TWI429656B - 改良之ｎｏｇｏ－ａ結合分子及其醫藥用途 - Google Patents

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Description

改良之NOGO-A結合分子及其醫藥用途
本發明係關於改良之NogoA結合分子，例如單株抗體、其衍生物或Fab片段。
由於存在包蓋軸突之抑制髓磷脂環境及瘢痕組織形成，成人中樞神經系統(CNS)損傷後之神經元再生受到限制。在最近幾年中，對CNS為何不能在損傷後本身自發修復之分子理解已獲得重要見解。髓磷脂中之抑制分子係軸突再生之主要阻礙物，尤其在剛剛發生損傷之後。迄今為止，NogoA、髓磷脂相關糖蛋白(MAG)及髓磷脂-少突神經膠質細胞糖蛋白(OMgp)已經鑒定為神經突增生之強效抑制劑。另外，髓磷脂亦含有諸如硫酸軟骨素蛋白聚糖等其他抑制組份。Nogo-A係網膜蛋白家族成員且其具有至少兩個稱為胺基-Nogo及Nogo-66之具有生物活性且藥理學上不同之結構域。儘管迄今為止吾人並不瞭解前者之受體位點，但Nogo-66在活體外及活體內經由神經元受體NgR抑制神經元生長。除Nogo-66外，MAG及OMgp亦以高親和力與NgR結合而抑制神經突增生。
當前所尋求之用於增強神經修復的新研究方法包括使用酶軟骨素酶ABC來消化瘢痕組織、使用嗅鞘細胞及幹細胞及蛋白生長因子來促進神經元生長之橋接技術。神經突增生抑制劑之阻斷作用可藉由調節諸如Rho(膜結合鳥苷三磷酸酶(GTPase))等細胞內信號傳導介體來達成，此似乎為抑制軸突生長之重要環節。環磷酸腺苷(cAMP)可在活體外克服與髓磷脂有關之抑制並在活體內誘導再生。NgR受體之肽抑制劑(NEP 1-40)可用於在大鼠脊柱損傷後誘導神經元再生及功能恢復。
除使用上文所述方法外，亦把較多注意力集中在使用一些單株抗體來中和中樞及周圍神經系統之神經突生長抑制分子(尤其中和NogoA之神經突生長抑制活性)上。因此，已顯示，單株抗體IN-1或其IN-1 Fab片段可在活體外誘導神經突增生並在活體內增強萌芽及再生(Schwab ME等人(1996)Physiol. Rev. 76,319-370)。IN-1之替代抗體亦闡述於WO 2004/052932(11C7-Ab)及WO 2005/028508(3A6-Ab)中。針對神經突生長抑制活性對NogoA之不同結構域實施測試已描繪出該分子之數個抑制結構域(Chen等人(2000)Nature 403，434-439；GrandPre等人，(2000)Nature 403，439-444；Prinjha等人(2000)Nature 403，383-384)。
天然免疫球蛋白或抗體包含通常呈Y形之多聚體分子，該多聚體分子在每一上臂末端皆具有抗原結合位點。該結構之剩餘部分(尤其Y之莖幹)介導與免疫球蛋白有關之效應子功能。抗體由2條重鏈及2條輕鏈組成。重鏈及輕鏈二者均包含可變結構域及恆定部分。抗原結合位點由重鏈之可變結構域與輕鏈之可變結構域組成。重鏈及輕鏈之可變結構域具有相同之一般結構。更具體而言，抗體之抗原結合特徵實質上係由重鏈及輕鏈可變結構域中之3個特定區域決定，其稱為超變區或互補決定區(CDR)。該等3個超變區與序列相對保守且不直接參與結合之4個框架區(FR)交替。CDR形成環並藉由大多採取β-折疊構象之框架區緊密結合在一起。重鏈之CDR與相關輕鏈之CDR一起實質上構成抗體分子之抗原結合位點。確定什麽構成FR或CDR區通常藉由比較在相同物種中培育之多種抗體的胺基酸序列來實施。用於鑒定CDR及FR區之一般規則係熟習此項技術者之一般知識且可見於(例如)網站(www.bioinf.org.uk/abs/)。
概言之，現仍明確需要在成人中樞神經系統(CNS)損傷後誘導神經組織再生之新穎及改良方法。
本發明係關於新穎單株人類抗體，其在活體外及活體內實驗中在調節NogoA活性態樣具有優良特性且對成人中樞神經系統(CNS)損傷後之神經元再生具有正性影響。因此，本發明提供NogoA蛋白之新穎結合分子或其片段。
因此，在一個實施例中，本發明提供包含至少一個抗原結合位點之經分離分子，該抗原結合位點與人類NogoA多肽(SEQ ID NO:2)或人類NiG(SEQ ID NO:3)特異性結合，該抗原結合位點按順序包含：
*超變區CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，其中該等超變區中之每一者分別與超變區CDR-H1-6A3(SEQ ID NO:8)、CDR-H2-6A3(SEQ ID NO:9)及CDR-H3-6A3(SEQ ID NO:10)具有至少90%之一致性；及
*超變區CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，其中該等超變區中之每一者分別與超變區CDR-L1-6A3(SEQ ID NO:11)、CDR-L2-6A3(SEQ ID NO:12)及CDR-L3-6A3(SEQ ID NO:13)具有至少90%之一致性。
在又一實施例中，本發明之該經分離分子之抗原結合位點按順序包含：
*超變區CDR-H1-6A3(SEQ ID NO:8)、CDR-H2-6A3(SEQ ID NO:9)及CDR-H3-6A3(SEQ ID NO:10)；及
*超變區CDR-L1-6A3(SEQ ID NO:11)、CDR-L2-6A3(SEQ ID NO:12)及CDR-L3-6A3(SEQ ID NO:13)。
在再一實施例中，本發明提供包含以下之結合分子：
*至少一種免疫球蛋白重鏈或其片段，其包含(i)按順序包含超變區CDR-H1-6A3(SEQ ID NO:8)、CDR-H2-6A3(SEQ ID NO:9)及CDR-H3-6A3(SEQ ID NO:10)之可變結構域及(ii)人類重鏈之恆定部分或其片段；及
*至少一種免疫球蛋白輕鏈或其片段，其包含(i)按順序包含超變區CDR-L1-6A3(SEQ ID NO:11)、CDR-L2-6A3(SEQ ID NO:12)及CDR-L3-6A3(SEQ ID NO:13)之可變結構域及(ii)人類輕鏈之恆定部分或其片段。
在另一實施例中，本發明結合分子之離解常數小於1000nM。
在本發明結合分子之替代實施例中，人類重鏈之恆定部分或其片段為γ4型且人類輕鏈之恆定部分或其片段為κ型。
在又一實施例中，本發明結合分子係人類或嵌合或人類化單株抗體。
在再一實施例中，本發明結合分子包含一或多種選自由下列組成之群之多肽序列：SEQ ID NO:4(IgG1重鏈)、SEQ ID NO:5(IgG1輕鏈)、SEQ ID NO:24(IgG4重鏈)及SEQ ID NO:25(IgG4輕鏈)。
另外，本發明亦提供包含編碼本發明結合分子之核酸序列的經分離聚核苷酸。
在某些實施例中，本發明之該經分離聚核苷酸包含：
*至少一種選自由SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16組成之群之聚核苷酸序列；或
*至少一種選自由SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:19組成之群之聚核苷酸序列。
在較佳實施例中，本發明之該聚核苷酸包含：
*按順序包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16之聚核苷酸序列；及
*按順序包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:19之聚核苷酸序列。
在再一較佳實施例中，本發明之該聚核苷酸包含：
*SEQ ID NO:6之聚核苷酸序列及/或SEQ ID NO:7之聚核苷酸序列；或
*SEQ ID NO:26之聚核苷酸序列及/或SEQ ID NO:28之聚核苷酸序列。
另外，本發明亦提供包含如上所述之本發明聚核苷酸之表現載體。
而且，本發明提供包含如上所述之表現載體之表現系統，其中當該表現系統或其部分存在於相容性宿主細胞中時該表現系統或其部分能夠產生如上所述之本發明多肽。
另外，本發明亦提供包含如上所述載體之經分離宿主細胞。
另外，本發明亦提供包含本發明結合分子及載劑之經分離組合物。
另外，本發明亦提供包含本發明聚核苷酸及載劑之經分離組合物。
另外，本發明亦提供包含本發明表現載體或本發明宿主細胞之經分離組合物。
本發明進一步提供向需要治療周圍神經系統(PNS)及/或中樞神經系統(CNS)疾病之人投與本發明結合分子的方法。
本發明亦提供醫藥組合物，其分別包含本發明結合分子、本發明聚核苷酸、本發明表現載體或表現系統、或本發明宿主細胞與至少一種醫藥上可接受之載劑或稀釋劑。在某些實施例中，該醫藥組合物係緩慢釋放組合物。本發明進一步提供治療周圍神經系統(PNS)及/或中樞神經系統(CNS)疾病之方法，其包含向需要該治療之個體分別投與有效量之本發明結合分子、本發明聚核苷酸、本發明表現載體或系統、或本發明宿主細胞。在較佳實施例中，該疾病係選自由下列組成之群之神經變性疾病：阿茲海默氏症(Alzheimer disease)、帕金森氏症(Parkinson disease)、肌萎縮側索硬化(ALS)、路易體類病狀(Lewy like pathologies)或其他一般癡呆症、顱、大腦或脊柱創傷後疾病、中風及脫髓鞘疾病。在又一較佳實施例中，脫髓鞘疾病係選自由下列組成之群：多發性硬化、單相脫髓鞘、腦脊髓炎、多竈性白質腦病、全腦炎、馬畢二氏病(Marchiafava-Bignami disease)、腦橋髓鞘溶解、腎上腺腦白質營養不良、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、海綿狀變性、亞歷山大氏病(Alexander's disease)、卡納萬病(Canavan's disease)、異染性腦白質營養不良及克利伯氏病(Krabbe's disease)。
或者，該疾病係與視網膜細胞或角膜細胞變性直接或間接相關之變性眼睛病症。在較佳實施例中，變性眼睛病症係選自由下列組成之群：缺血性視網膜病變、前部缺血性視神經病變、視神經炎、年齡相關性黃斑變性、糖尿病性視網膜病變、囊樣黃斑水腫(CME)、色素性視網膜炎、斯塔加特病(Stargardt's disease)、百斯特氏卵黃樣視網膜變性、利伯氏先天性黑矇(Leber's congenital amaurosis)及其他遺傳性視網膜變性、病理性近視、早產兒視網膜病變、及利伯氏遺傳性視神經病變(Leber's hereditary optic neuropathy)、角膜移植或屈光性角膜手術之後效應、及皰疹性角膜炎。
或者，該疾病係精神病病狀。較佳地，該精神病病狀係選自由精神分裂症及抑鬱症組成之群。
在上文所述之治療方法中，較佳經顱內或鞘內實施投與。
另外，本發明亦提供產生本發明結合分子之方法，其包含藉助重組DNA技術或藉助化學合成在本發明表現載體或系統中表現本發明聚核苷酸。
而且，本發明提供在損傷部位局部投與本發明醫藥組合物之方法。
最後，本發明亦提供一種方法，其包含以組合製劑形式投與一或多種以下選自由本發明結合分子、本發明聚核苷酸、本發明表現載體或系統、本發明宿主細胞組成之群之產品以同時、分別或依序用於治療周圍神經系統(PNS)及/或中樞神經系統(CNS)疾病。
本發明進一步提供藉助重組DNA技術或藉助化學合成產生本發明結合分子及編碼該結合分子之聚核苷酸、表現載體的方法。
本發明亦提供醫藥組合物，其包含本發明結合分子、聚核苷酸、表現載體或系統或宿主細胞與至少一種醫藥上可接受之載劑或稀釋劑。本發明亦提供含有該結合分子、聚核苷酸、表現載體或系統或該宿主細胞、或其藥理學上可接受之衍生物的產品，該產品以組合製劑形式同時、分別或依序用於治療周圍神經系統(PNS)及/或中樞神經系統(CNS)疾病。
本發明亦涵蓋治療周圍神經系統(PNS)及/或中樞神經系統(CNS)疾病之方法，該方法包含向需要該治療之個體投與有效量之本發明結合分子、聚核苷酸、表現載體或系統或宿主細胞。
本發明在實例中進一步指出，該等藥理學組合物及產品可用於緩慢釋放該結合分子及/或使該結合分子局部沈積於損傷部位。
在尋求可使成人中樞神經系統(CNS)損傷後神經元再生的新穎及改良方法中，現已令人驚奇地發現，由Medarex公司基因重構小鼠(其中人類免疫球蛋白基因代替其鼠科動物對應物)以HuMab-小鼠TM (HuMab-mouseTM )產生之新穎單株人類抗體6A3在活體外及活體內實驗中在調節NogoA活性態樣具有優良特性。在人類NiG下培育6A3，該6A3為IgG同種型且比先前技術中所述之NogoA抗體具有較佳特性。現在可以構建與該6A3抗體具有相同超變區之其他NogoA結合分子以創建具有6A3之較佳特性的新穎抗體。6A3-Ab之衍生物6A3-IgG4及6A3-Fab分別以0.14nM及1.1nM之高親和力識別人類NiG。而且，本發明抗體顯示高穩定性及較長之活體外及活體內高半衰期及保留性。最後，本發明之結合分子及抗體展示自引入部位緩慢釋放，使該等結合分子能夠局部沈積於損傷部位。已在藉由連續輸注之脊髓損傷動物及患者中檢測到高腦脊液(CSF)6A3抗體濃度。在(例如)腦脊液中6A3-Ab之保留性及停留性令人驚奇地高，此使得能夠使用濃注(例如每週1-3次，儘管甚至較長之間隔每2、3或4週一次亦可行)代替連續輸注將抗體注射至腦脊液中。可使用重複鞘內濃注。在較佳實施例中，投與係通過鞘內投與來實施，例如使用與便攜式幫浦連接之外部化導管。在又一較佳實施例中，使用鞘內濃注。實驗部分進一步闡釋本發明結合分子之較佳特性。
因此，本發明提供NogoA或NiG之結合分子(下文中稱為"本發明結合分子"或簡稱為"結合分子")。較佳地，本發明之結合分子較佳以小於1000nM之離解常數(Kd)、或以高達且包括100nM之Kd、更佳以小於100nM之Kd、或以高達且包括100nM之Kd、最佳以小於10nM之Kd、或以高達且包括10nM之Kd結合人類NogoA蛋白(SEQ ID NO:2，由SEQ ID NO:1編碼)或人類NiG蛋白(其係NogoA之最強效神經突增生抑制片段且以人類NogoA之第186號胺基酸開始且以人類NogoA之第1004號胺基酸結束，=SEQ ID NO:3)。結合反應可藉由標準方法(包括定性及定量分析法二者)顯示，包括(例如)西方印迹法、免疫沈澱法及生物感測器親和力方法(參見實例4)。另外，本發明結合分子與人類NogoA及人類NiG之結合及該等結合分子在功能分析法中之功效可在(例如)下文所述之神經突增生分析法中顯示。
因此，在又一較佳實施例中，與用不與人類NogoA多肽或人類NiG多肽結合(即離解常數大於1000nM)之對照抗體處理之大鼠小腦顆粒細胞神經突的數量相比，本發明結合分子(濃度為100μg/ml，較佳為10μg/ml，更佳為1.0μg/ml，甚至更佳為0.1μg/ml)使猴腦蛋白提取物受質上之大鼠小腦顆粒細胞神經突的數量增加至少20%、較佳50%、最佳80%。
在另一實施例中，本發明係關於包含至少一個抗原結合位點之經分離分子，該抗原結合位點與人類NogoA多肽(SEQ ID NO:2)或人類NiG多肽(SEQ ID NO:3)特異性結合，該抗原結合位點包含：
*超變區CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之至少一個，其中該等超變區中之每一者分別與超變區CDR-H1-6A3(SEQ ID NO:8)、CDR-H2-6A3(SEQ ID NO:9)及CDR-H3-6A3(SEQ ID NO:10)具有至少90%之一致性；及
*超變區CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之至少一個，其中該等超變區中之每一者分別與超變區CDR-L1-6A3(SEQ ID NO:11)、CDR-L2-6A3(SEQ ID NO:12)及CDR-L3-6A3(SEQ ID NO:13)具有至少90%之一致性。
當CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3或CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3存在於本發明結合分子中時，可確保特異性識別人類NogA或NiG。儘管如此，熟習此項技術者習知即使在該結合分子中僅存在一個CDR結構域亦足以確保與所識別分子特異性結合。片語"至少一個超變區"意指1個、或2個或3個超變區。片語"具有至少90%一致性"意指一致性大於90%，較佳一致性大於91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%。兩個胺基酸序列之間之一致性百分比可使用分析兩個或更多個胺基酸序列一致性之相對一致性之電腦算法來測定，例如，美國國立衛生研究院(the National Institutes of Health)網站上之基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST)，Altschul等人，1994，Nature Genetics，6:119-129；Altschul等人，1990，J. Mol. Biol. 215:403-410；Altschul等人，1997，Nucleic Acids Research，25:1389-1402；Karlin及Altschul，1990 PNAS，87:2264-68；Karlin及Altschul，1993 PNAS，90:5873-68。
本發明係關於包含至少一個抗原結合位點之經分離分子，該抗原結合位點以小於1000nM之離解常數與人類NogoA多肽(SEQ ID NO:2)或人類NiG(SEQ ID NO:3)特異性結合，該抗原結合位點包含:
*至少超變區CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，其中該等超變區中之每一者分別與超變區CDR-H1-6A3(SEQ ID NO:8)、CDR-H2-6A3(SEQ ID NO:9)及CDR-H3-6A3(SEQ ID NO:10)具有至少90%之一致性；及
*至少超變區CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，其中該等超變區中之每一者分別與超變區CDR-L1-6A3(SEQ ID NO:11)、CDR-L2-6A3(SEQ ID NO:12)及CDR-L3-6A3(SEQ ID NO:13)具有至少90%之一致性。
片語"按順序包含超變區之抗原結合位點"涵蓋其中超變區彼此不鄰接之抗原結合位點；較佳地該等抗體區域中插入抗體框架區、或為非抗體框架序列之序列，較佳為人類抗體框架區。
根據本發明，該結合分子亦可包含至少一個抗原結合位點，該抗原結合位點按順序包含:
*超變區CDR-H1-6A3(SEQ ID NO:8)、CDR-H2-6A3(SEQ ID NO:9)及CDR-H3-6A3(SEQ ID NO:10)；或
*超變區CDR-L1-6A3(SEQ ID NO:11)、CDR-L2-6A3(SEQ ID NO:12)及CDR-L3-6A3(SEQ ID NO:13)；或
*與該等超變區之序列具有至少90%一致性之其直接等效物。片語"具有至少90%一致性"意指一致性大於90%，較佳一致性大於91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%。
根據本發明，該結合分子亦可包含：
*第一抗原結合位點，其按順序包含超變區CDR-H1-6A3(SEQ ID NO:8)、CDR-H2-6A3(SEQ ID NO:9)及CDR-H3-6A3(SEQ ID NO:10)；及
*第二抗原結合位點，其按順序包含超變區CDR-L1-6A3(SEQ ID NO:11)、CDR-L2-6A3(SEQ ID NO:12)及CDR-L3-6A3(SEQ ID NO:13)；或
*與該等超變區之序列具有至少90%一致性之其直接等效物。具有至少90%一致性意指一致性大於90%，較佳大於91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%。
根據本發明，該結合分子亦可包含：
*至少一種免疫球蛋白重鏈或其片段，其包含(i)按順序包含超變區CDR-H1-6A3(SEQ ID NO:8)、CDR-H2-6A3(SEQ ID NO:9)及CDR-H3-6A3(SEQ ID NO:10)之可變結構域及(ii)人類重鏈之恆定部分或其片段；及
*至少一種免疫球蛋白輕鏈或其片段，其包含(i)按順序包含超變區CDR-L1-6A3(SEQ ID NO:11)、CDR-L2-6A3(SEQ ID NO:12)及CDR-L3-6A3(SEQ ID NO:13)之可變結構域及(ii)人類輕鏈之恆定部分或其片段；或
*與該等超變區之序列具有至少90%一致性之其直接等效物。具有至少90%一致性意指一致性大於90%，較佳一致性大於91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%。
在本發明結合分子中，人類重鏈之恆定部分或其片段可為伽瑪(γ)型，較佳為伽瑪4(γ4)型且人類輕鏈之恆定部分或其片段可為蘭姆達(λ)型或較佳為卡帕(κ)型。另外，本發明結合分子可為人類、部分人類或嵌合或人類化單株抗體。
根據本發明，該結合分子可包含一或多種如SEQ ID NO:4(IgG1重鏈)、SEQ ID NO:5(IgG1輕鏈)、SEQ ID NO:24(IgG4重鏈)及SEQ ID NO:25(IgG4輕鏈)中之任一序列所示之多肽序列。
在又一較佳實施例中，本發明結合分子包含至少一個抗原結合位點，該抗原結合位點按順序包含超變區CDR-H1-6A3、CDR-H2-6A3及CDR-H3-6A3；該CDR-H1-6A3具有胺基酸序列SEQ ID NO:8，該CDR-H2-6A3具有胺基酸序列SEQ ID NO:9，且該CDR-H3-6A3具有胺基酸序列SEQ ID NO:10；及與該等超變區之序列具有至少90%一致性之其直接等效物。具有至少90%一致性意指一致性大於90%，較佳一致性大於91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%。
在本發明之又一態樣中，本發明結合分子至少包含：
a)　按順序包含超變區CDR-H1-6A3、CDR-H2-6A3及CDR-H3-6A3之第一結構域；該CDR-H1-6A3具有胺基酸序列SEQ ID NO:8，該CDR-H2-6A3具有胺基酸序列SEQ ID NO:9，且該CDR-H3-6A3具有胺基酸序列SEQ ID NO:10；及
b)　按順序包含超變區CDR-L1-6A3、CDR-L2-6A3及CDR-L3-6A3之第二結構域；該CDR-L1-6A3具有胺基酸序列SEQ ID NO:11，該CDR-L2-6A3具有胺基酸序列SEQ ID NO:12，且該CDR-L3-6A3具有胺基酸序列SEQ ID NO:13；或
c)　與該等超變區之序列具有至少90%一致性之其直接等效物。具有至少90%一致性意指一致性大於90%，較佳一致性大於91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%。
而且，本發明亦提供以下本發明結合分子，其包含至少一個抗原結合位點，該抗原結合位點包含：
a)　6A3之重鏈可變區(SEQ ID NO:4)；或
b)　6A3之輕鏈可變區(SEQ ID NO:5)；或與該等超變區之序列具有至少90%一致性之其直接等效物。
當該抗原結合位點包含第一及第二結構域二者時，該等結構域可位於相同多肽分子上或(較佳地)各結構域可在不同鏈上，第一結構域為免疫球蛋白重鏈或其片段之一部分且第二結構域為免疫球蛋白輕鏈或其片段之一部分。
本發明結合分子之實例包括藉由B-細胞或雜交瘤所產生之抗體及人類或嵌合或人類化抗體或其任何片段，例如F(ab')2；及Fab片段、以及單鏈或單結構域抗體，如美國專利公開案第US20070065440A1號中所述。本文所用之"單結構域抗體"係可與抗原決定部位或抗原或配體特異性結合之可變結構域，其獨立於與彼抗原決定部位、抗原或配體結合之另一可變結合結構域。單結構域抗體可與其他VH或VL結構域一起存在於同源多聚體或異源多聚體中，其中該等其他結構域並非藉由該單結構域抗體結合抗原所需要，即，其中該單結構域抗體與獨立於該等其他VH或VL結構域之抗原結合。在較佳實施例中，單結構域抗體包含經分離之VH單結構域或經分離之VL單結構域。用於獲得單結構域抗體之技術已為熟習此項技術者所習知，該單結構域抗體具有其衍生自之完整抗體的至少一些結合特異性。例如，Ward等人，"Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted from Escherichia coli"，Nature 341:644-646揭示篩選以獲得抗體重鏈可變區(VH單結構域抗體)之方法，呈分離形式之該抗體重鏈可變區對於與其結合之其靶抗原決定部位具有足夠親和力。
單鏈抗體由抗體重鏈及輕鏈之可變結構域/區域組成，該等抗體重鏈及輕鏈藉由通常由10個至30個胺基酸、較佳15個至25個胺基酸組成之肽連接體共價結合。較佳方法包括使用(例如)與scFv分子連接之所述多肽連接體(Bird等人，(1988)Science 242:423-426)。因此，該結構不包括重鏈及輕鏈之恆定部分且吾人認為小肽間隔區應較完整恆定部分具有較低抗原性。所謂"嵌合抗體"意指其中抗體重鏈或輕鏈或二者之恆定區來源於第一物種而重鏈及輕鏈二者之可變區來源於第二物種之抗體。較佳地，"嵌合抗體"係其中重鏈或輕鏈或二者之恆定區係人類來源而重鏈及輕鏈二者之可變結構域係非人類(例如鼠科動物、猴、大鼠、豬、小鼠、雞、鳥類)來源之抗體。所謂"人類化抗體"意指其中超變區(CDR)係非人類(例如鼠科動物)來源而免疫球蛋白之所有或實質上所有其他部分(例如恆定區及可變結構域之高度保守部分，即框架區)係人類來源之抗體。然而，人類化抗體可保留與超變區相鄰之框架區部分中之鼠科動物序列的少數胺基酸。
超變區可與任何種類之框架區(較佳為鼠科動物或人類來源)相連。適宜框架區闡述於"Sequences of proteins of immunological interest"，Kabat E.A.等人，美國衛生及人類服務部(US department of health and human services)，公共衛生服務(Public health service)，美國國立衛生研究院。較佳地，該等結合分子之人類重鏈恆定部分可為IgG型，更佳為IgG4型(包括亞型)，較佳地，人類輕鏈之恆定部分可為蘭姆達(λ)或卡帕(κ)型，更佳為卡帕(κ)型。
在於所有人類中天然存在之蛋白質下培育之單株抗體可在非人類系統(例如，小鼠)中生長。作為此之直接結果，當將藉由雜交瘤產生之異種抗體投與給人類時會引發不期望之免疫反應，此主要藉由異種免疫球蛋白之恆定部分介導。此明顯限制了該等抗體之使用，因為該等抗體不能在延長時間段內投與。因此，尤佳使用當投與給人類時不可能引發實質同種異體反應之單鏈、單結構域、嵌合或人類化抗體。
鑒於上述內容，本發明結合分子亦可選自嵌合抗體，該嵌合抗體至少包含：
a)　一種免疫球蛋白重鏈或其片段，其包含(i)按順序包含超變區CDR-H1-6A3、CDR-H2-6A3及CDR-H3-6A3之可變結構域及(ii)人類重鏈之恆定部分或其片段；該CDR-H1-6A3具有胺基酸序列(SEQ ID NO:8)，該CDR-H2-6A3具有胺基酸序列(SEQ ID NO:9)，且該CDR-H3-6A3具有胺基酸序列(SEQ ID NO:10)；及
b)　一種免疫球蛋白輕鏈或其片段，其包含(i)按順序包含超變區CDR-L1-6A3、CDR-L2-6A3及CDR-L3-6A3之可變結構域及(ii)人類輕鏈之恆定部分或其片段；該CDR-L1-6A3具有胺基酸序列(SEQ ID NO:11)，該CDR-L2-6A3具有胺基酸序列(SEQ ID NO:12)，且該CDR-L3-6A3具有胺基酸序列(SEQ ID NO:13)；或
其直接相等物，其包含與該等超變區之序列至少90%一致性之區域。
或者，本發明結合分子可選自一種單鏈結合分子，其包含一個包含下列之抗原結合位點：
a)　按順序包含超變區CDR-H1-6A3、CDR-H2-6A3及CDR-H3-6A3之第一結構域；該CDR-H1-6A3具有胺基酸序列(SEQ ID NO:8)，該CDR-H2-6A3具有胺基酸序列(SEQ ID NO:9)，且該CDR-H3-6A3具有胺基酸序列(SEQ ID NO:10)；及
b)　按順序包含超變區CDR-L1-6A3、CDR-L2-6A3及CDR-L3-6A3之第二結構域；該CDR-L1-6A3具有胺基酸序列(SEQ ID NO:11)，該CDR-L2-6A3具有胺基酸序列(SEQ ID NO:12)，且該CDR-L3-6A3具有胺基酸序列(SEQ ID NO:13)；及
c)　肽連接體，其與第一結構域之N-末端及第二結構域之C-末端或第一結構域之C-末端及第二結構域之N-末端結合；
或其直接相等物，其與該等超變區之序列具有至少90%一致性。
眾所周知，諸如缺失、添加或取代一個或數個胺基酸之胺基酸序列的微小變化可能導致最初蛋白質之等位(allelic)形式，其具有實質上相同特性。因此，所謂術語"其直接等效物"意指任何超變區、任何抗原結合位點、任何抗體鏈或其片段、或本發明之任何單結構域結合分子(6A3分子)
(i)　其中該結合分子之各超變區CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3與CDR-H1-6A3(SEQ ID NO:8)、CDR-H2-6A3(SEQ ID NO:9)及CDR-H3-6A3(SEQ ID NO:10)之等效超變區具有至少90%之一致性，更佳具有至少91、92、93、94、95、96、97、98、99%之一致性，而CDR-H1等效於CDR-H1-6A3，CDR-H2等效於CDR-H2-6A3，CDR-H3等效於CDR-H3-6A3；且
(ii)　其能夠與人類NogoA或人類NiG結合，較佳地，離解常數(Kd)小於1000nM，更佳地，Kd小於100nM，最佳地，Kd小於10nM，或具有至少一個、較佳兩個結構域/結合位點之任何本發明結合分子(6A3分子)
(iii)　其中各超變區CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3與CDR-H1-6A3(SEQ ID NO:8)、CDR-H2-6A3(SEQ ID NO:9)、CDR-H3-6A3(SEQ ID NO:10)、CDR-L1-6A3(SEQ ID NO:11)、CDR-L2-6A3(SEQ ID NO:12)及CDR-L3-6A3(SEQ ID NO:13)之等效超變區具有至少90%之一致性，更佳具有至少91、92、93、94、95、96、97、98、99%之一致性，而CDR-H1等效於CDR-H1-6A3，CDR-H2等效於CDR-H2-6A3，CDR-H3等效於CDR-H3-6A3，CDR-L1等效於CDR-L1-6A3，CDR-L2等效於CDR-L2-6A3，CDR-L3等效於CDR-L3-6A3；且
(iv)　其能夠與人類NogoA或人類NiG結合，較佳地，離解常數(Kd)小於1000nM，更佳地，Kd小於100nM，最佳地，Kd小於10nM。
因此，本發明之又一些實施例係(例如)能夠以小於1000nM之離解常數與人類NogoA或人類NiG結合且包含至少一個抗原結合位點之結合分子，該抗原結合位點按順序包含：
*超變區CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，其中該等超變區中之每一者分別與超變區CDR-H1-6A3(SEQ ID NO:8)、CDR-H2-6A3(SEQ ID NO:9)及CDR-H3-6A3(SEQ ID NO:10)具有至少90%之一致性，較佳具有至少91、92、93、94、95、96、97、98、99%之一致性；及/或
*超變區CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，其中該等超變區中之每一者分別與超變區CDR-L1-6A3(SEQ ID NO:11)、CDR-L2-6A3(SEQ ID NO:12)及CDR-L3-6A3(SEQ ID NO:13)具有至少90%之一致性，較佳具有至少91、92、93、94、95、96、97、98、99%之一致性。
而且，本文所述之結合分子能夠以小於1000nM之離解常數與人類NogoA或人類NiG結合且包含：
*按順序包含超變區CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之第一抗原結合位點，其中該等超變區中之每一者分別與超變區CDR-H1-6A3(SEQ ID NO:8)、CDR-H2-6A3(SEQ ID NO:9)及CDR-H3-6A3(SEQ ID NO:10)具有至少90%之一致性，較佳具有至少91、92、93、94、95、96、97、98、99%之一致性；及
*按順序包含超變區CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之第二抗原結合位點，其中該等超變區中之每一者分別與超變區CDR-L1-6A3(SEQ ID NO:11)、CDR-L2-6A3(SEQ ID NO:12)及CDR-L3-6A3(SEQ ID NO:13)具有至少90%之一致性，較佳具有至少91、92、93、94、95、96、97、98、99%之一致性。
該離解常數可方便地在多種分析法中予以測試，包括(例如)生物感測器親和力方法(BIAcore)(參見上文)。另外，該等結合分子之結合及功能影響可在(例如)下文所述之生物分析法中顯示。
人類重鏈之恆定部分可為γ1、γ2、γ3、γ4、α1、α2、δ或ε型，較佳為γ型，更佳為γ4型，而人類輕鏈之恆定部分可為λ或κ型(其包括λ1、λ2、λ3及λ4亞型)，但較佳為κ型。所有該等恆定部分之胺基酸序列皆在Kabat等人(前述)中給出。
本發明結合分子之偶聯物(例如酶或毒素或放射性同位素偶聯物)亦包括於本發明之範圍內。在另一態樣中，藉由與(非多肽)聚合穩定部分連接或結合(例如糖基化)使含有NogoA或NiG結合分子之組合物在活體內穩定化，此可藉由活體外或活體內方法達成。該類型穩定化之實例闡述於(例如)WO99/64460(Chapman等人)及歐洲專利第1,160,255號(King等人)中，每一案件均以引用方式併入本文中。具體而言，該等參考文獻闡述使用合成性或天然存在之聚合物分子來延長免疫球蛋白多肽之活體內半衰期，該等聚合物分子係例如聚伸烷基(polyalkylene)、聚伸烯基(polyalkenylene)、聚氧化烯烴或多糖。穩定化部分之典型實例係聚乙二醇(或PEG)、聚伸烷基。使PEG與免疫球蛋白多肽連接之方法闡述於該等參考文獻中且在本文中稱為"PEG基化"。如彼等文獻中所述，可藉由使PEG附接於NogoA或NiG結合分子表面上之離胺酸或其他胺基酸上來使NogoA或NiG結合分子隨機PEG基化或通過(例如)使PEG附接於人工引入之表面半胱胺酸殘基上使NogoA或NiG結合分子位點特異性地PEG基化。端視NogoA或NiG結合分子而定，較佳使用非隨機聚合物附接方法，因為藉由在分子上之一或多個抗原-結合位點上或附近附接之隨機附接通常改變了該分子對其靶抗原之親和性或特異性。
較佳情形係添加PEG或另一聚合物不干擾抗體NogoA或NiG結合分子之抗原結合親和性或特異性。所謂"不干擾抗原結合親和性或特異性"意指與PEG連接之NogoA或NiG結合分子之IC50或ND50值比具有相同抗體單可變結構域之未與PEG連接之NogoA或NiG結合分子的IC50或ND50值分別大不超過10%。或者，片語"不干擾抗原結合親和性或特異性"意指與PEG連接之NogoA或NiG結合分子形式保留未經PEG基化之多肽形式之抗原結合活性的至少90%。
可用於延長活體內半衰期之PEG或其他聚合物之大小通常為約5,000至50,000道爾頓，例如，約5,000kD-10,000kD、5,000kD-15,000kD、5,000kD-20,000kD、5,000-25,000kD、5,000-30,000kD、5,000kD-35,000kD、5,000kD-40,000kD、或約5,000kD-45,000kD。聚合物大小之選擇端視複合物之預期用途而定。例如，在期望穿透實體組織(例如，腫瘤)之情形下，較佳使用較小之聚合物，相當於或約5,000kD。相反，在期望複合物在循環中保持不變之情形下，可使用較大之聚合物，例如，25,000kD至40,000kD或更大。
本發明之醫藥組合物可包括"治療有效量"或"預防有效量"之本發明之NogoA或Nig結合分子。"治療有效量"係指可在所需時間段內以所需劑量有效達成期望治療效果之量。本發明NogoA或Nig結合分子之治療有效量可端視諸如個體之疾病狀況、年齡、性別及重量以及本發明NogoA或Nig結合分子在個體中引發期望反應之能力等因素而有所變化。治療有效量亦為其中本發明NogoA或Nig結合分子之治療有益效應大於其任何毒性或有害效應的量。"預防有效量"係指可在所需時間段內以所需劑量有效達成期望預防效果之量。
本文所用之片語"特異性結合"係指本發明NogoA或Nig結合分子以1μM或更小之離解常數(Kd)與抗原結合，該離解常數係使用(例如)BIAcore(r)表面電漿共振系統及BIAcore(r)動力學評價軟體藉由表面電漿共振分析來量測。
除非本文另外說明，否則"多肽"包括包含藉由肽鍵彼此連接之胺基酸之任何肽或蛋白質，其胺基酸序列以N-末端開始且以C-末端結束。較佳地，本發明多肽係單株抗體，更佳係嵌合(亦稱為V-移植)或人類化(亦稱為CDR-移植)單株抗體。人類化(CDR-移植)單株抗體可包括或不包括引入至受體抗體之框架(FR)序列中之進一步突變。
本文所用之多肽之功能衍生物包括與本發明多肽具有共同定性生物活性(即能夠與人類NogoA或人類NiG結合)之分子。功能衍生物包括本發明多肽之片段及肽類似物。片段包含在本發明多肽(例如特定序列)之序列內的區域。術語"衍生物"用以定義本發明多肽(例如特定序列)之胺基酸序列變體及共價修飾物。本發明多肽(例如特定序列，例如輕鏈及重鏈之超變區)之功能衍生物較佳與本發明多肽(例如特定序列)之胺基酸序列具有至少約90%、更佳至少約91、92、93、94、95、96、97、98、99%之總體序列一致性，且實質上保留與人類NogoA或人類NiG結合之能力。
本文所用之片語"可變結構域"係指具有衍生自哺乳動物種系免疫球蛋白V區域之序列的多肽。當序列係分離自人類個體、分離自非人類動物(例如齧齒類動物，例如小鼠)，其中該非人類動物能夠響應免疫原而產生人類免疫球蛋白，更佳地該非人類動物不能夠產生對於其物種為內源性之抗體、分離自經選殖之人類抗體基因序列庫(或人類抗體V區域基因序列庫)時，或當使用經選殖之人類種系V區域序列來產生一或多種隨後經選擇用於與期望靶抗原結合之多樣化序列(藉由隨機或靶向誘變)時，該序列係"衍生自哺乳動物種系V區域"。最低地，人類免疫球蛋白可變結構域與天然存在之人類免疫球蛋白可變結構域序列具有至少85%胺基酸相似性(包括(例如)87%、90%、93%、95%、97%、99%或更高之相似性)。
或者，或另外，"可變結構域"係包含四種免疫球蛋白可變結構域框架區(FW1-FW4)(較佳為Kabat等人(1991)中所述之人類框架區)之免疫球蛋白可變結構域。"可變結構域框架區"涵蓋a)框架區(較佳為人類框架區)之胺基酸序列，及b)包含人類框架區胺基酸序列之至少8個鄰接胺基酸的框架區。抗體可變結構域可包含FW1-FW4之胺基酸序列，該胺基酸序列與藉由種系抗體基因片段(較佳為人類)編碼之對應框架區之胺基酸序列相同，或其亦可包含可變結構域，其中相對於種系抗體基因片段(較佳為人類)編碼之對應框架區的胺基酸序列而言FW1-FW4序列總共含有至多10個胺基酸序列差異(例如，至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸序列差異)。
本文所用之片語"通用框架"係指與藉由Kabat等人(1991)所定義之序列保守抗體區域對應或與藉由Chothia及Lesk，(1987)J. Mol. Biol. 196:910-917所定義之人類種系免疫球蛋白譜或結構對應之單一抗體框架序列。本發明提供單一框架或一組該等框架之用途，已發現，儘管僅超變區有所變化，但該單一框架或一組該等框架容許推導實際上任何結合特異性。在一個實施例中，超變區或CDR與NogoA及/或NiG特異性結合。
術語"共價修飾"包括用有機蛋白質性質或非蛋白質性質之衍生化試劑對本發明多肽(例如特定序列)或其片段進行修飾、與異源性多肽序列融合、及轉譯後修飾。經共價修飾之多肽(例如特定序列)仍然能夠藉由交聯與人類NogoA或人類NiG結合。共價修飾傳統上藉由以下引入：使靶向胺基酸殘基與能夠與所選側或末端殘基反應之有機衍生化試劑反應或在所選重組宿主細胞中起作用之轉譯後修飾的治理機制。某些轉譯後修飾係重組宿主細胞對表現多肽起作用之結果。通常使麩胺醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基經轉譯後脫去醯胺基成對應麩胺醯基及天冬胺醯基殘基。或者，在弱酸性條件下使該等殘基脫去醯胺基。其他轉譯後修飾包括羥基化脯胺酸及離胺酸、磷酸化絲胺醯基、酪胺酸或蘇胺醯基殘基之羥基、甲基化離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基，參見例如T. E. Creighton，Proteins:Structure and Molecular Properties，W. H. Freeman & Co.，San Francisco，第79-86頁(1983)。共價修飾物可包括包含本發明多肽(例如特定序列)及其胺基酸序列變體之融合蛋白(例如免疫黏附素)、及與異源性信號序列之N-末端融合物。
就天然多肽及其功能衍生物而言，"一致性"在本文中定義為在比對序列且若需要引入缺口以達成最大一致性百分比且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分後候選序列中與對應天然多肽之殘基一致之胺基酸殘基的百分比。N-或C-末端延伸或插入均不應理解為降低一致性。用於比對之方法及電腦程式已為熟習此項技術者所熟知，參見，Altschul等人(前述)。
"胺基酸"係指所有天然存在之L-α-胺基酸，例如且包括D-胺基酸。藉由熟知之單字母或三字母名稱來識別胺基酸。
術語"胺基酸序列變體"係指與本發明多肽(例如特定序列)相比胺基酸序列有一些差異之分子。本發明多肽(例如特定序列)之胺基酸序列變體仍然能夠與人類NogoA或人類NiG結合。取代變體係彼等已去除至少一個胺基酸殘基且在本發明多肽(例如特定序列)之相同位置上插入不同胺基酸以代替該至少一個胺基酸殘基者。該等取代可為單取代，其中分子中僅一個胺基酸經取代，或該等取代可為多取代，其中相同分子中兩個或更多個胺基酸經取代。插入變體係彼等在與本發明多肽(例如特定序列)之特定位置上的胺基酸直接相鄰處插入一或多個胺基酸者。與胺基酸直接相鄰意指與胺基酸之α-羧基或α-胺基官能團連接。缺失變體係彼等已去除本發明多肽(例如特定序列)中之一或多個胺基酸者。通常，缺失變體在分子之特定區域中會缺失一個或兩個胺基酸。
本發明之結合分子可藉由重組DNA技術來產生。通常而言，可如標準實驗室手冊中所述來構建實施本發明所需要之核酸分子及載體構建體並對其實施處理，例如Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，USA。鑒於此，必須構建編碼該結合分子之一或多種DNA分子，將其置於適當對照序列下並轉移至用於表現之適宜宿主生物體中。
因此，概言之，本發明提供：
(i)　編碼本發明之超變區、抗原結合位點、抗體鏈或其片段、或單結構域結合分子之DNA分子；及
(ii)　本發明DNA分子用於藉由重組手段產生本發明結合分子之用途。
現有技術水平下已知本文提供之資訊(即超變區之胺基酸序列及編碼其之DNA序列)熟習此項技術者將能夠合成本發明之DNA分子。用於構建可變結構域基因之方法闡述於(例如)歐洲專利第239 400號中且可簡單概述如下：選殖編碼具有任何特異性之單株抗體之可變結構域的基因。確定編碼框架區及超變區之DNA片段並移除編碼超變區之DNA片段以使編碼框架區之DNA片段與適宜限制位點在連接點處融合在一起。限制位點可藉由標準程序藉由DNA分子誘變而在適當位置產生。雙鏈合成CDR盒係按照上文給出之CDR-H1-6A3、CDR-H2-6A3、CDR-H3-6A3、CDR-L1-6A3、CDR-L2-6A3及CDR-L3-6A3序列藉由DNA合成來製備。使該等盒具有膠黏性末端以藉由用於獲得編碼免疫球蛋白可變結構域之DNA分子之標準方案使其與框架在連接點處連接。
而且，藉由產生雜交瘤細胞系來獲得編碼本發明單株抗體之DNA構建體無需使用mRNA。因此，PCT申請案WO 90/07861給出了藉由重組DNA技術產生單株抗體之完整說明，其中僅給出了基因之核苷酸序列的書面資訊。
該方法包含合成多種寡核苷酸、藉由PCR方法對其實施擴增、及其剪接以得到期望DNA序列。
可公開獲得多種載體，包括細菌質粒、噬菌體、人工染色體及附加型載體。可公開獲得包含一或多種適宜啟動子及/或編碼重鏈及輕鏈恆定部分之基因的表現載體。表現載體通常含有藉由宿主生物體識別且與所關注編碼序列可操作連接之啟動子。該啟動子可為誘導型或組成型啟動子。術語"可操作連接"係指其中所述組件呈容許其以擬定方式起作用之關係的並置。與編碼序列"可操作連接"之控制序列之連接方式應使該編碼序列之表現可在與該等控制序列相容之條件下達成。因此，在製備本發明之DNA分子後，可方便地將其轉移至適當表現載體中。
編碼單鏈抗體之DNA分子亦可藉由闡述於(例如)WO 88/1649中之標準方法來製備。
在本發明之特定實施例中，用於產生一些本發明結合分子之重組手段包括下文所述之第一及第二DNA構建體：
第一聚核苷酸可包含：
*如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16中所示之至少一種聚核苷酸序列；或
*如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:19中所示之至少一種聚核苷酸序列。
本發明之另一聚核苷酸包含：
*如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16中所示之聚核苷酸序列；及
*如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:19中所示之聚核苷酸序列。
在另一實施例中，該聚核苷酸包含：
*如SEQ ID NO:6中所示之聚核苷酸序列及/或如SEQ ID NO:7中所示之聚核苷酸序列；或
*如SEQ ID NO:26中所示之聚核苷酸序列及/或如SEQ ID NO:28中所示之聚核苷酸序列。
在再一實施例中，該DNA構建體編碼重鏈或其片段且包含：
a)　編碼包含框架區及超變區(二者擇一)之可變結構域之第一部分，該等超變區按順序包含DNA-CDR-H1-6A3(SEQ ID NO:14)、DNA-CDR-H2-6A3(SEQ ID NO:15)及DNA-CDR-H3-6A3(SEQ ID NO:16)；該第一部分以編碼該可變結構域之第一個胺基酸的密碼子開始且以編碼該可變結構域之最後一個胺基酸的密碼子結束；及
b)　編碼重鏈恆定部分或其片段之第二部分，該第二部分以編碼重鏈恆定部分之第一個胺基酸的密碼子開始且以編碼該恆定部分或其片段之最後一個胺基酸的密碼子結束，隨後無義密碼子。
較佳地，該第二部分編碼人類重鏈之恆定部分，更佳地人類γ4鏈之恆定部分。該第二部分可為基因組來源之DNA片段(包含內含子)或cDNA片段(無內含子)。
在另一實施例中，該DNA構建體編碼輕鏈或其片段且包含：
a)　編碼包含框架區及超變區(二者擇一)之可變結構域之第一部分，該等超變區按順序包含DNA-CDR-L1-6A3(SEQ ID NO:17)、DNA-CDR-L2-6A3(SEQ ID NO:18)及DNA-CDR-L3-6A3(SEQ ID NO:19)；該第一部分以編碼該可變結構域之第一個胺基酸的密碼子開始且以編碼該可變結構域之最後一個胺基酸的密碼子結束；及
b)　編碼輕鏈恆定部分或其片段之第二部分，該第二部分以編碼輕鏈恆定部分之第一個胺基酸的密碼子開始且以編碼該恆定部分或其片段之最後一個胺基酸的密碼子結束，隨後無義密碼子。
較佳地，該第二部分編碼人類輕鏈之恆定部分，更佳地人類κ鏈之恆定部分。
本發明之DNA構建體可較佳進一步包含另一部分，其位於先前所述部分之上游且編碼前導肽；該額外部分以編碼第一個胺基酸之密碼子開始且以該前導肽之最後一個胺基酸結束。該前導肽為宿主生物體分泌鏈所需要(該等鏈在宿主生物體中表現)且隨後被宿主生物體去除。較佳地，該DNA構建體之該部分所編碼之前導肽具有與如SEQ ID NO:20中所示之重鏈前導序列之胺基酸序列實質上一致之胺基酸序列(IgG1之重鏈，其以位置19上之胺基酸開始且以位置1上之胺基酸結束)、具有如SEQ ID NO:22中所示之胺基酸序列(IgG1之輕鏈，其以位置20上之胺基酸開始且以位置1上之胺基酸結束)、具有與如SEQ ID NO:30中所示之重鏈前導序列之胺基酸序列實質上一致之胺基酸序列(IgG4之重鏈，其以位置19上之胺基酸開始且以位置1上之胺基酸結束)、或具有如SEQ ID NO:31中所示之胺基酸序列(IgG4之輕鏈，其以位置20上之胺基酸開始且以位置1上之胺基酸結束)。
將每一該等DNA構建體置於適宜控制序列之控制下，尤其在適宜啟動子之控制下。可使用任何種類之啟動子，限制條件為其適於該等DNA構建體將轉移至其中以表現之宿主生物體。然而，若表現係在哺乳動物細胞中發生，則尤佳使用免疫球蛋白基因之啟動子。
期望抗體可在細胞培養物或轉基因動物中產生。適宜轉基因動物可按照標準方法獲得，該等標準方法包括將置於適宜控制序列下之第一及第二DNA構建體顯微注射至卵中，將所製備之卵轉移至適當假妊娠雌性動物中並選擇表現期望抗體之後代。
當抗體鏈需要在細胞培養物中產生時，必須首先將該等DNA構建體插入至單一表現載體中或兩個單獨但相容之表現載體中，後者可能較佳。
因此，本發明亦提供能夠在原核或真核細胞系中複製之表現載體，其包含至少一種上文所述之DNA構建體。
因此，本發明提供包含本發明聚核苷酸之表現載體。本發明亦係關於表現系統，其中當該表現系統或其部分存在於相容性宿主細胞中時該表現系統或其部分能夠產生本發明多肽。本發明亦揭示包含本發明表現系統之經分離宿主細胞。
因此，藉助重組DNA技術或藉助化學合成來產生結合分子、聚核苷酸、表現載體之方法亦涵蓋於本申請案中。
因此，將含有DNA構建體之每一表現載體轉移至適宜宿主生物體中。當該等DNA構建體係單獨插入至兩種表現載體中時，其可單獨轉移(即一種類型載體/細胞)或共轉移，該後者可能較佳。適宜宿主生物體可為細菌、酵母或哺乳動物細胞系，該後者較佳。更佳地，哺乳動物細胞系係淋巴來源，例如骨髓瘤、雜交瘤或正常永生化B-細胞，但不表現任何內源性抗體重鏈或輕鏈。
亦較佳之情形係宿主生物體含有大量含有一或多種DNA構建體/細胞之載體拷貝。若宿主生物體係哺乳動物細胞系，則該期望目標可藉由按照標準方法擴增拷貝數來達成。擴增方法通常由針對抗藥性增加進行選擇而組成，該抗性係藉由表現載體編碼。
在本發明之另一態樣中，提供產生本發明之多鏈結合分子的方法，其包含i)對經至少一種本發明DNA構建體轉化之生物體實施培養及(ii)自培養物回收本發明之活性結合分子。
或者，重鏈及輕鏈可(例如)單獨回收並在活體外重折疊後重構成活性結合分子。重構方法已為熟習此項技術者所熟知；方法實例尤其提供於歐洲專利第120 674號或歐洲專利第125 023號中。
因此，方法亦可包含
(i)對經編碼本發明結合分子之第一DNA構建體轉化之第一生物體實施培養並自培養物回收第一結合分子；及
(ii)對經編碼本發明結合分子之第二DNA構建體轉化之第二生物體實施培養並自培養物回收第二結合分子；及
(iii)在活體外自於(i)中獲得之第一結合分子及於(ii)中獲得之第二結合分子回收本發明之活性結合分子。
若需要，可產生更多種生物體或細胞(至多三種、四種、五種、六種、七種或八種)並用於提供更多種結合分子。
以類似方式，本發明亦提供產生本發明之單鏈或單結構域結合分子的方法，其包含：
(i)分別對經編碼本發明之單鏈或單結構域結合分子之DNA構建體轉化之生物體實施培養；及
(ii)自培養物回收該分子。
如下文所述，如在(例如)顆粒細胞神經突增生模型中所示，本發明之NogoA及NiG結合分子可呈現極佳神經再生活性。
1.顆粒細胞神經突增生分析(活體外)
取腦組織(皮質及腦幹)且對於每次分析皆如先前所述製備新鮮蛋白提取物(Spillmann等人，1998，Identification and characterization of a bovine neurite growth inhibitor (bNI-220)，J Biol Chem. 1998年7月24日；273(30):19283-93)。簡言之，在4℃下在3-4體積60mM Chaps-20mM Tris pH 8.0-1mM EDTA與蛋白酶阻斷劑(10μg/ml抑肽酶-5μg/ml亮抑蛋白酶肽-1μg/ml胃蛋白酶抑制素-1mM PMSF)中將一片冰凍組織(例如0.25g)勻化。將勻漿在4℃下之旋轉器上放置30min並在4℃下在TLA 100.3旋轉器(Beckman TL-100超速離心機)中於100'000g下離心45min。使用吸收分光光度計測定上清液之蛋白質濃度。
如先前所述自出生後5-7天之大鼠小腦組織的胰蛋白酶消化物中提純小腦顆粒細胞(Niederost等人，1999，Bovine CNS myelin contains neurite growth-inhibitory activity associated with chondroitin sulfate proteoglycans，J Neurosci. 1999年10月15日；19(20):8979-89)。隨後在測試受質上將本發明結合分子預培育30min並在添加細胞之前移除。添加小腦顆粒細胞並培育24小時。為停止實驗，向培養皿中緩慢添加2ml 4%緩衝甲醛。將如上文所述製備之猴腦膜蛋白提取物以15μg蛋白質/cm2 培養皿過夜吸附於Greiner 4-孔培養皿(Greiner，Nuertingen，德國)上。在將培養皿用溫漢克氏溶液(Hank's solution)洗滌三次之後鋪板神經元。如上文所述製備出生後(5-7)天之大鼠的小腦顆粒細胞並以50,000個細胞/cm2 進行鋪板。將細胞在無血清培養基中培養24hr，固定，並用神經突標記MAB 1b(Chemicon單株Ab，1:200)免疫染色。對於細胞體染色，在用MAB1b染色後使用DAPI(4',6-二脒基-2-苯基-吲哚二鹽酸鹽，來自分子探針(Molecular Probes))。對於抗體實驗，將抗-Nogo-A mAb或對照IgG Ab在培養皿上預培育30min並隨後移除。
對於每一孔使用40X物鏡藉由計數神經突與通過觀測區域中心放置之一條線的所有交點隨機對距孔邊緣規定距離之四個區域取樣。亦計數觸及該線之所有細胞體，並如先前報導(Simonen等人，2003，Neuron 38，201-211)計算每一孔之神經突/細胞體指數比。所有計數皆在編碼實驗上以盲法實施且以神經突/細胞體指數表示。結果以平均神經突/細胞體指數表示。
可觀察到在上文製備之脊髓提取物之非容許環境中藉由與本發明結合分子一起預培育小腦顆粒細胞之神經突增生增強。
本發明分子之中和活性亦可藉由在下文簡述之活體內脊髓損傷模型中量測再生性萌芽及神經突增生及功能恢復來評估。
2.大鼠及猴之脊髓損傷模型(活體內)以顯微手術方式藉由在第8胸椎層面上沿兩側橫切脊髓之背半部使成年路易大鼠(Lewis rat)受傷。椎板切除術、麻醉及手術闡述於Schnell及Schwab 1993(Eur. J. Neurosci. 5:1156-1171)中。
神經解剖示蹤術：藉由向幫浦或移植物對側皮質中注射順行示蹤劑生物素葡聚糖胺(BDA)來示蹤運動及感覺皮質脊髓束。BDA在10-14天內運送至脊髓中並如Brsamle等人，(2000 J. Neurosci. 20:8061-8068)中所述使用二胺基聯苯胺(DAB)作為受質使其顯影。
在脊髓損傷破壞脊髓節段T8之約40%(主要在背半部，包括兩次主要頸髓橫切(CST))後兩週，在對照動物中示蹤CST顯示中等脊髓束反應性萌芽程度。該現象對應於文獻中熟知之響應損傷之自發萌芽。用本發明結合分子或幫浦遞送本發明結合分子治療之受損傷大鼠顯示損害部位處之萌芽增強及受傷神經突之受傷軸突神經突增生的再生增強。而且，動物顯示感覺運動功能之恢復有所改良。該等功能測試先前已予以闡述(Merkler等人，2001，J. Neuroscience 21，3665-73)。
3.抗體在成年猴CNS中之組織分佈本發明之結合分子經純化為IgG並在PBS中濃縮至3mg/ml。使用衍生自小鼠血清之IgG(Chemicon公司，Temecula/CA，USA)或針對小麥生長素之mAB(AMS Biotechnology,Oxon/UR)作為對照治療。在該研究中使用兩隻雄性成年短尾猴(成束猴(Macaca fascicularis))用於鞘內輸注。
手術操作
藉由肌內注射氯胺酮(ketamine)(氯胺酮針劑(Retalar(r))；Parke-Davis，5mg/kg，肌內注射(i.m.))來誘導麻醉。肌內注射阿托品(Atropine)(0.05mg/kg)以減少支氣管分泌物。將靜脈內導管置於股靜脈中以連續灌注1%丙泊酚(費森尤斯(Fresenius(r)))與4%葡萄糖溶液之混合物(1體積丙泊酚與2體積葡萄糖溶液)以誘導更深度麻醉。隨後將動物置於立體定位框架中。在無菌條件下，自C2至Th1實施垂直中線皮膚切割。暴露C2至Th1之筋膜切口及脊柱突起。拉回椎旁肌肉並解剖C6、C7及Th1椎板。隨後實施完整C6椎板切除術及上部C7半側椎板切除術。暴露硬腦膜並在第7及第8頸椎段上方縱向切開，其對應於第6頸椎板覆蓋之椎骨部分的嘴狀區域。將聚乙烯管(長10cm)插入至硬腦膜下並向嘴側推數毫米並用縫線將其附接到硬腦膜上，該聚乙烯管與遞送hNogo-A抗體之滲透幫浦(Alzet(r)，2ML1；流動：50μg/hr)連接。放置滲透幫浦並將其緊固在左側低於椎板切除術幾公分之背部肌肉塊構成之空腔中。用縫線將聚乙烯管沿其軌道緊固至肌肉組織上。縫合肌肉與皮膚且通常在靜脈灌注丙泊酚中斷15-30分鐘後動物自麻醉中恢復過來。手術後用抗生素(氨比西林(Ampiciline)10%，30mg/kg，皮下(s.c.))對動物進行治療。在一週期間每天給與額外劑量之卡洛芬(Carprofen)。
在移植入滲透幫浦8天後宰殺猴。首先如上文所提及用氯胺酮誘導鎮靜，隨後藉由腹膜內(i.p.)注射致死劑量之戊巴比妥(pentobarbital)(90mg/kg)獲得深度麻醉。向動物快速灌流(perfused transcardially)0.4公升0.9%鹽水，隨後是4公升固定劑(存於0.1M磷酸鹽緩衝液(pH=7.6)中之4%低聚甲醛溶液)。繼續灌注增加濃度之3種蔗糖溶液(10%存於固定劑中，20%及30%存於磷酸鹽緩衝液中)。
組織學程序、免疫螢光及組織化學
小心地解剖猴之腦及脊髓，將其低溫保護於30%蔗糖中並在低溫狀態下以40μm切片。使用抗-人類二級抗體(Jackson Laboratories)來檢測所輸注之mABs。可使用以下抗體來實施雙標記：用於內源性Nogo-A之兔AS472(經親和純化)(Chen,2000)、用於星形膠質細胞之對抗GFAP之兔抗體、及用於溶酶體定位之對抗組織蛋白酶D(DARO)之兔抗體。所有抗血清皆藉由TRITC或FITC偶聯之對應二級抗體或使用ABC-DAB系統(Vector)來顯影。藉由在Zeiss Axiophot上表面螢光或藉由共焦顯微鏡檢查法(ZEISS LSM410)分析切片。
對輸注部位及距其6cm尾部之脊髓進行分析。在輸注部位存在高含量之本發明結合分子。在更尾部脊髓中，中央管及脊髓表面標記強烈，而灰質及白質顯示較均勻標記，然而，其具特異性且明顯超過背景。類似情形存在於前腦中，其表面及腦室標記強烈且Nogo-A抗體充分穿透至實質中。
該等實驗顯示脊柱鞘內輸注對抗CNS細胞表面抗原之抗體使得本發明之結合分子及抗體通過內部(腦室、中央管)及外部液體空間中之CSF循環達成良好分佈。IgG抗體充分穿透至腦及脊髓組織中。然而陰性對照IgG抗體被快速沖走，對抗Nogo-A之抗體保留在腦及脊髓組織中。
4.測試猴脊柱損害之神經修復及功能改良
藉由肌內注射氯胺酮(氯胺酮針劑(Keta1ar(r))；Parke-DaVis，5mg/kg，肌內注射(i.m.))來誘發麻醉。肌內注射阿托品(0.05mg/kg)以減少支氣管分泌。將靜脈內導管置於股靜脈中以連續灌注1%丙泊酚(費森尤斯(Fresenius(r)))與4%葡萄糖溶液之混合物(1體積丙泊酚與2體積葡萄糖溶液)以誘發更深度麻醉。隨後將動物置於立體定位框架中。在滅菌條件下，自C2至Th1實施垂直中線皮膚切割。暴露C2至Th1之筋膜切口及脊柱突起。拉回椎旁肌肉並解剖C6、C7及Th1椎板。隨後實施完整C6椎板切除術及上部C7半側椎板切除術。為將分子遞送至極接近損害處，將與幫浦附接之聚乙烯管的自由尖端固定在硬腦膜下嘴側距損害數毫米處。
按照公開程序實施行為手靈巧度測試。
藉由使猴坐在靈長類動物椅上前方為含有隨機分佈之50個洞之裝飾有珀思配克斯有機玻璃(Perspex)的"勃林克曼板(Brinkman board)"(10cm×20cm)來訓練手靈巧度；25個洞在水平方向上且25個洞在垂直方向上{Liu，199915428/同上；Rouiller，1998 13239/同上}。2.7.可如所述對纖維之再生及萌芽進行評價。注射於右半球中之順行示蹤劑為經生物素化之葡聚糖胺(BDA，分子探針(Molecular Probe(r))，10%，存於鹽水中)。在左半球中，注射螢光順行示蹤劑螢光素葡聚糖(分子探針(Molecular Probe(r))，10%，存於鹽水中)。使示蹤劑顯影之組織學處理可如先前詳述實施(Rouiller，1994 8322/同上}。
因此，本發明亦提供：
(i)本發明之Nogo及NiG結合分子於哺乳動物神經系統(具體而言，人類神經系統)神經修復中之用途；
(ii)一種修復哺乳動物神經系統(具體而言，人類神經系統)之神經的方法，其包含向需要治療之患者投與有效量之本發明Nogo及NiG結合分子；或
(iii)一種醫藥組合物，其係用於哺乳動物神經系統(具體而言，人類神經系統)之神經修復，其包含本發明結合分子及醫藥上可接受之載劑或稀釋劑。
因此，本發明提供可用作藥劑之本發明之結合分子、聚核苷酸、表現載體或系統、及宿主細胞。具體而言，該結合分子、聚核苷酸、表現載體或系統或宿主細胞可用於治療周圍神經系統(PNS)及/或中樞神經系統(CNS)疾病或用以製造用於治療周圍神經系統(PNS)及/或中樞神經系統(CNS)疾病之藥劑。
本發明亦提供包含本發明結合分子、聚核苷酸、表現載體或系統或宿主細胞與至少一種醫藥上可接受之載劑或稀釋劑的醫藥組合物。本發明亦提供含有該結合分子、聚核苷酸、表現載體或系統或該宿主細胞、或其藥理學上可接受之衍生物的產品，其以組合製劑形式同時、分別或依序用於治療周圍神經系統(PNS)及/或中樞神經系統(CNS)疾病。
本發明亦涵蓋治療周圍神經系統(PNS)及/或中樞神經系統(CNS)疾病之方法，該方法包含向需要該治療之個體投與有效量之本發明結合分子、聚核苷酸、表現載體或系統或宿主細胞。
本發明在實例中進一步指出該等藥理學組合物及產品可用於緩慢釋放該結合分子及/或使該結合分子局部沈積於損傷部位。
本文所用之術語"緩慢釋放"或等效術語"受控釋放"或"延長釋放"係指在投與給個體後經一段時間釋放活性藥物(例如多肽藥物，包括本發明之NogoA或NiG結合分子，例如針對NogoA或NiG之抗體)之藥物調配物。端視藥物調配物而定，多肽藥物之延長釋放可在一定時間範圍內發生，例如，數分鐘、數小時、數天、數週或更長時間，此與標準調配物形成對比，在標準調配物中實質上全部劑量單元可經由血流即刻吸收或即刻分佈。單次投與較佳之延長釋放調配物可使得循環藥物濃度持續(例如)8小時或更長、12小時或更長、24小時或更長、36小時或更長、48小時或更長、60小時或更長、72小時或更長、84小時或更長、96小時或更長、或甚至(例如)1週或2週或更長(例如1個月或更長)。延長釋放調配物已在業內充分闡述且可按照較佳之抗體釋放性質予以選擇。適宜聚合物包括諸如聚乳酸乙醇酸(PLGA)等可生物降解及不可生物降解之物質。
本文所用之術語"抗原決定部位"係指通常結合免疫球蛋白VH/VL對之結構單元。抗原決定部位界定抗體之最少結合位點且因此代表抗體之特異性靶標。在單結構域抗體情形下，抗原決定部位代表單獨結合單可變結構域之結構單元。
當用以提及本文所述之NogoA或NiG結合分子時，本文所用之術語"中和"意指該結合分子干擾NogoA或NiG之可量測活性或功能。若NogoA或NiG結合分子使靶抗原(例如Nogo或NiG)之可量測活性或功能減少至少50%，且較佳至少60%、70%、80%、90%、95%或更多(至多且包括100%抑制)，則該NogoA或NiG結合分子係"中和"多肽。該靶抗原之可量測活性或功能之減少可由熟習此項技術者使用量測該活性或功能之一或多個指標之標準方法來評價。例如，當靶標為Nogo或NiG時，中和活性可利用下文所述之神經突生長分析來評價。
具體而言，本發明結合分子可用於神經纖維受傷後之軸突再生及萌芽改良。因此，本發明分子尤其對於人類個體具有廣泛用途。例如，本發明結合分子可用於治療多種周圍神經系統(PNS)及中樞神經系統(CNS)疾病，即更具體而言神經變性疾病，例如阿茲海默氏症、帕金森氏症、肌萎縮側索硬化(ALS)、路易體類病狀或其他一般癡呆症、顱、大腦或脊柱創傷後疾病、中風及脫髓鞘疾病。該等脫髓鞘疾病包括(但不限於)多發性硬化、單相脫髓鞘、腦脊髓炎、多竈性白質腦病、全腦炎、馬畢二氏病、腦橋髓鞘溶解、腎上腺腦白質營養不良、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、海綿狀變性、亞歷山大氏病、卡納萬病、異染性腦白質營養不良及克利伯氏病。在一個實例中，投與本發明結合分子可用於治療與NogoA蛋白有關之脫髓鞘疾病。
在另一實例中，可將表現本發明結合分子之細胞移植至脊髓損傷部位以促進整個損傷部位之軸突生長。該等所移植細胞將提供用於在損傷或創傷後恢復脊髓功能之手段。該等細胞可包括不同譜系胎兒神經或組織移植物之嗅鞘細胞及幹細胞。
另外，本發明結合分子可用於治療變性眼睛病症，該等病症直接或間接與視網膜細胞或角膜細胞之變性有關，該等病症包括一般缺血性視網膜病變、前部缺血性視神經病變、所有形式之視神經炎、年齡相關性黃斑變性、糖尿病性視網膜病變、囊樣黃斑水腫(CME)、色素性視網膜炎、斯塔加特病、百斯特氏卵黃樣視網膜變性、利伯氏先天性黑矇及其他遺傳性視網膜變性、病理性近視、早產兒視網膜病變、及利伯氏遺傳性視神經病變、角膜移植或屈光性角膜手術之後效應、及皰疹性角膜炎。
而且，本發明結合分子可用於治療精神病病狀，尤其精神分裂症及抑鬱症。
當然，對於該等適應症而言，適當劑量將端視(例如)欲採用之本發明之特定分子、投與模式及所治療病狀之性質及嚴重程度而有所變化。通常而言，劑量較佳在1μg/kg/天至1mg/kg/天範圍內。
本發明之結合分子通常在損害部位藉由幫浦投與或以治療劑注射，例如可直接將其經顱內投與至CNS或經鞘內投與至脊柱以到達損害部位。脊髓周圍之含液體空間稱為蛛網膜下或鞘內空間。腦脊液(CSF)流經此區域，浸泡並保護腦及脊髓。鞘內藥物幫浦較經口藥物治療作用更加有效，因為鞘內藥物幫浦將藥物直接遞送至CSF中，繞過經口藥物治療在體內通過之路徑。因此，在較佳實施例中，投與係通過鞘內投與實施，例如使用與便攜式幫浦連接之外部化導管。在又一較佳實施例中，使用鞘內濃注。用於鞘內投與藥物之適宜手段及方法係彼等已為熟習此項技術者所習知者。幫浦之非限制性實例係：Alzet幫浦及Medtronic SynchroMed或Isomed輸注系統。該等結合分子可連續輸注，或較佳以固定劑量以1、2、3、4、5、6、7、10、14、21、或30天之特定時間間隔藉由(例如)直接濃注投與至腦脊液中。
本發明之結合分子可單獨或組合或與其他藥劑依序組合提供。例如，本發明之結合分子可與抗炎劑組合投與，該等抗炎劑例如但不限於中風或脊髓損傷後作為阻斷進一步神經元受傷及軸突再生抑制之手段的皮質類固醇、諸如神經生長因子(NGF)、腦源性親神經因子(brain-derived neurotropic factor)(BDNF)等神經營養因子或用於神經變性疾病之其他藥物，例如艾斯能(Exelon)(tm)(利斯的明(Rivastigmine))或左旋多巴(Levodopa)(L-DOPA(3,4-二羥基-L-苯丙胺酸))。用於治療中風之其他適宜組合搭配劑係阿替普酶(Alteplase)及去胺普酶(Desmoteplase)(DSPA，例如揭示於WO90/09438中)。在一個實施例中，本發明提供包含本發明結合分子及去胺普酶之組合(其尤其用於治療中風)以及包含該組合之醫藥組合物。在本文中，當兩種藥劑係同時投與或以使該等藥劑同時起作用之方式單獨投與時，認為該兩種藥劑係組合投與。
藉由編號、通用名或商標名標識之活性成份之結構可自標準綱要"默克索引(The Merck Index)"之現行版本或自諸如國際專利(Patents International)(例如IMS World Publications)或由IMS Health提供之其他數據庫等數據庫獲得。其對應內容以引用方式併入本文中。任一熟習此項技術者皆能夠完全識別此等活性成份，並亦可根據此等參考文獻於標準測試模型中(活體外及活體內二者)製造並測試此等醫藥適應症及特性。可以習用方式製造本發明之醫藥組合物。例如，包含本發明分子之本發明組合物較佳以凍乾形式提供。為即刻投與，將本發明組合物溶解於適宜水性載劑中，例如，注射用無菌水或無菌緩衝生理鹽水。
為有助於配製適宜組合物，可將本發明之結合分子及視情況能夠增強本發明結合分子之效應之第二藥物在相同容器中單獨包裝，並附有混合或伴隨投與之說明。上文已提供可選第二候選藥物。
本發明結合分子與諸如NGF等生長因子之組合的協同效應可藉由脊髓損傷模型在活體內證實。
本發明亦係關於本發明醫藥組合物用於製備本發明結合分子之緩慢釋放藥劑的用途。
本發明亦係關於本發明醫藥組合物用以製備用於使本發明結合分子局部沈積於損傷部位之藥劑的用途。
本發明進一步係關於用於緩慢釋放本發明結合分子及使本發明結合分子局部沈積於損傷部位之本發明醫藥。
本發明亦係關於緩慢釋放本發明結合分子及使本發明結合分子局部沈積之方法。
藉由參考以下實例可更全面地理解本發明。然而，不應將其理解為對本發明範圍進行限制。
在以下實例中，所有溫度皆以攝氏度(℃)計。
實例中所關注之單株抗體係本發明之結合分子，其包含由SEQ ID NO:5代表之輕鏈可變區及由SEQ ID NO:4代表之重鏈可變區(6A3-IgG1)或包含由SEQ ID NO:25代表之輕鏈可變區及由SEQ ID NO:24代表之重鏈可變區(6A3-IgG4)。
顯然，在上文所給出之段落中，術語"包含"涵蓋術語"由...組成"。
使用以下縮寫：
ELISA　酶聯免疫吸附分析法
FACS　螢光激活細胞分選
FITC　異硫氰酸螢光素
FBS　胎牛血清
FCS　胎牛血清
HCMV　人類巨細胞病毒啟動子
IgG　免疫球蛋白同種型G
mAb　單株抗體
VH　重鏈可變區
VL　輕鏈可變區
LC　輕鏈
HC　重鏈
CDR　互補決定區
BSA　牛血清白蛋白
aa　胺基酸
bp　鹼基對
CNS　中樞神經系統
HRP　辣根過氧化物酶
RT　室溫
PBS　磷酸鹽緩衝鹽水
TBS　Tris緩衝鹽水
CEA　癌胚抗原
IF　免疫螢光
IgG　免疫球蛋白G
PBS-T　磷酸鹽緩衝鹽水與0.05% Tween 20
PFA　低聚甲醛
實例
藉由以下非限制性實例來闡釋本發明。
實例1： Medarex 6A3抗-hu-NogoA單株抗體之序列。
選擇對於NogoA之人類NiG片段具有高親和力之人類IgG1單株抗體。最初單株抗體分泌自小鼠雜交瘤細胞純系，該等小鼠雜交瘤細胞純系係使用由Medarex公司(Annandale，NJ)用人類免疫球蛋白基因以重組方式重構之小鼠"Medarex小鼠"藉由標準雜交瘤技術獲得。經人類NiG免疫之Medarex小鼠之產生及其雜交瘤之產生已為熟習此項技術者所熟知；已仿效與闡述於WO 2005/028508中之該等條件類似之條件。大多數雜交瘤之抗體產生量非常低；因此，使用重組DNA技術來構建用於在細胞系中大量產生全抗體或Fab-片段之特異性表現載體。經純化Ab及Ab之Fab片段的產生已為熟習此項技術者所熟知且詳細闡述於(例如)WO 2005/028508中。已仿效類似步驟來產生經純化之6A3-mAb及6A3-Fab。
將編碼6A3-IgG1抗體之重鏈及輕鏈可變區的cDNA藉由PCR(聚合酶鏈反應)自雜交瘤mRNA進行擴增，選殖並藉由測序對其實施定性(圖1及2；SEQ ID NO7及6)。
實例2： Fab及IgG4產生。
6A3mAb為IgG1同種型。人類IgG1同種型抗體對於細胞Fc受體具有高親和力且可誘導抗體依賴性細胞毒性(AADC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)(Jerries等人，2002；Hezareh等人，2001)。而且，已報導IgG mAb會經由Fc受體介導之逆胞吞轉運作用跨過血-腦屏障自腦中快速流至血液中(Zhang等人，2001)。為去除6A3 IgG1 mAb之潛在的Fc受體介導之相互作用，以重組方式將其同種型轉變成IgG4且此亦為了重組產生在SP2/0細胞及大腸桿菌中高容量表現之單價Fab片段。
對該人類抗-Nogo-A抗體之重鏈及輕鏈之可變結構域實施測序能夠在高容量產生細胞系中重組產生6A3-Fab片段及6A3-IgG4同種型抗體。
在大腸桿菌中表現Fab片段時，兩種cDNA(SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:6)皆為經選殖pASK116。用以選殖cDNA之質粒提供小鼠IgG1/κ之恆定結構域基因(Skerra,1994)。在四環素啟動子之轉錄控制下將抗體片段之兩條多肽鏈編碼於操縱子上。第一順反子編碼Fab片段之重鏈部分。使VH結構域與其N-末端之OmpA信號肽及其C-末端之鼠科動物IgG1類CH1結構域融合。第二順反子編碼輕鏈，其VL結構域與PhoA前導肽及鼠科動物CH1結構域融合。誘導表現後，該Fab片段之兩條鏈同時隱匿至大腸桿菌之周質中，在周質中發生蛋白質折疊、二硫鍵形成及鏈組裝。為在大腸桿菌中表現Fab，將質粒轉移至BMP中以大規模生產。
為選殖6A3抗體之輕鏈及重鏈可變區以在SP2/0細胞中表現IgG4抗體，將對應cDNA選殖至質粒LCvec-AAL160及hcMCPfin中。為表現IgG4全抗體，對於LC構建體用NotI且對於HC構建體用PvuI使質粒線性化並轉染至SP2/0細胞中。
已成功產生帶有his-標籤之6A3 IgG4及6A3 Fab單價片段並對其進行純化。在BIAcore實驗中該等重組抗體對於人類NogoA片段hNiG呈現高親和力(參見下文)。Kd值分別為0.14nM及1.1nM證實選殖正確且成功及Ab之重組表現保留了其對人類NogoA片段hNiG之高親和力。
6A3-Ig4之重鏈及輕鏈之編碼區及胺基酸序列顯示於圖3及4中(SEQ ID NO 24、25、28及28)。
實例3： 測定6A3-Ab之互補決定區。
6A3-抗體之可變重鏈及輕鏈之互補決定區係使用www.bioinf.org.uk/abs/之URL上的Kabat數據庫來測定。Kabat定義係基於序列變異性且其為測定抗體可變區之CDR的最常用方法(Wu TT，Kabat EA，1970)。
所有6個CDR定義皆與除CDR-H2外之實驗測定胺基酸序列充分相關，對於CDR-H2而言，CDR前之典型殘基應為LEWIG，但發現其為LEWVA(圖5)。然而，對於CDR-H2可存在多種變異。
實例4： 小鼠6A3-IgG1、6A3-IgG4及6A3 Fab對NiG之生物感測器親和力量測。
小鼠6A3-IgG1 mAb、6A3-IgG4 mAb、及6A3 Fab之親和力係按照製造商說明書使用BIAcore 2000光學生物感測器(Biacore,Uppsala,Sweden)藉由表面電漿共振(SPR)來量測。利用胺偶聯化學將重組人類NIG共價固定於CM5感測芯片之流動池上。簡言之，藉由注射35μl含有0.025M NHS及0.1M EDC之溶液激活經羧基甲基化之葡聚糖基質。為固定於感測芯片上，將重組人類NIG稀釋於pH值為4之0.01M檸檬酸鹽緩衝液中並以5μl/min流速注射以達成容許親和力量測之偶聯程度。剩餘NHS-酯基之失活係藉由注射35μl 1M乙醇胺鹽酸鹽(pH 8.5)來實施。藉由注射5μl 0.1M HCl使感測芯片之表面再生。為量測親和力，以介於0.50nM至100nM範圍內之不同濃度以200μl/min流速注射抗體。每次注射後皆利用注射10μl 0.1M HCl使感測芯片表面再生以使該表面不失去結合活性。動力學常數ka及kd及親和力常數KA及KD係使用製造商提供之BIA評價3.0軟體來評價。
BIAcore中之親和力量測：小鼠6A3-IgG1 mAb、6A3-IgG4 mAb及6A3衍生單價Fab片段對重組人類NogoA之動力學及親和力結合常數係利用表面電漿共振(SPR)技術(Biacore)實時量測。對於該分析，將重組人類NIG偶聯於感測芯片表面上並注射不同濃度之抗體。藉由非線性曲線擬合自感測圖獲得結合相互作用之動力學參數。對於6A3-IgG4、6A3-IgG1、6A3 Fab而言，平衡時抗體對人類NIG之親和力常數在KD 0.13nM至2.5nM範圍內。
實例5： 抗-NogoA抗體NVP-6A3-Ab-NX-1及NVP-IIC7-NX-1與內源性人類NogoA之結合。
在該實例中顯示抗體與內源性人類Nogo-A之結合。為此，對兩種人類細胞系實施測試，該兩種人類細胞系經先前定性顯示Nogo-A之少突特異性(oligodendritic-specific)基因表現且隨後與抗體特異性結合。使用人類少突神經膠質細胞系MO3.13及HOG根據吾人之兩種抗-Nogo-A抗體NVP-6A3-Ab-NX-1(6A3-Ab)及NVP-IIC7Ab-NX-1(IIC7-Ab)與內源性Nogo-A之結合來定性該等抗體。可進一步使用該等細胞來實施用於定性用於臨床試驗之不同抗體批料之生物分析。在兩組單獨實驗裝置中，對彼等細胞中6A3-Ab與內源性人類Nogo-A之結合進行分析及檢測。
在第一步驟中，使用對於人類Nogo-A具有特異性之引物藉由RT-PCR來分析MO3:13細胞中是否存在Nogo-AmRNA。其次，藉由MO3.13細胞溶解產物之免疫沈澱法及免疫檢測顯示兩種抗體與內源性Nogo-A之結合。最後，含有6A3-Ab之MO3.13及HOG細胞的特異性免疫螢光染色證實了自免疫沈澱法獲得之結果。
因此，吾人發現6A3-AB及11C7-Ab二者均能夠與內源性人類Nogo-A特異性結合。
方法
細胞系：MO3.13細胞係自Dr. N. Cashman(UniVersity of Toronto)獲得。其來源於人類橫紋肌肉瘤(RD)之6-硫鳥嘌呤-抗性突變體與自手術樣本培養之成年人類少突神經膠質細胞的融合物。HOG細胞係自Dr. G. Dawson(University of Chicago)獲得。該細胞系係自以手術方式去除之少突神經膠質瘤建立。所有細胞皆在含有大量葡萄糖(Gibco)之補充有Glutamax、10%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之杜貝克氏改良鷹氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)中培養。
RT-PCR：總RNA係使用Tripure試劑(Roche Diagnostics)自5×105 個MO3.13細胞製備。在DNA酶處理後，使用Omniscript RT(Qiagen)及寡核苷酸dT-引物在20μl總體積中對1μg RNA實施逆轉錄。用於PCR之引物對Nogo-A具有特異性，擴增全長人類Nogo-A中以bp位置1197開始之194bp片段(5'-TGAGGGAAGTAGGGATGTGC-3'(SEQ ID NO:32)、5'-CAGGTGATGTACGCTCTGGA-3'(SEQ ID NO:33))。使用2μl cDNA(或0.1μgRNA-RT)、5μl 10x緩衝液、3μl dNTP(各5mM)、2.5μl 5'引物(10μM)、2.5μl 3'引物(10μM)、0.5μl HotStar Taq-聚合酶(Qiagen)及34.5μlH2 O來實施反應。使用以下PCR循環：95℃ 15 min.，(94℃ 30sec.、55℃ 30sec.、72℃ 15sec.)x35，72℃ 10min.-->4℃。完成PCR後，在2%溴化乙錠瓊脂糖凝膠上對10μl分液進行分析。
免疫沈澱法及免疫檢測：對於每一IP，用PBS洗滌MO3.13細胞生長至鋪滿之一個10cm培養皿並將細胞溶解於500μl含有完整蛋白酶抑制劑混合劑(RocheDiagnostics)之M-PER哺乳動物蛋白提取物試劑(Pierce)中。在RT(室溫)下用蛋白質G-瓊脂糖(Sigma)將溶解產物之可溶部分預清洗15分鐘。向經預清洗之上清液中添加新鮮蛋白質G-瓊脂糖及對應抗體(最終濃度為50nM)並在4℃下於旋轉振蕩器上培育4小時。抗體為6A3 IgG4、11C7 IgG1或對抗無關蛋白(癌胚抗原)之抗-CEA IgG4(其作為陰性對照)。分析每一上清液分液之未結合部分；將瓊脂糖用TNS緩衝液(10mM TrisHCl pH 7.8，1%(w/v)N-月桂基肌胺酸，100mM NaCl)洗滌四次，用PBS洗滌一次，並用20μlSDS-PAGE加樣緩衝液(Invitrogen)溶析瓊脂糖結合部分。將樣品加熱至95℃保持5分鐘且使各10μl分液在存於MES-緩衝液中之NuPage4-12%梯度凝膠(Invitrogen)上流過。在30V下將蛋白質印迹至纖維素膜上，持續4小時並利用麗春紅染色分析是否完全轉移。轉移後，將膜在4℃下於存於PBS-T中之西方阻斷試劑(Roche Diagnostics)中阻斷過夜。對於免疫檢測，將膜與1nM濃度之6A3-IgG4抗體在RT下培育2小時並隨後與偶聯抗-人類過氧化物酶之二級抗體在RT下培育1小時。使用ECL-Advance(Amersham)檢測信號並暴露於膜1分鐘。
免疫螢光：將MO3.13及HOG細胞鋪板於塗覆有聚-D-離胺酸之8-孔組織室形載玻片(Becton Dickinson)中並生長直至80%鋪滿。在於PBS中洗滌後，將細胞在室溫下於4%PFA中固定30min。用10% FCS、0.1% Triton X-100將非特異性結合阻斷20min。將細胞與6A3-IgG45nM或僅緩衝液(作為陰性對照)在1% FCS,0.1% Triton X-100中培育1小時。在培育抗體後，將細胞用PBS洗滌三次並與經Alexa Fluor 488標記之以1:200稀釋之抗人類IgG抗體(分子探針(Molecular Probes))在PBS中培育1小時。
結果
RT-PCR：使用MO3.13 RNA為模板實施RT-PCR產生200bp左右之不同DNA片段(圖6)。在陰性對照(RNA未逆轉錄及H2 O)中未檢測到產物。所存在之PCR片段具有預期大小194bp；在陰性對照樣品(經DNA酶處理之RNA及H2 O)中無擴增產物。
免疫沈澱法：在MO3.13細胞溶解產物之免疫沈澱法(IP)及用6A3抗Nogo-A抗體實施免疫檢測(圖7)後，對於6A3-IgG4(泳道4)及11C7-IgG1(泳道6)抗體二者均檢測到預期大小(190kDa)之單強譜帶。在對抗無關蛋白(癌胚抗原)之抗-CEA對照抗體之IP(泳道1)及在未結合部分(泳道5及7)之IP後未檢測到信號。在粗MO3.13細胞溶解產物中在IP之前可以看到微弱譜帶(泳道2)。在不可溶細胞溶解產物部分中可以看到較低分子量之微弱非特異性信號(泳道3)。
免疫螢光：含有6A3-IgG4及經Alexa-Fluor 488標記之抗人類二級抗體之透性化MO3.13細胞及HOG細胞的免疫螢光染色導致非常亮之細胞染色(圖8a及8b，左側部分)，而實質上在僅二級抗體下未檢測到信號(右側)。
討論
使用用於PCR之Nogo-A特異性引物對MO3.13細胞進行RT-PCR分析產生預期大小之DNA片段(194bp)，而未經逆轉錄之RNA樣品或水對照未檢測到PCR產物。自該結果吾人可斷定該等細胞表現內源性Nogo-A。
MO3.13細胞溶解產物之免疫沈澱法及抗-Nogo-A抗體6A3之免疫檢測顯示預期大小(190kDa)之單強Nogo-A譜帶。相比之下，抗-CEA(IgG4)對照抗體未產生對應大小之譜帶。產生於6A3及11C7免疫沈澱法之譜帶之間之強度差異最可能係由於不同抗體同種型對蛋白質G瓊脂糖之不同親和力(親和力6A3大於親和力11C7)導致。來自MO3.13及HOG細胞二者之細胞內免疫螢光染色的結果均顯示6A3-IgG4與內源性Nogo-A結合。
自該等結果可斷定兩種細胞系均以內源方式表現Nogo-A且6A3 IgG4(6A3-Ab)及11C7 IgG1(11C7-Ab)抗體二者均與內源性人類Nogo-A特異性結合。該等發現表明MO3.13細胞系可用於建立用於(例如)抗體定性之Nogo-A結合分析。
實例6： 6A3治療對患有腦損害之短尾猴之功能恢復的效果。
在進一步研究中，如先前所述使短尾猴經受損害並自損害之時起用4週鞘內輸注6A3或對照IgG治療。在如本文先前所述之條件下使用經改良之勃林克曼板測試測定受侵襲左手之手靈巧度。與對照IgG治療相比，6A3治療使功能恢復之速率及程度得以改良。當在實驗結束時測定損害之大小時，發現經對照IgG治療之猴之功能恢復與損害大小大致逆相關，自對於50%損害90%至對於90%損害53%變化。相比之下，在經抗-Nogo-AmAb治療之動物中恢復的量受損害大小之影響不顯著且對於經6A3治療之動物即使損害大小高達85%大多數動物仍達到其損害前表現。
實例7： 6A3抗體在人類個體中之CSF保留性及半衰期
在CSF輸注14天(日劑量為15mg/天)後測定6A3抗體在人類個體中之CSF保留性及半衰期並量測血清及CSF中之各濃度(圖9及10)。
與輸注期間量測之含量相比，在持續34天及56天(即輸注結束後約20天及42天)之兩種情形下，CSF濃度保持恆定或僅略微降低，此表明6A3在CSF中具有驚人長之保留期及/或半衰期。此藥物代謝動力學性質使不同投與途徑及較長間隔之劑量方案成為可能。在2天或更多天或數週間隔期間濃注至CSF中將可行。該6A3抗體亦適於受控釋放調配物，例如存於可生物降解或不可生物降解聚合物及移植物中之調配物。
實例8： 在短尾猴SCI模型中之功效
使3只猴在C7/C8邊界經受脊髓單向切割，已知此損傷會使得不能發生精確細緻之手指運動，並移植入滲透Alzet幫浦，該幫浦將小鼠IgG抗體(在對照動物中)或6A3抗體(在治療動物中)以1mg/天劑量鞘內遞送至損害部位，此持續4週(圖11及 Freund等人，Nat Med 12:790-2，2006)。手靈巧度係藉由在經改良之勃林克曼板測試中自垂直及水平狹槽獲取食物顆粒來評價。其他行為任務包括自抽屜獲取食物顆粒、彈道線形手臂運動、抓取食物之足運動能力及對疼痛及不適之行為觀察。自損害之前60天至損害後120天以一定間隔實施測試。
使猴經受脊髓單向切割並用小鼠IgG對照抗體(n=2，即對照1具有50%損害且對照2具有90%損害)或6A3(n=2，即ATI1具有85%損害且ATI2具有80%損害)以1mg/天劑量實施鞘內治療，此持續4週(猴重量：對照1，5.1kg；對照2，4.1kg；ATI 1，5.0kg；ATI 2，4.5kg)。結果以測試時間期間在特定試驗日之顆粒總數來顯示。使用損害前及損害後表現程度保持穩定時之個體行為分值來計算各值。
與經對照IgG治療之猴相比，實施6A3抗體治療之猴使用受侵襲之左手自水平及垂直狹槽獲取食物顆粒逐漸改良。對照猴顯示自水平狹槽獲取顆粒存在總體持久缺陷，自水平狹槽獲取顆粒之運動較自垂直狹槽獲取顆粒需要更高手靈巧度。
在於勃林克曼板測試中達到最大程度恢復後，測試猴用其受侵襲之左手抓取抽屜把手、將抽屜拉開並自抽屜中之孔取出食物顆粒之能力。損害90%(對照2)之經對照IgG治療之猴全部不能抓取把手及將抽屜打開。手臂運動較正常緩慢且手形狀異常。此可自雙箭頭線得出結論，表明損害前活動與損害後並用對照IgG抗體治療後之活動間存在明顯差異，表明僅部分恢復。不管損害大小，具有85%(ATI-1)或80%(ATI-2)損害之經6A3抗體治療之動物均恢復了快速且有效實施任務的能力。損害前與損害後用6A3抗體治療之活動間無實質差異，表明6A3抗體治療達成完全恢復。因此，與IgG對照抗體治療相比，在於短尾猴中誘導腦損害後該6A3抗體治療對恢復具有明顯有意效果。
實例9： 臨床試驗
適宜臨床研究闡述如下：
該研究具有三個時期：篩選期(包括基線)、開放式治療期及至少22週之隨訪期。在獨立數據安全監測委員會(Data Safety Monitoring Board)(DSMB)之監督下實施研究。
共有22名患者登記參與研究，其在4個部分重疊之依序群組中接受連續輸注6A3抗體。所有患者皆在輸注後具有至少22週之隨訪期以進一步評價安全性。
各群組之患者分配及治療劑量及持續時間如下：
‧群組1：3名截癱患者經24h接受5mg[2.5ml]；
‧群組2：3名截癱患者經24h接受30mg[2.5ml]；
‧群組3：6名截癱患者經14天接受至多30mg/天[2.5ml/天]。
‧群組4：10名截癱及四肢癱瘓患者經28天接受至多30mg/天[2.5ml/天]。
在開始輸注後至少六個月時間段內密切監測患者。藉由生命體徵量測、ECG記錄(由中心機構解釋)及基於基質血液、尿及CSF之實驗室評價密切監測患者狀況。使用ASIA等級(美國脊髓損傷協會之脊髓損傷之適用標準神經學分類)(Ditunno等人，1994；美國脊髓損傷協會。Paraplegia32(2)：7080.)由有資格之臨床醫師實施神經學檢查來評價功效，且亦評價脊髓損傷之潛在加劇。對於每一患者皆實施總共四次大腦及脊柱MRI。對於每一患者皆在三個時間點(劑量前、治療期期間及隨訪期期間)採取CSF樣品以用於藥物代謝動力學(PK)分析。亦在治療及隨訪期期間獲得血液樣品以用於PK分析。來自所有患者之數據皆由獨立DSMB根據方案進行審查。
圖1編碼6A3-IgG1抗體之輕鏈可變區之核苷酸(SEQ ID NO7)及胺基酸(SEQ ID NO5)。下劃線部分表示前導肽(SED ID NO 22)及編碼其之核苷酸序列(SEQ ID NO23)。
圖2編碼6A3-IgG1抗體之重鏈可變區之核苷酸(SEQ ID NO6)及胺基酸(SEQ ID NO4)序列。下劃線部分表示肽(SEQ ID NO20)及編碼其之核苷酸序列(SEQ ID NO21)。
圖36A3-Ig4之輕鏈(SEQ ID NO28；上部)及重鏈(SEQ ID NO26；下部)可變部分的編碼區。
圖46A3-Ig4可變及恆定部分之重鏈(SEQ ID NO24；下部)及輕鏈(SEQ ID NO25；上部)的胺基酸序列。輕鏈(SEQ ID NO31)及重鏈(SEQ ID NO30)之前導肽以斜體字表示。
圖5上部：6A3-IgG1抗體輕鏈胺基酸(SEQ ID NO 5)，其具有前導序列(SEQ ID NO 22)及CDR-L1(SEQ ID NO 11)、CDR-L2(SEQ ID NO 12)及CDR-L3(SEQ ID NO 13)序列。
下部：6A3-IgG1抗體重鏈胺基酸(SEQ ID NO 4)，其具有前導序列(SEQ ID NO 20)及CDR-H1(SEQ ID NO 8)、CDR-H2(SEQ ID NO 9)及CDR-H2(SEQ ID NO 10)序列。
圖6
使用MO3.13 RNA為模板及Nogo-A特異性引物實施RT-PCR產生200bp左右之不同DNA片段。
圖7
使用6A3抗體來自MO3.13細胞脂質之經免疫沈澱之Nogo-A的免疫印迹檢測。
在MO3.13細胞溶解產物之免疫沈澱法(IP)及用6A3抗Nogo-A抗體實施免疫檢測後，對於6A3-IgG4(泳道4)及11C7-IgG1(泳道6)抗體二者均檢測到預期大小(190kDa)之單強譜帶。
圖8a：MO3.13細胞之免疫螢光染色。
圖8b：HOG細胞之免疫螢光染色。
含有6A3-IgG4及經Alexa-Fluor 488標記之抗人類二級抗體之透性化MO3.13細胞及HOG細胞的免疫螢光染色導致非常亮之細胞染色(圖8a及8b，左側部分)，而實質上在僅二級抗體下未檢測到信號(右側)。
圖9在6個個體中至多兩個月內量測之6A3抗體血清濃度。
圖10在6個個體中至多兩個月內量測之6A3抗體CSF濃度。
圖11在猴SCI模型中不管損害大小6A3抗體治療使得功能恢復之速率及程度得以改良。
(無元件符號說明)

Claims (21)

  1. 一種分離分子，其包含至少一個與人類NogoA多肽(SEQ ID NO：2)或人類NiG(SEQ ID NO：3)特異性結合之抗原結合位點，該抗原結合位點包含：*按順序為超變區CDR-H1-6A3(SEQ ID NO：8)、CDR-H2-6A3(SEQ ID NO：9)及CDR-H3-6A3(SEQ ID NO：10)；及*按順序為超變區CDR-L1-6A3(SEQ ID NO：11)、CDR-L2-6A3(SEQ ID NO：12)及CDR-L3-6A3(SEQ ID NO：13)。
  2. 如請求項1之分離分子，其包含：*至少一種免疫球蛋白重鏈或其片段，其包含(i)按順序包含超變區CDR-H1-6A3(SEQ ID NO：8)、CDR-H2-6A3(SEQ ID NO：9)及CDR-H3-6A3(SEQ ID NO：10)之可變結構域及(ii)人類重鏈之恆定部分或其片段；及*至少一種免疫球蛋白輕鏈或其片段，其包含(i)按順序包含超變區CDR-L1-6A3(SEQ ID NO：11)、CDR-L2-6A3(SEQ ID NO：12)及CDR-L3-6A3(SEQ ID NO：13)之可變結構域及(ii)人類輕鏈之恆定部分或其片段。
  3. 如請求項1之分離分子，其離解常數小於1000nM。
  4. 如請求項1之分離分子，其中該人類重鏈之恆定部分或其片段為γ4型且該人類輕鏈之恆定部分或其片段為κ型。
  5. 如請求項1之分離分子，其中該結合分子係人類或嵌合 或人類化單株抗體。
  6. 如請求項1之分離分子，其包含一或多種選自由下列組成之群之多肽序列：SEQ ID NO：4(IgG1重鏈)、SEQ ID NO：5(IgG1輕鏈)、SEQ ID NO：24(IgG4重鏈)及SEQ ID NO：25(IgG4輕鏈)。
  7. 一種分離聚核苷酸，其包含編碼如請求項1之結合分子之核酸序列。
  8. 如請求項7之分離聚核苷酸，其包含：*至少一種選自由SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16組成之群之聚核苷酸序列；或*至少一種選自由SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：19組成之群之聚核苷酸序列。
  9. 如請求項7之聚核苷酸，其包含：*按順序包含SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16之聚核苷酸序列；及*按順序包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：19之聚核苷酸序列。
  10. 如請求項7之聚核苷酸，其包含：* SEQ ID NO：6之聚核苷酸序列及/或SEQ ID NO：7之聚核苷酸序列，或* SEQ ID NO：26之聚核苷酸序列及/或SEQ ID NO：28之聚核苷酸序列。
  11. 一種表現載體，其包含如請求項7至10中任一項之聚核苷酸。
  12. 一種表現系統，其包含如請求項11之表現載體，其中當該表現系統或其部分存在於相容性宿主細胞中時，該表現系統或其部分能夠產生如請求項1之多肽。
  13. 一種分離宿主細胞，其包含如請求項11之載體。
  14. 一種分離組合物，其包含如請求項11之表現載體或如請求項13之宿主細胞。
  15. 一種如請求項1之結合分子的用途，其係用以製造用於治療周圍神經系統(PNS)及/或中樞神經系統(CNS)疾病之藥劑。
  16. 一種醫藥組合物，其分別包含如請求項1之結合分子、如請求項7之聚核苷酸、如請求項11之表現載體或如請求項12之表現系統、或如請求項13之宿主細胞與至少一種醫藥上可接受之載劑或稀釋劑。
  17. 一種如請求項1之結合分子、如請求項7之聚核苷酸、如請求項11之表現載體或如請求項12之表現系統、或如請求項13之宿主細胞的用途，其係用以製造用於治療周圍神經系統(PNS)及/或中樞神經系統(CNS)疾病之藥劑。
  18. 如請求項17之用途，其中該疾病係選自由下列組成之群之神經變性疾病：阿茲海默氏症(Alzheimer disease)、帕金森氏症(Parkinson disease)、肌萎縮側索硬化(ALS)、路易體類病狀(Lewy like pathologies)或其他一般癡呆症、顱、大腦或脊柱創傷後疾病、中風及脫髓鞘疾病。
  19. 如請求項17-18中任一項之用途，其中在損傷部位局部、顱內或鞘內實施投與。
  20. 一種產生如請求項1之結合分子的方法，其包含藉重組DNA技術或藉化學合成分別在如請求項11之表現載體或如請求項12之表現系統中表現如請求項7之聚核苷酸。
  21. 如請求項16之醫藥組合物，其中該組合物係緩慢釋放組合物。
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