CN101910200B - 改良的nogo-a结合分子及其药学用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了能够以＜1000nM的解离常数与人NogoA多肽或人NiG结合的结合分子，编码此类结合分子的多核苷酸；包括所述多核苷酸的表达载体；包括能够产生结合分子的多核苷酸的表达系统；包括如上定义的表达系统的分离的宿主细胞；此类结合分子作为药物的用途，特别是在外周(PNS)和/或中枢(CNS)神经系统疾病治疗中的用途；包括所述结合分子的药物组合物；和治疗外周(PNS)和/或中枢(CNS)神经系统疾病的方法。

Description

改良的NOGO-A结合分子及其药学用途
发明领域
本发明涉及改良的NogoA结合分子，例如单克隆抗体、其衍生物或Fab片段。
发明背景
由于抑制性髓鞘环境的存在，在成年中枢神经系统(CNS)中损伤后的神经元再生是有限的，该环境导致轴突被纳入鞘中且形成瘢痕组织。在最近数年中，有关CNS在损伤后为何无法自发修复其自身的分子认识，已经有了重要的进展。髓鞘中的抑制性分子是轴突再生的主要障碍，特别是紧在损伤后。迄今为止NogoA、髓鞘相关糖蛋白(MAG)、和髓鞘-少突胶质细胞糖蛋白(OMgp)已被表征为神经突增生(outgrowth)的有力抑制剂。此外，髓鞘还包含其他抑制性组分，例如硫酸软骨素蛋白聚糖。Nogo-A是reticulon蛋白质家族的成员，并且它具有至少2个生物学活性且药理学不同的结构域，称为氨基-Nogo和Nogo-66。尽管前者的受体位点迄今未知，但Nogo-66可以经由神经元受体NgR在体外和体内抑制神经元生长。除Nogo-66外，MAG和OMgp也以高亲和力与NgR结合且抑制神经突增生。
目前寻求增强神经修复的新研究方法包括：使用软骨素酶ABC消化瘢痕组织，使用嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells)和干细胞以及蛋白质生长因子的桥接技术以加强神经元生长。神经突增生抑制剂的阻断作用可以通过调节细胞内信号介质例如Rho，一种膜结合鸟苷三磷酸酶(GTP酶)，而达到，Rho看起来是抑制轴突生长的关键环节。环腺苷一磷酸(cAMP)可以在体外克服髓鞘相关的抑制作用且在体内诱导再生。NgR受体(NEP 1-40)的肽抑制剂可以用于在大鼠中在脊髓损伤后诱导神经元再生长和功能恢复。
除使用上述方法外，更多关注也已集中于特定单克隆抗体的使用，以中和中枢和外周神经系统的神经突生长抑制分子，特别是中和NogoA的神经突生长抑制活性。因此，已显示单克隆抗体IN-1或其IN-1Fab片段在体外诱导神经突增生且在体内增强萌芽(sprouting)和再生(Schwab ME等人(1996)Physiol.Rev.76，319-370)。关于IN-1的备选抗体也已在WO2004/052932(11C7-Ab)和WO2005/028508(3A6-Ab)中得到描述。就神经突生长抑制活性测试了NogoA的不同结构域，结果描绘出该分子中的几个抑制结构域(Chen等人(2000)Nature 403，434-439；GrandPre等人，(2000)Nature 403，439-444；Prinjha等人(2000)Nature 403，383-384。
天然免疫球蛋白或抗体包括一般Y形的多聚体分子，所述分子在每个上臂末端处具有抗原结合位点。该结构的其余部分，特别是Y的茎，介导与免疫球蛋白相关的效应子功能。抗体由2条重链和2条轻链组成。重和轻链都包括可变结构域和恒定部分。抗原结合位点由与轻链可变结构域结合的重链可变结构域组成。重和轻链的可变结构域具有相同的一般结构。更特别地，抗体的抗原结合特征基本上由重和轻链的可变结构域中的3个特别区域决定，其称为高变区或互补决定区(CDRs)。3个高变区与4个构架区(FRs)交替，FRs的序列相对保守并且不直接参与结合。这些CDRs形成环并且通过主要采用β-片层构象的构架区保持紧密接近。重链的CDRs连同相关轻链的CDRs基本上构成抗体分子的抗原结合位点。关于何者构成FR或CDR区，通常可以通过比较在相同物种中产生的多个抗体的氨基酸序列来确定。用于鉴定CDR和FR区的一般规则是本领域技术人员的一般知识，并且可以例如在网站(www.bioinf.org.uk/abs/)中找到。
总体地，仍明确需要在成年中枢神经系统(CNS)中于损伤后诱导神经组织再生的新型和改良方法。
发明概述
本发明涉及新的单克隆人抗体，其在体外和体内实验中具有优良的NogoA活性调节性质并且对成年中枢神经系统(CNS)中损伤后的神经元再生具有正面影响。因此，本发明提供NogoA蛋白质的新结合分子或其片段。
在一个实施方案中，本发明因此提供了包括至少一个抗原结合位点的分离的分子，所述抗原结合位点与人NogoA多肽(SEQ ID NO：2)或人NiG(SEQ ID NO：3)特异性结合，所述抗原结合位点：
＊顺次包括高变区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中所述高变区各自分别与高变区CDR-H1-6A3(SEQ ID NO：8)、CDR-H2-6A3(SEQ IDNO：9)和CDR-H3-6A3(SEQ ID NO：10)具有至少90％同一性；且
＊顺次包括高变区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中这些高变区各自分别与高变区CDR-L1-6A3(SEQ ID NO：11)、CDR-L2-6A3(SEQ IDNO：12)和CDR-L3-6A3(SEQ ID NO：13)具有至少90％同一性。
在再一实施方案中，所述本发明的分离的分子的抗原结合位点：
＊顺次包括高变区CDR-H1-6A3(SEQ ID NO：8)、CDR-H2-6A3(SEQID NO：9)和CDR-H3-6A3(SEQ ID NO：10)；且
＊顺次包括高变区CDR-L1-6A3(SEQ ID NO：11)、CDR-L2-6A3(SEQID NO：12)和CDR-L3-6A3(SEQ ID NO：13)。
在另外一个实施方案中，本发明提供了结合分子，其包括
＊至少一条免疫球蛋白重链或其片段，包括(i)顺次包括高变区CDR-H1-6A3(SEQ ID NO：8)、CDR-H2-6A3(SEQ ID NO：9)和CDR-H3-6A3(SEQ ID NO：10)的可变结构域，和(ii)人重链的恒定部分或其片段；和
＊至少一条免疫球蛋白轻链或其片段，包括(i)顺次包括高变区CDR-L1-6A3(SEQ ID NO：11)、CDR-L2-6A3(SEQ ID NO：12)和CDR-L3-6A3(SEQ ID NO：13)的可变结构域，和(ii)人轻链的恒定部分或其片段。
在另一个实施方案中，根据本发明的结合分子具有＜1000nM的解离常数。
在本发明的结合分子的一个备选实施方案中，人重链的恒定部分或其片段为γ4型的，而人轻链的恒定部分或其片段是κ型的。
在一个进一步的实施方案中，根据本发明的结合分子是人的或嵌合的或人源化的单克隆抗体。
在另外一个实施方案中，根据本发明的结合分子包括选自SEQ IDNO：4(IgG1重)、SEQ ID NO：5(IgG1轻)、SEQ ID NO：24(IgG4重)和SEQ ID NO：25(IgG4轻)的一个或多个多肽序列。
此外，本发明还提供了包括编码本发明结合分子的核酸序列的分离的多核苷酸。
在特定实施方案中，本发明的所述分离的多核苷酸包括：
＊选自SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的多核苷酸序列中的至少一个；或
＊选自SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的多核苷酸序列中的至少一个。
在优选实施方案中，本发明的多核苷酸包括
＊顺次包括SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的多核苷酸序列；和
＊顺次包括SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的多核苷酸序列。
在另外一个优选实施方案中，本发明的多核苷酸包括：
＊SEQ ID NO：6的多核苷酸序列和/或SEQ ID NO：7的多核苷酸序列，或，
＊SEQ ID NO：26的多核苷酸序列和/或SEQ ID NO：28的多核苷酸序列。
另外，本发明还提供了包括如上定义的本发明多核苷酸的表达载体。
此外，本发明提供了包括如上定义的表达载体的表达系统，其中当所述表达系统或其部分存在于相容宿主细胞中时，所述表达系统或其部分能够产生如上定义的本发明多肽。
此外，本发明还提供了包括如上定义的载体的分离的宿主细胞。
此外，本发明还提供了包括本发明的结合分子和载体的分离的组合物。
此外，本发明还提供了包括本发明的多核苷酸和载体的分离的组合物。
此外，本发明还提供了包括本发明表达载体或本发明宿主细胞的分离的组合物。
本发明进一步提供了给需要治疗外周(PNS)和/或中枢(CNS)神经系统疾病的个体施用根据本发明的结合分子的方法。
本发明还提供了包括根据本发明的结合分子、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的表达载体或表达系统、或根据本发明的宿主细胞、以及至少一种药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。在特定实施方案中，所述药物组合物是缓释组合物。
本发明进一步提供了治疗外周(PNS)和/或中枢(CNS)神经系统疾病的方法，其包括给需要此类治疗的受试者施用有效量的根据本发明的结合分子、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的表达载体或表达系统、或根据本发明的宿主细胞。在一个优选实施方案中，疾病是选自下述的神经变性疾病：阿尔茨海默氏病，帕金森病，肌萎缩侧索硬化(ALS)，路易小体样病(Lewy like pathologies)或其他全面性痴呆(dementia in general)，颅、脑或脊髓创伤后的疾病，中风和脱髓鞘疾病。在一个进一步的实施方案中，脱髓鞘疾病选自多发性硬化症、单相脱髓鞘病、脑脊髓炎、多灶性白质脑病、全脑炎、马-比(Marchiafava-Bignami)病、脑桥髓鞘脱失(myelmolysis)、肾上腺脑白质营养不良、佩-梅(Pelizaeus-Merzbacher)病、海绵状变性、亚历山大(Alexander′s)病、卡纳万(Canavan′s)病、异染色性脑白质营养不良和克拉伯氏(Krabbe′s)病。
备选地，疾病是变性眼病症，其可以直接或间接涉及视网膜或角膜细胞变性。在一个优选实施方案中，变性眼病症选自缺血性视网膜病变、眼前部缺血性视神经病变、视神经炎、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、囊样黄斑水肿(CME)、色素性视网膜炎、斯塔加特(Stargardt′s)病、Best卵黄状视网膜变性、莱伯氏(Leber′s)先天性黑蒙和其他遗传性视网膜变性、病理性近视、早产儿视网膜病变、和Leber遗传性视神经病变、角膜移植或角膜屈光手术的后效应、和疱疹性角膜炎。
备选地，疾病是精神病病状。优选地，所述精神病病状选自精神分裂症和抑郁症。
在如上所述的治疗方法中，优选地进行颅内或鞘内施用。
此外，本发明还提供了用于产生根据本发明的结合分子的方法，其包括借助于重组DNA技术或借助于化学合成，在根据本发明的表达载体或系统中表达根据本发明的多核苷酸。
此外，本发明提供了在损伤部位局部施用根据本发明的药物组合物的方法。
最后，本发明还提供了包括，以用于在外周(PNS)和/或中枢(CNS)神经系统疾病治疗中同时、分开或相继使用的组合制剂的形式，施用选自下述的一种或多种产品的方法：根据本发明的结合分子、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的表达载体或系统、根据本发明的宿主细胞。
本发明进一步提供了借助于重组DNA技术或借助于化学合成，产生本发明的结合分子和编码此类结合分子的多核苷酸、表达载体的方法。
本发明还提供了包括根据本发明的结合分子、多核苷酸、表达载体或系统或宿主细胞、以及至少一种药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。还提供了包含所述结合分子、多核苷酸、表达载体或系统或所述宿主细胞、或其药学上可接受的衍生物的产品，其为用于在外周(PNS)和/或中枢(CNS)神经系统疾病治疗中同时、分开或相继使用的组合制剂形式。
本发明还涉及治疗外周(PNS)和/或中枢(CNS)神经系统疾病的方法，其包括给需要此类治疗的受试者施用有效量的本发明的结合分子、多核苷酸、表达载体或系统或宿主细胞。
本发明在实施例中进一步指出本发明药物组合物和产品可以用于结合分子的缓慢释放和/或结合分子在损伤部位的局部沉积。
附图简述
图1
编码6A3-IgG1抗体的轻链可变区的核苷酸(SEQ ID NO 7)和氨基酸(SEQ ID NO 5)。有下划线的部分指示前导肽(SED ID NO 22)和编码其的核苷酸序列(SED ID NO 23)。
图2
编码6A3-IgG1抗体的重链可变区的核苷酸(SEQ ID NO 6)和氨基酸(SEQ ID NO 4)。有下划线的部分指示肽(SED ID NO 20)和编码其的核苷酸序列(SED ID NO 21)。
图3
6A3-Ig4的轻(SEQ ID NO 28；上)和重(SEQ ID NO 26；下)可变部分的编码区。
图4
6A3-Ig4可变和恒定部分的重(SEQ ID NO 24；下)和轻(SEQ ID NO25，上)链的氨基酸序列。轻(SEQ ID NO 31)和重(SEQ ID NO 30)链的前导肽以斜体指示。
图5
上：具有前导区(SEQ ID NO 22)以及CDR-L1(SEQ ID NO 11)、CDR-L2(SEQ ID NO 12)和CDR-L3(SEQ ID NO 13)序列的6A3-IgG1抗体轻链氨基酸(SEQ ID NO 5)。
下：具有前导区(SEQ ID NO 20)以及CDR-H1(SEQ ID NO 8)、CDR-H2(SEQ ID NO 9)和CDR-H3(SEQ ID NO 10)序列的6A3-IgG1抗体重链氨基酸(SEQ ID NO 4)。
图6
使用MO3.13RNA作为模板以及Nogo-A特异性引物的RT-PCR导致约200bp的独特DNA片段。
图7
使用6A3抗体免疫印迹检测自M03：13-细胞脂质免疫沉淀的Nogo-A。
在免疫沉淀(IP)MO3.13细胞裂解物和用6A3抗Nogo-A抗体进行免疫检测后，对于6A3-IgG4(泳道4)和11C7-IgG1(泳道6)抗体，均检测到在预期大小(190kDa)的单个强带。
图8
图8a：M03.13细胞的免疫荧光染色。
图8b：HOG细胞的免疫荧光染色。
用6A3-IgG4和Alexa-Fluor 488标记的抗人二抗免疫荧光染色透化处理的MO3.13细胞和HOG细胞，导致细胞的极亮染色(图8a和8b，左侧部分)，而仅用二抗基本上未检测出信号(右侧部分)。
图9
在6个受试者中多达2个月测量的6A3抗体血清浓度。
图10
在6个受试者中多达2个月测量的6A3抗体CSF浓度。
图11
在猴SCI模型中6A3抗体处理提高功能恢复的速率和程度，与损伤大小无关。
发明详述
在研究可以在成年中枢神经系统(CNS)中提供损伤后神经元再生的新改良方法时，现已令人惊讶地发现，新型单克隆人抗体6A3在体外和体内实验中具有优良的调节NogoA活性的性质，该抗体6A3在Medarex Inc的HuMab-mouseTM中产生，所述HuMab-mouseTM是其中人免疫球蛋白基因代替了其鼠类对应物的遗传重构小鼠。6A3针对人NiG产生，具有IgG同种型并且具有比现有技术中描述的NogoA抗体更佳的性质。现可以构建与所述6A3抗体具有相同高变区的其他NogoA结合分子，产生具有6A3的有利性质的新抗体。6A3-Ab的衍生物——6A3-IgG4和6A3-Fab——分别以0.14nM和1.1nM的高亲和力识别人NiG。此外，本发明的抗体显示高稳定性以及延长的体外和体内高半衰期和保持性。最后，本发明的结合分子和抗体显示出自引入部位的缓慢释放，从而使得结合分子可以在损伤部位局部沉积。已检测到在脊髓损伤动物和患者中由连续输注造成的6A3抗体的高脑脊髓(CSF)浓度。在例如脑脊髓液中的这种令人惊讶的高6A3-Ab保持和停留使得可以使用快速浓注(bolus injections)(例如每周1-3次，但每2、3或4周一次的甚至更长间隔也是可行的)代替持续输注，使抗体进入脑脊髓液内。可以使用反复的鞘内快速浓注。在一个优选实施方案中，施用通过鞘内施用来完成，例如使用与便携式泵连接的外置导管(externalized catheter)。在一个进一步优选的实施方案中，使用鞘内快速浓注。实验部分进一步举例说明本发明的结合分子的有利性质。
因此，本发明提供了NogoA或NiG的结合分子(下文称为“本发明的结合分子”或简称为“结合分子”)。优选地，本发明的结合分子结合人NogoA蛋白质(SEQ ID NO：2，由SEQ ID NO：1编码)或人NiG蛋白质(其是NogoA的最有效神经突增生抑制片段，起始于人NogoA的氨基酸186并终止于氨基酸1004，＝SEQ ID NO：3)，优选具有＜1000nM的解离常数(Kd)、或具有小于等于100nM的Kd、更优选具有＜100nM的Kd、或具有小于等于100nM的Kd、最优选具有＜10nM的Kd、或具有小于等于10nM的Kd。结合反应可以通过标准方法(包括定性和定量测定法)显示，包括例如蛋白质印迹、免疫沉淀和生物传感器亲和力方法(参照实施例4)。此外，本发明的结合分子与人NogoA和人NiG的结合以及这些结合分子在功能测定法中的功效，可以在例如如下所述的神经突增生测定法中显示。
因此，在一个进一步优选的实施方案中，当与用对照抗体处理的大鼠小脑颗粒细胞的神经突数目相比较时(所述对照抗体不与人NogoA多肽或人NiG多肽结合(即，具有＞1000nM的解离常数))，本发明的结合分子(以100μg/ml的浓度、优选10μg/ml、更优选以1.0μg/ml、更加优选以0.1μg/ml)使在猴脑蛋白质提取物基质上的大鼠小脑颗粒细胞的神经突数目增加至少20％、优选50％、最优选80％。
在另一个实施方案中，本发明涉及包括至少一个与人NogoA多肽(SEQ ID NO：2)或人NiG多肽(SEQ ID NO：3)特异性结合的抗原结合位点的分离分子，其包括至少一个抗原结合位点，所述抗原结合位点包括：
＊高变区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3中的至少一个，其中所述高变区各自分别与高变区CDR-H1-6A3(SEQ ID NO：8)、CDR-H2-6A3(SEQID NO：9)和CDR-H3-6A3(SEQ ID NO：10)具有至少90％同一性；和
＊高变区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3中的至少一个，其中所述高变区各自分别与高变区CDR-L1-6A3(SEQ ID NO：11)、CDR-L2-6A3(SEQ ID NO：12)和CDR-L3-6A3(SEQ ID NO：13)具有至少90％同一性。
当CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3或CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3存在于本发明的结合分子中时，对人NogoA或NiG的特异性识别得到保证。然而，本领域技术人员已知，在结合分子中即使仅一个CDR结构域的存在也可能足以确保与该识别分子的特异性结合。短语“至少一个高变区”意指1、或2或3个高变区。短语“至少90％同一性”意指90％以上同一性，优选91％、92％、93％；94％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性。2个氨基酸序列的同一性百分比可以使用分析2个或更多个氨基酸序列的相对同一性的计算机算法，进行确定，例如在NationalInstitutes of Health网站上的Basic Local Alignment Search Tool，(BLAST)，Altschul等人1994，Nature Genetics，6：119-129，Altschul等人1990，J.Mol.Biol.215：403-410，Altschul等人1997，Nucleic AcidsResearch，25：1389-1402，Karlin和Altschul，1990PNAS，87：2264-68，Karlin和Altschul，1993PNAS，90：5873-68。
本发明涉及具有＜1000nM的解离常数、与人NogoA多肽(SEQ IDNO：2)或人NiG多肽(SEQ ID NO：3)特异性结合的、包括至少一个抗原结合位点的分离分子，所述抗原结合位点包括：
＊至少高变区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中所述高变区各自分别与高变区CDR-H1-6A3(SEQ ID NO：8)、CDR-H2-6A3(SEQ ID NO：9)和CDR-H3-6A3(SEQ ID NO：10)具有至少90％同一性；和
＊至少高变区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中所述高变区各自分别与高变区CDR-L1-6A3(SEQ ID NO：11)、CDR-L2-6A3(SEQ ID NO：12)和CDR-L3-6A3(SEQ ID NO：13)具有至少90％同一性。
短语“顺次包括高变区的抗原结合位点”包括其中高变区彼此不邻接的抗原结合位点；优选地所述抗体区域之间散置抗体构架区，或非抗体构架序列，优选人抗体构架区。
根据本发明，结合分子还可以包括至少一个抗原结合位点，所述抗原结合位点包括：
＊顺次地高变区CDR-H1-6A3(SEQ ID NO：8)、CDR-H2-6A3(SEQID NO：9)和CDR-H3-6A3(SEQ ID NO：10)；或
＊顺次地高变区CDR-L1-6A3(SEQ ID NO：11)、CDR-L2-6A3(SEQID NO：12)和CDR-L3-6A3(SEQ ID NO：13)；或
＊其直接等价物，所述等价物与所述高变区具有至少90％序列同一性。短语“至少90％同一性”意指90％以上同一性，优选91％、92％、93％；94％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性。
根据本发明，结合分子还可以包括：
＊顺次包括高变区CDR-H1-6A3(SEQ ID NO：8)、CDR-H2-6A3(SEQID NO：9)和CDR-H3-6A3(SEQ ID NO：10)的第一抗原结合位点；和
＊顺次包括高变区CDR-L1-6A3(SEQ ID NO：11)、CDR-L2-6A3(SEQ ID NO：12)和CDR-L3-6A3(SEQ ID NO：13)的第二抗原结合位点；或
＊其直接等价物，所述等价物与所述高变区具有至少90％序列同一性。至少90％同一性意指90％以上同一性，优选91％、92％、93％；94％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性。
根据本发明，结合分子还可以包括：
＊至少一条免疫球蛋白重链或其片段，包括(i)顺次包括高变区CDR-H1-6A3(SEQ ID NO：8)、CDR-H2-6A3(SEQ ID NO：9)和CDR-H3-6A3(SEQ ID NO：10)的可变结构域，和(ii)人重链的恒定部分或其片段；和
＊至少一条免疫球蛋白轻链或其片段，包括(i)顺次包括高变区CDR-L1-6A3(SEQ ID NO：11)、CDR-L2-6A3(SEQ ID NO：12)和CDR-L3-6A3(SEQ ID NO：13)的可变结构域，和(ii)人轻链的恒定部分或其片段；或
＊其直接等价物，所述等价物与所述高变区具有至少90％序列同一性。至少90％同一性意指90％以上同一性，优选91％、92％、93％；94％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性。
在本发明的结合分子中，人重链的恒定部分或其片段可以为γ型，优选γ4型，而人轻链的恒定部分或其片段可以为λ或优选地κ型。此外，本发明的结合分子可以是人的、部分人的或嵌合的或人源化的单克隆抗体。
根据本发明，结合分子可以包括一个或多个如SEQ ID NO：4(IgG1重)、SEQ ID NO：5(IgG1轻)、SEQ ID NO：24(IgG4重)和SEQ IDNO：25(IgG4轻)中任何一个所示的多肽序列。
在一个进一步优选的实施方案中，本发明的结合分子包括至少一个抗原结合位点，所述抗原结合位点顺次包括高变区CDR-H1-6A3、CDR-H2-6A3和CDR-H3-6A3(所述CDR-H1-6A3具有氨基酸序列SEQ IDNO：8，所述CDR-H2-6A3具有氨基酸序列SEQ ID NO：9，并且所述CDR-H3-6A3具有氨基酸序列SEQ ID NO：10)；及其直接等价物，所述等价物与所述高变区具有至少90％序列同一性。至少90％同一性意指90％以上同一性，优选91％、92％、93％；94％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性。
在本发明的再一方面，本发明的结合分子包括至少：
a)顺次包括高变区CDR-H1-6A3、CDR-H2-6A3和CDR-H3-6A3的第一结构域；所述CDR-H1-6A3具有氨基酸序列SEQ ID NO：8，所述CDR-H2-6A3具有氨基酸序列SEQ ID NO：9，并且所述CDR-H3-6A3具有氨基酸序列SEQ ID NO：10；和
b)顺次包括高变区CDR-L1-6A3、CDR-L2-6A3和CDR-L3-6A3的第二结构域；所述CDR-L1-6A3具有氨基酸序列SEQ ID NO：11，所述CDR-L2-6A3具有氨基酸序列SEQ ID NO：12，并且所述CDR-L3-6A3具有氨基酸序列SEQ ID NO：13；或
c)其直接等价物，所述等价物与所述高变区具有至少90％序列同一性。至少90％同一性意指90％以上同一性，优选91％、92％、93％；94％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性。
此外，本发明还提供了下述本发明的结合分子，其包括至少一个抗原结合位点，所述位点包括：
a)6A3的重链可变区(SEQ ID NO：4)；或
b)6A3的轻链可变区(SEQ ID NO：5)，或
其直接等价物，所述等价物与所述高变区具有至少90％序列同一性。
当抗原结合位点包括第一和第二结构域两者时，这些结构域可以位于相同多肽分子上，或优选地，每个结构域可以分别在不同链上，第一结构域是免疫球蛋白重链或其片段的部分，而第二结构域是免疫球蛋白轻链或其片段的部分。
本发明的结合分子的例子包括通过B细胞或杂交瘤产生的抗体和人的或嵌合的或人源化的抗体或其任何片段，例如F(ab′)2；和Fab片段，以及单链或单结构域抗体，如美国专利公开US20070065440A1中描述的。
如本文所使用的，“单结构域抗体”是可以特异性结合表位或抗原或配体的可变结构域，所述结合不依赖于结合该表位、抗原或配体的另一个可变结合结构域。单结构域抗体可以以同聚体形式存在、或以具有其他VH或VL结构域的异聚体形式存在，其中该其他结构域不是该单结构域抗体的抗原结合所必需的，即，该单结构域抗体不依赖于该额外的VH或VL结构域来结合抗原。在一个优选实施方案中，单结构域抗体包括分离的VH单结构域或分离的VL单结构域。获得具有其所衍生自的完整抗体的至少某些结合特异性的单结构域抗体的技术是本领域已知的。例如，Ward，等人在″Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin VariableDomains Secreted from Escherichia coli，″Nature 341：644-646中，公开了一种筛选以获得抗体重链可变区(VH单结构域抗体)的方法，其中所述可变区对其靶表位具有足够的亲和力，以致可以以分离的形式与该表位结合。
单链抗体由通过肽接头共价结合的抗体重和轻链的可变结构域/区组成，所述肽接头通常由10至30个氨基酸、优选15至25个氨基酸组成。优选方法包括使用例如就scFv分子描述的多肽接头(Bird等人，(1988)Science 242：423-426)。因此，此类结构不包括重和轻链的恒定部分，并且据信该小肽间隔物应比完整的恒定部分具有较小的抗原性。“嵌合抗体”意指这样的抗体，其中重或轻抗体链或两者的恒定区源于第一物种，而重和轻链两者的可变区源于第二物种。优选地，“嵌合抗体”是这样的抗体，其中重或轻链或两者的恒定区是人源的，而重和轻链两者的可变结构域是非人(例如鼠源、猴、大鼠、猪、小鼠、鸡、禽类)源的。“人源化抗体”意指这样的抗体，其中高变区(CDRs)是非人源的(例如鼠源的)，而该免疫球蛋白的所有或基本上所有其他部分，例如恒定区和可变结构域的高度保守部分(即构架区)，是人来源的。然而，人源化抗体可以在与高变区邻近的构架区部分中保留鼠源序列的少数氨基酸。
高变区可以与任何类型的构架区结合，优选鼠或人源的构架区。合适的构架区在″Sequences of proteins of immunological interest″，Kabat E.A.等人，US department of health and human services，Public health service，National Institute of Health中描述。优选地，结合分子的人重链的恒定部分可以是IgG型的，更优选IgG4型，包括亚型，优选地人轻链的恒定部分可以是λ或κ型的，更优选κ型。
可以在非人系统中，例如在小鼠中，产生针对所有人中天然存在的蛋白质的单克隆抗体。作为这个的直接后果，通过杂交瘤产生的异种抗体当施用于人时，将引发不希望有的免疫应答，该免疫应答主要由异种免疫球蛋白的恒定部分介导。这明显地限制了此类抗体的使用，因为它们不能长时间施用。因此，特别优选使用单链、单结构域、嵌合或人源化抗体，当施用于人时，其不太可能引发实质性的异源(allogenic)应答。
鉴于前述，本发明的结合分子还可以选自嵌合抗体，其包括至少：
a)一条免疫球蛋白重链或其片段，包括(i)顺次包括高变区CDR-H1-6A3、CDR-H2-6A3和CDR-H3-6A3的可变结构域，和(ii)人重链的恒定部分或其片段；所述CDR-H1-6A3具有氨基酸序列(SEQ IDNO：8)，所述CDR-H2-6A3具有氨基酸序列(SEQ ID NO：9)，并且所述CDR-H3-6A3具有氨基酸序列(SEQ ID NO：10)，和
b)一条免疫球蛋白轻链或其片段，包括(i)顺次包括高变区CDR-L1-6A3、CDR-L2-6A3和CDR-L3-6A3的可变结构域，和(ii)人轻链的恒定部分或其片段；所述CDR-L1-6A3具有氨基酸序列(SEQ ID NO：11)，所述CDR-L2-6A3具有氨基酸序列(SEQ ID NO：12)，并且所述CDR-L3-6A3具有氨基酸序列(SEQ ID NO：13)；或
其直接等价物，所述等价物包括与所述高变区具有至少90％序列同一性的区域。
备选地，本发明的结合分子可以选自包括抗原结合位点的单链结合分子，其中所述抗原结合位点包括：
a)顺次包括高变区CDR-H1-6A3、CDR-H2-6A3和CDR-H3-6A3的第一结构域；所述CDR-H1-6A3具有氨基酸序列(SEQ ID NO：8)，所述CDR-H2-6A3具有氨基酸序列(SEQ ID NO：9)，并且所述CDR-H3-6A3具有氨基酸序列(SEQ ID NO：10)；和
b)顺次包括高变区CDR-L1-6A3、CDR-L2-6A3和CDR-L3-6A3的第二结构域；所述CDR-L1-6A3具有氨基酸序列(SEQ ID NO：11)，所述CDR-L2-6A3具有氨基酸序列(SEQ ID NO：12)，并且所述CDR-L3-6A3具有氨基酸序列(SEQ ID NO：13)；和
c)与第一结构域的N末端和第二结构域的C末端或与第一结构域的C末端和第二结构域的N末端结合的肽接头；
或其直接等价物，所述等价物与所述高变区具有至少90％序列同一性。
如众所周知的，氨基酸序列中的小改变，例如一个或几个氨基酸的缺失、添加或置换，可以导致具有基本上相同性质的、原始蛋白质的等位形式。因此，术语“其直接等价物”意指本发明的任何高变区、任何抗原结合位点、任何抗体链或其片段、或任何单结构域结合分子(分子6A3)，
(i)其中该结合分子的高变区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3各自与CDR-H1-6A3(SEQ ID NO：8)、CDR-H2-6A3(SEQ ID NO：9)和CDR-H3-6A3(SEQ ID NO：10)的等价高变区具有至少90％同一性，更优选至少91、92、93、94、95、96、97、98、99％同一性，其中CDR-H1与CDR-H1-6A3等价，CDR-H2与CDR-H2-6A3等价，CDR-H3与CDR-H3-6A3等价；且
(ii)其能够与人NogoA或人NiG结合，优选具有＜1000nM的解离常数(Kd)，更优选具有＜100nM的Kd，最优选具有＜10nM的Kd，或
每结合位点具有至少一个、优选2个结构域的本发明任何结合分子(分子6A3)
(iii)其中高变区CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3各自与CDR-H1-6A3(SEQ ID NO：8)、CDR-H2-6A3(SEQID NO：9)、CDR-H3-6A3(SEQ ID NO：10)、CDR-L1-6A3(SEQ ID NO：11)、CDR-L2-6A3(SEQ ID NO：12)和CDR-L3-6A3(SEQ ID NO：13)的等价高变区具有至少90％同一性，更优选至少91、92、93、94、95、96、97、98、99％同一性，其中CDR-H1与CDR-H1-6A3等价，CDR-H2与CDR-H2-6A3等价，CDR-H3与CDR-H3-6A3等价，CDR-L1与CDR-L1-6A3等价，CDR-L2与CDR-L2-6A3等价，CDR-L3与CDR-L3-6A3等价；且
(iv)其能够结合人NogoA或人NiG，优选具有＜1000nM的解离常数(Kd)，更优选具有＜100nM的Kd，最优选具有＜10nM的Kd。
因此，本发明的进一步实施方案是例如这样的结合分子，其能够以＜1000nM的解离常数与人NogoA或人NiG结合，并且包括至少一个抗原结合位点，所述抗原结合位点包括：
＊顺次地高变区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中所述高变区各自分别与高变区CDR-H1-6A3(SEQ ID NO：8)、CDR-H2-6A3(SEQ IDNO：9)和CDR-H3-6A3(SEQ ID NO：10)具有至少90％，优选91、92、93、94、95、96、97、98、99％同一性；和/或
＊顺次地高变区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中所述高变区各自分别与高变区CDR-L1-6A3(SEQ ID NO：11)、CDR-L2-6A3(SEQ ID NO：12)和CDR-L3-6A3(SEQ ID NO：13)具有至少90％同一性，优选91、92、93、94、95、96、97、98、99％同一性。
此外，如本文所描述的结合分子能够以＜1000nM的解离常数结合人NogoA或人NiG，并且包括：
＊顺次包括高变区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的第一抗原结合位点，其中所述高变区各自分别与高变区CDR-H1-6A3(SEQ ID NO：8)、CDR-H2-6A3(SEQ ID NO：9)和CDR-H3-6A3(SEQ ID NO：10)具有至少90％，优选91、92、93、94、95、96、97、98、99％同一性；和
＊顺次包括高变区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的第二抗原结合位点，其中所述高变区各自分别与高变区CDR-L1-6A3(SEQ ID NO：11)、CDR-L2-6A3(SEQ ID NO：12)和CDR-L3-6A3(SEQ ID NO：13)具有至少90％，优选91、92、93、94、95、96、97、98、99％同一性。
这个解离常数可以在各种测定法中方便地进行测定，包括例如生物传感器亲和力方法(BIAcore)(参见上文)。此外，结合分子的结合和功能效应可以在例如如下文描述的生物测定法中显示。
人重链的恒定部分可以为γ1；γ2；γ3；γ4；α1；α2；δ或ε型，优选γ型，更优选γ4型，而人轻链的恒定部分可以为λ或κ型(其包括λ1；λ2；λ3；和λ4亚型)，但优选κ型。所有这些恒定部分的氨基酸序列在Kabat等人(上引文)中给出。
本发明结合分子的缀合物，例如酶或毒素或放射性同位素缀合物，也包括在本发明的范围内。在另一个方面，包含NogoA或NiG结合分子的组合物通过连接或结合(非多肽)聚合稳定化部分，例如糖基化(可通过体外或体内方法获得)，而被体内稳定。此类稳定化的例子在例如WO99/64460(Chapman等人)和EP1,160,255(King等人)中描述，所述文献各自通过引用合并入本文。特别地，这些参考文献描述了使用合成的或天然存在的聚合物分子，例如聚亚烷基、聚亚烯基、聚氧化烯或多糖，增加免疫球蛋白多肽的体内半衰期。稳定化部分的典型例子是聚乙二醇或PEG、聚亚烷基。将PEG与免疫球蛋白多肽连接的方法在这些参考文献中描述，并且在本文中称为“PEG化”。如文中描述的，NogoA或NiG结合分子可以如通过PEG与NogoA或NiG结合分子表面上的赖氨酸或其他氨基酸附着，而被随机地PEG化，或可以被位点特异性地PEG化，例如通过PEG与人工引入的表面半胱氨酸残基附着。依赖于NogoA或NiG结合分子，可能优选使用聚合物附着的非随机方法，因为通过在分子上的一个或多个抗原结合位点中或附近进行附着而发生的随机附着通常改变分子对于其靶抗原的亲和力或特异性。
优选PEG或其它聚合物的添加不干扰抗体NogoA或NiG结合分子的抗原结合亲和力或特异性。“不干扰抗原结合亲和力或特异性”意指，PEG连接的NogoA或NiG结合分子具有的IC50或ND50分别比具有相同抗体单可变结构域的非PEG连接的NogoA或NiG结合分子的IC50或ND50大不超过10％。在备选方案中，短语“不干扰抗原结合亲和力或特异性”意指，NogoA或NiG结合分子的PEG连接形式保留该多肽的非PEG化形式的至少90％抗原结合活性。
可以用于增加体内半衰期的PEG或其他聚合物一般大小是约5,000至50,000道尔顿，例如约5,000kD-10,000kD、5,000kD-15,000kD、5,000kD-20,000kD、5,000-25,000kD、5,000-30,000kD、5,000kD-35,000kD、5,000kD-40,000kD、或约5,000kD-45,000kD。聚合物大小的选择依赖于复合物的预期用途。例如，当希望穿透固体组织例如肿瘤时，有利地使用约5,000kD左右的较小聚合物。相反，当希望使复合物维持在循环中时，可以使用例如25,000kD至40,000kD或更多的较大聚合物。
本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明NogoA或Nig结合分子。“治疗有效量”指，在所需剂量和时间段，有效达到期望的治疗结果的量。本发明NogoA或Nig结合分子的治疗有效量可以根据下述因素而改变，例如疾病状态，个体的年龄、性别和体重，以及本发明NogoA或Nig结合分子在个体中引发所需应答的能力。治疗有效量也是这样的量，在该量，本发明的NogoA或Nig结合分子的治疗有利效应超过了其任何毒性或有害效应。“预防有效量”指，在所需剂量和时间段，有效达到所需预防结果的量。
如本文所使用的，短语“特异性结合”指，通过表面等离子体共振分析，使用例如BIAcore(r)表面等离子体共振系统和BIAcore(r)动力学评估软件，确定本发明NogoA或Nig结合分子以1μM或更低的解离常数(Kd)结合抗原。
如果本文不另行说明，那么“多肽”包括任何肽或蛋白质，包括通过肽键彼此连接的氨基酸，具有在N末端处开始且在C末端处结束的氨基酸序列。优选地，本发明的多肽是单克隆抗体，更优选是嵌合(也称为V移植的)或人源化(也称为CDR移植的)单克隆抗体。人源化(也称为CDR移植的)单克隆抗体可以包括或不包括引入受体抗体的构架(FR)序列内的进一步突变。
如本文所使用的，多肽的功能衍生物包括与本发明的多肽具有共同的定性生物学活性的分子，即具有与人NogoA或人NiG结合的能力。功能衍生物包括本发明多肽的片段和肽类似物。片段包括在本发明多肽(例如具体公开序列)的序列内的区域。术语“衍生物”用于定义本发明多肽(例如具体公开序列)的氨基酸序列变体和共价修饰。根据本发明的多肽(例如具体公开序列)，例如轻和重链的高变区，的功能衍生物，优选与根据本发明的多肽(例如具体公开序列)的氨基酸序列具有至少约90％，更优选至少约91、92、93、94、95、96、97、98、99％的全序列同一性，并且基本上保留结合人NogoA或人NiG的能力。
如本文所使用的，短语“可变结构域”指具有来自哺乳动物种系免疫球蛋白V区的序列的多肽。在如下情况下，序列“来自哺乳动物种系V区”：当该序列分离自人个体时；自非人动物例如啮齿类动物例如小鼠分离时，其中该非人动物能够响应免疫原产生人免疫球蛋白，更优选地所述非人动物无法产生其物种内源的抗体；从经克隆的人抗体基因序列文库(或人抗体V区基因序列文库)中分离时；或当使用经克隆的人种系V区序列产生一个或多个多样化序列(通过随机或靶向诱变)并然后就与期望靶抗原的结合进行选择时。最低限度，人免疫球蛋白可变结构域与天然存在的人免疫球蛋白可变结构域序列具有至少85％氨基酸相似性(包括例如87％、90％、93％、95％、97％、99％或更高相似性)。备选地或另外地，“可变结构域”是包括4个免疫球蛋白可变结构域构架区(FW1-FW4)(优选是人的)，如Kabat等人(1991，)所述的构架区，的免疫球蛋白可变结构域。“可变结构域构架区”包括a)构架区的氨基酸序列，优选人的，和b)包括人构架区的氨基酸序列的至少8个连续氨基酸的构架区。抗体可变结构域可以包括FW1-FW4的氨基酸序列，其中所述序列与种系抗体基因区段(优选人的)所编码的相应构架区的氨基酸序列相同；或它还可以包括这样的可变结构域，其中相对于种系抗体基因区段(优选人的)所编码的相应构架区氨基酸序列，FW1-FW4序列总共包含不超过10个氨基酸的序列差异(例如不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸序列差异)。如本文所使用的，短语“通用构架”指，与Kabat等人(1991)定义的序列保守的抗体区域相对应的，或与Chothia和Lesk，(1987)J.Mol.Biol.196：910-917定义的人种系免疫球蛋白库(repertoire)或结构相对应的单个抗体构架序列。本发明提供了单个构架或一组此类构架的用途，已发现所述构架允许通过单独高变区的变异而获得基本上任何的结合特异性。在一个实施方案中，高变区或CDRs特异性结合NogoA和/或NiG。
术语“共价修饰”包括根据本发明的多肽(例如具体公开序列)；或其片段由有机蛋白质性质或非蛋白质性质衍生试剂的修饰，与异源多肽序列的融合，和翻译后修饰。(例如具体公开序列的)共价修饰多肽仍具有通过交联与人NogoA或人NiG结合的能力。共价修饰可以通过下述方式常规引入：使所靶向的氨基酸残基与有机衍生试剂反应，所述有机衍生试剂能够与所选择的侧链或末端残基反应；或利用在所选择的重组宿主细胞中起作用的翻译后修饰机制。某些翻译后修饰是重组宿主细胞对所表达的多肽作用的结果。谷氨酰胺和天冬酰胺残基常常在翻译后被脱酰胺成为相应的谷氨酸和天冬氨酸残基。备选地，这些残基可以在轻度酸性条件下脱酰胺。其他翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化，参见例如T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，第79-86页(1983)。共价修饰可以包括包含根据本发明的多肽，例如特定序列及其氨基酸序列变体，的融合蛋白，例如免疫粘附素，和与异源信号序列的N末端融合物。
就天然多肽及其功能衍生物而言，“同一性”在本文中定义为，在使序列比对且需要时引入空位以达到最大同一性百分比后，在不将任何保守置换考虑为序列同一性的一部分的情况下，在候选序列中与相对应天然多肽的残基相同的氨基酸残基的百分比。N或C末端延伸和插入都不应解释为减少同一性。用于比对的方法和计算机程序是众所周知的，参见Altschul等人同上。
“氨基酸”指所有天然存在的L-α-氨基酸，例如且包括D-氨基酸。氨基酸可以通过众所周知的单字母或三字母命名法进行标识。
术语“氨基酸序列变体”指与根据本发明的多肽(例如具体公开序列)相比较，在其氨基酸序列中具有某些差异的分子。根据本发明的多肽(例如具体公开序列)的氨基酸序列变体仍可以具有与人NogoA或人NiG结合的能力。置换变体是在根据本发明的多肽(例如具体公开序列)中除去至少一个氨基酸残基且在相同位置在其位置处插入不同氨基酸的那些多肽。置换可以是单个的，其中分子中仅一个氨基酸已被置换，或可以是多个的，其中在同一分子中有2个或更多个氨基酸已被置换。插入变体是在根据本发明的多肽(例如具体公开序列)中于紧邻特定位置的氨基酸处具有插入的一个或多个氨基酸的那些多肽。与氨基酸紧邻意指与该氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团连接。缺失变体是在根据本发明的多肽例如具体公开序列中具有一个或多个氨基酸被去除的那些多肽。通常，缺失变体在分子的特定区域中具有一个或两个氨基酸的缺失。
本发明的结合分子可以通过重组DNA技术产生。一般地，执行本发明所需的核酸分子和载体构建体可以如标准实验室手册中所述进行构建和操作，例如Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor，USA。就这点而言，可以构建一种或多种编码结合分子的DNA分子，将其置于合适的控制序列下并且转移到合适的宿主生物体内用于表达。
非常一般地，本发明因此提供了，
(i)编码本发明的高变区、抗原结合位点、抗体链或其片段、或单结构域结合分子的DNA分子；和
(ii)本发明的DNA分子通过重组方法用于产生本发明的结合分子的用途。
考虑到本文提供的信息，即高变区的氨基酸序列和编码其的DNA序列，现有技术状况使得本领域技术人员能够合成本发明的DNA分子。用于构建可变结构域基因的方法例如在EP 239 400中描述，并且可以简要概述如下：克隆编码具有无论何种特异性的单克隆抗体的可变结构域的基因。确定编码构架区和高变区的DNA区段，去除编码高变区的DNA区段，使编码构架区的DNA区段通过合适限制性位点在接合处融合在一起。限制性位点可以通过标准操作诱变DNA分子而在合适位置处产生。通过DNA合成，根据上文给出的CDR-H1-6A3、CDR-H2-6A3、CDR-H3-6A3、CDR-L1-6A3、CDR-L2-6A3和CDR-L3-6A3的序列，制备合成的双链CDR盒。这些盒提供粘性末端，从而它们可以通过标准方案在接合处与构架连接，获得编码免疫球蛋白可变结构域的DNA分子。
此外，为了获得编码本发明单克隆抗体的DNA构建体，自生产性杂交瘤细胞系得到mRNA并非是必需的。PCT申请WO 90/07861给出了在已知仅基因核酸序列的书写信息的情况下，通过重组DNA技术，产生单克隆抗体的全面指导。
该方法包括合成多个寡核苷酸、通过PCR方法扩增这些寡核苷酸、及将其拼接以给出所需DNA序列。
众多载体是可公开获得的，包括细菌质粒、噬菌体、人工染色体和附加型载体。包括一个或多个合适启动子和/或编码重和轻链恒定部分的基因的表达载体是可公开获得的。表达载体通常包含由宿主生物体识别的启动子，所述启动子与目的编码序列可操作地连接。此类启动子可以是诱导型或组成型的。术语“可操作地连接”指并置，该并置导致所述成分处于允许其以预期的方式发挥作用的关系中。与编码序列“可操作地连接的”控制序列是以这样的方式连接的，该连接使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下达到。因此，制备本发明的DNA分子后，可以方便地将其转移至合适的表达载体中。
编码单链抗体的DNA分子也可以通过标准方法，例如如WO 88/1649中所述的方法，制备。
在本发明的一个具体实施方案中，用于产生本发明的某些结合分子的重组手段包括如下所述的第一和第二DNA构建体：
第一多核苷酸可以包括：
＊SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16中所示的多核苷酸序列中的至少一个；或
＊SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19中所示的多核苷酸序列中的至少一个。
根据本发明的另一多核苷酸包括：
＊SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16中所示的多核苷酸序列；和
＊SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19中所示的多核苷酸序列。
在另一个实施方案中，多核苷酸包括：
＊SEQ ID NO：6中所示的多核苷酸序列和/或SEQ ID NO：7中所示的多核苷酸序列，或
＊SEQ ID NO：26中所示的多核苷酸序列和/或SEQ ID NO：28中所示的多核苷酸序列。
在另外一个实施方案中，DNA构建体编码重链或其片段，并且包括：
a)编码交替包括构架区和高变区的可变结构域的第一部分，所述高变区顺次包括DNA-CDR-H1-6A3(SEQ ID NO：14)、DNA-CDR-H2-6A3(SEQ ID NO：15)和DNA-CDR-H3-6A3(SEQ ID NO：16)；此第一部分从编码可变结构域的第一个氨基酸的密码子开始，且终止于编码可变结构域的最后一个氨基酸的密码子，和
b)编码重链恒定部分或其片段的第二部分，其从编码重链恒定部分的第一个氨基酸的密码子开始，并且终止于编码重链恒定部分或其片段的最后一个氨基酸的密码子，随后为无义密码子。
优选地，第二部分编码人重链的恒定部分，更优选人γ4链的恒定部分。该第二部分可以是基因组来源的DNA片段(包括内含子)或cDNA片段(不含内含子)。
在另一个实施方案中，DNA构建体编码轻链或其片段，并且包括：
a)编码交替包括构架区和高变区的可变结构域的第一部分；所述高变区顺次包括DNA-CDR-L1-6A3(SEQ ID NO：17)、DNA-CDR-L2-6A3(SEQ ID NO：18)和DNA-CDR-L3-6A3(SEQ ID NO：19)，此第一部分从编码可变结构域的第一个氨基酸的密码子开始，并且终止于编码可变结构域的最后一个氨基酸的密码子，和
b)编码轻链恒定部分或其片段的第二部分，其从编码轻链恒定部分的第一个氨基酸的密码子开始，并终止于编码轻链恒定部分或其片段的最后一个氨基酸的密码子，随后为无义密码子。
优选地，第二部分编码人轻链的恒定部分，更优选人κ链的恒定部分。
本发明的DNA构建体可以有利地进一步包括位于已描述的部分上游并且编码前导肽的另一部分；此另外的部分从编码前导肽的第一个氨基酸的密码子开始并终止于该前导序列的最后一个氨基酸。前导肽是这些链自表达它们的宿主生物体分泌所需的，随后被宿主生物体去除。优选地，DNA构建体的这个部分编码这样的前导肽，其具有与SEQ ID NO：20中所示的重链前导序列的氨基酸序列(IgG1的重链，起始于位置-19处的氨基酸，并终止于位置-1处的氨基酸)基本上相同的氨基酸序列，具有SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列(IgG1的轻链，起始于位置-20处的氨基酸，并终止于位置-1处的氨基酸)，具有与SEQ ID NO：30中所示的重链前导序列的氨基酸序列(IgG4的重链，起始于位置-19处的氨基酸，并且终止于位置-1处的氨基酸)基本上相同的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列(IgG4的轻链，起始于位置-20处的氨基酸，并且终止于位置-1处的氨基酸)。
DNA构建体各自置于合适控制序列的控制下，特别地置于合适启动子的控制下。可以使用任何类型的启动子，前提是它适合于DNA构建体将转移到其内用于表达的宿主生物体。然而，如果表达在哺乳动物细胞中发生，那么特别优选使用免疫球蛋白基因的启动子。
期望抗体可以在细胞培养物中或在转基因动物中产生。合适的转基因动物可以根据标准方法获得，包括将置于合适控制序列下的第一和第二DNA构建体显微注射到卵内，将如此制备的卵转移到合适的假孕雌性体内，选择表达期望抗体的后代。
当抗体链必须在细胞培养物中产生时，首先必须将这些DNA构建体插入单个表达载体或2种分开但相容的表达载体内，后面一种可能方案是优选的。
因此，本发明还提供了能够在原核或真核细胞系中复制的表达载体，其包括上文描述的至少一个DNA构建体。
本发明因此提供了包括本发明的多核苷酸的表达载体。本发明还涉及表达系统，其中当所述表达系统或其部分存在于相容的宿主细胞中时，所述表达系统或其部分能够产生本发明的多肽。还公开了包括本发明的表达系统的分离的宿主细胞。
本申请中因此还涉及借助于重组DNA技术或借助于化学合成，用于产生结合分子、多核苷酸、表达载体的方法。
包含DNA构建体的每种表达载体因此待转移到合适的宿主生物体内。当DNA构建体分开插在2种表达载体上时，它们可以分开转移，即一种类型的载体/细胞，或共转移，这个后面一种可能方案是优选的。合适的宿主生物体可以是细菌、酵母或哺乳动物细胞系，后者是优选的。更优选地，哺乳动物细胞系是淋巴来源的，例如骨髓瘤、杂交瘤或正常永生化B细胞，但不表达任何内源抗体重或轻链。
还优选宿主生物体每细胞包含大量拷贝的载体，所述载体包含一种或多种DNA构建体。如果宿主生物体是哺乳动物细胞系，那么此期望目的可以通过根据标准方法扩增拷贝数目来达到。扩增方法通常由就对药物增加的抗性进行的选择来组成，其中所述抗性由表达载体编码。
在本发明的另一个方面，提供了用于产生本发明的多链结合分子的方法，其包括(i)培养用本发明的至少一种DNA构建体转化的生物体，和(ii)从培养物中回收本发明的活性结合分子。
备选地，重和轻链可以例如分开回收，并且在体外重折叠后重构为活性结合分子。重构方法是本领域众所周知的；方法的例子在EP 120 674或EP 125 023中特别提供。
因此，方法还可以包括
(i)培养用编码本发明的结合分子的第一DNA构建体转化的第一生物体，并且从培养物中回收第一结合分子，和
(ii)培养用编码本发明的结合分子的第二DNA构建体转化的第二生物体，并且从培养物中回收第二结合分子，和
(iii)由(i)中获得的第一结合分子和(ii)中获得的第二结合分子在体外重构本发明的活性结合分子。
需要时，可以产生更多种生物体或细胞，高达3、4、5、6、7或8种，并且用于提供更多种结合分子。
类似地，还提供了用于产生本发明的单链或单结构域结合分子的方法，其包括
(i)培养分别用编码本发明的单链或单结构域结合分子的DNA构建体转化的生物体，和
(ii)从培养物中回收所述分子。
本发明的NogoA和NiG结合分子可以显示出极佳的神经再生活性，如在如下所述的颗粒细胞神经突增生模型中显示的。
1.颗粒细胞神经突增生测定法(在体外)
获取脑组织(皮质和脑干)，并且对于每个测定法，如先前所述新鲜制备蛋白质提取物(Spillmann等人1998，Identification andcharacterization of a bovine neurite growth inhibitor(bNI-220)，J BiolChem.1998 Jul 24；273(30)：19283-93)。简言之，将一片冷冻组织(例如0.25g)在3-4体积具有蛋白酶阻断剂(10μg/ml抑酶肽-5μg/ml亮抑酶肽-1μg/ml抑胃酶肽-1mM PMSF)的60mM Chaps-20mM Tris pH8.0-1mM EDTA中在4℃匀浆。将匀浆物放到旋转器上在4℃30分钟，并且在TLA 100.3转子(Beckman TL-100超速离心机)中在100′000g在4℃离心45分钟。自上清液，使用吸收分光光度计测定蛋白质浓度。
如先前所述从出生后5-7天的大鼠小脑组织的胰蛋白酶消化物中纯化小脑颗粒细胞(Niederost等人1999，Bovine CNS myelin contains neuritegrowth-inhibitory activity associated with chondroitin sulfateproteoglycans，J Neurosci.1999 Oct 15；19(20)：8979-89)。随后本发明的结合分子在测试基底上预温育30分钟，并且在加入细胞前去除。加入小脑颗粒细胞并且温育24小时。为了停止实验，将2ml 4％缓冲的甲醛缓慢加入培养皿中。如上所述制备的猴脑膜蛋白质提取物以15μg蛋白质/cm2培养皿过夜吸附在Greiner 4孔皿(Greiner，Nuertingen，Germany)上。皿用温汉克氏(Hank′s)溶液洗涤3次，之后神经元铺板。如上所述制备出生后(5-7)天的大鼠小脑颗粒细胞，并且以50,000细胞/cm2铺平板。细胞在无血清培养基中培养24小时，固定，并且用神经突标记MAB 1b(Chemicon monoclonal Ab，1∶200)进行免疫染色。对于细胞体的染色，在用MAB1b染色后使用DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基-吲哚，二盐酸盐，来自Molecular Probes)。对于抗体实验，抗Nogo-A mAbs或对照IgG Ab在皿上预温育30分钟并且随后去除。
使用40X物镜，对每个孔，在距孔边缘规定距离处随机采取4个视野，计数神经突与放置于通过观察视野中心的一条线的所有相交点。还计数接触线的所有细胞体，并且如先前报告的对于每个孔计算神经突/细胞体的指数比(Simonen等人，2003，Neuron 38，201-211)。所有计数在编码的实验上盲法实施，并且表示为神经突/细胞体指数。结果表示为平均指数神经突/细胞体。
可以观察到通过与本发明的结合分子预温育在上文制备的脊髓提取物的非允许环境中小脑颗粒细胞的神经突增生被增强。
本发明的分子的中和活性也可以通过在下文简述的体内脊髓损伤模型中测量再生性萌芽和神经突增生及功能恢复进行评估。
2.在大鼠和猴中的脊髓损伤模型(在体内)
通过在第8胸椎水平双侧横断脊髓的背侧(dorsal half)，通过显微手术损伤成年Lewis大鼠。椎板切除术、麻醉和手术在Schnell和Schwab 1993(Eur.J.Neurosci.5：1156-1171)中描述。神经解剖学追踪：通过将顺向示踪剂生物素葡聚糖胺(BDA)注射到与泵或移植物相对侧的皮质内来追踪运动和感觉皮质脊髓束。BDA在10-14天内转运至脊髓，并且如Brosamle等人，(2000J.Neurosci.20：8061-8068)中所述使用二氨基联苯胺(DAB)作为底物进行显现。
破坏脊髓T8段的约40％的脊髓损伤(主要在背侧中，包括2个主要颈脊髓横切(CSTs))后2周：在对照动物中CST的追踪显示束的中等程度的反应性萌芽。这个现象与文献中众所周知的响应损伤的自发性萌芽相对应。用本发明的结合分子或用递送本发明的结合分子的泵处理的损伤大鼠可以显示在损伤部位处增强的萌芽，和受损轴突的再生、受损神经突的神经突增生。此外，动物可以显示感觉运动功能的改良恢复。此类功能试验先前已有描述(Merkler等人，2001，J.Neuroscience 21，3665-73)。
3.抗体在成年猴CNS中的组织分布
将本发明的结合分子纯化为IgG并且在PBS中浓缩至3mg/ml。小鼠血清来源的IgG(Chemicon Int.，Temecula/CA，USA)或针对小麦生长素的mAB(AMS Biotechnology，Oxon/UK)用作对照处理。在这个研究中使用2只雄性成年恒河猴(Macaca fascicularis)用于鞘内输注。
手术操作
通过肌内注射氯胺酮(Ketalar(r)；Parke-Davis，5mg/kg，i.m.)诱导麻醉。肌内注射阿托品(0.05mg/kg)以减少支气管分泌物。将静脉内导管置在队列静脉中，用于持续灌注丙泊酚1％(Fresenius(r))和葡萄糖4％溶液的混合物(1体积丙泊酚和2体积葡萄糖溶液)，诱导更深层的麻醉。动物随后放置在立体定位(stereotaxic)架中。在无菌条件下，执行从C2到Th1的垂直中线皮肤切开。切开筋膜，暴露C2至Th1棘突。牵缩椎旁肌肉，并且解剖C6、C7和Th1椎板。随后执行完全的C6椎板切除术和上部C7半椎板切除术。暴露硬膜，并且在第7和第8颈椎段上纵向切开，与第6颈椎板覆盖的脊椎部分的吻侧区(rostral zone)相对应。将与递送hNogo-A抗体的渗透泵(Alzet(r)，2ML1；流动：50μg/小时)连接的聚乙烯管(10cm长)插在硬膜下，并且向吻侧推数毫米，用缝线缝在硬膜上。放置渗透泵，并将其固定在一个腔中，所述腔在左侧在比椎板切除术低数厘米的背部肌肉块中形成。管沿着其轨道用缝线固定在肌肉组织上。缝合肌肉和皮肤，并且动物通常在用丙泊酚静脉灌注中断后15-30分钟从麻醉中苏醒。动物用抗生素(氨苄西林10％，30mg/kg，s.c)进行手术后处理。在一周中每天给予另外剂量的卡洛芬。
猴在植入渗透泵后8天处死。如上所述，首先用氯胺酮诱导镇静，随后为通过腹膜内(i.p.)注射致死剂量的戊巴比妥(90mg/kg)获得深层麻醉。动物经心脏(transcardially)灌注0.4升0.9％盐水，随后为4升固定剂(多聚甲醛在0.1M磷酸盐缓冲液中的4％溶液，pH＝7.6)。用浓度渐增的3种葡萄糖溶液(在固定剂中10％，在磷酸盐缓冲盐水中20％和30％)持续灌注。
组织学操作、免疫荧光和免疫组织化学
小心解剖猴的脑和脊髓，在30％蔗糖中冷冻保护，并且在cryostate中以40μm进行切片。为检测所灌注的mABs，使用抗人二抗(JacksonLaboratories)。对于双重标记，可以使用下述抗体：用于内源NogoA的兔AS472(亲和力纯化的)(Chen，2000)，用于星形胶质细胞的针对GFAP的兔抗体，和用于溶酶体定位的针对组织蛋白酶D(DAKO)的兔抗体。所有抗血清通过TRITC或FITC偶联的相应二抗，或使用ABC-DAB系统(Vector)显现。切片通过表面荧光在Zeiss Axiophot上或通过共聚焦显微术(ZEISS LSM 410)进行分析。
在输注部位和其6cm尾侧处进行脊髓分析。高水平的本发明结合分子存在于输注部位。在更尾侧的脊髓中，中央管和脊髓表面被强烈标记，而灰质和白质显示更同质的标记，然而，这是特异性的并且明显超过本底。相似情况存在于前脑中，其中表面和脑室被强标记且Nogo-A抗体良好渗透到实质内。
这些实验显示脊柱鞘内输注针对CNS细胞表面抗原的抗体将导致本发明的结合分子和抗体通过CSF循环在内部(脑室、中央管)和外部流体空间中的良好分布。该IgG抗体良好渗透到脑和脊髓组织内。尽管阴性对照IgG抗体被快速洗掉，但针对Nogo-A的抗体保留在脑和脊髓组织中。
4.在猴中检测脊髓损害的神经修复和功能改善
通过肌内注射氯胺酮(Ketalar(r)；Parke-Davis，5mg/kg，i.m.)诱导麻醉。肌内注射阿托品(0.05mg/kg)以减少支气管分泌物。将静脉内导管置于队列静脉中，用于持续灌注丙泊酚1％(Fresenius(r))和葡萄糖4％溶液的混合物(1体积丙泊酚和2体积葡萄糖溶液)，诱导更深层的麻醉。动物随后放置在立体定位架中。在无菌条件下，执行从C2到Th1的垂直中线皮肤切开。切开筋膜，暴露C2至Th1棘突。牵缩椎旁肌肉，并且解剖C6、C7和Th1椎板。随后执行完全的C6椎板切除术和上部C7半椎板切除术。为了紧靠损伤部位递送分子，将与泵连接的聚乙烯管的游离端固定在硬膜下于损伤吻侧数毫米处。
手指灵活性行为试验可以根据公开的操作执行。
通过将坐在灵长类动物椅上的猴放置在包含随机分布的50个洞的Perspex改良的″Brinkman板″(10cmx20cm)前，训练手指灵活性；其中25个洞水平向并且25个洞为垂直向{Liu，1999 15428/id；Rouiller，199813239/同上}.2.7。纤维的再生和萌芽可以如所述的进行评估。在右半球中注射的顺向示踪剂是生物素化葡聚糖胺(BDA，Molecular Probe(r)，在盐水中10％)。在左半球中，注射荧光顺向示踪剂荧光素葡聚糖(MolecularProbe(r)，在盐水中10％)。可以如先前详细描述{Rouiller，1994 8322/同上}进行组织学处理，以显现示踪剂。
因此，本发明还提供了：
(i)本发明的Nogo和NiG结合分子在哺乳动物神经系统，特别是人神经系统，的神经修复中的用途，
(ii)修复哺乳动物神经系统，特别是人神经系统，的神经的方法，其包括给需要此类治疗的患者施用有效量的本发明的Nogo和NiG结合分子，或
(iii)用于哺乳动物神经系统，特别是人神经系统，的神经修复的药物组合物，其包括本发明的结合分子和药学上可接受的载体或稀释剂。
因此，本发明提供了用作药物的根据本发明的结合分子、多核苷酸、表达载体或系统和宿主细胞。特别地，所述结合分子、多核苷酸、表达载体或系统或宿主细胞可以用于治疗外周(PNS)和/或中枢(CNS)神经系统疾病，或用于制造用于治疗外周(PNS)和/或中枢(CNS)神经系统疾病的药物。
本发明还提供了包括至少一种药学上可接受的载体或稀释剂、以及根据本发明的结合分子、多核苷酸、表达载体或系统或宿主细胞的药物组合物。还提供了包含所述结合分子、多核苷酸、表达载体或系统或所述宿主细胞，或其药学上可接受的衍生物的产品，所述产品为用于在外周(PNS)和/或中枢(CNS)神经系统疾病的治疗中同时、分开或相继使用的组合制剂。
还涉及治疗外周(PNS)和/或中枢(CNS)神经系统疾病的方法，其包括给需要此类治疗的受试者施用有效量的本发明的结合分子、多核苷酸、表达载体或系统或宿主细胞。
本发明在实施例中进一步指出该药物组合物和产品可以用于结合分子的缓慢释放和/或结合分子在损伤部位处的局部沉积。
如本文所使用的，术语“缓慢释放”或等价术语“控制释放”或“延长释放”是指这样的药物制剂，其在施用于个体后历经一段时间释放活性药物，例如多肽药物，包括本发明的NogoA或NiG结合分子，例如针对NogoA或NiG的抗体。依赖于药物制剂可以历经一段时间，例如数分钟、数小时、数天、数周或更长时间，发生的多肽药物延长释放，与标准制剂不同，对于所述标准制剂，基本上整个剂量单位可经由血流而获得立即吸收或立即分布。优选的延长释放制剂自单次施用导致维持例如8小时或更多、12小时或更多、24小时或更多、36小时或更多、48小时或更多、60小时或更多、72小时或更多、84小时或更多、96小时或更多、或甚至例如1周或2周或更多，例如1个月或更多的循环药物水平。延长释放制剂在本领域中得到充分描述，并且可以根据优选的抗体释放谱进行选择。合适的聚合物包括生物可降解和生物不可降解材料例如聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)。
如本文所使用的，术语“表位”指通常被免疫球蛋白VH/VL对结合的结构单位。表位定义抗体的最小结合位点，并且因此是抗体的特异性的靶标。在单结构域抗体的情况下，表位是由分离的单个可变结构域结合的结构单位。
如本文所使用的，术语“中和”，当就本文所描述的NogoA或NiG结合分子而言使用时，意指结合分子干扰NogoA或NiG的可测量活性或功能。如果NogoA或NiG结合分子可以使靶抗原例如Nogo或NiG的可测量活性或功能减少至少50％，并且优选至少60％、70％、80％、90％、95％或更多(直至且包括100％抑制)，则NogoA或NiG结合分子是“中和性”多肽。靶抗原的可测量活性或功能的这种减少可以通过本领域技术人员，使用测量此活性或功能的一或多种指示剂的标准方法，进行评估。作为例子，当靶是Nogo或NiG时，中和活性可以使用下文所述的神经突生长测定法进行评估。
特别地，本发明的结合分子可以用于神经纤维受损后的轴突再生和改善的萌芽。因此，本发明的分子具有广泛用途，特别是对于人受试者。例如，本发明的结合分子可以用于治疗外周(PNS)和中枢(CNS)神经系统的各种疾病，即，更具体地，神经变性疾病，例如阿尔茨海默氏病，帕金森病，肌萎缩侧索硬化(ALS)，路易小体样病或其他全面性痴呆，颅、脑或脊髓创伤后的疾病，中风或脱髓鞘疾病。此类脱髓鞘疾病包括但不限于多发性硬化症、单相脱髓鞘病、脑脊髓炎、多灶性白质脑病、全脑炎、马-比病、脑桥髓鞘脱失、肾上腺脑白质营养不良、佩-梅病、海绵状变性、亚历山大病、卡纳万病、异染性脑白质营养不良和克拉伯氏病。在一个例子中，本发明的结合分子的施用可以用于治疗与NogoA蛋白质相关的脱髓鞘疾病。
在另一个例子中，表达本发明的结合分子的细胞可以移植至脊髓损伤部位，以促进遍及损伤部位的轴突生长。此移植的细胞可以提供用于在损伤或创伤后恢复脊髓功能的手段。此细胞可以包括组织移植物或胎儿神经的不同谱系的干细胞和嗅鞘细胞。
此外，本发明的结合分子可以用于治疗变性眼病症，所述病症可以直接或间接涉及视网膜或角膜细胞变性，包括广泛性缺血性视网膜病变、眼前部缺血性视神经病变、所有形式的视神经炎、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、囊样黄斑水肿(CME)、色素性视网膜炎、斯塔加特病、Best卵黄状视网膜变性、莱伯氏先天性黑蒙和其他遗传性视网膜变性、病理性近视、早产儿视网膜病变和Leber遗传性视神经病变、角膜移植或角膜屈光手术的后效应、和疱疹角膜炎。
此外，本发明的结合分子可以用于治疗精神病病状，特别是精神分裂症和抑郁症。
对于这些适应症，合适剂量当然将取决于例如待采用的本发明的具体分子、施用方式以及待治疗病状的性质和严重度。一般而言，剂量优选在1μg/kg/天到1mg/kg/天的范围内。
本发明的结合分子可以通过泵方便地施用或作为治疗剂在受损部位注射，例如它们可以通过直接颅内施用到CNS内或鞘内施用到脊髓内而向损伤部位施用。脊髓周围充满流体的空间被称为蛛网膜下腔或鞘内腔。脑脊髓液(CSF)流经这个区域，浸浴且保护脑和脊髓。鞘内药泵可以比口服药物更有效得多地工作，因为它将药物直接递送到CSF内，绕过了口服药物通过身体的途径。因此，在一个优选实施方案中，施用通过鞘内施用来完成，例如使用与便携式泵连接的外置导管。在一个进一步优选的实施方案中，使用鞘内快速浓注。用于药物的鞘内施用的合适手段和方法是本领域已知的。泵的非限制性例子是：
Figure BPA00001174937700341
泵和Medtronic
Figure BPA00001174937700342
或输注系统。结合分子可以连续输注，或可以优选地以1、2、3、4、5、6、7、10、14、21或30天的特定时间间隔施用固定剂量，例如通过在脑脊髓液中的直接快速浓注。
本发明的结合分子可以单独或组合或与其他试剂顺次组合提供。例如，本发明的结合分子可以与抗炎剂，例如但不限于皮质类固醇(在中风或脊髓损伤后作为阻断进一步神经元受损和抑制轴突再生的手段)，神经营养因子例如神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)，或用于神经变性疾病的其他药物，例如艾斯能(Exelon，tm)(Rivastigmine，利斯的明)或左旋多巴(L-DOPA(3，4-二羟基-L-苯丙氨酸))，组合施用。用于治疗中风的其他合适组合伙伴是阿替普酶(Alteplase)和去氨普酶(Desmoteplase)(DSPA，例如WO90/09438中公开的)。在一个实施方案中，本发明提供了特别是用于治疗中风的、包括本发明的结合分子和去氨普酶的组合，以及包括所述组合的药物组合物。如本文所使用的，当2种药剂同时施用或独立地施用以致药剂可以同时起作用时，这2种试剂被称作组合(联合)施用。
通过代码号、通用名或商品名标识的活性成分的结构可以得自标准提纲″The Merck Index″的实际版本，或数据库例如Patents International(例如IMS World Publications)或由IMS Health提供的其他数据库。其相应内容通过引用在此合并。本领域技术人员完全能够识别这些活性成分，并且同样能够基于这些参考文献进行制造、以及在体外和体内在标准测试模型中检测药学适应症和性质。
本发明的药物组合物可以以常规方式进行制造。例如，包括本发明的分子的本发明组合物优选以冻干形式提供。为立即施用，可以将其溶解于合适的水性载体，例如无菌注射用水或无菌缓冲生理盐水中。
为了帮助配制合适组合物，本发明的结合分子和任选地增强本发明结合分子的效应的第二药物可以分开地包装在相同容器内，连同用于混合或相伴施用的说明书。在上文提供了任选的第二药物候选物。
本发明结合分子和生长因子例如NGF的组合的协同效应可以通过脊髓损伤模型在体内证明。
本发明还涉及本发明的药物组合物用于制备本发明结合分子的缓慢释放药物的用途。
本发明还涉及本发明的药物组合物在制备用于使本发明结合分子在损伤部位局部沉积的药物中的用途。
本发明进一步涉及用于缓慢释放本发明的结合分子和用于在损伤部位局部沉积本发明的结合分子的本发明药物。
本发明还涉及用于缓慢释放本发明的结合分子和用于局部沉积本发明的结合分子的方法。
通过参考下述实施例将可以更全面地理解本发明。然而，这些实施例不应解释为限制本发明的范围。
在下述实施例中，所有温度是摄氏度(℃)。
在实施例中提及的单克隆抗体是根据本发明的结合分子，其包括由SEQ ID NO：5表示的轻链可变区和由SEQ ID NO：4表示的重链可变区(6A3-IgG1)，或包括由SEQ ID NO：25表示的轻链可变区和由SEQ IDNO：24表示的重链可变区(6A3-IgG4)。
显而易见的是，在上文给出的段落中，术语“包括”涵盖术语“由......组成”。
使用下述缩写：
ELISA酶联免疫吸附测定法
FACS荧光激活细胞分选术
FITC异硫氰酸荧光素
FBS胎牛血清
FCS小牛血清
HCMV人巨细胞病毒启动子
IgG免疫球蛋白同种型G
mAb单克隆抗体
VH重链可变区
VL轻链可变区
LC轻链
HC重链
CDR互补决定区
BSA牛血清白蛋白
aa氨基酸
bp碱基对
CNS中枢神经系统
HRP辣根过氧化物酶
RT室温
PBS磷酸盐缓冲盐水
TBS Tris缓冲盐水
CEA癌胚抗原
IF免疫荧光
IgG免疫球蛋白G
PBS-T具有0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲盐水
PFA多聚甲醛
实施例
本发明通过下述非限制性实施例进行举例说明
实施例1：Medarex 6A3抗hu-NogoA单克隆抗体的序列。
选择对于NogoA的人NiG片段具有高亲和力的人IgG1单克隆抗体。自小鼠杂交瘤细胞克隆筛选该原始单克隆，其中所述杂交瘤细胞克隆通过标准杂交瘤技术使用″Medarex小鼠″获得；″Medarex小鼠″是MedarexInc.，Annandale，NJ用人免疫球蛋白基因通过重组方式重构的小鼠。产生用人NiG免疫的Medarex小鼠、及产生其杂交瘤是本领域熟知的；已遵循类似于WO 2005/028508中描述的那些条件。大多数杂交瘤的抗体生产水平极低；因此，采用重组DNA技术构建专门化的表达载体，用于在细胞系中高水平生产完整抗体或Fab片段。产生经纯化的Ab和Abs的Fab片段是众所周知的，并且在例如WO 2005/028508中有详细描述。已遵循相似步骤用于产生经纯化的6A3-mAb和6A3-Fab。
通过PCR(聚合酶链反应)从杂交瘤mRNA扩增编码6A3-IgG1抗体的重和轻链的可变区的cDNAs，克隆且通过测序进行表征(图1和2；SEQ ID NO 7和6)。
实施例2：Fab和IgG4产生。
该6A3mAb具有IgG1同种型。人IgG1同种型抗体对于细胞Fc受体具有高亲和力，可以诱导抗体依赖性细胞毒性(AADC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)(Jerries等人，2002，Hezareh等人，2001)。此外，已报告，IgG mAbs可以经由Fc受体介导的逆向胞转作用，跨越血脑屏障从脑中快速流出到血液(Zhang等人，2001)。为了去除6A3 IgG1 mAb潜在的Fc受体介导的相互作用，通过重组方式将其同种型转换为IgG4，此外还用于重组产生单价Fab片段，以在SP2/0细胞和大肠杆菌(E.coli)中高生产量表达。
对该人抗NogoA抗体的重和轻链的可变结构域的测序使得能够在高生产量的生产者细胞系中重组产生6A3-Fab片段和6A3-IgG4同种型抗体。
对于Fab片段的大肠杆菌表达，cDNAs(SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：6)被克隆pASK116。用于克隆cDNAs的该质粒提供小鼠IgG1/κ的恒定结构域基因(Skerra，1994)。抗体片段的2条多肽链在操纵子上在四环素启动子的转录控制下编码。第一顺反子编码Fab片段的重链部分。该VH结构域在其N末端处与OmpA信号肽融合，并且在其C末端处与鼠类IgG1的CH1结构域融合。第二顺反子编码轻链，具有与PhoA前导肽和鼠类CH1结构域融合的VL结构域。在诱导表达后，Fab片段的2条链同时分泌到大肠杆菌的周质内，在其中发生蛋白质折叠、二硫键形成和链装配。对于Fab在大肠杆菌中的表达，将质粒转移到BMP用于大规模生产。
对于为在SP2/0细胞中表达为IgG4抗体而进行的6A3抗体的轻和重链可变区的克隆，将相应的cDNAs克隆到质粒LCvec-AAL160和hcMCPfin内。对于IgG4完整抗体的表达，对于LC构建体用NotI并且对于HC构建体用PvuI进行质粒线性化，并且转染到SP2/0细胞内。
已成功地产生且纯化了具有his-标签的6A3 IgG4和6A3 Fab单价片段。重组抗体在BIAcore实验中显示出对于人NogoA片段hNiG的高亲和力(参见下文)。相应Kd值是0.14nM和1.1nM，证实保留对于人NogoA片段hNiG的高亲和力的Ab的正确和成功克隆及重组表达。
6A3-Ig4的重和轻链的编码区和氨基酸序列显示于图3和4(SEQ IDNOs 24、25、28和28)中。
实施例3：6A3-Ab的互补决定区的确定。
使用在www.bioinf.org.uk/abs/的URL处的Kabat数据库，确定6A3-抗体的可变重和轻链的互补决定区。Kabat定义基于序列变异性，并且是确定抗体可变区的CDRs的最常用方法(Wu TT，Kabat EA，1970)。
所有6个CDR定义中除了CDR-H2外与实验测定的氨基酸序列良好相关，在CDR-H2中于该CDR前的典型残基应是LEWIG，但发现的是LEWVA(图5)。然而，许多变异对于CDR-H2是可能的。
实施例4：小鼠6A3-IgG1、6A3-IgG4和6A3Fab对NiG的生物传感器亲和力测量
使用BIAcore 2000光学生物传感器(Biacore，Uppsala，Sweden)，根据制造商的说明书，通过表面等离子体共振(SPR)，测量小鼠6A3-IgG1mAb、6A3-IgG4mAb和6A3Fab的亲和力。使用胺偶联化学，将重组人NIG共价固定在CM5传感器芯片的流体池上。简言之；通过注射包含0.025M NHS和0.1M EDC的35μl溶液，活化羧甲基化葡聚糖基质。对于在传感器芯片上的固定，将重组人NIG在pH 4的0.01M柠檬酸缓冲液中稀释，并且以5μl/分钟的流速注射，以达到允许亲和力测量的偶联水平。通过注射35μl 1M乙醇胺盐酸盐(pH 8.5)灭活剩余的NHS-酯基团。通过注射5μl 0.1M HCl，使传感器芯片表面再生。对于亲和力的测量，以0.50nM至100nM的不同浓度以200μl/分钟的流速注射抗体。在每次注射后，通过注射10μl 0.1M HCl使传感器芯片表面再生而不丧失在表面上的结合活性。使用由制造商提供的BIAevaluations 3.0软件评估动力学常数ka和kd以及亲和力常数KA和KD。
在BIAcore中的亲和力测量：使用表面等离子体共振(SPR)技术(Biacore)，实时测量了小鼠6A3-IgG1 mAb、6A3-IgG4 mAb和6A3衍生的单价Fab片段对重组人NogoA的动力学和亲和力结合常数。对于这个分析，将重组人NIG偶联在传感器芯片表面上，并且注射不同浓度的抗体。通过非线性曲线拟合自传感图(sensogram)得到结合相互作用的动力学参数。对于6A3-IgG4、6A3-IgG1，6A3Fab，在这些抗体与人NIG平衡时的亲和力常数在KDs 0.13nM到2.5nM的范围内。
实施例5：抗NogoA抗体NVP-6A3-Ab-NX-1和NVP-IIC7-NX-1与内源人NogoA的结合。
在这个实施例中，显示了抗体与内源人Nogo-A的结合。为此，测试了2种人细胞系，所述细胞系先前已被表征为显示Nogo-A的少突胶质细胞特异性基因表达，并且随后用于抗体的特异性结合。人少突胶质细胞细胞系MO3.13和HOG用于表征我们的2种抗Nogo-A抗体NVP-6A3-Ab-NX-1(6A3-Ab)和NVP-IIC7Ab-NX-1(IIC7-Ab)对内源Nogo-A的结合。细胞可以进一步用于开发生物测定法，表征用于临床试验的不同抗体批次。在2个独立实验设置中，分析且检测了在这些细胞中6A3-Ab与内源人Nogo-A的结合。
在第一步中，使用对于人Nogo-A特异的引物，通过RT-PCR分析MO3：13细胞中Nogo-A mRNA的存在。接着，通过MO3：13细胞裂解物的免疫沉淀和免疫检测来显示2种抗体与内源Nogo-A的结合。最后，MO3.13和HOG细胞用6A3-Ab进行特异性免疫荧光染色，证实了来自免疫沉淀的结果。
因此，发现6A3-AB和11C7-Ab都能够与内源人Nogo-A特异性结合。
方法
细胞系：MO3.13细胞得自N.Cashman博士，University of Toronto。它们起源自人横纹肌肉瘤(RD)的6-硫代鸟嘌呤-抗性突变体与培养自手术标本的成人少突胶质细胞的融合物。HOG细胞得自G.Dawson博士，University of Chicago。这种细胞系自手术取出的oligodenroglioma(少突神经胶质瘤)建立。所有细胞在补充有Glutamax、10％胎牛血清和青霉素/链霉素的高葡萄糖达尔贝科改良伊格尔培养基(Gibco)中进行培养。
RT-PCR：总RNA使用Tripure试剂(Roche Diagnostics)由5x105MO3.13细胞制备。在DNA酶处理后，使用Omniscript RT(Qiagen)和寡dT-引物在20μl总体积中逆转录1μg RNA。用于PCR的引物对于Nogo-A是特异的，扩增起始于全长人Nogo-A的bp位置1197的194bp片段(5′-TGAGGGAAGTAGGGATGTGC-S′(SEQ ID NO：32)，5′-CAGGTGATGTACGCTCTGGA-S′(SEQ ID NO：33))。使用2μl cDNA(或0.1μg RNA-RT)、5μl 10x缓冲液、3μl dNTPs(各5mM)、2.5μl 5′引物(10μM)、2.5μl 3′引物(10μM)、0.5μl HotStar Taq-聚合酶(Qiagen)和34.5μl H2O设置反应。使用下述PCR循环：95℃15分钟，(94℃30秒、55℃30秒、72℃15秒)x35，72℃10分钟，--＞4℃。在PCR完成后，在2％溴化乙啶琼脂糖凝胶上分析10μl等分试样。
免疫沉淀和免疫检测：对于每个IP，生长至汇合的MO3.13细胞的1个10cm
Figure BPA00001174937700411
培养皿用PBS进行洗涤，并且细胞在包含完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics)的500μl M-PER哺乳动物蛋白质提取试剂(Pierce)中裂解。裂解物的可溶部分用蛋白质G-琼脂糖(Sigma)在RT(室温)预净化15分钟。向预净化的上清液中加入新鲜的蛋白质G-琼脂糖和相应抗体(50nM终浓度)，并且在4℃在旋转振荡器上温育4小时。抗体是6A3 IgG4、11C7 IgG1或针对无关蛋白质(癌胚抗原)的抗-CEAIgG4(其充当阴性对照)。每种上清液的等分试样保留用于分析未结合的级分；琼脂糖用TNS缓冲液(10mM TrisHCl pH 7.8、1％(w/v)N-月桂酰肌氨酸(Laurylsarcosine)、100mM NaCl)洗涤4次，用PBS洗涤1次，并且用20μl SDS-PAGE上样缓冲液(Invitrogen)洗脱琼脂糖结合的级分。样品加热至95℃5分钟，并且各10μl等分试样在NuPage 4-12％梯度凝胶(Invitrogen)上在MES缓冲液中跑胶。以30V将蛋白质印迹到纤维素膜上4小时，并且用Ponceau染色来分析完全转移。在转移后，膜在4℃在PBS-T中的western封闭试剂(Roche Diagnostics)中封闭过夜。对于免疫检测，膜与1nM浓度6A3-IgG4抗体在RT温育2小时，随后与抗人过氧化物酶偶联的二抗在RT温育1小时。使用ECL-Advance(Amersham)检测信号，并且对胶片进行1分钟曝光。
免疫荧光：MO3.13和HOG细胞铺在8孔聚D-赖氨酸包被的组织培养室载玻片(Becton Dickinson)上，并且生长直至80％汇合。在PBS中洗涤后，细胞在4％PFA中在室温固定30分钟。非特异性结合用10％FCS、0.1％Triton X-100封闭20分钟。细胞在1％FCS、0.1％Triton X-100中与6A3-IgG45nM或仅缓冲液(作为阴性对照)温育1小时。在抗体温育后，细胞用PBS洗涤3次，与在PBS中1∶200稀释的Alexa Fluor 488标记的抗人IgG抗体(Molecular Probes)温育1小时。
结果
RT-PCR：使用MO3.13RNA作为模板的RT-PCR导致约200bp的独特DNA片段(图6)。在阴性对照(未逆转录的RNA和H2O)中未检测出产物。PCR片段以194bps的预期大小存在；在阴性对照样品(DNA酶处理的RNA和H2O)中未扩增出产物。
免疫沉淀：在免疫沉淀(IP)MO3.13细胞裂解物和用6A3抗Nogo-A抗体进行免疫检测(图7)后，对于6A3-IgG4(泳道4)和11C7-IgG1(泳道6)抗体，检测出在预期大小(190kDa)处的单个强条带。在用针对无关蛋白质(癌胚抗原)的抗CEA对照抗体进行IP后(泳道1)以及在未结合的级分中(泳道5和7)未检测出信号。在IP前在粗MO3.13细胞裂解物中可见微弱条带(泳道2)。在不溶性细胞裂解物级分中观察到较低分子量的微弱非特异性信号(泳道3)。
免疫荧光：用6A3-IgG4和Alexa-Fluor 488标记的抗人二抗免疫荧光染色透化处理的MO3.13细胞和HOG细胞，导致了细胞的极亮染色(图8a和8b，左侧部分)，而仅用二抗时基本上未检测出信号(右侧部分)。
讨论
使用用于PCR的Nogo-A特异性引物对MO3.13细胞的RT-PCR分析，导致了预期大小(194bp)的DNA片段，而用未逆转录的RNA样品或水对照未检测出PCR产物。根据这个结果，得出结论：细胞表达内源Nogo-A。
自MO3.13细胞裂解物的免疫沉淀和用抗Nogo-A抗体6A3的免疫检测显示了在预期大小(190kDa)处的单个强Nogo-A条带。相比之下，抗CEA(IgG4)对照抗体未产生相应大小的条带。由6A3和11C7免疫沉淀导致的条带间强度差异最可能是由于不同抗体同种型对蛋白质G琼脂糖的不同亲和力(亲和力6A3＞亲和力11C7)所致。来自MO3.13和HOG细胞的细胞内免疫荧光染色的结果显示了6A3-IgG4与内源Nogo-A结合。
根据这些结果，得出结论：2种细胞系内源表达Nogo-A，并且6A3 IgG4(6A3-Ab)和11C7IgG1(11C7-Ab)抗体均特异性结合内源人Nogo-A。这些发现提示，MO3.13细胞系可以用于建立Nogo-A结合测定法用于例如抗体表征。
实施例6：6A3处理对脑损伤的恒河猴的功能恢复的影响。
在进一步的研究中，如先前所述对恒河猴实施损伤，从损伤时开始用6A3或对照IgG进行4周鞘内输注处理。使用改良的Brinkmann板试验，在如本文前文所述的条件下测定受影响的左手的手指灵巧度。与对照IgG处理相比较，6A3处理改善了功能恢复的速率和程度。当在实验结束时测定损伤的大小时，发现对照IgG处理的猴的功能恢复大致与损伤大小反相关，从50％损伤的90％恢复到90％损伤的53％恢复。相反，在抗Nogo-AmAb处理的动物中恢复量未受损伤大小的显著影响，并且即使当损伤大小高达85％时，对于6A3处理的动物，也几乎达到了其损伤前的表现。
实施例7：6A3抗体在人受试者中的CSF保留和半衰期
在为期14天CSF输注(日剂量15mg/天)后测定6A3抗体在人受试者中的CSF保留和半衰期，在血清和CSF中测量了各浓度(图9和10)。
与在输注过程中测量到的水平相比较，在持续至第34和56天，即在输注结束后约20和42天，的2种情况下，CSF浓度保持恒定或仅微下降，这说明6A3在CSF中令人惊讶地长的停留和/或半衰期。这种药代动力学行为将允许使用不同施用途径和具有更长间隔的剂量方案。在2天或更多天或数周的时间间隔期中快速浓注入CSF内将是可行的。6A3抗体还将适合于控制释放制剂，例如在生物可降解或生物不可降解的聚合物和埋植物中的制剂。
实施例8：在恒河猴SCI模型中的功效
3只猴在C7/C8边界处行脊髓单侧切断，一种已知会导致无法产生精细手指运动的损伤，以后植入渗透
Figure BPA00001174937700431
泵，在对照动物中向损伤位点鞘内递送小鼠IgG抗体或在处理动物中递送6A3抗体，剂量1mg/天共4周(图11和Freund等人，Nat Med 12：790-2，2006)。在改良Brinkman板试验中，通过自垂直和水平槽的食物丸取得，评估手指灵巧度。其他行为任务包括自抽屉取得食物丸，爆发式(ballistic)臂运动，用于抓握食物的足运动能力以及有关疼痛和不适的行为观察。试验以规律的时间间隔从损伤前60天执行到损伤后120天。
对猴实施单侧脊髓切断，并且用小鼠IgG对照抗体(n＝2，即Cont.1具有50％损伤和Cont.2具有90％损伤)或6A3(n＝2，即ATI1具有85％损伤和ATI2具有80％损伤)进行鞘内处理，剂量1mg/天共4周(猴体重：Cont 1，5.1kg，Cont 2，4.1kg，ATI 1，5.0kg，ATI 2，4.5kg)。结果显示为在测试期段(session)过程中在特定试验天上的丸总数目。当表现水平保持稳定时，使用损伤前和损伤后的个体行为得分计算值。
与对照IgG处理的猴相比较，在猴中的6A3抗体处理给出了使用受影响的左手自水平和垂直槽获取食物丸的逐步改善。对照猴显示在自水平槽获取丸方面的总体持续缺陷，其中该运动比自垂直槽的获取需要更大的手指灵巧度。
当在Brinkmann板试验中恢复已达到最大的水平后，检查猴用其受影响的左手抓握抽屉把手、将其拉开并且从抽屉中的孔中拿出食物丸的能力。具有90％损伤的对照IgG处理猴(Cont.2)完全无法抓握把手和打开抽屉。臂动作慢于正常，并且手形状异常。这可以得自双箭头线，说明损伤前的活动和损伤及用对照IgG抗体处理后的活动之间明显的差异，说明仅部分恢复。具有85％(ATI-1)或80％(ATI-2)损伤的6A3抗体处理的动物快速且有效地恢复执行任务的能力，与损伤大小无关。当用6A3抗体处理时，损伤前和后的活动不存在实质性差异，指出由于6A3抗体处理导致的完全恢复。与IgG对照抗体处理相比较，6A3抗体处理因此对恒河猴中经诱导的脑损伤后的恢复提供了明显的有利影响。
实施例9：临床试验
合适的临床研究描述如下：
研究具有3个时期：筛选期(包括基线)、开放标签(open-label)处理期和至少22周的随访期。研究在独立的数据安全监测委员会(Data SafetyMonitoring Board，DSMB)的监督下进行。
总共22个患者入选4个部分重叠的相继队列(cohorts)，以接受6A3抗体的连续输注。所有患者具有输注后至少22周的随访期用于进一步的安全评估。
队列的患者分配以及处理剂量和持续时间如下：
·队列1：3个截瘫患者，24小时接受5mg[在2.5ml中]；
·队列2：3个截瘫患者，24小时接受30mg[在2.5ml中]；
·队列3：6个截瘫患者，14天接受高达30mg/天[在2.5ml/天中]。
·队列4：10个截瘫和四肢瘫痪患者，28天接受高达30mg/天[在2.5ml/天中]。
输注开始后严密监控患者至少6个月。通过生命体征测量，ECG记录(由central facility解释)和基于Matrices血液、尿和CSF的实验室评价，紧密监控患者的状态。使用ASIA量表(Applicable Standard NeurologicalClassification of Spinal Cord Injury by the American Spinal InjuryAssociation)(Ditunno，等人，1994；American Spinal Cord InjuryAssociation.Paraplegia 32(2)：7080.)由合格临床医生执行神经学检查以评估功效，还评估脊髓损伤的潜在恶化。对于每个患者执行总共4个脑和脊髓MRIs。在3个时间点时(剂量前、在处理期过程中和在随访期过程中)从每个患者获取CSF样品用于药代动力学(PK)分析。在整个处理和随访期还获得血样用于PK分析。来自所有患者的数据由独立的DSMB根据方案进行评论。
序列表
<110>NOVARTIS A.G.
     University of Zurich
<120>改良的NOGO-A结合分子及其药学用途
<130>NIAG-006-PCT
<150>61/001,741
<151>2007-11-02
<150>EP07119847.7
<151>2007-11-02
<160>33
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>3919
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(3579)
<223>人NogoA
<400>1
atg gaa gac ctg gac cag tct cct ctg gtc tcg tcc tcg gac agc cca     48
Met Glu Asp Leu Asp Gln Ser Pro Leu Val Ser Ser Ser Asp Ser Pro
1               5                   10                  15
ccc cgg ccg cag ccc gcg ttc aag tac cag ttc gtg agg gag ccc gag     96
Pro Arg Pro Gln Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Arg Glu Pro Glu
            20                  25                  30
gac gag gag gaa gaa gag gag gag gaa gag gag gac gag gac gaa gac    144
Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Asp
        35                  40                  45
ctg gag gag ctg gag gtg ctg gag agg aag ccc gcc gcc ggg ctg tcc    192
Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly Leu Ser
    50                  55                  60
gcg gcc cca gtg ccc acc gcc cct gcc gcc ggc gcg ccc ctg atg gac    240
Ala Ala Pro Val Pro Thr Ala Pro Ala Ala Gly Ala Pro Leu Met Asp
65                  70                  75                  80
ttc gga aat gac ttc gtg ccg ccg gcg ccc cgg gga ccc ctg ccg gcc    288
Phe Gly Asn Asp Phe Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala
                85                  90                  95
gct ccc ccc gtc gcc ccg gag cgg cag ccg tct tgg gac ccg agc ccg    336
Ala Pro Pro Val Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Asp Pro Ser Pro
            100                 105                 110
gtg tcg tcg acc gtg ccc gcg cca tcc ccg ctg tct gct gcc gca gtc    384
Val Ser Ser Thr Val Pro Ala Pro Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ala Val
        115                 120                 125
tcg ccc tcc aag ctc cct gag gac gac gag cct ccg gcc cgg cct ccc    432
Ser Pro Ser Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro
    130                 135                 140
cct cct ccc ccg gcc agc gtg agc ccc cag gca gag ccc gtg tgg acc    480
Pro Pro Pro Pro Ala Ser Val Ser Pro Gln Ala Glu Pro Val Trp Thr
145                 150                 155                 160
ccg cca gcc ccg gct ccc gcc gcg ccc ccc tcc acc ccg gcc gcg ccc    528
Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr Pro Ala Ala Pro
                165                 170                 175
aag cgc agg ggc tcc tcg ggc tca gtg gat gag acc ctt ttt gct ctt    576
Lys Arg Arg Gly Ser Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr Leu Phe Ala Leu
            180                 185                 190
cct gct gca tct gag cct gtg ata cgc tcc tct gca gaa aat atg gac    624
Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Arg Ser Ser Ala Glu Asn Met Asp
        195                 200                 205
ttg aag gag cag cca ggt aac act att tcg gct ggt caa gag gat ttc    672
Leu Lys Glu Gln Pro Gly Asn Thr Ile Ser Ala Gly Gln Glu Asp Phe
    210                 215                 220
cca tct gtc ctg ctt gaa act gct gct tct ctt cct tct ctg tct cct    720
Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro Ser Leu Ser Pro
225                 230                 235                 240
ctc tca gcc gct tct ttc aaa gaa cat gaa tac ctt ggt aat ttg tca    768
Leu Ser Ala Ala Ser Phe Lys Glu His Glu Tyr Leu Gly Asn Leu Ser
                245                 250                 255
aca gta tta ccc act gaa gga aca ctt caa gaa aat gtc agt gaa gct    816
Thr Val Leu Pro Thr Glu Gly Thr Leu Gln Glu Asn Val Ser Glu Ala
            260                 265                 270
tct aaa gag gtc tca gag aag gca aaa act cta ctc ata gat aga gat    864
Ser Lys Glu Val Ser Glu Lys Ala Lys Thr Leu Leu Ile Asp Arg Asp
        275                 280                 285
tta aca gag ttt tca gaa tta gaa tac tca gaa atg gga tca tcg ttc    912
Leu Thr Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met Gly Ser Ser Phe
    290                 295                 300
agt gtc tct cca aaa gca gaa tct gcc gta ata gta gca aat cct agg    960
Ser Val Ser Pro Lys Ala Glu Ser Ala Val Ile Val Ala Asn Pro Arg
305                 310                 315                 320
gaa gaa ata atc gtg aaa aat aaa gat gaa gaa gag aag tta gtt agt    1008
Glu Glu Ile Ile Val Lys Asn Lys Asp Glu Glu Glu Lys Leu Val Ser
                325                 330                 335
aat aac atc ctt cat aat caa caa gag tta cct aca gct ctt act aaa    1056
Asn Asn Ile Leu His Asn Gln Gln Glu Leu Pro Thr Ala Leu Thr Lys
            340                 345                 350
ttg gtt aaa gag gat gaa gtt gtg tct tca gaa aaa gca aaa gac agt    1104
Leu Val Lys Glu Asp Glu Val Val Ser Ser Glu Lys Ala Lys Asp Ser
        355                 360                 365
ttt aat gaa aag aga gtt gca gtg gaa gct cct atg agg gag gaa tat    1152
Phe Asn Glu Lys Arg Val Ala Val Glu Ala Pro Met Arg Glu Glu Tyr
    370                 375                 380
gca gac ttc aaa cca ttt gag cga gta tgg gaa gtg aaa gat agt aag    1200
Ala Asp Phe Lys Pro Phe Glu Arg Val Trp Glu Val Lys Asp Ser Lys
385                 390                 395                 400
gaa gat agt gat atg ttg gct gct gga ggt aaa atc gag agc aac ttg    1248
Glu Asp Ser Asp Met Leu Ala Ala Gly Gly Lys Ile Glu Ser Asn Leu
                405                 410                 415
gaa agt aaa gtg gat aaa aaa tgt ttt gca gat agc ctt gag caa act    1296
Glu Ser Lys Val Asp Lys Lys Cys Phe Ala Asp Ser Leu Glu Gln Thr
            420                 425                 430
aat cac gaa aaa gat agt gag agt agt aat gat gat act tct ttc ccc    1344
Asn His Glu Lys Asp Ser Glu Ser Ser Asn Asp Asp Thr Ser Phe Pro
        435                 440                 445
agt acg cca gaa ggt ata aag gat cgt tca gga gca tat atc aca tgt    1392
Ser Thr Pro Glu Gly Ile Lys Asp Arg Ser Gly Ala Tyr Ile Thr Cys
    450                 455                 460
gct ccc ttt aac cca gca gca act gag agc att gca aca aac att ttt    1440
Ala Pro Phe Asn Pro Ala Ala Thr Glu Ser Ile Ala Thr Asn Ile Phe
465                 470                 475                 480
cct ttg tta gga gat cct act tca gaa aat aag acc gat gaa aaa aaa    1488
Pro Leu Leu Gly Asp Pro Thr Ser Glu Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys
                485                 490                 495
ata gaa gaa aag aag gcc caa ata gta aca gag aag aat act agc acc    1536
Ile Glu Glu Lys Lys Ala Gln Ile Val Thr Glu Lys Asn Thr Ser Thr
            500                 505                 510
aaa aca tca aac cct ttt ctt gta gca gca cag gat tct gag aca gat    1584
Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu Val Ala Ala Gln Asp Ser Glu Thr Asp
        515                 520                 525
tat gtc aca aca gat aat tta aca aag gtg act gag gaa gtc gtg gca    1632
Tyr Val Thr Thr Asp Asn Leu Thr Lys Val Thr Glu Glu Val Val Ala
    530                 535                 540
aac atg cct gaa ggc ctg act cca gat tta gta cag gaa gca tgt gaa    1680
Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala Cys Glu
545                 550                 555                 560
agt gaa ttg aat gaa gtt act ggt aca aag att gct  tat gaa aca aaa    1728
Ser Glu Leu Asn Glu Val Thr Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys
                565                 570                 575
atg gac ttg gtt caa aca tca gaa gtt atg caa gag tca ctc tat cct    1776
Met Asp Leu Val Gln Thr Ser Glu Val Met Gln Glu Ser Leu Tyr Pro
            580                 585                 590
gca gca cag ctt tgc cca tca ttt gaa gag tca gaa gct act cct tca    1824
Ala Ala Gln Leu Cys Pro Ser Phe Glu Glu Ser Glu Ala Thr Pro Ser
        595                 600                 605
cca gtt ttg cct gac att gtt atg gaa gca cca ttg aat tct gca gtt    1872
Pro Val Leu Pro Asp Ile Val Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Ala Val
    610                 615                 620
cct agt gct ggt gct tcc gtg ata cag ccc agc tca tca cca tta gaa    1920
Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val Ile Gln Pro Ser Ser Ser Pro Leu Glu
625                 630                 635                 640
gct tct tca gtt aat tat gaa agc ata aaa cat gag cct gaa aac ccc    1968
Ala Ser Ser Val Asn Tyr Glu Ser Ile Lys His Glu Pro Glu Asn Pro
                645                 650                 655
cca cca tat gaa gag gcc atg agt gta tca cta aaa aaa gta tca gga    2016
Pro Pro Tyr Glu Glu Ala Met Ser Val Ser Leu Lys Lys Val Ser Gly
            660                 665                 670
ata aag gaa gaa att aaa gag cct gaa aat att aat gca gct ctt caa    2064
Ile Lys Glu Glu Ile Lys Glu Pro Glu Asn Ile Asn Ala Ala Leu Gln
        675                 680                 685
gaa aca gaa gct cct tat ata tct att gca tgt gat tta att aaa gaa    2112
Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu
    690                 695                 700
aca aag ctt tct gct gaa cca gct ccg gat ttc tct gat tat tca gaa    2160
Thr Lys Leu Ser Ala Glu Pro Ala Pro Asp Phe Ser Asp Tyr Ser Glu
705                 710                 715                 720
atg gca aaa gtt gaa cag cca gtg cct gat cat tct gag cta gtt gaa    2208
Met Ala Lys Val Glu Gln Pro Val Pro Asp His Ser Glu Leu Val Glu
                725                 730                 735
gat tcc tca cct gat tct gaa cca gtt gac tta ttt agt gat gat tca    2256
Asp Ser Ser Pro Asp Ser Glu Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser
            740                 745                 750
ata cct gac gtt cca caa aaa caa gat gaa act gtg atg ctt gtg aaa    2304
Ile Pro Asp Val Pro Gln Lys Gln Asp Glu Thr Val Met Leu Val Lys
        755                 760                 765
gaa agt ctc act gag act tca ttt gag tca atg ata gaa tat gaa aat    2352
Glu Ser Leu Thr Glu Thr Ser Phe Glu Ser Met Ile Glu Tyr Glu Asn
    770                 775                 780
aag gaa aaa ctc agt gct ttg cca cct gag gga gga aag cca tat ttg    2400
Lys Glu Lys Leu Ser Ala Leu Pro Pro Glu Gly Gly Lys Pro Tyr Leu
785                 790                 795                 800
gaa tct ttt aag ctc agt tta gat aac aca aaa gat acc ctg tta cct    2448
Glu Ser Phe Lys Leu Ser Leu Asp Asn Thr Lys Asp Thr Leu Leu Pro
                805                 810                 815
gat gaa gtt tca aca ttg agc aaa aag gag aaa att cct ttg cag atg    2496
Asp Glu Val Ser Thr Leu Ser Lys Lys Glu Lys Ile Pro Leu Gln Met
            820                 825                 830
gag gag ctc agt act gca gtt tat tca aat gat gac tta ttt att tct    2544
Glu Glu Leu Ser Thr Ala Val Tyr Ser Asn Asp Asp Leu Phe Ile Ser
        835                 840                 845
aag gaa gca cag ata aga gaa act gaa acg ttt tca gat tca tct cca    2592
Lys Glu Ala Gln Ile Arg Glu Thr Glu Thr Phe Ser Asp Ser Ser Pro
    850                 855                 860
att gaa att ata gat gag ttc cct aca ttg atc agt tct aaa act gat    2640
Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr Leu Ile Ser Ser Lys Thr Asp
865                 870                 875                 880
tca ttt tct aaa tta gcc agg gaa tat act gac cta gaa gta tcc cac    2688
Ser Phe Ser Lys Leu Ala Arg Glu Tyr Thr Asp Leu Glu Val Ser His
                885                 890                 895
aaa agt gaa att gct aat gcc ccg gat gga gct ggg tca ttg cct tgc    2736
Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ala Pro Asp Gly Ala Gly Ser Leu Pro Cys
            900                 905                 910
aca gaa ttg ccc cat gac ctt tct ttg aag aac ata caa ccc aaa gtt    2784
Thr Glu Leu Pro His Asp Leu Ser Leu Lys Asn Ile Gln Pro Lys Val
        915                 920                 925
gaa gag aaa atc agt ttc tca gat gac ttt tct aaa aat ggg tct gct    2832
Glu Glu Lys Ile Ser Phe Ser Asp Asp Phe Ser Lys Asn Gly Ser Ala
    930                 935                 940
aca tca aag gtg ctc tta ttg cct cca gat gtt tct gct ttg gcc act    2880
Thr Ser Lys Val Leu Leu Leu Pro Pro Asp Val Ser Ala Leu Ala Thr
945                 950                 955                 960
caa gca gag ata gag agc ata gtt aaa ccc aaa gtt ctt gtg aaa gaa    2928
Gln Ala Glu Ile Glu Ser Ile Val Lys Pro Lys Val Leu Val Lys Glu
                965                 970                 975
gct gag aaa aaa ctt cct tcc gat aca gaa aaa gag gac aga tca cca    2976
Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu Asp Arg Ser Pro
            980                 985                 990
tct gct ata ttt tca gca gag ctg  agt aaa act tca gtt  gtt gac ctc    3024
Ser Ala Ile Phe Ser Ala Glu Leu  Ser Lys Thr Ser Val  Val Asp Leu
        995                 1000                 1005
ctg tac  tgg aga gac att aag  aag act gga gtg gtg  ttt ggt gcc    3069
Leu Tyr  Trp Arg Asp Ile Lys  Lys Thr Gly Val Val  Phe Gly Ala
    1010                 1015                 1020
agc cta  ttc ctg ctg ctt tca  ttg aca gta ttc agc  att gtg agc    3114
Ser Leu  Phe Leu Leu Leu Ser  Leu Thr Val Phe Ser  Ile Val Ser
    1025                 1030                 1035
gta aca  gcc tac att gcc ttg  gcc ctg ctc tct gtg  acc atc agc    3159
Val Thr  Ala Tyr Ile Ala Leu  Ala Leu Leu Ser Val  Thr Ile Ser
    1040                 1045                 1050
ttt agg  ata tac aag ggt gtg  atc caa gct atc cag  aaa tca gat    3204
Phe Arg  Ile Tyr Lys Gly Val  Ile Gln Ala Ile Gln  Lys Ser Asp
    1055                 1060                 1065
gaa ggc  cac cca ttc agg gca  tat ctg gaa tct gaa  gtt gct ata    3249
Glu Gly  His Pro Phe Arg Ala  Tyr Leu Glu Ser Glu  Val Ala Ile
    1070                 1075                 1080
tct gag  gag ttg gtt cag aag  tac agt aat tct gct  ctt ggt cat    3294
Ser Glu  Glu Leu Val Gln Lys  Tyr Ser Asn Ser Ala  Leu Gly His
    1085                 1090                 1095
gtg aac  tgc acg ata aag gaa  ctc agg cgc ctc ttc  tta gtt gat    3339
Val Asn  Cys Thr Ile Lys Glu  Leu Arg Arg Leu Phe  Leu Val Asp
    1100                 1105                 1110
gat tta  gtt gat tct ctg aag  ttt gca gtg ttg atg  tgg gta ttt    3384
Asp Leu  Val Asp Ser Leu Lys  Phe Ala Val Leu Met  Trp Val Phe
    1115                 1120                 1125
acc tat  gtt ggt gcc ttg ttt  aat ggt ctg aca cta  ctg att ttg    3429
Thr Tyr  Val Gly Ala Leu Phe  Asn Gly Leu Thr Leu  Leu Ile Leu
    1130                 1135                 1140
gct ctc  att tca ctc ttc agt  gtt cct gtt att tat  gaa cgg cat    3474
Ala Leu  Ile Ser Leu Phe Ser  Val Pro Val Ile Tyr  Glu Arg His
    1145                 1150                 1155
cag gca  cag ata gat cat tat  cta gga ctt gca aat  aag aat gtt    3519
Gln Ala  Gln Ile Asp His Tyr  Leu Gly Leu Ala Asn  Lys Asn Val
    1160                 1165                 1170
aaa gat  gct atg gct aaa atc  caa gca aaa atc cct  gga ttg aag    3564
Lys Asp  Ala Met Ala Lys Ile  Gln Ala Lys Ile Pro  Gly Leu Lys
    1175                 1180                 1185
cgc aaa  gct gaa tga aaacgcccaa aataattagt aggagttcat ctttaaaggg  3619
Arg Lys  Ala Glu
    1190
gatattcatt tgattatacg ggggagggtc agggaagaac gaaccttgac gttgcagtgc  3679
agtttcacag atcgttgtta gatctttatt tttagccatg cactgttgtg aggaaaaatt  3739
acctgtcttg actgccatgt gttcatcatc ttaagtattg taagctgcta tgtatggatt  3799
taaaccgtaa tcatatcttt ttcctatctg aggcactggt ggaataaaaa acctgtatat  3859
tttactttgt tgcagatagt cttgccgcat cttggcaagt tgcagagatg gtggagctag  3919
<210>2
<211>1192
<212>PRT
<213>人
<400>2
Met Glu Asp Leu Asp Gln Ser Pro Leu Val Ser Ser Ser Asp Ser Pro
1               5                   10                  15
Pro Arg Pro Gln Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Arg Glu Pro Glu
            20                  25                  30
Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Asp
        35                  40                  45
Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly Leu Ser
    50                  55                  60
Ala Ala Pro Val Pro Thr Ala Pro Ala Ala Gly Ala Pro Leu Met Asp
65                  70                  75                  80
Phe Gly Asn Asp Phe Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala
                85                  90                  95
Ala Pro Pro Val Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Asp Pro Ser Pro
            100                 105                 110
Val Ser Ser Thr Val Pro Ala Pro Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ala Val
        115                 120                 125
Ser Pro Ser Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro
    130                 135                 140
Pro Pro Pro Pro Ala Ser Val Ser Pro Gln Ala Glu Pro Val Trp Thr
145                 150                 155                 160
Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr Pro Ala Ala Pro
                165                 170                 175
Lys Arg Arg Gly Ser Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr Leu Phe Ala Leu
            180                 185                 190
Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Arg Ser Ser Ala Glu Asn Met Asp
        195                 200                 205
Leu Lys Glu Gln Pro Gly Asn Thr Ile Ser Ala Gly Gln Glu Asp Phe
    210                 215                 220
Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro Ser Leu Ser Pro
225                 230                 235                 240
Leu Ser Ala Ala Ser Phe Lys Glu His Glu Tyr Leu Gly Asn Leu Ser
                245                 250                 255
Thr Val Leu Pro Thr Glu Gly Thr Leu Gln Glu Asn Val Ser Glu Ala
            260                 265                 270
Ser Lys Glu Val Ser Glu Lys Ala Lys Thr Leu Leu Ile Asp Arg Asp
        275                 280                 285
Leu Thr Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met Gly Ser Ser Phe
    290                 295                 300
Ser Val Ser Pro Lys Ala Glu Ser Ala Val Ile Val Ala Asn Pro Arg
305                 310                 315                 320
Glu Glu Ile Ile Val Lys Asn Lys Asp Glu Glu Glu Lys Leu Val Ser
                325                 330                 335
Asn Asn Ile Leu His Asn Gln Gln Glu Leu Pro Thr Ala Leu Thr Lys
            340                 345                 350
Leu Val Lys Glu Asp Glu Val Val Ser Ser Glu Lys Ala Lys Asp Ser
        355                 360                 365
Phe Asn Glu Lys Arg Val Ala Val Glu Ala Pro Met Arg Glu Glu Tyr
    370                 375                 380
Ala Asp Phe Lys Pro Phe Glu Arg Val Trp Glu Val Lys Asp Ser Lys
385                 390                 395                 400
Glu Asp Ser Asp Met Leu Ala Ala Gly Gly Lys Ile Glu Ser Asn Leu
                405                 410                 415
Glu Ser Lys Val Asp Lys Lys Cys Phe Ala Asp Ser Leu Glu Gln Thr
            420                 425                 430
Asn His Glu Lys Asp Ser Glu Ser Ser Asn Asp Asp Thr Ser Phe Pro
        435                 440                 445
Ser Thr Pro Glu Gly Ile Lys Asp Arg Ser Gly Ala Tyr Ile Thr Cys
    450                 455                 460
Ala Pro Phe Asn Pro Ala Ala Thr Glu Ser Ile Ala Thr Asn Ile Phe
465                 470                 475                 480
Pro Leu Leu Gly Asp Pro Thr Ser Glu Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys
                485                 490                 495
Ile Glu Glu Lys Lys Ala Gln Ile Val Thr Glu Lys Asn Thr Ser Thr
            500                 505                 510
Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu Val Ala Ala Gln Asp Ser Glu Thr Asp
        515                 520                 525
Tyr Val Thr Thr Asp Asn Leu Thr Lys Val Thr Glu Glu Val Val Ala
    530                 535                 540
Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala Cys Glu
545                 550                 555                 560
Ser Glu Leu Asn Glu Val Thr Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys
                565                 570                 575
Met Asp Leu Val Gln Thr Ser Glu Val Met Gln Glu Ser Leu Tyr Pro
            580                 585                 590
Ala Ala Gln Leu Cys Pro Ser Phe Glu Glu Ser Glu Ala Thr Pro Ser
        595                 600                 605
Pro Val Leu Pro Asp Ile Val Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Ala Val
    610                 615                 620
Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val Ile Gln Pro Ser Ser Ser Pro Leu Glu
625                 630                 635                 640
Ala Ser Ser Val Asn Tyr Glu Ser Ile Lys His Glu Pro Glu Asn Pro
                645                 650                 655
Pro Pro Tyr Glu Glu Ala Met Ser Val Ser Leu Lys Lys Val Ser Gly
            660                 665                 670
Ile Lys Glu Glu Ile Lys Glu Pro Glu Asn Ile Asn Ala Ala Leu Gln
        675                 680                 685
Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu
    690                 695                 700
Thr Lys Leu Ser Ala Glu Pro Ala Pro Asp Phe Ser Asp Tyr Ser Glu
705                 710                 715                 720
Met Ala Lys Val Glu Gln Pro Val Pro Asp His Ser Glu Leu Val Glu
                725                 730                 735
Asp Ser Ser Pro Asp Ser Glu Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser
            740                 745                 750
Ile Pro Asp Val Pro Gln Lys Gln Asp Glu Thr Val Met Leu Val Lys
        755                 760                 765
Glu Ser Leu Thr Glu Thr Ser Phe Glu Ser Met Ile Glu Tyr Glu Asn
    770                 775                 780
Lys Glu Lys Leu Ser Ala Leu Pro Pro Glu Gly Gly Lys Pro Tyr Leu
785                 790                 795                 800
Glu Ser Phe Lys Leu Ser Leu Asp Asn Thr Lys Asp Thr Leu Leu Pro
                805                 810                 815
Asp Glu Val Ser Thr Leu Ser Lys Lys Glu Lys Ile Pro Leu Gln Met
            820                 825                 830
Glu Glu Leu Ser Thr Ala Val Tyr Ser Asn Asp Asp Leu Phe Ile Ser
        835                 840                 845
Lys Glu Ala Gln Ile Arg Glu Thr Glu Thr Phe Ser Asp Ser Ser Pro
    850                 855                 860
Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr Leu Ile Ser Ser Lys Thr Asp
865                 870                 875                 880
Ser Phe Ser Lys Leu Ala Arg Glu Tyr Thr Asp Leu Glu Val Ser His
                885                 890                 895
Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ala Pro Asp Gly Ala Gly Ser Leu Pro Cys
            900                 905                 910
Thr Glu Leu Pro His Asp Leu Ser Leu Lys Asn Ile Gln Pro Lys Val
        915                 920                 925
Glu Glu Lys Ile Ser Phe Ser Asp Asp Phe Ser Lys Asn Gly Ser Ala
    930                 935                 940
Thr Ser Lys Val Leu Leu Leu Pro Pro Asp Val Ser Ala Leu Ala Thr
945                 950                 955                 960
Gln Ala Glu Ile Glu Ser Ile Val Lys Pro Lys Val Leu Val Lys Glu
                965                 970                 975
Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu Asp Arg Ser Pro
            980                 985                 990
Ser Ala Ile Phe Ser Ala Glu Leu  Ser Lys Thr Ser Val  Val Asp Leu
        995                 1000                 1005
Leu Tyr  Trp Arg Asp Ile Lys  Lys Thr Gly Val Val  Phe Gly Ala
    1010                 1015                 1020
Ser Leu  Phe Leu Leu Leu Ser  Leu Thr Val Phe Ser  Ile Val Ser
    1025                 1030                 1035
Val Thr  Ala Tyr Ile Ala Leu  Ala Leu Leu Ser Val  Thr Ile Ser
    1040                 1045                 1050
Phe Arg  Ile Tyr Lys Gly Val  Ile Gln Ala Ile Gln  Lys Ser Asp
    1055                 1060                 1065
Glu Gly  His Pro Phe Arg Ala  Tyr Leu Glu Ser Glu  Val Ala Ile
    1070                 1075                 1080
Ser Glu  Glu Leu Val Gln Lys  Tyr Ser Asn Ser Ala  Leu Gly His
    1085                 1090                 1095
Val Asn  Cys Thr Ile Lys Glu  Leu Arg Arg Leu Phe  Leu Val Asp
    1100                 1105                 1110
Asp Leu  Val Asp Ser Leu Lys  Phe Ala Val Leu Met  Trp Val Phe
    1115                 1120                 1125
Thr Tyr  Val Gly Ala Leu Phe  Asn Gly Leu Thr Leu  Leu Ile Leu
    1130                 1135                 1140
Ala Leu  Ile Ser Leu Phe Ser  Val Pro Val Ile Tyr  Glu Arg His
    1145                 1150                 1155
Gln Ala  Gln Ile Asp His Tyr  Leu Gly Leu Ala Asn  Lys Asn Val
    1160                 1165                 1170
Lys Asp  Ala Met Ala Lys Ile  Gln Ala Lys Ile Pro  Gly Leu Lys
    1175                 1180                 1185
Arg Lys  Ala Glu
    1190
<210>3
<211>819
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>肽
<222>(1)..(819)
<223>人Nig
<400>3
Asp Glu Thr Leu Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Arg
1               5                   10                  15
Ser Ser Ala Glu Asn Met Asp Leu Lys Glu Gln Pro Gly Asn Thr Ile
            20                  25                  30
Ser Ala Gly Gln Glu Asp Phe Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala
        35                  40                  45
Ser Leu Pro Ser Leu Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ser Phe Lys Glu His
    50                  55                  60
Glu Tyr Leu Gly Asn Leu Ser Thr Val Leu Pro Thr Glu Gly Thr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Glu Asn Val Ser Glu Ala Ser Lys Glu Val Ser Glu Lys Ala Lys
                85                  90                  95
Thr Leu Leu Ile Asp Arg Asp Leu Thr Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr
            100                 105                 110
Ser Glu Met Gly Ser Ser Phe Ser Val Ser Pro Lys Ala Glu Ser Ala
        115                 120                 125
Val Ile Val Ala Asn Pro Arg Glu Glu Ile Ile Val Lys Asn Lys Asp
    130                 135                 140
Glu Glu Glu Lys Leu Val Ser Asn Asn Ile Leu His Asn Gln Gln Glu
145                 150                 155                 160
Leu Pro Thr Ala Leu Thr Lys Leu Val Lys Glu Asp Glu Val Val Ser
                165                 170                 175
Ser Glu Lys Ala Lys Asp Ser Phe Asn Glu Lys Arg Val Ala Val Glu
            180                 185                 190
Ala Pro Met Arg Glu Glu Tyr Ala Asp Phe Lys Pro Phe Glu Arg Val
        195                 200                 205
Trp Glu Val Lys Asp Ser Lys Glu Asp Ser Asp Met Leu Ala Ala Gly
    210                 215                 220
Gly Lys Ile Glu Ser Asn Leu Glu Ser Lys Val Asp Lys Lys Cys Phe
225                 230                 235                 240
Ala Asp Ser Leu Glu Gln Thr Asn His Glu Lys Asp Ser Glu Ser Ser
                245                 250                 255
Asn Asp Asp Thr Ser Phe Pro Ser Thr Pro Glu Gly Ile Lys Asp Arg
            260                 265                 270
Ser Gly Ala Tyr Ile Thr Cys Ala Pro Phe Asn Pro Ala Ala Thr Glu
        275                 280                 285
Ser Ile Ala Thr Asn Ile Phe Pro Leu Leu Gly Asp Pro Thr Ser Glu
    290                 295                 300
Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys Ile Glu Glu Lys Lys Ala Gln Ile Val
305                 310                 315                 320
Thr Glu Lys Asn Thr Ser Thr Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu Val Ala
                325                 330                 335
Ala Gln Asp Ser Glu Thr Asp Tyr Val Thr Thr Asp Asn Leu Thr Lys
            340                 345                 350
Val Thr Glu Glu Val Val Ala Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr Pro Asp
        355                 360                 365
Leu Val Gln Glu Ala Cys Glu Ser Glu Leu Asn Glu Val Thr Gly Thr
    370                 375                 380
Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys Met Asp Leu Val Gln Thr Ser Glu Val
385                 390                 395                 400
Met Gln Glu Ser Leu Tyr Pro Ala Ala Gln Leu Cys Pro Ser Phe Glu
                405                 410                 415
Glu Ser Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val Met Glu
            420                 425                 430
Ala Pro Leu Asn Ser Ala Val Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val Ile Gln
        435                 440                 445
Pro Ser Ser Ser Pro Leu Glu Ala Ser Ser Val Asn Tyr Glu Ser Ile
    450                 455                 460
Lys His Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala Met Ser Val
465                 470                 475                 480
Ser Leu Lys Lys Val Ser Gly Ile Lys Glu Glu Ile Lys Glu Pro Glu
                485                 490                 495
Asn Ile Asn Ala Ala Leu Gln Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile Ser Ile
            500                 505                 510
Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Ala Glu Pro Ala Pro
        515                 520                 525
Asp Phe Ser Asp Tyr Ser Glu Met Ala Lys Val Glu Gln Pro Val Pro
    530                 535                 540
Asp His Ser Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ser Glu Pro Val
545                 550                 555                 560
Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro Asp Val Pro Gln Lys Gln Asp
                565                 570                 575
Glu Thr Val Met Leu Val Lys Glu Ser Leu Thr Glu Thr Ser Phe Glu
            580                 585                 590
Ser Met Ile Glu Tyr Glu Asn Lys Glu Lys Leu Ser Ala Leu Pro Pro
        595                 600                 605
Glu Gly Gly Lys Pro Tyr Leu Glu Ser Phe Lys Leu Ser Leu Asp Asn
    610                 615                 620
Thr Lys Asp Thr Leu Leu Pro Asp Glu Val Ser Thr Leu Ser Lys Lys
625                 630                 635                 640
Glu Lys Ile Pro Leu Gln Met Glu Glu Leu Ser Thr Ala Val Tyr Ser
                645                 650                 655
Asn Asp Asp Leu Phe Ile Ser Lys Glu Ala Gln Ile Arg Glu Thr Glu
            660                 665                 670
Thr Phe Ser Asp Ser Ser Pro Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr
        675                 680                 685
Leu Ile Ser Ser Lys Thr Asp Ser Phe Ser Lys Leu Ala Arg Glu Tyr
    690                 695                 700
Thr Asp Leu Glu Val Ser His Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ala Pro Asp
705                 710                 715                 720
Gly Ala Gly Ser Leu Pro Cys Thr Glu Leu Pro His Asp Leu Ser Leu
                725                 730                 735
Lys Asn Ile Gln Pro Lys Val Glu Glu Lys Ile Ser Phe Ser Asp Asp
            740                 745                 750
Phe Ser Lys Asn Gly Ser Ala Thr Ser Lys Val Leu Leu Leu Pro Pro
        755                 760                 765
Asp Val Ser Ala Leu Ala Thr Gln Ala Glu Ile Glu Ser Ile Val Lys
    770                 775                 780
Pro Lys Val Leu Val Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr
785                 790                 795                 800
Glu Lys Glu Asp Arg Ser Pro Ser Ala Ile Phe Ser Ala Glu Leu Ser
                805                 810                 815
Lys Thr Ser
<210>4
<211>246
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>4
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Ser Asn Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Thr Ile Lys Gln Asp Gly Ser Gln Lys Asn Tyr Val
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
                85                  90                  95
Ser Leu Tyr Leu Arg Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Thr Glu Leu Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Ser Leu
        115                 120                 125
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
    130                 135                 140
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
145                 150                 155                 160
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
                165                 170                 175
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
            180                 185                 190
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
        195                 200                 205
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
    210                 215                 220
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
225                 230                 235                 240
Thr Cys Pro Pro Cys Pro
                245
<210>5
<211>246
<212>PRT
<213>小鼠
<400>5
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1               5                   10                  15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
            20                  25                  30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Cys Asp Arg Leu Leu Ser Cys Arg
        35                  40                  45
Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
    50                  55                  60
Cys Asp Arg Leu Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser
65                  70                  75                  80
Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
                85                  90                  95
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Cys Asp Arg Leu
            100                 105                 110
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile
        115                 120                 125
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
    130                 135                 140
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
145                 150                 155                 160
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
                165                 170                 175
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
            180                 185                 190
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
        195                 200                 205
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
    210                 215                 220
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
225                 230                 235                 240
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
                245
<210>6
<211>741
<212>DNA
<213>小鼠
<400>6
atggagtttg ggctgagctg ggttttcctt gttgctattt tagaaggtgt ccagtgtgag   60
gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtccagcctg gggggtccct gagactctcc  120
tgtgcagctt ctggattcac ctttagtaac tattggatga gctgggtccg ccaggctccg  180
gggaaagggc tggagtgggt ggccaccata aagcaagatg gaagtcagaa aaactatgtg    240
gactctgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaactc actgtatctg    300
cgattgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgac tgaactcttc    360
gatctctggg gccgtggctc cctggtcacc gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg    420
gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc    480
ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc    540
agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc    600
gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac    660
aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca aatcttgtga caaaactcac    720
acatgcccac cgtgcccata a                                              741
<210>7
<211>705
<212>DNA
<213>小鼠
<400>7
atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga     60
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc    120
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct    180
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc    240
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct    300
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgatcac cttcggccaa    360
gggacacgac tggagattaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca    420
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat    480
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag    540
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg    600
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc    660
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag                    705
<210>8
<211>10
<212>PRT
<213>小鼠
<400>8
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Ser
1               5                   10
<210>9
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
<400>9
Thr Ile Lys Gln Asp Gly Ser Gln Lys Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>10
<211>5
<212>PRT
<213>小鼠
<400>10
Glu Leu Phe Asp Leu
1               5
<210>11
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠
<400>11
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>12
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
<400>12
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1               5
<210>13
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>13
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile Thr
1                5
<210>14
<211>34
<212>DNA
<213>小鼠
<400>14
agggccagtc agagtgttag cagctactta gcct                                      34
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>小鼠
<400>15
gatgcatcca acagggccac t                                                    21
<210>16
<211>27
<212>DNA
<213>小鼠
<400>16
cagcagcgta gcaactggcc gatcacc                                             27
<210>17
<211>30
<212>DNA
<213>小鼠
<400>17
ggattcacct ttagtaacta ttggatgagc                                          30
<210>18
<211>51
<212>DNA
<213>小鼠
<400>18
accataaagc aagatggaag tcagaaaaac tatgtggact ctgtgaaggg c                 51
<210>19
<211>15
<212>DNA
<213>小鼠
<400>19
gaactcttcg atctc                                                           15
<210>20
<211>57
<212>DNA
<213>小鼠
<400>20
atggagtttg ggctgagctg ggttttcctt gttgctattt tagaaggtgt ccagtgt             57
<210>21
<211>19
<212>PRT
<213>小鼠
<400>21
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Val Gln Cys
<210>22
<211>60
<212>DNA
<213>小鼠
<400>22
atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga         60
<210>23
<211>20
<212>PRT
<213>小鼠
<400>23
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1               5                   10                  15
Asp Thr Thr Gly
            20
<210>24
<211>460
<212>PRT
<213>小鼠
<400>24
Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Pro Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Ser Asn Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Thr Ile Lys Gln Asp Gly Ser Gln Lys Asn Tyr Val
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
                85                  90                  95
Ser Leu Tyr Leu Arg Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Thr Glu Leu Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Ser Leu
        115                 120                 125
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
    130                 135                 140
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
145                 150                 155                 160
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
                165                 170                 175
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
            180                 185                 190
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
        195                 200                 205
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
    210                 215                 220
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
225                 230                 235                 240
Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
                245                 250                 255
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
            260                 265                 270
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
        275                 280                 285
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
    290                 295                 300
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
305                 310                 315                 320
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
                325                 330                 335
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
            340                 345                 350
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val  Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
        355                 360                 365
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
    370                 375                 380
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
385                 390                 395                 400
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
                405                 410                 415
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
            420                 425                 430
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
        435                 440                 445
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
    450                 455                 460
<210>25
<211>234
<212>PRT
<213>小鼠
<400>25
Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1               5                   10                  15
Gly Thr Arg Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
            20                  25                  30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
        35                  40                  45
Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
    50                  55                  60
Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
65                  70                  75                  80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
                85                  90                  95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser
            100                 105                 110
Asn Trp Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
        115                 120                 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
    130                 135                 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145                 150                 155                 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
                165                 170                 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
            180                 185                 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
        195                 200                 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
    210                 215                 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230
<210>26
<211>321
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(321)
<400>26
gaa att gtg ttg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg     48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt agc agc tac     96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc    144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
tat gat gca tcc aac agg gcc act ggc atc cca gcc agg ttc agt ggc    192
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc cta gag cct    240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag cag cgt agc aac tgg ccg atc    288
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile
                85                  90                  95
acc ttc ggc caa ggg aca aag ctt gaa atc aaa                        321
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>27
<211>107
<212>PRT
<213>小鼠
<400>27
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>28
<211>342
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(342)
<400>28
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gtc cag cct ggg ggg     48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gct tct gga ttc acc ttt agt aac tat     96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
tgg atg agc tgg gtc cgc cag gct ccg ggg aaa ggg ctg gag tgg gtg    144
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
gcc acc ata aag caa gat gga agt cag aaa aac tat gtg gac tct gtg    192
Ala Thr Ile Lys Gln Asp Gly Ser Gln Lys Asn Tyr Val Asp Ser Val
    50                  55                  60
aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tca ctg tat    240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
ctg cga ttg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt    288
Leu Arg Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
gcg act gaa ctc ttc gat ctc tgg ggc cgt ggc tcc ctg gtc acc gtc    336
Ala Thr Glu Leu Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Ser Leu Val Thr Val
            100                 105                 110
tcc tca                                                            342
Ser Ser
<210>29
<211>114
<212>PRT
<213>小鼠
<400>29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Thr Ile Lys Gln Asp Gly Ser Gln Lys Asn Tyr Val Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Arg Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val  Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Thr Glu Leu Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Ser Leu Val Thr Val
            100                 105                 110
Ser Ser
<210>30
<211>19
<212>PRT
<213>小鼠
<400>30
Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Pro Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
1                5                  10                 15
Val Gln Ala
<210>31
<211>20
<212>PRT
<213>小鼠
<400>31
Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1               5                   10                  15
Gly Thr Arg Cys
            20
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>32
tgagggaagt agggatgtgc                                      20
<210>33
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>33
caggtgatgt acgctctgga                                     20

Claims (15)

1.包括至少一个抗原结合位点的抗体，其与SEQ ID NO：2的人NogoA多肽或SEQ ID NO：3的人NiG特异性结合，所述抗原结合位点：
＊顺次包括高变区SEQ ID NO：8的CDR-H1-6A3、SEQ ID NO：9的CDR-H2-6A3和SEQ ID NO：10的CDR-H3-6A3；和
＊顺次包括高变区SEQ ID NO：11的CDR-L1-6A3、SEQ ID NO：12的CDR-L2-6A3和SEQ ID NO：13的CDR-L3-6A3。
2.根据权利要求1的抗体，其包括：
＊至少一条免疫球蛋白重链或其片段，包括(i)顺次包括高变区SEQID NO：8的CDR-H1-6A3、SEQ ID NO：9的CDR-H2-6A3和SEQ ID NO：10的CDR-H3-6A3的可变结构域，和(ii)人重链的恒定部分或其片段；和
＊至少一条免疫球蛋白轻链或其片段，包括(i)顺次包括高变区SEQID NO：11的CDR-L1-6A3、SEQ ID NO：12的CDR-L2-6A3和SEQ IDNO：13的CDR-L3-6A3的可变结构域，和(ii)人轻链的恒定部分或其片段。
3.根据权利要求1的抗体，其具有＜1000nM的解离常数。
4.根据权利要求2的抗体，其中所述人重链的恒定部分或其片段为γ4型，并且所述人轻链的恒定部分或其片段为κ型。
5.根据权利要求1的抗体，其中所述抗体是人的或嵌合的或人源化的单克隆抗体。
6.根据权利要求1的抗体，其包括选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25的一个或多个多肽序列。
7.分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1至6之任一项的抗体。
8.根据权利要求7的分离的多核苷酸，其包括：
＊选自SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的多核苷酸序列中的至少一个；或
＊选自SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的多核苷酸序列中的至少一个。
9.表达载体，其包括根据权利要求7或8的多核苷酸。
10.表达系统，其包括权利要求9的表达载体，其中当所述表达系统或其部分存在于相容宿主细胞中时，所述表达系统或其部分能够产生权利要求1-6之任一项的抗体。
11.分离的宿主细胞，其包括权利要求9的表达载体或权利要求10的表达系统。
12.用于治疗中枢神经系统疾病的药物组合物，其包括至少一种药学上可接受的载体或稀释剂、以及根据权利要求1-6之任一项的抗体、根据权利要求7的多核苷酸、根据权利要求9或10的表达载体或表达系统、或根据权利要求11的宿主细胞。
13.根据权利要求12的用于治疗中枢神经系统疾病的药物组合物，其中所述组合物是缓慢释放组合物。
14.用于产生根据权利要求1-6之任一项的抗体的方法，其包括借助于重组DNA技术或借助于化学合成，在根据权利要求9或10的表达载体或系统中表达根据权利要求7的多核苷酸。
15.根据权利要求3的抗体，其具有＜100nM的解离常数。
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