ES2895652T3 - Métodos y composiciones farmacéuticas para expresar un polinucleótido de interés en el sistema nervioso periférico de un sujeto - Google Patents

Métodos y composiciones farmacéuticas para expresar un polinucleótido de interés en el sistema nervioso periférico de un sujeto Download PDF

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Abstract

Un vector de AAV9 que contiene un polinucleótido de interés para el uso en un método de tratamiento de una enfermedad desmielinizante periférica en un sujeto que lo necesite, en donde el método comprende una etapa de transducción de células de Schwann mielinizantes del sujeto con dicho vector de AAV9 que contiene el polinucleótido de interés, en donde el polinucleótido de interés está ligado operativamente a una secuencia promotora y en donde la administración del vector se realiza mediante inyección directa en el nervio.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones farmacéuticas para expresar un polinucleótido de interés en el sistema nervioso periférico de un sujeto
CAMPO DE LA INVENCIÓN:
La presente invención se refiere a métodos y composiciones farmacéuticas para expresar un polinucleótido de interés en el sistema nervioso periférico de un sujeto.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN:
Una transferencia génica eficaz al sistema nervioso periférico (PNS) es crítica para la terapia génica de neuropatías periféricas heredadas y adquiridas, la aceleración de la regeneración de nervios periféricos o el tratamiento del dolor. El PNS contiene diferentes tipos de células, principalmente posmitóticas, y su comunicación continua es esencial para la función precisa de todo el sistema. A modo de ejemplo, la mielinización de los axones periféricos implica interacciones recíprocas entre células de Schwann y neuronas. En este contexto, la expresión de un polinucleótido de interés por el tipo de célula apropiado puede ser crucial para mantener o potenciar tanto la diafonía entre diferentes tipos de células como la función del PNS. En particular, la transducción específica de tipos de células no neuronales en el PNS, particularmente de células de Schwann, puede ser de gran interés para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes. El direccionamiento celular específico se puede alcanzar al usar diferentes vectores virales que pueden entrar en un tipo de célula particular a través de su receptor específico. Diferentes serotipos de vectores adenoasociados (AAV) también transducen neuronas sensoriales en los ganglios de las raíces dorsales (DRG) a través de la administración directa en el líquido cefalorraquídeo o a través de transporte retrógrado. Recientemente, se ha mostrado que la expresión conducida por AAV8 de factor neurotrófico ciliar (CNTF) por células de Schwann de ratón incrementa la expresión de proteína de mielina y mejora la regeneración de nervio ciático lesionado poco después de la transducción in vivo (Homs J, Ariza L, Pages G, Udina E, Navarro X, Chillon M, Bosch A. Gene Ther. jun. 2011; 18(6):622-30).
Mattar y cols. (2013, Gene Therapy, Vol. 20 (1) : 59-83) divulga el aporte sistémico de sCAAV9 que expresa GFP a fetos de macaco a través de terapia génica intrauterina. Elmallah y cols. (2012, Human Gene Therapy Methods (Vol.
23(2) : 148-156) divulga la inyección intramuscular a la lengua usando AAV9 que expresa GFP. Homs y cols. (2011, Gene Therapy, Vol. 18 (6) : 622-630) divulga que la administración al nervio intraciático del vector AAV8 es útil para la transducción de células de Schwann local y específica. Boulis y cols. (2003, Neurobiology of Disease, Vol. 14(3) : 535-541) divulga la administración de vectores de rAAV que expresan el indicador bien lacZ o bien GFP en el nervio ciático. La solicitud PCT n° WO 2011/133890 se refiere a métodos para aportar un transgén a tejido del CNS al administrar un rAAV mediante administración intracatecal. La Solicitud de Patente n° US 2013/225666 se refiere a métodos para aportar un polinucleótido de MECP2 al sistema nervioso central al administrar un rAAVg que comprende un polinucleótido de MECP2 en un genoma autocomplementario. La Solicitud de Patente n° US 2013/039888 se refiere a métodos para aportar un polinucleótido de alfa-N-acetilglucosaminidasa a través de la barrera encefálica al administrar sistémicamente un rAAV9 que incluye el polinucleótido de interés.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN:
La presente invención se refiere a métodos y composiciones farmacéuticas para expresar un polinucleótido de interés en el sistema nervioso periférico de un sujeto. En particular, la presente invención se define mediante las reivindicaciones.
DESCRIPCIÓN DETALLADA:
Los inventores han investigado la inyección intraciática de AAV9 en ratones y un primate no humano. Mostraron una fuerte tasa de transducción de células de Schwann mielinizadas con una buena difusión del vector, nunca obtenida ni descrita en la bibliografía hasta ahora. Según esto, estos resultados destacan que los vectores de AAV9 y AVV10 podrían representar una herramienta terapéutica útil para expresar un polinucleótido de interés en células de Schwann mielinizadas en patologías que afecten al sistema nervioso periférico.
Así, un primer objetivo de la presente divulgación se refiere a un método para expresar selectivamente un polinucleótido de interés en el sistema nervioso periférico de un sujeto que lo necesite, que comprende la etapa de transducir un nervio periférico del sujeto con una cantidad de un vector de AAV9 que contiene el polinucleótido de interés.
Según se usa en la presente memoria, el término "sujeto" se refiere a un ser humano u otro mamífero (p. ej., ratón, rata, conejo, hámster, perro, gato, vaca, cerdo, oveja, caballo o primate). En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano.
Típicamente, el sujeto está afectado o es probable que esté afectado por una enfermedad que afecta al sistema nervioso periférico. Según esto, una amplia variedad de enfermedades se puede tratar así dadas las enseñanzas proporcionadas en la presente e incluyen típicamente enfermedades desmielinizantes periféricas. En particular, el método de la presente divulgación es particularmente adecuada para expresar selectivamente el polinucleótido de interés en axones. Más particularmente, el método de la presente divulgación es particularmente adecuado para expresar selectivamente el polinucleótido de interés en células de Schwann. El método de la presente divulgación tiene así una amplia aplicabilidad para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes periféricas que afectan a las funciones de neuronas gangliónicas periféricas, neuronas sensoriales simpáticas y neuronas motrices. En particular, el método de la presente divulgación es útil en tratamientos diseñados para rescatar, por ejemplo, ganglios retinianos, neuronas del oído interno y acústicas y neuronas motrices. En particular, el método de la presente divulgación es particularmente adecuado para prevenir la desmielinización de nervios periféricos. La amplia variedad de defectos exhibidos en nervios periféricos afectados por enfermedades desmielinizantes periféricas se puede atribuir únicamente a una variedad de causas igualmente amplia. A modo de ejemplo, las enfermedades desmielinizantes periféricas pueden ser genéticamente adquiridas ("enfermedades desmielinizantes periféricas hereditarias") o pueden resultar de una enfermedad sistémica, o pueden ser inducidas por un agente tóxico o un agente infeccioso ("enfermedades desmielinizantes periféricas adquiridas").
Según se usa en la presente, el término "tratamiento" o "tratar" se refiere al tratamiento tanto profiláctico o preventivo como al tratamiento curativo o modificador de la enfermedad, incluyendo el tratamiento de sujetos con riesgo de contraer la enfermedad o que se sospecha que hayan contraído la enfermedad, así como sujetos que están enfermos o han sido diagnosticados de sufrir una enfermedad o afección médica, e incluye la supresión de una recaída clínica. El tratamiento se puede administrar a un sujeto que tenga un trastorno médico o que finalmente pueda adquirir el trastorno, a fin de prevenir, curar, retrasar el comienzo de, reducir la gravedad de o mejorar uno o más síntomas de un trastorno o trastorno recurrente, o a fin de prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de la esperada en ausencia de este tratamiento. Por "régimen terapéutico" se entiende el patrón de tratamiento de una enfermedad, p. ej., el patrón de dosificación usado durante la terapia. Un régimen terapéutico puede incluir un régimen de inducción y un régimen de mantenimiento. La expresión "régimen de inducción" o "período de inducción" se refiere a un régimen terapéutico (o la porción de un régimen terapéutico) que se usa para el tratamiento inicial de una enfermedad. El objetivo general de un régimen de inducción es proporcionar un alto nivel de fármaco a un sujeto durante el período inicial de un régimen de tratamiento. Un régimen de inducción puede emplear (en parte o en todo) un "régimen de carga", que puede incluir administrar una dosis mayor del fármaco de la que emplearía un médico durante un régimen de mantenimiento, administrar un fármaco más frecuentemente de lo que un médico administraría el fármaco durante un régimen de mantenimiento o ambos. La expresión "régimen de mantenimiento" o "período de mantenimiento" se refiere a un régimen terapéutico (o la porción de un régimen terapéutico) que se usa para el mantenimiento de un sujeto durante el tratamiento de una dolencia, p. ej., para mantener al sujeto en remisión durante períodos prolongados (meses o años). Un régimen de mantenimiento puede emplear terapia continua (p. ej., administrar un fármaco a intervalos regulares, p. ej., semanalmente, mensualmente, anualmente, etc.) o terapia intermitente (p. ej., tratamiento interrumpido, tratamiento intermitente, tratamiento en una recaída o tratamiento tras alcanzar un criterio predeterminado particular [p. ej., manifestación de la enfermedad, etc.]).
En algunas realizaciones, el método de la presente divulgación es adecuado para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes periféricas hereditarias. Las enfermedades desmielinizantes periféricas hereditarias están provocadas por anormalidades genéticas que se trasmiten de generación en generación. Para varias de estas, se conoce el defecto genético y están disponibles pruebas para diagnóstico y asesoramiento prenatal. En particular, el diagnóstico de una enfermedad desmielinizante periférica hereditaria se sugiere habitualmente con el inicio temprano de síntomas neuropáticos, especialmente cuando también están presentes antecedentes familiares positivos. Antes de los recientes avances genéticos, el diagnóstico estaba apoyado por hallazgos típicos de una ralentización marcada de los estudios de conducción nerviosa con electromiografía y una biopsia del nervio. Hallazgos típicos con una biopsia del nervio incluyen la presencia de los llamados bulbos de cebolla, que indican una desmielinización y remielinización recurrente de las fibras nerviosas. Existe un número de neuropatías desmielinizantes hereditarias. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a enfermedad de Refsum, abetalipoproteinemia, enfermedad de Tangier, enfermedad de Krabbe, leucodistrofia metacromática, enfermedad de Fabry, síndrome de Dejerine-Sottas - y otras. De todas las enfermedades desmielinizantes periféricas hereditarias, las más comunes de lejos son las enfermedades de Charcot-Marie-Tooth. Las enfermedades de Charcot-Marie-Tooth (CMT) son los trastornos neurológicos más comunes. Se caracteriza por debilidad y atrofia de los músculos debido a la desmielinización de nervios periféricos y la degeneración asociada de axones y células del cuerno anterior. Durante los últimos 15 años, ha habido un incremento sustancial en el conocimiento acerca de la base genética de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT) con más de 60 genes conocidos en la actualidad. Una lista regularmente actualizada se puede encontrar en http://www.molgen.ua.ac.be/CMTMutations/Home/IPN.cfm. La herencia dominante autosómica es habitual, y son comunes trastornos degenerativos asociados del CNS, tales como ataxia de Friedreich. En algunas realizaciones, el método de la presente divulgación se puede usar para el tratamiento de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth tipo 4F y la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth debida a la duplicación o la eliminación del gen PMP22. En algunas realizaciones, el método de la presente divulgación se puede usar en el tratamiento de neuropatía amiloidótica familiar y otras enfermedades desmielinizantes periféricas hereditarias relacionadas. El método de la presente divulgación se puede usar en el tratamiento de porfiria hereditaria, que puede tener componentes de neuropatía periférica. Otra enfermedad desmielinizante periférica hereditaria para la que se puede usar para el tratamiento el método de la presente divulgación es la neuropatía sensorial hereditaria tipo II (HSN II). En algunas realizaciones, el método de la presente divulgación se puede usar para el tratamiento de ciertas distrofias musculares.
El método de la presente divulgación también es adecuado para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes periféricas adquiridas.
En algunas realizaciones, el método de la presente divulgación es adecuado para el tratamiento de neuropatías diabéticas. La diabetes es la causa conocida más común de neuropatía. Produce síntomas en aproximadamente 10% de las personas con diabetes. En la mayoría de los casos, la neuropatía es predominantemente sensorial, con dolor y pérdida sensorial en las manos y los pies. Pero algunos diabéticos tienen mononeuritis o mononeuritis múltiple que provoca debilidad en uno o más nervios, o plexopatía lumbosacra o amiotrofia que provoca debilidad en las piernas.
En algunas realizaciones, el método de la presente divulgación también se puede usar en el tratamiento de neuropatías mediadas inmunitariamente. La principal función del sistema inmunitario es proteger el cuerpo contra organismos infecciosos que entran desde el exterior. En algunos casos, sin embargo, el sistema inmunitario se vuelve contra el cuerpo y provoca enfermedad autoinmunitaria. El sistema inmunitario consiste en varios tipos de glóbulos blancos, incluyendo linfocitos T, que también regulan la respuesta inmunitaria; y linfocitos B o células plasmáticas, que secretan proteínas especializadas llamadas "anticuerpos". A veces, por razones desconocidas, el sistema inmunitario ataca erróneamente partes del cuerpo tales como los nervios periféricos. Esta es una neuropatía periférica "autoinmunitaria". Existen varios tipos diferentes, dependiendo de la parte del nervio periférico que sea atacada y del tipo de la reacción inmunitaria. A modo de ejemplo, el método de la presente divulgación es adecuado para tratar el síndrome de Guillain-Barre (GBS). El GBS es una neuropatía aguda debido a que llega repentinamente o rápidamente. El síndrome de Guillain-Barre puede progresar hasta parálisis e insuficiencia respiratoria en días o semanas después del comienzo. La neuropatía se provoca cuando el sistema inmunitario destruye las envueltas de mielina de los nervios motores y sensoriales. A menudo está precedida por infección, vacunación o traumatismo, y se cree que eso es lo que desencadena la reacción autoinmunitaria. La enfermedad es autolimitativa, con recuperación espontánea en de seis a ocho semanas. Pero a menudo la recuperación es incompleta.
Otras enfermedades desmielinizantes periféricas adquiridas que comienzan agudamente, y que se pueden tratar mediante el método de la presente divulgación, incluyen neuropatía motriz aguda, neuropatía sensorial aguda y neuropatía autónoma aguda, en las que existe un ataque inmunitario contra los nervios motores, sensoriales o autónomos, respectivamente. El síndrome de Miller-Fisher es otra variante en la que existe parálisis de la mirada, descoordinación y marcha inestable. Otra enfermedad desmielinizante periférica adquirida más que se puede tratar mediante el método de la presente divulgación es la polineuropatía desmielinizante inflamatoria (CIDP). Se cree que la CIDP es una forma crónica y más indolora del síndrome de Guillain-Barre. La enfermedad progresa bien con ataques repetidos, llamados recaídas, o bien de un modo escalonado o estable. Como en el GBS, parece haber una destrucción de la envuelta de mielina por anticuerpos y linfocitos T. Pero no existe una prueba específica para la CIDP, el diagnóstico se basa en las características clínicas y de laboratorio.
Las polineuropatías crónicas con anticuerpos para los nervios periféricos son otras enfermedades desmielinizantes periféricas más para las que se puede emplear el método de la presente divulgación para el tratamiento. En algunos tipos de neuropatías crónicas, se han identificado anticuerpos para componentes específicos del nervio. Estas incluyen una enfermedad periférica desmielinizante asociada con anticuerpos para la glicoproteína asociada con mielina (MAG), neuropatía motriz asociada con anticuerpos para los gangliósidos GM1 o GDla, y neuropatía sensorial asociada con anticuerpos anti-sulfátido o gangliósido GDlb. En estos casos, los anticuerpos se unen a moléculas similares a oligosacáridos o azúcares, que están conectadas a proteínas (glicoproteínas) o lípidos (glicolípidos o gangliósidos) en los nervios.
El método de la presente divulgación también se puede usar como parte de un plan terapéutico para tratar enfermedades desmielinizantes periféricas asociadas con vasculitis o inflamación de los vasos sanguíneos en nervios periféricos. Una enfermedad desmielinizante periférica también puede estar provocada por vasculitis - una inflamación de los vasos sanguíneos en un nervio periférico. Produce pequeños "ataques" a lo largo del curso de los nervios periféricos, y se puede restringir a los nervios o puede ser generalizada, incluir una erupción cutánea o implicar a otros órganos. Varias enfermedades reumatológicas como artritis reumatoide, lupus, periarteritis nudosa o síndrome de Sjogren están asociadas con vasculitis generalizada, que también puede implicar a los nervios periféricos. La vasculitis puede provocar polineuritis, mononeuritis o mononeuritis múltiple, dependiendo de la distribución y la gravedad de las lesiones.
En algunas realizaciones, el método de la presente divulgación es adecuado para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes periféricas asociadas con gammopatías monoclonales. En la gammopatía monoclonal, clones individuales de células B o células plasmáticas en la médula ósea u órganos linfoides se expanden para formar tumores benignos o malignos y secretan anticuerpos. "Monoclonal" se debe a que hay clones individuales de anticuerpos. Y "gammopatía" indica gammaglobulinas, que es otro nombre para los anticuerpos. En algunos casos, los anticuerpos reaccionan con componentes del nervio; en otros, fragmentos de los anticuerpos forman depósitos amiloideos.
En algunas realizaciones, el método de la presente divulgación es adecuado para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes periféricas asociadas con tumores o neoplasmas. La neuropatía se puede deber a una infiltración directa de nervios por células tumorales o a un efecto indirecto del tumor. La última se denomina neuropatía paraneoplástica. Se han descrito varios tipos. A modo de ejemplo, el método de la presente divulgación se puede usar para manejar una neuropatía sensorial asociada con cáncer de pulmón. Asimismo, el método de la presente divulgación se puede usar para tratar enfermedades desmielinizantes periféricas asociadas con mieloma múltiple. En algunas realizaciones, el método de la presente invención es adecuado para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes periféricas asociadas con macroglobulemia de Waldenstrom, leucemia linfocítica crónica o linfoma de células B. En algunas realizaciones, el método de la presente divulgación se usa como parte del protocolo terapéutico para el tratamiento de pacientes con cánceres en los que una enfermedad desmielinizante periférica es una consecuencia de la irradiación local o está provocada por un agente quimioterapéutico. Agentes quimioterapéuticos que se sabe que provocan neuropatías sensoriales y/o motrices incluyen vincristina, un fármaco antineoplástico usado para tratar enfermedades malignas hematológicas y sarcomas, así como cisplatino, taxol y otros. La neurotoxicidad está relacionada con la dosis, y se exhibe como movilidad intestinal reducida y neuropatía periférica, especialmente en los músculos distales de las manos y los pies, hipotensión postural y atonía de la vejiga urinaria. Problemas similares se han documentado con taxol y cisplatino (MoUman, J. E., 1990, New Eng Jour Med. 322:126-127), aunque la neurotoxicidad relacionada con cisplatino se puede aliviar con factor de crecimiento nervioso (NGF) (Apfel, S. C. y cols, 1992, Annals of Neurology 31:76-80). Aunque la neurotoxicidad es a veces reversible después de la retirada del agente neurotóxico, la recuperación puede ser un proceso muy lento (Legha, S., 1986, Medical Toxicology 1:421-427; Olesen, y cols, 1991, Drug Safety 6:302-314). En algunas realizaciones, el método de la presente divulgación es particularmente adecuado para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes periféricas inducidas por un inhibidor proteasómico tal como bortezomib. El bortezomib, nombre químico: ácido [(lR)-3-metil-1-[[(2S)-1-oxo-3-fenil-2-[(piracinocarboxi)amino]propil]amino]butil]borónico, fue el primero en introducir la aplicación clínica de un inhibidor proteasómico, está aprobado actualmente por la FDA recomendado para el mieloma múltiple (MM) y el linfoma de células del manto.
En algunas realizaciones, el método de la presente divulgación es adecuado para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes periféricas provocadas por infecciones. Las enfermedades desmielinizantes periféricas pueden estar provocadas por una infección de los nervios periféricos. Virus que provocan enfermedades desmielinizantes periféricas incluyen el virus del sida, HIV-I, que provoca neuropatía sensorial lentamente progresiva, citomegalovirus que provoca una neuropatía paralítica rápidamente progresiva, herpes zoster que provoca “culebrilla” y poliovirus que provoca una neuropatía motriz. Las infecciones por hepatitis B o C están asociadas a veces con neuropatía vasculítica. Infecciones bacterianas que provocan neuropatía incluyen lepra, que provoca una neuropatía sensorial parcheada, y difteria, que puede provocar una neuropatía paralítica rápidamente progresiva. Otras enfermedades infecciosas que provocan neuropatía incluyen enfermedad de Lyme que está provocada por espiroquetas, y tripanosomiasis que está provocada por un parásito. Ambas se presentan comúnmente con una neuropatía multifocal.
En algunas realizaciones, el método de la presente divulgación es adecuado para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes periféricas provocadas por desequilibrio nutricional. Las deficiencias de vitaminas B12, B1 (tiamina), B6 (piridoxina) o E, por ejemplo, pueden producir polineuropatías con degeneración de axones de nervios periféricos. Esto se puede deber a una dieta pobre o una incapacidad para absorber los nutrientes desde el estómago o el intestino. Por otra parte, las megadosis de vitamina B6 también pueden provocar una enfermedad desmielinizante periférica, y el método de la presente divulgación se puede usar en estos casos como parte de un programa de destoxificación.
En algunas realizaciones, el método de la presente divulgación es adecuado para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes periféricas que surgen en nefropatías. La insuficiencia renal crónica puede provocar una neuropatía periférica predominantemente sensorial con degeneración de axones de nervios periféricos.
En algunas realizaciones, el método de la presente divulgación es adecuado para el tratamiento de neuropatías hipotiroideas. El hipotiroidismo está asociado a veces con una polineuropatía sensorial dolorosa con degeneración axonal. También se puede producir mononeuropatía o mononeuropatía múltiple debido a la compresión de los nervios periféricos por tejidos hinchados.
En algunas realizaciones, el método de la presente divulgación es adecuado para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes periféricas provocadas por alcohol y toxinas. Ciertas toxinas pueden provocar neuropatía periférica. La toxicidad por plomo está asociada con una neuropatía motriz; el arsénico o el mercurio provocan una neuropatía sensorial, el talio puede provocar una neuropatía sensorial y autónoma, varios de los disolventes orgánicos e insecticidas también pueden provocar polineuropatía. El alcohol es directamente tóxico para los nervios y el abuso del alcohol es una causa principal de neuropatía. El método de la presente divulgación se puede usar, en algunas realizaciones, como parte de un programa de destoxificación más amplio. En otra realización más, el método de la presente divulgación se puede usar para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes periféricas provocadas por fármacos. Se sabe que varios fármacos provocan neuropatía. Incluyen, entre otros, nitrofurantoína, que se usa en la pielonefritis, amiodarona en arritmias cardíacas, disulfiram en el alcoholismo, ddC en ddl en sida y dapsona que se usa para tratar la lepra. Como anteriormente, se puede usar el método de la presente divulgación, en algunas realizaciones, como parte de un programa de destoxificación más amplio.
En algunas realizaciones, el método de la presente divulgación es adecuado para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes periféricas provocadas por traumatismo o compresión. Las neuropatías localizadas pueden resultar de compresión de nervios por presión externa o superposición de tendones y otros tejidos. La más conocida de estas es el síndrome del túnel carpiano que resulta de compresión en la muñeca, y radiculopatías cervicales o lumbares (ciática) que resultan de la compresión de las raíces nerviosas cuando salen de la columna vertebral. Otras zonas comunes de compresión nerviosa incluyen codos, axilas y la parte posterior de las rodillas.
El método de la presente divulgación también es útil en una variedad de enfermedades desmielinizantes periféricas idiopáticas. El término "idiopático" se usa siempre que no se pueda encontrar la causa de la enfermedad desmielinizante periférica. En estos casos, la enfermedad desmielinizante periférica se clasifica según sus manifestaciones, es decir polineuropatía idiopática sensorial, motriz o sensomotriz.
Según se usa en la presente, la expresión "polinucleótido de interés" indica en la presente cualquier secuencia nucleotídica que codifique cualquier polipéptido, proteína estructural, enzima, etc., cuya expresión se desea en una célula diana, por cualquier tipo de razón. También puede indicar una secuencia no codificante, por ejemplo, una secuencia antisentido o la secuencia de un ARN interferente destinado a disminuir la expresión de un gen. Un experto en la técnica sabe, por su conocimiento de la bibliografía científica en este campo, que son los polinucleótidos los que pueden ser más apropiados para tratar una enfermedad específica que afecte al sistema nervioso periférico. La terapia génica del sistema nervioso periférico con los vectores de AAV9 de la presente divulgación se puede realizar, p. ej., bien al introducir en células de Schwann una copia funcional de un polinucleótido de interés (p. ej. un gen) que es deficiente en las mismas (terapia de sustitución génica), o bien al aportar a células de Schwann un polinucleótido de interés que tendrá un efecto beneficioso sobre la enfermedad que se vaya a tratar (terapia sintomática). En particular, el producto polinucleotídico conduce a la expresión de un polipéptido que potenciará la función de células diana (p. ej. células de Schwann). Ejemplos de polinucleótidos de interés que se pueden usar para la terapia de sustitución génica son genes que son expresados específicamente o preferentemente por células de Schwann deficientes. En algunas realizaciones, el polinucleótido de interés puede codificar un factor neurotrófico. Según se usa en la presente, el "factor neurotrófico" es un término genérico de proteínas que tienen una acción fisiológica tal como la supervivencia y el mantenimiento de células nerviosas, la promoción de la diferenciación neuronal. Ejemplos de factores neurotróficos incluyen, pero no se limitan a bFGF, aFGF, BDNF, CNTF, IL-1beta, NT-3, IGF-II, GDNF y NGF. En algunas realizaciones, el polinucleótido de interés codifica un mutante negativo dominante. Un mutante negativo dominante es un polipéptido o un ácido nucleico que codifica una secuencia de la región codificante que se ha cambiado con respecto a al menos una posición de la secuencia, con relación a la correspondiente versión natural silvestre, en una posición que cambia una posición de un residuo de aminoácido en un sitio activo requerido para la actividad biológica del polipéptido natural. Por ejemplo, un mutante negativo dominante puede consistir en un polipéptido truncado que puede actuar como un inhibidor competitivo del polipéptido natural. En algunas realizaciones, el producto polinucleotídico de interés es una endonucleasa sitioespecífica que proporciona una reducción sitioespecífica de la función génica, p. ej., cuando la endonucleasa inactiva un alelo asociado con una enfermedad de los nervios periféricos. Por ejemplo, cuando un alelo dominante codifica una copia defectuosa de un gen que, cuando es silvestre, es una proteína de mielina y/o proporciona una función normal de las células de Schwann, una endonucleasa sitioespecífica (tal como nucleasas TALE, meganucleasas, nucleasas del dedo de cinc y construcciones CRISPR/CAs9) se puede dirigir al alelo defectuoso e inactivar el alelo defectuoso. Además de inactivar un alelo defectuoso, una nucleasa sitioespecífica también se puede usar para estimular la recombinación homóloga con un ADN donante que codifica una copia funcional de la proteína codificada por el alelo defectuoso. Así, por ejemplo, el método de la divulgación tanto se puede usar para aportar una endonucleasa sitioespecífica que inactiva un alelo defectuoso, como se puede usar para aportar una copia funcional del alelo defectuoso, dando como resultado la reparación del alelo defectuoso, proporcionando de ese modo la producción de una proteína funcional. En algunas realizaciones, el vector comprende un polinucleótido que codifica una endonucleasa sitioespecífica; y un polinucleótido que codifica una copia funcional de un alelo defectuoso, donde la copia funcional codifica una proteína funcional. Endonucleasas sitioespecíficas que son adecuadas para el uso incluyen, p. ej., nucleasas del dedo de cinc (ZFNs); y nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALENs), donde estas endonucleasas sitioespecíficas no están presentes en la naturaleza y están modificadas para dirigirse a un gen específico. Estas nucleasas sitioespecíficas se pueden manipular para cortar posiciones específicas dentro de un genoma, y la ligación de extremos no homólogos puede reparar a continuación la rotura mientras se insertan o eliminan varios nucleótidos. A continuación, estas endonucleasas sitioespecíficas (también denominadas "INDELs") expulsan la proteína del marco e inactivan eficazmente el gen. Véase, p. ej., la Publicación de Patente de EE. UU. N° 2011/0301073. En algunas realizaciones, el polinucleótido de interés es una construcción oligonucleotídica antisentido. Los oligonucleótidos antisentido, incluyendo moléculas de ARN antisentido y moléculas de ADN antisentido, actuarían para bloquear directamente la traducción del ARNm elegido como diana al unirse al mismo y así evitan la traducción de proteína o incrementan la degradación de ARNm, disminuyendo así el nivel de la proteína elegida como diana, y así la actividad, en una célula. En algunas realizaciones, el polinucleótido de interés es un ARNsi. Los ARNs inhibidores pequeños (ARNsis) también pueden funcionar como inhibidores de la expresión génica para el uso en la presente divulgación. La expresión génica se puede reducir al poner en contacto el tumor, el sujeto o la célula con un ARN bicatenario pequeño (ARNds), o un vector o una construcción que provoque la producción de un ARN bicatenario pequeño, de modo que la expresión se inhiba específicamente (es decir, interferencia de ARN o iARN). En algunas realizaciones, el polinucleótido de interés es una ribozima. Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar la segmentación específica de ARN. El mecanismo de acción de la ribozima implica la hibridación específica de secuencia de la molécula de ribozima a ARN diana complementario, seguido por segmentación endonucleolítica. De ese modo, moléculas de ribozima del motivo de horquilla o cabeza de martillo manipuladas que catalizan específicamente y eficazmente la segmentación endonucleolítica de las secuencias de ARNm elegidas como diana son útiles dentro del alcance de la presente divulgación. Sitios de segmentación de ribozima específicos dentro de cualquier diana de ARN potencial son identificados inicialmente al barrer la molécula diana con respecto a sitios de segmentación de ribozima, que incluyen típicamente las siguientes secuencias, GUA, GUU y GUC. Una vez identificadas, secuencias de ARN cortas de entre aproximadamente 15 y 20 ribonucleótidos correspondientes a la región del gen diana que contiene el sitio de segmentación se pueden evaluar con respecto a características estructurales predichas, tales como una estructura secundaria, que pueden hacer inadecuada la secuencia oligonucleotídica. La idoneidad de posibles dianas también se puede evaluar al probar su accesibilidad a la hibridación con oligonucleótidos complementarios, usando, p. ej., ensayos de protección de ribonucleasas. En algunas realizaciones, el polinucleótido de interés es un antagomir. Según se usa en la presente, un "antagomir" es un oligómero de ácido nucleico que está diseñado para unirse a un microARN diana específico a través de apareamiento de bases complementarias (por ejemplo, según se describe anteriormente). Un antagomir puede tener una secuencia que sea totalmente o parcialmente complementaria a la secuencia del microARN diana. Los antagomirs pueden tener una estructura monocatenaria, bicatenaria, parcialmente bicatenaria o de horquilla. Los antagomirs pueden comprender además nucleótidos químicamente modificados (p. ej. según se describe posteriormente). En algunas realizaciones, el polinucleótido de interés es una esponja de microARN. Según se usa en la presente, el término "esponja de microARN" es un ácido nucleico que comprende múltiples (p. ej. al menos 2, 3, 4, 5 o 6) sitios de unión para un microARN diana específico. Así, una esponja de microARN es capaz de unirse a y secuestrar múltiples moléculas de microRNA diana. Una esponja de microARN puede comprender un ARNm expresado a partir de un vector (p. ej. un vector viral o vector plasmídico). La presencia en una esponja de microARN de múltiples sitios de unión para el microARN diana permite que los microARNs sean adsorbidos de un modo análogo a una esponja que se empape de agua. Una esponja de microARN se puede unir a microARNs diana a través de apareamiento de bases complementarias (por ejemplo, según se describe anteriormente).
Según se usa en la presente, el término "vector de AAV9" tiene sus significados generales en la técnica y se refiere a un vector derivado de un serotipo 9 de virus adenoasociado. En particular, el término "AAV9", según se usa en la presente, se refiere a un serotipo de virus adenoasociado con una secuencia genómica como la definida en el número de registro del GenBank AAS99264. El vector de AAV9 de la presente divulgación puede tener uno o más de los genes silvestres de AAV9 eliminados en todo o en parte, preferiblemente los genes rep y/o cap, pero retener secuencias de ITR de flanqueo funcionales. Las secuencias de ITR funcionales son necesarias para el rescate, la replicación y el empaquetamiento del virión de AAV. Así, un vector de AAV9 se define en la presente para incluir al menos las secuencias requeridas en cis para la replicación y el empaquetamiento (p. ej., ITRs funcionales) del virus. Las ITRs no necesitan ser las secuencias nucleotídicas silvestres y se pueden alterar, p. ej. mediante inserción, eliminación o sustitución de nucleótidos, con la condición de que las secuencias proporcionen rescate funcional, replicación y empaquetamiento. Los vectores de expresión de AAV9 se construyen usando técnicas conocidas para al menos proporcionar, como componentes ligados operativamente en la dirección de transcripción, elementos de control incluyendo una región de inicio de la transcripción, el polinucleótido de interés y una región de terminación de la transcripción. Los elementos de control se seleccionan para ser funcionales en una célula de mamífero. La construcción resultante que contiene los componentes ligados operativamente está unida (5' y 3') con secuencias de ITR de AAV9 funcionales. Por "repeticiones terminales invertidas de virus adenoasociado" o "ITRs de AAV9" se entiende las regiones reconocidas en la técnica encontradas en cada extremo del genoma del AAV que funcionan conjuntamente en cis como orígenes de replicación de ADN y como señales de empaquetamiento para el virus. Las ITRs de AAV9, junto con la región codificante rep de AAV9, proporcionan la escisión y el rescate de, y la integración de una secuencia nucleotídica interpuesta entre, dos ITRs de flanqueo en un genoma de células de mamífero.
El vector de AAV9 de la presente divulgación se puede construir al insertar directamente la secuencia o las secuencias seleccionadas en un genoma de AAV9 que tiene los marcos de lectura abiertos ("ORFs") de AAV9 principales escindidos del mismo. Otras porciones del genoma de AAV9 también se pueden eliminar, con la condición de que permanezca una porción suficiente de las ITRs para permitir las funciones de replicación y empaquetamiento. Estas construcciones se pueden diseñar usando técnicas bien conocidas en la técnica. Véanse, p. ej., las Patentes de EE. UU. N° 5.173.414 y 5.139.941; las Publicaciones Internacionales N° WO 92/01070 (publicada el 23 de enero de 1992) y WO 93/03769 (publicada el 4 de marzo de 1993); Lebkowski y cols., 1988 ; Vincent y cols., 1990; Carter, 1992 ; Muzyczka, 1992 ; Kotin,1994; Shelling and Smith, 1994; y Zhou y cols., 1994. Alternativamente, las ITRs de AAV se pueden escindir del genoma viral o de un vector AAV que contiene las mismas y fusionarse 5' y 3' de una construcción de ácido nucleico seleccionada que esté presente en otro vector usando técnicas de ligación estándar. Vectores de AAV9 que contienen ITRs se han descrito, p. ej., en la Patente de EE. UU. n° 5.139.941. En particular, se describen en la misma varios vectores de AAV que están disponibles de the American Type Culture Collection ("ATCC") bajo los Números de Registro 53222, 53223, 53224, 53225 y 53226. Adicionalmente, se pueden producir sintéticamente genes quiméricos para incluir secuencias de ITR de AAV9 dispuestas 5' y 3' de una o más secuencias de ácido nucleico seleccionadas. Se pueden usar codones preferidos para la expresión de la secuencia del gen quimérico en células del PNS de mamífero. La secuencia quimérica completa se ensambla a partir de oligonucleótidos solapados preparados mediante métodos estándar. Véanse, p. ej., Edge, 1981; Nambair y cols., 1984 ; Jay y cols., 1984. A fin de producir viriones de AAV, un vector de expresión de AAV se introduce en una célula hospedadora adecuada usando técnicas bien conocidas, tales como transfección. Un número de técnicas de transfección se conoce generalmente en la técnica. Véanse, p. ej. , Graham y cols., 1973; Sambrook y cols. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, Davis y cols. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, y Chu y cols., 1981. Métodos de transfección particularmente adecuados incluyen coprecipitación con fosfato cálcico (Graham y cols., 1973), microinyección directa en células cultivadas (Capecchi, 1980), electroporación (Shigekawa y cols., 1988), trasferencia génica mediada por liposomas (Mannino y cols., 1988), transducción mediada por lípidos (Feigner y cols., 1987) y aporte de ácidos nucleicos usando microproyectiles de alta velocidad (Klein y cols., 1987).
Típicamente, el vector de AAV9 de la presente divulgación comprende un casete de expresión. El término "casete de expresión", según se usa en la presente, se refiere a una construcción de ácido nucleico que comprende elementos de ácido nucleico suficientes para la expresión del polinucleótido de interés. Típicamente, un casete de expresión comprende el polinucleótido de interés ligado operativamente a una secuencia promotora. El término "ligado operativamente" se refiere a la asociación de dos o más fragmentos de ácido nucleico sobre un solo fragmento de ácido nucleico de modo que la función de uno se vea afectada por el otro. Por ejemplo, un promotor está ligado operativamente con una secuencia codificante cuando sea capaz de afectar a la expresión de esa secuencia codificante (p. ej., la secuencia codificante está bajo el control de la transcripción del promotor). Las secuencias codificantes pueden estar ligadas operativamente a secuencias reguladoras en la orientación de sentido o antisentido. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor heterólogo. El término "promotor heterólogo", según se usa en la presente, se refiere a un promotor que no se encuentra en la naturaleza que esté ligado operativamente a una secuencia codificante dada. En algunas realizaciones, un casete de expresión puede comprender elementos adicionales, por ejemplo, un intrón, un potenciador, un sitio de poliadenilación, un elemento de respuesta de marmota canadiense (WRE), y/u otros elementos que se sabe que afectan a los niveles de expresión de la secuencia codificante. Según se usa en la presente, el término "promotor", según se usa en la presente, se refiere a una secuencia nucleotídica capaz de controlar la expresión de una secuencia codificante o ARN funcional. En general, el polinucleótido de interés está situado 3' de una secuencia promotora. En algunas realizaciones, una secuencia promotora consiste en elementos aguas arriba proximales y más distales y puede comprender un elemento potenciador. Un "potenciador" es una secuencia nucleotídica que puede estimular la actividad promotora y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para potenciar el nivel de especificidad tisular de un promotor. En algunas realizaciones, el promotor se deriva en su totalidad de un gen natural. En algunas realizaciones, el promotor está compuesto por diferentes elementos derivados de diferentes promotores presentes en la naturaleza. En algunas realizaciones, el promotor comprende una secuencia nucleotídica sintética. Se entenderá por los expertos en la técnica que diferentes promotores dirigirán la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de células, o en diferentes fases de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales o a la presencia o ausencia de un fármaco o cofactor de transcripción. Los promotores ubicuos, específicos del tipo de célula, específicos del tejido, específicos de la fase de desarrollo y condicionales, por ejemplo, promotores sensibles a fármacos (p. ej. promotores sensibles a tetraciclina) son muy conocidos por los expertos en la técnica. Ejemplos de promotor incluyen, pero no se limitan a, el promotor de fosfoglicerato cinasa (PKG), promotores de CAG, NSE (enolasa específica neuronal), sinapsina o NeuN, el promotor temprano de SV40, promotor de LTR del virus de tumor mamario de ratón; promotor tardío principal de adenovirus (Ad MLP); un promotor del virus del herpes simple (HSV), un promotor de citomegalovirus (CMV) tal como la región promotora temprana inmediata de CMV (CMVIE), promotor de SFFV, promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV), promotores sintéticos, promotores híbridos, y similares. Los promotores pueden ser de origen humano o de otras especies, incluyendo de ratón. Además, también encontrarán uso en la presente secuencias derivadas de genes no virales, tales como el gen de metalotioneína murino. Estas secuencias promotoras están disponibles comercialmente de, p. ej., Stratagene (San Diego, CA). En algunas realizaciones, el casete de expresión comprende una secuencia de señal secretora apropiada que permitirá la secreción del polipéptido codificado por el polinucleótido de interés. Según se usa en la presente, el término "secuencia de señal secretora" o sus variaciones están destinados a referirse a secuencias de aminoácidos que funcionan para potenciar (según se define anteriormente) la secreción de un polipéptido ligado operativamente desde la célula en comparación con el nivel de secreción observado con el polipéptido natural. Según se define anteriormente, por secreción "potenciada", se entiende que se incrementa la proporción relativa del polipéptido sintetizado por la célula que se secreta desde la célula; no es necesario que también se incremente la cantidad absoluta de proteína secretada. En algunas realizaciones, se secreta esencialmente todo (es decir, al menos 95%, 97%, 98%, 99% o más) el polipéptido. Sin embargo, no es necesario que se secrete todo ni incluso la mayoría del polipéptido, con la condición de que el nivel de secreción se potencie en comparación con el polipéptido natural. Generalmente, las secuencias de señal secretoras se segmentan dentro del retículo endoplásmico y, en algunas realizaciones, la secuencia de señal secretora se segmenta antes de la secreción. Sin embargo, no es necesario que la secuencia de señal secretora se segmente con la condición de que la secreción del polipéptido desde la célula se potencie y el polipéptido sea funcional. Así, en algunas realizaciones, la secuencia de señal secretora se retiene parcial o totalmente. La secuencia de señal secretora se puede derivar en todo o en parte de la señal secretora de un polipéptido secretado (es decir, del precursor) y/o puede ser en todo o en parte sintética. La longitud de la secuencia de señal secretora no es crítica; generalmente, las secuencias de señal secretoras conocidas tienen una longitud de aproximadamente 10-15 a 50-60 aminoácidos. Además, las señales secretoras conocidas procedentes de polipéptidos secretados se pueden alterar o modificar (p. ej., mediante sustitución, eliminación, truncamiento o inserción de aminoácidos) con la condición de que la secuencia de señal secretora resultante funcione para potenciar la secreción de un polipéptido ligado operativamente. Las secuencias de señal secretoras de la divulgación pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de señal secretora presente en la naturaleza o una de sus modificaciones (como las descritas anteriormente). Numerosas proteínas secretadas y secuencias que dirigen la secreción desde la célula son conocidas en la técnica. La secuencia de señal secretora de la divulgación puede ser además en todo o en parte sintética o artificial. Péptidos de señal secretores sintéticos o artificiales son conocidos en la técnica, véase, p. ej., Barash y cols., "Human secretory signal peptide description by hidden Markov model and generation of a strong artificial signal peptide for secreted protein expression," Biochem. Biophys. Res. Comm. 294:835-42 (2002).
La administración del vector de la divulgación se puede realizar mediante inyección directa en el nervio. Las dosis de vectores se pueden adaptar dependiendo del estado patológico, el sujeto (por ejemplo, según su peso, metabolismo, etc.), el esquema de tratamiento, etc. Una dosis eficaz preferida dentro del contexto de esta divulgación es una dosis que permita una transducción óptima de las células de Schwann. Típicamente, se administran de 108 a 1010 genomas virales (vg) por dosis en ratones. Típicamente, las dosis de vectores de AAV9 que se van a administrar en seres humanos pueden variar de 1010 a 1012 vg.
El vector de AVV9 de la presente divulgación se puede formular en composiciones farmacéuticas. Estas composiciones pueden comprender, además del vector, un excipiente, portador, tampón, estabilizante u otros materiales, farmacéuticamente aceptables, u otros materiales bien conocidos por los expertos en la técnica. Estos materiales deben ser atóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo (es decir el vector de la divulgación). La naturaleza precisa del portador u otro material puede ser determinada por el experto según la vía de administración. La composición farmacéutica está típicamente en forma líquida. Las composiciones farmacéuticas líquidas incluyen generalmente un portador líquido tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, un aceite mineral o un aceite sintético. Se pueden incluir solución salina fisiológica, cloruro magnésico, solución de dextrosa u otro sacárido o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Para inyección, el ingrediente activo estará en la forma de una solución acuosa, que esté libre de pirógenos y tenga pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Aquellos con experiencia pertinente en la técnica serán perfectamente capaces de preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro sódico, inyección de Ringer, inyección de Ringer con lactato. Se pueden incluir conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, según se requiera. Para una liberación retardada, el vector se puede incluir en una composición farmacéutica, que se formula para una liberación lenta, tal como en microcápsulas formadas por polímeros biocompatibles o en sistemas portadores liposómicos según métodos conocidos en la técnica.
La invención se ilustrará adicionalmente mediante las figuras y los ejemplos siguientes. Sin embargo, no se debe interpretar de ningún modo que estos ejemplos y figuras limiten el alcance de la presente invención.
FIGURAS:
Figura 1: Análisis por criosección sobre nervios ciáticos de ratones adultos embebidos en OCT que muestra el perfil de transducción de nervios ciáticos inyectados con AAV. El nervio ciático entero se representa en el primer carril, la ampliación a 20 aumentos se representa en el segundo carril.
Figura 2: Porcentaje de células de Schwann mielinizantes transducidas entre todas las células de Schwann mielinizantes a lo largo del nervió ciático de PNH inyectado con AAV9. Los análisis se realizaron sobre secciones de nervio ciático embebidas en OCT y parafina.
EJEMPLO 1: INYECCIÓN INTRACIÁTICA EN RATONES ADULTOS
Métodos:
La metodología de inyección se describe en la siguiente publicación (González y cols., 2014) con los parámetros posteriores. Brevemente, los ratones se anestesiaron con isoflurano y se mantuvieron bajo isoflurano durante la cirugía. Se realizó una incisión con un bisturí en el muslo medio; el nervio ciático se levantó con una espátula y se expuso. Los vectores se coinyectaron en el nervio ciático con Fast green (concentración final 0,005%) a través de agujas de vidrio, con un ángulo agudo de <45° con la superficie del nervio, conectadas a un microinyector ligado a un generador de impulsos. El capilar permanecía en su lugar en el punto de inyección durante 1 min adicional, antes de que se retirara lentamente. Los parámetros de inyección se listan en la tabla posterior.
Tabla 1: parámetros de inyección en ratones adultos
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Resultados
Para explorar la capacidad de un vector de AAV para transducir axones o células de Schwann, los presentes inventores realizaron un análisis de aislamiento sobre nervios ciáticos inyectados (tres nervios inyectados por vector). Así, entre las células transducidas, los presentes inventores determinaron el porcentaje de células de Schwann mielinizantes transducidas, células de Schwann no mileinizantes y axones (Tabla 2).
Tabla 2: Análisis de aislamiento de nervios ciáticos de ratones inyectados con AAV que muestra la capacidad del vector de AAV para transducir axones o células de Schwann. Los resultados se presentan como un porcentaje de axones o células de Schwann mielinizantes o células de Schwann no mielinizantes transducidos entre todas las células transducidas.
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AAV9 transducía casi exclusivamente células de Schwann mielinizantes (97%), muy pocas células de Schwann no mielinizantes (3%) y ningún axón. AAVrh10 muestra un perfil de transducción ligeramente diferente con una fuerte proporción de células de Schwann mielinizantes (82%), muy pocas células de Schwann no mielinizantes (4%) y algunos axones (14%)
En paralelo al análisis de aislamiento, se realizaron secciones en corona de nervios ciáticos embebidos en OCT (cuatro nervios ciáticos inyectados por vector). El perfil de transducción obtenido para cada vector en una sección en corona entera del nervio ciático en el punto de inyección se describe en la Figura 1. AAV9 exhibía claramente un grado de transducción superior que AAVrh10. Para determinar los tipos de células transducidas, secciones en corona del nervio ciático se tiñeron con respecto a MBP, un marcador de células de Schwann mielinizantes, o con respecto a TUJ1, un marcador de células axonales. Los presentes inventores encontraron que la expresión de AAV9 y AAVrh10 se detectaba principalmente en células de Schwann mielinizantes. En el punto de inyección, se contó hasta 93% de células de Schwann mielinizantes positivas con AAV9, mientras que solo 51% con AAVrh10. Por otra parte, a lo largo del nervio ciático, AAV9 exhibía una difusión mejor que AAVrh10, con, respectivamente, 63 y 42% en 1 cm proximal al punto de inyección, 91 y 42% en 1 cm distal al punto de inyección (Tabla 3).
Tabla 3: Porcentaje de células de Schwann mielinizantes transducidas entre todas las células de Schwann mielinizantes a lo largo de los nervios ciáticos de ratones inyectados con AAV.
Figure imgf000011_0003
Por otra parte, se evaluó una copia del genoma del vector (VGC) a partir de todo el nervio ciático para cada grupo de ratones adultos inyectados (tres ratones por vector). En primer lugar, se realizó extracción de ADN gracias al DNA blood and tissue kit (Qiagen) al seguir las instrucciones del fabricante. A continuación, se realizó qPCR usando dos cebadores diferentes, uno contra el transgén eGFP y uno contra la secuencia de ITR. Los resultados se presentan en la tabla 4.
Tabla 4: VGC evaluada mediante qPCR sobre ADN extraído del nervio ciático entero usando bien cebadores contra el transgén eGFP o bien cebadores contra la secuencia de ITR.
Figure imgf000011_0002
Los resultados mostraban la capacidad del vector de AAV para transducir nervio ciático de ratón con un patrón aproximadamente similar para AAV9 y AAVrh10 con una VGC alrededor de 0,5.
EJEMPLO 2: INYECCIÓN INTRACIÁTICA SOBRE CRÍAS DE RATÓN (P3-P4)
Métodos:
Se usó la misma metodología de inyección descrita en el ejemplo 1 con los siguientes parámetros (Tabla 5):
Tabla 5: parámetros de inyección en crías de ratón
Figure imgf000011_0001
Resultados
Para explorar la capacidad de un vector de AAV para transducir axones o células de Schwann, los presentes inventores realizaron un análisis de aislamiento sobre nervios ciáticos inyectados (tres crías de ratón). Los resultados de aislamientos se presentan en la Tabla 6.
Tabla 6: Análisis de aislamiento de nervios ciáticos de ratones inyectados con AAV que muestra la capacidad del vector de AAV para transducir axones o células de Schwann. Los resultados se presentan como un porcentaje de axones o células de Schwann mielinizantes o células de Schwann no mielinizantes transducidos entre todas las células transducidas.
Figure imgf000012_0002
En crías de ratón, AAV9 transducía casi exclusivamente células de Schwann mielinizantes (87%), pocas células de Schwann no mielinizantes (14%) y muy pocos axones (2%).
En paralelo al análisis de aislamiento, se realizaron secciones en corona de nervios ciáticos embebidos en OCT (tres ratones inyectados), según se describe en el ejemplo 1. En el punto de inyección, se contó hasta 84% de células de Schwann mielinizantes positivas. A 1 cm proximal al punto de inyección, se transducía 74% de células de Schwann mielinizantes y a 1 cm distal al punto de inyección, se transducía 74% de células de Schwann mielinizantes (Tabla 7).
Tabla 7 Porcentaje de células de Schwann mielinizantes transducidas entre todas las células de Schwann mielinizantes a lo largo de los nervios ciáticos de crías de ratón inyectadas con AAV.
Figure imgf000012_0003
EJEMPLO 3: INYECCIÓN INTRACIÁTICA EN RATAS
Métodos:
Se usó la misma metodología de inyección descrita anteriormente con los siguientes parámetros (Tabla 8):
Tabla 8: parámetros de inyección en ratas
Figure imgf000012_0001
Resultados
Se realizaron un análisis de aislamiento (tres ratas inyectadas) y secciones en corona de nervios ciáticos embebidos en OCT (tres ratas inyectadas). Los resultados se presentan posteriormente (Tabla 9).
Tabla 9: Análisis de aislamiento de nervios ciáticos de ratones inyectados con AAV que muestra la capacidad del vector de AAV para transducir axones o células de Schwann. Los resultados se presentan como un porcentaje de axones o células de Schwann mielinizantes o células de Schwann no mielinizantes transducidos entre todas las células transducidas.
Figure imgf000013_0002
En ratas, AAV9 transducía casi exclusivamente células de Schwann mielinizantes (89%), muy pocas células de Schwann no mielinizantes (7%) y muy pocos axones (4%).
En paralelo al análisis de aislamiento, se realizaron secciones en corona de nervios ciáticos embebidos en OCT (tres ratas inyectadas), según se describe anteriormente. A lo largo del nervio, se transducía hasta 80% de células de Schwann mielinizantes (Tabla 10).
Tabla 10: Porcentaje de células de Schwann mielinizantes transducidas entre todas las células de Schwann mielinizantes a lo largo de los nervios ciáticos de rata inyectados con AAV.
Figure imgf000013_0003
EJEMPLO 4: INYECCIÓN INTRACIÁTICA EN PRIMATE NO HUMANO (NHP)
Métodos
NHP anestesiados se pusieron en una posición de decúbito ventral. Después de la exposición del nervio ciático, el vector se coinyectó con Fast green (concentración final 0,005%) en el nervio tibial izquierdo 1 cm por encima de la bifurcación entre el nervio peroneal común y el nervio tibial. En primer lugar, una aguja de calibre 22 se inserta en el epineuro (4 mm) y continuación un capilar de sílice, que contiene el vector y conectado a una microbomba, se arrastra a través de la aguja. El capilar permanecía en su lugar en el punto de inyección durante 1 -2 min adicionales, antes de que se retirara lentamente. Los parámetros de inyección se listan en la tabla posterior (Tabla 11).
Tabla 11: Parámetros de inyección en primate no humano
Figure imgf000013_0001
Resultados:
De forma similar a los ratones inyectados con AAV, los presentes inventores analizaron el perfil de transducción y los tipos de células transducidas. La inmunotinción sobre secciones en corona de nervio ciático embebido en OCT mostraba que la expresión conducida por AAV9 se observaba exclusivamente en células de Schwann mielinizantes y no en axones (Figura 2). En NHP, solo se transducen las células de Schwann mielinizantes y no se transducen los axones. La expresión de GFP de AAV9 se detectó a lo largo del nervio ciático en una distancia total de 5,5 cm, más precisamente 3,5 cm proximales al punto de inyección y 1,5 cm distales a la inyección con, respectivamente, 20 y 70% de células de Schwann mielinizantes transducidas (Figura 2). Hasta 70% de células de Schwann mielinizantes positivas se encontraban en el punto de inyección. Este porcentaje disminuía con la distancia proximal desde el punto de inyección y era constante hasta 1,5 cm distales al punto de inyección (Figura 2). Estos resultados se confirmaron mediante secciones de nervio ciático embebidas en parafina
Conclusión
La inyección intraciática de AAV9 en ratones (crías y adultos), ratas y primate no humano mostraba un fuerte grado de transducción de células de Schwann mielinizantes con una buena difusión del vector, nunca obtenido ni descrito en la bibliografía hasta ahora. Estos resultados destacan que el vector de AAV9 podría representar una herramienta terapéutica útil para expresar proteínas mutadas o desreguladas en células de Schwann mielinizantes en patologías que afectan al sistema nervioso periférico.
REFERENCIAS:
A lo largo de esta solicitud, diversas referencias describen el estado de la técnica a la que pertenece esta invención.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un vector de AAV9 que contiene un polinucleótido de interés para el uso en un método de tratamiento de una enfermedad desmielinizante periférica en un sujeto que lo necesite, en donde el método comprende una etapa de transducción de células de Schwann mielinizantes del sujeto con dicho vector de AAV9 que contiene el polinucleótido de interés, en donde el polinucleótido de interés está ligado operativamente a una secuencia promotora y en donde la administración del vector se realiza mediante inyección directa en el nervio.
2. El vector de AAV9 que contiene un polinucleótido de interés para el uso según la reivindicación 1, en donde la enfermedad desmielinizante periférica se selecciona del grupo que consiste en enfermedades desmielinizantes periféricas hereditarias y enfermedades desmielinizantes periféricas adquiridas.
3. El vector de AAV9 que contiene un polinucleótido de interés para el uso según la reivindicación 1, en donde la enfermedad desmielinizante periférica se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Refsum, abetalipoproteinemia, enfermedad de Tangier, enfermedad de Krabbe, leucodistrofia metacromática, enfermedad de Fabry, síndrome de Dejerine-Sottas y enfermedades de Charcot-Marie-Tooth.
4. El vector de AAV9 que contiene un polinucleótido de interés para el uso según la reivindicación 1, en donde la enfermedad desmielinizante periférica se selecciona del grupo que consiste en neuropatías diabéticas, neuropatías mediadas inmunitariamente, neuropatía motriz aguda, neuropatía sensorial aguda y neuropatía autónoma aguda, polineuropatías crónicas, enfermedades desmielinizantes periféricas asociadas con vasculitis o inflamación de los vasos sanguíneos en nervios periféricos, enfermedades desmielinizantes periféricas asociadas con gammopatías monoclonales, enfermedades desmielinizantes periféricas asociadas con tumores o neoplasmas, enfermedades desmielinizantes periféricas provocadas por infecciones, enfermedades desmielinizantes periféricas provocadas por desequilibrio nutricional, enfermedades desmielinizantes periféricas que surgen en nefropatías, neuropatías hipotiroideas, enfermedades desmielinizantes periféricas provocadas por alcohol y toxinas, enfermedades desmielinizantes periféricas provocadas por traumatismo o compresión y enfermedades desmielinizantes periféricas idiopáticas.
5. El vector de AAV9 que contiene un polinucleótido de interés para el uso según la reivindicación 1, en donde el producto polinucleotídico conduce a la expresión de un polipéptido que potenciará la función de células de Schwann.
6. El vector de AAV9 que contiene un polinucleótido de interés para el uso según la reivindicación 1, en donde el polinucleótido de interés codifica un factor neurotrófico.
7. El vector de AAV9 que contiene un polinucleótido de interés para el uso según la reivindicación 1, en donde el polinucleótido de interés codifica un mutante negativo dominante.
8. El vector de AAV9 que contiene un polinucleótido de interés para el uso según la reivindicación 1, en donde el producto polinucleotídico de interés es una endonucleasa sitioespecífica que proporciona la reducción de una función génica.
9. El vector de AAV9 que contiene un polinucleótido de interés para el uso según la reivindicación 1, en donde el polinucleótido de interés es una construcción oligonucleotídica antisentido.
10. El vector de AAV9 que contiene un polinucleótido de interés para el uso según la reivindicación 1, en donde el polinucleótido de interés es un ARNsi.
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