KR101215801B1

KR101215801B1 - 항?ＮｏｇｏＡ 항체 (″１Ｃ７″) 및 그의 제약상 용도

Info

Publication number: KR101215801B1
Application number: KR1020057010410A
Authority: KR
Inventors: 카르멘 바르스케; 아니스 쿠스로 미르; 토마스 외르틀; 리자 쉬넬; 마르틴 에. 쉬밥; 알레싼드라 비탈리티; 마우로 쥬리니
Original assignee: 유니베르시태트 취리히; 노파르티스 아게
Priority date: 2002-12-10
Filing date: 2003-12-09
Publication date: 2012-12-26
Also published as: DK1572745T3; CY1110848T1; ES2349293T3; CN1747971A; CA2509068C; SI1572745T1; EP1572745A2; IL169018A; RU2350623C2; ATE475671T1; EP1572745B1; PT1572745E; KR20050095768A; WO2004052932A2; ZA200504522B; US20060183678A1; ECSP055849A; JP4504200B2; US8535666B2; CN100384877C

Abstract

본 발명은 인간 NogoA 폴리펩티드 또는 인간 NiG 또는 인간 NiG-D20 또는 인간 NogoA_623-640에 해리 상수 < 1000 nM로 결합할 수 있는 분자, 예를 들어 모노클로날 항체 또는 그의 Fab 단편; 이러한 결합 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터; 이러한 결합 분자의 신경 복구 치료에 있어서의 용도; 이러한 결합 분자를 포함하는 제약 조성물 및 신경 복구 관련 질환의 치료 방법에 관한 것이다.

인간 NogoA 폴리펩티드, 인간 NiG, 인간 NiG-D20, 인간 NogoA_623-640, 신경 복구, 해리 상수

Description

항?ＮｏｇｏＡ 항체 (″１Ｃ７″) 및 그의 제약상 용도 {Antibody (″11C7″) Anti NogoA and Its Pharmaceutical Use}

본 발명은 NogoA 결합 분자, 예를 들어 모노클로날 항체 또는 그의 Fab 단편에 관한 것이다.

성체의 중추 신경계 (CNS)에서는 상해 후의 신경 재생이 축삭돌기를 초성화(ensheath)하는 억제성 수초 환경의 존재 및 반흔 조직의 형성으로 인해 제한된다. 과거 수년 동안에, CNS가 상해 후에 스스로를 자발적으로 복구할 수 없는 이유에 관한 분자적 이해에 있어서 중요한 통찰이 이루어졌다. 수초의 억제 분자는 축삭돌기 재생, 특히 상해 직후의 축삭돌기 재생에 주요 장애가 된다. 지금까지는 NogoA, 수초-관련 당단백질 (MAG) 및 수초-희돌기아교세포 당단백질 (OMgp)이 신경돌기 증식의 강력한 억제제로서 특징규명되어 왔다. 추가로, 수초는 또한 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 등과 같은 다른 억제 성분도 함유한다. NogoA는 레티큘론(reticulon) 단백질 족의 구성원이며 아미노-Nogo 및 Nogo-66이라 일컬어지는 적어도 2개의 도메인을 함유하는데, 이것들은 생물학적으로 활성이고 약리학적으로 상이하다. 아미노-Nogo에 대한 수용체 부위는 아직까지 알려지지 않은 반면, Nogo-66은 신경 수용체 NgR을 통해 시험관내 및 생체내 신경 성장을 억제한다. Nogo-66 뿐만이 아니라, MAG 및 OMgp 역시 NgR에 높은 친화도로 결합하여 신경돌기 증식을 억제한다.

신경 복구의 증진을 위해 최근에 추진되고 있는 가능성있는 새로운 연구법은 효소 콘드로이틴아제 ABC를 사용한 반흔 조직의 소화, 후각 초성화 세포 및 줄기 세포 및 단백질 성장 인자를 사용하여 신경 성장을 촉진시키는 조합 기술(bridging technology)을 포함한다. 신경돌기 증식 억제제가 Rho, 막-결합 구아노신 트리스포스파타제 (GTPase) 등과 같은 세포내 신호전달 매개자의 조정을 통해 일으키는 차단 작용이 축삭돌기 성장의 억제와 매우 중요한 연관성이 있다고 여겨진다. 시클릭 아데노신 모노포스페이트 (cAMP)는 시험관내 수초 관련 억제를 극복할 수 있고 생체내 재생을 유도할 수 있다. NgR 수용체의 펩티드 억제제 (NEP 1-40)를 사용하면 래트에서 척수 상해 후의 신경 재성장 및 기능 회복이 유도된다.

상기한 접근법의 사용에 더하여, 중추 신경계 및 말초 신경계의 신경돌기 성장 억제 분자를 중화시키는 특정 모노클로날 항체, 특히 NogoA의 신경돌기 성장 억제 활성을 중화시키는 특정 모노클로날 항체의 사용 역시 주목 받아왔다. 따라서, 모노클로날 항체 IN-1 또는 그의 IN-1 Fab 단편은 시험관내 신경돌기 증식을 유도하고 생체내 돌기돌출(sprouting) 및 재생을 증진시키는 것으로 나타났다 [Schwab ME et al. (1996) Physio. Rev. 76, 319-370]. NogoA의 여러 도메인을 신경돌기 성장 억제 활성에 대하여 시험하여 상기 분자 내의 여러 억제성 도메인이 밝혀졌다 ([Chen et al. (2000) Nature 403, 434-439], [GrandPre et al. (2000) Nature 403, 439-444], [Prinjha et al. (2000) Nature 403, 383-384], 또한 실시예 1의 상세한 분석법 참조).

일반적으로, 천연 이뮤노글로불린 또는 천연 항체는 각 상부 아암(arm)의 말단에 항원-결합 부위를 갖는 Y자형 다량체 분자를 포함한다. 상기 구조의 나머지, 특히 Y자의 몸통 부분은 이뮤노글로불린과 관련된 이펙터 기능을 매개한다. 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성된다. 중쇄와 경쇄 모두가 가변 도메인 및 불변부를 포함한다. 항원 결합 부위는 경쇄의 가변 도메인과 결합된 중쇄의 가변 도메인으로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 일반적 구조가 동일하다. 더욱 특히, 항체의 항원 결합 특성은 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 중에서 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR)이라 일컬어지는 특정한 3개 영역에 의해 본질적으로 결정된다. 이들 3개의 초가변 영역은, 비교적 보존된 서열을 가지며 결합에는 직접 관여하지 않는 4개의 프레임워크 영역 (FR, Framework Region)과 교대로 존재한다. CDR은 루프(loop)를 형성하며, 주로 β-시트 형태의 프레임워크 영역에 의해 근접한 위치로 유지된다. 중쇄의 CDR은 그와 결합된 경쇄의 CDR과 함께 본질적으로 항체 분자의 항원 결합 부위를 구성한다. 통상적으로, 무엇이 FR 영역 또는 CDR 영역을 구성하는 지를 결정하는 것은 동일 종에서 생성된 수많은 항체의 아미노산 서열을 비교하여 이루어진다. CDR 영역 및 FR 영역을 확인하는 일반적인 규칙은 당업자에게 통상적인 지식이며, 예를 들어 웹사이트 (http://www.bioinf. ora.uk/abs/)에서 찾을 수 있다.

놀랍게도, 본 발명에 이르러 래트 NogoA의 폴리펩티드 단편 (서열 1)에 대해 생성된 IgG1형의 신규 모노클로날 마우스 항체 (이하에서는 "11C7"이라 일컬음)가 선행기술의 NogoA 항체보다 더 우수한 성질을 가지며, 특히 호모사피엔스를 포함하는 여러 종의 NogoA에 대한 결합 친화도 측면 및 주어진 항체 농도에서 NogoA 신경돌기 증식 중화 활성이 더 높다는 측면에서 더 우수하다는 것이 밝혀졌다. 또한, 본 발명에 이르러 상기 항체와 동일한 초가변 영역을 갖는 다른 NogoA 결합 분자를 구축하는 것이 가능해졌다.

따라서, 본 발명은 NogoA의 특정 영역 또는 특정 에피토프에 대한 결합 분자 (이하에서는 "본 발명의 결합 분자" 또는 간단히 "결합 분자"라고 지칭함)를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 결합 분자는 인간 NogoA_623-640 (11C7 생성의 대상이 된 오르토로거스(orthologous) 단편, 서열 6), 인간 Nig-D20 (신경돌기 증식 억제 활성을 갖는 NogoA의 최소 단편에 대한 오르토로거스, 서열 24), 인간 NogoA (서열 5) 또는 인간 NiG (NogoA의 가장 강력한 신경돌기 증식 억제 단편이며, 인간 NogoA의 아미노산 186에서 출발하여 아미노산 1004에서 종결함, 서열 5)에 해리 상수 (Kd) < 1000 nM, 더욱 바람직하게는 Kd < 100 nM, 가장 바람직하게는 Kd < 10 nM로 결합한다. 결합 반응은 예를 들어 실시예 6에 기재한 ELISA 방법 및 실시예 7에 기재한 바이오센서 친화도 방법 등을 비롯한 표준 방법 (정성적 검정법)으로 나타낼 수 있다. 추가로, 인간 NogoA에 대한 결합 및 훨씬 더욱 중요하게는 인간 NogoA에 대한 결합 효율은 예를 들어 하기한 것과 같은 신경돌기 증식 검정법으로 나타낼 수 있다.

따라서, 추가의 바람직한 실시양태에서, 상기 결합 분자 (배양 배지 1 mL 당 1 mg, 더욱 바람직하게는 0.1 mg, 훨씬 더욱 바람직하게는 0.01 mg의 농도)는 래트 척수 단백질 추출물의 기질상에서 래트의 소뇌 과립 세포의 신경돌기 수를 인간 NogoA, 인간 NiG, 인간 Nig-D20 또는 NogoA_623-640 폴리펩티드에 결합하지 않는 (즉, 해리 상수 > 1000 nM) 대조군 항체로 처치한 래트 소뇌 과립 세포의 신경돌기 수에 비해 20％ 이상, 바람직하게는 50％, 가장 바람직하게는 100％ 증진시킨다.

추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 내에 서열 8의 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역 CDR1-11C7, 서열 9의 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역 CDR2-11C7 및 서열 10의 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역 CDR3-11C7 및 이들의 직접적인 등가물을 포함하는 1개 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 본 발명의 결합 분자는

a) 서열 내에 서열 8의 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역 CDR1-11C7, 서열 9의 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역 CDR2-11C7 및 서열 10의 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역 CDR3-11C7 또는

b) 서열 내에 서열 11의 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역 CDR1'-11C7, 서열 12의 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역 CDR2'-11C7 및 서열 13의 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역 CDR3'-11C7 또는

c) 이들의 직접적인 등가물

을 포함하는 1개 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 본 발명의 결합 분자는 적어도

a) 서열 내에 서열 8의 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역 CDR1-11C7, 서열 9의 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역 CDR2-11C7 및 서열 10의 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역 CDR3-11C7을 포함하는 제1 도메인 및

b) 서열 내에 서열 11의 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역 CDR1'-11C7, 서열 12의 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역 CDR2'-11C7 및 서열 13의 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역 CDR3'-11C7을 포함하는 제2 도메인 또는

c) 이들의 직접적인 등가물

을 포함한다.

또한, 본 발명은 a) 11C7의 중쇄 가변부 (서열 2) 또는 b) 11C7의 경쇄 가변부 (서열 3) 또는 이들의 직접적인 등가물을 포함하는 1개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 본 발명의 결합 분자를 제공한다.

항원 결합 부위가 제1 도메인과 제2 도메인을 둘다 포함하는 경우, 이들 도메인은 동일 폴리펩티드 분자상에 위치할 수도 있고, 또는 바람직하게는 각 도메인이 상이한 쇄상에 위치하여, 제1 도메인은 이뮤노글로불린 중쇄 또는 그의 단편의 일부이고 제2 도메인은 이뮤노글로불린 경쇄 또는 그의 단편의 일부일 수도 있다.

본 발명의 결합 분자의 예로는 B-세포 또는 하이브리도마에 의해 생성된 항체 및 키메라 항체 또는 인간화 항체 또는 이들의 임의의 단편, 예를 들어 F(ab')₂ 및 Fab 단편 및 단일쇄 항체 또는 단일 도메인 항체 등이 있다.

단일쇄 항체는 통상 10개 내지 30개 아미노산, 바람직하게는 15개 내지 25개 아미노산으로 구성된 펩티드 링커(linker)로 공유 결합된 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인으로 구성된다. 따라서, 이러한 구조는 중쇄 및 경쇄의 불변부를 포함하지 않으며, 상기한 작은 펩티드 스페이서는 온전한 불변부보다 덜 항원성이라고 여겨진다. "키메라 항체"란, 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역 또는 이들 둘다가 인간 기원이지만 중쇄와 경쇄 둘다의 가변 도메인은 비인간 (예컨대 뮤린(murine)) 기원인 항체를 의미한다. "인간화 항체"란, 초가변 영역 (CDR)은 비인간 (예컨대 뮤린) 기원이지만 이뮤노글로불린의 모든 또는 실질적으로 모든 다른 부분들, 예를 들어 불변 영역 및 가변 도메인 중 고도로 보존된 부분, 즉 프레임워크 영역은 인간 기원인 항체를 의미한다. 그러나, 인간화 항체는 초가변 영역에 인접한 프레임워크 영역의 일부에 뮤린 서열의 수개 아미노산을 보유할 수도 있다.

초가변 영역은 바람직하게는 뮤린 또는 인간 기원인 임의의 종류의 프레임워크 영역과 결합될 수 있다. 적합한 프레임워크 영역은 문헌 ["Sequences of proteins of immunological interest", Kabat E. A. et al, US department of health and human services, Public health service, National Institute of Health]에 기재되어 있다. 바람직하게는 결합 분자의 인간 중쇄 불변부는 IgG4 아형을 비롯한 IgG4형일 수 있고, 바람직하게는 인간 경쇄의 불변부는 κ형 또는 λ형, 더욱 바람직하게는 κ형일 수 있다.

모든 인간에서 천연적으로 발견되는 단백질에 대해 생성되는 모노클로날 항체는 비인간 시스템, 예를 들어 마우스에서 발생될 수 있다. 이의 직접적인 결과로서 하이브리도마에 의해 생성된 것과 같은 외인성 항체는 인간으로의 투여시에 바람직하지 않은 면역 반응을 유발하는데, 이것은 주로 상기 외인성 이뮤노글로불린의 불변부에 의해 매개된다. 이것은 상기 항체를 오랜 시간의 기간에 걸쳐 투여하는 것을 제한하므로 상기 항체의 사용이 명백하게 제한된다. 따라서, 인간으로의 투여시에 실질적인 동종 반응을 유발하지 않을 듯한 단일쇄 항체, 단일 도메인 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체를 사용하는 것이 특히 바람직하다.

전술한 관점에서, 본 발명의 더욱 바람직한 결합 분자는 적어도

a) (i) 서열 내에 서열 8의 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역 CDR1-11C7, 서열 9의 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역 CDR2-11C7 및 서열 10의 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역 CDR3-11C7을 포함하는 가변 도메인 및 (ii) 인간 중쇄의 불변부 또는 그의 단편을 포함하는 1개의 이뮤노글로불린 중쇄 또는 그의 단편, 및

b) (i) 서열 내에 서열 11의 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역 CDR1'-11C7, 서열 12의 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역 CDR2'-11C7 및 서열 13의 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역 CDR3'-11C7을 포함하는 가변 도메인 및 (ii) 인간 경쇄의 불변부 또는 그의 단편을 포함하는 1개의 이뮤노글로불린 경쇄 또는 그의 단편, 또는

이들의 직접적인 등가물

을 포함하는 키메라 항체로부터 선택된다.

별법으로, 본 발명의 결합 분자는

b) 서열 내에 서열 11의 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역 CDR1'-11C7, 서열 12의 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역 CDR2'-11C7 및 서열 13의 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역 CDR3'-11C7을 포함하는 제2 도메인 및

c) 제1 도메인의 N-말단과 제2 도메인의 C-말단 또는 제1 도메인의 C-말단과 제2 도메인의 N-말단에 결합된 펩티드 링커

또는 이들의 직접적인 등가물

을 포함하는 항원 결합 부위를 포함하는 단일쇄 결합 분자로부터 선택될 수 있다.

공지된 바와 같이, 1개 또는 여러개 아미노산의 결실, 부가 또는 치환 등과 같이 아미노산 서열에 있어서의 사소한 변화는 실질적으로 동일한 성질을 갖는, 원래 단백질의 대립유전자 형태를 유도할 수 있다. 따라서, 용어 "이들의 직접적인 등가물"은

(i) 결합 분자의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 각각이 초가변 영역 CDR1-11C7 (서열 8), CDR2-11C7 (서열 9) 및 CDR3-11C7 (서열 10)에 등가이고, 이들이 그의 등가 초가변 영역인 CDR1-11C7, CDR2-11C7 및 CDR3-11C7에 대해 각각 50％ 또는 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 더욱 바람직하게는 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 상동성이고, (ii) 인간 NogoA, 인간 NiG, 인간 NiG-D20 또는 인간 NogoA_623-640에 바람직하게는 해리 상수 (Kd) < 1000 nM, 더욱 바람직하게는 Kd < 100 nM, 가장 바람직하게는 Kd < 10 nM로 결합할 수 있는 본 발명의 임의의 단일 도메인 결합 분자 (분자 X) 또는

(iii) 결합 분자의 초가변 영역 CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2' 및 CDR3' 각각이 초가변 영역 CDR1-11C7 (서열 8), CDR2-11C7 (서열 9), CDR3-11C7 (서열 10), CDR1'-11C7 (서열 11), CDR2'-11C7 (서열 12) 및 CDR3'-11C7 (서열 13)에 등가이고, 이들이 그의 등가 초가변 영역인 CDR1-11C7, CDR2-11C7, CDR3-11C7, CDR1'-11C7, CDR2'-11C7 및 CDR3'-11C7에 대해 각각 50％ 또는 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 더욱 바람직하게는 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 상동성이고, (iv) 인간 NogoA, 인간 NiG, 인간 NiG-D20 또는 인간 NogoA_623-640에 바람직하게는 해리 상수 (Kd) < 1000 nM, 더욱 바람직하게는 Kd < 100 nM, 가장 바람직하게는 Kd < 10 nM로 결합할 수 있으며 결합 부위 당 2개 이상의 도메인을 갖는 본 발명의 임의의 결합 분자 (분자 X')

를 의미한다.

따라서, 본 발명의 추가의 실시양태는 예를 들어 인간 NogoA, 인간 NiG, 인간 NiG-D20 또는 인간 NogoA_623-640에 해리 상수 < 1000 nM로 결합할 수 있으며

● 서열 내에 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 이들 각각이 그의 등가 초가변 영역인 CDR1-11C7 (서열 8), CDR2-11C7 (서열 9) 및 CDR3-11C7 (서열 10)에 대해 50％ 이상, 바람직하게는 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 상동성인 1개 이상의 항원 결합 부위 또는

● 서열 내에 초가변 영역 CDR1', CDR2' 및 CDR3'을 포함하고, 이들 각각이 그의 등가 초가변 영역인 CDR1'-11C7 (서열 11), CDR2'-11C7 (서열 12) 및 CDR3'-11C7 (서열 13)에 대해 50％ 이상, 바람직하게는 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 상동성인 1개 이상의 항원 결합 부위

를 포함하는 결합 분자이다.

추가로, 상기 결합 분자는 인간 NogoA, 인간 NiG, 인간 NiG-D20 또는 인간 NogoA_623-640에 해리 상수 < 1000 nM로 결합할 수 있으며,

● 서열 내에 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 이들 각각이 그의 등가 초가변 영역인 CDR1-11C7 (서열 8), CDR2-11C7 (서열 9) 및 CDR3-11C7 (서열 10)에 대해 50％ 이상, 바람직하게는 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 상동성인 제1 항원 결합 부위 및

● 서열 내에 초가변 영역 CDR1', CDR2' 및 CDR3'을 포함하고, 이들 각각이 그의 등가 초가변 영역인 CDR1'-11C7 (서열 11), CDR2'-11C7 (서열 12) 및 CDR3'-11C7 (서열 13)에 대해 50％ 이상, 바람직하게는 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 상동성인 제2 항원 결합 부위

를 포함한다.

이러한 해리 상수는 예를 들어 실시예 7에 기재한 바이오센서 친화도 방법 등을 비롯한 각종 검정법으로 편리하게 시험할 수 있다. 추가로, 결합 분자의 결합 효과 및 기능적 효과는 예를 들어 하기한 바와 같은 생물검정법으로 나타낼 수 있다.

인간 중쇄의 불변부는 γ1형, γ2형, γ3형, γ4형, α1형, α2형, δ형 또는 ε형, 바람직하게는 γ형, 더욱 바람직하게는 γ4형일 수 있고, 인간 경쇄의 불변부는 κ형 또는 λ형 (λ1 아형, λ2 아형 및 λ3 아형 포함)일 수 있으나 κ형인 것이 바람직하다. 모든 이들 불변부의 아미노산 서열은 문헌 [Kabat et al (상기 문헌)]에 기재되어 있다.

본 발명의 결합 분자의 접합체, 예를 들어 효소 또는 독소 또는 방사성동위원소 접합체 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

본원에서 달리 명시하지 않는다면, "폴리펩티드"는 펩티드 결합으로 서로에게 연결된 아미노산을 포함하고 N-말단에서 출발하여 C-말단에서 종결하는 아미노산 서열을 갖는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 모노클로날 항체이고, 더욱 바람직하게는 키메라 모노클로날 항체 (V-이식된 모노클로날 항체라고 일컬어지기도 함) 또는 인간화 모노클로날 항체 (CDR-이식된 모노클로날 항체라고 일컬어지기도 함)이다. 인간화 모노클로날 항체 (CDR-이식된 모노클로날 항체)는 수용자 항체의 프레임워크 (FR) 서열에 도입된 추가의 돌연변이를 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다.

본원에서 사용된 바와 같은 폴리펩티드의 기능적 유도체는 본 발명의 폴리펩티드와 공통되는 정성적인 생물학적 활성을 갖는 분자, 즉 인간 NogoA, 인간 NiG, 인간 NiG-D20 또는 인간 NogoA_623-640에 대한 결합력을 갖는 분자를 포함한다. 기능적 유도체는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 단편 및 그의 펩티드 유사체를 포함한다. 단편은 본 발명에 따른 폴리펩티드의 서열, 예를 들어 명시된 서열의 폴리펩티드 서열 내의 영역을 포함한다. 용어 "유도체"는 본 발명에 따른 폴리펩티드, 예를 들어 명시된 서열의 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체 및 공유결합 변형체를 정의하는데 사용된다. 본 발명에 따른 폴리펩티드, 예를 들어 경쇄 및 중쇄 초가변 영역의 명시된 서열의 폴리펩티드의 기능적 유도체는 본 발명에 따른 폴리펩티드, 예를 들어 명시된 서열의 폴리펩티드의 아미노산 서열과의 전반적인 서열 상동성이 바람직하게는 약 65％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 75％ 이상, 훨씬 더욱 바람직하게는 약 85％ 이상, 가장 바람직하게는 약 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상이고, 실질적으로 인간 NogoA, 인간 NiG, 인간 NiG-D20 또는 인간 NogoA_623-640에 대한 결합력을 보유한다.

본 발명에 따른 폴리펩티드, 예를 들어 명시된 서열의 폴리펩티드 또는 그의 단편의 "공유결합 변형"이라는 용어는, 유기 단백질성 또는 비-단백질성 유도체화제에 의한 변형, 이종 폴리펩티드 서열과의 융합 및 번역후 변형을 포함한다. 공유결합 변형된 폴리펩티드, 예를 들어 명시된 서열의 공유결합 변형된 폴리펩티드는 인간 NogoA, 인간 NiG, 인간 NiG-D20 또는 인간 NogoA_623-640에 대하여 가교결합에 의한 결합력을 여전히 보유한다. 공유결합 변형은, 표적화된 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 잔기 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시켜 도입하거나 선택된 재조합 숙주 세포에서 기능하는 번역후 변형 메카니즘을 이용하여 도입하는 것이 통상적이다. 특정한 번역후 변형은 발현된 폴리펩티드에 대한 재조합 숙주 세포의 작용으로 인한 것이다. 글루타미닐 잔기 및 아스파라기닐 잔기는 종종 번역후에 탈아미드화되어 상응하는 글루타밀 잔기 및 아스파르틸 잔기가 된다. 별법으로, 이들 잔기는 온화한 산성 조건하에 탈아미노화된다. 다른 번역후 변형으로는 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 잔기, 티로신 잔기 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신 측쇄, 아르기닌 측쇄 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화 등이 있으며, 예를 들어 문헌 [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman ＆ Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)]을 참조한다. 공유결합 변형체는 예를 들어 본 발명에 따른 폴리펩티드, 예를 들어 명시된 서열의 폴리펩티드 및 이들의 아미노산 서열 변이체를 포함하는 융합 단백질, 예를 들어 이뮤노어드헤신 및 이종 신호 서열과의 N-말단 융합체를 포함한다.

본원에서 천연 폴리펩티드 및 그의 기능적 유도체와 관련한 "상동성"은 후보물질 서열에서 서열 정렬 및 필요에 따라서는 최대 상동성(％) 달성을 위한 갭(gap) 도입 후에 상응하는 천연 폴리펩티드의 잔기와 동일한 아미노산 잔기의 백분율(％)로서 정의되며 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 간주하지 않는다. N-말단 또는 C-말단의 신장 또는 삽입은 그 어느 것도 동일성 또는 상동성을 감소시키는 것으로 여기지는 않는다. 정렬 방법 및 이를 위한 컴퓨터 프로그램은 공지되어 있다.

"아미노산(들)"은 모든 천연 발생 L-α-아미노산을 지칭하고 예를 들어 D-아미노산을 포함한다. 아미노산은 공지된 1-문자 또는 3-문자 기호로 식별된다.

용어 "아미노산 서열 변이체"는 본 발명에 따른 폴리펩티드, 예를 들어 명시된 서열의 폴리펩티드와 비교할 때 아미노산 서열이 약간 상이한 분자를 지칭한다. 본 발명에 따른 폴리펩티드, 예를 들어 명시된 서열의 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 인간 NogoA 또는 인간 NiG 또는 더욱 바람직하게는 NogoA_623-640에 대한 결합력을 여전히 보유한다. 치환 변이체는 본 발명에 따른 폴리펩티드, 예를 들어 명시된 서열의 폴리펩티드에서 1개 이상의 아미노산 잔기가 제거되고 이를 대신하여 동일 위치에 상이한 아미노산이 삽입된 변이체이다. 이들 치환은 상기 분자에서 오직 1개의 아미노산만이 치환된 단일 치환일 수도 있고, 또는 동일 분자에서 2개 이상의 아미노산이 치환된 다중 치환일 수도 있다. 삽입 변이체는 본 발명에 따른 폴리펩티드, 예를 들어 명시된 서열의 폴리펩티드의 특정 위치에 있는 아미노산에 바로 인접하여 1개 이상의 아미노산이 삽입된 변이체이다. 아미노산에 바로 인접하였다는 것은, 상기 아미노산의 α-카르복시 관능기 또는 α-아미노 관능기에 연결된 것을 의미한다. 결실 변이체는 본 발명에 따른 폴리펩티드, 예를 들어 명시된 서열의 폴리펩티드에서 1개 이상의 아미노산이 제거된 변이체이다. 통상적으로, 결실 변이체는 분자의 특정 영역에서 1개 또는 2개의 아미노산이 결실된 것이다.

본 발명의 결합 분자는 재조합 DNA 기술로 생성될 수 있다. 이러한 관점에서, 결합 분자를 코딩하는 1개 이상의 DNA 분자가 구축되어 적절한 제어 서열하에 위치되고 발현을 위해 적합한 숙주 유기체로 이동되어야 한다.

따라서, 본 발명은 매우 일반적인 방식으로

(i) 본 발명의 단일 도메인 결합 분자, 본 발명의 단일쇄 결합 분자, 본 발명의 결합 분자의 중쇄 또는 경쇄 또는 그의 단편을 코딩하는 DNA 분자 및

(ii) 본 발명의 상기 DNA 분자의 재조합 수단에 의한 본 발명의 결합 분자 생성에 있어서의 용도

를 제공한다.

당업계의 현상태는, 당업자가 본원에 제공된 주어진 정보, 즉 초가변 영역의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 DNA 서열에 기초하여 본 발명의 DNA 분자를 합성할 수 있을 수준이다. 가변 도메인 유전자를 구축하는 방법은 예를 들어 EP 239 400에 기재되어 있으며, 다음과 같이 간략하게 요약될 수 있다: 임의의 특이성을 갖는 모노클로날 항체의 가변 도메인을 코딩하는 유전자를 클로닝한다. 프레임워크 영역 및 초가변 영역을 코딩하는 DNA 절편을 결정하고, 초가변 영역을 코딩하는 DNA 절편을 제거하여 프레임워크 영역을 코딩하는 DNA 절편들을 적합한 제한 부위를 갖도록 하면서 접합점에서 융합시킨다. 상기 제한 부위는 표준 절차에 의한 DNA 분자의 돌연변이유발을 통해 적절한 위치에서 생성될 수 있다. 상기한 CDR1-11C7, CDR2-11C7, CDR3-11C7, CDR1'-11C7, CDR2'-11C7 및 CDR3'-11C7 서열에 따른 DNA 합성을 통해 이중 가닥 합성 CDR 카세트를 제조한다. 이들 카세트에 점착성 말단을 제공하고 표준 프로토콜을 통해 프레임워크에 접합점에서 라이게이션시켜서 이뮤노글로불린 가변 도메인을 코딩하는 DNA 분자를 수득할 수 있다.

추가로, 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA 구조물을 수득하기 위해서 하이브리도마 세포주가 생성하는 mRNA에 접근할 필요가 없다. 따라서, PCT 출원 WO 90/07861은 유전자의 뉴클레오티드 서열에 관하여 기술된 정보만으로도 재조합 DNA 기술로 모노클로날 항체를 생성할 수 있는 완전한 지침을 제공한다.

상기 방법은 수많은 올리고뉴클레오티드의 합성, PCR 방법에 의한 이들의 증폭, 및 원하는 DNA 서열로의 스플라이싱(splicing)을 포함한다.

적합한 프로모터 또는 중쇄 및 경쇄 불변부를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터는 공개적으로 입수가능하다. 따라서, 일단 본 발명의 DNA 분자가 제조되면, 이것은 적절한 발현 벡터로 편리하게 이동될 수 있다.

또한, 단일쇄 항체를 코딩하는 DNA 분자도 예를 들어 WO 88/1649에 기재된 바와 같은 표준 방법으로 제조될 수 있다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자 일부를 생성하기 위한 재조합 수단은 하기한 바와 같은 제1 DNA 구조물 및 제2 DNA 구조물을 포함한다:

제1 DNA 구조물은 중쇄 또는 그의 단편을 코딩하고,

a) 프레임워크 영역과 초가변 영역을 교대로 포함하는 가변 도메인을 코딩하고, 상기 초가변 영역은 서열 내에 DNA-CDR1-11C7 (서열 15), DNA-CDR2-11C7 (서열 16) 및 DNA-CDR3-11C7 (서열 17)을 포함하며, 가변 도메인의 첫번째 아미노산을 코딩하는 코돈으로 출발하여 가변 도메인의 마지막 아미노산을 코딩하는 코돈으로 종결하는 제1 부분 및

b) 중쇄 불변부의 첫번째 아미노산을 코딩하는 코돈으로 출발하여 상기 불변부 또는 그의 단편의 마지막 아미노산을 코딩하는 코돈으로 종결되며 비-센스 코돈이 뒤따르는 중쇄 불변부 또는 그의 단편을 코딩하는 제2 부분

을 포함한다.

상기 제1 부분은 바람직하게는 인간 중쇄의 불변부, 더욱 바람직하게는 인간 γ4 쇄의 불변부를 코딩한다. 상기 제1 부분은 게놈 기원의 DNA 단편 (인트론을 포함함)이거나 cDNA 단편 (인트론 없음)일 수 있다.

제2 DNA 구조물은 경쇄 또는 그의 단편을 코딩하고,

a) 프레임워크 영역과 초가변 영역을 교대로 포함하는 가변 도메인을 코딩하고, 상기 초가변 영역은 서열 내에 DNA-CDR1'-11C7 (서열 17), DNA-CDR2'-11C7 (서열 18) 및 DNA-CDR3'-11C7 (서열 19)을 포함하며, 가변 도메인의 첫번째 아미노산을 코딩하는 코돈으로 출발하여 가변 도메인의 마지막 아미노산을 코딩하는 코돈으로 종결하는 제1 부분 및

b) 경쇄 불변부의 첫번째 아미노산을 코딩하는 코돈으로 출발하여 상기 불변부 또는 그의 단편의 마지막 아미노산을 코딩하는 코돈으로 종결되며 비-센스 코돈이 뒤따르는 경쇄 불변부 또는 그의 단편을 코딩하는 제2 부분

을 포함한다.

상기 제2 부분은 바람직하게는 인간 경쇄의 불변부, 더욱 바람직하게는 인간 κ쇄의 불변부를 코딩한다.

제1 DNA 구조물 또는 제2 DNA 구조물은 제1 부분의 상류에 위치하고 리더 펩티드의 첫번째 아미노산을 코딩하는 코돈으로 출발하여 리더 펩티드의 마지막 아미노산을 코딩하는 코돈으로 종결되어 리더 펩티드 부분을 코딩하는 제3 부분을 포함하는 것이 유리하다. 상기 펩티드는 숙주 유기체에 의한 쇄 분비에 필요하며 숙주 유기체에서 발현된 후에는 숙주 유기체에 의해 제거된다. 제1 DNA 구조물의 제3 부분은 서열 21에 나타낸 바와 같은 중쇄 리더 서열의 아미노산 서열 (위치 -19의 아미노산으로 출발하여 위치 -1의 아미노산으로 종결함)과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 리더 펩티드를 코딩하는 것이 바람직하다. 또한, 제2 DNA 구조물의 제3 부분은 서열 23에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 (경쇄, 위치 -18의 아미노산으로 출발하여 위치 -1의 아미노산으로 종결함)을 갖는 리더 펩티드를 코딩하는 것이 바람직하다.

DNA 구조물 각각은 적합한 제어 서열의 제어, 특히 적합한 프로모터의 제어하에 위치한다. 임의의 종류의 프로모터를 사용할 수 있지만, 상기 프로모터는 DNA 구조물이 발현을 위해 이동될 숙주 유기체에 적합해야 한다. 그러나, 포유동물 세포에서 발현이 일어나는 경우에는 이뮤노글로불린 유전자의 프로모터를 사용하는 것이 특히 바람직하다.

원하는 항체는 세포 배양물 또는 트랜스제닉 동물에서 생성할 수 있다. 적합한 트랜스제닉 동물은, 제어 서열하에 위치된 제1 DNA 구조물 및 제2 DNA 구조물을 난(卵)에 미세주사하는 단계, 이와 같이 제조된 난을 적절한 가임신 암컷으로 이동시키는 단계 및 원하는 항체를 발현하는 자손을 선별하는 단계를 포함하는 표준 방법에 따라 수득할 수 있다.

항체 쇄를 세포 배양물에서 생성해야 하는 경우, 상기 DNA 구조물들은 우선 단일 발현 벡터로 삽입되거나 또는 바람직하게는 별개이지만 상용가능한 2개의 발현 벡터로 삽입되어야 한다.

따라서, 본 발명은 또한 상기한 1개 이상의 DNA 구조물을 포함하는 원핵 세포주 또는 진핵 세포주에서 복제될 수 있는 발현 벡터를 제공한다.

이어서, DNA 구조물을 함유하는 각각의 발현 벡터를 적합한 숙주 유기체로 이동시킨다. DNA 구조물이 2개의 발현 벡터상에 따로 삽입되는 경우, 세포 당 1개 유형의 벡터를 이동시켜 이들을 따로 이동시킬 수도 있고 바람직하게는 동시 이동시킬 수도 있다. 적합한 숙주 유기체는 박테리아, 효모 또는 바람직하게는 포유동물 세포주일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 포유동물 세포주가 림프양 기원, 예를 들어 골수종, 하이브리도마 또는 통상적인 불멸화 B-세포이지만, 임의의 내인성 항체 중쇄 또는 경쇄는 발현하지 않는다.

또한, 세포 당 벡터의 카피 수를 많이 함유하는 숙주 유기체도 바람직하다. 숙주 유기체가 포유동물 세포주인 경우, 상기한 바람직한 목적은 표준 방법에 따른 카피 수 증폭에 의해 달성될 수 있다. 통상적으로, 증폭 방법은 발현 벡터에 의해 코딩되는 약물 내성이 증가했는지에 대한 선별 단계를 포함한다.

본 발명은 또다른 측면에서 (i) 본 발명의 제1 DNA 구조물 및 제2 DNA 구조물로 형질전환된 유기체를 배양하는 단계 및 (ii) 상기 배양물로부터 본 발명의 활성 결합 분자를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 다중쇄 결합 분자를 생성하는 방법을 제공한다.

별법으로, 중쇄 및 경쇄는 따로 회수되어 시험관내 리폴딩 후에 활성 결합 분자로 재구성될 수 있다. 재구성 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 이의 예는 특히 EP 120 674 또는 EP 125 023에 기재되어 있다.

따라서, 상기 방법은 또한

(i) 본 발명의 제1 DNA 구조물로 형질전환된 제1 유기체를 배양하고 상기 배양물로부터 상기 중쇄 또는 그의 단편을 회수하는 단계,

(ii) 본 발명의 제2 DNA 구조물로 형질전환된 제2 유기체를 배양하고 상기 배양물로부터 상기 경쇄 또는 그의 단편을 회수하는 단계 및

(iii) 상기 (i)에서 수득된 중쇄 또는 그의 단편 및 상기 (ii)에서 수득된 경쇄 또는 그의 단편으로부터 본 발명의 활성 결합 분자를 시험관내 재구성하는 단계

를 포함할 수도 있다.

유사한 방식으로, 본 발명은 또한

(i) 본 발명의 단일쇄 또는 단일 도메인 결합 분자를 코딩하는 DNA 구조물로 형질전환된 유기체를 각각 배양하는 단계 및

(ii) 상기 배양물로부터 상기 분자를 회수하는 단계

를 포함하는, 본 발명의 단일쇄 또는 단일 도메인 결합 분자를 생성하는 방법도 제공한다.

본 발명의 결합 분자는 예를 들어 과립 세포 신경돌기 증식 모델에서 나타나는 바와 같이 매우 우수한 신경 복구 활성을 발휘한다.

1. 과립 세포 신경돌기 증식 검정법 (시험관내)

문헌 [Niederoest et al. (1999) J. Neurosci. 19:8979-8989]에 기재된 바와 같이 해리된 소뇌 과립 세포로부터의 신경돌기 증식을 결정한다. 간략하게 말하자면, 출생후 제5일 내지 제7일의 래트를 목을 베어 죽여서 소뇌를 꺼내고 트립신을 처리하여 해리시킨다. 섬유아세포 오염을 줄이기 위해서, 상기 세포를 박테리아용 디쉬에 예비플레이팅한다. 이어서, 배지 (B27 혈청 대체물을 함유하는 영양배지(Neurobasal); 인비트로젠(Invitrogen) 제품)가 들어있는 4-웰 그라이너(Greiner) 조직 배양 디쉬 (독일 바젤 라이나하에 소재하는 후버 앤드 코 아게(Huber ＆ CoAG) 제품) (웰 표면: 1 cm²)에서 웰 당 75,000개 세포를 배양한다. 배양 디쉬를 폴리-L-리신 (시그마(Sigma) 제품)으로 코팅한다. 성숙 래트의 전체 척수 균질물로부터의 Chaps 추출 단백질 [Spillmann et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:19283-19293]을 웰 당 0.5 내지 8 ㎍의 단백질 농도로 밤새 4℃에서 코팅하여 세척한다. 이어서, 본 발명의 결합 분자를 30분 동안 시험 기질상에서 예비인큐베이션시키고 제거한 후에 세포를 가한다. 소뇌 과립 세포를 가하고 24시간 동안 인큐베이션한다. 실험을 중지시키기 위해서, 4％ 완충 포름알데히드 2 mL을 배양 디쉬에 서서히 가한다. 이어서, 배양물을 성장-관련 단백질 GAP-43에 대해 면역형광으로 염색하고 세포 핵에 대해 훽스트(Hoechst)로 염색한다 (과립 세포를 훽스트로 염색하여 모든 세포가 신경돌기 (신경돌기는 항-GAP-43으로 가시화됨)를 갖는지 여부를 확인함). 40× 배율의 자이스 악시오포트(Zeiss Axiophot) 형광 현미경을 사용하여 각 웰에서 상하좌우의 길이를 제한한 사진을 무작위로 3장 촬영한다. 번호를 매겨 무작위로 배열한 사진상에서 구역 내의 모든 신경돌기를 계수한다. 반응 (과립 세포 신경돌기의 증식)은 웰 당 총 단백질 약 0.1 내지 10 ㎍의 범위 내에서 사용량-의존적이다 (주어진 제제의 비(比)활성은 상기한 범위 내에서 변동됨).

상기와 같이 제조한 척수 추출물을 비허용 환경하에서 본 발명의 결합 분자와 예비인큐베이션하면 소뇌 과립 세포의 신경돌기 증식의 증진이 관찰될 수 있다. 예를 들어 과립 세포 신경돌기 증식 모델에서 마우스 11C7-IgG1 항체의 중화 효과에 대한 전형적인 프로파일은 하기와 같다:

<검정법 1>

래트 수초

(웰 당 1 ㎍으로 코팅함) 구역 당 신경돌기 백분율(％)

항체 없음 80.5 100％

+ 마우스 IgG 86.5 108％

11C7 250 ㎍/mL 160 199％

<검정법 2>

래트 수초 (제제 2)

(웰 당 8 ㎍으로 코팅함) 구역 당 신경돌기 백분율(％)

항체 없음 20 100％

+ 마우스 IgG 17.3 86.5％

11C7 250 ㎍/mL 31 155％

11C7 75 ㎍/mL 26 130％

11C7 7.5 ㎍/mL 26 130％

본 발명의 분자의 중화 활성은, 다음과 같이 생체내 척수 상해 모델에서 재생성 돌기돌출 및 신경돌기 증식을 측정하여 추정할 수도 있다:

2. 척수 상해 모델 (생체내)

성숙 루이스(Lewis) 래트를 미소외과술을 통해 척수의 뒤쪽 절반을 제8 흉추 수준에서 횡절단하여 상기 래트에게 상해를 입혔다. 추궁절제술, 마취법 및 수술법은 문헌 [Schnell and Schwab 1993 (Eur. J. Neurosci. 5:1156-1171)]에 기재되어 있다. 대조군 또는 본 발명의 결합 분자는 다음과 같은 2가지 상이한 방법으로 적용한다: 새로 수거한 하이브리도마 세포 10⁶개를 대뇌 피질의 한쪽 측에 이식하거나 (이식된 동물) 또는 별법으로는 피하 이식된 2 mL 알제트(Alzet) (미국 팔로 알토에 소재하는 알자 코포레이션(Alza Corporation) 제품) 펌프에 연결된 이식된 뇌실내(intraventricular) 캐뉼라를 통해 적용한다 (펌프 동물) - 하이브리도마 이식된 동물: 래트를 시클로스포린 A로 7 내지 10일 동안 면역저해시키고 상해 후 제14일에 4％ 완충 포르말린을 경심 관류(transcardial perfusion)하여 희생시킨다. - 펌프 동물: 본 발명의 결합 분자 (예를 들어 마우스 11C7, 3.3 mg/mL)를 2 mL 펌프에 충전하고 0.5 ㎕/시간으로 측뇌실(lateral ventricle)에 2주 동안 전달한다. 척수 병변 시기에 펌프를 이식하고, 2주 후에 래트를 희생시킨다.

신경해부학적 추적: 전방향 추적자 바이오틴 덱스트란 아민 (BDA)을 펌프 또는 이식물의 반대측 피질에 주사하여 운동 및 감각 피질척수로를 추적한다. 문헌 [Broesamle et al., (2000 J.Neurosci. 20:8061-8068)]에 기재된 바와 같이, BDA는 10일 내지 14일 이내에 척수 내로 수송되고, 디아미노벤지딘 (DAB)을 기질로서 사용할 때 가시화된다.

해부학적 결과의 평가: 반-정량적 방법과 정량적 방법의 2가지 평가 방법을 이용한다. 돌기돌출 및 재생 강도의 반-정량적 평가법: 번호를 매겨 무작위로 섞은 동물의 완전 시상 절편들을 다음과 같은 정의를 사용하여 병변부 문측(吻側)(rostral)의 재생성 돌기돌출부의 존재 및 밀도에 대해 평가한다: 재생성 돌기돌출부는 횡절단한 CST로부터 뻗어나오는 섬유로서 길고 불규칙한 경로를 가지며 정상의 회백질 측축삭보다 훨씬 덜 분지되어 있고 병변을 향해 그 주변의 하측 또는 측부로 성장한다. 재생성 돌기돌출부의 끝은 흔히 작은 구근형 또는 큰 분지형일 수 있는 성장 원추이다. 돌기돌출부의 밀도를 각 동물에 대해 0 내지 3의 크기로 등급을 매긴다. - 장거리 재생: 병변을 통과해 끝쪽 척수 내로 계속될 수 있는 섬유를 장거리 재생 섬유로 간주한다. 병변 부위로부터의 최대 거리를 측정할 수는 있으나 종종 작은 복측 섬유단(ventral funiculus) CST로부터의 미병변 섬유가 몇몇 존재하기 때문에 흔히 최소 거리가 되기도 한다. 상기 섬유의 분지는 재생 축삭돌기의 분지와 섞여서 분별이 어렵다.

섬유 계수 (정량적 검정법): 횡절단한 CST 말단부의 문측 -0.5 mm 위치의 선을 회백질의 교대 절편상에 놓고, CST 섬유 (정상적인 측축삭 또는 돌기돌출부)와의 모든 교차점을 계수한다. 병변의 끝쪽에 병변 중심으로부터 +0.5, +2 및 +5 mm 거리에 유사한 선을 긋는다. 선과 교차하는 섬유를 계수하고, 이 세개의 레벨을 합하여 끝쪽 척수에 존재하는 CST 섬유를 반영하는 합계를 구한다. 이들 끝쪽 섬유 수를 CST 말단부의 문측 -0.5 mm에서의 섬유수로 나누어 비율을 구한다.

주로 뒤쪽 절반에서 양쪽 메인 CST를 비롯한 척수 절편 T8의 약 40％를 파괴한 척수 상해 2주 후에, 대조군 동물에서의 CST 추적은 피질척수로에 중간 정도의 반응성 돌기돌출이 존재함을 나타낸다. 이러한 현상은, 상해에 대한 반응으로 문헌에 공지된 자발적 돌기돌출에 해당하는 것이다. 본 발명의 결합 분자 또는 본 발명의 결합 분자를 전달하는 펌프를 처치한 상해입은 래트는, 병변 부위에서의 돌기돌출이 증진되며 손상된 축삭돌기에서 손상된 신경돌기의 신경돌기 증식 재생이 증진된 것을 보여준다.

따라서, 본 발명은 또한

(i) 본 발명의 결합 분자의 포유동물 신경계, 특히 인간 신경계의 신경 복구에 있어서의 용도,

(ii) 신경계의 신경 복구가 필요한 환자에게 유효량의 본 발명의 결합 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물 신경계, 특히 인간 신경계의 신경 복구 방법 또는

(iii) 본 발명의 결합 분자 및 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는, 포유동물 신경계, 특히 인간 신경계의 신경 복구용 제약 조성물

을 제공한다.

특히, 본 발명의 결합 분자는 신경 섬유 손상 후의 축삭돌기 재생 및 돌기돌출 개선에 유용하다. 따라서, 본 발명의 분자는 특히 인간 대상체에 대해 광범위한 유용성을 갖는다. 예를 들어 본 발명의 결합 분자는 말초 신경계 (PNS) 및 중추 신경계 (CNS)의 각종 질환 치료에 유용하며, 더욱 특히 신경퇴행성 질환, 예를 들어 알쯔하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 루이 유사(Lewy like) 병리 또는 기타 치매, 통상적으로 두개, 대뇌 또는 척수 외상, 졸중 후의 질환 또는 탈수초 질환의 치료에 유용하다. 이러한 탈수초 질환으로는 다발성 경화증, 단상성 탈수초, 뇌척수염, 다병소성 백질뇌증, 범뇌염, 마르키아파바-비냐미병, 교탈수증, 부신백질이영양증, 펠리체우스-메르츠바허병, 해면 변성, 알렉산더병, 카나반병, 이염백질이영양증 및 크라베병 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 한 예에서, 본 발명의 결합 분자의 투여를 이용하여 NogoA 단백질과 관련된 탈수초 질환을 치료할 수 있다. 또다른 예에서, 본 발명의 결합 분자를 발현하는 세포를 척수 상해 부위에 이식하여 상해입은 부위 전체에 걸친 축삭돌기 성장을 용이하게 할 수 있다. 이와 같이 이식된 세포는 상해 또는 외상 후의 척수 기능을 복구하는 수단을 제공한다. 이러한 세포로는 여러 계통의 태아 신경 또는 조직 이식물의 줄기 세포 및 후각 초성화 세포 등을 들 수 있다.

추가로, 본 발명의 결합 분자는 허혈성 망막증, 통상적으로 전방 허혈성 시신경병증, 모든 형태의 시신경염, 노화 관련 황반 변성, 당뇨병성 망막증, 낭포 황반 부종 (CME), 색소성 망막염, 스타르가르드병, 베스트 난황상 망막 변성, 레베르 선천성 흑내장 및 기타 유전성 망막 변성, 병리적 근시, 미숙아 망막증 및 레베르 유전성 시각 신경병증, 각막 이식 또는 굴절교정 각막 수술의 후유증 및 포진 각막염 등을 비롯한, 망막 또는 각막 세포의 변성과 직접 또는 간접적으로 관련이 있을 수 있는 퇴행성 안구 장애의 치료에 유용하다.

추가로, NogoA는 정신의학적 상태, 특히 정신분열증 및 우울증에서 역할을 수행함이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 결합 분자는 정신의학적 상태, 특히 정신분열증 및 우울증의 치료에 유용하다.

본 발명의 결합 분자는 단독으로 제공될 수도 있고 또는 다른 작용제와의 배합물 또는 순차적 배합물로 제공될 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 결합 분자는 졸중 또는 척수 상해 후에 추가의 신경 손상 및 축삭돌기 재생의 억제를 차단하는 수단으로서의 코르티코스테로이드, 신경영양 인자, 예를 들어 NGF, BDNF 또는 신경퇴행성 질환을 위한 기타 약물, 예를 들어 엑셀론(Exelon) (상표명) 또는 레보도파(Levodopa) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 소염제와 병용하여 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 2종의 작용제가 동시에 투여되거나 이들 작용제가 동시에 작용하게 되는 방식으로 따로 투여되는 경우를 이들 2종의 작용제가 배합물로 투여된다고 일컫는다.

정신의학적 상태, 특히 정신분열증 또는 우울증의 치료를 위해서, 본 발명의 결합 분자는 단독으로 제공될 수도 있고 또는 특히 (a) 바르비투레이트 및 그의 유도체, 벤조디아제핀, 카르복스아미드, 히단토인, 숙신이미드, 발프로산 및 기타 지방산 유도체 및 기타 항-간질 약물로부터 선택된 항-간질 약물, (b) 통상의 항-정신병제, (c) 비전형적인 항-정신병제 및 (d) 항-우울제로 구성된 군에서 선택된 다른 작용제와의 배합물로 투여될 수도 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "바르비투레이트 및 그의 유도체"로는 페노바르비탈 및 프리미돈 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벤조디아제핀"으로는 클로나제팜, 디아제팜 및 로라제팜 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "카르복스아미드"로는 카르밤아제핀, 옥스카르브아제핀 및 10-히드록시-10,11-디히드로카르밤아제핀 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "히단토인"으로는 페니토인 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "숙신이미드"로는 에토숙스이미드 및 메숙스이미드 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "발프로산 및 기타 지방산 유도체"로는 발프로산 나트륨 염, 티아가빈 히드로클로라이드 일수화물 및 비그라바트린 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "기타 항-간질 약물"로는 레베티라세탐, 라모트리긴, 가바펜틴 및 펠바메이트 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "통상의 항-정신병제"로는 할로페리돌 및 플루페나진 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "비전형적인 항-정신병제"는 클로자릴, 리스페리돈, 올란자핀, 퀘티아핀, 지프라시돈 및 아리피프라졸 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항-우울제"로는 선택적 세로토닌 재흡수 억제제 (SSRI), 또는 선택적 세로토닌 및 노르에피네프린 재흡수 억제제 (SNRI) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 적합한 SSRI는 플루옥세틴, 푸브옥스아민, 세르트랄린, 파록세틴, 시탈로프람 및 에시탈로프람으로부터 선택될 수 있다.

코드 번호, 일반명 또는 상표명으로 나타낸 활성 성분의 구조는 표준 일람표인 문헌 ["The Merck Index"]의 최신판 또는 데이타베이스 (예를 들어 페이턴츠 인터내셔널(Patents International) (예컨대 IMS World Publications)로부터 알아낼 수 있다. 이들의 상응하는 내용은 본원에 참고로 도입된다. 임의의 당업자는 상기 활성 성분을 충분히 확인할 수 있을 것이고, 이들 참고문헌을 토대로 하여 유사하게 제작하고 표준 시험 모델에서 제약적 징후 및 성질을 시험관내 및 생체내 둘다에서 시험할 수 있다.

상기에서 언급한 증상에 대한 적절한 투여량은, 물론 사용될 본 발명의 특정 분자, 투여 방식 및 치료받을 상태의 특성 및 중증도 등에 따라 달라질 것이다. 편리하게는, 본 발명의 결합 분자를 병변 부위에 치료제로서 펌프로 투여하거나 주사하며, 예를 들어 병변 부위에서 CNS에 두개내로 또는 척추에 초내로 직접 투여할 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 통상의 방식으로 제작될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 분자를 포함하는 본 발명에 따른 조성물은 바람직하게는 동결건조 형태로 제공된다. 투여 직전에, 이것을 적합한 수성 담체, 예를 들어 주사용 멸균수 또는 멸균된 완충 생리 염수 중에 용해시킨다.

적합한 조성물의 구성을 보조하기 위해서, 본 발명의 결합 분자 및 본 발명의 결합 분자의 효과를 증진시키는 임의의 제2 약물은 혼합 투여 또는 동시 투여에 관한 지침서와 함께 동일 용기 내에 따로 포장될 수 있다. 임의의 제2 약물 후보물질은 상기에 기재하였다.

본 발명의 결합 분자와 NGF 등의 성장 인자 배합의 상승 효과는 상기한 척수 상해 모델로 생체내 입증될 수 있다.

도 1: 서열 비교 - 상이한 종의 NiG의 서열 비교로서, 11C7 mAb에 대한 면역원성 펩티드 서열을 나타낸다.

하기하는 실시예를 참조하면 본 발명이 더욱 완전하게 이해될 것이다. 그러나, 이들 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

하기 실시예에서, 모든 온도는 섭씨 온도(℃)이다.

하기 실시예에서 고려되는 모노클로날 항체는 경쇄 가변부 (서열 3) 및 중쇄 가변부 (서열 2)를 포함하는 본 발명에 따른 결합 분자이다.

다음과 같은 약어들을 사용하였다:

ELISA: 효소 연결 면역흡착 검정법

FACS: 형광 활성화 세포 분류법

FITC: 플루오레세인 이소티오시아네이트

FBS: 소 태아 혈청

HCMV: 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터

IgG: 이뮤노글로불린 이소형 G

MAb: 모노클로날 항체

PBS: 인산염 완충 염수

PCR: 중합효소 연쇄 반응.

실시예 1: NiG-D20 (서열 24)은 NogoA의 신경돌기 증식 억제 단편의 하나임

방법:

a) 래트 NogoA 결실 라이브러리: 내부 제한 부위를 사용하여, 엑소뉴클레아제 III/녹두(Mung Bean) 뉴클레아제 처리, 및 래트 Nogo-(WO 00/31235에서와 같은 방법): 래트 NogoA (aa 1-1163; 이하에 나타낸 DNA는 래트 NogoA (서열 26)의 아미노산에 대한 것이며, 예를 들어 aa 1-1163은 cDNA 구조물이 NogoA의 래트 폴리펩티드 서열 아미노산 1에서 출발하여 아미노산 1163에서 종결되는 폴리펩티드를 코딩함을 의미함), 래트 Nogo-B (aa 1-172 + 976-1163), 래트 Nogo-C (Nogo-C N-말단의 11 aa + aa 976-1163), 래트 Nogo-66 (aa 1019-1083), 래트 GST-Nogo-66 (aa 1026-1091), 래트 NiR-G (aa 1-979), 래트 NiR (1-172), 래트 NiR-D1 (aa 1-31), 래트 NiR-D2 (aa 59-172), 래트 NiR-D3 (aa 1-31 + 59-172), 래트 EST-Nogo1 (aa 762-1163), 래트 NiG (aa 174-979), 래트 NiG-D1 (aa 174-909), 래트 NiG-D2 (aa 174-865), 래트 NiG-D3 (aa 172-723), 래트 NiG-D4 (aa 172-646), 래트 NiG-D5 (aa 293-647), 래트 NiG-D6 (aa 763-975), 래트 NiG-D7 (aa 174-235 + 294-979), 래트 NiG-D8 (aa 218-653), 래트 NiG-D9 (aa 172-259 + 646-974), 래트 NiG-D10 (aa 293-979), 래트 NiG-D11 (aa 209-268), 래트 NiG-D12 (aa 198-233), 래트 NiG-D13 (aa 174-216), 래트 NiG-D14 (aa 174-260), 래트 NiG-D15 (aa 174-190 + 493-979), 래트 NiG-D16 (aa 174-190 + 621-979), 래트 NiG-D17 (aa 174-190 + 259-979), 래트 NiG-D18 (aa 174-190 + 263-979), 래트 NiG-D19 (aa 763-865), 래트 NiG-D20 (aa 544-725), 래트 NiG-D21 (aa 812-918), 래트 NiG-D22 (aa 866-975), 래트 NiG-D23 (aa 914-975), 래트 NiG-D24 (aa 544-685), 래트 NiG-D25 (aa 614-725), 래트 NiG-D26 (aa 544-613), 래트NiG-D27 (aa 581-648), 래트 NiG-D28 (aa 614-685), 래 트 NiG-D29 (aa 648-725), 래트 NiG-D30 (aa 682-725), 래트 NiG-D31 (aa 544-580), 래트 NiG-D32 (aa 581-613), 래트 NiG-D33 (aa 614-648), 래트 NiG-D34 (aa 648-685), 래트 NiG-D35 (aa 260-556), 래트 NiG-D36 (aa 260-415)에 대한 래트 NogoA-특이적 프라이머를 사용한 PCR로 결실 구조물을 제조하였다. NiR-G 및 NiR-a는 제한 효소 소화에 의해 NogoA-pET28로부터 유래되었다. NiG는 제한 소화 및 녹두 뉴클레아제 처리에 의해 NiR-G로부터 유래되었다. NiG-D1, -D3, -D4, -D5, -D7, -D8, -D9, -D10은 제한 효소 소화에 의해 NiG-pET28로부터 유래되었다. NiG-D15, -D16, -D17, -D18은 엑소뉴클레아제 III 소화에 의해 NiG-pET28로부터 유래되었다. NiR-b, NiR-D1, -D2, -D3은 주형으로 NiR-a-pET28을 사용한 PCR에 의해 유래되었다. NiG-D2, -D6, -D11, -D12, -D13, -D14, -D19, -D20, -D21, -D22, -D23, -D24, -D25, -D26, -D27, -D28, -D29, -D30, -D31, -D32, -D33, -D34, -D35, -D36은 주형으로 NiG-pET28을 사용한 PCR에 의해 유래되었다. 모든 구조물을 pET28에 서브클로닝하였다. pET28은 상기 언급된 모든 구조물에 대해 사용되었다. pGEX-6P는 래트 NiG의 원형질막주변공간(periplasmic) 발현을 위한 GST-Nogo66 및 pET26에 대해 사용되었다. 이어서, 인간 GST-Nogo-66 (인간 NogoA의 aa 1055-1120)은 주형으로서 인간 NogoA DNA (서열 4)에 대한 PCR에 의해 클로닝되었다. 이어서, 결실 구조물을 pET28 벡터 (노바젠(Novagen)), pGEX-6P (아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech)) 및 pET26 벡터 (노바젠)에 클로닝하였다. 인간 GST-Nogo-66은 문헌 [GrandPre et al. (상기 문헌)]에 공개된 GST-nogo 단백질에 상응하였다. 합성 래트 펩티드 4 EELVQKYSNSALGHVNSTIKELRRL (서열 27)은 인간 펩 티드 4에 상응하였다 (인간 펩티드 4는 Nogo-66 도메인의 억제성 영역인 것으로 밝혀졌다 [GrandPre et al., 2000]). 오르토로거스 래트 펩티드는 단일 미스매치(mismatch) C -> S를 가졌다 (문헌 [GrandPre et al., 2000, 상기 문헌]의 펩티드 4 서열 참조). 합성 Pro/Ser-풍부 펩티드 PSSPPPSSPPPSSPPPS (서열 28) 뿐만 아니라 래트 펩티드 4를 제조하여 프림(Primm) SA로 HPLC-정제하였다. 인간 NogoA_623-640 (서열 6)은 리서치 제네틱스 인크(Research Genetics Inc)가 합성 및 정제하였다.

b) 인간 NogoA 발현 구조물 (pRK7-hNogoA)의 생성: 람다 gt10 (클론테크( Clontech))에서 구축된 인간 cDNA 라이브러리를, 표준 절차를 사용한 2벌의 필터 세트로 스크리닝하였다. 표준 프로토콜을 사용한 PCR로 인간의 온전한 뇌 cDNA (클론테크)로부터 인간 NogoA의 단편을 증폭시킨 후에 이를 pBluescript에 클로닝하여 소화 및 단리하거나 또는 스크리닝 프로브로서 직접 사용하였다. 400 bp XhoI/SmaI 단편을 5' 프로브로 사용하고, 3' 프로브를 프라이머 CA-NA-2F: 5'-AAG CAC CAT TGA ATT CTG CAG TTC C-3' (서열 29) 및 CA-NA-3R: 5'-AAC TGC AGT ACT GAG CTC CTC CAT CTG C-3' (서열 30)로 증폭시켰다. 양성 클론을 단리하여 서브클로닝하고 서열을 확인하였다. 전장 인간 NogoA cDNA를 수득하기 위해, 인간 NogoA 서열 내의 유일한 EcoRI 제한 부위를 이용하여 중복 클론을 조립하고, 프브스노고아(Pbsnogoa)로 명명된 Bluescript 벡터에 서브클로닝하였다. pRK7-hNogo-A를 수득하기 위해서, 전장 cDNA를 방향성 클로닝으로 진핵 발현 벡터 pRK-7에 삽입하였다.

c) 박테리아 생산을 위한 인간 NiG (hNiG) 발현 플라스미드 (pET28a-hNiG)의 생성: 정방향 5'-GTC GCG GAT CCA TGG AGA CCC TTT TTG CTC TTC-3' (서열 31); 역방향 5'-GTT CTC GAG TTA TGA AGT TTT ACT CAG-3' (서열 32)의 프라이머 세트를 사용하여 박테리아 발현을 위한 N-말단 His-태그 및 T7-태그를 갖는 프레임내(in frame)에서 프브스노고아로부터의 각 코딩 영역을 PCR 증폭한 후에 hNiG 코딩 DNA 단편을 pET28a (노바젠)의 BamHI/XhoI에 서브클로닝하였다. 최종 플라스미드를 pET28a-hNiG라 명명하였다. 이어서, 1 mM 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드 (IPGT)로 유도하여 대장균(Escherichia coli, E. coli) BL21 pRP에서 hNiG를 발현시켰다.

d) 마우스 NiG-엑손3 (mNiG-엑손3) 발현 플라스미드의 생성: 정방향 5'-GTG CGG ATC CAT GGA TTT GAA GGA GCA GC-3' (서열 33); 역방향 5'-GTT TCT CGA GTG AAG TTT TAT TCA GCT C-3' (서열 34)의 프라이머를 사용하여 마우스 게놈 BAC 주형으로부터 마우스 엑손 3을 코딩하는 영역을 증폭시키고, pET28a의 BamHI/XhoI 클로닝 부위에 서브클로닝하였다. 최종 플라스미드 구조물을 pET28a-mNiG-엑손3이라 명명하였다.

원숭이 NiG의 클로닝: 폴리A RNA를 동결된 원숭이 뇌 조직으로부터 단리하고, 올리고 dT 프라이머를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 서열-특이적 프라이머 및 프루프-리딩(proof-reading) 효소를 사용한 PCR로 cDNA의 5' 및 3' 영역을 포함하는 2개의 중복 단편을 증폭시켰다. 인간 NiG cDNA의 공지된 서열을 사용하여 프라이머를 고안하였다. 5' 단편을 증폭시키기 위한 프라이머는 5'- TCCACCCCGGCCGCGCCCAA-3' (서열 35) 및 5'-AATGATGGGCAAAGCTGTGCTG-3' (서열 36)이었고, 3' 단편을 증폭시키기 위한 프라이머는 5'-GGTACAAAGATTGCTTATGAAACA-3' (서열 37) 및 5'-AGCAGGGCCAAGGCAATGTAGG-3' (서열 38)이었다. 이어서, 상기 2개의 단편을 서브클로닝하고, 각 단편마다 4개 이상의 독립적인 클론을 서열분석하였다. 상기 언급된 프라이머를 사용한 중복 PCR로 전장 cDNA를 조립하고, 생성된 산물을 다시 클로닝하여 서열분석하였다.

e) 상기 정의된 바와 같은 재조합 NogoNiG 단백질 및 NogoA-결실 라이브러리의 생성: 박테리아 NogoA-결실 라이브러리를 대장균에서 발현시켰다. 0.75 mg/mL 리소짐을 함유하는 초음파분해 완충액 (20 mM 트리스, 50 mM NaH₂PO₄, 100 mM NaCl, pH 8.0) 중에서의 반복적 초음파분해 또는 B-Per (상표명) (피어스(Pierce)) 또는 8 M 우레아를 사용한 가용화를 통해 단백질을 추출하였다. pelB-리더가 부착되어 발현된 NiG를 원형질막주변공간 단백질 정제를 위한 노바젠 프로토콜에 따라 원형질막주변공간으로부터 수득하였다. Co²⁺-탈론(Co²⁺-Talon) (상표명) 금속 친화도 수지(클론테크)를 배치(batch) 절차로 사용하여 pET28-구조물의 상등액을 정제하였다. 수지-배치 절차 동안에는 상기 완충액을 초음파분해 완충액으로 점차 교체하여 8 M 우레아 및 B-Per (상표명) 가용화된 용해물을 비-변성 조건으로 만들었다. 중력 컬럼 (바이오래드(BioRad))상에서 초음파분해 완충액 중의 250 mM 이미다졸로 단백질을 용출시켰다. 슈퍼덱스(Superdex) 200 하이로드(HiLoad) 16/60상의 겔 여과에 의해 NiG 단백질을 추가로 정제하였다. G-세파로스 컬럼을 제조사 (아머샴 파마시아(Amersham Pharmacia))의 지침에 따른 배치 절차로 사용하여 pGEX-6P 구조물의 상등액을 정제하였다. 가용화된 GST-Nogo-66을 프리시젼(PreScission) 프로테아제와 함께 인큐베이션하여 GST-Nogo-66의 절단을 수행한 후에 HPLC 정제를 수행하였다. IMAC-정제된 재조합 Nogo의 정제확인용 SDS-PAGE를 실시하고 바이오래드 엘렉트로-일루터(BioRad Electro-Eluter)를 사용하여 250 mA에서 1시간 동안 50 mM 트리스, pH 7.4, 100 mM NaCl, 0.2％ (w/v) CHAPS로 용출시킨 후에 반전된 전극 극성을 30초 동안 인가하여 겔 전기용출을 수행하였다. 피어스 쿠마시에(Pierce Coomassie) 염색을 실시하고 표준 단백질로서 BSA를 사용하여 크로마토그래피-정제된 단백질의 단백질 농도를 측정하였다. 표준물로 BSA를 사용하여 은-염색된 겔의 밴드 강도를 기준으로 겔 용출된 단백질의 단백질 농도를 평가하였다 [Merril CR, Dunau ML, Goldman D (1981) A rapid sensitive silver stain for polypeptides in polyacrylamide gels. Analyt. Biochem. 110:201-207].

f) CHO 세포내 재조합 NogoA 단편의 제조: 래트 NogoA cDNA의 부분적 HincII 소화로 생성된 3119 bp 단편인 NiR-G를 pSecTag2 발현 벡터 (네덜란드 그로닝겐에 소재하는 인비트로젠)에 클로닝하였다. pNiR-G를 CHO 세포내 형질감염시켜서 NiR-G를 세포내 세포질에서 발현시켰다. 250 ㎍/mL 제오신(Zeocin) (인비트로젠)을 사용하여 안정한 NiR-G CHO 세포주를 선별하였다. 세포 용해물로부터의 재조합 NiR-G를 Ni²⁺-NTA 컬럼 (스위스 바젤에 소재하는 퀴아젠 아게(Qiagen AG))상에서 정제하였다. PCR에 의해 래트 NiG-D20 및 Nogo-66을 pAPtag5 벡터에 클로닝하였다. pNiG-D20-AP를 CHO 세포에 형질감염시킴으로써 배양 상등액으로 분비된 NiG-δ20-AP를 생성시켰다. 250 ㎍/mL 제오신 (인비트로젠)을 사용하여 안정한 pNiG-D20-AP 및 pNogo-66-AP 세포주를 선별하였다. 이들 두 세포주 모두를 혈청-무함유 배지 (기브코(Gibco)) 조건에 적응시키고, 세포주 챔버 (인테그라(Integra))에서 배양하였다. 상등액을 사용 전에 10배 농축하고, 문헌 [Flanagan JG, Leder P (1990) The kit ligand: a cell surface molecule altered in steel mutant fibroblasts. Cell 63:185-194]에 기재된 바와 같이 융합 단백질의 농도를 평가하였다.

g) 3T3 섬유아세포 및 CHO 확산성장(spreading) 검정법: 3T3 확산성장 검정법을 선행 문헌 [Spillmann AA, Bandtlow CE, Lottspeich F, Keller F, Schwab ME (1998) Identification and characterization of a bovine neurite growth inhibitor (bNI-220). J. Biol. Chem. 273:19283-19293]에 기술된 바와 같이 수행하였다. CHO 확산성장 검정법은 3T3 섬유아세포에 대한 것과 본질적으로 동일한 방식으로 수행하였다. 간략하게 말하자면, CHO 세포를 1:2로 나누었다. 24시간 후에 이들을 PBS-EDTA 중에서 30초 동안 트립신처리하고, 약 8,000개의 CHO 세포를 5, 1, 0.5 및 0.2 ㎍/웰 NiG 또는 Nogo-66으로 예비코팅된 배양 디쉬에 플레이팅하였다. 30 내지 45분 후에 세포를 4％ (w/v) PFA, 5％ (w/v) 수크로스로 고정시킨 다음, 문헌 [Spillmann et al, 상기 문헌]에 기재된 바와 같이 분석하였다. 광 현미경을 사용하여 웰 당 약 100개의 세포를 계수하였다; 확산성장된 세포의 기준 - (a) 디쉬로의 부착 및 (b) 라멜리포디아(lamellipodia)로 나타난 퍼진 형태. 광 현미경하에서 세포는 확산성장되지 않은 원형 세포보다 더 어둡고 크게 보였다. (a) 디쉬에 부착되지 않거나 또는 (b) 디쉬에 부착되지만 작고 둥근모양이며 디쉬상에 돌기돌출된 검출가능한 라멜리포디아가 없는 세포는 확산성장되지 않은 세포로 간주하였다. 확산성장된 세포와 확산성장되지 않은 세포 사이의 비율은 기질(substratum)의 비허용 정도를 규정한다.

h) PC12 신경돌기 증식 검정법: PC12 신경돌기 증식 검정법을 선행 문헌 [Rubin BP, Spillmann AA, Bandtlow CE, Keller F, Schwab ME (1995) Inhibition of PC-12 cell attachment and neurite outgrowth by detergent solubilized CNS myelin proteins. Europ. J. Neurosci. 7:2524-2529]에 기술된 바와 같이 수행하였다. DMEM, 5％ 송아지 태아 혈청, 10％ 말 혈청, 100 U/mL 페니실린 및 0.5 mg/mL 스트렙토마이신 (기브코-BRL로부터 구입한 펜-스트렙(Pen-Strep))에 50 내지 100 ng/mL NGF (미국 인디애나폴리스에 소재하는 할란 바이오프로덕츠(Harlan Bioproducts))를 첨가하여 PC12 세포 (PC12 세포 클론은 미국 뉴욕에 소재하는 몬세스 챠오(Moses Chao)로부터 구입한 라미닌과 독립적으로 성장할 수 있음)를 2일 동안 프라이밍(priming)하였다. PC12 세포를 기계적으로 떼어내고, HBSS (기브코) 중 0.05％ 트립신 (시그마)으로 5분 동안 트립신처리하고, 100 ng/mL NGF를 함유하는 배양 배지 중에서 3,000개 내지 5,000개 세포/cm²의 밀도로 플레이팅하였다. 24시간 후에 PBS (pH 8) 중 4％ (w/v) PFA, 5％ (w/v) 수크로스를 가하여 검정을 중단하였다. PC12 세포의 경우에는 3T3 세포와 동일한 방법으로 세포 배양 디쉬를 코팅하였다.

i) 망막 신경절 세포 스트라이프(stripe) 검정법: 망막 신경절 세포 스트라이프 검정법을 문헌 [Vielmetter J, Stolze B, Bonhoeffer F, Stuermer CA (1990) In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Exp. Brain Res. 81:283-287]의 방법을 변형 (문헌 [Schmalfeldt M, Bandtlow CE, Dours-Zimmermann MT, Winterhalter KH, Zimmermann DR (2000) Brain derived versican V2 is a potent inhibitor of axonal growth. J. Cell Sci. 113:807-816] 참조)시켜 수행하였다. 체외이식편(explant)을 실온에서 10분 동안 PBS 중의 4％ (w/v) PFA, 0.1％ (v/v) 글루타르알데히드로 고정시킨 후에 평가하였다. 면역염색을 위해서, 고정된 체외이식편을 실온에서 1시간 동안 RNO-차단 용액 (PBS 중 0.5％ (w/v) BSA, 0.3％ (w/v) 탑블록(TopBlock) (쥬로 서플라이(Juro Supply)), 0.1％ (w/v) NaN₃)으로 차단하고, RNO-차단 용액 중의 0.05％ (v/v) Tx-100으로 10분 동안 투과화하고, -20℃에서 1분 동안 동결시키고, 1차 항체 (NiR의 경우에는 AS 비안카(Bianca); NogoA, NiR-G, NiG, NiG-D3 및 NiG-D20의 경우에는 AS 로라(Laura); Nogo-C 및 베타-Gal 대조군 단백질의 경우에는 노바젠 mAb 항-T7)와 함께 인큐베이션하였다. PBS를 사용하여 세척한 후, FITC- 및 TRITC (FITC: 플루오레세인-이소티오시아네이트; TRITC: 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트)-접합된 항체 (잭슨 이뮤노리서치 래버러토리즈(Jackson ImmunoResearch Laboratories))를 체외이식편에 가하였다 (1:150). 샘플을 50％ (v/v) 글리세롤, 25 mM NaHCO₃, 40 mM NaCl, 1％ (w/v) p-페닐렌디아민 (시그마) 중에 두고 커버슬립 을 덮었다.

결과:

a) NogoA의 N-말단부의 두 영역은 3T3 섬유아세포의 확산성장에 대해 억제성임: NogoA에서 3T3 섬유아세포의 확산성장 억제를 담당하는 영역을 확인하기 위해서, 50 Nogo 결실 구조물의 라이브러리를 제조하여 박테리아에서 재조합 단백질을 발현시켰다 (방법 1a 참조). 3T3 섬유아세포 확산성장의 억제에 대한 겉보기 EC₅₀은 배양 디쉬 1 cm² 당 밤새 코팅된 0.1 mL NogoA 당 대략 400 내지 500 ng이었다 (약 4 pmol/cm²). NogoA 또는 그의 단편은 8 M 우레아 처리시에 억제 활성이 크게 감소되었는데, 이는 형태가 중요함을 지시한다. 섬유아세포 확산성장 검정법에서의 Nogo 단편 분석으로, NogoA 단백질에서 적어도 NiR-D2 (aa 59-172) 및 NiG-D20 (aa 544-725)의 2개 스트레치(stretch)가 새로 플레이팅된 섬유아세포의 확산성장 억제를 매개한다는 것이 밝혀졌다. 억제 활성을 나타내는 NiG-영역으로부터 유래된 모든 단편 (예컨대 NiG-D4 및 NiG-D8)은 NiG-D20과 부분적으로 중복되는 것이었다. NiG-D6 영역 내의 NiG-D19에 대한 단백질 농도가 높을 때는 약간의 억제 활성이 나타났다. Nogo-C, Nogo-66 및 래트 펩티드 4 (문헌 [GrandPre et al., 2000]에 의해 Nogo-66의 억제성 영역인 것으로 나타남)는 섬유아세포 확산성장에 대해 억제성이 아니었다. 이러한 데이타는 3T3 섬유아세포상의 NogoA의 항-확산성장 활성이 상기 단백질의 N-말단에 위치하는 스트레치 (NiR-D2) 및 NogoA-특이적 부분 내의 스트레치 (NiG-D20)의 2개의 한정된 스트레치에 존재한다는 것을 나타낸다. 비-특이적 물리화학적 성질 (단편의 산성도, 프롤린 및 세린 잔기로 인한 구조적 영향)은 이러한 효과를 담당하지 않는다. C-말단의 RTN 도메인은 섬유아세포 확산성장의 억제에 관여하지 않는다.

b) NogoA의 NiG-D20 영역은 신경돌기 증식에 대해 억제성임: 세포 확산성장에 대해 비허용성인 NogoA의 단편이 신경돌기 증식에 대해서도 억제성인지 여부를 결정하기 위해, 일련의 박테리아 생성 NogoA 단편 뿐만 아니라 진핵세포 생성 NogoA-P 키메라를 여러가지 신경 검정법으로 시험하였다. 스트라이프 검정법 (방법 1)에서, 신경돌기는 라미닌/NogoA 코팅된 스트라이프를 피하여 라미닌-단독의 스트라이프상에서 성장하지만, 라미닌/베타-갈락토시다제로 코팅된 스트라이프는 피하지 않았다. 전장 NogoA는 망막 신경절 세포 (RGC) 신경돌기 증식에 대해 크게 비허용성이지만 N-말단부 (NiR)는 단지 최저의 효과만을 나타냈다. Nogo-C 활성은 대조군 단백질 베타-갈락토시다제와 구별되지 않았다. NogoA-특이적 영역인 NiG-D20은 RGC 신경돌기 증식에 대한 비허용 활성을 담당하는 주요 영역을 함유하며, 성장 원추는 NiG-D20-코팅된 스트라이프를 만날 때 정지하는 것으로 보인다. 비허용 효과는 농도 의존적이었다. 더 낮은 NogoA 농도에서는 교차하는 섬유의 수가 증가하였다. NogoA 영역에 대한 반응성에 관하여는 네이잘(nasal) 및 템포랄(temporal) RGC 신경돌기 사이에 명백한 차이는 관찰되지 않았다. PC12 세포의 라미닌-독립적 NGF-반응성 클론을 50 ng/mL NGF로 24시간 동안 프라이밍한 후에 박테리아 생성된 Nogo 단편을 0.1 내지 3 ㎍/cm²로 코팅한 디쉬상에 플레이팅하였다. 1 일 후에 신경돌기 증식을 스코어링(scoring)하였다. NogoA-특이적 영역 (NiG) 및 그의 단편 NiG-δ20은 PC12 신경돌기 증식을 강력하게 억제하였다. 반대로, N-말단 단편 NiR은 단백질 농도가 높을 경우에만 검출가능한 약한 활성을 가질 뿐이었다. Nogo-C 및 Nogo-66은 불활성이었다.

실시예 2: 3T3 섬유아세포 및 래트 피질 뇌 막에서 NiR-G 및 NiG-D20에 대한 결합 부위(들)의 존재:

방법:

a) 방사능 표지 및 결합 실험: IMAC-정제된 NiG-D20을, 락토퍼옥시다제를 사용하여 ANAWA 트레이딩(Trading) SA (스위스에 소재하는 반젠(Wangen)) (2,030 Ci/mmol)로 요오드화하고 역상 HPLC로 정제하였다. 래트 뇌 피질로부터의 막을 문헌 [Olpe HR, Karlsson G, Pozza MF, Brugger F, Steinmann M, Van Riezen H, Fagg G, Hall RG, Froestl W, Bittiger H (1990) CGP 35348: a centrally active blocker of GABAB receptors. Eur. J. Pharmacol. 187:27-38]에 기술된 바와 같이 프렙(preparation)하였다. 비-특이적 결합을 감소시키기 위해 1％ (w/v) 소 혈청 알부민과 함께 2시간 동안 예비인큐베이션한 1.5 mL 튜브를 사용하여 본질적으로 문헌 [Kaupmann K, Huggel K, Heid J, Flor PJ, Bischoff S, Mickel SJ, McMaster G, Angst C, Bittiger H, Froestl W, Bettler B (1997) Expression cloning of GABA (B) receptors uncovers similarity to metabotropic glutamate receptors. Nature 386:239-246]에 기술된 바와 같이 실온에서 1시간 동안 결합을 수행하였다. 프로테아제 억제제 (독일 만하임에 소재하는 로쉐 디아그노틱스(Roche Diagnostics))를 함유하는 HEPES 완충액 (pH 7.4) (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.6 mM MgCl₂, 1.8 mM CaCl₂, 20 mM HEPES, 6 mM 덱스트로스) 중의 막 균질물을 표지되지 않은 NiG-D20 없이 또는 표지되지 않은 NiG-D20의 농도를 증가시키면서 1.3 nM 요오드화된 NiG-D20과 함께 인큐베이션하였다.

b) 유동세포계측법: 유동세포계측법 및 세포 분류법을 사이토메이션(Cytomation) MoFlo 고속 세포 분류기 (미국 콜로라도에 소재하는 포트 콜린스(Fort Collins))에서 수행하였다. 유동세포계측기에는 130 mW의 전력을 사용하며 488 nm로 조정된 아르곤-이온/UV 엔터프라이즈(Enterprise) II 레이저가 장착되었다. 530/40 nm 밴드패스 필터를 통해 플루오레세인 (FITC)을 수집하였다. 분석을 위해, 세포 해리 완충액 (기브코)으로 3T3 섬유아세포를 떼어냈다. NiR-G와 3T3 섬유아세포의 결합을 검출하는데 사용된 예비-형성된 복합체는 다음과 같이 제조하였다: NiR-G 및 항-Myc 항체 (9E10)를 1:1의 몰비로 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, FITC 접합된 F(ab)₂ 염소 항-마우스 IgG를 첨가하고, 4℃에서 추가로 30분 동안 인큐베이션하였다. 생성된 삼량 복합체의 몰비는 1:1:0.5이었다. 상기 복합체를 0.1 mL의 최종 부피로 1×10⁶개의 3T3 섬유아세포에 첨가하고, 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션하여 유동세포계측법으로 분석하였다.

결과:

3T3 섬유아세포 및 래트 피질 뇌 막에서 NogoA-특이적 활성 단편에 대한 결합 부위(들)의 존재: NogoA의 NiR-D2 및 NiG-D20 영역은 Nogo-66의 부재에도 불구 하고 세포의 확산성장 및 신경돌기 증식에 대해 억제성이었고, NgR와의 무관성으로 인해 별도의 NogoA-특이적 수용체의 존재가 가정되어야 한다. 따라서, 살아있는 3T3 섬유아세포에 대하여 다량체화되고 myc-태그가 부착되어 있으며 IMAC-정제된 NiR-G에 대하여 결합 연구를 수행하였고, 이것은 유동세포계측법으로 분석된다. 3T3 세포의 90％ 초과의 형광 이동으로 나타난 바와 같이 Ab-복합체화된 NiR-G는 3T3 세포에 효율적으로 결합하였다. 반대로, 3T3 세포는 FITC-접합된 2차 F(ab)₂ 염소 항-마우스 IgG와 복합체화된 9E10 1차 마우스 항-myc mAb와의 인큐베이션 후에 표지되지 않았으며, 2차 Ab 단독과의 인큐베이션 후에도 표지되지 않았다. NiG-D20과 래트 피질 막의 결합을 시험하기 위해, 방사성리간드 결합 검정법에 [¹²⁵I]-표지된 NiG-D20을 사용하였다. 1.3 nM의 [¹²⁵I]-NiG-D20 농도에서, 표지되지 않은 NiG-D20에 의한 방사성리간드 결합의 농도-의존적 경쟁으로 나타나는 바와 같이 뇌 막에 특이적 NiG-D20 결합 부위가 존재한다는 증거가 발견되었다. 이들 결과는 NogoA의 아미노말단 단편이 3T3 세포 및 래트 피질 막의 표면에 결합할 수 있음을 나타내며, 이는 막-결합된 NogoA-특이적 결합 부위 또는 수용체(들)이 존재함을 입증한다.

실시예 3: 마우스 11C7-IgG1의 생성

NiG-D20의 특정 에피토프에 상응하는 합성 펩티드 SYDSIKLEPENPPPYEEA (= 래트 NogoA_623-640; 서열 1)로 마우스 (C3H- 및 C57BI6/J-종)를 피하 면역화하였다. 상기 에피토프는 인간, 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이 및 마우스 NiG-D20 NogoA- 특이적 영역에서 고도로 보존되어 있으며, 인간 NogoA 아미노산 서열 (서열 5)의 아미노산 623에서 출발하여 아미노산 640에서 종결된다 (또한, 도 1의 서열 정렬 참조).

래트 NogoA_623-640과 캐리어 단백질 키홀 림펫 혈구응집소 (KLH; Key hole Limped Hemagglutinin)의 융합물로 면역화된 마우스로부터 mAb 11C7을 수득하였다. 모노클로날 항체를 래트 NogoA_623-640-KLH, 래트 NogoA_623-640 유리 펩티드 및 비관련 펩티드-KLH에 대해 ELISA로 스크리닝하였다. 추가의 스크리닝에서, mAb를 NiR-G 대 b-갈락토시다제 (이들 둘 다는 his-태그가 부착된 단백질로서 발현됨)에 대하여 ELISA로 시험하였고 금속 친화도 크로마토그래피로 정제하였다. 이어서, mAb를 희돌기아교세포 및 뇌 용해물 (래트 기원)의 웨스턴 블롯으로 NogoA의 인식에 대하여 시험하였다. 래트 NogoA-형질감염된 CHO 세포 또는 COS 세포의 면역세포화학에서의 단백질 인식 및 래트 희돌기아교세포 (투과화된 세포)의 내인성 NogoA의 인식에 대하여 항체를 시험하였다. 또한, 이들을 살아있는 래트 희돌기아교세포에 대한 표면 결합에 대하여 시험하였다. 종 교차반응성은, 래트, 마우스, 인간 및 소 기원의 재조합 NiG에 대해서는 ELISA로 시험하고, 내인성 래트, 마우스, 인간 및 원숭이 NogoA에 대해서는 조직 또는 세포 추출물의 웨스턴 블럿으로 시험하였다.

웨스턴 블럿 분석: SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿팅을 문헌 [Huber AB, Weinmann O, Brosamle C, Oertle T, Schwab ME (2002) Patterns of Nogo mRNA and protein expression in the developing and adult rat and after CNS lesions. J. Neurosci. 22:3553-3567]에 기술된 바와 같이 수행하였고, 차단은 3％ (w/v) 탑 블록(Top Block) (스위스 루세르네에 소재하는 쥬로 서플라이)으로 수행하였다. 항체를 정제된 모노클로날 11C7 또는 하이브리도마 상등액 1:150로 희석하였다. 2차 항체는 HRP-접합된 항-마우스였다 (피어스; 1:5,000, 1:50,000). 11C7 항체와의 혼성화를 4℃에서 밤새 수행하였다. 검출에는 아머샴 파마시아의 ECL 검출 시약을 사용하였다.

결과:

11C7 mAb는 희돌기아교세포 세포 배양 균질물의 웨스턴 블럿상에서 190 kD NogoA 밴드를 확인시켜 준다. 또한, 11C7은 웨스턴 블럿에서 인간 NiG, 시노몰구스 NiG 세포 용해물 및 래트 NiG-D20을 확인시켜 준다. 11C7 mAb는 IgG1 이소형 (로쉐, 이소스트립 키트(IsoStrip Kit))으로 특징규명되었다.

실시예 4: 마우스11C7 mAb의 특징규명

면역세포화학: 시신경 희돌기아교세포를 문헌 [Schwab, Caroni, 1988, Neuron]에 기술된 바와 같이 프렙하였다. 폴리-L-리신으로 코팅된 커버슬립상에서 3일 내지 5일 배양된 배양물을 PBS로 2회 세척하고, 실온에서 15분 동안 PBS 중의 4％ (w/v) 파라포름알데히드 (PFA), 5％ (w/v) 수크로스 중에 고정시키고, 10％ (v/v) FCS로 비-특이적 결합을 차단하였다. 이어서, 세포를 마우스 11C7과 함께 (1:100) 인큐베이션하였다. 2차 항체는 염소-항-마우스 TRITC이었다 (잭슨 이뮤노리서치 래버러토리즈). 세포 표면 염색을 위해서, 2일 된 래트 시신경 배양물을 실온에서 25분 동안 배지 중의 모노클로날 항체와 함께 인큐베이션하였다. 알칼리 성 포스파타제로 접합된 2차 항체 (로잔에 소재하는 밀란 어낼러틱(Milan Analytic))를 1％ (w/v) 차단 시약을 함유하는 0.1 M 말산 중에서 1:7,500으로 사용하였다 (1시간). 배양물을 말산 완충액으로 2회, 알칼리성 포스파타제 완충액 (0.1 M 트리스-HCl, pH 9.5, 0.1 M NaCl, 5 mM MgCl₂)으로 1회 세척하고, 실온에서 3시간 동안 알칼리성 포스파타제 완충액 중 0.175 mg/mL BICP (시그마) 및 0.338 mg/mL NBT (시그마)를 사용하여 염색을 발색시켰다.

배양된 희돌기아교세포의 세포 표면에 존재하는 NogoA의 NogoA_623-640 에피토프: 살아있는 희돌기아교세포의 배양물과 마우스 11C7 mAb의 인큐베이션은 분화된 희돌기아교세포의 세포체 및 그의 방사돌기(radial process)를 염색시켰다. 대조군 마우스 IgG 및 세포내 단백질 CNPase에 대한 항체는 살아있는 세포를 염색시키지 않았다. 마우스 11C7 및 상응하는 면역원성 펩티드 (= 래트 NogoA_623-640, 서열 1)의 예비인큐베이션은 염색을 백그라운드(background) 수준으로 감소시켰다 (경쟁적 검정법). 세포 표면 염색은 모든 주요한 작은 돌기 및 세포체상에 존재하였다. 따라서, 마우스 11C7 mAb에 의해 인식되는 분자의 NogoA-특이적 부분은 희돌기아교세포의 원형질막상에서 세포외 공간에 노출된다.

마우스 11C7 mAb의 생성 및 정제: 마우스 11C7 mAb를 생성하는 하이브리도마 클론의 연속식 배양에는 10-L 글래스(glas) 생물반응기를 사용하였다. 상기 생물반응기에는 온화한 교반을 위해 중심 튜브에 배치된 마린 임펠러(marine impeller), 세포 보유를 위한 스핀 필터 및 발포 억제성 통기를 위한 코일형 실리 콘 튜빙이 구비되어 있었다. 하이브리도마 세포를 본 발명자들의 RPMI 기재의 혈청 무함유 배지에서 배양하였다. 배지에 3.7×10⁵개/mL 농도의 세포를 접종하였다. 28시간 후에는 생물반응기를 통한 연속적인 배지 유동을 0.5 발효기 용적/일 (5 L/일)의 속도로 출발하였다. 추가의 24 시간 후에는 상기 유속을 1 발효기 용적/일 (10 L/일)의 최종 수준으로 증가시켰다. 1주 후에 배양물은 11×10⁵개 세포/mL의 정상 상태(steady state)에 도달하였으며, 상기 과정을 1주 더 지속하였다. 마우스 11C7 mAb의 역가를 HPLC로 매일 측정하였다. 생물반응기로부터 총 150 L의 배양 상등액을 수거하고, 멸균 여과하여 세포 및 세포 찌꺼기를 제거하였다. 펠리콘 탄젠트(Pellikon tangential) 유동 장치 (밀리포어(Millipore); 10 kDa 컷-오프(cut-off))를 사용하여 상기한 150 L 배양 상등액을 약 6 L로 농축시켰다. 농축된 상등액을 단백질 A 세파로스(Sepharose) CI-4B (파마시아; 충전 높이 = 11 cm)의 220 mL 충전 부피의 컬럼상에서 3회 정제하였다. 간략하게 말하자면, pH를 8.1로 보정한 후에 배양 상등액을 4 mL/분으로 로딩하고, 100 mM Na₂HP0₄ (pH 8.1)을 사용하여 8 mL/분의 최저선까지 컬럼을 세척하였다. 8 mL/분의 50 mM NaH₂PO₄ (pH 3.0), 140 mM NaCl을 사용하여 결합 물질을 최종적으로 용출시키고, 5 N NaOH로 즉시 중화 (pH 7.0)시켜서 멸균 여과하였다. 흡광도를 280 nm에서 모니터링하였다. 정제된 물질의 일부를 한외여과하여 사실상 더욱 농축시키고(시키거나) PBS에 대해 투석하였다. 정제에 사용된 모든 완충액을 10 kDa 울트라세트(ULTRASETTE) (상표 명) 탄젠트 유동 장치 (필트론 테크놀로지 코포레이션(Filtron Technology Corporation))상에서 여과하여 가능한 내독소 오염물질을 제거하였다. 동일한 이유로, 단백질 A 수지를 20％ 에탄올로 전체적으로 세척하고, 모든 튜빙/펌프를 사용 전에 0.1 M NaOH로 처리하였다. 단백질 농도를 280 nm에서 분광학적으로 측정하였으며, 1 mg/mL에 대해 1.35의 기준 흡광도를 이용하였다. 일반적으로, 순도는 4 내지 20％ 노벡스(Novex) 농도구배 겔을 사용하여 환원 조건하에 SDS-PAGE로 평가한다. 내독소 함량은 전형적인 리물루스 아모에보사이트(Limulus Amoebocyte) 용해물 (LAL) 반응을 제조사 (스위스 알슈빌에 소재하는 엔도텔 아게(Endotell AG))의 지침에 따라 수행하여 측정하였다.

F _ab 단편의 생성: 마우스 11C7 mAb의 일부를 100 mM Na-아세테이트 (pH 5.5), 2 mM EDTA에 대해 전체적으로 투석하고, 6 mg/mL의 농도로 조정하였다. 0.25 mM 시스테인의 존재하에 파파인 소화 (1:200 w/w 비율)시켜 F_ab 단편을 생성시켰다. 상기 반응을 37℃에서 16시간 동안 진행시킨 후에 특이적 파파인 억제제인 E64 (N-[N-(L-3-트랜스-카르복시란-2-카르보닐)-L-류실]-아그마틴)을 과량(10 μM) 가하여 반응을 중단시켰다. 이어서, 소화된 항체를 단백질 A 세파로스 패스트 플로우(Fast Flow) 컬럼에 통과시켜 온전한 물질 및 Fc 단편을 제거하였다. F_ab 분획을 PBS에 대해 전체적으로 투석하고, 약 3 mg/mL로 농축하였다 (파파인 및 E64는 로쉐 몰레큘라 바이오케미칼스(Roche Molecular Biochemicals)로부터 구입함).

HPLC, 질량 분광법 및 V _L 및 V _H 영역의 N-말단 아미노산 서열분석:

a) 환원 및 알킬화: 정제하여 건조시킨 11C7 항체를 8 M 우레아 40 ㎕, 0.4 M NH₄HCO₃ (pH 8.3)에 용해시켰다. 동일한 완충액 10 ㎕에 미리 용해시킨 DTT (칼바이오켐(Calbiochem)) 60 ㎍을 단백질로서 첨가하였다. 아르곤하에 50℃에서 30분 동안 환원을 수행하였다 (단백질 티올보다 100배 몰 과량의 DTT). 환원 후에 샘플을 실온으로 냉각시켰다. 동일한 완충액에 용해된 요오도아세트아미드 (시그마 울트라(Sigma Ultra), I-1149) 304 ㎍을 단백질로서 첨가하였다. 카르복스아미도메틸화를 암조건하에 실온에서 15분 동안 수행하였다. β-메르캅토에탄올 1 ㎕를 첨가하여 반응을 켄칭(quenching)시켰다.

b) 중쇄 및 경쇄의 단리: DR5 펌핑 시스템 및 다이오드-어레이 UV 검출기를 장착한 휴렛 팩커드(Hewlett Packard) 1090M HPLC 시스템상의 역상 고압 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)를 통해 항체의 카르복스아미도메틸화된 중쇄 및 경쇄를 단리하였다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같았다: R1/H 물질로 충전된 퍼셉티브 바이오시스템즈 포로스(PerSeptive Biosystems Poros) 2.1×100 mm 컬럼, 유속 = 0.5 mL/분, 용매 - (A) 물 중 0.1％ TFA 및 (B) 0.09％ TFA/아세토니트릴/물 9:1; 농도구배 25 내지 70％ B, 80℃에서 8분; 218/280 nm에서 검출.

c) LC-ESI-MS: 마이크로매스(Micromass) Z-형 전자분무 이온화 공급원(ESI)을 장착한 Q-Tof (quadrupole time-of-flight) 하이브리드 탄뎀(tandem) 질량 분광계 (영국 맨체스터에 소재하는 마이크로매스(Micromass))를 사용하여 질량 분광법을 수행하였다. 획득 질량 범위는 전형적으로 m/z 500 내지 2000이었다. 매스린 스(Masslynx) 소프트웨어를 사용하여 데이타를 기록하고 처리하였다. 말 심장 미오글로빈 (MW 16951.5)의 다중 하전된 이온 피크를 이용하여 500 내지 2500 m/z 스케일의 보정을 달성하였다.

d) 중쇄 및 경쇄의 HPLC-MS: 퍼셉티브 바이오시스템즈 포로스 R1/H로 충전된 1 mm×150 mm LC 패킹스(Packings) 컬럼을 사용한 HP1100 HPLC 시스템 (미국 캘리포니아주 팔로 알토에 소재하는 휴렛 팩커드)상에서 환원되고 카르복스아미도메틸화된 중쇄 및 경쇄의 분리를 수행하였다. 컬럼을 60℃로 유지하였다. 밸코(Valco) 모델 C6UW HPLC 밸브 (미국 텍사스주 휴스턴에 소재하는 밸코) 및 10 ㎕ 주사 루프가 설치된 CTC PAL 자동샘플채취기 (스위스 즈빙겐에 소재하는 CTC)를 사용하여 컬럼상에 10 ㎕ 부피의 샘플을 주사하였다. 매스린스 소프트웨어 (영국 맨체스터에 소재하는 마이크로매스)로 HPLC를 제어하였다. 214 nm에서 UV 검출을 행하였다. 용출액 A는 0.05％ TFA를 함유하는 물이었다. 용출액 B는 0.045％ TFA를 함유하는 물:아세토니트릴 (1:9)의 혼합물이었다. 20％ B로부터 90％ B로의 농도구배를 20분 동안 80℃에서 가동시켰다. 유속은 전형적으로 60 ㎕/분이었다. LC 시스템으로부터의 전체 유동물을 UV 검출 셀에 도입한 후에 임의의 분할 없이 ESI 공급원에 도입하였다. 매스린스 소프트웨어 (영국 맨체스터에 소재하는 마이크로매스)를 사용하여 HPLC 시스템을 제어하고 UV 검출기로부터의 신호를 처리하였다. 다음과 같은 5가지 신호가 검출되었다:

측정:	신호 해석
A = 50959.0 Da	카르복스아미도메틸-시스테인(CAMCys)을 갖는 H 쇄^*
B = 51119.5 Da	신호 A + 162 Da (= 헥소스)^**
C = 51086.0 Da	신호 A + 127 (Lys), CAMCys를 갖는 H 쇄^*
D = 51251.0 Da	신호 C + 162 Da (= 헥소스)^**
E = 24464.8 Da	CAMCys를 갖는 L 쇄
	^두가지 유형의 H 쇄가 존재하는데, 하나는 C-말단에 Lys를 가지며, 다른 하나는 C-말단에 Lys를 갖지 않음. 두 형태의 비율은 대략 50:50％임. ^*두가지 유형의 H 쇄는 2가지의 상응하는 글리코실화 형태 (+162)를 가짐.

d) V_L 및 V_H 영역의 N-말단 아미노산 서열분석: HPLC로부터 수집된 H 쇄 + L 쇄 피크를 서열 분석에 사용하였다. 휴렛 팩커드 G1000A N-말단의 단백질 서열분석 시스템상에서 아미노산 서열을 결정하였다. 상기 시스템은 미니어처 흡착성 이상(biphasic) 컬럼상에 보유된 단백질 샘플에 대해 자동화된 에드만(Edman) 화학을 수행한다. 최적화된 화학 방법 (이중 커플링 3.0)을 이용하여 화학적 효율을 증진시키고 랙(lag)을 최소화하는 동시에 약 50개의 잔기까지 서열 분석을 연장하였다. 3원 펌핑 시스템 및 좁은(narrowbore) (2.1 mm×25 cm) PTH 컬럼을 장착한 온-라인 휴렛 팩커드 HP1090 HPLC 시스템상에서 PTH-아미노산 분석을 수행하였다.

결과:

질량 분석으로부터, 마우스 11C7-IgG1의 동종 중쇄 및 경쇄를 결정하였다. H 쇄는 단일 글리코실화되었으며, C-말단 리신에서 차이가 나는 2가지 형태가 존재하였다. 중쇄 및 경쇄의 전체 질량 분석은 2개 쇄 둘다에 대해 단일 질량을 나타냈다. 마우스 11C7-IgG1의 HPLC 크로마토그래피는 단일 피크를 나타냈다. HPLC 정제에 이어서 환원 및 알킬화를 수행한 후에는 순수한 중쇄 및 경쇄를 수득할 수 있었다. 경쇄 및 중쇄에 대해 N-말단 서열 분해를 수행하였다. 서열 분해에 의해서 L 쇄 및 H 쇄의 N-말단 서열로부터의 45개 내지 55개 아미노산이 확인되었다.

경쇄

중쇄

실시예 5: 마우스 11C7 mAb의 중쇄 및 경쇄 유전자의 클로닝

트리퓨어(TriPure) 시약 (독일에 소재하는 로쉐 디아그노틱스, 카탈로그 번호 1667157)을 제조사의 지침에 따라 사용하여 10⁷개 하이브리도마 세포 (클론 11C7)로부터 전체 RNA를 프렙하였다. cDNA 합성을 위해, 올리고텍스(Oligotex) 수지 (독일에 소재하는 퀴아젠(Qiagen), 카탈로그 번호 70022)를 사용하여 mRNA를 상기 프렙된 전체 RNA로부터 단리하였다.

다음과 같은 조건을 사용하는 역전사에 의해 cDNA를 생성시켰다: 2 ㎕ mRNA, 2 ㎕ 10× 역전사 완충액, 2 ㎕ (dT)₂₀ 프라이머 (10 μM), 0.5 ㎕ RNasin (프로메가(Promega), 40 U/mL), 2 ㎕ dNTP (각각 5 mM), 1 ㎕ 옴니스크립트(Omniscript) (상표명) 역전사효소 (퀴아젠, 카탈로그 번호 205110), 10.5 ㎕ ddH₂O, 반응: 37℃에서 1시간. V_H 및 V_L을 코딩하는 cDNA의 PCR 증폭에는 프루프-리딩 효소인 프루프스타트(ProofStart) (상표명) DNA 중합효소를 사용하였다.

경쇄 및 중쇄의 PCR: 반응 혼합물: 2 ㎕ cDNA, 5 ㎕ 10× 반응 완충액, 3 ㎕ dNTP (각각 5 mM), 2 ㎕ 5' 프라이머 (10 μM) (표 2 참조), 2 ㎕ 3' 프라이머 (10 μM) (표 2 참조), 1 ㎕ 프루프스타트 (퀴아젠, 카탈로그 번호 202203), 36 ㎕ ddH₂O. PCR 조건은 다음과 같았다: 95℃/5분, (95℃/40초, 53℃/1분, 72℃/1분)×35, 72℃/10분. 생성된 PCR 생성물을 pCRbluntTOPO (인비트로젠)에 바로 라이게이션시켰다. 라이게이션 혼합물로 TOP 10 세포 (인비트로젠)를 형질감염시키고, 여러개의 클론을 골라냈다. 11C7 mAb의 중쇄 가변부 뉴클레오티드 서열 (V-H, 서열 43) 및 11C7 mAb의 경쇄 가변부 뉴클레오티드 서열 (V-L, 서열 44)을 ABI 서열분석기상에서 결정하였다. V-H 및 V-L의 아미노산 서열은 서열 2 (V-H) 및 서열 3 (V-L)에 나타내었다. V_H 및 V_L cDNA의 PCR 증폭에는 다음과 같은 프라이머를 사용하였고, 모든 프라이머는 독일에 소재하는 엠더블유지 바이오테크(MWG Biotech)가 합성하였다:

실시예 6: ELISA를 사용한 11C7 및 Fab와 NogoA 도메인의 결합

그라이너 96 웰 PS 플레이트 (번호 655161)를 PBS (100 ㎕/웰) 중의 0.4 내지 2 ㎍/mL Nogo 단백질 단편으로 코팅하여 커버를 덮고 실온에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 플리킹(flicking)하고, 200 ㎕/웰 차단 완충액 (PBS + 2％ BSA)으로 재충전하여 커버를 덮고 인큐베이션하였다. 실온에서 1시간 또는 4℃에서 밤새 방치한 후에 물 및 PBS로 4회 세척하였다. 여러가지 농도의 마우스 11C7 mAb 또는 11C7 Fab를 PBS + 2％ BSA (100 ㎕/웰) 중에 희석시키고, 실온에서 2시간 또는 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세척 단계를 반복하고, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)와 접합된 염소 항-마우스 IgG를 PBS/0.1％ BSA/0.1％ 노니뎃(Nonidet) 40 (100 ㎕/웰) 중에 1:5000 (ICN 번호 55550)으로 희석하여 첨가하고 인큐베이션하였다. 실온에서 2시간 및 4℃에서 밤새 방치한 후에 세척 단계를 반복하였다. 100 ㎕/웰 BM 블루 POD (로쉐 번호 1484281)를 가하여 HRP 반응을 개시하고, 암조건하에 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 1 M H₂SO₄ 50 ㎕/웰을 가하여 HRP 기질 반응을 중단시키고, 450 nm로 설정된 마이크로플레이트 판독기 (팩커드 스펙트라 카운트(Packard Spectra Count))를 사용하여 광학 밀도를 측정하였다.

마우스 11C7 mAb는 0.02 내지 2.5 nM의 매우 낮은 농도에서 인간 NiG, 래트 NiG, 마우스 NiG, 래트 NiG-D20 및 펩티드 472와 결합하였다. 인간 NiG, 래트 NiG, 마우스 NiG와의 매우 낮은 농도에서의 결합은 매우 높은 친화도 (Kd 0.1 내지 0.44 nM 바이오센서 친화도 측정)로 확인되었으며, 472 펩티드가 래트 및 마우스 등가물 영역과 비교할 때 2개 내지 3개의 아미노산을 제외하면 인간에서 동일하다는 사실과 일치한다. 마우스 11C7 mAb가 동일 농도 범위에서 래트 NiG-D6 및 Nogo-66 단편과 전혀 결합하지 않는다는 사실은 결합 특이성을 암시한다. Fab 1가 단편은 인간 NiG 및 래트 NiG-D20과 0.025 내지 25 nM의 농도로 결합하였으며, 동일 농도 범위의 래트 NiG-D6 및 Nogo-66 단편과는 결합하지 않았다. 바이오센서로 측정된 Kd는 인간 NiG의 경우에 7.14 nM이었다.

실시예 7: NogoA 도메인에 대한 마우스 11C7-IgG1 및 Fab의 바이오센서 친화도 측정

비아코어(BIAcore) 2000 광학 바이오센서 (스웨덴 웁살라에 소재하는 비아코어)를 제조사의 지침에 따라 사용하여 표면 플라스몬 공명 (SPR)으로 마우스 11C7 mAb 및 11C7 Fab의 친화도를 측정하였다 (도 2 참조). 아민-커플링 화학을 이용하여 재조합 인간, 마우스 및 래트 NIG를 CM5 센서 칩의 3개의 별개 유동 셀에 공유 결합시켰다. 간략하게 말하자면, 0.025 M NHS 및 0.1 M EDC를 함유하는 용액 35 ㎕를 주사하여 카르복시메틸화된 덱스트란 매트릭스를 활성화시켰다. 재조합 마우스, 인간 및 래트 NIG를 센서 칩상에 고정시키기 위해, 이들을 3.5 내지 4.5 사이에서 달라지는 pH의 0.01 M 시트르산염 완충액 중에 희석시키고, 5 ㎕/분의 유속으로 주사하여 친화도 측정을 허용하는 커플링 수준을 달성하였다. 1 M 에탄올아민 하이드로클로라이드 (pH 8.5) 35 ㎕를 주사하여 나머지 NHS-에스테르기의 불활성화를 수행하였다. 0.1 M HCl 5 ㎕를 주사하여 센서 칩의 표면을 재생시켰다. 친화도 측정을 위해, 항체를 0.50 nM 내지 100 nM 범위의 여러 농도로 200 ㎕/분의 유속으로 주사하였다. 각 주사 후에는 0.1 M HCl 10 ㎕를 주사하여 표면에서의 결합 활성 소실 없이 센서 칩 표면을 재생시켰다. 제조사에 의해 제공된 BIAevaluations 3.0 소프트웨어를 사용하여 반응속도 상수인 ka 및 kd 및 친화도 상수인 KA 및 KD를 평가하였다.

비아코어의 친화도 측정: 마우스 11C7 mAb 및 11C7 유래된 1가 Fab 단편과 재조합 NogoA의 반응속도 및 친화도 결합 상수를 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기술 (비아코어)을 이용하여 실시간으로 측정하였다. 이러한 분석을 위해, 재조합 인간, 마우스 및 래트 NIG를 3가지 독립적인 센서 칩 표면에 커플링시키고, 여러가지 농도의 항체를 주사하였다. 결합 상호작용의 반응속도 파라미터는 센서그램(sensorgram)으로부터의 비선형 그래프 작도로 유도되었다. 평형시에 마우스 11C7-IgG1의 친화도 상수는 인간, 래트 및 마우스 NIG에 대하여 각각 KD = 0.1 nM, KD = 0.4 nM 및 KD = 0.19 nM이었다 (표 3). 11C7 유래된 Fab 단편의 경우, 인간 NIG에 대한 친화도 상수는 KD = 7.14 nM이었다. Fab 단편의 친화도가 더 낮은 것은, 두가지 반응속도 상수인 결합 및 해리 (kd, kd) 상수의 감소로 인한 것이다. 완전 항체에 비해 Fab 단편의 친화도가 더 낮은 것은, 아마도 단량체 Fab에 결여된 화합력(avidity) 효과와 관련이 있는 것으로 여겨진다.

<110> Novartis AG <120> Organic Compound <130> 4-32761P1/UNZ <160> 44 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> rat NogoA_623-640 <400> 1 Ser Tyr Asp Ser Ile Lys Leu Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu 1 5 10 15 Glu Ala <210> 2 <211> 221 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> CHAIN <222> (1)..(221) <223> Variable part of Heavy Chain of 11C7 with leader sequence <400> 2 Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Gly Leu Leu Lys Gly Val 1 5 10 15 Gln Cys Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 20 25 30 Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Asp Phe Arg 35 40 45 Arg Asn Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 50 55 60 Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Lys Ile Asn Tyr Thr Pro 65 70 75 80 Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 85 90 95 Leu Tyr Leu Gln Val Ser Thr Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr 100 105 110 Tyr Cys Val Arg Pro Val Trp Met Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val 130 135 140 Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser 195 200 205 Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala 210 215 220 <210> 3 <211> 238 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> CHAIN <222> (1)..(238) <223> Light Chain of 11C7 with leader sequence <400> 3 Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg Glu 1 5 10 15 Thr Ser Gly Asp Val Leu Leu Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Ile 20 25 30 Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Tyr Cys 100 105 110 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly 165 170 175 Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp 195 200 205 Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr 210 215 220 Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 4 <211> 3919 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(3579) <223> Human NogoA <400> 4 atg gaa gac ctg gac cag tct cct ctg gtc tcg tcc tcg gac agc cca 48 Met Glu Asp Leu Asp Gln Ser Pro Leu Val Ser Ser Ser Asp Ser Pro 1 5 10 15 ccc cgg ccg cag ccc gcg ttc aag tac cag ttc gtg agg gag ccc gag 96 Pro Arg Pro Gln Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Arg Glu Pro Glu 20 25 30 gac gag gag gaa gaa gag gag gag gaa gag gag gac gag gac gaa gac 144 Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Asp 35 40 45 ctg gag gag ctg gag gtg ctg gag agg aag ccc gcc gcc ggg ctg tcc 192 Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly Leu Ser 50 55 60 gcg gcc cca gtg ccc acc gcc cct gcc gcc ggc gcg ccc ctg atg gac 240 Ala Ala Pro Val Pro Thr Ala Pro Ala Ala Gly Ala Pro Leu Met Asp 65 70 75 80 ttc gga aat gac ttc gtg ccg ccg gcg ccc cgg gga ccc ctg ccg gcc 288 Phe Gly Asn Asp Phe Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala 85 90 95 gct ccc ccc gtc gcc ccg gag cgg cag ccg tct tgg gac ccg agc ccg 336 Ala Pro Pro Val Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Asp Pro Ser Pro 100 105 110 gtg tcg tcg acc gtg ccc gcg cca tcc ccg ctg tct gct gcc gca gtc 384 Val Ser Ser Thr Val Pro Ala Pro Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ala Val 115 120 125 tcg ccc tcc aag ctc cct gag gac gac gag cct ccg gcc cgg cct ccc 432 Ser Pro Ser Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro 130 135 140 cct cct ccc ccg gcc agc gtg agc ccc cag gca gag ccc gtg tgg acc 480 Pro Pro Pro Pro Ala Ser Val Ser Pro Gln Ala Glu Pro Val Trp Thr 145 150 155 160 ccg cca gcc ccg gct ccc gcc gcg ccc ccc tcc acc ccg gcc gcg ccc 528 Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr Pro Ala Ala Pro 165 170 175 aag cgc agg ggc tcc tcg ggc tca gtg gat gag acc ctt ttt gct ctt 576 Lys Arg Arg Gly Ser Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr Leu Phe Ala Leu 180 185 190 cct gct gca tct gag cct gtg ata cgc tcc tct gca gaa aat atg gac 624 Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Arg Ser Ser Ala Glu Asn Met Asp 195 200 205 ttg aag gag cag cca ggt aac act att tcg gct ggt caa gag gat ttc 672 Leu Lys Glu Gln Pro Gly Asn Thr Ile Ser Ala Gly Gln Glu Asp Phe 210 215 220 cca tct gtc ctg ctt gaa act gct gct tct ctt cct tct ctg tct cct 720 Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro Ser Leu Ser Pro 225 230 235 240 ctc tca gcc gct tct ttc aaa gaa cat gaa tac ctt ggt aat ttg tca 768 Leu Ser Ala Ala Ser Phe Lys Glu His Glu Tyr Leu Gly Asn Leu Ser 245 250 255 aca gta tta ccc act gaa gga aca ctt caa gaa aat gtc agt gaa gct 816 Thr Val Leu Pro Thr Glu Gly Thr Leu Gln Glu Asn Val Ser Glu Ala 260 265 270 tct aaa gag gtc tca gag aag gca aaa act cta ctc ata gat aga gat 864 Ser Lys Glu Val Ser Glu Lys Ala Lys Thr Leu Leu Ile Asp Arg Asp 275 280 285 tta aca gag ttt tca gaa tta gaa tac tca gaa atg gga tca tcg ttc 912 Leu Thr Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met Gly Ser Ser Phe 290 295 300 agt gtc tct cca aaa gca gaa tct gcc gta ata gta gca aat cct agg 960 Ser Val Ser Pro Lys Ala Glu Ser Ala Val Ile Val Ala Asn Pro Arg 305 310 315 320 gaa gaa ata atc gtg aaa aat aaa gat gaa gaa gag aag tta gtt agt 1008 Glu Glu Ile Ile Val Lys Asn Lys Asp Glu Glu Glu Lys Leu Val Ser 325 330 335 aat aac atc ctt cat aat caa caa gag tta cct aca gct ctt act aaa 1056 Asn Asn Ile Leu His Asn Gln Gln Glu Leu Pro Thr Ala Leu Thr Lys 340 345 350 ttg gtt aaa gag gat gaa gtt gtg tct tca gaa aaa gca aaa gac agt 1104 Leu Val Lys Glu Asp Glu Val Val Ser Ser Glu Lys Ala Lys Asp Ser 355 360 365 ttt aat gaa aag aga gtt gca gtg gaa gct cct atg agg gag gaa tat 1152 Phe Asn Glu Lys Arg Val Ala Val Glu Ala Pro Met Arg Glu Glu Tyr 370 375 380 gca gac ttc aaa cca ttt gag cga gta tgg gaa gtg aaa gat agt aag 1200 Ala Asp Phe Lys Pro Phe Glu Arg Val Trp Glu Val Lys Asp Ser Lys 385 390 395 400 gaa gat agt gat atg ttg gct gct gga ggt aaa atc gag agc aac ttg 1248 Glu Asp Ser Asp Met Leu Ala Ala Gly Gly Lys Ile Glu Ser Asn Leu 405 410 415 gaa agt aaa gtg gat aaa aaa tgt ttt gca gat agc ctt gag caa act 1296 Glu Ser Lys Val Asp Lys Lys Cys Phe Ala Asp Ser Leu Glu Gln Thr 420 425 430 aat cac gaa aaa gat agt gag agt agt aat gat gat act tct ttc ccc 1344 Asn His Glu Lys Asp Ser Glu Ser Ser Asn Asp Asp Thr Ser Phe Pro 435 440 445 agt acg cca gaa ggt ata aag gat cgt tca gga gca tat atc aca tgt 1392 Ser Thr Pro Glu Gly Ile Lys Asp Arg Ser Gly Ala Tyr Ile Thr Cys 450 455 460 gct ccc ttt aac cca gca gca act gag agc att gca aca aac att ttt 1440 Ala Pro Phe Asn Pro Ala Ala Thr Glu Ser Ile Ala Thr Asn Ile Phe 465 470 475 480 cct ttg tta gga gat cct act tca gaa aat aag acc gat gaa aaa aaa 1488 Pro Leu Leu Gly Asp Pro Thr Ser Glu Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys 485 490 495 ata gaa gaa aag aag gcc caa ata gta aca gag aag aat act agc acc 1536 Ile Glu Glu Lys Lys Ala Gln Ile Val Thr Glu Lys Asn Thr Ser Thr 500 505 510 aaa aca tca aac cct ttt ctt gta gca gca cag gat tct gag aca gat 1584 Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu Val Ala Ala Gln Asp Ser Glu Thr Asp 515 520 525 tat gtc aca aca gat aat tta aca aag gtg act gag gaa gtc gtg gca 1632 Tyr Val Thr Thr Asp Asn Leu Thr Lys Val Thr Glu Glu Val Val Ala 530 535 540 aac atg cct gaa ggc ctg act cca gat tta gta cag gaa gca tgt gaa 1680 Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala Cys Glu 545 550 555 560 agt gaa ttg aat gaa gtt act ggt aca aag att gct tat gaa aca aaa 1728 Ser Glu Leu Asn Glu Val Thr Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys 565 570 575 atg gac ttg gtt caa aca tca gaa gtt atg caa gag tca ctc tat cct 1776 Met Asp Leu Val Gln Thr Ser Glu Val Met Gln Glu Ser Leu Tyr Pro 580 585 590 gca gca cag ctt tgc cca tca ttt gaa gag tca gaa gct act cct tca 1824 Ala Ala Gln Leu Cys Pro Ser Phe Glu Glu Ser Glu Ala Thr Pro Ser 595 600 605 cca gtt ttg cct gac att gtt atg gaa gca cca ttg aat tct gca gtt 1872 Pro Val Leu Pro Asp Ile Val Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Ala Val 610 615 620 cct agt gct ggt gct tcc gtg ata cag ccc agc tca tca cca tta gaa 1920 Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val Ile Gln Pro Ser Ser Ser Pro Leu Glu 625 630 635 640 gct tct tca gtt aat tat gaa agc ata aaa cat gag cct gaa aac ccc 1968 Ala Ser Ser Val Asn Tyr Glu Ser Ile Lys His Glu Pro Glu Asn Pro 645 650 655 cca cca tat gaa gag gcc atg agt gta tca cta aaa aaa gta tca gga 2016 Pro Pro Tyr Glu Glu Ala Met Ser Val Ser Leu Lys Lys Val Ser Gly 660 665 670 ata aag gaa gaa att aaa gag cct gaa aat att aat gca gct ctt caa 2064 Ile Lys Glu Glu Ile Lys Glu Pro Glu Asn Ile Asn Ala Ala Leu Gln 675 680 685 gaa aca gaa gct cct tat ata tct att gca tgt gat tta att aaa gaa 2112 Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu 690 695 700 aca aag ctt tct gct gaa cca gct ccg gat ttc tct gat tat tca gaa 2160 Thr Lys Leu Ser Ala Glu Pro Ala Pro Asp Phe Ser Asp Tyr Ser Glu 705 710 715 720 atg gca aaa gtt gaa cag cca gtg cct gat cat tct gag cta gtt gaa 2208 Met Ala Lys Val Glu Gln Pro Val Pro Asp His Ser Glu Leu Val Glu 725 730 735 gat tcc tca cct gat tct gaa cca gtt gac tta ttt agt gat gat tca 2256 Asp Ser Ser Pro Asp Ser Glu Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser 740 745 750 ata cct gac gtt cca caa aaa caa gat gaa act gtg atg ctt gtg aaa 2304 Ile Pro Asp Val Pro Gln Lys Gln Asp Glu Thr Val Met Leu Val Lys 755 760 765 gaa agt ctc act gag act tca ttt gag tca atg ata gaa tat gaa aat 2352 Glu Ser Leu Thr Glu Thr Ser Phe Glu Ser Met Ile Glu Tyr Glu Asn 770 775 780 aag gaa aaa ctc agt gct ttg cca cct gag gga gga aag cca tat ttg 2400 Lys Glu Lys Leu Ser Ala Leu Pro Pro Glu Gly Gly Lys Pro Tyr Leu 785 790 795 800 gaa tct ttt aag ctc agt tta gat aac aca aaa gat acc ctg tta cct 2448 Glu Ser Phe Lys Leu Ser Leu Asp Asn Thr Lys Asp Thr Leu Leu Pro 805 810 815 gat gaa gtt tca aca ttg agc aaa aag gag aaa att cct ttg cag atg 2496 Asp Glu Val Ser Thr Leu Ser Lys Lys Glu Lys Ile Pro Leu Gln Met 820 825 830 gag gag ctc agt act gca gtt tat tca aat gat gac tta ttt att tct 2544 Glu Glu Leu Ser Thr Ala Val Tyr Ser Asn Asp Asp Leu Phe Ile Ser 835 840 845 aag gaa gca cag ata aga gaa act gaa acg ttt tca gat tca tct cca 2592 Lys Glu Ala Gln Ile Arg Glu Thr Glu Thr Phe Ser Asp Ser Ser Pro 850 855 860 att gaa att ata gat gag ttc cct aca ttg atc agt tct aaa act gat 2640 Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr Leu Ile Ser Ser Lys Thr Asp 865 870 875 880 tca ttt tct aaa tta gcc agg gaa tat act gac cta gaa gta tcc cac 2688 Ser Phe Ser Lys Leu Ala Arg Glu Tyr Thr Asp Leu Glu Val Ser His 885 890 895 aaa agt gaa att gct aat gcc ccg gat gga gct ggg tca ttg cct tgc 2736 Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ala Pro Asp Gly Ala Gly Ser Leu Pro Cys 900 905 910 aca gaa ttg ccc cat gac ctt tct ttg aag aac ata caa ccc aaa gtt 2784 Thr Glu Leu Pro His Asp Leu Ser Leu Lys Asn Ile Gln Pro Lys Val 915 920 925 gaa gag aaa atc agt ttc tca gat gac ttt tct aaa aat ggg tct gct 2832 Glu Glu Lys Ile Ser Phe Ser Asp Asp Phe Ser Lys Asn Gly Ser Ala 930 935 940 aca tca aag gtg ctc tta ttg cct cca gat gtt tct gct ttg gcc act 2880 Thr Ser Lys Val Leu Leu Leu Pro Pro Asp Val Ser Ala Leu Ala Thr 945 950 955 960 caa gca gag ata gag agc ata gtt aaa ccc aaa gtt ctt gtg aaa gaa 2928 Gln Ala Glu Ile Glu Ser Ile Val Lys Pro Lys Val Leu Val Lys Glu 965 970 975 gct gag aaa aaa ctt cct tcc gat aca gaa aaa gag gac aga tca cca 2976 Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu Asp Arg Ser Pro 980 985 990 tct gct ata ttt tca gca gag ctg agt aaa act tca gtt gtt gac ctc 3024 Ser Ala Ile Phe Ser Ala Glu Leu Ser Lys Thr Ser Val Val Asp Leu 995 1000 1005 ctg tac tgg aga gac att aag aag act gga gtg gtg ttt ggt gcc 3069 Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe Gly Ala 1010 1015 1020 agc cta ttc ctg ctg ctt tca ttg aca gta ttc agc att gtg agc 3114 Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val Ser 1025 1030 1035 gta aca gcc tac att gcc ttg gcc ctg ctc tct gtg acc atc agc 3159 Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile Ser 1040 1045 1050 ttt agg ata tac aag ggt gtg atc caa gct atc cag aaa tca gat 3204 Phe Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser Asp 1055 1060 1065 gaa ggc cac cca ttc agg gca tat ctg gaa tct gaa gtt gct ata 3249 Glu Gly His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile 1070 1075 1080 tct gag gag ttg gtt cag aag tac agt aat tct gct ctt ggt cat 3294 Ser Glu Glu Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His 1085 1090 1095 gtg aac tgc acg ata aag gaa ctc agg cgc ctc ttc tta gtt gat 3339 Val Asn Cys Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp 1100 1105 1110 gat tta gtt gat tct ctg aag ttt gca gtg ttg atg tgg gta ttt 3384 Asp Leu Val Asp Ser Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val Phe 1115 1120 1125 acc tat gtt ggt gcc ttg ttt aat ggt ctg aca cta ctg att ttg 3429 Thr Tyr Val Gly Ala Leu Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile Leu 1130 1135 1140 gct ctc att tca ctc ttc agt gtt cct gtt att tat gaa cgg cat 3474 Ala Leu Ile Ser Leu Phe Ser Val Pro Val Ile Tyr Glu Arg His 1145 1150 1155 cag gca cag ata gat cat tat cta gga ctt gca aat aag aat gtt 3519 Gln Ala Gln Ile Asp His Tyr Leu Gly Leu Ala Asn Lys Asn Val 1160 1165 1170 aaa gat gct atg gct aaa atc caa gca aaa atc cct gga ttg aag 3564 Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gln Ala Lys Ile Pro Gly Leu Lys 1175 1180 1185 cgc aaa gct gaa tga aaacgcccaa aataattagt aggagttcat ctttaaaggg 3619 Arg Lys Ala Glu 1190 gatattcatt tgattatacg ggggagggtc agggaagaac gaaccttgac gttgcagtgc 3679 agtttcacag atcgttgtta gatctttatt tttagccatg cactgttgtg aggaaaaatt 3739 acctgtcttg actgccatgt gttcatcatc ttaagtattg taagctgcta tgtatggatt 3799 taaaccgtaa tcatatcttt ttcctatctg aggcactggt ggaataaaaa acctgtatat 3859 tttactttgt tgcagatagt cttgccgcat cttggcaagt tgcagagatg gtggagctag 3919 <210> 5 <211> 1192 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Glu Asp Leu Asp Gln Ser Pro Leu Val Ser Ser Ser Asp Ser Pro 1 5 10 15 Pro Arg Pro Gln Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Arg Glu Pro Glu 20 25 30 Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Asp 35 40 45 Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly Leu Ser 50 55 60 Ala Ala Pro Val Pro Thr Ala Pro Ala Ala Gly Ala Pro Leu Met Asp 65 70 75 80 Phe Gly Asn Asp Phe Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala 85 90 95 Ala Pro Pro Val Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Asp Pro Ser Pro 100 105 110 Val Ser Ser Thr Val Pro Ala Pro Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ala Val 115 120 125 Ser Pro Ser Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro 130 135 140 Pro Pro Pro Pro Ala Ser Val Ser Pro Gln Ala Glu Pro Val Trp Thr 145 150 155 160 Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr Pro Ala Ala Pro 165 170 175 Lys Arg Arg Gly Ser Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr Leu Phe Ala Leu 180 185 190 Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Arg Ser Ser Ala Glu Asn Met Asp 195 200 205 Leu Lys Glu Gln Pro Gly Asn Thr Ile Ser Ala Gly Gln Glu Asp Phe 210 215 220 Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro Ser Leu Ser Pro 225 230 235 240 Leu Ser Ala Ala Ser Phe Lys Glu His Glu Tyr Leu Gly Asn Leu Ser 245 250 255 Thr Val Leu Pro Thr Glu Gly Thr Leu Gln Glu Asn Val Ser Glu Ala 260 265 270 Ser Lys Glu Val Ser Glu Lys Ala Lys Thr Leu Leu Ile Asp Arg Asp 275 280 285 Leu Thr Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met Gly Ser Ser Phe 290 295 300 Ser Val Ser Pro Lys Ala Glu Ser Ala Val Ile Val Ala Asn Pro Arg 305 310 315 320 Glu Glu Ile Ile Val Lys Asn Lys Asp Glu Glu Glu Lys Leu Val Ser 325 330 335 Asn Asn Ile Leu His Asn Gln Gln Glu Leu Pro Thr Ala Leu Thr Lys 340 345 350 Leu Val Lys Glu Asp Glu Val Val Ser Ser Glu Lys Ala Lys Asp Ser 355 360 365 Phe Asn Glu Lys Arg Val Ala Val Glu Ala Pro Met Arg 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PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> Human NogoA_623-640 <400> 6 Asn Tyr Glu Ser Ile Lys His Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu 1 5 10 15 Glu Ala <210> 7 <211> 819 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(819) <223> human Nig <400> 7 Asp Glu Thr Leu Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Arg 1 5 10 15 Ser Ser Ala Glu Asn Met Asp Leu Lys Glu Gln Pro Gly Asn Thr Ile 20 25 30 Ser Ala Gly Gln Glu Asp Phe Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala 35 40 45 Ser Leu Pro Ser Leu Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ser Phe Lys Glu His 50 55 60 Glu Tyr Leu Gly Asn Leu Ser Thr Val Leu Pro Thr Glu Gly Thr Leu 65 70 75 80 Gln Glu Asn Val Ser Glu Ala Ser Lys Glu Val Ser Glu Lys Ala Lys 85 90 95 Thr Leu Leu Ile Asp Arg Asp Leu Thr Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr 100 105 110 Ser Glu Met Gly Ser Ser Phe Ser Val Ser Pro Lys Ala Glu Ser Ala 115 120 125 Val Ile Val Ala Asn Pro Arg Glu Glu Ile Ile Val Lys Asn Lys Asp 130 135 140 Glu Glu Glu Lys Leu Val Ser Asn Asn Ile Leu His Asn Gln Gln Glu 145 150 155 160 Leu Pro Thr Ala Leu Thr Lys Leu Val Lys Glu Asp Glu Val Val Ser 165 170 175 Ser Glu Lys Ala Lys Asp Ser Phe Asn Glu Lys Arg Val Ala Val Glu 180 185 190 Ala Pro Met Arg Glu Glu Tyr Ala Asp Phe Lys Pro Phe Glu Arg Val 195 200 205 Trp Glu Val Lys Asp Ser Lys Glu Asp Ser Asp Met Leu Ala Ala Gly 210 215 220 Gly Lys Ile Glu Ser Asn Leu Glu Ser Lys Val Asp Lys Lys Cys Phe 225 230 235 240 Ala Asp Ser Leu Glu Gln Thr Asn His Glu Lys Asp Ser Glu Ser Ser 245 250 255 Asn Asp Asp Thr Ser Phe Pro Ser Thr Pro Glu Gly Ile Lys Asp Arg 260 265 270 Ser Gly Ala Tyr Ile Thr Cys Ala Pro Phe Asn Pro Ala Ala Thr Glu 275 280 285 Ser Ile Ala Thr Asn Ile Phe Pro Leu Leu Gly Asp Pro Thr Ser Glu 290 295 300 Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys Ile Glu Glu Lys Lys Ala Gln Ile Val 305 310 315 320 Thr Glu Lys Asn Thr Ser Thr Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu Val Ala 325 330 335 Ala Gln Asp Ser Glu Thr Asp Tyr Val Thr Thr Asp Asn Leu Thr Lys 340 345 350 Val Thr Glu Glu Val Val Ala Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr Pro Asp 355 360 365 Leu Val Gln Glu Ala Cys Glu Ser Glu Leu Asn Glu Val Thr Gly Thr 370 375 380 Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys Met Asp Leu Val Gln Thr Ser Glu Val 385 390 395 400 Met Gln Glu Ser Leu Tyr Pro Ala Ala Gln Leu Cys Pro Ser Phe Glu 405 410 415 Glu Ser Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val Met Glu 420 425 430 Ala Pro Leu Asn Ser Ala Val Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val Ile Gln 435 440 445 Pro Ser Ser Ser Pro Leu Glu Ala Ser Ser Val Asn Tyr Glu Ser Ile 450 455 460 Lys His Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala Met Ser Val 465 470 475 480 Ser Leu Lys Lys Val Ser Gly Ile Lys Glu Glu Ile Lys Glu Pro Glu 485 490 495 Asn Ile Asn Ala Ala Leu Gln Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile Ser Ile 500 505 510 Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Ala Glu Pro Ala Pro 515 520 525 Asp Phe Ser Asp Tyr Ser Glu Met Ala Lys Val Glu Gln Pro Val Pro 530 535 540 Asp His Ser Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ser Glu Pro Val 545 550 555 560 Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro Asp Val Pro Gln Lys Gln Asp 565 570 575 Glu Thr Val Met Leu Val Lys Glu Ser Leu Thr Glu Thr Ser Phe Glu 580 585 590 Ser Met Ile Glu Tyr Glu Asn Lys Glu Lys Leu Ser Ala Leu Pro Pro 595 600 605 Glu Gly Gly Lys Pro Tyr Leu Glu Ser Phe Lys Leu Ser Leu Asp Asn 610 615 620 Thr Lys Asp Thr Leu Leu Pro Asp Glu Val Ser Thr Leu Ser Lys Lys 625 630 635 640 Glu Lys Ile Pro Leu Gln Met Glu Glu Leu Ser Thr Ala Val Tyr Ser 645 650 655 Asn Asp Asp Leu Phe Ile Ser Lys Glu Ala Gln Ile Arg Glu Thr Glu 660 665 670 Thr Phe Ser Asp Ser Ser Pro Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr 675 680 685 Leu Ile Ser Ser Lys Thr Asp Ser Phe Ser Lys Leu Ala Arg Glu Tyr 690 695 700 Thr Asp Leu Glu Val Ser His Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ala Pro Asp 705 710 715 720 Gly Ala Gly Ser Leu Pro Cys Thr Glu Leu Pro His Asp Leu Ser Leu 725 730 735 Lys Asn Ile Gln Pro Lys Val Glu Glu Lys Ile Ser Phe Ser Asp Asp 740 745 750 Phe Ser Lys Asn Gly Ser Ala Thr Ser Lys Val Leu Leu Leu Pro Pro 755 760 765 Asp Val Ser Ala Leu Ala Thr Gln Ala Glu Ile Glu Ser Ile Val Lys 770 775 780 Pro Lys Val Leu Val Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr 785 790 795 800 Glu Lys Glu Asp Arg Ser Pro Ser Ala Ile Phe Ser Ala Glu Leu Ser 805 810 815 Lys Thr Ser <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> BINDING <222> (1)..(10) <223> hypervariable part of heavy chain of 11C7 <400> 8 Gly Phe Asp Phe Arg Arg Asn Trp Met Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> BINDING <222> (1)..(17) <223> hypervariable part of heavy chain of 11C7 <400> 9 Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Lys Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 Asp <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> BINDING <222> (1)..(9) <223> hypervariable part of heavy chain of 11C7 <400> 10 Pro Val Trp Met Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> BINDING <222> (1)..(16) <223> hypervariable part of light chain of 11C7 <400> 11 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> BINDING <222> (1)..(7) <223> hypervariable part of light chain of 11C7 <400> 12 Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> BINDING <222> (1)..(9) <223> hypervariable part of light chain of 11C7 <400> 13 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gln Thr 1 5 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_binding <222> (1)..(30) <223> DNA-CDR1-11C7 <400> 14 ggattcgatt ttagaagaaa ttggatgagt 30 <210> 15 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_binding <222> (1)..(51) <223> DNA-CDR2-11C7 <400> 15 gaaattaatc cagatagcag taagataaac tatacgccat ctctaaagga t 51 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_binding <222> (1)..(27) <223> DNA-CDR3-11C7 <400> 16 ccggtctgga tgtatgctat ggactac 27 <210> 17 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_binding <222> (1)..(48) <223> DNA-CDR'1-11C7 <400> 17 aagtcaagtc agagcctctt gcatagtgat ggaaagacat atttgaat 48 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_binding <222> (1)..(21) <223> DNA-CDR'2-11C7 <400> 18 ctggtgtcta aactggactc t 21 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_binding <222> (1)..(27) <223> DNA-CDR'3-11C7 <400> 19 tggcaaggta cacattttcc tcagacg 27 <210> 20 <211> 54 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(54) <223> leader sequence for heavy chain of 11C7 <400> 20 atg gat ttt ggg ctg att ttt ttt att gtt ggt ctt tta aaa ggg gtc 48 Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Gly Leu Leu Lys Gly Val 1 5 10 15 cag tgt 54 Gln Cys <210> 21 <211> 18 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Gly Leu Leu Lys Gly Val 1 5 10 15 Gln Cys <210> 22 <211> 57 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(57) <223> leader sequence for 11C7-light chain <400> 22 atg agt cct gcc cag ttc ctg ttt ctg tta gtg ctc tgg att cgg gaa 48 Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg Glu 1 5 10 15 acc agc ggt 57 Thr Ser Gly <210> 23 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg Glu 1 5 10 15 Thr Ser Gly <210> 24 <211> 181 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(181) <223> human Nig-D20 <400> 24 Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys Met Asp Leu Val Gln Thr Ser 1 5 10 15 Glu Val Met Gln Glu Ser Leu Tyr Pro Ala Ala Gln Leu Cys Pro Ser 20 25 30 Phe Glu Glu Ser Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val 35 40 45 Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Ala Val Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val 50 55 60 Ile Gln Pro Ser Ser Ser Pro Leu Glu Ala Ser Ser Val Asn Tyr Glu 65 70 75 80 Ser Ile Lys His Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala Met 85 90 95 Ser Val Ser Leu Lys Lys Val Ser Gly Ile Lys Glu Glu Ile Lys Glu 100 105 110 Pro Glu Asn Ile Asn Ala Ala Leu Gln Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile 115 120 125 Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Ala Glu Pro 130 135 140 Ala Pro Asp Phe Ser Asp Tyr Ser Glu Met Ala Lys Val Glu Gln Pro 145 150 155 160 Val Pro Asp His Ser Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ser Glu 165 170 175 Pro Val Asp Leu Phe 180 <210> 25 <211> 3492 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1)..(3492) <223> rat NogoA <400> 25 atg gaa gac ata gac cag tcg tcg ctg gtc tcc tcg tcc acg gac agc 48 Met Glu Asp Ile Asp Gln Ser Ser Leu Val Ser Ser Ser Thr Asp Ser 1 5 10 15 ccg ccc cgg cct ccg ccc gcc ttc aag tac cag ttc gtg acg gag ccc 96 Pro Pro Arg Pro Pro Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Thr Glu Pro 20 25 30 gag gac gag gag gac gag gag gag gag gag gac gag gag gag gac gac 144 Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Asp 35 40 45 gag gac cta gag gaa ctg gag gtg ctg gag agg aag ccc gca gcc ggg 192 Glu Asp Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly 50 55 60 ctg tcc gca gct gcg gtg ccg ccc gcc gcc gcc gcg ccg ctg ctg gac 240 Leu Ser Ala Ala Ala Val Pro Pro Ala Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp 65 70 75 80 ttc agc agc gac tcg gtg ccc ccc gcg ccc cgc ggg ccg ctg ccg gcc 288 Phe Ser Ser Asp Ser Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala 85 90 95 gcg ccc cct gcc gct cct gag agg cag cca tcc tgg gaa cgc agc ccc 336 Ala Pro Pro Ala Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Glu Arg Ser Pro 100 105 110 gcg gcg ccc gcg cca tcc ctg ccg ccc gct gcc gca gtc ctg ccc tcc 384 Ala Ala Pro Ala Pro Ser Leu Pro Pro Ala Ala Ala Val Leu Pro Ser 115 120 125 aag ctc cca gag gac gac gag cct ccg gcg agg ccc ccg cct ccg ccg 432 Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro Pro Pro Pro 130 135 140 cca gcc ggc gcg agc ccc ctg gcg gag ccc gcc gcg ccc cct tcc acg 480 Pro Ala Gly Ala Ser Pro Leu Ala Glu Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr 145 150 155 160 ccg gcc gcg ccc aag cgc agg ggc tcc ggc tca gtg gat gag acc ctt 528 Pro Ala Ala Pro Lys Arg Arg Gly Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr Leu 165 170 175 ttt gct ctt cct gct gca tct gag cct gtg ata ccc tcc tct gca gaa 576 Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Pro Ser Ser Ala Glu 180 185 190 aaa att atg gat ttg atg gag cag cca ggt aac act gtt tcg tct ggt 624 Lys Ile Met Asp Leu Met Glu Gln Pro Gly Asn Thr Val Ser Ser Gly 195 200 205 caa gag gat ttc cca tct gtc ctg ctt gaa act gct gcc tct ctt cct 672 Gln Glu Asp Phe Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro 210 215 220 tct cta tct cct ctc tca act gtt tct ttt aaa gaa cat gga tac ctt 720 Ser Leu Ser Pro Leu Ser Thr Val Ser Phe Lys Glu His Gly Tyr Leu 225 230 235 240 ggt aac tta tca gca gtg tca tcc tca gaa gga aca att gaa gaa act 768 Gly Asn Leu Ser Ala Val Ser Ser Ser Glu Gly Thr Ile Glu Glu Thr 245 250 255 tta aat gaa gct tct aaa gag ttg cca gag agg gca aca aat cca ttt 816 Leu Asn Glu Ala Ser Lys Glu Leu Pro Glu Arg Ala Thr Asn Pro Phe 260 265 270 gta aat aga gat tta gca gaa ttt tca gaa tta gaa tat tca gaa atg 864 Val Asn Arg Asp Leu Ala Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met 275 280 285 gga tca tct ttt aaa ggc tcc cca aaa gga gag tca gcc ata tta gta 912 Gly Ser Ser Phe Lys Gly Ser Pro Lys Gly Glu Ser Ala Ile Leu Val 290 295 300 gaa aac act aag gaa gaa gta att gtg agg agt aaa gac aaa gag gat 960 Glu Asn Thr Lys Glu Glu Val Ile Val Arg Ser Lys Asp Lys Glu Asp 305 310 315 320 tta gtt tgt agt gca gcc ctt cac agt cca caa gaa tca cct gtg ggt 1008 Leu Val Cys Ser Ala Ala Leu His Ser Pro Gln Glu Ser Pro Val Gly 325 330 335 aaa gaa gac aga gtt gtg tct cca gaa aag aca atg gac att ttt aat 1056 Lys Glu Asp Arg Val Val Ser Pro Glu Lys Thr Met Asp Ile Phe Asn 340 345 350 gaa atg cag atg tca gta gta gca cct gtg agg gaa gag tat gca gac 1104 Glu Met Gln Met Ser Val Val Ala Pro Val Arg Glu Glu Tyr Ala Asp 355 360 365 ttt aag cca ttt gaa caa gca tgg gaa gtg aaa gat act tat gag gga 1152 Phe Lys Pro Phe Glu Gln Ala Trp Glu Val Lys Asp Thr Tyr Glu Gly 370 375 380 agt agg gat gtg ctg gct gct aga gct aat gtg gaa agt aaa gtg gac 1200 Ser Arg Asp Val Leu Ala Ala Arg Ala Asn Val Glu Ser Lys Val Asp 385 390 395 400 aga aaa tgc ttg gaa gat agc ctg gag caa aaa agt ctt ggg aag gat 1248 Arg Lys Cys Leu Glu Asp Ser Leu Glu Gln Lys Ser Leu Gly Lys Asp 405 410 415 agt gaa ggc aga aat gag gat gct tct ttc ccc agt acc cca gaa cct 1296 Ser Glu Gly Arg Asn Glu Asp Ala Ser Phe Pro Ser Thr Pro Glu Pro 420 425 430 gtg aag gac agc tcc aga gca tat att acc tgt gct tcc ttt acc tca 1344 Val Lys Asp Ser Ser Arg Ala Tyr Ile Thr Cys Ala Ser Phe Thr Ser 435 440 445 gca acc gaa agc acc aca gca aac act ttc cct ttg tta gaa gat cat 1392 Ala Thr Glu Ser Thr Thr Ala Asn Thr Phe Pro Leu Leu Glu Asp His 450 455 460 act tca gaa aat aaa aca gat gaa aaa aaa ata gaa gaa agg aag gcc 1440 Thr Ser Glu Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys Ile Glu Glu Arg Lys Ala 465 470 475 480 caa att ata aca gag aag act agc ccc aaa acg tca aat cct ttc ctt 1488 Gln Ile Ile Thr Glu Lys Thr Ser Pro Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu 485 490 495 gta gca gta cag gat tct gag gca gat tat gtt aca aca gat acc tta 1536 Val Ala Val Gln Asp Ser Glu Ala Asp Tyr Val Thr Thr Asp Thr Leu 500 505 510 tca aag gtg act gag gca gca gtg tca aac atg cct gaa ggt ctg acg 1584 Ser Lys Val Thr Glu Ala Ala Val Ser Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr 515 520 525 cca gat tta gtt cag gaa gca tgt gaa agt gaa ctg aat gaa gcc aca 1632 Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala Cys Glu Ser Glu Leu Asn Glu Ala Thr 530 535 540 ggt aca aag att gct tat gaa aca aaa gtg gac ttg gtc caa aca tca 1680 Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys Val Asp Leu Val Gln Thr Ser 545 550 555 560 gaa gct ata caa gaa tca ctt tac ccc aca gca cag ctt tgc cca tca 1728 Glu Ala Ile Gln Glu Ser Leu Tyr Pro Thr Ala Gln Leu Cys Pro Ser 565 570 575 ttt gag gaa gct gaa gca act ccg tca cca gtt ttg cct gat att gtt 1776 Phe Glu Glu Ala Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val 580 585 590 atg gaa gca cca tta aat tct ctc ctt cca agc gct ggt gct tct gta 1824 Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Leu Leu Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val 595 600 605 gtg cag ccc agt gta tcc cca ctg gaa gca cct cct cca gtt agt tat 1872 Val Gln Pro Ser Val Ser Pro Leu Glu Ala Pro Pro Pro Val Ser Tyr 610 615 620 gac agt ata aag ctt gag cct gaa aac ccc cca cca tat gaa gaa gcc 1920 Asp Ser Ile Lys Leu Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala 625 630 635 640 atg aat gta gca cta aaa gct ttg gga aca aag gaa gga ata aaa gag 1968 Met Asn Val Ala Leu Lys Ala Leu Gly Thr Lys Glu Gly Ile Lys Glu 645 650 655 cct gaa agt ttt aat gca gct gtt cag gaa aca gaa gct cct tat ata 2016 Pro Glu Ser Phe Asn Ala Ala Val Gln Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile 660 665 670 tcc att gcg tgt gat tta att aaa gaa aca aag ctc tcc act gag cca 2064 Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Thr Glu Pro 675 680 685 agt cca gat ttc tct aat tat tca gaa ata gca aaa ttc gag aag tcg 2112 Ser Pro Asp Phe Ser Asn Tyr Ser Glu Ile Ala Lys Phe Glu Lys Ser 690 695 700 gtg ccc gaa cac gct gag cta gtg gag gat tcc tca cct gaa tct gaa 2160 Val Pro Glu His Ala Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro Glu Ser Glu 705 710 715 720 cca gtt gac tta ttt agt gat gat tcg att cct gaa gtc cca caa aca 2208 Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro Glu Val Pro Gln Thr 725 730 735 caa gag gag gct gtg atg ctc atg aag gag agt ctc act gaa gtg tct 2256 Gln Glu Glu Ala Val Met Leu Met Lys Glu Ser Leu Thr Glu Val Ser 740 745 750 gag aca gta gcc cag cac aaa gag gag aga ctt agt gcc tca cct cag 2304 Glu Thr Val Ala Gln His Lys Glu Glu Arg Leu Ser Ala Ser Pro Gln 755 760 765 gag cta gga aag cca tat tta gag tct ttt cag ccc aat tta cat agt 2352 Glu Leu Gly Lys Pro Tyr Leu Glu Ser Phe Gln Pro Asn Leu His Ser 770 775 780 aca aaa gat gct gca tct aat gac att cca aca ttg acc aaa aag gag 2400 Thr Lys Asp Ala Ala Ser Asn Asp Ile Pro Thr Leu Thr Lys Lys Glu 785 790 795 800 aaa att tct ttg caa atg gaa gag ttt aat act gca att tat tca aat 2448 Lys Ile Ser Leu Gln Met Glu Glu Phe Asn Thr Ala Ile Tyr Ser Asn 805 810 815 gat gac tta ctt tct tct aag gaa gac aaa ata aaa gaa agt gaa aca 2496 Asp Asp Leu Leu Ser Ser Lys Glu Asp Lys Ile Lys Glu Ser Glu Thr 820 825 830 ttt tca gat tca tct ccg att gag ata ata gat gaa ttt ccc acg ttt 2544 Phe Ser Asp Ser Ser Pro Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr Phe 835 840 845 gtc agt gct aaa gat gat tct cct aaa tta gcc aag gag tac act gat 2592 Val Ser Ala Lys Asp Asp Ser Pro Lys Leu Ala Lys Glu Tyr Thr Asp 850 855 860 cta gaa gta tcc gac aaa agt gaa att gct aat atc caa agc ggg gca 2640 Leu Glu Val Ser Asp Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ile Gln Ser Gly Ala 865 870 875 880 gat tca ttg cct tgc tta gaa ttg ccc tgt gac ctt tct ttc aag aat 2688 Asp Ser Leu Pro Cys Leu Glu Leu Pro Cys Asp Leu Ser Phe Lys Asn 885 890 895 ata tat cct aaa gat gaa gta cat gtt tca gat gaa ttc tcc gaa aat 2736 Ile Tyr Pro Lys Asp Glu Val His Val Ser Asp Glu Phe Ser Glu Asn 900 905 910 agg tcc agt gta tct aag gca tcc ata tcg cct tca aat gtc tct gct 2784 Arg Ser Ser Val Ser Lys Ala Ser Ile Ser Pro Ser Asn Val Ser Ala 915 920 925 ttg gaa cct cag aca gaa atg ggc agc ata gtt aaa tcc aaa tca ctt 2832 Leu Glu Pro Gln Thr Glu Met Gly Ser Ile Val Lys Ser Lys Ser Leu 930 935 940 acg aaa gaa gca gag aaa aaa ctt cct tct gac aca gag aaa gag gac 2880 Thr Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu Asp 945 950 955 960 aga tcc ctg tca gct gta ttg tca gca gag ctg agt aaa act tca gtt 2928 Arg Ser Leu Ser Ala Val Leu Ser Ala Glu Leu Ser Lys Thr Ser Val 965 970 975 gtt gac ctc ctc tac tgg aga gac att aag aag act gga gtg gtg ttt 2976 Val Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe 980 985 990 ggt gcc agc tta ttc ctg ctg ctg tct ctg aca gtg ttc agc att gtc 3024 Gly Ala Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val 995 1000 1005 agt gta acg gcc tac att gcc ttg gcc ctg ctc tcg gtg act atc 3069 Ser Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile 1010 1015 1020 agc ttt agg ata tat aag ggc gtg atc cag gct atc cag aaa tca 3114 Ser Phe Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser 1025 1030 1035 gat gaa ggc cac cca ttc agg gca tat tta gaa tct gaa gtt gct 3159 Asp Glu Gly His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala 1040 1045 1050 ata tca gag gaa ttg gtt cag aaa tac agt aat tct gct ctt ggt 3204 Ile Ser Glu Glu Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly 1055 1060 1065 cat gtg aac agc aca ata aaa gaa ctg agg cgg ctt ttc tta gtt 3249 His Val Asn Ser Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val 1070 1075 1080 gat gat tta gtt gat tcc ctg aag ttt gca gtg ttg atg tgg gtg 3294 Asp Asp Leu Val Asp Ser Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val 1085 1090 1095 ttt act tat gtt ggt gcc ttg ttc aat ggt ctg aca cta ctg att 3339 Phe Thr Tyr Val Gly Ala Leu Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile 1100 1105 1110 tta gct ctg atc tca ctc ttc agt att cct gtt att tat gaa cgg 3384 Leu Ala Leu Ile Ser Leu Phe Ser Ile Pro Val Ile Tyr Glu Arg 1115 1120 1125 cat cag gtg cag ata gat cat tat cta gga ctt gca aac aag agt 3429 His Gln Val Gln Ile Asp His Tyr Leu Gly Leu Ala Asn Lys Ser 1130 1135 1140 gtt aag gat gcc atg gcc aaa atc caa gca aaa atc cct gga ttg 3474 Val Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gln Ala Lys Ile Pro Gly Leu 1145 1150 1155 aag cgc aaa gca gat tga 3492 Lys Arg Lys Ala Asp 1160 <210> 26 <211> 1163 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 26 Met Glu Asp Ile Asp Gln Ser Ser Leu Val Ser Ser Ser Thr Asp Ser 1 5 10 15 Pro Pro Arg Pro Pro Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Thr Glu Pro 20 25 30 Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Asp 35 40 45 Glu Asp Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly 50 55 60 Leu Ser Ala Ala Ala Val Pro Pro Ala Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp 65 70 75 80 Phe Ser Ser Asp Ser Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala 85 90 95 Ala Pro Pro Ala Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Glu Arg Ser Pro 100 105 110 Ala Ala Pro Ala Pro Ser Leu Pro Pro Ala Ala Ala Val Leu Pro Ser 115 120 125 Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro Pro Pro Pro 130 135 140 Pro Ala Gly Ala Ser Pro Leu Ala Glu Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr 145 150 155 160 Pro Ala Ala Pro Lys Arg Arg Gly Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr Leu 165 170 175 Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Pro Ser Ser Ala Glu 180 185 190 Lys Ile Met Asp Leu Met Glu Gln Pro Gly Asn Thr Val Ser Ser Gly 195 200 205 Gln Glu Asp Phe Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro 210 215 220 Ser Leu Ser Pro Leu Ser Thr Val Ser Phe Lys Glu His Gly Tyr Leu 225 230 235 240 Gly Asn Leu Ser Ala Val Ser Ser Ser Glu Gly Thr Ile Glu Glu Thr 245 250 255 Leu Asn Glu Ala Ser Lys Glu Leu Pro Glu Arg Ala Thr Asn Pro Phe 260 265 270 Val Asn Arg Asp Leu Ala Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met 275 280 285 Gly Ser Ser Phe Lys Gly Ser Pro Lys Gly Glu Ser Ala Ile Leu Val 290 295 300 Glu Asn Thr Lys Glu Glu Val Ile Val Arg Ser Lys Asp Lys Glu Asp 305 310 315 320 Leu Val Cys Ser Ala Ala Leu His Ser Pro Gln Glu Ser Pro Val Gly 325 330 335 Lys Glu Asp Arg Val Val Ser Pro Glu Lys Thr Met Asp Ile Phe Asn 340 345 350 Glu Met Gln Met Ser Val Val Ala Pro Val Arg Glu Glu Tyr Ala Asp 355 360 365 Phe Lys Pro Phe Glu Gln Ala Trp Glu Val Lys Asp Thr Tyr Glu Gly 370 375 380 Ser Arg Asp Val Leu Ala Ala Arg Ala Asn Val Glu Ser Lys Val Asp 385 390 395 400 Arg Lys Cys Leu Glu Asp Ser Leu Glu Gln Lys Ser Leu Gly Lys Asp 405 410 415 Ser Glu Gly Arg Asn Glu Asp Ala Ser Phe Pro Ser Thr Pro Glu Pro 420 425 430 Val Lys Asp Ser Ser Arg Ala Tyr Ile Thr Cys Ala Ser Phe Thr Ser 435 440 445 Ala Thr Glu Ser Thr Thr Ala Asn Thr Phe Pro Leu Leu Glu Asp His 450 455 460 Thr Ser Glu Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys Ile Glu Glu Arg Lys Ala 465 470 475 480 Gln Ile Ile Thr Glu Lys Thr Ser Pro Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu 485 490 495 Val Ala Val Gln Asp Ser Glu Ala Asp Tyr Val Thr Thr Asp Thr Leu 500 505 510 Ser Lys Val Thr Glu Ala Ala Val Ser Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr 515 520 525 Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala Cys Glu Ser Glu Leu Asn Glu Ala Thr 530 535 540 Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys Val Asp Leu Val Gln Thr Ser 545 550 555 560 Glu Ala Ile Gln Glu Ser Leu Tyr Pro Thr Ala Gln Leu Cys Pro Ser 565 570 575 Phe Glu Glu Ala Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val 580 585 590 Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Leu Leu Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val 595 600 605 Val Gln Pro Ser Val Ser Pro Leu Glu Ala Pro Pro Pro Val Ser Tyr 610 615 620 Asp Ser Ile Lys Leu Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala 625 630 635 640 Met Asn Val Ala Leu Lys Ala Leu Gly Thr Lys Glu Gly Ile Lys Glu 645 650 655 Pro Glu Ser Phe Asn Ala Ala Val Gln Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile 660 665 670 Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Thr Glu Pro 675 680 685 Ser Pro Asp Phe Ser Asn Tyr Ser Glu Ile Ala Lys Phe Glu Lys Ser 690 695 700 Val Pro Glu His Ala Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro Glu Ser Glu 705 710 715 720 Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro Glu Val Pro Gln Thr 725 730 735 Gln Glu Glu Ala Val Met Leu Met Lys Glu Ser Leu Thr Glu Val Ser 740 745 750 Glu Thr Val Ala Gln His Lys Glu Glu Arg Leu Ser Ala Ser Pro Gln 755 760 765 Glu Leu Gly Lys Pro Tyr Leu Glu Ser Phe Gln Pro Asn Leu His Ser 770 775 780 Thr Lys Asp Ala Ala Ser Asn Asp Ile Pro Thr Leu Thr Lys Lys Glu 785 790 795 800 Lys Ile Ser Leu Gln Met Glu Glu Phe Asn Thr Ala Ile Tyr Ser Asn 805 810 815 Asp Asp Leu Leu Ser Ser Lys Glu Asp Lys Ile Lys Glu Ser Glu Thr 820 825 830 Phe Ser Asp Ser Ser Pro Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr Phe 835 840 845 Val Ser Ala Lys Asp Asp Ser Pro Lys Leu Ala Lys Glu Tyr Thr Asp 850 855 860 Leu Glu Val Ser Asp Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ile Gln Ser Gly Ala 865 870 875 880 Asp Ser Leu Pro Cys Leu Glu Leu Pro Cys Asp Leu Ser Phe Lys Asn 885 890 895 Ile Tyr Pro Lys Asp Glu Val His Val Ser Asp Glu Phe Ser Glu Asn 900 905 910 Arg Ser Ser Val Ser Lys Ala Ser Ile Ser Pro Ser Asn Val Ser Ala 915 920 925 Leu Glu Pro Gln Thr Glu Met Gly Ser Ile Val Lys Ser Lys Ser Leu 930 935 940 Thr Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu Asp 945 950 955 960 Arg Ser Leu Ser Ala Val Leu Ser Ala Glu Leu Ser Lys Thr Ser Val 965 970 975 Val Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe 980 985 990 Gly Ala Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val 995 1000 1005 Ser Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile 1010 1015 1020 Ser Phe Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser 1025 1030 1035 Asp Glu Gly His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala 1040 1045 1050 Ile Ser Glu Glu Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly 1055 1060 1065 His Val Asn Ser Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val 1070 1075 1080 Asp Asp Leu Val Asp Ser Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val 1085 1090 1095 Phe Thr Tyr Val Gly Ala Leu Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile 1100 1105 1110 Leu Ala Leu Ile Ser Leu Phe Ser Ile Pro Val Ile Tyr Glu Arg 1115 1120 1125 His Gln Val Gln Ile Asp His Tyr Leu Gly Leu Ala Asn Lys Ser 1130 1135 1140 Val Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gln Ala Lys Ile Pro Gly Leu 1145 1150 1155 Lys Arg Lys Ala Asp 1160 <210> 27 <211> 25 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(25) <223> rat PEP4 <400> 27 Glu Glu Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn 1 5 10 15 Ser Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu 20 25 <210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRO/SER rich peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Synthetic peptide <400> 28 Pro Ser Ser Pro Pro Pro Ser Ser Pro Pro Pro Ser Ser Pro Pro Pro 1 5 10 15 Ser <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA-NA-2F <220> <221> primer_bind <222> (1)..(25) <223> CA-NA-2F primer <400> 29 aagcaccatt gaattctgca gttcc 25 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA-NA-3R <220> <221> primer_bind <222> (1)..(28) <223> <400> 30 aactgcagta ctgagctcct ccatctgc 28 <210> 31 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward 5' <220> <221> primer_bind <222> (1)..(33) <223> forward primer <400> 31 gtcgcggatc catggagacc ctttttgctc ttc 33 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse 5' <220> <221> primer_bind <222> (1)..(27) <223> reverse primer <400> 32 gttctcgagt tatgaagttt tactcag 27 <210> 33 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward 5'-1 <220> <221> primer_bind <222> (1)..(29) <223> primer <400> 33 gtgcggatcc atggatttga aggagcagc 29 <210> 34 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse 5'-1 <220> <221> primer_bind <222> (1)..(28) <223> primer <400> 34 gtttctcgag tgaagtttta ttcagctc 28 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cccctgttga ag 32 <210> 41 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-VH leader <220> <221> primer_bind <222> (1)..(31) <223> primer <400> 41 aatatggatt ttgggctgat tttttttatt g 31 <210> 42 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-CH hinge <220> <221> primer_bind <222> (1)..(24) <223> primer <400> 42 aattgggcaa cgttgcaggt gacg 24 <210> 43 <211> 663 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_binding <222> (1)..(663) <223> DNA variable part of heavy chain 11C7 <400> 43 atggattttg ggctgatttt ttttattgtt ggtcttttaa aaggggtcca gtgtgaggtg 60 aagcttctcg agtctggagg tggcctggtg cagcctggag gatccctgaa actctcctgt 120 gtagtctcag gattcgattt tagaagaaat tggatgagtt gggtccggca ggctcctggg 180 aaagggctag aatggattgg agaaattaat ccagatagca gtaagataaa ctatacgcca 240 tctctaaagg ataaattcat catctccaga gacaatgcca agaatacgct gtacctgcaa 300 gtgagcacag tgagatctga ggacacagcc ctttattact gtgtgagacc ggtctggatg 360 tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctcagc caaaacgaca 420 cccccatctg tctatccact ggcccctgga tctgctgccc aaactaactc catggtgacc 480 ctgggatgcc tggtcaaggg ctatttccct gagccagtga cagtgacctg gaactctgga 540 tccctgtcca gcggtgtgca caccttccca gctgtcctgc agtctgacct ctacactctg 600 agcagctcag tgactgtccc ctccagcacc tggcccagcg agaccgtcac ctgcaacgtt 660 gcc 663 <210> 44 <211> 717 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_binding <222> (1)..(717) <223> variable part of light chain of 11C7 <400> 44 atgagtcctg cccagttcct gtttctgtta gtgctctgga ttcgggaaac cagcggtgat 60 gttctgttga cccagactcc tctcactttg tcgataacca ttggacaacc agcctccatc 120 tcttgcaagt caagtcagag cctcttgcat agtgatggaa agacatattt gaattggttg 180 ttacagaggc caggccagtc tccaaagcgc ctaatctatc tggtgtctaa actggactct 240 ggagtccctg acaggttcac tggcagtgga tcagggacgg atttcacact gaaaatcagc 300 agagtggagg ctgaggattt gggactttat tattgctggc aaggtacaca ttttcctcag 360 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420 atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480 aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540 aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600 agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660 actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggggaga gtgttag 717

Claims

서열 내에 초가변 영역인 서열 8의 CDR1-11C7, 서열 9의 CDR2-11C7 및 서열 10의 CDR3-11C7; 및

서열 내에 초가변 영역인 서열 11의 CDR1'-11C7, 서열 12의 CDR2'-11C7 및 서열 13의 CDR3'-11C7

을 포함하는 1개 이상의 항원 결합 부위를 포함하며, 서열 6의 인간 NogoA 폴리펩티드에 결합할 수 있는, 키메라 또는 인간화 모노클로날 항체, 또는 그의 F(ab')2 또는 Fab 단편, 단일 쇄 항체, 또는 단일 도메인 항체.
제1항에 있어서, 인간 중쇄의 불변부 및 인간 경쇄의 불변부를 더 포함하는 항체 또는 그의 단편.
제2항에 있어서, 인간 중쇄의 불변부가 γ4형이고, 인간 경쇄의 불변부가 κ형인 항체 또는 그의 단편.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제4항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
제1항에 따른 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상용가능한 숙주 세포에 존재하는 경우 제1항의 항체 또는 그의 단편을 생성할 수 있는 것인 발현 벡터.
제2항에 따른 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상용가능한 숙주 세포에 존재하는 경우 제2항의 항체 또는 그의 단편을 생성할 수 있는 것인 발현 벡터.
제3항에 따른 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상용가능한 숙주 세포에 존재하는 경우 제3항의 항체 또는 그의 단편을 생성할 수 있는 것인 발현 벡터.
제5항에 따른 발현 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 단편을 1종 이상의 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 포함하는, 척수 상해(spinal cord injury)를 치료하기 위한 제약 조성물.
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