JP4504200B2 - 抗体(“11c7”)抗nogoaおよびその薬学的使用 - Google Patents
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Description
a)順に超可変領域CDR1−11C7、CDR2−11C7およびCDR3−11C7(該CDR1−11C7は配列番号8のアミノ酸配列を有し、該CDR2−11C7は配列番号9のアミノ酸配列を有し、そして該CDR3−11C7は配列番号10のアミノ酸配列を有する);または
b)順に超可変領域CDR1'−11C7、CDR2'−11C7およびCDR3'−11C7(該CDR1'−11C7は配列番号11のアミノ酸配列を有し、該CDR2'−11C7は配列番号12のアミノ酸配列を有し、そして該CDR3'−11C7は配列番号13のアミノ酸配列を有する);または
c)それらの直接等価物
のいずれかを含む。
a)順に超可変領域CDR1−11C7、CDR2−11C7およびCDR3−11C7を含む第一ドメイン(該CDR1−11C7は配列番号8のアミノ酸配列を有し、該CDR2−11C7は配列番号9のアミノ酸配列を有し、そして該CDR3−11C7は配列番号10のアミノ酸配列を有する);および
b)順に超可変領域CDR1'−11C7、CDR2'−11C7およびCDR3'−11C7を含む第二ドメイン(該CDR1'−11C7は配列番号11のアミノ酸配列を有し、該CDR2'−11C7は配列番号12のアミノ酸配列を有し、そして該CDR3'−11C7は配列番号13のアミノ酸配列を有する);または
c)それらの直接等価物
を含む。
a)11C7の重鎖の可変部分(配列番号2);または
b)11C7の軽鎖の可変部分(配列番号3)、またはそれらの直接等価物
のいずれかを含む、少なくとも1つの抗原結合部位を含む。
a)(i)順に超可変領域CDR1−11C7、CDR2−11C7およびCDR3−11C7を含む可変ドメインおよび(ii)ヒト重鎖の定常部分またはそのフラグメントを含む一つの免疫グロブリン重鎖またはそのフラグメント(該CDR1−11C7は配列番号8のアミノ酸配列を有し、該CDR2−11C7は配列番号9のアミノ酸配列を有し、そして該CDR3−11C7は配列番号10のアミノ酸配列を有する)、および
b)(i)順に超可変領域CDR1'−11C7、CDR2'−11C7およびCDR3'−11C7を含む可変ドメインおよび(ii)ヒト軽鎖の定常部分またはそのフラグメントを含む一つの免疫グロブリン軽鎖またはそのフラグメント(該CDR1'−11C7は配列番号11のアミノ酸配列を有し、該CDR2'−11C7は配列番号12のアミノ酸配列を有し、そして該CDR3'−11C7は配列番号13のアミノ酸配列を有する);または
それらの直接等価物
を含む。
a)順に超可変CDR1−11C7、CDR2−11C7およびCDR3−11C7を含む第一ドメイン(該CDR1−11C7は配列番号8のアミノ酸配列を有し、該CDR2−11C7は配列番号9のアミノ酸配列を有し、そして該CDR3−11C7は配列番号10のアミノ酸配列を有する);および
b)順に超可変CDR1'−11C7、CDR2'−11C7およびCDR3'−11C7を含む第二ドメイン(該CDR1'−11C7は配列番号11のアミノ酸配列を有し、該CDR2'−11C7は配列番号12のアミノ酸配列を有し、そして該CDR3'−11C7は配列番号13のアミノ酸配列を有する);および
c)第一ドメインのN−末端と第二ドメインのC−末端、または、第一ドメインのC−末端と第二ドメインのN−末端のいずれかに結合するペプチドリンカー;
またはそれらの直接等価物
を含む、抗原結合部位を含む。
(i)結合分子の超可変領域CDR1、CDR2およびCDR3の各々が、CDR1−11C7(配列番号8)、CDR2−11C7(配列番号9)およびCDR3−11C7(配列番号10)の等価超可変領域に少なくとも50%または80%相同、好ましくは少なくとも90%相同、より好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%、99%相同であり、ここで、CDR1はCDR1−11C7と等価であり、CDR2はCDR2−11C7と等価であり、CDR3はCDR3−11C7と等価である;および
(ii)ヒトNogoA、ヒトNiG、ヒトNiG−D20またはヒトNogoA_623−640と、好ましくは解離定数(Kd)<1000nMで、より好ましくはKd<100nMで、最も好ましくはKd<10nMで結合できる
本発明の任意の単一ドメイン結合分子(分子X)、または
(iii)超可変領域CDR1、CDR2、CDR3、CDR1'、CDR2'およびCDR3'の各々が、CDR1−11C7(配列番号8)、CDR2−11C7(配列番号9)、CDR3−11C7(配列番号10)、CDR1'−11C7(配列番号11)、CDR2'−11C7(配列番号12)およびCDR3'−11C7(配列番号13)の等価超可変領域と少なくとも50%または80%相同、好ましくは少なくとも90%相同、より好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%、99%同一であり、ここで、CDR1はCDR1−11C7と等価であり、CDR2はCDR2−11C7と等価であり、CDR3はCDR3−11C7と等価であり、CDR1'はCDR1'−11C7と等価であり、CDR2'はCDR2'−11C7と等価であり、CDR3'はCDR3'−11C7と等価である;および
(iv)ヒトNogoA、ヒトNiG、ヒトNiG−D20またはヒトNogoA_623−640を、好ましくは解離定数(Kd)<1000nMで、より好ましくはKd<100nMで、最も好ましくはKd<10nMで結合できる、
結合部位あたり少なくとも2つのドメインを有する任意の本発明の結合分子(分子X')のいずれかを意味する。
・順に超可変領域CDR1、CDR2およびCDR3(その中で各超可変領域はそれらの等価超可変領域CDR1−11C7(配列番号8)、CDR2−11C7(配列番号9)およびCDR3−11C7(配列番号10)と少なくとも50%、好ましくは80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%相同である);または
・順に超可変領域CDR1'、CDR2'およびCDR3'(その中で各超可変領域はそれらの等価超可変領域CDR1'−11C7(配列番号11)、CDR2'−11C7(配列番号12)およびCDR3'−11C7(配列番号13)と少なくとも50%、好ましくは80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%相同である)
のいずれかを含む、結合分子である。
・順に超可変領域CDR1、CDR2およびCDR3を含む第一抗原結合部位(その中で各超可変領域はそれらの等価超可変領域CDR1−11C7(配列番号8)、CDR2−11C7(配列番号9)およびCDR3−11C7(配列番号10)と少なくとも50%、好ましくは80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%相同である);および
・順に超可変領域CDR1'、CDR2'およびCDR3'を含む第二抗原結合部位(その中で各超可変領域はそれらの等価超可変領域CDR1'−11C7(配列番号11)、CDR2'−11C7(配列番号12)およびCDR3'−11C7(配列番号13)と少なくとも50%、好ましくは80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%相同である)
結合分子。
最大相同性パーセントを達成するように、必要であれば、配列を整列し、ギャップを挿入した後の、対応する天然ポリペプチドの残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基の割合として定義し、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない。N−またはC−末端伸長も挿入も、同一性または相同性を減少させるものと解釈すべきではない。アラインメントのための方法およびコンピュータープログラムは既知である。
(i)本発明の単一ドメイン結合分子、本発明の一本鎖結合分子、本発明の結合分子の重鎖または軽鎖もしくはそれらのフラグメントをコードするDNA分子;および
(ii)組み換え手段により本発明の結合分子を製造するための本発明のDNA分子使用
が提供される。
本第一DNA構築物は重鎖またはそのフラグメントをコードし、かつ、
a)フレームワークおよび超可変領域を交互に含み、該超可変領域が順にDNA−CDR1−11C7(配列番号15)、DNA−CDR2−11C7(配列番号16)およびDNA−CDR3−11C7(配列番号17)を含む可変ドメインをコードする第一部分;この第一部分は可変ドメインの最初のアミノ酸をコードするコドンで開始し、可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる、そして
b)重鎖の定常部分の最初のアミノ酸をコードするコドンで開始し、定常部分またはそのフラグメントの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わり、非センスコドンに続く重鎖定常部分またはそのフラグメントをコードする第二部分
を含む。
a)フレームワークおよび超可変領域を交互に含む可変ドメインをコードする第一部分;該超可変領域は順にDNA−CDR1'−11C7(配列番号17)、DNA−CDR2'−11C7(配列番号18)およびDNA−CDR3'−11C7(配列番号19)を含み、この第一部分は可変ドメインの最初のアミノ酸をコードするコドンで開始し、可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる、そして、
b)軽鎖の定常部分の最初のアミノ酸をコードするコドンで開始し、定常部分またはそのフラグメントの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わり、非センスコドンに続く軽鎖定常部分またはそのフラグメントをコードする第二部分
を含む。
(i)本発明の第一DNA構築物を導入された第一生物を培養し、その培養から該重鎖またはそのフラグメントを回収し、そして
(ii)本発明の第二DNA構築物を導入された第二生物を培養し、その培養から軽鎖またはそのフラグメントを回収し、そして
(iii)(i)で得た重鎖またはそのフラグメントと(ii)で得た軽鎖またはそのフラグメントから、インビトロで活性の本発明の結合分子を再構築する
ことを含み得る。
(i)本発明の一本鎖または単一ドメイン結合分子を各々コードするDNA構築物を導入された生物を培養し、そして
(ii)該分子を培養から回収する
ことを含む、本発明の一本鎖または単一ドメイン結合分子の製造法も提供する。
分離した小脳顆粒細胞からの神経突起伸長を記載のように測定する(Niederoest et al. (1999)J.Neurosci. 19: 8979-8989)。簡単に言えば、断頭した生後5−7日のラットから小脳を摘出し、トリプシン処理により分離する。繊維芽細胞混入を減らすために、この細胞を細菌皿で予備培養する。ウェルあたり75,000細胞を次いで4−ウェルGreiner組織培養(Huber & Co AG, Rheinach, Basel)皿(ウェル表面:1cm2)中の培地(B27 serum replacement添加Neurobasal、Invitrogen)中で培養する。培養皿をポリ−L−リジン(Sigma)でコートする。成熟ラットの全脊髄ホモジネートからのChaps抽出タンパク質(Spillmann et al. (1998)J. Biol. Chem. 273:19283-19293)で、0.5から8μg/ウェルまでのタンパク質濃度で一晩4℃でコートし、洗浄する。本発明の結合分子を次いで30分試験基質上でプレインキュベートし、細胞を添加する前に除去する。小脳顆粒細胞を添加し、24時間インキュベートする。実験を停止するために、2mlの4%緩衝化ホルムアルデヒドをゆっくり培養皿に添加する。次いで、培養物を、増殖関連タンパク質GAP−43については免疫蛍光法で、細胞核に関してはHoechstで染色する(顆粒細胞は、全ての細胞が神経突起を有するかどうかを見るためにHoechstで染色する(神経突起は抗−GAP−43で可視化する))。三枚の写真を、Zeiss Axiophot Fluorescence Microscopeの40倍対物レンズを用いて、各ウェルの上部、底部および側面の端を定めた距離から無作為に撮る。視野中の全ての神経突起を、番号を振った無作為に配置した写真上で計数する。反応(顆粒細胞神経突起の伸長)は、約0.1−10μg総タンパク質/ウェルの範囲で用量依存性である(一定濃度の調製物の特異活性はこの範囲内で変化する)。
成熟Lewisラットを、顕微鏡手術で、第八胸椎の位置で、脊髄の両側の背面側半分を離断することにより傷害する。椎弓切除術、麻酔および手術はSchnell and Schwab 1993(Eur.J. Neurosci. 5:1156-1171)に記載されている。コントロールまたは本発明の結合分子を2つの異なる方法:106の新たに回収したハイブリドーマ細胞を大脳皮質の片側にインプラントすることにより(移植動物)、または、別法として皮下にインプラントした2ml Alzet(Alza Corporation, Palo Alto)ポンプに接続したインプラントした脳室内カニューレ(ポンプ動物)のいずれかにより適用する。−ハイブリドーマ移植動物:ラットをシクロスポリンAで7−10日免疫抑制し、損傷14日後に4%緩衝化ホルマリンの経心腔的潅流(transcardial perfusion)により殺す。−ポンプ動物:本発明の結合分子(例えばマウス11C7に関して3.3mg/ml)を、2週間、側脳室に0.5μl/時間で輸送する2mlポンプに入れる。ポンプを脊髄損傷時にインプラントし、ラットを2週間後に殺す。
(i)哺乳類神経系、特にヒト神経系の神経修復における、本発明の結合分子の使用、
(ii)哺乳類神経系、特にヒト神経系を修復する方法であり、このような処置を必要とする患者に有効量の本発明の結合分子を投与することを含む方法、または
(iii)本発明の結合分子および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、哺乳類神経系、特にヒト神経系の神経修復のための医薬組成物
を提供する。
本明細書で使用する“非定型抗精神病剤”なる用語は、クロザリル、リスペリドン、オランザピン、クエチアピン、ジプラシドンおよびアリピプラゾールを含むが、これらに限定されない。
図1:配列比較:11C7mAbに対する免疫原性ペプチド配列を示す、異なる種由来のNiGの配列比較である。
以下の実施例において、全ての温度は摂氏(℃)である。
ELISA 酵素結合免疫吸着検定法
FACS 蛍光標示式細胞分取器
FITC フルオレッセインイソチオシアネート
FBS ウシ胎児血清
HCMV ヒトサイトメガロウイルスプロモーター
IgG 免疫グロブリンイソタイプG
MAb モノクローナル抗体
PBS リン酸緩衝化食塩水
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
方法:
a)ラットNogo−A欠失ライブラリー:欠失構築物を内部制限部位を使用して、エキソヌクレアーゼIII/マング・ビーン・ヌクレアーゼ処理により、および、ラットNogo−:ラットNogo−A(aa 1−1163;以後に示すDNAは、ラットNogoA(配列番号26)のアミノ酸と関連付けて示し、例えばaa 1−1163は、cDNA構築物がNogoAのラットポリペプチド配列のアミノ酸1位から開始し、アミノ酸1163位で終わるポリペプチドをコードすることを意味する)、ラットNogo−B(aa 1−172+976−1163)、ラットNogo−C(Nogo−C N−末端11 aa+aa 976−1163)、ラットNogo−66(aa 1019−1083)、ラットGST−Nogo−66(aa 1026−1091)、ラットNiR−G(aa 1−979)、ラットNiR(1−172)、ラットNiR−D1(aa 1−31)、ラットNiR−D2(aa 59−172)、ラットNiR−D3(aa 1−31+59−172)、ラットEST−Nogo1(aa 762−1163)、ラットNiG(aa 174−979)、ラットNiG−D1(aa174−909)、ラットNiG−D2(aa 174−865)、ラットNiG−D3(aa 172−723)、ラットNiG−D4(aa 172−646)、ラットNiG−D5(aa 293−647)、ラットNiG−D6(aa 763−975)、ラットNiG−D7(aa 174−235+294−979)、ラットNiG−D8(aa 218−653)、ラットNiG−D9(aa 172−259+646−974)、ラットNiG−D10(aa 293−979)、ラットNiG−D11(aa 209−268)、ラットNiG−D12(aa 198−233)、ラットNiG−D13(aa 174−216)、ラットNiG−D14(aa 174−260)、ラットNiG−D15(aa 174−190+493−979)、ラットNiG−D16(aa 174−190+621−979)、ラットNiG−D17(aa 174−190+259−979)、ラットNiG−D18(aa 174−190+263−979)、ラットNiG−D19(aa 763−865)、ラットNiG−D20(aa 544−725)、ラットNiG−D21(aa 812−918)、ラットNiG−D22(aa 866−975)、ラットNiG−D23(aa 914−975)、ラットNiG−D24(aa 544−685)、ラットNiG−D25(aa 614−725)、ラットNiG−D26(aa 544−613)、ラットNiG−D27(aa 581−648)、ラットNiG−D28(aa 614−685)、ラットNiG−D29(aa 648−725)、ラットNiG−D30(aa 682−725)、ラットNiG−D31(aa 544−580)、ラットNiG−D32(aa 581−613)、ラットNiG−D33(aa 614−648)、ラットNiG−D34(aa 648−685)、ラットNiG−D35(aa 260−556)、ラットNiG−D36(aa 260−415)のラットNogo−A−特異的プライマーでのPCRにより製造する(方法はWO00/31235の通り)。NiR−GおよびNiR−aは、Nogo−A−pET28から制限酵素消化により生じた。NiGは、NiR−Gから制限消化およびマング・ビーン・ヌクレアーゼ処理により生じた。NiG−D1、−D3、−D4、−D5、−D7、−D8、−D9、−D10は、NiG−pET28から制限酵素消化により生じた。NiG−D15、−D16、−D17、−D18はNiG−pET28からエキソヌクレアーゼIII消化により生じた。NiR−b、NiR−D1、−D2、−D3は、NiR−a−pET28を鋳型としたPCRにより生じた。NiG−D2、−D6、−D11、−D12、−D13、−D14、−D19、−D20、−D21、−D22、−D23、−D24、−D25、−D26、−D27、−D28、−D29、−D30、−D31、−D32、−D33、−D34、−D35、−D36は、NiG−pET28を鋳型として使用するPCRにより生じた。全ての構築物をpET28にサブクローニングする。上記の全ての構築物にpET28を使用した。GST−Nogo66にpGEX−6Pを、ラットNiGの周辺質発現にpET26を使用した。ヒトGST−Nogo−66(ヒトNogo−Aのaa 1055−1120)を、鋳型としてのヒトNogoA DNA(配列番号4)上のPCRによりクローン化する。欠失構築物を次いでpET28ベクター(Novagen)、pGEX−6P(Amersham Pharmacia Biotech)およびpET26ベクター(Novagen)にクローン化する。ヒトGST−Nogo−66は、GrandPre et al. (前掲)により公表されたGST−nogoタンパク質に対応する。合成ラットペプチド4 EELVQKYSNSALGHVNSTIKELRRL(配列番号27)は、ヒトペプチド4(ヒトペプチド4は、Nogo−66ドメインの阻害性領域であることが示されている(GrandPre et al., 2000))に対応する。オーソロガスラットペプチドは一つのミスマッチC−>Sを含む(GrandPre et al., 2000, 前掲のペプチド4配列参照)。合成Pro/Serに富むペプチドPSSPPPSSPPPSSPPPS(配列番号28)ならびにラットペプチド4はPrimm SAにより製造され、HPLC−精製されている。ヒトNogoA_623−640(配列番号6)はResearch Genetics Incにより合成され、精製されている。
a)Nogo−AのN−末端における2つの領域は、3T3繊維芽細胞の延展に関して阻害性である:3T3繊維芽細胞延展の阻害を担うNogo−Aの領域を同定するために、50個のNogo欠失構築物ライブラリーを作成し、組み換えタンパク質を細菌中で発現させる(方法1a参照)。3T3繊維芽細胞延展阻害に対する見かけのEC50は、400−500ng/0.1ml Nogo−A一晩被覆/培養皿cm2(〜4pmol/cm2)であった。Nogo−Aまたはそのフラグメントの8M 尿素での処置は、阻害活性の著しい減少をもたらし、この構造が重要であることを示唆する。繊維芽細胞延展アッセイでのNogoフラグメントの分析は、少なくとも2つのNogo−Aタンパク質の範囲が新たに培養した繊維芽細胞の延展を阻害し、この2つはNiR−D2(aa 59−172)およびNiG−D20(aa 544−725)であることを明らかにする。NiG−領域由来の全てのフラグメントが阻害活性(例えばNiG−D4およびNiG−D8)を示し、一部NiG−D20と重複する。高タンパク質濃度でのわずかな阻害活性が、NiG−D6領域中のNiG−D19で観察される。Nogo−C、Nogo−66およびラットペプチド4(GrandPre et al., 2000により、Nogo−66の阻害性領域であるはずであると示されている)は繊維芽細胞延展に阻害性ではない。これらのデータは、3T3繊維芽細胞におけるNogo−Aの抗−延展活性が、N−末端(NiR−D2)に位置する2つの定義された範囲およびタンパク質のNogo−A−特異的部分(NiG−D20)に帰することを示す。非特異的物理化学的特性(フラグメントの酸性度、プロリンおよびセリン残基による構造的効果)はこの効果の原因ではない。C−末端RTNドメインは、繊維芽細胞延展の阻害に関与しない。
方法:
a)放射活性標識および結合実験:IMAC−精製NiG−D20を、ラクトペルオキシダーゼを使用したANAWA Trading SA(Wangen, Switzerland)(2,030Ci/mmol)のヨウ素化、逆相HPLCにより精製する。ラット脳皮質からの膜を記載のように調製する(Olpe HR, Karlsson G, Pozza MF, Brugger F, Steinmann M, Van Riezen H, Fagg G, Hall RG, Froestl W, Bittiger H(1990)CGP 35348:a centrally active blocker of GABAB receptors. Eur.J.Pharmacol. 187:27-38)。非特異的結合を減少させるために2時間、1%(w/v)ウシ血清アルブミンとプレインキュベートした1.5ml試験管を使用して、1時間、RTで本質的に記載のように結合させる(Kaupmann K, Huggel K, Heid J, Flor PJ, Bischoff S, Mickel SJ, McMaster G, Angst C, Bittiger H, Froestl W, Bettler B(1997)Expression cloning of GABA(B) receptors uncovers similarity to metabotropic glutamate receptors. Nature 386:239-246)。プロテアーゼ阻害剤(Roche Diagnostics, Mannheim, FRG)を含むHEPES緩衝液pH7.4(125mM NaCl、5mM KCl、0.6mM MgCl2、1.8mM CaCl2、20mM HEPES、6mM デキストロース)中の膜ホモジネートを、1.3nMヨウ素化NiG−D20と、非標識NiG−D20の漸増濃度の非存在下または存在下インキュベートする。
3T3繊維芽細胞およびラット脳皮質膜上のNogo−A−特異的活性フラグメントに関する結合部位(複数もある)の存在:Nogo−AのNiR−D2およびNiG−D20領域が、Nogo−66が不在であり、かつNgRと無関係であるにも関わらず、細胞延展および神経突起伸長に阻害性であるため、別の、Nogo−A−特異的レセプターの存在を仮定しなければならない。故に結合試験を、フローサイトメトリーにより分析された生存3T3繊維芽細胞に対して、多量体化、myc−タグ付けおよびIMAC−精製したNiR−Gで行われる。Ab複合体化NiR−Gは、3T3細胞に、90%を超える3T3細胞の蛍光シフトにより見られるように効率的に結合する。対照的に、3T3細胞は、FITC−結合二次F(ab)2ヤギ抗−マウスIgGと結合した9E10一次マウス抗−myc mAbと、または二次Ab単独とインキュベートした後、標識されない。NiG−D20のラット皮質膜に対する結合を試験するために、放射性リガンド結合アッセイにおける[125I]−標識NiG−D20を使用する。1.3nMの[125I]−NiG−D20の濃度で、非標識NiG−D20による放射リガンド結合の濃度依存的競合により示されるように、脳膜上の特異的NiG−D20結合部位の証拠を発見した。これらの結果は、Nogo−Aのアミノ末端フラグメントが、3T3細胞およびラット皮質膜に結合でき、膜−結合、Nogo−A−特異的結合部位またはレセプター(複数もある)の存在を証明する。
マウス(C3H−およびC57BI6/J−種)を、NiG−D20における特定のエピトープに対応する合成ペプチドSYDSIKLEPENPPPYEEA(=ラットNogoA_623−640;配列番号1)で免疫する。このエピトープはヒト、カニクイザルおよびマウスNiG−D20 Nogo−A特異的領域で非常に保存的であり、ヒトNogoAアミノ酸配列(配列番号5)のアミノ酸623で開始し、アミノ酸640で終わる(配列アライメント:図1をまた参照)。
11C7 mAbは、190kD Nogo−A バンドをオリゴデンドロサイト細胞培養ホモジネートのウェスタン・ブロットで同定する。11C7はまたウェスタン・ブロットでヒトNiG、カニクイザルNiG細胞融解物およびラットNiG−D20を同定する。11C7 mAbは、IgG1イソタイプ(IsoStrip Kit, Roche)として特徴付けられる。
免疫細胞化学:視神経オリゴデンドロサイトを記載のように調製する(Schwab, Caroni, 1988, Neuron)。ポリ−L−リジン被覆カバーガラス上で増殖させた3日から5日目の培養を2回PBSで洗浄し、4%(w/v)パラホルムアルデヒド(PFA)、5%(w/v)スクロースのPBS溶液で、15分、室温(RT)で固定し、非特異的結合を10%(v/v)FCSで遮断する。次いで、細胞をマウス11C7(1:100)とインキュベートした。二次抗体はヤギ−抗−マウスTRITC(Jackson ImmunoResearch Laboratories)である。細胞表面染色のために、2日目のラット視神経培養物を、培地中のモノクローナル抗体と25分、RTでインキュベートする。二次アルカリホスファターゼ結合抗体(Milan Analytica, Lausanne)を、0.1M マレイン酸中1:7,500で、1%(w/v)遮断試薬(1時間)と共に使用する。培養物を2回マレイン酸緩衝液で、1回アルカリホスファターゼ緩衝液(0.1M Tris−HCl pH9.5、0.1M NaCl、5mM MgCl2)で洗浄し、染色を3時間、室温で0.175mg/ml BCIP(Sigma)および0.338mg/ml NBT(Sigma)のアルカリホスファターゼ緩衝液中の溶液で展開する。
a)還元およびアルキル化:精製し、乾燥した11C7抗体を40μlの8M 尿素、0.4M NH4HCO3、pH8.3に溶解する。タンパク質と同じ緩衝液10μlに予め溶解した60μg DTT(Calbiochem)を添加する。還元を、50℃で30分、アルゴン下に行う(タンパク質チオールよりも100倍モル過剰のDTT)。還元後、サンプルを室温に冷却する。タンパク質と同じ緩衝液に溶解した304μgのヨードアセトアミド(Sigma Ultra、I−1149)を添加する。カルボキサミドメチル化を、室温で15分、暗所で行う。1μl β−メルカプトエタノールを反応を停止するために添加する。
室量分析から、マウス11C7−IgG1の同種重鎖および軽鎖を決定する。H−鎖は一つグリコシル化され、したがって、C−末端リジンが異なる2つの形が存在する。重鎖および軽鎖の総質量分析は、両方の鎖で一つの質量を示す。マウス11C7−IgG1のHPLCクロマトグラフィーは一つのピークを示す。HPLC精製、その後の還元およびアルキル化の後、純粋重鎖および軽鎖が利用可能である。N−末端配列変性を軽鎖および重鎖で行う。L−鎖およびH−鎖のN−末端配列からの45から55アミノ酸を、配列変性により同定する。
総RNAを、107ハイブリドーマ細胞(クローン11C7)から、TriPure試薬(Roche diagnostics, Germany, Cat.# 1667157)を使用し、製造者の指示にしたがって調製する。cDNA合成のために、mRNAを、上記のように製造した総RNAから、Oligotex樹脂(Qiagen, Germany, Cat. # 70022)を使用して単離する。
Greiner 96ウェルPSプレート(#655161)を、0.4−2μg/ml Nogoタンパク質フラグメントのPBS(100μl/ウェル)で被覆し、カバーし、4時間、室温でインキュベーションする。プレートを軽く叩き、200μl/ウェル遮断緩衝液(PBS+2%BSA)を再び入れ、カバーし、インキュベーションする。1時間、RTまたは一晩、4℃、次いで4回水およびPBSで洗浄する。マウス11C7 mAbまたは11C7 Fabの異なる濃度をPBS+2%BSA(100μl/ウェル)で希釈し、2時間、RTまたは一晩、4℃でインキュベートする。洗浄段階を繰り返し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)と結合したヤギ抗−マウスIgGを、PBS/0.1%BSA/0.1%Nonidet 40(100μl/ウェル)中の1:5000(ICN #55550)の希釈で添加し、インキュベートする。2時間、RTまたは一晩、4℃、そして洗浄段階を繰り返す。HRP反応を、100μl/ウェル BMブルーPOD(Roche #1484281)を添加により開始し、暗所でRTで15分インキュベートする。H2SO4 50μl/ウェル 1Mを添加してHRP基質反応を停止し、光学密度を450nmに設定したマイクロプレートリーダー(Packard Spectra Count)を使用して測定する。
マウス11C7 mAbおよび11C7 Fabの親和性を、BIAcore 2000光学バイオセンサー(Biacore, Uppsala, Sweden)を使用し、製造者の指示にしたがって表面プラスモン共鳴(SPR)により測定する(図2参照)。組み換えヒト、マウスおよびラットNIGは、アミン−結合化学反応を使用してCM5センサーチップの3つの別々のフローセルに共有結合させる。簡単に言えば;カルボキシメチル化デキストランマトリックスを、35μlの0.025M NHSおよび0.1M EDCを含む溶液の注入により活性化する。センサーチップ上への固定化のために、組み換えマウス、ヒトおよびラットNIGを3.5から4.5の範囲のpHの0.01Mクエン酸緩衝液で希釈し、5μl/分の流速で注入して親和性測定を可能にする結合レベルを達成する。残りのNHS−エステル基の不活性化は、35μlの1M エタノールアミン塩酸塩(pH8.5)の注入により行う。センサーチップの表面を、5μl 0.1M HClの注入により再生する。親和性の測定のために、本抗体を0.50nMから100nMの範囲の異なる濃度で、200μl/分の流速で注入する。各注入後、センサーチップ表面を10μl 0.1M HClの注入により、表面上の結合活性の損失なしに再生する。速度定数kaおよびkdならびに親和性定数KAおよびKDを、製造者により提供されたBIAevaluations 3.0ソフトウェアにより評価する。
Claims (10)
- ヒトNogoAポリペプチドのヒトNogoA_623−640(配列番号6)に結合可能なキメラもしくはヒト化モノクローナル抗体もしくはそのF(ab')2断片、一本鎖抗体、または単一ドメイン抗体であって、少なくとも1種の抗原結合部位を含み、該抗原結合部位が
順に、超可変領域CDR1−11C7(配列番号8)、CDR2−11C7(配列番号9)およびCDR3−11C7(配列番号10); ならびに
順に、超可変領域CDR1'−11C7(配列番号11)、CDR2'−11C7(配列番号12)およびCDR3'−11C7(配列番号13)
を含む、上記抗体または上記断片。 - さらに、ヒト重鎖の定常部分およびヒト軽鎖の定常部分を含む、請求項1に記載の抗体または断片。
- ヒト重鎖の定常部分がγ4タイプであり、ヒト軽鎖の定常部分がκタイプである、請求項2に記載の抗体または断片。
- 請求項1から3のいずれか1項に記載の抗体または断片をコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド。
- 請求項4に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
- 請求項4に記載のポリヌクレオチドまたは請求項5に記載のベクターを含む発現系であって、該発現系が適合性宿主細胞中に存在するとき、請求項1から3のいずれか1項に記載のポリペプチドを産生できる、発現系。
- 請求項6に記載の発現系を含む、単離宿主細胞。
- 医薬としての、請求項1から3のいずれか1項に記載の抗体または断片の使用。
- 神経修復の処置用医薬の製造のための請求項1から3のいずれか1項に記載の抗体または断片の使用。
- 請求項1から3のいずれか1項に記載の抗体または断片と、少なくとも1種の薬学的に許容される担体もしくは希釈剤を含む、医薬組成物。
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