ES2352551T3 - Proteína de unión a receptor nogo. - Google Patents

Abstract

Ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido soluble, donde: (A) dicho polipéptido soluble consiste en un polipéptido seleccionado del siguiente grupo, opcionalmente fusionado a un polipéptido heterólogo: (a) un polipéptido que comprende los aminoácidos 34-532 de la SEC ID Nº 2; (b) un polipéptido que comprende los aminoácidos 34-417 de la SEC ID Nº 2; (c) un polipéptido que comprende los aminoácidos 34-432 de la SEC ID Nº 2; (d) un polipéptido que comprende los aminoácidos 417-531 de la SEC ID Nº 2; (e) un polipéptido que comprende los aminoácidos 425-531 de la SEC ID Nº 2; (f) un polipéptido que comprende los aminoácidos 1-531 de la SEC ID Nº 2; (g) un polipéptido que comprende los aminoácidos 433-493 de la SEC ID Nº 2; (h) un polipéptido que comprende un dominio LRR de la SEC ID Nº 2, una región básica de la SEC ID Nº 2 C-terminal al dominio LRR, y un dominio de inmunoglobulina (Ig) de la SEC ID Nº 2 C-terminal a la región básica; (i) un polipéptido que comprende un dominio de Ig de la SEC ID Nº 2, pero que carece de un dominio LRR de la SEC ID Nº 2, una región básica de la SEC ID Nº 2, y un dominio citoplasmático; (j) un polipéptido que comprende un dominio LRR de la SEC ID Nº 2, pero que carece de un dominio de Ig de la SEC ID Nº 2, una región básica de la SEC ID Nº 2, y un dominio citoplasmático; y (k) un polipéptido como en (h), que carece de un dominio citoplasmático; donde el polipéptido soluble codificado por el ácido nucleico es capaz de unirse a NgR1 para aliviar la inhibición mediada por NgR1 de la extensión axonal en una neurona del sistema nervioso central; (B) dicho polipéptido soluble consiste en un polipéptido que incluye el siguiente motivo de aminoácidos, opcionalmente fusionado a un polipéptido heterólogo: LSPRKH (SEC ID Nº 10); donde el polipéptido soluble codificado por el ácido nucleico es capaz de bloquear, inhibir o interferir en la función de NgR1; o (C) dicho polipéptido soluble consiste en el siguiente polipéptido, opcionalmente fusionado a un polipéptido heterólogo: LSPRKH (SEC ID Nº 10); donde el polipéptido soluble codificado por el ácido nucleico es capaz de bloquear, inhibir o interferir en la función de NgR1.

Description

Campo de la Invención

Esta invención se refiere a la neurología, neurobiología y la biología molecular. Más particularmente, esta invención se refiere a moléculas y medicamentos para el tratamiento de enfermedades, trastornos y lesiones neurológicas tales como 5 lesión de la médula espinal.

Antecedentes de la Invención

Los axones y las dendritas se extienden desde las neuronas. La punta distal de un axón o neurita extensible incluye una región especializada, conocida como cono de crecimiento. Los conos de crecimiento detectar el entorno local y guían el crecimiento axonal hacia una célula diana de la neurona. Los conos de crecimiento responden a indicios 10 ambientales, por ejemplo, adhesividad superficial, factores de crecimiento, neurotransmisores y campos eléctricos. Los conos de crecimiento generalmente avanzan a una velocidad de uno a dos milímetros por día. El cono de crecimiento explora el área delante del mismo y a cada lado, mediante elongaciones clasificadas como lamelipodios y filopodios. Cuando una elongación contacta con una superficie desfavorable, se repliega. Cuando una elongación contacta con una superficie de crecimiento favorable, continúa extendiéndose y guía el cono de crecimiento en esa dirección. Cuando el 15 cono de crecimiento alcanza una célula diana apropiada se crea una conexión sináptica.

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La función de las células nerviosas está influida por el contacto entre neuronas y otras células en su entorno inmediato (Rutishauser, et al., 1988, Physiol. Rev. 68:819). Estas células incluyen células de la glía especializadas, oligodendrocitos en el sistema nervioso central (SNC), y células de Schwann en el sistema nervioso periférico (SNP), que envainan el axón neuronal con mielina (Lemke, 1992, en An Introduction to Molecular Neurobiology, Z. Hall, Ed., 20 pág. 281, Sinauer).

Las neuronas del SNC tienen el potencial inherente de regenerarse después de una lesión, pero están inhibidas para hacer eso por proteínas inhibidoras presentes en la mielina (Brittis et al., 2001, Neuron 30:11-14; Jones et al., 2002, J. Neurosci. 22:2792-2803; Grimpe et al., 2002, J. Neurosci.: 22:3144-3160).

Se han caracterizado varias proteínas inhibidoras de mielina en los oligodendrocitos. Los ejemplos conocidos de 25 proteínas inhibidoras mielina incluyen NogoA (Chen et al., Nature, 2000, 403, 434-439; Grandpre et al., Nature 2000, 403, 439-444), la glucoproteína asociada a mielina (MAG) (McKerracher et al., 1994, Neuron 13:805-811; Mukhopadhyay et al., 1994, Neuron 13:757-767) y la glucoproteína de oligodendrocitos (OM-gp), Mikol et al., 1988, J. Cell. Biol.106:1273-1279). Cada una de estas proteínas ha demostrado por separado que es un ligando para el NgR1 neuronal (Wang et al., Nature 2002, 417, 941-944; Grandpre et al., Nature 2000, 403, 439-444; Chen et al., Nature, 30 2000, 403, 434-439; Domeniconi et al., Neuron 2002, publicado online, 28 de junio de 2002).

El receptor-1 de Nogo (NgR1) es una proteína de membrana anclada a GPI que contiene 8 repeticiones ricas en leucina (Fournier et al., 2001, Nature 409:341-346). Tras la interacción con proteínas inhibidoras (por ejemplo, NogoA, MAG y OM-gp), el complejo NgR1 transduce señales que conducen a que el cono de crecimiento se contraiga y a la inhibición de la extensión de la neurita. 35

Existe una necesidad insatisfecha de moléculas y métodos para inhibir el colapso del cono de crecimiento mediada por NgR1 y la inhibición resultante de la extensión de la neurita.

Descripción resumida de la Invención

Se han hecho varios descubrimientos respecto al polipéptido denominado "Sp35" (nuestra denominación). Denominaciones alternativas para Sp35 incluyen "LINGO" y "LINGO-1". Estos descubrimientos incluyen los siguientes. 40 Sp35 se une a NgR1. Sp35 se une a sí misma en una interacción homotípica. Una proteína de fusión Sp35-Fc induce o promueve la fasciculación en neuronas granulares. Una proteína de fusión Sp35-Fc promueve la supervivencia neuronal tanto en el modelo de lesión de la hemisección del conducto rubro-espinal como en el modelo de transección del nervio óptico. Células primarias corticales infectadas con retrovirus Sp35, cuando se suministran a ratas con la médula espinal lesionada, provocan supervivencia neuronal potenciada, tinción aumentada en tubulina B III de los axones, y contenido 45 aumentado de mielina.

En base, en parte, a estos descubrimientos, la presente descripción caracteriza un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido en el que: (a) el polipéptido incluye (i) un dominio LRR de Sp35, (ii) una región básica de Sp35 C-terminal al dominio LRR, y (iii) un dominio de inmunoglobulina (Ig) de Sp35 C-terminal a la región básica; y (b) el polipéptido carece de un dominio transmembrana. El dominio LRR de Sp35 puede contener 50 un LRR carboxi-terminal (LRRCT), un LRR amino-terminal (LRRNT), o ambos. En algunos casos de la descripción, el polipéptido Sp35 codificado carece del dominio citoplasmático. En algunos casos, el polipéptido Sp35 codificado incluye los restos aminoacídicos 34-532 de la SEC ID Nº 2 y carece de los restos aminoacídicos 533-614.

La presente descripción también incluye un ácido nucleico que codifica un polipéptido donde el polipéptido incluye un dominio Ig de Sp35 y carece de un dominio LRR de Sp35, una región básica de Sp35, un dominio transmembrana, y un dominio citoplasmático.

La presente descripción también incluye un ácido nucleico que codifica un polipéptido donde el polipéptido incluye un dominio LRR de Sp35 y carece de un dominio Ig de Sp35, una región básica de Sp35, un dominio transmembrana, y un 5 dominio citoplasmático.

La presente descripción también incluye un ácido nucleico que codifica un polipéptido que carece de un dominio citoplasmático funcional pero que incluye todos los demás dominios de Sp35. Por ejemplo, el polipéptido codificado podría incluir los aminoácidos 1-576 de la SEC ID Nº 2 (antes del procesamiento de la secuencia señal).

En algunos casos de la descripción, el polipéptido codificado es un polipéptido de fusión que contiene un motivo no de 10 Sp35. El motivo de no Sp35 puede ser, por ejemplo, un motivo de Ig, un motivo de albúmina sérica, un motivo de dirección, un motivo informador, o un motivo que facilita la purificación. Un motivo no de Sp35 preferido es un motivo de Ig, por ejemplo, un motivo Fc.

La secuencia nucleotídica puede estar unida de forma funcional a una secuencia de control de la expresión, por ejemplo, en un vector de expresión. La presente descripción también incluye una célula hospedadora transformada con 15 un vector que expresa un polipéptido Sp35 de la descripción.

La presente descripción también incluye un polipéptido Sp35 codificado por cualquiera de los ácidos nucleicos descritos anteriormente.

La presente descripción también incluye un polipéptido Sp35 conjugado con un polímero, por ejemplo, un polialquilenglicol, un polímero de azúcar, y un polipéptido. Un polímero preferido es un polialquilenglicol, por ejemplo, 20 polietilenglicol (PEG). El polipéptido puede conjugarse a 1, 2, 3 ó 4 polímeros. Preferiblemente, el peso molecular total de los polímeros conjugados es de 20.000 Da a 40.000 Da por polipéptido Sp35.

La presente descripción también incluye un método para inhibir la transducción de señales por NgR1. El método incluye poner en contacto el NgR1 con una cantidad eficaz de un polipéptido Sp35. Los polipéptidos preferidos para su uso en el método incluyen los siguientes: 25

(a) un polipéptido Sp35, donde: (a) el polipéptido incluye (i) un dominio LRR de Sp35, (ii) una región básica de Sp35 C-terminal al dominio LRR, y (iii) un dominio de inmunoglobulina (Ig) de Sp35 C-terminal a la región básica; y (b) el polipéptido carece de un dominio transmembrana; y

(b) un polipéptido Sp35 que incluye un dominio Ig de Sp35 y carece de un dominio LRR de Sp35, una región básica de Sp35, un dominio transmembrana, y un dominio citoplasmático. 30

La presente descripción también incluye un método para disminuir la inhibición del crecimiento axonal de una neurona del sistema nervioso central (SNC). El método incluye poner en contacto la neurona con una cantidad eficaz de un polipéptido tal como un polipéptido Sp35, un anticuerpo anti-Sp35, o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Sp35.

La presente descripción también incluye un método para inhibir el colapso del cono de crecimiento de una neurona del 35 SNC. El método incluye poner en contacto la neurona con una cantidad eficaz de un polipéptido tal como un polipéptido Sp35, un anticuerpo anti-Sp35, o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Sp35.

La presente descripción también incluye un método para tratar una enfermedad, trastorno o lesión del SNC en un mamífero. El método incluye administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido tal como un polipéptido Sp35, un anticuerpo anti-Sp35, o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-Sp35. En 40 algunos casos de la descripción, la enfermedad, trastorno o lesión del SNC es una lesión de la médula espinal. El polipéptido Sp35 puede administrarse de forma local. En algunos casos del método, el polipéptido Sp35 se administra inicialmente dentro de las 48 horas desde una lesión de la médula espinal. Para administración local, la cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido preferiblemente es de 10 g/kg a 10 mg/kg. Para administración sistémica, la cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido preferiblemente es de 1 mg/kg a 20 mg/kg. 45

La presente descripción también incluye un método de terapia génica ex vivo para tratar una enfermedad, trastorno o lesión del SNC en un mamífero. El método incluye (a) proporcionar una célula hospedadora cultivada que expresa un polipéptido Sp35 recombinante; y (b) introducir la célula hospedadora en el mamífero en el sitio de la enfermedad, trastorno o lesión del SNC, por ejemplo, la lesión de la médula espinal. La célula hospedadora cultivada puede obtenerse del mamífero a tratar. En este método de terapia génica ex vivo, el polipéptido Sp35 recombinante puede ser 50 un polipéptido Sp35 de longitud completa.

La presente invención también incluye un método para promover la mielinización en el sitio de la enfermedad, trastorno o lesión del SNC. El método incluye poner en contacto el sitio de la enfermedad, trastorno o lesión del SNC con una

cantidad eficaz de un polipéptido Sp35, por ejemplo, un polipéptido que contiene un dominio LRR de Sp35 y que carece de un dominio Ig de Sp35, una región básica de Sp35, un dominio transmembrana, y un dominio citoplasmático.

La presente descripción también incluye un método de terapia génica in vivo para tratar una enfermedad, trastorno o lesión del SNC por terapia génica in vivo. El método incluye las etapas de administrar a un mamífero, en o cerca del sitio de la enfermedad, trastorno o lesión, un vector viral que contiene una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido 5 Sp35 de modo que el polipéptido Sp35 se exprese a partir de la secuencia nucleotídica en el mamífero en una cantidad suficiente para reducir la inhibición de la extensión axonal por neuronas en o cerca del sitio de la lesión. El vector viral puede ser, por ejemplo, un vector adenoviral, un vector lentiviral, un vector baculoviral, un vector viral de Epstein Barr, un vector papovaviral, un vector viral vaccinia, y un vector viral de herpes simplex. La enfermedad, trastorno o lesión puede ser, por ejemplo, una lesión de la médula espinal o una lesión del nervio óptico. El vector viral puede 10 administrarse por una vía tal como administración tópica, administración intraocular, administración parenteral, administración intratecal, administración subdural, y administración subcutánea.

La presente descripción también incluye un método para promover la supervivencia de una neurona en riesgo de morir. El método incluye poner en contacto la neurona con una cantidad eficaz de un polipéptido Sp35. El polipéptido Sp35 puede ser una forma soluble de Sp35, por ejemplo, una proteína de fusión Sp35-Fc. La neurona puede estar in vitro o in 15 vivo, por ejemplo, en un mamífero con una enfermedad, trastorno o lesión neurodegenerativa, por ejemplo, esclerosis múltiple, ALS, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, neuropatía diabética, apoplejía, lesiones traumáticas del cerebro y lesión de la médula espinal. En algunos casos de la descripción, el polipéptido Sp35 se administra indirectamente por: (a) proporcionando una célula hospedadora cultivada que expresa un polipéptido Sp35 recombinante; y (b) introduciendo la célula hospedadora en el mamífero en el sitio de la neurona. 20 En algunos casos de la descripción, el polipéptido se administra indirectamente a través de terapia génica in vivo. En dicho caso, el método incluye administrar, en o cerca del sitio de la neurona, un vector viral que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido Sp35 de modo que el polipéptido Sp35 se exprese a partir de la secuencia nucleotídica en el mamífero en una cantidad suficiente para promover la supervivencia de la neurona.

Como se usa en este documento, "polipéptido Sp35 humano de longitud completa" significa el polipéptido cuya 25 secuencia de aminoácidos es los aminoácidos 34-614 de la SEC ID Nº 2.

Como se usa en este documento, "resto heterólogo" significa una secuencia de aminoácidos no presente en un polipéptido Sp35 de longitud completa.

Como se usa en este documento, "receptor-1 de nogo" significa el polipéptido cuya secuencia está disponible al público en el nº de acceso a Genbank AAG53612. 30

Como se usa en este documento, "polipéptido antagonista de Sp35" significa un polipéptido Sp35 que bloquea, inhibe, o impide la actividad biológica de Sp35 de origen natural.

Como se usa en este documento, "región básica de Sp35" significa uno de los siguientes motivos de aminoácidos:

R R A R I R D R K (SEC ID Nº 4)

K K V K V K E K R (SEC ID Nº 5) 35

R R L R L R D R K (SEC ID Nº 6)

R R G R G R D R K (SEC ID Nº 7)

R R I R A R D R K (SEC ID Nº 8)

La fila superior de aminoácidos (en negrita; SEC ID Nº 4) es la secuencia preferida de la región básica de Sp35, con las variantes que muestran sustituciones opcionales mostradas a continuación (SEC ID Nº 5, 6, 7 y 8). 40

Como se usa en este documento, "proteína de fusión Sp35" significa una proteína de fusión que incluye un motivo Sp35 fusionado con un resto heterólogo.

Como se usa en este documento, "dominio Ig de Sp35" significa los aminoácidos 433-493 de la SEC ID Nº 2, con la condición de que la secuencia pueda contener hasta cinco inserciones, deleciones o sustituciones conservativas de aminoácidos, en los aminoácidos individuales. Las siguientes sustituciones (numeradas en base a la SEC ID Nº 2) se 45 incluyen expresamente: V a M en la posición 6; S a G en la posición 294; V a A en la posición 348; y R a H en la posición 419.

Como se usa en este documento, "dominio LRR de Sp35" significa un dominio que incluye de 10 a 14 de las secuencias de repetidas ricas en leucina, incluyendo LRRNT y LRRCT, enumeradas en la Tabla 1, con la condición de que puedan aparecer hasta cinco inserciones, deleciones, o sustituciones conservativas de aminoácidos, en los 50 aminoácidos dentro de las 10-14 repeticiones ricas en leucina agregadas.

Como se usa en este documento, "motivo Sp35" significa un fragmento biológicamente activo de un polipéptido Sp35 de longitud completa.

Como se usa en este documento, "polipéptido Sp35" significa un motivo Sp35 o una proteína de fusión que incluye un motivo Sp35.

En base a la descripción contenida en este documento, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que 5 codifica un polipéptido soluble, donde:

(A) dicho polipéptido soluble consiste en un polipéptido seleccionado del siguiente grupo, opcionalmente fusionado a un polipéptido heterólogo:

(a) un polipéptido que comprende los aminoácidos 34-532 de la SEC ID Nº 2;

(b) un polipéptido que comprende los aminoácidos 34-417 de la SEC ID Nº 2; 10

(c) un polipéptido que comprende los aminoácidos 3A-432 de la SEC ID Nº 2;

(d) un polipéptido que comprende los aminoácidos 417-531 de la SEC ID Nº 2;

(e) un polipéptido que comprende los aminoácidos 425-531 de la SEC ID Nº 2;

(f) un polipéptido que comprende los aminoácidos 1-531 de la SEC ID Nº 2;

(g) un polipéptido que comprende los aminoácidos 433-493 de la SEC ID Nº 2; 15

(h) un polipéptido que comprende un dominio LRR de la SEC ID Nº 2, una región básica de la SEC ID Nº 2 C-terminal al dominio LRR, y un dominio de inmunoglobulina (Ig) de la SEC ID Nº 2 C-terminal a la región básica;

(i) un polipéptido que comprende un dominio Ig de la SEC ID Nº 2, pero que carece de un dominio LRR de la SEC ID Nº 2, una región básica de la SEC ID Nº 2, y un dominio citoplasmático;

(j) un polipéptido que comprende un dominio LRR de la SEC ID Nº 2, pero que caree de un dominio Ig de la SEC ID Nº 20 2, una región básica de la SEC ID Nº 2, y un dominio citoplasmático; y

(k) un polipéptido como en (h), que carece de un dominio citoplasmático;

donde el polipéptido soluble codificado por el ácido nucleico es capaz de unirse a NgR1 de modo que alivie la inhibición mediada por NgR1 de la extensión axonal en una neurona del sistema nervioso central;

(B) dicho polipéptido soluble consiste en un polipéptido que incluye un motivo de aminoácidos seleccionado del 25 siguiente grupo, opcionalmente fusionado a un polipéptido heterólogo:

(i) LSPRKH (SEC ID Nº 10);

(ii) ITPKRR (SEC ID Nº 11);

(iii) ACPHHK (SEC ID Nº 12); y

(iv) VSPRKH (SEC ID Nº 13); 30

donde el polipéptido soluble codificado por el ácido nucleico es capaz de bloquear, inhibir o interferir en la función de NgR1; o

(C) dicho polipéptido soluble consiste en un polipéptido seleccionado del siguiente grupo, opcionalmente fusionado a un polipéptido heterólogo:

(i) SPRKH (SEC ID Nº 34); 35

(ii) LSPRKH (SEC ID Nº 10);

(iii) ITPKRR (SEC ID Nº 11);

(iv) ACPHHK (SEC ID Nº 12); y

(v) VSPRKH (SEC ID Nº 13);

donde el polipéptido soluble codificado por el ácido nucleico es capaz de bloquear, inhibir o interferir en la función de 40 NgR1.

La presente invención también proporciona un vector que comprende un ácido nucleico de la invención y una célula hospedadora que comprende dicho vector.

La presente invención también proporciona un polipéptido aislado codificado por un ácido nucleico de la invención, donde dicho polipéptido es capaz de disminuir la inhibición del crecimiento axonal de una neurona del sistema nervioso central. 5

La presente invención también proporciona un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de la SEC ID Nº 2, o un fragmento de unión a antígeno de dicho anticuerpo, donde dicho anticuerpo o fragmento es capaz de disminuir la inhibición del crecimiento axonal de una neurona del sistema nervioso central.

La presente invención también proporciona un método in vitro para inhibir la transducción de señales por NgR1, comprendiendo dicho método poner en contacto una célula que expresa NgR1 con una cantidad eficaz de un 10 polipéptido de la invención.

La presente invención también proporciona un método in vitro para disminuir la inhibición del crecimiento axonal de una neurona del sistema nervioso central, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha neurona con una cantidad eficaz de un polipéptido de la invención, o un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención.

La presente invención también proporciona un método in vitro para inhibir el colapso del cono de crecimiento de una 15 neurona del sistema nervioso central, comprendiendo dicho método poner en contacto la neurona con una cantidad eficaz de un polipéptido de la invención, o un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención.

La presente invención también proporciona un método in vitro para promover la supervivencia de una neurona en riesgo de morir, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha neurona con una cantidad eficaz de un polipéptido de la invención. 20

La presente invención también proporciona el uso de un polipéptido de la invención, o un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención en la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad, trastorno o lesión del sistema nervioso central en un mamífero.

La presente invención también proporciona el uso de un vector viral que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido de la invención en la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad, trastorno o 25 lesión del sistema nervioso central en un mamífero, donde dicho vector viral tiene que administrarse al mamífero en o cerca del sitio de la enfermedad, trastorno o lesión de modo que dicho polipéptido se exprese a partir de la secuencia nucleotídica en el mamífero en una cantidad suficiente para reducir la inhibición de la extensión axonal por neuronas en o cerca del sitio de la lesión.

La presente invención también proporciona el uso de un vector viral que comprende una secuencia nucleotídica que 30 codifica un polipéptido de la invención para la fabricación de un medicamento para promover la supervivencia de una neurona en riesgo de morir en un mamífero con una enfermedad, trastorno o lesión neurodegenerativa, donde dicho vector viral tiene que administrarse al mamífero en o cerca del sitio de la neurona.

La presente invención también proporciona una molécula de ARN interferente que se une específicamente a un ácido nucleico de la invención, donde dicha molécula de ARN interferente es un ARN de horquilla pequeño (shARN) 35 codificado por una molécula de ADN que comprende la SEC ID Nº 41 o la SEC ID Nº 42.

Se exponen aspectos y realizaciones adicionales de la presente invención en las reivindicaciones adjuntas.

Salvo que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por un especialista en la técnica a la que pertenece la invención. En caso de conflicto, predominará la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. 40

Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento en la práctica o ensayo de la invención, a continuación se describen los métodos y materiales preferidos. Los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos, y no se pretende que sean limitantes. Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción detallada y a partir de las reivindicaciones.

Breve Descripción de los Dibujos 45

La FIG. 1 es la secuencia nucleotídica de un ADNc de Sp35 humano de longitud completa (SEC ID Nº 1).

La FIG. 2 es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido Sp35 humano de longitud completa (SEC ID Nº 2).

La FIG. 3 es una ilustración esquemática de la estructura del dominio Sp35 y el mapeado de deleción para identificar la secuencia o secuencias de Sp35 que se unen a NgR1.

La FIG. 4 es un histograma que resume los datos sobre la unión de SP35 a células COS7 transfectadas con un vector de expresión que codifica p75 de rata o un control de vector. Después de 48 horas, se incubó AP-SP35 o AP con las células. Se detectó AP unido usando reactivo de detección de AP cromogénico.

La FIG. 5 es un histograma que resume los datos sobre la unión de AP-Omgp, y AP-Nogo-66 a células COS7 transfectadas con un vector de expresión que codifica NgR1; NgR1 y p75; NgR1, p75, y SP35, o un control de vector. 5 Después de 48 horas, se incubó AP-Omgp, AP-Nogo-66 o AP con las células. Se detectó AP unido usando reactivo de detección de AP cromogénico.

La FIG. 6 es un histograma que resume los datos sobre el alivio de la actividad inhibidora de los inhibidores de mielina sobre la extensión de la neurita in vitro. Se midió la longitud de la neurita de neuronas granulares cerebelares de rata 7 días después del nacimiento que expresan DN-Sp35, Sp35 de longitud completa, o controles cultivados sobre sustrato 10 Omgp, Mielina y Nogo-66 inmovilizado. Las células transfectadas con DN-SP35 mostraron una respuesta disminuida a los sustratos inhibidores. Se cuantificó la longitud de la neurita a partir de 1000 neuronas por grupo de tratamiento de dos experimentos independientes (p< 0,01).

La FIG. 7 es un histograma que resume los datos sobre la reversión de la actividad inhibidora de los inhibidores de mielina por SP35-Fc. Se midió la longitud de la neurita de neuronas granulares cerebelares de rata 7 días después del 15 nacimiento (1000 neuronas) cultivadas en sustrato OMgp, Mielina o Nogo-66 inmovilizado en presencia o ausencia de SP35-Fc. SP35-Fc redujo la inhibición de la extensión de la neurita causada por Omgp, Nogo-66 y MAG. Se cuantificó la longitud de la neurita a partir de 1000 neuronas por grupo de tratamiento de dos experimentos independientes (p< 0,01).

La FIG. 8 es un gráfico que resume los datos de un experimento que muestra que Sp35-Fc administrado por vía intratecal mejora la recuperación funcional después de hemisección dorsal en ratas. Se midió el valor BBB locomotor 20 como una función del tiempo después de la hemisección dorsal en ratas de control (IgG) o tratadas con Sp35-Fc (8 animales por grupo). El tratamiento se inició en el momento de la lesión de la médula espinal.

La FIG. 9 es un gráfico que muestra valores BBB de animales individual animales en la semana cuatro en el experimento resumido en la FIG. 8.

Descripción Detallada de la Invención 25

El Sp35 humano de origen natural es una proteína específica del SNC glucosilada que contiene 614 aminoácidos (FIG. 2; SEC ID Nº 2). El polipéptido SP35 de tipo silvestre de longitud completa, humano contiene un dominio LRR que consiste en 14 repeticiones ricas en leucina (incluyendo los límites N- y C-terminales), un dominio Ig, una región transmembrana, y un dominio citoplasmático (FIG. 3). El dominio citoplasmático contiene un sitio de fosforilación de tirosina canónico. Además, la proteína Sp35 de origen natural contiene una secuencia señal, una región básica corta 30 entre el LRRCT y el dominio Ig, y una región transmembrana entre el dominio Ig y el dominio citoplasmático (FIG. 3). El gen Sp35 humano contiene codones de unión de la traducción alternativos, de modo que seis aminoácidos adicionales, es decir, MQVSKR (SEC ID Nº 9) pueden estar o no presentes en el extremo N-terminal de la secuencia señal de Sp35. La Tabla 1 enumera los dominios de Sp35 y otras regiones, de acuerdo con el número del resto aminoacídico, en base a la secuencia de la FIG. 2 (SEC ID Nº 2). 35

Tabla 1

Dominio o Región

Resto Inicial Resto Final

Secuencia Señal

1 33

LRRNT

34 64

LRR

66 89

LRR

90 113

LRR

114 137

LRR

138 161

LRR

162 185

LRR

186 209

LRR

210 233

LRR

234 257

LRR

258 281

LRR

282 305

LRR

306 329

LRR

330 353

LRRCT

363 416

Básica

417 424

Ig

433 493

Secuencia de conexión

494 551

Transmembrana

552 576

Citoplásmica

577 614

Se ha estudiado la distribución tisular y la expresión en el desarrollo de Sp35 en seres humanos y ratas. Se ha estudiado la biología de Sp35 en un modelo de animal experimental (rata). La expresión de SP35 de rata está localizada en neuronas del SNC y oligodendrocitos cerebrales, como se determina por transferencia de northern y tinción inmuno-histoquímica. El nivel de expresión de ARNm de Sp35 de rata está regulado en el desarrollo, teniendo su pico poco 5 después del nacimiento, es decir, aproximadamente un día después del nacimiento. En un modelo de rata de lesión por transección de la médula espinal, Sp35 está regulado positivamente en el sitio de la lesión, como se determina por RT-PCR.

Se ha descubierto que Sp35 de tipo silvestre, de longitud completa se une a NgR1. Derivados solubles de Sp35 funcionan como polipéptidos antagonistas de Sp35 uniéndose a NgR1 y bloqueando, inhibiendo, o impidiendo su 10 función, aliviando de este modo la inhibición mediada por NgR1-de la extensión axonal que normalmente tiene lugar en neuronas del SNC. Esto es beneficioso en situaciones en las que se necesita extensión axonal o brote de neuritas en el cerebro o la médula espinal. La lesión de médula espinal, incluyendo el aplastamiento o separación parcial o completa, ejemplifica una situación en la que se necesita extensión axonal, pero normalmente está inhibida a través del funcionamiento de la vía Nogo. Los ejemplos de enfermedades o trastornos en los que la extensión axonal y/o el brote 15 de neuritas en el cerebro sería beneficioso incluyen apoplejía, esclerosis múltiple, y otras enfermedades o trastornos neurodegenerativos.

En métodos de la presente descripción, puede administrarse un polipéptido Sp35 o un anticuerpo de bloqueo de Sp35 (o fragmento del anticuerpo de unión a antígeno) directamente en forma de un polipéptido preformado, o indirectamente a través de un vector de ácido nucleico, para antagonizar la función NgR1 y permitir la extensión axonal beneficiosa. 20

En algunos casos de la descripción se administra un polipéptido soluble antagonista de Sp35 en un método de tratamiento que incluye: (1) transformar o transfectar una célula hospedadora implantable con un ácido nucleico, por ejemplo, un vector, que expresa un polipéptido Sp35; y (2) implantar la célula hospedadora transformada en un mamífero, en el sitio de una enfermedad, trastorno o lesión. Por ejemplo, la célula hospedadora transformada puede implantarse en el sitio de una lesión de la médula espinal. En algunos casos de la descripción, la célula hospedadora 25 implantable se retira de un mamífero, se cultiva temporalmente, se transforma o transfecta con un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido soluble Sp35, y se implanta de nuevo en el mismo mamífero del que se retiró. La célula puede retirarse, pero no es necesario, del mismo sito en el que tiene que implantarse. Dichos casos, a veces conocidos como terapia génica ex vivo, pueden proporcionar un suministro continuo del polipéptido Sp35, localizado en el sitio del sitio de acción, durante un periodo de tiempo limitado. 30

La presente descripción, incluyendo la invención, proporciona oligonucleótidos útiles como moduladores de la interacción de Sp35 con NgR1 y de las interacciones homotípicas de Sp35. Estos oligonucleótidos pueden incluir un motivo de aminoácidos seleccionado entre el grupo que consiste en:

L S P R K H (SEC ID Nº 10)

I T P K R R (SEC ID Nº 11) 35

A C P H H K (SEC ID Nº 12)

V S P R K H (SEC ID Nº 13)

La fila superior de aminoácidos (en negrita; SEC ID Nº 10) es la secuencia preferida, con las variantes que comprenden sustituciones mostradas a continuación (SEC ID Nº 11, 12 y 13).

A continuación se describen diversos polipéptidos Sp35, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo anti-Sp35 ejemplares, y métodos y materiales para obtener estas moléculas para poner en práctica la presente descripción, incluyendo la invención. 5

Proteínas de Fusión y Polipéptidos Conjugados

Algunos casos de la presente descripción, incluyendo algunas realizaciones de la invención, implican el uso de un polipéptido Sp35, por ejemplo, un polipéptido antagonista de Sp35, donde un motivo Sp35 está fusionado a un resto de polipéptido heterólogo para formar una proteína de fusión Sp35. La proteína de fusión Sp35s puede usarse para conseguir diversos objetivos, por ejemplo, vida media aumentada en suero, biodisponibiliad mejorada, reconocimiento in 10 vivo a un tipo de órgano o tejido específico, eficacia de expresión recombinante mejorada, secreción mejorada de las células hospedadoras, facilidad de purificación, y actividad más elevada. Dependiendo del objetivo u objetivos a conseguir, el resto heterólogo puede ser inerte o biológicamente activo. Además, puede elegirse para fusionar de forma estable al motivo Sp35 o para que se pueda escindir, in vitro o in vivo. Los restos heterólogos para conseguir diferentes objetivos son conocidos en la técnica. 15

Como alternativa a la expresión de una proteína de fusión Sp35, puede preformarse un resto heterólogo elegido y conjugarse químicamente con el motivo Sp35. En la mayoría de los casos, un resto heterólogo elegido funcionará de forma similar, esté fusionado o conjugado con el motivo Sp35. Por lo tanto, en el siguiente análisis de secuencias de aminoácidos heterólogas, salvo que se indique otra cosa, se entiende que la secuencia heteróloga puede unirse al motivo Sp35 en forma de una proteína de fusión o en forma de un conjugado químico. 20

Los polipéptidos farmacológicamente activos tales como Sp35 a menudo muestra una rápida eliminación in vivo, necesitando grandes dosis para conseguir concentraciones terapéuticamente eficaces en el cuerpo. Además, los polipéptidos más pequeños de aproximadamente 60 kDa experimentan potencialmente filtración glomerular, que a veces conduce a nefrotoxicidad. La fusión o conjugación de polipéptidos relativamente pequeños tales como fragmentos de Sp35 puede emplearse para reducir o evitar el riesgo de dicha nefrotoxicidad. Se conocen diversas secuencias de 25 aminoácidos heterólogas, es decir, restos o "vehículos" polipeptídicos, para aumentar la estabilidad in vivo, es decir, la vida media en suero, de los polipéptidos terapéuticos.

Debido a su larga vida media, su amplitud en la distribución in vivo, y la ausencia de función enzimática o inmunológica, la albúmina sérica humana (HSA) esencialmente de longitud completa, o un fragmento de HSA, es un resto heterólogo preferido. A través de la aplicación de métodos y materiales tales como mostrados en Yeh et al., 1992, Proc. Natl. Acad. 30 Sci. USA, 89:1904-1908 y Syed et al., 1997, Blood 89:3243-3252, puede usarse HSA para formar una proteína de fusión Sp35 para un conjugado que presenta actividad farmacológica en virtud del motivo Sp35 presentando al mismo tiempo estabilidad significativamente aumentada, por ejemplo, 10 veces o 100 veces mayor, in vivo. Preferiblemente, el extremo C-terminal de la HSA se fusiona al extremo N-terminal del motivo Sp35. Como HSA es una proteína secretada de forma natural, puede explotarse la secuencia señal USA para obtener la secreción de la proteína de fusión Sp35 en 35 el medio de cultivo celular, cuando se produce la proteína de fusión en un sistema de expresión eucariota, por ejemplo, de mamífero.

Algunos casos de esta descripción, por ejemplo, algunas realizaciones de la invención, emplean un polipéptido Sp35 donde un motivo Sp35 está fusionado a una región Fc, es decir, la parte C-terminal de una región constante de cadena pesada de Ig. Las ventajas potenciales de una fusión Sp35-Fc incluyen solubilidad, estabilidad in vivo, y multivalencia, 40 por ejemplo, dimerización. La región Fc usada puede ser una región Fc (bisagra-CH2-CH3) de IgA, IgD, o IgG. Como alternativa, puede ser una región Fc (bisagra-CH2-CH3-CH4) de IgE o IgM. Se prefiere una región Fc de IgG, por ejemplo, una región Fc de IgG1 o una región Fc de IgG4. Los materiales y métodos para construir y expresar ADN que codifica fusiones Fc son conocidos en la técnica y pueden aplicarse para obtener fusiones Sp35 sin experimentación excesiva. Algunos casos de esta descripción, por ejemplo algunas realizaciones de la invención, emplean una proteína 45 de fusión del tipo descrito en Capon et al. Patentes de Estados Unidos Nº 5.428.130 y 5.565.335.

La secuencia señal es un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que inicia el transporte de una proteína a través de la membrana del retículo endoplasmático. Las secuencias señal útiles para construir una inmunofusina incluyen secuencias señal de cadena ligera de anticuerpo, por ejemplo, el anticuerpo 14.18 (Gillies et. al., 1989, J. Immunol. Meth., 125:191-202), las secuencias señal de cadena pesada de anticuerpo, por ejemplo, la 50 secuencia señal de cadena pesada del anticuerpo MOPC141 (Sakano et al., 1980, Nature 286:5774). Como alternativa, pueden usarse otras secuencias señal. Véase, por ejemplo, Watson, 1984, Nucleic Acids Research 12:5145). El péptido señal habitualmente se escinde en la luz del retículo endoplasmático por peptidasas señal. Esto provoca la secreción de una proteína inmunofusina que contiene la región Fc y el motivo Sp35.

En algunos casos, por ejemplo, en algunas realizaciones, la secuencia de ADN codifica un sitio de escisión proteolítica 55 entre el casete de secreción y el motivo Sp35. Un sitio de escisión proporciona la escisión proteolítica de la proteína de fusión codificada, separando de este modo el dominio Fc de la proteína diana. Los sitios de escisión proteolítica útiles

incluyen secuencias de aminoácidos reconocidas por enzimas proteolíticas tales como tripsina, plasmina, trombina, factor Xa, o enteroquinasa K.

El casete de secreción puede incorporarse en un vector de expresión replicable. Los vectores útiles incluyen ácido nucleicos lineales, plásmidos, fagómidos, cósmidos y similares. Un vector de expresión ejemplar es pdC, en el que la transcripción del ADN de la inmunofusina está situada bajo el control del potenciador y el promotor del citomegalovirus 5 humano. Véase, por ejemplo, Lo et al., 1991, Biochim. Biophys. Acta 1088:712; y Lo et al., 1998, Protein Engineering 11:495-500. Una célula hospedadora apropiada puede transformarse o transfectarse con un ADN que codifica un polipéptido Sp35, y se usa para la expresión y secreción del polipéptido Sp35. Las células hospedadoras preferidas incluyen células de hibridoma inmortales, células de mieloma, células 293, células de ovario de hámster chino (CHO), células Hela, y células COS. 10

Las regiones Fc de tipo silvestre completamente intactas presentan funciones efectoras que normalmente son innecesarias y no deseadas en una proteína de fusión Fc de acuerdo con la presente descripción, incluyendo la invención. Por lo tanto, se delecionan preferiblemente ciertos sitios de unión de la región Fc durante la construcción del casete de secreción. Por ejemplo, como es innecesaria la co-expresión con la cadena ligera, se deleciona el sitio de unión para la proteína de unión de cadena pesada, Bip (Hendershot et al., 1987, Immunol. Today 8:111-114), del 15 dominio CH2 de la región Fc de IgE, de modo que este sitio no impida la secreción eficaz de la inmunofusina. Asimismo, los restos de cisteína presentes en las regiones Fc que son responsables de la unión a la cadena ligera de la inmunoglobulina deben delecionarse o sustituirse por otro aminoácido, de modo que estos restos de cisteína no impidan el plegamiento apropiado de la región Fc cuando se produce en forma de una inmunofusina. Las secuencias del dominio transmembrana, tales como los presentes en IgM, deben delecionarse. 20

Se prefiere la región Fc de IgG1. Como alternativa, puede usarse la región Fc de las otras subclases de inmunoglobulina gamma (gamma-2, gamma-3 y gamma-4) en el casete de secreción. La región Fc de IgG1 de inmunoglobulina gamma-1 preferiblemente usada en el casete de secreción incluye la región bisagra (al menos parte), la región CH2, y la región CH3. En algunos casos, por ejemplo, en algunas realizaciones, la región Fc de inmunoglobulina gamma-1 es una Fc con CH2 delecionada, que incluye parte de la región bisagra y la región CH3, pero 25 no la región CH2. Se ha descrito una Fc con CH2 delecionada por Gillies et al., 1990, Hum. Antibod. Hybridomas, 1:47. En algunos casos, por ejemplo, en algunas realizaciones, se usan las regiones Fc de IgA, IgD, IgE, o IgM.

Las proteínas de fusión Sp35-Fc pueden construirse en varias configuraciones diferentes. En una configuración, se fusiona el extremo C-terminal del motivo Sp35 directamente al extremo N-terminal del resto Fc. En una configuración ligeramente diferente, se incorpora un corto polipéptido, por ejemplo, de 2-10 aminoácidos, en la fusión entre el extremo 30 N-terminal del motivo Sp35 y el extremo C-terminal del resto Fc. Dicho enlazador proporciona flexibilidad conformacional, que puede mejorar la actividad biológica en algunas circunstancias. Si se retiene una parte suficiente de la región bisagra en el resto Fc, la fusión Sp35-Fc dimerizará, formando de este modo una molécula divalente. Una población homogénea de fusiones Fc monoméricas producirá dímeros bivalentes, mono-específicos. Una mezcla de dos fusiones Fc monoméricas teniendo, cada una, una especificidad diferente, producirá dímeros bivalentes, biespecíficos. 35

Puede usarse cualquiera de varios enlazadores de entrecruzamiento que contienen un grupo reactivo amino correspondiente y el grupo reactivo tiol para unir Sp35 a albúmina sérica. Los ejemplos de enlazadores adecuados incluyen enlazadores de entrecruzamiento amina reactivos que insertan una maleimida tiol reactiva, por ejemplo, SMCC, AMAS, BNIPS, MBS, EMUS, SMPB, SMPH, KMUS, y GMBS. Otros enlazadores adecuados insertan un grupo haloacetato tiol reactivo, por ejemplo, SBAP, SIA, SIAB. Los enlazadores que proporcionan un tiol protegido o no 40 protegido para la reacción con grupos sulfhidrilo para producir un enlace reducible incluyen SPDP, SMPT, SATA, y SATP. Dichos reactivos están disponibles en el mercado (por ejemplo, Pierce Chemicals).

La conjugación no tiene que implicar el extremo N-terminal de un polipéptido Sp35 o el resto tiol en la albúmina sérica. Por ejemplo, pueden obtenerse fusiones Sp35-albúmina usando técnicas de ingeniería genética, donde el motivo Sp35 se fusiona al gen de la albúmina sérica en su extremo N-terminal, C-terminal, o ambos. 45

Los polipéptidos Sp35 pueden fusionarse a péptidos heterólogos para facilitar la purificación o identificación del motivo Sp35. Por ejemplo, puede fusionarse una marca histidina a un polipéptido Sp35 para facilitar la purificación usando un medio de cromatografía disponible en el mercado.

En algunos casos de la descripción, por ejemplo, en algunas realizaciones de la invención, se usa una construcción de fusión Sp35 para potenciar la producción de un motivo Sp35 en bacterias. En dichas construcciones, se emplea una 50 proteína bacteriana normalmente expresada y/o secretada a un elevado nivel como compañero de fusión N-terminal de un polipéptido Sp35. Véase, por ejemplo, Smith et al., 1988 Gene 67:31; Hopp et al., 1988, Biotechnology 6:1204; La Vallie et al., 1993, Biotechnology 11:187.

En algunos casos de la descripción, por ejemplo, en algunas realizaciones de la invención, una construcción de fusión incluye un motivo Sp35 y un segundo resto de unión a NgR1 humano, por ejemplo, un resto de la glucoproteína 55 oligodendrocitomielina (OMgp), un resto de la glucoproteína asociada a mielina (MAG), o un resto Nogo66. Las ventajas de dichas construcciones incluyen afinidad de unión a NgR1 aumentada.

La secuencia de aminoácidos de OMgp de longitud completa es conocida en la técnica (nº de acceso a Genbank P23515). Ejemplos específicos de fusiones Sp35-OMgp incluyen las siguientes:

Sp35 (aa 34-532) + IgG1 Fc + OMgp (restos aminoacídicos 25-400); y

Sp35 (aa 34-532) + HSA + OMgp (restos aminoacídicos 25-400).

La secuencia de aminoácidos de MAG de longitud completa es conocida en la técnica (nº de acceso a Genbank 5 A61084). Ejemplos específicos de fusiones Sp35-MAG incluyen las siguientes:

Sp35 (aa 34-532) + IgG1 Fc + MAG (restos aminoacídicos 12-500); y

Sp35 (aa 34-532) + USA + MAG (restos aminoacídicos 12-500).

La secuencia de aminoácidos de Nogo de longitud completa es conocida en la técnica (nº de acceso a Genbank de NogoA AY102279). Ejemplos específicos de fusiones Sp35-Nogo incluyen las siguientes: 10

Sp35 (aa 34-532) + IgG1 Fc + Nogo66 (NogoA restos aminoacídicos 1056-1122);

Sp35 (aa 34-532) + HSA + Nogo66 (NogoA restos aminoacídicos 1056-1122);

Sp35 (aa 34-532) + IgG1 Fc + amino Nogo (NogoA restos aminoacídicos 1-949); y

Sp35 (aa 34-532) + HSA + amino Nogo (NogoA restos aminoacídicos 1-949).

Fusionando un motivo Sp35 en los extremos amino y carboxi de un compañero de fusión adecuado, pueden obtenerse 15 formas bivalentes o tetravalentes de un polipéptido Sp35. Por ejemplo, un motivo Sp35 puede fusionarse a los extremos amino y carboxi de un resto Ig para producir un polipéptido monomérico bivalente que contiene dos motivos Sp35. Después de la dimerización de dos de estos monómeros, en virtud del motivo Ig, se obtiene una forma tetravalente de una proteína Sp35. Dichas formas multivalentes pueden usarse para conseguir afinidad de unión aumentada por la diana. Las formas multivalentes de Sp35 también pueden obtenerse colocando motivos Sp35 en tándem para formar 20 concatémeros, que pueden emplearse be solos o fusionados a un compañero de fusión tal como Ig o HSA.

Polímeros Conjugados (diferentes de polipéptidos)

Algunos casos de la descripción, por ejemplo, algunas realizaciones de la invención, implican un polipéptido Sp35 donde se conjuga uno o más polímeros (unidos covalentemente) con el polipéptido Sp35. Los ejemplos de polímeros adecuados para dicha conjugación incluyen polipéptidos (analizados anteriormente), polímeros de azúcar y cadenas de 25 polialquilenglicol. Típicamente, pero no necesariamente, un polímero se conjuga con el polipéptido Sp35 para el propósito de mejorar una o más de las siguientes: solubilidad, estabilidad, o biodisponibilidad.

Una clase preferida de polímero para la conjugación con un polipéptido Sp35 es un polialquilenglicol. El polietilenglicol (PEG) es particularmente preferido. Los restos de PEG, por ejemplo, 1, 2, 3, 4 ó 5 polímeros de PEG, pueden conjugarse con cada polipéptido Sp35 para aumentar la vida media en suero, en comparación con el polipéptido Sp35 30 solo. Los restos de PEG son no antigénicos y esencialmente inertes biológicamente. Los restos de PEG usados en la práctica de la descripción, incluyendo la invención, pueden estar ramificados o no ramificados.

La cantidad de restos de PEG unidos al polipéptido Sp35 y el peso molecular de las cadenas de PEG individuales pueden variar. En general, cuando mayor es el peso molecular del polímero, menor es la cantidad de cadenas de polímero unidas al polipéptido. Preferiblemente, la masa total de polímero unido al polipéptido Sp35 es de 20 kDa a 40 35 kDa. Por tanto, si se une una cadena de polímero, el peso molecular preferido de la cadena es de 20-40 kDa. Si se unen dos cadenas, el peso molecular preferido de cada cadena es de 10-20 kDa. Si se unen tres cadenas, el peso molecular preferido es de 7-14 kDa.

El polímero, por ejemplo, PEG, puede unirse al polipéptido Sp35 a través de cualquier grupo reactivo expuesto adecuado en el polipéptido. El grupo o grupos reactivos expuestos pueden ser, por ejemplo, un grupo amino N-terminal 40 o el grupo épsilon amino de un resto de lisina interno, o ambos. Un polímero activado puede reaccionar y unirse covalentemente en cualquier grupo amino libre en el polipéptido Sp35. También pueden usarse grupos carboxílicos libres, grupos carbonilo adecuadamente activados, restos hidroxilo, guanidilo, imidazol, carbohidrato oxidado y grupos mercapto del Sp35 (si están disponibles) como grupos reactivos para la unión del polímero.

Preferiblemente, en una reacción de conjugación, se emplean de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 10 moles 45 de polímero activado por mol de polipéptido, dependiendo de la concentración de polipéptido. Habitualmente, la proporción elegida representa un equilibrio entre la maximización de la reacción minimizando al mismo tiempo las reacciones secundarias (a menudo no específicas) que pueden alterar la actividad farmacológica deseada del motivo Sp35. Preferiblemente, se retiene al menos el 50% de la actividad biológica (como se demuestra, por ejemplo, en cualquiera de los ensayos descritos en este documento o conocidos en la técnica) del polipéptido Sp35, y mucho más 50 preferiblemente se retiene casi el 100%.

El polímero puede conjugarse con el polipéptido Sp35 usando química convencional. Por ejemplo, un resto de polialquilenglicol puede acoplarse a un grupo épsilon amino de lisina del polipéptido Sp35. La unión a la cadena lateral de lisina puede realizarse con un éster activo de N-hidroxilsuccinimida (NHS) tal como succinato de PEG succinimidilo (SS-PEG) y propionato de succinimidilo (SPA-PEG). Los restos de polialquilenglicol adecuados incluyen, por ejemplo, carboximetil-NHS, norleucina-NHS, SC-PEG, tresilato, aldehído, epóxido, carbonilimidazol, y carbonato de PNP. Estos 5 reactivos están disponibles en el mercado. Enlazadores de PEG amina reactivos adicionales pueden sustituir al resto succinimidilo. Éstos incluyen, por ejemplo, isotiocianatos, nitrofenilcarbonatos, epóxidos, y benzotriazol carbonatos. Las condiciones se eligen preferiblemente para maximizar la selectividad y el grado o reacción. Dicha optimización de las condiciones de reacción pertenece a la experiencia habitual de la técnica.

La PEGilación puede realizarse por cualquiera de las reacciones de PEGilación conocidas en la técnica. Véase, por 10 ejemplo, Focus on Growth Factors, 3: 4-10, 1992; solicitudes de patente europea publicadas EP 0 154 316 y EP 0 401 384. La PEGilación puede realizarse usando una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de polietilenglicol reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo).

La PEGilación por acilación generalmente implica hacer reaccionar un derivado éster activo de polietilenglicol. Puede emplearse cualquier molécula de PEG reactiva en la PEGilación. Un éster de PEG activado preferido es PEG 15 esterificado con N-hidroxisuccinimida (NHS). Como se usa en este documento, "acilación" incluye, sin limitación, los siguientes tipos de enlaces entre la proteína terapéutica y un polímero soluble en agua tal como PEG: amida, carbamato, uretano, y similares. Véase, Bioconjugate Chem. 5: 133-140, 1994. Los parámetros de reacción deben elegirse para evitar condiciones de temperatura, disolvente, y pH que dañarían o inactivarían el polipéptido Sp35.

Preferiblemente, el enlace de conexión es una amida. Preferiblemente, al menos el 95% del producto resultante está 20 mono-, di- o tri-PEGilado. Sin embargo, pueden formarse algunas especies con grados mayores de PEGilación en cantidades que dependen de las condiciones de reacción específicas usadas. Opcionalmente, las especies PEGiladas purificadas se separan de la mezcla, particularmente especies sin reaccionar, por métodos de purificación convencionales, incluyendo, por ejemplo, diálisis, desalado, ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por filtración en gel, y electroforesis. 25

La PEGilación por alquilación generalmente implica hacer reaccionar un derivado aldehído terminal de PEG con Sp35 en presencia de un agente reductor. Además, se pueden manipular las condiciones de reacción para favorecer la PEGilación sustancialmente sólo en el grupo amino N-terminal de Sp35 (es decir, una proteína mono-PEGilada). En cualquier caso de mono-PEGilación o poli-PEGilación, los grupos de PEG preferiblemente se unen a la proteína mediante un grupo -CH2-NH-. Con referencia particular al grupo -CH2- este tipo de enlace es conocido como enlace 30 "alquilo".

La derivatización mediante alquilación reductora para producir un producto mono-PEGilado explota la reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino primarios (de lisina frente al N-terminal) disponibles para la derivatización. La reacción se realiza a un pH que permite sacar provecho de las diferencias de pKa entre los grupos épsilon-amino de los restos de lisina y el del grupo amino N-terminal de la proteína. Mediante dicha derivatización 35 selectiva, se controla la unión de un polímero soluble en agua que contiene un grupo reactivo tal como un aldehído, a una proteína: la conjugación con el polímero tiene lugar predominantemente en el extremo N-terminal de la proteína y no sucede modificación significativa de otro grupos reactivos, tales como los grupos amino de la cadena lateral de lisina.

Las moléculas de polímero usadas en los enfoques tanto de acilación como de alquilación se seleccionan entre polímeros solubles en agua. El polímero seleccionado debe modificarse para que tenga un único grupo reactivo, tal 40 como un éster activo para la acilación o un aldehído para la alquilación, preferiblemente, de modo que pueda controlarse el grado de polimerización que se tiene prevista en los presentes métodos. Un aldehído de PEG reactivo ejemplar es propionaldehído de polietilenglicol, que es estable en agua, o derivados mono alcoxi C1-C10 o ariloxi del mismo (véase, la patente de Estados Unidos 5.252.714). El polímero puede estar ramificado o no ramificado. Para las reacciones de acilación, el polímero o polímeros seleccionados deben tener un único grupo éster reactivo. Para la 45 alquilación reductora, el polímero o polímeros seleccionados deben tener un único grupo aldehído reactivo. Generalmente, el polímero soluble en agua no se seleccionará entre restos de glucosilo de origen natural ya que estos se fabrican más convenientemente por sistemas de expresión recombinante de mamífero.

Los métodos para preparar un Sp35 PEGilado generalmente incluyen las etapas de (a) hacer reaccionar una proteína o polipéptido Sp35 con polietilenglicol (tal como un derivado éster o aldehído reactivo de PEG) en condiciones por las 50 cuales la molécula llega a unirse a uno o más grupos de PEG, y (b) obtener el producto o productos de reacción. En general, las condiciones de reacción óptimas para las reacciones de acilación se determinarán caso por caso en base a parámetros conocidos y el resultado deseado. Por ejemplo, cuando mayor es la proporción de PEG:proteína, mayor será el porcentaje de producto poli-PEGilado.

La alquilación reductora para producir una población sustancialmente homogénea de mono-polímero Sp35 55 generalmente incluye las etapas de: (a) hacer reaccionar una proteína o polipéptido Sp35 con una molécula de PEG reactiva en condiciones de alquilación reductora, a un pH adecuado para permitir la modificación selectiva del grupo amino N-terminal de Sp35; y (b) obtener el producto o productor de reacción.

Para una población sustancialmente homogénea de mono-polímero Sp35, las condiciones de reacción de alquilación reductora son aquellas que permiten la unión selectiva del resto de polímero soluble en agua al extremo N-terminal de Sp35. Dichas condiciones de reacción generalmente prevén las diferencias de pKa entre los grupos amino de la cadena lateral de lisina y el grupo amino N-terminal. Para los propósitos de la presente descripción, incluyendo la invención, el pH preferido está en el intervalo de 3-9, preferiblemente 3-6. 5

Los polipéptidos Sp35 pueden incluir una marca, por ejemplo, un resto que puede liberarse posteriormente por proteolisis. Por tanto, el resto de lisina puede modificarse selectivamente haciendo reaccionar primer una marca His modificada con un enlazador de bajo peso molecular tal como reactivo de Traut (Pierce) que reaccionará tanto con la lisina como con el extremo N-terminal, y después liberando esta marca. El polipéptido entonces contendrá un grupo SH libre que puede modificarse selectivamente con un PEG que contiene un grupo principal tiol reactivo tal como un grupo 10 maleimida, un grupo vinilsulfona, un grupo haloacetato, o un SH libre o protegido.

El reactivo de Traut puede remplazarse por cualquier enlazador que establezca un sitio específico para la unión de PEG. Por ejemplo, el reactivo de Traut puede remplazarse por SPDP, SMPT, SATA, o SATP (Pierce). Asimismo, se podría hacer reaccionar la proteína con una un enlazador amina reactivo que inserta una maleimida (por ejemplo SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS, o GMBS), un grupo haloacetato (SBAP, SIA, SIAB), o un 15 grupo vinilsulfona y hacer reaccionar el producto resultante con un PEG que contenga un SH libre.

En algunos casos, por ejemplo, en algunas realizaciones, el resto de polialquilenglicol se acopla a un grupo de cisteína del polipéptido Sp35. El acoplamiento puede realizarse usando, por ejemplo, un grupo maleimida, un grupo vinilsulfona, un grupo haloacetato, o un grupo tiol.

Opcionalmente, el polipéptido Sp35 se conjuga con el resto de polietilenglicol a través de un enlace inestable. El enlace 20 inestable puede escindirse en, por ejemplo, hidrólisis química, proteolisis, o escisión de sulfhidrilo. Por ejemplo, el enlace puede escindirse en condiciones in vivo (fisiológicas).

Las reacciones pueden tener lugar por cualquier método adecuado usado para hacer reaccionar materiales biológicamente activos con polímeros inertes, preferiblemente a aproximadamente pH 5-8, por ejemplo, pH 5, 6, 7, ó 8, si los grupos reactivos están en el grupo alfa amino en el extremo N-terminal. Generalmente el proceso implica preparar 25 un polímero activado y después de ello hacer reaccionar la proteína con el polímero activado para producir la proteína soluble adecuada para formulación.

Vectores

La presente descripción, incluyendo la invención, proporciona vectores que comprenden ácidos nucleicos que codifican polipéptidos Sp35. La elección del vector y las secuencias de control de la expresión a las que se unen de forma 30 funcional los ácidos nucleicos de esta descripción, por ejemplo, los ácidos nucleicos de esta invención, depende de las propiedades funcionales deseadas, por ejemplo, la expresión proteica, y la célula hospedadora a transformar.

Los elementos de control de la expresión para regular la expresión de una secuencia codificante unida de forma funcional son conocidos en la técnica. Los ejemplos incluyen, aunque sin limitación, promotores inducibles, promotores constitutivos, señales de secreción, y otros elementos reguladores. Cuando se usa un promotor inducible, puede 35 controlarse, por ejemplo, por un cambio en el estado de nutrientes, o un cambio en la temperatura, en el medio de la célula hospedadora.

El vector puede incluir un replicón procariótico, es decir, una secuencia de ADN que tiene la capacidad de dirigir la replicación autónoma y el mantenimiento de la molécula de ADN recombinante de forma extra-cromosómica en una célula hospedadora bacteriana. Dichos replicones son bien conocidos en la técnica. Además, los vectores que incluyen 40 un replicón eucariótico también pueden incluir un gen cuya expresión confiere un marcador detectable tal como resistencia a un fármaco. Ejemplos de genes bacterianos de resistencia a fármacos son aquellos que confieren resistencia a ampicilina o tetraciclina.

Los vectores que incluyen un replicón eucariótico también pueden incluir un promotor procariótico o bacteriófago para dirigir la expresión de las secuencias génicas codificantes en una célula hospedadora bacteriana. Las secuencias 45 promotoras compatibles con hospedadores bacterianos típicamente se proporcionan en vectores plasmídicos que contienen sitios de restricción convenientes para la inserción de un segmento de ADN a expresar. Ejemplos de dichos vectores plasmídicos son pUC8, pUC9, pBR322 y pBR329 (BioRad), pPL y pKK223 (Pharmacia). Puede usarse cualquier hospedador procariótico adecuado para expresar una molécula de ADN recombinante que codifique una proteína de la descripción, por ejemplo, una proteína de la invención. 50

Se conocen vectores de expresión de células eucarióticas en la técnica y están disponibles en el mercado. Típicamente, dichos vectores contienen sitios de restricción convenientes para la inserción del segmento de ADN deseado. Los vectores ejemplares incluyen pSVL y pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1, pML2d (International Biotechnologies), pTDT1 (ATCC 31255), el vector de expresión retroviral pMIG, el vector lanzadera de adenovirus pDC3115, y vectores AAV. 55

Los vectores de expresión de células eucarióticas pueden incluir un marcador de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a fármacos. El gen de la neomicina fosfotransferasa (neo) (Southern et al., 1982, J. Mol. Anal. Genet. 1:327-341) es un ejemplo de dicho gen.

Para expresar los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, se insertan ADN que codifican cadenas ligeras y pesadas parciales o de longitud completa en vectores de expresión tales como plásmidos, retrovirus, cósmidos, YAC, epitomas 5 derivados de EBV, y similares. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se eligen para que sean compatibles con la célula hospedadora de expresión usada. El gen de la cadena ligera de anticuerpo y el gen de la cadena pesada de anticuerpo pueden insertarse en vectores diferentes. En algunos casos, se insertan ambos genes en el mismo vector de expresión.

Un vector conveniente es uno que codifica una secuencia de inmunoglobulina CH o CL humana funcionalmente 10 completa. Preferiblemente, se diseñan sitios de restricción de modo que pueda insertarse fácilmente y expresarse cualquier secuencia de VH o VL. En dichos vectores, el corte y empalme habitualmente sucede entre el sitio donante de corte y empalme en la región J insertada y el sitio aceptor de corte y empalme que precede la región C humana, y también en las regiones de corte y empalme que existen dentro de los exones de CH humana. La poliadenilación y la terminación de la transcripción suceden en sitios cromosómicos nativos cadena debajo de las regiones codificantes. El 15 vector de expresión recombinante también puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo desde una célula hospedadora.

Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión en células hospedadoras de mamífero incluyen elementos virales que dirigen elevados niveles de expresión de proteínas en células de mamífero, tales como promotores y potenciadores derivados de LTR retrovirales, citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/potenciador de CMV), el virus 20 de simio 40 (SV40) (tal como el promotor/potenciador de SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)), polioma y promotores fuertes de mamífero tales como los promotores nativos de inmunoglobulina y actina. Para una descripción adicional de elementos reguladores virales, y secuencias de los mismos, véase, por ejemplo, Stinski patente de Estados Unidos Nº 5.168.062; Bell patente de Estados Unidos Nº 4.510.245; y Schaffner patente de Estados Unidos Nº 4.968.615. 25

Los vectores de expresión recombinante pueden portar secuencias que regulan la replicación del vector en células hospedadoras (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores de selección. El gen marcador de selección facilita la selección de células hospedadoras en las que se ha introducido el vector (véase, por ejemplo, Axel patentes de Estados Unidos Nº 4.399.216; 4.634.665 y 5.179.017). Por ejemplo; típicamente el gen marcador de selección confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedadora en la que se 30 ha introducido el vector. Los genes marcadores de selección preferidos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en células hospedadoras dhfr- con selección/amplificación con metotrexato) y el gen neo (para selección con G418).

Las moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos Sp35 y anticuerpos anti-Sp35, y los vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico, pueden usarse para la transformación de una célula hospedadora 35 adecuada. La transformación puede ser por cualquier método adecuado. Los métodos para la introducción de ADN exógeno en células de mamífero son bien conocidos en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato cálcico, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del polinucleótido o polinucleótidos en liposomas, y microinyección directa del ADN en núcleos. Además, las moléculas de ácido nucleico pueden introducirse en células de mamífero por vector virales. 40

La transformación de células hospedadoras puede realizarse por métodos convencionales adecuados para el vector y la célula hospedadora empleados. Para la transformación de células hospedadoras procarióticas, pueden emplearse métodos de tratamiento por electroporación y con sales (Cohen et al., 1972, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110-2114). Para la transformación de células de vertebrados, pueden emplearse métodos de tratamiento por electroporación, con lípidos catiónicos o sales. Véase, por ejemplo, Graham et al., 1973, Virology 52:456-467; Wigler et al., 1979, Proc. Natl. 45 Acad. Sci. USA 76:1373-1376f.

Las líneas celulares de mamífero disponibles como hospedadores para la expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC). Éstas incluyen, inter alia, células de ovario de hámster chino (CHO), NSO, células SP2, células HeLa, células renales de cría de hámster (BHK), células renales de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), 50 células A549, y otras varias líneas celulares.

La expresión de polipéptidos a partir de líneas celulares de producción puede potenciarse usando técnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de glutamina sintetasa (GS) se usa habitualmente para potenciar la expresión en ciertas condiciones. Véanse, por ejemplo, las patentes europeas Nº 0216846, 0256055, y 0323997 y la solicitud de patente europea Nº 89303964.4. 55

Células Hospedadoras

Las células hospedadoras pueden ser procarióticas o eucarióticas. Las células hospedadoras eucarióticas preferidas incluyen, aunque sin limitación, células de levadura y de mamífero, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO) (Nº de acceso a la ATCC CCL61), células embrionarias de ratón del NIH suizo NIH-3T3 (Nº de acceso a la ATCC CRL1658), y células renales de cría de hámster (BHK). Otras células hospedadoras eucarióticas útiles incluyen células de insecto y células vegetales. Células hospedadoras procarióticas ejemplares son E. coli y Streptomyces. 5

Formulaciones

Las composiciones que contienen polipéptidos Sp35, anticuerpos anti-Sp35, o fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos anti-Sp35 pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados. Por ejemplo, pueden contener excipientes y/o auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones diseñadas para su suministro al sitio de acción. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen 10 soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua, por ejemplo, sales soluble en agua. Además, pueden administrarse suspensiones de los compuestos activos en forma de suspensiones de inyección oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa 15 sódica, sorbitol y dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores. También pueden usarse liposomas para encapsular las moléculas de la descripción, por ejemplo, las moléculas de la invención, para su suministro en células o espacios intersticiales. Vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares son disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isótonicos y retardantes de la absorción, agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares 20 fisiológicamente compatibles. En algunos casos, por ejemplo, en algunas realizaciones, la composición comprende agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro sódico. En algunos casos, por ejemplo, en algunas realizaciones, las composiciones comprenden sustancias farmacéuticamente aceptables tales como cantidades impregnantes o minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian el periodo de validez o la eficacia de los ingredientes activos. 25

Las composiciones de la descripción, por ejemplo, composiciones de la invención, pueden estar en una diversidad de formas incluyendo, por ejemplo, formas de dosificación líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infundibles), dispersiones, suspensiones, semi-sólidas y sólidas. La forma preferida depende del modo de administración y la aplicación terapéutica.

La composición puede formularse en forma de una solución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura 30 ordenada adecuada para una elevada concentración de fármaco. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el ingrediente activo en la cantidad necesaria en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el ingrediente activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos 35 estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y secado por congelación que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente filtrada a esterilidad. La fluidez apropiada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede 40 producirse incluyendo en la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo, sales monoestearato y gelatina.

El ingrediente activo puede formularse con una formulación o dispositivo de liberación controlada. Los ejemplos de dichas formulaciones y dispositivos incluyen implantes, parches transdérmicos, y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polímeros biocompatible, biodegradables, por ejemplo, acetato de etilenvinilo, 45 polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de dichas formulaciones y dispositivos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.

Pueden prepararse formulaciones de depósito inyectables formando matrices microencapsuladas del fármaco en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la proporción de fármaco a polímero, y la 50 naturaleza del polímero empleado, puede controlarse la velocidad de liberación del fármaco. Otros polímeros biodegradables ejemplares son poliortoésteres y polianhídridos. Las formulaciones inyectables de depósito también pueden prepararse atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones.

Pueden incorporarse compuestos activos suplementarios en las composiciones. En algunos casos, se co-administra un polipéptido Sp35, anticuerpo anti-Sp35 o fragmento del mismo con un anticuerpo anti-NgR1, o un fragmento de unión a 55 antígeno del mismo, o polipéptidos NgR1 o proteínas de fusión NgR1 solubles.

Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima. Por ejemplo, puede administrarse un único bolo, pueden administrarse varias dosis divididas en el tiempo, o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según hinquen las exigencias de la situación terapéutica. Es ventajoso formular

composiciones parenterales en forma unitaria de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA 1980).

Además del compuesto activo, la forma de dosificación líquida puede contener ingredientes inertes tales como agua, alcohol etílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites, glicerol, tetrahidrofurfuril alcohol, polietilenglicoles, y ésteres de ácido grado de sorbitán. 5

Terapia Génica

Puede producirse un polipéptido Sp35 in vivo en un mamífero, por ejemplo, un paciente humano, usando un enfoque de terapia génica para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o lesión del SNC en la que sería terapéuticamente beneficioso reducir la inhibición de la extensión axonal. Esto implica la administración de un ácido nucleico codificante de un polipéptido Sp35 adecuado unido de forma funcional a secuencias de control de la expresión adecuadas. 10 Preferiblemente, estas secuencias se incorporan en un vector viral. Los vectores virales adecuados para dicha terapia génica incluyen vectores adenovirales, vectores lentivirales, vectores baculovirales, vectores virales de Epstein Barr, vectores papovavirales, vectores virales vaccinia, vectores virales de herpes simplex, y vectores de virus adeno-asociados (AAV). El vector viral puede ser un vector viral deficiente en la replicación. Un vector adenoviral preferido tiene una deleción en su gen E1 o gen E3. Cuando se usa un vector adenoviral, preferiblemente el mamífero no se 15 expone a un ácido nucleico que codifica un gen marcador de selección.

Ejemplos

La invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos experimentales. Los ejemplos se proporcionan para propósitos ilustrativos solamente, y no deben entenderse como limitantes del alcance o contenido de la invención de 20 ningún modo.

Ejemplo 1: Patrón de Expresión de Sp35

Se evaluó la expresión de Sp35 en tejidos humano por análisis de transferencia de Northern. Se hibridaron múltiples transferencias tisulares que contenían 12 tejidos humanos principales o 14 tejidos humanos de SNC durante una noche a 68ºC con sonda Sp35 marcada con P32 (nucleótidos 150-450 de la secuencia de ADNc de Sp35). Las transferencias 25 se lavaron 3 veces con SSC 2x, SDS al 0,5%, después 3 veces con SSC 0,5x, SDS al 0,1%. La transferencia después se expuso a una película de rayos X y se visualizaron los niveles de ARNm por autorradiografía.

Sp35 se expresó ligeramente en el cerebro humano pero no en corazón, músculo esquelético, colon, timo, bazo, riñón, hígado, intestino delgado, placenta, pulmón y leucocitos de sangre periférica. Sp35 se expresión en todos los tejidos cerebrales ensayados, incluyendo tejidos aislados de corteza frontal, corteza posterior, corteza etorrinal, hipocampo, 30 bulbo olfativo, estriado, tálamo, cerebelo, mesencéfalo, puente de Varolio, médula y médula espinal. Se observó un gradiente de expresión génica a lo largo del eje rostral/cordal para Sp35, con los niveles más elevados en la corteza cortical y los niveles más bajos en la médula espinal.

Se usó tinción inmunohistoquímica (IHC) para determinar si Sp35 se expresa en células cerebrales específicas. Se incubaron secciones de cerebro de rata, de médula espinal fijadas en paraformaldehído al 4%, o cultivos de neuronas 35 granulares primarias con anticuerpos primarios contra Sp35, como se indica, seguido de anticuerpos secundarios conjugados con Alexa 480 o 590 (Molecular Probes Inc.). Las secciones después se montaron en Vectashield y se visualizaron por microscopía de fluorescencia. Los anticuerpos específicos anti-Sp35 usados para IHC se generaron a partir de una biblioteca de presentación de fagos Fab usando tecnología MorPhosys.

Sp35 se expresa específicamente en neuronas y oligodendrocitos, pero no en astrocitos. Esto se determinó en 40 experimentos en los que se tiñeron secciones tisulares de cerebro de rata con diversos agentes, incluyendo marcador anti-astrocito GFAP, un anticuerpo contra el marcador de oligodendrocitos (04), y un anticuerpo contra el marcador neuronal tubulina III, todos teñidos con contraste con un anticuerpo anti-Sp35. Los oligodendrocitos y las neuronas se tiñeron intensamente con el anticuerpo anti-Sp35. No se observó tinción de astrocitos.

Como confirmación independiente del patrón de expresión de Sp35, se realizó RT-PCR semi-cuantitativa usando 45 ARNm extraído (Ambion kit) de los cultivos celulares primarios de rata de astrocitos, oligodendrocitos, y neuronas granulares de cerebelo purificadas. Se usaron el cebador directo AAGGCCCAGCAGGTGTTTGTGGA (SEC ID Nº 14) y el cebador inverso TACTCGATCTCGATGTTGTGCTTT (SEC ID Nº 15). Después de 26 ciclos, se observó una banda fuerte en el ARNm de neuronas, se detectó una señal distinta pero más débil en el ARNm oligodendrocitos, y no se observó ninguna banda en astrocitos. 50

Ejemplo 2: Proteína de Fusión Sp35-Fc

Para estudiar la función biológica de Sp35, se creó una construcción fusionando la parte extracelular de Sp35 humano (restos 1-531) con la región bisagra y Fc de IgG1 humana. Se obtuvo una secuencia codificante parcial para Sp35 humano por PCR a partir del clon 227.2 (Incyte) usando el cebador directo

5'CAGCAGGTCGACGCGGCCGCATGCTGGCGGGGGGCGT3' (SEC ID Nº 16) y el cebador inverso 5'CAGCAGGTCGACCTCGCCCGGCTGGT-TGG3' (SEC ID Nº 17).

El producto de PCR de extremos romos se subclonó en el sitio SrfI del vector PCR SCRIPT AMP (Stratagene) para crear PCR SCRIPT AMP-sp35. Se aisló un fragmento SalI de PCR SCRIPT AMP-sp35 y se subclonó en el vector PCRCAMP Ig (derivado del vector PCR SCRIPT AMP de Stratagene donde la secuencia Fc gamma está subclonada 5 como un fragmento SalI(5') a NotI(3')), fusionando la secuencia señal de Sp35 y la secuencia del ectodominio (codones 1-531) en-fase con secuencias que codifican la región bisagra y Fc de Ig1 humana. Se identificaron los aislados correctos, y se subclonó un fragmento NotI que abarca el fragmento Sp35 Fc en el sitio de clonación NotI único del vector de expresión 293E, CH274, un derivado del vector de expresión comercial REP4 (Invitrogen). La fusión Sp35-Fc codificada por el nuevo vector, CH274/sp35-Fc, se confirmó por secuenciación de ADN como el plásmido GT123. 10

Se generaron líneas celulares estables que expresaban la proteína de fusión Sp35-Fc por electroporación de células hospedadoras CHO DG44 con el plásmido GT123. Las células CHO transfectadas se cultivaron en MEM alfa menos en presencia de suero dializado al 10% y glutamina 4 mM para seleccionar el crecimiento independiente de nucleósido. Catorce días después de la transfección, se suministró medio fresco a las células. Para explorar las células que expresaban Sp35-Fc, las células CHO se marcaron con anticuerpo de cabra anti-IgG humana marcado con ficoeritrina 15 (PE) (Jackson Labs) y se sometieron a clasificación por citometría de flujo de alta velocidad en un FACS Mo-Flo (Cytomation). Se seleccionaron las células que expresaban los niveles más elevados de Sp35-Ig. Estas células se expandieron en cultivo durante 7 días, después se volvieron a marcar y se clasificaron. Las células que expresaban los niveles más elevados de Sp35-Ig se aislaron como clones individuales en placas de 96 pocillos. Estos clones se cultivaron durando dos semanas y después se les suministró medio fresco un día antes del análisis FACS para 20 comprobar los niveles de expresión. Los clones que expresaban los niveles más elevados de Sp35-Fc se expandieron, y se establecieron bancos celulares congelados. Las líneas celulares se adaptaron para el cultivo en cultivo en suspensión en el medio libre de suero BCM16. El título de Sp35-Fc producido por estos clones se determinó cultivando las líneas celulares a 37ºC durante 4-5 pases, después cultivando las células hasta una densidad celular del 50% de la máxima y cultivándolas durante 10-15 días a 28ºC hasta que la densidad de células viables bajó hasta el 75%. En este 25 momento, se recogió el medio de cultivo, se eliminaron las células y los desechos por centrifugación, y se titularon los sobrenadantes de cultivo para los niveles de Sp35-Fc por análisis de transferencia de Western usando un anticuerpo anti-Ig humana (Jackson Lab) como sonda.

La proteína de fusión Sp35-Fc se purificó del medio de cultivo aclarado del siguiente modo: se añadieron 9 ml de HEPES 1 M pH 7,5 a 900 ml de medio condicionado. El medio se cargó por lotes durante 3 h a 4ºC sobre 3 ml de 30 Proteína A Sepharose (Pharmacia). La resina se recogió en una columna de 1,5 cm (I.D.), y se lavó cuatro veces con 3 ml de PBS, dos veces con 4 ml de PBS que contenía NaCl 800 mM, y después de nuevo con 3 ml de PBS. El Sp35-Fc se eluyó de la columna con NaH2PO4 25 mM pH 2,8, NaCl 100 mM en fracciones de 1,5 ml y se neutralizó añadiendo 75 l de NaH2PO4 0,5 M pH 8,6. Las fracciones que contenían el pico de proteínas se identificaron por absorbancia a 280 nm, se combinaron, y se sometieron a purificación adicional en una columna de Proteína A de 1 ml. Antes de la carga, 35 se añadió NaCl 600 mM y HEPES pH 7,5 50 mM. La columna se lavó dos veces con 600 l de HEPES 10 mM pH 7,5, NaCl 1 M, y después con 1 ml de PBS. El Sp35-Fc se eluyó de la columna con NaH2PO4 25 mM pH 2,8, NaCl 100 mM, recogiendo fracciones de 0,5 ml, y se neutralizó añadiendo 25 l de NaH2PO4 0,5 M pH 8,6. Las fracciones que contenían el pico de proteínas se identificaron por absorbancia a 280 nm y se combinaron. Por SDS-PAGE reductora, el Sp35-Ig migraba como una única banda (>95% pura) con una masa aparente de 90 kDa. En condiciones no reductoras, 40 la proteína corría como un dímero con una masa aproximada de 180 kDa. El Sp35-Fc purificado se hizo alícuotas y se almacenó a -70ºC. El fragmento NotI de GT123, que contiene los aminoácidos 1-531 de Sp35 y Fc de IgG1 humana, se subclonó en el sitio NotI del vector PV90 para crear DB002.

Ejemplo 3: Proteína de Fusión His-AP-Sp35

Para estudiar y aislar el receptor de Sp35, la proteína se expresó en células COS7 y CHO como una proteína de fusión 45 con fosfatasa alcalina marcada con His (His-AP). El plásmido se construyó del siguiente modo: El dominio extracelular de Sp35 (a.a. 34-532) se amplificó por PCR usando los cebadores (directo) 5'-AATTAAGAATTCACGGGCTGCCCGCCCCGCT-GCGAGT-3' (SEC ID Nº 18), que contiene un sitio de escisión Eco RI (subrayado), y (inverso) 5'-TATATTTCTAGATCACTCGCCCGGCTGGTTGGA-GATGAAAGCGA-3' (SEC ID Nº 19), que contiene un sitio de escisión Xba I (subrayado). El producto de PCR se escindió con Xba I, el extremo pegajoso 50 resultante se llenó con ADN polimerasa T4, después se digirió con Eco RI y se purificó en gel. El producto digerido se ligó en un fragmento Hind III-rellenado/ EcoRI His-AP del vector His-AP-pcDNA 1.1 (Invitrogen). El fragmento His-AP-Sp35 se digirió con Hind III y Eco RI, se rellenó, después se ligó en el sitio rellenado NotI en vector pV90. La secuencia de ADN del inserto se confirmó por secuenciación de ADN.

Las células COS7 se dividieron el día antes de la transfección. Se usó el ADN del vector His-AP-Sp35 (8 g) para 55 transfectar 5x106 células usando lipofectamina (Invitrogen). El medio condicionado se recogió 48 h después de la transfección.

Se desarrolló una línea celular CHO que expresaba la proteína de fusión His-AP-Sp35 usando el plásmido pV90. Las células hospedadoras CHO DG44 (2x106 células) se transfectaron con 100 g de plásmido por electroporación. Las

células se cultivaron en MEM alfa menos en presencia de suero dializado al 10% y glutamina 4 mM para seleccionar el crecimiento independiente de nucleósido. Catorce días después de la transfección se suministró medio fresco a las células en previsión de la exploración por clasificación por FACS Mo-Flo (Cytomation). Las células CHO transfectadas se marcaron con el anticuerpo monoclonal de ratón 8B6 dirigido contra fosfatasa alcalina de placenta humana (Sigma). Se usó un anticuerpo secundario, de cabra anti-Ig de ratón marcado con PE, para producir una señal específica para 5 células transfectadas. Después del marcaje con PE, las células se sometieron a clasificación por citometría de flujo de alta velocidad y se selección el 5% de arriba.

Para producir medio condicionado con His-AP-Sp35, se seleccionaron las células que expresaban los niveles más elevados de HIS-ApSp35. Las líneas celulares se adaptaron para crecimiento en cultivo en suspensión en medio libre de suero (BCM16). El título de His-AP-Sp35 que se produjo por estos clones se determinó cultivando las líneas 10 celulares a 37ºC durante 4-5 pases, después cultivando las células hasta una densidad celular del 50% de la máxima y cultivándolas durante 10-15 días a 28ºC hasta que la densidad de células viables bajó hasta el 75%. El medio de cultivo se recogió, se eliminaron las células y los desechos por centrifugación, y se titularon los sobrenadantes de cultivo para los niveles de His-AP-Sp35 por análisis de transferencia de Western usando anticuerpo anti-AP humana (Jackson Labs) como sonda. 15

El His-AP-Sp35 se purificó del medio condicionado del siguiente modo: se diluyeron 400 ml de medio condicionado de células CHO que expresaban His-AP-Sp35 con 400 ml de agua. Se añadió trietanolamina pH 8,5 25 mM de la solución madre 0,5 M y la muestra se cargó por lotes durante 2 horas a 4ºC sobre 6 ml de resina de intercambio aniónico Fractogel TMAE (EM Industries). La resina se recogió en una columna de 1,5 cm (I.D.), y se lavó dos veces con 6 ml de HEPES 10 mM pH 7,5, NaCl 50 mM. El AP-Sp35 se eluyó de la columna con HEPES 10 mM pH 7,5, NaCl 200 mM en 20 fracciones de 2 ml. Las fracciones del pico se identificaron controlando la actividad AP y por SDS-PAGE. La fracción de flujo continuo de la columna TMAE se diluyó adicionalmente con 300 ml de agua y se cargó por lotes durante una noche a 4ºC sobre 6 ml de resina TMAE. La resina se recogió y se lavó como se ha descrito anteriormente y se eluyó con HEPES 10 mM pH 7,5, NaCl 150 mM. Las fracciones del pico se identificaron de nuevo controlando la actividad AP y por SDS-PAGE. El His-AP-Sp35 de la primera columna era un 50% puro y el AP-Sp35 de la segunda columna era un 25 90% puro. En condiciones reductoras, el His-AP-Sp35 migraba en geles de SDS-PAGE con una pasa aparente de 130 kDa. Aunque el material un 90% puro era apropiado para la mayoría de las investigaciones, para algunos estudios se purificó adicionalmente el His-AP-Sp35 en resina de Ni-NTA agarosa (Qiagen). Se añadió NaCl a las fracciones de elución de la columna TAME a 800 mM y se añadió trietanolamina 0,5 M pH 8,5 e imidazol 1 M pH 7,0 a 25 mM y 15 mM, respectivamente. Se cargaron 4,5 ml de la muestra sobre una columna Niñita de 400 l. La columna se lavó tres 30 veces con trietanolamina 25 mM pH 8,5, NaCl 800 mM, imidazol 15 mM, y el His-AP-Sp35 se eluyó de la columna con imidazol 200 mM pH 7,0, NaCl 350 mM, recogiendo fracciones de 200 l. Las fracciones que contenían el pico de AP se combinaron y se dializaron durante una noche frente a 250 volúmenes de HEPES 10 mM pH 7,5, NaCl 200 mM. Se añadieron MgCl2 y ZnCl2 al resto a 2 y 0,25 mM, respectivamente. El producto final era más del 95% puro por SDS-PAGE, y corría como una única banda con una masa de aproximadamente 140 kDa en condiciones reductoras. 35

Las construcciones de Sp35 también se diseñaron como fusiones Fc. Se generó una construcción Sp35 LRR-Fc por PCR usando los cebadores (directo) 5'CTTGACACGGGATCCGCGGCCGCATGCTGGCGGGGGGCGTG-AGG3' (SEC ID Nº 20) y (inverso) 5'GCAGCGGGGCGGGCAGCCCGTGGCC-GAGCCTGACAGCACTGAGCC3' (SEC ID Nº 21). El producto de PCR se insertó en el sitio NotI del vector PV90. Se generó una construcción Sp35 IG-Fc por PCR usando los cebadores (directo) 5'CTTGACACGGGATCCGCGGCC-GCATGCTGGCGGGGGGCGTGAGG3' (SEC ID Nº 22) y 40 (inverso) 5'GTCCCGGATGCGGGCGCGGGCCGAGCCTGACAGCACTGAGCCCAG3' (SEC ID Nº 23). El producto de PCR se insertó en el sitio NotI del vector PV90. Las proteínas se expresaron en células CHO y se purificaron usando una columna de proteína A Sepharose.

Ejemplo 4: Unión de Sp35 a Células que Expresan NgR1

Se usaron cuatro métodos diferentes para mostrar la unión de Sp35 a NgR1. Primero se detectó la interacción en un 45 ensayo de unión directa en el que se incubó el conjugado fosfatasa alcalina-Sp35 (AP-Sp35) con células que expresan NgR1 y se evaluó la unión usando un reactivo de detección de AP cromogénico. Se cultivaron células COS7 confluyentes al 90% en placas de cultivo tisular de 100 mm y se transfectaron con plásmidos que expresan NgR1 usando reactivos Fugene 6 (Roche). Después de 48 horas, las células transfectadas se lavaron una vez con HBH (tampón salino equilibrado de Hank, 1 mg/ml de BSA, HEPES 20 mM, pH 7,0), y después se incubaron durante 1,5 h a 50 23ºC con 4 g/ml de la proteína de fusión AP-Sp35 en HBH. Las células se lavaron con tampón HBH enfriado en hielo 3 veces durante 3 min. cada vez, después se fijaron con formaldehído al 3,7% en HEPES 20 mM, pH 7,0, NaCl 150 mM durante 15 min., y se transfirieron de nuevo a tampón HBH. La AP endógena inestable al calor se inactivó por calor durante 2 horas a 67ºC. Se detectó el AP-Sp35 unido por incubación con nitroazul de tetrazolio NBT (Roche). El Ap-Sp35 se unía a células COS7 que expresaban el receptor NgR1 humano, pero no a células COS7 de control 55 transfectadas con el vector solo. Se observó un patrón de tinción punteado para NgR1, lo que refleja que solamente una fracción, probablemente el 50% de las células, se transfectaron con el NgR1.

Para cuantificar mejor la unión, se realizó el mismo experimento pero se trataron muestras celulares paralelas con 8, 4, 2, 1, 0,5, 0,125, 0,06 g/ml de AP-Sp35. La AP unida se incubó con fosfato de 4-nitrofenilo y la actividad AP se evaluó

en un lector de placa de 96 pocillos (Molecular Devices). A partir de estos datos, se estimó que la EC50 para la unión de Ap-Sp35 a NgR1 human era aproximadamente 6 nM.

En segundo lugar, se detectó la unión de Sp35 a NgR1 en un enfoque ELISA. Se recubrieron placas ELISA (Costar) con 10 g/ml de receptores NgR1-Fc solubles (sNgR310-Fc que contenía el péptido 35-310 de NgR1 de rata fusionado a las regiones bisagra y Fc de IgG1 de rata y sNgR344-Fc que contenía el péptido 35-344 de NgR1 de rata fusionado a 5 la IgG1 de rata) en NaHCO3 0,1 M, pH 9,0 durante 1 h a 37ºC. Las placas se bloquearon y se lavaron con Hepes 25 mM, pH 7,0, BSA al 0,1%, ovalbúmina al 0,1%, leche en polvo desnatada al 0,1% y NaN3 al 0,001%. La proteína AP-Sp35, 4 g/ml, se añadió a la placa y se incubó durante una noche a 4ºC. Las placas después se lavaron con Tris 10 mM pH 7,5, NaCl 150 mM y se detectó la AP unida usando 10 g/ml del sustrato cromogénico fosfato de 4-nitrofenilo diluido en glicina 0,1 M, MgCl2 1 mM, ZnCl2 1 mM pH 10,5. Se determinó la OD410 en un lector ELISA (Molecular 10 Devices) equipado con el programa Softmax. El AP-Sp35 se unía a sNgR-344-Fc inmovilizado pero no a la proteína sNgR-310-Fc, lo que indica que era necesaria la versión más larga de NgR1 para la unión de Sp35. Se fue capaz de generar competencia para la unión de AP-Sp35 a sNgR344-Fc NgR1 en un 80% preincubando el AP-Sp35 con un exceso de factor 100 de sNgR344-Fc. No se observó competición de unión usando una proteína de fusión hedgehog-Ig1 de rata como proteína de control de fusión de Ig de rata. 15

En tercer lugar, se detectó la unión de Sp35 a NgR1 co-inmunoprecipitando Sp35 con NgR1. Para este estudio, se transfectaron células COS7 confluyentes al 80%, cultivadas en placas de cultivo tisular de 100 mm, con plásmidos que codificaban Sp35-hemaglutinina (Sp35-HA) y NgR-FLAG usando reactivos Fugene 6 (Roche). Unas 48 horas después de la transfección, las células se recogieron y se lisaron en 1 ml de tampón de lisis (HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl2 1,5 mM, EGTA 1 mM, Triton X-100 al 1% y glicerol al 10%) a 4ºC durante 30 min. El lisado después se 20 centrifugó a 14.000 x g durante 15 min., y los sobrenadantes se recogieron y se incubaron a 4ºC durante una noche con agitación, usando matriz de afinidad anti-HA (Roche). Las muestras se lavaron 3 veces con 1 ml de tampón de lisis, después se hirvieron durante 3 minutos en tampón de muestra de Laemmli, se sometieron a SDS-PAGE la 4-15%, y se analizaron por inmunotransferencia con anticuerpo anti-FLAG M2 (Sigma). La resina de afinidad anti-marca HA recogió un complejo que contenía tanto Sp35-HA como FLAG-NgR, como es evidente por la presencia de FLAG. Este complejo 25 no se observó en lisados de transfecciones de control en los que las células se trataron con plásmido Sp35-HA o plásmido FLAG-NgR1 solo, o células que se co-transfectaron con Flag-NgR1 y una proteína de control marcada con HA que no se une a NgR1.

Sp35-HA se hizo del siguiente modo. Se amplificó la secuencia señal de Sp35 y el dominio extracelular (aminoácidos 1-531) por PCR usando los cebadores 5'ATATTCTAGAATGCTGGCGGGGGGCGTGAG3' (SEC ID Nº 24) y 5' 30 ATATACTAGTGTCGTTGCCGCCCGCGTTGG3' (SEC ID Nº 25) que contenían sitios XbaI y SpeI (subrayados). El producto de PCR se digirió con XbaI y SpeI y se insertó en el vector pCGCHA entre los sitios Xba I y Spe I. La secuencia del inserto se confirmó por secuenciación de ADN. La construcción FLAG NgR1 fue un presente del Dr. Zhigang He (Nature, Vol 420, 7 de noviembre de 2002).

En cuatro lugar, se mostró que Ap-Sp35 se unía a neuronas granulares de cerebelo (CGN) de rata que expresan NgR1. 35 Para este experimento, se cultivaron células CGN 8 días después del nacimiento confluyentes al 90% en placas de cultivo tisular de 10 mm. Después de 48 horas, las células se lavaron una vez con tampón HBH, y después se incubaron con 4 g/ml de AP-Sp35 en tampón HBH durante 1,5 horas a 23ºC. Las células después se lavaron con HBH enfriado en hielo 3 veces durante 3 minutos cada vez, después se fijaron con formaldehído al 3,7% en HEPES 20 mM, pH 7,0, y NaCl 150 mM durante 15 min., y se transfirieron de nuevo a HBH. La AP endógena inestable al calor se inactivó por 40 calor durante 2 horas a 67ºC. El AP-Sp35 unido se detectó por incubación con nitroazul de tetrazolio NBT (Roche). El AP-Sp35 se unía a neuronas granulares de cerebelo 8 días después del nacimiento, que expresan NgR1. La unión de AP-Sp35 a las neuronas se inhibió tratando las CGN con PIPLC (5 unidades/ml) que escinde la mayoría de las células ancladas a GPI de las superficies de membrana. Como NgR1 es una proteína unida a GPI, este resultado apoya adicionalmente la noción de que Sp35 se está uniendo a NgR1 en células CGN. 45

Ejemplo 5: Co-localización de Sp35 con NgR1

Para determinar si Sp35 y NgR1 se expresan en las mismas neuronas, se realizó un estudio de co-localización. Se incubaron cultivos de neuronas granulares primarias de rata p8 fijadas en paraformaldehído al 4% con anticuerpos contra Sp35 y NgR1 (Santa Cruz), y después con los anticuerpos secundarios marcados con Alexa apropiados (Molecular Probes Inc.). Las células se visualizaron por microscopía con-focal de fluorescencia. Las neuronas se tiñeron 50 intensamente por los anticuerpos contra Sp35 y NgR1. Ambas proteína se expresaron en los cuerpos celulares y los axones de las neuronas. Para ayudar al análisis de co-localización, se usaron sondas de diferentes colores para los 2 tipos de anticuerpos. Cuando surgieron las tinciones (rojo para células NgR positivas y verde para células Sp35 positivas) se observó un color amarillo en todas las células lo que indica que las dos proteínas estaban co-localizadas dentro de las neuronas. 55

Ejemplo 6: Sitios de Unión a NgR1 dentro de Sp35

Se usó mapeado de deleción para definir los dominios específicos de Sp35 implicados en las interacciones con NgR1. Se fabricaron las siguientes construcciones de deleción usando el kit de mutagénesis Stratagene Quikchange. Todas las construcciones de vector se verificaron por secuenciación de ADN de los insertos modificados.

His-AP-Sp35b que contiene el dominio de repetición rico en leucina de Sp35 más la región básica (a.a 34-432) se clonó a partir del vector His-AP-Sp35 (a.a. 34-532) por PCR. Los cebadores usados fueron 5'CCCAGCAGG-5 TGTTTGTGGACGAGTGATCTAGGGCCGCGGATCCCTG-3' (SEC ID Nº 26) y 5'-CAGGGATCCGCGGCCCTAGATCACTCGTCCACAAACACCTGCTGGG-3' (SEC ID Nº 27).

His-AP-Sp35d, que codifica el dominio Ig de Sp35 más la región básica (a.a 417-531), se clonó a partir del vector His-AP-Sp35a (a.a. 37-531) por PCR. Los cebadores usados fueron 5'CGCCGCGCACCCGGGTGAATTCCGCG-CCCGCATCCGGGACCGC-3' (SEC ID Nº 28) y 5'-GCGGTCCCGGATGCG-10 GGCGCGGAATTCACCCGGGTGCGCGGCG-3' (SEC ID Nº 29).

His-AP-Sp35e, que codifica solamente el dominio Ig (a.a 425-531), se clonó a partir del vector His-AP-Sp35 (aa 34-532) por PCR. Los cebadores usados fueron 5'-CGCCGCGCACCCGGGTGAATTCGCCCAGCAGGTGTTT-GTGGAC-3' (SEC ID Nº 30) y 5'-GTCCACAAACACCTGCTGGGCGAATTC-ACCCGGGTGCGCGGCG-3' (SEC ID Nº 31).

Se usó un kit de mutagénesis y protocolo comerciales (Stratagene Quikchange) para mutar el aminoácido 456 (de 15 arginina a ácido glutámico) y el aminoácido 458 (de histidina a valina) de Sp35 en el vector His-AP-Sp35 (34-532). Los cebadores usados fueron 5'-CATCCTCTGGCTCTCACCCGAA-AAGGTACTGGTCTCAGCCAAGAGC-3' (SEC ID Nº 32) y 5'-GCTCTTGGCT-GAGACCAGTACCTTTTCGGGTGAGAGCCAGAGGATG-3' (SEC ID Nº 33).

Se diseñaron construcciones de deleción de His-AP-Sp35 (FIG. 3) en vectores de expresión pV90 y se expresaron en células 293. El medio condicionado se recogió y se purificaron los aductos AP por etapas secuenciales de cromatografía 20 en resina Fractogel TMAE y NiNTA agarosa. Las proteínas purificadas se ensayaron para la unión a NgR1 expresado en células COS7. Las tres construcciones se unieron todas débilmente a Sp35. Estos resultados indicaron que el dominio de 1-14 repeticiones LRR de Sp35 (aminoácidos 34 a 417) y el dominio Ig de Sp35 (aminoácidos 425-531) ambos contribuyen a la unión de Sp35 a NgR1. El dominio Ig mostró mayor afinidad que el dominio LRR.

Se generó un modelo estructural para el dominio Ig de Sp35 usando la estructura cristalina de NCAM como esqueleto 25 (Rasmussen et al., 2000, Nat. Struct. Biol. 7:389-393). A partir de este modelo, se observó un bucle (números de los restos 454-458, aminoácidos: SPRKH; SEC ID Nº 34) que puede estar implicado en la unión. Para ensayar esta hipótesis, se diseñó una construcción Sp35 en la que se cambiaron los restos R en 456 y H en 458 por E y V, respectivamente. Cuando se ensayó esta construcción para la unión a NgR1, se observó un descenso del >10 veces en la señal. Como enfoque alternativo para ensayar la contribución de esta región de bucle en la unión, se sintetizó un 30 péptido correspondiente a la secuencia LSPRKH (SEC ID Nº 10) que se cicló añadiendo cisternas en el extremo N y C del péptido. Después de la unión a NgR1, este péptido bloquea, inhibe, o impide la función de NgR1.

Ejemplo 7: Sp35 induce la fasciculación de CGN p8

Para determinar la función biológica de Sp35 en neuronas, se incubó Sp35-Fc con neuronas granulares 8 días después del nacimiento para observar si Sp35 puede regular la extensión de neuritas. Se recubrieron portaobjetos de cultivo 35 Labtek (8 pocillos) con 0,1 mg/ml de poli-D-lisina (Sigma) antes de aplicar puntualmente la proteína Sp35-Fc (16 g/pocillo de proteína). Los portaobjetos se secaron durante una noche, después se aclararon y se recubrieron con 10 g/ml de laminina (Gibco). Las neuronas granulares de cerebelo 8 días después del nacimiento se disociaron y se sembraron en los portaobjetos pre-recubiertos. Los cultivos de portaobjetos se incubaron a 37ºC en CO2 al 5% durante 24 horas. Los portaobjetos después se fijaron en paraformaldehído al 4% que contenía sacarosa al 20% y se tiñeron 40 con anti-tubulina III (Covance TUJ1). Después de 24 horas, las CGN mostraron una clara morfología de fasciculación como se evidencia por el hacinamiento de las neuronas. No se observó fasciculación en las células tratadas o en los controles de muestra recubiertos con proteína Fc.

Ejemplo 8: Efectos de Sp35 sobre la activación/inactivación de RhoA

Sp35-Fc inducía a las neuronas granulares postnatales de cerebelo a experimentar fasciculación. Como se sabe que la 45 molécula de señalización RhoA está implicada en la fasciculación, se determinó si Sp35-Fc puede regular las funciones de RhoA en neuronas. El experimento de activación de RhoA se realizó del siguiente modo: se transfectaron células 293 o células COS7 con vectores de expresión que contenían combinaciones de RhoA, Sp35 o NgR1 usando reactivos Fugene 6 (Roche). Unas 48 h después de la transfección, se privó a las células de suero durante una noche, después se lisaron en Tris 50 mM, pH 7,5, Triton X-100 al 1%, desoxicolato sódico al 0,5%, SDS al 0,1%, NaCl 500 mM, MgCl2 50 10 mM, más un cóctel inhibidor de proteasa. Los lisados celulares se eliminaron por centrifugación a 13.000xg a 4ºC durante 5 minutos, y el 95% de los sobrenadantes se incubó con 20 g de una matriz de afinidad por el dominio de unión a de GST-Rho inmovilizado (perlas Rhotekin, Upstate Biotechnology) a 4ºC durante 45 minutos. Las perlas se lavaron 3 veces con tampón de lavado (Tris 50 mM, pH 7,5, Triton X-100 al 1%, NaCl 150 mM, MgCl2 10 mM, con inhibidores de proteasa). Rho unida a GTP se eluyó de las perlas calentando a 95ºC durante 5 min. en tampón de 55 muestra de SDS-PAGE. Las proteínas Rho unidas y totales se detectaron por transferencia de Western usando un anticuerpo monoclonal contra RhoA (Santa Cruz). Las células COS7 y HEK293 transfectadas con Sp35 inducían la

activación de RhoA, como se evidencia por un aumento en la cantidad de RhoA-GTP detectada en la transferencia después de la transfección con el gen Sp35. Se observó una potenciación adicional en RhoA-GTP después del tratamiento con Sp35-Fc. En contraste con el aumento en RhoA-GTP después de la transfección con Sp35 solo, cuando las células se transfectaron con Sp35 y NgR1, RhoA se inactivaba parcialmente. El tratamiento de estas células con Sp35-Fc provocaba una inactivación adicional de RhoA. 5

Se confirmó una respuesta de señalización por Sp35 usando un ensayo FLIPR (Molecular Devices) para determinar los efectos del tratamiento con Sp35 sobre el flujo de Ca++. Se observó un flujo de Ca++ significativo en células que expresaban Sp35 con tratamiento de Sp35-Fc, pero no en las células de control tratadas con Sp35-Fc. El flujo de Ca++ se redujo cuando las células que se habían co-transfectado con NgR1 y Sp35 se trataron con proteína de fusión Sp35-Fc. 10

Ejemplo 9: Interacción de la Proteína Sp35 consigo misma

Como los dominios LRR frecuentemente están implicados en interacciones homotípicas, y se observó que la adición de Sp35 soluble a células transfectadas con Sp35 causaba un aumento en RhoA-GTP sobre lo que se observaba con transfecciones de Sp35 solo, se ensayó la unión de Sp35 consigo mismo. Para realizar este ensayo, se usó co-inmunoprecipitación. Se transfectaron células COS7 confluyentes al 80%, cultivadas en placas de cultivo tisular de 10 15 mm, con plásmidos Sp35 HA o Sp35-FLAG, o ambos, usando reactivos Fugene 6 (Roche). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se recogieron las células y se lisaron en 1 ml tampón de lisis (HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl2 1,5 mM, EGTA 1 mM, Triton X-100 al 1% y glicerol al 10%) a 4ºC durante 30 min. El lisado después se centrifugó a 14.000xg durante 15 min., y los sobrenadantes se recogieron es incubaron, a 4ºC durante una noche con agitación, con una matriz de afinidad anti-HA (Roche). Las muestras después se lavaron 3 veces con 1 ml de tampón de 20 lisis, se hirvieron en tampón de muestra de Laemmli, se sometieron a SDS-PAGE al 4-15%, y se analizaron por inmunotransferencia con anticuerpos anti-FLAG. La resina de anticuerpo anti-HA capturó un complejo que contenía Sp35-FLAG, como se determina por transferencia de Western. Esto indicaba una interacción directa de Sp35 consigo mismo. También se trataron células transfectadas con HA-Sp35 con Sp35-Fc y se usó un enfoque de inmunoprecipitación similar para mostrar que HA-Sp35 se unía a Sp35-Fc. 25

Sp35-FLAG se hizo del siguiente modo. Se amplificó el dominio extracelular del gen Sp35 (a.a. 1-531) por PCR usando los cebadores 5'AATTAAGCGGCCGCATGCTGGCGGGGGGCGT3' (SEC ID Nº 35) y 5'AATTAAGCGGCCGCTTTGTCATGT'3 (SEC ID Nº 36) que contenían sitios NotI (subrayados). El producto de PCR se digirió por NotI y se insertó en el sitio NotI del vector pV90. La secuencia de ADN del inserto se confirmó por secuenciación de ADN. 30

Ejemplo 10: Transplante In Vivo de Células Transformadas con Sp35

Para determinar la función biológica de Sp35 en ratas con lesión de médula espinal, se infectaron células cultivadas primarias corticales (cultivos mixtos) con retrovirus que expresaban Sp35 de longitud completa o un control de retrovirus, para su suministro en el epicentro lesionado de las médulas espinales de rata. Se introdujeron 2x106 células, y las ratas se sacrificaron en el día 10. Las médulas espinales se fijaron en paraformaldehído al 4% durante una noche, 35 después se deshidrataron en ETOH al 70%, seguido del95%. Las muestras tisulares se impregnaron en parafina. Se usaron secciones (de 10 micrómetros de grosor) para la tinción inmunohistoquímica. Las ratas que recibieron células que expresaban Sp35, en comparación con el control, mostraron menos retracción del axón y más tinción de tubulina III cerca del epicentro. Se observó supervivencia neuronal aumentada en las ratas lesionadas que recibieron Sp35.

La construcción retroviral de Sp35 se hizo del siguiente modo: Se amplificó el gen Sp35 por PCR usando los cebadores 40 5'-GATTACTCGAGATGCTGGCGGGGGGCGTGAGG-3' (SEC ID Nº 37), que contenía un sitio XhoI (subrayado), y 5'CGCGGGAATTCTCATATCATCTTCAT-GTTGAACTTG-3' (SEC ID Nº 38), que contenía un sitio EcoRI (subrayado). El producto de PCR se digirió con XhoI y EcoRI, después se ligó en el vector retroviral pMIG (que contiene IRES-GFP), que se había escindido previamente con XhoI y EcoRI. El nuevo vector se llamó pMMC078. Todos los aislados de pMMC078 contenían mutaciones puntuales inadvertidas, de modo que se ligaron juntos dos aislados de pMMC078, 45 pMMC078.6 se cortó con XhoI y AccI y pMMC078.7 se cortó con XhoI y AccI. Estos dos fragmentos se ligaron juntos para crear el plásmido correcto final, pMMC089. La secuencia de ADN del inserto se confirmó por secuenciación de ADN. Los retrovirus Sp35 se prepararon como se ha descrito. Se dividieron células 293G el día antes de la transfección. Se usaron 8 g de ADN retroviral Sp35 para transfectar 5x106 células por lipofectamina (Invitrogen). El medio condicionado se recogió después de 92 horas después de la transfección. El medio condicionado se centrífugo a 5000 g 50 durante 10 minutos, y se usó el sobrenadante como solución madre de retrovirus Sp35. Esta solución madre se almacenó a 4ºC durante 1 semana o a -80ºC durante 6 meses.

Ejemplo 11: Modelo Animal de Lesión de Médula Espinal

Todos los procedimientos quirúrgicos se realizan usando técnicas asépticas. Durante 1 semana antes de cualquier manipulación quirúrgica, se maneja a los animales. Se administran SC 100 mg/kg de ampicilina de forma profiláctica 55 antes de y después de la cirugía para reducir la incidencia de lesión por infección de la vejiga.

Los animales se anestesian usando Midazolam a 2,5 mg/kg IP junto con Isoflurano al 2-3% en O2 para una profunda anestesia medida por un pinchazo en el dedo. Los animales se mantienen sobre una almohadilla de calentamiento de agua en circulación durante el tiempo que dura la cirugía y la recuperación. Se usa lubricante ocular para evitar el secado de la córnea y se da Atropina 0,05 mg/kg SC para reducir el exceso de salivación. Se hace una pequeña incisión en la piel y se retrae el músculo para exponer las vértebras. Se realiza una laminectomía dorsal al nivel espinal L6 (y L7 5 si se necesita la colocación de un catéter intratecal, véase a continuación), L6/L7 y las protuberancias vertebrales adyacentes se fijan de forma rígida en un tramo espinal (David Kopf Instruments). Se realiza una hemisección dorsal en L6 con tijeras finas de iridectomía interrumpiendo completamente los componentes del conducto corticoespinal dorsomedial principal y dorsolateral minoritario (CST). Después de la cirugía, se cubre el sitio de laminectomía con un material protector adecuado tal como Durafilm, y se sutura el músculo superpuesto con 4.0 chromic gut para proteger la 10 columna espinal expuesta. La piel se sutura y se frota con solución de betadine.

La recuperación funcional de los animales se evalúa usando el método de valoración de Basso Beattie y Bresnehan (BBB) habitualmente usado para evaluar ratas después de lesión de la médula espinal. Este método cuantificar la función de la extremidad posterior de las ratas por análisis detallado del movimiento de la articulación y la capacidad de llevar peso. Las ratas se evalúan el día después de la lesión de la médula espinal y posteriormente de forma semanal 15 después de ello.

Inmediatamente después de la transección CST, se inyectan adenovirus que expresan Sp35 o GFP o virus de control (1010 partículas) en el sitio de la transección y las regiones inmediatamente caudal y rostral al sitio de la lesión. Se inyecta un total de 10 l de Adv en 5 sitios diferentes (4 l/sitios). Para la administración intratecal de proteína Sp35, se hace un pequeño orificio en la dura de la médula espinal a 2 mm caudal de la lesión L7 y se inserta un catéter intratecal 20 en el espacio subaracnoideo en L7. El catéter se desliza lenta y suavemente por encima de la médula espinal aproximadamente 1 mm caudal a la lesión. La parte del catéter que está fuera del espacio intratecal se sutura firmemente en el lugar del tejido adyacente. Se conecta una minibomba osmótica cebada (Alza corp.) que contiene el material de ensayo (proteína Sp35 o proteína de control) al extremo expuesto de la cánula de guía y se inserta en el espacio subcutáneo. Después de la cirugía, se cubren los sitios de laminectomía con un material protector tal como 25 Durafilm y se sutura el músculo superpuesto con 4.0 chromic gut para proteger la columna espinal expuesta. La piel se sutura y se frota con solución de betadine.

Análisis histológico: La cirugía de trazado del conducto sucede en el momento de la cirugía para inducir la lesión de la médula espinal. La piel de la cabeza se afeita y se frota con Betadine y alcohol al 70%. El animal se coloca en un marco estereotáxico. Se hace una incisión en el cuero cabelludo de forma longitudinal y se raspa el periostio de las bóvedas 30 craneales. Se perfora un orificio en el cráneo de aproximadamente 1-2 mm de diámetro, y se inserta una aguja de microtitulación de vidrio de forma vertical en 8 localizaciones en la corteza motora (las coordenadas se determinan de acuerdo con el atlas del cerebro de la rata de Paxinos y Waston, 1997). Se inyectan aproximadamente 5 l de material de trazado del conducto (por ejemplo, Biotina dextrano amina, 10.000M.Wt) y la aguja se deja en el sitio durante cinco minutos adicionales para permitir la difusión de la solución. Después de la retirada de la aguja, se tapona el orificio del 35 cráneo con espuma de gel y se cierra con grapas el cuero cabelludo sobre el sitio de la lesión. Se deja que los animales se recuperen y reciben cuidados post-operatorios (descritos a continuación). De cuatro a diez semanas después, los animales se anestesian profundamente (Inactina 100-110 mg/kg ip) y se prefunden para la histología como se describe a continuación. El trazado del conducto se realiza por mecanismos de transporte anterógrado de forma descendente en el conducto espinal cortical hacia el extremo caudal de la médula espinal y proporciona un medio para cuantificar la 40 conectividad anatómica dentro del tracto corticoespinal.

Para los experimentos inmunohistoquímicos, los animales se anestesian profundamente con Inactina (100-110 mg/kg IP) 2-8 semanas después de la cirugía para inducir la lesión. Se abre la cavidad torácica y se expone el corazón, para permitir la perfusión. Se inserta una cánula en el ventrículo izquierdo a través de la cual se empujan lentamente 100 cc de PBS enfriado en hielo (se cortará un orificio en el ventrículo derecho para permitir que escape el fluido). Esto está 45 seguido de un goteo lento pero constante de paraformaldehído al 4% (50-100 ml) hasta que sea obvia la fijación de los ojos/orejas/dedos. Se retiran las médulas espinales, con cuidado para minimizar la alteración del sitio de la lesión, se congelan en OCT, se seccionan, y se procesan para inmunohistoquímica. También se recogen otros tejidos opcionalmente para el análisis posterior. Los animales que recibieron adenovirus Sp35 mostraron brote aumentado de axones determinado por tinción de tubulina III para el axón neuronal. 50

Ejemplo 12: Construcciones de Vector Viral Sp-35

Se preparó un vector viral de Sp-35 derivado de pMIG del siguiente modo. Se amplificó la secuencia codificante de Sp35 de longitud completa por PCR usando los cebadores 5'-GATTACTCGAGATGCTGGCGGGGGGCG-TGAGG-3' (SEC ID Nº 37), que contenía un sitio XhoI, y 5'-CGCGGGAATTCTCATATCATCTTCATGTTGAACTTG-3' (SEC ID Nº 38), que contenía un sitio EcoRI. El producto de PCR se cortó con XhoI y EcoRI, después se ligó en el vector retroviral 55 pMIG (Cheng et al, 1996, Nat. Biotechnol, 145:576) que se había cortado con XhoI y EcoRI. Este vector se denominó pMMC078. Todos los aislados de pMMC078 contenían mutaciones puntuales, de modo que se ligaron juntos dos aislados de pMMC078. El vector pMMC078.6 se cortó con XhoI y AccI y pMMC078.7 se cortó con XhoI y AccI. Estos dos fragmentos se ligaron para crear el plásmido pMMC089.

Se preparó un vector viral de Sp35-HA derivado de pMIG del siguiente modo. Se obtuvo un fragmento que codifica los aminoácidos 326-614 de Sp35 en fase con la secuencia de HA usando PCR con los cebadores 5'-GCCTTCCGCGGCCTCAACTACCTGCGCGTGCTC-3' (SEC ID Nº 39), que contenía un sitio SacII, y 5'-CCGGAATTCTCAAGCGTAATCAGGAA-CGTCGTAAGGGTATATCATCTTCATGTTGAACTTGCGGGGCGCGTCGGC-3' (SEC ID Nº 40), sirviendo pMMC089 como molde. El cebador más largo incluye la secuencia codificante de HA 5 (cursiva) después del codón 614 de Sp35 y antes del sitio EcoRI. El producto de PCR después se cortó con SacII y EcoRI, y se usó para remplazar el fragmento Sac II-EcoR I que contenía los codones 326-614 de Sp35 de tipo silvestre en el vector retroviral derivado de pMIG.

Se preparó un vector HA de baculovirus de Sp35 del siguiente modo. La secuencia codificante de Sp35-HA del vector retroviral Sp35-HA se cortó con Xho I y EcoR I, se hizo roma en los extremos, y se clonó en el sitio Bg12-de relleno del 10 vector lanzadera baculoviral pBV-CZPG (patentes de Estados Unidos Nº 6.190.887; y 6.338.953), remplazando el gen LacZ bajo el promotor de CMV.

Se preparó un vector adenoviral de Sp35 del siguiente modo. Se cortó la secuencia codificante Sp35-IRES-GFP del Sp35-retroviral con Xho I-de relleno y Nhe I, después se clonó en los sitios EcoR1-relleno/Nhe I del vector lanzadera adenoviral pDC315, bajo el promotor mínimo de CMV. 15

Ejemplo 13: Modelo Animal de Remielinización

Se usan ratas Long Evans hembra en todos los estudios. Las ratas se anestesian usando Isoflurano y se expone la T3/4 y se realiza una hemi-laminectomía dorsal. El agente desmielinizante químico, lisolecitina (3 l de lisolecitina al 1% en solución salina al 0,9%), se inyecta después en el lado derecho de las columnas dorsales de la médula espinal 0,5-1 mm por debajo de la superficie de la médula. Se administra tratamiento analgésico apropiado antes y después de la 20 cirugía.

Tres días después, se vuelve a exponer el sitio de la inyección (en anestesia de isoflurano, con tratamiento analgésico apropiado) y se inyectan las siguientes terapias en la médula espinal lesionada y se inyecta un vector adenoviral que codifica la proteína Sp35/proteína de control en el sitio de la lesión. Se inyectarán 1010 partículas de adenovirus que codifica Sp35 o control de GFP en un volumen de 10 l en la médula espinal de la rata lesionada en hasta 5 sitos 25 diferentes en y alrededor del sitio de desmielinización indicada por lisolecitina. Se inyecta un volumen de no más de 2 l en cada uno de los 5 sitios de inyección. Para el análisis histológico de desmielinización/remielinización de médula espinal 2, 3, 4 ó 6 semanas después de la cirugía, los animales se anestesian profundamente con inactina (100-110 mg/kg ip) y se prefundan con un fijador a través del corazón. La médula espinal entonces se retira y se procesa para el análisis. El animal que recibió tratamiento con Sp35 mostró mielinización aumentada del axón como se determina por 30 IHC usando anticuerpo anti-proteína MBP o azul rápido luxol.

Ejemplo 14: ARNi de Sp35

Para abordar el papel de Sp35 en la función cerebral, se introdujo el ARNi lentiviral de Sp35 en células CGN postnatales 8. Las células infectadas con ARNi de Sp35 tenían neuritas más cortas y velocidades más altas de proliferación que las células de control. Estos resultados indican un papel de Sp35 en la regulación de la activación de 35 RhoA.

Se compararon las secuencias de ADN de Sp35 murina y de rata para hallar regiones homólogas para usarlas para shARN candidatos. Se construyó CH324 hibridando los oligonucleótidos LV1-035 y LV1-036 y ligándolos a pLL3.7 digerido con Hpal y Xho1. Los oligonucleótidos se adquirieron de MWG. Las secuencias son:

LV1-035 (oligo con sentido) 40

5'TGATCGTCATCCTGCTAGACTTCAAGAGAGTCTAGCAGGATGACGATCTTTTTTC (SEC ID Nº 41)

LV1-036 (oligo antisentido)

5'TCGAGAAAAAAGATCGTCATCCTGCTAGACTCTCTTGAAGTCTAGCAGGATGACGATCA (SEC ID Nº 42).

Antes de producir el virus, se co-transfectó el ADN de pLL3.7 o el shARN candidato en pLL3.7 con plásmido de SP35 murino marcado con HA a una proporción de 5 a 1 en células CHO en formato de 6 pocillos. Se analizó el knockdown 45 por detección por transferencia de Western de SP35 marcado con HA de lisados de células CHO transfectadas así como por transferencia de northern del ARN total preparado a partir de pocillos duplicados. La transferencia se sondeó con un fragmento de 0,7 kb de mSP35. Los ensayos se realizaron 48 horas después de la transfección (datos no mostrados). Se produjeron virus a partir del mejor candidato para su uso en cultivos neuronales de rata. El vector, la metodología adicional y la producción de virus fueron como se describe en Rubinson et al. "A lentivirus-based system to 50 functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference." Nat. Genet. 33, 401-6 (2003).

Ejemplo 15: Activación de RhoA

Células COS7 que co-expresaban NgR1 y SP35 no mostraron cambios en los niveles de RhoA/GTP en respuesta a OMgp. Esto sugirió que el complejo SP35/NgR1 no es suficiente para mediar la transducción de señales por un inhibidor de mielina.

Se exploró la posibilidad de que un complejo ternario de SP35/NgR1/p75 medie la señalización. Se usaron dos enfoques para evaluar las interacciones entre SP35, NgR1 y p75. En primer lugar, se evaluó la unión en un ensayo de 5 unión directa usando un conjugado AP-SP35. El conjugado AP-SP35 se unía débilmente a células que expresaban p75. AP-P75 se unía a células que expresaban NgR1. La unión de AP-SP35 a NgR1 y p75 se midió por ELISA (FIG. 4). En segundo lugar, se evaluó la unión de SP35 a NgR1 y p75 por co-inmunoprecipitación de células COS7 que co-expresaban SP35, NgR1 y p75. Se anticuerpo anti-NgR1 inmunoprecipitaba un complejo que contenía SP35 y p75. Un anticuerpo anti-SP35 también inmunoprecipitaba un complejo que contenía p75. Los datos de interacción y co-10 inmunoprecipitación proporcionaron evidencias de una interacción directa entre SP35, NgR1 y p75. Se usó microscopía confocal y anticuerpos contra SP35, p75 y NgR1 para demostrar que SP35, NgR1 y p75 se co-localizan en cuerpos celulares y axones de neuronas CG p7 de rata.

A continuación se demostró que la combinación de SP35, NgR1 y p75 es suficiente para las actividades del inhibidor de mielina. Se diseñaron células COS7 no neuronales para que expresaran estos tres componentes. Usando estas células, 15 se demostró que los niveles de RhoA/GTP estaban regulados positivamente por OMgp. El tratamiento con OMgp-Fc aumentaba los niveles de RhoA/GTP en células que co-expresaban SP35/p75/NgR1, en comparación con otras combinaciones de estos tres componentes. Se confirmó la expresión de las proteínas por transferencia de Western de lisados de células COS7. La afinidad de la unión de los inhibidores de mielina a NgR1 no estaba afectada por la presencia de p75 o p75 y SP35. Los resultados combinados apoyan un modelo por el cual se requiere un complejo 20 ternario de NgR1, SP35 y p75 para la regulación de RhoA en presencia de ligandos de NgR1 (FIG. 5).

SP35 contiene un dominio citoplasmático que tiene implicación potencial directa o indirecta en la señalización. Para determinar el papel del dominio citoplasmático, se produjo un truncamiento en el dominio citoplasmático de SP35 (aminoácidos 34 a 576 de la SEC ID Nº 2), para que funcionara de un modo negativo dominante formando un complejo ternario no productivo incapaz de señalización. Esta molécula con el truncamiento del dominio citoplasmático se 25 denominó "DN-SP35" (para SP35 negativo dominante). Se transfectaron neuronas CG postnatal del día 7 (p7) con SP35 de longitud completa o DN-SP35, y después se ensayaron para la respuesta a los componentes inhibidores de mielina (Omgp, mielina y Nogo66). Como se muestra en la FIG. 6, las células transfectadas con DN-SP35 no lograron responder a los componentes inhibidores de la mielina y mostraron neuritas más largas que los controles. En contraste, las células transfectadas con la construcción de SP35 de longitud completa mostraron una respuesta potenciada a los 30 sustratos inhibidores, y tenían neuritas más cortas en comparación con los controles. Esto demostró que DN-SP35 actúa como competidos para atenuar la inhibición de la extensión de la neurita causada por los componentes de la mielina. Se esperaba que SP35-Fc soluble exógeno también se uniera a NgR1 y bloqueara la acción de los sustratos inhibidores. Como se muestra en la FIG. 7, SP35-Fc reducía la inhibición de la extensión de la neurita por Omgp, Nogo66 y MAG. 35

Ejemplo 16: Actividad Neuroprotectora

Se sembraron cantidades iguales de neuronas granulares de cerebelo de rata p6 en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 12 pocillos en presencia o ausencia de proteína sp35-Fc 50 nM. Estas placas de poli-D-lisina se han pre-recubierto [fondo secado] con 10 g de mielina del SNC, o 200 ng de Nogo66, MAG y OMgp o Fc de control. Los cultivos neuronales se mantuvieron durante 1-7 días a 37ºC y CO2 al 5%. Las neuronas estaban sanas y crecían bien 40 en los pocillos de control con PBS independientemente del tratamiento sp35-Fc con extensión completa de la neurita [determinada por marcador específico neuronal, tubulina III] que se examinó después de 3 días. En ausencia de sp35-Fc, las neuronas no crecían bien en los pocillos recubiertos con mielina, Nogo66, MAG y OMgp. Había un brote mínimo de neuritas [cortas y deformadas] y no parecía que las neuronas estuvieran sanas, con un cuerpo celular redondeado y materiales nucleares condensados. La tinción DAPI demostró que la cantidad de neuronas detectada en estos pocillos 45 era menor que en los pocillos de control con PBS, lo que sugiere pérdida neuronal. En presencia de sp35-Fc, había neuritas largas presentes y las neuronas parecían sanas. La tinción DAPI demostró una cantidad más elevada de neuronas en estos pocillos que en los que no recibieron el sp35-Fc. Los datos se resumen en la siguiente Tabla 2.

Tabla 2

En ausencia de sp35-Fc

sustrato del fondo secado:

OMgp/Nogo/MAG/mielina Fc de control

extensión de la neurita

corta larga

deformada extendida

morfología del cuerpo celular

redondeada esparcida

materiales nucleares

condensados transparentes

cantidad de neuronas al final del exp.

reducida Igual que en el Fc de control

En presencia de sp35-Fc

sustrato del fondo secado:

OMgp/Nogo/MAG/mielina Fc de control

extensión de la neurita

larga larga

extendida extendida

morfología del cuerpo celular

esparcida esparcida

materiales nucleares

transparentes transparentes

cantidad de neuronas al final del exp.

menos reducida que en el Fc de control igual que en el Fc de control

Estos datos indicaron que una forma soluble de Sp35, por ejemplo, Sp35-Fc, tiene actividad neuroprotectora.

En ratas con médula espinal hemi-transectada (T9, SCT), la tinción de tubulina -III de las escoñes de médula espinal mostró una pérdida sustancial de neuronas en el sitio de la lesión. Se usó un virus recombinante que expresaba sp35 para infectar los animales SCT en el sitio de la lesión. La tinción histológica de estas médulas espinales mostró una 5 cantidad aumentada de neuronas alrededor del sitio de la lesión en comparación con el grupo de control que se infectó con el virus de vector. Esto es coherente con los hallazgos experimentales in vitro descritos anteriormente, e indica adicionalmente propiedades neuroprotectoras asociadas con Sp35.

Ejemplo 17: Sp35 en Modelo Animal de Lesión de la Médula Espinal

Como Sp35-Fc reducía la inhibición de la extensión de la neurita causada por OMgp, Nogo-66 y MAG in vitro, se 10 esperaba que la molécula promoviera la recuperación funcional de lesiones del SNC in vivo. Para confirmar esto, se administró Sp35-Fc a ratas con médula espinal hemiseccionada, es decir, un modelo animal de traumatismo agudo del SNC. Como se muestra en la FIG. 8 y la FIG. 9, las ratas tratadas con Sp35-Fc mostraron una recuperación funcional significativamente mejorada, en comparación con las ratas de control tratadas con IgG.

Se realizó una lesión de la médula espinal y un análisis del comportamiento del siguiente modo. Todos los 15 procedimientos quirúrgicos se realizaron de acuerdo con las directrices del Biogen Institutional Animal Use and Care Committee. Se anestesiaron ratas Long Evans hembra (190-210 g, Charles River, Wilmington, MA) usando 2,5 mg/kg de Midazolam, I.P. y Fluotano al 2-3% en O2. Se realizó A una laminectomía dorsal al nivel espinal T6 y T7. Se realizó una hemisección dorsal, interrumpiendo completamente los componentes del conducto corticoespinal dorsomedial principal y dorsolateral minoritario (CST). Inmediatamente después de la transección CST, se insertó un catéter 20 intratecal en el espacio subaracnoideo en T7 y se conectó a una minibomba osmótica cebada (Alzet modelo 2004) insertada en el espacio subcutáneo. Las minibombas osmóticas suministraban la proteína de control de isotipo de Hu IgG (5 mg/ml, n=5, Pharmingen), PBS (n=3), proteína de fusión Hu Sp35-Ig soluble (4,3 mg/ml, n=8) a una velocidad de 0,25 l/h. después de la cirugía, se suturó el sitio de laminectomía y la herida de la piel se cerró con grapas. El cuidado postoperatorio incluía analgesia (Buprenorfina 0,05 mg/kg s.c.) durante 3 días y tratamiento con antibiótico (Ampicilina 25 100 mg/kg s.c. dos veces al día) durante 7 días después de la cirugía. Las vejigas se exprimieron manualmente dos veces al día mientras duró el estudio (28 días) o hasta la recuperación de la función (momento que se anotó). Todos loa animales se valoraron de forma ciega usando el sistema de valoración BBB de campo abierto (Basso et al., 1995, J. Neurotrauma 12:1-21; Ono et al., 2003, J. Neurosci. 23:5887-5896). Las ratas se evaluaron el día después de la transección CST (día 2) y semanalmente después de ello durante 4 semanas usando la escala de valoración locomotora 30 Basso-Beattie-Bresnahan (BBB). Los investigadores estuvieron ciegos a los grupos de tratamiento mientras duró el estudio.

Ejemplo 18: Supervivencia neuronal y regeneración de axones en el modelo de lesión de hemisección del conducto rubro-espinal (RST):

También se investigaron los efectos del tratamiento con Sp35 sobre la regeneración de neuronas en el conducto rubro-35 espinal que contribuye directamente a la locomoción.

Se anestesiaron ratas Sprague-Dawley adultas de 9 semanas de edad (200-250 g) con una inyección intraperitoneal de quetamina (80 mg/kg) y xilazina (8 mg/kg). Bajo el microscopio en funcionamiento, se realizó una laminectomía dorsal y se identificó la sétima vértebra espinal torácica (C7). Después de abrir la dura madre, se realizó una hemisección en el lado derecho al nivel C7 de la médula espinal usando un par de tijeras de resorte. Después de la hemisección de la 40 médula espinal, los animales recibieron un trozo de espuma de gel impregnado con 10 l de una solución de 2 g/ml de Sp35-Fc, o 10 l de una solución de 2 g/ml de Ig humana, o 10 l de PBS, colocado en la parte superior del sitio de la lesión. Después de las operaciones, los animales de cada grupo se subdividieron para el trazado axonal y en análisis

del comportamiento. Los animales para el trazado axonal (n = 5 para cada grupo) y el análisis del comportamiento (n = 7 para cada grupo) se dejaron sobrevivir durante 1 mes.

Se usó Fluoro-gold (FG, 6% p/v, Fluorocromo) para marcar las neuronas RST que habían regenerado sus axones a través de la cicatriz de la lesión y habían vuelto a entrar en la médula espinal caudal. Dos días antes del final del periodo de supervivencia después de la lesión (1 mes), se anestesió a los animales con una inyección intraperitoneal de 5 quetamina (80 mg/kg) y xilazina (8 mg/kg). Se realizó una laminectomía dorsal y se identificó el segmento espinal T2. Se inyectó manualmente FG a un volumen de 0,5 ml en la médula espinal T2 del lado derecho usando una jeringa Hamilton. Dos días después, se anestesió a los animales y se sacrificaron con una dosis letal de quetamina (150 mg/kg) y xilazina (8 mg/kg) y se prefundieron de forma intracardiaca con solución salina normal, seguida de 400 ml de fijador que contenía paraformaldehído al 4% en PBS 0,1 x. Se retiraron los cerebros y las médulas espinal, se post-fijaron con 10 paraformaldehído durante una noche, y después se colocaron en sacarosa tamponada con fosfato al 30%. El tejido cerebral y de médula espinal se cortó en secciones de 30 mm en un criostato y se montaron en portaobjetos recubiertos de gelatina. La cantidad de neuronas RST marcadas con FG en el lado de la lesión se expresó como un porcentaje de la cantidad total de neuronas marcadas con FG en el lado intacto contra-lateral. Este porcentaje entro los grupo se comparó estadísticamente usando ANOVA de una vía seguido de un ensayo de comparaciones múltiples de Tukey-15 Kramer. Como se muestra en la Tabla 3, Sp35-Fc a 2 g/ml promovía la supervivencia de neuronas del conducto rubro-espinal (RST).

Tabla 3

Tratamiento

Porcentaje de Supervivencia de Neuronas RST ( S.E.M.)

PBS

17,1  2

Sp35-Fc

31,9  1,5

Control-Fc

14,5  2,1

Para el análisis del comportamiento, se examinó el uso de las extremidades anteriores durante la exploración vertical 20 espontánea 1 mes después de diferentes tratamientos como se ha descrito (Liu et al., 1999) con modificaciones minoritarias. Las ratas se colocaron en un cilindro transparente de Plexiglas (15 cm de diámetro y 30 cm de alto) que alenta el uso de las extremidades anteriores para la exploración vertical durante 5 min. Se valoraron los siguientes comportamientos: (1) uso independiente de las extremidades anteriores izquierda (no alterada) o derecha (alterada) para contactar con la pared del cilindro; y (2) uso simultáneo de ambas extremidades anteriores para contactar con la 25 pared del cilindro. El comportamiento de exploración vertical se expresó en términos de (1) porcentaje del uso de la extremidad anterior izquierda (no alterada) relativo a la cantidad total de uso de la extremidad alterada, no alterada, y ambas; (2) porcentaje de uso de la extremidad anterior derecha (alterada) relativo a la cantidad total de uso de la extremidad alterada, no alterada, y ambas; y (3) porcentaje de uso de ambas extremidades anteriores relativo a la cantidad total de uso de la extremidad alterada, no alterada, y ambas. Las diferencias entre los grupos se ensayaron por 30 ANOVA de una vía seguido de análisis post hoc de Bonferroni. Los animales tratados con Sp35-Fc mostraron un movimiento significativamente mejorado de la extremidad anterior: uso del 30% de ambas extremidades anteriores en animales tratados con Sp35-1-Fc frente al 10% de uso de ambas extremidades anteriores en animales tratados con Fc de control o PBS; 55% de uso de la extremidad izquierda (no alterada) frente al 80% de uso en animales tratados con Fc de control o PBS; y 29% de uso de la extremidad derecha (alterada) frente a aproximadamente el 15% en animales 35 tratados con Fc de control o PBS.

Ejemplo 19: Sp35-Fc promueve la supervivencia de células del ganglio retiniano (RGC) en el modelo de transección del nervio óptico

Se confirmó adicionalmente la actividad de Sp35 usando el modelo de transección del nervio óptico, que investiga los factores que afectan a la función neuronal. Se usaron ratas Sprague Dawley (SD) hembra adulas jóvenes en este 40 estudio. Se transeccionó de forma intraorbital el nervio óptico derecho de cada animal 1,5 mm desde la papila óptica. Se aplicó un trozo de espuma de gel impregnada con Fluoro-Gold (FG) al 6% en el sitio recién transeccionado justo por detrás de la papila óptica para marcar las células del ganglio retiniano (RGC) supervivientes. Los animales se dividieron en 6 grupos (n=6 en cada grupo) que recibieron Sp35-Fc, IgG1 humana, o sólo PBS, por inyección intravitreal. El volumen de cada inyección intravitreal era de 4 ml aunque la dosificación de cada inyección era de 2 mg. Las 45 inyecciones intravitreales se realizaron inmediatamente después de la transección del nervio óptico.

Todos los animales se dejaron sobrevivir durante 1 semana. Dos días antes de sacrificar a los animales, se transeccionó el nervio óptico izquierdo de cada animal y se usó FG al 6% para marcar las RGC supervivientes para que sirvieran como control interno. Los animales se sacrificaron con una sobredosis de Nembutal y las retinas se diseccionaron en paraformaldehído al 4%. Se hicieron cuatro cortes radiales para dividir las retinas en cuatro cuadrantes 50 (superior, inferior, nasal y temporal). Las retinas después se post-fijaron en el mismo fijador durante 1 hora antes de que se montaran en plano con el medio de montaje (Dako). Los portaobjetos se examinaron en un microscopio de

fluorescencia usando un filtro ultra-violeta (longitud de onda excitación = 330-380 nm). Las RGC marcadas se contaron a lo largo de la línea media de cada cuadrante partiendo de la papila óptica hasta el límite periférico de la retina a intervalos de 500 mm, bajo una rejilla ocular de 200 X 200 mm. El porcentaje de RGC supervivientes resultante de cada tratamiento se expresó comparando la cantidad de RGC supervivientes en los ojos lesionados con sus ojos contra-laterales. Todos los datos se expresaron como la medio  SEM. La significancia estadística se evaluó por ANOVA de 5 una vía, seguido de un ensayo post de Tukey-Kramer. Las diferencias se consideraron significativas para p<0,05. Los animales tratados con Sp35-Fc mostraron supervivencia neuronal significativa (83%) en comparación con animales tratados con Fc de control o PBS, que mostraron cada uno una supervivencia neuronal solamente de aproximadamente el 50%.

Otras Realizaciones 10

Otras realizaciones están dentro de las siguientes reivindicaciones.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al 15 respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

• US 5428130 A, Capon

• US 5565335 A

• EP 0154316 A 20

• EP 0401384 A

• US 5252714 A

• US 5168062 A, Stinski

• US 4510245 A, Bell

• US 4968615 A, Schaffner 25

• US 4399216 A, Axel

• US 4634665 A

• US 5179017 A

• EP 0216846 A

• EP 0256055 A 30

• EP 0323997 A

• EP 89303964 A

• US 6190887 B

• US 6338953 B

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Claims (32)

1. REIVINDICACIONES

   1.Ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido soluble, donde:

   (A) dicho polipéptido soluble consiste en un polipéptido seleccionado del siguiente grupo, opcionalmente fusionado a un polipéptido heterólogo: 5

   (a) un polipéptido que comprende los aminoácidos 34-532 de la SEC ID Nº 2;

   (b) un polipéptido que comprende los aminoácidos 34-417 de la SEC ID Nº 2;

   (c) un polipéptido que comprende los aminoácidos 34-432 de la SEC ID Nº 2;

   (d) un polipéptido que comprende los aminoácidos 417-531 de la SEC ID Nº 2;

   (e) un polipéptido que comprende los aminoácidos 425-531 de la SEC ID Nº 2; 10

   (f) un polipéptido que comprende los aminoácidos 1-531 de la SEC ID Nº 2;

   (g) un polipéptido que comprende los aminoácidos 433-493 de la SEC ID Nº 2;

   (h) un polipéptido que comprende un dominio LRR de la SEC ID Nº 2, una región básica de la SEC ID Nº 2 C-terminal al dominio LRR, y un dominio de inmunoglobulina (Ig) de la SEC ID Nº 2 C-terminal a la región básica;

   (i) un polipéptido que comprende un dominio de Ig de la SEC ID Nº 2, pero que carece de un dominio LRR de la SEC ID 15 Nº 2, una región básica de la SEC ID Nº 2, y un dominio citoplasmático;

   (j) un polipéptido que comprende un dominio LRR de la SEC ID Nº 2, pero que carece de un dominio de Ig de la SEC ID Nº 2, una región básica de la SEC ID Nº 2, y un dominio citoplasmático; y

   (k) un polipéptido como en (h), que carece de un dominio citoplasmático;

   donde el polipéptido soluble codificado por el ácido nucleico es capaz de unirse a NgR1 para aliviar la inhibición 20 mediada por NgR1 de la extensión axonal en una neurona del sistema nervioso central;

   (B) dicho polipéptido soluble consiste en un polipéptido que incluye el siguiente motivo de aminoácidos, opcionalmente fusionado a un polipéptido heterólogo:

   LSPRKH (SEC ID Nº 10);

   donde el polipéptido soluble codificado por el ácido nucleico es capaz de bloquear, inhibir o interferir en la función de 25 NgR1; o

   (C) dicho polipéptido soluble consiste en el siguiente polipéptido, opcionalmente fusionado a un polipéptido heterólogo:

   LSPRKH (SEC ID Nº 10);

   donde el polipéptido soluble codificado por el ácido nucleico es capaz de bloquear, inhibir o interferir en la función de NgR1. 30
2. 2.Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, donde dicho polipéptido soluble consiste en un polipéptido que incluye el siguiente motivo de aminoácidos, opcionalmente fusionado a un polipéptido heterólogo:

   LSPRKH (SEC ID Nº 10);

   donde el polipéptido soluble codificado por el ácido nucleico es capaz de bloquear, inhibir o interferir en la función de NgR1. 35
3. 3.Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, donde dicho polipéptido soluble consiste en el siguiente polipéptido, opcionalmente fusionado a un polipéptido heterólogo:

   LSPRKH (SEC ID Nº 10);

   donde el polipéptido soluble codificado por el ácido nucleico es capaz de bloquear, inhibir o interferir en la función de NgR1. 40
4. 4.Ácido nucleico aislado según la reivindicación 2, donde el polipéptido de la SEC ID Nº 10 está ciclado.
5. 5.Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el polipéptido heterólogo se selecciona del grupo que consiste en un resto de Ig, un resto de albúmina sérica, un resto de reconocimiento, un resto informador, y un resto que facilita la purificación.
6. 6.Ácido nucleico según la reivindicación 5, donde el resto de Ig es un resto Fc.
7. 7.Vector que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 5
8. 8.Vector según la reivindicación 7, donde dicho ácido nucleico está unido de forma funcional a una secuencia de control de la expresión.
9. 9.Célula hospedadora que comprende el vector según la reivindicación 7 o reivindicación 8.
10. 10.Célula hospedadora según la reivindicación 9, que expresa el polipéptido que está codificado por dicho ácido nucleico. 10
11. 11.Polipéptido aislado codificado por el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho polipéptido es capaz de disminuir la inhibición del crecimiento axonal de una neurona del sistema nervioso central.
12. 12.Polipéptido según la reivindicación 11, donde el polipéptido está conjugado con un polímero.
13. 13.Polipéptido según la reivindicación 12, donde el polímero se selecciona del grupo que consiste en un polialquilenglicol, un polímero de azúcar, y un polipéptido. 15
14. 14.Polipéptido según la reivindicación 13, donde el polialquilenglicol es polietilenglicol (PEG).
15. 15.Polipéptido según la reivindicación 14, donde el polipéptido está conjugado con 1, 2, 3 ó 4 polímeros.
16. 16.Polipéptido según la reivindicación 15, donde el peso molecular total de los polímeros es de 20.000 Da a 40.000 Da.
17. 17.Anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de la SEC ID Nº 2 o un fragmento de unión a antígeno de dicho anticuerpo, donde dicho anticuerpo o fragmento es capaz de disminuir la inhibición del crecimiento axonal de una 20 neurona del sistema nervioso central (SNC).
18. 18.Método in vitro para inhibir la transducción de señales por NgR1, comprendiendo dicho método poner en contacto una célula que expresa NgR1 con una cantidad eficaz de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16.
19. 19.Método in vitro para disminuir la inhibición del crecimiento axonal de una neurona del sistema nervioso central, 25 comprendiendo dicho método poner en contacto dicha neurona con una cantidad eficaz de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, o un anticuerpo o segmento del mismo según la reivindicación 17.
20. 20.Método in vitro para inhibir el colapso del cono de crecimiento de una neurona del sistema nervioso central, comprendiendo dicho método poner en contacto la neurona con una cantidad eficaz de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, o un anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 17. 30
21. 21.Método in vitro para promover la supervivencia de una neurona en riesgo de morir, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha neurona con una cantidad eficaz de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16.
22. 22.Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, o un anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 17, en la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad, trastorno o lesión del 35 sistema nervioso central en un mamífero.
23. 23.Uso de una célula hospedadora según la reivindicación 10 en la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad, trastorno o lesión del sistema nervioso central en un mamífero, donde dicha célula hospedadora tiene que introducirse en el mamífero en o cerca del sitio de la enfermedad, trastorno o lesión.
24. 24.Uso según la reivindicación 23, donde la célula hospedadora deriva del mamífero a tratar. 40
25. 25.Uso de un vector viral que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido según la reivindicación 11, en la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad, trastorno o lesión del sistema nervioso central en un mamífero, donde dicho vector viral tiene que administrarse al mamífero en o cerca del sitio de la enfermedad, trastorno o lesión de modo que dicho polipéptido se exprese a partir de la secuencia nucleotídica en el mamífero en una cantidad suficiente para reducir la inhibición de la extensión axonal por neuronas en o cerca del sitio de la lesión. 45
26. 26.Uso de un vector viral que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido según la reivindicación 11, para la fabricación de un medicamento para promover la supervivencia de una neurona en riesgo de morir en un

    mamífero con una enfermedad, trastorno o lesión neurodegenerativa, donde dicho vector viral tiene que administrarse al mamífero en o cerca del sitio de la neurona.
27. 27.Uso según la reivindicación 25 ó 26, donde el vector viral se selecciona del grupo que consiste en un vector adenoviral, un vector lentiviral, un vector baculoviral, un vector viral de Epstein Barr, un vector papovaviral, un vector viral vaccinia, y un vector viral de herpes simplex. 5
28. 28.Uso según la reivindicación 25 ó 26 donde el vector viral tiene que administrarse por una vía seleccionada del grupo que consiste en administración tópica, administración intraocular, administración parenteral, administración intratecal, administración subdural y administración subcutánea.
29. 29.Uso según la reivindicación 25, donde la enfermedad, trastorno o lesión del sistema nervioso central es una lesión de la médula espinal o una lesión del nervio óptico. 10
30. 30.Uso según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 29, donde dicho polipéptido promueve la mielinización.
31. 31.Uso según la reivindicación 26, donde la enfermedad, trastorno o lesión neurodegenerativa se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, ALS, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, neuropatía diabética, apoplejía, lesión cerebral traumática, y lesión de la médula espinal.
32. 32.Una molécula de ARN interferente que se une específicamente al ácido nucleico según cualquiera de las 15 reivindicaciones 1 a 3, donde dicha molécula de ARN interferente es un ARN de horquilla pequeño (shARN) codificado por una molécula de ADN que comprende la SEC ID Nº 41 o la SEC ID Nº 42.