ES2349293T3

ES2349293T3 - Anticuerpos anti nogo a humano y su uso farmacéutico.

Info

Publication number: ES2349293T3
Application number: ES03782350T
Authority: ES
Inventors: Alessandra Vitaliti; Anis Khusro Mir; Thomas Oertle; Mauro Zurini; Lisa Schnell; Carmen Barske; Martin E. Schwab
Original assignee: Novartis Pharma GmbH; Novartis AG; Universitaet Zuerich
Current assignee: Novartis Pharma GmbH; Novartis AG; Universitaet Zuerich
Priority date: 2002-12-10
Filing date: 2003-12-09
Publication date: 2010-12-29
Anticipated expiration: 2023-12-09
Also published as: CA2509068A1; NO20053304D0; AU2003289998A1; CY1110848T1; PL210720B1; US20110059110A1; ATE475671T1; CA2509068C; DE60333585D1; US20060183678A1; CN1747971A; BR0317161A; PL377506A1; JP4504200B2; ECSP055849A; JP2006523087A; IL169018A; WO2004052932A2; AU2003289998B2; HK1084676A1

Abstract

Un anticuerpo monoclonal quimérico o humanizado o los fragmentos F(ab')2 o Fab de este, un anticuerpo de cadena sencilla, o un anticuerpo de dominio sencillo capaz de unirse con el polipéptido del NogoA humano, Nogo.A_623-640 humano (SEQ ID NO: 6), que comprende al menos un sitio de enlace de antígeno, dicho sitio de enlace de antígeno que comprende: - en secuencia las regiones hipervariables CDR1-:11C7 (SEQ ID NO: 8), CDR2-11C7 (SEQ ID NO: 9) y CDR3-11C7 (SEQ ID NO: 10); y -en secuencia las regiones hipervariables CDR1'-11C7 (SEQ ID NO: 11), CDR2'-11C7 (SEQ ID NO: 12) y CDR3'-11C7 (SEQ ID NO: 13).

Description

Esta invención se relaciona con las moléculas de enlace de NogoA, tales como por ejemplo anticuerpos monoclonales o fragmentos Fab de estos.

La regeneración neuronal después de una lesión en el sistema nervioso central (CNS) adulto, se limita debido a la presencia del ambiente inhibidor de mielina que envaina los axones y a la formación de tejido cicatrizante. En los últimos años, importantes conocimientos se han adquirido en el entendimiento molecular de porque el CNS no es capaz de repararse espontáneamente después de una lesión. Las moléculas inhibidoras en la mielina son el principal obstáculo para la regeneración axonal, particularmente inmediatamente después de la lesión. Hasta el momento NogoA, Glicoproteína Asociada con la Mielina (MAG) y glicoproteína mielina-oligodendrocito (OMgp) se han caracterizado como potentes inhibidores del crecimiento neurítico. Además, la mielina también contiene otros componentes inhibidores, tales como, proteoglicanos sulfato de condroitina. Nogo-A es un miembro de la familia de las proteínas reticulon y tiene al menos dos dominios biológicamente activos y farmacológicamente distintos denominados Amino-Nogo y Nogo-66. Mientras que el sitio receptor del formador no se conoce hasta ahora, Nogo-66 inhibe el crecimiento neuronal In vitro e In vivo vía el receptor neuronal NgR. Además de Nogo-66, MAG y OMgp también se unen al NgR con alta afinidad e inhiben el crecimiento neurítico.

Nuevos potenciales enfoques de investigación, que persiguen actualmente la mejora de la reparación de nervios incluyen, la digestión del tejido cicatrizante utilizando una enzima condroitinasa ABC, técnicas puntuales que utilizan células gliales olfatorias y células madre y factores de crecimiento de proteínas para estimular el crecimiento neuronal. Acciones de bloqueo de Inhibidores del crecimiento neurítico por modulación de mediadores de señalización intracelular tales como Rho, una guanosina trisfosfatasa (GTPasa) unida a la membrana, que parece ser un unión clave en la inhibición del crecimiento axonal. La adenosina monofosfato ciclica (cAMP), que puede superar la inhibición asociada de la mielina in vitro e induce la regeneración In vivo. El uso del inhibidor del péptido del receptor NgR (NEP 1-40) para inducir la regeneración neuronal y la recuperación funcional en ratas después de la lesión espinal.

Además del uso de los enfoques descritos anteriormente, también se ha enfocado la atención en el uso de ciertos anticuerpos monoclonales para neutralizar las moléculas inhibidoras del crecimiento de neuritas del sistema nervioso central y periférico, en particular para neutralizar la actividad inhibidora del crecimiento de neuritas de NogoA. Utilizando la expresión transgénica regulada de NogoA en células de Schwann del nervio periférico, Cathrine Pot y colaboradores mostraron que la regeneración axonal y la recuperación funcional se deterioran después de un aplastamiento del nervio ciático, indicando que NogoA domina los efectos que promueven y permisivos del crecimiento del nervio periférico lesionado, lo que demuestra su potencia in vivo como un inhibidor de regeneración axonal (J Cell Biol. 2002 Oct 14;159(1):29-35). De esta manera se ha demostrado que el anticuerpo monoclonal IN-1 o el fragmento Fab IN-1 de este, induce el crecimiento neurítico in vitro y realza la germinación y regeneración in vivo (Schwab ME et al. (1996) Physiol. Rev. 76, 319-370). La experimentación de diferentes dominios de NogoA para la actividad inhibidora del crecimiento de neuritas, han delineado varios dominios inhibidores en la molécula (Chen et al. (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre eta 1. (2000) Nature 403, 439-444; Prinjha et al. (2000) Nature 403, 383-384; ver también el análisis detallado en el Ejemplo 1). Merkler et al., 2001 en este respecto reporta que la aplicación del anticuerpo IN-1 puede realzar la capacidad plástica y regenerativa limitada de los axones en el CNS del mamífero adulto (J Neurosci. 2001 May 15;21(10):3665-73). Incluso, el anticuerpo IN-1 solo tiene una afinidad muy baja con NogoA.

Las inmunoglobulinas o anticuerpos naturales comprenden generalmente una molécula multimérica Y-configurada, que tiene un sitio de enlace de antígeno en el terminal de cada brazo. El resto de la estructura, en particular el tallo de la Y, media las funciones efector asociadas con las inmunoglobulinas. Los anticuerpos consisten de unas 2 cadenas pesadas y 2 livianas. Tanto las cadenas pesadas y livianas comprenden un dominio variable y una parte constante. Un sitio de enlace de antígeno consiste del dominio variable de una cadena pesada asociada con el dominio variable de una cadena liviana. Los dominios variables de las cadenas pesadas y livianas tienen la misma estructura general. Más particularmente, las características del enlace de antígeno de un anticuerpo se determinan esencialmente por 3 regiones específicas en el dominio variable de las cadenas pesadas y livianas que se denominan regiones hipervariables o regiones determinantes de complementariedad (CDRs). Estas 3 regiones hipervariables alternan con 4 regiones de los marcos (FRs), cuyas secuencias se conservan relativamente y que no se involucran directamente en el enlace. Las CDRs forman bucles y se mantienen en cercana proximidad mediante las regiones de los marcos que adoptan en gran parte una conformación β-lámina. Las CDRs de una cadena pesada junto con las CDRs de la cadena liviana asociadas esencialmente constituyen el sitio de enlace de antígeno de la molécula de anticuerpo. La determinación de lo que constituye una región FR o una CDR usualmente se hace por comparación de la secuencia de aminoácidos de un número de anticuerpos construidos en la misma especie. Las reglas generales para identificar las regiones CDR y FR son del conocimiento general de un experto en el oficio y se pueden por ejemplo encontrar en el sitio web (http://www.bioinf.org.uk/abs/).

En la actualidad, sorprendentemente se ha encontrado que, un novedoso anticuerpo monoclonal de ratón (de ahora en adelante denominado "11C7"), construido contra un fragmento del polipéptido de NogoA de rata (SEQ ID NO: 1) y del tipo IgG1 tiene mejores propiedades que los anticuerpos de NogoA del oficio previo especialmente con respecto a la afinidad de enlace con NogoA de diferentes especies, incluyendo el homo sapiens y con respecto a su mayor actividad de neutralización del crecimiento neurítico de NogoA a una concentración dada del anticuerpo. Además ahora es posible construir otras moléculas de enlace de NogoA, que tienen las mismas regiones hipervariables que el citado anticuerpo.

Por consiguiente, la invención se relaciona con moléculas de enlace con una región particular

o epitope de NogoA (de ahora en adelante denominadas como "las Moléculas de Enlace de la invención" o simplemente "Moléculas de Enlace"). Preferiblemente las Moléculas de Enlace de la invención se unen a NogoA_623-640 humano (fragmento ortólogo contra el cual 11C7 fue construido; = SEQ ID NO: 6) con una constante de disociación (Kd) < 1000nM, más preferiblemente con una Kd < 100 nM, de preferencia con una Kd < 10 nM. La reacción de enlace se puede mostrar por métodos estándar (ensayos cualitativos) incluyendo, por ejemplo, el método de ELISA descrito en el Ejemplo 6 y el método de afinidad biosensor descrito en el ejemplo 7. Además, la unión con NogoA humano y casi más considerablemente la eficacia se puede mostrar en un ensayo de crecimiento neurítico, por ejemplo como se describe a continuación.

En otro aspecto de la invención, la Molécula de Enlace de la invención comprende al menos

a) un primer dominio que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1-11C7, CDR2-11C7 y CDR3-11C7; dicha CDR1-11C7 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, dicha CDR2-11C7 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, y dicha CDR311C7 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10; y

3 b) un segundo dominio que comprende, en secuencia las regiones hipervariables CDR1’11C7, CDR2’-11C7 y CDR3’-11C7, dicha CDR1’-11C7 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, dicha CDR2’-11C7 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, y dicha CDR3’-11C7 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. Además, la invención también se relaciona con la siguiente Molécula de Enlace, que comprende al menos un sitio de enlace de antígeno que comprende a) ya sea la parte variable de la cadena pesada de 11C7 (SEQ ID NO: 2); o b) la parte variable de la cadena liviana de 11C7 (SEQ ID NO: 3). Cuando el sitio de enlace de antígeno comprende tanto el primer como el segundo dominio, estos se pueden localizar en la misma molécula de polipéptido o, preferiblemente, cada dominio puede estar en una cadena diferente, siendo el primer dominio parte de una cadena pesada de inmunoglobulina o fragmento de esta y siendo el segundo dominio parte de una cadena liviana de inmunoglobulina o fragmento de esta. Ejemplos de Moléculas de Enlace de la invención incluyen, anticuerpos como los producidos por las células-B o hibridomas y los anticuerpos quiméricos o humanizados o cualquier fragmento de estos, por ejemplo los fragmentos F(ab’)2; y Fab, así como anticuerpos de cadena sencilla o dominio sencillo. Un anticuerpo de cadena sencilla consiste de los dominios variables de un anticuerpo de cadenas pesadas y livianas, unido covalentemente por un ligador péptido que usualmente consiste de 10 a 30 aminoácidos, preferiblemente de 15 a 25 aminoácidos. Por consiguiente, tal estructura no incluye la parte constante de las cadenas pesadas y livianas y se cree que el espaciador del péptido pequeño debería ser menos antigénico que una parte constante completa. Por "anticuerpo quimérico" se entiende un anticuerpo en el cual las regiones constantes de cadenas pesadas o livianas o ambas con de origen humano mientras que los dominios variables de ambas cadenas pesadas y livianas son de origen no-humano (por ejemplo, murina). Por “anticuerpo humanizado" se entiende un anticuerpo en el cual las regiones hipervariables (CDRs) son de origen no-humano (por ejemplo murina), mientras que todas o sustancialmente todas las otras partes de la inmunoglobulina por ejemplo las regiones constantes y las partes altamente conservadas de los dominios variables, i.e. las regiones del marco, son de origen humano. Un anticuerpo humanizado sin embargo puede retener unos pocos aminoácidos de la secuencia murina en las partes de las regiones del marco adyacentes a las regiones hipervariables. Las regiones hipervariables, se pueden asociar con cualquier clase de regiones del marco, preferiblemente de origen murina o humano. Las regiones del marco apropiadas se describen en "Sequences of proteins of immunological interest", Kabat E.A. et al, US department of health and human services, Public health service, National Institute of Health. Preferiblemente la parte constante de una cadena pesada humana de las Moléculas de Enlace puede ser del tipo IgG4, incluyendo los subtipos, preferiblemente la parte constante de una cadena liviana humana puede ser del tipo κ o λ, más preferiblemente del tipo κ. Los anticuerpos monoclonales construidos contra una proteína encontrada naturalmente en todos los humanos se puede desarrollar en un sistema no-humano por ejemplo, en ratones. Como una consecuencia directa de esto, un anticuerpo xenogénico como los producidos por un hibridoma, cuando se administra a humanos, provoca una respuesta inmune indeseable, que predominantemente se media por la parte constante de la Inmunoglobulina xenogénica. Esto claramente limita el uso de tales anticuerpos, ya que no se pueden administrar durante un periodo prolongado de tiempo. Por consiguiente, se prefiere utilizar particularmente anticuerpos de cadena sencilla, de dominio sencillo,

quiméricos o humanizados, que probablemente no son para producir una respuesta alogénica sustancial cuando se administra a humanos.

En vista de lo anterior, una Molécula de Enlace de la invención más preferida, se selecciona de un anticuerpo quimérico, que comprende al menos

a) una cadena pesada de inmunoglobulina o fragmento de esta, que comprende (i) un dominio variable que comprende en secuencia, las regiones hipervariables CDR1-11C7, CDR2-11C7 y CDR311 C7 y (ii) la parte constante o fragmento de esta, de una cadena pesada humana; dicha CDR1-11C7 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8), dicha CDR2-11C7 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 9), y dicha CDR3-11C7 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10), y

b) una cadena liviana de inmunoglobulina o fragmento de esta, que comprende (i) un dominio variable que comprende en secuencia, las regiones hipervariables CDR1’-11C7, CDR2’11C7 y CDR3’-11C7 y (ii) la parte constante o fragmento de esta, de una cadena liviana humana; dicha CDR1’-11C7 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:11), dicha CDR2’-11C7 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 12), y dicha CDR3’-11C7 que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 13); o

equivalentes directas de las mismas.

Por otra parte, una Molécula de Enlace de la invención se puede seleccionar de una molécula de enlace de cadena sencilla, que comprende un sitio de enlace de antígeno que comprende

a) un primer dominio que comprende en secuencia, la hipervariable CDR1-11C7, CDR211C7 y CDR3-11C7; dicha CDR1-11C7, que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8), dicha CDR2-11C7, que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 9), y dicha CDR3-11C7, que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10); y

b) un segundo dominio que comprende en secuencia, la hipervariable CDR1’-11C7, CDR2’11C7 y CDR3’-11C7; dicha CDR1’-11C7, que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 11), dicha CDR2’-11C7, que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 12), y dicha CDR3’-11 C7, que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 13); y

c) un péptido ligador que se une tanto con el extremo terminal-N del primer dominio y con el extremo terminal-C del segundo dominio o con el extremo terminal-C del primer dominio y con el extremo terminal-N del segundo dominio;

o equivalentes directos de estos.

Como es bien conocido, los cambios menores en una secuencia de aminoácidos tales como deleción, adición o sustitución de uno o varios aminoácidos pueden conducir a una forma alélica de la proteína original que tiene sustancialmente propiedades idénticas. De esta manera, por el término "equivalentes directos de las mismas" se entiende cualquier Molécula de Enlace de dominio sencillo (molécula X)

(i): en la cual cada una de las regiones hipervariables CDR1, CDR2, y CDR3 de la Molécula de Enlace es al menos 50 o 80% homóloga, preferiblemente al menos 90% homóloga, más preferiblemente al menos 95, 96, 97, 98, 99% homóloga a las regiones hipervariables equivalentes de CDR1-11C7 (SEQ ID NO: 8), CDR2-11C7 (SEQ ID NO: 9) y CDR3-11C7 (SEQ ID NO: 10), mientras que CDR1 es equivalente a CDR1-11C7, CDR2 es equivalente a CDR2-11C7, CDR3 es equivalente a CDR3-11C7; y

(ii): que es capaz de unirse con el NogoA humano, NiG humano, NiG-D20 humano, o NogoA_623-640 humano, preferiblemente con una constante de disociación (Kd) < 1000nM, más

preferiblemente con una Kd < 100 nM, de preferencia con una Kd < 10 nM, o cualquier molécula de enlace que tiene al menos dos dominios por sitio de enlace (molécula X’)

(iii) en la cual cada una de las regiones hipervariables CDR1, CDR2, CDR3, CDR1’, CDR2’ y CDR3’ es al menos 50 o 80% homóloga, preferiblemente al menos 90% homóloga, más preferiblemente al menos 95, 96, 97, 98, 99% idéntica a las regiones hipervariables equivalentes de CDR1-11C7 (SEQ ID NO: 8), CDR2-11C7 (SEQ ID NO: 9), CDR3-11C7 (SEQ ID NO: 10), GDR1’11C7 (SEQ ID NO: 11), CDR2’-11C7 (SEQ ID NO: 12), y CDR3’-11C7 (SEQ ID NO: 13), mientras que CDR1 es equivalente a CDR1-11C7, CDR2 es equivalente a CDR2-11C7, CDR3 es equivalente a CDR3-11C7, CDR1’ es equivalente a CDR1’-11C7, CDR2’ es equivalente a CDR2’-11C7, CDR3’ es equivalente a CDR3’-11 C7; y

(iv) que es capaz de unirse con el NogoA humano, NiG humano, NiG-D20 humano, o NogoA_623-640 humano, preferiblemente con una constante de disociación (Kd) < 1000nM, más preferiblemente con una Kd < 100 nM, de preferencia con una Kd < 10 nM.

Por otra parte, una Molécula de Enlace que es capaz de unirse con el NogoA humano, NiG humano, NiG-D20 humano, o NogoA_623-640 humano con una constante de disociación < 1000nM y comprende

•: un primer sitio de enlace de antígeno que comprende en secuencia, las regiones hipervariables COR1, CDR2, y CDR3, de las cuales cada una de las regiones hipervariables son al menos 50%, preferiblemente 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% homólogas a sus regiones hipervariables equivalentes CDR1-11C7 (SEQ ID NO: 8), CDR2-11C7 (SEQ ID NO: 9) y CDR3-11C7 (SEQ ID NO: 10); y

•: un segundo sitio de enlace de antígeno que comprende en secuencia, las regiones hipervariables CDR1’, CDR2’, y CDR3’, de las cuales cada una de las regiones hipervariables son al menos 50%, preferiblemente 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% homólogas a sus regiones hipervariables equivalentes CDR1’-11C7 (SEQ ID NO: 11), CDR2’-11C7 (SEQ ID NO: 12) y CDR3’-11C7 (SEQ ID NO: 13).

Esta constante de disociación, se puede probar convenientemente en diferentes ensayos incluyendo, por ejemplo, el método de afinidad biosensor descrito en el ejemplo 7. Además, el efecto de enlace y funcional de las Moléculas de Enlace se puede mostrar en un bioensayo, por ejemplo como se describe a continuación.

La parte constante de una cadena pesada humana puede ser del tipo γ1; γ2; γ3; γ4; α1; α2; δ o ε, preferiblemente del tipo γ, más preferiblemente del tipo γ4, mientras que la parte constante de una cadena liviana humana puede ser del tipo κ o λ (que incluye los subtipos λ1; λ2; y λ3) pero es preferiblemente del tipo κ. La secuencia de aminoácidos de todas estas partes constantes se proporcionan en Kabat et al (Supra).

Conjugados de las moléculas de enlace de la invención, por ejemplo, conjugados de enzimas

o toxinas o radioisotopos, también se incluyen dentro del alcance de la invención.

"Polipéptido", si no se especifica de otra manera en este documento, incluye cualquier péptido o proteína que comprende aminoácidos unidos a cada otro por enlaces peptídicos, que tienen una secuencia de aminoácidos iniciando en el extremo terminal-N y terminando en el extremo terminal-C. Preferiblemente el polipéptido de la presente invención es un anticuerpo monoclonal, más preferido es un anticuerpo quimérico (también denominado V-injertado) o humanizado (también denominado CDR-injertado) monoclonal. El anticuerpo humanizado (CDR-injertado) monoclonal puede o no incluir otras mutaciones introducidas en las secuencias marco (FR) del anticuerpo aceptor.

6 Un derivado funcional de un polipéptido, como se utiliza en este documento, incluye una molécula que tiene una actividad biológica cualitativa en común con un polipéptido de la presente invención, i.e. que tiene la capacidad de unirse al NogoA humano, NiG humano, NIG-D20 humano, o NogoA_623-640 humano. Un derivado funcional incluye los fragmentos y péptidos análogos de un polipéptido de acuerdo con la presente invención. Los fragmentos comprenden regiones dentro de la secuencia de un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia especificada. El término "derivado" se utiliza para definir las variantes de la secuencia de aminoácidos, y modificaciones covalentes de un polipéptido de acuerdo con la presente Invención. Por ejemplo de una secuencia especificada. Los derivados funcionales de un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia especificada, por ejemplo de la región hipervariable de la cadena pesada y liviana, preferiblemente tiene al menos cerca del 65%, más preferiblemente al menos cerca del 75%, incluso más preferiblemente al menos cerca del 85%, de preferencia al menos cerca del 95, 96, 97, 98, 99% homología de la secuencia completa con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia especificada, y sustancialmente retienen la capacidad de unir al NogoA humano, NiG humano, NiG-D20 humano, o NogoA_623-640 humano. El término "modificación covalente" incluye modificaciones de un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia especificada; o un fragmento de este con un agente de derivatización orgánico proteínico o no-proteínico, fusiones con secuencias de polipéptidos heterólogos, y modificaciones pos-translacionales. Los polipéptidos modificados covalentes, por ejemplo de una secuencia especificada, aún tienen la capacidad de unirse al NogoA humano, NiG humano, NiG-D20 humano, o NogoA_623-640 humano por entrecruzamiento. Las modificaciones covalentes tradicionalmente se introducen mediante la reacción de los residuos de aminoácidos dirigidos con un agente de derivatización orgánico que es capaz de reaccionar con lados seleccionados

o residuos terminales, o por mecanismos de aparejamiento de modificaciones pos-translacionales que funcionan en células huésped recombinantes seleccionados. Ciertas modificaciones postranslacionales son el resultado de la acción de células huésped recombinantes en el polipéptido expresado. Los residuos glutaminil y asparaginil frecuentemente se desaminan pos-translacionalmente con los correspondientes residuos glutamil y aspartil. Por otra parte, estos residuos se desaminan bajo condiciones suavemente ácidas. Otras modificaciones pos-translacionales incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos seril, tirosina o treonil, metilación de los grupos α-amino de cadenas laterales lisina, arginina, y histidina, ver por ejemplo T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983). Las modificaciones covalentes por ejemplo, incluyen proteínas de fusión que comprende un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia especificada y sus variantes de secuencia de aminoácidos, tales como inmunoadesinas, y fusiones terminal-N con secuencias señal heterólogas.

"Homología" con respecto a un polipéptido nativo y su derivado funcional se define en este documento como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidato que son idénticos con los residuos de un polipéptido nativo correspondiente, después de alinear las secuencias y la introducción de huecos, si es necesario, lograr el porcentaje máximo de homología, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de la secuencia. Ni extensiones terminal -N-o –C, ni inserciones serán construidos como reducción de identidad o homología. Los métodos y programas de ordenador para la alineación son bien conocidos.

"Aminoácido(s)" se refiere a todos los L-α-aminoácidos que ocurren naturalmente, por ejemplo e incluyendo D-aminoácidos. Los aminoácidos se identifican por cualquiera letra única bien conocida o designaciones de tres-letras.

El término "variante de la secuencia de aminoácidos" se refiere a las moléculas con algunas diferencias en sus secuencias de aminoácidos en comparación con un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia especificada. Las variantes de secuencia de aminoácidos de un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia especificada, aún tienen la capacidad de unirse a NogoA humano o NiG humano o más preferiblemente a NogoA_623-640. Las variantes de sustitución son aquellas que tienen al menos un residuo de aminoácido eliminado y un aminoácido diferente insertado en su lugar, en la misma posición en un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia especificada. Estas sustituciones pueden ser sencillas, cuando solo un aminoácido en la molécula ha sido sustituido, o pueden ser múltiples, cuando dos o más aminoácidos han sido sustituidos en la misma molécula. Las variantes insercionales son aquellas con uno o más aminoácidos insertados inmediatamente adyacentes a un aminoácido en una posición particular en un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia especificada, inmediatamente adyacente a un aminoácido significa conectado a cualquiera de los grupos funcionales α-carboxi o α-amino del aminoácido. Las variantes delecionales son aquellas con uno o más aminoácidos, en un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia especificada, eliminada. Por lo general, las variantes delecionales tendrán uno o dos aminoácidos eliminados en una región particular de la molécula.

Una molécula de enlace de la invención se puede producir por técnicas de ADN recombinante. En vista de esto, una o más moléculas de ADN que codifican la molécula de enlace se deben construir, colocar bajo secuencias control apropiadas y transferir en un organismo huésped apropiado para la expresión.

De una manera muy general, por consiguiente se proporcionan

(i): moléculas de ADN que codifican una Molécula de Enlace de la invención de dominio sencillo, una Molécula de Enlace de la invención de cadena sencilla, una cadena pesada o liviana o fragmentos de estas de una Molécula de Enlace de la invención; y

(ii): el uso de las moléculas de ADN de la invención para la producción de una Molécula de Enlace de la invención por medios recombinantes.

El estado actual del oficio es tal que el experto será capaz de sintetizar las moléculas de ADN de la Invención dada en la información proporcionada en este documento i.e. las secuencias de aminoácidos de las regiones hipervariables y las secuencias de ADN codificadas por estas. Un método para la construcción de un gen de dominio variable, por ejemplo se describe en EP 239 400 y se pueden resumir brevemente de la siguiente manera: Un gen que codifica un dominio variable de un anticuerpo monoclonal de cualquier especificidad se clona. Los segmentos de ADN que codifican el regiones de los marcos e hipervariables se determinan y los segmentos de ADN que codifican las regiones hipervariables se eliminan de tal manera que los segmentos de ADN que codifican las regiones de los marcos se fusionan junto con apropiados sitios de restricción en las uniones. Los sitios de restricción se pueden generar en las posiciones apropiadas por mutagénesis de la molécula de ADN, mediante procedimientos estándar. Los casetes de CDR sintéticos bicatenarios se proporcionan por síntesis de ADN de acuerdo con las secuencias dadas anteriormente CDR1-11C7, CDR2-11C7, CDR3-11C7, CDR1’-11C7, CDR2’-11C7 y CDR3’-11C7. Estos casetes se proporcionan con terminales adhesivos de tal manera que se pueden ligar en las uniones con el marco, mediante un protocolo estándar para lograr una molécula de ADN que codifica un dominio variable de la inmunoglobulina.

Por otra parte, no es necesario tener acceso al ARNm de una línea celular de hibridoma producida con el fin de obtener una construcción de ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales de la invención. De esta manera PCT application WO 90/07861, da las instrucciones completas para la producción de un anticuerpo monoclonal, mediante técnicas de ADN recombinante, da solo la Información escrita como con la secuencia del nucleótido del gen.

El método comprende la síntesis de un número de oligonucleotidos, su amplificación por el método PCR, y su corte y empalme para proporcionar la secuencia de ADN deseada.

Los vectores de expresión que comprenden un promotor o genes apropiados que codifican partes constantes de cadena pesada y liviana son disponibles públicamente. De esta manera, una vez que una molécula de ADN de la invención se prepara, esta se puede transferir convenientemente en un vector de expresión apropiado.

Las moléculas de ADN que codifican anticuerpos de cadena sencilla, también se pueden preparar por métodos estándar, por ejemplo, como se describe en WO 88/1649.

En una modalidad particular de la invención, los medios recombinantes para la producción de algunas de las Moléculas de Enlace de la invención incluyen una primera y segunda construcción de ADN, como se describe a continuación:

La primera construcción de ADN, codifica una cadena pesada o fragmento de esta y comprende

a) una primera parte que codifica un dominio variable que comprende alternativamente regiones marco e hipervariables, dichas regiones hipervariables que comprenden en secuencia ADNCDR1-11C7 (SEQ ID NO: 15), ADN-CDR2-11C7 (SEQ ID NO: 16) y ADN-CDR3-11C7 (SEQ ID NO: 17); esta primera parte que inicia con un codón que codifica el primer aminoácido del dominio variable y termina con un codón que codifica el último aminoácido del dominio variable, y

b) una segunda parte que codifica una parte constante de la cadena pesada o fragmento de esta, que inicia con un codón que codifica el primer aminoácido de la parte constante de la cadena pesada y termina con un codón que codifica el último aminoácido de la parte constante o fragmento de este, seguido por un codón de terminación.

Preferiblemente, la segunda parte codifica la parte constante de una cadena pesada humana, más preferiblemente la parte constante de la cadena γ4 humana. Esta segunda parte puede ser un fragmento de ADN de origen genómico (que comprende intrones) o un fragmento de ADNc (sin intrones).

La segunda construcción de ADN codifica una cadena liviana o fragmento de esta y comprende

a) una primera parte, la cual codifica un dominio variable que comprende alternativamente regiones marco e hipervariables; dichas regiones hipervariables que comprenden en secuencia ADNCDR1’-11C7 (SEQ ID NO: 17), ADN-CDR2’-11C7 (SEQ ID NO:18) y ADN-CDR3’-11C7 (SEQ ID NO: 19), esta primera parte que inicia con un codón que codifica el primer aminoácido del dominio variable y termina con un codón que codifica el último aminoácido del dominio variable, y

b) una segunda parte que codifica una parte constante de la cadena liviana o fragmento de esta, que inicia con un codón que codifica el primer aminoácido de la parte constante de la cadena liviana y termina con un codón que codifica el último aminoácido de la parte constante o fragmento de este seguido por un codón de terminación.

9 Preferiblemente, la segunda parte codifica la parte constante de una cadena liviana humana, más preferiblemente la parte constante de la cadena κ humana. La primera o segunda construcción de ADN, ventajosamente comprende una tercera parte que se localiza en dirección 5’ de la primera parte y la cual codifica parte de un péptido líder; esta tercera parte que inicia con el codón que codifica el primer aminoácido y termina con el último aminoácido del péptido líder. Este péptido se necesita para la secreción de las cadenas por el organismo huésped en el cual se expresan y posteriormente se elimina por el organismo huésped. Preferiblemente, la tercera parte de la primera construcción de ADN codifica un péptido líder, que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos de la secuencia líder de la cadena pesada como se muestra en SEQ ID NO: 21 (inicia con el aminoácido en la posición -19 y termina con el aminoácido en la posición -1). También preferiblemente, la tercera parte de la segunda construcción de ADN codifica un péptido líder que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 23 (la cadena liviana, inicia con el aminoácido en la posición -18 y termina con el aminoácido en la posición -1). Cada una de las construcciones de ADN, se coloca bajo el control de apropiadas secuencias control, en particular bajo el control de un promotor apropiado. Cualquier clase de promotor se puede utilizar, a condición que se adapte al organismo huésped en el cual las construcciones de ADN serán transferidas para la expresión. Sin embargo, si la expresión va a tener lugar en una célula de mamífero, se prefiere utilizar particularmente el promotor de un gen de inmunoglobulina. El anticuerpo deseado se puede producir en un cultivo celular o en un animal transgénico. Un animal transgénico apropiado, se puede obtener de acuerdo con métodos estándar que incluyen la micro inyección en huevos de la primera y segunda construcción de ADN colocada bajo apropiadas secuencias control que se transfieran los huevos así preparados en apropiadas hembras seudo-preñadas y la selección de un descendiente que expresan el anticuerpo deseado. Cuando las cadenas del anticuerpo tienen que ser producidas en un cultivo celular, las construcciones de ADN deben primero ser insertadas en un vector de expresión sencillo o en dos separados pero vectores de expresión compatible, siendo preferida la última posibilidad. Por consiguiente, la invención también proporciona un vector de expresión capaz de replicar en la línea celular procariota o eucariota que comprende al menos una de las construcciones de ADN descritas anteriormente. Cada vector de expresión que contiene una construcción de ADN, luego se transfiere en un organismo huésped apropiado. Cuando las construcciones de ADN se insertan por separado en dos vectores de expresión, se pueden transferir por separado, i.e. un tipo de vector por célula, o cotransferir, siendo preferida esta última posibilidad. Un organismo huésped apropiado puede ser una bacteria, una levadura o una línea celular de mamífero, siendo preferida esta última. Más preferiblemente, la línea celular de mamífero es de origen linfoide por ejemplo un mieloma, hibridoma o una célula-B normal inmortalizada, pero no expresa cualquier cadena pesada o liviana del anticuerpo endógeno. También se prefiere que el organismo huésped contenga un gran número de copias de los vectores por célula. Si el organismo huésped es una línea celular de mamífero, este objetivo deseable se puede lograr, amplificando el número de copias de acuerdo con métodos estándar. Los métodos de amplificación usualmente consisten de la selección para una mayor resistencia a un fármaco, siendo codificada dicha resistencia por el vector de expresión. En otro aspecto de la invención, se proporciona un proceso para producir una molécula de enlace de la invención multi-cadena, que comprende (i) el cultivo de un organismo que se transforma

con la primera y segunda construcción de ADN de la invención y (ii) recuperación de una molécula de enlace de la invención activa a partir del cultivo.

Por otra parte, las cadenas pesadas y livianas se pueden recuperar por separado y reconstituir en una molécula de enlace activa después de plegamiento de las proteínas In vitro. Los métodos de reconstitución son bien conocidos en el oficio; Ejemplos de estos métodos, se proporcionan en particular en EP 120 674 o in EP 125 023. Por consiguiente un proceso también puede comprender

(i): el cultivo de un primer organismo que se transforma con una primera construcción de ADN de la invención y la recuperación de dicha cadena pesada o fragmento de esta a partir del cultivo y

(ii): el cultivo de un segundo organismo que se transforma con una segunda construcción de ADN de la invención y la recuperación de dicha cadena liviana o fragmento de esta a partir del cultivo y

(iii) reconstitución In vitro de una molécula de enlace de la invención activa a partir de la cadena pesada o fragmento de este obtenidas en (i) y la cadena liviana o fragmento de esta obtenida en (ii).

De una manera similar, también se proporciona un proceso para producir una molécula de enlace de la invención de cadena sencilla o dominio sencillo que comprende

(i) el cultivo de un organismo que se transforma con una construcción de ADN que respectivamente codifica una molécula de enlace de la invención de cadena sencilla o dominio sencillo y

(ii) recuperación de dicha molécula a partir del cultivo.

Las moléculas de enlace de la invención muestran muy buena actividad de reparación de nervios como se muestra, por ejemplo, en el modelo de crecimiento neurítico de células del gránulo.

1. Ensayo de crecimiento neurítico de células del gránulo (in vitro)

El crecimiento neurítico a partir de células del gránulo cerebelosas disociadas se determina como se describe (Niederöst et al. (1999) J.Neurosci. 19: 8979-8989). En resumen, el cerebelo se retira de ratas de 5-7 días posnatales decapitadas y se disocia por tratamiento con tripsina. Para reducir la contaminación del fibroblasto, las células se pre-plantaron en placas bacterianas. 75’000 células luego se cultivaron por pozo en placas de cultivo de tejido de 4-pozos Greiner (Huber & Co AG, Rheinach, Basel) (superficie del pozo: 1 cm2) en medio (Neurobasal con sustitución del suero B27, Invitrogen). Las placas de cultivo se cubren con poli-L-lisina (Sigma). Las proteínas extraídas con Chaps a partir de homogeneizados de la médula espinal total de ratas adultas (Spillmann et al. (1998)

J. Biol. Chem. 273: 19283-19293) se cubren en concentraciones de proteína de 0.5 a 8 µg por pozo durante la noche a 4°C y se lavan. Las moléculas de enlace de la invención luego se pre-incuban por 30 min, en el sustrato de prueba y se eliminan antes de que las células se adicionen. Las células del gránulo del cerebelo se adicionan e incuban por 24 horas. Para detener el experimento, se adicionan lentamente 2 ml de 4 % formaldehido estandarizado, a las placas de cultivo. Los cultivos luego se tiñen por inmunofluorescencia para la proteína GAP-43 asociada con el crecimiento y con Hoechst para los núcleos de la célula (Las células del gránulo se tiñen con Hoechst con el fin de ver si todas las células tienen neuritas (las neuritas se visualizan con anti-GAP-43)). Tres imágenes se toman al azar a una distancia definida del borde superior, inferior y lateral de cada pozo con un objetivo 40x en un Microscopio de Fluorescencia Zeiss Axiophot. Todas las neuritas en un campo se cuentan en el número-codificado, fotografías dispuestas al azar. La respuesta (crecimiento de las neuritas de célula gránulo) es dependiente de la dosis en el rango de aproximadamente 0.1-10 µg de proteína total por pozo (las actividades específicas de una preparación dada varían dentro de este rango).

11 El incremento de crecimiento neurítico de células del gránulo cerebelosas en el ambiente no-permisivo del extracto de médula espinal preparado anteriormente por la pre-incubación con una molécula de enlace de la invención se puede observar. Por ejemplo un perfil típico para el efecto neutralizante del anticuerpo 11C7-IgG1 de ratón en el modelo de crecimiento neurítico de células del 5 gránulo se da a continuación: Ensayo 1: cubierta de mielina de rata a 1 µg por pozo Neuritas por Porcentaje de campo sin anticuerpo 80,5 100 %

+: IgG de ratón 86,5 108% 11C7 250 µg/ml 160 199% Ensayo 2: cubierta de mielina rata (prep. 2) a 8 µg por pozo Neuritas por Porcentaje de campo sin anticuerpo 20 100 %

+: IgG de ratón 17,3 86,5% 11C7 250 µg/ml 31 155% 11 C7 75 µg/ml 26 130 % 11C7 7,5 µg/ml 26 130 %

La actividad de neutralización de las moléculas de la invención también se puede estimar mediante la determinación de la germinación regenerativa y del crecimiento neurítico en el modelo de lesión de la médula espinal in vivo de la siguiente manera:

10 2. Modelo de lesión de médula espinal (in vivo) Ratas Lewis adultas se lesionan microquirúrgicamente, cortando transversalmente la mitad dorsal de la médula espinal bilateralmente en el nivel de la octava vértebra torácica. La laminectomía, anestesia y cirugía se describen en Schnell and Schwab 1993 (Eur.J. Neurosci. 5: 1156 -1171). Los controles o moléculas de enlace de la invención se aplican de dos maneras diferentes: ya sea

15 implantando 106 células hibridoma, cultivadas recientemente en un lado del corte cerebral (animales injertados) o, alternativamente, mediante una cánula intraventricular implantada unida a una bomba Alzet de 2ml implantada subcutáneamente (Alza Corporation, Palo Alto) (animales bomba). Animales injertados con hibridoma: Las ratas son inmunodeprimidas por 7-10 días con ciclosporina A y se sacrificaron por perfusión transcardial con 4% formalina estandarizada 14 días después de la

20 lesión. -Animales bomba: Las moléculas de enlace de la invención (por ejemplo a 3.3 mg/ml para 11C7 de ratón) se ponen en bombas de 2 ml proporcionando 0.5 µl/h en el ventrículo lateral por 2 semanas. Las bombas se implantan en el momento de la lesión de la médula espinal, y las ratas se sacrifican 2 semanas después. Rastreo neuroanatómico: El tracto corticoespinal sensorial y motor se traza, mediante la

25 inyección del marcador anterógrado biotina dextrano amina (BDA) en la corteza del lado opuesto a la bomba o al injerto. La BDA se transporta a la médula espinal dentro de 10 -14 días y se visualiza utilizando diaminobencidina (DAB) como sustrato, según se describe en Brösamle et al., (2000 J.Neurosci. 20: 8061-8068). Evaluación de los resultados anatómicos: Se utilizan dos métodos de evaluación: uno semi

30 cuantitativo y uno cuantitativo. Estimación semi-cuantitativa de la intensidad de la germinación y regeneración: Una serie de la sección sagital completa de número codificado, animales mezclados al azar se evaluaron para determinar la presencia y densidad de brotes de regeneración rostral a la lesión utilizando las siguientes definiciones: los brotes de regeneración son fibras que emanan de la CST cortado transversalmente; son largas, irregulares en su curso, mucho menos ramificadas que las colaterales de materia gris normal, y crecen hacia y ventral o lateralmente al rededor de la lesión. Los brotes regenerativos generalmente terminan en un cono de crecimiento que puede ser pequeña y bulbosa o grande y ramificadas. La densidad de la germinación se evalúa en una escala de 0 -3 para cada animal. -Regeneración de distancia larga: las fibras que se pueden seguir a través de la lesión en la médula espinal caudal, se consideran fibras que regeneran a larga distancia. Su máxima distancia a partir del sitio de lesión se puede medir, pero es generalmente una distancia mínima como algunas fibras no lesionadas a partir de la CST del funículo ventral pequeño generalmente están presentes; sus ramas mezcladas con aquellas de los axones de regeneración y hacen difícil la distinción.

Los recuentos de fibras (ensayo cuantitativo): Una línea se coloca a -0.5 mm rostral al final de la CST cortada transversalmente se presenta en secciones alternas de la materia gris, y todas las interacciones con fibras de CST (colaterales normales o brotes) se cuentan. Las líneas similares se colocan caudal a la lesión a una distancia de +0.5, +2 y +5 mm a partir del centro de la lesión. Las fibras de intersección se cuentan y los 3 niveles se adicionan a una cantidad que refleja las fibras de CST en el caudal de la médula espinal. Estas fibras caudales se dividen por el número de fibras -0.5 mm rostral hasta el fin de CST, para obtener una relación.

Dos semanas después de una lesión de médula espinal, que destruye aproximadamente el 40 % del segmento T8 de la médula espinal, principalmente en la mitad dorsal, incluyendo ambas CSTs principales: el seguimiento de la CST en animales control muestra un grado moderado de germinación reactivo del tracto. Este fenómeno corresponde a la germinación espontánea en respuesta a la lesión bien conocida en la literatura. Las ratas lesionadas que se tratan con las moléculas de enlace de la invención o con bombas proporcionando las moléculas de enlace de la invención pueden mostrar una germinación mejorada en el sitio de lesión y regeneración de crecimiento neurítico de los axones dañados de neuritas dañadas.

Por consiguiente la invención también proporciona

(i) el uso de las moléculas de enlace de la invención en la reparación de nervios de un sistema nervioso de mamífero, en particular el sistema nervioso humano,

(iii) una composición farmacéutica para la reparación de nervios de un sistema nervioso de mamífero, en particular el sistema nervioso humano que comprende las moléculas de enlace de la invención y un portador o diluente farmacéuticamente aceptable.

En particular, las moléculas de enlace de la Invención son útiles para la regeneración axonal y mejora la germinación después de daño de fibra nerviosa. De esta manera las moléculas de la invención tienen una amplia utilidad en particular para sujetos humanos. Por ejemplo, las moléculas de enlace de la invención son útiles en el tratamiento de varias enfermedades del sistema nervioso periférico (PNS) y central (CNS), i.e. más particularmente en enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica (ALS), patologías como Lewy u otra demencia en general, las siguientes enfermedades craneales, cerebrales o trauma espinal, accidente cerebro vascular o una enfermedad desmielizante. Tales enfermedades desmielizantes incluyen, pero no se limitan a, esclerosis múltiple, desmielinación monofásica, encefalomielitis, leucoencefalopatía multifocal, panencefalitis, enfermedad de Marchiafava-Bignarnl, mielinólisis pontina, adrenoleucodistrofia, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, degeneración Spongy, enfermedad de Alexander, enfermedad de Canavan, leucodistrofia metacromática y enfermedad de Krabbe. En un ejemplo, la administración de las moléculas de enlace de la invención se puede utilizar para tratar una enfermedad desmielinante asociada con la proteína NogoA. En otro ejemplo, las células que expresan las moléculas de enlace de la invención pueden ser transplantadas a un sitio de la lesión de médula espinal para facilitar el crecimiento axonal por todo el sitio de lesión. Tales células transplantadas deberían proporcionar un medio para almacenar la función de la médula espinal después de una lesión o trauma. Tales células podrían incluir células olfatorias de la glia y células madre de diferentes linajes de nervio fetal o de injertos de tejido.

Además, las Moléculas de Enlace de la Invención son útiles para el tratamiento de desórdenes oculares degenerativos que puedan directa o indirectamente involucrar la degeneración de células retinales o corneales incluyendo retinopatías isquémicas en general, neuropatía óptica isquémica anterior, todas las formas de neuritis óptica, degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía diabética, edema macular cistoide (CME), retinitis pigmentosa, enfermedad de Stargardt, degeneración retinal vitelliform de Best, amaurosis congenital de Leber y otras degeneraciones retinales hereditarias, miopia patológica, retinopatia del prematuro, y neuropatía óptica hereditaria de Leber, los efectos después del trasplante de córnea o de cirugía corneal refractiva, y queratitis por herpes.

Por otra parte, fue demostrado que NogoA juega un papel en condiciones psiquiátricas, en particular esquizofrenia y depresión. Por lo tanto, las moléculas de enlace de la invención son útiles para el tratamiento de condiciones psiquiátricas, en particular esquizofrenia y depresión.

Las Moléculas de Enlace de la invención se pueden proporcionar solas, o en combinación, o en combinación secuencial con otros agentes. Por ejemplo, las moléculas de enlace de la invención se pueden administrar en combinación con agentes anti-inflamatorios, tales como pero no se limitan a corticosteroides después de un accidente cerebro vascular o lesión de médula espinal como un medio para bloquear otro daño neuronal y la inhibición de la regeneración axonal, Factores neurotróficos tales como NGF, BDNF u otros fármacos para enfermedades neurodegenerativas tales como Exelon™

o Levodopa. Como se utiliza en este documento, se dice que dos agentes se administran en combinación cuando los dos agentes administrados simultáneamente o se administran de forma independiente de un modo tal que los agentes actuarán al mismo tiempo.

Para el tratamiento de condiciones psiquiátricas, en particular esquizofrenia o depresión, las Moléculas de Enlace de la invención se puede utilizar solas o en combinación en particular con otros agentes seleccionados del grupo que consiste de (a) fármacos anti-epilépticos seleccionados de barbituratos y derivados de estos, benzodiazepinas, carboxamidas, hidantoinas, succinimidas, ácido valproico y otros derivados de ácidos grasos y otros fármacos anti-epilépticos, (b) antipsicóticos convencionales, (c) antipsicóticos atípicos y (d) antidepresivos.

El término "barbituratos y derivados de estos", como se utiliza en este documento incluye, pero no se limita a Fenobarbital y primidon. El término "benzodiazepinas" como se utiliza en este documento incluye, pero no se limita a clonazepam, diazepam y lorazepam. El término "carboxamidas" como se utiliza en este documento incluye, pero no se limita a carbamazepina, oxcarbazepina y 10-hidroxi-10,11-dihidrocarbamazepina. El término "hidantoinas" como se utiliza en este documento incluye, pero no se limita a fenitoina. El término "succinimidas" como se utiliza en este documento incluye, pero no se limita a etosuximida y mesuximida. El término "ácido valproico y otros derivados de ácidos grasos" como se utiliza en este documento incluye, pero no se limita a sal de sodio de ácido valproico, tiagabina clorhidrato monohidrato y vigrabatrina. El término "otro fármacos anti-epilépticos" como se utiliza en este documento incluye, pero no se limita a levetiracetam, lamotrigina, gabapentina y felbamato.

El término "antipsicóticos convencionales" como se utiliza en este documento incluye, pero no se limita a haloperidol y flufenazina.

14 El término "antipsicóticos atípicos" como se utiliza en este documento se relaciona con clozaril, risperidona, olanzapina, quetiapina, ziprasiduno y aripiprazol. El término "antidepresivos" como se utiliza en este documento incluye, pero no se limita a inhibidores selectivos de la reabsorción de la serotonina (SSRI’s), o inhibidores selectivos de la reabsorción de la serotonina y la norepinefrina (SNRI-s). Un SSRI’s apropiado para la presente invención se puede seleccionar de fluoxetina, fuvoxamina, sertralina, paroxetina, citalopram y escitalopram. La estructura de los ingredientes activos identificados por números de códigos, nombres genéricos o comerciales se pueden tomar de la edición actual del compendio estándar "The Merck index" o a partir de bases de datos, por ejemplo Patents International (por ejemplo IMS World Publications). Alguien de habilidad en el oficio, está completamente habilitado para identificar los ingredientes activos y, basándose en estas referencias, igualmente, habilitado para la fabricación y prueba de las propiedades e indicaciones farmacéuticas en modelos de prueba estándar, tanto in vitro como in vivo. Para las indicaciones mencionadas anteriormente, la dosificación apropiada, por supuesto, variará dependiendo de, por ejemplo, la molécula particular de la invención que se emplea, el modo de administración y la naturaleza y severidad de la condición que se trata. Las Moléculas de Enlace de la invención se pueden administrar convenientemente por bombas o inyectados como terapéuticos en el sitio lesionado, por ejemplo se pueden administrar directamente en el CNS intracranealmente o en la espina vía intratecal en el sitio lesionado. Las composiciones farmacéuticas de la invención, se pueden fabricar de manera convencional. Por ejemplo una composición de acuerdo con la invención que comprende las moléculas de la invención, preferiblemente se proporciona en forma liofilizada. Para la administración inmediata se disuelve en un portador acuoso apropiado, por ejemplo agua estéril para inyección o solución salina fisiológica estandarizada estéril. Para ayudar en la toma de composiciones apropiadas, las moléculas de enlace de la invención y opcionalmente un segundo fármaco que mejora el efecto de las Moléculas de Enlace de la invención, se puede empacar por separado dentro del mismo contenedor, con instrucciones para administración concomitante o mezclada. Candidatos opcionales del segundo fármaco se proporcionan anteriormente. El efecto sinérgico de una combinación de las moléculas de enlace de la invención y los factores de crecimiento tales como NGF se pueden demostrar in vivo, mediante el modelo de lesión de la médula espinal descrito anteriormente. Breve descripción del dibujo Figura 1: Comparación de la Secuencia: La comparación de la secuencia del NiG de diferentes especies, mostrando la secuencia del péptido inmunogénico para el mAb 11C7. La invención se entenderá más plenamente por referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, estos no se construyen como limitantes del alcance de la invención. En los siguientes ejemplos todas las temperaturas son en grados Centígrados (°C). El anticuerpo monoclonal de atención en los Ejemplos, es una Molécula de Enlace de acuerdo con la presente invención que comprende la parte variable de la cadena liviana (SEQ ID NO: 3) y la parte variable de la cadena pesada (SEQ ID NO: 2). Las siguientes abreviaturas se utilizan: ELISA ensayo inmuno-absorbente ligado a enzima FACS clasificación de células activadas por fluorescencia.

FITC isotiocianato de fluoresceína FBS suero fetal bovino HCMV promotor de citomegalovirus humano IgG inmunoglobulina de isotipo G MAb anticuerpo monoclonal PBS solución salina estandarizada de fosfato PCR reacción en cadena de la polimerasa

Ejemplo 1: NiG-D20 (SEQ ID NO: 24) es uno de los fragmentos inhibidores del crecimiento neurítico de NogoA

Métodos:

a) Biblioteca de deleción de Nogo-A de rata: Las construcciones de deleción se hacen utilizando sitios de restricción internos, mediante el tratamiento Exonucleasa III/Mung Bean Nucleasa y por PCR con cebadores específicos de Nogo-A de rata en Nogo-de rata (método como en WO00/31235): Nogo-A de rata (aa 1-1163; ADN como se muestra de ahora en adelante relacionado con los aminoácidos de Nogo-A de rata (SEQ ID NO: 26), por ejemplo aa 1-1163 significa que la construcción de ADNc codifica para el polipéptido que inicia en el aminoácido 1 y termina en el aminoácido 1163 de la secuencia del polipéptido de NogoA de rata), Nogo-B de rata (aa 1-172 + 9761163), Nogo-C de rata (Nogo-C terminal-N 11 aa + aa 976-1163), Nogo-66 de rata (aa 1019-1083), GST-Nogo-66 de rata (aa 1026-1091), NiR-G de rata (aa 1-979), NiR de rata (1-172), NiR-D1 de rata (aa 1-31), NiR-D2 de rata (aa 59-172), NiR-D3 de rata (aa 1-31 + 59-172), EST-Nogo1 de rata (aa 762-1163), NiG de rata (aa 174-979), NiG-D1 de rata (aa174-909), NiG-D2 de rata (aa 174-865), NiG-D3 de rata (aa 172-723), NiG-D4 de rata (aa 172-646), NiG-D5 de rata (aa 293-647), NiG-D6 de rata (aa prat NiG-D7 (aa 174-235 + 294-979), NiG-D8 de rata (aa 218-653), NiG-D9 de rata (aa 172259 + 646-974), NiG-D10 de rata (aa 293-979), NiG-D11 de rata (aa 209-268), NiGD12 de rata (aa 198-233), NiG-D13 de rata (aa 174-216), NiG-D14 de rata (aa 174-260), NiG-D15 de rata (aa 174190 + 493-979), NiG-D16 de rata (aa 174-190 + 621-979), NiG-D17 de rata (aa 174-190 + 259-979), NiG-D18 de rata (aa 174-190 + 263-979), NiG-D19 de rata (aa 763-865), NiG-D20 de rata (aa 544725), NiG-D21 de rata (aa 812-918), NiG-D22 de rata (aa 866-975), NiGD23 de rata (aa 914-975), NiG-D24 de rata (aa 544-685), NiG-D25 de rata (aa 614-725), NiG-D26 de rata (aa 544-613), NiGD27 de rata (aa 581-648), NiG-D28 de rata (aa 614-685), NiG-D29 de rata (aa 648-725), NiG-D30 de rata (aa 682-725), NiG-D31 de rata (aa 544-580), NiG-D32 de rata (aa 581-613), NiG-D33 de rata (aa 614-648), NiG-D34 de rata (aa 648-685), NiG-D35 de rata (aa 260-556), NiG-D36 de rata (aa 260415). NiR-G y NiR-a se derivan de Nogo-A-pET28 mediante digestiones de enzima de restricción. NiG se deriva de NiR-G por digestión de restricción y tratamiento con MungBean Nucleasa. NiG-D1, -D3, -D4, -D5, -D7, -D8, -D9, -D10 derivados de NiG-pET28, por digestiones de enzima de restricción. NiG-D15, -D16, -D17, -D18 derivados de NiGpET28 por digestión de la Exonucleasa III. NiR-b, NiR-D1, -D2, -D3 derivados por PCR con NiR-a-pET28 como una plantilla. NiGD2, -D6, D11, -D12, -D13, -D14, -D19, -D20, -D21, -D22, -D23, -D24, -D25, -D26, -D27, -D28, -D29, -D30, -D31, -D32, -D33, -D34, -D35, -D36 derivados por PCR utilizando NiG-pET28 como una plantilla. Todas las construcciones se subclonaron en pET28. pET28 utilizado para todas las construcciones mencionadas anteriormente. pGEX-6P utilizado para GST-Nogo66 y pET26 para la expresión periplásmica de NiG de rata. GST-Nogo-66 humano (aa 1055-1120 de Nogo-A humano) se clona por PCR en ADN de NogoA humano (SEQ ID NO: 4) como una plantilla. Las construcciones de deleción luego se clonan en el vector pET28 (Novagen), pGEX-6P (Amersham Pharmacia Biotech) y el vector pET26 (Novagen). GST-Nogo-66 humano corresponde a la proteína GST-nogo publicada por GrandPré et al. (supra). El péptido sintético 4 de rata EELVQKYSNSALGHVNSTIKELRRL (SEQ ID NO: 27) corresponde al péptido 4 humano (péptido 4 humano se ha mostrado que es la región inhibidora del dominio del Nogo-66 (GrandPre et al., 2000)). El péptido ortólogo de rata tienen un apareamiento erróneo sencillo C->S (ver secuencia del péptido 4 en GrandPré et al., 2000, supra). Péptido sintético rico en Pro/Ser PSSPPPSSPPPSSPPPS (SEQ ID NO: 28) así como péptido 4 de rata se han producido y se purificaron por HPLC mediante Primm SA. NogoA_623-640 Humano (SEQ ID NO: 6) se sintetiza y purifica por Research Genetics Inc.

b) Generación de construcciones de expresión de Nogo-A humano.(pRK7-hNogo-A): Una biblioteca de ADNc humana construida en lambda gt10 (Clontech) se selecciona con conjuntos de filtros duplicados utilizando procedimientos estándar. Los fragmentos de Nogo-A humano se amplifican por PCR a partir de un ADNc de cerebro completo humano (Clontech) utilizando un protocolo estándar y posteriormente se clona en pBluescript, se digiere y aísla, o se utiliza como sondas de selección directamente. Se utiliza un fragmento de 400bp Xhol/Smal como sonda 5’, la sonda 3’ se amplifica con los cebadores CA-NA-2F: 5’-AAG CAC CAT TGA ATT CTG CAG TTC C-3’ (SEQ ID NO: 29) y CA-NA-3R: 5’-AAC TGC AGT ACT GAG CTC CTC CAT CTG C-3’ (SEQ ID NO: 30). Los clones positivos se aíslan, subclonan y se confirma la secuencia. Para obtener un ADNc de Nogo-A humano de longitud completa, los clones solapados se ensamblan utilizando un único sitio de restricción EcoRI en la secuencia Nogo-A humano y se subclonan en el vector Bluescript, denominado Pbsnogoa. Para obtener pRK7-hNogo-A, el de ADNc longitud completa fue insertado en el vector de expresión eucariótico pRK-7 mediante clonación direccional.

c) Generación de plásmidos de expresión de NiG humano (hNiG) (pET28a-hNiG) para la producción bacteriana: Un hNiG que codifica un fragmento de ADN se subclona en BamHI/XhoI de pET28a (Novagen), después de la amplificación de PCR de la respectiva región codificante a partir de Pbsnogoa, en marco con el terminal-N His-y T7-tag para la expresión bacteriana, utilizando los conjuntos cebador: 5’ hacia adelante-GTC GCG GAT CCA TGG AGA CCC TTT TTG CTC TTC-3’ (SEQ ID NO: 31); 5’ reverso-GTT CTC GAG TTA TGA AGT TTT ACT CAG-3’ (SEQ ID NO: 32). El plásmido final se denomina pET28a-hNiG. hNiG luego fue expresado en E.coli BL21 pRP, mediante la inducción con Isopropil-beta-D-tiogalactopiranosida (IPGT)1 mM.

d) Generación del plásmido de expresión NiG-exon3 de ratón (mNiG-exon3): La región que codifica el exón 3 de ratón se amplifica a partir de la plantilla BAC del genoma de ratón con los cebadores: 5’ hacia adelante-GTG CGG ATC CAT GGA TTT GAA GGA GCA GC-3’ (SEQ ID NO: 33); 5’ reverso-GTT TCT CGA GTG AAG TTT TAT TCA GCT C-3’ (SEQ ID NO: 34) y se subclonan en los sitios de clonación BamHI/XhoI de pET28a. La construcción final del plásmido se denomina pET28a-mNiG-exon3. Clonación de ARN NiG: PolyA de mono, el aislado de tejido congelado de cerebro de mono y el ADNc se sintetizan utilizando un cebador oligo dT. Dos fragmentos solapados que cubren la región 5’ y 3’ del ADNc se amplifican por PCR utilizando cebadores específicos de la secuencia y una enzima de corrección. Los cebadores se designan utilizando la secuencia conocida del ADNc de NiG humano. Para la amplificación del fragmento 5’,

los: cebadores son 5’-TCCACCCCGGCCGCGCCCAA 3’ (SEQ ID NO: 35) y 5’

AATGATGGGCAAAGCTGTGCTG-3’: (SEQ ID NO: 36), para el fragmento 3’, 5’

GGTACAAAGATTGCTTATGAAACA-3’: (SEQ ID NO: 37) y 5’

AGCAGGGCCAAGGCAATGTAGG-3’ (SEQ ID NO: 38). Los dos fragmentos luego se subclonan y para cada fragmento, al menos 4 clones independientes fueron secuenciados. El ADNc de longitud completa se ensambla por PCR solapada utilizando los cebadores mencionados anteriormente y el producto resultante se clona y se secuencia otra vez.

17 e) Producción de proteínas NogoNiG recombinantes y de la biblioteca Nogo-A-deleción como se definió anteriormente: La biblioteca de Nogo-A-deleción bacteriana se expresa en Escherichia coli. Las proteínas se extrajeron ya sea por sonicación repetida en solución reguladora de sonicación (Tris 20 mM, NaH2PO4 50 mM, NaCl 100 mM, pH 8.0) con 0.75 mg/ml de Lisozima, por solubilización con B-Per™ (Pierce) o con urea 8 M. NiG expresado con pelB-líder se obtiene a partir del espacio periplásmico de acuerdo con el protocolo de Novagen para la purificación de proteínas periplásmicas. Los sobrenadantes de las construcciones de pET28, se purifican utilizando Co2+-Talon™ Metal Affinity Resin (Clontech) en un procedimiento de lote. Los lisados solubilizados en urea 8 M y B-Per™ se llevan a condiciones de no-desnaturalización, sustituyendo de forma creciente la solución reguladora con solución reguladora de sonicación durante el procedimiento en lote de resina. Las proteínas se eluyen con imidazol 250 mM, en solución reguladora de sonicación en una columna de gravedad (BioRad). Las proteínas de NiG adicionalmente se purifican por filtración por gel en Superdex 200 HiLoad 16/60. Los sobrenadantes de las construcciones pGEX-6P se purifican con columna de G-sefarosa en un procedimiento de lote de acuerdo con indicaciones del fabricante (Amersham Pharmacia). La conversión de GST-Nogo-66 se hace por incubación de GST-Nogo-66 solubilizados con proteasa PreScission y la posterior purificación por HPLC. La electroelución del gel se lleva a cabo por SDS-PAGE preparativa de Nogo recombinante IMAC-purificado y la elución con BioRad Electro-Eluter en Tris 50 mM, pH 7.4, NaCl 100 mM, 0.2% (peso/vol.) de CHAPS por 1 hr a 250 mA y seguido por 30 s de polaridades de electrodo reverso. Las concentraciones de proteínas de proteínas purificados por cromatografía se determinan utilizando Pierce Coomassie Stain y BSA como proteína estándar. Las concentraciones de proteínas de las proteínas eluidas del gel se estiman basándose en la intensidad de la banda de geles teñidos con plata (Merril CR, Dunau ML, Goldman D (1981). Una tinción rápida sensible de plata para polipéptidos en geles de poliacrilamida. Analyt.Biochem. 110:201-207) con BSA como estándar. f) Producción de fragmentos de NogoA recombinante en células CHO: Un fragmento de 3119 bp resultante de un HinclI parcial digerido del ADNc de Nogo-A de rata, NiR-G, se clona en vectores de expresión pSecTag2 (Invitrogen, Groningen, The Netherlands). La transfección de pNiR-G en células CHO resulta en expresión intracelular, citoplásmica de NiR-G. Las líneas celulares CHO de NiR-G estable, se seleccionan con 250 µg/ml de Zeocin (Invitrogen). NiR-G recombinante a partir del lisado celular se purifica sobre una columna Ni2+-NTA (Qiagen AG, Basel, Switzerland). NiGD20 y Nogo-66 de rata se clonan en el vector pAPtag5 por PCR. La transfección de pNiG-D20-AP en las células CHO da lugar a NIG-620-AP que fue secretada en el sobrenadante de cultivo. Las líneas celulares pNiG-D20-AP y pNogo-66-AP estables se seleccionaron con 250 µg/ml de Zeocin (Invitrogen). Ambas líneas celulares se adaptan a condiciones de medio libre de suero (Gibco) y crecimiento en una cámara de línea celular (Integra). Los sobrenadantes se concentran diez veces antes del uso, y la concentración de proteína de fusión se evalúa como se describe en otra parte (Flanagan JG, Leder P (1990). The kit ligand: a cell surface molecule altered in steel mutant fibroblasts. Cell 63:185-194). g) ensayos de propagación de CHO y fibroblasto 3T3: Los ensayos de propagación de 3T3 se llevan a cabo como se describe previamente (Spillmann AA, Bandtlow CE, Lottspeich F, Keller F, Schwab ME (1998) Identification and characterization of a bovine neurite growth inhibitor (bNI-220). J.Biol.Chem. 273:19283-19293). Los ensayos de propagación de CHO se llevan a cabo esencialmente de la misma manera que para los fibroblastos 3T3. En resumen, las células CHO se dividen 1:2. 24 hrs después se triptinizan en PBS-EDTA durante 30 s y ~8’000 células CHO se siembran en placas, sobre placas de cultivo precubiertas con 5, 1, 0.5 y 0.2 µg/pozo de NiG o Nogo-66. Después de 30-45 min

las células se fijan con 4% (peso/vol.) de PFA, 5% (peso/vol.) de sacarosa y luego se analizan como se describe en Spillmann et al, supra). ~100 células se cuentan por pozo con un microscopio óptico; criterio de células propagadas: (a) adheridas a la placa y (b) morfología extendida indicativa para lamellipodia; bajo el microscopio óptico las células parecen más oscuras y grandes que las células no propagadas, redondas; células no-propagadas se consideran aquellas células (a) que no se adhieren a la placa OR (b) se adhieren a la placa, pero pequeñas, redondas, sin proyección de lamellipodia detectable en la placa. La relación entre las células propagadas y no propagadas define el grado de no-permisividad del sustrato.

h) ensayos de crecimiento neurítico de PC12: ensayos de crecimiento neurítico de PC12, se llevan a cabo como se describe previamente (Rubin BP, Spillmann AA, Bandtlow CE, Keller F, Schwab ME (1995) Inhibition of PC-12 cell attachment and neurite outgrowth by detergent solubilized CNS myelin proteins. Europ. J. Neurosci. 7: 2524-2529). Las células PC12 (un clon de la célula PC12 capaz de crecer de forma independiente de laminina obtenida de Moses Chao, New York) se impriman por dos días con 50-100 ng/ml de NGF (Harlan Bioproducts, Indianapolis) a DMEM, 5% de suero fetal bovino, 10% de suero de caballo, 100 U/ml de Penicilina y 0.5 mg/ml de Estreptomicina (Pen-Strep de Gibco-BRL). Las células PC12 se separan mecánicamente, se triptinizan por 5 minutos con 0.05% de tripsina (Sigma) en HBSS (Gibco) y se plantan a una densidad de 3,000-5,000 células/cm2 en medio de cultivo con 100 ng/ml de NGF. Los ensayos fueron detenidos después de 24 hrs adicionando 4% (peso/vol.) de PFA, 5% (peso/vol.) de sacarosa en PBS, pH8. Las placas de cultivo celular se cubrieron para las células PC12 de la misma manera que para las células 3T3.

i) Ensayos de banda de células ganglionares de la retina: El ensayo de tirillas de células ganglionares de la retina se llevan a cabo de acuerdo con Vielmetter (ver Vielmetter J, Stolze B, Bonhoeffer F, Stuermer CA (1990) In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Exp. Brain Res. 81:283-287) con modificaciones (ver Schmalfeldt M, Bandtlow CE, Dours-Zimmermann MT, Winterhalter KH, Zimmermann DR (2000) Brain derived versican V2 is a potent inhibitor of axonal growth. J. Cell Sci. 113:807-816). Los explantes se evaluaron después de la fijación con 4% (peso/vol.) de PFA, 0.1% (v/v) de glutaraldehido en PBS por 10 min a RT. Para las inmunotinciones, los explantes fijados se bloquearon por 1 hr a RT con solución de bloqueo RNO (0.5% (peso/vol.) de BSA, 0.3% (peso/vol.) de TopBlock (Juro Supply), 0.1 % (peso/vol.) de NaN3 en PBS), se permeabilizaron por 10 min con 0.05% (v/v) de Tx-100 en solución de bloqueo-RNO, se congelan por un minuto a -20 °C e incuban con anticuerpos primarios (AS Bianca para NiR, AS Laura para Nogo-A, NiR-G, NiG, NiG-D3 y NiG-D20, Novagen mAb anti-T7 para Nogo-C y proteína control beta-Gal). Después del lavado con PBS, FITC-y TRITC (FITC: Fluoresceina-isoTioCianato: TRITC: Tetrametil Rodamina IsoTiocianato)-anticuerpos conjugados (Jackson ImmunoResearch Laboratories) se adicionan (1:150) a los explantes. Las muestras se cubrieron con el cubreobjetos en 50% (v/v) glicerol, NaHCO3 25 mM, NaCl 40 mM, 1% (peso/vol.) p-Fenilendiamina (Sigma).

Resultados:

a) Dos regiones en la parte terminal-N de Nogo-A se inhibieron para la propagación de los fibroblastos 3T3: Con el fin de identificar las regiones de Nogo-A responsables de la inhibición de la propagación del fibroblasto 3T3, una biblioteca de 50 construcciones de deleción Nogo se hizo y las proteínas recombinantes se expresan en bacterias (ver método 1a). La EC50 aparente para la inhibición de la propagación de fibroblasto 3T3, fue aproximadamente 400-500 ng/0.1ml de Nogo-A cubierta durante la noche por cm2 de la placa de cultivo (~4 pmol/cm2). El tratamiento de Nogo-A o sus fragmentos con urea 8 M, da lugar a una fuerte disminución de la actividad inhibidora, indicando que la conformación es importante. El análisis de los fragmentos de Nogo en el ensayo de propagación de fibroblastos revela que al menos dos extensiones de la proteína de Nogo-A media la inhibición de la propagación de fibroblastos plantados recientemente; denominados NiR-D2 (aa 59-172) y NiG-D20 (aa 544-725). Todos los fragmentos derivados de la región de NiG mostrando actividad inhibidora (por ejemplo NiG-D4 y NiG-D8) parcialmente solapado, con NiG-D20. La menor actividad inhibidora a una alta concentración de la proteína se ve para NiG-D19 dentro de la región NiG-D6. Nogo-C, Nogo-66 y Péptido 4 de rata (muestra que es la región inhibidora de Nogo-66 por GrandPré et al., 2000) no son inhibidores para la propagación de fibroblastos. Estos datos muestran que la actividad anti-propagación de Nogo-A en los fibroblastos 3T3 reside en dos extensiones definidas localizadas en el terminal-N (NiR-D2) y dentro de la parte específica de Nogo-A (NiG-D20) de la proteína. Las propiedades físico-químicas no-específicas (acidez de los fragmentos, efectos estructurales debidos a los residuos de prolina y serina) no son responsables de este efecto. El dominio RTN del terminal-C, no se involucra en la inhibición de la propagación de fibroblastos.

b) Región NiG-D20 de Nogo-A es inhibidora del crecimiento neurítico: Para determinar si los fragmentos de Nogo-A que son no-permisivos para la propagación celular también son inhibidores del crecimiento neurítico, una serie de fragmentos de Nogo-A producidos bacterianamente así como quimeras de Nogo-AP producidas eucarióticamente en diferentes ensayos neuronales se prueban. En el ensayo de tirillas (método 1), las neuritas evitan tirillas cubiertas de laminina/Nogo-A, creciendo en las tirillas solo de laminina, mientras que las tirillas cubiertas con laminina/beta-Galoctidasa no se evaden. El Nogo-A de longitud completa es no-permisivo fuertemente para el crecimiento neurítico de la célula ganglionar de la retina (RGC), mientras que la parte terminal-N (NiR) tuvo solo efectos marginales. La actividad de Nogo-C, es indistinguible del control de la proteína beta-Galoctidasa. La región específica de Nogo-A, NiG-D20 parece contener la región principal responsable de la actividad no-permisiva en el crecimiento neurítico de RGC; el crecimiento de conos se detiene cuando se encuentran con las tirillas cubiertas con NiG-D20. El efecto no-permisivo depende de la concentración. A concentraciones inferiores de Nogo-A, el número de cruzamiento de fibras aumenta. No se observaron diferencias evidentes entre las neuritas de RGC nasal y temporal, que afecten su grado de reacción con las regiones de Nogo-A. Un clon sensible a NGF, independiente de la laminina de las células PC12 se imprima con 50 ng/ml de NGF por 24 hrs y luego se siembra en las placas cubiertas con fragmentos de Nogo producidos bacterianamente a 0.1-3 µg/cm2. El crecimiento neurítico se registra un día después. La región específica de Nogo-A (NiG) y su fragmento NiG-620 inhibe fuertemente el crecimiento neurítico de PC12. Por lo contrario, el fragmento terminal-N NiR, tiene solamente una menor actividad, detectable solo a una alta concentración de la proteína. Nogo-C y Nogo-66 son inactivos.

Ejemplo 2: Presencia del sitio de enlace(s) para NiR-G y NiG-D20 en fibroblastos 3T3 y membranas corticales cerebrales de rata:

Métodos:

a) Experimentos de enlace y marcación radioactiva: NiG-D20 purificado por IMAC, yodado mediante ANAWA Trading SA (Wangen, Switzerland) (2,030 Ci/mmol) utilizando Lactoperoxidasa y purificado por HPLC de fase reversa. Las membranas de corte cerebral de rata se preparan como se describe en (Olpe HR, Karlsson G, Pozza MF, Brugger F, Steinmann M, Van Riezen H, Fagg G, Hall RG, Froestl W, Bittiger H (1990) CGP 35348: a centrally active blocker of GABAB receptors. Eur.J.Pharmacol. 187:27-38). El enlace se lleva a cabo por 1 hr a RT, esencialmente como se describe en (Kaupmann K, Huggel K, Heid J, Flor PJ, Bischoff S, Mickel SJ, McMaster G, Angst C, Bittiger H, Froestl W, Bettler B (1997) Expression cloning of GABA(B) receptors uncovers similarity to metabotropic glutamate receptors. Nature 386:239-246.), utilizando tubos de 1.5 ml preincubados por 2 hrs con 1 % (peso/vol.) de albúmina de suero de bovino para reducir el enlace no-específico. Los homogeneizados de membrana en solución reguladora HEPES, pH 7.4 (NaCl 125 mM, KCI 5 mM, MgCl2 0.6 mM, CaCl2 1.8 mM, HEPES 20 mM, dextrosa 6 mM) que contiene inhibidores de la proteasa (Rôche Diagnostics, Mannheim, FRG), se incuban con NiG-D20 yodado 1.3 nM en la ausencia o presencia de mayores concentraciones de NiG-D20 sin marcar.

b) Citometría de flujo: La citometría de flujo y clasificación celular se llevan a cabo en un clasificador celular de alta velocidad Cytomation MoFlo (Fort Collins, Colorado). El citómetro de flujo se equipa con un laser de ion de argón/UV Enterprise II, ajustado a 488 nm con 130 mW de poder. La fluorescencia de la fluoresceína (FITC) se recolecta a través de un filtro pasa banda de 530/40 nm. Para el análisis los fibroblastos 3T3 se despegaron con Solución reguladora de Disociación Celular (Gibco). El complejo pre-formado, utilizado para detectar el enlace de NiR-G con los fibroblastos 3T3, se prepara de la siguiente manera: NiR-G y anticuerpo anti-Myc (9E10) se incuban a una relación molar 1:1 durante 30 min a 4°C. Después, se adiciona IgG Anti Ratón de Cabra F(ab) 2 conjugado con FITC y se incuba por otros 30 min a 4°C. La relación molar resultante del complejo trimérico es 1:1:0.5. El complejo se adiciona a 1x106 de fibroblastos 3T3 en un volumen final de 0.1 ml, se incuba por 2 hrs a 4°C, se lava, y analiza por citometría de flujo.

Resultados:

Presencia del sitio de enlace(s) para fragmentos activos específicos de Nogo-A en fibroblastos 3T3 y membranas corticales cerebrales de rata: Dado que las regiones NiR-D2 y NiGD20 de Nogo-A se inhibieron para la propagación celular y el crecimiento neurítico a pesar de la ausencia de Nogo-66 y de forma independiente de NgR, la presencia de un receptor específico de Nogo-A, separado tiene que ser postulada. De esta manera, los estudios de enlace se llevan a cabo a partir de NiR-G purificado por IMAC, multimerizada y myc-etiquetada y para fibroblastos 3T3 vivos que se analizan por citometría de flujo. NiR-G Ab-complejo se une eficientemente a las células 3T3, como se ve mediante un cambio de fluorescencia de más del 90% de las células 3T3. Por lo contrario, las células 3T3 no están etiquetadas después de la incubación con el complejo mAb anti-myc ratón primario 9E10 con un IgG de cabra de anti-ratón F(ab)2 secundario FITC-conjugado, ni con Ab secundario solo. Para probar el enlace de NiG-D20 con las membranas corticales de rata, NiG-D20 [125I]-marcada en un ensayo de enlace radioligando se utiliza. A una concentración de 1.3 nM de [125I]-NiG-D20, la evidencia de un sitio de enlace específico de NiG-D20 en las membranas cerebrales, como se muestra mediante una competición dependiente de la concentración del enlace radioligando por NiG-D20 sin marcar se encuentra. Estos resultados muestran que los fragmentos aminoterminal de Nogo-A, se pueden unir a la superficie de las células 3T3 y a las membranas corticales de rata, lo que demuestra la presencia de sitios de enlace específicos de Nogo-A, unidos a la membrana o receptores.

Ejemplo 3: Generación de 11C7-IgG1 de ratón

Ratones (cepas C3H-y C57BI6/J-), se inmunizaron vía subcutánea con el péptido sintético SYDSIKLEPENPPPYEEA (= Nogo-A_623-640 de rata; SEQ ID NO: 1), correspondiente a un epitope particular en NiG-D20. Este epitope se conserva altamente en región específica de Nogo-A NiG-D20 humano, mono cinomólogo y de ratón e inicia en el aminoácido 623 y termina en el aminoácido 640 de la secuencia de aminoácidos de NogoA humano (SEQ ID NO: 5) (Ver también la alineación de la secuencia: Figura 1).

El mAb 11C7 ha sido obtenido de una fusión de Nogo-A_623-640 de rata con la ratones inmunizados proteína portadora de lapa californiana (KLH). Los anticuerpos monoclonales han sido seleccionados por ELISA en Nogo-A_623-640-KLH de rata, péptido libre de Nogo-A_623-640 de rata y un péptido-KLH no-relacionado. En otra selección, los mAbs se han probados por ELISA sobre NiR-G contra b-Galoctidasa, ambos se expresan como proteínas his-tagged y se purificaron por cromatografía de afinidad de metal. Posteriormente, los mAbs se han probado para el reconocimiento de Nogo-A en Western blot de lisados de oligodendrocito y de cerebro (origen de rata). Los anticuerpos se prueban para el reconocimiento de la proteína en inmunocitoquímica de Nogo-A de células CHO o COS transfectadas de rata y de Nogo-A endógeno de oligodendrocitos de rata (células permeabilizadas). También han sido probados por la unión superficial con oligodendrocitos de rata vivos. La reactividad en cruz de las especies se prueba en NiG recombinante de origen de rata, de ratón, de humano y bovino por ELISA y en Nogo-A endógeno de rata, ratón, humano y mono por Western blot de extractos de tejidos o celulares.

Análisis Western blot: SDS-PAGE y transferencia de Western, se llevan a cabo como se describe anteriormente (Huber AB, Weinmann O, Brosamle C, Oertle T, Schwab ME (2002) Patterns of Nogo mRNA and protein expression in the developing and adult rat and after CNS lesions. J. Neurosci. 22: 3553-3567), el bloqueo se hace con 3% (peso/vol.) de Top Block (Juro Supply, Lucerne, Switzerland). Los anticuerpos se diluyen de la siguiente manera: sobrenadantes de 11C7 monoclonal purificado o hibridoma 1:150. Los anticuerpos secundarios son anti-ratón HRP-conjugados ((Pierce; 1:5000,) 1:50,000). La hibridación con el anticuerpo 11C7 se lleva a cabo durante la noche a 4°C. Para la detección se utilizan, los reactivos de detección ECL de Amersham Pharmacia.

Resultados:

El mAb de 11C7 identifica la banda de Nogo-a de 190 KD en un Western blot de homogeneizado del cultivo celular de oligodendrocito. 11C7 también identifica NiG humano, lisado celular NiG cinomólogo y NiG-D20 de rata en western blots. El mAb de 11C7 se caracteriza como un isotipo IgG1 (IsoStrip Kit, Roche).

Ejemplo 4: Caracterización del mAb de 11C7 de ratón

Inmunocitoquímica: Los oligodendrocitos del nervio óptico se preparan como se describe (Schwab, Caroni, 1988, Neuron). Tres a cinco días de crecimiento de cultivos en cubreobjetos cubiertos de poli-L-lisina, se lavan dos veces con PBS, se fijaron en 4% (peso/vol.) de paraformaldehido (PFA), 5% (peso/vol.) de sacarosa en PBS por 15 min a temperatura ambiente (RT) y enlace no-específico se bloquea con 10% (v/v) de FCS. Las células luego se incuban con 11C7 de ratón (1:100). Los anticuerpos secundarios son TRITC de cabra anti-ratón (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Para la tinción de superficie celular, cultivos de nervio óptico de rata de dos días de edad se incuban con anticuerpo monoclonal en medio durante 25 min a RT. Los anticuerpos secundarios conjugados de fosfatasa alcalina (Milan Analytica, Lausanne) se utilizan a 1:7,500 en ácido maleico 0.1 M con 1% (peso/vol.) de reactivo de bloqueo (1 hr). Los cultivos se lavan dos veces con solución reguladora de ácido maleico, una vez que con solución reguladora fosfatasa alcalina (Tris-HCl 0.1 M pH 9.5, NaCl 0.1 M, MgCl2 5 mM) y la tinción se desarrolla por 3 hrs a temperatura ambiente con 0.175 mg/ml de BCIP (Sigma) y 0.338 mg/ml de NBT (Sigma) en solución reguladora de fosfatasa alcalina.

Epitope de NogoA_623-640 de Nogo-A presente en la superficie celular de oligodendrocitos cultivados: Los cultivos vivos de oligodendrocitos incubados con mAb de 11C7 de ratón tiñen los cuerpos celulares de oligodendrocitos diferenciados y sus procesos radiales. El IgG de ratón control y los anticuerpos contra la proteína intracelular CNPasa no tiñen las células vivas. La preincubación de 11C7 de ratón con el péptido inmunogénico correspondiente (= Nogo-A_623-640 de rata SEQ ID NO: 1), reduce la tinción a niveles de fondo (ensayo competitivo). La tinción de la superficie celular está presente en todos los procesos principales y pequeños y en el cuerpo celular. De esta manera, la parte específica de Nogo-A de la molécula reconocida por mAb de 11C7 de ratón se expone al espacio extracelular en la membrana plasmática de oligodendrocitos.

Producción y Purificación de mAb de 11C7 de ratón: Un bioreactor de 10-L glas, se utiliza para el cultivo de modo continuo del clon del hibridoma que produce el mAb de 11C7 de ratón. El bioreactor se equipa con un impulsor marino colocado en un tubo central, para una agitación suave, un filtro espín para retención celular, y tubería de silicona enrolladla para aeración libre de burbujas. Las células hibridoma se cultivan en nuestro medio libre de suero basado en RPMI. El medio se inocula con las células a 3.7 x 105/ml. Después de 28 horas medio continuo fluye a través del bioreactor se inicia con una velocidad de 0.5 volúmenes del fermentador/día (5 litros/día). Otras 24 horas después la velocidad de flujo se incrementa a su nivel final de 1 volumen del fermentador/día (10 litros/día). Después de 1 semana el cultivo alcanza un estado estable con 11 x 105 células/ml y el proceso se continúa por otra semana. El título del mAb de 11C7 de ratón se determina diariamente por HPLC. Un total de 150 litros sobrenadante del cultivo se cosecha del bioreactor, se filtra por esterilidad para la eliminación de las células y desechos de células. 150 L del sobrenadante del cultivo se concentran hasta aproximadamente 6 L utilizando un dispositivo de flujo tangencial Pellikon (Millipore ; 10 kDa corte). El sobrenadante concentrado se purifica en 3 corridas sobre una columna de volumen de lecho de 220 ml de Proteína A Sefarosa Cl-4B (Pharmacia; altura del lecho 11 cm). En resumen, el sobrenadante del cultivo después de la corrección del pH a 8.1 se carga a 4 ml/min y la columna se lava una línea de base a 8 ml/min utilizando Na2HPO4 100 mM, pH 8.1. El material unido, finalmente se eluye a 8 ml/min utilizando NaH2PO4 50 mM pH 3.0, NaCl 140 mM e inmediatamente se neutraliza (pH 7.0) con NaOH 5 N y se filtra a esterilidad. La absorbancia se monitorea a 280 nm. La porción del material purificado eventualmente se concentra otra vez, mediante ultrafiltración y/o dializa contra PBS. Todas las soluciones reguladoras utilizadas en la purificación se filtran en un dispositivo de flujo tangencial de 10 kDa ULTRASETTE™ (Filtron Technology Corporation) con el fin de eliminar las posibles contaminaciones de endotoxinas. Por la misma razón la resina de Proteína A, se lava ampliamente con etanol al 20% y todas las tuberías/bombas se tratan con NaOH 0.1 M antes del uso. La concentración de la proteína se determina espectrofotométricamente a 280 nm utilizando una absorción referencia de 1.35 para 1 mg/ml. La pureza se evalúa rutinariamente por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras utilizando geles de gradiente Novex 4-20%. El contenido de endotoxinas se determina por la reacción clásica de Lisado de Amebocitos de Limulus (LAL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Endotell AG, Allschwil, Switzerland).

Generación de los fragmentos Fab: Una porción de mAb de 11C7 de ratón se dializa extensamente contra acetato de sodio 100 mM, pH 5.5, EDTA 2 mM y se ajusta a una concentración de 6 mg/ml. Los fragmentos Fab se generan mediante la digestión con papaina (relación 1:200 peso/peso) en la presencia de cisteina 0.25 mM. La reacción se deja proceder por 16 horas a 37 °C y luego se detiene por la adición del inhibidor específico de la papaina E64 (N-[N-(L-3-transcarboxirano-2-carbonil)-Lleucil]-agmatina) en un exceso grande (10 µM). El anticuerpo digerido luego se pasa sobre una columna de proteína A Sefarosa de Flujo Rápido con el fin de eliminar el material intacto y los fragmentos Fc. La fracción Fab se dializa extensamente contra PBS y se concentra hasta aproximadamente 3 mg/ml. (La papaina y E64 son de Roche Molecular Biochemicals).

HPLC, Espectrometría de Masas y secuenciación aminoácido terminal-N de las regiones VL y VH:

23 a) Reducción y Alquilación: El anticuerpo 11C7 seco, purificado se disuelve en 40 µl de urea 8M, NH4HCO3 0.4M, pH 8.3. 60 µg de DTT (Calbiochem), pre-disuelto en 10 µl de la misma solución reguladora como la proteína, se adicionan. La reducción se lleva a cabo a 50°C por 30 min bajo argón (exceso molar de 100 veces de DTT sobre proteína tioles). Después de la reducción, la 5 muestra se enfría a temperatura ambiente. Se adicionan 304 µg de iodoacetamida (Sigma Ultra, I1149) disueltos en la misma solución reguladora que la proteína. La carboxamidometilación se lleva a cabo a temperatura ambiente por 15 min en la oscuridad. 1 µl de β-mercaptoetanol se adiciona para apagar la reacción. b) Aislamiento de Cadenas Pesada y Liviana: Las cadenas pesadas y livianas 10 carboxamidometiladas del anticuerpo se aíslan por Cromatografía Líquida de Altas Precisión de Fase Reversa (RP-HPLC) en un Sistema de HPLC Hewlett Packard 1090M con DR5 sistema de bombeo y detector de arreglo de diodos UV. Las condiciones para la cromatografía son: PerSeptive Biosystems Poros 2.1x100 mm columna empacada con material R1/H; el flujo es 0.5 ml/min; solventes: (A) TFA al 0.1 % en agua y (B) 0.09% TFA/acetonitrilo/agua 9:1; gradiente 25-70% B en 8 minutos a 80°C; 15 detección a 218/280 nm. c) LC-ESI-MS: La espectrometría de masas se lleva a cabo utilizando un espectrómetro de masas en tándem hibrido cuadrupolo tiempo de vuelo Q-Tof (Micromass, Manchester, UK) equipado con una fuente de ionización electrospray (ESI). El rango de adquisición de masas es por lo general m/z 500-2000. Los datos se registran y procesan utilizando el software MassLynx. La calibración de 20 la escala 500-2500 m/z se logra utilizando los picos de ion de carga múltiple de mioglobina de corazón de caballo (MW 16951.5). d) HPLC-MS de cadena pesada y liviana: La separación de las cadenas pesadas y livianas reducidas y carboxamidometiladas, se lleva a cabo en un sistema de HPLC HP1100 (Hewlett Packard, Palo-Alto, CA, USA) empleando una columna 1mmx150mm LC Packings empacada con Perseptive 25 Biosystems POROS R1/H. La columna se mantiene a 60°C. Volúmenes de muestra de 10 µl se inyectan en la columna utilizando un automuestreador CTC PAL (CTC, Zwingen, Switzerland) acondicionado con una válvula Valco modelo C6UW HPLC (Valco, Houston, TX, USA) y un loop de inyección de 10 µl. El HPLC fue controlado por el software MassLynx (Micromass, Manchester, UK). La detección UV es a 214 nm. El eluente A es agua que contiene TFA al 0.05%. El eluente B es 30 una mezcla 1:9 de agua: acetonitrilo que contiene TFA al 0.045%. Un gradiente de 20% de B a 90% de B, se corre en 20 minutos a 80 °C. La velocidad de flujo es por lo general 60 µl/min. El flujo total del sistema LC se introduce en la celda de detección UV, luego en la fuente ESI sin ninguna división. El sistema HPLC se controla y la señal a partir del detector UV se procesa utilizando el software MassLynx (Micromass, Manchester, UK). Las siguientes 5 señales se detectaron: 35 Tabla 1:

Medida:: Interpretación de la señal

A= 50959.0 Da B= 51119.5 Da C= 51086.0 Da D= 51251.0 Da E= 24464.8 Da: Cadena-H con carboxamidometil-cisteina (CAMCys)* Señal A+162 Da (= hexosa)** Señal A+ 127 (Lys), Cadena-H con CAMCys* Señal C+162 Da (= hexosa)** Cadena-L con CAMCys

*Existen dos tipos de cadena-H presentes, uno con y uno sin Lys en el final del terminal-C. La relación de ambas formas es aproximadamente 50:50%. **Ambos tipos de cadenas-H tiene dos formas glicosiladas correspondientes (+162)

24 d) La secuenciación aminoácido terminal-N de las regiones VL y VH: Los picos de las cadena H +L recolectadas del HPLC se utilizan para el análisis de secuencia. Las secuencias de aminoácidos se determinan en un Hewlett Packard G1000A Sistema de Secuenciación de Proteínas terminal-N. El sistema realiza la química de Edman automatizada en muestras de proteínas retenidas en columnas 5 bifásicas adsortivas miniatura. Un método de química optimizado (combinado doble 3.0) se utiliza para realzar la eficiencia química, minimizar retrasos y con ello extender el análisis de secuencia hasta aproximadamente 50 residuos. El análisis de aminoácidos-PTH se lleva a cabo en un Sistema de HPLC en-línea Hewlett Packard HP1090 equipado con un sistema ternario de bombeo y una columna PTH narrow-bore (2.1 mm x 25cm). 10 Resultados: A partir del análisis de masas de las cadenas pesadas y livianas homogéneas de 11C7-IgG1 de ratón se determinan. La cadena-H es solo glicosilada y existen dos formas con una diferencia en la Lisina terminal-C. El análisis total de masas de la cadena pesada y liviana, muestra una masa única para ambas cadenas. La cromatografía HPLC del 11C7-IgG1 de ratón muestra un pico único. Después 15 de la purificación por HPLC seguida por la reducción y alquilación, las cadenas pesadas y livianas puras están disponibles. La degradación de la secuencia terminal-N se lleva a cabo en la cadena liviana y la cadena pesada. 45 a 55 aminoácidos a partir de la secuencia terminal-N de la cadena-L y la cadena-H se identifican por la degradación de la secuencia.

imagen1

imagen2

Ejemplo 5: Clonación de genes de la cadena pesada y liviana de mAb de 11C7 de ratón

El ARN total se prepara a partir de 107 células hibridoma (clon 11C7) utilizando el reactivo TriPure (Roche diagnostics, Germany, Cat. # 1667157) de acuerdo con las instrucciones del 5 fabricante. Para la síntesis del ADNc, se aísla el ARNm a partir del ARN total preparado

anteriormente utilizando Oligotex Resin (Qiagen, Germany, cat. # 70022).

El ADNc se genera por transcripción reversa utilizando las siguientes condiciones: 2 µl de ARNm, 2 µl 10 x solución reguladora de transcripción reversa, 2 µl (dT)20 del cebador (10 µM), 0.5 µl de RNasin (Promega, 40 U/ml), 2 µl de dNTPs (5 mM cada una), 1 µl de transcriptasa reversa

10 Omniscript™ (Qiagen, Cat # 205110), 10.5 µl de ddH2O, Reacción:1hr a 37°C. Para la amplificación de PCR del ADNc que codifica para la VH y VL, se utiliza la enzima de corrección polimerasa de ADN ProofStart™.

PCR de cadena liviana y pesada: Mezcla de reacción: 2 µl de ADNc; 5 µl 10 x solución reguladora de reacción, 3 µl de dNTPs (5 mM cada una), 2 µl del 5’ cebador (10 µM) (ver Tabla 2), 15 2µl del 3’ cebador (10 µM) (ver Tabla 2), 1 µl de ProofStart (Qiagen, Cat # 202203), 36 µl de ddH2O. Condiciones del PCR: 95°C/5 min, (95°C/40 seg, 53°C/1 min, 72°C/1 min) x 35, 72°C/10 min. Los productos de PCR resultantes se ligan directamente en pCRbluntTOPO (Invitrogen). La mezcla de ligado se transfecta en las células 10TOP (Invitrogen) y varios clones se eligen. Las secuencias del nucleótido de la parte variable de la cadena pesada del mAb 11C7 (VH, SEQ ID NO: 43) y de la

20 cadena liviana del mAb 11C7 (V-L, SEQ ID NO: 44) cDNas se determinan en un secuenciador ABI. La posterior secuencia de aminoácidos de V-H y V-L se muestran en SEQ ID NO: 2 (V-H) y SEQ ID NO: 3 (V-L). Los cebadores utilizados para la amplificación de PCR de los cDNAs de VH y VL; todos los cebadores se sintetizaron por MWG Biotech, Germany. Tabla 2:

Cebador: Secuencia SEQ ID NO:

5’-VL líder: AATATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTTTC 39

3’-Cκ: TTAGGAATTCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAG 40

5’-VH líder: AATATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG 41

3’-CH bisagra: AATTGGGCAACGTTGCAGGTGACG 42

Ejemplo 6: Enlace de 11C7 y Fab con los dominios de Nogo-A utilizando ELISA

26 Placas PS de 96 pozos Greiner (#655161) se cubren con 0.4-2ug/ml de fragmentos de proteína Nogo en PBS (100ul/pozo), se cubren e incuban 4 horas a temperatura ambiente. A las placas se le dan golpecitos y se rellenan con 200ul/pozo de la solución reguladora de bloqueo (PBS+2% de BSA), se cubren e incuban 1 h a RT o durante la noche a 4 °C, luego se lavan 4 veces con agua y PBS. Las diferentes concentraciones de mAb de 11C7 de ratón o Fab de 11C7 se diluyen en PBS +2% de BSA (100 µl/pozo), e incuban 2h a RT o durante la noche a 4 °C. La etapa de lavado se repite y anti-IgG de cabra de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) a una dilución de 1:5000 (ICN #55550) en PBS/0.1% de BSA/0.1 % de Nonidet 40 (100 ul/pozo) se adiciona y se incuba 2h a RT o durante la noche a 4 °C y se repite la etapa de lavado. La reacción con HRP se inicia adicionando 100 ul/pozo de BM azul POD (Roche #1484281) e incuba en la oscuridad a RT por 15 minutos. Se adicionan 50ul/pozo de H2SO4 1M para detener reacción del sustrato HRP y la densidad óptica se determina utilizando un lector de microplacas (Packard Spectra Count) ajustado a 450nm. El mAb de 11C7 de ratón se une a NiG humano, NiG de rata, NiG de ratón, NiG-D20 de rata y péptido 472 a muy bajas concentraciones de 0.02 a 2.5 nM. El enlace con NiG humano, NiG de rata, NiG de ratón a muy baja concentración se confirma por la muy alta afinidad (mediciones de afinidad Biosensor Kd 0.1 -0.44nM) y es consistente con el hecho de que el péptido 472 con la excepción de 2-3 aminoácidos es idéntico en humanos en comparación con la región equivalente de rata y ratón. La especificidad del enlace se indica por el hecho que el mAb de 11C7 de ratón no muestra ningún enlace con fragmentos NiG-D6 de rata y Nogo-66 en el mismo rango de concentración. El fragmento de Fab monovalente se une con NiG humano y NiG-D20 rata a concentraciones de 0.025 a 25nM y no mostró enlace con los fragmentos NiG-D6 de rata y Nogo-66 en el mismo rango de concentración. La Kd medida por Biosensor fue 7.14 nM para NiG humano.

Ejemplo 7: Mediciones de afinidad Biosensor para 11C7-IgG1 de ratón y Fab para los dominios de Nogo-A

La afinidad del mAb de 11C7 de ratón y del Fab de 11C7 se mide por resonancia de plasmones superficiales (SPR) utilizando un biosensor óptico BIAcore 2000 (Biacore, Uppsala, Sweden) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Figura 2). NIG recombinante humano, ratón, y rata se adhiere covalentemente a tres células de flujo separadas de un chip sensor CM5 utilizando química de acoplamiento de amina. En resumen; la matriz dextrano carboximetilada se activa mediante la inyección de 35 µl de una solución que contiene NHS 0.025M y EDC 0.1M. Para la inmovilización en el chip sensor del NIG recombinante de ratón, humano, y rata se diluyen en solución reguladora citrato 0.01 M a un pH que varía entre 3.5 y 4.5 y se inyecta a una velocidad de flujo de 5ul/min para alcanzar los niveles de acoplamiento permitiendo mediciones de afinidad. La desactivación del grupo NHS-éster remanente se lleva a cabo mediante la inyección de 35 µl de etanolamina clorhidrato 1 M (pH 8.5): La superficie del chip sensor se regenera por la inyección de 5ul de HCl 0.1M. Para la medición de la afinidad de los anticuerpos se inyectan a diferentes concentraciones, que van desde 0.50nM a 100nM a una velocidad de flujo de 200 µl/min. Después de cada inyección el chip sensor superficial se regenera con la inyección de 10 ul de HCl 0.1 M sin pérdida de actividad de enlace en la superficie. Las constantes cinéticas, ka y kd y las constantes de afinidad KA y KD se evaluaron utilizando el software BlAevaluations 3.0, suministrado por el fabricante.

Medición de afinidad en BIAcore: La cinética y las constantes de afinidad de enlace del mAb de 11C7 de ratón y el 11C7 derivado del fragmento Fab monovalente con NogoA recombinante se miden en tiempo real utilizando tecnología de Resonancia de plasmones superficiales (SPR) (Biacore). Para este análisis NIGs recombinante humano, de ratón y de rata se acoplaron en tres

27 superficies del chip sensor independientes y diferentes concentraciones de los anticuerpos se inyectan. Los parámetros cinéticos de las interacciones de enlace se derivan del sensograma por un ajuste de curva no-lineal. Las constantes de afinidad en equilibrio de 11C7-IgG1 de ratón son KD= 0.1 nM, KD= 0.4nM y KD= 0.19nM para NIG humano, de rata, y de ratón respectivamente (tabla 3). Para el 5 fragmento Fab derivado de 11C7, la constante de afinidad para NIG humano es KD= 7.14nM. La afinidad inferior del fragmento Fab resulta de una disminución de ambas constantes cinéticas, de asociación y disociación (ka, kd). La menor afinidad del fragmento Fab en comparación con el anticuerpo completo probablemente se relaciona con el efecto de la avidez, que es carente en el Fab monomérico. 10

Tabla 3:

11C7: Ka (1/Ms) kd (1/s) KA (M-1) KD (M)

NIG Humano: 4.48x105 4.6x10-5 9.73x109 1.03x10-10

NIG Rata: 8.76x105 3.89x10-4 2.25x109 4.44x10.10

NIG Ratón: 5.52x105 1.06x10-4 5.2x109 1.92x10-10

11C7 Fab: Ka (1/Ms) kd (1/s) KA (M-1) KD (M)

NIG Humano: 7.29x104 5.28x10-4 1.4x108 7.14x10-9

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Novartis AG 15 <120> Compuesto Orgánico

<130> 4-32761P1/UNZ

<160> 44

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1 20 <211> 18

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> PÉPTIDO 25 <222> (1) .. (18)

<223> rat NogoA_623-640

<400> 1

imagen2

<210> 2 30 <211> 221

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220> <221> CADENA

<222> (1) .. (221)

<223> Parte variable de la Cadena Pesada de 11C7 con la secuencia líder

<400> 2 <210> 3

imagen3

imagen2

<211> 238

<212> PRT 5 <213> Mus musculus

<220>

<221> CADENA

<222> (1)..(238)

<223> Cadena Liviana -de 11C7 con la secuencia líder 10 <400> 3

imagen2

<210> 4

<211> 3919

<212> ADN 5 <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(3579)

<223> NogoA Humano 10 <400> 4

imagen2

<210> 5

<211> 1192

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

imagen2

<210> 6

<211> 18

<212> PRT 5 <213> Homo sapiens

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(18)

<223> NogoA_623-640 Humano 10 <400> 6

imagen2

<210> 7

<211> 819

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(819)

<223> Nig humano 20 <400> 7

imagen2

<210> 8

<211> 10

<212> PRT 5 <213> Mus musculus

<220>

<221> ENLACE

<222> (1)..(10)

<223> parte hipervariable de la cadena pesada de 11C7 10 <400> 8

imagen2

<210> 9

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> ENLACE

<222> (1)..(17)

<223> parte hipervariable de la cadena pesada de 11C7

<400> 9

imagen2

<210> 10

<211> 9 5 <212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> ENLACE

<222> (1)..(9) 10 <223> parte hipervariable de la cadena pesada de 11C7

<400> 10

imagen2

<210> 11

<211> 16 15 <212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> ENLACE

<222> (1)..(16) 20 <223> parte hipervariable de la cadena liviana de 11C7

<400> 11

imagen2

<210> 12

<211> 7 25 <212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> ENLACE

<222> (1)..(7) 30 <223> parte hipervariable de la cadena liviana de 11C7

<400> 12 <210> 13

imagen2

<211> 9

<212> PRT 5 <213> Mus musculus

<220>

<221> ENLACE

<222> (1)..(9)

<223> parte hipervariable de la cadena liviana de 11C7 10 <400> 13 <223> ADN-CDR3-11C7

imagen2

<210> 14

<211> 30

<212> ADN

15: <213> Mus musculus

<220>

<221> enlace_misc

<222> (1)..(30)

<223> ADN-CDR1-11C7

20: <400> 14

ggattcgatt ttagaagaaa ttggatgagt 30

<210> 15

<211> 51

<212> ADN

25: <213> Mus musculus

<220>

<221> enlace_misc

<222> (1)..(51)

<223> ADN-CDR2-11C7

30: <400> 15

gaaattaatc cagatagcag taagataaac tatacgccat ctctaaagga t: 51

<210> 16

<211> 27

<212> ADN

35: <213> Mus musculus

<220>

<221> enlace_misc

<222> (1)..(27)

<400> 16 ccggtctgga tgtatgctat ggactac 27

<210> 17

<211> 48

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221> enlace_misc

<222> (1)..(48)

<223> ADN-CDR’1-11C7

<400> 17 aagtcaagtc agagcctctt gcatagtgat ggaaagacat atttgaat

<210> 18

<211> 21

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221> enlace_misc

<222> (1) .. (21)

<223> ADN-CDR’2-11C7

<400> 18 ctggtgtcta aactggactc t 21

<210> 19

<211> 27

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221> enlace_misc

<222> (1)..(27)

<223> ADN-CDR’3-11C7

<400> 19 tggcaaggta cacattttcc tcagacg 27

<210> 20

<211> 54

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(54)

<223> secuencia líder para la cadena pesada de 11C7

<400> 20

imagen2

<210> 21

<211> 18

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 21

imagen2

<210> 22

<211> 57 10 <212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(57) 15 <223> secuencia líder para la cadena liviana de 11C7

<400> 22

imagen2

<210> 23 20 <211> 19

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 23

imagen2

<210> 24

<211> 181

<212> PRT 5 <213> Homo sapiens

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(181)

<223> Nig humano-D20 10 <400> 24

imagen2

<210> 25

<211> 3492 <212> ADN 5 <213> Rattus norvegicus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(3492)

<223> NogoA de rata 10 <400> 25

imagen2

<210> 26

<211> 1163

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus 5 <400> 26

imagen2

<210> 27

<211> 25

<212> PRT 5 <213> Rattus norvegicus

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1) .. (25)

<223> rat PEP4 10 <400> 27

imagen2

<210> 28

<211> 17

<212> PRT 15 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> péptido rico en PRO/SER

<220>

<221> PÉPTIDO 20 <222> (1)..(17)

<223> Péptido sintético

<400> 28 gtcgcggatc catggagacc ctttttgctc ttc

imagen2

<210> 29

5: <211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> CA-NA-2F

10: <220>

<221> enlace_cebador

<222> (1)..(25)

<223> cebador CA-NA-2F

<400> 29

15: aagcaccatt gaattctgca gttcc 25

<210> 30

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

20: <220>

<223> CA-NA-3R

<220>

<221> enlace_cebador

<222> (1)..(28)

25: <223>

<400> 30

aactgcagta ctgagctcct ccatctgc: 28

<210> 31

<211> 33

30: <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 5’ hacia adelante

<220>

35: <221> enlace_cebador

<222> (1)..(33)

<223> cebador hacia adelante

<400> 31

<210> 32

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 5’ reverso

<220>

<221> enlace_cebador

<222> (1)..(27)

<223> cebador reverso

<400> 32 gttctcgagt tatgaagttt tactcag 27

<210> 33

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 5’ hacia adelante-1

<220>

<221> enlace_cebador

<222> (1)..(29)

<223> cebador

<400> 33 gtgcggatcc atggatttga aggagcagc 29

<210> 34

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 5’-1 reverso

<220>

<221> enlace_cebador

<222> (1)..(28)

<223> cebador

<400> 34 gtttctcgag tgaagtttta ttcagctc 28

<210> 35

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador 5’

<220>

<221> enlace_cebador

84

<222> (1)..(20)

<223> cebador

<400> 35

tccaccccgg ccgcgcccaa 20

<210> 36

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador 5’-2

<220>

<221> enlace_cebador

<222> (1)..(22)

<223> cebador

<400> 36

aatgatgggc aaagctgtgc tg: 22

<210> 37

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador 3’

<220>

<221> enlace_cebador

<222> (1)..(24)

<223> cebador

<400> 37

ggtacaaaga ttgcttatga aaca: 24

<210> 38

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador 3’-2

<220>

<221> enlace_cebador

<222> (1)..(22)

<223> cebador

<400> 38

agcagggcca aggcaatgta gg: 22

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> líder 5’-VL

<220>

<221> enlace_cebador

<222> (1)..(28)

<223> cebador

<400> 39 aatatgagtc ctgcccagtt cctgtttc 28

<210> 40

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 3’-Ck

<220>

<221> enlace_cebador

<222> (1) .. (32)

<223> cebador

<400> 40 ttaggaattc ctaacactct cccctgttga ag

<210> 41

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> líder 5’-VH

<220>

<222> (1)..(31)

<223> cebador

<400> 41 aatatggatt ttgggctgat tttttttatt g 31

<210> 42

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> bisagra 3’-CH

<220>

<221> enlace_cebador

<222> (1)..(24)

<223> cebador

<400> 42 aattgggcaa cgttgcaggt gacg 24

<210> 43

<211> 663

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221> enlace_misc

<222> (1)..(663)

<223> parte variable del ADN de la cadena pesada de 11C7

<400> 43

imagen2

<210> 44 10 <211> 717

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221> enlace_misc 15 <222> (1)..(717)

<223> parte variable de la cadena liviana de 11C7

<400> 44

5

10

15

imagen2

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCION

Esta lista de referencias citada por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de la patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patentes citadas en la descripción

•: EP 239400 A [0030]

•: WO 9007861 A [0031]

•: WO 881649 A [0034]

•: EP 120674 A [0048]

•: EP 125023 A [0048]

•: WO 0031235 A [0080]

Literatura no-patente citada en la descripción

•: J Cell Biol., 14 October 2002, vol. 159 (1), 29-35 [0004]

•: Schwab ME et al. Physiol. Rev., 1996, vol. 76, 319-370 [0004]

•: Chen et al. Nature, 2000, vol. 403, 434-439 [0004]

•: GrandPre. Nature, 2000, vol. 403, 439-444 [0004]

•: Prinjha et al. Nature, 2000, vol. 403, 383-384 [0004]

•: J Neurosci., 15 May 2001, vol. 21 (10), 3665-73 [0004]

•: Kabat E.A. et al. Sequences of proteins of immunological interest. US department of

health and human services, Public health service [0013]

• T. E. Creighton. Proteins: Structure and Molecular Properties. W. H. Freeman & Co, 1983,

79-86 [0024]

•: Niederöst et al. J.Neurosci., 1999, vol. 19, 8979-8989 [0051]

•: Spillmann et al. J. Biol. Chem., 1998, vol. 273, 19283-19293 [0051]

•: Schnell ; Schwab. Eur.J. Neurosci., 1993, vol. 5, 1156-1171 [0055]

•: Brösamle et al. J.Neurosci., 2000, vol. 20, 8061-8068 [0056]

• Merril CR ; Dunau ML ; Goldman D. A rapid sensitive silver stain for polypeptides in polyacrylamide

gels. Analyt.Biochem., 1981, vol. 110, 201-207 [0080]

• Flanagan JG ; Leder P. The kit ligand: a cell surface molecule altered in steel mutant

fibroblasts. Cell, 1990, vol. 63, 185-194 [0080]

• Spillmann AA ; Bandtlow CE ; Lottspeich F ; Keller F ; Schwab ME. Identification and

characterization of a bovine neurite growth inhibitor (bNI-220). J.Biol.Chem., 1998, vol. 273, 19283

19293 [0080]

• Rubin BP ; Spillmann AA ; Bandtlow CE ; Keller F ; Schwab ME. Inhibition of PC-12 cell attachment and neurite outgrowth by detergent solubilized CNS myelin proteins. Europ. J. Neurosci., 1995, vol. 7, 2524-2529 [0080]

• Vielmetter J ; Stolze B ; Bonhoeffer F ; Stuermer CA. In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Exp. Brain Res., 1990, vol. 81, 283-287 [0080]

• Schmalfeldt M ; Bandtlow CE ; Dours-Zimmermann MT ; Winterhalter KH ; Zimmermann DR.

Brain derived versican V2 is a potent inhibitor of axonal growth. J. Cell Sci., 2000, vol. 113, 807-816

[0080]

• Olpe HR ; Karlsson G ; Pozza MF ; Brugger F ; Steinmann M ; Van Riezen H ; Fagg G ; Hall RG ; Froestl W ; Bittiger H. CGP 35348: a centrally active blocker of GABAB receptors. Eur.J.Pharmacol.,

5 1990, vol. 187, 27-38 [0082]

• Kaupmann K ; Huggel K ; Heid J ; Flor PJ ; Bischoff S ; Mickel SJ ; McMaster G ; Angst C ; Bittiger H ; Froestl W. Expression cloning of GABA(B) receptors uncovers similarity to

metabotropic 10 glutamate receptors. Nature, 1997, vol. 386, 239-246 [0082]

• Huber AB ; Weinmann O ; Brosamle C ; Oertle T ; Schwab ME. Patterns of Nogo mRNA and protein expression in the developing and adult rat and after CNS lesions. J. Neurosci., 2002, vol. 22, 3553-3567 [0086]

• Schwab, Caroni. Neuron, 1988 [0088]

Claims

Reivindicaciones

1.

Un anticuerpo monoclonal quimérico o humanizado o los fragmentos F(ab’)2 o Fab de este, un anticuerpo de cadena sencilla, o un anticuerpo de dominio sencillo capaz de unirse con el polipéptido del NogoA humano, Nogo.A_623-640 humano (SEQ ID NO: 6), que comprende al menos un sitio de enlace de antígeno, dicho sitio de enlace de antígeno que comprende:

-en secuencia las regiones hipervariables CDR1-:11C7 (SEQ ID NO: 8), CDR2-11C7 (SEQ ID NO: 9) y CDR3-11C7 (SEQ ID NO: 10); y -en secuencia las regiones hipervariables CDR1’-11C7 (SEQ ID NO: 11), CDR2’-11C7 (SEQ ID NO: 12) y CDR3’-11C7 (SEQ ID NO: 13).
2.

El anticuerpo o fragmento de este, de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende la parte constante de una cadena pesada humana y la parte constante de una cadena liviana humana.
3.

El anticuerpo o fragmento de este, de acuerdo con la reivindicación 2, en la cual la parte constante de la cadena pesada humana es del tipo γ4 y la parte constante de la cadena liviana humana es del tipo κ.
4.

Un polinucleótido que comprende los polinucleótidos que codifican un anticuerpo o un fragmento de este, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5.

Un vector de expresión que comprende los polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 4.
6.

Un sistema de expresión que comprende, un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4 o un vector de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicho sistema de expresión

o parte de este, es capaz de producir un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, cuando dicho sistema de expresión o parte de este, está presente en una célula huésped compatible.
7.

Una célula huésped aislada, que comprende un sistema de expresión de acuerdo con la reivindicación 6.
8.

El uso de un anticuerpo o de un fragmento de este, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, como un producto farmacéutico.
9.

El uso de un anticuerpo o de un fragmento de este, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de reparación de nerviosa.
10.

Una composición farmacéutica que comprende, un anticuerpo o fragmento de este de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en asociación con al menos un portador o diluente farmacéuticamente aceptable.