BRPI0718406A2 - Moléculas de ligação de lingo e uso farmacêutico das mesmas - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO DE LINGO E USO FARMACÊUTICO DAS MESMAS".

A presente invenção refere-se a moléculas de ligação de LIN- GO1 tais como, por exemplo, anticorpos monoclonais ou seus fragmentos de 5 Fab, e ao uso de tais moléculas de ligação para o tratamento de pacientes com lesões no seu sistema nervoso central.

Antecedentes da Invenção

Recuperação funcional após lesão no sistema nervoso central (CNS) de vertebrados superiores adultos é excepcionalmente limitada, resul- tando em déficits neurológicos persistentes tais como perda de sensação e movimento de membro. Até agora, há uma falta de uma terapia eficaz para tratar seres humanos com lesões no CNS tais como lesão na medula espi- nhal (SCI) e lesão cortical cerebral. Embora neurônios do CNS de adulto em geral sobrevivem a axotomia, regeneração axonal é transitória e apenas o- corre sobre uma área confinada, portanto, o retardo do melhoramento dos contatos sinápticos relevantes. Além do mais, a capacidade plástica do CNS de adulto é também restrita, assim impedindo a reorganização de trajetórias não Iesionadas para funcionalmente compensar aquelas removidas pela lesão. Paradoxicalmente, axônios axotomizados no sistema nervoso perifé- rico (PNS) têm uma alta capacidade de regenerar sobre longas distâncias e frequentemente estabelecem ligações funcionalmente significativas (Schwab (2004) Curr Opin Neurobiol 14,118-124). Essa restrição em plasticida- de/regeneração axonal é em parte à expressão nà mielinação de oligoden- drócitos de várias proteínas que demonstraram ser pontentes inibidores de crescimento de neurito, a saber Nogo-A (Chen e outros (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre e outros (2000) Nature 403, 439-444; Prinjha e outros (2000) Nature 403, 383-384), glicoproteína associada à mielina (MAG)1 e glicoproteína de mielina de oligodendrócito (OMgp) (McKerracher e outros (1994) Neurônio 13, 805-811; Wang e outros (2002) Nature 417:941-944) (figura 1A).

Nogo-A contém múltiplos domínios inibitórios de crescimento de neurito expostos sobre a superfície de oligodendrócitos: dois estão localiza- dos dentro da região amino-terminal (amino-Nogo-A) e um na região C- terminal (Nogo-66) (Oertie e outros (2003) J Neurosci 23, 5393-5406). Nogo- 66 liga e sinaliza através de um receptor contendo repetição rica em Ieucina (LRR) de glicosil-fosfatidilinositol (GPI) sobre a superfície neuronal conheci- 5 da como o receptor de Nogo-66 (NgR) (Fournier e outros (2001) Nature 409, 341-346). Embora estruturalmente não relacionado, MAG e OMgp também ligam e sinalizam através de NgR (Domeniconi e outros (2002) Neurônio 35, 283-290; Liu e outros (2002) Science 297, 1190-1193; Wang e outros (2002) Nature 417:941-944). Sinalização através de NgR leva à ativação do peque- 10 no GTPase RhoA que por sua vez ativa cinase associada a Rh (ROCK) que leva a um rigidificamento do citoesqueleto de actina e inibição de extensão axonal (Niederõst e outros (2002) J Neurosci 22, 10368-10376; Sehweigrei- ter e outros (2004) Mol Cell Neurosci 27:163-174). Todos os três Iigantes ligam dentro da região de LRR de NgR e têm parcialmente sítios de ligação 15 de sobreposição (Fournier e outros (2002) J Neurosci 22, 8876-8883; Liu e outros (2002) Science 297, 1190-1193; Wang e outros (2002) Nature 417:941-944; Barton e outros (2003) EMBO J 22, 3291-3302). O recep- tores) para os domínios inibitórios dentro de amino-Nogo-A são desconhe- cidos mas demonstraram ser distintos de NgR (Schweigreiter e outros 20 (2004) Mol Cell Neurosci 27:163-174). MAG também demonstrou sinalizar através de um homólogo fechado de NgR conhecido como NgR2 (Pignot e outros (2003) J Neurochem 85, 717-728; Venkatesh e outros (2005) J Neu- rosci 25, 808-822).

Uma vez que NgR carece de um domínio citoplásmico, utiliza 25 várias proteínas de transmembrana para transdução de sinal, a saber o re- ceptor de neurotrofina de baixa afinidade p75NTR, TROY (a.k.a. TAJ) e LIN- GO-1 (proteína de interação de receptor de Nogo, contendo domínio de LRR e Ig a.k.a LRRN6A or LERN1) (Wang e outros (2002) Nature 420, 74-78; Carim-Todd e outros (2003) Eur J Neurosci 18, 3167-3182; Mi e outros 30 (2004) Nat Neurosci 7, 221-228; Park e outros (2005) Neurônio 45:345-351; Shao e outros (2005) Neurônio 45, 353-359). TROY e p75NTR podem funcio- nalmente substituir entre si no complexo de receptor de NgR, enquanto que a presença de LINGO-1 é um pré-requesito absoluto para a sinalização ocorrer. O complexo de receptor de NgR é, portanto, visto como um comple- xo ternário compreendendo NgR como a subunidade de ligação de Iigante e LINGO-1 como a subunidade de transdução de sinal comum que age de comum acordo ou com p75NTR ou TROY.

LINGO-1 é uma proteína de transmembrana simples expressa exclusivamente dentro do CNS predominantemente nos neurônios e oligo- dendrócitos. A expressão de LINGO-1 definha no período pós-natal precoce e é regulada para cima na medula espinhal espinhal adulto na lesão. O ec- 10 todomínio de LINGO-1 contém doze LRRs tandem flanqueados por Subdo- mínios N- e C-terminais seguido por uma região básica e um domínio de Ig (figura 1B). Dado que uma fusão de AP do ectodomínio de LINGO-1 ligou-se a células de COS-7 que expressam NgR ou p75NTR ou ambos e, similarmen- te, LINGO-1 co-precipitado com NgR ou p75NTR em células que expressam 15 todas as três proteínas, LINGO-1 mais provavelmente forma um complexo ternário com NgR e p75NTR por interação com ambos simultaneamente.

Além de ser expresso nos neurônios, LINGO-1 é também ex- presso no oligodendrócitos no CNS de adulto (Mi e outros (2005) Nat Neu- rosci 8, 745-751). Inibição de sinalização de LINGO-1 em culturas de oligo- dendrócito ou por tratamento com LINGO-1-Fe, regulação para baixo da pro- teína com RNAi ou ultra-expressão de DN-LINGO-1 aumentou a diferencia- ção de OPCs para mielinisação de oligodendrócitos. Além do mais, remoção genética de LINGO-1 em camundongos aumentou o número de oligoden- drócitos maduros e, correspondentemente, axônios mielinizados na medula espinhal. Inibição de sinalização de LINGO-1 reduziu a ativação de RhoA e aumentou a atividade de cinase de Fyn, ambas as quais são relatadas para promover diferenciação de oligodendrócito, embora os ligantes/interações reais responsáveis por ativação da sinalização de LINGO-1 tenham ainda de ser exemplificados. Isso levou à conclusão o LINGO-1 é um regulador nega- tivo de mielinização.

Esclerose múltipla (MS) é uma doença inflamatória crônica do CNS caracterizada por desmielinização e degeneração axonal que leva a múltiplos déficits neurológicos. Embora remielinização de axônios possam ocorrer precocemente na doença, em algum ponto a remielinização cai to- talmente levando a degeneração axonal acelerada e dano irreversível. Re- mielinização mais provavelmente surge da diferenciação de células precur- 5 soras de oligodendrócito adultas (OPCs) que migram para as margens das lesões ativas. Uma vez que LINGO-1 negativamente regula mielinização, bloqueio de LINGO-1 pode aumentar remielinização, atenuar degeneração axonal, promover regeneração axonal e assim atenuar, deter ou mesmo re- verter o progresso de doenças de desminelinização tal como MS.

Bloqueio de LINGO-1 também demonstrou melhorar a sobrevi-

vência de neurônios dopaminérgicos e reduzir anormalidades comportamen- tais em modelos de roedor de doença de Parkinson (Inoue e outros (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104, 14430-14435).

Sumário da Invenção Agora surpreendentemente verificou-se que novos anticorpos

humanos monoclonais contra LINGO-1 (conhecido como anticorpo 4784, e anticorpo 4785 aqui em seguida) significativamente inibem a associação de LINGO-1 com NgR e significativamente atenuam a atividade inibitória de crescimento de neurito of mielina de medula espinhal de rato adulto a con- 20 centrações de sub-nM in vitro. Além disso, os ditos anticorpos significativa- mente aumentam a diferenciação de oligodendrócitos primários in vitro e demonstraram significativamente regular para baixo de superfície de célula LINGO-1 em células vivas. Tratamento com esses anticorpos é esperado aumentar regeneração axonal/plasticidade e melhorar a recuperação fun- 25 cional após lesões agudas no CNS tais como SCI e lesão cortical cerebral. Além do mais, bloqueio de sinalização de LINGO-1 usando-se os ditos anti- corpos em células oligondendrogliais tem o potencial para aumentar a re- mielinização de axônios em doenças de desminelinização tal como MS que leva a uma atenuação de progressão de doença. De comum acordo, inibi- 30 ção de sinalização de LINGO-1 em neurônios com os ditos anticorpos po- dem ser esperados melhorar a regeneração axonal e neuroplasticidade e promover a recuperação de função neurológica perdida durante o curso da doença. Finalmente, bloqueio de LINGO-1 com os ditos anticorpos pode ser esperado atenuar a patogênese da doença de Parkinson.

Além do mais, a invenção provê moléculas de ligação que se ligam a epitopos específicos no LINGO-1.

Os anticorpos têm sub-nM KDs contra o ectodomínio de LINGO-

1 de rato, macaco cinomólogo e ser humano, significativamente atenuam a atividade inibitória de crescimento de neurito de mielina de medula espinhal de rato adulto a concentrações de sub-nM e significativamente aumentam diferenciação de oligodendrócito in vitro. Além do mais, é agora possível 10 construir outras moléculas de ligação de LINGO-1 tendo as mesmas regiões variáveis como os ditos anticorpos.

Descrição Detalhada da Invenção

Correspondentemente, a invenção provê moléculas de ligação a uma região particular ou epitopo de LINGO-1 (aqui em seguida chamadas de "as moléculas de ligação da invenção" ou simplismente "moléculas de ligação").

As moléculas de ligação da invenção ligam o ectodomínio madu- ro (resíduos 34-550) de LINGO-1 de rato (SEQ ID NO: 1), LINGO-1 de ma- caco cinomólogo (SEQ ID NO: 2) e LINGO-1 de ser humano (SEQ ID NO: 3) 20 com uma constante dissociação (Kd) < 1000 nM, mais de preferência com um Kp < 100 nM, com mais preferência com um K0 < 10 nM. A reação de ligação pode ser mostrada por métodos padrão (ensaios qualitativos) inclu- indo, por exemplo, o método de FACS descrito nos exemplos. Além disso, a ligação a LINGO-1 de rato, de macaco cinomólogo e de ser humano, e tam- 25 bém a eficácia, pode ser mostrado em um ensaio de crescimento de neurito e ensaio de oligodendrócito como descrito abaixo.

Assim, em uma outra concretização preferida as moléculas de ligação (a uma concentração de 100 nM, preferência 10 nM, mais de prefe- rência a 1 nM ainda mais de preferência a 0,1 nM) aumentam o comprimen- 30 to médio de neurito por célula de células granulares cerebelares de rato de- senvolvem em um substrato de mielina de medula espinhal de rato adulto por pelo menos 20%, preferência 50%, mais preferido 60% em comparação com o comprimento médio de neurito por célula de células granulares ce- bBiài^arée fMaa^aeqBãcs&atfrdteJaerncumniantHMlriporple denimlfeOjeeqBãcBse liga ao ectodomínio de LINGO-1 de rato, de macaco cinomólogo e de ser humano.

Por uso de microensaios de peptídeo, o epitopo específico ao

qual as moléculas de ligação da invenção ligam é determinado de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica. Consequentemente, em uma outra concretização a invenção provê moléculas de ligação que se ligam pelo menos uma dos epitopos de LINGO-1 como definido por SEQ ID NO: 10 46-51. SEQ ID NO: 46: KIVILLDYMFQD, SEQ ID NO: 47: AIRDYSFKRLYR, SEQ ID NO: 48: LKVLEISHWPYL, SEQ ID NO: 49: NLTAVPYLAVRHLVY, SEQ ID NO: 50: YFTCRRARI, ou SEQ ID NO: 51: DVLLPNYFTCRRARI.

Em uma outra concretização, as moléculas de ligação da inven- ção compreende uma ou mais, das seguintes seqüências, por exemplo, a totalidade das seqüências de Anticorpo 4784 ou a totalidade das seqüências 4785 mencionadas ali:

SEQ ID NO: 12 (Anticorpo 4784 CDR-H1)

SSGVGVG SEQ ID NO: 13

(Anticorpo 4784 CDR-H2)

HIGSDDDKYYSTSLKT SEQ ID NO: 14 (Anticorpo 4784 CDR-H3)

NQQYGDGYPGYFDY SEQ ID NO: 15 (Anticorpo 4784 CDR-L1)

SGDNIGNYYVY SEQ ID NO: 16 (Anticorpo 4784 CDR-L2)

EDTNRPS SEQ ID NO: 17 (Anticorpo 4784 CDR-L3)

QSYDNLHEQV SEQ ID NO: 18 (Anticorpo 4785 CDR’-H1)

DNSAAWS SEQ ID NO: 19 (Anticorpo 4785 CDR’-H2)

LIYLRSKWDNDYA VSVKS SEQ ID NO: 20 (Anticorpo 4785 CDR’-H3)

TGRADEFDV SEQ ID NO: 21 (Anticorpo 4785 CDR-L1)

SGSSSNIGNNYVS SEQ ID NO: 22

(Anticorpo 4785 CDR’-L2)

RNSKRPS SEQ ID NO: 23 (Anticorpo 4785 CDR’-L3)

STYDTFSIV

Mais preferência, as moléculas de ligação compreendem uma ou mais das seqüências dadas acima para o Anticorpo 4784 com a SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16 e/ou 17; ou para o Anticorpo 4785 com a SEQ ID NO:

18, 19,20, 21,22 e/ou 23.

Aqueles versados na técnica entendidos que mudanças podem

ser produzidas para 4784 ou 4785 que, embora eles mudem vários, mais de preferência um ou mais aminoácidos, preferência até três, por exemplo, um ou dois, dos SDRs dados acima, especialmente em um ou mais ou a totali- dade deles, por exemplo, um ou dois deles, ou provêem modificação pós- 30 traducional alternativa de formatos de produto, resultam em um agente tera- pêutico que demonstra o mesmo ou substancialmente similar compartamen- to de ligação de antiLINGO-1. Em uma outra concretização as moléculas de ligação da inven- ção compreende pelo menos um sítio de ligação de antígeno escolhido do grupo que consiste em; uma seqüência que é pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 5 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% homóloga a SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7, e; uma seqüência que é pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% homóloga a SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO:

6, ou um seu equivalente direto.

Em uma concretização, a molécula de ligação compreende pelo

menos um sítio de ligação escolhido do grupo que consiste em SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7, e; SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6.

A invenção ulteriormente provê uma molécula de ligação que compreende uma primeira seqüência que é pelo menos 50%, pelo menos 15 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% homóloga a SEQ ID NO: 5, e uma segunda seqüência que é pelo menos 50% pelo menos 60%, pelo me- nos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% homóloga a SEQ ID NO: 4, ou um seu equivalente 20 direto.

A invenção ulteriormente provê uma molécula de ligação que compreende uma primeira seqüência que é pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% homóloga a SEQ ID NO: 7, e 25 uma segunda seqüência que é pelo menos 50% pelo menos 60%, pelo me- nos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% homóloga a SEQ ID NO: 6, ou um seu equivalente direto.

Em uma concretização, a invenção provê uma molécula de Iiga- ção de acordo com as reivindicações de 1 a 7, que compreende pelo menos

a) uma cadeia pesada de imunoglobulina ou seu fragmento que compreende (i) um domínio variável compreendendo SEQ ID NO: 5 ou SEQ

ID NO: 7, e

(ii) a parte constante ou seu fragmento de uma cadeia pesada de ser humano; e

b) uma cadeia leve de imunoglobulina ou seu fragmento que

compreende

(i) um domínio variável compreendendo SEQ ID NO: 4 ou SEQ

ID NO: 6, e

(ii) a parte constante ou seu fragmento de uma cadeia leve de ser humano; ou

seus equivalentes diretos; por exemplo, duas ou três de cada uma das ca- deias dadas sob a) ou b).

As seqüências podem ser pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo 15 menos 97%, ou pelo menos 99% homóloga a SEQ ID NO: 4-7. O fator im- portante é que tais variantes retêm as capacidades de ligação a LINGO-1, o efeito desinibitório (especialmente a capacidade de atenuar a atividade inibi- tória de crescimento de neurito de mielina de medula espinhal de rato adulto a concentrações de sub-nM), e/ou melhorar a recuperação funcional de SCI 20 (especialmente em um modelo de rato), em cada caso preferência como descritos nos exemplos ou a descrição restante.

Em uma concretização, a invenção provê uma molécula de liga- ção que é um anticorpo compreendendo uma ou mais das seqüências de acordo com SEQ ID NO: 4-7 ou SEQ ID NO: 12-23, ou a seu fragmento, ou um seu equivalente direto.

Em uma outra concretização, a molécula de ligação, como um anticorpo, tem uma parte constante ou seu fragmento da cadeia pesada de ser humano do tipo γ4 e a parte constante ou seu fragmento da cadeia leve de ser humano é o tipo λ.

Em uma outra concretização, a molécula de ligação, como um

anticorpo, tem uma parte constante ou seu fragmento da cadeia pesada de ser humano do tipo γ4 e a parte constante ou seu fragmento da cadeia leve de ser humano é do tipo κ.

Em uma outra concretização, a molécula de ligação é um anti- corpo monoclonal humanizado ou quimérico ou humano.

Em uma outra concretização, a molécula de ligação é um anti- corpo humanizado.

A invenção também provê um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação como definido acima.

O polinucleotídeo pode ser escolhido do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9; ou do grupo que consiste em SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11.

A invenção também provê um vetor de expressão compreen- dendo um ou mais polinucleotídeos de acordo com SEQ ID NO: 8-11.

Além do mais, a invenção provê um sistema de expressão com- preendendo um polinucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 8-11, em que o

dito sistema de expressão ou sua parte é capaz de produzir uma molécula de ligação como indicado acima, quando o dito sistema de expressão ou sua parte está presente em uma célula hospedeira compatível. A invenção também provê uma célula hospedeira isolada que compreende tal sistema de expressão.

A invenção também provê o uso de uma molécula de ligação

como indicado acima, como um medicamento.

A invenção também provê o uso de uma molécula de ligação como indicado acima na preparação de um medicamento para o tratamento de uma lesão no CNS.

A invenção também provê uma composição farmacêutica com-

preendendo uma molécula de ligação como indicado acima juntamente com pelo menos veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

Além do mais, a invenção provê um método de tratamento de doenças associadas à promoção de regeneração axonal/plasticidade com- preendendo a administração a um indivíduo que necessita de tal tratamento de uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação como indicado aci- ma. A invenção também provê um método de tratamento de doen- ças associadas à promoção de regeneração axonal/plasticidade compreen- dendo a administração a um indivíduo que necessita de tal tratamento de uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação de acordo com qualquer 5 uma das reivindicações de 1 a 10.

Quando o sítio de ligação de antígeno compreende tanto o pri- meiro quanto segundo domínios, esses podem ser localizados na mesma molécula de polipeptídeo ou, preferência, cada domínio pode ser em uma cadeia diferente, o primeiro domínio sendo parte de uma cadeia pesada de 10 imunoglobulina ou seu fragmento e o segundo domínio sendo parte de uma cadeia leve de imunoglobulina ou seu fragmento.

Exemplos de moléculas de ligação da invenção incluem anticor- pos como produzidos por exibição de fago e anticorpos humanizados quimé- ricos ou humanos, ou outros anticorpos humanizados, ou qualquer seu 15 fragmento, por exemplo, fragmentos de F(ab')2; e Fab, bem como anticor- pos de domínio simples ou de cadeia simples. O termo "anticorpo" destina- se a incluir tais moléculas de ligação.

Um anticorpo de cadeia simples consiste em domínios variáveis de um anticorpo de cadeias leve e pesada covalentemente ligado por um Iigador de peptídeo usualmente que consiste em desde 10 a 30 aminoáci- dos, preferência de 15 a 25 aminoácidos. Portanto, tal estrutura não inclui a parte constante das cadeias leve e pesada e acredita-se que o espaçador de peptídeo pequeno seria menos antigênico do que uma parte constante inteira. Por "anticorpo quimérico" quer se dizer um anticorpo em que as regi- ões constantes de cadeias leve ou pesada ou ambas são de origem humana enquanto domínios variáveis tanto cadeia leve quanto pesada são de origem não humana (por exemplo, murino). Por "anticorpo humanizado" quer se dizer um anticorpo em que as regiões hipervariáveis (CDRs) são de origem de não humano (por exemplo, murino), enquanto a totalidade ou substanci- almente a totalidade de outras partes da imunoglobulina, por exemplo, as regiões constantes e as partes altamente conservadas dos domínios variá- veis, isto é, as regiões de estrutura, são de origem humana. Um anticorpo humanizado pode, no entanto, reter alguns aminoácidos da seqüência de camundongo nas partes das regiões de estrutura adjacentes às regiões hi- pervariáveis.

Regiões hipervariáveis podem estar associadas a qualquer es- 5 pécie de regiões de estrutura, preferência de origem humana ou camundon- go. Regiões de estrutura adequadas são descritas nas "Seqüências of prote- ins of immunological interest" (Kabat E.A. e outros, US department of health e human services, Public health service, National Institute of Health, prefe- rência incorporada aqui, especialmente com relação às regiões de estrutura, 10 por referência). Preferência a parte constante de uma cadeia pesada de ser humano das moléculas de ligação pode ser do tipo γ4, incluindo subtipos, preferência a parte constante de uma cadeia leve de ser humano pode ser do tipo K ou λ, mais de preferência do tipo λ.

"Anticorpo" de ocorrência natural é uma glicoproteína compre- endendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias Ievest (L) interligadas por ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesada é constituída de uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como Vh) e uma regi- ão constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é constituída de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é constitu- ida da região variável de cadeia leve (abreviada aqui como VL) e a região variável de cadeia leve. A região variável de cadeia leve é constituída de um domínio, Cl. As regiões de Vh e Vl podem ser ulteriormente subdivididos em regiões e hipervariabilidade, chamadas de regiões complementares (CDR), interpassadas com regiões que são mais conservadas, chamadas regiões de estrutura (FR). Cada Vh e Vl é constituído de três CDRs e quatro FRs dispostas de amino-terminal a carbóxi-terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias leve e pesada contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobuli- na a fatores ou tecidos hospedeiros, incluindo várias células do sistema i- mune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (C1q) dos sistema de complemento clássico. O termo "porção de ligação de antigeno" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de antigeno"), como usado aqui, refere-se ao com- primento total ou um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a ca- pacidade de especificamente ligar-se a um antigeno (por exemplo, LINGO-1 5 e/ou LINGO-2). Verificou-se que a função de ligação de antigeno de um an- ticorpo pode ser realizadas por fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Exemplos de fragmentos de ligação incluídos dentro do termo "porção de ligação de antigeno" de um anticorpo incluem um fragmento de Fab, um fragmento monovalente que consiste em domínio de VL, VH, Cl e CH1; um 10 fragmento de F(ab’)2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmen- tos de Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região principal; um frag- mento de Fd que consiste em domínios de Vh e CH1; um fragmento de Fv que consiste em domínios de Vl e Vh de uma subdivisão simples de um an- ticorpo; um fragmento de dAb (Ward e outros, 1989 Nature 341:544-546), 15 que consiste em um domínio de VH; e uma região de determinação de com- plementaridade isolada (CDR).

Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal" como usado aqui referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular simples (isto é, são idênticas uma 20 vez que elas são produzidas por um tipo de célula imune que são todas clo- nes de uma única célula de origem). Uma composição de anticorpo mono- clonal exibe uma afindade e especificidade de ligação essencialmente sim- ples para um epitopo particular.

O termo "anticorpo humano", como usado aqui, destina-se a 25 incluir anticorpos tendo regiões variáveis em que tanto as regiões de estrutu- ra quanto CDR são derivadas das seqüências de origem humana. Além do mais, se o anticorpo contiver uma região constante, a região constante tam- bém é derivada de tais seqüências humanas, por exemplo, seqüências de linha de germe humanas, ou versões mutadas de seqüências de linha de 30 germe humanas. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resí- duos de aminoácidos não codificados pelas seqüências humanas (por e- xemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica de sítio in vitro ou por mutação somática in vivo). No entanto, o termo "anti- poohpmribaa1'araffl)'l7ioarisaclíBad|aiaqBQ dãetiéesÈieaasieGáuindatrcarfbicsrpcrB opjB seqüências de CDR derivadas da linha de germe de uma outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, foram exertadas sobre seqüências estruturais humanas.

O termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos que exibem uma especificidade de ligação (essencialmente) simples que têm regiões variáveis em que tanto as regiões de estrutura quanto CDR são derivadas de seqüências humanas. Em uma concretização, os anticorpos 10 humanos monoclonais são produzidos por um hibridoma que inclui uma cé- lula B obtida a partir de um animal não humano transgênico, por exemplo, um camundongo transgênico, tendo um genoma compreendendo um trans- gene de cadeia pesada humano e um transgene de cadeia leve humano fundidos a uma célula imortalizada.

O termo "anticorpo humano recombinante", como usado aqui,

inclui a totalidade dos anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meio recombinante, tais como anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou trans- cromossomal para genes de imunoglobulina de ser humano ou um hibrido- 20 ma preparado a partir do mesmo, anticorpos isolados de uma célula hospe- deira transformada para expressar o anticorpo humano, por exemplo, a par- tir de um transfectoma, anticorpos isolados de a biblioteca de anticorpo de ser humano combinatorial, recombinante, e anticorpos preparados, expres- sos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvem união da 25 totalidade ou uma porção de um gene de imunoglobulina de ser humano, seqüências para outras seqüências DNA. Tais anticorpos humanos recom- binantes têm regiões variáveis em que as regiões de estrutura e de CDR são derivadas de seqüências de imunoglobulina de linha de germe de ser humano. Em certas concretizações, no entanto, tais anticorpos humanos 30 recombinantes podem ser submetidos a mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para seqüências de Ig de ser humano é usado, mutagê- nese somática in vivo) e assim as seqüências de aminoácidos das regiões de Vh e Vl dos anticorpos recombinantes são seqüências que, enquanto derivadas de e relacionadas a seqüências de Vh e Vl de linha de germe de ser humano, não pode naturalmente existir dentro do repertório de linha de germe de anticorpo de ser humano in vivo.

5 Como usado aqui, "isótipo" refere-se à classe de anticorpo (por

exemplo, IgM, IgE, IgG tal como IgGI ou lgG4) que é provido pelos genes de região constante de cadeia pesada.

Como usado aqui, o termo "Afinidade" refere-se ao poder de interação entre anticorpo e antigeno em sítios antigênicos simples. Dentro de cada sítio antigênico, a região variável da "subdivisão" de anticorpo inte- rage através de forças não covalentes fracas com antigeno em numerosos sítios; quanto mais interações, mais forte a afinidade.

O termo "KD", como usado aqui, destina-se a referir-se à cons- tante de dissociação, que é obtida a partir da razão de Kd para Ka (taxa de 15 associação para taxa de dissociação) (isto é, Kd/Ka) e é expressa como uma concentração molar (M). Valores de Kd para anticorpos podem ser determi- nados usando-se métodos bem estabelecidos na técnica. Um método para a determinação do K0 de um anticorpo é por uso de ressonância de plasmônio de superfície, ou uso de um sistema de biossensor tal como um sistema Bi- 20 acore®.

Uma molécula de ligação de acordo com a invenção é preferên- cia um "anticorpo isolado", que, como usado aqui, refere-se a um anticorpo que está substancialmente livre de outros anticorpos tendo diferentes espe- cificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que especifica- 25 mente liga LINGO-1, LINGO-2 ou LINGO-1 e LINGO-2 está substancialmen- te livre de anticorpos que especificamente ligam antígenos outros que não aqueles mencionados). Um anticorpo isolado que especificamente liga pode, no entanto, ter reatividade cruzada a outros antígenos, tais com moléculas de LINGO-1 ou LINGO-2 oriundas de outras espécies. Além do mais, um 30 anticorpo isolado está preferência substancialmente livre de outros material celular e/ou produtos químicos.

A invenção também provê uma molécula de ligação da invenção que pode ser selecionada de uma molécula de ligação de cadeia simples que compreende um sítio de ligação de antigeno (especialmente com as CDRs descritas acima para o anticorpo 4784) de anticorpo 4784 compreen- dendo

a) um primeiro domínio compreendendo a seqüência variável da

cadeia pesada tendo a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 5)

b) um segundo domínio compreendendo a seqüência variável da cadeia leve tendo a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 4)

c) um Iigador de peptídeo que está ligado ou à extremidade N- terminal do primeiro domínio e à extremidade C-terminal do segundo domí- nio ou à extremidade C-terminal do primeiro domínio e à extremidade N- terminal do segundo domínio;

ou seus equivalentes diretos.

Uma molécula de ligação da invenção pode ser selecionada de uma molécula de ligação de cadeia simples que compreende um sítio de ligação de antigeno (especialmente com as CDRs descritas acima para anti- corpo 4785) de anticorpo 4785 compreendendo

a) um primeiro domínio compreendendo a seqüência variável da cadeia pesada tendo a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 7)

b) um segundo domínio compreendendo a seqüência variável da

cadeia leve tendo a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 6)

c) um Iigador de peptídeo que está ligado à extremidade N- terminal of o primeiro domínio e à extremidade C-terminal do segundo do- mínio ou à extremidade C-terminal do primeiro domínio e à extremidade N- terminal do segundo domínio; ou seus equivalentes diretos.

Como é bem conhecido, mudanças menores em uma seqüência de aminoácidos tal como deleção, adição ou substituição de um ou vários aminoácidos podem ser levadas a uma forma alélica da proteína original 30 que tem substancialmente propriedades idênticas. Assim, pelo termo "seus equivalentes diretos" quer se dizer qualquer molécula de ligação de domínio simples da invenção (molécula X) i) em que a região variável da molécula de ligação (por exem- plo, SEQ ID NO: 4, 5, 6 ou 7) é pelo menos 50 ou 80% homóloga, preferên- cia pelo menos 90% homóloga, mais de preferência pelo menos 95, 96, 97, 98, 99% homóloga às regiões variáveis equivalentes das cadeias leve e pe- 5 sada compreendendo os equivalentes diretos de SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, respectivamente ou cadeias leve e pesada compreendendo os equi- valentes diretos de SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7, respectivamente).

ii) que é capaz de ligar-se ao ectodomínio (resíduos 34-550) de LINGO-1 de rato (SEQ ID NO: 1), LINGO-1 de macaco cinomólogo (SEQ ID 10 NO: 2) e LINGO-1 de ser humano (SEQ ID NO: 3), preferência com uma constante dissociação (K0) < 1000 nM, mais de preferência com um K0 < 100 nM, com mais preferência com um K0 < 10 nM, ou qualquer molécula de ligação da invenção tendo pelo menos dois domínios por sítio de ligação (molécula X').

Assim outras concretizações da invençãos são, por exemplo,

uma molécula de ligação que é capaz de ligar-se ao ectodomínio de LINGO-

1 de rato, macaco cinomólogo e/ou de ser humano com uma constante dis- sociação < 1000 nM e compreende pelo menos um sítio de ligação de anti- geno, o dito sítio de ligação de antigeno compreendendo na seqüência a 20 região variável que é pelo menos 50%, preferência 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% homóloga às regiões variáveis equivalentes das cadeias leve e pesada de 4784 (SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, respectivamente) ou cadeias leve e pesada de 4785 (SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7, respectivamente).

Em uma outra concretização, a molécula de ligação compreende pelo menos uma seqüência de aminoácidos escolhido do grupo que consis- te em SEQ ID NO: 12-23, ou uma seqüência que é pelo menos 50%, prefe- rência 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% homóloga a essas seqüências.

Essa dissociação constante pode ser convenientemente testada em vários ensaios incluindo, por exemplo, o método de FACS descrito nos exemplos. Além disso, a ligação e efeito funcional das moléculas de ligação podem ser mostrados em um bioensaio, por exemplo, o ensaio de cresci- mento de neurito como descrito abaixo. A parte constante de uma cadeia pesada de ser humano pode ser do tipo de γ1; γ2; γ3; γ4; α1; α2; δ ou ε, preferência do tipo γ, mais de preferência do tipo γ4, enquanto que a parte constante de uma cadeia leve de ser humano pode ser do tipo κ ou λ (que inclui os subtipos λ1; Λ2; e λ3) 5 mas é preferência do tipo λ. A seqüência de aminoácidos de todas essas partes constantes são dadas em Kabat e outros (Supra).

Conjugados das moléculas de ligação da invenção, por exem- plo, conjugados de radioisótopo ou toxina ou enzima, são também incluídos dentro do escopo da invenção.

"Polipeptídeo", se não de outra maneira especificado aqui, inclui

qualquer peptídeo ou proteína compreendendo aminoácidos unidos a cada outro por ligações de peptídeo, tendo uma seqüência de aminoácidos que parte na extremidade N-terminal e que termina na extremidade C-terminal. Preferência, o polipeptídeo da presente invenção é um anticorpo monoclo- 15 nal, mais preferido é um anticorpo monoclonal quimérico (também chamado V-enxertado) ou humanizado (também chamado CDR-enxertado). O anti- corpo monclonal humanizado (CDR-enxertado) pode ou não pode incluir outras mutações introduzidas para dentro das seqüências de estrutura (FR) do anticorpo aceitante.

Um derivado funcional de um polipeptídeo como usado aqui in-

clui a molécula tendo uma atividade biológica quantitativa em comum com um polipeptídeo para a presente invenção, isto é, tendo a capacidade de ligar-se ao ectodomínio de LINGO-1 de rato, macaco cinomólogo e de ser humano.

Um derivado funcional inclui fragmentos e análogos de peptídeo

de um polipeptídeo de acordo com a presente invenção. Ele também inclui o termo "derivados diretos".

Fragmentos compreendem regiões dentro da seqüência de um polipeptídeo de acordo com a presente invenção, por exemplo, de uma se- quência especificada. Fragmentos de moléculas de ligação, especialmente de anticorpos, são fragmentos funcionais, isto é, eles compreendem pelo menos uma porção capaz de ligar-se a LINGO-1 e/ou LINGO-2, especial- mente a pelo menos um dos epitopos dado pela SEQ ID NO: 46, 47, 48, 49, 50 e 51, preferência com as afinidades de ligação (K0) mencionadas a- cima ou nos exemplos, especialmente como sendo preferidas.

O termo "derivado" é usado para definir variantes de seqüência de aminoácidos, e modificações covalentes de um polipeptídeo de acordo com a presente invenção. Por exemplo, de uma seqüência especificada. Os derivados funcionais de um polipeptídeo de acordo com a presente inven- ção, por exemplo, de uma seqüência especificada, por exemplo, da região hipervariável da cadeia leve e pesada, preferência têm pelo menos cerca de 65%, mais de preferência pelo menos cerca de 75%, ainda mais de prefe- rência pelo menos cerca de 85%, com mais preferência pelo menos cerca de 95, 96, 97, 98, 99% homologia de seqüência total com a seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo de acordo com a presente invenção, por exemplo, de uma seqüência especificada, e substancialmente reter a capa- cidade de ligar o ectodomínio de LINGO-1 de rato, macaco cinomólogo e de ser humano (e opcionalmente além do LINGO-2).

O termo "modificação covalente" inclui modificações de um poli- peptídeo de acordo com a presente invenção, por exemplo, de uma seqüên- cia especificada; ou a seu fragmento com um agente de derivação de não 20 proteináceo ou proteináceo orgânico, fusões a seqüências de polipeptídeos heterológas, e modificações pós-traducionais. Polipeptídeos modificados covalentes, por exemplo, de uma seqüência especificada, ainda têm a ca- pacidade de ligar-se ao ectodomínio de LINGO-1 de rato, de macaco cino- mólogo e de ser humano. Modificações covalentes são tradicionalmente in- 25 traduzidas por reação de resíduos de aminoácidos direcionados com um agente de derivação orgânico que é capaz de reagir com resíduos terminais ou laterais selecionados, ou por captação de mecanismos de modificações pós-traducionais que funcionam em células hospedeiras recombinantes se- lecionadas. Certas modificações pós-traducionais são o resultado da ação 30 de células hospedeiras recombinantes no polipeptídeo expresso. Resíduos de glutaminila ou asparaginila são frequentemente pós-traducionalmente desaminados aos resídios de glutamina e aspartila correspondentes. Alter- nativamente, esses resíduos são determinados sob condições moderada- mente ácidos. Outras modificações pós-traducionais incluem hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxila de resíduos de serila, tirosina ou treonila, metilação dos grupos α-amino de cadeias laterais de lisina, argi- 5 nina, e histidina, vide por exemplo, T. E. Creighton, Proteínas: Structure e Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, págs. 79-86 (1983). Modificações covalentes por exemplo, incluem proteínas de fusão compreendendo um polipeptídeo de acordo com a presente invenção, por exemplo, de uma seqüência especificada e suas variantes de seqüência de 10 aminoácidos, tais como imunoadesinas, e fusões N-terminal a seqüências de sinal heterólogas.

"Homologia" (ou "identidade) com relação a um polipeptídeo na- tivo e seu derivado funcional é definido aqui como a percentagem de resí- duos de aminoácidos na seqüência candidato que são idênticos com os re- 15 síduos de um polipeptídeo nativo correspondente, depois do alinhamento das seqüências e introdução de lacunas, se necessário, para alcançar per- centagem máxima de homologia, e não considerando-se quaisquer substitu- ições conservadoras como parte da seqüência identidade. Nem extensões de N- ou C-terminal nem interações serão interpretadas como redução de 20 identidade ou homologia. Métodos e programas de computador para o ali- nhamento são bem conhecidos.

Preferência, como usada aqui, a percentagem de homologia entre duas seqüências de aminoácidos ou duas seqüências de nucleotídeos é equivalente a uma percentagem de identidade entre as duas seqüências. 25 A percentagem de identidade entre as duas seqüências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas seqüências (isto é,% de homologia = # de posições idênticas/total # de posições x 100), levando em consideração o número de lacunas, e o comprimento de cada lacuna, que necessitam ser introduzidos para o alinhamento ótimo das duas seqüências. 30 A comparação de seqüências e determinação de percentagem de identida- de entre duas seqüências pode ser realizada usando-se um algoritmo ma- temático, como descrito nos exemplos não-limitantes abaixo: A percentagem identidade entre duas seqüências de aminoáci- dos pode ser determinada usando-se o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988) que foi incorporada no programa A- LIGN (versão 2.0), usando-se uma tabela de resíduo de peso de PAM120, 5 um pênalti de comprimento de lacuna de 12 e um pênalti de lacuna de 4. Além disso, a percentagem identidade entre duas seqüências de aminoáci- dos pode ser determinada usando-se o algoritmo Needleman e Wunsch (J. Mol1 Biol. 48:444-453, 1970) que foi incorporado no programa GAP na em- balagem de software GCG (disponível a http://www.gcg.com), usando-se ou 10 uma matriz Blossom 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.

Adicionalmente ou alternativamente, as seqüências de proteínas da presente invenção podem ulteriormente ser usadas como uma "seqüên- cia indagação" para realizar uma busca contra bases de dados pública para, por exemplo, identificar seqüências relacionadas. Tais buscas podem ser realizadas usando-se o programa XBLAST (versão 2.0) of Altschul, e outros, 1990 J.Mol. Biol. 215:403-10. Buscas de proteína de BLAST podem ser rea- lizadas com o programa XBLAST, classificação = 50, comprimento de pala- vra = 3 para se obter seqüências de aminoácidos homólogas às moléculas de anticorpo da invenção. Para se obter alinhamentos de lacuna para finali- dades de comparação, BLAST de lacuna pode ser utilizada como descrito em Altschul e outros, 1997 Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Quando da utilização de programas BLAST e BLAST de lacuna, os parâmetros pa- drão dos programas respectivos (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados. Vide http:www.ncbi.nhn.nih.gov.

"Aminoácido(s)" referem-se a todos os L-a-aminoácidos de ocor- rência natural, por exemplo, e incluindo D-aminoácidos. Os aminoácidos são identificados ou pelas designações de única letra ou de três letras bem co- nhecidas.

O termo "variante de seqüência de aminoácidos" refere-se a mo-

léculas com algumas diferenças em suas seqüências de aminoácidos quan- do em comparação com um polipeptídeo de acordo com a presente inven- ção, por exemplo, de uma seqüência especificada. Variantes de seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo de acordo com a presente invenção, por exemplo, de uma seqüência especificada, ainda têm a capacidade de ligar- se ao ectodomínio de LINGO-1 de rato, de macaco cinomólogo e de ser 5 humano. Variantes substitucionais são aquelas que têm pelo menos um re- síduo de aminoácido removido e um aminoácido diferente inserido em seu lugar na mesma posição em um polipeptídeo de acordo com a presente in- venção, por exemplo, de uma seqüência especificada. Essas substituições podem ser simples, onde apenas um aminoácido na molécula foi substituí- 10 do, ou elas podem ser múltipla onde dois ou mais, por exemplo, de 1 a 10, preferência de 1 a 5, mais de preferência de 1 a 3, aminoácidos foram subs- tituídos na mesma molécula. Variantes insercionais são aquelas com ou mais, por exemplo, de 1 a 100, tais como de 1 a 10, aminoácidos inseridos imediatamente adjacentes a um aminoácido a uma posição particular em 15 uma polipeptídeo de acordo com a presente invenção, por exemplo, de uma seqüência especificada. Imediatamente adjacente a um meio aminoácido ligado ou ao grupos funcional α-carbóxi ou α-amino do aminoácido. Varian- tes delecionais são aquelas com um ou mais, por exemplo, de 1 a 100, tais como de 1 a 10 ou de 1 a 5, aminoácidos em um polipeptídeo de acordo 20 com a presente invenção, por exemplo, de uma seqüência especificada, re- movida. Ordinariamente, variantes de deleção terão um ou dois aminoácidos deletados em uma região particular da molécula.

Uma molécula de ligação da invenção pode ser produzida por técnicas de DNA recombinantes. Em virtude disso, uma ou mais moléculas de DNA que codificam a molécula de ligação devem ser construídas, colo- cadas sob seqüências de controle apropriadas e transferidas para dentro de um organismo hospedeiro para expressão.

De um modo muito geral, são correspondentemente providas

(i) moléculas de DNA que codificam a molécula de ligação de domínio simples da invenção, uma molécula de ligação de cadeia simples da invenção, uma cadeia pesada ou leve ou seus fragmentos de uma molé- cula de ligação da invenção; e (ii) o uso das moléculas de DNA da invenção para a produção de uma molécula de ligação da invenção por meio recombinante.

O presente estado da técnica é tal que a pessoa versada será capaz de sintetizar as moléculas de DNA da invenção dadas a informação providas aqui, isto é, as seqüências de aminoácidos das regiões hipervariá- veis e das seqüências de DNA que codificam para elas. Um método para a construção de um gene de domínio variável é, por exemplo, descrito na EP 239 400 (preferência incorporada aqui por referência, especialmente em re- lação aos métodos para a construção de um gene de domínio variável) e pode ser resumidamente sumarizado como se segue: Um gene que codifica um domínio variável de um anticorpo monoclonal de se especificidade é clo- nada. Os segmentos de DNA que codificam as regiões de estrutura e hiper- variáveis são determinadas e os segmentos de DNA que codificam as regi- ões hipervariáveis são removidas de modo que os segmentos de DNA que codificam as regiões de estrutura sejam fundidas juntamente com sítios de restrição adequados nas junções. Os sítios de restrição podem ser gerados nas posições apropriadas da molécula de DNA por procedimentos padrão. Pacotes de região variável sintéticos de fio duplo são preparados por síntese de DNA de acordo com as seqüências dadas acima. Esses pacotes são providos com extremidades de DNA de modo que eles possam ser ligados nas junções à estrutura por protocolo padrão para alcançar uma molécula de DNA que codifica um domínio variável de imunoglobulina.

Além do mais, não é necessário ter acesso ao mRNA oriundo de uma produção de linha de célula de hibridoma a fim de se obter um constru- 25 to de DNA que codifica os anticorpos monoclonais da invenção. Assim, o pedido de PCT WO 90/07861 (preferência incorporado aqui por referência, especialmente com relação à produção de anticorpos monoclonais) dá ins- truções completas para a produção de um anticorpo monoclonal por técni- cas de DNA recombinantes dada apenas a informação escrita quanto à se- 30 quência de nucleotídeos do gene.

O método compreende a síntese de numerosos oligonucleotí- deos, sua ampliação pelo método de PCR, e união para dar a seqüência de DNA desejada.

Vetores de expressão compreendendo um promotor ou genes adequados que codificam partes constantes de cadeia pesada e leve estão publicamente disponíveis. Assim, uma vez que uma molécula de DNA da invenção é preparada pode ser convenientemente transferida em um vetor de expressão apropriado.

Moléculas de DNA que codificam anticorpos de cadeia simples podem também ser preparadas por métodos padrão, por exemplo, como descrita na WO 88/1649 (preferência incorporada aqui por referência, espe- cialmente com relação às moléculas de DNA que codificam anticorpos de cadeia simples).

Em uma concretização particular da invenção, o meio recombi- nante para a produção de algumas das moléculas de ligação da invenção inclui primeiro e segundo construtos de DNA como descritos abaixo:

O primeiro construto de DNA codifica uma cadeia pesada ou seu

fragmento e compreende

(a) uma primeira parte que codifica o domínio variável da cadeia pesada ou do anticorpo 4784, DNA-4784 Vh (SEQ ID NO: 8), ou do anticor- po 4785, DNA-4785 Vh (SEQ ID NO: 9); essa primeira parte que parte com

um códon que codifica o primeiro aminoácido do domínio variável e que ter- mina com um códon que codificam o último aminoácido do domínio variável, e

(b) uma segunda parte que codifica uma parte constante de ca- deia pesada ou seu fragmento que se inicia com um códon que codifica o

primeiro aminoácido da parte constante da cadeia pesada e termina com um códon que codificam o último aminoácido da parte constante ou seu frag- mento, seguido por um códon de sem sentido.

Preferência, a segunda parte codifica a parte constante de uma cadeia pesada de ser humano, mais de preferência a parte constante da cadeia de γ4 ser humano. Essa segunda parte pode ser um fragmento de DNA de origem genômica (compreendendo íntrons) ou um fragmento de cDNA (sem íntrons). O segundo construto de DNA codifica a cadeia leve ou seu fragmento e compreende

a) uma primeira parte que codifica o domínio variável da cadeia leve ou de anticorpo 4784, DNA-4784 Vl (SEQ ID NO: 10), ou de anticorpo

4785, DNA-4785 Vl (SEQ ID NO: 11); essa primeira parte que parte com um códon que codifica o primeiro aminoácido do domínio variável e que termina com um códon que codifica o último aminoácido do domínio variável, e

b) uma segunda parte que codifica a parte constante de cadeia leve ou seu fragmento que se inicia com um códon que codifica o primeiro

aminoácido da parte constante da cadeia leve e termina com um códon que codifica o último aminoácido da parte constante ou seu fragmento seguido por um códon de sem sentido.

Preferência, a segunda parte codifica a parte constante de uma cadeia leve de ser humano, mais de preferência a parte constante da cadeia K de ser humano.

Cada um dos construtos de DNA é colocado sob o controle de seqüências de controle adequadas, em particular sob o controle de um pro- motor adequado. Qualquer espécie de promotor pode ser usado, com a condição de que ela seja adaptada para o organismo hospedeiro em que os 20 construtos de DNA serão transferidos para a expressão. No entanto, se ex- pressão por para colocar em uma célula de mamífero, é particularmente pre- ferido usar o promotor de um gene de imunoglobulina.

O anticorpo desejado pode ser produzido em uma cultura de célula ou em um animal transgênico. Um animal transgênico adequado pode 25 ser obtido de acordo com métodos padrão que incluem microinjeção para dentro de ovos dos primeiro e segundo construtos de DNA colocados sob seqüências de controle adequadas que transferem os ovos assim prepara- dos para dentro de fêmeas pseudo-grávidas e que selecionam um descen- dente que expressa o anticorpo desejado.

Quando as cadeias de anticorpo têm de ser produzidas em uma

cultura de célula, os construtos de DNA deve primeiramente ser inseridos para dentro ou de um vetor de expressão simples ou para dentro de dois separados mas vetores de expressão compatíveis, a última possibilidade sendo preferida.

Correspondentemente, a invenção também provê um vetor de expressão capaz de replicar em uma linha de célula procariótica ou eucarió- tica que compreende pelo menos um dos construtos de DNA acima descri- tos.

Cada vetor de expressão contendo um construto de DNA é en- tão transferido para dentro de um organismo hospedeiro. Quando os cons- trutos de DNA são separadamente inseridos em dois vetores de expressão, 10 eles podem ser transferidos separadamente, isto é, um tipo de vetor por cé- lula, ou co- trasnsferido, essa última possibilidade sendo preferida. Um or- ganismo hospedeiro adequado pode ser uma linha de célula de bactéria, de levedura, ou de célula de mamífero, essa última sendo preferida. Mais prefe- rência, a linha de célula de mamífero é de origem linfóide, por exemplo, um 15 mieloma, hibridoma ou um célula B imortalizada normal, mas não expressa qualquer anticorpo endógeno de cadeia pesada ou leve.

É também preferido que o organismo hospedeiro contenha um grande número de cópias dos vetores por célula. Se o organismo hospedei- ro por uma linha de célula de mamífero, esse objetivo desejável pode ser 20 alcançado por ampliação do número de cópias de acordo com métodos pa- drão. Métodos de ampliação usualmente consistem em seleção para a resis- tência aumentada a um fármaco, a dita resistência sendo codificada pelo vetor de expressão.

Em um outro aspecto da invenção, é provido um processo para a produção de uma molécula de ligação de múltiplas cadeias da invenção, que compreende

(i) cultivo de um organismo que é transformado com os primeiro e segundo construtos de DNA da invenção e

(ii) recuperação de uma molécula de ligação ativa da invenção a partir da cultura.

Alternativamente, a cadeia leve e pesada podem ser separada- mente e reconstituída em uma molécula de ligação ativa depois do redo- bramento in vitro. Métodos de reconstituição são bem conhecidos na técni- ca; Exemplos de métodos são em particular providos na EP 120 674 ou na EP 125 023.

Portanto um processo pode também compreender (i) cultivo de um primeiro organismo que é transformado com um

primeiro construto de DNA da invenção e recuperação da dita cadeia pesa- da ou seu fragmento a partida cultura e

(ii) cultivo de um segundo organismo que é transformado com um segundo construto de DNA da invenção e recuperação da dita cadeia

leve ou seu fragmento a partir da cultura e

(iii) reconstituição in vitro de uma molécula de ligação ativa da invenção a partir da cadeia pesada ou seu fragmento obtido em (i) e na ca- deia leve ou seu fragmento obtido em (ii).

De um modo similar, é também provido um processo para a produção de uma molécula de ligação de domínio simples ou de cadeia simples da invenção que compreende

(i) cultivo de um organismo que é transformado com um constru- to de DNA respectivamente que codifica uma molécula de ligação de domí- nio simples ou de cadeia simples da invenção e (ii) recuperação da dita molécula a partir da cultura.

As moléculas de ligação da invenção significativamente inibem a ligação de LINGO-1 a NgR, significativamente atenuam a atividade inibitória de crescimento de neurito de mielina de medula espinhal de rato adulto a concentrações de sub-nM e significativamente aumentam diferenciação de oligodendrócito in vitro como exemplificado abaixo:

Legendas das Figuras

Figura 1. Efeito de Fabs 4784 e 4785 na ligação de AP-LINGO-1 a células de NgR:SH-SY5Y

células de NgR:SH-SY5Y em suspensão são incubadas ou com AP ou AP- LINGO-1 a 1 nM na ausência ou na presença de 2 μΜ do Fab de antiLIN- GO-1 indicado ou Fab 3207 de Iisozima de antigalinha. Atividade de AP li- gada nas células é medida como absorbância de 405 nm depois de uns 30 min de incubação com 1-StepTM PNPP. A ligação específica de AP- LINGO-1 é calculada como a diferença entre a quantidade total de ligação de AP-LINGO-1 e a quantidade de ligação com AP sozinho. A percentagem média de inibição de ligação específica (n = 3, ± STD) é calculada como um 5 diferença de percentil entre a quantidade de ligação específica de AP- LINGO-1 na presença de Fab 3207 e a presença de um Fab de antiLINGO- 1.

Figura 2. Desinibição de mielina de medula espinhal por anticor- pos 4784 e 4785 de lgG4 de antiLINGO-1 A) células de P7 CGN são incubadas por 16 h em cavidades

revestidas sem mielina de medula espinhal (nenhum SC, barras brancas) ou cavidades revestidas com mielina de medula espinhal na ausência (SC, bar- ras vermelhas) ou na presença de anticorpos de lgG4 de antiLINGO-1, um controle de anticorpo 3207 de lgG4 de antilisozima de controle(barras ver- 15 des) ou 1 pm do inibidor Y27632 de ROCK (barra amarela). ROCK é o men- sageiro secundário na trajetória de sinalização da maioria, não a totalidade dos, inibidores de crescimento de neurito associados à mielina, incluindo aqueles que não sinalizam através do complexo de receptor de NgR e como tal tratamento com Y27632 é usado como um controle positivo para a ate- 20 nuação da atividade inibitória de crescimento de neurito de mielina de medu- la espinhal (figura 1). A experiência é realizada em três placas de 96 cavida- des com uma condição de SC e não SC por placa à qual os efeitos dos anti- corpos naquela placa são comparados e comprimento de neurito médio por neurônio (pm) é calculado para 500 neurônios por cavidade em replicatas de 25 10. A percentagem de inibição (texto branco) é calculada como a diferença de percentil em comprimento de neurito médio/neurônio entre células lami- nadas em cavidades revestidas com e sem SC. A percentagem de desinibi- ção (texto itálico preto) é calculada como a diferença no comprimento de neurito médio entre células laminadas no SC na presença e na ausência de 30 anticorpo de antiLINGO-1 como um percentil da diferença entre células la- minadas em cavidades revestidas com e sem SC. *p<0,05, **p<0,01 (uma trajetória ANOVA, Holm-Sidak comparação com comprimento de neurito médio/neurônio para células laminadas nà mielina de medula espinhal na ausência de anticorpo).

B) Imagens fluorescentes de um campo de vista representativo de células incubadas em cavidades revestidas sem mielina de medula espi- 5 nhal (nenhum SC) e em cavidades revestidas com mielina de medula espi- nhal na ausência (SC) ou na presença de 1 nM de lgG4 3207 de controle ou lgG4 4784 de antiLINGO-1. Células se desenvolvendo em mielina de medu- la espinhal na presença de 4784 têm neuritos visivelmente mais longos e mais neuritos por célula do que aqueles desenvolvidos na ausência de anti- 10 corpo ou na presença do anticorpo 3207 de controle.

Figura 3. Desinibição de mielina de medula espinhal por anticor- pos Il de lgG4 de antiLINGO-1

A) células de P7 CGN são incubadas por 8 h em cavidades re- vestidas sem mielina de medula espinhal (nenhum SC, barras brancas) ou cavidades revestidas com mielina de medula espinhal na ausência (SC, bar- ras vermelhas) ou na presença de anticorpos de lgG4 de antiLINGO-1 ou um anticorpo 3207 de lgG4 de antilisozima de controle. A experiência é rea- lizada em três placas de 96 cavidades com uma condição de SC e não SC por placa à qual os efeitos dos anticorpos naquela placa são comparados e comprimento de neurito médio por neurônio (pm) é calculado por 500 neu- rônios por cavidade em replicatas de 10. A percentagem de inibição (texto branco) e de desinibição (texto itálico preto) é calculada como acima. **p<0,01 (uma trajeória ANOVA, Holm-Sidak comparação com comprimento de neurito médio/neurônio por células laminadas nà mielina de medula espi- nhal na ausência de anticorpo).

Figura 4. Desinibição de mielina de medula espinhal por anticor- pos Ill de lgG4 de antiLINGO-1

Células de P7 CGN são incubadas por 8 h em cavidades reves- tidas sem mielina de medula espinhal (nenhum SC) ou cavidades revestidas com mielina de medula espinhal na ausência (SC) ou na presença das con- centrações indicadas de anticorpos 4784 ou 4785 de lgG4 de antiLINGO-1, um controle de anticorpo 3207 de lgG4 de antilisozima de controle ou 1 μΜ de Y27632 (ROCK). A experiência é realizada em três placas de 96 cavida- des com uma condição de SC e não SC por placa à qual os efeitos dos anti- corpos naquela placa são comparados e comprimento de neurito médio por neurônio (μπι) é calculado para 500 neurônios por cavidade em replicatas de 5 10. A percentagem de inibição (texto branco) e a desinibição (texto itálico preto) é calculada como acima. *p<0,05, **p<0,01 (uma trajeória ANOVA, Holm-Sidak comparação com comprimento de neurito médio/neurônio para células laminadas nà mielina de medula espinhal na ausência de anticorpo).

Figura 5. Anticorpos de antiLINGO-1 significativamente aumen- tam a diferenciação de oligodendrócitos imaturos

A) OPCs frescamente isolados são tratados com 100 nM de 4784, 4785 ou lgG4 3207 de controle por 3 dias no meio de DMEM/CNTF/T3 seguido por manchamento com o anticorpo de anti-04 para visualizar oligo- dendrócitos imaturos e maduros (marcação mais larga, mais difusa) e o co-

rante de ácido nucléico DAPI (4’,6-diamidin-2’-fenil-indol-dicloridrato) para visualizar núcleos celulares (pontos circulares menores). Oligodendrócitos que portam processos prolongados e altamente arborizados e estruturas de tipo de folha de mielina são considerados ter uma morfologia madura e são indicados com setas brancas. Tratamento com anticorpo de antiLINGO-1 20 resulta em um aumento na proporção de células positivas a 04 com uma morfologia madura enquanto que tratamento com lgG4 3207 de controle não tem nenhum efeito.

B) A proporção de oligodendrócitos totais (gráfico à esquerda) e maduros (gráfico à direita) é quantificada em três experiências independen-

tes (1, 2, 3). O gráfico à esquerda mostra a percentagem de núcleos man- chados com DAPI associados a manchamento com 04 e o gráfico de barra à direita mostra a percentagem de células positivas a 04 com uma morfolo- gia madura (meio de triplicatas + STD). Em cada gráfico de barra, a barra mais à esquerda é com nenhum tratamento, o segundo controle de barra à 30 esquerda com IgG de controle, o próximo representa o tratamento com 4784 e o tratamento com 4785 mais à direita. Anticorpos de antiLINGO-1 não têm nenhum efeito na proporção de células que são oligodendrócitos mas signi- ficativamente aumentam a proporção de oligodendrócitos com uma morfo- logia madura. * p<0,05, ** p<0,01, uma trajetória ANOVA com um Holm- Sidak em comparação com a proporção de oligodendrócitos maduros na presença da lgG4 3207 de controle.

5 Figura 6. Anticorpos de antiLINGO-1 regulam para baixo de su-

perfície de célula LINGO-1

A) células de CHO-K1-hLINGO-1 ou de CHO-K1 não transfecta- das são incubadas a 37°C por 24 h com 100 nM de 4784, 4785 e 3207 e LINGO-1 detectadas na superfície de célula por uma outra incubação à

temperatura ambiente por 30 min com o anticorpo de anti-V5. As células são fixadas com 4% de PFA, bloqueadas com BSA e anticorpo de anti-V5 ligado detectado usando-se um conjugado de POD-(específico de Fe) de IgG de que é subsequentemente desenvolvido usando-se um kit 1-Step® Turbo TMB ELISA. A absorbância a 450 nm é tomada como uma medida da quan- 15 tidade de LINGO-1 na superfície de célula (meio de triplicatas ± STD). Um nível muito baixo de ligação de anticorpo de anti-V5 é observado para célu- las de CHO-K1 não transfectadas. Incubação de células de CHO-K1- hLINGO-1 com anticorpos de antiLINGO-1 mas não uma lgG4 3207 de con- trole resultam em uma redução significativa na quantidade de LINGO-1 na 20 superfície de célula ** p<0,01, uma trajetória ANOVA com a Holm-Sidak comparação com a absorbância após incubação com a lgG4 3207 de con- trole.

B) Superfície de célula proteínas nas células de CHO-K1- hLINGO-1 ou de CHO-K1 não transfectadas são biotiniladas a 4°C e as cé-

lulas são incubadas a 37°C pelos tempos indicados com ou sem 4784, 4785 e 3207 a 100 nM. No fim do período de incubação, LINGO-1 é precipitado a partir do Iisado de célula usando-se o anticorpo de anti-V5 acoplado a con- tas de agarose e LINGO-1 biotinilado (superfície de célula) detectados por análise de Western blot usando-se um anticorpo de antibiotina. Nenhum si- 30 nal é detectado para LINGO-1 biotinilado em células de CHO-K1 não trans- fectadas. Incubação de células de CHO-K1-hLINGO-1 com anticorpos de antiLINGO-1 aumenta a taxa de degradação de superfície de célula LINGO- 1.

Figura 7. Caracterização de Fabs de antiLINGO-1 por de ELISA

Valores para análise de ELISA são dados como valores médios de unidades de fluorescência relativa (RFU).

As afinidades de ligação desses clones são caracterizadas por

ensaios de saturação de FACS.

A presente invenção também provê o uso das moléculas de li- gação da invenção na promoção de regeneração axonal/plasticidade de um sistema nervoso de mamífero, em particular o sistema nervoso de ser hu- mano.

A invenção também provê um método de promoção de regene- ração axonal/plasticidade de um sistema nervoso de mamífero, em particu- lar sistema nervoso de ser humano que compreende a administração de uma quantidade eficaz das moléculas de ligação da invenção a um paciente que necessita de tal tratamento.

A invenção também provê uma composição farmacêutica para a promoção de regeneração axonal/plasticidade de um sistema nervoso de mamífero, em particular sistema nervoso de ser humano que compreende as moléculas de ligação da invenção e um veículo ou diluente farmaceuti- camente aceitável.

Em particular, as moléculas de ligação da invenção são úteis para a promoção de regeneração axonal e plasticidade depois de lesão de CNS (o termo lesão, no presente pedido, refere-se especialmente à lesão causada, por efeitos mecânicos ou químicos ou devido a doenças ou distúr- 25 bios que, por exemplo, levam à degeneração de neurônios, especialmente sua forma ou estrutura, por exemplo, em doenças neurológicas tal como doença de Alzheimer ou Parkinson ou outros distúrbios ou doenças mencio- nadas abaixo). Assim as moléculas da invenção têm uma ampla utilidade em particular para indivíduos humanos. Por exemplo a molécula de ligação 30 da invenção é útil no tratamento de várias doenças do sistema nervoso peri- férico (PNS) e central (CNS), isto é, mais particularmente doenças neurode- generativas tais como Doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclero- se lateral amiotrófica (ALS), patologias de tipo Lewy ou outra demência em geral, doenças após trauma craniano, cerebral ou espinhal e acidente vas- cular cerebral. Além do mais, dado que LINGO-1 é um regulador negativo de mielinização, as moléculas de ligação da invenção são úteis para a promo- 5 ção de remielinização de comum acordo com promoção de regeneração axonal/plasticidade em doenças de desmielinização que incluem, mas não são limitadas a, esclerose múltipla, desmielinização monofásica, encefalo- mielite, Ieucoencefalopatia multifocal, panencefalite, doença de Marchiafava- Bignami, mielmólise de pontina, adrenoleucodistrofia, doença de Pelizaeus- 10 Merzbacher, degeneração de Spongy, doença de Alexander, doença de Ca- navan, Ieucodistrofia metacromática e doença de Krabbe. Em um exemplo, células que expressam as moléculas de ligação da invenção podem ser transplantadas para um sítio de lesão na medula espinhal para facilitar cres- cimento axonal através de todo o sítio lesionado. Tais células transplantadas 15 proveriam um meio de restauração da função da medula espinhal após le- são ou trauma. Tais células poderiam incluir células de revestimento olfató- rio e células tronco de diferentes linhagens de enxertos de tecido ou nervo fetais.

Além disso, as moléculas de ligação da invenção são úteis para 20 o tratamento de distúrbios oculares degenerativos que podem diretamente ou indiretamente envolver a degeneração de células da retina ou córnea incluindo retinopatias isquêmicas em geral, neuropatia ótica isquêmica ante- rior, todas as formas de neurite ótica, degeneração macular relacionada com a idade, retinopatia diabética, edema macular cistóide (CME), retinite pig- 25 mentosa, doença de Stargardt, degeneração retinal viteliforme de Best, a- maurose congênita de Leber e outras degenerações retinais hereditárias, miopia patológica, retinopatia de prematuridade, e neuropatia ótica hereditá- ria de Leber, os efeitos posteriores de transplante de córnea ou de cirurgia corneal refrativa, e herpes ceratite.

Além do mais, as moléculas de ligação da invenção são úteis

para o tratamento de condições psiquiátricas, particularmente esquizofrenia e depressão. Para essas indicações, a dosagem apropriada, naturalmente, variará, por exemplo, da molécula particular da invenção a ser empregada, do modo de administração e da natureza e da severidade da condição a ser tratada. Em geral, a dosagem de preferência estará na faixa de 1 μg/kg/dia a 5 1 mg/kg/dia. As moléculas de ligação da invenção são convenientemente administradas por bombas ou injetadas como terapêutica no sítio Iesionado ou próxima a ele, por exemplo, elas podem ser administradas diretamenta- mente no CNS intracranialmente ou na espinha dorsal intratecalmente para

o sítio lesionado. No entanto, administração sistêmica não é excluída aqui. As moléculas de ligação da invenção podem ser providas sozinhas, ou em combinação, ou em combinação seqüencial com outros agentes. Por exem- plo, as moléculas de ligação da invenção podem ser administradas em combinação com anticorpos de anti-Nogo-A ou agentes anti-inflamatórios tais como mas não limitados a corticosteróides após o acidente vascular ce- rebral ou lesão na medula espinhal como um dispositivo para o bloqueio de outro dano neuronal e inibição de regeneração axonal, fatores neurotróficos tais como NGF, BDNF ou outros fármacos para doenças neurodegenerati- vas tal como Exelon® ou Levodopa. Outros pares de combinação adequa- dos para o tratamento de acidente vascular cerebral são Alteplase e Desmo- teplase (DSPA, por exemplo, descrito em WO 90/09438). Em uma concreti- zação, a presente invenção provê uma combinação compreendendo uma molécula de ligação da invenção e Desmoteplase, em particular para o tra- tamento de acidente vascular cerebral bem como composições farmacêuti- cas compreendendo a dita combinação. Como usado aqui, dois agentes são ditos serem administrados em combinação quando os dois agentes são ad- ministrados simultaneamente ou são administrados independentemente em um forma tal que os agentes agirão ao mesmo tempo.

A estrutura dos ingredientes ativos identificados por números de código, nomes genéricos ou marca registrada pode ser tomada da edição real do compêndio padrão "The Merck Index" ou a partir das bases de da- dos, por exemplo, Patentes Internacionais (por exemplo, IMS World Publica- tions) ou outras bases de dados providas por IMS Health. O seu conteúdo correspondente é incorporado aqui por referência. Qualquer pessoa versa- da na técnica é totalmente permitido identificar os ingredientes ativos e, com base nessas referências, do mesmo modo, é permitido fabricar e testar as indicações e propriedades farmacêuticas em modelos de teste padrão, tanto in vitro quanto in vivo.

Composições farmacêuticas da invenção podem ser fabricadas de modo convencional. Por exemplo, uma composição de acordo com a in- venção compreendendo as moléculas da invenção é de preferência provida em forma liofilizada. Para a administração imediata ela é dissolvida em um 10 veículo aquoso adequado, por exemplo, água estéril para a injeção ou solu- ção salina fisiológica tamponada estéril.

Para auxiliar na produção de composições adequadas, as molé- culas de ligação da invenção e opcionalmente um segundo fármaco que me- lhora o efeito das moléculas de ligação da invenção, podem ser embaladas 15 separadamente dentro do mesmo recipiente, com instruções para mistura- ção ou administração concomitante. Candidatos de segundo fármaco opcio- nais são providos acima.

O efeito sinérgico de uma combinação das moléculas de ligação da invenção e fatores de crescimento tal como NGF podem ser demonstra- dos in vivo pela lesão nos modelos de medula espinhal.

A invenção será mais totalmente entendida por referência aos seguintes exemplos. Eles, no entanto, não serão interpretados: como Iimi- tantes do escopo da invenção.

Os anticorpos monoclonais de atenção nos exemplos são molé- cuias de ligação de acordo com a presente invenção contendo por anticorpo

4784 - parte variável da cadeia leve (SEQ ID NO: 4) e a parte variável da cadeia pesada (SEQ ID NO: 5) e compreendendo por 4785 a parte variável da cadeia leve (SEQ ID NO: 6) e a parte variável da cadeia pesada (SEQ ID NO: 7).

As seguintes abreviações são usadas:

AP fosfatase alcalina de placenta de ser humano

CDR região de determinação de complementaridade cDNA DNA complementar ELISA ensaio imunossorvente ligado à enzima FACS classificação de célula ativada por fluorescência FBS soro de bovino fetal 5 HCMV promotor de citomegalovírus de ser humano IgG isótipo G de imunoglobulina PBS solução salina tamponada por fosfato PCR reação de cadeia de polimerase PFA paraformaldeído PNPP fosfato de para-nitrofenila Exemplo 1: Geração de células de CHO-K1 que expressam comprimento total de LINGO-1 de rato, macaco cinomólogo ou de ser humano e LINGO-2 de ser humano

Uma biblioteca de cDNA é gerada por RT-PCR de RNA de refe- rência de ser humano universal (Stratagene) usando-se iniciadores de oligo dT e aleatórios. Uma biblioteca de cDNA de cérebro de macaco cinomólogo é gerada por RT-PCR por polyA RNA isolado de cérebro de macaco cinomó- logo congelado usando-se iniciadores de oligo dT e aleatórios. Uma bibliote- ca de cDNA de cérebro de rato pronto Marathon é obtida a partir da Clonte- ch. cDNA que codifica a seqüência madura (resíduos 34-614) de LINGO-1 de ser humano (SEQ ID NO: 27), LINGO-1 de macaco cinomólogo (SEQ ID NO: 28) e LINGO-1 de rato (SEQ ID NO: 29) flanqueado por sítios de 5'- Xbal e 3'-Xhol são ampliados por PCR a partir da biblioteca respectiva u- sando-se o iniciador avante DM14, 5'-CTACGTCTAGAACGGGCTGCCCGC CCCGCT-3' (SEQ ID NO: 30), e o iniciador reverso DM15,

5'-GGTTTCTCGAGTCATATCATCTTCATGTTGAACTTGCGG-3' (SEQ ID NO: 31). O produto de PCR é clivado com Xbal e Xhol e é inserido nos sítios respectivos do vetor pSecTag2-V5 (SEQ ID NO: 32) para gerar hLINGO-1- pSecTag2-V5, cmLINGO-1-pSecTag2-V5 e rLINGO-1-pSecTag2-V5, res- 30 pectivamente. O produto de proteína previsto é a seqüência madura de LINGO-1 fundida no N-terminal a uma etiqueta de epitopo de V5 de 14 resí- duos de aminoácidos via um Iigador de 2 resíduos de aminoácidos. cDNA que codifica a seqüência madura (resíduos 26-606) de LINGO-2 de ser humano (SEQ ID NO: 33) flanqueado por sítios de 5'-Xbal e 3'-Xhol é PCR ampliado a partir de uma biblioteca de cDNA de cérebro de ser humano pronto Marathon (CIontech) usando-se o iniciador avante DM16, 5'- 5 CTACGTCTAGAATTGGCTGCCCCGCTCGCT-3' (SEQ ID NO: 34), e o ini- ciador reverso DM17, 5'-GGTTTCTCGAGTCAAATCATTTTCATGTTGAACC TCCTG-3' (SEQ ID NO: 35). O produto de PCR é clivado com Xbal e Xhol e é inserido nos sítios respectivos do vetor pSecTag2-V5 para gerar hLINGO- 2-pSecTag2-V5. O produto de proteína previsto é a seqüência madura de 10 LINGO-2 fundida no N-terminal a uma etiqueta de epitopo de V5 de 14 resí- duos de aminoácidos via um Iigador de 2 resíduos de aminoácidos. Células de CHO-K1 estavelmente que expressam LINGO-1 de ser humano (CHO- K1-hLINGO-1), cynomolgous LINGO-1 (CHO-K1-cmLINGO-1), LINGO-1 de rato (CHO-K1 -rLINGO-1) e LINGO-2 de ser humano (CHO-K1-hLINGO-2) 15 são gerados por transfecção de células com hLINGO-1-pSecTag2-V5, c- mLINGO-1-pSecTag2-V5, rLINGO-1-pSecTag2-V5 e hLINGO-2-pSecTag2- V5, respectivamente, usando-se lipofectamina-2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Transfectantes estavelmente expressos são selecionados com 1 mg/ml de zeocina (Invivogen) e clones simples iso- 20 lados ou por diluição em série em placas de 96 cavidades ou por uso de a- néis clonais. Expressão dos construtos na superfície de célula é confirmada por análise imunofluorescente usando-se um anticorpo de anti-V5 (Invitro- Gen).

Exemplo 2: Geração e expressão de LINGO-1-Fc de ser humano e LINGO- IALRR-Fcdeserhumano

Um MGC mRNA que codifica LINGO-1 de ser humano (clone MGC:17422 IMAGE:4214343) é usado como modelo para a ampliação de PCR. O domínio extracelular (ECD) precedido pela seqüência de sinal natu- ral (aa1-550) de LINGO-1 de ser humano é ampliado por PCR com a poli- 30 merase de Pwol (Roche Diagnostics) e com iniciadores que adicionaram um sítio de restrição de Hindlll e a seqüência de consenso de Kozak na ex- tremidade 5' da seqüência alvo e um sítio de restrição de Xhol imediatamen- te depois do último códon da seqüência alvo na extremidade 3'. O produto de PCR é digerido com Hindlll e Xhol1 gel purificado e inserido em plasmídio pRS5a-lgG (SEQ ID NO: 36) anteriormente digerido com as mesmas enzi- mas. A precisão da seqüência inserida, Fc completo e regiões de flanquea- 5 mento no clone de expressão resultante (natleader-hsLINGO-1-Fc/pRS5a, SEQ ID NO: 37) é confirmado por sequenciação de DNA. O mesmo clone de MGC serve como modelo para a construção por gene SOEing do plasmí- dio de expressão para LINGO-1 de ser humano que carece de domínio de LRR (aa34-65 + aa354-550). A região N-terminal de ECD LINGO-1 de ser 10 humano (aa34-65) é ampliada por PCR com iniciadores que se prolongam na extremidade 5’ com uma seqüência parcial que codifica um sinal de se- creção heterólogo fundido a LINGO-1 maduro e adição, na extremidade 3', de uma seqüência que codifica os primeiros sete aminoácidos do fragmento C-terminal. A região C-terminal de ECD LINGO-1 de ser humano (aa354- 15 550) é ampliada por PCR com iniciadores que se prolongam na extremidade 5’ com uma seqüência que codifica os últimos sete aminoácidos do frag- mento N-terminal e adição, na extremidade 3', de um sítio de Xhol imedia- tamente depois do último códon da seqüência alvo. Os dois produtos do PCR são gel purificado, misturado e serve como modelo para uma segunda 20 ampliação de PCR usando-se na extremidade 5' um iniciador que adiciona um sítio de restrição de HindIII, uma seqüência de consenso de Kozak e completa a seqüência de sinal de secreção heteróloga e, na extremidade 3',

o iniciador externo anteriormente usado para ampliar o fragmento C- terminal. O produto de PCR é digerido com Hindlll e Xhol, gel purificado e 25 inserido em plasmídio pRS5a-lgG anteriormente digerido com as mesmas enzimas. A precisão da seqüência inserida, Fc completo e regiões de flan- queamento no clone de expressão resultante (lgleader-hsLINGO-1-ALRR- Fc/pRS5a, SEQ ID NO: 38) é confirmado por sequenciação de DNA.

Como uma avaliação de expressão inicial ambos os construtos são testados em experiências em escala pequena. Células de HEK.EBNA (Invitrogen, previous cat.no. R620-07) são cultivadas no modo ligado em frascos de cultura de tecido em meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) tamponado com Hepes a 25 mM (Gibco/Life Technologies cat.no. 42430-025) e adicionalmente enriquecido com 10% de soro de bezerro fetal; as culturas são mantidas a 37°C e 5% de CO2 em atmosfera umidifidada. Para experiências de transfecção em escala pequena, 4x105 células são 5 semeadas um dia antes da transfecção em 6 cavidades revestidas com poly-D-lisina (placas). Transfecções são realizadas usando-se 3 pg de DNA de plasmídio e 6 μΙ de reagente Lipofectamina2000 (Invitrogen cat.no. 11668- 019) por cavidade, essencialmente como descrito pelo vendedor. Três dias pós-transfecção os sobrenadantes de célula são cultivados e o sobrenadan- 10 te livre de célula é submetido à análise de proteína, isto é, a análise de H- PLC por immunoafinidade HPLC nas colunas de Proteína G. Títulos que variam entre 8 mg/l para o construto natleader-hsLINGO-1-Fc/pRS5a e 40 mg/l para o construto lgleader-hsLINGO-1-ALRR-Fc/pRS5a são determina- dos. Subsequentemente, para ambos os plasmídios preps de plasmídio em 15 grande escala são preparados para permitir transfecções transitórias na es- cala de múltiplos litros em culturas de suspensão HEK.EBNA.

Para a produção de natleader-hsLINGO-1-Fc em escala aumen- tada, 2,9 L de cultura de célula de HEK.EBNA a uma densidade de 1,4x106 células/ml são misturados com 1,1 L de solução de DNA:PEI (1 pg de 20 DNA:2 pg de PEI por ml). Após a incubação de células por 4 h, a cultura é alimentada com 4 L de meio de ExCeII VPRO (SAFC, anteriormente JRH, Lenexa, KS). O sobrenadante de cultura de célula é coletado depois de 6 dias de cultivo e é concentrado por diafiltração abaixo de 1-L usando-se um filtro Hemoflow F10HPS descartável com um corte de 10 kDa (Fresenius 25 Medicai Care, Alemanha).

A segunda experiência de produção de proteína relevante para gerar proteína de lgleader-hsLINGO-1-ALRR-Fc é feita em uma forma simi- lar. Detalhes na transfecção em grande escala, razão de DNA:PEI, densida- des de célula, alimentação e coleta são exatamente os mesmos que descri- tos acima.

a) natleader-hsLINGO-1-Fc

1 L de concentrado (de 8 L de sobrenadante de cultura) é sub- metido em cromatografia em 20 ml de Sefarose de Proteína A. Depois de lavagem de base-linha com NaPi a 100 mM, pH 7,3, material ligado é eluído com citrato a 50 mM, NaCI a 140 mM, pH 2,7, é neutralizado e é filtrado es- téril. A fração eluída é ulteriormente concentrada e gel é filtrado em Super- 5 dex 75 em PBS fornecendo 8,2 mg de produto a uma concentração de 1,2 mg/ml.

b) lgleader-hsLINGO-1-ALRR-Fc

1 L concentrado (de 8 L sobrenadante de cultura) é submetido em cromatografia em 20 ml de Sefarose de Proteína A. Depois de lavagem de base-linha com NaPi a 100 mM, pH 7,3, material ligado é eluído com ci- trato a 50 mM, NaCI a 140 mM, pH 2,7, é neutralizado e é filtrado estéril for- necendo 52,5 mg de produto a uma concentração de 1,5 mg/ml.

As proteínas purificadas são extensivamente caracterizadas por sequenciação N-terminal e por análise de massa de peptídeo de MALDI de- pois da redução/alquilação e digestão de tripsina.

Exemplo 3: Ensaio de ligação de AP-LINGO-1

Bloqueio da ligação de LINGO-1 a NgR é esperado evitar a sina- lização de três inibidores associados à mielina de crescimento de neurito, a saber Nogo-66, MAG e OMgp, e portanto atenuam a atividade inibitória de 20 crescimento de neurito de mielina do CNS assim que leva à regeneração axonal/plasticidade melhorada e recuperação funcional melhorada após le- são do CNS aguda.

Para demonstrar que um anticorpo de antiLINGO-1 bloqueia a ligação de LINGO-1 a NgR, um ensaio pode ser usado que mede a ligação 25 de Ectodomínio de LINGO-1 (AP-LINGO-1) de rato etiquetado com fosfatase alcalina de placenta de ser humano (AP) a células de SH-SY5Y estavelmen- te que expressam NgR (NgR-SH-SY5Y, Walmsley e outros (2004) J Cell Sci 117, 4591-4602). cDNA que codifica a maior parte do ectodomínio de LIN- GO-1 de rato (resíduos 34-532) flanqueado por sítios de 5'-Xho I e 3'-Xba I 30 é ampliado por PCR a partir de rLINGO-1-pSecTag2-V5 usando-se o inicia- dor avante DM22, 5'-GGTTATCTCGAGACCGGCTGCCCGCCCC-3' (SEQ ID NO: 24), e o iniciador reverso DM23, 5'-GGCCCTTCTAGATCAC TCGCCTGGCTGGTTGGAGATG-3' (SEQ ID NO: 25). O produto de PCR é clivado com Xhol e Xbal e é inserido nos sítios respectivos do vetor APtag-5- NHIS (SEQ ID NO: 26) para gerar APtag-5-NHIS-solrLINGO-1. O produto de proteína previsto é a maioria do ectodomínio de LINGO-1 de rato fundido no 5 N-terminal a resíduos 23-511 de fosfatase alcalina de placenta de ser hu- mano via um Iigadorde resíduo de 3 aminoácidos. Células de HEK293T são transfectadas com APtag-5-NHIS-solrLINGO-1 usando-se Iipofectamina2000 de acordo com as instruções do fabricante. O meio de transfecção é remo- vido 4 h depois de transfecção e é substituído com OptiMEM I sem phenol 10 red (Invitrogen). Meio é coletado depois de 24 h, é substituído e é coletado novamente depois de umas outras 24 h. O meio é clarificado por centrifuga- ção a 13000xg por 5 min e o sobrenadante é concentrado por cerca de 15 vezes usando-se um dispositivo de filtragem Centriprep (MiIIipore) de acordo com as instruções do fabricante. Atividade de AP do sobrenadante concen- 15 trado é medida usando-se 1-Step® PNPP (Pierce) como mudança em ab- sorbância a 405 nm durante um tempo e é transformado para uma concen- tração usando-se a seguinte equiação (se aplica para um formato de placa de 96 cavidades com 200 μΙ de PNPP/cavidade):

Concentração de fusão de AP (nM) =_Mudanca em absorbância (mAU/min)

7,945 X volume de amostra adicionada a ΡΝΡΡ(μΙ)

Sobrenadante concentrado é submetido à eletroforese de gel de SDS-PAGE e Western blotted como descrito (Walmsley e outros (2004) J Cell Sci 117, 4591-4602). AP-LINGO-1 é detectado com 0,1% (v/v) de anti- corpo de anti-penta-histidina (Qiagen) seguido por 0,02% (v/v) de anticorpo 25 de IgG de anticamundongo conjugado por peroxidase (Sigma) usando-se o sistema ECL® (GE Healthcare). AP-LINGO-1 é visualizado como uma tira de cerca de 110 kDa, similar a seu peso molecular previsto de 112 kDa. Ne- nhum produto de degradação N-terminal é observado.

Células de NgR:SH-SY5Y a 50% de confluência são coletadas com tampão de dissociação livre de enzima (Invitrogen) para preservar pro- teínas de célula de superfície tal como NgR. AP a 1 nM, AP-LINGO-1 a 1 nM ou AP-LINGO-1 a 1 nM na presença de 2 μΜ de Fab de antiLINGO-1 ou um Fab de controle 3207 contra Iisozima oriunda de clara de ovo de galinha é pré-incubada por 30 min em OptiMEM (Invitrogen) e subsequentemente é incubada com agitação constante por 1,5 h com células de NgR:SH-SY5Y em suspensão. Células são lavadas 6 vezes em HBH (HEPES a 20 mM pH 5 7,4/1% de albumina de soro bovino em solução salina equilibrada de Hanks) e são fixadas em 4% de paraformaldeído (PFA)/5% de sacarose em PBS por 15 min. Após a inativação de atividade de AP endógena por incubação a 65°C por 1 h em HEPES a 20 mM pH 7,4 em solução salina equilibrada de Hanks, atividade de AP ligada à célula é quantificada como absorbância de 10 405 nm depois de uma incubação de 30 min com 1-Step® PNPP (Pierce) de acordo com as instruções do fabricante.

Os Fabs são usados a uma concentração de 2 μΜ a fim de satu- rar AP-LINGO-1 com Fab ligado e assim minimizar a influência de suas afi- nidades em sua capacidade de inibir ligação. A razão para isso é exluir a possibilidade de prematuramente descartar Fabs de outros estudos que ca- em para inibir a ligação devido à sua baixa afinidade ao invés da posição de seu sítio de ligação como a afinidade de tais Fabs poderia ser aumentada nos últimos estágios por maturação por afinidade e conversão de lgG4. AP- LINGO-1 a 1 nMé pré-incubada ou com o Fab de controle 3207 ou Fabs de antiLINGO-1 4784 e 4785 e então é deixada ligar-se na presença do Fab a células de NgR:SH-SY5Y em suspensão (figura 1). A percentagem de inibi- ção em ligação de AP-LINGO-1 específica na presença do Fabs de anti- LINGO-1 é normalizada para aquele para Fab 3207. 4784 e 4785 dão uma inibição significativa (p<0,01, uma trajeória ANOVA, Holm-Sidak compara- ção com ligação específica de AP-LINGO-1 na presença de Fab de controle 3207) de ligação de AP-LINGO-1 às células.

Bloqueio da ligação de LINGO-1 a NgR é previsto para prevenir a sinalização dos inibidores associados à mielina Nogo-66, MAG e OMgp que levam a uma redução na atividade inibitória de crescimento de neurito 30 de mielina de CNS. Naquele aspecto, 4784 e 4785 Fabs são convertidos no formato de lgG4 final (vide Exemplo 8) e são avaliados quanto à sua capa- cidade de atenuar a inibição de crescimento de neurito a partir de neurônios granulares cerebelares de rato de 7 dias pós-natal desenvolvidos em mieli- na de medula espinhal de rato adulto.

Exemplo 4; Ensaio de inibição de crescimento de neurito

O ensaio in vitro mais relevante para prever o efeito de anticorpo 5 de antiLINGO-1 s na regeneração axonal/plasticidade in vivo é sua capaci- dade de atenuar a atividade inibitória de crescimento de neurito de mielina no CNS. Nesse ensaio, neurônios granulares cerebalares de rato de 7 dias pós-natal (CGN) são desenvolvidos em cavidades revestidas com mielina de medula espinhal total extraída a partir de ratos adultos e crescimento de 10 neurito quantificado por uma leitora automatizada ArrayScan® HCS Reader (Cellomics).

A atividade desinibitória de anticorpos 4784 e 4785 de lgG4 de antiLINGO-1 é avaliada no dito ensaio de crescimento de neurito (figura 2).

Tecido de medula espinhal de rato fresco oriundo de ratos adul- 15 tos é homogeneizado em 3 volumes (w/v) de tampão de extração (Chaps 60 mM, Tris a 20 mM pH 8,0, EDTA a 1 mM, coquetel de inibidor de protease), incubado por 30 min a 4°C e clarificado por centrifugação a 170000xg por 30 min a 4°C. Cada cavidade em uma placa de 96 cavidades é revestida com 5 μΙ de nitrocelulose em MeOH (5 cm2 de nitrocelulose em 12 ml de MeOH), 20 seco ao ar e revestido com 100 μΙ de 5 μg/ml de poly-D-lisina por incubação por 4 h a 37°C. Após três lavagens em água, as placas são secas ao ar por

1 h e então revestidas com 60 pg/cm2 de extrato de medula espinhal por incubação de um dia para o outro a 37°C. Células de CGN são frescamente purificadas a partir de tripsina dissocia tecido cerebral de rato de 7 dias pós- 25 natal como descrito anteriormente (Schweigreiter e outros, 2004). Análise de Western blot para detectar LINGO-1 é realizada em Iisados oriundos de cé- lulas de CHO-K1 que expressam Células de P7 CGN ou LINGO-1 etiqueta- das com V5 usando-se 2 μg/ml (ou 13,3 nM) anticorpo policlonal de anti- LINGO-1 (Upstate) seguido por 0,02% (v/v) de anticorpo de IgG de anticoe- 30 Iho conjugado por peroxidase (Sigma). Células de CGN (35000 células /cavidade) são incubadas por 30 min a 37°C em cavidades revestidas sem ou com mielina de medula espinhal antes da adição ou do anticorpo de 3207 de controle ou anticorpo de lgG4 de antiLINGO-1 a 0-100 nM. Após umas 8-16 h de incubação a 37°C, células são fixadas com 4% de PFA e são manchadas com Hoechst 3342 (Invitrogen) para visualização do núcleo e anticorpo de anti-p-tubulina Ill anticorpo (R&D Systems) seguido por um 5 anticorpo de IgG de anticamundongo conjugado com Alexa Fluor 546 (Invi- trogen) para especificamente visualizar neurônios. Parâmetros de cresci- mento de neurito são determinados usando-se uma leitora ArrayScan® HCS (Cellomics). ArrayScan® Il automaticamente localiza, focaliza e expõe cam- pos de células dentro de uma placa de microtítulo de 96 cavidades. ArrayS- 10 can consiste em um sistema ótico de alta resolução, um filtro de emissão de passagem de banda múltipla com filtro de excitação de banda simples emparelhada (XF100), uma câmera CCD com garra mecânica, e software de aplicações de propriedade. Nesse ensaio, a Bioaplicação de neurito de crescimento prolongado é usada. Uma roda de filtro de excitação e múltiplos 15 filtros de emissão de passagem de banda são usados para permitir que i- magem de múltiplos canais de fluorescência de dois fluoróforos nas mes- mas células. Imagens de passagem de banda de núcleos marcados com Hoechst 33342 são adquiridas para identificar células discretas, e imagens de passagem de banda de Alexa Fluor 488 são então adquiridas para identi- 20 ficar a extensão de células marcadas com anticorpo de antitubulina (usando- se um conjugado secundário a Alexa Fluor 488). Corpos inapropriados den- tro das células são automaticamente excluídos da análise, de modo que a- penas corpos de célula de beta-tubulina de sobreposição de Hoechst são analisados. Imagens de emissão dupla são adquiridas por 5 campos discre- 25 tos de 350 μιη2 em cada cavidade da placa. Usando-se um objeto 10-x, isso resulta em 400-500 células por cavidade analisadas. A bioaplicação de crescimento de neurito prolongada então relata várias medidas quantitativas de morfologia neuronal para células simples, incluindo número de compri- mento de neurito de neuritos por célula, área de corpo de célula, e pontos 30 cruzados e de ramificação. O comprimento médio de neurito por neurônio (pm) é calculado por 500 neurônios por cavidade em replicatas de 10.

No ensaio de crescimento de neurito acima, os anticorpos 4784 e 4785 de lgG4 de antiLINGO-1 são desinibitórios a 1 e 10 nM, enquanto que o lgG4 de controle contra Iisozima não dá nenhuma desinibição em am- bas as concentrações (figura 2). O comprimento médio de neuritos por neu- rônio em mielina de medula espinhal na presença de 4784 e 4785 em am- 5 bas as concentrações é estatisticamente mais alto do que na ausência de anticorpo. O nível mais alto de desinibição alcançado com o inibidor de ROCK Y27632 em comparação com o anticorpo de antiLINGO-1 s 4784 e 4785 é esperado como esse composto inibe as trajetórias de sinalização de inibidores de crescimento de neurito associados à mielina outros que não 10 aqueles que sinalizam através do complexo de receptor de NgR.

Para confirmar os resultados acima, o ensaio de crescimento de neurito é repetido (figura 3). Novamente, o antiLINGO-1 anticorpos 4784 e 4785 são desinibitórios a 1 nM e 10 nM, enquanto que o lgG4 de controle contra Iisozima não dá nenhuma desinibição em ambas as concentrações. 15 O comprimento médio de neuritos por neurônio sobre mielina de medula espinhal na presença de 4784 e 4785 em ambas as concentrações é esta- tisticamente mais alto do que aquele na ausência de anticorpo.

Para ulteriormente estabelecer a potência dos anticorpos de an- tiLINGO-1 4784 e 4785, o efeito no crescimento de neurito inibição de con- 20 centração sub-nM do anticorpo é avaliado (figura 4). 4784 e 4785 dão uma desinibição significativa (38-51% e 51-57%, respectivamente) de mielina de medula espinhal a concentrações tão baixas quanto 0,1 nM, enquanto que o anticorpo de antilisozima de controle não tem nenhum efeito. Novamente, o inibidor de ROCK Y27632 dá um grau mais alto de desinibição (65-74%) do 25 que os anticorpos de lgG4 de antiLINGO-1 como esperado.

Exemplo 5: Ensaio de diferenciação de oligodendrócito primário

Função de bloqueio de LINGO-1 por meio genético ou por tra- tamento com um agonista de corpo de receptor foi relatada para aumentar a proporção de oligodendrócitos maduros que surgem de culturas de OPC 30 purificadas (Mi e outros (2005) Nat Neurosci 8, 745-751). Para avaliar a ca- pacidade de anticorpo de antiLINGO-1 de bloquear função de LINGO-1 em culturas de OPC e promover maturação de oligodendrócito, OPCs de rato frescamente isolados são incubados com 4784, 4785 ou lgG4 3207 de controle por 3 dias em meio de DMEM/CNTF/T3 seguido por manchamento com o anticorpo de anti-04 para marcar tanto oligodendrócitos imaturos quanto maduros (figura 5). O grau de maturação de oligodendrócito é medi- 5 do como a proporção de células positivas a 04 que exibem uma morfologia madura.

Populações enriquecidas de OPCs são isoladas de ratos OFA P3. Resumidamente, o cérebro é dissecado e os telencéfalos são colocados em solução salina tamponada por Hank em água gelada (HBSS, Invitrogen) contendo 0,15% de MgS04. O tecido é incubado com 1:1 HBBS/tripsina- EDTA (Invitrogen) e 100 μg/ml de DNAse I (Roche) por 10 min a 37°C e a tripsina inativada por adição de FCS (Invitrogen) para dar uma concentração final de 10%. A suspensão de tecido é centrifugada a 890 rpm por 10 min e o pélete ressuspenso em Basal Medium Eagle (BME, Invitrogen) com 10% de soro de cavalo (Invitrogen). A suspensão é filtrada através de um filtrado de célula de 40 μιη (BD Falcon) e as células laminadas em frascos de cultu- ra de tecido de 80 cm2 pré-revestidos com poli-D-lisina (BD Falcon) em 1 cérebro por frasco. Células são cultivadas a 37°C por 11 dias em BME/10% de soro de cavalo. Células microgliais são mortas por adição de éster de L- leucina-metila a 5 mM e os frascos são agitados por agitação a 140 rpm por

2 h. OPCs são coletados por agitação dos frascos de um dia para o outro a 200 rpm a 37CC e quaisquer atrócitos que permanecem no sobrenadante são ulteriormente separados dos OPCs por pré-ligação por 2 h a 37°C em pratos de cultura bacteriana de 10 cm. Células não aderentes são coletadas, 25 são centrifugadas, por 10 minutas a 890 rpm e são laminadas a cerca de 3 x 104 células/cavidade em lâminas de câmara de 8 cavidades revestidas com poli-D-lisina (BD Falcon). Culturas são mantidas por 3 dias ou em meio de DMEM/T3/CNTF que consiste em DMEM (Invitrogen) contendo 10 ng/ml de Fator neutrófico ciliar (R&D Systems) e Triiodotironina a 15 nM (Sigma) ou 30 em meio de SATO que consiste em DMEM (Invitrogen) contendo 10 μς/ιτιΙ de transferrina (Sigma), 10 μg/ml de insulina (Sigma), 100 μΜ de putresci- na(Sigma), progesterona a 200 nM (Sigma), trioxina a 520 nM (Sigma), 500 pM de Triiodotironina (Sigma), selenita de sódio a 220 nM (Sigma), 25 μg/ml gentamicina (Sigma) e 1% de HS (Invitrogen). Para avaliar a pureza das culturas com relação à linhagem de oligodendrócito, a percentagem de células que são manchadas com o anticorpo de anti-04 é quantificada de- 5 pois de 7 dias de cultura em meio de SATO. Tipicamente, 80-95% das célu- las são manchadas com o anticorpo de anti-04 que demonstra que a maio- ria das células na cultura são da linhagem de oligodendrócito. Para avaliar maturação de oligodendrócito com base em morfologia de oligodendrócito, culturas de OPC frescamente isoladas são incubadas em meio de 10 DMEM/T3/CNTF por 3 dias na ausência ou na presença de 4784 ou 4785 a 100 nM ou lgG4 3207 de controle ou seguido por manchamento com o anti- corpo de anti-04 para marcar tanto oligodendrócitos imaturos quanto madu- ros e DAPI para marcar núcleos celulares. Células positivas a 04 com pro- cessos curtos claramente definidos são consideradas representar oligoden- 15 drócitos imaturos enquanto que células positivas a 04 que portam proces- sos altamente arborizados e prolongados com estruturas de tipo de folha de mielina são consideradas representar oligodendrócitos maduros. A propor- ção de células positivas a 04 com uma morfologia madura é quantificada por cerca de 300-1300 de células em triplicata por tratamento e significância 20 determinado usando-se uma trajetória ANOVA com uma comparação com Holm-Sidak a proporção de oligodendrócitos maduros na presença da lgG4 3207 de controle. Para avaliar o efeito do tratamento com anticorpo na pro- porção total de oligodendrócitos (maduros e imaturos) na cultura, a propor- ção de núcleos de DAPI associados a manchamento com 04 é quantificada. 25 Em três experiências independentes, tratamento com o anticorpos de anti- LINGO-1 4784 e 4785 significativamente aumenta a proporção de oligoden- drócitos com uma morfologia madura como representado por células que portam processos altamente arborizados que se prolongam sobre uma am- pla área e estruturas de tipo folha de mielina (figura 5). Tratamento com o 30 anticorpo 3207 de lgG4 de controle não tem nenhum efeito na proporção de oligodendrócitos maduros na cultura. A proporção de núcleos manchados com DAPI associadas a manchamento com 04 é similar para todos os tra- tamentos, que demonstram que o anticorpo de antiLINGO-1 não tem ne- nhum efeito na proporção de células correspondentes tanto a oligodendróci- tos imaturos quanto maduros. Uma vez que tratamento com anticorpo de antiLINGO-1 não tem nenhum efeito na proporção de total oligodendrócitos, 5 o aumento na proporção de oligodendrócitos maduros mais provavelmente surge devido a um aumento na taxa de diferenciação de oligodendrócitos imaturos para oligodendrócitos maduros ao invés de um aumento na taxa de diferenciação de OPCs para oligodendrócitos imaturos.

Exemplo 6: Regulação para baixo de anticorpo de antiLINGO-1-de superfície de célula LINGO-1

A ligação de anticorpos multivalente para alvos de superfície de célula pode levar à internalização do complexo de anticorpo:alvo e degrada- ção subsequente do alvo dentro da trajetória endocítica (Weinmann e outros (2006) Mol Cell Neurosci 32, 161-173).

Para determinar o efeito de anticorpos de antiLINGO-1 na quan-

tidade de superfície de célula LINGO-1, células de CHO-K1-hLINGO-1 ou de CHO-KI não transfectadas (vide Exemplo 1) são incubadas a 37°C por 24 h com superfície de célula LINGO-1, 4784, 4785 ou 3207 a 100 nM é subse- quentemente detectada com um anticorpo de anti-V5 seguido por um conju- 20 gado de POD-(específico de Fe de IgG de anticamundongo desenvolvido com um kit 1-Step® Turbo TMB-ELISA kit (Pierce) (figura 6A).

A quantidade de superfície de célula LINGO-1 em células de CHO-K1-hLINGO-1 é significativamente reduzida após as 24 h de incubação com anticorpos de antiLINGO-1 4784 e 4785, enquanto que incubação com a lgG4 3207 de controle não tem nenhum efeito. Além disso, incubação com

4785 reduz superfície de célula LINGO-1 a uma extensão maior do que 4784. Para avaliar o efeito de anticorpos de antiLINGO-1 na degradação de superfície de célula LINGO-1, proteínas de célula de superfície em células de CHO-K1 ou células de CHO-K1-hLINGO-1 não transfectadas são biotini- 30 Iadas a 4°C como descritas (Walmsley e outros (2004) J Cell Sci 117, 4591- 4602) e as células incubadas a 37°C por várias vezes durante um período de 180 min com ou sem 4784, 4785 ou 3207 a 100 nM (figura 6B). No fim do período de incubação, LINGO-1 é imunoprecipitado a partir do Iisado de célula usando-se anticorpo de anti-V5 acoplado a contas de agarose e LIN- GO-1 biotinilado detectado no precipitado por análise de Western blot usan- do-se um anticorpo de antibiotina (Sigma). A intensidade da tira que corres- 5 ponde a LINGO-1 biotinilado (e portanto superfície de célula) diminui mais rapidamente em células de CHO-K1-hLINGO-1 incubadas com o anticorpo de antiLINGO-1 4784 e 4785 então em células incubadas sem anticorpo ou com a lgG4 3207 de controle. Além disso, incubação com 4785 aumenta a taxa de degradação da superfície de célula LINGO-1 em uma extensão mai- 10 or do que 4784. Esses resultados cumulativos mostram que anticorpos de antiLINGO-1 4784 e 4785 significativamente regulam para baixo LINGO-1 na superfície de célula mais provavelmente por aumento da internalização e degradação da proteína. Essa propriedade é esperada contribuir para a efi- cácia desses anticorpos no bloqueio de função de LINGO-1.

Exemplo 7: Ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) e técnicas de FACS

Proteína de fusão de LINGO-1-Fc recombinante de ser humano é imobilizada sobre placas Maxisorp de 96 ou 384 cavidades por 1 h à tem- peratura ambiente indiretamente por captura da parte de Fc via um anticor- po de IgG Fc de anti-humano de cabra diretamente imobilizado (100 μΙ ou μΙ revestido a 10 μg/ml em PBS).

Depois do revestimento de 20 μΙ do anticorpo a 5 pg/ml em PBS, as cavidades são bloqueadas com PBS/0,05% de Tween (PBS-T/5% de lei- te em pó por 1 h à temperatura ambiente. Depois da lavagem das cavidades 25 com extratos de PBS-T BEL, Fabs purificados ou IgGs de controle são diluí- dos em, adicionados às cavidades e incubados por 1 h à temperatura ambi- ente. Para detectar os anticorpos primários, os seguintes anticorpos secun- dários são ampliados: IgG de anticamundongo ou IgG de anti-humano de fragmento de F(ab')2 de cabra de AffiniPure conjugado porfosfatase alcalina 30 (Jackson ImmunoResearch). Para a detecção de AP- substratos fluorogêni- cos conjugados tipo AttoPhos (Roche) são usados de acordo com as instru- ções do fabricante. Entre todas as etapas de incubação, as cavidades da placa de microtítulo são lavadas com PBS-T cinco vezes e cinco vezes de- pois da incubação final com anticorpo secundário. Fluorescência é medida em uma leitora de placa TECAN Spectrafluor.

Para análise de FACS de anticorpo que se liga a LINGO-1 ex- presso na superfície de célula de células transfectadas de células de CHO- K1

Todos os manchamentos são realizados em placas de microtítu- lo de 96 cavidades de fundo redondo (NUNC®, Wiesbaden, Alemanha) com 2x105 células por cavidade. Células da respectiva linha de célula são res- suspensas em PBS/3% de FCS/0,02% de NaN3 (tampão de FACS) são mis- turadas com a) anticorpo oriundo de extratos periplásmicos ou Iisados de BEL ou b) fragmentos de Fab purificados ou c) IgG purificada diluída em tampão de FACS e incubada a 4°C por 30-60 min. Células são então lava- das uma vez com 150 μΙ de tampão de FACS/cavidade e são colocadas em 100 μΙ de anticorpo secundário marcado com ficoeritrina (IgG de anti- humano de cabra conjugada por R-PE (H+L) (Jackson ImmunoResearch) que foram então diluídos 1:200 em tampão de FACS. Depois da incubação por 30-60 min a 4°C células são lavadas uma vez com tampão de FACS, são ressuspenas em 100 μΙ de tampão de FACS e ligando-se a anticorpos específicos de LINGO-1 é medida via intensidade de fluorescência de FL2 de células em FACSCalibur® ou FACSArray® (Becton Dickinson).

Para a identificação de anticorpos específicos de LINGO-1, manchamentos são feitos em paralelo usando-se CHO-K1-cmLINGO-1 ou CHO-K1-rLINGO-1. Células não transfectadas de CHO-K1 servem como um 25 controle adicional. LINGO de rato e de Macaco cinomólogo que expressam células são escolhidos para a triagem como essas espécies ortólogas que diferem apenas em alguns aminoácidos oriundos da proteína de LINGO-1 de ser humano. Apenas aqueles clones são julgados como sendo LINGO-1 específico que são negativo nas células não transfectadas de CHO-K1 e >5x 30 acima da base no LINGO-1 que expressa linhas de células. Reatividade cru- zada a LINGO-1 de ser humano e outros ortólogos (LINGO-1 de cinomólo- go, LINGO-1 de rato) e ao "paralogue" de LINGO-2 de ser humano é testada seqüencialmente.

Depois da análise de seqüência trinta e um clones simples (31) são identificados que mostram forte ligação a LINGO-1 de ser humano ex- presso na superfície de célula em análise de FACS. Doze (12) aglutinantes 5 mostram forte ligação a LINGO-1-Fc de ser humano caputrado em ELISA (razão de sinai:ruído maior do que 10:1) e sete (7) mostram ligação de in- termediário em ELISA (razão de sinakruído maior do que 5:1). Quatro (4) dos aglutinantes mostraram forte ligação à proteína de fusão de NgR-Fc de ser humano capturada (R&D Systems) em ELISA e são descontinuados. 10 Uns outros três (3) dos aglutinantes não fazem reação cruzada a todas as espécies de LINGO-1 e são descontinuados. Os 24 clones restantes que têm reação cruzada a LINGO-1 de rato/ser humano/macaco cinomólogo mas não a NgR-Fc de ser humano são expressos, são purificados, e são testados quanto à sua capacidade de significativamente inibir a ligação de 15 LINGO-1 a NgR (vide figura 1) e desinibir a atividade inibitória de crescimen- to de neurito de mielina de medula espinhal in vitro (vide figuras 2-4) que leva à seleção de Fabs 4784 e 4785 para outra análise. Em uma ELISA,

4784 e 4785 se ligam a LINGO-1-Fc de ser humano capturado mas nenhu- ma ligação é observada a LINGO-1 de ser humano-ALRR-Fc ou NgR-Fc de ser humano em comparação com um controle de Fc não relacionado (vide Tabela 1 e figura 7). Isso indica que 4784 e 4785 têm epitopos que estão dentro da região de LRR (resíduos 66-353) de LINGO-1.

Tabela 1: Caracl erização de Fabs de antiLINGO-' por ELISA LINGO-1 de LINGO-1 LINGO- NgR-Fc Fc não ser humano Fc de ser IALRR-Fc de de ser relaciona¬ humano ser humano humano da 4784 98 49 68 52 4785 113 8 7 6 Valores para análise de ELISA são sados como valores médios

de unidades de fluorescência relativas.

Determinação de Afinidade de Fabs de antiLINGO-1 selecionados usando- se análise de saturação de FACS Afinidade à base de célula de anticorpos específicos de anti- LINGO-1 é determinada por experiências de ligação de saturação de FACS. Uma vez que concentração do antigeno presente na amostra para manchar influencia valores de Kd aparentes, apenas 1,25x104 células/cavidade em 5 constraste com 2x105 células/cavidade são usadas a fim de reduzir a con- centração de antigeno em experiências de saturação de FACS. De outro modo o procedimento de manchamento é feito idêntico ao procedimento de manchamento de FACS descrito acima.

Em detalhes, CHO-K1-hLINGO-1, CHO-K1-cml_INGO-1 ou CHO-K1-rLINGO-1 são separados dos frascos de cultura por versene, são lavados com tampão de FACS e são ressuspensos em tampão de FACS. Fabs de antiLINGO-1 purificados são diluídos em série no tampão de FACS e são borrifados em placas de microtítulo de 96 cavidades de fundo redondo (NUNC®, Wiesbaden, Alemanha). Para cada concentração, cavidades em duplicata são incubadas com 1,25x104 células por 30-60 min em gelo em um volume total de 100 μΙ. Depois de uma etapa de lavagem por aplicação de 150 μΙ de tampão de FACS e centrifugação por 5 min a 400xg, os péletes de células são ressuspensos em 100 μΙ de anticorpo secundário marcado com ficoeritrina (IgG de anti-humano de cabra conjugada por R-PE (H+L) (Jackson ImmunoResearch) que foram diluídas a 1:200 em tampão de FACS. Depois de incubação por 30-60 min a 4°C células são lavadas uma vez com tampão de FACS, são ressuspensas em 100 μΙ de tampão de FACS e ligação de anticorpos específicos de LINGO-1 é medida via intensi- dade de fluorescência de FL2 de células em FACSArray® (Becton Dickin- son). Valores de K0 /valores de EC50 aparentes são determinados das cur- vas de ligação de saturação usando-se software GraphPad Prism v3.03 ou GraphPad Prism v4.03 aplicando um ajuste de curva de regressão não- linear.

Usando-se esse ensaio os seguintes valores de K0 aparentes podem ser determinados (Tabela 2). No formato de Fab o clone 4784 tem certamente afinidades fracas para LINGO-1 de ser humano, LINGO-1 de rato e de Macaco cinomólogo (14,07 nM, 27,11, e 24,03 nM respectivamen- te). No entanto, clone 4784 não se liga a LINGO-2 de ser humano no for- mato de Fab. No formato de Fab o clone 4785 mostra afinidades de ligação subnanomolar (isto é, valores Kd aparentes serem menos do que 1x10'9 M) a LINGO-1 de ser humano, LINGO-1 de rato e de Macaco cinomólogo. Clo- 5 ne 4785 mostra reatividade cruzada a LINGO-2 de ser humano no formato de Fab com afinidade baixa nanomolar para subnanomolar. A conseqüência de reatividade cruzada a LINGO-2 não pode ser avaliada na hora da escrita como função e distribuição de LINGO-2 são até agora desconhecidas. No entanto, efeitos benéficos não podem ser exluídos.

Tabela 2: Valores K0 aparentes de Fabs de antiLINGO-1 para LINGO-1 ou

LINGO-2 expresso por células de CHO-K1 LINGO-1 LINGO-2 de LINGO-1 de LINGO-1 de de ser humano Cinomólogo rato ser humano 4784 14,07 nb 27,11 24,03 4785 0,35 1,21 0,26 0,260 Valores dados são valores médios de KDs aparentes em nM. nb,

não ligando.

Exemplo 8: Clonagem, expressão e purificação de HuCAL®lgG4 Conversão no formato de IgG

A fim de expressar imunoglobulina de comprimento total (Ig)1 fragmentos de domínio variáveis de cadeias pesadas (VH) e leves (VL) são subclonados para formar vetores de expressão de Fab de pMORPH®X9_MH (SEQ ID NO: 39) ou para formar séries de vetores de pMORPH®_h_lg (SEQ 20 ID NOS: 40-42) ou pMORPH®2_h_lg (SEQ ID NOS: 43-45) para lgG4 de ser humano.

Enzimas de restrição EcoRI, Mfel, e Blpl são usadas para a subclonagem do fragmento de domínio de VH para formar pMOR- PH®_h_lgG4 (SEQ ID NO: 40): a cadeia principal de vetor é gerada por di- 25 gestão e extração de EcoRI/BIpl do fragmento de 6400 pb enquanto que o fragmento de VH (350 pb) é produzido por digestão com Mfel e Blpl e purifi- cação subsequente. Vetor e inserto são ligados via projeções compatíveis geradas pelos digestos de EcoRI e Mfel, respectivamente, e via o sítio de Blpl. Desse modo, tanto o sítio de restrição de EcoRI quanto de Mfel são destruídos.

Enzimas de restrição Mfel e Blpl são usadas por subclonagem 5 do fragmento de domínio de VH para formar pMORPH®2_h_lgG4 (SEQ ID NO: 43). Nessa nova geração de vetores de IgG, em outra modificações, o sítio de EcoRI (que permitia somente subclonagem via projeções compatí- veis) é substituído pelo sítio de Mfel assim permitindo digestão de Mfel/BIpl de ambos, vetor e inserto.

Subclonagem do fragmento de domínio de VL para formar

pMORPH®_h_lgK (SEQ ID NO: 42) e pM0RPH®2_h_lgK (SEQ ID NO: 45) é realizada via os sítios de EcoRV e BsiWI, enquanto que subclonagem para formar pMORPH®_h_lgA (SEQ ID NO: 41) e pMORPH®2_h_lgA2 (SEQ ID NO: 43) é feita usando-se EcoRV e Hpal.

Expressão transitória e purificação de IgG de ser humano

Células de HEK293 são transfectadas com uma quantidade e- quimolar de vetores de expressão de cadeia leve e pesada de IgG. Nos dias

4 ou 5 pós-transfecção o sobrenadante de cultura de célula é coletado. De- pois do ajuste do pH do sobrenadante a 8,0 e filtração estéril, a solução é submetida à cromatografia de coluna de proteína A padrão (Poros 20A, PE Biosystems).

Exemplo 9: Determinação por afinidade de lgG4s de antiLINGO seleciona- das usando-se análise de saturação de FACS

Afinidade à base de célula de anticorpos específicos de anti- LINGO-1 é determinada por experiências de ligação de saturação de FACS. A determinação dos valores de Kd aparentes é realizada idêntica ao proce- dimento descrito acima usando-se anticorpo de Fab de antiLINGO-1.

Em detalhes, CHO-K1-hLINGO-1, CHO-K1-cmLINGO-1 ou CHO-K1-rLINGO-1 são separados dos frascos de cultura por versene, são lavados com tampão de FACS e são ressuspensos em tampão de FACS. lgG4s de antiLINGO-1 purificadas são diluídas em série em tampão de FACS e são borrifadas em placas de microtítulo de 96 cavidades de fundo redondo (NUNC®, Wiesbaden1 Alemanha). For cada concentração, cavida- des em duplicata são incubadas com 1,25x104 células por 30-60 min no gelo em um volume total de 100 μΙ. Depois da etapa de lavagem por aplicação de 150 μΙ de tampão de FACS e centrifugação por 5 min a 400xg, os péletes de 5 células são ressuspensos em 100 μΙ de anticorpo secundário marcado com ficoeritrina (IgG de anti-humano de cabra conjugada por R-PE (H+L) (Jack- son ImmunoResearch) que foram diluídos a 1:200 em tampão de FACS. Depois de incubação por 30-60 min a 4°C células são lavadas uma vez com tampão de FACS1 são ressuspensas em 100 μΙ de tampão de FACS e Iiga- 10 ção de anticorpos específicos de LINGO-1 é medida via intensidade de fluo- rescência de FL2 de células em FACSArray® (Becton Dickinson). Valores de Kp/valores de EC50 aparentes são determinados a partir das curvas de ligação de saturação usando-se software GraphPad Prism v3.03 ou Graph- Pad Prism v4.03 aplicando um ajuste de curva de regressão não-linear. U- 15 sando-se esse ensaio os seguintes valores de Kd aparentes podem ser de- terminados (Tabela 3).

A afinidade de anticorpos de lgG4 de 4784 e 4785 são produzi- dos por uso das séries de vetor de pMORPH®2_h_lg são mostradas na Ta- bela 3. 4784 e 4785 no formato de lgG4 têm valores de K0 aparentes clara- 20 mente abaixo de 1 nM para LINGO-1 de rato, de cinomólogo e de ser hu- mano. 4784 tem uma reatividade cruzada mais baixa distante a LINGO-2 de ser humano do que 4785.

Tabela 3: Valores Kd aparentes de lgG4s de antiLINGO-1 para LINGO-1 ou -INGO-2 expressos por células de CHO-K1 __

LINGO-1 de LINGO-2 de LINGO-1 de LINGO-1 de ser humano ser humano Cinomólogo rato 4784 0,29 25,94 0,62 0,98 4785 0,07 0,95 0,18 0,07 Valores dados são valores médios de KqS aparentes em nM.

Exemplo 10: Influência de fluido cérebro-espinhal de ser humano na ligação de lgG4s de antiLINGO selecionadas a LINGO-1 de ser humano usando-se análise de FACS Influência de fluido cérebro-espinhal de ser humano na ligação de lgG4s de antiLINGO-1 a LINGO-1 de ser humano é testada por experi- ências de ligação de saturação de FACS. Diluições em série dos 4784 e

4785 são preparadas. Ligações CHO-K1-hLINGO-1 é testado na presença 5 de 50% de fluido cérebro-espinhal de ser humano. As células são mancha- das na presença de CSF humano com esses anticorpos de lgG4 de acordo com os manchamentos de FACS descrito acima.

Em detalhes, CHO-K1-hLINGO-1 são separados dos frascos de cultura por versene, são lavados com tampão de FACS e são ressuspensos em tampão de FACS. lgG4s de antiLINGO-1 purificadas são diluídas em série em tampão de FACS mais 50% de soro humano e são incubadas por 60 min a 4°C. Como controles, diluições em série dos aglutinantes candida- tos no formato de lgG4 são incubados em tampão de FACS com 2,6% de BSA de teor de proteína similar a fluido cérebro-espinhal de ser humano por 60 min a 4°C. Depois de incubação as diluições em série são borrifadas em placas de microtítulo de 96 cavidades de fundo redondo (NUNC®, Wiesba- den, Alemanha). Para cada concentração, cavidades em duplicata são incu- badas com 1,25x104 células por 30-60 min no gelo em um volume total de 100 μΙ. Depois das três etapas de lavagem por aplicação de 150 μΙ de tam- pão de FACS e centrifugação por 5 min a 400xg, os péletes de células são ressuspensos em 100 μΙ de anticorpo secundário marcado com ficoeritrina (IgG de anti-humano de cabra conjugada por R-PE (H+L) (Jackson Immu- noResearch) que foi diluída a 1:200 em tampão de FACS. Depois de incu- bação por 30-60 min a 4°C células são lavadas uma vez com tampão de FACS, são ressuspensas em 100 μΙ de tampão de FACS e ligação de anti- corpos específicos de LINGO-1 é medida via intensidade de fluorescência de FL2 de células em FACSArray® (Becton Dickinson). Valores de Ko/valores de EC50 aparentes são determinados a partir das curvas de liga- ção de saturação usando-se software GraphPad Prism v3.03 ou GraphPad Prism v4.03 aplicando um ajuste de curva de regressão não-linear.

Usando-se esse ensaio a influência de 50% de fluido cérebro- espinhal de ser humano poderia ser comparado com os controles (Tabela 4). Incubação em 50% de fluido cérebro-espinhal de ser humano leva a uma diminuição na afinidade de ligação com todos os aglutinantes serem afetados diferentemente. O impacto mais forte na afinidade de ligação pela presença de fluido cérebro-espinhal de ser humano é visto por 4784 que 5 mostra uma redução em afinidade por 73% de 0,43 nM a 1,57 nM.

Tabela 4: Influência de Fluido cérebro-espinhal de ser humano em valores K0 aparentes de lgG4s de antiUNGO-1 para LINGO-1 expressas por células de CHO-K1

Kd w/o K0 w/ CSF de razão K0 50% CSF aparen¬ aparente aparente w/o tes CSF : w/ CSF 4784 0,43 1,57 0,27 4785 0,19 0,25 0,76 Valores dados são valores médios de aparentes KDs em nM.

Exemplo 11: Influência de soro de ser humano na Ligação de lgG4s de anti- LINGO selecionadas a LINGO-1 de ser humano usando-se análise de FACS Influência de soro de ser humano na ligação de lgG4s de anti- LINGO-1 a LINGO-1 de ser humano é testada por experiências de ligação de saturação de FACS. Diluições em série de 4784 e 4785 são preparadas 15 na presença de 50% v/v de soro de ser humano. Depois de incubação por 60 mins células são manchadas com esses anticorpos de lgG4 pré- incubados de acordo com os manchamentos de FACS descritos acima.

Em detalhes, CHO-K1-hLINGO-1 são separados dos frascos de cultura por versene, são lavados com tampão de FACS e são ressuspensos 20 em tampão de FACS. lgG4s de antiLINGO-1 purificadas são diluídas em série em tampão de FACS mais 50% de soro humano e são incubadas por 60 min at 4aC. Como controles, diluições em série dos aglutinantes candida- tos no formato de lgG4 são incubadas em tampão de FACS mais 2,6% de BSA de teor de proteína similar a soro de ser humano ou são incubadas em 25 tampão de FACS sozinho por 60 min a 4°C. Depois de incubação as dilui- ções em série são borrifadas em placas de microtítulo de 96 cavidades de fundo redondo (NUNC®, Wiesbaden, Alemanha). Para cada concentração, cavidades em duplicata são incubadas com 1,25x104 células por 30-60 min no gelo em um volume total de 100 μΙ. Depois das três etapas de lavagem por aplicação de 150 μΙ de tampão de FACS e centrifugação por 5 min a 400xg, os péletes de células são ressuspensos em 100 μΙ de anticorpo se-

5 cundário marcado com ficoeritrina (IgG de anti-humano de cabra conjugada por R-PE (H+L) (Jackson ImmunoResearch) que foram diluídas a 1:200 em tampão de FACS. Depois de incubação por 30-60 min a 4°C células são la- vadas uma vez com tampão de FACS, são ressuspensas em 100 μΙ de tam- pão de FACS e ligação de anticorpos específicos de LINGO-1 é medida via 10 intensidade de fluorescência de FL2 de células em FACSArray® (Becton Dickinson). Valores de Kp/valores de EC50 aparentes são determinados a partir das curvas de ligação de saturação usando-se software GraphPad Prism v3.03 ou GraphPad Prism v4.03 aplicando um ajuste de curva de re- gressão não-linear.

Usando-se esse ensaio a influência de pré-incubação em 50%

de soro humano pode ser comparado com os controles (Tabela 5). Incuba- ção por 1 h na presença de soro de ser humano não tem nenhum efeito nos valores de K0 de 4784 e 4785. Esses anticorpos são portanto estáveis no soro de ser humano durante esse período de tempo e, além do mais, uma 20 vez que seus K0 s são inalterados, eles não parecem reagir cruzadamente com componentes de soro.

Tabela 5: Influência de Soro de ser humano nos valores de K0 aparentes de lgG4s de antiLINGO-1 para LINGO-1 expresso por células de CHO-K1_

tampão de FB + 2,6% FB + 50% de FACS (FB) de BSA HS 4784 0,28 0,19 0,27 4785 0,08 0,05 0,06 Valores dados são valores médios de KqS aparentes em nM. Lista de seqüências com descrição curta

SEQ ID NO: 1

Ectodomínio de LINGO-1 de rato maduro (resíduos 34-550) TGCPPRCECSAQDRAVLCHRKRFVAVPEGIPTETRLLDLGKNRIKTLNQDEFAS FPHLEE 5 LELNENIVSAVEPGAFNNLFNLRTLGLRSNRL KLI PLGVFTGLSNLTKLDI SENKIVILL DYMFQDLYNLKSLEVGDNDLVYISHRAFSGLNSLEQLTLEKCNLTSIPTEALSHLHGLIV LRLRHLNINAIRDYS FKRLYRLKVLEI shwpyldtmt PNCLYGLNLTSLSI thcnltavp YLAVRHL VYLRFLNLS YN PIGTIEGSMLHELLRLQEIQL VGGQLAWE P YAFRGLN YLRV LNVSGNQLTTLEESAFHSVGNLETLILDSNPLACDCRLLWVFRRRWRLNFNRQQPTCATP 10 E FVQGKE FKDFPDVLLPNYFTCRRAHIRDRKAQQVFVDEGHTVQFVCRADGDPPPAILWL SPRKHLVSAKSNGRLTVFPDGTLEVRYAQVQDNGTYLCIAANAGGNDSMPAHLHVRSYSP DWPHQPNKTFAFISNQPGEGEANSTRATVPFPFDIKT SEQ ID NO: 2

Ectodomínio de LINGO-1 maduro de cinomólogo (resíduos 34-550) 15 TGCPPRCECSAQDRAVLCHRKRFVAVPEGIPTETRLLDLGKNRIKTLNQDEFAS FPHLEE LELNENIVSAVEPGAFNNLFNLRTLGLRSNRLKLIPLGVFTGLSNLTKLDISENKIVILL DYMFQDLYNLKSLEVGDNDLVYISHRAFSGLNSLEQLTLEKCNLTSIPTEALSHLHGLIV LRLRHLNINAIRDYS FKRL YRLKVLEI SHWPYLDTMT PNCLYGLNLTSLS I THCNLTAVP YLAVRHLVYLRFLNLSYNPISTIEGSMLHELLRLQEIQLVGGQLAMVEPYAFRGLNYLRV 20 LNVSGNQLTTLEESVFHSVGNLETLILDSNPLACDC RLLWV FRRRWRLNFNRQQPTCATP EFVQGKEFKDFPDVLLPNYFTCRRARIRDRKAQQVFVDEGHTVQFVCRADGDPPPAILWL SPRKHLVSAKSNGRLTVFPDGTLEVRYAQVQDNGTYLCIAANAGGNDSMPAHLHVRSYSP DWPHQPNKTFAFIPNQPGEGEANSTRATVPFPFDIKT SEQ ID NO: 3

ectodomínio de LINGO-1 maduro de ser humano (resíduos 34-550) TGCPPRCECSAQDRAVLCHRKRFVAVPEGIPTETRLLDLGKNRIKTLNQDEFASFPHLEE LELNENIVSAVEPGAFNNLFNLRTLGLRSNRLKLI PLGVFTGLSNLTKLDI SENKIVILL DYMFQDLYNLKSLEVGDNDLVYISHRAFSGLNSLEQLTLEKCNLTSIPTEALSHLHGLIV LRLRHLNINAI RDYSFKRLYRL KVLEISHWPYLDTMT PNCLYGLNLTSLS ITHCNLTAVP 30 YLAVRHLVYLRFLNLS YN PISTI EGSMLHELLRLQE IQLVGGQLAWE P YAFRGLN YLRV LNVSGNQLTTLEESVFHSVGNLETLILDSNPLACDCRLLWVFRRRWRLNFNRQQPTCATP EFVQGKEFKDFPDVLLPNYFTCRRARIRDRKAQQVFVDEGHTVQFVCRADGDPPPAILWL SPRKHLVSAKSNGRLTVFPDGTLEVRYAQVQDNGTYLCIAANAGGNDSMPAHLHVRSYSP DWPHQPNKTFAFISNQPGEGEANSTRATVPFPFDIKT SEQ ID NO: 4 4784 Vl

DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIGNYYVYWYQQKPGQAPVLVIYEDTNRPSGIPERFSGSNSGN TATLTISGTQAEDEADYYCQSYDNLHEQVFGGGTKLTVLG SEQ ID NO: 5

4784 Vh

QVQLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSSSGVGVGWIRQPPGKALEWLAHIGSDDDKYYSTSLKTR LTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARNQQYGDGYPGYFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 6

4785 Vl

DIVLTQPPSVSGAPGQRVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLISRNSKRPSGVPDRFSGSKS GTSASLAITGLQSEDEADYYCSTYDTFSIVFGGGTKLTVLG SEQ ID NO: 7 4785 Vh

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS DNSAAWSWIRQS PGRGLEWLGLIYLRSKWDNDYAVS VK SRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARTGRADEFDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 8 DNA-4784 V„

CAGGTGCAATTGAAAGAAAGCGGCCCGGCCCTGGTGAAACCGACCCAAACCCTGACCCTGACCTGTAC CTTTTCCGGATTTAGCCTGTCTTCTTCTGGTGTTGGTGTGGGTTGGATTCGCCAGCCGCCTGGGAAAG CCCTCGAGTGGCTGGCTCATATCGGTTCTGATGATGATAAGTATTATAGCACCAGCCTGAAAACGCGT CTGACCATTAGCAAAGATACTTCGAAAAATCAGGTGGTGCTGACTATGACCAACATGGACCCGGTGGA 25 TACGGCCACCTATTATTGCGCGCGTAATCAGCAGTATGGTGATGGTTATCCTGGTTATTTTGATTATT GGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA SEQ ID NO: 9 DNA-4785 Vh

CAGGTGCAATTGCAACAGTCTGGTCCGGGCCTGGTGAAACCGAGCCAAACCCTGAGCCTGACCTGTGC GATTTCCGGAGATAGCGTGAGCGATAATTCTGCTGCTTGGTCTTGGATTCGCCAGTCTCCTGGGCGTG GCCTCGAGTGGCTGGGCCTTATCTATCTTCGTAGCAAGTGGGATAACGATTATGCGGTGAGCGTGAAA AGCCGGATTACCATCAACCCGGATACTTCGAAAAACCAGTTTAGCCTGCAACTGAACAGCGTGACCCC GGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTACTGGTCGTGCTGATGAGTTTGATGTTTGGGGCCAA GGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA SEQ ID NO: 10 DNA-4784 Vl

5 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACCGCGCGTATCTCGTGTAG CGGCGATAATATTGGTAATTATTATGTTTATTGGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTG TGATTTATGAGGATACTAATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAAC ACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCCAGTCTTATGA TAATCTTCATGAGCAGGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG 10 SEQ ID NO: 11 DNA-4785 Vl

GATATCGTGCTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGTGGCGCACCAGGTCAGCGTGTGACCATCTCGTGTAG CGGCAGCAGCAGCAACATTGGTAATAATTATGTGTCTTGGTACCAGCAGTTGCCCGGGACGGCGCCGA AACTTCTGATTTCTCGTAATTCTAAGCGTCCCTCAGGCGTGCCGGATCGTTTTAGCGGATCCAAAAGC 15 GGCACCAGCGCGAGCCTTGCGATTACGGGCCTGCAAAGCGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCTCTAC TTATGATACTTTTTCTATTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG SEQ ID NO: 12 Anticorpo 4784 CDR-Hl SSGVGVG 20 SEQ ID NO: 13

Anticorpo 4784 CDR-H2 HIGSDDDKYYSTSLKT SEQ ID NO: 14 Anticorpo 4784 CDR-H3 25 NQQYGDGYPGYFDY SEQ ID NO: 15 Anticorpo 4784 CDR-Ll SGDNIGNYYVY SEQ ID NO: 16 30 Anticorpo 4784 CDR-L2 EDTNRPS SEQ ID NO: 17 Anticorpo 4784 CDR-L3 QSYDNLHEQV SEQ ID NO: 18 Anticorpo 4785 CDR'-Hl 5 DNSAAWS

SEQ ID NO: 19 Anticorpo 4785 CDR'-H2 LIYLRSKWDNDYAVSVKS SEQ ID NO: 20 10 Anticorpo 4785 CDR'-H3 TGRADEFDV SEQ ID NO: 21 Anticorpo 4785 CDR'-Ll SGSSSNIGNNYVS 15 SEQ ID NO: 22

Anticorpo 4785 CDR'-L2 RNSKRPS SEQ ID NO: 23 Anticorpo 4785 CDR'-L3 STYDTFSIV

SEQ ID NO: 24 Iniciador avante DM22 GGTTATCTCGAGACCGGCTGCCCGCCCC SEQ ID NO: 25 Iniciador reverso DM23

GGCCCTTCTAGATCACTCGCCTGGCTGGTTGGAGATG

SEQ ID NO: 26

Vetor de APtag-5-NHIS

gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtcgactctcagtacaatctgctctgatgccgcatag ttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagc tacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgc ttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaatt acggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgc ctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgcca atagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatca agtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatg cccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattacc atggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaag tctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtc gtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcaga gctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactataggga gacccaagctggctagccaccatggagacagacacactcctgctatgggtactgctgct ctgggttcc aggttccactggtgacgcggcccagccggcccatcatcatcatcatcatgaagcttacgtaagatctt ccggaatcatcccagttgaggaggagaacccggacttctggaaccgcgaggcagccgaggccctgggt « gccgccaagaagctgcagcctgcacagacagccgccaagaacctcatcatcttcctgggcgatgggat

gggggtgtctacggtgacagctgccaggatcctaaaagggcagaagaaggacaaactggggcctgaga 15 tacccctggccatggaccgcttcccatatgtggctctgtccaagacatacaatgtagacaaacatgtg ccagacagtggagccacagccacggcctacctgtgcggggtcaagggcaacttccagaccattggctt gagtgcagccgcccgctttaaccagtgcaacacgacacgcggcaacgaggtcatctccgtgatgaatc gggccaagaaagcagggaagtcagtgggagtggtaaccaccacacgagtgcagcacgcctcgccagcc ggcacctacgcccacacggtgaaccgcaactggtactcggacgccgacgtgcctgcctcggcccgcca 20 ggaggggtgccaggacatcgctacgcagctcatctccaacatggacattgacgtgatcctaggtggag gccgaaagtacatgtttcgcatgggaaccccagaccctgagtacccagatgactacagccaaggtggg accaggctggacgggaagaatctggtgcaggaatggctggcgaagcgccagggtgcccggtatgtgtg gaaccgcactgagctcatgcaggcttccctggacccgtctgtgacccatctcatgggtctctttgagc ctggagacatgaaatacgagatccaccgagactccacactggacccctccctgatggagatgacagag 25 gctgccctgcgcctgctgagcaggaacccccgcggcttcttcctcttcgtggagggtggtcgcatcga ccatggtcatcatgaaagcagggcttaccgggcactgactgagacgatcatgttcgacgacgccattg agagggcgggccagctcaccagcgaggaggacacgctgagcctcgtcactgccgaccactcccacgtc ttctccttcggaggctaccccctgcgagggagctccatcttcgggctggcccctggcaaggcccggga caggaaggcctacacggtcctcctatacggaaacggtccaggctatgtgctcaaggacggcgcccggc 30 cggatgttaccgagagcgagagcgggagccccgagtatcggcagcagtcagcagtgcccctggacgaa gagacccacgcaggcgaggacgtggcggtgttcgcgcgcggcccgcaggcgcacctggttcacggcgt gcaggagcagaccttcatagcgcacgtcatggccttcgccgcctgcctggagccctacaccgcctgcg acctggcgccccccgccggcaccaccgacgccgcgcacccgggttatctcgaggaagcgctctctct agaagggcccgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatc atcattgagtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgc ccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgagga 5 aattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagg gggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa agaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgt ggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgcttt cttcc cttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcggggcatccctttagggttc 10 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gtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggg 25 gcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgac acgtgctacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgg gacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccaacttgtt tattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcattttttt cactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtataccgtcgacc 30 tctagctagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaat tccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactca cattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgact cgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatcc acagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaa aaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgct caagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagct ccctc 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ccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaa cgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgat cgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctctta ctgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatag tgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaac tttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttga gatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtt tctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttg aatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggat acatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgcca cctgacgtc

SEQ ID NO: 27

Seqüência de DNA maduro de LINGO-I de ser humano acgggctgcccgccccgctgcgagtgctccgcccaggaccgcgctgtgctgtgccaccgcaagcgct ttgtggcagtccccgagggcatccccaccgagacgcgcctgctggacctaggcaagaaccgcatcaaa acgctcaaccaggacgagttcgccagcttcccgcacctggaggagctggagctcaacgagaacatcgt gagcgccgtggagcccggcgccttcaacaacctcttcaacctccggacgctgggtctccgcagcaacc 5 gcctgaagctcatcccgctaggcgtcttcactggcctcagcaacctgaccaagctggacatcagcgag aacaagattgttatcctgctggactacatgtttcaggacctgtacaacctcaagtcactggaggttgg cgacaatgacctcgtctacatctctcaccgcgccttcagcggcctcaacagcctggagcagctgacgc tggagaaatgcaacctgacctccatccccaccgaggcgctgtcccacctgcacggcctcatcgtcctg aggctccggcacctcaacatcaatgccatccgggactactccttcaagaggctctaccgactcaaggt 10 cttggagatctcccactggccctacttggacaccatgacacccaactgcctctacggcctcaacctga cgtccctgtccatcacacactgcaatctgaccgctgtgccctacctggccgtccgccacctagtctat ctccgcttcctcaacctctcctacaaccccatcagcaccattgagggctccatgttgcatgagctgct ccggctgcaggagatccagctggtgggcgggcagctggccgtggtggagccctatgccttccgcggcc tcaactacctgcgcgtgctcaatgtctctggcaaccagctgaccacactggaggaatcagtcttccac 15 tcggtgggcaacctggagacactcatcctggactccaacccgctggcctgcgactgtcggctcctgtg ggtgttccggcgccgctggcggctcaacttcaaccggcagcagcccacgtgcgccacgcccgagtttg tccagggcaaggagttcaaggacttccctgatgtgctactgcccaactacttcacctgccgccgcgcc cgcatccgggaccgcaaggcccagcaggtgtttgtggacgagggccacacggtgcagtttgtgtgccg ggccgatggcgacccgccgcccgccatcctctggctctcaccccgaaagcacctggtctcagccaaga 20 gcaatgggcggctcacagtcttccctgatggcacgctggaggtgcgctacgcccaggtacaggacaac ggcacgtacctgtgcatcgcggccaacgcgggcggcaacgactccatgcccgcccacctgcatgtgcg cagctactcgcccgactggccccatcagcccaacaagaccttcgctttcatctccaaccagccgggcg agggagaggccaacagcacccgcgccactgtgcctttccccttcgacatcaagaccctcatcatcgcc accaccatgggcttcatctctttcctgggcgtcgtcctcttctgcctggtgctgctgtttctctggag 25 ccggggcaagggcaacacaaagcacaacatcgagatcgagtatgtgccccgaaagtcggacgcaggca tcagctccgccgacgcgccccgcaagttcaacatgaagatgata SEQ ID NO: 28

Seqüência de DNA maduro de LINGO-I de macaco de cinomólogo acgggctgcccgccccgctgcgagtgctccgcccaggaccgggctgtgctctgccaccgcaagcgctt tgtggcagtgcctgagggcatccccacggagacgcgcctgctggacctggggaagaaccgcatcaaaa cgctcaaccaggacgagttcgccagcttcccgcacctggaggagctggagctcaacgagaacatcgtg agcgccgtggagcctggcgccttcaacaaccttttcaacctccggacgctgggtctccgcagcaaccg cctgaagctcatcccgctgggcgtcttcactggcctcagcaacttgaccaagctggacatcagcgag aacaagatcgttatcctgctggactacatgttccaggacctgtacaacctcaagtcactggaggttgg cgacaatgacctcgtctacatctcccaccgcgccttcagcggcctcaacagcctggagcagctgacgc tggagaaatgcaacctgacctccatccccaccgaggcgctgtcccacctgcacggcctcatcgtcctg 5 aggctccggcacctcaacatcaatgccatccgggactactccttcaagaggttgtaccgactcaaggt cttggagatctcccactggccctacttggacaccatgacacccaactgcctctacggcctcaacctga cgtccctgtccatcacgcactgcaatctgaccgctgtgccctacctggccgtccgccacctggtctat ctccgcttcctcaacctctcctacaaccccatcagcaccattgagggctccatgttgcatgagctgct ccggctgcaggagatccagctggtgggcgggcagctggccatggtggagccctatgccttccgcggcc 10 tcaactacctgcgcgtgctcaatgtctctggcaaccagctgaccacgctggaagaatcagtcttccac tcggtgggcaacctggagacgctcatcctggactccaacccactggcctgcgactgtcggctcctgtg ggtgttccggcgccgctggcggctcaacttcaaccggcagcagcccacgtgcgccacgcccgagttcg tccagggcaaggagttcaaggacttccctgatgtgctactgcccaactacttcacctgccgccgcgcc cgcatccgggatcgcaaggcccagcaggtgtttgtggatgagggccacacggtgcagtttgtgtgccg 15 ggccgatggcgacccgccgcccgccatcctctggctctcaccccgaaagcacctggtctcagccaaga gcaatgggcggctcacagtcttccctgatggcacgctggaggtgcgctacgcccaggtacaggacaat ggcacgtacctgtgcatcgcggccaatgcaggcggcaacgactccatgcctgcccacctgcatgtgcg cagctactcacccgactggccccatcagcccaacaagaccttcgccttcatccccaaccagccgggcg agggagaggccaacagcacccgagccactgtgcctttccccttcgacatcaagaccctcatcatcgcc 20 accaccatgggcttcatctctttcctgggcgtcgtcctcttctgcctggtgctgctgtttctctggag ccggggcaagggcaacacgaagcacaacatcgagatcgagtatgtcccccgaaagtcggacgcaggca tcagctccgccgacgcgccccgcaagttcaacatgaagatgata SEQ ID NO: 29

Seqüência de DNA maduro de LINGO-I de rato 25 accggctgcccgccccgctgcgagtgctcagcgcaggaccgagcagtgctctgtcaccgcaagcgctt tgtggcggtgcccgagggcatccccaccgagactcgcctgctggacctgggcaaaaaccgcatcaaga cactcaaccaggacgagtttgccagtttcccacacctggaggagctagaactcaatgagaacattgtg agcgctgtggagccgggcgccttcaacaacctcttcaacctgaggacgctggggcttcgcagcaaccg cctgaagctcatcccgctgggcgtcttcaccggcctcagcaacttgaccaagctggacatcagcgaga 30 acaagatcgtcatcctgctagactacatgttccaagacctatacaacctcaagtcgctggaggtcggc gacaatgacctcgtctacatctcccatcgagccttcagcggcctcaacagcctggaacagctgacgct ggagaaatgcaatctgacctccatccccactgaggcactctcccacctgcatggcctcatcgtcctgc ggctacgacacctcaacatcaatgccatacgggactactccttcaagaggctgtaccgactcaaggt cttagagatctcccactggccctacctggacaccatgacccccaactgcctctacggcctcaacctga catccctatctatcacgcactgcaacctgacagccgtgccctatctggcagtgcgccacctggtctat ctccgtttcctcaatctttcctacaaccccatcggtacaatcgagggctccatgctgcatgagctgct gcggttgcaagagatccaactggtgggcgggcagctggccgtggtggagccctacgcctttcgtgggc tcaattacctgcgtgtgctcaatgtttctggcaaccagctgaccaccctggaggagtcagccttccac tcggtgggcaacctggagacgctcattctggactccaacccactggcctgtgactgccggctgctgtg ggtgttccggcgccgctggcggctcaacttcaacaggcagcagcctacctgcgccacacctgagttcg tccagggcaaggagttcaaggacttccccgatgtgctcctacccaactacttcacctgccgccgggcc cacatccgggaccgcaaggcacagcaggtgtttgtagatgagggccacacggtgcagttcgtatgccg ggcagatggcgaccctccaccagctatcctttggctctcaccccgcaagcacttggtctcagccaaga gcaatgggcggctcacagtcttccctgatggcacgctggaggtgcgctacgcccaggtacaggacaac ggcacgtacctgtgcatcgcagccaatgcaggcggcaacgactccatgcccgcccacttgcatgtgcg cagctactcgcctgactggccccatcaacccaacaagaccttcgccttcatctccaaccagccaggcg agggagaggccaacagcacccgcgccactgtgcctttccccttcgacatcaagacgctcatcatcgcc accaccatgggcttcatctccttcctgggcgtggtcctattctgcctggtgctgctgtttctatggag ccggggcaaaggcaacacaaagcacaacatcgaaattgaatatgtgccccggaaatcggacgcaggca tcagctcagctgatgcaccccgcaagttcaacatgaagatgata SEQ ID NO: 30 Iniciador avante DM14

CTACGTCTAGAACGGGCTGCCCGCCCCGCT SEQ ID NO: 31 Iniciador reverso DM15

GGTTTCTCGAGTCATATCATCTTCATGTTGAACTTGCGG SEQ ID NO: 32

vetor de pSecTag2-V5

gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtcgactctcagtacaatctgctctgatgccgcatag ttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagc tacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgc 30 ttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaatt acggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcc tggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaa tagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatca agtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatg cccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattacc atggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaag 5 tctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtc gtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcaga gctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactataggga gacccaagctggctagccaccatggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttcc aggttccactggtgacgcggcccagcccggtaagcctatccctaaccctctcctcggtctcgattcta 10 cgtctagatatcctcgagaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgtt gtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaat-flssa tgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggaca gcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgag gcggaaagaaccagctggggct ctagggggtat ccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggc 15 gggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctt tcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcggggcatcccttta gggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtag tgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggac tcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttg 20 gggatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgtgg aatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgca tctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagca 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gtcgacctctagctagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgc tcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagc taactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgca ttaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctca ctgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacgg 10 ttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaa ccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatc gacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagc tccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcggg aagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagc 15 tgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgag tccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgag gtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtat ttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaa caaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatc 20 tcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaaggga ttttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaa tcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctat ctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatac gggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagat 25 ttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctc catccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacg ttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggt tcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcc tccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataatt 30 ctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctga gaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatag cagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgc tgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcac cagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacgga aatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatg agcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaa 5 agtgccacctgacgtc SEQ ID NO: 33

Seqüência de DNA maduro de LINGO-2 de ser humano

attggctgccccgctcgctgtgagtgctctgcccagaacaaatctgttagctgtcacagaaggcgatt gatcgccatcccagagggcattcccatcgaaaccaaaatcttggacctcagtaaaaacaggctaaaaa gcgtcaaccctgaagaattcatatcatatcctctgctggaagagatagacttgagtgacaacatcatt gccaatgtggaaccaggagcattcaacaatctctttaacctgcgttccctccgcctaaaaggcaatcg tctaaagctggtccctttgggagtattcacggggctgtccaatctcactaagcttgacattagtgaga ataagattgtcattttactagactacatgttccaagatctacataacctgaagtctctagaagtgggg gacaatgatttggtttatatatcacacagggcattcagtgggcttcttagcttggagcagctcaccct ggagaaatgcaacttaacagcagtaccaacagaagccctctcccacctccgcagcctcatcagcctgc atctgaagcatctcaatatcaacaatatgcctgtgtatgcctttaaaagattgttccacctgaaacac ctagagattgactattggcctttactggatatgatgcctgccaatagcctctacggtctcaacctcac atccctttcagtcaccaacaccaatctgtctactgtacccttccttgcctttaaacacctggtatacc tgactcaccttaacctctcctacaatcccatcagcactattgaagcaggcatgttctctgacctgatc cgccttcaggagcttcatatagtgggggcccagcttcgcaccattgagcctcactccttccaagggct ccgcttcctacgcgtgctcaatgtgtctcagaacctgctggaaactttggaagagaatgtcttctcct cccctagggctctggaggtcttgagcattaacaacaaccctctggcctgtgactgccgccttctctgg atcttgcagcgacagcccaccctgcagtttggtggccagcaacctatgtgtgctggcccagacaccat ccgtgagaggtctttcaaggatttccatagcactgccctttctttttactttacGtgcaaaaaaccca aaatccgtgaaaagaagttgcagcatctgctagtagatgaagggcagacagtccagctagaatgcagt gcagatggagacccgcagcctgtgatttcctgggtgacaccccgaaggcgtttcatcaccaccaagtc caatggaagagccaccgtgttgggtgatggcaccttggaaatccgctttgcccaggatcaagacagcg ggatgtatgtttgcatcgctagcaatgctgctgggaatgataccttcacagcctccttaactgtgaaa ggattcgcttcagatcgttttctttatgcgaacaggacccctatgtacatgaccgactccaatgacac catttccaatggcaccaatgccaatactttttccctggaccttaaaacaatactggtgtctacagcta tgggctgcttcacattcctgggagtggttttattttgttttcttctcctttttgtgtggagccgaggg aaaggcaagcacaaaaacagcattgaccttgagtatgtgcccagaaaaaacaatggtgctgttgtgga aggggaggtagctggacccaggaggttcaacatgaaaatgatt SEQ ID NO: 34 Iniciador avante DM16 CTACGTCTAGAATTGGCTGCCCCGCTCGCT 5 SEQ ID NO: 35

Iniciador reverso DM17

GGTTTCTCGAGTCAAATCATTTTCATGTTGAACCTCCTG

SEQ ID NO: 36

pRS5a-IgG

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tcgacggatcgggagatccgggacatgtacctcccaggggcccaggaagactacgggaggctacacca acgtcaatcagaggggcctgtgtagctaccgataagcggaccctcaagagggcattagcaatagtgtt tataaggcccccttgttaaccctaaacgggtagcatatgcttcccgggtagtagtatatactatccag actaaccctaattcaatagcatatgttacccaacgggaagcatatgctatcgaattagggttagtaaa 25 agggtcctaaggaacagcgatatctcccaccccatgagctgtcacggttttatttacatggggtcagg attccacgagggtagtgaaccattttagtcacaagggcagtggctgaagatcaaggagcgggcagtga actctcctgaatcttcgcctgcttcttcattctccttcgtttagctaatagaataactgctgagttgt gaacagtaaggtgtatgtgaggtgctcgaaaacaaggtttcaggtgacgcccccagaataaaatttgg acggggggttcagtggtggcattgtgctatgacaccaatataaccctcacaaaccccttgggcaataa 30 atactagtgtaggaatgaaacattctgaatatctttaacaatagaaatccatggggtggggacaagcc gtaaagactggatgtccatctcacacgaatttatggctatgggcaacacataatcctagtgcaatatg atactggggttattaagatgtgtcccaggcagggaccaagacaggtgaaccatgttgttacactctat ttgtaacaaggggaaagagagtggacgccgacagcagcggactccactggttgtctctaacaccccc gaaaattaaacggggctccacgccaatggggcccataaacaaagacaagtggccactcttttttttga 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Vetor de expressão de Fab pMORPH®X9_MH

C T AG AT AACG AGGGCAAAAA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTAGCGCAG GCCGATATCG TGCTGACCCA

GCCGCCTTCA GTGAGTGGCG CACCAGGTCA GCGTGTGACC ATCTCGTGTA GCGGCAGCAG CAGCAACATT GGTAATAATT ATGTGTCTTG GTACCAGCAG

TTGCCCGGGA CGGCGCCGAA ACTTCTGATT TCTCGTAATT CTAAGCGTCC CTCAGGCGTG CCGGATCGTT TTAGCGGATC CAAAAGCGGC ACCAGCGCGA GCCTTGCGAT TACGGGCCTG CAAAGCGAAG ACGAAGCGGA TTATTATTGC TCTACTTATG ATACTTTTTC TATTGTGTTT GGCGGCGGCA CGAAGTTAAC

CGTTCTTGGC CAGCCGAAAG CCGCACCGAG TGTGACGCTG TTTCCGCCGA GCAGCGAAGA ATTGCAGGCG AACAAAGCGA CCCTGGTGTG CCTGATTAGC

GACTTTTATC CGGGAGCCGT GACAGTGGCC TGGAAGGCAG ATAGCAGCCC CGTCAAGGCG GGAGTGGAGA CCACCACACC CTCCAAACAA AGCAACAACA

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AACCGTTGCG CCGACTGAGG CCTGATAAGC ATGCGTAGGA GAAAATAAAA TGAAACAAAG CACTATTGCA CTGGCACTCT TACCGTTGCT CTTCACCCCT GTTACCAAAG CCCAGGTGCA ATTGCAACAG TCTGGTCCGG GCCTGGTGAA ACCGAGCCAA ACCCTGAGCC TGACCTGTGC GATTTCCGGA GATAGCGTGA

GCGATAATTC TGCTGCTTGG TCTTGGATTC GCCAGTCTCC TGGGCGTGGC CTCGAGTGGC TGGGCCTTAT CTATCTTCGT AGCAAGTGGG ATAACGATTA TGCGGTGAGC GTGAAAAGCC GGATTACCAT CAACCCGGAT ACTTCGAAAA CCTGCAACTG AACAGCGTGA CCCCGGAAGA TACGGCCGTG TATTATTGCG CGCGTACTGG TCGTGCTGAT GAGTTTGATG TTTGGGGCCA 5 GTGACGGTTA GCTCAGCGTC GACCAAAGGT CCAAGCGTGT

TTCCGCTGGC TCCGAGCAGC AAAAGCACCA GCGGCGGCAC GGCTGCCCTG TTAAAGATTA TTTCCCGGAA CCAGTCACCG TGAGCTGGAA CAGCGGGGCG CTGACCAGCG GCGTGCATAC CTTTCCGGCG GTGCTGCAAA GTATAGCCTG AGCAGCGTTG TGACCGTGCC GAGCAGCAGC 10 TTAGGCACTC AGACCTATAT TTGCAACGTG AACCATAAAC CGAGCAACAC AAAAAAGTGG AACCGAAAAG CGAATTCGAG CAGAAGCTGA TCTCTGAGGA GGATCTGAAC GGCGCGCCGC ACCATCATCA CCATCACTGA CTGTGAAGTG AAAAATGGCG CAGATTGTGC GACATTTTTT TTGTCTGCCG TTTAATTAAA GGGGGGGGGG GGCCGGCCTG GGGGGGGGTG 15 TGTAAACGTT AATATTTTGT TAAAATTCGC GTTAAATTTT

TGTTAAATCA GCTCATTTTT TAACCAATAG GCCGAAATCG GCAAAATCCC AAAGAATAGA CCGAGATAGG GTTGAGTGTT GTTCCAGTTT GGAACAAGAG TCCACTATTA AAGAACGTGG ACTCCAACGT CAAAGGGCGA ATCAGGGCGA TGGCCCACTA CGAGAACCAT CACCCTAATC 20 AAGTTTTTTG GGGTCGAGGT GCCGTAAAGC ACTAAATCGG AACCCTAAAG ATTTAGAGCT TGACGGGGAA AGCCGGCGAA CGTGGCGAGA AAGGAAGGGA AGAAAGCGAA AGGAGCGGGC GCTAGGGCGC TGGCAAGTGT CTGCGCGTAA CCACCACACC CGCCGCGCTT AATGCGCCGC TACAGGGCGC GTGCTAGACT AGTGTTTAAA CCGGACCGGG GGGGGGCTTA 25 AAAACAAAAC GGCCTCCTGT CAGGAAGCCG CTTTTATCGG

GTAGCCTCAC TGCCCGCTTT CCAGTCGGGA AACCTGTCGT GCCAGCTGCA GGCCAACGCG CGGGGAGAGG CGGTTTGCGT ATTGGGAGCC AGGGTGGTTT TTCTTTTCAC CAGTGAGACG GGCAACAGCT GATTGCCCTT CCCTGAGAGA GTTGCAGCAA GCGGTCCACG CTGGTTTGCC 30 CCAGCAGGCG AAAATCCTGT TTGATGGTGG TCAGCGGCGG GATATAACAT CGGTATCGTC GTATCCCACT ACCGAGATGT CCGCACCAAC GCGCAGCCCG GACTCGGTAA TGGCACGCAT TGCGCCCAGC GCCATCTGAT

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GGCCAGGTTT TCACCGTAAC ACGCCACATC TTGCGAATAT ATGTGTAGAA ATCGTCGTGG TATTCACTCC AGAGCGATGA AAACGTTTCA GTTTGCTCAT GGAAAACGGT GTAACAAGGG TGAACACTAT CCCATATCAC TCTTTCATTG CCATACGGAA CTCCGGGTGA GCATTCATCA 10 GGCGGGCAAG AATGTGAATA AAGGCCGGAT AAAACTTGTG CTTATTTTTC TTAAAAAGGC CGTAATATCC AGCTGAACGG TCTGGTTATA GGTACATTGA GCAACTGACT GAAATGCCTC AAAATGTTCT TTACGATGCC ATCAACGGTG GTATATCCAG TGATTTTTTT CTCCATTTTA GCTTCCTTAG CTCCTGAAAA TCTCGATAAC TCAAAAAATA CGCCCGGTAG 15 TCATTATGGT GAAAGTTGGA ACCTCACCCG ACGTCTAATG

TGAGTTAGCT CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG AATTT SEQ ID NO: 40 Vetor de expressão de IgG4 pMORPH®_h_Igy4

AATTGCATGA AGAATCTGCT TAGGGTTAGG CGTTTTGCGC TGCTTCGCGA AGATATACGC GTTGACATTG ATTATTGACT AGTTATTAAT AGTAATCAAT TACGGGGTCA TTAGTTCATA GCCCATATAT GGAGTTCCGC TTACGGTAAA TGGCCCGCCT GGCTGACCGC CCAACGACCC 25 CCGCCCATTG ACGTCAATAA TGACGTATGT TCCCATAGTA ACGCCAATAG TTGACGTCAA TGGGTGGACT ATTTACGGTA AACTGCCCAC TTGGCAGTAC ATCAAGTGTA TCATATGCCA AGTACGCCCC CTATTGACGT AAATGGCCCG CCTGGCATTA TGCCCAGTAC ATGACCTTAT GGGACTTTCC TACTTGGCAG TACATCTACG TATTAGTCAT CGCTATTACC 30 GGTTTTGGCA GTACATCAAT GGGCGTGGAT AGCGGTTTGA

CTCACGGGGA TTTCCAAGTC TCCACCCCAT TGACGTCAAT GGGAGTTTGT AAATCAACGG GACTTTCCAA AATGTCGTAA CAACTCCGCC

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ATGGTGATGC

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CGCGTACTGG TCGTGCTGAT GAGTTTGATG TTTGGGGCCA AGGCACCCTG GCTCAGCTTC CACCAAGGGA CCATCCGTCT TCCCCCTGGC GCCCTGCTCC AGGAGCACCT CCGAGAGCAC AGCCGCCCTG GGCTGCCTGG CTTCCCCGAA CCGGTGACGG TGTCGTGGAA CTCAGGCGCC 15 CTGACCAGCG GCGTGCACAC CTTCCCGGCT GTCCTACAGT CCTCAGGACT AGCAGCGTGG TGACCGTGCC CTCCAGCAGC TTGGGCACGA AGACCTACAC CTGCAACGTA GATCACAAGC CCAGCAACAC CAAGGTGGAC AGTCCAAATA TGGTCCCCCA TGCCCATCAT GCCCAGCACC TGAGTTCCTG GGGGGACCAT CAGTCTTCCT GTTCCCCCCA AAACCCAAGG 20 GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACGTGCGT GGTGGTGGAC

GTGAGCCAGG AAGACCCCGA GGTCCAGTTC AACTGGTACG TGGATGGCGT AATGCCAAGA CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG TTCAACAGCA CGTACCGTGT GGTCAGCGTC CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAC ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC AAAGGCCTCC CGTCCTCCAT 25 CGAGAAAACC ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAG CCACAGGTGT CCCATCCCAG GAGGAGATGA CCAAGAACCA GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT CTACCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT CCCGTGCTGG ACTCCGACGG CTCCTTCTTC CTCTACAGCA GGCTAACCGT GGACAAGAGC 30 AGGGGAATGT CTTCTCATGC TCCGTGATGC ATGAGGCTCT

GCACAACCAC TACACACAGA AGAGCCTCTC CCTGTCTCTG GGTAAATGAG AACCCGCTGA TCAGCCTCGA CTGTGCCTTC TAGTTGCCAG

CAGAGCTCTC

ACACCTGTGG

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TGGGCCTTAT

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CTACTCCCTC

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AGGTGGCAGG

GGCCCGTTTA CCATCTGTTG TTTGCCCCTC CCCCGTGCCT TCCTTGACCC TGGAAGGTGC GTCCTTTCCT AATAAAATGA GGAAATTGCA TCGCATTGTC TGAGTAGGTG TCATTCTATT CTGGGGGGTG GGGTGGGGCA GGACAGCAAG GGGAAGACAA TAGCAGGCAT GCTGGGGATG CGGTGGGCTC 5 TATGGCTTCT GAGGCGGAAA GAACCAGCTG GGGCTCTAGG GGGTATCCCC TAGCGGCGCA TTAAGCGCGG CGGGTGTGGT GGTTACGCGC AGCGTGACCG CTACACTTGC CAGCGCCCTA GCGCCCGCTC CTTTCGCTTT TTTCTCGCCA CGTTCGCCGG CTTTCCCCGT CAAGCTCTAA ATCGGGGCAT CCCTTTAGGG TTCCGATTTA GTGCTTTACG GCACCTCGAC 10 TTGATTAGGG TGATGGTTCA CGTAGTGGGC CATCGCCCTG

ATAGACGGTT TTTCGCCCTT TGACGTTGGA GTCCACGTTC TTTAATAGTG CCAAACTGGA ACAACACTCA ACCCTATCTC GGTCTATTCT TTTGATTTAT AAGGGATTTT GGGGATTTCG GCCTATTGGT TAAAAAATGA CAAAAATTTA ACGCGAATTA ATTCTGTGGA ATGTGTGTCA 15 GTTAGGGTGT GGAAAGTCCC CAGGCTCCCC AGGCAGGCAG AAGTATGCAA TCAATTAGTC AGCAACCAGG TGTGGAAAGT CCCCAGGCTC CCCAGCAGGC AGAAGTATGC AAAGCATGCA TCTCAATTAG TCAGCAACCA CCTAACTCCG CCCATCCCGC CCCTAACTCC GCCCAGTTCC GCCCATTCTC CGCCCCATGG CTGACTAATT TTTTTTATTT ATGCAGAGGC 20 TCTGCCTCTG AGCTATTCCA GAAGTAGTGA GGAGGCTTTT

TTGGAGGCCT AGGCTTTTGC AAAAAGCTCC CGGGAGCTTG TATATCCATT ATCAAGAGAC AGGATGAGGA TCGTTTCGCA TGATTGAACA AGATGGATTG CACGCAGGTT CTCCGGCCGC TTGGGTGGAG AGGCTATTCG GGCACAACAG ACAATCGGCT GCTCTGATGC CGCCGTGTTC 25 CGGCTGTCAG CGCAGGGGCG CCCGGTTCTT TTTGTCAAGA CCGACCTGTC AATGAACTGC AGGACGAGGC AGCGCGGCTA TCGTGGCTGG CCACGACGGG CGTTCCTTGC GCAGCTGTGC TCGACGTTGT CACTGAAGCG GGCTGCTATT GGGCGAAGTG CCGGGGCAGG ATCTCCTGTC ATCTCACCTT GCTCCTGCCG AGAAAGTATC CATCATGGCT GATGCAATGC 30 TACGCTTGAT CCGGCTACCT GCCCATTCGA CCACCAAGCG

AAACATCGCA TCGAGCGAGC ACGTACTCGG ATGGAAGCCG GTCTTGTCGA CTGGACGAAG AGCATCAGGG GCTCGCGCCA GCCGAACTGT

CACTCCCACT

GGGGAGGATT

ACGCGCCCTG

CTTCCCTTCC

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GCTGATTTAA

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GCTATGACTG

CGGTGCCCTG

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GGCGGCTGCA

TCAGGATGAT TCGCCAGGCT CAAGGCGCGC ATGCCCGACG GCGAGGATCT CGTCGTGACC CCTGCTTGCC GAATATCATG GTGGAAAATG GCCGCTTTTC TGGATTCATC GACTGTGGCC GGCTGGGTGT GGCGGACCGC TATCAGGACA TACCCGTGAT ATTGCTGAAG AGCTTGGCGG CGAATGGGCT 5 GACCGCTTCC TCGTGCTTTA CGGTATCGCC GCTCCCGATT CGCAGCGCAT CGCCTTCTTG ACGAGTTCTT CTGAGCGGGA CTCTGGGGTT CGAAAT GACC GACCAAGCGA CGCCCAACCT GCCATCACGA GATTTCGATT CTTCTATGAA AGGTTGGGCT TCGGAATCGT TTTCCGGGAC GCCGGCTGGA TGATCCTCCA GCGCGGGGAT CTCATGCTGG AGTTCTTCGC 10 TTGTTTATTG CAGCTTATAA TGGTTACAAA TAAAGCAATA

GCAT CACAAA TTTCACAAAT AAAGCATTTT TTTCACTGCA TTCTAGTTGT AACTCATCAA TGTATCTTAT CATGTCTGTA TACCGTCGAC CTCTAGCTAG AGCTTGGCGT AATCATGGTC ATAGCTGTTT CCTGTGTGAA GCTCACAATT CCACACAACA TACGAGCCGG AAGCATAAAG 15 TGTAAAGCCT GGGGTGCCTA ATGAGTGAGC TAACTCACAT TAATTGCGTT CCCGCTTTCC AGTCGGGAAA CCTGTCGTGC CAGCTGCATT AATGAATCGG CCAACGCGCG GGGAGAGGCG GTTTGCGTAT TGGGCGCTCT CGCTCACTGA CTCGCTGCGC TCGGTCGTTC GGCTGCGGCG AGCGGTATCA GCTCACTCAA AGGCGGTAAT ACGGTTATCC AC AGAAT CAG 20 AGGAAAGAAC AT GT GAGCAA AAGGCCAGCA AAAGGCCAGG

AACCGTAAAA AGGCCGCGTT GCTGGCGTTT TTCCATAGGC TCCGCCCCCC CACAAAAATC GACGCTCAAG TCAGAGGTGG CGAAACCCGA CAGGACTATA AAGATACCAG GCGTTTCCCC CTGGAAGCTC CCTCGTGCGC CGACCCTGCC GCTTACCGGA TACCTGTCCG CCTTTCTCCC 25 TTCGGGAAGC GTGGCGCTTT CTCAATGCTC ACGCTGTAGG TATCTCAGTT CGTTCGCTCC AAGCTGGGCT GTGTGCACGA ACCCCCCGTT CAGCCCGACC GCTGCGCCTT ATCCGGTAAC TATCGTCTTG AGTCCAACCC GACTTATCGC CACTGGCAGC AGCCACTGGT AACAGGATTA GCAGAGCGAG GTATGTAGGC GGTGCTACAG AGTTCTTGAA GTGGTGGCCT 30 ACACTAGAAG GACAGTATTT GGTATCTGCG CTCTGCTGAA

GCCAGTTACC TTCGGAAAAA GAGTTGGTAG CTCTTGATCC GGCAAACAAA TAGCGGTGGT TTTTTTGTTT GCAAGCAGCA GATTACGCGC

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CCACCGCTGG AGAAAAAAAG GATCTCAAGA AGATCCTTTG ATCTTTTCTA CGGGGTCTGA CGCTCAGTGG AACGAAAACT CACGTTAAGG GATTTTGGTC ATGAGATTAT

CAAAAAGGAT CTTCACCTAG ATCCTTTTAA ATTAAAAATG AAGTTTTAAA TCAATCTAAA GTATATATGA GTAAACTTGG TCTGACAGTT ACCAATGCTT AATCAGTGAG GCACCTATCT CAGCGATCTG TCTATTTCGT TCATCCATAG TTGCCTGACT CCCCGTCGTG TAGATAACTA CGATACGGGA GGGCTTACCA

TCTGGCCCCA GTGCTGCAAT GATACCGCGA GACCCACGCT CACCGGCTCC AGATTTATCA GCAATAAACC AGCCAGCCGG AAGGGCCGAG CGCAGAAGTG

GTCCTGCAAC TTTATCCGCC TCCATCCAGT CTATTAATTG TTGCCGGGAA GCTAGAGTAA GTAGTTCGCC AGTTAATAGT TTGCGCAACG TTGTTGCCAT

TGCTACAGGC ATCGTGGTGT CACGCTCGTC GTTTGGTATG GCTTCATTCA GCTCCGGTTC CCAACGATCA AGGCGAGTTA CATGATCCCC CATGTTGTGC

AAAAAAGCGG TTAGCTCCTT CGGTCCTCCG ATCGTTGTCA GAAGTAAGTT GGCCGCAGTG TTATCACTCA TGGTTATGGC AGCACTGCAT AATTCTCTTA CTGTCATGCC ATCCGTAAGA TGCTTTTCTG TGACTGGTGA GTACTCAACC AAGTCATTCT GAGAATAGTG TATGCGGCGA CCGAGTTGCT CTTGCCCGGC

GTCAATACGG GATAATACCG CGCCACATAG CAGAACTTTA AAAGTGCTCA TCATTGGAAA ACGTTCTTCG GGGCGAAAAC TCTCAAGGAT CTTACCGCTG

TTGAGATCCA GTTCGATGTA ACCCACTCGT GCACCCAACT GATCTTCAGC ATCTTTTACT TTCACCAGCG TTTCTGGGTG AGCAAAAACA GGAAGGCAAA

ATGCCGCAAA AAAGGGAATA AGGGC GACAC GGAAATGTTG AATACTCATA CTCTTCCTTT TTCAATATTA TTGAAGCATT TATCAGGGTT ATTGTCTCAT

GAGCGGATAC ATATTTGAAT GTATTTAGAA AAATAAACAA ATAGGGGTTC CGCGCACATT TCCCCGAAAA GTGCCACCTG ACGTCGACGG ATCGGGAGAT 25 CTCCCGATCC CCTATGGTCG ACTCTCAGTA CAATCTGCTC TGATGCCGCA TAGTTAAGCC AGTATCTGCT CCCTGCTTGT GTGTTGGAGG TCGCTGAGTA GTGCGCGAGC AAAATTTAAG CTACAACAAG GCAAGGCTTG ACCGAC SEQ ID NO: 41

Vetor de expressão de cadeia lambda de IgG pMORPH®_h_Ig_lambda AATTGCATGA AGAATCTGCT TAGGGTTAGG CGTTTTGCGC TGCTTCGCGA TGTACGGGCC AGATATACGC GTTGACATTG ATTATTGACT AGTTATTAAT

AGTAATCAAT TACGGGGTCA TTAGTTCATA GCCCATATAT GGAGTTCCGC GTTACATAAC TTACGGTAAA TGGCCCGCCT GGCTGACCGC CCAACGACCC CCGCCCATTG ACGTCAATAA TGACGTATGT TCCCATAGTA ACGCCAATAG TTGACGTCAA TGGGTGGACT ATTTACGGTA AACTGCCCAC TTGGCAGTAC ATCAAGTGTA TCATATGCCA AGTACGCCCC CTATTGACGT AAATGGCCCG CCTGGCATTA TGCCCAGTAC ATGACCTTAT

GGGACTTTCC TACTTGGCAG TACATCTACG TAT TAGT CAT CGCTATTACC GGTTTTGGCA GTACATCAAT GGGCGTGGAT AGCGGTTTGA CTCACGGGGA TTTCCAAGTC TCCACCCCAT TGACGTCAAT GGGAGTTTGT AAATCAACGG GACTTTCCAA AATGTCGTAA CAACTCCGCC 10 CCATTGACGC AAATGGGCGG TAGGCGTGTA CGGTGGGAGG TCTATATAAG TGGCTAACTA GAGAACCCAC TGCTTACTGG CTTATCGAAA TTAATACGAC TCACTATAGG GAGACCCAAG CTGGCTAGCG CCACCATGGC CTGCTCCTCA CCCTCCTCAC TCAGGGCACA GGATCCTGGG CTGATATCGT GCTGACCCAG CCGCCTTCAG TGAGTGGCGC ACCAGGTCAG 15 TCTCGTGTAG CGGCAGCAGC AGCAACATTG GTAATAATTA

TGTGTCTTGG TACCAGCAGT TGCCCGGGAC GGCGCCGAAA CTTCTGATTT TAAGCGTCCC TCAGGCGTGC CGGATCGTTT TAGCGGATCC AAAAGCGGCA CCAGCGCGAG CCTTGCGATT ACGGGCCTGC AAAGCGAAGA TATTATTGCT CTACTTATGA TACTTTTTCT ATTGTGTTTG 20 GCGGCGGCAC GAAGTTAACC GTCCTAGGTC AGCCCAAGGC TGCCCCCTCG TCCCGCCCTC CTCTGAGGAG CTTCAAGCCA ACAAGGCCAC ACTGGTGTGT CTCATAAGTG ACTTCTACCC GGGAGCCGTG ACAGTGGCCT TAGCAGCCCC GTCAAGGCGG GAGTGGAGAC CACCACACCC TCCAAACAAA GCAACAACAA GTACGCGGCC AGCAGCTATC TGAGCCTGAC 25 TGGAAGTCCC ACAGAAGCTA CAGCTGCCAG GTCACGCATG

AAGGGAGCAC CGTGGAGAAG ACAGTGGCCC CTACAGAATG TTCATAGGGG CCCGCTGATC AGCCTCGACT GTGCCTTCTA GTTGCCAGCC ATCTGTTGTT TGCCCCTCCC CCGTGCCTTC CTTGACCCTG GAAGGTGCCA CCTTTCCTAA TAAAATGAGG AAATTGCATC GCATTGTCTG 30 AGTAGGTGTC ATTCTATTCT GGGGGGTGGG GTGGGGCAGG ACAGCAAGGG GAAGACAATA GCAGGCATGC TGGGGATGCG GTGGGCTCTA TGGCTTCTGA GGCGGAAAGA ACCAGCTGGG GCTCTAGGGG GTATCCCCAC

GGACTTTCCA

CAATGACGGT

ATGGTGATGC

TTTGGCACCA

CAGAGCTCTC

CTGGGCTCTG

CGTGTGACCA

CTCGTAATTC

CGAAGCGGAT

GTCACTCTGT

GGAAGGGAGA

GCCTGAGCAG

CCCGTTTAAA

CTCCCACTGT

GGAGGATTGG

GCGCCCTGTA GCGGCGCATT AAGCGCGGCG GGTGTGGTGG TTACGCGCAG CGTGACCGCT ACACTTGCCA GCGCCCTAGC GCCCGCTCCT TTCGCTTTCT TCTCGCCACG TTCGCCGGCT TTCCCCGTCA AGCTCTAAAT CGGGGCATCC CTTTAGGGTT CCGATTTAGT GCTTTACGGC ACCTCGACCC 5 GATTAGGGTG ATGGTTCACG TAGTGGGCCA TCGCCCTGAT

AGACGGTTTT TCGCCCTTTG ACGTTGGAGT CCACGTTCTT TAATAGTGGA AAACTGGAAC AACACTCAAC CCTATCTCGG TCTATTCTTT TGATTTATAA GGGATTTTGG GGATTTCGGC CTATTGGTTA AAAAATGAGC AAAATTTAAC GCGAATTAAT TCTGTGGAAT GTGTGTCAGT 10 TAGGGTGTGG AAAGTCCCCA GGCTCCCCAG GCAGGCAGAA GTATGCAAAG AATTAGTCAG CAACCAGGTG TGGAAAGTCC CCAGGCTCCC CAGCAGGCAG AAGTATGCAA AGCATGCATC TCAATTAGTC AGCAACCATA TAACTCCGCC CATCCCGCCC CTAACTCCGC CCAGTTCCGC CCATTCTCCG CCCCATGGCT GACTAATTTT TTTTATTTAT GCAGAGGCCG 15 TGCCTCTGAG CTATTCCAGA AGTAGTGAGG AGGCTTTTTT

GGAGGCCTAG GCTTTTGCAA AAAGCTCCCG GGAGCTTGTA TATCCATTTT CAGCACGTGT TGACAATTAA TCATCGGCAT AGTATATCGG CATAGTATAA TACGACAAGG TGAGGAACTA AACCATGGCC AAGTTGACCA GGTGCTCACC GCGCGCGACG TCGCCGGAGC GGTCGAGTTC 20 TGGACCGACC GGCTCGGGTT CTCCCGGGAC TTCGTGGAGG ACGACTTCGC CGGGACGACG TGACCCTGTT CATCAGCGCG GTCCAGGACC AGGTGGTGCC GGACAACACC CTGGCCTGGG TGTGGGTGCG CGGCCTGGAC CCGAGTGGTC GGAGGTCGTG TCCACGAACT TCCGGGACGC CTCCGGGCCG GCCATGACCG AGATCGGCGA GCAGCCGTGG GGGCGGGAGT 25 CGACCCGGCC GGCAACTGCG TGCACTTCGT GGCCGAGGAG

CAGGACTGAC ACGTGCTACG AGATTTCGAT TCCACCGCCG CCTTCTATGA TTCGGAATCG TTTTCCGGGA CGCCGGCTGG ATGATCCTCC AGCGCGGGGA TCTCATGCTG GAGTTCTTCG CCCACCCCAA CTTGTTTATT ATGGTTACAA ATAAAGCAAT AGCATCACAA ATTTCACAAA 30 TAAAGCATTT TTTTCACTGC ATTCTAGTTG TGGTTTGTCC AAACTCATCA TCATGTCTGT ATACCGTCGA CCTCTAGCTA GAGCTTGGCG TAATCATGGT CATAGCTGTT TCCTGTGTGA AATTGTTATC CGCTCACAAT

TCCCTTCCTT

CAAAAAACTT

CTCTTGTTCC

TGATTTAACA

CATGCATCTC

GTCCCGCCCC

AGGCCGCCTC

CGGATCTGAT

GTGCCGTTCC

CGGTGTGGTC

GAGCTGTACG

TCGCCCTGCG

AAGGTTGGGC

GCAGCTTATA

ATGTATCTTA

TCCACACAAC ATACGAGCCG GAAGCATAAA GTGTAAAGCC TGGGGTGCCT

AATGAGTGAG CTAACTCACA TTAATTGCGT TGCGCTCACT GCCCGCTTTC ACCTGTCGTG CCAGCTGCAT TAATGAATCG GCCAACGCGC GGGGAGAGGC GGTTTGCGTA TTGGGCGCTC TTCCGCTTCC TCGCTCACTG CTCGGTCGTT CGGCTGCGGC GAGCGGTATC AGCTCACTCA AAGGCGGTAA TACGGTTATC CAC AGAATCA GGGGATAACG CAGGAAAGAA AAAGGCCAGC AAAAGGCCAG GAACCGTAAA AAGGCCGCGT TGCTGGCGTT TTTCCATAGG CTCCGCCCCC CTGACGAGCA TCACAAAAAT GTCAGAGGTG GCGAAACCCG ACAGGACTAT AAAGATACCA GGCGTTTCCC CCTGGAAGCT CCCTCGTGCG CTCTCCTGTT CCGACCCTGC ATACCTGTCC GCCTTTCTCC CTTCGGGAAG CGTGGCGCTT TCTCAATGCT CACGCTGTAG GTATCTCAGT TCGGTGTAGG TCGTTCGCTC TGTGTGCACG AACCCCCCGT TCAGCCCGAC CGCTGCGCCT TATCCGGTAA CTATCGTCTT GAGTCCAACC CGGTAAGACA CGACTTATCG CAGCCACTGG TAACAGGATT AGCAGAGCGA GGTATGTAGG CGGTGCTACA GAGTTCTTGA AGTGGTGGCC TAACTACGGC TACACTAGAA TGGTATCTGC GCTCTGCTGA AGCCAGTTAC CTTCGGAAAA AGAGTTGGTA GCTCTTGATC CGGCAAACAA ACCACCGCTG GTAGCGGTGG TGCAAGCAGC AGATTACGCG CAGAAAAAAA GGATCTCAAG AAGATCCTTT GATCTTTTCT ACGGGGTCTG ACGCTCAGTG GAACGAAAAC GGATTTTGGT CATGAGATTA TCAAAAAGGA TCTTCACCTA GATCCTTTTA AATTAAAAAT GAAGTTTTAA ATCAATCTAA AGTATATATG GTCTGACAGT TACCAATGCT TAATCAGTGA GGCACCTATC TCAGCGATCT GTCTATTTCG TTCATCCATA GTTGCCTGAC TCCCCGTCGT ACGATACGGG AGGGCTTACC ATCTGGCCCC AGTGCTGCAA TGATACCGCG AGACCCACGC TCACCGGCTC CAGATTTATC AGCAATAAAC GAAGGGCCGA GCGCAGAAGT GGTCCTGCAA CTTTATCCGC CTCCATCCAG TCTATTAATT GTTGCCGGGA AGCTAGAGTA AGTAGTTCGC TTTGCGCAAC GTTGTTGCCA TTGCTACAGG CATCGTGGTG TCACGCTCGT CGTTTGGTAT GGCTTCATTC AGCTCCGGTT CCCAACGATC ACATGATCCC CCATGTTGTG CAAAAAAGCG GTTAGCTCCT TCGGTCCTCC GATCGTTGTC AGAAGTAAGT TGGCCGCAGT GTTATCACTC CAGTCGGGAA

ACTCGCTGCG

CATGTGAGCA

CGACGCTCAA

CGCTTACCGG

CAAGCTGGGC

CCACTGGCAG

GGACAGTATT

TTTTTTTGTT

TCACGTTAAG

AGTAAACTTG

GTAGATAACT

CAGCCAGCCG

CAGTTAATAG

AAGGCGAGTT

ATGGTTATGG CAGCACTGCA TAATTCTCTT ACTGTCATGC CATCCGTAAG ATGCTTTTCT GTGACTGGTG AGTACTCAAC CAAGTCATTC TGAGAATAGT GTATGCGGCG ACCGAGTTGC TCTTGCCCGG CGTCAATACG GGATAATACC

GCGCCACATA GCAGAACTTT AAAAGTGCTC ATCATTGGAA AACGTTCTTC GGGGCGAAAA CTCTCAAGGA TCTTACCGCT GTTGAGATCC AGTTCGATGT

AACCCACTCG TGCACCCAAC TGATCTTCAG CATCTTTTAC TTTCACCAGC GTTTCTGGGT GAGCAAAAAC AGGAAGGCAA AATGCCGCAA AAAAGGGAAT

AAGGGCGACA CGGAAATGTT GAATACTCAT ACTCTTCCTT TTTCAATATT ATTGAAGCAT TTATCAGGGT TATTGTCTCA TGAGCGGATA CATATTTGAA

TGTATTTAGA AAAATAAACA AATAGGGGTT CCGCGCACAT TTCCCCGAAA AGTGCCACCT GACGTCGACG GATCGGGAGA TCTCCCGATC CCCTATGGTC

GACTCTCAGT ACAATCTGCT CTGATGCCGC ATAGTTAAGC CAGTATCTGC TCCCTGCTTG TGTGTTGGAG GTCGCTGAGT AGTGCGCGAG CAAAATTTAA GCTACAACAA GGCAAGGCTT GACCGAC SEQ ID NO: 42

Vetor de expressão de cadeia kapa de IgG pMORPH®_h_Ig_kappa AATTGCATGA AGAATCTGCT TAGGGTTAGG CGTTTTGCGC TGCTTCGCGA TGTACGGGCC AGATATACGC GTTGACATTG ATTATTGACT AGTTATTAAT

AGTAATCAAT TACGGGGTCA TTAGTTCATA GCCCATATAT GGAGTTCCGC GTTACATAAC TTACGGTAAA TGGCCCGCCT GGCTGACCGC CCAACGACCC

CCGCCCATTG ACGTCAATAA TGACGTATGT TCCCATAGTA ACGCCAATAG GGACTTTCCA TTGACGTCAA TGGGTGGAGT ATTTACGGTA AACTGCCCAC

TTGGCAGTAC ATCAAGTGTA TCATATGCCA AGTACGCCCC CTATTGACGT CAATGACGGT AAATGGCCCG CCTGGCATTA TGCCCAGTAC ATGACCTTAT

GGGACTTTCC TACTTGGCAG TACATCTACG TATTAGTCAT CGCTATTACC ATGGTGATGC GGTTTTGGCA GTACATCAAT GGGCGTGGAT AGCGGTTTGA

CTCACGGGGA TTTCCAAGTC TCCACCCCAT TGACGTCAAT GGGAGTTTGT TTTGGCACCA AAATCAACGG GACTTTCCAA AATGTCGTAA CAACTCCGCC

CCATTGACGC AAATGGGCGG TAGGCGTGTA CGGTGGGAGG TCTATATAAG CAGAGCTCTC TGGCTAACTA GAGAACCCAC TGCTTACTGG CTTATCGAAA

TTAATACGAC TCACTATAGG GAGACCCAAG CTGGCTAGCG CCACCATGGT GTTGCAGACC CAGGTCTTCA TTTCTCTGTT GCTCTGGATC TCTGGTGCCT ACGGGGATAT CCAGATGACC CAGAGCCCGT CTAGCCTGAG CGCGAGCGTG TGACCATTAC CTGCAGAGCG AGCCAGTCTA TTTCTAATTG GCTGAATTGG TACCAGCAGA AACCAGGTAA AGCACCGAAA CTATTAATTT TACTTTGCAA AGCGGGGTCC CGTCCCGTTT TAGCGGCTCT 5 GGATCCGGCA CTGATTTTAC CCTGACCATT AGCAGCCTGC AACCTGAAGA TATTATTGCC AGCAGTATGG TAATATTCCT ATTACCTTTG GCCAGGGTAC GAAAGTTGAA ATTAAACGTA CGGTGGCTGC ACCATCTGTC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG AGAGGCCAAA GTACAGTGGA 10 CGCCCTCCAA TCGGGTAACT CCCAGGAGAG TGTCACAGAG

CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC AGCAGCACCC TGACGCTGAG TACGAGAAAC ACAAAGTCTA CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT TCAACAGGGG AGAGTGTTAG AAACCCGCTG ATCAGCCTCG ACTGTGCCTT CTAGTTGCCA 15 GCCATCTGTT GTTTGCCCCT CCCCCGTGCC TTCCTTGACC CTGGAAGGTG TGTCCTTTCC TAATAAAATG AGGAAATTGC ATCGCATTGT CTGAGTAGGT GTCATTCTAT TCTGGGGGGT GGGGTGGGGC AGGACAGCAA TGGGAAGACA ATAGCAGGCA TGCTGGGGAT GCGGTGGGCT CTATGGCTTC TGAGGCGGAA AGAACCAGCT GGGGCTCTAG GGGGTATCCC 20 GTAGCGGCGC ATTAAGCGCG GCGGGTGTGG TGGTTACGCG

CAGCGTGACC GCTACACTTG CCAGCGCCCT AGCGCCCGCT CCTTTCGCTT CTTTCTCGCC ACGTTCGCCG GCTTTCCCCG TCAAGCTCTA AATCGGGGGC TCCCTTTAGG GTTCCGATTT AGTGCTTTAC GGCACCTCGA CTTGATTAGG GTGATGGTTC ACGTAGTGGG CCATCGCCCT 25 GATAGACGGT TTTTCGCCCT TTGACGTTGG AGTCCACGTT CTTTAATAGT TCCAAACTGG AACAACACTC AACCCTATCT CGGTCTATTC TTTTGATTTA TAAGGGATTT TGCCGATTTC GGCCTATTGG TTAAAAAATG ACAAAAATTT AACGCGAATT AATTCTGTGG AATGTGTGTC AGTTAGGGTG TGGAAAGTCC CCAGGCTCCC CAGCAGGCAG AAGTATGCAA 30 TCAATTAGTC AGCAACCAGG TGTGGAAAGT CCCCAGGCTC

CCCAGCAGGC AGAAGTATGC AAAGCATGCA TCTCAATTAG TCAGCAACCA CCTAACTCCG CCCATCCCGC CCCTAACTCC GCCCAGTTCC

GGTGATCGTG

ATAAGGCTTC

CTTTGCGACT

TTCATCTTCC

AGGTGGATAA

CAAAGCAGAC

GGGCCCGTTT

CCACTCCCAC

GGGGGAGGAT

CACGCGCCCT

TCTTCCCTTC

CCCCAAAAAA

GGACTCTTGT

AGCTGATTTA

AGCATGCATC

TAGTCCCGCC GCCCATTCTC CGCCCCATGG CTGACTAATT TTTTTTATTT ATGCAGAGGC TCTGCCTCTG AGCTATTCCA GAAGTAGTGA GGAGGCTTTT TTGGAGGCCT AGGCTTTTGC AAAAAGCTCC CGGGAGCTTG TATATCCATT ATCAGCACGT GTTGACAATT AATCATCGGC ATAGTATATC 5 GGCATAGTAT AATACGACAA GGTGAGGAAC TAAACCATGG CCAAGTTGAC CCGGTGCTCA CCGCGCGCGA CGTCGCCGGA GCGGTCGAGT TCTGGACCGA CCGGCTCGGG TTCTCCCGGG ACTTCGTGGA GGACGACTTC TCCGGGACGA CGTGACCCTG TTCATCAGCG CGGTCCAGGA CCAGGTGGTG CCGGACAACA CCCTGGCCTG GGTGTGGGTG CGCGGCCTGG 10 CGCCGAGTGG TCGGAGGTCG TGTCCACGAA CTTCCGGGAC

GCCTCCGGGC CGGCCATGAC CGAGATCGGC GAGCAGCCGT GGGGGCGGGA CGCGACCCGG CCGGCAACTG CGTGCACTTC GTGGCCGAGG AGCAGGACTG ACACGTGCTA CGAGATTTCG ATTCCACCGC CGCCTTCTAT GCTTCGGAAT CGTTTTCCGG GACGCCGGCT GGATGATCCT 15 CCAGCGCGGG GATCTCATGC TGGAGTTCTT CGCCCACCCC AACTTGTTTA TAATGGTTAC AAATAAAGCA ATAGCATCAC AAATTTCACA AATAAAGCAT TTTTTTCACT GCATTCTAGT TGTGGTTTGT CCAAACTCAT TATCATGTCT GTATACCGTC GACCTCTAGC TAGAGCTTGG CGTAATCATG GTCATAGCTG TTTCCTGTGT GAAATTGTTA TCCGCTCACA 20 ACATACGAGC CGGAAGCATA AAGTGTAAAG CCTGGGGTGC

CTAATGAGTG AGCTAACTCA CATTAATTGC GTTGCGCTCA CTGCCCGCTT AAACCTGTCG TGCCAGCTGC ATTAATGAAT CGGCCAACGC GCGGGGAGAG GCGGTTTGCG TATTGGGCGC TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC CGCTCGGTCG TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA TCAGCTCACT 25 CAAAGGCGGT AATACGGTTA TCCACAGAAT CAGGGGATAA CGCAGGAAAG CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC AGGAACCGTA AAAAGGCCGC GTTGCTGGCG TTTTTCCATA GGCTCCGCCC CCCTGACGAG CATCACAAAA AAGTCAGAGG TGGCGAAACC CGACAGGACT ATAAAGATAC CAGGCGTTTC CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG TTCCGACCCT 30 GGATACCTGT CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA AGCGTGGCGC

TTTCTCATAG CTCACGCTGT AGGTATCTCA GTTCGGTGTA GGTCGTTCGC GCTGTGTGCA CGAACCCCCC GTTCAGCCCG ACCGCTGCGC

CGAGGCCGCC

TTCGGATCTG

CAGTGCCGTT

GCCGGTGTGG

ACGAGCTGTA

GTTCGCCCTG

GAAAGGTTGG

TTGCAGCTTA

CAATGTATCT

ATTCCACACA

TCCAGTCGGG

TGACTCGCTG

AACATGTGAG

ATCGACGCTC

GCCGCTTACC

TCCAAGCTGG CTTATCCGGT AACTATCGTC TTGAGTCCAA CCCGGTAAGA CACGACTTAT AGCAGCCACT GGTAACAGGA TTAGCAGAGC GAGGTATGTA GGCGGTGCTA CAGAGTTCTT GAAGTGGTGG CCTAACTACG GCTACACTAG TTTGGTATCT GCGCTCTGCT GAAGCCAGTT ACCTTCGGAA 5 AAAGAGTTGG TAGCTCTTGA TCCGGCAAAC AAACCACCGC TGGTAGCGGT TTTGCAAGCA GCAGATTACG CGCAGAAAAA AAGGATCTCA AGAAGATCCT TTGATCTTTT CTACGGGGTC TGACGCTCAG TGGAACGAAA AGGGATTTTG GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC TAGATCCTTT TAAATTAAAA ATGAAGTTTT AAATCAATCT AAAGTATATA 10 TGGTCTGACA GTTACCAATG CTTAATCAGT GAGGCACCTA

TCTCAGCGAT CTGTCTATTT CGTTCATCCA TAGTTGCCTG ACTCCCCGTC CTACGATACG GGAGGGCTTA CCATCTGGCC CCAGTGCTGC AATGATACCG CGAGACCCAC GCTCACCGGC TCCAGATTTA TCAGCAATAA CGGAAGGGCC GAGCGCAGAA GTGGTCCTGC AACTTTATCC 15 GCCTCCATCC AGTCTATTAA TTGTTGCCGG GAAGCTAGAG TAAGTAGTTC AGTTTGCGCA ACGTTGTTGC CATTGCTACA GGCATCGTGG TGTCACGCTC GTCGTTTGGT ATGGCTTCAT TCAGCTCCGG TTCCCAACGA TTACATGATC CCCCATGTTG TGCAAAAAAG CGGTTAGCTC CTTCGGTCCT CCGATCGTTG TCAGAAGTAA GTTGGCCGCA GTGTTATCAC 20 GGCAGCACTG CATAATTCTC TTACTGTCAT GCCATCCGTA

AGATGCTTTT CTGTGACTGG TGAGTACTCA ACCAAGTCAT TCTGAGAATA CGACCGAGTT GCTCTTGCCC GGCGTCAATA CGGGATAATA CCGCGCCACA TAGCAGAACT TTAAAAGTGC TCATCATTGG AAAACGTTCT AACTCTCAAG GATCTTACCG CTGTTGAGAT CCAGTTCGAT 25 GTAACCCACT CGTGCACCCA ACTGATCTTC AGCATCTTTT ACTTTCACCA GTGAGCAAAA ACAGGAAGGC AAAATGCCGC AAAAAAGGGA ATAAGGGCGA CACGGAAATG TTGAATACTC ATACTCTTCC TTTTTCAATA ATTTATCAGG GTTATTGTCT CATGAGCGGA TACATATTTG AATGTATTTA GAAAAATAAA CAAATAGGGG TTCCGCGCAC ATTTCCCCGA 30 CTGACGTCGA CGGATCGGGA GATCTCCCGA TCCCCTATGG

TGCACTCTCA GTACAATCTG CTCTGATGCC GCATAGTTAA GCCAGTATCT TGTGTGTTGG AGGTCGCTGA GTAGTGCGCG AGCAAAATTT

CGCCACTGGC

AAGAACAGTA

GGTTTTTTTG

ACTCACGTTA

TGAGTAAACT

GTGTAGATAA

ACCAGCCAGC

GCCAGTTAAT

TCAAGGCGAG

TCATGGTTAT

GTGTATGCGG

TCGGGGCGAA

GCGTTTCTGG

TTATTGAAGC

AAAGTGCCAC

GCTCCCTGCT AAGCTACAAC AAGGCAAGGC TTGACCGAC SEQ ID NO: 43

Vetor de expressão de IgG4 pMORPH2®_h_Igy4 TAATACGACT CAC T ATAGGG AGACCCAAGC TGGCTAGCGC CACCAT GAAA 5 TCTTCCTCCT GCTGGTGGCA GCTCCCAGAT GGGTCCTGTC

CCAGGTGCAA TTGCAACAGT CTGGTCCGGG CCTGGTGAAA CCGAGCCAAA GACCTGTGCG ATTTCCGGAG ATAGCGTGAG CGATAATTCT GCTGCTTGGT CTTGGATTCG CCAGTCTCCT GGGCGTGGCC TCGAGTGGCT TATCTTCGTA GCAAGTGGGA TAACGATTAT GCGGTGAGCG 10 TGAAAAGCCG GATTACCATC AACCCGGATA CTTCGAAAAA CCAGTTTAGC ACAGCGTGAC CCCGGAAGAT ACGGCCGTGT ATTATTGCGC GCGTACTGGT CGTGCTGATG AGTTTGATGT TTGGGGCCAA GGCACCCTGG CTCAGCTTCC ACCAAGGGAC CATCCGTCTT CCCCCTGGCG CCCTGCTCCA GGAGCACCTC CGAGAGCACA GCCGCCCTGG GCTGCCTGGT 15 TTCCCCGAAC CGGTGACGGT GTCGTGGAAC TCAGGCGCCC

TGACCAGCGG CGTGCACACC TTCCCGGCTG TCCTACAGTC CTCAGGACTC GCAGCGTGGT GACCGTGCCC TCCAGCAGCT TGGGCACGAA GACCTACACC TGCAACGTAG ATCACAAGCC CAGCAACACC AAGGTGGACA GTCCAAATAT GGTCCCCCAT GCCCATCATG CCCAGCACCT 20 GAGTTCCTGG GGGGACCATC AGTCTTCCTG TTCCCCCCAA AACCCAAGGA ATCTCCCGGA CCCCTGAGGT CACGTGCGTG GTGGTGGACG TGAGCCAGGA AGACCCCGAG GTCCAGTTCA ACTGGTACGT GGATGGCGTG ATGCCAAGAC AAAGCCGCGG GAGGAGCAGT TCAACAGCAC GTACCGTGTG GTCAGCGTCC TCACCGTCCT GCACCAGGAC TGGCTGAACG 25 CAAGTGCAAG GTCTCCAACA AAGGCCTCCC GTCCTCCATC

GAGAAAACCA TCTCCAAAGC CAAAGGGCAG CCCCGAGAGC CACAGGTGTA CCATCCCAGG AGGAGATGAC CAAGAACCAG GTCAGCCTGA CCTGCCTGGT CAAAGGCTTC TACCCCAGCG ACATCGCCGT GGAGTGGGAG AGCCGGAGAA CAACTACAAG ACCACGCCTC CCGTGCTGGA 30 CTCCGACGGC TCCTTCTTCC TCTACAGCAG GCTAACCGTG GACAAGAGCA GGGGAATGTC TTCTCATGCT CCGTGATGCA TGAGGCTCTG CACAACCACT ACACACAGAA GAGCCTCTCC CTGTCTCTGG GTAAATGAGG

CACCTGTGGT

CCCTGAGCCT

GGGCCTTATC

CTGCAACTGA

TGACGGTTAG

CAAGGACTAC

TACTCCCTCA

AGAGAGTTGA

CACTCTCATG

GAGGTGCATA

GCAAGGAGTA

CACCCTGCCC

AGCAATGGGC

GGTGGCAGGA

GCCCGTTTAA ACGGGTGGCA TCCCTGTGAC CCCTCCCCAG TGCCTCTCCT GGCCCTGGAA GTTGCCACTC CAGTGCCCAC CAGCCTTGTC CTAATAAAAT CATTTTGTCT GACTAGGTGT CCTTCTATAA TATTATGGGG TGGAGGGGGG TGGTATGGAG CAAGGGGCAA GTTGGGAAGA CAACCTGTAG GTCTATTGGG AACCAAGCTG GAGTGCAGTG GCACAATCTT

GGCTCACTGC AATCTCCGCC TCCTGGGTTC AAGCGATTCT CCTGCCTCAG TGTTGGGATT CCAGGCATGC ATGACCAGGC TCACCTAATT TTTGTTTTTT TGGTAGAGAC GGGGTTTCAC CATATTGGCC AGGCTGGTCT ATCTCAGGTG ATCTACCCAC CTTGGCCTCC CAAATTGCTG 10 GGATTACAGG CGTGAACCAC TGCTCCCTTC CCTGTCCTTC TGATTTTAAA CAGCAGGAGG ACGTCCAGAC ACAGCATAGG CTACCTGGCC ATGCCCAACC GGTGGGACAT TTGAGTTGCT TGCTTGGCAC TGTCCTCTCA CCACTCAGTA GATGCCTGTT GAATTGGGTA CGCGGCATCG ATTCCACGCG CCCTGTAGCG GCGCATTAAG CGCGGCGGGT GTGGTGGTTA 15 GACCGCTACA CTTGCCAGCG CCCTAGCGCC CGCTCCTTTC

GCTTTCTTCC CTTCCTTTCT CGCCACGTTC GCCGGCTTTC CCCGTCAAGC GGGCTCCCTT TAGGGTTCCG ATTTAGTGCT TTACGGCACC TCGACCCCAA AAAACTTGAT TAGGGTGATG GTTCACGTAG TGGGCCATCG CGGTTTTTCG CCCTTTGACG TTGGAGTCCA CGTTCTTTAA 20 TAGTGGACTC TTGTTCCAAA CTGGAACAAC ACTCAACCCT ATCTCGGTCT TTTATAAGGG ATTTTGCCGA TTTCGGCCTA TTGGTTAAAA AATGAGCTGA TTTAACAAAA ATTTAACGCG AATTAATTCT GTGGAATGTG GGTGTGGAAA GTCCCCAGGC TCCCCAGCAG GCAGAAGTAT GCAAAGCATG CATCTCAATT AGTCAGCAAC CAGGTGTGGA AAGTCCCCAG 25 AGGCAGAAGT ATGCAAAGCA TGCATCTCAA TTAGTCAGCA

ACCATAGTCC CGCCCCTAAC TCCGCCCATC CCGCCCCTAA CTCCGCCCAG TCTCCGCCCC ATGGCTGACT AATTTTTTTT ATTTATGCAG AGGCCGAGGC CGCCTCTGCC TCTGAGCTAT TCCAGAAGTA GTGAGGAGGC GCCTAGGCTT TTGCAAAAAG CTCCCGGGAG CTTGTATATC 30 CATTTTCGGA TCTGATCAAG AGACAGGATG AGGATCGTTT CGCATGATTG ATTGCACGCA GGTTCTCCGG CCGCTTGGGT GGAGAGGCTA TTCGGCTATG ACTGGGCACA ACAGACAATC GGCTGCTCTG ATGCCGCCGT

TAAGTTGCAT

GGCCTGCGGG

CCTCCCGAGT

CCAACTCCTA

ATAACTATAC

TGCGTTGGGT

CGCGCAGCGT

TCTAAATCGG

CCCTGATAGA

ATTCTTTTGA

TGTCAGTTAG

GCTCCCCAGC

TTCCGCCCAT

TTTTTTGGAG

AACAAGATGG

GTTCCGGCTG TCAGCGCAGG GGCGCCCGGT TCTTTTTGTC AAGACCGACC TGTCCGGTGC CCTGAATGAA CTGCAGGACG AGGCAGCGCG GCTATCGTGG CGGGCGTTCC TTGCGCAGCT GTGCTCGACG TTGTCACTGA AGCGGGAAGG GACTGGCTGC TATTGGGCGA AGTGCCGGGG CAGGATCTCC CCTTGCTCCT GCCGAGAAAG TATCCATCAT GGCTGATGCA

ATGCGGCGGC TGCATACGCT TGATCCGGCT ACCTGCCCAT TCGACCACCA CGCATCGAGC GAGCACGTAC TCGGATGGAA GCCGGTCTTG TCGATCAGGA TGATCTGGAC GAAGAGCATC AGGGGCTCGC GCCAGCCGAA GGCTCAAGGC GCGCATGCCC GACGGCGAGG ATCTCGTCGT 10 GACCCATGGC GATGCCTGCT TGCCGAATAT CATGGTGGAA AATGGCCGCT CATCGACTGT GGCCGGCTGG GTGTGGCGGA CCGCTATCAG GACATAGCGT TGGCTACCCG TGATATTGCT GAAGAGCTTG GCGGCGAATG TTCCTCGTGC TTTACGGTAT CGCCGCTCCC GATTCGCAGC GCATCGCCTT CTATCGCCTT CTTGACGAGT TCTTCTGAGC GGGACTCTGG 15 GACCGACCAA GCGACGCCCA ACCTGCCATC ACGAGATTTC

GATTCCACCG CCGCCTTCTA TGAAAGGTTG GGCTTCGGAA TCGTTTTCCG TGGATGATCC TCCAGCGCGG GGATCTCATG CTGGAGTTCT TCGCCCACCC CAACTTGTTT ATTGCAGCTT ATAATGGTTA CAAATAAAGC CAAATTTCAC AAATAAAGCA TTTTTTTCAC TGCATTCTAG 20 TTGTGGTTTG TCCAAACTCA TCAATGTATC TTATCATGTC TGTATACCGT CTAGAGCTTG GCGTAATCAT GGTCATAGCT GTTTCCTGTG TGAAATTGTT ATCCGCTCAC AATTCCACAC AACATACGAG CCGGAAGCAT GCCTGGGGTG CCTAATGAGT GAGCTAACTC ACATTAATTG CGTTGCGCTC ACTGCCCGCT TTCCAGTCGG GAAACCTGTC GTGCCAGCTG 25 TCGGCCAACG CGCGGGGAGA GGCGGTTTGC GTATTGGGCG

CTCTTCCGCT TCCTCGCTCA CTGACTCGCT GCGCTCGGTC GTTCGGCTGC ATCAGCTCAC TCAAAGGCGG TAATACGGTT ATCCACAGAA TCAGGGGATA ACGCAGGAAA GAACATGTGA GCAAAAGGCC AGCAAAAGGC AAAAAGGCCG CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT AGGCTCCGCC 30 CCCCTGACGA GCATCACAAA AATCGACGCT CAAGT CAGAG GTGGCGAAAC TATAAAGATA CCAGGCGTTT CCCCCTGGAA GCTCCCTCGT GCGCTCTCCT GTTCCGACCC TGCCGCTTAC CGGATACCTG TCCGCCTTTC

CTGGCCACGA

TGTCATCTCA

AGCGAAACAT

CTGTTCGCCA

TTTCTGGATT

GGCTGACCGC

GGTTCGAAAT

GGACGCCGGC

AATAGCATCA

CGACCTCTAG

AAAGTGTAAA

CATTAATGAA

GGCGAGCGGT

CAGGAACCGT

CCGACAGGAC

TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG CTTTCTCATA GCTCACGCTG TAGGTATCTC AGTTCGGTGT AGGTCGTTCG CTCCAAGCTG GGCTGTGTGC ACGAACCCCC GACCGCTGCG CCTTATCCGG TAACTATCGT CTTGAGTCCA ACCCGGTAAG ACACGACTTA TCGCCACTGG CAGCAGCCAC TGGTAACAGG CGAGGTATGT AGGCGGTGCT ACAGAGTTCT TGAAGTGGTG

GCCTAACTAC GGCTACACTA GAAGAACAGT ATTTGGTATC TGCGCTCTGC TACCTTCGGA AAAAGAGTTG GTAGCTCTTG ATCCGGCAAA CAAACCACCG CTGGTAGCGG TGGTTTTTTT GTTTGCAAGC AGCAGATTAC AAAGGATCTC AAGAAGATCC TTTGATCTTT TCTACGGGGT 10 CTGACGCTCA GTGGAACGAA AACTCACGTT AAGGGATTTT GGTCATGAGA GGATCTTCAC CTAGATCCTT TTAAATTAAA AATGAAGTTT TAAATCAATC TAAAGTATAT ATGAGTAAAC TTGGTCTGAC AGTTACCAAT TGAGGCACCT ATCTCAGCGA TCTGTCTATT TCGTTCATCC ATAGTTGCCT GACTCCCCGT CGTGTAGATA ACTACGATAC GGGAGGGCTT 15 CCCAGTGCTG CAATGATACC GCGAGACCCA CGCTCACCGG

CTCCAGATTT AT CAGCAATA AACCAGCCAG CCGGAAGGGC CGAGCGCAGA CAACTTTATC CGCCTCCATC CAGTCTATTA ATTGTTGCCG GGAAGCTAGA GTAAGTAGTT CGCCAGTTAA TAGTTTGCGC AACGTTGTTG AGGCATCGTG GTGTCACGCT CGTCGTTTGG TATGGCTTCA 20 TTCAGCTCCG GTTCCCAACG ATCAAGGCGA GTTACATGAT CCCCCATGTT GCGGTTAGCT CCTTCGGTCC TCCGATCGTT GTCAGAAGTA AGTTGGCCGC AGTGTTATCA CTCATGGTTA TGGCAGCACT GCATAATTCT TGCCATCCGT AAGATGCTTT TCTGTGACTG GTGAGTACTC AACCAAGTCA TTCTGAGAAT AGTGTATGCG GCGACCGAGT TGCTCTTGCC 25 ACGGGATAAT ACCGCGCCAC ATAGCAGAAC TTTAAAAGTG

CTCATCATTG GAAAACGTTC TTCGGGGCGA AAACTCTCAA GGATCTTACC TCCAGTTCGA TGTAACCCAC TCGTGCACCC AACTGATCTT CAGCATCTTT TACTTTCACC AGCGTTTCTG GGTGAGCAAA AACAGGAAGG CAAAAAAGGG AATAAGGGCG ACACGGAAAT GTTGAATACT 30 CATACTCTTC CTTTTTCAAT ATTATTGAAG CATTTATCAG GGTTATTGTC ATACATATTT GAATGTATTT AGAAAAATAA ACAAATAGGG GTTCCGCGCA CATTTCCCCG AAAAGTGCCA CCTGACGTCG ACGGATCGGG

CGTTCAGCCC

ATTAGCAGAG

TGAAGCCAGT

GCGCAGAAAA

TTATCAAAAA

GCTTAATCAG

ACCATCTGGC

AGTGGTCCTG

CCATTGCTAC

GTGCAAAAAA

CTTACTGTCA

CGGCGTCAAT

GCTGTTGAGA

CAAAATGCCG

TCATGAGCGG

AGATCTCCCG ATCCCCTATG GTGCACTCTC AGTACAATCT GCTCTGATGC CGCATAGTTA AGCCAGTATC TGCTCCCTGC TTGTGTGTTG GAGGTCGCTG AGTAGTGCGC GAGCAAAATT TAAGCTACAA CAAGGCAAGG CTTGACCGAC ATTTGCATGA AGAATCTGCT TAGGGTTAGG CGTTTTGCGC TGCTTCGCGA TGTACGGGCC AGATATACGC GTTGACATTG ATTATTGACT AGTTATTAAT AGTAATCAAT TACGGGGTCA TTAGTTCATA GCCCATATAT GGAGTTCCGC GTTACATAAC TTACGGTAAA TGGCCCGCCT GGCTGACCGC CCAACGACCC CCGCCCATTG ACGTCAATAA TGACGTATGT TCCCATAGTA ACGCCAATAG GGACTTTCCA TTGACGTCAA TGGGTGGAGT ATTTACGGTA AACTGCCCAC TTGGCAGTAC ATCAAGTGTA TCATATGCCA AGTACGCCCC CTATTGACGT CAATGACGGT AAATGGCCCG CCTGGCATTA TGCCCAGTAC ATGACCTTAT GGGACTTTCC TACTTGGCAG TACATCTACG TATTAGTCAT CGCTATTACC ATGGTGATGC GGTTTTGGCA GTACATCAAT GGGCGTGGAT AGCGGTTTGA CTCACGGGGA TTTCCAAGTC TCCACCCCAT TGACGTCAAT GGGAGTTTGT TTTGGCACCA AAATCAACGG GACTTTCCAA AATGTCGTAA CAACTCCGCC CCATTGACGC AAATGGGCGG TAGGCGTGTA CGGTGGGAGG TCTATATAAG CAGAGCTCTC TGGCTAACTA GAGAACCCAC TGCTTACTGG CTTATCGAAA Φ I 44 SEQ ID NO: Vetor de expressão de cadeia lambda de IgG pMORPH®2_h_Ig_lambda2 TAATACGACT CACTATAGGG AGACCCAAGC TGGCTAGCGC CACCATGGCC TGGGCTCTGC TGCTCCTCAC CCTCCTCACT CAGGGCACAG GATCCTGGGC TGATATCGTG CTGACCCAGC CGCCTTCAGT GAGTGGCGCA CCAGGTCAGC GTGTGACCAT CTCGTGTAGC GGCAGCAGCA GCAACATTGG TAATAATTAT GTGTCTTGGT ACCAGCAGTT GCCCGGGACG GCGCCGAAAC TTCTGATTTC TCGTAATTCT AAGCGTCCCT CAGGCGTGCC GGATCGTTTT AGCGGATCCA AAAGCGGCAC CAGCGCGAGC CTTGCGATTA CGGGCCTGCA AAGCGAAGAC GAAGCGGATT ATTATTGCTC TACTTATGAT ACTTTTTCTA TTGTGTTTGG CGGCGGCACG AAGTTAACCG TCCTAGGTCA GCCCAAGGCT GCCCCCTCGG TCACTCTGTT CCCGCCCTCC TCTGAGGAGC TTCAAGCCAA CAAGGCCACA CTGGTGTGTC TCATAAGTGA CTTCTACCCG GGAGCCGTGA CAGTGGCCTG GAAGGCAGAT AGCAGCCCCG TCAAGGCGGG AGTGGAGACC ACCACACCCT CCAAACAAAG CAACAACAAG TACGCGGCCA GCAGCTATCT GAGCCTGACG GGAAGTCCCA CAGAAGCTAC AGCTGCCAGG TCACGCATGA AGGGAGCACC GTGGAGAAGA CAGTGGCCCC TACAGAATGT TCATAGGGGC GGGTGGCATC CCTGTGACCC CTCCCCAGTG CCTCTCCTGG 5 CCCTGGAAGT TGCCACTCCA GTGCCCACCA GCCTTGTCCT AATAAAATTA TTTTGTCTGA CTAGGTGTCC TTCTATAATA TTATGGGGTG GAGGGGGGTG GTATGGAGCA AGGGGCAAGT TGGGAAGACA ACCTGTAGGG CTATTGGGAA CCAAGCTGGA GTGCAGTGGC ACAATCTTGG CTCACTGCAA TCTCCGCCTC CTGGGTTCAA GCGATTCTCC TGCCTCAGCC 10 TTGGGATTCC AGGCATGCAT GACCAGGCTC ACCTAATTTT

TGTTTTTTTG GTAGAGACGG GGTTTCACCA TATTGGCCAG GCTGGTCTCC CTCAGGTGAT CTACCCACCT TGGCCTCCCA AATTGCTGGG ATTACAGGCG TGAACCACTG CTCCCTTCCC TGTCCTTCTG ATTTTAAAAT GCAGGAGGAC GTCCAGACAC AGCATAGGCT ACCTGGCCAT 15 GCCCAACCGG TGGGACATTT GAGTTGCTTG CTTGGCACTG TCCTCTCATG ACTCAGTAGA TGCCTGTTGA ATTGGGTACG CGGCATCGAT TCCACGCGCC CTGTAGCGGC GCATTAAGCG CGGCGGGTGT GGTGGTTACG CCGCTACACT TGCCAGCGCC CTAGCGCCCG CTCCTTTCGC TTTCTTCCCT TCCTTTCTCG CCACGTTCGC CGGCTTTCCC CGTCAAGCTC 20 GCTCCCTTTA GGGTTCCGAT TTAGTGCTTT ACGGCACCTC

GACCCCAAAA AACTTGATTA GGGTGATGGT TCACGTAGTG GGCCATCGCC GTTTTTCGCC CTTTGACGTT GGAGTCCACG TTCTTTAATA GTGGACTCTT GTTCCAAACT GGAACAACAC TCAACCCTAT CTCGGTCTAT TATAAGGGAT TTTGGGGATT TCGGCCTATT GGTTAAAAAA 25 TGAGCTGATT TAACAAAAAT TTAACGCGAA TTAATTCTGT GGAATGTGTG TGTGGAAAGT CCCCAGGCTC CCCAGGCAGG CAGAAGTATG CAAAGCATGC ATCTCAATTA GTCAGCAACC AGGTGTGGAA AGTCCCCAGG GGCAGAAGTA TGCAAAGCAT GCATCTCAAT TAGTCAGCAA CCATAGTCCC GCCCCTAACT CCGCCCATCC CGCCCCTAAC TCCGCCCAGT 30 CTCCGCCCCA TGGCTGACTA ATTTTTTTTA TTTATGCAGA

GGCCGAGGCC GCCTCTGCCT CTGAGCTATT CCAGAAGTAG TGAGGAGGCT CCTAGGCTTT TGCAAAAAGC TCCCGGGAGC TTGTATATCC

CCTGAGCAGT

CCGTTTAAAC

AGTTGCATCA

CCTGCGGGGT

TCCCGAGTTG

AACTCCTAAT

AACTATACCA

CGTTGGGTCC

CGCAGCGTGA

TAAATCGGGG

CTGATAGACG

TCTTTTGATT

TCAGTTAGGG

CTCCCCAGCA

TCCGCCCATT

TTTTTGGAGG ATTTTCGGAT CTGATCAGCA CGTGTTGACA ATTAATCATC GGCATAGTAT TATAATACGA CAAGGTGAGG AACTAAACCA TGGCCAAGTT GACCAGTGCC GTTCCGGTGC TCACCGCGCG CGACGTCGCC GGAGCGGTCG CGACCGGCTC GGGTTCTCCC GGGACTTCGT GGAGGACGAC 5 TTCGCCGGTG TGGTCCGGGA CGACGTGACC CTGTTCATCA GCGCGGTCCA GTGCCGGACA ACACCCTGGC CTGGGTGTGG GTGCGCGGCC TGGACGAGCT GTACGCCGAG TGGTCGGAGG TCGTGTCCAC GAACTTCCGG GGCCGGCCAT GACCGAGATC GGCGAGCAGC CGTGGGGGCG GGAGTTCGCC CTGCGCGACC CGGCCGGCAA CTGCGTGCAC TTCGTGGCCG 10 CTGACACGTG CTACGAGATT TCGATTCCAC CGCCGCCTTC

TATGAAAGGT TGGGCTTCGG AATCGTTTTC CGGGACGCCG GCTGGATGAT GGGGATCTCA TGCTGGAGTT CTTCGCCCAC CCCAACTTGT TTATTGCAGC TTATAATGGT TACAAATAAA GCAATAGCAT CACAAATTTC CATTTTTTTC ACTGCATTCT AGTTGTGGTT TGTCCAAACT 15 CATCAATGTA TCTTATCATG TCTGTATACC GTCGACCTCT AGCTAGAGCT ATGGTCATAG CTGTTTCCTG TGTGAAATTG TTATCCGCTC ACAATTCCAC ACAACATACG AGCCGGAAGC ATAAAGTGTA AAGCCTGGGG GTGAGCTAAC TCACATTAAT TGCGTTGCGC TCACTGCCCG CTTTCCAGTC GGGAAACCTG TCGTGCCAGC TGCATTAATG AATCGGCCAA 20 GAGGCGGTTT GCGTATTGGG CGCTCTTCCG CTTCCTCGCT

CACTGACTCG CTGCGCTCGG TCGTTCGGCT GCGGCGAGCG GTATCAGCTC GGTAATACGG TTATCCACAG AATCAGGGGA TAACGCAGGA AAGAACATGT GAGCAAAAGG CCAGCAAAAG GCCAGGAACC GTAAAAAGGC GCGTTTTTCC ATAGGCTCCG CCCCCCTGAC GAGCATCACA 25 AAAATCGACG CTCAAGTCAG AGGTGGCGAA ACCCGACAGG ACTATAAAGA TTCCCCCTGG AAGCTCCCTC GTGCGCTCTC CTGTTCCGAC CCTGCCGCTT ACCGGATACC TGTCCGCCTT TCTCCCTTCG GGAAGCGTGG ATGCTCACGC TGTAGGTATC TCAGTTCGGT GTAGGTCGTT CGCTCCAAGC TGGGCTGTGT GCACGAACCC CCCGTTCAGC CCGACCGCTG 30 GGTAACTATC GTCTTGAGTC CAACCCGGTA AGACACGACT

TATCGCCACT GGCAGCAGCC ACTGGTAACA GGATTAGCAG AGCGAGGTAT CTACAGAGTT CTTGAAGTGG TGGCCTAACT ACGGCTACAC

ATCGGCATAG

AGTTCTGGAC

GGACCAGGTG

GACGCCTCCG

AGGAGCAGGA

CCTCCAGCGC

ACAAATAAAG

TGGCGTAATC

TGCCTAATGA

CGCGCGGGGA

ACTCAAAGGC

CGCGTTGCTG

TACCAGGCGT

CGCTTTCTCA

CGCCTTATCC

GTAGGCGGTG TAGAAGGACA GTATTTGGTA TCTGCGCTCT GCTGAAGCCA GTTACCTTCG TGGTAGCTCT TGATCCGGCA AACAAACCAC CGCTGGTAGC GGTGGTTTTT TTGTTTGCAA GCAGCAGATT ACGCGCAGAA AAAAAGGATC CCTTTGATCT TTTCTACGGG GTCTGACGCT CAGTGGAACG 5 AAAACTCACG TTAAGGGATT TTGGTCATGA GATTATCAAA AAGGATCTTC TTTTAAATTA AAAATGAAGT TTTAAATCAA TCTAAAGTAT ATATGAGTAA ACTTGGTCTG ACAGTTACCA ATGCTTAATC AGTGAGGCAC GATCTGTCTA TTTCGTTCAT CCATAGTTGC CTGACTCCCC GTCGTGTAGA TAACTACGAT ACGGGAGGGC TTACCATCTG GCCCCAGTGC 10 CCGCGAGACC CACGCTCACC GGCTCCAGAT TTATCAGCAA

TAAACCAGCC AGCCGGAAGG GCCGAGCGCA GAAGTGGTCC TGCAACTTTA TCCAGTCTAT TAATTGTTGC CGGGAAGCTA GAGTAAGTAG TTCGCCAGTT AATAGTTTGC GCAACGTTGT TGCCATTGCT ACAGGCATCG CTCGTCGTTT GGTATGGCTT CATTCAGCTC CGGTTCCCAA 15 CGATCAAGGC GAGTTACATG ATCCCCCATG TTGTGCAAAA AAGCGGTTAG CCTCCGATCG TTGTCAGAAG TAAGTTGGCC GCAGTGTTAT CACTCATGGT TATGGCAGCA CTGCATAATT CTCTTACTGT CATGCCATCC TTTCTGTGAC TGGTGAGTAC TCAACCAAGT CATTCTGAGA ATAGTGTATG CGGCGACCGA GTTGCTCTTG CCCGGCGTCA ATACGGGATA 20 ACATAGCAGA ACTTTAAAAG TGCTCATCAT TGGAAAACGT

TCTTCGGGGC GAAAACTCTC AAGGATCTTA CCGCTGTTGA GATCCAGTTC ACTCGTGCAC CCAACTGATC TTCAGCATCT TTTACTTTCA CCAGCGTTTC TGGGTGAGCA AAAACAGGAA GGCAAAATGC CGCAAAAAAG CGACACGGAA ATGTTGAATA CTCATACTCT TCCTTTTTCA 25 ATATTATTGA AGCATTTATC AGGGTTATTG TCTCATGAGC GGATACATAT TTAGAAAAAT AAACAAATAG GGGTTCCGCG CACATTTCCC CGAAAAGTGC CACCTGACGT CGACGGATCG GGAGATCTCC CGATCCCCTA TCAGTACAAT CTGCTCTGAT GCCGCATAGT TAAGCCAGTA TCTGCTCCCT GCTTGTGTGT TGGAGGTCGC TGAGTAGTGC GCGAGCAAAA 30 AACAAGGCAA GGCTTGACCG ACAATTGCAT GAAGAATCTG

CTTAGGGTTA GGCGTTTTGC GCTGCTTCGC GATGTACGGG CCAGATATAC TGATTATTGA CTAGTTATTA ATAGTAATCA ATTACGGGGT

GAAAAAGAGT

TCAAGAAGAT

ACCTAGATCC

CTATCTCAGC

TGCAATGATA

TCCGCCTCCA

TGGTGTCACG

CTCCTTCGGT

GTAAGATGCT

ATACCGCGCC

GATGTAACCC

GGAATAAGGG

TTGAATGTAT

TGGTCGACTC

TTTAAGCTAC

GCGTTGACAT CATTAGTTCA TAGCCCATAT ATGGAGTTCC GCGTTACATA ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT

AATGACGTAT GTTCCCATAG TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA CTATTTACGG TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT ACATGACCTT ATGGGACTTT CCTACTTGGC

AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA CCATGGTGAT GCGGTTTTGG CAGTACATCA ATGGGCGTGG ATAGCGGTTT GACTCACGGG GATTTCCAAG

TCTCCACCCC ATTGACGTCA ATGGGAGTTT GTTTTGGCAC CAAAATCAAC GGGACTTTCC AAAATGTCGT AACAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC

GGTAGGCGTG TACGGTGGGA GGTCTATATA AGCAGAGCTC TCTGGCTAAC TAGAGAACCC ACTGCTTACT GGCTTATCGA AAT SEQ ID NO: 45

Vetor de expressão de cadeia kapa de IgG pMORPH®2_h_Ig_kappa TAATACGACT CACTATAGGG AGACCCAAGC TGGCTAGCGC CACCATGGTG TTGCAGACCC AGGTCTTCAT TTCTCTGTTG CTCTGGATCT CTGGTGCCTA

CGGGGATATC CAGATGACCC AGAGCCCGTC TAGCCTGAGC GCGAGCGTGG GTGATCGTGT GACCATTACC TGCAGAGCGA GCCAGTCTAT TTCTAATTGG

CTGAATTGGT ACCAGCAGAA ACCAGGTAAA GCACCGAAAC TATTAATTTA TAAGGCTTCT ACTTTGCAAA GCGGGGTCCC GTCCCGTTTT AGCGGCTCTG

GATCCGGCAC TGATTTTACC CTGACCATTA GCAGCCTGCA ACCTGAAGAC TTTGCGACTT ATTATTGCCA GCAGTATGGT AATATTCCTA TTACCTTTGG

CCAGGGTACG AAAGTTGAAA TTAAACGTAC GGTGGCTGCA CCATCTGTCT TCATCTTCCC GCCATCTGAT GAGCAGTTGA AATCTGGAAC TGCCTCTGTT GTGTGCCTGC TGAATAACTT CTATCCCAGA GAGGCCAAAG TACAGTGGAA GGTGGATAAC GCCCTCCAAT CGGGTAACTC CCAGGAGAGT GTCACAGAGC

AGGACAGCAA GGACAGCACC TACAGCCTCA GCAGCACCCT GACGCTGAGC AAAGCAGACT ACGAGAAACA CAAAGTCTAC GCCTGCGAAG TCACCCATCA

GGGCCTGAGC TCGCCCGTCA CAAAGAGCTT CAACAGGGGA GAGTGTTAGG GGCCCGTTTA AACGGGTGGC ATCCCTGTGA CCCCTCCCCA GTGCCTCTCC

TGGCCCTGGA AGTTGCCACT CCAGTGCCCA CCAGCCTTGT CCTAATAAAA TTAAGTTGCA TCATTTTGTC TGACTAGGTG TCCTTCTATA ATATTATGGG GTGGAGGGGG GTGGTATGGA GCAAGGGGCA AGTTGGGAAG ACAACCTGTA GGTCTATTGG GAACCAAGCT GGAGTGCAGT GGCACAATCT TGGCTCACTG CAATCTCCGC CTCCTGGGTT CAAGCGATTC TCCTGCCTCA TTGTTGGGAT TCCAGGCATG CATGACCAGG CTCACCTAAT 5 TTTTGTTTTT TTGGTAGAGA CGGGGTTTCA CCATATTGGC CAGGCTGGTC AATCTCAGGT GATCTACCCA CCTTGGCCTC CCAAATTGCT GGGATTACAG GCGTGAACCA CTGCTCCCTT CCCTGTCCTT CTGATTTTAA CCAGCAGGAG GACGTCCAGA CACAGCATAG GCTACCTGGC CATGCCCAAC CGGTGGGACA TTTGAGTTGC TTGCTTGGCA CTGTCCTCTC 10 TCCACTCAGT AGATGCCTGT TGAATTGGGT ACGCGGCATC

GATTCCACGC GCCCTGTAGC GGCGCATTAA GCGCGGCGGG TGTGGTGGTT TGACCGCTAC ACTTGCCAGC GCCCTAGCGC CCGCTCCTTT CGCTTTCTTC CCTTCCTTTC TCGCCACGTT CGCCGGCTTT CCCCGTCAAG GGGGCTCCCT TTAGGGTTCC GATTTAGTGC TTTACGGCAC 15 CTCGACCCCA AAAAACTTGA TTAGGGTGAT GGTTCACGTA GTGGGCCATC ACGGTTTTTC GCCCTTTGAC GTTGGAGTCC ACGTTCTTTA ATAGTGGACT CTTGTTCCAA ACTGGAACAA CACTCAACCC TATCTCGGTC ATTTATAAGG GATTTTGGGG ATTTCGGCCT ATTGGTTAAA AAATGAGCTG AT TTAACAAA AATTTAACGC GAATTAATTC TGTGGAATGT 20 GGGTGTGGAA AGTCCCCAGG CTCCCCAGGC AGGCAGAAGT

ATGCAAAGCA TGCATCTCAA TTAGTCAGCA ACCAGGTGTG GAAAGTCCCC GCAGGCAGAA GTATGCAAAG CATGCATCTC AATTAGTCAG CAACCATAGT CCCGCCCCTA ACTCCGCCCA TCCCGCCCCT AACTCCGCCC ATTCTCCGCC CCATGGCTGA CTAATTTTTT TTATTTATGC 25 AGAGGCCGAG GCCGCCTCTG CCTCTGAGCT ATTCCAGAAG TAGTGAGGAG AGGCCTAGGC TTTTGCAAAA AGCTCCCGGG AGCTTGTATA TCCATTTTCG GATCTGATCA GCACGTGTTG ACAATTAATC ATCGGCATAG TAGTATAATA CGACAAGGTG AGGAACTAAA CCATGGCCAA GTTGACCAGT GCCGTTCCGG TGCTCACCGC GCGCGACGTC GCCGGAGCGG 30 GACCGACCGG CTCGGGTTCT CCCGGGACTT CGTGGAGGAC

GACTTCGCCG GTGTGGTCCG GGACGACGTG ACCCTGTTCA TCAGCGCGGT GTGGTGCCGG ACAACACCCT GGCCTGGGTG TGGGTGCGCG

GGGCCTGCGG

GCCTCCCGAG

TCCAACTCCT

AATAACTATA

ATGCGTTGGG

ACGCGCAGCG

CTCTAAATCG

GCCCTGATAG

TATTCTTTTG

GTGTCAGTTA

AGGCTCCCCA

AGTTCCGCCC

GCTTTTTTGG

TATATCGGCA

TCGAGTTCTG

CCAGGACCAG GCCTGGACGA GCTGTACGCC GAGTGGTCGG AGGTCGTGTC CACGAACTTC

CCGGGCCGGC CATGACCGAG ATCGGCGAGC AGCCGTGGGG GCGGGAGTTC GCCCTGCGCG ACCCGGCCGG CAACTGCGTG CACTTCGTGG GGACTGACAC GTGCTACGAG ATTTCGATTC CACCGCCGCC TTCTATGAAA GGTTGGGCTT CGGAATCGTT TTCCGGGACG CCGGCTGGAT CGCGGGGATC TCATGCTGGA GTTCTTCGCC CACCCCAACT TGTTTATTGC AGCTTATAAT GGTTACAAAT AAAGCAATAG CATCACAAAT AAGCATTTTT TTCACTGCAT TCTAGTTGTG GTTTGTCCAA ACTCATCAAT GTATCTTATC ATGTCTGTAT ACCGTCGACC TCTAGCTAGA ATCATGGTCA TAGCTGTTTC CTGTGTGAAA TTGTTATCCG CTCACAATTC CACACAACAT ACGAGCCGGA AGCATAAAGT GTAAAGCCTG TGAGTGAGCT AACTCACATT AATTGCGTTG CGCTCACTGC CCGCTTTCCA GTCGGGAAAC CTGTCGTGCC AGCTGCATTA ATGAATCGGC GGAGAGGCGG TTTGCGTATT GGGCGCTCTT CCGCTTCCTC GCTCACTGAC TCGCTGCGCT CGGTCGTTCG GCTGCGGCGA GCGGTATCAG GGCGGTAATA CGGTTATCCA CAGAATCAGG GGATAACGCA GGAAAGAACA TGTGAGCAAA AGGCCAGCAA AAGGCCAGGA ACCGTAAAAA CTGGCGTTTT TCCATAGGCT CCGCCCCCCT GACGAGCATC ACAAAAATCG ACGCTCAAGT CAGAGGTGGC GAAACCCGAC AGGACTATAA CGTTTCCCCC TGGAAGCTCC CTCGTGCGCT CTCCTGTTCC GACCCTGCCG CTTACCGGAT ACCTGTCCGC CTTTCTCCCT TCGGGAAGCG TCAATGCTCA CGCTGTAGGT ATCTCAGTTC GGTGTAGGTC GTTCGCTCCA AGCTGGGCTG TGTGCACGAA CCCCCCGTTC AGCCCGACCG TCCGGTAACT ATCGTCTTGA GTCCAACCCG GTAAGACACG ACTTATCGCC ACTGGCAGCA GCCACTGGTA ACAGGATTAG CAGAGCGAGG GTGCTACAGA GTTCTTGAAG TGGTGGCCTA ACTACGGCTA CACTAGAAGG ACAGTATTTG GTATCTGCGC TCTGCTGAAG CCAGTTACCT AGTTGGTAGC TCTTGATCCG GCAAACAAAC CACCGCTGGT AGCGGTGGTT TTTTTGTTTG CAAGCAGCAG ATTACGCGCA GAAAAAAAGG GATCCTTTGA TCTTTTCTAC GGGGTCTGAC GCTCAGTGGA ACGAAAACTC ACGTTAAGGG ATTTTGGTCA TGAGATTATC AAAAAGGATC TCCTTTTAAA TTAAAAATGA AGTTTTAAAT CAATCTAAAG CGGGACGCCT

CCGAGGAGCA

GATCCTCCAG

TTCACAAATA

GCTTGGCGTA

GGGTGCCTAA

CAACGCGCGG

CTCACTCAAA

GGCCGCGTTG

AGATACCAGG

TGGCGCTTTC

CTGCGCCTTA

TATGTAGGCG

TCGGAAAAAG

ATCTCAAGAA

TTCACCTAGA TATATATGAG TAAACTTGGT CTGACAGTTA CCAATGCTTA ATCAGTGAGG AGCGATCTGT CTATTTCGTT CATCCATAGT TGCCTGACTC CCCGTCGTGT AGATAACTAC GATACGGGAG GGCTTACCAT CTGGCCCCAG ATACCGCGAG ACCCACGCTC ACCGGCTCCA GATTTATCAG CAATAAACCA GCCAGCCGGA AGGGCCGAGC GCAGAAGTGG TCCTGCAACT CCATCCAGTC TATTAATTGT TGCCGGGAAG CTAGAGTAAG TAGTTCGCCA GTTAATAGTT TGCGCAACGT TGTTGCCATT GCTACAGGCA ACGCTCGTCG TTTGGTATGG CTTCATTCAG CTCCGGTTCC CAACGATCAA GGCGAGTTAC ATGATCCCCC ATGTTGTGCA AAAAAGCGGT GGTCCTCCGA TCGTTGTCAG AAGTAAGTTG GCCGCAGTGT TATCACTCAT GGTTATGGCA GCACTGCATA ATTCTCTTAC TGTCATGCCA GCTTTTCTGT GACTGGTGAG TACTCAACCA AGTCATTCTG AGAATAGTGT ATGCGGCGAC CGAGTTGCTC TTGCCCGGCG TCAATACGGG GCCACATAGC AGAACTTTAA AAGTGCTCAT CATTGGAAAA CGTTCTTCGG GGCGAAAACT CTCAAGGATC TTACCGCTGT TGAGATCCAG CCCACTCGTG CACCCAACTG ATCTTCAGCA TCTTTTACTT TCACCAGCGT TTCTGGGTGA GCAAAAACAG GAAGGCAAAA TGCCGCAAAA GGGCGACACG GAAATGTTGA ATACTCATAC TCTTCCTTTT TCAATATTAT TGAAGCATTT ATCAGGGTTA TTGTCTCATG AGCGGATACA TATTTAGAAA AATAAACAAA TAGGGGTTCC GCGCACATTT CCCCGAAAAG TGCCACCTGA CGTCGACGGA TCGGGAGATC TCCCGATCCC CTCTCAGTAC AATCTGCTCT GATGCCGCAT AGTTAAGCCA GTATCTGCTC CCTGCTTGTG TGTTGGAGGT CGCTGAGTAG TGCGCGAGCA TACAACAAGG CAAGGCTTGA CCGACAATTG CATG AAG AAT CTGCTTAGGG TTAGGCGTTT TGCGCTGCTT CGCGATGTAC GGGCCAGATA CATTGATTAT TGACTAGTTA TTAATAGTAA TCAATTACGG GGTCATTAGT TCATAGCCCA TATATGGAGT TCCGCGTTAC ATAACTTACG CGCCTGGCTG ACCGCCCAAC GACCCCCGCC CATTGACGTC AATAATGACG TATGTTCCCA TAGTAACGCC AATAGGGACT TTCCATTGAC GGACTATTTA CGGTAAACTG CCCACTTGGC AGTACATCAA GTGTATCATA TGCCAAGTAC GCCCCCTATT GACGTCAATG ACGGTAAATG CATTATGCCC AGTACATGAC CTTATGGGAC TTTCCTACTT

CACCTATCTC

TGCTGCAATG

TTATCCGCCT

TCGTGGTGTC

TAGCTCCTTC

TCCGTAAGAT

ATAATACCGC

TTCGATGTAA

AAGGGAATAA

TATTTGAATG

CTATGGTCGA

AAATTTAAGC

TACGCGTTGA

GTAAATGGCC

GTCAATGGGT

GCCCGCCTGG GGCAGTACAT CTACGTATTA GTCATCGCTA TTACCATGGT TCAATGGGCG TGGATAGCGG TTTGACTCAC GGGGATTTCC AAGTCTCCAC CCCATTGACG TCAATGGGAG TTTGTTTTGG TCCAAAATGT CGTAACAACT CCGCCCCATT GACGCAAATG GGCGGTAGGC GTGTACGGTG GGAGGTCTAT ATAAGCAGAG CCCACTGCTT ACTGGCTTAT CGAAAT

GATGCGGTTT TGGCAGTACA

CACCAAAATC AACGGGACTT

CTCTCTGGCT AACTAGAGAA

Claims (21)

1. Molécula de ligação que é capaz de ligar-se à proteína de a- cordo com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, ou SEQ ID NO: 3, com uma cons- tante dissociação <1000 nM.

2. Molécula de ligação de acordo com a reivindicação 1, que se liga a uma ou mais das seqüências escolhidas formam o grupo que consiste em; SEQ ID NO: 46-51.

3. Molécula de ligação de acordo com a reivindicação 1 ou 2, que é capaz de desinibir mielina de medula espinhal a uma concentração de menos do que 20 nM.

4. Molécula de ligação de acordo com a reivindicação 1, 2, ou 3, que é capaz de aumentar o comprimento médio de neurito por célula de cé- lulas granulares cerebelares de rato desenvolvidas em um substrato de mie- lina de medula espinhal de rato adulto por pelo menos 20%.

5. Molécula de ligação de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 4, que compreende uma ou mais seqüências de aminoácidos escolhido do grupo que consiste em SEQ ID NO: 12-17 ou SEQ ID NO: 18- 23.

6. Molécula de ligação de acordo com a reivindicação 5, que compreende pelo menos um sítio de ligação de antígeno escolhido do grupo que consiste em; uma seqüência que é pelo menos 50% homóloga a SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7, e; uma seqüência que é pelo menos 50% homóloga a SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6, ou um equivalente do mesmo direto.

7. Molécula de ligação de acordo com a reivindicação 6, que compreende uma primeira seqüência que é pelo menos 50% homóloga a SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7, e uma segunda seqüência que é pelo me- nos 50% homóloga a SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6, ou um equivalente do mesmo direto.

8. Molécula de ligação de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 7, que compreende pelo menos a) uma cadeia pesada de imunoglobulina ou fragmento da mesma que compreende (i) um domínio variável compreendendo SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7, e (ii) a parte constante ou seu fragmento de uma cadeia pesada de ser humano; e b) uma cadeia leve de imunoglobulina ou fragmento da mesma que compreende (i) um domínio variável compreendendo SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6, e (ii) a parte constante ou fragmento da mesma de uma cadeia leve de ser humano; ou equivalentes da mesma diretos.

9. Molécula de ligação de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 8, que, é um anticorpo ou um fragmento do mesmo, ou um e- quivalente do mesmo direto.

10. Molécula de ligação de acordo com a reivindicação 9, em que a parte constante ou fragmento da mesma da cadeia pesada de ser humano é o tipo γ4 e a parte constante ou fragmento da mesma da cadeia leve de ser humano é do tipo κ.

11. Molécula de ligação de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 9, que é um anticorpo monoclonal humanizado ou quimérico ou humano.

12. Polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

13. Polinucleotídeo escolhido do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9; ou do grupo que consiste em SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11.

14. Vetor de expressão compreendendo um ou mais polinucleo- tídeos como definidos na reivindicação 12 ou 13.

15. Sistema de expressão compreendendo um polinucleotídeo como definido na reivindicação 12 ou 13, em que o dito sistema de expres- são ou parte do mesmo é capaz de produzir um polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 1 a 11, quando o dito sistema de expressão ou sua parte está presente em uma célula hospedeira compatível.

16. Célula hospedeira isolada que compreende um sistema de expressão como definido na reivindicação 15.

17. Uso de uma molécula de ligação como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, como um medicamento.

18. Uso de uma molécula de ligação como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, na preparação de um medicamento para o tratamento de uma lesão no CNS.

19. Uso de uma molécula de ligação como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, no tratamento de uma lesão no CNS.

20. Composição farmacêutica compreendendo uma molécula de ligação como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, junta- mente com pelo menos um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

21. Método de tratamento de doenças associadas à promoção de regeneração axonal/plasticidade compreendendo a administração a um indivíduo que necessita de tal tratamento de uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a11.