JP4465148B2 - Ｎｏｇｏレセプターホモログ - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、神経学および分子生物学に関する。より詳細には、本発明は、ＣＮＳニューロンおよび軸索成長に関する。
【０００２】
（背景）
生物の細胞が互いに連絡し、そしてその環境から情報および刺激を獲得する機構の中には、細胞表面に発現される細胞膜レセプター分子を介した機構が存在する。多くのこのようなレセプターが同定され、特徴付けられ、そして時折、構造モチーフおよびシグナル伝達特徴に基づいて、主要なレセプタースーパーファミリーに分類されている。これらのレセプターは、細胞外シグナルを細胞の生理学的応答に変換するための最初の重要な連結部である。
【０００３】
ニューロン上のレセプターは、胚発生の間の神経系の発生において特に重要である。ニューロンは、レセプター媒介性のプロセスにおいて、標的細胞に向うニューロンの軸索伸長によって、発生の間に標的細胞との接続を形成する。軸索および樹状突起は、成長円錐として公知の遠位先端の特殊化した領域を有する。成長円錐は、ニューロンが、レセプター媒介性プロセスによって局所的環境を感知し、そしてニューロンの標的細胞に向かう、ニューロンの軸索または樹状突起の移動を指向することを可能にする。このプロセスは、伸長として公知である。成長円錐は、いくつかのガイダンスキュー（例えば、表面接着、増殖因子、神経伝達物質および電場）に感受性であり得る。円錐での成長のガイダンスは、種々のクラスの接着分子、細胞間シグナル、ならびに成長円錐を刺激および阻害する因子に依存する。
【０００４】
興味深いことに、損傷したニューロンは、外傷または疾患に起因する損傷後の中枢神経系（ＣＮＳ）において伸長しないが、一方で、末梢神経系（ＰＮＳ）において軸索は、容易に再生する。損傷したＣＮＳニューロンが伸長できないという事実は、ＣＮＳ軸索の固有の特性に起因せず、むしろ軸索伸長について許容性でないＣＮＳ環境に起因する。Ａｇｕａｙｏおよび共同研究者ら（例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ ２８４、２６４−２６５）による古典的な移植実験は、ＣＮＳ軸索が、末梢神経移植片内のかなりの距離を実際に伸長し得ること、およびＣＮＳミエリンが、ＣＮＳ軸索伸長を阻害することを実証した。従って、適切な環境を与えると、ＣＮＳ軸索は再生し得、このことは、ＣＮＳ軸索損傷が、ＣＮＳ環境の適切な操作によって、潜在的に対処され得ることを含意する。
【０００５】
損傷後の軸索再生の非存在は、軸索成長インヒビターの存在に起因し得る。これらのインヒビターは、ミエリンと優先的に会合し、そして再生のための重要な障壁をなす。軸索成長インヒビターは、ＣＮＳ由来のミエリンおよびＣＮＳにおいてミエリンを合成する稀突起神経膠細胞の原形質膜に存在する（Ｓｃｈｗａｂら、（１９９３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６、５６５−５９５）。ミエリン会合インヒビターは、軸索の継続性の妨害後の、インビボのＣＮＳ軸索再生の失敗の主な寄与因子であるようであるが、ＣＮＳ中の他の非ミエリン会合軸索増殖インヒビターは、ＣＮＳにおいてあまり役割を果たさないかもしれない。これらのインヒビターは、外傷、発作またはウイルス感染に起因する神経損傷後の軸索再生をブロックする。
【０００６】
多数のミエリン由来の軸索成長インヒビターが特徴付けされている（総説については、Ｄａｖｉｄら、（１９９９）ＷＯ９９５３９４５４７；Ｂａｎｄｍａｎら、（１９９９）米国特許第５，８５８，７０８号；Ｓｃｈｗａｂ、（１９９６）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２１、７５５−７６１を参照のこと）。ＣＮＳ白質のいくつかの成分（ＮＩ３５、ＮＩ２５０（Ｎｏｇｏ）およびミエリン会合糖タンパク質（ＭＡＧ）（これらは、軸索伸長について、阻害的活性を有する））が、同様に記載されている（Ｓｃｈｗａｂら、（１９９０）ＷＯ９００５１９１；Ｓｃｈｗａｂら、（１９９７）米国特許第５，６８４，１３３号）。特に、Ｎｏｇｏは、２５０ｋＤａのミエリン会合軸索成長インヒビターであり、これは、元々、インビトロで精製されたタンパク質およびこのタンパク質の活性を中和するモノクローナル抗体の効果に基づいて、特徴付けられた（Ｓｃｈｗａｂ（１９９０）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１０９、２−５）。Ｎｏｇｏ ｃＤＮＡは、脳のｃＤＮＡの無作為分析によって最初に同定され、機能は示唆されなかった（Ｎａｇａｓｅら、（１９９８）ＤＮＡ Ｒｅｓ．５、３５５−３６４）。２５０ｋＤａのミエリン会合軸索成長インヒビターをコードするｃＤＮＡとしての、このＮｏｇｏ ｃＤＮＡの同定は、ほんの最近発見された（ＧｒａｎｄＰｒｅら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０３、４３９−４４４；Ｃｈｅｎら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４３０、４３４−４３９；Ｐｒｉｎｊｈａら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０３、３８３−３８４）。
【０００７】
重要なことに、Ｎｏｇｏは、軸索伸長および再生の阻害を担うＣＮＳミエリンの主な成分であることが示された。稀突起神経膠細胞によるが、シュワン細胞（この細胞は、Ｐ．Ｓ．軸索をミエリン化する）によらない、Ｎｏｇｏの選択的発現は、Ｐ．Ｓ．ミエリンとは対照的に、ＣＮＳミエリンの阻害効果と一致する（ＧｒａｎｄＰｒｅら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０３、４３４−４３９）。培養物において、Ｎｏｇｏは、軸索伸長を阻害し、そして成長円錐崩壊を生じる（Ｓｐｉｌｌｍａｎｎら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、１９２８３−１９２９３）。Ｎｏｇｏに対する抗体（例えば、ＩＮ−１）は、インビトロの軸索成長に対するＣＮＳミエリンの阻害作用のほとんどをブロックすることが示された（Ｓｐｉｌｌｍａｎｎら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、１９２８３−１９２９３）。これらの実験は、Ｎｏｇｏが、培養物中で軸索伸長の阻害を担うＣＮＳミエリンの主要成分であることを示す。さらに、インビボで、ＩＮ−１抗体は、脊髄損傷後の軸索再生を増強し、接触配置（ｃｏｎｔａｃｔ ｐｌａｃｉｎｇ）およびストライド長（ｓｔｒｉｄｅ ｌｅｎｇｔｈ）のような挙動の回復を生じる（ＳｃｈｎｅｌｌおよびＳｃｈｗａｂ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４３、２６９−２７２；Ｂｒｅｇｍａｎら、（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７８、４９８−５０１）。従って、Ｎｏｇｏが疾患関連の分子標的であるという実質的な証拠が存在する。レセプターに対するＮｏｇｏの結合を妨害する薬剤は、軸索が損傷された臨床的状態において軸索再生を改善し、そして患者の結果を改善することが期待される。
【０００８】
Ｎｏｇｏの調節は、ＣＮＳの外傷、梗塞および変性疾患（Ｓｃｈｗａｂら、（１９９４）ＷＯ９４１７８３１；Ｔａｔａｇｉｂａら、（１９９７）Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ ４０、５４１−５４６）ならびにＣＮＳにおける悪性腫瘍（例えば、膠芽腫）（Ｓｃｈｗａｂら、（１９９３）米国特許第５，２５０，４１４号；Ｓｃｈｗａｂら、（２０００）米国特許第６，０２５，３３３号）によって損傷されたニューロンの再生の処置のための手段として記載されてきた。
【０００９】
Ｎｏｇｏを認識する抗体は、ＣＮＳの外傷、梗塞および変性疾患から生じる神経損傷の診断および処置において有用であることが示唆されている（Ｓｃｈｎｅｌｌ＆Ｓｃｈｗａｂ、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４３、２６９−２７２；Ｓｃｈｗａｂら、（１９９７）米国特許第５，６８４，１３３号）。ＣＮＳ軸索について、ミエリンの存在と長距離にわたる軸索再生の阻害との間に相関が存在する（ＳａｖｉｏおよびＳｃｈｗａｂ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７、４１３０−４１３３；Ｋｅｉｒｓｔｅａｄら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９、１１６６４−１１６６８）。Ｎｏｇｏが抗体によってブロックされた後、ニューロンは、再び神経損傷によって引き起こされた病変を横切って伸長し得る（ＳｃｈｎｅｌｌおよびＳｃｈｗａｂ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４３、２６９−２７２）。
【００１０】
（発明の要旨）
マウスおよびヒトにおいて、Ｎｏｇｏレセプター（ＮｇＲ１）のホモログ（ＮｇＲ２およびＮｇＲ３）をコードする遺伝子が発見されている。ＮｇＲ２遺伝子およびＮｇＲ３遺伝子によってコードされるポリペプチド中の種々のドメインが同定され、そしてマウスおよびヒトのＮｇＲ１ポリペプチドのドメインと比較されている。この比較によって、タンパク質のファミリー（ＮｇＲファミリー）を特徴付けるコンセンサス配列（ＮｇＲコンセンサス配列）が同定された。これらおよび他の発見に基づいて、本発明は、ＣＮＳニューロンにおいて軸索の成長を調節するための分子および方法を特徴とする。
【００１１】
本発明は、アミノ酸配列：
【００１２】
【化４】

からなる、トリプトファンリッチなＬＲＲＣＴドメインを含むポリペプチドを含むポリペプチドを提供し、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸またはギャップであり、そしてこのポリペプチドは、配列番号５（ヒトＮｇＲ１）の残基２６０〜３０９のアミノ酸配列も配列番号１７（マウスＮｇＲ１）の残基２６０〜３０９のアミノ酸配列も含まない。
【００１３】
好ましくは、Ｘ１７およびＸ２３は、（独立して）アルギニンまたはリジンである。いくつかの実施形態において、ＬＲＲＣＴドメインのアミノ酸配列は、配列番号２の残基２６１〜３１０、または１０個までの保存的置換を含む配列番号２の残基２６１〜３１０である。いくつかの実施形態において、このポリペプチドは、以下のＮＴＬＲＲＣＴアミノ酸配列：
【００１４】
【化５】

を含み、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸残基またはギャップであり、そしてこのポリペプチドは、配列番号５（ヒトＮｇＲ１）のポリペプチドでも配列番号１７（マウスＮｇＲ１）のポリペプチドでもない。例えば、Ｘ_６、Ｘ_３７およびＸ_３８は、ギャップを表し得る。本発明のポリペプチドの特定の例は、配列番号２（ヒトＮｇＲ２）、配列番号４（マウスＮｇＲ３）および配列番号１４（ヒトＮｇＲ３）である。いくつかの実施形態において、このポリペプチドは、以下を含む：（ａ）ＮＴＬＲＲＣＴドメインおよび（ｂ）完全未満のＣＴＳドメイン（但し、部分ＣＴＳドメイン（存在する場合）は、ＣＴＳドメインの最初の３９アミノ酸以下からなる）。このポリペプチドは、機能的ＧＰＩドメインを含み得るが、機能的ＧＰＩドメインは、存在しなくてもよい（例えば、可溶性ポリペプチドが所望される場合）。本発明のポリペプチドは、必要に応じて、異種ポリペプチド（例えば、抗体のＦｃ部分）のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
本発明はまた、上記ポリペプチドをコードする核酸；その核酸を含むベクター（この核酸は、発現制御配列に作動可能に連結され得る）；およびそのベクターを含む形質転換された宿主細胞、を提供する。本発明のポリペプチドを産生する方法もまた、提供される。この方法は、上記ポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞に導入する工程、このポリペプチドの発現に適切な条件下でこの細胞を培養する工程、およびこのポリペプチドを回収する工程を包含する。
【００１６】
本発明はまた、そのヌクレオチド配列が、以下からなる群より選択されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的である、アンチセンス分子を提供する：配列番号２の残基３１１〜３９５からなるポリペプチド、配列番号１４の残基２５６〜３９６からなるポリペプチド、および配列番号４の残基３２１〜４３８からなるポリペプチド。ここで、この核酸は、８〜１００ヌクレオチド長（例えば、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０ヌクレオチド）である。本発明はまた、このようなアンチセンス分子をコードする核酸を提供する。
【００１７】
本発明はまた、上記ポリペプチドに結合する抗体を提供する。本発明のポリペプチドまたは抗体は、そのポリペプチドまたは抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物に処方され得る。
【００１８】
本発明はまた、ＣＮＳニューロンの軸索成長の阻害を減少するための方法を提供する。この方法は、本発明のポリペプチドまたは抗体の治療有効量をそのニューロンに接触させる工程を包含する。本発明はまた、中枢神経系の疾患、障害または損傷を処置するための方法を提供する。この方法は、本発明のポリペプチドまたは抗体の治療有効量を哺乳動物（例えば、ヒト）に投与する工程を包含する。本発明の分子および方法を使用して処置され得る例示的疾患、障害および損傷としては、大脳損傷、脊髄損傷、発作、脱髄疾患（例えば、多発性硬化症）、単語症脱髄、脳脊髄炎、多病巣性白質脳症、汎脳炎、マルキアファーヴァ−ビニャーミ病、海綿状変性、アレグザンダー病、キャナヴァン病、異染性白質萎縮症およびクラッベ病が挙げられる。
【００１９】
本発明はまた、本発明のポリペプチドに結合する分子を同定するための方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）本発明のポリペプチドを提供する工程；（ｂ）候補分子にこのポリペプチドを接触させる工程；および（ｃ）そのポリペプチドへの候補分子の結合を検出する工程。
【００２０】
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本出願（定義を含めて）が優先する。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許および他の参考文献は、参照として援用される。
【００２１】
以下に示される材料、方法および実施例は、単に例示的であり、限定することを意図されない。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＮｇＲホモログ（本明細書中でＮｇＲと呼ばれる）をコードする精製ポリヌクレオチドおよび単離されたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列およびＲＮＡ転写物（センス鎖および相補的アンチセンス鎖の両方、一本鎖および二本鎖の両方）（そのスプライス改変体を含む））を提供する。他に示されない限り、本明細書中で使用される場合、小文字の略語（ＮｇＲ）は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸配列をいい、大文字バージョン（ＮｇＲ）は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、オリゴペプチドまたはアミノ酸配列をいう。特定のタンパク質は、番号によって示され、例えば、「ＮｇＲ２」は、ヒトＮｇＲホモログ、「ＮｇＲ３」は、マウス由来ＮｇＲホモログ、そして「ＮｇＲ１」は、Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ博士によって同定された公知のＮｇＲホモログである。公知のＮｇＲは、本明細書中で「ＮｇＲ」という。本発明のＤＮＡポリヌクレオチドには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および全部または一部が化学合成されたＤＮＡが含まれる。
【００２３】
当業者に公知の組換えＤＮＡ技術の一般原理を示す標準的な参照研究としては、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｋａｕｆｍａｎら編、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ（１９９５）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ編、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）が挙げられる。
【００２４】
本明細書中に使用される場合、用語「軸索」は、ニューロンからの長い細胞の突出をいい、それによって、活動電位が、細胞体へまたは細胞体から伝導される。
【００２５】
本明細書中に使用される場合、用語「軸索成長」は、長い突起または軸索の伸長をいい、細胞体で発生し、そして成長円錐に続く。
【００２６】
本明細書中に使用される場合、用語「中枢神経系障害」は、中枢神経系（ＣＮＳ）の異常な機能に関連する任意の病理学的状態をいう。この用語は、脳組織に対する物理的外傷、ウイルス感染、自己免疫機構および遺伝的変異から生じる、変化されたＣＮＳ機能を含むが、これに限定されない。
【００２７】
本明細書中に使用される場合、用語「脱髄性疾患」は、稀突起膠細胞の細胞膜のミエリン鞘の変性によって特徴付けられる病理学的障害をいう。
【００２８】
本明細書中に使用される場合、用語「成長円錐」は、局所的環境の感知およびその適切なシナプスの標的細胞への軸索の移動を担う、成長する神経突起の先端の特定の領域をいう。
【００２９】
本明細書中に使用される場合、用語「成長円錐移動」は、ニューロンの標的細胞へ向かう成長円錐の伸長または崩壊をいう。
【００３０】
本明細書中に使用される場合、用語「神経突起」は、ニューロンから成長する突起のことをいう。培養物中で樹状突起と軸索を区別することは時折困難であるので、この用語「神経突起」は、両方について使用される。
【００３１】
本明細書中に使用される場合、用語「稀突起膠細胞」は、その機能がＣＮＳ軸索を有髄化することであるＣＮＳの神経膠細胞をいう。
【００３２】
本明細書中で使用され、そして当該分野で理解されるように、用語「合成（された）」とは、酵素的方法とは対照的に、純粋に化学的に生成されたポリヌクレオチドをいう。従って、「全体的に」合成されたＤＮＡ配列は、その全体が化学的手段によって生成され、そして「部分的に」合成されたＤＮＡは、その得られたＤＮＡの一部分のみが化学的手段によって生成されたＤＮＡを包含する。用語「領域」によって、生体分子の一次構造の物理的に連続した部分を意味する。タンパク質の場合、領域は、そのタンパク質のアミノ酸配列の連続した部分によって定義される。用語「ドメイン」は、本明細書中で、生体分子の既知の機能または推測されている機能に寄与する、その生体分子の構造部分をいうものとして定義される。ドメインは、領域またはその部分と同じ広がりを有し得；ドメインはまた、その領域の全てまたは一部に加えて、特定の領域と区別される生体分子の一部を組み込み得る。ＮｇＲタンパク質ドメインの例としては、シグナルペプチド、細胞外（すなわち、Ｎ末端）ドメイン、ロイシンリッチ反復ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「活性」とは、結合（直接的または間接的のいずれか）を示唆または明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が、挙げられる。このような活性は、Ｎｏｇｏに対するＮｇＲ１結合の競合阻害のようなアッセイによって測定され得、ここで、例えば、未標識の可溶性ＮｇＲ２が、漸増濃度でアッセイ系に添加され、ＣＨＯ細胞の表面上に発現されたＮｇＲ１に対するＮｏｇｏの結合を阻害する。別の例として、ＮｇＲ機能の生物学的指標としての種々の形態のＮｇＲ２および／またはＮｇＲ３によるＮｏｇｏの阻害後の、神経損傷（ＳｃｈｎｅｌｌおよびＳｃｈｗａｂ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４３、２６９−２７２のような）によって引き起こされた病変を横切って伸長するニューロンの能力を評価し得る。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、完全なインタクトな抗体、ならびにそのＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、および他のフラグメントをいう。完全なインタクトな抗体には、モノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）、キメラ抗体、抗イディオタイプ抗体、抗抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体が挙げられる。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「結合」は、２つのタンパク質もしくは化合物または関連するタンパク質もしくは化合物の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「化合物」は、任意の識別可能な化学物質または分子を意味し、これらには、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、または核酸が挙げられるが、これらに限定されず、そしてこのようか化合物は、天然性または合成性であり得る。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「相補的」とは、核酸分子のヌクレオチド単位間のワトソン−クリック塩基対をいう。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「接触（させる）」とは、化合物を、直接的にかまたは間接的にかのいずれかで、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して物理的に近接させることを意味する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液などに存在し得る。接触とは、核酸分子あるいはＮｇＲまたはそのフラグメントをコードするポリペプチドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ（例えば、遺伝子チップ）などに化合物を置くことが挙げられる。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、句「相同ヌクレオチド配列」または「相同アミノ酸配列」あるいはそのバリエーションとは、少なくとも特定化されたパーセンテージのヌクレオチドレベルでの同一性またはアミノ酸レベルでの相同性によって特徴付けられる配列である。相同ヌクレオチド配列としては、タンパク質のアイソフォームをコードするヌクレオチド配列が挙げられる。このようなアイソフォームは、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの結果として同じ生物の異なる組織中に発現され得る。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によってコードされ得る。相同ヌクレオチド配列としては、哺乳動物を含むがこれらに限定されない、ヒト以外の種のタンパク質をコードするヌクレオチド配列が挙げられる。相同ヌクレオチド配列にはまた、本明細書中に示されるヌクレオチド配列の天然に存在する対立遺伝子バリエーションおよび対立遺伝子変異が含まれるが、これらに限定されない。しかし、相同ヌクレオチド配列には、ＮｇＲ１をコードするヌクレオチド配列が含まれない。相同アミノ酸配列としては、保存的アミノ酸置換を含み、そしてそのポリペプチドが同じ結合および／または活性を有する、アミノ酸配列が挙げられる。しかし、相同アミノ酸配列には、他の公知のＮｇＲをコードするアミノ酸は含まれない。相同性％は、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ，Ｍａｔｈ、１９８１、２、４８２−４８９（その全体が参考として本明細書中に援用される））を使用するＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）（デフォルト設定を使用して）によって決定され得る。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「単離された」核酸分子とは、天然で関連する他のタンパク質をコードする核酸を実質的に含まない核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）（すなわち、そのネイティブ環境から取り出された核酸）をいう。単離された核酸分子の例としては、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子、異種宿主細胞中に維持される組換えＤＮＡ分子、部分的または実質的に精製された核酸分子、および合成ＤＮＡまたはＲＮＡ分子が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、「単離された」核酸は、この核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中でこの核酸に天然に隣接する配列（すなわち、この核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、種々の実施形態で、単離されたＮｇＲ核酸分子は、この核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中でこの核酸に天然で隣接する、約５０ｋｂ、２５ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得る。さらに、「単離された」核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ分子は、組換え技術により産生される場合、他の細胞物質または培養培地を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合、化学物質前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないものであり得る。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、用語「異種」とは、異なる配列または対応しない配列、あるいは異なる種由来の配列である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列をいう。例えば、マウスＮｇＲのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、ヒトＮｇＲのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して異種であり、そしてヒトＮｇＲの核酸配列またはアミノ酸配列は、ヒト免疫グロブリンのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して異種である。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「可溶性ＮｇＲポリペプチド」は、それ自体が膜中に係留していないＮｇＲポリペプチドである。このような、可溶性ポリペプチドとしては、例えば、そのポリペプチドを係留するのに十分なそのＧＰＩアンカーシグナルの部分を欠いているか、または、そのＧＰＩアンカーシグナルがＧＰＩアンカーでのそのポリペプチドの置換を生じるに十分でないように改変されている、ＮｇＲ２ポリペプチドおよびＮｇＲ３ポリペプチドが挙げられる。好ましい実施形態において、５、１０、２０または２５アミノ酸までが、ＮｇＲ２またはＮｇＲ３のＣ末端から除去され、各タンパク質を可溶性にする。本明細書中で使用される場合、可溶性ＮｇＲポリペプチドとしては、全長ＮｇＲまたは短縮型（例えば、内部欠失を有する）ＮｇＲが挙げられる。
【００４３】
可溶性ＮｇＲポリペプチドとしては、推定ＧＰＩシグナル配列までの全ＮｇＲタンパク質（例えば、ＮｇＲ２のアミノ酸１〜およそアミノ酸３９５およびＮｇＲ３のアミノ酸１〜およそアミノ酸４３８）を含み得る。他の実施形態において、これらのタンパク質のシグナルペプチドは、除去され得るかまたは短縮化され得る（例えば、配列番号２のアミノ酸１〜およそアミノ酸３０にわたる、ＮｇＲ２のシグナル配列の全てまたは一部が、除去され得る；配列番号４のアミノ酸１〜およそアミノ酸４０にわたる、ＮｇＲ３のシグナル配列の全てまたは一部が、除去され得る）。いくつかの実施形態において、成熟ＮｇＲ２（配列番号８）および成熟ＮｇＲ３（配列番号９）が使用される。
【００４４】
可溶性ＮｇＲポリペプチドとしては、ＮｇＲの推定リガンド結合部分（第１のシステインリッチ領域（配列番号１０）、ロイシン反復領域（配列番号１２）および第２のシステインリッチ領域（配列番号１１））の少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、可溶性ＮｇＲポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜およそアミノ酸３９５または配列番号４のアミノ酸１〜およそアミノ酸４３８からなる。
【００４５】
他の実施形態において、可溶性ＮｇＲポリペプチドは、融合タンパク質であり、この融合タンパク質は、成熟ＮｇＲ２のアミノ酸３０〜およそアミノ酸３９５またはＮｇＲ３のアミノ酸４０〜およそアミノ酸４３８、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のＣ末端の１０アミノ酸（鎖間ジスルフィド結合に関与すると考えられる２つのシステイン残基を含む）、ならびにヒトＩｇＧＩ重鎖定常ドメインのＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む。この型の組換えタンパク質は、ＮｇＲ１へのＮｏｇｏリガンド結合の阻害を介するか、または、ＮｇＲのリガンドを細胞表面ＮｇＲとの相互作用から阻害することによって、軸索伸長の阻害を調節するように設計される。この融合体のＮｇＲ部分は、Ｎｏｇｏリガンドに結合し、そしてＩｇＧ１部分は、ＦｃγＲＩ（マクロファージ）レセプターおよびＦｃγＩＩＩ（ＮＫ細胞および好中球）レセプターに結合する。
【００４６】
本発明において有用な可溶性ポリペプチドの産生は、当該分野で公知の種々の方法によって達成され得る。例えば、ポリペプチドは、エキソペプチダーゼ、エドマン分解またはその両方と組み合わせて特定のエンドペプチダーゼを使用することによるタンパク質分解によって、インタクトな膜貫通ＮｇＲ分子から誘導され得る。このインタクトなＮｇＲ分子は、従来の方法を使用して、その天然の供給源から精製され得る。あるいは、インタクトなＮｇＲは、ｃＤＮＡ、発現ベクターおよび組換え遺伝子発現のための周知技術を使用する、公知の組換えＤＮＡ技術によって生成される。
【００４７】
好ましくは、本発明において有用な可溶性ポリペプチドは、直接的に産生され、従って、出発材料としてのＮｇＲ全体の必要性を排除する。これは、従来の化学合成技術によって達成され得るか、または周知の組換えＤＮＡ技術（ここで、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列のみが形質転換された宿主で発現される）によって達成され得る。例えば、所望の可溶性ＮｇＲポリペプチドをコードする遺伝子は、オリゴヌクレオチド合成機を使用する化学的手段によって合成され得る。このようなオリゴヌクレオチドは、所望の可溶性ＮｇＲポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計される。所望のペプチドをコードする特定のＤＮＡ配列はまた、特定の制限エンドヌクレアーゼフラグメントの単離によってか、またはｃＤＮＡからの特定の領域のＰＣＲ合成によって、全長ＤＮＡ配列から誘導され得る。
【００４８】
本発明の核酸分子（例えば、配列番号１、３のヌクレオチド配列、またはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの相補体を有する、核酸分子）は、標準的な分子生物学技術および本明細書中に提供される配列情報を使用して単離され得る。配列番号１または３の核酸配列の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、ＮｇＲ核酸配列は、標準的なハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら、（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３に記載されるように）を使用して単離され得る。
【００４９】
本発明の核酸は、テンプレートとしてのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ、および適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って、増幅され得る。そのように増幅された核酸分子は、適切なベクターにクローニングされ得、そしてＤＮＡ配列分析によって特徴付けされ得る。さらに、ＮｇＲヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術によって（例えば、自動化ＤＮＡ合成機を使用して）調製され得る。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、用語「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」または「改変する（ｍｏｄｉｆｙ）」は、特定の活性またはタンパク質の量、質または効果における増加または減少を意味する。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」とは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用されるのに十分な数の塩基を有する、一連の連結されたヌクレオチド残基をいう。この短い配列は、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列に基づき（または、それらから設計され）、そしてこれらを使用して、特定の細胞または組織における同一の、類似のまたは相補的なＤＮＡまたはＲＮＡの存在を増幅するか、確認するか、または明らかにする。オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１０ヌクレオチドでかつ５０ヌクレオチド程度の多さのヌクレオチド（好ましくは、１５〜３０ヌクレオチド）を有する、ＤＮＡ配列の部分を含む。これらは、化学的に合成され得、そしてプローブとして使用され得る。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、用語「プローブ」は、用途に依存して、種々の長さ（好ましくは少なくとも約１０個のヌクレオチドと約６，０００個ほど多数のヌクレオチドとの間）の核酸配列をいう。これらは、同一の核酸配列、類似の核酸配列または相補的な核酸配列の検出において使用される。より長い長さのプローブは、通常、天然または組換えの供給源から獲得され、そして高度に特異的であり、かつオリゴマーよりもはるかにゆっくりとハイブリダイズする。これらは、一本鎖または二本鎖であり得、そしてＰＣＲ技術、ハイブリダイゼーション膜ベースの技術、またはＥＬＩＳＡ様技術において特異性を有するように注意深く設計され得る。
【００５３】
用語「予防する（こと）」は、生物が病気にかかる（ｃｏｎｔｒａｃｔ）かまたは異常な状態を発生する可能性を減少させることをいう。
【００５４】
用語「処置する（こと）」は、治療効果を有すること、および生物における異常な状態を少なくとも部分的に軽減するかまたは抑止することをいう。
【００５５】
用語「治療効果」は、異常な状態を引き起こすかまたはこれに寄与する阻害因子または活性化因子をいう。治療効果は、異常な状態の症状の１つ以上をある程度緩和する。異常な状態の処置に関して、治療効果とは、以下の１つ以上をいい得る：（ａ）細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、増殖（ｇｒｏｗｔｈ）、および／または分化における増加；（ｂ）細胞死の阻害（すなわち、遅らせることまたは停止させること）；（ｃ）変性の阻害；（ｄ）異常な状態に関連する症状の１つ以上をある程度緩和する；および（ｅ）罹患した細胞集団の機能を強化すること。異常な状態に対する効力を示す化合物は、本明細書中に記載されるように同定され得る。
【００５６】
用語「異常な状態」は、生物におけるその正常な機能から逸脱する、生物の細胞または組織における機能をいう。異常な状態は、細胞増殖、細胞分化、細胞シグナル伝達、または細胞生存に関連し得る。異常な状態としてはまた、肥満、網膜変性のような糖尿病合併症、ならびにグルコースの取り込みおよび代謝における不規則性、ならびに脂肪酸の取り込みおよび代謝における不規則性が挙げられ得る。
【００５７】
異常な細胞増殖状態としては、例えば、線維症およびメサンギウム障害のような癌、異常な新脈管形成および脈管形成、創傷治癒、乾癬、糖尿病および炎症が挙げられる。
【００５８】
異常な分化状態としては、例えば、神経変性障害、緩徐な創傷治癒速度および緩徐な組織移植片治癒速度が挙げられる。
【００５９】
異常な細胞シグナル伝達状態としては、例えば、過度の神経伝達物質活性を含む精神障害が挙げられる。
【００６０】
異常な細胞生存状態はまた、プログラム細胞死（アポトーシス）経路が活性化されるかまたは抑止される状態に関連する。多数のタンパク質キナーゼが、アポトーシス経路に関連している。タンパク質キナーゼのいずれか１つの機能における異常は、細胞不死または未熟な細胞死を生じ得る。
【００６１】
用語「投与する（こと）」は、生物の細胞または組織に化合物を取り込むための方法に関する。異常な状態は、生物の細胞または組織が生物内または生物の外側に存在する場合、予防または処置され得る。生物の外側に存在する細胞は、細胞培養シャーレ中で維持または増殖され得る。生物内に保有される細胞について、経口、非経口、経皮、注射およびエアロゾル適用を含むが、これらに限定されない、化合物を投与するための多数の技術が、当該分野に存在する。生物の外側の細胞について、細胞微量注入技術、形質転換技術、およびキャリア技術が挙げられるが、これらに限定されない、化合物を投与するための複数の技術が当該分野に存在する。
【００６２】
異常な状態はまた、生物へのシグナル伝達経路に異常を有する細胞の群に化合物を投与することによって予防または処置され得る。次いで、化合物を投与することの生物機能に対する効果が、モニターされ得る。この生物は、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、またはヤギ、より好ましくは、サル（ｍｏｎｋｅｙ）またはサル（ａｐｅ）、および最も好ましくは、ヒトである。
【００６３】
「増幅」は、正常な細胞と比較した細胞中の増加した数のＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。「増幅」は、ＲＮＡについていう場合、細胞中のＲＮＡの検出可能な存在であり得る。なぜなら、いくつかの正常細胞において、ＲＮＡの基底発現が存在しないからである。他の正常な細胞において、基底レベルの発現が存在し、従って、これらの場合において、増幅は、少なくとも１〜２倍の検出であり、そしてより好ましくは、基底レベルと比較して多い。
【００６４】
アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向で、左から右へ示される。アミノ基およびカルボキシ基は、配列中に示されない。ヌクレオチド配列は、５’から３’の方向で、左から右へ、一本鎖のみによって示される。ヌクレオチドおよびアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される様式で、または（アミノ酸について）３文字コードによって示される。
【００６５】
（核酸）
本発明のゲノムＤＮＡは、本発明のポリペプチドのタンパク質コード領域を含み、そしてその対立遺伝子改変体を含むことが意図される。多数の遺伝子について、ゲノムＤＮＡは、ＲＮＡ転写物に転写され、この転写物は、転写物のイントロン（すなわち、非コード領域）が除去されるかまたは「スプライスアウト（ｓｐｌｉｃｅｄ ｏｕｔ）」される、１つ以上のスプライシング事象を経ることが広く理解される。代替的な機構によってスプライシングされ得、従って異なるＲＮＡ配列の除去に供され得るが、なおＮｇＲポリペプチドをコードするＲＮＡ転写物は、本発明によって包含されるスプライス改変体として当該分野でいわれる。従って、本発明によって包含されるスプライス改変体は、同じ元のゲノムＤＮＡ配列によってコードされるが、別々のｍＲＮＡ転写物から生じる。対立遺伝子改変体は、野生型遺伝子配列の改変された形態であり、この改変は、染色体分離の間の組換えまたは遺伝子変異を生じる条件への曝露から生じる。野生型遺伝子と同様に、対立遺伝子改変体は、天然に存在する配列である（インビトロ操作から生じる天然に存在しない改変体と対照的に）。
【００６６】
本発明はまた、ＮｇＲをコードするＲＮＡポリヌクレオチドの逆転写（慣例的に、二本鎖ＤＮＡを提供するための相補鎖の第二鎖合成が続く）を介して得られるｃＤＮＡを包含する。
【００６７】
ヒトＮｇＲポリペプチドをコードする好ましいＤＮＡ配列は、配列番号１および１３に示される。本発明の好ましいＤＮＡは、ＤＮＡのワトソン−クリック塩基対形成規則に従って、コード鎖から明白に推論可能な配列を有する相補的な分子（「非コード鎖」または「相補体」）と共にコード分子（すなわち、「コード鎖」）を含む二本鎖分子を含む。配列番号３に示されるように、ＮｇＲポリペプチドをコードする他のポリヌクレオチド（これは、マウスＮｇＲホモログのＮｇＲ３を含む）もまた好ましい。
【００６８】
ＮｇＲの少なくとも１つの生物学的機能を有するＮｇＲポリペプチドの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列もまた好ましい。疎水性Ｃ末端ＧＰＩシグナルを有さない少なくとも成熟ＮｇＲをコードするＮｇＲの一部をコードするヌクレオチド配列は、より好ましい。少なくともＮｇＲのリガンド結合領域をコードするＮｇＲの部分をコードするヌクレオチド配列もまた好ましい。
【００６９】
本発明はさらに、ヒトＮｇＲ ＤＮＡの他の種（好ましくは、哺乳動物）のホモログを包含する。種ホモログ（時々「オルソログ」と称される）は、一般に、本発明のヒトＤＮＡと、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を共有する。一般的に、本発明のポリヌクレオチドに関するパーセント配列「相同性」は、必要な場合、最大のパーセント配列同一性を達成するために、配列を整列しそしてギャップを導入した後、配列番号１、３または１３に示されるＮｇＲ配列におけるヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチド塩基の割合として計算され得る。
【００７０】
本発明によって提供されるポリヌクレオチド配列情報は、当該分野で周知かつ慣例的に実施される技術によって、コードされるポリペプチドの大規模な発現を可能にする。本発明のポリヌクレオチドはまた、サザンハイブリダイゼーションおよび／またはノーザンハイブリダイゼーション、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む周知の技術によって、関連したＮｇＲポリペプチド（例えば、ヒト対立遺伝子改変体および種ホモログ）をコードするポリヌクレオチドの同定および単離を可能にする。関連したポリヌクレオチドの例としては、ヒトゲノム配列および非ヒトゲノム配列（対立遺伝子改変体を含む）ならびにＮｇＲに相同なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびＮｇＲの１つ以上の生物学的特性、免疫学的特性、および／または物理的特性を共有する構造的に関連したポリペプチドが挙げられる。ＮｇＲに相同なタンパク質をコードする非ヒト種の遺伝子はまた、サザン分析および／またはＰＣＲ分析によって同定され得、そしてＮｇＲ障害の動物モデルにおいて有用である。ヒトＮｇＲ ＤＮＡの配列の知見はまた、サザンハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を介して、プロモーター、オペレーター、エンハンサー、リプレッサーなどのようなＮｇＲ発現制御調節配列をコードするゲノムＤＮＡ配列の同定を可能にする。本発明のポリヌクレオチドはまた、ＮｇＲを発現する細胞の能力を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイにおいて有用である。本発明のポリヌクレオチドはまた、疾患状態の根底にあるＮｇＲ遺伝子座における遺伝子変更を同定するのに有用な診断方法の基礎を提供し得る。この情報は、診断および治療ストラテジーの選択の両方に有用である。
【００７１】
ＮｇＲポリペプチドをコードする全長ポリヌクレオチドの本明細書中の開示は、全長ポリヌクレオチドの全ての可能なフラグメントを当業者に容易に利用可能にする。従って、本発明は、ＮｇＲをコードするポリヌクレオチドの少なくとも６、そして好ましくは、少なくとも１４、１６、１８、２０、２５、５０、または７５連続するヌクレオチドを含むＮｇＲコードポリヌクレオチドのフラグメントを提供する。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドのフラグメントは、ＮｇＲコードポリヌクレオチド配列に固有の配列を含み、従って、ＮｇＲをコードするポリヌクレオチド（またはそのフラグメント）に対してのみ（すなわち、「特異的に」）高度にストリンジェントまたは中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。本発明のゲノム配列のポリヌクレオチドフラグメントは、コード領域に固有の配列だけでなく、イントロン、調節領域および／または他の非翻訳配列由来の全長配列のフラグメントもまた含む。本発明のポリヌクレオチドに固有の配列は、他の公知のポリヌクレオチドに対する配列比較を介して認識可能であり、そして当該分野で慣例的に利用される整列プログラム（例えば、公の配列データベースにおいて利用可能な整列プログラム）の使用を介して同定され得る。このような配列はまた、ポリヌクレオチドがハイブリダイズするゲノムＤＮＡのフラグメントの数を決定するためのサザンブロットハイブリダイゼーション分析から認識可能である。本発明のポリヌクレオチドは、放射活性標識、蛍光標識および酵素標識を含む、これらの検出を可能にする様式で標識され得る。
【００７２】
ポリヌクレオチドのフラグメントは、ＮｇＲポリヌクレオチドの全長またはフラグメントの検出のためのプローブとして特に有用である。１つ以上のポリヌクレオチドは、ＮｇＲをコードするポリヌクレオチドの存在を検出するために使用されるか、またはＮｇＲをコードするポリヌクレオチド配列におけるバリエーションを検出するために使用されるキット中に含まれ得る。
【００７３】
本発明はまた、配列番号１または３のいずれかのポリヌクレオチドの非コード鎖または相補体に、中程度にストリンジェントな条件下または高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするＮｇＲポリペプチドをコードするＤＮＡを包含する。
【００７４】
ストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６において見出され得る。好ましくは、この条件は、互いに少なくとも約６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％相同な配列が、代表的に、互いにハイブリダイズしたままである条件である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６５℃で、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ＢＳＡおよび５００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中のハイブリダイゼーションである。このハイブリダイゼーションの後に、５０℃での０．２×ＳＳＣ、０．０１％ＢＳＡ中の１回または２回の洗浄が続く。配列番号１または３の配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書中で使用される場合、「天然に存在する」核酸分子は、天然に生じるヌクレオチド配列を有する（例えば、天然のタンパク質をコードする）ＲＮＡまたはＤＮＡ分子をいう。本明細書中で使用される場合、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、１０％（ｗｔ／容量）硫酸デキストランを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃、ならびに０．１×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを含む洗浄溶液中で６０℃で３０分間２回の洗浄を意味する。
【００７５】
（ベクター）
本発明の別の局面は、上記の核酸分子のいずれかを含む、ベクターまたは組換え発現ベクターに関する。ベクターは、ＮｇＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを増幅するためそして／またはＮｇＲをコードするＤＮＡを発現するためのいずれかのために、本明細書中で使用される。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、これが連結する別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二重鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノム中に連結され得る。特定のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）は、これらが導入される宿主細胞中で自律的に複製し得る。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、これらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で、「発現ベクター」といわれる。一般に、組換えＤＮＡ技術における発現ベクターの有用性は、しばしば、プラスミドの形態である。本明細書中において、「プラスミド」および「ベクター」は、交換可能に使用され得る。なぜなら、プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるためである。しかし、本発明は、等価な機能を果たす、発現ベクターのこのような他の形態（例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス））のようなベクターを含むことが意図される。
【００７６】
原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁に、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的または誘導性のプロモーターを含むベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ中で実行され得る。融合ベクターは、多数のアミノ酸を、そのベクターにコードされるタンパク質に、通常組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。このような融合ベクターは、代表的に３つの目的を果たす：（１）組換えタンパク質の発現を増加させること；（２）組換えタンパク質の可溶性を増加させること；および（３）親和性精製におけるリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を補助すること。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解切断部位は、融合タンパク質の精製に続いて、融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にするために、融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入される。このような酵素およびこれらの同族の認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては、それぞれ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７，３１〜４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
【００７７】
適切な誘導性の非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９，３０１−３１５）およびｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。
【００７８】
Ｅ．ｃｏｌｉ中の組換えタンパク質発現を最大化するための１つのストラテジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力を損なった宿主細菌においてタンパク質を発現することである。Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．（１９９０）１１９−１２８を参照のこと。別のストラテジーは、発現ベクター中に挿入される核酸の核酸配列を変更することであり、その結果、各アミノ酸についての個々のコドンは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用されるコドンである（Ｗａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０，２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって実施され得る。
【００７９】
別の実施形態において、ＮｇＲ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６，２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９８２）Ｃｅｌｌ ３０，９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９８７）Ｇｅｎｅ ５４，１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が挙げられる。
【００８０】
あるいは、ＮｇＲは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞中で発現され得る。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）におけるタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０，３１−３９）が挙げられる。
【００８１】
なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９，８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６，１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞において使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルス調節エレメントによって提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方の他の適切な発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９の１６章および１７章を参照のこと。
【００８２】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において核酸の発現を優先的に指向し得る（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現する）。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１，２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３，２３５−２７５）、特にＴ細胞レセプター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ．８，７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３，７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３，７４１−７４８）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経線維プロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開番号２６４，１６６）が挙げられる。発生的に調節されたプロモーター（例えば、マウスｈｏｘプロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３，５３７−５４６））もまた含まれる。
【００８３】
本発明はさらに、アンチセンス配向で発現ベクター中にクローン化された本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、このＤＮＡ分子は、アンチセンスＮｇＲ ｍＲＮＡであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能にする様式で調節配列に作動可能に連結される。種々の細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の連続的な発現を指向する、アンチセンス配向でクローン化された核酸に作動可能に連結された調節配列（例えば、ウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサー）が選択され得るか、あるいは、アンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現または細胞型特異的発現を指向する調節配列が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化ウイルスの形態であり得、ここで、アンチセンス核酸が、高効率調節領域の制御下で生成され、その活性は、ベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の考察については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，ＲＥＶＩＥＷＳ−−ＴＲＥＮＤＳ ＩＮ ＧＥＮＥＴＩＣＳ，第１巻（１）１９８６を参照のこと。
【００８４】
好ましいベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス粒子またはウイルスおよび組み込み可能なＤＮＡフラグメント（すなわち、相同組換えによって宿主ゲノム中に組み込み可能なフラグメント）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいウイルス粒子としては、アデノウイルス、バキュロウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ワクシニアウイルスおよびレトロウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい発現ベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の発現ベクターとしては、ｐＳＰＯＲＴ^ＴＭべクター、ｐＧＥＭ^ＴＭベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＰＲＯＥＸベクター^ＴＭ（ＬＴＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ^ＴＭベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＱＥ^ＴＭベクター（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＳＥ４２０^ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＹＥＳ２^ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
好ましい発現ベクターは、複製可能なＤＮＡ構築物であり、ここで、ＮｇＲをコードするＤＮＡ配列は、適切な宿主中でＮｇＲの発現をもたらし得る適切な制御配列に作動可能に連結されるかまたは結合されている。ＤＮＡ領域は、これらが互いに機能的に関連している場合、作動可能に連結されているかまたは結合されている。例えば、プロモーターが、配列の転写を制御する場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されているかまたは結合されている。増幅ベクターは、発現制御ドメインを必要としないが、通常、複製起点によって与えられる宿主中で複製する能力、および形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子のみを必要とする。発現ベクター中の制御配列の必要性は、選択される宿主および選択される形質転換方法に依存して変化する。一般的に、制御配列としては、転写プロモーター、エンハンサー、転写を制御するための任意のオペレーター配列、ポリアデニル化シグナル、適切なｍＲＮＡリボソーム結合をコードする配列ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられるが、これらに限定されない。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）において記載されている。調節配列としては、多数の型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的な発現を指向する配列、および特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指向する配列（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような因子に依存し得ることが当業者によって理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され得、それにより本明細書中に記載されるような核酸によってコードされる、タンパク質またはペプチド（融合タンパク質または融合ペプチドを含む）（例えば、ＮｇＲタンパク質、ＮｇＲの変異形態、融合タンパク質など）を生成する。
【００８６】
好ましいベクターは、好ましくは、宿主生物により認識されるプロモーターを含む。本発明のプロモーター配列は、原核生物性であっても、真核生物性であっても、またはウイルス性であってもよい。適切な原核生物配列の例としては、バクテリオファージλのＰＲプロモーターおよびＰＬプロモーター（ＴＨＥ ＢＡＣＴＥＲＩＯＰＨＡＧＥ ＬＡＭＢＤＡ，Ｈｅｒｓｈｅｙ，Ａ．Ｄ．編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９７３）（これは、その全体が参考として本明細書中で援用される）；ＬＡＭＢＤＡ ＩＩ、Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｒ．Ｗ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８０）（これは、その全体が参考として本明細書中で援用される））；Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、熱ショックプロモーター、およびｌａｃＺプロモーター、ならびにＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９０，３０４〜３１０（これは、その全体が参考として本明細書中で援用される）が、挙げられる。さらなるプロモーターとしては、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ヒト免疫不全ウイルスの長末端反復プロモーター、マロニーウイルスプロモーター、サイトメガロウイルス最初期プロモーター、エプスタイン−バーウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ヒトアクチンプロモーター、ヒトミオシンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター、ヒト筋肉クレアチンプロモーター、およびヒトメタロチオネインプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
さらなる調節配列もまた、好ましいベクター中に含まれ得る。適切な調節配列の好ましい例は、ファージＭＳ−２のレプリカーゼ遺伝子のシャイン−ダルガーノ配列、およびバクテリオファージλの遺伝子ｃＩＩのシャイン−ダルガーノ配列により代表される。このシャイン−ダルガーノ配列の直後に、ＮｇＲをコードするＤＮＡが続き、そして成熟ＮｇＲタンパク質の発現を生じる。
【００８８】
さらに、適切な発現ベクターは、形質転換された宿主細胞のスクリーニングを可能にする、適切なマーカーを含み得る。選択された宿主の形質転換は、当業者に周知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載される、種々の技術のうちの任意の技術を使用して、実行される。
【００８９】
複製起点はまた、内因性起点を含むようにそのベクターを構築することによって提供され得るか、または宿主細胞の染色体複製機構により提供され得るかのいずれかであり得る。そのベクターが、宿主細胞染色体中に組み込まれる場合、後者が十分であり得る。あるいは、ウイルス複製起点を含むベクターを使用するよりも、当業者は、選択マーカーとＮｇＲ ＤＮＡとを同時形質転換する方法によって、哺乳動物細胞を形質転換し得る。適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである（米国特許第４，３９９，２１６号を参照のこと）。
【００９０】
ＮｇＲをコードするヌクレオチド配列は、従来技術（連結のための平滑末端または互い違いの（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切なように付着末端を埋めること、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および適切なリガーゼによる連結を含む）に従って、ベクターＤＮＡを用いて組換えられ得る。そのような操作のための技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）により開示され、そして当該分野で周知である。哺乳動物発現ベクターの構築のための方法は、例えば、Ｏｋａｙａｍａら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０，Ｃｏｓｍａｎら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：９３５，Ｃｏｓｍａｎら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８，ＥＰ−Ａ−０３６７５６６、およびＷＯ ９１／１８９８２（これらの各々は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に開示される。
【００９１】
（宿主細胞および形質転換された宿主細胞）
本発明の別の局面に従って、コードされたＮｇＲポリヌクレオチドの発現を可能にする様式で本発明のポリヌクレオチド（または本発明のベクター）を含む、宿主細胞（原核生物宿主および真核生物宿主を含む）が、提供される。好ましくは、その細胞は、内因性ＮｇＲポリペプチドを、ほとんど産生しないかまたは全く産生しない。本発明のポリヌクレオチドは、環状プラスミドの一部としてか、または単離されたタンパク質コード領域を含む線状ＤＮＡまたはウイルスベクターとして、その宿主細胞中に導入され得る。当該分野で周知でありそして慣用的に実施される、宿主細胞中にＤＮＡを導入するための方法としては、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、核注入、またはキャリア（例えば、リポソーム、ミセル、ゴースト細胞およびプロトプラスト）との融合が、挙げられる。本発明の発現系としては、細菌細胞系、酵母細胞系、真菌細胞系、植物細胞系、昆虫細胞系、無脊椎動物細胞系、脊椎動物細胞系、および哺乳動物細胞系が、挙げられる。
【００９２】
本発明の宿主細胞は、ＮｇＲと特異的に免疫反応性である抗体の発生のための、有益な免疫原供給源である。本発明の宿主細胞はまた、ＮｇＲポリペプチドの大規模産生方法において有用であり、その方法において、その細胞は、適切な培養培地において増殖され、そして望ましいポリペプチド産物が、その細胞からかまたはその細胞が増殖された培地から、当該分野で公知の精製方法により、単離される。その当該分野で公知の精製方法とは、例えば、従来のクロマトグラフィー方法（免疫アフィニティークロマトグラフィー、レセプターアフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除濾過、カチオン交換クロマトグラフィーまたはアニオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣなどを含む）である。なお他の精製方法としては、特異的結合パートナーまたは特異的結合因子により認識される、特定のタグ、標識またはキレート部分を有する融合タンパク質として、所望のタンパク質が発現および精製される、方法が挙げられる。精製されたタンパク質は、所望のタンパク質を生じるように切断され得るか、またはインタクトな融合タンパク質のままにされ得る。この融合成分の切断は、切断プロセスの結果として付加的アミノ酸残基を有する形態の、所望のタンパク質を生成し得る。
【００９３】
ＮｇＲ ＤＮＡ配列についての知識により、内因性ＮｇＲの発現を可能にするかまたは増加するような、細胞の改変が可能になる。細胞は、天然に存在するＮｇＲプロモーター全体またはその一部を、異種プロモーター全体またはその一部で置換して、その細胞が、より高レベルでＮｇＲを発現するようにすることによって、発現の増加を提供するように（例えば、相同組換えによって）改変され得る。その異種プロモーターは、内因性ＮｇＲコード配列と作動可能に連結される様式で、挿入される。（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ ９４／１２６５０，ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ ９２／２０８０８，およびＰＣＴ国際公開番号ＷＯ ９１／０９９５５を参照のこと。）異種プロモーターＤＮＡに加えて、増幅可能なマーカーＤＮＡ（例えば、ａｄａ、ｄｈｆｒ、およびカルバモイルホスフェートシンターゼとアスパラギン酸トランスカルバミラーゼとジヒドロオロターゼをコードする多機能ＣＡＤ遺伝子）および／またはイントロンＤＮＡが、その異種プロモーターＤＮＡとともに挿入され得ることもまた、意図される。ＮｇＲコード配列に連結された場合、標準的選択方法によるそのマーカーＤＮＡの増幅は、細胞においてＮｇＲコード配列の同時増幅を生じる。
【００９４】
本発明により提供されるＤＮＡ配列情報により、機能性ＮｇＲを発現しないかまたはＮｇＲの改変体を発現する、動物の開発（例えば、相同組換え、または「ノックアウト」戦略による；Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８〜１２９２（１９８９））が可能になる。そのような動物（特に、小さい実験室動物（例えば、ラット、ウサギ、およびマウス）は、ＮｇＲのインビボ活性およびＮｇＲのモジュレーターを研究するためのモデルとして、有用である。
【００９５】
本発明のポリペプチドの発現のために適切な宿主細胞としては、原核生物、酵母、および真核生物が挙げられるが、これらに限定されない。原核生物発現ベクターが使用される場合、適切な宿主細胞は、クローン化された配列を発現することができる、任意の原核生物細胞である。適切な原核生物細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
真核生物発現ベクターが使用される場合、適切な宿主細胞は、クローン化された配列を発現することができる、任意の真核生物細胞である。好ましくは、真核生物細胞は、高等真核生物の細胞である。適切な真核生物細胞としては、非ヒト哺乳動物組織培養細胞およびヒト組織培養細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい宿主細胞としては、昆虫細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、アフリカミドリザル腎細胞（ＣＯＳ細胞）、ヒト２９３細胞、およびマウス３Ｔ３線維芽細胞が挙げられるが、これらに限定されない。細胞培養におけるこのような細胞の増殖は、慣用的手順になっている（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＫｒｕｓｅおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ編（１９７３）（これは、本明細書においてその全体が参考として援用される）を参照のこと）。
【００９７】
さらに、酵母細胞は、宿主細胞として使用され得る。好ましい酵母細胞としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属およびＫｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい酵母宿主は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓである。好ましい酵母ベクターは、２Ｔ酵母プラスミド由来の複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択マーカー遺伝子を含み得る。酵母およびＥ．ｃｏｌｉの両方における複製のためのシャトルベクターもまた、本明細書中に含まれる。
【００９８】
あるいは、昆虫細胞が、宿主細胞として使用され得る。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、バキュロウイルス発現系（Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８８，６，４７；ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＶＥＣＴＯＲＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｏ’Ｒｉｅｌｌｙら編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２；および米国特許第４，８７９，２３６号（これらの各々は、その全体が参考として本明細書中で援用される））を使用して、発現される。さらに、ＭＡＸＢＡＣ^ＴＭ完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が、例えば、昆虫細胞における産生のために使用され得る。
【００９９】
適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に、さらに記載される。あるいは、その組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写されそして翻訳され得る。
【０１００】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術を介して、原核生物細胞または真核生物細胞中に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、宿主細胞中に外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入するための、当該分野で認識される種々の技術を指すことが意図され、そのような技術としては、リン酸カルシウム共沈または塩酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが、挙げられる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、１９８９）および他の実験室マニュアルに見出され得る。
【０１０１】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについて、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、ほんの少しの割合の細胞のみが、そのゲノム中に外来ＤＮＡを組み込み得ることが、公知である。これらの組込み体を同定しそして選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する体性）をコードする遺伝子は、一般的に、目的の遺伝子とともに宿主細胞中に導入され得る。種々の選択マーカーとしては、薬物（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびメトトレキサート）に対する耐性を付与する選択マーカーが、挙げられる。選択マーカーをコードする核酸は、ＮｇＲをコードするのと同じベクター上で、宿主細胞中に導入され得るか、または別個のベクター上で、導入され得る。導入される核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択により同定され得る（例えば、その選択マーカーを組み込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【０１０２】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチド（ＮｇＲ２形態およびＮｇＲ３形態、可溶性形態のＮｇＲ、キメラＮｇＲポリペプチド、ＮｇＲ／Ｉｇ融合物、ならびに上記の各々のフラグメントおよび改変体を含む）が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現される。
【０１０３】
ＮｇＲタンパク質またはＮｇＲポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントをＣＨＯ細胞中に導入して、組換えＮｇＲタンパク質または組換えＮｇＲポリペプチドを発現させるために、発現ベクターを構築することが、必要である。
【０１０４】
ＣＨＯ発現のためのベクターとしては、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶおよびｐｃＤＮＡＩＮｅｏが挙げられるが、これらに限定されない。そのプロモーターは、ＣＨＯ細胞における発現を効果的に促進する限り、特に限定されない。適切なプロモーターの例は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、およびＨＳＶ−ＴＫプロモーターである。これらのうち、ＣＭＶプロモーターおよびＳｒαプロモーターが、好ましい。
【０１０５】
上記のプロモーターに加えて、その発現ベクターは、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー、およびＳＶ４０複製起点を含み得る。適切な選択マーカーとしては、メトトレキサート（ＭＴＸ）に対する耐性を付与するジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびネオマイシン耐性遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
ＮｇＲをコードするＤＮＡ、ＮｇＲの一部をコードするＤＮＡ、ＮｇＲのフラグメントをコードするＤＮＡ、およびＮｇＲの可溶性構築物をコードするＤＮＡを各々含む、発現ベクターの例としては、所望のＮｇＲ構築物をコードするヌクレオチド配列にプロモーターが（好ましくは上流に）作動可能に連結され、そのＮｇＲ構築物をコードするヌクレオチド配列から下流にポリアデニル化シグナルがある、ベクター（例えば、上記ベクター）が挙げられ、好ましくは、そのベクターは、作動可能なＤＨＦＲ遺伝子を含む。好ましくは、アンピシリン耐性遺伝子もまた、そのベクター中に、作動可能に含まれる。
【０１０７】
ＤＨＦＲ遺伝子を欠くＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７，４２１６〜４２２０）およびＣＨＯ−Ｋ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６０，１２７５（１９６８））が、使用に適する。
【０１０８】
上記のように調製されたＮｇＲ発現ベクターは、公知の任意の方法によりＣＨＯ細胞中に導入され、そのような方法としては、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ（１９７３）Ｖｉｒｏｌ．５２，４５６〜４６７）およびエレクトロポレーション（Ｎｕｅｍａｎｎら（１９８２）ＥＭＢＯ Ｊ．１，８４１〜８４５）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０９】
その発現ベクターを保有する形質転換体は、上記の選択マーカーに基づいて選択される。その選択マーカーを使用して形質転換体を繰返しクローン選択することにより、ＮｇＲ構築物の高発現を有する安定な細胞株の選択が可能になる。選択培地におけるＭＴＸ濃度を増加することにより、所望のタンパク質の遺伝子増幅および発現の増加が可能になる。組換えＮｇＲを含むＣＨＯ細胞は、ＮｇＲ構築物を構成的に発現するＮｇＲ発現ベクターを含むＣＨＯ細胞を培養することによって、生成され得る。
【０１１０】
ＣＨＯ細胞を培養する際に使用される培地としては、約０．５〜２０％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、およびＲＰＭＩ１６４０培地が、挙げられる。その培地のｐＨは、好ましくは、約６〜８である。培養は、好ましくは、通気しながら、約３０〜４０℃にて約１５〜７２時間である。
【０１１１】
本発明の宿主細胞（例えば、培養中の原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞）は、ＮｇＲタンパク質を生成（すなわち、発現）するために使用され得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用してＮｇＲタンパク質を生成するための方法を提供する。１つの実施形態において、その方法は、（ＮｇＲをコードする組換え発現ベクターが導入されている）本発明の宿主細胞を、ＮｇＲタンパク質が産生されるように、適切な培地において培養する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、その培地またはその宿主細胞からＮｇＲを単離する工程をさらに包含する。
【０１１２】
ＮｇＲポリペプチドが主に細胞内で見出される状況において、細胞内物質（グラム陰性細菌については封入体を含む）は、当業者に公知の任意の標準技術を使用して、宿主細胞から抽出され得る。そのような方法は、例としては、宿主細胞を溶解し、フレンチプレス、ホモジナイゼーション、および／または超音波処理によりペリプラズム／細胞質の内容物を放出させ、その後遠心分離することを包含するが、限定はしない。
【０１１３】
ＮｇＲポリペプチドが、細胞質ゾルにおいて封入体を形成した場合、そのような封入体は、細胞内膜および／または細胞外膜に頻繁に結合し得る。遠心分離の際、その封入体は、ペレット物質中に主に見出される。その後、そのペレット物質は、両極端のｐＨで処理されるか、またはアルカリ性ｐＨにて還元剤（例えば、ジチオスレイトール）の存在下で１つ以上のカオトロピック剤（例えば、界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、または尿素誘導体）で処理されるか、または酸性ｐＨにてトリス−カルボキシエチルホスフィンで処理されて、その封入体が、遊離され、壊されて離されそして可溶化され得る。一旦可溶化されると、ＮｇＲポリペプチドは、ゲル電気泳動、免疫沈降などを使用して分析され得る。ＮｇＲポリペプチドを単離する種々の方法は、当業者に明らかである。例えば、単離は、標準的方法（例えば、下記に示される方法、およびＭａｒｓｔｏｎら（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２，２６４〜２７５（その全体が参考として本明細書中に援用される）に示される方法）を使用して、達成され得る。
【０１１４】
単離されたＮｇＲポリペプチドが、使用された単離手順の後に生物学的活性でない場合、そのポリペプチドを「リフォールディングする」ため、すなわち、そのポリペプチドをその３次構造に変換しそしてジスルフィド結合を生成するための、種々の方法が、生物学的活性を回復するために使用され得る。当業者に公知の方法としては、可溶化したポリペプチドのｐＨを、特定の濃度のカオトロープの存在下で、通常は７を超えるｐＨに調整することが、挙げられる。カオトロープの選択は、封入体可溶化のために使用した選択と非常に類似するが、通常はより低濃度で行われ、そして可溶化のために使用されたのとは必ずしも同じカオトロープではない。特定のレドックス電位を生成してジスルフィドのシャッフリングを可能にし、そのタンパク質のシステイン架橋の形成を生じるためには、還元剤、または特定の比のその還元剤およびその酸化形態を使用することが、必要であり得る。一般的に使用されるいくつかの還元剤対としては、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化銅（ＩＩ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、２−メルカプトエタノール（βＭＥ）／ジチオ−β（ＭＥ）が、挙げられる。リフォールディングの効率を増加するために、共溶媒（例えば、グリセロール、種々の分子量のポリエチレングリコール、およびアルギニン）を使用することが、必要であり得る。
【０１１５】
（トランスジェニック動物）
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を生成するために使用され得る。例えば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＮｇＲコード配列が導入されている、受精卵母細胞または胚性幹細胞である。その後、そのような宿主細胞は、内因性ＮｇＲ配列がゲノム中に導入された非ヒトトランスジェニック動物、または内因性ＮｇＲ配列が変化した相同組換え動物を生成するために、使用され得る。そのような動物は、ＮｇＲの機能および／または活性を研究するため、ならびにＮｇＲ活性のモジュレーターを同定および／または評価するために、有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」は、非ヒト動物であり、好ましくは、哺乳動物であり、より好ましくは、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）であり、その動物の細胞のうちの１つ以上が導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが、挙げられる。導入遺伝子は、外因性ＤＮＡであり、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組み込まれ、その成熟動物のゲノム中に残り、それにより、そのトランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織において、コードされた遺伝子産物の発現を指向する。本明細書中で使用される場合、「相同組換え動物」は、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスであり、その中で、内因性ＮｇＲ遺伝子が、その内因性遺伝子と、その動物の発生前にその動物の細胞（例えば、その動物の胚性細胞）中に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えによって、変化している。
【０１１６】
本発明のトランスジェニック動物は、受精卵母細胞の雄性前核中に、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって、ＮｇＲコード核酸を導入すること、および偽妊娠した雌性養母動物においてその卵母細胞の発生を可能にすることによって、生成され得る。配列番号１または配列番号３のヒトＮｇＲ ＤＮＡ配列は、非ヒト動物のゲノム中に導入遺伝子として導入され得る。あるいは、ヒトＮｇＲ遺伝子の非ヒトホモログ（例えば、マウスＮｇＲ遺伝子）が、（さらに上記に記載される）ヒトＮｇＲ ｃＤＮＡへのハイブリダイゼーションに基づいて単離され得、そして導入遺伝子として使用され得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた、その導入遺伝子の発現の効率を増加するために、その導入遺伝子中に含まれ得る。組織特異的調節配列が、特定の細胞にＮｇＲタンパク質の発現を指向するように、ＮｇＲ導入遺伝子に作動可能に連結され得る。胚の操作およびマイクロインジェクションを介してトランスジェニック動物（特に、マウスのような動物）を生成するための方法は、当該分野において慣習的になっており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；同第４，８７０，００９号；および同第４，８７３，１９１号；ならびにＨｏｇａｎ １９８６、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ ＴＨＥ ＭＯＵＳＥ ＥＭＢＲＹＯ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹにおいて記載されている。同様の方法が、他のトランスジェニック動物の生成のために使用される。トランスジェニック初代動物は、そのゲノム中にＮｇＲ導入遺伝子が存在すること、および／またはその動物の組織もしくは細胞におけるＮｇＲ ｍＲＮＡの発現に基づいて、同定され得る。初代トランスジェニック動物は、その後、その導入遺伝子を保有するさらなる動物を産むために使用され得る。さらに、ＮｇＲをコードする導入遺伝子を保有するトランスジェニック動物は、さらに、他の導入遺伝子を保有する他のトランスジェニック動物と交配され得る。
【０１１７】
相同組換え動物を生成するために、ＮｇＲ遺伝子の少なくとも一部を含み、そのＮｇＲ遺伝子中に、欠失、付加、または置換が導入されそれにより、そのＮｇＲ遺伝子が変化（例えば、機能的に破壊）された、ベクターが、調製される。このＮｇＲ遺伝子は、ヒト遺伝子（例えば、配列番号１または配列番号１３）であり得るが、より好ましくは、ヒトＮｇＲ遺伝子の非ヒトホモログである。例えば、配列番号１または配列番号１３のヒトＮｇＲ遺伝子のマウスホモログが、マウスゲノム中の内因性ＮｇＲ遺伝子を変化させるために適切な相同組換えベクターを構築するために、使用され得る。１つの実施形態において、そのベクターは、相同組換えの際に、その内因性ＮｇＲ遺伝子が機能的に破壊される（すなわち、機能的タンパク質をもはやコードしない）ように、設計される（「ノックアウト」ベクターとも呼ばれる）。
【０１１８】
あるいは、このベクターは、相同組換えにより、内因性のＮｇＲ遺伝子が変異するか、そうでなければ変更されるが、なお機能的タンパク質をコードするように設計され得る（例えば、上流の調節領域が変更され、それによって内因性のＮｇＲタンパク質の発現が変更され得る）。相同組換えベクターにおいて、ＮｇＲ遺伝子の変更された部分は、その５’および３’末端で、ＮｇＲ遺伝子のさらなる核酸と隣接し、ベクターにより保有される内因性ＮｇＲ遺伝子と胚性幹細胞中の内因性ＮｇＲ遺伝子との間の相同組換えを可能にする。さらなる隣接ＮｇＲ核酸は、内因性遺伝子との首尾良い相同組換えに十分な長さを有する。代表的に、数キロベースの隣接ＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方）が、ベクター中に含まれる。例えば、相同組換えベクターの詳細については、Ｔｈｏｍａｓら（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：５０３を参照のこと。このベクターは、胚性幹細胞株に導入され（例えば、エレクトロポレーションにより）、そして導入されたＮｇＲ遺伝子が内因性ＮｇＲ遺伝子と相同組換えを起こした細胞が選択される（例えば、Ｌｉら（１９９２）Ｃｅｌｌ ６９：９１５を参照のこと）。
【０１１９】
次いで、選択された細胞は、動物（例えば、マウス）の胚盤胞に注入され、凝集キメラが形成される。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ １９８７、ＴＥＲＡＴＯＣＡＲＣＩＮＯＭＡＳ ＡＮＤ ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ、１１３〜１５２頁を参照のこと。次いで、キメラ胚は、適切な偽妊娠雌性養育動物（ｆｏｓｔｅｒ ａｎｉｍａｌ）に移植され得、そしてこの胚は、出産にいたる（ｂｒｏｕｇｈｔ ｔｏ ｔｅｒｍ）。生殖細胞中に相同組換えされたＤＮＡを有する子孫は、導入遺伝子の生殖系列伝達（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）により、その動物の全ての細胞が相同組換えされたＤＮＡを含む動物を飼育するのに使用される。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築する方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：８２３−８２９；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９０／０１１４０；ＷＯ９２／０９６８；およびＷＯ９３／０４１６９にさらに記載される。
【０１２０】
別の実施形態において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された系を含むトランスジェニック非ヒト動物が、生成され得る。このような系の１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の詳細については、例えば、Ｌａｋｓｏら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１、１３５１−１３５５）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を調節するために使用される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要とされる。このような動物は、「二重」トランスジェニック動物の構築を通して（例えば、２匹のトランスジェニック動物（一方は、選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、そして他方は、リコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む）を交配させることにより）提供され得る。
【０１２１】
本明細書中に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンもまた、Ｗｉｌｍｕｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３に記載される方法に従って生成され得る。簡潔には、トランスジェニック動物由来の細胞（例えば、体細胞）が単離され、そして成長サイクルから出てＧ_０期に入るように誘導され得る。次いで、休止細胞は、例えば、電気パルスの使用を通して、同種の動物から摘出された卵母細胞に融合され得、この卵母細胞から休止細胞が単離される。次いで、再構築された卵母細胞は培養され、その結果、桑実胚または未分化胚芽細胞に成長し、次いで、偽妊娠雌性養育動物に移される。誕生したこの雌性養育動物の子孫は、この動物のクローンであり、この動物から、細胞（例えば、体細胞）が単離される。
【０１２２】
（アンチセンス）
ＮｇＲポリヌクレオチドを認識し、ハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドもまた、本発明により提供される。全長およびフラグメントのアンチセンスポリヌクレオチドが提供される。本発明のフラグメントアンチセンス分子として、（ｉ）ＮｇＲ ＲＮＡを特異的に認識し、これにハイブリダイズする分子（ＮｇＲをコードするＤＮＡと、他の既知の分子をコードするＤＮＡとの配列比較により決定される）が挙げられる。ＮｇＲをコードするポリヌクレオチドに固有の配列の同定は、任意の公に利用可能な配列データベースの使用、および／または市販の配列比較プログラムの使用を通して推測され得る。所望の配列の同定後、制限消化または当該分野で周知の任意の種々のポリメラーゼ連鎖反応技術を用いた増幅を通じた単離が実施され得る。アンチセンスポリヌクレオチドは、特にＮｇＲ ｍＲＮＡを発現する細胞によるＮｇＲの発現の調節に関連する。
【０１２３】
ＮｇＲをコードする本発明のヌクレオチド配列から獲得される、アンチセンスオリゴヌクレオチド、あるいは配列番号１、３、１３に示されるヌクレオチド配列のフラグメントまたはそれらに相補的もしくは相同な配列は、種々の組織における遺伝子発現を探索するための診断ツールとして有用である。例えば、組織は、検出可能な基を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて、従来のオートラジオグラフィー技術によりインサイチュで探索されて、この酵素のネイティブの発現またはそれに関連する病理学的状態が調査され得る。特定の局面において、少なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０、または５００ヌクレオチドまたはＮｇＲコード鎖あるいはその一部のみに相補的な配列を含むアンチセンス核酸分子が提供される。配列番号２、４、または１４のＮｇＲタンパク質のフラグメント、ホモログ、誘導体、およびアナログをコードする核酸分子あるいは配列番号１、３、または１３のＮｇＲ核酸配列に相補的なアンチセンス核酸がさらに提供される。
【０１２４】
１つの実施形態において、アンチセンス核酸分子は、ＮｇＲをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「コード領域」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域をいう（例えば、コード領域配列番号１、３、または１３に対応するヒトＮｇＲのタンパク質コード領域）。別の実施形態において、アンチセンス核酸分子は、ＮｇＲをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。用語「非コード領域」は、コード領域に隣接し、アミノ酸に翻訳されない５’および３’配列をいう（すなわち、５’および３’非翻訳領域とも称される）。
【０１２５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１、３、１３のヌクレオチド配列、またはそれらに対応するｍＲＮＡの調節領域（開始コドン、ＴＡＴＡボックス、エンハンサー配列などが挙げられるがこれらに限定されない）を標的とする。本明細書中で開示されるＮｇＲをコードするコード鎖配列（例えば、配列番号１、３、または１３）が与えられれば、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋ塩基対形成の法則またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成の法則に従い設計され得る。アンチセンス核酸分子は、ＮｇＲ ｍＲＮＡの全コード領域に相補的であり得るが、より好ましくは、ＮｇＲ ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮｇＲ ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周辺の領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学合成または酵素的連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、またはその分子の生物学的安定性を増加させるかもしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成された二本鎖の物理的安定性を増加させるように設計された種々の改変ヌクレオチドを用いて（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る）化学合成され得る。
【０１２６】
アンチセンス核酸を生成するために使用され得る改変ヌクレオチドの例として、以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされた（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡが目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である（以下の節でさらに詳細に記載される））発現ベクターを用いて生物学に生成され得る。
【０１２７】
本発明のアンチセンス核酸分子（好ましくは、１０〜２０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド）は、代表的に、被験体に投与されるかまたはインサイチュで生成され、その結果、これらは、ＮｇＲタンパク質をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするかまたは結合し、それによって、例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより、タンパク質の発現を阻害する。転写レベルまたは翻訳レベルのいずれかでのＮｇＲ発現の抑制は、異常なＮｇＲ発現により特徴付けられる疾患／状態に関する細胞モデルまたは動物モデルを作製するのに有用である。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成する従来的なヌクレオチド相補性によるか、または、例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重らせんのメジャーグルーブにおける相互作用を通してであり得る。
【０１２８】
ホスホロチオエートおよびメチルホスホネートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明による治療用途に特に企図される。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’末端にポリ−Ｌ−リジン、トランスフェリンポリリジン、またはコレステロール部分を付加することによりさらに改変され得る。
【０１２９】
本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例として、組織部位への直接注入が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的化するよう改変され得、次いで全身投与され得る。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、例えば、細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗原にアンチセンス核酸分子を連結することにより、選択された細胞表面に発現するレセプターまたは抗体に特異的に結合するよう改変され得る。このアンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載されるベクターを用いて細胞に送達され得る。十分な細胞内濃度のアンチセンス分子を達成するために、このアンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が好ましい。
【０１３０】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、αアノマー核酸分子である。αアノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、このハイブリッドにおいて、通常のβユニットとは対照的に、鎖は互いに平行に延びる（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。このアンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）を含み得る。
【０１３１】
本発明において教示されるＮｇＲ配列は、ネイティブの細胞および動物ならびにＮｇＲポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた細胞におけるＮｇＲ発現の調節のための新規の転写因子の設計を容易にする。例えば、Ｃｙｓ_２−Ｈｉｓ_２ジンクフィンガータンパク質（これらのジンクフィンガードメインを介してＤＮＡに結合する）は、異なる標的配列の認識を導く構造変化に影響を受けやすいことが示されている。これらの人工的なジンクフィンガータンパク質は、特定の標的部位を、高い親和性および低い解離定数で認識し、そして遺伝子切り替えとして作用して遺伝子発現を調節し得る。本発明の特定のＮｇＲ標的配列の知見により、公知の方法（例えば、構造に基づくモデリングおよびファージディスプレイライブラリーのスクリーニングの組み合わせ）を用いた、標的配列に特異的なジンクフィンガータンパク質の操作が容易になる（Ｓｅｇａｌら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６、２７５８−２７６３；Ｌｉｕら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４、５５２５−５５３０；Ｇｒｅｉｓｍａｎら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５、６５７−６６１；Ｃｈｏｏら（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３、５２５−５３２）。各々のジンクフィンガードメインは、通常、３つ以上の塩基対を認識する。１８塩基対の認識配列は、一般的に、任意の既知のゲノムにおいてこの配列を特定するのに十分な長さであるので、６つのタンデムリピートのジンクフィンガーからなるジンクフィンガータンパク質は、特定の配列に対する特異性を確実にしていると考えられる（Ｓｅｇａｌら（１９９９）前出）。ＮｇＲ配列のプロモーターに基づき設計された、この人工的なジンクフィンガー反復は、活性化ドメインまたは抑制ドメインと融合されて、ＮｇＲの発現を促進または抑制する（Ｌｉｕら（１９９７）前出）。ＮｇＲのプロモーターは、本明細書中に含まれる開示およびＮｇＲ配列の知見と共に、当業者に公知の標準的な方法により獲得され得る。あるいは、ジンクフィンガードメインは、ＴＡＴＡボックス結合因子（ＴＢＰ）と融合されて（ジンクフィンガーペプチドとＴＢＰとの間のリンカー領域の長さを変化させて）、転写アクチベーターまたはリプレッサーのいずれかを生成する（Ｋｉｍら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４、３６１６−３６２０）。このようなタンパク質およびこれらをコードするポリヌクレオチドは、ネイティブの細胞、動物およびヒト；ならびに／またはＮｇＲをコードする配列でトランスフェクトされた細胞の両方において、インビボでＮｇＲ発現を調節するための有用性を有する。この新規の転写因子は、転写因子を発現する構築物をトランスフェクトすることによるか（遺伝子治療）、またはこのタンパク質を導入することにより、標的細胞に送達され得る。操作されたジンクフィンガータンパク質もまた、アンチセンスまたは触媒性ＲＮＡ分子の代替としての治療剤において使用するために、ＲＮＡ配列に結合するよう設計され得る（ＭｃＣｏｌｌら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６、９５２１−９５２６；Ｗｕら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２、３４４−３４８）。本発明は、本発明の遺伝子配列に基づき、このような転写因子、および細胞（ネイティブまたは形質転換体）におけるＮｇＲ発現を調節するのに有用なカスタマイズされたジンクフィンガータンパク質を設計する方法を企図する。これらの遺伝子相補体は、これらの配列に含まれる。
【０１３２】
（リボザイムおよびＰＮＡ部分）
さらに別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）（リボザイムは、それらに対する相補的領域を有する）を切断し得るリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１に記載される））は、ＮｇＲ ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによってＮｇＲ ｍＲＮＡの翻訳を阻害するために用いられ得る。ＮｇＲをコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示されるＮｇＲ ＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１、３、または１３）に基づいて設計され得る。例えば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ Ｌ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体は、活性部位のヌクレオチド配列がＮｇＲをコードするｍＲＮＡにおいて切断されるヌクレオチド配列に相補的であるように構築され得る。例えば、Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。あるいは、ＮｇＲ ｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子のプールから特定のリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択するために用いられ得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１−１４１８を参照のこと。
【０１３３】
あるいは、ＮｇＲ遺伝子発現は、ＮｇＲの調節領域（例えば、ＮｇＲプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的であるヌクレオチド配列を標的化し、標的細胞中のＮｇＲ遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成することによって阻害され得る。一般に、Ｈｅｌｅｎｅ（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．６：５６９−５８４；Ｈｅｌｅｎｅら（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；およびＭａｈｅｒ（１９９２）ＢｉｏＥｓｓａｙｓ １４：８０７−８１５を参照のこと。
【０１３４】
種々の実施形態では、ＮｇＲの核酸は、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で改変され、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解性を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を改変してペプチド核酸を生成し得る（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ． ４：５−２３を参照のこと）。本明細書中で用いる場合、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格が偽ペプチド（ｐｓｅｕｄｏｐｅｐｔｉｄｅ）骨格で置換され、かつ４つの天然のヌクレオ塩基のみが保持されている、核酸模倣物、例えば、ＤＮＡ模倣物をいう。ＰＮＡの中性の骨格は、低イオン強度条件下で、ＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐら（１９９６）前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３、１４６７０−１４６７５に記載されるような、標準的な固相ペプチド合成プロトコルを用いて実施され得る。
【０１３５】
ＮｇＲのＰＮＡは、治療適用および診断適用において用いられ得る。例えば、ＰＮＡは、例えば、転写または翻訳の停止を誘導すること、または複製を阻害することにより、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたはアンチ遺伝子剤として用いられ得る。ＮｇＲのＰＮＡはまた、例えば、ＰＮＡ特異的ＰＣＲクランピングにより、例えば、遺伝子中の単一塩基対変異の分析において使用され；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて使用される場合、人工の制限酵素として使用され（Ｈｙｒｕｐ（１９６６）前出）；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブまたはプライマーとして使用され得る（Ｈｙｒｕｐら（１９６６）前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ（１９９６）前出）。
【０１３６】
別の実施形態では、ＮｇＲのＰＮＡは、例えば、それらの安定性または細胞の取り込みを増大するために、ＰＮＡに親油性基またはその他の補助基を結合することによるか、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によるか、またはリポソームの使用もしくは当該分野で公知の他の薬物送達の技法によって改変され得る。例えば、ＰＮＡとＤＮＡの有利な性質を組み合わせ得る、ＮｇＲのＰＮＡ−ＤＮＡキメラが生成され得る。このようなキメラは、ＰＮＡ部分が高い結合親和性および特異性を提供しつつ、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓｅＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）が、ＤＮＡ部分と相互作用することを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング、ヌクレオ塩基間の結合数、および方向に関して選択された適切な長さのリンカーを用いて連結され得る（Ｈｙｒｕｐ（１９９６）前出）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、上記のＨｙｒｕｐ（１９６６）およびＦｉｎｎら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２４：３３５７−３３６３に記載されるように実施され得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホルホルアミダイトカップリング化学を用いて固体支持体上で合成され得、そして改変ヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイト）は、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間で使用され得る（Ｍａｇら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １７：９７３−９８８）。次いで、ＰＮＡモノマーは段階的様式でカップリングされて、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子が生成される（Ｆｉｎｎら（１９９６）前出）。あるいは、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを有するキメラ分子が、合成され得る。Ｐｅｔｅｒｓｅｎら（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９−１１２４を参照のこと。
【０１３７】
他の実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付属基（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するため）、または細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：６４８−６５２；ＰＣＴ公報番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）もしくは血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公報番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）を横切る輸送を容易にする薬剤を含み得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションにより誘導される切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６を参照のこと）またはインターカーレート剤（例えば、Ｚｏｎ（１９８８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照のこと）を用いて改変され得る。この目的のために、このオリゴヌクレオドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションにより誘導される架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションにより誘導される切断剤など）に連結され得る。
【０１３８】
自動配列決定法は、ＮｇＲのヌクレオチド配列を獲得および確認するために使用され得る。本発明のＮｇＲヌクレオチド配列は、１００％正確であると考えられる。しかし、当該分野で公知のように、自動方法により獲得されるヌクレオチド配列は、いくつかの誤りを含み得る。オートメーションにより決定されるヌクレオチド配列は、所定の核酸分子の正確なヌクレオチド配列と、代表的に少なくとも約９０％、より代表的には少なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当該分野で周知の手動の配列決定方法を用いてより正確に決定され得る。１つ以上のヌクレオチドの挿入または欠失を生じる配列中の誤りは、翻訳の際にフレームシフトを引き起こし、その結果、予想されたアミノ酸配列は、変異の点で始まるこの核酸分子の実際のヌクレオチド配列から予想されたアミノ酸配列と異なる。
【０１３９】
（ポリペプチド）
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる、精製および単離された哺乳動物ＮｇＲポリペプチドを提供する。配列番号２または配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むヒトＮｇＲポリペプチドが、現在のところ好ましい。別の好ましい実施形態は、配列番号４に示されるようなＮｇＲ３のアミノ酸配列を含む、マウスＮｇＲポリペプチドである。
【０１４０】
本発明の１つの局面は、単離されたＮｇＲタンパク質、およびその生物学的に活性な部分、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、もしくはホモログに関する。抗ＮｇＲ抗体を惹起するための免疫原として使用するのに適したポリペプチドフラグメントもまた提供される。好ましくは、ＮｇＲタンパク質のフラグメントは、ＮｇＲの少なくとも１つの生物学的活性を含む。１つの実施形態において、ネイティブのＮｇＲタンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いた適切な精製スキームにより、細胞供給源または組織供給源から単離され得る。別の実施形態において、ＮｇＲタンパク質は、組換えＤＮＡ技術により生成される。組換え発現の代替として、ＮｇＲタンパク質またはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を用いて化学的に合成され得る。
【０１４１】
本発明はまた、本発明の好ましいポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、少なくとも５０％、少なくとも４５％の、同一性および／または相同性を有するポリペプチドを含む。さらに、本発明は、配列番号６に示されるコンセンサス配列を有するポリペプチド（表５に示され、以前に特徴付けられたＮｇＲ（「ＮｇＲ１」）を除外する）、およびこのコンセンサス配列の少なくとも約９０％を含むポリペプチドを含む。
【０１４２】
用語「配列同一性の割合」は、以下により計算される：比較の領域にわたって、２つの最適に整列された配列を比較して、同一の核酸塩基（核酸の場合、例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両方の配列において存在する部位の数を決定して、一致した位置の数を得て、一致した位置の数を比較の領域（すなわち、ウィンドウサイズ）における位置の総数で除算して、そして結果に１００を乗算して配列同一性の割合を得る。本明細書中で用いられる場合、用語「実質的な同一性」は、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここで、このポリヌクレオチドは、比較領域にわたる参照配列と比較して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、および頻繁に９０〜９５％の配列同一性、さらに通常は、少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【０１４３】
１つの局面では、整列（アライメント）を最大にするために１００のアミノ酸の長さの４つのギャップが導入され得る場合、比較される配列の中の同一のアミノ酸残基と整列する、２つの配列のうちの小さい方の配列におけるアミノ酸残基の割合として計算される（Ｄａｙｈｏｆｆ，ＡＴＬＡＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＤ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ、第５巻、１２４頁、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９７２）本明細書中で参考として援用される）。
【０１４４】
相同性または同一性の決定は、代表的に、当該分野で公知のコンピューター相同性プログラムにより行われる。例示的なプログラムは、デフォルト設定を使用するＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ ＵＮＩＸ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）（これは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、１９８１、２：４８２−４８９（その全体が参考として本明細書中に援用される））を使用する）である。ＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰソフトウェア（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ １９７０ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８：４４３〜４５３を参照のこと）を用いて、核酸配列比較のための以下の設定：ＧＡＰ作成ペナルティー、５．０、およびＧＡＰ伸長ペナルティー、０．３を使用し得る。上記で言及される類似の核酸配列のコード領域は、配列番号１、３または１３に示されるＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード）部分と、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性の程度を示す。ＢｅｓｔＦｉｔは、バージョン１．０に関して、Ｐａｕｌ Ｈａｅｂｅｒｌｉによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）（上記）およびＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）（上記）による論文の詳細な解釈から、最初は書かれた。核酸配列比較のために以下のＢｅｓｔｆｉｔ設定：ＧＡＰ作成ペナルティーとして８．０、およびＧＡＰ伸長ペナルティーとして２を使用し得る。上記で言及される類似の核酸配列のコード領域は、配列番号２、４または１４に示されるアミノ酸配列のＣＤＳ（コード）部分と、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性の程度を示す。
【０１４５】
あるいは、相同性は、ハイブリダイゼーション分析により決定され得、ここで、核酸配列は、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、上記のタンパク質をコードする配列の相補体にハイブリダイズされる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９３および以下を参照のこと。
【０１４６】
本発明のポリペプチドは、天然の細胞供給源から単離され得るか、または化学的に合成され得るが、好ましくは、本発明の宿主細胞を含む組換え手順により産生される。
【０１４７】
「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、ＮｇＲタンパク質の由来する細胞または組織供給源由来の細胞性物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学合成される場合に化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、ＮｇＲタンパク質の調製物を含み、この調製物において、ＮｇＲタンパク質が単離または組換え産生される細胞の細胞性成分から、このタンパク質は分離されている。１つの実施形態において、用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、非ＮｇＲタンパク質（本明細書中において「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）を（乾燥重量にて）約３０％未満、より好ましくは非ＮｇＲタンパク質を約２０％未満、なおより好ましくは非ＮｇＲタンパク質を約１０％未満、そして最も好ましくは非ＮｇＲタンパク質を約５％未満有する、ＮｇＲタンパク質の調製物を含む。ＮｇＲタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え産生される場合、好ましくは、調製物はまた培養培地を実質的に含まない。すなわち、培養培地は、そのタンパク質調製物の容量の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは約５％未満を示す。
【０１４８】
用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、タンパク質が、そのタンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離されているＮｇＲタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態において、用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、化学前駆体または非ＮｇＲの化学物質を（乾燥重量にて）約３０％未満、より好ましくは化学前駆体または非ＮｇＲの化学物質を約２０％未満、なおより好ましくは化学前駆体または非ＮｇＲの化学物質を約１０％未満、そして最も好ましくは化学前駆体または非ＮｇＲの化学物質を約５％未満有する、ＮｇＲタンパク質の調製物を含む。
【０１４９】
ＮｇＲタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＮｇＲタンパク質より少ないアミノ酸を含み、そしてＮｇＲタンパク質の少なくとも１つの活性を示す、ＮｇＲタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２、４または１４に示されるアミノ酸配列）に十分に相同なアミノ酸配列、またはＮｇＲタンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。代表的には、生物学的に活性な部分は、ＮｇＲタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。ＮｇＲタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００またはそれより多いアミノ酸であるポリペプチドであり得る。
【０１５０】
本発明のＮｇＲタンパク質の生物学的に活性な部分は、ＮｇＲタンパク質の間で保存される特徴（例えば、成熟タンパク質のＮ末端として保存されたしステイン、ロイシンリッチ領域の前のＮ末端内の４つの保存されたシステイン、ロイシンリピート領域に関するＣ末端の４つの保存されたシステイン、８つのロイシンリッチリピート、および疎水性Ｃ末端）の少なくとも１つを含み得る。ＮｇＲタンパク質の代替的な生物学的に活性な部分は、少なくとも２つの上記ドメインを含み得る。ＮｇＲタンパク質の別の生物学的に活性な部分は、上記ドメインの少なくとも３つを含み得る。本発明のＮｇＲタンパク質のさらに別の生物学的に活性な部分は、上記ドメインの少なくとも４つを含み得る。
【０１５１】
さらに、他の生物学的に活性な部分（タンパク質の他の領域が欠失される）は、組換え技術により調整され得、そしてネイティブＮｇＲタンパク質の機能的活性の１つ以上について評価され得る。
【０１５２】
１つの実施形態では、ＮｇＲタンパク質は、配列番号２、４または１４に示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、ＮｇＲタンパク質は、配列番号２，４または１４に実質的に相同であり、そして配列番号２，４または１４のタンパク質の機能的活性を維持し、さらに、以下に詳細に記載されるように、天然の対立遺伝子改変体または変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なる。
【０１５３】
従って、別の実施形態では、ＮｇＲタンパク質は、配列番号２または配列番号４または配列番号１４のアミノ酸配列に、少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含み、かつ配列番号２、４または１４のＮｇＲタンパク質の機能的活性を維持するタンパク質である。
【０１５４】
哺乳動物宿主細胞の使用は、本発明の組換え発現産物に対して最適な生物学的活性を与えるために必要であり得るので、このような翻訳後の改変（例えば、グリコシル化、短縮化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、およびホスホリル化）を含むことが予想される。ＮｇＲポリペプチドのグリコシル化形態および非グリコシル化形態は、本発明に含まれる。
【０１５５】
本発明はまた、改変体（またはアナログ）ＮｇＲポリペプチドを含む。１つの例としては、挿入改変体が提供され、ここで、１以上のアミノ酸残基が、ＮｇＲアミノ酸配列を足し込む。挿入物は、タンパク質のいずれかの末端または両方の末端に配置され得るか、またはＮｇＲアミノ酸配列の内部の領域内に位置づけられ得る。いずれかの末端または両方の末端にさらなる残基を有する挿入改変体は、例えば、融合タンパク質、ならびにアミノ酸タグまたは標識を含むタンパク質を含み得る。
【０１５６】
挿入改変体は、ＮｇＲポリペプチドを含み、ここで、１つ以上のアミノ酸残基が、ＮｇＲ核酸配列またはその生物学的に活性なフラグメントに加えられる。
【０１５７】
本発明の改変体産物はまた、さらなるアミノ末端残基を有する、成熟ＮｇＲ産物（すなわち、リーダー配列またはシグナル配列が取り除かれているＮｇＲ産物）を含む。このさらなるアミノ末端残基は、別のタンパク質に由来し得るか、または特定のタンパク質に由来すると確認できない１つ以上の残基を含み得る。−２位および−１位（Ｍｅｔ^−２−Ｌｙｓ^−１−ＮｇＲ）にメチオニン残基およびリジン残基を有する改変体が意図されるように、−１位（Ｍｅｔ^−１−ＮｇＲ）にさらなるメチオニン残基を有するＮｇＲ産物が意図される。さらなるＭｅｔ残基、Ｍｅｔ残基−Ｌｙｓ残基、Ｌｙｓ残基を有するＮｇＲの改変体（または一般に１つ以上の塩基性残基）は、細菌宿主細胞における増幅された組換えタンパク質産生に特に有用である。
【０１５８】
（ポリペプチド改変体）
本発明はまた、特定の発現系の使用から生じる、さらなるアミノ酸残基を有するＮｇＲ改変体を含む。
【０１５９】
本明細書中で使用される場合、ＮｇＲ「キメラタンパク質」またはＮｇＲ「融合タンパク質」は、非ＮｇＲポリペプチドに作動可能に連結された、ＮｇＲポリペプチドを含む。「ＮｇＲポリペプチド」は、ＮｇＲに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいうが、「非ＮｇＲポリペプチド」は、ＮｇＲタンパク質に対して実質的に相同ではないタンパク質（例えば、ＮｇＲタンパク質とは異なるタンパク質、および同一生物または異なる生物に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ＮｇＲ融合タンパク質において、このＮｇＲポリペプチドは、ＮｇＲタンパク質のすべてまたは一部分に対応し得る。１つの実施形態では、ＮｇＲ融合タンパク質は、ＮｇＲタンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の実施形態では、ＮｇＲ融合タンパク質は、ＮｇＲタンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。さらに別の実施形態では、ＮｇＲ融合タンパク質は、ＮｇＲタンパク質の少なくとも３つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結された」は、ＮｇＲポリペプチドおよび非ＮｇＲポリペプチドが、インフレームで互いに融合されていることを示すことが意図される。非ＮｇＲポリペプチドは、ＮｇＲポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【０１６０】
例えば、１つの実施形態では、ＮｇＲ融合タンパク質は、第２のタンパク質の細胞外ドメインに作動可能に連結されたＮｇＲポリペプチドを含む。このような融合タンパク質は、ＮｇＲ活性を調節する化合物についてのスクリーニングアッセイでさらに利用され得る（このようなアッセイは、以下に詳細に記載される）。
【０１６１】
例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合産物の一部として所望のポリペプチドを発現する、市販のベクターの使用は、所望のポリペプチドからのＧＳＴ構成要素の切断の後に、−１位にさらなるグリシン残基を有する所望のポリペプチドを提供する。
【０１６２】
別の実施形態において、この融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含むＮｇＲタンパク質である。例えば、ネイティブＮｇＲシグナル配列（すなわち、配列番号２のアミノ酸１〜３０および配列番号４のアミノ酸１〜４０）が除去され得、そして別のタンパク質由来のシグナル配列で置換され得る。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、ＮｇＲの発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を介して増加され得る。
【０１６３】
さらに別の実施形態においては、この融合タンパク質は、ＮｇＲ−免疫グロブリン融合タンパク質であり、ここでは１つ以上のドメインを含むＮｇＲ配列が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合される。本発明のこのＮｇＲ−免疫グロブリン融合タンパク質は、薬学的組成物中に取り込まれ得、そして被験体に投与されて、細胞の表面上のＮｇＲリガントとＮｇＲタンパク質との間の相互作用を阻害し、それによってインビボでＮｇＲ媒介シグナル伝達を抑制し得る。このＮｇＲ−免疫グロブリン融合タンパク質を用い、ＮｇＲ同族リガンドのバイオアベイラビリティーを調節し得る。ＮｇＲリガンド／ＮｇＲ相互作用の阻害は、増殖障害および分化障害の処置、および細胞生存を調節（例えば、促進または阻害）することの両方について、治療的に有用であり得る。さらに、本発明のＮｇＲ−免疫グロブリン融合タンパク質は、被験体中で抗ＮｇＲ抗体を産生するための免疫原として、ＮｇＲリガンドを精製するため、そしてＮｇＲリガンドとのＮｇＲの相互作用を阻害する分子を同定するスクリーニングアッセイにおいて、用いられ得る。
【０１６４】
本発明のＮｇＲキメラタンパク質または融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技法により産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来の技法に従って、例えば、連結のための平滑化末端または付着（ｓｔａｇｇｅｒ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な付着（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）末端の充填、所望しない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を使用することにより、インフレームで一緒に連結する。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来技法により合成し得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２つの連続する遺伝子フラグメント間に相補的突出を生じるアンカープライマーを用いて実施し得、この遺伝子フラグメントは、キメラ遺伝子配列を生成するために次いでアニーリングおよび再増幅され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードした多くの発現ベクターが市販されている。ＮｇＲをコードする核酸は、この融合部分がＮｇＲタンパク質にインフレーム連結されるように、このような発現ベクター中にクローン化され得る。
【０１６５】
他のベクター系における発現から生じる改変体もまた含まれる。
【０１６６】
挿入改変体はまた、融合タンパク質を含み、ここで、ＮｇＲのアミノ末端および／またはカルボキシ末端は、別のポリペプチドに融合される。
【０１６７】
別の局面では、本発明は、欠失改変体を提供し、ここで、ＮｇＲポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸残基が取り除かれる。欠失は、ＮｇＲポリペプチドの一方の末端または両方の末端で行われ得るか、ＮｇＲの１つ以上の非末端アミノ酸残基の除去により行われる。従って、欠失改変体は、ＮｇＲポリペプチドの全てのフラグメントを含む。
【０１６８】
本発明はまた、配列番号２、４または１４に示される配列のポリペプチドフラグメントを含み、ここで、これらのフラグメントは、ＮｇＲポリペプチドの生物学的特性（リガンド結合および／または細胞間シグナル伝達）、免疫学的特性くを維持する。配列番号２、４または１４の、少なくとも４，５，１０，１５，２０，２５，３０，３５、または４０の連続するアミノ酸を含むフラグメントが、本発明により意図される。好ましいポリペプチドフラグメントは、ヒトＮｇＲ、ならびにその対立遺伝子ホモログおよび種ホモログに対して固有または特異的な抗原性特性を示す。所望の生物学的特性および免疫学的特性を有する本発明のフラグメントは、当該分野で周知および慣用的に実施される任意の方法により調整され得る。
【０１６９】
さらに別の局面では、本発明は、ＮｇＲポリペプチドの置換改変体を提供する。置換改変体は、ＮｇＲポリペプチドの１つ以上のアミノ酸残基が除去され、そして代替の残基と置換される、ポリペプチドを含む。１つの局面では、置換は、天然では保存的であるが、本発明はまた、非保存的である置換も含む。この目的のための保存的置換は、以下の表２、３、または４に示されるようび規定され得る。
【０１７０】
【表１】

改変体ポリペプチドとしては、保存的置換が、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを改変することによって導入された、ポリペプチドが挙げられる。アミノ酸は、物理学的特性およびタンパク質の二次構造およびタンパク質の三次構造への寄与に従って分類され得る。保存的置換は、あるアミノ酸から類似の特性を有する別のアミノ酸への置換として当該分野において認識されている。例示的な保存的置換は、（ＷＯ ９７／０９４３３，１０頁，１９９７年３月１３日に公開（ＰＣＴ／ＧＢ９６／０２１９７、９６年９月６日に出願）からの）すぐ下の表２に示される。
【０１７１】
（表２）
（保存的置換Ｉ）
【０１７２】
【表２】

あるいは、保存的アミノ酸は、すぐ下の表３に示されるように、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ［ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，第２版；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ，ＮＹ（１９７５），７１−７７頁］に記載のようにグループ分けされ得る。
【０１７３】
（表３）
（保存的置換ＩＩ）
【０１７４】
【表３】

なお別の代替として、例示的な保存的置換が以下の表４に示される。
【０１７５】
（表４）
（保存的置換ＩＩＩ）
【０１７６】
【表４】

さらに、（本明細書中で提示されるアライメントによって示されるような）本発明のＮｇＲタンパク質のファミリーのメンバーの間で保存されるアミノ酸残基はまた、変更に対して特に御しにくいと予測される。例えば、本発明のＮｇＲタンパク質は、ＮｇＲで代表的に保存される領域である少なくとも１つのドメインを包含し得る。これらの保存されたドメインの例としては、例えば、ロイシンリッチリピートドメインが挙げられる。ＮｇＲタンパク質のメンバーの中で保存されていないかまたは半保存的にすぎないアミノ酸残基は、変化に対して容易に影響を受けやすい。
【０１７７】
全長ＮｇＲは、配列番号１９に示されるアミノ酸コンセンサス配列によって特徴付けられるＬＲＲ領域を有する。少なくともいくつかの全長ＮｇＲはまた、ＣＴシグナル伝達（ＣＴＳ）ドメインおよびＧＰＩドメインを含む。
【０１７８】
本明細書中で使用されるＮｇＲドメインの呼称は、以下のように定義される：
【０１７９】
【表５】

。
【０１８０】
本発明のいくつかの実施形態において、上記のドメインは、改変される。改変は、ドメインの機能性を保存する様式であり得る。改変としては、特定のアミノ酸の、付加、欠失または置換が挙げられる。例示的な改変としては、保存的アミノ酸置換が挙げられる。好ましくは、このような置換は、１００残基当たり２０以下の残基である。より好ましくは、このような置換は、１００残基当たり１０以下の残基である。さらに例示的な改変としては、１以上のドメインのＮ末端および／またはＣ末端において５までのアミノ酸の隣接配列の付加が挙げられる。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、この単離された核酸分子は、配列番号２、４、１４に対して、少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９８％および最も好ましくは少なくとも約９９％相同性であるポリペプチドをコードする。
【０１８２】
変異は、標準的な技術（例えば、部位指向性変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）によって、配列番号１、３、または１３に導入され得る。保存的アミノ酸置換は、非必須であると予測される１以上のアミノ酸残基において生成され得る。あるいは、変異は、ＮｇＲコード配列に沿って無作為に導入され得る。これは、例えば、飽和突然変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって達成され得る。得られた変異体は、ＮｇＲ生物活性についてスクリーニングされ得る。ＮｇＲ生物学的な活性としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：（１）（例えば、他のＮｇＲまたはＮｏｇｏ関連シグナル伝達に関与する細胞表面タンパク質との）タンパク質：タンパク質相互作用；（２）ＮｇＲリガンドとの複合体形成；（３）抗ＮｇＲ抗体に対する結合。
【０１８３】
本発明のポリペプチドの定義は、アミノ酸残基の、挿入、欠失または置換以外の改変を保有するポリペプチドを含むことを意図すると理解される。例として、この改変は、事実上、共有結合性であり得、そしてこの改変は、例えば、ポリマー、脂質、他の有機部分および他の無機部分との化学結合を含む。このような誘導体は、ポリペプチドの循環半減期を増加するように調製され得るか、またはこの誘導体は、所望の細胞、組織、または器官についてのこのポリペプチドの標的化能力を改善するように設計され得る。同様に、本発明は、ＮｇＲポリペプチドをさらに包含し、このＮｇＲポリペプチドは、１以上の水溶性ポリマー結合物（例えば、ポリエチレングリコール、ポリオキシレングリコール、またはポリプロピレングリコール）を含むように共有結合的に改変される。ネイティブＮｇＲのリガンド結合特性を示し、かつより高いレベルで発現される、改変体、ならびに構成的に活性なレセプターを提供する改変体は、特に本発明のアッセイにおいて有用であり；この改変体はまた、異常型のＮｇＲ活性によって特徴付けられる、疾患／条件の細胞モデル、組織モデルおよび動物モデルの提供において有用である。
【０１８４】
ＮｇＲポリペプチドがポリマーに結合している、化学修飾されたＮｇＲポリペプチド組成物は、本発明の範囲に包含される。このポリマーは、水溶性であり得、水溶性環境（例えば、生理学的環境）でこのタンパク質の沈澱を防止し得る。適切な水性ポリマーは、例えば、以下からなる群より選択され得る：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物に基づくポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール。この選択されたポリマーは、通常は改変され、単一の反応性基（例えば、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒド）を有し、その結果、重合度は制御され得る。ポリマーは、任意の分子量であり得、そして、このポリマーは分枝状でも分枝状でなくてもよく、そしてこのようなポリマーの混合物はまた、使用され得る。この化学修飾されたＮｇＲポリマーは、治療用途に決定付けられる場合、薬学的に受容可能なポリマーが使用するために選択される。
【０１８５】
このポリマーがアシル化反応によって改変される場合、このポリマーは、単一の反応性エステル基を有するべきである。あるいは、このポリマーが還元アルキル化によって改変される場合、このポリマーは単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。好ましい反応性アルデヒドは、ポリエチレングリコール、プロピオンアルデヒド（このプロピオンアルデヒドは、水溶性である）または、そのモノＣ１〜Ｃ１０の、アルコキシ誘導体もしくはアリールオキシ誘導体である（例えば、米国特許第５，２５２，７１４号（これは、本明細書中で全体が参考として援用される）を参照のこと）。
【０１８６】
ＮｇＲポリペプチドのペグ化（Ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、例えば、以下の参考文献に記載されるような、当該分野で公知の、任意のペグ化反応によって実施され得る：Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３，４−１０（１９９２）；ＥＰ ０ １５４ ３１６ ；およびＥＰ ０ ４０１ ３８４（これらの各々は、本明細書中で、全体が参考として援用される）。好ましくは、このペグ化は、反応性ポリエチレングリコール分子（または、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施される。ポリペプチド（例えば、ＮｇＲ）のペグ化のための好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。本明細書中で使用される場合、「ポリエチレングリコール」は、ＰＥＧの任意の形態の包含することを意味し、ここで、このＰＥＧは、他のタンパク質（例えば、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシポリエチレングリコールまたはモノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アリールオキシポリエチレングリコール）を誘導体するために使用される。
【０１８７】
ＮｇＲポリペプチドの化学誘導体化を、生物学的に活性な物質を活性化したポリマー分子と反応させるのに使用される適切な条件下で、実施され得る。ペグ化したＮｇＲポリペプチドを調製するための方法は、一般に以下の工程を包含する：（ａ）ＮｇＲポリペプチドが１以上のＰＥＧ基に結合するような条件下で、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの、反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）とこのポリペプチドを反応させる工程および（ｂ）この反応生成物を得る工程。公知のパラメータおよび所望の結果に基づいて、最適な反応条件またはアシル化反応を選択することは当業者に容易である。
【０１８８】
ペグ化ポリマーおよび他のポリマー：ＮｇＲポリペプチドは、一般に、本明細書中に記載のＮｇＲポリペプチドを投与することによって、緩和または調節され得る状態を処置するために使用され得るが、しかし、本明細書中で開示された、化学誘導体化されたポリマー：ＮｇＲポリペプチド分子は、それらの非誘導体分子と比較して、さらなる活性、増大された生物活性もしくは減少した生物活性、または他の特徴（例えば、増大された半減期または減少した半減期）を有し得る。このＮｇＲポリペプチド、それらのフラグメント、改変体および誘導体は、単独で、併用して、または他の薬学的組成物を組み合わせて使用され得る。これらのサイトカイン、増殖因子、抗原、抗炎症剤および／または化学療法剤は、徴候を処置するのに適切である。
【０１８９】
本発明は、精製された本発明のポリペプチドを含む組成物を提供する。好ましい組成物は、本発明のポリペプチドに加え、薬学的に受容可能な（すなわち、無菌かつ非毒性の）液体、半固体、または固体の希釈剤を含み、この希釈剤は、薬学的ビヒクル、賦形剤または媒体として役割を果たす。当該分野で公知の任意の希釈剤が使用され得る。例示的希釈剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：水、生理食塩水溶液、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ステアリン酸マグネシウム、メチルヒドロキシ安息香酸およびプロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、アルギナート、デンプン、ラクトース、スクロース、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、リン酸カルシウム、鉱油、およびココアバター。
【０１９０】
ネイティブＮｇＲのリガンド結合特性を示し、かつより高いレベルで発現される、改変体、ならびに構成的に活性なレセプターを提供する改変体は、特に本発明のアッセイにおいて有用であり得；この改変体はまた、本発明のアッセイにおいて、ならびに異常型のＮｇＲ活性によって特徴付けられる、疾患／条件の細胞モデル、組織モデルおよび動物モデルの提供において、有用である。
【０１９１】
本発明で開示された核酸配列情報の知見を用いて、当業者は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（これは、本明細書中で全体が参考として援用される）に開示されるように、当業者に周知である種々の手段によって、異なる供給源（すなち、異なる組織または異なる生物種）からＮｇＲをコードするヌクレオチド配列を同定し、そしてこれらを得ることできる。
【０１９２】
例えば、ＮｇＲをコードするＤＮＡは、本明細書中で提供されるＮｇＲ遺伝子配列情報から生成されるオリゴヌクレオチドプローブを使用して、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡのスクリーニングによって得られ得る。プローブは、検出可能な基（蛍光基、放射性原子、または化学発光基）を使用して、当業者に公知の手順に従って、標識され得、そしてこのプローブは、例えば、上述のＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されるような従来のハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用され得る。
【０１９３】
上述の任意のＮｇＲヌクレオチド配列を含有する核酸分子は、代替的に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用によって合成され得、このＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、本明細書中に記載の核酸配列から生成される。例えば、特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）および特許第４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓ）を参照のこと。このＰＣＲ反応によって、特定の核酸配列が、特定のサンプル中で、予め精製されず、そしてこの核酸配列が単一のコピーのみ存在する場合ですら、特定の核酸配列の濃度を選択的に上昇させる方法が提供される。この方法を使用して、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡのいずれかを増幅し得る。この方法のエッセンスとしては、２つのオリゴヌクレオチドプローブの使用が挙げられ、これらのプローブは、テンプレート依存性であり、ポリメラーゼ媒介である、所望の核酸分子の複製のためのプライマーとして役割を果たす。
【０１９４】
広範な代替的なクローニングおよびインビトロの増幅法は、当業者にとって公知である。これらの技術の例は、例えば、Ｂｅｒｇｅｒら，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（これは、本明細書中で参考として全体が援用される）に見出される。
【０１９５】
本発明の核酸分子およびそれらから誘導されるフラグメントは、特定の疾患と関連する制限酵素切断断片長多型（ＲＦＬＰ）についてのスクリーニング、ならびに遺伝地図作製について有用である。
【０１９６】
（抗体）
ＮｇＲまたはそのフラグメントに特異的な抗体（例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、二官能性／二特異的抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体（本発明のポリペプチドを特異的に認識するＣＤＲ配列を含む化合物を含む））もまた、本発明によって意図される。本発明の好ましい抗体は、ＷＯ９３／１１２３６（１９９３年６月２０日公開）（これは、本明細書中に参考としてその全体が援用される）に記載される方法に従って生成され、そして同定されるヒト抗体である。抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦ_ｖ）もまた、本発明によって提供される。用語「特異的な」は、本発明の抗体を記載するために使用される場合、ＮｇＲポリペプチドを排他的に認識し、かつこれに結合する（すなわち、ＮｇＲとこのようなポリペプチドとの間の局在化された配列同一性、配列相同性、または配列類似性の可能性のある存在にかかわらず、結合親和性の測定可能な差異によって、ＮｇＲポリペプチドを他の公知のＮｇＲポリペプチドと区別し得る）本発明の抗体の可変領域を示す。
【０１９７】
ＮｇＲの抗原性ペプチドは、配列番号２、４または１４に示されるアミノ酸配列の少なくとも８アミノ酸残基を含み、そしてＮｇＲのエピトープを含み、その結果、このペプチドに対して惹起された抗体は、ＮｇＲと特異的な免疫複合体を形成する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１５アミノ酸残基、なおより好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基、そして最も好ましくは少なくとも３０アミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドによって含まれる好ましいエピトープは、タンパク質の表面上に位置するＮｇＲの領域（例えば、親水性領域）である。
【０１９８】
特定の抗体が、抗体の可変領域の外側の配列（特に、その分子の定常領域中）との相互作用を介して、他のタンパク質（例えば、ＥＬＩＳＡ技術における、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ プロテインＡまたは他の抗体）とも相互作用し得ることが、理解される。本発明の抗体の結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは、当該分野で周知であり、そして当該分野で慣用的に実施される。このようなアッセイの包括的な考察について、Ｈａｒｌｏｗら、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）第６章を参照のこと。本発明のＮｇＲポリペプチドのフラグメントを認識しかつこれに結合する抗体もまた、含まれ、但し、この抗体は、ＮｇＲポリペプチドに特異的である。本発明の抗体は、当該分野で周知の任意の方法を用いて生成され、そして当該分野において慣用的に実施され得る。
【０１９９】
ポリクローナル抗体の産生について、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物）が、ネイティブなタンパク質もしくはその合成改変体、または上述のものの誘導体を用いた注射によって免疫され得る。例えば、適切な免疫原性調製物は、組換え発現されたＮｇＲタンパク質または化学合成されたＮｇＲポリペプチドを含み得る。この調製物は、アジュバントをさらに含み得る。免疫学的応答を増大するために使用される種々のアジュバントとしては、フロイント（完全および不完全）アジュバント、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油状乳濁物、ジニトロフェノールなど）、ヒトアジュバント（例えば、Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｉｎおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）または類似の免疫刺激因子が挙げられるが、これらに限定されない。所望される場合、ＮｇＲに対する抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離され得、さらに、周知の技術（例えば、プロテインＡクロマトグラフィー）によって精製されてＩｇＧ画分を獲得し得る。
【０２００】
用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書中に使用される場合、ＮｇＲの特定のエピトープと免疫反応し得る抗原結合部位の１種のみを含む抗体分子の集団をいう。従って、モノクローナル抗体は、代表的に、この抗体が免疫反応する特定のＮｇＲタンパク質に対して単一の結合親和性を示す。特定のＮｇＲタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対するモノクローナル抗体の調製について、連続的な細胞株培養によって抗体分子の産生を提供する任意の技術が、利用され得る。このような技術としては、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６、４９５−４９７を参照のこと）；トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４，７２）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁）が挙げられるが、これらに限定されない。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実施に利用され得、そしてヒトハイブリドーマを用いることによって（Ｃｏｔｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０，２０２６−２０３０を参照のこと）、またはインビトロにおいてヒトＢ細胞をエプスタイン−バーウイルスで形質転換することによって（Ｃｏｌｅら（１９８５）、上記）、産生され得る。
【０２０１】
本発明に従って、技術は、ＮｇＲタンパク質に特異的な単鎖抗体の産生のために適合され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８を参照のこと）。さらに、方法は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築のために適合されて（例えば、Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６、１２７５−１２８１を参照のこと）、ＮｇＲタンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対する所望の特異性を有するモノクローナルＦ_ａｂフラグメントの迅速かつ有効な同定を可能にし得る。非ヒト抗体は、当該分野で周知の技術によって「ヒト化」され得る。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと。１つの方法において、非ヒトＣＤＲが、ヒト抗体またはコンセンサス抗体フレームワーク配列に挿入される。次いで、さらなる変更が、抗体フレームワーク中に導入されて、親和性または免疫原性を調節し得る。ＮｇＲタンパク質に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントが、当該分野で公知の技術によって産生され得、これらの抗体フラグメントとしては：（ｉ）抗体分子のペプシン消化により産生されるＦ（ａｂ’）_２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって産生されるＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤を用いた抗体の処理によって産生されるＦａｂフラグメント；ならびに（ｉｖ）Ｆ_ｖフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０２】
さらに、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製され得るキメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体（ヒト部分および非ヒト部分を含む）のような組換え抗ＮｇＲ抗体は、本発明の範囲内である。このようなキメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術によって（例えば、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；欧州特許出願第１８４，１８７号；欧州特許出願第１７１，４９６号； 欧州特許出願第１７３，４９４号；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許出願第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０，１０４１−１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｐｒｏｅ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＮＡ ８４，３４３９−３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９，３５２１−３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７，９９９−１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４，４４６−４４９；Ｓｈａｗら（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０，１５５３−１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９，１２０２−１２０７；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４，２１４；米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１，５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，１５３４；ならびにＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１，４０５３−４０６０に記載される方法を用いて）産生され得る。
【０２０３】
本発明の好ましい実施形態において、ＮｇＲの一部は、抗体のＦｃ部分と結合されて、ＮｇＲ／Ｆｃ融合タンパク質を形成する。好ましくは、Ｉｇ融合タンパク質は、可溶性である。ＮｇＲ／Ｆｃ融合タンパク質は、上記のような組換え技術によって形成され得る。１つの実施形態において、Ｃ末端疎水性領域以外のＮｇＲの全アミノ酸配列を含むＮｇＲの部分が、抗体のＦｃ部分に融合される。好ましい実施形態において、ＮｇＲは、ヒトのＮｇＲであり、そしてＦｃもまたヒトのＦｃである。より好ましくは、ヒトのＦｃ部分は、ＩｇＧ抗体から誘導される。他の実施形態において、Ｎ末端シグナル配列は排除される。このような抗体は、Ｎｏｇｏ結合において有用であり、ＮｇＲを通したＮｏｇｏシグナル伝達を妨害する。
【０２０４】
１つの実施形態において、所望の特異性を保有する抗体をスクリーニングするための方法としては、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）および当該分野内で公知の他の免疫学的に媒介される技術が挙げられるが、これらに限定さらない。特定の実施形態において、ＮｇＲタンパク質の特定のドメインに特異的である抗体の選択は、このようなドメインを保有するＮｇＲタンパク質のフラグメントに結合するハイブリドーマの作製によって、容易になる。ＮｇＲタンパク質内の１つ以上のドメイン（例えば、ＮｇＲ、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログの上記に同定された保存領域にわたるドメイン）を特異的に認識する抗体もまた、本明細書中に提供される。
【０２０５】
抗ＮｇＲ抗体は、ＮｇＲタンパク質の局在化および／または定量に関する当該分野で公知の方法において用いられ得る（例えば、適切な生理学的なサンプル内のＮｇＲタンパク質のレベルを測定の際の使用のために、診断的方法における使用のために、タンパク質の画像化における使用のために、など）。所定の実施形態において、ＮｇＲタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対する抗体（抗体由来の結合ドメインを含む）は、薬理学的に活性な化合物（本明細書中、以降において「治療剤」）として利用される。
【０２０６】
抗ＮｇＲ抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、標準的な技術（例えば、親和性クロマトグラフィーまたは免疫沈降）によって、ＮｇＲを単離するために用いられ得る。抗ＮｇＲ抗体は、細胞からの天然のＮｇＲ、そして宿主細胞において発現される組換え的に産生されたＮｇＲの精製を容易にし得る。さらに、抗ＮｇＲ抗体が、（例えば、細胞の溶解液または細胞上清における）ＮｇＲタンパク質を検出するために用いられ、ＮｇＲタンパク質の発現の存在の量およびパターンを評価し得る。抗ＮｇＲ抗体は、例えば、所定の処置レジメンの有効性を決定するために、臨床試験の手順の一部として組織におけるタンパク質レベルを診断的にモニターするために用いられ得る。検出は、抗体を検出可能物質に連結する（すなわち、物理的に連結する）ことにより容易になり得る。検出可能物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ）フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる；そして、適切な放射性物質の例としては^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓまたは^３Ｈが挙げられる。
【０２０７】
本発明の別の局面は、哺乳動物において、免疫応答を誘導するに十分な量のポリペプチドをこの哺乳動物に投与することにより本発明のポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法に関する。この量は、動物種、動物の大きさなどに依存するが、当業者により決定され得る。
【０２０８】
本発明の別の局面は、抗イディオタイプ抗体および抗抗イディオタイプ抗体に関する。抗イディオタイプ抗体は、別の抗体（標的抗体）の決定基を認識する抗体である。一般に、抗イディオタイプ抗体は、標的抗体の抗原結合部位の決定基を認識する。代表的には、この標的抗体は、モノクローナル抗体である。抗イディオタイプ抗体は、一般に、標的モノクローナル抗体の供給源と同じ種および同じ遺伝子型の動物（特にマウス）をこの標的モノクローナル抗体で免疫することにより調製される。免疫した動物は、この標的モノクローナル抗体のイディオタイプ決定基に対する免疫応答が上昇し、この標的モノクローナル抗体のイディオタイプ決定基に対する抗体を生成する。免疫した動物の抗体生成細胞（例えば、脾細胞）は、抗イディオタイプモノクローナル抗体を生成するために用いられ得る。さらに、抗イディオタイプ抗体をまた用いて、動物を免疫し、抗抗イディオタイプ抗体を生成し得る。これらの免疫した動物は、標準的な技術を用いて抗抗イディオタイプモノクローナル抗体を生成するために用いられ得る。この抗抗イディオタイプ抗体は、抗イディオタイプ抗体を調製するために用いられた、最初の標的モノクローナル抗体と同じエピトープに結合し得る。この抗抗イディオタイプ抗体は、最初の標的モノクローナル抗体と同じ抗原特異性を有する他のモノクローナル抗体を示す。
【０２０９】
この抗イディオタイプ抗体と標的抗体との結合が、標的抗体の関連抗原により阻害される場合、および抗イディオタイプ抗体が、標的抗体と同じ特異性を有する抗体応答を誘導する場合、この抗イディオタイプ抗体は、標的抗体の抗原を模倣する。このような抗イディオタイプ抗体が「内部イメージ抗イディオタイプ」であり、これが本来の抗原であるかのように抗体応答を誘導し得る（Ｂｏｎａ ａｎｄ Ｋｏｈｌｅｒ（１９８４）ＡＮＴＩ−ＩＤＩＯＴＹＰＩＣ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＩＮＴＥＲＮＡＬ ＩＭＡＧＥ，ＩＮ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＤ ＡＮＴＩ−ＩＤＩＯＴＹＰＩＣ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＯＢＥＳ ＦＯＲ ＲＥＣＥＰＴＯＲ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｖｅｎｔｅｒ Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．１４１−１４９，１９８４）。内部イメージ抗イディオタイプ抗体を組み込んだワクチンは、ウイルス、細菌および寄生生物に対する防禦応答を誘導することが示されている（Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）２３２，２２０−２２３；１０４７；ＭｃＮａｍａｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６，１３２５−１３２６）。内部イメージ抗イディオタイプ抗体はまた、腫瘍関連抗原に対する免疫を誘導することが示されている（Ｒａｙｃｈａｕｈｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７，１７４３−１７４９；Ｒａｙｃｈａｕｈｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９，３９０２−３９１０；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ−Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９，１３５４−１３６０；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ−Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１，１３９８−１４０３；Ｈｅｒｌｙｎ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，３４７−３５７；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ Ｉｍｍ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ ３５１−３５９；Ｈｅｒｌｙｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）ｉｎ ｖｉｖｏ ５，６１５−６２４；Ｆｕｒｕｙａ ｅｔ ａｌ．（１９９２） ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１２，２７−３２；Ｍｉｔｔｅｌｍａｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８９，４６６−４７０；Ｄｕｒｒａｎｔ．ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４，４８３７−４８４０；Ｍｉｔｔｅｌｍａｎ．ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４，４１５−４２１；Ｓｃｈｍｉｔｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １３，３８９−３９６；Ｃｈａｋｒｏｂａｒｔｙ．ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１８，９５−１０３；Ｃｈａｋｒｏｂａｒｔｙ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５，１５２５−１５３０；Ｆｏｏｎ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１，１２０５−１２９４；Ｈｅｒｌｙｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １４，１５９−１６６；Ｓｃｌｅｂｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １４，１６７−１７４；Ｈｅｒｌｙｎ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４３，６５−７６）。
【０２１０】
ＮｇＲに対する抗イディオタイプ抗体は、例えば、動物（例えば、マウス）をＮｇＲ２（配列番号２）、ＮｇＲ３（配列番号４または１４）、またはその免疫原性部分（ＮｇＲの少なくとも１つの抗原性エピトープを含む）を含む組成物の免疫原性量で免疫することにより調製され得る。この組成物はまた、免疫原性を提供するために必要な適切なアジュバントおよび任意のキャリアを含み得る。ＮｇＲを認識するモノクローナル抗体は、上記の免疫した動物の細胞から調製され得る。次いで、ＮｇＲのエピトープを認識するモノクローナル抗体を選択し、これを用いて、抗ＮｇＲモノクローナル抗体の免疫原性量を含む組成物を調製する。代表的には、適切なアジュバント中の２５〜２００μｇ用量の精製抗ＮｇＲモノクローナル抗体が十分である。
【０２１１】
動物を、用量間で１４〜３０日の間隔で２〜６回免疫し得る。代表的には、動物を、任意の適切な投与経路（例えば、腹腔内、皮下、静脈内、またはこれらの組み合わせ）により免疫する。抗イディオタイプ抗体生成は、標準的な免疫アッセイ方法を用いて免疫期間の間、モニターされ得る。標的モノクローナル抗体と反応する抗体の適切な力価を有する動物は、抗体生成細胞を採取する３日前に免疫原として用いたモノクローナル抗体で再び免疫され得る。好ましくは、脾細胞が使用されるが、他の抗体生成細胞が選択され得る。上記のように、抗体生成細胞を採取し、骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマを生成し、適切な抗イディオタイプ抗体生成細胞を選択する。
【０２１２】
抗抗イディオタイプ抗体は、免疫原として抗イディオタイプモノクローナル抗体を用いることにより別の回の免疫およびハイブリドーマ生成により生成される。
【０２１３】
本発明の抗体は、例えば、治療目的（ＮｇＲの活性を調節することにより）、ＮｇＲを検出もしくは定量する診断目的、およびＮｇＲの精製のために有用である。従って、本明細書中に記載の任意の目的のための、本発明の抗体を含むキットもまた企図される。
【０２１４】
（キット）
本発明はまた、キット（薬学的キットを含む）に関する。このキットは、上記の任意の核酸分子、上記の任意のポリペプチド、または上記の本発明のポリペプチドに結合する任意の抗体、ならびに適切なコントロール（例えば、ポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロール）を含み得る。このキットは、好ましくは、さらなる成分（例えば、指示書、固体支持体、定量に有用な試薬など）を含む。例えば、このキットは、以下を含み得る：生物学的サンプル中のＮｇＲタンパク質またはｍＲＮＡを検出し得る標識された化合物または標識された薬剤；サンプル中のＮｇＲの量を決定するための手段；およびサンプル中のＮｇＲの量と標準物質とを比較するための手段。この化合物または薬剤は、適切な容器中に包装され得る。
【０２１５】
（スクリーニングアッセイ）
本発明により提供されるＤＮＡ配列情報およびアミノ酸配列情報はまた、ＮｇＲポリペプチドまたはＮｇＲポリヌクレオチドが相互作用する結合パートナー化合物の同定を可能にする。この結合パートナー化合物を同定する方法としては、溶液アッセイ、ＮｇＲポリペプチドが固定化されるインビトロアッセイおよび細胞ベースのアッセイが挙げられる。ＮｇＲポリペプチドの結合パートナー化合物の同定は、ＮｇＲの正常な生物学的活性およびＮｇＲの異常な生物学的活性と関連する病理状態における治療的または予防的介入のための候補物を提供する。
【０２１６】
本発明はまた、モジュレーター、すなわち、ＮｇＲタンパク質に結合するか、あるいは例えば、ＮｇＲの発現またはＮｇＲの活性に対して刺激効果または阻害効果を有する、候補化合物または試験化合物または薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子（例えば、１，０００ダルトン未満の分子）または他の薬物）を同定するための方法（本明細書中において「スクリーニングアッセイ」とも称される）を提供する。
【０２１７】
１実施形態において、本発明は、ＮｇＲタンパク質またはＮｇＲポリペプチド、あるいはその生物学的に活性な部分に結合するか、またはこれらの活性を調節する、候補化合物もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチの任意のものを使用して得られ得、これには、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的にアクセス可能な平行固相もしくは溶液相ライブラリー；逆重畳を要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５）。
【０２１８】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ３７：１２３３。
【０２１９】
化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２〜４２１）、あるいはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ 米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ、上記）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２：３０１〜３１０；Ｌａｄｎｅｒ上記）において示され得る。
【０２２０】
（１．細胞ベースのアッセイ）
本発明はまた、ＮｇＲポリペプチドの結合化合物を同定するための細胞ベースのアッセイを提供する。１実施形態において、本発明は、細胞表面上に発現されるＮｇＲポリペプチドと、候補結合パートナー化合物とを接触させる工程、およびこの候補結合パートナー化合物のＮｇＲポリペプチドへの結合を検出する工程を包含する方法を提供する。別の実施形態において、アッセイは、ＮｇＲタンパク質の膜結合形態、またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上に発現する細胞と試験化合物とを接触させる工程、およびこの試験化合物がＮｇＲタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節する（例えば、刺激するか、または阻害する）能力を決定する工程を包含する細胞ベースのアッセイである。
【０２２１】
１実施形態において、アッセイは細胞ベースのアッセイであり、ここで、ＮｇＲタンパク質、またはその生物学的に活性な部分の膜結合形態を細胞表面上に発現する細胞が、試験化合物と接触され、そしてこの試験化合物のＮｇＲタンパク質に結合する能力が、決定される。例えば、細胞は、哺乳動物起源または酵母細胞であり得る。この試験化合物がＮｇＲタンパク質に結合する能力の決定は、例えば、その試験化合物を放射性同位体標識または酵素標識とカップリングさせて、この試験化合物のＮｇＲタンパク質またはその生物学的に活性な部分に対する結合が、複合体におけるその標識化合物を検出することによって検出され得ることによって、達成され得る。例えば、試験化合物は、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、または^３Ｈで直接的または間接的のいずれかで標識され得、そしてその放射性同位体が、放射線放射の直接の計数により、またはシンチレーション計数により、検出される。あるいは、試験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識され得、そしてこの酵素的標識が、適切な基質の生成物への転換を決定することにより、検出され得る。１実施形態において、このアッセイは、ＮｇＲタンパク質、またはその生物学的に活性な部分の膜結合形態をその細胞表面上に発現する細胞を、ＮｇＲと結合する既知の化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物に接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＮｇＲタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここでこの試験化合物がＮｇＲタンパク質と相互作用する能力を決定する工程が、この試験化合物がＮｇＲ、またはその生物学的に活性な部分と、既知の化合物と比較して優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０２２２】
試験化合物がＮｇＲまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する能力の決定は、例えば、ＮｇＲタンパク質が、ＮｇＲ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定により、達成され得る。本明細書中で用いられる場合、「標的分子」は、例えば、ＮｇＲタンパク質が、ＮｇＲタンパク質を発現する細胞の表面上の分子、第２の細胞の表面上の分子、細胞外環境中の分子、細胞膜分子または細胞質分子の内部表面と会合する分子と本質的に結合または相互作用する分子である。ＮｇＲ標的分子は、本発明の非ＮｇＲ分子あるいはＮｇＲタンパク質またはＮｇＲポリペプチドであり得る。１実施形態において、ＮｇＲ標的分子は、細胞外シグナル（例えば、膜結合型ＮｇＲ分子への化合物の結合により生成されるシグナル）の、細胞膜を介し、そして細胞への伝達を容易にするシグナル伝達経路の成分である。この標的は、例えば、触媒活性を有する第２の細胞内タンパク質またはＮｇＲと下流のシグナル伝達分子の会合を容易にするタンパク質であり得る。好ましい実施形態において、検出は、この分子の結合により引き起こされる細胞中のカルシウムフラックスまたは他の生理学的事象を検出することを包含する。
【０２２３】
特定の結合分子（天然のリガンドおよび合成化合物を含む）は、単離されたか、または組換えのＮｇＲ産物、ＮｇＲ改変体あるいは好ましくはこのような産物を発現する細胞を用いて同定または開発され得る。結合パートナーは、ＮｇＲ産物を精製するため、ならびに公知の免疫学的手順を用いて流体および組織サンプル中のＮｇＲ産物を検出または定量するために有用である。結合分子はまた、ＮｇＲの生物学的活性（特にシグナル伝達に関与するそれらの活性）を調節する（すなわち、ブロックするか、阻害するか、または刺激する）ことにおいて明らかに有用である。
【０２２４】
（２．無細胞アッセイ）
（ａ）直接結合：
本発明は、ＮｇＲ結合パートナーを同定するためのいくつかのアッセイ系を含む。溶液アッセイにおいて、本発明の方法は、以下の工程を包含する：（ａ）ＮｇＲポリペプチドと１以上の候補結合パートナー化合物とを接触させる工程および（ｂ）ＮｇＲポリペプチドに結合する化合物を同定する工程。ＮｇＲポリペプチドを結合する化合物の同定は、ＮｇＲポリペプチド／結合パートナー複合体を単離し、この結合パートナー化合物をＮｇＲポリペプチドから分離することにより達成され得る。この結合パートナー化合物の物理的、生物学的、および／または生化学的特性を特徴付けするさらなる工程はまた、本発明の別の実施形態において理解される。１つの局面において、ＮｇＲポリペプチド／結合パートナー複合体は、ＮｇＲポリペプチドまたは候補結合パートナー化合物のいずれかに免疫特異的な抗体を用いて単離される。
【０２２５】
なお別の実施形態において、ＮｇＲポリペプチドまたは候補結合パートナー化合物のいずれかが、その単離を容易にする標識またはタグを含み、そして結合パートナー化合物を同定する本発明の方法は、ＮｇＲポリペプチド／結合パートナー複合体を、標識またはタグとの相互作用によって単離する工程を包含する。この型の例示的タグは、ポリヒスチジン配列（一般には、約６つのヒスチジン残基）であり、このポリヒスチジン配列は、ニッケルキレート化を用いてこのように標識された化合物の単離を可能にする。当該分野で周知かつ慣用的に用いられる他の標識およびタグ（例えば、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ））は、本発明により採用される。
【０２２６】
（ｂ）固定化したＮｇＲ
インビトロアッセイの１つのバリエーションにおいて、本発明は、以下の工程を包含する方法を提供する：（ａ）固定化したＮｇＲポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分を、候補結合パートナー化合物と接触させる工程、および（ｂ）この候補化合物のＮｇＲポリペプチドへの結合を検出する工程。代替的な実施形態において、この候補結合パートナー化合物が固定化され、ＮｇＲの結合が検出される。固定化は、当該分野で周知の任意の方法を用いて達成される。これらの方法としては、支持体、ビーズまたはクロマトグラフィー樹脂への共有結合、ならびに非共有結合、高親和性相互作用（例えば、抗体結合）、あるいは固定化した化合物がビオチン部分を含むストレプトアビジン／ビオチン結合の使用が挙げられる。試験化合物のＮｇＲへの結合、または候補化合物の存在下および非存在下におけるＮｇＲと標的分子との相互作用は、反応物質を含むために適切な任意の容器中で達成され得る。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管および微量遠心管が挙げられる。１つの実施形態において、ドメインを付加した融合タンパク質が提供され、この融合タンパク質は、このタンパク質の一方または両方がマトリクスに結合することを可能にする。例えば（例示ではない）、ＧＳＴ−ＮｇＲ融合タンパク質またはＧＳＴ−標的融合タンパク質がグルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着され得、次いで、これらは、試験化合物と、非吸着標的タンパク質またはＮｇＲタンパク質のいずれかと結合され、これらの混合物は、複合体形成を助ける条件下で（例えば、塩およびｐＨについて生理学的条件で）インキュベートされる。インキュベーション後、このビーズまたはマイクロタイタープレートウェルが洗浄され、任意の結合していない成分が除去され、例えば、マトリクスがビーズの場合においては固定化され、上記のように、直接的または間接的のいずれかで複合体が決定される。あるいは、この複合体は、マトリクスから解離され得、ＮｇＲ結合または活性のレベルが、標準的な技術を用いて決定される。
【０２２７】
マトリクス上にタンパク質を固定化するための他の技術はまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて用いられ得る。例えば、ＮｇＲまたはその標的分子のいずれかが、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合体化を利用して固定化され得る。ビオチン化したＮｇＲまたは標的分子は、当該分野で周知の技術（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製され得、ストレプトアビジンコーティング９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のウェル中に固定化され得る。あるいは、ＮｇＲまたは標的分子と反応性の抗体（しかし、この抗体は、ＮｇＲタンパク質のその標的分子への結合を妨害しない）は、プレートのウェルに誘導体化され得、結合していない標的またはＮｇＲが、抗体結合体化によりウェル中に捕捉され得る。このような複合体を検出するための方法は、ＧＳＴ固定化複合体に関する上記の方法に加えて、ＮｇＲまたは標的分子と反応性の抗体を用いた複合体の免疫検出、ならびにＮｇＲまたは標的分子と関連する酵素活性を検出することによる酵素結合アッセイを含む。
【０２２８】
結合の検出は、以下により達成され得る：（ｉ）固定化されていない化合物上の放射活性標識を用いること、（ｉｉ）固定化されていない化合物上の蛍光標識を用いること、（ｉｉｉ）固定化されていない化合物に免疫特異的な抗体を用いること、（ｉｖ）固定化された化合物が結合している蛍光支持体を励起する、固定化されていない化合物上で標識を用いること、（ｖ）ＮｇＲの活性を決定すること、ならびに周知かつ当該分野で慣用的に行われている他の技術。
【０２２９】
標的分子の活性の決定は、例えば、その標的の細胞セカンドメッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ^２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ_３など）の誘導を検出すること、適切な基質への標的の触媒活性／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動可能に連結されたＮｇＲ応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出すること、または細胞応答（例えば、細胞生存度、細胞分化、または細胞増殖）を検出することにより、達成され得る。
【０２３０】
（ｃ）競合実験
なお別の実施形態において、このアッセイは、ＮｇＲタンパク質またはその生物学的に活性な部分とＮｇＲに結合する既知の化合物とを接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物と試験化合物とを接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮｇＲタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮｇＲタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、既知の化合物と比較して、ＮｇＲまたはその生物学的に活性な部分と優先的に相互作用する能力を決定することを包含する。
【０２３１】
なお別の実施形態において、この無細胞アッセイは、ＮｇＲタンパク質またはその生物学的に活性な部分とＮｇＲに結合する既知の化合物とを接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物と試験化合物とを接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮｇＲタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮｇＲタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、ＮｇＲ標的分子の活性を調節するこのＮｇＲタンパク質の能力を決定することを包含する。
【０２３２】
本発明の無細胞アッセイは、ＮｇＲの可溶性形態または膜結合形態の両方の使用に受け入れられる。膜結合形態のＮｇＲを含む無細胞アッセイの場合、ＮｇＲの膜結合形態が溶液中に維持されるように、可溶化剤を利用することが望ましくあり得る。このような可溶化剤の例には、非イオン性界面活性剤が挙げられ、例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）_ｎ（Ｉｓｏｔｒｉｄｅｃｙｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｅｔｈｅｒ）_ｎ、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオール−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−１−ｐｒｏｐａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳ）、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオール−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳＯ）、またはＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートである。
【０２３３】
（モジュレーター）
ＮｇＲ活性またはＮｇＲ発現を調節する（すなわち、増大するか、低減するか、またはブロックする）因子は、推定モジュレーターをＮｇＲポリペプチドまたはＮｇＲポリヌクレオチドを含む細胞とインキュベートすること、およびＮｇＲ活性またはＮｇＲ発現に対するその推定モジュレーターの効果を決定することによって、同定され得る。ＮｇＲの活性を調節する化合物の選択性は、その化合物のＮｇＲに対する効果を、その化合物の他のＮｇＲ化合物に対する効果と比較することによって、評価され得る。選択的モジュレーターとしては、例えば、抗体およびＮｇＲポリペプチドまたはＮｇＲをコードする核酸に特異的に結合する、他のタンパク質、ペプチド、または有機分子が挙げられ得る。ＮｇＲ活性のモジュレーターは、正常なＮｇＲ活性または異常なＮｇＲ活性が関与する疾患および生理学的状態の処置において、治療的に有用である。ＮｇＲポリヌクレオチド、ＮｇＲポリペプチドおよびＮｇＲモジュレーターは、脱髄と関連するような疾患および状態の処置に使用され得る。ＮｇＲポリヌクレオチドおよびＮｇＲポリペプチド、ならびにＮｇＲモジュレーターはまた、このような疾患または状態についての診断アッセイに使用され得る。
【０２３４】
モジュレーターを同定するための本発明の方法は、結合パートナー化合物を同定するための上記のいずれかの方法に対するバリエーションを含み、これらのバリエーションは、結合パートナー化合物が同定され、そして結合アッセイが候補モジュレーターの存在下および非存在下で実行される技術を含む。ＮｇＲポリペプチドとその結合パートナー化合物との間の結合が、候補モジュレーター化合物の非存在下における結合と比較して、その候補モジュレーターの存在下で変化する場合、モジュレーターは同定される。ＮｇＲポリペプチドとその結合パートナー化合物との間の結合を増大させるモジュレーターは、エンハンサーまたはアクチベーターとして記載され、そしてＮｇＲポリペプチドとその結合パートナー化合物との間の結合を低減するモジュレーターは、インヒビターとして記載される。
【０２３５】
別の実施形態において、ＮｇＲ発現のモジュレーターは、細胞を候補化合物と接触させ、そしてその細胞におけるＮｇＲ ｍＲＮＡまたはＮｇＲタンパク質の発現を決定する方法において、同定され得る。候補化合物の存在下におけるＮｇＲ ｍＲＮＡまたはＮｇＲタンパク質の発現レベルは、候補化合物の非存在下におけるＮｇＲ ｍＲＮＡまたはＮｇＲタンパク質の発現レベルと比較される。次いで、この候補化合物は、この比較に基づいて、ＮｇＲ発現のモジュレーターとして同定され得る。例えば、ＮｇＲ ｍＲＮＡまたはＮｇＲタンパク質の発現が候補化合物の非存在下よりもその候補化合物の存在下において大きい（統計的に有意に大きい）場合、この候補化合物は、ＮｇＲ ｍＲＮＡまたはＮｇＲタンパク質の発現の刺激因子として同定される。あるいは、ＮｇＲ ｍＲＮＡまたはＮｇＲタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下よりもその候補化合物の存在下において少ない（統計的に有意に少ない）場合、この候補化合物は、ＮｇＲ ｍＲＮＡまたはＮｇＲタンパク質の発現のインヒビターとして同定される。細胞中のＮｇＲ ｍＲＮＡまたはＮｇＲタンパク質の発現レベルは、ＮｇＲ ｍＲＮＡまたはＮｇＲタンパク質を検出するための本明細書中に記載される方法によって決定され得る。
【０２３６】
（ハイスループットスクリーニング）
本発明はまた、ＮｇＲポリペプチドと相互作用する化合物またはＮｇＲポリペプチドの生物学的活性を阻害する化合物（すなわち、酵素活性、結合活性などに影響を与える化合物）を同定するためのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイを含む。ＨＴＳアッセイは、効率的な様式で多数の化合物のスクリーニングを可能にする。細胞に基づくＨＴＳ系は、ＮｇＲレセプター−リガンド相互作用を調査することを意図する。ＨＴＳアッセイは、所望の特性を有する「ヒット」または「リード化合物」を同定するように設計され、これらの「ヒット」または「リード化合物」から、所望の特性を改善するような改変が設計され得る。「ヒット」または「リード化合物」の化学的な改変は、しばしば、この「ヒット」とＮｇＲポリペプチドとの間の同定可能な構造／活性の関係に基づく。
【０２３７】
本発明の別の局面は、ＮｇＲまたはＮｇＲをコードする核酸分子のいずれかに結合する化合物を同定する方法に関し、この方法は、ＮｇＲまたはＮｇＲをコードする核酸分子を化合物と接触させる工程、およびこの化合物がＮｇＲまたはＮｇＲをコードする核酸分子に結合するか否かを決定する工程を包含する。結合は、当業者に周知の結合アッセイ（ゲルシフトアッセイ、ウエスタンブロット、放射性標識競合アッセイ、ファージに基づく発現クローニング、クロマトグラフィーによる同時分画、同時免疫沈降、架橋、相互作用トラップ／ツーハイブリッド分析、サウスウエスタン分析、ＥＬＩＳＡなど（これらは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、１９９９、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ（これは、本明細書中にその全体が参考として援用される）に記載される）が挙げられるが、これらに限定されない）によって決定され得る。例えば、ＮｇＲタンパク質は、ツーハイブリッドシステムまたはスリーハイブリッドシステム（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２、２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６８、１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４、９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８、１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ ＷＯ ９４／１０３００を参照のこと）において「ベイトタンパク質」として使用されて、ＮｇＲに結合もしくはＮｇＲと相互作用する他のタンパク質（「ＮｇＲ結合タンパク質」または「ＮｇＲ−ｂｐ」）およびＮｇＲ活性を調節する他のタンパク質を同定し得る。このようなＮｇＲ結合タンパク質もまた、おそらく、例えば、ＮｇＲ経路の上流エレメントまたは下流エレメントとして、ＮｇＲタンパク質によるシグナルの伝達に関与する。
【０２３８】
他のアッセイを使用して、ＮｇＲレセプターの特異的なリガンドを同定し得、このアッセイとしては、試験リガンドの標的タンパク質への直接的な結合を測定することを介して、標的タンパク質のリガンドを同定するアッセイ、ならびにイオンスプレー質量分析法／ＨＰＬＣ方法または他の物理的方法および分析方法を用いた親和性限外濾過液を介して、標的タンパク質のリガンドを同定するアッセイが挙げられる。あるいは、このような結合相互作用は、Ｆｉｅｌｄｓら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０、２４５−２４６、およびＦｉｅｌｄｓら（１９９４）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１０、２８６−２９２（これらの両方が、本明細書中に参考として援用される）によって記載される酵母ツーハイブリッドシステムを用いて間接的に評価される。このツーハイブリッドシステムは、２つのタンパク質間または２つのポリペプチド間の相互作用を検出するために使用される最高の転写因子の調節性質（ｍｏｄｕｌａｒ ｎａｔｕｒｅ）に基づく、遺伝子アッセイである。このツーハイブリッドシステムを使用して、目的の既知タンパク質に結合するタンパク質を同定し得るか、または相互作用に重要なドメインもしくは残基を示し得る。この方法論に関するバリエーションは、ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子をクローン化するため、タンパク質に結合するペプチドを同定するため、および薬物をスクリーニングするために、開発されてきた。このツーハイブリッドシステムは、相互作用タンパク質の対が転写活性化ドメインをレポーター遺伝子の上流活性化配列（ＵＡＳ）に結合するＤＮＡ結合ドメインの近位にする能力を利用し、そして一般的に酵母の中で実行される。このアッセイは、（１）第１タンパク質に融合されたＤＮＡ結合ドメイン、および（２）第２タンパク質に融合された活性化ドメイン、をコードする２つのハイブリッド遺伝子の構築を必要とする。ＤＮＡ結合ドメインは、レポーター遺伝子のＵＡＳに対して第１ハイブリッドタンパク質を標的化させる；しかし、ほとんどのタンパク質は活性化ドメインを欠くので、このＤＮＡ結合ハイブリッドタンパク質は、レポーター遺伝子の転写を活性化しない。活性化ドメインを含む第２のハイブリッドタンパク質は、レポーター遺伝子の発現をそれ自体で活性化し得ない。なぜなら、この第２のハイブリッドタンパク質は、ＵＡＳに結合しないからである。しかし、両方のハイブリッドタンパク質が存在する場合、第１タンパク質および第２タンパク質の非共有結合的な相互作用が、ＵＡＳに活性化ドメインをつなぎ、レポーター遺伝子の転写を活性化する。例えば、第１タンパク質が別のタンパク質または別の核酸と相互作用することが既知であるＮｇＲ遺伝子産物またはそのフラグメントである場合、このアッセイは、結合相互作用を妨害する因子を検出するために使用され得る。異なる試験因子がこの系に添加された場合、レポーター遺伝子の発現がモニターされる。阻害因子の存在は、レポーターシグナルの欠如をもたらす。スクリーニングされる化合物（これは、ＮｇＲまたはＮｇＲをコードする核酸分子に結合することが疑われる化合物を含み得る）としては、細胞外起源のもの、細胞内起源のもの、生物学的起源のもの、または化学的起源のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３９】
ＮｇＲ遺伝子産物の機能は、未解明であり、そしてこの遺伝子産物に結合するリガンドは未だ見出されていない。酵母ツーハイブリッドアッセイは、この遺伝子産物に結合するタンパク質を同定するのに有用である。ＮｇＲレセプターまたはそのフラグメントに結合するタンパク質を同定するためのアッセイにおいて、ＮｇＲレセプター（またはフラグメント）およびＵＡＳ結合ドメイン（すなわち、第１タンパク質）の両方をコードする融合ポリヌクレオチドが、使用され得る。さらに、このアッセイにおいて、活性化ドメインに融合された異なる第２タンパク質を各々コードする多数のハイブリッド遺伝子が生成され、そしてスクリーニングされる。代表的に、第２タンパク質は、総ｃＤＮＡ融合ライブラリーまたは総ゲノムＤＮＡ融合ライブラリーのうちの１つ以上のメンバーによってコードされ、各第２タンパク質コード領域は、活性化ドメインに融合されている。この系は、広範な種々のタンパク質に適用可能であり、そして第２結合タンパク質の同一性または機能を必ずしも知る必要さえもない。この系は、非常に感度が高く、そして他の方法によって明らかにならなかった相互作用を検出し得；さらには、一過性相互作用は、転写を誘発して、レポータータンパク質を生じるように反復して翻訳され得る安定なｍＲＮＡを生成し得る。
【０２４０】
他のアッセイは、標的タンパク質に結合する薬剤を調査するために使用され得る。標的タンパク質への試験リガンドの直接的な結合を同定するためのこのようなスクリーニング方法の１つは、米国特許第５，５８５，２７７号に記載され、これは参考として本明細書中に援用される。この方法は、タンパク質が、一般的に折り畳まれた状態および折り畳まれていない状態の混合物として存在し、そしてこの２つの状態の間を絶えず行き来するという法則を基にする。試験リガンドが、折り畳まれた形態の標的タンパク質に結合する場合（すなわち、試験リガンドが標的タンパク質のリガンドである場合）、リガンドに結合された標的タンパク質分子は、その折り畳まれた状態のままである。それゆえ、折り畳まれた標的タンパク質は、リガンドの非存在下よりも、標的タンパク質を結合する試験リガンドの存在下でより高程度で存在する。標的タンパク質へのリガンドの結合は、標的タンパク質の折り畳まれた状態と折り畳まれていない状態との間を識別する任意の方法によって、決定され得る。標的タンパク質の機能は、このアッセイが実施されるために既知である必要はない。事実上、任意の薬剤が試験リガンドとして、この方法によって評価され得、この薬剤としては、金属、ポリペプチド、タンパク質、脂質、多糖体、ポリヌクレオチドおよび低有機分子が含まれるが、これらに制限されない。
【０２４１】
標的タンパク質のリガンドを同定する別の方法は、Ｗｉｅｂｏｌｄｔら（１９９７）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：１６８３−１６９１に記載され、これは本明細書中に参考として援用される。本技術は、標的タンパク質に結合するための液相において、一度に２０〜３０の薬剤のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする。標的タンパク質に結合した薬剤を、簡単な膜洗浄によって他のライブラリー成分から分離する。フィルター上に保持される特異的に選択された分子は、次に、標的タンパク質から遊離され、そしてＨＰＬＣおよび空気圧補助エレクトロスプレー（イオンスプレー）イオン化質量分析によって分析される。この手順は、標的タンパク質に対して最も高い親和性を有するライブラリー成分を選択し、そして低分子ライブラリーについて特に有用である。
【０２４２】
本発明の方法はまた、リガンド、特に神経ペプチドを含み、このリガンドは、放射標識（例えば、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^３Ｈ）、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識および免疫原性標識のような標識を付けられている。本発明の範囲内に入るモジュレーターとしては、非ペプチド模倣物のような非ペプチド分子、非ペプチドアロステリックエフェクターおよびペプチドが挙げられるが、これらに制限されない。このような試験において使用されるＮｇＲポリペプチドまたはＮｇＲポリヌクレオチドは、溶液中に遊離しているか、固体支持体に結合されているか、細胞表面に備えられているかまたは細胞内に局在されるかあるいは細胞の一部分に結合されるかのいずれかであり得る。例えば、当業者は、ＮｇＲと試験される化合物との間の複合体形成を測定し得る。あるいは、当業者は、試験される化合物によって引き起こされるＮｇＲとその基質との間の複合体形成における減少を試験し得る。
【０２４３】
本発明の別の局面は、ＮｇＲと化合物とを接触させる工程、およびその化合物がＮｇＲの活性を改変するか否かを決定する工程を包含する、ＮｇＲの活性を調節する（すなわち、増加または減少させる）化合物を同定する方法に関する。試験化合物の存在下での活性を、試験化合物の非存在下での活性と比較して測定する。試験化合物を含むサンプルの活性が、試験化合物を欠くサンプルにおける活性よりも高い場合、この化合物は、増強された活性を有する。同様に、試験化合物を含むサンプルの活性が、試験化合物を欠くサンプルにおける活性よりも低い場合、この化合物は、阻害された活性を有する。
【０２４４】
本発明は、任意の種々の薬物スクリーニング技術におけるＮｇＲの使用によって、化合物をスクリーニングするのに特に有用である。スクリーニングされる化合物としては、細胞外起源、細胞内起源、生物的起源または化学的起源が挙げられる（これは、ＮｇＲ活性を調節することが推測される化合物を含み得る）が、これらに制限されない。このような試験において使用されるＮｇＲポリペプチドは任意の形態であり得、好ましくは、溶液中に遊離するか、固体支持体に結合されるか、細胞表面に備えられるかまたは細胞内に局在される。当業者は、例えば、ＮｇＲと試験される化合物との間の複合体の形成を測定し得る。あるいは、当業者は、試験される化合物によって引き起こされるＮｏｇｏ−Ｒとその基質との間の複合体形成における減少を試験し得る。
【０２４５】
本発明のＮｇＲポリペプチドの活性は、例えば、結合能力を試験することによって決定され得るか、または化学的に合成されたペプチドリガンドによって活性化され得る。あるいは、ＮｇＲの活性は、カルシウムイオン、ホルモン、ケモカイン、神経ペプチド、神経伝達物質、ヌクレオチド、脂質、臭気物質および光子に結合するそれらの能力を試験することによってアッセイされ得る。あるいは、ＮｇＲの活性は、エフェクター分子の活性を試験することによって決定され得る。エフェクター分子としては、アデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼおよびイオンチャネルが挙げられるが、これらに制限されない。従って、ＮｇＲ活性のモジュレーターは、ＮｇＲレセプター機能（例えば、レセプターの結合特性または活性）を変化させ得る。本発明の種々の実施形態において、このアッセイは当該分野で一般的に公知である以下の形態を取り得る：イオンフラックスアッセイ、酵母増殖アッセイ、非加水分解性ＧＴＰアッセイ（例えば、［^３５Ｓ］−ＧＴＰ Ｓアッセイ）、ｃＡＭＰアッセイ、イノシトール三リン酸アッセイ、ジアシルグリセロールアッセイ、エクオリンアッセイ、ルシフェラーゼアッセイ、細胞内Ｃａ^２＋濃度についてのＦＬＩＰＲアッセイ、有糸分裂誘発アッセイ、ＭＡＰキナーゼ活性アッセイ、アラキドン酸放出アッセイ（例えば、［^３Ｈ］−アラキドン酸を用いる）および細胞外酸性化速度についてのアッセイ、ならびにＮｇＲ活性に関する他の結合または機能ベースのアッセイ。ＮｇＲ活性はＦａＲＰ活性についてのアッセイのために使用される方法論によって決定され得、これは当業者に周知である。本発明に従うＮｇＲレセプターの生物学的活性としては以下が挙げられるが、これらに制限されない：天然リガンドまたは非天然リガンドの結合および当該分野で公知であるＮｇＲの機能的活性のいずれかの活性。ＮｇＲ活性の非制限的な例としては、種々の形態の膜貫通型シグナル伝達（これには、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）結合および／またはＰＩに関する影響の発揮が挙げられ得；ＮｇＲの別の例示的な活性は、既知のＧＰＩタンパク質とは異なる修飾タンパク質またはポリペプチドの結合である。
【０２４６】
本発明のモジュレーターは、種々の化学的構造を示し、これは、一般的に天然のＮｇＲレセプターリガンドの非ペプチド模倣物、ＮｇＲレセプターのペプチドアロステリックエフェクターおよび非ペプチドアロステリックエフェクターならびにＮｇＲレセプターのアクチベーターまたはインヒビター（競合的、不競合的および非競合的）として機能し得るペプチド（例えば、抗体産物）に分類され得る。本発明は適切なモジュレーターについての供給源を制限せず、天然供給源（例えば、植物、動物または無機抽出物）または非天然供給源（例えば、低分子ライブラリー（これは、ライブラリー構築のためのコンビナトリアル化学的アプローチの生成物およびペプチドライブラリーを含む））から得られ得る。
【０２４７】
他のアッセイは、酵素活性を試験するために使用され得、これらとしては、光度計、放射計、ＨＰＬＣ、電気化学的なアッセイなどが挙げられるが、制限されず、例えばこれは、ＥＮＺＹＭＥ ＡＳＳＡＹＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ＥｉｓｅｎｔｈａｌおよびＤａｎｓｏｎ（編），１９９２，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている（これは、本明細書中にその全体が参考として援用される）。
【０２４８】
薬物発見プログラムにおけるｃＤＮＡの使用は周知である；ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）において、１日あたり何千もの未知の化合物を試験する能力があるアッセイは、徹底的に実証されている。この文献は、薬物発見についてのＨＴＳ結合アッセイにおける放射標識リガンドの使用の例を十分に記載する（Ｗｉｌｌｉａｍｓ（１９９１）Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，１１，１４７−１８４；Ｓｗｅｅｔｎａｍら、（１９９３）Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．５６，４４１−４５５の総説を参照のこと）。組換えレセプターは、結合アッセイＨＴＳのために好ましい。なぜなら、これらは特異性をより高くし（より高い相対純度）、レセプター物質を多量に生成する能力を提供し、そして広範な種々の形式において使用され得るからである（Ｈｏｄｇｓｏｎ（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，９７３−９８０を参照のこと；これらの各々は、本明細書中にその全体が参考として援用される）。
【０２４９】
種々の異種の系は、当業者に周知の組換えレセプターの機能的発現について利用可能である。このような系としては、細菌（Ｓｔｒｏｓｂｅｒｇら（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１３，９５−９８）、酵母（Ｐａｕｓｃｈ（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５，４８７−４９４）、数種の昆虫細胞（Ｖａｎｄｅｎ Ｂｒｏｅｃｋ（１９９６）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１６４，１８９−２６８）、両生類細胞（Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８，６２９−６３４）ならびに種々の哺乳動物細胞株（ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳなど；Ｇｅｒｈａｒｄｔら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３３４，１−２３を参照のこと）が挙げられる。これらの例は、他の可能性のある細胞発現系の使用を除外せず、これには、線虫から得られる細胞株が含まれる（ＰＣＴ出願ＷＯ９８／３７１７７）。
【０２５０】
本発明の好ましい実施形態において、ＮｇＲ活性を調節する化合物をスクリーニングする方法は、試験化合物とＮｇＲとを接触させる工程およびその化合物とＮｇＲとの間の複合体の存在をアッセイする工程を包含する。このようなアッセイにおいて、リガンドは代表的に標識される。適切なインキュベーション後、遊離のリガンドは、結合された形態から分離され、そして遊離または複合体を形成していない標識の量は、ＮｇＲに結合する特定化合物の能力の尺度である。
【０２５１】
本発明の別の実施形態において、ＮｇＲに対して適切な結合親和性を有する化合物についてのハイスループットスクリーニングが実施される。要するに、多くの異なる低ペプチド試験化合物は、固体基材上で合成される。ペプチド試験化合物は、ＮｇＲと接触され、そして洗浄される。次いで結合されたＮｇＲは、当該分野で周知の方法によって検出される。本発明の精製ポリペプチドはまた、上記の薬物スクリーニング技術における使用のためにプレート上に直接コートされ得る。さらに、非中和抗体はタンパク質を捕獲し、そして固体支持体上にそのタンパク質を固定するために使用され得る。
【０２５２】
一般的に、発現されたＮｇＲは、その規定されたリガンドとの結合におけるＨＴＳ結合アッセイのために使用され得る。同定されたペプチドは、当業者に周知の方法によって、適切な放射性同位体で標識され、これには^１２５Ｉ、^３Ｈ、^３５Ｓまたは^３２Ｐが挙げられるが、制限されない。あるいは、このペプチドは、周知の方法によって、適切な蛍光性誘導物で標識され得る（Ｂａｉｎｄｕｒら（１９９４）Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．３３，３７３−３９８；Ｒｏｇｅｒｓ（１９９７）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ２，１５６−１６０）。組換えタンパク質を発現する細胞株から作製された膜調製物におけるレセプターに特異的に結合された放射活性リガンドは、いくつかの標準的な方法の１つであるＨＴＳアッセイにおいて検出され得る。これらの方法には、結合していないリガンドから結合しているリガンドを分離するためのレセプター−リガンド複合体の濾過（Ｗｉｌｌｉａｍｓ（１９９１）Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１１，１４７−１８４；Ｓｗｅｅｔｎａｍら（１９９３）Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．５６，４４１−４５５）が含まれる。代替的な方法としては、シンチレーション近接（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）アッセイ（ＳＰＡ）またはＦｌａｓｈＰｌａｔｅ形式（ここでは、このような分離は、不必要である）（Ｎａｋａｙａｍａ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．１，８５−９１ Ｂｏｓｓｅら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ３，２８５−２９２）が挙げられる。蛍光性リガンドの結合は、種々の方法において検出され得、これらとしては、蛍光エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）、結合されたリガンドの直接的な分光光度的な分析、、または蛍光偏光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）（Ｒｏｇｅｒｓ（１９９７）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ２，１５６−１６０；Ｈｉｌｌ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．１，９２−９７）が挙げられる。
【０２５３】
このような生物学的応答の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：特異的に操作された酵母細胞において、制限的栄養物質の不在下で生存する能力（Ｐａｕｓｃｈ（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５、４８７−４９４）；蛍光色素によって測定されるような、細胞内Ｃａ^２＋濃度の変化（Ｍｕｒｐｈｙら（１９９８）Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．１、１９２−１９９）。蛍光の変化をまた使用して、膜電位におけるリガンド誘導性の変化または細胞内ｐＨをモニターし得る；ＨＴＳのために適切な自動化システムが、この目的のために記載されている（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ １、７５−８０）。Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓから調製されたメラニン保有細胞は、異種ＮｇＲ活性化に応答して、色素構築においてリガンド依存性の変化を示す；この応答は、ＨＴＳ形式に適合性である（Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８、６２９−６３４）。アッセイはまた、共通の第二メッセンジャー（ｃＡＭＰ、ホスホイノシチドおよびアラキドン酸を含む）の測定のために利用可能であるが、これらは、ＨＴＳには一般的に好ましくない。
【０２５４】
これらのレセプターを使用するＨＴＳの好ましい方法は、永続的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を含み、ここで、アゴニストおよびアンタゴニストは、推定ＧＰＩアンカーを介した、これらの細胞から調製される膜におけるＮｏｇｏの結合のためのシグナルを変換する能力によって同定され得る。本発明の別の実施形態では、永続的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞は、かなりの量の組換えレセプタータンパク質を含む膜の調製のために使用され得る；次いで、これらの膜調製物は、特定のレセプターに対して特異的な放射性標識リガンドを使用するレセプター結合アッセイにおいて使用される。あるいは、内部Ｃａ^２＋濃度におけるリガンド誘導性の変化の蛍光モニタリング、またはこれらの各レセプターを個々にかもしくは組合わせにおいて含む永続的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞における膜電位の蛍光モニタリングのような機能的アッセイが、ＨＴＳのために好ましい。同様に好ましいのは、類似の形式における代替的な型の哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＯＳ細胞）である。より好ましいのは、永続的にトランスフェクトされた昆虫細胞株（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞）である。さらにより好ましいのは、当業者に周知のＨＴＳ形式においてＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒレセプターを発現する、組換え酵母細胞である（例えば、Ｐａｕｓｃｈ（１９９７）上記）。
【０２５５】
本発明は、ＮｇＲレセプターに結合するリガンドのインヒビターをスクリーニングおよび同定するための複数のアッセイを意図する。１つの例では、ＮｇＲレセプターを固定し、そして結合パートナーとの相互作用を、インヒビター化合物のような候補モジュレーターの存在下および非存在下において評価する。別の例では、ＮｇＲレセプターとその結合パートナーとの間の相互作用を、候補インヒビター化合物の存在下および非存在下の両方において、溶液アッセイで評価する。いずれのアッセイにおいても、インヒビターは、ＮｇＲレセプターとその結合パートナーとの間での結合を減少させる化合物として同定される。別に意図されるアッセイは、２ハイブリッドアッセイのバリエーションを含み、ここではタンパク質／タンパク質相互作用のインヒビターは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／２０６５２（１９９５年８月３日付公開）に記載のように、形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞において陽性シグナルを検出することによって同定される。
【０２５６】
本発明によって意図される候補調節物質は、潜在的アクチベーターまたは潜在的インヒビターのいずれかのライブラリーから選択される化合物を含む。低分子調節物質の同定のために使用される多数の異なるライブラリーが存在する。これらとしては、（１）化学薬品ライブラリー、（２）天然の生成物のライブラリー、および（３）ランダムなペプチド、オリゴヌクレオチド、または有機分子から構成されるコンビナトリアルライブラリーが挙げられる。化学薬品のライブラリーは、ランダムな化学構造物から構成され、これらのうちのいくつかは、既知の化合物のアナログまたは他の薬物発見スクリーニングにおいて「ヒット」もしくは「リード」として同定された化合物のアナログであり、これらのうちのいくつかは、天然の生成物に由来し、そしてこれらのうちのいくつかは、非指向的合成有機化学から生じる。天然の生成物のライブラリーは、（１）土壌、植物もしくは海洋微生物由来のブロスの発酵および抽出、または（２）植物もしくは海洋生物の抽出、によって、スクリーニング用の混合物を作製するために使用される、微生物、動物、植物または海洋生物のコレクションである。天然の生成物のライブラリーとしては、ポリケチド（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ）、非リボソームペプチド、およびそれらの改変物（天然には存在しない）が挙げられる。総説として、Ｃａｎｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２８２、６３−６８を参照のこと。コンビナトリアルライブラリーは、混合物としての多数のペプチド、オリゴヌクレオチド、または有機化合物から構成される。これらのライブラリーは、伝統的な自動化合成方法、ＰＣＲ、クローニング、または専売の合成方法によって、比較的簡単に調製される。当然ながら、興味深いのは、非ペプチドコンビナトリアルライブラリーである。なお他に興味深いライブラリーとしては、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物、多重並行合成物コレクション（ｍｕｌｔｉｐａｒａｌｌｅｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、組換え、およびポリペプチドライブラリーが挙げられる。コンビナトリアル化学およびそれから作製されるライブラリーの総説として、Ｍｙｅｒｓ（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８，７０１−７０７を参照のこと。本明細書中に記載される種々のライブラリーの使用を通して調節物質を同定することによって、候補「ヒット」（または「リード」）が活性を調節する能力を最適化するように、その「ヒット」（または「リード」）を改変することが可能になる。
【０２５７】
本発明によって意図されるなお他の候補インヒビターが設計され得、そしてこれらには、可溶性形態の結合パートナー、ならびに、キメラタンパク質または融合タンパク質などのような結合パートナーが挙げられる。本明細書中で使用される場合「結合パートナー」は、広範に、非ペプチド調節物質、ならびに天然のリガンド以外の神経ペプチド、抗体、抗体フラグメント、および同定されたＮｇＲ遺伝子の発現産物に対して免疫特異的な抗体ドメインを含む改変化合物などのようなペプチド調節物質を含む。
【０２５８】
本発明の他の実施形態は、競合的スクリーニングアッセイの使用を含み、ここでは、本発明のポリペプチドを結合し得る中和抗体が、ポリペプチドに対する結合について、試験化合物と特異的に競合する。この様式において、抗体は、ＮｇＲと１個以上の抗原性決定基を共有する任意のペプチドの存在を検出するために使用され得る。放射性標識による競合的結合研究は、Ｌｉｎら（１９９７）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４１、２１２７−２１３１（この開示は、その全体において、本明細書中において参考として援用される）に記載されている。
【０２５９】
本発明の他の実施形態では、本発明のポリペプチドを、相互作用する調節タンパク質の同定、特徴付けおよび精製のための研究用ツールとして使用する。適切な標識が、当該分野で公知の種々の方法によって、本発明のポリペプチドに取り込まれ、そしてこのポリペプチドを使用して、相互作用分子を捕捉する。例えば、分子を、標識化ポリペプチドと共にインキュベートし、洗浄して、未結合ポリペプチドを取り除き、そしてポリペプチド複合体を定量する。異なる濃度のポリペプチドを用いて得られるデータを使用して、そのタンパク質複合体でのポリペプチドの数、親和性、および結合についての値を算出する。
【０２６０】
標識化ポリペプチドはまた、ポリペプチドが相互作用する分子（インヒビターを含むが、これに限定されない）の精製のための試薬として有用である。アフィニティー精製の１つの実施形態では、ポリペプチドを、クロマトグラフィーカラムに共有結合させる。細胞およびその膜を抽出し、そして種々の細胞亜成分を、そのカラムに通過させる。分子は、そのポリペプチドに対する親和性によって、そのカラムに結合する。ポリペプチド複合体を、カラムから回収し、解離し、そしてその回収された分子を、タンパク質配列決定に供する。次いで、このアミノ酸配列を使用して、補足された分子を同定するか、または適切なｃＤＮＡライブラリーから対応する遺伝子をクローニングするための縮重オリゴヌクレオチドを設計する。
【０２６１】
あるいは、本発明のＮｇＲに対するリガンドと類似の特性を示すが、より小さく、かつヒト体内または動物体内において内因性のリガンドよりも長い半減期を示す化合物が同定され得る。有機化合物を設計する場合、本発明に従う分子を、「リード」化合物として使用する。既知の薬学的に活性な化合物に対する模倣物を設計することは、このような「リード」化合物に基づいて医薬を開発するにおいて周知のアプローチである。模倣物の設計、合成および試験は、一般的に、標的特性について多数の分子をランダムにスクリーニングすることを回避するために使用される。さらに、本発明のＤＮＡによってコードされる推定アミノ酸配列の分析から導き出される構造データは、より特異的で、従って、より高い薬理学的能力を有する新規な薬物を設計するために有用である。
【０２６２】
本発明のタンパク質配列と、利用可能なすべてのデータベース中に存在する配列との比較によって、Ｇタンパク質共役型レセプターの膜貫通部分との有意な相同性が示された。従って、コンピューターモデリングを使用して、他のタンパク質に関する利用可能な膜貫通ドメイン情報に基づいて、本発明のタンパク質の推定三次元構造を進化させ得る。従って、ＮｇＲの推定構造に基づく新規なリガンドが設計され得る。
【０２６３】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイによって同定された新規な薬剤、および本明細書中で記載されるような処置のためのそれらの使用に関する。
【０２６４】
（組成物および薬学的組成物）
特定の実施形態では、本発明に従うスクリーニング方法によって同定される新規な分子は、低分子量の有機分子である。この場合において、組成物または薬学的組成物は、経口投与または非経口投与のために調製され得る。本明細書中に記載されるスクリーニング方法によって同定された核酸分子、ベクター、ポリペプチド、抗体および化合物を含む、組成物または薬学的組成物は代表的に、核酸分子、タンパク質、または抗体と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的な投与に適合した、任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤（ｄｅｌａｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）などを含むことが意図される。キャリアまたは他の成分の性質は、特定の投与経路および投与される本発明の特定の実施形態に依存する。この状況下において有用な技術およびプロトコールの例は、特に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、第１６版（１９８０）、Ｏｓｏｌ，Ａ（編）（これは、その全体において本明細書中に参考として援用される）において見出される。このようなキャリアまたは希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）もまた使用され得る。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性な化合物と不適合である範囲を除いて、組成物におけるその使用が意図される。補助活性化合物もまた、組成物へ組み込まれ得る。
【０２６５】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合するように処方される。投与の経路の例には、経口および非経口（例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、吸入投与、経皮（局所的）投与、経粘膜投与、および直腸投与）が挙げられる。非経口適用、皮内適用または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような、滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような、抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような、抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のような、キレート剤；アセテート、シトレートまたはホスフェートのような、緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような、張度の調整のための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調整され得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、あるいはガラス製またはプラスチック製の多用量のバイアル中に入れられ得る。
【０２６６】
注入用途に適切な薬学的組成物は、滅菌水溶液（ここでは、水溶性）または分散液、および滅菌された注入可能な溶液または分散液の即座の調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与について、適切なキャリアには、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ^ＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、組成物は、無菌でなければならず、そして容易な注入性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性であるべきである。これは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。キャリアは、例えば、以下を含む溶媒または分散媒であり得る：水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）ならびにそれらの適切な混合物。適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合には要求される粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトール）、塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注入可能組成物の長時間吸収は、組成物に吸収を遅らせる薬剤（例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチン）を含ませることによってもたらされ得る。
【０２６７】
滅菌された注射可能溶液は、必要量の活性化合物（例えば、ＮｇＲタンパク質または抗ＮｇＲ抗体）を、適切な溶媒中に、上記で列挙される成分の１つまたは組み合わせと共に組み込み、必要な場合、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒および上記で列挙される成分から必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中へ組み込むことによって調製される。滅菌された注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合において、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、活性成分および予め滅菌濾過されたその溶液からの任意のさらなる所望の成分の粉末を得る。
【０２６８】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤へと圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、この活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、そして錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、マウスウォッシュ（ｍｏｕｔｈｗａｓｈ）としての使用のための流体キャリアを使用して調製され得、ここで、この流体キャリア中のこの化合物は、経口的に適用され、そして音を立ててさっと動かされ、そして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバント材料が、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、任意の以下の成分または同様の性質を有する化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、ガムトラガントまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸）、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；滑り剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー）。
【０２６９】
吸入による投与について、この化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む圧縮容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器から、エアロゾル噴霧の形態で送達される。
【０２７０】
全身的投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。経粘膜投与または経皮投与について、浸透される障壁に適切な浸透剤が、処方において使用される。このような浸透剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻噴霧または坐剤の使用を通して達成され得る。経皮投与については、この活性化合物は、当該分野で一般的に公知である軟膏剤、軟膏、ゲル、またはクリーム剤へ処方される。
【０２７１】
この化合物はまた、直腸送達のための坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤基剤と共に）または保持浣腸の形態で調製され得る。
【０２７２】
１つの実施形態において、この活性化合物は、身体からの急速な排出に対してこの化合物を保護するキャリアを用いて調製され（例えば、制御放出処方物）、これには、インプラントおよびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生分解性の生体適合性ポリマーが使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当該業者には明らかである。これらの材料はまた、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販され、入手され得る。リポソーム懸濁剤（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を含む、感染させた細胞へ標的化されるリポソームを含む）もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。投与の容易さおよび投薬量の均一化のために、投薬単位形態で、経口組成物または非経口組成物を処方することが、特に有益である。本明細書で使用される投薬単位形態は、処置される被験体のための単位投薬量として適切な物理的に個々の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと関連して所望の治療的効果を生じるように計算された、所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての詳細は、この活性化合物、および達成される特定の治療効果によって決定されるか、あるいはこれらに直接依存する。
【０２７３】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、米国特許第５，７０３，０５５号に記載されるような、任意の多数の経路によって被験体に送達され得る。従って、送達はまた、例えば静脈内注射、局所的投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）を含み得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物には、受容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターが挙げられ得、または遺伝子送達ビヒクルが組み込まれる徐放性マトリックスが挙げられ得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞からインタクトで産生され得（例えば、レトロウイルスベクター）、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１以上の細胞を含み得る。
【０２７４】
薬学的組成物は、投与のための指示書と共に、容器、包装、またはディスペンサーに内包され得る。
【０２７５】
これらの低分子量化合物の投薬量は、処置される疾患の状況または状態および他の臨床的要素（例えば、ヒトまたは動物の体重および状態）、ならびに化合物の投与経路に依存する。ヒトまたは動物の処置のために、体重１ｋｇあたり約０．５ｍｇ〜体重１ｋｇあたり５００ｍｇの間の化合物が投与され得る。治療は代表的に、低投薬量で投与され、そして所望の治療的結果が観察されるまで続けられる。
【０２７６】
本発明の別の局面は、他の動物（ヒトならびに他の哺乳動物および無脊椎動物を含むが、これらに限定されない）において、Ｎｏｇｏ−Ｒのホモログを同定するための、本明細書中に開示されるＮｇＲヌクレオチド配列の使用である。本明細書中に開示される任意のヌクレオチド配列、またはその任意の部分が、例えば、当業者に周知のスクリーニング手順を使用して、データベースまたは核酸ライブラリー（例えば、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーのような）をスクリーニングしてホモログを同定するためのプローブとして使用され得る。従って、ＮｇＲ配列と、少なくとも５０％、より好ましくは、少なくとも６０％、より好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％、そして最も好ましくは、少なくとも１００％の相同性を有するホモログが同定され得る。
【０２７７】
本発明の化合物および方法（核酸分子、ポリペプチド、抗体、本明細書中に記載されるスクリーニング方法によって同定される化合物を含む）は、種々の薬学的適用を有し、そして例えば、無秩序な細胞増殖（例えば、癌細胞および腫瘍増殖）を処置または予防するために使用され得る。特定の実施形態では、本発明の分子は、遺伝子治療において使用される。遺伝子治療手順の総説として、例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６，８０８−８１３（これは、その全体において、本明細書中において参考として援用される）を参照のこと。
【０２７８】
本発明はまた、哺乳動物において、ＮｇＲの天然の結合パートナーに関連した活性をアゴナイズ（刺激）またはアンタゴナイズする方法を含む。この方法は、この哺乳動物に、そのアゴニスト性またはアンタゴニスト性をもたらすに十分な量で、上記に開示された１つのポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストを投与する工程を包含する。従って、本発明の１つの実施形態は、本発明のタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストを用いて、哺乳動物における疾患を処置する方法である。この方法は、哺乳動物に、ＮｇＲに関連した機能をアゴナイズまたはアンタゴナイズするに十分な量でアゴニストまたはアンタゴニストを投与する工程を包含する。
【０２７９】
患者に投与される化合物の投薬量を決定する方法および生物に化合物を投与する様式は、米国特許出願番号０８／７０２，２８２（１９９６年８月２３日付出願）および国際特許公開番号ＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日付公開）（任意の図面、図形、または表を含む）（この両方は、その全体において本明細書中において参考として援用される）に開示されている。当業者は、このような記載が、本発明に適用可能であり、そしてそれに容易に適合され得ることを理解する。
【０２８０】
適切な投薬量は、処置される疾患の型、使用される特定の組成物、ならびに患者のサイズおよび生理学的状態のような種々の因子に依存する。本明細書中で記載される化合物について治療的な有効量は、最初に、細胞培養物および動物モデルから概算され得る。例えば、用量は、動物モデルにおいて、細胞培養物アッセイで決定されるようなＩＣ_５０に最初に配慮した循環濃度範囲を達成するように処方化される。動物モデルデータを使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定し得る。
【０２８１】
血漿、腫瘍および主要器官中での薬物および代謝産物の血漿半減期および体内分布はまた、障害を阻害するのに最も適切な薬物の選択を容易にするように決定され得る。このような測定が行われ得る。例えば、ＨＰＬＣ分析は、薬物で処置された動物の血漿において行われ得、放射線標識された化合物の位置が、Ｘ線、ＣＡＴスキャンおよびＭＲＩのような検出方法を用いて決定され得る。スクリーニングアッセイにおいて強力な阻害活性を示すが、薬物動態学的特徴が不十分な化合物は、化学構造の変更や再試験によって最適化され得る。この点について、良好な薬物動態学的特徴を示す化合物が、モデルとして使用され得る。
【０２８２】
毒性研究はまた、血液細胞組成物を測定することによって行われ得る。例えば、毒性研究は、以下のような適切な動物モデルにおいて行われ得る：（１）化合物がマウスに投与される（未処置のコントロールマウスもまた、使用されるべきである）；（２）各々の処置群中の１匹のマウスから尾静脈を介して血液サンプルを周期的に得る；そして（３）上記サンプルを、赤血球および白血球の数、血液細胞組成物ならびにリンパ球と多形核細胞との割合について分析する。各々の投薬レジメンについての結果とコントロールとの比較は、毒性が存在するか否かを示す。
【０２８３】
各々の毒性研究の終了の際に、動物を屠殺することによって、さらなる研究を行い得る（好ましくは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．Ｐａｎｅｌ ｏｎ Ｅｕｔｈａｎａｓｉａ，（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２０２：２２９−２４９に従う）。次いで、各処置群からの代表的な動物が、転移、異常な病気または毒性の直接的な証拠のために全体的な検屍によって試験され得る。組織における全体の異常が記載され、組織が組織学的に試験される。体重の減少または血液成分の減少を引き起こす化合物は、主要な器官に対する有害作用を有する化合物と同様に好ましくない。一般的に、有害作用が大きいほど、その化合物は好ましくない。
【０２８４】
癌の処置のために、疎水性の医薬品の予想される１日の用量は、１〜５００ｍｇ／日の間、好ましくは、１〜２５０ｍｇ／日の間、そして最も好ましくは、１〜５０ｍｇ／日の間である。薬物は、活性部分の血漿レベルが治療有効性を維持するのに十分である限り、頻繁に送達しなくてもよい。血漿レベルは、薬物の効力を反映するべきである。一般的に、化合物がより強力であるほど、効力を達成するのに必要な血漿レベルはより低くなる。
【０２８５】
ＮｇＲ ｍＲＮＡ転写物は、脳および心臓において見い出されている。上述のように、配列番号１および／または配列番号３は、ＮｇＲを活性化するか、アゴナイズするか、またはアンタゴナイズする。内在性の神経刺激伝達物質／ホルモン／リガンド、ならびにＣＮＳ障害（例えば、発作）を含む障害を処置する際の潜在的な有用性を有する化合物、および髄鞘脱落に関連するような変性障害をスクリーニングし得る。
【０２８６】
例えば、ＮｇＲレセプター活性化は、神経突起生長の予防を媒介し得る。阻害は、慢性の脳障害および急性の脳障害の両方において有利である。例えば、Ｄｏｎｏｖａｎら，（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７，５３１６−５３２６；Ｔｕｒｇｅｏｎら，（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８，６８８２−６８９１；Ｓｍｉｔｈ−Ｓｗｉｎｔｏｓｋｙら，（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９，１８９０−１８９６；Ｇｉｌｌら，（１９９８）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．７９７，３２１−３２７；Ｓｕｉｄａｎら，（１９９６）Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．２２，１２５−１３３を参照のこと。
【０２８７】
（薬理ゲノミクス）
ＮｇＲ活性（例えば、ＮｇＲ遺伝子発現）において刺激効果または阻害効果を有する薬剤または調整剤は、本明細書中で記載されるスクリーニングアッセイによって同定されるように、個々に投与されて異常なＮｇＲ活性に関連する障害（例えば、髄鞘脱落障害のような疾患状態）を（予防的または治療的に）処置し得る。このような処置とともに、個々の薬理ゲノミクス（すなわち、個々の遺伝子型と、外因性化合物または薬物に対する個々の応答との間の関係の研究）が考慮され得る。治療の代謝における差異は、用量と薬理学的に活性な薬物の血液濃度との間の関係を変更することによって、重大な毒性または治療失敗をもたらし得る。従って、個々の薬理ゲノミクスによって、個々の遺伝子型の考慮に基づいて、予防処置または治療処置のために有効な薬剤（例えば、薬物）を選択し得る。このような薬理ゲノミクスは、さらに、適切な投薬量および治療レジメンを決定するために使用され得る。従って、個々におけるＮｇＲタンパク質の活性、ＮｇＲ核酸の発現またはＮｇＲ遺伝子の変異量が決定され、それによって個々の治療処置または予防処置のために適切な薬剤を選択し得る。
【０２８８】
薬理ゲノミクスは、罹患したヒトにおける変更された薬物処置および異常作用に起因した、薬物に対する応答における臨床的に重要な遺伝性の変化を扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３，９８３−９８５およびＬｉｎｄｅｒ（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３，２５４−２６６を参照のこと。一般的に、２つの型の遺伝薬理学的な状態は、異なり得る。薬物が体内で作用する方法を変更する（変更された薬物作用）単一の因子として伝達される遺伝状態、または身体が薬物に作用する方法を変更する（変更された薬物代謝）単一の因子として伝達される遺伝状態。これらの遺伝薬理学的な状態は、まれな欠損または多型のいずれかとして生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の欠損は、共通な遺伝的酵素異常症であり、主な臨床的合併症は、酸化薬物（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取の後の溶血およびソラマメの消費の後の溶血である。
【０２８９】
実施形態に示されるように、薬物を代謝する酵素の活性は、薬物作用の強度および持続時間の両者を決定する主要因である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見は、薬物を標準的かつ安全な用量摂取した後に、予想した薬物効果が得られないか、または過度の薬物応答および重大な毒性を示す患者が存在する理由に対する説明を与える。これらの多型は、集団において、高代謝群（ＥＭ）および低代謝群（ＰＭ）の２種の表現型において表現される。ＰＭの罹患率は、異なる集団間で異なっている。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は、非常に多型であり、いくつかの変異は、ＰＭにおいて同定され、これらはすべて、機能性ＣＹＰ２Ｄ６が存在しない原因となる。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低代謝群は、標準的な用量を受ける場合、過剰な薬物応答および副作用を非常に頻繁に被る。代謝物が活性な治療部分である場合、ＰＭは、ＣＹＰ２Ｄ６で形成された代謝モルヒネによって媒介されるコデインの鎮痛薬効果に関して示されるような、治療応答を示さない。他の極端な例は、標準的な用量に対して応答しない、いわゆる、極度に迅速な代謝を有する例（ｕｌｔｒａ−ｒａｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）である。近年、極度に迅速な代謝の分子基盤は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因するものであることが同定された。
【０２９０】
従って、個々におけるＮｇＲタンパク質の活性、ＮｇＲ核酸の発現、またはＮｇＲ遺伝子の変異量を決定して、それによって、個々の治療処置または予防処置のために適切な薬剤を選択し得る。さらに、遺伝薬理学的研究を使用して、個々の薬物応答性の表現型の同定に対して、薬物を代謝する酵素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子型決定を適用する。この知識は、投薬または薬物選択に適用される場合、有害反応または治療の失敗を防ぎ得、それによって、被験体をＮｇＲモジュレーター（例えば、本明細書中に記載される例示的なスクリーニングアッセイの１つによって同定されるモジュレーター）で処理する場合に、治療有効性または予防有効性を高める。
【０２９１】
（臨床的有効性のモニタリング）
ＮｇＲの発現または活性（例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調節する能力）に対する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響のモニタリングは、基本の薬物スクリーニングにおいてのみ適用されるだけではなく、臨床試験においても適用され得る。例えば、ＮｇＲ遺伝子発現、タンパク質レベルを増加させるか、またはＮｇＲ活性を上方制御することが本明細書中で記載されるようなスクリーニングアッセイによって決定された薬剤の有効性は、減少したＮｇＲ遺伝子発現、タンパク質レベル、または下方制御されたＮｇＲ活性を示す被験体の臨床試験においてモニタリングされ得る。あるいは、ＮｇＲ遺伝子発現、タンパク質レベルを減少させるか、またはＮｇＲ活性を下方制御することがスクリーニングアッセイによって決定された薬剤の有効性は、増加したＮｇＲ遺伝子発現、タンパク質レベル、または上方制御されたＮｇＲ活性を示す被験体の臨床試験においてモニタリングされ得る。このような臨床試験において、ＮｇＲの発現または活性、および、好ましくは、例えば、疾患または障害に関係付けられる他の遺伝子は、特定の細胞の免疫応答の「読み出し（ｒｅａｄ ｏｕｔ）」またはマーカーとして使用され得る。
【０２９２】
例えば、ＮｇＲ活性（例えば、本明細書中で記載されるようなスクリーニングアッセイにおいて同定される）を調節する薬剤（例えば、化合物、薬物または低分子）で処理することによって細胞中で調節される、ＮｇＲを含む遺伝子が同定され得る。従って、例えば、臨床試験において、脱髄異常障害に対する薬剤の効果を研究するために、細胞が単離され得、ＲＮＡが調製されてＮｇＲの発現レベルに関して分析され得、そして他の遺伝子が、障害に関係付けられる。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載されるようなノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲによって定量され得るか、または本明細書中に記載されるような方法の１つによって産生されるタンパク質の量を測定することによって、またはＮｇＲもしくは他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって定量され得る。この方法において、遺伝子発現パターンは、薬剤に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとして働き得る。従って、この応答状態は、薬剤を用いた個々の処置の前、および処置中の種々の時点で決定され得る。
【０２９３】
１つの実施形態において、本発明は、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質，、ペプチド、ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）、核酸、低分子または本明細書で記載されるスクリーニングアッセイによって同定される他の薬物候補）を用いた被験体の処置の有効性をモニタリングするための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）薬剤の投与の前に、被験体から投与前サンプルを得る工程；（ｉｉ）投与前サンプルにおいて、ＮｇＲタンパク質、ｍＲＮＡ、もしくはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出する工程；（ｉｉｉ）被験体から１つ以上の投与後サンプルを得る工程；（ｉｖ）投与後サンプルにおけるＮｇＲタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性レベルを検出する工程；（ｖ）投与前サンプルにおけるＮｇＲタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性レベルと、投与後サンプルにおけるＮｇＲタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性レベルとを比較する工程；ならびに（ｖｉ）上記に従って、被験体に対する薬剤の投与を変更する工程。例えば、薬剤の投与の増加は、検出されたレベルより高いレベルまでＮｇＲの発現または活性を増加させる（すなわち、薬剤の有効性を高める）ために望ましくあり得る。あるいは、薬剤の投与の減少は、検出されたレベルよりも低いレベルまでＮｇＲの発現または活性を減少させる（すなわち、薬剤の有効性を低める）ために望ましくあり得る。
【０２９４】
（処置の方法）
本発明は、異常なＮｇＲ発現またはＮｇＲ活性に関連する障害のリスクのある（罹患しているおそれのある）被験体または上記障害を有する被験体を処置する、予防的方法および治療的方法の両方を提供する。
【０２９５】
レベルまたは生物学的活性の増加（疾患または障害を罹患しない被験体と比較して）によって特徴付けられる疾患および障害は、活性をアンタゴナイズする（すなわち、減少または阻害する）治療剤で処置され得る。活性をアンタゴナイズする治療剤は、治療様式または予防様式において投与され得る。利用され得る治療剤としては、限定されないが、以下が挙げられる；（ｉ）ＮｇＲポリペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；（ｉｉ）ＮｇＲペプチドに対する抗体；（ｉｉｉ）ＮｇＲペプチドをコードする核酸；（ｉｖ）アンチセンス核酸および「機能障害性」（すなわち、ＮｇＲペプチドに対するコード配列のコード配列内における異種挿入に起因する）な核酸の投与は、相同組換えによるＮｇＲペプチドの「ノックアウト」内在性機能に利用される（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４，１２８８−１２９２を参照のこと）；あるいは（ｖ）ＮｇＲペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を変更するモジュレーター（すなわち、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト（本発明のさらなるペプチド模倣物または本発明のペプチドに特異的な抗体を含む）。
【０２９６】
レベルまたは生物学的活性の減少（疾患または障害を罹患していない被験体と比較して）によって特徴付けられる疾患または障害は、活性を増加させる（すなわち、アゴニストである）治療剤で処置され得る。活性を上方制御する治療剤は、治療様式または予防様式で投与され得る。利用され得る治療剤としては、限定されないが、ＮｇＲペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントまたはホモログ；あるいはバイアベイラビリティーを増大させるアゴニストが挙げられる。
【０２９７】
レベルの増加または減少は、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することによって、患者組織サンプル（例えば、生検組織から）を得てＲＮＡまたはペプチドのレベル、発現したペプチド（またはＮｇＲペプチドのｍＲＮＡ）の構造および／または活性に関してインビトロで上記サンプルをアッセイすることによって、容易に検出され得る。当該分野で周知の方法としては、限定されないが、免疫アッセイ（例えば、ウエスタンブロット分析、免疫沈降後のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫組織化学などによって）、および／またはｍＲＮＡの発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーションなど）が挙げられる。
【０２９８】
１つの局面において、本発明は、ＮｇＲ発現または少なくとも１つのＮｇＲ活性を調節する薬剤を被験体に投与することによって、被験体において、異常なＮｇＲ発現またはＮｇＲ活性に関連する疾患または状態を予防するための方法を提供する。異常なＮｇＲ発現またはＮｇＲ活性によって引き起こされるかまたは寄与される疾患に対するリスクのある被験体は、例えば、本明細書中に記載されるような診断アッセイまたは予後アッセイのいずれかまたは組み合わせによって同定され得る。予防剤の投与は、ＮｇＲ異常に特徴的な症状の出現の前に行い得、その結果、疾患または障害が予防されるか、またはその進行を遅らせる。ＮｇＲ異常の型に基づいて、例えば、ＮｇＲアゴニスト薬剤またはＮｇＲアンタゴニスト薬剤が、被験体を処置するために使用され得る。適切な薬剤は、本明細書中で記載されるスクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。
【０２９９】
本発明の別の局面は、治療目的のためのＮｇＲの発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節法は、細胞を、細胞と関連するＮｇＲタンパク質活性の１つ以上の活性を調節する薬剤と接触させる工程を包含する。ＮｇＲタンパク質活性を調節する薬剤は、本明細書中で記載されるような薬剤であり得、例えば、核酸またはタンパク質、ＮｇＲタンパク質の天然に存在する同族リガンド、ペプチド、ＮｇＲペプチド模倣物、または他の低分子であり得る。１つの実施形態において、薬剤は、１つ以上のＮｇＲタンパク質活性を刺激する。このような刺激剤の例としては、活性ＮｇＲタンパク質および細胞中に導入されたＮｇＲをコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態において、薬剤は、１つ以上のＮｇＲタンパク質活性を阻害する。このような阻害剤の例としては、アンチセンスＮｇＲ核酸分子および抗ＮｇＲ抗体が挙げられる。これらの調節方法は、インビトロで（例えば、細胞を薬剤とともに培養することによって）、あるいはインビボで（例えば、薬剤を被験体に投与することによって）実行され得る。このように、本発明は、ＮｇＲタンパク質または核酸分子の異常発現または異常活性によって特徴付けられる疾患または障害に悩まされる個々を処置する方法を提供する。１つの実施形態において、本方法は、薬剤（例えば、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される薬剤）、またはＮｇＲ発現またはＮｇＲ活性を調節する（例えば、上方制御または下方制御する）薬剤の組み合わせを投与する工程を包含する。別の実施形態において、本方法は、減少したＮｇＲ発現もしくはＮｇＲ活性または異常なＮｇＲ発現もしくはＮｇＲ活性を補うための治療として、ＮｇＲタンパク質または核酸分子を投与する工程を包含する。
【０３００】
（遺伝子治療）
ＮｇＲ遺伝子産物の正常な機能の欠失を生じるＮｇＲ遺伝子における変異は、ＮｇＲヒト疾患状態の原因である。本発明は、これらの疾患状態を処置するためのＮｇＲ活性を回復するための遺伝子治療を含む。機能性ＮｇＲ遺伝子の適切な細胞への送達は、ベクターを使用することによって、より詳細には、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、またはレトロウイルス）を使用することによって、エキソビボ、インサイチュ、またはインビボで効果があり、あるいは物理的なＤＮＡ移入法（例えば、リポソームまたは化学物質処理）の使用によってエキソビボで効果がある。例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ，３９２（６６７９）：２５−２０に補遺、を参照のこと。遺伝子治療技術のさらなる総説としては、Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４，１２７５−１２８１；Ｖｅｒｍａ（１９９０）Ｓｃｉ．Ａｍ．６８−８４；およびＭｉｌｌｅｒ（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５７，４５５−４６０を参照のこと。あるいは、他のヒト疾患状態において、ＮｇＲの発現を予防すること、またはＮｇＲの活性を阻害することは、疾患状態の処置において有用であることが意図される。アンチセンス治療または遺伝子治療は、ＮｇＲの発現を負に調節するために適用され得ることが意図される。
【０３０１】
本発明は、異常なＮｇＲ発現またはＮｇＲ活性に関連する障害のリスクがある（障害に罹患しているおそれのある）被験体または障害を有する被験体を処置する予防方法および治療方法の両方を提供する。
【０３０２】
レベルまたは生物学的活性の増加（疾患または障害を罹患していない被験体と比較して）によって特徴付けられる疾患および障害は、活性をアンタゴナイズする（すなわち、減少または阻害する）治療剤で処置され得る。活性をアンタゴナイズする治療剤は、治療様式または予防様式で投与され得る。利用され得る治療剤としては、限定されないが、以下が挙げられる：（ｉ）ＮｇＲポリペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；（ｉｉ）ＮｇＲペプチドに対する抗体；（ｉｉｉ）ＮｇＲペプチドをコードする核酸；（ｉｖ）アンチセンス核酸および「機能障害性」（すなわち、ＮｇＲペプチドに対するコード配列のコード配列内における異種挿入に起因する）な核酸の投与は、相同組換えによるＮｇＲペプチドの「ノックアウト」内在性機能に利用される（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９８９）（上述）を参照のこと）；あるいは（ｖ）ＮｇＲペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を変更するモジュレーター（すなわち、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト（本発明のさらなるペプチド模倣物または本発明のペプチドに特異的な抗体を含む）。
【０３０３】
レベルまたは生物学的活性の減少（疾患または障害を罹患していない被験体と比較して）によって特徴付けられる疾患または障害は、活性を増加させる（すなわち、アゴニストである）治療剤で処置され得る。活性を上方制御する治療剤は、治療様式または予防様式で投与され得る。利用され得る治療剤としては、限定されないが、ＮｇＲペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；あるいはバイアベイラビリティーを増大させるアゴニストが挙げられる。
【０３０４】
レベルの増加または減少は、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することによって、患者組織サンプル（例えば、生検組織から）を得てＲＮＡまたはペプチドのレベル、発現したペプチド（またはＮｇＲペプチドのｍＲＮＡ）の構造および／または活性に関してインビトロで上記サンプルをアッセイすることによって、容易に検出され得る。当該分野で周知の方法としては、限定されないが、免疫アッセイ（例えば、ウエスタンブロット分析、免疫沈降後のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫組織化学などによって）、および／またはｍＲＮＡの発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーションなど）が挙げられる。
【０３０５】
１つの局面において、本発明は、ＮｇＲ発現または少なくとも１つのＮｇＲ活性を調節する薬剤を被験体に投与することによって、被験体において、異常なＮｇＲ発現またはＮｇＲ活性に関連する疾患または状態を予防するための方法を提供する。異常なＮｇＲ発現またはＮｇＲ活性によって引き起こされるかまたは寄与される疾患に対してリスクのある被験体は、例えば、本明細書中に記載されるような診断アッセイまたは予後アッセイのいずれかまたは組み合わせによって同定され得る。予防剤の投与は、ＮｇＲ異常に特徴的な症状の出現の前に行い得、その結果、疾患または障害が予防されるか、またはその代わりにその進行を遅らせる。ＮｇＲ異常の型に基づいて、例えば、ＮｇＲアゴニスト薬剤またはＮｇＲアンタゴニスト薬剤が、被験体を処置するために使用され得る。適切な薬剤は、本明細書中で記載されるスクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。
【０３０６】
本発明の別の局面は、治療目的のためにＮｇＲ発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞を、その細胞に関するＮｇＲタンパク質活性の活性のうちの１つ以上を調節する薬剤と接触させる工程を包含する。ＮｇＲタンパク質活性を調節する薬剤は、核酸またはタンパク質、ＮｇＲタンパク質の天然に存在する同族リガンド、ペプチド、ＮｇＲペプチド模倣物、または他の低分子のような、本明細書中に記載されるような薬剤であり得る。１つの実施形態において、この薬剤は、ＮｇＲタンパク質活性のうちの１つ以上を刺激する。このような刺激薬剤の例としては、活性なＮｇＲタンパク質、およびその細胞に導入されたＮｇＲをコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態において、この薬剤は、ＮｇＲタンパク質活性のうちの１つ以上を阻害する。このような阻害薬剤の例としては、アンチセンスＮｇＲ核酸分子、および抗ＮｇＲ抗体が挙げられる。これらの調節方法は、インビトロで（例えば、その薬剤とともにその細胞を培養することによって）、あるいはインビボで（例えば、被験体にその薬剤を投与することによって）実施され得る。このように、本発明は、ＮｇＲのタンパク質または核酸分子の、異常な発現または異常な活性によって特徴付けられる、疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＮｇＲの発現または活性を調節する（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）薬剤（例えば、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される薬剤）あるいはそのような薬剤の組み合わせを投与する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、ＮｇＲのタンパク質または核酸分子を、低減したかまたは異常な、ＮｇＲの発現または活性を補償するための治療として、投与する工程を包含する。
【０３０７】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって、範囲が限定されることはない。実際、本明細書において記載されたものに加えて、本発明の種々の改変が、上記の記載および添付の図面から、当業者に明らかとなる。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【０３０８】
以下の表５は、本発明の例示的ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列を含む。
【０３０９】
【表６】

他で示されない限り、Ｘは任意のアミノ酸である。例えば、ここで示されるＸは、アミノ酸がないかもしれない。本発明のさらなる特徴は、以下の実施例から明らかである。実施例１〜５は実際のものであるが残りの実施例は、予言的なものである。
【０３１０】
以下の実施例によって示されるように、新規ＮｇＲをコードする遺伝子は、ＤＮＡ配列データのコンピューター分析によって同定されている。ＮｇＲ２およびＮｇＲ３によってコードされるタンパク質は、推定のシグナル配列、保存されたロイシンリッチ領域中（配列番号１２）の８つのロイシンリッチ反復ドメイン、ロイシンリッチ領域のＮ末端である保存されたシステインリッチ領域（配列番号１０）、ロイシンリッチ領域のＣ末端である第２のシステインリッチドメイン（配列番号１１）、および推定のグリコホスファチジルイノシトール結合（ＧＰＩ−結合）部位を有する。ＮｇＲ２およびＮｇＲ３は、以前に同定されたＮｇＲ配列とは異なる。公知のＮｇＲと比較される場合、ＮｇＲホモログは、コンセンサス配列（配列番号６）を示す。推定の成熟ＮｇＲ２およびＮｇＲ３は、それぞれ配列番号８および９として表５中に示される。
【０３１１】
（実施例１：ＨＴＧデータベースのＴｂｌａｓｔｎ問い合わせ（ｑｕｅｒｙ））
ヒトＮｇＲ（ＮｇＲ１）（配列番号５）についてのタンパク質配列を使用して、ハイスループットゲノム（ＨＴＧ）データベースに問い合わせた。この使用は、当業者にはよく知られている。ＨＴＧデータベースは、総合的なＮＩＨ遺伝子配列データベースであるＧｅｎＢａｎｋの一部であり、これは、公的に利用可能なＤＮＡ配列の全ての注釈的収集を含む（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０００）２８，１５−８）。ＨＴＧデータベースは、ゲノムＤＮＡより得られる配列を含む。ゲノムＤＮＡにおいて、遺伝子は、典型的にエキソンと呼ばれる複数のＤＮＡセグメントによってコードされる。よって、ｃＤＮＡ配列（またはｃＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質配列）がゲノムＤＮＡに整列される場合、この配列は、遺伝子中のエキソンの数に依存してセグメントに分けられる。
【０３１２】
Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌの略語であるＢＬＡＳＴアルゴリズムは、配列類似性を決定するために適切である（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５、４０３−４１０、その全体が本明細書中に参考として援用される）。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公的に利用可能である。基本的ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、データベース配列中の同一長のワード（ｗｏｒｄ）と整列される場合、いくつかの陽性値閾値スコアＴと一致するかまたはＴを満たす、問い合わせ配列中の長さＷの短いワード（ｗｏｒｄ）を同定することによって高スコア配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを包含する。Ｔは、近傍のワードスコア閾値という（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上述）。これらの最初の近傍ワードヒットは、これらを含むＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシード（ｓｅｅｄ）をとして作用する。ワードヒットは、累積整列スコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。各方向におけるワードヒットについての伸長は、以下の場合、停止される：１）累積整列スコアがその最大達成値から数Ｘだけ減少する；２）１つ以上のネガティブスコア付け残基整列の蓄積に起因して、累積スコアが０以下になる；または３）いずれかの配列の末端に到達される。ＢｌａｓｔアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、整列の感受性および速度を決定する。Ｂｌａｓｔプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９（この全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）整列（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両鎖の比較を使用する。
【０３１３】
ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，５８７３−５７８７（本明細書中に参考として援用される））およびギャップＢＬＡＳＴは、２つの配列間の類似性の統計学的分析を実施する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定は、最小和確率（ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、この確立の表示を提供し、これにより、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸の配列間の一致が、偶然生じる。例えば、試験核酸のＮｇＲ核酸との比較における最小和確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは、約０．０１未満、そして最も好ましくは０．００１未満である場合、核酸は、ＮｇＲ遺伝子またはｃＤＮＡに類似するとみなされる。
【０３１４】
ＮｇＲタンパク質配列を用いてＨＴＧデータベースを問い合わせるために、本発明者らは、ｔｂｌａｓｔｎプログラムとして公知の種々のＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用した。これは、タンパク質問い合わせ配列を、全てのリーディングフレームにおいて動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベースに対して比較する（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５，４０３−４１０：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９７）２５，３３８９−３４０２）。ｔｂｌａｓｔｎ検索の結果は、ＮｇＲに対して顕著な同一性を有する遺伝子のデータベース中での存在を示した。ヒトＮｇＲ遺伝子およびマウスＮｇＲ遺伝子を含むゲノムクローンに対するヒットを見出すことに加えて、本発明者らは、同一性が高くはないがなお非常に顕著であるクローンに対するヒットを見出した。４ｅ−４３のｅ値を有する３つのヒトクローン（登録番号：ＡＣ０６８５１４、ＡＣ０１６８６９、ＡＣ０１３６０６）が見出され、そして１ｅ−７８のｅ値を有する１つのマウスクローン（登録番号：ＡＣ０２１７６８）が見出された。３つのヒトクローンは、全て同一遺伝子をコードするようであり、よってさらなる分析は、ＡＣ０１３６０６に制限された。
【０３１５】
（実施例２：ヒトＮｇＲ２タンパク質配列（ＡＣ０１３６０６）の予想）
ヒトＮｇＲタンパク質配列を、ヌクレオチド配列ＡＣ０１３６０６から翻訳された配列の２つの領域と整列し、これは、新たな遺伝子が少なくとも２つのエキソンによってコードされることを示す。完全な遺伝子を規定するために、本発明者らは、コンピュータープログラムＧＥＮＳＣＡＮ^ＴＭ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）２６８，７８−９４）を使用した。これは、ゲノムＤＮＡ中の遺伝子の完全なエキソン／イントロン構造を同定し得る。ＧＥＮＳＣＡＮ^ＴＭによる遺伝子の予想は、７つのエキソンを含んだ。これらの予想されたエキソンをＮｇＲと比較することによって、新たなヒト遺伝子がこれらのエキソンのうち２つおよび別の一部（開始メチオニンを含む）を含むと結論付けた。これら３つのエキソンによりコードされる予想されたｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）を、座位が以下である３つのエキソン由来のヌクレオチドを合わせることによってＡＣ０１３６０６（ＨＴＧ１１；２０００年３月に寄託された；長さ＝１４３８９９；ＧｅｎＢａｎｋリリース１１８．０；配列番号１５）からアセンブリした：１２３２９２−１２３３２２（エキソン１）；１３００３５−１３０５１６（エキソン２）；および１３８５８９−１３９３３５（エキソン３）。このｃＤＮＡ配列についての配列は、配列番号１である（ヒトＮｇＲ２のヌクレオチド配列；ＡＣ０１３６０６）。このｃＤＮＡの翻訳は、ヒトＮｇＲ２のタンパク質配列を提供する（配列番号２）。
【０３１６】
本発明者らは、ヒトＮｇＲ２のタンパク質配列を、ヒトＥＳＴデータベースに対する問い合わせ配列として使用した。高有意性の多くのヒットを見出した。これは、ＮｇＲ２ ｍＲＮＡが胎児脳を含む多くの組織で発現されることを示す。さらに、これらのＥＳＴのうち２つは、本発明者らが推測したエキソン構造に対する支持を提供した。１つのＥＳＴ（登録番号ＧＢ＿ＥＳＴ１９：ＡＩ３４６７５７）は、ヒトＮｇＲ２（配列番号４）のアミノ酸８４〜２７１に対応する５６５ヌクレオチドを含む。これは、アミノ酸１７１と１７２との間に位置される第二イントロンにわたり、ｍＲＮＡレベルでのエキソン２および３のスプライシングについてのポジティブな証拠を提供する。別のＥＳＴ（ＧＢ＿ＥＳＴ２６：ＡＩ９２９０１９）は、５４５ヌクレオチドを含み、この一部は、ヒトＮｇＲ２（配列番号２）のアミノ酸１〜７５に対応する。これは、アミノ酸１０と１１との間に位置される第一イントロンにわたり、ｍＲＮＡレベルでのエキソン１および２のスプライシングについてのポジティブな証拠を提供する。
【０３１７】
（実施例３：マウスＮｇＲ３タンパク質配列（ＡＣ０２１７６８）の予想）
ヒトＮｇＲタンパク質配列を、ヌクレオチド配列ＡＣ０２１７６８から翻訳された配列の１つのみの領域と整列し、これは、新たなマウス遺伝子のほとんどが１つの大きなエキソンによってコードされることを示す。しかし、調べたところ、このエキソンによってコードされるタンパク質は、開始メチオニンを欠いていた。完全な遺伝子を規定するために、本発明者らは、上記のようなコンピュータープログラムＧＥＮＳＣＡＮ^ＴＭを使用した。ＧＥＮＳＣＡＮによる遺伝子の予想は、２つのエキソンを含んだ：眼による調査によって見出した大きなエキソンおよび開始メチオニンを提供する５’末端での短いエキソン。これら２つのエキソンによりコードされる予想されたｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）を、座位が以下である２つのエキソン由来のヌクレオチドを合わせることによってＡＣ０２１７６８（ＨＴＧ１４；２０００年３月に寄託された；長さ＝２１５９８０；ＧｅｎＢａｎｋリリース１１８．０；配列番号１６）からアセンブリした：１６４２６５−１６４３２５（エキソン１）の相補体；および１５５６７１−１５６９９２（エキソン２）の相補体。このｃＤＮＡ配列についての配列は、配列番号３である（マウスＮｇＲ３のヌクレオチド配列；ＡＣ０２１７６８）。このｃＤＮＡの翻訳は、マウスＮｇＲ３のタンパク質配列を提供する（配列番号４）。
【０３１８】
本発明者らは、マウスＮｇＲ３のタンパク質配列を、マウスＥＳＴデータベースに対する問い合わせ配列として使用した。高有意性の１つのヒットを見出した。これは、ＮｇＲ２ ｍＲＮＡが心臓で発現されることを示す。このＥＳＴ（ＧＢ＿ＥＳＴ２０：ＡＩ４２８３３４）は、その一部がマウスＮｇＲ３（配列番号４）のアミノ酸４５〜１９３に対応する４６３ヌクレオチドを含む。
【０３１９】
（実施例４：ＮｇＲ間の類似性）
ＮｇＲ１と新たな２つのレセプターとの間の整列を、図１Ａ〜１Ｂに示す。これらのタンパク質の間の類似性としては、以下が挙げられる：
（１）シグナル配列の切断位置を示すＳｉｇｎａｌＰプログラムは、全てのタンパク質における保存された第一システインの前の切断を予想する。よって、全ての場合において成熟タンパク質は、Ｎ末端にシステインを有する。
（２）全てのタンパク質は、８つのロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を含む。ＬＲＲは、多様な機能および細胞内局在を有する多くのタンパク質中に存在する短い配列モチーフである。これらのリピートは、通常、タンパク質−タンパク質相互作用に関与する。各ＬＲＲは、β−α単離から構成される。
（３）３つ全てのタンパク質は、ロイシンリッチリピートＮ末端ドメイン（ＬＲＲＮＴ）を含み、ここで、４つのシステインが保存されている。ＬＲＲは、しばしばＮ末端およびＣ末端の両方でシステインリッチドメインに隣接される。
（４）３つ全てのタンパク質は、ＬＲＲ Ｃ末端ドメイン（ＬＲＲＣＴ）を含む。これらの３つのＮｇＲタンパク質のＬＲＲＣＴは、このドメイン中で完全に保存されているトリプトファン（ｔｙｐｔｏｐｈａｎ）およびシステインのパターンによって、他のＬＬＲ含有タンパク質と区別され得る。
（５）３つ全てのタンパク質は、４つ目のＬＲＲドメイン中に保存されたシステインを含む。
（６）３つ全てのタンパク質は、８つ目のＬＲＲドメイン中に保存された潜在的グリコシル化部位を含む。
（７）ＮｇＲ２およびＮｇＲ３は、ＮｇＲ１と同様に疎水性Ｃ末端を有し、これらもまた、おそらくＮｇＲ１と同様の修飾を受けることを示す。ここで、ＧＰＩモチーフは、Ｃ末端アミノ酸に共有結合されている。このことによって、タンパク質を細胞につなぎとめておくことを可能にする。
【０３２０】
（実施例５：Ｎｏｇｏタンパク質の調製）
セマフォリンおよびエフリンの軸索誘導機能を試験する際に広く用いられる方法（Ｆｌａｎａｇａｎ＆Ｖａｎｄｅｒｈａｅｇｈｅｎ（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１，３０９−３４５；Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９，５９−６９）を利用する、Ｎｏｇｏ結合アッセイを開発した。これは、極めて高感度な比色測定アッセイを用いて検出され得る、生物学的に活性なレセプター結合因子を提供するために、問題のリガンドに、分泌された胎盤アルカリホスファターゼ（ＡＰ）部分を融合させる工程を包含する。Ｎｏｇｏについて、シグナルペプチド、精製のためのＨｉｓ６タグ、ＡＰ、およびＮｏｇｏの６６アミノ酸の活性ドメインをコードする発現ベクターを、作製する。この融合タンパク質を、ミリグラム量でトランスフェクトした細胞の馴化培地から精製し得る。このタンパク質は、１ｎＭのＥＣ_５０を有する、成長円錐を崩壊させる因子として、生物学的に活性である。
【０３２１】
あるいは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ Ｎｏｇｏ（ＧＳＴ−Ｎｏｇｏ）融合タンパク質が調製され得る。ＧＳＴ−Ｎｏｇｏについて、シグナルペプチド、ＧＳＴおよびＮｏｇｏの６６アミノ酸の活性ドメインをコードする発現ベクター（例えば、ｐＧＥＸベクター）を、作製する。ＧＳＴ−Ｎｏｇｏを、培養培地から精製し得、そしてＧＳＴ融合タンパク質として使用するか、またはＧＳＴを、融合タンパク質のＧＳＴ部分とＮｏｇｏ部分との間に操作された特異的アミノ酸切断部位を認識する酵素を用いて、融合タンパク質のＮｏｇｏ部分から切断し得る。このような部位は、市販のＧＳＴベクターの一部である。この特異的切断部位および酵素を、製造業者の手引きに従って使用し得る。
【０３２２】
ＡＰ−ＮｏｇｏはＧＳＴ−Ｎｏｇｏよりも実際にわずかにより有力であることが、見出された。なぜなら、おそらくこのタンパク質は原核生物細胞よりも真核生物細胞において合成されるからである。
【０３２３】
固定化されたＮｇＲホモログへのＮｏｇｏの結合を、ＥＬＩＳＡ型アッセイで実施し得る。ここで、ＡＰ−Ｎｏｇｏは、固定化されたレセプターホモログと反応し得る。結合の特異性を、低減した量のＡＰ−Ｎｏｇｏの結合を示すアッセイの型において、漸増量のＧＳＴ−Ｎｏｇｏを使用する競合的結合アッセイにおいて実証し得る（比色測定アッセイにおいて判断するように）。
【０３２４】
（実施例６：トランスフェクトしたＣＯＳ細胞結合アッセイ）
本発明のホモログを、ＣＯＳ細胞におけるトランスフェクション研究に使用して、Ｎｏｇｏの結合を実証し得る。特に、ＮｇＲ２およびＮｇＲ３をコードするヌクレオチド配列を、適切なベクターを使用してＣＯＳ細胞にトランスフェクションし得る。トランスフェクトされていないＣＯＳ−７細胞は、ＡＰ−Ｎｏｇｏを結合しない。しかし、ＮｇＲをコードする核酸配列を用いるＣＯＳ細胞のトランスフェクションによって、これらの細胞はＮｏｇｏに結合し得る。ＡＰ単独では、これらのトランスフェクトされた細胞に対する安定な親和性を有して結合しない。このことは、ＮｇＲ２およびＮｇＲ３に対するＮｏｇｏの親和性はいずれも、Ｎｏｇｏ由来の６６アミノ酸に起因することを示す。さらに、Ｎｏｇｏの、ＮｇＲ２タンパク質またはＮｇＲ３タンパク質に対する特異的親和性を、ＧＳＴ−Ｎｏｇｏを使用するＡＰ−Ｎｏｇｏアッセイの置換において試験し得る。ＮｇＲ２および／またはＮｇＲ３もまた、Ｎｏｇｏのホモログを結合し得、これもまた、このアッセイを使用して試験し得る。
【０３２５】
（実施例７：ノーザンブロットおよびランダムプライム（ｒａｎｄｏｍ−ｐｒｉｍｅ）プローブを使用するヒト細胞株におけるＮｇＲの発現）
ノーザンブロットを、商業的供給源より購入するか、または、目的の細胞由来のＲＮＡサンプルを、アガロースゲルで流し、そしてノーザンブロッティングについて周知の技術のいずれかを使用して膜にブロットする。ブロットを、ＮｇＲ２（配列番号１）またはＮｇＲ３（配列番号３）のフラグメントを用いてブロットする。ランダムプライム法（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ（１９８３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２，６−１３）によって標識されたｃＤＮＡ ５０ｎｇより、プローブを調製する。ハイブリダイゼーションを、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂＴＭ溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．８０１５−１）中にて６８℃で１時間行い、続いて、室温で２×ＳＳＣ／０．０５％ ＳＤＳを用いて洗浄し、そして５０℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳを用いて二度洗浄する。ＮｇＲ２および／またはＮｇＲ３の発現を、ブロット上の適切なサイズのバンドの存在によって評価し得る。
【０３２６】
（実施例８：ＮｇＲに対応するｃＤＮＡのクローニング）
ＮｇＲ２に対応する全長クローンをｃＤＮＡライブラリーから得るために、以下の方法を使用し得る。ＮｇＲ２を含むことが既知の組織から、標準法を使用してｃＤＮＡライブラリーを生成する。実施例２において、このような組織を同定した。このｃＤＮＡライブラリー由来の１×１０^６プラーク形成単位を、ＯＰＴＩＴＲＡＮ^ＴＭフィルター上にて二連でスクリーニングし得る。ＮｇＲ２部分に対応するＥＳＴから生成される^３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドを用いて、これらのフィルターをハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション反応は、６５℃で一晩、１０％ 硫酸デキストランおよび１００μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡおよび８０ｐｍｏｌの各^３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドを含む、４００ｍｌのプラークスクリーニング緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ ピロリン酸ナトリウム、０．２％ ポリビニルピロリジン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｒｙｏｌｉｄｉｎｅ）および０．２％ Ｆｉｃｏｌｌ）からなり得る。これらのフィルターを、２×ＳＳＣ／１％ ＳＤＳで二度、１×ＳＳＣ／１％ ＳＤＳで二度洗浄し、そしてフィルムに暴露する。二連の陽性物を精製する。これらのクローンの各々由来のＤＮＡを、制限酵素消化、続いて、アガロースゲル電気泳動およびサザンブロッティングによって分析する。フィルターを、元々のハイブリダイゼーションに使用した^３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、挿入物がプローブにハイブリダイズすることを確認する。次いで、挿入物を配列決定し、これがＮｇＲ２についてのｃＤＮＡを示すことを確認する。同様の方法を使用して、ＮｇＲ３に対応する全長クローンを生成し得る。
【０３２７】
あるいは、ＮｇＲ２またはＮｇＲ３の全長クローンは、慣用的ＰＣＲ技術を使用する当業者によって得られ得る。
【０３２８】
（実施例９：脳におけるＮｇＲ発現を実証するためのハイブリダイゼーション分析）
哺乳動物（例えば、ラット）におけるＮｇＲの発現を、インサイチュハイブリダイゼーション組織化学によって調査し得る。例えば、脳における発現を調査するために、冠状および矢状のラット脳の低温切片（２０μｍ厚）を、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ低温層を使用して調製する。個々の切片を、シラン化した、ヌクレアーゼのないスライド（ＣＥＬ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）上に解凍して載せ、そして−８０℃で貯蔵した。切片を、４％冷パラホルムアルデヒド中で後固定することで開始し、冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でリンスし、トリエタノールアミン緩衝剤中の無水酢酸を使用してアセチル化し、そして室温で、７０％、９５％、および１００％のアルコールでの一連のアルコール洗浄によって脱水して、処理する。引き続いて、切片をクロロホルム中で脱脂し、次いで室温で１００％および９５％のアルコールに連続的に曝露することによって、再水和する。処理された低温切片を含む顕微鏡スライドを風乾し、その後、ハイブリダイゼーションする。他の組織を、類似の様式でアッセイし得る。
【０３２９】
ＮｇＲ特異的プローブを、ＰＣＲを使用して生成し得る。ＰＣＲ増幅に続いて、フラグメントを制限酵素で消化し、そして同じ酵素で切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩにクローニングする。ＮｇＲのセンス鎖に対して特異的なプローブを生成するために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩにクローニングされたクローン化ＮｇＲフラグメントを、適切な制限酵素を用いて線状化し得、これは、ベクター保有Ｔ７プロモーターおよび市販のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、標識されたランオフ転写物（すなわち、ｃＲＮＡリボプローブ）に対する基質を提供する。ＮｇＲのアンチセンス鎖に対して特異的なプローブもまた、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩにおけるＮｇＲクローンを使用して、組換えプラスミドを適切な制限酵素で切断して、Ｔ３プロモーターおよび同種のポリメラーゼを使用して、標識ランオフｃＲＮＡ転写物を調製するための線状化基質を生成することによって、容易に調製し得る。リボプローブを［^３５Ｓ］−ＵＴＰで標識して、アンチセンスプローブに対しては約０．４０×１０^６ｃｐｍ／ｐｍｏｌの比活性を、そしてセンス鎖リボプローブに対しては約０．６５×１０^６ｃｐｍ／ｐｍｏｌの比活性を与え得る。各リボプローブを、引き続いて変性し、そしてハイブリダイゼーション緩衝液（これは、５０％ホルムアミド、１０％デキストラン、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液、および１０ｍＭジチオートレイトールを含む）に添加し得る（２ｐｍｏｌ／ｍｌ）。連続した脳の低温切片を含む顕微鏡のスライドを、独立して、スライドあたり４５μｌのハイブリダイゼーション溶液に曝露し得、そしてシラン化したカバーガラスを、ハイブリダイゼーション溶液に曝露されている切片の上に配置し得る。切片を、５２℃で一晩（１５〜１８時間）インキュベートして、ハイブリダイゼーションを起こす。次いで、等量の一連の低温切片を、センスＮｇＲまたはアンチセンスＮｇＲに特異的なｃＲＮＡリボプローブに曝露する。
【０３３０】
ハイブリダイゼーション時間に続いて、カバーガラスを、１×ＳＳＣ中でスライドから洗浄除去し、次いでＲＮａｓｅ Ａ処理した。このＲＮａｓｅ Ａ処理は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５Ｍ ＥＤＴＡ、および０．５Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液中２０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａに、３７℃で４５分間曝露する工程を包含する。次いで、低温切片を、３つの高ストリンジェンシー洗浄（それぞれ０．１×ＳＳＣ、５２℃で２０分間）に供する。この一連の洗浄に続いて、低温切片を、アルコール中７０％、９５％、および１００％の酢酸アンモニウムに連続的に曝露することによって脱水し、次いで風乾し、そしてＫｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ^ＴＭ ＭＲ−１フィルムに曝露する。曝露の１３日後、このフィルムを現像し、そして任意の有意なハイブリダイゼーションシグナルを検出する。これらの結果に基づいて、フィルムオートラジオグラムによって示される場合にハイブリダイズした組織を含むスライドを、Ｋｏｄａｋ ＮＴＢ−２核トラックエマルジョンでコーティングし、そしてこのスライドを暗所で３２日間貯蔵する。次いで、これらのスライドを現像し、そしてヘマトキシリンで対比染色する。エマルジョンをコーティングした切片を、顕微鏡で分析して、標識の特異性を決定する。オートジオグラフィー粒子（アンチセンスプローブハイブリダイゼーションによって生成した）が、クレシルバイオレットで染色した細胞体に明らかに結合する場合に、そのシグナルを特異的であると決定する。細胞体間に見出されたオートジオグラフィー粒子は、そのプローブの非特異的結合を示す。
【０３３１】
いくつかの場合（例えば、プローブを使用して異種の種においてＮｇＲホモログを検出する場合）において、最適なハイブリダイゼーションを達成するために、ストリンジェンシー条件を減少させる必要があり得る。このような条件は、当業者に周知であり、そして例は上に提供されている。
【０３３２】
脳におけるＮｇＲの発現は、ＮｇＲ活性のモジュレーターが、神経学的障害を処置するために有用性を有することの指標を提供する。ＮｇＲのモジュレーターが有用性を有し得る、他のいくつかの疾患としては、うつ病、不安症、双極性障害、癲癇、神経炎、神経衰弱症、ニューロパシー、神経症などが挙げられる。このような疾患状態を有する個体を処置するための、ＮｇＲモジュレーター（ＮｇＲリガンドおよび抗ＮｇＲ抗体を含む）の使用は、本発明の局面として意図される。
【０３３３】
（実施例１０：ＰＣＲにより生成したプローブを用いる、ＮｇＲ−ＲＮＡのノーザンブロット分析）
ノーザンブロットハイブリダイゼーションを実施して、ＮｇＲ ｍＲＮＡの発現を試験し得る。配列番号１の配列の少なくとも一部を含むクローンを、プローブとして使用し得る。ベクター特異的プライマーをＰＣＲにおいて使用して、^{３ ２}Ｐ標識に対するハイブリダイゼーションプローブフラグメントを生成する。ＰＣＲを、以下のように実施する：
混合： １μｌ ＮｇＲ含有プラスミド
２μｌ 順方向プライマー（１０〜５０ｐＭ）
２μｌ 逆方向プライマー（１０〜５０ｐＭ）
１０μｌ １０×ＰＣＲ緩衝液（例えば、酵素を含むもの、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰ（例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍからの＃１ ９６９ ０６４）
０．５μｌ Ｔａｑポリメラーゼ（例えば、＃２７−０７９９−６２、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
８３．５μｌ 水。
【０３３４】
ＰＣＲを、以下のプログラムを使用して、サーモサイクラーで実施する：
【０３３５】
【表７】

ＰＣＲ産物を、ＱｉａｇｅｎからのＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（＃２８１０４）を使用して、精製し得、そして^３２Ｐ−ｄＣＴＰ（＃ＡＡ０００５／２５０，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）での放射性（ｒａｄｉｃｔｉｖｅｌｙ）標識を、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈからの「Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｇｏ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｂｅａｄｓ」（＃２７−９２４０−０１）を使用するランダムプライミングによって、行い得る。ハイブリダイゼーションを、ＣｌｏｎｔｅｃｈからのＨｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔで、製造業者のプロトコルに記載されるように、またはＲＮＡサンプルを目的の細胞からアガロースゲル上で泳動させ、そして任意の公知のノーザンブロットプロトコルを使用して膜にブロットすることによって調製された、ノーザンブロットで実施する。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｉｍａｇｅｒスクリーン（＃ＭＤ１４６−８１４）に一晩露光した後、適切な大きさのバンドが可視化された。
【０３３６】
（実施例１１：真核生物宿主細胞における、ＮｇＲの組換え発現）
（Ａ．哺乳動物細胞におけるＮｇＲの発現）
ＮｇＲタンパク質を生成するために、ＮｇＲをコードするポリヌクレオチドが、適切な宿主細胞において、適切な発現ベクターおよび標準的な遺伝子操作技術を使用して、発現される。例えば、表４に記載されるＮｇＲコード配列を、市販の発現ベクターｐｚｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にサブクローニングし、そしてトランスフェクション試薬ＦｕＧＥＮＥ６^ＴＭ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および製品の挿入物に提供されるトランスフェクションプロトコルを使用して、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクトする。他の真核動物細胞株（ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ２９３）およびＣＯＳ細胞が挙げられる）もまた、適切である。ＮｇＲを安定に発現する細胞を、１００μｇ／ｍｌのｚｅｏｃｉｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）の存在下で増殖させることによって、選択した。ＦｕＧＥＮＥ６^ＴＭの代替として、発現ベクターは、ジヒドロフォレートレダクターゼ（ｄｈｆｒ）に対する遺伝子を有し得、そしてメトトレキサート（ＭＴＸ）薬物圧力でのクローンの選択は、ＣＨＯ細胞の安定な形質転換を可能にする。必要に応じて、ＮｇＲは、標準的なクロマトグラフィー技術を使用して、細胞から精製され得る。精製を容易にするために、抗血清が、ＮｇＲアミノ酸配列の一部に対応する１つ以上の合成ペプチド配列に対して惹起され、そしてこの抗血清は、Ｎｏｇｏ−Ｒをアフィニティー精製するために使用される。ＮｇＲはまた、ｔａｇ配列（例えば、ポリヒスチジン、ヘマグルチニン、ＦＬＡＧ）とインフレームで発現されて、精製を容易にし得る。さらに、ＮｇＲポリペプチドのための使用の多く（例えば、以下に記載されるアッセイ）は、宿主細胞からのＮｇＲの精製を必要としないことが、理解される。
【０３３７】
（Ｂ．ＣＨＯ細胞におけるＮｇＲの発現）
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞におけるＮｇＲの発現のために、関連するＮｇＲコード配列を保有するプラスミドを、ベクター（これもまた、選択マーカージヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）を保有する）を使用して調製する。このプラスミドを、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトする。ＭＴＸ薬物圧力下での選択は、ＮｇＲの安定な形質転換体（ＮｇＲ２またはＮｇＲ３）を、ＤＨＦＲのような選択マーカーを有する発現プラスミドにおいて調製することを可能にする。
【０３３８】
（Ｃ．２９３細胞におけるＮｇＲの発現）
哺乳動物細胞２９３（形質転換されたヒト始原胚性腎細胞）におけるＮｇＲの発現のために、関連するＮｇＲコード配列を保有するプラスミドを、ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して調製する。ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａは、分泌のためのマウスＩｇＫ鎖リーダー配列、抗ｍｙｃ抗体での組換えタンパク質の検出のためのｃ−ｍｙｃエピトープ、ニッケルキレートクロマトグラフィーでの精製のためのＣ末端ポリヒスチジン、および安定なトランスフェクト体の選択のためのＺｅｏｃｉｎ耐性遺伝子を含む。このＮｇＲ ｃＤＮＡの増幅のための順方向プライマーを、慣用的な手順によって決定し、そして好ましくは、ヌクレオチドの５’伸長を含んで、ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位およびＮｇＲ配列に適合するヌクレオチドを導入する。逆方向プライマーもまた、慣用的な手順によって決定され、そして好ましくは、ヌクレオチドの５’伸長を含んで、クローニングのためのＸｈｏＩ制限部位およびＮｇＲ配列の逆相補体に対応するヌクレオチドを導入する。ＰＣＲ条件は、アニーリング温度として５５℃である。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そしてベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングする。
【０３３９】
ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎクロマトグラフィーカラムを使用して精製し、そしてＤＯＴＡＰ^ＴＭトランスフェクション培地（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して、２９３細胞にトランスフェクトする。一時的にトランスフェクトした細胞を、トランスフェクションの２４時間後に、抗Ｈｉｓおよび抗ＮｇＲペプチド抗体でプローブされるウェスタンブロットを使用して、発現について試験する。永続的にトランスフェクトされた細胞を、Ｚｅｏｃｉｎを用いて選択し、そして増殖させる。組換えタンパク質の生成を、細胞および培地の両方から、抗Ｈｉｓ、抗Ｍｙｃまたは抗ＮｇＲペプチド抗体でプローブするウェスタンブロットによって検出する。
【０３４０】
（Ｄ．ＣＯＳ細胞におけるＮｏｇｏ−Ｒの一時的発現）
ＣＯＳ７細胞におけるＮｇＲの発現のために、例えば、配列番号１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を、ベクターｐ３−ＣＩにクローニングし得る。このベクターは、ｐＵＣ１８由来のプラスミドであり、これは、ｂＧＨ（ウシ成長ホルモン）ポリアデニル化配列から上流に位置するＨＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）プロモーターイントロンおよびマルチクローニング部位を含む。
【０３４１】
順方向プライマーを、慣用的な手順によって決定し、そして好ましくは、５’伸長を含み、これは、クローニングのためのＸｂａＩ制限部位、次いで、配列番号１のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチドを導入する。逆方向プライマーもまた、慣用的な手順によって決定され、そして好ましくは、ＳａｌＩクローニング部位、引き続いて配列番号１のヌクレオチド配列の逆相補体に対応するヌクレオチドを導入するヌクレオチドの、５’伸長を含む。
【０３４２】
ＰＣＲは、最初の９５℃で５分間の変性、３０サイクルの９５℃での３０秒間の変性、５８℃での３０秒間のアニーリング、および７２℃での３０秒間の伸長、続いて７２℃で５分間の伸長からなる。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そしてベクターｐ３−ＣＩのＸｂａＩおよびＳａｌＩ部位に連結する。この構築物を、増幅およびＤＮＡ精製のために、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換する。このＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎクロマトグラフィーカラムで精製し、そしてＢＲＬからのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ試薬を、製造業者のプロトコルに従って使用して、ＣＯＳ７細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションの４８時間後および７２時間後、培地および細胞を組換えタンパク質発現について試験する。
【０３４３】
ＣＯＳ細胞培養物から発現されるＮｇＲを、細胞増殖培地を約１０ｍｇのタンパク質／ｍｌに濃縮し、そしてこのタンパク質を、例えば、クロマトグラフィーによって精製することによって、精製し得る。精製したＮｇＲを、ＹＭ−１０膜を備えるＡｍｉｃｏｎ濃縮器で０．５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、そして−８０℃で貯蔵する。ＮｇＲ３もまた、この方法を使用して発現され得、そして配列番号３または配列番号１３のヌクレオチド配列である。
【０３４４】
（Ｅ．昆虫細胞におけるＮｇＲの発現）
バキュロウイルス系におけるＮｇＲの発現のために、配列番号１、３または１３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を、ＰＣＲによって増幅し得る。順方向プライマーを、慣用的な手順によって決定し、そして好ましくは、５’伸長を含み、これは、ＮｄｅＩクローニング部位、続いて配列番号１（またはそれぞれ配列番号３または配列番号１３）のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチドを付加する。逆方向プライマーもまた、慣用的な手順によって決定され、そして好ましくは、５’伸長を含み、これは、ＫｐｎＩクローニング部位、続いて配列番号１（またはそれぞれ配列番号３または配列番号１３）のヌクレオチド配列の逆相補体に対応するヌクレオチドを導入する。
【０３４５】
ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩで消化し、そしてベクターｐＡＣＨＴＬ−Ａ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の対応する部位にクローニングする。ｐＡｃＨＴＬ発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、およびマルチクローニング部位から上流の６×Ｈｉｓ ｔａｇを含む。リン酸化のためのプロテインキナーゼ部位、および組換えタンパク質の切除のための、マルチクローニング部位に先行するトロンビン部位もまた、存在する。もちろん、多くの他のバキュロウイルスベクターが、ｐＡｃＨＴＬ−Ａの代わりに使用され得る（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１およびｐＡｃＩＭ１）。ＮｇＲポリペプチドの発現のために適切な他のベクターは、そのベクター構築物が、必要に応じて、転写、翻訳、および転送のための適切に位置するシグナル（例えば、インフレームＡＵＧおよびシグナルペプチド）を含むことを条件として、使用され得る。このようなベクターは、とりわけ、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）１７０：３１−３９に記載されている。
【０３４６】
ウイルスを、標準的なバキュロウイルス発現方法（例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓら（１９８７）Ａ ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＶＥＣＴＯＲＳ ＡＮＤ ＩＮＳＥＣＴ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５に記載されるもの）を使用して、増殖および単離する。
【０３４７】
好ましい実施形態において、ｐＡｃＨＬＴ−Ａを含むＮｇＲ遺伝子を、「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^ＴＭ」トランスフェクションキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、製造業者によって樹立された方法を使用して、バキュロウイルスに導入する。個々のウイルス単離体を、感染した細胞を^３５Ｓ−メチオニンで、感染の２４時間後に放射性標識することによって、タンパク質産生について分析する。感染した細胞を、感染の４８時間後に採取し、そして標識したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで可視化する。高い発現レベルを示すウイルスを単離し得、そして規模を上げた発現のために使用し得る。
【０３４８】
Ｓｆ９細胞におけるＮｇＲポリペプチドの発現のために、配列番号１（または配列番号３または配列番号１３）のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を、ＰＣＲによって、バキュロウイルス発現に関して上記したプライマーおよび方法を使用して、増幅し得る。ＮｇＲ ｃＤＮＡを、Ｓｆ９昆虫における発現のために、ベクターｐＡｃＨＬＴ−Ａ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）にクローニングする。この挿入物を、（バキュロウイルスにおける発現に関して上記したものと同じプライマーを用いての）内部ＮｄｅＩ部位の排除後、ＮｄｅＩ部位およびＫｐｎＩ部位にクローニングする。ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎクロマトグラフィーカラムで精製し、そしてＳｆ９細胞において発現させる。精製していないプラークからの予備的なウェスタンブロット実験を、ＮｇＲ特異的抗体と反応した予測した大きさの組換えタンパク質の存在について、試験する。これらの結果を、ＨｉＧ５細胞におけるさらなる精製および発現最適化の後に、確認する。
【０３４９】
（Ｆ．ＮｇＲ−Ｉｇ融合タンパク質としての、ＮｇＲ２およびＮｇＲ３の可溶性形態の発現）
ＮｇＲ２−Ｉｇ融合タンパク質を生成するために、標準的な方法を、文献（例えば、Ｓａｎｉｃｏｌａら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９４，６２３８−６２４３）に記載されるように使用し得る。例えば、疎水性Ｃ末端（ＧＰＩアンカーシグナル）をコードする配列を含まない、ＮｇＲ２をコードするＤＮＡフラグメントを、ＩｇＧ１（これは、ヒトＩｇＧ１であり得る）のＦｃドメインをコードするＤＮＡフラグメントに連結し得、そしてこのキメラフラグメントを、発現ベクターにクローニングして、プラスミドを生成し得る。次いで、このプラスミドを、チャイニーズハムスター卵巣細胞にトランスフェクトして、融合タンパク質を産生する安定な細胞株を生成し得る。次いで、この融合タンパク質を、馴化培地から、標準的な方法を使用して精製する。例えば、細胞株由来の清澄化した馴化培地を、重力によって直接、プロテインＡセファロースに装填し得る。次いで、このカラムを、５倍カラム容量の、ＰＢＳ、０．５Ｍ ＮａＣｌおよび２５ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．０）を含むＰＢＳ、の各々で洗浄し得る。次いで、結合したタンパク質を、２５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ２．８）で溶出し得、そしてすぐに、１／１０画分容量の０．５Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４（ｐＨ８．６）で中和する。
【０３５０】
類似の方法を使用して、ＮｇＲ３−Ｉｇ融合タンパク質を生成し得る。
【０３５１】
（実施例１２：相互作用捕捉／ツーハイブリッド系）
ＮｇＲ相互作用タンパク質についてアッセイするために、相互作用捕捉／ツーハイブリッドライブラリースクリーニング法が使用され得る。このアッセイは、最初に、Ｆｉｅｌｄｓら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０，２４５（これはその全体が本明細書中で参考として援用される）に記載された。プロトコルは、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ １９９９、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹおよびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、１９９２，ＳＨＯＲＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、第４版、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ（これはその全体が本明細書中で参考として援用される）において公開される。キットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ（Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ３）から入手可能である。
【０３５２】
ＮｇＲの全てまたは一部をコードするヌクレオチド配列と酵母転写因子のＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＮＡ−ＢＤ）との融合物を、標準的なサブクローニング技術を使用して、適切なプラスミド（すなわち、ｐＧＢＫＴ７）において構築する。同様に、ＧＡＬ４活性ドメイン（ＡＤ）融合ライブラリーを、第２のプラスミド（すなわち、ｐＧＡＤＴ７）において、潜在的なＮｇＲ結合タンパク質のｃＤＮＡから構築する（ｃＤＮＡライブラリーを形成するプロトコルについては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（これはその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。このＤＮＡ−ＢＤ／ＮｇＲ融合構築物を、自律的なレポーター遺伝子活性および細胞毒性（この両方は首尾良いツーハイブリッド分析を妨げる）について試験する。類似のコントロールを、ＡＤ／ライブラリー融合構築物を用いて行って、宿主細胞における発現および転写活性の欠損を保証する。酵母細胞を、標準的な手順に従って、ＮｇＲおよびライブラリー融合プラスミドの両方で形質転換する（約１０５形質転換体／ｍｇ ＤＮＡ）（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９２，ＳＨＯＲＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，第４版、Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，（これはその全体が本明細書中で参考として援用される））。ＤＮＡ−ＢＤ／ＮｇＲとＡＤ／ライブラリータンパク質とのインビボの結合は、特定の酵母プラスミドレポーター遺伝子（すなわち、ｌａｃＺ、ＨＩＳ３、ＡＤＥ２、ＬＥＵ２）の転写を生じる。酵母細胞を栄養物を欠く培地にプレーとして、レポーター遺伝子の発現についてスクリーニングする。Ｘｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−Ｄ−ガラクトシド）を補充した培地中で増殖させて、コロニーを、β−ガラクトシダーゼ活性について二重にアッセイする（β−ガラクトシダーゼ活性についてのフィルターアッセイは、Ｂｒｅｅｄｅｎら、（１９８５）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５０，６４３（これはその全体が本明細書中で参考として援用される）に記載される）。陽性のＡＤ−ライブラリープラスミドを、この形質転換体からレスキューし、そして元の酵母株、および無関係のＤＮＡ−ＢＤ融合タンパク質を含む他の株に再び導入して、特異的なＮｇＲ／ライブラリータンパク質の相互作用を確認する。挿入ＤＮＡを配列決定して、ＧＡＬ４ ＡＤに融合したオープンリーディングフレームの存在を確認し、そしてＮｇＲ結合タンパク質の同一性を決定する。
【０３５３】
（実施例１３：Ｎｏｇｏ−Ｒに対する抗体）
標準的な技術を用いて、ＮｇＲレセプターに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を作製し、そして有用なそれらの抗原結合フラグメントまたはそれらの改変体（「ヒト化」改変体を含む）を作製する。このようなプロトコルは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）（上記）およびＨａｒｌｏｗら（編）、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）に見出され得る。一実施形態において、組換えＮｇＲポリペプチド（またはこのようなポリペプチドを含む細胞または細胞膜）を抗原として使用して、抗体を作製する。別の実施形態において、ＮｇＲの免疫原性部分に対応するアミノ酸配列（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のアミノ酸）を有する１つ以上のペプチドを、抗原として使用する。Ｎｏｇｏ−Ｒの細胞外部分に対応するペプチド、特に親水性細胞外部分が、好ましい。この抗原を、アジュバントと混合して、またはハプテンと結合して、抗体産生を増加し得る。
【０３５４】
（Ａ．ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）
１つの代表的なプロトコルとして、組換えＮｇＲまたはその合成フラグメントを使用して、モノクローナル抗体の作製のためのマウス（またはポリクローナル抗体のためのより大きな哺乳動物（例えば、ウサギ））を免疫する。抗原性を増大するために、製造者の推奨に従って、ペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン（Ｐｉｅｒｃｅ）に結合体化する。最初の注射のために、この抗原を、フロイント完全アジュバントを用いて乳化し、そして皮下注射する。２〜３週間の間隔で、ＮｇＲ抗原のさらなるアリコートをフロイント不完全アジュバントを用いて乳化し、そして皮下注射する。最後のブースター注射の前に、免役したマウスから血清サンプルを採取し、そしてウエスタンブロットによりアッセイして、ＮｇＲと免疫反応した抗体の存在を確認する。この免役した動物由来の血清を、ポリクローナル抗血清として使用し得るか、またはＮｇＲを認識するポリクローナル抗体を単離するために使用し得る。あるいは、このマウスを屠殺し、そしてその脾臓を、モノクローナル抗体の作製のために取り出す。
【０３５５】
モノクローナル抗体を作製するために、この脾臓を１０ｍｌの血清を含まないＲＰＭＩ １６４０に入れ、そしてこの脾臓を血清を含まないＲＰＭＩ １６４０（２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１００単位／ｍｌ ペニシリン、および１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン（ＲＰＭＩ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｎａｄａ）を補充）中で粉砕することによって、単細胞懸濁液を形成する。この細胞懸濁液を濾過し、そして遠心分離によって洗浄し、そして血清を含まないＲＰＭＩに再懸濁する。３つのネイティブのＢａｌｂ／ｃマウスから採取した胸腺細胞を、同様の様式で調製し、そして支持細胞層として使用する。ＮＳ−１骨髄腫細胞（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）中、融合の前の３日間対数期で保たれる）を、同様に遠心分離して、洗浄する。
【０３５６】
ハイブリドーマ融合物を作製するために、この免疫したマウス由来の脾臓細胞を、ＮＳ−１細胞と合わせ、遠心分離し、そして上清を吸引する。遠心管を叩くことによって、細胞ペレットを取り出し、そして２ｍｌの３７℃のＰＥＧ １５００（７５ｍＭ ＨＥＰＥＳ中５０％、ｐＨ８．０）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、ペレットになるまで撹拌し、続いて血清を含まないＲＰＭＩを添加する。この後に、これらの細胞を遠心分離し、ＲＰＭＩ（１５％ ＦＢＳ、１００μＭ ナトリウムヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭ チミジン（ＨＡＴ）（Ｇｉｂｃｏ）、２５単位／ｍｌ ＩＬ−６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および１．５×１０^６胸腺細胞／ｍｌを含む）に再懸濁し、そして１０個のＣｏｒｎｉｎｇ平底９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇｍ，ＮＹ）にプレートする。
【０３５７】
融合の２日後、４日後および６日後に、１００μｌの培地をこの融合プレートのウェルから取り出し、そして新しい培地と交換する。８日目に、この融合物を、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、ＮｇＲに結合するマウスＩｇＧの存在について試験する。選択した融合物のウェルを、抗ＮｇＲ抗体を産生するモノクローナル培養物が得られるまで、希釈法によってさらにクローニングする。
【０３５８】
（Ｂ．抗ＮｇＲモノクローナル抗体のヒト化）
本明細書中で報告されるようなＮｇＲの発現パターン、および治療的介入のための標的としてのＮｇＲの可能性は、ＮｇＲインヒビター（アンタゴニスト）のための治療的指標を示唆する。ＮｇＲ中和抗体は、ＮｇＲアンタゴニストとして有用な１種の治療剤を含む。以下は、モノクローナル抗体を「ヒト化」して、その血清半減期を改善し、そしてヒト宿主においてこの抗体の免疫原性を小さくする（すなわち、非ヒト抗ＮｇＲ抗体に対するヒト抗体の応答を防止する）ことによって、ヒトにおける抗ＮｇＲモノクローナル抗体の治療剤としての有用性を改善するためのプロトコルである。
【０３５９】
ヒト化の原理は、文献に記載されており、そして抗体タンパク質のモジュラー配置によって促進される。相補体に結合する可能性を最小にするために、ＩｇＧ４アイソタイプのヒト化抗体が好ましい。
【０３６０】
例えば、あるレベルのヒト化を、ヒト抗体分子の定常ドメインを有する目的の非ヒト抗体タンパク質の可変ドメインを含むキメラ抗体を作製することによって、達成する（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、（１９８９）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４，６５−９２を参照のこと）。ＮｇＲ中和抗ＮｇＲ抗体の可変ドメインを、Ｂ細胞ハイブリドーマのゲノムＤＮＡからクローニングするか、または目的のハイブリドーマから単離したｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡからクローニングする。Ｖ領域遺伝子フラグメントを、ヒト抗体定常ドメインをコードするエキソンに連結し、そして得られた構築物を、適切な哺乳動物宿主細胞（例えば、骨髄腫細胞またはＣＨＯ細胞）中で発現させる。
【０３６１】
さらに高いレベルのヒト化を達成するために、可変性領域遺伝子フラグメントの、非ヒトモノクローナル抗体遺伝子の抗原結合相補性決定領域（「ＣＤＲ」）をコードする部分のみを、ヒト抗体配列にクローニングする（例えば、Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１，５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２，３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，１５３４−１５３６；およびＴｅｍｐｅｓｔら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９，２６６−２７１を参照のこと）。必要ならば、ＣＤＲ３領域の周りのヒト抗体のβシートフレームワークをまた、元のモノクローナル抗体の抗原結合ドメインの三次元構造により近くなるように改変する（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎ．４，７７３−７８３；およびＦｏｏｔｅら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４．４８７−４９９を参照のこと）。
【０３６２】
代替のアプローチにおいて、目的の非ヒトモノクローナル抗体の表面を、例えば、部位特異的突然変異誘発によって、非ヒト抗体の内部残基および接触残基の全てを維持しつつ、非ヒト抗体の選択された表面残基を変更することによって、ヒト化する。Ｐａｄｌａｎ（１９９１）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８，４８９−４９８を参照のこと。
【０３６３】
上述のアプローチを、ＮｇＲ中和抗ＮｇＲモノクローナル抗体およびこれを産生するハイブリドーマを使用して用いて、ＮｇＲ発現またはリガンド媒介性ＮｇＲシグナル伝達が有害である状態を処置または緩和するための治療剤として有用な、ヒト化ＮｇＲ中和抗体を作製する。
【０３６４】
（Ｃ．ファージディスプレイ由来のヒトＮｇＲ中和抗体）
ヒトＮｇＲ中和抗体を、ファージディスプレイ技術（例えば、Ａｕｊａｍｅら（１９９７）Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ８，１５５−１６８；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ（１９９７）ＴＩＢＴＥＣＨ １５，６２−７０；およびＲａｄｅｒら（１９９７），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８，５０３−５０８（これら全ては本明細書中で参考として援用される）に記載される技術）によって作製する。例えば、Ｆａｂフラグメントまたは結合した単鎖Ｆｖフラグメントの形態の抗体可変領域を、線維状ファージマイナーコートタンパク質ｐＩＩＩのアミノ末端に融合する。この融合タンパク質の発現およびその成熟ファージコートへの組込みは、それらの表面に抗体を提示し、この抗体をコードする遺伝物質を含む、ファージ粒子を生じる。このような構築物を含むファージライブラリーを、細菌中で発現させ、そしてこのライブラリーを、標識したかまたは固定化したＮｇＲを抗原プローブとして使用して、ＮｇＲ特異的ファージ抗体についてスクリーニングする。
【０３６５】
（Ｄ．トランスジェニックマウス由来のヒトＮｇＲ７中和抗体）
ヒトＮｇＲ中和抗体を、本質的に、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７，３９１−３９７およびＢｒｕｇｇｅｍａｎｎら（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８，４５５−４５８に記載されるようにして、トランスＦｅニックマウスにおいて作製する。生殖系列構造のヒトＶ遺伝子セグメントを有し、それらのリンパ球組織においてその導入遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを、従来の免疫プロトコルを使用してＮｇＲ組成物で免疫する。この免疫したマウス由来のＢ細胞を使用して、従来のプロトコルを使用してハイブリドーマを作製し、そしてスクリーニングして、抗ＮｇＲヒト抗体（例えば、上記の抗体）を分泌するハイブリドーマを同定する。
【０３６６】
（実施例１４：ＮｇＲ活性のモジュレーターを同定するためのアッセイ）
ＮｇＲ活性のモジュレーター（アゴニストおよびアンタゴニスト）を同定するためのいくつかの非限定的なアッセイを記載する。これらのアッセイによって同定され得るモジュレーターとしては、レセプターの中和リガンド化合物；合成アナログおよび天然リガンドの誘導体；抗体、抗体フラグメント、および／または天然の抗体由来の抗体様化合物、または抗体様組み合わせライブラリー由来の抗体様化合物；ならびに／あるいはライブラリーのハイスループットスクリーニングにより同定される合成化合物などが挙げられる。ＮｇＲに結合する全てのモジュレーターが、組織サンプル中のＮｇＲを同定するために有用である（例えば、診断目的のため、病理学的目的のためなど）。アゴニストモジュレーターおよびアンタゴニストモジュレーターは、ＮｇＲ活性を、それぞれ、上方制御および下方制御して、異常なレベルのＮｇＲ活性により特徴付けられる疾患状態を処置するために有用である。このアッセイは、単一の推定モジュレーターを使用して実施され得、そして／または公知のアンタゴニストを候補アンタゴニストと組み合わせて実施され得る（またはその逆）。
【０３６７】
（Ａ．ｃＡＭＰアッセイ）
１つのタイプのアッセイにおいて、候補モジュレーター化合物に暴露されたＮｇＲトランスフェクト細胞中の環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）のレベルを測定する。ｃＡＭＰアッセイのためのプロトコルは、文献に記載されている（例えば、Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄら（１９６８）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ３７，２７９；Ｆｒａｎｄｓｅｎら（１９７６）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １８，５２９−５４１；Ｄｏｏｌｅｙら（１９９７）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．２８３，７３５−４１；およびＧｅｏｒｇｅら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ２，２３５−４０を参照のこと）。ＮＥＮ^ＴＭ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ製のＡｄｅｎｙｌｙｌ Ｃｙｃｌａｓｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（登録商標）を使用する、このようなアッセイのための代表的なプロトコルを以下に記載する。
【０３６８】
簡潔には、ＮｇＲコード配列（例えば、ｃＤＮＡまたはイントロンを含まないゲノムＤＮＡ）を、市販の発現ベクター（例えば、ｐｚｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にサブクローニングし、そして公知の方法（例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍにより提供されるトランスフェクションプロトコール）を使用して、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に一過性トランスフェクトし、この時にＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬を供給する。トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（登録商標）アッセイキットからの９６ウェルマイクロプレート（これは、固体シンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）でコーティングされており、これにｃＡＭＰに対する抗血清が結合されている）に、播種する。コントロールについて、いくつかのウェルに、野生型（トランスフェクトされていない）ＣＨＯ細胞を播種する。検量線を作成する際に使用するために、このプレート中の他のウェルに種々の量のｃＡＭＰ標準溶液を添加する。
【０３６９】
１つ以上の試験化合物（すなわち、候補モジュレーター）を、各ウェル中の細胞に、コントロールとして働く水および／または化合物を含まない培地／希釈剤と共に添加する。処理の後、ｃＡＭＰを、正確に１５分間室温で、細胞中に蓄積させる。［^１２５Ｉ］標識ｃＡＭＰを含有する溶解緩衝液を添加することによって、このアッセイを終了し、そしてプレートを、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐｃｏｕｎｔ^ＴＭ９６ウェルマイクロプレートシンチレーションカウンターを使用して、計数する。溶解した細胞（または標準物）由来の標識されていないｃＡＭＰおよび固定量の［^１２５Ｉ］−ｃＡＭＰは、このプレートに結合した抗体と競合する。検量線を作成し、そして未知のｃＡＭＰ値を、補間によって得る。試験化合物への暴露に応答する細胞の細胞内ｃＡＭＰレベルの変化は、ＮｇＲ調節活性の指標である。Ｇタンパク質のＧ_ｓサブタイプに結合するレセプターのアゴニストとして作用するモジュレーターは、ｃＡＭＰの産生を刺激して、測定可能な３〜１０倍大きいｃＡＭＰレベルを生じる。Ｇタンパク質のＧ_ｉ／ｏサブタイプに結合するレセプターのアゴニストは、フォルスコリン刺激性ｃＡＭＰ産生を阻害し、５０〜１００％のｃＡＭＰレベルの測定可能な減少を生じる。逆アゴニストとして作用するモジュレーターは、構成的に活性であるかまたは公知のアゴニストにより活性化されるかのいずれかのレセプターにおけるそれらの効果を逆転させる。
【０３７０】
（Ｂ．エクオリンアッセイ）
別のアッセイにおいて、細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）を、ＮｇＲ発現構築物および発光タンパク質アポエクオリン（ａｐｏａｑｕｏｒｉｎ）をコードする構築物の両方で、一過性同時トランスフェクトする。補因子のセレンテラジンの存在下で、アポエクオリンは、細胞内（細胞質）の遊離カルシウムの量に比例して測定可能な発光を放射する（一般には、Ｃｏｂｂｏｌｄら、「Ａｅｑｕｏｒｉｎ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｃｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｆｒｅｅ ｃａｌｃｉｕｍ」、ＭｃＣｏｒｍａｃｋ Ｊ．Ｇ．およびＣｏｂｂｏｌｄ Ｐ．Ｈ．編，ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＣＡＬＣＩＵＭ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ．Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；Ｓｔａｂｌｅｓら（１９９７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５２，１１５−２６；およびＨａｕｇｌａｎｄ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ．第６版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ（１９９６）を参照のこと）。
【０３７１】
１つの代表的なアッセイにおいて、ＮｇＲを、市販の発現ベクターｐｚｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングし、そしてトランスフェクション試薬のＦｕＧＥＮＥ６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および製品の挿入物に提供されるトランスフェクションプロトコルを使用して、発光タンパク質アポエクオリンをコードする構築物（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と共に、ＣＨＯ細胞に一過性同時トランスフェクションする。
【０３７２】
この細胞を、３７℃で２４時間、ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）（１０％ ウシ胎児血清、２ｍＭ グルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを補充）中で培養し、この時点で、培地を、５μＭ セレンテラジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を含有する血清を含まないＭＥＭに替える。次いで、培養を、３７℃でさらに２時間継続する。続いて、細胞を、ＶＥＲＳＥＮ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を使用してプレートから取り出し、洗浄し、血清を含まないＭＥＭ中に２００，０００細胞／ｍｌで再懸濁する。
【０３７３】
候補ＮｇＲモジュレーター化合物の希釈物を、血清を含まないＭＥＭ中で調製し、そして不透明な９６ウェルアッセイプレートのウェルに５０μｌ／ウェルで分散させる。次いで、プレートを、ＭＬＸマイクロタイタープレートルミノメーター（Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）に充填する。この機器を、５０μｌの細胞懸濁液を各ウェルの１つずつに分配し、そして１５秒間に発光を即時に読みとるようにプログラミングする。候補モジュレーターの用量応答曲線を、各光シグナルピークの曲線の下の面積を使用して作成する。データを、ＳｌｉｄｅＷｒｉｔｅを用いて、１部位リガンドについての式を使用して分析し、ＥＣ_５０値を得る。この化合物によって生じる発光の変化を、調節活性の指標とみなす。Ｇタンパク質のＧ_ｑサブタイプに結合するレセプターにおけるアンタゴニストとして働くモジュレーターは、１００倍までの発光の増加を生じる。逆アゴニストとして働くモジュレーターは、構成的に活性であるかまたは公知のアゴニストによって活性化されるかのいずれかであるレセプターにおいて、この効果を逆転する。
【０３７４】
（Ｃ．ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ）
発光タンパク質ルシフェラーゼは、ＮｇＲ活性のモジュレーターについてアッセイするための有用な別のツールを提供する。細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ７細胞）を、ＮｇＲ発現構築物（例えば、ｐｚｅｏＳＶ２中のＮｇＲ）、および転写因子結合部位から下流のルシフェラーゼタンパク質についての遺伝子を含むレポーター構築物（例えば、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、ＡＰ−１またはＮＦ−κＢ）の両方で、一過性同時トランスフェクトする。ルシフェラーゼの発現レベルは、シグナル伝達事象の活性化状態を示す（一般的に、Ｇｅｏｒｇｅら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ２，２３５−２４０；およびＳｔｒａｔｏｗａら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６，５７４−５８１を参照のこと）。ルシフェラーゼ活性を、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から市販されるルシフェラーゼアッセイ試薬を使用して、定量的に測定し得る。
【０３７５】
１つの代表的なアッセイにおいて、トランスフェクションの一日前に、ＣＨＯ細胞を、１００，０００細胞／ウェルの密度で、２４ウェル培養皿にプレートし、そしてＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）（１０％ ウシ胎児血清、２ｍＭ グルタミン、１０Ｕ／ｍｌ ペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを補充）中３７℃で培養する。細胞を、ＮｇＲ発現構築物およびルシフェラーゼ遺伝子を含むレポーター構築物の両方で、一過性同時トランスフェクトする。レポータープラスミドのＣＲＥ−ルシフェラーゼ、ＡＰ−１−ルシフェラーゼおよびＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌｅｇａｌｌｙ，ＣＡ）から購入し得る。メーカーの指示に従って、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、トランスフェクションを実施する。レポーター構築物のみでトランスフェクトされた細胞を、コントロールとして使用する。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、３７℃に予め加温したＰＢＳで１回洗浄する。次いで、この細胞に血清を含まないＭＥＭを単独（コントロール）でかまたは１つ以上の候補モジュレーターと共にのいずれかで添加し、そして３７℃で５時間インキュベートする。その後、細胞を氷冷したＰＢＳで１回洗浄し、そしてＰｒｏｍｅｇａにより供給されるルシフェラーゼアッセイキットにより、ウェル１つあたり１００μｌの溶解緩衝液を添加することによって、この細胞を溶解する。室温で１５分間インキュベートした後、１５μｌの溶解物を、白色不透明の９６ウェルプレート中で、５０μｌの基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合し、そしてＷａｌｌａｃｅ ｍｏｄｅｌ １４５０ ＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションおよび発光カウンター（Ｗａｌｌａｃｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で、発光を直ちに読みとる。
【０３７６】
候補モジュレーター化合物の存在下 対 非存在下の発光の差異は、調節活性の指標である。構成的に活性であるか、またはアゴニストによって活性化されるかのいずれかのレセプターは、レポーター遺伝子のみでトランスフェクトされた細胞と比較して、３〜２０倍の発光の刺激を与える。逆アゴニストとして働くモジュレーターは、この効果を逆転させる。
【０３７７】
（Ｄ．ＦＬＩＰＲを使用する、細胞内カルシウム測定）
細胞内カルシウムレベルにおける変化は、レセプターの活性についての別の認識された指標であり、そしてこのようなアッセイは、ＮｇＲ活性のモジュレーターをスクリーニングするために利用され得る。例えば、ＮｇＲ発現ベクターを用いて安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞は、Ｐａｃｋａｒｄブラックウォールド（ｂｌａｃｋ−ｗａｌｌｅｄ）、９６ウェルプレート（プレート上の種々のウェルから出る蛍光シグナルを識別するために特別に設計された）内に４×１０^４細胞／ウェルの密度でプレートされる。細胞を、１％ウシ胎仔血清および４つのカルシウム指示色素（Ｆｌｏ−３^ＴＭＡＭ、Ｆｌｏ−４^ＴＭＡＭ、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ−１ ＡＭ、またはＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ４８８ ＢＡＰＴＡ−１ ＡＭ）のうちの１つ（それぞれ、４μＭの濃度）の添加とともに、３６ｍｇ／Ｌピルビン酸塩および１ｇ／Ｌグルコースを含む、改変ダルベッコのＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）中で、３７℃で６０分間インキュベートする。プレートを、１回、１％ウシ胎仔血清を含まない改変Ｄ−ＰＢＳを用いて洗浄し、そして１０分間３７℃でインキュベートして、細胞膜から残りの色素を除去する。さらに、１％ウシ胎仔血清を含まない改変Ｄ−ＰＢＳを用いた一連の洗浄は、カルシウム応答の活性化の直前に実行される。
【０３７８】
カルシウム応答は、１つ以上の候補レセプターアゴニスト化合物、カルシウムイオノホアＡ２３１８７（１０μＭ；ポジティブコントロール）、またはＡＴＰ（４μＭ；ポジティブコントロール）の添加によって開始される。蛍光は、アルゴンレーザー（４８８ｎｍでの励起）を用いて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ’ｓ ＦＬＩＰＲによって測定する。（例えば、Ｋｕｎｔｚｗｅｉｌｅｒら、（１９９８）Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．４４，１４−２０を参照のこと）。検出カメラのＦストップは、２．５に設定され、そして露光の長さは、０．４ミリ秒である。細胞の基底の蛍光を、候補アゴニスト、ＡＴＰ、またはＡ２３１８７の添加の前に２０秒間測定し、そしてこの基底蛍光レベルを、応答シグナルから引く。カルシウムシグナルを、約２００秒間測定し、２秒毎に読み値をとる。カルシウムイオノホアＡ２３１８７およびＡＴＰは、カルシウムシグナルを基底レベルの２００％上に増加させる。一般的に、活性化ＮｇＲは、カルシウムシグナルを基底シグナルの少なくとも１０〜１５％上に増加させる。
【０３７９】
（Ｅ．［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合アッセイ）
ＮｇＲが、Ｇタンパク質媒介経路を介してシグナル伝達するか否かを評価することもまた、可能である。Ｇタンパク質共役レセプターは、細胞内Ｇタンパク質を介してシグナル伝達し、その活性は、ＧＴＰ結合および加水分解による結合ＧＤＰの生成を含むので、候補モジュレーターの存在下および非存在下での加水分解不可能ＧＴＰアナログ［^３５Ｓ］−ＧＴＰγＳの結合の測定は、モジュレーター活性についての別のアッセイを提供する（例えば、Ｋｏｗａｌら、（１９９８）Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３７、１７９−１８７を参照のこと）。
【０３８０】
１つの例示的なアッセイにおいて、ＮｇＲ発現ベクターを用いて安定にトランスフェクトされた細胞は、１０ｃｍ組織培養ディッシュ内においてサブコンフルエンスまで増殖され、５ｍｌの氷冷されたＣａ^２＋／Ｍｇ^２＋を含まないリン酸緩衝化生理食塩水を用いて、１回リンスされ、そして５ｍｌの同じ緩衝液中へとこすりとられる。細胞を、遠心分離（５００×ｇ、５分）によってペレット化し、ＴＥＥ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＥＧＴＡ）中に再懸濁し、そして液体窒素内に凍結する。解凍後、細胞を、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー（１プレートの細胞あたり１ｍｌのＴＥＥ）を使用してホモジナイズし、そして５分間、１，０００×ｇで遠心分離して、核および未破壊の細胞を除く。
【０３８１】
ホモジネート上清を、２０分間、２０，０００×ｇで遠心分離して、膜画分を単離し、そして膜ペレットを、ＴＥＥで１回洗浄し、そして結合緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁する。再懸濁された膜を、液体窒素内で凍結させ得、そして使用まで、−７０℃で保存し得る。
【０３８２】
上記のように調製され、そして−７０℃で保存された細胞膜のアリコートを、解凍し、ホモジナイズし、そして２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、１０μＭ ＧＤＰ、および０．２ｍＭアスコルビン酸塩を含む緩衝液中に、１０〜５０μｇ／ｍｌの濃度で希釈する。９０μｌの最終容量において、ホモジネートを、種々濃度の候補モジュレーター化合物または１００μＭ ＧＴＰとともに、３０分間３０℃でインキュベートし、次いで、氷上に配置する。それぞれのサンプルに、１０μｌのグアノシン ５’−Ｏ−（３［^３５Ｓ］チオ）トリホスフェート（ＮＥＮ、１２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；［^３５Ｓ］−ＧＴＰγＳ）を、１００〜２００ｐＭの最終濃度まで添加した。サンプルを、３０℃でさらに３０分間インキュベートし、１ｍｌの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２を４℃で添加し、そして反応を濾過によって停止した。
【０３８３】
サンプルを、Ｗｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｂフィルター上で濾過し、そしてフィルターを、２０ｍｌの氷冷１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２で洗浄する。フィルターを、液体シンチレーション分光法によって計数する。［^３５Ｓ］−ＧＴＰγＳの非特異的結合を、１００μＭ ＧＴＰの存在下で測定し、そして合計から引く。非トランスフェクトコントロール細胞と比較して、細胞中の［^３５Ｓ］−ＧＴＰγＳ結合の量を調節する化合物を選択する。アゴニストによるレセプターの活性化によって、［^３５Ｓ］−ＧＴＰγＳ結合において、５倍までの増加が与えられた。この応答は、アンタゴニストによってブロックされる。
【０３８４】
（Ｆ．［^３Ｈ］アラキドン酸放出）
ＮｇＲの活性化はまた、細胞内のアラキドン酸放出を増強し得、ＮｇＲ活性のモジュレーターについてのなお別の有用なアッセイを提供する。（例えば、Ｋａｎｔｅｒｍａｎら、（１９９１）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３９、３６４−３６９を参照のこと）。例えば、ＮｇＲ発現ベクターを用いて安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、１５，０００細胞／ウェルの密度で、２４ウェルプレート内にプレートし、そして、使用前に、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充されたＭＥＭ培地中で、３７℃で４８時間増殖させる。それぞれのウェルの細胞を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、および０．５％の脂肪酸を含まないウシ血清アルブミンを補充した１ｍｌ ＭＥＭ中で、０．５μＣｉ／ｍｌの［^３Ｈ］アラキドン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．、２１０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）とともに、２時間３７℃でのインキュベーションによって標識する。次いで、細胞を２回、１ｍｌの同じ緩衝液で洗浄する。
【０３８５】
候補モジュレーター化合物を、１ｍｌの同じ緩衝液中に、単独でかまたは１０μＭ ＡＴＰとともに添加し、そして細胞を３７℃で３０分間インキュベートする。緩衝液単独および偽トランスフェクト細胞をコントロールとして使用する。各ウェルからのサンプル（０．５ｍｌ）を、液体シンチレーション分光法によって計数する。レセプターを活性化するアゴニストは、［^３Ｈ］アラキドン酸のＡＴＰ刺激放出の増強を導く。この増強は、アンタゴニストによってブロックされる。
【０３８６】
（Ｇ．細胞外酸性化速度）
なお別のアッセイにおいて、ＮｇＲ活性の候補モジュレーターの効果は、試験化合物によって誘導されるｐＨにおける細胞外変化をモニターすることによってアッセイされる（例えば、Ｄｕｎｌｏｐら（１９９８）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０，４７−５５を参照のこと）。１つの実施形態において、ＮｇＲ発現ベクターを用いてトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリン、および１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充されたＭＥＭ中で、４×１０^５細胞／カップで、１２ｍｍのカプセルカップ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．）中に播種する。細胞を、２４時間、５％ＣＯ_２中で、３７℃でこの培地中でインキュベートする。
【０３８７】
細胞外酸性化速度を、Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒマイクロフィジオメーター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．）を使用して測定する。カプセルカップを、マイクロフィジオメーターのセンサーチャンバにロードし、そしてチャンバを、１００μｌ／分の流速で、流動（ｒｕｎｎｉｎｇ）緩衝液（４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０単位／ｍｌペニシリン、１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２６ｍＭ ＮａＣｌを補充された、重炭酸塩を含まないＭＥＭ）を用いて、灌流する。候補アゴニストまたは他の薬剤を、流動緩衝液中に希釈し、そして第２流路を通して灌流する。各６０秒のポンプサイクルの間、ポンプを、３８秒間稼動させ、そして残りの２２秒間切る。センサーチャンバ中の流動緩衝液のｐＨは、４３〜５８秒のサイクルの間、記録され、そして、ポンプは、６０秒で再開されて、次のサイクルを開始する。記録時間の間、流動緩衝液の酸性化速度は、Ｃｙｔｏｓｏｆｔプログラムによって計算される。酸性化速度における変化は、モジュレーター候補の添加後に得られる最も高い速度測定から基準値（モジュレーター候補の添加直前の４つの速度測定の平均）を引くことによって計算される。選択された機器は、６１ｍＶ／ｐＨ単位を検出する。レセプターのアゴニストとして作用するモジュレーターは、アゴニストの非存在下での速度と比較して、細胞外酸性化の速度の増加を生じる。この応答は、レセプターのアンタゴニストとして作用するモジュレーターによってブロックされる。
【０３８８】
（実施例１５：ｍＮｇＲ３は、ｈＮｏｇｏ−Ａ（１０５５−１１２０）に結合しない）
マウスＮｇＲ３（本明細書中において以後、ｍＮｇＲ３）を、ｈＮｏｇｏ−Ａ（１０５５−１１２０）に結合するその能力について機能的に試験するために、ｍｙｃエピトープタグ化ｍＮｇＲ３タンパク質に対するｃＤＮＡ発現ベクターを作製した。マウスＮｇＲ３ ｃＤＮＡを、マウス成体脳ｃＤＮＡから、シグナル配列から停止コドンまでをＰＣＲによって増幅し、そしてベクターが、シグナル配列、続いて、ｍｙｃタグ、続いて、成熟ｍＮｇＲ３配列をコードするように、ｐＳｅｃＴａｇ２ベクターに連結した。このプラスミドを、ＣＯＳ０７細胞にトランスフェクトし、そして推定サイズのｍｙｃタグ化タンパク質の発現を、イムノブロット分析によって確認した。アルカリホスファターゼ−ｈＮｏｇｏ−Ａ（１０５５−１１２０）結合研究およびｍｙｃ免疫組織学を、記載される（Ｆｏｕｒｎｉｅｒら、前出）ように行った。
【０３８９】
ｍＮｇＲ３を発現する細胞は、ｍｙｃタグ化タンパク質を発現するが、ＡＰ−ｈＮｏｇｏ−Ａ（１０５５−１１２０）への結合は、使用される条件下では観察されなかった（図８）。
【０３９０】
（実施例１６：部分ヒトＮｇＲ３ ｃＤＮＡおよびタンパク質配列の同定）
ｔｂｌａｓｔｎプログラムを使用して、マウスＮｇＲ３のヒトホモログを検索した。マウスＮｇＲ３タンパク質配列（配列番号４）を使用して、Ｉｎｃｙｔｅからの独占的な（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）ヒト発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースを問合せて、１つの高い有意なヒット（Ｉｎｃｙｔｅ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＩＤ １９０９８９．１）を得た。この配列（９３７ヌクレオチド）は、マウスＮｇＲ３（配列番号４）の残基６６〜３８１と８８％の同一性を示す第２逆フレームにおける３１２アミノ酸のオープンリーディングフレームを含み、このことは、それが、ヒトＮｇＲ３ホモログの一部であることを強く示す。
【０３９１】
Ｇｅｎｂａｎｋにおける公用ヒトＥＳＴデータベースに対する配列番号４の問合せはまた、４６５−ｂｐ ＥＳＴ（登録番号：Ｒ３５６９９；バージョン番号：Ｒ３５６９９．１；ＧＩ：７９２６００）とのヒットを生じた。この配列内に、フレームシフトエラーを引き起こす多くの単一ヌクレオチドの欠失および挿入が存在する。この公開ＥＳＴに含まれる信頼できる配列の全ては、Ｉｎｃｙｔｅ ＥＳＴ（Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＩＤ １９０９８９．１）中に存在する。
【０３９２】
そのカルボキシ末端においてアミノ酸配列を伸長するより多くのヌクレオチド配列を得るために、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍクローン番号３８３１９（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｒ３５６９９に対応する）を、Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．から購入し、そしてさらなるＤＮＡ配列分析に供した。このクローンは、目的の配列を含むＮｏｔＩ／ＨｉｎＤ ＩＩＩフラグメントからなり、ベクターＬａｆｍｉｄ ＢＡ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅ．ｌｌｎｌ．ｇｏｖ／ｉｍａｇｅ／ｈｔｍｌ／ｌｉｂｓ／ｌａｆｍｉｄＢＡ．ｓｈｔｍｌ）のＮｏｔＩ／ＨｉｎＤ ＩＩＩ部位にクローン化した。このクローンを、寒天スタブ（ａｇａｒ ｓｔａｂ）として受け入れ、これを、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに画線培養（ｓｔｒｅａｋ ｏｕｔ）して、個々のクローンを単離した。６つのコロニーを、抗生物質を含むＬＢ培地中で増殖させ、そしてプラスミドＤＮＡを、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ａ７５００）を使用して、調製した。引き続いて、これらのＤＮＡを、ＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＤ ＩＩＩ制限酵素を用いて消化して、このクローンが、挿入物を含んだことを確認した。１つの単離物の挿入物を、ベクター特異的プライマーおよび遺伝子特異的プライマーの組み合わせを使用して配列決定して、１１７６ヌクレオチドのヒトＮｇＲ３の部分ヌクレオチド配列（配列番号１３）を得た。この配列の翻訳は、３９２アミノ酸のヒトＮｇＲ３についての部分配列（配列番号１４）を提供する。
【０３９３】
配列番号１３のヌクレオチド配列は、３つの位置において、Ｉｎｃｙｔｅ ＥＳＴ配列とは異なる。配列番号１３のヌクレオチド１２位〜１３位は、ＣＧであるが、一方、Ｉｎｃｙｔｅ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＩＤ １９０９８９．１における対応するヌクレオチドは、ＧＴ（すなわち、Ｉｎｃｙｔｅ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＩＤ １９０９８９．１の相補体の１２位〜１３位）である。さらに、配列番号１３の６４１位は、Ｃであるが、一方、Ｉｎｃｙｔｅ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＩＤ １９０９８９．１配列における対応するヌクレオチドは、Ａ（すなわち、Ｉｎｃｙｔｅ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＩＤ １９０９８９．１の相補体の６４１位）である。これは、配列番号１４を、Ｉｎｃｙｔｅ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＩＤ １９０９８９．１によってコードされるＯＲＦと比較した場合に、アミノ酸において２つの変化を生じる：配列番号１４は、５位においてバリンを含むが、一方、Ｉｎｃｙｔｅ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＩＤ １９０９８９．１によってコードされるＯＲＦは、ロイシンを含み；配列番号１４は、２１４位においてアラニンを含むが、一方、Ｉｎｃｙｔｅ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＩＤ １９０９８９．１によってコードされるＯＲＦは、グルタミン酸を含む。
【０３９４】
配列番号１３のヌクレオチド配列は、２つの位置（信頼できる配列の最初の２００ヌクレオチド内）において公開ＥＳＴ（登録番号：Ｒ３５６９９；バージョン番号：Ｒ３５６９９．１；ＧＩ：７９２６００）配列とは異なる。配列番号１３におけるヌクレオチドの１２位〜１３位はＣＧであるが、一方、公開ＥＳＴにおける対応するヌクレオチドは、ＧＴ（すなわち、公開ＥＳＴ；登録番号Ｒ３５６９９；バージョン番号：Ｒ３５６９９．１；ＧＩ：７９２６００の１２位〜１３位）である。これは、配列番号１４を公開ＥＳＴによってコードされるＯＲＦと比較する場合に、単一アミノ酸変化を導く：配列番号１４は、５位にバリンを含むが、一方、公開ＥＳＴによってコードされるＯＲＦは、ロイシンを含む。
【０３９５】
全長マウスアミノ酸配列を用いる、部分ヒトアミノ酸配列のＢｅｓｔｆｉｔ分析は、ヒトＮｇＲ３アミノ酸配列が、カルボキシ末端において完全であること、およびこれらが、８９．５４％の同一性を共有することを示す。全てのＮｇＲタンパク質のアライメントを、図９に示す。ヒトＮｇＲ３アミノ酸配列は、最初の２５アミノ酸を欠いているが、ヒトＮｇＲ３タンパク質が、他のＮｇＲ配列と共通の以下の特徴を含むことが決定され得る：（１）８つのロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ドメイン；（２）ＬＲＲカルボキシ末端（ＬＲＲ−ＣＴ）ドメイン；（３）第４ＬＲＲドメインにおける保存されたシステイン；（４）８つのＬＲＲドメインにおける保存された潜在的グリコシル化部位；および（５）疎水性カルボキシル末端。
【０３９６】
当業者が理解するように、多くの変化および改変が、本発明の精神から逸脱することなく、本発明の好ましい実施形態に対してなされ得る。すべてのこのような改変が本発明の範囲内にあることが意図される。
【０３９７】
本明細書中に引用されるそれぞれの刊行物の開示全体が、本明細書により、参考として援用される。この出願は、２０００年１０月６日に出願された、米国仮出願第６０／２３８，３６１号（その全体が、本明細書中において参考として援用される）からの利益を主張する。
【０３９８】
配列表のための手がかり：
配列番号１ ゲノム配列ＡＣ０１３６０６由来のヒトＮｇＲ２ ｃＤＮＡ配列
配列番号２ ヒトＮｇＲ２アミノ酸配列
配列番号３ ＡＣ０２１７６８由来のマウスＮｇＲ３ ｃＤＮＡ配列
配列番号４ マウスＮｇＲ３アミノ酸配列
配列番号５ ヒトＮｇＲ１アミノ酸配列
配列番号６ ＮｇＲのコンセンサスアミノ酸配列
配列番号７ ｈＮｏｇｏＡ（Ｎｏｇｏ−６６）の番号１０５５〜１１２０アミノ酸残基
配列番号８ 成熟ヒトＮｇＲ２アミノ酸配列
配列番号９ 成熟マウスＮｇＲ３アミノ酸配列
配列番号１０ コンセンサスＮｇＲ ＬＬＲＮＴアミノ酸配列
配列番号１１ コンセンサスＮｇＲ ＬＲＲＣＴドメインアミノ酸配列
配列番号１２ コンセンサスＮｇＲ ＬＲＲドメインアミノ酸配列
配列番号１３ 部分ヒトＮｇＲ３ヌクレオチド配列
配列番号１４ 部分ヒトＮｇＲ３アミノ酸配列
配列番号１５ ヒトＮｇＲ２配列をコードするゲノム配列
配列番号１６ マウスＮｇＲ３をコードするゲノム配列（相補鎖）
配列番号１７ マウスＮｇＲ１アミノ酸配列
配列番号１８ ＮｇＲのＮＴＬＲＲＣＴドメインについてのコンセンサス配列
配列番号１９ コンセンサスＮｇＲ ＬＲＲＣＴドメインアミノ酸配列。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｂは、公知のＮｇＲ、ＮｇＲ１（配列番号５）およびコンセンサス配列（配列番号６）と共に、ＮｇＲ２（配列番号２）およびＮｇＲ３（配列番号４）のアライメントを示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｂは、公知のＮｇＲ、ＮｇＲ１（配列番号５）およびコンセンサス配列（配列番号６）と共に、ＮｇＲ２（配列番号２）およびＮｇＲ３（配列番号４）のアライメントを示す。
【図２】図２。ｍＮｇＲ３は、ｈＮｏｇｏＡ（１０５５〜１１２０）に結合しない。ＣＯＳ−７細胞を、ｍｙｃ−ＮｇＲ１またはｍｙｃ−ＮｇＲ３をコードするベクターでトランスフェクトし、固定し、そして抗ｍｙｃ抗体またはＡＰ−ｈＮｏｇｏＡ（１０５５〜１１２０）で染色した。
【図３】図３。ヒトＮｇＲ１、マウスＮｇＲ１、マウスＮｇＲ３、ヒトＮｇＲ３およびヒトＮｇＲ２のアミノ酸配列のアライメント。番号付けは、マウスＮｇＲ３のアミノ酸番号１から開始する。コンセンサス配列を下に列挙する。ＬＲＲ ＮＴドメインを、影付きボックスで示し；ドメインＬＬＲ１、ＬＬＲ３、ＬＬＲ５、およびＬＬＲ７を、白ボックスで示し；ＬＬＲ２、ＬＬＲ４、ＬＬＲ６およびＬＬＲ８を、影付きボックスで示し；そしてＬＬＲ ＣＴドメインを、影付きボックスで示す。ＬＬＲ８中の太字のアミノ酸は、保存グリコシル化部位を示す。点は、ＬＲＲ４の保存システイン残基を示す。Ｃ末端のボックスは、推定ＧＰＩシグナルを示す。

Claims (18)

1. 以下：
   （ａ）配列番号２のアミノ酸３１〜３１０からなるポリペプチドに対して少なくとも９０％同一であるポリペプチド；
   （ｂ）配列番号２のアミノ酸３１〜３１０を含むポリペプチド；
   （ｃ）配列番号２のアミノ酸１〜３１０からなるポリペプチドに対して少なくとも９０％同一であるポリペプチド；
   （ｄ）配列番号２のアミノ酸１〜３１０を含むポリペプチド；
   （ｅ）配列番号２のアミノ酸３１〜３９５からなるポリペプチドに対して少なくとも９５％同一であるポリペプチド；
   （ｆ）配列番号２のアミノ酸３１〜３９５を含むポリペプチド；
   （ｇ）配列番号２のアミノ酸１〜３９５からなるポリペプチドに対して少なくとも９５％同一であるポリペプチド；
   （ｈ）配列番号２のアミノ酸１〜３９５を含むポリペプチド；
   （ｉ）配列番号２のアミノ酸３１〜３１０からなるポリペプチドについて、該アミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に５つ以下のアミノ酸が付加された、ポリペプチド；ならびに、
   （ｊ）配列番号２のアミノ酸３１〜３９５からポリペプチドについて、該アミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に５つ以下のアミノ酸が付加された、ポリペプチド；
   からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリペプチドは、ＣＮＳニューロンの軸索成長の阻害を減少させる、ポリヌクレオチド。
2. 以下：
   （ａ）配列番号２のアミノ酸１〜４２０からなるポリペプチドに対して少なくとも９５％同一であるポリペプチド；および
   （ｂ）配列番号２のアミノ酸３１〜４２０からなるポリペプチドに対して少なくとも９５％同一であるポリペプチド、
   からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリペプチドは、ＣＮＳニューロンの軸索成長の阻害を減少させる、ポリヌクレオチド。
3. 請求項１または２に記載のポリヌクレオチドであって、異種ポリペプチドのアミノ酸配列をさらにコードする、ポリヌクレオチド。
4. 請求項３に記載のポリヌクレオチドであって、前記異種ポリペプチドが前記核酸によってコードされるポリペプチドと融合タンパク質を形成する、ポリヌクレオチド。
5. 請求項４に記載のポリヌクレオチドであって、前記異種ポリペプチドが、Ｆｃ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）からなる群から選択される、ポリヌクレオチド。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドであって、前記核酸に作動可能に連結した１つ以上の発現制御エレメントをさらに含む、ポリヌクレオチド。
7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
8. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または、請求項７に記載のベクターを含む宿主細胞であって、ここで、該宿主細胞は、ヒトを生成し得る細胞を除く、宿主細胞。
9. 請求項８に記載の宿主細胞であって、ここで、真核生物細胞である、宿主細胞。
10. 請求項８または９に記載の宿主細胞によって発現されたＮＯＧＯレセプター２ポリペプチド。
11. 以下：
    （ａ）配列番号２のアミノ酸３１〜３１０からなるポリペプチドに対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号２のアミノ酸３１〜３１０；
    （ｃ）配列番号２のアミノ酸１〜３１０からなるポリペプチドに対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；
    （ｄ）配列番号２のアミノ酸１〜３１０；
    （ｅ）配列番号２のアミノ酸３１〜３９５からなるポリペプチドに対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；
    （ｆ）配列番号２のアミノ酸３１〜３９５；
    （ｇ）配列番号２のアミノ酸１〜３９５からなるポリペプチドに対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；
    （ｈ）配列番号２のアミノ酸１〜３９５；
    （ｉ）配列番号２のアミノ酸３１〜３１０からなるポリペプチドについて、該アミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に５つ以下のアミノ酸が付加された、アミノ酸配列；ならびに、
    （ｊ）配列番号２のアミノ酸３１〜３９５からなるポリペプチドについて、該アミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に５つ以下のアミノ酸が付加された、アミノ酸配列；
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドは、ＣＮＳニューロンの軸索成長の阻害を減少させる、ポリペプチド。
12. 以下：
    （ａ）配列番号２のアミノ酸１〜４２０に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；および
    （ｂ）配列番号２のアミノ酸３１〜４２０に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドは、ＣＮＳニューロンの軸索成長の阻害を減少させる、ポリペプチド。
13. 請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、異種ポリペプチドをさらに含む、ポリペプチド。
14. 請求項１３に記載のポリペプチドであって、前記異種ポリペプチドが、Ｆｃ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）からなる群から選択される、ポリペプチド。
15. 請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
16. ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群から選択される、請求項１５に記載の単離された抗体またはそのフラグメント。
17. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項７に記載のベクター、あるいは、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、ＣＮＳニューロンの軸索成長の阻害を減少させるための組成物。
18. 請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチドと、ニューロンを接触させる工程を包含する、ＣＮＳニューロンの軸索成長の阻害を減少させる、インビトロでの方法。

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