EA008253B1 - Антагонисты nogo-рецептора - Google Patents

Abstract

Описаны иммуногенные полипептиды Nogo-рецептора-1, антитела против Nogo-рецептора-1, их антигенсвязывающие фрагменты, растворимые Nogo-рецепторы и их слитые белки и нуклеиновые кислоты, кодирующие их. Описаны также композиции, содержащие такие антитела против Nogo-рецептора, их антигенсвязывающие фрагменты, растворимые Nogo-рецепторы и их слитые белки и кодирующие их нуклеиновые кислоты, а также способы их получения и применения.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к нейробиологии и молекулярной биологии. Более конкретно, данное изобретение относится к иммуногенным полипептидам Ходо-рецептора-1, антителам Ыодо-рецептора-1, их антигенсвязывающим фрагментам, растворимым Ходо-рецепторам и их слитым белкам и нуклеиновым кислотам, кодирующим их. Данное изобретение дополнительно относится к композициям, содержащим такие антитела Ходо-рецептора, их антигенсвязывающие фрагменты, иммуногенные полипептиды Ходо-рецептора-1, растворимые Ходо-рецепторы и их слитые белки и нуклеиновые кислоты, кодирующие их, и способам получения и применения таких антител Ходо-рецептора, их антигенсвязывающих фрагментов, иммуногенных полипептидов Ходо-рецептора-1, растворимых Ходо-рецепторов и их слитых белков и нуклеиновых кислот, кодирующих их.

Уровень техники

Аксоны и дендриты нейронов являются длинными клеточными отростками нейронов. Дистальный кончик простирающегося аксона или нейрита содержит специализированный район, известный как конус роста. Конус роста ощущает локальную среду и направляет рост аксона в направлении клетки-мишени нейрона. Конус роста отвечает на некоторые сигналы окружающей среды, например адгезионную способность поверхности, факторы роста, нейротрансмиттеры и электрические поля. Направление роста в конусе роста включает в себя различные классы молекул адгезии, межклеточные сигналы, а также факторы, которые стимулируют и ингибируют конусы роста. Конус роста растущего нейрита продвигается с различными скоростями, но обычно со скоростью 1-2 мм в день.

Конусы роста имеют форму руки, с широким плоским расширением (микровыступы или филоподии), которые дифференциально прикрепляются к поверхностям в эмбрионе. Эти филоподии являются постоянно активными, некоторые филоподии втягиваются обратно в конус роста, тогда как другие продолжают удлиняться через субстрат. Удлинения между различными филоподиями образуют ламеллоподии.

Конус роста исследует зону, которая находится перед ним и на каждой его стороне, при помощи его ламеллоподий и филоподий. Когда удлинение контактирует с поверхностью, которая является неблагоприятной для роста, он отступает. Когда удлинение контактирует с благоприятной поверхностью роста, оно продолжает удлиняться и ведет конус роста в этом направлении. Конус роста может направляться посредством небольших вариаций в свойствах поверхности субстратов. Когда конус роста достигает подходящей клетки-мишени, создается синаптическое соединение.

На функцию нервной клетки сильно влияет контакт между нейроном и другими клетками в его непосредственном окружении (и. КибзИаизег, Т.М. 1е88е11, РйузюБ Кеу. 1988, 68, р. 819). Эти клетки включают в себя специализированные глиальные клетки, олигодендроциты в центральной нервной системе (ЦНС) и клетки Шванна в периферической нервной системе (ПНС), которые окутывают аксон нейрона миелином (изолирующей структурой многослойных мембран) (6. Ьешке, ίη Ап 1п!тобис!юп !о Мо1еси1аг ХеигоЬю1оду, Ζ. На11, Еб. [Бшаиет, 8ипбет1апб, Мазз., 1992], р. 281).

Хотя нейроны ЦНС способны регенерироваться после повреждения, они при этом ингибируются вследствие присутствия ингибиторных белков, присутствующих в миелине, и, возможно, также другими типами молекул, обычно обнаруживаемыми в их локальном окружении (Втйбз апб Иападап, Хеигоп 2001, 30, рр. 11-14; 1опез е! а1., I. Хеигозск 2002, 22, рр. 2792-2803; Спшре е! а1., I. Хеитозск 2002, 22, рр. 3144-3160).

Несколько ингибиторных белков миелина, которые были обнаружены на олигодендроцитах, были охарактеризованы, например ХодоА (Сйеп е! а1., Ха!ите, 2000, 403, 434-439; бгапбрге е! а1., Ха!ите 2000, 403, 439-444), миелин-ассоциированный гликопротеин (МАб, МсКеттасйет е! а1., Хеигоп 1994, 13, 805811; Микйорабйуау е! а1., Хеигоп 1994, 13, 757-767) и гликопротеин олигодендроцитов (ОМ-др. М1ко1 апб 8!е£апззоп, 1. Се11. Вю1. 1988, 106, 1273-1279). Было отдельно показано, что каждый из этих белков является лигандом для нейронного Ходо-рецептора-1 (№апд е! а1., №11иге 2002, 417, 941-944; Ьш е! а1., 8с1епсе, 2002, 297, 1190-93); бгапбрге е! а1., Ха!ите 2000, 403, 439-444; Сйеп е! а1., ХаШте, 2000, 403, 434439; Эошешсош е! а1., Хеигоп, 2002, 35, 283-90).

Ходо-рецептор-1 является бР1-заякоренным мембранным белком, который содержит 8 богатых лейцином повторов (Еоитшет е! а1., №1!иге 2001, 409, 341-346). После взаимодействия с ингибиторным белком (например, ХодоА, Мад и ОМ-др) комплекс Ходо-рецептора-1 трансдуцирует сигналы, которые приводят к коллапсу конуса роста и ингибированию выроста нейритов.

Существует настоятельная потребность в молекулах, которые ингибируют связывание Ходо-рецептора-1 с его лигандами и ослабляют опосредуемый миелином коллапс конуса роста и ингибирование выроста нейритов.

Сущность изобретения

Данное изобретение относится к растворимым полипептидам Ходо-рецептора-1 и слитым белкам, содержащим их, и к антителам и их антигенным фрагментам, направленным против специфических иммуногенных районов Ходо-рецептора-1. Данное изобретение относится также к иммуногенным полипептидам Ходо-рецептора-1, которые связываются с антителами данного изобретения. Данное изобретение относится также к полипептидам Ходо-рецептора-1, которые связываются с моноклональным антителом, которое связывается с Ходо-рецептором-1. Такие полипептиды могут быть использованы, т!ет аПа, в

- 1 008253 качестве иммуногенов или для скрининга антител для идентификации антител со сходной специфичностью относительно антитела данного изобретения. Данное изобретение относится дополнительно к нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептиды данного изобретения, векторам и клеткам-хозяевам, содержащим такие нуклеиновые кислоты, и способам получения этих пептидов. Эти антитела, растворимые рецепторы и слитые с рецептором белки данного изобретения противодействуют Ыодо-рецептору-1 или блокируют его и применимы для ингибирования связывания Ыодо-рецептора-1 с его лигандами, ингибирования коллапса конуса роста в нейроне и уменьшения ингибирования выроста нейритов или разрастания в нейроне.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает полипептид, выбранный из группы, состоящей из ЛЛЛЕТбЕТЕЕЕОЕЭЕ^ЭХЛОЕН (8ЕС) ΙΌ N0: 26); ЕОЕГОХЛОЕН (8ЕС) ΙΌ N0: 27); Р1)Р81)1)АЕРР (8ЕС) ΙΌ N0: 29); ЕЭЕА^ЭХАОЕН (8ЕС) ΙΌ N0: 30); РЭРА8ЭЭАЕРР (8ЕС) ΙΌ N0: 31); ьпльжтрьк. (8ЕС) ΙΌ N0: 32); Р1)АР81)1)АЕРР (8ЕС) ΙΌ N0: 33); Е1)Е^1)\АС)ЕН (8ЕС) ΙΌ N0: 34); РЭР88ЭЕАЕРР (8 ЕС) ΙΌ N0: 35); 1)\АС)ЕН\\'1)РТТ (8 ЕС) ΙΌ N0: 36); ЭХЛОЕН (8 ЕС) ΙΌ N0: 37); А1)Е81)ХАС)ЕН\\'1)РТГ (8ЕС) ΙΌ N0: 41); ^Α^8^NΑ^^Β\^ΡΤΤ (8ЕС) ΙΌ N0: 42); ^^^8^NΑΑ^ΒVV^ΡΤΤ (8ЕС) ΙΌ N0: 43); ^^^8^NΑ^^ΗVV^ΡТТ (8ЕС) ΙΌ N0: 44) и ^^^8^NΑ^^ΑVV^ΡТТ (8ЕС) ΙΌ N0: 45).

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид данного изобретения. В некоторых вариантах осуществления эта нуклеиновая кислота функционально связана с регуляторной последовательностью экспрессии. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает вектор, содержащий нуклеиновую кислоту данного изобретения.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает клетку-хозяина, содержащую нуклеиновую кислоту или содержащую вектор данного изобретения. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ получения полипептида данного изобретения, предусматривающий культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту или вектор данного изобретения, и извлечение этого полипептида из клетки-хозяина или культуральной среды.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ получения антитела, предусматривающий стадии иммунизации хозяина полипептидом данного изобретения или клеткойхозяином, содержащей нуклеиновую кислоту или содержащей вектор данного изобретения, и выделение этого антитела. Данное изобретение обеспечивает также антитело, получаемое по этому способу, или его антигенсвязывающий фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с полипептидом данного изобретения, где это антитело не является моноклональным антителом, продуцируемым гибридомной клеточной линией НВ 7Е11 (АТСС® ассеззюи Ыо. РТА-4587).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения это антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (а) ингибирует коллапс конуса роста нейрона; (Ь) уменьшает ингибирование выроста и разрастание нейритов в нейроне; и (с) ингибирует связывания ^до-рецептораИ с лигандом. В некоторых вариантах осуществления вырост и разрастание нейритов являются аксонным ростом. В некоторых вариантах осуществления этот нейрон является нейроном центральной нервной системы.

В некоторых вариантах осуществления антитело данного изобретения является моноклональным. В некоторых вариантах осуществления антитело данного изобретения является мышиным антителом. В некоторых вариантах осуществления антитело данного изобретения выбрано из группы, состоящей из гуманизированного антитела, химерного антитела и одноцепочечного антитела.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ ингибирования связывания ^до-рецептораИ с лигандом, предусматривающий стадию контактирования №дорецептора-1 с антителом данного изобретения или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления этот лиганд выбран из группы, состоящей из №доА, №доВ, №доС, МАС и 0М-др.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ ингибирования коллапса конуса роста в нейроне, предусматривающий стадию контактирования нейрона с антителом данного изобретения или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ уменьшения ингибирования выроста или разрастания нейритов в нейроне, предусматривающий стадию контактирования этого нейрона с антителом данного изобретения или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления вырост или разрастание нейритов является аксонным ростом. В некоторых вариантах осуществления этот нейрон является нейроном центральной нервной системы.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает композицию, содержащую фармацевтически приемлемый носитель и антитело данного изобретения или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления эта композиция содержит дополнительно один или несколько дополнительных терапевтических агентов.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ стимуляции выживания нейрона в случае риска умирания, предусматривающий контактирование этого нейрона с эф

- 2 008253 фективным количеством антитела против Ыодо-рецептора-1 данного изобретения или его антигенсвязывающего фрагмента. В некоторых вариантах осуществления этот нейрон находится ίη νίΐτο. В некоторых вариантах осуществления этот нейрон находится в млекопитающем. В некоторых вариантах осуществления это млекопитающее проявляет признаки или симптомы рассеянного склероза, болезни Гентингтона, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, диабетической невропатии, инсульта, травматических повреждений головного мозга или повреждения спинного мозга.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ стимуляции выживания нейрона в млекопитающем, нейрон которого находится при риске умирания, предусматривающий (а) обеспечение культивируемой клетки-хозяина, экспрессирующей антитело против Ыодо-рецептора-1 данного изобретения или его антигенсвязывающий фрагмент; и (Ь) введение этой клетки-хозяина в это млекопитающее в месте или вблизи от местоположения этого нейрона.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ генотерапии стимуляции выживания нейрона при риске умирания, причем нейрон находится в млекопитающем, предусматривающий введение в месте или вблизи места этого нейрона вирусного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, которая кодирует антитело против Ыодо-рецептора-1 данного изобретения или его антигенсвязывающий фрагмент, где это антитело против Ыодо-рецептора-1 или антигенсвязывающий фрагмент экспрессируется из этой нуклеотидной последовательности в млекопитающем в количестве, достаточном для стимуляции выживания этого нейрона.

Краткое описание графического материала

Фиг. 1 является схематическим представлением структуры Ыодо-рецептора-1. §№доВ310 человека содержит остатки 26-310, а §№доВ344 содержит остатки 26-344. кЫодоКЗ 10 крысы содержит остатки 27310, а 8ЫодоК344 содержит остатки 27-344.

Фиг. 2 изображает график антигенности для белка Модо-рецептора-1 с использованием программного обеспечения УссЮг ΝΤί™. Р-617 крысы является ЗЕО ГО N0: 10, а Р-618 крысы является ЗЕО ГО N0: 11. Р-617 человека является ЗЕО ГО N0: 47, а Р-618 человека является ЗЕО ГО N0: 48.

Фиг. 3А является графиком, изображающим активность связывания антитела против №§о-рсцсптора-1, 7Е11. Этот график представляет действие концентрации 7Е11 на связывание №§о66 с №§о-рецептором-1.

Фиг. 3В изображает активность связывания антитела против №§о-рецептора-Е 1Н2. Этот график представляет действие концентрации 1Н2 на связывание №§о66 с 5№§оВ344-Ес (также называемым здесь и в заявке на патент Соединенных Штатов 60/402866 Ес-5№доВ344 или 1д-§№доВ344). Рс-МАС не конкурировал с №§о66 за связывание с 5№§оВ344-Ес.

Фиг. 4 изображает результаты ЕЫБА для антител против №до-Р-1 1Н2, 3С5 и 2Е7. Определяли действие этих антител на 0И₄₅₀ в присутствии иммобилизованных антигенов. Иммобилизованными антигенами были 5№доР310-Ес (также называемый здесь и в заявке на патент Соединенных Штатов 60/402866 Ес-5№доР310 или 1д-§№доВ310), 5№доР344-Ес. р-617, р-618, р-4, р-5 или овальбумин и БСА.

Фиг. 5 является диаграммой, изображающей действия моноклонального антитела, 7Е11, на вырост ИВС-нейритов крысы в присутствии варьирующихся количеств миелина.

Фиг. 6А является диаграммой, изображающей действие связывания 5№§оВ310 с ¹²⁵1-№одо66 и ¹²⁵1№§о40 в присутствии следующих конкурентов: №§о66, №§о40 и супернатанта моноклонального антитела против №§о-рецептора-1.

Фиг. 6В изображает активность связывания ^|251-№до66 с §№доВ310.

Фиг. 7 является графиком, изображающим действие 5№доВ310-Ес на связывание ¹²⁵1-№до40 с 5№доР310.

Фиг. 8 является графиком, изображающим активность связывания 5№доВ310-Ес с ¹²⁵1-№до40.

Фиг. 9А является диаграммой действия 5№§оВ310 на вырост нейритов на клетку в присутствии или в отсутствие миелина.

Фиг. 9В является диаграммой действия 5№§оВ310 на вырост нейритов в присутствии или в отсутствие миелина.

Фиг. 10А является графиком, изображающим действие 5№§оВ310-Ес на вырост ИВС-нейритов крысы Р4 в присутствии или в отсутствие увеличивающихся количеств миелина.

Фиг. 10В изображает количество нейритов на клетку после обработки ЗФР, ЗФР + 8№доВ310-Ес, 20 нг миелина и миелина + 5№доК.310-Ес.

Фиг. 11 является графиком, изображающим действие моноклонального антитела 5В10 на вырост ИВС-нейритов на клетку в присутствии увеличивающихся количеств миелина.

Фиг. 12 является графиком, изображающим действие 5№§оВ310-Ес на ВВВ-оценку до 30 дней после индукции повреждения в модели поперечного разреза спинного мозга крысы.

Фиг. 13А и 13В сообщают опорно-двигательную ВВВ-оценку как функцию времени после дорсального одностороннего разреза в мышах ХУТ (дикого типа) или трансгенных мышах из Линии 08 или Линии 01.

Фиг. 13С изображает график максимального переносимого угла наклоненной плоскости как функции времени после повреждания для мышей УТ и трансгенных мышей.

- 3 008253

Фиг. 13Ό показывает рассогласования (ошибки) задних конечностей во время карабкания по наклоненной решетке как функции времени после повреждения. Во всех этих графиках сообщается среднее ±8.е.ш. (стандартная ошибка среднего) из 7-9 мышей в каждой группе. Эти величины из трансгенных мышей являются статистически отличающимися от величин мышей \УТ (двойные звездочки, Р<0,01; Iкритерий Стьюдента).

Фиг. 14А показывает опорно-двигательную ВВВ-оценку как функцию времени после дорсального одностороннего разреза в обработанных носителем или 5Νο§οΚ.310-Ре животных.

Фиг. 14В показывает рассогласования (ошибки) задних конечностей во время хождения по решетке как функцию времени после повреждения.

Фиг. 14С показывает анализ следов (отпечатков стоп), обнаруживающий более короткую длину шага и большую ширину шага в контрольных мышах в сравнении с неповрежденными или поврежденными + 5ΝοβθΡ310-Ρο крысами. Во всех этих графиках сообщается среднее ±8.е.ш. (стандартная ошибка среднего) из 7-9 мышей в каждой группе. Величины группы 5Νο§οΚ.310-Рс являются статистически отличающимися от контроля (фиг. 14А-В). Контрольные величины являются статистически отличающимися от варианта без 8С1 или 8С1 + кИодоЮЮ-Рс на фиг. 14С (звездочка, р<0,05; двойные звездочки, р<0,01; ΐ-критерий Стьюдента).

Подробное описание изобретения

Определения и общие способы

Если нет других указаний, все используемые здесь технические и научные термины имеют то же значение, которое понимается специалистом с обычной квалификацией в области, к которой относится данное изобретение. В случае противоречия, следует руководствоваться определениями, включенными в данную заявку. Кроме того, если контекст не требует другого понимания, термины, используемые в единственном числе, будут включать в себя множественное число, а термины, используемые во множественном числе, будут включать в себя единственное число. Все публикации, патенты и другие ссылки, упоминаемые здесь, включены в качестве ссылки в их полном виде для всех целей.

Хотя способы и материалы, сходные или эквивалентные со способами и материалами, описанными здесь, могут быть использованы в практике или испытании данного изобретения, ниже описаны подходящие способы и материалы. Эти материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для того, чтобы быть ограничивающими. Другие признаки и преимущества данного изобретения будут очевидными из данного подробного описания и из формулы изобретения.

Во всем этом описании и в формуле изобретения слово содержат или вариации этого слова, такие как содержит или содержащий, должны пониматься как включение указанного целого числа или группы целых чисел, но не исключение любого другого целого числа или любой другой группы целых чисел.

Для дополнительного определения данного изобретения здесь обеспечены следующие термины и определения.

В данном контексте антитело обозначает интактный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент. Антитела данного изобретения могут быть антителами любого изотипа или класса (например, М, Ό, О, Е и А) или любого подкласса (например, 01-4, А1-2) и могут иметь легкую цепь либо каппа (к), либо лямбда (λ).

В данном контексте Рс обозначает часть константной области тяжелой цепи антитела, которая может быть получена расщеплением папаином.

В данном контексте слитый белок Νο§οΚ. обозначает белок, содержащий часть растворимого Ыодо-рецептора-1, слитую с гетерологичным полипептидом.

В данном контексте гуманизированное антитело обозначает антитело, в котором по меньшей мере часть последовательностей не человека заменена последовательностями человека. Примеры того, каким образом могут быть получены гуманизированные антитела, могут быть найдены в патентах США 6054297,5886152 и 5877293.

В данном контексте химерное антитело обозначает антитело, которое содержит один или более районов из первого антитела и один или более районов из по меньшей мере одного другого антитела. Первое антитело и эти дополнительные антитела могут быть из одного и того же источника или из различных источников.

В данном контексте и в заявке на патент Соединенных Штатов 60/402866 Ыодо-рецептор, №§оК.. ЫодоК-1, Ν§Κ и Ν§Κ-1, каждый, обозначают Ыодо-рецептор-1.

Полипептиды Ыодо-рецептора-1

В одном аспекте данное изобретение относится к полипептидам Ыодо-рецептора-1, которые являются иммуногенными. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения этот иммуногенный полипептид состоит, по существу, из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: ΕΌΕδΌΝΑΟΕΚ.ννθΡΤΤ (крысы) (δΕΟ ГО ΝΟ: 1); ΕΌΕδΌΝΑΟΕΚδνΌΡΑΤ (человека) (8Е0 ГО ΝΟ: 2); ΑνΑδΟιΙΨΗΙΨΟΤΧΟΙ.ΊΌΕΕΙ.Ι.ΡιΙ.ΡΚίϊΌΡΙΐΑΑΙΐΚΑ (крысы) (8Е0 ГО ΝΟ: 3); Α\3ΑΤ(.ιΡΥ1 ΙΡΙΑ'ΤΕιΡΑΤΙΐΕΕΡΕΕιΕΡΚίϊΌΡΙΑΑΑΙΐΚΑ (человека) (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 4) и СΚ^О^ΑОδОΑ (мыши) (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 5).

- 4 008253

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к полипептидам Ыодо-рецептора-1, которые связываются моноклональным антителом, связывающимся с Модо-рецептором-1. В некоторых вариантах осуществления этот полипептид узнается моноклональным антителом 7Е11. В некоторых вариантах осуществления этот полипептид выбран из группы, состоящей из: ΕΌΕδΌΝΆρΕΚ (8ЕЦ ГО N0: 27); ЬОЕ8ООАЕЬК (8ЕС) ГО N0: 29); Е1)ЕА81)А'АС)ЕР (8ЕС) ΙΌ N0: 30); Е1)РА81)1)АЕЕР (8ЕС) ΙΌ N0: 31); Е1)АЕ81)А'АС)ЕР (8ЕС) ΙΌ N0: 32); Е1)АР81)1)АЕЕР (8ЕС) ΙΌ N0: 33); ^^^88^NΑ^^К (8ЕС) ΙΌ N0: 34); ЬОЕ88ОЕАЕЬК (8 ЕС) ΙΌ N0: 35); 1№АС)ЕР\АОРТТ (8 ЕС) ΙΌ N0: 36); ПА'АОЕР (8 ЕС) ΙΌ N0: 37); А1)Е81)А'АС)ЕР\А!)РТГ (8ЕС) ΙΌ N0: 41); ЕАЕ81)А'АС)ЕР\АОРТТ (8ЕС) ΙΌ N0: 42); Е1)Е81)А'ААЕР\А!)РТГ (8ЕС) ΙΌ N0: 43), Е1)Е81)А'АС)РН\АОРТТ (8ЕС) ΙΌ N0: 44) и Е1)Е81)А'АС)РА\\'1)РТТ (8ЕС) ГО N0: 45).

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид 8ЕЦ ΙΌ N0: 1-5, 26-27, 29-37 и 41-45. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения эта молекула нуклеиновой кислоты связана с регуляторной последовательностью экспрессии (например, рС^NΑ(I)).

Данное изобретение относится также к вектору, содержащему нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид данного изобретения. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения этот вектор является клонирующим вектором. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения этот вектор является экспрессирующим вектором. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения этот вектор содержит по меньшей мере один селектируемый маркер.

Данное изобретение относится также к клеткам-хозяевам, содержащим вышеописанные нуклеиновую кислоту или вектор.

Данное изобретение относится также к способу получения иммуногенного полипептида данного изобретения, предусматривающему стадию культивирования клетки-хозяина. В некоторых вариантах осуществления эта клетка-хозяин является прокариотической. В некоторых вариантах осуществления эта клетка-хозяин является эукариотической. В некоторых вариантах осуществления эта клетка-хозяин является клеткой дрожжей.

Антитела

Далее, данное изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфически связывают полипептид №§о-рецептора-1 данного изобретения. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывают полипептид, состоящий, по существу, из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0: 1-5, 26-27, 29-37 и 41-45. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент данного изобретения могут продуцироваться ίη νί\Ό или ίη νίΙΐΌ. Получение антитела или антигенсвязывающего фрагмента обсуждается ниже.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент данного изобретения ингибирует связывание №§о-рецептора-1 с лигандом (например, №доА, №доВ, №доС, МАО, 0М-др) и уменьшает опосредованное миелином ингибирование выроста и разрастания нейритов, в частности аксонный рост, и ослабляет опосредуемый миелином коллапс конуса роста.

В некоторых вариантах осуществления антитело против №§о-рецептора-1 или его антигенсвязывающий фрагмент является мышиным. В некоторых вариантах осуществления №§о-рецептор-1 является рецептором из крысы. В других вариантах осуществления №§о-рецептор-1 является рецептором из человека. В некоторых вариантах осуществления антитело против №§о-рецептора-1 или его антигенсвязывающий фрагмент является рекомбинантным, генно-инженерным, гуманизированным и/или химерным.

В некоторых вариантах осуществления антитело выбрано из группы, состоящей из: моноклонального 7Е11 (АТСС® ассеззюп №. РТА-4587); моноклонального 1Н2 (АТСС® ассеззюп №. РТА-4587); моноклонального 2Е7 (АТСС® ассеззюп №. РТА-4585); моноклонального 3О5 (АТСС® ассеззюп №. РТА-4586) и моноклонального 5В10 (АТСС® ассеззюп №. РТА-4588). В некоторых вариантах осуществления антитело является поликлональным антителом 46.

Примерами антигенсвязывающих фрагментов являются ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')₂, Εν, Ей, йАЬ и фрагменты, содержащие фрагменты определяющего комплементарность района (СОК), одноцепочечные антитела №Εν), химерные антитела, диатела и полипептиды, которые содержат по меньшей мере часть иммуноглобулина, которая является достаточной для придания связывания специфического антигена этому полипептиду (например, иммуноадгезины).

В данном контексте, Ей обозначает фрагмент, который состоит из Ун- и Сщ-доменов; Εν обозначает фрагмент, который состоит из \_ъ- и \_н-доменов одного плеча антитела; и йАЬ обозначает фрагмент, который состоит из \_н-домена (\агй е! а1., №!иге 341:544-546, 1989). В данном контексте, одноцепочечное антитело №Εν) обозначает антитело, в котором \_ъ-район и \_н-район являются спаренными с образованием моновалентных молекул через синтетический линкер, который позволяет получать их в виде единой белковой цепи (Вий е! а1., 8с1епсе 242:423-426, 1988 и ИиЧоп е! а1., Ргос. №11. Асай. 8с1. И8А 85:5879-5883, 1988). В данном контексте, диатело обозначает биспецифическое антитело, в котором \_ни \_ъ-домены экспрессируются на единой полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким для создания возможности спаривания между этими двумя доменами на одной и той же цепи, что заставляет эти домены спариваться с комплементарными доменами другой це

- 5 008253 пи и создавать два антигенсвязывающих сайта (см., например, НоШдег, Р., еБ а1., Ргос. Νη11. Асаб. БсБ. ИБА 90:6444-6448, 1993 и РоЩак, КД. е! а1., 8Бгис1иге 2:1121-1123, 1994). В данном контексте иммуноадгезин, который специфически связывается с представляющим интерес антигеном, обозначает молекулу, в которой могут быть включены один или несколько СЭР. либо ковалентно, либо нековалентно.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает полипептид субъединицы антитела №§о-рецептора-1 данного изобретения, где этот полипептид субъединицы выбран из группы, состоящей из (а) тяжелой цепи или ее вариабельного района; и (Ь) легкой цепи или ее вариабельного района.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь или ее вариабельный район или легкую цепь или ее вариабельный район полипептида субъединицы антитела №§о-рецептора-1 данного изобретения.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает гипервариабельный район (СОК) антитела №§о-рецептора-1 данного изобретения или нуклеиновую кислоту, кодирующую СЭР.

Иммунизация

Антитела данного изобретения могут быть получены иммунизацией подходящего хозяина (например, позвоночных, в том числе людей, мышей, крыс, овец, коз, свиней, крупного рогатого скота, лошадей, пресмыкающихся, рыб, земноводных и яиц птиц, пресмыкающихся и рыб). Такие антитела могут быть поликлональными или моноклональными.

В некоторых вариантах осуществления этого хозяина иммунизируют иммуногенным полипептидом №§о-рецептора-1 данного изобретения. В других вариантах осуществления этого хозяина иммунизируют Шдо-рецептором-к ассоциированным с клеточной мембраной интактной или разрушенной клетки и антитела данного изобретения идентифицируют по связыванию с полипептидом №§о-рецептора-1 данного изобретения.

В некоторых вариантах осуществления антиген №§о-рецептора-1 вводят с адъювантом для стимуляции иммунной реакции. Адъюванты часто требуется вводить, наряду с антигеном, для индукции иммунной реакции на этот антиген. Эти адъюванты являются обычно нерастворимыми или недеградируемыми веществами, которые стимулируют неспецифическое воспаление с рекрутингом мононуклеарных фагоцитов в участке иммунизации. Примеры адъювантов включают в себя, но не ограничиваются ими, адъювант Фрейнда, К1В1 (мурамилдипептиды), 1БСОМ (иммуностимулирующие комплексы) или их фрагменты.

В отношении обзора способов получения антител, см., например, Наг1о\у апб Ьапе (1988), АпББЬобБек: А ЬаЬогаБогу Мапиа1, УеИоп, Ό.Ε. е! а1. (1981); Апп. Кет. о£ ВБосйеш., 50, рр. 657-80, и АикиЬе1 е! а1. (1989); Сиггеп! Рго!осок Бп Мо1еси1аг ВБо1оду (Νο\ν Уогк: Бойл ^Б1еу апб Бопк). Определение иммунореактивности с иммуногенным полипептидом №§о-рецептора-1 данного изобретения может быть выполнено любым из нескольких способов, хорошо известных в данной области, в том числе, например, иммуноблот-анализом и ЕЫБА.

Получение антител и продуцирующие антитела клеточные линии

Моноклональные антитела данного изобретения могут быть получены стандартными процедурами, описанными, например, в Наг1ол апб Ьапе (1988), кирга.

Вкратце, в подходящий период времени животное умерщвляют и клетки лимфатического узла и/или В-клетки селезенки иммортализуют любым из нескольких способов, которые хорошо известны в данной области, в том числе, но не только, трансформацией, например, с использованием ЕВУ или слиянием с иммортализованной клеточной линией, такой как клетки миеломы. После этого клетки клонально разделяют и супернатанты каждого клона испытывают на продуцирование антитела, специфического в отношении иммуногенного полипептида №§о-рецептора-1 данного изобретения. Способы отбора, клонирования и размножения гибридом хорошо известны в данной области. Подобным образом, способы идентификации нуклеотидной и аминокислотной последовательности генов иммуноглобулинов известны в данной области.

Другие подходящие способы получения антитела данного изобретения включают в себя подвергание Бп уБ!го лимфоцитов действию №§о-рецептора-1 или иммуногенного полипептида данного изобретения или, альтернативно, отбор библиотек антител в фаговых или подобных им векторах. См. Нике е! а1., БсБепсе, 246, рр. 1275-81 (1989). Антитела, применимые в данном изобретении, могут быть использованы с модификацией или без модификации.

Антигены (в этом случае №§о-рецептор-1 или иммуногенный полипептид данного изобретения) и антитела могут быть помечены ковалентным или нековалентным присоединением вещества, которое обеспечивает детектируемый сигнал. В данной области известны различные метки и способы конъюгации, и они могут быть использованы в практике данного изобретения. Подходящие метки включают в себя, но не ограничиваются ими, радионуклеотиды, ферменты, хемилюминесцентные агенты, магнитные частицы и т.п. Патенты, описывающие применение таких меток, включают в себя патенты США 3817837; 3850752; 3939350; 3996345; 4277437; 4275149 и 4366241. Могут быть получены также рекомбинантные иммуноглобулины (см. патент США 4816567).

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело имеет множественные спе

- 6 008253 цифичности связывания, например бифункциональное антитело, полученное любым из ряда способов, известных специалистам с квалификацией в данной области, в том числе включающих в себя получение гибридных гибридом, дисульфидный обмен, химическое перкрестное сшивание, присоединение пептидных линкеров между двумя моноклональными антителами, введение двух наборов тяжелых и легких цепей иммуноглобулина в конкретную клеточную линию и т.д. (см. ниже в отношении более подробного обсуждения).

Антитела данного изобретения могут быть также моноклональными антителами человека, например моноклональными антителами, которые продуцируются иммортализованными клетками человека, мышами 8СШ-йи или другими животными (не человеком), способными продуцировать антитела человека.

Библиотеки фагового дисплея

Антитела против Ыодо-рецептора-1 данного изобретения могут быть выделены скринингом рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител. Примером комбинаторных библиотек для связывания с иммуногенным полипептидом Ыодо-рецептора-1 данного изобретения является, например, библиотека фагового дисплея ксРу, полученная с использованием У_ь- и У_н-кДНК, полученных из мРНК, происходящей из животного, иммунизированного иммуногенным полипептидом Ыодо-рецептора-1 данного изобретения. Методологии получения и скрининга таких библиотек известны в данной области. Имеются коммерчески доступные способы и материалы для генерирования библиотек фагового дисплея (например, РйагтаЫа ВесотЬтап! Рйаде АпйЬойу 8ук!ет, са!а1од по. 27-9400-01; набор для фагового дисплея 8йа!адепе ЗшХАР™, са!а1од по. 240612 и др. из Могрйо8ук). Имеются также другие способы и реагенты, которые могут быть использованы в генерировании и скрининге библиотек дисплея антител (см., например, Ьайпег е! а1., И.8. Ра!. Ио. 5213409; Капд е! а1., РСТ РиЫюайоп Ыо. νθ 92/18619; Ио^ег е! а1., РСТ РиЫюайоп Ыо. νθ 91/17271; \Уш1ег е! а1., РСТ РиЫюайоп Ыо. νθ 92/20791; Магк1апй е! а1. РСТ РиЫюайоп Ыо. νθ 92/15679; Вгеййпд е! а1. РСТ РиЫюайоп Ыо. νθ 93/01288; МсСаГГеПу е! а1. РСТ РиЫюайоп Ыо. νθ 92/01047; Оаггагй е! а1. РСТ РиЫюайоп Ыо. νθ 92/09690; РисЫ е! а1. (1991) Вю/Тескпо1о§у 9:1370-1372; Нау е! а1. (1992) Нит. АпйЬой. нуЬййотак 3:81-85; Нике е! а1. (1989) 8Ыепсе 246:1275-1281; МсСаГГег!у е! а1., Ыа!иге (1990) 348:552-554; Опйййк е! а1. (1993) ЕМВО I. 12:725-734; Паиктк е! а1. (1992) I. Мо1. Вю1. 226:889-896; С1асккоп е! а1. (1991) Ыа!иге 352:624-628; Стат е! а1. (1992) Ргос. Ыа!1. Асай. 8сг И8А 89:3576-3580; Оатгай е! а1. (1991) Вю/Тесйпо1о§у 9:1373-1377; НоодепЬоот е! а1. (1991) Ыис1. АЫйк Кек. 19:4133-4137 и ВагЬак е! а1. (1991) Ргос. Ыа!1. Асай. 8Ы. И8А 88:7978-7982.

После скрининга и выделения антитела против Ыодо-рецептора-1 данного изобретения из библиотеки дисплея рекомбинантных иммуноглобулинов нуклеиновая кислота, кодирующая выбранное антитело, может быть извлечена из упаковки-дисплея (например, из генома фага) и субклонирована в другие экспрессирующие векторы стандартными способами рекомбинантых ДНК. Если желательно, эта нуклеиновая кислота может быть подвергнута дополнительным манипуляциям для создания других форм антител данного изобретения, как описано ниже. Для экспрессии антитела, выделенного скринингом комбинаторной библиотеки, ДНК, кодирующую тяжелую цепь и легкую цепь этого антитела или их вариабельные области, клонируют в рекомбинантный экспрессирующий вектор и вводят в клетку-хозяина млекопитающего, как описано выше.

Переключение класса

Антитела против Ыодо-рецептора-1 данного изобретения могут быть антителами любого изотипа. Антитело любого желаемого изотипа может быть получено переключением класса. Для переключения класса нуклеиновые кислоты, кодирующие У_ъ или У_н, которые не включают в себя никаких нуклеотидных последовательностей, кодирующих Сь или С_н, выделяют с использованием способов, хорошо известных в данной области. Затем нуклеиновые кислоты, кодирующие Уь или У_н, функционально связывают с нуклеотидной последовательностью, кодирующей Сь или С_н, из желаемого класса молекулы иммуноглобулина. Это может быть достигнуто с использованием вектора или нуклеиновой кислоты, которая кодирует Сь- или С_н-цепь, как описано выше. Например, антитело против Ыодо-рецептора-1 данного изобретения, которое было первоначально 1дМ, переключают в 1дС. Далее, переключение класса может быть использовано для превращения одного подкласса 1дС в другой подкласс 1дС, например из 1дС1 в 1дС2.

Мутированные антитела

В других вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты данного изобретения могут быть мутированы в вариабельных доменах тяжелой и/или легкой цепей для изменения свойства связывания данного антитела. Например, мутация может быть произведена в одном или нескольких СИВ-районах для увеличения или уменьшения К_с антитела в отношении Ыодо-рецептора-1, для увеличения или уменьшения К_оГГ или для изменения специфичности связывания данного антитела. Способы сайт-направленного мутагенеза хорошо известны в данной области. См., например, 8атЬгоок е! а1. и АикиЬе1 е! а1., кирга. В предпочтительном варианте осуществления мутации получают в аминокислотном остатке, о котором известно, что он является измененным в сравнении с зародышевой линией в вариабельной области антитела против Ыодо-рецептора-1 данного изобретения. В некоторых вариантах осуществления мутации получают в одном или нескольких аминокислотных остатках, о которых известно, что они являются измененными в сравнении с зародышевой линией в вариабельной области антитела против Ыодо-рецептора-1 данного изобретения. В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота,

- 7 008253 кодирующая вариабельную область тяжелой цепи или легкой цепи, является мутированной в одном или нескольких каркасных районах. Мутация может быть произведена в каркасном районе или константном домене для увеличения времени полужизни. Мутация в каркасном районе или константном домене может быть также произведена для изменения иммуногенности антитела для обеспечения сайта для ковалентного или нековалентного связывания с другой молекулой или для изменения таких свойств, как фиксация комплемента. Мутации могут быть произведены в каждом из каркасных районов, константного домена и вариабельных областей в мутированном один раз антителе. Альтернативно, мутации могут быть произведены только в одном из каркасных районов, вариабельных областей или константного домена в мутированном один раз антителе.

Слитые антитела и иммуноадгезины

В другом варианте осуществления может быть произведено слитое антитело или иммуноадгезин, которое содержит все антитело против Ыодо-рецептора-1 данного изобретения или часть антитела против Ыодо-рецептора-1, связанные с другим полипептидом. В некоторых вариантах осуществления только вариабельная область антитела против Ыодо-рецептора-1 связана с этим полипептидом. В других вариантах осуществления У_н-домен антитела Ыодо-рецептора-1 данного изобретения связан с первым полипептидом, тогда как У_ь-домен этого антитела связан со вторым полипептидом, который связывается с первым полипептидом таким образом, что позволяет представляющим интерес У_н- и У_ь-доменам взаимодействовать друг с другом с образованием сайта связывания антитела. В других вариантах осуществления У_н-домен отделен от У_ь-домена линкером, который позволяет этим У_н- и У_ь-доменам взаимодействовать друг с другом (см. ниже в разделе Одноцепочечные антитела). Затем это У_н-линкер-У_ъантитело связывают с представляющим интерес полипептидом. Это слитое антитело применимо для направления полипептида в клетку или ткань, которая экспрессирует лиганд Ыодо-рецептора-1.

Представляющим интерес полипептидом может быть терапевтический агент, такой как токсин, или может быть диагностический агент, такой как фермент, который может быть визуализирован, такой как пероксидаза хрена. Кроме того, могут быть созданы слитые антитела, в которых два (или более) одноцепочечных антител связаны друг с другом. Это является полезным, если желательно создать двухвалентное или поливалентное антитело на единой полипептидной цепи или если желательно создать биспецифическое антитело.

Одноцепочечные антитела

Данное изобретение включает в себя одноцепочечное антитело (§сРу), которое связывает полипептид Ыодо-рецептора-1 данного изобретения. Для получения §сРу У_н- и У_ь-кодирующую ДНК функционально связывают с ДНК, кодирующей гибкий линкер, например, кодирующей аминокислотную последовательность (С1у₄-8ег)₃ (8ЕО ΙΌ N0: 10), так что У_н- и У_ь-последовательности могут экспрессироваться в виде непрерывного одноцепочечного белка с У_ь- и У_н-областями, соединенными этим гибким линкером (см., например, Впб е! а1. (1988) 8с1епсе 242:423-426, 1988; Инбоп е! а1. (1988) Ргос. №!1. Асаб. 8с1. И8А 85:5879-5883; МсСайеПу е! а1., №Шге (1990) 348:552-554). Одноцепочечное антитело может быть моновалентным, если используют только единственные У_н и У_ъ, бивалентным, если используют два У_н и У_ъ, или поливалентным, если используют более чем два У_н и У_ъ.

Химерные антитела

Данное изобретение включает в себя также биспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в котором одной специфичностью является специфичность в отношении полипептида №§о-рецептора-1 данного изобретения. В одном варианте осуществления может быть получено химерное антитело, которое специфически связывается с полипептидом №§о-рецептора-1 данного изобретения через один домен связывания и со второй молекулой через второй домен связывания. Это химерное антитело может быть получено рекомбинантными способами молекулярной биологии или может быть физически конъюгировано вместе. Кроме того, может быть получено одноцепочечное антитело, содержащее более чем один У_н и У_ь, которое связывается специфически с полипептидом данного изобретения и с другой молекулой, которая ассоциирована с аттенуированием опосредованного миелином коллапса конуса роста и ингибирования выроста и разрастания нейритов. Такие биспецифические антитела могут быть получены с использованием способов, которые хорошо известны, например, Рапдег е! а1., 1ттипо1. Ме11юб5 4: 72-81 (1994) и \Угщ111 апб Иагп5. кирга, и в связи с (ш) см., например, Тгаипескег е! а1., Ιη!. 1. Сапсег (8ирр;.) 7: 51-52 (1992).

В некоторых вариантах осуществления химерные антитела получают с использованием одного или нескольких вариабельных областей из антитела данного изобретения. В другом варианте осуществления химерное антитело получают с использованием одного или нескольких СЭЯ-районов из указанного антитела.

Дериватизованные и меченые антитела

Антитело или антигенсвязывающий фрагмент данного изобретения могут быть дериватизованы или связаны с другой молекулой (например, другим пептидом или белком). Обычно антитело или антигенсвязывающий фрагмент дериватизуют таким образом, что эта дериватизация или мечение не влияет негативным образом на полипептид данного изобретения. Например, антитело или часть антитела данного изобретения могут быть функционально связаны (химическим связыванием, генетическим слиянием, нековалентной ассоциацией или другим образом) с одной или несколькими другими молекулярными

- 8 008253 частицами, такими как другое антитело (например, биспецифическое антитело или диатело), детектируемый агент, цитотоксический агент, фармацевтический агент и/или белок или пептид, который может опосредовать ассоциацию этого антитела или антигенсвязывающего фрагмента с другой молекулой (такой, как внутренний район стрептавидина или полигистидиновая метка).

В некоторых вариантах осуществления дериватизованное антитело получают сшиванием двух или более антител (одного и того же типа или различных типов, например, для создания биспецифических антител). Подходящие сшивающие агенты включают в себя агенты, которые являются гетеробифункциональными, имеющими две различные реактивные группы, разделенные подходящим спейсером (например, сложным эфиром м-малеимидобензоил-Ы-гидроксисукцинимида) или гомобифункциональным спейсером (например, дисукцинимидилсубератом). Такие линкеры доступны из йегсе Сйеш1са1 Сотрапу, РоскГогб, III.

В некоторых вариантах осуществления это дериватизованное антитело является меченым антителом. Например, детектирующие агенты, которыми могут быть дериватизованы антитело или часть антитела данного изобретения, являются флуоресцентными соединениями, включающими в себя флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, 5-диметиламин-1-нафталинсульфонилхлорид, фикоэритрин, лантанидные (флуресцентные) фосфоры и т.п. Антитело может быть также помечено ферментами, которые применимы для детектирования, такими как пероксидаза хрена, β-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза, глюкозооксидаза и т. п. В вариантах, которые метят детектируемым ферментом, антитело детектируют добавлением дополнительных реагентов, которые использует данный фермент для образования детектируемого продукта реакции. Например, пероксидаза хрена использует пероксид водорода и диаминобензидин. Антитело может быть также помечено биотином и детектировано опосредованным измерением связывания авидина или стрептавидина. Антитело может быть также помечено предварительно определенными полипептидными эпитопами, узнаваемыми вторичным репортером (например, спаренными лейциновой молнией последовательностями, сайтами связывания для вторичных антител, доменами связывания металлов, эпитопными метками).

Антитело против Ыодо-рецептора-1 или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть также помечены радиоактивной аминокислотой. Радиоактивная метка может быть использована как для диагностических, так и для терапевтических целей. Радиоактивно меченое антитело против Ыодо-рецептора-1 может быть использовано диагностически, например, для определения уровней Ыодо-рецептора-1 в субъекте. Далее, радиоактивно меченое антитело против Ыодо-рецептора-1 может быть использовано терапевтически для лечения повреждения спинного мозга. Примеры меток для полипептидов включают в себя, но не ограничиваются ими, следующие радиоизотопы или радионуклеотиды: ³Н, ¹⁴С, ¹⁵Ν, ³⁵8 , ⁹⁰Υ, ⁹⁹Тс, ^1П1п, ¹²⁵1, ¹³¹1.

Антитело против Ыодо-рецептора-1 или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть также дериватизованы химической группой, такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ), метильная или этильная группа или углеводная группа. Эти группы могут быть полезными для улучшения биологических свойств антитела, например для увеличения времени полужизни в сыворотке или для увеличения связывания с тканью.

Характеристика антител против Ыодо-рецептора-1

Класс и подкласс антител против Ыодо-рецептора-1.

Класс и подкласс антител против Ыодо-рецептора-1 может быть определен любым известным в данной области способом. Обычно класс и подкласс антитела может быть определен с использованием антител, которые являются специфическими в отношении конкретного класса и подкласса антитела. Такие антитела являются коммерчески доступными. Класс и подкласс антител может быть определен ЕЬ18А, Вестерн-блоттингом, а также другими способами. Альтернативно, класс и подкласс может быть определен секвенированием всех константных доменов или части константных доменов тяжелой и/или легкой цепей этих антител, сравнением их аминокислотных последовательностей с известными аминокислотными последовательностями различных классов и подклассов иммуноглобулинов и определением класса и подкласса этих антител.

Аффинность связывания антитела против Ыодо-рецептора-1 с Ыодо-рецептором-1.

Аффинность связывания и скорость диссоциации антитела против Ыодо-рецептора-1 данного изобретения с полипептидом Ыодо-рецептора-1 данного изобретения могут быть определены любым способом, известным в данной области. Например, аффинность связывания может быть измерена конкурентными ЕЫ8А, ША, технологией В1Асоге или ΚίηΕχΑ. Аффинность связывания и скорость диссоциации измеряют посредством резонанса поверхностных плазмонов с использованием, например, В1Асоге.

Было определено, что К_с 7Е11 и 1Н2 равны 1х10^-7 М и 2х10^-8 М, соответственно.

Ингибирование активности Ыодо-рецептора-1 антителом против Ыодо-рецептора-1.

В некоторых вариантах осуществления антитело против Ыодо-рецептора-1 или его антигенсвязывающий фрагмент данного изобретения ингибирует связывание Ыодо-рецептора-1 с лигандом. 1С₅₀ такого ингибирования может быть измерена любым способом, известным в данной области, например ЕЬ18А, ША или Функциональным Антагонизмом. В некоторых вариантах осуществления 1С₅₀ находится между 0,1 и 500 нм. В некоторых вариантах осуществления 1С₅₀ находится между 10 и 400 нМ. В других вариантах осуществления это антитело или его часть имеет 1С₅₀ между 60 и 400 нМ. Было определено, что 1С₅₀ 7Е11 и 1Н2 равны 400 и 60 нМ, соответственно, в анализе связывания. См. также табл. 3, 1пГга.

- 9 008253

Таким образом, специалист с квалификацией в данной области, используя содержание данного изобретения, имеет в своем распоряжении различные способы, которые могут быть использованы для изменения биологических свойств антител данного изобретения, в том числе способы, которые будут увеличивать или уменьшать стабильность или время полужизни в сыворотке, иммуногенность, токсичность, аффинность или выход конкретной молекулы антитела, или изменения их любым другим путем, который может сделать их более подходящими для конкретного применения.

Композиции, содержащие антитела данного изобретения, и применения антител данного изобретения описаны ниже.

Растворимые полипептиды Ыодо-рецептора-1

Белок.

Полноразмерный Ыодо-рецептор-1 состоит из сигнальной последовательности, Ν-концевого района (ΝΤ), восьми богатых лейцином повторов (БРР), района БРРСТ (С-конец из восьми богатых лейцином повторов домена богатых лейцином повторов), С-концевого района (СТ) и СРБякоря (см. фиг. 1).

Некоторые варианты осуществления данного изобретения обеспечивают растворимый полипептид №до-рецептора-1. Растворимые полипептиды №до-рецептора-1 данного изобретения содержат ΝΤ-домен; 8 РИИ и БРРСТ-домен и лишены сигнальной последовательности и функционального СР1-якоря (т.е. не имеют СР1-якоря или имеют СРБякорь, который не способен эффективно связываться с клеточной мембраной).

В некоторых вариантах осуществления растворимый полипептид №до-рецептора-1 содержит гетерологичный БРИ. В некоторых вариантах осуществления растворимый полипептид №до-рецептора-1 содержит 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 гетерологичных БРР. Гетерологичный БРР обозначает БРР, полученный из белка, отличного от №до-рецептора-1. Примерами белков, из которых могут быть получены гетерологичные БРР, являются !о11-подобный рецептор (ТБР1.2); активирующий Т-клетки богатый лейциновыми повторами белок; декорин; ОМ-др; кислотолабильная субъединица 81ΐΐ белка, связывающего инсулинподобный фактор роста, и гоЬо; и (оП-подобный рецептор-4.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает растворимый полипептид №до-рецептора-1 из 319 аминокислот (растворимый №до-рецептор-1 344, ^одоР1-344 или ^одоР344) (остатки 26-344 8Ер ГО ΝΟ: 6 и 8 или остатки 27-344 8Ε^ ГО ΝΟ: 8). В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает растворимый полипептид №до-рецептора-1 из 285 аминокислот (растворимый №до-рецептор-1 310, «Ыодо1Т1-310 или ^одоР310) (остатки 26-310 8Ер ГО ΝΟ: 7 и 9 или остатки 27-310 8Ε^ ГО ΝΟ: 9). См. фиг. 1.

Таблица 1 Последовательности полипептидов №до-рецептора-1 человека и крысы

5Е0 Ιϋ ΝΟ: б (1-344 человека)	МКРАЗАОСЗкЬЬАИУЪИЪОАИОЗТААРСРОАСУСУЫЕРКТТТЗСРООСЗЬОАУРУб ΙΡΆΑ80ΗΙ^ΗΟΝΚΙ8ΗνΡΑΑ8ΕΙ^αΐ^ΤΙΐνΠ^8ΝνΐιΑΡΙϋΑΆΑΕΤ<3ΙΑΒΒΕ 0ЬОЬ8ПЫА0ЪК87ПРАТГНОШКЫПЪНЬПКС<ЗЪ0ЕЪСР(ЗЬРРаЬААЬ0УЬУЬ0 ОНАЬ0АЬРПГ>ТР1ФЬаЫЬТНЬГЪН(ЭНЯ188УРЕКАРНО1>Н8ЬПНЬЬЪН0№УАН УНРНАРКО1ХЗкЪМТЬУЪРАККЪ5АЬРТЕАЬАР1Ли^0УЪКЪНПКРМУСОСНАКР ЪЖИЬОКРАа383ЕУРС8ЬРОНЬАаНОЬКНЬАЖОЬОаСАУАТОРУНР1КТаНА ТОЕЕРЬаЬРКССОРПААОКА
8Е0 ГО N0: 7 (1-310 человека)	МКГЦ18Авв8КЬЬАИУЬ^ОАИОУААРСРвАСУСУМЕРКУТТ8СРООаЬОАУРУ0 1РАА30Р1РЪНОЫР13Н7РААЗРКАСККЬТ1ЬИЬНЗЯУ11АИГОАААРТО1*АЬЬЕ ОЪОЬЗОЫАОЪКЗТПРАТРНОЬаКЬНТЬНЬПКССЬОЕЬСРОЬРРОЪААЬОУЪУЬО ПЫАЬ0АЪРООТР1ШЪ(ЗЯЬТНЬР11Н(ЗНК183¥РЕКАРНОЪН81ЮНЬЬЬН0ЫНУАН νΗΡΗΑΡίωΐ^Ι^ΜΏ^ΡΑΝΝηβΑυΡΤΕΑΙιΑΡΙ^υαιΟΥΙΙ^ΝηΝΡ^ίπϊαΚΑΗΡ ЬИАтаОКРРО338ЕУРС8ЬРОМА01и)ЬКНЬААЫОЪОаСА
5Е0 Ιϋ ΝΟ: 8 (1-344 крысы)	МКИ^88аО8КЪРТН^ЬНЬОАННУАТРСРаАСУСУПЕРК7ТТ8КРООаЬОАУРА0 1РА380Р1Р1дНОКН18У¥РАА8Р08(ЖКЪТ1ЬИЪН8КА1|АаГОАААРТаЬТЬЪЕ ОЬОЬЗПКАОЬРУТОРТТРНОЬОНЬНТЬНЬПКСОЪОЕЬСРОЬРКОЬААЬОУЬУЪО ПКЫЪ0АЬРПКТР1ШЬОШ1ТНЬРШ<ЗЫЯ1Р5¥РЕНАРКО1|Н8Ы)НЬЬ11Н0ЫНУАК УНРНАРГШГХЗНЪМТЬУЬРАЬ^БМЬРАЕТЪУРШбЬОУЬЯЪНОПРтГСОСРАКР ЬИАКЬОКРРа383СУР5ПЪРОРЬА0М)ЬКМ1АТЗП11ЕОСА7АЗаРРКРРОТЫОЬ ТОЕЕЬЬаЬРКССОРОААОКА
δΕΟ Ιϋ ΝΟ: 9 (1-310 крысы)	МККАЗЗСЮЗГЛРТИУЬНЬОАтТАТРСРОА^та^РКОТТЗНРОООЬОАУРАО 1РА580К1РЬНаЫК18УУРААЗР08СКЫЬТГОН11Н5ПАЬАа1ПАААРТОЬТЬЬЕ ОЬОЪЗППАОЬЕУТОРТТРкСЗЬаНЬНТЬНЬОНСОЬОЕЪОРОЬРРОЬААЪОУЬУЬО О1ЖЬ0АЬРООТР№]УЗтТНЬРЬНаЫК1Р8УРЕНАРРСЗЬН8ЬОМ4Ь11Н0ННУАН УНРНАР^ЬаИиМТЬУЬРАНЫЪЗМЬРАЕУЬУРЬ^ЬОГОтШЫРтГСПСРАКР ЬИА^ОКРЯОЗЗЗОУРЗНЪРОРЬАЖОЬККЬАТЗПЬЕОСА

- 10 008253

В некоторых вариантах осуществления данного изобретения растворимые полипептиды Ыодо-рецептора-1 данного изобретения используют для ингибирования связывания лиганда с Ыодо-рецептором1 и действия в качестве антагониста лигандов Ыодо-рецептора-1. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения растворимые полипептиды Ыодо-рецептора-1 данного изобретения используют для уменьшения ингибирования выроста и разрастания нейритов в нейроне, такого как аксонный рост, и для ингибирования опосредованного миелином коллапса конуса роста в нейроне. В некоторых вариантах осуществления этим нейроном является нейрон центральной нервной системы.

Неожиданным образом, кЫодоКЗЮ и кЫодоК344 блокируют связывание ЫодоЛ, ЫодоВ, ЫодоС, МАС и 0М-др с Ыодо-рецептором-1.

В некоторых вариантах осуществления растворимый полипептид Ыодо-рецептора-1 данного изобретения является компонентом слитого белка, который дополнительно содержит гетерологичный полипептид. В некоторых вариантах осуществления этим гетерологичным полипептидом является константный домен иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления этим константным доменом иммуноглобулина является константный домен тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления гетерологичным полипептидом является Ре-фрагмент. В некоторых вариантах осуществления Рс присоединен к С-концевой стороне растворимого полипептида Ыодо-рецептора-1 данного изобретения. В некоторых вариантах осуществления этот слитый белок Ыодо-рецептора-1 является димером.

Молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения

Данное изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид данного изобретения, в том числе полипептиды любой из δΕζ ΙΌ N0: 1-9, 26-27, 29-37 и 41-45. В некоторых вариантах осуществления эта нуклеиновая кислота кодирует полипептид, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 26-344 №до-рецептора-1, показанных в 8Εζ ΙΌ N0: 6 и 8, или аминокислотных остатков 27-344 №до-рецептора-1, показанных в 8Εζ ΙΌ N0: 8. В некоторых вариантах осуществления эта молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 26-310 №до-рецептора-1, показанных в 8Εζ ΙΌ N0: 7 и 9, или аминокислотных остатков 27-310 №до-рецептора-1, показанных в 8Εζ ΙΌ N0: 9. В данном контексте, нуклеиновая кислота обозначает геномную ДНК, кДНК, мРНК и антисмысловые молекулы, а также нуклеиновые кислоты на основе альтернативных скелетов молекул или включающие в себя альтернативные основания, независимо от того, получены ли они из природных источников или синтезированы. В некоторых вариантах осуществления эта нуклеиновая кислота дополнительно содержит промотор транскрипции и необязательно сигнальную последовательность, каждый их которых функционально связан с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептиды данного изобретения.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, кодирующую слитый белок №до-рецептора-1 данного изобретения, в том числе слитый белок, содержащий полипептид, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 26-344 №до-рецептора-1, показанных в 8Εζ ΙΌ N0: 6 и 8, или аминокислотных остатков 27-344 8Εζ ΙΌ N0: 8 и аминокислотных остатков 26-310 №до-рецептора-1, показанных в 8Εζ ΙΌ N0: 7 и 9, или аминокислотных остатков 27-310 8Ε0 ΙΌ N0: 9. В некоторых вариантах осуществления эта нуклеиновая кислота кодирует слитый белок №до-рецептора-1, содержащий полипептиды, выбранные из группы, состоящей из 8Εζ ΙΌ N0: 26-27, 29-37 и 41-45. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок №до-рецептора-1, дополнительно содержит промотор транскрипции и необязательно сигнальную последовательность. В некоторых вариантах осуществления эта нуклеотидная последовательность дополнительно кодирует константную область иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления константная область иммуноглобулина является константной областью тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления эта нуклеотидная последовательность дополнительно кодирует константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, соединенную с шарнирной областью. В некоторых вариантах осуществления эта нуклеиновая кислота дополнительно кодирует Рс. В некоторых вариантах осуществления слитые белки Нодо-рецептора-1 содержат Рс-фрагмент.

Эти кодирующие нуклеиновые кислоты данного изобретения могут быть дополнительно модифицированы таким образом, что они содержат детектируемую метку для целей диагностики и зондирования. Разнообразные подобные метки известны в данной области и могут быть легко использованы с описанными здесь кодирующими молекулами. Подходящие метки включают в себя, но не ограничиваются ими, биотин, радиоактивно меченные нуклеотиды и т.п. Специалист с квалификацией в данной области может использовать любую из известных в данной области меток для получения меченой молекулы нуклеиновой кислоты.

Композиции

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает композиции, содержащие полипептид, выбранный из группы, состоящей из δΕζ ΙΌ N0: 1-5, 26-27, 29-37 и 41-45.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает композиции, содержащие антитело против №до-рецептора-1, или его антигенсвязывающий фрагмент, или растворимый полипептид №до-рецептора-1, или слитый белок данного изобретения.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение может содержать подходящие фармацевтически приемлемые носители, содержащие эксципиенты и вспомогательные вещества, которые об

- 11 008253 легчают процессинг активных соединений в препараты, которые могут быть использованы фармацевтически для доставки к месту действия. Подходящие формы для парентерального введения включают в себя водные растворы активных соединений в водорастворимой форме, например водорастворимых солей. Кроме того, могут вводиться суспензии активных соединений в виде подходящих масляных инъекционных суспензий. Подходящие липофильные растворители или носители включают в себя жирные масла, например кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, например этилолеат или триглицериды. Водные инъекционные суспензии могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, и эти вещества включают в себя, например, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, сорбит и декстран. Необязательно, эта суспензия может также содержать стабилизаторы. Липосомы могут быть также использованы для инкапсулирования молекул данного изобретения для доставки в клетку. Примерами фармацевтически приемлемых носителей являются любые и все растворители, диспергирующие среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты и т.п., которые являются физиологически совместимыми, вода, солевой раствор, забуференный фосфатом раствор, декстроза, глицерин, этанол и т.п., а также их комбинации. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит изотонические агенты, например сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия. В некоторых вариантах осуществления композиции содержат фармацевтически приемлемые вещества, такие как увлажнители, или минорные количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие и эмульгирующие агенты, консерванты или буферы, которые увеличивают время хранения или эффективность антител, антигенсвязывающих фрагментов, растворимых Ыодо-рецепторов или слитых белков данного изобретения.

Композиции данного изобретения могут быть в различных формах, в том числе, например, жидких, полутвердых и твердых дозированных формах, таких как жидкие растворы (например, инъекционные и инфузируемые растворы), дисперсии или суспензии. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического назначения в одном варианте осуществления, композиции находятся в форме инъекционных или инфузируемых растворов, таких как композиции, сходные с композициями, используемыми для пассивной иммунизации людей другими антителами.

Эта композиция может быть приготовлена в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Стерильные инъекционные растворы могут быть приготовлены включением антитела против Ыодо-рецептора-1 в требуемом количестве в подходящий растворитель с одним или с комбинацией из ингредиентов, перечисленных выше, по мере необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием. Обычно дисперсии готовят включением активного соединения в стерильный носитель, который содержит дисперсионную среду-основу и требуемые ингредиенты из ингредиентов, перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и лиофилизация, которая дает порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент, из их предварительно стерильно-отфильтрованного раствора. Надлежащая текучесть раствора может поддерживаться, например, с использованием покрытия, такого как лецитин, поддержанием требуемого размера частиц в случае дисперсии и с использованием поверхностно-активных веществ. Пролонгированная абсорбция инъекционных композиций может быть обеспечена включением в композицию агента, который задерживает абсорбцию, например моностеаратных солей и желатина.

В некоторых вариантах осуществления активное соединение может быть приготовлено в носителе, который будет защищать это соединение от быстрого высвобождения, например композиции регулируемого высвобождения, включающие в себя имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Могут быть использованы биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы приготовления таких форм запатентованы или обычно известны специалистам с квалификацией в данной области. См., например, Зийашей апй Соп1го11сй Кс1са5с Эгид ЭсПусгу 8у51еш5. ТВ. КоЬпъоп. ей., Магсс1 Эекксг. 1пс., Ысте Уотк, 1978.

В композиции могут быть также включены дополнительные активные соединения. В некоторых вариантах осуществления антитело против Ыодо-рецептора-1, или его антигенсвязывающие фрагменты, или растворимые полипептиды Ыодо-рецептора-1, или слитые белки данного изобретения готовят вместе или вводят вместе с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами.

Фармацевтические композиции данного изобретения могут включать в себя терапевтически эффективное количество или профилактически эффективное количество антитела, антигенсвязывающего фрагмента, полипептида (полипептидов) или слитого белка данного изобретения. Терапевтически эффективным количеством называют количество, эффективное, при дозах и в течение необходимых периодов времени, достаточное для достижения терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела против Ыодо-рецептора-1 или его антигенсвязывающего фрагмента, растворимого полипептида Ыодо-рецептора-1 или слитого белка Ыодо-рецептора может варьироваться в соответствии с такими факторами, как состояние заболевания, возраст, пол и масса индивидуума. Терапевтически эффективным количеством является также количество, в котором любые токсичные или вредные

- 12 008253 эффекты антитела против Ыодо-рецептора-1 или антигенсвязывающего фрагмента, растворимого полипептида Ыодо-рецептора-1 или слитого белка Ыодо-рецептора перевешиваются терапевтически выгодными эффектами. Профилактически эффективным количеством называют количество, эффективное, при дозах и в течение необходимых периодов времени, для достижения желаемого профилактического результата. Обычно, поскольку профилактическую дозу используют в субъектах перед заболеванием или на более ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество будет меньшим, чем терапевтически эффективное количество.

Схемы введения доз могут быть приспособлены для обеспечения оптимальной желаемой реакции (например, терапевтической или профилактической реакции). Например, может вводиться единственная болюсная доза, могут вводиться несколько разделенных доз на протяжении времени или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, в зависимости от острой необходимости терапевтической ситуации. Особенно предпочтительно готовить парентеральные композиции в дозированной унифицированной форме для легкости введения, и однородность дозированной унифицированной формы обозначает, в данном контексте, физически дискретные единицы, подходящие для единичных доз для проходящих лечение субъектов-млекопитающих, причем каждая единица содержит заранее определенное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического действия, в ассоциации с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация для дозированных унифицированных форм данного изобретения диктуется (а) уникальными характеристиками антитела, антигенсвязывающего фрагмента и растворимого полипептида Ыодо-рецептора-1 или слитого белка Ыодо-рецептора и конкретным терапевтическим или профилактическим эффектом, который должен быть достигнут, и (Ь) ограничениями, присущими в данной области компаундированию такого антитела, антигенсвязывающего фрагмента и растворимого полипептида Ыодо-рецептора-1 или слитого белка Ыодо-рецептора, для лечения чувствительности в индивидуумах, и непосредственно зависит от перечисленных условий. В некоторых вариантах осуществления диапазон терапевтически эффективных доз для антител против Ыодо-рецептора-1 или их антигенсвязывающих фрагментов находится в пределах 0,1-4,0 мг/кг в день. В некоторых вариантах осуществления диапазон терапевтически эффективных доз для антител против Ыодо-рецептора-1 или их антигенсвязывающих фрагментов находится в пределах 0,2-4,0 мг/кг в день. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективная доза для антител против Ыодо-рецептора-1 или их антигенсвязывающих фрагментов равна 0,2 мг/кг в день.

Применения антител, антигенсвязывающих фрагментов, растворимых рецепторов и слитых белков

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способы ингибирования активности Ыодо-рецептора-1 введением антител против Ыодо-рецептора-1, антигенсвязывающих фрагментов таких антител, растворимых полипептидов Ыодо-рецептора-1 или слитых белков, содержащих такие полипептиды, млекопитающему, нуждающемуся в этом.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ ингибирования связывания Ыодо-рецептора-1 с лигандом, предусматривающий стадию контактирования Ыодо-рецептора-1 с антителом или антигенсвязывающим фрагментом данного изобретения. В некоторых вариантах осуществления этот лиганд выбран из группы, состоящей из ^^Α, ЫодоВ, ЫодоС, ΜΑΟ и ΟΜ-др.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ ингибирования коллапса конуса роста в нейроне, предусматривающий стадию контактирования нейрона с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом данного изобретения. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ уменьшения ингибирования выроста или разрастания нейритов в нейроне, предусматривающий стадию контактирования этого нейрона с антителом или антигенсвязывающим фрагментом данного изобретения. В некоторых вариантах осуществления этот нейрон является нейроном центральной нервной системы. В некоторых из этих способов вырост или разрастание нейритов является аксонным ростом.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ стимуляции выживания нейрона в млекопитающем, который находится при риске умирания, предусматривающий (а) обеспечение культивируемой клетки-хозяина, экспрессирующей (ί) антитело против Ыодо-рецептора-1 или его антигенсвязывающий фрагмент; или (ίί) растворимый полипептид Ыодо-рецептора-1; и (Ь) введение клетки-хозяина в млекопитающее в месте или вблизи места этого нейрона. Α1тибеηа Ватоп-СиеЮ, Μ. НаЬе1 Согбего, Ретапбо Р. δα^^^η^υ апб 1е5И5 Ανίΐα (2000), Рипсбопа1 гесоуегу об рага1ещс га1з апб тоЮг ахоп гедепегабоп ш 1Не1г §рта1 согбк Ьу обасЮгу епкбеабпд се1к. Ыеигоп 25, 425-435.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ генотерапии стимуляции выживания нейрона при риске умирания, который находится в млекопитающем, предусматривающий введение в месте или вблизи места этого нейрона вирусного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, которая кодирует (а) антитело против Ыодо-рецептора-1 или его антигенсвязывающий фрагмент; или (Ь) растворимый полипептид Ыодо-рецептора-1, где это антитело против Ыодорецептора-1, антигенсвязывающий фрагмент или растворимый полипептид Ыодо-рецептора-1 экспрессируется из нуклеотидной последовательности в млекопитающем, в количестве, достаточном для стимуляции выживания этого нейрона. Вирусные векторы и способы, применимые для этих экспериментов, описаны, например, в Ыое1 е1 а1., Нитап Оепе Вегеру, 13, 1483-93 (2002).

- 13 008253

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ ингибирования связывания Иодо-рецептора-1 с лигандом, предусматривающий контактирование этого лиганда с растворимым полипептидом Иодо-рецептора-1 или слитым белком Иодо-рецептора-1 данного изобретения.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ модуляции активности лиганда Иодо-рецептора-1, предусматривающий стадию контактирования лиганда Модо-рецепгора-1 с растворимым полипептидом Иодо-рецептора-1 или слитым белком Иодо-рецептора-1 данного изобретения.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ ингибирования коллапса конуса роста в нейроне, предусматривающий стадию контактирования лиганда Иодо-рецептора-1 с растворимым полипептидом Иодо-рецептора-1 или слитым белком Иодо-рецептора-1 данного изобретения. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ уменьшения ингибирования выроста или разрастания нейритов в нейроне, предусматривающий стадию контактирования лиганда Иодо-рецептора-1 с растворимым полипептидом Иодо-рецептора-1 или слитым белком Иодо-рецептора-1 данного изобретения. В некоторых вариантах осуществления этот нейрон является нейроном центральной нервной системы. В некоторых вариантах осуществления этот лиганд выбран из ИодоА, ИодоВ, ИодоС, МАС и ОМ-др. В некоторых вариантах осуществления вырост или разрастание нейритов является аксонным ростом.

Любой из типов антител или рецепторов, описанных здесь, может быть использован терапевтически. В некоторых вариантах осуществления антитело против Иодо-рецептора-1 является антителом человека. В некоторых вариантах осуществления млекопитающим является пациент-человек. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят млекопитающему-не человеку, экспрессирующему Иодо-рецептор-1, с которым это антитело перекрестно реагирует (например, примату, собакоголовой обезьяне или мартышке-резус) для ветеринарных целей или в качестве животной модели заболевания человека. Такие модели животных могут быть применимы для оценки терапевтической эффективности антител данного изобретения.

В некоторых вариантах осуществления введение антитела против Иодо-рецептора-1, или антигенсвязывающего фрагмента, или растворимого полипептида, или слитого белка Иодо-рецептора-1 используют для лечения повреждения спинного мозга для облегчения аксонного роста через поврежденный участок.

Антитела против Иодо-рецептора-1, или антигенсвязывающие фрагменты, или растворимые полипептиды, или слитые белки Иодо-рецептора-1 данного изобретения могут быть обеспечены по отдельности, или в комбинации, или в последовательной комбинации с другими агентами, которые модулируют конкретный патологический процесс. Например, противовоспалительные агенты могут вводиться одновременно после инсульта в качестве средства для блокирования дополнительного повреждения нейронов и ингибирования регенерации аксонов. В данном контексте, говорят, что антитела против Иодо-рецептора-1, антигенсвязывающие фрагменты, растворимые полипептиды Иодо-рецептора-1 и слитые белки Иодо-рецептора вводят в комбинации с одним или несколькими терапевтическими агентами, когда эти два ингредиента вводят одновременно, последовательно или независимо.

Антитела против Иодо-рецептора-1, антигенсвязывающие фрагменты, растворимые полипептиды Иодо-рецептора-1, слитые белки Иодо-рецептора-1 данного изобретения могут вводиться парентеральным, подкожным, внутривенным, внутримышечным, внутрибрюшинным, трансдермальным, ингаляционным или буккальным способами. Например, агент может быть введен локально в место повреждения посредством микроинфузии. Типичные места включают в себя, но не ограничиваются ими, поврежденные зоны спинного мозга, возникающие в результате повреждения. Вводимая доза будет зависеть от возраста, здоровья и массы реципиента, типа сопутствующего лечения, если оно имеется, частоты введения и характера желаемого эффекта.

Соединения данного изобретения могут быть использованы ίη νί\Ό. обычно в млекопитающих, таких как люди, овцы, лошади, крупный рогатый скот, свиньи, собаки, крысы и мыши, или ίη νίΙΐΌ.

Векторы данного изобретения

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает рекомбинантные молекулы ДНК (рДНК), которые содержат кодирующую последовательность. В данном контексте, молекулой рДНК является молекула ДНК, которая была подвергнута молекулярной манипуляции. Способы генерирования молекул рДНК хорошо известны в данной области, например, см. 8атЬгоок с1 а1., (1989) Мо1еси1аг С1оп1пд - А ЕаЬогаЮгу Мапиа1, Со1б 8ргшд НагЬог каЬогаЮгу Рге§8. В некоторых молекулах рДНК кодирующая последовательность ДНК функционально связана с регуляторными последовательностями экспрессии и векторными последовательностями.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды данного изобретения. Выбор вектора и регуляторных последовательностей экспрессии, с которыми нуклеиновые кислоты данного изобретения функционально связаны, зависят непосредственно, как это хорошо известно в данной области, от желаемых функциональных свойств (например, экспрессии белка и подлежащей трансформации клетки-хозяина). Вектор данного изобретения может быть, по меньшей мере, способен направлять репликацию или инсерцию в хромосому хозяина и предпочтительно также экспрессию структурного гена, включенного в эту молекулу рДНК.

Регуляторные элементы экспрессии, которые могут быть использованы для регуляции экспрессии

- 14 008253 функционально связанной кодирующей белок последовательности, известны в данной области и включают в себя, но не ограничиваются ими, индуцируемые промоторы, конститутивные промоторы, сигналы секреции и другие регуляторные элементы. Предпочтительно индуцируемый промотор легко регулируется, будучи чувствительным к питательному элементу в среде клетки-хозяина.

В одном варианте осуществления вектор, содержащий кодирующую молекулу нуклеиновой кислоты, будет включать в себя прокариотический репликон, т.е. последовательность ДНК, имеющую способность управлять автономной репликацией и поддержанием этой рекомбинантной молекулы ДНК внехромосомно в прокариотической клетке-хозяине, такой как бактериальная клетка-хоязин, трансформированная им. Такие репликоны хорошо известны в данной области. Кроме того, векторы, которые включают в себя прокариотический репликон, могут также включать в себя ген, экспрессия которого придает детектируемый или селектируемый маркер, такой как устойчивость к лекарственному средству. Типичными бактериальными генами устойчивости к лекарственному средству являются гены, которые сообщают устойчивость к ампициллину или тетрациклину.

Векторы, которые включают в себя прокариотический репликон, могут дополнительно включать в себя прокариотический промотор или промотор бактериофага, способные управлять экспрессией (транскрипцией и трансляцией) кодирующих последовательностей генов в бактериальной клетке-хозяине, такой как Е. со1Б. Промотор является регуляторным элементом экспрессии, образуемым последовательностью ДНК, которая делает возможным связывание РНК-полимеразы и осуществление транскрипции. Промоторные последовательности, совместимые с бактериальными хозяевами, обычно обеспечены в плазмидных векторах, содержащих удобные сайты рестрикции для инсерции сегмента ДНК данного изобретения. Примерами таких векторных плазмид являются рИС8, рИС9, рВК322 и рВК329 (ВБо-Каб® ЬаЬогаБогБек), рРЬ и рКК223 (РйагтасБа). Любой подходящий прокариотический хозяин может быть использован для экспрессии рекомбинантной молекулы ДНК, кодирующей белок данного изобретения.

Экспрессирующие векторы, совместимые с эукариотическими клетками, предпочтительно векторы, совместимые с клетками позвоночных, могут быть также использованы для образования молекул рДНК, которые содержат кодирующую последовательность. Экспрессирующие векторы эукариотических клеток хорошо известны в данной области и доступны из нескольких коммерческих источников. Обычно такие векторы обеспечены удобными сайтами рестрикции для инсертирования желаемого сегмента ДНК. Примерами таких векторов являются рБЬУ и рКБУ-10 (РйагтасБа), рВРУ-1, рМЬ2б (1п!ета!Бопа1 ВБо!есйпо1одБек), рТЭТ1 (АТСС® 31255) и другие эукариотические экспрессирующие векторы.

Экспрессирующие векторы эукариотических клеток, используемые для конструирования молекул рДНК данного изобретения, могут дополнительно включать в себя селектируемый маркер, который является эффективным в эукариотической клетке, предпочтительно селектируемый маркер устойчивости к лекарственным средствам. Предпочтительным маркером устойчивости к лекарственным средствам является ген, экспрессия которого приводит к устойчивости к неомицину, т.е. ген неомицинфосфотрансеразы (пео) (БоиШегп е! а1., (1982) Б. Мо1. Апа1. Сепе1. 1, 327-341). Альтернативно, этот селектируемый маркер может присутствовать на отдельной плазмиде, эти два вектора вводят котрансфекцией клетки-хозяина и трансфектанты отбирают культивированием в подходящем лекарственном средстве на селектируемый маркер.

Для экспрессии антител или частей антител данного изобретения ДНК, кодирующие частичные или полноразмерные легкие и тяжелые цепи, инсертируют в экспрессирующие векторы таким образом, что эти гены функционально связаны с регуляторными последовательностями транскрипции и трансляции. Экспрессирующие векторы включают в себя плазмиды, ретровирусы, космиды, УАС, полученные из ЕВУ эписомы и т.п. Ген антитела лигируют в вектор таким образом, что регуляторные последовательности транскрипции и трансляции в этом векторе выполняют присущую им функцию регуляции транскрипции и трансляции гена антитела.

Экспрессирующий вектор и регуляторные последовательности транскрипции выбирают таким образом, что они являются совместимыми с используемой экспрессирующей клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть встроены в раздельные векторы. В некоторых вариантах осуществления оба гена инсертируют в один и тот же экспрессирующий вектор. Гены антител инсертируют в экспрессирующий вектор стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и вектора или лигированием тупых концов, если сайты рестрикции отсутствуют).

Удобным вектором является вектор, который кодирует функционально полную последовательность С_Н или Сь иммуноглобулина, причем подходящие сайты рестрикции конструируют таким образом, что любая последовательность У_Н или У_ъ может быть легко инсертирована и экспрессирована, как описано выше. В таких векторах обычно происходит сплайсинг между донорным сайтом сплайсинга в инсертированном Б-районе и акцепторным сайтом сплайсинга, предшествующим С-району человека, а также в районах сплайсинга, которые имеются в экзонах СН человека. Полиаденилирование и терминация транскрипции происходят в нативных хромосомных сайтах справа от кодирующих районов. Рекомбинантный экспрессирующий вектор может также кодировать сигнальный пептид, который способствует секреции цепи антитела из клетки-хозяина. Этот ген цепи антитела может быть клонирован в вектор таким образом, что этот сигнальный пептид связан в рамке считывания с аминоконцом гена цепи антитела. Этот сигнальный пептид может быть сигнальным пептидом иммуноглобулина или гетерологичным сигналь

- 15 008253 ным пептидом (т. е. сигнальным пептидом из белка, не являющегося иммуноглобулином).

Кроме этих иммуногенных полипептидов, антитела №до-рецептора-1, антигенсвязывающих фрагментов растворимых полипептидов №§о-рецептора-1 и слитых белков растворимого №до-рецептора-1 данного изобретения, рекомбинантные экспрессирующие векторы данного изобретения несут регуляторные последовательности, которые регулируют их экспрессию в клетке-хозяине. Специалистам с квалификацией в данной области будет понятно, что конструкция экспрессирующего вектора, в том числе выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор трансформируемой клетки-хозяина, уровень экспрессии желаемого белка и т.д. Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии клетки-хозяина млекопитающего включают в себя вирусные элементы, которые запускают высокие уровни экспрессии белков в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из ретровирусных ЬТВ, цитомегаловируса (СМУ) (например, промотор/энхансер СМУ), вируса 40 обезьяны (8У40) (такие, как промотор/энхансер 8У40), аденовируса (например, основной поздний промотор аденовируса (АбМЬР)), промоторы полиомы и сильные промоторы млекопитающих, такие как промоторы иммуноглобулина и актина. В отношении дополнительного описания вирусных регуляторных элементов и их последовательностей, см., например, и.8. Ра1. №. 5,168,062 8бпкк1, и.8. Ра!. №. 4,510,245 Ве11 е! а1. и и.8. Ра!. №. 4,968,615 ЗсЬайПег е! а1.

Кроме гетерологичных генов и регуляторных последовательностей, рекомбинантные экспрессирующие векторы данного изобретения могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, сайты инициации репликации), и гены селектируемых маркеров. Ген селектируемого маркера облегчает отбор клеток-хозяев, в которые был введен вектор (см., например, и.8. Ра!. №. 4,399,216, 4,634,665 и 5,179,017, Ьу Ахе1 е! а1.). Например, обычно ген селектируемого маркера придает устойчивость к лекарственным средствам, таким как С418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую был введен этот вектор. Предпочтительные гены селектируемых маркеров включают в себя ген дигидрофолатредуктазы (ИНЕВ) (для использования в бМг клетках-хозяевах с отбором с использованием метотрексата/амплификации) и ген пео (для отбора с использованием С418).

Клетки-хозяева и способы рекомбинантного получения белка данного изобретения

Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела против №до-рецептора-1, иммуногенные пептиды, растворимые полипептиды №до-рецептора-1, слитые белки растворимого №до-рецептора-1 данного изобретения и векторы, содержащие эти молекулы нуклеиновых кислот, могут быть использованы для трансформации подходящей клетки-хозяина. Трансформация может выполняться любым известным способом введения полинуклеотидов в клетку-хозяина. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают в себя опосредованную декстраном трансфекцию, осаждение фосфатом кальция, опосредованную полибреном трансфекцию, слияние протопластов, электропорацию, инкапсулирование полинуклеотида (полинуклеотидов) в липосомы и прямую микроинъекцию ДНК в ядра. Кроме того, молекулы нуклеиновых кислот могут быть введены в клетки млекопитающих вирусными векторами.

Трансформацию подходящих клеток-хозяев молекулой рДНК данного изобретения выполняют хорошо известными способами, которые обычно зависят от типа используемого вектора и используемой системы хозяина. Что касается трансформации прокариотических клеток-хозяев, могут быть использованы электропорация и способы солевой обработки (см., например, 8атЬгоок е! а1., (1989) Мо1еси1аг С1ошпд - А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк: Сойеп е! а1., (1972) Ргос. №11. Асаб. 8ск И8А 69, 2110-2114). Что касается трансформации клеток позвоночных векторами, содержащими рДНК, могут быть использованы электропорация, способы с использованием катионного липида или солевой обработки (см., например, Сгайат е! а1., (1973) Уйо1о§у 52, (456-467; У!д1ег е! а1., (1979) Ргос. N311. Асаб. 8ск И8А 76, 1373-1376).

Успешно трансформированные клетки, т.е. клетки, которые содержат молекулу рДНК данного изобретения, могут быть идентифицированы хорошо известными способами, в том числе отбором на селектируемый маркер. Например, клетки, полученные из введения рДНК данного изобретения, могут быть клонированы с получением отдельных колоний. Клетки из этих колоний могут быть собраны, лизированы, и содержание их ДНК может быть тестировано на присутствие рДНК с использованием такого способа, как способ, описанный 8ои!йегп е! а1., (1975) 1. Мо1. Вю1. 98, 503-517, или белки, полученные из этой клетки, могут быть анализированы иммунологическим способом.

Клеточные линии млекопитающих, доступные в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны в данной области и включают в себя многие иммортализованные клеточные линии, доступные из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС®). Они включают в себя, ш!ег айа, клетки яичника китайского хомячка (СНО), N80, клетки 8Р2, клетки НеЬа, клетки почки детеныша хомячка (ВНК), клетки почки обезьяны (С08), клетки печеночноклеточной карциномы человека (например, Нер С2), клетки А549 и ряд других клеточных линий. Особенно предпочтительные клеточные линии выбирают посредством определения, какие клеточные линии имеют высокие уровни экспрессии. Другими клеточными линиями, которые могут быть использованы, являются клеточные линии насекомых, такие как клетки 8£9. Когда рекомбинантные экспрессирующие векторы, кодирующие иммуногенные полипептиды, антитела против №до-рецептора-1 или антигенсвязывающие фрагменты, растворимые полипептиды №§о-рецеп

- 16 008253 тора-1 и слитые белки растворимого Ыодо-рецептора-1 вводят в клетки-хозяева млекопитающих, они продуцируются культивированием этих клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для возможности экспрессии этих антитела, полипептида и слитого полипептида в клетках-хозяевах или, более предпочтительно, секреции этих иммуногенных полипептидов, антител Ыодо-рецептора-1 или антигенсвязывающих фрагментов, растворимых полипептидов Ыодо-рецептора-1 и слитых белков растворимого Ыодо-рецептора-1 данного изобретения в культуральную среду, в которой эти клетки-хозяева выращивают. Иммуногенные полипептиды, антитела против Иодо-рецептора-1 или антигенсвязывающие фрагменты, растворимые полипептиды Иодо-рецептора-1 и слитые белки растворимого Иодо-рецептора-1 могут быть извлечены из этой культуральной среды с использованием стандартных способов очистки белков.

Далее, экспрессия иммуногенных полипептидов, антител против Иодо-рецептора-1 или антигенсвязывающих фрагментов, растворимых полипептидов Иодо-рецептора-1 и слитых белков растворимого Иодо-рецептора-1 данного изобретения (или других их частей) из продукционных клеточных линий может быть усилена с использованием ряда известных способов. Например, система экспрессии гена глутаминсинтетазы (система 08) является обычным подходом для усиления экспрессии при определенных условиях. Система 08 обсуждается в целом или частично в связи с европейскими патентами с номерами 0216846, 0256055 и 0323997 и заявкой на европейский патент с номером 89303964.4.

Клетки-хозяева

Далее, данное изобретение обеспечивает клетки-хозяева, трансформированные молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело против Иодо-рецептора-1, антигенсвязывающий фрагмент, растворимый полипептид Иодо-рецептора-1 и/или слитый белок растворимого Иодо-рецептора-1 данного изобретения. Эта клетка-хозяин может быть прокариотической или эукариотической. Эукариотические клетки, применимые для экспрессии белка данного изобретения, не ограничиваются, пока эта клеточная линия является совместимой со способами культивирования клеток и совместимой с размножением экспрессирующего вектора и экспрессии генного продукта. Предпочтительные эукариотические клетки-хозяева включают в себя, но не ограничиваются ими, клетки дрожжей, насекомых и млекопитающих, предпочтительно клетки позвоночных, такие как линия клеток из мыши, крысы, обезьяны или человека. Примеры применимых эукариотических клеток-хозяев включают в себя клетки яичника китайского хомячка (СНО), доступные из АТСС® в виде ССЬ61, эмбриональные клетки ΝΙΗ-3Τ3 мыши ΝΙΗ 8^ίκκ, доступные из АТСС в виде СКЕ1658, клетки почки детеныша хомячка (ВНК) и подобные эукариотические клеточные линии культуры ткани.

Получение рекомбинантных белков с использованием молекулы рДНК

Далее, данное изобретение обеспечивает способы получения антитела против №§о-рецептора-1 или антигенсвязывающего фрагмента, растворимого полипептида №§о-рецептора-1 и/или слитого белка растворимого №§о-рецептора-1 с использованием описанных здесь молекул нуклеиновых кислот. В общем виде, получение рекомбинантной формы белка обычно включает в себя следующие стадии.

Сначала получают молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок данного изобретения. Если эта кодирующая последовательность не прерывается интронами, она непосредственно пригодна для экспрессии в любом хозяине.

Затем эту молекулу нуклеиновой кислоты необязательно помещают в функциональную связь с подходящими регуляторными последовательностями, как описано выше, для образования экспрессионной единицы, содержащей открытую рамку считывания белка. Эту экспрессионную единицу используют для трансформации подходящего хозяина и этот трансформированный хозяин культивируется при условиях, которые делают возможной продуцирование рекомбинантного белка. Необязательно, этот рекомбинантный белок выделяют из среды или из клеток; извлечение и очистка этого белка может не быть необходимой в некоторых случаях, в которых могут быть допущены некоторые примеси.

Каждая из предыдущих стадий может быть выполнена различными способами. Например, желаемые кодирующие последовательности могут быть получены из геномных фрагментов и использованы непосредственно в подходящих хозяевах.

Конструирование экспрессирующих векторов, которые являются функциональными в различных хозяевах, выполняют с использованием подходящих репликонов и регуляторных последовательностей, как описано выше. Эти регуляторные последовательности, экспрессирующие векторы и способы трансформации зависят от типа клетки-хозяина, используемой для экспрессии данного гена, и обсуждались подробно ранее. Подходящие сайты рестрикции, если они не были в норме доступными, могут быть добавлены на концах этой кодирующей последовательности для обеспечения вырезаемого гена для инсертирования в эти векторы. Специалист с квалификацией в данной области может легко адаптировать любую систему хозяина/экспрессии, известную в данной области, для использования с молекулами нуклеиновых кислот данного изобретения для получения рекомбинантного белка.

Для лучшего понимания данного изобретения представлены следующие примеры. Эти примеры приведены только для целей иллюстрации и не должны рассматриваться как ограничивающие какимлибо образом объем данного изобретения.

Пример 1. Получение мышиных моноклональных антител против №§о-рецептора-1.

Антитела №§о-рецептора-1. которые специфически связывают иммуногенный полипептид №§о

- 17 008253 рецептора-1 данного изобретения, получали с использованием следующих способов и процедур.

Иммунизации

Использовали два подхода иммунизации.

1. Клетки СО8-7 или клеточные мембраны, содержащие №§о-рецептор-1 (№доЯ-1) в качестве иммуногена.

Ген №§о-рецептора-1 крысы (СепВапк™ №. АР 462390) субклонировали в экспрессирующий вектор млекопитающих рЕАС1256 (Вюдеп®), который содержал промотор СМУ и ген устойчивости к генетицину для отбора с лекарственным средством. Эту рекомбинантную плазмиду трансфицировали в клетки С08-7 с использованием 8ирегГес1 (О|адеп®). Трансфектанты отбирали с использованием генетицина (С1Ьсо™, 2 мг/мл), клонировали и проверяли в отношении поверхностной экспрессии белка №§о-рецептора-1 при помощи РАС8. Мембраны С08-7 получали из этих клеток в соответствии с описанными процедурами [Уапд е! а1., 1. №игосйет., 75:1155-1161 (2000)] с двумя промывками и хранили при концентрации белка 1 мг/мл в 10% глицерине при -70°С.

Восьминедельных самок мышей ЯВР (Ьасккоп ЬаЬк, Ваг нагЬог, МЕ) иммунизировали внутрибрюшинно либо эмульсией, содержащей 50 мкг №до-рецептор-1-СО8-7-мембран, либо целыми клетками С08, экспрессирующими на поверхности №до-рецептор-1, и 50 мкл адъюванта Я1В1 МРЬ+ТИМ+СУ8 (81дта® С11еииса1 Со., 8!. Ьоик, МО) 1 раз каждые 2 недели (Ыртап е! а1., 1992). Сыворотки из иммунизированных мышей собирали перед первой иммунизацией, спустя 7 дней после второй и третьей иммунизации и спустя 38 дней после третьей иммунизации и титры антител против №до-рецептора-1 измеряли с использованием ЕЬ18А, как описано ниже.

2. Специфические пептиды №до-рецептора-1 в качестве иммуногена.

Последовательность гена №до-рецептора-1 крысы подвергали анализам антигенности с использованием программы Уес!ог ΝΤί™ (фиг. 2). Антигенные пептиды, идентифицированные в этих анализах, конъюгировали с гемоцианином фиссуреллы (КЬн) с использованием стандартных процедур с использованием глутарового альдегида.

Восьминедельных самок мышей ЯВР (Ьасккоп ЬаЬк, Ваг нагЬог, МЕ) иммунизировали внутрибрюшинно эмульсией, содержащей 50 мкг КЬн-конъюгированных пептидов и 50 мкл полного адъюванта Фрейнда (81дта® С1ет1са1 Со., 8!. Ьоик, МО) 1 раз каждые 2 недели. Сыворотки из иммунизированных мышей собирали перед первой иммунизацией, спустя 1 неделю после второй и третьей иммунизации и измеряли титры антитела против №до-рецептора-1. После третьей иммунизации вводили бустерную дозу. Спустя 3 дня после этой иммунизации бустерной дозой начинали эксперименты по слиянию.

Получение и скрининг гибридом

Сыворотки из мышей, иммунизированных антигенными пептидами №до-рецептора-1, подвергали скринингу с использованием ЕЫ8А, тогда как сыворотки из мышей, иммунизированных клетками СО8, экспрессирующими №до-рецептор-1, подвергали скринингу проточной цитометрией. Мышей, которые были положительными в отношении антител, которые специфически связывали №§о-рецептор-1-СО8-7клетки, идентифицировали проточной цитометрией и умерщвляли. Из этих мышей выделяли спленоциты и сливали с миеломой РБ653 (АРЯТ- производным 1д-/нСРЯТ- миеломы мыши Ва1Ь/с, поддерживаемой в ИМЕМ, содержащей 10% ФТС, 4500 мг/л глюкозы, 4 мМ Ь-глутамин и 20 мг/мл 8-азагуанина), как описано (Кеппей е! а1., 1993. Мопос1опа1 АпйЬоб1е§: А №\ν Эппепмоп ш Вю1ощса1 Лпа1ум5. Р1епит Ргекк, №\ν Уогк). Слитые клетки высевали в 24- или 48-луночные планшеты (Согшпд С1а§8 Уогкк, Согшпд, ΝΥ) и подпитывали содержащей аденин, аминоптерин и тимидин культуральной средой. ААТ-устойчивые культуры подвергали скринингу с использованием ЕЫ8А или проточной цитометрии на связывание либо с №до-рецептор-1-СО8-7-клетками, либо с антигенным пептидом №до-рецептора-1, как описано ниже. Клетки в положительных лунках дополнительно субклонировали лимитирующим разведением.

Для скрининга на связывание антитела с антигенным пептидом №до-рецептора-1 пептиды, которые использовали в качестве иммуногенов, конъюгировали с БСА. 0,5 мкг конъюгированного пептида в 50 мкл 0,1М натрий-бикарбонатного буфера, рН 9,0 добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета Мах18огр™ (№пс™). Затем этот планшет инкубировали при 37°С в течение 1 ч или при 4°С в течение 16 ч и неспецифическое связывание блокировали с использованием 25 мМ ИЕРЕ8, рН 7,4, содержащего 0,1% БСА, 0,1% овальбумин, 0,1% Ь1о!!о и 0,001% азид. Гибридомный супернатант добавляли и инкубировали при 25°С в течение 1 ч. После промывания 3 раза ЗФР разведение 1:10000 конъюгированного с пероксидазой хрена козьего антимышиного вторичного антитела (1асккоп 1ттипоЯе8еагсй 1пс.) добавляли в каждую лунку и инкубировали дополнительно в течение 1 ч. После трех промывок окраску развивали при помощи ТМВ (Р1егсе) и останавливали 2М серной кислотой. Интенсивность окраски подвергали мониторингу в спектрофотометре при 450 нм.

Антитела подвергали скринингу на связывание с полноразмерным №§о-рецептором-1 следующим образом. Клетки СО8-7 метили 0,1 мкМ Се11Тгаскег™ Сгееп СМРИА (Мо1еси1аг РгоЬек, Еидепе, ОЯ), как описано изготовителем. Равные объемы меченых Се11Тгаскег™ контрольных клеток смешивали с промытыми №до-рецептор-1-СО8-7-клетками перед инкубированием с тест-сыворотками против №§о-рецептора-1. 50 мкл этой клеточной смеси помещали в каждую лунку 96-луночных У-донных полистироловых планшетов (Со§!аг® 3877, Согшпд, ΝΥ) и добавляли 100 мкл гибридомного супернатанта или контроль- 18 008253 ного антитела против Nодо-рецептора-1. После инкубирования при 4°С в течение 30 мин эти клетки промывали и инкубировали с 50 мкл конъюгированного с К-фикоэритрином аффинно чистого фрагмента 1’(аЬ')₂ вторичного козьего антитела против мышиного Ес !дС гамма (1:200, 1аскзоп ТтшипоКезеагск ЬаЬога1огу, \е§1 Сгоуе, РА) в ЗФР. В конце инкубирования эти клетки промывали дважды ЗФР и суспендировали в 200 мкл ЗФР, содержащего 1% ФТС, и подвергали ЕАС8-анализам. Альтернативно, ^до-рецептор-1-С08-7-клетки смешивали с гибридомным супернатантом и затем обрабатывали конъюгированным с Н-фикоэритрином козьим антимышиным вторичным антителом и непосредственно подвергали стандартным ЕАС8-анализам.

Авторы изобретения получали 25 антител против ^до-рецептора-Х с использованием различных иммуногенов. Авторы генерировали два антитела, 7Е11 и 5В10, с использованием пептидной последовательности, соответствующей остаткам 110-125 Nодо-рецептора-1 в качестве иммуногена. Авторы генерировали три антитела, 1Н2, 3С5 и 2Е7, с использованием мембран, полученных из клеток С08, трансфицированных полноразмерным крысиным ^до-рецептором^ в качестве иммуногена. Авторы генерировали 13 антител с использованием з^доКЗЮ-Ес в качестве иммуногена (1Ώ9.3. 1Е4.7, 1В4.3, 2С4.3, 1Е10.3, 2Н1.4, 1Н3.3, 1С4.1, 1Е4.1, 2С7.1, 2С4.1, 2Е11.1 и 1Н4.1) и 7 антител с использованием пептидной последовательности, соответствующей остаткам 423-434 крысиного ^до-рецептораЛ в качестве иммуногена (2Е8.1, 2С11.2 и 1В5.1).

Анализ последовательности моноклональных антител 7Е11 и 5В10

Авторы изобретения экстрагировали тотальную РНК с использованием мининабора (С)1адеп')'^; К^азу® и генерировали кДНК из выделенной РНК. Авторы амплифицировали последовательность легкой цепи при помощи ПЦР с использованием праймеров 5'-ТСАССАСАСССТСАСССТССТСССТТССССССАС-3' (8Е0 ΙΏ N0: 12) и 5'-АССТ8МАКСТССАС8АСТС\СС-3' (8Е0 ΙΏ N0: 25). Авторы амплифицировали последовательность тяжелой цепи при помощи ПЦР с использованием праймеров 5'-ССССАТАТССАССАТСААСТТСССТСТТАСССТСТТС-3' (8 ЕС) П) N0: 13 и 5'-ССССАТАТССАССАТСАССКСССС\\ССТСЛСУТУСТКС(Е\.-3' (813) И) N0: 14). Эти праймеры содержат следующие вырожденные нуклеотиды: 8 представляет С или С; М представляет А или С; К представляет С или Т; и Υ представляет Т или С. Авторы клонировали эти ПЦР-фрагменты в секвенирующий вектор и определяли последовательность ДНК СОК способом дидезокситерминации цепи с использованием праймеров, специфических в отношении этого секвенирующего вектора. Авторы умозрительно транслировали эти последовательности ДНК, и частичные аминокислотные последовательности СОК-районов тяжелой или легкой цепей моноклональных антител 7Е11 и 5В10 показаны в табл. 2. 3 СОК из тяжелой и легкой цепей этих тАЬ подчеркнуты в табл. 2. Легкие цепи 7Е11 и 5В10 имеют 94% идентичность аминокислотных последовательностей, а тяжелые цепи имеют 91% идентичность аминокислотных последовательностей. тАЬ 7Е11 и 1Н2 являются !дС1-изотипом, а т.АЬ 3С5 и 2Е7 являются !дС2а-изотипом. Каждое из этих пяти т.АЬ имеет легкую цепь изотипа каппа. Авторы изобретения анализировали последовательность других моноклональных антител с использованием этого подхода.

Таблица 2

Аминокислотная последовательность тАЬ 7Е11 и 5В10

	Последовательность	8Е0 ΙΌ ΝΟ:
Легкая цепь 7Е11	МКЪРУКШУЬМРШ РАЗ 8 ЗЦУУМТОТРЦЗЬРУЗЫЖСАЗ13 С кззозьтнзыеытуытьокреозркьыук^зыкгзсурц КР80808ОТОРТЬК15КУВАЕВЬСУУРС5ОЗТНУРРТР(3(3(ЭТ КЬЕ1КЕАОААРТУЗ15 НН	15
Легкая цепь 5В10	МКЬРУКШУЬМРШ ΡΑ333ϋννΜΤΟΤΡΕ3ΗΡν3Ό0ΌΟΑ3Ι ЗС КЗЗаЗЬУНЗЫаУТУЬНИУЪОЕРСЮЗРКЬЫУКУЗЫКРЗСУРВ ВРЗО5С50ТЦРТЬК13КУОАЕОЦ0УУРС5ОЗТНУРУТР0О0Т КЬЕ1ККАОААРТУЗIЗНН	16
Тяжелая цепь 7Е11	ТТГ\Т АПП/ПТУТЛТ ПТТТЛЧГНПЫТ\ ГМГЧЧГГПтгП'ГЧЛГТЛКЯТ.ТГ.’ГГГГЛ/-ЧТ1 ТЭП/Л ушгчгл©Ухи’кэк-лАОкдх ас лихпгшп СЬЕШ ΟΑΙϋΡΗϋΒ Υ3 5ΥΝΟΝΡΚ0ΚΆΤΣΤνοα3 3 ЗТАУМОЬЗ 3 ЪТЗЕЦ8АУУУСАКК1ТЕАОАИРАУИ0О0ТТ7Т	17
Тяжелая цепь 5В10	ЦОХЗОАЕ1УМРСТАУТМЗСКАЗ(ЗУТРТЦРЦМНЦУКОЕРеО0Ь· ΕΜΙ0ΑΙΟΡ3Ο3Υ8ΚΙΝΟΚΡΚΟΚΑΤΕΤνϋΕ388ΤΑΥΜΟΕ35ΣΤ 8ΕΟ3ΑνΥΥΟΑΚΚΙΤΕΑ0ΑΝΡΑΥΝ(3α0ΤΤνΤ	18

- 19 008253

Картирование эпитопов моноклонального антитела 7Е11 шЛЪ 7Е11 связывает ΝβΚ1 как крысы, так и человека. Для определения эпитопа, ответственного за связывание 7Е11, авторы генерировали фрагменты и синтетические пептиды крысиного ΝβΚ1 и испытывали их на связывание 7Е11.

Рекомбинантный фрагмент крысиного ΝβΚ1, который содержит все 8 доменов ЕВК и Ν- и С-концевые кэпы (₃\одоК310), обрабатывали либо кислотой, либо цианогенбромидом (САВг) и разделяли эти фрагменты гель-электрофорезом. Необработанный ₃\ороВ310 мигрирует со средней молекулярной массой 42 кДа. Обработка кислотой ₃\ороВ310 давала два основных продукта расщепления 15 кДа (аминокислота 27 - аминокислота 122) и 30 кДа (аминокислота 123 - аминокислота 310). Обработка САВг давала три фрагмента, дублет 33/35 кДа (аминокислота 27 аминокислота 220), который может представлять фрагменты с гетерогенным гликозилированием, продукт 10 кДа (аминокислота 241 - аминокислота 310) и фрагмент из 11 аминокислот (аминокислота 230 - аминокислота 240), который не удерживается на этом геле. Вестерн-блот этого геля зондировали 7Е11 и показали, что антитело 7Е11 связывалось с интактным Ν§Κ1 крысы (аминокислота 27 - аминокислота 310), кислотным фрагментом 15 кДа (аминокислота 27 аминокислота 122) и САВг-фрагментом 35 кДа (аминокислота 27 - аминокислота 239). 7Е11 не связывалось с кислотным фрагментом 30 кДа (аминокислота 123 - аминокислота 310) или СNΒ^-фрагментом 10 кДа (аминокислота 241 - аминокислота 310). Как кислотный фрагмент 15 кДа, так и САВг-фрагмент 35 кДа содержали последовательность Ε[)Ε3[)ΑΑ(')ΕΒ\\'[)ΡΤΤ (8ЕР ГО ΝΟ: 1), что согласуется со связыванием 7Е11 с единственным эпитопом на ΝβΚ1.

Сайт связывания 7Е11 дополнительно анализировали тестированием пептидных продуктов расщепления трипсином ₃АодоВ310. ВЖХ-анализы показали несколько фрагментов, что свидетельствует о том, что в последовательности ΝβΚ1 были несколько чувствительных к трипсину остатков лизина и аргинина. Антитело 7Е11 связывалось только с единственным пептидом продукта расщепления трипсином, обеспечивая дополнительное доказательство того, что 7Е11 связывается с единственным эпитопом на ΝβΚ1. Последующая масс-спектроскопия (М8) и анализы последовательности идентифицировали связанный пептид как ΑΑΑΓΤΘΕΤΕΕΕΡΕΏΕ8ΏΝΑΡΕΚ (8Ер ГО ΝΟ: 26).

Пептид Ε[)Ε3[)ΑΑ(')ΕΒ\\'[)ΡΤΤ (АЕС) ГО ΝΟ: 1) подвергали дополнительному анализу картирования. Этот пептид расщепляли трипсином, что дает два основных фрагмента, ΕΏΕ8ΏΝΑΡΕΚ (8ЕР ГО ΝΟ: 27) и \\Ί)ΡΤΤ (8ЕР ГО ΝΟ: 28), и испытывали способность 7Е11 связывать их. МС-анализ выявил, что это антитело связывало пептид ΕΏΕ8ΏΝΑΡΕΚ (А ЕЕ) ГО ΝΟ: 27), и, следовательно, этот пептид содержит связывающий эпитоп для 7Е11. В этой фракции пептидов подробный МС-анализ идентифицировал несколько перемешанных пептидов, которые также связывали 7Е11, в том числе пептидов с дезаминированием при Α§η115 и О1п117, добавлением аланина в положениях 112 или 113 или добавлением серина в положении 114 (табл. 3). Эти данные указывают на то, что несколько аминокислотных остатков, расположенных в этом пептидном фрагменте, могут не быть критическими для связывания антитела 7Е11.

Таблица 3

Мутантные пептиды, связываемые 7Е11

Связанные пептиды	Аминокислотная последовательность
Фрагмент дикого типа Дезаминированный	Ι_ϋΙ_80ΝΑ0Ι_Β (5ЕО Ю N0:27) Ш1_8ООАЕ1_Н (8ЕО ГО N0:29)
Перемешанный фрагмент №1 Дезаминированный	ίΌΙ-ΑδΟΝΑΟΙ-Β (8ЕО ГО N0:30) 1_01_А800АЕ1_Н (8ЕО ГО N0:31)
Перемешанный фрагмент №2 Дезаминированный	Ι_ΟΑΙ_8ΟΝΑΟΙ_Η (8ЕО ГО N0:32) ЮА1_800АЕ1_В (8ЕО ГО N0:33)
Перемешанный фрагмент №3 Дезаминированный	Ι_0Ι_880ΝΑ0Ι_Β (8ЕО ГО N0:34) ίΙ)Ι_380ΕΑΕΙ_Η (8ЕО ГО N0:35)

Пептид ΕΏΕ8ΏΝΑρΕΚ\ΏΡΤΤ (8ЕР ГО ΝΟ: 1) расщепляли также эндопротеазой Α§ρ-Ν и тестировали связывание 7Е11. Эндопротеаза Α§ρ-Ν расщепляла этот пептид на 3 пептидных фрагмента, Е, ЭЙЗ и [)ΑΑ(')ΕΒ\\'[)ΡΤΤ (8ЕР ГО ΝΟ: 36). Из этих продуктов 7Е11 связывало пептид Ι)ΑΑ(')ΕΒ\\'[)ΡΤΤ (8ЕР ГО ΝΟ: 36). Взятые вместе, данные расщепления трипсином и Α§η-Ν дополнительно определяют местоположение эпитопа, связывающего 7Е11, в последовательности, общей между ними, Ι)ΑΑ(')ΕΒ (АЕ(') ГО ΝΟ: 37).

Аминокислотные последовательности ΝβΚ1, АдВ2 и ΝβΚ3 из различных видов анализировали для предсказания критических остатков в 7Е11-связывающем эпитопе на основе наблюдения, что 7Е11 свя

- 20 008253 зывало Ν§Κ1 крысы и человека, но не ΝβΚ1 мыши, ΝβΚ2 человека или ΝβΚ3 мыши. Сопоставление последовательностей обнаружило, что аминокислоты 110-125 крысиного \дЕ1 и соответствующая последовательность Ν§Κ1 человека являются идентичными и что последовательность мышиного ΝβΚ1 отличается только одной аминокислотой в положении 119 (Агд119 в ΝβΚ1 крысы и человека и Н1з119 в ΝβΚ1 мыши; табл. 4).

Таблица 4

Сопоставление последовательностей \дЕ из разных видов

Белок (белки)	Последовательность аа 110 - аа 119	δΕΟ Ю N0:
ΝςΒΙ крысы и человека	Ι_ΟΙ_8ΟΝΑΟΙ_Β	27
ЫпР| мыши	Ι_0Ι_80ΝΑΩΙ_Η	38
ЫдН2 крысы и человека	ι_οι_αοΝΗΗΐ_ρΐ	39
ЫдВЗ крысы, человека и мыши	ι_ου3θΝΗαι_Β	40

Агд119 на ΝβΚ1 способствует связыванию антитела 7Е11, так как оно связывается хорошо с ΝβΚ1 крысы и человека, но слабо с \дЕ1 мыши. Подобным образом, поскольку антитело 7Е11 не связывается хорошо с Ν§Κ3, А1а116 участвует в этом эпитопе, так как в последовательности 1)\АС)ЕЕ (АЕЕ) II) ΝΟ: 37) Ν§Κ3 отличается от ΝβΚ1 только аргинином в соответствующей последовательности. В последовательности 1)\АС)ЕК 4 из 6 остатков в ΝβΚ2 являются идентичными ΝβΚ1 крысы. А1а116 и 6111117 заменены аргинином и гистидином, соответственно. Это подтверждает, что А1а116 является важным аминокислотным остатком, способствующим связыванию антитела 7Е11, но не должен обязательно мешать участию 61п117.

Для подтверждения этих точек контакта генерировали несколько пептидов, содержащих точковые мутации в последовательности ΕΏΕ8ΏΝΆΡΕΚ (8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: 27), и тестировали их на связывание антитела 7Е11. Эти пептиды иммобилизовали на планшете \1ах18о1р(!т)(\и11с(!т)) и наносили несколько разведений антитела 7Е11. Полученные величины ЕС₅₀ показаны в табл. 5.

Антитело 7Е11 связывалось с мутантами Еен110А1а и Азр111А1а с величинами ЕС₅₀, сходными с величинами исходного пептида. При испытании 61п117А1а ЕС₅₀ увеличивалась в 30 раз, и при испытании Агд119Н1з ЕС₅₀ увеличивалась в 25 раз. Наиболее значительное изменение ЕС₅₀ наблюдали при мутации Агд 119 в аланин.

Таблица 5

7Е11 связывается с мутантными пептидами с различными ЕС₅₀

Изменение в пептиде	Последовательность	ЕС50	ЗЕО Ю ΝΟ:
Нет изменений	ЬОЬЗОЦА(2ЬВУУОРТТ	0, 55	1
Ы10А	ΑΟΣδϋΝΑΟΕΚννΟΡΤΤ	0, 62	41
Ώ111Α	ЬАЬ5 ΏΝΑΩΣΚννΟΡΤΤ	0,31	42
0117А	ЬОЬЗ ΟΝΑΑΣΚννΟΡΤΤ	16	43
Р.119Н	ЬОЬЗОМАОЬНУУОРТТ	12	44
К119А	ЬОЬЗОБАОЬАУУОРТТ	88	45

Положение эпитопа связывания 7Е11 определяли также в недавно выясненной кристаллической структуре з^доЮЮ. Как и ожидалось, эта структура показывает, что эпитоп 7Е11 экспонирован на поверхности этой молекулы. Остатки Агд119, 0111117, А1а116 и Азр114 выступают наружу из этой структуры, в то время как Еен118 и Азп 115 расположены вовнутрь. Этот эпитоп опускается на верхнюю часть кислотного пластыря в вогнутой поверхности этой структуры и основной поверхности, которая обращена к одной из этих сторон.

Ингибирование связывания лиганда с растворимым \одо-рецентором-1 моноклональным антителом против Nодо-рецептора-1

Моноклональные антитела против Nодо-рецептора-1, полученные, как описано выше, испытывали для определения, ингибировали ли они связывание лиганда с Nодо-рецептором-1.

0,5 мкг слитого белка растворимого Nодо-рецептора-1, содержащего аминокислотные остатки 26344 Nодо-рецептора-1 крысы и шарнирную область и Ес-район молекулы 1д61 крысы (8NодоΚ344-Εс),

- 21 008253 полученного, как описано ниже, иммобилизовали на 250 мкг конъюгированных с белком А или агглютинином зародышей пшеницы гранул 8РА (АтегзЬат РйагтаОа Вю1есЬ) в течение 2 ч при 25°С. Гранулы 8РА, связанные с Рс-чХоцоК-Г тАЬ против Хоцо-рецептора-Р и 1 мкл ¹²⁵I-Nодо66 (АтегзЬат, 2000 Ки/'ммоль, 1 нМ), в 50 мкл забуференной ΗΕΡΕ8 инкубационной среды (10 мМ НЕРЕ8, рН 7,4, 0,1% бычий сывороточный альбумин, 0,1% овальбумин, 2 мМ МдС1₂, 2 мМ СаС1₂ и ингибиторы протеаз) добавляли в каждую лунку с пробой. Спустя 16 ч радиоактивность измеряли в четврех повторностях проб с использованием ТорСоип1® (Раскагб). Величины ГС₅₀ рассчитывали из анализа вычерчивания кривых (фиг. 3) (ΡΚΙ8Μ, ОгарЬРаб 8ой^аге, N1). В некоторых экспериментах авторы использовали также конъюгаты АРлиганд (например, АР-Ыодо66) и детектировали связывание мониторингом активности щелочной фосфатазы. Авторы анализировали также способность этих тАЬ блокировать связывание лигандов МАО-Рс и АР-ОМ-др с Nодо-рецептором-1.

Все моноклональные антитела 7Е11, 5В10, 1Н2, 305 и 2Р7 ингибировали связывание Nодо66. МАО и ОМ-др с зNодоК344-Γс. Рассчитанные КХ, для №до66 в отношении 7Е11 и 1Н2 были равны 400 и 60 нМ, соответственно. Данные из ЕЫ8А-мониторинга тАЬ-опосредованного ингибирования связывания этих трех лигандов с Nодо-рецептором-1 суммированы в табл. 6.

Таблица 6 тАЬ ингибируют связывание Nодо66. МАО и ОМ-др с Nодо-рецептором-1

тАЬ	МАО + зЫодоК344-Ес	Ыодобб + зМодоВ344-Гс	ОМ-др + зМодоК344-Ес
7Е11	30 нМ (60%) ЕС5о=О, 5 мкм	ЕС5о=1,7 мкм	ЕС5о=15О нМ
1Н2	30 нМ (60%)	Νϋ	Νϋ
305	30 нМ (60%)	ЕС50=9 нМ	ΝΌ
2Е7	30 нМ (55%)	ЕС5о=10 нМ	ЕС50=5 нМ
Ю9.3	30 нМ (70%) ЕС5о=2,7 нм	ЕС50=13 нМ	ЕС5о=5,2 нМ
207.1	30 нМ (84%)	ЕС50=18 нМ	ЕС5о=1 нМ
1Е4.1	30 нМ (75%) ЕС5о=2,8 нм		ЕС50=9,1 нМ
104.1	30 нМ (90%) ЕС5о=9 , 9 нм		ЕС50=8,2 нМ
2С4.1	30 нМ (50%)	-	N0
2Г11.1	30 нМ (45%)	Νϋ	Νϋ
1Н4.1	-	ΝΌ	Νϋ
2Е8.1	30 нМ (87%) ЕС5о=9,2 нм	ЕС5о=1,5 нМ	ЕС50=42,9 нМ
2011.2	30 нМ (80%)	Νϋ	Νϋ
1В5.1	30 нМ (0%)	Νϋ	Νϋ

Процентное вытеснение показано при 30 нМ антителе и ЕС₅₀ для некоторых тАЬ определяли из анализа вычерчивания кривых, как описано. - указывает отсутствие детектируемой активности, а N0 обозначает не определяли.

Пример 2. Получение антител против Nодо-рецептора-1 в виде РаЬ-фагов.

Антитела против Nодо-рецептора-1 в виде РаЬ-фагов, которые специфически связывают иммуногенный полипептид Nодо-рецептора-1 данного изобретения, получали также скринингом РаЬ-фаговой библиотеки следующим образом.

Библиотеку МогрЬо8уз РаЬ-фагов Н1САБ® 0()1,1) подвергали скринингу против крысиного растворимого з^доЮЮ-Гс-белка и клеток С08-7, экспрессирующих крысиный Nодо-рецептор-1. РаЬ-фаги, которые специфически связывались с Nодо-рецептором-1. очищали и характеризовали. Тяжелую цепь 14Ό5 получают из гена У_Н2, а легкую цепь получают из гена У_к1. Аминокислотные последовательности СЭК тяжелой цепи и легкой цепи одного из этих РаЬ-фагов 14Ό5 показаны в табл. 7.

- 22 008253

Таблица 7

Аминокислотная последовательность СЭК 14Ό5

	Аминокислотная последовательность	3ΕΩ N0:	Ю
СОК1	тяжелой	СЕЗЬЗТЗССЗУС	19
цепи
СЭК2	тяжелой	ЫУЗЫОТКУУЗТЗЬКТ	20
цепи

СОКЗ тяжелой цепи	ЗКГИТСЕУОУ	21
СБК1 легкой цепи	ΚΑ3<2ΝΙΑΙΊΈΝ	22
СЭК2 легкой цепи	ЬАЗЗЬ<25	23
СЭКЗ легкой цепи	ΟΟΥΟΝΥΡΙ,	24

14Ό5 связывается с крысиным Ыодо-рецептором-1 как в моновалентной, так и в бивалентной форме. Кроме того, 14Ό5 связывается с Ыодо-рецептором-1 мыши и человека и Ыодо-рецептором-2 человека, но не с Ыодо-рецептором-3 мыши.

Пример 3. Иммунопреципитация Ыодо-рецептора-1 моноклональными антителами против Ыодорецептора-1.

Для выполнения иммунопреципитации 100 мкл лизированных клеток или 50 мкл Р1РЬС-обработанных клеток смешивали с 400 или 450 мкл буфера для экстракции [10 мМ Трис-НС1, рН 7,2, 0,5% Твин20™, 0,2 мМ РМ8Р] или буфера К1РА, соответственно, в присутствии 30 мкл белка А или О и 1-2 мкг антитела. Эту смесь инкубировали в шейкере при 4°С в течение 16 ч.

Пробы откручивали осторожно для осаждения связанных с белком А или белком О гранул. Эти гранулы промывали 3 раза 1 мл промывочного буфера (10 мМ Трис-НС1, рН 7,2, 0,1 Твин-10™). Конечную промывку выполняли с использованием 10% исходного промывочного буфера.

Гранулы ресуспендировали в 100 мкл 2х ДСН с 10% бета-меркаптоэтанолом. Пробы инкубировали при комнатной температуре перед прохождением на 4-20% Трис-глициновом геле для электрофореза в ДСН-ПААГ. Как определено анализом геля электрофореза в ДСН-ПААГ, моноклональные антитела, 305 и 2Г7, иммунопреципитируют Ыодо-рецептор-1.

Пример 4. Определение специфичности антител с использованием ЕЫ8А.

Для определения специфичности моноклональных и РаЬ-фаговых антител, полученных в примерах 1 и 2, авторы выполняли ЕЫ8А с использованием панели полипептидов Ыодо-рецептора-1. Эта панель состояла из 8Ыо§оК310-Рс (слитого белка, содержащего аминокислоты 26-310 крысиного Ыодо-рецептора-1 и крысиный Рс-фрагмент), зЫодоК344-Рс (см. зирга), полипептида р-617 (8ЕО Ш ΝΟ: 1), полипептида р-618 (полипептида из 19 аминокислот из района ЕКК7 крысиного Ыодо-рецептора-1; фиг. 2; 8ЕЕ) Ш ΝΟ: 11) и полипептидов р-4 и р-5 (полипептидов из районов ЬКК5 и ЬККСТ Ыодо-рецептора-1, соответственно). Овальбумин и БСА использовали в качестве контролей. Как показано на фиг. 4, все тАЬ 1Н2, 305 и 2Г7 специфически связывались с зЫодоК344-Гс. В сходных экспериментах эти антитела также специфически связывали полипептид, состоящий из аминокислот 310-344 крысиного Ыодо-рецептора-1 (8ЕР Ш ΝΟ: 3), а тАЬ 7Е11 и 5В10 специфически связывали полипептид р-617 (8Е0 ГО ΝΟ: 1).

Десять из этих антител (1Ό9.3, 1Е4.7, 1В4.3, 2С4.3, 1Р10.3, 2Н1.4. 1Н3.3, 104.1, 1Е4.1 и 207.1), полученные из иммунизации з^доКЗЮ-Рс, вытесняли друг друга в отношении связывания, что свидетельствует о том, что они узнают сходные или перекрывающиеся эпитопы на з№доКЗ'10-Рс. Три других антитела из иммунизации з^доКЗЮ-Рс (2С4.1, 2Р11.1 и 1Н4.1) узнают разные эпитопы, расположенные в аминокислотных остатках 26-310.

Авторы изобретения выполняли также анализы связывания ЕЫ8А с использованием РаЬ-фага 14Ό5. Когда лигандам АР-\одо66, АРГОМ-др и МАО-Рс давали связываться с иммобилизованным зNодоК344-Рс, 1 мкМ 14Ό5 полностью ингибировал связывание МАО. Требовалось 10 мкМ 14Ό5 для полного ингибирования связывания ОМ-др с зNодоК344-Рс.

Пример 5. Анализ выроста нейритов.

Для испытания способности моноклональных антител и РаЬ-фаговых антител, полученных, как описано выше, ослаблять ингибиторное действие миелина ЦНС на нейроны культуральные предметные стекла ЬаЬ-Тек® (4 лунки) покрывали 0,1 мг/мл поли-О-лизина (81дта®). Миелин ЦНС или ЗФР наносили в виде капель по 3 мкл. Флуоресцентные микросферы (Ро1узс1епсез) добавляли к миелину/ЗФР для

- 23 008253 создания возможности последующей идентификации этих капель (Сгапйрге е! а1., Ыа!иге 403, 2000). Затем предметные стекла ЬаЬ-Тек® промывали и покрывали 10 мкг/мл ламинина (С1Ьсо™). Дорсальные корешковые ганглии (ЭКС) из детенышей крыс Р3-4 8ргащ.1е-Эа\у1еу диссоциировали 1 мг/мл коллагеназы типа 1 (\Уог11ипд1оп). растирали с использованием отполированных оплавлением Пастеровских пипеток, предварительно высевали для обогащения нервных клеток и, наконец, высевали при 23000 клеток на лунку на предварительно покрытые ЬаЬ-Тек® культуральные предметные стекла. Культуральной средой была среда Р12, содержащая 5% инактивированную нагреванием донорскую лошадиную сыворотку, 5% инактивированную нагреванием фетальную телячью сыворотку и 50 нг/мл тЫСР и инкубированная при 37°С и 5% СО₂ в течение 6 ч. 15 мкг/мл тАЬ 7Е11 добавляли сразу же после посева.

Предметные стекла фиксировали в течение 20 мин 4% параформальдегидом, содержащим 20% сахарозу, и окрашивали на нейронный маркер анти-бета-111-тубулин-антителом (Соуапсе ТИЛ), разведенным 1:500. В качестве вторичного антитела, антитело против мышиного 1д А1еха Р1иог® 594 (Мо1еси1аг РгоЬек) разводили 1:300 и предметные стекла покрывали Се1/Моип!™ (Вютейа™). Получали 5 цифровых изображений с использованием программного обеспечения ОрепЬаЬ™ и анализировали их с использованием программного обеспечения Ме!аМогрЬ® для количественного определения выроста нейритов.

тАЬ 7Е11 защищали ЭКС-нейроны от опосредованного миелином ингибирования выроста нейритов (фиг. 5). Сходные результаты наблюдали с тАЬ 1н2 и 3С5.

В анализе защиты выроста нейритов, в котором ЭКС-нейроны крыс Р7 культивировали на миелиновом субстрате ЦНС, бивалентное антитело 14Э5 также эффективно стимулировало вырост нейритов.

Пример 6. Иммунохимия с 7Е11 на клетках, трансфицированных Ыодо-рецептором-1.

Для дополнительной характеристики свойств связывания тАЬ против Ыодо-рецептора-1, полученных, как описано в примере 1, авторы изобретения сравнивали связывание как с фиксированными, так и с живыми клетками СО8-7 или 293, экспрессирующими Ыодо-рецептор-1 крысы или человека.

Фиксированные клетки.

Трансфицированные и не трансфицированные Ыодо-рецептором-1 клетки высевали в 8-луночных культуральных предметных стеклах ЬаЬ-Тек®, фиксировали 4% параформальдегидом в течение 15 мин, блокировали 10% нормальной козьей сывороткой, 0,1% Тритоном Х-100 в ЗФР в течение 1 ч. тАЬ 7Е11 добавляли при 15 мкг/мл и 1,5 мкг/мл в блокирующем растворе и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре: А1еха®-конъюгированное вторичное антимышиное антитело (Мо1еси1аг РгоЬек) инкубировали при разведении 1:300 в блокирующем растворе в течение 1 ч; ЭАР1 добавляли при 5 мкг/мл ко вторичному антителу для мечения всех ядер.

Живые клетки.

Трансфицированные и не трансфицированные Ыодо-рецептором-1 клетки высевали в 8-луночных культуральных предметных стеклах ЬаЬ-Тек®, блокировали РАС8-буфером (содержащим 4% донорскую лошадиную сыворотку) в течение 30 мин при 4°С, инкубировали с 7Е11 при 15 мкг/мл и 1,5 мкг/мл в РАС8-буфере в течение 1 ч при 4°С, промывали и инкубировали со вторичным антимышиным антителом А1еха® (1:300 в РАС8-буфере) в течение 30 мин при 4°С.

Эксперименты с иммуногистохимическим окрашиванием показали, что все тАЬ связывали клетки, экспрессирующие крысиный Ыодо-рецептор-1. тАЬ 7Е11, 2С7.1 и 2С4.1 связывали как фиксированные, так и живые клетки, экспрессирующие Ыодо-рецептор-1 человека.

Пример 7. Мышиная модель повреждения контузией спинного мозга.

Для испытания действия тАЬ Ыодо-рецептора-1, полученных, как описано в примере 1, на нейроны 1п у1уо авторы изобретения используют модель повреждения контузией спинного мозга.

Самок мышей (18-22 г) обрабатывали профилактически анальгезирующими и антибиотическими агентами. Мышей анестезировали и помещали в стереотаксический аппарат с фиксацией позвоночника под стереомикроскопом. Травму позвоночника вводят модифицированной версией \\'ещ1и-йгор-способа (способа с падением груза) (М. Ь1 е! а1., Рипсйопа1 го1е апй Легареийс йпрйсайопк оГ пеигопа1 сакраке-1 апй -3 ш тоике тойе1 оГ !гаитайс крта1 согй идшу. Ыеигокаепсе. Уо1. 99, рр. 333-342, 2000).

Вкратце, выполняют ламинэктомию Т9 и Т10 и позвоночник стабилизируют с использованием пары мышиных поперечных зажимов, поддерживающих билатерально поперечные выступы Т9-Т10. Ударный стержень из нержавеющей стали с диаметром 1,4 мм и массой 3 г поднимают на 2,5 см выше твердой мозговой оболочки и роняют на спинной мозг на уровне Т10. Во время хирургии мышей держат на согревающем одеяле при 37°С и 1 мл подогретого стерильного солевого раствора вводят подкожно каждой мыши после хирургии во избежание обезвоживания. Мочевой пузырь вручную отжимают 1 раз в день, пока не восстанавливается рефлекторный контроль мочевого пузыря.

Все животные получают послеоперационную анальгезию каждые 8-12 ч после хирургии и антибиотическую обработку 2 раза в день в течение 7 дней после этого. Животные имеют свободный доступ к корму и воде в течение всей продолжительности этого исследования. Антитела Ыодо-рецептора-1 доставляют к месту повреждения посредством подоболочечной инъекции в течение 28 дней, как описано в крысиной модели рассечения спинного мозга ниже.

Пример 8. Характеристика слитых белков растворимого Ыодо-рецептора-1.

Для характеристики полипептидов растворимого Ыодо-рецептора-1 (кЫодоК-1) и слитых белков

- 24 008253 растворимого Ыодо-рецептора-1 (Ρο-δΝο^οΚ-Ι) авторы выполняли следующий эксперимент.

мкг растворимых Νοβο-рецепторов (δΝο§οΚ310-Ρε и δΝοβθΚ.34 4-Рс) иммобилизовали на 250 мкг гранул \νθΛ-8ΡΛ. и они получали 0,5 мкл радиоактивного лиганда (конечная концентрация 0,5 нМ) в конечном объеме 100 мкл буфера для связывания (20 мМ НЕРЕБ, рН 7,4, 2 мМ Са, 2 мМ Мд, 0,1% БСА, 0,1% овальбумин и ингибиторы протеаз). Лиганды включали в себя 10 мкМ Nοдο66, 10 мкМ ¹²⁵I-Nοдο40 (аминокислоты 1-40 NοдοΑ) и 10 мкл супернатанта антитела против Nοдο-рецептора-1 для каждого набора лигандов. Три тирозина на Nοдο40 иодинировали по отдельности и обозначали Nοдο40-Α, -В и -С соответственно. Средние величины трех повторностей представлены в виде нормализованной % связанной радиоактивности (фиг. 6-8). Столбики ошибок указывают БЕМ. Связанную радиоактивность в отсутствие ингибиторов принимали за 100%, а самую низкую связанную радиоактивность в присутствии 10 мкМ Nοдο40 принимали за 0% для нормализации данных.

Пример 9. Ингибирование связывания лиганда со слитым белком растворимого Nοдο-рецептора-1.

Использовали анализ связывания, сходный с анализом связывания примера 8 для испытания способности двух шАЬ, полученных в примере 1, ингибировать связывание ¹²⁵I-Nοдο66 с δΝοβοΡ344-Ρ^ Моноклональные антитела (тАЬ) 2Р7 и 365 ингибировали связывание ¹²⁵I-Nοдο66 с δΝοβοΡ344-Ρ^

Пример 10. Анализ выроста нейритов.

Культуральные предметные стекла ЬаЬ-Тек® (4 лунки) покрывали 0,1 мг/мл поли-Э-лизина (81дта®). Миелин ЦНС, отдельно или смешанный с δΝοβοΚ310, слитым белком δΝοβοΚ310-Ρ^ тАЬ 5В10 или контроль ЗФР наносили в виде капель по 3 мкл. Флуоресцентные микросферы (Ροϊνδ^ΐ'^δ) добавляли к миелину/ЗФР для создания возможности последующей идентификации этих капель (бгапйрге е1 а1., №1Шге 403, 2000). Затем предметные стекла ЬаЬ-Тек® промывали и покрывали 10 мкг/мл ламинина (6ί^ο™).

Дорсальные корешковые ганглии (ΌΡ6) из детенышей крыс Р3-4 8ргадие-Эате1еу диссоциировали 1 мг/мл коллагеназы типа 1 (νοΠΗιηβΙοη), растирали с использованием отполированных оплавлением Пастеровских пипеток, предварительно высевали для обогащения нервных клеток и, наконец, высевали при 23000 клеток на лунку на предварительно покрытые ЬаЬ-Тек® культуральные предметные стекла. Культуральной средой была среда Р12, содержащая 5% инактивированную нагреванием донорскую лошадиную сыворотку, 5% инактивированную нагреванием фетальную телячью сыворотку и 50 нг/мл тN6Ρ и инкубированная при 37°С и 5% СО₂ в течение 6 ч. 15 мкг/мл тАЬ 7Е11 добавляли сразу же после посева.

Предметные стекла фиксировали в течение 20 мин 4% параформальдегидом, содержащим 20% сахарозу, и окрашивали на нейронный маркер анти-бета-111-тубулин-антителом (С^апсе ТИЛ), разведенным 1:500. В качестве вторичного антитела, антитело против мышиного 1д А1еха ΡΙπογ® 594 (ΜοΚαιΡίΓ РгоЬек) разводили 1:300 и предметные стекла покрывали 6е1/Μοинΐ™ (Вютейа™). Получали 5 цифровых изображений с использованием программного обеспечения ОрепЬаЬ™ и анализировали их с использованием программного обеспечения ΜеίаΜο^рй® для количественного определения выроста нейритов.

^ΝοβοΕ^/Η), 5ΝοβοΡ310^ и тАЬ 5В10 защищали ΌΚΟ-нейроны от опосредованного миелином ингибирования выроста нейритов (фиг. 9, 10). δΝοβοΚ310 использовали в сходном анализе с использованием куриных нейронов, и было обнаружено, что он является защитным.

Авторы испытывали также нейропротективное действие растворимых Νοβο-рецепторов проведением экспериментов с клетками, выращиваемыми в присутствии и в отсутствие ламинина. Рост нервных клеток в средах без ламинина является слабым и моделирует условия нейронного стресса.

Ганглии ΌΚ6 иссекали из постнатальных 6-7-дневных детенышей крыс (Р6-7), диссоциировали их на отдельные клетки и высевали на 96-луночных планшетах, предварительно покрытых поли-Э-лизином, как описано выше. В некоторые лунки 2 мкг/мл ламинина добавляли в течение 2-3 ч и ополаскивали перед высевом этих клеток. После 18-20 ч инкубирования эти планшеты фиксировали 4% параформальдегидом, окрашивали анти-бета-111-тубулин-антителом, разведенным 1:500 (^уансе®), и анти-НиС/ϋ-антителом, разведенным 1:100 (ΜοΕαιΡΗ· РгоЬек), и добавляли флуоресцентные вторичные антитела (ΜοΕαιΡΗ· РгоЬек) при разведении 1:200. АггауБсап® II (Се^тк^®) использовали для улавливания 5х цифровых изображений и для количественного определения выроста нейритов в виде среднего выроста нейритов/нейрон на лунку посредством использования приложения №игйе οιιΙβΐΌ\\11ι арр11са1юп. Анализировали девять 5х изображений из 3 лунок/условие варианта.

В некоторых вариантах осуществления использовали субклон клеток РС12 (Nеи^08С^еен™) (Се11οт^С8®’). Клетки №иго5сгееп^|Л| предварительно дифференцировали в течение 7 дней 200 нг/мл Ν6Ρ (фактора роста нервов), разделяли и повторно высевали на 96-луночные планшеты, предварительно покрытые полиΌ-лизином. В некоторые лунки 5 мкг/мл ламинина добавляли в течение 2-3 ч и ополаскивали перед высевом этих клеток. После 2 дней инкубирования эти планшеты фиксировали 4% параформальдегидом, окрашивали кроличьим анти-бета-111-тубулин-антителом, разведенным 1:500 (Сονаηсе®), и ЩеЛй (ядерным красителем). АггауБсап® II (Се11οт^с8®) использовали для количественного определения выроста нейритов, как и в клетках ΌΚ6.

δΝοβοΡ344^ или крысиные ^6 добавляли в раствор для ΌΚΟ-нейронов Р6-7 и к дифференцированным клеткам ^игоксгееп™ в момент высева.

Нейропротективное действие δΝοβοΡ344^ наблюдали при 1 и 10 мкМ, когда ИВб-нейроны Р6

- 25 008253 выращивали в отсутствие ламинина. Количественное определение выроста нейритов показало зависимое от дозы увеличение с добавлением к№доК344-Ес. Добавление к№доК344-Ес в той же самой концентрации к ИКС-нейронам, выращиваемым на ламининовом субстрате, не давало какого-либо необычного эффекта, указывая на то, что к№доК344-Ес является активным только на подвергнутых стрессу клетках. Нейропротективное действие к№доК344-Ес при той же самой концентрации в отсутствие ламинина наблюдали также с клетками №итоксгееп™.

Пример 11. Получение и очистка слитого белка Ес-к№доК-1.

Конструкцию кДНК, кодирующую аминокислоты 1-310 крысиного №до-рецептора-1, сливали с крысиным Ес Ι§01, содержащимся в экспрессирующем векторе млекопитающего, и этот вектор вводили электропорацией в клетки яичника китайского хомячка (СНО) (ΌΟ44). Клетки поддерживали в альфаМЕМ, дополненной 10% диализованной фетальной телячьей сывороткой, 2 мМ глутамином и антибиотическими-противомикробными реагентами. Спустя 2 дня после трансфекции кондиционированную среду собирали и анализировали Вестерн-блоттингом при восстанавливающих условиях. Полосу белка приблизительно 60 кДа детектировали с использованием поликлонального кроличьего антитела против №до-рецептора-1. Клетки размножали и подвергали сортингу с использованием К-РЕ-конъюгированного козьего антитела против ЦС крысы. После второго сортинга клетки высевали при плотности одна клетка на лунку в 96-луночных планшетах. Определяли уровни секретируемого растворимого белка №до-рецептора-1 из индивидуальных лунок и сравнивали с использованием Сэндвич-ЕЫ8А. Планшет ЕЫ8А покрывали козьим ЕсК-специфическим антителом против крысиного ЕаЬ ЦС. Использовали кондиционированную среду. Связанный растворимый белок №до-рецептора-1 детектировали нКР-конъюгированным ослиным Ес-специфическим антителом против ЕаЬ ЦС крысы. Клон 4С12 имел наивысший уровень секреции. 4С12 размножали и выращивали в среде СН0-М7 во вращающейся колбе. Уровень секреции был приблизительно 10 мг/л при 37°С.

Клетки СНО, экспрессирующие слитый белок к№доК310-Ес, культивировали в крупном масштабе. 1,7 л концентрированной кондиционированной среды получали из опыта с биореактором на 10 л. рН повышали добавлением 1/10 объема 1,0 М Трис-нС1, рН 8,9. Твердые хлорид натрия и глицин добавляли до 3,0М и 1,5М, соответственно. Готовили белок А-сефарозную колонку 60 мл, уравновешенную 10 мМ Трис-нС1, 3М хлоридом натрия, 1,5М глицином, рН 8,9. Концентрированную кондиционированную среду наносили на эту колонку при скорости 1,5 мл/мин с использованием перистальтического насоса. Колонку промывали 300 мл 10 мМ Трис-НС1, 3М хлорида натрия, 1,5М глицина, рН 8,9, и затем 120 мл 5 мМ Трис-НС1, 3М хлорида натрия, рН 8,9. Белок элюировали 25 мМ фосфатом натрия, 100 мМ хлоридом натрия, рН 2,8. Фракции по 10 мл собирали в пробирки, содержащие 1,0 мл 1,0М нЕРЕ8, рН 8,5. Белковые фракции объединяли и диализовали против 3х2 л 5 мМ фосфата натрия, 300 мМ №С1, рН 7,4.

Пример 12. Анализ поперечного разреза спинного мозга.

Для испытания его способности стимулировать функциональное восстановление ш νί\Ό слитый белок к№доК-1 испытывали в анализе поперечного разреза спинного мозга крысы.

Осмотические насосы АНе!® загружали тест-раствором (к№доК310-Ес в ЗФР), свежеприготовленным в день использования. Было рассчитано, что концентрация загрузки была 5 и 50 мкМ. Насосы праймировали в течение >40 ч при 37°С перед имплантацией в животных. Самки крыс Ьопд Ενаηк получали предоперационную анальгезию и транквилизатор и были анестезированы изофлураном (3% в 02).

Крыс помещали в стереотаксическую рамку и двигательную область коры головного мозга обнажали для инфузии прослеживающего путь агента ВИА (молекулярная масса 10000) билатерально. Затем крыс подвергали дорсальному одностороннему разрезу спинного мозга на уровне Т5-Т6 с последующей имплантацией подоболочечного катетера и системы насоса для доставки тест-соединения (п=11 на группу).

Крысам давали восстанавливаться и выживать до 28 дней после хирургии. Поведенческую оценку с использованием ВВВ-системы регистрировали до 28 дней после индукции повреждения, как раз перед окончанием прижизненной фазы данного исследования. После перфузии и фиксации спинной мозг удаляли, криопротектировали, делали срезы, окрашивали и выполняли счет аксонов.

Шкалу двигательных оценок Вакко-ВеаШе-Втекпайап (ВВВ) (Вакко е! а1., 1996, №ито!гаита 13, 343359), тест наклонной плоскости и тест хождения по наклонной решетке (Ь1 апй 8йй1тайег, 203, I. №йоксг 2003, 23, 4219-27) проводили посредством мониторинга в крысах и мышах после нанесения травмы. Для теста наклонной плоскости авторы изобретения измеряли максимальный угол, на который может быть наклонена доска 50х60 см в течение 5 с без соскальзывания мыши. Для хождения по наклоннной решетке мышей обучали карабкаться по проволочной решетке (длиной 35 см, площадью 2,54 кв.см) при наклоне 45°. Количество случаев, в которых задняя лапка проваливалась ниже плоскости решетки, оценивали для каждого перемещения от нижней части до верхней части. Для поведенческого тестирования крыс использовали локомоторную шкалу ВВВ, хождение по решетке и анализ следов. Для хождения по наклонной решетке крыс обучали ходить по проволочной решетке (длиной 70 см, площадью 2,54 кв.см) и подсчитывали количество случаев, в которых задняя лапка проваливалась ниже плоскости решетки. Для анализа следов картины хождения задних лапок крысы регистрировали с использованием чернил во время непрерывного передвижения через огороженное место 90 см и длину шага на каждой стороне и ширину шага рассчитывали (Ме!/ е! а1., 2000, Вташ Кек., 883, 165-177). Все эти поведенческие тесты вы

- 26 008253 полнялись по меньшей мере двумя индивидуумами. Во время хирургии, поведенческого тестирования и гистологического анализа исследователи были слепыми относительно идентичности конкретного соединения в мининасосе.

к№доК310-Ес стимулировал функциональное восстановление (фиг. 12).

Пример 13. Анализ контузии спинного мозга крыс.

Действие растворимых полипептидов №§о-рецептора-1 и слитых белков №§о-рецептора-1 на нейронах Бп уБуо испытывали в анализе контузии спинного мозга крыс.

Самок крыс Ьопд Еуапк (170-190 г), помещенных в бокс, обрабатывают профилактически анальтезирующими и антибиотическими агентами. За 10 мин перед хирургией животным вводят внутрибрюшинно (Б.р.) транквилизатор в виде 2,5 мг/кг мидозолама и анестезируют их 2-3% изофлурана в О₂. Затем крыс бреют, обтирают спиртом и бетадином и в их глаза вносят глазное смазывающее вещество. Затем делают разрез вниз по срединной линии и обнажают позвонки Т7-Т12.

Дорсальную ламнэктомию выполняют при 79 1.2 и Т10 для обнажения спинного мозга. Крысу помещают на импактор (устройство для нанесения ударов). Сначала фиксируют сегменты Т7 и Т8, а затем сегменты Т11 и Т12 прикрепляют к каудальному зажиму. Под грудью крысы помещают мягкий материал. Стержень импактора устанавливают в положение нуля и электрически опускающиеся скобки присоединяют к краю раны. Затем стержень импактора поднимают на 25,0 мм и корректируют должным образом до положения, находящегося непосредственно над обнаженным спинным мозгом. Затем стержень импактора высвобождают для удара по обнаженному спинному мозгу и немедленно поднимают стержень импактора.

Затем крысу снимают с прибора и на рану помещают Се1£оат®. Мышцу над раной зашивают и разрез хирургически ушивают. Животных помещают в инкубатор до восстановления от анестезии. По мере необходимости крысам вводят антибиотики, анальгетики и солевой раствор. Мочевые пузыри отжимают каждое утро и каждый вечер после этого, пока функция не восстанавливается.

Растворимый слитый белок №§о-рецептора-1 (например, к№доК310-Ес) вводят подоболочечно, как описано в модели поперечного разреза спинного мозга крыс выше. ВВВ-оценивание выполняют спустя 1 день после хирургии, затем каждую неделю после этого до 4-6 недель.

Пример 14. Экспрессия к№доК310 в трансгенных мышах.

Авторы изобретения получали трансгенных мышей, экспрессирующих растворимый белок №§орецептора-1, для испытания его действия при экспрессии Бп уБуо.

Авторы изобретения клонировали кДНК к№доК310 мыши (соответствующую аминокислотам 1310 №§о-рецептора-1) в сайт вектора С-3123. В этом векторе экспрессия к№доК310 находится под контролем регуляторных элементов глиального фибриллярного кислого белка (§£ар), которые делают возможным высокий уровень экспрессии с увеличенной секрецией из реактивных астроцитов в месте повреждения. Авторы изобретения расщепляли полученный вектор последовательно Аа!11 и БШ и выделяли конструкцию §£ар::к№доК310 на фрагменте 3,4 т.п.н. Авторы изобретения микроинъецировали этот фрагмент в зародыши для генерирования трансгенных мышей. Авторы подтвердили при помощи ПЦР, что этот трансген был интегрирован, и идентифицировали пять линий-основателей. Авторы изобретения скрестили гетерозиготных самцов двух линий-основателей с наивысшими уровнями экспрессии с самками мышей С57ВЬ/6Б. Авторы подтвердили, что СЕАР-положительные клетки экспрессируют и секретируют к№доК310 в гетерозиготных трансгенных мышах, при помощи Вестерн-блот-анализа с использованием антитела, индуцированного против №§о-рецептора-1.

Авторы изобретения гомогенизировали кору головного мозга и спинной мозг в забуференном Трисом солевом растворе, дополненном ингибиторами протеаз (Косйе) и центрифугировали этот гомогенат при 40000 об./мин в течение 20 мин при 4°С. Авторы изобретения обрабатывали супернатант 4% параформальдегидом в течение 20 мин для увеличения специфичности антител и диализовали перед иммуноблоттингом. Авторы гомогенизировали фракцию частиц обработкой ультразвуком в буфере К1РА (1% Тритон® Х-100, 0,5 % дезоксихолат натрия, 0,1% ДСН в ЗФР), центрифугировали полученный гомогенат и обрабатывали этот супернатант (растворимую детергентом фракцию частиц), как описано выше. Авторы анализировали 20 мкг белка головного мозга или спинного мозга иммуноблоттингом с использованием кроличьей антисыворотки, индуцированной против №§о-рецептора-Е при разведении 1:2000. Авторы изобретения визуализировали иммунореактивность инкубированием с АР-конъюгированными антителами против кроличьего 1дС и субстратами АР (кислой фосфатазы) NВТ/ВСIР.

Авторы изобретения детектировали секретированный к№доК310 в не содержащих детергента растворимых экстрактах коры головного мозга и спинном мозге из двух трансгенных линий Тд08 и Тд01, но малое количество, если оно вообще детектировалось, растворимого белка №§о-рецептора-1 при 37 или 81 кДа присутствовало в однопометных мышах дикого типа (^Т). Испытание фракций частиц показало, что уровни эндогенного №§о-рецептора-1 как в мышах ^Т, так и в трансгенных мышах были сравнимыми.

Пример 15. Экспрессия к№доК310 в трансгенных мышах после повреждения.

Авторы изобретения испытывали действие повреждения ЦНС на экспрессию к№доК310 в трансгенных мышах выполнением повреждения посредством дорсального глубокого одностороннего разреза. Получали к№доК310-трансгенных и нетрансгенных контрольных животных спариванием гетерозигот

- 27 008253 ных самцов с самками С57/ВБ6, как описано в примере 14.

Взрослых самок гетерозиготных трансгенных мышей или однопометных мышей дикого типа (АТ) (10-16-недельного возраста) глубоко анестезировали и выполняли полную ламинэктомию, полностью обнажая дорсальную часть спинного мозга на уровне позвонков Т6 и Т7. Выполняли дорсальный глубокий односторонний разрез при Т6 с использованием иглы 30 С и пары микроножниц для полного разъединения дорсального и дорсолатерального кортикоспинальных (корково-спинно-мозговых) (пирамидных) путей (С8Т). Помеченную иглу проводили через дорсальную часть спинного мозга несколько раз для гарантии того, что это повреждение имело глубину 1,0 мм. Мышечные слои зашивали над ламинэктомиями и кожу на спинке закрывали хирургическими скобками. Для прослеживания кортикоспинальных (корково-спинно-мозговых) делали трепанационное отверстие над корой головного мозга с правой стороны в череп спустя 14 дней после повреждения спинного мозга. Вводили индикатор ВИА (молекулярная масса 10000, 10% в ЗФР) (Мо1еси1аг РгоЬек, Еидепе, ОК) в 4 места инъекции при глубине 0,7 мм от поверхности коры головного мозга. Спустя 4 недели после повреждения этих мышей перфузировали через сердце ЗФР и затем 4% параформальдегидом.

Мыши, используемые для экспериментов по экспрессии §ИодоК310, не получали инъекции индикатора.

Для мышей, используемых для Вестерн-блот-анализа, спинной мозг на уровне между Т3 и Б3 собирали без перфузии спустя 14 дней после повреждения. Мышей, используемых для иммуногистохимического окрашивания, перфузировали 4% параформальдегидом спустя 10 дней после одностороннего разреза и поврежденный спинной мозг удаляли для приготовления срезов. Для испытания экспрессии §ИодоК310 в поврежденном головном мозге трансгенных мышей и мышей дикого типа (АТ) уколочное повреждение коры головного мозга выполняли с использованием лезвия скальпеля номер 11, удерживаемого в стереотаксическом аппарате (Όηνίά Кор£, Тнщпда, СА). Делали парасагиттальный разрез 4 мм, в 0,5 мм сзади относительно брегмы, в 1,5 мм латерально от срединной линии и на глубину 3,5 мм.

Увеличенные уровни §ИодоК310 детектировали в растворимых экстрактах спинного мозга спустя 10 дней после повреждения в трансгенных мышах, но не в мышах дикого типа (АТ), что согласуется с повышающей регуляцией после повреждения СЕАР вокруг повреждения. Для подтверждения, что это не обусловлено компенсаторной повышающей регуляцией Иодо-А, авторы испытывали его экспрессию и обнаружили, что она является одинаковой либо в интактной, либо в поврежденной коре головного мозга и в спинном мозгу либо из мышей дикого типа, либо из трансгенных мышей.

Клеточную экспрессию §ИодоК310 в поврежденной ЦНС испытывали иммуноокрашиванием поврежденного головного мозга и спинного мозга, содержащих зоны повреждения, с антителами против Иодо-рецептора-1 и СЕАР. Общая морфология реактивной астроцитарной глии не различается между мышами АТ и трансгенными мышами, но плотность, окрашенная на Иодо-рецептор-1 как во внутриклеточном, так и во внеклеточном пространстве, является явно более высокой в д£ар::8ИодоК310-трансгенных мышах, чем в мышах АТ, что указывает на увеличенную экспрессию §ИодоК310 вокруг повреждения в трансгенных мышах. Белок Иодо-рецептора-1 колокализуется с астроцитарным маркером СЕАР (глиальным фибриллярным кислым белком) только в трансгенных мышах. Имеется также в значительной степени увеличенное диффузное неклеточное окрашивание в трансгенных пробах, что согласуется с присутствием §ИодоК310 во внеклеточном пространстве. Окрашивание Иодо-рецептора-1 тела нейрона детектируется как в мышах АТ, так и в трансгенных мышах.

Пример 16. Секретированный §ИодоК310 индуцирует разрастание С8Т в трансгенных мышах.

Авторы изобретения исследовали, приводит ли увеличенная экспрессия §ИодоК310 около повреждения в трансгенных мышах к регенерации поврежденных аксонов.

Авторы исследовали целостность корково-спинно-мозговых путей (С8Т) инъекцией антероградного индикатора биотиндекстранамина (ВИА) в двигательную область коры головного мозга, как описано в Ы апб 81пйтайег, 2003, 1. Иеигоксг, 23, 4219-27. В однопометных мышах дикого типа рельефный дорсальный С8Т (бС8Т) прочно связан рострально с повреждением и несколько дорсолатеральных волокон С8Т видны ипсилатерально. Небольшое количество ВИА-меченых коротких коллатеральных выростов выступают в серое вещество, в частности, в вентральном тяже, но это разрастание в значительной степени ограничено стороной этого тяжа, контралатеральной относительно инъекции индикатора. Однако срезы рострального-дорсального одностороннего разреза из поврежденной §ИодоК310-трансгенной мыши обнаруживают совершенно другую картину распределения мечения. Высокая плотность ВИА-волокон С8Т наблюдается снаружи от рельефных бС8Т во всех трансгенных мышах из линии Тд08 или линии Тд01. Эктопические волокна простираются через зону серого вещества, и некоторые волокна доходят в латеральное и дорсолатеральное белое вещество. Несколько волокон (4-12 ответвлений на поперечный срез) видны на противоположной стороне спинного мозга (ипсилатерально относительно места инъекции индикатора). Микроденситометрическое измерение коллатеральных разрастаний указывает на приблизительно десятикратное увеличение плотности разрастания в 8ИодоК310-трансгенных мышах. Исследование парасагиттальных продольных срезов от 1 до 4 мм рострально относительно повреждения обнаруживает большое количество ветвящихся выростов в вентральную зону серого вещества в §ИодоК310трансгенной мыши, в противоположность однопометным животным АТ. В общем, картина и степень разрастания, рострального относительно повреждения в трансгенных мышах, являются сходными с кар

- 28 008253 тиной и степенью разрастания, наблюдаемыми в мышах, обработанных системно пептидом-антагонистом ΝΕΡ1-40 Ыодо-рецептора-1 (Ы апб δΐ^^йтаΐΐе^, 2003).

Эти результаты демонстрируют, что секретируемый кЫодоКЗЮ индуцирует разрастание СδΤ в трансгенных мышах.

Пример 17. Регенерирующие аксоны СδΤ обходят место повреждения в дистальный спинной мозг в кИодоЮЮ-трансгенных мышах.

Авторы изобретения выделили спинной мозг, рострально в 4 мм и каудально в 4 мм относительно места повреждения (длиной, в целом, 8 мм) из трансгенных мышей, и залили его в полимеризованный глутаровым альдегидом альбуминовый матрикс, и сделали срезы парасагиттально на вибратоме (толщиной 30 мкм). Поперечные срезы (50 мкм) брали из спинного мозга в 5-7 мм рострально и в 5-7 мм каудально относительно места повреждения. Для экспериментов с инъекцией 8ЫодоК.310-Рс на крысах спинной мозг, простирающийся от 10 мм рострально до 10 мм каудально от места повреждения, нарезали парасагиттально (50 мкм) на вибрирующем микротоме. Поперечные срезы собирали из спинного мозга рострально в 11-16 мм и каудально в 11-16 мм относительно места повреждения. Эти срезы инкубировали с комплексом авидин-биотин-пероксидаза и визуализировали индикатор ΒΌΑ усиленной никелем диаминобензидин-НРВ-реакцией (Огапбрге, 2002, ЫаШге, 417, 547-551). Авторы изобретения обрабатывали некоторые срезы для иммуногистохимии с использованием серотонина (анти-5-НТ-антитело) посредством опосредованной иммунофлуоресценции. Для визуализации зоны повреждения некоторые срезы окрашивали двойным окрашиванием антителами, направленными против ΟΡΑΡ ^1дта®, δΐ. Ьошк, МО). Эти срезы монтировали, дегидратировали и покрывали средой для гистологических препаратов.

Авторы изобретения исследовали, индуцировались ли волокна 8МодоК310, экспрессируемые в трансгенных мышах после повреждения (см. пример 16), через зону повреждения в каудальный спинной мозг для обеспечения функционального восстановления.

Последовательные парасагиттальные срезы через место повреждения, взятые в сатега 1ис1ба, показывают общую картину распределения регенерирующих волокон СδΤ в нескольких миллиметрах от повреждения. Срезы из мышей νΤ не показывавают волокон СδΤ за местом повреждения. Подобные срезы из 8МодоК310-трансгенных мышей показывают многочисленные волокна СδΤ, которые пересекают эту зону рассечения и выступают в дистальные зоны серого и белого вещества в виде высокоразветвленной картины. Непосредственно рострально относительно одностороннего разреза высокая плотность ΒΌΑмеченого разрастания СδΤ, происходящая из рельефных бСδΤ, выступает в зону повреждения, но большинство разрастаний СδΤ не могут проходить зону разреза, где образование рубцов и образование полостей в ткани являются очень заметными. Небольшая, но высоко значимая фракция регенерирующих аксонов обходит место повреждения через мостики оставшейся ткани вентрального и вентролатерального серого и белого вещества. Кроме того, небольшое количество волокон СδΤ, по-видимому, пересекают саму зону разреза через поврежденный дорсальный и дорсолатеральный спинной мозг в дистальные участки. Вблизи от повреждения ход регенерирующих волокон был обычно извилистым и очень отличающимся от нормальных прямых волокон в ростральных СδΤ. Боковые и древовидные волокна наиболее часто наблюдаются в зоне серого вещества дистального спинного мозга. Реконструирования демонстрируют 5-15 ΒΌΑ-меченых регенерирующих волокон, идущих в рострально-каудальной оси при любом уровне в 1-4 мм каудально относительно повреждения в каждой трансгенной мыши. Количества волокон для трансгенных мышей указывают на приблизительно сходное количество ΒΌΑ-меченых волокон относительно проксимальных уровней в сагиттальных срезах.

Кроме волокон СδΤ, другие нисходящие пути, такие как рафеспинальные волокна, также способствуют опорно-двигательной функции в мышах. В этой мышиной модели дорсального глубокого одностороннего разреза поперечный разрез повреждает большинство серотонергических волокон, уменьшая плотность этих волокон приблизительно на 80% в переднем роге. Анализ общей длины серотониновых волокон в переднем роге каудального спинного мозга показывает гораздо большее количество этих волокон в трансгенных мышах, чем в мышах дикого типа, что указывает на то, что стимулирующие рост эффекты 8ЫодоК310 в трансгенных мышах не ограничиваются одним нисходящим путем аксонов.

Пример 18. Трансгенная экспрессия 8ЫодоК310 улучшает локомоторное восстановление.

Прослеживание аксонов СδΤ и анализ серотонергических волокон показывают, что 8МодоК310, высвобождаемый из астроцитов в трансгенных мышах, стимулирует интенсивную анатомическую регенерацию поврежденных нисходящих аксонов в спинном мозге. Авторы выполняли несколько поведенческих тестов, как описано в примере 12, для определения, извлекают ли эти регенерированные волокна пользу в виде функционального восстановления.

Как было оценено в ВВВ-тесте, мыши νΤ частично восстанавливали опорно-двигательную функцию во время 4-недельного периода выживания. При 4 неделях после повреждения большинство мышей νΤ восстанавливают уровень, характеризуемый стойкой плантарной походкой со стойким поддержанием массы, но обнаруживают лишь случайную частую координацию передних/задних конечностей, с периодической переменой преобладающего положения лапок при начальном контакте с поверхностью. В противоположность этому, ВВВ-оценки кЫодоКЗЮ-трансгенных мышей как из линии Τд08, так и из линии Τд01 являются значимо более высокими, чем в контрольной группе на протяжении 7-28-дневного

- 29 008253 периода наблюдения (фиг. 13А и 13В). При 28 днях после повреждения большинство трансгенных мышей показывают стойкую координацию передних-задних конечностей, и преобладающее положение лапок является параллельным телу.

Авторы изобретения использовали два поведенческих теста для дополнительной характеристики двигательной активности ^одоК310-трансгенных мышей. Во-первых, авторы измерили максимальный угол, на который может быть наклонена доска без потери мышью ее крепкого удерживания в пределах 5 с. Перед дорсальным односторонним повреждением как трансгенные мыши, так и мыши АТ могут поддерживать свое положение тела (позу) на доске, наклоненной под углом 55°. В дни 7-28 после повреждения выдерживаемый угол наклона уменьшается для всех мышей, но углы, выдерживаемые трансгенными мышами, являются значительно большими, чем углы, выдерживаемые контрольной группой (фиг. 13С). В другом поведенческом тесте мыши взбирались на решетку, помещенную под углом 45° к вертикали, и проводился подсчет попаданий задних конечностей ниже поверхности этой решетки (Мс1х с1 а1., 2000). Ни одна из мышей не ошибалась в этом тесте во время тренировки перед обучением. Имелись многочисленные ошибки с промахами лапок всего лишь с минимальным улучшением в мышах дикого типа во время 2-6-недельного периода после повреждения. В отличие от этого, 8№доКЗ 10-трансгенные мыши обнаруживают прогрессирующее улучшение при вскарабкивании на решетке во время этого периода, причем большинство улучшений имеют место между 1-3 неделями после повреждения (фиг. 13Ό). Таким образом, трансгенные мыши, секретирующие 5№§оК.310 из астроцитов, проявляют регенерацию С8Т, рафеспинальное разрастание и улучшенную двигательную функцию после торакального одностороннего разреза спинного мозга.

Пример 19. Подоболочечное введение белка 5№доР310-Рс индуцирует разрастание С8Т.

В качестве второго теста стимулирующей рост пользы растворимого №§о-рецептора-1 после травмы спинного мозга авторы изобретения вводили этот очищенный белок подоболочечно (интратекально).

Авторы изобретения сливали лигандсвязывающий домен (27-310) крысиного №§о-рецептора-1 с Рс-доменом крысиного 1дО1 для улучшения стабильности и очистки. Белок очищали из стабильно трансфицированных клеток СНО. Этот белок блокирует действие №§о-66, МАО и миелина ίη убго, как показано ранее для мышиного 5№§оК.310-Мус-Н|5 (Роигшег с1 а1., 2002, ί. №иго8с1., 22, 8876-8883; Ьш с1 а1., 2002, 8с1епсе, 297, 1190-1193). Белок 5№доК.310-Рс доставляли подоболочечно крысам с использованием повреждения срединным торакальным дорсальным односторонним разрезом посредством осмотического мининасоса. Во время 4-недельного периода выживания после повреждения в каждую крысу вводили локально 1,2 мг белка 5№§оК.310-Рс. В крысах, получавших обработку носителем (1,2 мг крысиного ЦО), срезы, ростральные относительно одностороннего разреза, обнаруживают прочно связанные в пучок рельефные дорсальные С8Т и очень мало эктопических ΒΌΑ-меченых волокон С8Т выше места повреждения. Срезы, ростральные относительно повреждения, из поврежденных крыс, получавших белок 8№доК310-Рс, обнаруживают совершенно другую картину распределения мечения. Многочисленные эктопические волокна, разрастающиеся из ΒΌΑ-меченых С8Т, наблюдаются из поперечных и парасагиттальных срезов. В некоторых случаях выступы пересекают участок от зоны бС8Т вблизи срединной линии до периферии спинного мозга, становясь перемешанными с дорсолатеральными С8Т. Разрастание аксонов простирается через серое вещество в большей степени, чем через белое вещество. Измерение эктопических разрастающихся волокон (>100 мкм в поперечных срезах, >200 мкм в сагиттальных срезах) рядом с бС8Т выявило большее увеличение в обработанных 5№§оК.310-Рс крысах.

Пример 20. Аксоны С8Т регенерируют в дистальный спинной мозг в обработанных 5№доК.310-Рс крысах.

Авторы изобретения глубоко анестезировали самок крыс 8ргадие-Оает1еу (190-250 г) и проводили ламинэктомию при спинальных уровнях Т6-7 с обнажением спинного мозга. Дорсальную половину спинного мозга разрезали с использованием иглы 30 О и пары микроножниц для разъединения дорсальных частей путей С8ОТ и гарантировали глубину повреждения (1,8 мм) проведением острой части лезвия номер 11 через дорсальную половину спинного мозга (Огапбрге е1 а1., 2002, Шипе, 417, 547-551). Осмотический мининасос (А1хеГ' 2МЬ4 с объемом 2 мл, 2,5 мкл/ч, доставка в течение 28 дней), который был наполнен 1,2 мг крысиного 1дО в ЗФР или 1,2 мг слитого белка 5№§оК.3-Рс в ЗФР, зашивали в мышцы под кожей на спинке этих животных. Катетер, соединенный с выходом этого мининасоса, вставляли в подоболочечное пространство спинного мозга на уровне Т7-8 через небольшое отверстие в твердой мозговой оболочке.

Инфузия белка-антагониста №§о-рецептора-1 индуцировала интенсивное разрастание рострально относительно одностороннего разреза крысы, но более критической проблемой является, выступает ли разрастание волокон С8Т до дистального спинного мозга и способствует ли оно локомоторному восстановлению. Продольные срезы через место повреждения из обработанных носителем крыс не обнаруживают детектируемого количества или обнаруживают очень малое количество ΒΌΑ-меченых вентральных волокон С8Т ниже уровня повреждения (Огапбрге е1 а1., 2002; Ае1бпег е1 а1., 2001, Ргос. №И. Асаб. 8ск И8А, 98, 3513-3518). Подобные срезы из обработанных 5№доК.310-Рс крыс демонстрируют многочисленные ΒΌΑ-меченые волокна, которые обходят место повреждения и выступают до каудального спинного мозга, в основном, через мостиковые ткани вентрального и вентролатерального спинного мозга.

- 30 008253

Иммуноокрашивание на маркер астроцитов СЕАР показывает, что достигалась степень разреза более глубокая, чем зона центрального канала. В отличие от линейного профиля ростральных волокон в выступающем дорсальном С8Т, регенерированные волокна С8Т обычно идут по траектории высокого разветвления в дистальном спинном мозге, в частности в зоне серого вещества. Эти волокна детектируются во многих участках спинного мозга, но они более легко видны в центральной части и дорсальной половине спинного мозга по всему спинному мозгу. Количество волокон С8Т из сагиттальных срезов показывает приблизительно 20 ВИА-меченых аксонов в 1-2 мм каудально относительно повреждения и 15 меченых аксонов в 7-8 см дистально относительно повреждения из каждой обработанной к№доВ310-Ес крысы.

Обычно картина ветвления этих волокон является сходной с картиной ветвления, наблюдаемой из обработанных локально пептидом NЕР1-40 животных, но большее коллатеральное (боковое) ветвление в каждом выросте наблюдается из срезов из обработанных белком к№доВ310-Ес животных. Измерение выростов из дистального спинного мозга демонстрирует, что общая длина коллатеральных ветвлений каждого выроста в обработанных к№доВ310-Ес крысах является в 2 раза большей, чем эта длина из обработанных NЕР1-40 животных. Количество выростов (>200 мкм в длину) в 1-10 мм каудально относительно спинного мозга в обработанных обоими антагонистами №до-рецептора-1 группах является приблизительно в 20-40 раз большим, чем в контрольной группе. Больше выростов наблюдают из обработанных к№доВ310-Ес крыс, чем при локальной обработке №Р1-40 (~50 в сравнении с 25 выростами на крысу), но это различие не является статистически значимым (р=0,1713, !-критерий Стьюдента).

Регенерацию аксонов С8Т наблюдают в поперечных срезах спинного мозга в 11-12 мм каудально относительно одностороннего разреза в крысах, получающих обработку к№одоВ310-Ес. Эти волокна детектируются как в сером веществ, так и в белом веществе спинного мозга. Волокна, детектируемые в сером веществе, часто обнаруживают большее боковое ветвление, чем в зоне белого вещества. В противоположность этому, в поперечных срезах из обработанной носителем группы только случайные ВИАмеченые волокна видны в вентральной зоне белого вещества, что согласуется с неповрежденными вентральными аксонами С8Т. На этом уровне дистального спинного мозга среднее количество ВИА-меченых волокон С8Т из групп, обработанных обоими антагонистами №до-рецептора-1 [к№доВ310-Ес и NЕР1-40] приблизительно в 20 раз больше, чем это количество в обработанных носителем крысах. Взятые вместе, оба антагониста №до-рецептора-1, белок к№доВ310-Ес и пептид №Р1-40 приводят к разительной регенерации аксонов С8Т в дистальном спинном мозге, но разрастание, индуцируемое первым антагонистом, обнаруживает более высоко разветвленную картину разрастания.

Пример 21. Локальная обработка к№доВ310-Ес индуцирует разрастание руброспинальных и серотонергических аксонов в поврежденном спинном мозгу крысы.

Спустя 14 дней после одностороннего разреза трепанационное отверстие делали на каждой стороне черепа над сенсорно-моторной корой задних конечностей для прослеживания волокон С8Т. Антероградный нейронный индикатор ВИА (10% в ЗФР, 3,5 мкл на кору) наносили в семи местах инъекций при глубине 1,5 мм от твердой мозговой оболочки на каждой стороне (Сгапбрге, 2002). Для прослеживания руброспинального пути в крысах индикатор ВИА (1 мкл; молекулярная масса 10000; 10% в ЗФР) инъецировали в красное ядро на левой стороне (на 5,8 мм за брегмой, на 0,7 мм латерально, на 7,0 мм вентрально относительно поверхности черепа). Спустя 2 недели после инъекции ВИА этих животных перфузировали ЗФР, затем 4% параформальдегидом и ткань собирали для гистологии.

Восстановление порежденных волокон руброспинального пути (В8Т) способствует функциональным улучшениям после повреждения спинного мозга (Ьш е! а1., 1999, ί. №игокс1., 19, 4370-4387). Широко распространенное распределение №до-рецептора-1 в нейронах ЦНС (Уапд е! а1., 2002, ί. №игокс1., 22, 5505-5515) делает возможным то, что ингибирование №до-рецептора-1 его антагонистом может приводить к повторному росту аксонов В8Т после повреждения. Для испытания действий к№доВ310-Ес на поврежденный В8Т целостность этого пути прослеживали инъекцией ВИА в левое красное ядро. На уровне спинного мозга волокна В8Т обычно локализованы в дорсолатеральной зоне белого вещества спинного мозга и разрезаются дорсальными односторонними разрезами этого исследования. В поперечных срезах из контрольных крыс в 11-15 мм рострально относительно повреждения видно небольшое количество коротких ВИА-меченых волокон между выступающим В8Т и серым веществом дорсального рога. Срезы на том же уровне, обработанные к№доВ310-Ес, обнаруживают много связывающих волокон между основным В8Т и серым веществом дорсального рога. Поперечные срезы в 11-15 мм дистально относительно 8С1 не обнаруживают ВИА-меченых волокон В8Т в обработанных носителем крысах. В противоположность этому, срезы на том же самом уровне, получавшие обработку к№доВ310-Ес, показывают много ВИА-меченых волокон В8Т как в сером, так и в белом веществе, контралатеральном относительно инъекции индикатора. Некоторые выросты с картиной ветвления видны в сером веществе, ипсилатеральном относительно инъекции ВИА.

Руфеспинальные волокна спинного мозга также исследовали в обработанных к№доВ310-Ес, имеющих повреждение в спинном мозгу крыс. Иммуноокрашивание демонстрирует плотность серотонергических волокон в 11-15 мм рострально относительно повреждения, что является сходным между обработанными носителем и к№доВ310-Ес группами. В срезах в 11-15 мм ниже этого повреждения серотонер

- 31 008253 гические волокна в обработанных к№доК.310-Ес крысах находятся в количествах, в 2 раза больших, чем эти волокна в контрольной группе. Эти результаты демонстрируют, что чувствительность к ингибированию №до-рецептора-1 белком к№доК.310-Ес не ограничивается волокнами С8Т и что другие нисходящие пути, такие как руброспинальные и серотонергические аксоны, являются также чувствительными к антагонистам №до-рецептора-1.

Пример 22. Локальная обработка к№доЯ310-Рс улучшает функциональное восстановление у крыс.

Подоболочечное введение белка к№доЯ310-Рс стимулирует регенерацию аксонов в нескольких нисходящих путях после травматического повреждения спинного мозга. Авторы исследовали, улучшает ли этот белок также функциональное восстановление в поврежденном спинном мозгу.

При 2 неделях после одностороннего разреза локомоторная оценка ВВВ в обработанных носителем крысах достигает стабильного уровня 12 (фиг. 14А). При 4 неделях после повреждения большинство контролей (6 из 7) имеют часто стойкую плантарную походку со стойким поддержанием массы и часто стойкую координацию передних-задних конечностей, но они имеют периодическую перемену преобладающего положения лапок при начальном контакте с поверхностью. В противоположность этому, в крысах, получавших обработку белком κΝο§οΚ310, опорно-двигательная оценка продолжает улучшаться между 2-4 неделями после травмы. При 4 неделях после повреждения большинство обработанных к№доЯ310-Рс животных имели стойкую координацию передних-задних конечностей и параллельное положение лапок при начальном контакте с тестирующей поверхностью.

Хождение по решетке использовали для оценки недостатков в нисходящем тонком двигательном контроле после повреждения спинного мозга (Ме1х е! а1., 2000). Эта активность требует координации передних-задних конечностей и произвольного контролирования движения, опосредуемого вентролатеральными, корково-спинно-мозговыми (кортикоспинальными) и руброспинальными волокнами. Во время предварительного обучения все крысы точно помещают их задние конечности на стержни решетки. При 2-4 неделях после повреждения контрольные крысы делают 8-9 ошибок на одну попытку лишь с минимальным улучшением во времени. В противоположность этому, крысы, обработанные κΝο§οΚ310Рс, проявляют прогрессирующее улучшение в хождении по решетке и делают значимо меньше ошибок (4-7 на одну попытку, в среднем). Большая часть улучшения имеет место при 2-3 неделях после повреждения. Анализ следов задних лапок в контрольной группе показывает, что длина шага является значимо уменьшенной и ширина положения лапок является увеличенной при 4 неделях после одностороннего повреждения в сравнении с неповрежденными крысами или поврежденными животными, получающими обработку к№доЯ310-Рс (фиг. 14С). Таким образом, эти множественные поведенческие тесты демонстрируют, что блокада функции №до-рецептора-1 локальной инъекцией белка-антагониста улучшает локомоторное восстановление после повреждения.

Биологические депозиты

Гибридомы НВ 7Е11 (АТСС® ассеккюп Νθ. РТА-4587), нВ 1И2 (АТСС® ассеккюп Νθ. РТА-4586), НВ 5В10 (АТСС® ассеккюп Νο. РТА-4588) и НВ 2Р7 (АТСС® ассеккюп Νο. РТА-4585) были депонированы Американской Коллекцией Типовых Культур (АТСС®), 10801 Ищуегкйу Вои1еуагб, Мапаккак, УА 20110-2209, И8А, 9 августа 2002г.

Как будет понятно специалистам с квалификацией в данной области, многочисленные изменения и модификации могут быть произведены в отношении предпочтительных вариантов осуществления данного изобретения без отклонения от идеи данного изобретения. Предполагается, что все такие вариации находятся в рамках данного изобретения.

Claims (29)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Полипептид, выбранный из группы, состоящей из АААРС^Τ^^Е^^^^8^NА^^Я (8ЕО ΙΌ Ν0: 26); ΕΟΕ8ΟΝΛ0ΕΕ (8ЕО ΙΌ Ν0: 27); Е1)Е81)1)АЕЕЯ (8ЕО ΙΌ Ν0: 29); Е1)ЕА81)\'АОЕЯ (8ЕО ΙΌ Ν0: 30); ЕПЕА8ППАЕЕЯ (8ЕО ΙΌ Ν0: 31); ЕПАЕ8ПтрЕЯ (8ЕО ΙΌ Ν0: 32); ЕПАЕ8ППАЕЕЯ (8ЕО ΙΌ Ν0: 33); ЕПЕ88ПтрЕЯ (8ЕО ΙΌ Ν0: 34); ЕПЕ88ПЕАЕЕЯ (8ЕО ΙΌ Ν0: 35); ПтрЕЯУУПРТТ (8ЕО ΙΌ Ν0: 36); ПтрЬЯ (8ЕО ΙΌ Ν0: 37); АПЕ8ПтрЕЯУУПРТТ (8ЕО ΙΌ Ν0: 41); ЕАЕ8ПтрЕЯУУПРТТ (8ЕС) ΙΌ Ν0: 42); ЕПЕ8ПтАЕЯУУПРТТ (8ЕО ΙΌ Ν0: 43); ЕПЕ8ПтрЕнУУПРТТ (8ЕО ΙΌ Ν0: 44) и ЕПЕ8ПтрЕАУУПРТТ (8ЕО ΙΌ Ν0: 45).
2. 2. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по п.1.
3. 3. Нуклеиновая кислота по п.2, функционально связанная с последовательностью контроля экспрессии.
4. 4. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.2 или 3.
5. 5. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.2 или 3 или содержащая вектор по п.4.
6. 6. Способ получения полипептида по п.1, предусматривающий стадии:

   (a) культивирования клетки-хозяина по п.5 и (b) извлечения полипептида из клетки-хозяина или культуральной среды.
7. 7. Способ получения антитела, предусматривающий стадии:

   (а) иммунизации хозяина полипептидом по п.1 или клеткой-хозяином по п.5 и

   - 32 008253 (Ь) извлечения антитела.
8. 8. Антитело, полученное способом по п.7, или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела.
9. 9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с полипептидом по п.1, где это антитело не является моноклональным антителом, продуцируемым гибридомной клеточной линией НВ 7Е11 (АТСС® ассеззюп №. РТА-4587).
10. 10. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.8 или 9, где это антитело:

    (a) ингибирует коллапс конуса роста нейрона;

    (b) уменьшает ингибирование выроста и разрастание нейритов в нейроне и (c) ингибирует связывание №до-рецептора-1 с лигандом.
11. 11. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.10, где вырост и разрастание нейритов является аксонным ростом.
12. 12. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.10, где нейрон является нейроном центральной нервной системы.
13. 13. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.8 или 9, где антитело является моноклональным антителом.
14. 14. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.8 или 9, где антитело является мышиным антителом.
15. 15. Антитело по п.8 или 9, где антитело выбрано из группы, состоящей из гуманизированного антитела, химерного антитела и одноцепочечного антитела.
16. 16. Способ ингибирования связывания №до-рецептора-1 с лигандом, предусматривающий стадию контактирования №до-рецептора-1 с антителом или антигенсвязывающим фрагментом по п.10.
17. 17. Способ по п.16, где лиганд выбран из группы, состоящей из №доА, №доВ, №доС МАО и ΟМдр.
18. 18. Способ ингибирования коллапса конуса роста в нейроне, предусматривающий стадию контактирования этого нейрона с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по п.10.
19. 19. Способ уменьшения ингибирования выроста или разрастания нейритов в нейроне, предусматривающий стадию контактирования этого нейрона с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по п.10.
20. 20. Способ по п.19, где вырост или разрастание нейритов является аксонным ростом.
21. 21. Способ по п.18 или 19, где нейрон является нейроном центральной нервной системы.
22. 22. Композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.8 или 9.
23. 23. Композиция по п.22, дополнительно содержащая один или несколько дополнительных терапевтических агентов.
24. 24. Способ стимуляции выживания нейрона при риске умирания, предусматривающий контактирование этого нейрона с эффективным количеством антитела или антигенсвязывающего фрагмента против №до-рецептора-1 по п.8 или 9.
25. 25. Способ по п.24, где нейрон является нейроном ίη νίΙΐΌ.
26. 26. Способ по п.24, где нейрон находится в млекопитающем.
27. 27. Способ по п.26, где млекопитающее обнаруживает признаки или симптомы рассеянного склероза, АЬ8, болезни Гентингтона, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, диабетической невропатии, инсульта, травматических повреждений головного мозга или повреждения спинного мозга.
28. 28. Способ стимуляции выживания нейрона в млекопитающем, где нейрон подвержен риску умирания, предусматривающий:

    (a) обеспечение культивируемой клетки-хозяина, экспрессирующей антитело против №дорецептора-1 или его антигенсвязывающий фрагмент по п.8 или 9; и (b) введение этой клетки-хозяина млекопитающему в местоположение или вблизи местоположения этого нейрона.
29. 29. Способ генотерапии стимуляции выживания нейрона, подверженного риску умирания, который находится в млекопитающем, предусматривающий введение в местоположение или вблизи местоположения этого нейрона вирусного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, которая кодирует антитело против №до-рецептора-1 или его антигенсвязывающий фрагмент по п.8 или 9, где это антитело против №до-рецептора-1 или антигенсвязывающий фрагмент экспрессируется из нуклеотидной последовательности в млекопитающем в количестве, достаточном для стимуляции выживания этого нейрона.