ES2951945T3 - Vectores para el tratamiento de ataxia de Friedreich - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona terapias génicas para el tratamiento de la ataxia de Friedreich. Específicamente, la presente invención proporciona un ácido nucleico, un vector de clonación y un vector de transferencia para la producción de un vector de virus adenoasociado (AAV). El ácido nucleico comprende (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica frataxina, (ii) un promotor de fosfoglicerato-quinasa (PGK) y (iii) un elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE). La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el vector AAV o ácido nucleico. Además, el vector de AAV, el ácido nucleico o la composición farmacéutica se pueden utilizar como medicamento, específicamente como medicamento para el tratamiento de la ataxia de Friedreich. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Vectores para el tratamiento de ataxia de Friedreich

Campo técnico

La presente invención puede incluirse en el campo de nuevos productos terapéuticos para el tratamiento de ataxia de Friedreich. Específicamente, la presente solicitud se refiere a nuevos productos para terapia génica. Los productos son capaces de tratar la ataxia de Friedreich.

Antecedentes de la técnica

La ataxia de Friedreich (FRDA; 0MIM #229300) es una enfermedad neurodegenerativa hereditaria rara que provoca daño progresivo al sistema nervioso, lo que da como resultado síntomas que van desde trastornos de la marcha y problemas de lenguaje hasta enfermedad cardiaca o miocardiopatía. La enfermedad recibió el nombre en honor al médico Nikolaus Friedreich, que fue el primero en describirla en la década de 1860. La ataxia, que se refiere a problemas de la coordinación motora tales como movimientos torpes e inestabilidad, se produce en la ataxia de Friedreich por la degeneración de tejido nervioso en la médula espinal y los nervios que controlan el movimiento muscular de los brazos y las piernas. La médula espinal se contrae, perdiendo las células nerviosas parte de su vaina de mielina. La ataxia de Friedreich, aunque no es habitual, es la ataxia hereditaria más habitual, que se produce en 1 de cada 30.000-50.000 recién nacidos vivos, con una prevalencia de 2-4 por cada 100.000. Ambos sexos se ven igualmente afectados. Los síntomas comienzan habitualmente entre los 5 y 15 años de edad pero, en raras ocasiones, pueden aparecer tan pronto como a los 18 meses de edad otan tarde como a los 50 años de edad. El primer síntoma que aparece es habitualmente la dificultad para caminar, o ataxia de la marcha. La ataxia empeora gradualmente y se extiende lentamente a los brazos y luego al tronco. Como signos tempranos pueden aparecer deformidades de los pies tales como pie cavo, flexión involuntaria de los dedos de los pies o dedos de los pies en martillo. Con el tiempo, los músculos comienzan a debilitarse y a consumirse, especialmente en los pies, las piernas y las manos, y se desarrollan las deformidades. 0tros síntomas incluyen la pérdida de reflejos tendinosos, especialmente en las rodillas y los tobillos. A menudo hay una pérdida gradual de sensación en las extremidades, que puede extenderse a otras partes del cuerpo. Se desarrolla disartria, y el paciente se cansa fácilmente. Son habituales los movimientos rápidos, rítmicos e involuntarios de los ojos, denominados nistagmo. La mayoría de las personas con ataxia de Friedreich desarrollan escoliosis, que si es grave, puede afectar a la respiración.

0tros síntomas que pueden producirse son dolor torácico, disnea y palpitaciones. Estos síntomas son el resultado de diversas formas de enfermedad cardiaca que a menudo acompañan a la ataxia de Friedreich, tales como miocardiopatía hipertrófica, fibrosis miocárdica o insuficiencia cardiaca. También son habituales anomalías de la frecuencia cardiaca tales como taquicardia y bloqueo auriculoventricular. Aproximadamente el 20% de las personas con ataxia de Friedreich desarrollan intolerancia a los hidratos de carbono y el 30% presentan diabetes mellitus. Algunas personas afectadas pierden la audición o la visión. La velocidad de evolución de la enfermedad varía de persona a persona. En general, entre 10 y 20 años después de la aparición de los primeros síntomas, la persona queda postrada en una silla de ruedas, y en los estadios más tardíos de la enfermedad los individuos quedan totalmente incapacitados. Puede verse afectada la esperanza de vida. Muchas personas con ataxia de Friedreich mueren en la edad adulta debido a la enfermedad cardiaca asociada, la causa más habitual de muerte. Sin embargo, algunas personas con síntomas menos graves de ataxia de Friedreich algunas veces viven hasta los 60 ó 70 años.

La obtención de neuroimágenes, tal como IRM, muestra un aspecto normal en los estadios tempranos de la enfermedad, aunque revela progresivamente atrofia variable de la columna cervical y del cerebelo. A menudo, esto muestra atrofia del pedúnculo superior. Algunos estudios electrofisiológicos muestran velocidades de conducción superiores a 40 m/s con ausencia o reducción de los potenciales de acción sensoriales y ausencia de reflejo H. A nivel neuropatológico, se observan una atrofia marcada de la médula espinal, las raíces dorsales, ocasionalmente del cerebelo, e hipertrofia cardiaca. La neurodegeneración se identifica en los nervios sensoriales periféricos con pérdida progresiva de neuronas sensoriales ganglionares de raíces dorsales grandes, degeneración de la columna vertebral, degeneración transináptica de las neuronas en las fibras espinocerebelosas y de columna de Clarke, vías piramidales y atrofia de los núcleos gráciles y cuneiformes. Las lesiones secundarias pueden incluir atrofia del núcleo dentado en el cerebelo que afecta a las neuronas glutamatérgicas grandes y atrofia de las células de Betz y las vías corticoespinales.

En 1996, la causa de la ataxia de Friedreich se identificó como un defecto molecular en el gen FXN ubicado en el cromosoma 9 (banda 9q21). La mutación consiste en una expansión homocigótica anómala del triplete GAA ubicado dentro de la secuencia de ALU en el primer intrón del gen FXN. Aproximadamente el 98% de pacientes con FRDA tienen 2 cromosomas con un número de entre 201 y 1.700 repeticiones GAA (más frecuentemente de entre 600 y 900) en cada uno de ellos. Sin embargo, el 2-5% de los pacientes con FRDA presentan una expansión de GAA y una mutación puntual en el gen FXN en la heterocigosis compuesta (tabla 1). Hasta la fecha, se han descrito más de 17 mutaciones diferentes en el gen FXN capaces de desencadenar FRDA. La expansión de GAA en la FRDA es muy inestable durante la meiosis e interfiere con la transcripción del gen FXN, lo que provoca niveles anómalamente bajos de ARNm de frataxina. La expansión de GAA provocaría el silenciamiento de la transcripción del gen FXN y, por tanto, suprimiría la expresión de frataxina formando estructuras triples de ADN o híbridos de ADN-ARN, o ambos. Más recientemente, se ha propuesto que la expansión de GAA bloquearía la transición desde el inicio hasta la elongación de la transcripción debido a la formación de estructuras similares a heterocromatina en las proximidades de la hiperexpansión de GAA. También se ha propuesto que la expansión de GAA conduciría a la metilación epigenética de los sitios CpG ubicados en la región en el sentido de 5' del gen FXN, lo que provocaría su silenciamiento. Por tanto, como consecuencia de la mutación de GAA en el gen FXN, en la FRDA se produce una deficiencia de la proteína frataxina.

Tabla 1. Variantes alélicas más prevalentes identificadas en el gen FXN que provoca la ataxia de Friedreich.

El gen FXN codifica para una pequeña proteína mitocondrial conservada que contiene 210 aminoácidos (aa) en su forma precursora, con un peso molecular de 23.135 Da, denominada frataxina (Q16595). Esta forma de proteína precursora contiene una secuencia N-terminal de tránsito que la dirige a la matriz mitocondrial donde la peptidasa mitocondrial la convierte en diferentes isoformas más pequeñas (FXN42-210, FXN56-210, FXN81-210, FXN78-210) de la proteína frataxina madura, siendo FXN81-210 de 130 aa y 14,2 kDa la más abundante. En humanos, la frataxina se detecta en la matriz mitocondrial en asociación con su membrana interna en una gran variedad de tejidos, y los niveles más abundantes se identifican en el tejido cardiaco, la médula espinal y los linfoblastos en división, y notablemente los niveles más bajos en el cerebelo. Hasta la fecha, la frataxina no se ha detectado en la corteza cerebral. Dado que se identificó el gen responsable de la enfermedad, y con la generación de varios modelos animales, se han postulado diferentes funciones para la frataxina, tales como la homeostasis de hierro mitocondrial, el almacenamiento de hierro, la respuesta al estrés oxidativo, la biogénesis de agrupaciones de Fe-S, la modulación de la actividad aconitasa mitocondrial y la regulación de la fosforilación oxidativa. En la FRDA, la deficiencia de frataxina producida por la expansión homocigótica de la expansión de GAA en el gen FXN conduce a una biosíntesis insuficiente de las agrupaciones de hierro-azufre necesarias para el transporte de electrones en las mitocondrias y el ensamblaje de aconitasa, lo que conduce a la desregulación de la función mitocondrial y a la acumulación de hierro mitocondrial por alteraciones de su homeostasis. La frataxina también modula la capacidad de unión al ADN de la proteína aconitasa 1 (AC01) que, además de participar en el ciclo de ácido cítrico en la matriz mitocondrial, regula la captación y la utilización del hierro celular.

Se han generado varios modelos animales y celulares para la ataxia de Friedreich mediante manipulación genética. La generación de un modelo de AF en el ratón que simula lo más próximamente posible la enfermedad humana ha sido una ardua tarea, y en la actualidad hay 8 modelos murinos distintos de la FRDA. Desafortunadamente, ninguno de ellos se presenta con la combinación de todos los síntomas fenotípicos de la FA en el mismo animal, tales como lesiones en los ganglios de la raíz dorsal (DRG) y en los núcleos dentados cerebelosos, aunque son útiles para el estudio de aspectos aislados del proceso neurodegenerativo molecular en la FRDA y para la evaluación de diferentes tratamientos en síntomas específicos. Los tratamientos más usados en estudios preclínicos son los ratones Prp-CreERT e YG8R. Los ratones Prp-CreERT desarrollan específicamente ataxia sensorial progresiva y cerebelosa, las funciones neurológicas más prominentes de la ataxia de Friedreich. Algunos estudios histológicos en estos animales muestran anomalías de la médula espinal y de los ganglios de la raíz dorsal con ausencia de neuropatía motora, un sello distintivo de la enfermedad humana, así como defectos de arborización en las células de Purkinje del cerebelo. En cambio, los ratones transgénicos YG8R en ausencia de la proteína frataxina murina endógena muestran una patología lentamente progresiva de la FRDA. A diferencia de los humanos, estos ratones no muestran deficiencias cardiacas.

Entre los vectores virales y no virales usados en la terapia génica para patologías humanas, los vectores derivados de virus adenoasociado (Aa V) han mostrado importantes beneficios clínicos y expresiones prolongadas en modelos animales de enfermedad de Gaucher, enfermedad de Fabry, enfermedad de Pompe, leucodistrofia metacromática, enfermedad de Niemann-Pick A y mucopolisacaridosis I, II, III A, III B, IV y VII, entre otras. La administración intravenosa de vectores de AAV en modelos animales de enfermedades de almacenamiento lisosómico ha conducido a aumentos en la actividad enzimática de hasta 16 veces los valores normales en sangre, hígado, bazo, riñón y músculo, lo que hace que sean muy útiles para el tratamiento de este tipo de patologías. En los últimos 10 años, los AAV han sido los vectores de elección en la mayoría de los ensayos clínicos llevados a cabo para tratar patologías del sistema nervioso central y periférico (http://www.abedia.com/wiley/index.html). De manera importante, hasta la fecha no se han observado efectos adversos con estos vectores y los resultados son muy prometedores. Por tanto, varios factores han hecho que los AAV se conviertan en el vehículo de administración de genes ideal para el sistema nervioso central (SNC). Los vectores de virus adenoasociado que comprenden una secuencia de frataxina se han usado para tratar la FRDA en ratones (Gérard et al., 2014. Mol Ther Methods Clin Dev. 1: 14044; Chapdelaine et al., 2016. Gene Ther. 23(7): 606-614; Tremblay et al., 2015. Mol Ther. 23 (suμl. 1): pS153; documento W0 2016/150964). Sin embargo, los vectores de AAV divulgados en la técnica anterior o bien sobreexpresan o bien infraexpresan la frataxina y no alcanzan todas las células y neuronas diana afectadas en la FRDA, lo que hace que sean inadecuados para el tratamiento eficiente de la FRD^a y, en particular, de sus signos neurológicos. Por tanto, es necesario un vector de AAV que exprese la proteína frataxina a una cantidad terapéuticamente eficaz.

En la actualidad, no existe ninguna terapia eficaz para el tratamiento de la FRDA y, por tanto, existe la necesidad de nuevos productos terapéuticos para el tratamiento de la FRDA. Un objetivo de la presente invención es proporcionar una terapia adecuada para tratar la FRDA.

Figuras

Figura 1. Evaluación de los promotores humanos de SYN (sinapsina) y FXN (frataxina; 1.255 pb) en la expresión de la proteína frataxina (FXN). Para someter a prueba los niveles de expresión de la proteína frataxina (FXN) humana bajo la regulación de un fragmento del promotor endógeno (phFXN) y el promotor neuronal de sinapsina (phSYN), en comparación con la expresión bajo el promotor constitutivo de alta expresión CMV, se transfectaron células SH-SY5Y de neuroblastoma humano con vector vacío (carril 1), o constructos que codifican para la sinapsina humana (phSYN) (carril 3), o un fragmento de 1.255 pb de los promotores de frataxina (phFXN) (carril 4). Los constructos 1.2 y 1.3 que usan phSYN o phFXN (1.255 pb) para expresar la secuencia codificante de FXN humana (CDS de hFXN) no dieron como resultado la expresión de la proteína frataxina recombinante (rFXN). HA, etiqueta de hemaglutinina. Figura 2. Evaluación de los promotores humanos de SYN (sinapsina), NSE (enolasa específica de neuronas) y FXN (frataxina; 1.255 pb) junto con la secuencia de WPRE en la expresión de la proteína frataxina (FXN). Se evaluó el efecto de un fragmento de 320 pb del extremo 5' de FXN y las secuencias de WPRE sobre la expresión de FXN a partir del promotor phSYN previamente mostrado en la figura 1 (carriles 3, 4 frente a 8) y de phNSE (carril 6). Los diferentes constructos se transfectaron en células HEK y se analizaron los lisados 48 h después de la transfección. La eficiencia de las secuencias de WPRE en la estabilización del ARN se observa en el constructo que expresa FXN a partir del promotor de CMV (carril 2). Sin embargo, la adición y combinación de los elementos reguladores mostrados anteriormente no dio como resultado la expresión de fXn a partir de phSYN, hpFXN o phNSE. HA, etiqueta de hemaglutinina; iFXN, forma intermedia de FXN; mFXN, forma madura de FXN; WPRE, elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota.

Figura 3. Evaluación de los promotores humanos de SYN (sinapsina), NSE (enolasa específica de neuronas) y FXN (frataxina; 1.255 pb) junto con el potenciador de CMV y las secuencias de WPRE en la expresión de la proteína frataxina (FXN). Se transfectaron células HEK y células N₂a de neuroblastoma de ratón con constructos que comprendían el potenciador de CMV junto con cualquiera de los promotores de SYN, NSE o FXN (1.255 pb). La combinación de los elementos reguladores mostrados anteriormente no dio como resultado la expresión de FXN a partir de los promotores phSYN, phFXN o phNSE. HA, etiqueta de hemaglutinina; iFXN, forma intermedia de FXN; mFXN, forma madura de FXN; WPRE, elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota. Figura 4. Evaluación del efecto de los promotores humanos de SYN (sinapsina), NSE (enolasa específica de neuronas), y FXN (frataxina: 1.255 pb) con la adición de las secuencias de K0ZAK (5’) y WPRE (3’) en la expresión de la proteína frataxina (FXN). Los diferentes constructos se transfectaron en células HEK y se analizaron los lisados 48 h después de la transfección. La eficiencia de las secuencias de WPRE en la estabilización del ARN se observa en el constructo que expresa FXN a partir del promotor de CMV (carril 1 frente a 2). La potenciación adicional de la expresión de FXN mediante la adición de la secuencia de Kozak y las secuencias de 105 nt entre el promotor y la secuencia codificante de FXN se observa en el carril 2 frente a 3. Sin embargo, la adición y combinación de los elementos reguladores mostrados anteriormente no dio como resultado la expresión de FXN a partir de phSYN, phFXN o phNSE. HA, etiqueta de hemaglutinina; iFXN, forma intermedia de FXN; mFXN, forma madura; pFXN, forma precursora; WPRE, elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota.

Figura 5. Evaluación de la combinación de un ligador definido entre los promotores humanos de PGK1 (fosfoglicerato cinasa 1), NSE (enolasa específica de neuronas), SYN (sinapsina) o FXN (frataxina; 1.255 pb) y la región codificante (CDS) de FXN además de las secuencias de K0ZAK (5’) y WPRE (3’) en la expresión de la proteína frataxina (FXN). Los diferentes constructos mostrados se transfectaron o bien en células N₂a (A, B y E) o bien en células HEK (C y D) y se analizaron los lisados 48 h después de la transfección. La expresión de fXn se detectó sistemáticamente a partir del promotor phPGK, pero no a partir de phNSE o phFXN (1.255 pb), cuando se usó el ligador de 105 pb entre el promotor y la región codificante (A, C y D: carril 4; B: carril 5; y E: carril 8). HA, etiqueta de hemaglutinina; iFXN, forma intermedia de FXN; mFXN, forma madura; pFXN, forma precursora; WPRE, elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota.

Figura 6. Expresión de luciferasa (LUC) bajo el promotor humano de PGK1 (fosfoglicerato cinasa 1) tras la inyección intratecal del vector rAAV9 (4,6 x 1012 gv/kg) en ratones YG8R Tq/- y WT. La expresión de luciferasa se detectó después de la inyección intraperitoneal de 150 |il de D-luciferina a 150 mg/kg de peso de ratón 3,5 meses después de la inyección intratecal del vector (A). Se disecaron los órganos y se añadió sustrato de luciferasa nuevo antes de capturar la imagen (escalas relativas mostradas después de los paneles izquierdos y derechos (B)).

Figura 7. Expresión in vivo de ARNm de frataxina en ratones de 7 meses de edad a los que se les administró por vía intratecal rAAV9-PGK1-FXN. Los niveles de ARNm de frataxina se cuantificaron mediante qRT-PCR en tejidos de hígado, corazón, ganglios de la raíz dorsal lumbar (DRG-L), médula espinal lumbar (SC-L), médula espinal torácica (SC-T), médula espinal cervical (SC-C), cerebelo (Cb) y cerebro (región frontal C 1) de ratones YG8R de 7 meses de edad transgénicos hemicigóticos (Tg/-) u homocigóticos (Tg/Tg). A los ratones YG8R transgénicos hemicigóticos (Tg/-) se les administró o bien rAAV-Null (mostrado en negro) o bien rAAV9-PGK1-FXN (mostrado en gris claro), y no se les inyectó a los ratones transgénicos homocigóticos de FRDA (Tg/Tg) (mostrados en gris oscuro). A diferencia de los ratones YG8R hemicigóticos (Tg/-) que portan dos copias en tándem del gen FXN humano con ~82 y ~190 repeticiones de secuencia de trinucleótido GAA en uno de los cromosomas, los ratones YG8R homocigóticos contienen las dos copias en tándem en cada uno de los cromosomas. Ni los ratones YG8R homocigóticos ni los hemicigóticos para FXN humana expresan Fxn endógena, ya que tienen un acervo genético con desactivación génica de Fxn de ratón. Los ratones YG8R homocigóticos sirvieron como control de mayor expresión para el ARNm de FXN humana ya que contienen más copias del transgén humano pero muestran aun así funciones normales. A los ratones se les inyectó por vía intratecal a los 2,5 meses de edad y se usaron cebadores específicos de FXN humana para cuantificar el ARNm de FXN en los diferentes tejidos. Los niveles de ARNm de FXN total se normalizaron con respecto a los niveles detectados en los ratones YG8R hemicigóticos (Tg/-) tratados con rAAV9-Null para cada uno de los tejidos analizados. Cinco meses después de la inyección intratecal del vector rAAV9-PGK1-FXN, los niveles del ARNm de FXN fueron mayores (alrededor de 1,3 y 3,2 veces) en los ratones YG8R hemicigóticos (Tg/-) a los que se les inyectó rAAV9-PGK1-FXN con la dosificación sometida a prueba pero no mayores que los niveles en los ratones YG8R homocigóticos (Tg/Tg) en todos los tejidos, en comparación con los niveles en ratones Tg/- tratados con AAV-Null. A) Niveles relativos de ARNm de FXN humana en ratones tanto hembra como macho, n=6 (3 hembras y 3 machos). Las diferencias en veces entre los ratones YG8R del modelo de ratón de ataxia de Friedreich a los que se les inyectó el control AAV-Null en comparación con los ratones YG8R a los que se les inyectó rAAV9-PGK1-FXN son estadísticamente significativas en hígado, ganglios de la raíz dorsal y médula espinal (p=0,019, p=0,004 y p=0,024; indicadas mediante asteriscos *) con tendencias crecientes en todos los demás tejidos mostrados. Se observó más variabilidad en los ratones macho en comparación con las hembras con la dosis usada. B) Niveles relativos de ARNm de hFXN en ratones YG8R hembra. Se detectan diferencias en veces estadísticamente significativas en los niveles de frataxina en todos los tejidos estudiados tal como se indican mediante asteriscos y se enumeran en la tabla a continuación. Los aumentos en veces en los ratones a los que se les inyectó rAAV9-PGK1-FXN nunca fueron mayores que los niveles detectados en los ratones YG8R Tg/Tg. Significación estadística, p≤0,05*, p≤0,005**.

Figura 8. Expresión in vivo de la proteína frataxina recombinante a partir del vector rAAV9-hPGK1-FXN después de la inyección intratecal. Lisados a partir de células N₂a cultivadas transfectadas con vector vacío o el vector que expresa frataxina que se usó como control positivo (figuras 8A y 8B: carriles 1 y 2). La proteína FXN endógena en las células N₂a y los ratones WT se detecta con el anticuerpo anti-FXN (A y B). La proteína FXN humana a partir del transgén en los ratones YG8R así como la proteína FXN recombinante humana en los ratones inyectados se detectan tanto en el hígado como en el cerebro de los ratones (A y B). La incubación de las transferencias con el anticuerpo anti-FXN durante una hora comienza a revelar la proteína FXN humana mientras que la incubación durante la noche (o/n) revela tanto FXN de ratón en los ratones WT como FXN humana en los ratones hemicigóticos (Tg/-) y homocigóticos (Tg/Tg). Los niveles de expresión de la proteína FXN humana recombinante expresada a partir de rAAV9-FXN inyectado son similares a los niveles de la proteína FXN de ratón endógena en los ratones WT. HA, etiqueta de hemaglutinina; iFXN, forma intermedia de FXN; mFXN, forma madura de FXN; WPRE, elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota.

Figura 9. Restablecimiento del reflejo de cierre en los ratones YG8R a lo largo del tiempo tras la inyección del vector rAAV9-FXN. Se puntuó el cierre de las patas traseras desde 0 hasta 3 (véase la sección de métodos), que indica un deterioro de menos a más, en ratones hemicigóticos (Tg/-) y ratones WT a los que se les inyectó los vectores rAAV9-FXN o rAAV9-Null. Resultados para hembras y machos juntos (n=10, 5 machos y 5 hembras para cada grupo). Las alteraciones en el reflejo de cierre se detectan tan pronto como a los 4 meses de edad en los ratones YG8R hemicigóticos. Tras la inyección intratecal del vector rAAV9-FXN, parece que se normaliza el reflejo de cierre, lo que indica un restablecimiento a lo largo del tiempo de este fenotipo patológico neurológico. Los asteriscos (*) indican diferencias significativas entre los valores para ratones WT y Tg/- a los que se les inyectó rAAV9-Null y las almohadillas (#) indican diferencias significativas entre los valores obtenidos para los ratones Tg/- a los que se les inyectó rAAV9-Null y los ratones Tg/- a los que se les inyectó rAAV9-FXN. *, #: P≤0,05.

Figura 10. La expresión in vivo de la proteína frataxina recombinante en los ratones a los que se les inyectó rAAV9hPGK1-FXN restablece las propiedades electrofisiológicas a las diferentes distancias desde el estímulo (D1-D4) del nervio caudal. Los asteriscos (*) indican diferencias significativas entre ratones YG8R WT y Tg/- con FRDA tratados con rAAV9-Null, mientras que las almohadillas (#) indican diferencias significativas entre los ratones YG8R tratados con rAAV9-Null y rAAV9-FXN. La inyección intratecal del vector rAAV9-FXN a los ratones a los 2,5 meses de edad previene o ralentiza los defectos en la conducción nerviosa en el modelo de ratón de FRDA para la FRDA (YG8R). WT, verde (n=10); ratones YG8R Tg/- con FRDA tratados con el vector rAAV9-Null, gris (n=10); ratones YG8R Tg/-con FRDA tratados con el vector rAAV9-FXN, azul (n=10). Las mediciones se obtuvieron 1 cm, 2 cm, 3 cm y 4 cm desde la punta de la cola indicados como valores para los sitios D1, D2, D3 y D4, respectivamente. *, #: P≤0,05. Figura 11. Conservación de los ganglios de la raíz dorsal en los ratones YG8R del modelo de ratón de FRDA tratados con rAAV9-FXN. El calibre de los ganglios de la raíz dorsal lumbar parecía conservado, así como la morfología mitocondrial en el modelo de ratón de FRDA tratado con rAAV9-FXN en comparación con los mismos ratones tratados con el virus rAAV9-Null.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende un ácido nucleico, en el que el ácido nucleico comprende:

(i) una secuencia de ácido nucleico que codifica para frataxina;

(ii) un promotor de fosfoglicerato cinasa (PGK) que consiste en SEQ ID N0: 1; y

(iii) un elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE);

en el que (ii) y (iii) están unidos operativamente a y regulan la expresión de (i), en el que hay un ligador operacionalmente funcional entre (i) y (ii), en el que dicho ligador consiste en SEQ ID N0: 6, y en el que el vector de AAV es un vector de serotipo 9 de ^a A^v .

La presente invención también proporciona un vector de transferencia que comprende el ácido nucleico y elementos de ácido nucleico adicionales para fomentar la integración o transposición del vector de transferencia en un vector de serotipo 9 de AAV. Además, en el presente documento se describe el uso del vector de transferencia para la producción del vector de AAV de la presente invención. Además, la presente invención proporciona una composición farmacéutica y el vector de AAV de la invención para su uso como medicamento, específicamente para su uso en el tratamiento de FRDA.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Los términos “tratamiento” y “terapia”, tal como se usan en la presente solicitud, se refieren a un conjunto de medios higiénicos, farmacológicos, quirúrgicos y/o físicos usados con la intención de curar y/o aliviar una enfermedad y/o síntomas con el objetivo de remediar el problema de salud. Los términos “tratamiento” y “terapia” incluyen métodos preventivos y curativos, dado que ambos están dirigidos al mantenimiento y/o restablecimiento de la salud de un individuo o animal. Independientemente del origen de los síntomas, la enfermedad y la incapacidad, la administración de un medicamento adecuado para aliviar y/o curar un problema de salud deben interpretarse como una forma de tratamiento o terapia dentro del contexto de esta solicitud.

El término “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de materia que tiene un efecto terapéutico y que es capaz de tratar la FRDA.

Los términos “individuo”, “paciente” o “sujeto” se usan de manera intercambiable en la presente solicitud y no se pretende que sean limitativos en modo alguno. El “individuo”, “paciente” o “sujeto” puede ser de cualquier edad, sexo y estado físico.

Tal como se usa en el presente documento, “portador farmacéuticamente aceptable” o “diluyente farmacéuticamente aceptable” significa todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para principios farmacéuticamente activos se conoce bien en la técnica. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas y, sin limitar el alcance de la presente invención, incluyen: agentes de tamponamiento adicionales; conservantes; codisolventes; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; agentes quelantes tales como EDTA; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); polímeros biodegradables, tales como poliésteres; contraiones formadores de sal, tales como sodio, alcoholes de azúcares polihidroxilados; aminoácidos, tales como alanina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, lisina, ornitina, leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico y treonina; azúcares o alcoholes de azúcares orgánicos, tales como lactitol, estaquiosa, mañosa, sorbosa, xilosa, ribosa, ribitol, mioinisitosa, mioinisitol, galactosa, galactitol, glicerol, ciclitoles (por ejemplo, inositol), polietilenglicol; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutatión, ácido tióctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, [alfa]-monotioglicerol ytiosulfato de sodio; proteínas de bajo peso molecular, tales como albúmina sérica humana, albúmina sérica bovina, gelatina u otras inmunoglobulinas; y polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona.

El término “frataxina” se refiere a una proteína que está codificada por el gen FXN y que está ubicada habitualmente en la mitocondria. Pueden encontrarse detalles de la proteína en la base de datos UniProtκΒ con el número de registro Q16595.

El término “promotor” se refiere a una secuencia de ADN a la que puede unirse ARN polimerasa con el fin de iniciar la transcripción. La secuencia puede contener además sitios de unión para diversas proteínas que regulan la transcripción, tales como factores de transcripción. La secuencia promotora puede estar compuesta por diferentes fragmentos de promotor (ya sean fragmentos diferentes o iguales) que están ubicados cerca unos de otros en la secuencia de ADN y pueden estar separados por ligadores o espaciadores. Tales promotores se denominan promotores quiméricos. En una realización preferida, el término “promotor” se refiere a un promotor de fosfoglicerato cinasa (PGK).

El término “elemento regulador postranscripcional” se refiere a una secuencia de ADN que, cuando se transcribe, crea una estructura terciaria que potencia o inhibe la expresión de una proteína.

El término “unido operativamente” se refiere a dos o más secuencias de ácido nucleico que están conectadas de una manera que permite que una secuencia de ácido nucleico influya en la otra. Por ejemplo, el promotor de PGK y el WPRE están unidos operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica para frataxina de modo que los niveles de expresión de frataxina están regulados por el promotor de PGK y el WPRE.

El término “variante funcional” se refiere a ácidos nucleicos o aminoácidos cuya secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos difiere en una o más posiciones con respecto a la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos original, mediante lo cual las diferencias pueden ser adiciones, deleciones y/o sustituciones de residuos de ácido nucleico o de aminoácido, y que todavía son funcionales y, por tanto, adecuados para tratar la FRDA. Un experto puede determinar variantes funcionales buscando homólogos con una búsqueda con BLAST o estudiando la variabilidad de la proteína o el gen en una población.

El término “virus adenoasociado” se refiere a un virus pequeño que infecta a los humanos y a algunas otras especies de primate. Un “vector” es cualquier vehículo que puede usarse para transportar de manera artificial material genético extraño al interior de una célula. Por tanto, un “vector de AAV” se refiere a un AAV recombinante que transporta un ácido nucleico al interior de una célula.

Vector de AAV

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende un ácido nucleico, en el que el ácido nucleico comprende:

(i) una secuencia de ácido nucleico que codifica para frataxina;

(ii) un promotor de fosfoglicerato cinasa (PGK) que consiste en SEQ ID N0: 1; y

(iii) un elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE);

en el que (ii) y (iii) están unidos operativamente a y regulan la expresión de (i), en el que hay un ligador operacionalmente funcional entre (i) y (ii), en el que dicho ligador consiste en SEQ ID N0: 6, y en el que el vector de AAV es un vector de serotipo 9 de a Av .

SEQ ID N0: 1 se refiere a la siguiente secuencia:

GAATTCCGGGGTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGCAGCCCTGGGTCTGCGCAGGGAC GCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCGCCGACCCTGGGTCTCGCA CATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTACCCTTGTGGGCCC CCCGGCGACGCTTCCTGCTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTTCCTTGCGGTTCGCGGC GTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACTAGTACCCTCGCAGACGGACAG CGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGCGATGGGCTGTGGCCAATAGCGGCTGC TCAGCAGGGCGCGCCGAGAGCAGCGGCCGGGAAGGGGCGGTGCGGGAGGCGGGGT GTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCTGTTCCTGCCCGCGCGGTGTTCCGCATTCTGCAAGC CTCCGGAGCGCACGTCGGCAGTCGGCTCCCTCGTTGACCGAATCACCGACCTCTCTCC CCAG

El promotor de PGK es SEQ ID N0: 1.

La identidad de secuencia entre dos secuencias puede determinarse a través de métodos convencionales. Por ejemplo, usando logaritmos de alineación convencionales conocidos en el estado de la técnica tales como BLAST (Altschul et al., 1990. J Mol Biol. 215(3): 403-10). En una realización preferida, la identidad de secuencia entre dos secuencias se determina usando BLAST.

SEQ ID N0: 2 se refiere a la siguiente secuencia:

TCG ACAAT CAACCTCTGGATTACAAAATTT GT GAAAG ATT GACT GGTATT CTT AACT AT GT TGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTC CCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGA GTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACC CCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCC CCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGG GCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTC CATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGT CCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGG CCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCT CCCCGCCTG

En una realización preferida, el WPRE comprende SEQ ID N0: 2 o una secuencia que es al menos el 75% idéntica a SEQ ID N0: 2. Preferiblemente, el WPRE comprende SEQ ID N0: 2 o una secuencia que es al menos el 75%, el 80%, el 85%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 95%, el 97%, el 98% o el 99% idéntica a SEQ ID N0: 2. Más preferiblemente, el WPRE es SEQ ID N0: 2 o una secuencia que es al menos el 75%, el 80%, el 85%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 95%, el 97%, el 98% o el 99% idéntica a SEQ ID N0: 2.

SEQ ID N0: 3 se refiere a la siguiente secuencia:

ATGTGGACTCTCGGGCGCCGCGCAGTAGCCGGCCTCCTGGCGTCACCCAGCCCGGCC CAGGCCCAGACCCTCACCCGGGTCCCGCGGCCGGCAGAGTTGGCCCCACTCTGCGGC CGCCGTGGCCTGCGCACCGACATCGATGCGACCTGCACGCCCCGCCGCGCAAGTTCG AACCAGAGAGGTCTCAACCAGATTTGGAATGTCAAAAAGCAGAGTGTCTATTTGATGAAT TT GAGG AAATCT GGAACTTT GGGCCACCCAGGCT CTCT AG AT GAGACCACCT AT GAAAG ACTAGCAGAGGAAACGCTGGACTCTTTAGCAGAGTTTTTTGAAGACCTTGCAGACAAGC CATACACGTTTGAGGACTATGATGTCTCCTTTGGGAGTGGTGTCTTAACTGTCAAACTG GGT GGAGAT CT AGGAACCT AT GT GATCAACAAGCAGACGCCAAACAAGCAAATCTGGCT ATCTTCTCCATCCAGTGGACCTAAGCGTTATGACTGGACTGGGAAAAACTGGGTGTACT CCCACGACGGCGTGTCCCTCCATGAGCTGCTGGCCGCAGAGCTCACTAAAGCCTTAAA AACCAAACT GGACTTGTCTTCCTTGG CCT ATT CCGGAAAAG AT GCTT

En una realización preferida, la secuencia de ácido nucleico que codifica para frataxina comprende SEQ ID N0: 3 o una secuencia que es al menos el 75% idéntica a SEQ ID N0: 3 y es una variante funcional de frataxina. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica para frataxina comprende SEQ ID N0: 3 o una secuencia que es al menos el 75%, el 80%, el 85%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 95%, el 97%, el 98% o el 99% idéntica a SEQ ID N0: 3. Más preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica para frataxina es SEQ ID N0: 3 o una secuencia que es al menos el 75%, el 80%, el 85%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 95%, el 97%, el 98% o el 99% idéntica a SEQ ID N0: 3.

El ácido nucleico comprende: un ligador entre el promotor y la secuencia de ácido nucleico que codifica para frataxina, en el que el ligador consiste en SEQ ID N0: 6.

SEQ ID N0: 6 se refiere a la siguiente secuencia:

TGGCT AACT AGAGAACCCACTGCTT ACTGGCTTAT CGAAATTAAT ACGACTCACT AT AGG GAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGCCGCCACC

En una realización preferida, el ácido nucleico comprende además una secuencia de Kozaky la secuencia de Kozak también está unida operativamente a y regula la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica para frataxina. Una secuencia de Kozak es una secuencia que se produce en ARNm eucariota y tiene la secuencia de consenso gccRccAUGG, en la que R es una purina, las letras minúsculas indican la base más habitual en una posición en la que la base, no obstante, puede variar y las letras mayúsculas están altamente conservadas.

SEQ ID N0: 4 se refiere a la siguiente secuencia:

GAATTCCGGGGTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGCAGCCCTGGGTCTGCGCAGGGAC GCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCGCCGACCCTGGGTCTCGCA CATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTACCCTTGTGGGCCC CCCGGCGACGCTTCCTGCTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTTCCTTGCGGTTCGCGGC GTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACTAGTACCCTCGCAGACGGACAG CGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGCGATGGGCTGTGGCCAATAGCGGCTGC TCAGCAGGGCGCGCCGAGAGCAGCGGCCGGGAAGGGGCGGTGCGGGAGGCGGGGT GTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCTGTTCCTGCCCGCGCGGTGTTCCGCATTCTGCAAGC CTCCGGAGCGCACGTCGGCAGTCGGCTCCCTCGTTGACCGAATCACCGACCTCTCTCC CCAGTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTA TAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGCCGCCACCATGTGGACT CTCGGGCGCCGCGCAGTAGCCGGCCTCCTGGCGTCACCCAGCCCGGCCCAGGCCCA GACCCTCACCCGGGTCCCGCGGCCGGCAGAGTTGGCCCCACTCTGCGGCCGCCGTGG CCTGCGCACCGACATCGATGCGACCTGCACGCCCCGCCGCGCAAGTTCGAACCAGAG AGGTCTCAACCAGATTTGGAATGTCAAAAAGCAGAGTGTCTATTTGATGAATTTGAGGAA ATCTGGAACTTTGGGCCACCCAGGCTCTCTAGATGAGACCACCTATGAAAGACTAGCAG AGGAAACGCTGGACTCTTTAGCAGAGTTTTTTGAAGACCTTGCAGACAAGCCATACACG TTTGAGGACTATGATGTCTCCTTTGGGAGTGGTGTCTTAACTGTCAAACTGGGTGGAGA TCT AGGAACCT AT GT G AT CAACAAGCAG ACGCCAAACAAGCAAAT CTGGCTATCTTCT C CATCCAGTGGACCT AAGCGTT AT G ACTGGACTGGGAAAAACTGGGTGTACTCCCACGA CGGCGTGTCCCTCCATGAGCTGCTGGCCGCAGAGCTCACTAAAGCCTTAAAAACCAAA CTGGACTTGTCTTCCTTGGCCTATTCCGGAAAAGATGCTTTGCCCACCTAGGGATCGGA TCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCTGCAGATATCCAGCACACTTTGCCTTTCTCTCCAC AGGTGTCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAA CTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATT GCTTCCCGTAT G GCTTT C ATTTT CTCCTCCTTGTAT A AAT CCTGGTTGCTGTCT CTTT AT G AGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGC AACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTT TCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGAC AGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCC TTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTA CGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTG CGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCG CCTCCCCGCCTG

En una realización preferida, la secuencia del ácido nucleico que comprende (i), (ii) y (iii) es SEQ ID N0: 4 o una secuencia que es al menos el 75% idéntica a SEQ ID N0: 4. Preferiblemente, el ácido nucleico que comprende (i), (ii) y (iii) es SEQ ID N0: 4 o una secuencia que es al menos el 75%, el 80%, el 85%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 95%, el 97%, el 98% o el 99% idéntica a SEQ ID N0: 4.

En una realización preferida, el ácido nucleico comprende además una señal de PoliA. Preferiblemente, la señal de PoliA tiene una longitud de al menos 50, 100, 150 o 228 pb. Más preferiblemente, la señal de PoliA tiene una longitud de al menos 228 pb. Lo más preferiblemente, la señal de PoliA tiene una longitud de 228 pb.

En una realización preferida, el ácido nucleico comprende además una o más secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR). Preferiblemente, el ácido nucleico comprende dos secuencias de ITR. Más preferiblemente, las secuencias de ITR flanquean el resto de los componentes del ácido nucleico.

SEQ ID N0: 5 se refiere a la siguiente secuencia:

CTGGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGA CCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACT CCAT CACT AGGGGTT CCT GAATTCCGGGGTT GGGGTT GCGCCTTTTCCAAGGCAGCCC TGGGTCTGCGCAGGGACGCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCG CCGACCCTGGGTCTCGCACATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGC CGCTACCCTTGTGGGCCCCCCGGCGACGCTTCCTGCTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGG TTCCTTGCGGTTCGCGGCGTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACTAGT ACCCTCGCAGACGGACAGCGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGCGATGGGCT GTGGCCAATAGCGGCTGCTCAGCAGGGCGCGCCGAGAGCAGCGGCCGGGAAGGGGC GGTGCGGGAGGCGGGGTGTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCTGTTCCTGCCCGCGCGGT GTTCCGCATTCTGCAAGCCTCCGGAGCGCACGTCGGCAGTCGGCTCCCTCGTTGACCG AATCACCGACCTCTCTCCCCAGTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCG AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTG GCCGCCACCATGTGGACTCTCGGGCGCCGCGCAGTAGCCGGCCTCCTGGCGTCACCC AGCCCGGCCCAGGCCCAGACCCTCACCCGGGTCCCGCGGCCGGCAGAGTTGGCCCC ACTCTGCGGCCGCCGTGGCCTGCGCACCGACATCGATGCGACCTGCACGCCCCGCCG CGCAAGTTCGAACCAGAGAGGTCTCAACCAGATTTGGAATGTCAAAAAGCAGAGTGTCT ATTT GATG AATTT G AGGAAATCTGGAACTTTGGGCCACCCAGGCT CTCT AG ATGAG ACC ACCTATGAAAGACTAGCAGAGGAAACGCTGGACTCTTTAGCAGAGTTTTTTGAAGACCT TGCAGACAAGCCATACACGTTTGAGGACTATGATGTCTCCTTTGGGAGTGGTGTCTTAA CT GT CAAACT GGGT GG AGAT CT AGG AACCT AT GT G ATC AACAAGCAG ACGCCAAACAAG CAAATCTGGCTATCTTCTCCATCCAGTGGACCTAAGCGTTATGACTGGACTGGGAAAAA CTGGGTGTACTCCCACGACGGCGTGTCCCTCCATGAGCTGCTGGCCGCAGAGCTCACT AAAGCCTTAAAAACCAAACTGGACTTGTCTTCCTTGGCCTATTCCGGAAAAGATGCTTTG CCCACCTAGGGATCGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCTGCAGATATCCAGCACA CTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAG ATTGACTGGTATT CTTA ACTATGTTG CT CCTTTT ACGCTAT GTGG AT ACGCTG CTTT AATG CCTTTGTATCAT GCT ATT GCTTCCCGTATGGCTTT CATTTTCTCCT CCTT GT AT AAATCCT GGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTG CACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTC CTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTG CCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTG TCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGC GCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCG CGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGT CGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGAATTCGAGCTCGGTACGATCAGCTGA TCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCC TTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGC ATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGC AAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATG GCTGGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCG ACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAAC TCCATCACTAGGGGTTCCT

En una realización preferida, el ácido nucleico es SEQ ID N0: 5 o una secuencia que es al menos el 75% idéntica a SEQ ID N0: 5. Preferiblemente, el ácido nucleico es SEQ ID N0: 5 o una secuencia que es al menos el 75%, el 80%, el 85%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 95%, el 97%, el 98% o el 99% idéntica a SEQ ID N0: 5.

En una realización preferida, el vector permite la expresión de una cantidad terapéuticamente eficaz de frataxina en un paciente que padece ataxia de Friedreich. Por tanto, el vector administra el ácido nucleico a las células de un paciente en las que el ácido nucleico expresa luego la frataxina a una cantidad terapéuticamente eficaz.

El vector de AAV es un vector de serotipo 9 de AAV, es decir un vector de AAV-9.

Ácido nucleico

En un segundo aspecto, la presente memoria descriptiva divulga un ácido nucleico que comprende: (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica para frataxina; (ii) un promotor de PGK; y (iii) un WPRE; en el que (ii) y (iii) están unidos operativamente a y regulan la expresión de (i).

En una divulgación preferida, el promotor de PGK comprende SEQ ID N0: 1 o una secuencia que es al menos el 75% idéntica a SEQ ID N0: 1. Preferiblemente, el promotor de PGK comprende SEQ ID N0: 1 o una secuencia que es al menos el 75%, el 80%, el 85%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 95%, el 97%, el 98% o el 99% idéntica a SEQ ID N0: 1. Más preferiblemente, el promotor de PGK es SEQ ID N0: 1 o una secuencia que es al menos el 75%, el 80%, el 85%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 95%, el 97%, el 98% o el 99% idéntica a SEQ ID N0: 1. En una divulgación preferida, el WPRE comprende SEQ ID N0: 2 o una secuencia que es al menos el 75% idéntica a SEQ ID N0: 2. Preferiblemente, el WPRE comprende SEQ ID N0: 2 o una secuencia que es al menos el 75%, el 80%, el 85%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 95%, el 97%, el 98% o el 99% idéntica a SEQ ID N0: 2. Más preferiblemente, el WPRE es SEQ ID N0: 2 o una secuencia que es al menos el 75%, el 80%, el 85%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 95%, el 97%, el 98% o el 99% idéntica a SEQ ID N0: 2.

En una divulgación preferida, la secuencia de ácido nucleico que codifica para frataxina comprende SEQ ID N0: 3 o una secuencia que es al menos el 75% idéntica a SEQ ID N0: 3 y es una variante funcional de frataxina. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica para frataxina comprende SEQ ID N0: 3 o una secuencia que es al menos el 75%, el 80%, el 85%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 95%, el 97%, el 98% o el 99% idéntica a SEQ ID N0: 3. Más preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica para frataxina es SEQ ID N0: 3 o una secuencia que es al menos el 75%, el 80%, el 85%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 95%, el 97%, el 98% o el 99% idéntica a SEQ ID N0: 3.

En una divulgación preferida, el ácido nucleico comprende además: un ligador entre el promotor y la secuencia de ácido nucleico que codifica para frataxina, en el que el ligador consiste en o comprende SEQ ID N0: 6 o una secuencia que es al menos el 75% idéntica a SEQ ID N0: 6. Preferiblemente, el ligador consiste en o comprende SEQ ID N0: 6 o una secuencia que es al menos el 75%, el 80%, el 85%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 95%, el 97%, el 98% o el 99% idéntica a SEQ ID N0: 6.

En una divulgación preferida, el ácido nucleico comprende además una secuencia de Kozak y la secuencia de Kozak también está unida operativamente a y regula la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica para frataxina.

En una divulgación preferida, la secuencia del ácido nucleico que comprende (i), (ii) y (iii) es SEQ ID N0: 4 o una secuencia que es al menos el 75 % idéntica a SEQ ID N0: 4. Preferiblemente, el ácido nucleico que comprende (i), (ii) y (iii) es SEQ ID N0: 4 o una secuencia que es al menos el 75%, el 80%, el 85%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 95%, el 97%, el 98% o el 99% idéntica a SEQ ID N0: 4.

En una divulgación preferida, el ácido nucleico comprende además una señal de PoliA. Preferiblemente, la señal de PoliA tiene una longitud de al menos 50, 100, 150 o 228 pb. Más preferiblemente, la señal de PoliA tiene una longitud de al menos 228 pb. Lo más preferiblemente, la señal de PoliA tiene una longitud de 228 pb.

En una divulgación preferida, el ácido nucleico comprende además una o más secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR). Preferiblemente, el ácido nucleico comprende dos secuencias de ITR. Más preferiblemente, las secuencias de ITR flanquean el resto de los componentes del ácido nucleico.

En una divulgación preferida, el ácido nucleico es SEQ ID N0: 5 o una secuencia que es al menos el 75% idéntica a SEQ ID N0: 5. Preferiblemente, el ácido nucleico es SEQ ID N0: 5 o una secuencia que es al menos el 75%, el 80%, el 85%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 95%, el 97%, el 98% o el 99% idéntica a SEQ ID N0: 5.

Vector de clonación

En un tercer aspecto, la presente divulgación proporciona un vector de clonación que comprende el ácido nucleico según una cualquiera de las realizaciones previamente descritas y elementos de ácido nucleico adicionales para fomentar la replicación del vector de clonación en una célula bacteriana.

El término “vector de clonación” se refiere a cualquier vector que es adecuado para la clonación, que generalmente implica la presencia de sitios de restricción, un origen de replicación para la propagación bacteriana y un marcador seleccionable.

El vector de clonación de la divulgación comprende el ácido nucleico descrito en el presente documento y puede usarse preferiblemente para producir el vector de transferencia o el vector de AAV de la invención.

Vector de transferencia

En un cuarto aspecto, la presente divulgación proporciona un vector de transferencia que comprende el ácido nucleico según una cualquiera de las realizaciones o divulgaciones previamente descritas y elementos de ácido nucleico adicionales para fomentar la integración o transposición del vector de transferencia en un vector de AAV, preferiblemente un vector de AAV-9.

El término “vector de transferencia” se refiere a un vector que es adecuado para su integración o transposición en un vector de AAV. Por tanto, el vector de transferencia generalmente permite la inserción de información genética en un vector de AAV.

El vector de transferencia de la invención comprende el ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 9 y puede usarse preferiblemente para producir el vector de AAV de la invención.

Uso del vector de transferencia

En un quinto aspecto, la presente divulgación proporciona el uso del vector de transferencia de la presente invención para la producción de un vector de AAV según una cualquiera de las realizaciones previamente descritas.

Composición farmacéutica

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el vector de AAV de la presente invención y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Una composición farmacéutica, tal como se describe en el presente documento, también puede contener otras sustancias. Estas sustancias incluyen, pero no se limitan a, crioprotectores, lioprotectores, tensioactivos, agentes de carga, antioxidantes y agentes estabilizantes. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede estar liofilizada.

El término “crioprotector”, tal como se usa en el presente documento, incluye agentes que proporcionan estabilidad al vector de AAV contra tensiones inducidas por congelación, al estar excluidos preferentemente de la superficie del vector de AAV. Los crioprotectores también pueden ofrecer protección durante los secados primario y secundario y el almacenamiento del producto a largo plazo. Los ejemplos no limitativos de crioprotectores incluyen azúcares, tales como sacarosa, glucosa, trehalosa, manitol, manosa y lactosa; polímeros, tales como dextrano, hidroxietil almidón y polietilenglicol; tensioactivos, tales como polisorbatos (por ejemplo, PS-20 o PS-80); y aminoácidos, tales como glicina, arginina, leucina y serina. Generalmente se usa un crioprotector que presenta baja toxicidad en sistemas biológicos.

En una realización, se añade un lioprotector a una composición farmacéutica descrita en el presente documento. El término “lioprotector”, tal como se usa en el presente documento, incluye agentes que proporcionan estabilidad al vector de AAV durante el procedimiento de secado por congelación o deshidratación (ciclos de secado por congelación primario y secundario), al proporcionar una matriz vítrea amorfa y al unirse con la superficie del vector de AAV a través de enlaces de hidrógeno, reemplazando las moléculas de agua que se retiran durante el procedimiento de secado. Esto ayuda a minimizar la degradación del producto durante el ciclo de liofilización y a mejorar la estabilidad del producto a largo plazo. Los ejemplos no limitativos de lioprotectores incluyen azúcares, tales como sacarosa o trehalosa; un aminoácido, tal como glutamato de monosodio, glicina o histidina no cristalina; una metilamina, tal como betaína; una sal liotrópica, tal como sulfato de magnesio; un poliol, tal como alcoholes de azúcares trihidroxilados o superiores, por ejemplo, glicerina, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol; propilenglicol; polietilenglicol; Pluronics; y combinaciones de los mismos. La cantidad de lioprotector añadida a una composición farmacéutica es generalmente una cantidad que no conduce a una cantidad inaceptable de degradación de la cepa cuando se liofiliza la composición farmacéutica.

En algunas realizaciones, se incluye un agente de carga en la composición farmacéutica. El término “agente de carga”, tal como se usa en el presente documento, incluye agentes que proporcionan la estructura del producto secado por congelación sin interaccionar directamente con el producto farmacéutico. Además de proporciona una torta farmacéuticamente elegante, los agentes de carga también pueden conferir cualidades útiles con respecto a modificar la temperatura de colapso, proporcionar protección frente a la congelación-descongelación y potenciar la estabilidad de la cepa durante el almacenamiento a largo plazo. Los ejemplos no limitativos de agentes de carga incluyen manitol, glicina, lactosa y sacarosa. Los agentes de carga pueden ser cristalinos (tales como glicina, manitol o cloruro de sodio) o amorfos (tales como dextrano, hidroxietil almidón), y generalmente se usan en las formulaciones en una cantidad de desde el 0,5% hasta el 10%.

También pueden incluirse otros portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables, tales como los descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, 0sol, A. Ed. (1980), en una composición farmacéutica descrita en el presente documento, siempre que no afecten de manera adversa a las características deseadas de la composición farmacéutica. Tal como se usa en el presente documento, “portador farmacéuticamente aceptable” significa todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para principios farmacéuticamente activos se conoce bien en la técnica. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen: agentes de tamponamiento adicionales; conservantes; codisolventes; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; agentes quelantes tales como EDTA; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); polímeros biodegradables, tales como poliésteres; contraiones formadores de sal, tales como sodio, alcoholes de azúcares polihidroxilados; aminoácidos, tales como alanina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, lisina, ornitina, leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico y treonina; azúcares o alcoholes de azúcares orgánicos, tales como lactitol, estaquiosa, manosa, sorbosa, xilosa, ribosa, ribitol, mioinisitosa, mioinisitol, galactosa, galactitol, glicerol, ciclitoles (por ejemplo, inositol), polietilenglicol; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutatión, ácido tióctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, [alfa]-monotioglicerol y tiosulfato de sodio; proteínas de bajo peso molecular, tales como albúmina sérica humana, albúmina sérica bovina, gelatina u otras inmunoglobulinas; y polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona. La composición farmacéutica puede prepararse para la administración oral, sublingual, bucal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, conjuntival, rectal, transdérmica, intratecal, tópica y/o mediada por inhalación. En una realización preferida, la composición farmacéutica puede ser una disolución que es adecuada para la administración intravenosa, intramuscular, conjuntival, transdérmica, intraperitoneal y/o subcutánea. En otra realización, la composición farmacéutica puede ser una disolución que es adecuada para las vías de administración sublingual, bucal y/o mediada por inhalación. En una realización alternativa, la composición farmacéutica puede ser un gel o una disolución que es adecuado para la administración intratecal. En una realización alternativa, la composición farmacéutica puede ser un aerosol que es adecuado para la administración mediada por inhalación. En una realización preferida, la composición farmacéutica puede prepararse para la administración intratecal.

La composición farmacéutica puede comprender además excipientes y portadores habituales que se conocen en el estado de la técnica. Para composiciones farmacéuticas sólidas, pueden usarse portadores sólidos no tóxicos convencionales que incluyen, por ejemplo, manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio de calidades farmacéuticas, y similares. Para la disolución para inyección, la composición farmacéutica puede comprender además crioprotectores, lioprotectores, tensioactivos, agentes de carga, antioxidantes, agentes estabilizantes y portadores farmacéuticamente aceptables. Para la administración en aerosol, las composiciones farmacéuticas se suministran generalmente en forma finamente dividida junto con un tensioactivo y propelente. Naturalmente, el tensioactivo no debe ser tóxico, y generalmente es soluble en el propelente. Representativos de tales agentes son los ésteres o ésteres parciales de ácidos grasos que contienen desde 6 hasta 22 átomos de carbono, tales como los ácidos caproico, octanoico, láurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico, olestérico y oleico con un alcohol polihidroxilado alifático o su anhídrido cíclico. Pueden emplearse ésteres mixtos, tales como glicéridos mixtos o naturales. También puede incluirse un portador, según se desee, tal como, por ejemplo, lecitina para la administración intranasal. Para los supositorios, los aglutinantes y portadores tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialcalenglicoles o triglicéridos. Usos médicos

En un séptimo aspecto, la presente divulgación proporciona el vector de AAV de la presente invención, o la composición farmacéutica de la presente invención, para su uso como medicamento. En un octavo aspecto, la presente divulgación proporciona el vector de AAV de la presente invención, o la composición farmacéutica de la presente invención, para su uso en el tratamiento de ataxia de Friedreich.

En una realización preferida, el vector de AAV de la presente invención, o la composición farmacéutica de la presente invención, se administra por vía intratecal, intramuscular, intracerebral o intracerebroventricular, preferiblemente por vía intratecal o intramuscular.

En una realización preferida, el vector de AAV de la presente invención, o la composición farmacéutica de la presente invención, se administra a una dosis de al menos 1 x 109 genomas de vector/kg de peso corporal, preferiblemente 1 x 1010, 1 x 1011 ó 1 x1012 genomas de vector/kg de peso corporal. Más preferiblemente, se administran al menos o aproximadamente 4,6 x 1012 genomas de vector/kg de peso corporal.

Ejemplos

Ejemplo 1: Construcción de plásmidos

Se fusionó la secuencia codificante de la isoforma 1 de frataxina humana (hFXN) con una etiqueta de hemaglutinina (HA) y se clonó en el vector de expresión pcDNA3.1 usando el kit de clonación ln-Fusion® ^h D (Clontech). Se usó el sistema de fusión para todas las etapas de clonación.

Se generaron varios constructos fusionando o bien el CMV o bien los promotores (p) humanos (h) de sinapsina (phSYN), enolasa específica de neuronas (phNSE), 1.255 pb del promotor de FXN (phFXN1255) o la isoforma 1 de fosfoglicerato cinasa humana (phPGK1) con la región codificante del gen FXN. Se añadieron elementos reguladores adicionales tales como el potenciador de CMV y las secuencias de Kozak al extremo 5' además de la secuencia de elemento reactivo de virus de la hepatitis de la marmota (WPRE) en el extremo 3'. Todos estos vectores de expresión generaron los constructos que se enumeran en la tabla 2.

También se generaron plásmidos que contenían la misma combinación de elementos reguladores para impulsar la expresión de luciferasa reemplazando la secuencia codificante de FXN por la secuencia codificante de luciferasa de luciérnaga (LUC) que se amplificó a partir del vector pGL3-LUC (Promega), también usando el kit de clonación In-Fusion® HD (Clontech). Estos plásmidos se enumeran en la tabla 3.

Ejemplo 2: Construcción y producción de vectores de virus adenoasociado recombinantes

Se clonaron los casetes de expresión de los plásmidos pcDNA3.1-phPGK-kFXN-HA-WPRE y pcDNA3.1-phPGK-kLUC-HA-WPRE en los sitios SnaBI-MfeI del vector de AAV9 recombinante (vector rAAV9-phPGK1-FXN-HA-WPRE y vector rAAV9-phPGK-LUC-WPRE). Además, se generó un vector nulo de control que carecía de la secuencia codificante de FXN (AAV2/9-Null). Los tres constructos y las partículas virales se generaron por la Unidad de Producción de Vectores en el Centro de Biotecnología Animal y de Terapia Génica (Universidad Autónoma de Barcelona). Los títulos finales obtenidos fueron 1,4 x 1013 gv/ml para AAV9-phPGK-FXN-HA-WPRE, 9,8 x 1012 gv/ml para AAV9-phPGK-LUC-WPRE y 6 x 1012 gv/ml para AAV2/9-NuII.

Ejemplo 3: 0ptimización de la expresión de frataxina

1. Cultivo celular, expresión in vitro y ensayo de indicador de luciferasa

Se cultivaron células de neuroblastoma de ratón (N₂a), células de neuroblastoma humano (SH-SY5Y) y células de riñón embrionario humano (HEK 293) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía suero bovino fetal al 10% (Sigma), glutamina 2 mM, 50 |ig/ml de penicilina/estreptomicina (Life technologies) a una confluencia del 70% en placas de cultivo de 10 cm. Las transfecciones se llevaron a cabo usando Lipofectamine 2000 (Life technologies) para las células N₂a y SH-SY5Y y fosfato de calcio para HEK 293 usando 4 |ig de ADN plasmídicos solo además de 0,25 |ig de EGFP. Tras la transfección, se reemplazó el medio por medio de cultivo DMEM nuevo para las células HEK y por suplemento B27 neurobasal, ácido retinoico 10 |iM, glutamina 2 mM, 50 |ig/ml de penicilina/estreptomicina para las células N₂a y SH-SY5Y. Cuarenta y ocho horas después de cambiar el medio de cultivo celular, se recogieron las células transfectadas con los plásmidos de expresión enumerados en la tabla 2 y se almacenaron a -80°C hasta su uso posterior. Para el ensayo de indicador de luciferasa, se transfectaron los plásmidos enumerados en la tabla 3 tal como se mencionó anteriormente y volvieron a sembrarse las células en placas de 384 pocillos y se determinó la actividad luciferasa usando el kit de ensayo de indicador de luciferasa dual según las instrucciones del fabricante (Promega).

2. SDS-PAGE e inmunotransferencia

Se extrajeron proteínas a partir de las células cultivadas mediante homogeneización en tampón de lisis RIPA: Tris-HCl 10 mM pH 7,4, NaCl 140 mM, desoxicolato de sodio al 0,1%, Triton X-100 al 1%, SDS al 1%, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 2 mM, fluoruro de sodio (NaF) 25 mM, NaV0³ 2,5 mM y cóctel de inhibidores de proteínas (Roche). Se determinó la concentración de proteína usando el ensayo de proteínas DC-BioRad (BioRad). Se mezclaron los extractos de proteína total con tampón de carga de muestra de proteína 4X (Li-Cor Biosciences) que contenía DTT 1 mM y se separaron mediante electroforesis sobre un gel de acrilamida al 15% a 20 mA constantes antes de la transferencia a membranas de PVDF. Los anticuerpos primarios usados fueron anticuerpo anti-FXN PAC 2518 (obsequio generoso de la Dra. Grazia Isaya, Mayo Clinic, Rochester MN), anticuerpo anti-FXN (1G2, Merck Millipore), anticuerpo anti-etiqueta de HA (clon 16B12, MMS-101P, Covance) y anticuerpo anti-actina beta (AC15, Sigma). Los anticuerpos secundarios conjugados con colorantes infrarrojos fueron anticuerpo anti-IgG de ratón con IRDye-800CW y anticuerpo anti-IgG de conejo con IRDye-700CW (Li-Cor Biosciences), y se detectó la inmunorreactividad usando el software v2.1 del analizador 0dyssey (Li-Cor Biosciences).

3. Resultados

Tal como puede observarse en las figuras 1-5 y en las tablas 2-3, la provisión de un constructo que comprende el promotor de hPGK1, secuencias de ligador (longitud y contenido) y el WPRE permitió la expresión de frataxina en células. El promotor de PGK1 humana es un promotor metabólicamente regulado expresado en tejidos fisiológicamente relevantes, lo que hace que sea un buen candidato como promotor para la frataxina. Sin embargo, los elementos reguladores o las secuencias/longitud de ligador que van a usarse para poder expresar las secuencias codificantes de frataxina no son claros. Al probar diferentes combinaciones de elementos y secuencias, los presentes resultados muestran que la expresión de proteína a partir de las secuencias codificantes de frataxina humana requiere la inclusión de un ligador operacionalmente funcional entre el promotor de hPGK1 y las secuencias codificantes de FXN, dado que los constructos que contienen una longitud de aproximadamente 105 nt permiten la expresión de FXN mientras que longitudes de ligador de alrededor 35 nt no lo permiten, incluso con la adición de la secuencia de estabilidad de ARN de WPRE. Curiosamente, este requisito del ligador sólo se observó cuando se usó el promotor de hPGK1 pero no con otros promotores sometidos a prueba (es decir, hSYN). Además, los niveles de proteína frataxina a partir de este vector son mucho menores que los obtenidos a partir de los vectores impulsados por los promotores de CMV o CAG incluso en ausencia de secuencias de WPRE, siendo de ese modo más comparables a los niveles endógenos. Una de las limitaciones de los enfoques previos es que, para poder obtener la expresión de frataxina, se han usado promotores de alto impulso tales como promotores de ^cA^g o CMV, lo que da como resultado niveles muy altos de expresión de proteína que pueden provocar estrés celular y anular algunos de los efectos protectores. El vector presentado en este caso puede impulsar la expresión de la proteína frataxina en tejidos relevantes periféricos y del sistema nervioso en cantidades dentro del intervalo fisiológicamente funcional. Tabla 2: Sumario de resultados. Niveles relativos de FXN después de la transfección con diferentes constructos

Tabla 3: Ensayo de indicador de constructos de frataxina y promotores de PGK1

Ejemplo 4: Datos in vivo

1. Animales

El modelo de ratón de ataxia de Friedreich YG8R desarrollado por Pook y colaboradores (Pook et al. 2001. Neurogenetics. 3(4):185-93; Virmouni et al., 2014. PLoS 0NE. 9(9):e107416) usado en este estudio se obtuvo del depósito de Jackson Laboratories (n.° de reserva 012253). Este modelo de ratón transgénico de FXN humana presenta la desactivación del gen de frataxina de ratón endógeno (Fxn -/-) y contiene el transgén YAC de FXN humana a partir del fundador YG8 (que porta dos copias en tándem del gen fXn humano con aproximadamente 82 y con 190 repeticiones de secuencia trinucleotídica GAA). Los ratones se alojaron con condiciones similares a SPF en jaulas NexGen Mouse IVC (Allentown, NJ) con un ciclo de 12 h de luz-oscuridad y con presión negativa, temperatura y humedad controladas, y acceso libre a agua y un pienso de roedor irradiado Teklad global con proteína al 18% (Envigo). La colonia de ratones YG8R se generó en el Instituto de Investigación en Ciencias de la Salud Germans Trias i Pujol (IGTP). En todos los experimentos se usaron ratones hembra y macho YG8R hemicigóticos (Tg/-) y WT ^c 57BI/6.

Los ratones hemicigóticos para el gen FXN humano mutante (YG8R) se genotiparon tal como se notificó previamente (29,36). Brevemente, se extrajo el ADN genómico a partir de la cola del ratón YG8R mediante el kit de purificación de ADN de cola de ratón Maxwell® 16 (Promega). Se determinó el número de copias de transgenes para cada ratón usando PCR cuantitativa (qPCR) en tiempo real en el instrumento LightCycler® 480 (Roche) usando SYBR Premix Ex Taq Il (Tli RNase H Plus) (Takara) y los siguientes cebadores para el transgén de frataxina humano: hFXN_Tg_FW: 5'-GAACTTCAAATTAGTTCCCCTTTCTTC-3' (SEQ ID N0: 7), hFXN_Tg_RV: 5'-CACAGCCATTCTTTGGGTTTC-3' (SEQ ID N0: 8); y la isoforma X1 de la apolipoproteína B-100 de control interno: IC_FW 5'-CACGTGGGCTCCAGCATT-3' (SEQ ID N0: 9), IC_RV: TCACCAGTCATTTCTGCCTTTG (SEQ ID N0: 10). El ensayo se realizó con condiciones de ciclación térmica: 95°C durante 5 minutos, y 40 ciclos de 95°C durante 20 segundos y 60°C durante 30 segundos, 72°C durante 30 segundos y finalmente 1 ciclo a 72°C durante 2 min. Las muestras se sometieron a ensayo por triplicado para cada gen de interés y se determinaron los niveles del transgén mediante el método de Ct (AACt). Se estimaron los números de copias de transgenes con respecto a los datos de Ct a partir de la muestra de control con un número de copias conocido. La longitud de repeticiones GAA se determinó mediante amplificación por PCR de GAA usando LA taq (Invitrogen) y los siguientes cebadores: GAA-F: 5'-GGGATTGGTT-GCCAGTGCTT-AAAAGTTAG-3' (SEQ ID N0: 11) y GAA-R: 5'-GATCTAAGGACCATCATGG-CCACACTTGCC-3' (SEQ ID N0: 12). Los productos de PCR se resolvieron en geles de agarosa al 1,5% mediante electroforesis a 100 V durante 3 horas y se analizaron los tamaños de banda. Luego se determinó el número de repeticiones GAA restando 451 pb (ADN no de repetición flanqueante) del tamaño de producto de PCR y dividiendo el tamaño de repeticiones de pares de bases restante entre 3.

Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo según las regulaciones de la UE y locales y fueron aprobados por los comités éticos locales apropiados.

2. Administración de AAV

Los ratones YG8R hemicigóticos y WT de 10 semanas de edad se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de ketamina (10 mg/kg de peso corporal; Imalgene 500; Rhóne-Merieux, Lyon, Francia) y xilazina (1 mg/kg de peso corporal; Rompun; Bayer). La administración intratecal de AAV9-phPGK-FXN-HA-WPRE, AAV9-phPGK-LUC-WPRE o AAV2/9-NuII se realizó en la región lumbar. Después de la exposición de la espina lateral, mediante disección del músculo paravertebral, se inyectaron lentamente los vectores virales en el LCR a través de una aguja de calibre 33 y una jeringa Hamilton entre las vértebras lumbares L3 y L4. El acceso apropiado al espacio intratecal se confirmó por el movimiento de la cola del animal. Después de eso, se suturaron el músculo y la piel. La cantidad administrada para cada ratón de los diferentes vectores virales fue de 4,6 x 10e-12 gv/kg de peso de ratón.

3. Biodistribución de vectores usando la obtención de imágenes con luciferasa

Para la evaluación in vivo de la biodistribución de vectores AAV9-phPGK-LUC-WPRE, a los ratones se les administró el vector por vía intratecal a las 10 semanas de edad (2,5 meses de edad), y 3,5 meses después, recibieron una única inyección intraperitoneal de disolución de sustrato de D-luciferina a 150 mg/kg de peso de ratón. Los ratones se anestesiaron 15 min después de la administración de sustrato mediante anestesia inhalada (isoflurano al 4% para la inducción y al 2% para el mantenimiento). Los ratones anestesiados se mantuvieron en la cámara oscura de Perkin Elmer Ivis Lumina Il (Caliper Life Sciences, Alemania) para registrar las emisiones de fotones. Las imágenes se analizaron con el software de obtención de imágenes Living (Xenogen Corporation, CA, EE.UU.) con un tiempo de integración de 1 min, un campo de visión de 12,5 cm. Para la evaluación ex vivo, se extrajeron tejidos y órganos de los ratones después de 15 min de administración de sustrato. Los tejidos y órganos se colocaron en placas transparentes y se capturaron imágenes usando el software de obtención de imágenes Living (Xenogen Corporation, CA, EE.^u U.) tal como antes. Los resultados pueden observarse en la figura 6.

4. qRT-PCR

Se extrajo ARN a partir de 30 mg de tejido de ratón recién congelado usando el minikit RNeasy (Qiagen). La cuantificación y el RIN del ARN se obtuvieron con un dispositivo Agilent 2200 TapeStation (Agilent). Se sometió a transcripción inversa el ARN para dar ADNc (25 ng/ul) usando el kit de reactivos PrimeScriptTM RT (Takara) con condiciones térmicas: 37°C durante 15 minutos, 85°C durante 5 segundos. La qRT-PCR se realizó con ADNc a partir de tejidos de ratón para someter a prueba los niveles de expresión de frataxina en un formato de placa de múltiples pocillos usando el instrumento LightCycler480 (Roche Diagnostics). Las mezclas de reacción contenían un volumen total de 10 |i l que consistía en 0,1 mM de cada cebador, 10 ng de ADNc y 5 |i l de TaqMan Universal Master Mix Il, sin UNG (Thermofisher Scientific). Las sondas de cebador para la detección de frataxina humana se diseñaron previamente por Bio-rad (dHsaCPE5031641, Bio-rad), los cebadores para el gen de mantenimiento de microglobulina beta-2 (B2m) para las muestras de ratones se diseñaron previamente por IDT (Mm.PT.39a.22214835; IDT). El ensayo se realizó con condiciones de ciclación térmica: 50°C durante 2 minutos, 95°C durante 10 minutos, y 40 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 1 minuto. Las muestras se sometieron a ensayo por triplicado para cada gen de interés y se determinaron los niveles mediante el método de Ct (AACt). Los resultados pueden observarse en la figura 7.

5. SDS-PAGE e inmunotransferencia

Se extrajeron proteínas a partir de tejido de ratón mediante homogeneización en tampón de lisis RIPA: Tris-HCl 10 mM pH 7,4, NaCl 140 mM, desoxicolato de sodio al 0,1%, Triton X-100 al 1%, SDS al 1%, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 2 mM, fluoruro de sodio (NaF) 25 mM, NaV0³ 2,5 mM y cóctel de inhibidores de proteínas (Roche). Se determinó la concentración de proteína usando el ensayo de proteínas DC-BioRad (BioRad). Se mezclaron los extractos de proteína total con tampón de carga de muestra de proteína 4X (Li-Cor Biosciences) que contenía DTT 1 mM y se separaron mediante electroforesis sobre un gel de acrilamida al 15% a 20 mA constantes antes de la transferencia a membranas de PVDF. Los anticuerpos primarios usados fueron anticuerpo anti-FXN PAC 2518 (obsequio generoso de la Dra. Grazia Isaya, Mayo Clinic, Rochester MN), anticuerpo anti-FXN (1G2, Merck Millipore), anticuerpo anti-etiqueta de HA (clon 16B12, MMS-101P, Covance) y anticuerpo anti-actina beta (AC15, Sigma). Los anticuerpos secundarios conjugados con colorantes infrarrojos fueron anticuerpo anti-IGg de ratón con IRDye-800CW y anticuerpo anti-IgG de conejo con IRDye-700CW (Li-Cor Biosciences), y se detectó la inmunorreactividad usando el software v2.1 del analizador 0dyssey (Li-Cor Biosciences). Los resultados pueden observarse en la figura 8.

6. Cierre

Se ha demostrado que el cierre de las patas traseras es un marcador de la evolución de la enfermedad en varios modelos de ratón de neurodegeneración. Cada ratón se levantó por la cola lejos de cualquier objeto circundante. La posición de las patas traseras se observó durante 10 segundos y se puntuó de la siguiente manera: si las patas traseras se extendían sistemáticamente hacia fuera, lejos del abdomen, se les asigna una puntuación de 0. Si una de las patas traseras se retrae hacia el abdomen durante más del 50% del tiempo en suspensión, recibe una puntuación de 1. Si ambas patas traseras se retraen parcialmente hacia el abdomen durante más del 50% del tiempo en suspensión, recibe una puntuación de 2. Si sus patas traseras se retraen completamente y tocan el abdomen durante más del 50% del tiempo en suspensión, recibe una puntuación de 3. El reflejo de cierre se evaluó cada 2 meses en ratones a partir de 4 meses de edad. Los resultados pueden observarse en la figura 9.

7. Electrofisiología

Se midieron la amplitud (uV) y la velocidad de conducción nerviosa (m/s) en el nervio caudal de la cola del ratón. Con los animales bajo anestesia inhalada (isoflurano al 2%), se situó la aguja de electrodo de estimulación por vía subcutánea en 4 puntos de estimulación diferentes (1 cm, 2 cm, 3 cm, 4 cm desde la punta de la cola) mientras que el punto de aguja de registro se fijó a los 6 cm desde la punta de la cola. Los valores se registraron con EMG/PE N-EP con 2 canales del aparato Medelec Synergy (Viasys, EE.UU.). Durante las pruebas electrofisiológicas, la temperatura de la piel de los animales se mantuvo por encima de 32°C. Los ratones se evaluaron cada 2 meses a partir de 4 meses de edad. Los resultados pueden observarse en la figura 10.

8. Resultados

Se propone que el tratamiento con AAV presentado sería eficaz como tratamiento para la FRDA porque puede expresarse en niveles tisulares fisiológicamente relevantes, muestra un procesamiento similar a la proteína endógena y puede mejorar significativamente las propiedades electrofisiológicas de las neuronas afectadas y los síntomas neurológicos en un modelo de ratón de FRDA (YG8R). La figura 6 muestra que el gen de luciferasa en el vector de AAV9 bajo los mismos elementos reguladores que la FXN en el vector AAV9-hPGK1-FXN cuando se inyecta por vía intratecal se expresa a lo largo de toda la médula espinal, en el cerebro, así como en los tejidos periféricos. Además, la expresión de una luciferasa bajo el mismo vector y los mismos elementos reguladores permanece de manera sistemática alrededor de al menos 7 meses después de la inyección (datos no mostrados). Dado que los niveles disminuidos de frataxina subyacen a la mayoría, si no a todos los síntomas en FRDA, y los portadores de individuos para la mutación que expresan niveles >25% de frataxina están libres de síntomas de FRDA, un pequeño aumento en la expresión de FXN debe poder prevenir o mejorar significativamente los síntomas en pacientes con FRDA. Sin embargo, niveles muy altos de expresión de FXN o cualquier otra proteína pueden inducir efectos celulares y eventualmente disminuir los efectos protectores o incluso empeorar los síntomas. Por tanto, es de interés desarrollar un vector de expresión de FXN que dé como resultado niveles lo más similares posible a los de la proteína FXN endógena. Por tanto, se desarrolló un vector (AAV9-hPGK1-FXN) que permite la expresión de FXN bajo un promotor metabólicamente regulado en niveles fisiológicamente relevantes y su administración por vía intratecal en ratones YG8R hemicigóticos (Tg/-) de 10 semanas de edad. Se detectaron mayores niveles de ARNm de FXN en los ratones YG8R hemicigóticos (Tg/-) 3,5 meses después de la inyección intratecal del vector AAV9-PGK1-FXN en comparación con ratones no inyectados tanto en el hígado como en la porción torácica de la médula espinal (0,5 y 2 veces, respectivamente; figura 7). Estos fueron iguales a o menores que en los ratones YG8R homocigóticos que mostraron 0,5 y 3 veces en la médula espinal, respectivamente, en comparación con los ratones YG8R hemicigóticos. Esto indica que este vector que codifica para FXN inyectado en la región intratecal L3-L4 se absorbió y expresó en las neuronas de la médula espinal torácica o bien por transporte retrógrado o bien a medida que difunde a través del líquido espinal. También se observó que el vector de AAV9 administrado por vía intratecal también puede atravesar la barrera hematoencefálica y alcanzar tejidos periféricos tales como el hígado, el corazón, etc. (figura 6), y es capaz de expresar el ARNm de hFXN a partir del vector inyectado (figura 7).

También se analizaron los niveles de expresión de proteína FXN a partir del vector recombinante desarrollado. Aunque el anticuerpo usado muestra una mayor afinidad por la proteína FXN humana, tal como se observa por el patrón de proteína obtenido después de 1 hora frente a la incubación durante la noche de la transferencia con el anticuerpo primario anti-FXN, la figura 8 muestra que los niveles de la proteína FXN expresada a partir de vector rAAV9-pGKl-FXN parecen similares a los niveles de FXN de ratón en los ratones WT (figura 8A, carriles 3 frente a 4 y segundo panel de la figura 8B, carriles 3 frente a 4 y 5 frente a 6 y 7). Notablemente, también pudo detectarse la proteína fXn recombinante en la región de la corteza motora (C1) del cerebro de ratón (figura 8B, carril 7). Esto indica que la administración del presente vector mediante inyección intratecal en la región lumbar de la médula espinal da como resultado la distribución del vector a lo largo de todas las regiones motoras del SNC. Además, parece que la proteína recombinante se procesa en un patrón similar a la proteína FXN de tipo natural, siendo la forma intermedia y madura la forma procesada más prominente.

Además, se analizó el fenotipo de los ratones YG8R hemicigóticos (Tg/-) tratados con el vector rAAV9-PGK1-FXN en comparación con el vector rAAV9-Null para determinar el reflejo neurológico de cierre y las propiedades electrofisiológicas del nervio caudal. Se ha demostrado que el reflejo de cierre está implicado en varios trastornos neurodegenerativos. Este reflejo parece que implica las rutas motoras sensoriales y también las espinales que regulan los movimientos de las patas delanteras y traseras. En particular, se ha demostrado que están implicadas las rutas cerebelo-cortico-reticulares. Por tanto, para determinar el efecto del tratamiento con el vector rAAV9-hPGK1-FXN sobre estas rutas en los ratones YG8R, se cuantificó el reflejo de cierre a diferentes tiempos tras la inyección intratecal del vector (véase la sección de métodos). La figura 9 muestra que los ratones YG8R tratados con cualquiera de los vectores AAV9-Null y AAV9-FXN muestran defectos de cierre tan pronto como a los cuatro meses de edad (1,5 meses después de la inyección intratecal). Sin embargo, con el tiempo, el reflejo de cierre se normaliza en los ratones tratados con AAV-FXN para asemejarse más a los reflejos de los ratones WT incluso más a los 10 meses de edad (6,5 meses después de la inyección). Esto sugiere que hay anomalías tempranas en el sistema sensorial y cerebelo-cortico-reticular en el modelo de ratón de FRDA que se mejoran significativamente o revierten mediante el tratamiento con el vector AAV-FXN.

Para determinar más específicamente los efectos del tratamiento sobre las neuronas sensoriales, se determinaron

Claims (12)

REIVINDICACI0NES

1. Vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende un ácido nucleico, en el que el ácido nucleico comprende:

(i) una secuencia de ácido nucleico que codifica para frataxina;

(ii) un promotor de fosfoglicerato cinasa (PGK) que consiste en SEQ ID N0: 1; y

(iii) un elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE);

en el que (ii) y (iii) están unidos operativamente a y regulan la expresión de (i), en el que hay un ligador operacionalmente funcional entre (i) y (ii), en el que dicho ligador consiste en SEQ ID N0: 6, y en el que el vector de AAV es un vector de serotipo 9 de AAV.

2. Vector según la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica para frataxina comprende SEQ ID N0: 3, o una secuencia que es al menos el 90% idéntica a SEQ ID N0: 3 y es una variante funcional de frataxina.

3. Vector según la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica para frataxina consiste en SEQ ID N0: 3, o una secuencia que es al menos el 98% idéntica a SEQ ID N0: 3 y es una variante funcional de frataxina.

4. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el WPRE consiste en SEQ ID N0: 2 o una secuencia que es al menos el 90% idéntica a SEQ ID N0: 2.

5. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el WPRE consiste en SEQ ID N0: 2 o una secuencia que es al menos el 99% idéntica a SEQ ID N0: 2.

6. Vector según la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica para frataxina consiste en SEQ ID N0: 3, y el WPRE consiste en SEQ ID N0: 2 o una secuencia que es al menos el 90% idéntica a SEQ ID N0: 2.

7. Vector según la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica para frataxina consiste en SEQ ID N0: 3, y el WPRE consiste en SEQ ID N0: 2 o una secuencia que es al menos el 99% idéntica a SEQ ID N0: 2.

8. Vector según la reivindicación 1, en el que la secuencia del ácido nucleico que comprende (i), (ii), (iii) y el ligador consiste en SEQ ID N0: 4.

9. Vector de transferencia que comprende un ácido nucleico que comprende:

(i) una secuencia de ácido nucleico que codifica para frataxina;

(ii) un promotor de PGK que consiste en SEQ ID N0: 1; y

(iii) un WPRE;

en el que (ii) y (iii) están unidos operativamente a y regulan la expresión de (i), en el que hay un ligador operacionalmente funcional entre (i) y (ii), y en el que dicho ligador consiste en SEQ ID N0: 6, y en el que el vector de transferencia comprende además elementos de ácido nucleico adicionales para fomentar la integración o transposición del vector de transferencia en un vector de serotipo 9 de AAV.

10. Composición farmacéutica que comprende el vector de AAV según una cualquiera de las reivindicaciones

1-8 y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

11. Vector de AAV según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para su uso como medicamento.

12. Vector de AAV según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para su uso en el tratamiento de ataxia de

Friedreich.