CN1918180A - 用于治疗神经科疾病的nogo－a中和免疫球蛋白 - Google Patents

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CN1918180A CN 200480041952 CN200480041952A CN1918180A CN 1918180 A CN1918180 A CN 1918180A CN 200480041952 CN200480041952 CN 200480041952 CN 200480041952 A CN200480041952 A CN 200480041952A CN 1918180 A CN1918180 A CN 1918180A
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A·埃翁－迪瓦尔
R·I·格伦迪
F·胡赛因
R·麦卡丹
C·普卢姆普顿
R·K·普林哈
P·A·威尔逊
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Abstract

本发明涉及抗NOGO抗体、含有抗NOGO抗体的药物制剂及所述抗体在治疗和/或预防神经科疾病中的应 用。

Description

用于治疗神经科疾病的NOGO-A中和免疫球蛋白 免疫球蛋白
发明领域
本发明涉及免疫球蛋白、特别是与NOGO结合并中和其活性的抗体，涉及编码所述抗体的多核苷酸，涉及含有所述抗体的药物制剂以及所述抗体在治疗和/或预防神经科疾病中的用途。根据以下描述，本发明的其它方面、目的和优势将会是显而易见的。
发明背景
中风在西方世界是主要的死亡和致残原因。除了组织血纤蛋白溶解酶原(t-PA)用于治疗中风之外，尚无其它获得批准的疗法；组织血纤蛋白溶解酶原可以在发作3小时内根据计算机断层(CT)扫描来给予，以消除出血。迄今为止，大多数针对急性中风治疗(即神经保护)的治疗剂主要涉及靶向谷氨酸受体及其已知参与急性细胞死亡的下游信号传导途径。然而，迄今为止，在临床试验中已经证明这些策略是不成功的，它们经常与剂量局限性(dose-limiting)副作用有关(Hill& Hachinski，The Lancet，352：(增刊III)10-14(1998))。因此，需要针对在血流中断后改善细胞死亡的新方法。神经保护是响应损伤或疾病过程而预防或改善神经元细胞损失的治疗能力。可以通过防止由胶质细胞(包括少突胶质细胞)损失而直接或间接靶向神经元，从而达到这一目的。
在中风发作后，在许多患者中观察到某种程度的自发性功能恢复，这表明脑部具有修复和/或重构其后损害的能力(尽管是有限的)。因此，能潜在加强这类恢复的药物，使人们可以在大脑缺血发作很久以后(潜伏天数)进行干预。能够提供急性神经保护并加强功能恢复的药物，比起目前可能的神经保护策略来说，可提供显著的优势。
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)(AD)的特征是存在两个病理学诊断特征。它们是淀粉状蛋白斑块和神经原纤维缠结，其分别由聚集的β-淀粉状肽(Aβ40和Aβ42)和过度磷酸化tau蛋白组成(Dawbarn& Allen 2001 Neurobiology of Alzheimer’s disease OUP)。
一项综合研究表明，患者体内β-淀粉状蛋白的积累与认知减退之间有着密切关系(Naslund等，JAMA，March 22/29，2000，第283卷，第12期，第1571-1577页)。这与遗传学和流行病学研究是一致的，表明APP基因和早老蛋白基因中的某些突变，倾向于早期发作AD，这些突变也提高了Aβ40肽和Aβ42肽的水平，包括其比率。
两种不同蛋白酶(称为α-分泌酶和γ-分泌酶)切割I型跨膜淀粉状蛋白前体蛋白(APP)，这对形成β-淀粉状肽来说是必要的。已经证实了β-分泌酶与天冬氨酰-蛋白酶Asp2/BACE1的分子结构(Hussain等Mol.Cell.NeuroSci.16，609-619(2000)；Vassar等，Science(1999)，Oct.22；286(5440)：735-741)。γ-分泌酶的特性仍然存在一些争议，可能是由至少以下蛋白质所组成的高分子量复合体组成：早老蛋白、Aph1、Pen2和呆蛋白(有关综述参见Medina & Dotti Cell Signalling 2003 15(9)：829-41)。
APP在CNS内的加工可能发生在包括神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞在内的各种细胞类型中。同时在这些细胞中APP的总加工率受到以下蛋白表达的相对水平的影响：APP、BACE1/Asp2、早老蛋白-1、早老蛋白-2、Aph1、Pen2和呆蛋白。
此外，调节APP亚细胞定位的额外因素也可影响其加工，正如以下发现所示：阻断其胞吞作用的APP胞质结构域中YENP基序突变能降低β-淀粉状蛋白的产生(Perez等1999J Biol Chem 274(27)18851-6)。通过加入KKQN保留基序而保留ER中APP-β-CTF，足以降低转染细胞中淀粉状蛋白的产生(Maltese等2001 J Biol Chem 276(23)20267-20279)。相反，通过Rab5的过量表达而提高胞吞作用，足以提高转染细胞分泌淀粉状蛋白(Grbovic等2003 J Biol Chem 278(33)31261-31268)。
与这些发现一致，其它研究也显示，细胞胆固醇水平(众所周知是AD的危险因子)的降低能减少β-淀粉状蛋白的形成。该变化取决于胞吞作用的变化，正如通过使用显性失活发动蛋白突变体(K44A)和Rab5 GTP酶激活蛋白RN-Tre的过量表达所证明的一样(Ehehalt等2003 J Cell Biol 160(1)113-123)。
富含胆固醇的微域或膜阀(raft)也是β-淀粉状蛋白产生的重要细胞位点，而且APP、BACE1和γ-分泌酶复合物的组分也都显示出瞬时驻留在膜阀内。APP和BACE1与富含胆固醇的膜阀通过抗体交联，能够提高β-淀粉状蛋白的产生(Ehehalt等2003 J Cell Biol 160(1)113-123)。GPI-锚定BACE1的表达(其专一性靶向脂质膜阀)，同样也能提高APP裂解和β-淀粉状蛋白的产生(Cordy等2003 PNAS 100(20)11735-11740)。
功能恢复的基本机制目前尚不清楚。认为受损或未受损轴突的萌生(sprouting)是一个可能的机制。然而，尽管体内研究表明，用神经营养因子治疗脊髓损伤或中风，结果能增强功能恢复和某种程度的轴突萌生，但是这些并不能证明某种程度的轴突萌生与功能恢复程度之间的直接关系(Jakeman等，1998，Exp.Neurol.154：170-184，Kawamata等，1997，Proc Natl Acad.Sci.USA.，94：8179-8184，Ribotta等2000，J Neurosci.20：5144-5152)。此外，轴突萌生需要有活的神经元。因此，在例如中风等涉及大量细胞死亡的疾病中，通过在中风后给予药物而增强功能恢复，是通过例如内源干细胞分化、冗余途径的激活、受体分布的变化或者神经元或神经胶质兴奋性的变化等机制进行的，而不是通过轴突萌生机制来进行的(Fawcett & Asher，1999，Brain Res.Bulletin，49：377-391，Horner & Gage，2000，Nature 407963-970)。
人们认为，中枢神经系统(CNS)修复以下损伤的有限能力部分是因为CNS环境内存在着对轴突萌生(神经突增生)具有抑制效果的分子。认为CNS髓鞘质含有抑制分子(Schwab ME和Caroni P(1988)J.Neurosci.8，2381-2193)。已经克隆了两种髓鞘蛋白，即髓鞘相关糖蛋白(MAG)和NOGO，并确定为推定的神经突增生抑制剂(Sato S.等(1989)Biochem.Biophys.Res.Comm.163，1473-1480；McKerracher L等(1994)，Neuron 13，805-811；Mukhopadhyay G等(1994)，Neuron 13，757-767；Torigoe K和Lundborg G(1997)Exp.Neurology 150，254-262；Schafer等(1996)Neuron 16，1107-1113；WO 9522344；WO 9701352；Prinjha R等(2000)Nature 403，383-384；Chen MS等(2000)Nature 403，434-439；GrandPre T等(2000)Nature 403，439-444；US005250414A；WO 200005364A1；WO 0031235)。
已经鉴定出人NOGO的三种形式：NOGO-A，具有1192个氨基酸残基(GenBank检索号AJ251383)；NOGO-B，在推定胞外结构域中缺失残基186-1004的剪接变异体(GenBank检索号AJ251384)；NOGO-C，一种较短的剪接变异体，它也缺失残基186-1004并且也具有更小的可变氨基端结构域(GenBank检索号AJ251385)(Prinjha等(2000)，出处同上)。
对CNS抑制蛋白(例如NOGO)的抑制，可提供治疗方法，以改善神经元损伤并促进神经元修复和生长，因而潜在地有助于从神经元损伤(例如在中风中所经受的神经元损伤)中恢复过来。所述NOGO抑制剂的实例可包括小分子、肽和抗体。
抗体通常包括通过二硫键连接在一起的两条重链以及两条轻链。每条轻链通过二硫键连接各自的重链。每条重链在一端具有可变区，接着是若干恒定区。每条轻链在一端具有可变区，而在另一端具有恒定区。轻链可变区与重链可变区相对排列。轻链恒定区与重链第一恒定区相对排列。轻链恒定区和重链恒定区不直接参与抗体与抗原的结合。
每对轻链和重链的可变区构成抗原结合位点。轻链可变区和重链可变区具有相同的通用结构，并且每个可变区都包含4个构架区，其序列相对保守，通过3个互补决定区(CDR)连接，互补决定区通常称为超变区。4个构架区大部分是β-折叠构象，CDR构成环状连接，在某些情况下构成部分β-折叠结构。CDR紧靠构架区，与来自其它结构域的CDR，形成抗原结合位点。抗体的CDR和构架区可通过以下参考文献来确定：Kabat等(″Sequences of Proteins of immunologicalinterest″US Dept.of Health and Human Services，US GovernmentPrinting Office，1987)。
已经发现，描述于以下文献(Poltorak等(1987)Journal of CellBiology 105，1893-1899，DeBellard等(1996)Mol.Cell.Neurosci.7，89-101；Tang等(1997)Mol.Cell.Neurosci.9，333-346；Torigoe K和Lundborg G(1997)Exp.Neurology 150，254-262)的市售(MAB1567(Chemicon))的抗MAG单克隆抗体，当直接给予局灶性脑缺血的大鼠(一种中风模型)的脑部或经静脉内给药时，能提供神经保护并增强功能恢复(PCT/EP03/08749)。
因此，抗MAG抗体对于急性神经保护以及在中风后促进功能恢复，提供了潜在治疗剂。该抗体是鼠抗体。尽管鼠抗体通常用作诊断试剂，但是作为治疗药的用途，仅在少数几个病例中得到证明。这些有限的应用，部分是因为将鼠单克隆抗体重复给予人体，通常会引发人体针对这些分子的免疫应答。为了克服鼠抗体的这些不想要的固有特性，已经开发出设计掺入人抗体的“改变的”抗体，这在本领域已经了解清楚。例如，人源化抗体含有非人类来源的互补决定区(“CDR”)，而其余的大部分结构都来源于人抗体。
已经报道，针对NI-220/250(一种髓鞘蛋白，是神经突生长的有效抑制剂(示于以下的NOGO-A片段))产生的鼠单克隆抗体IN-1，能促进轴突再生(Caroni，P和Schwab，ME(1988)Neuron 185-96；Schnell，L和Schwab，ME(1990)Nature 343 269-272；Bregman，BS等(1995)Nature 378 498-501和Thallmair，M等(1998)Nature Neuroscience 1124-131)。也已报道，NOGO-A是IN-1的抗原(Chen等(2000)Nature 403434-439)。将IN-1 Fab片段或人源化IN-1给予经历脊髓横切的大鼠，能增强恢复(Fiedler，M等(2002)Protein Eng 15 931-941；Brosamle，C等(2000)J.Neuroscience 20 8061-8068)。然而，迄今为止，文献中并无证据表明IN-1或其人源化形式能与人NOGO-A结合并抑制它，而这正是单克隆抗体用于治疗性治疗人的NOGO介导疾病和障碍(例如中风和神经变性性疾病)所必须的条件。
因此，分离和开发能与人NOGO结合并抑制其活性的治疗用单克隆抗体，一直是非常希望达到的目标。神经变性过程是包括但不限于以下许多神经科疾病/障碍的基础，所述疾病/障碍例如中风(缺血性或出血性)、创伤性脑损伤和脊髓损伤等急性病；以及阿尔茨海默病、额颞痴呆(fronto-temporal dementias)((tau蛋白病(tauopathies))、周围神经病、帕金森病(Parkinson’s disease)、传染性海绵样脑病(Creutzfeldt-Jakob disease，CJD)、精神分裂症、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、多发性硬化、亨廷顿舞蹈病(Huntington’s disease)、多发性硬化和包含体肌炎(inclusion body myositis)等慢性病。
因此，抗NOGO单克隆抗体可用于治疗这些疾病/障碍。本发明提供用于治疗上述疾病/障碍的所述抗体，详细描述如下。
本说明书中公开的所有出版物，无论是期刊还是专利，全都通过引用结合到本文中。
发明概述
本发明提供一种抗体或其功能片段，所述抗体或其片段与NOGO、优选人NOGO、更优选人NOGO-A结合并中和其活性(在本文中有时称为“抗NOGO抗体”)。所述抗体可包括例如示于表1-6的一个或多个CDR，其显示出以下3个独立分离的抗体的CDR：2A10/3、2C4/1和15C3/3。CDR按照以下文献所述来鉴定：Kabat(Kabat等(1991)″Sequences of proteins of immunological interest″；第5版；USDepartment of Health and Human Services；NIH publication No 91-3242)。CDR优选根据Kabat的定义，但是也遵循Chothia和Lesk所定义的蛋白质结构和折叠原理(Chothia等，(1989)″Conformations ofimmunoglobulin hypervariable regions″；Nature 342，第877-883页)，可以理解，额外残基也可考虑作为抗原结合区的组成部分，并且因此也包括在本发明之内。
表1：抗体2A10/3(″2A10″)轻链CDR
  CDR   根据Kabat
  L1   RSSKSLLYKDGKTYLN(SEQ ID NO：1)
  L2   LMSTRAS(SEQ ID NO：2)
  L3   QQLVEYPLT(SEQ ID NO：3)
表2：抗体2A10/3重链CDR
  CDR   根据Kabat
  H1   SYWMH(SEQ ID NO：4)
  H2   NINPSNGGTNYNEKFKS(SEQ ID NO：5)
  H3   GQGY(SEQ ID NO：6)
表3：抗体2C4/1(″2C4″)轻链CDR
  CDR   根据Kabat
  L1   RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO：7)
  L2   KVSNRFS(SEQ ID NO：8)
  L3   SQSTHVPLT(SEQ ID NO：9)
表4：抗体2C4/1重链CDR
  CDR   根据Kabat
  H1   FSCYAMS(SEQ ID NO：10)
  H2   SISDGGSYTYYPDNVKG(SEQ ID NO：11)
  H3   ELLFDY(SEQ ID NO：12)
表5：抗体15C3/3(″15C3″)轻链CDR
  CDR   根据Kabat
  L1   RSSKSLLHSNGNTYLY(SEQ ID NO：13)
  L2   RMSNLAS(SEQ ID NO：14)
  L3   MQHLEYPLT(SEQ ID NO：15)
表6：抗体15C3/3重链CDR
  CDR   根据Kabat
  H1   SYWMN(SEQ ID NO：16)
  H2   QIYPGDGDTNYNGKFKG(SEQ ID NO：17)
  H3   RFDY(SEQ ID.NO：18)
第一方面，本发明提供：
(a)抗体或其功能片段，所述抗体或其片段与NOGO、尤其是人NOGO、更尤其是人NOGO-A结合并中和其活性，所述抗体或其功能片段包括含表2中各CDR的重链可变区和含有表1中各CDR的轻链可变区。
(b)抗体或其功能片段，所述抗体或其片段与NOGO、尤其是人NOGO、更尤其是人NOGO-A结合并中和其活性，所述抗体或其功能片段包括含表4中各CDR的重链可变区和含有表3中各CDR的轻链可变区。
(c)抗体或其功能片段，所述抗体或其功能片段包括含选自表6的各CDR的重链可变区和含有表5中各CDR的轻链可变区。
我们进一步提供抗NOGO抗体或其功能片段，所述抗体或其功能片段包含：
a)重链可变区(VH)，其包含来自表2的序列CDRH1、CDRH2和CDRH3，
和/或
b)轻链可变区(VL)，其包含来自表1的序列CDRL1、CDRL2和CDRL3；
抗NOGO抗体或其功能片段，其包含：
a)重链可变区(VH)，其包含来自表4的序列CDRH1、CDRH2和CDRH3，
和/或
b)轻链可变区(VL)，其包含来自表3的序列CDRL1、CDRL2和CDRL3；或
抗NOGO抗体或其功能片段，其包含：
a)重链可变区(VH)，其包含来自表6的序列CDRH1、CDRH2和CDRH3，
和/或
c)轻链可变区(VL)，其包含来自表5的序列CDRL1、CDRL2和CDRL3。
抗体可以是嵌合抗体、完全人抗体或人源化抗体。
另一方面，本发明也涉及抗NOGO抗体，所述抗体与NOGO多肽上相同(或重叠)表位结合，因为抗体具有上述重链可变区和轻链可变区。优选表位包含在586-785区之内(NOGO-A氨基酸编号，Genbank检索号AJ251383)，更优选表位包含在586-685或686-785区内。竞争性抑制测定用于对抗原上的表位作图。因此，也提供抗NOGO抗体，所述抗体与人NOGO-A在氨基酸586-685或686-785之间结合并中和NOGO-A的活性。这样的抗体可按照以下提出的方法来产生。在再一方面，也提供抗NOGO抗体，所述抗体竞争性抑制具有以上文献所述CDR的抗体与NOGO、优选人NOGO、最优选人NOGO-A的结合。
更准确地讲，提供完全人抗体、人源化抗体或嵌合抗体，所述抗体与NOGO、尤其是人NOGO、更尤其是人NOGO-A结合并中和其活性，所述抗体在等摩尔浓度下竞争性抑制抗体(其具有含有表2中各CDR的重链可变区以及含有表1中各CDR的轻链可变区)与人NOGO-A结合。
在另一个实施方案中，提供完全人抗体、人源化抗体或嵌合抗体，所述抗体与NOGO、尤其是人NOGO、更尤其是人NOGO-A结合并中和其活性，所述抗体竞争性抑制抗体(其具有含有表4中各CDR的重链可变区以及含有表3中各CDR的轻链可变区)与人NOGO-A结合。
在另一个实施方案中，提供完全人抗体、人源化抗体或嵌合抗体，所述抗体与NOGO、尤其是人NOGO、更尤其是人NOGO-A结合并中和其活性，所述抗体竞争性抑制抗体(其具有含有表6中各CDR的重链可变区以及含有表5中各CDR的轻链可变区)与人NOGO-A结合。
在典型实施方案中，竞争性抗体属于IgG类，更典型的是IgG1或IgG4。
嵌合抗体
也提供嵌合抗体，所述抗体与NOGO、优选人NOGO、更优选人NOGO-A结合并中和其活性，所述抗体包含例如表1-6中公开的那些CDR。优选嵌合抗体包含小鼠序列和人序列(例如小鼠可变区和人恒定区)。而且还提供嵌合抗体，所述抗体包括含表2中各CDR的重链可变区以及含有表1中各CDR的轻链可变区。
也提供嵌合抗体，所述抗体包括含表4中各CDR的重链可变区以及含有表3中各CDR的轻链可变区。
也提供嵌合抗体，所述抗体包括含表6中各CDR的重链可变区以及含有表5中各CDR的轻链可变区。
在典型实施方案中，竞争性抗体属于IgG类，更典型的是IgG1或IgG4，具有κ型人轻链。
人源化抗体
此外，本发明也提供人源化抗体，所述抗体与NOGO、优选人NOGO、更优选人NOGO-A结合并中和它们。
更准确地讲，提供人源化抗体，所述抗体包括含表2中各CDR的重链可变区以及含有表1中各CDR的轻链可变区。
也提供人源化抗体，所述抗体包括含表4中各CDR的重链可变区以及含有表3中各CDR的轻链可变区。
也提供人源化抗体，所述抗体包括含表6中各CDR的重链可变区以及含有表5中各CDR的轻链可变区。
在典型实施方案中，本发明的抗体，无论是嵌合抗体、人源化抗体还是完全人抗体，都属于IgG类，更典型的是人IgG1或IgG4，具有κ型人轻链。
本发明的另一方面提供药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗NOGO抗体或其功能片段以及药学上可接受的稀释剂或载体。
又一方面，本发明提供治疗或预防人的中风(尤其是局部缺血性中风)和其它神经科疾病、尤其是阿尔茨海默病的方法，所述方法包括给予有需要的人有效量的本发明抗NOGO抗体或其功能片段。
另一方面，本发明提供本发明抗NOGO抗体或其功能片段在制备用于治疗或预防中风(尤其是局部缺血性中风)和其它神经科疾病、尤其是阿尔茨海默病的药物中的用途。
再一方面，本发明提供抑制病人的神经变性和/或促进功能恢复的方法，所述方法包括给予有需要的病人有效量的本发明抗NOGO抗体或其功能片段；所述病人患有中风(尤其是局部缺血性中风)和其它神经科疾病、尤其是阿尔茨海默病，或者处于发生所述疾病的危险之中。
另一方面，本发明提供本发明抗NOGO抗体或其功能片段在制备用于抑制病人的神经变性和/或促进功能恢复的药物中的用途；所述病人患有中风和其它神经科疾病、尤其是阿尔茨海默病，或者处于发生所述疾病的危险之中。
又一方面，我们提供抗体或其功能片段，所述抗体或其片段包括含一个或多个选自表1的CDRH1、CDRH2和CDRH3的CDR的重链可变区，优选至少包含CDRH3，和/或含有一个或多个选自表4的CDRL1、CDRL2和CDRL3的CDR的轻链可变区；提供抗体或其功能片段，所述抗体或其片段包括含一个或多个选自表2的CDRH1、CDRH2和CDRH3的CDR的重链可变区，优选至少包含CDRH3，和/或含有一个或多个选自表5的CDRL1、CDRL2和CDRL3的CDR的轻链可变区；或者提供抗体或其功能片段，所述抗体或其片段包括含一个或多个选自表3的CDRH1、CDRH2和CDRH3的CDR的重链可变区，优选至少包含CDRH3，和/或含有一个或多个选自表6的CDRL1、CDRL2和CDRL3的CDR的轻链可变区。
本发明的其它方面和优势在发明详述及其优选的实施方案中进一步介绍。
附图简述
图1显示GST-NOGO-A56融合蛋白对神经突增生的抑制效果。Y轴表示平均神经突长度/神经突(NL/N)，以任意单位表示。
图2显示杂交瘤2A10上清液对NOGO-A56(GST-Nogo5和6)的神经突增生抑制活性的阻断效果。Y轴与图1所述相同。
图3显示杂交瘤2C4上清液对NOGO-A56(GST-Nogo5和6)的神经突增生抑制活性的阻断效果。Y轴与图1所述相同。
图4显示杂交瘤15C3上清液对NOGO-A56(GST-Nogo5和6)的神经突增生抑制活性的阻断效果。Y轴与图1所述相同。
图5是没有NOGO-A56阻断活性的对照杂交瘤上清液12G3。Y轴与图1所述相同。
图6显示4个浓度的纯化2A10的NOGO-A56-阻断效果。Y轴与图1所述相同。
图7显示重组IN-1单克隆抗体对NOGO-A56(GST-NOGO5和6)没有显示出任何阻断活性。Y轴与图1所述相同。
对于图1-图7，阴性对照是单独的GST蛋白。
图8显示2A10、2C4和15C3单克隆抗体与人NOGO-A56的结合。Y轴表示在450nm处测定的OD，是对各孔中所捕获抗体的定量测定。X轴表示每个数据点所用抗体的浓度(ng/ml)/孔。
图9显示在实施例10研究后，在不同浓度下，损害体积占脑总体积的百分比。
图10显示实施例10的神经病学评分数据，用平均值±SEM表示。
图11A、图11B、图11C、图11D：实施例10的圆筒(Cylinder)数据用平均值±SEM表示，对于A)两脚爪，B)左脚爪，C)右脚爪和D)右脚爪，将其分成接受3个剂量的15μg抗NOGO抗体的大鼠，以及接受4个剂量的抗NOGO抗体的大鼠。
图12显示实施例10的前肢失足(forelimb foot slips)，用平均值±95％置信区间表示。
图13显示实施例10的后肢失足(hindlimb foot slips)，用平均值±95％置信区间表示。
图14A)显示体重，用平均值±SEM表示。在24小时、1周和在3周至研究结束的每个时间点给予动物15μg抗体，引起体重增加。
图14B)曲线显示15μg剂量组的体重，所述剂量组分为接受3次给药的动物和接受4次给药的动物。数据用平均值±95％置信区间表示。*P＜0.05，重复测定ANOVA。
图14C)曲线显示15μg剂量组的体重，所述剂量组分为接受3次给药的动物和接受4次给药的动物。将接受5μg抗NOGO抗体的动物与接受对照抗体的动物进行比较。数据用平均值±95％置信区间表示。*P＜0.05，重复测定ANOVA。
图15表示实施例11的损害体积占脑总体积的百分比。
图16显示神经病学评分数据，以实施例11的平均值±SEM表示。
图17A、17B和17C。圆筒数据用平均值±SEM表示，对于实施例11的A)两脚爪，B)左脚爪，C)右脚爪。
图18显示前肢失足，以实施例11的楔形梁实验(tapered beam test)的平均值±SEM表示。
图19显示后肢失足，以实施例11的平均值±SEM表示。
图20显示后肢失足，用平均值±SEM表示(通过楔形梁实验的潜伏期)。
图21：NOGO A转染引起SHSY5Y-APPwt细胞中Aβ40肽水平的升高。
图22：NOGO A转染引起SHSY5Y-APPwt细胞中Aβ42肽水平的升高。
图23：NOGO A表达对Aβ40肽水平的影响。
图24：NOGO A表达对Aβ42肽水平的影响。
图25：NOGO A、NOGO-B和NOGO-C表达对Aβ40和Aβ42的影响。
图26.抗NOGO A抗体2A10-BR抑制由SHSY5Y-APPwt细胞分泌Aβ。
图27.对照IgG1对由SHSY5Y-APPwt细胞分泌Aβ的影响。
图28.对照IgG1对由SHSY5Y-APPswe细胞分泌Aβ的影响。
图29.对照抗NOGO(非功能性阻断)抗体6D5对由SHSY5Y-APPwt细胞分泌Aβ的影响。
图30.对照抗NOGO(非功能性阻断)抗体6D5对由SHSY5Y-APPswe细胞分泌Aβ的影响。
图31功能性阻断抗NOGO A单克隆抗体2A10抑制由SHSY5Y-APP wt细胞分泌Aβ。
图32.功能性阻断抗NOGO A单克隆抗体2A10抑制由SHSY5Y-APPswe细胞分泌Aβ。
图33.功能性阻断抗NOGO A单克隆抗体2C4抑制由SHSY5Y-APP wt细胞分泌Aβ。
图34.抗NOGO A静置培养抗体制剂和额外的对照抗体对由SHSY5Y-APPwt细胞分泌Aβ的影响。2A10、2C4和15C3都是静置培养抗体。所有其它抗体都是BR(Bioreactor)纯化对照或市售对照。
图35A至图35C显示在ELISA测定中，与嵌合(HcLc)相比，人源化抗体H1L11与人NOGO-A56的剂量依赖性结合。Y轴表示在490nm处测定的光密度(OD)，是对各孔中所捕获抗体的定量测定。X轴表示在每个数据点所用抗体的浓度(μg/ml)/孔。
图36.NogoA表达增加，能以剂量依赖方式提高Aβ水平。曲线的Y轴是Aβ40增加的％。X轴表示myc-标记的NogoA cDNA的增加浓度。曲线上方是凝胶，表明通过使用抗NogoA抗体的蛋白质印迹显示出NogoA蛋白表达的增加量。
发明详述
本发明的抗体通常是单克隆抗体(mAb)，并且优选为嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体或重构(reshaped)抗体。其中特别优选人源化抗体和完全人抗体。
本发明的抗体通常具有天然抗体或其功能片段的结构。因此，所述抗体可包括全长抗体、(Fab)2片段、Fab片段、轻链二聚体或重链二聚体。抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；或IgM；IgA、IgE或IgD或其修饰变异体。由此可选择抗体重链恒定区。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。此外，抗体可包括所有类别的修饰物，例如IgG二聚体、不再结合Fc受体或介导Clq结合的Fc突变体。抗体也可以是WO 86/01533所述类型的嵌合抗体，所述抗体包含抗原结合区和非免疫球蛋白区。抗原结合区是抗体轻链可变区或重链可变区。通常抗原结合区包含轻链可变区和重链可变区。非免疫球蛋白区在其C端与抗原结合区融合。非免疫球蛋白区通常是非免疫球蛋白，并且可以是具有已知结合特异性的酶、毒素或者蛋白质。这类嵌合抗体的两个区可以通过可切割接头序列连接在一起。具有下文所述的CDR的免疫粘附素也包括在本发明之内。
恒定区按照所需功能性来选择。通常，IgG1通过与补体结合而表现出溶解能力和/或介导ADCC(抗体依赖性细胞毒性)。优选IgG4，如果需要非细胞毒性阻断抗体的话。然而，IgG4抗体在产生上表现出不稳定性，因此更优选修饰通常更稳定的IgG1。建议的修饰描述于EP0307434，优选修饰包括在235位和237位的修饰。因此本发明提供溶解型或非溶解型的本发明抗体。
因此，在优选形式中，本发明抗体是全长(即H2L2四聚体)非溶解IgG1抗体，其具有上文所述的CDR。在最优选的形式中，我们提供全长非溶解IgG1抗体，其具有SEQ ID NO 1-6的CDR；SEQ ID NO7-12的CDR或SEQ ID NO 13-18的CDR。
又一方面，本发明提供编码CDR的多核苷酸。例如，本发明提供编码如表1-6所公开的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3的多核苷酸。优选的多核苷酸序列见下表7-12。
表7：抗体2A10/3轻链CDR
 CDR
 L1   AGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAAT(SEQ ID NO：19)
 L2   TTGATGTCCACCCGTGCATCA(SEQ ID NO：20)
 L3   CAACAACTTGTAGAGTATCCGCTCACG(SEQ IDNO：21)
表8：抗体2A10/3重链CDR
  CDR
  H1   AGCTACTGGATGCAC(SEQ ID NO：22)
  H2   AATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGC(SEQ ID NO：23)
  H3   GGACAGGGCTAC(SEQ ID NO：24)
表9：抗体2C4/1轻链CDR
  CDR
  L1   AGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACAT(SEQ ID NO：25)
  L2   AAAGTTTCCAACCGATTTTCT(SEQ ID NO：26)
  L3   TCTCAGAGTACACATGTTCCGCTCACG(SEQ ID NO：27)
表10：抗体2C4/1重链CDR
  CDR
  H1   TTCAGTTGCTATGCCATGTCT(SEQ ID NO：28)
  H2   TCCATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTATCCAGACAATGTAAAGGGC(SEQ ID NO：29)
  H3   GAACTACTTTTTGACTAC(SEQ ID NO：30)
表11：抗体15C3/3轻链CDR
  CDR
  L1   AGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTGTAT(SEQ ID NO：31)
  L2   CGGATGTCCAACCTTGCCTCA(SEQ ID NO：32)
  L3   ATGCAACATCTAGAATATCCGCTCACG(SEQ IDNO：33)
表12：抗体15C/3重链CDR
  CDR
  H1   AGCTACTGGATGAAC(SEQ ID NO：34)
  H2   CAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAACGGAAAGTTCAAGGGC(SEQ ID NO：35)
  H3   CGCTTTGACTAT(SEQ ID NO：36)
在本发明的又一方面，提供编码抗NOGO抗体轻链可变区的多核苷酸，所述可变区包含至少一个选自表1、3、5中的CDRL1、CDRL2和CDRL3的CDR，更优选包含表1中所有3个CDR或表3中所有3个CDR或表5中所有3个CDR。
在本发明的又一方面，提供编码抗NOGO抗体重链可变区的多核苷酸，所述可变区包含至少一个选自CDRH1、CDRH2和CDRH3的CDR，更优选包含表2中所有3个CDR或表4中所有3个CDR或表6中所有3个CDR。
本发明还提供抗NOGO抗体或其功能片段，所述抗体或其片段与NOGO、优选人NOGO、更优选人NOGO-A结合并中和其活性，所述抗体或其片段包括含以下氨基酸序列之一的重链可变区：
QVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSNGGTNY
NEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCELGQGYWGQGTTLTVSS
(SEQ ID NO：37)；或
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSCYAMSWVRQTPEKRLEWVASISDGGSYTYY
PDNVKGRFTISRDNAKNLYLQMSHLKSEDTAMYYCAKELLFDYWGQGTTLTVSS
(SEQ ID NO：38)；或
QVQLQQSGAELVKPGASVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGKGLEWIGQIYPGDGDTNY
NGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAVRFDYWGQGTTLTVSS
(SEQ ID NO：39).
本发明还提供抗NOGO抗体或其功能片段，所述抗体或其片段与NOGO结合并中和NOGO，所述抗体或其片段包括含以下氨基酸序列之一的轻链可变区：
DIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRA
SGVSDRFSGSGSGTDFTLEISRVKAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGAGTKLELK
(SEQ ID NO：40)
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRF
SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKLELK
(SEQ ID NO：41).
DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLA
SGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPLTFGAGTKLELK
(SEQ ID NO.42)。
在本发明的另一方面，提供抗NOGO抗体或其功能片段，所述抗体或其片段与NOGO、优选人NOGO、更优选人NOGO-A结合并中和其活性，所述抗体或其片段包含：
a)SEQ ID NO：37的重链可变区以及包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的轻链可变区；或
b)SEQ ID NO：38的重链可变区以及包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的轻链可变区；或
c)SEQ ID NO：39的重链可变区以及包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的轻链可变区。
在本发明的又一方面，提供抗NOGO抗体或其功能片段，所述抗体或其片段包含：
重链可变区片段，所述片段包含人重链SEQ ID NO：37及其恒定区部分或其片段和
轻链可变区片段，所述片段包含人轻链SEQ ID NO：40及其恒定区或其片段；
或
重链可变区片段，所述片段包含人重链SEQ ID NO：38及其恒定区部分或其片段；和
轻链可变区片段，所述片段包含人轻链SEQ ID NO：41及其恒定区或其片段
或
重链可变区片段，所述片段包含人重链SEQ ID NO：39及其恒定区部分或其片段；和
轻链可变区片段，所述片段包含人轻链SEQ ID NO：42及其恒定区或其片段。
又一方面，本发明提供编码重链可变区和轻链可变区的多核苷酸，所述重链可变区包含SEQ ID NO 37-39的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO 40-42的氨基酸序列。
编码SEQ ID NO：37的氨基酸序列的优选多核苷酸序列是：
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGACTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTG
TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGG
CCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTAC
AATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTAC
ATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGAACTGGGACAG
GGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
(SEQ ID NO：43)
编码SEQ ID NO：38的氨基酸序列的优选多核苷酸序列是：
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTC
CCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTTGCTATGCCA
TGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCC
ATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTATCCAGACAATGTAAAGGGCCG
ATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTACCTGCAAATGA
GCCATCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAAGGAACTA
CTTTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
(SEQ ID NO：44)
编码SEQ ID NO：39的氨基酸序列的优选多核苷酸序列是：
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTC
AGTGAAGATTTCCTGCAAAGCTTCTGGCTACGCATTCAGTAGCTACTGGA
TGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGAAAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAG
ATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAACGGAAAGTTCAAGGGCAA
GGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCA
GCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAGTACGCTTT
GACTATTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
(SEQ ID NO：45)
编码SEQ ID NO：40的氨基酸序列的优选多核苷酸序列是：
GATATTGTGATAACCCAGGATGAACTCTCCAATCCTGTCACTTCTGGAGA
ATCAGTTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATG
GGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTGCAGAGACCAGGACAATCTCCTCAG
CTCCTGATCTATTTGATGTCCACCCGTGCATCAGGAGTCTCAGACCGGTT
TAGTGGCAGTGGGTCAGGAACAGATTTCACCCTGGAAATCAGTAGAGTGA
AGGCTGAGGATGTGGGTGTGTATTACTGTCAACAACTTGTAGAGTATCCG
CTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
(SEQ ID NO：46)
编码SEQ ID NO：41的氨基酸序列的优选多核苷酸序列是：
GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGA
TCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATG
GAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAG
CTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTT
CAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGG
AGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAGAGTACACATGTTCCG
CTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
(SEQ ID NO：47)
编码SEQ ID NO：42的氨基酸序列的优选多核苷酸序列是：
GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGA
GTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATG
GCAACACTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAG
CTCCTGATATATCGGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTT
CAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGG
AGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAACATCTAGAATATCCG
CTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
(SEQ ID NO：48)
抗NOGO抗体2A10包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：37，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：40。
抗NOGO抗体2C4包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：38，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：41。
抗NOGO抗体15C3包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：39，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：42。
“NOGO”是指任何NOGO多肽，包括变异形式。NOGO包括但不限于NOGO-A，具有1192个氨基酸残基(GenBank检索号AJ251383)；NOGO-B，在推定胞外结构域中缺失了残基186-1004的剪接变异体(GenBank检索号AJ251384)；NOGO-C，一种较短的剪接变异体，也缺失了残基186-1004并且还具有更小的可变氨基端结构域(GenBank检索号AJ251385)(Prinjha等(2000)，出处同上)。除非指明具体形式，否则在本文中所有有关的“NOGO”都理解为包括NOGO的任何和全部变异形式，例如NOGO-A和所述剪接变异体。
“中和”是指全部或部分抑制NOGO功能，包括与神经元的结合和对神经突生长的抑制。
“改变的抗体”是指由改变的免疫球蛋白编码区所编码的蛋白质，所述抗体可通过在所选宿主细胞中表达而得到。所述改变的抗体包括工程抗体(例如嵌合抗体、重构抗体、人源化抗体或载体抗体(vectored antibody)或抗体片段，所述抗体或其片段缺失全部或部分免疫球蛋白恒定区，例如Fv、Fab或F(ab)2等。
“改变的免疫球蛋白编码区”是指编码改变的抗体的核酸序列。当改变的抗体是CDR移植抗体或人源化抗体时，将编码来自非人免疫球蛋白的互补决定区(CDR)的序列插入到包含人可变区构架序列的第一免疫球蛋白配偶体中。任选第一免疫球蛋白配偶体与第二免疫球蛋白配偶体有效连接。
“第一免疫球蛋白配偶体”是指编码人构架区或人免疫球蛋白可变区的核酸序列，其中天然(或天然存在)的CDR-编码区被供体抗体的CDR-编码区取代。人可变区可以是免疫球蛋白重链、轻链(或两者)、类似物或其功能片段。位于抗体(免疫球蛋白)可变区内的所述CDR区可以按照本领域已知方法来确定。例如Kabat等(Sequencesof Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S.Department of Healthand Human Services，National Institutes of Health(1987))公开了用于定位CDR的法则。另外，已知计算机程序可用于鉴定CDR区/结构。
“第二免疫球蛋白配偶体”是指编码蛋白质或肽的另一核苷酸序列，所述序列与第一免疫球蛋白配偶体符合读框地融合，或者通过任选常规接头序列的方式融合(即有效连接)。优选它是免疫球蛋白基因。第二免疫球蛋白配偶体可包含编码来自同一来源的目标抗体(即同源——第一和第二改变的抗体的来源相同)或额外的目标抗体(即异源)的完整恒定区的核酸序列。它可以是免疫球蛋白重链或轻链(或两者都作为单条多肽的组成部分)。第二免疫球蛋白配偶体并不限于特定免疫球蛋白类别或同种型。另外，第二免疫球蛋白配偶体可包含部分免疫球蛋白恒定区，例如在Fab或F(ab)2中发现的部分(即合适人恒定区或构架区的不连续部分)。所述第二免疫球蛋白配偶体也可包含编码暴露在宿主细胞外表面的膜内在蛋白的序列，例如作为噬菌体展示文库部分，或者包含编码用于分析或诊断检测的蛋白质的序列，所述蛋白质例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶等。
术语Fv、Fc、Fd、Fab或F(ab)2按照其标准含义来使用(参见例如Harlow等，Antibodies A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，(1988))。
本文所用的“工程抗体”描述的是一类经改变的抗体，即全长合成抗体(例如嵌合抗体、重构抗体或人源化抗体，相对于抗体片段来说)，其中所选受体抗体的轻链和/或重链可变区部分被来自一个或多个供体抗体的类似部分取代，所述供体抗体对所选表位具有特异性。例如，这样的分子可包含以人源化重链以及未修饰轻链(或嵌合轻链)为特征的抗体，或者反之亦然。工程抗体也可以以核酸序列的改变为特征，所述核酸序列编码受体抗体轻链和/或重链可变区构架区，以便保持供体抗体的结合特异性。这些抗体可包含一个或多个受体抗体的CDR(优选全部)被来自本文所述的供体抗体的CDR取代。
“嵌合抗体”是指一类工程抗体，其含有来自供体抗体的天然存在的可变区(轻链和重链)以及来自受体抗体的轻链恒定区和重链恒定区。
“人源化抗体”是指一类工程抗体，具有来自非人供体免疫球蛋白的CDR，其余部分来自一种(或多种)人免疫球蛋白分子的免疫球蛋白来源部分。另外，构架支持残基可以改变，以保留结合亲和力(参见例如Queen等，Proc.Natl Acad Sci USA，86：10029-10032(1989)，Hodgson等，Bio/Technology，9：421(1991))。可以根据与供体抗体核苷酸序列和氨基酸序列的同源性，从诸如KABAT数据库、Los Alamos数据库和瑞士蛋白质数据库等常规数据库中，筛选出合适的人受体抗体。以与供体抗体构架区的同源性(在氨基酸基础上)为特征的人抗体适合提供重链恒定区和/或重链可变区构架区，用于插入供体CDR。可以按类似方式，选择能够提供轻链恒定区或可变区构架区的合适的受体抗体。应当注意的是，受体抗体重链和轻链不一定要来自相同的受体抗体。现有技术介绍了产生这样的人源化抗体的若干方法，参见例如EP-A-0239400和EP-A-054951。
“重构人抗体”是指改变的抗体，其中最少有至少一个来自第一人单克隆供体抗体的CDR被第二人受体抗体的CDR取代。优选所有6个CDR都被取代。更优选来自第一人供体单克隆抗体的全部抗原结合区(例如Fv、Fab或F(ab′)2)被来自第二人受体单克隆抗体的相应区取代。更优选来自第一人供体的Fab区与第二人受体抗体的合适恒定区有效连接，构成全长单克隆抗体。
“载体抗体”是指已与药物相连接以改善跨越血脑屏障(BBB)转运的抗体。(有关综述参见Pardridge；Advanced Drug Delivery Review36，299-321，1999)。这样的连接可以是化学连接，或者所述部分可以经工程改造而与抗体连接。一个实例是制备带有针对脑毛细血管内皮细胞受体的抗体，例如抗胰岛素受体抗体或抗转铁蛋白受体抗体的嵌合体(Saito等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92 10227-31；Pardridge等(1995)Pharm.Res.12 807-816；Broadwell等(1996)Exp.Neurol.142 47-65；Bickel等(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90，2618-2622；Friden等(1996)J.Pharm.Exp.Ther.278 1491-1498，US5182107，US5154924，US5833988，US5527527)。一旦与受体结合，双特异性抗体的两部分通过胞转过程跨越BBB。或者所述药物可以是与所述细胞表面受体结合的配体，所述受体例如胰岛素、转铁蛋白或低密度脂蛋白(Descamps等(1996)Am.J.Physio.270 H1149-H1158；Duffy等(1987)Brain Res.420 32-38；Dehouck等(1997)J.Cell Biol.1997，877-889)。也可使用已知能改善跨越BBB转运的天然存在的肽，例如penetratin和SynB1和Syn B3(Rouselle等(2000)Mol.Pharm.57，679-686和Rouselle等(2001)Journal of Pharmacology and ExperimentalTherapeutics 296，124-131)。
术语“供体抗体”是指这样的抗体(单克隆抗体和/或重组抗体)：所述抗体将其可变区、CDR或其它功能片段或其类似物的氨基酸序列提供给第一免疫球蛋白配偶体，从而得到改变的免疫球蛋白编码区，结果表达的改变抗体具有供体抗体的抗原特异性和中和活性。
术语“受体抗体”是指与供体抗体异源的抗体(单克隆抗体和/或重组抗体)，所述供体抗体将编码其重链构架区和/或轻链构架区和/或其重链恒定区和/或轻链恒定区的所有(或任何部分，但优选所有)氨基酸序列提供给第一免疫球蛋白配偶体。优选人抗体是受体抗体。
“CDR”定义为抗体的互补决定区氨基酸序列，其是免疫球蛋白重链和轻链的超变区。参见例如Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and HumanServices，National Institutes of Health(1987)。免疫球蛋白可变部分中有3个重链CDR和3个轻链CDR(或CDR区)。因此，本文所用的“CDR”是指所有3个重链CDR或所有3个轻链CDR(或者所有重链CDR和所有轻链CDR，如果合适的话)。抗体的结构和蛋白质折叠意味着其它残基可考虑为抗原结合区的组成部分，技术人员可以理解这一点。参见例如Chothia等，(1989)Conformations ofimmunoglobulin hypervariable regions；Nature 342，第877-883页。为了方便起见，包括如Kabat所定义的SEQ ID NO 37-42中的CDR。
CDR提供抗体与抗原或表位结合的接触残基的大部分。本发明的目标CDR来自供体抗体可变重链和轻链序列，并且包括天然存在的CDR的类似物，所述类似物也共享或保留与其来源供体抗体相同的抗原结合特异性和/或中和能力。
“功能片段”是部分重链可变序列或轻链可变序列(例如在免疫球蛋白可变区的氨基端或羧基端具有小缺失)，其保留与该片段的来源抗体相同的抗原结合特异性以及相同或相似的中和能力。
“类似物”是具有至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，其中所述修饰可以是化学修饰或者是取代或少数氨基酸(即不超过10个氨基酸)重排，所述修饰允许氨基酸序列保留未修饰序列的生物学特性，例如抗原特异性和高亲和力。例如，当在CDR编码区内或周围产生某种内切酶限制位点时，可以通过取代，构建(沉默)突变。本发明包括本发明抗体的类似物的用途。众所周知，氨基酸序列或核酸序列中的小变化可产生例如原始蛋白质的等位形式，所述形式基本上保留类似特性。因此，本发明抗体的类似物包含这样的类似物：其中重链和轻链的超变区CDR与上表1-6中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3所定义的CDR具有至少80％同源性、优选至少90％同源性、更优选至少95％同源性，并且保留了NOGO中和活性。当序列进行优化比对时，空位或插入算作不相同残基，如果它们在类似位置上具有80％相同氨基酸残基的话，则氨基酸序列具有至少80％同源性。本发明也包括本发明抗体的类似物，其中构架区与SEQ ID NO 37-42所示构架区具有至少80％同源性、优选至少90％同源性、更优选至少95％同源性。当序列进行优化比对时，空位或插入算作不相同残基，如果它们在同样位置上具有80％相同氨基酸残基的话，则氨基酸序列具有至少80％同源性。
类似物也可以是等位变异。“等位变异或修饰”是核酸序列的变化。所述变异或修饰可以是因为遗传密码的简并性，或者可以经有意工程改造，以提供想要的特性。这些变异或修饰可以导致或不导致任何编码氨基酸序列的变化。
术语“效应物”是指非蛋白载体分子，所述分子通过常规方法连接的经改变的抗体和/或天然或合成供体抗体轻链或重链或供体抗体的其它片段。此类非蛋白载体可包括用于诊断领域的常规载体，例如聚苯乙烯或其它塑料珠、多糖(例如用于BlAcore[Pharmacia]系统)，或者用于医药领域并可安全地给予人和动物的其它非蛋白物质。其它效应物可包含用于螯合重金属原子的大环类或放射性同位素。所述效应物也可用于增加经改变的抗体的半寿期，例如聚乙二醇。
或者，人们可以构建抗体、改变的抗体及片段，即通过免疫非人类物种(例如牛、绵羊、猴子、鸡、啮齿动物(例如鼠和大鼠)等)，以产生想要的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白当与来自任何物种的天然NOGO一起呈递时，可产生与人NOGO具有交叉反应的抗体，例如人类或鸡。常规杂交瘤技术用于提供分泌抗NOGO的非人类mAb的杂交瘤细胞系。然后可以使用NOGO包被的384或96孔板、使用结合生物素化NOGO的链霉抗生物素包被板或者在均匀铕-APC联免疫测定中使用生物素化NOGO，来筛选所述杂交瘤的结合。
天然人抗体可以在人抗体小鼠例如“XenomouseTM”(Abgenix)中产生，其中已经除去小鼠免疫球蛋白基因，并且已将编码人免疫球蛋白的基因插入到小鼠染色体中。小鼠按照通常方法免疫并产生源自人体基因的抗体反应。因此，小鼠产生人抗体，这样在阳性杂交选择之后就不需要进行人源化了。(参见Green L.L.，J ImmunolMethods，1999年12月10日；231(1-2)：11-23)。
本发明也包括来自抗NOGO的mAb的Fab片段或F(ab′)2片段的用途。Fab片段含有完整轻链和重链氨基端部分；F(ab′)2片段是两个Fab片段通过二硫键结合而形成的片段。可以通过常规方法，得到Fab片段和F(ab′)2片段，所述方法例如用合适的蛋白酶(木瓜蛋白酶和/或胃蛋白酶)切割mAb，或者通过重组方法。Fab和F(ab′)2片段本身可用作治疗药或预防药，并且可作为包括可变区和CDR序列在内的序列供体，用于形成如本文所述的重组抗体或人源化抗体。
也可通过组合噬菌体文库(参见例如Winter等，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994))或者通过免疫球蛋白链改组(参见例如Marks等，Bio/Technology，10：779-783(1992)，来构建Fab和F(ab’)2片段，这两篇参考文献都通过引用全部结合到本文中。
因此，对NOGO具有特异性的人抗体片段(Fv、scFv、Fab)可以用人抗体片段噬菌体展示文库来分离。针对NOGO蛋白淘选展示人抗体片段蛋白的噬菌体颗粒文库。从文库中保留与NOGO结合的这些噬菌体展示抗体片段并进行克隆扩增。然后从特定噬菌体上切下人抗体基因，并插入到含有人IgG恒定区的人IgG表达构建体上，形成完整的人IgG分子，该分子具有来自所分离噬菌体的、并对NOGO具有特异性的可变区。
供体抗体可提供序列，例如可变重链和/或轻链肽序列、构架序列、CDR序列、功能片段及其类似物和编码它们的核酸序列，用于设计和得到不同的改变抗体，所述抗体的特征是供体抗体的抗原结合特异性。
考虑到遗传密码的简并性，可以构建编码可变重链和轻链氨基酸序列和CDR序列以及功能片段及其类似物的不同编码序列，所述序列共享供体抗体的抗原特异性。当与第二免疫球蛋白配偶体有效连接时，编码可变链肽序列或CDR的分离的核酸序列或其片段可用来产生改变的抗体，例如嵌合抗体或人源化抗体或其它工程抗体。
改变的免疫球蛋白分子可编码改变的抗体，所述抗体包括工程抗体，例如嵌合抗体和人源化抗体。想要的改变的免疫球蛋白编码区含有编码肽的CDR编码区，所述肽具有抗NOGO抗体、优选高亲和性抗体的抗原特异性，所述区插入到第一免疫球蛋白配偶体(人构架区或人免疫球蛋白可变区)。
优选第一免疫球蛋白配偶体与第二免疫球蛋白配偶体有效连接。第二免疫球蛋白配偶体的定义同上，并且可包含编码目标第二抗体区的序列，例如Fc区。第二免疫球蛋白配偶体也可包含编码另一免疫球蛋白的序列，该序列与轻链或重链恒定区符合读框地融合或者通过接头序列的方式融合。可以设计针对功能片段或NOGO类似物的工程抗体，以引发增强的结合。
第二免疫球蛋白配偶体也可与包括非蛋白载体分子在内的如上定义的效应物连接，第二免疫球蛋白配偶体可以通过常规方法与所述效应物有效连接。
第二免疫球蛋白配偶体(例如抗体序列)与效应物之间可以通过任何合适的方式融合或连接，例如通过常规共价键或离子键、蛋白融合或杂双官能交联接头(例如碳二亚胺、戊二醛等)。该技术是本领域已知的，并且容易地描述于常规化学和生物化学课本中。
此外，在第二免疫球蛋白配偶体和效应物之间简单提供所需数量的空间的常规接头序列也可构建到改变的免疫球蛋白编码区之中。所述接头的设计对本领域技术人员来所是众所周知的。在本发明的又一方面，我们提供双抗体(双价或双特异性)、三抗体、四抗体和其它多价scFV蛋白，其具有一个或多个与NOGO结合并中和其功能的上述CDR。
在再一个实施方案中，本发明的抗体可与额外试剂连接。例如，重组DNA技术方法可用于产生本发明的工程抗体，其中Fc片段或全长抗体分子的CH2-CH3结构域已经被酶或其它可检测分子(即多肽效应物或报道分子)替代。
第二免疫球蛋白配偶体也可与非免疫球蛋白肽、蛋白质或其片段有效连接，所述肽、蛋白质或片段对于具有抗NOGO抗体的抗原特异性的含有CDR的序列来说是异源的。所得蛋白在表达后，可同时表现出抗NOGO抗原特异性和非免疫球蛋白的特征。该融合配偶体的特征可以是例如功能特征(例如另一个结合结构域或受体结构域)、或治疗性特征(如果融合配偶体本身是治疗性蛋白质的话)或者额外的抗原特征。
另一种想要的本发明的蛋白质可包含全长抗体分子，所述分子具有全长重链和轻链或其任何不连续片段，例如Fab或F(ab’)2片段、重链二聚体，或其任何最小的重组片段，例如Fv或单链抗体(SCA)或与所选供体mAb具有相同特异性的任何其它分子。所述蛋白可以以改变的抗体的形式使用，或者可以以其未融合形式使用。
只要第二免疫球蛋白配偶体来自与供体抗体不同的抗体，例如任何同种型或免疫球蛋白构架区或恒定区类别，都能得到工程抗体。工程抗体可包括来自一个来源的免疫球蛋白(Ig)恒定区和可变构架区，例如受体抗体；和一个或多个(优选全部)来自供体抗体的CDR。另外，可以在受体mAb轻链和/或重链可变区构架区的核酸或氨基酸水平上进行改变(例如缺失、取代或添加)或者改变供体CDR区，以便保留供体抗体抗原结合特异性。
这样的工程抗体设计用于抗NOGO mAb的一个(或两个)可变重链和/或轻链或者一个或多个重链CDR或轻链CDR。如上所述，工程抗体可以被中和。
这样的工程抗体可包含人源化抗体或嵌合抗体，其中人源化抗体含有所选人免疫球蛋白或亚型的构架区，嵌合抗体含有与抗NOGO抗体功能片段融合的人重链恒定区和轻链恒定区。可以根据与供体抗体核苷酸序列和氨基酸序列的同源性，从诸如KABAT数据库、Los Alamos数据库和瑞士蛋白质数据库等常规数据库中，筛选出合适的人(或其它动物)受体抗体。以与供体抗体构架区的同源性(在氨基酸基础上)为特征的人抗体适合提供重链恒定区和/或重链可变区构架区，用于插入供体CDR。可以按类似方式，选择能够提供轻链恒定区或可变区构架区的合适的受体抗体。应当注意的是，受体抗体重链和轻链不一定要来自相同的受体抗体。
最好异源构架区和恒定区选自人免疫球蛋白类别和同种型，例如IgG(亚型1-4)、IgM、IgA和IgE。然而，受体抗体不必只包含人免疫球蛋白的蛋白质序列。例如，可以构建这样的基因：其中人免疫球蛋白链的DNA序列编码部分与编码非免疫球蛋白氨基酸序列(例如多肽效应物或报道分子)的DNA序列融合。
优选在人源化抗体中，人重链可变区和轻链可变区都通过一个或多个CDR取代而工程改造。可使用所有6个CDR或少于6个CDR的不同组合。优选所有6个CDR都被取代。可以在人重链中只取代CDR，用作轻链即未修饰轻链来自人受体抗体。或者，相容的轻链可选自来自常规抗体数据库的另一种人抗体。其余的工程抗体可来自任何合适的受体人免疫球蛋白。
因此，工程化人源化抗体优选具有天然人抗体或其片段的结构，并且具有有效治疗用途所需的特征组合。
本领域技术人员可以理解，工程抗体还可以通过可变区氨基酸的变化而进一步修饰，同时又不必影响供体抗体(即类似物)的特异性和高亲和性。预期重链氨基酸和轻链氨基酸可以在可变区构架或CDR或这两者中被其它氨基酸取代。
另外，可以改变恒定区，以增加或降低本发明分子的选择性。例如，二聚体化，与Fc受体结合，或者结合并激活补体的能力(参见例如Angal等，Mol.Immunol，30：105-108(1993)，Xu等，J.Biol.Chem，269：3469-3474(1994)，Winter等，EP 307，434-B)。
作为嵌合抗体的改变抗体与上述人源化抗体是不同的：即通过提供完整非人供体抗体重链和轻链可变区(包括构架区)以及来自其它物种(优选人)在两条链上的免疫球蛋白恒定区。
优选合适供体mAb的可变轻链和/或重链序列和CDR及其编码它们的核酸序列，用于通过以下方法来构建改变的抗体、优选本发明的人源化抗体。也可采用相同或相似技术来产生本发明的其它实施方案。
通过例如以下文献中介绍的技术等本领域技术人员已知技术，对产生所选供体mAb的杂交瘤进行常规克隆，得到其重链和轻链可变区的DNA：Sambrook等，(Molecular Cloning(A Laboratory Manual)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory(1989))。需要至少含有CDR编码区和受体mAb轻链和/或重链可变区构架区的部分的重链可变区和轻链可变区，以便保留供体mAb结合特异性，以及使用多核苷酸引物和逆转录酶，得到来自人免疫球蛋白抗体链的免疫球蛋白剩余部分。采用已知数据库并通过与其它抗体比较，鉴定CDR编码区。
然后可以制备小鼠/人嵌合抗体并检测其结合能力。所述嵌合抗体含有完整非人供体抗体VH和VL区，以及两条链的人Ig恒定区。
采用计算机化数据库(例如KABAT)，可鉴定来自人抗体重链可变区的同源构架区，并且可以选择对供体抗体具有同源性的人抗体作为受体抗体。可以按照类似方式设计合适的轻链可变构架区。
人源化抗体可来自嵌合抗体，或者优选通过将来自重链和轻链的供体mAb CDR编码区适当地插入到所选重链和轻链构架内而合成制得。或者，可以采用标准诱变技术制备人源化抗体。因此，所得人源化抗体含有人构架区和供体mAb CDR编码区。随后对构架残基进行操作。所得人源化抗体可以在重组宿主细胞(例如COS、CHO或骨髓瘤细胞)中表达。
可通过将这些抗体编码序列与能够在宿主细胞中控制复制和表达和/或从宿主细胞中分泌的常规调节控制序列有效连接，产生常规表达载体或重组质粒。调节序列包括启动子序列(例如CMV启动子)和信号序列，所述序列可来自其它已知抗体。同样，可以产生第二表达载体，所述载体具有编码互补抗体轻链或重链的DNA序列。优选该第二表达载体与第一表达载体相同，除了要考虑编码序列和选择标记之外，由此尽可能保证每条多肽链能功能性表达。或者，改变的抗体的重链和轻链编码序列可在一个载体上存在。
通过常规技术，同时用第一载体和第二载体共转染所选宿主细胞(或者就用一个载体进行转染)，得到本发明的转染宿主细胞，所述细胞包含重组或合成轻链和重链。然后通过常规技术培养转染细胞，产生本发明的工程抗体。通过例如ELISA或RIA等合适的测定方法，从培养物中筛选出同时包含重组的重链和/或轻链的抗体。类似常规技术可用于构建其它改变的抗体和分子。
本领域技术人员可以选择用于本发明组合物的方法及构建的克隆和亚克隆步骤的合适载体。例如，可以使用克隆载体的常规pUC系列。载体pUC19是市售的，由例如Amersham(Buckinghamshire，英国)或Pharmacia(Uppsala，瑞典)供应。此外，容易复制的、具有丰富克隆位点和选择性基因(例如抗生素抗性)并且容易操作的任何载体，都可用于克隆。因此，克隆载体的选择在本发明并不是限制性因素。
同样，本领域技术人员可以从任何常规载体中，选择用于表达抗体的载体。该载体也含有所选调节序列(例如CMV或RSV启动子)，所述序列指导异源DNA序列在所选宿主细胞中复制和表达。这些载体含有编码抗体或改变的免疫球蛋白编码区的上述DNA序列。另外，载体可掺入到通过插入所需限制位点而修饰的所选免疫球蛋白序列中，以便操作。
表达载体又一特征是适于扩增表达异源DNA序列的基因，例如哺乳动物二氢叶酸还原酶基因(DHFR)。其它优选的载体序列包括聚A信号序列，例如来自牛生长激素(BGH)和β珠蛋白启动子序列(betaglopro)的聚A信号序列。本文所用的表达载体可以通过本领域技术人员众所周知的技术来合成。
所述载体的组成，例如复制子、选择基因、增强子、启动子、信号序列等，是市售的或是天然来源的或是通过已知方法合成的，用于指导所选宿主中重组DNA产物的表达和/或分泌。按照该目的，也可选择其它合适的表达载体，本领域已知多种类型不同的载体，可用于哺乳动物、细菌、昆虫、酵母和真菌表达。
本发明也包括用重组质粒转染的细胞系，所述重组质粒含有抗体或其改变的免疫球蛋白分子的编码序列。用于克隆的宿主细胞以及这些克隆载体的其它操作也是常规的。然而，最好的是，来自大肠杆菌(E.coli)不同菌株的细胞在本发明改变的抗体的构建中用于克隆载体的复制和其它步骤。
用于表达本发明抗体的合适宿主细胞或细胞系优选为哺乳动物细胞，例如NS0、Sp2/0、CHO(例如DG44)、COS、成纤维细胞(例如3T3)和骨髓瘤细胞，更优选CHO或骨髓瘤细胞。可以使用人体细胞，因此该分子可以用人糖基化模式来修饰。或者，可以使用其它真核细胞系。本领域已知用于转化、培养、扩增、筛选和产物制备及纯化的合适哺乳动物宿主细胞和方法的选择。参见例如Sambrook等，出处同上。
已经证明，细菌细胞可用作适于表达本发明重组Fab的宿主细胞(参见例如Plückthun，A.，Immunol.Rev.，130：151-188(1992))。然而，因为细菌细胞表达的蛋白质倾向于呈现不折叠或不适当折叠的形式或者非糖基化形式，所以必须筛选细菌细胞产生的任何重组Fab对抗原结合力的保留。如果细菌细胞表达的分子以适当折叠形式产生，则该细菌细胞是所需宿主。例如，用于表达的大肠杆菌不同菌株在生物工程领域作为宿主细胞，这是众所周知的。在该方法中，也可使用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、链霉菌属(Streptomyces)、其它芽孢杆菌等不同菌株。
如有必要，本领域技术人员已知的酵母细胞、以及昆虫细胞(例如果蝇属(Drosophila)和鳞翅目属(Lepidoptera)和病毒表达系统)也可以作为宿主细胞。参见例如Miller等，Genetic Engineering，8：277-298，Plenum Press(1986)及其所引用的参考文献。
构建载体的通用方法、产生本发明宿主细胞所需的转染方法以及从所述宿主细胞产生本发明抗体所需的培养方法，都是常规技术。通常，本发明的培养方法是无血清培养方法，通常通过悬浮培养无血清细胞。同样，一旦产生本发明抗体后，可以按照本领域的标准方法，从细胞培养物中纯化本发明的抗体，所述方法包括硫酸铵沉淀法、亲和柱法、柱色谱法、凝胶电泳法等。这些技术都是本领域内的技术，并不限制本发明。例如，改变的抗体的制备方法描述于WO 99/58679和WO 96/16990。
表达抗体的再一种方法可采用在转基因动物中进行表达，例如描述于美国专利号4,873,316。该技术涉及利用动物酪蛋白启动子的表达系统，所述系统当经过转基因技术掺入到动物时，允许雌性动物在其乳汁中产生所需重组蛋白。
在本发明的另一方面，提供产生本发明抗体的方法，所述方法包括培养用载体转化或转染的宿主细胞的步骤，以及回收由此产生的抗体的步骤，所述载体编码本发明抗体的轻链和/或重链。
按照本发明，提供产生抗NOGO抗体的方法，所述抗体与人NOGO-A特异性结合并中和其活性，所述方法包括下述步骤：
(a)提供编码抗体重链的第一载体；
(b)提供编码抗体轻链的第二载体；
(c)用所述第一和第二载体转化哺乳动物宿主细胞(例如CHO)；
(d)在允许步骤(c)的宿主细胞将所述抗体分泌到所述培养基中的条件下，培养所述宿主细胞；
(e)回收步骤(d)分泌的抗体。
一旦通过所需方法表达，就可采用合适的测定方法来检测抗体的体外活性。目前常规ELISA测定方法可用于评价抗体与NOGO的定性和定量结合。此外，其它体外测定方法也可用于证实中和功效，随后再进行人体临床研究，以评价抗体在体内的持久性，虽然通常采用清除率机制。
本发明的治疗剂可以作为预防给予，或者在中风事件之后/临床症状发作之前给予，或者视需要给予。治疗剂量和持续时间与本发明分子在人体循环中的相对持续时间有关，可以由本领域技术人员根据所治疗病症和患者的一般健康状况来调整。预计可能需要在延长的时间周期内(例如4-6个月)重复给药(例如每周一次或每两周一次)，以达到最大的治疗功效。
本发明治疗剂的给药方式可以是将其给予宿主的任何合适途径。本发明的拮抗剂和抗体以及药物组合物尤其可用于胃肠外给予，即皮下、鞘内、腹膜内、肌内、静脉内或鼻内，其中特别优选静脉内给予。
可以将本发明的治疗剂制备成药物组合物，所述组合物含有有效量的作为活性成分的本发明拮抗剂或抗体以及药学上可接受的载体。在本发明的预防剂中，优选含有工程抗体的、以易于注射的形式的水性混悬剂或溶液剂，优选在生理pH下缓冲。供胃肠外给药用的组合物通常包括溶于药学上可接受的载体(优选水性载体)的本发明拮抗剂或抗体的溶液剂或其混合物。可以使用各种水性载体，例如0.9％盐水、0.3％甘氨酸等。这些溶液剂是无菌的，通常不含颗粒物质。这些溶液剂可以通过常规的众所周知的灭菌技术(例如过滤)除菌。组合物可含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅料，例如pH调节剂和缓冲剂等。本发明拮抗剂或抗体在所述药物制剂中的浓度可以在宽范围内变动，即从小于约0.5％、通常在或至少约1％至最高15％或20％(重量)，并且可以按照具体选择的给药方式，主要根据液体体积、粘度等进行选择。
因此，供肌内注射用的本发明药物组合物可以制备成含有1ml无菌缓冲水和介于约1ng至约100mg、例如约50ng至约30mg、或更优选约5mg至约25mg本发明拮抗剂或抗体。同样，供静脉内输注用的本发明药物组合物可以制备成含有约250ml无菌林格液和约1mg至约30mg、优选5mg至约25mg本发明工程抗体。制备供胃肠外给药用组合物的实际方法是众所周知的，或者对本领域技术人员来说是显而易见的，详细描述于例如Remington′s PharmaceuticalScience，第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania。对于制备供静脉内给药用的本发明抗体制剂来说，参见Lasmar U和Parkins D″The formulation of Biopharmaceutical products″，Pharma.Sci.Tech.today，第129-137页，第3卷(2000年4月3日)，Wang，W″Instability，stabilization and formulation of liquid proteinpharmaceutical″，Int.J.Pharm 185(1999)129-188，Stability of ProteinPharmaceuticals第A部分和第B部分，Ahern T.J.，Manning M.C.主编，New York，NY：Plenum Press(1992)，Akers，M.J.″Excipient-Druginteractions in Parenteral Formulations″，J.Pharm Sci 91(2002)2283-2300，Imamura，K等″Effects of types of sugar on stabilization of proteinin the dried state″，J Pharm Sci 92(2003)266-274，Izutsu，Kkojima，S.″Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect duringfreeze-drying″，J Pharm.Pharmacol，54(2002)1033-1039，Johnson，R，″Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for proteinlyophilization″，J.Pharm.Sci，91(2002)914-922。
Ha，E Wang W，Wang Y.j.″Peroxide formation in polysorbate 80and protein stability″，J.Pharm Sci，91，2252-2264，(2002)，所述文献的全部内容通过引用结合到本文中，读者可以逐一查阅。
当在药物制剂中时，优选本发明的治疗剂呈单位剂型。本领域技术人员可以容易地确定合适的治疗有效剂量。为了有效治疗人的中风和其它神经科疾病，可以通过胃肠外、优选i.v.(静脉内)或i.m(肌内)，给予一剂最高700mg/70kg体重的本发明拮抗剂或抗体。必要时，可以由医生选择合适的时间间隔，重复给予所述剂量。正如实施例中公开的，在静脉内给予本发明抗体的大鼠模型中，本发明人已经能够证明对于功能恢复的阳性效果。
可以将本文所述的抗体冻干后贮藏，临用前用合适的载体重建。该技术对于常规免疫球蛋白来说，已经显示出是有效的，可使用本领域已知冻干技术和重建技术。
本发明的抗体也可与以下药物联合使用(即同时、序贯或独立使用)：神经营养因子(例如神经生长因子(NGF)、例如脑源性神经营养因子(BDNF))、抗炎药(例如皮质类固醇)和/或tPA。可以在以下实施例所述MCAO模型中评价本发明NOGO抗体与例如tPA的联合用药。
另一方面，本发明提供用于治疗或预防中风和其它神经科疾病的药物组合物，所述组合物包含本发明的抗NOGO抗体或其功能片段以及药学上可接受的载体。
另一方面，本发明提供用于抑制病人的神经变性和/或促进功能恢复的药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗NOGO抗体或其功能片段以及药学上可接受的载体；所述病人患有中风或其它神经科疾病，或者处于发生所述疾病的危险之中。
本发明还提供治疗或预防人的中风(尤其是局部缺血性中风)和其它神经科疾病/障碍、尤其是阿尔茨海默病的方法，所述方法包括给予有需要的人有效量的抗NOGO抗体或其功能片段。本发明的抗体除了治疗病人已知疾病(或作为其替代)之外，还可用于治疗方法，以缓解阿尔茨海默病的进展和/或发作或者使之停止。
本发明还提供抗NOGO抗体或其功能片段在制备用于治疗或预防中风和其它神经科疾病/障碍、尤其是阿尔茨海默病的药物中的用途。
本发明也提供抑制病人的神经变性和/或促进功能恢复的方法，所述方法包括给予有需要的病人有效量的抗NOGO抗体或其功能片段；所述病人患有中风或其它神经科疾病/障碍、尤其是阿尔茨海默病，或者处于发生所述疾病的危险之中。
此外，本发明提供抗NOGO抗体或其功能片段在制备用于抑制病人的神经变性和/或促进功能恢复的药物中的用途；所述病人患有中风和其它神经科疾病/障碍、尤其是阿尔茨海默病，或者处于发生所述疾病的危险之中。
本发明还提供治疗或预防人的中风或其它神经科疾病/障碍、尤其是阿尔茨海默病的方法，所述方法包括胃肠外给予治疗有效量的抗NOGO抗体的步骤。优选抗NOGO抗体经静脉内给药。
以上所用的神经科疾病或障碍包括但不限于创伤性脑损伤、脊髓损伤、额颞痴呆(tau蛋白病)、周围神经病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、多发性硬化，尤其是阿尔茨海默病。
本发明也提供促进轴突萌生的方法，所述方法包括使人体轴突与抗NOGO抗体接触的步骤。该方法可以在体外或体内进行，优选该方法在体内进行。
因此又一方面，以静脉内给药形式提供本发明抗NOGO抗体或其功能片段在制备用于治疗病人以下疾病的药物中的用途：中风(尤其是局部缺血性中风)、脑损伤、脊髓损伤、额颞痴呆(tau蛋白病)、周围神经病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、多发性硬化，尤其是阿尔茨海默病；所述抗体或其功能片段包含表1和表2的CDR；表3和表4的CDR；或表5和表6的CDR。
因此，又一方面，提供治疗病人以下疾病的方法：中风(尤其是局部缺血性中风)、脑损伤、脊髓损伤、额颞痴呆(tau蛋白病)、周围神经病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、多发性硬化，尤其是阿尔茨海默病，所述方法包括静脉内给予治疗有效量的本发明抗NOGO抗体。
在本发明的又一方面，提供在人类受试者(例如病人)中枢神经系统内促进神经元轴突萌生的方法，所述方法包括给予(例如静脉内给予)治疗有效量的抗NOGO抗体(例如包含本文所示CDR的抗NOGO抗体)。
在本发明的又一方面，提供抗NOGO抗体(例如包含本文所示CDR的抗NOGO抗体)在制备用于治疗病人以下疾病的静脉内给药用药物中的用途：中风(尤其是局部缺血性中风)、脑损伤、脊髓损伤、额颞痴呆(tau蛋白病)、周围神经病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、多发性硬化，尤其是阿尔茨海默病。
在本发明的又一方面，提供在病人中枢神经系统内再生神经元轴突突起的方法，所述方法包括给予(例如静脉内给予)治疗有效量抗NOGO抗体(例如具有本文所示CDR的抗NOGO抗体)的步骤；所述患者患有(或怀疑患有)中风(尤其是局部缺血性中风)、脑损伤、脊髓损伤、额颞痴呆(tau蛋白病)、周围神经病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、多发性硬化，尤其是阿尔茨海默病。
在本发明的又一方面，提供抗NOGO抗体(例如具有本文所示CDR的抗NOGO抗体)在制备用于在病人中枢神经系统内再生神经元轴突突起的静脉内给药用药物中的用途；所述病人患有(或易患有)中风(特别是局部缺血性中风)、脑损伤、脊髓损伤、额颞痴呆(tau蛋白病)、周围神经病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、多发性硬化，尤其是阿尔茨海默病。
在本发明的又一方面，提供调节促淀粉状变肽(amyloidogenicpeptide)产生的方法，所述方法包括使表达促淀粉状变肽前体和NOGO多肽(例如人NOGO-A)的细胞接触抗NOGO抗体(例如包含本文所示CDR的抗NOGO抗体，尤其是2A10及其完全人抗体形式或人源化抗体形式)。在典型实施方案中，所述前体是APP。在另一些实施方案中，促淀粉状变肽是Aβ，最优选Aβ40、Aβ42或两者的组合。
本文所用的术语“功能恢复”是指患者在例如缺血事件或损伤或临床症状发作后的运动和/或感觉和/或行为改善。可以通过仪器评价人体功能恢复，所述仪器是设计用于测定基本神经学功能(例如运动强度、感觉和协调)、认知功能(例如记忆、语言和服从指令的能力)和功能能力(例如日常生活的基本活动或器械活动(instrumentalactivity))。可以用以下仪器测量基本神经学功能的恢复：例如NIH中风量表(NIHSS)；可以用以下神经心理学实验测定认知功能的恢复：例如波士顿命名实验(Boston Naming Test)、Trail-making实验和加州言语学习实验(California Verbal Learning Test)；可以用以下仪器测定日常活动：例如ADCS/ADL(阿尔茨海默病临床研究/日常生活的活动)量表或Bristol日常生活活动量表；所有这些实验和量表都是本领域已知的。
以下实施例用于说明而不是限制本发明。
实施例
实施例1：杂交瘤的制备和筛选
抗NOGO单克隆抗体由杂交瘤细胞产生，杂交瘤细胞是小鼠骨髓瘤细胞与来自用靶抗原免疫的小鼠的B淋巴细胞融合的结果。杂交瘤细胞因骨髓瘤融合配偶体而成为无限增殖细胞，同时由B淋巴细胞提供产生抗体的能力。每个杂交瘤细胞只产生一种具有独特特异性的抗体，称为单克隆抗体。
给SJL小鼠皮下注射10μg总蛋白(1∶1，人NOGO-A剪接体(氨基酸186-1004)和大鼠NOGO-A剪接体(氨基酸173-975)，在大肠杆菌BL21中产生GST-融合蛋白)及CFA和RIBI两种佐剂，对SJL小鼠进行免疫。4天和8天后，再给予小鼠5μg相同蛋白及RIBI佐剂，进行加强免疫。再过3天后，从局部引流的淋巴结收获免疫细胞，使用PEG 1500使所得免疫细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤。通过两轮有限稀释，克隆单一杂交瘤细胞系。同时用人NOGO-A和大鼠NOGO-A免疫小鼠，产生与大鼠NOGO-A及其人NOGO-A具有良好结合特异性和/或结合亲和性的抗体。这样就能在将所述抗体给予人体之前，先用大鼠和/或啮齿动物模型进行评价。
起始杂交瘤抗体选择是根据在微量滴定板上与NOGO蛋白的直接结合。然后根据在ELISA测定中可溶性蛋白(由使用PrescissionTM蛋白酶从GST部分切割而来的人NOGO-A序列组成)竞争该结合活性的能力，筛选出约60个杂交瘤。
实施例2：可变区的克隆
从选定的2A10/3、2C4/1和15C3/3杂交瘤细胞中，提取总RNA，接着用逆转录和聚合酶链式反应(RT-PCR)提取重链可变区和轻链可变区cDNA序列。RT-PCR的正向引物是简并引物的混合物(所述引物对鼠免疫球蛋白基因前导序列具有特异性)，而反向引物是针对恒定区的同种型特异性抗体。PCR引物被设计为携带5′限制酶识别位点，使其克隆到pUC19中，用于DNA测序。
RNA提取
按照制造商的使用说明，使用来自Promega的SV总RNA分离系统，从每个杂交瘤克隆的106细胞沉淀中提取总RNA。
逆转录
用对鼠前导序列具有特异性的正向引物以及对鼠IgGκ恒定区具有特异性的反向引物，对RNA进行逆转录，产生重链可变区和轻链可变区的cDNA。IgGγ1反向引物用于杂交瘤2C4/1和15C3/3；而IgGγ2b用于2A10/3。正向引物在5′端携带SalI限制酶识别位点，并且在5′向该位点添加4个额外核苷酸，用于有效限制消化。这些引物是由Jones ST和Bendig MM 1991修改而来(Biotechnology 9，88-89)。反向引物携带XmaI限制酶识别位点加上5′端上额外4个核苷酸。
引物
鼠VH前导序列正向引物：
AG77：5′-ACT AGT CGA CAT GAA ATG CAG CTG GGT CAT STT CTT C-3′(SEQ.I.D.NO：51)
AG78：5′-ACT AGT CGA CAT GGG ATG GAG CTR TAT CAT SYT CTT-3′(SEQ.I.D.NO：52)
AG79：5′-ACT AGT CGA CAT GAA GWT GTG GTT AAA CTG GGT TTT T-3′(SEQ.I.D.NO：53)
AG80：5′-ACT AGT CGA CAT GRA CTT TGG GYT CAG CTT GRT TT-3′(SEQ.I.D.NO：54)
AG81：5′-ACT AGT CGA CAT GGA CTC CAG GCT CAA TTT AGT TTT CCT T-3′(SEQ.I.D.NO：55)
AG82：5′-ACT AGT CGA CAT GGC TGT CYT RGS GCT RCT CTT CTG C-3′(SEQ.I.D.NO：56)
AG83：5′-ACT AGT CGA CAT GGR ATG GAG CKG GRT CTT TMT CTT-3′(SEQ.I.D.NO：57)
AG84：5′-ACT AGT CGA CAT GAG AGT GCT GAT TCT TTT GTG-3′(SEQ.I.D.NO：58)
AG85：5′-ACT AGT CGA CAT GGM TTG GGT GTG GAM CTT GCT ATT CCT G-3′(SEQ.I.D.NO：59)
AG86：5′-ACT AGT CGA CAT GGG CAG ACT TAC ATT CTC ATT CCT G-3′(SEQ.I.D.NO：60)
AG87：5′-ACT AGT CGA CAT GGA TTT TGG GCT GAT TTT TTT TAT TG-3′(SEQ.I.D.NO：61)
AG89：5′-ACT AGT CGA CAT GAT GGT GTT AAG TCT TCT GTA CCT G-3′(SEQ.I.D.NO：62)
鼠VL前导序列正向引物：
AG90：5′-ACT AGT CGA CAT GAA GTT GCC TGT TAG GCT GTT GGT GCT G-3′(SEQ.I.D.NO：63)
AG91：5′-ACT AGT CGA CAT GGA GWC AGA CAC ACT CCT GYT ATG GGT-3′(SEQ.I.D.NO：64)
AG92：5′-ACT AGT CGA CAT GAG TGT GCT CAC TCA GGT CCT GGC GTT G-3′(SEQ.I.D.NO：65)
AG93：5′-ACT AGT CGA CAT GAG GRC CCC TGC TCA GWT TYT TGG MWTCTT G-3′(SEQ.I.D.NO：66)
AG94：5′-ACT AGT CGA CAT GGA TTT WCA GGT GCA GAT TWT CAG CTT C-3′(SEQ.I.D.NO：67)
AG95：5′-ACT AGT CGA CAT GAG GTK CYY TGY TSA GYT YCT GRG G-3′(SEQ.I.D.NO：68)
AG96：5′-ACT AGT CGA CAT GGG CWT CAA GAT GGA GTC ACA KWY YCWGG-3′(SEQ.I.D.NO：69)
AG97：5′-ACT AGT CGA CAT GTG GGG AYC TKT TTY CMM TTT TTC AATTG-3′(SEQ.I.D.NO：70)
AG98：5′-ACT AGT CGA CAT GGT RTC CWC ASC TCA GTT CCT TG-3′(SEQ.I.D.NO：71)
AG99：5′-ACT AGT CGA CAT GTA TAT ATG TTT GTT GTC TAT TTC T-3′(SEQ.I.D.NO：72)
AG100：5′-ACT AGT CGA CAT GGA AGC CCC AGC TCA GCT TCT CTT CC-3′(SEQ.I.D.NO：73)
MKV12：5′-ACT AGT CGA CAT GAA GTT TCC TTC TCA ACT TCT GCT C-3′(SEQ.I.D.NO：74)
鼠γ1恒定区反向引物：
AG102：5′-GGA TCC CGG GCC AGT GGA TAG ACA GAT G-3′(SEQ.I.D.NO：75)
鼠γ2b恒定区反向引物：
AG104：5′-GGA TCC CGG GAG TGG ATA GAC TGA TGG-3′(SEQ.I.D.NO：76)
鼠κ恒定区反向引物：
AG101：5′-GGA TCC CGG GTG GAT GGT GGG AAG ATG-3′(SEQ.I.D.NO：77)
制备50μM鼠VH或VL前导序列正向引物的混合物。也制备50μM鼠γ或κ恒定区反向引物溶液。
逆转录酶PCR(RT-PCR)
按照制造商的使用说明，使用来自Promega的Access RT-PCR系统，对编码重链可变区和轻链可变区的RNA进行逆转录，一式两份。含有供应的RT-PCR缓冲液、0.2mM dNTP、1μM各引物组、1μMMgSO4和5U各AMV逆转录酶以及Tfl DNA聚合酶的50μl反应物中，含有约200ng RNA。
RT-PCR循环：1-48℃ 45分钟
            2-94℃ 2分钟
            3-94℃ 30秒钟
            4-50℃ 1分钟
            5-68℃ 2分钟
            6-68℃ 7分钟
            步骤3-5：重复30次。
pUC19克隆
用Qiagen MinElute Qiagen PCR纯化试剂盒，按照其使用说明，纯化可变区RT-PCR产物，然后按照制造商的使用说明，依次用来自New England Biolabs的XmaI和SalI进行消化。然后将其上样到含有0.5％溴化乙锭的制备型1％琼脂糖凝胶上，在TAE缓冲液中、在50mA下电泳1小时，在紫外灯下切取V区条带。使用来自Qiagen的MinElute凝胶提取试剂盒，按照制造商的使用说明，从凝胶纯化DNA片段。通过用SalI和XmaI消化pUC19，以制备pUC19载体臂，然后按照制造商的使用说明，用来自Qiagen的MinElute Reaction Cleanup试剂盒进行纯化，再用虾碱性磷酸酶(USB)脱去磷酸。根据分析型1％琼脂糖/溴化乙锭凝胶，评价载体臂和V区片段的浓度，以1∶2的摩尔比混合，并且按照制造商的使用说明，用Promega的快速连接试剂盒进行连接。按照制造商的使用说明，将连接质粒转化到DH5α细胞(Invitrogen)中。选择在含有100μg/ml氨苄青霉素的L-琼脂板上生长的菌落，用于DNA序列分析。
可变区测序
菌落在补充了100μg/ml氨苄青霉素的5ml LB培养基中、在37℃培养过夜并提取质粒DNA，然后使用Qiagen QIAprep Spin Miniprep试剂盒，按照制造商的使用说明进行纯化。使用标准M13正向引物和反向引物，对VH区和VL区进行DNA测序。
测序检测结果见SEQ ID NO 43-48。
实施例3：重组抗NOGO抗体
可以从用质粒转染的细胞中，纯化具有鼠2a/k恒定区的重组抗体，所述质粒包含克隆到小鼠IgG2a/k恒定区基因区段中的轻链可变区和重链可变区。通过PCR扩增克隆鼠V区，引入克隆到哺乳动物表达载体Rld和Rln中所需的限制位点。在VH区中符合读框地设计Hind III和Spe I位点，以便克隆到含有小鼠γ2a恒定区的修饰Rld载体中。在VL区中符合读框地设计Hind III和BsiW I位点，以便克隆到含有小鼠κ恒定区的修饰Rln载体中。
PCR引物
2A10VH正向引物：
5′-ACTCATAAGCTTGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTTTTGGTAG-3′(SEQ.I.D.NO：78)
VH反向引物：
5′-ACTATGACTAGTGTGCCTTGGCCCCAGTAG-3′(SEQ.I.D.NO：79)
VL正向引物：
5′-ACTCATAAGCTTGCCACCATGAGGTGCTCTCTTCAGTTTCTG-3′(SEQ.I.D.NO：80)
VL反向引物：
5′-ACTATGCGTACGTTTCAGCTCCAGCTTGG-3′(SEQ.I.D.NO：81)
按照制造商的使用说明，使用Hercules(Stratagene)，在50μl体积中进行PCR，所述体积中含有约10ng pUC19小量制备物(miniprep)(含有V区)、2％DMSO、400μM dNTP、1μm各引物和供应的缓冲液。PCR进行如下：1-95℃2分钟，2-95℃1分钟，3-56℃1分钟，4-72℃1分钟。步骤2-4进行30次循环。
克隆到表达载体中
按照制造商的使用说明，使用来自Qiagen的MinElute PCR纯化试剂盒，纯化PCR产物。按照制造商的使用说明，VH PCR产物和Rld(IgG2a)哺乳动物表达载体用Hind III-Spe I消化，VL PCR产物和Rln(k)哺乳动物表达载体用Hind III-BsiW I(NEB)消化。使用Promega快速连接试剂盒以1∶2的摩尔比连接载体并插入。将连接混合物转染到DH5α细胞中，然后培养生长在氨苄青霉素选择培养基上的菌落，进行DNA序列证实实验。
重组抗NOGO抗体2A10/3的测序
HindIII和EcoRI克隆位点之间的2A10重链序列经测定为：
AAGCTTGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTTTTGGTAGCAGC
AGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGACTGAAC
TGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTAC
ACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGG
CCTTGAGTGGATTGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACA
ATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGC
ACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTA
TTATTGTGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAAGGCACACTAGTCACCG
TCTCCTCAGCCAAAACAACAGCCCCATCGGTCTATCCACTGGCCCCTGTG
TGTGGAGATACAACTGGCTCCTCGGTGACTCTAGGATGCCTGGTCAAGGG
TTATTTCCCTGAGCCAGTGACCTTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCA
GTGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACCCTC
AGCAGCTCAGTGACTGTAACCTCGAGCACCTGGCCCAGCCAGTCCATCAC
CTGCAATGTGGCCCACCCGGCAAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTG
AGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCA
CCTAACCTCCTGGGTGGCCCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAA
GGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGG
ATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAAC
GTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAG
TACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGA
GTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCC
ATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGT
ATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTC
TGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGG
ACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCT
GGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGA
AGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGT
CTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAATG
AGAATTC
(SEQ ID NO：49)
HindIII和EcoRI克隆位点之间的2A10轻链序列经测定为：
AAGCTTGCCACCATGAGGTGCTCTCTTCAGTTTCTGGGGGTGCTTATGTT
CTGGATCTCTGGAGTCAGTGGGGATATTGTGATAACCCAGGATGAACTCT
CCAATCCTGTCACTTCTGGAGAATCAGTTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGT
AAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTGCA
GAGACCAGGACAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATTTGATGTCCACCCGTG
CATCAGGAGTCTCAGACCGGTTTAGTGGCAGTGGGTCAGGAACAGATTTC
ACCCTGGAAATCAGTAGAGTGAAGGCTGAGGATGTGGGTGTGTATTACTG
TCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGG
AGCTGAAACGTACGGATGCTGCACCGACTGTATCCATCTTCCCACCATCC
AGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAA
CTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAAC
GACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGC
ACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACG
ACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCA
TTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAAGAATTC
(SEQ ID NO：50)
也构建了2A10嵌合体，在本文中称为HcLc。
实施例4：小鼠抗NOGO抗体与NOGO结合
将溶于50mM Tris(pH9.5)的5μg/ml GST-人NOGO-A56包被在Nunc Immunosorp板(100μl/孔)上，在4℃过夜。各孔用PBS冲洗一次，再与1％BSA的PBS一起在室温下孵育1小时，以封闭非特异性结合位点。抗体用PBS稀释成2μg/ml，由此制备1/3的稀释液。将抗体加入到各孔中，一式三份，在4℃孵育过夜。各孔用PBS洗涤3次，再与抗小鼠-HRP(1∶1000)一起孵育1小时。用PBS洗涤5次，再与100μl TMB底物(Sigma)/孔一起孵育10分钟。加入50μl浓HCl终止显色反应。用读板仪测定450nm处的光密度。减去从无抗体各孔中读取的背景值。
图8显示在ELISA测定中，所有3种小鼠抗NOGO-A单克隆抗体2A10、2C4和15C3对人NOGO-A56的剂量依赖性结合。
Y轴表示在450nm处测定的光密度(OD)，是对各孔中所捕获抗体的定量测定。X轴表示每个数据点所用抗体的浓度(ng/ml)/孔。抗体2A10在浓度范围中显示出最高信号，表明对人NOGO-A的亲和性更高。
实施例5：抑制性NOGO-A片段(NOGO-A56，SEQ.I.D.NO：87)的产生
将编码人NOGO-A氨基酸586-785
(MQESLYPAAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAGASVIQPSSSPLEASSV
NYESIKHEPENPPPYEEAMSVSLKKVSGIKEEIKEPENINAALQETEAPYISIACDLIKE
TKLSAEPAPDFSDYSEMAKVEQPVPDHSELVEDSSPDSEPVDLFSDDSIPDVPQKQDETV
MLVKESLTETSFESMIEYENKE-SEQ.I.D.NO：87)的cDNA序列，克隆到pGEX-6P1的BamHI-XhoI位点，产生GST-标记的融合蛋白，称为NOGO-A56。用IPTG(达0.5mM)在37℃诱导3小时后，在含有100μg/ml氨苄青霉素的2XTY培养基中培养的BL21细胞中表达质粒。细胞沉淀物用超声波裂解，然后按照制造商的使用说明，用谷胱甘肽-琼脂糖凝胶(Amersham Pharmacia)纯化融合蛋白。纯化蛋白用还原型谷胱甘肽洗脱，然后针对PBS充分透析，使用BSA标准和基于BioRad考马斯蓝的蛋白测定法进行定量测定，然后以等分试样贮藏于-80℃。因此，本发明提供抗体或其功能片段，所述抗体或其功能片段与NOGO-A、尤其是人NOGO-A结合，其中所述抗体或其功能片段中和NOGO蛋白的活性，所述NOGO蛋白包含由SEQ.ID.NO：87编码的多肽，其中所述抗体与所述蛋白质的SEQ.ID.NO：87结合。在典型形式中，本发明的抗体结合在人NOGO-A氨基酸586-785之间并中和NOGO-A的活性。
实施例6：神经突增生测定
将对照GST或GST-NOGOA56融合蛋白在冰上融化，在0.5x组织培养级PBS中稀释至3pmol/μl。在组织培养箱中，将5μl点(spots)干燥到BD-Biocoat聚-d-赖氨酸包被的96孔板的各孔中间。一旦干燥，将纯化抗体、杂交瘤条件性组织培养上清液或化合物在HBSS(LifeTechnologies)中稀释，各孔加入50μl，在4孔和8孔之间一式两份。仅含GST的对照孔和GST-NOGO-A56对照孔用未补充的HBSS处理。在37℃预处理2小时后，在100μl体积中，以20-40,000神经元/孔，加入来自出生后8天大鼠脑的纯化、分离的小脑颗粒状神经元(granule neuron)，在37℃孵育24小时。用4％低聚甲醛/10％蔗糖/PBS，将培养物固定1小时，再用多克隆抗β-III-微管蛋白抗体给神经突染色。采用Cellomics Arrayscan系统的自动图像捕获和分析，定量测定神经突增生。
结果见图1-6。
图1显示与仅用对照蛋白GST相比，NOGO-A56对神经突增生的抑制效果。
图2-5显示对功能阻断性抗NOGO抗体2A10/3、2C4/1和15C3/3以及非功能阻断性对照抗体12G3的鉴定。抗体12G3与NOGO56结合，但不抑制神经突增生活性。曲线显示在暴露给未纯化抗体(在上清液中)的培养物中的平均神经突长度。数据显示对于NOGO-A56对2A10/3、2C4/1和15C3/3的神经突增生抑制活性的阻断效应。对照是单独的GST。
图6显示纯化2A10/3对于NOGO-A56对神经突增生抑制效果的阻断。
实施例7：IN-1对人NOGO没有阻断活性
当用IN-1抗体进行实施例5所述神经突增生测定时，表明IN-1并不阻断人NOGO-A的抑制活性(图7)。
实施例8：2A10的人源化
通过构建重叠寡核苷酸，从头开始制备人源化VH和VL构建体，所述重叠寡核苷酸包含用于克隆到Rld和Rln哺乳动物表达载体的限制位点以及人信号序列。将Hind III和Spe I限制位点符合读框地引入到含有CAMPATH-1H信号序列的VH区中，用于克隆到含有人体突变恒定区的Rld中。将Hind III和BsiW I限制位点符合读框地引入到含有CAMPATH-1H信号序列的VL区中，用于克隆到含有人κ恒定区的Rln中。
CAMPATH-1H信号序列：MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ.ID.NO：82)
重链
鉴定出一种与2A10 VH氨基酸序列具有66％同一性的人类种系(germline)序列。选择U84162构架序列用于人源化：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSY
AQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGQWLVILNFDYWGQGTLVTVSS
(SEQ.I.D.NO：83).
因此本发明提供SEQ.ID.NO：83(或具有少于10个不同于SEQ.ID.NO：83的氨基酸的构架，例如具有少于8个不同氨基酸、优选少于6个不同氨基酸、更优选少于4个不同氨基酸(例如2个或1个不同氨基酸)的构架)在制备人源化抗NOGO抗体(尤其是与人NOGO-A结合并且包含表2所示CDR的抗NOGO抗体和/或与以上所示表位结合的抗NOGO抗体)中的用途。
经鉴定，93位和94位可能是维持CDR构象的重要残基。
位置(Kabat#)    2A10VH   U84162
93-94           EL        AR
注意，在这些位置的EL基序是稀有的。
设计以下人源化构建体：
人源化VH构建体H1：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGNINPSNGGTNY
NEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCELGQGYWGQGTTVTVSS
(SEQ.I.D.NO：84).
轻链
鉴定出与2A10 VL氨基酸序列具有66％同一性的人类种系序列。选择CAA85593构架序列用于人源化：
构架：CAA85593
DIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQGLVYSDGDTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRD
SGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPYTFGQGTKLEIK
(SEQ.I.D.NO：85)
因此本发明提供SEQ.I.D.NO：85(或具有少于8个不同氨基酸的构架，例如具有少于6个不同氨基酸、优选少于4个不同氨基酸(例如2个或1个不同氨基酸)的构架)在制备人源化抗NOGO抗体中的用途，所述人源化抗体与NOGO-A结合(尤其是包含一个或多个(例如全部)上表1所示CDR的轻链和/或与以上所示NOGO-A表位结合的抗体)并中和NOGO-A、尤其是人NOGO-A的活性。
经鉴定，以下构架残基在恢复亲和力方面可能是重要残基：
位置(Kabat#)   2A10VL   AAK94811
4              I         M
45             R         Q
46             R         L
设计以下人源化VL构建体：
构建体        构架模板               氨基酸
                       位置(Kabat#)  人     小鼠
L11           CAA85593 4             M      I
                       45            R      Q
                       46            R      L
人源化VL构建体L11：
DIVITQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFQQRPGQSPQLLIYLMSTRA
SGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK
(SEQ.I.D.NO：86)
将编码SEQ.ID.NO：84和86的质粒瞬时共转染到CHO细胞中，少量表达，产生抗体H1L11。编码SEQ.I.D.NO：92和86的质粒也可瞬时共转染到CHO细胞中，少量表达，产生抗体H7L11。
因此本发明提供与NOGO、尤其是人NOGO、更尤其是人NOGO-A结合并中和其活性的人源化抗体，所述人源化抗体包含SEQ.ID.NO：84的重链可变区和SEQ.I.D.NO：86的轻链可变区。在本发明的另一方面，提供与NOGO、尤其是人NOGO、更尤其是人NOGO-A结合并中和其活性的抗体(尤其是完全人抗体或人源化抗体)，所述抗体以等摩尔浓度竞争性抑制包含SEQ.I.D.NO：84的重链可变区和SEQ.ID.NO：86的轻链可变区的人源化抗体与人NOGO-A的结合。优选该竞争性抗体抑制至少50％的包含SEQ.I.D.NO：84的重链可变区和SEQ.ID.NO：86的轻链可变区的抗体与人NOGO-A的结合。
按照本发明，提供与人NOGO-A特异性结合并中和其活性的抗NOGO抗体，所述抗体包含SEQ.I.D.NO：88的重链和SEQ.I.D.NO：89的轻链。本发明也涉及包含所述抗体的药物组合物以及治疗病人、尤其是中风(例如局部缺血性中风)或阿尔茨海默病患者的方法。对本领域技术人员来说显而易见的是，SEQ.I.D.NO：88和SEQ.I.D.NO：89分别代表用于除去信号序列的任何加工(例如宿主细胞介导的加工)之前的重链和轻链。通常，SEQ.I.D.NO：88的加工形式开始于20位，而SEQ.ID.NO：89的加工形式开始于20位。
SEQ.I.D.NO：88
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAP
GQGLEWMGNINPSNGGTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCELGQG
YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS
GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT
CPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH
NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE
PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF
LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
SEQ.I.D.NO：89
MGWSCIILFLVATATGVHSDIVITQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWF
QQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPL
TFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS
GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
编码SEQ.ID.NO：88的多核苷酸示于SEQ.I.D.NO：90：
AAGCTTTACAGTTACTCAGCACACAGGACCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCT
TCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTG
AGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCA
CCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAA
ATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGTCACCA
TGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGTCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGG
ACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCA
CAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGA
GCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGG
TGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCC
TACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGG
GCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGA
AAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAC
TCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCT
CCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCA
AGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGG
AGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGC
TGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGA
AAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCAT
CCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATC
CCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA
CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACA
AGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA
ACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAATTC
(SEQ.I.D.NO：90)
编码SEQ.ID.NO：89的多核苷酸示于SEQ.I.D.NO：91：
AAGCTTTACAGTTACTCAGCACACAGGACCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTG
GTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGATATTGTGATAACCCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGT
CACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGA
AGACATACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATTTATTTGATG
TCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACT
GAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTTGTAGAGTATC
CGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTC
ATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAA
CTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCC
AGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTG
AGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTC
GCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGGAATTC
(SEQ.I.D NO：91)
实施例9：H1L11抗NOGO单克隆抗体的BiaCore分析
使用Biacore3000生物传感器，对抗NOGO单克隆抗体(mAb)与重组表达的人NOGO-A(hNOGO)的结合动力学进行分析。方法如下：
方法
采用设计用于靶向固定化水平(targeted immobilization level)的Biacore Wizard程序，使hNOGO通过伯胺偶联，固定到CM5芯片上。CM5传感器表面通过50mM N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)和200mMN-乙基-N′-二甲氨基丙基碳化物(EDC)溶液而活化。然后使用300nMhNOGO/5mM乙酸钠(pH5.0)溶液，将浓度范围为50-200共振单位的hNOGO固定化。固定化完成后，通过注入1M乙醇胺盐酸盐(pH8.5)，将任何仍然具有活性的酯封闭起来。
将H1L11 mAb(参见实施例8)在HBS-EP(10mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl，3mM EDTA和0.005％P-20表面活性剂)中稀释，然后在0.1-100nM的浓度范围内，进行结合研究。对于动力学分析，使用60μl/分的流速，没有观察到传质效应。所有浓度都一式两份，以随机顺序，并且带有缓冲液空白。通过单次注入15μl脉冲的50mM氢氧化钠或者在注入15μl 100mM H3PO4后，再注入15μl 50mM氢氧化钠，得到再生。两种再生方案都在30μl/分的流速下进行；而且两种方法都能够完全除去结合的H1L11，但却不会引起hNOGO传感器表面结合容量的任何损失。所有运行均参照空白传感器表面(即已经如上所述地被活化并封闭，但不加入配体)。采用BlA评价动力学分析软件第4.1版，进行结合分析。本发明其它抗体的Biacore分析基本上按照本文所述的相同方案进行。
结果
  抗体   ka(l/Ms)   kd(l/s)   KD(nM)
  HcLc   2.23×106   2.49×10-3   1.26
  H1L11   1.0×106   2.15×10-2   22.16
  小鼠2A10   2.9×106   1.84×10-3   0.8
  小鼠2C4   8.09×106   6.44×10-4   8
  小鼠15C3   4.07×104   8.28×10-4   17.5
用大鼠NOGO-A进行类似分析。
结果：
  抗体   ka(l/Ms)   kd(l/s)   KD(nM)
  小鼠2C4   1.62×105   5.33×10-4   3.9
  小鼠15C3   4.6×104   8.7×10-4   24.9
  小鼠2A10   1.26×106   1.01×10-3   1
实施例10：tMCAO之后，抗NOGO抗体(2C4)对损害体积和功能恢复的影响
目的
本项研究的目的是调查在大鼠大脑中动脉瞬时闭塞(tMCAO)后，脑室内(ICV)给予抗NOGO单克隆抗体(mab)对损害体积和功能恢复的功效。采用圆筒实验(Cylinder test)、楔形梁实验和神经病学评分，评价瞬时局部缺血90分钟后的长期功能恢复，并且取出脑，用于再生过程的免疫组织化学评价和损害体积评价。
方法
手术准备
本项研究中使用由Charles River供应的雄性Sprague-Dawley大鼠(300-350g)。在全身麻醉下，将脑室内(i.c.v.)插管插入到左侧脑室内。术后至少4天恢复后，通过ICV给予血管紧张素II进行刺激，来证实插管位置。
局灶性局部缺血的诱导
按照Longa及其合作者(Stroke，1989，20，84-91)所述，在氟烷/氧/氧化亚氮麻醉下，对所有动物进行tMCAO。手术全程均用直肠温度计监测体温，并且通过由温度计控制的加热毯，使动物保持正常体温(37±0.50℃)。在左侧大脑中动脉(MCA)闭塞和再灌注时，记录实际核心温度值。
MCA闭塞90分钟后，再次麻醉大鼠，然后缓慢而完全松开丝线，进行再灌注。切开的动脉用透热法闭合，重新检查是否止血并缝合颈部伤口。
闭塞后的恢复
MCA闭塞后，停止麻醉，动物放在恒温箱(23-25℃)中严格观察1小时，让其恢复知觉和翻正反射(righting reflex)。然后在术后恢复室中，单独关养动物，在此密切监测整个存活期的总体健康状况。
行为任务(Behavioural Task)
1.神经学评价
用28点分级量表，在1小时、24小时和MCA闭塞后8周内的每周时间点，评价MCA闭塞后的运动变化和行为变化。
所用的神经学评价(“神经病学评分”)详述
与同一研究中的其它大鼠相比，MCAO动物的神经病学评分—最高评分28点。
爪位(Paw placement)
在工作台边缘，纵向抓住动物，用你的手罩住它的头，然后一个接一个地抓住每个脚爪并将其放在工作台边缘。观察脚爪后缩，并且重新放回工作台上。
评分：每个成功的爪位得1分(最高分＝4)。
翻正反射
抓牢动物，将其翻转，直至它的背躺在你手掌中。松开抓牢的手，观察动物是否自己翻正。
评分：成功翻正得1分。
水平条棒(Horizontal Bar)
将动物前爪放在有棱条棒(ribbed bar)上并让其垂悬。
评分：如果双后肢趴到条棒上，得3分
      如果一个后肢趴到条棒上，得2分
      如果动物只是垂悬，得1分
      如果动物掉下来(因为没有握住)，得0分。
倾斜平台(Inclined Platform)
以45°抓住笼盖。将动物脸朝“下坡”站在盖子上
评分：如果在15秒内动物转身使脸朝“上坡”，得3分
      如果花费15-30秒，得2分
      如果时间超过30秒，得1分
      如果动物因无力/没有抓住而从盖子上掉下来或者保持朝
      “下坡”，得0分。
对侧旋转(Contralateral Rotation)
抓住动物尾部，先顺时针、再逆时针旋转动物。观察动物对侧转向旋转方向的能力。
评分：每侧1分(最高评分＝2)。
视前爪到达(Visual Fore-paw Reaching)
抓住动物尾部，让其头略低于工作台顶部水平面。靠近工作台，直到动物触须几乎触及到。动物应该弓身并试图将前爪放在工作台面上。
评分：每次成功的爪位，得1分(最高评分＝2)。
转圈(Circling)
将动物放在地板上，观察转圈。
评分：不转圈，得4分
倾向一侧，得3分
半径大于＞50cm的大圈，得2分
半径＞15＜50cm的中圈，得1分
自转/半径＜15cm的小图，得0分。
对侧反射
抓住动物尾部
评分：反射，得0分
      无反射，得1分。
握力
让动物仅用前爪握住笼条。拉住尾巴，将动物向后拉。
评分：2分—正常握力
      1分—握力小
      0分—没有握力。
活动性
观察在地板上转圈活动
评分：3分—正常活动性
      2分—如果有活力，但转圈
      1分—如果不稳定
      0分—如果不愿活动。
一般状态
评分：3分—正常(良好的皮毛状态，有警觉，灵活多动，体重增加正常)
      2分—非常好，但体重增加低于正常值
      1分—好
      0分—良好(例如肮脏的皮毛，没有多次理毛，弓身姿势、
     攻击性、微弱的肌肉紧张性)
最高评分(即正常大鼠)＝28
2.圆筒实验
每周在前爪位的圆筒实验中评价动物。将动物在直径为20cm、高30cm的透明Perspex圆筒中放3分钟。在此期间评价左右前爪的位置数。该实验在红光条件下进行。
3.楔形梁行走(Tapered beam walking)
为了做该实验，在红光房间内训练所有大鼠走过长度为1米、约40度角的方形楔形梁，上坡跑回其鼠笼。当大鼠跑过的梁宽度减小时，该任务逐渐变得越来越困难。梁是带有标记的，从而将其分为3部分，用于分析，最宽部分(6cm)容易，到楔形端(2cm)则困难。
操作前的训练—进行2天，将各鼠从其笼中取出，放到增加距离(总体上约为4倍)的梁上。当各鼠不用引诱就能走过梁，而且几乎没有走错时，就认为是通过训练了。任何表现差的大鼠从实验中剔除。
实验—每次实验期间，将各鼠放在梁上，共3次，手工记录走过梁的潜伏期(latency)、失足次数(定义为没有接触到梁的上表面的前肢和后肢位置)，然后计算其平均值。对于第1批动物在第5周，对于第2批动物在第4周，将分析改为录象记录实验。根据记录的实验进行分析，以便增加灵敏度。
MCAO动物的实验时间在术前、再在术后第7天和此后一直到第8周处死之前的每周。
给药方案
在闭塞后1小时、24小时、1周和2周给予抗体。
分组：
IgG1对照(5μg)(D组)
抗体2C4(5μg)(F组)
抗体2C4(15μg)(E组)
所有制剂均在无菌盐水中制备。
给药前，盲法分组。
为了避免因所用大鼠顺序导致的偏倚，采用拉丁方设计。
借助输液泵(2.5μl/min)，在2分钟内给予抗体，体积为5μl储液(1mg/ml和3mg/ml)。注射后，插管在原位继续保留2分钟。
局部缺血损伤的神经病理学和定量测定
MCA闭塞后8周，大鼠用冰冷的4％低聚甲醛灌注固定。然后给动物去头，将脑部原位贮藏于冰冷的4％低聚甲醛中，然后解剖并进行石蜡包埋处理，随后进行免疫组织化学研究。
对于脑体积分析，使用脑矩阵(brain matrix)，以2mm的间隔，从前极至小脑，对脑部进行连续切片，以进行石蜡处理。再给脑部进行石蜡处理并包埋在蜡中。收集对应于立体预定冠状面的相对于前囟的前+3mm至后-7.5mm的4微米切片。将切片放在聚赖氨酸包被的玻片上，用苏木精和伊红染色。采用计算机图像分析系统(Datacell，硬件。Optimas软件)，对切片进行损害体积和肿胀分析。损伤面积在未被苏木精和伊红染色的组织内。通过描记损伤面积的边界，测量损伤，表示为与脑部对侧非损伤侧相比的％损伤面积。
统计学分析
用重复测量ANOVA方法，以时间作为重复测量，分析神经病学评分和体重数据。用单侧ANOVA和ANCOVA方法分析损害体积，用重复测量ANCOVA方法分析损伤面积。
用重复测量ANOVA方法，以周和梁的难度作为重复测量，分别分析前肢和后肢失足数据，观察分组效应。为了观察前肢和后肢之间的差异，也使用重复测量ANOVA方法分析失足数据，用周和腿作为重复测量，平均交叉难度。
接受单次给药的E组(高剂量Ab组)3只动物少于该组的其它动物(见下文)。尽管用或不用这些动物进行分析，但都显示出对结果没有显著影响，因此这些动物包括在分析之内，重要的是，在圆筒实验和体重分布型的情况下，当3次给药的动物和4次给药的动物与对照相比较时，仅4次给药的动物与给予对照抗体的动物相比有显著性差异。
应该注意的是，在该项研究期间，大量大鼠推测因感染而死亡。结果，接受单次给药的最高给药组(E组)中的3只动物少于该组其它动物。
结果
接受单次给药的E组(高剂量Ab组)的3只动物少于该组其它动物。除非另有说明，否则用或不用这些动物进行数据分析，对分析结果都没有显著影响。
图9显示在对照和5μg和15μg试验组中，损害体积占总脑体积的百分比。当与对照组相比较时，抗体对损害体积没有影响。
图10.
该图显示神经病学评分数据，用平均值±SEM表示。因为观察了大量的数据，所以参数分析被认为是有效的。在1、4、7和8周，15μg剂量组和对照之间具有显著性差异。
当用此方式分析时，在7和8周，15μg剂量组和对照之间具有显著性差异。
圆筒实验
参见图11A、11B、11C、11D。圆筒数据用平均值±SEM表示，对于A)两脚爪，B)左脚爪，C)右脚爪和D)右脚爪，将大鼠分别分成接受3个剂量的15μg抗NOGO抗体，以及接受4个剂量的抗NOGO抗体。
在使用右脚爪时，15μg剂量的抗体产生显著增加。
当高剂量组分为接受所有4次给药的大鼠以及仅接受3次给予抗体的大鼠时，在这两个亚组之间没有观察到显著性差异。然而，见图11D，当4次给药组与对照组相比时，存在着显著性差异，而这样的差异是3次给药组与对照相比较中所没有的。统计学分析对重复测量数据采用Fisher的LSD检验。
楔形梁
参见图12。
图12显示前肢失足，用平均值±95％置信区间表示。
*在6周，F组与D组对照相比，5μg剂量增加了前肢失足次数。(p＝0.0305)。
尽管在本文中没有显示，但是随着梁的难度增加，前肢失足次数也增加。
参见图13。
图13显示后肢失足，用平均值±95％置信区间表示。
*在本项研究中，F组与D组对照相比，5μg剂量显著增加了后肢失足次数(p＝0.0488)。在6和7周，F组与D组相比，显著增加了后肢失足次数(分别为p＝0.0098和p＝0.0370)。
尽管在本文中没有显示，但是随着梁的难度增加，后肢失足次数也增加。
动物跨越梁的潜伏期数据表明，当动物恢复时，开始一周潜伏期减少，但是没有观察到治疗效果。
图14A)显示体重，用平均值±SEM表示。给予动物15μg抗体，在24小时、1周和在3周至研究结束的每个时间点引起体重增加。
图14B)曲线显示15μg剂量组的体重，该组分为接受3次给药的动物和接受4次给药的动物。数据表示为平均值±95％置信区间。*P＜0.05，重复测定ANOVA。
图14C)曲线显示15μg剂量组的体重，该组分为接受3次给药的动物和接受4次给药的动物。将接受5μg抗NOGO抗体的动物与接受对照抗体的动物进行比较。数据表示为平均值±95％置信区间。*P＜0.05，重复测定ANOVA。
与其它组相比，尽管没有明显地更高，但是高剂量组具有高比例的动物因安乐死或死亡而除去。这能解释为什么体重的平均值比对照组高。
结论
该项研究观察了在tMCAO 90分钟之后，在1小时、24小时、1周和2周经ICV给予两个剂量的抗NOGO抗体2C4，对损害体积和功能恢复的影响。
·抗体治疗对损害体积没有影响。
·在15μg(ICV)最高剂量下，抗体治疗对神经病学评分具有低而明显的效果。使用平均评分(在涉及大范围、因而调整参数分析时用作数据)，在1、4、7和8周，该剂量明显提高了神经病学评分。
·在圆筒实验中，在最高剂量15μg ICV下，抗体治疗对右脚爪具有显著效果。在整个实验期间，与对照相比，该剂量显著性增加了右脚爪的使用，特别是在第2周和第6周也引起右脚爪使用的显著增加。
·抗体治疗对楔形梁行走实验(tapered beam walking test)中的表现没有阳性效果。然而却表现出低剂量抗体组(5μg ICV)增加失足次数，尤其是在第6周。然而当分析每一难度部分的失足次数时，没有观察到差异，而当分析跨越梁的潜伏期时，也没有观察到差异。
·在最高剂量15μg ICV时，抗体治疗对体重具有显著效果。当3周后与对照相比时，该抗体组具有显著增加的体重。尽管没有功能性结果，但是体重能够很好地说明总体良好，这样的增加说明在tMCAO后具有改善的生理恢复。
该组中接受较高剂量抗体的最后3只大鼠没有接受第4次即最后的剂量，原因同上。为了测定这最后的剂量的重要性，将最高抗体剂量组内接受3次剂量的大鼠与接受4次剂量的大鼠进行比较。
给药持续时间
4次给药的动物显著增加右爪位数，而3次给药的动物却没有增加。另外，与3次给药的动物相比，在第二周给药看来加速了体重增加。与对照相比，4次给药也引起显著的体重增加，而3次给药却没有增加。
给药不影响损害体积、神经病学评分或楔形梁行走实验中的表现。
总结
总之，尽管治疗对损害体积没有影响，但是，当在3或4次给药后用本文所述的神经病学评分进行评价时，以及在4次给药后用爪位和体重进行评价时，最高剂量的抗NOGO抗体2C4(15μg)对功能恢复具有阳性效果。
实施例11：tMCAO后，静脉内给予抗NOGO单克隆抗体对损害体积和功能恢复的影响
目的
本项研究的目的是调查在大鼠左中动脉瞬时闭塞(tMCAO)后，静脉内(IV)给予抗NOGO单克隆抗体(mab)2A10和2C4对损害体积和功能恢复的功效。采用圆筒实验、楔形梁实验和神经病学评分，评价瞬时局部缺血90分钟后的长期功能恢复，并且取出脑，用于再生过程的免疫组织化学评价和损害体积评价。
方法
局灶性局部缺血的诱导
按照Longa及其合作者(Stroke，1989，20，84-91)所述，在氟烷/氧/氧化亚氮麻醉下，对所有动物进行tMCAO。手术全程均用直肠温度计监测体温，并且通过由温度计控制的加热毯，使动物保持正常体温(37±0.50℃)。在MCA闭塞和再灌注时，记录实际核心温度值。MCA闭塞90分钟后，再次麻醉大鼠，然后缓慢而完全松开丝线，让其再灌注。切开的动脉用透热法闭合，重新检查是否止血并缝合颈部伤口。
闭塞后的恢复
MCA闭塞后，停止麻醉，在恒温箱(23-25℃)中、在严格观察下让动物恢复知觉1小时。然后在术后恢复室中，单独关养动物，在此密切监测整个存活期的总体健康状况。
行为任务
神经学评价
用28点分级量表(“神经病学评分“，详见实施例10)，在1小时、24小时和MCA闭塞后8周内的每周时间点，评价MCA闭塞后的运动变化和行为变化。
圆筒实验
每周在前爪位的圆筒实验中评价动物。将动物在直径为20cm、高30cm的透明Perspex圆筒中放3分钟。在此期间评价自然饲养暴露给环境的左、右前爪及两前爪的位置数。该实验在红光条件下进行。
楔形梁行走
为了做该实验，在红光房间内训练所有大鼠走过长度为1米、约40度角的方形楔形梁，上坡跑回其鼠笼。当大鼠跑过的梁的宽度减小时，该任务逐渐变得越来越困难。
操作前的训练—进行2天，将各鼠从其笼中取出，以增加的距离(总体上约为4倍)放到梁上。当各鼠不用引诱就能走过梁，而且几乎没有走错时，就认为是通过训练了。任何表现差的大鼠从实验中剔除。
实验—每次实验期间，将各鼠放在梁上，共3次，录象记录走过梁的潜伏期、失足次数(定义为没有接触到梁的上表面的前肢和后肢位置)，分析晚期数据并求出其平均值。MCAO动物的实验时间在术前、再在术后第7天和此后一直到第8周处死之前的每周。
给药方案(IV)
在闭塞后1小时、24小时、1周和2周静脉内给予抗体。
分组：
A-2C4 3mg/kg(4.7mg/kg因低MW部分而调节)
B-2A10 3mg/kg
C-对照IgG2a 3mg/kg
D-2A10 10mg/kg
所有制剂均在无菌盐水中制备。
给药前，盲法分组。
为了避免因所用大鼠顺序导致的偏倚，采用拉丁方设计。将动物随机分布，操作者对治疗毫不知情。
局部缺血损伤的神经病理学和定量测定
MCA闭塞后8周，大鼠用冰冷的4％低聚甲醛灌注固定。然后给动物去头，将脑部原位贮藏于冰冷的4％低聚甲醛中过48小时，然后解剖并进行石蜡包埋处理，随后进行免疫组织化学分析。
对于脑体积分析，使用脑矩阵(brain matrix)，以2mm的间隔，从前极至小脑，对脑部进行连续切片，以进行石蜡处理。再给脑部进行石蜡处理并包埋在蜡中。收集对应于立体预定冠状面的相对于前囟的前+3mm至后-7.5mm的4微米切片。将切片放在聚赖氨酸包被的玻片上，用苏木精和伊红染色。采用计算机图像分析系统(Datacell，硬件。Optimas软件)，对切片进行损害体积分析。损伤面积由具有少量苏木精和伊红的组织面积表示。通过描记损伤面积的边界，测量损伤，表示为与脑部对侧非损伤侧相比的％损伤面积。
统计学分析
用重复测量ANOVA方法，以时间作为重复测量，分析神经病学评分和体重数据。用单侧ANOVA和ANCOVA方法分析损害体积，用重复测量ANCOVA方法分析损伤面积。
用重复测量ANOVA方法，以周和梁的难度作为重复测量，分别分析前肢失足和后肢失足数据，观察分组效应。为了观察前肢和后肢的差异，也使用重复测量ANOVA方法，以周和腿作为重复测量，平均交叉难度，分析失足数据。
结果
损害体积
图15表示损害体积占总脑体积的百分比。
与对照组相比，抗体对损害体积没有影响。
神经病学评分
图16显示神经病学评分数据，用平均值±SEM表示。因为观察了大量的数据，所以参数分析被认为是有效的。*P＜0.05，相对于对照抗体，重复测定ANOVA。
圆筒实验
参见图17A、17B和17C。圆筒数据用平均值±SEM表示，对于A)两脚爪，B)左脚爪，C)右脚爪。*P＜0.05，**P＜0.01，相对于对照抗体，重复测定ANOVA。
楔形梁
前肢失足
参见图18。前肢失足用平均值±SEM表示。*P＜0.05，**P＜0.01，相对于对照抗体，重复测定ANOVA。
后肢失足
参见图19。后肢失足用平均值±SEM表示。*P＜0.05，相对于对照抗体，重复测定ANOVA。
跨越梁的潜伏期
参见图20。后肢失足用平均值±SEM表示。*P＜0.05，相对于对照抗体，重复测定ANOVA。
结论
该项研究观察了在tMCAO 90分钟之后，在1小时、24小时、1周和2周经IV给予两个剂量的抗NOGO抗体2A10(3 & 10mg/kg)和一个剂量的2C4(3mg/kg)，对损害体积和功能恢复的影响。
·抗体治疗对损害体积没有影响。
·在2A10(10mg/kg)最高剂量下，在24小时，抗体治疗对神经病学评分具有明显效果。
·在圆筒实验中，2A10抗体治疗(3mg/kg)对右脚爪使用具有显著效果，准确地讲是在第1周和第2周。
·在tMCAO后1周和2周，2A10(3mg/kg)减少前肢失足次数具有明显作用；在tMCAO后2周，2A10(10mg/kg)减少后肢失足有效果；在tMCAO后1周，这两个浓度的2A10都缩短了跨越梁的潜伏期。在tMCAO后3周，相对于对照抗体来说，2C4(3mg/kg)减少前肢失足。
总结
总之，尽管治疗对损害体积没有影响，但是，主要在tMCAO后的最初2周，当采用神经病学评分、爪位以及楔形梁进行评价时，静脉内注射抗NOGO单克隆抗体2A10和2C4对功能恢复都具有阳性效果。
实施例12：将NOGO cDNA转染到SHSY5Y-APP细胞中
在SHSY5Y-APPwt转染前一天，细胞经胰蛋白酶水解，计数并以200,000-1,000,000细胞/孔的浓度重新接种到6孔板(Nunc)中。通过将DNA稀释到无血清培养基(OptiMEM-1)中，加入PlusTM试剂，混合并在室温下孵育15分钟，将NOGO表达构建体(FLAG-标记的NOGO-A cDNA，在pCDNA3(Invitrogen)中；MYC-标记的NOGO-B和NOGO-C，在pCDNA3.1A中)与PlusTM试剂混合。(每孔含6μl Plus试剂，以及含有2μg DNA和OptiMEM-1的100μl总体积)。
在第二支试管中，将脂转染胺(LipofectAMINETM)试剂稀释到无血清培养基(Optimem-l)中并进行混合(4μl脂转染胺试剂/100μl体积/孔)。预先混合的DNA(来源同上)与稀释的脂转染胺试剂合并，混合，在室温下孵育15分钟。
同时，细胞用无血清培养基(OptiMEM-I)洗涤，再将新鲜无血清培养基加入到细胞中(800μl/孔)。
将DNA-Plus-脂转染胺试剂混合物加入到细胞(200μl)中，小心混合，将细胞在5％CO2/37℃孵育5小时。
5小时后，将1ml含有血清的生长培养基加入到细胞中，将细胞孵育过夜或2小时。
14小时(或2小时)后，取出所有培养基，每孔更换为1ml(OptiMEM-1)。
48小时后，收集条件培养基，按照实施例13所述，测定淀粉状蛋白含量。
实施例13：通过IGEN ELISA测定Aβ肽
以所需密度，将过量表达人APPwt或淀粉状蛋白前体蛋白瑞典变异序列(APPswe)的SHSY5Y细胞接种到6孔或96孔Nunc板中。
24小时后，将待测试剂(例如抗体、肽、化合物等)加入到细胞中，终体积为120μl再将细胞孵育24小时。从细胞中取出培养基，在过夜ORIGEN免疫测定中，使用AβC端特异性抗体，用50μl检测Aβx-40，用50μl检测Aβx-42。简而言之，用生物素化6E10(SignetLabs)捕获Aβ肽。Ori-标记的标记AβC-端特异性抗体用于检测Aβx-40和Aβx-42。在IGEN M8分析仪中，用链霉抗生物素包被的dynabead来捕获抗体-Aβ复合物并进行检测。细胞活力用MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基溴化四唑；噻唑蓝)试剂来检测。简而言之，MTT试剂(5mg/ml的磷酸缓冲盐溶液)在培养基中进行1∶10稀释，每孔加入100μl。在37℃孵育4小时后，加入100μl增溶溶液(20％SDS/50％二甲基甲酰胺)。用Delfia Wallac读板仪，在590nM处读取平板的吸光度。
结果见图21-34。
SHSY5Y-APPwt细胞表达野生型APP。SHSY5Y-APPswe细胞表达瑞典突变型APP。
实施例14：NOGO-A的表达对分泌型Aβ40和Aβ42肽水平的影响
当表达NOGO-A的表达构建体导入SHSY5Y-APPwt细胞或SHSY5Y-APPswe细胞中时，观察到Aβ40和Aβ42的水平显著上升，这表明NOGO-A以某种方式直接或间接地调节APP的蛋白水解过程和/或Aβ肽的降解过程。该改变的APP加工产物是肽Aβ40肽的这一事实，表明NOGO的效果可以在调节β-分泌酶活性水平上。
图21显示当表达载体表达NOGO-A时，分泌型Aβ40的水平增加。左手两个柱状图是对照(只有载体和携带对照蛋白即绿色荧光蛋白(GFP)的载体)，表明在该细胞系中Aβ40产生的背景水平。其它柱状图显示，当与FLAG肽融合的NOGO-A在细胞中表达时，检测到Aβ40肽水平显著增加，当与myc融合的NOGO-B表达时，也有类似的增加，虽然不明显。
用对Aβ42具有特异性的ELISA重复同一实验。结果表明，与使用Aβ40 ELISA的较早实验中所观察到的一样，Aβ42肽分泌水平也有类似的增加。而且NOGO-B也显示出Aβ42肽分泌增加，而且其增加不如NOGO-A的明显。结果见图22。
用NOGO-A转染的细胞中分泌肽的水平的重复实验与仅用载体pCDNA3进行比较，见图23(对于Aβ40)和图24(对于Aβ42)。
Aβ40肽和Aβ42肽分泌水平的直接比较见图25。图25是3-5次单独实验的平均值，证实NOGO的一致性。
因此，本发明提供抗NOGO抗体(尤其是抗NOGO-A和/或抗NOGO-B抗体)在制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。
实施例15：抗NOGO-A抗体抑制Aβ40肽和Aβ42肽从SHSY5Y-APPwt和SHSY5Yswe细胞分泌
图26显示当抗NOGO抗体2A10引入到培养基时，Aβ40肽和Aβ42肽从表达内源NOGO-A的SHSY5Y-APPwt细胞分泌的水平急剧下降。
观察到的结果是以剂量依赖性方式，在30μg/ml达到接近90％的抑制水平。在Aβ40和Aβ42肽之间没有明显差异(分别是图26中的白色和黑色柱状图)，换句话说，抗NOGO抗体对APP加工的任何效果，对于Aβ40或Aβ42肽来说，并没有谁更优先。
图27显示与图26相同的实验，但是使用了无关IgG1抗体。图中清晰可见，无关(非抗NOGO A)单克隆抗体对由细胞分泌Aβ40肽和Aβ42肽的水平没有抑制效果。
图28显示相同的无关IgG1抗体同样也显示出对由表达NOGO-A的SHSY5Y-APPswe细胞分泌Aβ40肽和Aβ42肽的水平几乎没有或没有抑制效果。
同样，图29显示出与上述图26相同的实验的结果，但是使用与NOGO-A结合的抗NOGO单克隆抗体，而不是功能阻滞剂(6D5)。非功能阻断性抗NOGO-A单克隆抗体对由表达NOGO-A的SHSY5Y-APPwt细胞分泌Aβ40肽和Aβ42肽的影响最小(小于10％)。该结果表明，图26所示结果是NOGO功能活性被抗NOGO抗体抑制的结果。
图30显示与图29相同的实验的结果，使用非功能阻断性抗NOGO单克隆抗体(6D5)，但具有表达内源NOGO-A的SHSY5Y-APPswe细胞。如上(图29)所述，对于Aβ40和Aβ42从该细胞系分泌的水平具有最小效果，即抑制小于10％。
图31显示实验结果，该结果扩大了图26的实验结果。图31显示功能阻断性抗体2A10/3的抑制效果的浓度依赖性效应持续到较高浓度，在50μg/ml的抗体浓度下达到抑制水平大于90％。
图32显示与图31相同的实验的结果，只是使用SHSY5Yswe细胞。观察到抗体2A10/3的浓度依赖性抑制效果持续到50μg/ml的较高浓度。
图33显示不同功能阻断性抗NOGO-A抗体2C4对由SHSY5Y-APPwt细胞分泌Aβ40肽和Aβ42肽的影响。结果表明，对Aβ40肽和Aβ42肽分泌水平的浓度依赖性抑制效果在20μg/ml浓度下达36％的水平。而且也观察到对Aβ40肽和Aβ42肽的效果。
图34比较了抗NOGO-A功能阻断性抗体2A10、2C4和15C3(浓度见图)以及其它对照抗体10A4、IgG2b和14D12的抑制效果。该图显示对Aβ40和Aβ42分泌的抑制效果，对功能阻断性抗NOGO-A单克隆抗体来说是特异性的。
实施例16：NogoA表达增加，以剂量依赖性方式提高Aβ水平
为了研究NogoA表达对Aβ水平的影响，SHSY5Y-APPwt细胞用增加数量的C-端myc标记的NogoA cDNA瞬时转染。对于每次转染，使用pcDNA3.1myc cDNA，cDNA总量(5μg)保持恒定。转染后48小时，取出培养基，检测Aβ40。另外，收获细胞，在含有1％TritonX-100和完全蛋白酶抑制剂(Roche)的10mM Tris/HCl中裂解。细胞裂解物在10％Novex Tris-甘氨酸凝胶上进行分离，并用抗NogoA抗体进行蛋白质印迹分析。观察到NogoA蛋白表达的增加伴随NogoAcDNA浓度的增加。这伴随着培养基中来自这些细胞的Aβ40水平的相应增加。因此，NogoA的表达增加引起Aβ40水平的剂量依赖性增加。参见图36
实施例17：嵌合2A10(HcLc)
当检测人源化构建体时，设计由亲本鼠V区移植到人IgG1/k野生型C区组成的嵌合抗体，用作参考。小鼠重组Rld质粒中的NOGO2A10 VH区被Hind III-Spe I切割并连接到含有hCylwt的Rld载体中。小鼠重组Rln质粒中的NOGO 2A10VI区被Hind III-BsiW I切割并连接到含有hCk的Rln载体中。
SEQ.ID.NO：92显示HcLc的重链序列
MGWSCIILFLVAAATGVHSQVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRP
GQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCELGQG
YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS
GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH
NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE
PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF
LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ.I.D.NO：92)
编码SEQ.ID.NO：92的多核苷酸示于SEQ.I.D.NO：93。
AAGCTTGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTTTTGGTAGCAGCAGCTACAGGT
GTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGACTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCA
GTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTG
AAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGT
ACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGC
ACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGAA
CTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAAGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAG
GGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCC
CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGC
GCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCC
CTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC
GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC
AAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTC
CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGC
GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGC
GTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGT
GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC
AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGG
CAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAAC
CAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG
GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC
GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC
GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC
TCCCTGTCTCCGGGTAAATGAATTC(SEQ.I.D.NO：93).
HcLc轻链氨基酸序列示于SEQ.I.D.NO：94：
MRCSLQFLGVLMFWISGVSGDIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNW
FLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVSDRFSGSGSGTDFTLEISRVKAEDVGVYYCQQLVEYP
LTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ
SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
(SEQ.I.D.NO：94)
编码SEQ.I.D.NO：94的多核苷酸示于SEQ.I.D.NO：95：
AAGCTTGCCACCATGAGGTGCTCTCTTCAGTTTCTGGGGGTGCTTATGTTCTGGATCTCT
GGAGTCAGTGGGGATATTGTGATAACCCAGGATGAACTCTCCAATCCTGTCACTTCTGGA
GAATCAGTTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACA
TACTTGAATTGGTTTCTGCAGAGACCAGGACAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATTTGATG
TCCACCCGTGCATCAGGAGTCTCAGACCGGTTTAGTGGCAGTGGGTCAGGAACAGATTTC
ACCCTGGAAATCAGTAGAGTGAAGGCTGAGGATGTGGGTGTGTATTACTGTCAACAACTT
GTAGAGTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTACGGTGGCT
GCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCT
GTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGAC
AACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGC
ACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTC
TACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGG
GGAGAGTGTTAGGAATTC(SEQ.I.D.NO：95)
实施例18：人源化抗NOGO抗体与人NOGO结合
将1μg/ml GST-人NOGO-A56的50mM Tris(pH9.5)包被到NuncImmunosorp板(100μl/孔)上，在4℃过夜。各孔用TBS+0.05％吐温冲洗一次，再与2％BSA的TBS+0.05％吐温在室温下孵育1小时，以封闭非特异性结合位点。抗体在TBS+0.05％吐温+2％BSA中稀释至10μg/ml，由此再进行1/2的稀释。将抗体加入到各孔中，一式两份，在室温下孵育1小时。各孔用TBS+0.05％吐温洗涤3次，再与抗人κ过氧化物酶缀合物(1∶2000)孵育1小时。用TBS+0.05％吐温洗涤3次，再与100μl OPD过氧化物酶底物(Sigma)/孔一起孵育10分钟。加入25μl浓H2SO4，终止显色反应。用读板仪测定490nm处的光密度。减去从没有抗体的各孔中读取的背景值。
图35A-C显示在ELISA测定中，与嵌合(HcLc)相比，人源化抗体H1L11与人NOGO-A56的剂量依赖性结合。Y轴表示在490nm处测定的光密度(OD)，是对各孔中所捕获抗体的定量测定。X轴表示在每个数据点所用抗体浓度(μg/ml)/孔。抗体H1L11和HcLc的EC50值分别为0.118μg/ml和0.022μg/ml。
                                序列表
<110>葛兰素集团有限公司(Glaxo Group Limited)
Ellis，Jonathan H
Eon-Duval，Alexandre
Grundy，Robert I
Hussain，Farhana
McAdam，Ruth
Plumpton，Christopher
Prinjha，Rabinder K
Wison，Paul A
<120>免疫球蛋白
<130>GCN/PB60608
<140>PCT/GB2004/005325
<141>2004-12-20
<150>GB 0329684.5
<151>2003-12-22
<150>GB 0329711.6
<151>2003-12-22
<160>97
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>16
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>1
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
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<211>7
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
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<213>小家鼠(Mus musculus)
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<213>小家鼠(Mus musculus)
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<213>小家鼠(Mus musculus)
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Ser
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<213>小家鼠(Mus musculus)
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<213>小家鼠(Mus musculus)
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<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
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<213>小家鼠(Mus musculus)
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<213>小家鼠(Mus musculus)
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<213>小家鼠(Mus musculus)
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<213>小家鼠(Mus musculus)
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<213>小家鼠(Mus musculus)
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<213>小家鼠(Mus musculus)
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<213>小家鼠(Mus musculus)
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<213>小家鼠(Mus musculus)
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<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>17
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Gly
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<213>小家鼠(Mus musculus)
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<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
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<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
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<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
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<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
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<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>23
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<213>小家鼠(Mus musculus)
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<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
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<211>21
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<400>26
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<211>27
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<213>小家鼠(Mus musculus)
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<210>28
<211>21
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>28
ttcagttgct atgccatgtc t                                    21
<210>29
<211>51
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>29
tccattagtg atggtggtag ttacacctac tatccagaca atgtaaaggg c   51
<210>30
<211>18
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>30
gaactacttt ttgactac                                        18
<210>31
<211>48
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>31
aggtctagta agagtctcct gcatagtaat ggcaacactt acttgtat       48
<210>32
<211>21
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>32
cggatgtcca accttgcctc a                                    21
<210>33
<211>27
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>33
atgcaaca tctagaa tatcc gctcacg                             27
<210>34
<211>15
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>34
agctactgga tgaac                                           15
<210>35
<211>51
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>35
cagatttatc ctggagatgg tgatactaac tacaacggaa agttcaaggg c   51
<210>36
<211>12
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>36
cgctttgact at                                              12
<210>37
<211>113
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>37
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Glu Leu Gly Gln Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
            100                 105                 110
Ser
<210>38
<211>115
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Cys Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Ser Ile Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ser His Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Glu Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>39
<211>113
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>39
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Val Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
            100                 105                 110
Ser
<210>40
<211>112
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>40
Asp Ile Val Ile Thr Gln Asp Glu Leu Ser Asn Pro Val Thr Ser Gly
1               5                   10                  15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys
            20                  25                  30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Ser
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Glu Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Lys Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu
                85                  90                  95
Val Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
            100                 105                 110
<210>41
<211>112
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>41
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
                85                  90                  95
Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
            100                 105                 110
<210>42
<211>112
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>42
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
                85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
            100                 105                 110
<210>43
<211>339
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>43
caggtccaac tgcagcagcc tgggactgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagctg    60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg    120
cctggacaag gccttgagtg gattggaaat attaatccta gcaatggtgg tactaactac    180
aatgagaagt tcaagagcaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac    240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attattgtga actgggacag    300
ggctactggg gccaaggcac cactctcaca gtctcctca                           339
<210>44
<211>345
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>44
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc    60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt tgctatgcca tgtcttgggt tcgccagact    120
ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgcatcc attagtgatg gtggtagtta cacctactat    180
ccagacaatg taaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caacctgtac    240
ctgcaaatga gccatctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aaaggaacta    300
ctttttgact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca                    345
<210>45
<211>339
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>45
caggttcagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatt    60
tcctgcaaag cttctggcta cgcattcagt agctactgga tgaactgggt gaagcagagg    120
cctggaaagg gtcttgagtg gattggacag atttatcctg gagatggtga tactaactac    180
aacggaaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac    240
atgcagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct atttctgtgc agtacgcttt    300
gactattggg gccaaggcac cactctcaca gtctcctca                           339
<210>46
<211>336
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>46
gatattgtga taacccagga tgaactctcc aatcctgtca cttctggaga atcagtttcc    60
atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta tataaggatg ggaagacata cttgaattgg    120
tttctgcaga gaccaggaca atctcctcag ctcctgatct atttgatgtc cacccgtgca    180
tcaggagtct cagaccggtt tagtggcagt gggtcaggaa cagatttcac cctggaaatc    240
agtagagtga aggctgagga tgtgggtgtg tattactgtc aacaacttgt agagtatccg    300
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa                              336
<210>47
<211>336
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>47
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc    60
atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg    120
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt    180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc    240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcagagtac acatgttccg    300
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa                              336
<210>48
<211>336
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>48
gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc    60
atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttgtattgg    120
ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc    180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc    240
agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacatct agaatatccg    300
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa                              336
<210>49
<211>1407
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>49
aagcttgcca ccatgggatg gagctgtatc atcctctttt tggtagcagc agctacaggt    60
gtccactccc aggtccaact gcagcagcct gggactgaac tggtgaagcc tggggcttca    120
gtgaagctgt cctgcaaggc ttctggctac accttcacca gctactggat gcactgggtg    180
aagcagaggc ctggacaagg ccttgagtgg attggaaata ttaatcctag caatggtggt    240
actaactaca atgagaagtt caagagcaag gccacactga ctgtagacaa atcctccagc    300
acagcctaca tgcagctcag cagcctgaca tctgaggact ctgcggtcta ttattgtgaa    360
ctgggacagg gctactgggg ccaaggcaca ctagtcaccg tctcctcagc caaaacaaca  420
gccccatcgg tctatccact ggcccctgtg tgtggagata caactggctc ctcggtgact  480
ctaggatgcc tggtcaaggg ttatttccct gagccagtga ccttgacctg gaactctgga  540
tccctgtcca gtggtgtgca caccttccca gctgtcctgc agtctgacct ctacaccctc  600
agcagctcag tgactgtaac ctcgagcacc tggcccagcc agtccatcac ctgcaatgtg  660
gcccacccgg caagcagcac caaggtggac aagaaaattg agcccagagg gcccacaatc  720
aagccctgtc ctccatgcaa atgcccagca cctaacctcc tgggtggccc atccgtcttc  780
atcttccctc caaagatcaa ggatgtactc atgatctccc tgagccccat agtcacatgt  840
gtggtggtgg atgtgagcga ggatgaccca gatgtccaga tcagctggtt tgtgaacaac  900
gtggaagtac acacagctca gacacaaacc catagagagg attacaacag tactctccgg  960
gtggtcagtg ccctccccat ccagcaccag gactggatga gtggcaagga gttcaaatgc  1020
aaggtcaaca acaaagacct cccagcgccc atcgagagaa ccatctcaaa acccaaaggg  1080
tcagtaagag ctccacaggt atatgtcttg cctccaccag aagaagagat gactaagaaa  1140
caggtcactc tgacctgcat ggtcacagac ttcatgcctg aagacattta cgtggagtgg  1200
accaacaacg ggaaaacaga gctaaactac aagaacactg aaccagtcct ggactctgat  1260
ggttcttact tcatgtacag caagctgaga gtggaaaaga agaactgggt ggaaagaaat  1320
agctactcct gttcagtggt ccacgagggt ctgcacaatc accacacgac taagagcttc  1380
tcccggactc cgggtaaatg agaattc                                      1407
<210>50
<211>738
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>50
aagcttgcca ccatgaggtg ctctcttcag tttctggggg tgcttatgtt ctggatctct  60
ggagtcagtg gggatattgt gataacccag gatgaactct ccaatcctgt cacttctgga  120
gaatcagttt ccatctcctg caggtctagt aagagtctcc tatataagga tgggaagaca  180
tacttgaatt ggtttctgca gagaccagga caatctcctc agctcctgat ctatttgatg  240
tccacccgtg catcaggagt ctcagaccgg tttagtggca gtgggtcagg aacagatttc  300
accctggaaa tcagtagagt gaaggctgag gatgtgggtg tgtattactg tcaacaactt  360
gtagagtatc cgctcacgtt cggtgctggg accaagctgg agctgaaacg tacggatgct  420
gcaccgactg tatccatctt cccaccatcc agtgagcagt taacatctgg aggtgcctca  480
gtcgtgtgct tcttgaacaa cttctacccc aaagacatca atgtcaagtg gaagattgat  540
ggcagtgaac gacaaaatgg cgtcctgaac agttggactg atcaggacag caaagacagc  600
acctacagca tgagcagcac cctcacgttg accaaggacg agtatgaacg acataacagc  660
tatacctgtg aggccactca caagacatca acttcaccca ttgtcaagag cttcaacagg  720
aatgagtgtt aagaattc                                                738
<210>51
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠VH前导序列正向引物
<400>51
actagtcgac atgaaatgca gctgggtcat sttcttc                   37
<210>52
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠VH前导序列正向引物
<400>52
actagtcgac atgggatgga gctrtatcat sytctt                    36
<210>53
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠VH前导序列正向引物
<400>53
actagtcgac atgaagwtgt ggttaaactg ggttttt                   37
<210>54
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠VH前导序列正向引物
<400>54
actagtcgacatgractttg ggytcagctt grttt                      35
<210>55
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠VH前导序列正向引物
<400>55
actagtcgac atggactcca ggctcaattt agttttcctt                40
<210>56
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠VH前导序列正向引物
<400>56
actagtcgac atggctgtcy trgsgctrct cttctgc                   37
<210>57
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠VH前导序列正向引物
<400>57
actagtcgac atggratgga gckggrtctt tmtctt                    36
<210>58
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠VH前导序列正向引物
<400>58
actagtcgac atgagagtgc tgattctttt gtg                       33
<210>59
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠VH前导序列正向引物
<400>59
actagtcgac atggmttggg tgtggamctt gctattcctg                40
<210>60
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠VH前导序列正向引物
<400>60
actagtcgac atgggcagac ttacattctc attcctg                   37
<210>61
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠VH前导序列正向引物
<400>61
actagtcgac atggattttg ggctgatttt ttttattg                  38
<210>62
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠VH前导序列正向引物
<400>62
actagtcgac atgatggtgt taagtcttct gtacctg                   37
<210>63
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠VL前导序列正向引物
<400>63
actagtcgac atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg                40
<210>64
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠VL前导序列正向引物
<400>64
actagtcgac atggagwcag acacactcct gytatgggt                 39
<210>65
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠VL前导序列正向引物
<400>65
actagtcgac atgagtgtgc tcactcaggt cctggcgttg                40
<210>66
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠VL前导序列正向引物
<400>66
actagtcgac atgaggrccc ctgctcagwt tyttggmwtc ttg            43
<210>67
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠VL前导序列正向引物
<400>67
actagtcgac atggatttwc aggtgcagat twtcagcttc                40
<210>68
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠VL前导序列正向引物
<400>68
actagtcgac atgaggtkcy ytgytsagyt yctgrgg                   37
<210>69
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠VL前导序列正向引物
<400>69
actagtcga catgggcwtca agatggagtc acakwyycwg g              41
<210>70
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠VL前导序列正向引物
<400>70
actagtcgac atgtggggay ctktttycmm tttttcaatt g              41
<210>71
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠VL前导序列正向引物
<400>71
actagtcgac atggtrtccw casctcagtt ccttg                     35
<210>72
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠VL前导序列正向引物
<400>72
actagtcgac atgtatatat gtttgttgtc tatttct                   37
<210>73
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠VL前导序列正向引物
<400>73
actagtcgac atggaagccc cagctcagct tctcttcc                  38
<210>74
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
 <223>鼠VL前导序列正向引物
<400>74
actagtcgac atgaagtttc cttctcaact tctgctc                   37
<210>75
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠γ1恒定区反向引物
<400>75
ggatcccggg ccagtggata gacagatg                             28
<210>76
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠γ2b恒定区反向引物
<400>76
ggatcccggg agtggataga ctgatgg                              27
<210>77
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>鼠κ恒定区反向引物
<400>77
ggatcccggg tggatggtgg gaagatg                              27
<210>78
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>2A10 VH正向引物
<400>78
actcataagc ttgccaccat gggatggagc tgtatcatcc tctttttggt ag  52
<210>79
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VH反向引物
<400>79
actatgacta gtgtgccttg gccccagtag                           30
<210>80
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VL正向引物
<400>80
actcataagc ttgccaccat gaggtgctct cttcagtttc tg             42
<210>81
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>VL反向引物
<400>81
actatgcgta cgtttcagct ccagcttgg                            29
<210>82
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CAMPATH-1H信号序列
<400>82
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1                5                  10                  15
Val His Ser
<210>83
<211>120
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>83
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Gln Trp Leu Val Ile Leu Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>84
<211>113
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人源化VH构建体H1
<400>84
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
     50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Glu Leu Gly Gln Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
            100                 105                 110
Ser
<210>85
<211>112
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>85
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Gly Leu Val Tyr Ser
            20                  25                  30
Asp Gly Asp Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
                85                  90                  95
Thr His Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>86
<211>112
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人源化VL构建体L11
<400>86
Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
                5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys
            20                  25                  30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
         35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu
                85                  90                  95
Val Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>87
<211>201
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>87
Met Gln Glu Ser Leu Tyr Pro Ala Ala Gln Leu Cys Pro Ser Phe Glu
1               5                   10                  15
Glu Ser Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val Met Glu
            20                  25                  30
Ala Pro Leu Asn Ser Ala Val Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val Ile Gln
        35                  40                  45
Pro Ser Ser Ser Pro Leu Glu Ala Ser Ser Val Asn Tyr Glu Ser Ile
    50                  55                  60
Lys His Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala Met Ser Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Lys Val Ser Gly Ile Lys Glu Glu Ile Lys Glu Pro Glu
                85                  90                  95
Asn Ile Asn Ala Ala Leu Gln Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile Ser Ile
            100                 105                 110
Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Ala Glu Pro Ala Pro
        115                 120                 125
Asp Phe Ser Asp Tyr Ser Glu Met Ala Lys Val Glu Gln Pro Val Pro
    130                 135                 140
Asp His Ser Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ser Glu Pro Val
145                 150                 155                 160
Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro Asp Val Pro Gln Lys Gln Asp
                165                 170                 175
Glu Thr Val Met Leu Val Lys Glu Ser Leu Thr Glu Thr Ser Phe Glu
            180                 185                 190
Ser Met Ile Glu Tyr Glu Asn Lys Glu
        195                 200
<210>88
<211>462
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗NOGO抗体重链
<400>88
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1               5                   10                  15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
        35                  40                  45
Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln AlaPro Gly Gln Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Met Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Glu Lys Phe Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser
                85                  90                  95
Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Glu Leu Gly Gln Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
        115                 120                 125
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
    130                 135                 140
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
145                 150                 155                 160
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
                165                 170                 175
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
            180                 185                 190
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
        195                 200                 205
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
    210                 215                 220
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
225                 230                 235                 240
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe
                245                 250                 255
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
            260                 265                 270
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
        275                 280                 285
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
    290                 295                 300
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
305                 310                 315                 320
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
                325                 330                 335
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
            340                 345                 350
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
        355                 360                 365
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
    370                 375                 380
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
385                 390                 395                 400
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
                405                 410                 415
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
            420                 425                 430
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
        435                 440                 445
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    450                 455                 460
<210>89
<211>238
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗NOGO抗体轻链
<400>89
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1               5                 10                  15
Val His Ser Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val
            20                  25                  30
Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu
        35                  40                  45
Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro
    50                  55                  60
Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser
65                  70                  75                  80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
                85                  90                  95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
            100                 105                 110
Gln Gln Leu Val Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu
        115                 120                 125
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
    130                 135                 140
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145                 150                 155                 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
                165                 170                 175
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
            180                 185                 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
        195                 200                 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
    210                 215                 220
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
<210>90
<211>1428
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码SEQ ID N0：88的多核苷酸
<400>90
aagctttaca gttactcagc acacaggacc tcaccatggg atggagctgt atcatcctct  60
tcttggtagc aacagctaca ggtgtccact cccaggtgca gctggtgcag tctggggctg  120
aggtgaagaa gcctggggcc tcagtgaagg tttcctgcaa ggcatctgga tacaccttca  180
ccagctactg gatgcactgg gtgcgacagg cccctggaca agggcttgag tggatgggaa  240
atattaatcc tagcaatggt ggtactaact acaatgagaa gttcaagagc agagtcacca  300
tgaccaggga cacgtccacg agcacagtct acatggagct gagcagcctg agatctgagg  360
acacggccgt gtattactgt gaactgggac agggctactg gggccaggga acactagtca  420
cagtctcctc agcctccacc aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga  480
gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg  540
tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc  600
tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg  660
gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga  720
aagttgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac  780
tcgcgggggc accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct  840
cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca  900
agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg  960
agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc  1020
tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga  1080
aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat  1140
cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc  1200
ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca  1260
cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca  1320
agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca  1380
accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa atgaattc               1428
<210>91
<211>758
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码SEQ ID NO：89的多核苷酸
<400>91
aagctttaca gttactcagc acacaggacc tcaccatggg atggagctgt atcatcctct    60
tcttggtagc aacagctaca ggtgtccact ccgatattgt gataacccag tctccactct    120
ccctgcccgt cacccttgga cagccggcct ccatctcctg caggtctagt aagagtctcc    180
tatataagga tgggaagaca tacttgaatt ggtttcagca gaggccaggc caatctccac    240
agctcctaat ttatttgatg tccacccgtg catctggggt cccagacaga ttcagcggcg    300
gtgggtcagg cactgatttc acactgaaaa tcagcagggt ggaggctgag gatgttgggg    360
tttattactg ccaacaact tgtagagtatc cgctcacgtt tggccagggg accaagctgg    420
agatcaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt    480
tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca    540
aagtacagtg gaaggtggac aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag    600
agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag    660
actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg    720
tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt aggaattc                            758
<210>92
<211>462
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HcLc的重链序列
<400>92
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1               5                   10                  15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
        35                  40                  45
Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Glu Leu Gly Gln Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
        115                 120                 125
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
    130                 135                 140
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
145                 150                 155                 160
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
                165                 170                 175
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
            180                 185                 190
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
        195                 200                 205
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
    210                 215                 220
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
225                 230                 235                 240
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
                245                 250                 255
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
            260                 265                 270
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
        275                 280                 285
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
    290                 295                 300
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
305                 310                 315                 320
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
                325                 330                 335
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
            340                 345                 350
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
        355                 360                 365
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
    370                 375                 380
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
385                 390                 395                 400
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
                405                 410                 415
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
            420                 425                 430
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
        435                 440                 445
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    450                 455                 460
<210>93
<211>1405
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码SEQ ID NO：92的多核苷酸
<400>93
aagcttgcca ccatgggatg gagctgtatc atcctctttt tggtagcagc agctacaggt  60
gtccactccc aggtccaact gcagcagcct gggactgaac tggtgaagcc tggggcttca  120
gtgaagctgt cctgcaaggc ttctggctac accttcacca gctactggat gcactgggtg  180
aagcagaggc ctggacaagg ccttgagtgg attggaaata ttaatcctag caatggtggt  240
actaactaca atgagaagtt caagagcaag gccacactga ctgtagacaa atcctccagc  300
acagcctaca tgcagctcag cagcctgaca tctgaggact ctgcggtcta ttattgtgaa  360
ctgggacagg gctactgggg ccaaggcaca ctagtcacag tctcctcagc ctccaccaag  420
ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc  480
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc  540
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc  600
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac  660
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac  720
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc  780
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc  840
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc  900
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt  960
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc  1020
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg  1080
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac  1140
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg  1200
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac  1260
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac  1320
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc  1380
tccctgtctc cgggtaaatg aattc                                        1405
<210>94
<211>239
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HcLc的轻链序列
<400>94
Met Arg Cys Ser Leu Gln Phe Leu Gly Val Leu Met Phe Trp Ile Ser
1               5                   10                  15
Gly Val Ser Gly Asp Ile Val Ile Thr Gln Asp Glu Leu Ser Asn Pro
            20                  25                  30
Val Thr Ser Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser
        35                  40                  45
Leu Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Arg
    50                  55                  60
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala
65                  70                  75                  80
Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
                85                  90                  95
Thr Leu Glu Ile Ser Arg Val Lys Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
            100                 105                 110
Cys Gln Gln Leu Val Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys
        115                 120                 125
Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
    130                 135                 140
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
                165                 170                 175
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
            180                 185                 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
        195                 200                 205
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
    210                 215                 220
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
<210>95
<211>738
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码SEQ ID NO：94的多核苷酸
<400>95
aagcttgcca ccatgaggtg ctctcttcag tttctggggg tgcttatgtt ctggatctct  60
ggagtcagtg gggatattgt gataacccag gatgaactct ccaatcctgt cacttctgga  120
gaatcagttt ccatctcctg caggtctagt aagagtctcc tatataagga tgggaagaca  180
tacttgaatt ggtttctgca gagaccagga caatctcctc agctcctgat ctatttgatg  240
tccacccgtg catcaggagt ctcagaccgg tttagtggca gtgggtcagg aacagatttc  300
accctggaaa tcagtagagt gaaggctgag gatgtgggtg tgtattactg tcaacaactt  360
gtagagtatc cgctcacgtt cggtgctggg accaagctgg agctgaaacg tacggtggct  420
gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct  480
gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggac  540
aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc  600
acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc  660
tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg  720
ggagagtgtt aggaattc                                                738
<210>96
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>基序
<400>96
Tyr Glu Asn Pro
1
<210>97
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>基序
<400>97
Lys Lys Gln Asn
1

Claims (33)

1.一种抗体或其功能片段，所述抗体或其功能片段与人NOGO结合并中和人NOGO。
2.权利要求1的抗体，所述抗体与人NOGO-A蛋白的氨基酸586-785之间的区域结合。
3.权利要求2的抗体，所述抗体与人NOGO-A的氨基酸586-685之间的区域结合。
4.权利要求2的抗体，所述抗体与人NOGO-A的氨基酸686-785之间的区域结合。
5.权利要求1的抗体，所述抗体包含以下各种CDR：
轻链CDR：SEQ ID NO：1、2和3；
重链CDR：SEQ ID NO：4、5和6。
6.权利要求1的抗体，所述抗体包含以下各种CDR：
轻链CDR：SEQ ID NO：7、8和9；
重链CDR：SEQ ID NO：10、11和12。
7.权利要求1的抗体，所述抗体包含以下各种CDR：
轻链CDR：SEQ ID NO：13、14和15；
重链CDR：SEQ ID NO：16、17和18。
8.权利要求5的抗体，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含选自CDRH1、CDRH2和CDRH3的各种CDR，所述轻链可变区包含一个或多个选自CDRL1、CDRL2和CDRL3的CDR。
9.权利要求6的抗体，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含选自CDRH1、CDRH2和CDRH3的各种CDR，所述轻链可变区包含一个或多个选自CDRL1、CDRL2和CDRL3的CDR。
10.权利要求7的抗体，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含选自CDRH1、CDRH2和CDRH3的各种CDR，所述轻链可变区包含一个或多个选自CDRL1、CDRL2和CDRL3的CDR。
11.权利要求1-10中任一项的抗体，所述抗体是单克隆抗体。
12.权利要求1-13中任一项的抗体，所述抗体是人源化抗体或嵌合抗体。
13.权利要求8的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列。
14.权利要求9的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列。
15.权利要求10的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列。
16.权利要求8或13的抗体，其中所述轻链可变区包含SEQ IDNO：40所示的氨基酸序列。
17.权利要求9或14的抗体，其中所述轻链可变区包含SEQ IDNO：41所示的氨基酸序列。
18.权利要求10或15的抗体，其中所述轻链可变区包含SEQ IDNO：42所示的氨基酸序列。
19.一种药物组合物，所述组合物包含前述权利要求中任一项的抗NOGO抗体或其功能片段以及药学上可接受的稀释剂或载体。
20.一种治疗或预防人的中风和其它神经科疾病的方法，所述方法包括给予有需要的人有效量的权利要求1-18中任一项的抗NOGO抗体，包括改变的抗体或其功能片段。
21.包括改变的抗体或其功能片段在内的权利要求1-18中任一项的抗NOGO抗体在制备用于治疗或预防中风和其它神经科疾病的药物中的用途。
22.一种抑制病人的神经变性和/或促进功能恢复的方法，所述方法包括给予有需要的病人有效量的权利要求1-18中任一项的抗NOGO抗体，包括改变的抗体或其功能片段；所述病人患有中风或其它神经科疾病或者处于发生所述疾病的危险之中。
23.包括改变的抗体或其功能片段在内的权利要求1-18中任一项的抗NOGO抗体在制备用于抑制病人的神经变性和/或促进功能恢复的药物中的用途，所述病人患有中风和其它神经科疾病或者处于发生所述疾病的危险之中。
24.一种治疗或预防人的中风或其它神经科疾病/障碍的方法，所述方法包括将治疗有效量的权利要求1-18中任一项的抗NOGO抗体经胃肠外给予所述人的步骤。
25.权利要求24的方法，其中所述抗NOGO抗体经静脉内给药。
26.权利要求20-24中任一项的方法，其中所述其它神经科疾病选自创伤性脑损伤、脊髓损伤、阿尔茨海默病、额颞痴呆(tau蛋白病)、周围神经科疾病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病和多发性硬化。
27.一种促进轴突萌生的方法，所述方法包括使人体轴突与权利要求1-18中任一项的抗NOGO抗体接触的步骤。
28.权利要求27的方法，其中所述方法是体外方法。
29.一种产生权利要求1-18中任一项的抗NOGO抗体的方法，所述抗体与人NOGO-A特异性结合并中和其活性，所述方法包括下述步骤：
(a)提供编码所述抗体重链的第一载体；
(b)提供编码所述抗体轻链的第二载体；
(c)用所述第一和第二载体共转染哺乳动物宿主细胞；
(d)在允许步骤(c)的宿主细胞将所述抗体分泌到所述培养基中的条件下，在培养基、优选无血清培养基中培养所述宿主细胞；
(e)回收步骤(d)分泌的抗体。
30.一种产生抗NOGO抗体的方法，所述抗体竞争性抑制权利要求1-18中任一项的抗体的结合，所述方法包括下述步骤：
(a)提供编码所述抗体重链的第一载体；
(b)提供编码所述抗体轻链的第二载体；
(c)用所述第一和第二载体共转染哺乳动物宿主细胞；
(d)在允许步骤(c)的宿主细胞将所述抗体分泌到所述培养基中的条件下，在培养基、优选无血清培养基中培养所述宿主细胞；
(e)回收步骤(d)分泌的抗体。
31.一种产生静脉内给药用药物组合物的方法，所述组合物包含与NOGO-A结合并中和其活性的抗NOGO抗体，所述方法包括下述步骤：
(a)提供编码所述抗体重链的第一载体；
(b)提供编码所述抗体轻链的第二载体；
(c)将所述第一和第二载体导入例如共转染到哺乳动物宿主细胞中；
(d)在培养基、优选无血清培养基中培养步骤(c)的宿主细胞，其中所述宿主细胞将包含轻链和重链的抗体分泌到所述培养基中；
(e)回收并任选纯化步骤(d)分泌的抗体；
(f)将步骤(e)的抗体掺入到静脉内给药用药物组合物中。
32.一种产生抗NOGO抗体的方法，所述抗体与人NOGO-A在氨基酸586-785、尤其是586-685或686-785之间结合并中和所述NOGO-A的活性，所述方法包括下述步骤：
(a)提供编码所述抗体重链的第一载体；
(b)提供编码所述抗体轻链的第二载体；
(c)将所述第一和第二载体导入例如共转染到哺乳动物宿主细胞中；
(d)在培养基、优选无血清培养基中培养步骤(c)的宿主细胞，其中所述宿主细胞将包含轻链和重链的抗体分泌到所述培养基中；
(e)回收并任选纯化步骤(d)分泌的抗体。
33.权利要求29-31中任一项的方法，其中所述宿主细胞选自：NS0 Sp2/o、CHO、COS、成纤维细胞，例如3T3，尤其是CHO。
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CN109954136A (zh) * 2017-12-14 2019-07-02 深圳市中科艾深医药有限公司 人sDR5-Fc重组融合蛋白作为脑卒中治疗药物的应用
WO2024041450A1 (zh) * 2022-08-22 2024-02-29 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 特异性识别Nogo-A的抗体及其应用

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