ES2425768T3 - Moléculas de unión a nogo-a mejoradas y uso farmacéutico de las mismas - Google Patents

Abstract

Una molécula aislada que comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno que se une específicamente al polipéptido NogoA humano (SEQ ID NO: 2) o NiG humano (SEQ ID NO: 3), dicho sitio de unión a antígeno comprende: - en secuencia las regiones hipervariables CDR-H1- 6A3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2- 6A3 (SEQ ID NO: 9) y CDR-H3- 5 6A3 (SEQ ID NO: 10); y - en secuencia las regiones hipervariables CDR-L1- 6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2- 6A3 (SEQ ID NO: 12) y CDR-L3- 6A3 (SEQ ID NO: 13).

Description

Moléculas de unión a nogo-a mejoradas y uso farmacéutico de las mismas

Campo de la invención

La invención se relaciona con moléculas de unión a NogoA mejoradas, tal como por ejemplo, anticuerpos monoclonales, derivados o fragmentos Fab de las mismas.

Antecedentes de la invención

La regeneración neuronal luego de lesión en el sistema nervioso central de adultos (SNC) se limita debido a la presencia del ambiente inhibidor de mielina que envuelven los axones y la formación de tejido de cicatriz. En años recientes se han adquirido conocimientos importantes en la comprensión molecular del porqué el SNC es incapaz de repararse espontáneamente luego de lesión. Las moléculas inhibidoras en la mielina son el impedimento principal para la regeneración axonal, particularmente inmediatamente después de lesión. Hasta el momento NogoA, Glucoproteína Asociada con Mielina (MAG) y glucoproteína de oligodendrocito-mielina (OMgp) se han caracterizado como inhibidores potentes del crecimiento de neuritas. Adicionalmente, la mielina también contiene otros componentes inhibidores, tal como proteoglicanos de sulfato de condroitina. El Nogo-A es un miembro de la familia de proteína de reticulón y tiene por lo menos dos dominios farmacológicamente distintos y biológicamente activos denominados Amino-Nogo y Nogo-66. Aunque el sitio del receptor para el primero no se conoce hasta ahora, el Nogo-66 inhibe el crecimiento neuronal in vitro e in vivo por medio del receptor neuronal NgR. Además del Nogo-66, el MAG y OMgp también se unen al NgR con alta afinidad e inhiben el crecimiento de neuritas.

Actualmente se siguen nuevos métodos de investigación para la mejora de reparación del nervio que incluyen digestión de tejido de cicatriz utilizando una condroitinasa de enzima ABC, técnicas de puenteado que utilizan células Olfativas envolventes y mastocitos y factores de crecimiento de proteína para estimular el crecimiento neuronal. Se pueden lograr acciones de bloqueo de los inhibidores de crecimiento de neuritas mediante la modulación de mediadores de señalización intracelular tal como Rho, una trifosfatasa de guanosina unida a membrana (GTPasa), que parece ser un enlace clave en la inhibición del crecimiento axonal. El monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) puede superar la inhibición asociada con mielina in vitro e induce la regeneración in vivo. El inhibidor de péptido del receptor NgR (NEP 1-40) se puede utilizar para inducir el recrecimiento neuronal y la recuperación funcional en ratas luego de lesión espinal.

Además del uso de los métodos descritos anteriormente, también se ha enfocado la atención en el uso de ciertos anticuerpos monoclonales para neutralizar las moléculas inhibidoras de crecimiento de neuritas del sistema nervioso central y periférico, en particular para neutralizar la actividad inhibidora de crecimiento de neuritas de NogoA. Sin embargo se ha mostrado que el anticuerpo monoclonal IN-1 o el fragmento IN-1 Fab del mismo induce el crecimiento de neuritas in vitro y mejora la germinación y la regeneración in vivo (Schwab ME et al. (1996) Physiol. Rev. 76, 319370). También se han descrito anticuerpos alternativos para IN-1 en los documentos WO2004/052932 (11C7-Ab) y WO2005/028508 (3A6-Ab). La prueba de diferentes dominios del NogoA para la actividad inhibidora de crecimiento de neuritas ha delineado diversos dominios inhibidores en la molécula (Chen et al. (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre et al., (2000) Nature 403, 439-444; Prinjha et al. (2000) Nature 403, 383-384.

Las inmunoglobulinas o anticuerpos naturales comprenden una molécula multimérica generalmente con forma de Y que tiene un sitio de unión a antígeno al final de cada brazo superior. El resto de la estructura, en particular el tallo de Y media las funciones efectoras asociadas con las inmunoglobulinas. Los anticuerpos consisten de 2 cadenas pesadas y 2 cadenas ligeras. Las cadenas pesada y ligera comprenden un dominio variable y una parte constante. Un sitio de unión a antígeno consiste del dominio variable de una cadena pesada asociada con el dominio variable de una cadena ligera. Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera tienen la misma estructura general. Más particularmente, las características de unión a antígeno de un anticuerpo se determinan esencialmente por 3 regiones específicas en el dominio variable de las cadenas pesada y ligera que se denominan regiones hipervariables o regiones de determinación de complementariedad (CDR). Estas 3 regiones hipervariables alternan con 4 regiones de estructura (FR) cuyas secuencias se conservan relativamente y no está directamente implicadas en la unión. Los CDR forman bucles y se mantienen muy cerca las regiones de estructura principal que adoptan en gran medida una conformación de lámina ß. Los CDR de una cadena pesada junto con los CDR de la cadena ligera asociada constituyen esencialmente el sitio de unión a antígeno de la molécula de anticuerpo. La determinación de lo que constituye un FR o una región CDR se hace usualmente al comparar la secuencia de aminoácidos de una serie de anticuerpos producidos en la misma especie. Las reglas generales para identificar las regiones CDR y FR son de conocimiento general de un experto en la técnica y por ejemplo se puede encontrar en el sitio web (www.bioinf.org.uk /abs/).

En general, se presenta aún una necesidad clara de formas nuevas y mejoradas para inducir la regeneración del tejido neural luego de lesión en el sistema nervioso central del adulto (SNC).

Resumen de la invención

La invención está dirigida a un nuevo anticuerpo humano monoclonal con propiedades superiores para modular la actividad NogoA en experimentos in vitro e in vivo y con una influencia positiva en la regeneración neuronal luego de lesión en el sistema nervioso central del adulto (SNC). La invención por lo tanto proporciona nuevas moléculas de unión a la proteína NogoA o fragmentos de la misma.

En una realización, la invención por lo tanto proporciona una molécula aislada que comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno que se une específicamente al polipéptido NogoA humano (SEQ ID NO: 2) o NiG humano (SEQ ID NO: 3), dicho sitio de unión a antígeno comprende:

*

en secuencia las regiones hipervariables CDR-H1- 6A3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2- 6A3 (SEQ ID NO: 9) y CDR-H36A3 (SEQ ID NO: 10); y

*

en secuencia las regiones hipervariables CDR-L1- 6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2- 6A3 (SEQ ID NO: 12) y CDR-L3- 6A3 (SEQ ID NO: 13).

En todavía otra realización, la invención proporciona una molécula de unión que comprende:

*

por lo menos una cadena pesada de inmunoglobulina o fragmento de la misma que comprende (i) un dominio variable que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2- 6A3 (SEQ ID NO: 9) y CDR-H3- 6A3 (SEQ ID NO: 10) y

(ii) la parte constante o fragmento de la misma de una cadena pesada humana; y

* por lo menos una cadena ligera de inmunoglobulina o fragmento de la misma que comprende (i) un dominio variable que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR-L1- 6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2- 6A3 (SEQ ID NO: 12) y CDR-L3- 6A3 (SEQ ID NO: 13) y (ii) la parte constante o fragmento de la misma de una cadena ligera humana.

En otra realización, la molécula de unión de acuerdo con la invención tiene una constante de disociación < 1000nM.

En una realización alternativa de la molécula de unión de la invención, la parte constante o fragmento de la misma de la cadena pesada humana es del tipo y4 y la parte constante o fragmento de la misma de la cadena ligera humana es del tipo κ.

En una realización adicional, la molécula de unión de acuerdo con la invención es un anticuerpo monoclonal humano

o quimérico o humanizado.

En todavía otra realización, la molécula de unión de acuerdo con la invención comprende una o más secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO: 4 (IgG1 pesado), SEQ ID NO: 5 (IgG1 ligero), SEQ ID NO: 24 (IgG4 pesado) y SEQ ID NO: 25 (IgG4 ligero).

Adicionalmente, la invención también proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula de unión de acuerdo con la invención.

En ciertas realizaciones, dicho polinucleótido aislado de la invención comprende:

*

por lo menos una de las secuencias de polinucleótidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16; o

*

por lo menos una de las secuencias de polinucleótidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19.

En realizaciones preferidas, dicho polinucleótido de la invención comprende:

*

una secuencia de polinucleótidos que comprende en secuencia SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16; y

*

una secuencia de polinucleótidos que comprende en secuencia SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19.

*

la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 6 y/o la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 7, o,

*

la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 26 y/o la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 28.

En todavía otra realización preferida, dicho polinucleótido de la invención comprende: Adicionalmente, la presente invención también proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido de acuerdo con la invención como se definió anteriormente.

Adicionalmente, la invención proporciona un sistema de expresión que comprende el vector de expresión como se definió anteriormente, en donde dicho sistema de expresión o parte del mismo es capaz de producir un polipéptido de la invención como se definió anteriormente, cuando dicho sistema de expresión o parte del mismo está presente en una célula anfitriona compatible.

Adicionalmente, la presente invención también proporciona una célula anfitriona aislada que comprende el vector como se definió anteriormente.

Adicionalmente, la presente invención también proporciona una composición aislada que comprende la molécula de unión de acuerdo con la invención y un portador.

Adicionalmente, la presente invención también proporciona una composición aislada que comprende el polinucleótido de acuerdo con la invención, y un portador.

Adicionalmente, la presente invención también proporciona una composición aislada que comprende el vector de expresión de acuerdo con la invención, o una célula anfitriona de acuerdo con la invención.

La invención proporciona adicionalmente un método para administrar una molécula de unión de acuerdo con la invención a una persona en necesidad de tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso periférico (SNP) y/o central (SNC).

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión de acuerdo con la invención, una polinucleótido de acuerdo con la invención, un vector de expresión o sistema de expresión de acuerdo con la invención, respectivamente, o una célula anfitriona de acuerdo con la invención, en asociación con por lo menos un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En cierta realización, dicha composición farmacéutica es una composición de liberación lenta.

La invención proporciona adicionalmente un método para el tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso periférico (SNP) y/o central (SNC) que comprende administrar a un sujeto en necesidad de dicho tratamiento una cantidad efectiva de una molécula de unión de acuerdo con la invención, un polinucleótido de acuerdo con la invención, un vector de expresión o sistema de acuerdo con la invención, respectivamente, o una célula anfitriona de acuerdo con la invención. En una realización preferida, la enfermedad es una enfermedad neurodegenerativa seleccionada del grupo que consiste de enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, Esclerosis amiotrófica lateral (ALS), patologías como Lewy u otra demencia en general, enfermedades luego de trauma craneal, cerebral o espinal, apoplejía y una enfermedad desmielinizante. En una realización preferida adicional, la enfermedad desmielinizante se selecciona del grupo que consiste de esclerosis múltiple, desmielinación monofásica, encefalomielitis, leucoencefalopatía multifocal, panencefalitis, enfermedad de Marchiafava-Bignami, mielmolisis pontine, adrenoleucodistrofia, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, Degeneración esponjosa, enfermedad de Alexander, enfermedad de Canavan, leucodistrofia metacromática y enfermedad de Krabbe.

Alternativamente, la enfermedad es un trastorno ocular degenerativo que puede implicar directamente o indirectamente la degeneración de células retinales o de córnea. En una realización preferida, el trastorno ocular degenerativo se selecciona del grupo que consiste de retinopatías isquémicas, neuropatía óptica isquémica anterior, neuritis óptica, degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía diabética, edema macular quístico (CME), retinitis pigmentosa, enfermedad de Stargardt, degeneración retinal viteliforme de Best, amaurosis congénita de Leber y otras degeneraciones retinales hereditarias, miopía patológica, retinopatía del prematuro, y neuropatía óptica hereditaria de Leber, los efectos posteriores de trasplante de córnea o de cirugía de córnea refractiva, y queratitis por herpes.

Alternativamente, la enfermedad es una afección siquiátrica. Preferiblemente, dicha afección siquiátrica se selecciona del grupo que consiste de esquizofrenia y depresión.

En los métodos de tratamiento como se indicó anteriormente, la administración se realiza preferiblemente intracranialmente o intratecalmente.

Adicionalmente, la invención también proporciona un método para producir la molécula de unión de acuerdo con la invención, que comprende expresar el polinucleótido de acuerdo con la invención en un vector de expresión o sistema de acuerdo con la invención, por medio de tecnología de ADN recombinante o por medio de síntesis química.

Adicionalmente, la invención proporciona un método para administrar la composición farmacéutica de acuerdo con la invención localmente en el sitio de una lesión.

Finalmente, la invención también proporciona un método que comprende administrar uno o más de los siguientes productos seleccionados del grupo que consiste de: una molécula de unión de acuerdo con la invención, un polinucleótido de acuerdo con la invención, un vector de expresión o sistema de acuerdo con la invención, una célula anfitriona de acuerdo con la invención, como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso periférico (SNP) y/o central (SNC).

La invención proporciona adicionalmente un método para producir una molécula de unión de la invención y un polinucleótido, un vector de expresión, por medio de tecnología de ADN recombinante o por medio de síntesis química que codifica dicha molécula de unión.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión, un polinucleótido, un vector de expresión o sistema o una célula anfitriona de acuerdo con la presente invención en asociación con por lo menos un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. También proporciona productos que contienen dicha molécula de unión, polinucleótido, vector de expresión o sistema o dicha célula anfitriona, o un derivado farmacológicamente aceptable del mismo, como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso periférico (SNP) y/o central (SNC).

También se prevé un método para el tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso periférico (SNP) y/o central (SNC) que comprende administrar a un sujeto en necesidad de dicho tratamiento una cantidad efectiva de una molécula de unión, un polinucleótido, un vector de expresión o sistema o una célula anfitriona de la presente invención.

La presente invención indica adicionalmente en los ejemplos que las composiciones farmacológicas y los productos se pueden utilizar para la liberación lenta de la molécula de unión y/o para depósito local de la molécula de unión en el sitio de la lesión.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1

El nucleótido (SEQ ID NO 7) y el aminoácido (SEQ ID NO 5) que codifica las regiones variables de la cadena ligera del anticuerpo 6A3-IgG1. La sección subrayada indica el péptido líder (SED ID NO 22) y la secuencia de nucleótidos que lo codifica (SEQ ID NO 23).

Figura 2

La secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO 6) y aminoácidos (SEQ ID NO 4) que codifica las regiones variables de la cadena pesada del anticuerpo 6A3-IgG1. La sección subrayada indica el péptido (SEQ ID NO 20) y la secuencia de nucleótidos que lo codifica (SEQ ID NO 21).

Figura 3

Las regiones codificantes de la parte variable ligera (SEQ ID NO 28; superior) y pesada (SEQ ID NO 26; inferior) de 6A3-Ig4.

Figura 4

Las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada (SEQ ID NO 24; inferior) y ligera (SEQ ID NO 25,) de la parte variable y constante 6A3-Ig4. El péptido líder de la cadena ligera (SEQ ID NO 31) y pesada (SEQ ID NO 30) se indica en cursiva.

Figura 5 Superior: aminoácido de cadena ligera de anticuerpo 6A3-IgG1 (SEQ ID NO 5) con las secuencias líder (SEQ ID NO 22) y CDR-L1 (SEQ ID NO 11), CDR-L2 (SEQ ID NO 12) y CDR-L3 (SEQ ID NO 13).

Inferior: aminoácido de cadena pesada de anticuerpo 6A3-IgG1 (SEQ ID NO 4) con las secuencias líder (SEQ ID NO 20) y CDR-H1 (SEQ ID NO 8), CDR-H2 (SEQ ID NO 9) y CDR-H2 (SEQ ID NO 10).

5 Figura 6

RT-PCR utilizando el ARN MO3.13 como plantilla y los cebadores específicos Nogo-A resultan en un fragmento de ADN distinto de aproximadamente 200 bp.

Figura 7

La detección de inmunotransferencia de Nogo-A inmunoprecipitado de lípidos de célula M03:13 utilizando el 10 anticuerpo 6A3.

Después de inmunoprecipitación (IP) de los lisados celulares MO3.13 e inmunodetección con el anticuerpo anti Nogo-A 6A3 se detecta una banda fuerte única del tamaño esperado (190kDa) para el anticuerpo 6A3-IgG4 (línea 4) y 11C7- IgG1 (línea 6).

Figura 8

Figura 8a: Tinción inmunofluorescente de células M03.13.

Figura 8b: Tinción inmunofluorescente de células HOG.

La tinción inmunofluorescente de células permeabilizadas MO3.13 y células HOG con el anticuerpo secundario antihumano marcado 6A3-IgG4 y Alexa-Flúor 488 resultan en tinción muy brillante de las células (Figura 8a y 8b, parte

20 izquierda), mientras no se detecta virtualmente la señal solo con el anticuerpo secundario (parte derecha).

Figura 9

Las concentraciones de suero de anticuerpo 6A3 se miden en 6 sujetos hasta dos meses.

Figura 10

Las concentraciones de CSF de anticuerpo 6A3 se miden en 6 sujetos hasta dos meses.

25 Figura 11

El tratamiento de anticuerpo 6A3 en modelo SCI de mono mejora el índice y grado de recuperación funcional independientemente del tamaño de la lesión.

Descripción detallada de la invención

En la búsqueda de nuevas y mejoradas formas para proporcionar la regeneración neuronal luego de lesión en el

30 sistema nervioso central de adultos (SNC), ahora se ha encontrado sorprendentemente que se genera un anticuerpo humano monoclonal 6A3 novedoso en el HuMab-mouse™ por Medarex Inc, ratones genéticamente reconstituidos en donde los genes de inmunoglobulina humana reemplazan sus contrapartes de murino, tiene propiedades superiores en la modulación de la actividad NogoA en experimentos in vitro e in vivo. El 6A3 surge contra el NiG humano, es del isotipo IgG y tiene propiedades mejores que los anticuerpos NogoA descritos en la técnica anterior.

35 Ahora es posible construir otras moléculas de unión NogoA que tienen las mismas regiones hipervariables como dicho anticuerpo 6A3, creando nuevos anticuerpos que tienen las propiedades ventajosas de 6A3. Los derivados de 6A3-Ab, 6A3-IgG4 y 6A3-Fab reconocen el NiG humano con una alta afinidad de 0.14nM y 1.1 nM, respectivamente. Adicionalmente, los anticuerpos de la presente invención muestran una alta estabilidad y se extienden en retención y vida útil alta in vitro e in vivo. Finalmente las moléculas de unión y anticuerpos de la invención visualizan la liberación

40 lenta del sitio de introducción, haciendo depósitos locales de las moléculas de unión en el sitio de posible lesión. Se han detectado altas concentraciones cerebroespinales (CSF) del anticuerpo 6A3 en lesión de médula espinal de animales y pacientes mediante infusión continúas. Esta retención 6A3-Ab sorprendentemente alta y residencia en, por ejemplo, el fluido cerebroespinal hace posible utilizar inyecciones de bolo (de por ejemplo 1-3 veces por semana, aunque pueden ser factibles incluso intervalos mayores de una vez por 2, 3 o 4 semanas) en lugar de infundir constantemente el anticuerpo en el fluido cerebroespinal. Se pueden utilizar inyecciones de bolo intratecales repetidas. En una realización preferida, la administración se hace aunque la administración intratecal, por ejemplo utilizando catéter externalizado conectado a una bomba portátil. En una realización preferida adicional, se utiliza inyección de bolo intratecal. La sección experimental ilustra las propiedades ventajosas de las moléculas de unión de la invención.

De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona moléculas de unión a NogoA o NiG (denominado aquí adelante como "moléculas de unión de la invención" o simplemente "Moléculas de unión"). Preferiblemente, la moléculas de unión de la invención unen la proteína humana NogoA (SEQ ID NO: 2, codificado por SEQ ID NO: 1) o proteína NiG humana (que es el fragmento inhibidor de crecimiento de neurita más potente de NogoA e inicia en el aminoácido No. 186 y finaliza en el aminoácido No. 1004 del NogoA humano, = SEQ ID NO: 3) preferiblemente con una constante de disociación (Kd) < 1000nM, o con un Kd hasta e incluye 100nM, más preferiblemente con un kd < 100 nM, o con un kd de hasta y que incluye 100nM, más preferiblemente con un kd < 10 nM, o con un kd de hasta y que incluye 10 nM. La reacción de unión se puede mostrar mediante métodos estándar (que incluyen ensayos cualitativos y cuantitativos) que incluye, por ejemplo, métodos Western blot, inmunoprecipitación y afinidad de biosensor (cf. Ejemplo 4). Adicionalmente, la unión de las moléculas de unión de la invención al NogoA humano y NiG humano, y la eficacia de estas moléculas de unión en los ensayos funcionales se puede mostrar en un ensayo de crecimiento de neurita, por ejemplo como se describe adelante.

Sin embargo, en una realización preferida adicional la moléculas de unión de la presente invención (en una concentración de 100 mg/ml, preferiblemente 10 mg/ml, más preferiblemente a 1.0 mg/ml incluso más preferiblemente a 0.1 mg/ml) mejora el número de neuritas de células de gránulo cerebelar de rata sobre un sustrato de extracto de proteína de cerebro de mono mediante por lo menos 20%, preferiblemente 50%, más preferiblemente 80%, cuando se compara con el número de neuritas de células de gránulo cerebelar de rata que se tratan con un anticuerpo de control que no se une al polipéptido NogoA humano o polipéptido NiG humano (es decir tiene una constante de disociación > 1000 nM).

El reconocimiento específico del NogA o NiG humano se garantiza cuando CDR-H1, CDR- H2 y CDR-H3 o CDR-L1, CDR- L2 y CDR-L3 están presentes en la molécula de unión de la presente invención. No obstante, se conoce por la persona experta que incluso la presencia de solo un dominio CDR en la molécula de unión puede ser suficiente para asegurar la unión específica para la molécula reconocida. La frase "por lo menos una de las regiones hipervariables" significa 1, o 2 o 3 regiones hipervariables.

La frase "sitio de unión a antígeno comprende en secuencia las regiones hipervariables" abarca un sitio de unión a antígeno en el que las regiones hipervariables no son contiguas entre sí; preferiblemente dichas regiones de anticuerpo se intercalan con regiones de estructura principal de anticuerpo, o con secuencias que son secuencias de estructura principal de no anticuerpo, preferiblemente regiones de estructura principal de anticuerpo humano.

De acuerdo con la presente invención la molécula de unión también puede comprender por lo menos un sitio de unión a antígeno, dicho sitio de unión a antígeno comprende:

*

en secuencia las regiones hipervariables CDR-H1- 6A3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2- 6A3 (SEQ ID NO: 9) y CDR-H36A3 (SEQ ID NO: 10); o

*

en secuencia las regiones hipervariables CDR-L1- 6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2- 6A3 (SEQ ID NO: 12) y CDR-L3- 6A3 (SEQ ID NO: 13);

De acuerdo con la presente invención la molécula de unión también puede comprender:

*

un primer sitio de unión a antígeno que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR-H1- 6A3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2- 6A3 (SEQ ID NO: 9) y CDR-H3- 6A3 (SEQ ID NO: 10); y

*

un segundo sitio de unión a antígeno que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR-L1- 6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2- 6A3 (SEQ ID NO: 12) y CDR-L3- 6A3 (SEQ ID NO: 13);

De acuerdo con la presente invención la molécula de unión también puede comprender:

*

por lo menos una cadena pesada de inmunoglobulina o fragmento de la misma que comprende (i) un dominio variable que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR-H1- 6A3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2- 6A3 (SEQ ID NO: 9) y CDR-H3- 6A3 (SEQ ID NO: 10) y (ii) la parte constante o fragmento de la misma de una cadena pesada humana; y

*

por lo menos una cadena ligera de inmunoglobulina o fragmento de la misma que comprende (i) un dominio variable que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-6A3 (SEQ ID NO: 12) y CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO: 13) y (ii) la parte constante o fragmento de la misma de una cadena ligera humana;

En la molécula de unión de la presente invención la parte constante o fragmento de la misma de la cadena pesada humana puede ser del tipo gamma (γ), preferiblemente el tipo gamma 4 (γ4) y la parte constante o fragmento de la misma de la cadena ligera humana puede ser del tipo lambda (λ) o preferiblemente kappa (κ). Adicionalmente, la molécula de unión de la presente invención puede ser un anticuerpo monoclonal humano o quimérico o humanizado, parcialmente humano.

De acuerdo con la presente invención, la molécula de unión puede comprender una o más secuencias de polipéptidos como se muestra en cualquiera de la SEQ ID NO: 4 (IgG1 pesado), SEQ ID NO: 5 (IgG1 ligero), SEQ ID NO: 24 (IgG4 pesado) y SEQ ID NO: 25 (IgG4 ligero).

En una realización preferida adicional la molécula de unión de la presente invención comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno, dicho sitio de unión a antígeno comprende en secuencia, las regiones hipervariables CDR-H1-6A3, CDR-H2-6A3 y CDR-H3-6A3; dicho CDR-H1-6A3 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8, dicho CDR-H2-6A3 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9, y dicho CDR-H3-6A3 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10;

En un aspecto adicional de la invención, la molécula de unión de la invención comprende por lo menos:

a) un primer dominio que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR-H1-6A3, CDR-H2-6A3 y CDR-H3-6A3; dicho CDR-H1-6A3 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, dicho CDR-H2-6A3 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9, y dicho CDR-H3-6A3 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10; y

b) un segundo dominio que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR-L1-6A3, CDR-L2-6A3 y CDR-L3-6A3, dicho CDR-L1-6A3 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11, dicho CDR-L2-6A3 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, y dicho CDR-L3-6A3 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13; o

Más aún, la invención también proporciona la siguiente molécula de unión de la invención, que comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno que comprende:

a) la región variable de la cadena pesada de 6A3 (SEQ ID NO: 4); o

b) la región variable de la cadena ligera de 6A3 (SEQ ID NO: 5),

Cuando el sitio de unión a antígeno comprende el primer y segundo dominios, estos se pueden ubicar en la misma molécula de polipéptido o, preferiblemente, cada dominio puede estar en una cadena diferente, el primer dominio es parte de una cadena pesada de inmunoglobulina o fragmento de la misma y el segundo dominio es parte de una cadena ligera de inmunoglobulina o fragmento de la misma.

Ejemplos de las moléculas de unión de la invención incluyen anticuerpos como se produce por células B o hibridomas y anticuerpos humanos o quiméricos o humanizados o cualquier fragmento de los mismos, por ejemplo F(ab’)2; y fragmentos Fab, así como también los anticuerpos de dominio únicos o de cadena sencilla, como se describe en la publicación de patente Estadounidense US20070065440A1.

Como se utiliza aquí, un "anticuerpo de dominio único" es un dominio variable que se puede unir específicamente a un epítopo o un antígeno o un ligando independientemente de otro dominio de unión variable que se une al epítopo, antígeno o ligando. Un anticuerpo de dominio único puede estar presente en un homo o heteromultímero con otros dominios VH o VL en donde otros dominios no se requieren para la unión de antígeno por el anticuerpo de dominio único, es decir, cuando el anticuerpo de dominio único se une al antígeno independientemente de los dominios VH o VL adicionales. En una realización preferida, un anticuerpo de dominio único, comprende un dominio único VH aislado o un dominio único VL aislado. Las técnicas para obtener un anticuerpo de dominio único con por lo menos alguna especificidad de unión del anticuerpo intacto del que se derivan se conocen en la técnica. Por ejemplo, Ward, et al., in "Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted from Escherichia coli," Nature 341:644-646, describe un método de detección para obtener una región variable de cadena pesada de anticuerpo (anticuerpo de dominio único VH) con suficiente afinidad para su epítopo objetivo para unirse en forma aislada.

Un anticuerpo de cadena sencilla consiste de los dominios variables/regiones de un anticuerpo de cadenas ligera y pesada unido covalentemente por un ligador de péptido que consiste usualmente de 10 a 30 aminoácidos, preferiblemente de 15 a 25 aminoácidos. Los métodos preferidos incluyen el uso de ligadores de polipéptido, como se describe, por ejemplo, en relación con moléculas scFv (Bird et al., (1988) Science 242:423-426). Por lo tanto, dicha estructura no incluye la parte constante de las cadenas pesada y ligera y se considera que el espaciador de péptido pequeño debe ser menos antigénico que una parte constante completa. "Anticuerpo quimérico" significa un anticuerpo en el que las regiones constantes de el anticuerpo de cadenas pesada o ligera o ambos, o ambos, tienen un origine de una primera especie, mientras que las regiones variables de las cadenas pesada y ligera tienen un origen de una segunda especie. Preferiblemente, un "anticuerpo quimérico" es un anticuerpo en el que las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera, o ambos, son de origen humano mientras que los dominios variables de las cadenas pesada y ligera son de origen no humano (por ejemplo murino, mono, rata, cerdo, ratón, pollo, aviar,). "Anticuerpo humanizado" significa un anticuerpo en el que las regiones hipervariables (CDR) son de origen no humano (por ejemplo murino), mientras que todas o sustancialmente todas las otras partes de la inmunoglobulina por ejemplo las regiones constantes y las partes altamente conservadas de los dominios variables, es decir las regiones de estructura principal, son de origen humano. Sin embargo un anticuerpo humanizado puede retener unos pocos aminoácidos de la secuencia de murino en las partes de las regiones de estructura principal adyacentes a las regiones hipervariables.

Las regiones hipervariables se puede asociar con cualquier tipo de regiones de estructura principal, preferiblemente de origen de murino o humano. Las regiones de estructura principal adecuadas se describen en "Sequences of proteins of immunological interest", Kabat E.A. et al, US department of health and human services, Public health service, National Institute of Health. Preferiblemente la parte constante de una cadena pesada humana de la moléculas de unión puede ser del tipo IgG, más preferiblemente el tipo IgG4, incluyendo los subtipos, preferiblemente la parte constante de una cadena ligera humana puede ser del tipo lambda (λ) o kappa (κ), más preferiblemente del tipo kappa (κ).

Los anticuerpos monoclonales producidos contra una proteína encontrada en forma natural en todos los humanos se pueden desarrollar en un sistema no humano, por ejemplo, en ratones. Como una consecuencia directa de esto, un anticuerpo xenogénico como se produce por un hibridoma, cuando se administra a humanos, provoca una respuesta inmune indeseable, que está mediada predominantemente por la parte constante de la inmunoglobulina xenogénica. Esto limita claramente el uso de dichos anticuerpos cuando no se pueden administrar durante un periodo prolongado. Por lo tanto se prefiere particularmente utilizar anticuerpos humanizados, quiméricos o de dominio único, de cadena sencilla que no provocan sustancialmente una respuesta alogénica sustancial cuando se administran a los humanos.

En vista de lo anterior, la molécula de unión de la invención también se puede seleccionar de un anticuerpo quimérico, que comprende por lo menos:

a) una cadena pesada de inmunoglobulina o fragmento de la misma que comprende (i) un dominio variable que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR-H1-6A3, CDR-H2- 6A3 y CDR-H3-6A3 y (ii) la parte constante o fragmento de la misma de una cadena pesada humana; dicho CDR-H1-6A3 tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8), dicho CDRH2- 6A3 tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 9), y dicho CDR-H3-6A3 tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10), y

b) una cadena ligera de inmunoglobulina o fragmento de la misma que comprende (i) un dominio variable que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR-L1-6A3, CDR-L2-6A3 y CDR-L3-6A3 y (ii) la parte constante o fragmento de la misma de una cadena ligera humana; dicho CDR-L1-6A3 tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 11), dicho CDR-L2-6A3 tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 12), y dicho CDR-L3-6A3 tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 13);

Alternativamente, se puede seleccionar una molécula de unión de la invención de una molécula de unión de cadena sencilla que comprende un sitio de unión un antígeno que comprende:

a) un primer dominio que comprende en secuencia el CDR-H1-6A3, CDR-H2-6A3 y CDR-H3-6A3 hipervariable; dicho CDR-H1-6A3 tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8), dicho CDR-H2-6A3 tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 9), y dicho CDR-H3-6A3 tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10); y

b) un segundo dominio que comprende en secuencia el CDR-L1-6A3, CDR-L2-6A3 y CDR-L3-6A3 hipervariable; dicho CDR-L1-6A3 tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 11), dicho CDR-L2-6A3 tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 12), y dicho CDR-L3-6A3 tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 13); y

c) un ligador de péptido que se une a la extremidad de terminal N del primer dominio y a la extremidad de terminal C del segundo dominio o a la extremidad de terminal C del primer dominio y a la extremidad de terminal N de segundo dominio.

La constante de disociación se puede probar convenientemente en diversos ensayos que incluyen, por ejemplo, el método de afinidad de biosensor (BIAcore) (visto anteriormente). Adicionalmente, el efecto de unión y funcional de la moléculas de unión se puede mostrar en un bioensayo, por ejemplo como se describe adelante.

La parte constante de una cadena pesada humana puede ser del tipo γ1; γ2; γ3; γ4; α1; α2; δ o ε, preferiblemente del tipo γ, más preferiblemente del tipo γ4; mientras que la parte constante de una cadena ligera humana puede ser del tipo λ o K (que incluye los subtipos λ1; λ2; λ3; y λ4) pero es preferiblemente del tipo κ La secuencia de aminoácidos de todas estas partes constantes se dan en Kabat et al (Supra).

Los conjugados de las moléculas de unión de la invención, por ejemplo conjugados de enzima o toxina o radioisótopo, también se incluyen dentro del alcance de la invención. En otro aspecto, una composición que contiene la molécula de unión NogoA o NiG se estabiliza in vivo mediante enlace o asociación con una unidad estructural estabilizante polimérica (no polipéptido), tal como glucosilación, como se puede obtener mediante procesos in vitro o in vivo. Ejemplos de este tipo de estabilización se describen, por ejemplo, en el documento WO99/64460 (Chapman et al.) y el documento EP1,160,255 (King et al.). Específicamente, estas referencias describen el uso de moléculas de polímero que ocurren en forma natural o sintética, tal como polialquileno, polialquenilenos, polioxialquilenos o polisacáridos, para aumentar la vida útil in vivo de los polipéptidos de inmunoglobulina. Un ejemplo típico de una unidad estructural estabilizante es polietilenglicol, o PEG, un polialquileno. El proceso para unir PEG a un polipéptido de inmunoglobulina se describe en estas referencias y se denomina aquí como "PEGilación." Como se describe aquí, una molécula de unión NogoA o NiG se puede PEGilar aleatoriamente, mediante la unión de PEG a lisina u otros aminoácidos en la superficie de la molécula de unión NogoA o NiG, o específica de sitio, por ejemplo, a través de unión a PEG a un residuo de cisteína de superficie introducido artificialmente. Dependiendo de la molécula de unión NogoA o NiG, se puede preferir utilizar un método no aleatorio de unión a polímero, debido a la unión aleatoria, mediante unión en o cerca al sitio o sitios de unión a antígeno en la molécula frecuentemente altera la afinidad o especificidad de la molécula para su antígeno objetivo.

Se prefiere que la adición de PEG u otro polímero no interfiera con la afinidad o especificidad de unión a antígeno de la molécula de unión del anticuerpo NogoA o NiG. "No interfiere con afinidad o especificidad de unión a antígeno" significa que la molécula de unión NogoA o NiG unida a PEG tiene un IC50 o ND50 que no es mayor de 10% mayor que el IC50 o ND50, respectivamente, de una molécula de unión NogoA o NiG no unida a PEG que tiene el mismo dominio variable único de anticuerpo. En la alternativa, la frase "no interfiere con afinidad o especificidad de unión a antígeno" significa que la forma ligada PEG de la molécula de unión NogoA o NiG retiene por lo menos 90% de la actividad de unión a antígeno de la forma no PEGilada del polipéptido.

El PEG u otro polímero útil para aumentar la vida útil in vivo es aproximadamente de manera general 5,000 a 50,000 Daltons de tamaño, por ejemplo, aproximadamente 5,000 kD-10,000 kD, 5,000 kD-15,000 kD, 5,000 kD-20,000 kD, 5,000-25,000 kD, 5,000-30,000 kD, 5,000 kD-35,000 kD, 5,000 kD-40,000 kD, o aproximadamente 5,000 kD-45,000. La elección del tamaño de polímero depende del uso pretendido del complejo. Por ejemplo, en donde se desea penetrar el tejido sólido, por ejemplo, un tumor, es ventajoso utilizar un polímero más pequeño, en orden o aproximadamente 5,000 kD. Cuando, en su ligar, se desea mantener el complejo en circulación, se pueden utilizar polímeros más grandes, por ejemplo, 25,000 kD a 40,000 kD o más.

Las composiciones farmacéuticas de la invención puede incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "cantidad profilácticamente efectiva" de una molécula de unión NogoA o Nig de la invención. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosificaciones y durante periodos necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva de la molécula de unión NogoA o Nig de la invención puede variar de acuerdo con los factores tal como el estado de la enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y la capacidad de la molécula de unión de la invención NogoA o Nig de provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la que cualesquier efectos tóxicos o perjudiciales de la molécula de unión de la invención NogoA o Nig se compensan por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosificaciones y durante periodos necesarios, para lograr el efecto profiláctico deseado.

Como se utiliza aquí, la frase "se une específicamente" se refiere a la unión de un antígeno mediante una molécula de unión NogoA o Nig de la invención con una constante de disociación (Kd) de 1 mM o menor como se mide por análisis de resonancia de plasmón de superficie utilizando, por ejemplo, un sistema de resonancia de plasmón de superficie BIAcore(r) y software de evaluación cinética BIAcore(r).

"Polipéptido", si no se especifica de otra forma, incluye cualquier péptido o proteína que comprende los aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces de péptido, que tienen una secuencia de aminoácidos partiendo en la extremidad de terminal N y finalizando en la extremidad de terminal C. Preferiblemente, el polipéptido de la presente invención es un anticuerpo monoclonal, se prefiere más un anticuerpo monoclonal quimérico (también denominado injertado a V) o humanizado (también denominado injertado a CDR). El anticuerpo monoclonal humanizado (injertado a CDR) puede o no incluir mutaciones adicionales introducidas en las secuencias de estructura principal (FR) del anticuerpo receptor.

Un derivado funcional de un polipéptido como se utiliza aquí incluye una molécula que tiene una actividad biológica cualitativa en común con un polipéptido para la presente invención, es decir que tiene la capacidad de unirse al NogoA humano o NiG humano. Un derivado funcional incluye fragmentos y análogos de péptido de un polipéptido de acuerdo con la presente invención. Los fragmentos comprenden las regiones dentro de la secuencia de un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia específica. El término "derivado" se utiliza para definir las variantes de la secuencia de aminoácidos, y modificaciones covalentes de un polipéptido de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo de una secuencia específica. Los derivados funcionales de un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia específica, por ejemplo de la región hipervariable de la cadena pesada y ligera, preferiblemente tienen por lo menos aproximadamente 90%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de identidad de secuencia general con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia específica, y sustancialmente retiene la capacidad de unirse al NogoA humano o NiG humano.

Como se utiliza aquí, la frase "dominio variable" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia derivada de una región de inmunoglobulina V de línea germinal de mamífero. Una secuencia se "deriva de una región V de línea germinal de mamífero" cuando la secuencia se aísla de un individuo humano, se aísla de un animal no humano, tal como un roedor tal como un ratón, en el que el animal no humano es capaz de generar inmunoglobulinas humanas en respuesta a un inmunógeno, más preferiblemente dicho animal no humano no es capaz de producir anticuerpos endógenos para su especie, se aísla de un colección de secuencias de gen de anticuerpo humanas clonadas (o una colección de secuencias de gen de región V anticuerpo humanas), o cuando se utiliza una secuencia de región V de línea germinal humana clonada para generar una o más secuencias diversificadas (mediante mutagenia aleatoria u objetivo) que luego se seleccionan para unión a un antígeno objetivo deseado. A un mínimo, un dominio variable de inmunoglobulina humana tiene por lo menos 85 % de similitud de aminoácido (que incluye, por ejemplo, 87 %, 90 %, 93 %, 95 %, 97 %, 99 % o mayor similitud) a una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina humana que ocurre en forma natural. Alternativamente, o adicionalmente, "dominio variable" es un dominio variable de inmunoglobulina que comprende cuatro regiones de estructura principal de dominio variable inmunoglobulina (FW1-FW4) que son preferiblemente humanas, como las regiones de estructura principal establecidas por Kabat et al. (1991,). Las "regiones de estructura principal de dominio variable " abarcan a) una secuencia de aminoácidos de una región de estructura, preferiblemente humana, y b) una región de estructura que comprende por lo menos 8 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de una región de estructura humana. Un anticuerpo dominio variable puede comprender las secuencias de aminoácidos de FW1-FW4 que son iguales a las secuencia de aminoácidos de las regiones de estructura principal correspondientes codificadas por un segmento de gen de anticuerpo de línea germinal, preferiblemente humana, o también puede comprender un dominio variable en el que las secuencias FW1-FW4 que contienen colectivamente hasta 10 diferencias de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 diferencias de la secuencia de aminoácidos) con relación a las secuencia de aminoácidos de las regiones de estructura principal correspondientes codificadas por un segmento de gen de anticuerpo de línea germinal, preferiblemente humana. Como se utiliza aquí, la frase "estructura universal" se refiere a una secuencia de estructura de anticuerpo única que corresponde a las regiones de un anticuerpo conservado en la secuencia como se define por Kabat et al. (1991) o que corresponde al repertorio o estructura de inmunoglobulina de línea germinal humano como se define por Chothia y Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196: 910-917. La invención proporciona el uso de una estructura única, o un grupo de dichas estructuras, que se ha encontrado para permitir la derivación virtualmente de cualquier especificidad de unión a través de la variación en las regiones hipervariables solas. En una realización, las regiones hipervariables o CDR específicamente se unen NogoA y/o NiG. El término "modificación covalente" incluye modificaciones de un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia específica; o un fragmento de la misma con un agente de derivación proteináceo o no proteináceo orgánico, fusiones a las secuencias de polipéptidos heterólogas, y modificaciones post-traduccionales. Los polipéptidos modificados covalentes, por ejemplo de una secuencia específica, aún tienen la capacidad de unirse al NogoA humano o NiG humano mediante entrecruzamiento. Las modificaciones covalentes se introducen tradicionalmente al hacer reaccionar los residuos de aminoácido objetivo con un agente de derivación orgánico que es capaz de reaccionar con los residuos terminales o laterales seleccionados, o mediante mecanismos de aprovechamiento de las modificaciones post-traduccionales que funcionan en las células anfitrionas recombinantes. Ciertas modificaciones post-traduccionales son el resultado de la acción de células anfitrionas recombinantes en el polipéptido expresado. Los residuos de glutaminilo y asparaginilo se desamidan frecuentemente posttransduccionalmente en los residuos glutamino y aspartilo correspondientes. Alternativamente, estos residuos se desaminan bajo condiciones levemente ácidas. Otras modificaciones post-traduccionales incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de los grupos hidroxilo de residuos serilo, tirosina o treonilo, metilación de los grupos αamino de las cadenas laterales lisina, arginina, e histidina, véase por ejemplo T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983). Las modificaciones covalentes pueden incluir las proteínas de fusión que comprenden un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia específica y sus variantes de secuencia de aminoácidos, tal como inmunoadhesinas, y fusiones de terminal N para las secuencias de señal heterólogas.

"Identidad" con respecto a un polipéptido natural y su derivado funcional se define aquí como el porcentaje de residuos de aminoácido en la secuencia candidata que son idénticos a los residuos de un polipéptido natural correspondiente, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, lograr el porcentaje máximo de identidad, y que no considera cualquiera de las sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. Ni las extensiones de terminal N o C ni las inserciones se deben constituir como identidad de reducción. Se conocen bien los métodos y programas de ordenador para la alineación, véase Altschul et al. supra.

"Aminoácidos" se refiere a todos los aminoácidos L-α que ocurren en forma natural, por ejemplo y que incluyen los aminoácidos D. Los aminoácidos se identifican por las designaciones de tres letras o de una letra bien conocidas.

El término "variante de secuencia de aminoácidos" se refiere a las moléculas con algunas diferencias en sus secuencias de aminoácidos como se compara con un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia específica. Las variantes de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia específica, aún pueden tener la capacidad de unirse al NogoA humano o NiG humano. Las variantes sustitucionales son aquellas que tienen por lo menos un residuo de aminoácido retirado y un aminoácido diferente insertado en su lugar en la misma posición en un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia específica. Estas sustituciones pueden ser únicas, cuando solo un aminoácido en la molécula se ha sustituido, o pueden ser múltiples, cuando dos o más aminoácidos se han sustituido en la misma molécula. Las variantes insercionales son aquellas con uno o más aminoácidos insertados inmediatamente adyacentes a un aminoácido en una posición particular en un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia específica. Inmediatamente adyacente a un aminoácido significa conectado a el grupo funcional o-carboxi o α-amino del aminoácido. Las variantes de eliminación son aquellas con uno o más aminoácidos en un polipéptido de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una secuencia específica, retirada. De forma ordinaria, las variantes de eliminación tendrán uno o dos aminoácidos eliminados en una región particular de la molécula.

Se puede producir una molécula de unión de la invención mediante técnicas de ADN recombinantes. En general, las moléculas de ácido nucleico y las construcciones de vector requeridas para el desempeño la presente invención se pueden construir y manipular como se establece en los manuales de laboratorio estándar, tal como Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA. En vista de esto, se puede construir una o más moléculas de ADN que codifican la molécula de unión, se ponen bajo las secuencias de control apropiadas y se transfieren en un organismo anfitrión adecuado para expresión.

En una forma muy general, de acuerdo con lo anterior se proporciona aquí,

(i)

moléculas de ADN que codifican una región hipervariable, un sitio de unión a antígeno, una cadena de anticuerpo

o fragmento de la misma, o una molécula de unión de dominio único de la presente invención; y

(ii)

el uso de las moléculas de ADN de la invención para la producción de una molécula de unión de la presente invención mediante medios recombinantes.

El actual estado de la técnica es tal que el experto será capaz de sintetizar las moléculas de ADN de la invención dando la información proporcionada aquí es decir las secuencia de aminoácidos de las regiones hipervariables y las secuencias de ADN que las codifica. Un método para construir un gen de dominio variable por ejemplo se describe en el documento EP 239 400 y se puede resumir brevemente como sigue: se clona un gen que codifica un dominio variable de un anticuerpo monoclonal de cualquier especificidad. Se determinan los segmentos de ADN que codifican las regiones hipervariables y de estructura y los segmentos de ADN que codifican las regiones hipervariables se retiran de tal manera que los segmentos de ADN que codifican las regiones de estructura principal se fusionan junto con los sitios de restricción adecuados en las uniones. Los sitios de restricción se pueden generar en las posiciones apropiadas mediante mutagenia de la molécula de ADN mediante procedimientos estándar. Se preparan casetes CDR sintéticos de hebra doble mediante síntesis de ADN de acuerdo con las secuencias dadas en CDR-H1-6A3, CDR-H2-6A3, CDR-H3-6A3, CDR-L1-6A3, CDR-L2-6A3 y CDR-L3-6A3 anteriores. Estos casetes se proporcionan con extremos pegajosos de tal manera que se pueden ligar a las uniones de la estructura principal mediante protocolo estándar para lograr una molécula de ADN que codifica un dominio variable de inmunoglobulina.

Adicionalmente, no es necesario tener acceso al mARN de una estirpe celular de hibridoma producida con el fin de obtener una construcción de ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención. Sin embargo la solicitud PCT W0 90/07861 da instrucciones completas para la producción de un anticuerpo monoclonal mediante técnicas de ADN recombinantes dado solo información escrita como la secuencia de nucleótidos del gen.

El método comprende la síntesis de un número de oligonucleótidos, su amplificación mediante el método PCR, y su división para dar la secuencia de ADN deseada.

Están públicamente disponibles numerosos vectores, que incluyen plásmidos bacterianos, bacteriófago, cromosomas artificiales y vectores episómicos. Los vectores de expresión que comprenden uno o más promotores adecuados y/o genes que codifican las partes constantes de la cadena ligera y pesada están disponibles públicamente. Los vectores de expresión usualmente contienen un promotor que se reconoce por el organismo 5 anfitrión y se une operablemente a la secuencia codificante de interés. Dicho promotor puede ser inducible o constitutivo. El término "ligado operablemente" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su forma pretendida. Una secuencia de control "ligada operablemente" a una secuencia codificante se liga de tal manera que la expresión de la secuencia se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. Sin embargo, una vez se prepara la molécula de ADN de la

10 invención se puede transferir convenientemente en un vector de expresión apropiado.

También se pueden preparar moléculas de ADN que codifican anticuerpos de cadena sencilla mediante métodos estándar, por ejemplo, como se describe en el documento WO 88/1649.

En una realización particular de la invención, los medios recombinantes para la producción de algunas de las moléculas de unión de la invención incluyen primera y segunda construcciones de ADN como se describe adelante:

15 El primer polinucleótido puede comprender:

*

por lo menos una de las secuencias de polinucleótidos como se muestra en la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16; o

*

por lo menos una de las secuencias de polinucleótidos como se muestra en la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19.

20 Otro polinucleótido de acuerdo con la invención comprende:

*

una secuencia de polinucleótidos como se muestra en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16; y

*

una secuencia de polinucleótidos como se muestra en SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19.

En otra realización el polinucleótido comprende:

* una secuencia de polinucleótidos como se muestra en la SEQ ID NO: 6 y/o una secuencia de polinucleótidos como 25 se muestra en la SEQ ID NO: 7, o,

* una secuencia de polinucleótidos como se muestra en la SEQ ID NO: 26 y/o una secuencia de polinucleótidos como se muestra en SEQ ID NO: 28.

En todavía otra realización la construcción de ADN codifica una cadena pesada o fragmento de la misma y comprende:

30 a) una primera parte que codifica un dominio variable que comprende alternativamente las regiones hipervariables y de estructura, dichas regiones hipervariables comprenden en secuencia ADN-CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO: 14), ADNCDR-H2-6A3 (SEQ ID NO: 15) y ADN-CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: 16); esta primera parte partiendo con el codón que codifica el primer aminoácido del dominio variable y finalizando con un codón que codifica el último aminoácido del dominio variable, y

35 b) una segunda parte que codifica una parte constante de cadena pesada o fragmento de la misma que inicia con un codón que codifica el primer aminoácido de la parte constante de la cadena pesada y finaliza con un codón que codifica el último aminoácido de la parte constante o fragmento de la misma, seguido por un codón no codificante.

Preferiblemente, la segunda parte codifica la parte constante de una cadena pesada humana, más preferiblemente la parte constante de la cadena y4 humana. Esta segunda parte puede ser un fragmento de ADN de origen

40 genómico (que comprende intrones) o un fragmento de cADN (sin intrones).

En otra realización la construcción de ADN codifica una cadena ligera o fragmento de la misma y comprende:

a) una primera parte que codifica un dominio variable que comprende alternativamente las regiones hipervariables y de estructura; dichas regiones hipervariables que comprende en secuencia ADN-CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO: 17), ADN-CDR-L2-6A3 (SEQ ID NO: 18) y ADN-CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO: 19), esta primera parte inicia con un codón que codifica el primer aminoácido del dominio variable y finaliza con un codón que codifica el último aminoácido del dominio variable, y

b) una segunda parte que codifica una parte constante de cadena ligera o fragmento de la misma que inicia con un codón que codifica el primer aminoácido de la parte constante de cadena ligera y finaliza con un codón que codifica el último aminoácido de la parte constante o fragmento de la misma seguido por un codón no codificante.

Preferiblemente, la segunda parte codifica la parte constante de una cadena ligera humana, más preferiblemente la parte constante de la cadena κ humana.

La construcción de ADN de la presente invención puede comprender adicionalmente ventajosamente comprende otra parte que se ubica en la dirección 5’ de las partes ya descritas y que codifica un péptido líder; esta parte adicional parte del codón que codifica el primer aminoácido y finaliza con el último aminoácido del péptido líder. Este péptido líder se requiere para secreción de las cadenas mediante el organismo anfitrión en el que se expresan y se retira posteriormente por el organismo anfitrión. Preferiblemente, ese parte de la construcción de ADN codifica un péptido líder que tienen una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia líder de aminoácidos de la cadena pesada como se muestra en la SEQ ID NO: 20 (cadena pesada de IgG1, partiendo con el aminoácido en la posición -19 y finaliza con el aminoácido en la posición -1), que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 22 (cadena ligera de IgG1, partiendo con el aminoácido en la posición -20 y finaliza con el aminoácido en la posición -1), que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la secuencia líder como se muestra en la SEQ ID NO: 30 (cadena pesada de IgG4, partiendo con el aminoácido en la posición -19 y finaliza con el aminoácido en la posición -1), o, tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 31 (cadena ligera de IgG4, partiendo con el aminoácido en la posición -20 y finaliza con el aminoácido en la posición -1).

Cada una de las construcciones de ADN se coloca bajo el control de las secuencias de control adecuadas, en particular bajo el control de un promotor adecuado. Se puede utilizar el tipo de promotor, dado que se adapta al organismo anfitrión en el que las construcciones de ADN se transferirán para expresión. Sin embargo, si la expresión toma lugar en una célula de mamífero, se prefiere particularmente para utilizar el promotor de un gen inmunoglobulina.

El anticuerpo deseado se puede producir en un cultivo celular o en un animal transgénico. Se puede obtener el animal transgénico adecuado de acuerdo con los métodos estándar que incluyen microinyectar en huevos la primera y segunda construcciones de ADN colocadas bajo las secuencias de control adecuadas que trasfieren los huevos así preparados a hembras seudo-preñadas apropiadas y seleccionar un descendiente que exprese el anticuerpo deseado.

Cuando se han producido las cadenas de anticuerpo en un cultivo celular, la construcción de ADN primero se pueden insertar a un vector de expresión único o en dos vectores de expresión separados pero compatibles, se prefiere la última posibilidad.

De acuerdo con lo anterior, la invención también proporciona un vector de expresión capaz de replicar en una estirpe celular eucariótica o procariótica que comprende por lo menos una de las construcciones de ADN descritas anteriormente.

La presente invención proporciona así un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. La presente invención también se relaciona con un sistema de expresión, en donde dicho sistema de expresión o parte del mismo es capaz de producir un polipéptido de la presente invención, cuando dicho sistema de expresión o parte del mismo está presente en una célula anfitriona compatible. También se describe una célula anfitriona aislada que comprende un sistema de expresión de la invención.

Un método para producir una molécula de unión, un polinucleótido, un vector de expresión, por medio de tecnología de ADN recombinante o por medio de síntesis química sin embargo también se prevé en la presente solicitud.

Cada vector de expresión que contiene una construcción de ADN así se transfiere a un organismo anfitrión adecuado. Cuando las construcciones de ADN se insertan de forma separada en dos vectores de expresión, se pueden transferir en forma separada, es decir un tipo de vector por célula, o se co- transfiere, se prefiere esta última posibilidad. Un organismo anfitrión adecuado puede ser una estirpe celular de bacteria, levadura o mamífero, se prefiere este último. Más preferiblemente, la estirpe celular de mamífero es de origen linfoide por ejemplo un mieloma, hibridoma o una célula B inmortalizada normal, pero no expresa cualquier anticuerpo endógeno de cadena ligera o pesada.

También se prefiere que el organismo anfitrión contenga un gran número de copias de los vectores que contienen una o más construcciones de ADN por célula. Si el organismo anfitrión es una estirpe celular de mamífero, este objetivo deseable se puede lograr al amplificar el número de copias de acuerdo con métodos estándar. Los métodos de amplificación consisten usualmente de seleccionar una resistencia aumentada a un fármaco, dicha resistencia se codifica por el vector de expresión.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un proceso para producir una molécula de unión multicadena de la invención, que comprende (i) cultivar un organismo que se transforma con por lo menos una construcción de ADN de la invención y (ii) recuperar las moléculas de unión activas de la invención del cultivo.

Alternativamente, las cadenas pesada y ligera por ejemplo se pueden recuperar y reconstituir en forma separada en una molécula de unión activa después de replegado in vitro. Los métodos de reconstitución se conocen bien en la técnica; Ejemplos de los métodos se proporcionan en particular en el documento EP 120 674 o en el documento EP 125 023.

Por lo tanto un proceso también puede comprender

(i)

cultivar un primer organismo que se transforma con una primera construcción de ADN que codifica una molécula de unión de la invención y recuperar una primera molécula de unión del cultivo, y

(ii)

cultivar un segundo organismo que se transforma con una segunda construcción de ADN que codifica una molécula de unión de la invención y recuperar una segunda molécula de unión del cultivo, y

(iii) reconstituir in vitro una molécula de unión activa de la invención de la primera molécula de unión obtenida en (i) y la segunda molécula de unión obtenida en (ii).

Si se necesita, se pueden producir más organismos o células, hasta tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho, y se utilizan para proporcionar más moléculas de unión.

De una forma similar, también se proporciona un proceso para producir una molécula de unión de dominio único o cadena sencilla de la invención que comprende (i) cultivar un organismo que se transforma con una construcción de ADN que codifica una molécula de unión de dominio único o cadena sencilla de la invención, respectivamente, y (ii) recuperar dicha molécula de cultivo.

Las moléculas de unión NogoA y NiG de la invención puede exhibir muy buena actividad de regeneración de nervio como se muestra, por ejemplo, en el modelo de crecimiento de neuritas de célula de gránulo, como se describe adelante.

1. Ensayo de crecimiento de neuritas de célula de gránulo (in vitro)

Se toma tejido cerebral (corteza y tallo cerebral) y para cada ensayo se prepara frescamente extracto de proteína como se describió previamente (Spillmann et al. 1998, Identification and characterization of a bovine neurite growth inhibitor (bNI-220), J Biol Chem. 1998 Jul 24; 273(30):19283-93). En resumen, se homogeniza una pieza de tejido congelado (por ejemplo 0.25g) en 3-4 Vol de 60mM Chaps - 20mM Tris pH 8.0-1mM EDTA con un bloqueador de Proteasa (10mg/ml de Aprotinina - 5mg/ml, Leupeptina - 1mg/ml de Pepstatina - 1mM PMSF) a 4° C. El homogenato se pone en un rotador a 4° C durante 30 min y se centrifuga a 100’000g durante 45 min a 4° C en un rotor TLA 100.3 (ultracentrífuge Beckman TL-100). A partir de sobrenadante, se determina la concentración de proteína utilizando un espectrofotómetro de absorción.

Las células de gránulo cerebelar se purifican de compendios de tripsina de tejido cerebelar de ratas de 5-7 días postnatales como se describió previamente (Niederost et al 1999, Bovine SNC myelin containing neurite growthinhibitory activity asociated with chondroitin sulfate proteoglycans, J Neurosci. 1999 Oct 15; 19 (20):8979-89). Las moléculas de unión de la invención luego se preincuban durante 30 min en el sustrato de prueba y se retiran antes que se agreguen las células. Las células de gránulo cerebelar se agregan y se incuban durante 24 horas. Para detener el experimento, se agrega lentamente 2 ml de 4 % de formaldehido regulado a los platos de cultivo. El extracto de proteína de membrana cerebral de mono preparado como se describió anteriormente se absorbe durante la noche a 15mg de proteína por cm2 de plato de cultivo en platos de 4 pozos Greiner (Greiner, Nuertingen, Alemania). Los platos se lavan tres veces con solución de Hank caliente antes de poner en placas las neuronas. Se preparan células de gránulo cerebelar de rata (5-7) día postnatal como se describió anteriormente y se ponen en placas de 50,000 células/cm2. Las células se cultivan durante 24 hr en medio libre de suero, se fijan, y se inmunotiñen con marcador de neuritas MAB 1b (Chemicon monoclonal Ab, 1:200). Para la tinción de los cuerpos celular DAPI (4’,6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato, de Molecular Probes) se utiliza después de tinción con MAB1b. Para experimentos de anticuerpo, los mAb anti- Nogo-A o el IgG Ab de control se preincuban en los platos durante 30 min y posteriormente se retiran.

Se toman muestras aleatorias de cuatro campos a una distancia definida al borde del pozo para cada pozo utilizando un objetivo 40 X mediante el conteo de todas las intersecciones de neuritas con una estirpe puesta a través del centro del campo de observación. Todos los cuerpos celulares que tocan la estirpe también se cuentan, y se calcula una relación de índice de neuritas por cuerpo celular para cada pozo como se reportó previamente (Simonen et al, 2003, Neuron 38,201-211). Todos los conteos se hacen en ciego en experimentos codificados y se expresan como un índice de neuritas por cuerpo celular. Los resultados se expresan como neuritas de índice medio /cuerpo celular.

Se puede observar la mejora de crecimiento de neurita de la célula de gránulo cerebelar en el ambiente no permisivo del extracto de médula espinal preparado anteriormente mediante preincubación con una molécula de unión de la invención.

La actividad neutralizante de las moléculas de la invención también se puede estimar al medir la germinación regenerativa y el crecimiento de neurita y la recuperación funcional en los modelos de lesión de médula espinal in vivo brevemente descritos adelante.

2. Modelos de lesión de médula espinal en ratas y monos (in vivo)

Se lesionan ratas Lewis adultas microquirúrgicamente mediante transección de la mitad dorsal de la médula espinal bilateralmente en el nivel de la octava vertebra torácica. La laminectomía, anestesia y cirugía se describen en Schnell and Schwab 1993 (Eur. J. Neurosci. 5: 1156 - 1171). Trazado neuroanatómico: El tracto corticoespinal motor y sensor se traza al inyectar la amina de dextrano de biotina de trazador anterogrado (BDA) en la corteza del lado opuesto a la bomba o al injerto. El BDA se transporta a la médula espinal dentro de 10 - 14 días y se visualiza utilizando diaminobenzidina (DAB) como un sustrato como se describe en Brösamle et al., (2000 J. Neurosci. 20: 8061-8068).

Dos semanas después una lesión de la médula espinal que destruyó aproximadamente 40 % del segmento de médula espinal T8, principalmente en la mitad dorsal, que incluye ambas transecciones de médula espinal cervical principales (CST): trazado del CST en animales de control muestra un grado moderado de germinación reactiva del tracto. Este fenómeno corresponde a la germinación espontánea en respuesta a la lesión bien conocida en la literatura. Las ratas lesionadas se tratan con las moléculas de unión de la invención o con bombas que suministran las moléculas de unión de la invención que pueden mostrar germinación mejorada en el sitio de lesión y regeneración del crecimiento de axones de neuritas dañados de las neuritas dañadas. Más aún los animales pueden mostrar la recuperación mejorada de las funciones sensor-motoras. Se describieron previamente dichas pruebas funcionales (Merkler et al, 2001, J. Neuroscience 21,3665-73).

3. Distribución de Tejido de Anticuerpos en el SNC de Mono Adulto

La moléculas de unión de la invención se purifican como IgG y se concentran en 3 mg/ml en PBS. El suero de ratón derivado de IgG (Chemicon Int., Temecula/CA, USA) o un mAB dirigido contra auxina de trigo (AMS Biotechnology, Oxon/UK) se utilizan como tratamientos de control. Se utilizan dos monos macacos adulto machos (Macaca fascicularis) en este estudio para infusión intratecal.

Procedimientos quirúrgicos

Se induce anestesia mediante inyección intramuscular de cetamina (Ketalar(r); Parke-Davis, 5 mg/kg, i.m.). Se inyecta atropina i.m. (0.05 mg/kg) para reducir las secreciones bronquiales. Se pone un catéter intravenoso en la vena femoral para perfusión continua con una mezcla de propofol 1% (Fresenius (r)) y solución de glucosa al 4% (1 volumen de Propofol y 2 volúmenes de solución de glucosa), que induce una anestesia más profunda. El animal luego se pone en una estructura estereotáxica. Bajo condiciones estériles, se realiza una incisión de piel en la línea media vertical de C2 a Th1. Se exponen el corte fascia y los procesos espinales de C2 a Th1. Los músculos paravertebrales se retraen y se cortan las láminas de C6, C7 y Th1. Luego se realizan una laminectomía completa C6 y una hemilaminectomía superior C7. La materia dura se expone y se corta longitudinalmente por encima del séptimo y octavo segmentos espinales cervicales, que corresponde a la zona rostral de la porción espinal cubierta por la sexta lámina cervical. Un tubo de polietileno (10 cm de largo), conectado a una bomba osmótica (Alzet(r), 2ML1; flujo: 50mg/hr) que suministra el anticuerpo hNogo-A, se inserta por debajo la dura y se empuja unos pocos milímetros en forma rostral y se une a la dura con una sutura. La bomba osmótica se pone y se asegura en una cavidad hecha en la masa de los músculos de la espalda unos pocos centímetros menos que la laminectomía, en el lado izquierdo. El tubo se asegura a lo largo de su trayectoria con suturas al tejido de músculo. Los músculos y la piel se suturan y el animal se recupera de la anestesia usualmente 15-30 minutos después de la interrupción de la perfusión venosa con propofol. El animal se trata post-operatoriamente con un antibiótico (Ampicilina 10%, 30 mg/kg, s.c.). Se dan dosis adicionales de Carprofen diariamente durante una semana.

Los monos se sacrifican 8 días después del implante de la bomba osmótica. La sedación primero se induce con cetamina, como se mencionó anteriormente, seguido por una anestesia profunda obtenida mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de una dosis letal de pentobarbital (90 mg/kg). Los animales se someten a perfusión transcardialmente con 0.4 litros de 0.9% de solución salina, seguido por 4 litros de fijador (4% de solución de paraformaldehído en regulador de fosfato 0.1 M, pH= 7.6). Se continúa la perfusión con 3 soluciones de sacarosa para aumentar la concentración (10% en fijador, 20 y 30 % en regulador de fosfato).

Procedimientos histológicos, inmuno-fluorescencia e histoquímica

Los cerebros y médulas espinales de los monos se cortan cuidadosamente, se crio-protegen en 30% de sacarosa y se seccionan a 40 mm en un crioestato. Para la detección de los mAB infundidos se utiliza un anticuerpo secundario anti-humano (Jackson Laboratories). Para marcado doble, se pueden utilizar los siguientes anticuerpos: el AS472 de conejo (purificado por afinidad) para Nogo-A endógenos (Chen, 2000), los anticuerpos de conejo contra GFAP para los astrocitos, y un anticuerpo de conejo contra Catepsina D (DAKO) para ubicación lisosomal. Todos los anticuerpos se visualizan por TRITC o FITC acoplados que corresponden a los anticuerpos secundarios, o utilizando el sistema ABC-DAB (Vector). Las secciones se analizan mediante epifluorescencia en un Axiophot Zeiss o mediante microscopía confocal (ZEISS LSM 410).

Se analizan las médulas espinales en el sitio de infusión y en 6 cm en el caudal de las mismas. Están presentes altos niveles de moléculas de unión de la invención en el sitio de infusión. En la médula espinal más caudal, el canal central y la superficie de la médula se marcan fuertemente, mientras que la materia gris y blanca muestra una marca más homogénea, que, sin embargo, es específica y clara sobre el fondo. Una situación similar está presente en el prosencéfalo con marca fuerte de la superficie o ventrículos y buena penetración del anticuerpo Nogo-A en la parenquima.

Estos experimentos muestran que la infusión intratecal espinal de los anticuerpos contra un antígeno de superficie celular del SNC conduce a una buena distribución de las moléculas de unión y anticuerpos de la invención a través de la circulación de CSF en los espacios de licor interno (ventrículos, canal central) y externo. Los anticuerpos IgG penetran bien en el cerebro y el tejido de la médula espinal. Aunque el anticuerpo IgG de control negativo se lava rápidamente, el anticuerpo contra Nogo-A se retiene en el tejido de médula espinal y cerebro.

4. Pruebas para reparación del nervio y mejora funcional en las lesiones espinales en monos

Se induce anestesia mediante inyección intramuscular de cetamina (Ketalar(r); Parke-Davis, 5 mg/kg, i.m.). Se inyecta atropina i.m. (0.05 mg/kg) para reducir las secreciones bronquiales. Se pone un catéter intravenoso en la vena femoral para perfusión continúa con una mezcla de propofol 1% (Fresenius (r)) y solución de glucosa al 4% (1 volumen de Propofol y 2 volúmenes de solución de glucosa), que induce una anestesia más profunda. El animal luego se pone en una estructura estereotáxica. Bajo condiciones estériles, se realiza una incisión en la piel en la línea media vertical de C2 a Th1. El corte fascia y los procesos espinales de C2 a Th1 se exponen. Los músculos paravertebrales se retraen y se cortan las láminas de C6, C7 y Th1. Luego se realiza una laminectomía completa C6 y una hemilaminectomía C7 superior. Con el fin de suministrar las moléculas en proximidad cercana a la lesión, la punta libre de un tubo de polietileno unido a la bomba se fija bajo la dura unos pocos milímetros en forma rostral a la lesión.

Se pueden realizar pruebas manuales de destreza de comportamiento de acuerdo con el procedimiento publicado.

Se entrena la destreza manual al poner el mono sentado en una silla para primates en la parte frontal de un Perspex modificado "tablero Brinkman" (10 cm x 20 cm) que contiene 50 agujeros distribuidos aleatoriamente; 25 agujeros se orientan horizontalmente y 25 verticalmente {Liu, 1999 15428 /id; Rouiller, 1998 13239 /id}. 2.7. La regeneración y germinación de las fibras se pueden evaluar cómo se describe. El trazador anterogrado inyectado en el hemisferio derecho es Amina de Dextrano Biotinilado (BDA, Molecular Probe(r), 10% en solución salina). En el hemisferio izquierdo, se inyecta el Dextrano de Fluoresceína de trazador de anterogrado fluorescente (Molecular Probe (r), 10% en solución salina). El procesamiento histológico para visualizar los trazadores se puede realizar como se describe en detalle previamente {Rouiller, 1994 8322 /id}.

Por lo tanto la invención también proporciona:

(i)

el uso de las moléculas de unión Nogo y NiG de la invención en la reparación del nervio del sistema nervioso de un mamífero, en particular, el sistema nervioso de un humano,

(ii)

un método para reparar los nervios del sistema nervioso de un mamífero, en particular, el sistema nervioso de un humano, que comprende administrar una cantidad efectiva de las moléculas de unión Nogo y NiG de la invención a un paciente en necesidad de dicho tratamiento, o

(iii) una composición farmacéutica para la reparación del nervio del sistema nervioso de un mamífero, en particular, el sistema nervioso de un humano, que comprende las moléculas de unión de la invención y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Por lo tanto, la presente invención proporciona una molécula de unión, un polinucleótido, un vector de expresión o sistema, y una célula anfitriona de acuerdo con la presente invención para uso como un medicamento. En particular dicha molécula de unión, polinucleótido, un vector de expresión o sistema o célula anfitriona se puede utilizar en el tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso periférico (SNP) y/o central (SNC) o para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso periférico (SNP) y/o central (SNC).

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión, un polinucleótido, un vector de expresión o sistema o una célula anfitriona de acuerdo con la presente invención en asociación con por lo menos un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. También proporciona productos que contienen dicha molécula de unión, polinucleótido, vector de expresión o sistema o dicha célula anfitriona, o un derivado farmacológicamente aceptable del mismo, como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso periférico (SNP) y/o central (SNC).

También se prevé un método para el tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso periférico (SNP) y/o central (SNC) que comprende administrar a un sujeto en necesidad de dicho tratamiento una cantidad efectiva de una molécula de unión, un polinucleótido, un vector de expresión o sistema o una célula anfitriona de la presente invención.

La presente invención indica adicionalmente en los ejemplos que las composiciones farmacológicas y los productos se pueden utilizar para liberación lenta de la molécula de unión y/o para depósito local de la molécula de unión en el sitio de la lesión.

Como se utiliza aquí, el término "liberación lenta" o los términos equivalentes "liberación controlada" o "liberación extendida" se refiere a formulaciones de fármaco que liberan un fármaco activo, tal como un fármaco de polipéptido, que incluye una molécula de unión NogoA o NiG de la invención, tal como un anticuerpo dirigido a NogoA o NiG, durante un periodo luego de la administración a un individuo. La liberación extendida de los fármacos de polipéptido, que puede ocurrir sobre un rango de tiempos, por ejemplo, minutos, horas, días, semanas o más, dependiendo de la formulación del fármaco, está en contraste con formulaciones estándar en las que sustancialmente la unidad de dosificación completa está disponible para la absorción inmediata o distribución inmediata por medio del torrente sanguíneo. Las formulaciones de liberación extendida preferidas resultan en un nivel para hacer circular el fármaco de una administración única que es sostenida, por ejemplo, durante 8 horas o más, 12 horas o más, 24 horas o más, 36 horas o más, 48 horas o más, 60 horas o más, 72 horas o más 84 horas o más, 96 horas o más, o incluso, por ejemplo, durante 1 semana o 2 semanas o más, por ejemplo, 1 mes o más. Las formulaciones de liberación extendida se describen bien en la técnica y se pueden seleccionar de acuerdo con el perfil de liberación anticuerpo preferido. Los polímeros adecuados incluyen materiales biodegradables y no biodegradables tal como ácido poliláctico glicólico (PLGA).

Como se utiliza aquí, el término "epítopo" se refiere a una unidad de estructura unida convencionalmente por un par de inmunoglobulina VH/VL. Los epítopos definen el sitio de unión mínimo para un anticuerpo, y así representa el objetivo de especificidad de un anticuerpo. En el caso de un anticuerpo de dominio único, un epítopo representa la unidad de estructura unidad por un dominio variable único en aislamiento.

Como se utiliza aquí, el término "neutralizante," cuando se utiliza en referencia a la molécula de unión NogoA o NiG como se describe aquí, significa que la molécula de unión interfiere con una actividad o función medible de NogoA o NiG. Una molécula de unión NogoA o NiG es un polipéptido "neutralizante" si reduce una actividad o función medible del antígeno objetivo, por ejemplo Nogo o NiG, mediante por lo menos 50 %, y preferiblemente por lo menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más, de hasta y que incluye 100% de inhibición. Esta reducción de una actividad o función medible del antígeno objetivo se puede evaluar por un experto en la técnica utilizando métodos estándar para medir uno o más indicadores de dicha actividad o función. Como un ejemplo, cuando el objetivo es Nogo o NiG, se puede evaluar la actividad neutralizante utilizando un ensayo de crecimiento de Neurita descrito adelante.

En particular, las moléculas de unión de la invención son útiles para la regeneración axonal y germinación mejorada después del daño de fibra de nervio. Sin embargo, las moléculas de la invención tienen amplia utilidad en particular para sujetos humanos. Por ejemplo, la molécula de unión de la invención es útil en el tratamiento de diversas enfermedades del sistema nervioso periférico (SNP) y central (SNC), es decir más particularmente en enfermedades neurodegenerativas tal como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, Esclerosis amiotrófica lateral (ALS), patologías como Lewy u otra demencia en general, enfermedades luego de trauma craneal, cerebral o espinal, apoplejía o una enfermedad desmielinizante. Dichas enfermedades desmielinizantes incluyen, pero no se limitan a, esclerosis múltiple, desmielinación monofásica, encefalomielitis, leucoencefalopatía multifocal, panencefalitis, enfermedad de Marchiafava-Bignami, mielmolisis pontine, adrenoleucodistrofia, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, Degeneración esponjosa, enfermedad de Alexander, enfermedad de Canavan, leucodistrofia metacromática y enfermedad de Krabbe. En un ejemplo, la administración de las moléculas de unión de la invención se puede utilizar para tratar una enfermedad desmielinizante asociada con la proteína NogoA.

En otro ejemplo, las células que expresan las moléculas de unión de la invención se pueden trasplantar a un sitio de lesión de la médula espinal para facilitar el crecimiento axonal a través del sitio de la lesión. Dichas células trasplantadas proporcionarían medios para restaurar la función de la médula espinal luego de lesión o trauma. Dichas células pueden incluir células olfatorias envolventes y mastocitos de diferentes linajes de nervio fetal o injertos de tejido.

Adicionalmente, la moléculas de unión de la invención son útiles para el tratamiento de trastornos oculares degenerativos que pueden implicar directa o indirectamente la degeneración de células retinales o de córnea que incluye retinopatías isquémicas en general, neuropatía óptica isquémica anterior, todas las formas de neuritis óptica, degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía diabética, edema macular quístico (CME), retinitis pigmentosa, enfermedad de Stargardt, degeneración retinal viteliforme de Best, amaurosis congénita de Leber y otras degeneraciones retinales hereditarias, miopía patológica, retinopatía del prematuro, y neuropatía óptica hereditaria de Leber, los efectos posteriores de trasplante de córnea o de cirugía de córnea refractiva, y queratitis por herpes.

Adicionalmente, la moléculas de unión de la invención son útiles para el tratamiento de afecciones siquiátricas, particularmente esquizofrenia y depresión.

Para estas indicaciones, la dosificación apropiada, por supuesto, variará dependiendo de, por ejemplo, la molécula particular de la invención que se va a emplear, el modo de administración y la naturaleza y severidad de la afección que se va a tratar. En general, la dosificación preferiblemente estará en el rango de 1 mg/kg/día a 1 mg/kg/día.

La moléculas de unión de la invención se administran convenientemente mediante bombas o se inyectan como agentes terapéuticos en el sitio lesionado, por ejemplo se pueden administrar directamente en el SNC intracranialmente o en la espina intratecalmente al sitio lesionado. El espacio lleno con fluido alrededor de la médula espinal se denomina el espacio subaracnoide o intratecal. El fluido cerebroespinal (CSF) fluye a través de esta área, bañando y protegiendo el cerebro y la médula espinal. Una bomba de fármaco intratecal puede funcionar más eficientemente que la medicación oral debido a que suministra medicina directamente en el CSF, al derivar la ruta que la medicación oral toma a través del cuerpo. Por lo tanto en una realización preferida, la administración se hace a través de la administración intratecal, por ejemplo utilizando un catéter externalizado conectado a una bomba portátil. En una realización preferida adicional, se utiliza inyección de bolo intratecal. Los medios y métodos adecuados para administración intratecal de fármacos son aquellos conocidos en la técnica. Ejemplos no limitantes de bombas son: la bomba Alzet® y los sistemas de infusión Medtronic SynchroMed® o Isomed®. La moléculas de unión se pueden infundir continuamente, o se pueden administrar preferiblemente como dosis fijas en intervalos de tiempo específicos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21, o 30 días, por ejemplo mediante inyecciones de bolo directas en el fluido cerebroespinal.

Las moléculas de unión de la invención se pueden proporcionar solas, o en combinación, o en combinación secuencial con otros agentes. Por ejemplo, las moléculas de unión de la invención se pueden administrar en combinación con agentes anti-inflamatorios tal como pero no limitado a corticosteroides luego de apoplejía o lesión de la médula espinal como un medio para bloquear el daño neuronal adicional y la inhibición de la regeneración axonal, los factores neurotróficos tal como factor de crecimiento del nervio (NGF), factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) o otros fármacos para enfermedades neurodegenerativas tal como Exelon(tm) (Rivastigmina) o Levodopa (L-DOPA (3,4-dihidroxi-L-fenilalanina)). Otros patrones de combinación adecuados para el tratamiento de apoplejía son Alteplasa y Desmoteplasa (DSPA, por ejemplo descrito en el documento WO90/09438). En una realización, la presente invención proporciona una combinación que comprende una molécula de unión de la invención y Desmoteplasa, en particular para el tratamiento de apoplejía así como también composiciones farmacéuticas que comprenden dicha combinación. Como se utiliza aquí, se dice que dos agentes se administran en combinación cuando los dos agentes se administran simultáneamente o se administran independientemente en una forma de tal manera que los agentes actuarán al mismo tiempo.

La estructura de los ingredientes activos identificados por números de código, pueden tomar nombres genéricos o comerciales de la edición actual del compendio estándar "The Merck Index" o de las bases de datos, por ejemplo Patentes Internacionales (por ejemplo Publicaciones Mundiales IMS) u otras bases de datos proporcionadas por IMS Health. Cualquier experto en la técnica es completamente capaz de identificar los ingredientes activos y, con base en estas referencias, de forma similar permite fabricar y probar las indicaciones y propiedades farmacéuticas en los modelos de prueba estándar, ambos in vitro e in vivo.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden fabricar en una forma convencional. Por ejemplo una composición de acuerdo con la invención que comprende las moléculas de la invención se proporciona preferiblemente en forma liofilizada. Para la administración inmediata se disuelve en un portador acuoso adecuado, por ejemplo agua estéril para inyección o solución salina fisiológica regulada estéril.

Para ayudar a elaborar las composiciones adecuadas, las moléculas de unión de la invención y opcionalmente un segundo fármaco que mejora el efecto de las moléculas de unión de la invención, se pueden empacar en forma 5 separada dentro del mismo contenedor, con instrucciones para mezcla o administración concomitante. Se proporcionaron anteriormente candidatos de segundo fármaco opcionales.

El efecto sinérgico de una combinación de las moléculas de unión de la invención y los factores de crecimiento tal como NGF se puede demostrar in vivo mediante los modelos de lesión de médula espinal.

La presente invención también se relaciona con el uso de la composición farmacéutica de la invención para la 10 preparación del medicamento de liberación lenta de la molécula de unión de la invención.

La presente invención también se relaciona con el uso de la composición farmacéutica de la invención para la preparación de un medicamento para el depósito local de la molécula de unión de la invención en el sitio de lesión.

La presente invención se relaciona adicionalmente con el agente farmacéutico de la invención para la liberación lenta de la molécula de unión de la invención y para el depósito local de la molécula de unión de la invención en el 15 sitio de la lesión.

La presente invención también se relaciona con un método para la liberación lenta de una molécula de unión de la invención y para el depósito local de una molécula de unión de la invención.

La invención se entenderá más completamente mediante referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo estos no se deben constituir como limitantes del alcance de la invención.

20 En los siguientes ejemplos todas las temperaturas están en grados Celsius (° C). Los anticuerpos monoclonales de atención en los Ejemplos son moléculas de unión de acuerdo con la presente invención que comprenden la región variable de la cadena ligera representada por la SEQ ID NO: 5 y la región variable de la cadena pesada representada por la SEQ ID NO: 4 (6A3-IgG1), o que comprende la región variable de la cadena ligera representada por la SEQ ID NO: 25 y la región variable de la cadena pesada representada por la 25 SEQ ID NO: 24 (6A3-IgG4).

Es evidente que en los párrafos dados anteriormente, el término "que comprende" abarca el término "que consiste de". Se utilizan las siguientes abreviaturas: ELISA ensayo inmuno-adsorbente ligado a enzima

30 FACS clasificación de células activadas por fluorescencia FITC isotiocianato de fluoresceína FBS suero bovino fetal FCS suero de becerro fetal HCMV promotor de citomegalovirus humano

35 IgG isotipo G de inmunoglobulina mAb anticuerpo monoclonal VH región variable de la cadena pesada VL región variable de la cadena ligera LC cadena ligera HC cadena pesada

CDR región determinante de complementariedad

BSA albúmina de suero bovina

aa aminoácidos

5 bp pares base

SNC sistema nervioso central

HRP peroxidasa de rábano

RT temperatura ambiente

PBS solución salina regulada con fosfato

10 TBS solución salina regulada con Tris

CEA antígeno carcinoembriónico

IF inmunofluorescencia

IgG inmunoglobulina G

PBS-T solución salina regulada con fosfato con 0.05% de Tween 20

15 PFA Paraformaldehído

EJEMPLOS

La invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos no limitantes

Ejemplo 1: Secuencia del anticuerpo monoclonal anti-hu-NogoA Medarex 6A3.

Se selecciona un anticuerpo monoclonal IgG1 humano con alta afinidad para el fragmento humano NiG humano de

20 NogoA. Los monoclonales originales se secretan de los clones de células de hibridoma de ratón que se derivan mediante tecnología de hibridoma estándar utilizando "ratones Medarex"; ratones reconstituidos recombinantemente con genes de inmunoglobulina humanos, mediante Medarex Inc., Annandale, NJ. La generación de Ratones Medarex inmunizados con NiG humano, y la producción de hibridomas de los mismos, se conoce bien en la técnica; se han seguido condiciones similares a aquellas descritas en el documento WO 2005/028508. El nivel de producción

25 de anticuerpo de la mayor parte de los hibridomas es muy bajo; por lo tanto se emplea tecnología de ADN recombinante para construir vectores de expresión especializados para producción a alto nivel del anticuerpo completo o el fragmento Fab en una estirpe celular. La generación de fragmentos Ab y Fab purificados de Abs se conoce bien y se describe en detalle en por ejemplo el documento WO 2005/028508. Se han seguido etapas similares para la generación del 6A3-mAb y 6A3-Fab purificado. Los cADN que codifican las regiones variables de

30 las cadenas ligera y pesada del anticuerpo 6A3-IgG1 se amplifican mediante PCR (reacción de cadena polimerasa) de mARN de hibridoma, se clonan y se caracterizan mediante secuenciamiento (Figuras 1 y 2; SEQ ID NO 7 y 6).

Ejemplo 2: Generación de Fab y IgG4.

El 6A3 mAb es del isotipo IgG1. Los anticuerpos de isotipo IgG1 humanos tienen una alta afinidad para los receptores Fc celulares y pueden inducir toxicidad celular dependiente de anticuerpo (AADC) y citotoxicidad 35 dependiente de complemento (CDC) (Jerries et al., 2002, Hezareh et al., 2001). Más aún, se han reportado los mAb IgG para el flujo de salida rápidamente del cerebro a la sangre a través de la barrera de cerebro-sangre por medio de transcitosis inversa mediada por el receptor Fc (Zhang et al., 2001). Con el fin de retirar las interacciones mediadas por el receptor Fc potencial del 6A3 IgG1 mAb, su isotipo se ha intercalado recombinantemente a un IgG4 y también para la producción recombinante de un fragmento monovalente Fab para expresión de alta capacidad en

40 células SP2/0 y E. coli.

El secuenciamiento de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera de este anticuerpo anti-Nogo-A humano permite la producción recombinante del fragmento 6A3-Fab y el anticuerpo de isotipo 6A3-IgG4 en estirpes celulares productoras de alta capacidad.

Para la expresión de E. coli del fragmento Fab, ambos cADN (SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 6) se clonan pASK116.

5 El plásmido utilizado para clonar los cADN que proporciona los genes de dominio constante de IgG1/κ de ratón (Skerra, 1994). Las dos cadenas de polipéptidos del fragmento de anticuerpo se codifican en un operón bajo el control transcripcional del promotor tetraciclina. El primer cistrón codifica la unidad estructural de cadena pesada del fragmento Fab. El dominio VH se fusiona al péptido de señal OmpA en su terminal N y en el dominio CH1 del IgG1 de clase de murino en su extremo de terminal C. El segundo cistrón codifica la cadena ligera con el dominio VL fusionado al péptido líder PhoA y el dominio de murino CH1. Luego de la inducción de la expresión de las dos cadenas del fragmento Fab se llega a secretar simultáneamente en el periplasma de E. coli en donde la proteína se pliega, ocurre la formación de enlace de disulfuro y ensamble de cadena. Para la expresión del Fab en E.coli los plásmidos se transfieren a BMP para producción a gran escala.

Para la clonación de la región variable de cadena pesada y variable del anticuerpo 6A3 para expresión como un

15 anticuerpo IgG4 en células SP2/0, los cADN correspondientes se clonan en el plásmido LCvec-AAL160 y hcMCPfin. Para la expresión del anticuerpo IgG4 completo, los plásmidos se linearizan con NotI para la construcción LC y PvuI para la construcción HC y se transfectan en células SP2/0.

El fragmento monovalente 6A3 IgG4 y 6A3 con su etiqueta his se han producido y purificado exitosamente. Los anticuerpos recombinantes exhiben altas afinidades para el fragmento humano NogoA hNiG en Experimentos BIAcore (véase adelante). Los valores Kd respectivos son 0.14 nM y 1.1 nM confirmando la clonación exitosa y correcta y expresión recombinante del Ab retiene su afinidad para el fragmento NogoA hNiG humano.

Las regiones codificantes y las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera y pesada de 6A3-Ig4 se muestran en las Figuras 3 y 4 (SEQ ID NOs 24, 25, 28 y 28).

Ejemplo 3: Determinación de las regiones determinantes de complementariedad del 6A3-Ab.

25 Las regiones determinantes de complementariedad de la cadena ligera y pesada variable del anticuerpo 6A3 se determinan utilizando la base de datos Kabat en el URL de www.bioinf.org.uk/abs/. La definición Kabat se basa en la variabilidad de la secuencia y es el método más comúnmente utilizado para determinar los CDR de las regiones variables de anticuerpo (Wu TT, Kabat EA, 1970).

Todas las 6 definiciones CDR se correlacionan bien las secuencias de aminoácidos experimentalmente determinadas excepto para CDR-H2, en donde se encuentran los residuos típicos antes del CDR que deben ser LEWIG, LEWVA (Figura 5). Sin embargo son posibles una serie de variaciones para CDR-H2.

Ejemplo 4: Mediciones de afinidad de biosensor para 6A3-IgG1, 6A3-IgG4 y 6A3 Fab de ratón a NiG.

La afinidad de 6A3-IgG1 mAb, 6A3-IgG4 mAb de ratón, y del 6A3 Fab se miden mediante resonancia de plasmón de superficie (SPR) utilizando un biosensor óptico BIAcore 2000 (Biacore, Uppsala, Suecia) de acuerdo con las 35 instrucciones del fabricante. El NiG humano recombinante se inmoviliza covalentemente en una célula de flujo de un chip sensor CM5 utilizando química de acoplamiento de amina. En resumen, se activa la matriz de dextrano carboximetilado al inyectar 35 ml de una solución que contiene 0.025M NHS y 0.1M EDC. Para la inmovilización en el chip sensor, el NiG humano recombinante se diluye en regulador de citrato 0.01M a pH 4 y se inyecta a un índice de flujo de 5ml/min para lograr niveles de acoplamiento que permiten mediciones de afinidad. La desactivación del grupo éster NHS restante se realiza mediante la inyección de 35ml de clorhidrato de etanolamina 1M (pH 8.5). Se regenera la superficie del chip sensor al inyectar 5ml 0.1M HCl. Para la medición de la afinidad, los anticuerpos se inyectan en diferentes concentraciones, que varían de 0.50nM a 100nM a un índice de flujo de 200 ml/min. Después de cada inyección, se regenera la superficie del chip sensor con la inyección de 10 ml de 0.1M HCl sin pérdida de actividad de unión en la superficie. Las constantes cinéticas, ka y kd y las constantes de afinidad KA y KD se

45 evalúan utilizando el software BIAevaluations 3.0 suministrado por el fabricante.

Medición de afinidad en BIAcore: Las constantes de unión de afinidad y cinéticas del 6A3-IgG1 mAb, 6A3-IgG4 mAb de ratón, y del fragmento Fab monovalente derivado de 6A3 al NogoA humano recombinante se miden en tiempo real utilizando tecnología de resonancia de plasmón de superficie (SPR) (Biacore). Para este análisis el NiG humano recombinante se acopla en una superficie de chip sensor y se inyectan diferentes concentraciones de los anticuerpos. Los parámetros cinéticos de las interacciones de unión se derivan de los sensogramas mediante ajuste de curva no lineal. Estas constantes de afinidad en equilibrio al NiG humano para los anticuerpos están en el rango de KD 0.13nM a 2.5 nM para 6A3-IgG4, 6A3-IgG1, 6A3 Fab.

Ejemplo 5: Unión de anticuerpos anti-NogoA NVP-6A3-Ab-NX-1 y NVP-IIC7-NX-1 al NogoA endógeno humano.

En este ejemplo se muestra la unión de los anticuerpos al Nogo-A humano endógeno. Para este fin, se han caracterizado dos estirpes celulares humanas previamente para mostrar la expresión génica específica oligodendrítica de Nogo-A, y posteriormente se prueban para la unión específica de los anticuerpos. Las estirpes celulares oligodendrogliales humanas MO3.13 y HOG se utilizan para caracterizar nuestros dos anticuerpos antiNogo-A NVP-6A3-Ab-NX-1 (6A3-Ab) y NVP-IIC7Ab-NX-1 (IIC7- Ab) con respecto a su unión al Nogo-A endógeno. Las células se pueden utilizar adicionalmente para realizar un bioensayo para la caracterización de las diferentes tandas de anticuerpo para ensayos clínicos. En dos configuraciones experimentales independientes, se analiza y detecta la unión de 6A3-Ab al Nogo-A humano endógeno en aquellas células.

En una primera etapa las células MO3:13 se analizan para la presencia de mARN Nogo-A mediante RT-PCR utilizando cebadores específicos para el Nogo-A humano. En segundo lugar, la unión de ambos antricuerpos al Nogo-A endógeno se muestra mediante inmunosupresión de los lisados celulares MO3.13 e inmunodetección. Finalmente, la tinción inmunofluorescente específica de las células MO3.13 y HOG con el 6A3-Ab confirma los resultados de las inmunoprecipitaciones.

Sin embargo, se encuentra que 6A3-AB y 11C7-Ab son capaces de unirse específicamente al Nogo-A humano endógeno.

Métodos

Estirpes celulares: Se obtienen células MO3.13 del Dr. N. Cashman, University of Toronto. Estas se originan de la fusión de un mutante resistente a 6-tioguanina del rabdomiosarcoma humano (RD) con oligodendrocitos humanos de adulto cultivados de espécimen quirúrgico. Las células HOG se obtienen de Dr. G. Dawson, University of Chicago. Esta estirpe celular se establece de oligodenroglioma retirado quirúrgicamente. Todas las células se cultivan en Medio Eagle Modificado de Dulbecco con alta glucosa (Gibco) complementada con Glutamax, 10 % de suero bovino fetal y Penicilina/Estreptomicina.

RT-PCR: Se prepara ARN total de 5 x 105 células MO3.13 utilizando reactivos Tripure (Roche Diagnostics). Después de tratamiento de ADNsa, se transcribe a la inversa 1 mg de ARN en un volumen total de 20 ml utilizando Omniscript RT (Qiagen) y un cebador oligo dT. Los cebadores utilizados para PCR son específicos para Nogo-A, amplificando un fragmento 194 bp partiendo de la posición bp 1197 en un Nogo-A humano de longitud completa (5’-TGAGGGAAGTAGGGATGTGC-3’ (SEQ ID NO: 32), 5’-CAGGTGATGTACGCTCTGGA- 3’ (SEQ ID NO: 33)). Se establece una reacción utilizando 2ml de cADN (o 0.1mg ARN -RT), 5ml de regulador 10x, 3ml de dNTP (5mM cada uno), 2.5 ml de cebador 5’ (10mM), 2.5 ml de Cebador 3’ (10 mM), 0.5 ml de polimerasa de HotStar-Taq (Qiagen) y

34.5 ml de H2O. Se utilizan los siguientes ciclos PCR: 95° C 15 min., (94° C 30 seg., 55° C 30 seg., 72° C 15 seg.) x 35, 72° C 10min. -->4°C. Después de la terminación de PCR, se analiza una alícuota de 10ml en un gel de agarosa de bromuro de etidio al 2%.

Inmunoprecipitación e Inmunodetección: Para cada IP un plato de cultivo de 10cm de células MO3.13 que se cultivan en confluencia se lava con PBS y las células se lisan en 500 ml de Reactivo de Extracción de Proteína de Mamífero M-PER (Pierce) que contiene cóctel de inhibidor de proteasa completo (Roche Diagnostics). La fracción soluble de lisado se pre-limpia con Proteína G-Sefarosa (Sigma) durante 15 minutos a temperatura ambiente (temperatura ambiente). Para pre-limpieza se agrega sobrenadante fresco de Proteína G-Sefarosa y el anticuerpo correspondiente (50 nM concentración final) y se incuba a 4° C durante 4 horas en un agitador de rotación. Los anticuerpos son 6A3 IgG4, 11C7 IgG1 o anti-CEA IgG4 contra una proteína no relacionada (antígeno carcinoembriónico), que sirve como un control negativo. Una alícuota de cada sobrenadante se mantiene para análisis de la fracción no unida; la Sefarosa se lava 4 veces con regulador TNS (10mM TrisHCl pH 7.8, 1% (p/v) de N-Laurilsarcosina, 100mM NaCl), una vez con PBS, y la fracción unida a sefarosa se eluye con 20 ml de regulador de carga SDS-PAGE (Invitrogen). Las muestras se calientan a 95° C durante 5 minutos y una 10ml de alícuota cada una se hace correr en gel de gradiente de 4-12% NuPage (Invitrogen) en regulador MES. Las proteínas se transfieren en una membrana de celulosa durante 4 horas a 30 V y se analizan para transferencia con tinción Ponceau. Después de transferencia, la membrana se bloquea durante la noche a 4° C en reactivo de bloqueo western (Roche Diagnostics) en PBS-T. Para inmunodetección, la membrana se incuba con el anticuerpo 6A3-IgG4 en concentración 1nM durante 2 horas a temperatura ambiente y posteriormente con una peroxidasa anti-humana acoplada al anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente. Se detectan señales utilizando ECL-Advance (Amersham) y se exponen a la película durante 1 minuto.

Inmunofluorescencia: Se colocan en placas células MO3.13 y HOG en portaobjetos de cámara de tejido recubiertos con poli-D-lisina de 8 pozos (Becton Dickinson) y se cultivan hasta 80% de confluencia. Después de lavado en PBS, las células se fijan en 4% de PFA durante 30 min a temperatura ambiente. Se bloquea la unión no específica con 10% de FCS, 0.1% de Triton X-100 durante 20 min. Las células se incuban en 1% de FCS, 0.1% de Triton X-100 durante 1 hora con 6A3-IgG4 5nM o regulador solo como control negativo. Después de la incubación del anticuerpo, las células se lavan 3 veces con PBS y se incuban con un anticuerpo IgG anti humano marcado con Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) en dilución 1:200 en PBS durante 1 hora.

Resultados

RT-PCR: RT-PCR utilizando el ARN MO3.13 como plantilla resulta en un fragmento de ADN distinto de aproximadamente 200 bp (Figura 6). No se detecta producto en los controles negativos (ARN sin transcripción inversa y H2O). Está presente un fragmento de PCR en el tamaño esperado de 194 bps; no se amplifican productos en las muestras de control negativas (ADNsa tratada con ARN y H2O).

Inmunoprecipitación: Después de inmunoprecipitación (IP) de los lisados celulares M03.13 y la inmunodetección con el anticuerpo 6A3 anti Nogo-A (Figura 7) se detecta una banda fuerte única de tamaño esperado (190kDa) ambos para el anticuerpo 6A3- IgG4 (línea 4) y 11C7-IgG1 (línea 6). No se detecta señal después de IP con el anticuerpo de control anti-CEA contra una proteína no relacionada (antígeno carcinoembriónico) (línea 1) y en las fracciones no unidas (líneas 5 y 7). Una banda débil es visible en el lisado celular crudo MO3.13 IP (línea 2). Una señal débil no específica en un bajo peso molecular visto en la fracción de lisado celular insoluble (línea 3).

Inmunofluorescencia: La inmunofluorescencia por tinción de células permeabilizadas MO3.13 y células HOG con el anticuerpo secundario anti-humano marcado con 6A3-IgG4 y Alexa-Fluor 488 resulta en tinción muy brillante de las células (Figura 8a y 8b, parte izquierda), mientras no se detecta virtualmente señal con solo el anticuerpo secundario (parte derecha).

Discusión

El análisis RT-PCR de las células MO3.13 utilizando los cebadores específicos Nogo-A para PCR resultan en un fragmento de ADN de tamaño esperado (194 bp), mientras no se detecta producto PCR con la muestra de ARN transcrita no inversa o el control de agua. A partir de este resultado concluimos que las células expresan el Nogo-A endógeno.

La inmunoprecipitación de los lisados celulares MO3.13 y la inmunodetección con el anticuerpo anti-Nogo-A 6A3 muestra una banda Nogo-A única fuerte en el tamaño esperado (190kDa). En contraste, el anticuerpo de control anti-CEA (IgG4) no produce una banda de tamaño correspondiente. La diferencia en intensidad entre las bandas resulta de las inmunoprecipitaciones 6A3 y 11C7 se deben más probablemente a las diferentes afinidades de los diferentes isotipos de anticuerpo para Proteína G SefarosA (afinidad 6A3 > afinidad 11C7). Los resultados de la tinción inmunofluorescente intracelular de las células MO3.13 y HOG que muestran que el 6A3-IgG4 se une al Nogo-A endógeno.

A partir de estos resultados se concluye que las dos estirpes celulares expresan endógenamente Nogo-A y que el anticuerpo 6A3 IgG4 (6A3-Ab) y el 11C7 IgG1 (11C7-Ab) se unen específicamente al Nogo-A humano endógeno. Estos hallazgos sugieren que la estirpe celular MO3.13 se puede utilizar para establecer ensayos de unión Nogo-A para, por ejemplo, la caracterización del anticuerpo.

Ejemplo 6: Efecto del tratamiento 6A3 en la recuperación funcional de monos Macacos sometidos a lesiones cerebrales.

En un estudio adicional, se someten monos macaco a una lesión como se describió previamente y se tratan con una infusión intratecal de 4 semanas de 6A3 o IgG de control desde el tiempo de lesión. Se determina la destreza manual para la mano izquierda afectada utilizando la prueba de tablero de Brinkmann modificada bajo condiciones como se describió aquí anteriormente. El tratamiento 6A3 mejora la velocidad y grado de recuperación funcional comparado con el tratamiento de control IgG. Cuando se determina el tamaño de la lesión al final del experimento, la recuperación funcional de monos tratados con IgG de control se encuentra que se correlaciona casi inversamente con el tamaño de la lesión, que varía de 90 % para una lesión del 50 % a 53 % para una lesión del 90 %. Por el contrario, la cantidad de recuperación en los animales tratados con mAb anti-Nogo-A no se afecta significativamente por el tamaño de la lesión y para animales tratados 6A3 que casi alcanza su desempeño pre-lesión cuando el tamaño de la lesión es tan alto como 85 %.

Ejemplo 7: Retención CSF y vida útil del anticuerpo 6A3 en sujetos humanos

La retención CSF y la vida útil del anticuerpo 6A3 en sujetos humanos se determinan después de infusiones CSF durante 14 días (dosis diaria 15 mg / día) y se miden las concentraciones individuales en suero y CSF (figuras 9 y 10).

Las concentraciones CSF permanecen constantes o declinan solo marginalmente, en los dos casos finalizando en los días 34 y 56, es decir aproximadamente 20 y 42 días después de final de la infusión, cuando se compara con los niveles medidos durante la infusión, que indica la residencia sorprendentemente larga y/o vida útil en el CSF de 6A3. Este comportamiento farmacocinético permitiría diferentes rutas de administración y regímenes de dosis con intervalos más largos. Serían factibles las inyecciones de bolo en el CSF durante intervalos de 2 o más días o semanas. El anticuerpo 6A3 también sería adecuado para formulaciones de liberación controlada, tal como formulación en polímeros e implantes biodegradables o no biodegradables.

Ejemplo 8: Eficacia en modelo SCI de macaco

Se someten 3 monos a una sección unilateral de la médula espinal en el límite C7/C8, una lesión conocida como para deshabilitar la generación de movimientos de dedos preciso fino, y se implanta con una bomba Alzet® osmótica que se suministra intratecalmente al sitio de la lesión de anticuerpo de ratón IgG en el animal de control o 6A3 anticuerpo en los animales tratados durante 4 semanas en una dosis de 1 mg/día (Figura 11 y Freund et al., Nat Med 12:7 90-2, 2006). Se evalúa la destreza manual mediante la recuperación del gránulo de alimento de ranuras verticales y horizontales en una prueba de tablero de Brinkman modificada. Otras tareas de comportamiento incluyen la recuperación del gránulo de alimento de un cajón, movimientos de brazo balístico, capacidad motora de la pata para agarrar los alimentos y observación del comportamiento en dolor e incomodidad. Las pruebas se realizan 60 días antes de la lesión hasta 120 días después de la lesión en intervalos regulares.

Los monos se someten a una sección de la médula espinal unilateral y se tratan intratecalmente con el anticuerpo de control de ratón IgG (n=2, es decir Cont. 1 con 50 % de lesión y Cont. 2 con 90% de lesión) o 6A3 (n=2, es decir ATI1 con 85 % de lesión y ATI2 con 80% de lesión) en una dosis de 1 mg/día durante 4 semanas (pesos del mono: Cont 1, 5.1 kg, Cont 2, 4.1 kg, ATI 1, 5.0 kg, ATI 2, 4.5 kg). Los resultados se muestran como el número total de gránulos durante las sesiones de prueba en los días específicos del ensayo. Se calculan los valores utilizando puntajes de comportamiento individuales pre-lesión y post-lesión cuando el nivel de desempeño permanece estable.

El tratamiento de anticuerpo 6A3 en los monos da una mejora gradual en la recuperación del gránulo de alimento utilizando la mano izquierda afectada de las ranuras horizontal y vertical en comparación con un mono tratado con IgG de control. El mono de control muestra un déficit persistente total en la recuperación de los gránulos de las ranuras horizontales, un movimiento que requiere mayor destreza manual que la recuperación de las ranuras verticales.

Después de la recuperación que ha alcanzado un nivel máximo en la prueba de tablero de Brinkmann, a los monos se les prueba su capacidad para agarrar la manija de un cajón con su mano izquierda afectada, para abrirlo y extraer un gránulo de alimento de un pozo en el cajón. El mono tratado con IgG de control con una lesión del 90% (Cont. 2) se incapacitó totalmente para agarrar la manija y abrir el cajón. El movimiento del brazo es más lento de lo normal y la forma de la mano es anormal. Esto se puede derivar de la línea con flecha doble, indicando una diferencia clara entre la actividad antes de la lesión y la actividad después de la lesión y el tratamiento con el anticuerpo IgG de control, que indica solo recuperación parcial. Los animales tratados con anticuerpo 6A3 con 85 % (ATI-1) o 80 % (ATI-2) de lesiones recuperan la capacidad de realizar la tarea rápida y efectivamente, independiente del tamaño de la lesión. No se presenta diferencia sustancial en la actividad antes y después de la lesión cuando se trata con el anticuerpo 6A3, apuntando a una recuperación completa debido al tratamiento con anticuerpo 6A3. El tratamiento con anticuerpo 6A3 así proporciona un efecto beneficioso claro en la recuperación después de lesiones cerebrales inducidas en Macacos, cuando se compara con el tratamiento con anticuerpo IgG de control.

Ejemplo 9: Ensayos clínicos

Se describe un estudio clínico adecuado como sigue:

El estudio tiene tres fases: Fase de Detección (que incluye Inicial), Fase de Tratamiento de marca abierta y por lo menos una Fase de Seguimiento de 22 semanas. El estudio se conduce bajo la supervisión de Un Tablero de Supervisión de Seguridad de Datos Independientes (DSMB).

Se involucró un total de 22 pacientes en 4 cohortes secuenciales, parcialmente superpuestos para recibir una infusión continua del anticuerpo 6A3. Todos los pacientes tienen un periodo de seguimiento durante por lo menos 22 semanas post infusión para evaluación de seguridad adicional.

La asignación del paciente y la dosis de tratamiento y duración por cohorte es como sigue:

•

Cohorte 1: 3 pacientes paraplégicos reciben 5 mg [en 2.5 ml] durante 24h;

•

Cohorte 2: 3 pacientes paraplégicos reciben 30 mg [en 2.5 ml] durante 24 h;

•

Cohorte 3: 6 pacientes paraplégicos reciben hasta 30 mg/día [en 2.5 ml/día] durante 14 días.

•

Cohorte 4: 10 pacientes para- y tetraplégicos reciben hasta 30 mg/día [en 2.5 ml/día] durante 28 días.

Los pacientes se supervisan cercanamente durante un periodo de por lo menos seis meses luego del inicio de infusión. El estado de los pacientes se supervisa cercanamente mediante mediciones de los signos vitales, registros 5 ECG (interpretación mediante una instalación central) y evaluaciones de laboratorio con base en matrices de sangre, orina y CSF. Los exámenes neurológicos utilizando la escala ASIA (Clasificación Neurológica Estándar Aplicable de Lesión de Médula Espinal por la Asociación Americana de Lesiones de Médula Espinal) (Ditunno, et al, 1994; American Spinal Cord Injury Association. Paraplegia 32(2): 7080.) se realizan por médicos calificados para evaluar la eficacia, pero también para evaluar la exacerbación potencial de la lesión de la médula espinal. Se realiza un total de

10 cuatro MRI cerebrales y espinales para cada paciente. Se toman muestras CSF en tres puntos de tiempo de cada paciente (pre-dosis, durante la fase de tratamiento y durante la fase de seguimiento) para análisis farmacocinético (PK). Las muestras de sangre también se obtienen para análisis PK a través de las fases de tratamiento y seguimiento. Los datos de todos los pacientes se revisan mediante el DSMB independiente por protocolo.

LISTADO DE SECUENCIAS

15 <110> NOVARTIS A.G. University of Zurich

<120> Moléculas de unión a NOGO-A mejoradas y uso farmacéutico de las mismas

<130> NIAG-006-PCT

<150> 61/001,741

<151> 2007-11-02 20 <150> EP07119847.7

<151> 2007-11-02

<160> 33

<170> PatentIn version 3.3

<210> 125 <211> 3919

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS 30 <222> (1)..(3579)

<223> NogoA Humano

<400> 1

<210> 2

<211> 1192

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 819

<212> PRT 5 <213> Homo sapiens

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(819)

<223> NiG humano 10 <400> 3

<210> 4

<211> 246

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

<210> 5

<211> 246

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

<210> 6

<211> 741

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 6

<210> 7

<211> 705

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 7

<210> 8

<211> 10 10 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 8

<210> 9

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 9

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 10

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 11

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 12

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 13

<210> 14

<211> 34

<212> ADN

<213> Mus musculus < 400> 14 agggccagtc agagtgttag cagctactta gcct 34

<210> 15

<211> 21

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 15 gatgcatcca acagggccac t 21

<210> 16

<211> 27

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 16 cagcagcgta gcaactggcc gatcacc 27

<210> 17

<211> 30

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 17 ggattcacct ttagtaacta ttggatgagc 30

<210> 18

<211> 51

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 18 accataaagc aagatggaag tcagaaaaac tatgtggact ctgtgaaggg c

<210>

19

<210>

24

<211> 15

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 19

5

gaactcttcg atctc 15

<210> 20

<211> 57

<212> ADN

<213> Mus musculus

10

<400> 20

atggagtttg ggctgagctg ggttttcctt gttgctattt tagaaggtgt ccagtgt

57

<210> 21

<211> 19

<212> PRT

15

<213> Mus musculus

<400> 21

<210> 22

<211> 60

20

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 22

atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga

60

<210> 23

25

<211> 20

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 23

<211> 460

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 24

<210> 25

<211> 234

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 25

<210> 26

<211> 321

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(321)

<400> 26

<210> 27

<211> 107

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 27

<210> 28

<211> 342

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(342)

<400> 28

<210> 29

<211> 114

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 29

10 <210> 30

<211> 19

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 30

<210> 31

<211> 20

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 31

10

<210> 32

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

15

<223> cebador

<400> 32

tgagggaagt agggatgtgc

20

<210> 33

<211> 20

20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 33

25

caggtgatgt acgctctgga 20

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una molécula aislada que comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno que se une específicamente al polipéptido NogoA humano (SEQ ID NO: 2) o NiG humano (SEQ ID NO: 3), dicho sitio de unión a antígeno comprende:

   *

   en secuencia las regiones hipervariables CDR-H1- 6A3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2- 6A3 (SEQ ID NO: 9) y CDR-H36A3 (SEQ ID NO: 10); y

   *

   en secuencia las regiones hipervariables CDR-L1- 6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2- 6A3 (SEQ ID NO: 12) y CDR-L3- 6A3 (SEQ ID NO: 13).

2. 2. La molécula de unión de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende:

   *

   por lo menos una cadena pesada de inmunoglobulina o fragmento de la misma que comprende (i) un dominio variable que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2- 6A3 (SEQ ID NO: 9) y CDR-H3- 6A3 (SEQ ID NO: 10) y (ii) la parte constante o fragmento de la misma de una cadena pesada humana; y

   *

   por lo menos una cadena ligera de inmunoglobulina o fragmento de la misma que comprende (i) un dominio variable que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR-L1- 6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2- 6A3 (SEQ ID NO: 12) y CDR-L3- 6A3 (SEQ ID NO: 13) y (ii) la parte constante o fragmento de la misma de una cadena ligera humana.

3. 3.

   La molécula de unión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la parte constante o fragmento de la misma de la cadena pesada humana es del tipo y4 y la parte constante o fragmento de la misma de la cadena ligera humana es del tipo κ.

4. 4.

   La molécula de unión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha molécula de unión es un anticuerpo monoclonal humano o quimérico o humanizado.

5. 5.

   La molécula de unión de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una o más secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO: 4 (IgG1 pesado), SEQ ID NO: 5 (IgG1 ligero), SEQ ID NO: 24 (IgG4 pesado) y SEQ ID NO: 25 (IgG4 ligero).

6. 6.

   Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula de unión de acuerdo con la reivindicación 1.

7. 7.

   Un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 6 que comprende:

   *

   por lo menos una de las secuencias de polinucleótidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16; o

   *

   por lo menos una de las secuencias de polinucleótidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19.

8. 8.

   Un vector de expresión que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 6 o 7.

9. 9.

   Un sistema de expresión que comprende el vector de expresión de la reivindicación 8, en donde dicho sistema de expresión o parte del mismo es capaz de producir un polipéptido de la reivindicación 1, cuando dicho sistema de expresión o parte del mismo está presente en una célula anfitriona compatible.

10. 10.

    Una célula anfitriona aislada que comprende el vector de la reivindicación 9.

11. 11.

    Una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión de acuerdo con la reivindicación 1, un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 6, un vector de expresión o sistema de expresión de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, respectivamente, o una célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 10, en asociación con por lo menos un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

12. 12.

    La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicha composición es una composición de liberación lenta.

13. 13.

    Un método para producir la molécula de unión de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende expresar el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 6 en un vector de expresión o sistema de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, respectivamente, por medio de tecnología de ADN recombinante o por medio de síntesis química.