PT1904104E - Anticorpos sp35 e suas utilizações - Google Patents

Anticorpos sp35 e suas utilizações Download PDF

Info

Publication number
PT1904104E
PT1904104E PT67864280T PT06786428T PT1904104E PT 1904104 E PT1904104 E PT 1904104E PT 67864280 T PT67864280 T PT 67864280T PT 06786428 T PT06786428 T PT 06786428T PT 1904104 E PT1904104 E PT 1904104E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
seq
antibody
quot
antibodies
antigen
Prior art date
Application number
PT67864280T
Other languages
English (en)
Inventor
Sha Mi
Blake R Pepinsky
Zhaohui Shao
Christilyn P Graff
Original Assignee
Biogen Idec Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Idec Inc filed Critical Biogen Idec Inc
Publication of PT1904104E publication Critical patent/PT1904104E/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Diabetes (AREA)

Description

DESCRIÇÃO
ANTICORPOS sp35 E SUAS UTILIZAÇÕES
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Campo da Invenção
Esta invenção refere-se a neurologia, neurobiologia e biologia molecular. Mais particularmente, esta invenção refere-se a anticorpos SP35, assim como aos referidos anticorpos para utilização no tratamento de lesões, distúrbios e doenças neurológicas tais como lesões na espinal-medula.
Antecedentes da Invenção
Os axónios e as dendrites estendem-se dos neurónios. A extremidade distai de um axónio ou de uma neurite que se estende inclui uma região especializada, conhecida como o cone de crescimento. Os cones de crescimento sentem o ambiente local e guiam o crescimento dos axónios em direcção a uma célula alvo de um neurónio. Os cones de crescimento respondem a estímulos ambientais, por exemplo, adesividade de superfícies, factores de crescimento, neurotransmissores e campos eléctricos. Os cones de crescimento geralmente avançam a uma velocidade de um a dois milímetros por dia. 0 cone de crescimento explora a área à sua frente e em ambos os lados, por intermédio de alongamentos classificadas como lamellipodia e filopodia. Quando um alongamento contacta com uma superfície desfavorável, retira-se. Quando um alongamento contacta com uma superfície de crescimento favorável, continua a se estender e guia o cone de crescimento naquela direcção. Quando o cone de crescimento atinge uma célula alvo apropriada, é criada uma ligação sináptica. 1 A função das células nervosas é influenciada pelo contacto entre neurónios e outras células no seu ambiente circundante imediato (Rutishauser, et al., 1988, Physiol. Rev. 68: 819). Estas células incluem células gliais especializadas, oligodendrócitos no sistema nervoso central (SNC), e células de Schwann no sistema nervoso periférico (PNS), que reveste o axónio neuronal com mielina (Lemke, 1992, em An Introduction to Molecular Neurobiology, Z. Hall, Ed., p. 281, Sinauer).
Neurónios do SNC têm o potencial inerente de se regenerarem após uma lesão, mas são inibidos de o fazerem por intermédio de proteínas inibidores presentes na mielina (Brittis et al., 2001, Neuron 30: 11-14; Jones et al., 2002, J. Neurosci. 22: 2792-2803; Grimpe et al., 2002, J. Neurosci. 22: 3144-3160).
Foram caracterizadas várias proteínas inibidoras da mielina encontradas em oligodendrócitos. Exemplos conhecidos de proteínas inibidoras da mielina incluem NogoA (Chen et al., Nature, 2000, 403, 434-439; Grandpre et al., Nature 2000, 403, 439-444), glicoproteína associada à mielina (MAG) (McKerracher et al., 1994, Neuron 13: 805-811; Mukhopadhyay et al., 1994, Neuron 13: 757-767) e glicoproteína de oligodendrócito (OM-gp), Mikol et al., 1988, J. Cell. Biol. 106: 1273-1279). Verificou-se separadamente que cada uma destas proteínas era um ligando para o receptor neuronal Nogo-1 (NgRl (Wang et al., Nature 2002, 417, 941-944; Grandpre et al., Nature 2000, 403, 439-444; Chen et al., Nature, 2000, 403, 434-439; Domeniconi et al., neurónio 2002, publicado na internet a 28 de Junho de 2002) . Mi et al. (2004) Nat. neurosci. 7, 221-228, ensina que Sp35 (LINGO-1) é um componente do complexo de sinalização receptor Nogo-66/p75. Mi et al. (2004) Nat. neurosci. 8, 745-751, ensina que Sp35 (LINGO-1) regula negativamente a mielinização pelos oligodendrócitos. W02004/085648 divulga polipéptidos Sp35 e 2 suas proteínas de fusão, anticorpos Sp35 e seus fragmentos de ligação a antigénio, e ácidos nucleicos que os codificam. 0 receptor Nogo-1 (NgRl) é uma proteína de membrana ancorada a GPI que contém 8 repetições ricas em leucina (Fournier et al. , 2001, Nature 409: 341-346) . Aquando da interacção com proteínas inibidoras (por exemplo, NogoA, MAG e OM-gp), o complexo NgRl faz a transdução de sinais que conduzem ao colapso do cone de crescimento e à inibição do crescimento da neurite.
Existe uma necessidade não satisfeita para moléculas e métodos para a inibição do colapso do cone de crescimento mediado por NgRl e da resultante inibição do crescimento da neurite. Adicionalmente existe uma necessidade para moléculas que aumentam a sobrevivência neuronal e a regeneração dos axónios. Particularmente para o tratamento de lesões, distúrbios ou doenças que envolvam lesões dos axónios, morte de células neuronais ou de oligodendrócitos, demielinação ou dimielinação ou que geralmente estão relacionadas com o sistema nervoso.
Tais lesões, distúrbios ou doenças incluem, mas não se limitam a, esclerose múltipla (MS), leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), encefalomielite (EPL), mileinose centropôntica (CPM), adrenoleucodistrofia, doença de Alexander, doença de Pelizaeus Merzbacher (PMZ), leucodistrofia da célula globóide (doença de Krabbe) e degeneração Walleriana, neurite óptica, mielite transversa, esclerose lateral amilotrófica (ALS), doença de Huntington, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, lesões da espinal-medula, lesões traumáticas do cérebro, lesões pós radiação, complicações neurológicas da quimioterapia, acidente vascular, neuropatia óptica isquémica aguda, deficiência em 3 vitamina E, síndrome da deficiência em vitamina E isolada, AR, síndrome de Bassen-Kornzweig, síndrome de Marchiafava-Bignami, leucodistrofia metacromática, neuralgia trigeminal, e paralisia de Bell. Entre estas doenças, a MS é a mais disseminada, afectando aproximadamente 2,5 milhões de pessoas globalmente. A MS geralmente inicia-se com um padrão de recaída-remissão do envolvimento neurológico, que então progride para uma fase crónica com danos neurológicos crescentes. A MS está associada à destruição da mielina, de oligodendrócitos e de axónios localizados em lesões crónicas. A demielinação observada em MS não é sempre permanente e a remielinização foi documentada em fases iniciais da doença. A remielinização de neurónios requer oligodendrócitos.
Estão disponíveis vários tratamentos que modificam a doença para MS, incluindo a utilização de corticoesteróides e imunomoduladores tais como interferão beta e Tysabri®. Além disso, devido ao papel central dos oligodendrócitos e da mielinização em MS, têm havido esforços para o desenvolvimento de terapias para aumentar os números de oligodendrócitos ou para aumentar a mielinização. Ver, por exemplo, Cohen et ai., Pat. E.U.A. No. 5, 574, 009; Chang et ai., N. Engl. J. Med. 346: 165-73 (2002). No entanto, subsiste uma necessidade urgente em desenvolver terapias adicionais para MS e outros distúrbios de demielinação e dismielinação.
RESUMO DA INVENÇÃO A presente divulgação baseia-se na descoberta de que Sp35 (Sp35 é também designada na literatura como LINGO-1 e LRRN6) é expressa em oligodendrócitos e células neuronais e regula negativamente a diferenciação oligodendrócito/neuronal, 4 sobrevivência e mielinização dos axónios. Além disso, certos antagonistas de Sp35 promovem a sobrevivência, a proliferação e a diferenciação de oligodendrócitos e de células neuronais, assim como a mielinização de neurónios. Com base nestas descobertas, a divulgação refere-se geralmente to anticorpos, fragmento de ligação a um antigénio ou seus derivados gue podem ser usados como um antagonista de Sp35.
Mais particularmente, a invenção proporciona um anticorpo ou um seu fragmento de ligação a um antigénio que se pode ligar especif icamente a Sp35 e pode antagonizar Sp35, em que o anticorpo ou o seu fragmento é escolhido do grupo que consiste em: (i) um anticorpo ou um seu fragmento de ligação a um antigénio compreendendo uma VH, e que as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 da VH são SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, e SEQ ID NO: 79, e uma VL em que as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 da VL são SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, e SEQ ID NO: 148; e (ii) um anticorpo ou um seu fragmento de ligaçao a um antigénio compreendendo uma VH e uma VL, em que a VH compreende SEQ ID NO: 170 e a VL compreende SEQ ID NO: 283.
Ainda noutra realização, o anticorpo ou um seu fragmento de ligação a um antigénio é um antagonista da inibição do crescimento de neurites mediada por Sp35, um antagonista da inibição da mielinização mediada por Sp35, ou um antagonista da inibição da diferenciação de oligodendrócitos mediada por Sp35.
Aspectos e realizações adicionais da invenção são apresentados nas reivindicações anexas. 5
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS/FIGURAS FIG. 1: Gel de SDS-PAGE apresentando a imunoprecipitação de
Sp35 por anticorpos monoclonais 1A7 e 2F3. FIG. 2: Resultado de FACS mostrando que os MAbs 1A7 e 2F3 se ligaram a células COS-7 ou 293 que expressam Sp35, mas não controlam células sem expressão Sp35. FIG. 3: MAbs 1A7 e 2F3 protegeram os neurónios DRG da inibição do crescimento das neurites mediada pela mielina. FIG. 4A-G: Coloração imuno-histoquímica ("IHC") de co-culturas de neurónios DRG e oligodendrócitos tratados com anticorpos monoclonais 1A7 e 2F3, ou anticorpo de controlo. Os painéis D e E são ampliações, respectivamente, dos painéis B e C. A coloração com o anticorpo anti-BUI-tubulina para identificar axónios, ou anticorpo anti-MBP para identificar oligodendrócitos. F: Quantificação de células MBP+ mielinantes aquando do tratamento de co-culturas com 1A7 ou 2F3. G: Análise por "Western blot" para quantificar as MBP produzidas a partir de co-culturas de neurónios DRG e de oligodendrócitos tratados com anticorpos monoclonais 1A7 e 2F3 . FIG. 5A-C: A: Coloração com anticorpo CC1 de oligodendrócitos de ratinho em modelo cuprizona. B. Coloração com anticorpo anti-proteina MBP ou com luxol fast blue de neurónios de ratinho em modelo cuprizona. C: Quantificação de oligodendrócitos positivos para o anticorpo CC1 às quatro semanas e às 6 semanas. FIG. 6: Sobrevivência de RGCs. tratamento com anticorpo monoclonal 1A7. Animais tratados com o anticorpo 1A7 anti-Sp35 apresentaram uma sobrevivência neuronal significativa 6 (80%) quando comparados com animais tratados com o anticorpo controlo ou com PBS, que apenas apresentaram uma sobrevivência neuronal de aproximadamente 50%. FIG. 7. Pontuações BBB de ratinhos que recebem o anticorpo 1A7 anti-Sp35 após lesão da espinal-medula tal como descrito no exemplo 8. FIG. 8. "Western blot" oligodendrócitos e DRGs co-cultivadas após incubação com anticorpos anti-Sp35 Li05, Li06 e 3, 10 e 30 mg de Sp35-Fc (LINGO-l-Ig) tal como descrito no exemplo 9. FIG. 9. Fotografias dos nervos ópticos de A) Ratos Normais; B) ratos com Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE) induzida pela Glicoproteina de Oligodendrócito da Mielina (MOG); e C) ratos com Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE) induzida pela Glicoproteina de Oligodendrócito da Mielina (MOG) tratados com o Anticorpo 1A7 Sp35. Micrografias electrónicas de cada nervo óptico são apresentadas abaixo de cada fotografia do nervo óptico. FIG. 10. Gráfico do número de fibras neuronais regenerativas por secção contadas em animais que receberam uma injecção no vitreo do anticorpo 1A7 Sp35 após esmagamento do nervo óptico.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. DEFINIÇÕES
Deve notar-se que o termo "uma" entidade refere-se a uma ou mais dessa entidade; por exemplo, por "um anticorpo Sp35," entende-se representar um ou mais anticorpos Sp35. Como tal, os termos "um", "um ou mais," e "pelo menos um" podem aqui ser usados sem distinção. 7
Tal como aqui utilizado, pretende-se que o termo "polipéptido" abranja o singular "polipéptido" assim como o plural "polipéptidos", e refere-se a uma molécula composta por monómeros (aminoácidos) ligados linearmente através de ligações amida (também conhecidas como ligações peptídicas). 0 termo "polipéptido" refere-se a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, e não se refere a um comprimento especifico do produto. Assim, péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, "proteína", "cadeia de aminoácidos", ou qualquer outro termo usado para referir uma ou mais cadeias de dois ou mais aminoácidos, são incluídos no âmbito da definição de "polipéptido," e o termo "polipéptido" pode ser usado em vez de, ou sem qualquer distinção relativamente a qualquer um destes termos. 0 termo "polipéptido" também pretende referir-se aos produtos de modificações pós-expressão do polipéptido, incluindo sem limitação glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização através de grupos de protecção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ou modificação por aminoácidos que não ocorrem naturalmente. Um polipéptido pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou produzido por uma tecnologia recombinante, mas não é necessariamente traduzido de uma sequência de ácido nucleico designada. Pode ser gerado de qualquer modo, incluindo por síntese química.
Um polipéptido da divulgação pode ter um comprimento de cerca de 3 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 50 ou mais, 75 ou mais, 100 ou mais, 200 ou mais, 500 ou mais, 1000 ou mais, ou 2000 ou mais aminoácidos. Polipéptidos podem ter uma estrutura tridimensional definida, apesar de não terem necessariamente tal estrutura. Polipéptidos com uma estrutura tridimensional definida são referidos como enrolados, e polipéptidos que não possuem uma estrutura tridimensional definida, mas que podem alternativamente adoptar um grande número de conformações diferentes e são referidos como não enrolados. Tal como aqui utilizado, o termo glicoproteina refere-se a uma proteína acoplada a pelo menos uma porção de hidrato de carbono que está ligada à proteína através de uma cadeia lateral contendo oxigénio ou de uma cadeia lateral contendo azoto de um resíduo de aminoácido, por exemplo, um resíduo serina ou um resíduo asparagina.
Por um polipéptido ou um fragmento, uma variante, ou um seu derivado "isolado" pretende-se referir um polipéptido que não está no seu meio natural. Não é necessário nenhum nível particular de purificação. Por exemplo, um polipéptido isolado pode ser removido do seu ambiente nativo ou natural. Polipéptidos produzidos de forma recombinante e proteínas expressas em células hospedeiras são considerados isolados para os fins da divulgação, tal como são polipéptidos nativos ou recombinantes que foram separados, fraccionados, ou parcialmente ou substancialmente purificados por qualquer técnica adequada.
Também incluídos como polipéptidos da presente divulgação estão fragmentos, derivados, análogos, ou variantes dos polipéptidos anteriores, e quaisquer combinações destes. Os termos "fragmento", "variante", "derivado" e "análogo" quando se referem a anticorpos Sp35 ou anticorpos polipéptidos da presente divulgação incluem quaisquer polipéptidos que retêm pelo menos algumas das propriedades de ligação ao antigénio do polipéptido ou anticorpo nativo correspondente. Fragmentos de polipéptidos da presente divulgação incluem fragmentos proteolíticos, assim como fragmentos de deleção, além dos fragmentos específicos de anticorpos aqui discutidos noutro lado. Variantes de anticorpos Sp35 e polipéptidos anticorpos da presente divulgação incluem fragmentos tal como descrito 9 acima, e também polipéptidos com sequências de aminoácidos alteradas devido a substituições, deleções, ou inserções de aminoácidos. Variantes podem ocorrer naturalmente ou ocorrer de forma não natural. Variantes que ocorrem de forma não natural podem ser produzidas usando técnicas de mutagénese conhecidas na técnica. Polipéptidos variantes podem compreender substituições, deleções ou adições de aminoácidos conservativas ou não conservativas. Derivados de anticorpos Sp35 e polipéptidos anticorpos da presente divulgação, são polipéptidos que foram alterados de modo a apresentar caracteristicas adicionais que não se encontram no polipéptido nativo. Exemplos incluem proteínas de fusão. Polipéptidos variantes podem também ser aqui referidos como "polipéptido análogos". Tal como aqui utilizado um "derivado" de um anticorpo Sp35 ou polipéptido anticorpo refere-se a um polipéptido objecto com um ou mais resíduos quimicamente derivatizados por reacção de um grupo lateral funcional. Também incluídos como "derivados" estão aqueles péptidos que contêm um ou mais aminoácidos que ocorrem naturalmente derivados dos vinte aminoácidos convencionais. Por exemplo, a 4-hidroxiprolina pode ser substituída por prolina; 5-hidroxilisina pode ser substituída por lisina; 3-metil-histidina pode ser substituída por histidina; homosserina pode ser substituída por serina; e ornitina pode ser substituída por lisina. 0 termo "polinucleótido" pretende abranger um único ácido nucleico assim como vários ácidos nucleicos, e refere-se a uma molécula ou construção de ácido nucleico isolada, por exemplo, ARN mensageiro (mARN) ou ADN plasmídico (pADN). Um polinucleótido pode compreender uma ligação fosfodiéster convencional ou uma ligação não convencional (por exemplo, uma ligação amida, tal com aquela encontrada em ácido nucleicos peptídicos (ANP)). 0 termo "ácido nucleico" referes 10 a qualquer um ou mais segmentos de ácido nucleico, por exemplo, fragmentos de AND ou de ARN, presentes num polinucleótido. Por ácido nucleico ou polinucleótido "isolado" pretende-se referir uma molécula de ácido nucleico, ADN ou ARN, que foi removida do seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleótido recombinante que codifica para um anticorpo Sp35 contido num vector é considerado isolado para os objectivos da presente divulgação. Outros exemplos de um polinucleótido isolado incluem polinucleótidos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleótidos purificados (parcialmente ou substancialmente) em solução. Moléculas de ARN isoladas incluem transcritos de ARN in vivo ou in vitro de polinucleótidos da presente divulgação. Polinucleótidos ou ácido nucleicos isolados de acordo com a presente divulgação incluem ainda tais moléculas produzidas por via sintética. Além disso, polinucleótido ou um ácido nucleico podem ser ou podem incluir um elemento de regulação tal como um promotor, local de ligação a um ribossoma, ou um terminador da transcrição.
Tal como aqui utilizado, um "região codificante" é uma porção de ácido nucleico que consiste em codões traduzidos para aminoácidos. Apesar de um "codão de terminação" (TAG, TGA, ou TAA) não ser traduzido num aminoácido, pode ser considerado como sendo parte de uma região codificante, mas quaisquer sequências que o flanqueiam, por exemplo promotores, locais de ligação a ribossomas, terminadores da transcrição, intrões, e semelhantes, não fazem parte de uma região codificante. Duas ou mais regiões codificantes da divulgação podem estar presentes numa única construção de polinucleótido, por exemplo, num único vector, ou em construções separadas de polinucleótidos, por exemplo, em vectores separados (diferentes). Além disso, qualquer vector 11 pode conter uma única região codificante, ou pode compreender duas ou mais regiões codif icantes, por exemplo, um único vector pode codificar separadamente para uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina e uma região variável da cadeia leve da imunoglobulina. Além disso, um vector, polinucleótido, ou ácido nucleico da divulgação pode codificar para regiões codificantes heterólogas, sejam fundidas ou não a um ácido nucleico que codifica para um anticorpo Sp35 ou seu fragmento, variante ou derivado. Regiões codificantes heterólogas incluem sem limitação elementos ou unidades especializadas, tais como um péptido sinal de secreção ou um domínio funcional heterólogo.
Nalguns casos, o polinucleótido ou ácido nucleico é ADN. No caso de ADN, um polinucleótido compreendendo um ácido nucleico que codifica para um polipéptido normalmente podem incluir um promotor e/ou outros elementos de controlo da transcrição ou da tradução operativamente associados com uma ou mais regiões codificantes. Uma associação operativa é quando uma região codificante para um produto génico, por exemplo, um polipéptido, está associada com uma ou mais sequências de regulação de tal modo que a expressão do produto génico fique sob influência ou controlo da ou das sequências de regulação. Dois fragmentos de ADN (tais como um polipéptido região codificante e um promotor a ele associado) são "associados operativamente" se a indução da função do promotor resulta na transcrição de mARN que codifica para o produto génico desejado e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de AND não interfere com a capacidade das sequências de regulação da expressão em dirigir a expressão do produto génico ou interferir com a capacidade do molde de ADN em ser transcrito. Assim, uma região promotora seria operativamente associada com um ácido nucleico que codifique para um polipéptido se o promotor foi capaz de efectuar a 12 transcrição daquele ácido nucleico. 0 promotor pode ser um promotor especifico para uma célula que dirige transcrição substancial do AND apenas em células predeterminadas. Outros elementos de controlo da transcrição, para além de um promotor, por exemplo potenciadores, operadores, repressores, e sinais de terminação da transcrição, podem ser operativamente associados ao polinucleótido para dirigir transcrição especifica para uma célula. Promotores adequados e outras regiões de controlo da transcrição são aqui divulgados. São conhecidas várias regiões de controlo da transcrição pelos peritos na técnica. Estas incluem, sem limitação, regiões de controlo da transcrição que funcionam em células de vertebrados, tais como, mas sem limitação a segmentos promotores e potenciadores de citomegalovirus (o promotor precoce imediato, em conjunção com o intrão-A), virus simio 40 (o promotor precoce), e retrovirus (tais como o virus do sarcoma de Rous). Outras regiões de controlo da transcrição incluem aquelas derivadas de genes de vertebrados tais como actina, proteína de choque térmico, hormona de crescimento bovina e β-globina de coelho, assim como outras sequências capazes de controlar a expressão génica em células eucarióticas. Regiões de controlo adequadas adicionais da transcrição incluem promotores e potenciadores específicos para tecidos e assim como promotores indutíveis por linfocinas (por exemplo, promotores indutíveis por interferões ou interleucinas).
Da mesma forma, uma variedade de elementos de controlo de tradução sao conhecidos pelos peritos na técnica. Estes incluem, mas nao estão limitados a, locais de ligaçao ao ribossoma , codões de iniciação e de terminação da tradução, e elementos derivados de picornavírus (particularmente um local 13 interno de entrada de ribossoma, ou IRES, também referida como uma sequência CITE).
Noutros casos, um polinucleótido da divulgação é ARN, por exemplo, sob a forma de ARN mensageiro (mARN).
As regiões que codificam o polinucleótido e o ácido nucleico da divulgação podem ser associados com regiões codificantes adicionais que codificam para os péptidos de sinal ou secreção, que dirigem a secreção de um polipéptido codificado por um polinucleótido da divulgação. De acordo com a hipótese de sinal, proteínas secretadas por células de mamífero têm um péptido de sinal ou sequência líder de secreção que é clivada da proteína madura, uma vez iniciada a exportação da cadeia de proteína em crescimento através do retículo endoplasmático rugoso. Aqueles competentes na técnica estão cientes de que polipéptidos secretados por células de vertebrados têm, geralmente, um péptido de sinal fundido com a extremidade N do polipéptido, que é clivado do polipéptido completo ou de "comprimento total" para produzir uma forma secretada ou "madura" do polipéptido. Em certos casos, utiliza-se o péptido de sinal nativo, por exemplo, um péptido sinal de uma cadeia ou de uma cadeia leve de imunoglobulina, ou um derivado funcional dessa sequência que retenha a capacidade para dirigir a secreção do polipéptido que está operativamente associado com ela. Alternativamente, um péptido de sinal heterólogo de mamífero, ou um seu derivado funcional, podem ser utilizados. Por exemplo, a sequência líder nativa pode ser substituída pela sequência líder do activador de plasminogénio tecidular humano (TPA) ou a β-glucuronidase de rato. A presente divulgação é dirigida a certos anticorpos SP35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou 14 derivados. A menos que feita referência específica aos anticorpos de tamanho completo, tais como os anticorpos que ocorrem naturalmente, o termo "anticorpos Sp35" inclui anticorpos SP35-tamanho completo, bem como fragmentos de ligação ao antigénio, variantes, análogos ou derivados de tais anticorpos, por exemplo, um anticorpo que ocorre naturalmente ou moléculas de imunoglobulina ou moléculas ou fragmentos modificados de anticorpos que se ligam ao antigénio de um modo semelhante às moléculas de anticorpos.
Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" são aqui utilizados indiferentemente. Um anticorpo ou imunoglobulina compreende pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada, e normalmente compreende pelo menos os domínios variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve. Estruturas básicas de imunoglobulina em sistemas vertebrados são relativamente bem compreendidas. Ver, por exemplo, de Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988) .
Como será discutido em mais detalhe abaixo, o termo "imunoglobulina" compreende várias classes amplas de polipéptidos que podem ser distinguidos bioquimicamente.Os peritos na técnica apreciarão que as cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, (γ, μ, α, δ, ε), com algumas subclasses entre eles (por exemplo, γΐ-γ4) . É a natureza desta cadeia, que determina a "classe" do anticorpo como IgG, IgM, IgA IgG, ou IgE, respectivamente. As subclasses de imunoglobulina (isotipos), por exemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi, etc, são bem caracterizadas e são conhecidos por conferir especialização funcional. Versões modificadas de cada uma destas classes e isotipos são facilmente perceptíveis para um especialista na matéria tendo em vista a presente divulgação e, portanto, estão no âmbito 15 da divulgação. Todas as classes de imunoglobulinas estão claramente dentro do âmbito da presente invenção, a discussão seguinte irá geralmente ser dirigida para a classe IgG de moléculas de imunoglobulina. No que respeita à IgG, uma molécula de imunoglobulina padrão é composta por dois polipéptidos de cadeia leve idênticos de peso molecular de aproximadamente 23000 Daltons, e dois polipéptidos de cadeia pesada idênticos de peso molecular de 53000-70000. As quatro cadeias são tipicamente unidas por pontes dissulfureto numa configuração "Y" em que as cadeias leves rodeiam as cadeias pesadas começando na boca do "Y" e continuando através da região variável.
As cadeias leves são classificadas como kapa ou lambda (k, λ). Cada classe de cadeia pesada pode ser ligada tanto com a cadeia leve kapa como com a lambda. Em geral, as cadeias leve e pesada estão covalentemente ligadas uma à outra, e as porções da "cauda" das duas cadeias pesadas estão ligadas uma à outra por ligações dissulfureto covalentes ou ligações não covalentes quando as imunoglobulinas são geradas ou por hibridomas, ou células B ou células hospedeiras geneticamente modificadas. Na cadeia pesada, as sequências de aminoácidos desenvolvem-se a partir de uma extremidade N nas pontas bifurcadas da configuração Y para a extremidade C no final de cada cadeia.
Ambas as cadeias, quer a leve e a pesada, estão divididas em regiões de homologia estrutural e funcional. Os termos "constante" e "variável" são usados funcionalmente. A este respeito, deve notar-se que os domínios variáveis de ambas as porções da cadeia leve (VL) e pesada (VH) determinam o reconhecimento e a especificidade do antigénio. Por outro lado, os domínios constantes da cadeia leve (CL) e da cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) conferem propriedades biológicas 16 importantes tais como secreção, mobilidade transplacentária, a ligação do receptor Fc, a ligação do complemento e similares. Por convenção, a numeração dos dominios da região constante aumenta à medida que eles se tornam mais distais relativamente ao local de ligação do antigénio ou da extremidade amina do anticorpo.A porção N-terminal é uma região variável e a porção da extremidade C é uma região constante; os dominios CH3 e CL compreendem, na verdade, a extremidade carboxilo da cadeia pesada e leve, respectivamente.
Tal como indicado acima, a região variável permite ao anticorpo reconhecer selectivamente e se ligar especificamente a epitopos em antigénios. Isto é, o domínio VL e domínio VH, ou um subconjunto das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de um anticorpo combinam-se para formar a região variável que define um local de ligação ao antigénio tridimensional. Esta estrutura do anticorpo quaternário constitui o local de ligação ao antigénio presente na extremidade de cada braço do Y. Mais especificamente, o local de ligação ao antigénio é definida por três CDR de cada uma das cadeias VH e VL. Nalguns casos, por exemplo, certas moléculas de imunoglobulina derivadas de espécies de camelídeos ou modificadas com base em imunoglobulinas de camelídeos, uma molécula de imunoglobulina completa podem consistir apenas em cadeias pesadas, sem cadeias leves. Ver, por exemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-448 (1993).
Em anticorpos que ocorrem naturalmente, as seis "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDR" presentes em cada domínio de ligação ao antigénio são sequências curtas, não contíguas de aminoácidos que são especificamente posicionadas de modo a formar o domínio de ligação ao 17 antigénio à medida que o anticorpo assume a sua configuração tridimensional num ambiente aquoso. Os restantes aminoácidos nos dominios de ligação ao antigénio, referidos como regiões "estruturais", apresentam menos variabilidade intermolecular. As regiões estruturais adoptam sobretudo uma conformação em folha β e as CDRs formam laços que ligam, e nalguns casos fazem parte da estrutura de folhas β. Assim, regiões estruturais actuam de modo a formar uma estrutura de suporte que proporciona o posicionamento das CDRs na orientação correcta por interacções inter-cadeia, interacções não-covalentes. 0 dominio de ligação ao antigénio formado pelas CDRs posicionadas define uma superfície complementar ao epitopo no antigénio imunorreactivo. Esta superfície complementar promove a ligação não-covalente do anticorpo ao seu epitopo cognato. Os aminoácidos que compõem as CDR e as regiões estruturais, respectivamente, podem ser facilmente identificadas por qualquer região variável da cadeia pesada por qualquer pessoa competente na técnica, uma vez que elas foram já definidas com precisão (ver, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E., et al, U.S. Department of Health and Human Services, (1983); e Chothia e Lesk, J. Mol Biol., 196: 901-917 (1987).
No caso de existirem duas ou mais definições de um termo que é usado e/ou aceite na técnica, a definição do termo como aqui usada destina-se a incluir todos esses significados, excepto se explicitamente indicado para o contrário. Um exemplo específico é a utilização do termo "região determinante de complementaridade" ("CDR") para descrever os locais de combinação de antigénio não-contíguos encontrados no interior da região variável de ambos os polipéptidos de cadeia pesada e leve. Esta região tem sido descrita por Kabat et al, U.S. Dept. Of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) e por Chothia et 18 al. , J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), em que as definições incluem sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos, quando comparadas umas com as outras. No entanto, a aplicação de qualquer uma das definições para se referir a uma CDR de um anticorpo ou as suas variantes pretende-se que esteja no âmbito do termo tal como aqui usado e definido. Os resíduos de aminoácidos adequados que compreendem as CDR tal como definidas por cada uma das referências citadas acima são apresentados abaixo na Tabela I como uma comparação. O número exacto de resíduos que abrangem uma CDR particular irá variar dependendo do tamanho da sequência e da CDR. Os peritos na técnica podem determinar de forma rotineira quais os resíduos que compreendem uma CDR particular, dada a sequência de aminoácidos da região variável do anticorpo. TABELA 1. Definições de CDR1
Kabat Chothia VH CDR1 31-35 26-32 VH CDR2 50-65 52-58 VH CDR3 95-102 95-102 VL CDR1 24-34 26-32 VL CDR2 50-56 50-52 VL CDR3 89-97 91-96 λΑ numeração de todas as definições de CDR da Tabela 1 é de acordo com as convenções de numeração definidas por Kabat et al. (ver abaixo) .
Kabat et al. também definiu um sistema de numeração para as sequências de domínio variável que é aplicável a qualquer anticorpo. Um perito na técnica consegue atribuir sem ambiguidades este sistema de "numeração de Kabat" a qualquer sequência de domínio variável, sem se basear em quaisquer dados experimentais para além da própria sequência.Tal como aqui utilizado, "numeração de Kabat" refere-se ao sistema de numeração estabelecido por Kabat et al., U.S. Dept. of Health 19 and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983). Salvo indicação em contrário, as referências à numeração das posições específicas de resíduos de aminoácidos num anticorpo Sp35 ou num seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado da divulgação estão de acordo com o sistema de numeração de Kabat.
Nas espécies de camelídeos, a cadeia pesada da região variável, designada por VhH, constitui a totalidade do domínio de ligação ao antigénio. As principais diferenças entre as regiões variáveis VhH de camelídeos e aqueles derivados a partir de anticorpos convencionais (VH) incluem: (a) mais aminoácidos hidrofóbicos na superfície de contacto da cadeia leve da VH, em comparação com a região correspondente em VhH, (b) uma CDR3 mais comprida em VhH e (c) a ocorrência frequente de uma ligação dissulfureto entre CDR1 e CDR3 em VhH.
Os anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação incluem, mas não estão limitados a, anticorpos policlonais, monoclonais, multiespecífico, humanos, humanizados, primatizados, ou quiméricos, anticorpos de cadeia simples, fragmentos de ligação a epitopo, por exemplo, Fab, Fab' e F(ab')2r Fd, Fvs, Fvs de cadeia simples (scFv), anticorpos de cadeia simples, Fvs ligados por dissulfureto (sdFv), fragmentos compreendendo ou um VL ou VH domínios, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, e anticorpos (anti-Id) anti-idiotípicos (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-Id para anticorpos Sp35 aqui divulgados). Moléculas ScFv são conhecidas na técnica e são descritos, por exemplo, na patente US 5,892,019. A imunoglobulina ou moléculas de anticorpo da divulgação podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, 20
IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina.
Os fragmentos de anticorpos, incluindo os anticorpos de cadeia simples, podem compreender a ou as regiões variáveis isoladamente ou em combinação com a totalidade ou uma porção das seguintes: região de charneira, domínios CH1, CH2 e CH3. Também incluídos na divulgação estão fragmentos de ligação ao antigénio, também compreendendo qualquer combinação de região ou regiões variáveis com uma região de charneira, domínios CH1, Ch2 e CH3. Anticorpos ou seus fragmentos imunoespecíficos para utilização nos métodos de diagnóstico e terapêuticos aqui descritos podem ser de qualquer origem animal, incluindo aves e mamíferos. De preferência, os anticorpos são anticorpos de humanos, murinos, burros, coelhos, cabras, cobaias, camelos, lamas, cavalos, ou de galinha. Noutro caso, a região variável pode ser de origem em peixes cartilagíneos (por exemplo, a partir de tubarões). Tal como aqui utilizado, anticorpos "humanos" incluem anticorpos que possuem a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados a partir de bibliotecas de imunoglobulinas humanas ou de animais transgénicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas e que não expressam imunoglobulinas endógenas, tal como descrito abaixo e, por exemplo, em, U.S. Pat. No. 5,939,598 por Kucherlapati et al.
Tal como aqui utilizado, o termo "porção de cadeia pesada", inclui as sequências de aminoácidos derivadas de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Um polipéptido que compreende uma porção de cadeia pesada compreende, pelo menos, um dos seguintes: um domínio CH1, um domínio "hinge" (por exemplo, uma região "hinge" superior, média, e/ou inferior), um domínio CH2, um domínio CH3, ou uma sua variante ou um seu fragmento. Por exemplo, um polipéptido de ligação pode 21 compreender uma cadeia de polipéptido compreendendo um domínio CH1, uma cadeia de polipéptido compreendendo um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio "hinge" e um domínio Ch2; uma cadeia de polipéptido compreendendo um domínio CH1 e um domínio Ch3; uma cadeia de polipéptido que compreende um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio "hinge" e um domínio CH3; ou uma cadeia polipeptídica que compreende um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio "hinge", um domínio CH2, e um domínio CH3. Noutro exemplo, um polipéptido da divulgação compreende uma cadeia polipeptídica que compreende um domínio CH3. Além disso, um polipéptido de ligação pode não ter pelo menos uma porção de um domínio CH2 (por exemplo, a totalidade ou parte de um domínio CH2) . Como acima foi referido, será entendido por um perito na técnica que estes domínios (por exemplo, as porções de cadeia pesada) podem ser modificadas de tal forma que elas variam na sequência de aminoácidos da molécula de imunoglobulina que existe naturalmente.
Em certos anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados aqui descritos, as porções de cadeia pesada de uma cadeia de polipéptido de um multímero são idênticas àquelas de uma segunda cadeia de polipéptido do multímero. Alternativamente, os monómeros contendo a porção da cadeia pesada da divulgação não são idênticos. Por exemplo, cada monómero pode compreender um local alvo de ligação diferente, formando, por exemplo, um anticorpo bi-específico.
As porções de cadeia pesada de um polipéptido de ligação para utilização nos métodos de diagnóstico e de tratamento aqui divulgados podem ser derivados de diferentes moléculas de imunoglobulina. Por exemplo, uma porção de um polipéptido de cadeia pesada pode compreender um domínio CH1 derivado de uma molécula de IgGl e uma região "hinge" de uma molécula 22 derivada de IgG3. Num outro exemplo, uma porção de cadeia pesada pode incluir uma região "hinge" derivada, em parte, de uma molécula de IgGl e, em parte, de uma molécula de IgG3. Num outro exemplo, uma porção de cadeia pesada pode incluir uma região "hinge" quimérica derivada, em parte, de uma molécula de IgGl e, em parte, de uma molécula de IgG4.
Tal como aqui utilizado, o termo "porção de cadeia leve" inclui as sequências de aminoácidos derivadas de uma cadeia leve de imunoglobulina. De preferência, a porção da cadeia leve compreende pelo menos um de um domínio VL ou CL.
Anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados aqui divulgados podem ser descritos ou especificados em termos do ou dos epitopos ou porções) de um antigénio, por exemplo, um polipéptido alvo (Sp35) que reconhecem ou se ligam especificamente. A porção de um polipéptido alvo, que interage especificamente com o domínio de ligação ao antigénio de um anticorpo é um "epitopo" ou "determinante antigénico". Um polipéptido alvo pode compreender um único epitopo, mas compreende tipicamente pelo menos dois epitopos, e pode incluir qualquer número de epitopos, dependendo do tamanho, da conformação, e do tipo de antigénio. Além disso, deve notar-se que um "epitopo" num polipéptido alvo pode ser ou incluir elementos não polipeptidicos, por exemplo, um "epitopo" pode incluir uma cadeia lateral de hidrato de carbono.
Crê-se que a dimensão mínima de um epitopo de péptido ou polipéptido para um anticorpo seja de cerca de quatro a cinco aminoácidos. Epitopos de péptido ou polipéptido, de preferência contêm pelo menos sete, mais preferencialmente pelo menos nove e preferivelmente pelo menos entre cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos. Uma vez que uma CDR pode reconhecer um polipéptido ou péptido antigénico na sua forma 23 terciária, os aminoácidos que compreende um epitopo não precisam de ser contíguos, e, nalguns casos, pode, até não estar na mesma cadeia de péptido. Na presente divulgação, o epitopo de polipéptido ou péptido reconhecido pelos anticorpos Sp35 da presente divulgação contêm uma sequência de pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, mais preferivelmente pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10 , pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, ou entre cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos contíguos ou não contíguos de Sp35.
Por "liga-se especificamente" entende-se geralmente que um anticorpo se liga a um epitopo através do seu domínio de ligação ao antigénio, e que a ligação envolve alguma complementaridade entre o domínio de ligação ao antigénio e o epitopo. De acordo com esta definição, um anticorpo diz-se "ligar especificamente" a um epitopo que se liga àquele epitopo, através do seu domínio de ligação ao antigénio, mais rapidamente do que se ligaria a um epitopo aleatório, não relacionado. O termo "especificidade" é aqui usado para qualificar a afinidade relativa com a qual um determinado anticorpo se liga a um determinado epitopo. Por exemplo, o anticorpo "A" pode ser considerado como tendo uma elevada especificidade para um determinado epitopo do que o anticorpo "B", ou o anticorpo de "A" pode ser referido ligar-se ao epitopo "C" com uma especificidade mais elevada do que aquela que tem para o epitopo relacionado "D".
Por "liga-se preferencialmente" entende-se que o anticorpo se liga especificamente a um epitopo mais rapidamente do que se ligaria a um epitopo relacionado, semelhante, homólogo, ou análogo. Assim, um anticorpo que se "liga preferencialmente" a um determinado epitopo irá provavelmente ligar-se àquele epitopo do que a um epitopo relacionado, apesar de um tal 24 anticorpo poder ter uma reacção cruzada com o epitopo relacionado. A titulo de exemplo não limitativo, um anticorpo pode ser considerado ligar-se a um primeiro epitopo preferencialmente se se ligar ao referido primeiro epitopo com uma constante de dissociação (KD) que é menor do que a KD do anticorpo para o segundo epitopo. Noutro exemplo não limitativo, um anticorpo pode ser considerado ligar-se a um primeiro antigénio preferencialmente se se ligar o primeiro epitopo com uma afinidade que é pelo menos uma ordem de grandeza menor do que a KD do anticorpo para o segundo epitopo. Noutro exemplo não limitativo, um anticorpo pode ser considerado ligar-se a um primeiro epitopo preferencialmente se se ligar ao primeiro epitopo com uma afinidade que é pelo menos duas ordens de grandeza menor do que a KD do anticorpo para o segundo epitopo.
Noutro exemplo não limitativo, um anticorpo pode ser considerado ligar-se a um primeiro epitopo preferencialmente se se ligar ao primeiro epitopo com uma velocidade de dissociação (k(dissociação)), que é menor do que a k(dissociação) do anticorpo para o segundo epitopo. Noutro exemplo não limitativo, um anticorpo pode ser considerado ligar-se a um primeiro epitopo preferencialmente se se ligar ao primeiro epitopo com uma afinidade que é pelo menos uma ordem de grandeza menor do que a k(dissociação) do anticorpo para o segundo epitopo. Noutro exemplo não limitativo, um anticorpo pode ser considerado ligar-se a um primeiro epitopo preferencialmente se se ligar ao primeiro epitopo com uma afinidade que é pelo menos duas ordens de grandeza menor do que a k(dissociação) do anticorpo para o segundo epitopo. 25
Um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante ou derivado aqui divulgado pode ser referido como se ligando a um polipéptido alvo aqui divulgado ou um seu fragmento ou uma sua variante com uma velocidade de dissociação (k(dissociação)) inferior ou igual a 5 X 1CT2 s~2, IO-2 s^1, 5 X IO-3 s~2 ou 1CT3 s~4. Mais preferencialmente, um anticorpo da divulgação pode ser referido como se ligando a um polipéptido alvo aqui descrito ou um seu fragmento ou uma sua variante com uma velocidade de dissociação (k (dissociação) ) inferior ou igual a 5 X IO-4 s_1, 1CT4 s_1, 5 x 10“5 s_1, ou 1CT5 s_1, 5 X 1CT6 s“\ 1CT6 s_1, 5 X 1CT7 s_1 ou 1CT7 s_1.
Um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antigénio, variante ou derivado, aqui divulgado pode ser referido como se ligando a um polipéptido alvo aqui divulgado ou um seu fragmento ou uma sua variante, com uma velocidade de associação (k (associação) ) superior ou igual a 103 M_1 s_1, 5 X ΙΟ3 ΝΓ1 s“ 1, 104 M 1 s 1 ou 5 X 104 M 1 s_1. Mais preferencialmente, um anticorpo da divulgação pode ser referido como se ligando a um polipéptido alvo aqui descrito ou um seu fragmento ou uma sua variante, com uma velocidade de associação (k (associação) ) superior ou igual a 105 M”1 s~4, 5 X 105 M~4 s” \ 106 M_1 s_1, ou 5 X 106 M_1 s~4 ou 107 M~4 s'1.
Um anticorpo é referido inibir competitivamente a ligação de um anticorpo de referência a um dado epitopo se se ligar preferencialmente ao epitopo na medida em que bloqueia, até certo grau, a ligação do anticorpo de referência ao epitopo.A inibição competitiva pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, os ensaios de ELISA competitivos. Um anticorpo pode ser referido inibir competitivamente a ligação do anticorpo de referência a um 26 dado epitopo de pelo menos, 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, ou, pelo menos, 50%.
Tal como aqui utilizado, o termo ''afinidade" refere-se a uma medida da força da ligação de um epitopo individual com a CDR de uma molécula de imunoglobulina. Ver, por exemplo, Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a 1988) nas páginas 27-28. Tal como aqui utilizado, o termo "avidez" refere-se à estabilidade global do complexo entre uma população de imunoglobulinas e um antigénio, ou seja, a força da combinação funcional de uma mistura de imunoglobulina com o antigénio. Ver, por exemplo, Harlow, nas páginas 29-34. A avidez está relacionada tanto com a afinidade de moléculas de imunoglobulina individuais na população com epitopos específicos, e também com as valências das imunoglobulinas e do antigénio. Por exemplo, a interacção entre um anticorpo monoclonal bivalente e um antigénio com uma estrutura de epitopo altamente repetida, tal como um polímero, seria uma de grande avidez.
Anticorpos Sp35 anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação também podem ser descritos ou especificados em termos da sua reactividade cruzada. Tal como aqui utilizado, o termo "a reactividade cruzada" refere-se à capacidade de um anticorpo, específico para um antigénio, reagir com um segundo antigénio; uma medida de parentesco entre duas substâncias antigénicas diferentes. Assim, um anticorpo tem reacção cruzada se se ligar a um epitopo diferente daquele que induziu a sua formação. O epitopo com reacção cruzada geralmente contém muitas das mesmas características estruturais complementares que o epitopo indutor e, nalguns casos, pode efectivamente se ajustar melhor do que o original. 27
Por exemplo, certos anticorpos têm algum grau de reactividade cruzada, em que eles se ligam a epitopos relacionados, mas não-idênticos, por exemplo, os epitopos com pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 65%, pelo menos 60%, pelo menos 55%, e pelo menos 50% de identidade (como calculada utilizando métodos conhecidos na técnica e aqui descritos) para um epitopo de referência. Um anticorpo pode ser considerado como tendo pouca ou nenhuma reactividade cruzada, se não se liga a epitopos com menos de 95%, menos de 90%, menos de 85%, menos de 80%, menos de 75%, menos de 70%, menos de 65%, menos de 60%, menos de 55%, e menos de 50% de identidade (como calculada utilizando métodos conhecidos na técnica e aqui descritos) a um epitopo de referência. Um anticorpo pode ser considerado como "altamente especifico" para um determinado epitopo, se ele não se ligar a qualquer outro análogo, ortólogo ou homólogo daquele epitopo.
Anticorpos Sp35 ou fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da invenção também podem ser descritos ou especificados em termos da sua afinidade de ligação a um polipéptido da invenção. As afinidades de ligação preferidas incluem aquelas com uma constante de dissociação ou Kd inferiores a 5 x 1CT2 M, 10 ~2 M, 5 x 10” 3 M, 10" 3 M, 5 x 1 0~ 4 M, 1(T4 M, 5 x 1(T5 M, IO-5 M , 5 X 10 ~6 M, 10 ~6 M, 5 x 10“7 M, 1 0' 7 M, 5 x 1(Γ8 M, 1(T8 M, 5 x : 10~9 M, 1 O-9 M, 5 x 1 0 10 M, 10_1° M f 5 x i—1 1 O i—1 Μ, 1(Γ: 1 M, 5 x IO-12 M, 10 -12 M, 5 X 10“13 M, 10~13 M, 5 X 10“ 14 M, 1CT14 M ,5x1 CT15 M, ou 10 -15 M.
Anticorpos Sp35 anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação podem ser "multiespecificos", por exemplo, bi-especificos, tri-específicos ou de maior multi-especificidade, o que significa que ele reconhece e se liga a dois ou mais epitopos 28 diferentes apresentar num ou mais antigénios diferentes (por exemplo, proteínas), ao mesmo tempo. Assim, se um anticorpo Sp35 é "mono-específico" ou "multi-específico", por exemplo, "bi-específico", refere-se ao número de diferentes epitopos com os quais um polipéptido de ligação reage. Os anticorpos multi-específicos podem ser específicos para epitopos diferentes de um polipeptídeo alvo aqui descrito ou pode ser específico para um polipéptido alvo, bem como para um epitopo heterólogo, tal como um polipeptídeo heterólogo ou um material de suporte sólido.
Tal como aqui utilizado, o termo "valência" refere-se ao número de possíveis domínios de ligação, por exemplo, os domínios de ligação ao antigénio, presentes num anticorpo Sp35, polipéptido de ligação ou anticorpo. Cada domínio de ligação se liga especificamente a um epitopo. Quando um anticorpo Sp35, polipéptido de ligação ou anticorpo compreende mais do que um domínio de ligação, cada domínio de ligação pode ligar-se especificamente ao mesmo epitopo, para um anticorpo com dois domínios de ligação, denominado "bivalente mono-específico", ou a epitopos diferentes, para um anticorpo com dois domínios de ligação, denominado "bivalente bi-específico". Um anticorpo pode também ser bi-específico e bivalente para cada especificidade (denominados "anticorpos tetravalentes bi-específicos"). Noutro exemplo, podem ser preparados "minibodies" tetravalentes ou anticorpos com eliminação de domínio.
Anticorpos bi-específicos bivalentes, e os métodos para a sua preparação, são descritos, por exemplo, nas Patentes dos E.U.A. Nos. 5,731,168, 5,807,706, 5,821,333, Publicações de Pedidos de Patente dos E.U.A. Nos. 2003/020734 e 2002/0155537, cujas divulgações de todas são aqui incorporadas por referência. Anticorpos tetravalentes, 29 biespecíf icos, e métodos para a sua preparação, são descritos, por exemplo, em WO 02/096948 e WO 00/44788. Ver em geral, as publicações PCT WO 93/17715, WO 92/08802, WO 91/00360, WO 92/05793; Tutt et al. , J. Immunol. 147: 60-69 (1991), Patentes dos E.U.A. Nos. 4,474,893, 4,714,681, 4,925,648, 5,573,920, 5,601,819; Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992) .
Conforme indicado anteriormente, as estruturas de subunidade e a configuração tridimensional das regiões constantes das várias classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.Tal como aqui utilizado, o termo "domínio VH" inclui o domínio variável de extremidade amina de uma cadeia pesada de imunoglobulina e o termo "domínio cHi" inclui o primeiro domínio de região constante (mais próxima da extremidade amina) de uma cadeia pesada de imunoglobulina. O domínio CH1 é adjacente ao domínio VH e situa-se na extremidade amina em relação à região "hinge" de uma molécula de cadeia pesada de imunoglobulina.
Tal como aqui utilizado, o termo "domínio CH2" inclui a porção de uma molécula de cadeia pesada, que se estende, por exemplo, desde cerca do resíduo 244 até ao resíduo 360 de um anticorpo utilizando esquemas de numeração convencionais (resíduos 244 a 360, sistema de numeração de Kabat, e resíduos 231 a 340, sistema de numeração da UE; ver Kabat EA et al op cit. O domínio CH2 é único na medida em que não está intimamente emparelhado com outro domínio. Em vez disso, duas cadeias de hidrato de carbono ramificadas N-ligadas estão interpostas entre os dois domínios CH2 de uma molécula de IgG nativa intacta. Também está bem documentado que o domínio CH3 estende-se desde o domínio CH2 para a extremidade C da molécula de IgG e compreende aproximadamente 108 resíduos. 30 inclui a
Tal como aqui utilizado, o termo "região "hinge"" porção de uma molécula de cadeia pesada une o domínio CH1 ao domínio CH2. Esta região "hinge" compreende cerca de 25 resíduos e é flexível, permitindo assim que as duas regiões de ligação ao antigénio da extremidade N se movam de forma independente. As regiões "hinge" podem ser subdivididas em três domínios distintos: domínios "hinge" superior, médio e inferior (Roux et al., J. Immunol. 161: 4083 (1998)).
Tal como aqui utilizado, o termo "ligação dissulfureto" inclui a ligação covalente formada entre dois átomos de enxofre. 0 aminoácido cisteína compreende um grupo tiol que pode formar uma ponte dissulfureto ou uma ponte com um segundo grupo de tiol. Na maioria das moléculas de classe IgG que ocorrem naturalmente, as regiões CL e CH1 estão ligadas por uma ligação de dissulfureto e as duas cadeias pesadas estão ligadas por ligações de dissulfureto nas posições correspondentes a 239 e 242, utilizando o sistema de numeração de Kabat (posição 226 ou 229, o sistema de numeração da UE).
Tal como aqui utilizado, o termo "anticorpo quimérico" significará qualquer anticorpo em que a região ou local imunorreactivo se obtém ou deriva de uma primeira espécie e a região constante (que pode estar intacta, parcial ou modificada de acordo com a divulgação) é obtida de uma segunda espécie. Em exemplos preferidos a região ou local de ligação ao alvo será de uma fonte não humana (por exemplo, rato ou primata) e a região constante é humana.
Tal como aqui utilizado, o termo "anticorpo modificado" refere-se a um anticorpo em que o domínio variável quer na cadeia pesada e leve, ou ambas, é alterado por pelo menos uma substituição parcial de uma ou mais CDRs de um anticorpo de 31 especificidade conhecida e, se necessário, por substituição parcial região estrutural e alteração de sequência. Embora as CDR possam ser derivadas de um anticorpo da mesma classe ou mesmo subclasse que o anticorpo a partir do qual as regiões estruturais são derivadas, pretende-se que as CDRs sejam derivadas de um anticorpo da classe diferente e de preferência de um anticorpo de uma espécie diferente. Um anticorpo modificado em que uma ou mais CDRs "doadores" de um anticorpo não-humano de especificidade conhecida estão inseridas numa região estrutural de cadeia pesada ou leve humana é aqui referido como um "anticorpo humanizado". Pode não ser necessário substituir todas as CDRs com as CDRs completas da região variável do doador para transferir a capacidade de ligação ao antigénio de um domínio variável para outro. Em vez disso, pode ser apenas necessário transferir aqueles resíduos que são necessários para manter a actividade do local de ligação ao alvo. Dadas as explicações apresentadas em, por exemplo, Patentes dos E.U.A. Nos. 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762, e 6,180,370, estará bem no âmbito da competência dos peritos na técnica, ou através da realização de experiências de rotina, ou por ensaios de tentativa e erro para obter um anticorpo humanizado ou modificado funcional.
Tal como aqui utilizado, o termo "polipéptido correctamente enrolado" inclui polipéptidos (por exemplo, anticorpos Sp35), nos quais todos os domínios funcionais que compreendem o polipéptido são distintamente activos. Tal como aqui utilizado, o termo "polipéptido incorrectamente enrolado" inclui polipéptidos nos quais pelo menos um dos domínios funcionais do polipéptido não está activo. Num exemplo, um polipéptido correctamente enrolado, compreende cadeias polipeptídicas ligadas por pelo menos uma ligação dissulfureto, e, inversamente, um polipéptido incorrectamente 32 enrolado compreende cadeias polipeptídicas não ligadas por pelo menos uma ligação de dissulfureto.
Tal como aqui utilizado, o termo "modificado" inclui a manipulação de moléculas de ácido nucleico ou de polipéptido, por meios sintéticos (por exemplo, por técnicas recombinantes, síntese de péptidos in vitro, por ligação enzimática ou química de péptidos ou alguma combinação destas técnicas).
Tal como aqui utilizados, os termos "ligado", "fundido" e "fusão" são usados indiferentemente. Esses termos referem-se à união de mais dois elementos ou componentes, por qualquer meio, incluindo a conjugação química ou meios recombinantes.Uma "fusão em grelha" refere-se à união de duas ou mais grelhas de leitura abertas de polinucleótidos (ORFs) para formar uma ORF contínua mais comprida, de uma maneira que mantém a grelha de leitura de tradução correcta das ORFs originais. Assim, uma proteína de fusão recombinante é uma única proteína que contém dois ou mais segmentos que correspondem aos polipéptidos codificados pelas ORFs originais (cujos segmentos não são normalmente assim unidos na natureza). Embora a grelha de leitura ser assim tornada contínua ao longo dos segmentos fusionados, os segmentos podem ser fisicamente ou espacialmente separados, por exemplo, uma sequência de ligação na grelha. Por exemplo, polinucleótidos que codificam para as CDR de uma região variável de imunoglobulina podem ser fundidos, em grelha, mas ser separadas por um polinucleótido que codifica pelo menos uma região estrutural de imunoglobulina ou regiões CDR adicionais, desde que os CDRs "fundidos" sejam co-traduzidos como parte de um polipéptido contínuo. 33
No contexto de polipéptidos, uma "sequência linear" ou uma "sequência" é uma ordem de aminoácidos num polipéptido na direcção de uma extremidade amina para carboxilo em que os resíduos vizinhos na sequência são contíquos na estrutura primária do polipéptido. 0 termo "expressão", tal como aqui utilizado refere-se a um processo pelo qual um gene produz um bioquímico, por exemplo, um ARN ou um polipéptido. 0 processo inclui qualquer manifestação da presença funcional do gene dentro da célula, incluindo, sem limitação, o "knockdown" do gene, bem como, tanto a expressão transitória como a expressão estável. Inclui, sem limitação, a transcrição do gene em ARN mensageiro (mARN), ARN de transferência (tARN), ARN "shorth hairpin" (shARN), pequeno ARN de interferência (siARN) ou qualquer outro produto de ARN e a tradução de tal mARN em polipéptido(s). Se o produto final desejado é um bioquímico, a expressão inclui a criação desse bioquímico e quaisquer precursores. A expressão de um gene que produz um "produto génico". Tal como aqui utilizado, um produto génico pode ser um ácido nucleico, por exemplo, um ARN mensageiro produzido por transcrição de um gene, ou de um polipéptido que é traduzido a partir de um transcrito. Os produtos génicos aqui descritos incluem ainda ácidos nucleicos com modificações pós-transcrição, por exemplo, de poliadenilação, ou polipéptidos com modificações pós-tradução, por exemplo, glicosilação, metilação, a adição dos lípidos, a associação com outras subunidades de proteína, clivagem proteolítica, e semelhantes.
Tal como aqui utilizados, os termos "tratar" ou "tratamento" referem-se tanto ao tratamento terapêutico e a medidas profiláticas ou preventivas, em que o objectivo é prevenir ou travar (diminuir) uma alteração fisiológica ou distúrbio 34 indesejados, tais como a progressão de esclerose múltipla.Os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, alívio de sintomas, diminuição da extensão da doença, estado de doença estabilizado (isto é, sem piorar), atraso ou retardamento da progressão da doença, melhoria ou paliação do estado da doença, e remissão (quer parcial ou total), seja detectável ou não detectável. "Tratamento" também pode significar prolongar a sobrevivência em comparação com a sobrevivência esperada se não receber o tratamento. Aqueles que necessitam de tratamento incluem aqueles já com a doença ou distúrbio bem como aqueles propensos a ter a doença ou distúrbio ou aqueles em que a doença ou distúrbio se pretende prevenir.
Por "sujeito" ou "indivíduo" ou "animal" ou "paciente" ou "mamífero" entende-se qualquer sujeito, particularmente um sujeito mamífero, para o qual o diagnóstico, prognóstico ou terapia são desejados. Sujeitos mamíferos incluem os seres humanos, animais domésticos, animais de criação, e de jardins zoológicos, para desporto, ou animais de estimação, tais como cães, gatos, porquinhos da índia, coelhos, ratos, cavalos, gado, vacas, e assim por diante.
Tal como aqui usadas, frases tais como "um sujeito que iria beneficiar da administração de um anticorpo Sp35" e "um animal em necessidade de tratamento" inclui sujeitos, tais como sujeitos mamíferos, que beneficiariam da administração de um anticorpo utilizado Sp35 usado, por exemplo, para a detecção de um polipéptido Sp35 (por exemplo, durante um procedimento de diagnóstico) e/ou do tratamento, ou seja, paliação ou prevenção de uma doença tal como esclerose múltipla, com um anticorpo Sp35. Como descrito aqui em mais pormenor, o anticorpo SP35 pode ser utilizado na forma não 35 conjugada ou pode ser conjugado, por exemplo, a um fármaco, profármaco, ou um isótopo. II. Sp35
Sp35 humano que ocorre naturalmente (Sp35) é uma proteína específica do sistema nervoso central glicosilada que se prevê ter 614 aminoácidos (SEQ ID NO: 2), incluindo uma sequência de sinal de 33 aminoácidos. Sp 35 também é conhecido na técnica pelos nomes LINGO-I, LRRN6, LRRN6A, FLJ14594, LERN1, MGC17422 e UNQ201. 0 polipéptido Sp35 humano, de comprimento total nativo contém um domínio LRR composto por 14 repetições ricas em leucina (incluindo tampas nas extremidades N e C) , um domínio Ig, uma região transmembranar e um domínio citoplasmático. 0 domínio citoplasmático contém um local de fosforilação de tirosina canónica. Além disso, a proteína que ocorre naturalmente Sp35 contém uma sequência de sinal, uma região de base curta entre o LRRCT e o domínio Ig, e uma região transmembranar entre o domínio de Ig e o domínio citoplasmático. 0 gene Sp35 humano (SEQ ID NO: 1) contém os codões de iniciação da tradução alternativos, de modo a que seis aminoácidos adicionais, ou seja, MQVSKR (SEQ ID NO: 3) possam ou não estar presentes na extremidade N da sequência sinal de Sp35. A Tabela 2 lista os domínios Sp35 e outras regiões, de acordo com o número dos resíduos de aminoácidos, com base na sequência de aminoácidos de Sp35 aqui apresentada como SEQ ID NO: 2. 0 polipéptido
Sp35 é caracterizado em maior detalhe na Publicação PCT No. WO 2004/085648. TABELA 2--Domínios Sp35
Domino ou Região Resíduo inicial Resíduo Final Sequência de 1 33 ou 35 36
Sinal LRRNT 34 ou 36 64 LRR 66 89 LRR 90 113 LRR 114 137 LRR 138 161 LRR 162 185 LRR 186 209 LRR 210 233 LRR 234 257 LRR 258 281 LRR 282 305 LRR 306 329 LRR 330 353 LRRCT 363 414 ou 416 Básico 415 ou 417 424 Ig 419 493 Sequência de ligação 494 551 Transmembranar 552 576 Citoplasmático 577 614 A distribuição do tecido e de desenvolvimento da expressão de Sp35 foi estudada em humanos e ratos. A biologia de Sp35 foi estudada num modelo animal (rato) experimental. A expressão de Sp35 de rato é localizada nos neurónios e nos oligodendrócitos, tal como determinado por "Northern blot" e coloração imuno-histoquimica. 0 nivel de expressão de mARN de Sp35 de rato é regulado durante o desenvolvimento, com um pico logo após o nascimento, ou seja, cerca do dia um pós-natal. Num modelo de lesão por corte transversal da espinal medula de rato, Sp35 é sobre-regulada no local da lesão, tal como determinado por RT-PCR. Ver Mi et al. Nature Neurosci. 7: 221-228 (2004). 37
No contexto dos aminoácidos compreendendo os vários domínios estruturais e funcionais de um polipéptido Sp35, o termo "cerca de" inclui o valor particularmente citado e valores maiores ou menores por vários (por exemplo, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1) aminoácidos. Uma vez que a localização destes domínios, tal como listados na Tabela 1, foi prevista por gráficos de computador, alguém competente na técnica apreciará que os resíduos de aminoácidos que constituem os domínios podem variar ligeiramente (por exemplo, em cerca de 1 a 15 resíduos), dependendo dos critérios utilizados para definir o domínio.
Os inventores descobriram que o Sp35 nativo de comprimento total se liga a NgRl. Ver publicação PCT No. WO 2004/085648.Os inventores também descobriram que Sp35 é expressa em oligodendrócitos e que a proteína Sp35 está envolvida na regulação da mielinização dos axónios mediada pelos oligodendrócitos. Ver Publicação da Patente E.U.A. No. 2006/0009388 AI. A sequência de nucleótidos para a molécula Sp35 de comprimento total é como segue:
ATGCTGGCGGGGGGCGTGAGGAGCATGCCCAGCCCCCTCCTGGCCTGCTGGCAGCCCATCC
TCCTGCTGGTGCTGGGCTCAGTGCTGTCAGGCTCGGCCACGGGCTGCCCGCCCCGCTGCGA
GTGCTCCGCCCAGGACCGCGCTGTGCTGTGCCACCGCAAGCGCTTTGTGGCAGTCCCCGAG
GGCATCCCCACCGAGACGCGCCTGCTGGACCTAGGCAAGAACCGCATCAAAACGCTCAACC
AGGACGAGTTCGCCAGCTTCCCGCACCTGGAGGAGCTGGAGCTCAACGAGAACATCGTGAG
CGCCGTGGAGCCCGGCGCCTTCAACAACCTCTTCAACCTCCGGACGCTGGGTCTCCGCAGC
AACCGCCTGAAGCTCATCCCGCTAGGCGTCTTCACTGGCCTCAGCAACCTGACCAAGCTGG
ACATCAGCGAGAACAAGATTGTTATCCTGCTGGACTACATGTTTCAGGACCTGTACAACCT
CAAGTCACTGGAGGTTGGCGACAATGACCTCGTCTACATCTCTCACCGCGCCTTCAGCGGC
CTCAACAGCCTGGAGCAGCTGACGCTGGAGAAATGCAACCTGACCTCCATCCCCACCGAGG
CGCTGTCCCACCTGCACGGCCTCATCGTCCTGAGGCTCCGGCACCTCAACATCAATGCCAT
CCGGGACTACTCCTTCAAGAGGCTCTACCGACTCAAGGTCTTGGAGATCTCCCACTGGCCC
TACTTGGACACCATGACACCCAACTGCCTCTACGGCCTCAACCTGACGTCCCTGTCCATCA
CACACTGCAATCTGACCGCTGTGCCCTACCTGGCCGTCCGCCACCTAGTCTATCTCCGCTT
CCTCAACCTCTCCTACAACCCCATCAGCACCATTGAGGGCTCCATGTTGCATGAGCTGCTC
CGGCTGCAGGAGATCCAGCTGGTGGGCGGGCAGCTGGCCGTGGTGGAGCCCTATGCCTTCC
GCGGCCTCAACTACCTGCGCGTGCTCAATGTCTCTGGCAACCAGCTGACCACACTGGAGGA
ATCAGTCTTCCACTCGGTGGGCAACCTGGAGACACTCATCCTGGACTCCAACCCGCTGGCC 38 TGCGACTGTCGGCTCCTGTGGGTGTTCCGGCGCCGCTGGCGGCTCAACTTCAACCGGCAGC AGCCCACGTGCGCCACGCCCGAGTTTGTCCAGGGCAAGGAGTTCAAGGACTTCCCTGATGT GCTACTGCCCAACTACTTCACCTGCCGCCGCGCCCGCATCCGGGACCGCAAGGCCCAGCAG GTGTTTGTGGACGAGGGCCACACGGTGCAGTTTGTGTGCCGGGCCGATGGCGACCCGCCGC CCGCCATCCTCTGGCTCTCACCCCGAAAGCACCTGGTCTCAGCCAAGAGCAATGGGCGGCT CACAGTCTTCCCTGATGGCACGCTGGAGGTGCGCTACGCCCAGGTACAGGACAACGGCACG TACCTGTGCATCGCGGCCAACGCGGGCGGCAACGACTCCATGCCCGCCCACCTGCATGTGC GCAGCTACTCGCCCGACTGGCCCCATCAGCCCAACAAGACCTTCGCTTTCATCTCCAACCA GCCGGGCGAGGGAGAGGCCAACAGCACCCGCGCCACTGTGCCTTTCCCCTTCGACATCAAG ACCCTCATCATCGCCACCACCATGGGCTTCATCTCTTTCCTGGGCGTCGTCCTCTTCTGCC TGGTGCTGCTGTTTCTCTGGAGCCGGGGCAAGGGCAACACAAAGCACAACATCGAGATCGA GTATGTGCCCCGAAAGTCGGACGCAGGCATCAGCTCCGCCGACGCGCCCCGCAAGTTCAAC ATGAAGATGATATGA (SEQ ID NO: 1). A sequência de polipéptido para o polipéptido Sp35 de comprimento total é como se segue: MLAGGVRSMPSPLLACWQPILLLVLGSVLSGSATGCPPRCECSAQDRAVLCHRKRFVAVPE GIPTETRLLDLGKNRIKTLNQDEFASFPHLEELELNENIVSAVEPGAFNNLFNLRTLGLRS NRLKLIPLGVFTGLSNLTKLDISENKIVILLDYMFQDLYNLKSLEVGDNDLVYISHRAFSG LNSLEQLTLEKCNLTSIPTEALSHLHGLIVLRLRHLNINAIRDYSFKRLYRLKVLEISHWP YLDTMTPNCLYGLNLTSLSITHCNLTAVPYLAVRHLVYLRFLNLSYNPISTIEGSMLHELL RLQEIQLVGGQLAVVEPYAFRGLNYLRVLNVSGNQLTTLEESVFHSVGNLETLILDSNPLA CDCRLLWVFRRRWRLNFNRQQPTCATPEFVQGKEFKDFPDVLLPNYFTCRRARIRDRKAQQ VFVDEGHTVQFVCRADGDPPPAILWLSPRKHLVSAKSNGRLTVFPDGTLEVRYAQVQDNGT YLCIAANAGGNDSMPAHLHVRSYSPDWPHQPNKTFAFISNQPGEGEANSTRATVPFPFDIK TLIIATTMGFISFLGVVLFCLVLLFLWSRGKGNTKHNIEIEYVPRKSDAGISSADAPRKFN MKMI (SEQ ID NO: 2). III. Anticorpos Sp35
Num exemplo, a presente divulgação é dirigida a anticorpos Sp35, ou fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou seus derivados. Por exemplo, a presente divulgação inclui pelo menos os domínios de ligação ao antigénio de certos anticorpos monoclonais, e fragmentos, variantes, e os seus derivados apresentados nas Tabelas 3A e 3B. A Tabela 3A descreve as regiões do polipéptido Sp35 que estão ligadas por certos anticorpos de comprimento total derivados de uma biblioteca de fagos. Estes anticorpos têm as mesmas regiões variáveis que os fragmentos Fab derivados da Biblioteca de Fagos-1, tal como indicado na Tabela 3B (por 39 exemplo, D05 na Tabela 3A tem a mesma região variável que Li05 na Tabela 3B, D06 na Tabela 3A tem a mesma região variável que Li06 no Quadro 3B, etc.)· Os anticorpos foram testados quanto à ligação a fragmentos Sp35 tal como definidos na Tabela 3A, utilizando métodos bem conhecidos na técnica. A Tabela 3B descreve a capacidade dos referidos anticorpos monoclonais ou fragmentos Fab para detectar Sp35 em diversos ensaios, tais como: selecção celular activada por fluorescência (FACS), imunoprecipitação (IP), análise de "Western blot", imuno-histoquímica (IHQ) e Ensaio de imunossorção associado a enzima (ELISA). Protocolos detalhados para a realização destes ensaios são aqui descritos ou são bem conhecidas e compreendidas pelos competentes na técnica. Os anticorpos monoclonais derivados de hibridoma listados na Tabela 3B foram produzidos por injecção de Sp35 solúvel em ratinhos e, em de seguida isolados usando tecnologia de hibridoma que é bem conhecida na técnica e aqui descrita. Os anticorpos monoclonais e fragmentos de anticorpo Fab listados na Tabela 3B foram isolados a partir de duas bibliotecas de apresentação de fagos diferentes, utilizando técnicas conhecidas na técnica.
TABELA 3A
Fragme nto Sp35 D03 (Li03 Região Variáv el) D05 (Li05 Região Variáv el) D06 (Li06 Região Variáv el) D08 (Li08 Região Variáv el) Dll (Li03 Região Variáv el) D13 (Lil3 Região Variáv el) D33 (Li33 Região Variáv el) 1-432 Fc de rato + + + + + 417-493 Fc de rato + /- + /- AP- N/D + -/ + -/ + N/D N/D N/D 40
Sp35 (i- 419) AP- Sp35 (418- 498) N/D N/D N/D N/D 417-498 Fc humano 417-503 Fc humano 363-498 Fc humano 244-498 Fc humano 41 201 ' TABELA 3B - ANTICORPOS MONOCLONAIS SP35
Anticorpos monoclonais DERIVADOS DE HIBRIDOMA IHQ em Células
Transfectada IHQ em
FACs Imunoprecipitação Western s Tecidos ELISA 3P4C8.2G 9 7P1D5.1G 9 huSp 35 mSp 35 sp35Fc huSp35 sp35 de ratinho/ mSp35huSp35 rato huSp3 5 WT (para-mSp35fina) KO 34-(parafi 417 417-na) 493 419- 495 1- 532 34- 532 sim sim Não (ratinho e rato) N/A N/A s im s im - + - - não Não (ratinho e rato) não não s im s im ++ +/- ++ ++ + -/+ não Não (ratinho e rato) sim c ruido de fundo não ++ ++ ++ + -/+ não Não (ratinho e rato) sim c ruido de fundo não + /- s im sim ++ +/- ++ ++ + + não Não (ratinho e rato) sim c ruido de fundo não ++ +/- + ++ + -/+ não Não (ratinho e rato) sim c ruido de fundo não s im s im - - - - - não Não (ratinho e rato) não não + /- +/- ++ + +++ não sim com sobre-expres são de mSp35 s im sim s im s im s im s im ++ + - ++ + - + /- s im sim ++ + - + /- s im sim ++ + - + /- s im sim ++ + - + /- s im sim ++ + - + /- s im sim ++ + - ++ + +++ s im s im ++ + - + /- s im sim ++ + +++ s im Sim (ratinho) s im s im + + ++ + +++ não Não (ratinho) 3A3 3A6 1A7 1G7 2B10 2C11 2F3
3P1B1-1F 9 3P1D10.2 C3 3P1E11.3 B7 3P2C6. 3G10.2H7 3P2C9.2G 4 3P4A6.1D 9
3P4A1.2B 9
3P4C2.2D 2 3P4C5.1D 8 42 FACs
Imunoprecipitaçao
Western sp35F huSp3 mSp3 huSp3 huSp3 5 mSp3 5 c 5 5 5 +++ +++ (ban (band da a inf e super rior 1B6.4 +++ ++ + ior) ) não +++ +++ (ban (band da a inf e super rior 2C7.2 +++ ++ + ior) ) não ++ ++ (liga- (liga se a -se a 293 293 célula célul 2D6.1 s) as ) - - não +++ +++ (ban (band da a inf e inf er rior 2F7.3 + + ++ ior) ) s im +++ +++ (ban (band da a inf e inf er rior 2H3.2 + + ++ ior) ) s im +++ +++ (ban (band da a inf e 3C11 . inf er rior 1 + + ++ ior) ) s im +++ +++ (ban (band da a inf e super rior 3E3.1 +++ ++ + ior) ) não +++ +++ (ban (band da a inf e 3H11 . inf er rior 2 ++ ++ ior) ) s im +++ (band a super 3G8 .1 + + ior) ++ + não +++ + (ban (band da a inf e super rior 2B8 .1 + + ++ ior) ) não +++ (band a super 3B5 . 2 +++ ++ + ior) ++ + não Não (ratin ho) Não (ratin ho) Não (ratin ho) Sim (ratin ho) Sim (ratin ho) Sim (ratin ho) Não (ratin ho) Sim (ratin ho) Não (ratin ho) Não (ratin ho) Não (ratin ho) sp35 de ratinh o/ rato IHQ em Células Transfectad huSp3 5 mSp3 5 IHQ em Tecid os
ELISA WT (para fina) (par af in a) 419 1- 34- 532 532 495 43
FRAGMENTOS Fab MONOCLONAIS DERIVADOS DA BIBLIOTECA DE APRESENTAÇAO DE FAGOS-1 F AC s
Imunoprecipitaçao
Western sp3 5 de IHQ em Células Transfecta das IHQ em Tecidos
ELISA WT KO rati (pa raf 34- 34 417 419 1- nho/ huSp3 mSp3 -j_na (paraf 417 532 53 rato 5 5 ) ina) 493 495 2 huSp3 mSp3 sp35F huSp huSp3 5 5c 35 mSp35 5 30-C12 (LiOl) ++ + + 38-D01 (Li02) -/ + -/ + 35-E04 (Li03) ++ +++ 36-C09 (Li04) -/ + -/ + 30-All (Li05) + ++ ++ + + 34-F02 (Li06) ++ + + 29-E07 (LiO 7) ++ + + 34-G04 (Li08) + /- + ++ + + 36-A12 (Li09) - - 28-D02 (LilO) -/ + + /- 30-B01 (Lill) ++ ++ + + 34-B03 (Lil2) + + 44 FRAGMENTOS Fab MONOCLONAIS DERIVADOS DA BIBLIOTECA DE APRESENTAÇÃO DE FAGOS-2 IHQ em Células IHQ em
FACs imunoprecipitação Western Transf ectadas Tecidos ELISA WT KO sp35 de (par (par 41 417 9- 1- huSp mSp3 sp35F huS mSp3 huSp3 ratinho/ af in af in 34- 49 53 34- 35 5 c p3 5 5 5 rato huSp35 mSp3 5 a) a) 417 493 5 2 532 3383 si (D + N/A N/A sim sim sim m 3495 (2 + / si ) + s im não fraco N/A sim sim - m sim 3563 si (3) + não não sim m 3564 si (4) + não não sim m 35 65 si (5) + não não sim m 3566 muito + / si (6) + sim fraco sim sim - m sim 3567 + / si (7) + sim não sim sim - m sim 3568 si (8) + não não sim m 3569 si (9) + não não sim m 3570 si (10) + não não sim m 3571 (11) + não não 45 FACs
Imunoprecipitaça o
Western IHQ em Células Transfectadas IHQ em Tecidos ELISA WT KO 41 (par (par 7- af in af in 34- 49 419- 1- 34- a) a) 417 3 495 532 532 s im s im sim s im + /- s im s im huSp mSp3 sp3 huS mSp3 35 5 5Fc p3 5 5 3582 (12) + sp35 de huSp Ratinho 35 /rato huSp3 5 mSp35 não não sim c ruído f r ac muito de o não fraco coloração em apenas muito poucas fundo células fraco não não sim c ruido de fundo elev sim sim c ruído de fundo elev muito fraco sim 1968 (13) +/- - ++ 3011 - +/- 3012 agre 3013 g. + agre 3418 g. sim c ruido de fundo 3422 agre 3562 g. elev nao não
Anticorpos monoclonais COMPLETOS DERIVADOS DA BIBLIOTECA DE APRESENTAÇAO DE FAGOS-1 DO 5 + + DO 7 +++ DO 8 + + Dl 0 +++ Dl 1 +++
Legenda: huSp35 = proteína Sp35 humana mSp35 = proteína Sp35 de ratinho WT = nativo KO = "knock-out" IHQ = imuno-histoquímica FACS = Selecção Celular Activada por Fluorescência 46
Tal como aqui utilizado, o termo "domínio de ligação ao antigénio" inclui um local que se liga especificamente a um epitopo de um antigénio (por exemplo, um epitopo de Sp35) . 0 domínio de ligação ao antigénio de um anticorpo tipicamente inclui pelo menos uma porção de uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina e de pelo menos uma porção de uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina. 0 local de ligação formada por estas regiões variáveis determina a especificidade do anticorpo. A presente divulgação é dirigida, mais especificamente, a um anticorpo Sp35, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante ou derivado, onde o anticorpo SP35 se liga ao mesmo epitopo que um anticorpo monoclonal seleccionado a partir do grupo consistindo em 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6 . 1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2 , 3P4C5. 1D8, , 3P4C8.2G9, 30 -C12 (LiOl ) , 38- DO 1 (Li02 ) r 35-E04 (Li03), 36- C09 (Li04), 30 -AI 1 (Li 0 5 ) , 34- -F02 (Li06) r 29-E07 (Li 0 7), 34- G04 (Li08), 36 -AI 2 (Li 0 9 ) , 28- -DO 2 (LilO) 1 30-B01 (Li11), 34 -B03 (Li 12), L il3, Li3 2, Li33, Li3 4, 33 83 (Lia.1 ), 3495 (Lia .2) , 3563 (Lia .3) , 3564 (Lia.4 ), 3565 (L la .5), 3566 (Lia. 6) , 3567 (Lia.7) r 3568 (Lia. 8), 3569 (Lia.9 ) , 3570 ( (Lia.10), , 3: 571 (Lia.11) r 3582 (Lia. 12) , e 1968 (Lia. . 13 ) · A divulgação é ainda direccionada para um anticorpo Sp35, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante ou derivado, em que o anticorpo inibe competitivamente um anticorpo monoclonal Sp35 seleccionado do grupo que consiste em 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (LiOl), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li 0 6), 29-E07 (Li 0 7), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 47 (LilO), 30-B01 (Lill), 34-B03 (Lil2), Lil3, Li32, Li33, Li34, 3383 (Lia.1), 3495(Lla.2), 3563 (Lia.3), 3564 (Lia.4), 3565 (Lia.5), 3566 (Lia.6), 3567 (Lia.7), 3568 (Lia.8), 3569 (Lia.9), 3570 (Lia.10), 3571 (Lia.11), 3582 (Lia.12), e 1968 (Lia.13) de se ligar a Sp35. A divulgação também se dirige a um anticorpo Sp35, ou a um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante ou derivado, onde o anticorpo Sp35 compreende pelo menos a região de ligação ao antigénio de um anticorpo monoclonal seleccionado do grupo que consiste em 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6 .1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2 , 3P4C5 .1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (LiOl ), 38-D01 (Li02) , 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05 ), 34-F02 (Li06) , 29-E07 (LiO 7), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09 ), 28-D02 (LilO), 30-B01 (Lill), 34-B03 (Lil2), Lil3, Li32, Li33, Li3 4, 3383 (Lia.1 ), 3495(Lia.2), 3563 (Lia.3), 3564 (Lia.4), 3565 (Lia .5), 3566 (Lia. 6), 3567 (Lia.7) , 3568 (Lia. 8), 3569 (Lia.9), 3570 1 [Lia.10) , 3571 (Lia.11) , 3582 (Lia. 12), e 1968 (Lia.13 ) ·
Nalguns exemplos, a divulgação é dirigida a um anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado, que se liga especificamente ou preferencialmente a um determinado domínio ou fragmento de polipéptido de SP35 domínio. Tais fragmentos de polipéptido de Sp35 incluem, mas não estão limitados a, um polipéptido Sp35 compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste nos aminoácidos 34 a 532; 34 a 417; 34 a 425; 34 a 493; 66 a 532; 66 a 417; 66 a 426; 66 a 493;66 a 532;417 a 532; 417 a 425 (a região Sp35 básica) ; 417 a 493; 417 a 532;, 419 a 493 (a região Ig Sp35);, ou 425 a 532 de SEQ ID NO: 2; ou polipéptido Sp35 variante pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% idêntico aos aminoácidos 34 a 532; 34 a 417; 34 a 425; 48 34 a 493; 66 a 532; 66 a 417; 66 a 426; 66 a 493; 66 a 532; 417 a 532; 417 a 425 (a região Sp35 básica) ; 417 a 493; 417 a 532; 419 a 493 (a região Ig Sp35); ou 425 a 532 de SEQ ID NO: 2 .
Os fragmentos de péptidos SP35 adicionais aos guais se ligam certos anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes, ou derivados da divulgação incluem, mas não estão limitados àqueles fragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo num ou mais repetições ricas em leucina-se (LRR) de SP35. Tais fragmentos, incluem, por exemplo, fragmentos compreendendo, consistindo essencialmente de ou consistindo nos aminoácidos 66 a 89; 66 a 113; 66 a 137; 90 a 113; 114 a 137; 138 a 161; 162 a 185; 186 a 209; 210 a 233;, 234 a 257; 258 a 281; 282 a 305; 306 a 329; ou 330 a 353 de SEQ ID NO: 2. São também contemplados os fragmentos correspondentes de uma variante do polipéptido Sp35 pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% idênticos aos aminoácidos 66 a 89; 66 a 113; 90 a 113; 114 a 137; 138 a 161; 162 a 185; 186 a 209; 210 a 233; 234 a 257; 258 a 281; 282 a 305; 306 a 329; ou 330 a 353 de SEQ ID NO: 2.
Fragmentos de péptidos de Sp35 adicionais aos quais se ligam certos anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes, ou derivados da divulgação incluem, mas não estão limitados a esses fragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo numa ou mais regiões ricas em cisteina que flanqueia a LRR de Sp35. Tais fragmentos, incluem, por exemplo, um fragmento que compreende, que consiste essencialmente em, ou que consiste nos aminoácidos 34 64 da SEQ ID NO: 2 (a extremidade N da região que flanqueia LRR (LRRNT) ) , ou um fragmento que compreende, que consiste essencialmente de, ou que consiste nos aminoácidos 363 416 da SEQ ID NO: 2 (a extremidade C LRR da região que 49 flanqueia (LRRCT)), estando também contemplados os aminoácidos correspondentes de fragmentos de um polipéptido variante SP35, pelo menos, 70%, 75%, 80%, 85 %, 90% ou 95% idênticos aos aminoácidos 34 a 64 e 363 a 416 da SEQ ID NO: 2.
Como é conhecido na técnica, a "identidade de sequência" entre dois polipéptidos é determinada pela comparação da sequência de aminoácidos de um polipéptido com a sequência de um segundo polipéptido. Quando aqui discutido, se qualquer polipéptido em particular é pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico a outro polipéptido pode ser determinado utilizando os métodos e programas de computador/software conhecidos na técnica tais como, mas não limitados a, o programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). O BESTFIT usa o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981), para encontrar o melhor segmento de homologia entre duas sequências. Ao utilizar BESTFIT ou qualquer outro programa de alinhamento de sequências para determinar se uma sequência em particular é, por exemplo, 95% idêntica a uma sequência de referência de acordo com a divulgação, os parâmetros são ajustados, naturalmente, de tal modo que a percentagem de identidade é calculada sobre o comprimento total da sequência do polipéptido de referência e em que são permitidas as lacunas de homologia até 5% do número total de aminoácidos na sequência de referência.
Fragmentos de péptidos de Sp35 aos quais certos anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes, ou derivados da divulgação se ligam incluem, mas não estão limitados a esses fragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo nos aminoácidos 41 a 525 de 50 SEQ ID NO: 2; 40 a 526 de SEQ ID NO: 2; 39 a 527 de SEQ ID NO: 2; 38 a 528 de SEQ ID NO: 2; 37 a 529 de SEQ ID NO: 2; 36 a 530 de SEQ ID NO: 2; 35 a 531 de SEQ ID NO: 2; 34 a 531 de SEQ ID NO: 2; 46 a 520 de SEQ ID NO: 2; 45 a 521 de SEQ ID NO: 2; 44 a 522 de SEQ ID NO: 2; 43 a 523 de SEQ ID NO: 2; e 42 a 524 de SEQ ID NO: 2.
Adicionalmente ainda fragmentos peptidicos Sp35 aos quais certos anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes, ou derivados da divulgação se ligam incluem, mas não estão limitados a esses fragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo nos aminoácidos 1 a 33 de SEQ ID NO: 2; 1 a 35 de SEQ ID NO: 2; 34 a 64 de SEQ ID NO: 2; 36 a 64 de SEQ ID NO: 2; 66 a 89 de SEQ ID NO: 2; 90 a 113 de SEQ ID NO: 2; 114 a 137 de SEQ ID NO: 2; 138 a 161 de SEQ ID NO: 2; 162 a 185 de SEQ ID NO: 2; 186 a 209 de SEQ ID NO: 2; 210 a 233 de SEQ ID NO: 2; 234 a 257 de SEQ ID NO: 2; 258 a 281 de SEQ ID NO: 2; 282 a 305 de SEQ ID NO: 2; 306 a 329 de SEQ ID NO: 2; 330 a 353 de SEQ ID NO: 2; 363 a 416 de SEQ ID NO: 2; 417 a 424 de SEQ ID NO: 2; 419 a 493 de SEQ ID NO: 2; e 494 a 551 de SEQ ID NO: 2.
Mais ainda, fragmentos peptidicos Sp35 aos quais certos anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes, ou derivados da divulgação se ligam incluem, mas não estão limitados a esses fragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo nos aminoácidos 1 a 33 de SEQ ID NO: 2; 1 a 35 de SEQ ID NO: 2; 1 a 64 de SEQ ID NO: 2; 1 a 89 de SEQ ID NO: 2; 1 a 113 de SEQ ID NO: 2; 1 a 13 7 de SEQ ID NO: 2; 1 a 161 de SEQ ID NO: 2; 1 a 185 de SEQ ID NO: 2; 1 a 209 de SEQ ID NO: 2; 1 a 233 de SEQ ID NO: 2; 1 a 257 de SEQ ID NO: 2; 1 a 281 de SEQ ID NO: 2; 1 a 305 de SEQ ID NO: 2; 1 a 329 de SEQ ID NO: 2; 1 a 353 de SEQ ID NO: 2; 1 a 416 de SEQ ID NO: 2; 1 a 424 de SEQ ID NO: 2; 1 a 51 493 de SEQ ID NO: 2; 1 a 551 de SEQ ID NO: 2; 1 a 531 de SEQ ID NO: 2 e 1 a 532 de SEQ ID NO: 2.
Fragmentos de péptidos Sp35 aos quais certos anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes, ou derivados da divulgação se ligam incluem, mas não estão limitados a esses fragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consiste nos aminoácidos 34 a 64 de SEQ ID NO: 2; 34 a 89 de SEQ ID NO: 2; 34 a 113 de SEQ ID NO: 2; 34 a 137 de SEQ ID NO: 2; 34 a 161 de SEQ ID NO: 2; 34 a 185 de SEQ ID NO: 2; 34 a 209 de SEQ ID NO: 2; 34 a 233 de SEQ ID NO: 2; 34 a 257 de SEQ ID NO: 2; 34 a 281 de SEQ ID NO: 2; 34 a 305 de SEQ ID NO: 2; 34 a 329 de SEQ ID NO: 2; 34 a 353 de SEQ ID NO: 2; 34 a 416 de SEQ ID NO: 2; 34 a 424 de SEQ ID NO: 2; 34 a 493 de SEQ ID NO: 2; e 34 a 551 de SEQ ID NO: 2.
Mais fragmentos de péptidos Sp35 adicionais aos quais certos anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes, ou derivados da divulgação se ligam incluem, mas não estão limitados àquelas fragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consiste nos aminoácidos 34 a 530 de SEQ ID NO: 2; 34 a 531 de SEQ ID NO: 2; 34 a 532 de SEQ ID NO: 2; 34 a 533 de SEQ ID NO: 2; 34 a 534 de SEQ ID NO: 2; 34 a 535 de SEQ ID NO: 2; 34 a 536 de SEQ ID NO: 2; 34 a 537 de SEQ ID NO: 2; 34 a 538 de SEQ ID NO: 2; 34 a 539 de SEQ ID NO: 2; 30 a 532 de SEQ ID NO: 2; 31 a 532 de SEQ ID NO: 2; 32 a 532 de SEQ ID NO: 2; 33 a 532 de SEQ ID NO: 2; 34 a 532 de SEQ ID NO: 2; 35 a 532 de SEQ ID NO: 2; 36 a 532 de SEQ ID NO: 2; 30 a 531 de SEQ ID NO: 2; 31 a 531 de SEQ ID NO: 2; 32 a 531 de SEQ ID NO: 2; 33 a 531 de SEQ ID NO: 2; 34 a 531 de SEQ ID NO: 2; 35 a 531 de SEQ ID NO: 2; e 36 a 531 de SEQ ID NO: 2. 52
Mais ainda, fragmentos de péptidos Sp35 aos quais certos anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes, ou derivados da divulgação se ligam incluem, mas não estão limitados àquelas fragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consiste nos aminoácidos 36 a 64 de SEQ ID NO: 2; 36 a 89 de SEQ ID NO: 2; 36 a 113 de SEQ ID NO: 2; 36 a 137 de SEQ ID NO: 2; 36 a 161 de SEQ ID NO: 2; 36 a 185 de SEQ ID NO: 2; 36 a 209 de SEQ ID NO: 2; 36 a 233 de SEQ ID NO: 2; 36 a 257 de SEQ ID NO: 2; 36 a 281 de SEQ ID NO: 2; 36 a 305 de SEQ ID NO: 2; 36 a 329 de SEQ ID NO: 2; 36 a 353 de SEQ ID NO: 2; 36 a 416 de SEQ ID NO: 2; 36 a 424 de SEQ ID NO: 2; 36 a 493 de SEQ ID NO: 2; e 36 a 551 de SEQ ID NO: 2.
Fragmentos de péptido Sp35 adicionais aos quais certos anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes, ou derivados da divulgação se ligam incluem, mas não estão limitados àquelas fragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consiste nos aminoácidos 36 a 530 de SEQ ID NO: 2; 36 a 531 de SEQ ID NO: 2; 36 a 532 de SEQ ID NO: 2; 36 a 533 de SEQ ID NO: 2; 36 a 534 de SEQ ID NO: 2; 36 a 535 de SEQ ID NO: 2; 36 a 536 de SEQ ID NO: 2; 36 a 537 de SEQ ID NO: 2; 36 a 538 de SEQ ID NO: 2; e 36 a 539 de SEQ ID NO: 2.
Mais fragmentos de péptido Sp35 aos quais certos anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes, ou derivados da divulgação se ligam incluem, mas não estão limitados àquelas fragmentos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consiste nos aminoácidos 417 a 493 de SEQ ID NO: 2; 417 a 494 de SEQ ID NO: 2; 417 a 495 de SEQ ID NO: 2; 417 a 496 de SEQ ID NO: 2; 417 a 497 de SEQ ID NO: 2; 417 a 498 de SEQ ID NO: 2; 417 a 499 de SEQ ID NO: 2; 417 a 500 de SEQ ID NO: 2; 417 a 492 de SEQ ID NO: 2; 417 a 491 de 53 SEQ ID NO: 2; 412 a 493 de SEQ ID NO: 2; 413 a 493 de SEQ ID NO: 2; 414 a 493 de SEQ ID NO: 2; 415 a 493 de SEQ ID NO: 2; 416 a 493 de SEQ ID NO: 2; 411 a 493 de SEQ ID NO: 2; 410 a 493 de SEQ ID NO: 2; 410 a 494 de SEQ ID NO: 2; 411 a 494 de SEQ ID NO: 2; 412 a 494 de SEQ ID NO: 2; 413 a 494 de SEQ ID NO: 2; 414 a 494 de SEQ ID NO: 2; 415 a 494 de SEQ ID NO: 2; 416 a 494 de SEQ ID NO: 2; 417 a 494 de SEQ ID NO: 2; e 418 a 494 de SEQ ID NO: 2.
Num exemplo adicional fragmentos peptídicos Sp35 aos quais certos anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes, ou derivados da presente invenção se ligam incluem, um polipéptido Sp35 compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste em péptidos do domínio Ig de Sp35 ou fragmentos, variantes ou derivados de tais polipéptidos. Especificamente, polipéptidos compreendendo, consistindo essencialmente de ou consistindo nas seguintes sequências polipeptídicas: ITX1X2X3 (SEQ ID NO: 287), ACX1X2X3 (SEQ ID NO: 288), VCXiXzXsíSEQ ID NO: 289) e SPX!X2X3(SEQ ID NO: 290) em que Xi é lisina, arginina, histidina, glutamina ou asparagina, X2 i é lisina, arginina, histidina, glutamina ou asparagina e X3 é lisina, arginina, histidina, glutamina ou asparagina. Por exemplo, fragmentos peptídicos Sp35 aos quais certos anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes, ou derivados da presente invenção se ligam incluem aqueles fragmentos que compreendem, que consistem essencialmente em, ou que consistem nas seguintes sequências polipeptídicas: SPRKH (SEQ ID NO: 291), SPRKK (SEQ ID NO: 292), SPRKR (SEQ ID NO: 293), SPKKH (SEQ ID NO: 294), SPHKH (SEQ ID NO: 295), SPRRH (SEQ ID NO: 296), SPRHH (SEQ ID NO: 297), SPRRR (SEQ ID NO: 298), SPHHH (SEQ ID NO: 299) SPKKK (SEQ ID NO: 300), LSPRKH (SEQ ID NO: 301), LSPRKK (SEQ ID NO: 302), LSPRKR (SEQ ID NO: 303), LSPKKH (SEQ ID NO: 304), LSPHKH (SEQ ID NO: 305), LSPRRH (SEQ ID NO: 306), LSPRHH (SEQ 54 ID NO: 307), LSPRRR (SEQ ID NO: 308), LSPHHH (SEQ ID NO: 309) LSPKKK (SEQ ID NO: 310), WLSPRKH (SEQ ID NO: 311), WLSPRKK (SEQ ID NO: 312), WLSPRKR (SEQ ID NO: 313), WLSPKKH (SEQ ID NO: 314), WLSPHKH (SEQ ID NO: 315), WLSPRRH (SEQ ID NO: 316), WLSPRHH (SEQ ID NO: 317), WLSPRRR (SEQ ID NO: 318), WLSPHHH (SEQ ID NO: 319) WLSPKKK (SEQ ID NO: 320). Estes polipéptidos Sp35 incluem a "volta RKH" básica (aminoácidos arginina-lisina-histidina 456-458) no dominio Ig de Sp35. Péptidos Sp35 adicionais que incluem tripéptido básico são ITPKRR (SEQ ID NO: 321), ACHHK (SEQ ID NO: 322) e VCHHK (SEQ ID NO: 323).
Fragmentos de péptidos Sp35 adicionais aos quais certos anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes, ou derivados da divulgação se ligam incluem, um polipéptido Sp35 compreendendo, consistindo essencialmente de, ou consistindo de péptidos do dominio Ig de Sp35 ou fragmentos, variantes ou derivados de tais polipéptidos. Especificamente, os péptidos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consistem nas seguintes sequências polipeptídicas: X4X5RKH (SEQ ID NO: 324), X4X5RRR (SEQ ID NO: 325), X4X5KKK (SEQ ID NO: 326), X4X5HHH (SEQ ID NO: 327), X4X5RKK (SEQ ID NO: 328), X4X5RKR (SEQ ID NO: 329 ), X4X5KKH (SEQ ID NO: 330 ), X4X5HKH (SEQ ID NO: 331), X4X5RRH (SEQ ID NO: 332) e X4X5RHH (SEQ ID NO: 333) em que X4 é qualquer aminoácido e X5 é qualquer aminoácido.
Noutros exemplos fragmentos peptídicos Sp35 aos quais certos anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes, ou derivados da presente invenção se ligam incluem, um polipéptido Sp35 compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em péptidos da dominio Ig de Sp35 ou fragmentos, variantes ou derivados de tais polipéptidos. Especificamente, polipéptidos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consistem nas seguintes 55 sequências polipeptídicas: ITX6X7X8 (SEQ ID NO: 334), ACX6X7X8 (SEQ ID NO: 335), VCX6X7X8 (SEQ ID NO: 336) e SPX6X7X8 (SEQ ID NO: 337) onde Χε é lisina, arginina, histidina, glutamina ou asparagina, X7 é qualquer aminoácido e X8 é lisina, arginina, histidina, glutamina ou asparagina. Por exemplo, um polipéptido que compreende, que consiste essencialmente em, ou que consiste na seguinte sequência de polipéptido: SPRLH (SEQ ID NO: 338).
Fragmentos peptídicos Sp35 ao quais certos anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes, ou derivados da presente invenção se ligam incluem, um polipéptido Sp35 compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste em péptidos que contêm aminoácidos 452 -458 no domínio Ig de Sp35, ou os seus derivados, em que o aminoácido 452 é um resíduo de triptofano ou fenilalanina.
Fragmentos de péptidos Sp35 adicionais aos quais certos anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes, ou derivados da divulgação se ligam incluem, um polipéptido Sp35 compreendendo, consistindo essencialmente de, ou consistindo nos péptidos do domínio básico de Sp35. Especificamente, os péptidos compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consistem nas seguintes sequências polipeptídicas: RRARIRDRK (SEQ ID NO: 339), KKVKVKEKR (SEQ ID NO: 340), RRLRLRDRK (SEQ ID NO: 341), RRGRGRDRK (SEQ ID NO: 342) e RRIRARDRK (SEQ ID NO: 343).
Exemplares adicionais de polipéptidos Sp35 solúveis e de métodos e materiais para a obtenção dessas moléculas para a produção de anticorpos ou fragmentos de anticorpos da divulgação podem ser encontrados, por exemplo, no Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2004/008323. 56
Os métodos de preparação de anticorpos são bem conhecidos na técnica e são aqui descritos. Uma vez produzidos anticorpos para vários fragmentos de, ou para o Sp35 de comprimento total sem a sequência de sinal, a determinação de quais os aminoácidos, ou epitopo, de Sp35 ao qual se liga o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio pode ser determinado por protocolos de mapeamento de epitopo tal como aqui descrito, bem como por métodos conhecidos na técnica (por exemplo, ELISA com sanduíche de dois anticorpos, como descrito no "Capítulo 11 - Immunology", Current Protocols in Molecular
Blology, ed. Ausubel et ai., v.2, John Wiley & Sons, Inc. (1996)) . Protocolos adicionais de mapeamento de epitopos podem ser encontrados em Morris, G. Epitope Mapping Protocols, New Jersey: Humana Press (1996) . 0 mapeamento de epitopos também pode ser realizado por meios disponíveis comercialmente (isto é, ProtoPROBE, Inc. (Milwaukee,
Wisconsin)) .
Além disso, anticorpos produzidos que se ligam-se a qualquer porção do SP35 podem então ser pesquisados relativamente à sua capacidade para actuar como um antagonista de Sp35 e portanto promover o crescimento de neurites, a sobrevivência neuronal e de oligodendrócitos, a proliferação e diferenciação bem como para promover a mielinização. Os anticorpos podem ser rastreados para a sobrevivência de oligodendrócitos/neuronal usando o método tal como descrito nos Exemplos 10 e 11. Além disso, os anticorpos podem ser rastreados quanto à sua capacidade para promover a mielinização usando o método do Exemplo 9. Finalmente, os anticorpos podem ser rastreados quanto à sua capacidade para promover a proliferação de oligodendrócitos e s diferenciação, bem como o crescimento de neurites, utilizando o método descrito no Exemplo 7. Outras funções antagonistas de anticorpos da divulgação pode ser testadas utilizando 57 outros ensaios tal como descrito nos Exemplos aqui apresentados.
Noutros exemplos, a divulgação inclui um anticorpo, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado, que se liga especificamente ou preferencialmente a pelo menos um epitopo de SP35, quando o epitopo compreende, consiste essencialmente em, ou é constituído por, pelo menos, cerca de quatro a cinco aminoácidos de SEQ ID NO: 2, pelo menos sete, pelo menos, nove, ou entre, pelo menos, cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Os aminoácidos de um dado epitopo de SEQ ID NO: 2 tais como descritos podem ser, mas não precisam de ser contíguos ou lineares. Em certos exemplos, o pelo menos um epitopo de Sp35 compreende, consiste essencialmente de, ou consiste num epitopo não linear formado pelo domínio extracelular de Sp35, tal como expresso na superfície de uma célula ou na forma de um fragmento solúvel, por exemplo, fundido com uma região Fc de IgG. Assim, em certos exemplos, o pelo menos um epitopo de Sp35 compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, entre cerca de 15 e cerca de 30, ou pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 , 85, 90, 95 ou 100 aminoácidos contíguos ou não contíguos de SEQ ID NO: 2, onde os aminoácidos não-contíguos formam um epitopo através do enrolamento de proteínas.
Noutros exemplos, a divulgação inclui um anticorpo, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado, que se liga especificamente ou preferencialmente a pelo menos um epitopo de SP35, quando o epitopo compreende, consiste essencialmente em, ou é constituído por, além de um, dois, três, quatro, cinco, seis ou mais aminoácidos contíguos ou 58 não contíguos da SEQ ID NO: 2, tal como descrito acima, e uma porção adicional que modifica a proteína, por exemplo, uma unidade de hidrato de carbono pode ser incluída de modo que o anticorpo Sp35 se ligue com maior afinidade à proteína alvo modificado do que uma versão não modificada da proteína. Alternativamente, o anticorpo SP35 não se liga de todo à versão não modificada da proteína alvo.
Em certos casos, a divulgação dirige-se a um anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado, que se liga especif icamente a um polipéptido Sp35 ou seu fragmento, ou a um polipéptido variante Sp35, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (KD) , que é menor do que a KD para o referido anticorpo monoclonal de referência.
Em certos exemplos, um anticorpo, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado da divulgação liga-se especificamente a pelo menos um epitopo de Sp35, ou fragmento ou variante acima descrito, ou seja, liga-se a um tal epitopo mais rapidamente do que se ligaria a um epitopo não relacionado, ou a um epitopo aleatório; liga-se preferencialmente a pelo menos um epitopo de Sp35, ou fragmento ou variante acima descrito, ou seja, liga-se a um tal epitopo mais facilmente do que se ligaria a uma epitopo relacionado, semelhante, homólogo ou análogo; inibe competitivamente a ligação de um anticorpo de referência que por si se liga especif icamente ou preferencialmente a um determinado epitopo de Sp35 ou um fragmento ou variante acima descrita; ou se liga a pelo menos um epitopo de Sp35 ou um fragmento ou variante acima descrita com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação KD de menos do que cerca de 5 x 1CT2 M, cerca de 10“2 M, cerca de 5 x 10“3 M, cerca de IO-3 M, cerca de 5 x 1CT4 M, cerca de 10“4 M, cerca de 59 5 χ ΙΟ-5 Μ, cerca de 1CT5 Μ, cerca de 5 χ 10'6 M, cerca de ΙΟ'6 Μ, cerca de 5 χ 10-7 M, cerca de 10-7 M, cerca de 5 χ 1CT8 Μ, cerca de 10-8 M, cerca de 5 χ 1CT9 M, cerca de 1CT9 M, cerca de 5 χ IO-10 M, cerca de 1CT10 M, cerca de 5 χ IO'11 M, cerca de 1CT 11 M, cerca de 5 x 1CT12 M, cerca de 1CT12 M, cerca de 5 x IO'13 M, cerca de 10' 13 M, cerca de 5 x 10'14 M, cerca de 10'14 M, cerca de 5 X 10'15 M, ou cerca de 10'15 M. Num exemplo particular, o anticorpo ou um seu fragmento liga-se preferencialmente a um polipéptido Sp35 humano ou a um seu fragmento, em relação a um polipéptido SP35 murino ou a um seu fragmento.
Tal como utilizado no contexto de constantes de dissociação da ligação de anticorpos, o termo "cerca de" permite o grau de variação inerente aos métodos utilizados para medir a afinidade de anticorpos. Por exemplo, dependendo do grau de precisão dos instrumentos utilizados, do erro padrão com base no número de amostras medidas, e do erro de arredondamento, o _o termo "cerca de 10 M" pode incluir, por exemplo, a partir de 0,05 M até 0,005 M.
Em exemplos específicos, um anticorpo, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado da divulgação liga-se aos polipéptidos Sp35 ou seus fragmentos ou variantes com uma velocidade de dissociação (k(dissociação)) inferior ou igual a 5 X 10'2 s'1, 10'2 s”1, 5 X 10'3 s'1 ou 10'3 s'1. Alternativamente, um anticorpo, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado da divulgação liga-se a polipéptidos SP35 ou seus fragmentos ou variantes com uma velocidade de dissociação (k(dissociação)) inferior ou igual a 5 X 10'4 s'1, 10'4 s'1, 5 X 10'5 s'1, ou 10'5 s'1 5 X IO'6 s'1, 10“6 s'1, 5 X 10'7 s'1 ou 10'7 s'1. 60
Noutros exemplos, um anticorpo, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado da divulgação liga—se a polipéptidos Sp35 ou seus fragmentos ou variantes com uma velocidade de associação (k(associação)) superior ou igual a 103 1Γ1 s_1, 5 X 103 M_1 s^1, ΙΟ4 ΝΓ1 s_1 ou 5 X 104 1ΥΓ1 s~ 1Alternativamente, um anticorpo, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado da divulgação liga-se a polipéptidos Sp35 ou seus fragmentos ou variantes com uma velocidade de associação (k(associação)) superior ou igual a 105 M'1 s_1, 5 X ΙΟ5 ΝΓ1 s~4, 106 M_1 s_1, ou 5 X 106 M_1 s~4 ou ΙΟ7 M_1 s'1.
Em vários exemplos, um anticorpo, ou SP35 seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado, como aqui descrito é um antagonista da actividade de Sp35. Em certos exemplos, por exemplo, a ligação de um anticorpo antagonista de SP35 a SP35, como expresso em neurónios, bloqueia a inibição do crescimento das neurites associada à mielina ou a morte celular neuronal. Noutros exemplos, a ligação do anticorpo Sp35 a Sp35, como expresso em oligodendrócitos, bloqueia a inibição do crescimento ou diferenciação de oligodendrócitos, ou bloqueia a desmielinização ou dismielinização de neurónios do SNC. A menos que seja especificamente indicado, como aqui utilizado, um "seu fragmento", em referência a um anticorpo refere-se a um fragmento de ligação ao antigénio, isto é, a uma porção do anticorpo que se liga especificamente ao antigénio. Num exemplo, um anticorpo Sp35, por exemplo, um anticorpo da presente divulgação é um anticorpo Sp35 bi-especifico, polipéptido que se liga, ou anticorpo, por exemplo, um anticorpo bi-específico, "minibody", anticorpo com dominio suprimido, ou uma proteína de fusão possuindo especificidade de ligação para mais do que um epitopo, por 61 exemplo, mais do que um antigénio ou mais de um epitopo no mesmo antigénio. Num exemplo, um anticorpo bi-especifico Sp35, polipéptido que se liga, ou anticorpo tem pelo menos um dominio de ligação especifico para pelo menos um epitopo de um polipéptido alvo aqui descrito, por exemplo, Sp35. Noutro exemplo, um anticorpo bi-especifico Sp35, polipéptido de ligação, ou anticorpo tem pelo menos um dominio de ligação especifico para um epitopo num polipéptido alvo e pelo menos um dominio de ligação ao alvo especifico para um fármaco ou toxina. Ainda noutro exemplo, um anticorpo bi-especifico SP35, polipéptido de ligação, ou anticorpo tem pelo menos um dominio de ligação especifico para um epitopo num polipéptido alvo aqui divulgado, e pelo menos um dominio de ligação especifico para um profármaco. Um anticorpo bi-especifico Sp35, polipéptido de ligação, ou anticorpo pode ser um anticorpo tetravalente que tem dois domínios de ligação ao alvo específicos para um epitopo de um polipéptido alvo aqui divulgado e dois domínios de ligação ao alvo específicos para um segundo alvo. Assim, um anticorpo bi-especifico tetravalente Sp35, polipéptido de ligação, ou anticorpo podem ser bivalentes para cada especificidade.
Anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou seus derivados da divulgação, tal como é conhecido pelos especialistas na matéria, pode compreender uma região constante que medeia uma ou mais funções efectoras. Por exemplo, a ligação do componente de complemento Cl para uma região constante de anticorpo pode activar o sistema do complemento. A activação do complemento é importante na opsonização e lise de patogénios para as células. A activação do complemento também estimula a resposta inflamatória e pode também estar envolvida na hipersensibilidade autoimune. Além disso, os anticorpos ligam-se aos receptores das várias células através da região 62
Fc, com um local de ligação ao receptor de Fc na região Fc do anticorpo que se liga a um receptor de Fc (FcR) numa célula. Existem vários receptores Fc que são específicos para diferentes classes de anticorpos, incluindo IgG (receptores gama), IgE (receptores épsilon), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu) . A ligação do anticorpo a receptores Fc às superfícies celulares desencadeia um número de reacções biológicas importantes e diversas, incluindo absorção e destruição de partículas revestidas pelo anticorpo, a eliminação de complexos imunes, a lise de células alvo revestidas com anticorpo por células assassinas (denominada citotoxicidade mediada por células dependente do anticorpo, ou ADCC), a liberação de mediadores inflamatórios, transferência placentária e controlo da produção de imunoglobulina.
Por conseguinte, certos exemplos da divulgação incluem um anticorpo Sp35, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado, em que pelo menos uma fracção de um ou mais dos domínios da região constante foi eliminado ou de outro modo alterado de modo a proporcionar características bioquímicas desejadas como funções efectoras reduzidas, a capacidade de dimerizar não-covalentemente, maior capacidade de se localizar no local de um tumor, reduzida meia-vida no soro, ou aumento da meia-vida no soro, quando comparados com um anticorpo completo, inalterado de aproximadamente a mesma imunogenicidade. Por exemplo, certos anticorpos para utilização nos métodos de diagnóstico e de tratamento aqui descritos são anticorpos com deleção de domínio que compreendem uma cadeia de polipéptido semelhante a uma cadeia pesada de imunoglobulina, mas que não têm pelo menos uma porção de um ou mais domínios de cadeia pesada. Por exemplo, em certos anticorpos, um domínio completo da região constante 63 do anticorpo modificado será eliminado, por exemplo, a totalidade ou parte do dominio CH2 será deletado.
Em certos anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou seus derivados aqui descritos, a parte Fc pode ser mutada para reduzir a função efectora utilizando técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, a deleção ou inactivação (através de mutações pontuais ou por outros meios) de um dominio da região constante pode reduzir a ligação ao receptor Fc do anticorpo modificado em circulação, aumentando assim a localização do tumor. Noutros casos, pode ser que as alterações da região constante de acordo com a divulgação moderem a ligação do complemento e, assim, reduzam a meia-vida no soro e a associação não especifica de uma citotoxina conjugada. Ainda outras modificações da região constante podem ser usadas para modificar as ligações dissulfureto ou porções de oligossacáridos que permitem um aumento da localização devido ao aumento da especificidade do antigénio ou da flexibilidade do anticorpo. 0 perfil fisiológico resultante, biodisponibilidade e outros efeitos bioquímicos das modificações, tais como a localização tumoral, biodistribuição e meia-vida no soro, pode ser facilmente medido e quantificado utilizando técnicas imunológicas bem conhecidas, sem experimentação indevida.
Formas modificadas de anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação podem ser preparadas a partir do precursor completo ou de anticorpos parentes utilizando técnicas conhecidas na técnica. Exemplos de técnicas são aqui discutidos em maior pormenor. 64
Em certos exemplos, tanto as regiões variáveis e como as constantes de anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados são inteiramente humanos. Os anticorpos totalmente humanos podem ser preparados usando técnicas que são conhecidas na técnica e tal como aqui descrito. Por exemplo, os anticorpos totalmente humanos contra um antigénio especifico, podem ser preparados pela administração do antigénio a um animal transgénico, que foi modificado para produzir tais anticorpos em resposta ao estimulo antigénico, mas cujos loci endógenos foram desactivados. Exemplos de técnicas que podem ser usadas para preparar tais anticorpos estão descritos nas Patentes dos E.U.A.: 6,150,584; 6,458,592; 6,420,140. Outras técnicas são conhecidas na técnica. Os anticorpos totalmente humanos podem igualmente ser produzidos por diversas tecnologias de apresentação, por exemplo, de apresentação de fagos ou de outros sistemas de apresentação virais, como descrito em mais detalhe aqui noutro local.
Anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação podem ser preparados ou fabricados utilizando técnicas que são conhecidas na técnica. Em certos exemplos, as moléculas de anticorpo ou seus fragmentos são "produzidos de forma recombinante", isto é, são produzidos utilizando tecnologia de ADN recombinante. Exemplos de técnicas para fabricar moléculas de anticorpo ou seus fragmentos são discutidas em mais detalhe neste documento.
Anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação também inclui os derivados que são modificados, por exemplo, através da ligação covalente de qualquer tipo de molécula de anticorpo de tal modo que a ligação covalente não impede o anticorpo de 65 se ligar especificamente ao seu epitopo cognato. Por exemplo, mas não como limitação, os derivados do anticorpo incluem anticorpos que foram modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos protectores/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligando celular ou outra proteína, etc. Qualquer das numerosas modificações químicas pode ser realizada por técnicas conhecidas, incluindo, mas não se limitando a clivagem química específica, acetilação, formilação, a síntese metabólica de tunicamicina, etc. Além disso, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos.
Em certos exemplos, anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação não irão induzir uma resposta imunitária prejudicial no animal a ser tratado, por exemplo, num ser humano. Num exemplo, anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação são modificados para reduzir a sua imunogenicidade, utilizando técnicas reconhecidas na técnica. Por exemplo, os anticorpos podem ser humanizados, primatizados, des-imunizados, ou podem ser preparados anticorpos quiméricos. Estes tipos de anticorpos são derivados de um anticorpo não humano, tipicamente um anticorpo de murino ou primata, que retém ou retém substancialmente as propriedades de ligação ao antigénio do anticorpo progenitor, mas que é menos imunogénico em humanos. Isto pode ser conseguido por vários métodos, incluindo: (a) enxerto dos domínios variáveis não-humanos completos nas regiões constantes humanas para gerar anticorpos quiméricos, (b) enxerto de pelo menos uma parte de uma ou mais regiões determinantes de complementaridade não humanas (CDRs) numa estrutura humana e regiões constantes, com ou sem retenção de resíduos críticos estruturais, ou (c) 66 transplante da totalidade dos domínios variáveis não humanos, mas "encobri-los" com uma secção de tipo humano através da substituição de resíduos de superfície. Tais métodos são descritos em Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 81: 6851-6855 (1984); Morrison et al., Adv. Immunol. 44: 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988);
Padlan, Molec. Immun. 28: 489-498 (1991); Padlan, Molec.
Immun. 31: 169-217 (1994), e Pat. E.U.A. Nos. 5, 585, 089, 5,693,761, 5,693,762, e 6,190,370. A des-imunização pode também ser usada para diminuir a imunogenicidade de um anticorpo. Tal como aqui utilizado, o termo "des-imunização" inclui a alteração de um anticorpo para modificar os epitopos de células T (ver, por exemplo, W09852976A1, WOO034317A2). Por exemplo, as sequências VH e VL do anticorpo de partida são analisadas e um epitopo de célula T humana "mapeia" de cada região V mostrando a localização de epitopos em relação às regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e outros resíduos chave no interior da sequência. Epitopos individuais das células T a partir do mapa de epitopos de célula T são analisados de modo a identificar substituições de aminoácidos alternativos, com um baixo risco de alteração da actividade do anticorpo final. Uma série de sequências alternativas de VH e VL são desenhadas compreendendo combinações de substituições de aminoácidos e estas sequências são subsequentemente incorporadas numa gama de polipéptidos de ligação, por exemplo, anticorpos específicos para Sp35 ou seus fragmentos imunoespecíficos para utilização nos métodos de diagnóstico e de tratamento aqui descritos, que são então testados relativamente à função. Normalmente, são gerados e testados entre 12 e 24 anticorpos variantes. Os genes completos de cadeia pesada e leve que compreendendo as regiões V modificada e C humana são então clonados em vectores de expressão e os plasmídeos 67 subsequentes introduzidos em linhas celulares para a produção do anticorpo completo. Os anticorpos são então comparados em ensaios bioquímicos e biológicos adequados, e a variante óptima é identificada.
Anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação podem ser gerados por qualquer método adequado conhecido na técnica. Anticorpos policlonais contra um antigénio de interesse podem ser produzidos por vários processos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, um anticorpo Sp35, por exemplo, um polipéptido de ligação, por exemplo, um anticorpo específico para Sp35 ou um seu fragmento imunoespecífico pode ser administrado a vários animais hospedeiros, incluindo, mas não limitados a, coelhos, ratinhos, ratos, galinhas, hamsters, cabras, burros, etc., para induzir a produção de soros contendo anticorpos policlonais específicos para o antigénio. Vários adjuvantes podem ser utilizados para aumentar a resposta imunológica, dependendo das espécies hospedeiras, e incluem, mas não estão limitados a, Freund (completo e incompleto) , géis minerais tais como hidróxido de alumínio, substâncias activas de superfície tais como lisolecitina, polióis plurónicos, polianiões, péptidos, emulsões oleosas, hemocianinas da lapa gigante, dinitrofenol e adjuvantes humanos potencialmente úteis tais como BCG (bacilo Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum. Esses adjuvantes são também bem conhecidos na técnica.
Os anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando uma ampla variedade de técnicas conhecidas na técnica, incluindo o uso de tecnologias de hibridoma, recombinante, e de apresentação de fagos, ou uma combinação destas. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos utilizando técnicas de hibridoma incluindo aquelas conhecidas na técnica 68 e ensinadas, por exemplo, em: Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. (1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hibridomas Elsevier, Nova Iorque, 563-681 (1981). 0 termo "anticorpo monoclonal", tal como aqui usado não se limita a anticorpos produzidos através de tecnologia de hibridoma. 0 termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo que é derivado a partir de um único clone, incluindo qualquer clone eucariota, procariota, ou de fago, e não o método pelo qual foi produzido. Assim, o termo "anticorpo monoclonal", não se limita a anticorpos produzidos através de tecnologia de hibridoma. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando ratinhos "knockout" Sp35 para aumentar as regiões de reconhecimento do epitopo. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando uma ampla variedade de técnicas conhecidas na técnica, incluindo a utilização de tecnologia de hibridoma, recombinante e de apresentação de fagos, tal como aqui descrito noutro local.
Utilizando protocolos reconhecidos na técnica, num exemplo, os anticorpos são estimulados em mamíferos através de múltiplas injecções subcutâneas ou intraperitoneais do antigénio relevante (por exemplo, antigénios associados a tumores purificado, tais como Sp35 ou células ou extractos celulares que compreendem tais antigénios) e um adjuvante. Esta imunização tipicamente provoca uma resposta imune que compreende a produção de anticorpos reactivos para o antigénio de esplenócitos ou linfócitos activados. Enquanto os anticorpos resultantes podem ser recolhidos do soro do animal para proporcionar preparações policlonais, é muitas vezes desejável isolar linfócitos individuais do baço, nódulos linfáticos ou do sangue periférico para proporcionar preparações homogéneas de anticorpos monoclonais (MAbs). 69
Preferencialmente, os linfócitos são obtidos a partir do baço.
Neste processo bem conhecido (Kohler et al., Nature 256: 495 (1975)), os linfócitos de vida relativamente curta, ou mortais, de um mamífero que tenha sido injectado com antigénio são fundidos com uma linha celular tumoral imortal (por exemplo, uma linha celular de mieloma), assim, a produção de células híbridas ou "hibridomas", que são ambos imortais e capazes de produzir o anticorpo codificado geneticamente da célula B. Os híbridos resultantes são segregados em estirpes genéticas simples por selecção, diluição e novo crescimento com cada uma das estirpes individuais compreendendo genes específicos para a formação de um único anticorpo. Produzem anticorpos que são homogéneos contra um antigénio desejado e, em referência à sua ascendência genética pura, são chamados de "monoclonal".
As células de hibridoma assim preparadas são inoculadas e crescidas num meio de cultura adequado que preferivelmente contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células de mieloma parentais não fundidas. Os peritos na técnica apreciarão que os reagentes, as linhas celulares e os meios para a formação, a selecção e o crescimento de hibridomas estão disponíveis comercialmente a partir de um número de fontes e protocolos padronizados estão bem estabelecidos. Geralmente, o meio de cultura no qual as células de hibridoma estão a crescer é ensaiado relativamente à produção de anticorpos monoclonais contra o antigénio desejado. De preferência, a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinada por ensaios in vitro, tais como a imunoprecipitação, o radioimunoensaio (RIA) ou ensaio de imunossorçao associado a enzima (ELISA) Depois de 70 identificadas as células de hibridoma que produzem anticorpos com a especificidade, afinidade e/ou actividade desejadas, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição limitante e crescidos por métodos convencionais (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, pp 59-103 (1986)). Será ainda apreciado que os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones podem ser separados do meio de cultura, fluido de ascites ou soro por procedimentos convencionais de purificação, tais como, por exemplo, a proteína A, cromatografia de hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade. Fragmentos de anticorpos que reconhecem epitopos específicos podem ser gerados por técnicas conhecidas. Por exemplo, fragmentos de Fab e F(ab')2 podem ser produzidos por clivagem proteolítica de moléculas de imunoglobulina, utilizando enzimas tais como papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F(afc>')2)· Os fragmentos F(ab')2 contêm a região variável, região constante da cadeia leve e do domínio CH1 da cadeia pesada.
Os especialistas na técnica também apreciarão que os ADN que codificam para anticorpos ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, locais de ligação ao antigénio) podem também ser derivados de bibliotecas de anticorpos, tais como bibliotecas de apresentação de fagos. Em particular, tal fago pode ser utilizado para visualizar os domínios de ligação ao antigénio, expressos a partir de um repertório ou uma biblioteca combinatória de anticorpos (por exemplo, humano ou murino). O fago que expressa um domínio de ligação ao antigénio que se liga ao antigénio de interesse pode ser seleccionado ou identificado com antigénio, por exemplo, utilizando o antigénio ou antigénio marcado ligado ou capturado numa superfície sólida ou esfera. Os fagos utilizados nestes métodos são tipicamente fagos filamentosos 71 incluindo domínios de ligação fd e M13 expressos do fago com Fab, Fv OE DAB (região Fv individual de cadeias leves ou pesadas) ou domínios anticorpo de anticorpo Fv estabilizados com dissulfureto fundidos com ou a proteína do gene III ou do gene VIII do fago. Exemplos de métodos estão apresentados, por exemplo, na EP 368 684 Bl; Patente E.U.A. 5,969,108, Hoogenboom, HR e Chames, Immunol. Today 21: 371 (2000); Nagy et al. Nat. Med. 8 : 801 (2002); Huie et al., Proc. Natl Acad. Sic. USA 98: 2682 (2001); Lui et al., J. Mol Biol., 315: 1063 (2002). Várias publicações (por exemplo, Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)) descreveram a produção de anticorpos humanos de elevada afinidade por recombinação homóloga na cadeia, assim como infecção combinatória e recombinação in vivo como estratégia para a construção de grandes bibliotecas de fagos. Noutro exemplo, pode-se usar uma apresentação ribossomal para substituir o bacteriófago como plataforma de apresentação (ver, por exemplo, Hanes et al., Nat. Biotechnol. 18: 1287 (2000); Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98: 3750 (2001); ou Irving et al., J. Immunol. Methods 248: 31 (2001)). Ainda noutro exemplo, bibliotecas de superfície celular podem ser rastreados para anticorpos (Boder et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97: 10701 (2000); Daugherty et al., J. Immunol. Methods 243: 211 (2000)). Tais procedimentos proporcionam alternativas às técnicas tradicionais de hibridoma para o isolamento e clonagem subsequente de anticorpos monoclonais.
Em métodos de apresentação de fagos, os domínios de anticorpo funcionais são apresentados à superfície de partículas de fago que transportam as sequências de polinucleótidos que os codificam. Por exemplo, as sequências de ADN que codificam para as regiões VH e VL são amplificadas a partir de bibliotecas de cADN de origem animal (por exemplo, bibliotecas de cADN humano ou murino de tecidos linfóides) ou 72 bibliotecas de cADN sintético. Em certos exemplos, os ADN que codificam para regiões VH e VL estão ligados um ao outro por um ligante scFv por PCR e clonados num vector de fagemideo (por exemplo, pCANTAB 6 ou pComb 3 HSS). 0 vector é electroporado em E. coli e a E. coli é infectada com o fago auxiliar. Os fagos utilizados nestes métodos são tipicamente fagos filamentosos incluindo fd e M13 e as regiões VH ou VL são normalmente fundidas de forma recombinante, quer ao gene III ou ao gene VIII do fago. 0 fago que expressa um domínio de ligação ao antigénio que se liga a um antigénio de interesse (ou seja, um polipéptido Sp35 ou um seu fragmento) pode ser seleccionado ou identificado com o antigénio, por exemplo, utilizando o antigénio marcado ou o antigénio ligado ou capturado numa superfície sólida ou esfera.
Exemplos adicionais de métodos de apresentação de fagos que podem ser usados para preparar os anticorpos incluem aqueles divulgados em Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182: 41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184: 177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24: 952-958 (1994); Persic et al., Gene 187: 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57: 191-280 (1994); Pedido PCT No. PCT/GB91/01134; publicações PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e Pat. E.U.A. Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5, 427, 908; 5, 516,637; 5, 780,225; 5, 658, 727; 5, 733, 743 e 5,969,108.
Tal como descrito nas referências acima, após a selecção de fagos, as regiões que codificam para o anticorpo do fago podem ser isoladas e utilizadas para gerar anticorpos completos, incluindo anticorpos humanos, ou qualquer outro fragmento de ligação ao antigénio desejado, e expressas em 73 qualquer hospedeiro desejado, incluindo células de mamífero, células de insecto, células de planta, leveduras e bactérias. Por exemplo, as técnicas para produzir de modo recombinante fragmentos Fab, Fab' e F(ab')2 podem também ser empregues utilizando modos conhecidos na técnica, tais como os divulgados na publicação PCT WO 92/22324; Mullinax et ai., BioTechniques 12(6): 864-869 (1992); e Sawai et ai., AJRI 34: 26-34 (1995); e Better et ai., Science 240: 1041-1043 (1988).
Exemplos de técnicas que podem ser utilizadas para produzir Fvs de cadeia simples e anticorpos incluem aquelas descritas nas Patentes E.U.A. Nos. 4,946,778 e 5,258,498; Huston et ai., Methods in Enzymology 203: 46-88 (1991); Shu et ai., PNAS 90: 7995-7999 (1993); e Skerra et ai., Science 240: 1038-1040 (1988). Para algumas utilizações, incluindo a utilização in vivo de anticorpos em seres humanos e em ensaios de detecção in vitro, pode ser preferível utilizar anticorpos quiméricos, humanizados ou humanos. Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual diferentes porções do anticorpo são derivadas de diferentes espécies animais, tais como anticorpos que possuem uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal murino e uma região constante de imunoglobulina humana. Os métodos para produzir os anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Morrison, Science 229: 1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4: 214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125: 191-202 (1989); Pat. E.U.A. Nos. 5, 807, 715; 4, 816,567; e 4,816397. Os anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo derivadas de um anticorpo de espécie não humana que se ligam ao antigénio desejado possuindo uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da espécie não humana e regiões estruturais de uma molécula de imunoglobulina humana. Muitas vezes, os resíduos estruturais das regiões estruturais humanas serão substituídos pelo 74 resíduo correspondente do anticorpo dador de CDR para alterar, preferencialmente melhorar, a ligação ao antigénio. Estas substituições estruturais são identificadas por métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, através de modelação das interacções entre a CDR e resíduos estruturais para identificar os resíduos importantes estruturais para a ligação ao antigénio e pela comparação de sequências para identificar os resíduos estruturais incomuns em posições particulares. (Ver, por exemplo, Queen et al., Pat. E.U.A. No. 5, 585, 089; Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988)).
Anticorpos podem ser humanizados usando uma variedade de técnicas conhecidas na técnica incluindo, por exemplo, enxerto de CDR (EP 239,400; publicação PCT WO 91/09967; Pats. E.U.A. Nos. 5,225,539; 5,530,101; e 5,585,089), revestimentos ou alterações à superfície (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6): 805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91: 969-973 (1994)), e recombinação homóloga na cadeia (Pat. E.U.A. No. 5,565,332.
Os anticorpos completamente humanos são particularmente desejáveis para o tratamento terapêutico de pacientes humanos. Os anticorpos humanos podem ser preparados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindo métodos de apresentação de fagos descritas acima utilizando bibliotecas de anticorpos derivados a partir de sequências de imunoglobulina humana. Ver também, Patentes dos EUA. Nos. 4,444,887 e 4,716,111; e publicações PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, e WO 91/10741.
Os anticorpos humanos também podem ser produzidos utilizando ratinhos transgénicos que são incapazes de expressar imunoglobulinas endógenas funcionais, mas que podem expressar 75 genes de imunoglobulina humana. Por exemplo, os complexos de genes de imunoglobulina humana de cadeia pesada e leve podem ser introduzidos aleatoriamente ou por recombinação homóloga em células estaminais embrionárias de ratinho. Em alternativa, a região variável humana, a região constante e a região de diversidade podem ser introduzidas em células estaminais embrionárias de ratinho, para além dos genes de cadeia pesada e leve humanas. Os genes das cadeia pesada e leve da imunoglobulina de ratinho podem ser tornados não funcionais separadamente ou simultaneamente com a introdução de loci de imunoglobulina humana, por recombinação homóloga. Em particular, a deleção homozigótica da região JH impede a produção de anticorpos endógenos. As células estaminais embrionárias modificadas são expandidas e microinjectadas em blastocistos para produzir ratinhos quiméricos. Os ratinhos quiméricos são então criados para produzir uma prole homozigótica que expressa anticorpos humanos. Os ratinhos transgénicos são imunizados da forma normal com um antigénio seleccionado, por exemplo, a totalidade ou uma parte de um polipéptido alvo desejado. Os anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio podem ser obtidos a partir dos ratinhos transgénicos imunizados, utilizando tecnologia de hibridoma convencional. Os transgenes de imunoglobulina humana nos ratinhos transgénicos rearranjam-se durante a diferenciação de células-B, e subsequentemente sofrem troca de classe e de mutação somática. Assim, utilizando uma tal técnica, é possível produzir anticorpos IgG, IgA, IgM e IgE terapeuticamente úteis. Para uma visão geral desta tecnologia para a produção de anticorpos humanos, ver Lonberg e Huszar Int. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995). Para uma discussão detalhada desta tecnologia para produzir anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos e protocolos para produzir tais anticorpos, ver, por exemplo, as publicações PCT WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; Patente dos E.U.A. Nos. 76 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; e 5,939,598. Além disso, empresas como a Abgenix, inc. (Freemont, CA) e Genpharm (San José, CA) pode ser envolvidas para proporcionar anticorpos humanos dirigidos contra um antigénio seleccionado utilizando tecnologia semelhante à descrita acima. 5,625,126; 5,633,425; 5,5 6 9, 82 5;
Os anticorpos completamente humanos que reconhecem um epitopo seleccionado podem ser gerados utilizando uma técnica conhecida como "selecção guiada". Nesta abordagem um anticorpo monoclonal não humano seleccionado, por exemplo, um anticorpo de rato, é utilizado para orientar a selecção de um anticorpo completamente humano reconhecendo o mesmo epitopo. (Jespers et al., Bio/Technology 12: 899-903 (1988). Ver também, Patente E.U.A. No. 5,565,332).
Além disso, os anticorpos dirigidos para os polipéptidos alvo da divulgação podem, por sua vez, ser utilizados para gerar anticorpos anti-idiotipo que "mimetizam" polipéptidos alvo utilizando técnicas bem conhecidas dos peritos na técnica. (Ver, por exemplo, Greenspan e Bona, FASEB J. 7(5): 437-444 (1989) e Nissinoff, J. Immunol. 147(8): 2429-2438 (1991)). Por exemplo, os anticorpos que se ligam a e inibem competitivamente a formação de multimeros do polipéptido e/ou a ligação de um polipéptido da divulgação a um ligando pode ser utilizada para gerar anti-idiotipos que "mimetizam" a formação de multimeros do polipéptido e/ou do domínio de ligação e, por consequência, ligar-se ao e neutralizar o polipéptido e/ou o seu ligando. Tais fragmentos neutralizantes anti-idiotipos ou Fab de tais anti-idiotipos podem ser utilizados em regimes terapêuticos para neutralizar o ligando polipeptídico. Por exemplo, tais anticorpos anti-idiotípicos podem ser utilizados para ligar um polipéptido 77 alvo desejado e/ou para se ligar os seus ligandos/receptores e assim bloquear a sua actividade biológica.
Noutro exemplo, o ADN que codifica para os anticorpos monoclonais desejados pode ser facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, utilizando de sondas de oligonucleótidos que são capazes de se ligarem especificamente a genes que codificam para as cadeias pesada e leve de anticorpos murinos). As células de hibridoma isoladas e subclonadas servem como uma fonte preferida de tal ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado em vectores de expressão, que são então transfectados para células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, tais como células de E. coli, células COS de simio, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que de outro modo não produzem imunoglobulinas. Mais particularmente, o ADN isolado (que pode ser sintético, tal como aqui descrito) pode ser utilizado para clonar as sequências de regiões constantes e variável para o fabrico de anticorpos, tal como descrito em Newman et al. , Patente dos E.U.A. No. 5,658,570, depositada em 25 de Janeiro de 1995. Essencialmente, isto envolve a extracção de ARN das células seleccionadas, a conversão em cADN e amplificação por PCR utilizando iniciadores específicos para Ig. Iniciadores adequados para este fim estão também descritos na Patente dos E.U.A. No. 5,658,570. Como será discutido em mais detalhe abaixo, as células transformadas que expressam o anticorpo desejado podem ser crescidas em quantidades relativamente grandes para proporcionar fontes clínicas e comerciais da imunoglobulina.
Num exemplo, um anticorpo Sp35 da divulgação compreende pelo menos uma cadeia pesada ou leve CDR de uma molécula de anticorpo. Noutro exemplo, um anticorpo Sp35 da divulgação 78 compreende pelo menos duas CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Noutro exemplo, um anticorpo Sp35 da divulgação compreende, pelo menos, três CDR de uma ou mais moléculas de anticorpo. Noutro exemplo, um anticorpo SP35 da divulgação compreende pelo menos quatro CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Noutro exemplo, um anticorpo SP35 da divulgação compreende, pelo menos, cinco CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Noutro exemplo, um anticorpo SP35 da divulgação compreende, pelo menos, seis CDR de uma ou mais moléculas de anticorpo. Exemplos de moléculas de anticorpo que compreendem pelo menos uma CDR que podem ser incluídos nos anticorpos Sp35 em questão são descritas aqui.
Num exemplo específico, a sequência de aminoácidos dos domínios variáveis de cadeia pesada e/ou leve pode ser inspeccionada para identificar as sequências de regiões determinantes de complementaridade (CDRs) através de métodos que são bem conhecidos na técnica, por exemplo, através da comparação com sequências de aminoácidos conhecidas de outras regiões variáveis da cadeia pesada e leve para determinar as regiões de hipervariabilidade de sequência. Usando técnicas de ADN recombinante de rotina, uma ou mais das CDRs podem ser inseridos dentro de regiões estruturais, por exemplo, em regiões estruturais humanas para humanizar um anticorpo não-humano. As regiões estruturais podem ser de ocorrência natural ou regiões estruturais de consenso e, de preferência, regiões estruturais humanas (ver, por exemplo, Chothia et al. , J. Mol. Biol. 278: 457-479 (1998) para uma lista de regiões estruturais humanas). De preferência, o polinucleótido gerado pela combinação das regiões estruturais e CDRs codifica para um anticorpo que se liga especificamente a, pelo menos, um epitopo de um polipéptido desejado, por exemplo, Sp35. De preferência, uma ou mais substituições de aminoácidos podem ser feitas dentro das regiões estruturais, 79 e, de preferência, as substituições de aminoácidos melhoram a ligação do anticorpo ao seu antigénio. Além disso, tais métodos podem ser usados para fazer as substituições ou deleções de aminoácidos de um ou mais resíduos de cisteína da região variável que participam num ligação dissulfureto intra-cadeia para gerar moléculas de anticorpo que carecem de uma ou mais ligações dissulfureto intra-cadeia. Outras alterações no polinucleótido são englobadas pela divulgação e estão no âmbito da perícia na técnica.
Além disso, as técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos" (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 81: 851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314: 452-454 (1985)) por "splicing" dos genes de uma molécula de anticorpo de ratinho de especificidade apropriada para o antigénio, em conjunto com genes de uma molécula de anticorpo humano de actividade biológica apropriada podem ser utilizadas. Como aqui utilizado, um anticorpo quimérico é uma molécula na qual porções diferentes são derivadas de diferentes espécies animais, tais como aqueles que têm uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal murino e uma região constante de imunoglobulina humana, por exemplo, anticorpos humanizados.
Alternativamente, as técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única (Patente dos E.U.A. No. 4,694,778; Bird, Science 242: 423-442 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883 (1988); e Ward et al., Nature 334: 544-554 (1989)) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia simples. Os anticorpos de cadeia simples são formados através da ligação dos fragmentos da região Fv de cadeia pesada e leve através de uma ponte de aminoácidos, resultando num anticorpo de cadeia simples. As técnicas para 80 a montagem de fragmentos Fv funcionais em E. coli podem também ser utilizadas (Skerra et al.r Science 242: 1038-1041 (1988)).
Ainda outros exemplos da divulgação compreendem a geração de anticorpos humanos ou substancialmente humanos em animais transgénicos (por exemplo, ratinhos) que são incapazes de produção de imunoglobulina endógena (ver por exemplo, Patente dos E.U.A. Nos. 6,075,181, 5,939,598, 5,591,669 e 5,589,369 cada uma das quais é aqui incorporada por referência) . Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica da região de união da cadeia pesada do anticorpo em ratinhos quiméricos e de mutantes na linha germinal ratinhos resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência de um conjunto de genes de imunoglobulina humana para os ratinhos mutantes na linha germinal humana irá resultar na produção de anticorpos humanos após estimulo com o antigénio. Outro meio preferido para a produção de anticorpos humanos utilizando ratinhos SCID é divulgado na Patente dos E.U.A. No. 5,811,524. Será apreciado que o material genético associado a estes anticorpos humanos podem também ser isolado e manipulado, tal como aqui descrito.
Ainda outro método altamente eficiente para a produção de anticorpos recombinantes é descrito por Newman, Biotechnology 10: 1455-1460 (1992). Especificamente, esta técnica resulta na geração de anticorpos primatizados que contêm domínios variáveis de macaco e sequências humanas constantes. Além disso, esta técnica é também descrita nas Patente dos E.U.A. atribuídas em conjunto Nos. 5,658,570, 5,693,780 e 5,756,096.
Noutro exemplo, os linfócitos podem ser seleccionados por micromanipulação e os genes variáveis isolados. Por exemplo, as células mononucleares do sangue periférico podem ser 81 isoladas a partir de um mamífero imunizado e cultivadas durante cerca de 7 dias in vitro. As culturas podem ser rastreadas para IgG específicos que cumpram com os critérios de selecção. As células de poços positivos podem ser isoladas. As células B produtoras de Ig individuais podem ser isoladas por FACS ou através da sua identificação num ensaio de placa hemolítico mediado pelo complemento. As células B produtoras de Ig pode ser micromanipuladas num tubo e os genes VH e VL podem ser amplificados utilizando, por exemplo, RT-PCR. Os genes VH e VL podem ser clonados num vector de expressão de anticorpos e transfectado para células (por exemplo, células eucarióticas ou procarióticas) para a expressão.
Alternativamente, as linhas celulares produtoras de anticorpos podem ser seleccionadas e cultivadas utilizando técnicas bem conhecidas pelos especialistas na técnica. Tais técnicas são descritas em diversos manuais de laboratório e publicações principais. A este respeito, técnicas adequadas para utilização na divulgação tal como descrita abaixo são descritas em Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates e Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, Nova Iorque (1991) .
Anticorpos para utilização nos métodos de diagnóstico e terapêuticos aqui descritos podem ser produzidos por qualquer método conhecido na técnica para a síntese de anticorpos, em particular, por síntese química ou, de preferência, por técnicas de expressão recombinante, conforme aqui descrito.
Num exemplo, um anticorpo Sp35, ou seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado da divulgação compreende uma região constante de síntese em que um ou mais domínios são parcialmente ou completamente suprimidos ("anticorpos com 82 domínios suprimidos"). Em certos exemplos anticorpos modificados compatíveis compreendem construções ou variantes de domínio suprimido em que a totalidade do domínio Ch2 foi removida (construções ACh2) . Para outros exemplos de um péptido curto de ligação pode substituir o domínio suprimido para proporcionar flexibilidade e liberdade de movimento para a região variável. Os peritos na técnica irão apreciar que tais construções são particularmente preferidas devido às propriedades reguladoras do domínio CH2 da taxa catabólica do anticorpo. Construções com domínios suprimidos podem ser obtidos utilizando um vector (por exemplo, da Biogen IDEC Incorporated) que codifica para um domínio constante de IgGi humana (ver, por exemplo, WO 02/060955 A2 e WO02/096948A2. Esse vector exemplo foi desenhado para eliminar o domínio CH2 e fornecer um vector sintético que expressa uma região constante de IgGi com supressão de domínio.
Nalguns exemplos, anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação são "minibodies". "Minibodies" podem ser preparados utilizando métodos descritos na técnica (ver, por exemplo, Patente dos E.U.A. 5,837,821 ou WO 94/09817A1).
Num exemplo, um anticorpo Sp35, ou seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado da divulgação compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina com deleção ou substituição de alguns ou mesmo de um único aminoácido desde que permita a associação entre as subunidades monoméricas. Por exemplo, a mutação de um único aminoácido em áreas seleccionadas do domínio CH2 pode ser suficiente para reduzir substancialmente a ligação de Fc e assim aumentar a localização tumoral. Do mesmo modo, pode ser desejável simplesmente excluir aquela parte de um ou mais domínios de região constante que controlam a função efectora (por 83 exemplo, ligação ao complemento) a ser modulada. Tais deleções parciais das regiões constantes podem melhorar as características seleccionadas do anticorpo (soro de meia-vida), enquanto deixam intactas as outras funções desejáveis associadas ao domínio da região constante. Além disso, como mencionado acima, as regiões constantes dos anticorpos divulgados podem ser sintéticas através da mutação ou substituição de um ou mais aminoácidos que melhoram o perfil da construção resultante. A este respeito, pode ser possível afectar a actividade proporcionada por um local de ligação conservado (por exemplo, ligação a Fc), mantendo substancialmente o perfil de configuração e imunogénico do anticorpo modificado. Ainda outros exemplos compreendem a adição de um ou mais aminoácidos para a região constante para melhorar as características desejáveis, tais como a função efectora ou proporcionar uma maior ligação a citotoxina ou a hidrato de carbono. Em tais exemplos, pode ser desejável inserir ou replicar sequências específicas derivadas de domínios de regiões constantes seleccionados. A presente divulgação também proporciona anticorpos que compreendem, consistem essencialmente em, ou consistir em, variantes (incluindo derivados) de moléculas de anticorpo (por exemplo, as regiões VH e/ou regiões VL) aqui descritas, cujos seus anticorpos ou fragmentos se ligam de forma imunoespecífica a um polipéptido Sp35 ou seu fragmento ou variante. Técnicas convencionais conhecidas pelos peritos na técnica podem ser usadas para introduzir mutações na sequência de nucleótidos que codifica para um anticorpo Sp35, incluindo, mas não se limitando a, mutagénese dirigida e mutagénese mediada por PCR, que resultam em substituições de aminoácidos. De preferência, as variantes (incluindo derivados) codificam para menos de 50 substituições de aminoácidos, substituições de menos de 40 aminoácidos, 84 substituições de menos de 30 aminoácidos, substituições de menos de 25 aminoácidos, substituições de menos de 20 aminoácidos, substituições de menos de 15 aminoácidos, substituições de menos de 10 aminoácidos, substituições de menos de 5 aminoácidos, substituições de menos de 4 aminoácidos, substituições de menos de 3 aminoácidos, substituições de menos de 2 aminoácidos em relação à região de referência VH, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, região VL, VLCDR1, VlCDR2, ou VlCDR3. Uma "substituição de aminoácidos conservativa" é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral com uma carga semelhante. As famílias de resíduos de aminoácidos possuindo cadeias laterais com cargas semelhantes foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina , cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramifiçadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Alternativamente, as mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo da totalidade ou de parte da sequência codificante, tal como por mutagénese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser rastreados relativamente à actividade biológica para identificar mutantes que retêm a actividade (por exemplo, a capacidade para ligar um polipéptido Sp35).
Por exemplo, é possível introduzir mutações apenas em regiões estruturais ou apenas nas regiões CDR de uma molécula de 85 anticorpo. Mutações introduzidas podem ser mutações silenciosas ou "missense" neutras, ou seja, não têm nenhum ou pouco efeito sobre a capacidade de um anticorpo se ligar ao antigénio. Estes tipos de mutações podem ser úteis para optimizar a utilização de codões, ou melhorar a produção de um anticorpo de hibridoma. Alternativamente, as mutações "missense" não neutras podem alterar a capacidade do anticorpo se ligar ao antigénio. É provável que a localização da maioria das mutações silenciosas e "missense" neutras se situe nas regiões estruturais, enquanto que é provável que a localização da maioria das mutações "missense" não neutras se situe na CDR, embora isso não seja um requisito absoluto. Um perito na técnica seria capaz de conceber e testar as moléculas mutantes com as propriedades desejadas, tais como nenhuma alteração na actividade de ligação ao antigénio ou alteração na actividade de ligação (por exemplo, melhorias na actividade de ligação ao antigénio ou alteração da especificidade do anticorpo). Após mutagénese, a proteína codificada pode ser rotineiramente expressa e a actividade funcional e/ou biológica da proteína codificada (por exemplo, capacidade para se ligar imunoespecificamente a pelo menos um epitopo de um polipéptido Sp35) pode ser determinada utilizando técnicas aqui descritas ou por modificação rotineira de técnicas conhecidas na técnica. IV. POLINUCLEÓTIDOS QUE CODIFICAM PARA ANTICORPOS Sp35 A presente divulgação também proporciona moléculas de ácido nucleico que codificam para anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação.
Num exemplo, a presente divulgação proporciona um polinucleótido isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo num ácido nucleico que 86 codifica para uma região variável da imunoglobulina de cadeia pesada (VH) , em que pelo menos uma das CDR da região variável da cadeia pesada ou pelo menos duas das CDRs da região variável da cadeia pesada são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às sequências de aminoácidos CDR1, CDR2 ou CDR3 da cadeia pesada de referência de anticorpos Sp35 monoclonais aqui divulgados. Alternativamente, as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 da VH são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às sequências de aminoácidos CDR1, CDR2 ou CDR3 da cadeia pesada de referência dos anticorpos Sp35 monoclonais aqui divulgados. Assim, de acordo com este exemplo uma região da cadeia pesada variável da divulgação tem sequências polipeptidicas CDR1, CDR2 ou CDR3 relacionadas com as sequências polipeptídicas apresentadas na Tabela 4: 87 TABELA 4: Sequências de aminoácidos CDR1, CDR2, e CDR3 VH de referência * 8 8
Noie do anticorpo VH-CDRl VH-CDR2 VH-CDR3 LilO P=TYPMV (SEQ ID NO: 6) P=WIGPSGGVTAYADSVKG (SEQ ID NO: 8) P=PYSSGWWDFDL (SEQ ID NO: 10) MCTTACCCTATGGTT (SEQ ID NO: 5) N=TGGATCGGTCCTTCT GGTGGCGTTACTGCTTA TGCTGACTCCGTTAAAGGT (SEQ ID NO: 7) N=CCCTATAGCAGTGGCT GGTGGGACTTCGATCTC (SEQ ID NO: 9) Li07 P=MYFMG (SEQ ID NO: 12) P=SISPSGGFTSYADSVKG (SEQ ID NO: 14) P=DRHAFDI (SEQ ID NO: 16) MTGTACIIIATGGGI (SEQ ID NO: 11) N=TCTATCTCTCCTTCTGGTGGCTTTAC TTCTTATGCTGACTCCGTTAAAGGT (SEQ ID NO: 13) N=GATCGGCATGCTTTTGATATC (SEQ ID NO: 15) Li05 P=AYAMG (SEQ ID NO: 18) P=SIVSSGGYTDYADSVKG (SEQ ID NO: 20) P=EGDHNAFDI (SEQ ID NO: 22) N=CTTACGCTATGGGT (SEQ ID NO: 17) N=TCTATCGTTTCTTCTGGTGGCT ATACTGATTATGCTGACTCCGTTAAAGGT (SEQ ID NO: 19) N=GAGGGT GACC AT AATGC T T T T GATATC (SEQ ID NO: 21) Lill P=SYAMY (SEQ ID NO: 24) P=SIS T S GGYTGYAD SVKG (SEQ ID NO: 26) P=DTSDNDYYYMDV (SEQ ID NO: 28) MCTTACGCIAIGIAI (SEQ ID NO: 23) MCTATCTCTACTTCTGGIGGCIA TACTGGTTATGCTGACTCCGTTAAAGGT (SEQ ID NO: 25) N=GATACCAGCGATAATGAC TACTACTACATGGACGTC (SEQ ID NO: 27) LiOl P=KYQMT (SEQ ID NO: 30) P=SIYP S GGNTVYAD SVKG (SEQ ID NO: 32) P=GTTEAVFDY (SEQ ID NO: 34) 6 8
Nome do anticorpo VH-CDRl VH-CDR2 VH-CDR3 N==MGT AC C AGAT GAC T (SEQ ID NO: 29) N=TCTATCTATCCTTCTGGTGGCAA TACTGTTTATGCTGACTCCGIIAAAGGI (SEQ ID NO: 31) N=GGGACT ACAGAGGCAGT C T T TGACTAC (SEQ ID NO: 33) Lil2 P=QYNMF (SEQ ID NO: 30) P=RIS S S GGMTMYAD SVKG (SEQ ID NO: 38) P=EALRPY C S GGS CYS DYYYYGMDV (SEQ ID NO: 40) N= CAGTACMIAIGITI (SEQ ID NO: 35) N= CGTATCTCTTCTTCTGGIGGCAI GACTATGTATGCTGACTCCGTTAAAGGT (SEQ ID NO: 37) N= GAAGCGTTACGGCCTTAIIG TAGTGGTGGTAGCTGCTACICCG ACTACTACTACTACGGTAIGGAC GTC (SEQ ID NO: 39) LÍ06 P-EYPMD (SEQ ID NO: 42) P-SIYSSGGSTVYADSIKG (SEQ ID NO: 44) P-EGDSDAFDI (SEQ ID NO: 46) N=GAGTACCCTATGGAT (SEQ ID NO: 41) MCTATCTATTCTTCTGGIGGCIC TACTGTTTATGCTGACTCCATTAAAGGT (SEQ ID NO: 43) N=GAGGGTGACTCTGATGCTTTT GATATC (SEQ ID NO: 45) Li08 P=HYEMV (SEQ ID NO: 48) P=SIRSSGGATKYADSVKG (SEQ ID NO: 50) P=ESPDDYFDY (SEQ ID NO: 52 N= CATTACGAGAIGGII (SEQ ID NO: 47) N= TCTATCCGTTCTTCTGGIGGCGCIAC TAAGTATGCTGACTCCGTIAAAGGI (SEQ ID NO: 49) N= GAGTCGCCAGACGACTACIII GACTAC (SEQ ID NO: 51) Li03 P=QYPME (SEQ ID NO: 54) P=GIYPSGGSTVYADSVKG (SEQ ID NO: 56) P=AGQWLGDFDY (SEQ ID NO: 58) N=CAGTACCCTATGGAG (SEQ ID NO: 53) N=GGTATCTATCCTTCTGGTGGCTCTA CTGTTTATGCTGACTCCGTIAAAGGI (SEQ ID NO: 55) N=GCGGGGCAGTGGCTGGGGGAC TTTGACTAC (SEQ ID NO: 57) Ο 6
Nome do anticorpo VH-CDRl VH-CDR2 VH-CDR3 Li09 P=MYSMV (SEQ ID NO: 60) P=YISPSGGKTMYADSVKG (SEQ ID NO: 62) P=D SRRRYYDFW S GYHNYYYYYMDV (SEQ ID NO: 64) MTGTACTCTATGGTT (SEQ ID NO: 59) MATATCTCTCCTTCTGGIGGCAAG ACTATGTATGCTGACTCCGTTAAAGGT (SEQ ID NO: 61) N=GATTCGAGACGCCGGTATTACGA TTTTTGGAGTGGTTATCACAACIACI ACTACTACTACATGGACGTC (SEQ ID NO: 63) Li04 P=RYNMG (SEQ ID NO: 66) P=VIYPSGGGTHYADSVKG (SEQ ID NO: 68) P=SIADDAFDI (SEQ ID NO: 70) N=CGTTACAATATGGGT (SEQ ID NO: 65) N=GTTATCTATCCTTCTGGIGGCGGI ACTCATTATGCTGACTCCGTTAAAGGT (SEQ ID NO: 67) N=TCTATAGCAGATGATGCITITGATATC (SEQ ID NO: 69) Li02 P=TYEMI (SEQ ID NO: 72) P=SIGP S GGLTWYAD SVKG (SEQ ID NO: 74) P=MYYCVRIDDSSGWAFDI (SEQ ID NO: 76) N=ACTTACGAGATGATT (SEQ ID NO: 71) N=TCTATCGGTCCTTCTGGTGGCC TTACTTGGTATGCTGACTCCGTTAAA (SEQ ID NO: 73) N=AT GTAT TACT GT GTAC GGAT T GATGA TAGTAGTGGTTGGGCTTTTGATATC (SEQ ID NO: 75) Lil3 P=HYEMY (SEQ ID NO: 389) P=RIVSSGGFTKYADSVKG (SEQ ID NO: 390) P=EGDNDAFDI (SEQ ID NO: 391) Li32 P=AYMMQ (SEQ ID NO: 395) P=SISP S GGNTKYAD SVKG (SEQ ID NO: 396) P=GDYGYWFDP (SEQ ID NO: 397) Li33 P=IYPMF (SEQ ID NO: 401) P=WIGPSGGITKYADSVKG (SEQ ID NO: 402) P=EGHNDWYFDL (SEQ ID NO: 403) Li34 P=NYEMY (SEQ ID NO: 407) P=GIYSSGGITVYADSVKG (SEQ ID NO: 408) P=AAILDWYFDL (SEQ ID NO: 409) 1A47 P=NYGMN (SEQ ID NO: 77) P=WINTDTGEPTYTEDFQG (SEQ ID NO: 78) P=EGVHFDY (SEQ ID NO: 79) 2F3 P=FSDAWLD (SEQ ID NO: 80) P=EIRSKANNHATNYAE SVKG (SEQ ID NO: 81) P=SFAY (SEQ ID NO: 82) Τ 6
Nome do anticorpo VH-CDRl VH-CDR2 VH-CDR3 3P1D10.2C3 e 3P1E11.3B7 P=SSWTQ (SEQ ID NO: 83) P4IYPGDGDTRYTQKFKG (SEQ ID NO: 84) P=HNSYGMDY (SEQ ID NO: 85) Lia.01 P4YSFTNYIIG (SEQ ID NO: 195) P4IDPDDSYTTYSPSFQG (SEQ ID NO: 196) P-AEFYWGAYDG (SEQ ID NO: 197) Lia.02 P=GGSIRGNYWS (SEQ ID NO: 198) P=SINYS GFTNP S LKG (SEQ ID NO: 199) P=VRHWYFDV (SEQ ID NO: 200) Lia.03 P=GYTFNGFDMH (SEQ ID NO: 201) P=WIDPYNGSTTYAQKFQG (SEQ ID NO: 202) P=DFYMDGHYYIFDV (SEQ ID NO: 203) Lia.04 P=GYSFSNYYIH (SEQ ID NO: 204) P=IIDPGDSFTSYSPSFQG (SEQ ID NO: 205) P=DLAWIDYGFDY (SEQ ID NO: 206) Lia.05 P=GFTFTSHTVS (SEQ ID NO: 207) P=SITGNGSTTYYADSVKG (SEQ ID NO: 208) P=FYGDFDS (SEQ ID NO: 209) Lia.00 P=GFTFSSNWMS (SEQ ID NO: 210) P=TIFYSGSSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 211) P=DLPMKGFIQQRYGFDDV (SEQ ID NO: 212) Lia.07 P=GFTFSGYAIS (SEQ ID NO: 213) P=TIWGSGSTTYYADSVKG (SEQ ID NO: 214) P=EYWYYDQFTAV (SEQ ID NO: 215) Lia.08 P=GDSVSSNSMIS (SEQ ID NO: 210) P=RIYYRSKWYNDYAVSVKS (SEQ ID NO: 217) P=EVYSAGIMDY (SEQ ID NO: 218) Lia.09 P=GYSFTNHWIG (SEQ ID NO: 219) P=IIDPSDSDTNYSPSFQG (SEQ ID NO: 220) P=GFYGIADTFDV (SEQ ID NO: 221) Lia.10 P=GYSFTNYWIA (SEQ ID NO: 222) P=MIYPDDSNTNYSPSFQG (SEQ ID NO: 223) P=TNYLGFYDS (SEQ ID NO: 224) Lia.11 P=GFTFSDYGIS (SEQ ID NO: 225) P=NILYDGSETYYADSVKG (SEQ ID NO: 226) P=GYPTDDYSFDI (SEQ ID NO: 227) Lia.12 P=GDSVSDNSMIG (SEQ ID NO: 228) P=RIYYRSKWYNDYAVSVKS (SEQ ID NO: 229) P=GRHEYGGLGYAEAMDH (SEQ ID NO: 230) Lia.13 P=GFTFSSYAMS (SEQ ID NO: 231) P4ISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 232) P=HYTYMHFEDY (SEQ ID NO: 233) ♦Determinadas pelo sistema de Kabat (ver supra). N=sequência de nucleótido, P=sequência de polipéptido.
Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreendendo a VH codificada pelo polinucleótido liga-se preferencialmente ou especificamente a Sp35.
Noutro exemplo, a divulgação proporciona um polinucleótido isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste num ácido nucleico que codifica para uma região variável da imunoglobulina de cadeia pesada (VH) na qual as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 têm sequências de polipéptidos que sejam idênticas aos grupos CDR1, CDR2 e CDR3 apresentados na Tabela 4. Em certos exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreendendo a VH codificada pelo polinucleótido liga-se preferencialmente ou especificamente a Sp35.
Noutro exemplo, a divulgação proporciona um polinucleótido isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste num ácido nucleico que codifica para uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH) no qual as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 são codificadas por sequências de nucleótidos que são idênticas às sequências de nucleótidos que que codificam para os grupos CDR1, CDR2 e CDR3 apresentados na Tabela 4. Em certos exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreendendo a VH codificada pelo polinucleótido liga-se especificamente ou preferencialmente a Sp35.
Em certos exemplos, um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste numa VH codificada por um ou mais dos polinucleótidos acima descritos liga-se especificamente ou preferencialmente ao mesmo epitopo que o anticorpo monoclonal seleccionado do grupo que consiste em: 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 93 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (LiOl), 38-D01 (LÍ022), 35-E04 (LÍ033), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (LiO 7), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (LilO), 30-B01 (Lill), 34-B03 (Lil2), Lil3, Li32, Li33, Li34, 3383 (Lla.l), 3495(Lla.2), 3563 (Lia.3), 3564 (Lia.4), 3565 (Lia.5), 3566 (Lia.6), 3567 (Lia.7), 3568 (Lia.8), 3569 (Lia.9), 3570 (Lia.10), 3571 (Lia.11), 3582 (Lia.12), e 1968 (Lia.13), ou irá inibir competitivamente um tal anticorpo monoclonal de se ligar a Sp35.
Em certos exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio, compreendendo, consistindo essencialmente de, ou consiste numa VH codificado por um ou mais dos polinucleótidos acima descritos, ligando-se especificamente ou preferencialmente a um polipéptido Sp35 ou a um seu fragmento, ou um SP35 polipéptido variante, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (KD) não supe: r ic >r a 5 x 10" -2 M, CM 1 o \—1 M, 5 x 10 "3 M, co 1 O i—1 M, 5 X 10 ~4 M, V1 1 O \—1 M, 5 x 10“5 M, 10" '5 M, 5 x IO"6 M, 10"6 M, 5 x 10 -7 M, IO"7 M, 5 X 10 ~8 M, 10~8 M, 5x1 O"9 M, 10 -9 M, 5 x 10 -10 M, 10 -10 M, 5 O \—1 X -11 M, 10"11 M, 5 X 10~12 M, IO"12 M, 5 x CO t—1 1 O i—1 M, 10 -13 M, 5 x 10~14 M, 1 0“14 M, 5 X 10 -15 ou 10"15 M .
Noutro exemplo, o divulgação proporciona um polinucleótido isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo num ácido nucleico que codifica para uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL), onde pelo menos uma das CDRs da região variável da cadeia leve ou, pelo menos duas das CDRs da região variável da cadeia leve é pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica à sequência de aminoácidos CDR1, CDR2 ou CDR3 da cadeia leve de referência de anticorpos Sp35 monoclonais aqui divulgados. Alternativamente, as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 da VL são, pelo menos, 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às sequências de 94 aminoácidos CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de referência de anticorpos Sp35 monoclonais aqui divulgados. Assim, de acordo com este exemplo uma região variável de cadeia leve da CDR2 ou CDR3 apresentadas divulgação tem sequências polipeptidicas CDR1, relacionadas com as sequências de polipéptidos na Tabela 5: 95 TABELA 5: Sequências de aminoácidos CDR1, CDR2, e CDR3 VL de referência * 9 6
Nome do anticorpo VL-CDRl VL-CDR2 VL-CDR3 LilO P=RASQGIGNWLA (SEQ ID NO: 81) P=AASSLES (SEQ ID NO: 89) P=QQAQTFPLT (SEQ ID NO: 91) N=CGGGCGAGTCAGGG TATTGGCAACTGGTTAGCC (SEQ ID NO: 86) N=GCTGCATCCAGTTTGGAAAGT (SEQ ID NO: 88) N=CAACAGGCTCAGAC TTTCCCGCTCACC (SEQ ID NO: 90) Li07 P=SGDQLGDKHVA (SEQ ID NO: 93) P=LDIKRPA (SEQ ID NO: 95) P=QAWDIKTV (SEQ ID NO: 91) N=TCTGGAGATCAGTTG GGTGACAAACATGTGGCT (SEQ ID NO: 92) N=CT AGACAT TAAGAGGCCCGCA (SEQ ID NO: 94) N=CAGGCGIGGGACATC AAGACGGTC (SEQ ID NO: 96) Li05 P=GGDNIGSKSVH (SEQ ID NO: 99) P=DDYDRPS (SEQ ID NO: 101) P=QVRDSRTEERV (SEQ ID NO: 103) N=GGGGGAGACAACAT IGGAAGIAAGAGTGTCCAC (SEQ ID NO: 98) N=GATGATTATGACCGGCCCTCA (SEQ ID NO: 100) N=CAGGIGAGGGACAGCCG TACTGAGGAACGGGIG (SEQ ID NO: 102) Lill P=RASQEIANYLA (SEQ ID NO: 105) P=DTYTLQT (SEQ ID NO: 101) P=QQADIFPLS (SEQ ID NO: 109) N=CGGGCGAGTCAGGAG ATTGCCAACTACTTAGCC (SEQ ID NO: 104) N=GAT AC AT AC AC T T T GC AGAC T (SEQ ID NO: 106) N=CAACAGGC T GACATTTT CCCGCTC1CI (SEQ ID NO: 108) LiOl P=QASQDISNYLN (SEQ ID NO: 111) P=DASNLET (SEQ ID NO: 113) P=QQADRFPAVT (SEQ ID NO: 115) L· 6
Nome do anticorpo VL-CDR1 VL-CDR2 VL-CDR3 N=CAGGCGAGTCAGGA CATTAGCAACTATTTAMT (SEQ ID NO: 110) N=GAT GCAT CCAAT TT GGAAACA (SEQ ID NO: 112) N=CAACAGGCTGACAGGTTC CCTGCGGTCACT (SEQ ID NO: 114) Li06 P=RASQSISSWLA (SEQ ID NO: 117) P=AASSLRT (SEQ ID NO: 119) P=LQDYSYPLT (SEQ ID NO: 121) N=CGGGCCAGTCAGAGTA TTAGTAGCIGGIIGGCC (SEQ ID NO: 116) N=GCTGCATCCAGTTTACGAACT (SEQ ID NO: 118) N=CTACAAGATTACAGTTAC CCTCTCACT (SEQ ID NO: 120) LÍ08 P=QASQDISYYLN (SEQ ID NO: 123) P=DVSNLQT (SEQ ID NO: 125) P=QQSDNLPLT (SEQ ID NO: 127) N=CAGGCGAGICAGGAC AIIAGIIACTA111AAAT (SEQ ID NO: 122) N=GAIGIAICCAATTTGCAAACA (SEQ ID NO: 124) N=CAACAGTCTGATA ATCTCCCTC1CACT (SEQ ID NO: 126) LÍ03 P=RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 129) P=AASSLQS (SEQ ID NO: 131) P=QQSYSTPWT (SEQ ID NO: 133) N=GGGCAAGT CAGAGC ATTAGCAGCTATTTAAAT (SEQ ID NO: 128) N=GCTGCAT CCAGT TT GCAAAGT (SEQ ID NO: 130) KAACAGAGTTACA GTACCCCGTGGACG (SEQ ID NO: 132) Li09 P=RASQSIDTYLN (SEQ ID NO: 135) P=AASKLED (SEQ ID NO: 137) P=QQSYSPPLT (SEQ ID NO: 139) N=C GC GCMGT CAGAGC ATCGACACCTATTTAAAT (SEQ ID NO: 134) N=GCTGCAT CCAAGTT GGAAGAC (SEQ ID NO: 136) N=CAACAGAGTTACAG TCCCCCTCTCAC (SEQ ID NO: 138) Li02 P=SGDKLGDKFAS (SEQ ID NO: 141) P=QDRKRLS (SEQ ID NO: 143) P=QAWDTNTVV (SEQ ID NO: 145) 8 6
Nome do anticorpo VL-CDRl VL-CDR2 VL-CDR3 N=TCTGGAGATAAATTGG GGGATAAATTTGCTTCC (SEQ ID NO: 140) N=C AAGAT AGGAAGC GTCTCTCA (SEQ ID NO: 142) N=CAGGCGTGGGACA CCAACACTGTGGIC (SEQ ID NO: 144) LÍ13 P=RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 380) P=DASNRAT (SEQ ID NO: 387) P=QQRSNWPMYT (SEQ ID NO: 388) LÍ32 P=QASQDISYYLN (SEQ ID NO: 392) P=DAFILEG (SEQ ID NO: 393) P=QQSDQLPVT (SEQ ID NO: 394) LÍ33 P=RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 398) P=DASNRAT (SEQ ID NO: 399) P=QQYDKWPLT (SEQ ID NO: 400) Li34 P=HASQDISNYLS (SEQ ID NO: 404) P=DAFNLET (SEQ ID NO: 405) P=QHYDNLPFT (SEQ ID NO: 406) 1A47 P=SASSSVSYMH (SEQ ID NO: 140) P=DTSKLAS (SEQ ID NO: 147) P=QQWSSNPFT (SEQ ID NO: 148) 2F3 P=RASGNIYNYLA (SEQ ID NO: 149) P=NAKTLPD (SEQ ID NO: 150) P=QHFWAIPYT (SEQ ID NO: 151) 3P1D10.2C3 P=KSSQSLLNSGNQKNYLT (SEQ ID NO: 152) P=WASTRES (SEQ ID NO: 153) P=QNDYSYPLFT (SEQ ID NO: 154) 3P1E11.3B7 P=KSSQSLLNSGNQKSYLT (SEQ ID NO: 155) P=WASTRES (SEQ ID NO: 156) P=QNDYSYPLFT (SEQ ID NO: 157) Lia.01 P=SGDSLPSKFVH (SEQ ID NO: 234) P=RDNNRPS (SEQ ID NO: 235) P=SSYDALTD (SEQ ID NO: 236) Lia.02 P=RASQSIINSYLG (SEQ ID NO: 237) P=DASSRAI (SEQ ID NO: 238) P=QQASDAPE (SEQ ID NO: 239) Lia.03 P=RASQGINFWLN (SEQ ID NO: 240) P=AGSNLQS (SEQ ID NO: 241) P=MQDSDFPF (SEQ ID NO: 242) Lia.04 P=TGSSSNIGAGYDVS (SEQ ID NO: 243) P=RNNNRPS (SEQ ID NO: 244) P=QTYDNSTD (SEQ ID NO: 245) 6 6
Nome do anticorpo VL-CDRl VL-CDR2 VL-CDR3 Lia.05 P=SGDNIRSYYVH (SEQ ID NO: 246) P=EDSNRPS (SEQ ID NO: 247) P=QSYDSAILLH (SEQ ID NO: 248) Lia.06 P=RSSQSLVLRTGYTYLN (SEQ ID NO: 249) P=LVSNRAS (SEQ ID NO: 250) P=QQYYGMPL (SEQ ID NO: 251) Lia.07 P=RASQSVSYQYLA (SEQ ID NO: 252) P=GASSRAT (SEQ ID NO: 253) P=QQYGSVPR (SEQ ID NO: 254) Lia.00 P=SGDSLGSYYVH (SEQ ID NO: 255) P=DDNDRPS (SEQ ID NO: 256) P=SAYDYSART (SEQ ID NO: 257) Lia.09 P=SGDNLGSKYVS (SEQ ID NO: 258) P=DDDDRPS (SEQ ID NO: 259) P=SSYDFLNIGL (SEQ ID NO: 260) Lia.10 P=SGDSLGKKSVH (SEQ ID NO: 261) P=EDSERPS (SEQ ID NO: 262) P=SSYTNSVD (SEQ ID NO: 263) Lia.11 P=SGDNLGKKYVG (SEQ ID NO: 264) P=DDDNRPS (SEQ ID NO: 265) P=QSYDDTSI (SEQ ID NO: 266) Lia.12 P=SGDSLGNKYVH (SEQ ID NO: 267) P=DDSDRPS (SEQ ID NO: 268) P=QTWDYVGY (SEQ ID NO: 269) Lia.13 P=TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 270) P=DVSNRPS (SEQ ID NO: 271) P=QSYDRYRLKN (SEQ ID NO: 272) ‘Determinado pelo sistema de Kabat (ver suprã). N^sequência de nucleótido, P=sequência de polipéptido.
Em certos exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreendendo a VL codificado pelo polinucleótido liga-se preferencialmente ou especificamente a Sp35.
Noutro exemplo, a divulgação proporciona um polinucleótido isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo num ácido nucleico que codifica para uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) na qual as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 têm sequências de polipéptidos que são idênticas aos grupos CDR1, CDR2 e CDR3 apresentados na Tabela 5. Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreendendo a VL codificada pelo polinucleótido liga-se preferencialmente ou especificamente a Sp35.
Noutro exemplo, a divulgação proporciona um polinucleótido isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo num ácido nucleico que codifica para uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) na qual as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 são codificadas por sequências de nucleótidos que são idênticas às sequências de nucleótidos que codificam para os grupos CDR1, CDR2 e CDR3 apresentados na Tabela 5. Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreendendo a VL codificado pelo polinucleótido liga-se preferencialmente ou especificamente a Sp35.
Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio, compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste num VL codificado por um ou mais dos polinucleótidos acima descritos liga-se especificamente ou preferencialmente ao mesmo epitopo que um anticorpo monoclonal anticorpo seleccionado de entre o grupo que consiste em 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 100 3P1D10.2C3, 3Ρ1Ε11.3Β7, 3P2C6.3G1Ο.2Η7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3Ρ4Α1.2Β9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (LiOl), 38-D01 (Li 0 2), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li 0 4), 30-A11 (Li 0 5), 34-F02 (L i 0 6 ) , 29-E07 (Li 0 7), 34-G04 (Li08), 36-A12 (L i 0 9 ) , 28-D02 (LilO), 30-B01 (Lill) , 34-B03 (Li12) , Lil3, Li32, Li33, Li3 4, 3383 (Lia .1), 3495(Lia.2), 3563 (Lia.3) , 3564 (Lia.4; ), 3565 (Lia.5) , 3566 (Lia.6), 3567 (Lia.7) , 3568 (Lia.8: ), 3569 (Lia.9), 3570 (Lia.10), 3571 (Lia.11) , 3582 (Lia.12), e 1968 (Lia.13), ou irá inibir competitivamente um tal anticorpo monoclonal de se ligar a Sp35.
Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio, compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste num VL codificado por um ou mais dos polinucleótidos acima descritos, liga-se especificamente ou preferencialmente a um polipéptido Sp35 ou a de um seu fragmento, ou a um polipéptido variante Sp35, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (KD) nao superior a 5 x 10“2 M, 10"2 M f 5 X 10" '3 M, 10" -3 M, 5 x 10"4 M, 1 0"4 M, 5 x 10~5 M, 10" 5 M, 5 X 1 0“6 M, 10"6 M( 5 x 10' "7 M, 10~7 M, co 1 O \—1 X LO M, CO 1 O \—1 M, 5 x 10' -9 M , 1 O"9 M, 5 X 1 O"10 M, 10"10 M, 5 x 10 11 M, 10" 11 M, 5 x 10 -12 M f 10' -12 M, 5 X 1 O"13 M, 10"13 M, 5 x 10“14 Μ, 1(Γ14 M, 5 x 10 15 M, ou 10 15 M.
Noutro exemplo, a presente divulgação inclui um polinucleótido isolado que compreende, que consiste essencialmente em, ou que consistindo num ácido nucleico que codifica para uma VH que é pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica a uma sequência de polipéptido de referência VH seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 158 a 172, 372, 376, 380, e 384 apresentadas na Tabela 6.
Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreendendo a VH codificada pelo polinucleótido liga-se preferencialmente ou especificamente a Sp35. 101
Noutro exemplo, a presente divulgação inclui um polinucleótido isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste numa sequência de ácido nucleico que codifica para VH com uma sequência de polipéptido seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 158 a 172 , 372, 376, 380 e 384 apresentadas na Tabela 6. Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreendendo a VH codificada pelo polinucleótido liga-se preferencialmente ou especificamente a Sp35.
TABELA 6 - Sequências de polipéptido VH VH Sequência SE Q ID NO Li EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYEMIWVRQAPGKGLEWVSSIGP 15 02 SGGLTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCVRIDDSSGW AFDIWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAP 8 Li EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYSMVWVRQAPGKGLEWVSYIS 15 09 PSGGKTMYADSVKGRFTISRDNSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSRRRY YDFWSGYHNYYYYYMDVWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAP 9 Li EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSEYPMDWVRQAPGKGLEWVSSIY 16 06 SSGGSTVYADSIKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGDSDAF DIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAP 0 Li EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIV 16 05 SSGGYTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGDHNA FDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAP 1 Li EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYNMGWVRQAPGKGLEWVSVIY 16 04 PSGGGTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSIADDAF DIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAP 2 102 VH Sequência SE Q ID NO Li EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYEMVWVRQAPGKGLEWVSSIRS 16 08 SGGATKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKESPDDYF DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP 3 Li EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMYWVRQAPGKGLEWVSSIST 16 11 SGGYTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDTSDNDY YYMDVWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAP 4 Li EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYPMVWVRQAPGKGLEWVSWIG 16 10 PSGGVTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPYSSGW WDFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP 5 Li EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYQMTWVRQAPGKGLEWVSSIY 16 01 PSGGNTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGTTEAV FDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP 6 Li EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYFMGWVRQAPGKGLEWVSSIS 16 07 PSGGFTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRHAFD IWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAP 7 Li EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSQYPMEWVRQAPGKGLEWVSGIY 16 03 PSGGSTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAGQWL GDFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP 8 Li EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSQYNMFWVRQAPGKGLEWVSRISS 16 12 SGGMTMYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREALRPY CSGGSCYSDYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAP 9 IA QVQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGW 17 7 INTDTGEPTYTEDFQGRFAFSLETSASTVYLQFNNLKNEDTATYFCAREGVHF DYWGQGTTVTVSS 0 2F EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWLDWVRQSPEKGLEWVAEIR 17 3 SKANNHATNYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAEDTGIYFCTPSFAYW GQGTTVTVSS 1 103 VH Sequência SE Q ID NO 3P 1D 10 .2 C3 e 3P 1E 11 .3 B7 QVQLQQSGAELARPGASVKLSCRASGYTFTSSWTQWVKQRPGQGLEWIGAIY PGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCARHNSYG MDYWGQGTSVTVSS 17 2 Li EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYEMYWVRQAPGKGLEWVSRIVS 37 13 SGGFTKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATEGDNDAFD IWGQGTTVTVSS 2 Li EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYMMQWVRQAPGKGLEWVSSISP 37 32 SGGNTKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGDYGYWFD PWGQGTLVTVSS 6 Li EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYPMFWVRQAPGKGLEWVSWIGP 38 33 SGGITKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCAREGHNDWYF DLWGRGTLVTVSS 0 Li EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYEMYWVRQAPGKGLEWVSGIYS 38 34 SGGITVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAAILDWYF DLWGRGTLVTVSS 4
Noutro exemplo, a presente divulgação inclui um polinucleótido isolado que compreende, que consiste essencialmente em, ou consistindo num ácido nucleico que codifica para uma VH que é pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica a uma sequência de polipéptido de referência VH seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 158-172, 372, 376, 380, e 384. Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreendendo a VH codificada pelo polinucleótido liga-se preferencialmente ou especificamente a Sp35.
Noutro exemplo, a presente divulgação inclui um polinucleótido isolado compreendendo, consistindo 104 essencialmente em, ou que consiste numa sequência de ácido nucleico que codifica para uma VH da divulgação, seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 158-172 , 372, 376, 380, e 384. Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreendendo a VH codificado pelo polinucleótido liga-se preferencialmente ou especificamente a Sp35.
Nalguns exemplos, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio, compreendendo, consistindo essencialmente de, ou que consiste numa VH codificada por um ou mais dos polinucleótidos acima descritos, liga-se especificamente ou preferencialmente ao mesmo epitopo que um anticorpo monoclonal seleccionado do grupo constituído por, (201') 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (LiOl), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03) , 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (LiO 7), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (LilO), 30-B01 (Li 11) , 34-B03 (Li 12) , Lil3, Li32, Li33, Li34, 3383 (Lla.l), 3495 (Lia. 2) , 3563 (Lia.3), 3564 (Lia.4), 3565 (Lia.5), 3566 (Lia.6), 3567 (Lia.7), 3568 (Lia.8), 3569 (Lia.9), 3570 (Lia.10) , 3571 (Lia.11), 3582 (Lia.12), e 1968 (Lia.13 ) , ou inibirá competitivamente um tal anticorpo monoclonal de se ligar a Sp35.
Nalguns exemplos, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio, compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste numa VH codificada por um ou mais dos polinucleótidos acima descritos liga-se especificamente ou preferencialmente a um polipéptido Sp35 ou a um seu fragmento, ou a um polipéptido Sp35 variante, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (KD) não superior a 5 x 10“2 M, 1CT2 M, 5 x 1CT3 M, 1CT3 M, 5 x 1CT4 105 M, 10“4 M, 5 x 10“5 M, 10“5 M, 5 x 10~6 M, 10~6 M, 5 x 10' ~7 M, 10' _7 M, 5 x 10“8 M, 10~8 M, 5 x 10~9 M, 10“9 M, 5 X 1Q-10 M, l0-i° M, 5 x ΙΟ-11 Μ, 10-11 M, 5 x 10~12 Μ, 10'12 M, 5 X 10~13 M, io-13 M, 5 x 10“14 M, 10“14 M, 5 x 10~15 M, ou 10“15 M.
Em exemplos adicionais, a presente divulgação inclui um polinucleótido isolado que codifica para uma região variável de cadeia pesada (VH) , em que o polinucleótido compreende uma sequência de ácido nucleico VH seleccionada do grupo consistindo em nas SEQ ID NOs 173 a 184, 370, 374, 378 e 382, como apresentado na Tabela 7. Em certos exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreendendo a VH codificada pelo polinucleótido liga-se especificamente ou preferencialmente a Sp35.
TABELA 7 - Sequências Polinucleotídicas VH VH Sequência SEQ ID NO: Li02 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTC TTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTACTTACGAGA TGATTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTCT ATCGGTCCTTCTGGTGGCCTTACTTGGTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCG C T T CAC TAT C T C TAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACT TGCAGATGA ACAGCTTAAGGGCTGAGGACACCGCCATGTATTACTGTGTACGGATTGAT GATAGTAGTGGTTGGGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCAC CGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC 173 Li09 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTC TTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTATGTACTCTA TGGTTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTAT ATCTCTCCTTCTGGTGGCAAGACTATGTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCG C T T CAC TAT C T C TAGAGACAAC T C TAAGAATAC T T T C TAC T T GCAGAT GA ACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATTCG AGACGCCGGTATTACGATTTTTGGAGTGGTTATCACAACTACTACTACTA CTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCAAGCGCCT CCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC 174 106 VH Sequência SEQ ID NO: Li 0 6 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTC TTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTGAGTACCCTA TGGATTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTCT ATCTATTCTTCTGGTGGCTCTACTGTTTATGCTGACTCCATTAAAGGTCG CTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGA ACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGAGGGT GACTCTGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTC AAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC 175 Li05 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTC TTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTGCTTACGCTA TGGGTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTCT ATCGTTTCTTCTGGTGGCTATACTGATTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCG CTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGA ACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGAGGGT GACCATAATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTC AAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC 176 Li 0 4 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTC TTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTCGTTACAATA TGGGTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTGTT ATCTATCCTTCTGGTGGCGGTACTCATTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCG CTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGA ACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGTTCTATA GCAGATGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTC AAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC 177 Li 0 8 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTC TTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTCATTACGAGA TGGTTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTCT ATCCGTTCTTCTGGTGGCGCTACTAAGTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCG CTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGA ACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAAGAGTCG CCAGACGACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTC AAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC 178 Li 11 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTC TTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTTCTTACGCTA TGTATTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTCT ATCTCTACTTCTGGTGGCTATACTGGTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCG CTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGA ACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATACC AGCGATAATGACTACTACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGT CACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCAC CC 179 107 VH Sequência SEQ ID NO: LilO GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTC TTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTACTTACCCTA TGGTTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTGG ATCGGTCCTTCTGGTGGCGTTACTGCTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCG CTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGA ACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACCCTAT AGCAGTGGCTGGTGGGACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCAC CGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC 180 LiOl GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTC TTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTAAGTACCAGA TGACTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTCT ATCTATCCTTCTGGTGGCAATACTGTTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCG CTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGA ACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGTGGGACT ACAGAGGCAGTCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTC AAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC 181 Li 0 7 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTC TTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTATGTACTTTA TGGGTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTCT ATCTCTCCTTCTGGTGGCTTTACTTCTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCG CTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGA ACAGCTTAAGGGCTGAGGACACTGCAGTCTACTATTGTGCGAGAGATCGG CATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGCGC CTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC 182 Li03 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTC TTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTCAGTACCCTA TGGAGTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTGGT ATCTATCCTTCTGGTGGCTCTACTGTTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCG CTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGA ACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCGGGG CAGTGGCTGGGGGACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGT CTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC 183 Li 12 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTC TTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTCAGTACAATA TGTTTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTCGT ATCTCTTCTTCTGGTGGCATGACTATGTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCG CTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGA ACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAAGCG TTACGGCCTTATTGTAGTGGTGGTAGCTGCTACTCCGACTACTACTACTA CGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCAAGCGCCT CCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC 184 108 VH Sequência SEQ ID NO: Lil3 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTC TTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTCATTACGAGA TGTATTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTCGT ATCGTTTCTTCTGGTGGCTTTACTAAGTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCG CTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGA ACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAACAGAGGGT GATAATGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTC AAGC 370 Li3 2 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTC TTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTGCTTACATGA TGCAGTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTCT ATCTCTCCTTCTGGTGGCAATACTAAGTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCG CTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGA ACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGAGAT TATGGATACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTC AAGC 374 Li33 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTC TTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTATTTACCCTA TGTTTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTGG ATCGGTCCTTCTGGTGGCATTACTAAGTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCG CTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGA ACAGCTTAAGGGCTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCGAGAGAGGGG CATAACGACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACCGT CTCAAGC 378 Li3 4 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTC TTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTAATTACGAGA TGTATTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTGGT ATCTATTCTTCTGGTGGCATTACTGTTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCG C T T C AC T AT C T C TAGAGACAAC T C T AAGAAT AC T C T C T AC T T GC AGAT GA ACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCTAGGGCAGCC ATCCTCGACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACCGT CTCAAGC 382
Noutro exemplo, a presente divulgação inclui um polinucleótido isolado compreendendo, consistindo essencialmente de, ou que consiste num ácido nucleico que codifica para VH que é pelo menos, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico a uma sequência de ácido nucleico de referência seleccionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 173-184, 370, 374, 378 e 382 da Tabela 7. Nalguns exemplos, o polinucleótido codifica para um polipéptido VH que se liga especificamente ou preferencialmente a Sp35. 109
Nalguns exemplos, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio, compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste numa VH codificada por um ou mais dos polinucleótidos acima descritos, liga-se especificamente ou preferencialmente ao mesmo epitopo que um anticorpo monoclonal seleccionado de entre o grupo constituído por, (201') 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (LiOl), 38-D01 (Li 0 2), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (LilO), 30-B01 (Lill), 34-B03 (Lil2), Lil3, Li32, Li33, Li34, 3383 (Lla.l), 3495(Lla.2), 3563 (Lia.3), 3564 (Lia.4), 3565 (Lia.5), 3566 (Lia.6), 3567 (Lia.7), 3568 (Lia.8), 3569 (Lia.9), 3570 (Lia.10), 3571 (Lia.11), 3582 (Lia.12), e 1968 (Lia.13), ou inibirá competitivamente um tal anticorpo monoclonal de se ligar ao Sp35.
Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio, compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste numa VH codificada por um ou mais dos polinucleótidos acima descritos, liga-se especificamente ou preferencialmente a um polipéptido Sp35 ou a um seu fragmento, ou um polipéptido Sp35 variante, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (KD) não superior a 5 x 10 2 M, 10 2 M, 5 x 10 3 M, 10 3 M, 5 x 10 4 M, 10~4 M, 5 x ΙΟ-5 Μ, 10~5 M, 5 x 10~6 Μ, 10~6 M, 5 x 10-7 M, 10~7 M, 5 X CO 1 0 \—1 s CO 1 O \—1 M, 5 x ΙΟ-9 Μ, 10~9 M, 5 X 10 10 M, 10 -10 5 x 10" 11 M, 10 11 M, 5 x 10“12 M, 10“12 M, 5 X 10“13 M, 10“13 M, 5 X 10~14 M, 10“14 M, 5 x 10~15 M, ou 10~15 M.
Noutro exemplo, a presente divulgação inclui um polinucleótido isolado que compreende, que consiste essencialmente em, ou que consiste num ácido nucleico que 110 codifica para uma VL pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica a uma sequência de polipéptido VL de referência seleccionada de entre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 273 a 286, 373, 377, 381 e 385, apresentadas na Tabela 8. Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreendendo a VL codificada pelo polinucleótido liga-se preferencialmente ou especificamente a Sp35.
Noutro exemplo, a presente divulgação inclui um polinucleótido isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste numa sequência de ácido nucleico que codifica para VL possuindo uma sequência de polipéptido seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 273 a 286 , 373, 377, 381 e 385, apresentadas na Tabela 8. Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreendendo a VL codificada pelo polinucleótido liga-se preferencialmente ou especificamente a Sp35.
TABELA 8 - Sequências Polipeptidicas VL VL Sequência SEQ ID NO: LiO 2 FYSHSAQYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKFASWYQQKAGQSPVL V IFQDRKRLSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDTNTVVF GGGTKLTVLGQPKAAP 273 LiO 9 FYSHSAQDIQMTQSPSSLSAFVGDRVAITCRASQSIDTYLNWYQQKPGKAP KLLIYAASKLEDGVPSRFSGSGTGTDFTLTIRSLQPEDFGTYYCQQSYSPP LTFGGGTKVEIKRTVAAP 274 LiO 6 FYSHSAQDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAP NLLIYAASSLRTGVPSRFRGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYSYP LTFGQGTKLEIKRTVAAP 275 LiO 5 FYSHSAQSVLTQPPSVSVAPGQTARISCGGDNIGSKSVHWYQQRPGQAPVL VVYDDYDRPSGIPERFSGSNSGDTAILTITRVEVGDEADFYCQVRDSRTEE RVFGGGTKVTVLGQPKAAP 276 LiO 8 FYSHSAQDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISYYLNWYQQKPGKAP KVLIYDVSNLQTGVPSRFSGSASATDFTLTISSLQPEDIATYYCQQSDNLP LTFGGGTKVEIKRTVAAP 277 111 VL Sequência SEQ ID NO: Lil 1 FYSHSAQDIQMTQSPSSVSAPIGDRVTITCRASQEIANYLAWYQQKPGKAP K LLIYDTYTLQTDVPPRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDTATYFCQQADIFPL SFG GGTKVEIKRTVAAP 278 Lil 0 FYSHSAQDIQMTQSPSSMSASVGDTVTITCRASQGIGNWLAWYQQKPGKAP TLLIYAASSLESGVPSRFTGSGSSSGIDFTLTISDLHPEDLATYYCQQAQT FPLTFGGGTRVDLKRTVAAP 279 LiO 1 FYSHSAQDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAP KLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQADRFP AVTFGGGTKVEIKRTVAAP 280 LiO 7 FYSHSAQSELTQPPSVSVSPGQTAIITCSGDQLGDKHVAWYQQKPGQSPVL VIYLDIKRPAGISERFSGSNSGNTATLTIRGTQAMDEADYYCQAWDIKTVF GGGTKLTVL S QPKAAP 281 LiO 3 FYSHSAQDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAP KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTP WTFGQGTKVEIKRTVAAP 282 1A7 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTS KLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTK LEIK 283 2F3 DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIYNYLAWFQQKQGKSPQLLVYNA KTLPDGVPSRFSGSGSGTQYFLKINSLQPEDFGSYYCQHFWAIPYTFGGGT RLE IKR 284 3P1 Dl 0 . 2C 3 DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPK LLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTINSVQAEDLAVYYCQNDYSYPL FTFGSGTKLEIR 285 3P1 Eli . 3B 7 DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKSYLTWYQQKPGQPPK LLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTINSVQAEDLAVYYCQNDYSYPL F TFGSGTKLEIR 286 Lil 3 DIQMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDA SNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPMYTFGQG TKLEIK 373 Li3 2 DIQMTQSPDSLSASVGDRVTITCQASQDISYYLNWYQQKPGMAPKLLIYDA FILEGGAPSRFSGSGSGTDFSFTISNLQPEDIATYFCQQSDQLPVTFGQGT KVEIR 377 Li3 3 DIQMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDA SNRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYDKWPLTFGGGT KVEIR 381 Li3 4 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQDISNYLSWYQQKPGKAPKLLIYDA FNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFATYYCQHYDNLPFTFGPGT RVAIR 385 112
Noutro exemplo, a presente divulgação inclui um polinucleótido isolado que compreende, que consiste essencialmente em, ou que consistindo num ácido nucleico que codifica para VL pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica a uma sequência polipeptídica de referência VL seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 273 a 286, 373, 377, 381 e 385. Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreendendo a VL codificada pelo polinucleótido liga-se preferencialmente ou especificamente a Sp35.
Noutro exemplo, a presente divulgação inclui um polinucleótido isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste numa sequência de ácido nucleico que codifica para VL da divulgação, seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 273 a 286 , 373, 377, 381 e 385. Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreendendo a VL codificada pelo polinucleótido liga-se preferencialmente ou especificamente a Sp35.
Nalguns exemplos, um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste num VL codificado por um ou mais dos polinucleótidos acima descritos, liga-se especificamente ou preferencialmente ao mesmo epitopo que o anticorpo monoclonal seleccionado de entre o grupo que consiste em 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (LiOl), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (LilO), 30-B01 (Lill), 34-B03 (Lil2), Lil3, Li32, Li33, Li34, 3383 (Lla.l), 3495(Lia.2), 3563 (Lia.3), 3564 (Lia.4), 3565 (Lia.5), 3566 113 (Lia.6), 3567 (Lia.7), 3568 (Lia.8), 3569 (Lia.9), 3570 (Lia.10), 3571 (Lia.11), 3582 (Lia.12), e 1968 (Lia.13), ou irá inibir competitivamente um tal anticorpo monoclonal de se ligar a Sp35.
Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio, compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste num VL codificado por um ou mais dos polinucleótidos acima descritos, liga-se especificamente ou preferencialmente a um polipéptido Sp35 ou a um seu fragmento, ou a um polipéptido Sp35 variante, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (KD) não superior a 5 x 1CT2 M, 10“2 M r 5 1 O \—1 X 43 M, 10' '3 M, 5 x 10“4 M, 1 O'4 M, 5 x 1CT5 M, 10“ 5 M, 5 X 1 0“6 M, 10“6 M. , 5 x 10' 7 M, 1CT7 M, 5 x 1(T8 M, 1CT8 M, 5 x 10' -9 M, , 10“9 M, 5 X O 1 O i—1 M, 10“10 M, 5 X 1CT11 M, 10“ 11 M, 5 x 10 -12 M ί 10“12 M, 5 X co t—1 1 O i—1 M, co t—1 1 o i—1 M, 5 x 10“14 Μ, 1(Γ14 M, 5 x IO-15 M, ou IO-15 M.
Em exemplos adicionais, a presente divulgação inclui um polinucleótido isolado que codifica para uma região variável de cadeia leve (VL) , onde o polinucleótido compreende uma sequência de ácido nucleico de VL seleccionada de entre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs 185 a 194, 371, 375, 379 e 383, como apresentado na Tabela 9. Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreendendo a VL codificada pelo polinucleótido liga-se preferencialmente ou especificamente a Sp35.
TABELA 9 - Sequências de Polinucleótido VL
VL
Sequência SEQ ID NO: 114 VL Sequência SEQ ID NO: LiO 2 TTCTATTCTCACAGTGCACAGTACGAATTGACTCAGCCACCCTCAGTGTC CGTGTCCCCAGGACAGACAGCCAGCATCACCTGCTCTGGAGATAAATTGG GGGATAAATTTGCTTCCTGGTATCAGCAGAAGGCAGGCCAGTCCCCTGTG CTGGTCATCTTTCAAGATAGGAAGCGTCTCTCAGGGATCCCTGAGCGATT CTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCC AGGCTATGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACACCAACACT GTGGTCTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGC TGCCCCC 185 LiO 9 TTCTATTCTCACAGTGCACAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTC CCTGTCTGCATTTGTGGGAGACAGAGTCGCCATCACTTGCCGCGCAAGTC AGAGCATCGACACCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCC CCTAAACTCCTGATCTATGCTGCATCCAAGTTGGAAGACGGGGTCCCATC AAGATTCAGTGGCAGTGGAACTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGAA GTCTGCAACCTGAAGATTTTGGAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGT CCCCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGT GGCTGCACCA 186 LiO 6 TTCTATTCTCACAGTGCACAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCAC CCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTC AGAGTATTAGTAGCTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCC CCTAACCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTACGAACTGGGGTCCCATC AAGATTCAGGGGCAGTGGATCTGGCACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA GCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACGTATTACTGTCTACAAGATTACAGT TACCCTCTCACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGT GGCTGCACCA 187 LiO 5 TTCTATTCTCACAGTGCACAGAGCGTCTTGACTCAGCCACCCTCGGTGTC AGTGGCCCCAGGCCAGACGGCCAGGATTTCCTGTGGGGGAGACAACATTG GAAGTAAGAGTGTCCACTGGTACCAGCAGAGGCCAGGCCAGGCCCCTGTC CTGGTCGTGTATGATGATTATGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATT CTCTGGCTCCAACTCTGGGGACACGGCCATCCTGACCATCACCAGGGTCG AAGTCGGGGATGAGGCCGACTTTTATTGTCAGGTGAGGGACAGCCGTACT GAGGAACGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGACCGTCTTAGGTCAGCC CAAGGCTGCCCCC 188 LiO 8 TTCTATTCTCACAGTGCACAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTC CCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTC AGGACAT TAGTTACTATTTAAAT T GGTAT CAGCAGAAGCCAGGGAAAGC C CCTAAGGTCCTGATCTACGATGTATCCAATTTGCAAACAGGGGTCCCATC AAGGTTCAGTGGAAGTGCGTCTGCGACAGATTTTACTCTCACCATCAGCA GCCTGCAGCCTGAAGATATTGCGACATATTACTGTCAACAGTCTGATAAT CTCCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATTAAACGAACTGT GGCTGCACCA 189 115 VL Sequência SEQ ID NO: Lil 1 TTCTATTCTCACAGTGCACAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTC TGTGTCTGCACCTATAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTC AGGAGATTGCCAACTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCC CCTAAGCTCCTGATCTATGATACATACACTTTGCAGACTGACGTCCCACC GAGGTTCAGCGGCAGTGGTTCGGGGACAGATTTCACTCTCACTATCAGCA GCCTGCAGCCTGAAGATACTGCAACTTACTTTTGTCAACAGGCTGACATT TTCCCGCTCTCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGT GGCTGCACCA 190 Lil 0 TTCTATTCTCACAGTGCACAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTC CATGTCTGCTTCTGTAGGGGACACAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTC AGGGTATTGGCAACTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCC CCAACTCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATC AAGGTTCACCGGCAGCGGCAGTTCCTCTGGGATAGATTTCACTCTCACCA TCAGCGACCTGCACCCTGAAGATTTGGCAACTTACTATTGTCAACAGGCT CAGACTTTCCCGCTCACCTTCGGCGGAGGGACCAGGGTGGACCTCAAGCG AACTGTGGCTGCACCA 191 LiO 1 TTCTATTCTCACAGTGCACAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTC CCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTC AGGACAT TAGCAAC TATT TAAATT GGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGC C CCTAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATC AAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA GCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTGACAGG TTCCCTGCGGTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAAC TGTGGCTGCACCA 192 LiO 7 TTCTATTCTCACAGTGCACAGAGCGAATTGACTCAGCCACCCTCAGTGTC CGTGTCCCCAGGACAGACAGCCATCATCACCTGCTCTGGAGATCAGTTGG GTGACAAACATGTGGCTTGGTATCAACAGAAGCCAGGCCAGTCCCCTGTG CTGGTCATCTATCTAGACATTAAGAGGCCCGCAGGGATTTCTGAGCGATT CTCTGGCTCCAACTCTGGAAATACAGCCACTCTGACCATCAGAGGGACCC AGGCTATGGATGAAGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACATCAAGACG GTCTTCGGCGGGGGGACCAAGCTGACCGTCCTGAGTCAGCCCAAGGCTGC CCCC 193 LiO 3 TTCTATTCTCACAGTGCACAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTC CCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTC AGAGCAT TAGCAGC TAT T TAAAT T GGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCC CCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATC AAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCA GT C T GCAACC T GAAGAT T T T GCAAC T T AC T AC T GTCAACAGAGT TACAGT ACCCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGT GGCTGCACCA 194 Lil 3 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGA AAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAG CCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGAT GCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTC TGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTG CAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCGATGTACACTTTTGGC CAGGGGACCAAGC T GGAGAT CAAA 371 116 VL Sequência SEQ ID NO: Li3 2 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGTCTGCATCTGTTGGAGA CAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAAGACATTAGCTACTATTTAA ATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGATGGCCCCTAAACTCCTCATCTACGAT GCCTTCATTTTGGAAGGAGGGGCCCCATCACGGTTCAGTGGGAGCGGCTC TGGGACAGATTTTTCTTTCACCATCAGCAATCTACAGCCTGAGGATATTG CAACTTATTTCTGTCAACAGTCTGATCAACTGCCCGTGACCTTCGGCCAA GGGACCAAGGTGGAAATCAGA 375 Li3 3 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGA AAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAG CCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGAT GCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTC TGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAGGATTTTG CAGTTTATTACTGTCAGCAGTATGATAAGTGGCCGCTCACTTTCGGCGGA GGGACCAAGGTGGAGATCAAA 379 Li3 4 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGA CAGAGTCACCATCACTTGCCATGCGAGTCAGGACATTAGCAACTATTTAA GTTGGTATCAGCAGAAACCAGGTAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTACGAT GCTTTCAATTTGGAGACAGGAGTCCCATCGAGGTTCAGTGGAAGTGGATC TGGCACAGATTTTACATTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTG CAACATATTACTGTCAGCACTATGATAATCTCCCATTCACTTTCGGCCCT GGGACCAGAGTGGCGATCAGA 383
Noutro exemplo, a presente divulgação inclui um polinucleótido isolado que compreende, que consiste essencialmente em, ou que consiste num ácido nucleico que codifica uma VL pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica a um polinucleótido VL seleccionado de entre o grupo constituído por SEQ ID NOs: 185-194, 371, 375, 379 e 383 da Tabela 9. Nalguns exemplos, o polinucleótido codifica para um polipéptido VL que se liga especif icamente ou preferencialmente a Sp35.
Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio, compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste num VL codificado por um ou mais dos polinucleótidos acima descritos, liga-se especificamente ou preferencialmente ao mesmo epitopo que o anticorpo monoclonal seleccionado de entre o grupo que consiste em 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 117 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9. 2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (LiOl), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (LiO 7), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (LilO), 30-B01 (Lill), 34-B03 (Li12), Lil3, Li32, Li33, Li34, 3383 (Lla.l), 3495(Lia .2), 3563 (Lia .3), 3564 (Lia. 4), 3565 (Lia.5), 3566 (Lia.6), 3567 (Lia.7) , 3568 (Lia.8) , 3569 (Lia.9), 3570 (Lia.10) , 3571 (Lia.11), 3582 (Lia.12 ), e 1968 (Lia.13), ou irá inibir competitivamente um tal anticorpo monoclonal de se ligar a Sp35 .
Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio, compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste num VL codificado por um ou mais dos polinucleótidos acima descritos, liga-se especificamente ou preferencialmente a um polipéptido Sp35 ou a um seu fragmento, ou a um polipéptido Sp35 variante, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (KD) não superior a 5 x CM 1 O \—1 M, CM 1 O 5-1 M r 5 x 10“ 3 M, 10' '3 M, 5 x 10“4 M, 1 o-4 M, 5 x 10“5 M, 10“ 5 M, 5 X 1 0“6 M, 10“6 M, , 5 x 10' "7 M, 10“7 M, co 1 O \—1 X LO M, 10“8 M, 5 x 10' -9 M , 10“9 M, 5 x 10“10 M, O t—1 1 O i—1 M, 5 X 10-11 M, 10“ 11 M, 5 x 10 -12 M r 10“12 M, 5 x 10“13 M, 10“13 M, 5 x 1CT14 M, 1CT14 M, 5 x 10 15 M, ou 10 15 M.
Qualquer um dos polinucleótidos acima descritos pode ainda incluir ácidos nucleicos adicionais, que codificam, por exemplo, para um péptido sinal para dirigir a secreção do polipéptido codificado, regiões constantes dos anticorpos, tal como aqui descrito, ou de outros polipéptidos heterólogos como aqui descrito.
Além disso, tal como descrito em mais detalhe noutra secção deste documento, a divulgação inclui composições que compreendem os polinucleótidos compreendendo um ou mais dos 118 polinucleótidos acima descritos. Num exemplo, a divulgação inclui composições que compreendem um primeiro polinucleótido e um segundo polinucleótido em que o referido primeiro polinucleótido codifica para um polipéptido VH tal como aqui descrito e em que o referido segundo polinucleótido codifica para um polipéptido VL, como aqui descrito. Especificamente, uma composição que compreende, consiste essencialmente em, ou consiste num polinucleótido VH, como apresentado na Tabela 7, e um polinucleótido VL, como apresentado na Tabela 9, em que o referido polinucleótido VH e o referido polinucleótido VL são seleccionados a partir do grupo constituído por: i) SEQ ID NO: 173 e SEQ ID NO: 185; ii) SEQ ID NO: 174 e SEQ ID NO: 186; iii) SEQ ID NO: 175 e SEQ ID NO: 187; iv) SEQ ID NO: 176 e SEQ ID NO: 188; v) SEQ ID NO: 178 e SEQ ID NO: 189; vi) SEQ ID NO: 179 e SEQ ID NO: 190; vii) SEQ ID NO: 180 e SEQ ID NO: 191; viii) SEQ ID NO: 181 e SEQ ID NO: 192; ix) SEQ ID NO: 182 e SEQ ID NO: 193; x) SEQ ID NO: 183 e SEQ ID NO: 194; xi) SEQ ID NO: 370 e SEQ ID NO: 371; xii) SEQ ID NO: 374 e SEQ ID NO: 375; xiii) SEQ ID NO: 378 e SEQ ID NO: 379; e xiv) SEQ ID NO: 382 e SEQ ID NO: 385. A presente divulgação também inclui fragmentos dos polinucleótidos da divulgação, como descrito noutro lado. Além disso, os polinucleótidos que codificam para polinucleótidos de fusão, fragmentos Fab e outros derivados, como aqui descritos, são também contempladas pela divulgação.
Os polinucleótidos podem ser produzidos ou fabricados por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, se a sequência de nucleótidos do anticorpo é conhecida, um 119 polinucleótido que codifica para o anticorpo pode ser montado a partir de oligonucleótidos sintetizados quimicamente (por exemplo, como descrito em Kutmeier et al., BioTechniques 17: 242 (1994)), que, resumidamente, envolve a sintese de porções contendo oligonucleótidos que se sobrepõem da sequência que codifica para o anticorpo, hibridação e ligação destes oligonucleótidos, e depois amplificação dos oligonucleótidos ligados por PCR.
Alternativamente, um polinucleótido que codifica para um anticorpo Sp35, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado pode ser gerado a partir do ácido nucleico de uma fonte adequada. Se um clone contendo um ácido nucleico que codifica para um anticorpo particular não está disponível, mas a sequência da molécula de anticorpo for conhecida, um ácido nucleico que codifica para o anticorpo pode ser quimicamente sintetizado ou obtido a partir de uma fonte adequada (por exemplo, uma biblioteca de cADN de anticorpos, ou uma biblioteca de cADN gerada a partir de, ou ácido nucleico, de preferência de poli-A+ARN, isolados a partir de, qualquer tecido ou células que expresse o anticorpo ou outro anticorpo Sp35, tais como células de hibridoma seleccionadas para expressar um anticorpo) por amplificação por PCR usando iniciadores sintéticos hibridáveis nas extremidades 3 ' e 5' da sequência ou por clonagem utilizando uma sonda oligonucleotídica específica para a sequência de gene particular a identificar, por exemplo, um clone de cADN de uma biblioteca de cADN que codifica para o anticorpo ou outro anticorpo Sp35. Os ácidos nucleicos amplificados gerados por RCP podem ser então clonados em vectores de clonagem replicáveis usando qualquer método bem conhecido na técnica. 120
Uma vez determinada a sequência de nucleótidos e a correspondente sequência de aminoácidos do anticorpo Sp35, ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado, a sua sequência de nucleótidos pode ser manipulada através de métodos bem conhecidos na técnica para a manipulação de sequências de nucleótidos, por exemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénese dirigida, PCR, etc. (ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) e Ausubel et al., eds., Current Protocols in Biologia Molecular, John Wiley & Sons, N.I. (1998)), para gerar anticorpos que possuem uma sequência de aminoácidos diferente, por exemplo, para criar as substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos.
Um polinucleótido que codifica para um anticorpo Sp35, ou para um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado pode ser composto por qualquer polirribonucleótido ou polidesoxirribonucleótido, que pode ser ARN ou ADN não modificado ou ARN ou ADN modificado. Por exemplo, um polinucleótido que codifica para o anticorpo Sp35, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado pode ser composto por um AND de cadeia simples e de cadeia dupla, ADN que é uma mistura de regiões de cadeia simples e de cadeia dupla ARN, e ARN que é uma mistura de regiões de cadeia simples e de cadeia dupla, moléculas híbridas compreendendo ADN e ARN que podem ser de cadeia simples ou, mais tipicamente, de cadeia dupla ou uma mistura de regiões de cadeia simples e de cadeia dupla. Além disso, um polinucleótido que codifica para um anticorpo Sp35, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado pode ser composto por regiões de cadeia tripla compreendendo ARN ou ADN ou ambos ARN e ADN. Um polinucleótido que codifica 121 para um anticorpo SP35, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado, podem também conter uma ou mais bases modificadas ou estruturas de ADN ou ARN modificadas para a estabilidade ou por outras razões. Bases "modificadas" incluem, por exemplo, bases tritiladas e bases incomuns, como a inosina. Uma variedade de modificações pode ser feita ao ADN e ARN; assim, "polinucleótido" abrange formas quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente modificadas.
Um polinucleótido isolado que codifica para uma variante não natural de um polipéptido derivado de uma imunoglobulina (por exemplo, uma porção da cadeia pesada de imunoglobulina ou uma porção de cadeia leve), pode ser criado através da introdução de uma ou mais substituições, adições ou deleções de nucleótidos dentro a sequência de nucleótidos da imunoglobulina de tal forma que uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos são introduzidas na proteína codificada. As mutações podem ser introduzidas por meio de técnicas convencionais, tais como a mutagénese dirigida e mutagénese mediada por PCR. De preferência, substituições de aminoácidos conservativas são feitas num ou mais resíduos não essenciais de aminoácidos. V. POLIPÉPTIDOS DO ANTICORPO Sp35 A presente divulgação é ainda dirigida a polipéptidos isolados que compõem anticorpos Sp35, seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados. Os anticorpos Sp35 da divulgação compreendem polipéptidos, por exemplo, as sequências de aminoácidos que codificam para as regiões de ligação a antigénios específicos para SP35 derivadas de moléculas de imunoglobulina. Um polipéptido ou sequência de aminoácido "derivado de" uma proteína designada refere-se à origem do polipéptido. Em certos casos, o polipéptido ou a 122 sequência de aminoácido que é derivado de um polipéptido ou sequência de aminoácido de partida particular tem uma sequência de aminoácidos que é essencialmente idêntica à daquela da sequência de partida, ou de uma sua porção, em que a porção consiste em pelo menos 10-20 aminoácidos, pelo menos 20-30 aminoácidos, em pelo menos 30-50 aminoácidos, ou que seja de outro modo identificável por alguém competente na técnica como tendo a sua origem na sequência de partida.
Num exemplo, a divulgação proporciona um polipéptido isolado que compreende, que consiste essencialmente em, ou que consiste numa região variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH), em que pelo menos uma das CDRs da região variável da cadeia pesada ou em pelo menos duas das CDRs da região variável da cadeia pesada é pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica às sequências de aminoácidos CDR1, CDR2 ou CDR3 da cadeia pesada de referência dos anticorpos Sp35 monoclonais aqui descritos. Alternativamente, as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 da VH são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às sequências de aminoácidos CDR1, CDR2 ou CDR3 da cadeia pesada de referência dos anticorpos Sp35 monoclonais aqui descritos. Assim, de acordo com este exemplo uma região da cadeia pesada variável da divulgação tem sequências de polipéptidos CDR1, CDR2 e CDR3 relacionadas aos grupos apresentados na Tabela 4, supra. Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreendendo o polipéptido VH liga-se especificamente ou preferencialmente a Sp35.
Noutro exemplo, a divulgação proporciona um polipéptido isolado que compreende, que consiste essencialmente em, ou que consiste numa região variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH) , em que as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 possuem sequências de polipéptidos que são idênticas aos 123 grupos CDR1, CDR2 e CDR3 apresentados na Tabela 4. Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreendendo o polipéptido VH liga-se especificamente ou preferencialmente a Sp35.
Noutro exemplo, a presente divulgação inclui um polipéptido isolado que compreende, que consiste essencialmente em, ou que consiste num polipéptido VH que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idêntico a uma sequência polipeptídica VH de referência seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 158 a 172, 372, 376, 380 e 384, como apresentado na Tabela 6. Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreendendo o polipéptido VH liga-se especificamente ou preferencialmente a Sp35.
Noutro exemplo, a presente divulgação inclui um polipéptido isolado que compreende, que consiste essencialmente em, ou que consiste num polipéptido de VH seleccionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 158 a 172, 372, 376, 380 e 384 como apresentado na Tabela 6. Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreendendo o polipéptido VH liga-se especificamente ou preferencialmente a Sp35.
Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio, compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo num ou mais de um dos polipéptidos VH acima descritos liga-se especificamente ou preferencialmente ao mesmo epitopo que um anticorpo monoclonal seleccionado do grupo constituído por 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10. 2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (LiOl), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 124 (Li09) , 28-D02 (LilO), 30-B01 (Lill), 34-B03 (Lil2), Lil3, Li32, Li33, Li3 4, 3383 (Lla.l), 3495 (Lla.2), 3563 (Lia.3), 3564 (Lia.4), 3565 (Lia.5), 3566 (Lia.6), 3567 (Lia.7), 3568 (Lia.8), 3569 (Lia.9), 3570 (Lia.10), 3571 (Lia.11), 3582 (Lia.12), e 1968 (Lia.13), ou irá inibir competitivamente um tal anticorpo monoclonal de se ligar a Sp35.
Nalguns exemplos, um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo num ou mais dos polipéptidos VH acima descritos liga-se especificamente ou preferencialmente a um polipéptido Sp35 ou fragmento do mesmo, ou a um polipéptido Sp35 variante, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (KD) não superior a 5 x 1CT2 M, 1CT2 M, 5 x ΙΟ-3 Μ, 1(Γ3 M, 5 x ΙΟ-4 Μ, IO-4 M, 5 x 1(T5 M, 1CT5 M, 5 x 10-6 M, 10' 6 M, 5 x 10-7 Μ, 10-7 M, 5 x 10 '8 M, 10 8 M, 5 x 10“ Μ, 10“9 M, 5 x 10“10 Μ, 10“10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10“12 M, 10“12 M, 5 x 10“13 Μ, 10-13 M, 5 x IO-14 M, 10“14 M, 5 x 10-15 M, ou 10 15 M.
Noutro exemplo, a divulgação proporciona um polipéptido isolado que compreende, que consiste essencialmente em, ou que consiste numa região variável da cadeia leve de imunoglobulina (VL) , onde pelo menos uma das CDRs da região variável da cadeia leve ou pelo menos duas das CDRs da região variável da cadeia leve é pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica às sequências de aminoácidos CDR1, CDR2 ou CDR3 de cadeia pesada de referência de anticorpos Sp35 monoclonais aqui descritos. Alternativamente, as regiões CDRl, CDR2 e CDR3 de VL são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas idêntica às sequências de aminoácidos CDRl, CDR2 ou CDR3 de cadeia leve de referência de anticorpos Sp35 monoclonais aqui descritos. Assim, de acordo com este exemplo, uma região variável de cadeia leve da divulgação tem sequências de 125 polipéptidos CDRl, CDR2 e CDR3 relacionadas com os polipéptidos apresentados na Tabela 5, supra. Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreendendo o polipéptido VL liga-se especificamente ou preferencialmente a Sp35.
Noutro exemplo, a presente divulgação proporciona um polipéptido isolado que compreende, que consiste essencialmente em, ou que consiste numa região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) na qual as regiões CDRl, CDR2 e CDR3 possuem sequências de polipéptidos que são idênticas aos grupos CDRl, CDR2 e CDR3 apresentados na Tabela 5. Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreendendo o polipéptido VL liga-se especificamente ou preferencialmente a Sp35.
Noutro exemplo, a divulgação inclui um polipéptido isolado que compreende, que consiste essencialmente em, ou que consiste num polipéptido de VL que é pelo menos, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico a uma sequência polipept idica VL de referência seleccionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 273 a 286, 373, 377, 381 e 385, apresentadas na Tabela 8. Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreendendo o polipéptido VL liga-se especificamente ou preferencialmente a Sp35.
Noutro exemplo, a presente divulgação inclui um polipéptido isolado que compreende, que consiste essencialmente em, ou que consiste num polipéptido de VL seleccionado de entre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 273 a 286, 373, 377, 381 e 385, apresentadas na Tabela 8. Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreendendo o polipéptido VL liga-se especificamente ou preferencialmente a Sp35. 126
Nalguns exemplos, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio, compreendendo, consistindo essencialmente de, um ou mais dos polipéptidos descritos acima de VL liga-se preferencialmente ou especificamente ao mesmo epitopo que um anticorpo monoclonal seleccionado a partir do grupo consistindo em 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7, 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30-C12 (LiOl), 38-D01 (Li 0 2), 35-E04 (Li03), 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05), 34-F02 (Li 0 6), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09), 28-D02 (LilO), 30-B01 (Lill), 34-B03 (Lil2), Lil3, Li32,
Li33, Li3 4, 3383 (Lla.l), 3495 (Lla.2), 3563 (Lia.3), 3564 (Lia.4), 3565 (Lia.5), 3566 (Lia.6), 3567 (Lia.7), 3568 (Lia.8), 3569 (Lia.9), 3570 (Lia.10), 3571 (Lia.11), 3582 (Lia.12), e 1968 (Lia.13), ou irá inibir competitivamente um tal anticorpo monoclonal de se ligar aos Sp35.
Nalguns exemplos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio, compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo num ou mais de um dos polipéptidos VL acima descritos liga-se especificamente ou preferencialmente a um polipéptido Sp35 ou a um seu fragmento, ou a um polipéptido variante SP35, com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (KD) não superior a 5 x 1CT2 M, 1CT2 M, 5 x 1CT3 M, 1CT3 M, 5 x 1CT4 Μ, 1CT4 M, 5 x 10“5 M, 1CT5 M, 5 x 1CT6 M, 1CT6 M, 5 x 1CT7 M, 10“7 M, 5 x 1CT8 M, 10“8 M, 5 x 1CT9
M, 10~9 M, 5 X 10' 10 M, 10 10 M, 5 x 10~41 M, t—1 t—1 1 O \—1 M, 5 x 10“12 M 10' '12 M, 5 X 10“13 M, 10“13 M, 5 x 10~14 M, 10“14 M, 5 x LO t—1 1 O {—1 M ou 10 15 M.
Noutros exemplos, um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio compreende, consiste essencialmente de ou consiste num polipéptido VH, tal como apresentado na Tabela 127 6, e num polipéptido VL, como apresentado na Tabela 8, seleccionado de entre o grupo que consiste em: i) SEQ ID NO: 170 e SEQ ID NO: 283; ii) SEQ ID NO: 171 e SEQ ID NO: 284; iii) SEQ ID NO: 172 e SEQ ID NO: 285; iv) SEQ ID NO: 172 e SEQ ID NO: 286; v) SEQ ID NO: 158 e SEQ ID NO: 273; vi) SEQ ID NO: 159 e SEQ ID NO: 274; vii) SEQ ID NO: 160 e SEQ ID NO: 275; viii) SEQ ID NO: 161 e SEQ ID NO: 276; ix) SEQ ID NO: 163 e SEQ ID NO: 277; x) SEQ ID NO: 164 e SEQ ID NO: 278; xi) SEQ ID NO: 165 e SEQ ID NO: 279; xii) SEQ ID NO: 166 e SEQ ID NO: 280; xiii) SEQ ID NO: 167 e SEQ ID NO: 281; xiv) SEQ ID NO: 168 e SEQ ID NO: 282; xv) SEQ ID NO: 372 e SEQ ID NO: 373; xvi) SEQ ID NO: 376 e SEQ ID NO: 377; xvii) SEQ ID NO: 380 e SEQ ID NO: 381; e xv iii) SEQ ID NO: 384 e SEQ ID NO: 385.
Qualquer um dos polipéptidos acima descritos pode ainda incluir polipéptidos adicionais, por exemplo, um péptido sinal para dirigir a secreção do polipéptido codificado, regiões constantes do anticorpo, tal como aqui descrito, ou outros polipéptidos heterólogos tal como aqui descrito. Além disso, os polipéptidos da divulgação incluem fragmentos de polipéptido, tal como descrito noutro lado. Além disso, os polipéptidos da divulgação incluem a fusão de polipéptidos, fragmentos Fab e outros derivados, como aqui descrito.
Ainda, tal como descrito em mais detalhe neste documento, a divulgação inclui composições compreendendo os polipéptidos acima descritos. 128
Será também entendido por um perito na técnica que polipéptidos do anticorpo Sp35 tal como aqui descritos podem ser modificados de tal modo que variam na sequência de aminoácidos relativamente ao polipéptido que se liga que ocorre naturalmente a partir do qual foram derivadas. Por exemplo, um polipéptido ou sequência de aminoácido derivada de uma proteína designada pode ser semelhante, por exemplo, ter uma determinada percentagem de identidade relativamente à sequência de partida, por exemplo, pode ser 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica relativamente à sequência de partida.
Além disso, as substituições, deleções ou inserções de nucleótidos ou de aminoácidos que conduzem a substituições ou alterações conservativas em regiões de aminoácidos "não essenciais" podem ser realizadas. Por exemplo, um polipéptido ou sequência de aminoácido derivada de uma proteína designada, pode ser idêntica à sequência de partida com a excepção de uma ou mais substituições, inserções ou deleções individuais de aminoácidos, por exemplo, substituições, inserções ou deleções de um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, quinze, vinte ou mais aminoácidos individuais. Nalguns exemplos, uma sequência de polipéptido ou aminoácido derivado de uma proteína designada tem uma a cinco, uma a dez, uma a quinze, ou uma a vinte substituições, inserções ou deleções de aminoácidos individuais em relação à sequência de partida.
Determinados polipéptidos do anticorpo Sp35 da divulgação compreendem, consistem essencialmente em, ou consistem numa sequência de aminoácidos derivada de uma sequência de aminoácidos humana. No entanto, certos polipéptidos do anticorpo Sp35 compreendem um ou mais aminoácidos contíguos derivados de outras espécies de mamíferos. Por exemplo, um 129 anticorpo Sp35 da divulgação pode incluir uma porção de cadeia pesada, a porção "hinge", ou a região de ligação ao antigénio de primata. Em outro exemplo, um ou mais aminoácidos derivados de murino podem estar presentes num polipéptido de anticorpo não murino, por exemplo, num local de ligação ao antigénio de um anticorpo SP35. Em certas aplicações terapêuticas, os anticorpos específicos para Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes, ou análogos são concebidos de modo a não serem imunogénicos no animal ao qual o anticorpo é administrado.
Nalguns exemplos, um polipéptido do anticorpo Sp35 compreende uma sequência de aminoácidos ou uma ou mais porções que não são normalmente associadas com um anticorpo. Exemplos de modificações são descritos em mais detalhe abaixo. Por exemplo, um fragmento de anticorpo fv de cadeia simples da divulgação pode compreender uma sequência ligante flexível, ou pode ser modificado para adicionar uma porção funcional (por exemplo, PEG, um fármaco, uma toxina, ou uma marcação).
Um polipéptido do anticorpo Sp35 da divulgação pode compreender, consistir essencialmente em, ou consistir numa proteína de fusão. As proteínas de fusão são as moléculas quiméricas que compreendem, por exemplo, um domínio de ligação ao antigénio de imunoglobulina com pelo menos um local de ligação ao alvo, e pelo menos uma porção heteróloga, ou seja, uma porção com a qual não está naturalmente ligada na natureza. As sequências de aminoácidos podem normalmente existir em proteínas separadas que são reunidas no polipéptido de fusão ou podem existir normalmente na mesma proteína mas são colocados num novo arranjo no polipéptido de fusão. As proteínas de fusão podem ser criadas, por exemplo, por síntese química, ou através da criação e da tradução de 130 um polinucleótido no qual as regiões peptídicas são codificadas na relação desejada. 0 termo "heterólogo", quando aplicado a um polinucleótido ou um polipéptido, significa que o polinucleótido ou polipéptido é derivado de uma entidade distinta da do resto da entidade em relação à qual está a ser comparada. Por exemplo, tal como é aqui utilizado, um "polipéptido heterólogo" para ser fundido a um anticorpo Sp35, ou a um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou análogo é derivado de um polipéptido não imunoglobulina da mesma espécie, ou de um polipéptido imunoglobulina ou não imunoglobulina de uma espécie diferente.
Uma "substituição de aminoácidos conservativa" é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral semelhante. As famílias de resíduos de aminoácidos possuindo cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramifiçadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um resíduo de aminoácido não essencial num polipéptido de imunoglobulina é de preferência substituído por um outro resíduo de aminoácido a partir da mesma família de cadeias laterais. Noutro exemplo, uma sequência de aminoácidos pode ser substituída por sequência 131 estruturalmente semelhante que difere na ordem e/ou na composição dos membros da família de cadeias laterais.
Alternativamente, noutro exemplo, as mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte da sequência codificante para a imunoglobulina, tal como por mutagénese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser incorporados em anticorpos Sp35 para utilização nos métodos de diagnóstico e de tratamento aqui descritos e pesquisados quanto à sua capacidade para se ligarem ao antigénio desejado, por exemplo, Sp35.
VI. PROTEÍNAS DE FUSÃO E CONJUGADOS DE ANTICORPOS
Tal como aqui discutido em mais detalhe noutro lado, anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação podem ainda ser recombinantemente fundidos a um polipéptido heterólogo na extremidade N ou C ou quimicamente conjugados (incluindo conjugações covalentes e não covalentes) a polipéptidos ou outras composições. Por exemplo, anticorpos Sp35 específicos para Sp35 podem ser recombinantemente fundidos ou conjugados a moléculas úteis como marcadores em ensaios de detecção e moléculas efectoras, tais como polipéptidos heterólogos, fármacos, radionuclídeos, ou toxinas. Ver, por exemplo, as publicações PCT WO 92/08495, WO 91/14438, WO 89/12624, Patente E.U.A. No. 5,314,995 e EP 396,387.
Anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados, da divulgação incluem derivados que são modificados, isto é, por ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo, tal que a ligação covalente não impede a ligação do anticorpo a Sp35. Por exemplo, mas não como limitação, os derivados do anticorpo incluem 132 exemplo anticorpos que foram modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosfilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos protectores/bloqueio conhecidos, clivagem proteolitica, ligação a um ligando celular ou outra proteína, etc. Qualquer das numerosas modificações químicas pode ser realizada por técnicas conhecidas, incluindo, mas não se limitando a clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Além disso, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos.
Anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação podem ser compostos por aminoácidos ligados uns aos outros por ligações peptídicas ou ligações peptídicas modificadas, isto é, isósteros peptídicos, e podem conter outros aminoácidos para além dos 20 aminoácidos codificados por genes. Os anticorpos específicos para Sp35 podem ser modificados por processos naturais, tal como processamento pós-tradução, ou por técnicas de modificação química que são bem conhecidas na técnica. Tais modificações estão bem descritas em textos básicos e em monografias mais pormenorizadas, bem como numa volumosa literatura de investigação. As modificações podem ocorrer em qualquer parte do anticorpo específico para Sp35, incluindo o esqueleto peptídico, as cadeias laterais de aminoácidos e as extremidades amino ou carboxilo, ou em porções, tais como hidratos de carbono. Será apreciado que o mesmo tipo de modificação pode estar presente no mesmo ou em graus variáveis em vários locais num determinado anticorpo específico para SP35. Além disso, um determinado anticorpo específico para SP35 pode conter muitos tipos de modificações. Anticorpos Sp35 específicos podem ser ramificados, por exemplo, como resultado de ubiquitinação, e podem ser cíclicos, com ou sem ramificação. Anticorpos 133 ramificados específicos para Sp35 cíclicos, ramificados, cíclicos e ramificados pode resultar de processos naturais de pós-tradução ou podem ser produzidos por métodos sintéticos. As modificações incluem acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma porção heme, ligação covalente de um nucleótido ou derivado de nucleótido, ligação covalente de um lípido ou derivado lipídico, ligação covalente de fosfotidilinositol, reticulação, ciclização, formação de ligações dissulfureto, desmetilação, formação de ligações-cruzadas covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora GPI, hidroxilação, iodação, metilação, miristoilação, oxidação, peguilação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação, adição de aminoácidos a proteínas mediada por ARN de transferência, como arginilação, e ubiquitinação. (Ver, por exemplo, Proteins - Structure and Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nova Iorgue 2a Ed., (1993); Posttranslatlonal Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nova Iorque, págs. 1-12 (1983); Seifter et al. , Meth Enzymol 182: 626-646 (1990); Rattan et al., Ann NY Acad Sei 663: 48-62 (1992)). A presente divulgação também proporciona proteínas de fusão compreendendo um anticorpo Sp35, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado, e um polipéptido heterólogo. O polipéptido heterólogo ao qual o anticorpo é fundido pode ser útil para a função ou é útil para alvejar as células que expressam o polipéptido Sp35. Num exemplo, uma proteína de fusão da divulgação compreende, consiste essencialmente de, ou consiste num polipéptido possuindo a sequência de aminoácidos de qualquer uma ou mais das regiões VH de um anticorpo da divulgação, ou a sequência de 134 aminoácidos de qualquer uma ou mais das regiões VL de um anticorpo da divulgação, ou seus fragmentos ou variantes, e uma sequência polipeptídica heteróloga. Noutro exemplo, uma proteína de fusão para utilização nos métodos de diagnóstico e de tratamento aqui divulgados compreende, consiste essencialmente em, ou consiste num polipéptido possuindo a sequência de aminoácidos de qualquer uma, duas, três das CDRs de VH de um anticorpo especifico para Sp35, ou seus os fragmentos, variantes ou derivados, ou a sequência de aminoácidos de qualquer uma, duas, três das CDRs de VL de um anticorpo especifico para SP35, ou seus fragmentos, variantes ou derivados, e uma sequência de polipéptido heterólogo. Num exemplo, a proteína de fusão compreende um polipéptido possuindo a sequência de aminoácidos de uma CDR3 de VH de um anticorpo específico para Sp35 da presente divulgação, ou um seu fragmento, derivado ou variante, e uma sequência de polipéptido heterólogo, cuja proteína de fusão se liga especificamente a, pelo menos, um epitopo de Sp35. Noutro exemplo, uma proteína de fusão compreende um polipéptido possuindo a sequência de aminoácidos de pelo menos uma região VH de um anticorpo específico para Sp35 da divulgação e a sequência de aminoácidos de pelo menos uma região VL de um anticorpo específico de Sp35 da divulgação ou seus fragmentos, derivados ou variantes, e uma sequência de polipéptido heterólogo. De preferência, as regiões VH e VL da proteína de fusão correspondem a uma única fonte de anticorpo (ou fragmento scFv ou Fab) que se liga especif icamente a, pelo menos, um epitopo de Sp35. Ainda noutro exemplo, uma proteína de fusão para utilização nos métodos de diagnóstico e de tratamento aqui descritos compreende um polipéptido tendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma, duas, três ou mais das CDR de VH de um anticorpo específico para Sp35 e a sequência de aminoácidos de qualquer uma, duas, três ou mais das CDRs de VL de um anticorpo específico para Sp35, ou 135 seus fragmentos ou variantes, e uma sequência de polipéptido heterólogo. De preferência, duas, três, quatro, cinco, seis, ou mais de VHCDR (s) ou VLCDR (s) correspondem a uma única fonte de anticorpo (ou fragmento scFv ou Fab) da divulgação. As moléculas de ácido nucleico que codificam para estas proteínas de fusão também são abrangidos pela divulgação.
Exemplos de proteínas de fusão reportadas na literatura incluem fusões do receptor de células T (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 2936-2940 (1987)); CD4 (Capon et al., Nature 337: 525-531 (1989); Traunecker et al., Nature 339: 68-70 (1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9: 347-353 (1990); e Byrn et al., Nature 344: 667-670 (1990)); L-selectina (receptor de "homing") (Watson et al., J. Cell. Biol. 110: 2221-2229 (1990); e Watson et al., Nature 349: 164-167 (1991)); CD44 (Aruffo et al., Cell 61: 1303-1313 (1990) ); CD28 e B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173: 721-730 (1991) ); CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med. 174: 561-569 (1991)); CD22 (Stamenkovic et al., Cell 66: 1133-1144 (1991)); receptor de TNF (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 10535-10539 (1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27: 2883-2886 (1991); e Peppel et al., J. Exp. Med. 174: 1483-1489 (1991)); e receptor de IgE (Ridgway e Gorman, J. Cell. Biol. Vol. 115, Resumo No. 1448 (1991)).
Nalguns exemplos, anticorpos Sp35, fragmentos de anticorpos, seus derivados e variantes compreendem ainda uma porção de direccionamento. Porções de direccionamento incluem uma proteína ou um péptido que se dirige para a localização de uma determinada parte do corpo, por exemplo, o cérebro ou compartimentos no seu interior. Nalguns exemplos, anticorpos Sp35, fragmentos de anticorpos, seus derivados e variantes, são ligados ou fundidos a uma porção de direccionamento para o cérebro. As porções de direccionamento para o cérebro de 136 estão ligadas covalentemente (por exemplo, fusão por tradução directa, ou por ligação química, quer directamente ou através de uma molécula espaçadora, a qual pode ser opcionalmente clivável) ou não covalentemente (por exemplo, através de interacções reversíveis, tais como avidina, biotina, proteína A, IgG, etc.)· Noutros exemplos, os anticorpos Sp35, os fragmentos de anticorpos, seus derivados e variantes estão ligados a uma ou mais porções de direccionamento para o cérebro. Em exemplos adicionais, a porção de direccionamento cérebro está ligada a uma pluralidade de anticorpos Sp35, fragmentos de anticorpos, seus derivados e variantes.
Uma porção de direccionamento para o cérebro associada a um anticorpo Sp35, um fragmento de anticorpo, ou seu derivado ou variante aumenta a administração de tais anticorpos Sp35, fragmentos de anticorpos, seus derivados e variantes ao cérebro. Foram descritos uma série de polipéptidos que, quando fundidos a uma proteína ou agente terapêutico, administram a proteína ou agente terapêutico através da barreira hematoencefálica (BBB). Exemplos não limitativos incluem o anticorpo de domínio único FC5 (Abulrob et ai. (2005) J. Neurochem. 95, 1201-1214); mAB 83-14, um anticorpo monoclonal contra o receptor de insulina humana (Pardridge et al. (1995) Pharmacol. Res. 12, 807-816); os péptidos B2, B6 e B8 que se ligam ao receptor de transferrina humana (hTfR) (Xia et al. (2000) J. Virol. 74, 11359-11366); o anticorpo monoclonal 0X26 para o receptor de transferrina (Pardridge et al. (1991) J. Pharmacol. Exp. Ther. 259, 66-70); e SEQ ID NOs: 1-18 da Patente E.U.A. No. 6,306,365. A administração aumentada ao cérebro de um anticorpo SP35, fragmento de anticorpo, seu derivado ou variante, é determinada por uma série de meios bem estabelecidos na técnica. Por exemplo, a administração a um animal de um 137 anticorpo Sp35, fragmento de anticorpo, seu derivado e variante, fragmento de anticorpo, derivado e sua variante marcado radioactivamente, com fluorescência ou enzimaticamente ligado a uma porção de direccionamento para o cérebro; determinar a localização no cérebro; e comparar a localização com um anticorpo Sp35, fragmento de anticorpo, seu derivado e variante, fragmento de anticorpo, derivado e sua variante marcado radioactivamente, com fluorescência ou enzimaticamente equivalente que não está associada a uma porção de direccionamento para o cérebro. Outros meios para determinar um maior direccionamento são descritos nas referências acima.
Tal como aqui discutido noutro local, anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação podem ser fundidos com polipéptidos heterólogos, para aumentar a meia-vida in vivo dos polipéptidos ou para utilização em imunoensaios usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, num exemplo, o PEG pode ser conjugado aos anticorpos Sp35 da divulgação para aumentar a sua meia-vida in vivo. Leong, S.R., et al., Cytokine 16: 106 (2001); Adv. in Drug Deliv. Rev. 54: 531 (2002); ou Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30: 512 (2002) .
Além disso, anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação podem ser fundidos com sequências de marcador, tal como um péptido para facilitar a sua purificação ou detecção. Em exemplos preferidos, a sequência de aminoácidos marcadora é um péptido hexa-histidina, tal como a marcação fornecida num vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Califórnia, 91311), entre outros, muitos dos quais são comercialmente disponíveis. Conforme descrito em Gentz et al. Proc. Natl. 138
Acad. Sei. USA 86:821-824 (1989), por exemplo, a hexa-histidina proporciona a purificação conveniente da proteína de fusão. Outras marcações de péptidos úteis para a purificação incluem, mas não estão limitados a, a marcação "HA", que corresponde a um epitopo derivado da proteína hemaglutinina de influenza (Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) e a marcação "flag".
Proteínas de fusão podem ser preparadas usando métodos que são bem conhecidos na técnica (ver por exemplo Patentes dos E.U.A. Nos. 5,116,964 e 5,225,538). 0 local preciso em que a fusão é feita pode ser seleccionado empiricamente para optimizar as características de secreção ou de ligação da proteína de fusão. 0 ADN que codifica para a proteína de fusão é então transfectado para uma célula hospedeira para a expressão.
Anticorpos Sp35 ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes, ou derivados da divulgação podem ser utilizados na forma não conjugada ou podem ser conjugados com, pelo menos, um de uma variedade de moléculas, por exemplo, para melhorar as propriedades terapêuticas da molécula, para facilitar a detecção do alvo, ou para imagiologia ou terapia do paciente. Anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação podem ser marcados ou conjugados, quer antes ou depois da purificação, quando a purificação é realizada.
Em particular, anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação podem ser conjugados com agentes terapêuticos, pró-drogas, péptidos, proteínas, enzimas, lípidos, vírus, modificadores da resposta biológica, agentes farmacêuticos ou PEG. 139
Os especialistas na técnica apreciarão que os conjugados podem também ser montados utilizando uma variedade de técnicas, dependendo do agente seleccionado para ser conjugado. Por exemplo, conjugados com biotina são preparados, por exemplo, por reacção de um polipéptido de ligação com um éster activado da biotina tal como o éster de N-hidroxisuccinimida biotina. Do mesmo modo, conjugados com um marcador fluorescente podem ser preparados na presença de um agente de acoplamento, por exemplo, aqueles aqui listados, ou por reacção com um isotiocianato, de preferência fluoresceina-isotiocianato. Os conjugados dos anticorpos SP35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação são preparados de uma maneira análoga. A presente divulgação engloba ainda anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação conjugados com um agente de diagnóstico ou terapêutico. Os anticorpos SP35 podem ser usados para diagnóstico para, por exemplo, monitorizar o desenvolvimento ou a progressão de uma doença neurológica, como parte de um procedimento de ensaio clinico para, por exemplo, determinar a eficácia de um dado tratamento e/ou regime de prevenção. A detecção pode ser facilitada pelo acoplamento do anticorpo Sp35, ou seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado, a uma substância detectável. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos de prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, materiais radioactivos, metais emissores de positrões utilizando várias tomografias de emissão de positrões, e iões metálicos paramagnéticos não radioactivos. Ver, por exemplo, a Patente dos E.U.A. No. 4, 741, 900 para iões metálicos que podem ser conjugados com anticorpos para utilização como agentes de 140 diagnóstico de acordo com a presente divulgação. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, β-galactosidase, ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupos prostéticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansilo ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui o luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem a luciferase, a luciferina, e a aequorina, e exemplos de material radioactivo adequado incluem 125I, 131I, niln ou 99Tc.
Um anticorpo Sp35, ou seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado pode também ser marcado de forma detectável acoplando-o a um composto quimioluminescente. A presença do anticorpo quimioluminiscente Sp35 marcado é então determinada detectando a presença da luminescência que surge durante o decurso de uma reacção química. Exemplos de compostos de marcação quimioluminescentes particularmente úteis são o luminol, isoluminol, éster de acridínio teromático, imidazole, sal acridinio e éster de oxalato.
Uma das formas na qual um anticorpo Sp35, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado podem ser marcados de forma detectável é ligando-o a uma enzima e utilizar o produto ligado num imunoensaio enzimático (EIA) (Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)" Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2: 1-7 (1978)); Voller et al., J. Clin. Pathol. 31: 507-520 (1978); Butler, J. E., Meth. Enzymol. 73: 482-523 (1981); Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fia., (1980); Ishikawa, E. et al., (eds.), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tóquio 141 (1981) . A enzima, que está ligada ao anticorpo Sp35 irá reagir com um substrato apropriado, de preferência um substrato cromogénico, de forma a produzir uma porção química que pode ser detectada, por exemplo, por meios espectrofotométricos, fluorimétricos ou por visuais. As enzimas que podem ser utilizadas para marcar o anticorpo de forma detectável incluem, mas não estão limitados a, malato desidrogenase, nuclease de estafilococo, isomerase de delta-5-esteróide, a levedura da álcool desidrogenase, a alfa-glicerofosfato, desidrogenase, triose fosfato isomerase, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina , asparaginase, glucose oxidase, beta-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glucose-6-fosfato desidrogenase, glucoamilase e acetilcolinesterase. Além disso, a detecção pode ser conseguida por métodos colorimétricos que utilizam um substrato cromogénico para a enzima. A detecção pode também ser conseguida por comparação visual da extensão da reacção enzimática de um substrato em comparação com padrões preparados de modo semelhante. A detecção pode também ser conseguida utilizando qualquer um de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, por marcação radioactiva do anticorpo Sp35, ou seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado, é possível detectar o anticorpo através da utilização de um radioimunoensaio (RIA) (ver, por exemplo, Weintraub, B., Principies de Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, (Março, 1986)). 0 isótopo radioactivo pode ser detectado por meios incluindo, mas não limitado a, um contador de raios gama, um contador de cintilação, ou auto-radiografia.
Um anticorpo Sp35, ou seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado pode também ser marcado de forma 142 detectável utilizando metais emissores de fluorescência, tais como 152Eu, ou outros da série dos lantanideos. Estes metais podem ser ligados ao anticorpo utilizando grupos quelantes de metais tais como como o ácido dietilenotriaminapentacético (DTPA) ou ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Técnicas para conjugar várias porções de um anticorpo Sp35, ou seu fragmento de ligação de antigénio, variante ou derivado são bem conhecidas, ver, por exemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting of Drugs In Câncer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), Mareei Dekker, Inc., pp. 623-53 (1987); Thorpe, "Antibody Carriers de Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinicai Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective of The Therapeutic Use de Radiolabeled Antibody In Câncer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp. 303-16 (1985), e Thorpe et al., "The Preparation e Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62: 119-58 (1982).
VII. EXPRESSÃO DE POLIPÉPTIDOS DE ANTICORPOS
Como é bem conhecido, o ARN pode ser isolado a partir das células de hibridoma originais ou de outras células transformadas por meio de técnicas convencionais, tais como extraeção de isotiocianato de guanidínio e precipitação seguida por centrifugação ou cromatografia. Quando desejável, o mARN pode ser isolado a partir do ARN total por meio de técnicas convencionais, tais como cromatografia em oligo dT celulose. Técnicas adequadas são conhecidas na técnica. 143
Num exemplo, os cADNs que codificam para as cadeias leve e pesada do anticorpo podem preparados, simultaneamente ou separadamente, utilizando transcriptase reversa e polimerase de ADN de acordo com métodos bem conhecidos. A reacção de PCR pode ser iniciada por iniciadores da região constante de consenso ou por mais iniciadores específicos com base no ADN nas sequências de aminoácidos publicadas da cadeia pesada e leve. Como discutido acima, pode-se também usar PCR para isolar clones de ADN que codificam para as cadeias leve e pesada do anticorpo. Neste caso, as bibliotecas podem ser rastreadas por iniciadores de consenso ou sondas homólogas maiores, tais como sondas da região constante de rato. 0 ADN, tipicamente ADN plasmídico, pode ser isolado a partir das células utilizando técnicas conhecidas na técnica, com mapeamento de restrição e sequenciação de acordo com técnicas bem conhecidas convencionais apresentadas em detalhe, por exemplo, nas referências anteriores relativas a técnicas de ADN recombinante. Claro que, o ADN pode ser sintético de acordo com a presente divulgação em qualquer momento durante o processo de isolamento ou a análise subsequente.
Após a manipulação do material genético isolado para fornecer anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação, os polinucleótidos que codificam para os anticorpos Sp35 são tipicamente inseridos num vector de expressão para a introdução em células de um hospedeiro que podem ser utilizadas para produzir a quantidade desejada de anticorpo Sp35. A expressão recombinante de um anticorpo, ou de um seu fragmento, derivado ou análogo, por exemplo, uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo que se liga a uma molécula alvo aqui descrito, por exemplo, Sp35, requer a construção de 144 um vector de expressão que contenha um polinucleótido que codifica para o anticorpo. Uma vez obtido um polinucleótido que codifica para uma molécula de anticorpo de uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo, ou uma sua porção (de preferência contendo o domínio variável da cadeia pesada ou leve), da divulqação, o vector para a produção da molécula de anticorpo pode ser produzido por tecnologia de ADN recombinante usando técnicas bem conhecidas na técnica. Assim, os métodos para a preparação de uma proteína pela expressão de um polinucleótido contendo uma sequência de nucleótidos que codifica para o anticorpo são aqui descritos. Os métodos que são bem conhecidos dos peritos na técnica podem ser usados para construir vectores de expressão contendo sequências que codificam para o anticorpo e sinais de controlo da transcrição e da tradução apropriados. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas de síntese, e recombinação genética in vivo. A divulgação, assim, proporciona vectores replicáveis que compreendem uma sequência de nucleótidos que codifica para uma molécula de anticorpo da divulgação, ou uma sua cadeia leve ou pesada, ou um domínio variável de cadeia leve ou pesada, operacionalmente ligada a um promotor. Tais vectores podem incluir a sequência de nucleótidos que codifica para a região constante da molécula de anticorpo (ver, por exemplo, a publicação PCT WO 86/05807, Publicação PCT WO 89/01036, e Patente dos E.U.A. No. 5,122,464) e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado num tal vector de expressão da totalidade da cadeia pesada ou leve. A célula hospedeira pode ser co-transfectada com dois vectores da expressão, o primeiro vector codifica um polipéptido derivado de cadeia pesada e o segundo vector que codifica para um polipéptido derivado da cadeia leve. Os dois vectores podem conter marcadores seleccionáveis idênticos que 145 permitem uma expressão igual dos polipéptidos das cadeias pesada e leve. Alternativamente, um único vector pode ser usado que codifica para ambos os polipéptidos de cadeia pesadas e leves. Em tais situações, a cadeia leve é vantajosamente colocada antes da cadeia pesada para evitar um excesso de cadeia pesada sem tóxico (Proudfoot, Nature 322: 52 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 2197 (1980)). As sequências codificantes para as cadeias pesada e leve podem compreender cADN ou ADN genómico. O termo "vector" ou "vector de expressão" é aqui utilizado para significar vectores utilizados em conformidade com a presente divulgação, como um veiculo para introduzir no interior e expressar um gene desejado numa célula hospedeira. Como é conhecido dos peritos na técnica, tais vectores podem ser facilmente seleccionados de entre o grupo que consiste em plasmideos, fagos, virus e retrovirus. Em geral, os vectores compatíveis com a presente divulgação irão compreender um marcador de selecção, os locais de restrição adequados para facilitar a clonagem do gene desejado e a capacidade de entrar e/ou replicar-se em células eucarióticas ou procarióticas.
Para os fins da divulgação, podem ser empregues vários sistemas de vectores de expressão. Por exemplo, uma classe de vector utiliza elementos de ADN que derivam de vírus animais tais como vírus do papiloma bovino, virus polioma, adenovírus, vírus vaccinia, baculovírus, retrovirus (RSV, MMTV ou MoMLV) ou vírus SV40. Outros envolvem a utilização de sistemas policistrónicos com locais de ligação ao ribossoma internos. Além disso, as células que tenham integrado o ADN nos seus cromossomas podem ser seleccionadas através da introdução de um ou mais marcadores que permitem a selecção de células hospedeiras transfectadas. O marcador pode 146 proporcionar prototrofia a um hospedeiro auxotrófico, resistência a biocidas (por exemplo, antibióticos) ou resistência a metais pesados, tais como o cobre. 0 gene marcador seleccionável pode ser ou directamente ligado às sequências de ADN a serem expressas, ou introduzido na mesma célula por co-transformação. Elementos adicionais também podem ser necessários para a síntese óptima de mARN. Estes elementos podem incluir sequências de sinal, sinais de "splicing", assim como promotores da transcrição, potenciadores e sinais de terminação.
Em exemplos particularmente preferidos, os genes das regiões variáveis clonadas são inseridos num vector de expressão, em conjunto com os genes da região constante da cadeia pesada e leve (de preferência humanos) sintéticos, como discutido acima. Num exemplo, isto é conseguido utilizando um vector de expressão proprietário da Biogen IDEC, Inc., referido como NEOSPLA (Patente dos E.U.A. 6,159,730). Este vector contém o promotor/potenciador de citomegalovírus, o promotor principal beta globina de rato, a origem de replicação SV40, a sequência de poliadenilação da hormona de crescimento bovina, o exão 1 e exão 2 da neomicina fosfotransferase, o gene da di-hidrofolato redutase e a sequência líder. Verificou-se que este vector resultava num nível muito elevado de expressão de anticorpos mediante a incorporação de genes da região variável e constante, a transfecção em células CHO, seguido pela selecção em meio contendo G418 e amplificação de metotrexato. Claro que, qualquer vector de expressão que é capaz de induzir a expressão em células eucarióticas pode ser utilizado na presente divulgação. Exemplos de vectores adequados incluem, mas não estão limitados a plasmídeos PCDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl e pZeoSV2 (disponível de Invitrogen, San Diego, CA) , e o plasmídeo pCI 147 (disponível da Promega, Madison, WI). Em geral, o rastreio de grandes números de células transformadas para aquelas que expressam níveis apropriadamente elevados de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina é uma experimentação de rotina, que pode ser realizada, por exemplo, por sistemas robóticos. Sistemas de vectores também são ensinados na Patente dos E.U.A. Nos. 5,736,137 e 5,658,570. Este sistema proporciona níveis elevados de expressão, por exemplo,> 30 pg/célula/dia. Outros exemplos de sistemas de vectores são divulgados por exemplo, na Patente dos E.U.A. 6,413,777.
Noutros exemplos preferidos, os anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação podem ser expressos utilizando construções policistrónicas, tais como as revelados na Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2003-0157641 Al, depositado a 18 de Novembro de 2002. Nestes novos sistemas de expressão, vários produtos de gene de interesse, tais como as cadeias pesada e leve de anticorpos podem ser produzidos a partir de uma única construção policistrónica. Estes sistemas vantajosamente utilizam um local de entrada de ribossoma interno (IRES) para fornecer níveis relativamente elevados de anticorpos Sp35, por exemplo, polipéptidos de ligação, por exemplo, anticorpos específicos de Sp35 ou seus fragmentos destes imunoespecíficos em células hospedeiras eucarióticas. Sequências IREs compatíveis são divulgadas na Patente dos E.U.A. No. 6,193,980. Os peritos na técnica irão apreciar que tais sistemas de expressão podem ser utilizados para produzir de forma eficaz toda a gama de anticorpos Sp35 divulgados no presente pedido de patente.
De modo mais geral, uma vez preparado o vector ou sequência de ADN que codifica para uma subunidade monomérica do anticorpo Sp35, o vector de expressão pode ser introduzido 148 numa célula hospedeira apropriada. A introdução do plasmideo na célula hospedeira pode ser realizada por várias técnicas bem conhecidas dos peritos na técnica. Estas incluem, mas não estão limitadas a, transfecção (incluindo electroforese e electroporação), fusão de protoplastos, precipitação com fosfato de cálcio, fusão celular com ADN em envelope, microinjecção e infecção com o vírus intacto. Ver, Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Vectors, Rodriguez e Denhardt, Eds., Butterworths, Boston, Mass., Capítulo 24.2, pp. 470-472 (1988). Tipicamente, a introdução plasmideo no hospedeiro é através de electroporação. As células hospedeiras com a construção de expressão são cultivadas sob condições adequadas para a produção das cadeias leves e cadeias pesadas, e testadas para a síntese da proteína de cadeia pesada e/ou leve. Exemplos de técnicas de ensaio incluem ensaio de imunossorção associado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) ou análise de selecção de células activado por fluorescência (FACS), imuno-histoquímica e semelhantes. 0 vector de expressão é transferido para uma célula hospedeira através de técnicas convencionais e as células transfectadas são então cultivadas através de técnicas convencionais para produzir um corpo para utilização nos métodos aqui descritos. Assim, a divulgação inclui células hospedeiras que contêm um polinucleótido que codifica um anticorpo da divulgação, ou para uma cadeia pesada ou leve do mesmo, ligado operativamente a um promotor heterólogo. Em exemplos preferidos para a expressão de anticorpos de cadeia dupla, vectores que codificam para ambas as cadeias pesada e leve podem ser co-expressos na célula hospedeira para a expressão da totalidade da molécula de imunoglobulina, tal como detalhado abaixo. 149 refere-se a
Tal como aqui utilizado, "células hospedeiras" células que contêm vectores construídos utilizando técnicas de ADN recombinante e que codificam para pelo menos um gene heterólogo. Nas descrições de processos para o isolamento de anticorpos a partir de hospedeiros recombinantes, os termos "célula" e "cultura de células" são utilizados indiferentemente para indicar a fonte de anticorpo a menos que seja claramente indicado em contrário. Noutras palavras, a recuperação do polipéptido a partir das "células" pode significar a partir de células inteiras centrifugadas, ou a partir da cultura de células contendo tanto o meio como as células em suspensão.
Pode ser usada uma variedade de sistemas hospedeiro-vector de expressão para expressar as moléculas de anticorpo para utilização nos métodos aqui descritos. Tais sistemas hospedeiro-expressão representam veículos através dos quais as sequências de codificação de interesse podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas também representam células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências de codificação nucleotídicas apropriadas, expressar uma molécula de anticorpo da divulgação ín situ. Estas incluem, mas não estão limitadas a, microorganismos, tais como bactérias (por exemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas com vectores de expressão recombinante de ADN de bacteriófago, ADN plasmídico de ADN de cosmídeos contendo as sequências de codificação de anticorpo; levedura (por exemplo, Saccharomyces, Pichia) transformada com vectores de expressão de leveduras recombinantes contendo as sequências que codificam para os anticorpos; sistemas de células de insectos infectadas com vectores recombinantes de expressão de vírus (por exemplo, baculovírus) contendo as sequências que codificam para os anticorpos; sistemas de células vegetais infectadas com vectores recombinantes de 150 expressão de vírus (por exemplo, o vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; do vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformadas com vectores recombinantes de expressão plasmídicos (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo sequências de codificação de anticorpo; ou sistemas de células de mamífero (por exemplo, células COS, CHO, BLK, 293, 3T3) portadores de construções de expressão recombinantes contendo promotores derivados do genoma de células de mamíferos (por exemplo, promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamíferos (por exemplo, o promotor tardio do adenovírus, o promotor do vírus vaccinia 7,5 K) . De preferência, as células bacterianas tais como Escherichia coli, e mais preferencialmente, as células eucarióticas, em particular para a expressão da molécula de anticorpo recombinante inteira, são usados para a expressão de uma molécula de anticorpo recombinante. Por exemplo, células de mamífero tais como células de ovário de hamster chinês (CHO), em conjunto com um vector tal como elemento promotor do gene precoce intermediário principal do citomegalovírus humano é um sistema de expressão eficaz para anticorpos (Foecking et al., Gene 45: 101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8: 2 (1990)). A linha celular hospedeira utilizada para a expressão de proteínas é frequentemente de origem mamífera; aqueles peritos na técnica são creditados com a capacidade para determinar preferencialmente as linhas celulares hospedeiras particulares que são mais adequadas para o produto génico que se deseja aqui expressar. Exemplos de linhas celulares hospedeiras exemplares incluem, mas não estão limitadas a, CHO (Ovário de Hamster Chinês), DG44 e DUXB11 (linhas de Ovário de Hamster Chinês, sem DHFR), HELA (carcinoma cervical humano), CVI (linha de rim de macaco), COS (um derivado da CVI com o antigénio SV40 T), VERY, BHK (rim de hamster bebé), MDCK, 293, WI38, R1610 (fibroblastos de hamster chinês), 151 BALBC/3T3 (fibroblastos de rato), HAK (linha de rim de hamster), SP2/0 (mieloma de ratinho), P3x63-Ag3.653 (mieloma de ratinho), BFA-lclBPT (células endoteliais bovinas), RAJI (linfócitos humanos) e 293 (rim humano) . As células CHO são particularmente preferidas. Linhagens de células hospedeiras estão normalmente disponíveis a partir de serviços comerciais, da American Tissue Culture Collection ou da literatura publicada.
Além disso, uma estirpe de célula hospedeira pode ser escolhida que modula a expressão das sequências inseridas, ou modifica e processa o produto génico na forma específica desejada. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) de produtos proteicos podem ser importantes para a função da proteína. Células hospedeiras diferentes têm mecanismos característicos e específicos para o processamento e a modificação pós-tradução de proteínas e produtos génicos. Linhas celulares apropriadas ou sistemas hospedeiros podem ser escolhidos para assegurar a modificação e processamento correcta da proteína estranha expressa. Para este fim, podem ser utilizadas células hospedeiras eucarióticas que possuam a maquinaria celular para o processamento adequado do transcrito primário, glicosilação, e fosforilação do produto génico.
Para a produção em longo prazo, de alto rendimento de proteínas recombinantes, é preferida expressão estável. Por exemplo, as linhas celulares que expressam de forma estável da molécula de anticorpo pode ser manipulada. Em vez de usar vectores de expressão que contenham origens de replicação virais, as células hospedeiras podem ser transformadas com ADN controlado por elementos de controlo de expressão apropriados (por exemplo, promotor, intensificador, sequências, terminadores de transcrição, locais de 152 seleccionável. No poliadenilação, etc.), e um marcador seguimento da introdução do ADN estranho, as células manipuladas podem ser deixadas crescer durante 1-2 dias num meio enriquecido e depois são mudadas para um meio selectivo. 0 marcador seleccionável no plasmídeo recombinante confere resistência à selecção e permite às células integrarem estavelmente o plasmideo nos seus cromossomas e crescer para formar focos que por sua vez podem ser clonados e expandidos em linhas celulares. Este método pode ser vantajosamente utilizado para modificar linhas celulares que expressam de forma estável da molécula de anticorpo.
Podem ser usados diversos sistemas de selecção, incluindo, mas não se limitando à timidina-cinase do vírus do herpes simplex (Wigler et al., Cell 11: 223 (1977)), fosforribosiltransferase da hipoxantina-guanina (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48: 202 (1992)), e fosforribosiltransferase da adenina (Lowy et al., Cell 22: 817 1980) podem ser empregues em células, respectivamente, tk, hgprt ou aprt. Além disso, a resistência anti-metabolito pode ser utilizada como base de selecção para os genes seguintes: dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Wigler et al., Natl. Acad. Sei. USA 77: 357 (1980); 0'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 1527 (1981)); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 2072 (1981)); neo, que confere resistência ao aminoglicósido G-418 Clinicai Pharmacy 12: 488-505; Wu e Wu, Biotherapy 3: 87-95 (1991); Tolstoshev,
Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596 (1993); Mulligan, Science 260: 926-932 (1993); e Morgan e Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993); TIBTECH 11(5): 155-215 (Maio, 1993); e higro, que confere resistência à higromicina (Santerre et al., Gene 30: 147 (1984). Métodos vulgarmente conhecidos na técnica da tecnologia de ADN recombinante que 153 podem ser usados estão descritos em Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Blology, John Wiley & Sons, NI (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NI (1990); e nos Capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. (eds), Current Prolocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NI (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150: 1 (1981).
Os níveis de expressão de uma molécula de anticorpo podem ser aumentados através de amplificação do vector (para uma revisão, ver Bebbington e Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in manunalian cells in DNA cloning, Academic Press, Nova Iorque, Vol. 3. (1987)). Quando um marcador no sistema de vector que expressa o anticorpo é amplificável, aumento do nível de inibidor presente na cultura de célula hospedeira irá aumentar o número de cópias do gene marcador. Uma vez que a região amplificada está associada ao gene do anticorpo, a produção do anticorpo também irá aumentar (Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3: 257 (1983)). A produção in vitro permite aumento de escala para se obter grandes quantidades dos polipéptidos desejados. Técnicas para o cultivo de células de mamíferos sob condições de cultura de tecido são conhecidas na técnica e incluem cultura em suspensão homogénea, por exemplo, num reactor airlift ou num reactor de agitação contínua, ou cultura de células imobilizadas, por exemplo, em fibras ocas, microcápsulas, em microesferas de agarose ou cartuchos de cerâmica. Se necessário e/ou desejado, as soluções de polipéptidos podem ser purificadas pelos métodos de cromatografia habituais, por exemplo filtração em gel, cromatografia de permuta troca iónica, cromatografia sobre DEAE-celulose ou cromatografia de (imuno-)afinidade, por exemplo, depois da biossíntese 154 preferencial de um polipéptido da região "hinge" sintético, ou antes ou depois da etapa de cromatografia HIC aqui descrito.
Os genes que codificam para os anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação também podem ser expressos em células que não são de mamífero, tais como bactérias ou leveduras ou células vegetais. Bactérias que facilmente incorporam ácidos nucleicos incluem membros da família Enterobacteriaceae, tais como estirpes de Escherichia coli ou Salmonella; Bacillaceae, tais como Bacillus subtilis; pneumococos, estreptococos, e Haemophilus influenzae. Será ainda apreciado que, quando expressos em bactérias, os polipéptidos heterólogos normalmente fazem parte de corpos de inclusão. Polipéptidos heterólogos deve ser isolados, purificados e em seguida montados em moléculas funcionais. Quando são desejadas formas de anticorpos tetravalentes, as subunidades, irão então se auto-associar em anticorpos tetravalentes (WO02/096948A2).
Nos sistemas bacterianos, uma série de vectores de expressão podem ser vantajosamente seleccionados dependendo da utilização pretendida para a molécula de anticorpo a ser expressa. Por exemplo, quando se pretende produzir uma grande quantidade de tal proteína, para a preparação de composições farmacêuticas de uma molécula de anticorpo, os vectores que dirigem a expressão de elevados níveis de produtos proteicos de fusão que sejam facilmente purificados podem ser desejáveis. Tais vectores incluem, mas não estão limitados, ao vector de expressão de E. coli pUR278 (Ruther et ai., EMBO J. 2: 1791 (1983)), em que a sequência de codificação de anticorpo pode ser ligada individualmente no vector em gralha com a região que codifica para lacZ de forma que seja produzida uma proteína de fusão; vectores pIN (Inouye e 155
Inouye, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109 (1985); Van Heeke e Schuster, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509 (1989)); e semelhantes, vectores pGEX podem também ser utilizados para expressar polipéptidos estranhos como proteínas de fusão com glutationa-S-transferase (GST). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas das células lisadas por adsorção e ligação a uma matriz de esferas de glutationa-agarose seguida da eluição na presença de glutationa livre. Os vectores pGEX são concebidos para incluir locais de clivagem de trombina ou do factor protease Xa de modo que o produto génico alvo clonado possa ser libertado da porção GST.
Além dos procariotas, podem também ser utilizados micróbios eucarióticos. Saccharomyces cerevisiae, ou levedura de padeiro comum, é o mais vulgarmente utilizado entre os microorganismos eucariotas, embora um número de outras estirpes estão normalmente disponíveis, por exemplo, de Pichia pastoris.
Para a expressão em Saccharomyces, o plasmídeo YRp7, por exemplo, (Stinchcomb et al.r Nature 282: 39 (1979); Kingsman et al.r Gene 7: 141 (1979); Tschemper et al.r Gene 10: 157 (1980)) é normalmente utilizado. Este plasmídeo já contém o gene TRP1 que proporciona um marcador de selecção para uma estirpe mutante de levedura sem a capacidade de crescer em triptofano, por exemplo ATCC No. 44076 ou PEP4-1 (Jones, Genetics 85: 12 (1977)). A presença da deficiência trpl como uma característica do genoma da célula hospedeira de levedura proporciona então um ambiente eficaz para detectar a transformação através do crescimento na ausência de triptofano. 156
Num sistema de insecto, utiliza-se tipicamente o vírus da poliedrose nuclear Autographa californica (AcNPV) usado como um vector para expressar genes estranhos. 0 vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. A sequência que codifica para o anticorpo pode ser clonada individualmente em regiões não essenciais (por exemplo o gene da poliedrina) do vírus e colocada sob controlo de um promotor de AcNPV (por exemplo o promotor da poliedrina).
Uma vez que uma molécula de anticorpo da divulgação tenha sido expressa de modo recombinante, pode ser purificada por qualquer método conhecido na técnica para a purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, de permuta iónica, de afinidade, particularmente de afinidade para o antigénio específico após Proteína A, e cromatografia exclusão molecular em coluna), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica convencional para a purificação de proteínas. Alternativamente, um método preferido para aumentar a afinidade dos anticorpos da divulgação é divulgado em US 2002 0123057 Al. VIII. MÉTODOS DE TRATAMENTO USANDO ANTICORPOS Sp35
TERAPÊUTICOS
Tal como aqui descrito, anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes, ou derivados da divulgação podem aliviar a inibição mediada NgRl de extensão dos axónios que normalmente tem lugar em neurónios do SNC. Isto é benéfico em situações onde é necessária extensão dos axónios ou desenvolvimento de neurites no cérebro ou na medula espinal. Lesões na medula espinal, incluindo esmagamento ou ruptura total ou parcial, exemplifica uma situação em que é necessária extensão dos axónios, mas em que é normalmente inibida através de uma operação da via Nogo. 157
Exemplos de doenças ou distúrbios em que a extensão dos axónios e/ou o surgimento das neurites no cérebro seriam benéficas incluem o acidente vascular, esclerose múltipla e outras doenças ou distúrbios neurodegenerativos tais como a esclerose múltipla (MS), a leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), a encefalomielite (EPL), a mielose pôntica central (CPM), a adrenoleucodistrofia, a doença de Alexander, a doença de Pelizaeus Merzbacher (PMZ), a leucodistrofia de células globóides (doença de Krabbe) e degeneração Walleriana, neurite óptica, mielite transversal, esclerose lateral amiotrófica (ELA), a doença de Huntington, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, lesão medular, traumatismo crânio-encefálico, lesão pós-radiação, as complicações neurológicas da quimioterapia, acidente vascular cerebral, neuropatia, neuropatia óptica isquémica aguda, deficiência de vitamina E, sindrome da deficiência de vitamina E isolada, AR, sindrome de Bassen-Kornzweig, sindrome de Marchiafava-Bignami, leucodistrofia metacromática, neuralgia trigeminal, paralisia de Bell, lesão da medula espinal e todas as doenças neurológicas relacionadas com a morte celular neuronal.
Os inventores descobriram ainda que Sp35 é expresso em oligodendrócitos, e contribui para a biologia dos oligodendrócitos. Derivados solúveis de Sp35, certos polinucleótidos (por exemplo, ARNi), bem como determinados anticorpos que se ligam especificamente a Sp35, como aqui descrito actuam como antagonistas para a função Sp35 em oligodendrócitos, promovendo a proliferação, diferenciação e sobrevivência de oligodendrócitos e promovendo a mielinização dos neurónios in vitro e in vivo. Isso é benéfico para doenças, distúrbios ou condições que envolvem a desmielinização e dismielinização. Exemplos de doenças ou distúrbios em que a proliferação, diferenciação e sobrevivência de oligodendrócitos e/ou a mielinização ou remielinização seriam benéficas incluem a esclerose múltipla 158 (MS), a leucoencefalopatia multifocal progressiva (PML), a encefalomielite (EPL), a mielose pôntica central (CPM), a adrenoleucodistrofia, a doença de Alexander, a doença de Pelizaeus Merzbacher (PMZ), leucodistrofia de células Globóides (doença de Krabbe), a degeneração Wallerina, a neurite óptica, a mielite transversal, a esclerose lateral amiotrófica (ELA), a doença de Huntington, a doença de Alzheimer, a doença de Parkinson, lesões da medula espinal, lesão traumática do cérebro, lesão pós-radiação, complicações neurológicas da quimioterapia, acidente vascular cerebral, neuropatia óptica isquémica aguda, deficiência de vitamina E, síndrome da deficiência de vitamina E isolada, AR, síndrome de Bassen-Kornzweig, síndrome Marchiafava-Bignami, leucodistrofia metacromática, neuralgia trigeminal e paralisia de Bell.
Assim, um exemplo da presente divulgação proporciona métodos para o tratamento de lesões da medula espinal, doenças ou distúrbios associados com a inibição do crescimento neuronal no SNC, doenças ou distúrbios associados com a inibição do crescimento ou diferenciação de oligodendrócitos, e doenças que envolvem desmielinização ou dismielinação de neurónios do SNC num animal que sofra de uma tal lesão ou doença, ou que tenha predisposição em contrair tal doença, o método compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo na administração ao animal de uma quantidade eficaz de um anticorpo Sp35, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio , variante, ou derivado. Os anticorpos da divulgação são aqui descritos, e incluem os anticorpos monoclonais listados na Tabela 3A e 3B, os anticorpos que se ligam especificamente ao mesmo epitopo como os anticorpos monoclonais listados na Tabela 3A e 3B, os anticorpos que inibem competitivamente a ligação dos anticorpos monoclonais listados na Tabela 3A e 3B para Sp35, e compreendendo polipéptidos e anticorpos 159 derivados a partir dos anticorpos monoclonais indicados na Tabela 3A e 3B.
Um anticorpo Sp35 terapêutico a ser utilizado em métodos de tratamento aqui descritos pode ser preparado e utilizado como um agente terapêutico que promove o crescimento de neurites do SNC, a sobrevivência neuronal, a orientação dos axónios e regeneração dos axónios, que promove a sobrevivência, o crescimento e/ou a diferenciação de oligodendrócitos, e que promove a mielinização ou remielinização de neurónios do SNC. Caracteristicas de anticorpos Sp35 terapêuticos adequados incluem: ligação a epitopos Sp35 que resultam no bloqueio da actividade Sp35, ligação a Sp35 com afinidade suficiente para induzir um efeito terapêutico, e ligação a Sp35 preferencialmente a parceiros de ligação normais, por exemplo, receptor Nogo.
Anticorpos Sp35 terapêuticos podem ser anticorpos monoclonais, quiméricos ou humanizados, ou fragmentos de anticorpos que se ligam especificamente a Sp35. Os anticorpos podem ser anticorpos monovalentes, bivalentes, polivalentes, ou bifuncionais. Os fragmentos de anticorpos incluem, sem limitação, Fab, F(ab')2 e Fv.
Anticorpos Sp35 terapêuticas ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados de acordo com a divulgação podem ser utilizados na forma não conjugada ou não marcada, ou podem ser acoplados ou ligados a fármacos, marcações ou agentes de estabilização que podem ou não exercer efeitos terapêuticos adicionais. A dosagem especifica e o regime de tratamento para qualquer paciente em particular dependerá de uma variedade de factores, incluindo o anticorpo particular Sp35, ou seu 160 fragmento de ligação ao antigénio, variante ou derivado utilizado, a idade, o peso corporal, a saúde geral, o sexo e a dieta do paciente, e o tempo de administração, a taxa de excreção, a combinação de fármacos, e a gravidade da doença particular a ser tratada. 0 julgamento de tais factores por prestadores de cuidados de saúde está no âmbito da perícia vulgar na técnica. A quantidade também irá depender do paciente individual a ser tratado, da via de administração, do tipo de formulação, das características do composto utilizado, da gravidade da doença, e do efeito desejado. A quantidade utilizada pode ser determinada por princípios farmacológicos e farmacocinéticos bem conhecidos na técnica.
Nos métodos da divulgação, os anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados, podem ser administrados directamente ao sistema nervoso, por via intracerebroventricular, ou por via intratecal, por exemplo, numa lesão crónica de EM, tal como discutido em maior detalhe abaixo.
Em vários exemplos, um anticorpo Sp35, como descrito acima é um antagonista da actividade de SP35. Em certos casos, por exemplo, a ligação de um anticorpo de Sp35 antagonista a Sp35, como expresso em neurónios, bloqueia a inibição do crescimento de neurites associada à mielina ou a morte celular neuronal. Noutros exemplos, a ligação do anticorpo Sp35 a Sp35, como expresso em oligodendrócitos, bloqueia a inibição do crescimento ou diferenciação de oligodendrócitos, ou bloqueia a desmielinização ou dismielinação de neurónios do SNC.
Em métodos da divulgação, um anticorpo SP35, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado, em especial os anticorpos Sp35 aqui descritos, pode ser administrados directamente como um polipéptido preformado, ou 161 ácido nucleico, para benéfico, promover a sobrevivência de mielinização ou a indirectamente através um vector de permitir o crescimento de axónios proliferação, diferenciação e oligodendrócitos e/ou promover a remielinização.
Nalguns exemplos, um sujeito pode ser tratado com uma molécula de ácido nucleico que codifica para um anticorpo Sp35, ou seu fragmento de ligação ao antigénio, a variante, ou análogo, por exemplo, num vector. As doses de ácidos nucleicos que codificam para polipéptidos variam de cerca de 10 ng a 1 g, 100 ng a 100 mg, 1 pg a 10 mg, ou 30-300 yg de ADN por doente. As doses para vectores virais infecciosos variam desde 10-100 ou mais, partículas virais por dose.
Nalguns exemplos da divulgação, um anticorpo Sp35, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado é administrado num método de tratamento, que inclui: (1) transformação ou transfecção de uma célula hospedeira implantável com um ácido nucleico, por exemplo, um vector, que expressa um anticorpo Sp35, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado, e (2) a implantação da célula hospedeira transformada num mamífero, no local de uma doença, distúrbio ou lesão. Por exemplo, a célula hospedeira transformada pode ser implantada no local de uma lesão na medula espinal ou num local de dismielinação. Nalguns exemplos da divulgação, a célula hospedeira implantável é removida a de um mamífero, temporariamente cultivadas, transformada ou transfectada com um ácido nucleico isolado que codifica para um anticorpo SP35, e implantada de volta para o mesmo mamífero da qual foi removido. A célula pode ser, mas não é necessário, removida do mesmo local no qual é implantada. Tais exemplos, por vezes conhecidos na como terapia génica ex vivo, pode proporcionar 162 um fornecimento contínuo do polipéptido Sp35 polipéptido, localizado no local do local de acção, durante um período de tempo limitado.
Os métodos para tratar a lesão da medula espinal, as doenças ou distúrbios associados com a inibição do crescimento neuronal no SNC, doenças ou distúrbios associados com a inibição do crescimento ou diferenciação de oligodendrócitos, e doenças que envolvem a desmielinização ou dismielinação de neurónios do SNC compreendendo a administração de um anticorpo Sp35, ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante ou derivado da divulgação são tipicamente testados in vitro, e depois in vivo, num modelo animal aceitável, para a actividade terapêutica ou profilática desejada, antes do uso em seres humanos. Modelos animais adequados, incluindo animais transgénicos, são bem conhecidas dos competentes na técnica. Por exemplo, ensaios in vitro para demonstrar a utilidade terapêutica do anticorpo Sp35 aqui descritos incluem o efeito de um anticorpo Sp35 numa linha celular ou numa amostra de tecido de um paciente. 0 efeito do anticorpo Sp35 na linha celular e/ou amostra de tecido pode ser determinada utilizando técnicas conhecidas pelos especialistas na técnica, tais como os ensaios divulgados aqui noutro lado. De acordo com a divulgação, ensaios in vitro que podem ser utilizados para determinar se é indicada a administração de um anticorpo específico Sp35, incluem ensaios de cultura de células in vitro em que uma amostra de tecido do paciente é crescida em cultura e exposta ou de outro modo um composto administrado, e o efeito desse composto sobre a amostra do tecido é observada.
Compostos activos suplementares podem também ser incorporados nas composições da divulgação. Por exemplo, um anticorpo Sp35, ou seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou 163 derivado da divulgação pode ser co-formulado com e/ou co-administrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. A divulgação abrange qualquer método de administração adequado para um anticorpo Sp35, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado da divulgação a tecido alvo seleccionado, incluindo a injecção em bolus de uma solução aquosa ou a implantação de um sistema de libertação controlada. A utilização de um implante de libertação controlada reduz a necessidade de injecções repetidas.
IX. COMPOSIÇÕE FARMACÊUTICAS E MÉTODOS DE ADMINISTRAÇÃO
Os métodos para preparar e administrar Anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação a um sujeito que deles necessite são bem conhecidos ou são facilmente determinados pelos peritos na técnica. A via de administração do anticorpo Sp35, ou seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado, pode ser, por exemplo, oral, parenteral, por inalação ou tópica. 0 termo parenteral como aqui utilizado inclui, por exemplo, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, rectal ou vaginal. Embora todas estas formas de administração sejam claramente contempladas como estando dentro do âmbito da divulgação, uma forma para administração seria uma solução injectável, em particular, para injecção ou gotejamento intravenoso ou intra-arterial. Geralmente, uma composição farmacêutica adequada para injecção pode compreender um tampão (por exemplo, tampão acetato, fosfato ou citrato), um surfactante (por exemplo, polissorbato), opcionalmente, um agente estabilizador (por exemplo albumina), etc. No entanto, noutros métodos compatíveis com os ensinamentos do presente documento, anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, 164 variantes, ou derivados da divulgação podem ser administrados directamente ao local da população celular adversa, aumentando assim a exposição do tecido doente ao agente terapêutico.
Tal como discutido anteriormente, anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação podem ser administrados numa quantidade farmaceuticamente eficaz para o tratamento in vivo da lesão da medula espinal em mamíferos, das doenças ou distúrbios associados à inibição do crescimento neuronal no SNC, das doenças ou distúrbios associados à inibição do crescimento ou diferenciação de oligodendrócitos, e de doenças que envolvem a desmielinização ou dismielinação do SNC. A este respeito, deve notar-se que os anticorpos descritos serão formulados de modo a facilitar a administração e promover a estabilidade do agente activo. De preferência, as composições farmacêuticas de acordo com a divulgação compreendem um veículo estéril, não-tóxico, farmaceuticamente aceitável, tal como solução salina fisiológica, tampões não-tóxicos, conservantes e semelhantes. Para os efeitos do presente pedido de patente, uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um anticorpo Sp35, ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado, conjugado ou não conjugado, significará uma quantidade suficiente para alcançar uma ligação eficaz ao alvo e alcançar um benefício, por exemplo, para melhorar os sintomas de uma doença ou distúrbio ou para detectar uma substância ou uma célula.
As composições farmacêuticas compreendem veículos farmaceuticamente aceitáveis, incluindo, por exemplo, permutadores de iões, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas séricas, tais como albumina de soro humana, substâncias tampão, tais como fosfatos, glicina, 165 ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas de glicéridos parciais de ácidos gordos vegetais, água, sais ou electrólitos, tais como sulfato de protamina, hidrogenofosfato dissódico, hidrogenofosfato de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinilpirrolidona, substâncias à base de celulose, polietileno glicol, carboximetilcelulose de sódio, poliacrilatos, ceras, polímeros de blocos de polietileno-polioxipropileno, polietilenoglicol e lanolina.
As preparações para administração parenteral incluem soluções, suspensões e emulsões estéreis aquosas ou não-aquosas. Exemplos de solventes não-aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais tais como azeite, e ésteres orgânicos injectáveis tais como oleato de etilo. Os veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo meios salinos e tamponados. Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, 0,01-0,1 M e preferentemente 0,05 M de tampão fosfato ou 0,8% de solução salina. Outros veículos parenterais comuns incluem soluções de fosfato de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, lactato de Ringer ou óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluidos e nutrientes, reabastecedores de electrólitos, tais como aqueles baseados em dextrose de Ringer, e semelhantes. Conservantes e outros aditivos podem também estar presentes tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, e gases inertes e semelhantes.
Mais particularmente, composições farmacêuticas adequadas para utilização injectável incluem soluções aquosas estéreis (quando solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação prévia de soluções ou dispersões injectáveis 166 estéreis. Em tais casos, a composição deve ser estéril e deve ser fluida na medida em que possibilita o fácil processamento por seringa. Deve ser estável sob as condições de fabrico e armazenamento e será de preferência preservada contra a acção contaminante de microorganismos, tais como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e semelhantes), e misturas adequadas destes. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pela utilização de surfactantes. As formulações adequadas para utilização nos métodos terapêuticos aqui descritos são descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., 16a ed. (1980) . A prevenção da acção de microorganismos pode ser conseguida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis, tais como, sorbitol, manitol ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injectáveis pode ser conseguida pela inclusão na composição de um agente que atrase a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
Em qualquer caso, as soluções injectáveis estéreis podem ser preparadas através da incorporação de um composto activo (por exemplo, um anticorpo Sp35, ou seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado, por si só ou em combinação com outros agentes activos) na quantidade necessária de um solvente apropriado com um ou uma combinação dos ingredientes 167 aqui enumerados, conforme necessário, seguido de esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação do composto activo num veiculo estéril, que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários entre os enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são a secagem sob vácuo e a liof ilização, que resultam num pó do ingrediente activo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma sua solução previamente esterilizada por filtração. As preparações para injecção são processadas, introduzidas em recipientes tais como ampolas, bolsas, garrafas, seringas ou frascos, e seladas em condições assépticas de acordo com métodos conhecidos na técnica. Além disso, as preparações podem ser embaladas e vendidas sob a forma de um kit, tais como aqueles descritos na patente co-pendente U.S.S.N. 09/259,337 (US-2002-0102208 Al). Tais artigos de fabrico terão preferivelmente rótulos ou folhetos informativos indicando que as composições associadas são úteis para o tratamento de um indivíduo que sofra de, ou com predisposição para, doenças auto-imunes ou neoplásicas.
As formulações parentéricas podem ser uma única dose de bolus, uma infusão ou uma dose de bolus inicial seguida de uma dose de manutenção. Estas composições podem ser administradas em intervalos fixos ou variáveis específicos, por exemplo, uma vez por dia, ou numa base "conforme necessário".
Certas composições farmacêuticas podem ser administradas oralmente numa forma de dosagem aceitável, incluindo, por exemplo, cápsulas, comprimidos, suspensões ou soluções aquosas. Certas composições farmacêuticas podem também ser administradas por aerossol nasal ou inalação. Tais 168 composições podem ser preparadas como soluções em solução salina, utilizando álcool benzilico ou outros conservantes adequados, promotores de absorção para aumentar a biodisponibilidade, e/ou outros agentes solubilizantes ou dispersantes convencionais. A quantidade de um anticorpo SP35, ou um seu fragmento, variante, ou derivado, que pode ser combinada com os materiais veiculo para produzir uma forma de dosagem única irá variar dependendo do hospedeiro tratado e do modo particular de administração. A composição pode ser administrada como uma dose única, doses múltiplas ou ao longo de um período de tempo estabelecido numa infusão. Os regimes de dosagem também podem ser ajustados para proporcionar a resposta desejada óptima (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profilática).
De acordo com o âmbito da presente divulgação, anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação podem ser administrados a um ser humano ou outro animal de acordo com os métodos de tratamento acima mencionados numa quantidade suficiente para produzir um efeito terapêutico. Os anticorpos SP35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação podem ser administrados a esse ser humano ou outro animal numa forma de dosagem convencional preparada por combinação do anticorpo da divulgação com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável convencional de acordo com técnicas conhecidas. Será reconhecido por um perito na técnica que a forma e carácter do veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável é ditada pela quantidade de ingrediente activo com a qual se pretende combinar, a via de administração e outras variáveis bem conhecidas. Os peritos na técnica irão apreciar que um cocktail que compreende uma 169 ou mais espécies de anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação pode revelar-se particularmente eficaz.
Doses eficazes das composições da divulgação, para o tratamento de lesões da medula espinal, doenças ou distúrbios associados com a inibição do crescimento neuronal no SNC, doenças ou distúrbios associados com a inibição do crescimento ou diferenciação de oligodendrócitos, e doenças envolvendo desmielinização ou dismielinação do SNC irão variar dependendo de muitos factores diferentes, incluindo os meios de administração, local alvo, o estado fisiológico do paciente, se o paciente é um ser humano ou um animal, outros medicamentos administrados, e se o tratamento é profilático ou terapêutico. Normalmente, o paciente é um ser humano, mas mamíferos não humanos, incluindo mamíferos transgénicos podem também ser tratados. As dosagens de tratamento podem ser tituladas utilizando métodos de rotina conhecidos pelos peritos na técnica para optimizar a segurança e eficácia.
Para o tratamento de lesões da espinal medula, doenças ou distúrbios associados com a inibição do crescimento neuronal no SNC, doenças ou distúrbios associados com a inibição do crescimento ou diferenciação de oligodendrócitos, e doenças que envolvem a desmielinização ou dismielinização do SNC com um anticorpo Sp35, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado, a dosagem pode variar, por exemplo, a partir de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais usualmente de 0,01 a 5 mg/kg (por exemplo, 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etc.), do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser de 1 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal, ou dentro da gama de 1-10 mg/kg, de preferência pelo menos 1 mg/kg. Pretende-se que as doses intermédias nas gamas acima 170 referidas também estão no âmbito da divulgação. Podem-se administradas a indivíduos tais doses diariamente, em dias alternados, semanalmente ou de acordo com qualquer outro programa determinado por análise empírica. Um exemplo de tratamento envolve a administração em doses múltiplas ao longo de um período prolongado, por exemplo, de pelo menos seis meses. Exemplos adicionais de regimes de tratamento implicam a administração uma vez em cada duas semanas ou uma vez por mês ou uma vez a cada 3 a 6 meses. Exemplos de regimes de dosagem incluem 1-10 mg/kg ou 15 mg/kg em dias consecutivos, 30 mg/kg em dias alternados ou 60 mg/kg semanalmente. Nalguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com diferentes especificidades de ligação são administrados simultaneamente, caso em que a dosagem de cada anticorpo administrado situa-se no interior dos intervalos indicados.
Anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação podem ser administrados em múltiplas ocasiões. Os intervalos entre as doses individuais podem ser diários, semanais, mensais ou anuais. Os intervalos podem ser igualmente irregulares conforme indicado pela medição dos níveis no sangue do polipéptido alvo ou a molécula alvo no paciente. Nalguns métodos, a dose é ajustada para alcançar uma concentração de polipéptido no plasma de 1-1000 pg/ml e, nalguns métodos 25-300 pg/ml. Alternativamente, anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação podem ser administrados como uma formulação de libertação sustentada, e nesse caso é necessária uma administração menos frequente. A dosagem e a frequência variam dependendo da meia-vida do anticorpo no paciente. A meia-vida de um anticorpo Sp35 também pode ser prolongada por meio da fusão a uma porção ou polipéptido estável, por exemplo, PEG ou 171 albumina. Em geral, os anticorpos humanizados apresentam a meia-vida mais longa, seguidos pelos anticorpos quiméricos e anticorpos não-humanos. Num exemplo, os anticorpos SP35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou seus derivados da divulgação podem ser administrados numa forma não conjugada. Noutro exemplo, os anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes, ou seus derivados da divulgação podem ser administrados várias vezes sob a forma conjugada. Ainda noutro exemplo, anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação podem ser administrados numa forma não conjugada, de seguida na forma conjugada, ou vice-versa.
As composições da divulgação podem ser administrados por qualquer método apropriado, por exemplo, por via parenteral, por via intraventricular, por via oral, por spray para inalação, por via tópica, por via rectal, por via nasal, por via bucal, por via vaginal ou através de um reservatório implantado. 0 termo "parenteral", tal como aqui utilizado, inclui técnicas de injecção ou infusão subcutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-sinovial, intra-esternal, intratecal, intra-hepática, intralesional e intracraniana ou técnicas de infusão. Tal como descrito anteriormente, anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação actuam no sistema nervoso para promover a sobrevivência, a proliferação e a diferenciação de oligodendrócitos e mielinização de neurónios e a sobrevivência neuronal, regeneração de axónios e orientação do axónio. Consequentemente, nos métodos da divulgação, os anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados, são administrados de tal forma que eles atravessam a barreira hematoencefálica. Este cruzamento pode ser devido às propriedades físico-químicas inerentes da própria molécula de anticorpo SP35, de 172 outros componentes numa formulação farmacêutica, ou da utilização de um dispositivo mecânico, tal como uma agulha, cânula ou instrumentos cirúrgicos para romper a barreira hematoencefálica. Quando o anticorpo Sp35 é uma molécula que não atravessa inerentemente a barreira hematoencefálica, por exemplo, uma fusão de uma fracção que facilita a travessia, as vias adequadas de administração são, por exemplo, intratecal ou intracraniana, por exemplo, directamente para uma lesão crónica de EM. Quando o anticorpo Sp35 é uma molécula que inerentemente atravessa a barreira hematoencef álica, a via de administração pode ser por uma ou mais das várias vias descritas abaixo. Nalguns métodos, os anticorpos são administrados como uma composição ou dispositivo de libertação prolongada, tal como um dispositivo Medipad™. A administração através da barreira hematoencefálica pode ser melhorada por uma molécula de transporte, tais como um receptor anti-Fc, a transferrina, receptor anti-insulina ou de um conjugado de toxina ou potenciador de penetração.
Os anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados, utilizados nos métodos da divulgação podem ser directamente introduzidos no cérebro. Vários implantes para infusão directa no cérebro de compostos são conhecidos e são eficazes para a administração de compostos terapêuticos aos pacientes humanos que sofrem de distúrbios neurológicos. Estes incluem a infusão crónica para o cérebro utilizando uma bomba, implantação estereotáctica, cateteres intersticiais temporários, implantes de cateteres intracranianos permanentes, e implantes biodegradáveis implantados cirurgicamente. Ver, por exemplo, Gill et al., "Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease," Nature Med. 9: 589-95 (2003); Scharfen et al., "High Activity Iodine-125 173
Interstitial Implant For Gliomas," Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 24 (4): 583-91 (1992); Gaspar et al., "Permanent 125I Implants for Recurrent Malignant Gliomas," Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 43(5): 977-82 (1999); capitulo 66, páginas 577-580, Bellezza et al., "Stereotactic Interstitial Brachytherapy," em Gildenberg et al. , Textbook of Stereotactic and Functional Neurosurgery, McGraw-Hill (1998); e Brem et al., "The Safety de Interstitial Chemotherapy with BCNU-Loaded Polymer Followed by Radiation Therapy in the Treatment of Newly Diagnosed Malignant Gliomas: Phase I Trial", J. Neuro-Oncology 26: 111-23 (1995).
As composições podem também compreender um anticorpo Sp35 disperso num material transportador biocompatível que funciona como um administração adequado ou sistema de suporte para os compostos. Exemplos apropriados de veículos de libertação sustentada incluem matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de artigos moldados, tais como supositórios ou cápsulas. As matrizes de libertação sustentada microcapsular ou implantáveis incluem polilactidos (Patente dos E.U.A. No. 3,773,319, EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers 22: 547-56 (1985)); poli(2-hidroxietil-metacrilato), etileno vinil acetato (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12: 98-105 (1982)) ou ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133,988).
Nalguns exemplos da divulgação, um anticorpo SP35, ou seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado da divulgação é administrado a um paciente através de infusão directa a uma região apropriada do cérebro. Ver, por exemplo, Gill et ai, supra. Técnicas alternativas estão disponíveis e podem ser aplicadas para administrar um anticorpo Sp35 de 174 acordo com a divulgação. Por exemplo, a colocação de um cateter ou implante estereotáctico pode ser realizada utilizando a unidade de Riechert-Mundinger e a unidade localizante multiuso ZD (Zamorano-Dujovny). A tomografia computadorizada com aumento de contraste (TC), injectando 120 ml de Omnipaque, 350 mg de iodo/ml, com 2 mm de espessura de fatia pode permitir o planeamento de tratamento multiplanar tridimensional (STP, Fischer, Freiburg, Alemanha). Este equipamento permite o planeamento na base em estudos de imagiologia de ressonância magnética, consolidando a informação da TC e do alvo IRM para confirmação clara do alvo. O sistema estereotáctico Leksell (Downs Surgical, Inc., Decatur, GA), modificado para utilização com um digitalizador CT GE (General Electric Company, Milwaukee, WI), bem como o sistema de estereotáctico Brown-Roberts-Wells (BRW) (Radionics, Burlington, MA) pode ser usado para esta finalidade. Assim, na manhã do implante, o anel de base anular da estrutura estereotáctica BRW pode ser anexado ao crânio do paciente. Secções de TC em série podem ser obtidas em intervalos que 3 mm ao longo da região (o tecido alvo) com uma estrutura de vareta de grafite localizadora fixada à placa de base. Um programa de planeamento de tratamento computadorizado pode ser executado num computador VAX 11/780 (Digital Equipment Corporation, Maynard, Mass.) usando coordenadas CT das imagens da vereta de grafite para mapear entre o espaço CT e o espaço BRW.
Anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação podem, opcionalmente, ser administrados em combinação com outros agentes que sejam eficazes no tratamento do distúrbio ou condição que necessite de tratamento (por exemplo, profilático ou terapêutico). 175 X.
DIAGNÓSTICOS A divulgação proporciona ainda um método de diagnóstico útil durante o diagnóstico de doenças ou lesões neuronais, que envolve a medição do nivel de expressão da proteína SP35 ou seu transcrito em tecidos ou outras células ou fluido corporal de um indivíduo e comparando o nível de expressão medido com níveis de expressão Sp35 convencionais num tecido normal ou de fluido corporal, em que um aumento no nível de expressão em comparação com o padrão é indicativo de uma doença.
Os anticorpos específicos para Sp35 podem ser usados para testar os níveis da proteína numa amostra biológica utilizando métodos imuno-histológicos clássicos conhecidos pelos peritos na técnica (por exemplo, ver Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101: 976-985 (1985); Jalkanen, et al., J. Cell Biol. 105: 3087-3096 (1987)). Outros métodos baseados em anticorpos úteis para detectar a expressão da proteína incluem imunoensaios, tais como o ensaio de imunossorção associado a enzima (ELISA), imunoprecipitação ou "Western blotting". Ensaios adequados são descritos em mais pormenor noutro local neste documento.
Por "testando o nível de expressão do polipéptido Sp35" pretende-se medir ou estimar qualitativamente ou quantitativamente o nível do polipéptido Sp35 numa primeira amostra biológica quer directamente (por exemplo, determinando ou estimando o nível absoluto de proteína) ou relativamente (por exemplo, por comparação com o nível de polipéptido associado a cancro numa segunda amostra biológica). Preferencialmente, o nível de expressão do polipéptido Sp35 na primeira amostra biológica é medido ou estimado e comparado a um nível de polipéptido Sp35, sendo o padrão preparado a partir de uma segunda amostra biológica 176 obtida de um indivíduo que não tem a doença ou sendo determinado calculando os níveis médios de uma população de indivíduos que não têm o distúrbio. Como será apreciado na técnica, uma vez que o nível de polipéptido Sp35 "padrão" é conhecido, pode ser utilizado repetidamente como um padrão para comparação.
Por "amostra biológica" entende-se qualquer amostra biológica obtida a partir de uma linha celular, cultura de tecidos ou outra fonte individual de células que potencialmente expressam Sp35. Métodos para a obtenção de biópsias de tecidos e fluidos corporais de mamíferos são bem conhecidos na técnica.
Anticorpos Sp35 para utilização nos métodos de diagnóstico acima descritos incluem qualquer anticorpo Sp35 que se liga especificamente a um produto do gene SP35, como aqui descrito noutro lado.
XI. IMUNOENSAIOS
Anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação podem ser ensaiados para a ligação imunoespecífica por qualquer método conhecido na técnica. Os imunoensaios que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a sistemas de ensaio competitivos e não competitivos utilizando técnicas tais como "Western blot", radioimunoensaios, ELISA (ensaio de imunossorçao ligado a enzima), imunoensaios "sanduíche", ensaios de imunoprecipitaçao, reacções de precipitina, reacções de precipitina de difusão em gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação do complemento, ensaios imunorradiométricos, imunoensaios fluorescentes, imunoensaios de proteína A, para apenas citar alguns. Tais 177 ensaios são rotineiros e são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque, Vol. 1 (1994)). Exemplos de imunoensaios são resumidamente descritos abaixo (mas não se pretende a titulo de limitação).
Protocolos de imunoprecipitação compreendem geralmente a lise de uma população de células num tampão de lise tal como tampão RIPA (1% de NP-40 ou Triton X-100, desoxicolato de sódio a 1%, SDS a 0,1%, NaCl a 0,15 M, 0,01 M de fosfato de sódio a pH 7,2, 1% de Trasylol) suplementado com proteina fosfatase e/ou inibidores da protease (por exemplo, EDTA, PMSF, aprotinina, vanadato de sódio), adicionando o anticorpo de interesse ao lisado celular, incubando durante um período de tempo (por exemplo, 1-4 horas) a 4°C, a adição de grânulos de proteína G sepharose e/ou proteína A ao lisado celular, incubando durante cerca de uma hora ou mais a 4°C, lavando as esferas em tampão de lise e ressuspendendo as esferas em tampão da amostra/SDS. A capacidade do anticorpo de interesse para imunoprecipitar um antigénio particular pode ser avaliada por exemplo, por análise por "Western blot". Um perito na técnica seria sabedor sobre os parâmetros que podem ser modificados para aumentar a ligação do anticorpo a um antigénio e diminuir o ruído de fundo (por exemplo, a limpeza prévia do lisado celular com esferas de sepharose). Para uma discussão mais aprofundada sobre os protocolos de imunoprecipitação ver, por exemplo, Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque, Vol. 1 (1994) a 10.16.1. A análise de "Western blot" compreende geralmente a preparação de amostras de proteínas, electroforese das amostras de proteína num gel de poliacrilamida (por exemplo, 8%-20% de SDS-PAGE dependendo do peso molecular do 178 antigénio) , a transferência da amostra de proteínas a partir de o gel de poliacrilamida para uma membrana tal como nitrocelulose, PVDF ou nylon, bloquear a membrana em solução de bloqueio (por exemplo, PBS com 3% de BSA ou leite magro) , lavar a membrana em tampão de lavagem (por exemplo, PBS-Tween 20), bloquear a membrana com o anticorpo primário (o anticorpo de interesse) diluído em tampão de bloqueio, lavagem da membrana em tampão de lavagem, o bloqueio da membrana com um anticorpo secundário (que reconhece o anticorpo primário, por exemplo, um anticorpo anti-humano) conjugado com um substrato enzimático (por exemplo, peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina) ou uma molécula radioactiva (por exemplo, 32p ou 1251), diluído em tampão de bloqueio, lavando a membrana em tampão de lavagem e detectar a presença do antigénio. Um perito na técnica conhecerá quais os parâmetros que podem ser modificados para aumentar o sinal detectado e reduzir o ruído de fundo. Para uma discussão mais aprofundada relativamente a protocolos de "Western blot" ver, por exemplo, Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque Vol. 1 (1994) a 10.8.1. ELISA compreendem a preparação de antigénio, o revestimento do poço de uma microplaca de 96 poços com o antigénio, adicionando o anticorpo de interesse conjugado a um composto detectável, tal como um substrato enzimático (por exemplo, peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina) ao poço e incubando durante um período de tempo, e a detectando a presença do antigénio. Em ELISAs, o anticorpo de interesse não tem que ser conjugado com um composto detectável; em vez disso, um segundo anticorpo (o qual reconhece o anticorpo de interesse) conjugado com um composto detectável pode ser adicionado ao poço. Além disso, em vez de revestimento do poço com o antigénio, o anticorpo pode ser revestido para o 179 poço. Neste caso, um segundo anticorpo conjugado com um composto detectável pode ser adicionado após a adição do antigénio de interesse ao poço revestido. Um perito na técnica conhecerá os parâmetros que podem ser modificados para aumentar o sinal detectado bem como outras variações de ELISAs conhecidas na técnica. Para uma discussão mais aprofundada sobre os testes ELISA ver, por exemplo, Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque, Vol. 1 (1994) a 11.2.1. A afinidade de ligação de um anticorpo a um antigénio e a taxa de dissociação de uma interacção anticorpo-antigénio pode ser determinada por ensaios de ligação competitivos. Um exemplo de um ensaio de ligação competitiva é um radioimunoensaio compreendendo a incubação do antigénio marcado (por exemplo, 3H ou 125I) com o anticorpo de interesse na presença de quantidades crescentes do antigénio não marcado, e a detecção do anticorpo ligado ao antigénio marcado. A afinidade do anticorpo de interesse para um determinado antigénio e as velocidades de dissociação podem ser determinadas a partir dos dados por análise de gráfico de Scatchard. A competição com um segundo anticorpo pode também ser determinada utilizando radioimunoensaios. Neste caso, o antigénio é incubado com o anticorpo de interesse é conjugado com um composto marcado (por exemplo, 3H ou 125I), na presença de quantidades crescentes de um segundo anticorpo não marcado.
Anticorpos Sp35, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, variantes ou derivados da divulgação, adicionalmente, podem ser empregues histologicamente, como em imunofluorescência, microscopia imunoelectrónica análises não imunológicas, para a detecção in situ dos produtos génicos do antigénio de cancro ou de suas variantes conservadas ou fragmentos 180 peptídicos. A detecção in situ pode ser conseguida removendo um espécime histológico de um paciente e aplicando ao mesmo um anticorpo Sp35 marcado, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado, de preferência, aplicado pela sobreposição do anticorpo marcado (ou fragmento) a uma amostra biológica. Através da utilização de tal procedimento, é possível determinar não só a presença da proteína Sp35, ou de variantes conservadas ou fragmentos de péptidos, mas também a sua distribuição no tecido examinado. Utilizando a divulgação, os peritos irão prontamente perceber que qualquer um de uma grande variedade de métodos histológicos (tais como procedimentos de coloração) pode ser modificado, de modo a conseguir uma tal detecção in situ.
Os imunoensaios e não-imunoensaios para os produtos do génicos SP35 ou suas variantes conservadas ou fragmentos de péptido compreenderá tipicamente a incubação de uma amostra, tal como um fluido biológico, um extracto de tecido, células recentemente colhidas, ou lisados de células que tenham sido incubados em cultura de células, na presença de um anticorpo marcado de forma detectável capaz de se ligar a Sp35 ou a suas variantes conservadas ou fragmentos de péptidos, e detectar o anticorpo ligado por qualquer um de uma série de técnicas bem conhecidas na técnica. A amostra biológica pode ser colocada em contacto com e imobilizada num suporte ou veículo de fase sólida tal como nitrocelulose, ou outro suporte sólido que seja capaz de imobilizar células, partículas de células ou proteínas solúveis. 0 suporte pode então ser lavado com tampões adequados seguido de tratamento com o anticorpo SP35marcado de forma detectável, ou seu fragmento de ligação ao antigénio, variante, ou derivado. 0 suporte de fase sólida pode então ser lavado com o tampão uma segunda vez para 181 remover o anticorpo não ligado. Opcionalmente, o anticorpo é subsequentemente marcado. A quantidade de marcação ligada ao suporte sólido pode então ser detectada por meios convencionais.
Por "suporte ou veiculo de fase sólida" entende-se qualquer suporte capaz de se ligar a um antigénio ou um anticorpo. Suportes conhecidos ou veiculos incluem vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilases, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, gabros e magnetite. A natureza do transportador pode ser solúvel em certa medida ou insolúvel para os fins da presente divulgação. 0 material de suporte pode ter virtualmente qualquer configuração estrutural possível desde que a molécula acoplada seja capaz de se ligar a um antigénio ou anticorpo. Assim, a configuração do suporte pode ser esférica, como numa conta, ou cilíndrica, como na superfície interior de um tubo de ensaio, ou a superfície externa de uma vareta. Alternativamente, a superfície pode ser plana tal como uma folha, tira de teste, etc. Os suportes preferidos incluem esferas de poliestireno. Os peritos na técnica conhecerão muitos outros veículos adequados para a ligação do anticorpo ou antigénio, ou serão capazes de o determinar através do uso de experimentação de rotina. A actividade de ligação de um dado lote de anticorpo Sp35, ou um seu fragmento, variante, ou derivado de ligação ao antigénio pode ser determinada de acordo com métodos bem conhecidos. Os peritos na técnica serão capazes de determinar condições de ensaio operativas e óptimas para cada determinação empregando experimentação de rotina.
Existe uma variedade de métodos disponíveis para a medição da afinidade da interacção anticorpo-antigénio, mas 182 relativamente poucos para determinar constantes de velocidade. A maioria dos métodos dependem da marcação ou do anticorpo ou do antigénio, o que, inevitavelmente, complica as medições de rotina e introduz as incertezas das quantidades medidas. A ressonância de plasma de superfície (SPR), tal como realizada em BIAcore oferece diversas de vantagens relativamente aos métodos convencionais de medição da afinidade da interacções anticorpo-antigénio: (i) não é necessária a marcação do anticorpo ou do antigénio, (ii) os anticorpos não precisam a ser purificados previamente, podendo o sobrenadante da cultura de células ser utilizado directamente, (iii) são permitidas medições em tempo real, permitindo uma comparação semi-quantitativa rápida de diferentes interacções de anticorpos monoclonais e são suficientes para muitos fins de avaliação, (iv) a superfície bioespecífica pode ser regenerada de forma que uma série de diferentes anticorpos monoclonais podem ser facilmente comparados em condições idênticas, (v) os procedimentos analíticos estão totalmente automatizados, e podem ser executadas grande séries de medições, sem intervenção do utilizador. BIAapplications Handbook, versão AB (reimpressão 1998), código BIACORE No. BR-1001-86; BIAtechnology Handbook, versão AB (reimpressão 1998), código BIACORE No. BR-1001-84.
Os estudos de ligação baseados em SPR exigem que um membro de um par de ligação seja imobilizado sobre uma superfície do sensor. 0 parceiro de ligação imobilizado é referido como o ligando. 0 parceiro de ligação em solução é referido como o analito. Nalguns casos, o ligando está ligado indirectamente à superfície através da ligação a uma outra molécula imobilizada, que é referida como a molécula de captura. A resposta SPR reflecte uma mudança na concentração mássica à 183 superfície do detector à medida que os analitos se ligam ou dissociam.
Com base em SPR, as medições BIAcore em tempo real, monitorizam interacções directamente à medida que acontecem. A técnica é bem adequado à determinação de parâmetros cinéticos. A classificação comparativa de afinidade é extremamente simples de executar, e tanto as constantes cinética como as de afinidade podem ser derivadas dos dados do sensorgrama.
Quando o analito é injectado num pulso discreto ao longo de uma superfície de ligando, o sensorgrama resultante pode ser dividido em três fases essenciais: (i) Associação de analito com o ligando durante a injecção da amostra, (ii) Equilíbrio ou estado estacionário durante a injecção da amostra, onde a velocidade de ligação do analito é equilibrada pela dissociação do complexo, (iii) Dissociação do analito a partir da superfície durante o fluxo de tampão.
As fases de dissociação e associação fornecem informações sobre a cinética de interacção analito-ligando (ka e kd, as velocidades de formação de complexos e dissociação, kd/ka = KD). A fase de equilíbrio fornece informações sobre a afinidade da interacção ligando-analito (KD). 0 programa informático BIAevaluation proporciona amplas ferramentas para ajuste de curvas, utilizando tanto a integração numérica como algoritmos de ajuste globais. Com a análise adequada dos dados, podem-se obter de forma separada as constantes de afinidade e de velocidade para a interacção a partir de investigações BIAcore simples. A gama de afinidades mensuráveis por esta técnica é muito ampla desde mM a pM. 184 A especificidade do epitopo é uma característica importante de um anticorpo monoclonal. 0 mapeamento de epitopos com BIAcore, em contraste com as técnicas convencionais usando radioimunoensaio, ELISA ou outros métodos de adsorção de superfície, não necessita de marcação ou de anticorpos purificados, e permite que testes de especificidade em vários locais, usando uma sequência de vários anticorpos monoclonais. Além disso, um qrande número de análises podem ser processadas automaticamente.
Experiências de liqação de pares testam a capacidade de dois MAbs se ligarem simultaneamente ao mesmo antigénio. MAbs dirigidos contra epitopos separados ligar-se-ão de forma independente, enquanto que MAbs dirigidos contra epitopos idênticos ou estreitamente relacionados irão interferir com a ligação um do outro. Estas experiências de ligação com BIAcore são simples de realizar.
Por exemplo, pode-se usar uma molécula de captura para se ligar ao primeiro Mab, seguida pela adição do antigénio e do segundo MAb sequencialmente. Os sensorgramas irão revelar: 1. quanto do antigénio se liga ao primeiro Mab, 2. em que medida o segundo MAb se liga ao antigénio ligado à superfície, 3. se o segundo MAb não se liga, se a inversão da ordem do teste de pares altera os resultados. A inibição de péptidos é outra técnica utilizada para o mapeamento de epitopos. Este método pode complementar os estudos de ligação de pares de anticorpos, e pode relacionar epitopos funcionais com características estruturais quando a sequência primária do antigénio é conhecida. Os péptidos ou fragmentos de antigénios são testados relativamente à inibição da ligação de diferentes anticorpos monoclonais para 185 o antigénio imobilizado. Os péptidos que interferem com a ligação de um dado MAb são assumidos serem estruturalmente relacionados com o epitopo definido por aquele MAb. A prática da divulgação irá empregar, a menos que indicado em contrário, técnicas convencionais de biologia celular, cultura celular, biologia molecular, biologia transgénica, microbiologia, ADN recombinante, e imunologia, que estão no âmbito da perícia na técnica. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Ed., Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque (1992), DNA Cloning, D. N. Glover ed., Volumes I e II (1985); Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait ed., (1984); Mullis et al. Pat. E.U.A. No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames e S. J. Higgins eds. (1984); Transcription And Translation, B. D. Hames e S. J. Higgins eds. (1984); Culture Of Animal Cells, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); o tratado, Methods in Enzymology, Academic Press, Inc., N.I.; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller e Μ. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods in Enzymology, Vols. 154 e 155 (Wu et al. eds.); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Mayer e Walker, eds., Academic Press, Londres (1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV, D. M. Weir e C. C. Blackwell, eds., (1986); Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I., (1986); e em Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989). 186
Os princípios gerais de engenharia de anticorpos estão apresentados em Antibody Engineering, 2a edição, C.A.K. Borrebaeck, Ed., Oxford Univ. Press (1995). Princípios gerais de engenharia de proteínas são estabelecidos em Protein Engineering, A Practical Approach, Rickwood, D., et al., Eds., IRL Press na Oxford Univ. Press, Oxford, Inglaterra (1995). Princípios gerais de anticorpos e ligação anticorpo-hapteno são apresentados em: Nisonoff, A., Molecular Immunology, 2a ed., Sinauer Associates, Sunderland, MA (1984); e Steward, M.W., Antibodies, Their Structure and Function, Chapman e Hall, Nova Iorque, NI (1984). Adicionalmente, os métodos convencionais em imunologia conhecidos na técnica e não especificamente descritos são geralmente levados a cabo como em Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nova Iorque; Stites et al. (eds), Basic e Clinical-Immunology (8a ed.), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) e Mishell e Shiigi (eds), Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman e Co., Nova Iorque (19 8 0) .
Obras de referência padrão que estabelecem princípios gerais de imunologia incluem Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nova Iorque; Klein, J., Immunology; The Science de Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, Nova Iorque (1982); Kennett, R., et al., eds., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Nova Iorque (1980); Campbell, A., "Monoclonal Antibody Technology" em Burden, R., et al., eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Elsevier, Amesterdão (1984), Kuby Immunnology 4a ed. Ed. Richard A. Goldsby, Thomas J. Kindt e Barbara A. Osborne, H. Freemand & Co. (2000); Roitt, I., Brostoff, J. e Male D., Immunology 6a ed. Londres; Mosby (2001); Abbas A., Abul, A. e Lichtman, A., Cellular and Molecular Immunology Ed. 5, Elsevier Health Sciences Division (2005); Kontermann e Dubel, 187
Antibody Engineering, Springer Verlag (2001); Sambrook e Russell, Molecular Clonlng: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press (2001); Lewin, Genes VIII, Prentice Hall (2003); Harlow e Lane, Antlbodles: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); Dieffenbach e Dveksler, PCR Primer Cold Spring Harbor Press (2003) . EXEMPLOS EXEMPLO 1
Sp35 está envolvido na biologia de oligodendrócitos
Os oligodendrócitos amadurecem através de vários estágios de desenvolvimento desde células progenitoras A2B5 (que expressa A2B5), que se diferenciam em oligodendrócitos pré-mielinantes (que expressam 01 e 04) e, finalmente, em oligodendrócitos mileinantes maduros (que expressam 01, 04 e MBP) . Assim, através da monitorização da presença e da ausência dos marcadores A2B5, 01, 04 e MBP, é possível determinar a fase de desenvolvimento de uma determinada célula e avaliar o papel de Sp35-Fc na biologia dos oligodendrócitos. Para uma revisão geral da biologia oligodendrócitos, ver, por exemplo, Baumann e Pham-Dinh, Physiol. Rev. 81: 871-927 (2001).
Os anticorpos monoclonais contra 04, MBP e CNPase foram da Sternberger Monoclonais; o anticorpo para APC (clone CC-1; ref. 29) foi da Calbiochem. Outros anticorpos foram para βΐΐΐ tubulina (Covance), Sp35 (Biogen Idec), Fyn (Santa Cruz Biotechnology) e fosfo-Fyn (Biosource). Os anticorpos monoclonais contra A2B5 estão disponíveis da Chemicon.
Sp35 é expresso em oligodendrócitos A expressão de SP35 de rato em culturas purificadas de neurónio CG P13 de rato, oligodendrócitos P2, e culturas de astrócitos P4 foi analisada por reacção em cadeia da polimerase após a transcrição reversa (RT-PCR). Um kit da
Ambion, Inc. foi usado para extrair o mARN a partir das células de cérebro de rato de acordo com as instruções do fabricante. RT-PCR semi-quantitativo foi realizado utilizando o iniciador directo 5' AGAGACATGCGATTGGTGA 3' (SEQ ID NO: 344), e o iniciador reverso 5' 'AGAGATGTAGACGAGGTCATT 3' (SEQ ID NO: 345), e mostrou expressão elevada em neurónios, menor expressão em oligodendrócitos, e nenhuma expressão em astrócitos. A expressão de SP35 em oligodendrócitos foi confirmada por hibridização in situ em secções derivadas de nervo óptico de rato adulto. Secções do nervo óptico de rato foram preparadas e processadas como descrito em Mi et ai., "Sp35 is a component of the Nogo-66 receptor/p75 signaling complex," Nat. Neurosci. 7: 221-28 (2004) e sondada ARNs no sentido directo ou inverso de Sp35 marcado com digoxigenina, utilizando os primeiros 500 nucleótidos da sequência que codifica para Sp35. As secções foram coradas de acordo com as instruções do fabricante, utilizando um kit de amplificação de sinal de tiramida (Amersham Biosciences) e um kit de anticorpo conjugado com anti-digoxigenina fluorescente (Perkin Elmer). Para análises combinadas in situ e de imunofluorescência, as secções foram primeiro sondadas com ARN marcado com digoxigenina, e depois com anticorpos, por exemplo, anticorpo CC1 (Calbiochem, um marcador de oligodendrócitos maduros) ou anticorpo anti-Sp35. Observou-se que os oligodendrócitos que hibridaram com uma sonda no sentido inverso Sp35 também co-coraram com um anticorpo para CC1 (dados não mostrados). Não se observou qualquer marcação específica usando uma sonda no sentido directo Sp35. A expressão de Sp35 em oligodendrócitos foi também confirmada por estudos de imuno-histoquímica de secções de tecido da região do ventrículo lateral do córtex de rato P7. Uma maioria das células do córtex que marcaram com o anticorpo 189 CC1 também marcaram com o anticorpo anti-Sp35. Dados não apresentados. A especificidade da interacção foi confirmada por pré-adsorção do anticorpo anti-Sp35 com Sp35-Fc (ver Exemplo 2), o que eliminou o sinal. "Knockdown" da expressão de Sp35 com ARNi especifico para Sp35 promove o crescimento e a diferenciação de oligodendrócitos
Usou-se ARNi especifico de Sp35 para eliminar a expressão de Sp35 em células precursoras de oligodendrócitos para examinar como Sp35 contribui para o crescimento e a diferenciação de oligodendrócitos. 50000 células precursoras de oligodendrócitos A2B5 foram infectadas com lentivirus que contêm a sequência de ARNi especifica para Sp35 ou ARNi de controlo preparado como se segue.
Sequências de ADN de Sp35 murino e de rato foram comparadas para encontrar regiões homólogas para usar para candidatos de ARNs "small-hairpin" (shARN). Construiu-se CH324, para a expressão em lentivirus de ARNi de Sp35, por emparelhamento dos oligonucleótidos LV1-035 e LV1-036 e ligando a pLL3.7 digerido com Hpa I e XhoI. O vector pLL3.7, metodologias adicionais e a produção de vírus foram conforme descrito em Rubinson et al., Nat. Genet. 33, 401-06 (2003) . Os oligonucleótidos ARNi Sp35 foram adquiridos da MWG e têm as seguintes sequências: LV1-035 (oligo sentido directo) 5 TCC TCA TCG TGA TGC TAG ACT TCA AGA GAG AGG ATG TCT AGC ACG ATC TTT TTT C - 3' (SEQ ID NO : 346) e LV1-036 (oligo sentido inverso) 5 AGA AAA AAG TCG ATC GTC ATC CTG CTA GAC TCT CTT GAA GTC CAG TAG GAT GAC GAT CA - 3' (SEQ ED NO: 347). O ARNi de controlo foi desenhado com as mesmas sequências de oligonucleótidos, excepto para as mudanças de nucleótidos 190 indicados em letras minúsculas: 5'-TGA TCC TCA TcC TTC Tat ACT TCA AGA GAG TGT AGC ATG AGG ACG ATC TTT TTT CTC GA -3 ' (SEQ ID NO: 348) e 5' -TCG AGA AAA AAG ATC GTC ATC CTG CTA GAC TCT CTT GAA GTa TAG AAG GAT GAC GAT CA-3 ' (SEQ ID NO: 349) .
Antes de se produzir o lentivirus, ADN de pLL3.7 ou shARN candidato em pLL3.7 foram co-transfectados com plasmídeo marcado Sp35-HA murino numa proporção de 5 para 1 em células CHO em um formato de 6 poços. 0 "knockdown" foi analisado por detecção de "Western blot" da marcação Sp35-HA de lisados de células CHO transfectadas SP35-HA, bem como por "Northern blot" do ARN total preparado a partir de poços em duplicado. 0 "blot" foi sondado com um fragmento de cADN de Sp35. Os ensaios foram realizados 48 horas após a transfecção. Como esperado, houve uma redução de 10 vezes de mARN de SP35 em células CHO tratadas com ARNi CH324 relativamente às células tratadas com controlo. Dados não apresentados. Os lentivirus de ARNi transportando a proteína verde fluorescente (GFP) foram gerados como descrito em Rubinson et al. Em culturas tratadas com ARNi controlo ou SP35, cerca de 80% dos oligodendrócitos foram positivos para GFP. O número total de células não foi alterado pelos tratamentos de ARNi. Para quantificar os efeitos de ARNi na diferenciação, apenas foram contados oligodendrócitos que expressam GFP.
Populações enriquecidas de oligodendrócitos foram cultivadas a partir de ratos P2 Long Evans fêmea, tal como descrito por Conn, Meth. Neurosci. 2: 1-4 (Academic Press, 1990) com modificações como se segue. Resumidamente, o cérebro anterior foi dissecado e colocado em solução salina tamponada de Hank (HBSS; Invitrogen). O tecido foi cortado em fragmentos de 1 mm e foi incubado a 37°C durante 15 minutos em 0,01% de tripsina e 10 pg/ml de DNase. As células dissociadas foram 191 plaqueadas em frascos de cultura de tecidos T75 revestidos com em poli-L-lisina e foram cultivadas a 37°C durante 10 d em meio DMEM com 20% de soro fetal de vitelo (Invitrogen) . Recolheram-se precursores de oligodendrócitos (A2B5+) agitando o frasco durante a noite a 200 rpm, a 37°C, resultando numa população com uma pureza de 95%. As culturas foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco com elevada concentração de glucose (DMEM) com FGF/PDGF (10 ng/ml; Peprotech) durante 1 semana. A remoção da FGF/PDGF permitiu a diferenciação das células A2B5+ em oligodendrócitos premielinantes 04+ após 3-7 d, e a diferenciação em oligodendrócitos maduros 04+ e MBP+ após 7-10 d. Esses estados de diferenciação são facilmente visíveis por alterações na morfologia: as células A2B5+ têm uma forma bipolar, os oligodendrócitos premielinantes 04+ têm processos mais longos e ramificados os oligodendrócitos maduros MBP+ contêm estruturas de folha de mielina entre processos.
As células precursoras de oligodendrócitos A2B5 foram infectadas com o lentivírus contendo o ARNi CH324. As células resultantes foram cultivadas durante 3 dias e contou-se o número de oligodendrócitos positivos para 04 (um marcador para a diferenciação dos oligodendrócitos). A expressão endógena de Sp35 foi reduzida por infecção lentivírus ARNi Sp35 e foi confirmada por RT-PCR. A redução de SP35 resultou em mais oligodendrócitos maduros, altamente diferenciados quando comparados com as células de controlo infectadas, como se tornou evidente pelo aumento do comprimento dos processos celulares e pela presença de abundantes estruturas de folha de mielina (dados não apresentados). Em células que expressavam ARNi Sp35, observaram-se três vezes mais oligodendrócitos maduros (positivos para 04) do que nas culturas de controlo. Estes dados indicam que Sp35 podem regular negativamente a diferenciação dos oligodendrócitos. 192
Sp35 dominante-negativa promove o crescimento e a diferenciação de oligodendrócitos
Foram construídos vectores lentivirais que expressam o tipo nativo e uma forma dominante-negativa de Sp35. A sequência de ADN que codifica para Sp35 de rato de comprimento total (FL-Sp35, resíduos de aminoácidos 34-614 da SEQ ID NO: 2) foi amplificada por PCR utilizando os iniciadores 5' - GAG GAT GAC GCG CCG CTC ACG TGG ACA CAC CAG AGA TCC TG - 3 ' (SEQ ID NO: 3 50) e 5' - GGG GCG TTG GAA GAT CCT CAC TCC TCT TCT AGA GAG ATG AG-3' (SEQ ID NO: 351) e inserido no vector lentiviral HRST-IRESeGFP nos locais Not I e Bamtil. Do mesmo modo, a sequência de ADN que codifica para Sp35 dominante negativo (DN-Sp35, resíduos de aminoácidos 34-581 da SEQ ID NO: 2) foi amplificado por PCT, utilizando os iniciadores 5' - GAG GAT GAC GCG CCG CTC ACG TGG ACA CAC CAG AGA TCC TG 3' (SEQ ID NO: 352) e 5' - GAT ACG GAT CCT CAG CCT TTG CCC CGG AGA CTC CAT AAC AGC - 3' (SEQ ID NO: 353). Os plasmídeos FL-Sp35 e DN-Sp35 foram transfectados em células 293 para a produção de lentivírus, como descrito por Rubinson et al., "A lentivirus-based System to functionalmente silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RN A interference," Nat. Genet. 33: 401-06 (2003). Os oligodendrócitos estavam infectados com lentivírus a 2 MOI por célula e confirmou-se a expressão de FL-SP35 e DN-SP35 por "western blot". DN-Sp35 promoveu a diferenciação dos oligodendrócitos, produzindo um aumento no número de oligodendrócitos maduros. Pelo contrário, a sobre-expressão de Sp35 de comprimento completo (FL-Sp35) teve o efeito oposto e inibiu a diferenciação, como ficou evidente pela redução no número de 193 oligodendrócitos maduros quando comparados com o controlo (dados não apresentados). EXEMPLO 2
Construção e purificação da proteína de fusão Sp35-Fc
Preparou-se uma construção através da fusão da porção extracelular de Sp35 humana (resíduos 1-532) às regiões "hinge" e Fc de IgGl humana para estudar a função biológica de Sp35. Uma sequência de codificação parcial para Sp35 humano foi obtida por PCR a partir do clone 227.2 utilizando o iniciador directo 5' - CAG CAG GTC GAC GCC GCG CGC TGC TGG CGG GGG GCG T - 3' (SEQ ID NO: 354) e o iniciador inverso 5' - CAG CAG GTC GAC CTC GCC CGG CTG GTT CAA GGC CCA GCC GGG CGA GGT CGA CCT CGA GG - 3' (SEQ ID NO: 355). 0 produto de PCR de extremidades não coesivas foi subclonado no local Srfl do vector PCR SCRIPT AMP (Stratagene) para criar PCR SCRIPT AMP-Sp35. Um fragmento Sail foi isolado a partir de PCR SCRIPT AMP-Sp35 e subclonado no vector PCRCAMP Ig (derivado do vector da Stratagene PCR SCRIPT AMP) . No vector PCRCAMP Ig, a sequência "hinge" e a sequência gama Fc são subclonadas como um fragmento Sail(5') a Not1(3'). 0 fragmento Sp35 SalI foi subclonado no local de SalI do vector PCRCAMP Ig fundindo assim a sequência de sinal e o domínio extracelular de Sp35 (codões 1-532) em grelha com as sequências que codificam para a região "hinge " e Fc de Igl humano. Foram identificados isolados correctos, e um fragmento Not I que abrange o fragmento Fc de Sp35 foi subclonado no local de clonagem Not I único do vector de expressão para CHO, PV90 (Biogen Idec) . 0 plasmídeo resultante foi confirmado por sequenciaçao de ADN e designado GT123 . 194
Linhas celulares estáveis que expressam a proteina de fusão Sp35-Fc foram geradas por electroporação de células hospedeiras DG44 de CHO com o plasmideo GT123. As células CHO transfectadas foram cultivadas em MEM alfa menos na presença de soro dialisado a 10% e glutamina a 4 mM para seleccionar para o crescimento independente de nucleósidos. Catorze dias após a transfecção, as células foram alimentadas com meio fresco. Para seleccionar as células que expressam SP35-Fc, as células CHO foram marcadas com IgG anti-humano de cabra marcado com ficoeritrina (PE) (Jackson Labs) e submetidas a triagem por citometria de fluxo de alta velocidade num FACS Mo-Flo (Cytomation). Foram escolhidas as células que expressam os niveis mais altos de Sp35-Fc. Essas células foram expandidas em cultura durante 7 dias, em seguida, novamente marcadas e de novo triadas. As células que expressam os niveis mais altos de SP35-Fc foram isoladas como clones individuais em placas de 96 poços. Estes clones foram cultivados durante duas semanas e, em seguida, alimentou-se meio fresco um dia antes da análise FACS para verificar os níveis de expressão. Os clones que expressaram os níveis mais elevados de Sp35-Fc foram expandidos, e os bancos de células congeladas foram estabelecidos. As linhas celulares foram adaptadas para crescer em cultura de suspensão em meio isento de soro BCM16. O título de Sp35-Fc produzido por estes clones foi determinado através do crescimento de linhas celulares a 37°C durante 4-5 passagens, em seguida, crescer as células a 50% da densidade celular máxima e cultivá-las durante 10-15 dias, a 28°C até que a densidade de células viáveis diminuiu para 75%. Neste momento, os meios de cultura foram recolhidos, limpos de células e detritos por centrifugação, e os sobrenadantes da cultura titulados para os níveis de Sp35-Fc por meio de análise de "Western blot" utilizando um anticorpo Ig anti-humano (Jackson Lab.) como a sonda. 195 A proteína de fusão SP35-Fc foi purificada do meio de cultura clarificado como se segue: 9 ml de IM de HEPES pH 7,5 foi adicionado a 900 ml de meio condicionado. O meio foi carregado em lotes durante 3 h a 4°C em 3 ml de Protein A Sepharose (Amersham Bioscience). A resina foi recolhida numa coluna de 1,5 cm (D.I.) e lavou-se quatro vezes com 3 ml de PBS, duas vezes com 4 ml de PBS contendo 800 mM de NaCl, e depois novamente com 3 ml de PBS. A Sp35-Fc foi eluída da coluna com 25 mM de NaH2P04, pH 2,8 e 100 mM de NaCl em fracções de 1,5 ml e neutralizada pela adição de 75 μΐ de NaH2P04 a 0,5 M, pH 8,6. As fracções contendo o pico de proteína foram identificadas por absorvância a 280 nm, reunidas, e submetidas a purificação adicional numa coluna de 1 ml de Proteína A. Antes da carga, adicionou-se NaCl a 600 mM e HEPES, pH 7,5 a 50 mm. A coluna foi lavada duas vezes com 600 μΐ de HEPES a 10 mM pH 7,5 e NaCl a 1 M, e em seguida com 1 mL de PBS. Eluiu-se Sp35-Fc da coluna com 25 mM de NaH2P04, pH 2,8 e NaCl a 100 mM, recolhendo fracções de 0,5 mL, e neutralizou-se pela adição de 25 μΐ de 0,5 M de NaH2P04, pH 8,6. As fracções contendo o pico de proteína foram identificadas por absorvância a 280 nm e reunidas. Através de SDS-PAGE em condições redutoras, a proteína Sp35-Fc migrou como uma única banda (pureza > 95%), com uma massa aparente de 90 kDa. Sob condições não redutoras, a proteína correu como um dímero com uma massa de aproximadamente 180 kDa. A proteína purificada Sp35-Fc foi recolhida em alíquotas e armazenada a -70°C. EXEMPLO 3
Produção de Anticorpos Monoclonais Específicos para Sp35 196
Os anticorpos anti-Sp35 que se ligam especificamente a um polipéptido SP35 da divulgação foram preparados utilizando os seguintes métodos e procedimentos. A. Ensaios de Rastreio de Anticorpos
1. Ensaio ELISA
Adicionou-se Sp35-Fc (0,5 pg em 50 pL de tampão de bicarbonato de sódio a 0,1 M, pH 9,0) a cada poço de placas de 96 poços MaxiSorp™ (Nunc™) . As placas foram então incubadas a 37°C durante 1 hora ou 4°C durante 16 horas. Locais de ligação não específicos nas placas foram bloqueados usando HEPES a 25 mM, pH 7,4 contendo BSA a 0,1%, ovalbumina a 0,1%, 0,1% de (5% (p/v) de leite em pó magro em 150 mM de NACE), e 0,001% de azida. As diluições de soro ou de sobrenadantes de hibridoma (por exemplo, diluições em série de três vezes) foram adicionadas ao longo de cada fila da placa, e incubou-se a 25°C durante 1 hora. Depois de se lavar três vezes com PBS, adicionou-se 50 pl de uma diluição 1:10000 de anticorpo secundário anti-ratinho de cabra conjugado com peroxidase de rábano (Jackson ImmunoResearch Inc.) a cada poço e incubou-se durante mais 1 hora. Após três lavagens, a cor foi revelada por TMB (Pierce) e parou.se com 2 M de ácido sulfúrico. A intensidade da cor foi monitorizada num espectrofotómetro a 450 nm.
2 . Ensaio FACS
Marcaram-se células COS-7 foram marcadas com 0,1 pM CellTracker™ CMFDA verde (Molecular Probes, Eugene, OR) , conforme descrito pelo fornecedor. Volumes iguais de células controlo marcadas com CellTracker™ foram misturadas com células Sp35-COS-7 lavadas (produzidas por transfecção transiente do vector de expressão Sp35) antes da incubação 197 com o soro de teste anti-Sp35 ou sobrenadantes de hibridoma. Cinquenta microlitros da mistura de células foi distribuída em cada poço de uma placa de 96 poços de poliestireno com fundo em V (Costar® 3877, Corning, NI, EUA) e adicionou-se 100 μΐ de soro de ratinho, sobrenadante de hibridoma ou um controlo de anticorpo anti-Sp35. Após incubação a 4°C durante 30 minutos, as células foram lavadas e incubadas com 50 μΐ de anticorpo secundário específico Fc gama IgG anti-ratinho de cabra fragmento F(ab')2 puro por afinidade conjugado com ficoeritrina (1:200, Jackson ImmunoResearch Laboratory, West Grove, PA) em PBS. No final da incubação, as células foram lavadas duas vezes com PBS e suspensas em 200 μΐ de PBS contendo 1% de soro fetal bovino (FBS), e submetidas a análise por FACS. Alternativamente, células Sp35-COS-7 foram misturados com soro de ratinho ou sobrenadante de hibridoma e em seguida tratou-se com anticorpo secundário anti-ratinho de cabra conjugado com R-ficoeritrina e directamente submetido a análises de FACS convencional. B. Produção de Anticorpos Monoclonais Murinos Anti-Sp35 por Hibridoma
Ratinhos RBF fêmea com oito semanas de idade (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) foram imunizados por via intraperitoneal com a emulsão contendo 50 pg de Sp35-Fc (aminoácidos 34 a 532 da SEQ ID NO: 2 fundido à região "hinge" e à região Fc de IgGl humano), produzido como descrito no Exemplo 2 ou foram imunizados intraperitonealmente com uma emulsão contendo 50 pg de Sp35-Fc humano, e 50 μΐ de adjuvante completo de Freund (Sigma® Chemical Co., St. Louis, MO) uma vez cada duas semanas. Os soros dos ratinhos imunizados foram recolhidos antes da primeira imunização e 1 semana após a segunda e terceira imunizações, e os títulos dos anticorpos anti-Sp35 foram medidos por ensaio de FACS em células COS-7 que expressam Sp35, tal como descrito acima. Uma dose final de 198 reforço foi administrada após a terceira imunização, e três dias antes do inicio das fusões de hibridoma.
Os soros de ratinhos imunizados com os vários péptidos Sp35 foram testados por ELISA, como descrito acima. Os ratinhos que foram positivos para anticorpos que se ligam especificamente a células COS-7 que expressam Sp35 foram identificados por citometria de fluxo (FACS), como descrito acima, e foram sacrificados. Isolaram-se esplenócitos foram isolados dos ratinhos e fundiram-se com o mieloma FL653 (um derivado APRT de um mieloma de ratinho Ig-/HGPRT-BaIb/c, mantido em DMEM contendo FBS a 10%, 4500 mg/L de glucose, 4 mM de L-glutamina, e 20 mg/ml de 8-azaguanina) como descrito em Monoclonal Antibodies. Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, ed. Kennett, R.H., McKearn, T.J. e Bechtol, K.B. Nova Iorque: Plenum Press (1982). As células fundidas foram plaqueadas em placas de 24 ou de 48 poços (Corning Glass Works, Corning, NI, EUA), e alimentadas com adenina, aminopterina e timidina (AAT, disponível a partir de Sigma® Chemical Co., St. Louis, MO) contendo meio de cultura. Culturas resistentes AAT, foram testados por ELISA ou citometria de fluxo, tal como descrito acima, relativamente à ligação ou a células COS-7-Sp35 ou a Sp35-Fc. Os hibridomas positivos foram ainda subclonados por diluição limitante.
Dezassete linhas de células de hibridoma produtoras de anticorpos monoclonais produzidas a partir de ratinhos imunizados com Sp35-Fc foram isoladas. As propriedades dos anticorpos monoclonais derivados de hibridoma são apresentadas nas Tabelas 3A e 3B.
Os polinucleótidos que codificam para os domínios variáveis (VH e VL) dos anticorpos monoclonais 1A7, 2F3, 3P1D10.2C3 e 3P1E11.3B7 foram isolados por PCR, clonados e foram 199 submetidos a análise de sequência pelo método seguinte. 0 RNA total foi extraído de células de hibridoma utilizando o RNeasy® mini-kit da Qiagen® and gerou-se cADN a partir de ARN isolado por RT PCR, utilizando condições convencionais. Um cocktail de iniciadores foi utilizado para o RT-PCR. Um conjunto preferido de iniciadores incluiu um iniciador com a extremidade 5' do iniciador que híbrida com a sequência de sinal e a extremidade 3' do iniciador que híbrida com o domínio constante 3' da junção FR4/domínio constante. Isto permite a amplificação de um domínio variável intacto sem ambiguidades relativamente à extremidade N do anticorpo monoclonal e à junção V/C. Um perito na técnica reconhecerá que é necessária a modificação de conjuntos de iniciadores para amplificar diferentes moldes e para diferentes condições de PCR. Ocasionalmente, a presença de mensagens não produtivas altamente abundantes (por exemplo, a cadeia leve não produtiva de grelha deslocada CDR3-FR4 do parceiro de fusão) ou mensagens produtivas inespecíficas podem ser produzidas e complicar a clonagem de cadeias variáveis. Uma solução é a utilização de dados de sequência da extremidade N a partir do anticorpo purificado autêntico para desenhar um iniciador degenerado para permitir a clonagem. Alternativamente, pode-se utilizar um "quadro universal" de iniciadores, tais como os descritos em Orlandi et al, PNAS 86: 3833 (1989), que "corrigem" as extremidades N e C dos domínios variáveis ({isto é, a extremidade N de FR1 e a extremidade C de FR4 são determinadas pelo iniciador).
Além disso, os dados de sequência para o desenho de iniciadores mais eficazes, podem ser obtidos a partir dos produtos em bruto de RT-PCR que foram purificados em gel e de seguida sequenciados. 0 produto de PCR também pode ser subclonado utilizando, por exemplo, o TOPO Cloning Kit (Invitrogen) e depois sequenciação. Os dados de sequência de 200 subclones sao então obtidos a partir de múltiplos independentes ou fragmentos purificados em gel para estabelecer firmemente a sequência de consenso. A sequência da cadeia leve do P1E11.3B7 foi determinada
utilizando um cocktail de iniciadores de sequência de sinal da cadeia leve kapa murina 5: (i) 5' GGG GAT ATC CAC CAT GGA
TTT GGT TCA GCA GAT TTT CAG 3' (SEQ ID NO: 356), (ii) 5' GGG
GAT ATC CAC CAT GTC ACA GRA KAC YCA GGT CTT YRT A 3' (SEQ ID
NO: 357), (iii) 5' GGG GAT ATC CAC CAT GAA GTT GCC TGT GCT TAG GTT G 3' (SEQ ID NO: 358), e (iv) 5' GGG GAT ATC CAC CAT GAG GKC CCC WGC TCA GYT YCT KGG A 3' (SEQ ID NO: 359), com um único iniciador de domínio kapa constante murino 3': 5' GCG TCT AGA ACT GGA TGG TGG GAG ATG GA 3 (SEQ ID NO: 4), onde K = G/T, R = A/G, W = A/T e Y = C/T. 0 produto de PCR resultante foi subclonado e foram sequenciados múltiplos subclones independentes. A sequência de consenso deduzida era consistente com os dados de sequenciação de degradação de
Edman. A sequenciação indicou que o iniciador 5' da sequência de sinal degenerada 5' GGG GAT ATC CAC CAT GTC ACA GRA KAC YCA YRT CTT GGT A 3' (SEQ ID NO: 357) foi a que proporcionou o domínio variável de cadeia leve 3P1E11.3B7 durante a amplificação. A sequência de cadeia pesada 3P1E11.3B7 foi determinada utilizando um cocktail de iniciadores de PCR 5' da sequência sinal da cadeia pesada murina: (i) 5' GGG GAT ATC CAC CAT GGR ATG SAG CTG KGT MAT SCT CTT 3' (SEQ ID NO: 360) (ii) 5' GGG GAT ATC CAC CTT CGG CAT GRA GYT CTK GAG GGT TTT 3' (SEQ ID NO: 361), e (iii) 5' GGG GAT ATC CAC CAT GCG CTT TGT GGG GCT TCG CTT CT 3' (SEQ ID NO: 362), com um iniciador 3' do domínio constante CHI IgG murino degenerado 5' AGG TCT AGA AYC TCC ACA CAC AGG RRC CAG TGG ATA GAC 3' (SEQ ID NO: 363), em que K = G/T, M = A/C, R = A/G, e Y = C/T. PCR utilizando 201 este cocktail de iniciadores, com uma variedade de diferentes condições dos ciclos, não conseguiu produzir uma sequência de domínio variável de cadeia pesada em que a extremidade N deduzida fosse consistente com a sequência determinada por degradação de Edman do anticorpo 3P1E11.3B7 purificado. Portanto utilizámos os iniciadores universais da cadeia pesada: FR1 5' AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G 3' (SEQ ID NO: 364) e FR4 5' TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G 3' (SEQ ID NO: 365), em que M = A/C, R = A/G, S = C/G, e W = A/T. Este conjunto resultou num domínio variável de cadeia pesada murino cuja sequência deduzida foi consistente com os dados empíricos 3P1E11.3B7.
De modo a verificar que as extremidades N e C do domínio variável de cadeia pesada eram autênticos e não determinados pelo iniciador, uma outra reacção de PCR foi realizada com um iniciador de sequência de sinal degenerado 5 'ATG TGG AAY GAR TGY ATH CTN CCN TTY A 3 '(SEQ ID NO: 366) e o iniciador 3' do domínio constante acima mencionado iniciador 5' AGG TCT AGA AYC TCC ACA CAC AGG RRC CAG TGG ATA GAC 3' (SEQ ID NO: 367), em que H = A/C/T, N = A/C/G/T, R = A/G, e Y = C/T. 0 desenho do iniciador da sequência de sinal degenerado foi baseado em sequências de sinal que originaram melhores correspondências derivados de uma pesquisa TFASTA da base de dados de sequências de roedores Genbank consultada com a sequência FR1 deduzida de consenso 3P1E11.3B7 da reacção de PCR com o "iniciador universal" acima descrito. Este PCR originou um produto com um domínio variável de cadeia pesada de murino completo.
Os domínios variáveis de murino 3P1E11.3B7 completos foram usados (com mutagénese silenciosa quando necessário para introduzir locais de restrição), em conjugação com cADNs do domínio kapa constante e de IgGl humana para construir cADNs 202 quiméricos das cadeias pesada e leve, respectivamente. Os cADNs de imunoglobulinas de comprimento total foram subclonados num vector de expressão denominado pNEOOl, um derivado do pCEP4, vector de expressão epissomal de células de EBV comercial. Os vectores de expressão de cadeia pesada e leve (chamados pXW372 e pXW363, respectivamente) foram co-transfectados em células 293-EBNA. A análise de "Western blot" (sondada com reagentes específicos para a IgG humana) de meio condicionado de células transfectadas de forma transiente, confirmou a expressão de kapa mAb, 3P1E11.3B7-huIgGl quimérico. As sequências de polipéptido resultantes VH e VL 3P1E11.3B7 estão apresentadas nas Tabelas 6 e 8 e são SEQ ID NOs: 173 e 209, respect ivamente. As sequências da cadeia pesada e leve para a 1A7, 2F3, e 3P1D10.2C3 anticorpos monoclonais foram determinados por métodos semelhantes. C. Identificação de Anticorpos Monoclonais Anti-Sp35 por Apresentação de Fagos
Fragmentos Fab de anticorpos monoclonais anti-Sp35 foram identificados e isolados a partir de bibliotecas de apresentação de fagos como descrito em Hoet et al., Nat. Biotech. 23: 344-348 (2005); Rauchenberger, et al., J. Biol. Chem. 278: 194-205 (2003); e Knappik, et al., J. Mol. Biol. 296: 57-86 (2000) . A biblioteca de apresentação de fagos Fab MorphoSys HuCAL® GOLD ("Biblioteca de Apresentação de Fagos-2" na Tabela 3B) , que compreende as regiões variáveis de anticorpos sintéticos humanizados foi pesquisada relativamente à proteína Sp35-Fc solúvel humana recombinante por métodos de rastreio ELISA e IHC convencionais. Ver, por exemplo, Ostendorp, R., Frisch, C. e Urban M, "Generation, engineering and production of human antibodies using HuCAL®." Antibodies, Volume 2 Novel Technologies and Therapeutic Use. Nova Iorque: Kluwer 203
Academic/Plenum 13-52 (2004). Fagos-Fab que se ligaram especificamente a Sp35 foram purificados e caracterizados. As propriedades destes fragmentos Fab anticorpos monoclonais derivados da apresentação de fagos são apresentados na Tabela 3B como "fragmentos Fab monoclonais derivados da biblioteca de apresentação de fagos-2". O fago-Fab 1968 isolado foi escolhido para análise posterior. EXEMPLO 4
Imunoprecipitação de Sp35 por anticorpos monoclonais Anti-
Sp35
Para realizar a imunoprecipitação, foram produzidas células COS-1 que expressam Sp35, fundidas com uma marcação de hemaglutinina (HA) na extremidade N, por transfecção transiente de células COS-1 com uma construção de ADN que expressa a proteína Sp35 de comprimento total com uma marcação HA. As células foram recolhidas 48 horas após a transfecção e foram lisadas em 1 ml de tampão de lise (50 mM de HEPES, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1,5 mM de MgCl2, 1 mM de EGTA, 1% de Triton X-100 e glicerol a 10%) durante 30 min a 4°C. Após centrifugação a 14000 xg durante 15 minutos, os sobrenadantes foram incubados com esferas de Proteína A/G-Sepharose (Santa Cruz), a 4°C durante 1 hora, e, em seguida, incubou-se a 4°C durante 1 hora com os anticorpos monoclonais murinos anti-Sp35 1A7 ou 2F3. As esferas foram lavadas três vezes com tampão de lise, fervidos em tampão de amostra de Laemmli, submetidas a 4-20% SDS-PAGE e analisadas por "Western blotting" utilizando um anticorpo que reconhece o marcador HA. Tal como mostrado no gel de SDS-PAGE, os anticorpos monoclonais 1A7 e 2F3, imunoprecipitaram Sp35 humana e murina (Fig. 1) . Como apresentado na FIG. 1, o anticorpo monoclonal 2F3 imunoprecipitou fortemente ambas as Sp35 humana e murina, enquanto que o anticorpo monoclonal 204 1Α7, que imunoprecipitou fortemente a Sp35 humana, apenas reconheceu a proteína Sp35 murina fracamente. Da mesma forma, os anticorpos monoclonais 1G7, 2B10, 2F3, 3P4C2.2D2, 3P4C8.2G9, LiOl, Li03, LÍ05, LÍ06, Li07, LÍ08, Lill e Lil2 imunoprecipita Sp35 humano e de ratinho ou humano ou de ratinho (Ver Tabela 3B) . Além disso, Li08 imunoprecipita AP-SP35 e os anticorpos monoclonais 1B6.4 e 3E3.1 imunoprecipitam Sp35 endógeno (Ver Quadro 3B). EXEMPLO 5
Anticorpo Anti-Sp35 Que Se Liga Especificamente a Sp35
Determinada por ELISA
De modo a determinar quais as regiões do polipéptido Sp35 foram ligados pelos vários anticorpos monoclonais derivados de hibridomas e de apresentação de fagos produzidos no Exemplo 2, um ensaio de ELISA foi realizado utilizando um painel de polipéptidos Sp35 truncados, cada um fundida às regiões "hinge" e Fc de IgGl pelos métodos descritos no
Exemplo 1. 0 painel consistiu nos seguintes fragmentos de
Sp35: aminoácidos 34-425 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos 417-532 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos 417-493 da SEQ ID NO: 2, e os aminoácidos 34-532 da SEQ ID NO: 2. Ovalbumina e BSA foram utilizadas como controlo. Como mostrado no Quadro 3B, mAbs 2F3, 2B10, 3A3, 3P4c2.2d2 e 3P4c8.2g9 derivados de hibridoma e mAbs 3383, 3563, 3564, 3565, 3568, 3569, 3570 e 3582 derivados de fago-Fab todos se ligaram especificamente aos fragmentos 1-417 e 1-534 de Sp35, sugerindo que estes anticorpos se ligam a epitopos na região LRR de Sp35. Mabs 1A7, 3P1B11F9, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C63G10.2H7, 2P2C9.2G4, 3P4A61D9 e 394C51D8 derivados de hibridoma e Mabs 3495, 3566, 3567, e 1968, derivados de fago-Fab ligaram-se especificamente ao fragmento 34-532 de Sp35 e ligaram-se fracamente ao 417-532 de Sp35, sugerindo que estes anticorpos 205 provavelmente se ligam a epitopos que, pelo menos, incluem uma porção da extremidade C da região de LRR de Sp35. Em experiências similares, estes últimos anticorpos também se ligaram especificamente a um polipéptido Sp35 que consiste nos aminoácidos 34-534 de Sp35 humano e baixa afinidade relativamente a Sp35 de ratinhos e ratos. A afinidade destes últimos anticorpos para Sp35 de ratinhos e rato foi restaurada para o nivel observado usando Sp35 humano quando o aminoácido 419 de Sp35 de ratinho ou rato é alterado de histidina (H) para arginina (R). A arginina é o aminoácido na posição 419 em Sp35 humano. A KD para o anticorpo monoclonal 1A7 foi determinada ser 10 nM (1 x 10^9 M) para a ligação a Sp35 humano e 20 μΜ (2 x 10~5 M) para a ligação a Sp35 murino. Para ELISA de Ap-Sp35 para detectar os anticorpos ligados à região 417-532, realizou-se ELISA como se segue: Os Mabs foram usados para revestir placas de ELISA, em seguida, incubadas ou com uma proteína de fusão Sp35-AP a 4°C durante a noite, seguido por (H+L) anti-humano ligado a AP (1:5000, Jackson ImmunoResearch) à TA durante 1 hora, ou com proteínas de fusão com AP a 4°C durante a noite. O substrato AP foi então revelado por 10 mg/ml de 4NPP em 0,1 M de Glicina, 1 mM de MgCl2, 1 mM de ZnCl2, pH 10,5, e lido a D.O. 405. EXEMPLO 6
Anticorpo Anti-Sp35 que se liga Especificamente a Sp35
Determinado por FACS
Para caracterizar adicionalmente as propriedades de ligação de mAbs anti-Sp35 derivados de hibridoma 1A7 e 2F3 produzidos como descrito no Exemplo 3, a ligação tanto às células COS-7 ou 293 vivas e fixas que expressam Sp35 de rato ou humano foram comparadas. Células Sp35 transfectadas e não transfectadas foram fixadas e sujeitas a análise por FACS (FACS: As células transfectadas com Sp35 de rato ou humano ou 206 controlo do vector foram dissociadas de placas de cultura, lavadas com 2% de FBS/PBS, e incubadas com o anticorpo primário a 1 pg/ml em gelo durante 1 h. As células foram lavadas três vezes com 2% de FBS/PBS, depois incubadas com o anticorpo secundário marcado com PE (1:100, Jackson Immuno Research) em gelo durante 30 min. Depois de 2 lavagens com 2% de FBS/PBS, as células foram fixadas em 2% de PFA e sujeitas a análise de FACS com PE). O resultado de FACS mostrou que os MAbs 1A7 e 2F3 ligados a células COS-7 ou 293 que expressam Sp35, mas não se ligam a células controlo sem expressão de Sp35 (Fig. 2). EXEMPLO 7
Ensaio de Crescimento de Neurites
Para testar a capacidade dos anticorpos monoclonais derivados de fago-Fab e de hibridoma produzidos acima em reverter o efeito inibidor dos inibidores de mielina do SNC, por exemplo, OMgp, em neurónios, revestiram-se lâminas de cultura Lab-Tek® (4 poços) com 0,1 mg/ml de poli-D-lisina (Sigma®). Colocam-se pontos de Ap-OMgp (1 pg/ponto) ou PBS como gotas de 3 μΐ. As lâminas de Lab-Tek® foram em seguida lavadas e revestidas com 10 pg/ml de laminina (Gibco™) . Gânglios da raiz dorsal (DRG) de crias de ratos Sprague Dawley P6-7 foram dissociadas com 1 mg/ml de colagenase de tipo 1 (Worthington), trituradas com o pipetas Pasteur polidas à chama pré-plaqueadas para enriquecer em células neuronais e finalmente plaqueadas a 10000 células/poço nas lâminas de cultura Lab-Tek® pré-revestidas. Adicionaram-se dez pg/ml de mAb 2F3 ou 1A7 imediatamente após o plaqueamento das DRG. O meio de cultura foi F12 (disponível na Gibco/Invitrogen) contendo 5% de soro de cavalo inactivado pelo calor do doador, 5% de soro fetal bovino inactivado pelo calor e 50 ng/ml de factor de crescimento do nervo de ratinho (mNGF) e incubou-se a 37°C e 5% de C02 durante 6 horas. Após a incubação, as lâminas foram fixadas em 4% de paraformaldeído 207 /20% de sacarose e coradas com anticorpo TUJ1 anti-βΙΙΙ-tubulina (Covance) após 16 horas.
Como anticorpo secundário, adicionou-se Alexa Fluor® 594 anti-rato (Molecular Probes) diluído a 1:300 às lâminas e incubou-se durante 2 horas à temperatura ambiente. As lâminas foram cobertas com Gel/Mount™ (Biomeda™) . 5x imagens digitais foram obtidas com o software OpenLab™ (Improvision, Inc., Lexington, MA), e as imagens foram analisadas para quantificação do crescimento de neurites utilizando o software OPENLAB™, tudo de acordo com os parâmetros especificados pelo fabricante.
Ambos os MAbs e 1A7 e 2F3 protegeram os neurónios DRG da inibição do crescimento de neurites mediada por OMgp. (Fig. 3) . EXEMPLO 8 O Anticorpo Monoclonal 1A7 Promove a Recuperação Funcional no Modelo de Lesão da Espinal Medula do Rato A lesão da medula espinal ("SCI") foi induzida por sobre-hemi-secção dorsal como se segue, modificado dos métodos descritos anteriormente (Li, S. et al. J. Neurosci. 24, 10511-10520 (2004)). Ratos fêmea Long Evans anestesiados (7 semanas de idade, Charles River) receberam analgesia pré-operatória (Buprenorfina/Buprenex, 0,05 mg/kg s.c.) e tranquilizados (Midazolam, 2,5 mg/kg i.p.) e realizou-se uma hemi-secção dorsal na vértebra torácica 6/7 interrompendo completamente o tracto corticoespinhal (CST) dorsomedial e dorsolateral principal. Os componentes dorsal e dorso-lateral do tracto corticoespinhal (CST) foram completamente interrompidos e a porção ventral do CST deixados intactos. A ponte de tecido ventral remanescente após hemi secção 208 constituiu aproximadamente 20% do cordão em ambos os grupos de tratamento (dados não apresentados). A função dos membros posteriores foi quantificada utilizando o método de pontuação de campo aberto de Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) (Eby, M.T. et al., J. Biol. Chem. 275, 15336- 15342 (2000)) e todos os animais apresentaram défices funcionais marcados após a SCI, com quase completa paralisia dos membros posteriores ao dia depois da cirurgia. Imediatamente após a transsecção CST, um cateter intratecal foi inserido no espaço subaracnóide em T7 e ligado a uma bomba mini-osmótica ferrada (Alzet modelo 2004, Alza Corp) inserida no espaço subcutâneo. As bombas mini-osmóticas administraram proteína de controlo IgG de isotipo humano (5 mg/ml) ou anticorpo monoclonal 1A7 (4,8 mg/ml) continuamente a uma taxa de 0,25 μΐ/h ao longo de 5 semanas. Os animais controle (tratados com IgG humana) recuperaram substancialmente a função ao longo da duração da experiência de 5 semanas, mas estabilizaram às 3-4 semanas, acabando por atingir uma pontuação média BBB de 9 BBB ± 0,45 (Fig. 7) .
Pelo contrário, a infusão intratecal contínua de 1A7 durante 5 semanas após a transsecção da medula espinal resultou numa melhora significativa nas pontuações de BBB nos animais do grupo de controlo ao longo de cinco semanas, com uma melhoria contínua da função no prazo de 2-5 semanas, atingindo uma pontuação média de 11,1 BBB ±0,7 (Fig. 4). Estes resultados demonstram que o tratamento com o anticorpo monoclonal 1A7 anti-Sp35 promoveu a recuperação da função após a lesão da medula espinal, como demonstrado por um aumento da pontuação de BBB, pela regeneração dos axónios e pela menor retracção dos axónios observada por coloração immuno-histoquímica dos axónios. 209 EXEMPLO 9
Os anticorpos anti-Sp35 1A7, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 6P4F4.1D3, 6P4F4.1F9, 7P1D5.1G9, Li05, Li06, LÍ08, Lil3, Li28, Li33, D05 e D08 promovem a mielinização in vitro 0 papel de anticorpos anti-Sp35 1A7 e 2F3 na mielinização foi investigado in vitro por tratamento de co-culturas de neurónios do gânglio da raiz dorsal (DRG) e de oligodendrócitos com anticorpos anti-Sp35 1A7 e 2F3 e testando a mielinização por imuno-histoquímica e "Western blot". Para estes estudos, foi necessário primeiro gerar culturas primárias de neurónios de DRG e de oligodendrócitos. Gânglios da raiz dorsal de ratinhos E14-E17 Long Evans fêmea embrionários foram cultivados como descrito por Plant et al., J. Neurosci. 22·. 6083-91 (2002). DRGs dissecados foram plaqueados em lamelas revestidas com poli-L-lisina (100 pg/ml) durante 2 semanas. As células foram incubadas na presença de fluorodesoxiuridina durante 2-6 dias e em meio NLA contendo 1 x B27, com 100 ng/ml de NGF (Gibco) durante 8-11 dias.
Oligodendrócitos de ratos Long Evans fêmea com 2 dias de idade (P2) foram cultivados como descrito por Conn, Meth. Neurosci. 2: 1-4 (Academic Press, 1990) com modificações como se segue. Resumidamente, o prosencéfalo foi extirpado de ratos P2 e colocado em meio HBSS frio (Gibco). Os fragmentos de tecido foram cortados em pedaços de um milímetro e incubou-se a 37°C durante 15 minutos em 0,01% de tripsina e 10 pg/ml de DNase. As células dissociadas foram plaqueadas um fasco de cultura de tecidos T75 e crescidas em meio DMEM com 20% de soro fetal bovino a 37°C durante 10 dias. Os oligodendrócitos positivos para A2B5 foram recolhidos agitando os frascos durante a noite a 200 rpm, a 37°C. Os oligodendrócitos A2B5 foram cultivados durante 7 dias em DMEM 210 (Gibco) contendo 25 mM de D-glucose, 4 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, 50 pg/ml de apo-transferrina humana, 5 pg/ml de insulina pancreática bovina, 30 nM de selenato de sódio, 10 nM de hidrocortisona, 10 nM de D-biotina, 1 mg/ml de BSA, 10 ng/ml FGF e PDGF (Peprotech) . As células foram então recolhidas por tripsinização. As células foram em seguida co-cultivadas com os neurónios DRG na presença ou na ausência de 1, 3, 10 ou 30 pg/ml de anticorpos monoclonais anti-Sp35 1A7 ou 2F3, ou um anticorpo de controlo negativo em meio NLA contendo 2% de soro fetal bovino, 50 yg/mL de ácido ascórbico, 100 ng/ml de NGF (Gibco) . Uma dose eficaz para administrar o anticorpo num tal ensaio foi determinada como estando na gama de 0,1 pg/ml a 10 pg/ml, dependendo do anticorpo. Um perito na técnica seria capaz de determinar uma dose eficaz utilizando os ensaios aqui descritos. O meio de cultura foi mudado e os vários anticorpos monoclonais foram reabastecidos cada três dias. Após 30 dias a 37°C, as células co-cultivadas foram coradas por coloração imuno-histoquimica ("IHC") para neurofilamentos com anticorpo anti^III-tubulina para identificar axónios, ou anticorpo anti-MBP para identificar oligodendrócitos (Fig. 4A-E). As células co-cultivadas também foram lisadas e sujeitas a análise de "Western blot" para quantificar MBP (Fig. 4G) . Com base nas análises de IHC e "Western blot", as células co-cultivadas tratadas com anticorpos anti-Sp35 1A7 e 2F3 mostraram um aumento da sobrevivência dos oligodendrócitos e neurónios, aumento do número de axónios em feixes e aumentar o número de células positivas para MBP (Fig. 4F, 10 vezes mais as células positivas para MBP em comparação com o co-culturas controlo tratadas com anticorpo).
Numa experiência semelhante, oligodendrócitos e co-culturas DRG foram incubadas na presença ou ausência de anticorpos 211 anti-Sp35 Li05 e Li06, ou um anticorpo de controlo negativo. A células em co-cultura foram lisadas e sujeitas a análise de "Western blot" para quantificar a MBP (Fig. 8). Com base em análises de "Western blot", as células co-cultivadas tratadas com anticorpos anti-Sp35 Li05 Li06 apresentaram um aumento do número de células positivas para MBP, semelhantes às células de co-cultuivadas tratadas com 3, 10 e 30 pg de SP35-Fc (LINGO-l-Fc).
Em experiências semelhantes, co-culturas de oligodendrócitos e DRG foram incubadas na presença ou ausência de anticorpos anti-SP35 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 6P4F4.1D3, 6P4F4.1F9, 7P1D5.1G9, Li08, Lil3 , Li28, Li33 e também promoveram a mielinização. De modo semelhante, os anticorpos completos D05 e D08 também promoveram a mielinização.
Estes resultados indicaram que o tratamento de co-culturas de DRG-oligodendrócitos com anticorpos anti-Sp35 1A7, 2F3, 3P1D10.2C3 3P1E11.3B7, 6P4F4.1D3, 6P4F4.1F9, 7P1D5.1G9, Li05, Li06, Li08, Lil3, Li28, Li33, D05 e D08 promoveu interacções de axónios de oligodendrócitos maduros e mielinização em comparação com co-culturas tratadas com o anticorpo de controlo. EXEMPLO 10 O anticorpo 1A7 anti-Sp35 promove a sobrevivência de oligodendrócitos e a mielinização in vivo
Ratinhos C57B1/6 macho adultos nativos foram alimentados com cuprizona (0,2% em peso moída com ração para ratinho) durante 6 semanas para induzir desmielinização no corpo caloso de acordo com o método descrito por P Morell et ai., Mol Cell Neurosci. 12: 220-7 (1998). Resumidamente, o anticorpo monoclonal 1A7 anti-Sp35 foi estereotacticamente injectado no corpo caloso desmielinizante nas semanas 2, 2,5, e 3 semanas 212 de alimentação de cuprizona, segundo o método descrito abaixo. Ratinhos controlo foram estereotacticamente injectados nos mesmos intervalos com meio esterilizado contendo anticorpo controlo. Depois das 6 semanas a alimentação de cuprizona foi completada, os ratos retornaram a uma dieta normal durante 2, 4 e 6 semanas (apenas ração para ratinhos morda) para permitir a remielinização.
Os anticorpos monoclonais 1A7 e de controlo foram apresentados como se segue. Os ratinhos tratados com cuprizona foram anestesiados com cetamina (80 mg/kg de peso corporal) e xilazina (10 mg/kg de peso corporal) e posicionados num aparelho de imobilização para cirurgia estereotáctica (David Kopf Instruments). O escalpe foi aberto e os compostos estéreis injectados (1 μΜ em 1 ml de HBSS) unilateralmente no corpo caloso agudamente desmielinizado dos ratinhos receptores nativos com uma seringa Hamilton de 10 μΐ através de coordenadas estereotácticas de 0, 7 mm por trás e 0,3 mm ao lado do bregma, a uma profundidade de 1,7 mm (Messier et al., Pharmacol. Biochem. Behav. 63: 313-18 (1999)). Ratinhos controlo receptores adicionais foram injectados estereotacticamente com HBSS não contendo compostos. A abertura no crânio foi preenchido com Gelfoam e a área foi esfregada com penicilina e estreptomicina (Gibco), e a ferida foi suturada. Foram sacrificados ratinhos a cada semana de teste após a injecção e os seus cérebros removidos e processados para análise molecular, bioquímica e histológica.
Os animais que receberam o anticorpo anti-Sp35 tratamento 1A7 mostraram um aumento da sobrevivência de oligodendrócitos maduros (com base na coloração de anticorpos CC1, Fig. 5A) e da mielinização dos axónios por IHC utilizando o anticorpo anti-proteína MBP ou azul "luxol fast" (Fig. 5B) . 213
Oligodendrócitos positivos para o anticorpo-CCl foram quantificados às quatro semanas e 6 semanas (Fig. 5C) . Estes resultados indicam que o tratamento com o anticorpo anti-Sp35 1A7 promoveu a sobrevivência de oligodendrócitos maduros e a mielinização dos axónios em comparação com ratos tratados com anticorpo de controlo. Do mesmo modo, os animais que receberam o anticorpo 1A7 num modelo lisolecitina de desmielinizaçao também promoveu a mielinização dos axónios em comparação com animais de controlo (dados não apresentados). EXEMPLO 11 0 anticorpo anti-Sp35 1A7 promove a sobrevivência das células do gânglio retinal (RGC) no modelo de transsecção do nervo óptico 0 anticorpo anti-Sp35 1A7 foi testado num modelo de transsecção do nervo óptico, que investiga os factores que afectam a função neuronal. Ratos Sprague-Dawley jovens adultos fêmea (SD) foram utilizados neste estudo. 0 nervo óptico direito de cada animal foi seccionado intraorbitalmente 1,5 mm do disco óptico. Um pedaço de Gelfoam embebido com 6% Fluoro-Gold (FG) foi aplicado no local recentemente seccionado mesmo por trás do disco óptico para marcar as células do gânglio retinal sobreviventes (RGCs) . Os animais foram divididos em três grupos (n = 6 em cada grupo) que receberam os anticorpos anti-SP35 1A7, anticorpo de controlo, ou apenas PBS, por injecção intravitrea. 0 volume de cada injecção intravitrea foi de 4 μΐ enquanto que a dosagem de cada injecção foi de 2 pg. As injecções intravitreas foram realizadas imediatamente após a transsecção do nervo óptico.
Deixou-se os animais sobreviver durante 1 semana. Dois dias antes de se sacrificados os animais, o nervo óptico esquerdo de cada animal foi transseccionado e administrou-se 6% de FG como descrito acima, para marcar as CGRs sobreviventes, para 214 servir como controlo interno. Os animais foram sacrificados com uma overdose de Nembutal e as retinas dissecadas em paraformaldeido a 4%. Quatro cortes radiais foram feitos para dividir as retinas em quatro quadrantes (superior, inferior, nasal e temporal). As retinas foram então pós-fixados no mesmo fixador durante 1 hora antes de serem montados planos com o meio de montagem (Dako). As lâminas foram examinadas sob um microscópio de fluorescência, utilizando um filtro de ultravioletas (comprimento de onda de excitação = 330-380 nm) . CGRs marcadas foram contadas ao longo da linha média de cada um dos quadrantes, a partir do disco óptico para a fronteira periférica da retina em intervalos de 500 pm, sob uma grelha ocular de 200 X 200 pm2. A percentagem de CGRs sobreviventes resultantes de cada tratamento foi expressa através da comparação do número de CGRs sobreviventes nos olhos lesionados com os seus olhos contra-laterais. Todos os dados foram expressos como média ± EPM. A significância estatística foi avaliada por ANOVA, seguida de um teste post hoc de Tukey-Kramer. As diferenças foram consideradas significativas para p <0,05. Animais tratados com anticorpo anti-Sp35 1A7 apresentaram mais sobrevivência neuronal (80%) em comparação com os animais tratados com o anticorpo controlo ou com PBS, cada um dos quais apenas apresentaram aproximadamente 50% de sobrevivência neuronal (Fig. 6). EXEMPLO 12
Teste de anticorpos anti-Sp35 para a remielinização no modelo de esmagamento do nervo óptico O nervo óptico direito é completamente esmagado por acção de um fórceps #5 durante 10 segundos a cerca de 1,5 mm detrás do globo ocular intraorbitalmente imediatamente antes da administração de 2 pl de anticorpo monoclonal 1A7, 2F3, Li05 e Li06 em 2 ml por injecção intravitrea. 215
Os animais recebem uma segunda injecção intravitrea do mesmo tratamento, uma semana após a cirurgia. Duas semanas após a cirurgia, faz-se uma perfusão aos animais com fixadores de microscopia electrónica, procede-se a uma pós-fixação e preparam-se seções semifinas e ultrafinas. As seções longitudinais do nervo óptico estão coradas e preparados para observação de mielina. A mielinização das partes proximal e distai do nervo óptico esmagado são comparadas entre os diferentes grupos de tratamento. Os animais tratados com Sp35-Fc e 1A7, 2F3, Li05 e Li06, assim como os controlos apropriados, serão analisados para remielinização na parte distai do nervo óptico em comparação com os controlos. EXEMPLO 13
Teste de anticorpos anti-Sp35 para regeneração do axónio no modelo de esmagamento do nervo óptico 0 nervo óptico direito foi esmagado por acção de um fórceps #5 durante 10 segundos a cerca de 1,5-2 mm para detrás do globo ocular intraorbitalmente imediatamente antes da administração de 2 μΐ de anticorpo monoclonal 1A7 em PBS por injecção intravitrea. 4 ratos foram testados com o anticorpo 1A7 e 8 os ratos foram usados como animais de controlo. Os animais receberam uma segunda injecção intravitrea de um mesmo tratamento, uma semana após a cirurgia. Três dias antes do sacrifício dos animais em teste (dia 11 da experiência), injectou-se 2 ml de CTB-FITC intravitrealmente para marcação, anterógrada, dos axónios do nervo óptico regenerativos. Ao 14° dia após a cirurgia, procedeu-se à perfusão e pós-fixação dos animais. O nervo óptico esmagado foi processado para secções longitudinais congeladas. Os axónios marcados com CTB-FITC, gue atravessam o local da lesão foram contados como fibras regenerativas a várias distâncias para além do local 216 de esmagamento. Quando se injectou 1A7 no olho, a regeneração dos axónios foi observada até 250 pm para além do local do esmagamento. Ver Fig. 10. EXEMPLO 14
Os anticorpos anti-Sp35 promovem a remielinização e reparação do nervo óptico usando o modelo de rato EAE induzida pela MOG.
Para estas experiências, foi usado o modelo de rato de Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE) induzida pela Glicoproteina Mielina do Oligodendrócito (MOG). Este é o modelo animal para a esclerose múltipla humana. Emulsificou-se 50 μΐ de 200 ng de adjuvante completo de Freund (Chondrex Inc.) mais 50 μΐ de 50 pg MOG em solução salina (1:1) e manteve-se em gelo antes de ser injectado por via intradérmica na base da cauda de cada animal. Ratos Norway castanhos fêmea, com 8-10 semanas de idade, foram utilizados para todas as experiências. Observação geral na técnica indica que o modelo EAE é induzido a cerca de 15 dias após a injecção de MOG. Os ratos são pontuados relativamente a sinais clínicos de EAE. Os sinais são pontuados do seguinte modo: grau 0,5, paresia distai da cauda, grau 1, paralisia completa da cauda; grau 1,5, paresia da cauda e leve paresia da perna posterior; grau 2,0, paresia grave unilateral da perna posterior; grau 2,5, paresia grave bilateral dos membros posteriores; grau 3,0, paralisia bilateral completa dos membros posteriores; grau 3,5, paralisia completa bilateral dos membros posteriores e paresia de um membro dianteiro; paralisia de grau completo (tetraplegia), estado moribundo ou morte. Os animais recebem o tratamento uma vez que o modelo de EAE é induzido. 217
Injectou-se intravitrealmente 2 μg/μl de um anticorpo anti-Sp35 (1A7) no dia 15 após indução MOG-EAE. Injectou-se mais duas vezes 2 pg/μΐ de anticorpo anti-Sp35, 1A7, no dia 22 e no dia 28. Após a finalização da experiência, procedeu-se á perfusão dos animais com PFA a 4%. Os nervos ópticos foram pós-fixados em 0s04 a 1%, desidratados e embebidos em Epon. Seções semifinas (1 μΜ) foram cortados e coradas com azul de toluidina para avaliação da mielinização. Os nervos ópticos dos animais tratados foram comparados com aqueles dos animais não tratados relativamente à regeneração dos axónios e para a remielinização no nervo óptico. Todos os procedimentos foram realizadas seguindo um protocolo aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
Os animais que receberam tratamento com o anticorpo anti-Sp35 1A7 apresentou remielinização e reparação do nervo óptico em comparação com os nervos ópticos normais ou animais que foram submetidos a EAE induzida pela MOG, mas que não receberam tratamento (Fig. 9) . Na Fig. 9C, as setas apontam para axónios mielinizados. Os animais que receberam um anticorpo que reconhece o domínio III da Proteína G de Streptococcus (M0PC21) não específico para Sp35, não apresentou sinais de remielinização ou reparação do nervo óptico, em comparação com os nervos ópticos normais ou os nervos ópticos de animais não tratados (dados não apresentados). 0 anticorpo antagonista Sp35 1A7 promoveu a remielinização e reparação de nervos ópticos num modelo de neurite óptica num rato EAE induzida por MOG (Fig. 9). EXEMPLO 15
Teste de anticorpos anti-Sp35 para a promoção da remielinização do SNC usando o modelo de ratinho EAE induzido por MOG 218 É induzida EAE na estirpe mista 129B6 de ratinhos através de imunização intradérmica (dia 0) com 100 pg de proteína MOG1-125 emulsionada com adjuvante completo de Freund (CFA). O volume injectado é de 100 μΐ por rato e é distribuído por três locais (pavilhão do ouvido, costas e pele) . A emulsão é preparada a partir de uma proporção de 1:1 em volume e contém 1 mg/ml de MOG1-125 e 2 mg/mL de M. tuberculosis (estirpe H37Ra, Chondrex). A toxina pertussis (200 ng/ratinho) é administrada intraperitonealmente no momento da imunização e 2 dias depois. São registados diariamente o peso corporal e os aos graus clínicos de EAE (0 = sem sinais clínicos; 1 = cauda mole, 2 = fraqueza dos membros posteriores, limitações no reflexo de endireitamento ou marcha bamboleada, 3 = paralisia completa dos membros posteriores ou ausência do reflexo de endireitamento, 4 = paralisia completa dos membros posteriores com algum grau de envolvimento dos membros, 5 = animais totalmente paralisados; 6 = moribundo ou morto).
Todos os procedimentos são realizados seguindo um protocolo, aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Os animais recebem o tratamento com anticorpos monoclonais 1A7, 2F3, Li05 e Li06 ou anticorpos de controlo no dia 0 do estudo. São recolhidas amostras de sangue são recolhidas em diversos momentos ao longo das experiências pela técnica sangramento retro-orbital. O plasma é separado das PBMC por centrifugação e a fenotipagem das células é realizada por coloração de FACS. 0 perfil da resposta humoral de anticorpos anti-MOG é realizada por ELISA utilizando mAbs específicos para a subclasse/isotipo (Pharmingen). No final de cada experiência, o cérebro, a espinal medula, os nervos ópticos e os nervos ciáticos são recolhidas após a perfusão. [0100] Este mesmo protocolo é usado para induzir a EAE em ratinhos "knockout" Sp35 e aqueles da mesma ninhada. Ratinhos "knockout" Sp35 normalmente apresentam uma menor pontuação de EAE (1,5), e não apresentam recaídas em relação ao controlo 219 (durante um período de 45 dias), que os animais da mesma ninhada (EAE pontuação 3,5).
Animais tratados com Sp35-Fc e 1A7, 2F3 serão analisadas relativamente à remielinização em comparação com o controlo. A proteína MOG1-125 com cauda His foi expressa em Pichia pastoris utilizando um promotor TetO-AOXl indutível pela doxiciclina (M. Levesque, D. Krushinskie e K. Strauch, manuscrito em preparação). A sequência de codificação extracelular (Glyl até Glyl25 da proteína madura após remoção da sequência de sinal) de MOG de rato foi amplificada por PCR usando os seguintes iniciadores: 5' GGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGCATCATCATCATCATCATATGGGACAGTTCAGAGT GATAGGG 3 ' (SEQ ID NO: 368), e 5'TTCGCGGCCGCTATTAGCCAGGGTTG ATCCAGTAGAAGGG3' (SEQ ID NO: 369). k -k rk 220
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Biogen IDEC MA, Inc. SHA, Mi PEPINSKY, R. Blake SHAO, Zhaohui <120> Anticorpos SP35 e Suas Utilizações <13 0> 2159.036PC02 <150> 60/697,336 <151> 2005-07-08 <150> 60/771,900 <151> 2006-02-10 <150> 60/814,522 <151> 2006-06-19 <160> 409 <170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 1845
<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 atgctggcgg ggggcgtgag gagcatgccc agccccctcc tggcctgctg gcagcccatc 60 ctcctgctgg tgctgggctc agtgctgtca ggctcggcca cgggctgccc gccccgctgc 120 gagtgctccg cccaggaccg cgctgtgctg tgccaccgca agcgctttgt ggcagtcccc 180 gagggcatcc ccaccgagac gcgcctgctg gacctaggca agaaccgcat caaaacgctc 240 aaccaggacg agttcgccag cttcccgcac ctggaggagc tggagctcaa cgagaacatc 300 gtgagcgccg tggagcccgg cgccttcaac aacctcttca acctccggac gctgggtctc 360 cgcagcaacc gcctgaagct catcccgcta ggcgtcttca ctggcctcag caacctgacc 420 aagctggaca tcagcgagaa caagattgtt atcctgctgg actacatgtt tcaggacctg 480 tacaacctca agtcactgga ggttggcgac aatgacctcg tctacatctc tcaccgcgcc 540 ttcagcggcc tcaacagcct ggagcagctg acgctggaga aatgcaacct gacctccatc 600 cccaccgagg cgctgtccca cctgcacggc ctcatcgtcc tgaggctccg gcacctcaac 660 221 atcaatgcca tccgggacta ctccttcaag aggctctacc gactcaaggt cttggagatc 720 tcccactggc cctacttgga caccatgaca cccaactgcc tctacggcct caacctgacg 780 tccctgtcca tcacacactg caatctgacc gctgtgccct acctggccgt ccgccaccta 840 gtctatctcc gcttcctcaa cctctcctac aaccccatca gcaccattga gggctccatg 900 ttgcatgagc tgctccggct gcaggagatc cagctggtgg gcgggcagct ggccgtggtg 960 gagccctatg ccttccgcgg cctcaactac ctgcgcgtgc tcaatgtctc tggcaaccag 1020 ctgaccacac tggaggaatc agtcttccac tcggtgggca acctggagac actcatcctg 1080 gactccaacc cgctggcctg cgactgtcgg ctcctgtggg tgttccggcg ccgctggcgg 1140 ctcaacttca accggcagca gcccacgtgc gccacgcccg agtttgtcca gggcaaggag 1200 ttcaaggact tccctgatgt gctactgccc aactacttca cctgccgccg cgcccgcatc 1260 cgggaccgca aggcccagca ggtgtttgtg gacgagggcc acacggtgca gtttgtgtgc 1320 cgggccgatg gcgacccgcc gcccgccatc ctctggctct caccccgaaa gcacctggtc 1380 tcagccaaga gcaatgggcg gctcacagtc ttccctgatg gcacgctgga ggtgcgctac 1440 gcccaggtac aggacaacgg cacgtacctg tgcatcgcgg ccaacgcggg cggcaacgac 1500 tccatgcccg cccacctgca tgtgcgcagc tactcgcccg actggcccca tcagcccaac 1560 aagaccttcg ctttcatctc caaccagccg ggcgagggag aggccaacag cacccgcgcc 1620 actgtgcctt tccccttcga catcaagacc ctcatcatcg ccaccaccat gggcttcatc 1680 tctttcctgg gcgtcgtcct cttctgcctg gtgctgctgt ttctctggag ccggggcaag 1740 ggcaacacaa agcacaacat cgagatcgag tatgtgcccc gaaagtcgga cgcaggcatc 1800 agctccgccg acgcgccccg caagttcaac atgaagatga tatga 1845 <210> 2 <211> 614
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Met Leu Ala Gly Gly Vai Arg Ser Met Pro Ser Pro Leu Leu Ala Cys 15 10 15 222
Trp Gin Pro Ile Leu Leu Leu Vai Leu Gly Ser Vai Leu 20 25 Ser Gly Ser 30 Ala Thr Gly Cys Pro Pro Arg Cys Glu Cys Ser Ala Gin 35 40 45 Asp Arg Ala Vai Leu Cys His Arg Lys Arg Phe Vai Ala Vai Pro Glu 50 55 60 Gly Ile Pro Thr Glu Thr Arg Leu Leu Asp Leu Gly Lys Asn Arg Ile 65 70 75 Lys Thr Leu 80 Asn Gin Asp Glu Phe Ala Ser Phe Pro His Leu Glu Glu 85 90 Leu Glu Leu 95 Asn Glu Asn Ile Vai Ser Ala Vai Glu Pro Gly Ala Phe 100 105 Asn Asn Leu 110 Phe Asn Leu Arg Thr Leu Gly Leu Arg Ser Asn Arg Leu 115 120 125 Lys Leu Ile Pro Leu Gly Vai Phe Thr Gly Leu Ser Asn Leu Thr Lys 130 135 140 Leu Asp Ile Ser Glu Asn Lys Ile Vai Ile Leu Leu Asp Tyr Met Phe 145 150 155 Gin Asp Leu 160 Tyr Asn Leu Lys Ser Leu Glu Vai Gly Asp Asn Asp Leu 165 170 Vai Tyr Ile 175 Ser His Arg Ala Phe Ser Gly Leu Asn Ser Leu Glu Gin 180 185 Leu Thr Leu 190 Glu Lys Cys Asn Leu Thr Ser Ile Pro Thr Glu Ala Leu 195 200 205 Ser His Leu His Gly Leu Ile Vai Leu Arg Leu Arg His Leu Asn Ile Asn Ala Ile 223 210 215 220
Arg Asp Tyr Ser Phe Lys Arg Leu Tyr Arg Leu Lys Vai Leu Glu Ile 225 230 235 240
Ser His Trp Pro Tyr Leu Asp Thr Met Thr Pro Asn Cys Leu Tyr Gly 245 250 255
Leu Asn Leu Thr Ser Leu Ser Ile Thr His Cys Asn Leu Thr Ala Vai 260 265 270
Pro Tyr Leu Ala Vai Arg His Leu Vai Tyr Leu Arg Phe Leu Asn Leu 2^5 280 285
Ser Tyr Asn Pro Ile Ser Thr Ile Glu Gly Ser Met Leu His Glu Leu 290 295 300
Leu Arg Leu Gin Glu Ile Gin Leu Vai Gly Gly Gin Leu Ala Vai Vai 305 310 315 320
Glu Pro Tyr Ala Phe Arg Gly Leu Asn Tyr Leu Arg Vai Leu Asn Vai 325 330 335
Ser Gly Asn Gin Leu Thr Thr Leu Glu Glu Ser Vai Phe His Ser Vai 340 345 350
Gly Asn Leu Glu Thr Leu Ile Leu Asp Ser Asn Pro Leu Ala Cys Asp 355 360 365
Cys Arg Leu Leu Trp Vai Phe Arg Arg Arg Trp Arg Leu Asn Phe Asn 370 375 380
Arg Gin Gin Pro Thr Cys Ala Thr Pro Glu Phe Vai Gin Gly Lys Glu 385 390 395 400
Phe Lys Asp Phe Pro Asp Vai Leu Leu Pro Asn Tyr Phe Thr Cys Arg 405 410 415 224
Arg Ala Arg Ile Arg Asp Arg Lys Ala Gin Gin Vai Phe Vai Asp Glu 425 43o Gly His Thr Vai Gin Phe Vai Cys Arg Ala Asp Gly Asp Pro Pro Pro 435 440 445 Ala Ile 450 Leu Trp Leu Ser Pro Arg Lys His Leu Vai Ser Ala Lys Ser 455 460 Asn Gly 465 Arg Leu Thr Vai Phe Pro Asp Gly Thr Leu Glu Vai Arg Tyr 470 475 480 Ala Gin Vai Gin Asp Asn Gly Thr Tyr Leu Cys Ile Ala Ala Asn Ala 485 490 495 Gly Gly Asn Asp Ser Met Pro Ala His Leu His Vai Arg Ser Tyr Ser 500 505 5io Pro Asp Trp Pro His Gin Pro Asn Lys Thr Phe Ala Phe Ile Ser Asn 515 520 525 Gin Pro 530 Gly Glu Gly Glu Ala Asn Ser Thr Arg Ala Thr Vai Pro Phe 535 540 Pro Phe 545 Asp Ile Lys Thr Leu Ile Ile Ala Thr Thr Met Gly Phe Ile 550 555 560 Ser Phe Leu Gly Vai Vai Leu Phe Cys Leu Vai Leu Leu Phe Leu Trp 565 570 575 Ser Arg Gly Lys Gly Asn Thr Lys His Asn Ile Glu Ile Glu Tyr Vai 580 585 590 Pro Arg Lys Ser Asp Ala Gly Ile Ser Ser Ala Asp Ala Pro Arg Lys 595 600 605 Phe Asn 610 Met Lys Met Ile 225 <210> <211> <212> <213> 3 6 PRT Homo sapiens <400> 3
Met Gin Vai Ser Lys Arg 1 5 <210> <211> <212> <213> 4 29 ADN Murinae gen. sp. <400> 4 gcgtctagaa ctggatggtg ggagatgga 29 <210> <211> <212> <213> 5 15 ADN Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (LilO) <400> 5 acttacccta tggtt 15 <210> <211> <212> <213> 6 5 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (LilO) <400> 6
Thr Tyr Pro Met Vai 1 5 <210> <211> <212> <213> 7 51 ADN Sequência artificial 226 <220> <223> VH-CDR2 (LilO) <40 0> 7 tggatcggtc cttctggtgg cgttactgct tatgctgact ccgttaaagg t 51 <210> 8 <211> 17
<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (LilO) <400> 8
Trp Ile Gly Pro Ser Gly Gly Vai Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 15 10 15
Gly <210> 9 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (LilO) <400> 9 ccctatagca gtggctggtg ggacttcgat ctc 33 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (LilO) <400> 10 Pro Tyr Ser Ser Gly Trp Trp Asp Phe Asp 1 5 10 227 <210> <211> <212> <213> 11 15 ADN Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Li 0 7) <400> 11 atgtacttta tgggt 15 <210> <211> <212> <213> 12 5 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Li 0 7) <400> 12
Met Tyr Phe Met Gly 1 5 <210> <211> <212> <213> 13 51 ADN Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Li 0 7) <400> 13 tctatctctc cttctggtgg ctttacttct tatgctgact ccgttaaagg t 51 <210> <211> <212> <213> 14 17 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Li 0 7) <400> 14
Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Phe Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 15 10 15 228
Gly <210> <211> <212> <213> 15 21 ADN Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Li 0 7) <400> 15 gatcggcatg cttttgatat c 21 <210> <211> <212> <213> 16 7 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Li 0 7) <400> 16
Asp Arg His Ala Phe Asp Ile 1 5 <210> <211> <212> <213> 17 14 ADN Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Li 0 5) <400> 17 cttacgctat gggt 14 <210> <211> <212> <213> 18 5 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Li 0 5) 229 <400> 18 Ala Tyr Ala Met Gly 1 5 <210> 19 <211> 51 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Li 0 5) <400> 19 tctatcgttt cttctggtgg ctatactgat tatgctgact ccgttaaagg t 51 <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Li 0 5) <400> 20
Ser Ile Vai Ser Ser Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 15 10 15
Gly <210> 21 <211> 27 <212> ADN <213> Sequênc <220> <223> VH-CDR3 <400> 21 gagggtgacc ata ia artificial (Li 0 5) atgcttt tgatatc 27 <210> 22 <211> 9 230 <212> <213> PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Li05) <400> 22
Glu Gly Asp His Asn Ala Phe Asp Ile 1 5 <210> <211> <212> <213> 23 15 ADN Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Li11) <400> 23 tcttacgcta tgtat 15 <210> <211> <212> <213> 24 5 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Li11) <400> 24
Ser Tyr Ala Met Tyr 1 5 <210> <211> <212> <213> 25 51 ADN Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Li11) <400> 25 tctatctcta cttctggtgg ctatactggt tatgctgact ccgttaaagg t 51 <210> 26 231 <211> <212> <213> 17 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Li11) <400> 26
Ser Ile Ser Thr Ser Gly Gly Tyr Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 1 5 10 15 Gly <210> <211> <212> <213> 27 36 ADN Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Li11) <400> 27 gataccagcg ataatgacta ctactacatg gacgtc 36 <210> <211> <212> <213> 28 12 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Li11) <400> 28
Asp Thr Ser Asp Asn Asp Tyr Tyr Tyr Met Asp Vai 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 29 15 ADN Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (LiOl) 232 15 <40 0> 29 aagtaccaga tgact <210> <211> <212> <213> 30 5 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (LiOl) <400> 30
Lys Tyr Gin Met Thr 1 5 <210> <211> <212> <213> 31 51 ADN Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (LiOl) <400> 31 tctatctatc cttctggtgg caatactgtt tatgctgact ccgttaaagg t 51 <210> <211> <212> <213> 32 17 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (LiOl) <400> 32
Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Asn Thr Vai Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 1 5 10 15 Gly
<210> <211> <212> 33 27 ADN 233 <213>
Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (LiOl) <400> 33 gggactacag aggcagtctt tgactac 27 <210> <211> <212> <213> 34 9 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (LiOl) <400> 34
Gly Thr Thr Glu Ala Vai Phe Asp Tyr 1 5 <210> <211> <212> <213> 35 15 ADN Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Li12) <400> 35 cagtacaata tgttt 15 <210> <211> <212> <213> 36 5 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Li12) <400> 36
Gin Tyr Asn Met Phe 1 5 <210> 37 <211> 51 234 <212> <213> ADN Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Li12) <40 0> 37 cgtatctctt cttctggtgg catgactatg tatgctgact ccgttaaagg t <210> <211> <212> <213> 38 17 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Li12) <400> 38
Arg Ile Ser Ser Ser Gly Gly Met Thr Met Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 1 5 10 15 Gly <210> <211> <212> <213> 39 69 ADN Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Li12) <400> 39 gaagcgttac ggccttattg tagtggtggt agctgctact ccgactacta ctactacggt 60 atggacgtc 69 <210> <211> <212> <213> 40 23 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Lil2) <400> 40 235
Glu Ala Leu Arg Pro Tyr Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr Ser Asp Tyr 15 10 15
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Vai 20 <210> <211> <212> <213> 41 15 ADN Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Li 0 6) <400> 41 gagtacccta tggat 15 <210> <211> <212> <213> 42 5 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Li06) <400> 42
Glu Tyr Pro Met Asp 1 5 <210> <211> <212> <213> 43 51 ADN Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Li 0 6) <400> 43 tctatctatt cttctggtgg ctctactgtt tatgctgact ccattaaagg t 51 <210> <211> <212> <213> 44 17 PRT Sequência artificial 236 <220> <223> VH-CDR2 (LÍ06) <40 0> 44
Ser Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Ser Thr Vai Tyr Ala Asp Ser Ile Lys 1 5 10 15 Gly <210> <211> <212> <213> 45 27 ADN Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Li 0 6) <400> 45 gagggtgact ctgatgcttt tgatatc 27 <210> <211> <212> <213> 4 6 9 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Li 0 6) <400> 4 6
Glu Gly Asp Ser Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 <210> <211> <212> <213> 47 15 ADN Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Li 0 8) <400> 47 cattacgaga tggtt 15 237 <210> <211> <212> <213> 48 5 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Li 0 8) <400> 48
His Tyr Glu Met Vai 1 5 <210> <211> <212> <213> 49 51 ADN Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Li 0 8) <400> 49 tctatccgtt cttctggtgg cgctactaag tatgctgact ccgttaaagg t 51 <210> <211> <212> <213> 50 17 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Li08) <400> 50
Ser Ile Arg Ser Ser Gly Gly Ala Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 1 5 10 15 Gly <210> <211> <212> <213> 51 27 ADN Sequência artificial <220> 238 <223> VH-C DR3 (Li08) <400> 51 gagtcgccag acgactactt tgactac 27 <210> <211> <212> <213> 52 9 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Li08) <400> 52
Glu Ser Pro Asp Asp Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> <211> <212> <213> 53 15 ADN Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Li03) <400> 53 cagtacccta tggag 15 <210> <211> <212> <213> 54 5 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Li03) <400> 54
Gin Tyr Pro Met Glu 1 5 <210> <211> <212> <213> 55 51 ADN Sequência artificial 239 51 <220> <223> VH-CDR2 (LÍ03) <400> 55 ggtatctatc cttctggtgg ctctactgtt tatgctgact ccgttaaagg t <210> 56 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Li03) <400> 56
Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Vai Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 15 10 15
Gly <210> 57 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Li03) <400> 57 30 gcggggcagt ggctggggga ctttgactac <210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Li03) <400> 58 Ala Gly Gin Trp Leu Gly Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 240 <210> <211> <212> <213> 59 15 ADN Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Li09) <400> 59 atgtactcta tggtt 15 <210> <211> <212> <213> 60 5 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Li 0 9) <400> 60
Met Tyr Ser Met Vai 1 5 <210> <211> <212> <213> 61 51 ADN Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Li 0 9) <400> 61 tatatctctc cttctggtgg caagactatg tatgctgact ccgttaaagg t 51 <210> <211> 62 17 <212> <213> PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Li 0 9) <400> 62
Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr Met Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 15 10 15 241
Gly <210> 63 <211> 69 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Li 0 9) <400> 63 60 69 gattcgagac gccggtatta cgatttttgg agtggttatc acaactacta ctactactac atggacgtc <210> 64 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Li09) <400> 64
Asp Ser Arg Arg Arg Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr His Asn Tyr 15 10 15
Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Vai 20 <210> 65 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Li 0 4) <400> 65 cgttacaata tgggt <210> 66 <211> 5 242 15 <212> <213> PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Li 0 4) <400> 66
Arg Tyr Asn Met Gly 1 5 <210> <211> <212> <213> 67 51 ADN Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Li 0 4) <400> 67 gttatctatc cttctggtgg cggtactcat tatgctgact ccgttaaagg t 51 <210> <211> <212> <213> 68 17 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Li 0 4) <400> 68
Vai Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Gly Thr His Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 1 5 10 15 Gly <210> <211> <212> <213> 69 25 ADN Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Li 0 4) <400> 69 243 tctatagcag atgatgcttt tgata 25 <210> <211> <212> <213> 70 9 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Li 0 4) <400> 70
Ser Ile Ala Asp Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 <210> <211> <212> <213> 71 15 ADN Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Li 0 2) <400> 71 acttacgaga tgatt 15 <210> <211> <212> <213> 72 5 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Li02) <400> 72
Thr Tyr Glu Met Ile 1 5 <210> <211> <212> <213> 73 48 ADN Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Li73) 244 48 <400> 73 tctatcggtc cttctggtgg ccttacttgg tatgctgact ccgttaaa <210> 74 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Li02) <400> 74 1 5 Gly
Ser Ile Gly Pro Ser Gly Gly Leu Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Vai Lys <210> 75 <211> 51 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Li02) <400> 75 51 atgtattact gtgtacggat tgatgatagt agtggttggg cttttgatat c <210> 76 <211> 17
<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Li02) <400> 76
Met Tyr Tyr Cys Vai Arg Ile Asp Asp Ser Ser Gly Trp Ala Phe Asp 15 10 15
Ile 245 <210> <211> <212> <213> 77 5 PRT Murinae gen. sp. <400> 77
Asn Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> <211> <212> <213> 78 17 PRT Murinae gen. sp. <400> 78
Trp Ile Asn Thr Asp Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Glu Asp Phe Gin 1 5 10 15 Gly <210> <211> <212> <213> 79 7 PRT Murinae gen. sp. <400> 79
Glu Gly Vai His Phe Asp Tyr 1 5 <210> <211> 80 7 <212> <213> PRT Murinae gen. sp. <400> 80
Phe Ser Asp Ala Trp Leu Asp 1 5 81 19 <210> <211> 246 <212> <213> PRT Murinae gen. sp. <400> 81
Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Asn Tyr Ala Glu Ser 15 10 15
Vai Lys Gly <210> <211> 82 4 <212> <213> PRT Murinae gen. sp. <400> 82
Ser Phe Ala Tyr <210> <211> <212> <213> 83 5 PRT Murinae gen. sp. <400> 83
Ser Ser Trp Thr Gin 1 5 <210> <211> <212> <213> 84 17 PRT Murinae gen. sp. <400> 84
Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gin Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 85 247 <211> <212> <213> 8 PRT Murinae gen. sp. <400> 85
His Asn Ser Tyr Gly Met Asp Tyr 1 5 <210> <211> <212> <213> 86 33 ADN Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (LilO) <400> 86 cgggcgagtc agggtattgg caactggtta gcc 33 <210> <211> <212> <213> 87 11 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (LilO) <400> 87
Arg Ala Ser Gin Gly Ile Gly Asn Trp Leu Ala 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 88 21 ADN Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (LilO) <400> 88 gctgcatcca gtttggaaag t 21 <210> 89 <211> 7
<212> PRT 248 <213>
Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (LilO) <400> 89
Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> <211> <212> <213> 90 27 ADN Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (LilO) <400> 90 caacaggctc agactttccc gctcacc 27 <210> <211> <212> <213> 91 9 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (LilO) <400> 91
Gin Gin Ala Gin Thr Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> <211> <212> <213> 92 33 ADN Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Li 0 7) <400> 92 tctggagatc agttgggtga caaacatgtg gct 33 <210> 93 <211> 11 249 <212> <213> PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Li 0 7) <400> 93
Ser Gly Asp Gin Leu Gly Asp Lys His Vai Ala 15 10 <210> <211> <212> <213> 94 21 ADN Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Li 0 7) <400> 94 ctagacatta agaggcccgc a 21 <210> <211> <212> <213> 95 7 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Li 0 7) <400> 95
Leu Asp Ile Lys Arg Pro Ala 1 5 <210> <211> 96 24 <212> <213> ADN Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Li 0 7) <400> 96 caggcgtggg acatcaagac ggtc 24 <210> 97 250 <211> <212> <213> 8 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Li 0 7) <400> 97
Gin Ala Trp Asp Ile Lys Thr Vai 1 5 <210> <211> <212> <213> 98 33 ADN Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Li 0 5) <400> 98 gggggagaca acattggaag taagagtgtc cac 33 <210> <211> <212> <213> 99 11 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Li05) <400> 99
Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Ser Vai His 15 10 <210> <211> <212> <213> 100 21 ADN Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Li 0 5) <400> 100 gatgattatg accggccctc a 21 251 <210> <211> <212> <213> 101 7 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Li05) <400> 101
Asp Asp Tyr Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> <211> <212> <213> 102 33 ADN Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Li 0 5) <400> 102 caggtgaggg acagccgtac tgaggaacgg gtg 33 <210> <211> <212> <213> 103 11 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Li 0 5) <400> 103
Gin Vai Arg Asp Ser Arg Thr Glu Glu Arg Vai 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 104 33 ADN Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Li11) <400> 104 cgggcgagtc aggagattgc caactactta gcc 33 252 <210> <211> <212> <213> 105 11 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Li11) <400> 105
Arg Ala Ser Gin Glu Ile Ala Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> <211> 106 21 <212> <213> ADN Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Li11) <400> 106 gatacataca ctttgcagac t 21 <210> <211> <212> <213> 107 7 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Li11) <400> 107
Asp Thr Tyr Thr Leu Gin Thr 1 5 <210> <211> <212> <213> 108 27 ADN Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Li11) <400> 108 caacaggctg acattttccc gctctct 27 253 <210> <211> <212> <213> 109 9 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Li11) <400> 109
Gin Gin Ala Asp Ile Phe Pro Leu Ser 1 5 <210> <211> <212> <213> 110 33 ADN Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (LiOl) <400> 110 caggcgagtc aggacattag caactattta aat 33 <210> <211> <212> <213> 111 11 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (LiOl) <400> 111
Gin Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 112 21 ADN Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (LiOl) <400> 112 254 21 gatgcatcca atttggaaac a <210> <211> <212> <213> 113 7 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (LiOl) <400> 113
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr 1 5 <210> <211> <212> <213> 114 30 ADN Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (LiOl) <400> 114 caacaggctg acaggttccc tgcggtcact 30 <210> <211> <212> <213> 115 10 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (LiOl) <400> 115
Gin Gin Ala Asp Arg Phe Pro Ala Vai Thr 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 116 33 ADN Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Li 0 6) 255 33 <40 0> 116 cgggccagtc agagtattag tagctggttg gcc <210> <211> <212> <213> 117 11 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Li06) <400> 117
Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 118 21 ADN Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Li 0 6) <400> 118 gctgcatcca gtttacgaac t 21 <210> <211> <212> <213> 119 7 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Li 0 6) <400> 119
Ala Ala Ser Ser Leu Arg Thr 1 5 <210> <211> 120 27 <212> <213> ADN Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Li06) 256 27 <400> 120 ctacaagatt acagttaccc tctcact <210> <211> <212> <213> 121 9 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Li 0 6) <400> 121
Leu Gin Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> <211> <212> <213> 122 33 ADN Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Li08) <400> 122 caggcgagtc aggacattag ttactattta aat 33 <210> <211> <212> <213> 123 11 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Li 0 8) <400> 123
Gin Ala Ser Gin Asp Ile Ser Tyr Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> <211> <212> <213> <220> 124 21 ADN Sequência artificial 257 <223> VL-CDR2 (Li08) <40 0> 124 gatgtatcca atttgcaaac a 21 <210> <211> <212> <213> 125 7 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Li08) <400> 125
Asp Vai Ser Asn Leu Gin Thr 1 5 <210> <211> <212> <213> 126 27 ADN Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Li 0 8) <400> 126 caacagtctg ataatctccc tctcact 27 <210> <211> <212> <213> 127 9 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Li 0 8) <400> 127
Gin Gin Ser Asp Asn Leu Pro Leu Thr 1 5 <210> <211> <212> <213> 128 32 ADN Sequência artificial 258 <220> <223> VL-CDR1 (Li03) <400> 128 gggcaagtca gagcattagc agctatttaa at 32 <210> <211> <212> <213> 129 11 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Li03) <400> 129
Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> <211> 130 21 <212> <213> ADN Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Li03) <400> 130 gctgcatcca gtttgcaaag t 21 <210> <211> <212> <213> 131 7 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Li03) <400> 131
Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser 1 5 <210> <211> <212> <213> 132 27 ADN Sequência artificial 259 <220> <223> VL-CDR3 (LÍ03) <40 0> 132 caacagagtt acagtacccc gtggacg 27
<210> 133 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Li03) <400> 133 Gin G1 n Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 134 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Li 0 9) <400> 134 cgcgcaagtc agagcatcga cacctattta aat <210> 135 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Li 0 9) <400> 135 Arg Ala Ser Gin Ser Ile Asp Thr Tyr Leu 1 5 10 <210> 136 <211> 21 <212> ADN 260 <213>
Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Li 0 9) <400> 136 gctgcatcca agttggaaga c 21 <210> <211> <212> <213> 137 7 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Li 0 9) <400> 137
Ala Ala Ser Lys Leu Glu Asp 1 5 <210> <211> <212> <213> 138 26 ADN Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Li09) <400> 138 caacagagtt acagtccccc tctcac 26 <210> <211> <212> <213> 139 9 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Li 0 9) <400> 139
Gin Gin Ser Tyr Ser Pro Pro Leu Thr 1 5 <210> <211> 140 33 261 <212> <213> ADN Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Li02) <400> 140 tctggagata aattggggga taaatttgct tcc 33 <210> <211> <212> <213> 141 11 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Li 0 2) <400> 141
Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Phe Ala Ser 15 10 <210> <211> <212> <213> 142 21 ADN Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Li 0 2) <400> 142 caagatagga agcgtctctc a 21 <210> <211> <212> <213> 143 7 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Li 0 2) <400> 143
Gin Asp Arg Lys Arg Leu Ser 1 5 <210> 144 262 <211> 27
<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Li Ο 2) <400> 144 caggcgtggg acaccaacac tgtggtc 27 <210> 145 <211> 9
<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Li Ο 2) <400> 145
Gin Ala Trp Asp Thr Asn Thr Vai Vai 1 5 <210> 146 <211> 10 <212> PRT <213> Murinae gen. sp. <400> 146 Ser AI a Ser Ser Ser Vai Ser Tyr Met His 1 5 10 <210> 147 <211> 7 <212> PRT <213> Murinae gen. sp. <400> 147 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 148 <211> 9 <212> PRT <213> Murinae gen. sp. 263 <400> 148
Gin Gin Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 1 5 <210> <211> <212> <213> 149 11 PRT Murinae gen. sp. <400> 149
Arg Ala Ser Gly Asn Ile Tyr Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 150 7 PRT Murinae gen. sp. <400> 150
Asn Ala Lys Thr Leu Pro Asp 1 5 <210> <211> <212> <213> 151 9 PRT Murinae gen. sp. <400> 151
Gin His Phe Trp Ala Ile Pro Tyr Thr 1 5 <210> <211> 152 17 <212> <213> PRT Murinae gen. sp. <400> 152
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gin Lys Asn Tyr Leu 15 10 15 264
Thr <210> 153 <211> 7
<212> PRT <213> Murinae gen. sp. <400> 153
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> <211> 154 10 <212> <213> PRT Murinae gen. sp. <400> 154
Gin Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Phe Thr 1 5 10 <210> <211> 155 17 <212> <213> PRT Murinae gen. sp. <400> 155
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gin Lys Ser Tyr Leu 1 5 10 15 Thr <210> <211> 156 7 <212> <213> PRT Murinae gen. sp. <400> 156
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 265 10 <210> 157 <211> 10 <212> PRT <213> Murinae > gen. sp. <40 0> 157 Gin Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro 1 5 <210> 158 <211> 133 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> VH (Li02 ) <400> 158 Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser 1 5 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 20 Glu Met Ile Trp Vai Arg Gin 35 Ser Ser Ile Gly Pro Ser Gly 50 55 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 65 70 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg 85 Vai Arg Ile Asp Asp Ser Ser 100 Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser 40 10 15 25 30 105 60 90 75 45 80 110 266 95 115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro 130 <210> 159 <211> 145 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> VH (Li09) <400> 159
Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15
Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly 15 10
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Met Tyr 20 25 30
Ser Met Vai Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr Met Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60
Lys Gly Arg Phe 65
Thr Ile Ser Arg 70
Asp Asn Ser Lys 75
Asn Thr Phe Tyr 80
Leu Gin Met Asn
Ser Leu Arg Ala 85
Glu Asp Thr Ala 90
Vai Tyr Tyr Cys 95
Arg Arg Arg Tyr
Ala Arg Asp Ser 100
Tyr Asp Phe Trp 105
Ser Gly Tyr His 110
Vai Trp Gly Lys
Asn Tyr Tyr Tyr 115
Tyr Tyr Met Asp 120
Gly Thr Thr Vai 125
Thr Vai Ser Ser 130
Ala Ser Thr Lys 135
Gly Pro Ser
Vai Phe Pro Leu Ala 140 267
Pro 145 <210> 160 <211> 131
<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> VH (Li06) <400> 160
Glu Vai Gin Leu Leu Glu 1 5
Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Glu Tyr 20 25 30
Pro Met Asp Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Ser Thr Vai Tyr Ala Asp Ser Ile 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ile Trp Gly Gin Gly Thr 110
Ala Arg Glu Gly Asp Ser Asp Ala Phe Asp 100 105
Met Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro 115 120 125
Leu Ala Pro 130 268 <210> 161 <211> 131 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> VH (Li05) <400> 161
Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr 20 25 30
Ala Met Gly Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45
Ser Ser Ile Vai Ser Ser Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Gly Asp His Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Met Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro 115 120 125
Leu Ala Pro 130 <210> 162 <211> 131
<212> PRT <213> Sequência artificial 269 <220> <223> VH (LÍ04) <40 0> 162
Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Glv 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30
Asn Met Gly Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45
Ser Vai Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Gly Thr His Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr 65
Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ser Ser Ile Ala Asp Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Met Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro 115 120 125
Leu Ala Pro 130 <210> 163 <211> 131 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> VH (Li08) <400> 163 270
Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr 20 25 30
Glu Met Vai Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45
Ser Ser Ile Arg Ser Ser Gly Gly Ala Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Glu Ser Pro Asp Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro 115 120 125
Leu Ala Pro 130 <210> 164 <211> 134 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> VH (Li11) <400> 164
Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 271
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Tyr Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45
Ser Ser Ile Ser Thr Ser Gly Gly Tyr Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 30
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Thr Ser Asp Asn Asp Tyr Tyr Tyr Met Asp Vai Trp Gly 100 105 110
Lys Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125
Vai Phe Pro Leu Ala Pro 130 <210> 165 <211> 133
<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> VH (LilO) <400> 165
Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 10 15
Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly 1 5
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 25 30
Pro Met Vai Trp Vai Arg Gin Ala
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 272 35 40 45
Ser Trp Ile Gly Pro Ser Gly Gly Vai Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Pro Tyr Ser Ser Gly Trp Trp Asp Phe Asp Leu Trp Gly Arg 100 105 lio
Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai 115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro 130 <210> 166 <211> 131
<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> VH (LiOl) <400> 166
Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
Gin Met Thr Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Asn Thr Vai Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60 273
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ser Gly Thr Thr Glu Ala Vai Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro 115 120 125
Leu Ala Pro 130 <210> 167 <211> 129 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> VH (Li07) <400> 167 Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Met Tyr 20 25 30
Phe Met Gly 35
Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 40 45
Ser Ser Ile 50
Ser Pro Ser Gly Gly Phe Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Vai 55 60
Lys Gly Arg 65
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 70 75 80 274
Leu Gin Met Asn
Ser Leu Arg Ala 85
Glu Asp Thr Ala 90
Vai Tyr Tyr Cys 95
His Ala Phe Asp
Ala Arg Asp Arg 100
Ile Trp Gly Gin 105
Gly Thr Met Vai 110
Gly Pro Ser Vai
Thr Vai Ser Ser 115
Ala Ser Thr Lys 120
Phe Pro Leu Ala 125
Pro <210> 168 <211> 132 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> VH (Li03) <400> 168
Glu Vai Gin Leu Leu Glu 1 5
Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gin Tyr 20 25 30
Pro Met Glu Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Vai 50 55
Tyr Ala Asp Ser Vai 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 65 70
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 275
Ala Arg Ala Gly Gin Trp Leu Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe 115 120 125
Pro Leu Ala Pro 130 <210> 169 <211> 145 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> VH (Li12) <400> 169
Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gin Tyr 20 25 30
Asn Met Phe Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45
Ser Arg Ile Ser Ser Ser Gly Gly Met Thr Met Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Ala Leu Arg Pro Tyr Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr Ser 100 105 110
Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai 276 115 120 125
Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala 130 135 140
Pro 145 <210> 170 <211> 116 <212> PRT <213> Murinae gen. <400> 170
Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15
Thr Vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30
Gly Met Asn Trp Vai Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asp Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Glu Asp Phe 50 55 60
Tyr 80
Gin Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Vai 65 70 75
Leu Gin Phe Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Gly Vai His Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai 100 105 110
Thr Vai Ser Ser 115 <210> 171 277 <211> 115
<212> PRT <213> Murinae gen. sp. <400> 171
Glu Vai Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30
Trp Leu Asp Trp Vai Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Asn Tyr Ala Glu 50 55 60
Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80
Vai Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95
Phe Cys Thr Pro Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr 100 105 110
Vai Ser Ser 115 <210> 172 <211> 117 <212> PRT <213> Murinae gen. <400> 172
Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Vai Lys Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser 20 25 30 278
TrP Thr Gln Trp Vai Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 4c
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg His Asn Ser Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 lio
Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 173 <211> 399
<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> VH (Li 0 2) <400> 173 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct acttacgaga tgatttgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atcggtcctt ctggtggcct tacttggtat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac accgccatgt attactgtgt acggattgat 300 gatagtagtg gttgggcttt tgatatctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcaagc 360 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccc 399 <210> 174 279 <211> 435
<212> ADN <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> VH (Li Ο 9) <400> 174 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct atgtactcta tggtttgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactatgtat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactttctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagattcg 300 agacgccggt attacgattt ttggagtggt tatcacaact actactacta ctacatggac 360 gtctggggca aagggaccac ggtcaccgtc tcaagcgcct ccaccaaggg cccatcggtc 420 ttcccgctag caccc 435 <210> 175 <211> 393 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> VH (Li06) <400> 175 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct gagtacccta tggattgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctattctt ctggtggctc tactgtttat 180 gctgactcca ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc cagagagggt 300 gactctgatg cttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc aagcgcctcc 360 accaagggcc catcggtctt cccgctagca ccc 393 <210> 176 <211> 393 280
<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> VH (Li 0 5) <400> 176 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct gcttacgcta tgggttgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atcgtttctt ctggtggcta tactgattat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc cagagagggt 300 gaccataatg cttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc aagcgcctcc 360 accaagggcc catcggtctt cccgctagca ccc 393 <210> 177 <211> 393 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> VH (Li04) <400> 177 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cgttacaata tgggttgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttctgtt atctatcctt ctggtggcgg tactcattat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagttctata 300 gcagatgatg cttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc aagcgcctcc 360 accaagggcc catcggtctt cccgctagca ccc 393 <210> 178 <211> 393
<212> ADN <213> Sequência artificial 281 <220> <223> VH (Li Ο 8) <400> 178 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cattacgaga tggtttgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atccgttctt ctggtggcgc tactaagtat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaagagtcg 300 ccagacgact actttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc aagcgcctcc 360 accaagggcc catcggtctt cccgctagca ccc 393 <210> 179 <211> 402 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> VH (Lill) <400> 179 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct tcttacgcta tgtattgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctctactt ctggtggcta tactggttat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatacc 300 agcgataatg actactacta catggacgtc tggggcaaag ggaccacggt caccgtctca 360 agcgcctcca ccaagggccc atcggtcttc ccgctagcac cc 402 <210> 180 <211> 399 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> VH (LilO) 282 60 <40 0> 180 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt tcttgcgctg cttccggatt cactttctct acttacccta tggtttgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttgg atcggtcctt ctggtggcgt tactgcttat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaccctat 300 agcagtggct ggtgggactt cgatctctgg ggccgtggca ccctggtcac cgtctcaagc 360 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccc 399 <210> 181 <211> 393
<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> VH (LiOl) <400> 181 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct aagtaccaga tgacttgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctatcctt ctggtggcaa tactgtttat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagtgggact 300 acagaggcag tctttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc aagcgcctcc 360 accaagggcc catcggtctt cccgctagca ccc 393 <210> 182 <211> 387
<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> VH (Li0 7) <400> 182 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 283 120 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct atgtacttta tgggttgggt tcgccaagct cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctctcctt ctggtggctt tacttcttat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagtct actattgtgc gagagatcgg 300 catgcttttg atatctgggg ccaagggaca atggtcaccg tctcaagcgc ctccaccaag 360 ggcccatcgg tcttcccgct agcaccc 387 <210> 183 <211> 396
<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> VH (Li03) <400> 183 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cagtacccta tggagtgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttctggt atctatcctt ctggtggctc tactgtttat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagcgggg 300 cagtggctgg gggactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcaagcgcc 360 tccaccaagg gcccatcggt cttcccgcta gcaccc 396 <210> 184 <211> 435
<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> VH (Lil2) <400> 184 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cagtacaata tgttttgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttctcgt atctcttctt ctggtggcat gactatgtat 180 284 240 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaagcg 300 ttacggcctt attgtagtgg tggtagctgc tactccgact actactacta cggtatggac 360 gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcaagcgcct ccaccaaggg cccatcggtc 420 ttcccgctag caccc 435 <210> 185 <211> 357
<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> VL (Li02) <400> 185 ttctattctc acagtgcaca gtacgaattg actcagccac cctcagtgtc cgtgtcccca 60 ggacagacag ccagcatcac ctgctctgga gataaattgg gggataaatt tgcttcctgg 120 tatcagcaga aggcaggcca gtcccctgtg ctggtcatct ttcaagatag gaagcgtctc 180 tcagggatcc ctgagcgatt ctctggctcc aactctggga acacagccac tctgaccatc 240 agcgggaccc aggctatgga tgaggctgac tattactgtc aggcgtggga caccaacact 300 gtggtcttcg gcggagggac caagctgacc gtcctaggtc agcccaaggc tgccccc 357 <210> 186 <211> 360
<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> VL (Li09) <400> 186 ttctattctc acagtgcaca agacatccag atgacccagt ctccatcctc cctgtctgca 60 tttgtgggag acagagtcgc catcacttgc cgcgcaagtc agagcatcga cacctattta 120 aattggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaaactcc tgatctatgc tgcatccaag 180 ttggaagacg gggtcccatc aagattcagt ggcagtggaa ctgggacaga tttcactctc 240 285 300 accatcagaa gtctgcaacc tgaagatttt ggaacttact actgtcaaca gagttacagt ccccctctca ctttcggcgg agggaccaag gtggagatca aacgaactgt ggctgcacca 360 <210> 187 <211> 360
<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> VL (Li06) <400> 187 ttctattctc acagtgcaca agacatccag atgacccagt ctccttccac cctgtctgca 60 tctgtaggag acagagtcac catcacttgc cgggccagtc agagtattag tagctggttg 120 gcctggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaacctcc tgatctatgc tgcatccagt 180 ttacgaactg gggtcccatc aagattcagg ggcagtggat ctggcacaga tttcactctc 240 accatcagca gcctgcagcc tgaagatttt gcaacgtatt actgtctaca agattacagt 300 taccctctca cttttggcca ggggaccaag ctggagatca aacgaactgt ggctgcacca 360 <210> 188 <211> 363
<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> VL (Li 0 5) <400> 188 ttctattctc acagtgcaca gagcgtcttg actcagccac cctcggtgtc agtggcccca 60 ggccagacgg ccaggatttc ctgtggggga gacaacattg gaagtaagag tgtccactgg 120 taccagcaga ggccaggcca ggcccctgtc ctggtcgtgt atgatgatta tgaccggccc 180 tcagggatcc ctgagcgatt ctctggctcc aactctgggg acacggccat cctgaccatc 240 accagggtcg aagtcgggga tgaggccgac ttttattgtc aggtgaggga cagccgtact 300 gaggaacggg tgttcggcgg agggaccaag gtgaccgtct taggtcagcc caaggctgcc 360 ccc 363 286 <210> <211> <212> <213> 189 360 ADN Sequência artificial <220> <223> VL (Li0 8 ) <40 0> 189 ttctattctc acagtgcaca agacatccag atgacccagt ctccatcttc cctgtctgca 60 tctgtaggag acagagtcac catcacttgc caggcgagtc aggacattag ttactattta 120 aattggtatc agcagaagcc agggaaagcc cctaaggtcc tgatctacga tgtatccaat 180 ttgcaaacag gggtcccatc aaggttcagt ggaagtgcgt ctgcgacaga ttttactctc 240 accatcagca gcctgcagcc tgaagatatt gcgacatatt actgtcaaca gtctgataat 300 ctccctctca ctttcggcgg agggaccaag gtggagatta aacgaactgt ggctgcacca 360 <210> <211> <212> <213> 190 360 ADN Sequência artificial <220> <223> VL (Li 11) <400> 190 ttctattctc acagtgcaca agacatccag atgacccagt ctccatcttc tgtgtctgca 60 cctataggag acagagtcac catcacttgt cgggcgagtc aggagattgc caactactta 120 gcctggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaagctcc tgatctatga tacatacact 180 ttgcagactg acgtcccacc gaggttcagc ggcagtggtt cggggacaga tttcactctc 240 actatcagca gcctgcagcc tgaagatact gcaacttact tttgtcaaca ggctgacatt 300 ttcccgctct ctttcggcgg agggaccaag gtggagatca aacgaactgt ggctgcacca 360 <210> <211> <212> <213> 191 366 ADN Sequência artificial <220> 287 <223> VL (LilO) <400> 191 ttctattctc acagtgcaca agacatccag atgacccagt ctccatcttc catgtctgct 60 tctgtagggg acacagtcac catcacttgt cgggcgagtc agggtattgg caactggtta 120 gcctggtatc agcagaaacc agggaaagcc ccaactctcc tgatctatgc tgcatccagt 180 ttggaaagtg gggtcccatc aaggttcacc ggcagcggca gttcctctgg gatagatttc 240 actctcacca tcagcgacct gcaccctgaa gatttggcaa cttactattg tcaacaggct 300 cagactttcc cgctcacctt cggcggaggg accagggtgg acctcaagcg aactgtggct 360 gcacca 366 <210> 192 <211> 363 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> VL (LiOl) <400> 192 ttctattctc acagtgcaca agacatccag atgacccagt ctccatcctc cctgtctgca 60 tctgtaggag acagagtcac catcacttgc caggcgagtc aggacattag caactattta 120 aattggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaagctcc tgatctacga tgcatccaat 180 ttggaaacag gggtcccatc aaggttcagc ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc 240 accatcagca gcctgcagcc tgaagatttt gcaacttact attgtcaaca ggctgacagg 300 ttccctgcgg tcactttcgg cggagggacc aaggtggaga tcaaacgaac tgtggctgca 360 cca 363 <210> 193 <211> 354
<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> VL (Li07) 193 <400> 60 ttctattctc acagtgcaca gagcgaattg actcagccac cctcagtgtc cgtgtcccca ggacagacag ccatcatcac ctgctctgga gatcagttgg gtgacaaaca tgtggcttgg 120 tatcaacaga agccaggcca gtcccctgtg ctggtcatct atctagacat taagaggccc 180 gcagggattt ctgagcgatt ctctggctcc aactctggaa atacagccac tctgaccatc 240 agagggaccc aggctatgga tgaagctgac tattactgtc aggcgtggga catcaagacg 300 gtcttcggcg gggggaccaa gctgaccgtc ctgagtcagc ccaaggctgc cccc 354 <210> 194 <211> 360
<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> VL (Li03) <400> 194 ttctattctc acagtgcaca agacatccag atgacccagt ctccatcctc cctgtctgca 60 tctqtagqag acagagtcac catcacttgc cgggcaagtc agagcattag cagctattta 120 aattgqtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaagctcc tgatctatgc tgcatccagt 180 ttqcaaagtq gggtcccatc aaggttcagt ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc 240 accatcagca gtctgcaacc tgaagatttt gcaacttact actgtcaaca gagttacagt 300 accccqtgga cgttcggcca agggaccaag gtggaaatca aacgaactgt ggctgcacca 360 <210> 195
<211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Lia.01) <400> 195
Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp Ile Gly 15 10 <210> 196 <211> 17 289 <212> <213> PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Lia.01) <40 0> 196
Ile Ile Asp Pro Asp Asp Ser Tyr Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Phe Gin 1 5 10 15 Gly <210> <211> <212> <213> 197 10 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Lia.01) <400> 197
Ala Glu Phe Tyr Trp Gly Ala Tyr Asp Gly 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 198 10 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Lia.02) <400> 198
Gly Gly Ser Ile Arg Gly Asn Tyr Trp Ser 1 5 10 <210> <211> 199 14 <212> <213> PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Lia.02) 290 <400> 199
Ser Ile Asn Tyr Ser Gly Phe Thr Asn Pro Ser Leu Lys Gly 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 200 8 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Lia.02) <400> 200
Vai Arg His Trp Tyr Phe Asp Vai 1 5 <210> <211> <212> <213> 201 10 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Lia.03) <400> 201
Gly Tyr Thr Phe Asn Gly Phe Asp Met His 15 10 <210> <211> <212> <213> 202 17 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Lia.03) <400> 202
Trp Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Gin Lys Phe Gin 1 5 10 15 Gly 291 <210> <211> <212> <213> 203 13 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Lia.03) <400> 203
Asp Phe Tyr Met Asp Gly His Tyr Tyr Ile Phe Asp Vai 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 204 10 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Lia.04) <400> 204
Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Tyr Tyr Ile His 15 10 <210> <211> <212> <213> 205 17 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Lia.04) <400> 205
Ile Ile Asp Pro Gly Asp Ser Phe Thr Ser Tyr Ser Pro Ser Phe Gin 1 5 10 15 Gly
<210> <211> <212> 206 11 PRT 292 <213>
Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Lia.04) <400> 206
Asp Leu Ala Trp lie Asp Tyr Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> <211> <212> <213> <220> 207 10 PRT Sequência artificial <223> VH-CDR1 (Lia.05) <400> 207
Gly Phe Thr Phe Thr Ser His Thr Vai Ser 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 208 17 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Lia.05) <400> 208
Ser lie Thr Gly Asn Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 1 5 10 15 Gly <210> <211> <212> <213> 209 7 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Lia.05) 293 <40 0> 209
Phe Tyr Gly Asp Phe Asp Ser 1 5 <210> <211> <212> <213> 210 10 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Lia.06) <400> 210
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn Trp Met Ser 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 211 17 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Lia.06) <400> 211
Thr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 1 5 10 15 Gly <210> <211> 212 17 <212> <213> PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Lia.06) <400> 212
Asp Leu Pro Met Lys Gly Phe Ile Gin Gin Arg Tyr Gly Phe Asp Asp 1 5 10 1 s 294
Vai <210> <211> <212> <213> 213 10 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Lia.07) <400> 213
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Ala Ile Ser 1 5 10 <210> <211> 214 17 <212> <213> PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Lia.07) <400> 214
Thr Ile Trp Gly Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 1 5 10 15 Gly <210> <211> <212> <213> 215 11 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Lia.07) <400> 215
Glu Tyr Trp Tyr Tyr Asp Gin Phe Thr Ala Vai 15 10 295 <210> <211> <212> <213> 216 12 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Lia.08) <400> 216
Gly Asp Ser Vai Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Ser 15 10 <210> <211> <212> <213> 217 18 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Lia.08) <400> 217
Arg Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Vai Ser Vai 15 10 15
Lys Ser <210> <211> <212> <213> 218 10 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Lia.08) <400> 218
Glu Vai Tyr Ser Ala Gly Ile Met Asp Tyr 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 219 10 PRT Sequência artificial 296 <220> <223> VH-CDR1 (Lia.09) <400> 219
Gly Tyr Ser Phe Thr Asn His Trp Ile Gly 15 10 <210> <211> <212> <213> 220 17 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Lia.09) <400> 220
Ile Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe Gin 1 5 10 15 Gly <210> <211> <212> <213> 221 11 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Lia.09) <400> 221
Gly Phe Tyr Gly Ile Ala Asp Thr Phe Asp Vai 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 222 10 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Lia.10) <400> 222 297
Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp Ile Ala 15 10 <210> <211> <212> <213> 223 17 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Lia.10) <400> 223
Met Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asn Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe Gin 1 5 10 15 Gly <210> <211> <212> <213> 224 9 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Lia.10) <400> 224
Thr Asn Tyr Leu Gly Phe Tyr Asp Ser 1 5 <210> <211> <212> <213> 225 10 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Lia.11) <400> 225
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Ile Ser 1 5 10 <210> 226 298 <211> <212> <213> 17 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Lia.11) <400> 226
Asn Ile Leu Tyr Asp Gly Ser Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 1 5 10 15 Gly <210> <211> <212> <213> 227 11 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Lia.11) <400> 227
Gly Tyr Pro Thr Asp Asp Tyr Ser Phe Asp Ile 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 228 12 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Lia.12) <400> 228
Gly Asp Ser Vai Ser Asp Asn Ser Ala Ala Trp Gly 1 5 10 <210> <211> <212> <213> <220> 229 18 PRT Sequência artificial 299 <223> VH-CDR2 (Lia.12) <40 0> 229
Arg Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Vai Ser Vai 15 10 15
Lys Ser <210> <211> <212> <213> 230 16 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Lia.12) <400> 230
Gly Arg His Glu Tyr Gly Gly Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Met Asp His 1 5 10 15 <210> <211> <212> <213> 231 10 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Lia.13) <400> 231
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 10 <210> <211> <212> <213> <220> 232 17 PRT Sequência artificial <223> VH-CDR2 (Lia.13) <400> 232
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 300 1 5 10 15 Gly <210> <211> <212> <213> 233 10 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Lia.13) <400> 233
His Tyr Thr Tyr Met His Phe Glu Asp Tyr 15 10 <210> <211> 234 11 <212> <213> PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Lia.01) <400> 234
Ser Gly Asp Ser Leu Pro Ser Lys Phe Vai His 15 10 <210> <211> <212> <213> 235 7 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Lia.01) <400> 235
Arg Asp Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 236 <211> 8 301 <212> <213> PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Lia.01) <400> 236
Ser Ser Tyr Asp Ala Leu Thr Asp 1 5 <210> <211> <212> <213> 237 12 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Lia.02) <400> 237
Arg Ala Ser Gin Ser Ile Thr Asn Ser Tyr Leu Gly 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 238 7 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Lia.02) <400> 238
Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> <211> <212> <213> 239 8 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Lia.02) <400> 239
Gin Gin Ala Ser Asp Ala Pro Glu 302 1 5 <210> <211> <212> <213> 240 11 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Lia.03) <400> 240
Arg Ala Ser Gin Gly Ile Asn Phe Trp Leu Asn 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 241 7 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Lia.03) <400> 241
Ala Gly Ser Asn Leu Gin Ser 1 5 <210> <211> <212> <213> 242 8 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Lia.03) <400> 242
Met Gin Asp Ser Asp Phe Pro Phe 1 5 <210> <211> <212> <213> <220> 243 14 PRT Sequência artificial 303 <223> VL-CDR1 (Lia.04) <400> 243
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Vai Ser 15 10 <210> <211> <212> <213> 244 7 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Lia.04) <400> 244
Arg Asn Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> <211> <212> <213> 245 8 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Lia.04) <400> 245
Gin Thr Tyr Asp Asn Ser Thr Asp 1 5 <210> <211> <212> <213> 246 11 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Lia.05) <400> 246
Ser Gly Asp Asn Ile Arg Ser Tyr Tyr Vai His 15 10 <210> 247 304 <211> <212> <213> 7 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Lia.05) <400> 247
Glu Asp Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> <211> <212> <213> 248 10 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Lia.05) <400> 248
Gin Ser Tyr Asp Ser Ala Ile Leu Leu His 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 249 16 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Lia.06) <400> 249
Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai Leu Arg Thr Gly Tyr Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> <211> <212> <213> 250 7 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Lia.06) <400> 250 305
Leu Vai Ser Asn Arg Ala Ser 1 5 <210> <211> <212> <213> 251 8 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Lia.06) <400> 251
Gin Gin Tyr Tyr Gly Met Pro Leu 1 5 <210> <211> <212> <213> 252 12 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Lia.07) <400> 252
Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Tyr Gin Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 253 7 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Lia.07) <400> 253
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> <211> <212> <213> 254 8 PRT Sequência artificial 306 <220> <223> VL-CDR3 (Lia.07) <400> 254
Gin Gin Tyr Gly Ser Vai Pro Arg 1 5 <210> <211> <212> <213> 255 11 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Lia.08) <400> 255
Ser Gly Asp Ser Leu Gly Ser Tyr Tyr Vai His 15 10 <210> <211> <212> <213> 256 7 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Lia.08) <400> 256
Asp Asp Asn Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> <211> <212> <213> 257 9 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Lia.08) <400> 257
Ser Ala Tyr Asp Tyr Ser Ala Arg Thr 1 5 307 <210> <211> <212> <213> 258 11 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Lia.09) <400> 258
Ser Gly Asp Asn Leu Gly Ser Lys Tyr Vai Ser 15 10 <210> <211> <212> <213> 259 7 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Lia.09) <400> 259
Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> <211> <212> <213> 260 10 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Lia.09) <400> 260
Ser Ser Tyr Asp Phe Leu Asn Ile Gly Leu 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 261 11 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Lia.10) <400> 261 308
Ser Gly Asp Ser Leu Gly Lys Lys Ser Vai His 15 10 <210> <211> <212> <213> 262 7 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Lia.10) <400> 262
Glu Asp Ser Glu Arg Pro Ser 1 5 <210> <211> <212> <213> 263 8 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Lia.10) <400> 263
Ser Ser Tyr Thr Asn Ser Vai Asp 1 5 <210> <211> <212> <213> 264 11 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Lia.11) <400> 264
Ser Gly Asp Asn Leu Gly Lys Lys Tyr Vai Gly 15 10 <210> <211> <212> <213> 265 7 PRT Sequência artificial 309 <220> <223> VL-CDR2 (Lia.11) <400> 265
Asp Asp Asp Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> <211> <212> <213> 266 8 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Lia.11) <400> 266
Gin Ser Tyr Asp Asp Thr Ser Ile 1 5 <210> <211> <212> <213> 267 11 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Lia.12) <400> 267
Ser Gly Asp Ser Leu Gly Asn Lys Tyr Vai His 15 10 <210> <211> 268 7 <212> <213> PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Lia.12) <400> 268
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser 1 5 310 269 <210> <211> <212> <213> 269 8 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Lia.12) <400> 269
Gin Thr Trp Asp Tyr Vai Gly Tyr 1 5 <210> <211> 270 14 <212> <213> PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Lia.13) <400> 270
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Vai Gly Gly Tyr Asn Tyr Vai Ser 15 10 <210> <211> <212> <213> 271 7 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Lia.13) <400> 271
Asp Vai Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> <211> <212> <213> 272 10 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Lia.13) 311
<40 0> 272 Gin Ser Tyr 1 Asp Arg Tyr Arg Leu Lys Asn 5 10 <210> 273 <211> 119 <212> PRT
<213> Sequência artificial <220> <223> Li02 <400> 273 (VL) Phe Tyr Ser 1 His Ser Ala Gin Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Vai 5 10 15 Ser Vai Ser Pro Gly Gin Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys 20 25 30 Leu Gly Asp 35 Lys Phe Ala Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Ala Gly Gin Ser 40 45 Pro Vai Leu 50 Vai Ile Phe Gin Asp Arg Lys Arg Leu Ser Gly Ile Pro 55 60 Glu Arg Phe 65 Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile 70 75 80 Ser Gly Thr Gin Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ala Trp 85 90 95 Asp Thr Asn Thr Vai Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu 100 105 110 Gly Gin Pro 115 Lys Ala Ala Pro <210> 274 <211> 120 <212> PRT
274 120 PRT 312 <213> Sequência artificial <220> <223> Li 0 9 (VL) <400> 274
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gin Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ala Phe Vai Gly Asp Arg Vai Ala Ile Thr Cys Arg Ala 20 25 30 Ser Gin Ser 35 Ile Asp Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 40 45 Lys Ala Pro 50 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Glu Asp Gly 55 60
Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70 75 80 Thr Ile Arg Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gin 85 90 95 Gin Ser Tyr Ser Pro Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu 100 105 110 Ile Lys Arg 115 Thr Vai Ala Ala Pro 120 <210> 275 <211> 120
<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Li06 <400> 275 (VL) Phe Tyr Ser 1 His Ser Ala Gin Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser 5 10 15 313
Thr Leu Ser Ala Ser Vai 20
Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala 25 30
Ser Gin Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45
Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile 50 55
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Arg Thr Gly 60
Vai Pro Ser Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70 75 80
Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu 85 90 95
Gin Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu 100 105 lio
He Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro 115 120 <210> 276
<211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Li05 (VL) <40 0> 276
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gin Ser Vai Leu Thr Gin Pro Pro Ser Vai 1 5 10 15
Ser Vai Ala Pro Gly Gin Thr Ala Arg Ile Ser Cys Gly Gly Asp Asn 20 25 30
Ile Gly Ser Lys 35
Ser Vai His Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ala 40 45 314
Pro Vai Leu 50 Vai Vai Tyr Asp Asp Tyr Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro 55 60 Glu Arg Phe 65 Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asp Thr Ala Ile Leu Thr Ile 70 75 80 Thr Arg Vai Glu Vai Gly Asp Glu Ala Asp Phe Tyr Cys Gin Vai Arg 85 90 95 Asp Ser Arg Thr Glu Glu Arg Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Thr 100 105 HO Vai Leu Gly 115 Gin Pro Lys Ala Ala Pro 120 <210> 277 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Li08 <400> 277 (VL) Phe Tyr Ser 1 His Ser Ala Gin Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser 5 10 15 Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Gin Ala 20 25 30 Ser Gin Asp 35 Ile Ser Tyr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 40 45 Lys Ala Pro 50 Lys Vai Leu Ile Tyr Asp Vai Ser Asn Leu Gin Thr Gly 55 60
Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ala Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu 65 70 75 80 315
Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin 85 90 95
Gin Ser Asp Asn Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu 100 105 110
Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro 115 120 <210> 278 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Lill (VL) <400> 278
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gin Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser 1 5 10 15
Ser Vai Ser Ala Pro Ile Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala 20 25 30
Ser Gin Glu Ile Ala Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Tyr Thr Leu Gin Thr Asp 50 55 60
Vai Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70 75 80
Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gin 85 90 95
Gin Ala Asp Ile Phe Pro Leu Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu 100 105 110
Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro 316 115 120 <210> 279 <211> 122 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> LilO (VL) <400> 279
Phe Tyr Ser His Ser Ala Gin Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser 1 5 10 15
Ser Met Ser Ala Ser Vai Gly Asp Thr Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala 20 25 30
Ser Gin Gly Ile Gly Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45
Lys Ala Pro Thr Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly 50 55 60
Ile Asp Phe 80
Vai Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ser Ser Gly 65 70 75
Tyr Tyr 95
Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu His Pro Glu Asp Leu Ala Thr 85 90
Cys Gin Gin Ala Gin Thr Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly 100 105
Gly 110
Thr Arg
Vai Asp Leu Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro 115 <210> 280 <211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 317 <223> LiOl (VL) <400> 280 Phe Tyr Ser His Ser Ala Gin Asp 1 5 Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp 20 Ser Gin Asp ile Ser Asn Tyr Leu 35 40 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 50 55 Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 65 70 Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu 85 Gin Ala Asp Arg Phe Pro Ala Vai 100 Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala 115 120 <210> 281 <211> 118 <212> PRT <213> Sequência . artificial <220> <223> Li 0 7 (VL) <400> 281 Phe Tyr Ser His Ser Ala Gin Ser 1 5 Ser Vai Ser Pro Gly Gin Thr Ala Pro
Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser 10 15
Arg Vai Thr Ile Thr Cys Gin Ala 25 30
Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 45
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai 105 110
Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Vai 10 15
Ile Ile Thr Cys Ser Gly Asp Gin 318 20 25 30
Leu Gly Asp 35 Lys His Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 40 45 Pro Vai Leu 50 Vai Ile Tyr Leu Asp Ile Lys Arg Pro Ala Gly Ile Ser 55 60 Glu Arg Phe 65 Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile 70 75 80 Arg Gly Thr Gin Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ala Trp 85 90 95 Asp Ile Lys Thr Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Ser 100 105 110 Gin Pro Lys 115 Ala Ala Pro <210> 282 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Li03 <400> 282 (VL) Phe Tyr Ser 1 His Ser Ala Gin Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser 5 10 15 Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala 20 25 30 Ser Gin Ser 35 Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 40 45 Lys Ala Pro 50 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly 55 60 319
Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 65 70 Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu 85 Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr 100 Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro 115 120 <210> 283 <211> 106 <212> PRT <213> Murinae gen. sp. <400> 283 Gin Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro 1 5 Glu Lys Vai Thr Met Thr Cys Ser 20 His Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly 35 40 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly 50 55 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 65 70 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin 85
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 75 80
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin 90 95
Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu 110
Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 10 15
Ser Ser Ser Vai Ser Tyr Met 30
Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 45
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 60
Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 75 80
Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 90 95
Phe Gly Ser
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 320 <210> 284
<211> 108 <212> PRT <213> Murinae gen. sp. <400> 284
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15
Glu Thr Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile Tyr Asn Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gin Gin Lys Gin Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu Vai 35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Pro Asp Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly 65
Thr Gin Tyr Phe 70
Leu Lys Ile Asn 75
Ser Leu Gin Pro 80
Glu Asp Phe Gly
Ser Tyr Tyr Cys 85
Gin His Phe Trp 90
Ala Ile Pro Tyr 95
Gly Thr Lys Leu
Thr Phe Gly Gly 100
Glu Ile Lys Arg 105 <210> 285 <211> 114 <212> PRT <213> Murinae <400> 285 gen. sp.
Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Thr Vai Thr Ala Gly 1 5 10 15
Glu Lys Vai Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 321
Gly Asn Gin Lys Asn 35 Tyr Leu Thr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu 50 He Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Vai 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr 65 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 70 75 80 Ile Asn Ser Vai Gin 85 Ala Glu Asp Leu Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Asn 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro 100 Ile Arg Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu 105 HO <210> 286 <211> 114 <212> PRT <213> Murinae gen. <400> 286 sp. Asp Ile Vai Met Thr 1 5 Gin Ser Pro Ser Ser Leu Thr Vai Thr Ala Gly 10 15 Glu Lys Vai Thr Met 20 Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser 25 30 Gly Asn Gin Lys Ser 35 Tyr Leu Thr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu 50 Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Vai 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr 65 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 70 75 80 322
Gin Asn 95
Ile Asn Ser Vai Gin Ala Glu Asp Leu Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90
Asp Tyr Ser
Tyr Pro Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu 100 105 110
Ile Arg <210> 287 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CARAC_DIVERSAS <222> (3) . . (5) <223> Xaa é lys, arg, his, glu, ou asp <400> 287 Ile Thr Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 288 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CARAC_DIVERSAS <222> (3) . . (5) <223> Xaa é lys, arg, his, glu, ou asp. <400> 288 Ala Cys Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 289 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens 323 <220> <221> CARAC_DIVERSAS <222> (3)..(5) <223> Xaa é lys, arg, his, glu, ou asp <400> 289
Vai Cys Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 290 <211> 5
<212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CARAC_DIVERSAS <222> (3)..(5) <223> Xaa é lys, arg, his, glu, ou asp <40 0> 290
Ser Pro Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 291 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 291 Ser Prc i Arg Lys His 1 5 <210> 292 <211> 5
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 292
Ser Pro Arg Lys Lys 1 5 324 <210> 293 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 293 Ser Prc ' Arg Lys Arg 1 5 <210> 294 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 294 Ser Prc ι Lys Lys His 1 5 <210> 295 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 295 Ser Prc ) His Lys His 1 5 <210> 296 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 296 Ser Prc ) Arg Arg His 1 5 <210> 297 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 297 325
Ser Pro Arg His His 1 5 <210> 298 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 298 Ser Prc i Arg Arg Arg 1 5 <210> 299 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 299 Ser Prc 1 His His His 1 5 <210> 300 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 300 Ser Prc i Lys Lys Lys 1 5 <210> 301 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 301 Leu Ser Pro Arg Lys 1 5 <210> 302 <211> 6 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 302 Leu Ser Pro Arg Lys 1 5 <210> 303 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 303 Leu Ser • Pro Arg Lys 1 5 <210> 304 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 304 Leu Ser Pro Lys Lys 1 5 <210> 305 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 305 Leu Ser • Pro His Lys 1 5 <210> 306 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 306 Leu Ser Pro Arg Arg 1 5 327 <210> <211> <212> <213> 307 6 PRT Homo sapiens <400> 307
Leu Ser Pro Arg His His 1 5 <210> <211> <212> <213> 308 6 PRT Homo sapiens <400> 308
Leu Ser Pro Arg Arg Arg 1 5 <210> <211> <212> <213> 309 6 PRT Homo sapiens <400> 309
Leu Ser Pro His His His 1 5 <210> <211> <212> <213> 310 6 PRT Homo sapiens <400> 310
Leu Ser Pro Lys Lys Lys 1 5 <210> <211> 311 7 <212> <213> PRT Homo sapiens 328 <40 0> 311
Trp Leu Ser Pro Arg Lys His 1 5 <210> 312 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 312 Trp Leu . Ser Pro Arg Lys Lys 1 5 <210> 313 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 313 Trp Leu . Ser Pro Arg Lys Arg 1 5 <210> 314 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 314 Trp Leu l Ser Pro Lys Lys His 1 5 <210> 315 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 315 Trp Leu Ser Pro His 1 5 <210> 316 329 <211> 7
<212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 316
Trp Leu Ser Pro Arg Arg His 1 5 <210> 317 <211> 7
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 317
Trp Leu Ser Pro Arg His His 1 5 <210> 318 <211> 7
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 318
Trp Leu Ser Pro Arg Arg Arg 1 5 <210> 319 <211> 7
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 319
Trp Leu Ser Pro His His His 1 5 <210> 320 <211> 7
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 320
Trp Leu Ser Pro Lys Lys Lys 330 1 5 <210> 321 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 321 Ile Thr Pro Lys Arg 1 5 <210> 322 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 322 Ala Cys His His Lys 1 5 <210> 323 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 323 Vai Cys His His Lys 1 5 <210> 324 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> CARAC_DIVERSAS <222> (1)..(2) <223> Xaa é qualquer aminoácido. <400> 324
Xaa Xaa Arg Lys His 1 5 331 <210> <211> <212> <213> 325 5 PRT Homo sapiens <220> <221> <222> <223> CARAC_DIVERSAS (D · · (2) Xaa é qualquer aminoácido. <400> 325
Xaa Xaa Arg Arg Arg 1 5 <210> <211> 326 5 <212> <213> PRT Homo sapiens <220> <221> <222> <223> CARAC_DIVERSAS (D · · (2) Xaa é qualquer aminoácido. <400> 326
Xaa Xaa Lys Lys Lys 1 5 <210> <211> <212> 327 5 PRT <213> Homo sapiens <220> <221> <222> <223> CARAC_DIVERSAS (D · · (2) Xaa é qualquer aminoácido. <400> 327
Xaa Xaa His His His 1 5 332 <210> <211> <212> <213> 328 5 PRT Homo sapiens <220> <221> <222> <223> CARAC_DIVERSAS (D · · (2) Xaa é qualquer aminoácido. <400> 328
Xaa Xaa Arg Lys Lys 1 5 <210> <211> 329 5 <212> <213> PRT Homo sapiens <220> <221> <222> <223> CARAC_DIVERSAS (D · · (2) Xaa é qualquer aminoácido. <400> 329
Xaa Xaa Arg Lys Arg 1 5 <210> <211> <212> 330 5 PRT <213> Homo sapiens <220> <221> <222> <223> CARAC_DIVERSAS (D · · (2) Xaa é qualquer aminoácido. <400> 330
Xaa Xaa Lys Lys His 1 5 333 <210> <211> <212> <213> 331 5 PRT Homo sapiens <220> <221> <222> <223> CARAC_DIVERSAS (D · · (2) Xaa é qualquer aminoácido. <400> 331
Xaa Xaa His Lys His 1 5 <210> <211> 332 5 <212> <213> PRT Homo sapiens <220> <221> <222> <223> CARAC_DIVERSAS (D · · (2) Xaa é qualquer aminoácido. <400> 332
Xaa Xaa Arg Arg His 1 5 <210> <211> <212> 333 5 PRT <213> Homo sapiens <220> <2 21> <222> <223> CARAC_DIVERSAS (D · · (2) Xaa é qualquer aminoácido. <400> 333
Xaa Xaa Arg His His 1 5 334 <210> <211> <212> <213> 334 5 PRT Homo sapiens <220> <221> <222> <223> CARAC_DIVERSAS (3)..(3) Xaa é lys, arg, his, glu, ou asp <220> <221> <222> <223> CARAC_DIVERSAS (4) . . (4) Xaa é qualquer aminoácido. <220> <2 21> <222> <223> CARAC_DIVERSAS (5) . . (5) Xaa é lys, arg, his, glu, ou asp <400> 334
Ile Thr Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> <211> <212> 335 5 PRT <213> Homo sapiens <220> <221> <222> <223> CARAC_DIVERSAS (3)..(3) Xaa é lys, arg, his, glu, ou asp <220> <221> <222> <223> CARAC_DIVERSAS (4) . . (4) Xaa é qualquer aminoácido. <220> <221> <222> <223> CARAC_DIVERSAS (5) . . (5) Xaa é lys, arg, his, glu, ou asp <400> 335 335
Ala Cys Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> <211> <212> <213> 336 5 PRT Homo sapiens <220> <221> <222> <223> CARAC_DIVERSAS (3)..(3) Xaa é lys, arg, his, glu, ou asp <220> <221> <222> <223> CARAC_DIVERSAS (4) . . (4) Xaa é qualquer aminoácido. <220> <221> <222> <223> CARAC_DIVERSAS (5) . . (5) Xaa é lys, arg, his, glu, ou asp <400> 336
Vai Cys Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> <211> <212> 337 5 PRT <213> Homo sapiens <220> <221> <222> <223> CARAC_DIVERSAS (3)..(3) Xaa é lys, arg, his, glu, ou asp <220> <221> <222> <223> CARAC_DIVERSAS (4) . . (4) Xaa é qualquer aminoácido. <220> <221> <222> CARAC_DIVERSAS (5) .. (5) 336 <223> Xaa é lys, arg, his, glu, ou asp. <400> 337
Ser Pro Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 338 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 338 Ser Prc i Arg Leu His 1 5 <210> 339 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 339
Arg Arg Ala Arg Ile Arg Asp Arg Lys 1 5 <210> 340 <211> 9
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 340
Lys Lys Vai Lys Vai Lys Glu Lys Arg 1 5 <210> 341 <211> 9
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 341
Arg Arg Leu Arg Leu Arg Asp Arg Lys 1 5 337 <210> 342 <211> 9 <212> PRT <213> Homo <400> 342 Arg Arg 1 Gly sapiens
Arg Gly Arg Asp Arg Lys 5 <210> 343 <211> 9 <212> PRT <213> Homo <400> 343 sapiens
Arg Arg Ile Arg Ala Arg Asp Arg Lys 1 5 <210> 344 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> RT-Iniciador de PCR <400> 344 agagacatgc gattggtga 19 <210> 345 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> RT-Iniciador de PCR <400> 345 agagatgtag acgaggtcat t <210> 346 <211> 55 <212> ADN <213> Sequência artificial 338 <220> <223> LV1-036 (oligo no sentido directo) <400> 346 tgatcgtcat cctgctagac ttcaagagag tctagcagga tgacgatctt ttttc 55 <210> <211> <212> <213> 347 59 ADN Sequência artificial <220> <223> LV1-036 (oligo no sentido inverso) <400> 347 tcgagaaaaa agatcgtcat cctgctagac tctcttgaag tctagcagga tgacgatca 59 <210> <211> <212> <213> 348 59 ADN Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 348 tgatcctcat ccttctatac ttcaagagag tgtagcagga tgacgatctt ttttctcga 59 <210> <211> <212> <213> 349 59 ADN Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 349 tcgagaaaaa agatcgtcat cctgctagac tctcttgaag tatagaagga tgacgatca 59
<210> <211> <212> <213> 350 41 ADN Sequência artificial <220> <223> Iniciador de PCR 339 41 <40 0> 350 gaggatctcg acgcggccgc atggagacag acacactcct g <210> 351 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador de PCR <400> 351 ggggcggaat tggatcctca cagatcctct tctgagatga g 41 <210> 352 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador de PCR <400> 352 gaggatctcg acgcggccgc atggagacag acacactcct g 41 <210> 353 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador de PCR <400> 353 42 gatacggatc ctcagccttt gccccggctc catagaaaca gc <210> 354 <211> 37 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador de PCR <400> 354 cagcaggtcg acgcggccgc atgctggcgg ggggcgt 37 340 <210> 355 <211> 59 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador de PCR <400> 355 <210> 356 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador de PCR <400> 356 39 ggggatatcc accatggatt ttcaggtgca gattttcag <210> 357 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador de PCR <220> <221> carac_diversas <222> (17)..(17) <223> R é A ou G. <220> <221> carac_diversas <222> (25)..(25) <223> K é G ou T. <220> <221> carac_diversas <222> (28)..(28) <223> Y é C or T. <220> <221> carac_diversas cagcaggtcg acctcgcccg gctggttggc caaccagccg ggcgaggtcg acctcgagg 59 341 <222> <223> (37) . . (37) Y é C ou T. <220> <221> <222> <223> carac_diversas (38)..(38) R é A ou G. <400> 357 ggggatatcc accatgragt cacakacyca ggtcttyrta 40 <210> <211> <212> <213> 358 37 ADN Sequência artificial <220> <223> Iniciador de PCR <400> 358 ggggatatcc accatgaagt tgcctgttag gctgttg 37 <210> <211> <212> <213> 359 40 ADN Sequência artificial <220> <223> Iniciador de PCR <220> <221> <222> <223> carac_diversas (20)..(20) K é G ou T. <220> <221> <222> <223> carac_diversas (25) . . (25) W é A ou T. <220> <221> <222> <223> carac_diversas (32) .. (32) Y é C ou T. <220> <221> <222> <223> carac_diversas (34) .. (34) Y é C ou T. 342 <220> <221> <222> <223> carac_diversas (37) . . (37) K é G ou T. <400> 359 ggggatatcc accatgaggk ccccwgctca gytyctkgga 40 <210> <211> <212> <213> 360 39 ADN Sequência artificial <220> <223> Iniciador de PCR <220> <221> <222> <223> carac_diversas (18)..(18) R é A ou G. <220> <221> <222> <223> carac_diversas (28)..(28) K é G ou T. <220> <221> <222> <223> carac_diversas (31) . . (31) M é A ou C. <400> 360 ggggatatcc accatggrat gsagctgkgt matsctctt 39 <210> <211> <212> <213> 361 39 ADN Sequência artificial <220> <223> Iniciador de PCR <220> <221> <222> <223> <220> carac_diversas (17)..(17) R é A ou G. 343 <221> <222> <223> carac_diversas (26)..(26) Y é C ou T. <220> <221> <222> <223> carac_diversas (33)..(33) K é G ou T. <400> 361 ggggatatcc accatgract tcgggytgag ctkggtttt 39
<210> <211> <212> <213> 362 38 ADN Sequência artificial <220> <223> Iniciador de PCR <400> 362 ggggatatcc accatggctg tcttggggct gctcttct 38 <210> <211> <212> <213> 363 39 ADN Sequência artificial <220> <223> Iniciador de PCR <220> <221> <222> <223> carac_diversas (11) .. (11) Y é C ou T. <220> <221> <222> <223> carac_diversas (25)..(26) R é A ou G. <400> 363 aggtctagaa yctccacaca caggrrccag tggatagac 39 <210> <211> <212> <213> 364 22 ADN Sequência artificial 344 <220> <223> Iniciador FR1 <220> <221> <222> <223> carac_diversas (5) . . (5) S é C ou G. <220> <221> <222> <223> carac_diversas (6)..(6) M é A ou C. <220> <221> <222> <223> carac_diversas (8) .. (8) R é A ou G. <2 2 0> <221> <222> <223> carac_diversas (15)..(15) S é C ou G. <220> <221> <222> <223> carac_diversas (20)..(20) W é A ou T. <400> 364 aggtsmarct gcagsagtcw gg 22 <210> <211> <212> <213> 365 34 ADN Sequência artificial <220> <223> Iniciador FR4 <400> 365 tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc ccag 34 <210> <211> 366 27 <212> <213> ADN Sequência artificial 345 <220> <223> Iniciador de PCR <220> <221> <222> <223> carac_diversas (6)..(6) R é A ou G. <220> <221> <222> <223> carac_diversas (9) .. (9) Y é C ou T. <220> <221> <222> <223> carac_diversas (12)..(12) Y é C ou T. <220> <221> <222> <223> carac_diversas (18)..(18) H é A, C, ou T. <220> <221> <222> <223> carac_diversas (21)..(21) N é A, G, C, ou T. <220> <221> <222> <223> carac_diversas (24) .. (24) N é A, G, C, ou T. <220> <221> <222> <223> carac_diversas (27) .. (27) Y é C ou T. <400> 366 atggartgya aytggathct nccntty
<210> <211> <212> <213> 367 39 ADN Sequência artificial <220> <223> Iniciador de PCR <220> <221> <222> <223> carac_diversas (11)..(11) Y é C ou T. <220> <221> <222> <223> carac_diversas (25)..(26) R é A ou G. <400> 367 aggtctagaa yctccacaca caggrrccag tggatagac 39
<210> <211> <212> <213> 368 66 ADN Sequência artificial <220> <223> Iniciador de PCR <400> 368 ggggtatctc tcgagaaaag agagcatcat catcatcatc atatgggaca gttcagagtg 60 ataggg 66
<210> <211> <212> <213> 369 40 ADN Sequência artificial <220> <223> Iniciador de PCR <400> 369 ttcgcggccg ctattagcca gggttgatcc agtagaaggg 40 <210> <211> <212> <213> 370 354 ADN Sequência artificial <220> <223> Lil3 (VH) <400> 370 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 347 120 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cattacgaga tgtattgggt tcgccaagct cctggtaaag gtttggagtg ggtttctcgt atcgtttctt ctggtggctt tactaagtat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc aacagagggt 300 gataatgatg cttttgatat ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc aagc 354 <210> 371 <211> 324
<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Lil3 (VL) <400> 371 gacatccaga tgacccagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgatgta cacttttggc 300 caggggacca agctggagat caaa 324 <210> 372 <211> 118 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Lil3 (VH) <400> 372
Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr 20 25 30 348
Glu Met Tyr 35 Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 40 45 Ser Arg Ile 50 Vai Ser Ser Gly Gly Phe Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Vai 55 60 Lys Gly Arg 65 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Glu Gly Asp Asn Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 Thr Vai Thr 115 Vai Ser Ser <210> 373 <211> 108 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Lil3 <400> 373 (VL) Asp Ile Gin 1 Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 349
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Met 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 374 <211> 354
<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> LI32 (VH) <40 0> 374 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct gcttacatga tgcagtgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctctcctt ctggtggcaa tactaagtat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaggagat 300 tatggatact ggttcgaccc ctggggccag ggcaccctgg tcaccgtctc aagc 354 <210> 375 <211> 321
<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Li32 (VL) <400> 375 gacatccaga tgacccagtc tccagactcc ctgtctgcat ctgttggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc aggcgagtca agacattagc tactatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggatggccc ctaaactcct catctacgat gccttcattt tggaaggagg ggccccatca 180 cggttcagtg ggagcggctc tgggacagat ttttctttca ccatcagcaa tctacagcct 240 350 300 gaggatattg caacttattt ctgtcaacag tctgatcaac tgcccgtgac cttcggccaa gggaccaagg tggaaatcag a 321 <210> 376 <211> 118 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Li3 2 (VH) <400> 376
Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro 15 10
Gly Gly 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 20 25
Ser Ala Tyr 30
Met Met Gin Trp Vai Arg Gin Ala 35 40
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly 50 55
Asn Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Vai 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 65 70
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 85
Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Gly Tyr Trp 100
Phe Asp Pro Trp Gly Gin Gly Thr 105 110
Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 377 <211> 107
<212> PRT <213> Sequência artificial 351 <220> <223> Li32 (VL) <40 0> 377
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15
Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp Ile Ser Tyr Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Met Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Asp Ala Phe Ile Leu Glu Gly Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Phe Thr Ile Ser Asn Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Asp Gin Leu Pro Vai 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Arg 100 105 <210> 378 <211> 357
<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Li33 (VH) <400> 378 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct atttacccta tgttttgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttgg atcggtcctt ctggtggcat tactaagtat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 352 300 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acagccacat attactgtgc gagagagggg cataacgact ggtacttcga tctctggggc cgtggcaccc tggtcaccgt ctcaagc 357 <210> 379 <211> 321
<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Li33 (VL) <400> 379 gacatccaga tgacccagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240 gaggattttg cagtttatta ctgtcagcag tatgataagt ggccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 380 <211> 119
<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Li33 (VH) <400> 380
Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr 20 25 30
Pro Met Phe Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45
Ser Trp Ile Gly Pro Ser Gly Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Vai 5° 55 60 353
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Gly His Asn Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly 100 105 110
Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 381 <211> 107
<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Li33 (VL) <400> 381
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Ser 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asp Lys Trp Pro Leu 85 90 95 354
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 <210> 382 <211> 357
<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Li3 4 (VH) <400> 382 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct aattacgaga tgtattgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttctggt atctattctt ctggtggcat tactgtttat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc tagggcagcc 300 atcctcgact ggtacttcga tctctggggc cgtggcaccc tggtcaccgt ctcaagc 357 <210> 383 <211> 321
<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Li3 4 (VL) <400> 383 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc atgcgagtca ggacattagc aactatttaa gttggtatca gcagaaacca 120 ggtaaagccc ctaaactcct gatctacgat gctttcaatt tggagacagg agtcccatcg 180 aggttcagtg gaagtggatc tggcacagat tttacattca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacatatta ctgtcagcac tatgataatc tcccattcac tttcggccct 300 gggaccagag tggcgatcag a 321 <210> 384 <211> 119 355 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Li3 4 (VH) <400> 384
Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser 1 5
Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30
Glu Met Tyr Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Ile Thr Vai Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ala Ala Ile Leu Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly 100 105 110
Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 385 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Li 34 (VL) <400> 385
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 356 1 5 10 15
Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys His Leu Ser 20 Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 35 40 Tyr Asp Ala Phe Asn Leu Glu Thr 50 55 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Phe 85 Gly Pro Gly Thr Arg Vai <210> 100 386 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Lil3) <400> 386 Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser 1 5 <210> 387 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Lil3) <400> 387 Ala Ile Arg 105 Tyr Leu Ala 10
Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr 25 30
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 45
Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 60
Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 75 80
Gin His Tyr Asp Asn Leu Pro Phe 90 95 357
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> <211> <212> <213> 388 10 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Lil3) <400> 388
Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Met Tyr Thr 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 389 5 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Lil3) <400> 389
His Tyr Glu Met Tyr 1 5 <210> <211> <212> <213> 390 17 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Lil3) <400> 390
Arg Ile Vai Ser Ser Gly Gly Phe Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 1 5 10 15 Gly <210> 391 358 <211> <212> <213> 9 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Lil3) <400> 391
Glu Gly Asp Asn Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 <210> <211> 392 11 <212> <213> PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Li32) <400> 392
Gin Ala Ser Gin Asp Ile Ser Tyr Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 393 7 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Li32) <400> 393
Asp Ala Phe Ile Leu Glu Gly 1 5 <210> <211> <212> <213> 394 9 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Li3 2) <400> 394 359
Gin Gin Ser Asp Gin Leu Pro Vai Thr 1 5 <210> <211> <212> <213> 395 5 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Li32) <400> 395
Ala Tyr Met Met Gin 1 5 <210> <211> <212> <213> 396 17 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Li3 2) <400> 396
Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 1 5 10 15 Gly <210> <211> <212> <213> 397 9 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Li3 2) <400> 397
Gly Asp Tyr Gly Tyr Trp Phe Asp Pro 1 5 <210> 398 360 <211> <212> <213> 11 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Li33) <400> 398
Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> <211> 399 7 <212> <213> PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Li33) <400> 399
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> <211> <212> <213> 400 9 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Li33) <400> 400
Gin Gin Tyr Asp Lys Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> <211> <212> <213> 401 5 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Li33) <400> 401 361
Ile Tyr Pro Met Phe 1 5 <210> <211> <212> <213> 402 17 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Li33) <400> 402
Trp Ile Gly Pro Ser Gly Gly Ile Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 1 5 10 15 Gly <210> <211> <212> <213> 403 10 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Li33) <400> 403
Glu Gly His Asn Asp Trp Tyr Phe Asp Leu 15 10 <210> <211> <212> <213> 404 11 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR1 (Li3 4) <400> 404
His Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 405 362 <211> <212> <213> 7 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR2 (Li3 4) <400> 405
Asp Ala Phe Asn Leu Glu Thr 1 5 <210> <211> <212> <213> 406 9 PRT Sequência artificial <220> <223> VL-CDR3 (Li3 4) <400> 406
Gin His Tyr Asp Asn Leu Pro Phe Thr 1 5 <210> <211> <212> <213> 407 5 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR1 (Li3 4) <400> 407
Asn Tyr Glu Met Tyr 1 5 <210> <211> <212> <213> 408 17 PRT Sequência artificial <220> <223> VH-CDR2 (Li3 4) <400> 408 363
Gly Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Ile Thr Vai Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 1 5 Gly <210> 409 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> VH-CDR3 (Li3 4) <400> 409
Ala Ala Ile Leu Asp Trp Tyr Phe Asp Leu 15 10
Lisboa, 14 de Novembro de 2013 364

Claims (9)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antigénio que se pode ligar especificamente a Sp35 e pode antagonizar Sp35, em que o anticorpo ou o seu fragmento é seleccionado do grupo que consiste em: (i) um anticorpo ou seu fragmento que se liga a um antigénio compreendendo uma VH, em que as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 da VH são SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, e SEQ ID NO: 79 e uma VL em que as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 da VL são SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, e SEQ ID NO: 148; e (ii) um anticorpo ou seu fragmento que se liga a um antigénio compreendendo uma VH e uma VL, em que a VH compreende SEQ ID NO: 170 e a VL compreende SEQ ID NO: 283.
  2. 2. O anticorpo ou seu fragmento de ligação a um antigénio da reivindicação, 1 em que, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a um antigénio é um antagonista da inibição do crescimento de neurites mediada por Sp35, um antagonista da inibição da mielinização mediada por Sp35, ou um antagonista da inibição da diferenciação de oligodendrócitos mediada por Sp35.
  3. 3. Utilização do anticorpo Sp35 ou seu fragmento de ligação a um antigénio da reivindicação 1 ou 2 isolado para o fabrico de um medicamento para o tratamento de lesão cerebral traumática, lesão da espinal medula, ou lesão do nervo óptico.
  4. 4. 0 anticorpo Sp35 ou seu fragmento de ligação a um antigénio da reivindicação 1 ou 2 isolado, para utilização no tratamento de lesão cerebral traumática, lesão da espinal medula, ou lesão do nervo óptico. 1
  5. 5. Uma composição compreendendo um ou mais polinucleótidos isolados que codificam para o anticorpo da reivindicação 1 ou da reivindicação 2.
  6. 6. Uma célula hospedeira compreendendo o um ou mais polinucleótidos isolados da reivindicação 5.
  7. 7. Utilização do anticorpo Sp35 ou seu fragmento de ligação a um antigénio de acordo com a reivindicação 1 ou 2 isolado para o fabrico de um medicamento para o tratamento da esclerose múltipla.
  8. 8. 0 anticorpo Sp35 ou seu fragmento de ligação a um antigénio de acordo com a reivindicação 1 ou 2 isolado, para o tratamento da esclerose múltipla.
  9. 9. Um método in vitro de inibição da transdução de sinal por NgRl, compreendendo o método contactar o NgRl com uma quantidade eficaz do anticorpo Sp35 ou seu fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 1 ou 2 isolado. Lisboa, 14 de Novembro de 2013 2
PT67864280T 2005-07-08 2006-07-07 Anticorpos sp35 e suas utilizações PT1904104E (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US69733605P 2005-07-08 2005-07-08
US77190006P 2006-02-10 2006-02-10
US81452206P 2006-06-19 2006-06-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT1904104E true PT1904104E (pt) 2013-11-21

Family

ID=37637730

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT67864280T PT1904104E (pt) 2005-07-08 2006-07-07 Anticorpos sp35 e suas utilizações

Country Status (22)

Country Link
US (4) US8551476B2 (pt)
EP (4) EP2394661A1 (pt)
JP (4) JP2009502123A (pt)
KR (1) KR101245462B1 (pt)
CN (1) CN101495509B (pt)
AU (1) AU2006269458B2 (pt)
BR (1) BRPI0613387A2 (pt)
CA (2) CA2902070A1 (pt)
DK (1) DK1904104T3 (pt)
ES (1) ES2434470T3 (pt)
HK (2) HK1117763A1 (pt)
HR (1) HRP20131066T1 (pt)
IL (3) IL188440A (pt)
MX (1) MX2008000253A (pt)
NO (1) NO20080692L (pt)
PH (1) PH12014500347A1 (pt)
PL (1) PL1904104T3 (pt)
PT (1) PT1904104E (pt)
RS (1) RS53058B (pt)
SG (2) SG163591A1 (pt)
SI (1) SI1904104T1 (pt)
WO (1) WO2007008547A2 (pt)

Families Citing this family (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002051438A2 (en) 2000-12-22 2002-07-04 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Use of repulsive guidance molecule (rgm) and its modulators
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
ATE479754T1 (de) 2003-03-19 2010-09-15 Biogen Idec Inc Nogo rezeptor bindendes protein
RS52593B (en) * 2004-06-24 2013-04-30 Biogen Idec Ma Inc. TREATMENT OF THE CONDITIONS CONCERNING DEMYELINIZATION
EP2394661A1 (en) 2005-07-08 2011-12-14 Biogen Idec MA Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
CA2624562A1 (en) * 2005-09-30 2007-04-12 Abbott Gmbh & Co. Kg Binding domains of proteins of the repulsive guidance molecule (rgm) protein family and functional fragments thereof, and their use
US20090246189A1 (en) * 2005-11-04 2009-10-01 Biogen Idec Ma Inc. And Mclean Hospital Methods for Promoting Neurite Outgrowth and Survival of Dopaminergic Neurons
CN101432302A (zh) 2005-11-30 2009-05-13 艾博特公司 抗－Aβ球聚体抗体，其抗原结合部分，相应的杂交瘤、核酸、载体、宿主细胞，生产所述抗体的方法，包含所述抗体的组合物，所述抗体的应用以及使用所述抗体的方法
CA2631195C (en) 2005-11-30 2016-04-05 Abbott Laboratories Monoclonal antibodies against amyloid beta protein and uses thereof
EP2543384A3 (en) * 2005-12-02 2013-04-10 Biogen Idec MA Inc. Treatment of conditions involving demyelination
US8642040B2 (en) 2006-07-24 2014-02-04 Biogen Idec Ma Inc. Methods for promoting myelination, neuronal survival and oligodendrocyte differentiation via administration of Sp35 or TrkA antagonists
JP5647414B2 (ja) 2006-11-17 2014-12-24 ノバルティス アーゲー Ｌｉｎｇｏ結合分子およびその医薬用使用
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
JP2010515456A (ja) * 2007-01-09 2010-05-13 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｓｐ３５抗体およびその使用
AU2013201278B2 (en) * 2007-01-09 2015-03-26 Biogen Ma Inc. Sp35 Antibodies and Uses Thereof
US8128926B2 (en) 2007-01-09 2012-03-06 Biogen Idec Ma Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
EP2124952A2 (en) 2007-02-27 2009-12-02 Abbott GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
EP2033971A1 (de) * 2007-09-06 2009-03-11 Abbott GmbH & Co. KG Bone Morphogenetic Protein (BMP)-bindende Domänen von Proteinen der Repulsive Guidance Molecule (RGM) Proteinfamilie und funktionale Fragmente davon sowie deren Verwendung
CA2701189C (en) * 2007-10-11 2017-05-16 Biogen Idec Ma Inc. Methods for treating pressure induced optic neuropathy, preventing neuronal degeneration and promoting neuronal cell survival via administration of lingo-1 antagonists and trkb agonists
CN101918540B (zh) * 2007-11-08 2016-05-11 比奥根Ma公司 Lingo-4拮抗剂在治疗涉及脱髓鞘的疾患中的应用
US8962803B2 (en) * 2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof
CA2997870A1 (en) 2008-07-09 2010-01-14 Biogen Ma Inc. Compositions comprising antibodies to lingo or fragments thereof
US8980610B2 (en) 2008-11-20 2015-03-17 Biogen Idec Ma Inc. Arginine inactivation of viruses
JP2012510295A (ja) * 2008-12-03 2012-05-10 ベーリンガー インゲルハイム ファーマスーティカルズ アイエヌシー． グアニル酸シクラーゼ受容体に対する抗体
EP2483289B1 (en) 2009-10-02 2019-03-20 Biogen MA Inc. Methods of preventing and removing trisulfide bonds
WO2011070045A1 (en) * 2009-12-08 2011-06-16 Abbott Gmbh & Co. Kg Monoclonal antibodies against the rgm a protein for use in the treatment of retinal nerve fiber layer degeneration
US8987419B2 (en) 2010-04-15 2015-03-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Amyloid-beta binding proteins
US9517257B2 (en) 2010-08-10 2016-12-13 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Erythrocyte-binding therapeutics
US9850296B2 (en) 2010-08-10 2017-12-26 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Erythrocyte-binding therapeutics
WO2012021512A2 (en) 2010-08-10 2012-02-16 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Erythrocyte-binding therapeutics
MX358739B (es) 2010-08-14 2018-09-03 Abbvie Inc Star Proteinas de union a amiloide beta.
EP3388443A1 (en) 2011-05-13 2018-10-17 Biogen MA Inc. Methods of preventing and removing trisulfide bonds
AU2013203422A1 (en) * 2012-01-06 2013-07-18 Bioalliance C.V. Anti-transferrin receptor antibodies and methods using same
WO2013109829A1 (en) * 2012-01-20 2013-07-25 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Ltd Anti-adamts4 antibodies and methods of treatment
NZ714482A (en) 2012-01-27 2017-08-25 Abbvie Inc Composition and method for diagnosis and treatment of diseases associated with neurite degeneration
NZ702178A (en) 2012-05-14 2017-01-27 Biogen Ma Inc Lingo-2 antagonists for treatment of conditions involving motor neurons
US9498532B2 (en) 2013-03-13 2016-11-22 Novartis Ag Antibody drug conjugates
US9415118B2 (en) * 2013-03-13 2016-08-16 Novartis Ag Antibody drug conjugates
CA2929547C (en) 2013-11-06 2023-02-28 Astute Medical, Inc. Assays for igfbp7 having improved performance in biological samples
AU2015233084B2 (en) 2014-02-21 2020-12-17 Anokion Sa Glycotargeting therapeutics
US10946079B2 (en) 2014-02-21 2021-03-16 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Glycotargeting therapeutics
US10953101B2 (en) 2014-02-21 2021-03-23 École Polytechnique Fédérale De Lausanne (Epfl) Glycotargeting therapeutics
US10046056B2 (en) 2014-02-21 2018-08-14 École Polytechnique Fédérale De Lausanne (Epfl) Glycotargeting therapeutics
TWI724997B (zh) 2014-08-19 2021-04-21 美商默沙東藥廠 抗ｔｉｇｉｔ抗體
JP2018504400A (ja) 2015-01-08 2018-02-15 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． Ｌｉｎｇｏ‐１拮抗薬及び脱髄障害の治療のための使用
WO2016197009A1 (en) 2015-06-05 2016-12-08 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Triazoles for the treatment of demyelinating diseases
ES2895652T3 (es) * 2015-07-07 2022-02-22 Inst Nat Sante Rech Med Métodos y composiciones farmacéuticas para expresar un polinucleótido de interés en el sistema nervioso periférico de un sujeto
CA2994555A1 (en) 2015-08-14 2017-02-23 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-tigit antibodies
US11542332B2 (en) 2016-03-26 2023-01-03 Bioatla, Inc. Anti-CTLA4 antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
WO2018106646A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Aminotriazoles for the treatment of demyelinating diseases
WO2018106643A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Heterocyclic azoles for the treatment of demyelinating diseases
WO2018106641A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Pyrazoles for the treatment of demyelinating diseases
WO2018123979A1 (ja) * 2016-12-26 2018-07-05 協和発酵キリン株式会社 ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質に結合する抗体
EP3638296A1 (en) 2017-06-16 2020-04-22 The University Of Chicago Compositions and methods for inducing immune tolerance
CN110759996B (zh) * 2018-07-27 2022-09-06 深圳康体生命科技有限公司 一种gfp抗体
CA3117102A1 (en) * 2018-10-26 2020-04-30 Janssen Biotech, Inc. Type i interferon signatures and methods of use
CN109825497A (zh) * 2019-01-25 2019-05-31 石河子大学 一种新型结核杆菌融合菌株的制备方法及其应用
CN116601170A (zh) * 2020-12-10 2023-08-15 上海药明生物技术有限公司 抗p-钙粘蛋白抗体及其用途
CN113274400B (zh) * 2021-06-07 2022-07-12 四川大学 四面体框架核酸在治疗多发性硬化症的药物中的用途
WO2024117777A1 (ko) * 2022-11-29 2024-06-06 한국생명공학연구원 면역세포의 면역학적 간극 형성 촉진을 통해 세포용해 활성을 향상시키기 위한 NgR1 단백질의 활성 또는 발현 억제제

Family Cites Families (245)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773319A (en) 1971-12-16 1973-11-20 Fabcor Ind Inc Corrugated sheet inverting machine
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4714681A (en) 1981-07-01 1987-12-22 The Board Of Reagents, The University Of Texas System Cancer Center Quadroma cells and trioma cells and methods for the production of same
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
US6054561A (en) 1984-02-08 2000-04-25 Chiron Corporation Antigen-binding sites of antibody molecules specific for cancer antigens
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US4694778A (en) 1984-05-04 1987-09-22 Anicon, Inc. Chemical vapor deposition wafer boat
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
JP2532858B2 (ja) 1985-04-01 1996-09-11 セルテツク リミテツド 形質転換したミエロ―マ細胞系
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
WO1989012624A2 (en) 1988-06-14 1989-12-28 Cetus Corporation Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
US4925648A (en) 1988-07-29 1990-05-15 Immunomedics, Inc. Detection and treatment of infectious and inflammatory lesions
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
DE68927933T2 (de) 1988-09-02 1997-08-14 Dyax Corp Herstellung und auswahl von rekombinantproteinen mit verschiedenen bindestellen
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
ATE135370T1 (de) 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
IE63847B1 (en) 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
CA2055441C (en) 1989-05-19 2003-01-07 Robert M. Hudziak Her2 extracellular domain
WO1991000360A1 (en) 1989-06-29 1991-01-10 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
US5180820A (en) 1989-08-30 1993-01-19 Barde Yves Alain Brain-derived neurotrophic factor
US5605690A (en) 1989-09-05 1997-02-25 Immunex Corporation Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69133566T2 (de) 1990-01-12 2007-12-06 Amgen Fremont Inc. Bildung von xenogenen Antikörpern
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
AU654811B2 (en) 1990-03-20 1994-11-24 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5219837A (en) 1990-06-21 1993-06-15 Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of stimulating myelination of cells
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5532351A (en) 1990-07-12 1996-07-02 Arch Development Corporation Nucleic acid sequences encoding OMGP
EP0814159B1 (en) 1990-08-29 2005-07-27 GenPharm International, Inc. Transgenic mice capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
EP0553244B8 (en) 1990-10-05 2005-06-08 Celldex Therapeutics, Inc. Targeted immunostimulation with bispecific reagents
EP0557300B1 (en) 1990-10-29 1997-11-19 Chiron Corporation Bispecific antibodies, method of production, and uses thereof
EP1149913A1 (en) 1990-11-09 2001-10-31 GILLIES, Stephen D. Cytokine immunoconjugates
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
JP3672306B2 (ja) 1991-04-10 2005-07-20 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート ファージミドを使用するヘテロ二量体受容体ライブラリー
US5573920A (en) 1991-04-26 1996-11-12 Surface Active Limited Antibodies, and methods for their use
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
CA2110799A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Arnold H. Horwitz Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
US5756096A (en) 1991-07-25 1998-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant antibodies for human therapy
IE922437A1 (en) 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Recombinant antibodies for human therapy
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
ATE408012T1 (de) 1991-12-02 2008-09-15 Medical Res Council Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
JP3571337B2 (ja) 1992-02-11 2004-09-29 セル ジェネシス，インコーポレーテッド 遺伝子標的現象による同型遺伝子接合
EP1306095A3 (en) 1992-03-05 2003-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
EP0627932B1 (en) 1992-11-04 2002-05-08 City Of Hope Antibody construct
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
ES2088838T3 (es) 1992-11-13 2004-01-01 Idec Pharmaceuticals Corporation Secuencias kozak de consenso totalmente alteradas destinadas a la expresion en los mamiferos.
US5468872A (en) 1993-09-16 1995-11-21 Cephalon, Inc. K-252a functional derivatives potentiate neurotrophin-3 for the treatment of neurological disorders
ATE163231T1 (de) 1993-11-23 1998-02-15 Genentech Inc Kinaserezeptoraktivierungstest
US5753225A (en) * 1993-12-03 1998-05-19 The Regents Of The University Of California Antibodies that mimic actions of neurotrophins
WO1995015982A2 (en) 1993-12-08 1995-06-15 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
DE69534347T2 (de) 1994-01-31 2006-05-24 Trustees Of Boston University, Boston Bibliotheken aus Polyklonalen Antikörpern
GB9402331D0 (en) 1994-02-07 1994-03-30 Univ Mcgill Nerve growth factor structural analogs and their uses
US5877016A (en) 1994-03-18 1999-03-02 Genentech, Inc. Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors
DE4447588C2 (de) 1994-05-03 1997-11-20 Omer Osama Dr Dr Med Pflanzliches Arzneimittel zur Behandlung von chronischen und allergischen Rhino-Sino-Bronchitiden
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
GB9413127D0 (en) 1994-06-30 1994-08-24 Philips Electronics Uk Ltd Data processing apparatus
WO2001004311A1 (en) 1999-07-07 2001-01-18 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO1996012717A1 (fr) 1994-10-25 1996-05-02 Toyama Chemical Co., Ltd. Potentialisateur de l'activite du facteur de croissance nerveuse contenant un derive de 1,2-ethanediol ou un sel de celui-ci
US5770577A (en) 1994-11-14 1998-06-23 Amgen Inc. BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6280964B1 (en) 1995-04-14 2001-08-28 The Regents Of The University Of California Binding sites for phosphotyrosine binding domains
ATE390933T1 (de) 1995-04-27 2008-04-15 Amgen Fremont Inc Aus immunisierten xenomäusen stammende menschliche antikörper gegen il-8
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5811524A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
AU6113396A (en) 1995-06-14 1997-01-15 Regents Of The University Of California, The Novel high affinity human antibodies to tumor antigens
US5707829A (en) 1995-08-11 1998-01-13 Genetics Institute, Inc. DNA sequences and secreted proteins encoded thereby
IT235676Y1 (it) 1995-07-27 2000-07-12 Felice Gaudioso Allestimenti per lo svolgimento del gioco wormhole action match.
US6068829A (en) 1995-09-11 2000-05-30 The Burnham Institute Method of identifying molecules that home to a selected organ in vivo
GB9524973D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Lynxvale Ltd Viral vectors
GB9525180D0 (en) 1995-12-08 1996-02-07 Univ Mcgill Design of hormone-like antibodies with agonistic and antagonistic fuctions
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
US6455277B1 (en) 1996-04-22 2002-09-24 Amgen Inc. Polynucleotides encoding human glial cell line-derived neurotrophic factor receptor polypeptides
JP2000501416A (ja) 1996-04-26 2000-02-08 ユニバーシティー オブ オタワ ニューロン病を治療し予防するための、治療法および薬物のスクリーニング法
NZ333441A (en) 1996-06-25 1999-05-28 Cephalon Inc Use of k-252a derivatives for the treatment of peripheral or central nerve disorders, and cytokine overproduction
EP0938556B1 (en) 1996-07-12 2005-03-09 Genentech, Inc. Gamma-heregulin
US6211150B1 (en) 1996-07-19 2001-04-03 Amgen Inc. Analogs of cationic proteins
KR20000036051A (ko) 1996-09-11 2000-06-26 마빈 씨. 구트리 변형 외피 단백질을 보유하는 비포유류 ｄｎａ 바이러스를 이용한 포유류 세포에서의 외래 유전자 발현
CN1233963A (zh) 1996-09-13 1999-11-03 有限会社最先端医学研究所 神经营养因子的眼科用组合物、视神经机能障碍治疗药和视神经机能障碍治疗方法
US6420140B1 (en) 1996-10-11 2002-07-16 Abgenix, Inc. Production of multimeric protein by cell fusion method
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
US20070213290A1 (en) 1996-10-17 2007-09-13 Kingsman Alan J Neurite regeneration
US6593290B1 (en) 1996-11-01 2003-07-15 Genentech, Inc. Treatment of inner ear hair cells
US6156728A (en) 1996-11-01 2000-12-05 Genentech, Inc. Treatment of inner ear hair cells
AU5702298A (en) 1996-12-03 1998-06-29 Abgenix, Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and VK regions nd antibodies produced therefrom
CA2283740C (en) 1997-03-14 2006-06-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same
US20020137890A1 (en) 1997-03-31 2002-09-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
SI0970126T1 (en) 1997-04-14 2001-08-31 Micromet Ag Novel method for the production of antihuman antigen receptors and uses thereof
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
DE69833755T2 (de) 1997-05-21 2006-12-28 Biovation Ltd. Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen
US6190370B1 (en) 1997-07-25 2001-02-20 Arrow International, Inc. Devices, systems and methods for determining proper placement of epidural catheters
US20020112251A1 (en) 1997-08-04 2002-08-15 Mccarthy Sean A. Novel genes encoding proteins having prognostic, diagnostic, preventive, therapeutic and other uses
CA2299276A1 (en) 1997-08-04 1999-02-11 Millennium Biotherapeutics, Inc. Tango-78, tango-79, and tango-81 nucleic acid molecules and polypeptides
CA2303834A1 (en) 1997-09-17 1999-03-25 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6974689B1 (en) 1997-09-18 2005-12-13 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding PRO211 polypeptides
EP1205546B1 (en) 1997-10-24 2005-11-23 Genentech, Inc. Polypeptide and nucleic acids encoding the same
FR2776661B1 (fr) 1998-03-26 2002-04-05 Centre Nat Rech Scient Polypeptide immunoreactif du recepteur trka du ngf et utilisations
US7282482B2 (en) 1998-04-08 2007-10-16 The Regents Of The University Of California NGF for the prevention of demyelination in the nervous system
AU5922999A (en) 1998-09-16 2000-04-03 Genentech Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
SK287323B6 (sk) 1998-11-06 2010-07-07 University Of Z�Rich Nogo proteín, jeho purifikovaný fragment, chimérny proteín a purifikovaná molekula s jeho obsahom, izolovaná nukleová kyselina, vektor s jej obsahom, rekombinantná bunka, spôsob produkcie rekombinantného proteínu a jeho použitie
CN1202128C (zh) 1998-12-08 2005-05-18 拜奥威神有限公司 修饰蛋白的免疫原性
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
US20020102208A1 (en) 1999-03-01 2002-08-01 Paul Chinn Radiolabeling kit and binding assay
WO2000058473A2 (en) 1999-03-31 2000-10-05 Curagen Corporation Nucleic acids including open reading frames encoding polypeptides; 'orfx'
US7034132B2 (en) 2001-06-04 2006-04-25 Anderson David W Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
US20040067490A1 (en) 2001-09-07 2004-04-08 Mei Zhong Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
US6949245B1 (en) 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
CA2373721C (en) 1999-07-02 2013-10-15 Genentech, Inc. Compounds that bind her2
AU6181200A (en) 1999-07-29 2001-02-19 Helix Research Institute Stomach cancer-associated gene
EP1074617A3 (en) 1999-07-29 2004-04-21 Research Association for Biotechnology Primers for synthesising full-length cDNA and their use
AU6906100A (en) * 1999-08-16 2001-03-13 Government of The United States of America, as represented by The Secretary Department of Health & Human Services, The National Institutes of Health, The Receptor-mediated uptake of an extracellular bcl-xl fusion protein inhibits apoptosis
CA2382015A1 (en) 1999-08-17 2001-02-22 Incyte Genomics, Inc. Membrane associated proteins
US6461414B1 (en) 1999-10-29 2002-10-08 Baker Hughes Incorporated Foam monitoring and control system
EP1686134A3 (en) 1999-12-01 2006-08-09 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6680209B1 (en) 1999-12-06 2004-01-20 Biosite, Incorporated Human antibodies as diagnostic reagents
GEP20063830B (en) 2000-01-12 2006-05-25 Univ Yale Nogo Receptor-Mediated Blockade of Axonal Growth
US7119165B2 (en) 2000-01-12 2006-10-10 Yale University Nogo receptor-mediated blockade of axonal growth
CA2397670C (en) 2000-01-18 2010-06-08 Mcgill University .beta.-turn peptidomimetic cyclic compounds
EP1254246A4 (en) 2000-01-25 2003-05-21 Hyseq Inc METHODS AND MATERIALS FOR ALPHA-LIKE TRANSFORMATION GROWTH FACTOR-LIKE POLYPEPTIDES AND POLYNUCLEOTIDES
WO2001059063A2 (en) 2000-01-31 2001-08-16 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
CA2393616A1 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
WO2001055320A2 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
EP1254269A4 (en) 2000-02-03 2004-10-27 Nuvelo Inc METHODS AND MATERIALS IN CONNECTION WITH POLYPEPTIDES AND POLYNUCLEOTIDS, WHICH LIKE NEURONAL GUIDE MOLECULES
CN1426422A (zh) 2000-02-29 2003-06-25 株式会社Ltt研究所 修饰的bdnf
KR20020093029A (ko) 2000-04-11 2002-12-12 제넨테크, 인크. 다가 항체 및 그의 용도
WO2002000677A1 (en) 2000-06-07 2002-01-03 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
US6430914B1 (en) 2000-06-29 2002-08-13 Foster Wheeler Energy Corporation Combined cycle power generation plant and method of operating such a plant
US20040010118A1 (en) 2000-08-16 2004-01-15 Zerhusen Bryan D. Novel proteins and nucleic acids encoding same
NZ524328A (en) 2000-09-13 2004-09-24 Smithkline Beecham Corp A protein with homology to relaxin
JP2004531203A (ja) 2000-10-05 2004-10-14 キュラジェン コーポレイション ヒトタンパク質、これらをコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらの利用方法
JP4465148B2 (ja) 2000-10-06 2010-05-19 イェール ユニバーシティー Ｎｏｇｏレセプターホモログ
ATE352040T1 (de) 2000-11-17 2007-02-15 Univ Rochester In-vitro verfahren zur herstellung und identifizierung von immunglobulin moleküle in eukaryotischen zellen
US20030216558A1 (en) 2000-12-22 2003-11-20 Morris David W. Novel compositions and methods for cancer
WO2002068579A2 (en) 2001-01-10 2002-09-06 Pe Corporation (Ny) Kits, such as nucleic acid arrays, comprising a majority of human exons or transcripts, for detecting expression and other uses thereof
MXPA03006771A (es) 2001-01-29 2004-05-05 Idec Pharma Corp Anticuerpos modificados y metodos de uso.
AU2002327164A1 (en) 2001-01-29 2002-12-09 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
WO2003008583A2 (en) 2001-03-02 2003-01-30 Sagres Discovery Novel compositions and methods for cancer
WO2002099116A2 (en) 2001-06-04 2002-12-12 Curagen Corporation Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
US20030162734A1 (en) 2001-06-28 2003-08-28 Miller Carol A. Modulation of DENN-MADD expression and interactions for treating neurological disorders
US7223558B2 (en) * 2001-07-11 2007-05-29 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding three novel human cell surface proteins with leucine rich repeats and immunologobulin folds, BGS2, 3, and 4 and variants thereof
US20030020733A1 (en) 2001-07-24 2003-01-30 Yin Memphis Zhihong Computer display having selective area magnification
US20030226155A1 (en) * 2001-08-30 2003-12-04 Biorexis Pharmaceutical Corporation Modified transferrin-antibody fusion proteins
US20040142325A1 (en) 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
US20050123990A1 (en) 2001-09-26 2005-06-09 Incyte Corporation Membrane associated proteins
US7098302B2 (en) 2001-10-12 2006-08-29 University Of Vermont And State Agricultural College Binding peptides specific for the extracellular domain of ErbB2 and uses therefor
AU2002337916A1 (en) 2001-10-22 2003-05-06 Exelixis, Inc. Modifier of the p53 pathway and methods of use
US20030157641A1 (en) 2001-11-16 2003-08-21 Idec Pharmaceuticals Corporation Polycistronic expression of antibodies
US7309485B2 (en) 2001-12-03 2007-12-18 Children's Medical Center Corporation Reducing myelin-mediated inhibition of axon regeneration
WO2003054152A2 (en) 2001-12-10 2003-07-03 Nuvelo, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
AU2003216482A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Exelixis, Inc. MSRAs AS MODIFIERS OF THE p53 PATHWAY AND METHODS OF USE
AU2003243139B2 (en) 2002-04-05 2007-06-21 Amgen Inc. Human anti-OPGL neutralizing antibodies as selective OPGL pathway inhibitors
US7077522B2 (en) 2002-05-03 2006-07-18 University Of Rochester Sharpness metric for vision quality
PT1534736E (pt) 2002-08-10 2010-09-07 Univ Yale Antagonistas do receptor nogo
BRPI0314038B8 (pt) 2002-09-06 2021-05-25 Amgen Inc anticorpo humano isolado, molécula de ácido nucleico isolada, vetor, uso de um anticorpo, e, composição farmacêutica
US6919426B2 (en) 2002-09-19 2005-07-19 Amgen Inc. Peptides and related molecules that modulate nerve growth factor activity
US7816497B2 (en) 2002-10-30 2010-10-19 University Of Kentucky Compositions and methods for inhibiting drusen complement components C3a and C5a for the treatment of age-related macular degeneration
US20040186044A1 (en) 2002-11-06 2004-09-23 Cosgaya Jose Miguel Modulation of myelination by interaction with P75 and TRK receptors
US7388079B2 (en) * 2002-11-27 2008-06-17 The Regents Of The University Of California Delivery of pharmaceutical agents via the human insulin receptor
ATE479754T1 (de) 2003-03-19 2010-09-15 Biogen Idec Inc Nogo rezeptor bindendes protein
CN1926147A (zh) 2003-08-07 2007-03-07 比奥根艾迪克Ma公司 Nogo受体拮抗剂
WO2005018572A2 (en) 2003-08-22 2005-03-03 Biogen Idec Ma Inc. Improved antibodies having altered effector function and methods for making the same
US7205387B2 (en) 2003-08-28 2007-04-17 Agency For Science, Technology And Research Recombinant polypeptide useful for neurotrophin receptor mediated gene delivery and as neurotrophin agonist
WO2005021579A2 (en) * 2003-08-28 2005-03-10 Biorexis Pharmaceutical Corporation Epo mimetic peptides and fusion proteins
US7288638B2 (en) 2003-10-10 2007-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Fully human antibodies against human 4-1BB
ES2378767T3 (es) 2003-12-23 2012-04-17 Crucell Holland B.V. Molécula de unión humana contra CD1a
CA2555340A1 (en) 2004-02-12 2005-09-01 Lexicon Genetics Incorporated Gene disruptions, compositions and methods relating thereto
EP1786463A4 (en) * 2004-03-26 2009-05-20 Human Genome Sciences Inc ANTIBODY AGAINST NOGO RECEPTOR
US20050214288A1 (en) 2004-03-26 2005-09-29 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against Nogo receptor
AU2005232657B2 (en) 2004-04-08 2010-12-16 David B. Agus ErbB antagonists for pain therapy
RS52593B (en) 2004-06-24 2013-04-30 Biogen Idec Ma Inc. TREATMENT OF THE CONDITIONS CONCERNING DEMYELINIZATION
US20060009288A1 (en) 2004-07-07 2006-01-12 Devos John A Conveying information to an interrogator using resonant and parasitic radio frequency circuits
US7846438B2 (en) 2004-08-03 2010-12-07 Biogen Idec Ma Inc. Methods of promoting neurite outgrowth with soluble TAJ polypeptides
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
AR054260A1 (es) 2005-04-26 2007-06-13 Rinat Neuroscience Corp Metodos de tratamiento de enfermedades de la neurona motora inferior y composiciones utilizadas en los mismos
WO2006119013A2 (en) 2005-04-29 2006-11-09 Wyeth Nogo receptor functional motifs and peptide mimetics related thereto and methods of using the same
US8309517B2 (en) 2005-05-16 2012-11-13 Mcgill University LGI, LINGO and p75NTR family members: novel modulators of neuronal growth
EP2298813A3 (en) 2005-06-06 2012-03-21 Wyeth LLC Anti-TRKB monoclonal antibodies and uses thereof
ES2569881T3 (es) 2005-06-08 2016-05-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Procedimientos para facilitar la supervivencia de células neuronales usando miméticos de neurotrofina BDNF peptídicos y no peptídicos
WO2006133533A1 (en) 2005-06-16 2006-12-21 University Technologies International Inc. A treatment for short bowel syndrome
EP2394661A1 (en) 2005-07-08 2011-12-14 Biogen Idec MA Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
WO2007050866A2 (en) 2005-10-27 2007-05-03 Biogen Idec Ma Inc. Oligodendrocyte-myelin glycoprotein compositions and methods of use thereof
US20090246189A1 (en) 2005-11-04 2009-10-01 Biogen Idec Ma Inc. And Mclean Hospital Methods for Promoting Neurite Outgrowth and Survival of Dopaminergic Neurons
EP2543384A3 (en) 2005-12-02 2013-04-10 Biogen Idec MA Inc. Treatment of conditions involving demyelination
WO2007092777A2 (en) 2006-02-02 2007-08-16 Wyeth Cloning, characterization, and application of tnfrsf19 in neurological disorders
CN101405297A (zh) 2006-02-03 2009-04-08 惠氏公司 Lingo-1结构
WO2007098283A2 (en) * 2006-02-27 2007-08-30 Biogen Idec Ma Inc. Use of antagonists of maif receptor complex molecules and neurotrophic factors for treatment of neurological diseases and disorders
US8642040B2 (en) 2006-07-24 2014-02-04 Biogen Idec Ma Inc. Methods for promoting myelination, neuronal survival and oligodendrocyte differentiation via administration of Sp35 or TrkA antagonists
JP5647414B2 (ja) 2006-11-17 2014-12-24 ノバルティス アーゲー Ｌｉｎｇｏ結合分子およびその医薬用使用
US8128926B2 (en) 2007-01-09 2012-03-06 Biogen Idec Ma Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
JP2010515456A (ja) 2007-01-09 2010-05-13 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｓｐ３５抗体およびその使用
CA2701189C (en) 2007-10-11 2017-05-16 Biogen Idec Ma Inc. Methods for treating pressure induced optic neuropathy, preventing neuronal degeneration and promoting neuronal cell survival via administration of lingo-1 antagonists and trkb agonists
CN101918540B (zh) 2007-11-08 2016-05-11 比奥根Ma公司 Lingo-4拮抗剂在治疗涉及脱髓鞘的疾患中的应用
ES2464459T3 (es) 2008-06-25 2014-06-02 H. Lundbeck A/S Modulación del sistema receptor Trpv:receptor de dominio Vps 10p para el tratamiento del dolor
CA2729749A1 (en) 2008-07-02 2010-01-07 Emergent Product Development Seattle, Llc Tnf-a antagonist multi-target binding proteins
CA2997870A1 (en) 2008-07-09 2010-01-14 Biogen Ma Inc. Compositions comprising antibodies to lingo or fragments thereof
GB2507680B (en) 2008-11-17 2014-06-18 Veracyte Inc Methods and compositions of molecular profiling for disease diagnostics
JP5289986B2 (ja) 2009-01-20 2013-09-11 株式会社オーディオテクニカ 赤外線送信機
FR2958293B1 (fr) 2010-04-01 2014-09-26 Centre Nat Rech Scient Outils pour l'identification de ligands de lingo-1,lingo-2, lingo-3 et lingo-4, et utilisations
NZ702178A (en) 2012-05-14 2017-01-27 Biogen Ma Inc Lingo-2 antagonists for treatment of conditions involving motor neurons

Also Published As

Publication number Publication date
US20090017039A1 (en) 2009-01-15
US20140199315A1 (en) 2014-07-17
EP2238986A2 (en) 2010-10-13
EP1904104B1 (en) 2013-09-11
EP1904104A2 (en) 2008-04-02
RS53058B (en) 2014-04-30
AU2006269458A1 (en) 2007-01-18
US8551476B2 (en) 2013-10-08
MX2008000253A (es) 2008-04-02
CN101495509A (zh) 2009-07-29
JP2013135694A (ja) 2013-07-11
US20130336991A1 (en) 2013-12-19
SG163591A1 (en) 2010-08-30
SI1904104T1 (sl) 2013-12-31
BRPI0613387A2 (pt) 2011-01-11
WO2007008547A2 (en) 2007-01-18
PL1904104T3 (pl) 2014-02-28
KR101245462B1 (ko) 2013-03-20
AU2006269458B2 (en) 2012-11-08
EP2394661A1 (en) 2011-12-14
HK1137460A1 (en) 2010-07-30
IL220782A0 (en) 2012-08-30
JP2015180688A (ja) 2015-10-15
IL188440A0 (en) 2008-11-03
SG10201508322SA (en) 2015-11-27
DK1904104T3 (da) 2013-11-11
HK1117763A1 (en) 2009-01-23
IL235620A0 (en) 2014-12-31
HRP20131066T1 (hr) 2013-12-06
NO20080692L (no) 2008-04-03
EP1904104A4 (en) 2009-12-09
US9066984B2 (en) 2015-06-30
IL188440A (en) 2015-07-30
JP2009502123A (ja) 2009-01-29
KR20080031057A (ko) 2008-04-07
EP2238986A3 (en) 2010-11-03
ES2434470T3 (es) 2013-12-16
WO2007008547A3 (en) 2009-03-26
US20110311542A1 (en) 2011-12-22
CA2902070A1 (en) 2007-01-18
PH12014500347A1 (en) 2015-09-28
CN101495509B (zh) 2015-04-22
EP2478917A1 (en) 2012-07-25
CA2614421A1 (en) 2007-01-18
JP2009291214A (ja) 2009-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210395360A1 (en) SP35 Antibodies And Uses Thereof
KR101245462B1 (ko) Ｓｐ35 항체 및 그의 용도
US9745375B2 (en) Compositions comprising antibodies to LINGO or fragments thereof
JP5847881B2 (ja) Ｓｐ３５抗体およびその使用
JP2010515456A5 (pt)
JP2014144017A5 (pt)
JP2009502123A5 (pt)
AU2013200333A1 (en) Sp35 Antibodies and Uses Thereof