JP5647414B2 - Lingo結合分子およびその医薬用使用 - Google Patents
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Description
驚くべきことに、LINGO−1に対する新規モノクローナルヒト抗体(本明細書後記の抗体4784、および抗体4785としても公知)がLINGO−1とNgRとの会合を有意に阻止し、そしてインビトロでnM以下の濃度でラット成体の脊髄ミエリンの神経突起伸長阻止活性を有意に減弱することが見出されている。加えて、該抗体はインビトロで一次オリゴデンドロサイトの分化を有意に増大させ、そして生存細胞における細胞表面LINGO−1を有意に下方調節することが示されている。これらの抗体での処理は軸索再生/可塑性を増大させ、そしてSCIおよび脳皮質傷害のような急性CNS傷害の後の機能的回復を改善すると予期される。さらに、オリゴデンドログリア細胞における該抗体を用いるLINGO−1シグナル発生の遮断は、MSのような脱髄性疾患における軸索のミエリン再形成を増強し、疾患進行の減弱に至る可能性がある。一致して、該抗体でのニューロンにおけるLINGO−1シグナル発生の阻止は軸索再生および神経可塑性を改善し、そして疾患の経過中の神経学的機能喪失の回復を促進すると予期できる。最後に、該抗体でのLINGO−1の遮断はパーキンソン病の病因を減弱すると予期できる。
抗体はラット、カニクイザルおよびヒトLINGO−1外部ドメインに対してnM以下のKDを有し、ラット成体脊髄ミエリンの神経突起伸長阻止活性をnM以下の濃度で有意に減弱し、そしてインビトロでオリゴデンドロサイト分化を有意に増大させた。さらに今では該抗体と同一の可変領域を有するその他のLINGO−1結合分子を構築することが可能である。
したがって、本発明はLINGO−1の特定の領域またはエピトープに対する結合分子(以後「本発明の結合分子」または単に「結合分子」と称する)を提供する。
本発明の結合分子は解離定数(KD)<1000nM、さらに好ましくはKD<100nM、最も好ましくはKD<10nMでラットLINGO−1(配列番号1)、カニクイザルLINGO−1(配列番号2)およびヒトLINGO−1(配列番号3)の成熟外部ドメイン(残基34−550)に結合する。結合反応を例えば実施例に記載されるFACS法を含む標準的な方法(定性アッセイ)により示すことができる。加えてラット、カニクイザルおよびヒトLINGO−1に対する結合、ならびに効率もまた以下で記載されるような神経突起伸長アッセイおよびオリゴデンドロサイトアッセイにおいて示すことができる。
配列番号12
(抗体4784CDR−H1)
SSGVGVG
配列番号13
(抗体4784CDR−H2)
HIGSDDDKYYSTSLKT
配列番号14
(抗体4784CDR−H3)
NQQYGDGYPGYFDY
配列番号15
(抗体4784CDR−L1)
SGDNIGNYYVY
配列番号16
(抗体4784CDR−L2)
EDTNRPS
配列番号17
(抗体4784CDR−L3)
QSYDNLHEQV
配列番号18
(抗体4785CDR’−H1)
DNSAAWS
配列番号19
(抗体4785CDR’−H2)
LIYLRSKWDNDYAVSVKS
配列番号20
(抗体4785CDR’−H3)
TGRADEFDV
配列番号21
(抗体4785CDR’−L1)
SGSSSNIGNNYVS
配列番号22
(抗体4785CDR’−L2)
RNSKRPS
配列番号23
(抗体4785CDR’−L3)
STYDTFSIV
別の実施態様では、本発明の結合分子は;配列番号5もしくは配列番号7に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%もしくは少なくとも99%相同である配列、および;
配列番号4もしくは配列番号6に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%もしくは少なくとも99%相同である配列、またはその直接的な均等物;からなる群から選択される少なくとも1つの抗原結合部位を含む。
配列番号4または配列番号6;
からなる群から選択される少なくとも1つの結合部位を含む。
本発明はさらに配列番号5に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%もしくは少なくとも99%相同である第1の配列、および配列番号4に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%もしくは少なくとも99%相同である第2の配列、またはその直接的な均等物を含む結合分子を提供する。
a)
(i)配列番号5または配列番号7を含む可変ドメイン、および;
(ii)ヒト重鎖の定常部分またはそのフラグメント;
を含む1つの免疫グロブリン重鎖またはそのフラグメント;ならびに
b)
(i)配列番号4または配列番号6を含む可変ドメイン、および;
(ii)ヒト軽鎖の定常部分またはそのフラグメント;
を含む1つの免疫グロブリン軽鎖またはそのフラグメント;
またはその直接的な均等物;例えばa)もしくはb)の下で与えられた鎖の各々の2つもしくは3つ;
を含む上記の結合分子を提供する。
さらなる実施態様では、抗体としての結合分子はγ4型のヒト重鎖の定常部分またはそのフラグメントおよびλ型であるヒト軽鎖の定常部分またはそのフラグメントを有する。
さらなる実施態様では、結合分子はヒトまたはキメラまたはヒト化モノクローナル抗体である。
さらなる実施態様では、結合分子はhumaneered抗体である。
本発明はまた前記で定義されたような結合分子をコードするポリヌクレオチドをも提供する。
本発明はまた配列番号8−11による1つまたはそれより多いポリヌクレオチドを含む発現ベクターをも提供する。
さらに本発明は配列番号8−11によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供し、ここで該発現系またはその部分が適合する宿主細胞中に存在する場合、該発現系またはその部分は前記で示されたような結合分子を生成することができる。本発明はまたはかかる発現系を含む単離された宿主細胞をも提供する。
本発明はまたはCNS傷害の処置のための医薬品の調製における前記で示されたような結合分子の使用をも提供する。
本発明はまたは前記で示されたような結合分子を少なくとも1つの薬学的に許容される担体または希釈剤と一緒に含む医薬組成物をも提供する。
本発明はまたは有効量の請求項1から10のいずれかに記載の結合分子をかかる処置を必要とする対象に投与することを含む、軸索再生/可塑性の促進に関連する疾患の処置の方法をも提供する。
抗原結合部位が第1および第2の双方のドメインを含む場合、これらは同一のポリペプチドに位置してよいか、または好ましくは各ドメインが異なる鎖に位置してよく、第1のドメインは免疫グロブリン重鎖の部分またはそのフラグメントであり、そして第2のドメインは免疫グロブリン軽鎖の部分またはそのフラグメントである。
一本鎖抗体は通常10から30個のアミノ酸、好ましくは15から25個のアミノ酸からなるペプチドリンカーにより共有結合した抗体重および軽鎖の可変ドメインからなる。それ故に、かかる構造は重および軽鎖の定常部分を含まず、そして小型ペプチドスペーサーは定常部分全体よりも抗原性が低いはずであると考えられている。「キメラ抗体」とは重もしくは軽鎖または双方の定常領域がヒト起源であるが、重および軽鎖の双方の可変ドメインが非ヒト(例えばマウス)起源である抗体を意味する。「ヒト化抗体」とは超可変領域(CDR)は非ヒト(例えばマウス)起源であるが、免疫グロブリンの全てまたは実質的に全てのその他の部分、例えば定常領域および可変ドメインの高度に保存された部分、すなわちフレームワーク領域はヒト起源である抗体を意味する。しかしながらヒト化抗体は超可変領域に隣接するフレームワーク領域の部分においてネズミ配列の数個のアミノ酸を保持し得る。
「組換えヒト抗体」なる用語は本明細書で使用される際には、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関して遺伝子導入もしくは染色体導入された動物(例えばマウス)またはそこから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマ(transfectoma)から単離された抗体、組換え体から単離された抗体、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーのような組換え手段により調製、発現、創成または単離された全てのヒト抗体、およびヒト免疫グロブリン遺伝子の全てまたは一部の、配列をその他のDNA配列にするスプライシングを伴う任意のその他の手段により調製、発現、創成または単離された抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、フレームワークおよびCDR領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から誘導される可変領域を有する。しかしながら特定の実施態様では、かかる組換えヒト抗体をインビトロ変異誘発(またはヒトIg配列に関して遺伝子導入された動物を用いる場合、インビボ体細胞変異誘発)に供することができ、そして故に組換え抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系VHおよびVL配列から誘導され、そしてそれに関連するが、インビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。
本明細書で使用される際には、「親和性」なる用語は単一の抗原性部位での抗体と抗原との間の相互作用の強さを指す。各抗原性部位内では、抗体「アーム」の可変領域は弱い非共有結合力を介して多くの部位で抗原と相互作用し;より相互作用すると、親和性がより強くなる。
「KD」なる用語は、本明細書で使用される際には、Kaに対するKdの比(解離率に対する会合率)(すなわちKd/Ka)から得られる解離定数を指すと意図され、そしてモル濃度(M)として表現される。当分野において十分に確立された方法を用いて抗体に関するKD値を決定することができる。抗体のKDを決定するための方法は表面プラズモン共鳴法の使用、またはBiacore(登録商標)システムのようなバイオセンサーシステムの使用による。
本発明はまたは:
a)アミノ酸配列(配列番号5)を有する重鎖の可変配列を含む第1ドメイン;
b)アミノ酸配列(配列番号4)を有する軽鎖の可変配列を含む第2ドメイン;
c)第1ドメインのN末端および第2ドメインのC末端もしくは第1ドメインのC末端および第2ドメインのN末端のいずれかに結合したペプチドリンカー;
またはその直接的な均等物;
を含む抗体4784の抗原結合部位(特に抗体4784に関して前記されたCDRを伴う)を含む一本鎖結合分子から選択できる本発明の結合分子を提供する。
本発明の結合分子を
a)アミノ酸配列(配列番号7)を有する重鎖の可変配列を含む第1ドメイン;
b)アミノ酸配列(配列番号6)を有する軽鎖の可変配列を含む第2ドメイン;
c)第1ドメインのN末端および第2ドメインのC末端もしくは第1ドメインのC末端および第2ドメインのN末端のいずれかに結合したペプチドリンカー;
またはその直接的な均等物;
を含む抗体4785の抗原結合部位(特に抗体4785に関して前記されたCDRを伴う)を含む一本鎖結合分子から選択できる。
周知のように、1つまたはいくつかのアミノ酸の欠失、付加または置換のようなアミノ酸配列におけるわずかな変化は、実質的に同一の特性を有する元来のタンパク質のアレル形態に至り得る。故に「その直接的な均等物」なる用語は:
(i)結合分子の可変領域(例えば配列番号4、5、6または7)は、配列番号4および配列番号5の各々の直接的な均等物を含む軽および重鎖または配列番号6および配列番号7の各々の直接的な均等物を含む軽および重鎖の均等な可変領域に対して少なくとも50または80%相同、好ましくは少なくとも90%相同、さらに好ましくは少なくとも95、96、97、98、99%相同であり;
(ii)ラットLINGO−1(配列番号1)、カニクイザルLINGO−1(配列番号2)およびヒトLINGO−1(配列番号3)の外部ドメイン(残基34−550)に、好ましくは解離定数(KD)<1000nM、さらに好ましくはKD<100nM、最も好ましくはKD<10nMで結合できる;
本発明のいずれかの任意の単一ドメイン結合分子(分子X)、または結合部位あたり少なくとも2つのドメインを有する本発明の任意の結合分子(分子X’)を意味する。
この解離定数を例えば実施例で記載されるFACS法を含む種々のアッセイにおいて都合よく試験できる。加えて結合分子の結合および機能的影響をバイオアッセイ、例えば以下に記載されるような神経突起伸長アッセイにおいて示すことができる。
本発明の結合分子の抱合体、例えば酵素または毒素または放射性同位体抱合体もまた本発明の範囲内に含まれる。
機能的誘導体には本発明によるポリペプチドのフラグメントおよびペプチド類似体が含まれる。それはまた「直接的な誘導体」をも含む。
「誘導体」なる用語は本発明による、例えば特定された配列のポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、および共有結合性修飾を定義するために用いられる。本発明による、例えば特定された配列のポリペプチドの例えば軽および重鎖の超可変領域の機能的誘導体は好ましくは、本発明による、例えば特定された配列のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約65%、さらに好ましくは少なくとも約75%、なおさらに好ましくは少なくとも約85%、最も好ましくは少なくとも約95、96、97、98、99%の配列全体にわたる相同性を有し、そしてラット、カニクイザルおよびヒトLINGO−1(および場合によっては加えてLINGO−2)の外部ドメインに結合する能力を実質的に保持している。
「(複数の)アミノ酸」は全ての天然発生の例えばL−α−アミノ酸を指し、そしてD−アミノ酸を含む。アミノ酸は周知の一文字表記または三文字表記のいずれかにより同定される。
(i)本発明の単一ドメイン結合分子、本発明の一本鎖結合分子、本発明の結合分子の重もしくは軽鎖またはそのフラグメントをコードするDNA分子;および
(ii)組換え手段による本発明の結合分子の生成のための本発明のDNA分子の使用;
が提供される。
その方法は多数のオリゴヌクレオチドの合成、PCR法によるその増幅および望ましいDNA配列を与えるためのそのスプライシングを含む。
一本鎖抗体をコードするDNA分子を標準的な方法により、例えば第WO88/1649号(好ましくは特に一本鎖抗体をコードするDNA分子に関して、出典明示により本明細書の一部とする)に記載されるように調製することもできる。
本発明の特定の実施態様では、本発明の結合分子のいくつかの生成のための組換え手段には、以下に記載されるような第1および第2のDNA構築物が含まれる:
a)抗体4784、DNA−4784VH(配列番号8)、または抗体4785、DNA−4785VH(配列番号9)のいずれかの重鎖の可変ドメインをコードする第1の部分;この第1の部分は可変ドメインの最初のアミノ酸をコードするコドンで始まり、そして可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる;および
b)重鎖の定常部分の最初のアミノ酸をコードするコドンで始まり、そして定常部分またはそのフラグメントの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わり、ナンセンスコドンが続く重鎖定常部分またはそのフラグメントをコードする第2の部分;
を含む。
好ましくは第2の部分はヒト重鎖の定常部分、さらに好ましくはヒトγ4鎖の定常部分をコードする。この第2の部分はゲノム起源のDNAフラグメント(イントロンを含む)またはcDNAフラグメント(イントロンを含まない)でよい。
a)抗体4784、DNA−4784VL(配列番号10)、または抗体4785、DNA−4785VL(配列番号11)のいずれかの軽鎖の可変ドメインをコードする第1の部分;この第1の部分は可変ドメインの最初のアミノ酸をコードするコドンで始まり、そして可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる;および
b)軽鎖の定常部分の最初のアミノ酸をコードするコドンで始まり、そして定常部分またはそのフラグメントの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わり、ナンセンスコドンが続く軽鎖定常部分またはそのフラグメントをコードする第2の部分;
を含む。
好ましくは第2の部分はヒト軽鎖の定常部分、さらに好ましくはヒトκ鎖の定常部分をコードする。
抗体鎖が細胞培養中に生成されなければならない場合、DNA構築物を単一の発現ベクターまたは2つの別個であるが適合する発現ベクターのいずれかに最初に挿入すべきであり、恐らく後者が好ましい。
次いでDNA構築物を含有する各発現ベクターを適当な宿主生物に移す。DNA構築物を2つの発現ベクターに別個に挿入する場合、それらを別個に、すなわち細胞あたり1つの型のベクターに移すか、または同時に移すことができ、恐らくこの後者が好ましい。適当な宿主生物は細菌、酵母または哺乳動物細胞系でよく、この後者が好ましい。さらに好ましくは、哺乳動物細胞系はリンパ系起源、例えば骨髄腫、ハイブリドーマまたは通常の不死化B細胞であるが、内因性抗体重または軽鎖を全く発現しない。
本発明の別の態様では、本発明の多鎖結合分子を生成するための方法が提供され、それは(i)本発明の第1および第2の構築物で形質転換された生物を培養すること;ならびに(ii)培養物から本発明の活性な結合分子を回収すること;を含む。
それ故に方法はまた:
(i)本発明の第1のDNA構築物で形質転換された第1の生物を培養し、そして培養物から該重鎖またはそのフラグメントを回収すること;ならびに
(ii)本発明の第2のDNA構築物で形質転換された第2の生物を培養し、そして培養物から該軽鎖またはそのフラグメントを回収すること;ならびに
(iii)(i)で得られた重鎖またはそのフラグメントおよび(ii)で得られた軽鎖またはそのフラグメントから本発明の活性な結合分子をインビトロで再構成すること;
をも含む。
(i)本発明の一本鎖または単一ドメイン結合分子を各々コードするDNA構築物で形質転換された生物を培養すること;および
(ii)培養物から該分子を回収すること;
を含む本発明の一本鎖または単一ドメイン結合分子を生成するための方法もまた提供される。
本発明はまた有効量の本発明の結合分子をかかる処置を必要とする患者に投与することを含む、哺乳動物神経系、とりわけヒト神経系の軸索再生/可塑性を促進する方法をも提供する。
本発明はまた本発明の結合分子および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、哺乳動物神経系、とりわけヒト神経系の軸索再生/可塑性を促進するための医薬組成物をも提供する。
さらに本発明の結合分子は精神医学的症状、とりわけ統合失調症および抑うつの処置に有用である。
適当な組成物を作り上げるのを助けるために、本発明の結合分子および場合によっては本発明の結合分子の影響を増強する第2の薬物を、混合または併用投与のための説明書と共に同一容器内に別個に包装することができる。最適な第2の薬物候補は前記で提供した。
以下の実施例を参照して本発明はさらに十分に理解されよう。しかしながらそれらは本発明の範囲を限定するとは解釈されるべきではない。
実施例において注目を集めるモノクローナル抗体は抗体4784に関して軽鎖の可変部分(配列番号4)および重鎖の可変部分(配列番号5)を含有し、そして4785に関して軽鎖の可変部分(配列番号6)および重鎖の可変部分(配列番号7)を含む本発明による結合分子である。
AP ヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼ
CDR 相補性決定領域
cDNA 相補的DNA
ELISA 酵素結合免疫吸着アッセイ
FACS 蛍光活性化セルソーティング
FBS ウシ胎仔血清
HCMV ヒトサイトメガロウイルスプロモーター
IgG 免疫グロブリンアイソタイプG
PBS リン酸塩緩衝生理食塩水
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
PFA パラホルムアルデヒド
PNPP リン酸パラニトロフェニル
無作為およびオリゴdTプライマーを用いてユニバーサルヒト参照RNA(Stratagene)のRT−PCRによりヒトcDNAライブラリーを作成する。無作為およびオリゴdTプライマーを用いて凍結カニクイザル脳から単離されたポリA RNAのRT−PCRにより、カニクイザル脳cDNAライブラリーを作成する。Marathon−readyラット脳cDNAライブラリーをClontechから入手する。5’−XbaIおよび3’−XhoI部位によりフランキングされたヒトLINGO−1(配列番号27)、カニクイザルLINGO−1(配列番号28)およびラットLINGO−1(配列番号29)の成熟配列をコードするcDNA(残基34−614)を正方向プライマーDM14、5’−CTACGTCTAGAACGGGCTGCCCGCCCCGCT−3’(配列番号30)および逆方向プライマーDM15、5’−GGTTTCTCGAGTCATATCATCTTCATGTTGAACTTGCGG−3’(配列番号31)を用いて各々のライブラリーからPCR増幅する。PCR生成物をXbaIおよびXhoIで切断し、そしてベクターpSecTag2−V5(配列番号32)の各々の部位に挿入して、各々hLINGO−1−pSecTag2−V5、cmLINGO−1−pSecTag2−V5およびrLINGO−1−pSecTag2−V5を作成する。予測されるタンパク質生成物はN末端で2アミノ酸残基リンカーを介して14アミノ酸残基V5エピトープタグに融合されたLINGO−1の成熟配列である。5’−XbaIおよび3’−XhoI部位によりフランキングされたヒトLINGO−2(配列番号33)の成熟配列をコードするcDNA(残基26−606)を正方向プライマーDM16、5’−CTACGTCTAGAATTGGCTGCCCCGCTCGCT−3’(配列番号34)および逆方向プライマーDM17、5’−GGTTTCTCGAGTCAAATCATTTTCATGTTGAACCTCCTG−3’(配列番号35)を用いてMarathon−readyヒト脳cDNAライブラリー(Clontech)からPCR増幅する。PCR生成物をXbaIおよびXhoIで切断し、そしてベクターpSecTag2−V5の各々の部位に挿入して、hLINGO−2−pSecTag2−V5を作成する。予測されるタンパク質生成物はN末端で2アミノ酸残基リンカーを介して14アミノ酸残基V5エピトープタグに融合されたLINGO−2の成熟配列である。lipofectamine−2000(Invitrogen)を用いて製造者の説明書にしたがって、hLINGO−1−pSecTag2−V5、cmLINGO−1−pSecTag2−V5、rLINGO−1−pSecTag2−V5およびhLINGO−2−pSecTag2−V5で各々細胞をトランスフェクトすることにより、ヒトLINGO−1(CHO−K1−hLINGO−1)、カニクイザルLINGO−1(CHO−K1−cmLINGO−1)、ラットLINGO−1(CHO−K1−rLINGO−1)およびヒトLINGO−2(CHO−K1−hLINGO−2)を安定して発現するCHO−K1細胞を作成する。安定して発現するトランスフェクト体を1mg/mlゼオシン(Invivogen)で選択し、そして96ウェルプレートへの連続希釈か、またはクローンリング(clonal rings)の使用かのいずれかにより単一のクローンを単離する。細胞表面での構築物の発現を、抗V5抗体を用いる免疫蛍光分析により確認する(InvitroGen)。
ヒトLINGO−1をコードするMGC mRNA(クローンMGC:17422 IMAGE:4214343)をPCR増幅のための鋳型として使用する。Pwo1ポリメラーゼ(Roche Diagnostics)ならびに標的配列の5’末端でHindIII制限部位およびKozakコンセンサス配列および3’末端で標的配列の最後のコドンの直後にXhoI制限部位を加えられたプライマーで、ヒトLINGO−1の天然のシグナル配列により先行される細胞外ドメイン(ECD)(aa1−550)をPCRにより増幅する。PCR生成物をHindIIIおよびXhoIで消化し、ゲル精製し、そして以前に同一の酵素で消化されたプラスミドpRS5a−IgG(配列番号36)に挿入する。得られた発現クローン(天然リーダー(natleader)−hsLINGO−1−Fc/pRS5a、配列番号37)における挿入された配列、完全なFcおよびフランキング領域の正確さをDNAシークエンシングにより確認する。
規模を拡大した天然リーダー−hsLINGO−1−Fcの生成のために、1.4×106セル/mlの密度のHEK.EBNA細胞培養物2.9lをDNA:PEI溶液(DNA 1μg:PEI 2μg/ml)1.1lと混合する。4時間インキュベートした後、培養物にExCell VPRO培地(SAFC、以前はJRH、Lenexa, KS)4lを供給する。培養の6日後に細胞培養上澄を収集し、そして10kDaカットオフの使い捨てHemoflow F10HPSフィルター(Fresenius Medical Care, Germany)を用いてダイアフィルトレーションにより1lまで濃縮する。Igリーダー−hsLINGO−1−ΔLRR−Fcタンパク質を作成するために行う第2の関連するタンパク質生成を類似の様式で行う。大規模トランスフェクションに関する詳細、DNA:PEI比率、細胞密度、供給および収集は前記されたものと全く同一である。
濃縮物1l(培養上澄8lから)を20mlプロテインAセファロースのクロマトグラフィーにより分析する。100mM NaPi、pH7.3のベースライン洗浄の後、結合材料を50mMクエン酸、140mM NaCl、pH2.7で溶出し、中和し、そして滅菌ろ過する。溶出された分画さらに濃縮し、そしてPBS中Superdex 75でゲルろ過し、1.2mg/mlの濃度の生成物8.2mgを生じる。
b)Igリーダー−hsLINGO−1−ΔLRR−Fc
濃縮物1l(培養上澄8lから)を20mlプロテインAセファロースのクロマトグラフィーにより分析する。100mM NaPi、pH7.3のベースライン洗浄の後、結合材料を50mMクエン酸、140mM NaCl、pH2.7で溶出し、中和し、そして滅菌ろ過して、1.5mg/mlの濃度の生成物52.5mgを生じる。
精製されたタンパク質を還元/アルキル化およびトリプシン消化の後、N末端シークエンシングおよびMALDIペプチド質量分析により詳しく特徴付けする。
LINGO−1のNgRに対する結合の遮断は神経突起伸長の3つのミエリン関連阻害剤、すなわちNogo−66、MAGおよびOMgpのシグナル発生を防御し、そしてしたがってCNSミエリンの神経突起伸長阻止活性を減弱し、故に軸索再生/可塑性の増大および急性CNS傷害後の機能的回復の改善に至ると予期される。抗LINGO−1抗体がLINGO−1のNgRに対する結合を遮断することを実証するために、ヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼ(AP)−タグ化ラットLINGO−1外部ドメイン(AP−LINGO−1)の、NgRを安定して発現するSH−SY5Y細胞(NgR−SH−SY5Y、Walmsley et. al., J Cell Sci 117:4591−4602(2004))への結合を測定するアッセイを用いることができる。
インビボ軸索再生/可塑性に及ぼす抗LINGO−1抗体の影響を予測する最も関連性のあるインビトロアッセイは、CNSミエリンの神経突起伸長阻止活性を減弱するその能力である。このアッセイでは、成体ラットから抽出された全脊髄ミエリンでコーティングされたウェル中で出生後7日のラット小脳顆粒ニューロン(CGN)を成長させ、そして神経突起伸長を自動ArrayScan(登録商標)HCSリーダー(Cellomics)により定量する。
抗LINGO−1 IgG4抗体4784および4785の脱抑制活性を該神経突起伸長アッセイにおいて評価する(図2)。
遺伝的手段による、または受容体アンタゴニストでの処理によるLINGO−1機能の遮断により、精製されたOPC培養物から生じる成熟オリゴデンドロサイトの比率が増大することが報告されている(Mi et al., Nat Neurosci 8:745−751(2005))。抗LINGO−1抗体がOPC培養物におけるLINGO−1機能を遮断し、そしてオリゴデンドロサイト成熟化を促進する能力を評価するために、新たに単離されたラットOPCをDMEM/CNTF/T3培地中4784、4785または対照IgG4 3207と共に3日間インキュベートし、続いて抗O4抗体で染色して未成熟および成熟双方のオリゴデンドロサイトを標識する(図5)。オリゴデンドロサイト成熟の程度を、成熟形態を呈するO4陽性細胞の比率として測定する。
多価抗体の細胞表面標的に対する結合は抗体:標的複合体の内部移行およびその後のエンドサイトーシス経路内での標的の分解に至り得る(Weinmann et al., Mol Cell Neurosci 32:161−173(2006))。
抗LINGO−1抗体の細胞表面LINGO−1の量に及ぼす影響を決定するために、トランスフェクトされていないCHO−K1またはCHO−K1−hLINGO−1細胞(実施例1参照)を100nM 4784、4785または3207と共に37℃で24時間インキュベートし、そしてその後細胞表面LINGO−1を抗V5抗体、続いて1−Step(商標)Turbo TMB−ELISAキット(Pierce)で展開される抗マウスIgG(Fc特異的)−POD抱合体で検出する(図6A)。
ヒト組換えLINGO−1−Fc融合タンパク質を、直接固定されたヤギ抗ヒトIgG Fc抗体を介するFc部分の捕捉により間接的にMaxisorpプレート96または384ウェルに室温で1時間固定する(PBS中10μg/mlでコーティングされた100μlまたは20μl)。
PBS中5μg/mlの抗原20μlのコーティングの後、ウェルをPBS/0.05%Tween(PBS−T)/5%粉乳で、室温で1時間遮断する。ウェルをPBS−T BEL抽出物で洗浄した後、精製されたFabまたは対照IgGをPBSで希釈し、ウェルに加え、そして室温で1時間インキュベートする。一次抗体を検出するために、以下の二次抗体を適用する:アルカリ性ホスファターゼ(AP)抱合AffiniPureヤギF(ab’)2フラグメント抗ヒトIgGまたは抗マウスIgG(Jackson ImmunoResearch)。AP抱合体の検出のためにAttoPhos(Roche)のような蛍光発生基質を製造者の説明書にしたがって使用する。全インキュベーション工程の間に、マイクロタイタープレートのウェルをPBS−Tで5回、および二次抗体との最終インキュベーションの後に5回洗浄する。TECAN Spectrafluorプレートリーダーで蛍光を測定する。
丸底96ウェルマイクロタイタープレート(NUNC(商標)、Wiesbaden, Germany)中ウェルあたり2×105セルで全染色を実施する。各々の細胞系の細胞をPBS/3%FCS/0.02%NaN3(FACSバッファー)に再懸濁し、そしてa)周辺質抽出物もしくはBELライゼートからの抗体またはb)精製されたFabフラグメントまたはc)FACSバッファーで希釈された、精製されたIgGと混合し、そして4℃で30−60分間インキュベートする。次いで細胞をFACSバッファー/ウェル150μlで1回洗浄し、そしてFACSバッファー中1:200で希釈されている、フィコエリスリン標識された二次抗体(R−PE抱合されたヤギ抗ヒトIgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch)100μlに取る。4℃で30−60分間インキュベートした後、細胞をFACSバッファーで1回洗浄し、FACSバッファー100μlに再懸濁し、そしてLINGO−1特異的抗体の結合をFACSCalibur(商標)またはFACSArray(商標)(Becton Dickinson)においてFL2蛍光強度により測定する。
抗LINGO−1特異的抗体の細胞基盤の親和性をFACS飽和結合実験により決定する。染色するために試料中に存在する抗原の濃度は見かけのKD値に影響するので、FACS飽和結合実験における抗原濃度を低下させるために2×105セル/ウェルと対比して1.25×104セル/ウェルのみを用いる。その他の点は前記されたFACS染色手順と同一に染色手順を行う。
IgG形式への転換
全長免疫グロブリン(Ig)を発現するために、重(VH)および軽鎖(VL)の可変ドメインフラグメントをpMORPH(登録商標)X9 MH(配列番号39)Fab発現ベクターからヒトIgG4のためのpMORPH(登録商標) h Ig(配列番号40−42)またはpMORPH(登録商標)2 h Ig(配列番号43−45)ベクターシリーズのいずれかにサブクローニングする。
VLドメインフラグメントのpMORPH(登録商標) h Igκ(配列番号42)およびpMORPH(登録商標)2 h Igκ(配列番号45)へのサブクローニングをEcoRVおよびBsiWI部位を介して実施するが、一方pMORPH(登録商標) h Igλ(配列番号41)およびpMORPH(登録商標)2 h Igλ2(配列番号43)へのサブクローニングをEcoRVおよびHpaIを用いて行う。
HEK293細胞を等モル量のIgG重および軽鎖発現ベクターでトランスフェクトする。トランスフェクション後4または5日に、細胞培養上澄を収集する。上澄のpHを8.0に調整し、そして滅菌ろ過した後、溶液を標準的なプロテインAカラムクロマトグラフィー(Poros 20A、PE Biosystems)に供する。
抗LINGO−1特異的抗体の細胞基盤の親和性をFACS飽和結合実験により決定する。見かけのKD値の決定は、抗LINGO−1Fab抗体を用いて前記された手順と同一に実施する。
詳細には、CHO−K1−hLINGO−1、CHO−K1−cmLINGO−1またはCHO−K1−rLINGO−1をベルセンにより培養フラスコから剥がし、FACSバッファーで洗浄し、そしてFACSバッファーに再懸濁する。精製された抗LINGO−1 IgG4をFACSバッファーで連続希釈し、そして丸底96ウェルマイクロタイタープレート(NUNC(商標)、Wiesbaden, Germany)に広げる。各濃度に関して、2検体ずつのウェルを1.25×104セルと共に全容量100μlで、氷上で30−60分間インキュベートする。FACSバッファー150μlを適用し、そして400×gで5分間遠心することによる洗浄工程の後、細胞ペレットをフィコエリスリン標識二次抗体(R−PE抱合ヤギ抗ヒトIgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch)100μlに再懸濁し、それをFACSバッファーで1:200に希釈する。4℃で30−60分間インキュベートした後、細胞をFACSバッファーで1回洗浄し、FACSバッファー100μlに再懸濁し、そしてLINGO−1特異的抗体の結合をFACSArray(商標)(Becton Dickinson)において細胞のFL2蛍光強度により測定する。見かけのKD値/EC50値をGraphPad Prism v3.03ソフトウェアまたはGraphPad Prism v4.03を用いて飽和結合曲線から決定し、非線形回帰曲線フィットに適用する。このアッセイを用いて以下の見かけのKD値を決定することができる(表3)。
抗LINGO−1 IgG4のヒトLINGO−1に対する結合に及ぼすヒト脳脊髄液の影響をFACS飽和結合実験により試験する。4784および4785の連続希釈物を調製する。CHO−K1−hLINGO−1に対する結合を50%ヒト脳脊髄液の存在下で試験する。前記されたFACS染色にしたがって細胞をヒトCSFの存在下、これらのIgG4抗体で染色する。
抗LINGO−1 IgG4のヒトLINGO−1に対する結合に及ぼすヒト血清の影響をFACS飽和結合実験により試験する。4784および4785の連続希釈物を50容量/容量%ヒト血清の存在下で調製する。細胞を60分間インキュベートした後、前記されたFACS染色にしたがってこれらのプレインキュベートされたIgG4抗体で細胞を染色する。
Claims (15)
- 解離定数<20nMで配列番号1、配列番号2および配列番号3によるタンパク質に結合することができ、かつ、少なくとも1つの抗原結合部位を含む抗体またはそのフラグメントであって、該抗原結合部位が以下のCDR:
(i)配列番号12のCDR−H1、配列番号13のCDR−H2、配列番号14のCDR−H3、配列番号15のCDR−L1、配列番号16のCDR−L2および配列番号17のCDR−L3、
または
(ii)配列番号18のCDR’−H1、配列番号19のCDR’−H2、配列番号20のCDR’−H3、配列番号21のCDR’−L1、配列番号22のCDR’−L2および配列番号23のCDR’−L3
を順に含むものである、抗体またはそのフラグメント。 - 20nM未満の濃度で脊髄ミエリンを脱抑制することができる請求項1に記載の抗体またはそのフラグメント。
- ラット成体脊髄ミエリンの基質上で成長させたラット小脳顆粒細胞の細胞あたりの平均神経突起長を少なくとも20%まで増加させることができる請求項1または2に記載の抗体またはそのフラグメント。
- 少なくともa)
(i)配列番号5を含む可変ドメイン、および
(ii)ヒト重鎖の定常部分またはそのフラグメント
を含む1つの免疫グロブリン重鎖またはそのフラグメント;ならびに
b)
(i)配列番号4を含む可変ドメイン、および
(ii)ヒト軽鎖の定常部分またはそのフラグメント
を含む1つの免疫グロブリン軽鎖またはそのフラグメント
を含む、請求項1−3のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント。 - 少なくともa)
(i)配列番号7を含む可変ドメイン、および
(ii)ヒト重鎖の定常部分またはそのフラグメント
を含む1つの免疫グロブリン重鎖またはそのフラグメント;ならびに
b)
(i)配列番号6を含む可変ドメイン、および
(ii)ヒト軽鎖の定常部分またはそのフラグメント
を含む1つの免疫グロブリン軽鎖またはそのフラグメント
を含む、請求項1−3のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント。 - ヒト重鎖の定常部分またはそのフラグメントがγ4型のものであり、そしてヒト軽鎖の定常部分またはそのフラグメントがκ型のものである請求項5に記載の抗体またはそのフラグメント。
- ヒトまたはキメラまたはヒト化モノクローナル抗体である請求項1−5のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント。
- 請求項1−5のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号8および配列番号9からなる群から;または配列番号10および配列番号11からなる群から選択されるポリヌクレオチド。
- 請求項8または9のいずれかに記載の1つまたはそれより多いポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項8または9のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターであって、該発現ベクターが適合する宿主細胞中に存在する場合に、請求項1から7のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントを生成することができるものである、発現ベクター。
- 請求項10または11に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
- CNS傷害の処置のための医薬品の調製における請求項1から7のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントの使用。
- 請求項1から7のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントを少なくとも1つの薬学的に許容される担体または希釈剤と一緒に含む医薬組成物。
- 軸索再生/可塑性の促進に関連する疾患の処置における使用のための医薬の調製における、請求項1から7のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントの使用。
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