04 7ME-06 7·7Ε-06 1.4Ε-04 3.4E-S 4.2Ε-06

Bladder Contents

Stomach Contents

Si Contents si Contents

Lli Contents SOURCE ORGANS Intestinal Tract

KidneyM

Liver

Lungs other Tisae {Muscle)

62862-960914.DOC -77-

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1294969 A7 B7 五、發明説明（ 75 REFERENCE - MIRD PAMPHLET NO. 11. PAGE 164

TOTAL §DY 6.S 丨 06 6.2E-06 6.1E-06 7.3E.06 6WE-06 SE-06 6.6E-06 6.6^06 5.9E-SOI.6E-06

Target Organs

Adrenals sadder Contents

Stomach Contents

Si Contents si Contents

Lli .noments

Inr?stinal Tract

SOURS ORGANS

Kidneys

Liver

Lungs other Tissue {Muses

62862-960914.DOC •78- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1294969 at B7 五、發明説明（ 76 ADREZALS LIE 丨06 2.6E.05 7.9E—06 3.9E-06 3.9E-06 2.4E-06 20E.05 1.4E-07 BLADDER WALL 2·1Ε·05 4 7E.07 2.4E-06r5§6 1.5E.06 1·6Ε-06 4.7Ε-Ό7 1.5E—05 BOZE 3-8E-06 3.6E-06 1.2E-05 30E-05 2.6E-05 2.9E-06 2.9ΕΌ6 2.4E-06 GI(STOMWALL) 2.4E.06 5.9E-05 3·2Ε,06 1.7E.06 UE-06 1.7E,06 30E05 1.5E.07 GIB 3.8E-05 5.5E-06 7·9Ε·06 2.3E-06 2.3E-06 1.5E-06 4.2E-06 1.2E66 GI(ULIWALL) 3·7Ε·05 5ΟΝΕ·06 6.4E-06 2.2E-06 2.2E-06 1.4E-06 18E-06 1.1E.06 GI(LLIWALL) 4.8E-05 1.7W.06 90E-06 3.2S6 3.2E-06 1.5E-06 1.9E-06 8.3E-06 KIDNEYS 2.9E06 L9E—05 6.8W06 2·7Ε-06 2.7E-06 20E-06 2·8Εώ5rTE-07 LIVEIl L7E06 1.3E-05 2.9E.S 20E-06 20E.06 1.7E-06 30E-06 1.2E-07 LUNGS 2.2E-07 7.6E.06 3.7E06 30E.06 30E-06 1.9E-06 6.9E-06 3.4Ecb8 MARROW (RED) 一.3E05 6.8E-06 jws一竽00|2.S.SKJJ^S.^4^06 1.9E.06 OTH TISS (Muse)_6.3E-Q6 5.7E.06 3.8E-06 3.21^06 3.2E-06 2.5E-06 卢6«-06 ·1ο\ΕΌ6 4.7E-07 1.2S00 2OXE-06 1.5Ε·07 私.2^000 3WE.08 2·2Ε·08 1.2Ε-07 3.5Ε 丨 07 1 2.9Ε 丨 06 产3Ε丨06 7.0S6 6VOE—06 61 7.ΙΕ-06 7.5Ε.06 7.0Ε-06 6.7Ε 丨 06 6·6Ε·06 6.5Ε 丨 06 5.9Ε-067.7Ε06 5.6Ε-06

62862-960914.DOC -79- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

Target Organs

Ovaries

Pancreas nsarrow Cort Bone TRAWODe

Skeleton SOURCE ORGi

Skin spies Testes

Thyroid Total Body 如12φ5Ι^^ΐ?~^^ίΗ:1:,(ΚΑϋ/υα·Η) 窗·nll】+_^67.44、J4

1294969 A7 B7五、發明説明（77 ) REFEREZnE- Mi PAMKILETZO· lr PAGE 165

Targs Organs OVARIES PANCREASsicm SPLSN TESTES THYROID CTERCS(NONGRVO) TOTAL §DY 1·0Ε·02 1·0Ε·06 1UE—06 1.6Ε·03 1.4E-06 1.3E-06 1.6E-S 6·2§5 P0E+8 2.IE-07 2.5W08 4·5Ε·07 6.5E-05 1.9E.06 7.7E-06H5E-06 H7E丨06 2·2§6 4.S-06 3.IE-06 2.0W06 2.3EI06 2.7^06 20E-06 1·0Ε-06 L9E-06 2.2Ε-06 2·8Εώ6 6.7Ε-06 1.8Ε-06 6LE 丨06 5— 2k>E-06r4E-06 3.IE-06 1.7Ε·06 2.3E-06 3.7E65 SE-06rTEroe 1.9E-06 3.4E.06 200E06 2.4E.06 100E06 1.2E—06 5— 3οοΕ·06 1·7Ε·06poe+8 6.IE-05 2JE-07 L5E-06 4.9E-06 9IE-04 8.9SS 2.0W07 3.6E—03 3.4E-07 woje.09 1.2E-06 o.ow+8 6.6E-06 5.61 2·5Ε·08 7bE丨06 30E 丨37.8E.06 2.5E-06 3·7Ε·06 3·5Ε·07 SE—06 3.3Ε-09 4.9Ε-06 5ΟΟΕ-03 5.2Ε-06 2.4SOO7.8E-06 5·3Ε-06 5ΟΟΕ-06 ovaris panesas 为 Marrow Con Bone TRA Bos

Slceleton

SOURCE ORGANS

Spleen

Testes

Thyroid Total wody

62862-960914.DOC -80- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公董) 1294969 A7 B7 五、發明説明（78 ) ADRENALS WLADDER WALL BONE GI1M WALL) GI(S GI(ULIWALL) GI (LLI WAjLL) KIDZEYS LIVER LUZGS MARROW {RED) •4E-01 Ob 00 00 Ob 00 00 00 00 00 00

Ob 5·0Ε·03 00 00 Ob 00 Ob 00 Ob 00 00

Ob 00 00 40E-03 00 00 00 00 00 0.0 0.0 0.0 00 00 00 2·5Ε·03 00 00 00 00 00 00

Ob 00 00 00 00 谷· 5E.03 00 00 00 00 00

Ob 00 00 00 00 00 7— 00 00 00 00 0.0 00 00 00 00 00 00 6— 00 00 0.0

Ob 0.0 0.0 00 00 00 00 00 1.1E-03 00 00

Ob 00 00 00 Ob 00 00 00 002o§0.0

Ob 00 00 00 00 00 00 0.0 00 00 00 _62862-960914.DOC - 81 " 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

Target Organs

Stomach SI ULI LLI Contents nontents Conti com—

Adrenaloa

Bladder nontents

Inrtsdnal Tract

SOURCE ORGANS >13^-^^I^$iia斧3:¾^(RAD/UCI-H) 裝·

Kidneys

Liver

Lungca

Other Tisse {Muscle) .¾ 1294969五、發明説明（

7 7 A B 79 REFERENCE . MIRD PAMPHLET No. 11· PAGE 144 OTHdss (Muse) 0.0 Ob 0.0 Ob Ob 0.0 OVARIES 00Ob 00000000 PANCREAS0.0 0000000000 SKIN 0000000.0 0000 SPLEEN000.0 0.0 000000 TESTES 000000000000 THYROID 000000000000 UTERUS (NONGRVD) 000000000000 TOTAL §Dy 2OOE-05 3.2E-06 8.5Εώ5 2.3E-05 1.4E-05 1.7E.05 0.0 00 00 00 Ob 00 0.0 00 2.8E-05

Ob 00 00 00 00 00 00 00 200E-05

Ob 00 Ob 00 00 00 00 00 2.8E.05 7.1E65 00 00 00 Ob Ob 00 Ob 2.8E-05

Target Organs

Adrenals

Bladder contents

Stomach SI ULI LU oo-ntsts Contents Contents Contents

Intestinal Traot

SOURCWORGANS

Kidneys Liver

Lungs

Other Tissue (M6de)

62862-960914.DOC -82-

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1294969 A7 B7 五、發明説明（8Q ) ADSNALS Ob 0.0 0.0 Ob 0.0 «LADDER WALL 0000000000 BOZE 00οο1·1Ε·£ 产 OE—04 2.3E.S GI(STOMWALL) Ob 0000Ob. 00 GI (so 00000:0 0000 GI (ULI WALr·) 0000000.0 00 GI (LLI WALL) 0000000.0 0.0 KIDNEYS000 000000.0 LIVER 0000000000 LUNGS 00000.0 0000 MARROW (RED) 0.0 008.6E-S3.3E-05 5.7E-S OTH TISS (Muse) 000.0 000.000

Ob 00 Ob Ob 00 00 00 Ob 00 00 00 0.0 0.0 00 00 00 00 00 00 Ob 00 00 0.0 00

Ob 00 0.0 00 Ob 00 00 00 00 00 00 00 0.0 00 00 00 00 00 00 00 00 00 0.0 00 2.8E-05 2boEo5 2.8E-05 2.8Εώ5 2.8E65 2boEo5 2.8E.05 2.8E-05 200E05 2.8E-S 2.8E-05 2.OOE.05 62862-960914.DOC - 83 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

Target Organs

Ovaries

pancrctoM R. Marrow coaBos TRA Bos

Skeleton

SURnE ORGANS

Skin Spleen Testes

Thyroid TOE wody >14^•【90】+沐砮£+眾裝· -訂· 1294969 A7 B7 五、發明説明（81 ) REFERENnE - MIRD 弋 AMPHrET zo. 11· PAGE M5 UTERUS (NONGRVO) 0.0 TOTALWODY 2.8E-05

OVARIES PAZCREAS si SPSEN TESTES THYROID 1.8E-01 00 00 00 00 00 0.0 2.0E02 00 0.0 00 00 0.0 2.8§5 0.0 Ob Ob Ob 00 00 002.S05 0.0 00 00 00 00 00 00 2.8E—05

Ob 00 00 00 00 00 0.0 2boEo5

Ob 00 7.6E-04 00 00 00 00 2.8E05

Ob 00 00 1.1E62 00 00 00 2boE-05

Ob 00 00 Ob 5JWS 00 00 2.S-05 0.0 00 00 00 00sws 00 2boE_05 N8E-05 200S5 2boE 丨 05 2.8E-05 2boE,05 SE-05 2.S.05 2.S05 62862-960914.DOC - 84 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

Target orgi

Ovaries pancrrtas nssownoaBODe TRA wonc SOURCE ORGANS Skeleton

Skin Spleen Tes泛

ThyroidTOE toody 1294969 A7 B7 五、發明説明（ 82 ADREZA rs BLADDERWALL GI (STOS WALL) Gi GI (ULI WALL) 01 (LLIiArL) KIDNEYS LIVER rczGS OTHEH TISSUES Muses obE+8 3.1E65 ooE+00 2.4E—02 OOE+S4X.6E.S ooE+8 4JE.04 OOE+S3.8E.S OOE+8 1.2E-03 OOE+8 4.6E05 pOE+8 3.4E.05 ooE+00 4.5E-06 O.OE+00 30E-2

Ibws1.4E03 1 .IE-04 2.SE—03 4.8E.02 3.5E03 ME-03 0.7E-03 L5E.03 2.S02 1 7.6E-03 1.5E-03 2.9E.03 8.3E-S 100E03 7.3E-S2.4E-S 60E-04 1.5E03 1. IE-03 4.9E-04 2.6E-03 7.6Ε·03 2.2E—02 2.0Ε·03 2IOW02 1·1Ε·02 1.3E-01 5.3E-03 3.8E-03 1.8E01 3.4E-03 1.1E03 3.2E-03 3·2Ε·04 3.4E.S 9ΟΟΕΤ05 1100Ε03 2.0Ε03 1.4Ε-02 1.5Ε-01 3.8Ε-04 5.2E-S 40Ε-03 5.8E.02 3·5Ε.03 5.0Ε-02 3UE.03 7LTIWS 1.01Ε·03 7.3Ε-03 2.5-01 1.2Ε-01 4.9E-S 1.3Ε+00 ιοΕ-03 7.8Ε-02 1.8Ε-03 ㈩夂Εο2 1.3Ε-02 2.4Ε-01 2.6Ε.04 2.7Ε-01 9.8Ε-03 2.1Ε-0110Ε03 2— 13Ε-03 2·5Ε·01 5.2m-04 2.6Ε-01 4.SI03 2.2Ε-01 1.3E-02r7E-01 2.4E-01 2.1E-01 7.6E-03 3·7Ε-01

62862-960914.DOC -85 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

Target orgi

Adrsals Bladder Contents

Kidneys Liver Lungs other Int8tinalHsctHissuc stolch SIc-LI LLI Contents Contents Contents Contents

SOURCE ORGANS _15涔耸洚涔窆_(RAD=A*S) 畲丨【一二】沐^67.44二4 裝· -訂· ··線 1294969 A7 B7 五、發明説明（83 ) ADIPOSE 0.0m+8 C0LOOD ooE+8 BRAIN ooE+00 HEART oow+8 OVARIES OOE+00 PAZnREAS ooe+8 SKELETOZ OORTlnArWOZE 0.0E+00 TRAlBEncLAH BO2JE 0.0E+00 MARROW (RED) obE+oo MARROW (YELLOW} OOE+00 nARTILAGE O.OE+S OTKEHnozsTIT. ooE-foosiooE+00

3οΕ·04 3·0Ε·04 3.0E-S Α·1Ε·05 1JE-03 4.7E-05 UE.04 13E—04 2.9E-04 2COE-04 1.3E.S 1.3E-S 9.2E-S

Target Organs

Adrenals «ladder nontents

Stomach nomesw 6οΕ·04 60E-04 60E.04 4.4E63 ιοοΕέ s§3 3.2E-S 3ν)ε·2 OI.6E.04 5.V3E-2 3ME-S 3.2E-S 2·0Ε·04 κ Contents 1.5Ε-03 L5E—03 L5E63 1.5Ε03 i 1VOE03 ιοΕ·03 1.0S3 3.5E-03 3.5S3 SE-03 loE-03 4·5Ε·04

ULI noptents L8E-03 1·8Ε-8 1·8Ε·03 1.7E-03 1·5Ε·02 219E.03 1.2E-03 r2E 丨 03 3VJE.03 3·7Ε-03 1·2§3 1.2Ε—03 5.7E.S

Intestinal Tract

LLI Contents 2.0Ε-03 2.0Ε.03 2·0Ε·03 No· 1E-04 2·4Ε·02 80E-S losE—03 1.6Ε03 4.6Ε03 4·9Ε·03 1·6Εο3 1.6Ε-03 6L-E-S ιύοΕ-03 1οοΕ·03 looE-s 1.1E-S L5E.03 οο·δο3 1.5Ε·03 1.5Ε 丨 03 3.9Ε-03 3— 1.5Ε.03 1.5Ε-03 7·3Ε·2

Kidneys 3.4Ε02 3.4Ε.02 3.-4WS 2.O0E-02 ΜΕ.02 1.2Ε01 2.9E—S 2.9Ε-02 4.1Ε-02 4.S.S 2.9E-022— 1.6Ε-02

Liver 7.6Ε·03 7.6Ε-03 7.6Ε-03 1.2Ε02 6.2Ε·04 1WS2 6·5Εο3 6.5§3 ?°3Ε-03 SS3 6.5Ε03 6.5Ε03 3.1W03

Lungs 3.7S1 3」Εώ1 3.7Ε-01 3.7Ε-01 2.8Ε-01 r2E 丨 01 ισνΕοι lbsEol 2.S.01 2ΟΝΕ-01 1.6Ε-01ΙσνΕοι 1.2Ε.01

Other Tisue 62862-960914.DOC - 86 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1294969 A7 B7 五、發明説明（ 84

ADIPOSE obE+oo 3.0E-04 6.0E-04 1.5E63 1.8E63 2.0E-03 ®LOOD ooE+8 3.0E-2 6bE-04 1.5E03 looE-03 20E-03 WRAIN POE+00 30E-04 60E.04 1.5E03 l.SE-03 2.0E.03 SEART OOE+8 4.1E—05 4 4W03 1.7E 丨03 9.1E-04 OVARIES OOE+Sr3 E-03 ιοοΕέ 1」Ε·02 1UE-S 2·4Ε·02 PANOREAS OOE+8 4.7E-05OO0E03r9w03 219E03 8.0E.S SKELETON noRToAr WOZE OOE+SL3E-04 3.2E-04 loE<b3rMws iw TRABECULAR BOZE OOE+8 1.3E.04 3.2E-04 1οΕ·03 L2E.03 1.6E-03 MARROW (RED) obE+8 2.9E-04 5.6E-04 3.5E丨03 3.7E.03 产6E-03 MARROW (YELLOVO ooE+00 2.9E-04 5CVE-04 3.5E.03 3·7Ε-03 产 9E-03 OAIRTILAGE 00E4-8 1.3E-04 3.2WS loE-03 1.2E-03 1.6E03 OTHER ΠΟΝ5ΤΙΤ· 0.0E+00 1.3E-S 3.2E-S10E03 L2E03 1.6E03 _oloE+8 9.2E05 20W04 4.5E.04 5.7W04 6.1E—S lboE-03 looE-03 1οοΕ·03 rlE-02 L5E-03 8」E.03 1r5Eo3 3— 3.9E.03 1.5E03 L5E03 7.3E-2 3.4E-02 3.4E-02 3.4WS 2«E—S ME02 lMEol SE.S 2.9E—02 4.1E-02 4.S02 2.9E-S 2.9E 丨 02 】.6Ε·02 7.6E-03 7·6Ε-03 7.6E-03 1·2Εο2 6.S-S L3E62 6.5S3 6.5E-03 OO.3E-03 8·3Ε·ο3 6.5E-03 6.5E-03 3.S03 3.7E-01 3·*7Ε—ο1 3.7Ε·01 3.7E-01 ί°8Ε-οι 1.2Ε 丨 01 1.6Ε—01 1.6Ε-01 2.6Ε61 2.6Ε-01 1.6Ε.01 1.6Ε-01 1Κ>Ε-01

62862-960914.DOC 87- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公爱）

Target orgi

Adrenals

Bladder oonteas LQtstiDal Tract ssmach SI ULI LLI Contents Contents noments Contents

Kidneys

Liver

LungCA other Tissue

SOURCE OUGAZS 裝· 1294969 A7 B7 五、發明説明（85 ) SPLEEN O.OE+S HmsT£s obm+8 THYROID GbE+oo CTERUS (ZOZGIIVD) POE+00 TOTAL BODY obm+8 4.1E-05 7.6E.04 6·5Ε·07 3.4E-04 2·7Εο3 户4§3 2.5E<b5 4VOE-05 W.S.S 3.4E.04 1.5E63 3IOE-S 2·2Ε65 2.3E63 9IOE03 1.7E-03 SE-04 3.0E.05 2.7E—03 6. IE丨 03 9.1E-S 2IOE03 10E05 2.6E-03 8_0E.03 1.1E.S ME.S 8.1E-05 2.7E.03 1.3E-03 20OE-02 2.5E丨 03 6.2E—03 6.6E.S 1K>E 丨 s

1.2E-02 6.7E-05 十 5E-03 lbE-02 4.S-S 2.3E-01 lboEol 2.1E01 3.7E-01 2.8E61

Targs Organs

Adrenals

Bladder nontentM

Stomach nomenls GOI nossts ULI Contents LLI Contents 62862-960914.DOC_- 88 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） SOURCE ORGANS Intestinal Tract

Kidneys

Liver

Lungs other Tissue

1294969 A7 B7 五、發明説明（ 86 ADRENALS GI (STOM WALL) GI (s GICLI WALL)

obE+oo 0.GE+8 0.0E+Sp-OE+00 3.6E-02 2·6Ε-02 1.2E62 0bE+8 0.0E+8 ooE+00 ooe+8P0E+8 ooE+8 1.4E02 1·7ς«02 2/7E-0400E+S ooE+00 pOE+00 ooE+8 OOE+00 OOE+00 1.6E-02 looE-02 1.7E.02 00E+800E+8 o.OE+8pOE+00 0.0E+00 G.OE+8 2.1E-02r6Eo2 2.4W03 00E+800E+8 0·0Ε+8 0.0E+OO obE+oo o.ow+8 2bE-02 1.5E-02 2.2E-03 O.OE+SOOE+S 0.0E+0 0 0.0E+0 0 ooE+0 0 oow+0 0 oom+0 0

62862-960914.DOC

Target Organs ovaricw Pancreas

Josarrow coaBos TRA Bone -89 SOURCE OIIGAZS skeleton

Skin Spleen Tses Thyroid Total Body 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) ^耸洚斧窆：一: (RADH A* S) 窗.【111】+^务 67.44二4 裝· _16 -訂· 1294969 A7 B7 五、發明説明（ 87

GI{LLIiALL> KIDNEYS 1 LUNGS OTHER TISWUES MUSPB ADIPOSE BLOOD BRAIN P0E+S ObE+s OOB+S OOE+S 301M2 2.7E-02 2JE.SpGB+80bE+sobE+o 0 O.OB+S O.OEi obE+s o.?8 wb§ 2·7Ε^03 ο·ΟΕ— O.OB+8 0.0B+0 0 O.OE+S ο.οβ-foo O-GB+S o.s+s 3bET02 2.7¾¾ 2/7B-S obB+oo P0B+8POE+0 0 0bE+80.0E+8 OOE+8 ooE+8 3.0&S2.7E.02 17E-S ooB+8POB+S ooB+0 _ 0 obE+s o.ort+8 0.0W+SPOE+S 3bE4nr6EM 1JS3 obB+8 0.0B+80·§+0 0 0.0E+8P0E+O0OOE 十 8 O.OE+OO 2.5Er02 2·1&αζΓ6&02 0·αΕ·ΗΧ> O.QB+8 0.0m+0 0 obB 十 s P0B+8 0.0E+8 o.s+8 1.9E-S rsMff L7E63 o.s+s GbE+oo 0.OBS 0 POE 十sPOE 十 8 ooE+8 ooE+8 2』EH02 2_01M2 40B-8 0·0Ε+8P8 十 8pOB+0 0

Target Organs

Ovaries R. Marrow Cort Bone TRA Bone SOURCcnORGANS MkeidDn

Skia Spleen TSB Thyroid TOE wody

62862-960914.DOC -90 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

1294969 A7 B7 五、發明説明（ 88

MARROW (YELLOW} OARmAGE TRADOECCrAR COOZE MARROW (RED)

HEART OVA2ES PAZOREAS SKELETi OORTICArWONE

Target Organs o.ora+8 o.ow^-s OOE+S ooE+814E-01 o.om+8 o.ow+8obE+8 ObE+s2.4E01 P0E+00 ObE+oo 0.0E+8 ObE+oo 2·4Εό1 obE+8 obE+sobE+8ob'txl+8!°4E01 obE+spOE+00 obE+8 obE+oo 2.4E.01 0bE+8 G.GE+8 GbE+oo obE+8 2.9E-02 0.0E+8 O.OE+00 0.0E+00 o.ow+8 2.0E-02 obE+s obE+8obE+8obE+8. 3·0Ε·02

Ovaries pancrcs R. Marrow Con Bone TRA Bone SOURCW ORGANS Skeleton 3·1Ε·02 1.7E.03P0E+S G.GE+ooobE+o 0 3.IE-02 1·7Ε·03 0.0E+S 0.0E+S 0bE+0 0 2·9Ε-02 2.6E-03 POE+00 0bE+s O.OE-fO 0 2·9Εο2 2.6E-03 0.0E+800E+S00E+0 0 3.1E-S 1.7E03 ooE+8 ooE+8 ooE+0 I_ 0 2.7W.02 2.7E-S O.GE+00 0bE+00 0.0E+0 0 1JE-02 9.9E-04 G.GE+00 GbE+oo GbE+o 0 1.8E-S 3.5E-02 obE+oo O.OE+OO 0.0E+0 0

Skin spies Teaes Thyroid HOE Body

62862-960914.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公董）

1294969 A7 B7 五、發明説明 89

OTHER C01T.ssz SPLS2: TESTES THYROID UTERUS (ZOZGRVO) ToTAr BODY obE+8 obE+8P0E+80.0E+8 oow+s 0.0E+S o.ow+8 o.ow+8 0.0E+8 0.0E+8 0.0E+8 0.0E+00 obE-foo 0.0E+S 0.0E+S 0.0E+00 ooE+8 ooE+8 OOE+SooE+00 ooE+00 ooe+8ooe+sooe+s ooE+00 OOE+00 ooe+8ooe+8 2.4E.01 3.1E-02 L7E-03 obE+s obE+oo obE 十 0 0 2.1E-02 4·0Ε·2 8.7E.SOOE+00 OOE+SooE+0 0 i 100E02 5JE-01 OOE+00 0.0E+80.0E+0 0 1.8E-02 3.6E-S 1.2E-04 O.OE+S 0.0E+00 O.OE+0 0 2ONE-S 2.6E-02 2oE,s OOE+SOOE+8 ooE+0 0 1·7Ε-02 OOE+8 7.0E.20.0E+S0.0E+8O.OE+O 0 5.5E-02 4.1Ε·02 3·8Ε-03 OOE+SOOE+S OOE+0 0

Target Organs

Ovaries panercs H Marrow Cort wone TRA Bos SOURCE ORGi Skeleton spies Testes Thyroid TOE wody

62862-960914.DOC -92-

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1294969 A7 B7 五、發明説明（ 90 ADRENALS «LADDER WALL 215ALL) GI (SI) GI (ULI WALL) GI (LLI WArL) 0bE+00 0.0E+00 O.OE+00 obE+s O.OE+00 obE 十 00 ob.w+00 o.oe+8obE+oo 1.1E+00 0.0E+8 0.0E+8 obE+8 yoE-ol POE+00

OOE+SOOE+S3.6E01OOE+SOOE+S o.ow+8 2.7E0lobE+8obE+s obE+s

ooE+8 ObE+8 POE+SOOE+8 O.OE+00pOE+00 ooE+00 O.OE+00 1.8E+00 OOE+S

0.0E+00 0.0Ϊ00 0.0E+0O 0.0E+S 0.0E+8 0.0E+00 OOE+OO 0.0E+0 0ooE+0 0 OOE+0 0 oow+0 0 POE+0 0 0.0E+0 0 obE+o 0OOE+0 0 1 0 ooE+0 0 OOE+0 0 0.0E+0 obE+o 0OOE+0 0OOE+0 0 OOE+0 0 0.0E+0 0 OOE+0 0

62862-960914.DOC

Target Organs

Adrcnah Bsr&e·-» nonteots

Stomach SI ULI nontentsoonteDtco· Oop?0ff LLI nontcnc* -93- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） COOURCW ORGANS Intsts-al Tract

KidneyMrivrtrrungtA

Other Hisuc ζ :¾:耸洚斧窆 3:cradha*s) 冷丨【90】+_釜64二»令裝· ，訂· ••線 1294969 A7 B7 五、發明説明（ 91

KIDMEYS LIVER LU2JGS OTHER TISSUES MUSOLE ADiE toLOOD OORAIN HEART O.OE+00 obE+oo O.GE+00 obE+oo §E+ooobE+s ME+00 0bE+0 0bE+0 0.0E+0 0 0 0 0.0E+00 0.0E+00 0.GE+8 0·0Ε+8 0.0E+00 ο·0Ε+8 0.0E+S 8.6E+0 0.0E+0 Ό.0Ε+0 0 0 0 0.0E+00 obw+s obw+8 o.ow+8 0.0E+8 obE+oo 0bE+8 obE+o 2」E+0 0.0E+0 0 0 0 o.ow+s 0.0E+8 0.0E+8 O.OE+00 0.QE+8 0.QE+00 0bE+00 O.OE+0 0.0E+0 2.7E+0 〇 0·0 00E+800E+800E4-SPOE+S 0.0E+00 0.0E+00 O.OE+00 0.0E+0 0·0Ε+0 2.7E+Q 0 0 0 o.ow+s O.OE+00 O.OE-fOO 0.GE+S 0.GE+8 0.0E+00 0.0E+8 0.0E+0 0.0E+0 2.7E+0 0 0 0 o.om+8 o.om+s o.ow+8 o.ow+s POE+S PGE+00 GbE+s 0.0E+0 Ο.ΟΕέ 2.7E+0 0 0 0 obw+s POE+00 O.OE+S o.ow+s o.ow+00 obE+oo O.OE+S 0.0E+0 0.0E+0 2/7E+0 -----I_I__0 0 〇

62862-960914.DOC -94- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公爱）

Target orwans

Adrenals Bladder Contents

Stomach SI CLIru Contents Contents coptsts Contents SOUROE ORGAZS Intestinal Tract

Kidneys Liver Lungs other Tissue 1294969 A7 B7 五、發明説明（92 OVA2ES PANCREAS SKHLETOZ OORTICArlBONE TRAooEncrAHWONE MAJRROW 01ES MARROW (YmLLOW} OARTILAGE OTHE为 cotsTIT. 0bE+00 obE+s 0·0Ε+00 aoE+oo GbE+oo 0.0E+8 0·0Ε+00 0·0Εέ aoE+0 0bE+0 0 0 0 obm+8 o.ow+8 o.ow+8 o.om+s obw+s o.om+8 obw+s o.ow+0 o.ow+0 o.ow+0 ' 〇 0 0 0.0E+00P0E+00 0.0E+00 ooE+00P0E+SP0E+8P0E+8pOE+0Ρ0Ε+0 ooE+0 〇〇0 o.ow+8 o.ow+8 o.ow+8 o.ow+s o.ow+8 o-ow+8 o.ow+s o.ow+0 o.ow+0 o.ow+0 0 0 0 obm+s o.ow+8 o.ow+s o.ow+8 o.ow+8 obw+8 obw+s obw+o o.ow+0 o.ow+0 0 0 0 o.om+8 o.om+8 obm+8 obm+8 obw+s obw+8 o.ow+s o.ow+0 obw+o obm+o 0 0 0 o.om+s o.ow+8 o.ow+8 o.ow+8 obw+s obw+s o.ow+8 O.QE+G 0.0E+0 0.0E+0 〇〇〇0.0E+00 0bE+00 o.ow+s o.ow+00 o.ow+s o-om+s obw+8 o.ow^.0 o.ow+0 o.ow+0 ------————————— 0 0 0 -95 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱）

Target Organs >.drsals Bladder Contents stoich SI ULI LU Contents Contents Contents Contents

Imcsiinal Tract

JiccKrCTcpccAINo:

Kidneys Liver Lungcoothc*-! Tissue 1294969 A7 B7 五、發明説明（ 93

Target orgi ssz SPLSZ TESTES THYROID UTERUS (ZOZGHVD) TOTALWODY ooE+00 OOE+8ooro+oo o.ow+8

ObE+oo oow+8 obE+oo 0.0E+8 obE+8 OOE+SOOE+SOOE+S OOE+OO 0_0E+8 ooE+00 ooE+8 OOE+00 ooE+8 1.7E-04 7.6E63 4.6E-03 OOE+8 0·0?00 OOE+8 obE+oo obE+8pOE+8 OOE+8 OOE+8 OOE+8 •OOE+S OOE+8 OOE+00 0.0E+00 obw+8 o.ow+s 3.6E-03 4.1E.03 3.7E62 0.GE+00 o.om+8 G.GE+00 obE+o O.OE+0 obE+o 0 0 0 o.ow+0 o.ow+0 o.ow+0 0 0 0 O.OE+G G.OE+0 G.OE+0 0 0 0 o.om+0 o.ow+0 o.ow+0 0 0 0 2.2E.2 2.9E-02 0.0E+0 0 o.ow+0 o.ow+0 UE+0 0 0 0

Adrenals

Bladder Contents somaccr nomems SI nontents ULI nontents LLI Contents

Intstbal Tract

SOURCE ORGAZS

Kidneys

Liver

LUDgCA other Tissue

62862-960914.DOC -96- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1294969 A7 B7 五、發明説明（94 )

ADREZALS BLADDER WALL GI (STOM WALL) GI(SI> GI (ULI WALL) GI (LLI WALL) 2DMEYS LIVER rGZGS OTHEH TISSUES obE+8 0.0E+S 10 ooE+8 ooE+00 OOE+OO ooE+00 OOE 十 00 0.0E+00 obE+sooE+8ooE+00 ooE+8 ooE+8 P0E-+-00 ooE+00 OOE+OO OOE+00

ObE+8 OOE+S OOE+8 ooe+8 pOE+8 OOE+8 OOE+00 —0 OOE+00

obE+s OOE+8 OOE+8 0.0E+8 OOE+00 OOE+S OOE+OO 0.0E-H8 O.OE+S obE+oo OOE+S ooe+8 OOE+8 OOE+8 OOE+00 OOE+00o.om+00 OOE+8 O.OE+S OOE+00 OOE+8 OOE+8 0.0E+8 OOE+S OOE+00 OOE+00 OOE+00

ObE+oo ooe+8 ooe+8 O-OE+S OOE+00 OOE+S OOE+8 OOE+00 OOE+00 obw+s OOE 十 8 OOE 十 8 OOE+S ooE+8 OOE+00 OOE+00 O.OE+00 OOE+00

ObE+8 OOE+00 ooe+8 00E-K8 OOE+8 OOE+00 OOE+00 OOE+OO ooe+8

ObE+oo OOE+S ooe+8 OOE+8 OOE+8 OOE+8 OOE+S P0.-CT1+0O OOE+S 62862-960914.DOC - 97 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐）

Target Organs

Maixow

Cort Bone

Bone

Ovaries Pancreas skeleton

SOURnw ORGANS

Skin

Spleen

Testes Thyroid TOE Body _18 冷丨【90】卡_»64+岑

1294969 A7 B7 五、發明説明（95 ) MUSCLE obE+8 obE+8 obE+8 0.0E+00 obE+8 obE+B obE+00 obE+spOE+8 ADIPOSE 0.0E+00 O.OE+8OOE+S O.OE+sooE+8 O.OE+00 ooE+00 0bE+8 obE+8 blood ooe+00 ooe+8 ooe+00 o.oe+8 ooe+00 ooe+8 ooe+8pOE+8 ooE+8 «rain ooe+8 o.oe+00 obE+oo obE+8 obE+8 o.ow+8 OOE+00 obE+8 OOE+8 HEART ooe+sooe+00 ooe+sooe+00 ooe+8 ooe+8 ooe+00 0bE+8 ooe+8 OVA2ES O.OE+00 OOE+8 OOE+8 OOE+8 OOE+8 OOE+00 OOE+8 0bE+8 ObE+8 PAZnREAS ooE-f8 oow+8 OOE+00 OOE+8 0.0E+8 OOE+8 OOE+8 OOE+8 P0E+8 SKELETON OORTIOAL BOZE 00E+800E+S OOE+8ooE+00 3.1E+00 OOE+8 0.0E4-8 OOE+00 0bE+8 TRABEOULAUBOIViE ..OOE+S OOE+S OOE+SOOE+S3.1E+8OOE+8 OOE+00 0bE+8p0E+8 MARROW (RED) O.OE+8 OOE+8 OOE+SOOE+S 7·8Ε+8 OOE+SOOE+S ooE+ooooE-fs MARROW (YELLOW) ooE-hs OOE+00 OOE+8 0.0E 十00 7.SE+8 OOE+SOOE+S00E-+S OOE+8 OARTILAGE OOE+8POE+S OOE+00 OOE+00 3.1E+8 OOE+8 OOE+8 ObE+8 oom+8 OTHEH OONSTIT. οσΕ-foo ooe+8ooe+sooe+s3.1E+00 ooE+8OOE+00 OOE+SObE+8 obE+oo OOE+8 POE+OO OOE+8 OOE+8 OOE+8 OOE+8 OOE+00 OOE+S P0E4-00 O.OE+Sobm+oo OOE+8 62862-960914.DOC - 98 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） τεγώ【 Organs R Marrow

Cort Bone TRA »one

Ovaries pancrnK

Skeleton

Skin spies Tests Thyroid

Total wody

SOURCE ORGANS

1294969 A7 B7 五、發明説明（ 96 SKlhi 0bE+00 0bE+00 POE+00 0bE+80bE+s 1.0E+01 0.0E+S SPLEEN ooE+sooE+8 ooe+booe+sooe+00 ooE+00 90E+8 TESTES 0.GE+00 o.ow+s obw^ s obw+s o.ow+8 o.ow+8 0.0WX.S THYROID 0.0 m+8 o.ow+8 o.ow+8 o.ow+8 o.ow+8 o.ow+8 o.ow+s CTE1RCSZONGHVO) ooE+00 ooE+00 00E+S00E+800E+8 ooE+00 OOE+S TOTAnwoDY O.OE+S ooE-f8 OOE+00 OOE 十83'ooEol 3.8E+01 2.3E-02 0.0E+00O.OE+8o.ow+s 0.0E+8obE+oo OOE+00 obE+8 OOE+S OOE+00 o.ow+s OOE+00 ooE+8

ObE+oo OOE+00 OOE+8 OOE+8ObE+oo0.0E+8

Target Organs

Marrow

Oort wone tdonc

Ovaries Pancreas

Skeleton

SOURCE OHGAZS

Skin

Spleen

Testes

Thyroid HOE Body

62862-960914.DOC -99- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) A7 B7 1294969 五、發明説明（97 ) 表19 由經銦-[111]標誌之2B8-MX投予均勻分佈在標準人類（70 公斤）所估算出之放射劑量，並以注射後7 2小時之動物分佈數據為基礎 ______ 活性量= 1000微居里/病人劑量 RADS RADS 腎上腺 0.493 卵巢 0.387 膀胱壁 0.348 胰臟 0.362 胃壁 0.412 骨骼小腸 0.434 皮質骨 0.474 UL腸壁 0.533 小梁骨 0.474 LL腸壁 0.505 髓質(紅) 0.602 腎臟 0.625 髓質(黃） 0.602 肝 1.533 軟骨 0.474 肺 0.582 其他組成 0.474 其他組織皮膚 0.564 肌肉脾 0.854 脂肪睪丸 0.239 金液甲狀腺 0.276 腦子宮(無GRVD) 0.473 心臟總體 0.417

Ref : A Schema for Absorbed-dose Calculation for Biologically Distributed Radionuclides, MIRD J. of Nucl. Med./Suppl. #1? 2/68

Calculations Performed Using a Spreadsheet Template in

Symphony (Lotus Development Corporation) and Created by

Phillip L. Hagan，MS

Nuclear Medicine Service VA Hospital

San Diego, CA 92161 62862-960914.DOC - 1 00 _ 本紙張尺度適用中國國家襟準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（％ ) 表20 由經釔-[9 0]標誌之2B 8-MX投予均勻分佈在標準人類（70 公斤）所估算出之放射劑量，並以注射後72小時之動物分佈數據為基礎 _____ 活性量= 1000微居里/病人劑量 RADS RADS 腎上腺 0.000 卵巢 0.000 膀胱壁 0.271 胰臟 0.000 胃壁 0.356 骨骼小腸 0.504 皮質骨 3.138 UL腸壁 1.150 小梁骨 3.138 LL腸壁 1.772 髓質(紅) 7.776 腎臟 8.366 髓質(黃） 7.776 肝 8.575 軟骨 3.138 肺 2.079 其他組成 3.138 其他組織皮膚 10.269 肌肉 2.716 脾 8.965 脂肪 2.716 睪丸 0.000 血液 2.716 甲狀腺 0.000 腦 2.716 子宮(無GRVD) 0.304 心臟 2.176 總體 1.854

Ref : A Schema for Absorbed-dose Calculation for Biologically Distributed Radionuclides, MIRD J. of Nucl. Med./Suppl· #1，2/68

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San Diego, CA 92161 62862-960914.DOC _ 101 本紙張尺度適用中國國家槺準(CNS) A4規格(210X297公釐) A7 B7 1294969 五、發明説明（99 ) II.結果 A.里2B8及2B8-MX-DTPA於試營内研交 1 •拖-CD20抗體2B8之產製及鑑定由二種可產製融合瘤的抗體可造成共9次的融合，此抗體係可與經放射標誌之Coulter B 1抗體有效地競爭。在各例子中，融合瘤擴大到2 4孔洞的盤中。由第3及4次融合中分離出的前二個抗體是同型，且均鑑知為IgM。第三種抗體，由第5次融合所產生並命名為2B8，經決定是igGl k同型，並選用於繼續研究。純系2B 8· HI 1予以擴大，並可長期貯於液態氮中。純系2 B 8 · Η 1 1繼代選殖產生純系 2 Β 8 · Η 1 1 · G 3，並再次產生純系2 Β 8 · Η 1 1 · G 3 · G 9。此純系擴大以繼續研究，抗體再以蛋白質Α親和力層析純化。利用未經標諸之2 B 8，B 1及Leu 16經放射標誌、之Coulter B1行競爭分析，證明2B8在抑制B1與CD20結合上較同濃度的B 1或Leu 16更有效率（圖1 )。在利用FiTC -共輛之 2B8，天然的B1及不相關抗體UPC-10及S-003之競爭研究中可得類似結果（數據未示出）（UPC-10及S-003分別是 IgG2a及1同型）。以FACS分析比較2B8及B1抗體對細胞CD20抗原之直接結合，並利用CD20-陽性之SB細胞及CD20-陰性之HSB細胞。示於圖2之結果顯示，於抗體之可比較劑量下，與8 b 細胞結合之2B8多於B 1。而以不相關的抗體則未見與sb細胞有顯著的結合。任何使用之試劑與HSB細胞僅可見到背景值螢光。這些結果證實2B 8與CD20抗原交互作用之特異 62862-96Q914.DOC -102· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1294969

性，且推知對細胞表面抗原而言，2B8有較βΐ為高之親和力。 ▲士為了决疋2B 8之表現親和力，經純化的抗體以125】放射標 "且/辰度漸增的經標誌抗體與抗原-陽性的S B細胞共培育；經過！小時的培育期可決定與細胞有關之放射活性（圖 3)。結果推知，2B8抗體與⑶別抗原結合之表觀親和力常數是 4.3x 1 〇·9Μ 〇以人類正#周邊血液淋巴細胞進行的流動細胞計數研究顯不，2Β 8與Β-細胞具特異性，且不與其他型式之淋巴細胞反應（如τ -細胞，單核球，巨噬細胞）。經FITC _標誌之 2B8，利用人顏淋巴細胞相的族群，與Bl_FiTc&Leu 16_ FITC比較。示於表21之結果顯示，2B8與周邊血液淋巴細胞之反應約1 4 0/〇，相較於Leu 16之1 2 %及B 1之1 1 %。在另一B_巴細胞標幟（c D _丨9 )為準之淋巴細胞族群，為介於 11及14%之間。最後，當人類周邊血液淋巴細胞與2B8及 B1 或 Leu 16 共培育，再以 CD19 標幟（Bect〇n/Dickins〇n)對比染色’則B淋巴細胞雙重染色族群為以2 b 8的9 %及B 1或 Leu 16的1 〇 %。這些結果證實這些試劑的類似性。

62862-960914.DOC -103- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1294969 B7 五、發明説明（1Q1) 表2 1 比較2B8與其他B -及T- 對人類周邊血液淋抗體標幟 A.單一染色：淋巴細胞特異試劑巴細胞之結合 C D 4 5限制之淋巴細胞百分率無（自動螢光） 0 Bl-FITC(Coulter Immunology, (IgG2a,k) 11 Leu 16_FITC(Becton Dickinson，IgGl，k) 12 2B8-FITC(EDEC，IgGl，k) 14 B72.3-FITC(IgGl，k不相關之對照組） 4 抗-CD4-FITC(Coulter Immunology) 37 抗-CD3-FITC(Becton Dickinson) 59 抗-CD 19-RPE(Becton Dickinson) 11 抗-CD 19-FITC(Becton Dickinson) 14 B.雙重染色： Bl-FITC/抗-CD19-RPE 10 Leu 16-FITC/抗-CD19-RPE 10 2B8 FITC/抗-CD19-RPE 9 抗-CD19 FITC/抗-CD19-RPE 13 Bl-FITC/抗 Hu IgRPE 10 2B8-FITC/抗 Hu Ig RPE 10 B72.3-FITC/抗 HuIgRPE 2 Leucogate Simultest 99 62862-960914.DOC -104 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1294969 A7 ___ B7 五、發明説明（~ 2·1Β8_ΜΧ·ΡΤΡΑ之轰製及鑑定 • 2B8-MX-DTPA共軛物之產生係將抗體與4 : 1莫耳濃度過量之異硫氰酸苄基-3 -甲基二乙三胺五醋酸（4)反應。典型而言，每莫耳2Β8抗體，引入1-2莫耳的MX-DTPA嵌合物。如圖4之結果，2B8-MX-DTPA共軛物在免疫反應性上並未呈現表觀的喪失，與天然2 Β 8比較下因天然及共軛的 2Β 8抗體基本上呈現相同的β 1抑制概況；2Β 8及2Β 8-MX-DTPA之IC50值分別是約3及4微克/毫升。這些結果利用經 12 5 I -標諸之Β 1抗體於全細胞免疫分析（利用s B細胞進行）中獲得。利用2B8或2B8-MX-DTPA為125I-標誌之2B8結合至SB細胞之抑制劑，可得類似結果；2B 8及其MX_ DTPA共軛物均可以約3-4微克/亳升之濃度抑制與S B細胞之結合（數據未示出）。為評估天然的2B8抗體及2B8-MX-DTPA共軛物之試管内穩定性’於生理食鹽水或含有1 〇 mM甘胺酸-HC1，p Η 6.8之食鹽水中之樣品，在4。〇及30°C下培育12週，再分裝並利用以下分析法每週評估之：以全細胞酵素免疫分析法行免疫反應性，在還原及非還原條件下行SDS_pAGE，及等電焦距凝膠電泳。雖然免疫反應性分析法對於抗體樣品在任一溫度下培育，測及並無抗原確認上之喪失（圖5 )，但是抗體之等電焦距範圍（pH 7.30-8.40，在第零週），其在4t 下是穩定的，在3 0°C下一週後確實呈現〇·2 pH單位之下降 (表22)。此結果或許是模稜兩可的，然而，其係在分析之實驗誤差限制下。 62862-960914.DOC _ 1 05 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1294969 A7 B7五、發明説明（1Q3) >H^2B8^2B8-MX-DTPMriJ3iD^;Fd3s^穿斜涔+ - iu#.s"^4d^30d-f 12筚。^^括3- 保^妒薄今车巧本4:錡»知矜本煞¾斗扣妒s^#+ - >渰涔凇衆^»^^ ·ί^45Ί:ϊ?^θ- Jut#Hi^>^iE^itl2ia^H clfe^^^:2B8 4SL - 2B8^4niL 冷皞矢奇忝 t - 2B8 30SAL - 2Β8Λ30η~吟 g7Kti{r.f - 2B8 4GLY >2B8^4o~吟抖si-a-zg热 6¾^¾玲晡 ^-+^4 : 2B8 30GLY - 2B8^30o^呤斜 10 ΙηΜ4/&δέΛ*±ί1 玲晡添 W ·· 2B00—MX4 SAL ; 2B8.MX6TPACV!M2:i-4o.:t_S^K^i#*f:2B8-MX30SAL-^^^^30o^»7Ki#t" 2B8-MX-4.GLK;-^^穿 >Μο~吟科 10 mM4^热~忤»玲睜；TK+&4 ip2B8-MX 30 GLY *» 求穿私 300.41呤妍 10 ΓΠΜΦ^洱泠 W7K +添·f。 2 3 私 5 6 7 OQ 9 o 11 12 7.46-8.37 7.39-8.24 7.300-8.27 7.47 丨8.301 7·38-8·24 7.29 丨 8·25 7.24-8· 12 7·39-8.32 7.33 丨 8.29 7.4900·53 7·26·8·27 7.498.27 7.2600.18 7.42-8.27 7·45,8.:Μ 7·33-8·35 7.38-8.24 7.2900.25 7M98.27 7.17- 8.32 7.26- 8.36 7.26- 8.45 7.19-8.27 7.18- 8.27 7.04-8. H00 7.46-8.37 7·46·8.31 7.45-8.40 7.40- 8.29 538—8.35 7·37-8·32 7.27 丨 8.27 7·35·8·25 7.40- 8.36 7.41- 8.45 7.26-8.27 7.S.8.35 7·26·8·18 7.46.8.24 7_45-8·:Μ 7·33ά·29 7.300-8108 7.37·8.32 7.298.12 7·17_?°47 7.34-S.30 7.19-8.27 7,18-8.13 7·19·8·11 6.398.21 6.3900.26 602,8.40 6.0-8.29 5.99_00·2ΟΘ 5.90- 8.32 5'005·8·27 6ο2·8·25 5·86-8·36 5.S.8.45 5·95·8·35 5.93-8.35 5.90- 8.26 6.39-8.26 S2-S4 6.98.29 5·99·.°°35 5.S 丨 8·27 5.85-8.27 5·86 丨 8.36 5.5- 8.45 5.5- 8.35 5.s-8.27 5.998.18 6.30-8.21 6.32-8.24 6.02-8.40 6·0.8·22 5.9S.35 5.5- S.32 5.5- 8.27 5·95-8·32 5.86-8.36 5ιο3έ5 5·88ώ.35 U1.93-8.27 5.90-8.26 6.25-8.24 5.9500.27 6·0·8·15 5.99-8.35 5·90-8·27 5.85- 7.95 S 丨 8.32 5.86- 00.21 5_93 丨 8.23 5.95-8.13 ^93-8.13 5.998.18

2Β00/2Β8·ΜΧ-ΙΠΤΑΡΙ 恭命 11¾ 2B8 4 SAL 2B8 30 SAL 2BIOOI4 GLY 2B8 30 GLY 2B8-MX 厶 SAL 2B8.MX 30 SAL 2Β8·ΜΧ S一 GLY 2B8-MX 30 GLY

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本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 1294969 五、發明説明（1Q4) 最後，利用非還原SDS-PAGE，30°C抗體樣品在1週後呈現高分子量的凝集物（表23)。凝膠的密度分析顯示，凝集物代表8及17%間之樣品（表23)。然而，當這些樣品以還原性SDS-PAGE分析時，未見有高分子量種類之證據，推知在 3 0 °C有共價抗體凝集物之形成。同樣的，未觀察到免疫反應性之喪失。表23 2B8之試管内穩定性

62862-960914.DOC - 1 07 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1294969

在此穩定性研究過程中，2B8_MX_DTPA樣品在4。〇及 3 0 °C下培育，也利用9〇γ測試放射金屬納入情形❶在4，8 及12週分析之樣品可納入9〇%以上的”γ，而不論培育溫度為何。最後，在另一個研究中，一份238-]^：^_1)丁1>八在4弋及 30°C下培育1〇週，並以⑴^放射標誌，再於balb/c老鼠中分析其組織之生物分佈。在二種培育溫度下之共軛物可有類似的生物分佈（數據未示出）。再者，利用Ull_標誌之共軛物，貯於4°C下，於BALB/c老鼠所得的生物分佈結果和所得的結果相似。（見下文）^ 111 In及9 GY之放射標誌策略頃發現都是可再現的。典型而言，對於^Ιη有95%以上之放射併入，而9〇γ有9〇%以上。1及^ Υ-標諸之共輛物，其比活性分別例常在2 - 3及 10-15 mCi/毫克之間。在放射標誌策略的最初發展中，利用HPLC凝膠滲透層析，將未複合的放射標誌自經放射標誌之2B8-MX-DTPA中移去。在較後之實驗中，消去經姻-標誌共軛物之HPLC純化，因為以此同位素可得高的放射併入率（>95%)。以Lindmo(3 )方法分析經111 in及9〇 γ·標誌之2b 8-MX-DTPA產製之免疫反應性。頃發現"ιΙη_標誌之2β8-ΜΧ· DTPA具100%免疫反應性（圖6)，而9〇γ·標誌之共軛物具 6 0%免疫反應性（數據未示出）。 3 ·1 111-及9 0 Υ -標誌之2 Β 8 _ Μ X · DTP a之特攸化以9 G Y -標誌之共軛物行初步實驗證明，有顯著的抗體降 -108-

62862-960914.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1294969 A7 B7 五、發明説明（106) ^ ’並在比活性>1〇 mCi/亳克抗體時會發生免疫反應性之喪失。因此，發展出調和物將放射分解之影響減至最小。雖然有許多低分子量自由基清除劑被評估，且發現是有效的仁在保持抗體完整性及免疫反應性上仍以高濃度的人類血清白蛋白（HSA)為最有效。經9G Y-標誌之抗體調和在含有7 5毫克/亳升^^八之以 PBS，pH 7.4中，也加入二乙三胺五醋酸（DTpA)至i福之終濃度，以確保可能自抗體中喪失之任何9❹γ可予以嵌合。放射標誌至14.6 mCi/亳克比活性之2B8-MX_DTpA ^ 在0及4 8小時時利用SDS_PAGE及放射自顯術評估其降解作用。圖8及9顯示，經放射標誌之抗體在4。〇時培育，其降解作用歷48小時仍無顯著的呈現。利用即時薄層層析分析顯示，在48小時之培育間9〇γ之喪失未少於2%(表。免疫反應性在6 0 %時也相當固定（表2 4 )。 62862-960914.DOC - 1 09 - 本紙張尺歧财® ®家料(CNS)八4縣(21()><297公釐） 1294969

表24 穩定性免疫活性 _百分率 62 60 臨床-調和之9GY-2B8-MX_DTPA< 。與共輛物相關時間(每^ c下:Sdlff) 之放射活性百分率 0 24 97.2 96.2 經放射標誌之共軛物（14·6 mCi/亳克比活性）調和在含有乃毫克/毫升人類血清白蛋白及i mM DTPA之pBs中， 7·4，並分裝培育在4 °C下。分析共輛物之穩定性，利用 SDS-PAGE及放射自顯術，立即薄層層析及全細胞結合分析。數值顯示，4°C下48小時後，約有96%之放射金屬仍可與共軛物保持結合，且在約6 〇 %時，抗體免疫反應性仍保持固定。也以111 In-標記之共輛物來進行調和研究，比活性是2 2 mCi/毫克。在含有50亳克/亳升HSA之IX PBS，pH 7.4中評估經放射標誌之抗體。圖1 〇示出〇及4 8小時培育樣品之放射自顯圖照片。照片之密度分析顯示，在整個研究期間，經放射標誌之抗體並無降解（圖η，12)。樣品之即時薄層層析證明並無11 hn之喪失（表25);再者，免疫活性維持在約100 %(表2 5)。

62862-960914.DOC -110- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公董)

A7 B7

1294969 五、發明説明（108) 表25 臨床調和的時間(在4°c下之小時） ^^η^Βδ-ΜΧ-ΟΤΡΑ^ 與共輛物相關之放射活性百分率穩定性免疫活性百分率 0 94.0 105 24 96.5 104 48 96.0 100 放射標諸之共輛物（2·2 mCi /亳克比活性）調和在含有5 〇毫克/亳升人類血清白蛋白的PBS，pH 7.4中，並分裝培育在 4t：下。共軛物穩定性以SDS-PAGE及故射自顯術分析，即時薄層層析，及全細胞結合分析。結果顯示在4 下4 8小時後，約9 6 %的放射標誌可與共軛物一起保留，且抗體的免疫反應性保持固定在約1 〇〇 %下。當放射標誌以9G γ至14.6 mCi/毫克比活性之2B 8·MX-DTPA臨床調和製劑，在3 7 °C之人類血清中培育9 6小時，再以非還原性SDS-PAGE及放射自顯術分析，於培育過程中喪失之放射標誌少於4 %。放射自顯圖在〇及9 6小時時之密度掃描顯示，放射標誌之共軛物並無顯著的降解。（圖1 3 _ 1 5 )。這些結果由〇及9 6小時時之分析式薄層層析分析中可 4證（表2 6)。綜合這些結果推知，以纪_標諸之共輛物在此研究所採用之條件下是穩定的。以"ιΙη_標誌之2Β8·ΜΧ_ DTPA共軛物可得類似的結果（圖！ 6_ i 8)。 62862-960914.DOC - 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 1294969 五、發明説明（109 表26 90Y-2B8-MX - DTP A共轭物在3 7 °C之人類金清中培育9 6小時之分析式薄層層析時間(37°C下小時）共軛物相關之放射活性百分率 0 95.1 24 95.2 48 93.2 72 92.0 96 91.4 在所示時間點時分析含有人類血清之9GY-2B8-MX_DTPA (比活性14·6 mCi/毫克），係將1徵升的1 ·· 20樣品稀釋液點在即時薄層層析長條上；樣品分析三次。層析長條之展開是向上層析於1 0%醋酸銨於曱醇：水（1 : 1 ; v/v)，乾燥，再交又地切半。與各條底部及上半有關之放射活性再予以決定，並估算出與共軛物有關之放射活性百分率。（自由態放射金屬在溶劑前移動，而與蛋白質結合之放射活性保留在原點）。示出與共軛物有關之放射活性決定值之平均。 B .動物研究 1 ·以2B8及2B8-MX-DTPA行高劑詈藥理/毒性研究在 White Sands Resarch Center (Study No. 920111 )(白沙研究中心）進行的glp研究中，猴子靜脈注射以各種劑量之 2B8。在各次新注射之前採血，再處理血樣以流體細胞計數評估淋巴細胞族群。（表2 7 )。 -112-

62862-960914.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1294969 B7 五、發明説明（11Q ) 表27 以流體細胞計數決定靈長類B細胞族群，在灌注以抗-CD20鼠類單株抗體2 B 8之後動物數# 劑量天數 B細胞a，b 耗盡率％ I組 452 食鹽水. 0 20.1 0 1 18.3 9 7 21.6 0 13 14.6 27 38 15.5 23 52 18.6 7 424 食鹽水 0 12.4 0 1 11.6 6 7 11.2 10 13 8.4 32 38 7.7 38 52 13.1 0 II組 540 0.6毫克/公斤 0 16.1 0 1 7.1 54 7 6.0 63 13 5.7 65 38 10.8 33 52 14.4 11 804 0.6毫克/公斤 0 17.6 0 1 8.3 53 7 6.1 65 13 6.6 62 38 5.1 71 52 5.2 68 62862-960914.DOC -113-、本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1294969 B7 五、發明説明（ 111 ) III組 701 2.5毫克/公斤 0 21.6 0 1 10.7 50 7 3.0 86 13 10.7 50 754 2.5亳克/公斤 0 19.9 0 1 11.2 44 7 10.5 47 13 9.0 55 IV組 782 10毫克/公斤 0 15.9 0 1 3.0 81 7 3.5 78 13 6.5 59 164 10毫克/公斤 0 17.7 0 1 8.4 47 7 7.9 50 13 7.7 42 V組 705 10毫克/公斤 0 17.2 0 1 5.2 70 7 1.3 69 13 8.2 52 38 17.1 1 52 13.3 22 716 10毫克/公斤 0 34.7 0 1 18.6 46 7 8.1 77 13 3.5 90 38 6.9 80 52 9.2 61 a總淋巴細胞百分率 62862-960914.DOC -114- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 1294969 五、發明説明（112) 由雙重染色標幟試劑抗老鼠IGG-RPE+抗人類 FITC(抗老鼠IgG RPE可偵測2B8阻斷之CD20，且抗人類 IgG FITC可偵測猴子B細胞表面lg) 在第I至IV組之動物每48小時注射，共七次；第v組動物在第0天注射一次。第III及IV組動物於14天時犧牲。在研究中或之後評估的任何臨床變數上，均未見投予抗· CD20抗體2 B 8有關之任何顯著的藥物毒性作用。類似的，在由III及IV組動物所得的各種組織病理檢品的研究中，也未見有不正常處。研究期是1 4天，並在研究中以下列各類來評估動物··臨床觀察，體重，體溫，食物及水之攝入，糞便之減少，血清化學，血液學，尿液分析，及身體檢查。另外，各組動物在第0 ’ 1，7及13天時採血，再分析血清抗體（2B8)水平及T -及B -細胞水平。在第13天，第III及1乂組之動物犧牲’檢品準備好再以光學顯微鏡檢查選定之組織。所評估之組織為：心臟，脾臟，肝，腎臟，肺，腦皮質，脊柱，淋巴結’胃’迴腸’結腸，骨胳肌，睪丸/印巢，騰臟及骨鏞。當分析受試動物血中之循環T -及B -細胞水平時，π至V 組動物之循環B -細胞，在1 3天時呈現5 0 %以上之喪失（圖 19) ’抗體之投予在T-細胞水平上並無影響（數據未示出）。接受2B8 ·的各組顯示B -細胞之飽和及血漿中過多的抗體（未示出）。第V組動物，接受1〇·〇亳克/公斤單一劑之2B8，也 _62862-960914.DOC -115- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（”3 ) 呈現循環B -細胞水平之減低，此和在他組動物所見的相當。在第I，II及V組之動物於第52天時檢查（圖20)。B-細胞在第3 8天之水平回到正常值之70%以上，除了 π組的一隻動物（PRO 804)及V組的一隻動物（PR0716)。在這些動物中的循環B-細胞水平，52天後維持在正常水平的約4〇〇/〇處。除了此研究之外，白沙研究中心之GLP研究中（study No. 920611)也評估89Y-2B8-MX -DTPA在狼子中之藥理毒性作用。臨床級之共軛物填加以非故射活性之89γ。攜有纪之共軛物調和於PBS，pH 6·8中，内含有75亳克/亳升人類血清白蛋白及1 mM DTPΑ (臨床調和物），再如方法一段中所述地靜脈内投予。如圖2 1結果所示，在這些動物中，不論所投予之劑量為何，89Y-標誌之2B8-MX-DTPA少有（若有的話）作用於循環的Β -細胞上。此外，和淋巴細胞的一般耗盡不同的〇 _ 43%)，在所評估的任何臨床變數上未見顯著的異常處，包括血清化學，尿液分析，體重及溫度。 2 · j^.2B8及2Β8-ΜΧ - DTPA之藥物動力學研究如上述，GLP研究中之第v組動物，接受1〇〇亳克/公斤單一劑量之2B8。數據之線性回歸分析推知，天然抗體以約 4.5天之lStm值自猴子的循環中清除。在利用BALB/e老鼠之類似研究中，天然及共軛2B8以線性回歸分析所決定之冷 t!"值為8.75天（未示出）（圖22)。這些結果推測，2B8之共 - 62862-960914.DOC - 1 16 _ 本紙張尺度適用巾B國家鮮(CNS) Μ規格(21GX 297公复) 一 - A7 B7 1294969 五、發明説明（114 ) 軛作用對其自BALB/c老鼠中清除並無作用。 3·氬故射標誌之2B8-MX-DTPA之生物分佈及賤瘤定位研 %_ 以上述初步生物分佈實驗為基礎（2d部份），共軛的2B8以 "hn放射標諸至2.3 mCi/毫克，並以約1.1 "Ci注入12隻 BALB/c老鼠各自體内，以決定放射標諸物之生物分佈。接下來，5隻一組老鼠各自在1、24、48及72小時時犧牲，且取出其器官及部份皮膚，肌肉及骨路，再行分析處理。此外，也收集尿液及糞便，於2 4 - 7 2小時時間點分析。血中之放射活性於1小時的每克注入劑量之4〇.3 %降至7 2小時之 18.9%(表1-4 ;圖23)。心臟，腎，肌肉及脾臟之數值保持在0.7-9.8%範圍。見於肺之放射活性水平，由1小時之 14.2%下降至72小時的7.6% ;類似的，個別的肝每克注入劑里為10 · 3 %及9 · 9 %。這些數據可用於決定放射吸收劑量，以估算"ilndBe-MX-DTPA(表 19)。在BALB/ c老鼠中评估具有12.2 mCi /亳克抗體比活性之 9 0Y標誌共軛物之生物分·佈。可得大於9〇%之放射併入率，且經放射彳示遠之抗體以HPLC純化。於主要器官，及皮膚，肌肉，骨骼及尿液及糞便中，評估放射活性之組織沉積達 72小時，再以每克組織注入劑量之百分率表示。結果示於表5 - 8及圖2 4，其中說明雖然與血液結合之放射活性水平由1小時之每克注入劑量約39·2 %下降至7 2小時後之約 15.4%，但在整個過程中與尾部，心臟，腎，肌肉及脾結合之放射活性水平仍保持在相當固定的1〇2 %以下。很重 62862-960914.DOC _ 1 1 7 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公茇) 1294969 Δ7 Α7 ______Β7 五、發明説明（115 ) 要的，與骨結合之放射活性，由1小時之每克骨骼注入劑量之4.4 %到72小時的3.2%範圍中。综而言之，這些結果可推知’在研究過程中與共軛物結合之自由態釔極少，而釋出之自由態放射金屬也極少。這些數據可用於決定放射吸收劑量，以估算 90Y-2B8-MX-DTPA(表 20)。於腫瘤定位研究中，製備2B8-MX-DTPA並以^Ιη放射標諸至比活性2.7 mCi/毫克。1〇〇微升之經標誌的共軛物 (約24 // Ci)再庄入1 2隻無胸腺而有Ranios b -細胞腫瘤之老鼠各自體内。腫瘤重量範圍由心丨至^克。在注入後的〇， 2 4，4 8及7 2小時時間點時，由眼窩後方穿刺取出5 〇微升之血液’再以斷頸法犧牲老鼠，並取出尾，心，肺，肝，腎，脾，肌肉，股骨及腫瘤。組織經處理及稱重後，再利用7 a十數器決疋各組織檢品有關之放射活性，且數值以每克注入劑量之百分率表示。結果（圖25)證明’在整個實驗過程中，ι"Ιη>_2Β8_ΜΧ-DT^A之腫瘤濃度穩定地增加。7 2小時後，1 3 %注入劑量會累積在腫瘤中。相反的，在實驗中血中水平由〇時間之 3 0 %下降至7 2小時之1 3 %。所有的其他組織（除了肌肉例外）在實驗末了均含有1 _3及6.0 %每克組織之注入劑量百分率範圍；肌肉組織每克含有約1 3 %注入劑量。 C .密度偵測關於銦-及釔-標誌共軛物，分別由正常]3八1^]3/(^老鼠之生物分佈研究及示於表1 9及2 0之綜合密度偵測數據，當以每亳克居里注入劑量（5 )比較時是與文獻中所示之數據符合 62862-960914.DOC___**118 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1294969 A7 _____B7_____ 五、發明説明（116) 的’且推知2B 8的記-及銦-標諸之共輛物，均可在淋巴瘤患者中安全地進行臨床效力之評估。 D .毒性 1 ·超8 : Uj量一般安全性漁丨就老鼠及天竺鼠以單一腹膜内劑量之2B8投予（分別是〇·5亳升或5·0毫升）再觀察七天。未測及整體之毒性跡象。 2·^ΜΑ·2^_-ΜΧ-ΡΤΡΑ :以人類組織進行免癌組織學研 Ά. 利用一列3 2種以丙酮固定的不同人類組織，評估鼠類單株抗體2Β8之組織反應性。抗體2Β8可與抗- CD20抗原反應’其具有極受限之組織分佈型式，僅見於淋巴組織中之細胞子集中，包括源自造血者。在淋巴結中，可在成熟的皮質Β -淋巴細胞以及生殖中樞内之增殖細胞族群中觀察到免疫反應性。正面的反應性也見於週邊血液，扁桃腺之Β-細胞區域，脾之白髓及見於胸腺中4 0 - 7 0 %之骨髓淋巴細胞。正面的反應性也可見於大腸集合淋巴結（派亞氏腺）中之濾泡。最後，在各種器官基質中之聚集或四散之淋巴細胞，包括膀胱，乳房，子宮頸，食道’肺’肥腺，前列腺，小腸及胃，對於抗體2Β8也呈陽性。所有單純的上皮細胞，以及條狀上皮及不同器官之鱗狀上皮均是無反應性的。類似的，與神經外胚層細胞亦無反應性’包括在腦，脊柱及周圍神經中者。間葉元素，如骨絡及平滑肌細胞，纖維母細胞，内皮細胞及多形核發炎細 62862-960914.DOC _ 1 1 9 _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（117 ) 胞也發現是陰性的。利用一列1 6種已用丙酮固定之人類組織，來評估2 B 8 -MX-DTPA共軛物之組織反應性。如先前以天然抗體所說明的，2B8-MX-DTPA共軛物可確認CD20抗原，其呈現高度之分佈受限型式，只見於淋巴系細胞子集。在淋巴結中，於B -細胞族群中可觀察到免疫反應性。於脾之白髓及胸腺之髓質淋巴細胞中可見強烈的反應性。也可在膀胱，心臟，大腸，肝，肺及子宮之分散淋巴細胞中觀察到免疫反應性，此可歸因於在這些組織中存在有炎性細胞之故。如天然抗體所述的（上文），以神經外胚層細胞或間葉元素則並未觀察到反應性。 III.討論以相同命名之純系所產生之鼠類單株抗_CD2〇抗體2B8，對B -細胞CD20抗原呈現親和力，且此高於在b 1抗體中所見的，可由與已知特異性抗體對CD20抗原之競爭中，以及由Scatchard分析中決定。進一步由免疫沉澱數據推知，由 2B8所沉澱之抗原似乎與*B1所沉澱者相同，因此二抗體會沉澱出相對分子量為33及35 KD之雙重線。2B8抗體對周邊血液淋巴細胞特異性之細胞氟描記分析證明，抗體可與B-細胞特異地·反應，且與τ_細胞或其他淋巴細胞型式無明白之反應性。最後，初步的穩定性數據推知，抗體在切 C下可穩定達1 2週，而且無免疫反應性之喪失。當2Β8抗體與甲基芊基二乙三胺五醋酸（Mx_DTpA)共輛，可觀察到相較於天然抗體，基本上無免疫反應性之減 62862-960914.DOC _ 1 本紙張尺度適财S @家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1294969 A7 _____B7 五、發明説明（118 ) 少。再者，以luIn或9GY放射標誌共軛物，可分別產生免疫反應性100%及60%之經標誌的共軛物。ulIn或9GY-標誌之共軛物在3 7 °C之人類血清中培育9 6小時之穩定性研究顯示，在研究過程中放射金屬之喪失幾可忽略，可推知共軛物當於臨床應用時是穩定的。利用經銦·標誌之2B8-MX-DTPA製劑在無胸腺老鼠中行腫瘤定位研究證明，在實驗過程中漸增量之共軛物可結合至腫瘤細胞，而其他組織中並無異常的累積。再者，劑量計法由生物分佈衍生估算，且此與文獻中發展之數據符合。最後，人類組織與天然及共軛抗體之交叉反應性研究顯示’此二抗體均可與高度受限之組織分佈之抗原確認，僅可與淋巴組織中一子集之細胞反應，包括源自造血者。綜合而之’這些結果推知共軛作用不會改變抗體之組織特異性’且經放射標誌、之共輛物於活體内是穩定的，並可確 δ忍由無胸腺老鼠實驗產生之腫瘤表面上所存在之CD2〇抗原。當2B8應用於高劑量藥理/毒物學研究時，抗體在研究中或之後的任何變數評估上，均未產生顯著的藥物毒性作用。類似地，各種組織病理檢品以光學顯微鏡檢時，也未見異常之處。令人驚訝地，所有採血之抗體劑量下，均可使循環的細胞產生顯著的耗盡情況。然而，一旦停止抗體之投予，循環的B·細胞水平確實會回復到大概正常水平。在單-劑量之猴子組中（第”且），天然抗體以約4.5天之表現心1/2值自循環中清除。可斷言的，當此藥物動力學

62862-960914.DOC 1294969 Δ7 Α7 _ —_Β7 五、發明説明（119 ) 研九疋在BALB / c老鼠中進行的，則2B8抗體可以8.75天之 3tW2值清除。因此，總而言之，這些數據可推知，天然抗體當以放射標誌共軛物之佐劑型式投予時，也可提供某些臨床作用。

吾等數據的整體可顯示，高親和力的238抗體及其Μχ_ DTPA共軛物，呈現受限的人類組織反應性型式。再者，於靈長類中’天然的抗體是無毒的且可造成B ·細胞之暫時清除作用；然而，一旦抗體自循環中清除，B ·細胞水平可合理地快速回復。另外，以銦-及釔-標誌之2B8_MX_DTpA 共軛物在試管内似乎是穩定的，在人類血清中延長培育期中並無放射金屬之喪失。最後，由B alb / c老鼠中9 0 γ _或 111 In-標誌之2B 8 -MX_DTPA生物分佈衍生所估算之放射劑量，每注射劑量之亳居里計，符合由人類臨床研究所衍生估算之劑量，而此研究是利用以這些同位素放射標誌之共軛的抗-共有之同型抗體來進行。 IV·製備9〇y_2B8-MX<bDTPA之，，混合及掃射，，放射標誌策略臨床前發展之要點 A.前言經9GY-標誌之鼠類單株抗_CD2〇抗體（2B8)已在工期臨床 «式驗中坪估，以治療抒緩之B -細胞淋巴瘤。在用來製備經妃-“ 之抗體之原先策略中，使用高性能液相層析（HpLC) 步驟來移去與放射標誌結合之非蛋白質，再行調和及投予至患者。不幸地，此過程特別耗時，造成抗體以未保護階 ί又較長曝路於放射仏遠、下。此造成抗體漸增之放射溶解， 62862-960914. Dnr. - 1 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) A7 B7 1294969 五、發明説明（120 ) 同時免疫反應性減低。另外’此過程費力的方面，使得在放射藥局中每天難以製備一劑以上。簡化製程可促進在臨床位置對此工作之完成度，是利用NIPI Pharmacy Services 之放射藥學外另一選擇。因此，發展出修正版的放射標誌步驟，稱之為π混合及掃射’，方法（’，11^-壮11(1-811〇〇1:”），其中略去1^1^純化步驟同時可維持高的放射併入率，並改善免疫反應性之保留性。在老鼠中之試管内穩定性研究以及生物分佈研究顯示，利用 n mix-and-shootπ方法製備之放射標諸之抗體，可與利用目前HPLC方法所產生之物質相比。這些臨床前研究之結果顯示，此新的"混合及掃射，，策略可用來製成適用於臨床之 90Υ-標誌之2B8-MX-DTPA。 Β .材料及方法材料 1 .細胞人類淋巴母細胞株SB(CD20陽性）及HSB(CD20陰性）得自美國標準菌種收集所，並維持在含有1 0%胎牛血清並添加有榖胺醯胺之RPMI- 1640中。 2.抗體 2B8抗體經製造部門自中空纖維生物反應器中純化，利用 IND先前所述之策略（BB-IND 4850/4851 )。 3 .額外的Igl 氯化纪-[9〇]得自Amersham。其他試劑得自下述報告中所描述之來源。將放射標誌策略中所用的試劑進行處理， -123-

62862-960914.DOC 本紙張尺度適用中國國家檩準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1294969 A7 B7 五、發明説明（121 ) 以移去摻雜的重金屬離子，其可在放射標諸步驟中與放射標諸競爭（見方法部份）。試劑在GMP條件下由iDEC，s-製造 4門依循已發展之Batch Production Records製造。方法

1 ·製備 2B8-D4X-FITPA 臨床級之MX·DTPA以二納鹽於水之型式得自coulter

Immunology ’ 並貯於下。共轭物（2B8__mx-DTPA) 由製造部門製備。在這些研究中使用二批不同批號之共軛物，二者均以10毫克/亳升，提供於生理食鹽水中。共軛物充填在無菌的2亳升聚丙烯注射器中，並貯於2_8°c下。 2 .無金屬狀況之_ _ 所有試劑均進行操作處理以將金屬污染之可能性減至最小。使用聚丙烯或聚苯乙烯塑質容器，如燒瓶，燒杯及計虿之I筒。這些均以Alconox洗滌，再以Milli-Q水或灌注用水(WFIr)於使用前充份潤洗。使用無金屬之吸量尖端 (BioRad)以正確操作小劑量。較大量之試劑則利用無菌，塑質血清學吸量管來操作。反應可在18亳升有螺紋蓋之微量離心管（由聚丙烯製成）中合宜地進行。 3 .放射併入率之決定利用即時薄層層析（ITLC)依據s〇p sp_13_〇〇8決定放射併入率共三次。一般而言，策略如下：經放射標誌之共軛物以 1 : 20稀釋於含有 i mM DTPA45 福 EDTAiixpBs 中，再取1微升點在lx5公分之ITLC SG紙長條之一端達15 公分（Gelman Sciences)。紙利用1〇%醋酸銨於甲醇··水 62862-960914.DOC _ 1 24 · 本紙張尺度適财@ @家標準卿8)44規格(2麟297公釐)一 --- 1294969 A7 _____B7 五、發明説明（122 ) (1 : 1，V/V)中展開，長條再乾燥，十字切半，再以液體閃燦計數決定各段中之放射活性。與長條下半段結合之放射活性（與蛋白質結合之放射活性）再以總放射活性之百分率表示，可利用由上及下半數值之總和來決定。 4 ·對豈釔-『901^標$ 之”混合及掃射”策略抗體以Amersham提供之於0.04 μ HC1中的無載劑9〇 γ氣化物放射標誌之。取一份放射標誌（1〇_2〇 mCi/毫克抗體）轉移至聚丙烯管中，再加入0·02Χ體積之無金屬2]^醋酸鈉，以將溶液之pH值調至3·6。再立即加入2B8_NaDTpA (0·3毫克；10·0亳克/亳升於生理食鹽水中），並緩和混合溶液。溶液以pH紙檢查以證實ρΗ值在3·8-41，且培育5分鐘。反應轉移至另一個聚丙烯試管以中止之，其内含有1χ PBS並加有75毫克/亳升人類血清白蛋白（HSA)及i mM二乙二胺五醋酸（DTP A )，再緩和地混合。經放射標誌之抗體貯於2 · 8 °C下。決疋比活性，係決定放射樣誌、共輛物適當量下之放射活性。此數值對計數器效率校正之，係和共輛物之蛋白質濃度有關’由280耄微米下之吸光度來決定，且以mci/毫克蛋白質表示。 5 ·羞乙d 9 01- 2B 8 - MX-DTPA之試管内务,_反應性利用SOP # SP13-009來決定Μ Y-標誌之共軛物之免疫反應性’其係以Lindmo所述之全細胞結合分析法修飾版為基礎。將在對數期之濃度漸增之CD20·陽性SB細胞或CD20陰 62862-960914.DOC - ^ 25 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1294969五、發明説明（ A7 B7 123 ) 性HSB細胞加至二個一組的Ί·5亳升聚丙烯試管；細胞之終體積為0.40亳升。經放射標誌之共軛物稀釋至毫微克 /亳升之最終抗體濃度，再於各管中加入〇·35亳升。經過9〇分鐘之培育，細胞以離心方式使成團塊，再收集上清液。留於上清液部份之放射活性以液體閃爍計數器決定。以數據緣圖，是所加入之總放射活性除以與細胞結合之放射活性之商，對每管中細胞數目之倒數作圖。y軸截矩代表免疫反應分數。 6.痤床-調和之釔-「901268-]^又-〇丁？八之諕管肉_金钟 2B8-MX-DTPA共軛物以9GY放射標誌，再如上述之”混合及掃射’’策略調和之。製備二批放射標誌之共軛物；一批用於評估放射併入穩定性，且另一批用來評估免疫反應性之保留。所調和之共軛物在4 °C下培育4 8小時，取數份在 0 ’ 24及48小時時以未還原之SDS-PAGE及放射自顯術分析。利用上述之分析法評估在各時間點下之免疫反應性。 7-人類.血清中釔-『901-26 8->^又_〇丁？人之試營内穩定性由培育在人類血清，3 7 °C下，高達7 2小時來評估9 0 Y -標誌之2B8-MX-DTPA之穩定性。共軛之抗體以釔-[90]放射標誌，再如上述地調和。經放射標誌之共軛物以正常人類血清（未以熱失活者）1 : 1〇稀釋，再分裝於37 °C下之塑質試管内。所選定之時間下，取出樣品並以未還原之SDS-PAGE及放射自顯術分析之。 8·釔二Li〇卜2B8-MX-DTPA之生物分佈經纪-[90]-標誌之2B8-MX-DTPA在8至10週大之 62862-960914.DOC - 1 26 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（124 ) BALB/c老鼠中進行組織生物分佈之評估。經放射標誌之共軛物如上述般製備及調和。老鼠靜脈内注入5 // C i的9 G Y -標誌之2B8-MX-DTPA，每組5隻老鼠再於1，24，48及 7 2小時時犧牲。犧牲後，移出尾，心，肺，肝，腎，脾，肌肉，股骨，洗滌，稱重；也取出血液及皮膚樣品以供分析。再利用7計數器偵測放射性以決定與各組織樣品有關之放射活性，再求得每克組織注入之劑量百分率，及每個器官注入劑量百分率。 9 ·劑量計量以9GY -標誌之2B8-MX-DTPA注入老鼠求得生物分佈數據，再以此用來估算出由1 ·0 mCi劑量投予至7 0公斤病人中所吸收之放射劑量。估算依Medical Internal Radiation Dose (MIRO) Committee of the Society of Nuclear Medicine 採用之方法來進行。這些估算之執行是Mr. Phillip Hagan， Nuclear Medicine Service, VA Medical Center, La Jolla, CA 92161 。 10.釔-[~9 01 -233 8 -1^乂-0丁？入臨庆劑量製備籃略之證實 (參考R&D報告的”製備9()丫-26 8-厘又-0丁？八臨床劑量之 ”混合及掃射”放射標誌策略之證實；作者，P . Chinn ;曰期1994年4月22曰）。 C .結果

1 ·利用”混合&掃射”篦略製備釔-「9 01-標誌之2B8-MX-DTPA 以2B8-MX-DTPA及9ΌΥ評估放射標誌反應動力學之初步 62862-960914.DOC _- 127 ~ 、_ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（125 ) 實驗顯示，在pH 3.6-4.0下，反應時間在5至10分鐘，可納入9 5 %之放射標誌。接下來在針對擴大規模策略之證實研究中，證實此放射併入率之再現性（95.7% ±1.7%)(參考 R&D報告，標題為”製備9GY-2B8-MX-DTPA臨床劑量之” 混合及掃射π放射標諸策略之證實；作者，p · Chinn ;曰期 1994年4月22曰）。利用此”混合&掃射，，策略製備9〇γ_標誌之2B8-MX-DTPA可生成可與以HPLC方法產生之產物相比者（見BB-IND 4850/4851)。頃發現放射標諸策略是可再現的，比活性為由10至15 mCi/亳克抗體。利用此策略製備之9 G Y -標誌之2 B 8 - Μ X - DTP A之免疫反應性通常大於7 0%，與針對HPLC策略之證實流程中所觀察到的5 5 -60%可比得上（圖26)。此差異可能是由於採用”混合及掃射”策略中培育時間減少造成放射分解作用減低之故。此結果通常且如下所討論，代表製備放射標誌共軛物臨床劑量時針對擴大規模策略之證實用流程。 2.!1^標誌之288-]^又-0丁？人之試營內穩宕柹以利用HPLC策略所製備之未保護之9〇γ·抗體共軛物行初步實驗可證明，放射分解作用會造成顯著的抗體降解及免疫反應性之喪失。因此發展出一種調和緩衝溶液，以將放射分解作用減至最低。已示出人類血清白蛋白（HSA)可有效地減低由於放射分解所致之抗體降解作用。以利用 ”混合&掃射”方法製成之放射標誌共軛物來進行評估，以證實調和物在減少放射分解作用之效力。將比活性達14.5 mCi/毫克抗體之9〇γ·標誌之抗體，調和在1><;^8，pH 74 62862-960914.DOC _ 1 28 本紙張尺度適财S @家辟(CNS) A4規格(21GX 297公釐)' ---- A7 B7 1294969 五、發明説明（126 ) 中，其中含有75毫克/毫升HSA及1 mM DTPA。在0，24及 48小時時利用SDS-PAGE及放射自顯術評估共軛物2B8-MX-DTPA之降解作用。圖2，3及4顯示，當培育在4°C 下，放射標誌之共軛物呈現出並無顯著的降解作用達4 8小時。即時薄層層析顯示，在48小時之培育期間並無9GY之喪失；這些結果由SDS-PAGE/放射自顯分析確認（表28)。免疫反應性也相當固定於88%以上（表29)。表28 ”混合及掃射”的9()丫-268-]^又_0丁？八於含有人類血清白蛋白及DTPA之PBS中之穩定性

裝與共軛物有關之放射活性百分率時間(小時） ITLC SDS/PAGE 0 92.9 96.0 24 95.5 95.4 48 91.3 94.6

表29 混合及掃射”之9()丫-2 68-]^乂-0丁？八於含有人類血清白蛋白及DTPA之PBS中之免疫反應性時間（在4°C下之小時數）免疫反應性百分率

0 87.9 24 88.5 48 90.4 62862-960914.DOC_- 1 29 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（127 ) 比活性1 5.7 mCi /宅克之臨床調和的90 γ_標誌、的2B 8 -MX_DTPA，在37 °C之人類血清中培育72小時。樣品以非還原SDS-PAGE及放射自顯術（圖30)分析顯示，在培育過程中無放射標諸之喪失（表3 0 )。在〇時及7 2小時之放射自顯圖經密度掃描顯示，經放射標誌之共軛物並無顯著的降解作用（圖3 1及3 2)。這些結果以薄層層析確認（表3 〇 )。應注意到’針對本研究中所使用抗體之放射併入作用較標誌桌略確認研究中所得的還低。此較低的放射併入率可歸因於用於此放射標誌抗體特殊製備中之9 〇 γ氯化物批次品質減低之故。較低之放射併入率並無法改變結論，即以"混合及掃射π方法製備之以記-標誌、之共輛物，在這些培育條件下是穩定的。表30 9()Y-2B8-MX-DTPA共軛物培育在人類血清中之穩定性疫間(在37 C下之小時數) 般Μ物有Μ之:¾:紐性百分率 ITLC SDS/PAGE/放射自顯 0 85.7 88.8 24 76.4 90.0 72 87.6 88.7 含有二Y-2B8-MX-DTPA之人類血清樣品（比活性15.7 mCi/宅克）利用即時薄層層析長條及SDs_pAGE/放射自顯術依所示之時間分析未與蛋白質結合之9〇γ。 62862-960914.DOC _ ^ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公复)一 A7 B7 1294969 五、發明説明（128) 3.私乾dX〇12B8^〇L^TPA衍生物免」涉研究在BALB/c老鼠中評估比活性為115 mci/亳克蛋白質及 95%以上放射併入率之”γ_標誌之共軛物之生物分佈。'在主要裔官，皮膚，肌肉，骨絡，尿液及翼便中評估放射活性在組織中之沉積達72小時，並以每克組織注入劑量之百分率，以及每器官注入劑量之百分率表示。示於表3卜34 及圖33之結果顯示，與血液有關之放射活性水平，由時之每克約43%注入劑量（％ID/克）下降至72小時後之約 16% ;在24小時及之後，與心，腎及脾有關之放射活性水平保持在4-8%相當固定狀況下。至於在肺及肝，放射活性由1小時之1 0 - 1 2 %減低至7 2小時的8 % _ 1 0 %。在皮膚，放射活性由24至72小時均保持'在約3 %相當固定。於胃腸道中之放射活性由24至7 2小時則固定在〇·5 - 1 〇/〇。肌肉之放射活性在整個研究過程中保持在約〇·6 %下。由股骨（骨骼）所吸收之放射活性，在所有時間點下均保持在低於4%，顯示在共軛物製劑中自由態釔之含量幾可忽視，且在研究過程中少有自由態放射金屬之釋出。 -131 -

62862-960914.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X 297公釐） 1294969 A7 B7

五、發明説明（ 90Y-2B8_ 129 ) 表3 1 MX-DTPA I.V·注入正常 BALB/c 活性之分佈平均值± S D 老鼠1.0小時後樣品器官重量 %ID/克 %ID/器官 (克) 血液 1.37±0.053 42.74±0.78 58.52±1.74 心 0.101+0.01 8.03±3.33 0.82±0.37 肺(2) 0.126+0.01 12.44±0.94 1.56+0.05 腎⑴ 0.129+0.01 7.81±1,24 0.997±0.10 肝 0.899+0.07 10.08±1.28 9.01+0.52 脾 0.077±0.004 10.74±0.96 0.823+0.04 肌肉 7.83±0.28 0.44±0.08 3·43±0·51 骨骼 2.94±0.11 3.44+0.57 10.11±1.80 皮膚 2.94±0.11 1.46±0.58 4.24±1.57 GI道 2.33±0.08 1.02±0.19 2.36±0.35 尿液 — — — 糞便一· 總和 94·66±3·47 老鼠數目= 3 平均重量= 19.58克 ±0.71 克 62862-960914.DOC -132 晒 V 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1294969 B7 五、發明説明（ 130 ) 表32 90 γ -2B8- -MX-DTPA I.V.注入正常 BALB/c 老鼠24小時後活性之分佈平均值± S D 樣品器官重量 (克) %ID/克 %ID/器官血液 1.55±0.12 19.77+2.42 30.77±6.04 心 0·105±0·01 4.44±0.55 0.47±0.08 肺(2) 0.127±0.02 8.78±1.61 1.11±0.21 腎⑴ 0.139±0.01 5.02±0.52 0.69±0.05 肝 0.966±0.09 8.62±2.73 8.20±1.97 脾 0.083±0.01 6.75±1.27 0.55±0.064 肌肉 8.83±0.69 0.692±0.01 6.12±0.52 骨骼 3.31±0.26 2.24±0.31 7.47±1.53 皮膚 3.31±0.26 3·33±0·76 10.88±1.76 GI道 2.89±0.43 0.73±0_09 1.02±0.05 尿液 2.31 糞便 1.23 總和 73.52+6.18% 老鼠數目= 3 平均重量= 22·09±1·73 克 62862-960914.DOC -133 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 五、發明説明（131 1294969 表33 90Y-2B8-MX-DTPA I.V.注入正常BALB/c老鼠48小時後

活性之分佈平均值± S D 樣品器官重量 (克). %ID/克 %ID/器官血液 1.50+0.14 14.97±5.77 22.53+8.48 心 0.104±0.01 3.99+1.43 0·415±0·16 肺(2) 0.122±0.02 8.41±1.57 1·04±0·31 腎⑴ 0.124+0.01 3.99+L62 0.49±0.19 肝 0·966±0·13 6.12+3.21 5.69±2.25 脾 0.079+0.01 6.05±2.38 0·46±0·16 肌肉 8.59+0.82 0.54+0.19 4.67±1.67 骨骼 3.22±0.31 2.07+0.84 6.65±2.56 皮膚 3.22+0.31 2.30±0.70 7.34±1.95 GI道 2.63±0.40 0.652±0.30 1.67±0.64 尿液 — — 2.83 糞便 — -一 2.06 總和 57.28±17.60 老鼠數目=3 平均重量=21.48±2.05克 62862-960914.DOC - 1 34 _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

A7 B7 1294969 五、發明説明（132 表34 90Υ-2Β8· MX-DTPA I.V·注入正常 BALB/c 活性之分佈平均值± S D 老鼠72小時後樣品器官重量 %ID/克 %ID/器官 (克) 血液 1.4510.07 15.87±4.81 23.14±7.26 心 0.093±0.01 4.16+1.27 0.392±0.13 肺(2) 0.123+0.02 10.67±3.79 1·30±0·45 腎⑴ 0.123+0.01 4.79±L03 0.596±0.16 肝 0.876±0.07 7.26+1.79 6.39±1.76 脾 0.081+0.01 7.37+234 0.584+0.16 肌肉 8·30±0·39 0.67+0.13 5.58±1.22 骨骼 3.11+0.15 2.58+0.51 8.05+1.76 皮膚 3.11±0.15 3.09+0.82 9.66+2.68 GI道 2.59±0.20 0.79+0.18 2.05+0.53 尿夜 — — 3.56 糞便一 2.82 總和 65.47+14.0 老鼠數目= 3 平均重量= 20·76±0·97 克 62862-960914.DOC _- 1 35 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（133 ) 4 .劑量計量利用老鼠生物分佈數據（％ ID/器官值，於表3 1 - 3 4估算出 9GY-標誌之共軛物於一個π標準的”70公斤人類之放射吸收劑量示於表3 5中。這些結果可與先前利用HPLC放射標誌方法所製備之9GY -標誌之2B8-MX-DTPA所得之結果比得上。表3 5 活性量== 1000微居里/病人劑量拉德拉德腎上腺 0.534 卵巢 0.534 膀胱壁 0.534 胰臟 0.534 胃壁 0.534 骨骼小腸 1.158 皮質骨 1.466 UL小腸壁 1.657 小梁骨 1.466 LL小腸壁 2.380 髓質(紅） 4.452 腎 7.015 髓質(黃） 2.096 肝 7.149 軟骨 1.466 肺 2.157 其他組成 1.466 其他組織皮膚 6.603 肌肉 2.646 脾 4.973 由投予釔-[90]標誌之2B8-MX均勻分佈在標準人類（70公斤）及以注射後72小時之動物分佈數據為基礎，所估算出之 ___ 放射劑量計量 _62862-960914.DOC_- 1 36 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（134 脂肪 2.646 睪丸 0.534 血液 2.646 甲狀腺 0.534 腦 2.112 子宮(無GRVD) 0.767 心 2.646 總體 1.755 參見：對生物分佈之放射核種所做之吸收劑量估算之流程，MIRD J. of Nucl· Med./Suppl· #1，2/68

Calculations Performed Using a Spreadsheet Template in Symphony (Lotus Development Corporation) and Created by Phillip L. Hagan, MS，Nuclear Medicine Service VA Hospital，San Diego，CA 92161 o 5.釔-「9 01-288_]^又-〇丁？八臨床劑量製備策略之瘦盤· 在MPI Pharmacy Services，Inc製備共10個確認批次。在各批次之測試結果綜合於表3 6中。估算出各試驗結果之平均值，且適合時註明標準偏差。為評估製程由於不同標誌時間之變化，利用1 0分鐘標誌時間製備# 1至# 8批次；利用 5分鐘反應時間製備# 9及# 1 〇批次。依據1 〇次確認批次之試驗結果，可確立釋出詳情。釋出之詳細說明綜合於表3 7。 62862-960914.DOC _ 1 本紙張尺度適用中國國家檩準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1294969 五、發明説明（135 A7 B7 無菌度 f 小瓶之放射活性(mCi) 比活性(mCi/毫克）放射活性(mCi/毫升) 雖 ί $ ，年放射納入率％内毒素(Eu/毫升）免疫反應性％， pass σ\ 76.2 00 ►—· 〇\ 10.0 io N> ρ 97.5 <0.12 5 72.8 2 pass Os a 8.68 12.0 1.22 0.102 97.0 <0.12 5 93.3 δ pass ON 73.6 8.26 N) 0.98 0.088 93.5 <0.12 5 71.7 pass 〇\ ρί — 8.52 v〇 bo 1.26 0.128 96.0 <0.12 5 70.2 pass 〇\ 72.4 8.43 μ-Α Η-^ 1.51 0.134 94.7 <0.12 5 60.6 pass p\ On ί—· 8.45 13.0 1.55 0.119 94.9 <0.25 68.2 ! pass 0\ 76.4 8.56 1—i H-a Lo 1.06 0.093 95.9 <0.25 79.5 ί pass On 74.3 8.45 0.98 0.088 96.5 <0.25 72.4 pass On 71.2 8.45 Ln 1.28 0.111 97.5 <0.12 5 88.2 I- pass ON 74.8 8.45 10.7 1·02 0.096 93.5 <0.12 5 68.5 #10 6.4 ± 0.0 74·4 土 1·8 8.44 土 0.15 11.2 土0.9 1.21 土 0.21 0·108 土 0·017 95.7 土 1.4 <0.162 土 0.06 74.5 士 9.8 平均 =Y-ISI&4L2B8,MX.DTPA 二二3"52呤&莓耸=嫜豸 10窗#软莫^~今本據^ 裝· >36 -訂·

62862-960914.DOC -138- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（136 表37 90Y-標誌之2B8-MX-DTPA，利用’’混合&掃射”策略製備，之釋放詳細說明試驗說明方法免疫反應性 -60% RIA 内毒素 <5EU/毫升 LAL 放射標諸之納入 -90% ITLC 抗體濃度 0.075-0.150毫克/毫升 A280 放射活性濃度1 -6.0mCi/亳升劑量校正比活性1 -9.0mCi/毫克抗體八28〇/劑$校正總小瓶放射活性1 ^6.0 mCi 劑量校正 pH 6.0-8.0 pH紙總蛋白質濃度 65-85毫克/亳升八280 無菌度測試通過 CFR 610.12 1 (零時之校正） D ·討論在原先製備9 G Υ 標誌之2 Β 8 - MX - DTPA之放射標誌策略中係利用特別費力及耗時之HPLC純化步驟移去製劑中之非蛋白質結合之90Y。為了簡化此過程，並使其更易於應用於臨床位置，因此有很多努力致力於消除HPLC步驟，以支持所謂的’’混合及掃射，’策略。此目標是用以鑑定放射標誌條件，此造成同位素以極高之放射併入率納入共軛物中，由是消除純化步驟之必要。頃發現，在ρ Η 3.6下以5至1 0分鐘 62862-960914.DOC 139-____ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1294969 A7 _ ,_B7 ___ 五、發明説明（137 ) 培育是可獲得>95 %之放射併入率。此策略的額外益處是免疫反應活性保留性的增加（>7〇%)，可能是由於在加入人類血清白蛋白之前，其可對放射溶解提供保護作用，抗體對南月b里放射標諸曝露時間較短所致。此免疫反應性之保留係優於利用HPLC方法所觀察到的。利用”混合及掃射”策略所製備之9〇γ_標誌之共軛物，其培育在調和緩衝溶液（lxPBs含有75亳克/毫升人類血清白蛋白及1 mM DTPA)於4°C下達48小時之穩定性研究顯示，並無放射標誌之喪失，且完全保留了免疫反應活性。以人類血清在3 7 °C下達7 2小時之穩定性研究也顯示有極微之放射標諸喪失。這些穩定性結果可與利用HPLC策略放射標誌之共軛物所見的比得上。利用”混合及掃射”方法製備之9〇γ_標誌之共軛物，其在 BALB/c老鼠中之生物分佈顯示無異常的組織沉積。這些結果推知，放射標誌之抗體並無顯著的改變，因此可劇烈地影響抗體之活體内特性。同時，這些結果可與利用HpLc放射標誌方法所製備之放射標誌共軛物先前所得的比得上（見 BB-IND 4850/4851 )。另外，劑量計量結果與包含在進行的臨床試驗（IDEC study #1315)中病人所得之結果是可比的，係當比較每注射劑量之亳居里時。對研究中的6個病人而言，對整體，心，肝及脾之平均數值（拉德±SD)分別是上仂 ±0·57，10·50±4·68，9·89±8·91，及 9·75±6·0〇。在進行π混合及掃射”標誌策略以製備臨床級之9 〇γ_2Β 8 MX-DTPA之前，有必要評估策略之再現性。因此，利用不 62862-960914.DOC - 140 -

A7 B7 1294969 五、發明説明（138 ) 同批次之9GY氯化物來製備10個證實批次。對於所製備之 1 0批次，利用”混合及掃射”方法所得之免疫反應性數值在 60.6 %至93.3%範圍中，平均是74.5%，且中值為72.1 %。此免疫反應性之保留顯著優於利用目前HPLC方法所得之約 60%(54.9%至65.1%範圍；平均60.2%)。10批次的平均放射併入率是95.7%(93.5%至97.5%範圍）。此數值可與先前以HPLC方法所見的比得上（91.7%至93.7%範圍，平均是 93.1%)。同時，關於内毒素，抗體濃度，放射活性濃度，比活性，總小瓶放射活性？總蛋白質濃度，pH及無菌度均比得上1 0批次。總而言之，這些結果證實”混合及掃射”方法之再現性。此外，吾等藉著進行反應達5及1 0分鐘評估製程由於不同標誌時間之變化性。由於此二種反應時間無顯著的差異，因此決定在最終策略中使用較短的培育時間。 E.要點吾等已發展出稱之為”混合及掃射”方法之標誌步驟，以製備臨床劑量的9GY_標誌之2B8-MX-DTPA，其中可略去目前為移去非蛋白質結合之放射標誌所必要之高性能液相層析（HPLC)步驟。經簡化的策略可省去此費力之純化步驟，同時可維持高度的放射標誌納入率（>95%)，且免疫反應性改善的保留（>7 0%)。頃發現經臨床調和之放射標誌共輛物當在4 °C下培育48小時，依據放射標誌及免疫反應性之保留，知其於試管内是穩定的。另外，當在人類血清中以3 7 °C培育7 2小時時，放射性共軛物是穩定的。在 62862-960914.DOC 141 本紙張尺度適用中獨國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（139 ) BALB / c老鼠中之生物分佈研究證明無異常的組織沉積，包括骨骼。對”標準”70公斤人類所估計之放射吸收劑量，可與利用90 Y -標誌之2B 8-MX-DTPA進行之臨床試驗中所得的比得上。這些研究之結果顯示，利用”混合及掃射”策略所產生之90Y-標誌之2B8-MX-DTPA，可與利用傳統 HPLC方法製備的比得上。對製備臨床經放射標誌共軛物之擴大規模策略之確認中顯示，此方法是可再現的且產物比得上利用目前HPLC方法所產生的。這些臨床前研究結果顯示’此新的”混合及掃射”策略可用來製備適合臨床試驗中採用之9()丫_標誌之26 8-1^又-〇丁？八。較佳具體實例之詳細說明實例1 ·放射併入-套組及分析 I. 要點本發明的一個主題是發明出可製備ηιΙηΛ9〇Υ-標誌之 2Β 8 -MX-DTPA(分別是111268及丫288)，並對臨床產物發展出釋出說明。放射標誌套組策略就放射併入作用而言是可再現的，且可結合至抗原-陽性之SB細胞，且顯示放射標諸套組適用於臨床試驗之適用性。其建議，放射併入及結合之In2B8及Y2B8釋放說明，可分別確立在g95%及g 70% 〇 II. 前言經9GY·標諸之單株抗-CD20抗體（Y2B8)目前可在臨床試驗中評估’以治療復發之B -細胞淋巴瘤。紀同位素缺乏γ 組份，使其不適於顯像系統。因此，標諸之2Β8- 62862-960914.DOC - 142 - s 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（140 ) MX-DTPA(In2B8)可用來評估腫瘤定位，及在以釔-標誌之治療劑治療之前或之後評估病人之劑量計量。目前用於製備Y2B8及In2B8之策略，稱之為’’混合及掃射”方法，可產生適於臨床研究之經放射標誌之抗體。然而，標誌過程之簡化可促成在臨床定位下之劑量製備。新的放射標誌套組較好含有四組份：1)2B8-MX-DTPA 以2亳克/亳升於低金屬之生理食鹽水中，2)50 mM的醋酸鈉可用來調整放射標誌溶液，至適合的標誌pH值，3 )調和緩衝溶液（lxPBS，pH 7.4，含有7.5%人類血清白蛋白及1 mM DTPA)，4)空的1 〇亳升玻璃小瓶（反應小瓶）。所有的組份均經過試驗，要無菌且無熱原。本報告中綜合了此放射標誌套組之確認，其係簡單且易於使用，且可生成放射併入率-95%之放射標誌抗體，且對抗原-陽性細胞之結合有可接受之保留。對於臨床產物有建議之釋出測試說明。 111 ·放射併入之材料及方法 A ·放射標誌套組中之試劑 1 . 2B8-MX-DTPA，IDEC ; Lot # 082395RM2 2. 50 mM醋酸鈉，低金屬，IDEC ; Lot # 082395RM3 3· 調和緩衝溶液（lxPBS，pH 7·4，含有7.5%(w/v)人類血清白蛋白及 1 mM DTPA)，IDEC ; Lot # 082395RM1 4· 反應小瓶，i〇毫升，idEC B .材料及設借 1· Biodex Tec-Control Radioincorporation 套組，Cat· 62862-960914.DOC - 1 43 · 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公嫠） 1294969 A7

#151-770 2·手套：無粉式 3 ·無菌的聚丙烯注射器 4 · 無讀的注射針頭 5·有蓋的小試管，ι·5亳升 C.方法

1 •利用放身套組盥備Υ 2Β 8及T n R 製備套組試劑，並充填至玻璃中隔的小瓶内。I型的硼矽酸鹽小瓶（2或10亳升）以注射用無菌水潤洗（WFI)，再高壓滅菌後充填。丁基橡皮中隔以無菌WFI潤洗，使用前再高壓滅菌。試劑手動充填，並重疊於100等級之室内，利用 USP方法測試熱原及無菌度。 a-In2B8 之備額外的試劑： 1·銦-[111]:氣化物鹽，無載劑，於HCh 注意事項： 1·所有步驟利用無菌技術進行。 2 ·放射標誌套組組份應令其達室溫再使用。 3 ·最終產物在完成下步驟9之8小時内投予至患者。

In2B8放射標誌、策略步驟 1.如下計算加至反應小瓶内11 iinCh之容量： a·在放射標誌時之放射活性濃度，mCi/亳升計： C〇 =在計算時之放射活性濃度（見廠商之分析說明）。 62862-960914.DOC _ 1 44 _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1294969 A7 B7 五、發明説明（142 ) △ t=時間的變化（正數是計算後，負數是計算前）。於標諸時之放射活性濃度= Cn_ e0.0103(At) b.加至反應小瓶内之minCh容量： __5.5 mCi_=加至反應小瓶之容量在標誌時之放射活性濃度 2·可如下計算欲加至反應小瓶内之5〇 mMS皆酸鈉容量：加入之minCU容量（lb步驟）χ(1·2) =加入之50 mM醋酸鈉容量。 3 ·反應小瓶之中隔及50 mM醋酸鈉小瓶以乙醇擦拭。利用1毫升之注射器，將50 mM醋酸鈉（步驟2)估算出之容量轉移至反應小瓶中。 4·11 hnCh來源之中隔以乙醇擦拭。小瓶以針鑽孔，其配備有無菌的0.2微米濾紙。利用1亳升的無菌注射器， 11 In CI3所需容量（1 b步驟）可轉移至反應小瓶。小瓶再以反轉數次混合之。 5.2B8-MX-DTPA小瓶之中隔以乙醇擦拭。利用i毫升的注射器，1·〇毫升的2B8-MX-DTPA可緩緩轉移至反應小瓶。小瓶在以反轉數次混合之。 6·令反應在環境溫度下處理3〇分鐘±5分鐘。 7 ·反應混合物之總容量由加入之1 η In Cl3容量（步驟4 )，

50 mM Sf酸納加入之容量（步驟3)及加入之2B 8 - MX-DTP A 谷置（步驟5)加在一起而求得。 8 ·計算出加至反應小瓶内以得1 〇亳升終體積之調和緩衝 62862-960914.DOC _ 145 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1294969 五、發明説明（143) 溶液容量，係自10中扣去在步驟7中計算而得之總量。 ^調和緩衝溶液小瓶以乙醇擦拭，小瓶㈣孔。由於調、’友衝办液之黏度’反應小瓶利用針頭穿孔，其配有μ微米^主射器濾紙。利用配有適當尺寸之針頭之H)CC無菌注射器在步驟8中估异出之調和緩衝溶液可轉移至反應小瓶。移出反應小瓶内穿孔之針，小瓶再以反轉數次混合（終產物）。此小瓶在進行"放射併入分析"之前至少培育5分鐘。溶液的顏色是褐色，且小瓶充滿著，證實有加入調和緩衝溶液。 10.利用針對"ιΙιΗ貞測之適合的❹，可偵測最終產物小瓶之總放射活性。 1 1.終產物立即貯於2t： _8它下以進行"結合分析"及"放射併入分析’’。 b.Y2B8之製備額外的試劑： 1.在乙-[90]:氣化物鹽，無载劑，於hci中。注意事項： 1·所有步驟利用無菌技術進行。 2 ·放射標魂套組組份應在使用前使回至室溫。 3 .產物應在完成下步驟8的8小時内投予至患者。 Y2B8放射標誌策略 1· 如下計算加至反應小瓶内之9GYC13之容量： a ·在放射標誌時之放射活性濃度： C 〇 ==在計算時之放射活性濃度（見廠商之分析說日月> 裝訂線 62862-960914.DOC -146- 1294969 A7 __B7 五、發明説明（144 ) △ t=時間之變化（正值是計算後，負值是計算前）。在標誌時之放射活性濃度= Cn_^ e0.0108(At) b.加至反應小瓶内9GYC13之容量： __45 mCi_ =加至反應小瓶内之容量標誌、時放射活性》農度 2.如下計算加至反應小瓶内之50 mM醋酸鈉之容量·· a. 90YCl3 於 0.040 M HCl(Amersham): 9GYC13之容量（lb步驟）χ(0·8) =加入之醋酸鈉容量 b. 90YCl3 於 0.050 M HCl(Nordion): 9 GYC13之容量（lb步驟）x (1.0) =加入之醋酸鈉容量 3 ·反應小瓶之中隔及醋酸鈉小瓶以乙醇擦拭。利用1 “注射器，將50 mM醋酸鈉（步驟2)計算之容量（1&或lb步驟）轉移至反應小瓶。小瓶由反轉數次混合之。 4 ·9G YCI3來源小瓶之中隔以乙醇擦拭。小瓶以針穿孔，其配備有無菌的0.2微米濾紙。利用1 c c無菌注射器9 〇 YC1 需要量（1 b步驟）可轉移至反應小瓶。小瓶由反轉數次混合之。 5.2B8-MX-DTPA小瓶之中隔以乙醇擦拭。利用3cc無菌注射器’將1 · 5耄升的2 B 8 - Μ X - DTP A轉移至反應小瓶。小瓶反轉數次混合之。 6 ·估汁反應混合物之總體積’係將加入之γ · 9 〇氯化物量 (步驟4)，加上50 mM醋艘納加入量（步驟3 )，再加上238_ Μ X _ D T P A加入量（步驟5 )。 147 -

62862-960914.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1294969 A7 B7 五、發明説明（145 ) 7 ·加入調和緩衝溶液至反應小瓶中以得1 0亳升終體積之必要量，可由1 0中扣除在步驟6中所計算之總反應容量而得。 8 ·調和缓衝溶液小瓶以乙醇擦拭，小瓶再穿孔。由於調和緩衝溶液之黏度，反應小瓶利用配有0.20微米注射器濾紙之針頭穿孔。利用配有適合尺寸之針頭之10 cc無菌注射器，將在步驟7中計算之調和緩衝溶液容量轉移至反應小瓶，再移出穿孔之針頭，且小瓶以反轉數次混合之（終產物）。小瓶在進行’’放射併入分析”之前至少培育5分鐘。溶液的顏色是褐色，且反應小瓶充滿，由是可證實調和緩衝溶液已加入。 9 .利用針對偵測9GY之適合儀器，偵測終產物小瓶之總放射活性。 10.終產物立即貯於2 °C-8 °C下，直到病人需投予為止。 1 1 .免疫反應活性之測試：利用1毫升的注射器，自反應小瓶中無菌地移出0.1毫升，再轉移至另一個1.5毫升有螺蓋之試管内。試管立即貯於2°C-8°C，以進行”結合分析”及”放射併入分析M。放射標諸套組策略之確認，在IDEC Pharmaceuticals (San Diego, CA), MD Anderson Health Center (Houston, TX)\ Mayo Clinic (Rochester，MN)及 City of Hope (Duarte，CA) 中進行。所有的套組組份，包括臨床級2B8-MX-DTPA，由 IDEC Pharmaceuticals 在 GMP 條件下（依據 Code of Federal Regulations之優良製造條件）製備，並決定知是無菌且無熱 62862-960914.DOC - 1 48 _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公爱） 1294969 A7 B7 五、發明説明（146 ) 原的。經放射標誌之抗體調和於lxPBS中，其内有7.5%(w/v) 人類血清白蛋白（HSA ;臨床級；Baxter-Hyland)及1 nM DTPA。在各確認批次中進行之釋出試驗結果，述於下。由五個操作者製備In2B8及Y2B8各6個確認批次。這些批次之設計如下，並在以下工廠進行：

In2B8 #1 ： IDEC Pharmaceuticals #2 ： IDEC Pharmaceuticals #3 ： IDEC Pharmaceuticals #4 ： MD Anderson Health Center #5 ： Mayo Clinic #6 ： City of Hope Υ2Β8 • #1 ： IDEC Pharmaceuticals #2 ： IDEC Pharmaceuticals #3 ： IDEC Pharmaceuticals #4 ： MD Anderson Health Center #5 ： Mayo Clinic #6 ： City of Hope 2 .製備冷凌乾燥之S B及HSB細胞人類細胞株SB(CD20-陽性）及HSB(CD20-陰性）得自美國標準菌種收集所，並培養在T型燒瓶内，利用含有1 0 %胚牛血清並添加2%榖胺醯胺之RPMI- 1640。培養物維持在37 62862-960914.DOC -149- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公嫠） 1294969 A7 -— ___ B7 五、發明説明（147 ) c及.5% C〇2下。細胞每隔一小時會分裂成1 : 2，並於〇5_ 2·5X 1〇6細胞/亳升時回收，存活率大於8 〇 %。利用血球計決定細胞濃度，存活率再以錐藍排阻法決定。在環境溫度及0.5-2X106細胞/毫升細胞密度下，以離心 ( 1300 rpm，Sorvall離心機）回收細胞，再以、xpBs洗二次。成團塊之細胞再懸浮成5〇χ1〇6細胞/亳升，於1xHbss 中，並含有l〇/〇(w/v)牛金清白蛋白（BSA)及1〇% 甘露醇（冷凍乾燥緩衝溶液），取〇·5毫升分配至15亳升聚丙烯微里離心試管，其配有〇環墊圈並貯於_ 7 〇〇C下，再以3 〇 _ 60亳托冷凍乾燥一夜。冷凍乾燥細胞管貯於2_8它之乾燥相内，並重組於分析用無菌水中；冷凍乾燥於微量離心管之細胞試管在有乾燥劑下貯存。 3 .分析用來測試In2B8及Y2B8確認批次之分析方法述於下。對各確認批次進行以下分析： 1·利用經冷凍乾燥SB細胞之結合分析法 2.利用Bi〇dex套組之γ2Β8/Ιη2Β8放射併入分析 a·^合分析& 由各操作者分別依1η2β8及Y2B8之策略，利用經冷燥之CD20陽性SB細胞評估結合百分率。這些分析‘對：證實經放射標諸之抗體仍可確認⑽^為抗原日有效率的方法。在臨床位置下，也評估咖〇_陰== 細胞。製備經冷柬乾燥之細胞，係依上述方法-f, 之SB及HSB細胞之製備、並貯存之。乙、八 -150-

62862-960914.DOC 本紙張尺度勒T國輯料(CNS) A4規格(21G χ 297公董） 1294969 A7 B7 五、發明説明（I48) i · Ln 2B 8結合分析法額外的試劑： 1·錮-[111]_2B8-MX-DTPA。 2 .經冷凍乾燥之sb細胞；三管中含有25x1 〇6細胞/管。 3:經冷凍乾燥之HSB細胞；三管中含有2 5 X 1 06細胞/管。 4 .灌注用無菌水，或注射用無菌水。 5.稀釋緩衝溶液（lxPBS，pH 7.2-7.4，含有1%牛血清白蛋白（BSA)，及0.02%疊氮化鈉，〇·2微米過濾及貯於室溫下。 6 ·用於計數放射標誌之玻璃或塑質試管。步驟：分析設立（無放射活性部份） 1 ·獲得三管經冷凍乾燥之S Β及HSB細胞。 2.在各管中加入〇·5〇亳升的swFI(無菌注射用水），且營予以渦旋直到獲得均質之懸液為止。 3· 4個空的毫升微量離心試管。對三管中加入〇·5〇亳升的稀釋緩衝溶液，代表無細胞之對照組。 4·對另一個1.5毫升微量離心管，加入〇·99亳升稀釋緩衝溶液；此管標以1 ·_ 1 〇〇。 5.得一管50毫升的無菌聚丙烯管（有蓋），再於管中加入 1 〇毫升稀释緩衝溶液。分析之設立（放射活性部份） 1 ·經放射標誌之抗體貯於2。_ 8 下。 2·以p2〇抽出0.01亳升，加至丨·5亳升微量離心管，其 62862-960914.DOC _ 151 _ 本紙張尺Μ财®时料(。鄉纟4祕(21(^297公釐) · " --— 1294969

内含有0.99奎斗接理ρ μ 、毛开柿釋緩衝溶液（1 : 100稀釋）。尖端潤濕，再渦旋試管以混合之。、P2〇^自1 · 1〇〇稀釋管中抽出毫升，再加至含有1 〇笔升稀釋緩衝溶液之角錐試管中。試管充份混合0 分析策略 1·在各&内加入0.50亳升經稀釋之，，ΐη2Β8-Μχ_ DTPA 〇 2.緊閉各管上之蓋子，再連續混合6〇分鐘。 3_在至溫下培育6〇分鐘後，各管以最小之汕⑼$離心$ 分鐘。 4.各上清液取0.75亳升轉移至適於計數儀器之管中。 5 ·利用7*汁數器計數各管中之放射活性，作背景值之調整。 ii.Y2B8結合合& 額外試劑

1 · 90Y2B8-MX-DTPA 2 ·經冷凍乾燥之s B細胞 3 ·灌注用無菌水或注射用無菌水 4·稀釋緩衝溶液（lxPBS，pH 7·2-7·4，含有ι%牛血清白蛋白（BSA)及0.02%疊氮化納）步驟：放射標誌之抗體樣品製備 1 ·獲得貯於2 ° - 8 °C下之經放射標誌抗體。 -152-

62862-960914.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(Ciis) A4規格(210X 297公釐） 1294969 A7 B7

千微量離心管中，内 :100稀釋）。尖端潤含有990微升之稀釋緩衝溶液（1 : 洗，管再略渦旋。 3.獲得50毫升有蓋的無菌聚丙稀管，在管中利用⑽ 升血清用吸量管加入10毫升稀釋緩衝溶液。 4·以P2〇0自1.100稀釋管中抽出35微升，並加至含有 10毫升稀釋緩衝溶液之角錐試管中。充份混合。經冷凍乾燥細胞之製備 1·獲得3管經冷凍乾燥之SB細胞。 1 ·在各管中加入0·50亳升的SWFI，管再渦旋直到獲得單細胞懸液為止。 3 ·獲得3管空的1.5亳升微量離心試管；在此3管中加入〇·5毫升的稀釋緩衝溶液，代表無細胞之對照組。分析策略

1.在各管中加入0.5亳升經稀釋的9〇 γ2Β 8-MX-DTP A ο 2·管之一端置混合器中45分鐘，且先確立蓋已緊密。 3 ·經過在環境溫度下培育4 5分鐘後，細胞微量離心5分鐘使成團塊。 4 · 〇·8亳升之上清液轉移至液體閃爍計數小瓶内。 5 ·於各小瓶中加入閃爍計數用雞尾酒液。 6 ·利用液體閃爍計數決定各小管内之放射活性含量，作背景值之調整。 b.放射併入分析本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1294969 A7 _______ Β7 五、發明説明（151 ) 以即日夺薄層層析（ITLC)利用Biodex Tec-Control Radiochromatographic套組，依以下策略，來決定放射併入百分率：額外的材料及設備：

1· In-或 9GY-放射樣諸之 2B 8-MX-DTP A 2·計數放射活性TLC長條之試管 3.剪刀 4 · 無菌注射器，1 cc

5 · 無菌針頭，2 6 G 6· T計數器或液體閃爍計數器 7 · 吸量管步驟： 1·整個Biodex操作手冊應先閱讀。 2 ·依套組彳曰示測试各放射標諸樣品，三個一組；每小瓶發展出一長條。 3 ·為將放射標諸樣品點在層析條上，使用吸量管在原點線上點1微升。另外，可自黏接在i cc無菌注射器上之 2 6 G針頭中，點出一小滴。 4 ·利用適合的計數器計數各段之活性，即，γ計數写用於Ιη及液體閃爍計數用於90Υ，並作背景之調整。 5.依據Biodex指示中對放射標誌抗體百分率之計算。 IV.結果對各In2B8或Y2B8確認批次之測試結果綜合於表3 8及 3 9。 62862-960914.DOC -154- 本紙張尺度適用中國國家標準(C泣S) A4規格(210X297公釐） 1294969 A7 B7 五、發明説明（ 152 ) 表38. Y2B8確認之釋出分析結果批號放射併入率％結合率％ 1 99.5 78.6 2 99.3 87.0 3 99.4 85.9 4 99.2 81.8 5 99.2 79.6 6 96.3 80.8 平均=98.8 平均=82.3 標準偏差=12.4 標準偏差=3.4 %GV=1.25% CV=4.2% 62862-960914.DOC -155- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1294969 A7 B7 五、發明説明（153) 表39· 對In2B8確認之釋出分析結果批號放射併入率％結合率％ 1 99.4 86.2 2 98.7 86.8 3 99.3 85.8 4 98.3 86.7 5 99.0 82.1 6 99.3 8.30 平均=99.0 平均=85.2 標準偏差=043 標準偏差=2.06 %CV=0.45% CV=2.42% 62862-960914.DOC 156- 本紙張尺度適用中國國家標準(C5iS) A4規格(210X 297公釐) 1294969 A7 B7 五、發明説明（154 ) V.討論及結論為簡化目前對Ιπ2Β8及Y2B8之放射標誌方法，於是發展一種四組份之套組。醋酸鈉及2B8-MX-DTPA之濃度分別減至50 mM及2亳克/亳升，以令注射器可正確轉移容量。所有的套組組份較好充填在玻璃中隔小瓶，而於釋出前以 IDEC測試無菌度及熱原，因此可省去這些試驗在臨床位置上進行之必要性。在此位置上，所有的試劑操作均利用無菌的注射器及針來進行。因此，固守放射藥學環境中習見之無菌技術’可確保經放射標誌及調和之抗體適合病人投〇才估In2B8及Y2B8放射標誌策略之再現性及難難，係利用不同批-人的各放射標誌進行數次確認流程。對〗n2B8所製備的6個確涊批次，結合率由821 %至，平均 851/°，放射併入值約99%(98·3%至99.4%)。對Υ2Β8所製備的6個確認批次，所得之結合百分率由78.6%至 87爲，平均82 3 %。γ2Β8之放射併入率平均為98·8% (96 3 /° "·5%)。綜合而之，這些結果證實製備Ιη2Β8及二2Β8之放射標煞套組方法之再現性及難難。基於這些峰認結果，可建議對Ιη2Β8&Υ2Β8而言，放射併入之釋出說明及結合可分別在-95%及g 70%時確立。 ^由於增加使用之容易性，及減少製備過程中犯錯 :】=〖生’可建議利用經冷凍乾燥之陽性細胞行結分析’且放射併入可用來於臨床位置上進行1112則及 Y2B8之釋出試驗。

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1294969 A7 _____B7_ 五、發明説明（~^7) — 總而言之，這些結果一起顯示，利用放射標誌套組製備之Ιη2Β8及Y2B8適用於臨床定位。另外，對二種放射標誌抗體，可確立釋放說明，以反映由5位不同操作者進行之許多確認結果。 ° 實例2 ·放射併入及結合-套組及分析 I. 要點咋名為2B8之鼠類抗-CD20單株抗體已被選殖至ch〇細胞中，以生成高度表現之細胞株。可由FACS分析及競爭結合證明由CHO-衍生之抗體内CD20-陽性人類細胞之特異性。對人類T -細胞為幾可忽略之結合。利用競爭結合分析決定知’抗體對CD20 -陽性細胞之親和力為1 ·3 x 1 〇 -1 Q μ。抗體與嵌合劑MX-DTPA反應，形成共軛物2B8-MX-DTPA，免疫反應性幾無喪失（親和力值為4·4χ1〇-ι〇Μ)。經由之放射併入決定可知，於8小時反應之後可達到最佳之嵌合物共輛作用。2B8-MX-DTPA之放射標誌策略就PH及培育時間方面，針對或ill以使更完善，以確保最大之放射併入（^ 9 5 % )及免疫反應性最大的保留（^ 7 0 % )。在臨床定位上利用CHO -衍生之2B8-mX-DTPA製備之In2B8及 Y2B8 ’其釋出說明所建議的有放射併入（^95〇/〇)及結合至經冷凍乾燥及重組之CD20 -陽性人類細胞（$ 7 0 % )。總而言之，這些結果顯示CHO ·衍生之2 B 8 - Μ X - DTP A之適用性可用於臨床試驗。 II. 前言先前使用之2B8抗體可在中空纖維生物反應器中產製。為 62862-960914.DOC -158 本紙張尺度適用中國國家標準(CfiS) A4規格(210X297公釐:) 1294969 A7 B7 五、發明説明（156) 減少此抗體之製作成本，其選殖及表現在CHO細胞中以生成高度表現之產製細胞株。此實例描述由CHO -衍生之2B8 抗體；共軛抗體（2B8-MX_DTPA)，及利用臨床放射標誌套組策略製備之9GY及^In-標誌抗體產物，之試管内特性化結果。 III.材料及方法 A.試劑人類細胞株SB(CD20-陽性）及HSB(CD20-陰性）得自美國專準菌種收集所，並培養在T燒瓶中，利用含有1〇%胎牛血清並添加有2%榖胺醢胺之RPMI- 1640。培養物維持在37 °0：及5% C02中。細胞每隔一天分裂1 : 2，於0.5-2.5X106細胞/毫升時回收且存活率> 8 0 %。利用血球計決定細胞濃度，再以錐藍排阻法決定存活率。細胞批次之特殊資料記錄在 Notebook # 1553，並集結在'’Cell Activity Logbook 1995 & 1996”，作者為 Ron Morena。 CHO-衍生之2B8由IDEC’s製造工廠在GMP條件下產製。抗體以11.5毫克/亳升調和在低金屬之生理食鹽水中。以 SDS-PAGE決定抗體是均質的。2B8-MX-DTPA依PSBR-0.43在GMP條件下產自CHO-衍生之2B8，並以2毫克/亳升調和在低金屬食鹽水（Lot # 0165A及0165B)。藥品級之111 In氯化物購自Amersham (U · K .)或Cyclotron Products Inc. (Coral Gables，FL)。釔[90]氯化物得自 Amersham (U. K.) ， Nordion International (Kanatta，

Canada)，或 Pacific Northwest National Laboratory 62862-960914.DOC - 59 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CSS) A4規袼(210 X 297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（157) (Richland, WA)。在 GMP 下製備之 MX-DTPA 得自 Hauser Chemical (Boulder，CO)。臨床級之二乙三胺五醋酸約三鈉 (DTPA)得自 Heyl (Berlin, Germany)。TAG-NHS 得自 IGEN Inc_ (Rockville，MD)。鼠類抗-CD 1 9 珠粒購自 Dynal Inc· (Lake Success，NY)。山羊抗-老鼠FITC-標誌之（Fab，)2購自 Jackson ImmunoResearch 0 移去掺雜的重金屬所需之試劑，成批以Chelex 100 (BioRad Industries)或以喪合用 Speharose (Pharmacia)處理，係將溶液通過管柱。低金屬貯液以灌注用無菌水 (SWFIr)稀釋。溶液貯於無菌之塑質容器内。以下描述針對特殊方法之額外試劑。 . B .材料及設備 1. 〇1^§611分析儀；10£>1111。.機型# 1 100-1000;10£0# 1492 2· Top-Count液體閃爍計數；Packard，機型 #A9912 ; IDEC ； #1329 3· 7 計數器；Isodata，機型#20-10 ; IDEC # 0628 4. Tec-Control 於射層析套組，Biodex，機型 #151-770 5. 冷束乾燥劑；Virtis，Model Freezemobile 12 ; IDEC #0458 針對特殊方法描述額外的材料及設備。 C.方法 1 凍乾燥之SB及HSB細胞之芻備細胞如上述培養，並在環境溫度及〇.5 _2χ1〇6細胞/亳升 62862-960914.DOC _ 1 60 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CHS) Α4規格(210X297公釐） 1294969 A7 ___ B7 _ 五、發明説明（158) 細胞密度下以離心回收（13〇〇 rpnl於s〇rvau離心機），並以1 XHBSS洗二次。成團塊之細胞懸浮在50x1 〇6細胞/毫升，於含有1 %(w/v)牛血清白蛋白（BSA)及l〇%(w/v)甘露醇 (冷;東乾燥緩衝溶液）21xHbss中，取〇·5毫升分配至1·5毫升有〇環塾圈之聚丙烯微量離心管中，再貯M_7(rc下，並以30-60亳托冷凍乾燥一夜。經冷凍乾燥之細胞試管貯於 2-8 C乾燥箱中，並重組於分析用無菌水中；冷凍乾燥於微量離心管中之細胞試管在有乾燥劑下貯存。合分柄由流體細胞計數決定抗體與人類Β -細胞之直接結合。濃度漸增之抗體，在lxPBS，pH 7.2，含有1%(W/V) BSA (結合緩衝溶液）與5 χ 1 〇6 CD20-陽性（SB)或CD20-陰性 (HSB)在冰上共培育3〇分鐘。細胞以離心洗滌，再懸浮於結合緩衝溶液中，並與FITC_標誌之山羊抗-老鼠F(ab，）2在冰上培育3 〇分鐘。與二次試劑共培育後，細胞以離心洗務’再懸浮於1 XPBS中，其内含有ι·1%(ν/ν)甲醛可固定細胞。利用流體細胞計數決定平均螢光強度。 3 .競爭性結合分；|；彳 2Β8及2B8-MX-DTPA之免疫反應性，利用〇RIGEN電化學發光方法（Leland and Powell)以競爭性結合至CD2〇 _陽性 SB細胞而決定。對數生長期之8]8細胞自培養物中回收，再以1XHBSS洗二次。細胞稀釋在lxpBS，pH 7·2中，其内含有i〇/〇(w/v)牛血清白蛋白。在某些實驗中，經無菌ς重組後使用冷凍乾燥之細胞。 62862-960914.DOC _ 161 本紙張尺度適用中a Η家標準(CNs) Α4規格(21GX 297公釐) 1294969 A7 ____B7 五、發明説明（159 ) 準備釕-標諸之示踪物抗體，係將由CH〇-衍生之2B8 (lot #165)培育在lxPBS，pH 7.2中，加上叁-雙吡啶釕（II)之 N-羥基琥珀醯亞胺酯（TAG-NHS)，TAG-NHS對抗體為 1 5 : 1莫耳濃度比例。經過在環境溫度下培育1小時之後，避光’反應以甘胺酸驟冷1〇分鐘。未反應之TAG由大小排阻層析移去，利用以lxPBS平衡之Phannacia PD_10管柱。利用Bradford蛋白質分析法來決定蛋白質濃度。在455亳微米下偵測吸光度可決定TAG之納入。TAG對蛋白質之莫耳濃度比例，經估計是3.0。在12x75毫米聚丙烯試管中進行分析。各種量之競爭抗體（0.002- 1 7微克/毫升）培育在ixpBS，pH 7.2，含有1〇/〇 (w/v)BSA，加上0·08微克/毫升TAG-標誌之CHO 2B8， 0.08毫克/亳升抗-CD19珠粒，及167,000細胞/亳升。經過在環境溫度下迴轉混合培育3小時後，利用0RIGEN儀器決定相對電化學發光（ECL)。對二組一份之樣品決定平均ECL 值，再利用Kaleidagraph軟體對競爭抗體濃度作圖。基於某些實驗，可繪出百分抑制率。利用以下4 -變數程式決定競爭曲線及EC50值（可生成50%最大結合之抗體濃度）： y = ((ml-m4)/(l + (mO/m3)Am2)) + m4 ； ml= ； ml =； m 3 = ； m 4 = m0 =獨立的變數 m 1 =在相對ECL單位中零訊號反應 m2=曲度變數 m3=EC50，微克/亳升 62862-960914.DOC - 162 - _ . 本紙張尺度適用中國國家標準(C^S) A4規格(210X 297公釐) A7 B7 1294969 五、發明説明（湖） m4 =在相對ECL·單位中最大訊號反應利用Muller方法，自EC50值及示踪抗體之已知濃度中估算出平均親和力數值。 4.2JB8-MX-DTPA之製借嵌合劑，1 -異硫氰酸基苄基-3 -曱基二乙三胺五醋酸 (MX-DTPA)以乾粉型式（自由態-酸）提供，並貯於_2〇。〇或-7 0°C之乾燥處。约3亳克之CHO 2B8抗體於低金屬生理食鹽水中，由加入1/10倍體積之50 mM硼酸鈉，pH 8.6調至pH 8.6。10-11亳克/毫升之抗體，以MX-DTPA對蛋白質4 : 1莫耳濃度比例培育之，係加入已溶於5 〇 mM爛酸納之MX-DTPA，pH 8.6。經過在環境溫度下培育後（2_24小時），經由在低金屬生理食鹽水中利用Centricon 30自旋濾器重複透析過濾，可移出共軛物中未反應之嵌合物。 5·Ιη2Β8及Y2B8之製備利用如此中所述之放射標誌套組策略，製備Ιη2Β8。抗體標諸至3 mCi /毫克比活性，並調和至〇.2亳克/亳升。簡言之，0.5-2 mCi的"Un氣化物轉移至無金屬之微量離心管，再利用1.2X體積之低金屬50 mM醋酸鈉調至約PH 4.2。在醋酸銦溶液中加入2亳克/亳升的2B8-MX-DTPA，且在環境溫度下培育30分鐘後，經放射標誌之抗體調和至〇·2毫克 /亳升，於lxPBS，pH 7.2，其中含有7·5%〇/ν)人類血清白蛋白及1 mM DTPA(4%_6°/〇的HSA終濃度）。所有樣品均作放射併入之測試，作三次；數值為大於9 5 %。也利用實例1所述之放射標誌套組小規模版本製備 62862-960914.DOC - 1 63 - 本紙張尺度適用中國國家標準(Ci^S) A4規格(210X297公釐) "

裝訂 1294969 A7 B7 五、發明説明（161) Y2B8。抗體標誌至比活性為15 mci/亳克，再調和成〇·3毫克/亳升。簡言之，〇·5_2 mCi的9〇γ氣化物轉移至無金屬之微量離心管，再利用Ι2χ體積之低金屬5〇 mM醋酸鈉調至約pH 4.2。2亳克/亳升之2B8-MX-DTpA加至9〇γ醋酸鹽浴液，經過在環境溫度下培育5分鐘後，經標誌之抗體調和成〇·3亳克/耄升，於含有7 5%(w/v)人類血清白蛋白及i mM DTPA(HSA最終濃度，4%-6%)之 ixpBS，pH 7.2 中。所有樣品均作放射併入之測試，作三次；數值為 >9 5% 〇依據加至反應混合物中放射活性之量，估算出最終放射標誌產物之放射活性濃度，並參考放射標誌分析之檢定。自加入之已知量抗體中，估算出已中止之反應混合物中抗體之濃度。於評估pH對於放射併入及結合作用之放射標誌動力學研究中，加入各種量之低金屬50 mM醋酸鈉以調整反應混合物之pH值（0.8-2.2X體積之放射標誌溶液）。 6·Ι_η2Β8及Y2B8放射併入之決炎利用由Biodex出品之商品化套組（Tec_c〇ntr〇1 Padiochromatographic Kit ;見實例丨）決定在終產物或培育樣品中’與共轭物結合之放射活性含量（放射併入率）。一般而言，施加1微升之試樣，二份或三份一組，利用微量吸量管進行，再依Biodex之指示說明展開。長條半邊置玻璃管中，如下述以Isodata r計數器或Packard T〇p c〇unt液體閃爍計數器計數其放射活性。放射標誌之納入係將在長條 62862-960914.DOC___: 1 64 - 本紙張尺度適用中國國家檬準(CiiS) A4规格(210X297公^ ^ -- 1294969 A7 ____B7_ 五、發明説明（162 ) 上半部份放射活性之量除以見於上及下半之總放射活性。此數值以百分率表示，並求出平均值。 7.I1L2B8及Y2B8免癌反應性之決宕利用Lindmo et al之方法及如實例1所述，評估免疫反應性。 8.Ln2B8及Y2B8之亩接結合分析使用如此中所述之相同策略，分別決定CD20-陽性SB細胞對In2B8及Y2B8之結合。In2B8及Y2B8如上述般製備及調和。於分析時，In2B8或Y2B8樣品以分析稀釋緩衝溶液 (lxPBS，pH 7.2，含有1%(W/V)牛血清白蛋白（BSA》分別稀釋至4 0亳微克/亳升及1 1亳微克/毫升。抗原-陽性（SB)及抗原-陰性（HSB)細胞維持在RPMI 164〇中，其中添加有10%胎牛血清，在3 7l&5〇/〇〇〇2下。在環土兄溫度下以離心（1300 rpm，於Sorvall離心機）回收〇·5_2χ 1〇6細胞/亳升之細胞密度，並以5〇亳升1)<11]838洗二次。成團塊的細胞於含有l〇/〇(w/v)牛血清白蛋白（BSA)及 10%(w/v)甘露醇之lxHBSS預冷溶液（冷凍乾燥用緩衝溶液）再懸浮成5 0 x 1 06細胞/毫升。細胞懸液分配至15毫升有〇環墊圈之聚丙浠微量離心管中，5〇xl〇6細胞/亳升（〇5毫升 /管）’並在3 0 - 6 0亳托下冷凍乾燥一夜。經冷凍乾燥之細胞貯於2 - 8 °C乾燥箱，於分析時再重組於無菌水中。於1.5亳升聚丙烯管中之冷凍乾燥SB&HSB細胞，利用無菌水重組至50X106細胞/亳升。經稀釋之In2B8或γ2Β8加至細胞中，三組一份，並以上下反轉方式在環境溫度下分 62862-960914.DOC - 1 65 - 本紙張尺度適用中國國家標準(Cfis) Α4規格(21〇Χ297公釐） ----- A7 B7 1294969 五、發明説明（163) 別培育4 5 - 6 0分鐘。培育之後，細胞以離心使成團塊，再以Iso data τ計數器或Packard Top C ourit液體閃爍計數器中計數樣品而決定與細胞結合之放射活性。與細胞結合（B )之放射活性係自所加入之總放射活性中扣除未結合之放射活性（上清液）而求得。總放射活性則是由無細胞管中計數出之放射活性求得。結合計數以總計數之百分率表示，可得結合率。 9 ·放射活性之偵測放射併入時，樣品以Isodata τ計數器計數1分鐘。計數器定在100 _ 500 KeV能量窗下，且在在使用前針對使用 111 In之樣品將背景調至零。Isodata 7計數器也用於計數其上點有9GY之ITLC長條。偵測軔致輻射之能量窗為100 -1000 KeV。於結合分析中，9 G Y樣品轉移至2 4孔洞之盤中，加入 MicroScint 40 雞尾酒，再於 Packard Top Count 中計數 1 分鐘，使用最低及最高之能量定位。銦-[111 ]樣品以Isodata 7計數器計數1分鐘，計數器之能量窗定在100 - 500 KeV，使用前才將背景值調至零。 10.In2B8及Y2B8臨床劑量之釋出說明確立放射併入及結合至CD20 -陽性細胞之釋出說明，係以二批次的臨床級2B8-MX-DTPA(lot # 0219及0220)製成各6劑量之In2B8及Y2B8，此依本發明來製備，再於GMP 條件下完成。如下進行釋出分析。 IV結果 62862-960914.DOC - 166 - _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CHS) A4規格(210X297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（164) A. CHO-衍生之2B8之鑑定利用流體細胞計數分析，可證明CHO 2B8直接結合至 CD20-陽性之SB細胞，未結合至CD20-陰性HSB細胞（圖 3 4)。對技藝上不相關之同型（τ / /c )抗體（S004)未見與SB 或HSB細胞有顯著的結合。在競爭分析中，利用ORIGEN化學發光偵測系統評估CHO 2B8對CD20-陽性細胞之結合。在釕-標誌之CHO 2B8示踪物存在下，將經冷凍乾燥及重組之抗原-陽性S B細胞與增量之抗體共培育。結果顯示，CHO 2B8抑制與CD20 -陽性細胞之結合，其程度等同於由中空纖維生物反應器所衍生者（2B8-49)(圖35)。在圖中決定出EC50值，並以Muller (1980)方法來計算平均親和力數值。對CHO 2B8之親和力經決定知是1·3 xlO·1 GM ;由中空纖維生物反應器所衍生之 2B8抗體有2.5 X 1 (T1GM之親和力值。由與不相關之同型抗體，S004缺乏競爭上可證知，非特異之結合是幾可忽略的。 B. CHO·衍生之2B8-MX - DTP A之鑑定利用類似先前鑑定2B8-49所用之策略，製備2B8共軛物 (2B8-MX-DTPA)。反應之進行係利用約3毫克的抗體，及 4 : 1莫耳濃度比例之嵌合物對抗體。評估2，4，8，1 7及 2 4小時培育時間，以決定生成結合至CD20陽性細胞可接受之保留性及放射併入111 In之反應時間。比較CHO 2B8對 CHO 2B8-MX-DTPA共軛物反應達8·24小時之競爭結合曲線是相似的，顯示共軛作用過程並不會顯著地改變抗體與 62862-960914.DOC - 167 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（165 ) CD20抗原之結合（圖36)。利用圖解求得之EC50值（圖 3 6)，未共軛及共軛抗體之親和力常數範圍可在2.3 X 1 〇_10 Μ至5.9 X 10_ 10M(表4 0)。8至24小時之共軛時間下可得到 >95%之放射併入率。表40.共軛反應時間對於CHO 2B8-MX-DTPA放射納入及免疫反應性之影響培育時間(VI、時）放射併入率Γ%) 親和力ηνπ 0 ND 2.3Χ10·10 2 83.5 ND 4 90.5 ND 8 96.1 5.9xl〇·10 17 97.3 5.9xl〇·10 24 98.8 4.4xl〇·10 C.製備自CHO-衍丰之2B8-MX-DTPA之In2B8及Y2B8之鑑定利用先前於中空纖維生物反應器-衍生之抗體中之小規模放射標誌套組策略（實例1)製備經銦_ [丨i i ]-標誌之CHO 2B8-MX-DTPA(In2B8)。簡言之，共軛的抗體（CH0·衍生之2B8-MX-DTPA ; lot # 0165A)與"hn醋酸鹽在所示之 pH值下共培育於環境溫度下3〇分鐘。反應混合物以Pbs， pH 7.2 ’含有7·5%〇/ν)人類血清白蛋白及1 mM DTPA調和。In2B8經調和的樣品再利用即時薄層層析分析其放射 62862-960914.DOC „ gg 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1294969 A7 B7 五、發明説明（166 ) 併入率。利用經冷凍乾燥且重組之SB細胞決定In2B8與 CD20 -陽性細胞之結合。為比較用，由融合瘤-產生之抗體 (2丑8_49)所製備之共軛物，與111111醋酸鹽，在0114.2下培育30分鐘（採用先前為此抗體發展之條件）。進行動力學研究，以決定可對CD20 -陽性細胞之結合提供最大保留及高度放射併入率之標誌條件（表41及42)。共軛的抗體（CHO -衍生之2B8-MX-DTPA)在環境溫度下與 1MI醋酸鹽在pH 4.2下依所指示之時間共培育（表42)。表4 1. In2B8放射標諸動力學：pH值對於放射納入率及與CD20 -陽性細胞結合上之影響反應pH 放射併入率ί%) 結合率(％) 3.0 97.7 85.3 3.7 98.5 83.9 4.0 98.6 84.1 4.3 98.0 84.0 4.6 98.9 83.4 對照組(2B8-49) 99.3 86.5 表42. In2B8放射標誌動力學：培育時間對於放射納入率及與CD20 -陽性細胞結合上之影響培育時間(分鐘）放射併入率(％) 結合率(％) pH 2.9： 15 97.2 85.3 30 99.1 85.2 62862-960914.DOC -169- 本紙張尺度適用中國國家標準(CiiS) A4規格(210X297公釐) 1294969

45 97.2 84.8 pH 4.6： 15 99.0 87.2 30 97.2 86.8 45 99.4 86.3 對照組(2B8-49) 99.4 87.8 結果證實，ρΗ3·〇_46及m八执 . 及30刀鐘之培育時間，可達到放射標誌> 9 7 %之放射併入，闾拄沾人 ^ Η時結合可維持在約84〇/〇。對於 15-45分鐘培育時間，ρΗ 2.9_4 6下之反應，放射併入率及結合值是不變的(表42)。結果可與利用2則_49抗體所得的比得上（表4 1及4 2 )。將共軛抗體（CHO-衍生之2B8_Mx_DTpA)與”γ醋酸鹽在所指示之ΡΗ值及環境溫度下培育5分鐘，可製成經釔_ [90]-標誌之抗體。反應混合物調和在含有75%(w/v)人類血清白奎白及1 mMDTPA之PBS，PH 7.2中。Y2B8經調和之樣品再利用即時薄層層析分析其放射併入率。利用冷束乾燥及再重組之SB細胞，可決定Y2B8與CD20-陽性細胞之結合。為比較用，由融合瘤產生之抗體（2B8_4 9)所製成之共軛物，與9GY醋酸鹽在pH 4_2下共培育5分鐘（條件為先前為此抗體所確立的）。'

進行類似的動力學研究，以評估9GY-標誌抗體之製備 (Y 2 B 8 )。放射標遠、反應在p Η 3 · 9 - 4 · 7 ’培育時間為$分鐘下，放射併入可達96%以上，與CD20-陽性細胞之結合保留性大於80%(表43)。3，5及10分鐘的培育時間及pH 170-

62862-960914.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(C5is) A4規格(210X 297公爱) 1294969 A7 B7 五、發明説明（168 ) 2.9-4.6，可得到類似結果（表44)。之後，共軛抗體（CHO-衍生之2B8-MX-DTPA)在環境溫度下與9GY醋酸鹽，在pH 4.2下依所示之時間培育（表44)。結果可與利用2B8-49抗體所得者比得上（表4 3及4 4)。表4 3. Y2B8放射標誌動力學：pH對於放射納入及結合至CD20 _陽性細胞之影響反應pH 3.9 4.2 4.4 4.6 4.7 對照組(2B8-49) %] 入併射放 (%心口結 .4.8.1.0.4.3 8.7.6.7.7.9. 9 9 9 9 9 9 7 0 0 2 6 6 0.1.0.0.0.2. 表44 . Y2B8放射標誌動力學··培育時間對於放射納入及結合至CD20 -陽性細胞之影響培育時間ί分）放射併入率ί%) 結合率(％) pH 3.9 ： 3 97.0 82.0 5 98.9 82.1 10 99.2 82.3 pH 4.7 ： 3 97.2 82.5 5 96.7 81.8 10 97.6 81.5 對照組(2B8-49) 99.2 84.2 62862-960914.DOC -171 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CiiS) A4規格(210X297公釐） 1294969 A7 B7 五、發明説明（169 ) 利用Lindmo et al之方法，決定由CHO 2B8製備之In2B8 及Y2B8之免疫反應性。將量漸增之新鮮回收之CD20-陽性 SB細胞，與固定量之In2B8或Y2B8，在抗原過量之條件下共培育。結合數據之倒數作圖分析，可分別決定出In2B8 及Y2B8 80.6%及72.2%之免疫反應性（圖37及38)。 D.CHO-衍生之In2B8及Y2B8之釋出說明使用二批次臨床級的In2B8/Y2B8放射標誌套組，製備 In2B8及Y2B8各六批次。In2B8及Y2B8以目前用於臨床試驗之放射標誌策略小規模版來製備。各經放射標誌之2 B 8 -MX-DTPA批次，進行放射併入及結合至CD20-陽性（SB) 及CD20-陰性（HSB)人類細胞之測試。結果綜合於表45及 46。對製成的In2B8六批次而言，放射併入率為98.9%至 99.3%，平均99.1%。結合至CD20 -陽性細胞由81.9%至 85.1%，平均83.6% ;結合至CD20-陰性細胞則<4%。對所製成的Y2B8六批次而言，放射併入率為97.4%至98.7%，平均98.2%。與CD20-陽性細胞之結合為81.4%至82.7%，平均81.9% ;結合至CD20-陰性細胞則<8%。表45.利用放射標誌套組策略所製備之CHO-衍生之In2B8之釋出分析結果 , 結合率流程#_放射併入率(％) SB細胞_HSB細胞 #l(Lot#0219) 99.1 81.9 2.8 #2(Lot#0219) 99.3 83.2 2.8 62862-960914.DOC - 172 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1294969 A7 B7 五、發明説明（17C 丨） #3(Lot#0219) 99.2 83.6 3.7 #4(Lot # 0220) 99.0 83.8 2.6 #5(Lot#0220) 98.9 84.1 2.6 #6(Lot#0220) 98.9 85.1 3.3 平均=99.1% 平均=83.6% 平均=2.9% SD=0.2% SD=1.1% SD=0.4% 表4 6 · 利用放射標誌套組策略製備之CHO · 衍生之Y2B8之釋出分析結果結合率ί%) 流程# 放射併入率(％) SB細胞 HSB細胞 #l(Lot#0219) 98.7 82.1 7.4 #2(Lot#0219) 98.6 82.7 0.7 #3(Lot#0219) 98.3 82.2 7.2 #4(Lot#0220) 97.4 81.8 1.7 #5(Lot#0220) 97.6 81.4 2.2 #6(Lot#0220) 98.4 81.4 1.1 平均=98.2% 平均=81.9% 平均=3.4% SD=0.5% SD=0.5% SD=3.1% V .討論及總結選殖及表現在CHO細胞（CHO ·衍生之2B8 )之抗-CD20鼠單株抗體（2B8) ，可維持對CD20-陽性人類細胞之特異性，可由FACS及競爭結合分析示出。與人類T-細胞之結合減至 62862-960914.DOC -173- 本紙張尺度適用中國國家標準(CfiS) A4規格(210X297公釐) 1294969 A7 ___—_B7 五、發明説明1 ~" 最小。利用競爭結合分析可決定出，抗體對人類CD20 -陽性細胞之親和力為1 ·3 X 1 〇 ·1 〇M。利用相同的分析法，由中空纖維生物反應器衍生之2B8抗體得2.5 X 1 (Γ10M之親和力數值。 CHO 2B8抗體與MX-DTPA反應形成共軛物2B8-MX-DTPA ’同時可保有免疫反應性適合之保留性。在環境溫度下培育8小時後，偵測111 in之放射併入，可決定最佳之嵌合物納入率。就pH及培育時間，將2B8-MX-DTPA共軛物之放射標諸策略對9GY或^Ιη更臻完善，以確保有最大之放射併入率及免疫反應性最大之保留。 Ιη2Β8及Υ2Β8的許多製備結果明示出，用來製備臨床劑篁之放射標誌、策略之再現性。依據這些放射標誌、結果，可推知利用經冷凍乾燥CD20-陽性細胞之放射併入及結合釋出說明，分別是^ 9 5 %及7 0 %。總而言之，這些結果證明’ CHQ-衍生之2Β8及由中空纖維衍生之2Β8-49之可比較性’且顯示由CHO-衍生之2B8-MX-DTPA用於臨床試驗上之適合性。最後’本發明揭示一種稱為”混合及掃射，，方法之標諸策略，可製備放射標誌抗體之臨床劑量，此省略了目前為移出非蛋白質結合之放射標'誌所必要之高性能液相層析 (HPLC )步驟。經簡化之策略可省去此費力之純化步驟，而維持高水平之放射標誌納入率（> 9 5 % )，並有改善之免疫反應性保留程度（>70%)。頃發現臨床上調和之放射標誌共輛物者培育在4°C下48小時，依放射標誌及免疫反應性之保 62862-960914.DOC · 1 74 . 本紙張尺度適用中國國家標準(cjjs) A4規格(21〇x 297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（172 ) 留為準，其於試管内是穩定的。另外，經放射標誌之共軛物當在3 7 °C之人類血清中培育7 2小時，是穩定的。在 BALB/c老鼠中之生物分佈研究證明，並無異常的組織沉積，在骨骼中無顯著的累積。估算其對”標準的’’ 7 0公斤人類之放射吸收劑量，可與利用9GY-標誌之2B8-MX-DTPA 在進行的臨床試驗中所得的比得上。這些研究的結果顯示，利用π混合及掃射’’策略所產生之9GY-標誌之2B8-MX-DTPA，可與利用傳統HPLC製程製備的比得上。製備臨床級放射標誌共軛物之擴大規模策略之確認中顯示，此方法是可再現的，且產物與利用目前HPLC方法產生者是比得上的。這些臨床前研究之結果顯示，此新的”混合及掃射”策略可用來製備適用於臨床試驗之經90Y -標誌之2B8-MX-DTPA ° 參考文獻

Each of the following citations is herein incorporated by reference ： 1 . Adams，R_A·，Flowers，A.，and Davis，B.J. Direct Implantation and Transplantation of Human Acute Lymphoblastic Leukemia in Hamsters，SB-2. Cancer Research 28 : 1121-1125, 1968 o 2. Adams， R.A. Formal Discussion · The Role of Transplantation in the Experimental Investigation of Human Leukemia and Lymphoma. Cancer Res. 27(1): 2479-2482, 1967 o 62862-960914.DOC -175- 本紙張尺度適用中國國家標準(CKS) A4規格(210 X 297公釐） A7 B7 1294969 五、發明説明（173 ) 3. Lindmo，T·，Boven，E·，Cuttitta，F·，Fedoroko，J·，and Bunn，P_A·，J. Immunol· Methods，72 : 77-1984 0 4 . Kozak, R.W., Raubitschek, A.? Mirzadeh, S.5 Brechbiel, M.W·，Junghaus，R.，Gansow，O.A·，and Waldmann，T.A. Cancer Res. (1989)49 : 2639-2644。 5. Parker，B.A·，Halpern，S.E·，Miller，R.A·，Hupf，H·， Shawler，D.L.，Collins，H.A.，Amox，D.，White，C.A· and Royston，I.N. Eng. J. Med.，submitted 0 6. Leland, J.K. and Powell, M.J.J. (1990) Electrochem. Soc. 137, 3127 。 7. Muller，R.J· Immunological Methods (1980) 34，345 o 8. Mirzadeh，S·，Brechbiel，M.W·，Atcher，R.W. and Gansow，O.A. (1990) Bioconjugate Chemistry 1(1)，59 o 9. Brechbiel，M.W·，Gansow，O.A·，Atcher，R-W·，Sclom， J·，Esteban，J·，Simpson，D.E. and Colcher，D. (1986) 25, 2772 〇 _ 62862-960914.DOC _ 176 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐）

Claims

1294969 申請專利範園

1· 一種用以放射標誌嵌合物共軛之抗_ C D 2 0抗體之方法，其包括： (i)混合嵌合物-共軛之抗體與含有放射標誌之溶液； (i i)培育混合物相對短的時間，在適合溫度及p Η下以藉此於少於1 0分鐘下產生具大於9 5 %放射併入 (radioincorporation)之經放射標誌抗體，且於該適合溫度及p Η產生的經放射標誌抗體具有足夠比活性及大於 7 〇 %免疫反應性，因此該經放射標誌抗體可直接投予至病人而毋需進一步將放射標誌抗體自未併入放射標誌者中純化；及 (iii)將經標誌之抗-CD20抗體稀釋於調和緩衝液至適合濃度’以供投予至病人而毋需進一步將放射標誌抗體自未併入放射標誌者中純化。 2·根據申請專利範圍第1項之方法，其中的嵌合物選自： MX-DTPA ’ 苯基_DTPA，节基-DTPA，CHX-DTPA 及 DOTA所組成之群。 3·根據申請專利範圍第2項之方法，其中的嵌合物是Μχ-DTPA 〇 4·根據申請專利範圍第丨項之方法，其中該含放射標誌溶液於與嵌合物-共軛之抗體混合前，係經調整至約3至6之 pH值。 5.根據申請專利範圍第4項之方法，其中該？11值係以低金屬醋酸納溶液調整。 6·根據中晴專利範圍第5項之方法，其中醋酸納溶液濃度為 62862-960914.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS> A4規格(210 X 297公袭：) A8 B8 G8 D8 1294969 六、申請專利範圍約 1 0 至 1000 mM。 7·根據申請專利範圍第1項之方法，其中的抗體是嵌合的抗-CD20抗體。 8·根據申請專利範圍第1項之方法，其中的抗_ c d 2 0抗體是 2B8-MX-DTPA。 9.根據申請專利範圍第1項之方法，其中的抗_ c d 2 0抗體係 2B8 ;嵌合物為MX-DTPA ;且放射標誌為9〇γ。 10·根據申請專利範圍第1項之方法，其中該調配緩衝液係含生理食鹽水、放射保護劑、及未共輛之喪合物。 11·根據申請專利範圍第1 〇項之方法，其中的放射保護劑選自：人類血清白蛋白（HSA)，抗壞血酸鹽，抗壞血酸，酚，亞硫酸鹽，穀胱甘肽，半胱胺酸，龍膽酸，菸鹼酸，棕櫚酸抗壞血酸鹽，H0P(:0)H2，甘油，甲醛次硫酸鈉，Na2S205，Na2S203，及S02所組成之群。 12·根據申請專利範圍第1 〇項之方法，其中未共軛的嵌合物是 DTPA 或 EDTA〇 13.根據申請專利範圍第1項之方法，其中的放射標誌是 111 In氯化物。 14·根據申請專利範圍第13項之方法，其中該^^氯化物抗體之比活性為2至3亳居里/毫克抗體。 15. 根據申請專利範圍第1 3項之方法，其中"1 In氣化物之體積用量是約4 - 6亳居里除以標誌時之放射活性濃度。 16. 根據申請專利範圍第1 3項之方法，其中約1亳升且濃度約0.5-3 0毫克/毫升之嵌合物-共軛的抗體與放射標誌溶 -2- 62862-960914.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐）. 1294969

液混合。 ’其中的混合物培育於 ’其中的混合物培育於 17·根據申請專利範圍第1 3項之方法約3 0秒及6 〇分鐘之間。 18·根據申請專利範圍第丨7項之方法 1 5至4 5分鐘之間。 19. 根，中請專利範圍第13項之方法，丨中調和緩衝溶液加入量為達到約10毫升至約50毫升最終總體積所必要之量。 20. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中的放射標誌是9〇γ 氣化物。 - 21. 根據申請專利範圍第2〇項之方法，其中該9〇γ_標誌抗體之比活性為1 〇至1 5毫居里/毫克抗體。 22·根據申請專利範圍第2〇項之方法，其中9〇γ氯化物體積用量為介於約5及1 〇〇亳居里之間，除以標誌時之放射活性濃度。 23·根據申請專利範圍第22項之方法，其中9〇γ氯化物之體積用量是約45亳居里除以標誌時之放射活性濃度。 24·根據申請專利範圍第2 〇項之方法，其中約1至2亳升濃度約0.5至30亳克/毫升之MX-DTPA-共軛之抗體與放射標誌溶液混合。 25.根據申請專利範圍第2 4項之方法，其中混合物培育的時間在約3 0秒及6 0分鐘之間。 26·根據申請專利範圍第2 5項之方法，其中該混合物培育的時間在約3及1 0分鐘之間。 -3- 62862-960914.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1294969 έ88 C8 _______D8 I、申請專利範圍 ~ 27.根據申凊專利範圍第2 0項之方法’其中調和緩衝溶液加入量為達到約1 0毫升至約5 0毫升最終總體積所必要之量。 28·根據申請專利範圍第1項之方法，其中該經放射標誌之抗-CD2 0抗體之免疫反應性係表示為與其標的細胞結合之經放射標誌抗體的百分率，而於結合分析法中決定，此分析方法包括： (1)混合及培育至少一份經放射標誌之抗_ c D 2 〇抗體與至少一份CD 2 0 -陽性細胞； (i 1)混合及培育至少一份經放射標誌抗體，與（丨）步驟之一份相同，與至少一份稀釋緩衝溶液，其體積和（丨）步驟之C D 2 0 ·陽性細胞的一份相同，以作為對照組； (i i i)細胞以離心使成團塊； (IV)偵測在成團塊細胞上清液及對照組中之放射活性；及 (v)將在細胞上清液中之放射活性量，與在對照組中之放射活性量比較。 29.根據申請專利範圍第28項之方法，其中該放射標誌為 9 0 γ 〇 30·根據申請專利範圍第2 8項之方法，其中該抗_ CD2〇抗體是 2B8 〇 31·根據申請專利範圍第3 〇項之方法，其中該嵌合物為 DTPA 〇 32·根據申請專利範圍第2 8項之方法，其中該抗體是嵌合的 62862-960914.DOC - 4 _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐）. A8 B8 C8 D8 1294969 六、申請專利範圍抗-CD20抗體。 33·根據申請專利範圍第2 8項之方法，其中該CD2〇陽性細胞是 SB 細胞（ATCC # CCL 120)。 34·根據申請專利範圍第28項之方法，其進一步包括 (1)混合至少一份的經放射標誌抗體與至少一份的 CD20·陰性細胞； (i i)將C D 2 0 -陰性細胞以離心使成團塊； (iv) 偵測在CD20-陰性之成團塊細胞上清液中之放射活性；及 (v) 比較在002 0_陰性細胞-上清液中之放射活性量與在 C D 2 0 -陽性細胞上清液及對照組中之放射活性量。 35·根據申請專利範圍第3 4項之方法，其中該放射標誌為 9〇γ 〇 36. 根據申請專利範圍第3 5項之方法，其中該嵌合物為 DTPA 〇 37. 根據申請專利範圍第3 4項之方法，其中該CD20 陰性細胞是HSB 細胞（ATCC # CCL120· 1)。 38. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該經放射標誌抗體之免疫反應性係表示為與其標的細胞結合之經放射標誌抗體的結合百分率，而於結合分析方法中決定此分析方法包括： (i)混合至少一份經放射標諸之抗體與至少一份C D 2 0 -陽性細胞； (i i)混合至少一份放射標誌抗體，和（i)步驟的一份相 62862-960914.DOC - 5 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1294969 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍同，與至少一份稀释緩衝溶液，其體積和（丨）步驟之 C D 2 0 -陽性細胞相同，以作為對照組； (i i i)將細胞以離心使成團塊； (iv)偵測在成團塊細胞上清液及對照組中之放射活性；及 (V)比較在細胞上.清液中之放射活性量與在對照組中之放射活性量；其中該分析係使用含有如下成份之套組來進行： (1)至少一個含固定的或冷凍乾燥之C D 2 〇陽性細胞之小瓶； - (ii) 一個含有嵌合物·共軛之抗_(：1)2〇抗體之小瓶； (iii) 一個含有調和緩衝溶液之小瓶；及 (iv) 放射標誌抗體用之操作指示，其中該小瓶組份以此劑量及此濃度供應下，當依據套組指示與放射標誌組合時，係產生具大於9 5 %放射併入、足夠比活性及大於70免疫反應性之經敢射標誌抗體’因此該經放射標魂抗體於投予至病人前勿需自未併入放射標誌者中進一步的純化。 39·根據申請專利範圍第38項之方法，其中該放射標誌為 9〇γ 〇 40. 根據申請專利範圍第3 9項之方法，其中該抗體為2 Β 8。 41. 根據申請專利範圍第4 0項之方法，其中該嵌合物為 DTPA。 42. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該經放射標誌抗體 -6- 62862-960914.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1294969 έ88 _S___ 六、申請專利範圍之免疫反應性係表示為與其標的細胞結合之經放射標談抗體的結合百分率，而於結合分析方法中決定此分析方法包括： (i) 混合至少一份的放射標誌抗體與至少一份的C d 2 0 -陽性細胞； (ii) 混合至少一份的放射標誌抗體，和（i)步驟之一份相同，與至少一份稀釋緩衝溶液，其體積和（i)步驟之 C D 2 0 -陽性細胞相同，以作為對照組； (i i i)將細胞以離心使成團塊； (i v)债測在成團塊細胞上清液及對照組中之放射活性；及 (V)比較細胞上清液中放射活性之量與對照組之放射活性量；其中該分析係利用含有至少一個含經固定或經冷凍乾燥的CD20·陽性細胞之小瓶、及一含特別結合至該 CD20-陽性細胞之CD20抗原的嵌合物·共軛之抗_cD2〇 4几體之小瓶的套組來進行。 43.根據申請專利範圍第42項之方法，其中該放射標誌為 9〇γ 〇 44·根據申請專利範圍第43項之方法，其中該抗體為2Β8。 45.根據申請專利範圍第44項之方法，其中該嵌合物為 DTPA 0 46·根據申請專利範圍第以之方法，其中該經放射標諸抗體之免疫反應性係以競爭結合分析來決定，該方法包括： 62862-960914.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐) 1294969

(i) 製備以釕-標誌之受試抗_ C D 2 0抗體； (ii) 於具固定濃度的經固定、新鮮的或經冷凍乾燥之 CD20-陽性細胞及具固定濃度之經釕-標誌抗體的不同管中培育漸增量之受試抗體； (iii) 依據相對電化學發光（ECL)決定各反應試管中經釕-標諸抗體結合至細胞之相對量；及 (iv) 依據於各反應管中偵測所得結釕·標誌抗體結合至細胞之相對量，計算受試抗體對細胞之親和力。 47·根據申請專利範圍第46項之方法，其中該抗體為2b8。 48·根據申請專利範圍第46項之-方法，其中該cd20-陽性細胞是 SB 細胞（ATCC # CCL 120)。 49·根據申請專利範圍第9項之方法，其中該9〇γ_標誌抗體之比活性大於3.2亳居里/亳克抗體。 50.根據申請專利範圍第20項之方法，其中該9〇丫_標誌抗體之比活性大於3.2亳居里/亳克抗體。 -8 - 62862-960914.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210Χ 297公爱）.