PT1534736E

PT1534736E - Antagonistas do receptor nogo

Info

Publication number: PT1534736E
Application number: PT03785123T
Authority: PT
Inventors: Stephen M Strittmatter; R Blake Pepinsky; Daniel H S Lee; Weiwei Li; Sylvia A Rabacchi; Jane K Relton; Dane S Worley; Dinah Y W Sah
Original assignee: Univ Yale; Biogen Idec Inc
Priority date: 2002-08-10
Filing date: 2003-08-07
Publication date: 2010-09-07
Also published as: WO2004014311A2; RS20060089A; BR0313331A; WO2004014311A3; CN1681838A; AU2003264033A1; ZA200501135B; KR20050062525A; DE60332842D1; JP2011173899A; NO20050685L; US8030456B2; ATE469913T1; RS20050129A; DK1534736T3; MXPA05001615A; PL375301A1; ES2346868T3; JP2005535329A; EA200500330A1

Description

ΕΡ 1 534 736/ΡΤ DESCRIÇÃO "Antagonistas do receptor Nogo"

CAMPO DO INVENTO 0 presente invento refere-se à neurobiologia e biologia molecular. Mais particularmente, o presente invento refere-se a polipéptidos imunogénicos do receptor Nogo-1, a anticorpos do receptor Nogo-1, seus fragmentos de ligação ao antigénio, receptores de Nogo solúveis e suas proteínas de fusão e ácidos nucleicos que codificam os mesmos. 0 presente invento refere-se ainda a composições compreendendo, e métodos para produção e utilização de, tais anticorpos do receptor Nogo, seus fragmentos de ligação ao antigénio, polipéptidos imunogénicos do receptor Nogo-1, receptores de Nogo solúveis e suas proteínas de fusão e ácidos nucleicos que codificam os mesmos.

ANTECEDENTES DO INVENTO

Os axónios e as dendrites dos neurónios são longas extensões celulares dos neurónios. A ponta distai de um axónio ou neurite em alongamento compreende uma região especializada, conhecida como o cone de crescimento. Os cones de crescimento sentem o ambiente local e orientam o crescimento axónico em direcção à célula alvo do neurónio. Os cones de crescimento respondem a várias pistas ambientais, por exemplo, adesividade superficial, factores de crescimento, neurotransmissores e campos eléctricos. A orientação do crescimento no cone envolve várias classes de moléculas de adesão, sinais intercelulares, bem como factores que estimulam e inibem os cones de crescimento. 0 cone de crescimento de uma neurite em crescimento avança a várias velocidades, mas tipicamente a uma velocidade de um ou dois milímetros por dia.

Os cones de crescimento têm a forma de uma mão com uma ampla expansão plana (micro-espículas ou filopódios (filopodia)) que aderem de forma diferencial a superfícies no embrião. Os filopódios estão continuamente activos, alguns filopódios retraem novamente para o cone de crescimento, enquanto outros continuam a alongar-se através do substrato. 2 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ

Os alongamentos entre diferentes filopódios formam lamelipódios (lamellipodia) . 0 cone de crescimento explora a área que está à sua frente e de ambos os lados com os seus lamelipódios e filopódios. Quando um alongamento contacta com uma superfície que é desfavorável ao crescimento, retrai-se. Quando um alongamento contacta uma superfície favorável ao crescimento, continua a estender-se e orienta o cone de crescimento nessa direcção. 0 cone de crescimento pode ser orientado através de pequenas variações nas propriedades da superfície dos substratos. Quando o cone de crescimento atinge uma célula alvo apropriada é criada uma conexão sináptica. A função da célula nervosa é grandemente influenciada pelo contacto entre o neurónio e outras células no seu ambiente imediato (U. Rutishauser, T.M. Jessell, Physiol. Rev. 68, pág. 819, 1988). Estas células incluem células gliais especializadas, oligodendrócitos no sistema nervoso central (SNC), e células de Schwann no sistema nervoso periférico (SNP), que embainham o axónio neuronal com mielina (uma estrutura isoladora de membranas em múltiplas camadas) (G. Lemke, em "An Introduction to Molecular Neurobiology", Z. Hall, Ed. (Sinauer, Sunderland, Mass., 1992), pág. 281).

Embora os neurónios do SNC tenham a capacidade de regenerar após lesão, são inibidos de o fazer devido à presença de proteínas inibidoras presentes na mielina e possivelmente também através de outros tipos de moléculas que se encontram normalmente no seu ambiente local (Brittis e Flanagan, Neuron 30, págs. 11-14, 2001; Jones et al., J.

Neurosci. 22, págs. 2792-2803, 2002; Grimpe et al., J.

Neurosci. 22, págs. 3144-3160, 2002). Várias proteínas inibidoras da mielina que se encontram nos oligodendrócitos foram caracterizadas, p.ex., NogoA (Chen et al., Nature 403: 434-439, 2000; Grandpre et al., Nature 403: 439-444, 2000), glicoproteína associada à mielina (MAG,

McKerracher et al., Neuron 13: 805-811, 1994; Mukhopadhyay et al., Neuron 13: 757-767, 1994) e glicoproteína dos oligodendrócitos (OM-gp, Mikol e Stefansson, J. Cell. Biol. 106: 1273-1279, 1988). Mostrou-se separadamente que cada uma 3 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ destas proteínas é um ligando para o receptor Nogo-1 neuronal (Wang et al., Nature 417: 941-944, 2002; Liu et al., Science 291: 1190-93, 2002; Grandpre et al., Nature 403: 439-444, 2000; Chen et al., Nature 403: 434-439, 2000; Domeniconi et al., Neuron 35: 283-90, 2002). O receptor Nogo-1 é uma proteína membranar ancorada por GPI que contém 8 repetições ricas em leucina (Fournier et al., Nature 409: 341-346, 2001; WO 01/51520). Após interacção com uma proteína inibidora (p.ex., NogoA, MAG e OM-gp), o complexo do receptor Nogo-1 transduz sinais que conduzem ao colapso do cone de crescimento e à inibição do crescimento das neurites.

Existe uma necessidade urgente de moléculas que inibam a ligação do receptor Nogo-1 aos seus ligandos e atenuem o colapso do cone de crescimento mediado por mielina e a inibição do crescimento das neurites.

SUMÁRIO DO INVENTO O assunto objecto do presente invento é estabelecido nas reivindicações anexas. Mais geralmente, no entanto, a presente divulgação refere-se a polipéptidos solúveis do receptor Nogo-1 e a proteínas de fusão que os compreendem, e a anticorpos e seus fragmentos antigénicos dirigidos contra regiões imunogénicas específicas do receptor Nogo-1. A divulgação refere-se também a polipéptidos imunogénicos do receptor Nogo-1 que se ligam aos anticorpos da divulgação. A divulgação refere-se ainda a ácidos nucleicos codificando os polipéptidos desta divulgação, vectores e células hospedeiras compreendendo tais ácidos nucleicos e métodos de produção dos péptidos. Os anticorpos, receptores solúveis e proteínas de fusão do receptor desta divulgação antagonizam ou bloqueiam o receptor Nogo-1 e são úteis para inibição da ligação do receptor Nogo-1 aos seus ligandos, inibição do colapso do cone de crescimento num neurónio e diminuição da inibição do crescimento ou desenvolvimento de neurites num neurónio.

Nalguns casos, a divulgação proporciona um polipéptido imunogénico seleccionado de entre o grupo que consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5. 4 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ

Nalguns casos, a divulgação proporciona ácidos nucleicos que codificam os referidos polipéptidos imunogénicos, vectores compreendendo os referidos ácidos nucleicos e células hospedeiras compreendendo os referidos ácidos nucleicos ou vectores. Nalguns casos, o ácido nucleico está operativamente ligado a uma sequência de controlo da expressão.

Nalguns casos, a divulgação proporciona um método de produção do polipéptido imunogénico compreendendo os passos de (a) cultura de uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico que codifica o péptido imunogénico ou o vector que o codifica; e (b) recuperação do polipéptido a partir da célula hospedeira ou do meio de cultura.

Nalguns casos, a divulgação proporciona um método de produção de um anticorpo que se liga especificamente a um receptor Nogo-1, compreendendo os passos de (a) imunização de um hospedeiro com um polipéptido seleccionado de entre o grupo que consiste em SEQ id N0:1, SEQ id N0:2, SEQ id N0:3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5 ou uma célula hospedeira expressando o referido polipéptido; e (b) recuperação do anticorpo. Nalguns casos, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste é produzido através deste método. Nalguns casos, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio liga-se especificamente a um polipéptido seleccionado de entre o grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO:5. Nalguns casos, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio (a) inibe o colapso do cone de crescimento de um neurónio; (b) diminui a inibição do crescimento e desenvolvimento de neurites num neurónio; e (c) inibe a ligação do receptor Nogo-1 a um ligando. Nalguns casos, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio promove a sobrevivência de um neurónio em risco de morrer. Nalguns casos, o neurónio em risco de morrer está num animal, p.ex., um mamífero. Nalguns casos, o crescimento e desenvolvimento de neurites é crescimento axónico. Nalguns casos, o neurónio é um neurónio do sistema nervoso central (SNC).

Nalguns casos, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio é um anticorpo monoclonal. Nalguns casos, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio é um anticorpo de murideo. Nalguns casos, o anticorpo é um anticorpo 5 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ humanizado, um anticorpo quimérico ou um anticorpo de cadeia simples.

Nalguns casos, a presente divulgação proporciona uma linha celular de hibridoma seleccionada de entre o grupo que consiste em HB 7E11 (N.° de entrada ATCC® PTA-4587), HB 1H2 (N.° de entrada ATCC® PTA-4584), HB 3G5 (N.° de entrada ATCC® PTA-4586) , HB 5B10 (N.° de entrada ATCC® PTA-4588) e HB 2F7 (N.° de entrada ATCC® PTA-4585). Nalguns casos, a presente divulgação proporciona um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste que é produzido através da linha celular de hibridoma.

Nalguns casos, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada de entre o grupo que consiste em (a) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; (b) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; e (c) uma sequência de aminoácidos compreendendo as sequências de aminoácidos de CDRl, CDR2 e CDR3 de SEQ ID NOs:22, 23 e 24. Nalguns casos, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada de entre o grupo que consiste em (a) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:17; (b) a sequência de aminoácidos de SEQ ID N0:18; e (c) uma sequência de aminoácidos compreendendo as sequências de aminoácidos de CDRl, CDR2 e CDR3 de SEQ ID N0s:19, 20 e 21. Nalguns casos, a presente divulgação proporciona um ácido nucleico que codifica o referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste. Nalguns casos, o ácido nucleico está operativamente ligado a uma sequência de controlo da expressão. Nalguns casos, a divulgação proporciona um vector compreendendo o referido ácido nucleico. Nalguns casos, a divulgação proporciona uma célula hospedeira compreendendo o referido ácido nucleico ou compreendendo um vector compreendendo o ácido nucleico.

Nalguns casos, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste inibe competitivamente a ligação de um anticorpo produzido através de uma linha celular de hibridoma da presente divulgação a um receptor Nogo-1 ou a um polipéptido imunogénico seleccionado de entre o grupo que 6 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ consiste em SEQ ID N0:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5.

Nalguns casos, a divulgação proporciona um método de inibição da ligação do receptor Nogo-1 a um ligando, compreendendo o passo de contacto do receptor Nogo-1 com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio desta divulgação. Nalguns casos, o ligando é seleccionado de entre o grupo que consiste em NogoA, NogoB, NogoC, MAG e OM-gp.

Nalguns casos, a divulgação proporciona um método para inibição do colapso do cone de crescimento num neurónio, compreendendo o passo de contacto do neurónio com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste desta divulgação. Nalguns casos, a divulgação proporciona um método para diminuir a inibição do crescimento ou desenvolvimento de neurites num neurónio, compreendendo o passo de contacto do neurónio com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio desta divulgação. Nalguns casos, o neurónio é um neurónio do SNC. Nalguns destes métodos, o crescimento ou desenvolvimento de neurites é crescimento axónico.

Nalguns casos, a divulgação proporciona um método de promoção da sobrevivência de um neurónio em risco de morrer, compreendendo o contacto do neurónio com uma quantidade eficaz de (a) um anticorpo anti-receptor Nogo-1 ou fragmento de ligação ao antigénio deste; ou (b) um polipéptido solúvel do receptor Nogo-1. Nalguns casos, o polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 é uma proteína de fusão, p.ex., uma proteína de fusão de Fc. Nalguns casos, a proteína de fusão é a proteína sNogoR344-Fc. Nalguns casos, o neurónio está in vitro. Nalguns casos, o neurónio está num mamífero apresentando sinais ou sintomas, p.ex., de esclerose múltipla, ELA, doença de Huntington, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, neuropatia diabética, AVC, lesões cerebrais traumáticas e lesões da espinal-medula.

Nalguns casos, a divulgação proporciona um método de promoção da sobrevivência de um neurónio em risco de morrer, estando o neurónio num mamífero, compreendendo (a) o proporcionar uma célula hospedeira cultivada expressando (i) um anticorpo anti-receptor Nogo-1 ou fragmento de ligação ao 7 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ antigénio deste; ou (ii) um polipéptido solúvel do receptor Nogo-1; e (b) a introdução da célula hospedeira no mamífero no local do neurónio ou próximo deste.

Nalguns casos, a divulgação proporciona um método de terapia génica de promoção da sobrevivência de um neurónio num mamífero, neurónio esse que está em risco de morrer, compreendendo a administração no local do neurónio ou próximo deste de um vector virai compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica (a) um anticorpo anti-receptor Nogo-1 ou um fragmento de ligação ao antigénio; ou (b) um polipéptido solúvel do receptor Nogo-1, em que o anticorpo anti-receptor Nogo-1, fragmento de ligação ao antigénio, ou polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 é expresso a partir da sequência nucleotídica no mamífero numa quantidade suficiente para promover a sobrevivência do neurónio.

Nalguns casos, a divulgação proporciona um polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 consistindo essencialmente num domínio N-terminal (NT), 8 domínios de repetições ricas em leucina (LRR) e um domínio C-terminal de LRR (LRRCT) do receptor Nogo-1. Nalguns casos, o referido polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 está unido a uma sequência sinal. Nalguns casos, a LRR compreende uma LRR heteróloga. Nalguns casos, a divulgação proporciona um polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 seleccionado de entre o grupo que consiste em: resíduos de aminoácido 26-344 de SEQ ID NO:6; resíduos de aminoácido 26- 310 de SEQ ID NO:7; resíduos de aminoácido 26-344 de SEQ ID NO:8; resíduos de aminoácido 26-310 de SEQ ID NO:9; resíduos de aminoácido 27-344 de SEQ ID NO:8; e resíduos de aminoácido 27- 310 de SEQ ID NO:9. Nalguns casos, a divulgação proporciona um ácido nucleico que codifica o referido polipéptido solúvel do receptor Nogo-1. Nalguns casos, o ácido nucleico está operativamente ligado a uma sequência de controlo da expressão. Nalguns casos, a divulgação proporciona um vector compreendendo o referido ácido nucleico. Nalguns casos, a divulgação proporciona uma célula hospedeira compreendendo o referido ácido nucleico ou um vector compreendendo o ácido nucleico.

Nalguns casos, a divulgação proporciona um método de produção de um polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 da 8 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ divulgação compreendendo os passos de (a) cultura de uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico que codifica o polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 ou um vector compreendendo o ácido nucleico; e (b) recuperação do polipéptido a partir da célula hospedeira ou do meio de cultura.

Nalguns casos, a divulgação proporciona uma proteína de fusão do receptor Nogo-1 compreendendo um polipéptido solúvel e um heterólogo do receptor Nogo-1. Nalguns casos, o polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 consiste essencialmente num domínio N-terminal (NT), 8 domínios de repetições ricas em leucina (LRR) e um domínio C-terminal de LRR (LRRCT) do receptor Nogo-1. Nalguns casos, o polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 está unido a uma sequência sinal. Nalguns casos, a proteína de fusão do receptor Nogo-1 compreende uma LRR heteróloga. Nalguns casos, a proteína de fusão do receptor Nogo-1 compreende um polipéptido seleccionado de entre o grupo que consiste em: resíduos de aminoácido 26-344 de SEQ ID NO: 6; resíduos de aminoácido 26-310 de SEQ ID NO:7; resíduos de aminoácido 26-344 de SEQ ID NO:8; resíduos de aminoácido 26-310 de SEQ ID NO: 9; resíduos de aminoácido 27-344 de SEQ ID NO:8; e resíduos de aminoácido 27-310 de SEQ ID NO:9. Nalguns casos, o polipéptido heterólogo compreende uma região constante de imunoglobulina. Nalguns casos, a região constante de imunoglobulina é uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina. Nalguns casos, a região constante da cadeia pesada de imunoglobulina é uma região constante da cadeia pesada de IgG. Nalguns casos, o polipéptido heterólogo é uma região Fc. Nalguns casos, a proteína de fusão do receptor Nogo-1 é um dímero.

Nalguns casos, a divulgação proporciona um ácido nucleico que codifica a proteína de fusão do receptor Nogo-1. Nalguns casos, o ácido nucleico que codifica a proteína de fusão do receptor Nogo-1 está operativamente ligado a uma sequência de controlo da expressão.

Nalguns casos, a divulgação proporciona um vector compreendendo o ácido nucleico que codifica a proteína de fusão do receptor Nogo-1. 9 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ

Nalguns casos, a divulgação proporciona uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico que codifica a proteína de fusão do receptor Nogo-1 ou o vector compreendendo o ácido nucleico que codifica a proteína de fusão do receptor Nogo-1.

Nalguns casos, a divulgação proporciona um método de produção de uma proteína de fusão do receptor Nogo-1 compreendendo os passos de (a) cultura de uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico que codifica a proteína de fusão do receptor Nogo-1 ou um vector compreendendo o ácido nucleico; e (b) recuperação de uma proteína de fusão do receptor Nogo-1 a partir da célula hospedeira ou meio de cultura.

Nalguns casos, a divulgação proporciona um método de inibição da ligação do receptor Nogo-1 a um ligando, compreendendo o passo de contacto do ligando com o polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 ou a proteína de fusão do receptor

Nogo-1 desta divulgação.

Nalguns casos, a divulgação proporciona um método de modulação de uma actividade de um ligando do receptor Nogo-1, compreendendo o passo de contacto do ligando do receptor Nogo-1 com um polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 ou uma proteína de fusão do receptor Nogo-1 da divulgação.

Nalguns casos, a divulgação proporciona um método para inibição do colapso do cone de crescimento num neurónio, compreendendo o passo de contacto de um ligando do receptor Nogo-1 com um polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 ou uma proteína de fusão do receptor Nogo-1 desta divulgação. Nalguns casos, a divulgação proporciona um método para diminuir a inibição do crescimento ou desenvolvimento de neurites num neurónio, compreendendo o passo de contacto de um ligando do receptor Nogo-1 com o polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 ou a proteína de fusão do receptor Nogo-1 desta divulgação. Nalguns casos, o neurónio é um neurónio do SNC. Nalguns casos, o ligando é seleccionado de entre o grupo que consiste em NogoA, NogoB, NogoC, MAG e OM-gp. Nalguns casos, o crescimento ou desenvolvimento de neurites é crescimento axónico. 10 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ

Nalguns casos, a divulgação proporciona uma composição compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável e um componente seleccionado a partir de (a) um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigénio de acordo com esta divulgação; (b) um polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 de acordo com esta divulgação; e (c) uma proteína de fusão do receptor Nogo-1 de acordo com esta divulgação. Nalguns casos, a composição compreende ainda um ou mais agentes terapêuticos adicionais.

Agora tal como exposto acima, uma parte da divulgação que está contida aqui proporciona o assunto do presente invento, tal como definido pelas reivindicações anexas. No entanto, a totalidade da divulgação que está contida aqui deverá ser utilizada para interpretar as reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é uma representação esquemática da estrutura do receptor Nogo-1. O sNogoR310 humano contém os resíduos 26-310 e sNogoR344 contém os resíduos 26-344. O sNogoR310 de rato contém os resíduos 27-310 e sNogoR344 contém os resíduos 27- 344 . A Figura 2 representa um gráfico de antigenicidade para a proteína do receptor Nogo-1 utilizando o suporte lógico Vector Nti™. P-617 de rato é SEQ ID NO: 10 e P-618 de rato é SEQ id NO:11. A Figura 3A é um gráfico representando a actividade de ligação do anticorpo anti-receptor Nogo-1, 7E11. O gráfico apresenta o efeito da concentração de 7E11 na ligação de Nogo66 ao receptor Nogo-1. A Figura 3B representa a actividade de ligação do anticorpo anti-receptor Nogo-1, 1H2. O gráfico apresenta o efeito da concentração de 1H2 na ligação de Nogo66 a sNogoR344-Fc (também referido aqui e no pedido de patente dos Estados Unidos 60/402866 como Fc-sNogoR344 ou Ig-sNogoR344). Fc-MAG não competiu com Nogo66 pela ligação a sNogoR344-Fc. A Figura 4 representa os resultados de um ELISA para os anticorpos anti-Nogo-R-1 1H2, 3G5 e 2F7. O efeito dos 11 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ anticorpos na DO450 na presença de antigénios imobilizados foi determinado. Os antigénios imobilizados foram sNogoR310-Fc (também referido aqui e no pedido de patente dos Estados Unidos 60/402866 como Fc-sNogoR310 ou lg-sNogoR310), sNogoR344-Fc, p-617, p-618, p-4, p-5 e ovalbumina e BSA. A Figura 5 é um gráfico representando os efeitos do anticorpo monoclonal, 7E11, no crescimento de neurites de GRD de rato na presença de quantidades variáveis de mielina. A Figura 6A é um gráfico representando o efeito da ligação de sNogoR310 a 125l-Nogo66 e 125I-Nogo40 na presença dos seguintes competidores: Nogo66, Nogo40 e sobrenadante de anticorpo monoclonal anti-receptor Nogo-1. A Figura 6B representa a actividade de ligação de 125I-Nogo66 a sNogoR310. A Figura 7 é um gráfico representando o efeito de sNogoR310-Fc na ligação de 125I-Nogo40 a sNogoR310. A Figura 8 é um gráfico representando a actividade de ligação de sNogoR310-Fc a 125I-Nogo40. A Figura 9A é um gráfico do efeito de sNogoR310 no crescimento de neurites/célula na presença ou ausência de mielina. A Figura 9B é um gráfico do efeito de sNogoR310 no crescimento de neurites na presença ou ausência de mielina. A Figura 10A é um gráfico representando o efeito de sNogoR310-Fc no crescimento de neurites de GRD de rato P4 na presença ou ausência de quantidades crescentes de mielina. A Figura 10B representa o número de neurites/célula após tratamento com PBS, PBS + sNogoR310-Fc, 20 ng de mielina e mielina + sNogoR310-Fc. A Figura 11 é um gráfico representando o efeito do anticorpo monoclonal 5B10 no crescimento de neurites de GRD/célula na presença de quantidades crescentes de mielina. A Figura 12 é um gráfico representando o efeito de sNogoR310-Fc no registo BBB até 30 dias após indução de lesão num modelo de corte transversal da espinal-medula de rato. 12 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ

As Figuras 13Α e 13B relatam o registo BBB locomotor em função do tempo após hemissecção dorsal nos ratinhos WT ou transgénicos da Linha 08 ou da Linha 01. A Figura 13C representa graficamente o ângulo máximo do plano inclinado tolerado em função do tempo após a lesão para ratinhos WT e transgénicos. A Figura 13D mostra erros nos membros posteriores durante escalada de uma rede inclinada em função do tempo após a lesão. Em todos os gráficos, são relatadas médias ± e.p.m. de 7-9 ratinhos em cada grupo. Os valores do grupo dos transgénicos são estatisticamente diferentes dos dos ratinhos WT. (duplo asterisco, P<0,01; teste t de Student). A Figura 14A mostra o registo BBB locomotor em função do tempo após hemissecção dorsal em animais tratados com veículo ou sNogoR310-Fc. A Figura 14B mostra erros nos membros posteriores durante a caminhada na rede em função do tempo após a lesão. A Figura 14C mostra a análise das pegadas revelando uma passada mais curta e uma passada mais larga em ratos de controlo que em ratos não lesionados ou lesionados + sNogoR310-Fc. Em todos os gráficos, são relatadas médias ± e.p.m. de 7-9 ratos em cada grupo. Os valores do grupo de sNogoR310-Fc são estatisticamente diferentes dos do controlo (Figuras 14A-B). Os valores dos controlos são estatisticamente diferentes dos dos ratos sem-LEM (lesão da espinal-medula) ou LEM + sNogoR310-Fc da Figura 14C. (asterisco, p<0,05; duplo asterisco, p<0,01; teste t de Student).

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Definições e Técnicas Gerais A menos que definido em contrário, todos os termos científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que é vulgarmente entendido por um perito na arte à qual este invento pertence. Em caso de conflito, o presente pedido incluindo as definições prevalecerão. Também, a menos que seja requerido de outro modo pelo contexto, os termos singulares deverão incluir plurais e os termos plurais deverão incluir o singular.

Embora possam ser utilizados métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos na prática ou 13 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ testes da presente divulgação, incluindo o presente invento, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos, e não se pretende que sejam limitantes. Outras caracteristicas e vantagens do presente invento serão aparentes a partir da descrição detalhada e das reivindicações.

Em todo este fascículo e nas reivindicações, a palavra "compreender" ou variações tais como "compreende" ou "compreendendo" serão entendidas como implicando a inclusão de um inteiro ou grupo de inteiros afirmado mas não a exclusão de qualquer outro inteiro ou grupo de inteiros.

Para melhor definir este invento, são aqui proporcionados os seguintes termos e definições.

Tal como aqui se utiliza, "anticorpo" significa uma imunoglobulina intacta ou um fragmento de ligação ao antigénio desta. Os anticorpos desta divulgação, incluindo anticorpos do presente invento, podem ser de qualquer isotipo ou classe (p.ex., M, D, G, E e A) ou qualquer subclasse (p.ex., Gl-4, Al-2) e podem ter uma cadeia leve capa (k) ou lambda (λ).

Tal como aqui se utiliza, "Fc" significa uma porção da região constante da cadeia pesada de um anticorpo que é obtenível através de digestão com papaína.

Tal como aqui se utiliza, "proteína de fusão de NogoR" significa uma proteína compreendendo uma porção receptor Nogo-1 solúvel fundida com um polipéptido heterólogo.

Tal como aqui se utiliza, "anticorpo humanizado" significa um anticorpo no qual pelo menos uma porção das sequências não humanas é substituída por sequências humanas. Exemplos de como produzir anticorpos humanizados podem ser verificados nas Patentes dos Estados Unidos N.os 6054297, 5886152 e 5877293.

Tal como aqui se utiliza, "anticorpo quimérico" significa um anticorpo que contém uma ou mais regiões de um primeiro anticorpo e uma ou mais regiões de pelo menos um outro 14 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ anticorpo. 0 primeiro anticorpo e os anticorpos adicionais podem ser da mesma espécie ou de espécies diferentes.

Tal como aqui se utiliza e no pedido de patente dos Estados Unidos 60/402,866, o "receptor Nogo", "NogoR", "NogoR-1", "NgR" e "NgR-1" significam todos o receptor Nogo-1.

Polipéptidos imunogénicos do Receptor Nogo-1

Num aspecto, a presente divulgação, incluindo o presente invento, refere-se a polipéptidos do receptor Nogo-1 que são imunogénicos. Nalguns casos da presente divulgação, o polipéptido imunogénico consiste essencialmente numa sequência de aminoácidos seleccionada de entre o grupo que consiste em: LDLSDNAQLRWDPTT (rato) (SEQ ID NO: 1) ; LDLSDNAQLRSVDPAT (humano) (SEQ ID NO:2); AVASGPFRPFQTNQLTDEELLGLPKCCQPDAADKA (rato) (SEQ ID NO:3); AVATGPYHPIWTGRATDEEPLGLPKCCQPDAADKA (humano) (SEQ ID NO:4); e CRLGQAGSGA (ratinho) (SEQ ID NO:5).

Nalguns casos, p.ex. em certas concretizações do presente invento, a divulgação refere-se a um ácido nucleico que codifica um polipéptido de qualquer uma de SEQ ID NOs:l-5. Nalguns casos, p.ex. em certas concretizações preferidas do presente invento, a molécula de ácido nucleico está ligada a uma sequência de controlo da expressão (p.ex., pCDNA(I)). A presente divulgação refere-se também a um vector compreendendo um ácido nucleico que codifica para um polipéptido imunogénico da divulgação. Certos vectores proporcionam aspectos do presente invento. Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações do presente invento, o vector é um vector de clonagem. Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações do presente invento, o vector é um vector de expressão. Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações do presente invento, o vector contém pelo menos um marcador seleccionável. A presente divulgação refere-se também a células hospedeiras compreendendo o ácido nucleico ou vector acima descrito, p.ex. um ácido nucleico ou vector do presente invento. 15 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ A presente divulgação refere-se também a um método de produção de um polipéptido imunogénico da presente divulgação, p.ex. um polipéptido imunogénico do presente invento, compreendendo o passo de cultura de uma célula hospedeira. As células hospedeiras compreendendo um ácido nucleico ou vector do presente invento, e métodos de cultura das referidas células hospedeiras e de recuperação do polipéptido imunogénico do presente invento, formam mais aspectos do presente invento tal como exposto nas reivindicações. Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, a célula hospedeira é procariótica. Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, a célula hospedeira é eucariótica. Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, a célula hospedeira é de levedura.

Anticorpos A presente divulgação refere-se ainda a um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigénio deste gue se liga especificamente a um polipéptido imunogénico do receptor Nogo-1 da divulgação, p.ex. um polipéptido imunogénico do receptor Nogo-1 do presente invento. Nalguns casos, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio liga-se a um polipéptido consistindo essencialmente numa sequência de aminoácidos seleccionada de entre o grupo que consiste em SEQ ID N0s:l-5. Os anticorpos e fragmentos de ligação ao antigénio do presente invento são expostos nas reivindicações anexas. 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio da presente divulgação, p.ex. um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio do presente invento, pode ser produzido in vivo ou in vitro. A produção do anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio é discutida abaixo.

Um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigénio deste de acordo com a presente divulgação, p.ex. de acordo com o presente invento, inibe a ligação do receptor Nogo-1 a um ligando (p.ex., NogoA, NogoB, NogoC, MAG, OM-gp) e diminui a inibição mediada por mielina do crescimento e desenvolvimento de neurites, particularmente crescimento axónico, e atenua o colapso do cone de crescimento mediado pela mielina.

Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, o anticorpo anti-receptor Nogo-1 ou fragmento de ligação ao antigénio 16 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ deste é de murídeo. Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, o receptor Nogo-1 é de rato. Noutros casos, p.ex. noutras concretizações, o receptor Nogo-1 é humano. Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, o anticorpo anti-receptor Nogo-1 ou fragmento de ligação ao antigénio deste é recombinante, modificado, humanizado e/ou quimérico.

Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, o anticorpo é seleccionado de entre o grupo que consiste em: monoclonal 7E11 (N.° de entrada ATCC® PTA-4587); monoclonal 1H2 (N.° de entrada ATCC® PTA-4584); monoclonal 2F7 (N.° de entrada ATCC® PTA-4585); monoclonal 3G5 (N.° de entrada ATCC® PTA-4586); e monoclonal 5B10 (N.° de entrada ATCC® PTA-4588). Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, o anticorpo é o anticorpo policlonal 46.

Fragmentos de ligação ao antigénio exemplares são Fab, Fab', F(ab')2/ Fv, Fd, dAb, e fragmentos contendo fragmentos da região determinante de complementaridade (CDR), anticorpos de cadeia simples (scFv), anticorpos quiméricos, diacorpos e polipéptidos que contenham pelo menos uma porção de uma imunoglobulina que seja suficiente para conferir ao polipéptido ligação especifica ao antigénio (p.ex., imunoadesinas).

Tal como aqui se utiliza, Fd significa um fragmento que consiste nos domínios VH e Chi,’ Fv significa um fragmento que consiste nos dominios VL e VH de um único braço de um anticorpo; e dAb significa um fragmento que consiste num dominio VH (Ward et ai., Nature 341: 544-546, 1989). Tal como aqui se utiliza, anticorpo de cadeia simples (scFv) significa um anticorpo no qual uma região VL e uma região VH são emparelhadas para formar moléculas monovalentes através de um ligante sintético que lhes permite serem produzidas como uma única cadeia proteica (Bird et al., Science 242: 423-426, 1988 e Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883, 1988). Tal como aqui se utiliza, diacorpo significa um anticorpo biespecifico no qual os dominios VH e VL são expressos numa única cadeia polipeptidica, mas utilizando um ligante que seja demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois dominios da mesma cadeia, forçando deste modo os dominios a emparelhar com dominios 17 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ complementares de outra cadeia e criando dois locais de ligação ao antigénio (ver p.ex., Holliger, P., et al.r Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448, 1993, e Poljak, R.J., et ai., Structure 2: 1121-1123, 1994). Tal como aqui se utiliza, imunoadesina que se liga especificamente a um antigénio de interesse, significa uma molécula na qual uma ou mais CDR podem ser incorporadas, covalentemente ou não covalentemente.

Nalguns casos, a divulgação proporciona um polipéptido de subunidade de um anticorpo do receptor Nogo-1 da presente divulgação, p.ex. de um anticorpo do receptor Nogo-1 do presente invento, em que o polipéptido de subunidade é seleccionado de entre o grupo que consiste em: (a) uma cadeia pesada ou uma região variável desta; e (b) uma cadeia leve ou um região variável desta.

Nalguns casos, a divulgação proporciona um ácido nucleico que codifica a cadeia pesada ou a região variável desta ou a cadeia leve ou a região variável desta, de um polipéptido de subunidade de um anticorpo do receptor Nogo-1 da presente divulgação, p.ex. de um anticorpo do receptor Nogo-1 do presente invento.

Nalguns casos, a divulgação proporciona uma região hipervariável (CDR) de um anticorpo do receptor Nogo-1 da presente divulgação, p.ex. de um anticorpo do receptor Nogo-1 do presente invento, ou um ácido nucleico que codifica uma CDR.

Imunização

Os anticorpos da presente divulgação, incluindo anticorpos do presente invento, podem ser gerados através de imunização de um hospedeiro adequado (p.ex., vertebrados, incluindo humanos, ratinhos, ratos, ovelhas, cabras, porcos, gado, cavalos, répteis, peixes, anfíbios e em ovos de aves, répteis e peixes). Tais anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais.

Nalguns casos da presente divulgação, o hospedeiro é imunizado com um polipéptido imunogénico do receptor Nogo-1 da presente divulgação, p.ex. com um polipéptido imunogénico do 18 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ receptor Nogo-1 do presente invento. Noutros casos, o hospedeiro é imunizado com o receptor Nogo-1 associado à membrana celular de uma célula intacta ou rompida e os anticorpos da divulgação, p.ex. anticorpos do presente invento, são identificados através da ligação a um polipéptido imunogénico do receptor Nogo-1 da divulgação, p.ex. a um polipéptido imunogénico do receptor Nogo-1 do presente invento. Certos métodos de produção de anticorpos através de imunização de hospedeiros proporcionam outros aspectos do presente invento tal como exposto nas reivindicações anexas.

Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, o antigénio do receptor Nogo-1 é administrado com um adjuvante para estimular a resposta imunitária. É frequentemente necessário administrar adjuvantes para além do antigénio para desencadear uma resposta imunitária ao antigénio. Estes adjuvantes são habitualmente substâncias insolúveis ou não degradáveis que promovem inflamação não especifica, com recrutamento de fagócitos mononucleares no local de imunização. Exemplos de adjuvantes incluem, mas não se limitam a adjuvante de Freund, RIBI (dipéptidos de muramilo), ISCOM (complexos imunoestimuladores) ou fragmentos destes.

Para uma revisão dos métodos de produção de anticorpos, ver p.ex., Harlow e Lane (1988), "Antibodies, A Laboratory Manual", Yelton, D.E. et al. (1981); Ann. Rev. of Biochem. 50, págs. 657-80., e Ausubel et al. (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" (New York: John Wiley & Sons). A determinação da imunorreactividade com um polipéptido imunogénico do receptor Nogo-1 da divulgação, p.ex. com um polipéptido imunogénico do receptor Nogo-1 do presente invento, pode ser feita através de qualquer um de vários métodos bem conhecidos na arte, incluindo, p.ex., ensaio immunoblot e ELISA.

Produção de Anticorpos e Linhas Celulares Produtoras de Anticorpos

Os anticorpos monoclonais da presente divulgação, incluindo anticorpos monoclonais do presente invento, podem ser produzidos através de procedimentos padrão tal como descrito, p.ex., em Harlow e Lane (1988), supra. 19 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ

Resumidamente, num período de tempo apropriado o animal é sacrificado e as células B dos nódulos linfáticos e/ou do baço são imortalizadas através de uma de várias técnicas que são bem conhecidas na arte, incluindo mas não se limitando a transformação, tal como com EBV ou fusão com uma linha celular imortalizada, tais como células de mieloma. A parir daí, as células são separadas clonalmente e os sobrenadantes de cada clone testados quanto à produção de um anticorpo específico para um polipéptido imunogénico do receptor Nogo-1 da divulgação, p.ex. para um polipéptido imunogénico do receptor Nogo-1 do presente invento. Os métodos de selecção, clonagem e expansão de hibridomas são bem conhecidos na arte. Semelhantemente, os métodos para identificação da sequência nucleotídica e de aminoácidos dos genes de imunoglobulinas são conhecidos na arte.

Outras técnicas adequadas para produção de um anticorpo da presente divulgação, p.ex. um anticorpo do presente invento, envolve exposição in vitro de linfócitos ao receptor Nogo-1 ou a um polipéptido imunogénico da divulgação, p.ex. a um polipéptido imunogénico do presente invento, ou alternativamente, selecção de bibliotecas de anticorpos em vectores fágicos ou semelhantes. Ver Huse et al., Science 246, págs. 1275-81 (1989). Os anticorpos úteis na presente divulgação, p.ex., no presente invento, podem ser empregues com ou sem modificação.

Os antigénios (neste caso receptor Nogo-1 ou um polipéptido imunogénico da divulgação, p.ex. um polipéptido imunogénico do presente invento) e anticorpos podem ser marcados através da ligação, covalentemente ou não covalentemente, de uma substância que proporcione um sinal detectável. Vários marcadores e técnicas de conjugação são conhecidos na arte e podem ser empregues na prática do presente invento. Marcadores adequados incluem, mas não se limitam a, radionucleótidos, enzimas, substratos, cofactores, inibidores, agentes fluorescentes, agentes quimioluminescentes, partículas magnéticas e semelhantes. Patentes ensinando a utilização de tais marcadores incluem as Patentes U.S. 3817837; 3850752; 3939350; 3996345; 4277437; 4275149 e 20 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ 4366241. Podem também ser produzidas imunoglobulinas recombinantes (ver Patente U.S. 4816567).

Nalguns casos da presente divulgação, p.ex. nalgumas concretizações do presente invento, um anticorpo tem múltiplas especificidades de ligação, tais como um anticorpo bifuncional preparado através de qualquer uma de várias técnicas conhecidas dos peritos na arte incluindo a produção de hibridomas híbridos, permuta de dissulfuretos, ligação quimica cruzada, adição de ligantes peptídicos entre dois anticorpos monoclonais, introdução de dois conjuntos de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina numa determinada linha celular, e por aí adiante (ver abaixo para uma discussão mais detalhada).

Os anticorpos desta divulgação, p.ex. os anticorpos do presente invento, podem também ser anticorpos monoclonais humanos, por exemplo os produzidos através de células humanas imortalizadas, através de ratinhos SCID-hu ou outros animais não humanos capazes de produzir anticorpos "humanos".

Bibliotecas de Apresentação Fágica

Os anticorpos anti-receptor Nogo-1 desta divulgação, p.ex. os anticorpos anti-receptor Nogo-1 do presente invento, podem ser isolados através de pesquisa de uma biblioteca combinatória de anticorpos recombinantes. Bibliotecas combinatórias exemplares são pesquisadas quanto à ligação a um polipéptido imunogénico do receptor Nogo-1 da divulgação, p.ex. a um polipéptido imunogénico do receptor Nogo-1 do presente invento, tal como uma biblioteca de apresentação fágica de scFv, preparada utilizando ADNc de VL e VH preparados a partir de ARNm derivado de um animal imunizado com um polipéptido imunogénico do receptor Nogo-1 da divulgação, p.ex. com um polipéptido imunogénico do receptor Nogo-1 do presente invento. As metodologias para preparação e pesquisa de tais bibliotecas são conhecidas na arte. Existem métodos e materiais comercialmente disponíveis para geração de bibliotecas de apresentação fágica (p.ex., o Pharmacia

Recombinant Phage Antibody System, N.° de catálogo 27-9400-01; o estojo de apresentação fágica SurfZAP™ de Stratagene, N.° de catálogo 240612; e outros de MorphoSys). Existem também outros métodos e reagentes que podem ser utilizados na geração 21 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ e pesquisa de bibliotecas de apresentação de anticorpos (ver p.ex., Ladner et al., Pat. U.S. 5223409; Kang et al., Publicação PCT N.° WO 92/18619; Dower et al., Publicação PCT N.° wo 91/17271; Winter et al., Publicação PCT N.° WO 92/20791; Markland et al., Publicação PCT N.° WO 92/15679; Breitling et al., Publicação PCT N.° WO 93/01288; McCafferty et al., Publicação PCT N.° WO 92/01047; Garrard et al., Publicação PCT N.° WO 92/09690; Fuchs et al., Bio/Technology 9: 1370-1372, 1991; Hay et al., Hum. Antibod. Hibridomas 3: 81-85, 1992; Huse et al., Science 246: 1275-1281, 1989;

McCafferty et al., Nature 348: 552-554, 1990; Griffiths et al., EMBO J. 12: 725-734, 1993; Hawkins et al., J. Mol. Blol. 226: 889-896, 1992; Clackson et al., Nature 352: 624-628, 1991; Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 3576-3580, 1992; Garrad et al., Bio/Technology 9: 1373-1377, 1991;

Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res. 19: 4133-4137, 1991; e

Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 7978-7982, 1991) .

Após pesquisa e isolamento de um anticorpo anti-receptor Nogo-1 da divulgação, p.ex. um anticorpo anti-receptor Nogo-1 do presente invento, de uma biblioteca de apresentação de imunoglobulinas recombinantes, o ácido nucleico que codifica o anticorpo seleccionado pode ser recuperado a partir do pacote de apresentação (p.ex., do genoma fágico) e subclonado noutros vectores de expressão através de técnicas de ADN recombinante padrão. Se desejado, o ácido nucleico pode ser ainda manipulado para criar outras formas de anticorpo da presente divulgação, p.ex., outras formas de anticorpo do presente invento, tal como descrito abaixo. Para expressar um anticorpo isolado através de pesquisa de uma biblioteca combinatória, ADN que codifica a cadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo ou as regiões variáveis destas é clonado num vector de expressão recombinante e introduzido numa célula hospedeira de mamífero, tal como descrito acima.

Mudança de Classe

Os anticorpos anti-receptor Nogo-1 da divulgação, incluindo os anticorpos anti-receptor Nogo-1 do presente invento, podem ser de qualquer isotipo. Um anticorpo de qualquer isotipo desejado pode ser produzido através de 22 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ mudança de classe. Para a mudança de classe, ácidos nucleicos que codificam VL ou VH, que não incluam quaisquer sequências nucleotídicas que codificam CL ou CH, são isolados utilizando métodos bem conhecidos na arte. Os ácidos nucleicos que codificam VL ou VH são então operativamente ligados a uma sequência nucleotídica que codifica uma CL ou CH de uma classe desejada de molécula de imunoglobulina. Isto pode ser alcançado utilizando um vector ou ácido nucleico que compreenda uma cadeia CL ou CH, tal como descrito acima. Por exemplo, um anticorpo anti-receptor Nogo-1 da divulgação, p.ex. um anticorpo anti-receptor Nogo-1 do presente invento, que era originalmente igM pode ser mudado de classe para uma IgG. Mais, a mudança de classe pode ser utilizada para converter uma subclasse de IgG noutra, p.ex., de igGl para IgG2 .

Anticorpos Mutados

Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antigénio da presente divulgação, p.ex. anticorpos ou fragmentos de ligação ao antigénio do presente invento, podem ser mutados nos domínios variáveis das cadeias pesadas e/ou leves para alterar uma propriedade de ligação do anticorpo. Por exemplo, pode ser feita uma mutação numa ou mais das regiões CDR para aumentar ou diminuir a Kd do anticorpo para o receptor Nogo-1, para aumentar ou diminuir a Koff, ou para alterar a especificidade de ligação do anticorpo. As técnicas em mutagénese dirigida ao local são bem conhecidas na arte. Ver p.ex., Sambrook et al. e Ausubel et al., supra. Num caso preferido, p.ex. numa concretização preferida, são feitas mutações num resíduo de aminoácido que se saiba estar mudado em comparação com a linha germinativa numa região variável de um anticorpo anti-receptor Nogo-1 da divulgação, p.ex. de um anticorpo anti-receptor Nogo-1 do presente invento, conforme apropriado. Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, são feitas mutações num ou mais resíduos de aminoácido que se saiba estarem mudados em comparação com a linha germinativa numa região variável de um anticorpo anti-receptor Nogo-1 da presente divulgação, p.ex. de um anticorpo anti-receptor Nogo-1 do presente invento, conforme apropriado. Noutro caso, p.ex. noutra concretização, um ácido nucleico que codifica uma região variável da cadeia pesada ou cadeia leve de um anticorpo é mutado numa ou mais 23 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ das regiões estruturais. Pode ser feita uma mutação numa região estrutural ou num domínio constante para aumentar a semivida. Pode também ser feita uma mutação numa região estrutural ou num domínio constante para alterar a imunogenicidade do anticorpo, para proporcionar um local para ligação covalente ou não covalente a outra molécula, ou para alterar propriedades tais como fixação do complemento. Podem ser feitas mutações em cada uma das regiões estruturais, no domínio constante e nas regiões variáveis num único anticorpo mutado. Alternativamente, podem ser feitas mutações apenas numa das regiões estruturais, nas regiões variáveis ou no domínio constante num único anticorpo mutado.

Anticorpos de Fusão e Imunoadesinas

Pode ser produzido um anticorpo de fusão ou imunoadesina que compreenda todo ou uma porção de um anticorpo anti-receptor Nogo-1 da presente divulgação, p.ex. de um anticorpo anti-receptor Nogo-1 do presente invento, ligado a outro polipéptido. Nalguns casos, apenas a região variável do anticorpo anti-receptor Nogo-1 está ligada ao polipéptido. Noutros casos, o domínio VH de um anticorpo anti-receptor Nogo-1 da divulgação, p.ex. de um anticorpo anti-receptor Nogo-1 deste invento, está ligado a um primeiro polipéptido, enquanto o domínio VL do anticorpo está ligado a um segundo polipéptido que se associa com o primeiro polipéptido de um modo que permita que os domínios VH e VL interajam um com o outro para formar um local de ligação do anticorpo. Noutros casos, o domínio Vh é separado do domínio Vl através de um ligante que permita que os domínios Vh e VL interajam um com o outro (ver abaixo em Anticorpos de Cadeia Simples). 0 anticorpo VH-ligante-VL é então ligado a um polipéptido de interesse. 0 anticorpo de fusão é útil para dirigir um polipéptido para uma célula ou um tecido que expresse um ligando do receptor Nogo-1. 0 polipéptido de interesse pode ser um agente terapêutico, tal como uma toxina, ou pode ser um agente de diagnóstico, tal como uma enzima que possa ser facilmente visualizada, tal como peroxidase de rábano. Adicionalmente, podem ser criados anticorpos de fusão nos quais dois (ou mais) anticorpos de cadeia simples estão ligados um ao outro. Isto é útil se se quiser criar um anticorpo bivalente ou polivalente numa única cadeia 24 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ polipeptídica, ou se se quiser criar um anticorpo biespecifico.

Anticorpos de Cadeia Simples A presente divulgação inclui um anticorpo de cadeia simples (scFv) que se liga a um polipéptido imunogénico do receptor Nogo-1 da presente divulgação, p.ex. um polipéptido imunogénico do receptor Nogo-1 do presente invento. Para produzir o scFv, ADN que codifica VH e VL é operativamente ligado a ADN que codifica um ligante flexível, p.ex., que codifica a sequência de aminoácidos (Gly4-Ser)3 (SEQ ID NO: 10), para que as sequências de VH e VL possam ser expressas como uma proteína de cadeias simples contíguas, com as regiões VL e VH unidas através do ligante flexível (ver p.ex., Bird et al., Science 242: 423-426, 1988; Huston et al., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 85: 5879-5883, 1988; McCafferty et al., Nature 348: 552-554, 1990). O anticorpo de cadeia simples pode ser monovalente, se for utilizada apenas uma única VH e VL, bivalente, se forem utilizadas duas VH e VL, ou polivalentes, se forem utilizadas mais de duas VH e VL. Certos anticorpos de cadeia simples da presente divulgação formam um aspecto do presente invento, tal como exposto nas reivindicações anexas.

Anticorpos Quiméricos É também proporcionado um anticorpo biespecífico ou fragmento de ligação ao antigénio deste no qual uma especificidade é para um polipéptido imunogénico do receptor Nogo-1 da divulgação, p.ex. para um polipéptido imunogénico do receptor Nogo-1 do presente invento. Pode ser gerado um anticorpo quimérico que se ligue especificamente a um polipéptido imunogénico do receptor Nogo-1 da divulgação, p.ex. a um polipéptido imunogénico do receptor Nogo-1 do presente invento, através de um domínio de ligação, e a uma segunda molécula através de um segundo domínio de ligação. O anticorpo quimérico pode ser produzido através de técnicas de biologia molecular recombinantes, ou podem ser fisicamente conjugados juntos. Adicionalmente, pode ser gerado um anticorpo de cadeia simples contendo mais de uma VH e VL que se ligue especificamente a um polipéptido imunogénico da divulgação, p.ex. a um polipéptido imunogénico do presente invento, e a outra molécula que esteja associada a atenuação 25 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ do colapso do cone de crescimento mediado por mielina e inibição do crescimento e desenvolvimento de neurites. Tais anticorpos biespecificos podem ser gerados utilizando técnicas que são bem conhecidas, por exemplo Fanger et al., Immunol Methods 4: 72-81, 1994 e Wright e Harris, supra., e em relação a (iii) ver p.ex., Traunecker et al., Int. J. Câncer (Supl.) 7: 51-52, 1992.

Nalguns casos, os anticorpos quiméricos são preparados utilizando uma ou mais regiões variáveis de um anticorpo da presente divulgação, p.ex. de um anticorpo do presente invento. Noutro caso, o anticorpo quimérico é preparado utilizando uma ou mais regiões CDR do referido anticorpo.

Anticorpos Derivados e Marcados

Um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigénio da presente divulgação, p.ex. um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio do presente invento, pode ser derivado ou ligado a outra molécula (p.ex., outro péptido ou proteína). Em geral, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio é derivado para que a ligação a um polipéptido imunogénico da divulgação, p.ex. a um polipéptido imunogénico do presente invento, não seja afectada adversamente pela derivação ou marcação. Por exemplo, um anticorpo ou porção de anticorpo da presente divulgação, p.ex. um anticorpo ou porção de anticorpo do presente invento, pode ser funcionalmente ligado (através de ligação química, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais outras entidades moleculares, tais como outro anticorpo (p.ex., um anticorpo biespecifico ou um diacorpo), um agente de detecção, um agente citotóxico, um agente farmacêutico, e/ou uma proteína ou um péptido que possa mediar a associação do anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio a outra molécula (tal como uma região central de estreptavidina ou um marcador de poli-histidina).

Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, um anticorpo derivado é produzido através de ligação cruzada de dois ou mais anticorpos (do mesmo tipo ou de diferentes tipos, p.ex., para criar anticorpos biespecificos). Ligantes cruzados adequados incluem os que são heterobifuncionais, possuindo dois grupos reactivos distintos separados por um espaçador 26 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ apropriado (p.ex., éster de m-maleimidobenzoíl-N-hidroxissuccinimida) ou homobifuncional (p.ex., suberato de dissuccinimidilo). Tais ligantes estão disponíveis em Pierce Chemical Company, Rockford, 111.

Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, o anticorpo derivado é um anticorpo marcado. Agentes de detecção exemplares com os quais um anticorpo ou uma porção de anticorpo do presente invento pode ser derivado são compostos fluorescentes, incluindo fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloreto de 5-dimetilamino-l-naftalenossulfonilo, ficoeritrina, compostos luminescentes de lantanídeos e semelhantes. Um anticorpo pode também ser marcado com enzimas que sejam úteis para detecção, tal como peroxidase de rábano, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina, glicose-oxidase e semelhantes. Nalguns casos, p.ex. em concretizações que são marcadas com uma enzima detectável, o anticorpo é detectado através da adição de reagentes adicionais que a enzima utiliza para produzir um produto de reacção detectável. Por exemplo, peroxidase de rábano com peróxido de hidrogénio e diaminobenzidina. Um anticorpo pode também ser marcado com biotina, e detectado através de medição indirecta da ligação de avidina ou estreptavidina. Um anticorpo pode também ser marcado com epítopos polipeptídicos predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (p.ex., sequências de pares de fechos de leucina, locais de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação a metais, marcadores epitópicos).

Um anticorpo anti-receptor Nogo-1 ou um fragmento de antigénio deste pode também ser marcado com um aminoácido radiomarcado. 0 radiomarcador pode ser utilizado para fins de diagnóstico e terapêuticos. 0 anticorpo anti-receptor Nogo-1 radiomarcado pode ser utilizado em diagnóstico, por exemplo, para determinação dos níveis de receptor Nogo-1 num sujeito. Mais, o anticorpo anti-receptor Nogo-1 radiomarcado pode ser utilizado terapeuticamente para tratamento de lesão na espinal-medula. Exemplos de marcadores para polipéptidos incluem, mas não se limitam aos seguintes radioisótopos ou ; 3U 14,, 15,. 35 0 90., 99-,,. 111T„ 125x 131x radionucleótidos — H, C, N, S, Y, TC, In, I, I. 27 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ

Um anticorpo anti-receptor Nogo-1 ou um fragmento de antigénio deste pode também ser derivado com um grupo quimico tal como polietilenoglicol (PEG), um grupo metilo ou etilo ou um grupo hidrato de carbono. Estes grupos podem ser úteis para melhorar as caracteristicas biológicas do anticorpo, p.ex., para aumentar a semivida sérica ou para aumentar a ligação aos tecidos.

Caracterização de Anticorpos Anti-receptor Nogo-1

Classe e Subclasse de Anticorpos Anti-receptor Nogo-1 A classe e subclasse de anticorpos anti-receptor Nogo-1 podem ser determinadas através de qualquer método conhecido na arte. Em geral, a classe e subclasse de um anticorpo podem ser determinadas utilizando anticorpos que sejam específicos para uma determinada classe e subclasse de anticorpo. Tais anticorpos estão comercialmente disponíveis. A classe e subclasse podem ser determinadas através de ELISA, Western Blot bem como outras técnicas. Alternativamente, a classe e subclasse podem ser determinadas através de sequenciação de todos ou de uma porção dos domínios constantes das cadeias pesada e/ou leve dos anticorpos, comparando as suas sequências de aminoácidos com as sequências de aminoácidos conhecidas de várias classes e subclasses de imunoglobulinas e determinando a classe e subclasse dos anticorpos.

Afinidade de ligação do anticorpo anti-receptor Nogo-1 ao receptor Nogo-1 A afinidade de ligação e a velocidade de dissociação de um anticorpo anti-receptor Nogo-1 da divulgação, p.ex. de um anticorpo anti-receptor Nogo-1 do presente invento, a um polipéptido imunogénico do receptor Nogo-1 da divulgação, p.ex. a um polipéptido imunogénico do receptor Nogo-1 do presente invento, podem ser determinadas através de qualquer método conhecido na arte. Por exemplo, a actividade de ligação pode ser medida através de tecnologia de ELISA, RIA, BIAcore ou KinExA competitivos. A velocidade de dissociação pode também ser medida através de tecnologia BIAcore ou KinExA. A afinidade de ligação e a velocidade de dissociação são medidas 28 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ através de ressonância plasmónica de superfície utilizando, p.ex., um BIAcore. A Kd de 7E11 e 1H2 foi determinada ser lxlCT7 M e 2xlCT8 M, respectivamente.

Inibição da actividade do receptor Nogo-1 pelo anticorpo anti-receptor Nogo-1

Nalgumas concretizações, um anticorpo anti-receptor Nogo-1 ou um fragmento de ligação ao antigénio da presente divulgação, p.ex. um anticorpo anti-receptor Nogo-1 ou fragmento de ligação ao antigénio do presente invento, inibe a ligação do receptor Nogo-1 a um ligando. A CI50 de tal inibição pode ser medida através de qualquer método conhecido na arte, p.ex., através de ELISA, RIA, ou Antagonismo Funcional. Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, a CI5o está entre 0,1 e 500 nM. Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, a Ci5o está entre 10 e 400 nM. Ainda noutros casos, p.ex. noutras concretizações, o anticorpo ou uma porção deste tem uma CI50 de entre 60 nM e 400 nM. A Cl50 de 7E11 e 1H2 foi determinada ser 400 nM e 60 nM, respectivamente, num ensaio de ligação. Ver também Tabela 3, infra.

Em suma, um perito na arte, instruído com os ensinamentos desta divulgação, incluindo este invento, tem disponível uma variedade de métodos que podem ser utilizados para alterar as propriedades biológicas dos anticorpos desta divulgação, incluindo os anticorpos deste invento, incluindo métodos que aumentariam ou diminuiriam a estabilidade ou semivida, imunogenicidade, toxicidade, afinidade ou rendimento de uma dada molécula de anticorpo, ou para a alterar de qualquer outro modo que a possa tornar mais adequada para uma determinada aplicação.

Composições compreendendo, e utilizações de, os anticorpos da presente divulgação, p.ex. os anticorpos do presente invento, são descritas abaixo. 29 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ

Polipéptidos Solúveis do Receptor Nogo-1 Proteína 0 receptor Nogo-1 inteiro consiste numa sequência sinal, uma região N-terminal (NT), oito repetições ricas em leucina (LRR), uma região LRRCT (um domínio de repetições ricas em leucina C-terminal às oito repetições ricas em leucina), uma região C-terminal (CT) e uma âncora GPI (ver Fig. 1).

Alguns casos da presente divulgação, incluindo algumas concretizações do presente invento, proporcionam um polipéptido solúvel do receptor Nogo-1. Os polipéptidos solúveis do receptor Nogo-1 da divulgação, incluindo os do presente invento, compreendem um domínio NT; 8 LRR e um domínio LRRCT e não possuem uma sequência sinal nem uma âncora GPI funcional (i.e., sem âncora GPI ou uma âncora GPI sem capacidade para se associar eficientemente a uma membrana celular).

Nalguns casos da presente divulgação, um polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 compreende uma LRR heteróloga. Nalguns casos, um polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 LRR heterólogas. Uma LRR heteróloga significa uma LRR obtida a partir de uma proteína diferente do receptor Nogo-1. Proteínas exemplares a partir das quais pode ser obtida uma LRR heteróloga são o receptor semelhante a toll (TLR1.2); a proteína rica em repetições de leucina de activação de células T; deceorina; OM-gp; subunidades lábeis ácidas slit e robo da proteína de ligação ao factor de crescimento semelhante a insulina; e o receptor semelhante a toll 4.

Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações do presente invento, a divulgação proporciona um polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 de 319 aminoácidos (receptor Nogo-1 solúvel 344, sNogoRl-344 ou sNogoR344) (resíduos 26-344 de SEQ ID NOs: 6 e 8 ou resíduos 27-344 de SEQ ID N0:8). Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações do presente invento, a divulgação proporciona um polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 de 285 aminoácidos (receptor Nogo-1 solúvel 310, 30 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ sNogoRl-310 ou sNogoR310) (resíduos 26-310 de SEQ ID NOs:7 e 9 ou resíduos 27-310 de SEQ ID NO:9). Ver Fig. 1.

Tabela 1. Sequências de Polipéptidos do receptor Nogo-1

Humanos e de Rato SEQ ID NO:6 (humano 1-344) MKRASAGGSRLLAWVLWIjQAWQVAAPCPGACVCYNEPKVTTSCPQQGtiQAVPVG IPAASQRIFLHGMISHVPAASFRACRNLTILWLHSNVIiARIDAAAFTGLALLE QLDLSDNAQLRSVDPATFHGLGRLHTIiHLDRCGLQEIiGPGIiFRGIiAALQYLYIíQ DHALQALPDDTFRDLGNLTHLFIiHGHRISSVPSRAFRGLHSLDRLLLHONRVAH VHPHAFRDLGRLMTLYLFANNLSAIPTEALAPLRAIQYLRIiNDKPWVCDCRARP LWAWLQKFRGS SS EVPCSLPQRLAGRDLKRLAANDLQGCAVATGP YHPIWTGRA TDEEPLGLPKCCQPDAADKA SEQ ID NO:7 (humano 1-310) MKRASAGGSRU^WVLWLQAWQVAAPCPGACTCraEPKVTTSCPQQGLQAVPVG IPAASQRIFLHCnWISHVPAASFRACRNLTILWLHSNVIiARIDAAAFTGIALLB QIiDLSDNAQLRSVDPATFHGLGRLHTIiHLDRCGIjQBLGPGLFRGIiAAIiQYLYLQ DNALQALPDDTFRDLGNLTHI1FI1HGNRI SS VPERAFRGLHSLDRLLJjHQHRVAH VHPHAFRDIiGRLMTLYLPAIíOTiSALPTEAIAPIiRALQyXiRLHDNPWVCDCRARP LWAWLQKFRGSSSEVPCSLPQRIAGRDLKRIíAANDLQGCA SEQ ID NO:8 (rato 1-344) MKRASSGGSRLPTWVLWLQAWRVATPCPGACVCYNEPKVTTSRPQQGLQAVPAG IPASSQRIFLHGTOISYVPAASFQSCMÍÍIiTILWLHSÍJALAQIDAAAFTGIiTLIjE QLDLSDNAQLRWDPTTFRGLGHLHTLHLDRCGLQELGPGLFRGIAAIiQyLYiQ ΟΐηίΙ1Κ^Ρ1»ΠΦΐωΐ^ΗίΤΗΤΡΙ£ΟΝΗΙΡ8νΡΒΗΑΡΡαΐ>Η8ΙιΡΐα·ίΙ1ΗΟΝΗνΑΚ VHPHAFRDLGRLMTLYLPANMIiSMLPAEVLVPLiRSLQYIiRLNDNPWVCDCRARP LWAWIjQKFRGSSSGVPSNLPQEIíAGEDLKRLATSDLEGCAVASGPFRPFQTNQL TDEELLGLPKCCQPDAADKA SEQ ID NO:9 (rato 1-310)

Os polipéptidos solúveis do receptor Nogo-1 da divulgação, p.ex. os polipéptidos solúveis do receptor Nogo-1 do presente invento, podem ser utilizados para inibir a ligação de um ligando ao receptor Nogo-1 e actuar como antagonistas dos ligandos do receptor Nogo-1. Os polipéptidos solúveis do receptor Nogo-1 da divulgação, p.ex. os polipéptidos solúveis do receptor Nogo-1 do presente invento, podem ser utilizados para diminuir a inibição do crescimento e desenvolvimento de neurites num neurónio, tal como crescimento axónico e para inibir o colapso do cone de crescimento mediado por mielina num neurónio. Nalguns casos, o neurónio é um neurónio do SNC. 31 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ sNogoR310 e sNogoR344, surpreendentemente, bloqueiam a ligação de NogoA, NogoB, NogoC, MAG e OM-gp ao receptor Nogo-1.

Nalguns casos, o polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 da divulgação, p.ex. o polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 do presente invento, é um componente de uma proteína de fusão que compreende ainda um polipéptido heterólogo. Nalguns casos, o polipéptido heterólogo é um domínio constante de imunoglobulina. Nalguns casos, o domínio constante de imunoglobulina é um domínio constante da cadeia pesada. Nalguns casos, o polipéptido heterólogo é um fragmento Fc. Nalguns casos o Fc é unido à extremidade C-terminal do polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 da divulgação, p.ex. do polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 do presente invento. Nalguns casos, a proteína de fusão do receptor Nogo-1 é um dímero. As proteínas de fusão do presente invento são expostas nas reivindicações anexas.

Moléculas de Ácido Nucleico do Presente Invento A presente divulgação proporciona um ácido nucleico que codifica um polipéptido da divulgação, incluindo os polipéptidos de qualquer uma de SEQ ID N0s:l-9. Certos ácidos nucleicos da presente divulgação formam aspectos do presente invento, sendo estes expostos nas reivindicações anexas. Nalguns casos da divulgação, p.ex. nalgumas concretizações do presente invento, o ácido nucleico codifica um polipéptido seleccionado de entre o grupo que consiste nos resíduos de aminoácido 26-344 do receptor Nogo-1 tal como mostrado em SEQ ID NOs:6 e 8 ou resíduos de aminoácido 27-344 do receptor Nogo-1 tal como mostrado em SEQ ID NO:8. Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, a molécula de ácido nucleico codifica um polipéptido seleccionado de entre o grupo que consiste nos resíduos de aminoácido 26-310 do receptor Nogo-1 tal como mostrado em SEQ ID NOs:7 e 9 ou resíduos de aminoácido 27-310 do receptor Nogo-1 tal como mostrado em SEQ ID NO:9. Tal como aqui se utiliza, "ácido nucleico" significa ADN genómico, ADNc, ARNm e moléculas anti-sentido, bem como ácidos nucleicos baseados em estruturas alternativas ou incluindo bases alternativas derivadas de fontes naturais ou sintetizadas. 32 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ

Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, o ácido nucleico compreende ainda um promotor da transcrição e opcionalmente uma sequência sinal cada um dos quais operativamente ligado à sequência nucleotídica que codifica o polipéptido da presente divulgação, p.ex. o polipéptido do presente invento, conforme apropriado. É também proporcionado um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão do receptor Nogo-1 da presente divulgação, p.ex. uma proteína de fusão do receptor Nogo-1 do presente invento. Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, o ácido nucleico codifica uma proteína de fusão do receptor Nogo-1 do presente invento, incluindo uma proteína de fusão compreendendo um polipéptido seleccionado de entre o grupo que consiste nos resíduos de aminoácido 26-344 do receptor Nogo-1 tal como mostrado em SEQ ID NOs: 6 e 8 ou resíduos de aminoácido 27-344 de SEQ ID NO:8 e resíduos de aminoácido 26-310 do receptor Nogo-1 tal como mostrado em SEQ ID NOs:7 e 9 ou resíduos de aminoácido 27-310 de SEQ ID NO:9. Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, o ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão do receptor Nogo-1 compreende ainda um promotor da transcrição e opcionalmente uma sequência sinal. Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, a sequência nucleotídica codifica ainda uma região constante de imunoglobulina. Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, a região constante de imunoglobulina é uma região constante da cadeia pesada. Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, a sequência nucleotídica codifica ainda uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina unida a uma região charneira. Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, o ácido nucleico codifica ainda Fc. Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, as proteínas de fusão do receptor Nogo-1 compreendem um fragmento Fc.

Os ácidos nucleicos codificadores da presente divulgação, p.ex. os do presente invento, podem ainda ser modificados para conterem um marcador detectável para fins de diagnóstico e de sonda. Uma variedade de tais marcadores são conhecidos na arte e podem ser facilmente empregues com as moléculas codificadoras aqui descritas. Marcadores adequados incluem, mas não se limitam a, biotina, nucleótidos radiomarcados e semelhantes. Um perito na arte pode empregar qualquer um dos 33 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ marcadores conhecidos na arte para obter uma molécula ácido nucleico codificadora marcada.

Composições São também proporcionadas composições compreendendo um polipéptido imunogénico seleccionado de entre o grupo que consiste em SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4 e SEQ ID NO:5. São ainda proporcionadas composições compreendendo um anticorpo anti-receptor Nogo-1 ou um fragmento de ligação ao antigénio deste, ou um polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 ou uma proteína de fusão da presente divulgação, p.ex. do presente invento. Certas composições da divulgação proporcionam um outro aspecto do presente invento, tal como exposto nas reivindicações anexas.

Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações do presente invento, as composições podem conter transportadores farmaceuticamente aceitáveis adequados compreendendo excipientes e auxiliares que facilitem o processamento dos compostos activos em preparações que possam ser utilizadas farmaceuticamente para distribuição no local de acção. Formulações adequadas para administração parentérica incluem soluções aquosas dos compostos activos em forma solúvel em água, por exemplo, sais solúveis em água. Adicionalmente, podem ser administradas suspensões dos compostos activos como suspensões para injecção oleosas apropriadas. Solventes ou veículos lipófilos adequados incluem ácidos gordos, por exemplo, óleo de sésamo, ou ésteres de ácidos gordos sintéticos, por exemplo, oleato de etilo ou triglicéridos. As suspensões para injecção aquosas podem conter substâncias que aumentem a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose sódica, sorbitol e dextrano. Opcionalmente, a suspensão pode também conter estabilizadores. Também podem ser utilizados lipossomas para encapsular as moléculas desta divulgação, p.ex. as moléculas deste invento, para distribuição na célula. "Transportadores farmaceuticamente aceitáveis" exemplares são qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e de 34 ΕΡ 1 534 736/PT retardamento da absorção, e semelhantes que sejam fisiologicamente compatíveis, água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e semelhantes, bem como combinações destes. Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, as composições compreendem agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio. Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, as composições compreendem substâncias farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes humidificantes ou quantidades mínimas de substâncias auxiliares tais como agentes humidificantes ou emulsionantes, conservantes ou tampões, que aumentem a vida de armazenamento ou a eficácia dos anticorpos, fragmentos de ligação ao antigénio, receptores Nogo solúveis ou proteínas de fusão da presente divulgação, incluindo os do presente invento.

As composições da presente divulgação, p.ex. as do presente invento, podem estar numa variedade de formas, incluindo, por exemplo, formas de dosagem líquidas, semi-sólidas e sólidas, tais como soluções líquidas (p.ex., soluções susceptíveis de injecção e infusão), dispersões ou suspensões. A forma preferida depende do modo de administração pretendido e da aplicação terapêutica. Num caso, p.ex., numa concretização, as composições estão na forma de soluções susceptíveis de injecção ou infusão, tais como composições semelhantes às utilizadas para imunização passiva de humanos com outros anticorpos.

As composições podem ser formuladas como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada a elevada concentração de fármaco. As soluções injectáveis estéreis podem ser preparadas através da incorporação do anticorpo anti-receptor Nogo-1 nas quantidades necessárias num solvente apropriado com um ou uma combinação dos ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido de esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas através da incorporação do composto activo num veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários dos enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são a secagem por vácuo e a secagem por congelação que produz um 35 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ pó do ingrediente activo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução deste previamente esterilizada por filtração. A fluidez correcta de uma solução pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de um revestimento tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e através da utilização de tensioactivos. A absorção prolongada de composições injectáveis pode ser alcançada através da inclusão na composição de um agente que retarde a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, o composto activo pode ser preparado com um transportador que protegerá o composto contra libertação rápida, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes, pensos transdérmicos e sistemas de distribuição microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, tais como etileno-acetato de vinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres e ácido poliláctico. Muitos métodos para a preparação de tais formulações estão patenteados ou são geralmente conhecidos dos peritos na arte. Ver p.ex., "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J.R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., New York, 1978 .

Compostos activos suplementares podem também ser incorporados nas composições. Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, os anticorpos do receptor Nogo-1 ou fragmentos de ligação ao antigénio destes, ou polipéptidos solúveis do receptor Nogo-1 ou proteínas de fusão da divulgação, incluindo os do presente invento, são co-formulados com e/ou co-administrados com um ou mais agentes terapêuticos adicionais.

As composições farmacêuticas podem incluir uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou uma "quantidade profilacticamente eficaz" de um anticorpo, fragmento de ligação ao antigénio, polipéptido(s) ou proteína de fusão da divulgação, p.ex. do presente invento. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e durante os períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo do receptor Nogo-1 ou 36 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ fragmento de ligação ao antigénio deste, polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 ou proteína de fusão do receptor Nogo pode variar de acordo com factores tais como o estado da doença, a idade, o sexo, e o peso do indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também uma na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo, fragmento de ligação ao antigénio, polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 ou proteína de fusão do receptor Nogo são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilacticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e durante os períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profiláctico desejado. Tipicamente, uma vez que uma dose profilática é utilizada em sujeitos antes ou num estádio mais inicial da doença, a quantidade profilacticamente eficaz será menos que a quantidade terapeuticamente eficaz.

Os regimes de dosagem podem ser ajustados para proporcionar a resposta óptima desejada (p.ex., uma resposta terapêutica ou profiláctica). Por exemplo, pode ser administrado um único bolo, podem ser administradas várias doses divididas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada tal como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parentéricas na forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade da forma de unidade de dosagem, que tal como aqui se utiliza refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os sujeitos mamíferos a tratar, contendo cada unidade uma quantidade predeterminada de composto activo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o transportador farmacêutico necessário. A especificação para as formas de unidade de dosagem da presente divulgação, p.ex. do presente invento, é ditada por, e directamente dependente de, (a) as características únicas do anticorpo, fragmento de ligação ao antigénio, e polipéptido solúvel do receptor-1 ou proteína de fusão do receptor Nogo e o efeito terapêutico ou profilático particular a alcançar, e (b) as limitações inerentes na arte de composição de um tal anticorpo, fragmento de ligação ao antigénio, e polipéptido solúvel do receptor-1 ou proteína de fusão do receptor Nogo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos. Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, o 37 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ intervalo de dose terapeuticamente eficaz para os anticorpos do receptor Nogo-1 ou fragmentos de ligação ao antigénio deste é de 0,1-4 mg/Kg por dia. Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, um intervalo de dose terapeuticamente eficaz para os anticorpos do receptor Nogo-1 ou fragmentos de ligação ao antigénio deste é de 0,2-4 mg/Kg por dia. Nalguns casos, p.ex. nalgumas concretizações, um intervalo de dose terapeuticamente eficaz para os anticorpos do receptor Nogo-1 ou fragmentos de ligação ao antigénio deste é de 0,2 mg/Kg por dia.

Utilizações dos Anticorpos, Fragmentos de Ligação ao Antigénio, Receptores Solúveis e Proteínas de Fusão

Nalguns casos, a presente divulgação proporciona métodos para inibição da actividade do receptor Nogo-1 através da administração de anticorpos anti-receptor Nogo-1, fragmentos de ligação ao antigénio de tais anticorpos, polipéptidos solúveis do receptor Nogo-1, ou proteínas de fusão compreendendo tais polipéptidos a um mamífero a necessitar destes.

Nalguns casos, a divulgação proporciona um método de inibição da ligação do receptor Nogo-1 a um ligando, compreendendo o passo de contacto do receptor Nogo-1 com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio da presente divulgação, p.ex. do presente invento. Nalguns casos, o ligando é seleccionado de entre o grupo que consiste em NogoA, NogoB, NogoC, MAG e OM-gp.

Nalguns casos, a presente divulgação proporciona um método para inibição do colapso do cone de crescimento num neurónio, compreendendo o passo de contacto do neurónio com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio da presente divulgação, p.ex. do presente invento. Nalguns casos, a divulgação proporciona um método para diminuição da inibição do crescimento ou desenvolvimento de neurites num neurónio, compreendendo o passo de contacto do neurónio com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio da presente divulgação, p.ex. do presente invento. Nalguns casos, o neurónio é um neurónio do SNC. Nalguns destes métodos, o crescimento ou desenvolvimento de neurites é crescimento axónico. 38 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ

Nalguns casos, a presente divulgação proporciona um método de promoção da sobrevivência de um neurónio num mamifero, neurónio esse que está em risco de morrer, compreendendo (a) o proporcionar uma célula hospedeira cultivada expressando (i) um anticorpo anti-receptor Nogo-1 ou fragmento de ligação ao antigénio deste; ou (ii) um polipéptido solúvel do receptor Nogo-1; e (b) a introdução da célula hospedeira no mamifero no local do neurónio ou próximo deste. Almudena Ramon-Cueto, M. Isabel Cordero, Fernando F. Santos-Benito e Jesus Avila "Functional recovery of paralegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing cells", Neuron 25: 425-435, 2000.

Nalguns casos, a presente divulgação proporciona um método de terapia génica de promoção da sobrevivência de um neurónio em risco de morrer, neurónio esse que está num mamifero, compreendendo a administração no local do neurónio ou próximo deste de um vector virai compreendendo uma sequência nucleotidica que codifica (a) um anticorpo anti-receptor Nogo-1 ou fragmento de ligação ao antigénio deste; ou (b) um polipéptido solúvel do receptor Nogo-1, em que o anticorpo anti-receptor Nogo-1, fragmento de ligação ao antigénio, ou polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 é expresso a partir da sequência nucleotidica no mamifero numa quantidade suficiente para promover a sobrevivência do neurónio. Os vectores virais e métodos úteis para estas concretizações são descritos, p.ex., em Noêl et al., Human Gene Therapy 13. 1483-93, 2002.

Nalguns casos, a divulgação proporciona um método de inibição da ligação do receptor Nogo-1 a um ligando, compreendendo o passo de contacto do ligando com o polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 ou a proteína de fusão do receptor Nogo-1 da presente divulgação, p.ex. do presente invento.

Nalguns casos, a divulgação proporciona um método de modulação de uma actividade de um ligando do receptor Nogo-1, compreendendo o passo de contacto de um ligando do receptor Nogo-1 com um polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 ou uma proteína de fusão do receptor Nogo-1 da presente divulgação p.ex. do presente invento. 39 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ

Nalguns casos, a divulgação proporciona um método para inibição do colapso do cone de crescimento num neurónio, compreendendo o passo de contacto de um ligando do receptor Nogo-1 com um polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 ou uma proteína de fusão do receptor Nogo-1 da presente divulgação, p.ex. do presente invento. Nalguns casos, a divulgação proporciona um método para diminuição da inibição do crescimento ou desenvolvimento de neurites num neurónio, compreendendo o passo de contacto de um ligando do receptor Nogo-1 com o polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 ou a proteína de fusão do receptor Nogo-1 da presente divulgação, p.ex. do presente invento. Nalguns casos, o neurónio é um neurónio do SNC. Nalguns casos, o ligando é seleccionado de entre o grupo que consiste em NogoA, NogoB, NogoC, MAG e OM-gp. Nalguns casos, o crescimento ou desenvolvimento de neurites é crescimento axónico.

Qualquer um dos tipos de anticorpos ou receptores aqui descritos pode ser utilizado terapeuticamente. Nalguns casos, o anticorpo anti-receptor Nogo-1 é um anticorpo humano. Nalguns casos, o mamífero é um paciente humano. Nalguns casos, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste é administrado a um mamífero não humano expressando um receptor Nogo-1 com o qual o anticorpo reage de forma cruzada (p.ex., um primata, Macaca fascicularis ou macaco rhesus) para fins veterinários ou como um modelo animal de doença humana. Tais modelos animais podem ser úteis para avaliação da eficácia terapêutica dos anticorpos desta divulgação, incluindo os anticorpos deste invento.

Nalguns casos, a administração de anticorpo anti-receptor Nogo-1 ou fragmento de ligação ao antigénio, ou polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 ou proteína de fusão é utilizada para tratar uma lesão da espinal-medula para facilitar o crescimento axónico ao longo do local lesionado.

Os anticorpos anti-receptor Nogo-1 ou fragmentos de ligação ao antigénio, ou polipéptidos solúveis do receptor Nogo-1 ou proteínas de fusão da presente divulgação, incluindo os do presente invento, podem ser proporcionados sozinhos ou em combinação, ou em combinação sequencial com outros agentes 40 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ que modulem um determinado processo patológico. Por exemplo, os agentes anti-inflamatórios podem ser co-administrados após AVC como meio de bloqueio de mais danos neuronais e inibição da regeneração axónica. Tal como aqui se utiliza, os anticorpos do receptor Nogo-1, fragmentos de ligação ao antigénio, receptor Nogo-1 solúvel e proteínas de fusão do receptor Nogo, são referidos como sendo administrados em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais quando os dois são administrados simultaneamente, consecutivamente ou independentemente.

Os anticorpos anti-receptor Nogo-1, fragmentos de ligação ao antigénio, polipéptidos solúveis do receptor Nogo-1, ou proteínas de fusão do receptor Nogo-1 da presente divulgação, incluindo os do presente invento, podem ser administrados através das vias parentérica, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, por inalação ou bucal. Por exemplo, um agente pode ser administrado localmente num local de lesão através de microinfusão. Locais típicos incluem, mas não se limitam a, áreas lesionadas da espinal-medula resultando de ferimento. A dosagem administrada será dependente da idade, da saúde e do peso do receptor, do tipo de tratamento concorrente, se houver, da frequência do tratamento e da natureza do efeito desejado.

Os compostos desta divulgação, incluindo os do presente invento, podem ser utilizados in vivo, vulgarmente em mamíferos, tais como humanos, ovelhas, cavalos, gado, porcos, cães, gatos, ratos e ratinhos, ou in vitro. Os métodos e utilizações de acordo com o presente invento são expostos nas reivindicações anexas.

Vectores do Invento A presente divulgação, incluindo o presente invento, proporciona moléculas de ADN recombinante (ADNr) que contêm uma sequência de codificação. Tal como aqui se utiliza, uma molécula de ADNr é uma molécula de ADN que foi sujeita a manipulação molecular. Os métodos para geração de moléculas de ADNr são bem conhecidos na arte, por exemplo, ver Sambrook. et al., (1989) "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press. Nalgumas moléculas de ADNr, 41 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ uma sequência de ADN de codificação está operativamente ligada a sequências de controlo da expressão e sequências de vector. São também proporcionados vectores compreendendo os ácidos nucleicos que codificam os polipéptidos da presente divulgação, p.ex. os polipéptidos do presente invento. Os vectores que fazem parte do presente invento são expostos nas reivindicações anexas. A escolha do vector e das sequências de controlo da expressão às quais os ácidos nucleicos desta divulgação, p.ex. os ácidos nucleicos deste invento, são operativamente ligados depende directamente, tal como é bem conhecido na arte, das propriedades funcionais desejadas (p.ex., da expressão proteica e da célula hospedeira a transformar). Um vector da presente divulgação, p.ex. um vector do presente invento, pode ser pelo menos capaz de dirigir a replicação ou inserção no cromossoma hospedeiro, e de preferência também a expressão, do gene estrutural incluído na molécula de ADNr.

Os elementos de controlo da expressão que são utilizados para regulação da expressão de uma sequência de codificação de proteína operativamente ligada são conhecidos na arte e incluem, mas não se limitam a, promotores indutíveis, promotores constitutivos, sinais de secreção, e outros elementos reguladores. De preferência, o promotor indutível é facilmente controlado, tal como sendo responsivo a um nutriente no meio da célula hospedeira.

Num caso, p.ex. numa concretização, o vector contendo uma molécula de ácido nucleico codificadora incluirá um replicão procariótico, i.e., uma sequência de ADN possuindo a capacidade para dirigir a replicação autónoma directa e manutenção da molécula de ADN recombinante extra-cromossomicamente numa célula hospedeira procariótica, tal como uma célula hospedeira bacteriana, transformada com esta. Tais replicões são bem conhecidos na arte. Adicionalmente, vectores que incluam um replicão procariótico podem também incluir um gene cuja expressão confira um marcador detectável ou seleccionável tal como uma resistência a fármacos. Típicos dos genes bacterianos de resistência a fármacos são os que conferem resistência a ampicilina ou tetraciclina. 42 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ

Vectores que incluam um replicão procariótico podem ainda incluir um promotor procariótico ou bacteriófago capaz de dirigir a expressão (transcrição e tradução) das sequências génicas de codificação numa célula hospedeira bacteriana, tal como E. coli. Um promotor é um elemento de controlo da expressão formado por uma sequência de ADN que permite que ocorra ligação da ARN-polimerase e transcrição. Sequências promotoras compatíveis com hospedeiros bacterianos são tipicamente proporcionadas em vectores plasmídicos contendo locais de restrição convenientes para inserção de um segmento de ADN do presente invento. Exemplos de tais vectores plasmídicos são pUC8, pUC9, pBR322 e pBR329 (Bio-Rad® Laboratories), pPL e pKK223 (Pharmacia). Qualquer hospedeiro procariótico adequado pode ser utilizado para expressar uma molécula de ADN recombinante que codifica uma proteína da presente divulgação, p.ex. uma proteína do presente invento.

Vectores de expressão compatíveis com células eucarióticas, de preferência os compatíveis com células de vertebrado, podem também ser utilizados para formar moléculas de ADNr que contêm uma sequência de codificação. Os vectores de expressão de células eucarióticas são bem conhecidos na arte e estão disponíveis em várias fontes comerciais. Tipicamente, tais vectores são proporcionados contendo locais de restrição convenientes para inserção do segmento de ADN desejado. Exemplos de tais vectores são pSVL e pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1, pML2d (International Biotechnologies), pTDTl (ATCC® 31255) e outros vectores de expressão eucarióticos.

Os vectores de expressão de células eucarióticas utilizados para construir as moléculas de ADNr da presente divulgação, incluindo moléculas de ADNr do presente invento, podem ainda incluir um marcador seleccionável que seja eficaz numa célula eucariótica, de preferência um marcador de selecção de resistência a fármacos. Um marcador de resistência a fármacos preferido é o gene cuja expressão resulta em resistência a neomicina, i.e., o gene da neomicina-fosfotransferase (neo). (Southern et al., J. Mol. Anal. Genet. 1: 327-341, 1982). Alternativamente, o marcador seleccionável pode estar presente num plasmídeo separado, os dois vectores podem ser introduzidos através de co-transfecção da célula 43 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ hospedeira, e os transfectantes seleccionados através de cultura no fármaco apropriado para o marcador seleccionável.

Para expressar os anticorpos, ou porções de anticorpo da presente divulgação, p.ex. os anticorpos ou porções de anticorpo do presente invento, ADN que codifica as cadeias leves e pesadas parciais ou inteiras são inseridos nos vectores de expressão para que os genes fiquem operativamente ligados a sequências de controlo da transcrição e da tradução. Vectores de expressão incluem plasmideos, retrovirus, cosmideos, YAC, epissomas derivados de EBV e semelhantes. 0 gene do anticorpo é ligado num vector de modo a que as sequências de controlo da transcrição e tradução dentro do vector cumpram a sua função pretendida de regulação da transcrição e tradução do gene de anticorpo. 0 vector de expressão e as sequências de controlo da expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira da expressão utilizada. 0 gene da cadeia leve de anticorpo e o gene da cadeia pesada de anticorpo podem ser inseridos em vectores separados. Ambos os genes podem, no entanto, ser inseridos no mesmo vector de expressão. Os genes de anticorpo são inseridos no vector de expressão através de métodos padrão (p.ex., ligação de locais de restrição complementares no fragmento do gene de anticorpo e no vector, ou ligação de extremidades cegas se não estiverem presentes locais de restrição).

Um vector conveniente é um que codifica uma sequência de imunoglobulina de CH ou CL humana funcionalmente completa, com locais de restrição apropriados concebidos para que qualquer sequência de VH ou VL possa ser facilmente inserida e expressa, tal como descrito acima. Em tais vectores, a união ocorre geralmente entre o local dador de união na região J inserida e o local aceitador de união que precede a região C humana, e também nas regiões de união que ocorrem dentro dos exões de CH humanos. A poliadenilação e a terminação da transcrição ocorrem em locais cromossómicos nativos a jusante das regiões de codificação. 0 vector de expressão recombinante pode também codificar um péptido sinal que facilite a secreção da cadeia de anticorpo a partir de uma célula hospedeira. 0 gene da cadeia de anticorpo pode ser clonado no vector de modo a que o péptido sinal seja ligado enquadrado no terminal amino 44 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ do gene da cadeia de anticorpo. O péptido sinal pode ser um péptido sinal de imunoglobulina ou um péptido sinal heterólogo (i.e., um péptido sinal de uma proteina não imunoglobulina).

Para além de codificar os polipéptidos imunogénicos, anticorpos do receptor Nogo-1, fragmentos de ligação ao antigénio, polipéptidos solúveis do receptor Nogo-1 e proteinas de fusão solúveis do receptor Nogo-1 da presente divulgação, p.ex. do presente invento, os vectores de expressão recombinantes que são aqui divulgados possuem sequências reguladoras que controlam a sua expressão numa célula hospedeira. Será apreciado pelos peritos na arte que o desenho do vector de expressão, incluindo a selecção de sequências reguladoras pode depender de factores tais como a escolha da célula hospedeira a transformar, o nível de expressão da proteína desejada, etc. Sequências reguladoras preferidas para expressão em células hospedeiras de mamífero incluem elementos virais que dirigem elevados níveis de expressão proteica em células de mamífero, tais como promotores e/ou estimuladores derivados de LTR retrovirais, citomegalovírus (CMV) (tal como o promotor/estimulador de CMV) , Vírus Símio 40 (SV40) (tal como o promotor/estimulador de SV40), adenovírus, (p.ex., o promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP)), polioma e promotores de mamífero fortes tais como os promotores nativos da imunoglobulina e actina. Para mais descrição de elementos reguladores virais e sequências destes, ver, p.ex., Pat. U.S. 5168062 por Stinski, Pat. U.S. 4510245 por Bell et al. e Pat. U.S. 4968615 por Schaffner et al.

Para além dos genes e sequências reguladoras heterólogos, os vectores de expressão recombinantes da presente divulgação, incluindo os do presente invento, podem possuir sequências adicionais, tais como sequências que regulam a replicação do vector em células hospedeiras (p.ex., origens de replicação) e genes marcadores seleccionáveis. O gene marcador seleccionável facilita a selecção de células hospedeiras nas quais o vector foi introduzido (ver p.ex., Pat. U.S. Nos. 4399216, 4634665 e 5179017, todas por Axel et al.) . Por exemplo, tipicamente o gene marcador seleccionável confere resistência a fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, numa célula hospedeira na qual o vector foi introduzido. Genes marcadores 45 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ seleccionáveis preferidos incluem o gene da di-hidrofolato-redutase (DHFR) (para utilizar em células hospedeiras dhfr~ com selecção/amplificação com metotrexato) e o gene neo (para selecção com G418). Células Hospedeiras e Métodos de Produção Recombinante das Proteínas do Invento

Moléculas de ácido nucleico que codificam anticorpos anti-receptor Nogo-1, péptidos imunogénicos, polipéptidos solúveis do receptor Nogo-1, ou proteínas de fusão solúveis do receptor Nogo-1 desta divulgação, p.ex. deste invento, e vectores compreendendo estas moléculas de ácido nucleico, podem ser utilizados para transformação de uma célula hospedeira adequada. A transformação pode ser através de qualquer método para introdução de polinucleótidos numa célula hospedeira. Os métodos para introdução de polinucleótidos heterólogos em células de mamífero são bem conhecidos na arte e incluem transfecção mediada por dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplastos, electroporação, encapsulação do polinucleótido(s) em lipossomas, e microinjecção directa do ADN nos núcleos. Adicionalmente, as moléculas de ácido nucleico podem ser introduzidas em células de mamífero através de vectores virais. A transformação de células hospedeiras apropriadas com uma molécula de ADNr da presente divulgação, p.ex. uma molécula de ADNr do presente invento, é alcançada através de métodos bem conhecidos que dependem tipicamente do tipo de vector utilizado e do sistema hospedeiro empregue. Em relação à transformação de células hospedeiras procarióticas, podem ser empregues métodos de electroporação e de tratamento salino (ver, por exemplo, Sambrook et al., (1989) "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69, 2110-2114, 1972). Em relação à transformação de células de vertebrado com vectores contendo ADNr, podem ser empregues métodos de electroporação, lípidos catiónicos ou tratamento salino (ver, por exemplo, Graham et al., Virology 52: 456-467, 1973; Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76: 1373-1376, 1979). 46 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ

As células transformadas com sucesso, i.e., as células que contêm uma molécula de ADNr da presente divulgação, p.ex. uma molécula de ADNr do presente invento, podem ser identificadas através de técnicas bem conhecidas incluindo a selecção de um marcador seleccionável. Por exemplo, as células resultando da introdução de um ADNr da presente divulgação, p.ex. uma molécula de ADNr do presente invento, podem ser clonadas para produzir colónias individuais. As células destas colónias podem ser colhidas, lisadas e o seu teor de adn examinado quanto à presença do ADNr utilizando um método tal como o descrito por Southern, J. Mol. Biol. 98: 503-517, 1975 ou as proteínas produzidas a partir da célula podem ser ensaiadas através de um método imunológico.

Linhas celulares de mamífero disponíveis como hospedeiros para expressão são bem conhecidas na arte e incluem muitas linhas celulares imortalizadas disponíveis em American Type Culture Collection (ATCC®) . Estas incluem, ínter alia, células de ovário de hamster chinês (CHO), células NSO, SP2, células HeLa, células de rim de hamster bebé (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (p.ex., Hep G2), células A549 e várias outras linhas celulares. Linhas celulares de particular preferência são seleccionadas através da determinação de que linhas celulares têm elevados níveis de expressão. Outras linhas celulares que podem ser utilizadas são linhas celulares de insecto, tais como as células Sf9. Quando vectores de expressão recombinantes codificando os polipéptidos imunogénicos, anticorpos do receptor Nogo-1 ou fragmentos de ligação ao antigénio, polipéptidos solúveis do receptor Nogo-1 e proteínas de fusão solúveis do receptor Nogo-1 da presente divulgação, p.ex. do presente invento, são introduzidos em células hospedeiras de mamífero, estes são produzidos através de cultura das células hospedeiras durante um periodo de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo, polipéptido e polipéptido de fusão nas células hospedeiras ou, de preferência, secreção dos polipéptidos imunogénicos, anticorpos do receptor Nogo-1 ou fragmentos de ligação ao antigénio, polipéptidos solúveis do receptor Nogo-1 e proteínas de fusão solúveis do receptor Nogo-1 para o meio de cultura em que as células hospedeiras são criadas. Os polipéptidos imunogénicos, anticorpos do receptor Nogo-1 ou 47 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ fragmentos de ligação ao antigénio, polipéptidos solúveis do receptor Nogo-1 e proteínas de fusão solúveis do receptor Nogo-1 da presente divulgação, p.ex. do presente invento, podem ser recuperados a partir do meio de cultura utilizando métodos padrão de purificação de proteínas.

Mais, a expressão dos polipéptidos imunogénicos, anticorpos do receptor Nogo-1 ou fragmentos de ligação ao antigénio, polipéptidos solúveis do receptor Nogo-1 e proteínas de fusão solúveis do receptor Nogo-1 da presente divulgação, p.ex. do presente invento, (ou outras porções destes) a partir de linhas celulares de produção pode ser estimulada utilizando várias técnicas conhecidas. Por exemplo, o sistema de expressão do gene da glutamina-sintetase (o sistema GS) é uma abordagem vulgar para aumentar a expressão sob certas condições. 0 sistema GS é discutido no todo ou em parte em ligação com as Patentes Europeias Nos. 0216846, 0256055 e 0323997 e o Pedido de Patente Europeia N.° 89303964.4. Células Hospedeiras São também proporcionadas células transformadas com uma molécula de ácido nucleico que codifique um anticorpo do receptor Nogo-1, fragmento de ligação ao antigénio, polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 e/ou proteína de fusão solúvel do receptor Nogo-1 da presente divulgação, p.ex. uma proteína de fusão do presente invento. Certas células hospedeiras da presente divulgação proporcionam outros aspectos do presente invento tal como exposto nas reivindicações anexas. As células hospedeiras podem ser procarióticas ou eucarióticas. As células eucarióticas úteis para expressão de uma proteína da presente divulgação, p.ex. uma proteína do presente invento, não estão limitadas, desde que a linha celular seja compatível com métodos de cultura celular e compatíveis com a propagação do vector de expressão e expressão do produto génico. Células hospedeiras eucarióticas preferidas incluem, mas não se limitam a, células de levedura, insecto e mamífero, de preferência células de vertebrado tais como as de uma linha celular de ratinho, rato, macaco ou humana. Exemplos de células hospedeiras eucarióticas úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO) 48 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ disponíveis em ATCC como CCL61, células de embrião de ratinho Swiss de NIH NIH-3T3 disponíveis em ATCC como CRL1658, células de rim de hamster bebé (BHK), e linhas celulares de cultura de tecidos eucarióticas semelhantes.

Produção de Proteínas Recombinantes utilizando uma Molécula de ADNr São também proporcionados métodos para produção de um anticorpo do receptor Nogo-1 ou fragmento de ligação ao antigénio, polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 e/ou proteína de fusão solúvel do receptor Nogo-1 da presente divulgação, p.ex. do presente invento, utilizando moléculas de ácido nucleico aqui descritas. Em termos gerais, a produção de uma forma recombinante de uma proteína envolve tipicamente os seguintes passos:

Primeiro, é obtida uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína da presente divulgação, p.ex. uma proteína do presente invento. Se a sequência codificadora não for interrompida por intrões, é directamente adequada para expressão em qualquer hospedeiro. A molécula de ácido nucleico é então opcionalmente colocada em ligação operativa com sequências de controlo adequadas, tal como descrito acima, para formar uma unidade de expressão contendo o enquadramento de leitura aberto da proteína. A unidade de expressão é utilizada para transformar um hospedeiro adequado e o hospedeiro transformado é cultivado sob condições que permitam a produção da proteína recombinante. Opcionalmente a proteína recombinante é isolada do meio ou das células; a recuperação e purificação da proteína podem não ser necessárias nalguns casos onde algumas impurezas podem ser toleradas.

Cada um dos passos anteriores pode ser feito numa variedade de modos. Por exemplo, as sequências de codificação desejadas podem ser obtidas a partir de fragmentos genómicos e utilizadas directamente em hospedeiros apropriados. A construção de vectores de expressão que sejam operativos numa variedade de hospedeiros é alcançada utilizando replicões apropriados e sequências de controlo, tal como exposto acima. 49 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ

As sequências de controlo, vectores de expressão e métodos de transformação são dependentes do tipo de célula hospedeira utilizada para expressar o gene e foram discutidos em detalhe anteriormente. Locais de restrição adequados podem, se não estiverem normalmente disponíveis, ser adicionados às extremidades da sequência de codificação para proporcionar um gene excisável para inserir nestes vectores. Um perito na arte pode adaptar facilmente qualquer sistema hospedeiro/expressão conhecido na arte para utilizar com as moléculas de ácido nucleico da presente divulgação, p.ex. com as moléculas de ácido nucleico do presente invento, para produzir proteína recombinante. Certos métodos de produção de proteínas da presente divulgação proporcionam ainda outros aspectos do presente invento tal como exposto nas reivindicações anexas.

Para que este invento possa ser melhor compreendido, são expostos os seguintes exemplos. Estes exemplos são apenas para fins de ilustração e não devem ser entendidos como limitando de modo algum o âmbito do presente invento. EXEMPLO 1

Produção de Anticorpos Monoclonais de Murídeo Anti-Receptor Nogo-1

Anticorpos anti-receptor Nogo-1 que se ligam especificamente a um polipéptido imunogénico do receptor Nogo-1 do presente invento foram produzidos utilizando os seguintes métodos e procedimentos.

Imunizações

Foram utilizadas duas abordagens de imunização: 1. Células COS-7 ou Membranas Celulares Contendo Receptor Nogo-1 (NogoR-1) como Imunogénio 0 gene do receptor Nogo-1 de rato (GenBank™ N.° AF 462390) foi subclonado no vector de expressão de mamífero pEAGl256 (Biogen®) que continha o promotor CMV e o gene de resistência a geneticina para selecção pelo fármaco. O plasmídeo recombinante foi transfectado em células COS-7 50 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ utilizando Superfect (Qiagen®) . Os transfectantes foram seleccionados utilizando geneticina (Gibco™, 2 mg/ml), clonados e verificados quanto à expressão superficial da proteina do receptor Nogo-1 através de FACS. As membranas de COS-7 foram preparadas a partir destas células de acordo com procedimentos tal como os descritos (Wang et al., J. Neurochem. 75: 1155-1161, 2000) com duas lavagens, e armazenadas a 1 mg/ml (concentração proteica) em glicerol a 10% a -70°C.

Ratinhos RBF fêmeas de oito semanas (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) foram imunizados intraperitonealmente com uma emulsão contendo 50 g de membranas de COS-7 com receptor Nogo-1 de rato ou células COS-7 inteiras expressando o receptor Nogo-1 à superfície e 50 μΐ de adjuvante RIBI MPL+TDM+CWS (Sigma® Chemical Co., St. Louis, MO) uma vez cada duas semanas (Lipman et ai., 1992). Os soros dos ratinhos imunizados foram colhidos antes da primeira imunização, 7 dias após a segunda e terceira imunizações, e 38 dias após a terceira imunização e os títulos de anticorpo anti-receptor Nogo-1 foram medidos através de ELISA tal como descrito abaixo. 2. Péptidos Específicos do Receptor Nogo-1 como Imunogénio A sequência do gene do receptor Nogo-1 de rato foi sujeita a análises de antigenicidade utilizando o suporte lógico Vector NTi™ (Fig. 2) . Os péptidos antigénicos, identificados nas análises foram conjugados com Hemocianina da Lapa (KLH) utilizando procedimentos padrão de glutaraldeído.

Ratinhos RBF fêmeas de oito semanas (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) foram imunizados intraperitonealmente com uma emulsão contendo 50 pg de péptidos conjugados com KLH e 50 μΐ de adjuvante completo de Freund (Sigma® Chemical Co., St. Louis, MO) uma vez cada duas semanas. O soro dos ratinhos imunizados foi colhido antes da primeira imunização e 1 semana após a segunda e terceira imunizações, e os títulos de anticorpo anti-receptor Nogo-1 foram medidos. Foi dada uma dose de reforço após a terceira imunização. Três dias após esta imunização em dose de reforço, foram iniciadas experiências de fusão. 51 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ

Produção e pesquisa de hibridomas

Os soros de ratinhos imunizados com péptidos antigénicos do receptor Nogo-1 foram pesquisados através de ELISA enquanto os soros de ratinhos imunizados com células COS-7 expressando o receptor Nogo-1 foram pesquisados através de citometria de fluxo. Os ratinhos que foram positivos para anticorpos que se ligavam especificamente a células COS-7 com receptor Nogo-1 foram identificados através de citometria de fluxo e foram sacrificados. Esplenócitos foram isolados dos ratinhos e fundidos com o mieloma FL653 (um derivado APRT- de um mieloma de ratinho Balb/c Ig-/HGPRT-, mantido em DMEM contendo FBS a 10%, 4500 mg/1 de glicose, L-glutamina 4 mM, e 20 mg/ml de 8-azaguanina) tal como descrito (Kennett et al., 1993, "Monoclonal Antibodies: A New Dimension in Biological

Analysis". Plenum Press, New York). As células fundidas foram plaqueadas em placas de 24 ou 48 poços (Corning Glass Works, Corning, NY), e alimentadas com adenina, aminopterina e timidina contendo meio de cultura. As culturas resistentes a AAT foram pesquisadas através de ELISA ou citometria de fluxo quanto à ligação a células COS-7 com receptor Nogo-1 ou a um péptido antigénico do receptor Nogo-1 tal como descrito abaixo. As células nos poços positivos foram ainda subclonadas através de diluição limitante.

Para pesquisar quanto à ligação do anticorpo a um péptido antigénico do receptor Nogo-1, os péptidos que foram utilizados como imunogénios foram conjugados com BSA. 0,5 pg do péptido conjugado em 50 μΐ de tampão bicarbonato de sódio 0,1 M, pH 9,0 foram adicionados a cada poço de uma placa de 96 poços MaxiSorp (Nunc™) . A placa foi então incubada a 37°C durante 1 hora ou 4°C durante 16 horas e os locais de ligação não especifica foram bloqueados utilizando HEPES 25 mM, pH 7,4 contendo BSA a 0,1%, ovalbumina a 0,1%, BLOTTO a 0,1% e azida a 0,001%. O sobrenadante do hibridoma foi adicionado e incubado a 25°C durante 1 hora. Após lavagem três vezes com PBS, 50 μΐ de uma diluição 1:10000 de anticorpo secundário de cabra anti-ratinho conjugado com peroxidase de rábano (Jackson immunoResearch Inc.) foram adicionados a cada poço e incubados durante mais 1 hora. Após três lavagens, a cor foi revelada através de TMB (Pierce) e fixada com ácido sulfúrico 2 Μ. A intensidade da cor foi monitorizada num espectrofotómetro a 450 nm. 52 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ

Os anticorpos foram pesquisados quanto à liqação ao receptor Nogo-1 inteiro como se segue. Células COS-7 foram marcadas com 0,1 μΜ de CellTracker™ Green CMFDA1 (Molecular Probes, Eugene, OR) tal como descrito pelo vendedor. Foram misturados volumes iguais de células de controlo marcadas com CellTracker™ com células COS-7 com receptor Nogo-1 lavadas antes da incubação com os soros anti-receptor Nogo-1 de teste. Cinquenta microlitros da mistura celular foram dispensados em cada poço de uma placa de 96 poços de poliestireno de fundo em V (Costar® 3877, Corning, NY) e 100 μΐ de sobrenadante de hibridoma ou foi adicionado um anticorpo anti-receptor Nogo-1 de controlo. Após incubação a 4°C durante 30 minutos, as células foram lavadas e incubadas com 50 μΐ de anticorpo secundário especifico fragmento F(ab')2 de cabra anti-Fc gama de IgG de ratinho conjugado com R-ficoeritrina purificado por afinidade (1:200, Jackson ImmunoResearch Laboratory, West Grove, PA) em PBS. No final da incubação, as células foram lavadas duas vezes com PBS e suspensas em 200 μΐ de PBS contendo FBS a 1%, e sujeitas a análises FACS. Alternativamente, células COS-7 com receptor Nogo-I foram misturadas com sobrenadante de hibridoma e depois tratadas com anticorpo secundário de cabra anti-ratinho conjugado com R-ficoeritrina e directamente sujeitas a análises FACS padrão.

Gerámos 25 anticorpos anti-receptor Nogo-1 utilizando uma variedade de imunogénios. Gerámos dois anticorpos, 7E11 e 5B10, utilizando uma sequência peptidica correspondendo aos residuos 110-125 do receptor Nogo-1 de rato como imunogénio. Gerámos três anticorpos, 1H2, 3G5 e 2F7, utilizando membranas preparadas a partir de células COS7 transfectadas com receptor Nogo-1 de rato inteiro como imunogénio. Gerámos 13 anticorpos utilizando sNogoR310-Fc como imunogénio (1D9.3, 1E4.7, 1B4.3, 2C4.3, 1F10.3, 2H1.4, 1H3.3, 1G4.1, 1E4.1, 2G7.1, 2C4.1, 2F11.1 e 1H4.1) e 7 anticorpos utilizando uma sequência peptidica correspondendo aos residuos 423-434 do receptor Nogo-1 de rato como imunogénio (2E8.1, 2G11.2 e 1B5.1).

Análise da Sequência dos Anticorpos Monoclonais 7Eli e 5B10

Extraímos ARN total utilizando o estojo Qiagen® RNeasy® mini, e gerámos ADNc a partir do ARN isolado. Amplificámos a sequência da cadeia leve por PCR utilizando os iniciadores 53 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ 5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3' (SEQ ID Ν0:12) e 5'-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3' (SEQ ID ΝΟ:25). Amplificámos a sequência da cadeia pesada por PCR utilizando os iniciadores 5'-GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3' (SEQ ID NO:13) e 5'-GGGGATATCCACCATGAGGKCCCCWGCTCAGYTYCTKGGA-3' (SEQ ID NO:14). Estes iniciadores compreendem nucleótidos degenerados como se segue: S representa G ou C; M representa A ou C; R representa G ou A; W representa A ou T; K representa G ou T; e Y representa T ou C. Clonámos os fragmentos de PCR num vector de sequenciação e determinámos a sequência de ADN das CDR através de terminação da cadeia didesoxi utilizando iniciadores específicos para o vector de sequenciação. Traduzimos conceptualmente as sequências de ADN e as sequências de aminoácidos parciais das regiões CDR das cadeias pesadas e leves dos anticorpos monoclonais 7E11 e 5B10 são mostradas na Tabela 2. As 3 CDR das cadeias pesadas e leves dos mAb estão sublinhadas na Tabela 2. As cadeias leves de 7E11 e 5B10 têm uma identidade de sequência de aminoácidos de 94% e as cadeias pesadas têm uma identidade de sequência de aminoácidos de 91%. Os mAb 7E11, 5B10 e 1H2 são do isotipo IgGl e os mAb 3G5 e 2F7 são do isotipo IgG2a. Cada um destes cinco mAb tem uma cadeia leve do isotipo capa. Analisámos a sequência dos outros anticorpos monoclonais através desta abordagem. 54 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ

Tabela 2 Sequência de Aminoácidos dos mAb 7E11 e 5B10 Sequência SEQ ID NO: Cadeia Leve de 7E11 MKLPVRLLVLMFWIPASSSDWMTQTPLSLPVSLGDQASISC RSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPD RFSGSGSGTDFTLKISRVDAEDLGVYFCSQSTHVPFTFGGGT KLEIKRADAAPTVSISHH 15 Cadeia Leve de 5B10 MKLPVRLLVLMFWIPASSSDWMTQTPLSLPVSLGDQASISC RSSQSLVHSNGYTYLHWYLQRPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPD RFSGSGSGTDFTLKISRVDAEDLGVYFCSQSTHVPYTFGGGT KLEIKRADAAPTVSISHH 16 Cadeia Pesada de 7E11 VQLQESGAELVMPGASVKMSCKASGYTFTDYWMHWVKQRPGQ GLEWIGAIDPSDSYSSYNQNFKGKATLTVDGSSSTAYMQLSS LTSEDSAVYYCARRITEAGAWFAYWGQGTTVT 17 Cadeia Pesada de 5B10 LQXSGAEIVMPGTAVTMSCKASGYTFTDFWMHWVKQRPGQGL EWIGAIDPSDSYSRINQKFKGKATLTVDESSSTAYMQLSSLT S ED S AVYY CARRITEAGAW FAYWGQGTT VT 18

Inibição da Ligação do Ligando ao Receptor Nogo-1 Solúvel pelo Anticorpo Monoclonal Anti-receptor Nogo-1

Testámos os anticorpos monoclonais anti-receptor Nogo-1 produzidos tal como descrito acima para determinar se inibiam a ligação do ligando ao receptor Nogo-1.

0,5 pg de uma proteina de fusão solúvel do receptor Nogo-1 compreendendo os resíduos de aminoácido 26-344 do receptor Nogo-1 de rato e a região charneira e Fc da molécula igGl de rato (sNogoR344-Fc) produzido tal como descrito abaixo foram imobilizados em 250 pg de contas SPA conjugadas com proteína-A ou aglutinina de gérmen de trigo (Amersham Pharmacia Biotech) durante 2 horas a 25°C. As contas SPA 55 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ conjugadas com mAb Fc-sNogoR-1, anti-receptor Nogo-1 e 1 μΐ de 125l-Nogo66 (Amersham, 2000 Ci/mmol, 1 nM) em 50 μΐ do meio de incubação tamponado com HEPES (HEPES 10 mM, pH 7,4, albumina de soro bovino a 0,1%, ovalbumina a 0,1%, MgCl2 2 mM, CaCl2 2 mM e inibidores de proteases) foram adicionadas a cada poço de amostra. Após 16 horas, a radioactividade foi medida em amostras em quadruplicado utilizando um TopCount® (Packard). Os valores de CI5o foram calculados a partir de uma análise de ajuste à curva (Fig. 3) (PRISM, GraphPad Software, NJ). Nalgumas experiências, utilizámos também conjugados AP-ligando (p.ex. AP-Nogo66) e detectámos a ligação através de monitorização da actividade da fosfatase alcalina. Ensaiámos também a capacidade dos mAb para bloquearem a ligação dos ligandos MAG-Fc e AP-OM-gp ao receptor Nogo-1.

Os anticorpos monoclonais 7E11, 5B10, 1H2, 3G5 e 2F7 inibiram todos a ligação de Nogo66, MAG e OM-gp a sNogoR344-Fc. A CI50 calculada para Nogo66 para 7E11 e 1H2 foi de 400 nM e 60 nM, respectivamente. Os dados dos ELISA monitorizando a inibição mediada por mAb da ligação dos três ligandos ao receptor Nogo-1 estão resumidos na Tabela 3.

Tabela 3. mAb que Inibem a Ligação de Nogo66, MAG e OM-gp ao Receptor Nogo-1.

mAb MAG + sNogoR344-Fc Nogo66 + sNogoR344-FC OM-gp + sNogoR344-Fc 7E11 30 nM (60%) CE50 = 0,5 μΜ CE50 = 1,7 μΜ CE50 = 150 nM 1H2 30 nM (60%) ND ND 3G5 30 nM (60%) CE5o = 9 nM ND 2F7 30 nM (55%) CE50 = 10 nM CE50 = 5 nM 1D9.3 30 nM (70%) CE5o = 2,7 nM CE50 = 13 nM CE50 = 5,2 nM 2G7.1 30 nM (84%) CE50 = 18 nM CE50 = 1 nM 1E4.1 30 nM (75%) CES0 = 2,8 nM - CE50 = 9,1 nM 1G4.1 30 nM (90%) CE50 = 9,9 nM - CE50 = 8,2 nM 2C4.1 30 nM (50%) - ND 2F11.1 30 nM (45%) ND ND 1H4.1 - ND ND 56 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ

mAb MAG + sNogoR344-Fc Nogo66 + sNogoR344-FC OM-gp + sNogoR344-Fc 2E8.1 30 nM (87%) CE50 = 9,2 nM CE50 = 1,5 nM CES0 = 42,9 nM 2G11.2 30 nM (80%) ND ND 1B5.1 30 nM (0%) ND ND A percentagem de deslocamento é mostrada a 30 nM de anticorpo e a CE50 para certos mAb determinada a partir da análise do ajuste à curva tal como descrito. indica ausência de actividade detectável e "ND" indica não determinado. EXEMPLO 2

Produção de Anticorpos Anti-Receptor Noqo-1 Fab-Faqos

Anticorpos anti-receptor Nogo-1 Fab-fagos que se ligam especificamente a um polipéptido imunogénico do receptor Nogo-1 do presente invento foram também produzidos através de pesquisa de uma biblioteca fágica de Fab como se segue. A biblioteca fágica de Fab MorphoSys HuCAL® GOLD foi pesquisada contra a proteína sNogoR310-Fc solúvel de rato recombinante e células COS7 expressando o receptor Nogo-1 de rato. Os Fab-fagos que se ligaram especificamente ao receptor Nogo-1 foram purificados e caracterizados. A cadeia pesada de 14D5 é derivada do gene de VH2 e a cadeia leve é derivada do gene de VK1. As sequências de aminoácidos das CDR de uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um destes Fab-fagos, 14D5, são mostradas na Tabela 4.

Tabela 4. Sequência de Aminoácidos das CDR de 14D5

Sequência de Aminoácidos SEQ ID NO: CDRl da Cadeia Pesada GFSLSTSGGSVG 19 CDR2 da Cadeia Pesada LIYSNDTKYYSTSLKT 20 Cadeia Pesada CDR3 da SRFWTGEYDV 21 CDRl da Cadeia Leve RASQNIAITLN 22 CDR2 da Cadeia Leve LASSLQS 23 CDR3 da Cadeia Leve QQYDNYPL 24 57 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ 14D5 liga-se ao receptor Nogo-1 de rato em ambas as formas monovalente e bivalente. Adicionalmente, 14D5 liga-se ao receptor Nogo-1 de ratinho e humano e ao receptor Nogo-2 humano mas não ao receptor Nogo-3 de ratinho. EXEMPLO 3 imunoprecipitação do Receptor Nogo-1 pelos Anticorpos Monoclonais Anti-receptor Nogo-1

Para efectuar a imunoprecipitação, 100 μΐ de células lisadas ou 50 μΐ de células tratadas com PiPLC foram misturados com 400 ou 450 μΐ de tampão de extracção (Tris-HCl 10 mM, pH 7,2, Tween-20™ a 0,5%, PMSF 0,2 mM) ou tampão RIPA, respectivamente na presença de 30 μΐ de Proteína A ou G e 1-2 pg de anticorpo. A mistura foi incubada num misturador a 4°C durante 16 horas.

As amostras foram centrifugadas suavemente para sedimentar as contas conjugadas com proteína A ou G. As contas foram lavadas três vezes com 1 ml de tampão de lavagem (Tris-HCl 10 mM, pH 7,2, Tween-20™ a 0,1%). A lavagem final foi efectuada utilizando 10% do tampão de lavagem original.

As contas foram ressuspensas em 100 μΐ de SDS 2χ com beta-mercaptoetanol a 10%. As amostras foram incubadas à temperatura ambiente antes de serem corridas num gel de Tris-Glicina a 4-20% para SDS-PAGE. Conforme determinado através de análise em gel de SDS-PAGE, os anticorpos monoclonais, 3G5 e 2F7, imunoprecipitaram o receptor Nogo-1. EXEMPLO 4

Determinação da Especificidade do Anticorpo através de ELISA

Para determinar a especificidade dos anticorpos monoclonais e Fab-fagos produzidos nos Exemplos 1 e 2, efectuámos um ELISA utilizando um painel de polipéptidos do receptor Nogo-1. O painel consistiu em sNogoR310-Fc (uma proteína de fusão compreendendo os aminoácidos 26-310 do receptor Nogo-1 de rato e um fragmento Fc de rato), sNogoR344- 58 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ

Fc (ver supra), polipéptido p-617 (SEQ ID N0:1), polipéptido p-618 (um polipéptido de 19 aminoácidos da região LRR7 do receptor Nogo-1 de rato; Fig. 2; SEQ ID N0:11) e polipéptidos p-4 e p-5 (polipéptidos das regiões LRR5 e LRRCT do receptor Nogo-1, respectivamente). Ovalbumina e BSA foram utilizadas como controlos. Tal como mostrado na Fig. 4, os mAb 1H2, 3G5 e 2F7 ligaram-se todos especificamente a sNogoR344-Fc. Em experiências semelhantes, esses anticorpos também se ligaram especificamente a um polipéptido consistindo nos aminoácidos 310-344 do receptor Nogo-1 de rato (SEQ ID NO:3) e os mAb 7E11 e 5B10 ligaram-se especificamente ao polipéptido p-617 (SEQ ID NO:1).

Dez dos anticorpos (1D9.3, 1E4.7, 1B4.3, 2C4.3, 1F10.3, 2H1.4, 1H3.3, 1G4.1, 1E4.1 e 2G7.1) da imunização com sNogoR310-Fc deslocaram-se uns aos outros para ligação, indicando que reconhecem epitopos semelhantes ou sobrepostos em sNogoR310-Fc. Os outros três anticorpos da imunização com sNogoR310-Fc (2C4.1, 2F11.1 e 1H4.1) reconhecem epitopos diferentes localizados nos resíduos de aminoácido 26-310.

Efectuámos também ensaios de ligação ELISA utilizando o Fab-fago 14D5. Onde se deixou que os ligandos AP-Nogo66, AP-OM-gp e MAG-Fc se ligassem a sNogoR344-Fc imobilizado, 14D5 1 μΜ inibiu completamente a ligação de Nogo e MAG. Foram necessários 10 μΜ de 14D5 para inibir completamente a ligação de OM-gp a sNogoR344-Fc. EXEMPLO 5

Ensaio de Crescimento de Neurites

Para testar a capacidade dos anticorpos monoclonais e Fab-fagos produzidos acima para diminuir o efeito inibidor da mielina do SNC nos neurónios, lâminas de cultura Lab-Tek® (4 poços) foram revestidas com 0,1 mg/ml de poli-D-lisina (Sigma®) . Mielina do SNC ou PBS foi aplicado como gotas de 3 μΐ. Foram adicionadas microesferas fluorescentes (Polysciences) à mielina/PBS para permitir a posterior identificação das gotas (Grandpre et al., Nature 403: 2000). As lâminas Lab-Tek® foram então lavadas e revestidas com 10 pg/ml de laminina (Gibco™) . Os gânglios da raiz dorsal (GRD) de crias de rato Sprague Dawley P3-4 foram dissociados 59 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ com 1 mg/ml de colagenase de tipo 1 (Worthington), triturados com pipetas de Pasteur polidas com fogo, pré-plaqueados para enriquecer em células neuronais e finalmente plaqueados a 23 000 células/poço nas lâminas de cultura Lab-Tek® pré-revestidas. O meio de cultura era F12 contendo soro de cavalo dador inactivado com calor a 5%, soro fetal bovino inactivado com calor a 5% e 50 ng/ml de mNGF e foram incubadas a 37°C e CO2 a 5% durante 6 horas. Foram adicionados 15 pg/ml de mAb 7E11 imediatamente após plaqueamento.

As lâminas foram fixadas durante 20 minutos com paraformaldeido a 4% contendo sacarose a 20% e coradas para o marcador neuronal anti-beta-III-tubulina (Covance TUJl) diluido 1:500. Como anticorpo secundário anti-ratinho-Alexa Fluo®594 (Molecular Probes) foi diluido 1:300 e as lâminas foram montadas com Gel/Mount™ (Biomeda™) . Foram adquiridas imagens digitais a 5x com suporte lógico OpenLab™ que foram analisadas utilizando o suporte lógico MetaMorph® para quantificação do crescimento de neurites. O mAb 7E11 protegeu os neurónios de GRD de inibição mediada por mielina do crescimento de neurites (Fig. 5). Resultados semelhantes foram observados com os mAb 1H2 e 3G5.

Num ensaio de protecção do crescimento de neurites onde neurónios de GRD de ratos P7 foram cultivados num substrato de mielina do SNC, 14D5 bivalente também promoveu eficientemente o crescimento de neurites. EXEMPLO 6

Imuno-histoquímica com 7E11 em Células Transfectadas com Receptor Nogo-1

Para melhor caracterizar as propriedades de ligação dos mAb anti-receptor Nogo-1 produzidos tal como descrito no Exemplo 1, comparámos a ligação a ambas células COS-7 ou 293 fixadas e vivas expressando receptor Nogo-1 de rato ou humano. Células fixadas: Células transfectadas e não transfectadas com o receptor Nogo-1 foram plaqueadas em lâminas de cultura de 8 poços Lab- 60 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ

Tek®, fixadas com paraformaldeído a 4% durante 15 minutos, bloqueadas com soro de cabra normal a 10%, Triton X-100 a 0,1% em PBS durante 1 hora. O mAb 7E11 foi adicionado a 15 pg/ml e 1.5 pg/ml em solução de bloqueio e incubado durante 2 horas à temperatura ambiente; anticorpo secundário anti-ratinho conjugado com Alexa® (Molecular Probes) foi incubado a uma diluição 1:300 em solução de bloqueio durante 1 hora; DAPI foi adicionado a 5 pg/ml ao anticorpo secundário para marcar todos os núcleos. Células vivas: Células transfectadas e não transfectadas foram plaqueadas em lâminas de cultura de 8 poços Lab-Tek®, bloqueadas com tampão FACS (contendo soro de cavalo dador a 4%) durante 30 minutos a 4°C, incubadas com 7E11 a 15 pg/ml e 1.5 pg/ml em tampão FACS durante 1 hora a 4°C, lavadas e incubadas com anticorpo secundário anti-ratinho-Alexa® (1:300 em tampão FACS) durante 30 minutos a 4°C.

As experiências de coloração imuno-histoquimica demonstraram que todos os mAb se ligaram a células expressando o receptor Nogo-1 de rato. Os mAb 7E11, 2G7.1 e 2C4.1 ligaram-se tanto a células fixadas como vivas expressando o receptor Nogo-1 humano. EXEMPLO 7

Modelo de Ratinho de Lesão Contundente da Espinal-medula

Para testar o efeito dos mAb anti-receptor Nogo-1 produzidos no Exemplo 1 em neurónios in vivo, utilizámos um modelo de lesão contundente da espinal-medula de ratinho.

Ratinhos fêmea (18-22 g) são tratados profilacticamente com agentes analgésicos e antibióticos. Os ratinhos são anestesiados e colocados num aparelho estereotáxico com fixação da coluna vertebral sob um estereomicroscópio. O traumatismo da espinal-medula é introduzido através de uma versão modificada do método da queda de peso (M. Li et al., "Functional role and therapeutic implications of neuronal caspase-1 and -3 in a mouse model of traumatic spinal cord injury". Neuroscience Vol. 99, págs. 333-342, 2000). 61 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ

Resumidamente, é feita uma laminectomia em T9 e TIO e a coluna vertebral é estabilizada utilizando um par de grampos transversos de ratinho suportando os processos transversos T9-T10 bilateralmente. Uma vareta de aço inoxidável de impacto com um diâmetro de 1,4 mm e peso de 2 g, é elevada 2,5 cm acima da dura e deixada cair sobre a espinal-medula ao nivel de TIO. Durante a cirurgia, os ratinhos são mantidos num cobertor aquecido a 37°C e é administrado subcutaneamente 1 ml de solução salina estéril aquecida a cada ratinho após cirurgia para evitar desidratação. A bexiga é manualmente espremida uma vez por dia até ser recuperado o controlo reflexo da bexiga.

Todos os animais recebem analgésicos pós-operatórios cada 8-12 horas após a cirurgia e tratamento de antibióticos duas vezes ao dia durante 7 dias a partir dai. Os animais têm livre acesso a alimento e água durante a duração do estudo. Os anti-anticorpos do receptor Nogo-1 são distribuídos ao local da lesão através de injecção intratecal durante 28 dias tal como descrito no modelo de corte transversal da espinal-medula de rato abaixo. EXEMPLO 8

Caracterização das Proteínas de Fusão Solúveis do Receptor Noqo-1

Para caracterizar os polipéptidos (sNogoR-1) e as proteínas de fusão (Fc-sNogoR-1) solúveis do receptor Nogo-1 efectuámos a seguinte experiência.

Foram imobilizados 3 pg de receptores solúveis Nogo (sNogoR310-Fc e sNogoR344-Fc) em 250 pg de contas WGA-SPA que receberam 0,5 pl de ligando radioactivo (concentração final de 0,5 nM) num volume final de 100 pl de tampão de ligação (HEPES 20 mM, pH 7,4, Ca 2 mM, Mg 2 mM, BSA a 0,1%, ovalbumina a 0,1% e inibidores de proteases). Os ligandos incluíram Nogo66 10 pM, 125I-Nogo40 10 pM (aminoácidos 1-40 de NogoA) e 10 pl de sobrenadante de anticorpo anti-receptor Nogo-1 para cada conjunto de ligandos. As três tirosinas de Nogo40 foram separadamente iodadas e designadas como Nogo40-A, B e C, respectivamente. Os valores médios dos triplicados são 62 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ apresentados como % de radioactividade ligada normalizada (Fig. 6, 7 e 8). As barras de erro indicam EMP. A radioactividade ligada na ausência de inibidores foi tomada como 100% e a menor radioactividade ligada na presença de Nogo40 10 μΜ foi tomada como o 0% para normalização dos dados. EXEMPLO 9

Inibição da Ligação do Ligando à Proteína de Fusão Solúvel do Receptor Nogo-1

Foi utilizado um ensaio de ligação semelhante ao ensaio de ligação do Exemplo 8 para testar a capacidade de dois mAb produzidos no Exemplo 1 para inibir a ligação de 125I-Nogo66 a sNogoR344-Fc. Os mAb 2F7 e 3G5 inibiram a ligação de 125I-Nogo66 a sNogoR344-Fc. EXEMPLO 10

Ensaio de Crescimento de Neurites Lâminas de cultura Lab-Tek (4 poços) foram revestidas com 0,1 mg/ml de poli-D-lisina (Sigma®). A mielina do SNC sozinha ou misturada com sNogoR310, proteína de fusão sNogoR310-Fc, mAb 5B10 ou PBS de controlo foi separadamente aplicada como gotas de 3 μΐ. Foram adicionadas microesferas fluorescentes (Polysciences) à mielina/PBS para permitir posterior identificação das gotas (Grandpre et ai., Nature 403: 2000). As lâminas Lab-Tek® foram então lavadas e revestidas com 10 pg/ml de laminina (Gibco™) . Gânglios da raiz dorsal (GRD) de crias de rato Sprague Dawley P3-4 foram dissociados com 1 mg/ml de colagenase de tipo 1 (Worthington), triturados com pipetas de Pasteur polidas com fogo, pré-plaqueados para enriquecer em células neuronais e finalmente plaqueados a 23000 células/poço nas lâminas de cultura Lab-Tek® pré-revestidas. O meio de cultura foi F12 contendo soro de cavalo dador inactivado com calor a 5%, soro fetal bovino inactivado com calor a 5% e 50 ng/ml de mNGF e foram incubadas a 37°C e CO2 a 5% durante 6 horas.

As lâminas foram fixadas durante 20 minutos com paraformaldeído a 4% contendo sacarose a 20% e coradas para 0 marcador neuronal anti-beta-III-tubulina (Covance TUJl) 63 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ diluído 1:500. Como anticorpo secundário anti-ratinho-Alexa Fluo®594 (Molecular Probes) foi diluído 1:300 e as lâminas foram montadas com Gel/Mount™ (Biomeda™) . Foram adquiridas imagens digitais a 5χ com suporte logico OpenLab que foram analisadas utilizando o suporte lógico MetaMorph® para quantificação do crescimento de neurites. sNogoR310, sNogoR310-Fc e mAb 5B10 protegeram todos os neurónios de GRD de inibição mediada por mielina do crescimento de neurites (Figs. 9-11). sNogoR310 foi utilizado num ensaio semelhante utilizando neurónios de galinha e verificou-se que era protector.

Testámos também o efeito neuroprotector de receptores Nogo solúveis através da realização de experiências com células criadas na presença e ausência de laminina. O crescimento de células neuronais em meio sem laminina é fraco e modela condições de stress neuronal. GRD foram dissecados a partir de crias de rato 6-7 dias pós-natais (P6-7), dissociados em células individuais que foram plaqueadas em placas de 96 poços pré-revestidos com poli-D-lisina tal como descrito acima. Nalguns poços foram adicionados 2 pg/ml de laminina durante 2-3 horas e lavou-se antes das células serem plaqueadas. Após uma incubação de 18-20 h as placas foram fixadas com paraformaldeído a 4%, coradas com anticorpo de coelho anti-Beta-m-tubulina diluído 1:500 (Covance®) e anti-HuC/D diluído 1:100 (Molecular Probes), e foram adicionados anticorpos secundários fluorescentes (Molecular Probes) a uma diluição 1:200. O ArrayScan® II (Cellomics®) foi utilizado para capturar imagens digitais a 5x e para quantificar o crescimento de neurites como crescimento médio de neurites/neurónio por poço, utilizando a aplicação Crescimento de neurites. Foram analisadas nove imagens a 5χ de 3 poços/condição.

Nalgumas experiências, foi utilizado um subclone de células PC12 (Neuroscreen™) (Cellomics®) . As células Neuroscreen™ foram pré-diferenciadas durante 7 dias com 200 ng/ml de NGF, desprendidas e replaqueadas em placas de 96 poços pré-revestidos com poli-D-lisina. Nalguns poços foram adicionados 5 pg/ml de laminina durante 2-3 horas e lavou-se 64 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ antes das células serem plaqueadas. Após 2 dias de incubação as placas foram fixadas com paraformaldeído a 4%, coradas com anticorpo de coelho anti-Beta-III-tubulina diluído 1:500 (Covance®) e Hoechst (corante nuclear). O ArrayScan® li foi utilizado para quantificar o crescimento de neurites tal como nas células de GRD. sNogoR344-Fc ou IgG de rato foram adicionadas em solução a neurónios de GRD P6-7 e a células Neuroscreen™ diferenciadas no momento do plaqueamento. O efeito neuroprotector de sNogoR344-Fc foi observado a 1 μΜ e 10 μΜ quando neurónios de GRD P6 foram criados na ausência de laminina. A quantificação do crescimento de neurites mostrou um aumento dependente da dose com a adição de sNogoR344-Fc. A adição de sNogoR344-Fc nas mesmas concentrações a neurónios de GRD a crescer num substrato de laminina, não produziu nenhum efeito invulgar, indicando que sNogoR344-Fc é apenas activo em células sujeitas a stress. O efeito neuroprotector de sNogoR344-Fc nas mesmas concentrações na ausência de laminina foi também observado com células Neuroscreen. EXEMPLO 11

Produção e Purificação da Proteina de Fusão Fc-sNogoR-1

Uma construção de ADNc que codifica os aminoácidos 1-310 do receptor Nogo-1 de rato foi fundida com Fc de IgGl de rato contida num vector de expressão de mamífero e este vector foi electroporado em células de ovário de hamster chinês (CHO) (DG44). As células foram mantidas em alfa-MEM, suplementado com soro fetal bovino dialisado a 10%, glutamina 2 mM e reagentes antibióticos-antimicóticos. Dois dias após a transfecção, o meio condicionado foi colhido e analisado através de Western blot sob condições redutoras. Foi detectada uma banda proteica de cerca de 60 kDa utilizando um anticorpo policlonal de coelho anti-receptor Nogo-1. As células foram expandidas e separadas utilizando um anticorpo de cabra anti-IgG de rato conjugado com R-PE. Após a segunda separação, as células foram plaqueadas a uma densidade de uma célula/poço em placas de 96 poços. Os níveis proteicos de receptor Nogo-1 solúvel segregados de poços individuais foram testados e 65 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ comparados utilizando um ELISA em sanduíche. A placa de ELISA foi revestida com anticorpo específico de cabra anti-FcK de IgG de rato. Foi aplicado meio condicionado. A proteína receptor Nogo-1 solúvel ligada foi detectada através do anticorpo específico de Fc, Fab de burro anti-IgG de rato conjugado com HRP. 0 clone 4C12 teve o nível de secreção mais elevado. 4C12 foi expandido e criado em meio CH0-M7 em balão rotativo. 0 nível de secreção foi de cerca de 10 mg/1 a 37°C. Células CHO expressando a proteína de fusão sNogoR310-Fc foram cultivadas em larga escala. Foram obtidos 1,7 1 de meio condicionado concentrado a partir de uma corrida de biorreactor de 10 L. O pH foi elevado através da adição de um décimo do volume de Tris-HCl 1,0 M, pH 8,9. Foram adicionados cloreto de sódio sólido e glicina a 3,0 M e 1,5 M, respectivamente. Foi preparada uma coluna de proteína A-Sepharose™ de 60 ml equilibrada com Tris-HCl 10 mM, cloreto de sódio 3 M, glicina 1,5 M, pH 8,9. Meio condicionado concentrado foi aplicado à coluna a 1,5 ml/min utilizando uma bomba peristáltica. A coluna foi lavada com 300 ml de Tris-HCl 10 mM, cloreto de sódio 3 M, glicina 1,5 M, pH 8,9 seguido de 120 ml de Tris-HCl 5 mM, cloreto de sódio 3 M, pH 8,9. A proteína foi eluída com fosfato de sódio 25 mM, cloreto de sódio 100 mM, pH 2,8. Foram colhidas fracções de 10 ml em tubos contendo 1,0 ml de HEPES 1,0 M, pH 8,5. As fracções proteicas foram reunidas e dialisadas contra 3x 2 1 de fosfato de sódio 5 mM, NaCl 300 mM, pH 7,4. EXEMPLO 12

Ensaio de Corte Transversal da Espinal-medula

Para testar a sua capacidade para promover recuperação funcional in vivo, uma proteína de fusão sNogoR-1 foi testada num ensaio de corte transversal da espinal-medula de rato.

Bombas osmóticas Alzet® foram carregadas com solução de teste (sNogoR310-Fc em PBS) preparadas de fresco no dia da utilização. A concentração de carga foi calculada como sendo 5 e 50 μΜ. As bombas foram iniciadas durante >40 horas a 37°C antes da implantação nos animais. Foi dado a ratos fêmeas Long Evans analgésico e tranquilizante pré-operatórios e anestesiados utilizando isoflurano (3% em O2) . 66 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ

Os ratos foram colocados num suporte estereotáxico e o córtex motor foi exposto para infusão do agente de traçado do tracto bda (10000 PM) bilateralmente. Os ratos foram então sujeitos a hemissecção dorsal da espinal-medula em T5-T6 seguida de implantação do cateter intratecal e do sistema de bomba para distribuir o composto de teste (n=ll por grupo).

Os ratos foram deixados recuperar e sobreviver até 28 dias após a cirurgia. O registo do comportamento através da utilização do sistema BBB foi registado até 28 dias após a indução da lesão, mesmo antes do fim da fase em vida do estudo. Após perfusão e fixação, as espinal-medulas foram removidas, crioprotegidas, seccionadas, coradas e efectuadas as contagens de axónios. A escala de avaliação locomotora de Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) (Basso et al.r Neurotrauma 13. 343-359, 1996), o teste do plano inclinado e o teste de caminhada na rede inclinada (Li e Strittmatter, J. Neurosci. 23: 4219-27, 2003) foram monitorizados em ratos e ratinhos após lesão. Para o teste do plano inclinado, medimos o ângulo máximo ao qual uma prancha de 50 cm χ 60 cm podia ser inclinada durante 5 seg. sem que o ratinho escorregasse. Para a caminhada na rede inclinada, os ratinhos foram treinados a escalar uma rede de arame (35 cm de comprimento com quadrados de 2,54 cm) a um declive de 45 graus. O número de casos nos quais a pata traseira caiu abaixo do plano da rede foi registado para cada excursão desde a base até ao topo. Para os testes comportamentais dos ratos, foi efectuada a escala locomotora BBB, a caminhada na rede e a análise de pegadas. Para a caminhada na rede, os ratos foram treinados a caminhar numa rede de arame (70 cm de comprimento com quadrados de 2,54 cm), e foi contado o número de casos nos quais a pata traseira caiu abaixo do plano da rede. Para a análise de pegadas, os padrões da caminhada das patas traseiras dos ratos foram registados com tinta durante uma locomoção contínua através de uma corrida de 90 cm, e foi calculado o comprimento da passada de cada lado e o afastamento das patas (Metz et al., Brain Res. 883: 165-177, 2000). Todos estes testes comportamentais foram efectuados por pelo menos dois indivíduos. Ao longo da cirurgia, dos testes comportamentais e da análise histológica, 67 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ os investigadores foram cegos à identidade do composto na minibomba. sNogoR310-Fc promoveu recuperação funcional (Fig. 12). EXEMPLO 13

Ensaio de Contusão da Espinal-medula de Rato 0 efeito de polipéptidos e proteínas de fusão solúveis do receptor Nogo-1 em neurónios in vivo são testados num ensaio de contusão da espinal-medula de rato.

Ratos fêmeas Long Evans hooded (170-190 g) são tratados profilacticamente com agentes analgésicos e antibióticos. Dez minutos antes da cirurgia, os animais são tranquilizados com 2,5 mg/kg de Midazolam i.p. e anestesiados em isoflurano a 2-3% em 02. Os ratos são então rapados, limpos com álcool e betadine e é aplicado lubrificante ocular nos seus olhos. A seguir, é feita uma incisão abaixo da linha média e são expostas as vértebras T7 a T12. É efectuada laminectomia dorsal em T9 1/2 e TIO para expor a medula. O rato é montado no Impactor. Os segmentos T7 e T8 são primeiro presos e depois os segmentos Til e T12 são presos ao grampo caudal. É colocado um material macio por baixo do peito do rato. A vareta do Impactor é colocada na posição zero e o clip eléctrico da terra é preso ao bordo da ferida. A vareta do Impactor é então elevada até 25,0 mm e apropriadamente ajustada a uma posição directamente acima da espinal-medula exposta. A seguir, a vareta do Impactor é libertada para atingir a medula exposta e a vareta do Impactor é imediatamente levantada. O rato é então desmontado e é colocado Gelfoam® na ferida. O músculo sobre a ferida é suturado, e a incisão é cirurgicamente agrafada. Os animais são colocados numa incubadora até recuperarem da anestesia. São dados aos ratos antibióticos, analgésicos e solução salina conforme necessário. As bexigas são espremidas todas as manhãs e todas tardes a partir daí até a função ser recuperada. 68 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ

Proteína de fusão solúvel do receptor Nogo-1 (p.ex., sNogoR310-Fc) é administrada intratecalmente tal como descrito no modelo de corte transversal da espinal-medula de rato acima. O registo bbb é efectuado um dia após a cirurgia, depois todas as semanas a partir daí até 4 a 6 semanas. EXEMPLO 14

Expressão de sNoqoR310 em Ratinhos Transqénicos

Produzimos ratinhos transgénicos expressando proteína solúvel do receptor Nogo-1 para testar o seu efeito quando expressa in vivo.

Clonámos o ADNc de sNogoR310 de ratinho (correspondendo aos aminoácidos 1-310 do receptor Nogo-1) no local NotI do vector C-3123. Neste vector, a expressão de sNogoR310 está sob o controlo dos elementos reguladores do gene da proteína ácida fibrilar glial (gfap), que permitem um elevado nível de expressão com maior secreção a partir de astrócitos reactivos no local da lesão. Digerimos o vector resultante sequencialmente com Aatll e Sfil e isolámos a construção gfap::sNogoR310 num fragmento de 3,4 kb. Microinjectámos este fragmento em embriões para gerar ratinhos transgénicos. Verificámos por PCR que o transgene se tinha integrado e identificámos cinco linhas fundadoras. Cruzámos machos heterozigóticos das duas linhas fundadoras com os níveis de expressão mais elevados com ratinhos fêmeas C57BL/6J. Confirmámos que as células positivas para GFAP expressam e segregam sNogoR310 em ratinhos transgénicos heterozigóticos através de análise Western blot utilizando anticorpo criado contra o receptor Nogo-1.

Homogeneizámos o córtex e a espinal-medula em solução salina tamponada com Tris suplementada com inibidores de proteases (Roche) e centrifugámos o homogenato a 40 000 rpm durante 20 min a 4°C. Tratámos o sobrenadante com paraformaldeído a 4% durante 20 min para aumentar a especificidade do anticorpo e dialisámos antes do immunoblotting. Homogeneizámos a fracção particulada através de ultra-sons em tampão RIPA (Triton® X-100 a 1%, desoxicolato de sódio a 0,5%, SDS a 0,1% em PBS), centrifugámos o homogenato resultante e tratámos este sobrenadante (fracção 69 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ particulada solúvel em detergente) tal como acima. Analisámos 20 pg de proteína cerebral ou da espinal-medula através de immunoblot utilizando anti-soro de coelho criado contra receptor Nogo-1 a uma diluição 1:2000. visualizámos a imunorreactividade através de incubação com anti-IgG de coelho conjugado com AP e os substratos de AP NBT/BCIP.

Detectámos sNogoR310 de 37 kDa segregado em extractos solúveis sem detergente de córtex e espinal-medula das duas linhas transgénicas Tg08 e TgOl, mas está presente pouca ou nenhuma proteína solúvel do receptor Nogo-1 a 37 ou 81 kDa em ratinhos da mesma ninhada de tipo selvagem (WT). O exame das fracções particuladas demonstrou que havia níveis comparáveis de receptor Nogo-1 endógeno tanto nos ratinhos WT como transgénicos. EXEMPLO 15

Expressão de sNoqoR310 em Ratinhos Transgénicos Após Lesão

Testámos o efeito de lesão no SNC na expressão de sNogoR310 em ratinhos transgénicos através da realização de uma lesão sobre-hemissecção dorsal. Obtivemos animais transgénicos de sNogoR310 e não transgénicos de controlo acasalando machos heterozigóticos com fêmeas C57/BL6 tal como descrito no Exemplo 14.

Anestesiámos profundamente ratinhos adultos fêmeas heterozigóticos transgénicos ou WT da mesma ninhada (10-16 semanas de idade) e efectuámos uma laminectomia completa, expondo completamente a parte dorsal da espinal-medula ao nível de T6 e T7. Efectuámos uma sobre-hemissecção dorsal em T6 com uma agulha de calibre 30 e um par de microtesouras para danificar completamente os tractos corticospinais (TCS) dorsal e dorsolateral. Passámos uma agulha marcada através da parte dorsal da espinal-medula várias vezes para assegurar que a lesão era a uma profundidade de 1,0 mm. Suturámos as camadas musculares sobre as laminectomias e fechámos a pele nas costas com agrafos cirúrgicos. Para seguir os tractos corticoespinais, fizemos um furo com broca sobre o córtex cerebral no lado direito no crânio 14 dias após a lesão da espinal-medula. Aplicámos o marcador BDA (PM 10 000, 10% em PBS) (Molecular Probes, Eugene, OR) em 4 locais de injecção a 70 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ uma profundidade de 0,7 mm desde a superfície cortical. Quatro semanas após a lesão, os ratinhos foram perfundidos transcardialmente com PBS, seguido de paraformaldeído a 4%. Os ratinhos utilizados para experiências de expressão de sNogoR310 não receberam qualquer injecção de marcador.

Para os ratinhos utilizados para análise de Western blot, a espinal-medula a um nível entre T3 e L3 foi colhida sem perfusão 14 dias após a lesão. Os ratinhos utilizados para coloração imuno-histoquímica do receptor Nogo-1 foram perfundidos com paraf ormaldeído a 4% 10 dias após a hemissecção, e a espinal-medula lesionada foi removida para seccionamento. Para examinar a expressão de sNogoR310 no cérebro lesionado de ratinhos transgénicos e WT, foi efectuada uma lesão de golpe no córtex com uma lâmina de bisturi número 11 presa num aparelho estereotáxico (David Kopf, Tujunga, CA). Foi feito um corte parassagital de 4 mm, 0,5 mm posterior ao Bregma, 1,5 mm lateralmente à linha média e com 3,5 mm de profundidade.

Detectámos maiores níveis de sNogoR310 em extractos solúveis de espinal-medulas dez dias após a lesão em ratinhos transgénicos mas não em ratinhos WT, consistente com a sobre-regulação após lesão de GFAP em torno da lesão. Para confirmar que isto não foi devido a sobre-regulação compensatória de Nogo-A, testámos a sua expressão e verificámos que era semelhante no córtex intacto ou no córtex lesionado e na espinal-medula de ratinhos WT e transgénicos.

Examinámos a expressão celular de sNogoR310 no SNC lesionado através de imunocoloração do cérebro lesionado e da espinal-medula contendo a área da lesão com anticorpos contra receptor Nogo-1 e GFAP. A morfologia geral da glia astrocítica reactiva não difere entre os ratinhos WT e transgénicos, mas a densidade corada para receptor Nogo-1 tanto no espaço intracelular como extracelular é notavelmente maior nos ratinhos transgénicos gfap::sNogoR310 que nos ratinhos WT, indicando maior expressão de sNogoR310 em torno da lesão em ratinhos transgénicos. A proteína do receptor Nogo-1 co-localiza-se com o marcador astrocítico GFAP apenas nos ratinhos transgénicos. Existe também uma coloração não celular difusa grandemente aumentada nas amostras transgénicas, 71 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ consistente com sNogoR310in no espaço extracelular. Coloração do receptor Nogo-1 no corpo celular neuronal é detectada tanto em WT como em ratinhos transgénicos. EXEMPLO 16 sNogoR310 Segregado Induz Desenvolvimento de TCS em Ratinhos Transgénicos

Testámos se a maior expressão de sNogoR310 em torno da lesão em ratinhos transgénicos resulta na regeneração de axónios lesionados.

Investigámos a integridade dos tractos corticoespinais (TCS) descendentes através da injecção do marcador anterógrado biotina-dextrano-amina (BDA) no córtex motor direito tal como descrito em Li e Strittmatter, J. Neurosci. 23: 4219-27, 2003. Em ratinhos WT da mesma ninhada, o TCS dorsal (TCSd) proeminente está intimamente enfaixado rostral à lesão, e umas poucas fibras do TCS dorsolaterais são visíveis ipsilateralmente. Um pequeno número de rebentos colaterais curtos marcados com BDA projectam para a matéria cinzenta, particularmente na medula ventral, mas o desenvolvimento está grandemente confinado ao lado da medula contralateral à injecção do marcador. No entanto, as secções rostrais à hemissecção dorsal de ratinhos transgénicos para sNogoR310 lesionados indica um padrão de marcação de BDA bastante diferente. É observada uma elevada densidade de fibras de TCS marcadas com BDA fora dos TCSd proeminentes em todos os ratinhos transgénicos da linha Tg08 ou da linha TgOl. Fibras ectópicas estendem-se através da área de matéria cinzenta e algumas fibras chegam dentro da matéria branca lateral e dorsolateral. Várias fibras (4-12 rebentos por secção transversa) são observadas no lado oposto da espinal-medula (ipsilateral ao local de injecção do marcador). A medição microdensitométrica dos rebentos colaterais indica um aumento de aproximadamente dez vezes na densidade de desenvolvimento em ratinhos transgénicos para sNogoR310. O exame de secções longitudinais parassagitais de 1 a 4 mm rostrais à lesão revela que as fibras de TCSd estendem um grande número de rebentos ramificados para a área de matéria cinzenta ventral em ratinhos transgénicos para sNogoR310, em contraste com os animais da mesma ninhada WT. Geralmente, o padrão e a extensão 72 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ de desenvolvimento rostral à lesão em ratinhos transgénicos são semelhantes aos observados nos ratinhos tratados sistemicamente com o péptido antagonista do receptor Nogo-1 NEPl-40 (Li e Strittmatter, 2003) .

Estes resultados demonstram que sNogoR310 segregado induz desenvolvimento de TCS nos ratinhos transgénicos. EXEMPLO 17 A Regeneração de Axónios de TCS Contorna o Local de Lesão para a Espinal-medula Distai em Ratinhos Transgénicos para sNogoR310

Isolámos espinal-medula 4 mm rostral a 4 mm caudal ao local da lesão (8 mm de comprimento no total) de ratinhos transgénicos e impregnámo-la numa matriz de albumina polimerizada com glutaraldeido, e cortámos parassagitalmente num vibrátomo (30 pm de espessura). Colhemos secções transversais (50 pm) da espinal-medula 5-7 mm rostral a 5-7 mm caudal ao local da lesão. Para experiências de injecção de sNogoR310-Fc em ratos, a espinal-medula estendendo-se de 10 mm rostral a 10 mm caudal desde o local da lesão foi cortada parassagitalmente (50 pm) num micrótomo com vibração. Secções transversais foram colhidas da espinal-medula 11-16 mm rostral e 11-16 mm caudal ao local da lesão. Incubámos as secções com complexo avidina-biotina-peroxidase e visualizámos o marcador BDA através de reacção de HRP com diaminobenzidina estimulada com níquel (Grandpre, Nature 417: 547-551, 2002). Processámos algumas secções para imuno-histoquímica de serotonina (anticorpo anti-5-ΗΤ) através de imunofluorescência indirecta. Para visualizar a área da lesão, corámos duplamente algumas secções com anticorpos dirigidos contra GFAP (Sigma®, St. Louis, MO) . Montámos, desidratámos e cobrimos as secções com meio de montagem.

Testámos se as fibras induzidas por sNogoR310 expresso em ratinhos transgénicos após a lesão (ver Exemplo 16) atravessam a área da lesão para a espinal-medula caudal para proporcionar recuperação funcional.

Secções parassagitais consecutivas através do local da lesão afogadas na câmara lúcida apresentam o padrão de 73 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ distribuição global das fibras de TCS em regeneração a poucos milímetros da lesão. As secções de ratinhos WT não mostram fibras de TCS estendendo-se para além do local da lesão. Secções semelhantes de ratinhos transgénicos para sNogoR310 apresentam numerosas fibras de TCS que atravessam a área de corte e se projectam para as áreas de matéria cinzenta e branca distais num padrão altamente ramificado. Imediatamente rostral à hemissecção, uma elevada densidade de desenvolvimento de TCS marcados com BDA teve origem a partir de projecções proeminentes de TCSd para a área da lesão, mas a maioria dos rebentos de TCS não conseguiu passar a área de corte onde a formação de cicatriz e cavitação dos tecidos são proeminentes. Uma pequena mas altamente significativa fracção dos axónios em regeneração contorna o local da lesão através das restantes pontes de tecido da matéria cinzenta e branca ventral e ventrolateral. Adicionalmente, umas poucas fibras de TCS parecem atravessar a própria área de corte através da espinal-medula dorsal e dorsolateral lesionada até regiões distais. Na vizinhança da lesão, o curso das fibras em regeneração foi tipicamente tortuoso e bastante distinto do das fibras direitas normais no TCS rostral. As fibras colaterais e arborizadas são mais frequentemente observadas na área da matéria cinzenta da espinal-medula distai. As reconstruções demonstram 5-15 fibras em regeneração marcadas com BDA em curso no eixo rostral-caudal a qualquer nível 1-4 mm caudal à lesão em cada ratinho transgénico. Para secções transversais 5-7 mm caudais à hemissecção dorsal, axónios de TCS marcados com BDA são observados tanto nas áreas da matéria cinzenta como da matéria branca em ratinhos transgénicos. As contagens de fibras para os ratinhos transgénicos indicam um número aproximadamente semelhante de fibras de TCS marcadas com BDA aos níveis proximais nas secções sagitais.

Para além das fibras de TCS, os outros tractos descendentes, tais como fibras rafespinais, contribuem também para a função locomotora em ratinhos. Neste modelo de sobre-hemissecção dorsal de ratinho, o corte transversal lesiona a maioria das fibras serotonérgicas, diminuindo a densidade destas fibras em aproximadamente 80% no corno ventral. A análise do comprimento total das fibras de serotonina no corno ventral da espinal-medula caudal indica um número muito maior destas fibras em ratinhos transgénicos que no grupo WT, 74 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ indicando que os efeitos promotores do crescimento de sNogoR310 em ratinhos transgénicos não estão limitados a uma via de axónios descendentes. EXEMPLO 18 A Expressão Transgénica de sNogoR31Q Melhora a Recuperação Locomotora A marcação dos axónios do TCS e a análise das fibras serotonérgicas indicam que o sNogoR310 libertado dos astrócitos em ratinhos transgénicos estimula extensa regeneração anatómica dos axónios descendentes lesionados na espinal-medula. Efectuámos vários testes comportamentais tal como descrito no Exemplo 12 para determinar se estas fibras regeneradas beneficiam a recuperação funcional.

Tal como avaliado através do teste BBB, os ratinhos WT recuperam parcialmente a função locomotora durante um período de 4 semanas de sobrevivência. 4 semanas após a lesão, a maioria dos ratinhos WT recupera um nível caracterizado por passada plantar consistente com suporte do peso consistente, mas exibem uma coordenação membro anterior-membro posterior apenas ocasional a frequente, com uma rotação da posição da pata predominante quando fazem o contacto inicial com a superfície. Em contraste, os registos BBB de ratinhos transgénicos para sNogoR310 de ambas as linhas Tg08 e TgOl são significativamente superiores aos do grupo de controlo ao longo do período de observação de 7-28 dias (Figs. 13A e 13B). 28 dias após a lesão, a maioria dos ratinhos transgénicos mostra coordenação membro anterior-membro posterior consistente, e a posição da pata predominante é paralela ao corpo.

Empregámos dois ou mais testes comportamentais para caracterizar melhor o desempenho dos ratinhos transgénicos para sNogoR310. Primeiro, medimos o ângulo máximo ao qual a prancha seria levantada sem que um ratinho perdesse a sua aderência em 5 s. Antes da lesão de hemissecção dorsal, tanto os ratinhos transgénicos como os WT podem suster a sua postura na prancha inclinada a 55 graus. Nos dias 7-28 após a lesão, o ângulo sustentável é reduzido em todos os ratinhos, mas os ângulos sustentáveis pelos ratinhos transgénicos são 75 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ significativamente superiores aos do grupo de controlo (Fig. 13C). Noutro teste comportamental, os ratinhos escalaram uma rede colocada a um ângulo de 45 graus a vertical e foram contadas as excursões dos membros posteriores abaixo do plano da rede (Metz et al., 2000). Nenhum ratinho cometeu erros neste teste durante o treino pré-lesão. Existem numerosos erros de falha da pata com apenas uma melhoria mínima nos ratinhos WT durante o período de 2-6 semanas após a lesão. Em contraste, os ratinhos transgénicos para sNogoR310 exibem uma melhoria progressiva na escalada da rede durante este período, com a maioria das melhorias a ocorrer entre as semanas 1-3 após a lesão (Fig. 13D). Assim, os ratinhos transgénicos segregando sNogoR310 a partir dos astrócitos exibem regeneração dos TCS, desenvolvimento rafespinal e função motora melhorada após hemissecção espinal torácica. EXEMPLO 19

Administração Intratecal da Proteína sNogoR310-Fc Induz Desenvolvimento do TCS

Como segundo teste do benefício da promoção do crescimento do receptor Nogo-1 solúvel após traumatismo espinal, administrámos a proteína purificada intratecalmente.

Fundimos o domínio de ligação ao ligando (27-310) do receptor Nogo-1 de rato ao domínio Fc de IgGl de rato para promover a estabilidade e purificação. Purificámos a proteína a partir de células CHO transfectadas estavelmente. Esta proteína bloqueia a acção de Nogo-66, MAG e mielina in vitro, tal como mostrado anteriormente para o ratinho sNogoR310-Myc His (Fournier et al., J. Neuroscl. 22: 8876-8883, 2002; Liu et al., Science 297, 1190-1193, 2002). Distribuímos intratecalmente a proteína sNogoR310-Fc a ratos com uma lesão de hemissecção dorsal torácica média através de uma minibomba osmótica. Durante um período de sobrevivência de quatro semanas após a lesão, foram administrados localmente 1,2 mg de proteína sNogoR310-Fc em cada rato. Em ratos que receberam tratamento de veículo (1,2 mg de igG de rato), secções rostrais à hemissecção apresentam os TCS dorsais proeminentes intimamente enfaixados e muito poucas fibras de TCS ectópicas marcadas com BDA acima do local da lesão. Secções rostrais à lesão de ratos lesionados que receberam proteína sNogoR310-Fc 76 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ exibem um padrão de marcação bastante diferente. São observadas numerosas fibras ectópicas a desenvolverem-se a partir de TCS marcados com BDA de secções transversais e parassagitais. Nalguns casos, as projecções atravessam a área de TCSd próximo da linha média à circunferência da medula, tornando-se misturadas com os TCS dorsolaterais. Os axónios em desenvolvimento estendem-se através da matéria cinzenta até uma maior extensão gue a matéria branca. Uma medida das fibras ectópicas em desenvolvimento (álOO pm em secções transversais, á200 pm em secções sagitais) adjacentes ao TCSd revela um maior aumento nos ratos tratados com sNogoR310-Fc. EXEMPLO 20

Axónios do TCS Regeneram para a Espinal-medula Distai em Ratos Tratados com sNogoR310-Fc

Anestesiámos profundamente ratos fêmeas Sprague-Dawley (190-250 g) e conduzimos laminectomias ao nível espinal de T6-7, expondo a espinal-medula. Cortámos a metade dorsal da espinal-medula com uma seringa de calibre 30 e um par de microtesouras para danificar as partes dorsais dos tractos TCSG, e assegurámo-nos da profundidade da lesão (1,8 mm) passando a parte afiada de uma lâmina número 11 através da metade dorsal da medula (Grandpre et al., Nature 417: 547-551, 2002). Uma minibomba osmótica (Alzet® 2ML4, 2 ml de volume, 2,5 pl/h, 28 dias de distribuição), gue foi enchida com 1,2 mg de IgG de rato em PBS ou 1,2 mg de proteína de fusão sNogoR310-Fc em PBS, foi suturada nos músculos sob a pele nas costas dos animais. Um cateter conectado com a saída da minibomba foi inserido no espaço intratecal da espinal-medula ao nível T7-8 através de um pegueno furo na dura. A infusão de proteína antagonista do receptor Nogo-1 induziu desenvolvimento extenso rostral a uma hemissecção de rato, mas uma questão mais crítica é se as fibras de TCS em desenvolvimento se projectam para a espinal-medula distai e contribuem para a recuperação locomotora. Secções longitudinais através do local da lesão dos ratos tratados com veículo não apresentam um número detectável ou apresentam um número muito pegueno de fibras de TCS ventrais marcadas com BDA abaixo do nível da lesão (GrandPre et al., 2002; Weidner 77 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ et âl., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98, 3513-3518, 2001). As secções semelhantes de ratos tratados com sNogoR310-Fc demonstram que muitas fibras marcadas com BDA contornam o local da transecção e projectam para a espinal-medula caudal grandemente através dos tecidos de ponte da espinal-medula ventral e ventrolateral. A imunocoloração para o marcador astrocitico GFAP mostra que a extensão do corte transversal chegou mais fundo que a área do canal central. Ao contrário do perfil linear das fibras rostrais nos TCS dorsais proeminentes, as fibras do TCS regeneradas habitualmente seguem uma trajectória altamente ramificada na espinal-medula distai, particularmente na área da matéria cinzenta. Estas fibras são detectadas em muitas regiões da espinal-medula, mas são mais facilmente observadas na parte central e na metade dorsal da espinal-medula ao longo desta. As contagens de fibras de TCS a partir de secções sagitais indicam aproximadamente 20 axónios marcados com BDA a 1-2 mm caudal à lesão e 15 axónios marcados a 7-8 mm distai à lesão de cada rato tratado com sNogoR310-Fc.

Geralmente, o padrão de ramificação destas fibras é semelhante ao observado a partir de animais tratados com péptido NEP 1-40 no local, mas é observada uma ramificação mais colateral em cada rebento a partir das secções tratadas com proteína sNogoR310-Fc. Uma medida dos rebentos da espinal-medula distai demonstra que o comprimento colateral total de cada rebento em rato tratados com sNogoR310-Fc é duas vezes maior que o dos animais tratados com NEP 1-40. O número de rebentos (h200 pm de comprimento) a 1-10 mm caudal à espinal-medula em ambos os grupos tratados com antagonistas do receptor Nogo-1 é aproximadamente 20-40 vezes maior que o dos grupos de controlo. São observados mais rebentos a partir de ratos tratados com sNogoR310-Fc que com tratamento local com NEP 1-40 (*50 vs. 25 rebentos/rato), mas esta diferença não é estatisticamente significativa (p=0,1713, teste t). São observados axónios de TCS em regeneração em secções transversais de espinal-medula 11-15 mm caudais à hemissecção em ratos que receberam tratamento com sNogoR310-Fc. Estas fibras são detectadas tanto na matéria cinzenta como na matéria branca da espinal-medula. As fibras detectadas na matéria cinzenta exibem frequentemente mais ramificação 78 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ colateral que na área da matéria branca. Em contraste, nas secções transversais do grupo tratado com veículo, são observadas apenas fibras marcadas com BDA ocasionais na área da matéria branca ventral, consistente com os axónios de TCS ventrais não lesionados. A este nível da espinal-medula distai, o número médio de fibras de TCS marcadas com BDA de ambos os grupos tratados com antagonista do receptor Nogo-1 (sNogoR310-Fc e NEP 1-40) é aproximadamente 20 vezes maior que o dos ratos tratados com veículo. Tomados em conjunto, ambos os antagonistas do receptor Nogo, a proteína sNogoR310-Fc e o péptido NEP 1-40, resultam em dramática regeneração de axónios de TCS na espinal-medula distai, mas o desenvolvimento induzido pelo primeiro exibe um padrão mais altamente ramificado. EXEMPLO 21 sNogoR310-Fc Local Induz o Desenvolvimento de Axónios Rubrospinais e Serotonérgicos na Espinal-medula Lesionada de Ratos

Quarenta dias após a hemissecção, foi feito um furo com broca de cada lado do crânio sobre o córtex sensorimotor dos membros inferiores para marcar as fibras de TCS. O marcador neuronal anterógrado BDA (10% em PBS, 3,5 μΐ por córtex) foi aplicado em sete locais de injecção a uma profundidade de 1,5 mm da dura de cada lado (Grandpre, 2002) . Para marcação do tracto rubrospinal em ratos, o marcador BDA (1 μΐ; PM 10000; 10% em PBS) foi injectado no núcleo vermelho no lado esquerdo (5,8 mm posterior ao bregma, 0,7 mm lateral, 7,0 mm ventral à superfície do crânio). Duas semanas após a injecção de BDA, estes animais foram perfundidos com PBS, seguido de paraformaldeído a 4%, e o tecido foi colhido para histologia. A reparação das fibras do tracto rubrospinal (TRS) lesionadas contribui para melhorias funcionais após lesão da espinal-medula (Liu et al., J. Neurosci. 19: 4370-4387, 1999). A distribuição disseminada do receptor Nogo-1 em neurónios do SNC (Wang et al., J. Neurosci. 22: 5505-5515, 2002) torna possível que a inibição do receptor Nogo-1 com o seu antagonista possa resultar em novo crescimento de axónios do TRS após a lesão. Para testar os efeitos de sNogoR310-Fc em 79 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ TRS lesionados, a integridade desta via foi marcada através de injecção de BDA no núcleo vermelho esquerdo. Ao nivel da espinal-medula, as fibras de TRS estão normalmente localizadas na área da matéria branca dorsolateral da espinal-medula, e são cortadas transversalmente através das hemissecções dorsais deste estudo. Em secções transversais 11-15 mm rostrais à lesão de ratos de controlo, um pequeno número de fibras curtas marcadas com BDA é observado entre o TRS proeminente e a matéria cinzenta do corno dorsal. Secções ao mesmo nível tratadas com sNogoR310-Fc exibem muitas fibras ligadas entre o TRS principal e a matéria cinzenta do corno dorsal. Secções transversais 11-15 mm distais à LEM, não mostram fibras de TRS marcadas com BDA em ratos tratados com veículo. Em contraste, secções ao mesmo nível que receberam tratamento com sNogoR310-Fc mostram muitas fibras de TRS marcadas com BDA tanto na matéria cinzenta como na branca contralateral à injecção do marcador. São observados alguns rebentos com um padrão de ramificação na matéria cinzenta ipsilateral à injecção de BDA.

Fibras espinais rufespinais foram também examinadas em ratos lesionados na espinal-medula tratados com sNogoR310-Fc. A imunocoloração demonstra a densidade de fibras serotonérgicas 11-15 mm rostrais à lesão que é semelhante entre os grupos tratados com veículo e sNogoR310-Fc. Nas secções 11-15 mm abaixo da lesão, as fibras de serotonina em ratos tratados com sNogoR310-Fc são duas vezes mais numerosas que as do grupo de controlo. Estes resultados demonstram que a responsividade à inibição do receptor Nogo-1 através da proteína sNogoR310-Fc não está limitada às fibras de TCS, e que os outros tractos descendentes, tais como os axónios rubrospinais e serotonérgicos, são também responsivos a antagonismo do receptor Nogo-1. EXEMPLO 22

Tratamento Local com sNogoR310-Fc Melhora a Recuperação Funcional em Ratos A administração intratecal de proteína sNogoR310-Fc estimula a regeneração de axónios em várias vias descendentes após lesão traumática da espinal-medula. Testámos se a 80 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ proteína também melhora a recuperação funcional na espinal-medula lesionada. 2 semanas após a hemissecção, o registo BBB locomotor em ratos tratados com veículo alcança um nível estável de 12 (Fig. 14A). 4 semanas após a lesão, a maioria dos controlos (6 dos 7) tem passadas plantares com peso suportado frequente-consistente e coordenação de membros posteriores-membros anteriores frequente-consistente, mas têm uma rotação da posição da pata predominante quando fazem o contacto inicial com a superfície. Em contraste, em ratos que receberam tratamento com proteína sNogoR310-Fc, o registo locomotor continua a melhorar entre 2-4 semanas após o traumatismo. 4 semanas após a lesão, todos os 9 animais tratados com sNogoR310-Fc tinham coordenação de membros posteriores-membros anteriores consistente e uma posição da pata paralela no contacto inicial com a superfície de teste. A caminhada na rede foi utilizada para avaliar os défices de controlo motor fino descendente após lesão da espinal-medula (Metz et al., 2000). Este desempenho requer coordenação de membros posteriores-membros anteriores e controlo do movimento voluntário mediado por fibras ventrolaterais, corticospinais e rubrospinais. Durante o treino pré-lesão, todos os ratos colocaram com exactidão os seus membros posteriores nas barras da rede. 2-4 semanas após a lesão, os ratos de controlo fazem 8-9 erros por sessão com apenas uma melhoria mínima ao longo do tempo. Em contraste, os ratos tratados com sNogoR310-Fc exibem uma melhoria progressiva na caminhada na rede e fazem significativamente menos erros (4-7/sessão em média). A maioria das melhorias ocorre 2-3 semanas após a lesão. A análise das pegadas das patas traseiras no grupo de controlo mostra que o comprimento da passada é significativamente diminuído e o afastamento das patas é aumentado 4 semanas após a hemissecção, em comparação com ratos não lesionados ou animais lesionados que receberam tratamento com sNogoR310-Fc (Fig. 14C) . Por essa razão, estes múltiplos testes comportamentais demonstram que o bloqueio da função do receptor Nogo-1 com a injecção local de proteína antagonista melhora a recuperação locomotora após lesão. 81 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ

Depósitos Biológicos

Os hibridomas HB 7E11 (N.° de entrada ATCC® PTA-4587), HB 1h2 (N.° de entrada ATCC® pta-4584), hb 3G5 (N.° de entrada ATCC® PTA-4586), HB 5B10 (N.° de entrada ATCC® PTA-4588) e HB 2F7 (N.° de entrada ATCC® PTA-4585) foram depositados na

American Type Culture Collection ("ATCC®"), 10801 University

Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA, a 9 de Agosto 2002. LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110> Yale University, et al.

<120> ANTAGONISTAS DO RECEPTOR NOGO

<130> P29268EP-PCT <140> EP03785123.5 <141> 2003-08-07 <150> 60/402,866 <151> 2002-08-10 <160> 25 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Rattus sp. < 4 0 0 > 1

Leu Asp Leu Ser Asp Asn Ala Gin Leu Arg Vai Vai Asp Pro Thr Thr 15 10 15

<210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Leu Asp Leu ser Asp Asn Ala Gin Leu Arg ser vai Asp pro Ala Thr 15 10 15 <210> 3 <211> 35 <212> PRT <213> Rattus sp. 82 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ < 4 Ο Ο > 3

Ala Vai Ala Ser Gly Pro Phe Arg Pro Phe Gin Thr Asn Gin Leu Thr 15 10 15

Asp Glu Glu Leu Leu Gly Leu Pro Lys cys cys Gin Pro Asp Ala Ala 20 25 30

Asp Lys Ala 35

<210> 4 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 4

Ala vai Ala Thr Gly Pro Tyr His Pro Ile Trp Thr Gly Arg Ala Thr 15 10 15

Asp Glu Glu pro Leu Gly Leu Pro Lys cys Cys Gin pro Asp Ala Ala 20 25 30

Asp Lys Ala 35

<210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 0 0 > 5

Cys Arg Leu Gly Gin Ala Gly ser Gly Ala 1 5 10

<210> 6 <211> 344 <212> PRT <213> Homo sapiens 83 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ < 4 Ο Ο > 6

Met 1/1 > —1 Arg Ala ser Ala Gly Gly ser Arg Leu Leu Ala Trp val Leu 1 5 10 15 Trp Leu Gin Ala Trp Gin Vai Ala Ala pro Cys Pro Gly Ala cys val 20 25 30 Cys Tyr Asn Glu pro Lys Vai Thr Thr Ser Cys Pro Gin Gin Gly Leu 35 40 45 Gin Ala vai Pro vai Gly Ile Pro Ala Ala Ser Gin Arg Ile phe Leu 50 55 60 His Gly Asn Arg lie Ser His vai Pro Ala Ala Ser Phe Arg Ala Cys 65 70 75 80 Arg Asn Leu Thr ile Leu Trp Leu His ser Asn val Leu Ala Arg Ile 85 90 95 Asp Ala Ala Ala Phe Thr Gly Leu Ala Leu Leu Glu Gin Leu Asp Leu 100 105 110 Ser Asp Asn Ala Gin Leu Arg Ser vai Asp pro Ala Thr Phe HÍS Gly 115 120 125 Leu Gly Arg Leu Hi s Thr Leu His Leu Asp Arg cys Gly Leu Gin Glu 130 135 140 Leu Gly Pro Gly Leu Phe Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gin Tyr Leu Tyr 145 150 155 160 Leu Gin Asp Asn Ala Leu Gin Ala Leu pro Asp Asp Thr Phe Arg Asp 165 170 175 Leu Gly Asn Leu Thr His Leu Phe Leu His Gly Asn Arg ile Ser Ser 180 185 190 vai Pro Glu Arg Ala Phe Arg Gly Leu His Ser Leu Asp Arg Leu Leu 195 200 205 Leu His 210 Gin Asn Arg vai Ala 215 His val HiS Pro His 220 Ala Phe Arg Asp Leu Gly Arg Leu Met Thr Leu Tyr Leu Phe Ala Asn Asn Leu ser Ala 225 230 235 240 Leu ΡΓΟ Thr Glu Ala Leu Ala Pro Leu Arg Ala Leu Gin Tyr Leu Arg 245 250 255 Leu Asn Asp Asn pro Trp Vai Cys Asp Cys Arg Ala Arg Pro Leu Trp 260 265 270 Ala Trp Leu Gin Lys Phe Arg Gly Ser ser Ser Glu val Pro cys Ser 275 280 285 Leu Pro Gin Arg Leu Ala Gly Arg Asp Leu Lys Arg Leu Ala Ala Asn 290 295 300 Asp Leu Gin Gly cys Ala Vai Ala Thr Gly pro Tyr His Pro ile Trp 305 310 315 320 Thr Gly Arg Ala Thr ASP Glu Glu Pro Leu Gly Leu Pro Lys Cys Cys 325 330 335 Gin Pro Asp Ala Ala ASp Lys Ala 340

<210> 7 <211> 310 <212> PRT <213> Homo sapíens 84 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ < 4 Ο Ο > 7

Met Lys Arg Ala ser Ala Gly Gly Ser Arg Leu Leu Ala Trp val Leu 1 5 10 15 Trp Leu Gin Ala Trp Gin Vai Ala Ala Pro Cys Pro Gly Ala Cys Val 20 25 30 cys Tyr Asn Glu pro Lys vai Thr Thr ser cys pro Gin Gin Gly Leu 35 40 45 Gin Ala vai Pro vai Gly ile Pro Ala Ala ser Gin Arg Ile Phe Leu 50 55 60 hí s Gly Asn Arg lie Ser Hi s Vai Pro Ala Ala Ser Phe Arg Ala Cys 65 70 75 80 Arg Asn Leu Thr ile Leu Trp Leu His ser Asn val Leu Ala Arg Ile 85 90 95 Asp Ala Ala Ala Phe Thr Gly Leu Ala Leu Leu Glu Gin Leu Asp Leu 100 105 110 Ser Asp Asn Ala Gin Leu Arg ser Vai Asp Pro Ala Thr Phe His Gly 115 120 125 Leu Gly Arg Leu His Thr Leu His Leu ASp Arg cys Gly Leu Gin Glu 130 135 140 Leu Gly pro Gly Leu Phe Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gin Tyr Leu Tyr 145 150 155 160 Leu Gin Asp Asn Ala Leu Gin Ala Leu Pro ASp Asp Thr Phe Arg Asp 165 170 175 Leu Gly Asn Leu Thr His Leu phe Leu His Gly Asn Arg Ile Ser Ser 180 185 190 vai pro Glu Arg Ala Phe Arg Gly Leu His ser Leu Asp Arg Leu Leu 195 200 205 Leu His Gin Asn Arg vai Ala His Val His Pro His Ala Phe Arg ASp 210 215 220 Leu 225 Gly Arg Leu Met Thr 230 Leu Tyr Leu Phe Ala 235 Asn Asn Leu Ser Ala 240 Leu pro Thr Glu Ala Leu Ala pro Leu Arg Ala Leu Gin Tyr Leu Arg 245 250 255 Leu Asn Asp Asn 260 Pro Trp vai cys Asp 265 Cys Arg Ala Arg Pro 270 Leu Trp Ala Trp Leu 275 Gin Lys Phe Arg Gly 280 ser ser ser Glu val 285 Pro cys Ser Leu Pro 290 Gin Arg Leu Ala Gly 295 Arg Asp Leu Lys Arg 300 Leu Ala Ala Asn Asp Leu Gin Gly Cys Ala 305 310 <210> 8 <211> 344 <212> PRT <213> Rattus sp. 85 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ < 4 Ο Ο > 8

Met Lys Arg Ala Ser Ser Gly Gly ser Arg Leu Pro Thr Trp vai Leu 1 5 10 15 Trp Leu Gin Ala Trp Arg vai Ala Thr Pro Cys Pro Gly Ala Cys vai 20 25 30 cys Tyr Asn Glu pro Lys vai Thr Thr ser Arg Pro Gin Gin Gly Leu 35 40 45 Gin Ala vai pro Ala Gly ile pro Ala Ser ser Gin Arg ile Phe Leu 50 55 60 His Gly Asn Arg Ile Ser Tyr Vai Pro Ala Ala Ser Phe Gin Ser Cys 65 70 75 80 Arg Asn Leu Thr lie Leu Trp Leu Hi S Ser Asn Ala Leu Ala Gly Ile 85 90 95 ASP Ala Ala Ala Phe Thr Gly Leu Thr Leu Leu Glu Gin Leu Asp Leu 100 105 110 Ser Asp Asn Ala Gin Leu Arg vai vai Asp Pro Thr Thr Phe Arg Gly 115 120 125 Leu Glv HÍ S Leu Hi s Thr i eu His Leu Asp Arg CVS Gly Leu Gin Glu 13Ô 135 14Õ Leu Gly Pro Gly Leu Phe Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gin Tyr Leu Tyr 145 150 155 160 Leu Gin Asp Asn Asn Leu Gin Ala Leu pro Asp Asn Thr Phe Arg ASp 165 170 175 Leu Gly Asn Leu Thr His Leu Phe Leu Hi S Gly Asn Arg Ile Pro Ser 180 185 190 vai ΡΓΟ Glu His Ala Phe Arg Gly Leu HÍS Ser Leu Asp Arg Leu Leu 195 200 205 Leu His Gin Asn His vai Ala Arg Vai HÍS pro His Ala Phe Arg Asp 210 215 220 Leu Gly Arg Leu Met Thr Leu Tyr Leu Phe Ala Asn Asn Leu Ser Met 225 230 235 240 Leu pro Ala Glu vai Leu vai Pro Leu Arg ser Leu Gin Tyr Leu Arg 245 250 255 Leu Asn ASp Asn Pro Trp vai Cys Asp Cys Arg Ala Arg Pro Leu Trp 260 265 270 Ala Trp Leu Gin Lys Phe Arg Gly Ser Ser Ser Gly vai Pro Ser Asn 275 280 285 Leu Pro Gin Arg Leu Ala Gly Arg Asp Leu Lys Arg Leu Ala Thr ser 290 295 300 Asp Leu Glu Gly Cys Ala Vai Ala Ser Gly pro Phe Arg Pro Phe Gin 305 310 315 320 Thr Asn Gin Leu Thr Asp Glu Glu Leu Leu Gly Leu Pro Lys Cys Cys 325 330 335

Gin ργο Asp Ala Ala Asp Lys Ala 340 <210> 9 <211> 310 <212> PRT <213> Rattus sp. 86 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ <400> 9

Met Lys Arg Ala Ser Ser Gly Gly Ser Arg Leu Pro Thr Trp val Leu 1 5 10 15 Trp Leu Gin Ala Trp Arg Vai Ala Thr Pro cys Pro Gly Al a Cys Val 20 25 30 cys Tyr Asn Glu Pro Lys Vai Thr Thr Ser Arg Pro Gin Gin Gly Leu 35 40 45 Gin Ala vai Pro Ala Gly ile Pro Ala Ser Ser Gin Arg Ile Phe Leu 50 55 60 His Gly Asn Arg Ile ser Tyr val Pro Ala Ala Ser Phe Gin Ser Cys 65 70 75 80 Arg Asn Leu Thr lie Leu Trp Leu His Ser Asn Ala Leu Ala Gly Ile 85 90 95 Asp Ala Ala Ala Phe Thr Gly Leu Thr Leu Leu Glu Gin Leu ASp Leu 100 105 110 Ser Asp Asn Ala Gin Leu Arg val val Asp Pro Thr Thr Phe Arg Gly 115 120 125 Leu Gly His Leu His Thr Leu His Leu Asp Arg Cys Gly Leu Gin Glu 130 135 140 Leu Gly Pro Gly Leu Phe Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gin Tyr Leu Tyr 145 150 155 160 Leu Gin Asp Asn Asn Leu Gin Ala Leu pro ASp Asn Thr Phe Arg Asp 165 170 175 Leu Gly Asn Leu Thr His Leu Phe Leu His Gly Asn Arg ile pro Ser 180 185 190 vai pro GlU HiS Ala Phe Arg Gly Leu His ser Leu Asp Arg Leu Leu 195 200 205 Leu His Gin Asn His vai Ala Arg val HÍS Pro HÍ S Ala Phe Arg Asp 210 215 220 Leu Gly Arg Leu Met Thr Leu Tyr Leu Phe Ala Asn Asn Leu Ser Met 225 230 235 240 Leu pro Ala Glu vai Leu val Pro Leu Arg Ser Leu Gl n Tyr Leu Arg 245 250 255 Leu Asn Asp Asn Pro Trp vai Cys Asp cys Arg Ala Arg Pro Leu Trp 260 265 270 Ala Trp Leu Gin Lys Phe Arg Gly Ser Ser Ser Gly val Pro Ser Asn 275 280 285 Leu Pro Gin Arg Leu Ala Gly Arg Asp Leu Lys Arg Leu Ala Thr Ser 290 295 300 Asp Leu Glu Gly cys Ala 305 310

<210 > 10 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência Artificial <2 2 Ο > <223> Descrição de Sequência Artificial: Ligante sintético 87 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ <210> 11 <211> 19 <212> PRT <213> Rattus sp. < 4 Ο Ο > 11

Arg vai His Pro His Ala Phe Arg Asp Leu Gly Arg Leu Met Thr Leu 15 10 15

Tyr Leu Phe

<210> 12 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador < 4 0 0 > 12 tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc ccag 34

<210> 13 <211> 37 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador < 4 0 0 > 13 ggggatatcc accatgaagt tgcctgttag gctgttg 37

<210> 14 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador degenerado < 4 0 0 > 14 ggggatatcc accatgaggk ccccwgctca gytyctkgga 40

<210> 15 <211> 144 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: sequência peptidica da cadeia leve sintética 88 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ 400 > 15 Ile Ala Met 1 Lys Leu Pro Val 5 Arg Leu Leu Val Leu 10 Met Phe Trp Pro 15 ser Ser Ser Asp 20 val val Met Thr Gin 25 Thr Pro Leu Ser Leu 30 Pro Val Ser Leu Gly Asp Gin Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu 35 40 45 vai His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro 50 55 60 Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly val Pro Asp Arg phe Ser Gly ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Asp Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe cys 100 105 110 Ser Gin ser Thr His val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu ile Lys Arg Ala ASp Ala Ala Pro Thr val Ser Ile Ser HiS HÍS 130 135 140

<210> 16 <211> 144 < 212 > PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: sequência peptidica da cadeia leve sintética <400> 16

Met Γ* *< l/> Leu pro val Arg Leu Leu val Leu Met phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser ser ser Asp val val Met Thr Gin Thr pro Leu Ser Leu Pro val 20 25 30 ser Leu Gly ASP Gin Ala Ser ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu 35 40 45 val HiS ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu HiS Trp Tyr Leu Gin Arg Pro 50 55 60 Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu ile Tyr Lys val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly val pro ASP Arg Phe ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys lie Ser Arg val Asp Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 100 105 110 ser Gin ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr val ser Ile Ser HÍS His 130 135 140

<210> 17 <211> 116 <212> PRT <213> Sequência Artificial 89 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ < 2 2 Ο > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência peptidica da cadeia pesada sintética < 4 0 0 > 17 vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Ala Glu Leu vai Met pro Gly Ala ser 1 5 10 15 Vai Lys Met ser cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Trp 20 25 30 Met Hi S Trp vai Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp ile Gly 35 40 45 Ala ile ASp pro Ser Asp Ser Tyr Ser Ser Tyr Asn Gin Asn Phe Lys 50 55 60 Gly Lys Ala Thr Leu Thr vai Asp Gly ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Gin Leu ser ser Leu Thr ser Glu Asp ser Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Arg ile Thr Glu Ala Gly Ala Trp phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Thr Vai Thr 115 < 210 > 18 <211> 114

< 212 > PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência peptidica da cadeia pesada sintética < 2 2 0 > <221> MOD_RES <222> (3) <223> aminoácido variável < 4 0 0 > 18

Leu Gin xaa Ser Gly Ala Glu Ile vai Met Pro Gly Thr Ala vai Thr 1 5 10 15 Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe Trp Met His 20 25 30 Trp vai Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile 35 40 45 Asp Pro ser ASp Ser Tyr ser Arg Ile Asn Gin Lys Phe Lys Gly Lys 50 55 60 Ala Thr Leu Thr Vai Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gin Leu 65 70 75 80 ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp ser Ala vai Tyr Tyr cys Ala Arg Arg 85 90 95 Ile Thr Glu Ala Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110 Vai Thr <210 > 19 <211 > 12 90 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ

< 212 > PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência peptídica da cadeia pesada sintética < 4 0 0 > 19

Gly Phe ser Leu ser Thr Ser Gly Gly Ser vai Gly 1 5 10

<210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência peptidica da cadeia pesada sintética <400> 20

Leu Ile Tyr Ser Asn Asp Thr Lys Tyr Tyr ser Thr ser Leu Lys Thr 15 10 15

<210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência peptidica da cadeia pesada sintética <400> 21

Ser Arg Phe Trp Thr Gly Glu Tyr Asp vai 1 5 10

<210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência peptidica da cadeia leve sintética <400> 22

Arg Ala Ser Gin Asn Ile Ala Ile Thr Leu Asn 1 5 10

<210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência peptidica da cadeia leve sintética 91 ΕΡ 1 534 736/ΡΤ <4Ο Ο> 23

Leu Ala ser ser Leu Gin ser 1 5

<210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência peptídica da cadeia leve sintética <400> 24

Gin Gin Tyr Asp Asn Tyr Pro Leu 1 5

<210> 25 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador degenerado <400> 25 aggtsmarct gcagsagtcw gg 22

Lisboa, 2010-08-30

Claims

ΕΡ 1 534 736/ΡΤ 1/11 REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido seleccionado de entre o grupo que consiste em SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5.
2. Molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido de acordo com a reivindicação 1.
3. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 2 operativamente ligada a uma sequência de controlo da expressão.
4. Vector compreendendo a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 2 ou 3.
5. Célula hospedeira compreendendo a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 2 ou 3 ou compreendendo o vector de acordo com a reivindicação 4.
6. Método de produção do polipéptido de acordo com a reivindicação 1 compreendendo os passos de: (a) cultura da célula hospedeira de acordo com a reivindicação 5; e (b) recuperação do polipéptido a partir da célula hospedeira ou do meio de cultura.
7. Método de produção de um anticorpo compreendendo os passos de: (a) imunização de um hospedeiro com um polipéptido de acordo com a reivindicação 1 ou uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 5; e (b) recuperação do anticorpo.
8. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga especificamente a um polipéptido de acordo com a reivindicação 1, ou produzido através do método de acordo com a reivindicação 7, em que o referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio: (a) inibe o colapso do cone de crescimento de um neurónio; ΕΡ 1 534 736/ΡΤ 2/11 (b) diminui a inibição do crescimento e desenvolvimento de neurites num neurónio; ou (c) inibe a ligação do receptor Nogo-1 a um ligando.
9. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 8, em que o crescimento e desenvolvimento de neurites é crescimento axónico.
10. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 8 ou 9, em que o neurónio é um neurónio do sistema nervoso central.
11. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, em que: (a) o anticorpo é um anticorpo monoclonal; (b) o anticorpo é um anticorpo de murídeo; ou (c) o anticorpo é seleccionado de entre o grupo que consiste num anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico e um anticorpo de cadeia simples.
12. Linha celular de hibridoma seleccionada de entre o grupo que consiste em: HB 7E11 tal como depositada na ATCC sob o N.° de entrada PTA-4587, HB 1H2 tal como depositada na ATCC sob o N.° de entrada PTA-4584, HB 3G5 tal como depositada na ATCC sob o N.° de entrada PTA-4586, HB 5B10 tal como depositada na ATCC sob o N.° de entrada PTA-4588, e HB 2F7 tal como depositada na ATCC sob o N.° de entrada PTA-4585.
13. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio produzido pela linha celular de hibridoma de acordo com a reivindicação 12.
14. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio que inibe competitivamente a ligação de um anticorpo de acordo com a reivindicação 13 ao polipéptido de acordo com a reivindicação 1 ou a um receptor Nogo-1, em que o referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio: (a) inibe o colapso do cone de crescimento de um neurónio; (b) diminui a inibição do crescimento e desenvolvimento de neurites num neurónio; ou ΕΡ 1 534 736/ΡΤ 3/11 (c) inibe a ligação do receptor Nogo-1 a um ligando.
15. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga especif icamente ao receptor Nogo-1, em que o referido anticorpo ou fragmento compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada de entre o grupo que consiste em: (i) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:15; (ii) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:16; e (iii) uma sequência de aminoácidos compreendendo as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de SEQ ID NOs:22, 23 e 24; e em que o referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio: (a) inibe o colapso do cone de crescimento de um neurónio; (b) diminui a inibição do crescimento e desenvolvimento de neurites num neurónio; ou (c) inibe a ligação do receptor Nogo-1 a um ligando.
16. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio da reivindicação 15 compreendendo ainda uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada de entre o grupo que consiste em: (i) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:17; (ii) a sequência de aminoácidos de SEQ ID N0:18; e (iii) uma sequência de aminoácidos compreendendo as sequências de aminoácidos de CDRl, CDR2 e CDR3 de SEQ ID N0s:19, 20 e 21.
17. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga especif icamente ao receptor Nogo-1, em que o referido anticorpo ou fragmento compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada de entre o grupo que consiste em: (i) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:17; (ii) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:18; e ΕΡ 1 534 736/ΡΤ 4/11 (iii) uma sequência de aminoácidos compreendendo as sequências de aminoácidos de CDRl, CDR2e CDR3 de SEQ ID NOs:19, 20, e 21; e em que o referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio: (a) inibe o colapso do cone de crescimento de um neurónio; (b) diminui a inibição do crescimento e desenvolvimento de neurites num neurónio; ou (c) inibe a ligação do receptor Nogo-1 a um ligando.
18. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio da reivindicação 17 compreendendo ainda uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada de entre o grupo que consiste em: (i) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:15; (ii) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:16; e (iii) uma sequência de aminoácidos compreendendo as sequências de aminoácidos de CDRl, CDR2 e CDR3 de SEQ ID NOs:22, 23 e 24.
19. Polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 seleccionado de entre o grupo que consiste em: resíduos de aminoácido 26-344 de SEQ ID NO:6; resíduos de aminoácido 26-310 de SEQ ID NO:7; resíduos de aminoácido 26-344 de SEQ ID NO:8; resíduos de aminoácido 26-310 de SEQ ID NO:9; resíduos de aminoácido 27-344 de SEQ ID NO:8; e resíduos de aminoácido 27-310 de SEQ ID NO:9.
20. Polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 de acordo com a reivindicação 19 unido a uma sequência sinal.
21. Molécula de ácido nucleico que codifica o polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 20.
22. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 21 operativamente ligada a uma sequência de controlo da expressão. ΕΡ 1 534 736/ΡΤ 5/11
23. Vector compreendendo a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 21 ou 22.
24. Célula hospedeira compreendendo a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 21 ou 22 ou compreendendo o vector de acordo com a reivindicação 23.
25. Método de produção do polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 20 compreendendo os passos de: (a) cultura da célula hospedeira de acordo com a reivindicação 24; e (b) recuperação do polipéptido a partir da célula hospedeira ou do meio de cultura.
26. Proteína de fusão do receptor Nogo-1 compreendendo: (a) resíduos de aminoácido 26-344 de SEQ ID NO:6; resíduos de aminoácido 26-310 de SEQ ID NO:7; resíduos de aminoácido 26-344 de SEQ ID NO:8; resíduos de aminoácido 26-310 de SEQ ID NO: 9; resíduos de aminoácido 27-344 de SEQ ID NO:8; e resíduos de aminoácido 27-310 de SEQ ID NO:9; e (b) um polipéptido heterólogo compreendendo: (i) uma região constante de imunoglobulina; ou (ii) uma região Fc.
27. Proteína de fusão do receptor Nogo-1 de acordo com a reivindicação 26, que é um dímero.
28. Proteína de fusão do receptor Nogo-1 de acordo com a reivindicação 26 ou 27, em que a região constante de imunoglobulina é uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina.
29. Proteína de fusão do receptor Nogo-1 de acordo com a reivindicação 28 em que a região constante da cadeia pesada de imunoglobulina é uma região constante da cadeia pesada de igG.
30. Proteína de fusão do receptor Nogo-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 29, compreendendo ainda uma sequência sinal. ΕΡ 1 534 736/ΡΤ 6/11
31. Molécula de ácido nucleico que codifica a proteína de fusão do receptor Nogo-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 30.
32. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 31 operativamente ligada a uma sequência de controlo da expressão.
33. Vector compreendendo a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 31 ou 32.
34. Célula hospedeira compreendendo a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 31 ou 32 ou compreendendo o vector de acordo com a reivindicação 33.
35. Método de produção da proteína de fusão do receptor Nogo-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 30 compreendendo os passos de: (a) cultura da célula hospedeira de acordo com a reivindicação 34; e (b) recuperação da proteína de fusão de Nogo a partir da célula hospedeira ou do meio de cultura.
36. Método de produção de um anticorpo específico do receptor Nogo-1 compreendendo os passos de: (a) imunização de um hospedeiro com um polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 20, uma proteína de fusão do receptor Nogo-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 30, ou uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 24 ou 34; e (b) recuperação do anticorpo.
37. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga especificamente a um polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 20, ou produzido através do método de acordo com a reivindicação 36, em que o referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio: (a) inibe o colapso do cone de crescimento de um neurónio; ΕΡ 1 534 736/ΡΤ 7/11 (b) diminui a inibição do crescimento e desenvolvimento de neurites num neurónio; ou (c) inibe a ligação do receptor Nogo-1 a um ligando.
38. Método in vitro de inibição da ligação do receptor Nogo-1 a um ligando, compreendendo o passo de: (a) contacto do receptor Nogo-1 com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11 e 13 a 18; ou (b) contacto do ligando com o polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 20 ou a proteina de fusão do receptor Nogo-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 30.
39. Utilização de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11 e 13 a 18, ou do polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 20, ou da proteina de fusão do receptor Nogo-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 30, para a preparação de uma composição farmacêutica para tratamento de um mamífero apresentando sinais ou sintomas de esclerose múltipla, ELA, doença de Huntington, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, neuropatia diabética, AVC, lesões cerebrais traumáticas ou lesão da espinal-medula.
40. Métodos in vitro de modulação de uma actividade de um ligando do receptor Nogo-1, compreendendo o passo de contacto do ligando do receptor Nogo-1 com o polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 20 ou a proteína de fusão do receptor Nogo-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 30.
41. Utilização do polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 20, ou da proteína de fusão do receptor Nogo-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 30, para a preparação de uma composição farmacêutica para tratamento de um mamífero apresentando sinais ou sintomas de esclerose múltipla, ELA, doença de Huntington, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, ΕΡ 1 534 736/ΡΤ 8/11 neuropatia diabética, AVC, lesões cerebrais traumáticas ou lesão da espinal-medula.
42. Método in vitro para inibição do colapso do cone de crescimento num neurónio, compreendendo os passos de: (a) contacto do neurónio com o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11 e 13 a 18; ou (b) contacto de um ligando do receptor Nogo-1 com o polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 20 ou a proteina de fusão do receptor Nogo-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 30.
43. Método in vitro para diminuição da inibição do crescimento ou desenvolvimento de neurites num neurónio, compreendendo os passo de: (a) contacto do neurónio com o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11 e 13 a 18; ou (b) contacto de um ligado do receptor Nogo-1 com o polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 20 ou a proteina de fusão do receptor Nogo-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 30 .
44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38, 40, 42 e 43, em que o ligando é seleccionado de entre o grupo que consiste em NogoA, NogoB, NogoC, MAG e OM-gp.
45. Método de acordo com a reivindicação 43, em que o crescimento ou desenvolvimento de neurites é crescimento axónico.
46. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 42, 43 e 45, em que o neurónio é um neurónio do SNC. ΕΡ 1 534 736/ΡΤ 9/11
47. Composição compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável e um componente seleccionado a de entre: (a) o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, 13 a 18 e 37; (b) o polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 20; e (c) a proteina de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 30.
48. Composição de acordo com a reivindicação 47 compreendendo ainda um ou mais agentes terapêuticos adicionais.
49. Método in vitro de promoção da sobrevivência de um neurónio em risco de morrer, compreendendo o contacto do neurónio com uma quantidade eficaz de: (a) um anticorpo anti-receptor Nogo-1 ou fragmento de ligação ao antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11 e 13 a 18; ou (b) um polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 20; ou (c) uma proteina de fusão do receptor Nogo-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 30.
50. Método da reivindicação 49, ou utilização da reivindicação 39 ou 41, em que a proteina de fusão é uma proteina de fusão de Fc.
51. Método ou utilização da reivindicação 50, em que a proteína de fusão de Fc são os resíduos de aminoácido 26-344 de SEQ ID NO:8 e a região de charneira e Fc da molécula IgGl de rato (Ig-sNogoR344).
52. Método de qualquer uma das reivindicações 49 a 51, em que o neurónio é de um mamífero.
53. Método da reivindicação 52, em que o mamífero apresenta sinais ou sintomas de esclerose múltipla, ELA, ΕΡ 1 534 736/ΡΤ 10/11 doença de Huntington, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, neuropatia diabética, AVC, lesões cerebrais traumáticas ou lesão da espinal-medula.
54. Utilização de uma célula hospedeira cultivada expressando: (a) um anticorpo anti-receptor Nogo-1 ou seu fragmento de ligação ao antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11 e 13 a 18; ou (b) um polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 20; ou (c) uma proteína de fusão do receptor Nogo-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 30; para a preparação de uma composição farmacêutica para tratamento de um mamífero apresentando sinais ou sintomas de esclerose múltipla, ela, doença de Huntington, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, neuropatia diabética, AVC, lesões cerebrais traumáticas ou lesão da espinal-medula, em que a referida célula hospedeira se destina a introdução no mamífero no local do neurónio que está em risco de morrer ou próximo deste.
55. Utilização de um vector virai compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica: (a) um anticorpo anti-receptor Nogo-1 ou seu fragmento de ligação ao antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11 e 13 a 18; ou (b) um polipéptido solúvel do receptor Nogo-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 20; ou (c) uma proteína de fusão do receptor Nogo-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 30; para a preparação de uma composição farmacêutica para tratamento de um mamífero apresentando sinais ou sintomas de esclerose múltipla, ELA, doença de Huntington, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, neuropatia diabética, AVC, lesões cerebrais traumáticas ou lesão da espinal-medula, em que o anticorpo anti-receptor Nogo-1, fragmento de ligação ao antigénio, proteína de fusão do receptor Nogo-1, ou polipéptido solúvel do receptor Nogo-1, se pretendem para ΕΡ 1 534 736/ΡΤ 11/11 expressão a partir da sequência nucleotidica no mamífero numa quantidade suficiente para promover a sobrevivência de um neurónio em risco de morrer. Lisboa, 2010-08-30