WO2024117777A1

WO2024117777A1 - 면역세포의 면역학적 간극 형성 촉진을 통해 세포용해 활성을 향상시키기 위한 NgR1 단백질의 활성 또는 발현 억제제

Info

Publication number: WO2024117777A1
Application number: PCT/KR2023/019461
Authority: WO
Inventors: 김태돈; 오세찬
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2022-11-29
Filing date: 2023-11-29
Publication date: 2024-06-06

Abstract

본 발명은 면역 세포의 면역학적 간극의 안정적인 형성과 세포용해 활성을 향상시키기 위한 표적과 이의 용도에 관한 것으로서, NgR1 단백질의 활성 또는 발현 억제제를 통해 면역 세포의 면역학적 간극 형성의 안정성을 향상시키고, 세포용해 활성 또는 세포독성을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, NgR1 단백질을 표적으로 하여 그의 활성 또는 발현 정도를 측정함으로써 신규 항암제를 스크리닝해 낼 수 있는 장점이 있다. 한편, 본 발명은 면역 세포와 암 세포 간의 접합인 면역학적 간극 형성을 촉진할 수 있을 뿐만 아니라, 면역 세포간, 암 세포간, 신경 세포간등을 포함하는 체내 장기 및 조직의 서로 같거나 다른 다양한 세포간의 세포 접합을 조절하여 세포의 기능을 조절 할 수 있다.

Description

면역세포의 면역학적 간극 형성 촉진을 통해 세포용해 활성을 향상시키기 위한 NgR1 단백질의 활성 또는 발현 억제제

[관련 출원과의 상호 인용]

본 출원은 2022. 11. 29.일자 한국 특허 출원 제10-2022-0162743호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.

[기술분야]

본 발명은 면역 세포의 면역학적 간극 형성 촉진을 통해 세포용해 활성을 향상시키기 위한 NgR1 단백질의 활성 또는 발현 억제제에 관한 것이다.

서로 같거나 다른 세포들 간에 강도 높고 빠른 신호를 전달하기 위해서는 세포들이 물리적으로 접하는 세포 간 접합 (cell-to-cell contact)이 필수적이다. 세포 간 접합은 세포 간의 의사소통 중 하나로, 세포 표면에 발현되는 분자들의 결합과 연속적인 세포 내 신호전달 분자들의 활성 조절을 통해서 세포의 기능을 조절한다. 세포 표면 분자들을 이용하는 세포 신호 전달을 위해서는 세포 간의 접합이 우선적으로 필요하다. 이러한 세포 간 접합 형성 및 과정의 오류는 암, 자가면역질환, 대사질환을 포함하는 다양한 질병을 유도할 수 있다. 따라서, 세포 간 접합을 통한 세포의 기능에 대한 깊은 이해는 질병을 더 효과적으로 치료하는데 도움이 될 수 있다.

한편, 세포 간 접합은 다양한 세포 간에 이루어질 수 있으며, 뉴런 (neuron) 간, 암 세포 간, 면역 세포 간, 암 세포와 면역 세포 간을 포함하는 체내 장기 및 조직을 구성하는 같거나 다른 여러 종류의 세포 간에 이루어질 수 있다. 세포 간 접합은 대표적으로 신경계의 신경 세포들이 형성하는 간극 (synapse)으로 설명 할 수 있는데, 신경 세포의 간극은 신경 세포 간 접합을 기반으로 신경 전달물질들을 전달하여 신경 신호의 활성을 조절하여 신경 세포의 기능을 조절하는 특징을 가진다. 간극의 정상적이지 않은 형성은 신경 세포 신호의 활성 조절 불능으로 인한 정상적인 신경 세포의 기능 이상을 초래하여, 다양한 신경생리병리학적 질병을 유발할 수 있다. 신경계에서는 신경의 축삭 성장이나 간극 형성을 조절하는, 인력 (attractive)과 척력 (repulsive) 인자를 포함하는 유도 인자 (guidance cue)들이 알려져 있다. 인력인자는 신경세포의 축삭을 성장하게 하고 간극 형성을 촉진하는 반면에, 척력인자는 이를 방해한다. 신경세포가 손상 되었을 때, 신경세포의 정상적인 기능을 위한 신경 재생과 간극 형성이 척력 인자에 의해 저해된다. NgR1 (Nogo receptor 1)은 리간드인 NogoA를 인지하여 신경 세포의 세포 골격을 위축시켜, 신경의 재생과 간극 형성을 저해하는 대표적인 인자로서, NgR1은 신경 세포 간 접합에 국한되어 그 기능이 잘 연구되어 있지만, 면역 세포 간, 암 세포 간, 다른 다양한 세포들 간의 세포 접합에서의 기능과 생물학적 의의는 깊은 연구가 필요하다.

그 기원이 세포 간 접합과 신호전달의 유사한 특성을 공유하는 신경계의 간극에서 유래된 면역학적 간극 (immunological synapse)는 또 다른 대표적인 세포 간 접합이다. 면역학적 간극 역시 세포 간 접합에 기반 된 세포 내 신호전달을 통해 면역 세포의 다양한 기능 조절에 관여한다. 특히, 면역 세포가 암 세포나 바이러스에 감염된 세포같은 표적 세포를 인식하고 제거하는 과정에 필수적이다. 면역 세포의 세포 표면 분자들은 표적 세포의 세포 표면 분자들을 인식하고 면역 세포 내로 전달되는 신호를 활성화하거나 억제하여, 표적 세포를 제거하는 세포 용해 활성을 조절한다. 표적 세포를 인식하는 면역 세포의 세포 내 신호 활성 조절 이전에, 면역 세포와 암 세포간의 세포 간 접합과 이를 통한 면역학적 간극 형성이 우선적인 과정이다.

면역 체계를 구성하는 세포들 중, 특히 자연살해 세포(natural killer cell; NK 세포)는 항원에 의한 사전 감작 없이도 종양세포, 박테리아, 세포 내 기생생물 또는 바이러스에 감염된 숙주세포를 제거하는 기능을 수행하며, 부적절한 골수 이식을 거부하고, T세포의 면역반응을 조절하는 등 생체 내 면역계 방어 기작의 제 1선에서 작용하는 행동세포이다.

이러한 자연살해 세포의 다양한 기능 중 특히, 암세포를 선택적으로 살상하는 능력이 밝혀지면서 많은 관련 연구들이 진행되었는데, 암 환자의 경우, 말초 혈액의 자연살해 세포의 수나 활성이 정상인보다 감소하였으며, 동물실험에서 자연살해 세포의 활성이 저하되면 암 발생 및 암 전이의 위험이 증가하는 것으로 알려졌다.

또한, 자연살해 세포는 숙주에 감염된 병원균 또는 암세포에 대항하기 위한 선천성 면역 반응과 사이토카인 분비를 통한 후천성 면역 반응에 중요한 역할을 하는데, 자연살해 세포가 표적 세포를 살상하는 세포 용해에 사용되는 주된 메커니즘은 퍼포린(perforin) 및 그랜자임(granzyme) B와 같은 세포 용해성 과립을 면역학적 간극을 통하여 표적 세포에 분비하는 것으로, 분비된 퍼포린은 표적 세포벽에 구멍을 만들고, 구멍을 통하여 표적 세포 내로 들어간 그랜자임이 표적 세포의 세포사멸(apoptosis)을 유도한다. 정상적인 면역학적 간극 형성은 표적 세포를 효과적으로 살상할 수 있는 기반이 되지만, 정상적이지 않은 면역학적 간극의 형성은 면역세포의 표적 세포 용해를 성공적으로 이루어내지 못하게 한다.이와 같이, 자연살해 세포는 세포가 악성으로 변형되는 발암과정이나, 바이러스 감염 초기의 방어기전에서 결정적인 역할을 하는 것으로 확인되었으며, 이러한 연구들을 바탕으로 암 치료 및 면역 질환 치료에 있어서 자연살해 세포를 비롯하여 T 세포나 자연살해 T 세포 등과 같은 면역 세포를 이용하는 면역 세포 치료법이 대두됨에 따라, 면역 세포의 세포 간 접합과 면역학적 간극 형성을 촉진시켜 세포용해 활성 또는 세포독성을 향상시키는 새로운 물질의 발굴이 필요한 실정이다.

본 발명의 일 목적은 NgR1 단백질에 특이적으로 결합하는 신규 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 NgR1 mRNA에 특이적으로 결합하는 신규 작은 간섭 RNA를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 NgR1 mRNA에 특이적으로 결합하는 신규 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 면역 세포의 면역학적 간극 형성을 촉진시켜서 면역 세포의 세포용해 활성을 향상시키는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 암 환자의 예후를 진단하거나 또는 치료전략을 결정하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 서열번호 1, 서열번호 41, 서열번호 43 또는 서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 CDR1-H, 서열번호 3, 서열번호 47 또는 서열번호 49의 아미노산 서열을 갖는 CDR2-H 및 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 51, 서열번호 53, 서열번호 55 또는 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 CDR3-H를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 23, 서열번호 79 또는 서열번호 81의 아미노산 서열을 갖는 CDR1-L, 서열번호 25, 서열번호 83 또는 서열번호 85의 아미노산 서열을 갖는 CDR2-L 및 서열번호 27, 서열번호 87 또는 서열번호 89의 아미노산 서열을 갖는 CDR3-L을 포함하는 경쇄 가변영역;을 포함하고, NgR1 단백질에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 측면은 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 59, 서열번호 61, 서열번호 63, 서열번호 65 또는 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33 또는 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역;을 포함하고, NgR1 단백질에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 69, 서열번호 71, 서열번호 73, 서열번호 75 또는 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;를 포함하고, NgR1 단백질에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

상기 항체의 항원 결합 단편은 단일 사슬 가변 단편(single chain variable fragment; scFv)일 수 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 유전자를 제공한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 재조합 발현 벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 제공한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 NgR1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법을 제공한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 서열번호 99 내지 서열번호 106 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, NgR1 mRNA에 특이적으로 결합하는, 작은 간섭 RNA를 제공한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 서열번호 107 내지 서열번호 110 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, NgR1 mRNA에 특이적으로 결합하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 작은 간섭 RNA, 및 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상를 유효성분으로 포함하는, 면역 세포의 세포용해 활성 향상용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 면역학적 간극 형성을 촉진하거나 및/또는 면역세포를 조절하여 면역세포의 활성을 증가시킴으로써 면역세포의 표적세포(예를 들면, 암세포 등) 용해 활성을 향상시켜서 표적세포의 성장을 억제시키거나 및/또는 표적세포 사멸을 유도하여 면역 세포의 세포용해 활성을 향상시키는 것일 수 있다.

상기 조성물은 NgR1 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물일 수 있다.

구체적으로, 상기 NgR1 관련 질환은, 암, 다발성 경화증, ALS, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 파킨슨병, 당뇨병성 신경병증, 뇌졸중, 외상성 뇌 손상 및 척수 손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니며, NgR1 관련 질환은 모두 포함할 수 있다.

상기 암은 피부암, 유방암, 자궁암, 식도암, 위암, 뇌종양, 교모세포종결장암, 직장암, 대장암, 폐암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 외음부암, 신장암, 혈액암, 췌장암, 전립선암, 고환암, 후두암, 두경부암, 갑상선암, 간암, 방광암, 골육종, 림프종, 혈액암, 흉선암, 요도암, 및 기관지암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니며, 암종에 속하는 질환은 모두 포함될 수 있다.

상기 조성물은 항암 치료 요법의 보조제일 수 있다.

상기 보조제는 면역 세포의 면역학적 간극 형성을 촉진하거나 및/또는 면역 세포를 조절하여 면역 세포의 활성을 증가시킴으로써 면역 세포의 면역 기능을 활성화시켜서 항암 치료 효과를 향상시킬 수 있다.

상기 조성물은 면역항암제를 추가로 더 포함할 수 있다.

상기 면역 세포는 자연살해 세포, T 세포 또는 자연살해 T 세포일 수 있다.

상기 면역항암제는 anti-PD-1, anti-PD-L1, anti-CTLA-4, anti-KIR, anti-LAG3, anti-CD137, anti-OX40, anti-CD276, anti-CD27, anti-GITR, anti-TIM3, anti-41BB, anti-CD226, anti-CD40, anti-CD70, anti-CD73, anti-ICOS, anti-CD40L, anti-BTLA, anti-TCR, anti-TIGIT, anti-VISTA, anti-TIGIT, 및 anti-NKG2A 로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니며, 공지의 면역항암제라면 모두 포함될 수 있다.

상기 조성물은 NEP1-40을 더 포함할 수 있다.

상기 NEP1-40는 서열번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor; CAR)를 제공한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 암 환자로부터 분리된 암 세포에서 Nogo 단백질의 발현 수준을 측정하는 것, 및 상기 발현 수준을 정상 세포에서의 Nogo 단백질의 발현 수준과 비교하는 것을 포함하는 암 환자의 예후 진단 또는 치료전략 결정을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 면역 세포에 후보 물질을 처리하는 것; 상기 후보 물질이 처리된 면역 세포에서 NgR1 단백질의 발현 수준 또는 활성 수준을 측정하는 것, 및 상기 측정된 NgR1 단백질의 발현 수준 또는 활성 수준을, 상기 후보 물질이 처리되지 않은 면역 세포에서의 NgR1 단백질의 발현 수준 또는 활성 수준과 비교하는 것을 포함하는, 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 항암제 스크리닝 방법은, 상기 후보 물질이 처리된 면역 세포에서 측정된 NgR1 단백질의 발현 수준 또는 활성 수준이, 상기 후보 물질이 처리되지 않은 면역 세포에서의 NgR1 단백질의 발현 수준 또는 활성 수준 보다 낮은 경우, 상기 후보 물질을 항암제로 판정하는 것을 더 포함할 수 있다.

본 발명에서는 면역 세포의 면역학적 간극 형성과 세포용해 활성에 영향을 미치는 인자로 NgR1을 확인하고, NgR1 단백질이 과발현 또는 과활성화되는 경우에 면역 세포의 세포 간 접합, 면역학적 간극 형성 및 세포용해 활성(세포독성)이 저하되는 한편, 이러한 NgR1 단백질의 발현이나 활성을 억제함으로써 면역 세포의 암 세포에 대한 세포 간 접합, 면역학적 간극 형성 및 세포용해 활성(세포독성)을 향상시킬 수 있음이 확인되었는바, 이로부터 면역 세포에서 NgR1 단백질의 발현이나 활성을 억제함으로써 암 치료 효과를 더욱 향상시키는 치료 전략이나, NgR1 단백질의 발현이나 활성을 억제할 수 있는 억제제를 스크리닝해 낼 수 있게 된 장점이 있다.

나아가, 본 발명에서는 NgR1 단백질의 활성 또는 발현을 효과적으로 억제할 수 있고, 이를 통해 면역 세포의 암 세포에 대한 세포 간 접합, 면역학적 간극 형성 및 세포용해 활성을 현저히 향상시킬 수 있는 구체적인 물질들을 스크리닝하여 최적화하였는바, 이러한 억제제들은 면역 세포의 세포용해 활성 향상 및 항암 용도로 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1a는 자연살해 세포에서도 NgR1 단백질이 발현되는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 1b는 T 세포에서도 NgR1 단백질이 발현되는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이며, 도 1c는 자연살해 세포에서 발현되는 NgR1 단백질 역시 그 리간드(Nogo 단백질)에 의해 세포내 하위 신호전달을 활성시킴을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 2a는 자연살해 세포와 표적 세포 간의 접합 과정의 각 단계를 구분한 것이고, 도 2b 및 도 2c는 NgR1의 활성을 억제함에 따라 자연살해 세포와 표적 세포가 일시적으로 접합하는 단계의 비율과 접합 유지 시간의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 3a는 자연살해 세포가 표적 세포와 면역 간극을 형성하는 경우에 액틴이 형성되는 밀도를 측정하는 원리를 살명한 것이고, 도 3b는 NgR1의 활성 억제에 따른 자연살해 세포 내의 액틴 형성 거동을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 3c는 자연살해 세포의 과립을 염색하여 형광 현미경으로 과립의 형성 과정을 시간의 경과에 따라 실시간으로 측정한 과정을 나타낸 것이고, 도 3d는 NgR1의 활성 억제에 따른 자연살해 세포 내의 과립 형성 거동을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 4a 내지 도 4d는 자연살해 세포의 NgR1 단백질이 활성화 되는 경우 자연살해 세포의 세포용해 활성 또는 세포독성이 저하됨을 인 비트로에서 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 4e는 T 세포의 NgR1 단백질이 활성화 되는 경우 T 세포의 세포용해 활성 또는 세포독성이 저하됨을 인 비트로에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 4f는 Nogo 단백질을 발현하는 U87MG 세포주를 생쥐에 이종이식하여 동물모델을 제조하는 과정을 설명한 것이고, 도 4g 및 도 4h는 자연살해 세포의 NgR1 단백질이 활성화 되는 경우 자연살해 세포의 세포용해 활성 또는 세포독성이 저하됨을 인 비보에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 5a 및 도 5b는 각각 자연살해 세포와 T 세포의 NgR1과 암 세포의 Nogo 단백질 간의 관계가 항암 면역에 미치는 영향을 확인하기 위하여, TCGA 데이터를 이용하여 진단학적 예후를 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 6a는 신규 CSA108 항체 및 이를 최적화한 2종의 항-NgR1 항체의 NgR1에 대한 결합 특이성을 분석한 표면 플라즈몬 공명 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 6b는 신규 CSA123 항체 및 이를 최적화한 4종의 항-NgR1 항체의 NgR1에 대한 결합 특이성을 분석한 표면 플라즈몬 공명 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 7a 내지 7c는 CSA108 항체 및 이를 최적화한 2종의 항-NgR1 항체와, CSA123 항체 및 이를 최적화한 4종의 항-NgR1 항체에 의해 NgR1의 활성이 억제되었을 때 자연살해 세포의 세포용해 활성 또는 세포독성이 향상됨을 인 비트로에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 8은 NgR1의 mRNA에 특이적으로 결합하는 8종의 신규 siRNA(siNgR1 #11 내지 #18)에 의해 NgR1의 활성이 억제되었을 때 자연살해 세포의 세포용해 활성 또는 세포독성이 향상됨을 인 비트로에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 9는 NK 세포에 NgR1의 mRNA에 특이적으로 결합하는 4종의 신규 ASO(aso-NgR1 #2s, #3s, #5s 및 #7s)를 처리하였을 때, NK 세포 표면에서 NgR1의 발현이 감소됨을 인 비트로에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 10은 NgR1의 mRNA에 특이적으로 결합하는 4종의 신규 ASO(aso-NgR1 #2s, #3s, #5s 및 #7s)에 의해 NgR1의 활성이 억제되었을 때 자연살해 세포의 세포용해 활성 또는 세포독성이 향상됨을 인 비트로에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 11은 본 발명에서 NgR1의 활성 억제가 면역 세포의 활성에 영향을 미치는 원리를 설명한 개략도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

1. 면역 세포의 면역학적 간극 형성 촉진을 통해 세포 용해 활성을 향상시키기 위한 조성물

본 발명의 일 측면은 면역 세포의 세포용해 활성 향상용 조성물을 제공한다.

상기 면역 세포의 세포용해 활성 향상용 조성물은 면역학적 간극 형성을 촉진하거나 및/또는 면역세포를 조절하여 면역세포의 활성을 증가시킴으로써 면역세포의 표적세포(예를 들면, 암세포 등) 용해 활성을 향상시켜서 표적세포의 성장을 억제시키거나 및/또는 표적세포 사멸을 유도하여 면역 세포의 세포용해 활성을 향상시키는 것일 수 있다.

본 발명의 면역 세포의 세포용해 활성 향상용 조성물은 NgR1 단백질에 대한 억제제를 유효성분으로 포함한다.

구체적으로, 본 발명의 상기 면역 세포의 세포용해 활성 향상용 조성물은 NgR1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편. NgR1 mRNA에 특이적으로 결합하는 작은 간섭 RNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함한다.

상기 면역 세포의 세포용해 활성 향상용 조성물은 NgR1 단백질에 특이적으로 결합하는 NEP1-40를 추가적으로 유효성분으로 포함할 수 있다.

상기 면역 세포는 면역을 유도하여 표적 세포를 사멸시키는 효과를 나타낼 수 있는 세포일 수 있고, 특히 표적 세포를 용해시킴으로써 사멸시키는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 면역 세포는 자연살해 세포(NK cell), T 세포, 자연살해 T 세포(NKT cell), 사이토카인 유도 살해세포(Cytokine Induced Killer cell; CIK), 마크로파지, 수지상세포 등일 수 있다.

상기 NgR1 단백질은 'Nogo receptor 1', 'Reticulon 4 receptor'(RTN4R) 또는 'Nogo-66 Receptor'(NgR)이라고 불리는 473개의 아미노산으로 이루어진 분자량 50,708Da의 단백질로서, 신경돌기 성장 억제제(neurite outgrowth inhibitor)인 Nogo(또는 'Reticulon 4 ') 단백질을 리간드로 하는 수용체이다. 상기 NgR1 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열은 NCBI의 GeneBank 등 공지의 데이터베이스(예를 들어, GenBank No. NP_075380, NM_023004 등)에서 얻을 수 있다. 그러나, 상기 공지된 서열뿐만 아니라, 상기 NgR1의 공지된 아미노산 서열의 일부 아미노산이 부가, 치환, 결실 등의 방법으로 변이된 변이체도 본 발명의 NgR1 단백질의 범주에 포함될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 자연살해 세포나 T 세포 등과 같은 면역 세포에서 NgR1 단백질이 활성화된 경우에 암 세포에 대한 면역 세포 고유의 세포용해 활성 또는 세포독성이 저하되는 반면, 상기와 같은 NgR1 단백질이 활성화되는 것을 억제함으로써 암 세포에 대한 면역 세포의 세포용해 활성 또는 세포독성이 향상됨을 확인하였고, 이로부터 면역 세포의 세포용해 활성 또는 세포독성을 향상시키기 위한 수단으로 NgR1 단백질에 대한 억제제가 이용될 수 있음을 확인하였다. 특히, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 자연살해 세포에서 상기 NgR1 단백질이 활성화되면, 자연살해 세포가 그 표적인 암 세포와 접합하는 초기 단계에 면역학적 간극을 형성하는 액틴(actin)의 형성이 억제됨으로써 종국적으로 자연살해 세포의 세포용해 활성 또는 세포독성을 음성적으로 조절하는 것으로 확인되었다. 따라서 자연살해 세포나 T 세포 등과 같은 면역 세포에서 NgR1 단백질의 활성화를 억제하거나, NgR1 단백질의 발현 자체를 억제함으로써, NgR1 단백질의 리간드에 의한 면역 세포의 세포용해 활성 또는 세포독성이 저하되는 것을 방지할 수 있음을 알 수 있다.

상기 NgR1 단백질에 대한 억제제는 면역 세포내에서 NgR1의 활성 또는 발현을 억제하는 제제를 의미하는 것으로, 예컨대 발현된 NgR1 단백질의 분해를 증가시키거나 그 활성을 방해하는 NgR1 단백질의 활성 억제제, 또는 NgR1 단백질의 발현을 전사 수준에서 감소시키는 NgR1 단백질의 발현 억제제일 수 있다.

상기 NgR1 단백질의 활성 억제제는 NgR1 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스(peptide mimetics), 앱타머(aptamer), 항체 등일 수 있다.

상기 NgR1 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물나 펩티드는 본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 통상의 방법, 예컨대 화합물 스크리닝이나 파지 디스플레이 등의 방식으로 얻을 수 있다.

본 발명에서 상기 NgR1 단백질에 특이적으로 결합하는 펩티드는 NEP1-40일 수 있고, 상기 NEP1-40는 서열번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 펩티드 미메틱스는 상기 NgR1 단백질의 결합 도메인을 억제하는 펩티드 또는 비펩티드로서, psi 결합과 같은 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있다(Benkirane et al., J. Biol. Chem., 271: 33218-33224 (1996)). 또한, 상기 펩티드 미메틱스는 상기 NgR1 단백질의 이차 구조 특성과 유사하게 구조화되고, 항체나 수용성 수용체와 같은 거대한 분자의 억제 특성을 모방할 수 있으며(Park et al.,. Nat. Biotechnol., 18: 194-198 (2000); Takasaki et al., Nat. Biotechnol., 15: 1266-1270 (1997)), 천연의 길항제와 동등한 효과로 작용할 수 있는 신규한 소분자일 수 있다(Wrighton et al., Nat. Biotechnol., 15: 1261-1265 (1997)).

상기 앱타머는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 상기 NgR1 단백질에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형 핵산)을 의미한다. 상기 앱타머는 고유의 높은 친화성(보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 단일 항체와 비교가 되고, 특히 '화학 항체'라고 할 만큼 대체 항체로서의 높은 가능성이 있다. 본 발명의 목적상 상기 앱타머는 NgR1 단백질에 결합하여 그 활성을 억제할 수 있는 것인 한, 제한 없이 이용될 수 있다.

상기 항체는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 두 개의 중쇄 각각에 하나씩의 경쇄가 이황화 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 면역글로불린 분자 및 이들의 다량체로서, 상기 NgR1 단백질의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하는 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 통상의 방법에 의해 제조될 수 있다.

상기 경쇄는 두 개의 영역, 즉 하나의 가변영역(경쇄 가변영역, VL)과 하나의 불변 영역(경쇄 불변 영역, CL)을 포함하고, 상기 중쇄는 네 개의 영역, 즉 하나의 가변영역(중쇄 가변영역, VH)과 세 개의 불변 영역(중쇄 불변 영역, CH; CH1, CH2 및 CH3)을 포함한다. 경쇄와 중쇄의 불변 영역은 경쇄 및/또는 중쇄들 간의 결합, 분비, 보체 결합, Fc 수용체(FcR)와의 결합 등과 같은 생물학적 성질을 부여하는 역할을 하고, 경쇄와 중쇄의 가변영역은 항원에 대한 인식 및 결합 특이성을 결정한다. 특히, 항체의 결합 특이성은 항체 결합 자리(antigen binding site) 및 항원 결정기(epitope) 사이의 구조적인 상보성에 의한 것인데, 상기와 같은 항체 결합 자리는 주로 중쇄와 경쇄의 가변영역에 포함된 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)이라고 불리는 3개의 초가변영역에서 유래한 잔기들로 이루어지기 때문에, 상기와 같은 상보성 결정 영역을 항체의 결합 특이성을 정의하는 아미노산 서열들로 지칭한다. 상기와 같은 3개의 CDR은 프레임워크 영역(framework region, FR)이라고 불리는 4개의 비교적 잘 보존된 영역들 사이에 배치되는데, 이들은 N-말단에서 C-말단의 방향으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 순서로 배치되어 연결된다. 이때, 상기 중쇄 가변영역에 포함되는 3개의 CDR을 각각 CDR1-H, CDR2-H 및 CDR3-H라고 하고, 상기 경쇄 가변영역에 포함되는 3개의 CDR을 각각 CDR1-L, CDR2-L 및 CDR3-L이라고 한다.

본 발명에서 일컫는 '항원 결합 단편'은 온전한 항체의 일부분, 특히 온전한 항체의 항원 결합 자리 또는 가변영역을 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 당단백질을 의미한다. 상기와 같은 항체 결합 단편은 재조합 DNA 기법에 의하거나, 온전한 항체를 효소적 또는 화학적으로 분해함으로써 생성될 수 있고, 상기 항체 결합 단편의 예로는 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, 디아바디(diabodies) 등은 물론, 이들로부터 형성된 이중특이적 및 다중특이적 항체들도 포함하며, 이에 국한되지 않는다.

상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1 개의 항원 결합 부위를 가진다. 상기 Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역 (hinge region)을 가진다는 점에서 상기 Fab와 차이가 있다. 상기 F(ab')2는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. 상기 Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체 조각을 의미한다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고, 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통해 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 항원 결합 단편은, 단백질 가수분해 효소를 이용하거나(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다.), 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예컨대 인간으로부터 유래하는 항체의 중쇄 불변영역 및/또는 경쇄 불변영역을 더 포함할 수 있으며, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 NgR1에 대해 특이적으로 결합하는 특성을 저해하지 않는 것이라면, 상기 인간으로부터 유래하는 항체의 중쇄 불변영역 및/또는 경쇄 불변영역은 그 종류나 아미노산 서열에 제한없이 이용될 수 있다.

본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1, 서열번호 41, 서열번호 43 또는 서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 CDR1-H, 서열번호 3, 서열번호 47 또는 서열번호 49의 아미노산 서열을 갖는 CDR2-H 및 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 51, 서열번호 53, 서열번호 55 또는 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 CDR3-H를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 23, 서열번호 79 또는 서열번호 81의 아미노산 서열을 갖는 CDR1-L, 서열번호 25, 서열번호 83 또는 서열번호 85의 아미노산 서열을 갖는 CDR2-L 및 서열번호 27, 서열번호 87 또는 서열번호 89의 아미노산 서열을 갖는 CDR3-L을 포함하는 경쇄 가변영역;을 포함하는 것일 수 있고, 또는 이를 기반으로 항원 특이성을 최적화한 것일 수 있으나, 이에 특별히 한정되지 아니한다.

또한, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 59, 서열번호 61, 서열번호 63, 서열번호 65 또는 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33 또는 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역;을 포함하는 것일 수 있고, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 69, 서열번호 71, 서열번호 73, 서열번호 75 또는 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;를 포함하는 것일 수 있으며, 또는 이를 기반으로 항원 특이성을 최적화한 것일 수 있으나, 이에 특별히 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CSA108 항체일 수 있고, 이를 기반으로 항원 특이성을 최적화한 C1HE2E6 항체 또는 H6HE2L 항체일 수 있다. 본 발명에서 서열번호 1의 아미노산 서열은 CSA108 항체, C1HE2E6 항체, 및 H6HE2L 항체의 CDR1-H 서열을 의미하고, 서열번호 3의 아미노산 서열은 CSA108 항체, C1HE2E6 항체, 및 H6HE2L 항체의 CDR2-H 서열을 의미하고, 서열번호 5의 아미노산 서열은 CSA108 항체의 CDR3-H 서열을 의미하고, 서열번호 7의 아미노산 서열은 C1HE2E6 항체의 CDR3-H 서열을 의미하고, 서열번호 9의 아미노산 서열은 H6HE2L 항체의 CDR3-H 서열을 의미한다. 서열번호 11의 아미노산 서열은 CSA108 항체의 중쇄 가변영역 서열을 의미하고, 서열번호 13의 아미노산 서열은 C1HE2E6 항체의 중쇄 가변영역 서열을 의미하고, 서열번호 15의 아미노산 서열은 H6HE2L 항체의 중쇄 가변영역 서열을 의미한다. 서열번호 17의 아미노산 서열은 CSA108 항체의 중쇄 전체 서열을 의미하고, 서열번호 19의 아미노산 서열은 C1HE2E6 항체의 중쇄 전체 서열을 의미하고, 서열번호 21의 아미노산 서열은 H6HE2L 항체의 중쇄 전체 서열을 의미한다.

또한, 본 발명에서 서열번호 23의 아미노산 서열은 CSA108 항체, C1HE2E6 항체, 및 H6HE2L 항체의 CDR1-L 서열을 의미하고, 서열번호 25의 아미노산 서열(AAS)은 CSA108 항체, C1HE2E6 항체, 및 H6HE2L 항체의 CDR2-L 서열을 의미하고, 서열번호 27의 아미노산 서열은 CSA108 항체, C1HE2E6 항체, 및 H6HE2L 항체의 CDR3-H 서열을 의미한다. 서열번호 29의 아미노산 서열은 CSA108 항체의 경쇄 가변영역 서열을 의미하고, 서열번호 31의 아미노산 서열은 C1HE2E6 항체의 경쇄 가변영역 서열을 의미하고, 서열번호 33의 아미노산 서열은 H6HE2L 항체의 경쇄 가변영역 서열을 의미한다. 서열번호 35의 아미노산 서열은 CSA108 항체의 경쇄 전체 서열을 의미하고, 서열번호 37의 아미노산 서열은 C1HE2E6 항체의 경쇄 전체 서열을 의미하고, 서열번호 39의 아미노산 서열은 H6HE2L 항체의 경쇄 전체 서열을 의미한다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CSA123 항체일 수 있고, 이를 기반으로 항원 특이성을 최적화한 G8 항체, S3 항체, S6 항체 또는 D11 항체일 수 있다. 본 발명에서 서열번호 41의 아미노산 서열은 CSA123 항체, S3 항체, 및 D11 항체의 CDR1-H 서열을 의미하고, 서열번호 43의 아미노산 서열은 G8 항체의 CDR1-H 서열을 의미하고, 서열번호 45의 아미노산 서열은 S6 항체의 CDR1-H 서열을 의미하고, 서열번호 47의 아미노산 서열은 CSA123 항체, 및 S3 항체의 CDR2-H 서열을 의미하고, 서열번호 49의 아미노산 서열은 G8 항체, S6 항체, 및 D11 항체의 CDR2-H 서열을 의미하고, 서열번호 51의 아미노산 서열은 CSA123 항체, 및 S6 항체의 CDR3-H 서열을 의미하고, 서열번호 53의 아미노산 서열은 G8 항체의 CDR3-H 서열을 의미하고, 서열번호 55의 아미노산 서열은 S3 항체의 CDR3-H 서열을 의미하고, 서열번호 57의 아미노산 서열은 D11 항체의 CDR3-H 서열을 의미한다. 서열번호 59의 아미노산 서열은 CSA123 항체의 중쇄 가변영역 서열을 의미하고, 서열번호 61의 아미노산 서열은 G8 항체의 중쇄 가변영역 서열을 의미하고, 서열번호 63의 아미노산 서열은 S3 항체의 중쇄 가변영역 서열을 의미하고, 서열번호 65의 아미노산 서열은 S6 항체의 중쇄 가변영역 서열을 의미하고, 서열번호 67의 아미노산 서열은 D11 항체의 중쇄 가변영역 서열을 의미한다. 서열번호 69의 아미노산 서열은 CSA123 항체의 중쇄 전체 서열을 의미하고, 서열번호 71의 아미노산 서열은 G8 항체의 중쇄 전체 서열을 의미하고, 서열번호 73의 아미노산 서열은 S3 항체의 중쇄 전체 서열을 의미하고, 서열번호 75의 아미노산 서열은 S6 항체의 중쇄 전체 서열을 의미하고, 서열번호 77의 아미노산 서열은 D11 항체의 중쇄 전체 서열을 의미한다.

또한, 본 발명에서 서열번호 79의 아미노산 서열은 CSA123 항체, 및 D11 항체의 CDR1-L 서열을 의미하고, 서열번호 81의 아미노산 서열은 G8 항체, S3 항체, 및 S6 항체의 CDR1-L 서열을 의미하고, 서열번호 83의 아미노산 서열(AAS)은 CSA123 항체, 및 D11 항체의 CDR2-L 서열을 의미하고, 서열번호 85의 아미노산 서열(YAA)은 G8 항체, S3 항체, 및 S6 항체의 CDR2-L 서열을 의미하고, 서열번호 87의 아미노산 서열은 CSA123 항체, 및 D11 항체의 CDR3-L 서열을 의미하고, 서열번호 89의 아미노산 서열은 G8 항체, S3 항체, 및 S6 항체의 CDR3-L 서열을 의미한다. 서열번호 91의 아미노산 서열은 CSA123 항체, G8 항체, S3 항체, S6 항체, 및 D11 항체의 경쇄 가변영역 서열을 의미하고, 서열번호 94의 아미노산 서열은 CSA123 항체, G8 항체, S3 항체, S6 항체, 및 D11 항체의 경쇄 전체 서열을 의미한다.

앞서 설명한 아미노산 서열들은, 이를 포함하는 폴리펩티드의 구조, 기능, 활성 등에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해 상이한 서열을 가지는 변이체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 아미노산 서열들은 당업계에 알려진 통상적인 변형이 일어난 아미노산을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 아미노산 변형은 예컨대 인산화 (phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등일 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 앞서 설명한 아미노산 서열들을 포함하는 것뿐만 아니라, 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 것이나 이의 변이체를 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 것의 의미는, 앞서 설명한 아미노산 서열과 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않고, 다중클론 항체, 단일클론 항체 및 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고, 모든 면역글로불린 항체뿐만 아니라 인간화 항체 등의 특수한 항체를 포함할 수 있다. 아울러, 상기 항체는 전체 길이의 경쇄 2개 및 전체 길이의 중쇄 2개를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체의 기능적인 단편 또한 포함한다. 상기 항체의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합성을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 항체는 NgR1 단백질에 결합하여 그 활성을 억제할 수 있는 것인 한, 제한 없이 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 암호화하는 유전자를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서는 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역에 포함되는 CDR들 각각을 암호화하는 유전자, 다시 말해 CDR1-H를 암호화하는 유전자, CDR2-H를 암호화하는 유전자 및 CDR3-H를 암호화하는 유전자를 각각 개별적으로 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역에 포함되는 CDR들 각각을 암호화하는 유전자는 본 발명의 CSA108 항체와, 이를 기반으로 항원 특이성을 최적화한 C1HE2E6 항체, 및 H6HE2L 항체의 중쇄 가변영역에 포함되는 CDR들 각각을 암호화하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에서 서열번호 2의 염기서열은 CSA108 항체, C1HE2E6 항체, 및 H6HE2L 항체의 CDR1-H를 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 4의 염기서열은 CSA108 항체, C1HE2E6 항체, 및 H6HE2L 항체의 CDR2-H를 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 6의 염기서열은 CSA108 항체의 CDR3-H를 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 8의 염기서열은 C1HE2E6 항체의 CDR3-H를 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 10의 염기서열은 H6HE2L 항체의 CDR3-H를 암호화하는 유전자를 의미한다.

또한, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역에 포함되는 CDR들 각각을 암호화하는 유전자는 본 발명의 CSA123 항체와, 이를 기반으로 항원 특이성을 최적화한 G8 항체, S3 항체, S6 항체, 및 D11 항체의 중쇄 가변영역에 포함되는 CDR들 각각을 암호화하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에서 서열번호 42의 염기서열은 CSA123 항체, S3 항체, 및 D11 항체의 CDR1-H를 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 44의 염기서열은 G8 항체의 CDR1-H를 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 46의 염기서열은 S6 항체의 CDR1-H를 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 48의 염기서열은 CSA123 항체, 및 S3 항체의 CDR2-H를 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 50의 염기서열은 G8 항체, S6 항체, 및 D11 항체의 CDR2-H를 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 52의 염기서열은 CSA123 항체, 및 S6 항체의 CDR3-H를 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 54의 염기서열은 G8 항체의 CDR3-H를 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 56의 염기서열은 S3 항체의 CDR3-H를 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 58의 염기서열은 D11 항체의 CDR3-H를 암호화하는 유전자를 의미한다.

또한, 본 발명의 다른 구현예에서는 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역을 암호화하는 유전자와 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 전체를 암호화하는 유전자를 각각 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역, 또는 중쇄 전체를 암호화하는 유전자는 본 발명의 CSA108 항체와, 이를 기반으로 항원 특이성을 최적화한 C1HE2E6 항체, 및 H6HE2L 항체의 중쇄 가변영역, 또는 중쇄 전체를 암호화하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에서 서열번호 12의 염기서열은 CSA108 항체의 중쇄 가변영역을 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 14의 염기서열은 C1HE2E6 항체의 중쇄 가변영역을 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 16의 염기서열은 H6HE2L 항체의 중쇄 가변영역을 암호화하는 유전자를 의미한다. 서열번호 18의 염기서열은 CSA108 항체의 중쇄 전체를 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 20의 염기서열은 C1HE2E6 항체의 중쇄 전체를 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 22의 염기서열은 H6HE2L 항체의 중쇄 전체를 암호화하는 유전자를 의미한다.

또한, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역, 또는 중쇄 전체를 암호화하는 유전자는 본 발명의 CSA123 항체와, 이를 기반으로 항원 특이성을 최적화한 G8 항체, S3 항체, S6 항체, 및 D11 항체의 중쇄 가변영역, 또는 중쇄 전체를 암호화하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에서 서열번호 60의 염기서열은 CSA123 항체의 중쇄 가변영역을 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 62의 염기서열은 G8 항체의 중쇄 가변영역을 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 64의 염기서열은 S3 항체의 중쇄 가변영역을 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 66의 염기서열은 S6 항체의 중쇄 가변영역을 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 68의 염기서열은 D11 항체의 중쇄 가변영역을 암호화하는 유전자를 의미한다. 서열번호 70의 염기서열은 CSA123 항체의 중쇄 전체를 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 72의 염기서열은 G8 항체의 중쇄 전체를 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 74의 염기서열은 S3 항체의 중쇄 전체를 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 76의 염기서열은 S6 항체의 중쇄 전체를 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 78의 염기서열은 D11 항체의 중쇄 전체를 암호화하는 유전자를 의미한다.

또한, 본 발명의 또 다른 구현예에서는 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역에 포함되는 CDR들 각각을 암호화하는 유전자, 다시 말해 CDR1-L을 암호화하는 유전자, CDR2-L을 암호화하는 유전자 및 CDR3-L을 암호화하는 유전자를 각각 개별적으로 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역에 포함되는 CDR들 각각을 암호화하는 유전자는 본 발명의 CSA108 항체와, 이를 기반으로 항원 특이성을 최적화한 C1HE2E6 항체, 및 H6HE2L 항체의 경쇄 가변영역에 포함되는 CDR들 각각을 암호화하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에서 서열번호 24의 염기서열은 CSA108 항체, C1HE2E6 항체, 및 H6HE2L 항체의 CDR1-L을 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 26의 염기서열(gct gca tcc)은 CSA108 항체, C1HE2E6 항체, 및 H6HE2L 항체의 CDR2-L을 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 28의 염기서열은 CSA108 항체, C1HE2E6 항체, 및 H6HE2L 항체의 CDR3-H를 암호화하는 유전자를 의미한다.

또한, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역에 포함되는 CDR들 각각을 암호화하는 유전자는 본 발명의 CSA123 항체와, 이를 기반으로 항원 특이성을 최적화한 G8 항체, S3 항체, S6 항체, 및 D11 항체의 경쇄 가변영역에 포함되는 CDR들 각각을 암호화하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에서 서열번호 80의 염기서열은 CSA123 항체, 및 D11 항체의 CDR1-L을 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 82의 염기서열은 G8 항체, S3 항체, 및 S6 항체의 CDR1-L을 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 84의 염기서열(gct gca tcc)은 CSA123 항체, 및 D11 항체의 CDR2-L을 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 86의 염기서열(tat gct gca)은 G8 항체, S3 항체, 및 S6 항체의 CDR2-L을 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 88의 염기서열은 CSA123 항체, 및 D11 항체의 CDR3-L을 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 90의 염기서열은 G8 항체, S3 항체, 및 S6 항체의 CDR3-L을 암호화하는 유전자를 의미한다.

또한, 본 발명의 다른 구현예에서는 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역을 암호화하는 유전자와 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 전체를 암호화하는 유전자를 각각 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역, 또는 경쇄 전체를 암호화하는 유전자는 본 발명의 CSA108 항체와, 이를 기반으로 항원 특이성을 최적화한 C1HE2E6 항체, 및 H6HE2L 항체의 경쇄 가변영역, 또는 경쇄 전체를 암호화하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에서 서열번호 30의 염기서열은 CSA108 항체의 경쇄 가변영역을 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 32의 염기서열은 C1HE2E6 항체의 경쇄 가변영역을 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 34의 염기서열은 H6HE2L 항체의 경쇄 가변영역을 암호화하는 유전자를 의미한다. 서열번호 36의 염기서열은 CSA108 항체의 경쇄 전체를 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 38의 염기서열은 C1HE2E6 항체의 경쇄 전체를 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 40의 염기서열은 H6HE2L 항체의 경쇄 전체를 암호화하는 유전자를 의미한다.

또한, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역, 또는 경쇄 전체를 암호화하는 유전자는 본 발명의 CSA123 항체와, 이를 기반으로 항원 특이성을 최적화한 G8 항체, S3 항체, S6 항체, 및 D11 항체의 경쇄 가변영역, 또는 경쇄 전체를 암호화하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에서 서열번호 92의 염기서열은 CSA123 항체, G8 항체, S3 항체, 및 D11 항체의 경쇄 가변영역을 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 93의 염기서열은 S6 항체의 경쇄 가변영역을 암호화하는 유전자를 의미한다. 서열번호 95의 염기서열은 CSA123 항체, G8 항체, S3 항체, 및 D11 항체의 경쇄 전체를 암호화하는 유전자를 의미하고, 서열번호 96의 염기서열은 S6 항체의 경쇄 전체를 암호화하는 유전자를 의미한다.

상기 CDR들을 암호화하는 유전자는 암호화 영역으로부터 발현되는 상기 CDR들의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변이가 이루어질 수 있다. 결국, 상기 CDR들의 유전자는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이러한 변이 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

또한, 상기 중쇄 또는 경쇄의 가변영역을 암호화하는 유전자는 암호화 영역으로부터 발현되는 상기 가변영역들의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변이가 이루어질 수 있다. 결국, 상기 가변영역들의 유전자는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이러한 변이 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 유전자는 상기 나열된 염기서열과 실질적으로 동일한 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 실질적으로 동일한 염기서열이란, 예컨대 전사 및 번역되었을 때 동일한 아미노산이 합성될 수 있는 경우를 포함하며, 상기 나열된 염기서열들과 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 상동성을 가지는 염기서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 유전자는 이를 도입시켜 발현시키고자 하는 생물의 종류와 상기 생물의 전사, 번역 등 발현 시스템에 따라, 최적화된 염기서열을 포함할 수 있다. 이는 코돈의 축퇴성(degeneracy)에서 기인한 것으로, 이에 따라 발현되는 단백질을 암호화할 수 있는 다양한 조합의 뉴클레오티드 서열이 존재할 수 있으며 이들은 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 코돈 최적화에 따른 폴리뉴클레오티드의 변형은, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시켜 적용시키고자 하는 생물의 종류에 따라 결정될 수 있으며, 예컨대 본 발명의 유전자는 포유동물, 영장류의 코돈 선택에 최적화하여 변형된 유전자일 수 있고, 더욱 구체적으로는 인간으로부터 발현시켜 작용하기에 적합하도록 최적화되어 변형된 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 암호화하는 유전자가 포함된 재조합 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.

상기 재조합 발현 벡터는 세포 내에서 삽입물이 발현되도록 삽입물에 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미하는 것으로, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 암호화하는 유전자를 포함하고, 상기 유전자는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.

상기 '작동가능하게 연결된'은 목적 단백질을 암호화하는 영역이 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 조절 요소에 연결된 상태를 의미한다.

상기 재조합 발현 벡터는 표준적인 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조 및 정제될 수 있다. 상기 재조합 발현 벡터의 종류는 원핵 세포 및 진핵 세포의 각종 숙주 세포에서 원하는 유전자를 발현하고, 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 목적 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 재조합 발현 벡터는 플라스미드(plasmids), 코스미드(cosmids), 인공 염색체(artificial chromosomes), 리포솜(liposomes), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노 부속 바이러스(adenovirus-associated virus, AAV), 백시니아바이러스(vaccinia virus), 허피스바이러스(herpes virus), 렌티바이러스(lentivirus) 또는 스푸마바이러스(spumavirus)로 구성된 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 재조합 발현 벡터는 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 발현 또는 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 터미네이터(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절서열, 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 목적에 따라 조합하여 더 포함할 수 있다.

상기 재조합 발현 벡터는 벡터가 도입된 숙주세포를 선택하기 위한 선택 마커를 추가로 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.

또한, 상기 재조합 발현 벡터는 발현 단백질의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 암호화하는 유전자에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자가 연결될 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-태그(His-tag), c-myc 등이 단독으로 사용되거나 이들 중 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수도 있다. 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 암호화하는 유전자는 제한효소 절단 위치를 통해 클로닝될 수 있으며, 상기 벡터에 단백질 절단효소 인식 부위를 암호화하는 유전자가 사용된 경우에는 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 암호화하는 유전자와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 수득한 후 단백질 절단효소로 절단 시, 원래 형태의 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부가 생산될 수 있도록 할 수 있다.

또한, 본 발명의 형질전환체에는 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 전부 또는 일부를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된다.

본 발명에 따른 상기 재조합 발현 벡터를 발현 목적에 따라 박테리아, 효모, 대장균, 진균류, 식물 세포 및 동물 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 적절한 숙주세포에 형질 전환시킴으로써 형질전환체를 제조할 수 있다. 예컨대, 상기 숙주세포는 대장균(E. coli BL21(DE3), DH5α등) 또는 효모 세포 (Saccharomyces 속, Pichia 속 등) 등일 수 있다. 이때, 숙주세포의 종류에 따라 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 NgR1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 형질전환체 제조를 위한 재조합 발현 벡터의 도입 방법은 공지의 기술, 즉, 열 충격법, 전기충격법 등을 사용할 수 있다.

상기 형질전환체로부터 발현된 단백질은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편이므로, 상기 형질전환체를 대량 배양하여 상기 유전자를 발현시킴으로써, 상기 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 대량 생산을 용이하게 할 수 있다.

본 발명에서, 상기 NgR1 단백질의 발현 억제제는 상기 NgR1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA와 RNA 간섭(RNA interference)을 일으킬 수 있는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 핵산 서열일 수 있고, 예컨대 상기 NgR1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 마이크로RNA(microRNA; miRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA) 등일 수 있다. 상기 NgR1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA와 RNA 간섭(RNA interference)을 일으킬 수 있는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 핵산 서열은 상기 NgR1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 일부에 대하여 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상 또는 100%의 상동성을 가지는 서열로 이루어질 수 있으며, 상기 NgR1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 일부에 대하여 상동성을 가지는 서열 부분은 7 염기 이상, 10 염기 이상, 13 염기 이상, 15 염기 이상, 18 염기 이상 또는 20 염기 이상일 수 있다. 특히, 상기 NgR1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA와 RNA 간섭(RNA interference)을 일으킬 수 있는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 핵산 서열은 서열번호 41 내지 서열번호 54 중 어느 하나의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 특별히 한정되지 아니한다. 한편, 상기 NgR1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA와 RNA 간섭(RNA interference)을 일으킬 수 있는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 핵산 서열은 화학적 또는 생화학적으로 합성되거나, 생체 내에서 합성될 수 있다. 예컨대, 상기 NgR1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA와 RNA 간섭(RNA interference)을 일으킬 수 있는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 핵산 서열은 시험관 내에서 RNA 중합효소 I를 이용하는 등의 방법으로 합성되어 생체 내로 투여될 수 있고, 또는 다중 클로닝 자리(multi-cloning site; MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 등의 방법으로 생체 내에서 합성되도록 할 수도 있다.

상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 상기 NgR1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 6 내지 100 염기, 8 내지 60 염기 또는 10 내지 40 염기의 길이를 갖는 DNA나 RNA, 또는 이들의 유도체를 의미한다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 상기 NgR1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 상기 mRNA가 단백질로 번역되는 것을 저해할 뿐만 아니라, 상기 NgR1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA가 세포질 내로의 전위(translocation)되거나 성숙(maturation)되는 등의 전반적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해하는 작용을 할 수 있다.

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 107 내지 서열번호 110 중 어느 하나의 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 서열번호 108 내지 서열번호 110 중 어느 하나의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 특별히 한정되지 아니한다.

상기 마이크로RNA는 상기 NgR1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 3'-UTR(untranslated region) 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 10 내지 40 염기, 12 내지 30 염기 또는 15 내지 25 염기의 길이를 갖는 DNA나 RNA, 또는 이들의 유도체를 의미한다. 상기 마이크로RNA는 상기 NgR1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 3'-UTR에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA의 불안정화를 유도하거나, 상기 mRNA의 번역을 억제하는 작용을 할 수 있다.

상기 작은 간섭 RNA는 상기 NgR1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA와 동일한 서열을 가지는 센스 서열의 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 서열의 RNA 가닥으로 이루어지고 10 내지 40 염기, 12 내지 30 염기 또는 15 내지 25 염기의 길이를 갖는 이중 가닥의 RNA를 의미한다. 상기 작은 간섭 RNA는 상기 NgR1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA의 절단을 통해 RNA 간섭 현상을 유도함으로써 NgR1 단백질의 발현을 억제하는 작용을 할 수 있다.

본 발명의 작은 간섭 RNA는 서열번호 97 내지 서열번호 106 중 어느 하나의 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로 서열번호 99 내지 서열번호 106 중 어느 하나의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 서열번호 100 내지 서열번호 106 중 어느 하나의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 특별히 한정되지 아니한다.

상기 짧은 헤어핀 RNA는 상기 NgR1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 대한 작은 간섭 RNA의 센스 서열과 안티센스 서열이 3개 내지 10개의 핵산 서열로 연결된 단일 가닥의 RNA가 분자내 염기쌍성(intramolecular base pairing)을 일으킴으로써 형성된 루프를 갖는 헤어핀 구조의 RNA를 의미한다. 상기 짧은 헤어핀 RNA는 세포 내의 다이서(Dicer)에 의해 siRNA로 전환되어 RNA 간섭 현상을 유발할 수 있다.

앞서 설명한 염기서열들은, 이를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 구조, 기능, 활성 등에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 핵산 염기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해 상이한 서열을 가지는 변이체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열들은 당업계에 알려진 통상적인 변형이 일어난 뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 변형은 염기의 변형, 오탄당(pentose)의 변형, 인산(phosphate)의 변형, 염기 간 연결 부분의 변형 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명의 작은 간섭 RNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 앞서 설명한 염기서열들을 포함하는 것뿐만 아니라, 이와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 것이나 이의 변이체를 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 염기서열이란, 예컨대 전사 및 번역되었을 때 동일한 아미노산이 합성될 수 있는 경우를 포함하며, 상기 나열된 염기서열들과 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 상동성을 가지는 염기서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, 기본적으로 자연살해 세포나 T 세포 등과 같은 면역 세포는 암 세포에 대한 세포용해 활성 또는 세포독성을 나타내기 때문에, 상기와 같이 NgR1 단백질에 대한 억제제를 통해 면역학적 간극 형성이 촉진되고, 면역 세포 자체의 세포용해 활성이나 세포독성을 향상시킬 수 있다.

따라서 본 발명의 상기 면역 세포의 세포용해 활성 향상용 조성물은, NgR1 관련 질환의 예방 또는 치료에 이용할 수 있다.

상기 NgR1 관련 질환은, 암, 다발성 경화증, ALS, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 파킨슨병, 당뇨병성 신경병증, 뇌졸중, 외상성 뇌 손상 및 척수 손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니고, NgR1이 관련된 질환이라면 어느 것이나 포함될 수 있다.

상기 암은 피부암, 유방암, 자궁암, 식도암, 위암, 뇌종양, 교모세포종결장암, 직장암, 대장암, 폐암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 외음부암, 신장암, 혈액암, 췌장암, 전립선암, 고환암, 후두암, 두경부암, 갑상선암, 간암, 방광암, 골육종, 림프종, 혈액암, 흉선암, 요도암, 및 기관지암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

특히, 상기 암은 면역 세포의 NgR1 단백질을 활성화시키는 리간드가 발현되는 것, 특히 과발현되는 것일 수 있다. 상기 NgR1 단백질에 대한 리간드는 Nogo 단백질이 신경돌기 성장 억제제(neurite outgrowth inhibitor)인 Nogo(또는 'Reticulon 4 ') 단백질일 수 있으며, Nogo-A, Nogo-B, Nogo-C 등과 같은 Nogo 단백질의 이소형(isoform) 또는 이들의 일부 도메인(예컨대, Nogo-66)일 수도 있다. 상기와 같이 NgR1 단백질에 대한 리간드를 발현 또는 과발현하는 암의 경우, 면역 세포의 NgR1 단백질을 활성화시켜 면역 세포 자체의 세포용해 활성 또는 세포독성을 저하시키는데, 본 발명의 상기 NgR1 단백질의 억제제를 통해 면역 세포의 NgR1 단백질의 활성화를 억제함으로써 상기와 같은 면역 세포 자체의 세포용해 활성 또는 세포독성의 저하를 방지할 수 있다.

상기 조성물은 NgR1 단백질 활성 억제제인 NEP1-40을 더 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 상기 면역 세포의 세포용해 활성 향상용 조성물은 항암 보조제일 수 있다. 상기 항암 보조제는 면역 세포의 면역 기능을 활성화시켜 항암 치료 효과를 향상시킬 수 있는 조성물을 의미하는 것으로, 상기 항암 치료는 방사선 치료, 항암제 치료, 또는 면역 항암제 치료일 수 있다.

본 발명의 상기 조성물들은 상기와 같은 유효성분들 외에, 면역 항암제를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 면역 항암제는 항-PD-1, 항-PD-L1, 항-CTLA-4, 항-KIR, 항-LAG3, 항-CD137, 항-OX40, 항-CD276, 항-CD27, 항-GITR, 항-TIM3, 항-41BB, 항-CD226, 항-CD40, 항-CD70, 항-CD73, 항-ICOS, 항-CD40L, 항-BTLA, 항-TCR, 항-TIGIT, 항-VISTA, 및 anti-NKG2A 로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 수용체(chimeric antigen receptor; CAR)를 제공한다.

상기 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"이란 세포외 항원 결합 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 조작된 수용체를 의미한다. CAR의 가장 흔한 유형이 CD3ζ 사슬과 같은 T 세포 동시수용체의 막통과 및 세 포내 도메인에 융합된 단일 클론 항체로부터 유래된 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하지만, 본 명세서에 기재된 본 발명은 이들 도메인으로 제한되지 않는다. 오히려, 본 명세서에 사용된 바와 같은 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 임의의 세포 내 신호전달 분자를 발현하도록 조작된 임의의 수용체 및 이들에 융합되거나 연결된 세포외 항원 결합 도메인을 의미한다.

본 발명에서 상기 결합 도메인은 본 발명에서 제공하는 항원 결합 단편, 바람직하게는 scFv를 포함할 수 있다.

본 발명의 키메라 항원 수용체는 힌지 영역 (또는 스페이서) 및 신 호전달 도메인 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 힌지 영역은 항원 결합 도메인과 막통과 도메인을 연결하는 부분으로 '스페이서'라고도 불리우는데, T 세포막 또는 NK 세포막으로부터 항원 결합 도메인을 확장하기 위한 목적을 갖는다.

본 발명에서 상기 힌지 영역은 예를 들어 인간 또는 그의 일부를 포함하는 임의의 속으로부터의 임의의 적합한 서열로부터 얻어질 수 있으며, 혹은 본 기술분야에서 통상적으로 사용하는 CD8, CD28, 4-1BB, OX40, CD3 제타(ζ) 사슬의 전부 또는 일부, T 세포 수용체 α 또는 β 사슬, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, 이들의 기능적 유도체 또는 이들의 조합을 포함한 인간 단백질의 힌지 영역 을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서 상기 힌지 영역은 면역글로불린에 제한하지 않으면서 면역글로불린 (예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgD)으로부터 선택되는 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 T 세포 또는 NK 세포 내부에서 발견되거나 발견되도록 조작된 키메라 항원 수용체의 부분을 의미한다. 본 발명에서 상기 신호 전달 도메인은 T 세포 또는 NK 세포의 혈장 막에서 키메라 항원 수용체를 고정하는 역할을 하는 막통과 도메인을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

본 발명에서 상기 막통과 도메인과 상기 신호전달 도메인은 동일한 단백질(예를 들어, CD3ζ)로부터 유래할 수 있고, 혹은 상기 막통과 도메인과 상기 신호전달 도메인은 상이한 단백질(예를 들어, CD28의 막관통 도메인 및 CD3ζ 분자 의 세포 내 신호전달 도메인, 또는 그 반대)로부터 유래할 수 있다

본 발명에서 상기 막통과 도메인은 세포막에 걸친 소수성 폴리펩타 이드를 포함한다. 특히, 막통과 도메인은 세포막의 한 면 (세포 외)에서 세포막의 다른 면 (세포 내 또는 세포질)을 통하여 걸쳐 있을 수 있다.

본 발명에서 상기 막통과 도메인은 알파 나선 또는 베타 배럴, 또는 이들의 조합의 형태일 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 막통과 도메인은 다수의 막통과 조각, 각 알파-나선형, 베타 시트, 또는 이들의 조합을 갖는 다원 단백질을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 막통과 도메인으로는, 예를 들면 T 세포 수용체 α 또는 β 사슬, CD3 제타(ζ) 사슬의 전부 또는 일부, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, 이들의 기능적 유도체 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 막통과 도메인으로 예를 들어 인공적으로 설계된 것은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체는 합성 막 변 이 도메인의 각 말단에서 발견될 수 있다.

본 발명에서 상기 막통과 도메인과 상기 신호전달 도메인 사이에 적 어도 하나의 보조자극 도메인을 더 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 보조자극 도메인은 보조자극 신호가 전달되는 부위로서 항원 결합 도메인과 결합한 특정 항원을 인식한 CAR-T 세포 또는 CAR-NK 세포가 면역반응을 일으키며 자가 증식을 돕고, 체내에 잔존하는 시간을 늘리도록 신호를 전달하는 역할을 할 수 있다.

본 발명에서 상기 보조자극 도메인은 상기 보조자극 도메인은 4-1BB (CD137); OX40; CD27; CD28; CD30; CD40; PD-1; CD2; CD7; CD258; 자연살해 그룹 2 멤버 C (NKG2C); 자연살해 그룹 2 멤버 (NKG2D); B7-H3; CD83; ICAM-1; LFA-1(CD11a/CD18) 또는 ICOS에 결합하는 리간드; 이들의 활성 단편; 이들의 기능 유도 체; 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩타이드로부터 유래한 기능 신호전달 도메인을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 면역세포 신호전달 경로의 적어도 일부 면을 자극 또는 활성화시키기 위해 면역세포의 활성화를 제공하는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 CD3 제타(ζ)의 전부 또는 일부, 공통 FcR 감마 (FcER1G), Fc감마RIIIa, FcR베타 (Fc 엡실론 립), CD3감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DNAX- 활성화 단백질 10 (DAP10), DNAX- 활성화 단백질 12 (DAP12), 이의 활성 단편, 이의 기능적 유도체 또는 이들의 조합을 포함 하는 폴리펩타이드로부터 유래한 기능 신호전달 도메인을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 이러한 신호전달 도메인은 이 기술분야에 공지되어 있다.

또한, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 신호 펩타이드(signal peptide)를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 "신호 펩타이드"는 펩타이드 서열을 포함하는 데, 이는 임의의 분비된 또는 막통과 단백질의 일종 펩타이드로, 본 발명의 키메라 항원 수용체를 세포막 및 세포 표면으로의 수송을 지시하고, 본 발명의 키메라 항원 수용체의 정확한 위치 선정을 제공할 수 있다. 특히, 본 발명에서 상기 신호 펩타이드는 본 발명의 키메라 항원 수용체를 세포막에 지지시키고, 그 점에서 상기 키 메라 항원 수용체의 세포 외 부분이 세포 표면 상에 표시되며, 막통과 부분이 원형 질 막에 걸쳐 있고, 활성 도메인은 세포질 부분, 또는 세포의 내부에 있게 된다.

또한, 본 발명의 상기 약학적 조성물들은 상기와 같은 유효성분들 외에, 약학적으로 허용가능한 담체(carrier) 또는 첨가제를 더 포함할 수 있다.

상기 '약학적으로 허용가능한'의 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다. 상기 '담체'는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다.

본 발명의 상기 유효성분들은 단독으로 또는 어떤 편리한 담체 등과 함께 혼합하여 투여될 수 있고, 그러한 투여 제형은 단회 투여 또는 반복 투여 제형일 수 있다. 상기 약학 조성물은 고형 제제 또는 액상 제제일 수 있다. 고형 제제는 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 좌제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고형 제제에는 담체, 착향제, 결합제, 방부제, 붕해제, 활택제, 충진제 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 액상 제제로는 물, 프로필렌 글리콜 용액 같은 용액제, 현탁액제, 유제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 적당한 착색제, 착향제, 안정화제, 점성화제 등을 첨가하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 산제는 본 발명의 유효 성분인 다중불포화지방산의 테트라-하이드록시 유도체와 유당, 전분, 미결정셀룰로오스 등 약제학적으로 허용가능한 적당한 담체를 단순 혼합함으로써 제조될 수 있다. 과립제는 본 발명의 상기 유효성분들, 약학적으로 허용가능한 적당한 담체 및 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필셀룰로오스 등의 약학적으로 허용가능한 적당한 결합제를 혼합한 후, 물, 에탄올, 이소프로판올 등의 용매를 이용한 습식과립법 또는 압축력을 이용한 건식과립법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 정제는 상기 과립제를 마그네슘스테아레이트 등의 약학적으로 허용가능한 적당한 활택제와 혼합한 후, 타정기를 이용하여 타정함으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 상기 유효성분들은 치료해야 할 질환 및 개체의 상태에 따라 경구제, 주사제(예를 들어, 근육주사, 복강주사, 정맥주사, 주입(infusion), 피하주사, 임플란트), 흡입제, 비강투여제, 질제, 직장투여제, 설하제, 트랜스더말제, 토피칼제 등으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여 경로에 따라 통상적으로 사용되고 비독성인, 약학적으로 허용가능한 운반체, 첨가제, 비히클을 포함하는 적당한 투여 유닛 제형으로 제제화될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 매일 약 0.0001 mg/kg 내지 약 10 g/kg이 투여될 수 있으며, 약 0.001 mg/kg 내지 약 1 g/kg의 1일 투여 용량으로 투여될 수 있다. 그러나 상기 투여량은 상기 혼합물의 정제 정도, 환자의 상태(연령, 성별, 체중 등), 치료하고 있는 상태의 심각성 등에 따라 다양할 수 있다. 필요에 따라 편리성을 위하여 1일 총 투여량을 하루 동안 여러 번 나누어 투여될 수 있다.

2. 암 환자의 진단 방법 및 항암제 스크리닝 방법

본 발명의 또 다른 측면은 암 환자의 예후 진단 또는 치료전략 결정을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 암 환자의 예후 진단 또는 치료전략 결정을 위한 정보를 제공하는 방법은, 암 환자로부터 분리된 암 세포에서 Nogo 단백질의 발현 수준을 측정하는 것, 및 상기 발현 수준을 정상 세포에서의 Nogo 단백질의 발현 수준과 비교하는 것을 포함한다.

상기 Nogo 단백질의 발현 수준을 측정하는 것은 상기 NgR1 단백질을 암호화하는 유전자가 전사된 mRNA의 양이나 상기 mRNA가 번역된 단백질의 양을 측정하는 것일 수 있다.

상기 Nogo 단백질을 암호화하는 유전자가 전사된 mRNA의 양을 측정하는 것은, 역전사중합효소연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction, RT-PCR), 경쟁적 역전사중합효소연쇄반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사중합효소연쇄반응(real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏(Northern Blotting), DNA 칩 등을 이용하여 수행할 수 있고, 이때 상기 mRNA에 대한 프라이머(primer) 쌍, 프로브(probe), 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (anti-sense oligonucleotide) 등이 이용될 수 있다.

또한, 상기 Nogo 단백질의 양을 측정하는 것은, 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블랏(Western Blotting), 유세포 분석법(FACS), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 단백질 칩(protein chip) 등을 이용하여 수행할 수 있고, 이때 상기 단백질에 대한 펩티드, 펩티드 미메틱스(peptide mimetics), 앱타머(aptamer), 항체 등이 이용될 수 있다.

한편, 상기 암 세포에서 발현되는 Nogo 단백질은 면역 세포의 NgR1 단백질을 활성화시켜 면역 세포의 세포용해 활성 또는 세포독성을 저하시키는바, Nogo 단백질의 발현 수준이 정상 세포보다 높은 암 세포의 경우에는 면역 세포를 이용한 항암 치료가 효과적이지 않을 수 있다. 따라서 본 발명의 상기 암 환자의 예후 진단 또는 치료전략 결정을 위한 정보를 제공하는 방법은, 상기 암 세포에서 측정된 Nogo 단백질의 발현 수준이 정상 세포에서의 Nogo 단백질의 발현 수준에 비해 높은 경우 면역 세포를 이용한 항암 치료가 효과적이지 않을 것으로 판단하거나, 또는 상기 측정된 Nogo 단백질의 발현 수준이 정상 세포에서의 Nogo 단백질의 발현 수준에 비해 높지 않은 경우 면역 세포를 이용한 항암 치료가 효과적일 것으로 판단하는 것을 더 포함할 수 있다. 예컨대, 암 세포에서 측정된 Nogo 단백질의 발현 수준이 정상 세포에서의 Nogo 단백질의 발현 수준에 비해 높은 경우에는, 면역 세포를 이용한 항암제를 투여하더라도 그 이후의 예후가 좋지 않을 수 있다고 판단할 수 있고, 면역 세포를 이용한 항암제가 아닌 다른 종류의 항암제를 이용하도록 치료전략을 결정할 수 있는 것이다. 또한, 암 세포에서 측정된 Nogo 단백질의 발현 수준이 정상 세포에서의 Nogo 단백질의 발현 수준에 비해 높지 않은 경우에는, 면역 세포를 이용한 항암제를 적극적으로 이용하도록 치료전략을 결정할 수 있는 것이다. 따라서 상기 예후는 면역 세포를 이용한 항암제의 투여 이후의 예후일 수 있고, 상기 치료전략은 면역 세포를 이용한 항암제의 이용 전략일 수 있다.

상기 암 환자로부터 분리된 암 세포에서 측정된 Nogo 단백질의 발현 수준이 정상 세포에 비해 높은 경우는, 상기 암 환자에서 분리된 암 세포에서 측정된 Nogo 단백질의 발현 수준이 정상 세포에 비해 1% 이상, 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 100% 이상 높은 경우일 수 있다.

한편, 본 발명의 또 다른 측면은 신규 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 항암제 스크리닝 방법은 면역 세포에 후보 물질을 처리하는 것, 상기 후보 물질이 처리된 면역 세포에서 NgR1 단백질의 발현 수준 또는 활성 수준을 측정하는 것, 및 상기 측정된 NgR1 단백질의 발현 수준 또는 활성 수준을, 상기 후보 물질이 처리되지 않은 면역 세포에서의 NgR1 단백질의 발현 수준 또는 활성 수준과 비교하는 것을 포함한다.

상기 후보 물질은 새롭게 합성된 또는 공지된 화합물로, NgR1 단백질의 발현 또는 활성을 억제할 것으로 기대되는 물질을 의미한다.

또한, 상기 NgR1 단백질의 발현 또는 활성의 정도를 측정하는 것은, 상기 NgR1 단백질을 암호화하는 유전자가 전사된 mRNA의 양이나 상기 mRNA가 번역된 단백질의 양을 측정하는 것일 수 있고, 이를 위한 구체적인 수단은 상기에서 설명한 바와 같다.

또한, 상기 항암제 스크리닝 방법은, 상기 측정된 NgR1 단백질의 발현 또는 활성의 정도를 상기 후보 물질을 처리하기 전과 비교하는 단계와, 상기 후보 물질을 처리하고 난 이후에 측정된 NgR1 단백질의 발현 또는 활성의 정도가 상기 후보 물질을 처리하기 전에 비해 감소된 경우, 상기 후보 물질을 항암제로 판단하는 단계를 더 포함한다. 상기 후보 물질을 처리하고 난 이후에 측정된 NgR1 단백질의 발현 또는 활성의 정도가 상기 후보 물질을 처리하기 전에 비해 감소된 경우는, 후보 물질을 처리하고 난 이후에 측정된 NgR1 단백질의 발현 또는 활성의 정도가 상기 후보 물질을 처리하기 전에 비해 1% 이상, 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 100% 이상 감소된 경우일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 면역 세포의 세포용해 활성 향상용 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 면역 세포의 세포 용해 활성을 향상시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 면역 세포의 세포용해 활성 향상용 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 면역 세포의 세포용해 활성 향상용 조성물의 면역 세포의 세포 용해 활성 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 면역 세포의 세포용해 활성 향상용 조성물의 암의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.

[실시예 1]

면역 세포에서 NgR1의 발현 여부 및 그에 의한 신호전달 확인

먼저 자연살해 세포(Natural Killer Cell, NK 세포)와 T 세포에서도 NgR1이 발현되는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, NgR1 단백질의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 항체에 형광 염료를 접합시키거나 형광 염료가 접합되어 있는 항체를 이용하여 NK 세포와 T 세포의 표면을 염색하고, 유세포 분석기(Flow cytometry)를 이용하여 NK 세포와 T 세포에서 NgR1의 발현 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 1a에 도시된 바와 같이, 인간 제대혈의 NK 세포(UCB-NK), 분화 유도된 성숙 NK 세포(mNK) 및 NK92 세포 모두에서 세포 표면에 NgR1이 발현되는 것으로 확인되었다. 또한, 도 1b에 도시된 바와 같이, 인간 제대혈의 CD8 T 세포(UCB-CD8)와 Jurkat 세포 모두에서 세포 표면에 NgR1이 발현되는 것으로 확인되었다.

그리고, NK92 세포에 NgR1의 리간드(ligand)인 Nogo-P4 펩티드를 처리하여 NgR1을 활성화시키고, NgR1의 하위 신호들로 알려진 분자들의 발현을 확인하였다. 구체적으로, NK92 세포의 생존을 유지하기 위하여 배지에 첨가되는 사이토카인인 IL-2가 제거된 배지에서 NK92 세포를 24시간 동안 배양한 후, Nogo-P4 펩티드를 0분, 10분, 30분 및 60분 동안 처리하여 각각의 NK92 세포에서 NgR1을 활성화시켰다. 상기와 같이 Nogo-P4 펩티드를 0분, 10분, 30분 및 60분 동안 처리한 각각의 NK92 세포를 용해시킨 후, 그 세포 용해물로부터 단백질을 분리하고, 웨스턴블롯팅으로 NgR1의 하위 신호들로 알려진 분자들의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 1c에 도시된 바와 같이, NK 세포에서도 NgR1의 활성화에 의해 세포내 하위 신호전달이 활성화가 되는 것으로 확인되었다.

[실시예 2]

자연살해 세포와 표적 세포(암 세포) 간의 접합 과정 중 NgR1이 관여하는 단계 확인

NK 세포가 세포용해 활성을 나타내는 메커니즘 상에서, NgR1이 어느 단계에서 관여하는지 확인하였다. 본 발명의 발명자들은 NgR1이 NK 세포와 표적 세포(암 세포) 간의 '접합' 과정에 영향을 미칠 것으로 생각하고, 이를 확인하기 위하여 먼저 NK 세포와 표적 세포 간의 접합 과정을 도 2a와 같은 3 단계로 정립하였다.

위와 같이 정립된 각각의 단계들 중, NgR1의 억제에 의해 변화가 발생하는 단계가 무엇인지 확인하기 위하여, 표적 세포(U87MG 세포)와 NK 세포를 NgR1에 대한 (경쟁적) 억제제인 NEP1-40의 존재 또는 부재 하에서 공배양하면서 현미경으로 각 단계들을 실시간으로 분석하였다. 각각의 단일 NK 세포를 실시간으로 분석함으로써 일시적으로 접합하는 단계와 접합을 유지하는 시간을 분석할 수 있었다.

그 결과, 도 2b 및 도 2c에 도시된 바와 같이, NEP1-40을 처리하여 NgR1의 활성을 억제하였을 때, NK 세포와 표적 세포(U87MG 세포) 간의 접합 과정에서 일시적 접합 단계의 비율은 감소되었고(도 2b), 접합을 유지하는 시간은 증가되는 것으로 확인되었다(도 2c).

[실시예 3]

면역학적 간극 형성 과정에서 NgR1의 음성적인 역할 확인

상기와 같은 결과를 바탕으로, 본 발명의 발명자들은 NgR1이 NK 세포와 표적 세포(암 세포) 간의 면역학적 간극을 형성하는데 영향을 미치는 것으로 생각하고, 이를 확인하기 위하여 먼저 GFP가 결합된 액틴(actin)을 지속적으로 발현하는 NK 세포주(lifeact-NK92)를 제작하였다. 상기 lifeact-NK92는 표적 세포와 공배양하였고, 도 3a에 도시된 바와 같이 lifeact-NK92가 표적 세포와 접합하는 동안 lifeact-NK92에서 형광을 나타내는 액틴(actin)의 형성 밀도를 실시간으로 형광 현미경을 통해 측정하였다. 이를 통해, NgR1을 억제함에 따라, 형광을 나타내는 액틴이 전체적으로 퍼져있거나, 표적 세포쪽이나 먼쪽, 표적 세포 쪽, 또는 표적 세포에서 먼 쪽 중 어디로 형성되는지 확인할 수 있었다.

그 결과, 도 3b에 도시된 바와 같이, NgR1의 활성을 억제함에 따라, NK 세포의 액틴이 표적 세포 쪽으로 빠르게 고밀도화 되는 것으로 확인되었다.

아울러, NK 세포와 표적 세포(암 세포) 간의 면역학적 간극 형성 과정에서, 상기 NgR1이 NK 세포의 과립구의 분극화에 영향을 미치는지 여부를 확인하였다. 이를 위하여, NK 세포의 과립을 LysoSensor^TM로 염색하여 NgR1에 대한 (경쟁적) 억제제인 NEP1-40의 존재 또는 부재 하에서 표적 세포와 공배양하면서, 도 3c에 도시된 바와 같이 과립이 염색된 NK 세포가 표적 세포와 접합하는 동안 NK 세포에서 형광을 나타내는 과립의 분극화 과정을 실시간으로 형광 현미경을 통해 측정하였다. 이를 통해, NgR1의 활성을 억제함에 따라, 형광을 나타내는 과립이 전체적으로 퍼져있거나, 표적 세포 쪽, 표적 세포에서 먼 쪽 중 어디로 분극화되는지를 확인할 수 있었다.

그 결과, 도 3d에 도시된 바와 같이, NEP1-40을 처리하여 NgR1의 활성을 억제하였을 때, NK 세포의 과립이 표적 세포 쪽으로 빠르게 고밀도화 되는 것으로 확인되었다.

[실시예 4]

NgR1의 활성화가 면역 세포의 세포용해 활성에 미치는 영향 확인

[4-1] 인 비트로( in vitro )에서의 효과 확인

NK 세포나 T 세포는 기본적으로 세포 매개하여 암 세포를 사멸시키는 활성을 가지므로, 위와 같은 NgR1의 활성화에 의해 NK 세포나 T 세포의 세포용해 활성이 어떻게 영향을 받는지 확인하였다.

먼저, NgR1의 리간드인 Nogo-A가 발현되지 않는 K562 세포주에 칼세인(calcein)을 처리하여 1시간 동안 상기 K562 세포를 염색한 다음, 그냥 NK 세포를 처리하거나 또는 NgR1에 대한 (경쟁적) 억제제인 NEP1-40와 NK 세포를 함께 처리하여(NK 세포 : K562 세포 = 2:1), 2시간 동안 공배양하였다. 상기와 같은 공배양 과정에서, NK 세포에 의해 K562 세포가 사멸되면 상기 K562 세포에서 칼세인이 배지로 방출되고, 이렇게 배지 내에 존재하는 칼세인의 형광량을 형광 분석기로 측정하여 상기 K562 세포의 사멸(세포용해) 정도를 확인함으로써 상대적인 NK 세포의 세포용해 활성을 확인하였다. 그 결과, 도 4a에 도시된 바와 같이, Nogo-A가 발현되지 않는 K562 세포주에 대해서는 NgR1에 대한 억제제를 처리한 경우나 처리하지 않은 경우에 NK 세포의 세포용해 활성에 큰 차이가 없는 것으로 확인되었다.

그리고, 상기와 동일한 방법으로, Nogo-A가 발현되지 않는 K562 세포주와 Nogo-A를 과발현시킨 K562 세포주를 칼세인으로 염색한 다음, NK 세포를 K562 세포와 2:1의 비율로 처리하여 2시간 동안 공배양한 다음, 그에 따른 K562 세포의 사멸(세포용해) 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 4b에 도시된 바와 같이, Nogo-A가 과발현되는 K562 세포주에서 칼세인의 형광이 확연히 낮아지는 것으로 확인된 반면, NgR1에 대한 억제제를 처리한 경우에는 Nogo-A가 과발현되지 않는 K562 세포주에서와 유사한 수준으로 칼세인의 형광이 회복되는 것으로 확인되었다. 이로부터 Nogo-A의 과발현 여부가 K562 세포주에 대한 NK 세포의 세포용해 활성에 부정적으로 영향을 미침을 알 수 있다.

한편, 상기와 동일한 방법으로, 종래 Nogo-A가 발현되는 것으로 보고된 교모세포종(glioblastoma) 세포주인 U87MG 세포를 칼세인으로 염색한 다음, 그냥 NK 세포를 처리하거나 또는 NgR1에 대한 (경쟁적) 억제제인 NEP1-40와 NK 세포를 함께 처리하여(NK 세포 : U87MG 세포 = 2:1), 2시간 동안 공배양하였다. 그런 다음, NK 세포에 의해 사멸된 U87MG 세포에서 배지로 방출된 칼세인을 수득하고 그 형광을 측정하여 상기 U87MG 세포의 사멸(세포용해) 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 4c에 도시된 바와 같이, 그냥 NK 세포를 처리한 경우에 비해 NgR1에 대한 억제제를 함께 처리하여 NgR1의 활성화를 억제한 경우에 칼세인의 형광이 확연히 높아지는 것으로 확인되었고, 이로부터 NgR1에 대한 억제제를 함께 처리하였을 때 NK 세포의 세포용해 활성이 현저히 향상됨을 알 수 있다.

나아가, 상기와 같이 칼세인으로 염색된 U87MG 세포에, 그냥 전기천공만 처리한 NK 세포, 전기천공법을 통해 scrambled siRNA((주)바이오니아)를 도입한 NK 세포 또는 전기천공법으로 NgR1의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA인 서열번호 97의 염기서열을 갖는 siNgR1 #1 또는 서열번호 98의 염기서열을 갖는 siNgR1 #3을 도입하여 NgR1의 발현을 녹 다운(knock down)시킨 NK 세포를 각각 처리하여(NK 세포 : U87MG 세포 = 2:1), 4시간 동안 공배양하였다. 그런 다음, NK 세포에 의해 사멸된 U87MG 세포에서 배지로 방출된 칼세인을 수득하고 그 형광을 측정하여 상기 U87MG 세포의 사멸(세포용해) 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 4d에 도시된 바와 같이, 전기천공만을 처리한 NK 세포나 스크램블된 siRNA를 도입한 NK 세포를 처리한 경우에 비해, siRNA가 도입되어 NgR1의 발현이 억제된 NK 세포를 처리한 경우에 칼세인의 형광이 확연히 높아지는 것으로 확인되었고, 이로부터 NgR1의 발현이나 활성을 억제하면 Nogo-A가 발현되는 암 세포임에도 불구하고 NK 세포의 세포용해 활성이 증가됨을 알 수 있다.

마지막으로, 상기와 동일한 방법으로, NgR1의 활성화가 T 세포의 세포용해 활성에 미치는 영향을 확인하였다. 이를 위해 gag 항원과 Nogo-A를 발현하는 마우스 백혈병 세포주인 FBL-3 세포(FBLgag), 그리고 gag 항원의 돌연변이체와 Nogo-A를 발현하는 FBL-3 세포(FBLgagΔ)를 입수하였다. 그리고 gag 항원을 특이적으로 인식할 수 있는 T 세포를 가지는 형질전환 마우스의 비장세포(splenocyte)와 방사선을 조사한 상기 FBLgag에 IL-2를 첨가하여 4일 동안 공배양하여 T 세포를 분화시켰다. 상기와 같이 비장세포와 FBLgag를 공배양하여 T 세포를 분화시키는 경우에, 4일간의 분화 이후에 T 세포와 함께 FBLgag가 섞여있게 되어 T 세포만을 취하기 어려운바, FBLgag에 방사선을 조사하여 FBLgag가 점차 사멸하게 만들면서 상기와 같은 4일 간의 분화 이후에는 T 세포만이 잔존할 수 있도록 하였다. 한편, 상기와 같이 분화시킨 T 세포는 gag 항원을 특이적으로 인식할 수 있는데, 이를 칼세인으로 염색된 FBLgag 또는 FBLgagΔ와 함께 NgR1에 대한 (경쟁적) 억제제인 NEP1-40가 처리 또는 미처리되는 조건에서 4시간 동안 공배양하였다. 그런 다음, T 세포에 의해 사멸된 FBL-3 세포에서 배지로 방출된 칼세인을 수득하고 그 형광을 측정하여 상기 FBL-3 세포의 사멸(세포용해) 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 4e에 도시된 바와 같이, gag 항원의 돌연변이체를 발현하기 때문에 T 세포가 인식하지 못하는 FBLgagΔ 세포에 비해, T 세포가 인식할 수 있는 FBLgag 세포에서 칼세인의 형광이 높게 확인되었고, NgR1에 대한 억제제를 함께 처리하여 T 세포에서 NgR1의 활성화를 억제한 경우에 칼세인의 형광이 더욱 높아지는 것으로 확인되었다. 이로부터 NgR1에 대한 억제제를 함께 처리하였을 때 T 세포의 세포용해 활성이 현저히 향상됨을 알 수 있다.

[4-2] 인 비보( in vivo )에서의 효과 확인

NgR1의 억제에 따른 NK 세포의 세포용해 활성의 향상 효과를 인 비보에서 다시 한번 확인하였다. 이를 위해, 도 42f에서와 같이, 6주령의 NSIG 수컷 생쥐의 오른쪽 허벅지에 4x10⁶개의 U87MG 세포주 피하주사하여 암을 고형화하였다. 10일 경과 후, 2.5x10⁶개의 NK 세포를 꼬리 정맥으로 주사하거나, 그 다음 날 5ug의 NEP1-40를 종양내로 주사하였다. 그리고, U87MG 세포를 피하주사한지 14일 경과 후 시점에 NK 세포를, 그리고 15일 경과 후 시점에 NEP1-40을 상기와 동일하게 주사하고, 상기 이종이식 생쥐 모델에서 시간의 경과에 따른 암의 크기와 생쥐 모델의 생존률을 측정하였다.

그 결과, 도 4g 및 도 4h에 도시된 바와 같이, NEP1-40을 주사하여 NgR1의 활성을 억제하였을 때, 암의 성장이 억제될 뿐만 아니라, 생쥐의 생존률도 현저히 개선되는 것으로 확인되었다.

[4-3] 정리

결국, NgR1이 활성화되는 경우 NK 세포나 T 세포 등과 같은 면역 세포의 세포용해(cytolytic) 활성이 저하되고, NgR1이 억제되는 경우에 상기 면역 세포들의 세포용해 활성이 다시 회복되는 것으로 확인되었다. 따라서 상기와 같은 실험 결과로부터 NK 세포나 T 세포 등과 같은 면역 세포에서 NgR1은 세포용해(cytolytic) 활성을 음성적으로 조절하는(negatively regulate) 것임을 알 수 있다.

[실시예 5]

자연살해 세포의 세포용해 활성에 기반한 항암 면역에서 NgR1의 생물학적 역할 확인

NK 세포의 NgR1과 암 세포의 Nogo-A의 관계가 항암 면역에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 먼저 암 세포내에 침윤된 면역세포들의 프로필 분석 데이터 베이스인 Cibersort를 이용하여 전체 암 환자를 NK 세포가 많이 침윤된 군과 NK 세포가 적게 침윤된 군으로 나누었다. 그런 다음, 각 군에서 TCGA 데이터를 이용하여 Nogo-A(RTN4)의 발현 정도에 따른 암 환자의 생존률을 분석하였다.

그 결과, 도 5a에 도시된 바와 같이, NK 세포의 침윤 정도에 관계없이, Nogo-A를 많이 발현하는 암 환자의 생존률이 Nogo-A를 적게 발현하는 암 환자의 생존률 보다 낮은 것으로 확인되었다.

또한, 암 세포내에 침윤된 면역세포들의 프로필 분석 데이터 베이스인 Cibersort를 이용하여 전체 암 환자를 CD8 T 세포가 많이 침윤된 군과 CD8 T 세포가 적게 침윤된 군으로 나누었다. 그런 다음, 각 군에서 TCGA 데이터를 이용하여 Nogo-A(RTN4)의 발현 정도에 따른 암 환자의 생존률을 분석하였다.

그 결과, 도 5b에 도시된 바와 같이, T 세포의 침윤 정도에 관계없이, Nogo-A를 많이 발현하는 암 환자의 생존률이 Nogo-A를 적게 발현하는 암 환자의 생존률 보다 낮은 것으로 확인되었다.

결국, 상기와 같은 결과로부터, Nogo-A가 발현되는 암에 대해서는 NK 세포나 T 세포와 같은 면역 세포가 충분한 세포용해 활성을 나타내지 못하고, 그로 인해 항암 면역이 충분히 일어나지 못하게 되어 종국적으로는 암 환자의 생존률에도 악영향을 미치는 것임을 알 수 있다.

[실시예 6]

신규 항-NgR1 항체를 이용한 자연살해 세포의 세포용해 활성 개선 효과 확인

상기와 같은 결과를 바탕으로 NgR1을 효과적으로 억제할 수 있는 항체를 스크리닝하여, 신규 항-NgR1 항체 CSA108 및 CSA123을 도출하였다. 이후, 상기 신규 항체로부터 항원 결합력을 증가시킨 항체를 도출해내기 위해, 항체 최적화를 수행하였다.

먼저, 항체 최적화를 위해, 먼저 Diversify PCR Random Mutagensis 키트(clontech, cat no. 630703)를 사용하여, CSA108 항체 및 CSA123 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역 전반에 걸쳐 무작위로 돌연변이를 유발시켰고, 수득한 PCR 산물을 파지미드 벡터에 클로닝하여 라이브러리를 구축하였다. 이후, 바이오-패닝(bio-panning)을 위해 항원 및 항체 파지 라이브러리를 결합한 후, 항원의 Fc 또는 히스티딘을 각각 Protein A 코팅 플레이트 또는 니켈 코팅 플레이트에 결합시키고, 항원과 결합하는 파지를 회수하여 증폭하였다. 패닝 시 항원으로 hNgR1-Fc, hNgR1-his을 0.1 내지 1μg/ml의 농도로 사용하였으며, 2% BSA가 포함된 PBS 완충액으로 차단(blocking)하였다. 항체 파지와 항원을 결합시킨 후, PBST(0.1% tween20)로 세척하였다.

이후, 96-웰 면역플레이트에 항원을 1μg/ml 농도로 100μl씩 첨가한 후, 4℃에서 밤새 코팅하였고, PBST(0.1% tween20)로 2번 세척한 후 2% BSA가 포함된 PBS 완충액으로 플레이트를 차단(blocking)하였다. 차단 이후 패닝 라운드 별로 폴리 파지 액을 첨가하여 1시간 동안 상온에서 결합시킨 후, PBST(0.1% tween20)로 3번 세척하였고, 항-M13-HRP(Sino biologics, 11973-MM05T-H)를 1:5000의 비율로 PBST에 희석하여 상온에서 1시간 동안 결합시켰다. 반응이 종결된 플레이트는 PBST로 3회 세척한 후, TMB 용액(BD, 555214)을 첨가하여 4분간 발색을 유도하고, 1N 황산을 이용하여 발색 반응을 중지시킨 후, 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

또한, 패닝 완료 후, 3회 결과물에서 단일 콜로니를 선택하여 96-딥웰 플레이트에 접종하고 4시간 배양한 후, 배양액에 헬퍼 파지(VCSM13)를 감염시킨 후, 30℃에서 밤새 배양하였고, 상등액을 회수하여 결합 ELISA를 수행하였다. 먼저, hNgR1 단백질 0.5μg/ml의 또는 이소타입 IgG1 0.5μg/ml를 96-면역플레이트에 4℃에서 밤새 코팅하였으며, PBST(0.1% tween20)로 2번 세척한 후 2% BSA가 포함된 PBS 완충액으로 플레이트를 차단(blocking)하였다. 차단 이후 상기 상등액을 첨가하여 1시간 동안 상온에서 결합시킨 후, PBST로 3회 세척하였다. 세척 후 항-M13-HRP(Sino biologics, 11973-MM05T-H)를 1:5000의 비율로 PBST에 희석하여 상온에서 1시간 동안 결합시켰다. 반응이 종결된 플레이트는 PBST로 3회 세척한 후, TMB 용액(BD, 555214)을 첨가하여 4분간 발색을 유도하고, 1N 황산을 이용하여 발색 반응을 중지시킨 후, 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

후보 항체 군은 IgG1 형태로 변환하여, HEK293 세포에 일시적 형질발현시켰으며, 이를 Protein A 친화 크로마토그래피로 정제하여, SPR 분석에 사용하였다. SPR 분석 시 KD 값은 Biacore T200을 사용하여 측정하였으며, Protein A 칩에 후보 항체들을 포착한 후, 항원 단백질(hNgR1-his)을 농도별로 결합시켜 측정하였다.

SPR 분석 결과, CSA108 항체의 항원에 대한 결합력은 23.3nM로 나타나나, 이를 최적화한 C1HE2E6 항체 및 H6HE2L 항체의 경우 항원에 대한 결합력이 각각 0.194nM 및 1.69nM로 나타나, 최적화 과정을 통해 항원에 대한 결합력이 현저하게 상승되는 것으로 확인되었다.

또한, CSA123 항체의 항원에 대한 결합력은 31.54nM로 나타나나, 이를 최적화한 G8 항체, S3 항체, S6 항체 및 D11 항체의 경우 항원에 대한 결합력이 각각 4.149nM, 5.836nM, 5.513nM 및 5.327nM로 나타나, 역시 최적화 과정을 통해 항원에 대한 결합력이 현저하게 상승되는 것으로 확인되었다.

상기 신규 항-NgR1 항체 CSA108 및 CSA123과, 이들을 최적화하여 항원 결합력을 증가시킨 신규 항체들의 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL) 서열은 하기 표 1과 같다.

항체	부위	아미노산 서열	서열번호
CSA108	VH	QMQLVQSGGGLEQPGRSLRLSCVTSGFNFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGAIGYADSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDYYYETSGYYYGFDNWGQGTLVTVSS	11
CSA108	VL	DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPLRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDSATYYCQQTNNFPYTFGQGTKVEIKR	29
C1HE2E6	VH	QMQLVQSGGGLEQPGRSLRLSCVTSGFNFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGAIGYADSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDYNYEISGYYYGFDNWGQGTLVTVSS	13
C1HE2E6	VL	DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLSWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPLRFSGSGFGTDFTLTINSLQPEDSATYYCQQTNNFPYTFGQGTKVEIKR	31
H6HE2L	VH	QMQLVQSGGGLEQPGRSLRLSCVTSGFNFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGAIGYADSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDYNYETSGYYHGFDNWGQGTLVTVSS	15
H6HE2L	VL	DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLSWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPLRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDSATYYCQQTNNFPYTFGQGTKVEIKR	33
CSA123	VH	QMQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLSELSIHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDDETVYAQKFQGRVTLTDDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDLGYLTSGNYYDAFDIWGRGTMITVSS	59
CSA123	VL	DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDINRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASRLQSGVPLRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDSATYYCQQTNNFPRTFGQGTRLEIKR	91
G8	VH	QMQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYPLSELSIHWVRQAPGKGLEWMGGFDSEDDETVYAQKFQGRVTLTDDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDLGYLTSGNYYDAFGIWGRGTMITVSS	61
G8	VL	DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDINRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASRLQSGVPLRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDSATYYCQQTNNFPRTFGQGTRLEIKR	91
S3	VH	QMQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLSELSIHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDDETVYAQKFQGRVTLTDDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDLGYLTSGNYYNAFGIWGRGTMITVSS	63
S3	VL	DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDINRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASRLQSGVPLRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDSATYYCQQTNNFPRTFGQGTRLEIKR	91
S6	VH	QMQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLSGLSIHWVRQAPGKGLEWMGGFDSEDDETVYAQKFQGRVTLTDDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDLGYLTSGNYYDAFDIWGRGTMITVSS	65
S6	VL	DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDINRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASRLQSGVPLRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDSATYYCQQTNNFPRTFGQGTRLEIKR	91
D11	VH	QMQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLSELSIHWVRQAPGKGLEWMGGFDSEDDETVYAQKFQGRVTLTDDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDLGYLTSGNYYDAFDFWGRGTMITVSS	67
D11	VL	DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDINRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASRLQSGVPLRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDSATYYCQQTNNFPRTFGQGTRLEIKR	91

상기와 같이 CSA108 항체 및 이를 최적화한 2종의 항-NgR1 항체와, CSA123 항체 및 이를 최적화한 4종의 항-NgR1 항체가 포함된 용액을 항원인 NgR1이 고정된 바이오칩에 농도별로 흘려준 다음, Biacore^TM 8K system으로 상기 항-NgR1 항체들에 대한 표면 플라즈몬 공명 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 6a 및 6b에 도시된 바와 같이, 상기 8종의 항-NgR1 항체 모두 농도의존적으로 항원인 NgR1와 특이적인 결합을 형성하는 것으로 확인되었다.

다음으로, NEP1-40 대신, 상기와 같이 CSA108 항체 및 이를 최적화한 2종의 항-NgR1 항체와, CSA123 항체 및 이를 최적화한 4종의 항-NgR1 항체를 이용하여, 상기 실시예 [4-1]에서와 동일한 방법으로 U87MG 세포를 표적 세포로 하여 NK 세포의 세포용해 활성을 분석하였다.

그 결과, 도 7a 및 7b에 도시된 바와 같이, 상기 8종의 신규 항-NgR1 항체를 처리함에 따라 표적 세포(U87MG 세포)에 대한 NK 세포의 세포용해 활성이 향상되는 것으로 확인되었다.

나아가, NEP1-40 대신, 상기와 같이 CSA108 항체 및 이를 최적화한 2종의 항-NgR1 항체를 이용하여, 상기 실시예 [4-1]에서와 동일한 방법으로 대조군 DNA를 도입하여 Nogo-A가 발현되지 않는 K562 세포주(Mock-K562)와 Nogo-A를 과발현시킨 K562 세포주(NogoA-K562)를 표적 세포로 하여 NK 세포의 세포용해 활성을 분석하였다.

그 결과, 도 7c에 도시된 바와 같이, 상기 3종의 신규 항-NgR1 항체를 처리함에 따라 표적 세포(NogoA-K562)에 대한 NK 세포의 세포용해 활성이 향상되는 것으로 확인되었다.

이는 NgR1에 대한 (경쟁적) 억제제인 NEP1-40를 이용하여 NgR1의 활성을 억제하거나 NgR1의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA를 이용하여 NgR1의 발현을 억제하였을 때와 동일한 결과로서, NgR1 단백질에 대한 억제제는 펩티드 형태나 siRNA의 형태 뿐만 아니라, 항체의 형태로도 구성될 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 7]

NgR1의 mRNA에 특이적으로 결합하는 신규 siRNA를 이용한 자연살해 세포의 세포용해 활성 개선 효과 확인

한편, siRNA 스크리닝을 통해, 하기 표 2과 같은 염기서열을 갖는, NgR1의 mRNA에 특이적으로 결합하는 8종의 신규 항-NgR1 siRNA를 도출하였다.

siRNA	염기서열	서열번호
siNgR1 #11	CCACCCAGAUCGCGGUAUA	99
siNgR1 #12	GCAUCUUCCUGCACGGCAA	100
siNgR1 #13	CGAAUGUGCUGGCCCGAAU	101
siNgR1 #14	GAGCCCAAGGUGACGACAA	102
siNgR1 #15	CGGCAGGCAAUGCGCUGAA	103
siNgR1 #16	CAACAAUCUAUCAGCGCUG	104
siNgR1 #17	AGGCCAGGCUGUUCACGCA	105
siNgR1 #18	AAAUAUCGGACGACGUGGA	106

상기 실시예 [4-1]에서와 같은 방법으로, 칼세인으로 염색된 U87MG 세포에, 그냥 전기천공만 처리한 NK 세포, NgR1에 대한 (경쟁적) 억제제인 NEP1-40와 공배양된 NK 세포, 전기천공법을 통해 scrambled siRNA((주)바이오니아)를 도입한 NK 세포 또는 전기천공법으로 상기 표 2에 기재된 8종의 siRNA를 각각 도입하여 NgR1의 발현을 녹 다운(knock down)시킨 NK 세포를 각각 처리하여(NK 세포 : U87MG 세포 = 5:1), 4시간 동안 공배양하였다. 그런 다음, NK 세포에 의해 사멸된 U87MG 세포에서 배지로 방출된 칼세인을 수득하고 그 형광을 측정하여 상기 U87MG 세포의 사멸(세포용해) 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 8에 도시된 바와 같이, 전기천공만을 처리한 NK 세포나 스크램블된 siRNA를 도입하거나 NEP1-40와 공배양된 NK 세포를 처리한 경우에 비해, 8종의 신규 siRNA가 도입되어 NgR1의 발현이 억제된 NK 세포를 처리한 경우에 칼세인의 형광이 확연히 높아지는 것으로 확인되었고, 이로부터 NgR1의 발현이나 활성을 억제하면 Nogo-A가 발현되는 암 세포임에도 불구하고 NK 세포의 세포용해 활성이 증가됨을 알 수 있다.

[실시예 8]

NgR1의 mRNA에 특이적으로 결합하는 신규 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide, ASO)를 이용한 자연살해 세포의 세포용해 활성 개선 효과 확인

또한, ASO 스크리닝을 통해, 하기 표 3과 같은 염기서열을 갖는, NgR1의 mRNA에 특이적으로 결합하는 4종의 신규 항-NgR1 ASO를 도출하였다.

siRNA	염기서열	서열번호
aso-NgR1 #2s	gcatcttcctgcacggcaa	107
aso-NgR1 #3s	cgaatgtgctggcccgaat	108
aso-NgR1 #5s	cggcaggcaatgcgctgaa	109
aso-NgR1 #7s	aggccaggctgttcacgca	110

먼저, NK 세포에 상기 표 3에 기재된 4종의 ASO를 각각 도입한 후, NK 세포 표면에서 NgR1의 발현양을 측정한 결과, 도 9에 도시된 바와 같이, scrambled control을 도입한 NK 세포 표면에 비해, 4종의 신규 ASO가 도입된 NK 세포 표면에서 NgR1의 발현이 현저히 감소되는 것으로 확인되었다.

다음으로, 상기 실시예 [4-1]에서와 같은 방법으로, 칼세인으로 염색된 U87MG 세포에, 그냥 전기천공만 처리한 NK 세포, NgR1에 대한 (경쟁적) 억제제인 NEP1-40와 공배양된 NK 세포, 전기천공법을 통해 scrambled control을 도입한 NK 세포 또는 전기천공법으로 상기 표 3에 기재된 4종의 ASO를 각각 도입하여 NgR1의 발현을 녹 다운(knock down)시킨 NK 세포를 각각 처리하여(NK 세포 : U87MG 세포 = 5:1), 4시간 동안 공배양하였다. 그런 다음, NK 세포에 의해 사멸된 U87MG 세포에서 배지로 방출된 칼세인을 수득하고 그 형광을 측정하여 상기 U87MG 세포의 사멸(세포용해) 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 10에 도시된 바와 같이, 전기천공만을 처리한 NK 세포나 스크램블된 ASO를 도입하거나 NEP1-40와 공배양된 NK 세포를 처리한 경우에 비해, 4종의 신규 ASO가 도입되어 NgR1의 발현이 억제된 NK 세포를 처리한 경우에 칼세인의 형광이 확연히 높아지는 것으로 확인되었고, 이로부터 NgR1의 발현이나 활성을 억제하면 Nogo-A가 발현되는 암 세포임에도 불구하고 NK 세포의 세포용해 활성이 증가됨을 알 수 있다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

Claims

서열번호 1, 서열번호 41, 서열번호 43 또는 서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 CDR1-H, 서열번호 3, 서열번호 47 또는 서열번호 49의 아미노산 서열을 갖는 CDR2-H 및 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 51, 서열번호 53, 서열번호 55 또는 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 CDR3-H를 포함하는 중쇄 가변영역; 및

서열번호 23, 서열번호 79 또는 서열번호 81의 아미노산 서열을 갖는 CDR1-L, 서열번호 25, 서열번호 83 또는 서열번호 85의 아미노산 서열을 갖는 CDR2-L 및 서열번호 27, 서열번호 87 또는 서열번호 89의 아미노산 서열을 갖는 CDR3-L을 포함하는 경쇄 가변영역;을 포함하고,

NgR1 단백질에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 59, 서열번호 61, 서열번호 63, 서열번호 65 또는 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및

서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33 또는 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역;을 포함하고,

NgR1 단백질에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 69, 서열번호 71, 서열번호 73, 서열번호 75 또는 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및

서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄;를 포함하고,

NgR1 단백질에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,

상기 항체의 항원 결합 단편은 단일 사슬 가변 단편(single chain variable fragment; scFv)인 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 유전자.
청구항 5의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
청구항 6의 재조합 발현 벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체.
서열번호 99 내지 서열번호 106 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, NgR1 mRNA에 특이적으로 결합하는, 작은 간섭 RNA.
서열번호 107 내지 서열번호 110 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, NgR1 mRNA에 특이적으로 결합하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 청구항 8의 작은 간섭 RNA, 및 청구항 9의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 면역 세포의 세포용해 활성 향상용 조성물.
청구항 10에 있어서,

상기 조성물은 면역 세포의 면역학적 간극 형성을 촉진하거나, 면역세포를 조절하여 면역 세포의 활성을 증가시키는 것인, 면역 세포의 세포용해 활성 향상용 조성물.
청구항 10에 있어서,

상기 조성물은 NgR1 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이고,

상기 NgR1 관련 질환은, 암, 다발성 경화증, ALS, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 파킨슨병, 당뇨병성 신경병증, 뇌졸중, 외상성 뇌 손상 및 척수 손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 면역 세포의 세포용해 활성 향상용 조성물.
청구항 12에 있어서,

상기 암은 피부암, 유방암, 자궁암, 식도암, 위암, 뇌종양, 교모세포종결장암, 직장암, 대장암, 폐암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 외음부암, 신장암, 혈액암, 췌장암, 전립선암, 고환암, 후두암, 두경부암, 갑상선암, 간암, 방광암, 골육종, 림프종, 혈액암, 흉선암, 요도암, 및 기관지암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 면역 세포의 세포용해 활성 향상용 조성물.
청구항 13에 있어서,

상기 조성물은 면역 항암제를 더 포함하는 것인, 면역 세포의 세포용해 활성 향상용 조성물.
청구항 14에 있어서,

상기 면역 항암제는 anti-PD-1, anti-PD-L1, anti-CTLA-4, anti-KIR, anti-LAG3, anti-CD137, anti-OX40, anti-CD276, anti-CD27, anti-GITR, anti-TIM3, anti-41BB, anti-CD226, anti-CD40, anti-CD70, anti-CD73, anti-ICOS, anti-CD40L, anti-BTLA, anti-TCR, anti-TIGIT, anti-VISTA, anti-TIGIT, 및 anti-NKG2A로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 면역 세포의 세포용해 활성 향상용 조성물.
청구항 10에 있어서,

상기 면역 세포는 자연살해 세포, T 세포 또는 자연살해 T 세포인 것인, 면역 세포의 세포용해 활성 향상용 조성물.
청구항 10에 있어서,

상기 조성물은 NEP1-40을 더 포함하는 것인, 면역 세포의 세포용해 활성 향상용 조성물.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체.
청구항 18의 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역세포.