BRPI0414174B1 - Anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo uso dos mesmos, polinucleotídeo, vetor, sistema de expressão, e composição farmacêutica. - Google Patents

Abstract

"moléculas de ligação nogo-a e o uso farmacêutico das mesmas". a presente invenção proporciona uma molécula de ligação que é capaz de se ligar a um polipeptídio nogoa humano, ou a nig humano, ou a nig-d20 humano ou a nogoa_342-357 humano com uma constante de dissociação < 1000 nm, um polipeptídio que codifica essa molécula de ligação; um vetor de expressão que compreende o referido polinucleotídeo; um sistema de expressão que compreende um polinucleotídeo capaz da produção e uma molécula de ligação; uma célula hospedeira isolada que compreende um sistema de expressão como definido acima; o uso de tal molécula de ligação como um produto farmacêutico especialmente para o tratamento de reparo de nervo; uma composição farmacêutica que compreende a referida molécula; e um método para o tratamento de doenças associadas com o reparo de nervos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPO OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO DO MESMO USO DOS MESMOS, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR, SISTEMA DE EXPRESSÃO, E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA.

[001] A presente invenção refere-se a moléculas de ligação NOGO-A, tais como por exemplo anticorpos monoclônicos ou fragmentos Fab das mesmas.

[002] A regeneração neuronal em seguida a lesão no sistema nervoso central adulto (SNC) é limitada devido à presença do ambiente de inibição da mielina que cobre os axônios e a formação do tecido de cicatriz. Nos últimos anos foram conseguidos critérios importantes dentro da compreensão molecular da razão pela qual o SNC não é capaz de reparar de forma espontânea ele próprio em seguida à lesão. As moléculas inibitórias na mielina são o impedimento principal com relação à regeneração dos axônios, especificamente imediatamente depois da lesão. Até agora a Nogo-A, a glicoproteína associada à Mielina (MAG) e a glicoproteína oligodendrócita mielina (OMgp) tem sido caracterizadas como inibidores potentes do crescimento da neurite. Além disso a mielina também contém outros componentes inibitórios, tais como os politeoglicanos de sulfato de condroitina. A Nogo-A é um membro da família da proteína reticulon e tem pelo menos dois domínios separados biologicamente e farmacologicamente ativos denominados de Amino-Nogo e Nogo-66. Embora o sítio receptor para este último não seja conhecido até então, a Nogo-66 inibe o crescimento neuronal in vitro e in vivo através de receptor neuronal NgR. Alem da Nogo-66 MAG e OMgp também se ligam a NgR com alta afinidade e inibem o crescimento exagerado da neurite.

[003] Novas abordagens potenciais de pesquisa correntemente diligenciadas com relação a um aperfeiçoamento de reparo de nervo

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2/52 incluem a digestão do tecido da cicatriz com a utilização técnicas de ligação de uma enzima condroitinase ABC, com o uso de células olfativas desembainhadas e células tronco e fatores de crescimento de proteínas para aumentar o crescimento neuronal. As ações de bloqueio dos inibidores do crescimento exagerado da neurite através da modulação dos mediadores de sinalização intracelulares tais como o Rho, uma trifosfatase de guanosina ligada a membrana (GTPase), que parece ser uma ligação chave na inibição do crescimento dos axônios. A monofosfatase cíclica da adenosina (cAMP) que pode superar a inibição associada a mielina in vitro e induz a regeneração in vivo. Uso do inibidor de peptídio do receptor NgR (NEP-1-40) para a indução do recrescimento neuronal e da recuperação funcional em ratos em seguida a lesão espinhal.

[004] Além do uso das abordagens descritas acima, também foi focalizada a atenção sobre o uso de determinados anticorpos monoclônicos para a neutralização das moléculas inibitórias do crescimento da neurite dos sistemas nervosos central e periférico, de forma específica com relação a neutralização da atividade inibitória do crescimento da neurite da NogoA. Desse modo tem sido mostrado que o anticorpo monoclônico IN-1 do fragmento Fab IN-1 do mesmo induz o crescimento exagerado da neurite in vitro e aumenta o desenvolvimento rápido e a regeneração in vivo (Schwab ME et al., (1996) Physiol. Ver. 76, 319 a 370). O teste de diferentes domínios da NogoA com relação a atividade de inibição do crescimento de neurite delineou diversos domínios de inibição na molécula (Chen et al., (2000) Nature 403, 434 a439; GrandPre et al., (2000) Nature 403, 439 a 444; Prinjha et al., (2000) Nature 403, 383 a 384.

[005] As imunoglobulinas ou os anticorpos naturais compreendem, de um modo geral uma molécula multimérica com o formato de Y que tem um sítio de ligação com antígeno no final de cada braço superior. O

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3/52 restante da estrutura, de forma específica a haste do Y media funções de efetuador associadas com as imunoglobulinas. Os anticorpos consistem em cadeias 2 pesada e 2 leve. Ambas as cadeias pesada e leve compreendem um domínio variável e uma parte constante. Um sítio de ligação com antígeno consiste no domínio variável de uma cadeia pesada associada com o domínio variável de uma cadeia leve. Os domínios variáveis das cadeias pesada e leve tem a mesma estrutura geral. Mais especificamente, as características de ligação com antígeno de um anticorpo são determinadas de modo essencial por 3 regiões específicas no domínio variável das cadeias pesada e leve que são denominados de regiões hipervariáveis, ou regiões que determinam a complementaridade (as CDRs). Essas 3 regiões hipervariáveis se alternam com 4 regiões de estrutura (as FR) cujas seqüências são relativamente conservadas e que não se envolvem diretamente na ligação. As CDRs formam alças e são mantidas em proximidade estreita pelas regiões de estrutura que adotam amplamente uma conformação de folha em β. As CDRs de uma cadeia pesada em conjunto com as CDRs da cadeia leve associada constituem de forma essencial o sítio de ligação com o antígeno da molécula do anticorpo. A determinação com relação ao que constitui uma região FR ou CDR é feita usualmente através da comparação da seqüência de aminoácido de uma quantidade de anticorpos levantada na mesma espécie. As regras gerais com relação a identificação das regiões CDR e FR são co conhecimento geral de uma pessoa versada na técnica e podem ser encontradas, por exemplo no website (http://www.bioinf.org.uk/abs).

[006] Foi agora descoberto de forma surpreendente que um novo anticorpo monoclônico humano (a partir deste ponto, nesta especificação denominado de 3A6) levantado em Camundongos Medarex (camundongos reconstituídos geneticamente com genes da imunoglobulina humana) contra o NiG humano e do tipo de IgG tem

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4/52 melhores propriedades do que os anticorpos NagoA da técnica anterior (Schwab ME et al. (1996) Physiol. Rev. 76, 319-370), de modo especial com relação a afinidade de ligação a NogoA de espécies diferentes incluindo a homo sapiens e com relação a atividade mais alta de neutralização do crescimento exagerado da neurite da NogoA em uma determinada concentração de anticorpos. Além disso, é agora possível a construção de outros moléculas de ligação NogoA que tenham as mesmas regiões hipervariáveis como as do referido anticorpo.

[007] Por conseqüência, a invenção proporciona moléculas de ligação com relação a uma região específica ou epítopo de NogoA (a partir daqui, nesta especificação referida como as Moléculas de Ligação da invenção ou simplesmente Moléculas de Ligação). De preferência as Moléculas de Ligação da Invenção ligam a NogoA_342357 (epítopo da 3A6 em NiG humano; = SEQ ID NO: 6), NogoA humano (SEQ ID NO: 5) ou NiG humano (que é fragmento of NogoA inibidor mais potente do crescimento exagerado da neurite e que se inicia no aminoácido No. 186 e termina no aminoácido No. 1004 da NogoA humana, = SEQ ID NO: 5) com uma constante de dissociação (Kd) < 1000nMde mais preferência com uma Kd < 100 nM, de maior preferência com uma Kd < 10 nM. A reação de ligação pode ser mostrada através de métodos padrão (análises qualitativas) que incluem, por exemplo, o método ELISA descrito no Exemplo 6 e o método do biossensor de afinidade descrito no Exemplo 7. Além disso, a ligação a NogoA humana e quase de forma mais importante a eficiência pode ser mostrada em uma análise de crescimento exagerado da neurite, como por exemplo o descrito abaixo.

[008] Assim,em uma outra modalidade de preferência as Moléculas de Ligação (em uma concentração de 100 ug/ml, de preferência de 10 ug/ml, de mais preferência de 1,0 ug/ml e ainda de maior preferência de 0,1 ug;ml) aumentam o número de nevrites em

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5/52 células de grânulo do cerebelo de ratos em um substrato de estrato de proteína de cérebro de macaco por pelo menos 20%, de preferência 50%, de maior preferência 80% comparado com o número de nevrites de células de grânulo do cerebelo de ratos que são tratadas com um anticorpo de controle que não se liga NogoA humana, NiG humana ou ao polipeptídio NogoA_342-357 (isto é, que tem uma constante de dissociação > 1000 nM).

[009] Em uma outra modalidade de preferência as Moléculas de Ligação da invenção compreendem um sítio de ligação com antígeno que compreende na seqüência, as regiões hipervariáveis CDR-H1-3A6, CDR-H2-3A6 e CDR-H3-3A6; a referida CDR-H1-3A6 tendo a seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 8, a referida CDR-H2-3A6 tendo a seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 9, e a referida CDR-H3-3A6 tendo a seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 10; e os equivalentes diretos das mesmas.

[0010] Em um outro aspecto da invenção, a Molécula de Ligação da invenção compreende pelo menos um sitio de ligação com o antígeno, o referido sítio de ligação com o antígeno compreendendo tanto:

a) em seqüência as regiões hipervariáveis CDR-H1-3A6, CDR-H2-3A6 e CDR-H3-3A6; a referida CDR-H1-3A6 tendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 8, a referida CDR-H2-3A6 tendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 9, e a referida CDRH3-3A6 tendo a seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 10; ou

b) em seqüência as regiões hipervariáveis CDR-L1-3A6, CDR-L2-3A6 e CDR-L3-3A6, a referida CDR-L1-3A6 tendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 11, a referida CDR-L2-3A6 tendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 12, e a referida CDR-L3-3A6 tendo a seqüência de aminoácido of SEQ ID NO: 13; ou

c) equivalentes diretos das mesmas.

[0011] Em um aspecto adicional da invenção, a molécula de ligação

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6/52 da invenção compreende pelo menos

a) um primeiro domínio compreendendo em seqüência as regiões hepervariáveis CDR-H1-3A6, CDR-H2-3A6 e CDR-H3-3A6; a referida CDR-H1-3A6 possuindo a seqüência de minoácido de SEQ ID NO: 8, a referida CDR-H2-3A6 possuindo a seqüência de aminoácido de SEQ ID ID NO:9, e a referida CDR-H3-3A6 possuindo a seqüência de aminoácido de SEQ ID ID NO:10, e

b) um segundo domínio compreendendo em seqüência as regiões hipervariáveis CDR-L1-3A6, CDR-L2-3A6 e CDR-L3-3A6; a referida CDR-L1-3A6 possuindo a seqüência de minoácido de SEQ ID NO: 11, a referida CDR-L2-3A6 possuindo a seqüência de aminoácido de SEQ ID ID NO:12, e a referida CDR-L3-3A6 possuindo a seqüência de aminoácido de SEQ ID ID NO:13, e

c) equivalentes diretos dos mesmos [0012] Alem disso, a invenção também proporciona a Molécula de Ligação da invenção que se segue, que compreende, pelo menos um sítio de ligação com antígeno que compreende (a) tanto a parte variável da cadeia pesada de 3A6 (SEQ ID NO: 2); ou (b) a parte variável da cadeia leve de 3A6 (SEQ ID NO: 3) ou equivalentes diretos da mesma.

[0013] Quando o sítio de ligação com o antígeno compreende ambos os primeiro e segundo domínios, esses podem estar localizados na mesma molécula do polipeptídio, ou, de preferência, cada um dos domínios pode estar em uma cadeia diferente, o primeiro domínio sendo parte de uma cadeia pesada de imunoglobulina ou de um fragmento da mesma e o segundo domínio sendo parte de uma cadeia leve da imunoglobulina ou de um fragmento da mesma.

[0014] Os exemplos de Moléculas de Ligação da invenção incluem os anticorpos como os produzidos por células B ou hibridomas e

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7/52 anticorpos humanos ou quiméricos ou humanizados de qualquer fragmento do mesmo, como por exemplo os fragmentos F(ab')2 e Fab, bem como anticorpos de cadeia única ou o domínio único.

[0015] Um anticorpo de cadeia única consiste em domínios variáveis de uma cadeia pesada e leve de anticorpo ligadas de forma covalente através de um ligante de peptídio que consiste usualmente em a partir de 10 até 30 aminoácidos, de preferência a partir de 15 até 25 animo ácidos. Por esse motivo, uma tal estrutura não inclui a parte constante das cadeia pesada e leve e se acredita que o pequeno peptídio espaçador deva ser menos antigênico do que uma parte constante inteira. Por anticorpo quimérico é significado um anticorpo no qual as regiões constantes das cadeias pesada ou leve ou ambas são de origem humana, enquanto que os domínios variáveis de ambas as cadeias pesada e leve são de origem não humana (como por exemplo murina). Por anticorpo humanizado é entendido um anticorpo no qual as regiões hipervariáveis As (CDR1) são de origem não-humana (por exemplo murina), enquanto que todas ou substancialmente todas as partes da imunoglobulina, como por exemplo as regiões constantes e as partes altamente conservadas dos domínios variáveis, isto pe as regiões de estrutura, são de origem humana. Um anticorpo humanizado pode, no entanto, reter uns poucos aminoácidos da seqüência murina nas partes das regiões de estrutura adjacentes as regiões hipervariáveis.

[0016] As regiões hipervariáveis podem estar associadas com qualquer tipo de regiões de estrutura, de preferência de origem murina ou humana. As regiões de estrutura adequadas estão descritas em Sequences of proteins of immunological interest, Kabat E.A. et al, US department of health and human services, Public health service, National Institute of Health. De preferência a parte constante de uma cadeia humana pesada das Moléculas de Ligação podem ser do tipo

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IgG4, incluindo os subtipos, de preferência a parte constante de uma cadeia leve humana pode ser do tipo κ ou l, de mais preferência do tipo κ.

[0017] Os anticorpos monoclônicos levantados contra uma proteína encontrada e forma natural em todos os seres humanos pode ser desenvolvidos em um sistema não-humano, como por exemplo em camundongos. Como uma conseqüência direta disso, um anticorpo xenogênico na medida em que produzido através de um hibridoma, quando administrado a seres humanos, provoca uma resposta de imunização não desejável, que é mediada, de forma predominante pela parte constante da imunoglobulina xenogênica. Isso limita claramente o uso de tais anticorpos na medida em que eles não podem ser administrados durante um período de tempo prolongado. Por esse motivo, é de preferência específica a utilização de anticorpos de cadeia única, de domínio único, quimérico ou humanizado que não sejam prováveis de provocar uma resposta alogênica substancial, quando administrados a seres humanos.

[0018] Em vista do precedente, uma Molécula de Ligação da invenção, de mais preferência é selecionada a partir de um anticorpo quimérico que compreenda, pelo menos:

a) Uma cadeia pesada de imunoglobulina ou um fragmento da mesma que compreenda (i) um domínio variável compreendendo em seqüência as regiões hipervariáveis CDR-H1-3A6, CDR-H2-3A6 e CDR-H3-3A6 e (ii) a parte constante ou fragmentos da mesma de uma cadeia pesada humana; a referida CDR-H1-3A6 que tenha a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 8), a referida CDR-H2-3A6 que tenha a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 9), e a referida CDR-H3-3A6 que tenha a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 10), e

b) uma cadeia leve de imunoglobulina ou um fragmento da mesma que compreenda (i) um domínio variável que compreenda, em

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9/52 seqüência as regiões hipervariáveis CDR-L1-3A6, CDR-L2-3A6 e CDRL3-3A6 e (ii) a parte constante ou um fragmento da mesma de uma cadeia leve humana; a referida CDR-L1-3A6 tendo a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 11), a referida CDR-L2-3A6 tendo a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 12)e a referida CDR-L3-3A6 tendo a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 13); ou equivalentes diretos das mesmas.

[0019] De forma alternativa, uma Molécula de Ligação da Invenção pode ser selecionada a partir de uma molécula de ligação de cadeia única que compreende um sítio de ligação com antígeno compreendendo:

a) um primeiro domínio que compreende, em seqüência as hipervariáveis CDR-H1-3A6, CDR-H2-3A6 e CDR-H3-3A6; a referida CDR-H1-3A6 tendo a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 8), a referida CDR-H2-3A6 tendo a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 9), a referida CDR-H3-3A6 tendo a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 10); e

b) um segundo domínio que compreende em seqüência as hipervariáveis CDR-L1-3A6, CDR-L2-3A6 e CDR-L3-3A6; a referida CDR-L1-3A6 tendo a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 11), a referida CDR-L2-3A6 tendo a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:

12), a referida CDR-L3-3A6 tendo a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 13);e

c) um ligante de peptídio que está ligado tanto á extremidade do terminal N do primeiro domínio e a extremidade do terminal C do segundo domínio ou a extremidade do terminal C do primeiro domínio e a extremidade do terminal N do segundo domínio; ou equivalentes diretos dos mesmos.

[0020] Como é bastante conhecido, pequenas mudanças em uma seqüência de aminoácido tais como cancelamento, adição ou

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10/52 substituição de um ou de diversos aminoácidos podem levar a uma forma alélica da proteína original que tenha substancialmente propriedades idênticas. Desse modo, através da expressão equivalente direto do mesmo é significado tanto qualquer Molécula de Ligação de domínio único da invenção (molécula X) (i) na qual cada uma das regiões hipervariáveis CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 da molécula de ligação é pelo menos 50 ou 80% homóloga, de preferência, pelo menos 90% homóloga, de mais preferência 95, 96, 97, 98, 99% homóloga as regiões hipervariáveis equivalentes de CDR-H1-3A6 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-3A6 (SEQ ID NO: 9) e CDR-H3-3A6 (SEQ ID NO: 10), enquanto que CDR-H1 é equivalente a CDR-H1-3A6, CDR-H2 é equivalente a CDR-H2-3A6, CDR-H3 é equivalente a CDR-H3-3A6; e (ii) que seja capaz de se ligar a NogoA humana, NiG humana ou NogoA_342-367 humana, de preferência com uma constante de dissociação (Kd) < 1000 nM, de mais preferência com uma Kd < 100 nM, de maior preferência com uma Kd < 10 nM, ou qualquer molécula de ligação da invenção que tenha pelo menos dois domínios por sítio de ligação (molécula X');

(iii) em que cada uma das regiões hipervariáveis CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 é pelo menos 50 ou 80% homóloga, de preferência, pelo menos 90% homóloga, de mais preferência 95, 96, 97, 98, 99% idêntica as regiões hipervariáveis equivalentes de CDR-H1-3A6 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-3A6 (SEQ ID NO: 9) e CDR-H3-3A6 (SEQ ID NO: 10), CDR-L1-3A6 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-3A6 (SEQ ID NO: 12), e CDR-L3-3A6 (SEQ ID NO: 13), enquanto que CDR-H1 é equivalente a CDR-H1-3A6, CDR-H2 é equivalente a CDR-H2-3A6, CDR-H3 é equivalente a CDR-H3-3A6; CDR-L1 é equivalente a CDR-L1-3A6, CDR-L2 é equivalente a CDRL2-3A6, CDR-L3 é equivalente a CDR-L3-3A6; e

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11/52 (iv) que seja capaz de se ligar a NogoA humana, NiG humana ou NogoA_342-357 humana, de preferência com uma constante de dissociação (Kd) < 1000 nm, de mais preferência com uma Kd < 100 nM, de maior preferência com uma Kd < 10 nM.

Assim, outras modalidades da invenção são, por exemplo uma Molécula de Ligação que seja capaz de se ligar a NogoA humana, NiG humana ou NogoA_342-357 humana, com uma constante de dissociação (Kd) < 1000 nm e que compreende, pelo menos um sítio de ligação com o antígeno, o referido sítio de ligação com antígeno compreendendo, tanto:

[0021] .em seqüência as regiões hipervariáveis CDR-H1, CDR-H2, e CDR-H3, das quais cada uma das regiões hipervariáveis são pelo menos 50%, de preferência 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% homologas as suas regiões hipervariáveis equivalentes CDR-H1-3A6 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-3A6 (SEQ ID NO: 9) e CDR-H3-3A6 (SEQ ID NO: 10); ou em seqüência as regiões hipervariáveis CDR-L1, CDR-L2, e CDR-L3, das quais cada uma das regiões hipervariáveis são pelo menos 50%, de preferência 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% homologas as suas regiões hipervariáveis equivalentes CDR-L1-3A6 (SEQ ID NO: 11), CDR-L23A6 (SEQ ID NO: 12) e CDR-L3-3A6 (SEQ ID NO: 13).

[0022] Alem disso, uma Molécula de Ligação que seja capaz de se ligar a NogoA humana, NiG humana ou NogoA_342-357 humana, com uma constante de dissociação (Kd) < 1000 nM e que compreende: [0023] . um primeiro sítio de ligação com antígeno que compreende em seqüência as regiões hipervariáveis CDR-H1, CDR-H2, e CDR-H3, das quais, cada uma das regiões hipervariáveis são, pelo menos 50%, de preferência 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% homologas as suas regiões hipervariáveis equivalentes CDR-H1-3A6 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-3A6 (SEQ ID NO: 9) e CDR-H3-3A6 (SEQ ID NO: 10);

[0024] . um segundo sítio de ligação com antígeno que compreende

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12/52 em seqüência as regiões hipervariáveis CDR-L1, CDR-L2, e CDR-L3, das quais, cada uma das regiões hipervariáveis são, pelo menos 50%, de preferência 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% homologas as suas regiões hipervariáveis equivalentes CDR-L1-3A6 (SEQ ID NO: 11), CDR-L23A6 (SEQ ID NO: 12) e CDR-L3-3A6 (SEQ ID NO: 13).

[0025] A constante de dissociação pode ser testada de modo conveniente em diversas análises incluindo, por exemplo. o método de afinidade biossensor descrito no Exemplo 7, Alem disso, os efeitos de ligação e funcional das Moléculas de Ligação podem ser mostrados em uma análise biológica como, por exemplo descrita abaixo.

[0026] A parte constante de uma cadeia pesada humana pode ser do tipo γ1; γ2; γ3; γ4; α1; α2; δ ou ε, de preferência do tipo γ, de mais preferência do tipo γ4; enquanto que a parte constante de uma cadeia leve humana pode ser do tipo κ ou λ (que incluem os sub tipos λ1; λ2; e λ3) porem é de preferência do tipo κ. As seqüências de aminoácido de todas essas partes constantes são fornecidas em Kabat et al (Supra).

[0027] Conjugados das moléculas de ligação da invenção, por exemplo conjugados com enzima ou toxina ou rádio isótopo, também estão incluídos no âmbito da invenção.

[0028] Polipeptídio de não for especificado de outra forma neste relatório, inclui qualquer peptídio ou proteína que compreenda aminoácidos juntados um com o outro através de ligações de peptídio, tendo uma seqüência de aminoácido se iniciando na extremidade do terminal N e se finalizando na extremidade do terminal C. De preferência, o polipeptídio da presente invenção me um anticorpo monoclônico, de mais preferência é um anticorpo monoclônico quimérico (também denominado de enxertado em V) ou humanizado (também denominado de enxertado em CDR). O anticorpo monoclônico humanizado (enxertado em CDR) pode ou não pode incluir outras mutações introduzidas nas seqüências de estrutura (FR) do anticorpo

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13/52 aceitador.

[0029] Um derivado funcional de um polipeptídio na forma usada nesta especificação inclui uma molécula que tenha atividade biológica qualitativa em comum com um polipeptídio da presente invenção, isto é, que tenha a capacidade de se ligar a NogoA humana, NiG humana ou NogoA_342-367 humana. Um derivado funcional inclui fragmentos e análogos de peptídios de um polipeptídio de acordo com a presente invenção. Os fragmentos compreendem regiões dentro da seqüência de um polipeptídio de acordo com a presente invenção, como por exemplo uma seqüência específica. O termo derivado é usado para definir as variantes da seqüência de aminoácidos, e modificações covalentes de um polipeptídio de acordo com a invenção, por exemplo uma seqüência especificada. Os derivados funcionais de um polipeptídio de acordo com a presente invenção, por exemplo, uma seqüência específica, por exemplo de uma região hipervariável da cadeia leve e pesada, tem de preferência pelo menos cerca de 65%, de preferência pelo menos cerca de 75%, ainda de mais preferência pelo menos cerca de 85%, de maior preferência, pelo menos cerca de pelo menos 95, 96, 97, 98, 99% de homologia total da seqüência com a seqüência de aminoácido de um polipeptídio de acordo com a presente invenção, por exemplo, de uma seqüência especial, e que retenha de forma substancial a capacidade de se ligar a NogoA humana, NiG humana ou NogoA_342-367 humana.

[0030] A expressão modificação covalente inclui as modificações de um polipeptídio de acordo com a presente invenção, por exemplo, de uma seqüência específica; ou de um fragmento da mesma com um agente de derivatisação proteinóico ou não proteinóico, fusões a seqüências de polipeptídio heterólogas, e modificações pós translacionais. Os polipeptídios modificados de modo covalente, por exemplo, de uma seqüência especificada, ainda tem a capacidade de se ligar a NogoA humana, NiG humana ou NogoA_342-367 humana

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14/52 através de reticulação. As modificações covalentes são introduzidas tradicionalmente através de reação dos resíduos de aminoácido objetivados com um agente orgânico de derivatização que se já capaz de reagir com lados selecionados ou resíduos terminais, ou pela anexação de mecanismos de modificações pós translacionais que funcionem em células hospedeiras recombinantes selecionadas. Determinadas modificações pós translacionais são o resultado da ação de células hospedeiras recombinantes sobre os polipeptídios expressados. Os resíduos de glutaminila e de asparaginila são freqüentemente desaminados após a translação para aos resíduos de glutamila e aspartila correspondentes. De forma alternativa, esses resíduos são desaminados sob condições ácidas suaves. Outras modificações pós translacionais incluem a hidroxilação da prolina e da lisina, fosforilação dos grupos hidroxila dos resíduos de serila, tirosina ou treonila, metilação dos grupos a-amino das cadeias laterais da lisina, arginina e histidina, ver, por exemplo T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 7986 (1983). As modificações covalentes incluem, por exemplo, proteínas de fusão que compreendem um polipeptídio de acordo com a presente invenção, por exemplo, de uma seqüência especial e as suas seqüências de aminoácido variantes, tais como as imuno adesinas e fusões do terminal N a seqüências de sinal heterólogas.

[0031] Homologia com relação a um polipeptídio natural e o derivado funcional do mesmo é definido nesta especificação como a percentagem de resíduos de aminoácidos na seqüência candidata que são idênticos com os resíduos de um polipeptídio natural correspondente, depois do alinhamento das seqüências e introduzindo os intervalos, se necessário, para ser conseguido um percentual de homologia máximo, e não considerando nenhuma substituições alternativas como parte da identidade da seqüência. Nenhuma das

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15/52 extensões N- ou C- nem as inserções devem ser consideradas como redutoras da identidade ou da homologia.Os métodos e os programas de computador para o alinhamento são bastante conhecidos.

[0032] Aminoácido(s) se refere a todos os L-a-aminoácidos de ocorrência natural, e incluindo, por exemplo os D-aminoácidos. Os aminoácidos são identificados tanto pelas suas designações de uma única letra como as designações de três letras.

[0033] A expressão variante da seqüência de aminoácido se refere a moléculas com algumas diferenças nas suas seqüências de aminoácidos quando comparadas a um polipeptídio de acordo com a presente invenção, como por exemplo, uma seqüência específica. As variantes das seqüências de aminoácido de um polipeptídio de acordo com a presente invenção, por exemplo, uma seqüência especificada, ainda tem a capacidade de se ligar a NogoA humana, NiG humana ou NogoA_342-367 humana. As variantes de substituição são aquelas que tem pelo menos um resíduo de aminoácido removido e um aminoácido diferente inserido em seu lugar na mesma posição em um polipeptídio de acordo com a presente invenção, por exemplo uma seqüência especificada. Essas substituições podem ser únicas, nas quais somente um aminoácido na molécula tenha sido substituído, ou elas podem ser múltiplas, nas quais dois ou mais aminoácidos tenham sido substituídos na mesma molécula. As variantes de inserção são aquelas nas com um ou mais aminoácidos inseridos imediatamente adjacente a um aminoácido em uma posição específica em um polipeptídio de acordo com a presente invenção, por exemplo de uma seqüência especificada. Imediatamente adjacente a um aminoácido significa conectado tanto ao grupo funcional a-carbóxi ou a um grupo funcional a-amino do aminoácido. As variantes de deleção são aquelas com um ou mais aminoácidos removido em um polipeptídio de acordo com a presente invenção, por exemplo uma seqüência especificada. De forma comum,

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16/52 as variantes de deleção terão um ou dois aminoácidos cancelados em uma região específica da molécula.

[0034] Uma molécula recombinante da invenção pode ser produzida através de técnicas de DNA recombinante. Em vista disso, uma ou mais moléculas de DNA que codificam a molécula de ligação devem ser construídas, colocadas sob seqüências de controle apropriadas e transferidas para dentro de um organismo hospedeiro adequado para a expressão.

[0035] De uma maneira muito geral, são, por conseqüência providos:

(i) moléculas de DNA que codifiquem a Molécula de Ligação da invenção de domínio único, uma Molécula de Ligação da invenção de cadeia única, um fragmento de cadeia leve ou pesada da mesma de uma Molécula de Ligação da invenção; e (ii) o uso das moléculas de DNA da invenção para a produção de uma Molécula de Ligação da invenção através de meios recombinantes.

[0036] O estado atual da técnica é tal que a pessoa versada na técnica será capaz de sintetizar as moléculas de DNA da invenção dadas as informações providas nesta especificação, isto é, as seqüências de aminoácido das regiões hipervariáveis e as seqüências de DNA que codificam para as mesmas. Um método para a construção de um gene de domínio variável está descrito, por exemplo na EP 239 400 e pode ser resumido brevemente como se segue: Um gene codificando um domínio variável de um anticorpo monoclônico de qualquer especificidade é clonado. Os segmentos de DNA que codificam as regiões de estrutura e hipervariáveis são determinados e os segmentos de DNA que codificam as regiões hipervariáveis são removidos de tal forma que os segmentos de DNA que codificam as regiões de estrutura são fundidos em conjunto com sítios de restrição

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17/52 adequados nas junções. Os sítios de restrição podem ser gerados nas posições apropriadas através da mutagenese da molécula de DNA por procedimentos padrão. Os cassetes sintéticos de CDR de filamento duplo são preparados através da síntese do DNA de acordo com as seqüências dadas acima CDR-H1-3A6, CDR-H2-3A6, CDR-H3-3A6, CDR-L1-3A6, CDR-L2-3A6 e CDR-L3-3A6. Os cassetes são providos com extremidades pegajosas de tal forma que eles podem ser ligados nas junções a estrutura através de protocolo padrão para ser conseguida uma molécula de DNA que codifique um domínio variante de imunoglobulina.

[0037] Além do mais, não é necessário ter acesso ao mRNA a partir de uma linha de células produzindo hibridoma com a finalidade de ser obtido um construto de DNA codificando para os anticorpos monoclônicos da invenção. Desse modo, o requerimento PCT WO 90/07861 dá instruções completas para a produção de um anticorpo monoclônico através de técnicas de DNA recombinante dando que somente informação inscrita com relação a seqüência de nucleotídio do gene.

[0038] O método compreende a síntese de uma quantidade de oligonucleotídios, sua amplificação pelo método PCR a divisão dos mesmos para dar as seqüências de DNA desejadas.

[0039] Os vetores de expressão que compreendem um promotor adequado ou genes codificando partes constantes de cadeia leve e de cadeia pesada estão publicamente disponíveis. Dessa forma, uma vez que uma molécula de DNA da invenção é preparada ela pode ser convenientemente transferida em um vetor de expressão apropriado. [0040] As moléculas de DNA que codificam anticorpos de cadeia única também podem ser preparadas através de métodos padrão, por exemplo,como descritos na WO 88/1649.

[0041] Em uma modalidade específica da invenção, os meios

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18/52 recombinantes para a produção de algumas das Moléculas de Ligação da invenção incluem primeiro e segundo construtos de DNA como descrito abaixo:

[0042] O primeiro construto de DNA codifica uma cadeia pesada ou um fragmento da mesma e compreende:

a) uma primeira parte que codifica um domínio variável que compreende de modo alternativo regiões de estrutura e hipervariáveis, as referidas regiões hipervariáveis compreendendo, em seqüência DNA-CDR-H1-3A6 (SEQ ID NO: 14), DNA-CDR-H2-3A6 (SEQ ID NO: 15) e DNA-CDR-H3-3A6 (SEQ ID NO: 16); esta primeira parte se iniciando com um códon que codifica o primeiro aminoácido do domínio variável e finalizando com um códon que codifica o último aminoácido do domínio variável, e

b) uma segunda parte que codifica uma parte constante de uma cadeia pesada ou de um fragmento da mesma que se inicia com um códon que codifica o primeiro aminoácido da parte constante da cadeia pesada e que finaliza com um códon que codifica o último aminoácido da parte constante ou do fragmento da mesma, seguido por um códons não senso.

[0043] De preferência, a segunda parte codifica a parte constante de uma cadeia pesada humana, de mais preferência a parte constante de uma cadeia humana y4. Esta segunda parte pode ser um fragmento de DNA de origem genômica (compreendendo introns) ou um fragmento de cDNA (sem introns).

[0044] O segundo construto de DNA codifica uma cadeia leve ou um fragmento da mesma e compreende:

a) uma primeira parte que codifica um domínio variável que compreende de forma alternativa regiões de estrutura e hipervariáveis; as referidas regiões hipervariáveis compreendendo em seqüência DNACDR-L1-3A6 (SEQ ID NO: 17), DNA-CDR-L2-3A6 (SEQ ID NO: 18) e

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DNA-CDR-L3-3A6 (SEQ ID NO: 19), esta primeira parte se iniciando com um códon que codifica o primeiro aminoácido do domínio variável e finalizando com um códon que codifica o último aminoácido do domínio variável, e

b) uma segunda parte que codifica uma parte constante de uma cadeia leve ou de um fragmento da mesma que se inicia com um códon que codifica o primeiro aminoácido da parte constante da cadeia leve e que finaliza com um códon que codifica o último aminoácido da parte constante ou do fragmento da mesma, seguido por um códons não senso.

[0045] De preferência, a segunda parte codifica a parte constante de uma cadeia leve humana, de mais preferência a parte constante de uma cadeia humana k.

[0046] Os primeiro ou segundo construtos de DNA compreendem vantajosamente uma terceira parte que é localizada á montante da primeira parte de um peptídio líder; esta terceira parte se iniciando com o códon que codifica o primeiro aminoácido e finalizando com o último aminoácido do peptídio líder. Este peptídio é necessário para a secreção das cadeias pelo organismo hospedeiro no qual eles são expressos e em seguida removido pelo organismo hospedeiro. De preferência a terceira parte do primeiro construto de DNA codifica um peptídio líder que tem uma seqüência de aminoácido substancialmente idêntica a seqüência de aminoácido da seqüência líder da cadeia pesada como mostrado na SEQ ID NO: 21 (se iniciando com o aminoácido na posição -19 e finalizando com o aminoácido na posição -1). Também de preferência, a terceira parte do segundo construto de DNA codifica um peptídio líder tendo uma seqüência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 23 (cadeia leve, se iniciando com o aminoácido na posição -18e finalizando com o aminoácido na posição 1).

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20/52 [0047] Cada um dos construtos de DNA é colocado sob o controle de seqüências de controle adequadas, de forma específica sob o controle de um promotor adequado. Qualquer tipo de promotor pode ser usado, contanto que ele esteja adaptado ao organismo hospedeiro no qual os construtos de DNA serão transferidos para expressão. No entanto, se a expressão é para ter lugar em uma célula de mamífero, é de preferência específica o uso do promotor de um gene de imunoglobulina.

[0048] O anticorpo desejado pode ser produzido em uma cultura de células ou em um animal transgênico. Um animal transgênico adequado pode ser obtido de acordo com métodos padrão que incluem a micro injeção em óvulos dos primeiro e segundo construtos de DNA colocados sob seqüências de controle adequadas e transferindo os óvulos preparados desse modo para fêmeas apropriadas pseudográvidas e selecionando um descendente que expresse o anticorpo desejado.

[0049] Quando as cadeias de anticorpos tem que ser produzidas em uma cultura de células, os construtos de DNA devem ser inseridos, tanto primeiro dentro de um único vetor de expressão como dentro de dois vetores de expressão separados porem compatíveis, a última possibilidade sendo a de preferência.

[0050] Por conseqüência, a invenção também proporciona um vetor de expressão capaz de se replicar em uma linha de célula procariótica ou eucariótica que compreenda pelo menos um dos construtos de DNA descritos acima.

[0051] Cada um dos vetores de expressão que contém um construto de DNA é em seguida transferido para um organismo hospedeiro adequado. Quando os construtos de DNA são inseridos separadamente em dois vetores de expressão, eles podem ser transferidos de forma separada, isto é, um tipo de vetor por célula, ou co-transferidos, esta ultima possibilidade sendo a de preferência. Um

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21/52 organismo hospedeiro adequado pode ser uma bactéria, um fermento ou uma linha de célula de mamífero. De mais preferência, a linha de célula de mamífero é de origem linfóide como por exemplo um mieloma, hibridoma ou uma célula B normal imortalizada, porém não expressa nenhuma cadeia leve ou pesada de um anticorpo endógeno.

[0052] Também é de preferência que o organismo hospedeiro contenha um grande numero de cópias dos vetores por célula. Se o organismo hospedeiro é uma linha de célula de mamífero, esse objetivo desejável pode ser alcançado através da amplificação do número de cópias de acordo com métodos padrão. Os métodos de amplificação consistem, de modo usual, em selecionar com relação a resistência aumentada a uma droga, a referida resistência sendo codificada através do vetor de expressão.

[0053] Em um outro aspecto da invenção, é provido um processo para a produção de uma molécula de ligação de cadeia múltipla, que compreende (i) cultivar um organismo que seja transformado com os primeiro e segundo construtos de DNA da invenção e (ii) recuperando uma molécula de ligação ativa da invenção a partir da cultura.

[0054] De forma alternativa, as cadeias leve e pesada podem ser recuperadas de forma separada e reconstituídas dentro de uma molécula de ligação ativa depois de redobragem in vitro. Os métodos de reconstituição são bem conhecidos na técnica; Exemplos dos métodos são providos especificamente na EP 120 674 ou na EP 125 023.

[0055] Por esse motivo, um processo pode compreender:

(i) cultivar um primeiro organismo que é transformado com um primeiro construto de DNA da invenção e recuperando a referida cadeia pesada ou um fragmento da mesma a partir da cultura, e (ii) cultivando um segundo organismo que é transformado com um segundo construto de DNA da invenção e recuperando a referida cadeia leve ou um fragmento da mesma a partir da cultura, e

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22/52 (iii) reconstituindo in vitro uma molécula de ligação ativa da invenção a partir da cadeia pesada ou de um fragmento da mesma obtido em (i) e a cadeia leve, ou um fragmento da mesma obtido em (ii). [0056] De uma maneira similar, também é provido um processo para a produção de uma molécula de ligação da invenção, de cadeia única ou de domínio único que compreende:

(i) cultivar um organismo que é transformado com um construto de DNA que codifique, respectivamente, uma molécula de ligação da invenção de cadeia única ou de domínio único, e (ii) recuperando a referida molécula a partir da cultura.

[0057] As moléculas de ligação da invenção exibem uma atividade de regeneração de nervos muito boa como mostrada, por exemplo, no modelo de crescimento da neurite em célula grânulo.

1. Ensaio de crescimento da neurite em células de granulo (in vitro). [0058] Tecido do cérebro (córtex e tronco do cérebro) é tomado e para cada ensaio estrato de proteína preparado de modo fresco como descrito anteriormente (Spillmann et al. 1998, Identification and characterization of a bovine neurite growth inhibitor (bNI-220), J Biol Chem. 1998 Jul 24;273(30):19283-93). Um pedaço de tecido congelado (por exemplo 0,25 g) é homogeneizado e 3 a 4 Vol de 60 mM Chaps 10 mM Tris pH 8,0 - 1 mM EDTA com bloqueador de protease (10mg/ml Aprotinina - 5mg/ml, Leupeptina - 1mg/ml Pepstatina - 1mM PMSF) a 4° C. O homogenato é colocado em um girador a 4°C durante 30 minutos e centrifugado a 100.000 g 45 minutos a 4°C em um rotor TLA 100.3 (Beckman TL-100ultracentrifuge). A concentração da proteína é determinada a partir do sobrenadante com a utilização de BioRad.

[0059] As células de grânulo do cerebelo são purificadas a partir de tecido do cerebelo de ratos pós natal de 5 a 7 dias desassociado com tripsina como descrito anteriormente (Niederost et al 1999, Bovine CNS myelin contains neurite growth-inhibitory activity associated with

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23/52 chondroitin sulfate proteoglycans, J Neurosci. 1999 Oct 15;19(20):897989). As moléculas de ligação da invenção são em seguida pré incubadas durante 30 minutos sobre o substrato de teste e removidas antes da adição das células. Ao células granulares do cerebelo são adicionadas e incubadas durante 24 horas. Para parar o experimento, são adicionados lentamente 2 ml de formaldeído compensado a 4% aos pratos de cultura. Extrato de proteína extraída da membrana de cérebro de macaco preparado como descrito acima foi adsorvido de um dia para o outro a 15pg de proteína por cm² de prato de cultura em pratos de Greiner de 4 cavidades (Greiner, Nuertingen, Alemanha). os pratos são lavados três vezes com solução de Hank morna antes da colocação dos neurônios. As células granulares de cerebelo de ratos pós natais com 5 a 7 dias de idade são preparadas como descrito acima e colocadas nos pratos as 50.000 células por cm². As células são cultivadas durante 24 horas em meio isento de soro, fixadas e imuno marcadas com marcador de neurite MAB 1b (Chemicon monoclonal Ab, 1:200). Para o manchamento do corpo das células é usado DAPI (dicloridrato de 4',6diamidino-2-fenil-indol, de Molecular Probes) depois da marcação com o MAB 1b. Para experimentos com anticorpos, o anti-NogoA Abs ou o IgG Ab de controle pré-incubado dos pratos durante 30 minutos e em seguida removidos.

[0060] Quatro campos em uma distância definida da borda da cavidade são amostradas de forma aleatória com relação a cada cavidade com a utilização de uma objetiva 40 X pela contagem de todas as intercessões de neuritos com a linha colocada através do centro do campo de observação. Todos os corpos de células que estiverem tocando a linha também são contados, e uma proporção do índice de neuritos por corpo de célula é calculada para cada uma das cavidades como reportado anteriormente (Simonen et al, 2003, Neuron 38,201211). Todas as contagens são feitas cegamente sobre experimentos

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24/52 codificados e expressas como um índice de neurite por corpo de célula. Os resultados são expressos como índice médio de neurite / corpo de célula.

[0061] Pode ser observado um aumento no crescimento da neurite de células granulares do cerebelo no ambiente não permissivo do estrato de cordão espinhal preparado acima através da pré incubação com uma molécula de ligação. Por exemplo, um perfil típico com relação ao efeito de neutralização da 3A6-IgG1 humana e anticorpo IgG4 no modelo de crescimento de neurite em célula grânulo é dado abaixo:

	índice de neurite / corpo de célula	% de aumento comparado com o IgG de controle
nenhum anticorpo	0,87
+Control IgG	0,90
3A6IgG1 0,1 pg/ml	1,44	60%
3A6 IgG4 0,1 pg/ml	1,43	59%
+Control IgG	0,92
3A6IgG1 10,0 pg/ml	1,69	84%
3A6 IgG4 10,0 pg/ml	1,55	68%

[0062] O atividade de neutralização das moléculas da invenção também pode ser calculada através da medição da germinação regenerativa r do crescimento na neurite e a recuperação funcional nos modelos de lesão do cordão espinhal in vivo descrito abaixo em resumo.

2. Modelos de lesão no cordão espinhal em ratos e macacos (in vivo).

[0063] Ratos Lewis adultos são lecionados através de micro cirurgia pela transecção da metade dorsal do cordão espinhal bilateralmente no nível da 8^a. vértebra torácica. A Laminectomia, anestesia e cirurgia estão descritas em Schnell e Schwab 1993 (Eur.J. Neurosci. 5: 1156 1171).

[0064] Traçado neuro anatômico: O trato córtico espinhal motor e sensório e traçado através da injeção de tracejador de grau anterior de biotina dextrano amina (BDA) no interior do córtex do lado oposto ao da

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25/52 bomba ou do enxerto. O BDA é transportado para o cordão espinhal dentro de 10 a 14 dias e visualizado com a utilização de diaminobenzidina (DAB) como um substrato como descrito em Brosamle et al., (2000 J.Neurosci. 20: 8061-8068).

[0065] Duas semanas depois uma lesão espinhal destruindo cerca de 40% do segmento T8 do cordão espinhal, principalmente na metade dorsal, incluindo ambos os CST principais: traçando o CST nos animais de controle mostra um grau moderado de uma germinação reativa do trato. Esse fenômeno corresponde à germinação espontânea em resposta à lesão bem conhecida na literatura. Os ratos lesionados sendo tratados com as moléculas de ligação da invenção ou com bombas fornecendo as moléculas de ligação da invenção podem mostrar uma germinação aumentada no local da lesão e a regeneração dos axônios danificados e do crescimento da neurite dos neuritos danificados. Além disso os animais podem mostrar uma recuperação aumentada nas funções sensórias e motoras. Esses testes funcionais são descritos anteriormente (Merkler et al, 2001, J. Neuroscience 21,3665-73).

3. Distribuição de Anticorpos em Tecidos de Macacos CSN Adultos. [0066] O anticorpo 3A6 é purificado como IgG e concentrado para 3 mg/ml em PBS. Soro de camundongo derivado de IgG ((Chemicon Int., Temecula/CA, USA) ou um mAB direcionado contra a auxina do trigo (AMS Biotechnology, Oxon/UK) são usados como os tratamentos de controle. Dois macacos adultos macaque (Macaca fascicularis) são usados neste estudo com relação à infusão intra tecal.

Procedimentos cirúrgicos [0067] A anestesia é induzida através da injeção intramuscular de cetamina (Ketalar®; Parke-Davis, 5 mg/kg, i.m.). Atropina é injetada por via intramuscular (0,05 mg/kg) para a redução das secreções brônquicas. Um cateter intravenoso é colocado na via femoral para a

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26/52 perfusão contínua com uma mistura de propofol a 1% (Fresenius®) e solução de glicose a 4% (1 volume de Propofol e 2 volumes de solução de glicose) induzindo uma anestesia mais profunda. O animal em seguida colocado em uma estrutura de trabalho estereotáxica. Sob condições estéreis, é realizada uma incisão vertical na linha do meio da pele a partir de C2 até Th1. O corte da fascia e os processos espinhais de C2 até Th1 são expostos. os músculos para vertebrais são retraídos e as lâminas de C6, C7 e Th1 são dissecadas. A dura mater é exposta e cortada longitudinalmente acima dos 7° e 8° segmentos cervicais espinhais, que correspondem a zona rostral da parte espinhal coberta pela 6^a lâmina cervical. Um tubo de polietileno (comprimento de 10 cm) ligado a uma bomba osmótica (Alzet®, 2ML1; fluxo: 50pg/hr) que fornece o anticorpo hNogo-A, é inserido abaixo da dura mater e empurrado alguns milímetros na direção do rostro e fixado a dura mater com uma sutura. A bomba osmótica é colocada e segura em uma cavidade feita na massa dos músculos do dorso alguns centímetros mais baixa do que a laminectomia, sobre o lado esquerdo. O tubo é seguro ao longo da sua trajetória no tecido muscular com suturas. Os músculos e a pele são suturados e os animais recuperados da anestesia usualmente de 15 a 30 minutos depois da interrupção da perfusão venosa com o propofol. O animal é tratado de forma pós operativa com um antibiótico (Ampicilina 10%, 30 mg/kg, s. c.). Doses adicionais de Carprofen são administradas diariamente durante uma semana.

[0068] Os macacos são sacrificados 8 dias depois da implantação da bomba osmótica. A sedação é primeiro induzida com quetamina, como mencionado acima, seguida por uma anestesia profunda obtida por injeção i. p. de uma dose letal de pentobarbital (90 mg/kg). Os animais são submetidos à perfusão de forma trans cardíaca com 0,4 litro de solução salina a 0,9% seguida por 4 litros de fixador (solução de paraformaldeído a 4% em 0,1 M de compensador de fosfato, pH = 7,6).

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A perfusão é continuada com 3 soluções de sacarose de concentração crescente (50% em fixador, 20 e 30% em compensador de fosfato). Procedimentos histológicos, imunofluorescência e histo- química.

[0069] Os cérebros e os cordões espinhais dos macacos são dissecados de forma cuidadosa, crioprotegidos em 30% de sacarose e secionados a 40 mm em um criostato. Para a detecção da mAbs infundida é usado um anticorpo secundário [0070] Anti-humano (Jackson Laboratories). Para uma dupla marcação, podem ser usados os seguintes anticorpos: o AS742 do coelho (purificado por afinidade) para a Nogo-A endógena (Chen, 2000); anticorpos de coelho contra GFAP para astrócitos e um anticorpo de coelho contra Catepsina D (DAKO) para a localização lisossômica. Todos os anti soros são visualizados por anticorpos secundários acoplados correspondendo a TRITC ou FITC, ou com a utilização de sistema ABC-DAB (Vector).

[0071] As secções são analisadas através de epifluorescencia em um microscópio Zeiss Axiophot ou confocal (ZEISS LSM 410).

[0072] Os cordões espinhais são analisados no sítio da infusão e 6 cm em direção à cauda com relação a ele. Níveis elevados de 3A6 estão presentes no local da infusão. No cordão espinhal mais caudal, o canal central e a superfície do cordão são fortemente marcados, enquanto que as matérias cinzenta e branca mostram uma marcação mais homogênea, que, no entanto está específica e claramente sobre o fundo. Uma situação similar está presente no cérebro anterior com uma marcação forte da superfície e dos ventrículos e boa penetração do anticorpo Nogo-A dentro do parênquima.

[0073] Esses experimentos mostram que a infusão intra tecal espinhal de anticorpos contra o antígeno de superfície de células CNS levam a uma boa distribuição do anticorpo através da circulação CSF nos espaços de líquido interiores (ventrículos e canal central) e

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28/52 exteriores. Os anticorpos IgG penetram bem no cérebro e no tecido do cordão espinhal. Enquanto que o IgG de controle é removido por lavagem rapidamente, o anticorpo contra a Nogo-A é retido no tecido.

4. Testes com relação ao reparo e aumento funcional de nervo em lesões espinhais em macacos.

[0074] A anestesia é introduzida através de injeção intramuscular de quetamina (Ketalar®; Parke-Davis, 5 mg/kg, i.m.). Atropina é injetada i. m. (0,05 mg/kg) para a redução da secreção brônquica. Um cateter intravenoso é colocado na via femoral para a perfusão contínua com uma mistura de propofol a 1% (Frescenius®) e solução de glicose a 4% (1 volume de Propofol e 2 volumes de solução de glicose) induzindo uma anestesia mais profunda. O animal é em seguida colocado em uma estrutura de trabalho estereotáxica. Sob condições estéreis, é realizada uma incisão vertical na linha do meio da pele a partir de C2 até Th1. O corte da fascia e os processos espinhais de C2 até Th1 são expostos. os músculos para vertebrais são retraídos e as lâminas de C6, C7 e Th1 são dissecadas. Uma laminectomia completa de C6 e uma hemilaminectomia da C7 superior são em seguida realizadas. Com a finalidade de suprir as moléculas em proximidade estreita à lesão, a ponta livre de um tubo de polietileno ligado à bomba é fixada sob a dura mater a alguns milímetros na direção do rostro com relação à lesão.

[0075] Testes de comportamento de destreza manual podem ser realizados de acordo com o procedimento publicado. A destreza manual é treinada através da colocação do macaco sentado em uma cadeia de primata em frente de um Brinkman board (10 cm x 20 cm) Perspex modificado, contendo 50 furos distribuídos de forma aleatória; 25 furos sendo orientados de modo horizontal e 25 de forma vertical {Liu, 1999 15428 /id; Rouiller, 1998 13239 /id}. 2.7. A regeneração e a germinação das fibras podem ser avaliadas como descrito. O traçado anterogrado injetado no hemisfério direito é Biotinylated Dextran Amine (BDA,

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Molecular Probe®, 10% em solução salina). No hemisfério esquerdo é injetado o traçador anterogrado Fluorescein Dextran (Molecular Probe®, 10% em solução salina). O processamento histológico para a visualização dos trançadores pode ser executado como descrito em detalhes anteriormente {Rouiller, 1994 8322 /id}.

[0076] Por essa razão a invenção também proporciona:

(i) o uso das moléculas de ligação da invenção no reparo de nervos de um sistema nervoso de um mamífero, especificamente do sistema nervoso humano, (ii) um método para o reparo de nervos de um sistema nervoso de um mamífero, especificamente de um sistema nervoso humano que compreende a administração de uma quantidade eficaz das moléculas de ligação da invenção a um paciente que esteja necessitando de tal tratamento, ou (iii) uma composição farmacêutica para o reparo de nervos de um sistema nervoso de um mamífero, especificamente de um sistema nervoso humano que compreende as moléculas de ligação da invenção e um veículo ou um diluente farmaceuticamente aceitável. [0077] De modo específico, as moléculas de ligação da invenção são úteis para a regeneração de axônios e uma germinação aumentada depois de lesões de fibras de nervos. Desse modo, as moléculas da invenção têm uma ampla utilidade especificamente para indivíduos humanos. Por exemplo as moléculas de ligação da invenção são úteis para o tratamento de diversas doenças do sistema nervoso periférico (PNS) ou do sistema nervoso central (CNS), isto é, mais especificamente em doenças neuro degenerativas tais como a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica (ALS), patologias do tipo de Lewy ou outras demências em geral, doenças que se seguem a trauma craniano, cerebral ou espinhal, derrame cerebral ou uma doença desmielinante. Essas doenças desmielinantes incluem,

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30/52 porém não estão limitadas à esclerose múltipla, desmielinação monofásica encefalomielite, leucoencefalopatia multifocal, panencefalite, doença de Marchiafava-Bignami, mielmolise pontina, adrenoleucodistrofia, doença de Pelizaeus-Merzbacher, degeneração de Spongy, doença de Alexander, doença de Canavan, leucodistrofia metacromática e doença de Krabbe. Em administração das moléculas de ligação da invenção pode ser usada para o tratamento de uma doença de desmielinação associada com uma proteína NogoA. Em um outro exemplo, as células que expressam as moléculas de ligação da invenção podem ser transplantadas para um sítio de lesão no cordão espinhal para facilitar o crescimento dos axônios através de todo o sítio lesionado. Essas células transplantadas poderão prover um meio para a restauração da função do cordão espinhal em seguida a uma lesão ou trauma. Essas células podem incluir células olfativas embainhadas e células tronco de linhagens diferentes de nervo fetal ou de enxerto de tecidos.

[0078] O efeito do bloqueio retardado a longo prazo sobre a recuperação funcional e a plasticidade neuro anatômica em ratos adultos depois de derrame cerebral foi o assunto de um resumo publicado por Shih-Yen Tsai, Anay Pradham, Josh Rosales, Anis K. Mir, Martin E. Schwab, Gwendolyn L. Kartje em 2004. O anticorpo Nogo-A antiamino purificado foi administrado através da utilização de bombas osmóticas a ratos adultos 8 semanas depois da oclusão da artéria mediana do cérebro (MCAO). A recuperação da função foi examinada com a utilização do teste de alcance habilitado da pata dianteira e o teste de andar por degraus de escada. Os resultados preliminares mostraram que mesmo quando tratando com bloqueio de Nogo-A antiamino dois meses depois do derrame cerebral, a recuperação da função melhorou [0079] Além disso, as Moléculas de Ligação da invenção são úteis

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31/52 para o tratamento de distúrbios oculares degenerativos que podem envolver diretamente ou indiretamente a degeneração das células da retina ou da córnea, incluindo as retinopatias isquêmicas em geral, neuropatia isquêmica ótica anterior, todas as formas de neurite ótica, degeneração macular relacionada com a idade, retinopatia diabética, edema cistóide macular (CME), retinite pigmentosa, doença de Stargardt, degeneração retínica viteliforme de Best,, amaurose congênita de Leber, e outras degenerações hereditárias da retina, miopia patológica, retinopatia ou pré-maturidade, e neuropatia ótica hereditária de Leber, os efeitos em seguida ao transplante de córnea ou cirurgia refrativa da córnea e queratite herpes.

[0080] Além disso, as moléculas de ligação da invenção são úteis para o tratamento de condições psiquiátricas, especificamente esquizofrenia e depressão.

[0081] Para essas indicações a dosagem apropriada irá variar por certo, dependendo, por exemplo, da molécula específica da invenção a ser empregada, o modo de administração e a natureza e a gravidade da condição que está sendo tratada. Em geral, a dosagem ficará, de preferência, na faixa de 1 mg/kg/dia até 1 mg/kg/ dia. As moléculas de Ligação da invenção são administradas de forma conveniente diretamente de forma intracraniana ao CNS ou dentro da espinha por via intra tecal ao local lesionado.

[0082] As Moléculas de Ligação da invenção podem ser providas de forma isolada, ou em combinação, ou em combinação seqüencial com outros agentes. Por exemplo, as moléculas de ligação da invenção podem ser administradas em combinação com agentes anti inflamatórios tais como, porém não-limitados a costicoesteróides, em seguida a derrame cerebral, ou lesão no cordão espinhal como um meio para o bloqueio de outros danos neurológicos e da inibição da regeneração dos axônios, fatores neurotróficos, tais como NGF e BDNF

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32/52 ou outras drogas para doenças neuro degenerativas, tais como Exelon® ou Levodopa. Outros de combinação adequados para o tratamento de derrame cerebral são Alteplase e Desmoteplase (DSPA, por exemplo descrito na WO90/09438). Em outra modalidade, a presente invenção proporciona uma combinação que compreende uma Molécula de Ligação da invenção e Desmoteplase, especificamente para o tratamento de derrame cerebral bem como composições farmacêuticas que compreendem essa combinação. Na forma usada neste relatório, dois agentes são referidos como sendo administrados em combinação, quando dois agentes são administrados de forma simultânea ou administrados de forma independente de uma forma tal que os agentes possam agir ao mesmo tempo.

[0083] A estrutura dos ingredientes ativos identificados por números de código, nomes genêricos ou comerciais pode ser tomada a partir da edição atual do compendio padrão The Merck Index ou a partir de base de dados, por exemplo, Patents International (por exemplo, IMS World Publications) ou de outras bases de dados providas pela IMS Health. O teor correspondente das mesmas fica incorporado a este relatório por referência. Qualquer pessoa versada na técnica é totalmente capaz de identificar os ingredientes ativos e, com base nessas referências, ser, da mesma forma capaz de fabricar e testar as indicações e propriedades farmacêuticas em modelos de teste padrão, tanto in vitro como in vivo. [0084] As composições farmacêuticas da invenção podem ser fabricadas de maneira convencional. Por exemplo, uma composição de acordo com a invenção que compreende as moléculas da invenção é provida, de preferência em forma liofilizada. para a administração imediata ela é dissolvida em um veículo aquoso adequado, por exemplo, água estéril para injeção ou solução fisiológica salina compensada. [0085] Para auxiliar na fabricação de composições adequadas, as moléculas de ligação da invenção e opcionalmente uma segunda droga

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33/52 que aumenta o efeito das Moléculas de Ligação da Invenção, podem ser embaladas separadamente no interior do mesmo recipiente, com instrução para a mistura ou a administração concomitante. Os candidatos a segunda droga opcional estão providos acima.

[0086] O efeito sinérgico de uma combinação das moléculas de ligação da invenção e fatores de crescimento tais como o NGF pode ser demonstrado in vivo através dos modelos de lesão do cordão espinhal. [0087] A invenção será mais totalmente entendida com referência aos exemplos que se seguem. Eles não devem, no entanto, ser considerados como limitando o âmbito da invenção.

[0088] Nos exemplos que se seguem todas as temperaturas são em graus Celsius (°C).

[0089] O anticorpo monoclônico de atenção nos exemplos é uma Molécula de Ligação de acordo com a presente invenção que compreende a parte variável da cadeia leve (SEQ ID NO: 3) e a parte variável da cadeia pesada (SEQ ID NO: 2).

[0090] São usadas as seguintes abreviaturas:

ELISA análise de enzima ligada imuno absorvente

FACS escolha de célula ativada por fluorescência

FITC isotiocianato de fluoresceína

FBS soro feral bovino

HCMV promotor do citomegalovírus humano

IgG isotipo G da imunoglobulina

MAb anticorpo monoclônico

PBS solução salina compensada com fosfato

PCR reação dm cadeia de polimerase

Exemplo 1: Métodos:

[0091] Geração de construtos de expressão de Nogo-A humano (pRK7-hNogo-A): Uma coleção de cDNA humano construída em lambda gt10 (Clontech) é submetida à triagem com conjuntos de filtro

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34/52 em duplicata com a utilização de procedimentos padrão. Fragmentos de Nogo-A humano são amplificados por PCR a partir de cDNA cerebral humano total (Clontech) com a utilização de um protocolo padrão e em seguida clonado em Bluescript, digerido e isolado, ou usado diretamente como sondas de triagem. Um fragmento XhoI/SmaI de 400 pb é usado como uma sonda 5', a sonda 3' amplificada com os iniciadores CA-NA-2F: 5'-AAG CAC CAT TGA ATT CTG CAG TTC C-3' (SEQ ID NO: 29) e CA-NA-3R: 5'-AAC TGC AGT ACT GAG CTC CTC CAT CTG C-3' (SEQ ID NO: 30). Os clones positivos são isolados, sub clonados e a seqüência é confirmada. Para ser obtido um cDNA NogoA humano de comprimento total, os clones que se sobrepõem são montados com a utilização de um único sítio de restrição EcoRI na seqüência do Nogo-A humano e sub clonado em um vetor Bluescript denominado de Pbsnogoa. Para ser obtido o pRK7-hNogo-A, o cDNA de comprimento total foi inserido dentro do vetor de expressão eucariótico pRK-7 através de clonagem direcional.

[0092] Geração de plasmídeos de expressão de NiG humano (hNiG) (pET28a-hNiG) para produção bacteriana: Um fragmento de DNA codificando hNiG é subclonado dentro de BamHI/XhoI de pET28a (Novagen), depois da amplificação por PCR da respectiva região de codificação a partir de Pbsnogoa, em estrutura com o terminal N His- e marcador T-7 para a expressão bacteriana, com a utilização de conjuntos de iniciadores: para frente 5'-GTC GCG GAT CCA TGG AGA CCC TTT TTG CTC TTC-3' (SEQ ID NO: 31); reverso 5'-GTT CTC GAG TTA TGA AGT TTT ACT CAG-3' (SEQ ID NO: 32). O plasmídeo final é denominado de pET28a-hNiG. O hNiG foi em seguida expresso em BL21 pRP de E.coli através de indução com 1 mM de Isopropil-beta-Dtiogalactopiranosídeo (IPGT).

[0093] Geração do plasmídeo de expressão do NiG-éxon3 (mNiGéxon3) do camundongo: A região que codifica o exonio 3 do

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35/52 camundongo 3 é amplificada a partir do gabarito do genoma do camundongo BAC com os iniciadores: para frente 5'-GTG CGG ATC CAT GGA TTT GAA GGA GCA GC-3' (SEQ ID NO: 33); reverso 5'-GTT TCT CGA GTG AAG TTT TAT TCA GCT C-3' (SEQ ID NO: 34) e sub clonado dentro dos sítios de clonagem BamHI/XhoI do pET28a. O construto de plasmídeo final é denominado de pET28a-mNiG-éxon3. [0094] Clonagem de NiG de macaco: O RNA PolyA é isolado a partir de tecido congelado de cérebro de macaco e o cDNA é sintetizado com a utilização de um iniciador oligo dT. Dois fragmentos sobrepostos cobrindo a região 5' e a região 3' dos cDNA são amplificados através de PCR com a utilização de iniciadores específicos para a enzima e enzima de leitura de prova. Os iniciadores são projetados com a utilização da seqüência conhecida do cDNA do NiG humano. Para a amplificação do fragmento 5', os iniciadores são 5'-TCCACCCCGGCCGCGCCCAA-3' (SEQ ID NO: 35) e 5'-AATGATGGGCAAAGCTGTGCTG-3' (SEQ ID NO: 36), para o fragmento 3', 5'-GGTACAAAGATTGCTTATGAAACA-3' (SEQ ID NO: 37) e 5'-AGCAGGGCCAAGGCAATGTAGG-3' (SEQ ID NO: 38). os dois fragmentos são em seguida sub clonados e para cada fragmento pelo menos 4 clones independentes foram seqüenciados. o cDNA de comprimento total é montado por PCR de sobreposição com a utilização dos iniciadores mencionados acima e o produto resultante é clonado e de novo seqüenciado.

[0095] Produção de proteínas recombinantes NogoNig como definidas acima: A coleção de cancelamento da Nogo-A bacteriana é expressa em Escherichia coli. As proteínas são extraídas tanto por sonicação repetida em solução compensadora de sonicação (20 mM de Tris, 50 mM de NaH2PO4, 100 mM de NaCl, pH 8.0) com 0,75 mg/ ml de Lisozima, pela solubilização com B-Per™ (Pierce) ou com 8 M de uréia. A NiG expressa com a líder peIB é obtida a partir do espaço periplásmico de acordo com o protocolo Novagen para a purificação da

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36/52 proteína periplásmica. Os sobrenadantes dos construtos pET28 são purificados com a utilização da Co²⁺-Talon™ Metal Affinity Resin (Clontech) em procedimento de batelada.8 M de uréia e lisados solubilizados B-Per™ são levados para condições de não desnaturação pela substituição crescente do compensador com o compensador de sonicação durante o procedimento de batelada de resina. As proteínas são decantadas com 250 mM de imidazol através de filtragem sobre gel em uma Superdex 200 HiLoad 16/60. Os sobrenadantes dos construtos de pGEX-6P são purificados com uma coluna de G-Sepharose em um procedimento de batelada de acordo com as indicações do fabricante (Amersham Pharmacia). A clivagem da GST-Nogo-66 é feita pela incubação da GST-Nogo-66 com protease PreScission e com purificação subseqüente por HPLC. A eletro decantação com gel é executada através de SDS-PAGR de preparação da Nogo recombinante purificada com IMAC com o BioRad Electro-Eluter dentro de 50 mM de Tris, pH 7,4, 100 mM de NaCl, 0.2% (p/v) CHAPS durante 1 hora a 250 mA e seguido por 30 segundos de polaridades de eletrodo revertidas. As concentrações de proteína das proteínas purificadas por cromatografia são determinadas com a utilização de Pierce Coomassie Stain e BSA como proteína padrão. A concentração das proteínas das proteínas decantadas com gel são calculadas com base na intensidade da faixa de géis manchados com prata (Merril CR, Dunau ML, Goldman D (1981). Um manchamento de prata sensível e rápido para polipeptídios em géis de poliacrilamida. Analyt.Biochem. 110:201-207) com BSA como um padrão.

Exemplo 2: Geração de 3A6-IgG mAb humana.

[0096] Camundongos Medarex (Reconstituídos de forma recombinante com genes da imunoglobulina humana) são imunizados por via subcutânea com NiG humano, que corresponde a uma seqüência específica no anticorpo monoclônico Nogo-A humano. O

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37/52 anticorpo monoclônico 3A6 foi gerado através de tecnologia padrão de hibridoma pela fusão de células do baço de camundongo com uma linha de célula de hibridoma. A imunização dos camundongos Medarex foi executada com NiG humana 70 ug por camundongo na parte posterior do pescoço e nos flancos s. c. concentração de 1,5 mg em 1,9 ml de V/V misturado com TiterMax Adjuvante. Injeção de 180 ml s. c. por camundongo e em seguida reforçada várias vezes.

[0097] A determinação das titulações de anti Nogo-A Ab no soro com ELISA foi executada em placas de 096 cavidades que foram revestidas com 8 ug/ml de NiG humana em PBS (100 ml por cavidade). Incubada 4 horas em temperatura ambiente (TA).As placas foram salpicadas e reenchidas com 200 ml por cavidade com compensador de bloqueio (PBS + 5% de BSA), cobertas e incubadas durante uma hora em temperatura ambiente e de um dia para o outro a 4 graus, em seguida lavadas 4 vezes com água de bica, reenchidas com PBS e salpicadas. O soro de camundongo foi diluído em PBS + 10% de FCS (100 ml por cavidade) e incubado durante duas horas em temperatura ambiente ou de um dia para o outro a 4 graus. As diluições do soro do camundongo usadas: 1:100,1:1000,1:10000, 1:30000. A etapa de lavagem foi repetida. O Ab conjugado F(ab')2 de cabra IgG anti humano específico Fc HRP foi diluído em PBS/0,1% de BSA /0.1% de Nonidet 40 (100 ml/ por cavidade) e incubado durante 2 horas temperatura ambiente e de um dia para o outro a 4 graus. A etapa de lavagem foi repetida. 100 ml por cavidade de substrato POD Blue BM foram adicionados e incubados no escuro em temperatura ambiente durante 15 minutos e 50 ml por cavidade de 1M H2SO4 foram adicionadas para parar a reação do substrato HPR. A O:D foi determinada com a utilização de um leitor de micro placas ajustado a 450 nm. A triagem dos hibridomas e dos clones com ELISA foi executada como descrito acima. O NiG humano (8 mg/ml, E,coli). Isotipagem do IgGcp, ELISA. Foram

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38/52 executados experimentos para a determinação das sub classes de IgG dos anticorpos. Placas foram revestidas com NiG humano e sobrenadantes de cultura foram usados em diluições de 1:10 até 1:100. A reatividade dos anticorpos foi avaliada através da utilização de um painel HRP de conjugados de mAbs de sub classes de IgG de camundongo anti humano (IgG1, IgG2,IgG3,IgG4) HRP por incubação durante 4 horas. O mAb anti-MCP1 IgG1 foi usado como um controle positivo.O ELISA foi realizado como descrito acima. A geração de hibridomas foi feita a partir de camundongos com as titulações de soro mais elevadas contra o NuG humano em ELISA e selecionados para fusão. O camundongo foi sacrificado por inalação de CO2. O baço foi tirado de forma asséptica e uma única suspensão de células foi feita. Lavada em PBS cálcio isento de magnésio. As células de mieloma de camundongo (PAIO) foram lavadas em PBS. Números iguais de células de baço de camundongo 50 milhões foram adicionadas com as células de mieloma de camundongo e giradas em temperatura ambiente durante 10 minutos. 900 RPM. O sobrenadante foi removido cuidadosamente e completamente. Adicionado gota a gota 1 ml de PEG 4000 como o agente de fusão (50:50 em PBS) sob agitação leve durante de 2 a 3 minutos em temperatura ambiente. Agitado de modo suave em banho de água a 37 graus durante 90 segundos. Adição gota a gota de 5 a 10 ml de meio RPMI 1640 durante 5 minutos, para a diluição do PEG deixar em temperatura ambiente durante 10 minutos. Adicionar outros 20 ml de meio isento de soro e centrifugar. Colocar de novo em suspensão em uma quantidade apropriada de meio HAT (RPMI+10%FCS+20ml/litro 50xHAT). As células fundidas foram colocadas em placas em 100 ml por cavidade em cavidades que continham uma camada de alimentação de células do peritônio de camundongos Balb/c (1 ml por cavidade). A preparação das células de peritônio de camundongo foi feita 24 horas mais cedo e 3 ml de culturas

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39/52 em meio Hat, foram preparada placas Costar de 24 cavidades. O rendimento a partir de um camundongo é suficiente para uma placa de 24 cavidades = aproximadamente 2000 células por cavidade.Em seguida ao sacrifício, a cavidade do peritônio é lavada com 5 ml de 0,34 M de sacarose, com a utilização de uma seringa de 10 ml e uma agulha de calibre 18. Grupos de 6 camundongos foram coletados dentro de um tubo, centrifugados, de novo suspensos em meio HAT e divididos dentro das cavidades. O meio de cultura foi RPMI 1640 com Glutamax, que continha 100 pM de hipoxantina, 1,6 pM Timidina, 0,4 pM de Aminoptrina, 50 pM beta-mercaptoetanol, 50 pg/ml de Gentamicina, 10% de FCS ativado com calor. 50% do meio foi trocado a cada 3° ou 4° dia dependendo da velocidade de crescimento e do aparecimento de hibridomas e depois de 14 dias o meio HAT foi trocado para o meio HT deixando de fora a Aminotripina. Triagem para hibridomas e da geração de clones. Os sobrenadantes foram testados quando as cavidades atingiram aproximadamente 80% de confluência em uma diluição de 1:3 em ELISA como descrito acima. A clonagem de células isoladas foi executada a partir de hibridomas que foram positivos com relação a Ab anti-Nogo por limitação da diluição. A clonagem foi executada pela limitação da diluição, colocando em placas 0,5 célula por 100 pl por cavidade foram usadas. As células PE de camundongo foram usadas para a camada de alimentação. O crescimento dos clones foi conferido através de microscopia, 100 pl de meio foram adicionados no dia anterior a realização da triagem. As taxas de crescimento dos hibridomas individuais variará, porém cerca de 10 dias são necessários para que as culturas fiquem densas, para produzir anticorpo suficiente. A triagem dos sobrenadantes foi feita em diluições de 1:10 até 1:100. A expansão da cultura de clones positivos foi executada e adaptada às condições de baixo soro 1% para a produção em frascos cilíndricos e a purificação foi feita a partir dos sobrenadantes de culturas com a

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40/52 utilização de afinidade a proteína A.

Exemplo 3: Produção e Purificação de mAb 3A6 e Fab 3A6 de camundongo:

[0098] Foi usada uma coluna Sepharose CI-4B de Proteína A (Pharmacia; 11 cm de altura do leito). Em resumo, o sobrenadante da cultura depois da correção do pH para 8,1 é carregado a 4 ml por minuto e a coluna é lavada até a linha de base a 8 ml por minuto com a utilização de 100 mM de Na2HPO4, pH 8.1. O material ligado é finalmente decantado a 8 ml por minuto com a utilização de 50 mM de NaH2PO4, pH 3.0, 140 mM de NaCl e neutralizado imediatamente (pH 7.0) com 5 N de NaOH e filtrado de forma estéril. A absorção é monitorada a 280 nm. Parte do material purificado é eventualmente mais concentrada através de ultra filtragem e/ ou dializada contra PBS. Todos os compensadores usados são filtrados em um dispositivo de fluxo tangencial de 10 kDa ULTRASETTE™ (Filtron Technology Corporation) com a finalidade da remoção de possíveis contaminações por endotoxinas. Pela mesma razão, a proteína A é extensamente lavada com 20% de etanol e todas as tubulações e bombas são tratados com 0,1 M de NaOH antes de serem usados. A concentração da proteína é medida de forma espectrométrica a 280 nm com a utilização de uma absorção de referência de 1,35 para 1 mg/ml. A pureza é avaliada de forma rotineira por SDS-PAGE sob condições de redução com a utilização de gradiente de 4 a 20% de géis Novex. O teor das endotoxinas é medido através da reação, clássica de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) de acordo com as instruções do fabricante (Endotell AG, Allschwil, Switzerland).

[0099] Geração de fragmentos Fab: Uma parte do mAb 3A6 de camundongo é dializada de forma extensa contra 10 mM de acetato de Na, pH 5,5, 6 mM de EDTA e ajustada para uma concentração de 8 mg por ml. Os fragmentos Fab são gerados pela digestão com papaína

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41/52 (proporção de 1:200 p/p) na presença de 0,25 mM de cisteína. A reação é deixada continuar durante 16 horas a 37° C e em seguida é parada através da adição do inibidor específico da papaína E64 (N-[N-(L-3trans-carboxirano- 2-carbonil)-L-leucil]-agmatina) em grande excesso (10 mM). O anticorpo digerido é em seguida passado sobre uma coluna Sepharose Fast Flow de proteína A com a finalidade da remoção de material intacto e fragmentos de Fc. A fração Fab é extensivamente dializada contra PBS e concentrada para cerca de 3 mg por ml. (A papaína e o E64 são da Roche Molecular Biochemicals).

Exemplo 4: HPLC, Espectrometria de Massa e seqüenciamento de amjnoácjdos da região Vl e Vh:

a) Redução e Alquilação: Anticorpos 3A6, purificados e secados são dissolvidos em 40 ml de 8 M de uréia, 0,4M de NH4HCO3, pH 8,3. 60 mg de DTT (Calbiochem), pre-dissolvido em 10 ml do mesmo compensador como o da proteína são adicionados. A redução é realizada a 50° C durante 30 minutos sob argônio (100 vezes de excesso molar de DTT sobre os tióis da proteína). Depois da redução, a amostra é resfriada para a temperatura ambiente. 304 mg de iodoacetamida (Sigma Ultra, I-1149) dissolvidos no mesmo compensador como o da proteína são adicionados. A carboxiamidometilação é executada em temperatura ambiente durante 15 minutos no escuro. É adicionado 1 ml de β-mercaptoetanol para extinguir a reação.

b) Isolamento das Cadeias Pesada e Leve: As cadeias pesada e leve do anticorpo carbóxiamidometilado são isoladas através de Cromatografia Líquida de Fase Reversa de Alta Pressão (RP-HPLC) em um sistema Hewlett 1090M HPLC com sistema de bombeamento DR5 e detector de UV de arranjo de diodo. As condições para a cromatografia são: coluna PerSeptive Biosystems Poros 2.1x100 mm carregada com material R1/H; fluxo é de 0,5 ml/ min; solventes: (A) 0.1%

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TFA em água e (B) 0,09% TFA / acetonitrila/ água 9:1; gradiente de 25 - 70% de B em 8 minutos a 80°C; detecção a 218 / 28 0 nm.

c) LC-ESI-MS: A espectrometria de massa é realizada com a utilização de um espectrômetro de massa de quatro pólos em tandem híbrido de tempo de vôo, Q-Tof (Micromass, Manchester, UK) equipado com uma fonte de ionização de eletropulverização Micromass tipo Z (ESI). A faixa de aquisição de massa é tipicamente de 500 a 2000 m/z. Os dados são registrados e processados com a utilização do software MassLynk. A calibração da escala de 500 a 2000 m/z é conseguida com a utilização dos picos de íon carregados de forma múltipla da mioglobina do coração de cavalo (MW 16851,5).

d) HPLC-MS das cadeias pesada e leve: A separação das cadeias pesada e leve reduzidas e carboxamidometiladas é realizada em um sistema HP1100 HPLC (Hewlett, Palo-Alto, CA, USA) empregando uma coluna LC Packings de 1mmx150mm carregada com o Perseptive Biosystems POROS R1/H. A coluna é mantida a 60°C. Volumes das amostras de 10 ul são injetados na coluna com a utilização de um auto-amostrador CTC PAL (CTC, Zwingen, Switzerland) equipado com uma válvula Valco modelo C6UW HPLC (Valco, Houston, TX, USA) e uma alça de injeção de 10 ml. A HPLC foi controlada pelo software MassLynx (Micomass, Manchester, UK). A detecção de UV é a 214 nm. O decantador A é água que contem 0,05% TFA. O decantador B é uma mistura a 1:9 de água : acetonitrila contendo 0,045% de TFA. Um gradiente a partir de 20% de B até 90% de B é mantido em 20 minutos a 80°C. A velocidade de fluxo é tipicamente de 60 ml por minuto. O fluxo total a partir do sistema LC é introduzido dentro da célula de detecção de UV, em seguida na fonte de ESI sem nenhuma divisão. O sistema de HPLC é controlado e o sinal a partir do detector de UV é processado com a utilização do software MassLynx (Micomass, Manchester, UK). Os cinco sinais que se seguem são detectados:

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TABELA 1:

Medida	Interpretação do sinal
A=50614,2 Da	Cadeia H com carboxamidometil - cisteína (CAMCys)
B= 5077645 Da	Sinal A + 162 Da (= a hexose)
C= 23727+8	Cadeia L com CAMCys)

d) Seqüenciamento dos aminoácidos do terminal N das regiões Vl e Vh: Os picos coletados das cadeias H + L da HPLC são usados para a análise das seqüências. As seqüências de aminoácidos são determinadas em um Hewlett G1000A N-terminal Protein Sequencing System. O sistema executa química Edman automatizada sobre amostras de proteína retidas em colunas bifásicas de adsorção em miniatura. Um método de química otimizado (casal duplo 3,0) é usado para o aumento da eficiência química, mininizar as falhas e com isso prolongar a análise de seqüência até cerca de 50 resíduos. A análise dos aminoácidos PTH é realizada em um Hewlett HP1090 HPLC System em linha equipado com um sistema de bomba ternário e uma coluna PTH de calibre estreito (2,1 mm X 25 cm).

RESULTADOS:

[00100] A partir da análise de massa são determinadas as cadeias homogêneas pesada e leve do 3A6-IgG1 de camundongo. A cadeia H é glicosilada de modo isolado. A análise da massa total das caldeias pesada e leve mostra uma única massa para ambas as cadeias. A cromatografia por HPLC do3A6-IgG1 de camundongo mostra um único pico. Depois da purificação por HPLC seguida pela redução e alquilação as cadeias pesada e leve puras ficam disponíveis. A degradação da seqüência do terminal N é realizada na cadeia leve e na cadeia pesada. Os aminoácidos da seqüência do terminal N da cadeia pesada (H) e da cadeia leve (L) são identificadas através da degradação da seqüência. Cadeia Leve:

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVS

Cadeia Pesada

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EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF

Exemplo 5: Clonagem dos genes de cadeia pesada e de cadeia leve do mAb 3A5 humano [00101] O RNA total é preparado a partir de 10⁷ células de hibridoma (clone 3A6) com a utilização do reagente TriPure (Roche diagnostics, Alemanha, Cat.# 1667157) de acordo com as instruções do fabricante. Para a síntese do cDNA, o mRNA é isolado a partir do RNA total preparado acima com a utilização da Oligotex Resin (Quiagen, Alemanha, Cat. # 70022).

[00102] O cDNA é gerado através de transcrição reversa, usando as seguintes condições: 2 pl mRNA, 2 pl 10 x compensador de transcrição reversa, 2 pl de iniciador (dT)20 (10 μΜ), 0,5 pl RNasin (Promega, 40 U/ml), 2 pl de dNTPs (5 mM cada), 1 pl transcriptase reversa Omniscript™ (Qiagen, Cat # 205110), 10.5 pl ddH2O, Reação:1 hora à 37^oC. Para amplificação por PCR do cDNA codificando para a Vh e Vl é usada a enzima de leitura de prova ProofStart^TM DNA polimerase.

[00103] PCR da cadeia leve e pesada: Mistura de reação: 2 pl cDNA, 5 pl 10 x compensador de reação, 3 pl dNTPs (5 mM cada), 2 pl de iniciador de 5' (10 pM) (ver Tabela 2), 2pl de iniciador de 3' (10 pM) (ver Tabela 2), 1 pl de ProofStart (Qiagen, Cat # 202203), 36 pl de ddH₂O. Condições de PCR: 95^oC / 5 minutos, (95^oC/40 segundos, 53^oC/1 minuto, 72^oC 1 minuto) x 35, 72^oC/ 10 minutos. Os produtos resultantes da PCR são ligados diretamente dentro de pCRbluntTOPO (Invitrogen). A mistura de ligação é transfectada para dentro de células TOP 10 (Invitrogen) e são colhidos diversos clones. As seqüências de nucleotídios da parte variável dos cDNA da cadeia pesada do mAb 3A6 (V-H, SEQ ID NO: 43) e da cadeia leve do 3A6 mAb (V-L, SEQ ID NO: 44) são determinados em um seqüenciador ABI. No total, 10 clones de cDNA da cadeia leve do mAb 3A6 a partir de dois experimentos independentes(RNA cDNA ^RT-PCR) foram seqüenciados e

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45/52 alinhados. A seqüência de aminoácido subseqüente de V-H e de V-L estão mostrados nas SEQ ID NO: 2 (V-H) e SEQ ID NO: 3 (V-L). Os iniciadores usados para a amplificação por PCR dos cDNA de Vh and Vl; todos os iniciadores são sintetizados pela MWG Biotech, Alemanha. TABELA 2:

Iniciador	Seqüência	SEQ ID NO:
5'-Vl líder	gctatggccATCGAAGCCCCAGCTCAG	39
3'-Ck	ttaggaattcCTAACACTCTCCCCTGTTGAAG	40
5'-Vh lider	aatgtcgaccATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGG	41
3'-Ch ligação	ttagTTATGGGCACGGTGGGCATGTGTGAG	42

Clonagem dos vetores de expressão do IgG4:

Clonagem molecular da região Vh.

[00104] O cDNA de Vh é amplificado por PCR a partir do plasmídeo recombinante pCRII com a utilização dos iniciadores #1 e # 2.O fragmento de PCR resultante é cortado com BstEII e sub clonado dentro do sítio HincII/BstEII do HCcassAAL gerando a classe nogo do plasmídeo intermediário. Através da utilização do iniciador IgG4HC5' é conseguida uma troca de aminoácidos (glutamina no ligar do ácido aspártico) na cadeia pesada líder na posição -2. A seqüência correta é verificada através de seqüenciamento automatizado e o fragmento VH cDNA é liberado pela digestão com XbaI/ BamHI. A ligação dentro de hcMCPfin digerido com BamHI/XbaI resultou no construto de expressão final AnogoHC3A6.

Clonagem molecular da região Vl.

[00105] O cDNA da Vl é amplificado por PCR a partir do plasmídeo recombinante pCRII com a utilização dos iniciadores # 3 e # 4. introduzindo, por esse motivo um sitio Mlul e HindIII. Através da introdução do sítio de restrição HindIII uma troca de aminoácido (R®K) na região de junção tem lugar. Isso resulta na mudança da região de junção do tipo J5 para uma região do tipo J2. O fragmento de PCR

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46/52 resultante é sub clonado dentro de pCRIl-blunt e a seqüência é verificada. O fragmento correto é liberado através de digestão com MluI/HindIII e ligado ao vetor de expressão LCvec-AAL160 criando, por essa razão o plasmídeo final AnogoLC3A6.

Iniciador #	Descrição	Seqüência	SEQ ID NO:
1	IgG4HC5'	CAGGCAGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG
2	IgG4HC3'	aaaTTGGTGGAGGCTGAGGAGACG
3	IgG4LC5'	aaaaacgcgttgtGAAATTGTGTTGACACAGTCT
4	IgG4LC3'	aaaaaagcttTGTCCCTTGGCCGAAGGTGATC

Caracterização do mAb 36A humano.

Exemplo 6: Ligação de 36A e de Fab a Nogo-A humana com a utilização de ELISA.

[00106] Pratos Greiner PS de 96 cavidades (# 655161) são revestidos com, de 0,4 a 2 ug /ml de fragmentos de proteína Nogo em PBS (100 ul por cavidade) cobertos e incubados durante 4 horas em temperatura ambiente. Os pratos são salpicados e reenchidos com 200 ml por cavidade com compensador de bloqueio (PBS + 2% BSA),cobertos e incubados. 1 hora em temperatura ambiente ou de um dia para o outro a 4° C, em seguida lavados 3 vezes com água e uma vez com PBS. Concentrações diferentes de 3A6 IgG1 humano, mam IgG ou 3A6 Fab são diluídas em PBS + 2% de BSA (100 ul por cavidade) e incubadas durante 2 horas em temperatura ambiente ou de um dia para o outro a 4° C. A etapa de lavagem é repetida e IgG de cabra anti humano conjugado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) em uma diluição de 1:5000 (Jackson Immuno Research #109-036-098) ou HRP anti-humano de burro em uma diluição de 1:5000 (Jackson Immuno Research 709-035-149) para 3A6Fab em PBS/ 0,1% BSA /0,1% Nonidet 40 (100 ml/por cavidade) é adicionado e incubado. Duas horas em temperatura ambiente ou de um dia para o outro a 4° C, e a etapa de lavagem é repetida. A reação de HRP é iniciada através da adição

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47/52 de 100 μΙ por cavidade de M=BM Blue POD(Roche #1484281) e incubado no escuro durante 15 minutos. 50 ml por cavidade de 1M H2SO4 foram adicionados para parar a reação do substrato HPR e a densidade ótica é determinada com a utilização de um leitor de microprato (Packard Spectra Count) ajustado para 450 nm.

RESULTADOS:

[00107] Os 3A6 IgG1 humano, mAbs IgG ou 3A6 Fab se ligam a NiG humana em concentrações muito baixas sobre uma faixa de 0,01 a 10 nM.

Exemplo 7: Medições de afinidade de biossensor com relação aos 3A6-IgG1,3A6-IgG4 e 3A6 Fab de camundongo aos domínios NogoA.

[00108] A afinidade dos mAb 3A6-IgG1, mAb3A6-IgG4 e do 3A6 Fab são medidas por ressonância de superfície de plasmônio (SPR) com a utilização de um biossensor ótico BIAcore 000 (Biacorem Uppsala, Suécia) de acordo com as instruções do fabricante. A NiG humana recombinante é imobilizada de forma covalente sobre um fluxo de células de um chip sensor CM5 com a utilização da química de acoplamento de amina. Em resumo; a matriz de dextrano carboximetilada é ativada pela injeção de 5 ml de uma solução que contém 0,05 M NHS e 0,1 M de EDC. Para a imobilização do chip do sensor a NiG humana recombinante é diluída em 0,01 M de compensador de citrato em pH 4 e injetada em uma velocidade de fluxo de 5 ml por minuto para serem alcançados níveis de acoplamento que permitam a medição de afinidade. A desativação do grupo de éster de NHS restante é executada através da injeção de 5 ml de 1M cloridrato de etanolamina (pH 8,5). A superfície do chip sensor é regenerada pela injeção de 5 ul de 0,1 M de HCl. Para a medição da afinidade os anticorpos são injetados em concentrações diferentes, que variam a partir de 0,05 nM até 100 nM em uma velocidade de fluxo de 100 ml por

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48/52 minuto. Depois de cada injeção a superfície do chip sensor é regenerada com a injeção de 10 ml de 1M HCl sem a perda da atividade de ligação sobre a superfície. As constantes cinéticas ka e kd e as constantes de afinidade KA e KD são avaliadas com a utilização do software BIAevaluations 3.0 suprido pelo fabricante.

[00109] Medição de afinidade em BIAcore: Aa constantes cinéticas e de afinidade de ligação dos mAb 3A6-IgG1, mAb3A6-IgG4 e do fragmento monovalente do Fab derivado do 3A6 do camundongo com relação a NogoA humana recombinante são medidos em tempo real com a utilização de tecnologia de ressonância de superfície de plasmônio (SPR) (Biacore). Para essa análise a NiG humana recombinante é acoplada sobre a superficie de um chip sensor e são injetadas concentrações diferentes dos anticorpos. Os parâmetros cinéticos das interações de ligação são derivados a partir de sensogramas através de ajuste de curva não linear. As constantes de afinidade de equilíbrio para a NiG humana com relação aos anticorpos ficaram na faixa dos Kd 0,14 nM até 2,7 nM para 3A6-IgG4, 3A6-IgG1, 3A6 Fab.

Exemplo 8: Identificação do epítopo de mAb A6 com a Análise Pepspot.

[00110] A membrana Pepspot é adquirida da Jerini Peptide Technologies, Berlin, Alemanha. Antes da primeira incubação a membrana é enxaguada com etanol durante um minuto e três vezes com TBS durante 10 minutos. Antes de cada incubação com o primeiro anticorpo a membrana é incubada em compensador de bloqueio de um dia para o outro a 4° C. Depois de lavagem durante 10 minutos com TBS-T a membrana é incubada com o primeiro anticorpo em compensador de bloqueio durante horas em temperatura ambiente. As concentrações do anticorpo são c(A6) - 0,6 nM. Depois de três lavagens com TBS-T durante 10 minutos a membrana é incubada durante duas

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49/52 horas em temperatura ambiente com o segundo anticorpo correspondente marcado com HRP (Fab IgG de cabra anti humano da Jackson Immuno Research) em diluição de 1:500.000 em compensador de bloqueio. Depois de três lavagens com TBS-T a membrana é incubada com o reagente de detecção de luminescência química (ECL Advance, Amersham Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante e exposta a filme.

Análise por Western Blot de proteínas Nogo-A humana e de macaco.

[00111] A análise por Western Blot é executada de acordo com métodos padrão. 10 ng de NiG humana purificada a partir de E.coli são aplicados a cada faixa, SDS-PAGE é executado e transferido para a membrana de nitrocelulose. O bloqueio é a 4° C em compensador de bloqueio de um dia para o outro. Depois da incubação do anticorpo (1 nM em 0,5% de compensador de bloqueio) o epítopo do peptídio NiG humano HNQQELPTALTKLVKED, peptídio misturado HETQLAKLPVDLKTQE: Jerini Peptide Technologies, Berlin, Alemanha) durante 1 hora em temperatura ambiente, a membrana é adicionada a esta solução e incubada durante uma hora em temperatura ambiente dm um agitador. Depois de três lavagens com TBS-T durante 10 minutos a membrana é incubada durante uma hora em temperatura ambiente com o segundo anticorpo correspondente marcado co HRP (Fab2 IgG de cabra anti humano da Jackson Immuno Research) em uma diluição de 1:100.000 em compensador de bloqueio. Depois de três lavagens com o reagente de detecção de luminescência química (ECL Advance, Amersham Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante e exposto em filme durante 15 segundos.

[00112] A análise de Western blot com relação ao NiG cinomólogo é executada de acordo com os métodos padrão. Alíquotas de lisados de E.coli de células NiG pET8 de macaco que expressam a NiG quando da

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50/52 indução dom IPTH são aplicadas a cada faixa. Como o controle negativo os lisados de células das mesmas células sem a indução de expressão são carregados. DSD_PAGE é realizada e transferida para membrana de celulose. O bloqueio é a 4° C em compensador de bloqueio de um dia para o outro. Depois da incubação do anticorpo (1 nM em 0,5% de compensador de bloqueio Roche Applied Science) com o peptídio (10, 100 e 100 vezes o excesso molar de peptídio, seqüência NQQELPIALTKLVKEED, Jerini Peptide Technologies) durante 1 hora em temperatura ambiente a membrana é adicionada a essa solução e incubada durante mais uma hora em temperatura ambiente em um agitador. Depois de três lavagens com TBS-T durante 10 minutos a membrana é incubada durante uma hora em temperatura ambiente com um anticorpo secundário anti-humano marcado com HPR em uma diluição de 1:100.000 em compensador de bloqueio. Depois de três lavagens com TBS-T a membrana é incubada com o reagente de detecção de luminescência química (ECL Advance, Amersham Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante e exposto em filme durante 15 segundos.

Ligação do mAb 3A6 a epitopos de peptídio humano e de macaco em ELISA.

[00113] Pratos Greiner PS de 96 cavidades (# 655161) são revestidos com 8 mg/ml de peptídio misturado H-ETQLAKLPVDLKTQE, epítopo do peptídio humano NiG 3A6IgG4 H-NQQELPTALTKLVKED e epítopo do peptídio NiG 3A6 IgG4 de macaco, HNQQELPIALTKLVKEED em PBS (100μ]/ por cavidade) foram cobertos e incubados durante 4 horas em temperatura ambiente. Os pratos são salpicados e reenchidos com 200 ml por cavidade com compensador de bloqueio (PBS + 2% BSA), cobertos e incubados durante 1 hora em temperatura ambiente ou de um dia para o outro a 4° centígrados, em seguida lavados 4 vezes com água da bica, reenchidos com PBD e

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51/52 salpicados. O mAb 3A6IgG4 é diluído em PBS + 2% BSA (100 μΙ por cavidade) e incubado durante duas horas em temperatura ambiente ou de um dia para o outro a 4 graus. As diluições do mAb: 10 nM até 0,001 nM. A etapa de lavagem é repetida. O segundo Ab é diluído em PBS/0,1% BSA /0,1% Nonidet 40 (100 ml/ por cavidade) e incubado durante duas horas em temperatura ambiente ou de um dia para o outro a 4 graus. A etapa de lavagem é repetida, 100 ml por cavidade de substrato POD Blue BM foram adicionados e incubados no escuro em temperatura ambiente durante 15 minutos e 50 ml por cavidade de 1M H2SO4 foram adicionados para parar a reação do substrato HPR. A O:D foi determinada com a utilização de um leitor de micro placa ajustado a 450 nm.

RESULTADOS:

[00114] Mapeamento do epítopo de mAb 3A6 humano: O mapeamento do epítopo resultou em uma seqüência ELPTALTKLV na proteína NiG humana.

Competição de ligação de mAb 3A6 à NiG humana em western blot com peptídio sintético:

[00115] Para a confirmação dos resultados obtidos através da técnica pepspot é realizado um experimento de competição em western blot. Um 16-mero sintético que contém a seqüência putativa do epítopo (NQQELPIALTKLVKEED) é usada para competir com a NiG humana de comprimento total com relação à ligação ao anticorpo 3A6. Antes da incubação com a NiG humana ligada à membrana o anticorpo 36A (1 nM) é incubado durante uma hora com o peptídio sintético com a utilização de proporções molares diferentes de peptídio para anticorpo. Um excesso molar de 10 vezes de peptídio exibe uma redução significativa no sinal detectado para a NiG humana (produzida em E. coli). Um excesso de 100 vezes resulta em uma redução adicional do sinal e um excesso molar de 1000 vezes do peptídio inibe quase

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52/52 completamente a ligação do 3A6 com a NiG humana. Em contraste um excesso de 1000 vezes de um peptídio com o mesmo teor de aminoácido, porém com uma seqüência diferente (misturada) não tem nenhum efeito sobre a ligação do anticorpo a NiG humana.

Ligação do mAb 3A6 a NiG do macaco: competição com o epítopo do peptídio sintético.

[00116] Um 17-mero sintético que contém a seqüência do epítopo (NQQELPIALTKLVKEED) é usado para competir com a NiG cimóloga do macaco de comprimento total expressa em E.coli com relação a ligação do anticorpo 3A6. Antes da incubação com a NiG de macaco ligada a membrana o anticorpo 3A6 (1 nM) é incubado durante uma hora com o peptídio sintético com a utilização de proporções molares diferentes de peptídio para anticorpo. Um excesso molar de 100 vezes resulta em uma redução do sinal, e um excesso molar de 1000 vezes do peptídio inibe de forma substancial a ligação do 3A6 a NiG do macaco. Em contraste, um excesso de 1000 vezes de um peptídio com o mesmo teor de aminoácido, porem com uma seqüência diferente (misturada) não tem nenhum efeito sobre a ligação do anticorpo a NiG humana.

Ligação de 3A6 IgG4 ao epítopo do peptídio NiG humano e do macaco em ELISA.

[00117] São executadas análises detalhadas de ligação do mAb ao epítopo e a seqüência misturada com a utilização de ELISA. Os resultados mostram de forma clara que o mAb se liga de uma maneira dependente de concentração a concentrações muito baixas (0,001 a 1,0 mM) aos epítopos do peptídio do macaco e humano, que pode ser comparado com o se KF em BIAcore para a Nig humana de 0,14 nM. Além disso a ligação é específica sem ligação ao peptídio de controle misturado.

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região varável da cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 2 e uma região variável da cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 3.
2. 2. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a parte constante ou o fragmento da mesma da cadeia humana pesada é do tipo y4 e a parte constante ou o fragmento da mesma da cadeia humana leve é do tipo k.
3. 3. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo monoclonal humano, quimérico ou humanizado.
4. 4. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 44.
5. 5. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo como definido na reivindicações 4.
6. 6. Sistema de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo, como definido na reivindicação 4, em que o referido sistema de expressão ou parte do mesmo é capaz de produzir um polipeptídio como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, quando o referido sistema de expressão ou parte do mesmo esteja presente em uma célula hospedeira compatível.
7. 7. Uso de anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é como um produto farmacêutico.
8. 8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o farmacêutico é para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de reparo de nervos.

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9. 9. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, em associação com pelo menos um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.