MXPA06001444A

MXPA06001444A - Antagonistas del receptor nogo.

Info

Publication number: MXPA06001444A
Application number: MXPA06001444A
Authority: MX
Inventors: Stephen M Strittmatter
Original assignee: Biogen Idec Inc
Priority date: 2003-08-07
Filing date: 2004-01-30
Publication date: 2006-05-15
Also published as: BRPI0413426A; NO20061081L; WO2005016955A3; CA2535007A1; EP1660517A4; JP2007501612A; WO2005016955A2; AU2004264405A1; PL380274A1; EP1660517A2; IS8339A; CN1926147A

Abstract

Se describen polipeptidos inmunogenicos de receptor-1 Nogo, anticuerpos de receptor-1 Nogo, fragmentos de union a antigeno de los mismos, receptores solubles Nogo y proteinas de fusion de los mismos y acidos nucleicos que codifican para los mismos. Tambien se describen composiciones que comprenden, y metodos para hacer y usar, estos anticuerpos de receptor Nogo, fragmentos Nogo antigeno de los mismos, receptores solubles Nogo, y proteinas de fusion de los mismos y acidos nucleicos que codifican para los mismos.

Description

ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR NOGO Campo de la Invención Esta invención se refiere a neurobiologia y biología molecular. De manera más particular, esta invención se refiere a polipéptidos inmunogénicos de receptor-1 Nogo, anticuerpos de receptor-1 Nogo, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, receptores solubles Nogo y proteínas de fusión de los mismos y ácidos nucleicos que codifican para los mismos. Esta invención se refiere adicionalmente a composiciones que comprenden, y a métodos para hacer y usar, estos anticuerpos de receptor Nogo, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, polipéptidos inmunogénicos de receptor-1 Nogo, receptores solubles Nogo y proteínas de fusión de los mismos y ácidos nucleicos que codifican para los mismos. Antecedentes de la Invención Los axones y dentritas de neuronas son largas extensiones celulares de las neuronas. La punta distante de un axon o neurita en extensión comprende una región especializada, conocida como el cono de crecimiento. Los conos de crecimiento perciben el ambiente local y guían el crecimiento axonal hacia la célula objetivo de la neurona. Los Ref . :169976 conos de crecimiento responden a varios indicios ambientales, por ejemplo, adherencia superficial, factores de crecimiento, neurotransmisores y campos eléctricos. La guia de crecimiento en el cono comprende varias clases de moléculas de adhesión, señales intracelulares, así como factores que estimulan e inhiben los conos de crecimiento. El cono de crecimiento de una neurita en crecimiento avanza a varias velocidades, pero típicamente a la velocidad de uno a dos milímetros por día. Los conos de crecimiento se forman manualmente, con expansión plana amplia, (micropúas o filopodios) que se adhieren de manera diferencial a las superficies en el embrión. Los filopodios están continuamente activos, algunos filopodios se retraen al cono de crecimiento, en tanto que otros continúan alargándose a través del sustrato. Los alargamientos entre los diferentes filopodios forman los lamelipodios . El cono de crecimiento explora el área que está delante del mismo y en cualquiera lado con sus lamelipodios y filopodios . Cuando un alargamiento hace contacto con una superficie que es desfavorable al crecimiento, éste se retira. Cuando un alargamiento hace contacto con una superficie favorable de crecimiento, continua extendiéndose y guía el cono de crecimiento en esa dirección. El cono de crecimiento se puede guiar por pequeñas variaciones en las propiedades superficiales de los sustratos. Cuando el cono de crecimiento alcanza una célula objetivo apropiada, se crea una conexión sináptica. La función de las células nerviosas se ve influenciada en su mayor parte por el contacto entre la neurona y otras células en su ambiente inmediato (U. Rutishauser, T. M. Jessell, Physiol . Rev. 1988, 68, p. 819). Estas células incluyen células gliales especializadas, oligodendrocitos en el sistema nervioso central (CNS, por sus siglas en inglés) , células de Schwann en el sistema nervioso periférico (PNS, por sus siglas en inglés) , que enfundan el axon neural con mielina (una estructura aislante de las membranas de múltiples capas) (G. Lemke, en An Introduction to Molecular Neurobiology, Z. Hall, Ed. [Sinauer, Sunderland, Mass., 1992], p. 281). En tanto que las neuronas del CNS tienen la capacidad de regenerarse después de una lesión, se inhiben de hacerlo debido a la presencia de proteínas inhibitorias presentes en la mielina y posiblemente también por otros tipos de moléculas normalmente encontradas en sus ambientes locales (Brittis y Flanagan, Neuron 2001, 30, pp. 11-14; Jones et al., J. Neurosci. 2002, 22, pp. 2792-2803; Grimpe et al., J. Neurosci. 2002, 22, pp . 3144-3160). Varias proteínas inhibidoras de mielina que se encuentran en los oligodendrocitos se han caracterizado, por ejemplo, NogoA (Chen et al., Nature, 2000. 403, 434-439; Grandpre et al., Nature 2000, 403, 439-444), glicoproteína asociada a mielina (MAG, McKerracher et al, Neuron 1994, 13, 805-811; Mukhopadhyay et al, Neuron 1994, 13, 757-767) y glicoproteí a de oligodendrocito (OM-gp, ikol y Stefansson, J. Cell. Biol. 1988, 106, 1273-1279). Cada una de estas proteínas se ha mostrado de forma separada que es un ligando para el receptor-1 Nogo neural (Wang et al., Nature 2002, 417, 941-944; Liu et al., Science, 2002, 297, 1190-93; Grandpre et al., Nature 2000, 403, 439-444; Chen et al., Nature, 2000, 403, 434-439; Domeniconi et al., Neuron, 2002, 35, 283-90) . El receptor-1 Nogo es una proteína de membrana anclada en GPI que contiene 8 repeticiones de alto contenido de leucina (Fournier et al., Nature 2001, 409, 341-346). En la interacción con una proteína inhibidora (por ejemplo, NogoA, MA.G y OM-gp) , el complejo de receptor-1 Nogo transduce señales que conducen al colapso de los conos de crecimiento y a la inhibición de la excrescencia de las neuritas. Hay una necesidad urgente de moléculas que inhiban la unión del receptor-1 Nogo a sus ligandos y que atenúen el colapso mediado por mielina de los conos de crecimiento, y la inhibición de la excrescencia de neuritas . Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a polipéptidos solubles de receptor-1 Nogo y proteínas de fusión que los comprenden, y anticuerpos y fragmentos antigénicos de los mismos dirigidos contra regiones inmunogénicas especificas del receptor-1 Nogo. La invención también se refiere a polipéptidos inmunogénicos de receptor-1 Nogo que se unen a los anticuerpos de la invención. La invención también se refiere a polipéptidos de receptor-1 Nogo que se unen por un anticuerpo monoclonal que se une al receptor-1 Nogo. Estos polipéptidos se pueden usar, inter alia, como inmunógenos o para detectar anticuerpos para identificar aquellos con especificidad similar a un anticuerpo de la invención. La invención se refiere adicionalmente a ácidos nucleicos que codifican para los polipéptidos de esta invención, vectores y células hospedadoras que comprenden estos ácidos nucleicos y métodos para elaborar los péptidos . Los anticuerpos, receptores solubles y proteínas de fusión de receptor de esta invención antagonizan o bloquean al receptor-1 Nogo y son útiles para inhibir la unión del receptor-1 Nogo a sus ligandos, para inhibir el colapso de los conos de crecimiento en una neurona y para disminuir la inhibición de la excrescencia de neuritas o el brote en una neurona. En algunas modalidades, la invención proporciona un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR (SEQ ID NO : 26); LDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 27); LDLSDDAELR (SEQ ID NO: 29); LDLASDNAQLR (SEQ ID NO: 30); LDLASDDAELR (SEQ ID NO: 31); LDALSDNAQLR (SEQ ID NO: 32); LDALSDDAELR (SEQ ID NO: 33); LDLSSDNAQLR (SEQ ID NO: 34); LDLSSDEAELR (SEQ ID NO: 35) ; DNAQLRWDPTT; (SEQ ID NO: 36) ; DNAQLR (SEQ ID NO : 37); ADLSDNAQLRWDPTT (SEQ ID NO: 41); LALSDNAQLRWDPTT (SEQ ID NO: 42); LDLSDNAALRWDPTT (SEQ ID NO: 43); LDLSDNAQLHWDPTT (SEQ ID NO: 44); y LDLSDNAQLAWDPTT (SEQ ID NO: 45) . E algunas modalidades, la invención proporciona un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la invención. En algunas modalidades, el ácido nucleico está enlazado de forma operable a una secuencia de control de expresión. En algunas modalidades, la invención proporciona un vector que comprende un ácido nucleico de la invención. En algunas modalidades, la invención proporciona una célula hospedadora que comprende una ácido nucleico o que comprende el vector de la invención. En algunas modalidades, la invención proporciona un método para producir un polipéptido de la invención que comprende cultivar una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico o vector de la invención y recuperar el polipéptido de la célula hospedadora o medio de cultivo . En algunas modalidades, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo que comprende los pasos de inmunizar un hospedador con un polipéptido de la invención o una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico o que comprende el vector de la invención y recuperar el anticuerpo. La invención también proporciona un anticuerpo producido por el método o un fragmento de unión a antígeno del mismo . En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une de forma específica o un polipéptido de la invención, en donde el anticuerpo no es el anticuerpo monoclonal producido por la línea de células de hibridoma HB 7E11 (ATCC® acceso No. PTA-4587) . En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno (a) inhibe el colapso de los conos de crecimiento de una neurona; (b) disminuye la inhibición de la excrescencia de neuritas y el brote en una neurona; y (c) inhibe la unión del receptor-1 Nogo a un ligando. En algunas modalidades, la excrescencia de neurita y el brote es crecimiento axonal . En algunas modalidades, la neurona es una neurona del sistema nervioso central . En algunas modalidades, un anticuerpo de la invención es monoclonal. En algunas modalidades, un anticuerpo de la invención es un anticuerpo murino. En algunas modalidades, un anticuerpo de la invención se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico y un anticuerpo de cadena individual .

En algunas modalidades, la invención proporciona un método para inhibir la unión del receptor-1 Nogo a un ligando, que comprende el paso de poner en contacto el receptor-1 Nogo con un anticuerpo de la invención o fragmentos de unión a antígeno del mismo . En algunas modalidades, el ligando se selecciona del grupo que consiste NogoA, NogoB, NogoG, MAG y OM-gp. En algunas modalidades, la invención proporciona un método para inhibir el colapso de los conos de crecimiento en una neurona, que comprende el paso de poner en contacto la neurona con un anticuerpo de la invención o fragmentos de un antigeno del mismo . En algunas modalidades, la invención proporciona un método para disminuir la inhibición de la excrescencia de neuritas o brote en una neurona, que comprende el paso de poner en contacto la neurona con un anticuerpo de la invención o fragmentos de unión a antígeno del mismo. En algunas modalidades, la excrescencia de neuritas o brote es crecimiento axonal . En algunas modalidades, la neurona es una neurona del sistema nervioso central . En algunas modalidades, la invención proporciona una composición que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y un anticuerpo de la invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas modalidades, la composición comprende además uno o más agentes terapéuticos adicionales . En algunas modalidades, la invención proporciona un método para promover la supervivencia de una neurona en riesgo agónico, que comprende poner en contacto la neurona con una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-receptor-1 Nogo de la invención o fragmentos de unión a antígeno del mismo. En algunas modalidades, la neurona esta in vitro. En algunas modalidades, la neurona esta en un mamífero. En algunas modalidades, el mamífero exhibe señales o síntomas de esclerosis múltiple, ALS, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, neuropatía diabética, ataque, lesiones cerebrales traumáticas o lesión de la médula espinal. En algunas modalidades, la invención proporciona un método para promover la supervivencia de una neurona en un mamífero, neurona que está en riesgo agónico, que comprende (a) proporcionar una célula hospedadora cultivada que expresa un anticuerpo anti-receptor-1 Mogo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo; y (b) introducir la célula hospedadora en el mamífero en o cerca del sitio de la neurona . En algunas modalidades, la invención proporciona un método terapia génica para promover la supervivencia de una neurona en riesgo agónico, neurona que está en un mamífero, que comprende administrar en o cerca del sitio de la neurona un vector viral que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican para un anticuerpo anti-receptor-1 Nogo de la invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo anti-receptor-1 Nogo o fragmentos de unión a antxgeno se expresa de la secuencia de nucleótidos en el mamífero en una cantidad suficiente para promover la supervivencia de la neurona. Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 es una representación esquemática de la estructura del receptor-1 Nogo. sNogoR310 humano contiene los residuos 26-310 y sNogoR344 contiene los residuos 26-344. sNogoR310 de rata contiene los residuos 27-310 y sNogoR344 contiene los residuos 27-344. La Figura 2 representa una gráfica de antigenicidad para la proteina de receptor-1 Nogo usando el programa Vector Ntim. P-617 de rata es SEQ ID NO: 10 y P-618 de rata es SEQ ID NO: 11. La Figura 3A es una gráfica que representa la actividad de unión del anticuerpo anti-receptor-1 Nogo, 7E11. La gráfica representa el efecto de la concentración de 7E11 en la unión Nogo66 al receptor-1 Nogo. La Figura 3B representa la actividad de unión del anticuerpo anti-receptor-1 Nogo, 1H2. La gráfica representa el efecto de la concentración de 1H2 en la unión Nogo66 a sNogoR344-Fc (también referida en la presente y en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 60/402,866 como Fe- sNogoR344 o Ig-sNogoR344) . Fc-MAG no compite con Nogo66 para la unión a sNogoR344-Fc . La Figura 4 representa los resultados de un ELISA para los anticuerpos anti-Nogo-R-1, 1H2, 3G5 y 2F7. Se determinó el efecto de los anticuerpos en OD450 en la presencia de antígenos inmovilizados. Los antigenos inmovilizados fueron sNogoR310-Fc (también referido en la presente en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 60/402,866 como Fc-sNogoR310 o Ig-sNogoR310) , sNogoR344-Fc, p-617, p-618, p-4, p-5 y ovalbúmina y BSA. La Figura 5 es una gráfica que representa los efectos del anticuerpo monoclonal, 7E11, en la excrescencia de neuritas de DRG de rata en la presencia de cantidades variables de mielina. La Figura 6A es una gráfica que representa el efecto de unión de sNogoR310 a 12sI-Nogo66 y 125I-Nogo40 en la presencia de los siguientes competidores: Nogo66, Nogo40 y sobrenadante de anticuerpo monoclonal anti-receptor-1 Nogo. La Figura 6B representa la actividad de unión de 125I-Nogo66 a sNogoR310. La Figura 7 es una gráfica que representa el efecto de sNogoR310-Fc en 125I-Nogo40 que se une a sNogoR310. La Figura 8 es una gráfica que representa la actividad de unión de sNogoR310-Fc a 125I-Nogo40.

La Figura 9A es una gráfica del efecto de sNogo 310 en la excrescencia de neuritas/célula en la presencia o ausencia de mielina. La Figura 9B es una gráfica del efecto de sNogoR310 en excrescencia de neuritas en la presencia o ausencia de mielina. La Figura 10A es una gráfica que representa el efecto de sNogoR310-Fe en excrescencia de neuritas de DRG de rata P4 en la presencia o ausencia de cantidades crecientes de mielina. La Figura 10B representa el número de neuritas/célula después del tratamiento con PBS, PBS + sNogoR310-Fc, 20 ng mielina y mielina + sNogoR310-Fc . La Figura 11 es una gráfica que representa el efecto del anticuerpo monoclonal 5B10 en la excrescencia de neuritas DRG/célula en la presencia de cantidades crecientes de mielina. La Figura 12 es una gráfica que representa el efecto de sNogoR310-FC en la puntuación BBB hasta 30 días después de la inducción de lesión en un modelo de transección de médula espinal de rata. Las Figuras 13A y 13B reportan la puntuación BBB locomotora como una función del tiempo después de la hemiseccion dorsal en ratones WT o ratones transgénicos de la Línea 08 o Línea 01. La Figura 13C gráfica el ángulo en plano inclinado, tolerado, máximo como una función del tiempo después de la lesión para WT y ratones transgénicos. La Figura 13D muestra errores en la extremidad posterior durante^ el ascenso en rejilla inclinada como una función del tiempo post-lesión. En todas las gráficas, media ± es s.e.m. de 7-9 ratones en cada grupo se reportan. Los valores del grupo transgénico son estadísticamente diferentes de los ratones WT. (dobles asteriscos, p < 0.01; prueba t de Student) . La Figura 14A muestra la puntuación BBB locomotora como una función del tiempo después de la hemiseccion dorsal en animales tratados con vehículo o sNogoR310-Fc . La Figura 14B muestra errores en la extremidad posterior durante la caminata en rejilla como una función del tiempo después de la lesión. La Figura 14C muestra análisis de la impresión que revela una longitud de zancada más corta y un ancho de zancada más grande en ratones de control que ratas no lesionadas o lesionadas + sNogoR310-Fc. En todas las gráficas, se reporta media ± s.e.m. de 7-9 ratas en cada grupo.. Los valores del grupo de sNogoR310-Fc son estadísticamente de diferentes del control (Figuras 14A-B) . Los valores de control son estadísticamente diferentes de ratas sin SCI ó SCI + sNogoR310-Fc en la Figura 14C. (asterisco, p < 0.05; doble asterisco, p < 0.01; prueba t de Student) . Descripción Detallada de la Invención Definiciones y Técnicas Generales A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto en la técnica al cual corresponde esta invención. En el caso de conflicto, controlará la presente solicitud que incluye las definiciones. También, a menos que se requiera de otro modo por el contexto, los términos singulares deben incluir pluralidades y los términos plurales deben incluir lo singular. Todas las publicaciones, patentes y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan como referencia en su totalidad para todos los propósitos. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente se pueden usar en la práctica o prueba de la invención, más adelante se describen los métodos y materiales adecuados. Los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos, y no se propone que sean limitantes. Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción detallada y de las reivindicaciones. De principio a fin en esta especificación y reivindicaciones, la palabra "comprenden" o variaciones tal como "comprende" o "que comprende" se entenderá que implica la inclusión de un número entero señalado o grupo de números enteros pero no la exclusión de ningún otro número entero o grupo de números enteros. A fin de definir adicionalmente esta invención, se proporcionan en la presente los siguientes términos y definiciones . Como se usa en la presente, "anticuerpo" significa una inmunoglobulina intacta, o un fragmento de unión a antígeno de la misma. Los anticuerpos de esta invención pueden ser de cualquier isotipo o clase (por ejemplo, M, D, G, E y A) y cualquier sub-clase (por ejemplo, Gl-4, Al-2) y pueden tener una cadena ligera ya sea kappa (?) o lambda (?) . Como se usa en la presente, "Fe" significa una porción de la región constante de cadena pesada de un anticuerpo que se puede obtener por digestión con papaina. Como se usa en la presente, proteína de fusión Nogo " significa una protelna que comprende una porción de receptor-1 soluble Nogo fusionado a un. polipéptido heterólogo . Como se usa en la presente, "anticuerpo humanizado" significa un anticuerpo en el cual al menos una porción de las secuencias no humanas se reemplazan con secuencias humanas. Los ejemplos de como fabricar anticuerpos humanizados se puede encontrar en las patentes de los Estados Unidos Nos. 6,054,297, 5,886,152 y 5,877,293. Como se usa en la presente, "anticuerpo quimérico" significa un anticuerpo que contiene uno o más regiones de un primer anticuerpo y uno o más regiones de al menos otro anticuerpo . El primer anticuerpo y los anticuerpos adicionales pueden ser de la misma o diferente especie.

Como se usa en la presente y en la solicitud de patente de los Estados Unidos 60/402,866, "receptor Nogo" , "NogoR", "NogoR-1", "NgR" , y "NgR-1" significa cada uno receptor- 1 Nogo. Polipéptidos de Receptor- 1 Nogo En un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos de receptor-1 Nogo que son inmunogénicos . En algunas modalidades de la invención, el polipéptido inmunogénico consiste esencialmente de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: LDLSDNAQLRWDPTT (rata) (SEQ ID NO: 1) ; LDLSDNAQLRSVDPAT (humano) (SEQ ID NO: 2); AVSGPFRPFQTNQLTDEELLGLPKCCQPDAADKA (rata) (SEQ ID NO: 3) ; AVATGP YHP I WTGRATDEE PLGLPKC CQPDAADKA (humano) (SEQ ID NO: 4) ; y CLRGQAGSGA (ratón) (SEQ ID NO : 5) . En algunas modalidades, la invención se refiere a polipéptidos de receptor-1 Nogo que se unen por un anticuerpo monoclonal que se une al receptor-1 Nogo. En algunas modalidades, el polipéptido se reconoce por el anticuerpo monoclonal 7E11. En algunas modalidades, el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de LDLSDNAQIR (SEQ ID NO: 28); LDLSDDAELR (SEQ ID NO: 30); LDIASDNAQLR (SEQ ID NO: 31); IDLASDDAELR (SEQ ID NO: 32); IDALSDNAQLR (SEQ ID NO: 33); IDALSDDAELR (SEQ ID NO: 34); LDLSSDNAQLR (SEQ ID NO: 35) ; LDLSSDEAELR (SEQ ID NO : 36); DNAQLRWDPTT (SEQ ID NO: 37) ; DNAQLR (SEQ ID NO : 38) ; ADLSDNAQLRWDPTT (SEQ ID NO : 42) ; LALSDNAQLRWDPTT (SEQ ID NO: 43); LDLSDNAALRWDPTT (SEQ ID NO: 44); LDLSDNAQLHWDPTT (SEQ ID NO: 45); y LDLSDNAQLAWDPTT (SEQ ID NO: 46) . En algunas modalidades, la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de SEQ ID Nos: 1-5, 26-27, 29-37 y 41-45. En algunas modalidades de la invención, la molécula de ácido nucleico está enlazada a una secuencia de control de expresión (por ejemplo, pCDNA(I) ) . La presente invención también se refiere a un vector que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la invención. En algunas modalidades de la invención, el vector es un vector de clonación. En algunas modalidades de la invención, el vector es un vector de expresión. En algunas modalidades de la invención, el vector contiene al menos un marcador selecciónatele . La presente invención también se refiere a células hospedadoras que comprenden el ácido nucleico o vector descrito anteriormente . La presente invención también se refiere a un método para producir un polipéptido inmunogénico de la invención que comprende el paso de cultivar la célula hospedadora. En algunas modalidades, la célula hospedadora es procariótica . En algunas modalidades, la célula hospedadora es eucariótica. En algunas modalidades, la célula hospedadora es levadura.

Anticuerpos La presente invención se refiere adicionalmente a un anticuerpo o fragmentos de unión a antigeno del mismo que se une de forma específica a un polipéptido de receptor-1 Nogo de la invención. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une a un polipéptido que consiste esencialmente de una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 1-5, 26-27, 29-37 y 41-45. El anticuerpo o fragmento de unión a antigeno de la presente invención se puede producir in vivo o in vitro. La producción del anticuerpo o fragmento de unión a antígenos se analiza más adelante. Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención inhibe la unión del receptor-1 Nogo a un- ligando (por ejemplo, NogoA, NogoB, NogoC, ¡YLA.G, OM-gp) y disminuye la inhibición mediada por melina de la excrescencia de neuritas y el brote, particularmente crecimiento axonal, y atenúa el colapso mediado por mielina de los conos de crecimiento . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-receptor-1 Nogo o fragmento de unión a antígeno del mismo es murina. En algunas modalidades, el receptor-1 Nogo es de rata. En otras modalidades, el receptor-1 Nogo es humano. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-receptor-1 Nogo o fragmentos de unión a antígeno del mismo es recombinante, manejado, humanizado y/o quimérico . En algunas modalidades, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de: 7E11 monoclonal (*ATCCMR acceso número PTA-4587) ; 1H2 monoclonal (ATCC® acceso No. PTA-4587) ; 1H2 monoclonal (ATCC® acceso No. PTA 4584); 2F7 monoclonal (ATCC® acceso No. PTA-4585) ; 3G5 monoclonal (ATCC® acceso No. PTA-458S) ; y 5B10 monoclonal (ATCC® acceso No. PTA-4588) . En algunas modalidades, el anticuerpo es anticuerpo 46 policlonal . Los fragmentos de unión a antígeno de ejemplo son Fab, Fa ' , F(ab')ai Fv, Fd, dAb, y fragmentos que contienen fragmentos de la región de determinación de complementariedad (CDR) anticuerpos de cadena individual (scFv) , anticuerpos quiméricos, diacuerpos y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión específica a antígeno al polipéptido (por ejemplo, inmunoadhesinas) . Como se usa en la presente, Fd significa un fragmento que consiste de los dominios VH y CHi; Fv significa un fragmento que consiste de los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo y dAb significa un fragmento que consiste de un dominio VH (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989) . Como se usan en la presente, anticuerpo de cadena individual (scFv) significa un anticuerpo en el cual están apareadas una región VL y una región VH para formar moléculas monovalentes vía un ligador sintético que les permite hacerse como una cadena de proteína individual (Bird et al . , Science 242:423-426, 1988 y Huston et al., Proc . Nati, Acad. Sci . USA 85:5879-5883, 1988) . Como se usa en la presente, diacuerpo significa un anticuerpo biespecífico en el cual los dominios VH y VL se expresan en una cadena individual de polipéptido, pero usando un ligador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de este modo los dominios a aparearse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígeno. (ver, por ejemplo Holliger, P., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993 y Poljak, R.J., et al., Structure 2:1121-1123, 1994). Como se usa en la presente, inmunoadhesina que se une de manera específica a un antígeno de interés, significa una molécula en la cual se pueden incorporar una o más CDR, ya sea de manera covalente o no covalente . En algunas modalidades, la invención proporciona un polipéptido de sub-unidad de un anticuerpo de receptor-1 Nogo de la invención, en donde el polipéptido de sub-unidad se selecciona del grupo que consista de: (a) una cadena pesada o una región variable del mismo; y (b) una cadena ligera o una región variable del mismo. En algunas modalidades, la invención proporciona un ácido nucleico que codifica para la cadena pesada o la región variable del mismo, o la cadena ligera y la región variable del mismo de un polipeptido de sub-unidad de un anticuerpo de receptor-1 Nogo de la invención. En algunas modalidades, la invención proporciona una región hipervariable (CDR) de un anticuerpo de receptor-1 Nogo de la invención o un ácido nucleico que codifica para una CDR. Inmunización Los anticuerpos de la invención se pueden generar por inmunización de un hospedador adecuado (por ejemplo, vertebrados, incluyendo humanos, ratones, ratas, ovejas, cabras, cerdos, ganado, caballos, reptiles, peces, anfibios y en huevos de aves, reptiles y peces) . Estos anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales . En algunas modalidades, el hospedador se inmuniza con un polipeptido inmunogénico de receptor-1 Nogo de la invención. En otras modalidades, el hospedador se inmuniza con el receptor-1 Nogo asociado con la membrana celular de una célula intacta o desestabilizada y los anticuerpos de la invención se identifican por unión a un polipeptido de receptor-1 Nogo de la invención. En algunas modalidades, el antigeno del receptor-1 Nogo se administra con un adyuvante para estimular la respuesta inmunitaria. Los adyuvantes necesitan frecuentemente ser administrados además del antígeno a fin de producir una respuesta inmunitaria al antígeno. Estos adyuvantes son usualmente sustancias insolubles o no degradables que promueven la inflamación no especifica, con reclutamiento de fagocitos mononucleares en el sitio de inmunización. Los ejemplos de adyuvantes incluyen de manera enunciativa y sin limitación, adyuvante de Freund, IBI (muramil-dipéptidos) , ISCOM (complejos inmunoestimulantes) o fragmentos de los mismos. Para una revisión de los métodos para fabricar anticuerpos, ver por ejemplo, Harlow y La e (1988) , Antibodies, A Laboratory Manual, Yelton, D.E. et al. (1981); Ann. ev. of Biochem. , 50, pp. 657-80., and Ausubel et al. (1989) ; Current Protocols in Molecular Biology (New York: John Wiley & Sons) . La determinación de la inmunorreactividad con un polipéptido inmunogénico de receptor-1 Nogo de la invención se puede hacer por cualquiera de varios métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, ensayo de inmunotransferencia y ELISA. Producción de Anticuerpos y Líneas Celulares que Producen Anticuerpos Los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden elaborar por procedimientos normales como se describe por ejemplo en Harlow y Lañe (1988), supra. En pocas palabras, en un periodo apropiado de tiempo, el animal se sacrifica y se inmortalizan los nodulos linfáticos y/o células B esplénicas por cualquiera de las varias técnicas que son bien conocidas, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, transformación, tal como con EBV o fusión con una línea celular inmortalizada, tal como células de mieloma. Posteriormente, las células se separan de forma clonal y los sobrenadantes de cada clon se prueban para la producción de un anticuerpo específico para un polipéptido inmunogénico de receptor-1 Nogo de la invención. Los métodos para seleccionar, clonar y expandir hibridomas son bien conocidos en la técnica. De manera similar, son bien conocidos en la técnica los métodos para identificar el nucleótido y secuencia de aminoácidos de los · genes de inmunoglobulina. Otras técnicas adecuadas para producir un anticuerpo de la invención comprenden exposición in vitro de linfocitos al receptor-1 Nogo o un polipéptido inmunogénico de la invención, o de manera alternativa, selección de bibliotecas de anticuerpos en fago o vectores similares. Ver Huse et al., Science, 246, pp. 1275-81 (1989). Los anticuerpos útiles en la presente invención se pueden emplear con o sin modificación. Los antígenos (en este caso el receptor-1 Nogo o un polipéptido inmunogénico de la invención) y los anticuerpos se pueden marcar por unión, ya sea de manera covalente o no covalente, de una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conocen varias marcas y técnicas de conjugación en la técnica y se pueden emplear en la práctica de la invención. Las marcas o marbetes adecuados incluyen de manera enunciativa y sin limitación, radionucleótidos , enzimas, sustratos, co-factores, inhibidores, agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes , partículas magnéticas y similares. Las patentes que enseñan el uso de estas marcas o marbetes incluyen las Patentes de los Estados Unidos Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 y 4,366,241. También se pueden producir inmunoglobulinas recombinantes (ver Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567). En algunas modalidades de la invención, un anticuerpo tiene múltiples especificidades de unión, tal como un anticuerpo bifuncional preparado por cualquiera de varias técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica incluyendo la producción de hibridomas híbridos, intercambio de disulfuro, reticulación química, adición de ligadores peptídicos entre dos anticuerpos monoclonales , la introducción de dos conjuntos de cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina en una línea celular particular, y de más (ver más adelante para análisis más detallado) . Los anticuerpos de esta invención también pueden ser anticuerpos monoclonales humanos, por ejemplo, aquellos producidos por células humanas inmortalizadas, por ratones SCID-hu u otros animales no humanos capaces de producir anticuerpos "humanos" . Bibliotecas de Exhibición en Fago Los anticuerpos anti-receptor-1 Nogo de esta invención se pueden aislar por detección de una biblioteca' de anticuerpos de combinación, recombinante . Las bibliotecas de combinación de ejemplo son para la unión a un polipéptido inmunogénico de receptor-1 Mogo de la invención, tal como una biblioteca de exhibición en fago de scFv, preparada usando ADNc de VL y VH preparados a partir de ARNm derivado de un animal inmunizado con un polipéptido inmunogénico de receptor-1 Nogo de la invención. Las metodologías para preparar y detectar estas bibliotecas se conocen en la técnica. Hay métodos y materiales comercialmente disponibles para generar bibliotecas de exhibición en fago (por ejemplo, the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, catalog no. 27-9400-01; the Stratagene SurfZAP™ phage display kit, catalog no. 240612; y otros de MorphoSys) . También hay otros métodos y reactivos que se pueden usar en la generación y detección de bibliotecas de exhibición de anticuerpo (ver por ejemplo, Ladner et al. Patente de los Estados Unidos No. 5,223,409, Kang et al. PCT Publication No. WO 92/18619; Dower et al. Publicación PCT No. WO 91/17271; Winter et al. Publicación PCT No. WO 92/20791; Markland et al. Publicación PCT No. WO 92/15679; Breitling et al. Publicación PCT No. WO 93/01288; McCafferty et al. Publicación PCT No. WO 92/01047; Garrard et al . Publicación PCT No. WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc . Nati. Acad. Sci . USA 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nucí. Acids Res. 19:4133-4137; y Barbas et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:7978-7982. Después de la detección y aislamiento de un anticuerpo anti-receptor-1 Nogo de la invención a partir de una biblioteca de exhibición de inmunoglobulinas recombinantes, el ácido nucleico que codifica para el anticuerpo seleccionado se puede recuperar del paquete de exhibición (por ejemplo, del genoma del fago) y se sub-clona en otros vectores de expresión por técnicas de ADN recombinante, normales. Si se desea, el ácido nucleico se puede manipular adicionalmente para crear otras formas de anticuerpo de la invención, como se describe más adelante. Para expresar un anticuerpo aislado por detección de una biblioteca de combinación, el ADN que codifica para la cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo con las regiones variables del mismo se clona en un vector de expresión recombinante y se introduce en una célula hospedadora de mamífero, como se describe anteriormente. Cambio de Clase Los anticuerpos anti-receptor-1 Nogo de la invención pueden ser de cualquier isotipo. Un anticuerpo de cualquier isotipo deseado se puede producir por cambio de clase. Para el cambio de clase, los ácidos nucleicos que codifican para VL ó VH, que no incluyen ninguna secuencia de nucleótidos que codifica para CL ó CH, se aislan usando métodos bien conocidos en la técnica. Los ácidos nucleicos que codifican para VL ó VH, entonces se enlazan de forma operativa a una secuencia de nucleótidos que codifica para una CL ó CH, de una clase deseada de molécula de inmunoglobulina . Esto se puede lograr usando un vector o ácido nucleico que comprende una cadena CL ó CH, como se describe anteriormente. Por ejemplo, un anticuerpo anti-receptor-1 Nogo de la invención que fue originalmente IgM puede ser cambiada de clase a una IgG. Adicionalmente, el cambio de clase se puede adicionar para convertir una sub-clase de IgG a otro, por ejemplo, de IgGl a IgG2. Anticuerpos Mutados En otras modalidades, los anticuerpos o fragmentos de unión a antigeno de la invención se pueden mutar en los dominios variables de las cadenas pesada y/o ligera para alterar una propiedad de unión del anticuerpo. Por ejemplo, se puede hacer una mutación en una o más de las regiones GDR para incrementar o disminuir la d del anticuerpo para el receptor-1 Nogo, para incrementar o disminuir la Dff, o para alterar la especificidad de unión del anticuerpo. Son bien conocidas las técnicas en la mutagénesis dirigida al sitio. Ver, por ejemplo Sambrook et al . y Ausubel et al., supra . En una modalidad preferida, se hacen mutaciones en un residuo de aminoácido que se conoce que se cambia en comparación a la línea germinal en una región variable de un anticuerpo anti-receptor- 1 Nogo de la invención. En algunas modalidades, se hacen mutaciones en una o más residuos de aminoácido que se conoce que se cambian en comparación a la línea germinal en una región variable de un anticuerpo anti-receptor- 1 Nogo de la invención. En otra modalidad, un ácido nucleico que codifica para una región variable de cadena ligera o cadena pesada de anticuerpo o se muta en una o más de las regiones de estructura. Se puede hacer una mutación en una región de estructura o dominio constante para incrementar la vida en anaquel . Una mutación en una región de estructura o dominio constante también se puede hacer para alterar la inmunogenicidad del anticuerpo, para proporcionar un sitio para la unión covalente o no covalente a otra molécula, o para alterar estas propiedades como fijación de complemento. Se pueden hacer mutaciones en cada una de las regiones de estructura, el dominio constante y las regiones variables en un anticuerpo mutado, individual. De manera alternativa, se pueden hacer mutaciones en sólo una de las regiones de estructura, las regiones variables o el dominio constante en un anticuerpo mutado, individual. Anticuerpos de Fusión e Inmunoadhesinas En otra modalidad, se puede elaborar un anticuerpo de fusión o inmunoadhesina que comprende todo o una porción de un anticuerpo ant -receptor- 1 Nogo de la invención enlazado a otro polipéptido. En algunas modalidades, solo la región variable del anticuerpo anti-receptor- 1 Nogo esta enlazado al polipéptido. En otras modalidades, el dominio VH de un anticuerpo ant i -receptor- 1 Nogo de esta invención se enlaza a un primer polipéptido, en tanto que el dominio VL del anticuerpo se enlaza a un segundo polipéptido que se asocia con el primer polipéptido de una manera que permite que los dominios VH y VL interactúan entre sí para formar un sitio de unión a anticuerpo. En otras modalidades, el dominio VH se separa del dominio VL por un ligador que permite que los dominios VH y VL interactúen entre sí (ver más adelante bajo Anticuerpos de Cadena Individual) . El anticuerpo VH -ligador-VL entonces se enlaza a un polipéptido de interés. El anticuerpo de fusión es útil para dirigir un polipéptido a una célula o tejido que' expresa un ligando de receptor-1 Nogo. El polipéptido de interés puede ser un agente terapéutico, tal como una toxina, o puede ser un agente de diagnóstico, tal como una enzima, que se puede visualizar fácilmente, tal como peroxidasa de rábano. Además, los anticuerpos de fusión se pueden crear en los cuales se enlazan dos (o más) anticuerpos de cadena individual entre sí . Esto es útil si se desea crear un anticuerpo divalente o polivalente en una cadena individual de polipéptido, o si se desea crear un anticuerpo biespecxfico. Anticuerpos de Cadena Individual La presente invención incluye un anticuerpo de cadena individual (scFv) que se une al polipéptido de receptor-1 Nogo de la invención. Para producir el ScFv, y el ADN que codifica para VH y VL se enlaza operativamente al ADN que codifica para un ligador flexible, por ejemplo, que codifica para la secuencia de aminoácidos (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO: 10) , tal que las secuencias de VH y VL se puedan expresar como una proteína de cadena individual, contigua, con las regiones VL y VH unidas por el ligador flexible (ver, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554) . El anticuerpo de cadena individual puede ser monovalente, si solo se usan un VH y VL individual, divalente, si se usan dos VH y VL, o polivalente, si se usan más de dos VH y VL . Anticuerpos quiméricos La presente invención incluye . además un anticuerpo biespecifico o fragmento de unión a antígeno del mismo en el cual una especificidad es para un polipéptido de receptor-1 Nogo de la invención. En una modalidad, se puede generar un anticuerpo quimérico que se una de forma especifica a un polipéptido de receptor-1 Nogo de la invención a través de un dominio de unión y a una segunda molécula a través de un segundo dominio de unión. El anticuerpo quimérico se puede producir a través de técnicas biológicas moleculares recombinantes , o se puede conjugar físicamente de forma conjunta. Además, un anticuerpo de cadena individual que contiene uno o más de VH y VL se puede generar el cual se une de forma específica a un polipéptido de la invención y a otra molécula que está asociada con la atenuación del colapso mediado por mielina de los conos de crecimiento y de la inhibición de la excrescencia de neuritas y brote. Estos anticuerpos biespecífieos se pueden generar usando técnicas que don bien conocidas, por ejemplo, Fanger et al. Immunol Methods 4: 72-81 (1994) y Wright y Harris, supra . , y en unión con (iii) ver por ejemplo Traunecker et al. Int. J. Cáncer (Suppl.) 7: 51-52 (1992) . En algunas modalidades, los anticuerpos quiméricos se preparan usando una o más de las regiones variables de un anticuerpo de la invención. En otra modalidad, el anticuerpo quimérico se prepara usando una o más regiones CDR de este anticuerpo. Anticuerpos Derivatizados y Marcados Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de la invención se puede derivatizar o enlazar a otra molécula (por ejemplo, otro péptido o proteína) . En general, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se derivatiza tal que no se afecta de forma adversa por la derivati zación o marcación la unión a un polipéptido de la invención. Por ejemplo, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención se puede enlazar de forma funcional (por acoplamiento químico, función genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares diferentes, tal como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo) , un agente de detección, un agente citotóxico, un agente farmacéutico, y/o una proteina o péptido que puede mediar la asociación del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno con otra molécula (tal como una región de núcleo de estreptavidina o una marca de polihist idina) . Es algunas modalidades, se produce un anticuerpo derivatizado por reticulación de dos o más anticuerpos (del mismo tipo o de diferentes tipos, por ejemplo, para crear anticuerpos biespecificos ) . Los ret iculadores adecuados incluyen aquellos que son heterobifuncionales , que tiene dos grupos distintamente reactivos separados por un separador apropiado (por ejemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) u homobifuncional (por ejemplo suberato de disuccinimidilo . Estos ligadores están disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford, 111. En algunas modalidades, el anticuerpo de ivat i zado es un anticuerpo marcado. Los agentes de detección de ejemplo con los cuales se puede derivatizar un anticuerpo o una porción de anticuerpo de la invención son compuestos fluorescentes, que incluyen fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína , rodamina, cloruro de 5 -dimetilamina- 1 -naft alensulfonilo, picoeritrina , fósforos de lantánidos y similares. Un anticuerpo también se puede marcar con enzimas que son útiles para la detección, tal como peroxidasa de rábano, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, glucosa-oxidasa y similares. En modalidades que se marcan con una enzima detectable, el anticuerpo se detecta al adicionar reactivos adicionales que la enzima usa para producir un producto de reacción detectable. Por ejemplo, peroxidasa de rábano con peróxido de hidrógeno y diaminobencidina. También se puede marcar un anticuerpo con biotina, y se detecta a través de la medición indirecta de la unión de avidina o estreptavidina. Un anticuerpo también sé puede marcar con un epitope de polipéptido predeterminado reconocido por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de par de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpo secundarios, dominios de unión metálica, indicadores de epítopes) . Un anticuerpo anti-receptor-1 Nogo o un fragmento de antígeno del mismo también se puede marcar con un aminoácido radiomarcado . La radiomarca se puede usar tanto para propósitos de diagnóstico como terapéuticos. El anticuerpo anti-receptor-1 Nogo radiomarcado se puede usar en forma de diagnóstico, por ejemplo, para determinar los niveles de receptor-1 Nogo en un sujeto. Adicionalmente, el anticuerpo anti-receptor-1 Nogo radiomarcado se puede usar de forma terapéutica para tratar lesión en médula ' espinal . Los ejemplos de marcas para polipéptidos incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, los siguientes radioisótopos o radionucleótidos - 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, llxIn, 125I, 131I . Un anticuerpo anti-receptor-1 Nogo o un fragmento de antígeno del mismo también se puede derivatizar con un grupo químico tal como polietilenglicol (PEG) , un grupo metilo o etilo, o un grupo de carbohidratos. Estos grupos pueden ser útiles para mejorar las características biológicas del anticuerpo, por ejemplo, para incrementar la vida media en suero o para incrementar la unión en tejido. Caracterización de Anticuerpos Anti-receptor-1 Nogo Clase y Subclase de Anticuerpos Anti-receptor-1 Nogo La clase y subclase de anticuerpos anti-receptor-1 Nogo se puede determinar por cualquier método conocido en la técnica. En general, la clase y subclase de un anticuerpo se puede determinar usando anticuerpos que son específicos para una clase particular y subclase particular de anticuerpo. Estos anticuerpos están disponibles de forma comercial . La clase y subclase se puede determinar por ELISA, Transferencia Western así como otras técnicas. De manera alternativa, la clase y subclase se puede determinar al secuenciar todos o una porción de los dominios constantes de las cadenas pesadas y/o ligeras de los anticuerpos, comparando sus secuencias de aminoácidos a secuencias conocidas de aminoácidos de varias clases y subclases de inmunoglobulinas, y al determinar la clase y subclase de los anticuerpos. Afinidad de unión de anticuerpo anti-receptor-1 Nogo al receptor-1 Nogo La afinidad de unión y velocidad de disociación de un. anticuerpo anti-receptor-1 Nogo de la invención o un polipéptido de receptor-1 Nogo de la invención se puede determinar por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la afinidad de unión se puede medir por ELISA competitivos, RIA, BIAcore o tecnología KinExA. La velocidad de disociación también se puede medir por tecnología BIAcore o KinExA. La afinidad de unión y la velocidad de disociación se miden por resonancia de plasmón superficial usando, por ejemplo, un BIAcore. La ¾ de 7E11 y 1H2 se determinó que es 1 x 10~7 M y 2 x 10"8 M, respectivamente. Inhibición de actividad de receptor-1 Nogo por anticuerpo anti-receptor-1 Nogo En algunas modalidades, un anticuerpo anti-receptor-1 Nogo o un fragmento de unión a antígeno de la invención del mismo inhibe la unión del receptor-1 Nogo a un ligando. La IC50 de esta inhibición se puede medir por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, por ELISA, RIA, o Antagonismo Funcional. En algunas modalidades, la IC50 está entre 0.1 y 500 nM. En algunas modalidades, la IC50 está entre 10 y 400 nM. En aún otras modalidades, el anticuerpo o porción del mismo tiene una IC50 entre 60 nM y 400 nM. La IC50 de 7E11 y 1H2 se determinó que son 400 nM y SO nM, respectivamente, en un ensayo de unión. Ver también tabla 3 , infra. En resumen, un experto en la técnica, provisto con las enseñanzas de esta invención, tiene disponible una variedad de métodos que se pueden usar para alterar las propiedades biológicas de los anticuerpos de esta invención incluyendo métodos que incrementarán o disminuirán la estabilidad o vida media, inmunogenicidad, toxicidad, afinidad o rendimiento de una molécula de anticuerpo dada, o la alterarán de cualquier otra manera que la pueda volver más adecuada para una aplicación particular. Las composiciones que comprenden, y los usos de, los anticuerpos de la presente invención se describen a continuación. Polipéptidos Solubles de Receptor-1 Mogo Proteína El receptor-1 Nogo de longitud completa consiste de una secuencia de señal, una región de N-término (NT) , ocho repeticiones de alto contenido de leucina (LRR) , una región LRRCT (un dominio de repeticiones de alto contenido de leucina C-terminal de las ocho repeticiones de alto contenido de leucina) , una región de C-término (CT) y un ancla GPI (ver Figura 1) . Algunas modalidades de la invención proporcionan un polipéptido soluble de receptor-1 Nogo. Los polipéptidos solubles de receptor-1 Nogo de la invención comprenden un dominio NT; 8 LRR y un dominio LRRCT y carecen de una secuencia de señal y un ancla GPI funcional (es decir, ninguna ancla GPI o un ancla GPI que carece de la capacidad para asociarse de forma eficiente a una membrana celular) . En algunas modalidades, un polipéptido soluble de receptor-1 Nogo comprende una LRR heteróloga. En algunas modalidades, un polipéptido soluble de receptor-1 Nogo comprende 2, 3, 4 , 5, 6 , 7 u 8 LRR heterólogas . Una LRR heteróloga significa una LRR obtenida de una proteína diferente del receptor-1 Nogo. Las proteínas de ejemplo de las cuales se puede obtener una LRR heteróloga son receptor tipo tañido (TLR1.2); proteína de alto contenido de repeticiones de leucina de activación de células T; OM-gp; corte de sub-unidad lábil ácida de proteína de unión a factor de crecimiento tipo insulina, y robo; y el receptor 4 tipo tañido . En algunas modalidades, la invención proporciona un polipéptido soluble de receptor-1 Nogo de 319 aminoácidos (receptor-1 soluble Nogo 344, sNogoRl-344, o sNogoR344) (residuos 26-344 de SEQ ID Nos: 6 y 8 o residuos 27-344 de SEQ ID NO: 8) . En algunas modalidades, la invención proporciona un polipép ido soluble de receptor-1 de Nogo de 285 aminoácidos (receptor-1 soluble Nogo 310, sNogoRl-310, o sNogoR310)' (residuos 26-310 de SEQ ID Nos: 7 y 9 o residuos 27-310 de SEQ ID NO: 9) . Ver Figura 1. Tabla 1 Secuencias de Polipéptidos de receptor-1 Nogo de Humano y Rata En algunas modalidades de la invención, los polipéptidos solubles de receptor-1 Nogo de la invención se usan para inhibir la unión de un ligando al receptor-1 Nogo y actuar como un antagonista de los ligandos del receptor-1 Nogo. En algunas modalidades de la invención los polipéptidos solubles de receptor-1 Nogo de la invención se usan para disminuir la inhibición de la excrescencia de neuritas y brote en una neurona, tal como crecimiento axonal y para inhibir el colapso mediado por mielina de los conos de crecimiento en una neurona. En algunas modalidades, la neurona es una neurona del CNS . De manera sorprendente sNogoR310 y sNogoR344, bloquean la unión NogoA, NogoB, NogoC, MAG y OM-gp al receptor-1 Nogo. En algunas modalidades, el polipeptido soluble del receptor-1 Nogo de la invención es ' un componente de una proteína de fusión que comprende adicionalmente un polipeptido heterólogo. En algunas modalidades, el polipéptido heterólogo es un dominio constante de inmunoglobulina. En algunas modalidades, el dominio constante de inmunoglobulina es un dominio constante de cadena pesada. En algunas modalidades, el polipéptido heterólogo es un fragmento Fe. En algunas modalidades, el Fe está unido al extremo C-terminal del polipéptido soluble de receptor-1 Nogo de la invención. En algunas modalidades, la proteína de receptor-1 Nogo de fusión es un dímero. Moléculas de Ácido Nucleico de la Presente Invención La presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la invención, que incluye los polipéptidos de cualquiera de SEQ ID Nos: 1-9, 26-27, 29-37 y 41-45. En algunas modalidades, el ácido nucleico codifica para un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de los residuos de aminoácido 26-344 del receptor-1 Nogo como se muestra en SEQ ID Nos: 6' y 8 o residuos 27-344 de aminoácidos del receptor-1 Nogo como se muestra en SEQ ID NO: 8. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico codifica para un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de los residuos 26-310 de aminoácidos del receptor-1 Nogo como se muestra en SEQ ID NO: 7 y 9 o los residuos 27-310 de aminoácidos del receptor-1 Nogo como se muestra en SEQ ID NO: 9. Como se usa en la presente, "ácido nucleico" significa ADN genómico, ADNc, ARNm y moléculas antisentido, asi como ácidos nucleicos basados en estructuras alternativas o que incluyen bases alternativas ya sea derivadas de fuentes naturales o sintetizadas. En algunas modalidades, el ácido nucleico comprende adicionalmente un promotor trascripcional y opcionalmente una secuencia de señal cada una de las cuales está enlazada operablemente a la secuencia de nucleótidos que codifica para los polipéptidos de la invención. En algunas modalidades, la invención proporciona un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión de receptor-1 Nogo de la invención, incluyendo una proteína de fusión que comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de los residuos 26-344 de aminoácidos del receptor-1 Nogo como se muestra en SEQ ID Nos: 6 y 8 o residuos 27-344 de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y residuos 26-310 de aminoácido del receptor-1 Nogo como se muestra en SEQ ID Nos: 7 y 9 o los residuos 27-310 de aminoácidos de SEQ ID NO : 9. En algunas modalidades, el ácido nucleico codifica para una proteína de fusión de receptor-1 Nogo que comprende polipéptidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 26-27, 29-37 y 41-45. En algunas modalidades, el ácido nucleico codifica para una proteína de fusión de receptor-1 Nogo comprende además un promotor trascripcional y opcionalmente una secuencia de señal. En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos codifica adicionalmente para una región constante de inmunoglobulina . En algunas modalidades, la región constante de inmunoglobulina es una región constante de cadena pesada. En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos codifica adicionalmente para una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina unida a una región de articulación. En algunas modalidades, el ácido nucleico codifica adicionalmente para Fe. En algunas modalidades, las proteínas de fusión del receptor-1 Nogo comprenden un fragmento Fe. Los ácidos nucleicos de codificación de la presente invención se pueden modificar adicionalmente para contener una marca detectable para propósitos de diagnóstico o de sonda. Se conocen en la técnica una variedad de estas marcas y se pueden emplear fácilmente con las moléculas de codificación descritas en la presente. Las marcas adecuadas incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, biotina, nucleótidos radiomarcados y similares. Un experto puede emplear cualquier de las marcas conocidas en la técnica para obtener una molécula de ácido nucleico de codificación, marcada . Composiciones En algunas modalidades, la invención proporciona composiciones que comprenden un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 1-5, 26-27, 29-37 y 41-45. En algunas modalidades, la invención proporciona composiciones que comprenden un anticuerpo anti-receptor-1 Nogo o un fragmento de unión a antlgeno del mismo, o un polipéptido soluble de receptor-1 Nogo o proteina de fusión de la presente invención. En algunas modalidades, la presente invención puede contener portadores farmacéuticamente aceptables, adecuados, que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en las preparaciones que se pueden usar de forma farmacéutica para la distribución al sitio de acción. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en la forma soluble en agua, por ejemplo, sales solubles en agua. Además, las suspensiones de los compuestos activos como suspensiones apropiadas de inyección aceitosa se pueden administrar. Los solventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de ajonjolí, o esteres sintéticos de ácidos grasos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos . Las suspensiones de inyección acuosa pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión e incluyen, por ejemplo, carboximetil-celulosa sódica, sorbitol y dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores. Los liposomas también se pueden usar para encapsular las moléculas de esta invención para la distribución a la célula. Los "portadores farmacéuticamente aceptables" de ejemplo son cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungales, agentes de retraso de absorción e isotónicos, y similares, que son fisiológicamente compatibles, agua, solución salina, solución salina amortiguada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como •combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la composición comprende agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tal como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio. En algunas modalidades, las composiciones comprenden sustancias farmacéuticamente aceptables tal como sustancias humectantes o cantidades menores de sustancias auxiliares tal como agentes humectantes o emulsionantes, conservadores o amortiguadores, que mejoran la vida en anaquel o efectividad de los anticuerpos, fragmentos de unión a. antígeno, receptores solubles Nogo o proteínas de fusión de la invención. Las composiciones de la invención pueden estar en una variedad de formas, incluyendo, por ejemplo, formas líquida, semisólida y sólida, tal como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles) , dispersiones o suspensiones . La forma preferida depende del modo propuesto de administración y de la aplicación terapéutica. En una modalidad, las composiciones están en la forma de soluciones inyectables o infusibles, tal como composiciones similares a aquellas usadas para la inmunización pasiva de humanos con otros anticuerpos. La composición de puede formular como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para la alta concentración del fármaco. Se pueden preparar soluciones inyectables estériles al incorporar un anticuerpo anti-receptor-1 Nogo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, como se requiere, seguido por esterilización filtrada. En general, se preparan dispersiones al incorporar el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio básico de dispersión y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente . En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son, secado al vacío y liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución anteriormente estéril-filtrada del mismo. La fluidez apropiada de una solución se puede mantener, por ejemplo, por el uso de un revestimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de agentes tensioactivos . La absorción prolongada de composiciones inyectables se puede ocasionar al incluir en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. En algunas modalidades, el compuesto activo se puede preparar con un portador que protegerá al compuesto contra la rápida liberación, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas microencapsulados de distribución. Se pueden usar polímeros biocompatibles biodegradables , tal como acetato de etilen-vinilo, polian ídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido ¦ poliláctico . Muchos métodos para la preparación de estas formulaciones están patentados o se conocen en general por aquellos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Los compuestos activos complementarios también se pueden incorporar en las composiciones. En algunas modalidades, un anticuerpo de receptor-1 Nogo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o polipéptidos solubles del receptor-1 Nogo o proteínas de fusión de la invención se co-formulan con y/o co-administran con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "cantidad profilácticamente efectiva" de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, polipéptido (s) o proteína de fusión de la invención. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a las dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de receptor-1 Nogo fragmento de unión a antígeno del mismo, polipéptido soluble de receptor-1 Nogo o proteína de fusión de receptor Nogo puede variar de acuerdo a factores tal como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la cual cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, polipéptido soluble de receptor-1 Nogo o proteína de fusión de receptor Nogo se ponderan por los efectos terapéuticos benéficos. Una "cantidad profilácticamente efectiva"' se refiere a una cantidad efectiva, a las dosis durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, puesto que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes de o e . una etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva. Se pueden ajustar regímenes de dosis para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica) . Por ejemplo, se puede administrar un bolo individual, varias dosis divididas se pueden administrar durante el tiempo y la dosis se puede reducir o incrementar de forma proporcional como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Especialmente es ventajoso formular composiciones parenterales en la forma de unidades de dosis para facilidad de administración y uniformidad de la forma unitaria de dosis como se usa en la presente se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos mamíferos que se van a tratar, cada unidad que contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosis de la invención se dictan por, y son directamente dependientes de, (a) las características únicas del anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, y polipéptido de receptor-1 soluble o proteína de fusión de receptor Nogo y el efecto terapéutico o profiláctico particular que se va a lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica del mezclado de este anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, y polipéptido soluble de receptor-1 o proteína de fusión de receptor Nogo para el tratamiento de sensibilidad en individuos. En algunas modalidades, un intervalo de dosis terapéuticamente efectivo para los anticuerpos de receptor-1 Nogo o fragmentos de unión a antígeno de los mismos es 0.1-4 mg/kg por día. En algunas modalidades, un intervalo de dosis terapéuticamente efectivo para anticuerpos de receptor-1 Nogo o fragmentos de unión a antígeno de los mismos es 0.2-4 mg/Kg por día. En algunas modalidades, un intervalo de dosis terapéuticamente efectivo para anticuerpos de receptor-1 Nogo o fragmentos de unión a antígeno de los mismos es 0.2 mg/Kg por día. Usos de los Anticuerpos, Fragmentos de Unión a Antígeno, Receptores Solubles y Proteínas de Fusión En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para inhibir la actividad del receptor-1 Nogo al administrar anticuerpos anti-receptor-1 Nogo, fragmentos de unión a antígeno de estos anticuerpos, polipéptidos solubles de receptor-1 Nogo, o proteínas de fusión que comprenden estos polipéptidos a un mamífero en necesidad del mismo. En algunas modalidades, la invención proporciona un método para inhibir la unión del receptor-1 Nogo a un ligando, que comprende el paso de poner en contacto el receptor-1 Nogo con un anticuerpo o un fragmento de unión a antigeno de esta invención. En algunas modalidades, el ligando se selecciona del grupo que consiste NogoA, NogoB, NogoC, MA.G y OM-gp. En algunas modalidades, la invención proporciona un método para inhibir el colapso de los conos de crecimiento en una neurona, que comprende el paso de poner en contacto una neurona con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de esta invención. En algunas modalidades, la invención proporciona un método para disminuir la inhibición de la excrescencia de neuritas o brote en una neurona, que comprende el paso de poner en contacto la neurona en el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de esta invención. En algunas modalidades, la neurona es una neurona del CNS . En algunos de estos métodos, la excrescencia de neuritas o brote es crecimiento axonal . En algunas modalidades , la invención proporciona un método para promover la supervivencia de una neurona en un mamífero, neurona que está en riesgo agónico, que comprende (a) proporcionar una célula hospedadora cultivada que expresa (i) un anticuerpo anti-receptor-1 Nogo o fragmento de unión a antígeno del mismo; o (ii) un polipéptido soluble de receptor-1 Nogo; y (b) introducir la célula hospedadora en el mamífero en o cerca del sitio de la neurona. Almudena Ramón-Cueto, M Isabel Cordero, Fernando F Santos- Benito y Jesús Avila (2000) Functional recovery of paralegic rats and motor axon regneration in their spinal cords by olfactory ensheathing cells. Neuron 25,425-435. En algunas modalidades, la invención proporciona un método de terapia génica para promover la supervivencia de una neurona en riesgo agónico, neurona que está en un mamífero, que comprende administrar en o cerca del sitio de la neurona un vector viral que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para (a) un anticuerpo anti-receptor-1 Nogo o fragmentos de unión a antígeno del mismo; o (b) un polipéptido soluble de receptor-1 Nogo, en donde el anticuerpo anti-receptor-1 Nogo, fragmentos de unión a antigeno, o polipéptido soluble de receptor-1 Nogo se expresa de la secuencia de nucleótidos en el mamífero en una cantidad suficiente para promover la supervivencia de la neurona.

Los vectores virales y métodos útiles para estas modalidades se describen en por ejemplo Noel et al., Human Gene Therapy, 13,1483-93 (2002). En algunas modalidades, la invención proporciona un método para inhibir la unión del receptor-1 Nogo a un ligando, que comprende el paso de poner en contacto el ligando con el polipéptido soluble de receptor-1 Nogo o la proteína de fusión del receptor-1 Nogo de esta invención. En algunas modalidades, la invención proporciona un método para modular una actividad de un ligando de receptor-1 Nogo, que comprende el paso de poner en contacto el ligando de receptor-1 Nogo con un polipeptido soluble de receptor-1 Nogo o una proteína de fusión de receptor-1 Nogo de la invención . En algunas modalidades, la invención proporciona un método para inhibir el colapso de los conos de crecimiento en una neurona, que comprende el paso de poner en contacto un ligando del receptor-1 Nogo con un polipeptido soluble de receptor-1 Nogo o una proteína de fusión de receptor-1 Nogo de esta invención. En algunas modalidades, la invención proporciona un método para disminuir la inhibición de la excrescencia de neuritas o brote en una neurona, que comprende el paso de poner en contacto un ligando de receptor-1 Nogo con el polipeptido soluble de receptor-1 Nogo o la proteína de fusión de receptor-1 Nogo de esta invención. En algunas modalidades, la neurona es una neurona del CNS. En algunas modalidades, el ligando selecciona del grupo que consiste NogoA, NogoB, NogoC, MAG y OM-gp. En algunas modalidades, la excrescencia de neuritas o brote es crecimiento axonal . Cualquiera de los tipos de anticuerpos o receptores descritos- en la presente, se pueden usar de forma terapéutica. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-receptor-1 Nogo es un anticuerpo humano. En algunas modalidades, el mamífero es un paciente humano. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se administra a un mamífero no humano que expresa un receptor-1 Nogo con el cual reacciona de forma cruzada el anticuerpo (por ejemplo, un primate, mono cynomologous o rhesus) para propósitos veterinarios o como un modelo de animal de la enfermedad humana. Estos modelos en animal pueden ser útiles para evaluar la eficiencia terapéutica de los anticuerpos de esta invención. En .algunas modalidades, la administración del anticuerpo anti-receptor-1 Nogo o fragmento de unión a antígeno, o polipéptido soluble de receptor-1 Nogo o proteína de fusión se usa para tratar una lesión de la médula espinal para facilitar el crecimiento axonal a través del sitio lesionado . Los anticuerpos anti- eceptor-1 Nogo o fragmento de unión a antígeno o polipéptidos solubles de receptor-1 Nogo o proteína de fusión de la presente invención se pueden proporcionar solas, o en combinación, en una combinación secuencial con otros agentes que modulan un proceso patológico particular. Por ejemplo, los agentes antiinflamatorios se pueden co-administrar después del ataque como un medio para bloquear daño neuronal adicional e inhibición de la regeneración axonal . Como se usa en la presente, los anticuerpos de receptor-1 Nogo, fragmento de unión a antígeno, receptor-1 Nogo soluble y proteína de fusión de receptor Nogo, se dice que se administran en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales cuando dos se administran de forma simultánea, consecutiva o independiente . Los anticuerpos anti-receptor-1 Nogo, fragmento de unión a antígeno, polipéptidos solubles de receptor-1 Nogo, proteína de fusión de receptor-1 Nogo de la presente invención se pueden administrar vía rutas parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal , transdérmica, por inhalación o bucal. Por ejemplo, se puede administrar un agente de forma local a un sitio de lesión vía microinfusión. Los sitios típicos incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, áreas dañadas de la médula espinal que resultan de lesión. La dosis administrada será dependiente de la edad, salud y peso del receptor, clase de tratamiento concurrente, si lo hay, frecuencia de tratamiento, la naturaleza del efecto deseado. Los compuestos de esta invención se pueden utilizar in vivo, ordinariamente en mamíferos, tal como humanos, ovejas, caballos, ganado, cerdos, perros, gatos, ratas y ratones, o in vitro. Vectores de la Invención En algunas modalidades, la invención proporciona moléculas de ADN recombinante (ADNr) que contienen una secuencia de codificación. Como se usa en la presente, una molécula de ADNr es una molécula de ADN que se ha sometido a manipulación molecular . Los métodos para generar moléculas de ADNr son bien conocidos en la técnica , ver por ej emplo Sambrook et al . , (1989) Molecular Cloriing-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press . En algunas moléculas de ADNr, se enlaza de forma operable una secuencia de ADN de codificación a secuencias de control de expresión y secuencias de vector. En algunas modalidades, la invención proporciona vectores que comprenden los ácidos nucleicos que codifican para los polipéptidos de la invención. La elección de las secuencias de vector y de control de expresión a las cuales se enlazan operablemente los ácidos nucleicos de esta invención depende directamente, como es bien conocido en la técnica de las propiedades funcionales deseadas (por ejemplo, expresión de proteína, y la célula hospedadora que se va a transformar) . Un vector de la presente invención puede ser al menos capaz de dirigir la replicación de inserción en el cromosoma hospedador, y de manera preferente también la expresión, del gen estructural incluido en la molécula de ADNr . Los elementos de control de expresión que se usan para regular la expresión de una secuencia de codificación de proteína operablemente enlazada se conocen en la técnica e incluyen de manera enunciativa y sin limitación, promotores inducibles , promotores constitutivos , señales de secreción, y otros elementos reguladores . De manera preferente , el promotor inducible se controla fácilmente , tal como al ser sensible a un nutriente en el medio de la célula hospedadora . En una modalidad, el vector que contiene una molécula de ácido nucleico de codificación incluirá un replicón procariotico , es decir, una secuencia de ADN que tiene la capacidad para dirigir replicación autónoma y mantenimiento de la molécula de ADN recombinante de forma extracromosómica en una célula hospedadora procariótica, tal como una célula hospedadora bacteriana, transformada con el mismo. Estos replicones son bien conocidos en la técnica. Además, los vectores que incluyen un replicón procariotico también pueden incluir un gen cuya expresión confiere un marcador detectable o seleccionable tal como una resistencia a fármacos . Típico de los genes bacterianos de resistencia a fármacos son aquellos que confieren resistencia a ampicilina o tetraciclina . Los vectores que incluyen un replicón procariotico pueden incluir adicionalmente un promotor procariotico o de bacteriófago capaz de dirigir la expresión (trascripción y transducción) de las secuencias génicas de codif icación en una célula hospedadora bacteriana , tal como E. coli Un promotor es un elemento de control de expresión formado por una secuencia de ADN que permite la unión de ARN-polímerasa y que esté presente la trascripción .

Las secuencias promotoras compatibles con los hospedadores bacterianos se proporcionan típicamente en vectores de plásmido que contiene sitios de restricción convenientes para la inserción de un segmento de ADN de la presente invención. Los ejemplos de estos plásmidos de vector son pUC8, pUC9, pBR322 y pBR329 (Bio-Rad1* Laboratories) , pPL y pKK223 (Pharmacia) . Cualquier hospedador procariótico adecuado se puede usar para expresar una molécula de ADN recorribinante que codifica para una proteína de la invención Los vectores de expresión compatibles con células eucarióticas, de manera preferente aquellos compatibles con células de vertebrados, también se pueden usar para formar moléculas de ADNr que contienen una secuencia de codificación. Los vectores de expresión de células eucarióticas son bien conocidos en la técnica y están disponibles de varias fuentes comerciales . Típicamente, estos vectores se proporcionan conteniendo sitios convenientes de restricción para la inserción del segmento deseado de ADN. Los ejemplos de estos vectores son pSVL y pKSV-10 (Pharmacia) , pBPV- 1 , pML2d (International Biotechnologies) , pTDTl (ATCC^ 31255 ) y otros vectores eucarióticos de expresión . Los vectores de expresión de células eucarióticas usados para construir las moléculas de ADNr de la presente invención pueden incluir adicionalmente un marcador seleccionable que es efectivo en una célula eucariótica, de manera preferente un marcador de selección de resistencia a fármacos . Un marcador de resistencia a fármacos preferido es el gen cuya expresión da por resultado resistencia a neomicina , es decir, el gen de neomicina-f osf otransf erasa (neo) . (Southern et al . , (1982 ) J . Mol . Anal . Genet . 1 , 327-341) . De manera alternativa , el marcador seleccionable puede estar presente en un plásmido separado , los dos vectores introducidos por co-transfección de la célula hospedadora, y los transíectantes seleccionados al cultivar en el fármaco apropiado para el marcador seleccionable . Para expresar los anticuerpos, o porciones de anticuerpo de la invención, los ADN que codifican para cadenas ligeras y pesadas parciales o de longitud completa se insertan en vectores de expresión tal que los genes se enlazan operativamente a las secuencias de control trascripcionales y transduccionales . Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, cósmicos, YAC, episomas derivadas de EBV, y similares. El gen de anticuerpos se liga en un vector tal que las secuencias de control trascripcional y transduccional dentro del vector sirven a sus funciones propuestas de regular la trascripción y transducción del gen de anticuerpo. Las secuencias de control de expresión y de vector de expresión de eligen para ser compatibles con la célula hospedadora de expresión usada. El gen de cadena ligera de anticuerpo y el gen de cadena pesada de anticuerpo se pueden insertar en vectores separados. En algunas modalidades, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpo se insertan en el vector de expresión por métodos normales (por ejemplo, ligación de sitios complementarios de restricción en el fragmento del gen de anticuerpo y vector, o ligación por extremos romos si no están presentes sitios de restricción) .

Un vector conveniente es uno que codifica para una secuencia de inmunoglobulina CH o CL humana, funcionalmente completa, con sitios de restricción apropiados manejados de modo que cualquier secuencia de VH o VL se puede insertar y expresar fácilmente, como se describe anteriormente. En estos vectores, el empalme se presenta usualmente entre el sitio donador de empalme y la región J insertada y el sitio aceptor de empalme que precede a la región C humana, y también en las regiones de empalme que se presentan dentro de los exones CH humanos . La terminación de trascripción y la poliadenilación se presentan en los sitios cromosómicos nativos en la dirección 3 ' de las regiones de codificación. El vector de expresión recombinante también puede codificar para un péptido de señal que facilita la secreción de la cadena del anticuerpo a partir de una célula hospedadora. El gen de la cadena de anticuerpo se puede clonar en el vector tal que el péptido de señal se enlaza en cuadro al término amino del gen de la cadena de anticuerpo. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de inmunoglobulina o un péptido de señal heterólogo (es decir, un péptido de señal de una proteína no de inmunoglobulina) . Además de los polipéptidos inmunogénicos , los anticuerpos de receptor-1 Nogo, fragmento de unión a antígeno, polipéptidos solubles de receptor-1 Nogo y proteína de fusión de receptor-1 Nogo solubles de la presente invención, los vectores de expresión recombinantes de la invención tiene secuencias reguladoras que controlan su expresión en una célula ospedadora . Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de las secuencias reguladoras puede depender de factores tal como la elección de la célula hospedadora que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc . Las secuencias reguladoras preferidas para expresión en células hospedadoras de mamífero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteína en células de mamífero , tal como promotores y/o intensif icadores derivados de LTR retrovirales , citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/intensif icador de CMV) , virus Simiesco 40 (SV40 ) (tal como el promotor/intensif icador de SV40) , adenovirus (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP) ) , polioma y fuertes promotores de mamíferos tal como promotores de actina e inmunoglobulina nativa. Para descripción adicional de elementos reguladores virales, y secuencias de los mismos, ver por ejemplo la Patente de los Estados Unidos No. 5, 168, 062 de Stinski, Patente de los Estados Unidos No . 4 , 510 , 245 de Bell et al . , y Patente de los Estados Unidos No . 4 , 968 , 615 de Schaffner et al . Además de los genes heterólogos y secuencias reguladoras , los vectores de expresión recombinante de la invención pueden tener secuencias adicionales , tal como secuencias que regulan la replicación del vector en células hospedadoras (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables . El gen marcador seleccionable facilita la selección de células hospedadoras en las cuales se ha introducido el vector (ver por ejemplo Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,399,216; 4,634,665 y 5,179,017 todas de Axel et al . ) . Por ejemplo, de forma típica, el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tal como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedadora en la cual se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de dihidrofoliato-reductasa (DHFR) (para el uso en células hospedadoras dhfr" con selección/amplificación por metotrexato) y el gen neo (para la selección de G418) . Células Hospedadoras y Métodos para Producir Recombinantemente la Proteína de la Invención Las moléculas de ácido nucleico que codifican para los anticuerpos anti-receptor-1 Nogo, péptidos inmunogénicos , polipéptidos solubles de receptor-1 Nogo, proteínas de fusión solubles de receptor-1 Nogo de esta invención y vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico se pueden usar para la transformación de una célula hospedadora adecuada. La transformación puede ser por cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula hospedadora. Los métodos para introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son bien conocidos en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos , electroporación, encapsulación de los polinucleótidos en liposomas, y microinyección directa del ADN en los núcleos. Además, las moléculas de ácido nucleico se pueden introducir en las células de mamífero por vectores virales . La transformación de hospedadores celulares apropiados con una molécula de ADNr de la presente invención se logra por métodos bien conocidos que dependen típicamente del tipo de vector usado y el sistema hospedador empleado. Con respecto a la transformación de células hospedadoras procarióticas, se pueden emplear métodos de tratamiento salino y electroporación (ver, por ejemplo Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cohén et al., (1972) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 69,2110-2114). Con respecto a la transformación de células de vertebrado con vectores que contienen ADNr, se pueden emplear métodos de electroporación, tratamiento salino o por lípidos catiónicos (ver por ejemplo, Graham et al., (1973) Virology 52,456-467., Wigler et al., (1979) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 76,1373-1376). Las células exitosamente transformadas, es decir, células que contienen una molécula de ADNr de la presente invención, se pueden identificar por técnicas bien conocidas que incluyen la selección para un marcador seleccionable. Por ejemplo, las células que resultan de la introducción de un ADNr de la presente invención se pueden clonar para producir colonias individuales . Las células de estas colonias se pueden recolectar, lisar y su contenido de ADN se examina para la presencia del ADNr usando un método tal como se describe por Southern, (1975) J. Mol. Biol . 98,503-517 o las proteínas producidas de las células se pueden valorar por un método inmunológico . Las líneas de células de mamífero disponibles como hospedadoras para la expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas de células inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCCMR) . Estas incluyen ínter alia., células de ovario de hámster Chino (CHO) , NSO, células SP2, células HeLa, células de riñon de hámster neonato (BHK) , células de riñon de mono (COS) , células de carcinoma hepatocelulares humanas (por ejemplo, Hep G2) , células A549, y varias otras líneas celulares. Las líneas celulares de preferencia particular se seleccionan a través de la determinación de qué líneas celulares tienen altos niveles de expresión. Otras líneas celulares que se pueden usar son líneas de células de insecto, tal como las células Sf9. Cuando los vectores de expresión recombinante que codifican para los polipéptidos inmunogénicos, anticuerpos de receptor-1 Nogo o fragmento de unión a antígeno, polipéptidos solubles de receptor-1 Nogo y proteína de fusión de receptor-1 Nogo solubles de la invención se introducen en células hospedadoras de mamífero, se producen al cultivar las células hospedadoras durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo, polipéptido y polipéptido de fusión en la célula hospedadora o de manera preferente, secreción de los polipéptidos inmunogénicos , anticuerpos de receptor-1 Nogo o fragmento de unión a antígeno, polipéptidos solubles de receptor-1 Nogo y proteínas de fusión solubles de receptor-1 Nogo de la invención en el medio de cultivo en el cual se cultivan las células hospedadoras. Los polipéptidos inmunogénicos, anticuerpos de receptor-1 Nogo o fragmento de unión a antígeno, polipéptidos solubles de receptor-1 Nogo y proteínas de fusión solubles de receptor-1 Nogo de la invención se pueden recuperar del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteínas normales. Adicionalmente , la expresión de polipéptidos inmunogénicos, anticuerpos de receptor-1 Nogo o fragmento de unión a antígeno, polipéptidos solubles de receptor-1 Nogo y proteínas de fusión solubles de receptor-1 Nogo de la invención (u otras porciones de los mismos) de líneas celulares de producción se pueden mejorar usando varias técnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de expresión de gen de glutamina-sintetasa (el sistema GS) es un planteamiento común para mejorar la expresión bajo ciertas condiciones. El sistema GS se analiza en totalidad o en parte con respecto a las Patentes Europeas Nos. 0,216,846; 0,256,055 y 0,323,997 y Solicitud de Patente Europea No. 89303964.4. Células Hospedadoras La presente invención proporciona además células hospedadoras transformadas con una molécula de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo de receptor-1 Nogo, fragmentos de unión a antígeno, polipéptido soluble de receptor-1 Nogo y/o protelna de fusión soluble de receptor-1 Nogo de la invención. La célula hospedadora puede ser ya sea procariótica o eucariótica. Las células eucarióticas útiles para la expresión de una proteína de la invención no se limitan, en tanto que la línea celular sea compatible con los métodos de cultivo celular y compatible con la propagación del vector de expresión y la expresión del producto génico. Las células hospedadoras eucarióticas preferidas incluyen de manera enunciativa y sin limitación, levadura, células de insecto y mamífero, de manera preferente células de vertebrado tal como aquellas de un ratón, rata, mono o línea celular humana. Los ejemplos de células hospedadoras eucarióticas útiles incluyen células de ovario de hámster Chino (CHO) disponible de ATCC™ como CCL61, células de embrión de ratón Swiss NIH, NIH-3T3 disponibles de la ATCC como CRL1658, células de riñon de hámster neonato (BHK) , y las líneas celulares de cultivos de tejidos eucarióticos similares . Producción de Proteínas Recombinantes usando una Molécula de ADNr La presente invención proporciona además un método para producir un anticuerpo de receptor-1 Nogo o fragmentos de unión a antígeno, polipéptido soluble de receptor-1 Nogo y/o proteína de fusión soluble de receptor-1 Nogo de la invención usando moléculas de ácido nucleico descritas en la presente.' En términos generales, la producción de una forma recombinante de una proteína comprende típicamente los siguientes pasos : Primero, se obtiene una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de la invención. Si la secuencia de codificación está ininterrumpida por intrones, es directamente adecuada para la expresión en cualquier hospedador . La molécula de ácido nucleico entonces se coloca de forma opcional en enlace operable con secuencias de control adecuadas, como se describe anteriormente, para formar una unidad de expresión que contiene el cuadro de lectura abierto de la proteína. La unidad de expresión se usa para transformar un hospedador adecuado y el hospedador transformado se cultiva bajo condiciones que permiten la producción de la proteína recombinante. Opcionalmente, la proteína recombinante se aisla del medio de las células; y la recuperación y purificación de la proteína no puede ser necesaria en algunos casos con algunas impurezas que se pueden tolerar. Cada uno de los pasos anteriores se puede hacer en una variedad de maneras. Por ejemplo, las secuencias de codificación deseadas se pueden obtener de fragmentos genómicos y se usan directamente en hospedadores apropiados. La construcción de vectores de expresión que son operables en una variedad de hospedadores se logran usando replicones apropiados y secuencias de control, como se expone anteriormente. Las secuencias de control, vectores de expresión, y métodos de transformación son dependientes del tipo de célula hospedadora usada para expresar el gen y se analizan en detalle anteriormente. Los sitios de restricción adecuados pueden ser adicionados, si normalmente no están disponibles, a los extremos de la secuencia de codificación para proporcionar un gen escindible para insertar en estos vectores. Un experto puede adaptar fácilmente cualquier sistema hospedador/de expresión conocido en la técnica para el uso con las moléculas de ácido nucleico de la invención para producir una proteína recombinante. A fin de que esta invención se pueda entender mejor, se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son para los propósitos de ilustración únicamente y no se deben considerar como que limitan el alcance de la invención de ninguna manera.

Ejemplo 1 Producción de Anticuerpos Monoclonales Marinos Anti-Receptor-1 Nogo Los anticuerpos anti-receptor-1 Nogo que se unen de forma específica a un polipéptido inmunogénico de receptor-1 Nogo de la invención se elaboraron usando los siguientes métodos y procedimientos. Inmunizaciones Se usaron dos planteamientos de inmunización: 1. Células COS-7 o iVIembranas Celulares que Contienen Receptor-1 Nogo (NogoR-1) Como el Inmunogeno El gen del receptor-1 Nogo de rata (GenBank1® No. AF 462390) se súb-clonó en el vector de expresión mamífero pFAG1256 (Biogen® ) que contuvo el promotor CMV y el gen de resistencia a geneticina para la selección de fármaco. El plásmido recombinante se transfectó en células COS-7 usando Superfect . (Qiagen®) . Los transfectantes se seleccionaron usando geneticina (GibcoI4R, 2 mg/ l) , se clonaron y verificaron para la expresión superficial de la proteína de receptor-1 Nogo por FACS. Se prepararon membranas de COS-7 a partir de estas células de acuerdo a los procedimientos como se describe [Wang et al., J. Neuroche . , 75:1155-1161 (2000)] con dos lavados, y se almacenaron a 1 mg/ml [concentración de proteína en glicerol al 10% a -70°C. Se inmunizaron intraperitonealmente ratones RBF hembras de ocho semanas de edad (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) ya sea con una emulsión que contiene 50 µ< de membranas de COS-7-receptor-1 Nogo de rata o células COS-7 enteras que expresan el receptor- 1 Nogo en la superficie y 50 µ? del adyuvante RIBI PL+TDM+C S (Sigma® Chemical Co. , St . Louis, MO) una vez cada dos semanas (Lipman et al . , 1992) . Los sueros de los ratones inmunizados se recolectaron antes de la primera iiminización, 7 días después de la segunda y tercera inmunizaciones, y 38 días después de la tercera inmunización y los títulos de los anticuerpos anti-receptor-1 de Nogo se inpidieron por ELISA como se describe más adelante . 2 . P ptidos Específicos de receptor-1 Mogo como el Inmunógeno La secuencia del gen receptor-1 Nogo de rata se sometió a análisis de antigenicidad usando el programa ector NTi1* (Figura 2) . Los péptidos antigénicos identificados en los análisis se conjugaron a Hemocianina de lapa (KLH) usando procedimientos normales con glutaraldehí do . Se inmunizaron intraperitonealmente ratones RBF hembras de ocho semanas de edad (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) con una emulsión que contiene 50 µg de péptidos conjugados con KLH y 50 µ? del adyuvante completo de Freund (Sigma® Chemical Co . , St . Louis , MO) una vez cada dos semanas . El suero de los ratones inmunizados se recolectó antes de la primera inmunización y 1 semana después de la segunda y tercera inmunizaciones y se midieron los títulos de los anticuerpos anti-receptor-1 Nogo . Se dio una dosis de refuerzo después de la tercera inmunización . Tres días después de esta inmunización con dosis de refuerzo , se iniciaron los experimentos de fusión .

Producción y detección de hibridomas Los sueros de los ratones inmunizados con péptidos antigénicos de receptor-1 Nogo se detectaron por ELISA en tanto que los sueros de los ratones inmunizados con células COS-7 que expresan el receptor-1 Nogo se detectaron por citometría de flujo. Los ratones que fueron positivos para anticuerpos que se unen de forma especifica a células C0S-7-receptor-1 Nogo se identificaron por citometría de flujo y se sacrificaron. Se aislaron los esplenocitos de los ratones y se fusionaron al mieloma FL653 (un derivado APRT-de un mieloma de ratón Balb/c Ig-/HGPRT, manteniendo en DMEM que contiene FBS al 10%, 4500 mg/L de glucosa, L-glutamina 4 uiM, y 20 mg/mL de 8-azaguanina) como se describió (Kennett et al., 1993. Monoclonal Antibodies : A New Dimensión in Biological Analysis. Plenum Press, New York). Las células fusionadas se colocaron en placas de 24 o 48 cavidades (Corning Glass Works, Corning, NY) , y se alimentaron con medio de cultivo que contiene adenina, aminopterina y timidina. Se detectaron cultivos resistentes a AAT por ELISA o citometría de flujo para la unión a ya sea las células 00S-7-receptor-1 Nogo o a un péptido antihigiénico de receptor-1 de Nogo como se describe más adelante. Las células en los pozos positivos se sub-clonaron adicionalmente al limitar la dilución. Para detectar la unión al anticuerpo a un péptido antigénico de receptor-1 Nogo, los péptidos que se usaron como inmunógenos se conjugaron a BSA. Se adicionaron 0.5 xg del péptido conjugado en 50 µ? de amortiguador de bicarbonato de sodio 0.1 M, pH 9.0 a cada cavidad de una placa de 96 cavidades MaxiSorp1^ (Nunc^) . La placa se incubo entonces a 37°C durante 1 hora o 4°C durante 16 horas y se bloquearon los sitios de unión específica usando HEPES 25 n , pH 7.4 que contiene BSA al 0.1%, ovalbúirdna al 0.1 %, blotto al 0.1 % y azida al 0.00 1% . Se adicionó sobrenadante de hibridoma y se incubó a 25 °C durante 1 hora. Después del lavado tres veces con PBS, se adicionaron 50 µ? de una dilución 1 : 10 , 000 de anticuerpo secundario anti-ratón de cabra conj ugado con peroxidasa de rábano (Jackson Immuno esearch Inc . ) a cada cavidad y se incubaron adicionalmente durante 1 hora . Después de tres lavados , se reveló el color por TMB (Pierce) y se detuvo con ácido sulfúrico 2 M . Se monitorizó la intensidad de color en un espectrof otómetro a 450 nm. Se detectaron anticuerpos para la unión al receptor-1 Nogo de longitud completa como sigue . Células COS-7 se marcaron con CellTracker 1 Green CMFDA 0 . 1 µ? (Molecular Probes , Eugene , OR) como se describe por el vendedor . Se mezclaron volúmenes iguales de células de control marcadas . con CellTrackerMR con células C0S- 7 -receptor- 1 Nogo , lavadas antes de la incubación con sueros de prueba anti -receptor- 1 Nogo . Se adicionaron cada cavidad cincuenta microlitros de la mezcla celular de placas de poliestireno con fondo en V de 96 cavidades (Constar® 3877 , Corning, NY) y se adicionaron 100 µ? de sobrenadante de hibridoma o un anticuerpo anti-receptor-1 Nogo de control. Después de la incubación a 4°C durante 30 minutos, las células se lavaron e incubaron con 50 µ? de segundo anticuerpo gamma-específico, Fe de IgG anti-ratón de cabra de fragmento F(ab')2 puro por afinidad, conjugado con R-ficoeritrina (1:200, Jackson ImmunoResearch Laboratoy, West Grove, PA) en PBS . Al final de la incubación, las células se lavaron dos veces con PBS y se suspendieron en 200 µ? de PBS que contiene FBS al 1%, y se sometieron a análisis de FACS. De manera alternativa, células COS-7-receptor-1 Nogo se mezclaron con sobrenadante e hibridoma y entonces se trataron con anticuerpo secundario anti-ratón de cabra conjugado con R-ficoeritrina y se sometieron directamente a análisis normales de FACS. Se generaron 25 anticuerpos anti-receptor-1 Nogo usando una variedad de inmunógenos . Se generaron dos anticuerpos, 7E11 y 5B10, usando una secuencia peptidica que corresponde a los residuos 110-125 de receptor-1 Nogo de rata como el inmunógeno. Se generaron tres anticuerpos, 1H2 , 3G5 y 2F7, usando las membranas preparadas a partir de las células C0S7 transfectadas con el receptor-1 Nogo, de rata, de longitud completa como el inmunógeno. Se generaron 13 anticuerpos usando sNogoR310-Fc como el inmunógeno (1D9.3, 1E4.7, 1B4.3 , 2C4.3, 1F10.3, 2H1.4, 1H3.3 , 1G4.1, 1E4.1, 2G7.1, 2C4.1, 2P11.1, y 1H4.1) y 7 anticuerpos usando una secuencia peptldica que corresponde a los residuos 423-434 de receptor-1 Nogo de rata como el inmunógeno (2E8.1, 2G11.2 y 1B5.1) . Análisis de Secuencia de Anticuerpos Monoclonales 7E11 y 5B10 Se extrajo el ARN total usando el miniequipo Qiagen® RNeasy®, y se generó ADNc del ARM aislado. Se amplificó la secuencia de cadena ligera por PCR usando los cebadores 5 ' -TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3 ' (SEQ ID No: 12) y 5 ' -AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3 ' (SEQ ID No: 25). Se amplificó la secuencia de cadena pesada por PCR usando los cebadores 5 ' -GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3 ' (SEQ ID No: 13) y 5 ' GGGGATATCCACCATGAGGKCCCCWGCTCAGYTYCTKGGA-3 ' (SEQ ID No: 14) . Estos cebadores comprenden los nucleótidos degenerados como sigue: S representa G o C; M representa A o C, R representa G o A; W representa A o T; K representa G o T; y Y representa T o C. Se clonaron los fragmentos de PCR en un vector de secuenciación y se determinó la secuencia de ADN de la CDR por terminación con didesoxi-cadena usando cebadores específicos para el vector de secuenciación. Se tradujeron conceptualmente las secuencias de ADN y las secuencias parciales de aminoácidos de las regiones CDR de las cadenas pesada o ligera de los anticuerpos monoclonales 7E11 y 5B10 se muestran en la Tabla 2. Las 3 CDR de las cadenas pesadas y ligeras de los mAbs se subrayan en la Tabla 2 . Las cadenas ligeras de 7E11 y 5B10 tienen 94 % de identidad de secuencia de aminoácidos y las cadenas pesadas tienen 91 % de identidad de secuencia de aminoácidos . Los mAbs 7E11, 5B10 y 1H2 son del isotipo IgGl y los mftbs 3G5 y 2F7 son del isotipo IgG2a. Cada uno de estos cinco mAbs tiene una cadena ligera del isotipo kappa. Se analiza la secuencia de los otros anticuerpos monoclonales por este planteamiento . Tabl a 2 S e cuenc i a de Aminoác i do s de los mAbs 7 E11 y 5B 10 Secuencia SEQ ID NO : 7E11 MKLPVRLLVLMF I PAS S SD WMTQTPLSLPVS LGDQAS I SC 15 Cadena RSSQSLVHSNGNTYLHWYLQ PGQSPKLLIYKVSNRFSGVPD Ligera RFSGSGSGTDFTLKISRVDAEDLGWFCSQSTHVPFTFGGGT KLEI RADAAPTVS I SHH 5B10 MKLPVRLLVLMFWI PAS SSDWMTQTPLSLPVSLGDQAS I SC 16 RSSQSLVHSNGY YLHWYLQRPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPD Cadena RFSGSGSGTDFTLKISRVDAEDLGVYFCSQSTHVPYTFGGGT Ligera KLEI RADAAPTVS I SHH 7E11 VQLQESGAELWPGASVKMSCKASGYTFTDYWMHWVKQRPGQ 17 Cadena GLEWIGAIDPSDSYSSYNQNFKGKATLTVDGSSSTAYMQLSS Pesada LTSEDSAVYYCARRI TEAGAWFAYWGQGTTVT 5B10 LQXS GAE I VMPGTAVTMSCKASGYTFTDFWMHWVKQRPGQGL 18 Cadena EWI GAIDP SDS YSRINQKFKGKATLTVDES S STAYMQLS SLT Pesada SEDSAVYYCARRITEAGAWFAYWGQGTTVT Correlación de Epítopes de Anticuerpo Monoclonal 7E11 El Mab 7E11 se une- a NgRl tanto de rata como de humano. Para determinar el epitope responsable de la unión de 7E11, se generaron fragmentos y péptidos sintéticos de NgRl de rata y se probaron para la unión a 7E11. Un fragmento recombinante del NgRl de rata que contiene los 8 dominios de LRR y las capas N- y C- terminales (sNgR310) se trató con ya sea bromuro ácido o de cianógeno (CNBr) y se separaron los fragmentos por electroforesis en gel . El sNgR310 sin tratar migra con un peso molecular aparente de 42 kDa. El tratamiento con ácido de sNgR310 produjo dos productos principales de escisión de 15 kDa (aa 27-aa 122) y 30 kDa (aa 123-11 310) . El tratamiento con CNBr generó tres fragmentos, un doblete de 33/35 kDa (aa 27-aa 229) , que puede representar fragmentos con glicosilación heterogénea, un producto de 10 kDa (aa 241-aa 310) y un fragmento de 11 aminoácidos (aa 230-aa 240) que no se retiene en el gel . Una transferencia estern el gel de sondeó con 7E11 y demostró que se unió a NgRl intacto de rata (aa 27-aa 310) , y el fragmento ácido de 15 kDa (aa 27-aa 122) y el fragmento de CNBr de 35 kDa (aa 27-aa 229) . El 7E11 no se une al fragmento ácido de 30 kD (aa 123-aa 310) o el fragmento de CNBr de 10 kDa (aa 241-aa 310) . Tanto el fragmento ácido de 15 kDa como el fragmento de CNBr de 35 kDa contuvieron la secuencia LDLSDNAQLRWDPTT (SEQ ID No: 1) , consistente con 7E11 que se une a un epítope individual en NgRl. El sitio de unión de 7E11 se analizó adicionalmente al probar digestiones peptidicas trxpsicas de sNgR310. Los análisis por HPLC mostraron varios fragmentos, indicando que hubo varios residuos de lisina y arginina sensibles a tripsina en la secuencia de NgRl . El 7E11 se unió sólo a un péptido individual de la disección tríptica, proporcionando evidencia adicional que el 7E11 se une a un epítope individual en NgRl. La espectroscopia de masa (MS) subsiguiente y los análisis de secuencia subsiguientes identificaron el péptido unido como que es AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR (SEQ ID No : 26) . El péptido LDLSDNAQLRVVDPTT (SEQ ID No: 1) se sometió a análisis adicional de correlación. El péptido se digirió con tripsina, que produjo dos fragmentos principales, LDLSDNAQLR (SEQ ID No: 27) y VVDPTT (SEQ ID NO: 28), y se probó la capacidad de 7E11 para unirlos. El análisis de MS reveló el péptido LDLSDNAQLR (SEQ ID No: 27) unido al anticuerpo, y por lo tanto este péptido contiene el epítope de unión para 7E11. Dentro de esta fracción peptídica, el análisis detallado de MS identificó varios péptidos mezclados que también se unieron a 7E11, incluyendo péptidos con desaminación en Asnll5 y Glnll7, adición de Alanina de 112 a 113, o adición de Serina a 114 (Tabla 3) . Estos datos indican que varios residuos de aminoácidos localizados en este fragmento peptídico no pueden ser críticos para la unión de 7?11. Tabla 3 Péptidos imitantes unidos por 7E11 El péptido LDLSDNAQLRWDPTT también se digirió con la endoproteasa Asp-N y se probó la unión de 7E11. La endoproteasa Asp-N escindió el péptido en 3 fragmentos peptídicos L, DLS y DNAQLRVVDPTT (SEQ ID NO: 36) . De estos productos,, el 7E11 unió el péptido DNAQLRVVDPTT. Tomados conjuntamente, los datos de la escisión con Asp-N y tripsina localizan acero inoxidable el epitope de unión de 7E11 a la secuencia compartida entre los mismos, DNAQLR (SEQ ID NO: 37) . Las secuencias de aminoácidos de NgRl, NgR2 y NgR3 de varias especies se analizaron para predecir residuos críticos en el epítope de unión de 7E11 en base a la observación que 7E11 se unió a NgRl de rata y humano pero no a NgRl de ratón, NgR2 humano o NgR3 de ratón. La alineación de secuencias reveló que los aminoácidos 110-125 de NgRl de rata y la correspondiente secuencia de NgRl humano son idénticos y que la secuencia de NgRl de ratón difiere sólo por un aminoácidos en la posición 119 (Argll9 en NgRl de rata y humano, y Hisll9 en NgRl de ratón; Tabla 4) . Tabla 4 Alineación de secuencia de los NgR de diferentes especies Argll9 en NgRl contribuye a la unión de 7E11 debido a que se ' une bien a NgRl de rata y humano pero pobremente a NgRl de ratón. De manera similar, debido a que 7E11 no se une bien a Ng 3 , la Alall6 está comprendida en el epitope debido a que dentro de la secuencia DNAQLR (SEQ ID No: 38) , NgR3 sólo difiere de NgRl por una arginina en la secuencia correspondiente. Dentro de la secuencia DNAQLR, 4 de los 5 residuos en NgR2 son idénticos a NgRl de rata. Alall6 y Glnll7 se reemplazan con arginina e histidina, respectivamente. Esto confirma que Alall6 es un residuo de aminoácido importante que contribuye a la unión de 7E11, pero no imposibilita necesariamente la implicación de Glnll7. Para verificar estos puntos de contacto, se generaron varios péptidos que contienen mutaciones puntuales dentro de la secuencia LDLSDNAQLR (SEQ ID No : 27) y se probaron para la unión de 7E11. Los péptidos se inmovilizaron en una placa MaxiSorpMR (NuncMR) y se aplicaron diluciones en serie de 7E11. Los valores de EC50 resultantes se muestran en la Tabla 5. 7E11 se une a los mutantes LeullOAla y AsplllAla con valores EC5o similares en cuanto al péptido original . Cuando se probó Glnll7Ala, la EC50 se incrementó 30 veces y cuando se probó Argll9His la EC50 se incrementó 25 veces. El cambio más significativo EC50 se observó cuando Argll9 se mutó a Alanina.

Tabla 5 7E11 se une a péptidos mutantes con diferentes La posición del epitope de 7E11 también se determinó en la estructura cristalina recién resuelta de sNgR310. Como se espera, la estructura muestra que el epitope de 7E11 se exponga en la superficie de la molécula. Los residuos Argll9; Glnll7, Alall6 y Aspll4 sobresalen hacia afuera de la estructura en tanto que Leull8 y Asnll5 se localizan hacia dentro. El epitope cae en la parte superior de un parche ácido dentro de la superficie cóncava de la estructura y una superficie básica que da hacia uno de los lados. Inhibición de Unión a Ligando a receptor- 1 Nogo Soluble por anticuerpo Monoclonal anti -receptor- 1 Nogo Los anticuerpos monoclonales ant i-receptor- 1 Nogo producidos como se describe anteriormente se probaron para determinar si se inhibió la unión a ligando al receptor-1 Nogo . 0.5 µg de una proteína de fusión soluble de receptor-1 Nogo que comprende los residuos 26-344 de aminoácido del receptor-1 Nogo de rata y la región de articulación y Fe de la molécula IgGl de rata (sNogo 344 -Fe) producida como se describe más adelante se inmovilizó en 250 µg de cuentas de SPA conjugados con aglutinina de germen de trigo o proteína A (Amersham Pharmacia Biotech) durante 2 horas a 25°C. Las cuentas de SPA se acoplaron con Fc-sNogoR-1, mAb ant i -receptor- 1 Nogo y 1 µ? de 125I-Nogc>56 (Amersham, 2000 Ci/mmol, 1 nM) en 50 µ? de medio de incubación amortiguado con HEPES (HEPES 10 m , pH 7.4, albúmina de suero bovino al 0.1 %, ovalbúmina al 0.1 %, MgCl2.2 mM, CaCl2 2 m e inhibidores de proteasa) se adicionaron a cada cavidad de muestra. Después de 16 horas, se midió la radioactividad en muestras en cuadruplicado usando un TopCount® (Packard) . Se calcularon los valores de IC50 a partir de un análisis de ajuste a la curva (Figura 3) (PRISM, GraphPad Software, NJ) . En algunos experimentos, también se usaron conjugados de AP-ligando (por ejemplo AP-Nogo66) y se detectó la unión al monitorizar la actividad de fosfatasa alcalina. También se valoró la capacidad de los mAbs para bloquear la unión de los ligandos MAG-Fc y AP-OM-gp al receptor-1 Nogo. Los anticuerpos monoclonales 7E11, 5B10, 1H2, 3G5 y 2F7 inhibieron todos la unión Nogo66, MAG y OM-gp a sNogoR344-Fc. La IC50 calculada para NogoS6 para 7E11 y 1H2 fue 400 nM y 60 nM, respectivamente. Los datos de los ELISA que monitorizan la inhibición mediada por mAb de la unión de los tres ligandos al receptor-1 Nogo se resumen en la Tabla 6. Tabla 6 mAbs Inhiben la Unión Nogo66, MAG y OM-gp al receptor-1 Nogo mAb MAG + Nogo 66 + OM-gp + sNogoR344-Fc sNogoR344-Fc sNogoR344-Fc 7E11 30 nM (60 %) EC50 = 1.7 µ? EC50 = 150 nM ECso = 0.5 ? 1H2 30 nM (60. %) ND ND 3G5 30 nM (60 %) EC50 = 9 nM ND 2F7 30 nM (55 %) EC50 = 10 nM EC50 = 5 nM 1D9.3 30 nM (70 %) EC50 = 13 nM EC50 = 5.2 nM EC50 = 2.7 nM 2G7.1 30 nM (84 %) EC50 = 18 nM EC50 - 1 nM 1E4.1 30 nM (75 %) - EC50 = 9.1 nM EC5o = 2.8 nM 1G4.1 30 nM (90 %) - EC50 = 8.2 nM EC50 = 9.9 nM 2C4.1 30 nM (50 %) - ND raAb MA.G + Nogo65 + OM-gp + sMogoR344-Fc sNogoR344-Fc sNogoR344-Fc 2F11.1 30 nM (45 %) ND ND 1H4.1 - D ND 2E8.1 30 nM (87 %) ECso = 1.5 nM EC50 = 42.9 nM ECso = 9.2 nM 2G11.2 30 nM (80 %) ND ND 1B5.1 30 nM (0 %) ND ND El porcentaje de desplazamiento se muestra a anticuerpo 30 nM y la EC50 para ciertos m&bs determinados del análisis de ajuste a la curva como se describe. "-" indica actividad no detectable y "ND" indica no determinado. Ejemplo 2 Producción de Anticuerpos Anti-Receptor-1 Nogo por Fab-Fago Los anticuerpos de Fab-fago anti-receptor-1 Nogo que se unen de forma específica a un polipéptido inmunogénico de receptor-1 Nogo de la invención también se hicieron al detectar una biblioteca de Fab-fago como sigue. La biblioteca HuCAL1^ GOLD de Fab-fago MorphoSys se detectó contra la proteína sNogoR310-Fc soluble de rata recombinante y células COS7 que expresan receptor-1 Nogo de rata. Los Fab-fagos que se unieron específicamente al receptor-1 Nogo se purificaron y caracterizaron. La cadena pesada de 14D5 se derivó del gen VH2 y la cadena ligera se derivó del gen VK1.

La secuencia de aminoácidos de la CDR de la cadena pesada y de la cadena ligera de uno de estos Fab- fagos, 14D5, se muestran en la Tabla 7. Tabla 7 Secuencia de Aminoácidos de CDR de 14D5 14D5 se une al receptor- 1 Nogo de rata en formas tanto monovalentes como bivalentes. Además, 14D5 se une al receptor-1 Nogo de ratón y humano y receptor-2 Nogo de humano pero no receptor-3 Nogo de ratón. Ej emplo 3 Inmunoprecipitación de receptor-1 Nogo por Anticuerpos Monoclonales Anti-receptor-1 Nogo Para realizar la inmunoprecipitación, se mezclaron 100 µ? de células Usadas o 50 µ? de células tratadas con PiPLC con 400 o 450 µ? de amortiguador de extracción [Tris-HCl 10 mM, pH 7.2, Tween-20 al 0.5 %, PMSF 0.2 mM] o amortiguador RIPA, respectivamente en la presencia de 30 µ? de Proteína A o G y 1-2 g de anticuerpo. La mezcla se incubó en un agitador a 4°C durante 16 horas. Las muestras se hicieron girar suavemente para sedimentar la proteína A o G acoplada a las cuentas. Las cuentas se lavaron tres veces con amortiguador de lavado 1 mL (Tris-HCl 10 mM , pH 7.2, Tween-20 al 0.1 %) . El lavado final se realizó usando 10 % del amortiguador original de lavado. Las cuentas se re-suspenden en 100 µ? de 2X SDS con 10 % de beta-mercaptoetanol . Las muestras se incubaron a temperatura ambiente antes de que se corran en un gel de Tris-glicina al 4-20 % para SDS-PAGE. Como se determina por el análisis en gel de SDS-PAGE, los anticuerpos monoclonales, 3G5 y 2P7, inmunoprecipitan el receptor-1 Nogo. Ejemplo 4 Determinación de la Especificidad de Anticuerpo por ELISA Para determinar la especificidad de los anticuerpos monoclonales y de Fab-fago producidos en los Ejemplos 1 y 2, se realizó en ELISA usando un panel de polipéptidos de receptor-1 Nogo. El panel consistió de sNogoR310-Fc (una proteína de fusión que comprende los aminoácidos 26-310 del receptor-1 Nogo de rata y un fragmento Fe de rata) , sNogoR344-Fc (ver supra) , polipéptido p-617 (SEQ ID NO: 1) , polipéptidos p-618 (un polipéptido de 19 aminoácidos a partir de la región LRR7 del receptor-1 Nogo de rata; Figura 2; SEQ ID NO: 11) y los' polipéptido p-4 y p-5 (polipéptidos de las regiones LRR5 y LRRCT del receptor-1 Nogo, respectivamente) . Se usaron ovalbúmina y BSA como controles. Como se muestra en la Figura 4, los mAbs 1H2 , 3G5 y 2F7 se unieron todos específicamente a sNogoR344 -Fe . En experimentos similares, estos anticuerpos también se unieron de forma especifica a un polipéptido que consiste de los aminoácidos 310-344 del receptor-1 Nogo de rata (SEQ ID NO: 3) y los mAbs 7E11 y 5B10 se unieron específicamente al polipéptido p-617 (SEQ ID NO: 1) . Diez de los anticuerpos (1D9.3, 1E4.7, 1B4.3, 2C4.3, 1F10.3, 2H1.4, 1H3.3, 1G4.1, 1E4.1 y 2G7.1) de la inmunización de sNogoR310-Fc se desplazaron entre sí para la unión, indicando que reconocen epí topes similares o traslapados en sNogoR310-Fc. Los otros tres anticuerpos de la inmunización de sNogoR310-Fc (2C4.1, 2F11.1 y 1H4.1) reconocen diferentes epítopes localizados en los residuos de aminoácido 26-310. También se realizaron ensayos de unión de ELISA usando el Fab-fago 14D5. Donde los ligandos AP-Nogo66, AP-OM-gp y MAG-Fc se dejaron unir al sNogoR344-Fc inmovilizado, 1 |i de 14D5 inhibió completamente la unión Nogo y MAG . Se requirieron 10 µ? de 14D5 para inhibir completamente la unión de OM-gp a sNogoR344-Fc . E emplo 5 Ensayo de Excrescencia de Neuritas Para probar la capacidad de los anticuerpos monoclonales y de Fab-fago producidos anteriormente para disminuir el efecto inhibidor de la mielina de CNS en las neuronas, se revistieron portaobjetos de cultivo Lab-TekMR (4 cavidades) con 0.1 mg/mL de poli-D-lisina (Sigmamr) . La mielina de CNS o PBS se transfirió como gotas de 3 µ? . Se adicionaron microesferas fluorescentes (Polysciences) a la mielina/PBS para permitir la identificación posterior de las gotas (Grandpre et al., Nature 403, 2000). Los portaobjetos Lab-TekMR entonces se enjuagaron y revistieron con 10 µg/ml de laminina (GibcoMR) . Los ganglios de la raíz dorsal (DRG) de crias de rata Sprague Dawley P3-4 se desasociaron con 1 mg/ml de colagenasa tipo 1 (Worthington) , se trituraron con pipetas Pasteur pulidas a fuego pre-chapeadas para enriquecer en células neuronales y se colocaron finalmente en placa a 23,000 células/cavidad en los portaobjetos de cultivo Lab-TecMR pre-revestidos . El medio de cultivo fue F12 que contiene suero de caballo donador inactivado térmicamente al 5 %, suero bovino fetal inactivado térmicamente al 5 % y 50 ng/ml de raNGF y se incubaron a 37°C y C02 al 5 % durante 6 horas. Se adicionaron inmediat mente después de la colocación en placa quince µg/ l del mAb 7E11. Los portaobjetos se fijaron durante 20 minutos con paraf ormaldehído al 4 % que contiene 20 % de sacarosa y se tiñeron por el marcador neuronal anti-beta-III-tubulina (Covance TUJI) diluido 1:500. Como anticuerpo secundario anti-ratón, se diluyó Alexa FluorMR 594 (Molecular Probes) 1:300 y los portaobjetos se cubrieron con Gel/Mount1* (Biomeda1*) . Se adquirieron imágenes digitales 5x con el programa OperíLab"11 y se analizaron al usar el programa MetaMorpb!51 para cuantificación de la excrescencia de neuritas . El mAb 7E11 protegió las neuronas de DRG de la inhibición mediada por mielina de la excrescencia de neuritas. (Figura 5) . Se observaron resultados similares con los mAbs 1H2 y 3G5. En un ensayo de protección de excrescencias de neuritas donde se cultivaron neuronas de DRG P7 de rata en un substrato de mielina de CNS, el 14D5 bivalente también promovió eficientemente la excrescencia de neuritas. Ejemplo 6 Inmunohistoquímica con 7E11 en Células transí ectadas con Receptor- 1 Nogo Para caracterizar adicionalmente las propiedades de unión de los mAbs anti - rece tor- 1 Nogo producidos como se describe en el Ejemplo 1, se comparó la unión tanto a células COS-7 o 293 fijas como vivas que expresan el receptor-1 Nogo de rata o humano. Células fijas: Células transfectadas y no transfectadas con receptor-1 Nogo se colocaron en portaobjetos de cultivo Lab-Tek® de 8 cavidades, se fijaron, con paraformaldehído con 4 % durante 15 minutos, se bloquearon con suero de cabra normal al 10 %, Tritón X-100 al 0.1 % en PBS durante 1 hora. El mAb 7E11 se adicionó a 15 g/ml y 1.5 µg/ml en solución de bloqueo y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente; se incubó el anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con Ale a^ (Molecular Probes) a una dilución 1:300 en solución de bloqueo durante 1 hora; se adicionó DAPI a 5 µg/ml al anticuerpo secundario para marcar todos los núcleos . Célula vivas Se sembraron en placa células transfectadas y no transfectadas en portaobjetos de cultivo Lab-Tekm de 8 cavidades, se bloquearon con amortiguador FACS (que contiene 4 % de suero de caballo donador) durante 30 minutos a 4°C, se incubaron con 7E11 y a 15 µg/ml y 1.5 g/ml en amortiguador FACS durante 1 hora a 4°C, se enjuagaron e incubaron con anticuerpo secundario anti-ratón-Alexa™1 (1:300 en amortiguador PACS) durante 30 minutos a 4 °C . Los experimentos de tinción inmunohistoquímica demostraron que todos los mAbs se unieron a las células que expresan el receptor-1 Nogo de rata . Los mAbs 7E11 , 2G7 . 1 y 2C4 . 1 se unieron tanto a las células fij as como a las vivas que expresan el receptor- 1 Nogo . Ej emplo 7 Modelo de Ratón de Lesión por Contusión de Médula Espinal Para probar el efecto de los mAbs anti -receptor- 1 Nogo producidos en el Ej emplo 1 de neuronas in vivo , se usó un modelo en ratón de lesión por contusión de médula espinal . Se trataron ratones hembra ( 18-22 g) de forma profiláctica con agentes analgésicos y antibióticos . Los ratones se anestesiaron y colocaron en un aparato estereotaxico con fijación de columna vertebral bajo un microscopio estereoscópico. Se introdujo trauma a la medula espinal por una versión modificada del método de caída de peso (M. Li et al. , Functional role and therapeutic implications of neuronal caspase-1 y -3 in a mouse model of traumatic spinal cord injury. Neuroscience Vol . 99, pp. 333-342 , 2000) . En pocas palabras, se hizo una laminectomía T9 y TIO y la columna vertebral se estabilizó usando un par de abrazaderas transversales de ratón que soportan bilateralmente los procesos transversales T9-T10. Una varilla de impacto de acero inoxidable con un diámetro de 1.4 mm y un peso de 2 g, se levantó 2 .5 cm por arriba de la dura y se dejó caer sobre la médula espinal al nivel TIO . Durante la cirugía, los ratones se mantienen en un manto de calentamiento de 37°C y se administra de forma subcutánea 1 mi de solución salina estéril calentada a cada ratón después de la cirugía para evitar la deshidratación. La vejiga se expresa manualmente una vez diariamente hasta que se recupera del control reflexivo de la vejiga. .Todos los animales recibieron analgesia post-operativa cada 8-12 horas después de la cirugía y tratamiento con antibióticos dos veces diariamente durante 7 días más adelante. Los animales tienen libre acceso a alimento y agua durante la alineación del estudio. Los anticuerpos anti-recéptor-1 Nogo se distribuyen al sitio de lesión vía inyección intratecal durante 28 días como se describe más adelante en el modelo de transección de médula espinal de rata. Ejemplo 8 Caracterización de Proteínas de Fusión Solubles de Receptor-1 Nogo Para caracterizar los polipéptidos solubles de receptor-1 Nogo (sNogoR-1) y las proteínas de fusión (Fc-sNogoR-1) se realizó el siguiente experimento. Tres µg de receptores solubles Nogo (sNogoR310-Fc y sNogoR344 -Fe) se inmovilizaron en 250 µg de cuentas WGA-SPA y recibieron 0.5 L de ligando radioactivo (concentración final 0.5 nM) en un volumen final de 100 µL de amortiguador de unión (HEPES 20 mM, pH 7.4, Ca 2 mM, Mg 2 mM, BSA al 0.1 %, inhibidores de proteasa y ovalbumina al 0.1 %) . Los ligandos incluyeron Nogo66 10 µ mM, 125I-Nogo40 10 µ? (aminoácidos 1-40 NogoA) y 10 µ]^ de sobrenadante de anticuerpo anti-receptor-1 Nogo para cada conjunto de ligandos. Las tres tirosinas Nogo40 se yodaron de forma separada y se designaron como Nogo40-A, -B y -C, respectivamente. Los valores medios de los triplicados se presentan como % de radioactividad unida normalizada (Figuras 6, 7 y 8) . Las barras de errores indican SEM. La radioactividad unida en la ausencia de inhibidores se tomó como 100 % y la radioactividad unida más baja en la presencia Nogo40 10 µ? se tomó como el 0 % para normalización de datos . Ejemplo 9 Inhibición de Unión al Ligando a Proteína de Fusión Soluble de Receptor-1 Nogo Un ensayo de unión similar al ensayo de unión del Ejemplo 8 se usó para probar la capacidad de dos mAbs producidos en el Ejemplo 1 para inhibir la unión de 125i-Nogo66 a sNogoR344-Fc . Los mAbs 2F7 y 3G5 inhibieron la unión de 125I-Nogo66 a sWogoR34 -Fe . Ejemplo 10 Ensayo de Excrescencia de Neuritas Se revistieron portaobjetos de cultivo Lab-Tek"11 (4 cavidades) con 0.1 mg/ml de poli-D-lisina (SigmaMR) . Mielina de CNS sola o mezclada con sNogoR310, protelna de fusión sNogoR310-Fc, mAb 5B10 o PBS de control se transfirieron de forma separada como gotas de 3µ1. Se adicionaron microesferas fluorescentes (Polysciences) a la mielila/PBS para permitir la identificación posterior de las gotas (Grandpre et al, Nature 403, 2000). Portaobjetos Lab-Tek" entonces se enjuagaron y . revistieron con 10 g/ml de laminina (GibcoMR) . Los ganglios de la raíz dorsal (DRG) de crías de rata Sprague Dawley P3-4 se disociaron con 1 mg/ml de colagenasa tipo 1 (Worthington) , se trituraron con pipetas Pasteur pulidas con fuego, pre-puestas en placa para enriquecer en células neuronales y finalmente se colocaron en placas a 23,000 células /cavidad en los portaobjetos de cultivo Lab-tek pre-revestidos . El medio de cultivo fue F12 que contiene suero de caballo donador inactivado con calor al 5 ¾, suero bovino fetal inactivado con calor al 5 % y 50 ng/ml de mNGF y se incubaron a 37°C y C02 al 5 % durante 6 horas. Se fijaron los portaobjetos durante 20 minutos con paraformaldehído al 4 % que contiene sacarosa al 20 % y se tiñeron por el marcador neuronal anti -beta- II I - tubulina (Covance TUJ1) diluido 1-.500. Como anticuerpo secundario, se diluyó anti -ratón Alexa Fluo 594 (Molecular Probes) 1:300 y los portaobjetos se cubrieron con Gel/MountMR (BÍ0medaMR) . Se adquirieron imágenes digitales 5x con el programa OpenLabMR y se analizaron al usar el programa MetaMorphMR para cuantificación de la excrescencia de neuritas. sNogoR310, sNogoR310-FC y mAb 5B10 protegieron todos las neuronas de DRG de la inhibición mediada por mielina de la excreción de neuritas (Figuras 9-11) . Se usó sNogoR310 en un ensayo similar usando neuronas de pollo y se encontró que es protector . También se probó el efecto neuroprotector de los receptores Nogo solubles al realizar estos experimentos con células cultivadas con la presencia y ausencia de laminina. El crecimiento de células neurales en medios en laminina es pobre y modela las condiciones de esfuerzo neuronal. Los DRG se diseccionaron de crias de rata de día 6-7 post-natales (P6-7) , Se disociaron en células individuales y se colocaron en placas de 96 cavidades pre-revestidas con poli-D-lisina como se describe anteriormente. En algunas cavidades, se adicionaron 2 g/ml de laminina durante 2-3 horas y se incubaron antes de que las células se colocaran en placa. Después de la incubación de 18-20 horas, las placas se fijaron con paraformaldehido al 4 %, se tiñeron con anticuerpos anti-Beta-III-tubulina diluido 1:500 (Covance*) y anti-HuC/D diluido 1:100 (Molecular Probes) , y se adicionaron anticuerpos secundarios fluorescentes (Molecular Probes) a una dilución en 1:200. Se usó el ArrayScan^ (II (Cellomics1511) para capturar imágenes digitales 5x y para cuantificar la excrescencia de neuritas como excrescencia promedio de neuritas/neurona por cavidad, al usar la aplicación de excrescencia de neuritas. Se analizaron nueve imágenes 5x de 3 cavidades/condición. En algunos experimentos, se usó un sub-clon de células PC12 (Neuroscreen1®) (Cellomics™1) . Las células NeuroscreenMR se pre-diferenciaron durante 7 días con 200 ng/ml de NGF, se desprendieron y re-colocaron en placas de 96 cavidades pre-revestidas con poli-D-lisina . En algunas cavidades, se adicionaron 5 µg/ml de laminina durante 2-3 horas y se enjuagaron antes de que las células se colocaran en placa. Después de 2 días de incubación, las placas se fijaron con paraformaldehído al 4 %, se tiñeron con anticuerpo anti-Beta-III-tubulina de conejo diluido 1:500 (Covance^) y Hoechst (tinción nuclear) . Se usó el ArrayScan1* II para cuantificar la excrescencia de neuritas como en las células de DRG. Se adicionaron sNogoR344-Fc o IgG de rata en solución a las neuronas de DRG P6-7 y a células Meuroscreen1® diferenciadas en el momento de la colocación en placa. El efecto neuroprotector de sNogoR344-Fc se observó a 1 µ? y 10 µ? cuando las neuronas de DRG 6 se cultivaron en la ausencia de laminina. La cuantificación de la excrescencia de neuritas mostró un incremento dependiente a la dosis con la adición de sNogoR344-Fc . La adición de sNogoR344-Fc a las mismas concentraciones a las neuronas de DRG que crecen en un sustrato de laminina, no produjo ningún efecto inusual, indicando que el sNogoR344-Fc sólo es activo en células estresadas. El efecto neuroprotector de sNogoR344-Fc a las mismas concentraciones en la ausencia de laminina también se vio con células Neuroscreen™*. Ejemplo 11 Producción y Purificación de Proteína de Fusión Fc-sNogoR-l Se fusionó una construcción de .ADNc que codifica para los aminoácidos 1-310 del receptor-1 Nogo de rata a Fe de IgGl de rata contenido en el vector de expresión de mamífero y este vector se sometió a electroforesis en células de ovario de hámster Chino (CHO) (DG44) . Las células se mantuvieron en alfa-MEMr se complementaron con suero bovino fetal dializado al 10 %, glutamina 2 mM y reactivos antibióticos-antimicóticos . Dos días después de la transfección, el medio acondicionado se recolectó y analizó por transferencia Western bajo condiciones reductoras . Se detectó una banda de proteína de aproximadamente 60 kDa usando un anticuerpo anti-receptor-1 Nogo de conejo policlonal . Se expandieron las células y se clasificaron usando, un anticuerpo anti-IgG de rata, de cabra, conjugado con R-PE. Después de la segunda clasificación, las células se colocaron en placa a una densidad de una célula/cavidad en placas de 96 cavidades. Los niveles de la proteína soluble segregada del receptor-1 Nogo de las cavidades individuales se probó y comparó usando un ELISA de intercalación. La placa de ELISA se revistió con anticuerpo específico FCK anti-IgG de rata, de cabra. Se aplicó medio acondicionado. La proteína de receptor-1 Nogo soluble, unida se detectó por Pab anti-IgG de rata, de asno, conjugado con HRP, anticuerpo Fc-espec fico. El clon 4C12 tiene el nivel más alto de secreción. Se expandió y cultivó 4C12 en medio CH0-M7 en matraz giratorio. El nivel de secreción fue aproximadamente 10 mg/L a 37°C. Se cultivaron a gran escala células CHO que expresan la proteína de fusión sNogoR310-Fc. Se obtuvieron 1.7 L de medio acondicionado concentrado a partir de una corrida de 10 L de biorreactor. El pH se aumentó por adición de una décima de volumen de Tris-HCl 1.0 M, pH 8.9. Se adicionaron cloruro de sodio sólido y glicina a 3.0 M y 1.5 M, respectivamente. Una columna de proteína A-Sepharosa^ de 60 mL se puso en equilibrio con Tris-HCl 10 mM, cloruro de sodio 3 M, glicina 1.5 M, pH 8.9 se preparó. Se aplicó un medio condicionado concentrado a la columna 1.5 mL/min usando una bomba preristáltica . La columna se lavó con 300 mL de Tris-HCL 10 mM cloruro de sodio 3 M, glicina 1.5 M, pH 8.9 seguido con 120 mL de Tris-HCl 5 mM, cloruro de sodio 3 M, H 8.9. La proteína se eluyó con fosfato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 100 mM, pH 2.8. Se recolectaron fracciones de 10 mL en tubos que contienen 1.0 mL de HEPES, 1.0 M, o pH 8.5. Las fracciones de proteínas se mezclaron y dializaron contra 3 x 2 L de fosfato de sodio 5 mM, NaCl 300 mM, pH 7.4. Ejemplo 12 Ensayo de Transección de Médula Espinal Para probar su capacidad para promover la recuperación funcional in vivo, se probó una proteína de fusión de sNogoR-1 en un ensayo de transección de médula espinal de rata. Se cargaron bombas osmóticas Alzet^ con solución de prueba (sNogoR310-FC en PBS) hechas recientemente en el día de uso. La concentración de carga se calculó que es 5 y 50 µ?. Las bombas se cebaron durante a >40 horas a 37°C antes de la implantación en los animales. Ratas hembras Long Evans se les dio analgesia pre-operativa y tranquilizador y se anestesiaron usando isofluorano (3 % en 02) . Las ratas se colocaron en un armazón estereotáxico y la corteza motriz se expuso para infusión del agente de seguimiento de distancia BDA (100,000, MW) bilateralmente . Las ratas entonces experimentaron hemisección dorsal de la médula espinal a T5-T6 seguido por implantación del catéter intratecal y sistema de bomba para distribuir el compuesto de prueba (n=ll por grupo) .

A las ratas se les dejó recuperar y sobrevivir hasta 28 dias después de la cirugía. La puntuación de comportamiento usando el sistema BBB se registró hasta los 28 días después de la inducción de la lesión, justo antes de la terminación de la fase en vida del estudio. Después de la perfusión y fijación, se removieron las glándulas espinales, se crio-protegieron, se seccionaron se tiñeron y se realizaron las cuentas axonales . La escala de clasificación locomotriz de Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) (Basso et al., 1996, Neurotrauma 13, 343-359), la prueba de plano inclinado y la prueba de caminata en rejilla inclinada (Li y Strittmatter, 2003, J. Neurosci. 2003, 23, 4219-27) se monitorizaron en ratas y ratones después de la lesión. Para la prueba de plano inclinado, se midió el ángulo máximo al cual se puede poner en ángulo una tabla de 50 cm por 60 cm durante 5 segundos sin que el ratón se deslice. Para la caminata en rejilla inclinada, los ratones se entrenaron inclinaron para escalar una rejilla de alambre (35 cm de largo con cuadrados de 2.54 cm) a una inclinación de 45 grados. El número de casos en los cuales la extremidad posterior cayó por abajo del plano de la rejilla se puntualizó para cada exclusión desde abajo hacia arriba. Para la prueba de comportamiento de rata, se realizaron la escala motriz de BBB, caminata en rejilla y análisis de la huella de impresión. Para la caminata en re illa, la ratas se entrenaron para caminar en una re illa de alambre (70 era de largo con cuadrados de 2.54 cm) , y se contó el número de casos en los cuales la pata posterior cayó por abajo del plano de la rejilla. Para análisis de la huella de impresión, los patrones de caminata de las extremidades posteriores de rata se registraron con tinta durante una locomoción continua a través de una corrida de 90 cm, y longitud de zancada en cada lado y ancho de zancada se calcularon ( etz et al., 2000, Brain Res., 883, 165.177). Todas las pruebas de comportamiento se realizaron por al menos dos individuos. De principio a fin en la cirugía, en la prueba de comportamiento y en el análisis histológico, los investigadores no sabían la identidad del compuesto en la minibomba . sNogoR310-Fc promovió recuperación funcional (Figura 12) . Ejemplo 13 Ensayo de Contusión de Médula Espinal de Rata El efecto de los polxpeptidos solubles de receptor-1 Nogo y proteínas de fusión en neuronas in vivo se probaron en un ensayo de contusión de médula espinal de rata. Ratas Long Evans encaperuzadas , hembras (170-190 g) , se trataron profilácticamente con agentes analgésicos y antibióticos. Diez minutos antes de la cirugía, los animales se tranquilizaron con 2.5 mg/kg de Midazolam i.p. y se anestesiaron en isofluorano al 2-3 % en 02. Entonces las ratas se rasuraron, se enjuagaron con alcohol y betadina, y se aplicó el lubricante ocular a sus ojos. Entonces, se hizo una incisión en la línea media y las vértebras T7 a T12 expuestas . Se realizó una laminectomía dorsal a T9 1/2 y TIO para exponer la médula. La rata se monta en el Impactador. Se sujetan primero los segmentos T7 y Til y luego los segmentos Til y T12 se unen a la abrazadera caudal . Se coloca material blando por debajo del pecho de la rata. La varilla impactadora se ajusta a la posición 0 y la pinza de tierra eléctrica se une al borde de la herida. La varilla impactadora entonces 'se levanta a 25.0 mm y se ajusta de manera apropiada a una posición directamente por arriba de la médula espinal expuesta-. A continuación, la varilla impactadora se libera para golpear la médula expuesta y la varilla impactadora se levanta inmediatamente. La rata entonces se desmonta, y se coloca Gelfoam"1 sobre la herida. El músculo sobre la herida se sutura, y la incisión se engrapa quirúrgicamente. Los animales se colocan en una incubadora hasta que se recuperan de la anestesia. A las ratas se les da antibióticos analgésicos y solución salina como se requiera. Las vejigas se expresan cada mañana y tarde posteriormente hasta que se recupera la función.

La proteína de fusión soluble del receptor-1 Nogo (por ejemplo, sNogoR310-Fc) se administra de forma intratecal como se describe en el modelo de transección de médula espinal de rata anterior. Se realiza la puntuación de BBB un día después de la cirugía, entonces cada semana posteriormente hasta las 4 ó 6 semanas . Ejemplo 14 Expresión de sNogoR310 en ratones transgenicos Se produjeron ratones transgenicos que expresan proteínas soluble del receptor-1 Nogo para probar su efecto cuando se expresa in vivo. Se clonó ADNc de sNogoR310 de ratón (que corresponde a los aminoácidos 1-310 del receptor-1 Nogo) en el sitio Notl del vector C-3123. En este vector, la expresión de sNogoR310 esta bajo el control de los elementos reguladores del gen de proteína acida fibrilar, glial (gfap) , que permiten una expresión de alto nivel con secreción mejorada de astrocitos reactivos en el sitio de lesión. Se decidieron el vector resultante secuencialmente con AatlI y Sfil y se aisló la construcción gfap: :sNogoR310 en un fragmento de 3.4 kb . Se microinyectó este fragmento en embriones para generar ratones transgenicos. Se verificó por PCR que el transgen sea integrado y se identificaron 5 líneas fundadoras . Se cruzaron machos heterocigotos de lineas fundadoras con los niveles más altos de expresión y ratones C57BL/6J hembras. Se confirmó que las células positivas a GFAP se expresan y segregan sNogoR310 en ratones transgenicos heterocigotos por análisis de transferencia Western usando anticuerpo formado contra el receptor- 1 Nogo. Se homogenizó la corteza y médula espinal en solución salina amortiguada en Tris complementada con inhibidores de proteasa (Roche) y se centrifugó el homogenado a 40,000 rpm durante 20 min a 4°C. Se trató el sobrenadante con paraformaldehído a 4 % durante 20 minutos para mejorar la especificidad del anticuerpo y se dializó antes de la inmunotransf erencia . Se homogeneizaron la fracción en partículas por tratamiento con ultrasonido en amortiguador RIPA (Tritonm X-100 al 1 %, desoxicolato de sodio al 0.5 %, SDS al 0.1 % en PBS) , se centrifugó el homogenado resultante y se trató este sobrenadante (fracción de partículas soluble en detergente) como antes. Se analizaron 20 pg de proteína de médula espinal o cerebral por inrnunotransferencia usando antisuero de conejo formulado contra receptor-1 Mogo a dilución de 1:2000. Se visualizó inmunoreacti idad por incubación con IgG anti-conejo conjugado con AP y sustratos NBT/BCIP AP. Se detectó sNogoR310 de 37 kDa segregado en extractos solubles libres de detergente de corteza y médula espinal de las dos líneas transgénicas Tg08 y TgOl, pero poco si cualquier proteína soluble de receptor-1 Nogo a 37 ó 81 kDa esta presente en ratones tipo silvestre de carnada (WT) . El examen de las fracciones en partículas demostró que hubo niveles comparables de receptor-1 Mogo endógeno tanto en ratones WT como en ratones transgénicos . Ejemplo 15 Expresión de sNogoR310 en Ratones Transgénicos Después de Lesión Se probó el efecto de la lesión en CNS en la expresión de sNogoR310 en ratones transgénicos al realizar una lesión de hemisección excesiva dorsal . Se obtuvieron animales de control no transgénicos y transgénicos de sNogoR310 al acoplar machos heterocigotos con hembras C57/BL6 como se describe en el Ejemplo 14. Se anestesiaron profundamente ratones WT transgénicos o de carnada, heterocigotos , hembras, adultos, (10-16 semanas de edad), y se realizó una laminectomía completa, exponiendo completamente la parte dorsal de la médula espinal a los niveles T6 y T7. Se realizó una hemisección excesiva dorsal en T6 con una aguja de calibre 30 y un par de microtijeras para cortar completamente los tractos corticospinales (CST) dorsales y dorsolaterales . Se pasó una ag ja marcada a través de la parte dorsal de la médula espinal varias veces para asegurar que la lesión estuviera a una profundidad de 1.0 mm . Se suturaron las capas de músculo sobre las laminectomías y se cerró la piel en la espalda con grapas quirúrgicas. Para trazar los tractos corticospinales , se hizo un agujero de taladro que está sobre la corteza cerebral en el lado derecho en el cráneo 14 días después de la lesión de la médula espinal. Se aplicó el trazador BDA (MVJ 10,000, 10 % en PBS) (Molecular Provees. Eugene, OR) a 4 sitios de inyección a una profundidad de 0.7 mm de la superficie cortical. Cuatro semanas después de la lesión, los ratones se metieron a perfusión de forma transcardial con PBS, seguido por paraformaldehído al 4 %. Los ratones usados' para los experimentos de expresión de sNogoR310 no recibieron ninguna inyección de trazador. Para los ratones usados para el análisis western, Blot la médula espinal a un nivel entre T3 y L3 se recolectó sin perfusión 14 días después de la perfusión. Los ratones usados para la tinción inmunohistoquímica de receptor-1 Mogo se sometieron a perfusión con paraformaldehido al 4 % 10 días después de la hemisección , y se removió la médula espinal lesionada para seccionamiento . Para examinar la expresión de sNogoR310 en el cerebro lesionado de ratones transgénicos y de ratones W , se realizó una lesión de punzada en corteza con una cuchilla de escalpelo número 11 sostenida en un aparato estereotáxico (David Kopf , Tujunga, CA) . Se hizo un corte parasagital de 4 mm, 0.5 mm posterior a Bregma, 1.5 mm lateralmente desde la línea media y 3.5 mm de profundo . Se detectaron niveles incrementados de sNogo 310 en extractos solubles de medulas espinales diez días después de la lesión en ratones transgénicos pero no en ratones WT, consistente con el favorecimiento después de la lesión de GFAP alrededor de la lesión. Para confirmar que esto no fue debido al favorecimiento compensatorio Nogo-A, se probó su expresión y se encontró que fue similar en ya sea corteza intacta o lesionada y médula espinal intacta o lesionada de ya sea ratones WT y ratones transgénicos . Se examinó la expresión celular de sNogoR310 en CMS lesionado al inmunoteñir el cerebro y médula espinal lesionados que contiene el área de lesión con anticuerpos contra el receptor-1 Nogo y GFAP. La morfología general de los glia astrocíticos reactivos no difiere entre ratones WT y ratones transgénicos, pero la densidad teñida para receptor-1 Nogo tanto en el espacio intra- como extra-celular es notablemente mayor en los ratones transgénicos de gfap::sNogoR310 que en los ratones WT, indicando expresión incrementada de sNogoR310 alrededor de la lesión en ratones transgénicos . La proteína del receptor-1 Nogo se co-localiza con el marcador astrocítico GFAP sólo en los ratones transgénicos. También hay una tinción no celular difusa grandemente me orada en las muestras transgénicas , consistente con sNogoR310 en el espacio intracelular . La tinción del receptor-1 Nogo del cuerpo de célula neuronal se detecta tanto en ratones WT como en transgénicos. Ejemplo 16 sNogoR310 Segregado Induce Brote de CST en Ratones Transgénicos Se probó si la expresión incrementada de sNogoR310 alrededor de la lesión en ratones transgénicos da por resultado la regeneración de axones lesionados. Se investigó la integridad de los tractos corticospinales descendentes - (CST) al inyectar el trazador anterógrado, biot ina-dextrano-amina (BDA) en la corteza motriz derecha como se describe en Li y Strittmatter , 2003, J. Heurosci. , 23, 4219-27. En ratones WT de carnada, los CST dorsales prominentes (dCST) están herméticamente unidos rostrales a la lesión, y son visibles ipsilateralmente unas pocas fibras de CST dorsolaterales . Un pequeño número de brotes colaterales cortos marcados con BDA se proyectan en la materia gris, particularmente en la médula ventral, pero el brote está confinado en su mayor parte al lado de la médula contralateral a la inyección del trazador. Sin embargo, las lesiones rostrales a la hemisección dorsal de ratones transgénicos de sNogoR310 lesionados indica un patrón de marcación de BDA completamente diferente. Se observa una alta densidad de fibras de CST marcadas con BDA fuera de los dCST prominentes en todos los ratones transgénicos de la linea Tg08 o línea TgOl. Las fibras ectópicas se extienden de principio a fin en el área de la materia gris, y algunas fibras alcanzan la materia blanca lateral y dorsolateral . Se ven varias fibras (4-12 brotes por sección transversal) en el lado opuesto de la médula espinal (ipsilateral al sitio de inyección de trazador) . Las mediciones micro-densitométricas de los brotes colaterales indica un incremento de aproximadamente diez veces en la densidad de brote en ratones transgénicos de sNogoR310. El examen de las secciones longitudinales parasigitales de 1 a 4 mm rostrales a la lesión revela que las fibras de dCST se extienden en gran número de brotes de ramificación en e.l área ventral de la materia gris en ratones transgénicos sNogoR310, en contraste a los animales WT de carnada. En general, el patrón y grado de brote rostral a la lesión en ratones transgénicos es similar a aquel observado en los ratones tratados sistemáticamente con el péptido NEP1-40 de antagonista de receptor-1 Nogo (Li y Stri t tmatt er , 2003) . Estos resultados demuestran que sNogoR310 segregado induce brote de CST en los ratones transgénicos . Ejemplo 17 Regeneración de Derivación de Axones de CST, el Sitio de Lesión en la médula Espinal Distante en Ratones Transgénicos sNogoR310 Se aisló la médula espinal 4 mm rostral a y 4 rnm caudal al sitio de lesión (8 mm de largo total) de ratones transgénicos y se incrustó en una matriz de albúmina polimerizada con glutaraldehído, y se cortó parasagitalmente en un vibratomo (30 µp? de grueso) . Se recolectaron secciones transversales (50 µta) de la médula espinal 5-7 mm rostrales a y 5-7 mm caudales al sitio de lesión. Para los experimentos de inyección de sNogoR310-Fc en ratas, la médula espinal que se extiende 10 mm rostral a, 10 mm caudal del sitio de lesión se cortan en forma parasagital (50 µp?) en un microtomo vibrador. Se recolectaron secciones transversales de la médula espinal 11-16 mm rostral a, y 11-16 mm caudal al sitio de lesión. Se incubaron las secciones con completo de avidita-biotina-peroxidasa y se visualizó el trazador BDA por reacción de HRP de diaminobenzidina mejorada con níquel (Grandpre, 2002, Nature, 417, 547-551) . Se procesaron algunas secciones para la inmunohistoquímica de serotonina (anticuerpo anti-5-??) por inmunofluorescencia indirecta. Para visualizar el área de lesión, se tiñeron doblemente algunas secciones con anticuerpos dirigidos contra (Sigma14, St . Louis, MO) . Se montaron, se deshidrataron y se cubrieron las secciones con medio de montaje. Se probó si las fibras ya sea inducidas por sNogoR310 expresadas en ratones transgenicos después de la lesión (ver Ejemplo 16) cruzan el área de lesión en la médula espinal caudal para proporcionar recuperación funcional . Secciones parasagitales consecutivas cruzan el sitio de lesión trazado en la pantalla lucida de la cámara, el patrón de distribución total de las fibras de CST regenerantes, a unos pocos milímetros de la lesión. Las secciones de los ratones WT no muestran fibras de CST que se tienen más allá del sitio de lesión. Secciones similares de ratones transgenicos de sNogoR310 exhiben numerosas fibras de CST que cruzan el área de transección y sobresalen en las áreas de materia gris y blanca distantes en un patrón altamente ramificado. Inmediatamente rostral a la hemisección, una alta densidad de brote de CST marcado con BDA originado de salientes prominentes de dCST en el área de lesión, pero más brotes de CST fallaron en pasar el área de transección donde son prominentes la formación de cicatriz y cavitación de tejido. Una pequeña fracción, pero altamente significativa de los axones regenerantes derivó el sitio de lesión a través de los puentes restantes de tejido de la materia gris y blanca ventral y ventrolateral . Además, unas pocas fibras de CST parecen cruzar por si misma el área de transección mediante la médula espinal dorsal y dorsolateral lesionada en las regiones distantes. En la vecindad de lesión, el curso de las fibras regenerantes fue típicamente tortuoso y completamente distinto de las fibras rectas normales en los CST rostrales . Se ven más frecuentemente fibras colaterales y arborizadas en el área de materia gris de la médula espinal distante. Las reconstrucciones demuestran 5-15 fibras regenerantes marcadas con BDA que cursan en el eje rostral-caudal a cualquier nivel 1-4 mm caudal a la lesión en cada ratón transgénico. Para secciones transversales 5-7 mm caudales a la hemisección dorsal, se ven axones de CST marcados con BDA tanto en las áreas de materia gris como de materia blanca en cada ratón transgénico. Las cuentas de fibras para los ratones transgénicos indican un número aproximadamente similar de fibras de CST marcadas con BDA a los niveles próximos en las secciones sagitales. Además de las fibras de CST, los otros tractos descendentes, tal como las fibras rafespinales , también contribuyen a la función locomotora en los ratones . En el modelo de hemisección excesiva dorsal en ratón, la transección lesiona una mayoría de las fibras serotonérgicas, disminuyendo la densidad de estas fibras, por aproximadamente 80 % en -el cuerno ventral. El análisis de la longitud total de las fibras de serotonina en el cuero ventral de la médula espinal caudal indica un número mucho mayor de estas fibras en ratones transgénicos que en el grupo WT, indicando que los efectos promotores de crecimiento de sNogoR310 en ratones transgénicos no se limitan a una ruta descendente de axones. Ejemplo 18 Expresión Transgénica de sNogoR310 Mejora Recuperación Locomotriz El análisis de las fibras serotonérgicas y el trazado- de axones de CST indica que el sNogoR310 liberado de los astrocitos en ratones transgénicos estimula la regeneración anatómica extensiva de axones descendentes lesionados en la médula espinal. Se realizaron varias pruebas de comportamiento como se describe en el Ejemplo 12 para determinar si estas fibras regeneradas benefician la recuperación funcional . Como se valora por la prueba BBB, los ratones WT recuperan parcialmente la función locomotriz durante un periodo de 4 semanas de supervivencia. A las 4 semanas después de la lesión, la mayoría de los ratones T recuperan un nivel caracterizado por un paso plantar consistente con soporte de peso consistente, pero exhiben sólo coordinación ocasional a frecuente de extremidad delantera-extremidad posterior, con una rotación de la posición predominante de la extremidad cuando se hace contacto inicial con la superficie. En contraste, las puntuaciones de BBB de ratones transgenicos de sNogoR310 tanto de las líneas Tg08 y Tg 01 son significativamen e mayores que el grupo de control de principio a fin del periodo de observación de 7-28 días (Figuras 13A y 13B) . A los 28 días después de la lesión, la mayoría de los ratones transgenicos mostró coordinación consistente de extremidad delantera-extremidad posterior, y la posición predominante de la pata es paralela al cuerpo. Se emplearon dos pruebas más de comportamiento para caracterizar adicionalmente el desempeño de los ratones transgenicos de sNogoR310. Primero, se midió el ángulo máximo al cual una tabla se inclinará sin que un ratón suelte su sujeción en el espacio de 5 segundos. Después de la lesión de hemisección dorsal, los ratones tanto transgénicos como WT pueden sostener su postura en una tabla a un ángulo de 55 grados. En los días 7-28 después de la lesión, el ángulo sostenible se reduce en todos los ratones, pero los ángulos sostenibles por los ratones transgénicos son significativamente mayores que aquellos para el grupo de control (Figura 13C) . En otra prueba de compor miento, los ratones escalaron una rejilla colocada a un ángulo de' 45 grados a la vertical ·y se contaron (Metz et al., 2000) . Las excursiones de las extremidades posteriores por arriba del plano de la rejilla. Ningún ratón cometió errores en esta prueba durante el entrenamiento de pre-lesión. Hay numerosos errores de falta de pata con sólo mejora mínima en ratones WT durante el periodo de 2-6 semanas después de la lesión. En contraste, los ratones transgénicos de sNogoR3lO exhiben una mejora progresiva en la subida en rejilla durante este periodo, con la mayoría de la mejora que se presenta entre 1-3 semanas después de la lesión (Figura 13D) . De esta manera, los ratones transgénicos que segregan sNogoR310 de astrositos exhiben regeneración de CST, brote rafespinal y función motriz mejorada después de la hemisección final torácica. Ejemplo 19 Administración Intratecal de Proteína sNogoR310-Fc Induce Brote de CST Como una segunda prueba del beneficio de promoción de crecimiento del receptor-1 Nogo soluble después del trauma espinal, se administró de forma intratecal la proteína purificada . Se fusionó el dominio de unión a ligando (27-310) del receptor-1 Nogo de rata al dominio Fe de igGl de rata para promover la estabilidad y purificación. Se purificó proteína de células CHO establemente transfectadas . Esta proteína bloquea la acción Nogo-66, MAG y mielina in vitro, como se muestra anteriormente para sNogoR310-Myc His de ratón (Fournier et al., 2002, J. Neurosci . , 22, 8876-8883; Liu et al., 2002, Science, 297, 1190-1193). Se distribuyó de forma intratecal proteína sNogoR310-Fc a ratas con una lesión de hemisección dorsal media toráxica a través de una minibomba osmótica. Durante un periodo de supervivencia de cuatro semanas después de la lesión, se administraron localmente 1.2 mg de proteína sNogoR310-Fc en cada rata. En las ratas que reciben el tratamiento de vehículo (1.2 mg de IgG de rata) , las secciones rostrales a la hemisección exhiben la CST dorsal prominente herméticamente unida y muy pocas fibras de CST marcadas con BDA ectópicas por arriba del sitio de lesión. Las secciones rostrales a la lesión de ratas lesionadas que reciben proteína sNogoR310-Fc exhiben un patrón completamente diferente de marcación. Se observan numerosas fibras ectópicas que brotan de los CST marcados con BDA de las secciones transversales y parasagitales . En algunos casos, las salientes cruzan del área dCST cerca de la línea media a la circunferencia de la médula, llegando a entremezclarse con el CST dorsolateral . Los axones de brote se extienden a través de la materia gris a un mayor grado que la materia blanca. Una medida de las fibras de brote ectópico (= 100 µta. en secciones transversales, = 200 µt en secciones sagitales) adyacentes al dCST revela un mayor incremento en las ratas tratadas con sNogoR310-Fc . Ejemplo 20 Axones de CST se Regeneran en médula Espinal Distante en Ratas Tratadas con sNogoR310-Fc Se anestesiaron profundamente ratas hembra Sprague -Dawley (190-250 g) y se llevaron a cabo laminectomías a niveles espinales de T6-7, exponiendo la médula espinal. Se corta la mitad dorsal de la médula espinal con una aguja de calibre 30 y un par de microtijeras para cortar las partes dorsales de los tractos CSGT, y se aseguran a la profundidad de la lesión (1.8 mm) al hacer pasar la parte aguda de una cuchilla número 11 a - través de la mitad dorsal de la médula (Grandpre et al . , 2002 , Nature, 417, 547-551) . Una bomba osmótica (AlzetMR 2ML4 , 2 mi volumen 2.5 µ?/h, día 28 de distribución) , que se rellenó con 1.2 mg de IgG de rata en PBS o 1.2 mg de proteína de fusión sNogoR310-Fc en PBS, se suturó a músculos bajo la piel en la espalda de los animales . Se insertó un catéter conectado a la salida de la minibomba en el espacio intratecal de la médula espinal al nivel T7-8 a través de un pequeño agujero en la dura .

La infusión de la proteína antagonista del receptor-1 Nogo indujo brote extensivo rostral a una hemisección de rata, pero una cuestión más crítica es si las fibras de CST de brote sobresalen a la médula espinal distante y contribuyen a la recuperación locomotriz. Las secciones longitudinales a través del sitio de lesión de las ratas tratadas con vehículo exhiben un número no detectable o muy pequeño de fibras de CST dentrales marcadas con BDA por abajo del nivel de lesión (GrandPre et al., 2002,- eidner et al., 2001, Proc . Nati. Acad. Sci . EUA , 98, 3513-3518). Las secciones similares de ratas tratadas con sNogoR310-Fc demuestran que muchas fibras marcadas con BDA derivan el sitio de transección y sobresalen a la médula espinal caudal grandemente a través de los tejidos de puente de la médula espinal dentral y dentrolateral . La inmunot inción para el marcado astrocítico GFAP exhibe que el grado de transección alcanzó algo más profundo que el área del canal central . Diferente del perfil lineal de las fibras rostrales en el CST dorsal prominente, las fibras de CST regeneradas siguen usualmente una trayectoria altamente ramificada en la médula espinal distante, particularmente en el área de la materia gris. Estas fibras se detectan en muchas regiones en la médula espinal, pero se ven más fácilmente en la parte central y la mitad dorsal de la médula espinal de principio a fin de la médula espinal. Las cuentas de las fibras de CST de las secciones sagitales indican aproximadamen e 20 axones marcados con BDA a 1-2 mm caudal a la lesión y 15 axones trazados a 7-8 mm distantes a la lesión de cada rata tratada con sNogo 310 -Fe . En general, el patrón de ramificación de estas fibras es similar a aquel observado de los animales tratados con el péptido NEP 1-40 local, pero la ramificación más colateral en cada brote se ve de las secciones tratadas con la proteína sNogoR310-Fc . Una medida de los brotes de la médula espinal distante demuestra que la longitud colateral total de cada brote en ratas tratadas con sNogoR310-Fc es dos veces tan grande como aquella de los animales tratados con NEP 1-40. El número de brotes (= 200 µt en la longitud) a 1-10 mm caudal a la médula espinal tanto en los grupos tratados con el antagonista de receptor-1 Nogo es aproximadamente 20-40 veces mayor que los grupos de control. Se ven más brotes de las ratas tratadas con sNogoR310-Fc que el tratamiento con NEP 1-40 local (aproximadamente 50 vs . 25 brotes/ratas) , pero esta diferencia no es estadísticamente significativa (p = 0.1713, prueba t) . Se observan axones de CST regenerantes en secciones transversales de la médula espinal 11-15 mm caudal a la hemisección en ratas que reciben tiramiento con sNogoR310 -Fe . Estas fibras se detectan tanto en la materia gris como en la materia blanca de la médula espinal. Las fibras detectadas en la materia gris exhiben frecuentemente más ramificación colateral en el área de la materia blanca. En contraste, en secciones transversales de grupos tratados con vehículo, sólo marcadas BDA ocasional se ven en el área ventral de materia blanca, consistente con los axones de CST ventrales sin lesionar. A este nivel de médula espinal distante, el número promedio de fibras de CST marcadas con BDA tanto de los grupos tratados con el antagonista de receptor-1 Nogo [ sNogoR.310 - Fe y NEP 1-40] son aproximadamente 20 veces mayores que las ratas tratadas con vehículo. Tomados conjuntamente, tanto los antagonistas del receptor Mogo, la proteína sNogoR310-Fc y el péptido NEP 1-40, da por resultado regeneración dramática de axones de CST en la médula espinal distante, pero el brote inducido por los anteriores exhiben un patrón más altamente rami ficado . Ejemplo 21 sNogoR310 - Fc Local Induce Brote de Axones Rubropinal es y Serotonergicos en Médula Espinal es de Rata Lesionada Catorce días después de la hemisección, se hace un agujero de taladro en cada lado del cráneo que está sobre la corteza sensorimotriz de las extremidades inferiores para tratar las fibras de CST. El trazador neuronal anterógrado, BDA (10 % en PBS , 3.5 µ? por corteza) se aplicó a siete sitios de inyección a una profundidad de 1.5 mm desde dura en cada lado (Grandpre, 2002 ) . Para el tracto rubroespinal que se traza en ratas, el trazados BDA (1 µ1· MW 10 , 000 ; 10 % en PBS) se inyectó en núcleo rojo en el lado izquierdo (5.8 mm posterior a bregma, 0.7 mm lateral, 7.0 mm ventral a la superficie del cráneo) . Dos semanas después de la inyección de BDA, estos animales se sometieron a perfusión con PBS, seguido por paraformaldehído al 4 %, y se recolectó tejido para histología. La reparación de las fibras del tracto rubroespinal lesionado (RST) contribuye a mejoras funcionales después de la lesión de la médula espinal (Liu et al., 1999, J. Neurosci., 19, 4370-4387) . La distribución extendida del receptor-1 Nogo en neuronas del CNS (Wang. et al., 2002 , J. Neurosci . , 22, 5505-5515) hace posible que la inhibición del receptor-1 Nogo con su antagonista pueda dar por resultado el re-crecimiento de los axones de RST después de la lesión. Para probar los efectos de sNogoR310-Fc en RST lesionado, la integridad de esta ruta se trazó al inyectar BDA en núcleo rojo izquierdo. Al nivel de la médula espinal, las fibras de RST - se localizan normalmente en el área dorsolateral de materia blanca de la médula espinal, y se cortan transversalmente por las hemisecciones dorsales de este estudio. En las secciones transversales 11-15 mm rostrales a la lesión de las ratas de control, se ve un pequeño número de fibras cortas marcadas con BDA entre el RST prominente 'y la materia gris del cuerno dorsal. Las secciones al mismo nivel tratadas con sNogoR310 - Fe exhiben muchas fibras de enlace entre el RST principal y la materia gris del cuerno dorsal . Las secciones transversales 11-15 mm distantes a SCI, no las fibras de RST marcadas con BDA en ratas tratadas con vehículo. En contraste, las secciones al mismo nivel que reciben tratamiento con sNogoR310-Fc exhiben muchas fibras de RST marcadas con BDA tanto en la materia gris como blanca cont al ateral a la inyección del trazador. Algunos brotes con un patrón de ramificación se ven en la materia gris ipsilateral a la inyección de BDA. Las fibras espinales rufespinales también se examinaron en ratas lesionadas en la médula espinal tratadas con sNogoR310 -Fe . La inmunotinción demuestra la densidad de las fibras serotonérgicas 11-15 mm rostrales a la lesión que es similar entre el vehículo y los grupos tratados con sNogoR310 -Fe . En las secciones 11-15 mm por abajo de la lesión, las .fibras seroton en ratas tratadas con sNogo 310-Pc son dos veces tan numerosas como aquellas en el grupo de control. Estos resultados demuestran la sensibilidad a la inhibición del receptor-1 Nogo por la proteína sNogoR310-Fc no se limita a fibras de CST, y que otros tractos descendentes, tal como los axones rubroespinales y serotonérgicos , también son sensibles al antagonismo del receptor-1 Nogo. Ejemplo 22 Tratamiento Local de sHogoR310-Fc Mejora la Recuperación Funcional en Ratas La administración intratecal de la proteina sNogoR310-Fc estimula la regeneración de axon en varias rutas descendentes después de la lesión traumática de la médula espinal. Se probó si la proteína también mejora la recuperación funcional en la médula espinal lesionada. A las 2 semanas después de la hemisección, la puntuación BBB locomotriz en ratas tratadas con vehículo alcanza un nivel estable de 12 (Figura 14A) . A las 4 semanas después de la lesión, la mayoría de los controles (6 de 7) tienen pasos planteres soportados en peso, consistentes, frecuentes y coordinación extremidad delantera-extremidad posterior, consistente y frecuente, pero tienen una rotación de la posición de la pata predominan e cuando hacen contacto inicial con la superficie. En contraste, en ratas que reciben tratamiento con proteína sNogoR310 - Fe , la puntuación locomotriz continúa mejorando entre 2-4 semanas después del trauma. A las 4 semanas después de la lesión, los 9 animales tratados con sNogoR310-Fc tuvieron coordinación consistente de extremidad delantera-extremidad posterior y una posición paralela de patas en el contacto inicial con la superficie de prueba. Se ha usado la caminata en rejilla para valorar los déficit en el descenso del control motor fino después de la lesión de la médula espinal (Metz et al., 2000) . Este desempeño requiere la coordinación de extremidad delantera-extremidad posterior y el control de movimiento voluntario mediado por fibras ventrolaterales , cort icospinales y rubroespinales . Durante el entrenamiento antes de la lesión, todas las ratas colocaron exactamente sus extremidades posteriores en las barras de la rejilla. A las 2-4 semanas después de la lesión, las ratas de control hicieron 8-9 errores por sesión con sólo mejora mínima durante el tiempo. En contraste, las ratas tratadas con sNogoR310-Fc exhibieron una mejora progresiva en la caminata en rejilla e hicieron significativamente menos errores (4-7/sesión en promedio) . La mayoría de la mejora se presenta a las 2-3 semanas después de la lesión. El análisis de las impresiones dactilares de la pata posterior en el grupo de control exhibe que la longitud de zancada se disminuye significativamente y el ancho de la postura se incrementa a las 4 semanas después de la hemisección, en comparación con ratas en lesión o animales lesionados que reciben tratamiento con sNogoR310-Fc (Figura 14C) . Por lo tanto, estas múltiples pruebas de comportamiento demuestran que el bloqueo de la función del receptor-1 Nogo con inyección local de proteína antagonista mejora la recuperación locomotriz después de la lesión. Depósitos Biológicos Se depositaron los hibridoraas HB 7311 (ATCC acceso No. PTA-4587), HB 1H2 (ATCCMR acceso No. ???-4584), HB' 3G5 (ATCCMR acceso No. PTA 4586), HB 5B10 (ATCCMR acceso No. PTA-4588) y HB 2F7 (ATCCm acceso No. PTA-4585) con la American Type Culture Collection ("ATCC^"), 10801 University Boulevard, anassas, VA 20110-2209, EUA, el Agosto 9 del 2002. Como lo apreciarán aquellos expertos en la técnica, se pueden hacer numerosos cambios y modificaciones a las modalidades preferidas de la invención sin apartarse del espíritu de la invención. Se propone que todas esas variaciones caigan dentro del alcance de la invención. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Polipéptido, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 26); LDLSDNAQLR ( SEQ ID NO: 27); LDLSDDAELR ( SEQ ID NO: 29);

LDLASDNAQLR (SEQ ID NO: 30); LDLASDDAELR (SEQ ID NO: 31); LDALSDNAQLR (SEQ ID NO: 32); LDALSDDAELR (SEQ ID NO: 33); LDLSSDNAQLR (SEQ ID NO: 34); LDLSSDEAELR (SEQ ID NO: 35); DNAQLRVVDPTT (SEQ ID NO: 36); DNAQLR ( SEQ ID NO: 37) ; ADLSDNAQLRVVDPTT (SEQ ID NO: 41) ;

LALSDNAQLRVVDPTT (SEQ ID NO: 2); LDLSDNAALRVVDPTT (SEQ ID NO: 43); LDLSDNAQLHVVDPTT (SEQ ID NO: 44); y LDLSDNAQLAVVDPTT (SEQ ID NO : 45) . 2. Ácido nucleico, caracterizado porque codifica para un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1. 3. Ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque se enlaza operablemente a una secuencia de control de expresión.

4. Vector, caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 2 o 3.

5. Célula hospedadora, caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 2 o 3, o que comprende el vector de conformidad con la reivindicación 4.

6. Método para producir el polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) cultivar la célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 5; y (b) recuperar el polipéptido de la célula hospedadora o medio de cultivo.

7. Método para producir un anticuerpo caracterizado porque comprende los pasos de: (a) inmunizar un hospedador con un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o una célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 5; y (b) recuperar el anticuerpo.

8. Anticuerpo, caracterizado porque se produce por el método de conformidad con la reivindicación 7 o un fragmento de unión a antígeno del anticuerpo.

9. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une de forma específica a un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porgue el anticuerpo no es el anticuerpo monoclonal producido por la linea de células de hibridoma HB 7E11 (ATCCMR acceso No. PTA-4587) .

10. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 8 o 9, caracterizado porgue el anticuerpo (a) inhibe el colapso de los conos de crecimiento de una neurona; (b) disminuye la inhibición de la excrescencia de neuritas y brote en una neurona; y (c) inhibe la unión del receptor-1 Nogo a un ligando .

11. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porgue la excrescencia de neuritas y el brote es crecimiento axonal .

12. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la neurona es una neurona del sistema nervioso central.

13. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 8 o 9, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .

14. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 8 o 9, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo murino .

15. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8 o 9, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico y un anticuerpo de cadena individual.

16. Método para inhibir la unión del receptor-1 Nogo a un ligando, caracterizado porque comprende el paso de poner en contacto el receptor-1 Nogo con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 10.

17. Método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el ligando se selecciona del grupo que consiste NogoA, NogoB, NogoC, MAG y OM-gp.

18. Método para inhibir el colapso de los conos de crecimiento en una neurona, caracterizado porque comprende el paso de poner en contacto la neurona con el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo de conformidad con la reivindicación 10.

19. Método para disminuir la inhibición de la excrescencia de neuritas o brote en una neurona, caracterizado porgue comprende el paso de poner en contacto la neurona con el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo de conformidad con la reivindicación 10.

20. Método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la excrescencia de neurita o brote es crecimiento axonal .

21. Método de conformidad con la reivindicación 18 o 19, caracterizado porque la neurona es una neurona nerviosa central .

22. Composición, carac erizada porque comprende un portador farmacéuticamente aceptable y el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 8 o 9.

23. Composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque además comprende uno o más agentes terapéuticos adicionales .

24. Método para promover la supervivencia de una neurona en riesgo agónico, caracterizado porque comprende poner en contacto la neurona con una cantidad efectiva de un anticuerpo anta -receptor- 1 Nogo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo a la reivindicación 8 o 9.

25. Método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la neurona está in vi tro .

26. Método de conformidad' con la reivindicación 24, caracterizado porque la neurona está en un mamífero.

27. Método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el mamífero exhibe signos o síntomas de esclerosis múltiple, ALS , enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, neuropatía diabética, ataque, lesiones cerebrales traumáticas o lesión de medula espinal.

28. Método para promover la supervivencia de una neurona en un mamífero; la neurona está en riesgo agónico, el método está caracterizado porque comprende (a) proporcionar una célula hospedadora cultivada que expresa un anticuerpo anti-receptor-1 Nogo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo a la reivindicación 8 o 9; e (b) introducir la célula hospedadora en el mamífero en o cerca del sitio de la neurona.

29. Método de terapia génica para promover la supervivencia de una neurona en riesgo agónico, neurona que está en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar en o cerca del sitio de la neurona, un vector viral que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un anticuerpo anti-receptor-1 Nogo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo a la reivindicación 8 o 9, en donde el anticuerpo anti-receptor-1 Nogo o fragmento de unión a antígeno se expresa de la secuencia de nucleótidos en el mamífero en una cantidad suficiente para promover la supervivencia de la neurona.