CN1798840A - Nogo受体结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明提供Sp35多肽及其融合蛋白，Sp35抗体及其抗原结合片段，以及编码它们的核酸。本发明还提供包含这种Sp35抗体、抗体的抗原结合片段，Sp35多肽及其融合蛋白的组合物，以及制备和使用这种Sp35抗体、其抗原结合片段，Sp35多肽及其融合蛋白的方法。

Description

NOGO受体结合蛋白
发明领域
本发明涉及神经学、神经生物学和分子生物学。更特别地，本发明涉及用于治疗神经性疾病、异常和损伤如脊髓损伤的分子和方法。
发明背景
轴突和树突从神经元中伸展出来。伸展的轴突或神经突的末梢包括一个专门区域，被称作生长锥。生长锥感觉局部环境，并引导轴突朝向神经元靶点细胞生长。生长锥对环境诱因响应，例如表面粘附、生长因子、神经递质和电场。生长锥通常以每天1-2毫米的速度向前生长。生长锥在两侧借助被称为片状伪足和丝状伪足的伸长来探测其前方的区域。当伸长部分接触到不宜的表面时，就会缩回来。当伸长部分接触到适宜生长的表面时，就会继续伸长，并朝该方向引导生长锥。当生长锥到达适当的靶点细胞时，就会建立突触联系。
神经细胞的功能受到神经元与它们的相邻环境中的其它细胞之间的接触的影响(Rutishauser，等人，1988，Physiol.Rev.68：819)。这些细胞包括中枢神经系统(CNS)中的特化神经胶质细胞，少突细胞以及外周神经系统(PNS)中的神经膜细胞(Schwann cell)，施万细胞用髓磷脂覆盖神经轴突(Lemke，1992，An Introduction to Molecular Neurobiology，Z.Hall，编辑，281，Sinauer)。
CNS神经元具有在受损后再生的内在潜能，但是髓磷脂中存在的抑制蛋白限制了它们的再生(Brittis等人，2001，Neuron 30：11-14；Jones等人，2002，J.Neurosci.22：2792-2803；Grimpe等人，2002，J.Neurosci.：22：3144-3160)。
数个存在于少突细胞中的髓磷脂抑制蛋白已经被表征。髓磷脂抑制蛋白的已知例子包括NogoA(Chen等人，Nature，2000，403，434-439；Grandpre等人，Nature 2000，403，439-444)，髓磷脂相关糖蛋白(MAG)(McKerracher等人，1994，Neuron 13：805-811；Mukhopadhyay等人，1994，Neuron 13：757-767)和少突细胞糖蛋白(OM-gp)，Mikol等人，1988，J.Cell.Biol.106：1273-1279)。这些蛋白质中的每一种已经分别地被证明是神经元NgRl的配体(Wang等人，Nature 2002，417，941-944；Grandpre等人，Nature 2000，403，439-444；Chen等人，Nature，2000，403，434-439；Domeniconi等人，Neuron2002，2002年6月28日在线发表)。
Nogo受体-1(NgRl)是GPI锚定的膜蛋白，含有8个富含亮氨酸的重复(Fournier等人，2001，Nature 409：341-346)。在与抑制蛋白(例如NogoA、MAG和OM-gp)相互作用时，NgRl复合物转导信号，导致生长锥崩解(growthcone collape)，抑制神经突的延长。
迫切需要用于阻止NgRl介导的生长锥崩解和这所导致的对神经突生长(neurite outgrowth)的抑制的分子和方法。
发明概述
本发明人已经进行了各种与名为“Sp35”(本发明人的命名)的多肽相关的发现。Sp35的可替代命名包括“LINGO”和“LINGO-1”。本发明人的发现包括如下。Sp35结合NgRl。Sp35以同型相互作用(homotypic interaction)与自身结合。Sp35-Fc融合蛋白诱导或促进粒状神经元(granular neuron)成束。在红核脊束半切损伤模型(rubro-spinal tract hemisection injury model)和视神经横切模型中，Sp35-Fc融合蛋白都促进神经元存活。当将Sp35逆转录病毒感染的皮层原代细胞递送到脊髓受损的大鼠中时，提高了神经元存活，增强了轴突的βIII微管蛋白染色，并增加了髓磷脂的含量。
部分地基于这些发现，本发明的特征在于分离的核酸，含有编码多肽的核苷酸序列，其中(a)该多肽包括(i)Sp35LRR结构域，(ii)位于LRR结构域的C末端的Sp35碱性区，和(iii)位于所述碱性区的C末端的Sp35免疫球蛋白(Ig)结构域；和(b)该多肽缺少跨膜结构域。Sp35LRR结构域含有羧基末端的LRR(LRRCT)，氨基末端的LRR(LRRNT)或者两者。在本发明的一些实施方案中，所编码的Sp35多肽缺少胞质结构域。在一些实施方案中，所编码的Sp35多肽包括SEQ ID NO：2的氨基酸残基34-532，而缺少氨基酸残基533-614。
本发明还包括编码多肽的核酸，其中该多肽包括Sp35Ig结构域，而缺少Sp35LRR结构域，Sp35碱性区，跨膜结构域和胞质结构域。
本发明还包括编码多肽的核酸，其中该多肽包括Sp35LRR结构域，而缺少Sp35Ig结构域，Sp35碱性区，跨膜结构域和胞质结构域。
本发明还包括编码多肽的核酸，其中该多肽缺乏功能性胞质结构域，但是包括所有其它Sp35结构域。例如，所编码的多肽包括SEQ ID NO：2的氨基酸1-576(在信号肽加工前)。
在本发明的一些实施方案中，所编码的多肽是融合多肽，含有非Sp35c部分。非Sp35部分可以是，例如，Ig部分、血清白蛋白部分、靶向部分、受体部分，或者有助于纯化的部分。优选的非Sp35部分是Ig部分，例如Fc部分。
核苷酸序列被可操作地连接到表达调控序列上，例如在表达载体中。本发明还包括用表达本发明的Sp35多肽的载体转化的宿主细胞。
本发明还包括由上述核酸的任何一种所编码的Sp35多肽。
本发明还包括偶联到多聚体上的Sp35多肽，该多聚体例如聚亚烷基二醇(polyalkylene glycol)、糖多聚体和多肽。优选的多聚体是聚亚烷基二醇，例如聚乙二醇(PEG)。多肽被偶联到1，2，3或4个多聚体上。优选地，偶联到每个Sp35多肽上的多聚体的总分子量从20,000Da到40,000Da。
本发明还包括用NgRl抑制信号转导的方法。该方法包括用有效量的Sp35多肽接触NgRl。用于该方法的优选多肽包括如下：
(a)Sp35多肽，其中(a)该多肽包括(i)Sp35LRR结构域，(ii)位于LRR结构域的C末端的Sp35碱性区，和(iii)位于该碱性区C末端的Sp35免疫球蛋白(Ig)结构域；和(b)多肽缺乏跨膜结构域；和
(b)Sp35多肽，包括Sp35Ig结构域，而缺乏Sp35LRR结构域，Sp35碱性区，跨膜结构域和胞质结构域。
本发明还包括降低对中枢神经系统(CNS)的神经元的轴突生长的抑制的方法。该方法包括用有效量的多肽接触神经元，该多肽例如Sp35多肽，抗Sp35抗体，或者抗Sp35抗体的抗原结合片段。
本发明还包括抑制CNS神经元的生长锥的崩解的方法。该方法包括用有效量的多肽接触神经元，该多肽例如Sp35多肽，抗Sp35抗体，或者抗Sp35抗体的抗原结合片段。
本发明还包括治疗哺乳动物中的CNS疾病、异常或损伤的方法。该方法包括将治疗有效量的多肽施用给哺乳动物，该多肽例如Sp35多肽，抗Sp35抗体，或者抗Sp35抗体的抗原结合片段。在本发明的一些实施方案中，CNS疾病、异常或损伤是脊髓损伤。可以局部施用Sp35多肽。在该方法的一些实施方案中，Sp35多肽在脊髓损伤的48小时内开始施用。对于局部施用，治疗有效量的多肽优选为10μg/kg-10mg/kg。对于全身性施用，治疗有效量的多肽优选为1mg/kg-20mg/kg。
本发明还包括治疗哺乳动物中的CNS疾病、异常或损伤的离体基因治疗(ex vivo gene therapy)方法。该方法包括(a)提供表达重组Sp35多肽的培养的宿主细胞；和(b)将宿主细胞导入哺乳动物的CNS疾病、异常或损伤部位，CNS疾病、异常或损伤例如脊髓损伤。培养的宿主细胞来源于将被处理的哺乳动物。在这种离体基因治疗方法中，重组Sp35多肽可以是全长的Sp35多肽。
本发明还包括在CNS疾病、异常或损伤部位促进髓鞘形成。该方法包括用有效量的Sp35多肽接触CNS疾病、异常或损伤部位，例如，多肽含有Sp35LRR结构域，而缺乏Sp35Ig结构域，Sp35碱性区，跨膜结构域和胞质结构域。
本发明还包括通过体内基因治疗来治疗CNS疾病、异常或损伤的体内基因治疗方法。该方法包括给哺乳动物位于或者接近CNS疾病、异常或损伤部位，施用含有编码Sp35多肽的核苷酸序列的病毒性载体，使得在哺乳动物中位于或接近损伤部位，核苷酸序列以足以减少通过神经元的轴突伸长的抑制的含量表达Sp35多肽。病毒性载体可以是例如腺病毒载体，慢病毒载体，杆状病毒载体，EB病毒载体(Epstein Barr viral vector)，乳多空病毒载体(papovaviral vector)，痘苗病毒载体(vaccinia viral vector)和单纯疱疹病毒载体。该疾病、异常或损伤是例如脊髓损伤或者视神经损伤。病毒性载体可以通过例如局部施用、眼内施用、胃肠外施用、鞘内施用(intrathecaladministration)、硬膜下施用和皮下施用的路径施用。
本发明还包括促进处于垂死危险中的神经元的存活的方法。该方法包括用有效量的Sp35多肽接触神经元。Sp35多肽可以是可溶形式的Sp35，例如Sp35-Fc融合蛋白。该神经元可以是体外或体内的，例如在患有神经退化性疾病、异常或损伤的哺乳动物中，例如多发性硬化(multiple sclerosis)、ALS、享廷顿病(Hantington’s disease)、阿尔茨海默氏病、帕金森病(Parkinson’sdisease)、糖尿病性神经病(neuropathy)、发作综合征(stroke)、创伤性大脑损伤(traumatic brain injury)和脊髓损伤。在本发明的一些实施方案中，间接施用Sp35多肽，通过：(a)提供表达重组Sp35多肽的培养的宿主细胞；和(b)将该宿主细胞导入到哺乳动物的神经元部位。在本发明的一些实施方案中，通过体内基因治疗施用多肽。在这样一个实施方案中，该方法包括位于或接近神经元的部位施用包含编码Sp35多肽的核苷酸序列的病毒性载体，使得核苷酸序列在哺乳动物中以足以促进神经元存活的含量表达Sp35多肽。
如在此所用，“全长的人Sp35多肽”是指氨基酸序列为SEQ ID NO：2的氨基酸34-614的多肽。
如在此所用，“异源部分”是指不存在于全长Sp35多肽中的氨基酸序列。
如在此所用，“nogo受体-1”是指序列是公众在Genbank登录号AAG53612下可获得的多肽。
如在此所用，“Sp35拮抗剂多肽”是指阻断、抑制或干扰天然存在的Sp35的生物学活性的Sp35多肽。
如在此所用，“Sp35碱性区”是指如下的氨基酸基序：
R R A R I R D R K    (SEQ ID NO：4)
K K V K V K E K R    (SEQ ID NO：5)
R R L R L R D R K    (SEQ ID NO：6)
R R G R G R D R K    (SEQ ID NO：7)
R R I R A R D R K    (SEQ ID NO：8)
最上面一行氨基酸(粗体；SEQ ID NO：4)是优选的Sp35碱性区序列，具有可选择的取代的变体被显示在下面(SEQ ID NO：5，6，7和8)。
如在此所用，“Sp35融合蛋白”是指包括融合到异源部分上的Sp35部分的融合蛋白。
如在此所用，“Sp35Ig结构域”是指SEQ ID NO：2的氨基酸433-493，只要该序列含有五个以上的独立的(individual)氨基酸插入、缺失或者保守氨基酸取代。特别地包括如下取代(基于SEQ ID NO：2的编号)：位置6上的V变化为M；位置294上的S变化为G；位置348上的V变化为A；位置419上的R变化为H。
如在此所用，“Sp35LRR结构域”是指包括10-14个富含亮氨酸的重复的结构域，包括LRRNT和LRRCT，被列举在表1中，只要在聚集的10-14个富含亮氨酸的重复中，出现达五个氨基酸插入、缺失或者保守氨基酸取代。
如在此所用，“Sp35部分”是指全长的Sp35多肽的生物学活性片段。
如在此所用，″Sp35多肽″是指Sp35部分或包括Sp35部分的融合蛋白。
除非另外定义，所有在此所用的科技术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。在相互冲突的情形下，以本说明书为准，包括定义。所有的出版物、专利和其它在此提及的参考文献都被引入作为参考。
虽然可以在实施和检验本发明中采用与在此描述的那些相似或相当的方法和材料，下面将描述优选的方法和材料。材料、方法和实施例仅是说明性的，而不用于限制。根据详细描述的说明书和权利要求书，本发明的其它特征和优点是显然的。
附图说明
附图1是全长的人Sp35cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。
附图2是全长的人Sp35多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
附图3是Sp35结构域的结构和缺失作图的示例性说明，以鉴定结合NgRl的Sp35序列。
附图4是总结结合到COS7细胞上的SP35的数据的柱形图，该COS7细胞用表达大鼠p75的载体或者载体对照转染。48小时后，AP-SP35或AP与细胞一起培养。被结合的AP可用显色AP检测试剂检测。
附图5是总结关于AP-Omgp和AP-Nogo-66结合到COS7细胞上的数据的柱形图，COS7细胞用编码NgRl；NgRl和p75；NgRl、p75、和SP35的表达载体或者载体对照转染。48小时后，AP-Omgp、AP-Nogo-66或AP与细胞一起培养。被结合的AP可用显色AP检测试剂检测。
附图6是总结关于髓磷脂抑制剂对神经突体外生长的抑制活性的减弱(relief)的数据的柱形图。在出生后第7天，在表达DN-Sp35、全长的Sp35的大鼠大脑粒状神经元(cerebellar granular neuron)或者培养在固定底物Omgp、Myelin和Nogo-66上的对照中测量神经突的长度。DN-SP35转染的细胞对抑制底物的响应降低。量化对来自两个独立试验的每个处理组的1000个神经元的神经突的长度(p＜0.01)。
附图7是总结关于SP35-Fc逆转髓磷脂抑制剂的抑制活性的数据的柱形图。出生后第7天的大鼠大脑粒状神经元(1000个神经元)的神经突长度，在存在或者缺乏SP35-Fc时，在固定底物OMgp、髓磷脂或者Nogo-66上培养这些神经元。SP35-Fc降低Omgp，Nogo-66和MAG对神经突生成的抑制作用。量化来自两个独立试验的、每个处理组1000个神经元的神经突的长度(p＜0.01)。
附图8是总结来自一个试验的数据的图形，表明鞘内施用Sp35-Fc改善了大鼠在背部半切后(dorsal hemisection)的功能恢复。测量移行BBB(locomoter BBB)分值，作为对照(IgG)或者Sp35-Fc-处理大鼠(每组8只大鼠)在背部半切后的时间函数(function of time)。处理开始于脊髓损伤。
附图9是显示在附图8中概述的试验中的第4周的各个动物的BBB分值的图形。
发明详述
天然存在的人Sp35是糖基化的CNS特异性蛋白，含有614个氨基酸(附图2；SEQ ID NO：2)。全长的野生型的人SP35多肽含有一个由14个富含亮氨酸的重复(包括N-和C-末端帽子)组成的LRR结构域、Ig结构域、跨膜区和胞质结构域(附图3)。胞质结构域含有规则的酪氨酸磷酸化位点。此外，天然存在的Sp35蛋白含有信号序列、位于LRRCT和Ig结构域之间的短的碱性区，和位于Ig结构域和胞质结构域之间的跨膜区(附图3)。人Sp35基因含有可选择的翻译起始密码子，使得在Sp35信号序列的N末端可能存在或不存在六个额外的氨基酸，即MQVSKR(SEQ ID NO：9)。表1中列举了Sp35结构域和其它区域，对应于附图2中序列的氨基酸残基的编号(SEQ ID NO：2)。
表1
  结构域或区域   起始残基   终止残基
  信号序列   1   33
  LRRNT   34   64
  LRR   66   89
  LRR   90   113
  LRR   114   137
  LRR   138   161
  LRR   162   185
  LRR   186   209
  LRR   210   233
  LRR   234   257
  LRR   258   281
  LRR   282   305
  LRR   306   329
  LRR   330   353
  LRRCT   363   416
  碱性区   417   424
  Ig   433   493
  连接序列   494   551
  跨膜   552   576
  胞质   577   614
已经在人和大鼠中研究了Sp35的组织分布和发育表达。在实验动物(大鼠)模型中研究了Sp35的生物学。大鼠SP35的表达局限于CNS神经元和大脑少突细胞，通过northern印迹和免疫组化染色确定。大鼠Sp35mRNA的表达水平在发育中被调控，而在出生后立即(在出生后第一天)急剧升高。在大鼠脊髓横断损伤模型中，通过RT-PCR确定，Sp35在损伤部位被上调。
本发明人已经发现，全长的野生型Sp35结合到NgRl上。可溶性的Sp35衍生物作为Sp35拮抗多肽起作用，通过结合到NgRl上，并阻断、抑制或干扰NgRl的功能，从而减轻通常发生在CNS神经元中的由NgRl介导的对轴突伸长的抑制作用。这在大脑或脊髓中需要轴突伸长或神经突萌发的情形下是有益的。脊髓损伤，包括部分或完全粉碎或断裂，示例说明了需要轴突伸长的情形，但是该轴突伸长通常被Nogo路径运行所抑制。其中大脑中的轴突伸长和/或神经突萌发将是有益的疾病或异常的例子包括卒中、多发性硬化和其它神经退行性疾病或异常。
在本发明的方法中，Sp35多肽或者Sp35阻断抗体(结合抗原的抗体片段)作为预制的(preformed)多肽直接施用，或者通过核酸载体间接施用，以拮抗NgRl功能，准许有益的轴突生成。
在本发明的一些实施方案中，在治疗方法中施用可溶性的Sp35拮抗多肽，该方法包括(1)用核酸转化或转染可移植的宿主细胞，所述核酸例如表达Sp35多肽的载体；和(2)将被转化的宿主细胞移植到哺乳动物的疾病、异常或损伤的部位。例如，被转化的宿主细胞移植到脊髓损伤的部位。在本发明的一些实施方案中，从哺乳动物上获取可移植的宿主细胞，暂时培养，用编码可溶性的Sp35多肽的分离核酸转化或转染，再植回到获取该细胞的同一哺乳动物中。该细胞可以，但是不是必须，从与所植入的部位相同的部位获取。这种实施方案有时也被称作为离体基因治疗，能够在有限时期内，在作用局部连续供应Sp35多肽。
本发明提供作为Sp35与NgRl互作以及Sp35同型互作的调节物的寡肽。该寡肽包括如下氨基酸基序：
L S P R K H(SEQ ID NO：10)
I T P K R R(SEQ ID NO：11)
A C P H H K(SEQ ID NO：12)
V S P R K H(SEQ ID NO：13)
顶端一行氨基酸(粗体；SEQ ID NO：10)是优选序列，包含可选择的取代的变体显示在下面(SEQ ID NO：11，12和13)。
各种示例性的Sp35多肽、抗Sp35抗体和抗体片段，以及用于获得这些分子来实施本发明的方法和材料将在下面描述。
融合蛋白和偶联多肽
本发明的一些实施方案包括Sp35多肽的用途，例如Sp35拮抗多肽，其中Sp35部分被融合到异源多肽部分上，形成Sp35融合蛋白。Sp35融合蛋白被用于实施各种目的，例如延长血清半衰期，提高生物利用度，体内靶向特定器官或组织类型，提高重组表达效率，改进宿主细胞分泌，容易纯化，提高亲合性。根据所有达到的目的，插入惰性或生物活性的异源部分。此外，还可以选择异源部分，以在体外或体内被稳定地融合到Sp35部分上或者在体内或体外是可裂解的。在本领域，用于实施不同目的的异源部分是已知的。
作为Sp35融合蛋白的表达的替代，可以预制所选择的异源部分，并化学偶联到Sp35部分上。在大多数情形下，无论是融合或者偶联到Sp35部分上，所选择的异源部分会类似地起作用。因此，在如下对异源氨基酸序列的讨论中，除非另外指出，应当理解，异源序列以融合蛋白形式或者作为化学偶联物被连接到Sp35部分上。
药学活性的多肽例如Sp35，通常在体内被迅速清除，迫使需要大剂量来在机体中达到治疗有效浓度。此外，小于约60kDa的多肽可能发生肾小球滤过，肾小球滤过有时会导致肾毒症。可以融合或偶联相对小的多肽，例如Sp35片段，以降低或避免这种肾毒症的危险。用于增加治疗性多肽的体内稳定性即血清半衰期的各种异源氨基酸序列，即多肽部分或者“载体”，是已知的。
由于半衰期长、体内分布广泛，并且没有酶的或免疫学的功能，基本上全长的人血清白蛋白(HSA)或者HSA片段是优选的异源部分。通过应用方法和材料如Yeh等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：1904-1908和Syed等人，1997，Blood 89：3243-3252中教导的那些，HAS被用于构成Sp35融合蛋白或偶联物，具有依赖于Sp35部分的药学活性，而体内稳定性显著地升高，例如10倍到100倍。优选地，HSA的C末端被融合到Sp35部分的N末端上。由于HSA是天然分泌的蛋白质，当在真核动物如哺乳动物的表达系统中生成Sp35融合蛋白时，HSA信号序列被利用，将该融合蛋白分泌到细胞培养基中。
本发明的一些实施方案使用Sp35多肽，其中Sp35部分被融合到Fc区域，即Ig重链恒定区的C末端部分上。Sp35-Fc融合物的潜在优点包括溶解性，体内稳定性，和多价(multivalency)，例如二聚作用。所用的Fc区可以是IgA、IgD或IgG Fc区(铰链-CH2-CH3)。可替代地，可以是IgE或IgM Fc区(铰链-CH2-CH3-CH4)。IgG Fc区是优选的，例如IgGl Fc区或IgG4 Fc区。在本领域，用于构建和表达编码Fc融合物的DNA的材料和方法是已知的，可以被用于获得Sp35融合物，而无需过度的试验。本发明的一些实施方案中采用Sp35融合蛋白，例如在Capon等人的美国专利5,428,130和5,565,335中所描述的那些。
信号序列是编码起始将蛋白质转运通过内质网的膜的氨基酸序列的多核苷酸。用于构建免疫融合物(immunofusin)的信号序列包括抗体轻链信号序列，例如抗体14.18(Gillies等人，1989，J.Immunol.Meth.，125：191-202)，抗体重链信号序列，例如MOPC141抗体重链信号序列(Sakano等人，1980，Nature 286：5774)。可替代地，可以试验其它信号序列。参见，例如Watson，1984，Nucleic Research 12：5145)。信号肽通常在内质网腔内被信号肽酶切割。这导致分泌含有Fc区和Sp35部分的免疫融合物蛋白。
在一些实施方案中，DNA序列编码分泌表达盒(secretion cassette)与Sp35部分之间的蛋白水解切割位点。切割位点被用于蛋白水解断裂所编码的融合蛋白，从目标蛋白上分离Fc结构域。有用的蛋白水解切割位点包括蛋白水解酶，例如胰蛋白酶、纤溶酶、凝血酶、因子Xa或肠激酶K所识别的氨基酸序列。
分泌表达盒被插入到可复制的表达载体中。有用的载体包括线性核酸、质粒、噬菌粒、粘粒等。示例性的表达载体是pdC，其中免疫融合物DNA的转录受人巨细胞病毒(cytomegalovirus)的增强子和启动子调控。参见，例如Lo等人，1991，Biochim.Biophys.Acta 1088：712；和Lo等人，1998，Protein Engineering 11：495-500。适当的宿主细胞用编码Sp35多肽的DNA转化或转染，用于表达和分泌Sp35多肽。优选的宿主细胞包括无限增殖的杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Hela细胞和COS细胞。
完整的野生型Fc区具有效应子功能，这种功能在本发明的Fc融合蛋白中是不需要和不期望的。因此，在构建分泌表达盒的过程中，优选从Fc区中删除某些结合位点。例如，由于不必与轻链一起共表达，从IgE的Fc区的CH2结构域中删除重链结合蛋白Bip(Hendershot等人，1987，Immunol.Today 8：111-114)的结合位点，使得该位点不会干扰免疫融合物的有效分泌。同样地，存在于Fc区中的半胱氨酸残基负责结合到免疫球蛋白的轻链上，应当被删除或者用其它氨基酸取代，使得这些半胱氨酸残基不会干扰作为免疫融合物生成时的Fc区的正确折叠。跨膜结构域序列应当被删除，例如存在于IgM中的那些。
IgGl Fc区是优选的。可替代地，可以在表达盒中使用其它亚类的免疫球蛋白γ(γ-2、γ-3和γ-4)的Fc区。免疫球蛋白γ-1的IgGl Fc区优选被用于分泌表达盒中，该表达盒包括铰链区(至少部分)、CH2区和CH3区。在一些实施方案中，免疫球蛋白γ-1的Fc区是CH2-删除的-Fc，其中包括部分铰链区和CH3区，而不包括CH2区。CH2-删除的-Fc已经在Gillies等人，1990，Hum.Antibod.Hybridomas，1：47中描述。在一些实施方案中，使用IgA、IgD、IgE或IgM的Fc区。
可以用几种不同结构来构建Sp35-Fc融合蛋白。在一种结构中，Sp35部分的C末端被直接融合到Fc部分的N末端上。在一种稍微不同的结构中，将短多肽例如2-10个氨基酸，插入到Sp35部分的N末端和Fc部分C末端之间的融合中。这种接头具有构象弹性，在有些情形下会提高生物学活性。如果在Fc部分中保留足够的铰链区部分，Sp35-Fc融合将会二聚化，从而形成二价分子。相同群体的单体Fc融合物将会产生特异性的、二价二聚物。各自具有不同特异性的两种单体Fc融合物的混合将会生成双特异性的、二价二聚物。
可以使用大量含有相应的氨基反应基和巯基反应基的交联剂的任何一种，将Sp35连接到血清白蛋白上。合适的交联剂的例子包括氨基反应交联剂，该交联剂插入与巯基反应的马来酰亚胺，例如SMCC、AMAS、BMPS、MBS、EMCS、SMPB、SMPH、KMUS和GMBS。其它合适的交联剂插入与巯基反应的卤代乙酸盐(酯)(haloacetate)基团，例如SBAP、S1A、SLAB。为与巯基反应提供的保护性或非保护性的硫醇(thiol)以产生还原性连接的接头包括SPDP、SMPT、SATA和SATP。这种试剂可以购买得到(例如，Pierce Chemicals)。
偶联不必包括Sp35多肽的N末端或者血清白蛋白的巯羟基部分。例如，可以采用遗传工程化技术来获得Sp35-白蛋白融合物，其中Sp35部分被融合到血清白蛋白基因的N末端、C末端或两者上。
Sp35多肽被融合到异源多肽上，以方便Sp35部分的纯化或鉴定。例如，将组氨酸标记融合到Sp35多肽上，方便采用商业上可获得的层析介质来纯化。
在本发明的一些实施方案中，用Sp35融合构建体来提高在细菌中生成Sp35部分。在这种构建体中，高水平表达和/或分泌的细菌蛋白被用作Sp35多肽的N末端融合配偶体。参见，例如Smith等人，1988Gene 67：31；Hopp等人，1988，Biotechnology 6：1204；La Vallie等人，1993，Biotechnology 11：187。
在本发明的一些实施方案中，融合构建体包括Sp35部分和第二个人NgRl-结合部分，例如少突细胞髓磷脂糖蛋白(OMgp)部分、髓磷脂相关糖蛋白(MAG)部分或Nogo66部分。这种构建体的优点包括NgRl结合亲合性升高。
全长的Omgp氨基酸序列在本领域是已知的(Genbank登录号P23515)。Sp35-OMgp融合物的特定例子包括如下：
Sp35(氨基酸34-532)+IgGl Fc+OMgp(氨基酸残基25-400)；和
Sp35(氨基酸34-532)+HSA+OMgp(氨基酸残基25-400)。
全长的MAG氨基酸序列在本领域是已知的(Genbank登录号A61084)。Sp35-MAG融合物的特定例子包括如下：
Sp35(氨基酸34-532)+IgGl Fc+MAG(氨基酸残基12-500)；和
Sp35(氨基酸34-532)+HSA+MAG(氨基酸残基12-500)。
全长的Nogo氨基酸序列在本领域是已知的(NogoA Genbank登录号AY102279)。Sp35-Nogo融合物的特定例子包括如下：
Sp35(氨基酸34-532)+IgGl Fc+Nogo66(NogoA氨基酸残基1056-1122)；
Sp35(氨基酸34-532)+HSA+Nogo66(NogoA氨基酸残基1056-1122)；
Sp35(氨基酸34-532)+IgGl Fc+氨基Nogo(NogoA氨基酸残基1-949)；和
Sp35(氨基酸34-532)+HSA+氨基Nogo(NogoA氨基酸残基1-949)。
将Sp35部分融合到合适的融合配偶体的氨基末端和羧基末端上，可以获得二价或者四价形式的Sp35多肽。例如，将Sp35部分融合到Ig部分的氨基末端和羧基末端上，生成含有两个Sp35部分的二价单体多肽。借助Ig部分，二聚化两个这种单体，获得四价形式的Sp35蛋白。这种四价形式用于提高对靶点的结合亲合性。将Sp35部分串联放置，形成串联体，获得多价形式的Sp35，该串联体可以单独使用或者被融合到融合配偶体如Ig或HSA上。
偶联多聚体(除多肽之外)
本发明的一些实施方案涉及一种Sp35多肽，其中一种或多种多聚体被偶联(共价连接)到Sp35多肽上。适合用于这种偶联的多聚体的例子包括多肽(上述)、糖多聚体和聚亚烷基二醇链。典型地，但是不是必需，多聚体被偶联到Sp35多肽上，以提高一种或多种如下性能：溶解性、稳定性或生物利用度。
用于偶联到Sp35多肽上的优选类型的多聚体是聚亚烷基二醇。聚乙二醇(PEG)是特别优选的。PEG部分，例如1个、2个、3个、4个或5个PEG的多聚体被偶联到各个Sp35多肽上，以当与单独的Sp35多肽相比时，延长了血清半衰期。PEG部分是非抗原性的，和基本上是生物学惰性的。用于实施本发明的PEG部分可以是有分支的或无分支的。
连接到Sp35多肽上的PEG部分的数量以及单条PEG链的分子量是可变的。总之，多聚体的分子量越大，连接到多肽上的多聚体链越少。优选地，连接到Sp35多肽上的所有多聚体的质量为20kDa到40kDa。因此，如果连接一条多聚体链，该链的优选分子量为20-40kDa。如果连接两条链，每条链的优选分子量为10-20kDa。如连接三条链，优选每个链的分子量为7-14kDa。
多聚体，例如PEG，通过任何合适的、暴露在多肽上的反应基团连接到Sp35多肽上。暴露的反应基团可以是，例如，内在的赖氨酸的N末端氨基或ε氨基，或者两者。活化的多聚体发生反应，并共价连接到Sp35多肽上的任何游离氨基上。Sp35上的游离的羧基、合适的活化的羰基、羟基、胍基、咪唑、氧化的碳水化合物部分和巯基(如果有)也可以被用作多聚体连接的反应基团。
优选地，在偶联反应中，根据多肽的浓度，每摩尔多肽使用从约1.0-约10摩尔的活化的多聚体。通常，所选择的比例表示最大化该反应和最小化副反应(通常是非特异性的)之间的平衡，该副反应会影响Sp35的期望药学活性。优选地，Sp35多肽的生物活性的至少50％被保留(如在本文所描述或者本领域已知的任何分析中所证明)，最优选几乎100％被保留。
用传统化学方法，将多聚体偶联到Sp35多肽上。例如，聚亚烷基二醇部分被偶联到Sp35多肽的赖氨酸的ε氨基上。可以用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯例如PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS-PEG)和琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA-PEG)，连接到赖氨酸侧链上。合适的聚亚烷基二醇部分包括，例如羧甲基-NHS、正亮氨酸-NHS、SC-PEG、tresylate、醛、环氧化物、金刚基咪唑和PNP碳酸盐。这些试剂可以购买得到。可用其它胺反应活性的PEG接头来取代琥珀酰亚胺部分。这些包括，例如异硫氰酸盐、碳酸硝基苯酯、环氧化物和苯并三唑碳酸盐。优选选择反应条件，以最大化选择性和程度或者反应。这种反应条件的优化是本领域普通技术人员能力范围内的事。
可以用本领域已知的任何PEG化反应来进行PEG化。参见，例如Focuson Growth Factors，3：4-10，1992；公开的欧洲专利申请EP 0154316和EP0401384。可以用反应活性的聚乙二醇分子(或类似的反应活性的水溶性多聚体)，通过酰化反应或烷基化反应来进行PEG化。
通过酰化来PEG化通常包括与聚乙二醇的活性酯衍生物反应。任何反应活性PEG分子都可以被用于PEG化中。优选的活化的PEG酯是被酯化到N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)上的PEG。如在此所用，“酰化”包括，而不限于如下类型的治疗性蛋白和水溶性多聚体如PEG之间的连接：酰胺、氨基甲酸酯、氨基甲酸乙酯等。参见，例如，Bioconiugate Chem.5：133-140，1994。应当选择反应参数来避免将会损害或灭活Sp35多肽的温度、溶剂和pH条件。
优选地，连接键为酰胺。优选地，至少95％的最终产物是一个、二个或三个PEG化的。但是，一些具有较高PEG化程度的种类以一定量形成，取决于所用的特定反应条件。可选择地，通过传统的纯化方法，包括例如透析、脱盐、超滤、离子交换层析、凝胶过滤层析和电泳，从混合物中分离纯化的PEG化种类，特别是未反应的种类。
通过烷基化PEG化通常包括在存在还原剂时，将PEG的末端醛衍生物与Sp35反应。此外，可以操作反应条件，以基本上仅在Sp35的N末端氨基发生PEG化(即，单一PEG化的蛋白)。在单一PEG化或多PEG化的情形下，PEG基团优选通过-CH2-NH-基团连接到蛋白质上。特别提及的是-CH2-基团，该类型的连接被称作为“烷基”连接。
通过还原性烷基化进行衍生，生成单一PEG化产物，利用了可用于衍生化的不同类型的伯氨基(相对于N末端的赖氨酸)的不同反应活性。在一定pH下进行反应，使得可以利用赖氨酸残基的ε氨基和蛋白质的N末端氨基之间的pKa差异。通过这种选择性的衍生化，控制含有反应活性基团如醛的水溶性多聚体连接到蛋白质上：与多聚体的偶联主要发生在蛋白质的N末端，而其它反应基团例如赖氨酸侧链氨基无显著的改变发生。
用于酰化和烷基化方法中的多聚体分子选自水溶性多聚体。所选择的多聚体应当被修饰，以具有单一的反应基团，例如用于酰化的活性酯或者用于烷基化的醛，优选地，在本发明的方法中控制聚合程度。示例性的反应活性PEG醛为聚乙二醇丙醛，这种醛是水溶性的，或其单C1-C10烷氧基的或芳氧基的衍生物(参见，美国专利5,252,714)。多聚体可以是分支的或无分支的。对于酰化反应，所选择的多聚体应当具有单一的反应活性酯基。对于还原的烷基化，所选择的多聚体应当具有单一的反应活性的醛基。总之，水溶性的多聚体不选自天然存在的糖基残基，因为这些残基通常更加便利地通过哺乳动物重组表达系统来制备。
用于制备PEG化Sp35的方法通常包括步骤：(a)在分子连接到一个或多个PEG基团上的条件下，将Sp35蛋白或多肽与聚乙二醇(例如PEG的反应活性的酯或醛衍生物)反应，和(b)获得反应产物。总之，可以根据已知的反应参数和期望结果，逐一地确定用于酰化反应的最佳反应条件。例如，PEG：蛋白的比例越大，多聚PEG化的产物的比例越高。
用于生成基本上均一的(homogeneous)单多聚体/Sp35的群体的还原烷基化反应通常包括步骤：(a)在还原烷基化反应条件下，在适合选择性地修饰Sp35的N末端氨基的pH下，将Sp35蛋白或多肽与反应活性的PEG分子反应；和(b)获取反应产物。
对于基本上均一的单多聚体/Sp35的群体，还原的烷基化反应条件是允许选择性地将水溶性多聚体部分连接到Sp35的N末端上的条件。这种反应条件通常规定在赖氨酸侧链氨基和N末端氨基之间存在pKa差异。为了本发明的目的，优选pH的范围在3-9，优选为3-6。
Sp35多肽可以包括标记，例如随后可以通过蛋白水解释放的部分。因此，赖氨酸部分首先用具有低分子量的接头如Traut试剂(Pierce)修饰的His标记反应选择性地修饰，Traut试剂会与赖氨酸和N末端反应，然后释放His标记。然后多肽含有游离的SH基团，SH基团选择性地被含有巯基反应活性的头部基团(head group)的PEG修饰，头部基团如马来酰亚胺基、乙烯基碘酸(vinylsulfone)基团、卤代醋酸盐(酯)基团或者游离的或被保护的SH。
Traut试剂可以用任何可以为PEG连接建立特定位点的接头所替代。例如，Traut试剂可以用SPDP、SMPT、SATA或SATP(Pierce)替代。类似地，还可以将蛋白质与胺反应活性的接头反应，插入马来酰亚胺(例如SMCC、AMAS、BMPS、MBS、EMCS、SMPB、SMPH、KMUS或GMBS)、卤代醋酸盐(酯)基团(SBAP、SIA、SIAB)或者乙烯基碘酸基团，和将生成的产物与含有游离SH的PEG反应。
在一些实施方案中，聚亚烷基二醇部分被偶联到Sp35多肽的半胱氨酸基团上。采用马来酰亚胺基团、乙烯基碘酸基团、卤代醋酸盐(酯)基团或巯基基团来进行偶联。
可选择地，Sp35多肽通过不稳定键偶联到聚乙二醇部分上。在如生物化学水解、蛋白水解或者巯基断裂中，这种不稳定键会被断裂。例如，该键在体内(生理)条件下被断裂。
如果反应活性基团位于N末端的α氨基上时，优选在约pH5-8，例如，pH5，6，7或8，通过任何用于使生物活性材料与惰性多聚体反应的合适方法进行反应。通常，该过程包括制备被活化的多聚体，接着将蛋白质与被活化的多聚体反应，制备适合配制成制剂的可溶性蛋白。
载体
本发明提供包含编码Sp35多肽的核酸的载体。对载体和可操作连接本发明的核酸的表达控制序列的选择取决于期望特性，例如，蛋白质表达和所要转化的宿主细胞。
在本领域，用于调控被可操作地连接的编码序列的表达的表达控制元件是已知的。例子包括，但是不限于，诱导型启动子、组成型启动子、分泌信号和其它调控元件。当使用诱导型启动子时，其表达受宿主细胞培养基中的营养状况的变化或温度变化的控制。
该载体包括原核复制子，即能够在细菌宿主细胞中引导自动复制维持染色体外和重组DNA分子的DNA序列。在本领域，这种复制子是已知的。此外，包括原核复制子的载体还包括其表达赋予可检测标记如抗药性的基因。细菌抗药性基因的例子是赋予对氨卡青霉素或四环素抗性的那些基因。
包括原核复制子的载体还包括原核或噬菌体启动子，用于在细菌宿主细胞中引导编码基因序列的表达。通常在质粒载体中提供与细菌宿主相容的启动子序列，该质粒载体含有用于插入将要表达的DNA片段的便捷限制性位点。这种质粒载体的例子为pUC8、pUC9、pBR322和pBR329(BioRad)、pPL和pKK223(Pharmacia)。任何合适的原核宿主都可以被用于表达编码本发明的蛋白质的重组DNA分子。
在本领域，真核细胞表达载体是已知的，可以购买得到。典型地，这种载体含有用于插入期望的DNA片段的便捷的限制性位点。示例性的载体包括pSVL和pKSV-10(Pharmacia)、pBPV-1、pML2d(InternationalBiotechnologies)、pTDTl(ATCC 31255)，逆转录病毒表达载体pMIG、腺病毒穿梭载体pDC315和AAV载体。
真核细胞表达载体可以包括可选择标记，例如，抗药性基因。新霉素磷酸转移酶(neo)基因(Southem等人，1982，J.Mol.Anal.Genet.1：327-341)是这种基因的一个例子。
为了表达抗体或抗体片段，编码部分或全长的轻链和重链的DNA被插入到表达载体中，例如质粒、逆转录病毒、粘粒、YACs，、EBV来源的附加体等。选择表达载体和表达控制序列，与所用的表达宿主细胞相容。抗体轻链基因和抗体重链基因被插入到分开的载体中。在一些实施方案中，这两种基因被插入到同一表达载体中。
便捷的载体是编码功能完整的人CH或CL免疫球蛋白序列的载体。优选地，工程化限制性位点，使得可以容易地插入和表达任何的VH和VL序列。在这种载体中，剪接通常发生在插入J区中的剪接供体位点和人C区前的剪接受体位点之间，还发生在存在于人CH外显子的剪接区。多聚腺苷酸化和转录终止发生在编码区下游的天然染色体位点上。重组表达载体还编码信号肽，该信号肽方便抗体链从宿主细胞中分泌。
用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括病毒性元件，该元件在哺乳动物细胞中引导高水平的蛋白表达，例如来源于逆转录病毒LTR和巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)，来源于猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))、多瘤病毒的启动子和增强子以及强大的哺乳动物启动子如天然免疫球蛋白和肌动蛋白启动子。对病毒性调控元件及其序列的进一步描述参见，例如Stinski美国专利5,168,062；Bell美国专利4,510,245和Schaffner美国专利4,968,615。
重组表达载体含有在宿主细胞中调控载体复制的序列(例如复制起始)和可选择的标记。可选择的标记基因方便导入载体的宿主细胞的分泌(参见，例如Axel美国专利4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，典型地，可选择标记基因赋予宿主细胞对药物的抗性，例如对G418、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性，宿主细胞中导入了载体。优选的可选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于用氨甲蝶呤选择/放大的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用G418选择)。
编码Sp35多肽和抗Sp35抗体的核酸分子，以及包含这些核酸分子的载体用于合适的宿主细胞转化。转化可以通过任何合适的方法进行。用于将外源DNA导入哺乳动物细胞中的方法在本领域是已知的，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、polybrene介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸封装在脂质体中，和将DNA微注射到细胞核中。此外，通过病毒载体将核酸分子导入哺乳动物细胞中。
用适合于所采用的载体和宿主细胞的常规方法进行宿主细胞的转化。对于原核宿主细胞的转化，可采用电穿孔和盐处理方法(Cohen等人，1972，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69：2110-2114)。对于脊椎动物细胞的转化，可以采用电穿孔、阳离子脂质或盐处理的方法。参见，例如Graham等人，1973，Virology 52：456-467；Wigler等人，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：1373-1376f。
在本领域，可获得作为表达宿主的哺乳动物细胞系是已知的，包括许多可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的无限增殖的细胞系。这些细胞其中包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼儿仓鼠肾脏(BHK)细胞、猴肾脏细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)、A549细胞和大量其它细胞系。
可以用已知方法来增强从产物细胞系中表达多肽。例如，谷氨酸合成酶(GS)系统通常被用于在一定条件下增强表达。参见，例如欧洲专利0216846、0256055和0323997和欧洲专利申请89303964.4。
宿主细胞
宿主细胞可以是原核细胞或者真核细胞。优选的真核宿主细胞包括，但是不限于，酵母和哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(ATCC保藏号CCL61)、NIH Swiss小鼠胚胎细胞NIH-3T3(ATCC保藏号CRL1658)和幼儿仓鼠肾脏细胞(BHK)。其它有用的真核宿主细胞包括昆虫细胞和植物细胞。示例性的原核宿主细胞为大肠杆菌和链霉菌。
制剂
含有Sp35多肽、抗Sp35抗体或者抗Sp35抗体的抗原结合片段的组合物含有药学上可接受的载体。例如，组合物可以含有赋形剂和/或佐剂，以有利于将活性化合物加工成适合向作用部位递送的制剂。用于胃肠外施用的合适制剂包括水溶形式的活性化合物的水溶液，例如水溶性盐。此外，可以施用作为合适的油性注射悬浮液的活性化合物的悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括油脂，例如，芝麻油或者合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或者甘油三酯。水性注射悬浮液含有增加悬浮液粘性的物质，包括，例如，羧甲基纤维素钠、山梨醇和葡聚糖。可选择地，悬浮液还含有稳定剂。脂质体可用于封装本发明的分子，以递送到细胞中或者胞间隙中。示例性的药学上可接受的载体为生理相容的溶剂、分散介质、包被物、抗菌剂和抗真菌剂、等渗试剂和延缓吸收试剂、水、盐水、磷酸缓冲盐溶液、葡聚糖、甘油和乙醇等。在一些实施方案中，组合物含有等渗试剂、例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。在一些实施方案中，组合物含有药学上可接受的物质如湿润剂或少量的辅佐物质如湿润剂或乳化剂，防腐剂或缓冲液，延长了活性成分的保存期限或者提高效力。
本发明的组合物可以是各种形式的，包括，例如，液体(例如，可注射的和可灌注的溶液)、分散液、悬浮液、半固体和固体的剂量形式。优选形式取决于施用的模式和治疗性应用的模式。
组合物可被配制成溶液、微乳化液、分散液、脂质体或者其它适合高药物浓度的有序结构(ordered structure)。按照需要，将以所需量溶解在合适的溶剂中的活性成分与上面列举的成分的一种或其组合相结合，接着通过过滤灭菌，制备无菌的注射液。通常，通过将活性成分纳入到无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体含有基础分散介质和来自上面列举的那些的其它必需成分。对于用于制备无菌的可注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥，产生活性成分的粉末，加入到从先前的无菌过滤溶液中获得的任何其它期望的成分。维持适当的溶液流动性，例如使用包被，入卵磷脂，在为分散体的情形下维持期望的颗粒大小，和使用表面活性剂。在组合物中包括延长吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，延长可注射的组合物的吸收。
活性成分与控制释放制剂或装置一起配制。这种制剂和装置的例子包括埋植剂(implant)、经皮贴片和微包囊的递送系统。使用可生物降解的、生物相容性多聚体，例如，乙烯基醋酸乙酯、多元酸酐(polyanhydride)、聚乙二醇酸(polyglycolic acid)、胶原聚原酸酯和多聚乳酸。用于制备这种制剂和装置的方法是本领域已知的。参见，例如Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems，J.R.Robinson编辑，MarcelDekker，Inc.，纽约，1978。
通过在可生物降解的多聚体如聚交酯-聚乙醇的交酯中形成药物的微包囊基质，制备可注射的存储制剂。根据药物与多聚体的比例和所用的多聚体的性质，可以控制药物释放的速度。其它的示例性可生物降解的多聚体为聚原酸酯(polyorthoester)和多元酸酐。将药物装载在脂质体或者微乳剂中，制备可注射的存储制剂。
将辅助的活性化合物结合到组合物中。在一些实施方案中，Sp35多肽、抗Sp35抗体或其片段与抗NgRl抗体，或其抗原结合片段，或可溶的NgRl多肽或者NgRl融合蛋白一起施用。
调整剂量方案，产生最佳的期望反应。例如，施用单次大药丸(bolus)给药，在一段时期内施用多个分开的剂量，或者可以根据治疗情形的要求，按比例地减少或增加剂量。以容易施用和统一剂量地配制胃肠外组合物是有利的。参见，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，Easton，PA 1980)。
除了活性化合物，液体剂量形式含有惰性成分，如水、乙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油脂、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯。
基因治疗
在哺乳动物体内生成Sp35多肽，例如在人类患者中，采用基因治疗方法来治疗CNS疾病、异常或损伤，在该疾病、异常或损伤中，降低对轴突伸长的抑制在治疗上是有益的。该方法包括施用被可操作地连接到合适的表达控制序列上的合适的表达Sp35多肽的核酸。优选地，这些序列被结合到病毒性载体中。用于这种基因治疗的合适病毒性载体包括腺病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、EB病毒载体、乳多空病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体和腺伴随病毒(AAV)载体。病毒性载体可以是复制缺陷的病毒性载体。优选的腺病毒载体缺失其E1基因或者E3基因。当采用腺病毒载体时，优选该哺乳动物不暴露于编码可选择的标记基因的核酸。
                          实施例
通过如下实验性实施例来阐明本发明。提供实施例，仅用于说明目的，而无论如何不被解释为限制本发明的保护范围或内容。
实施例1：Sp35的表达模式
通过Northern印迹分析，评价Sp35在人组织中的表达。在68℃，含有12种人的主要组织或者14种人的CNS组织的多组织印迹与p32标记的Sp35探针(Sp35cDNA序列的核苷酸150-450)杂交过夜。用2x SSC，0.5％SDS洗涤印迹3次，然后用0.5x SSC，0.1％SDS洗涤3次。然后将印迹曝光到X射线胶片上，通过自动射线照相术显示mRNA水平。
Sp35在人大脑中高度表达，但是在心脏、骨骼肌、结肠、胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、胎盘、肺和外周血白细胞中，表达水平不高。在所有被检测的大脑组织中，都表达Sp35，包括前皮层(frontal cortex)、后皮层(posterior cortex)、海马、嗅球、纹状体、丘脑、小脑、中脑、脑桥、延髓和脊髓。沿着喙/索轴(rostral/cordal axis)，观察Sp35的基因表达梯度，最高表达水平在皮层，最低表达水平在脊髓。
采用免疫组织化学(IHC)染色，确定在特定大脑细胞中是否表达Sp35。按需要，将4％多聚甲醛固定的大鼠大脑、脊髓切片或者原代粒状神经元(granular neuron)培养物与第一Sp35抗体温育，接着用偶联到Alexa 480或590(Molecular Probes Inc.)上的第二抗体温育。然后将切片装载在Vectashield中，用荧光显微镜显示。采用MorPhosys技术，从Fab噬菌体展示文库中生成用于IHC的抗Sp35的特定抗体。
在神经元和少突细胞中，特异性地表达Sp35，在星形胶质细胞中不表达Sp35。这在用各种试剂对大鼠大脑组织切片染色的试验中被确定，这些试剂包括抗星形胶质细胞的标记GFAP、少突细胞标记的抗体(O4)和对神经元标记βIII微管蛋白的抗体，都用抗Sp35抗体进行复染。少突细胞和神经元被抗Sp35抗体强烈地染色。而星形胶质细胞未被染色。
作为一种不受约束的对Sp35的表达模式的证实，用mRNA进行半定量的RT-PCR，mRNA从大鼠的纯化星形胶质细胞、少突细胞和小脑粒状神经元的原代细胞培养物中提取得到(Ambion试剂盒)。采用正向引物AAGGCCCAGCAGGTGTTTGTGGA(SEQ ID NO：14)和反向引物TACTCGATCTCGATGTTGTGCTTT(SEQ ID NO：15)。进行26个循环，在来自神经元的mRNA中观察到明显的条带，在少突细胞的mRNA中检测到清楚但是较弱的信号，在星形胶质细胞中未观察到条带。
实施例2：Sp35-Fc融合蛋白
为了研究Sp35的生物学功能，制备一个构建体，将人Sp35的细胞外部分(残基1-531)融合到人IgGl的铰链区和Fc区上。采用正向引物5′CAGCAGGTCGACGCGGC CGCATGCTGGCGGGGGGCGT3′(SEQ ID NO：16)和反向引物5′CAGCAGGTCGACCTCGCCCGGCTGGTTGG3′(SEQIDNO：17)，通过PCR，从克隆227.2(Incyte)获得人Sp35的部分编码序列。
将平端PCR产物亚克隆到PCR SCRIPT AMP载体(Stratagene)的Srf I位点上，生成PCR SCRIPT AMP-sp35。从PCR SCRIPT AMP-sp35分离Sal I片段，亚克隆到PCRCAMP Ig载体中(Stratagene载体PCR SCRIPT AMP的衍生物，其中Fcγ序列作为SalI(5′)亚克隆到NotI(3′)的片段)，在读框内，将Sp35信号序列和外结构域序列(密码子1-531)与编码人Igl的铰链区和Fc区的序列融合。鉴定正确的分离物，将包括Sp35Fc片段的Not I片段亚克隆到293E表达载体CH274的单一克隆Not I位点上，所述CH274是商业表达载体REP4(Invitrogen)的衍生物。新载体CH274/sp35-Fc编码的Sp35-Fc融合物通过DNA测序被确定为质粒GT123。
用质粒GT123通过电穿孔CHO宿主细胞DG44，生成表达Sp35-Fc融合蛋白的稳定细胞系。在存在10％的透析血清和4mM谷氨酰胺时，将被转染的CHO细胞培养在alpha minus MEM中，选择不依赖于核苷的生长。在转染后14天，往细胞中加入新鲜的培养基。为了筛选表达Sp35-Fc的细胞，用藻红蛋白(PE)标记的山羊抗人IgG(Jackson Labs)来标记CHO细胞，在FACS Mo-Flo(Cytomation)中进行高速流式细胞计数。选择表达最高水平的Sp35-Ig的细胞。在培养中扩增这些细胞7天，然后再标记和再计数。在96孔平板中，以单个克隆分离表达最高水平的Sp35-Ig的细胞。这些克隆生长两周，然后在进行FACS分析前的一天，加入新鲜的培养基，以检测表达水平。扩增表达最高水平的Sp35-Fc的克隆，建立冷冻细胞库使该细胞适应以悬浮形式在无血清培养基BCM16中生长。在37℃下培养细胞系4-5代，以确定由这些克隆生成的Sp35-Fc的滴度，然后培养细胞到50％的最大细胞密度，在28℃培养细胞10-15天，直到活细胞密度降低到75％。此时，收集培养基，通过离心去除细胞和碎片，用抗人Ig抗体(Jackson Lab)作为探针，通过Western印迹滴定培养上清液的Sp35-Fc水平。
如下，从澄清的培养基中纯化Sp35-Fc融合蛋白：将9ml的1M HEPESpH7.5加入到900ml条件培养基中。在4℃，将培养基批量3小时加载到3ml的蛋白A琼脂糖(Pharmacia)上。将该树脂集中到1.5cm(I.D.)柱中，用3ml PBS洗涤四次，用4ml含有800mM NaCl的PBS洗涤2次，然后再用3mL PBS洗涤一次。用25mM NaH2PO4 pH2.8，100mM NaCl以1.5mL级分洗脱Sp35-Fc，加入75μL的0.5M NaH2PO4 pH8.6进行中和。根据280nm的吸收值，确定含有峰值蛋白的级分，汇集，在1mL蛋白A柱中进一步纯化。在加载前，加入NaCl达600mM和加入HEPES pH7.5达50mM。柱用600μL的10mM HEPES pH7.5，1M NaCl洗涤两次，然后用1mL PBS洗涤。用25mM NaH2PO4 pH2.8，100mM NaCl从柱上洗脱Sp35-Fc，收集0.5mL级分，加入25μL的0.5MNaH2PO4 pH8.6进行中和。根据280nm的吸收值，确定含有峰值蛋白的级分，汇集。通过还原SDS-PAGE，Sp35-Ig以具有90kDa的表观质量的单一条带(＞95％的纯度)迁移。在非还原的条件下，蛋白质以具有180kDa的表观质量的二聚物迁移。等分纯化的Sp35-Fc并且存储在-70℃下。GT123的Not I片段含有Sp35氨基酸1-531和人IgGlFc，被亚克隆到PV90载体的Not I位点上，产生DB002。
实施例3：His-AP-Sp35融合蛋白
为了研究和分离Sp35的受体，在COS7和CHO细胞中以His标记的碱性磷酸酶(His-AP)融合蛋白表达Sp35。如下构建质粒：用引物(正向)5′-AATTAA GAATTCACGGGCTGCCCGCCCCGCTGCGAGT-3′(SEQ IDNO：18)，含有Eco RI切割位点(下划线)和(反向)5′TATATT TCTAGATCACTCGCCCGGCTGGTTGGAGATGAAAGCGA-3′(SEQ ID NO：19)，含有Xba I切割位点(下划线)，PCR扩增Sp35的细胞外结构域(氨基酸34-532)。用XbaI切割PCR产物，生成的粘性末端用T4DNA聚合酶补平，然后用Eco RI消化，凝胶纯化。将消化产物连接到来自His-AP-pcDNA 1.1载体(Invitrogen)的Hind III添加/EcoR I His-AP片段。用Hind III和Eco RI消化His-AP-Sp35片段，补平，然后连接到载体pV90中的Not I添加位点上。通过DNA测序来确认插入物的DNA序列。
转染的前一天，破裂COS7细胞。采用脂质转染胺(Invitrogen)，用His-AP-Sp35载体DNA(8μg)转染5×106细胞。转染后48小时，收集条件培养基。
采用pV90质粒，本发明人开发了表达His-AP-Sp35融合蛋白的CHO细胞系。用100μg质粒通过电穿孔转染CHO宿主细胞DG44(2×106个细胞)。存在10％的被透析血清和4mM谷氨酰胺时，在alpha minus MEM中培养细胞，选择不依赖于核苷的生长。在转染后14天，往细胞中加入新鲜的培养基，期望通过FACS Mo-Flo(Cytomation)计数进行筛选。用抗人胎盘碱性磷酸酶(Sigma)的小鼠单克隆抗体8B6标记被转染的CHO细胞。用二抗体PE标记的山羊抗小鼠IgG产生特异于转染细胞的信号。在PE标记后，对细胞进行高速流式细胞分选，选择峰端的5％(the top 5％selected)。
为了用His-AP-Sp35制备条件培养基，选择表达最高水平HIS-ApSp35的细胞。使细胞系适应悬浮培养在无血清的培养基(BCM16)中。通过在37℃进行4-5次传代，然后培养细胞到50％的最大细胞密度，在28℃培养10-15天，直到活细胞浓度降低到75％，确定由这些克隆产生的His-AP-Sp35的滴度。收集培养基，通过离心去除细胞和碎片，用抗人AP抗体(Jackson Labs)作为探针，通过Western印迹滴定培养上清液中的His-AP-Sp35水平。
如下，从澄清的培养基中纯化His-AP-Sp35：用400mL水稀释400mL来自表达His-AP-Sp35的CHO细胞的条件培养基。加入0.5M的母液，使得三羟基乙基胺pH8.5到25mM，在4℃，将样本批量加载到6ml的Fractogel TMAE(EM Industries)阴离子交换树脂中2小时。将树脂收集到1.5cm(I.D.)柱中，用6mL的10mM HEPES pH7.5，50mM NaCl洗涤两次。用10mM HEPES pH7.5，200mM NaCl，将AP-Sp35洗脱到2mL的级分中。通过监控AP活性和通过SDS-PAGE，确定峰值级分。来自TMAE柱的流下来的级分用300ml水进一步稀释，在4℃批量过夜加载到6ml的TMAE树脂中。收集树脂，并且如上所述进行洗涤，用10mM HEPES pH7.5，150mMNaCl洗脱。再通过监控AP活性和通过SDS-PAGE，确定峰值级分。来自第一柱的His-AP-Sp35的纯度为50％，而来自第二柱的AP-Sp35的纯度为90％。在还原条件下，His-AP-Sp35以130kDa的表观质量在SDS-PAGE凝胶上迁移。虽然90％纯度物质适合于大部分研究，对于某些研究，在Ni-NTA琼脂糖树脂(Qiagen)上进一步纯化His-AP-Sp35。往来自TMAE柱的洗脱级分中加入NaCl，达到800mM，而加入0.5M三羟基乙基胺pH.8.5和1M咪唑pH7.0，分别达到25mM和15mM。将4.5ml样本加载到400μL NiNTA柱中。该柱用25mM三羟基乙基胺pH8.5，800mM NaCl，15mM咪唑洗涤三次，用200mM咪唑pH7.0，350mM NaCl，从该柱上洗脱His-AP-Sp35，收集200μL级分。收集含有峰值AP的级分，用250体积的10mM HEPES pH7.5，200mM NaCl透析过夜。加入MgCl2和ZnCl2，分别保持在2mM和0.25mM。通过SDS-PAGE，终产物的纯度超过95％，在还原条件下，以具有约140kDa质量的条带迁移。
Sp35构建体还被工程化为Fc融合物。通过PCR生成Sp-35LRR-Fc构建体，采用引物(正向)5′CTTGACACGGGATCCGCGGCCGCATGCTGGCGGGGGGCGTGAGG3′(SEQ ID NO：20)和(反向)5′GCAGCGGGGCGGGCAGCCCGTGGCCGAGCCTGACAGCACTGAGCC3′(SEQ ID NO：21)。将PCR产物插入到PV90载体的NotI位点上。通过PCR生成Sp35IG-Fc构建体，采用引物(正向)5′CTTGACACGGGATCCGCGGCCGCATGCTGGCGGGGGGC  GTGAGG3′(SEQ ID NO：22)和(反向)5′GTCCCGGATGCGGGCGCGGGCCGAGCCTGACAGCACTGAGCCCAG3′(SEQ ID NO：23)。将PCR产物插入到PV90载体的NotI位点上。在CHO细胞中表达蛋白，用蛋白A琼脂糖柱进行纯化。
实施例4：Sp35结合到表达NgRl的细胞上
四种不同方法用于证明Sp35结合到NgRl上。第一，在定向结合分析中检测相互作用，在该分析中，用碱性磷酸酶-Sp35偶联物(AP-Sp35)与表达NgRl的细胞一起培养，用显色AP检测试剂评价结合。将90％汇合的COS7细胞培养在100mm组织培养皿中，采用Fugene 6试剂(Roche)，用表达NgRl的质粒进行转染。48小时后，用HBH(Hank平衡盐缓冲液，1mg/ml BSA，20mM HEPES，pH7.0)洗涤被转染的细胞一次，然后在23℃用溶解在HBH中的4μg/ml的AP-Sp35融合蛋白培养1.5小时。用冰冷的HBH洗涤细胞三次，每次3分钟，然后用溶于20mM HEPES，pH7.0，150mM NaCl中的3.7％甲醛固定l5分钟，再转移到HBH缓冲液中。在67℃，热灭活内在的热不稳定AP。通过用硝基蓝四唑NBT(Roche)温育来检测结合的AP-Sp35。Ap-Sp35结合到表达人NgRl受体的COS7的细胞上，但是不结合到仅用载体转染的对照COS7细胞上。观察NgRl的点状染色模式，表明仅一种级分，约50％细胞转染了NgRl。
为了更好地量化结合，进行相同试验，但是平行细胞样本用8，4，2，1，0.5，0.125，0.06μg/ml的AP-Sp35处理。被结合的AP与4-磷酸硝基苯温育，在96孔平板阅读器(Molecular Devices)中评价AP活性。从这些数据可以估计，Ap-Sp35结合到人NgRl上的EC50约6nM。
第二，在ELISA方法中检测Sp35结合到NgRl上。在37℃，用溶解在0.1M NaHCO3，pH9.0中的10μg/ml可溶性的NgRl-Fc受体(含有融合到大鼠IgGl铰链区和Fc上的大鼠NgRl肽35-310的sNgR310-Fc和含有融合到大鼠IgGl上的大鼠NgRl肽35-344的sNgR344-Fc)包被ELISA平板(Costar)1小时。用25mM Hepes，pH7.0，0.1％BSA，0.1％卵清白蛋白，0.1％无脂奶粉和0.001％NaN3封闭和洗涤平板。将4μg/ml的AP-Sp35蛋白添加到平板上，4℃温育过夜。然后用10mM Tris pH7.5，150mM NaCl洗涤平板，用稀释在0.1M甘氨酸、1mM MgCl2、1mM ZnCl2 pH10.5中的10μg/ml显色底物4-磷酸硝基苯检测结合的AP。在装备有Softmax程序的ELISA阅读器(MolecularDevices)中确定OD410。AP-Sp35结合到固定的sNgR-344-Fc上，但是未结合到sNgR-310-Fc蛋白上，表明较长的NgRl是Sp35竞争结合所需的。通过用100倍过量的sNgR344-Fc预培养AP Sp35，可以使80％的AP-Sp35竞争结合到sNgR344-Fc NgRl上。用猬-大鼠Igl融合蛋白作为大鼠Ig融合对照蛋白，未出现结合竞争。
第三，通过用NgRl免疫共沉淀Sp35，检测Sp35结合到NgRl上。对于该研究，生长在100mm的组织培养皿上的80％汇合COS7细胞用编码Sp35-血凝素(Sp35-HA)的质粒转染，转染后48小时，用Fugene 6试剂(Roche)进行NgR-FLAG，收集细胞，在4℃，在1ml的溶解缓冲液(50mM HEPES，pH7.5，150mM NaCl，1.5mM MgCl2，1mM EGTA，1％Triton X-100和10％甘油)中溶解30分钟。然后，以14,000xg离心溶解产物15分钟，收集上清液，4℃搅拌培养过夜，使用抗HA亲合基质(Roche)。样本用1ml溶解缓冲液洗涤3次，然后在Laemmli样本缓冲液中沸腾3分钟，进行4-15％SDS-PAGE，用抗FLAG M2抗体(Sigma)，进行免疫印迹分析。抗HA标记亲合树脂收集含有Sp35-HA和FLAG-NgR的复合物，作为FLAG存在的证据。该复合物不存在于来自对照转染的溶解产物中，在对照转染中，细胞仅用Sp35-HA质粒或者FLAG-NgRl质粒处理，或者细胞用Flag-NgRI和HA标记的对照蛋白共转染，对照蛋白不结合NgRl。
如下制备Sp35-HA。PCR扩增Sp35信号序列和细胞外结构域(氨基酸1-531)，采用引物5′ATAT TCTAGAATGCTGGCGGGGGGCGTGAG3′(SEQIDNO：24)和5′ATAT ACTAGTGTCGTTGCCGCCCGCGTTGG3′(SEQID NO：25)，含有XbaI和SpeI位点(下划线)。PCR产物用XbaI和SpeI消化，被插入到载体pCGCHA中，在Xba I和Spe I位点之间。插入物的序列通过DNA测序确认。FLAG NgRl构建体由Zhigang He博士赠送(Nature，420，2002年7月)。
第四，本发明人证明Ap-Sp35结合到表达NgRl的大鼠小脑粒状神经元(CGN)上。对于该试验，90％汇合的出生后8天的CGN细胞生长在100mm的组织培养皿上。48小时后，细胞用HBH缓冲液洗涤一次，然后在23℃，用溶解在HBH缓冲液中的4μg/ml的AP-Sp35培养1.5小时。细胞用冰冷的HBH洗涤3次，每次3分钟，然后用溶解在20mM HEPES，pH7.0和150mMNaCl中的3.7％甲醛固定15分钟，再转移到HBH中。67℃下，热灭活内在的热不稳定AP 2小时。通过用硝基蓝四唑NBT(Roche)温育，检测被结合的AP-Sp35。AP-Sp35结合到出生后8天的小脑粒状神经元上，该神经元表达NgRl。用PIPLC(5单位/ml)处理CGN，抑制AP-Sp35结合到神经元上，所述PIPLC从膜表面上断裂大部分的GPI锚定蛋白。由于NgRl是连接GPI的蛋白，该结果进一步证明了Sp35结合到位于CGN细胞上的NgRl上的观点。
实施例5：用NgRl共定位Sp35
为了确定是否在同一神经元上表达Sp35和NgRl，进行共定位试验。4％多聚甲醛固定的大鼠p8原代粒状神经元培养物与抗Sp35和NgR1的抗体一起温育(Santa Cruz)，然后与合适的Alexa标记的第二抗体(MolecularProbesInc.)温育。通过共聚焦荧光显微镜可视所述细胞。神经元强烈地被Sp35和NgRl的抗体染色。神经元的细胞体和轴突中表达这两种蛋白。为了辅助共定位分析，对两种类型的抗体采用不同的着色探针。当染色(红色为NgR阳性细胞，而绿色为Sp35阳性细胞)汇合时，在整个细胞中出现黄色，表明两种蛋白共定位在神经元内。
实施例6：Sp35中的NgRl结合位点
采用缺失作图来定义参与NgRl互作的Sp35的特定结构域。用Stratagene Quikchange Mutagenesis试剂盒，制备缺失构建体。通过对修饰的插入物进行DNA测序，确认所有的载体构建体。
通过PCR，从His-AP-Sp35(氨基酸34-532)载体中克隆含有Sp35的富含亮氨酸重复结构域和碱性区(氨基酸34-432)的His-AP-Sp35b。所用的引物为5′CCCAGCAGGTGTTTGTGGACGAGTGATCTAGGGCCGCGGATCCCTG-3′(SEQ ID NO：26)和5′-CAGGGATCCGCGGCCCTAGATCACTCGTCCACAAACACCTGCTGGG-3′(SEQ ID NO：27)。
His-AP-Sp35d编码Sp35的Ig结构域和碱性区(氨基酸417-531)，是通过PCR，从His-AP-Sp35a(氨基酸37-531)载体克隆得到。所用引物为5′CGCCGCGCACCCGGGTGAATTCCGCGCCCGC ATCCGGGACCGC-3′(SEQ ID NO：28)和5′-GCGGTCCCGGATGCGGGCGCGAATTCACCCGGGTGCGCGGCG-3′(SEQ ID NO：29)。
His-AP-Sp35e仅编码Ig结构域(氨基酸425-531)，是通过PCR从His-AP-Sp35(氨基酸34-532)载体克隆得到。所用引物为5′-CGCCGCGCACCCGGGTGAATTCGCCCAGCAGGTGTTTGTGGAC-3′(SEQ ID NO：30)和5′-GTCCACAAACACCTGCTGGGCGAATTCACCCGGGTGCGCGGCG-3′(SEQ ID NO：31)。
用商业的诱变试剂盒和方案(Stratagene Quikchange)，突变载体His-AP-Sp35(34-532)中的Sp35氨基酸456(由精氨酸变为谷氨酸)和氨基酸458(由组氨酸变为缬氨酸)。所用的引物为5′-CATCCTCTGGCTCTCACCCGAAAAGGTACTGGTCTCAGCCAAGAGC-3′(SEQ ID NO：32)和5′-GCTCTTGGCTGAGACCAGTACCTTTTCGGGTGAGAGCCAGA GGATG-3′(SEQ ID NO：33)。
His-AP-Sp35缺失构建体(附图3)被工程化到pV90表达载体中，在293细胞中表达。收集条件培养基，通过连续的层析步骤，在Fractogel TMAE树脂和NiNTA琼脂糖中纯化AP加合物。检测纯化的蛋白质结合到COS7细胞上表达的NgRl上。三种构建体都微弱地结合到Sp35上。这些结果表明，Sp35LRR的重复1-14(氨基酸34-417)和Sp35的Ig结构域(氨基酸425-531)都对Sp35结合到NgRl上起作用。Ig结构域具有高于LRR结构域的亲合性。
采用NCAM结晶结构作为框架，生成Sp35的Ig结构域的结构模型(Rasmussen等人，2000，Nat.Struct.Biol.7：389-393)。从该模型，可以观察到一个环(残基编号454-458，氨基酸：SPRKH；SEQ ID NO：34)，该环可能参与结合。为了验证该假设，构建Sp35构建体，其中位置456的残基R和位置458的残基H分别被改变为E和V。当该构建体检测NgRl的结合时，观察到信号降低超过10倍。作为检测该环在结合中的作用的替代方法，假设一种肽对应于序列LSPRKH(SEQ ID NO：10)，通过在该肽的N和C末端添加半胱氨酸进行环化。在结合到NgRl时，该肽阻断、抑制和干扰NgRl功能。
实施例7：Sp35诱导p8 CGN成束
为了确定Sp35在神经元中的生物学功能，将Sp35-Fc与出生后8天的粒状神经元一起培养，查看Sp35是否能够调节神经突生成。在点样Sp35-Fc蛋白(16μg/孔蛋白)之前，Labtek培养载玻片(8孔)用0.1mg/ml多聚D-赖氨酸(Sigma)包被。载玻片干燥过夜然后漂洗，用10μg/ml层粘连蛋白(Gibco)包被。分离出生后8天的小脑粒状神经元，种植到预包被的载玻片上。在37℃，在5％CO2中培养载玻片培养物24小时。然后，在含有20％蔗糖的4％多聚甲醛中固定该载玻片，用抗βIII微管蛋白(Covance TUJ1)染色。24小时后，CGN显示出清楚的成束形态，作为神经元成束的证据。在未被处理的细胞或者Fc蛋白包被的样本对照中，未出现成束现象。
实施例8：Sp35对RhoA活化/灭活的作用
Sp35-Fc诱导出生后的小脑粒状神经元发生成束现象。由于已知信号分子RhoA参与成束现象，确定Sp35-Fc是否能够调节神经元中的RhoA的功能。如下进行RhoA活化试验：使用Fugene 6试剂(Roche)，用含有RhoA、Sp35或NgRl的组合的表达载体转染293细胞或者COS7细胞。转染后48小时，细胞在缺乏血清状态下过夜，然后将细胞溶解在50mM Tris，pH7.5，1％Triton X-100，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，500mM NaCl，10mMMgCl2，加上蛋白酶抑制剂混合物中。通过在4℃，以13,000xg离心5分钟，使细胞溶解产物澄清，95％上清液与20μg被固定的GST-Rho结合结构域亲合基质(Rhotekin beads，Upstate Biotechnology)在4℃温育45分钟。用洗涤缓冲液(50mM Tris，pH7.5，1％ Triton X-100，150mM NaCl，10mMMgCl2，含有蛋白酶抑制剂)洗涤珠三次。通过在95℃，在SDS-PAGE样本缓冲液中加热，从珠上洗脱GTP结合Rho。用抗RhoA的单克隆抗体(Santa Cruz)，通过western印迹检测被结合的总的Rho蛋白。用Sp35转染的COS7和HEK293细胞诱导RhoA活化，作为用Sp35基因转染后，在印迹中检测到的RhoA-GTP的量增加的证据。用Sp35-Fc处理后，也观察到RhoA-GTP进一步增加。与仅用Sp35转染后RhoA-GTP增加相反，当细胞用Sp35和NgRl转染时，RhoA被部分地灭活。用Sp35-Fc处理这些细胞，导致进一步灭活RhoA。
用FLIPR分析(Molecular Devices)确认由Sp35产生的信号反应，确定Sp35处理对Ca++流的作用。在用Sp35-Fc处理的表达Sp35的细胞中，观察到显著的Ca++流，但是在用Sp35-Fc处理的对照细胞中，没有观察到该Ca++流。当用NgRl和Sp35共转染的细胞用Sp35-Fc融合蛋白处理时，Ca++流减弱。
实施例9：Sp35蛋白与自身互作
由于LRR结构域常常参与同型互作，本发明人观察到，将可溶的Sp35加入Sp35转染细胞中，会导致RhoA-GTP升高，超过在仅用Sp35转染的细胞中观察到的结果，检测Sp35结合到自身上。为了进行该测试，采用共免疫沉淀方法。80％汇合的COS7细胞生长在100mm组织培养皿中，用质粒Sp35HA或Sp35-FLAG，或者两者进行转染，使用Fugene 6试剂(Roche)。转染后48小时，收集细胞，4℃，将细胞溶解在缓冲液中(50mMHEPES，pH 7.5，150mM NaCl，1.5mM MgCl2，1mM EGTA，1％Triton X-100和10％甘油)30分钟。然后以14,000xg离心溶解产物15分钟，收集上清液并用抗HA亲合基质(Roche)温育，4℃搅拌过夜。然后用1ml溶解缓冲液洗涤样本三次，在Laemmli样本缓冲液中沸腾，进行4-15％SDS-PAGE，用抗FLAG抗体通过免疫印迹进行分析。抗HA抗体树脂捕获一种含有Sp35-FLAG的复合物，通过Western印迹确定。这表明Sp35与自身直接相互作用。还用Sp35-Fc处理用HA-Sp35转染的细胞，采用类似的免疫沉淀方法来证明，HA-Sp35结合到Sp35-Fc上。
如下制备Sp35-FLAG。PCR扩增Sp35基因细胞外结构域(氨基酸1-531)，使用引物5′AATTAA GCGGCCGCATGCTGGCG GGGGGCGT3′(SEQID NO：35)和5′AATTAA GCGGCCGCTTTGTCATGT′3(SEQ ID NO：36)，含有NotI位点(下划线)。用NotI消化PCR产物，插入到载体pV90的NotI位点上。通过DNA测序来证实插入物的DNA序列。
实施例10：Sp35转化细胞的体内移植
为了确定Sp35在脊髓损伤大鼠中的生物学功能，用表达全长Sp35的逆转录病毒或者逆转录病毒对照来感染皮层原代培养细胞(混合培养物)，用于递送到大鼠脊髓的损伤中心中。导入2×106细胞，在第10天处死大鼠。将脊髓在4％多聚甲醛中固定过夜，然后在70％乙醇中脱水，接着在95％ETOH中脱水。将组织样本包埋在石蜡中。切片(10微米厚度)用于免疫组化染色。与对照相比，接受表达Sp35的细胞的大鼠表现出较少的轴突回缩，在损伤中心具有较多的βIII微管蛋白染色。在接受Sp35的受损大鼠中，存活的神经元增加。
如下制备Sp35逆转录病毒构建体：PCR扩增Sp35基因，采用引物5′-GATTA CTCGAGATGCTGGCGGGGGGCGT GAGG-3′(SEQ ID NO：37)，含有XhoI位点(下划线)和5′CGCGG GAATTCTCATATCATCTTCATGTTGAACTTG-3′(SEQ ID NO：38)，含有EcoRI位点(下划线)。PCR产物用XhoI和EcoRI消化，然后连接到逆转录病毒载体pMIG(含有IRES-GFP)上，该载体预先用XhoI和EcoRI断裂。新载体命名为pMMC078。pMMC078的所有分离物中含有意外的点突变，所以将pMMC078的两个分离物连接在一起。pMMC078.6用XhoI和AccI切割，pMMC078.7用XhoI和AccI切割。将这两个片段连接在一起，制备最终的正确质粒pMMC089。通过DNA测序来确认插入物的DNA序列。如所述制备Sp35逆转录病毒。转染前的一天，破裂293G细胞。通过脂转染胺(Invitrogen)，用8μg Sp35逆转录病毒DNA转染5×106细胞。转染后92小时，收集条件培养基。以5000g离心条件培养基10分钟，上清液用作Sp35逆转录病毒母液。该母液在4℃存储1周，或在-80℃存储6个月。
实施例11：脊髓损伤的动物模型
所有手术操作采用无菌技术进行。在进行任何手术操作的前1周，处理动物。手术前后，预防性施用氨卡青霉素100mg/kg SC，降低膀胱感染损伤的发生率。
采用IP注射2.5mg/kg的Midazolam来麻醉动物，结合溶于氧气中的2-3％Isoflurane进行深度麻醉，通过脚趾收缩来确定。在手术和苏醒过程中，将动物保持在循环水加热垫上。用眼润滑剂防止角膜干燥，SC给予0.05mg/kg阿托品以减少唾液过度分泌。在皮肤上切一小口，肌肉回缩，暴露脊骨。在脊髓水平L6(和如果需要放置鞘内导管，则为L7，参见下文)进行背部椎板切除术，将L6/L7和相连的棘突紧紧地固定在脊椎框架上(DavidKopfInstruments)。使用精细的虹膜切除剪，在L6上进行背部半切术，完全切断主要的背内侧(dorsomedial)和次要的背侧(dorsolateral)的皮质脊髓束(CST)成分。手术后，椎板切除部位覆盖保护性物质，例如Durafilm，和重叠的肌肉用4.0铬丝(chromic gut)缝合以保护暴露的脊柱。缝合皮肤，用碘酊(betadine)溶液擦拭。
动物IS的功能恢复，采用Basso Beattie和Bresnehan(BBB)评分方法来评价，该方法通常被用于评价脊髓损伤后的大鼠。该方法通过仔细分析关节活动和承重能力，量化大鼠的后腿功能。在脊髓损伤后的第一天和此后每周，对大鼠进行评价。
在CST横断后，立即将表达Sp35或GFP的腺病毒或者对照病毒(1010个)注射到横断部位以及紧邻损伤部位的尾端(caudal)和吻端(rostral)的区域上。总共将1Oμl的Adv注射到5个不同部位上(4μl/部位)。对于鞘内施用Sp35蛋白，在损伤L7的尾部2mm的脊索硬脊膜上作一个小洞，将鞘内导管插入到L7处的蛛网膜下腔中。导管缓慢和轻轻地滑到脊索上方，在近损伤尾部的1mm处。位于鞘内间隙外的导管的部分被紧紧缝合到环绕组织的位置中。预先制备的小型渗透泵(Alza corp.)含有测试物质(Sp35蛋白或者对照蛋白)，被连接到暴露的导管末端上，插入到皮下空间中。手术后，椎板切除部位覆盖保护性物质，例如Durafilm，和重叠的肌肉用4.0铬丝缝合以保护暴露的脊柱。缝合皮肤，用碘酊溶液擦拭。
组织分析：在手术时进行管道追踪手术，以诱导脊髓损伤。剃除头部皮肤的毛发，用碘酊和70％酒精擦拭。将动物放置到立体定位框架中。纵向切割头皮，从颅顶刮掉骨膜。在头骨上钻一个直径约1-2mm的孔，和将玻璃的微升针头垂直地插到运动皮层的位置8上(按照Paxinos和Waston，1997的大鼠大脑寰椎确定的坐标)。注射大约5μl管道追踪物质(例如，生物素葡聚糖胺，10,000M.Wt)，将针头在该位置上再放置5分钟，使溶液扩散。在取出针头后，脑壳上的洞用凝胶泡沫塞紧，关闭损伤部位上的头皮。使动物复原，并进行手术后的护理(如下描述)。4-10周后，深度麻醉动物(Inactin 100-110mg/kg ip)，如下描述进行组织学灌注。通过顺向传输机制，从皮层脊束到脊髓的尾部，进行管道追踪，提供量化皮层脊束内的解剖学连通的手段。
对于免疫组织化学试验，手术后2-8周，用Inactin(100-110mg/kg IP)进行深度麻醉，诱导损伤。打开胸腔，暴露心脏，进行灌注。将套管插入左心室中，通过该套管将100cc冰冷的PBS缓慢推入心室中(在右心室切个口，让液体溢出)。接着缓慢但是稳定地滴加4％多聚甲醛(50-100ml)，直到眼睛/耳朵/脚趾的固定。去除脊髓，小心使损伤部位的改变最小化，在OCT中冷冻，切片，和处理进行免疫组织化学分析。其它组织也被可选择地收集，用于后面的分析。接受腺病毒Sp35的动物表现出轴突萌发增强，通过用βIII微管蛋白染色神经元轴突来确定。
实施例12：Sp-35病毒载体构建体
如下制备pMIG来源的Sp-35病毒载体。PCR扩增全长的Sp35编码序列PCR，采用引物5′-GATTA CTCGAGA TGCTGGCGGGGGGCGTGAGG-3′(SEQ ID NO：37)，含有XhoI位点，和5′CGCGG GAATTCTCATATCATCTTCATGTTGAACTTG-3′(SEQ ID NO：38)，含有EcoRI位点。PCR产物用XhoI和EcoRI切割，然后连接到逆转录病毒载体pMIG上(Cheng等人，1996，Nat.Biotechnol.145：576)，该载体用Xhol和EcoRI切割。该载体被命名为pMMC078。pMMC078的所有分离物含有点突变，所以将pMMC078的两个分离物连接在一起。载体pMMC078.6用XhoI和AccI切割，而pMMC078.7用XhoI和AccI切割。连接这两个片段，制备质粒pMMC089。
如下制备pMIG来源的Sp35-HA病毒载体。采用PCR获得编码Sp35氨基酸326-614的片段，该片段与HA序列在一个读框内，采用引物5′-GCCTT CCGCGGCCTCAACTACCTGCGCGTG CTC-3′(SEQ ID NO：39)，含有SacII位点，和5′-CCG GAATTCTCAAGCGTAATCAGGAACGTCGTAAGGGTATATCATCTTCAT′GTTGAACTTGCG GGGCGCGTCGGC-3′(SEQ ID NO：40)，pMMC089作为模板。较长的引物包括在Sp35密码子614之后和在EcoR I位点之前的HA编码序列(斜体)。然后PCR产物用Sac II和EcoRI切割，和用于置换pMIG来源的逆转录病毒载体中的SacII-EcoR I片段，该片段含有野生型Sp35密码子326-614。
如下制备Sp35杆状病毒HA载体。来自Sp35-HA逆转录病毒载体的Sp35-HA编码序列用Xho I和EcoRI切出，补平末端，克隆到杆状病毒穿梭载体pBV-CZPG(美国专利6,190,887和6,338,953)的Bgl2插入位点上，替换CMV控制下的LacZ基因。
如下制备Sp35腺病毒载体。来自Sp35逆转录病毒的Sp35-IRES-GFP编码序列用Xho I-填充和Nhe I切割，然后克隆到在最小CMV启动子的控制下的腺病毒穿梭载体pDC315的EcoRl-填充/Nhe I位点上。
实施例13：髓鞘再形成的动物模型
在所有研究中使用Long Evans雌性大鼠。用异氟烷麻醉大鼠，T3/4暴露，进行背部半椎板切除术。化学脱髓鞘试剂溶血卵磷脂(将3μl的1％溶血卵磷脂溶解在0.9％盐水中)，然后注射到脊髓的背部脊柱的右侧，脊索表面下方0.5-1mm处)。在手术前后进行适当的止痛处理。
3天后，再次暴露注射部位(在异氟烷麻醉下，进行适当的止痛处理)，将如下的治疗剂注射到受损的脊髓中，将编码蛋白Sp35/对照蛋白的腺病毒载体注射到损伤部位上。将体积10μl的1010个编码Sp35或者GFP对照的腺病毒颗粒注射到受损大鼠脊髓中，在溶血卵磷脂诱导的脱髓鞘部位和其周围达5个不同部位上。在5个注射部位的各个部位上注射不超过2μl的体积。对于在手术后2、3、4或6周组织分析脊髓的脱髓鞘/再形成髓鞘，用inactin(100-110mg/kg ip)深度麻醉动物，通过心脏灌注固定液。然后去除脊髓，进行处理，用于分析。采用抗MBP蛋白的抗体或者luxol坚蓝(luxol fastblue)，通过IHC确定接受Sp35处理的动物表现出轴突髓鞘形成加强。
实施例14：Sp35RNAi
为了证明Sp35在大脑功能中的作用，本发明人将慢病毒Sp35RNAi导入出生后的8CGN细胞中。Sp35RNAi感染的细胞具有较短的神经突，和高于对照细胞的扩增率。这些结果说明了Sp35在调节RhoA活化中的作用。
比较小鼠和大鼠Sp35DNA序列，发现用于候选shRNA的同源区。通过退火寡核苷酸LV1-035和LV1-036，并连接到Hpal和Xho1消化的pLL3.7上，构建CH324。寡核苷酸购自MWG。序列为：LV1-035(有义寡核苷酸)
5′TGATCGTCATCCTGCTAGACTTCAAGAGAGTCTAGCAGGATGACGATCTTTTTTC(SEQ ID NO：41)LV1-036(反义寡核苷酸)5′TCGAGAAAAAAGATCGTCATCCTGCTAGACTCTCTTGAAGTCTAGCAGGATGACGATCA(SEQ ID NO：42)。
在制备病毒之前，用来自pLL3.7的DNA或者pLL3.7中的候选shRNA与小鼠SP35-HA标记质粒以5∶1的比例共转染6孔平板中的CHO细胞中。通过western印迹检测来自被转染CHO细胞的溶解产物的SP35-HA标记，和通过northern印迹检测从重复孔制备的总RNA，分析敲除。印迹用0.7kb的mSP35片段进行探查。在转染后48小时进行分析(数据未显示)。从最好的候选物中制备病毒，用于大鼠神经元培养。载体，其它方法和病毒生产被描述在Rubinson等″A lentivirus-based system to functionally silence genes inprimary mammalian cell，stem cell and transgenic mice by RNAinterference.″Nat.Genet.33,401-6(2003)。
实施例15：RhoA活化
共表达NgRl和SP35的COS7细胞在对Omgp反应时，没有表现出RhoA/GTP水平的变化。这表明SP35/NgRl复合物不足以通过髓磷脂抑制剂来调节信号传导。
本发明研究了SP35/NgRl/p75的三重复合物调节信号发送的可能性。用两种方法评价SP35，NgRl和p75之间的相互作用。第一，在直接结合分析中，用AP-SP35偶联物评价结合。AP-SP35偶联物微弱地结合到表达p75的细胞上。AP-P75结合到表达NgRl的细胞上。通过ELISA测量AP-SP35结合到NgRl和p75(附图4)。第二，通过免疫共沉淀共表达SP35NgRl和p75的COS7细胞，来评价SP35结合到NgRl和p75上。抗NgRl抗体免疫沉淀含有SP35和p75的复合物。抗SP35抗体也免疫沉淀含有p75的复合物。相互作用和共免疫沉淀的数据提供了SP35，NgRI和p75之间直接相互作用的证据。本发明人用共聚焦显微镜和抗SP35，p75和NgRl的抗体，来证明SP35，NgRl和p75共定位到细胞体和来自大鼠的p7CG神经元的轴突上。
接着，本发明人证明SP35，NgRl和p75的组合对于髓磷脂抑制剂的活性是足够的。工程化非神经元的COS7细胞来表达所有三种成分。使用这些细胞，本发明人证明RhoA/GTP水平被OMgp上调。与这三种成分的其它组合相比，OMgp-Fc处理提高共表达SP35/p75/NgRl的细胞中的RhoA/GTP水平。通过COS7细胞溶解产物的Western印迹，本发明人证明蛋白质的表达。结合到NgRl上的髓磷脂抑制剂的亲合性不受p75或p75和SP35存在的影响。组合结果支持一种模式，其中在存在NgRI配体时，NgRl，SP35和p75的三重复合物是RhoA调节所需的(附图5)。
SP35含有胞质结构域，该结构域可能直接或间接地参与信号发送。为了确定胞质结构域的作用，本发明人制备了SP35的胞质结构域截断物(SEQID NO：2的氨基酸34-576)，通过形成不能进行信号发送的无用三重复合物，以显性失活的方式起作用。本发明人将这种具有胞质结构域截断的分子称作为″DN-SP35″(为显性失活SP35)。用全长的SP35或者DN-SP35转染出生后7天的(p7)CG神经元，然后分析对抑制剂髓磷脂成分(Omgp，髓磷脂和Nogo66)的反应。如附图6中所示，DN-SP35转染的细胞不能对抑制剂髓磷脂成分反应，具有比对照更长的神经突。相反，用全长SP35构建体转染的细胞对抑制性物质的反应增强，与比对相比，具有更短的神经突。这证明DN-SP35作为竞争者，消弱由髓磷脂成分引起的神经突生成的抑制，期望外源的、可溶SP35-Fc也会结合NgRl，并阻断抑制物质的作用。如附图7中所示，SP35-Fc降低由Omgp，Nogo66和MAG引起的对神经突生成的抑制。
实施例16：神经保护活性
在存在或缺乏50nM的sp35-Fc蛋白时，将等量的大鼠p6小脑粒细胞神经元种植在12孔细胞培养平板的各个孔中。这些多聚D-赖氨酸平板已经用10μg的CNS髓磷脂或者200ng的Nogo66、MAG和Omgp或者对照Fc进行预包被[干燥]。在37℃和5％CO2环境下维持神经元培养物1-7天。在独立于sp35-Fc处理的PBS对照孔中，神经元是健康的，并且生长良好，3天后检查，神经突完全延长[通过神经元特异性标记βIII微管蛋白确定]。缺乏sp35-Fc时，在用髓磷脂、Nogo66、MAG和OMgp包被的孔中，神经元未能充分地生长。神经突萌发最小[短而且歪曲]，而且神经元看上去不健康，具有圆形的细胞体和浓缩的核物质。DAPI染色证明，在这些孔中检测到的神经元的数量少于PBS对照孔中的数量，表明神经元损失。在存在sp35-Fc时，出现长的神经突，神经元表现健康。DAPI染色证明，这些孔中具有多于未接受sp35-Fc的孔中的神经元数量。该数据被总结在如下的表2中。
                           表2
 缺乏sp35-Fc时干燥的基质(dried downsubstrate)： OMgp/Nogo/MAG/髓磷脂 Fc对照
 神经突伸长   短歪曲   长延长
  细胞体形态学细胞核物质实验末的神经元数量   圆形浓缩减少   伸展清晰与对照Fc相同
  存在sp35-Fc时干燥的基质： OMgp/Nogo/MAG/髓磷脂 Fc对照
  神经突伸长细胞体形态学细胞核物质实验末的神经元数量   长延长伸展清晰比对照Fc降低得更少   长延长伸展清晰与对照Fc相同
这些数据表明，可溶性的Sp35，例如Sp35-Fc，具有神经保护活性。
在脊髓半切(T9，SCT)大鼠中，βIII微管蛋白染色脊髓切片表明，在病灶部位神经元真正减少了。用表达sp35的重组病毒在病灶部位感染SCT动物。这些脊髓的组织染色表明，与用载体病毒感染的对照组相比，病灶部位的神经元数量增加。这与上述体外试验结果是一致的，并且进一步说明了与Sp35相关的神经保护特性。
实施例17：脊髓损伤的动物模型中的Sp35
由于Sp35-Fc降低了体外由OMgp，Nogo-66和MAG引起的对神经突的生长抑制作用，本发明人期望该分子在体内促进CNS损伤的功能性恢复。为了证实这一点，本发明人将Sp35-Fc施用给脊髓半切大鼠，即，急性CNS损伤动物模型。如附图8和附图9中所示，与用IgG处理的对照大鼠相比，Sp35-Fc处理的大鼠显著促进功能的恢复。
脊髓损伤和行为分析按如下进行。所有的手术操作按照BiogenInstitutional Animal Use and Care Committee的指南进行。雌性Long Evans大鼠(190-210g，Charles River，Wilmington，MA)用2.5mg/kg Midazolam，I.P和溶于O2中的2-3％氟烷麻醉。在脊髓水平T6和T7上进行背部椎板切除。进行背部半切，完全切断主要的背中和小部分的背侧皮层脊髓束(CST)组分。在CST横断后，立即将鞘内导管插入到T7处的蛛网膜下隙中，连接到预先制备好的小型渗透泵(Alzet型号2004)上，该泵插入到皮下间隙中。小型渗透泵以0.25μl/h的流速，递送Hu IgG同种型对照蛋白(5mg/ml，n＝5，Pharmingen)，PBS(n＝3)可溶的Hu Sp35-Ig融合蛋白(4.3mg/ml，n＝8)。手术后，缝合椎板切除部位，关闭损伤的皮肤。手术后的护理包括手术后止痛3天(Buprenorphine 0.05mg/kg s.c.)和抗生素处理(每天两次氨卡青霉素100mg/kg s.c.)7天。在试验过程中(28天)，或者持续到功能恢复(该时间被记录)，每天人为按摩膀胱两次。用open-field BBB评分体系(Basso等人，1995，J.Neurotrauma 12：1-21；Ono等人，2003，J.Neurosci.23：5887-5896)，对所有动物进行随机打分。在CST横断后的第二天(第2天)和此后4周的每周1次评价大鼠，采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)运动等级标准(locomotor rating scale)。在试验过程中，调查人并不清楚各个处理组。
实施例18：红核脊束(RST)半切损伤模型中的神经元存活和轴突再生
本发明人还研究了Sp35处理对红核脊髓束中的神经元再生的作用，红核脊髓束直接对运动起作用。
腹腔内注射克他命(ketamine)(80mg/kg)和甲苯噻嗪(xylazine)(8mg/kg)来麻醉成年的9周龄Sprague-Dawley大鼠(200-250g)。在操作显微镜下，进行背部椎板切除手术，确定第7胸椎骨(C7)。在打开硬脑脊膜后，用弹簧剪，在脊髓高度C7上进行右侧半切。在进行脊髓半切后，给动物施用一块浸润了10μl的2μg/ml Sp35-Fc溶液或者10μl的2μg/ml的人Ig溶液或者10μlPBS，放置在病灶部位上。手术操作后，各组中的动物再细分为轴突追踪和行为分析。用于轴突追踪(各组n＝5)和行为分析(各组n＝7)的动物允许存活1个月。
用氟-金(FG，6％w/v，荧光染料)标记RST神经元，该神经元在损伤疤痕上具有再生轴突，再伸入近尾部脊髓。在损伤后存活期(1个月)末前的两天，用腹膜内注射可他命(80mg/kg)和甲苯噻嗪(8mg/kg)来麻醉动物。进行背部椎板切除，确定T2脊髓节段。使用Hamilton注射器，人为地将体积0.5ml的FG注射到右侧T2脊髓中。两天后，用致死量的克他命(150mg/kg)和甲苯噻嗪(8mg/kg)麻醉和处死动物，心内灌注常规的盐水，接着为400ml溶于0.1x PBS中的含有4％多聚甲醛的固定剂。取出大脑和脊髓，用多聚甲醛后固定过夜，然后放置在30％磷酸缓冲蔗糖溶液中。在冷冻切片机上，将大脑和脊髓组织切成30mm的切片，并固定到明胶包被的载玻片上。
病灶侧的FG标记的RST神经元的数量表示为完整对侧的FG标记的神经元总数的百分比。用单因子(one-way)ANOVA，接着通过Tukey-Kramer多重比较检测，统计比较各组间的所述百分比。如表3中所示，2μg/ml的Sp35-Fc促进红核脊束(RST)神经元的存活。
                          表3
  处理   RST神经元存活百分比(±S.E.M)
  PBS   17.1±2
  Sp35-Fc   31.9±1.5
  对照-Fc   14.5±2.1
对于行为分析，在进行不同处理后的1个月，在自发性垂直探查中，如(Liu等人，1999)所述，并稍作修改，对前肢进行检查。将大鼠放置在清洁的树脂玻璃(Plexiglas)圆筒中(直径15cm，高30cm)，该圆筒使得前肢可以进行5分钟的垂直探查。对如下行为打分：(1)独立使用左前肢(未受损)或者右前肢(损伤)接触圆筒壁；和(2)同时使用两前肢接触圆筒壁。垂直探查行为被表示为(1)相对于使用损伤肢体、未受损肢体和前后肢的总次数，使用左(未受损)前肢的百分数；(2)相对于使用损伤肢体、未受损肢体和前后肢的总次数，使用右(受损)前肢的比例；和(3)相对于使用损伤肢体、未受损肢体和前后肢的总次数，使用两前肢的百分比。用单因子ANOVA检测组间差异，接着进行Bonferroni后hoc分析(Bonferroni post hocanalysis)。Sp35-Fc处理的动物的前肢运动显著改进：Sp35-1-Fc处理的动物利用两前肢达到30％，而对照Fc或PBS处理的动物两前肢的利用为10％；利用左肢(未受损)为55％，而对照Fc或PBS处理的动物为80％；利用右肢(受损)为29％，而对照Fc或PBS处理的动物约为15％。
实施例19：Sp35-Fc促进视神经横断模型中的视网膜神经节细胞(RGC)的存活
用视神经横断模型进一步验证的Sp35活性，研究作用于神经元功能的因子。在该试验中使用年轻的成年雌性Sprague Dawley(SD)大鼠。从视盘向眼窝内1.5mm处横断各个动物的右侧视神经。将一块浸湿了6％氟-金(FG)的明胶海绵施用于新横断的部位上，正好在视盘后面，以标记存活的视网膜中心细胞(RGCs)。将动物分成6组(每组n＝6)，玻璃体内注射Sp35-Fc、人IgGl或者仅PBS。玻璃体内注射的体积为4ml，而每次注射的剂量为2mg。在视神经横断后，立即进行玻璃体内注射。
所有动物存活1周。在处死动物两天前，横断每只动物的左侧视神经，用6％FG标记存活的RGC，作为内部对照。用过量戊巴比妥钠处死动物，将视网膜分离在4％多聚甲醛中。进行四个径向切断(radial cut)，将视网膜分成四个区(上端、下端、鼻区和颞区)。在用封固剂(Dako)进行不透明封装(flat-mounted)前，用相同的固定剂进行后固定1小时。在荧光显微镜下检查切片，使用紫外线滤光片(激发波长＝330-380mn)。在200×200mm的目镜下，沿着从视盘到视网膜外边缘的各个分区的中线，以500mm的间隔，计数被标记的RGC。比较受损眼睛与另一侧的眼睛中的存活RGC的数量，来表示从各个处理获得的存活RGC的百分比。所有数据表示为平均值±SEM。通过单因子ANOVA来评价统计显著性，接着进行Tukey-Kramer后hoc检测。p＜0.05视为差异显著。与对照Fc或PBS处理的动物相比，Sp35-Fc处理的动物具有显著的神经元存活(83％)，对照仅分别具有约50％神经元存活。
其它实施方案
其它实施方案在如下的权利要求书中。

Claims (57)

1.一种分离的核酸，包含编码多肽的核苷酸序列，其中：(a)该多肽包含(i)Sp35 LRR结构域，(ii)位于LRR结构域C末端的Sp35碱性区和(iii)位于该碱性区的C末端的Sp 35免疫球蛋白(Ig)结构域；和(b)该多肽缺乏跨膜结构域。
2.一种分离的核酸，包含编码多肽的核苷酸序列，其中该多肽包含Sp35Ig结构域，而缺乏Sp35 LRR结构域、Sp35碱性区、跨膜结构域和胞质结构域。
3.一种分离的核酸，包含编码多肽的核苷酸序列，其中该多肽包含Sp35LRR结构域，而缺乏Sp35 Ig结构域、Sp35碱性区、跨膜结构域和胞质结构域。
4.权利要求1的核酸，其中Sp35多肽缺乏胞质结构域。
5.权利要求1的核酸，其中该多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基34-532。
6.权利要求1-3的任何一项的核酸，其中该多肽是包含非Sp35部分的融合多肽。
7.权利要求6的核酸，其中非Sp35部分选自Ig部分、血清白蛋白部分、靶向部分、报道分子部分或便于纯化的部分。
8.权利要求7的核酸，其中非Sp35部分是Ig部分。
9.权利要求8的核酸，其中Ig部分是Fc部分。
10.权利要求1-3的任何一项的核酸，其中核苷酸序列被可操作地连接到表达控制序列上。
11.一种载体，包含权利要求10的核酸。
12.一种宿主细胞，包含权利要求11的载体。
13.一种分离的多肽，其中：(a)该多肽包含(i)Sp35 LRR结构域，(ii)位于LRR结构域C末端的Sp35碱性区和(iii)位于该碱性区的C末端的Sp 35免疫球蛋白(Ig)结构域；和(b)该多肽缺乏跨膜结构域。
14.一种分离的多肽，其中该多肽包含Sp35 Ig结构域，而缺乏Sp35LRR结构域、Sp35碱性区、跨膜结构域和胞质结构域。
15.一种分离的多肽，其中该多肽包含Sp35 LRR结构域，而缺乏Sp35Ig结构域、Sp35碱性区、跨膜结构域和胞质结构域。
16.权利要求13的多肽，其中富含亮氨酸的重复之一是羧基末端的富含亮氨酸的重复(LRRCT)。
17.权利要求13的多肽，其中富含亮氨酸的重复之一是氨基末端的富含亮氨酸的重复(LRRNT)。
18.权利要求13的多肽，其中Sp35多肽缺乏胞质结构域。
19.权利要求13的多肽，其中该多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基34-532。
20.权利要求13，14或15的多肽，其中该多肽是包含非Sp35部分的融合多肽。
21.权利要求20的多肽，其中非Sp35部分选自Ig部分、血清白蛋白部分、靶向部分、报道分子部分和便于纯化的部分。
22.权利要求21的多肽，其中非Sp35部分是Ig部分。
23.权利要求22的多肽，其中Ig部分是Fc部分。
24.权利要求13，14或15的多肽，其中该多肽被偶联到多聚体上。
25.权利要求24的多肽，其中多聚体选自聚亚烷基二醇、糖部分和多肽。
26.权利要求25的多肽，其中多聚体是聚亚烷基二醇。
27.权利要求26的多肽，其中聚亚烷基二醇是聚乙二醇(PEG)。
28.权利要求24的多肽，其中多肽被偶联到l，2，3或4多聚体上。
29.权利要求28的多肽，其中多聚体的总分子量为20,000Da到40,000Da。
30.抑制通过NgRl的信号转导的方法，包含用有效量的Sp35多肽与NgRl接触。
31.降低对中枢神经系统(CNS)神经元的轴突生长抑制的方法，包括用有效量的多肽与神经元接触，该多肽选自Sp35多肽、抗Sp35抗体或者抗Sp35抗体的抗原结合片段。
32.抑制CNS神经元的生长锥崩解的方法，包括用有效量的多肽与神经元接触，该多肽选自Sp35多肽、抗Sp35抗体或者抗Sp35抗体的抗原结合片段。
33.治疗哺乳动物中的CNS疾病、异常或损伤的方法，包括给哺乳动物施用有效量的多肽，该多肽选自Sp35多肽、抗Sp35抗体或者抗Sp35抗体的抗原结合片段。
34.权利要求30-33的任何一项的方法，其中Sp35多肽选自这样的多肽：
其中(a)该多肽包含(i)含有12-14个Sp35富含亮氨酸重复的LRR结构域，(ii)位于LRR结构域C末端的Sp35碱性区，和(iii)位于碱性区的C末端的免疫球蛋白(Ig)结构域；和(b)该多肽缺乏跨膜结构域；
和这样的多肽：
其中该多肽包含Sp35 Ig结构域，而缺乏LRR结构域、碱性区、跨膜结构域和胞质结构域。
35.权利要求33的方法，其中CNS疾病、异常或损伤是脊髓损伤或者视神经损伤。
36.权利要求33的方法，其中多肽被局部施用。
37.权利要求33的方法，其中多肽在脊髓损伤的48小时内开始施用。
38.权利要求36的方法，其中多肽的治疗有效量为10μg到10mg。
39.治疗哺乳动物中的CNS疾病、异常或损伤的方法，包括(a)提供表达重组Sp35多肽的培养的宿主细胞；和(b)在位于或接近CNS疾病、异常或损伤的部位，将宿主细胞导入到哺乳动物。
40.权利要求39的方法，其中疾病、异常或损伤是脊髓损伤。
41.权利要求39的方法，其中培养的宿主细胞来源于将被治疗的哺乳动物。
42.权利要求39的方法，其中重组Sp35多肽是全长的Sp35多肽。
43.促进CNS疾病、异常或损伤的部位的髓鞘形成的方法，包括用有效量的Sp35多肽与CNS疾病、异常或损伤的部位接触。
44.权利要求43的方法，其中Sp35多肽包含Sp35 LRR结构域，而缺乏Sp35 Ig结构域、Sp35碱性区、跨膜结构域和胞质结构域。
45.通过体内基因疗法来治疗CNS疾病、异常或损伤的方法，包含在位于或接近疾病、异常或损伤的部位，给哺乳动物施用包含编码Sp35多肽的核苷酸序列的病毒载体，使得在位于或接近损伤的部位，所述Sp35多肽以足以降低对神经元轴突延伸的抑制的量在哺乳动物中由所述核苷酸序列表达。
46.权利要求36的方法，其中病毒性载体选自腺病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、EB病毒载体、乳多空病毒载体、痘苗病毒载体或单纯疱疹病毒载体。
47.权利要求45的方法，其中疾病、异常或损伤选自脊髓损伤和视神经损伤。
48.权利要求45的方法，其中病毒性载体通过一种路径施用，该路径选自局部施用、眼内施用、胃肠外施用、鞘内施用、硬膜下施用或皮下施用。
49.一种编码多肽的核酸，该多肽包含Sp35 LRR结构域、碱性区、Ig结构域、连接序列和跨膜结构域；而缺乏功能性胞质结构域。
50.权利要求49的核酸，其中该核酸编码基本上由SEQ ID NO：2的氨基酸1-576组成的多肽。
51.促进处于死亡危险中的神经元存活的方法，包括用有效量的Sp35多肽与神经元接触。
52.权利要求51的方法，其中神经元是体外的。
53.权利要求51的方法，其中神经元在患有神经退行性疾病、异常或损伤的哺乳动物中。
54.权利要求53的方法，其中神经退行性疾病、异常或损伤选自多发性硬化、ALS、享廷顿病、阿尔茨海默氏病、帕金森病、糖尿病性神经病、发作综合征、创伤性脑损伤或脊髓损伤。
55.促进患有神经退行性疾病、异常或损伤的哺乳动物中处于死亡危险中的神经元存活的方法，包括(a)提供表达重组Sp35多肽的培养的宿主细胞；和(b)将宿主细胞导入哺乳动物的神经元处。
56.一种促进处于死亡危险的神经元存活的体内基因治疗方法，包括在位于或接近神经元的部位，给哺乳动物施用包含编码Sp35多肽的核苷酸序列的病毒性载体，使得由该核苷酸序列在哺乳动物中以足以促进神经元存活的量表达Sp35多肽。
57.权利要求51的方法，其中Sp35多肽是可溶性的。
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