ES2328100T3 - Kit de radiomarcaje y ensayo de union. - Google Patents

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Abstract

Un método para radiomarcar un anticuerpo conjugado con quelador con 90 Y para su administración a un paciente, que comprende: (i) mezclar un anticuerpo conjugado con quelador con una solución que contiene 90 Y para formar una mezcla; (ii) incubar la mezcla a una temperatura apropiada durante 10 minutos o menos para producir un anticuerpo radiomarcado, donde el anticuerpo radiomarcado tiene más del 95% de radioincorporación de modo que puede administrarse directamente a un paciente sin purificación adicional del 90 Y no incorporado; y (iii) diluir el anticuerpo radiomarcado en un tampón de formulación a una concentración apropiada para dicha administración a un paciente.

Description

Kit de radiomarcaje y ensayo de unión.
Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención
La presente descripción se refiere a ensayos de unión de anticuerpos y kits de radiomarcaje, preparaciones celulares liofilizadas, reactivos y protocolos para ensayar la eficacia clínica de anticuerpos terapéuticos para el tratamiento/formación de imágenes de tumores y células tumorales. Específicamente, los kits de la presente descripción se usan para preparar y evaluar conjugados de anticuerpos radiomarcados que se usarán para el tratamiento y la formación de imágenes de tumores de linfoma de células B marcando el antígeno superficial de células B BP35 ("CD20").
2. Antecedentes de la tecnología
Todas las publicaciones y solicitudes de patente de este documento se incorporan por referencia en la misma medida que si cada publicación individual o solicitud de patente estuviera específica e individualmente indicada como incorporada por referencia.
El sistema inmune de los vertebrados (por ejemplo, los primates, que incluyen los seres humanos, simios, monos, etc.) consta de varios órganos y tipos celulares que han evolucionado hasta: reconocer de forma precisa y específica microorganismos extraños ("antígenos") que invaden el hospedador vertebrado; unirse específicamente a dichos microorganismos extraños; y, eliminar/destruir dichos microorganismos extraños. Los linfocitos, así como otros tipos de células, son críticos para el sistema inmune. Los linfocitos se producen en el timo, el bazo y la médula ósea (en adultos) y representan aproximadamente el 30% de los glóbulos blancos totales presentes en el sistema circulatorio de los seres humanos (en adultos).
Hay dos sub-poblaciones principales de linfocitos: células T y células B. Las células T son responsables de la inmunidad mediada por células, mientras que las células B son responsables de la producción de anticuerpos (inmunidad humoral). Sin embargo, las células T y las células B pueden considerarse como interdependientes - en una respuesta inmune típica, las células T se activan cuando el receptor de células T se une a fragmentos de un antígeno que se unió a las glicoproteínas del complejo principal de histocompatibilidad ("MHC") sobre la superficie de una célula presentadora de antígeno; dicha activación causa la liberación de mediadores biológicos ("interleuquinas") que, en esencia, estimulan a las células B a diferenciarse y producir anticuerpos ("inmunoglobulinas") contra el antígeno.
Cada célula B dentro el hospedador expresa un anticuerpo diferente sobre su superficie, por tanto una célula B expresará un anticuerpo específico para un antígeno, mientras que otra célula B expresará un anticuerpo específico para un antígeno diferente. Por consiguiente, las célula B son bastante diversas, y esta diversidad es crítica para el sistema inmune. En seres humanos, cada célula B puede producir una cantidad enorme de moléculas de anticuerpo (es decir, aproximadamente de 10^{7} a 10^{8}). Dicha producción de anticuerpos muy típicamente cesa (o disminuye sustancialmente) cuando el antígeno extraño se ha neutralizado. Ocasionalmente, sin embargo, la proliferación de una célula B particular continuará sin disminución; dicha proliferación puede provocar un cáncer conocido como "linfoma de células B".
Las células T y las células B comprenden ambas proteínas de superficie celular que pueden utilizarse como "marcadores" para la diferenciación e identificación. Uno de dichos marcadores de células B humanas es el antígeno de diferenciación restringido a linfocitos B humanos Bp35, mencionado como "CD20". CD20 se expresa durante el desarrollo temprano de células pre-B y permanece hasta la diferenciación de células plasmáticas. Específicamente, la molécula CD20 puede regular una etapa en el proceso de activación que es necesaria para el inicio del ciclo celular y la diferenciación y habitualmente se expresa a niveles muy elevados en células B neoplásicas ("tumorales"). CD20, por definición, está presente tanto en células B "normales" como en células B "malignas", es decir, aquellas células B cuya proliferación sin disminución puede conducir a linfoma de células B. Por tanto, el antígeno de superficie CD20 tiene el potencial de servir como candidato para "marcar" linfomas de células B.
En esencia, dicho marcaje puede generalizarse del siguiente modo: se inyectan anticuerpos específicos para el antígeno de superficie CD20 de células B, por ejemplo, en un paciente. Estos anticuerpos anti-CD20 se unen específicamente al antígeno de superficie celular CD20 (ostensiblemente) tanto de células B normales como de células B malignas; el anticuerpo anti-CD20 unido al antígeno de superficie CD20 puede conducir a la destrucción y eliminación de células B neoplásicas. Además, pueden conjugarse agentes químicos o marcadores radiactivos que tienen el potencial de destruir el tumor con el anticuerpo anti-CD20 de modo que el agente se "suministre" específicamente a, por ejemplo, las células B neoplásicas. Independientemente del enfoque, un objetivo principal es destruir el tumor: el enfoque específico puede determinarse por el anticuerpo anti-CD20 particular que se utiliza y, por tanto, los enfoques disponibles para marcar el antígeno CD20 pueden variar considerablemente.
Por ejemplo, se ha informado de intentos en dicho marcaje de antígeno superficial CD20. El anticuerpos monoclonal murino (ratón) 1F5 (un anticuerpo anti-CD20) se administró según se informa por infusión intravenosa continua a pacientes con linfoma de células B. Se requirieron, según se informa, niveles extremadamente elevados (>2 gramos) de 1F5 para eliminar las células tumorales en circulación, y los resultados se describieron como "transitorios". Press et al., "Monoclonal Antibody 1F5 (Anti-CD20) Serotherapy of Human B-Cell Lymphomas", Blood 69/2:584-591 (1987).
Un problema potencial con este enfoque es que anticuerpos monoclonales no humanos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales murinos) típicamente carecen de funcionalidad efectora humana, es decir, son incapaces, entre otras cosas, de mediar la lisis dependiente del complemento o de lisar células diana humanas a través de la toxicidad celular dependiente de anticuerpo o la fagocitosis mediada por el receptor Fc. Además, los anticuerpos monoclonales no humanos puede reconocerlos el hospedador humano como una proteína extraña; por lo tanto, inyecciones repetidas de dichos anticuerpos extraños pueden conducir a la inducción de respuestas inmunes que conducen a reacciones de hipersensibilidad dañinas. Para anticuerpos monoclonales de base murina, esto a menudo se menciona como una respuesta de Anticuerpo Humano Anti-Ratón, o respuesta "HAMA". Además, a estos anticuerpos "extraños" puede atacarlos el sistema inmune del hospedador de tal modo que se neutralicen, en efecto, antes de que alcancen su sitio diana.
Los linfocitos y las células de linfoma son sensibles de forma inherente a radioterapia. Por lo tanto, las malignidades de células B son dianas atractivas para radioinmunoterapia (RIT) por varias razones: la emisión local de radiación ionizante de anticuerpos radiomarcados puede eliminar células con o sin el antígeno diana (por ejemplo, CD20) en cercana proximidad al anticuerpo unido al antígeno; la radiación penetrante, es decir, emisores beta, puede obviar el problema de acceso limitado al anticuerpo en tumores voluminosos o poli vascularizados; y, la cantidad total de anticuerpo requerida puede reducirse. El radionúclido emite partículas radiactivas que pueden dañar el ADN celular hasta el punto en que los mecanismos de reparación celular son incapaces de permitir que la célula continúe viviendo; por lo tanto, si las células diana son tumores, el marcador radiactivo elimina de forma beneficiosa las células tumorales. Los anticuerpos radiomarcados, por definición, incluyen el uso de una sustancia radiactiva que puede requerir la necesidad de precauciones tanto para el pacientes (es decir, posible transplante de médula ósea) como el asistente sanitario (es decir, la necesidad de ejercer un elevado grado de precaución cuando se trabaja con radiactividad).
Por lo tanto, un enfoque para mejorar la capacidad de anticuerpos monoclonales murinos de realizar el tratamiento de trastornos de células B ha sido conjugar un marcador radiactivo con el anticuerpo de tal modo que el marcador o toxina se localice en el sitio del tumor. También se han conjugado toxinas (es decir, agentes quimioterapéuticos tales como doxorrxubicina o mitomicina C) a anticuerpos. Véase, por ejemplo, la solicitud publicada PCT WO 92/07466 (publicada el 14 de mayo de 1992).
Se han desarrollado anticuerpos "quiméricos", es decir, anticuerpos que comprenden partes de dos o más especies diferentes (por ejemplo, ratón y ser humano) como una alternativa a los anticuerpos "conjugados". Se han creado anticuerpo quiméricos de ratón/ser humano, y ha demostrado mostrar las características de unión del anticuerpo de ratón parental, y las funciones efectoras asociadas con la región constante humana. Véase, por ejemplo, Cabilly et al., Patente de Estados Unidos 4.816.567; Shoemaker et al., Patente de Estados Unidos 4.978.745; Beavers et al., Patente de Estados Unidos 4.975.369; y Boss et al., Patente de Estados Unidos 4.816.397 todas las cuales se incorporan por referencia en este documento. Generalmente estos anticuerpos quiméricos se construyen preparando una biblioteca genómica de genes a partir de ADN extraído de hibridomas murinos pre-existentes. Nishimura et al. (1987) Cancer Research 47: 999. La biblioteca se explora después para genes de la región variable para las cadenas tanto pesada como ligera que muestren los patrones de reordenamiento correctos de los fragmentos de anticuerpos. Los genes clonados de la región variable después se ligan en un vector de expresión que contiene casetes clonados del gen apropiado de la región constante humana de cadena pesada o ligera. Los genes quiméricos se expresan después en una línea celular de elección, habitualmente una línea de mieloma murino.
Por ejemplo, Liu, A.Y., et al., "Production of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent Biologic Activity", J. Immun. 139/10:3521-3526 (1987), describe un anticuerpo quimérico e ratón/ser humano dirigido contra el antígeno CD20. Véase también, la Publicación PCT Nº WO 88/04936. Sin embargo, no se proporciona información en cuanto a la capacidad, eficacia o viabilidad de usar los anticuerpos quiméricos de Liu para el tratamiento de trastornos de células B en la referencia.
Se observa que ensayos funcionales in vitro (por ejemplo, lisis dependiente del complemento ("CDC"); citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos ("ADCC"), etc.) no pueden predecir de forma inherente la capacidad in vivo de ningún anticuerpo de destruir o eliminar las células diana que expresan el antígeno específico. Véase, por ejemplo, Robinson, R.D., et al., "Chimeric mouse-human anti-carcinoma antibodies that mediate different antitumor cell biological activities", Hum. Antibod. Hybridomas, 2:84-93 (1991) (anticuerpo quimérico de ratón-ser humano que tiene actividad ADCC indetectable). Por lo tanto, la eficacia terapéutica potencial de los anticuerpos solamente puede evaluarse realmente por experimentación in vivo.
Para este fin, las solicitudes en trámite junto con la presente 08/475.813, 08/475.815 y 08/478.967, incorporadas en este documento por referencia en su totalidad, describen conjugados anti-CD20 radiomarcados para la "formación de imágenes" diagnósticas de tumores de linfoma de células B antes de la administración de anticuerpos terapéuticos. El conjugado "In2B8" comprende un anticuerpo monoclonal murino, 2B8, específico para el antígeno CD20 humano, que está unido a indio[111] (^{111}In) mediante un quelador bifuncional, es decir, MX-DTPA (ácido dietilenotriaminapentaacético), que comprende una mezcla 1:1 de 1-isotiocianatobencil-3-metil-DTPA y 1-metil-3-isotiocianatobencil-DTPA. El indio-[111] se selecciona como radionúclido diagnóstico porque emite radiación gamma y encuentra uso previo como agente de formación de imágenes.
Se conocen patentes que se refieren a queladores y conjugados queladores en la técnica. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.831.175 de Gansow se refiere a quelatos de ácido dietilenotriaminapentaacético polisustituidos y conjugados proteicos que contienen los mismos, y métodos para su preparación. Las Patentes de Estados Unidos Nº 5.099.069, 5.246.692, 5.286.850, y 5.124.471 de Gansow también se refieren a quelatos de DTPA polisustituidos. Estas patentes se incorporan en este documento en su totalidad.
El quelador bifuncional específico usado para facilitar la quelación en la solicitudes 08/475.813, 08/475.815 y 08/478.967 se seleccionó ya que tiene elevada afinidad por metales trivalentes, y proporciona proporciones aumentadas tumor-a-no tumor, captación ósea disminuida, y mayor retención in vivo del radionúclido en sitios diana, es decir, sitios de tumor de linfoma de células B. Sin embargo, se conocen otros queladores bifuncionales en la técnica y también pueden ser beneficiosos en terapia tumoral.
También se describen en las solicitudes 08/475.813, 08/475.815 y 08/478.967 anticuerpos terapéuticos radiomarcados para el marcaje y destrucción de linfomas de células B y células tumorales. En particular, el conjugado Y2B8 comprende el mismo anticuerpo monoclonal murino anti-CD20 humano, 2B8, unido a itrio-[90] (^{90}Y) mediante el mismo quelador bifuncional. Este radionúclido se seleccionó para terapia por varias razones. La vida media de 64 horas de ^{90}Y es suficientemente larga para permitir la acumulación de anticuerpo por el tumor y, a diferencia, por ejemplo, e ^{131}I, es un emisor beta puro de elevada energía sin irradiación gamma acompañante en su deterioro, con un intervalo de diámetros celulares de 100 a 1000. La cantidad mínima de radiación penetrante permite la administración a pacientes externos de anticuerpos marcados con ^{90}Y. Además, no es necesaria la internalización de anticuerpos marcados para la eliminación celular, y la emisión local de radiación ionizante debe ser letal para células tumorales adyacentes que carecen del antígeno diana.
Como el radionúclido ^{90}Y se unió al anticuerpo 2B8 usando la misma molécula queladora bifuncional MX-DTPA, el conjugado Y2B8 tiene las mismas ventajas analizadas anteriormente, por ejemplo, retención aumentada de radionúclido en un sitio diana (tumor). Sin embargo, a diferencia de ^{111}In, no puede usarse para propósitos de formación de imágenes debido a la ausencia de radiación gamma asociada con el mismo. Por tanto, puede usarse un radionúclido diagnóstico de "formación de imágenes", tal como ^{111}In, para determinar la localización y tamaño relativo de un tumor antes de y/o después de la administración de anticuerpos quiméricos terapéuticos o marcados con ^{90}Y para el propósito de reducción del tumor. Además, un anticuerpo marcado con indio posibilita que se haga una evaluación dosimétrica.
Dependiendo del uso pretendido del anticuerpo, es decir, como un reactivo de diagnóstico o terapéutico, se conocen otros radiomarcadores en la técnica y se han usado para propósitos similares. Por ejemplo, los radionúclidos que se han usado en diagnosis clínica incluyen ^{131}I, ^{125}I, ^{123}I, ^{99}Tc, ^{67}Ga, así como ^{111}In. Los anticuerpos también se han marcado con una diversidad de radionúclidos para su uso potenciar inmunoterapia dirigida (Peirersz et al. (1987) The use of monoclonal antibody conjugates for the diagnosis and treatment of cancer. Immunol. Cell Biol. 65:111-125). Estos radionúclidos incluyen ^{188}Re y ^{186}Re así como ^{90}Y, y en menos medida ^{199}Au y ^{67}Cu. También se ha usado I-[131] para propósitos terapéuticos. La Patente de Estados Unidos Nº 5.460.785 proporciona un listado de dichos radioisótopos y se incorpora en este documento por referencia.
Como se informa en las solicitudes en trámite junto con la presente 08/475.813, 08/475.815 y 08/478.967 la administración del conjugado Y2B8 radiomarcado, así como el anticuerpo quimérico anti-CD20 no marcado, produjo una reducción tumoral significativa en ratones que portaban un tumor linfoblástico de células B. Además, ensayos clínicos en seres humanos presentados en las mismas mostraron una eliminación significativa de células B en pacientes con linfoma infudidos con anticuerpo quimérico anti-CD20. De hecho, recientemente se ha anunciado un 2B8 quimérico como el primer anticuerpo monoclonal anti-cáncer aprobado por la FDA de la nación con el nombre de Rituxan®. Por tanto, al menos un anticuerpo quimérico anti-CD20 ha mostrado demostrar eficacia terapéutica en el tratamiento de linfoma de células B.
Además, la Solicitud de Estados Unidos con Nº de serie 08/475.813, incorporada en este documento por referencia, describe la administración secuencial de Rituxan®, un anti-CD20 quimérico, con anticuerpo monoclonal murino tanto marcado con indio como marcado con itrio o con cada uno de ellos. Aunque los anticuerpos radiomarcados usados en estas terapias combinadas son anticuerpos murinos, el tratamiento inicial con anti-CD20 quimérico elimina suficientemente la población de células B de modo que se disminuya la respuesta HAMA, facilitando de este modo un régimen terapéutico y de diagnóstico combinado.
Por tanto, en este contexto de inmunoterapia combinada, los anticuerpos murinos pueden encontrar utilidad particular como reactivos de diagnóstico. Además, se ha mostrado en la Solicitud de Estados Unidos 08/475.813 que una dosificación terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD20 marcado con itrio después de la administración de Rituxan® es suficiente para (a) eliminar cualquier célula B sanguínea periférica restante no eliminada por el anticuerpo anti-CD20 quimérico; (b) comenzar la eliminación de células B desde los nódulos linfáticos; o (c) comenzar la eliminación de células B desde otros tejidos.
Por tanto, la conjugación de radiomarcadores con anticuerpos terapéuticos contra el cáncer proporciona una herramienta clínica valiosa que puede usarse para evaluar la eficacia terapéutica potencial de dichos anticuerpos, crear reactivos de diagnóstico para controlar el progreso del tratamiento, y concebir reactivos terapéuticos adicionales que puedan usarse para potenciar el potencial inicial de eliminación de tumores del anticuerpo quimérico. Dada la eficacia demostrada de un anticuerpo anti-CD20 en el tratamiento de linfoma no Hodgkin, y la sensibilidad conocida de los linfocitos a la radiactividad, sería muy ventajoso para dichos anticuerpos terapéuticos que llegaran a estar disponibles en el mercado en forma de kit por el cual pudieran modificarse fácilmente con un radiomarcador y administrarse directamente al paciente en la situación clínica.
Aunque existen muchos métodos y reactivos para conseguir el radiomarcaje de anticuerpos, de lo que se carece en la técnica es de un vehículo adecuado para colocar estos reactivos en la situación clínica, de un modo que puedan producirse fácilmente y administrarse al paciente antes del deterioro significativo del radiomarcador o la destrucción significativa del anticuerpo debido a la existencia del radiomarcador. La ausencia de dicho medio adecuado para comercializar esta tecnología valiosa podría deberse a las malas eficacias de incorporación demostradas por algunos protocolos de marcaje, y la posterior necesidad de purificar en columna el reactivo después del procedimiento de radiomarcaje. La demora en el desarrollo de dichos kits también puede deberse en parte a la ausencia previa de accesibilidad a radioisótopos comerciales puros que puedan usarse para generar de forma eficaz productos marcados sin purificación posterior. Como alternativa, quizá la razón de que dichos kits estén generalmente no disponibles es la ausencia real de anticuerpos que hayan sido capaces de conseguir la aprobación o la eficacia que Rituxan® ha conseguido para el tratamiento de linfoma en pacientes humanos.
Por ejemplo, como se analiza en la Patente de Estados Unidos 4.636.380, incorporada en este documento por referencia, generalmente se ha creído en la comunidad científica que para que un compuesto radiofarmacéutico encuentre utilidad clínica, debe soportar un proceso de separación y purificación largo y tedioso. De hecho, no sería deseable inyectar radiomarcador no unido en el paciente. La necesidad de etapas de purificación adicionales vuelve al proceso de radiomarcaje de anticuerpos en la situación clínica en imposible, particularmente para doctores que no tienen ni el equipo ni el tiempo para purificar sus propios compuestos terapéuticos.
Además, las proteínas radiomarcadas pueden ser inherentemente inestables, particularmente aquellas marcadas con isótopos radiolíticos tales como ^{90}Y, que tienen tendencia a causar daño al anticuerpo el tiempo que estén unidos al mismo en cercana proximidad. A su vez, dicha radiolisis causa eficacia no fiable del compuesto terapéutico debido a la pérdida de radiomarcador y/o la unión reducida al antígeno diana, y puede conducir a respuestas inmunes indeseadas dirigidas a la proteína desnaturalizada. Todavía sin las instalaciones para marcar y purificar los anticuerpos en el sitio, los médicos no han tenido elección salvo solicitar anticuerpos terapéuticos ya marcados, u obtenerlos marcados fuera del sitio en una instalación relacionada y transportados después de marcarlos para la administración al paciente. Todas estas manipulaciones agregan un tiempo muy preciado entre el marcaje y la administración, contribuyendo de este modo a la inestabilidad del compuesto terapéutico, disminuyendo al mismo tiempo, de hecho, la utilidad de los kits de radiomarcaje en la situación clínica.
Otros han intentado, de forma insatisfactoria, desarrollar kits de radiomarcaje de anticuerpos que fueran suficientemente competentes para prescindir de una etapa de purificación diferente del anticuerpo. Por ejemplo, Cytogen recientemente ha lanzado un kit comercial para radiomarcar un anticuerpo monoclonal murino dirigido contra la glicoproteína asociada a tumores TAG-72. Sin embargo, el anticuerpo de Cytogen es particularmente poco susceptible a una formulación de kit debido a la tendencia de desarrollar particulados durante el almacenamiento que después deben eliminarse por una etapa de filtración adicional. Además, el anticuerpo de Cytogen ha causado reacciones adversas en los pacientes debido a respuestas HAMA.
Otros han reivindicado haber desarrollado protocolos de radiomarcaje que serían susceptibles al formato de kit porque no se requeriría una etapa diferente de purificación (Richardson et al. (1987) Optimization and batch production of DTPA-labeled antibody kits for routine use in 111In immunoscintography. Nuc. Med. Commun. 8:347-356; Chinol and Hnatowich (1987) Generator-produced yttrium-[90] for radioimmunotherapy. J. Nucl. Med. 28(9): 1465-1470). Sin embargo, dichos protocolos no eran capaces de conseguir el nivel de incorporación que se ha conseguido en la presente invención usando los protocolos descritos en este documento, que han provocado eficacias de incorporación de al menos el 95%. Dicho nivel de incorporación proporciona el beneficio añadido de seguridad aumentada, porque prácticamente no se inyectará marcador sin unir en el paciente como resultado de la baja radioincorporación.
Finalmente, el documento WO 94/11026 describe métodos terapéuticos que implican la administración de anticuerpos anti-CD20 radiomarcados. También se describen métodos para preparar dichos anticuerpos radiomarcados.
Los protocolos incluidos en los kits de la presente descripción permiten el rápido marcaje que puede realizarse en aproximadamente media hora o en tan poco como cinco minutos dependiendo del marcador. Además, los protocolos de kit de la presente descripción tienen una eficacia de marcaje de más del 95% prescindiendo de este modo de la necesidad de purificación adicional. Prescindiendo de la necesidad de purificación adicional, la vida media del radiomarcador y la integridad del anticuerpo se reservan para el propósito terapéutico para el que está marcado.
La presente solicitud describe kits y métodos adecuados por los cuales pueden radiomarcarse anticuerpos de diagnóstico y terapéuticos y administrarse a un paciente de un modo reproducible, fiable y conveniente. Los kits de la presente descripción transforman el proceso de radiomarcaje de los anticuerpos en un proceso normalizado, libre de problemas y preocupaciones, que facilita enormemente los protocolos de tratamiento de los pacientes. Los presentes kits proporcionan ventajas sobre la técnica anterior porque se han determinado los parámetros óptimos para marcar y administrar anticuerpos terapéuticos o de diagnóstico, reduciendo de este modo el coste de bienes. Como los kits descritos en este documento proporcionan los parámetros óptimos de acuerdo con el marcador particular, el uso de un kit diseñado para un marcador particular también minimizará la canibalización, es decir, lo que sucede cuando se usa un kit inapropiado para un marcador particular. Evitando la canibalización también se proporciona a su vez una eficacia óptima de marcaje. Además, los protocolos e ingredientes estériles, libres de pirógenos incluidos con cada kit conllevan un proceso más fácil para el usuario, ya que se obvian en ensayo de esterilidad y pirógenos y la purificación post-marcaje de los reactivos.
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3. Sumario de la invención
En base a la descripción que está contenida en este documento, la presente invención proporciona, en un primer aspecto, un método para radiomarcar un anticuerpo conjugado con quelador con ^{90}Y para su administración a un paciente, que comprende:
(i) mezclar un anticuerpo conjugado con quelador con una solución que contiene ^{90}Y para formar una mezcla;
(ii) incubar la mezcla a una temperatura apropiada durante 10 minutos o menos para producir un anticuerpo radiomarcado, donde el anticuerpo radiomarcado tiene una radioincorporación mayor del 95% de modo que puede administrarse directamente a un paciente sin purificación adicional del ^{90}Y no incorporado; y
(iii) diluir el anticuerpo radiomarcado en un tampón de formulación a una concentración apropiada para dicha administración a un paciente.
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En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona un ensayo de unión para determinar el porcentaje de unión de un anticuerpo radiomarcado a su célula diana, que comprende:
(i) radiomarcar un anticuerpo de acuerdo con el método del primer aspecto de la invención para producir un anticuerpo radiomarcado;
(ii) mezclar e incubar al menos una alícuota del anticuerpo radiomarcado con al menos una alícuota de células positivas al antígeno;
(iii) mezclar e incubar al menos una alícuota del anticuerpo radiomarcado idéntica a la alícuota de la etapa (ii) con al menos una alícuota de tampón de dilución del mismo volumen que la alícuota de células positivas al antígeno en la etapa (ii) como control;
(iv) sedimentar las células por centrifugación;
(v) medir la radiactividad en el sobrenadante de las células sedimentadas y el control; y
(vi) comparar la cantidad de radiactividad en el sobrenadante celular con la cantidad de radiactividad en el control.
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Estos aspectos de la presente invención, y realizaciones de esos aspectos, se exponen en las reivindicaciones adjuntas.
De forma más general, sin embargo, la presente descripción describe un kit para radiomarcar un anticuerpo de diagnóstico o terapéutico antes de su administración a un paciente, que comprende al menos (i) un vial que contiene un anticuerpo conjugado con quelador, (ii) un vial que contiene tampón de formulación para estabilizar y administrar el anticuerpo radiomarcado, y (iii) instrucciones para radiomarcar el anticuerpo, donde dichos componentes de vial se suministra en una cantidad tal y a una concentración tal que cuando se combinan con un radiomarcador de suficiente pureza y actividad de acuerdo con las instrucciones del kit, no se requiere purificación adicional del anticuerpo marcado antes de su administración a dicho paciente. Además, cuando se marca de acuerdo con las instrucciones del kit y con un radioisótopo de suficiente pureza y actividad, dicha incorporación de isótopo puede alcanzar niveles mayores del 95%, e incluso tan elevados como del 98% o más elevados.
El anticuerpo incluido en el kit es más preferiblemente un anticuerpo anti-CD20. El anticuerpo se suministra en una forma por la cual está unido a un quelador bifuncional. Preferiblemente, el anticuerpo está conjugado con MX-DTPA, pero pueden usarse otros queladores tales como DTPA conjugado con fenilo o bencilo, ciclohexil-DTPA, derivados de EDTA y DOTA. Un quelador de acuerdo con la presente invención puede ser cualquier quelador que sea al menos bifuncional, es decir, que tenga al menos dos sitios de unión (al menos un sitio para quelar un ión metálico y al menos un sitio para acoplarse a un ligando proteico).
Dependiendo del anticuerpo usado, el anticuerpo conjugado se suministra típicamente a una concentración de 0,5 a 30 mg/ml, más preferiblemente 2 mg/ml. El volumen de anticuerpo conjugado dependerá de la concentración y la cantidad requerida para el marcaje óptimo dependiendo del radiomarcador. Sin embargo, el anticuerpo conjugado tiene que suministrarse en un volumen y concentración tales que el volumen completo se añada al vial de reacción usando una jeringa estéril y una técnica aséptica. Esto permitirá una reproducibilidad aumentada y facilidad de uso. Todos los reactivos de los kits descritos en este documento son estériles y están libres de pirógenos, y están diseñados específicamente para su simplicidad y rapidez para avanzar directamente desde el ensayo del anticuerpo a su administración. Con algunos marcadores, puede que no se requiera la necesidad de ensayar la eficacia de marcaje.
Un componente particularmente ventajoso del kit es el tampón de formulación para estabilizar frente a los efectos de radiolisis y para administrar el anticuerpo conjugado radiomarcado a un paciente. El tampón de formulación es un vehículo farmacéuticamente aceptable que sirve como diluyente para el anticuerpo marcado y también como tampón de administración. Aunque puede usarse cualquier diluyente farmacéuticamente aceptable para administrar anticuerpos terapéuticos o de diagnóstico al paciente, el tampón de formulación de la presente descripción es particularmente adecuado para administrar anticuerpos radiomarcados.
Por ejemplo, el tampón de formulación de la presente descripción comprende un radioprotector tal como albúmina sérica humana (HSA) o ascorbato, que minimiza la radiolisis debida al itrio, y en menor medida, indio. Se conocen otros radioprotectores en la técnica y también podrían usarse en el tampón de formulación de la presente descripción, es decir, aceptores de radicales libres (fenol, sulfitos, glutatión, cisteína, ácido gentísico, ácido nicotínico, palmitato de ascorbilo, HOP(:O)H_{2}, glicerol, formaldehído sulfoxilato sódico, Na_{2}S_{2}O_{5}, Na_{2}S_{2}O_{3}, y SO_{2}, etc.).
Debe apreciarse que, aunque generalmente se emplean radioprotectores en el tampón de formulación para proteger el anticuerpo de la radiolisis, puede ser posible realizar una protección adicional incluyendo el radioprotector en el tampón de reacción también. Generalmente eso no se ha hecho anteriormente, es decir, con HSA, debido a la presencia de metales que impedirían el proceso de marcaje. Sin embargo, puede ser posible "limpiar" la HSA usando una resina quelante de tal modo que pudiera incluirse también en el tampón de reacción. También puede necesitarse tratar con ascorbato u otros radioprotectores para retirar metales contaminantes.
El tampón de formulación de la presente descripción también comprende un exceso de quelador sin conjugar. El propósito de incluir quelador sin conjugar es que este quelador sirve para eliminar cualquier radiomarcador no unido a proteínas en el paciente, y realizar la excreción del radiomarcador reduciendo de este modo la captación de isótopos "de acumulación ósea", es decir, ^{90}Y, por los huesos del paciente. Por ejemplo, cuando el anticuerpo del kit se conjuga a un quelador DTPA, el exceso de DTPA o cualquier otro quelador puede incluirse en el tampón de formulación. El tampón de formación también se suministra preferiblemente en un volumen tal que los contenidos completos se transfieran al vial de reacción. Como se ha analizado anteriormente, esto provoca una facilidad aumentada de uso y reproducibilidad porque no tienen que medirse y transferirse volúmenes exactos.
Un tampón de formulación preferido comprende solución salina tamponada con fosfato o fisiológica, albúmina sérica humana y DTPA. La albúmina sérica humana está preferiblemente a una concentración entre aproximadamente el 1 y el 25% (p/v), y más preferiblemente a una concentración de aproximadamente el 7,5% (p/v). La concentración de DTPA es preferiblemente aproximadamente 1 mM. Puede usarse ascorbato como alternativa a la albúmina sérica humana, y se usa típicamente a una concentración de aproximadamente 1 a 100 mg/ml. No obstante, puede usarse un intervalo más amplio de concentraciones sin comprometer la seguridad del paciente.
El anticuerpo del kit de radiomarcaje se marca fácilmente con un radioisótopo de elección mediante un quelador bifuncional de acuerdo con los métodos de la presente descripción. Por simplicidad adicional a este respecto, el kit de la presente descripción también puede incluir un vial que contiene un tampón para ajustar el pH de la solución de radioisótopo, y un vial de reacción de vidrio estéril para realizar el marcaje y posteriormente para resuspender el anticuerpo radiomarcado final en tampón de formulación. Un vial de reacción de 10 ml típicamente es suficiente, pero también pueden usarse viales capaces de albergar de 5 a 20 ml. El tampón es preferiblemente una solución de acetato sódico de bajo contenido en metales a una concentración de 10 a 1000 mM, más preferiblemente 50 mM.
Un kit específico de la presente descripción comprende el anticuerpo conjugado con MX-DTPA, 2B8-MX-DTPA. 2B8 es un anticuerpo anti-CD20 que ha mostrado afectar a la eliminación de células B después de su administración a pacientes con linfoma. Sin embargo, debe ser evidente para los especialistas en la técnica que el kit de radiomarcaje de la presente descripción puede optimizarse para el radiomarcaje de otros anticuerpos anti-CD20, o cualquier otro anticuerpo que se haya conjugado con DTPA u otro quelador polivalente. El kit preferido de la presente descripción puede comprender al menos (i) un vial que contiene el anticuerpo 2B8 conjugado con MX-DTPA, en solución o liofilizado (que requiere reconstitución); y (ii) un vial que contiene tampón de formulación para administrar el anticuerpo radiomarcado a un paciente. El kit preferido también contendrá (iii) un tampón para ajustar el pH del isótopo, y (iv) un vial de reacción. Como alternativa, y más preferiblemente, el tampón se suministra en el vial de reacción, eliminado de este modo las etapas de medir y transferir el tampón y aumentando la simplicidad, la consistencia y la esterilidad de los componentes del kit. Sin embargo, también se prevén otros casos, es decir, por los cuales se añade el tampón al vial de isótopo primero, y después se transfiere el isótopo tamponado al vial de reacción. En este caso, el vial de reacción podría suministrarse con el volumen de anticuerpo requerido. Como alternativa, el vial de isótopo/tampón podría hacerse suficientemente grande para acomodar la adición del conjugado de anticuerpo, es decir, directamente al vial del proveedor. Esto eliminaría la necesidad del vial de reacción.
Como se ha descrito anteriormente, se incluye otra configuración de kit preferida por la cual el propio vial de reacción contiene el volumen requerido de anticuerpo conjugado (es decir, 1 o 1,5 ml para ^{111}In y ^{90}Y, respectivamente). El anticuerpo puede suministrarse en un tampón que proporcione el pH de radiomarcaje apropiado de acuerdo con el isótopo deseado específico (es decir, pH 3-6 para ^{111}In, pH 3-5 para ^{90}Y). Pueden usarse diferentes tampones, dependiendo del isótopo (es decir, acetato sódico para ^{90}Y, citrato sódico para ^{111}In). El pH y la composición del tampón también pueden variar dependiendo de la naturaleza del ligando de unión a marcar (es decir, el marcaje de péptidos puede permitir que se use <pH 3). Esencialmente después, el isótopo se transferiría directamente al vial de reacción, como el tampón de formulación. Limitando el uso del kit a dos etapas de transferencia se aumentaría adicionalmente la reproducibilidad y simplicidad, y se disminuirían adicionalmente las posibilidades de contaminación de la esterilidad durante la manipulación de los componentes del kit.
Los kits de radiomarcaje de la presente descripción pueden comprender adicionalmente un vial de radioisótopo, o puede solicitarse el radioisótopo por separado de un proveedor apropiado. Los radioisótopos preferidos de la presente descripción son cloruro de ^{111}In y cloruro de ^{90}Y en HCl aunque los métodos descritos no se limitan a estos isótopos. Otros radionúclidos que se han usado para aplicaciones de formación de imágenes son conocidos en la técnica, es decir, como se describe en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.634.586, 5.460.785 y 5.766.571, que se incorporan en este documento por referencia. El indio-[111] es particularmente ventajoso para formar imágenes de tumores de células B y los emisores beta tales como ^{90}Y son particularmente útiles como agentes radioterapéuticos. No obstante, pueden usarse otros radioisótopos adecuados para estos y otros propósitos, es decir, emisores alfa, dependiendo del quelador usado para la conjugación del anticuerpo.
Dada la eficacia demostrada de los regímenes terapéuticos combinados descritos en la Solicitud de Estados Unidos con Nº de serie 08/475.813, un kit adicional también incluirá un vial diferente de anticuerpo quimérico, es decir, Rituxan®, a administrar antes o después del anticuerpo anti-CD20 radiomarcado. Cuando el anticuerpo quimérico se administra antes del anticuerpo radiomarcado, puede disminuirse significativamente la respuesta HAMA que generalmente puede suceder en respuesta a la administración de un anticuerpo anti-CD20 murino, aumentando de este modo la utilidad terapéutica de anticuerpos murinos radiomarcados. Además, cuando se emplea un anticuerpo anti-CD20 quimérico para eliminar células B circulantes, las posteriores imágenes diagnósticas conseguidas con anticuerpos marcados con ^{111}In pueden ser mucho más claras.
También debe ser evidente que puede usarse tanto un anticuerpo radiomarcado de diagnóstico como un anticuerpo radiomarcado terapéutico juntos en un régimen terapéutico combinado. A este respecto, el anticuerpo de diagnóstico puede usarse antes o después del anticuerpo terapéutico para visualizar el tamaño del tumor antes y después del tratamiento. En este caso, el kit de la presente descripción puede incluir viales de tampón diferentes, quizá codificados por color, formulados específicamente de acuerdo con los requisitos de pH óptimos para radiomarcar anticuerpos con los radioisótopos específicos a usar. Dicho sistema aseguraría que se usa el tampón apropiado para cada marcador, y permitiría al médico la misma facilidad en el radiomarcaje de dos anticuerpos que si se hubieran adquirido dos kits. Dicho kit en efecto combina los componentes de dos kits de radiomarcaje en uno.
Los componentes del kit de radiomarcaje de la presente descripción se suministran a la concentración y pH apropiados de modo que se mantenga fácilmente la esterilidad antes de la administración del anticuerpo y existe poca necesidad de tampones o medios adicionales. Sin embargo, debe ser evidente para los especialistas en la técnica que pueden prepararse, esterilizarse y ensayarse algunos reactivos en el sitio. Por tanto, se prevén variaciones del kit de la presente descripción dependiendo del presupuesto y preferencia del consumidor.
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El kit de radiomarcaje de la presente descripción puede usarse en un método para radiomarcar un anticuerpo conjugado con quelador para su administración a un paciente. De acuerdo con la presente descripción, dicho método comprende, en general,
(i) mezclar un anticuerpo conjugado con quelador con una solución que contiene un radioisótopo;
(ii) incubar la mezcla durante un periodo apropiado de tiempo a temperatura apropiada; y
(iii) diluir el anticuerpo marcado a una concentración apropiada en tampón de formulación, de modo que el anticuerpo radiomarcado pueda administrarse directamente a un paciente sin purificación adicional.
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Más preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD20, y en particular, el anticuerpo anti-CD20 puede ser 2B8. El anticuerpo puede estar conjugado con cualquier quelador apropiado, es decir, MX-DTPA, CHX-DTPA, fenil- o bencil-DTPA, DOTA, derivados de EDTA, etc. Se prefiere MX-DTPA. Se conocen en la técnica métodos para realizar la conjugación del anticuerpo (Kozak et al. (1989); Mirzadeh et al. (1990), Brachbiel et al. (1986)).
En la presente invención se ha descubierto que el método para radiomarcar un anticuerpo conjugado con quelador funciona mejor cuando la solución que contiene el radiomarcador se ajusta a un pH entre aproximadamente 3,0 y 6,0, y más preferiblemente a aproximadamente 4,2 antes de mezclarse con el anticuerpo conjugado con quelador. Se prefiere particularmente acetato sódico de bajo contenido en metales para ajustar el pH, aunque pueden usarse otros tampones. Preferiblemente, el acetato sódico está a una concentración entre aproximadamente 10 y 1000 mM, y más preferiblemente 50 mM.
Cuando el radioisótopo es cloruro de ^{111}In, la cantidad en volumen de cloruro de ^{111}In que debe usarse para preparar una única dosis administrativa es típicamente aproximadamente 5,5 mCi dividida por la concentración de radiactividad en el momento del marcaje. Para la administración al paciente, una dosis de diagnóstico típica de ^{111}In es de aproximadamente 2 a 10 mCi. La cantidad de acetato sódico usada para ajustar el pH varía dependiendo de la concentración de acetato sódico y la solución vehículo del isótopo, y por lo tanto puede ser bastante amplia. Cuando la concentración de acetato sódico es 50 mM, la cantidad necesaria para ajustar el pH es típicamente aproximadamente 1,2 veces la cantidad en volumen de cloruro de ^{111}In usada aunque pueden usarse volúmenes más grandes. Debe apreciarse que lo importante es la proporción de acetato sódico a HCl, y la cantidad de acetato sódico usada cambiaría dependiendo de la cantidad y concentración de HCl en el tampón. Después se mezcla aproximadamente 1 ml de un anticuerpo conjugado con quelador a una concentración de aproximadamente 2 mg/ml con la solución acetato de radiomarcador, y la mezcla se incuba durante aproximadamente 30 minutos, o durante un tiempo suficiente para conseguir el marcaje óptimo del anticuerpo. Dicho tiempo puede variar de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 60 minutos. Después se añade tampón de formulación en una cantidad necesaria para conseguir un volumen final total de aproximadamente 10 ml.
El tiempo óptimo requerido para marcar el anticuerpo puede variar dependiendo del anticuerpo, el radiomarcador particular y el conjugado particular empleado. Un factor subyacente en la optimización del tiempo asignado para el radiomarcaje es la proporción de quelador a anticuerpo del reactivo que se tiene que marcar. Por ejemplo, la proporción de quelador a anticuerpo debe ser suficientemente elevada para conseguir un nivel terapéuticamente útil de incorporación, es decir, del 90 al 95% dependiendo del radioisótopo, pero también debe ser no demasiado elevado para comprometer la integridad estructural o inmunorreactividad del anticuerpo. Esto requiere un cierto proceso de equilibrado que en algunos casos puede conducir a un nivel inferior de quelador conjugado y mayor tiempo de marcaje.
Por ejemplo, para 2B8 y MX-DTPA, se ha descubierto que el marcaje puede conseguirse en cinco minutos para ^{90}Y y en aproximadamente treinta minutos para ^{111}In para conseguir el nivel deseado de radioincorporación, con una proporción molar de sólo aproximadamente 11/2 a 1 de quelador a anticuerpo. No fue necesario, por lo tanto, aumentar la proporción de quelador a anticuerpo, porque se consiguió un nivel deseable de radioincorporación. Además, no era ventajoso aumentar la cantidad de quelador conjugado porque esto podría afectar a la inmunorreactividad del anticuerpo. Dichos parámetros podrían determinarse empíricamente para otros anticuerpos para el diseño de kits tales como los descritos en la presente descripción.
Cuando el radioisótopo es cloruro de ^{90}Y, la cantidad en volumen de cloruro de ^{90}Y usada para preparar una única dosis administrativa típicamente varía de aproximadamente 10 a 50 mCi, y es preferiblemente aproximadamente 45 mCi, dividida por la concentración de radiactividad en el momento del marcaje. La cantidad de acetato sódico usada para ajustar el pH varía dependiendo de la concentración de acetato sódico y la concentración del vehículo del isótopo, y por lo tanto puede ser bastante amplia. Cuando la concentración de acetato sódico es 50 mM y el ^{90}Y se suministra en HCl 50 mM, la cantidad requerida para ajustar el pH es típicamente aproximadamente 1,2 veces la cantidad en volumen de cloruro de ^{90}Y usada. Después se mezclan aproximadamente 1,5 ml de un anticuerpo conjugado con quelador a una concentración de aproximadamente 2 mg/ml con la solución acetato de radiomarcador, y se incuban durante aproximadamente 5 minutos, o durante un tiempo suficiente para conseguir el marcaje óptimo del anticuerpo. Dicho tiempo puede variar de aproximadamente 30 segundo a aproximadamente 60 minutos. El tampón de formulación se añade en una cantidad necesaria para conseguir un volumen final total de aproximadamente 10 ml.
Preferiblemente, el método de radiomarcaje de la presente descripción se realiza usando el kit de radiomarcaje descrito en este documento. Sin embargo, debe ser evidente para los especialistas en la técnica que los componentes y condiciones preferidos son simplemente directrices aceptables para practicar el método de la presente descripción, y pueden alterarse en cierta medida con optimización apropiada. Las condiciones de que alejan de las preferidas pero que aún consiguen el propósito del método se consideran dentro del alcance de la presente descripción.
El kit de radiomarcaje de la presente descripción también puede suministrarse con reactivos adecuados para verificar de forma adecuada la afinidad de unión del anticuerpo después del radiomarcaje. En dicho caso, el kit de la descripción también puede usarse para determinar el porcentaje de unión de un anticuerpo radiomarcado a su célula diana antes de administrar el anticuerpo a un paciente. En la presente invención también se ha descubierto que el kit de ensayo de unión particular descrito puede ser útil para ensayar la afinidad de cualquier anticuerpo para el que generalmente no está disponible en antígeno purificado. Por consiguiente, los componentes del ensayo de unión también pueden venderse en forma de un kit diferente.
En general, un ensayo de unión y kit de radiomarcaje comprende (i) al menos un vial de células liofilizadas que expresan el antígeno que se reconoce por el anticuerpo del kit; (ii) un vial que contiene anticuerpo conjugado con quelador; (iii) un vial que contiene tampón de formulación, y (iv) instrucciones para radiomarcar el anticuerpo de modo que el anticuerpo radiomarcado pueda administrarse directamente a un paciente sin la necesidad de posterior purificación. Como se ha descrito anteriormente para el kit de radiomarcaje, este kit también puede comprender un vial que contiene un tampón para ajustar el pH del radioisótopo, y un vial de reacción de vidrio estéril. Preferiblemente el tampón buffer es una solución de acetato sódico de bajo contenido en metales a una concentración entre aproximadamente 10 y 1000 mM, y el vial de reacción de vidrio alberga un volumen de al menos 5 ml. El anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo anti-CD20, y el quelador es preferiblemente MX-DTPA. Pueden usarse otros queladores como se ha descrito previamente. El anticuerpo conjugado preferido es 2B8-MX-DTPA, aunque puede marcarse cualquier anticuerpo conjugado con quelador y evaluarse su afinidad. El tampón de formulación es solución salina tamponada con fosfato que comprende un radioprotector y quelador sin conjugar como se ha descrito anteriormente, y puede estar incluido o no el radioisótopo y es preferiblemente cloruro de ^{111}In o cloruro de ^{90}Y. Pueden usarse otros radioisótopos dependiendo del quelador.
La diferencia entre el ensayo de unión/kit de radiomarcaje y el kit de radiomarcaje descrito anteriormente es la inclusión de células positivas al antígeno para que sirvan como sustrato diana para ensayar la afinidad del anticuerpo. Cuando el antígeno es CD20, las células CD20-positivas preferidas son células SB (ATCC Nº CCL 120) pero puede usarse cualquier célula CD20-positiva. El ensayo de unión y kit de radiomarcaje pueden incluir adicionalmente células negativas al antígeno para su uso como control negativo. Las células CD20-negativas preferidas son células HSB (ATCC Nº CCL 120.1) pero puede usarse cualquier célula CD20-negativa.
Por supuesto, el kit de radiomarcaje y ensayo de unión combinado puede comprender adicionalmente un vial de anticuerpo anti-CD20 quimérico además del anticuerpo a marcar para los propósitos de realizar un régimen terapéutico combinado, o para eliminar las células B periféricas antes de la formación de imágenes de diagnóstico. Dicho anticuerpo diferentes es preferiblemente Rituxan®, pero puede ser cualquier anticuerpo que haya demostrado realizar la eliminación de células tumorales. De hecho, pueden combinarse dos tipo diferentes de anticuerpo en un kit, es decir, anticuerpos dirigidos a dos antígenos diferentes de células B, siempre que el régimen terapéutico combinado sirva para marcar el mismo tipo de célula, es decir, el linfoma de células B.
Como los componentes del kit pueden usarse para marcar otros anticuerpos, pueden prepararse otras células para ensayar la afinidad del anticuerpo dependiendo del antígeno diana. Sin embargo, para anticuerpos anti-CD20, el ensayo de unión y kit de radiomarcaje de la presente descripción es particularmente adecuado para el entorno comercial porque las células diana se proporcionan en forma liofilizada. Esto permite la verificación de la eficacia del anticuerpo para proceder de forma simple y sistemática, y anula la dificultad y los gastos implicados en el mantenimiento de instalaciones de cultivo. Las células liofilizadas generalmente se suministran en alícuotas entre 0,5 y 500 x 10^{6} células por vial de acuerdo con los métodos de la descripción.
Es posible que instalaciones particulares prefieran solicitar un anticuerpo que ya se haya radiomarcado, en cuyo caso dicha instalación podría desear los reactivos del ensayo de unión con el fin de garantizar que los anticuerpos retienen la afinidad diana. En este caso, la presente descripción también proporciona un kit de ensayo de unión para determinar el porcentaje de unión de un anticuerpo radiomarcado a su célula diana. Dicho kit incluye al menos un vial de células positivas al antígeno fijadas y/o liofilizadas, y puede contener opcionalmente células negativas al antígeno como se ha descrito anteriormente para el ensayo de unión y kit de radiomarcaje. Además, debe ser evidente que variaciones de dicho kit pueden incluir un anticuerpo de control sin marcar para verificar la especificidad de unión del anticuerpo del consumidor mediante un ensayo competitivo.
De nuevo, cuando el antígeno es CD20, las células CD20-positivas son preferiblemente células SB (ATCC Nº CCL 120) y las células CD20-negativas son preferiblemente células HSB (ATCC Nº CCL 120.1), que se suministran en forma liofilizada en alícuotas entre 0,5 y 50 x 10^{6} células. En este caso, el anticuerpo es preferiblemente un conjugado MX-DTPA de 2B8 marcado con ^{111}In o ^{90}Y.
En vista de los kits adicionales descritos en este documento, se debe enfatizar que una de las ventajas del kit de radiomarcaje y método de la presente descripción es que no es necesaria una etapa de purificación adicional, y el anticuerpo radiomarcado puede administrarse directamente al paciente, ahorrando de este modo un tiempo valioso y aumentando la estabilidad del anticuerpo. Por lo tanto, se enfatiza que, aunque puede ser deseable para el médico ensayar o verificar la especificidad y afinidad de unión del anticuerpo radiomarcado antes de la administración, puede prescindirse de dicho ensayo con radioisótopos particulares si la estabilidad del anticuerpo y la inhibición de la radiolisis son preocupaciones particulares, es decir, como con itrio. Proporcionando kits por los cuales pueden ensayarse la afinidad y la especificidad de unión, no se pretende sugerir de ningún modo que dichos ensayos sean absolutamente necesarios en los métodos o kits de la presente descripción. La opción para ensayar la validez del anticuerpo es simplemente a elección del médico.
En la presente invención también se ha descubierto que el método usado para preparar células fijadas y liofilizadas para los kits de ensayo de unión de la presente descripción es particularmente adecuado para preparar células para kits comerciales. Las células pueden fijarse antes de la liofilización para mejorar la estructura/estabilidad. En particular, las células de la presente descripción demuestran elevada reproducibilidad cuando se usan para los ensayos de unión de anticuerpo.
En particular, la presente descripción incluye un método para preparar células liofilizadas que comprende (i) recoger células a una densidad celular de 0,5 a 2 x 10^{6} células por ml por centrifugación; (ii) lavar las células al menos una vez en una solución salina equilibrada, es decir, HBSS; (iii) resuspender las células sedimentadas en un tampón de liofilización que comprende una solución salina equilibrada que contiene proteína vehículo y al menos un tipo de azúcar; (iv) dosificar una alícuota de células resuspendidas en un tubo de microfuga o un vial de vidrio; y (v) liofilizar las células 12-96 h y más preferiblemente 24-72 h a aproximadamente 3,99-7,98 Pa (30-60 militor). El método es particularmente adecuado para preparar células liofilizadas cuando dichas células son células SB (ATCC Nº CCL 120) o células HSB (ATCC Nº CCL 120.1), pero probablemente es aplicable también a otros tipos celulares.
Preferiblemente, el tampón generalmente contiene albúmina sérica bovina como proteína vehículo a una concentración del 1% (p/v) y manitol a una concentración del 10%. Sin embargo, pueden usarse posiblemente otras proteínas vehículo, es decir, HSA, y otros azúcares. Las células se recogen por centrifugación a una velocidad de aproximadamente 1300 rpm, y se añade la solución salina HBSS (solución salina equilibrada de Hank). Las células generalmente se resuspenden a una concentración de 50 X 10^{6} células por ml. Sin embargo, debe ser evidente para los especialistas en la técnica que las condiciones anteriores pueden modificarse ligeramente sin comprometer significativamente la viabilidad celular. Además, las condiciones anteriores puede suplementarse por procedimientos adicionales diseñados para optimizar el proceso para cantidades más grandes de células, por ejemplo, diafiltración de flujo tangencial para el intercambio de células en el tampón de liofilización.
Los kits de ensayo de unión de la presente descripción pueden usarse en un ensayo para evaluar la afinidad de unión de un anticuerpo radiomarcado. Dicho ensayo también es un asunto de la presente descripción. Un ensayo de unión para determinar el porcentaje de unión de un anticuerpo radiomarcado a su célula diana comprende en general las siguientes etapas: (i) mezclar al menos una alícuota de un anticuerpo radiomarcado con al menos una alícuota de células positivas al antígeno; (ii) mezclar al menos una alícuota de un anticuerpo radiomarcado idéntica a la alícuota de la etapa (i) con al menos una alícuota de tampón de dilución del mismo volumen que la alícuota de células positivas al antígeno de la etapa (i) como control; (iii) sedimentar las células por centrifugación; (iv) medir la radiactividad en el sobrenadante de las células sedimentadas y el control; y (v) comparar la cantidad de radiactividad en el sobrenadante celular con la cantidad de radiactividad en el control.
Como los kits de radiomarcaje de la presente descripción contienen opcionalmente cloruro de ^{111}In o cloruro de ^{90}Y, el ensayo de unión de la presente descripción se realiza típicamente con anticuerpos marcados con ^{111}In o ^{90}Y. Cuando ^{111}In es el radiomarcador, la radiactividad en los tubos de ensayo se mide usando un contador gamma. Cuando ^{90}Y es el marcador, la radiactividad se mide usando un contador de centelleo, aunque podría usarse un contador gamma.
Para el ensayo de unión de la presente descripción, el anticuerpo preferido es un anticuerpo anti-CD20, y el anticuerpo anti-CD20 es preferiblemente 2B8, donde el anticuerpo 2B8 se marca usando el kit de radiomarcaje de la presente descripción. Sin embargo, puede ensayarse cualquier anticuerpo radiomarcado con la condición de que estén disponibles células que expresen el antígeno particular. Cuando CD20 es el antígeno, las células preferidas para realizar el ensayo son células SB (ATCC Nº CCL 120), sin embargo, el ensayo también puede optimizarse y realizarse con cualquier anticuerpo radiomarcado y célula diana apropiada.
El tampón de dilución usado para el ensayo debe mantener la unión del anticuerpo, es decir, tampón fisiológico, que contiene posiblemente una proteína vehículo, por ejemplo BSA, para minimizar la unión no específica a las células. Aunque el tubo con tampón de dilución sirve como control, puede incluirse un control adicional en el ensayo usando células negativas al antígeno. En este caso, el ensayo de unión comprende adicionalmente las siguientes etapas: (i) mezclar al menos una alícuota de un anticuerpo radiomarcado con al menos una alícuota de células negativas al antígeno; (ii) sedimentar las células negativas al antígeno por centrifugación; (iv) medir la radiactividad en el sobrenadante de las células sedimentadas negativas al antígeno; y (v) comparar la cantidad de radiactividad en el sobrenadante celular negativo al antígeno con la cantidad de radiactividad en el sobrenadante de las células positivas al antígeno y el control. La comparación de la radiactividad obtenida de este tubo con el control de tampón de dilución servirá como medición de la cantidad de unión no específica a las células positivas al antígeno. Cuando CD20 es el antígeno, y las células CD20-positivas son células SB, las células CD20-negativas son preferiblemente células HSB (ATCC Nº CCL 120.1).
Como se ha descrito anteriormente, las células liofilizadas de la presente descripción proporcionan un patrón simple, eficaz y reproducible para ensayar la eficacia de unión de un anticuerpo radiomarcado. Por lo tanto, el ensayo de unión de la presente descripción se realiza preferiblemente usando las células liofilizadas incluidas en los kits de ensayo de unión de la presente descripción. Además, los ensayos de radiomarcaje de la presente descripción pueden combinarse con los ensayos de unión de la presente descripción, donde el anticuerpo se marca primero por el método de marcaje de un anticuerpo conjugado con quelador como se describe en la presente descripción. Más preferiblemente, el ensayo de unión de la presente descripción se realiza usando uno de los ensayos de unión y kits de radiomarcaje descritos en este documento.
Puede haber algunos casos donde debe ensayarse o verificarse la afinidad de un anticuerpo pero no se ha unido un radiomarcador. Por ejemplo, en ciertas circunstancias, es decir, en la localización de problemas, puede ser ventajoso ensayar la afinidad de unión de un anticuerpo antes de radiomarcarlo. Para dicho caso, la presente descripción también incluye un ensayo de unión competitiva para evaluar la afinidad de un anticuerpo de ensayo por una célula diana, que comprende (i) preparar un anticuerpo de control marcado con rutenio usando un anticuerpo conocido específico para el mismo antígeno; (ii) incubar cantidades crecientes de anticuerpo de ensayo y cantidades crecientes de anticuerpo de control sin marcar con una concentración fija de células diana y una cantidad traza de anticuerpo marcado con rutenio donde cada concentración diferente de anticuerpo de ensayo y cada concentración diferente de anticuerpo de control están en tubos diferentes, respectivamente; (iii) determinar la cantidad de unión en cada tubo de reacción en base a la electroquimioluminescencia (ECL) relativa usando instrumentación ORIGEN; y (iv) calcular el valor de afinidad promedio del anticuerpo de ensayo. El valor de afinidad promedio puede calcularse a partir de valores de EC50 y la concentración conocida del anticuerpo traza usando el método de Muller (J. Immunological Methods (1980) 34:345) o cualquier otro método apropiado. Debe observarse que este ensayo también puede usarse para ensayar la afinidad de anticuerpos radiomarcados, o cualquier anticuerpo para el que no puede purificarse el antígeno y se requieren células como fuente de antígeno. Las células fijadas, liofilizadas de la presente descripción pueden usarse como células diana.
Cuando se realiza el ensayo de unión competitiva de la presente descripción para ensayar la afinidad de anticuerpos anti-CD20, el anticuerpo de control puede ser 2B8, o cualquier otro anticuerpo anti-CD20 sin conjugar. El anticuerpo de control puede ser un anticuerpo conjugado con quelador. El anticuerpo de ensayo también puede ser un conjugado con quelador del anticuerpo de control. Como alternativa, el anticuerpo de ensayo puede ser otro anticuerpo anti-CD20 cuya afinidad de unión a CD20 en comparación con 2B8 sea de interés. Sin embargo, el ensayo puede adaptarse para su uso con anticuerpos que tienen otras especificidades siempre que esté disponible una célula diana apropiada.
En el ensayo de unión competitiva de la presente descripción, las células diana preferidas son células CD20-positivas, más preferiblemente células SB (ATCC Nº CCL 120), y son más preferiblemente células SB liofilizadas resuspendidas preparadas de acuerdo con el método de la presente descripción. También pueden usarse células liofilizadas usando otros métodos o células fijadas. El anticuerpo marcado con rutenio se prepara típicamente por un proceso que comprende incubar el anticuerpo de control con quelador tris-bipiridina del éster N-hidroxisuccinimida de rutenio (II) (TAG-NHS), aunque también se prevén otros métodos conocidos para marcar anticuerpos. Para el marcaje, el anticuerpo de control y TAG-NHS se incuban preferiblemente a una proporción molar de aproximadamente 1:15.
Estos y otros aspectos de la presente descripción llegarán a entenderse claramente por referencia a las siguientes figuras, ejemplos y descripción.
Habiendo dicho esto, debe mantenerse siempre en mente que el asunto de la presente invención es el asunto que se expone en las reivindicaciones adjuntas, proporcionándose en este documento el resto de los aspectos de la presente descripción para facilitar la comprensión de la presente invención y para poner la presente invención en contexto.
4. Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Se comparó la inmunorreactividad de 2B8 nativo como anticuerpo anti-CD20 disponibles en el mercado B1 (Coulter) y Leu 16 (Becton Dickinson) por competición directa en un radioinmunoensayo usando B1 marcado con ^{125}I. Se añadieron células SB positivas al antígeno (100.000) a cada pocillo de placas de filtro V&P; se mezclaron 10 ng de B1 radiomarcado con diversas concentraciones de agente de competición sin marcar y la mezcla se añadió a las células. Los anticuerpos se incubaron con las células durante una hora a temperatura ambiente; las determinaciones se realizaron por triplicado. Posteriormente, los pocillos se lavaron, se secaron y se determinó la radiactividad asociada al filtro. Los datos mostrados se corrigieron para la radiactividad de fondo y son la media de determinaciones por triplicado.
Figura 2. Se analizaron cantidades crecientes de 2B8 sin conjugar para la unión a células B humanas (SB) usando análisis FACS. Se hicieron comparaciones con un anticuerpo monoclonal anti-CD20 disponible en el mercado (B1) y con dos anticuerpos de isotipo irrelevante. Se usó F(ab)'_{2} de cabra anti-IgG de ratón-FITC como reactivo secundario. Los resultados muestran que 2B8 es específico para el antígeno CD20 y que muestra mayor unión que B1.
Figura 3. Se incubaron células B humanas (SB) con cantidades crecientes de 2B8 marcado con ^{125}I. Se incubaron muestras triplicadas durante una hora y se determinó la radiactividad unida a las células después de la filtración para recoger las células. El análisis de Scatchard permitió el cálculo de una constante de afinidad aparente de 4,3 X 10^{-9} M.
Figura 4. Inmunorreactividad de 2B8 nativo, 2B8-MX-DTPA, y B1. El anticuerpo B1 se radiomarcó como se describe en la sección de Métodos. Se mezclaron diez nanogramos de B1 radiomarcado con concentraciones crecientes del competidor y la mezcla se añadió a pocillos de placas de filtro V&P que contenían 100.000 células SB positivas a antígeno cada uno; todas las determinaciones se realizaron por triplicado. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, los pocillos se lavaron extensivamente. Posteriormente, se secaron los filtros y se determinó la radiactividad asociada por recuento gamma; todos los valores se corrigieron para el fondo. Los valores mostrados con las medias de determinaciones por triplicado.
Figura 5. Se formuló el anticuerpo 2B8 a una concentración final de 10 mg/ml en solución salina normal o solución salina normal que contenía glicina-HCl 10 mM, pH 6,8. Después se colocaron series duplicadas de muestras en viales cerrados a rosca, los viales se purgaron con nitrógeno, y después se taparon. Las muestras después se incubaron a 4ºC o 30ºC durante 12 semanas; la inmunorreactividad de las muestras se evaluó semanalmente. No se observó pérdida de inmunorreactividad con ninguna de las muestras de 2B8 en todo el estudio de 12 semanas. Se representan las inmunorreactividades en la semana 1 (Fig. 5A), semana 6 (Fig. 5B) y semana 12 (Fig. 5C).
Figura 6. Ensayo de unión para la determinación de la inmunorreactividad de 2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In incubado en PBS, pH 7,4 que contenía 50 mg/ml de albúmina sérica humana (48 h de incubación). Figura 6A) Se incubó una cantidad constante de anticuerpo radiomarcado (5 ng/ml) con volúmenes crecientes de células SB (20 x 10^{6} células/ml). La cantidad de radiactividad (cpm) unida a las células se representó frente al volumen de suspensión celular añadido. Figura 6B) Se representó la radiactividad aplicada total sobre la radiactividad unida (AT/B). La extrapolación lineal permitió el cálculo del punto de corte con el eje y (0,997). El recíproco del punto de corte con el eje y X 100 produjo un valor de inmunorreactividad del 100% a exceso de antígeno infinito.
Figura 7. Autorradiogramas obtenidos a partir de análisis SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y incubado a 4ºC en PBS, pH 7,4 que contenía 75 mg/ml de albúmina sérica humana y DTPA 1 mM. En los tiempos indicados, las muestras se sometieron a electroforesis en geles de Tris-glicina al 4-20% usando condiciones no reductoras, condiciones desnaturalizantes (SDS). Las muestras se cargaron a 5 \mul (carriles 1, 2), 10 \mul (carriles 5, 6). Los geles se expusieron a una película de rayos x durante aproximadamente 15 min. a temperatura ambiente y se fotografiaron.
Figura 8. Exploración densitométrica del autorradiograma a tiempo cero obtenido a partir del análisis SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y incubado a 4ºC en PBS, pH 7,4 que contenía 75 mg/ml de albúmina sérica humana y DTPA 1 mM. La muestra se sometió a electroforesis en un gel de Tris-glicina al 4-20% usando condiciones no reductoras. Las muestras se cargaron a 5 \mul, 10 \mul, y 20 \mul en pocillos duplicados. El gel se expuso a una película de rayos x durante aproximadamente 15 min. a temperatura ambiente y se exploró uno de los carriles usando un densitómetro. El área relativa del pico de conjugado radiomarcado (nº 2) era del 96,2%.
Figura 9. Exploración densitométrica del autorradiograma de 48 h obtenido a partir del análisis SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y incubado a 4ºC en PBS, pH 7,4 que contenía 75 mg/ml de albúmina sérica humana y DTPA 1 mM. La muestra se sometió a electroforesis en un gel de Tris-glicina al 4-20% usando condiciones no reductoras. Las muestras se cargaron a 5 \mul, 10 \mul, y 20 \mul en pocillos duplicados. El gel se expuso a una película de rayos x durante aproximadamente 15 min. a temperatura ambiente y se exploró uno de los carriles usando un densitómetro. El área relativa del pico del conjugado radiomarcado (nº 2) era del 95,5%.
Figura 10. Autorradiogramas obtenidos a partir del análisis SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In incubado a 4ºC en PBS, pH 7,4 que contenía 50 mg/ml de albúmina sérica humana. En los tiempos indicados, las muestras se sometieron a electroforesis en geles de Tris-glicina al 4-20% usando condiciones no reductoras. Las muestras se cargaron a 5 \mul (carriles 1, 2), 10 \mul (carrilles 3, 4), y 20 \mul (carriles 5, 6). Los geles se expusieron a una película de rayos x durante aproximadamente 15 min. a temperatura ambiente y se fotografiaron. (Nota: El autorradiograma de 48 h se obtuvo usando tamices de intensificación que produjeron una señal más intensa en comparación con el autorradiograma de tiempo cero).
Figura 11. Exploración densitométrica del autorradiograma de tiempo cero obtenido a partir del análisis SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In incubado a 4ºC en PBS, pH 7,4 que contenía 50 mg/ml de albúmina sérica humana. La muestra se sometió a electroforesis en un gel de Tris-glicina al 4-20% en condiciones no reductoras. La muestra se cargó a 5 \mul, 10 \mul, y 20 \mul en pocillos duplicados. El gel se expuso a una película de rayos x durante aproximadamente 15 min. a temperatura ambiente y se exploró uno de los carriles usando un densitómetro. El área relativa del pico del conjugado radiomarcado (nº 3) era del 95,9%.
Figura 12. Exploración densitométrica del autorradiograma de 48 h obtenido a partir del análisis SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In incubado a 4ºC en PBS, pH 7,4 que contenía 50 mg/ml de albúmina sérica humana. La muestra se sometió a electroforesis en un gel de Tris-glicina al 4-20% en condiciones no reductoras. La muestra se cargó a 5 \mul, 10 \mul, y 20 \mul en pocillos duplicados. El gel se expuso a una película de rayos x durante aproximadamente 15 min. a temperatura ambiente y se exploró uno de los carriles usando un densitómetro. El área relativa del conjugado radiomarcado era del 97,0% (área combinada de los picos nº 2, 3, y 4).
Figura 13. Autorradiogramas obtenidos a partir del análisis SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y incubado a 37ºC en suero humano. En los tiempos indicados, las muestras se sometieron a electroforesis en geles de Tris-glicina al 4-20% usando condiciones no reductoras. Las muestras se cargaron a 5 \mul (carriles 1, 2), 10 \mul (carriles 3, 4), y 20 \mul (carriles 5, 6). Los geles se expusieron a una película de rayos x durante aproximadamente 15 min. a temperatura ambiente y se fotografiaron.
Figura 14. Exploración densitométrica del autorradiograma de tiempo cero obtenido a partir del análisis SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y incubado a 37ºC en suero humano. La muestra se sometió a electroforesis en un gel de Tris-glicina al 4-20% usando condiciones no reductoras. La muestra se cargó a 5 \mul, 10 \mul, y 20 \mul en pocillos duplicados. Los geles se expusieron a una película de rayos x durante aproximadamente 15 min. a temperatura ambiente y se exploró uno de los carriles usando un densitómetro. El área relativa del pico del conjugado radiomarcado (nº 2) era del 97,9%.
Figura 15. Exploración densitométrica del autorradiograma de 98 h obtenido a partir del análisis SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y incubado a 37ºC en suero humano. La muestra se sometió a electroforesis en un gel de Tris-glicina al 4-20% usando condiciones no reductoras. La muestra se cargó a 5 \mul, 10 \mul, y 20 \mul en pocillos duplicados. Los geles se expusieron a una película de rayos x durante aproximadamente 15 min. a temperatura ambiente y se exploró uno de los carriles usando un densitómetro. El área relativa del pico del conjugado radiomarcado (nº 2) era del 94,7%.
Figura 16. Autorradiogramas obtenidos a partir del análisis SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In incubado a 37ºC en suero humano. En los tiempos indicados, las muestras se sometieron a electroforesis en geles de Tris-glicina al 4-20% usando condiciones no reductoras. Las muestras se cargaron a 5 \mul (carriles 1, 2), 10 \mul (carriles 3, 4), y 20 \mul (carriles 5, 6). Los geles se expusieron a una película de rayos x durante aproximadamente 16-20 h a temperatura ambiente y se fotografiaron.
Figura 17. Exploración densitométrica del autorradiograma de tiempo cero obtenido a partir del análisis SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In incubado a 37ºC en suero humano. La muestra se sometió a electroforesis en un gel de Tris-glicina al 4-20% usando condiciones no reductoras. La muestra se cargó a 5 \mul, 10 \mul, y 20 \mul en pocillos duplicados. El gel se expuso a una película de rayos x durante aproximadamente 16-20 h a temperatura ambiente y se exploró uno de los carriles usando un densitómetro. El área relativa del pico del conjugado radiomarcado (nº 3) era del 95,3%.
Figura 18. Exploración densitométrica del autorradiograma de 96 h obtenido a partir del análisis SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In incubado a 37ºC en suero humano. La muestra se sometió a electroforesis en un gel de Tris-glicina al 4-20% usando condiciones no reductoras. La muestra se cargó a 5 \mul, 10 \mul, y 20 \mul en pocillos duplicados. El gel se expuso a una película de rayos x durante aproximadamente 16-20 h a temperatura ambiente y se exploró uno de los carriles usando un densitómetro. El área relativa del pico del conjugado radiomarcado (nº 3) era del 94,0%.
Figura 19. Se inyectó a monos cynomolgus por vía intravenosa cada 48 horas para un total de siete inyecciones; se muestran las cantidades administradas. Se determinaron los niveles de células T y B circulantes por análisis FACS usando anti-CD2 (células T), anti-IgG Mo (2B8), anti-CD20 (Leu 16), y anti-IgG humana (células B). No se observó efecto sobre los niveles de células T en circulación. (Al Grupo V de animales se le dio una única dosis).
Figura 20. La recuperación de los niveles de células B circulantes en animales que recibieron 2B8 estuvo seguida del análisis FACS usando los anticuerpos marcados de forma fluorescente descritos en la breve descripción de la Fig. 19. Los animales de los Grupos III y IV no se controlaron ya que se sacrificaron en el día 13.
Figura 21. Se inyectó a monos cynomolgus por vía intravenosa ^{89}Y-2B8-MX-DTPA que se había preparado usando 2B8-MX-DTPA de calidad clínica. A los animales se les dosificó cada 48 horas las cantidades mostradas anteriormente para un total de siete dosis. En los días 0, 2, 7, 10 y 14 se extrajo sangre de los monos y se evaluaron para la química sérica, la hematología y los niveles de células B circulantes (los sueros del día 10 no se analizaron para el contenido de células B). No se observaron anormalidades significativas diferentes al recuento disminuido de linfocitos totales en todos los animales, excepto en un individuo en el grupo II, durante el transcurso del estudio.
Figura 22. La eliminación de anticuerpo murino anti-CD20 2B8 de los monos cynomolgus se determinó por ELISA después de una única inyección de 10 mg/kg en el día cero. Como se muestra en el panel A, el anticuerpo mostró un valor \betat_{1/2} de aproximadamente 4,5 días. La eliminación del anticuerpo 2B8 y su conjugado MX-DTPA de la circulación de ratones BALB/c se muestran en el panel B. Se inyectó a los ratones por vía intravenosa 25 \mug de 2B8 nativo o conjugado y muestras sanguíneas tomadas en diversos tiempos hasta 264 horas después de la inyección; los sueros se analizaron posteriormente por inmunoensayo enzimático usando células SB como agente de captura. Los anticuerpos tanto nativos como conjugados mostraron valores de eliminación de 8,75 días.
Figura 23. A veinte ratones BALB/c se inyectó a cada uno 1,1 \muCi de conjugado radiomarcado (100 \mul) formulado en PBS, pH 7,4, que contenía 50 mg/ml de HSA. Se sacrificaron grupos de cinco ratones a 1, 24, 48, y 72 horas y después se prepararon sangre y diversos tejidos y se analizaron para la radiactividad asociada.
Figura 24. A veinte ratones BALB/c se inyectó a cada uno por vía intravenosa aproximadamente 1,0 \muCi (en 100 \mul) de conjugado radiomarcado formulado en 1 X PBS, pH 7,4, que contenía 75 mg/ml de albúmina sérica humana y DTPA 1 mM. Los grupos de cinco ratones cada uno se sacrificaron a 1, 24, 48 y 72 horas y se preparó y analizó su sangre y diversos tejidos para la radiactividad asociada.
Figura 25. Se inyectó por vía intravenosa a ratones atímicos que albergan tumores de células B Ramos 24 \muCi de ^{111}-In-2B8-MX-DTPA y se sacrificaron grupos de tras ratones cada uno a 0, 24, 48 y 72 horas. Después de la preparación tisular y la determinación de la radiactividad asociada, se determinaron los valores de porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido y se representaron como se muestra.
Figura 26. Ensayo de unión para la determinación de la inmunorreactividad de 2B8-MX-DTPA de "mezclar y usar" marcado con ^{90}Y incubado en PBS, pH 7,4 que contenía 50-75 mg/ml de albúmina sérica humana (48 h de incubación). Panel A) Se incubó una cantidad constante de anticuerpo marcado con ^{90}Y (aproximadamente 1 ng/ml) con cantidades crecientes de células SB. La cantidad de radiactividad (cpm) unida a las células se representó frente a la concentración celular. Panel B) Se representó la radiactividad ^{90}Y aplicada total sobre la radiactividad unida (AT/B). La extrapolación lineal permitió el cálculo del punto de corte con el eje y (1,139). El recíproco del punto de corte con el eje y X 100 produjo un valor de inmunorreactividad del 87,9% a exceso de antígeno infinito. No se observó unión con células CD20-negativas (HSB).
Figura 27. Autorradiogramas obtenidos a partir del análisis SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y incubado a 4ºC en PBS, pH 7,4 que contenía 75 mg/ml de albúmina sérica humana y DTPA 1 mM. A los tiempos indicados, las muestras se sometieron a electroforesis en geles de Tris-glicina al 4-20% usando condiciones no reductoras, condiciones desnaturalizantes (SDS). Las muestras se cargaron a 5 \mul (carriles 1, 2), 10 \mul (carriles 5, 6). Los geles se expusieron a una película de rayos x durante aproximadamente 15 min. a temperatura ambiente y se fotogra-
fiaron.
Figura 28. Exploración densitométrica del autorradiograma de tiempo cero obtenido a partir del análisis SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y incubado a 4ºC en PBS, pH 7,4 que contenía 75 mg/ml de albúmina sérica humana y DTPA 1 mM. La muestra se sometió a electroforesis en un gel de Tris-glicina al 4-20% usando condiciones no reductoras. Las muestras se cargaron a 5 \mul, 10 \mul, y 20 \mul en pocillos duplicados. El gel se expuso a una película de rayos x durante aproximadamente 15 min. a temperatura ambiente y se exploró uno de los carriles usando un densitómetro. El área relativa del pico del conjugado radiomarcado (nº 2) era del 96,1%.
Figura 29. Exploración densitométrica del autorradiograma de 48 h obtenido a partir del análisis SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y incubado a 4ºC en PBS, pH 7,4 que contenía 75 mg/ml de albúmina sérica humana y DTPA 1 mM. La muestra se sometió a electroforesis en un gel de Tris-glicina al 4-20% usando condiciones no reductoras. Las muestras se cargaron a 5 \mul, 10 \mul, y 20 \mul en pocillos duplicados. El gel se expuso a una película de rayos x durante aproximadamente 15 min. a temperatura ambiente y se exploró uno de los carriles usando un densitómetro. El área relativa del pico del conjugado radiomarcado (nº 2) era del 94,1%.
Figura 30. Autorradiogramas obtenidos a partir del análisis SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA de "mezclar y usar" marcado con ^{90}Y incubado a 37ºC en suero humano. A los tiempos indicados, las muestras se sometieron a electroforesis en geles de Tris-glicina al 4-20% usando condiciones no reductoras. Las muestras se cargaron a 5 \mul (carriles 1, 2), 10 \mul (carriles 3, 4), y 20 \mul (carriles 5, 6). Los geles se expusieron a una película de rayos x durante aproximadamente 15 min. a temperatura ambiente y se fotografiaron.
Figura 31. Exploración densitométrica del autorradiograma de tiempo cero obtenido a partir del análisis SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA de "mezclar y usar" marcado con ^{90}Y incubado a 37ºC en suero humano. La muestra se sometió a electroforesis en un gel de Tris-glicina al 4-20% usando condiciones no reductoras. La muestra se cargó a 5 \mul, 10 \mul, y 20 \mul en pocillos duplicados. Los geles se expusieron a una película de rayos x durante aproximadamente 15 min. a temperatura ambiente y se exploró uno de los carriles usando un densitómetro. El área relativa del pico del conjugado radiomarcado (nº 2) era del 89,1%.
Figura 32. Exploración densitométrica del autorradiograma de 72 h obtenido a partir del análisis SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA de "mezclar y usar" marcado con ^{90}Y incubado a 37ºC en suero humano. La muestra se sometió a electroforesis en un gel de Tris-glicina al 4-20% usando condiciones no reductoras. La muestra se cargó a 5 \mul, 10 \mul, y 20 \mul en pocillos duplicados. Los geles se expusieron a una película de rayos x durante aproximadamente 15 min. a temperatura ambiente y se exploró uno de los carriles usando un densitómetro. El área relativa del pico del conjugado radiomarcado (nº 2) era del 88,8%.
Figura 33. A veinte ratones BALB/c se inyectó a cada uno por vía intravenosa 5 \muCi de 2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y formulado en 1 X PBS, pH 7,4, que contenía 75 mg/ml de albúmina sérica humana y DTPA 1 mM. Se sacrificaron grupos de cinco ratones cada uno a 1, 24, 48 y 72 horas y se prepararon y analizaron su sangre y diversos tejidos para la radiactividad asociada.
Figura 34. Se incubaron cantidades crecientes de anticuerpo 2B8 derivado de CHO marcado con una concentración fija de células B CD20-positivas recién recogidas (SB) o células T CD20-negativas (HSB). La unión del anticuerpo a las células se cuantificó usando análisis FACS usando F(ab)'_{2} de cabra anti-IgG de ratón-FITC como se describe en este documento. Se hizo la comparación con un anticuerpo de isotipo irrelevante (S004). Solamente el anticuerpo 2B8 derivado de CHO mostró algo de unión apreciable a células SB CD20-positivas.
Figura 35. Se comparó la inmunorreactividad de 2B8 derivado de CHO con el anticuerpo parental 2B8-49 producido en una línea celular de hibridoma por competición directa en un ensayo ORIGEN. Se incubaron cantidades crecientes de anticuerpo con una cantidad fija de células B CD20-positivas (SB) y una cantidad traza de CHO 2B8 marcado con rutenio. Después de incubación durante tres horas a temperatura ambiente, se determinó la unión, expresada como electroquimioluminescencia (ECL) relativa, usando el instrumento ORIGEN como se describe en Materiales y Métodos. Los valores representan las medias de determinaciones por duplicado. Se calculó que las constantes de afinidad promedio para CHO 2B8 y 2B8-49 eran 1,3 X 10^{-10} M y 2,5 X 10^{-10} M, respectivamente. Se incluyó un anticuerpo de isotipo irrelevante (S004), para la comparación.
Figura 36. Se comparó la unión de conjugados 2B8-MX-DTPA preparados a partir de 2B8 derivado de CHO con el anticuerpo no conjugado por competición directa en un ensayo ORIGEN. Los conjugados se prepararon por incubación de 2B8 con MX-DTPA durante 8, 17, y 24 h antes de la retirada del quelato sin reaccionar. Para la evaluación de la unión, se incubaron los anticuerpos con una cantidad fija de células B CD20-positivas (SB) y una cantidad traza de CHO 2B8 marcado con rutenio. Después de incubación durante tres horas a temperatura ambiente, se determinó la unión, expresada como electroquimioluminescencia (ECL) relativa, usando el instrumento ORIGEN como se describe en los Materiales y Métodos. Los valores representan las medias de determinaciones duplicadas. Las preparaciones de conjugado mostraron unión similar en comparación con anticuerpo 2B8 sin conjugar.
Figura 37. A) Las células SB se lavaron y resuspendieron a 90 X 10^{6} células/ml con tampón de dilución (1X PBS, pH 7,4 que contenía albúmina sérica bovina al 1% (p/v)). Se incubaron concentraciones crecientes de las células durante 3 h con 7,5 ng/ml de In2B8 preparado usando 2B8-MX-DTPA lote 0165A. B) Representación doble inversa de la concentración celular frente a la radiactividad unida/radiactividad total (B/AT). La inmunorreactividad se calculó como 1/punto corte y X 100. Los valores de inmunorreactividad y coeficiente de correlación (R) eran el 80,6% y 0,981, respectivamente.
Figura 38. A) Se lavaron y resuspendieron células SB a 90 X 10^{6} células/ml con tampón de dilución (1X PBS, pH 7,4 que contenía albúmina sérica bovina al 1% (p/v)). Se incubaron concentraciones crecientes de células durante 3 h con 2 ng/ml de Y2B8 preparado usando 2B8-MX-DTPA lote nº 0165A. B) Representación doble inversa de la concentración celular frente a la radiactividad unida/radiactividad total (B/AT). La inmunorreactividad se calculó como 1/punto corte y X 100. Los valores de inmunorreactividad y coeficiente de correlación (R) eran el 72,2% y 0,999, respectivamente.
5. Descripción detallada Definiciones
Salvo que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comprendido habitualmente por un especialista en la técnica a la que pertenece esta descripción y esta invención. Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en este documento en la práctica o ensayo de la presente descripción, se describen los métodos y materiales preferidos. Para propósitos de la presente descripción, los siguientes términos se describen a continuación:
de bajo contenido en metales - se refiere a reactivos tratados para reducir la contaminación metálica a un nivel que no afecte a la radioincorporación.
positivo a antígeno - significa que expresa antígeno que se reconoce por un anticuerpo particular de la descripción de tal modo que el anticuerpo sea capaz de unirse.
% de radioincorporación - se refiere a la cantidad de radiomarcador a partir de una reacción de radiomarcaje que se conjuga con el anticuerpo con relación a la cantidad total de radiomarcador inicialmente añadida a la reacción.
% de unión - se refiere a la cantidad de anticuerpo de una muestra que se une al antígeno diana, con o sin especificidad.
% de inmunorreactividad o especificidad de unión - se refiere a la cantidad de una muestra de anticuerpo que se une al antígeno diana con especificidad.
anticuerpo de diagnóstico - se refiere a un anticuerpo conjugado con un radiomarcador tal como ^{111}In que puede realizar la formación de imágenes de diagnóstico de tumores y células positivas al antígeno.
anticuerpo terapéutico - se refiere a un anticuerpo conjugado con un radiomarcador de emisión alfa o beta (tal como ^{90}Y) que puede realizar la eliminación celular cuando está unido al antígeno diana.
Desarrollo Pre-Clínico de Anticuerpo Monoclonal Murino Anti-CD20 2B8, 2B8 Conjugado, 2B8 Marcado con ^{111}In y ^{90}Y I. Materiales y Métodos para el Desarrollo de Anticuerpo Monoclonal Murino Anti-CD20 2B8, 2B8-MX-DTPA Conjugado, 2B8-MX-DTPA Marcado con ^{111}In y ^{90}Y-MX-DTPA Purificado por HPLC A. Materiales 1. Células
Las líneas celulares humanas SB y HSB se obtuvieron de la American Type Culture Collection y se cultivaron en RPMI-1640 que contenía suero bovino fetal al 10%. La Línea celular SB CD20-positiva es una línea celular linfoblastoide B derivada de la capa leuco-plaquetaria de sangre periférica de un paciente con leucemia linfoblástica aguda (1). La línea celular HSB negativa al antígeno es una Línea celular linfoblastoide T desarrollada a partir de tumores inducidos en hámster sirios recién nacidos (2). La línea celular de mieloma murino SP2/0 se mantuvo de forma similar en RPMI-1640 que contenía suero bovino fetal al 10%.
2. Anticuerpos
Los anticuerpos anti-CD20 B1 y Leu 16 se adquirieron de Coulter Immunology y Becton/Dickinson, respectivamente. Los anticuerpos de cabra anti-IgG de ratón y anti-IgG humana marcados con ^{125}I se obtuvieron de ICN.
El F(ab')2 de cabra anti-IgG de ratón se obtuvo de Cappel.
3. Reactivos
Los adyuvantes completo e incompleto de Freund se adquirieron de Sigma Chemical Company. El polietilenglicol, concentrado HAT, y concentrado HT se obtuvieron todos de Boehringer Mannheim. El isotiocianato de fluoresceína (FITC) se adquirió de Sigma Chemical Company. El cloruro de indio-[111] y el cloruro de ^{90}Y se obtuvieron de Amersham o NEN Dupont. El cloruro de itrio-[89] se adquirió de Aldrich Chemical Company. Todos los demás reactivos se obtuvieron de fuentes convencionales.
Los reactivos usados para los protocolos de conjugación y radiomarcaje se procesaron para retirar los iones de metales pesados contaminantes que podrían competir con los radioisótopos durante la etapa de radiomarcaje. Los reactivos se procesaron típicamente pasando las soluciones a través de una columna de resina de intercambio iónico Chelex 100 (BioRad Industries) o por procesamiento por lotes mediante la adición de Chelex 100 a una solución preparada. Se usó agua de bajo contenido en metales, Milli-Q-purificada o Agua para Irrigación (WFIr del inglés Water for Irrigation) para todas las preparaciones y diluciones. Las soluciones sin metales se filtraron a esterilidad y se recogieron en recipientes de plástico estériles.
B. Métodos 1. Producción y Exploración de Sobrenadantes de Hibridoma 2B8 por RIA
Se inmunizaron diez ratones BALB/c con 20 millones de células SB suspendidas en PBS que contenía adyuvante completo de Freund. Las células se inyectaron tanto s.c. como i.p. en múltiples sitios en el animal. Después de un periodo de reposo de 2 semanas, se inyectó a los animales una segunda vez células SB emulsionadas en adyuvante incompleto de Freund. Se realizaron posteriores refuerzos de inmunización en un programa semanal con células SB suspendidas en PBS. Los ratones se inmunizaron durante un periodo de 6 semanas a 4 meses.
Se sacrificaron dos animales al mismo tiempo por dislocación cervical y se retiraron sus bazos por fusión con el mieloma murino SP2/0. Los animales se eligieron en base a la capacidad de los sueros post-inmunes de inhibir de forma eficaz la unión del anticuerpo anti-CD20 radiomarcado B1 de Coulter a células SB humanas. Tres días antes de cada fusión, se les dio a los animales seleccionados una última inyección intravenosa (vena de la cola) de 20 millones de células SB en PBS. Después del sacrificio se retiraron los bazos en condiciones asépticas y se fusionaron los esplenocitos con células SP2/0 a una proporción de 5:1 (esplenocitos:SP2/0). Las células fusionadas se lavaron en medio de cultivo tisular y se distribuyeron en placas de 96 pocillos que contenían medio de selección HAT. Los hibridomas se exploraron por radioinmunoensayo de inhibición usando anticuerpo B1 de Coulter después de 10-14 días.
La exploración de híbridos que secretan anticuerpos anti-CD20 se consiguió usando métodos de radioinmunoensayo establecidos. En resumen, el anticuerpo anti-CD20 B1 de Coulter se purificó por cromatografía de afinidad por Proteína A. Se acoplaron cincuenta microgramos de anticuerpo purificado a ^{125}I por oxidación breve en presencia de Iodobeads (Pierce Chemical Co.), siguiendo el procedimiento del fabricante. El anticuerpo radiomarcado se desaló en resina amberlite y se almacenó en tampón de dilución (PBS, pH 7,4, que contenía gelatina al 0,2%, azida sódica al 0,02%, y BSA al 1,0%). Se colocaron diez nanogramos de anticuerpo radiomarcado en cada pocillo de una placa de ensayo de filtro previamente bloqueada (tampón de bloqueo: tampón de dilución que contenía FBS al 10%) junto con 50 \mul de sobrenadante de hibridoma de los pocillos de ensayo y 100.000 células SB suspendidas en 50 \mul de tampón de dilución. La suspensión se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron minuciosamente con tampón de lavado (PBS, pH 7,4, que contenía gelatina al 0,2% y azida sódica al 0,02%) en un colector de vacío V&P Scientific y los fondos de filtro que contenían células SB atrapadas se transfirieron a un contador gamma. Los pocillos que contenían solamente medio HAT y anticuerpo B1 marcado se usaron como controles de fondo y pocillos idénticos que contenían células SB se usaron como controles positivos. Los controles de inhibición contenían B1 radiomarcado y diversas cantidades de anticuerpo B1 sin marcar que variaban de 2 \mug a 2 ng.
2. Estudios de Citometría de Flujo a. Líneas Celulares
Se realizaron estudios de citometría de flujo preliminares con sobrenadantes de cultivos de hibridoma 2B8. Se incubaron cien microlitros de sobrenadante de hibridoma con células SB durante una hora a temperatura ambiente; se añadió un anticuerpo secundario (F(ab')2 de cabra anti-IgG de ratón; Cappel), usado a una dilución 1/400, posteriormente y se continuó la incubación durante 1 hora en la oscuridad. Las células se lavaron 5 veces. Los controles incluían células solamente (sin anticuerpo primario o secundario) a partir de las cuales se determinó la autofluorescencia, células con anticuerpo secundario solamente para determinar la unión no específica y B1 conjugado con isotiocianato de fluoresceína disponible en el mercado (B1-FITC) para un control de la población CD20.
Para algunos experimentos, la fluoresceína se acopló a anticuerpo 2B8 purificado a través de la reacción de los grupos amino con isotiocianato de fluoresceína (FITC). En resumen, se incubó el anticuerpo 2B8 (1,2 mg/ml) en tampón carbonato sódico 0,1 M, pH 9,5 con 150-200 \mug de FITC por mg de proteína. La solución se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas y el conjugado 2B8-FITC resultante se purificó en una columna Sephadex G-25. Otros reactivos usados en estos estudios tales como B1 y Leu 16 se adquirieron como conjugados con fluoresceína directamente de Coulter o Becton Dickinson.
Las células a analizar se recogieron y lavaron tres veces con PBS que contenía BSA al 0,2% y azida sódica al 0,1%. La viabilidad se determinó por exclusión de azul de tripano con un requerimiento de viabilidad de >90%. Las concentraciones celulares se ajustaron a 3 millones por ml con 50 \mul añadidos por pocillo en placas de fondo en U de 96 pocillos. El anticuerpo primario (50 \mul) se añadió a los pocillos apropiados y la mezcla se incubó durante 30 min. a 1 h. a temperatura ambiente; posteriormente las células se lavaron 5 veces con 200 \mul/pocillo de PBS que contenía BSA al 0,2% y azida sódica al 0,02%. Las células se centrifugaron en las placas a 1300 RPM durante 1 min. en una centrífuga Sorvall y los sobrenadantes se retiraron "golpeando" suavemente las placas. Se añadió el anticuerpo secundario, si fuera necesario, y se incubó durante 30 min. a 1 h adicional a temperatura ambiente en la oscuridad; después se lavaron los pocillos como anteriormente. Finalmente, se añadieron 200 \mul de tampón de fijación (cloruro sódico 0,15 M que contenía paraformaldehído al 1%, pH 7,4) a cada muestra y las células tratadas se transfirieron a tubos de 12X75 mm para el análisis.
b. Sangre Completa de Monos Cynomolgus
Después de retirar el plasma, las células se lavaron dos veces por centrifugación y resuspensión en HBSS. Se añadió suero bovino fetal (2 ml) y se resuspendieron las células. Después se distribuyeron cien microlitros de las células resuspendidas a cada uno de los 6 tubos de centrífuga cónicos de 15 ml. Los anticuerpos monoclonales marcados de forma fluorescente se añadieron del siguiente modo:
Tubo nº 1:
Murino anti-CD2-FITC (AMAC), 2,5 \mug/ml, 5 \mug;
Tubo nº 2:
Cabra anti-IGM humana-FITC (Fisher) 2,5 \mug/ml, 5 \mug;
Tubo nº 3:
Cabra anti-IgG de ratón-RPE (Fisher) 2,5 \mug/ml, 5 \mug;
Tubo nº 4:
Cabra anti-IgM humana-FITC + Cabra anti-IgG de ratón-RPE (absorbido), 2,5 \mug/ml, 5 \mug;
Tubo nº 5:
anti-CD20 humano-FITC (anti-Leu 16, Becton Dickinson), 5 \mug;
Tubo nº 6:
Células solamente (auto-fluorescencia).
Los anticuerpos marcados y las células se centrifugaron durante 2 min. a 1500 rpm para mezclar las células y los anticuerpos y las 6 muestras después se colocaron en hielo y se incubaron durante 30 min. Posteriormente los tubos se retiraron del hielo y se añadió tampón de lisis (precalentado a 37ºC) hasta un volumen de 12 ml Las muestras después se incubaron durante 15 min. a temperatura ambiente, se centrifugaron durante 5 min. a 4ºC a 1500 rpm, y se retiraron los sobrenadantes. Los sedimentos celulares se lavaron después dos veces en tampón de marcaje (PBS que contenía BSA al 1% y azida sódica al 0,05%).
Posteriormente las células se fijaron por la adición de 0,5 ml de tampón de fijación (cloruro sódico 0,15 M, pH 7,4, que contenía paraformaldehído al 1%) por tubo y se analizaron en un instrumento Becton Dickinson FACScan usando autocompensación y precalibrado con perlas Calibrite. La fluorescencia verde de la fluoresceína se midió en modo FL1 y la fluorescencia roja de la ficoeritrina se midió en modo FL2. Los datos se expresaron en forma log. Las poblaciones de linfocitos viables se identificaron inicialmente por dispersión de luz directa frente a ángulo recto en un mapa de bits de diagrama de puntos. La población de linfocitos total se aisló después separando todos los demás casos. Las mediciones de fluorescencia posteriores reflejaban solamente aquellos casos específicos que existían dentro del área abierta.
Para estudios de farmacología/toxicología de elevada dosis se determinaron los niveles de linfocitos antes del estudio para cada mono cynomolgus y se usaron como valores iniciales. El porcentaje de células T y B y las proporciones T:B se calcularon y usaron como referencias de eliminación. La población de células B antes de estudio se contó con anticuerpos Leu 16 y anti-IgM humana.
Después de la inyección de 2B8 en los monos, cuando el antígeno CD20 se saturó con 2B8, el porcentaje de células B en la población total se aproximó usando anticuerpo de cabra anti-IgM humana-FITC, anti-IgG de ratón-RPE y la población de tinción doble que contenía estos dos marcadores. La población de tinción doble se usó para la cuantificación hasta que se eliminó todo el 2B8 de la sangre periférica de los animales. El porcentaje de células T en la población de linfocitos total se estimó usando anti-CD2-FITC. Los datos se promediaron a partir de tres mediciones de 10.000 casos hechas con cada muestra. Las células de cada una de las muestras sanguíneas designadas se evaluaron posteriormente, contando en cada caso las subpoblaciones de células T y B dentro de la población de linfocitos total. También se examinaron las proporciones T:B. Se calculó la eliminación de células B como el porcentaje de reducción de células B con relación a los niveles originales de células B para cada mono individual.
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3. Radioyodación e Inmunoprecipitación de CD20
Un millón de células SB se dividió en dos partes iguales después de yodación superficial con ^{125}I y Iodobeads (Pierce Chemical Co.). Las células se lavaron repetidamente por centrifugación hasta que los niveles de radiactividad en el sobrenadante volvieron a ser los de fondo. Se añadieron cien microgramos de anticuerpo 2B8 o B1 (Coulter Immunology) a cada una de las dos muestras de células B marcadas. Los anticuerpos y las células SB se incubaron durante una noche y después se lavaron tres veces por centrifugación hasta que se retiró todo el anticuerpo no unido. Los sedimentos celulares que contenían 2B8 y B1 unidos se lisaron después y se extrajeron por la adición de detergente NP-40 al 1% en Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 1 h. El extracto se centrifugó en una microfuga a elevada velocidad durante 30 min. y los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos. Se añadió proteína A-Sepharose (300 \mul) a cada tubo y se sedimentó la resina por centrifugación. La proteína A-Sepharose se lavó después 20 veces para retirar la proteína yodada no unida específicamente. Cuando la proporción de radiactividad perla-a-sobrenadante alcanzó un valor de 100, se extrajo el sedimento con tampón de muestra de SDS PAGE y se calentó a ebullición. Después de un periodo de refrigeración, se añadieron aproximadamente 15.000 cpm de cada uno de los extractos a los pocillos de un gel de poliacrilamida al 10%. Se añadió un patrón de bajo peso molecular pre-teñido (BioRad Inc.) a un pocillo diferente y se usó para estimar el peso molecular. Las proteínas se resolvieron por electroforesis y el gel se secó y se expuso a una lámina de película de rayos X durante 24 horas a -70ºC; posteriormente se reveló la película y se analizó.
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4. Análisis de Scatchard de la Unión de 2B8
Se evaluó 2B8 purificado para la afinidad aparente por análisis de Scatchard. Se preparó 2B8 radiomarcado por reacción con ^{125}I en presencia de Iodobeads. Después de retirar el yodo libre, se incubó el anticuerpo radiomarcado en diversas concentraciones, por duplicado, que variaban de 5000 ng por pocillo a 35 ng/pocillo con 10.000 células SB. La cantidad de unión del anticuerpo a las células se calculó a partir de la actividad específica del 2B8 marcado con ^{125}I. La proporción de anticuerpo unido/libre se representó frente a la concentración molar del anticuerpo unido y se determinó la constante de afinidad aparente a partir de la proporción de los puntos de corte en el eje X e Y.
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5. Preparación de 2B8-MX-DTPA a. Fuente de MX-DTPA
Para algunos estudios pre-clínicos, el ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilenotriaminapentaacético marcado con carbono-14 (MX-DTPA) lo proporción el Dr. Otto Gansow del National Institute of Health en forma de un sólido seco y se almacenó desecado a 4ºC protegido de la luz. Se prepararon soluciones madre del quelato en agua Milli-Q y se determinó la concentración evaluando la radiactividad y usando la actividad específica del compuesto. Las soluciones madre generalmente eran 2-5 mM y se almacenaron a -70ºC en tubos de polipropileno. Para otros estudios, se obtuvo MX-DTPA de Coulter Immunology en forma de sal disódica en agua y se almacenó a -70ºC.
b. Mantenimiento de Condiciones Libres de Metales
Además de usar reactivos libres de metales, todas las manipulaciones de los reactivos se realizaron para minimizar la posibilidad de contaminación con metales. Cuando era posible, se usaron recipientes de plástico de polipropileno tales como matraces, vasos de precipitados y cilindros graduados. Estos se lavaron con Alconox y se aclararon exhaustivamente con agua Milli-Q antes de su uso. Además, se usaron puntas de pipeta libres de metales (BioRad) para manipular de forma precisa pequeños volúmenes. Para manipular volúmenes más grandes de reactivos, se usaron pipetas serológicas de plástico, estériles (disponibles en tamaños de 1 a 25 ml). Las reacciones se realizaron convenientemente en tubos de microfuga de polipropileno, con tapa a rosca (Sardstedt Industries; capacidad de 1,5 ml) o tubos cónicos de polipropileno (Costar; 15 ml y 50 \mul). Cuando se manipulaban tubos de diálisis, se usaban guantes quirúrgicos desechables, previamente aclarados con agua Milli-Q.
c. Preparación de Anticuerpos
El anticuerpo murino anti-CD20 2B8 se purificó inicialmente a partir de líquido ascítico por cromatografía con Proteína A y QAE. Para posteriores experimentos 2B8 se purificó de sobrenadantes del biorreactor de fibra hueca usando el mismo proceso de purificación. El anticuerpo obtenido de la fibra hueca ahora se ha remplazado para propósitos de comercialización con el anticuerpo derivado de CHO descrito en el Ejemplo 2.
El anticuerpo se preparó para conjugación transfiriéndolo en bicina-NaOH 50 mM libre de metales, pH 8,6, que contenía NaCl 150 mM, usando diálisis o intercambio repetitivo de tampón. En algunos estudios, el intercambio de tampón se realizó usando ultrafiltración repetitiva con filtros de centrifugación (30.000 D MWCO) Centricon 30 (Amicon). En general, se añadieron 50-200 \mul de proteína (10 mg/ml) a la unidad de filtro y se añadieron 2 ml de tampón bicina. El filtro se centrifugó a 4ºC en un rotor Sorvall SS-34 a 6.000 rpm durante 45 min. El volumen retenido era de aproximadamente 50-100 \mul. Este proceso se repitió dos veces con el mismo filtro. El producto retenido se transfirió a un tubo con tapón a rosca de 1,5 ml de polipropileno, se ensayó para las proteínas, se diluyó a 10,0 mg/ml y se almacenó a 4ºC hasta que se usó para la conjugación. Para algunos estudios, la proteína se transfirió en citrato sódico 50 mM, pH 5,5 que contenía NaCl 150 mM y azida sódica al 0,05% usando el mismo protocolo descrito anteriormente.
d. Protocolo de Conjugación
La conjugación de 2B8 con MX-DTPA se realizó en tubos de polipropileno a temperatura ambiente. Las soluciones madre congeladas de MX-DTPA se descongelaron inmediatamente antes de su uso. Típicamente, se hicieron reaccionar 50-200 \mul de anticuerpo a 10 mg/ml con el quelato a una proporción molar de quelato-a-proteína de 4:1. Las reacciones se iniciaron añadiendo la solución madre de quelato y mezclando suavemente; se dejó que procediera la conjugación durante una noche, generalmente durante 14 a 20 h, a temperatura ambiente. El quelato sin reaccionar se retiró del conjugado por diálisis o ultrafiltración repetitiva, como se ha descrito anteriormente, en solución salina normal libre de metales (0,9% p/v) que contenía azida sódica al 0,05%. La concentración de proteína se ajustó a 10 mg/ml y se almacenó a 4ºC en un tubo de polipropileno hasta el radiomarcaje.
e. Determinación de la Incorporación de Quelato
La incorporación de quelato se determinó por recuento de centelleo y comparando el valor obtenido con el conjugado purificado a la actividad específica del quelato marcado con carbono-[14]. Para estudios posteriores, en los que se usó quelato no radiactivo obtenido de Coulter Immunology, la incorporación de quelato se evaluó incubando el conjugado con un exceso de una solución de vehículo radiactivo de ^{90}Y de concentración y actividad específica conocidas.
En resumen, se preparó una solución madre de cloruro de itrio de concentración conocida en HCl 0,05 N libre de metales a la que se añadió ^{90}Y sin vehículo (sal cloruro). Se analizó una alícuota de esta solución por recuento de centelleo líquido para determinar una actividad específica precisa para este reactivo. Se añadió un volumen del reactivo de cloruro de itrio igual a 3 veces la cantidad de moles de quelato que se espera que se unan al anticuerpo, típicamente 2 mol/mol de anticuerpo, a un tubo de polipropileno, y el pH se ajustó a 4,0-4,5 con acetato sódico 2 M. El anticuerpo conjugado se añadió posteriormente y la mezcla se incubó durante 15-30 min. a temperatura ambiente. La reacción se interrumpió añadiendo EDTA 20 mM a una concentración final de 1 mM y el pH de la solución se ajustó a aproximadamente pH 6 con acetato sódico 2 M.
Después de 5 min. de incubación se purificó el volumen completo por cromatografía por exclusión de tamaño de alta resolución como se describe a continuación. Las fracciones que contenían la proteína eluida se combinaron, se determinó la concentración de proteína, y se ensayó una alícuota para la radiactividad. La incorporación de quelato se calculó usando la actividad específica de la preparación de cloruro de ^{90}Y y la concentración de proteína.
f. Inmunorreactividad de 2B8-MX-DTPA
La inmunorreactividad de 2B8 conjugado se evaluó usando ELISA de células completas. Se recogieron células SB en fase semi-log del cultivo por centrifugación y se lavaron dos veces con 1X HBSS. Las células se diluyeron a 1-2 X 10^{6} células/ml en HBSS y se hicieron alícuotas en placas de microtitulación de poliestireno de 96 pocillos a 50.000-100.000 células/pocillo. Las placas se secaron al vacío durante 2 h a 40-45ºC para fijar las células al plástico. Las placas se almacenaron en seco a -20ºC hasta que se usaron. Para el ensayo, las placas se calentaron a temperatura ambiente inmediatamente antes de su uso, después se bloquearon con 1X PBS, pH 7,2-7,4 que contenía BSA al 1% (2 h). Las muestras para el ensayo se diluyeron en 1X PBS/BSA al 1%, se aplicaron a placas y se diluyeron en serie (1:2) en el mismo tampón. Después de incubar las placas durante 1 h a temperatura ambiente, las placas se lavaron tres veces con 1X PBS. Se añadió el anticuerpo secundario (conjugado de cabra anti-IgGI de ratón-HRP específico) (50 \mul) a los pocillos (dilución 1:1500 en 1X PBS/BSA al 1%) y se incubó 1 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron cuatro veces con 1X PBS seguido de la adición de solución de sustrato ABTS (citrato sódico 50 mM, pH 4,5 que contenía ATBS al 0,01% y H_{2}O_{2} al 0,001%). Las placas se leyeron a 405 nm después de 15-30 min. de incubación. Se incluyeron células HSB negativas al antígeno en los ensayos para controlar la unión no específica. La inmunorreactividad del conjugado se calculó representando los valores de absorbancia frente al factor de dilución respectivo y comparando con los valores obtenidos usando el anticuerpo nativo (que representa el 100% de inmunorreactividad) ensayado en la misma placa. Se compararon varios valores en la parte lineal del perfil de titulación y se determinó un valor medio.
g. Estabilidad In Vitro de 2B8 Nativo y 2B8-MX-DTPA
Para esta evaluación de 12 semanas de estabilidad del anticuerpo y el conjugado, se formularon alícuotas de anticuerpo 2B8 y 2B8-MX-DTPA en solución salina normal o solución salina normal que contenía glicina-HCl 10 mM, pH 6,8. Se incubaron series duplicadas de muestras tanto a 4ºC como a 30ºC y las muestras se ensayaron semanalmente usando los siguientes métodos: SDS-PAGE (tanto reductora como no reductora), inmunorreactividad por inmunoensayo enzimático de células completas usando células SB (positivas al antígeno) o HSB (negativas al antígeno) como captura, y electroforesis en gel por electroenfoque isoeléctrico (intervalo de pH, 3-10). Además, la eficacia de radiomarcaje del conjugado se evaluó en las semanas 4, 8, y 12 radiomarcando el conjugado con ^{90}Y y analizando el producto por SDS-PAGE y análisis autorradiográfico. Finalmente, en un estudio diferente, se radiomarcaron alícuotas de 2B8-MX-DTPA incubadas a 4ºC y 30ºC durante 10 semanas con ^{111}In y se evaluaron en un estudio de biodistribución en ratones BALB/c como se describe a continuación.
h. Estudio de Inmunohistología
Se realizaron estudios de inmunohistología tanto con anticuerpos nativos como conjugados (2B8-MX-DTPA) por IMPATH Laboratories usando secciones de tejidos humanos fijados con acetona. El anticuerpo se purificó a partir de sobrenadantes de biorreactor de fibra hueca por cromatografía sobre proteína A y Q Sepharose. El conjugado de calidad clínica se preparó usando MX-DTPA de Coulter Immunology de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente.
i. Inmunorreactividad In Vitro de 2B8-MX-DTPA Radiomarcado
Para algunos experimentos, se usó el protocolo de ELISA de células completas usado para 2B8-MX-DTPA sin marcar. En experimentos posteriores, se determinó la inmunorreactividad de conjugados marcados con ^{111}In y ^{90}Y (cada uno preparado en IDEC Pharmaceuticals o, como alternativa, en MPI Pharmacy Services, Inc.) usando una versión modificada del ensayo de unión de células completas descrito por Lindmo (3). En resumen, se añadieron concentraciones crecientes de células SB positivas al antígeno o células HSB negativas al antígeno, en fase semi-log [20-30 X 10^{6} células/ml en tampón de dilución (PBS, pH 7,4 que contenía BSA al 1%, gelatina al 0,1%, y azida sódica al 0,02%)] a series duplicadas de tubos. El conjugado radiomarcado se diluyó a una concentración final de anticuerpo de 1-5 ng/ml con tampón de dilución y se añadieron 0,35 ml a cada tubo. Después de un periodo de incubación de 75-90 min. a temperatura ambiente, se sedimentaron las células por centrifugación y se recogieron los sobrenadantes. La radiactividad restante en la fracción sobrenadante se determinó con un contador gamma o de centelleo. Los datos se representaron como el cociente de la radiactividad total añadida dividida por la radiactividad asociada a las células, frente a la inversa de la cantidad de células por tubo. El punto de corte del eje y por tanto representa la fracción inmunorreactiva.
j. Estabilidad In Vitro de 2B8-MX-DTPA Radiomarcado en Suero Humano
La estabilidad in vitro de 2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In y ^{90}Y se evaluó por incubación en suero humano a 37ºC durante 96 horas. El anticuerpo conjugado se preparó y se radiomarcó con ^{111}In (protocolo "mezclar y usar") o ^{90}Y como se ha descrito anteriormente. Las actividades específicas de los conjugados marcados con ^{111}In y ^{90}Y eran 2,5 y 14,6 mCi/mg, respectivamente; los conjugados radiomarcados se suspendieron en tampón que contenía 75 mg/ml de albúmina sérica humana (HSA) y DTPA 1 mM (conjugado marcado con itrio) o tampón que contenía 50 mg/ml de HSA (conjugado marcado con indio). Los conjugados radiomarcados se diluyeron 1:10 con suero humano normal (no inactivado por calor) y se colocaron alícuotas de forma aséptica en tubos tapados estériles; estos tubos después se incubaron a 37ºC durante periodos de hasta 96 horas. A tiempos seleccionados se retiraron muestras conjugadas y se analizaron por SDS-PAGE no reductora en geles con gradiente del 4-20% seguido de autorradiografía, y por cromatografía en capa fina instantánea.
k. Estabilidad In Vitro de ^{111}In-2B8-MX-DTPA Formulado Clínicamente
El conjugado 2B8-MX-DTPA se radiomarcó con ^{111}In y se usó son purificación por HPLC (protocolo "mezclar y usar"). El anticuerpo radiomarcado se diluyó en PBS y albúmina sérica humana (HSA) añadidos a una concentración final de 50 mg/ml. La actividad específica del conjugado radiomarcado formulado era de 2,2 mCi/mg. El conjugado formulado se incubó posteriormente a 4ºC durante 48 horas y se analizaron las alícuotas a tiempo 0, 24 h y 48 horas usando SDS-PAGE no reductora en geles con gradiente del 4-20% seguido de autorradiografía, y por cromatografía en capa fina instantánea. La inmunorreactividad en cada momento puntual se evaluó usando el ensayo de suspensión de células completas descrito en la anterior sección 1.
1. Estabilidad In Vitro de ^{90}Y-288-MX-DTPA Formulado Clínicamente
El conjugado 2B8-MX-DTPA se radiomarcó con ^{90}Y y se purificó por cromatografía por exclusión de tamaño en HPLC usando 1X PBS como tampón de elución. Las fracciones de conjugado radiomarcado se combinaron y se añadieron albúmina sérica humana y DTPA a concentraciones finales de 75 mg/ml y 1 mM, respectivamente. La actividad específica del conjugado radiomarcado formulado era de 14,6 mCi/mg. El conjugado formulado se incubó posteriormente a 4ºC durante 48 horas y se analizaron alícuotas a tiempo 0, 24 h y 48 horas usando SDS-PAGE no reductora en geles con gradiente del 4-20% seguido de autorradiografía, y cromatografía en capa fina instantánea. La inmunorreactividad en cada momento puntual se evaluó usando el ensayo de suspensión de células completas descrito en la anterior sección 1.
2. Estudios en Animales a. Estudio de Farmacología/Toxicología de Elevada Dosis en Primates Usando 2B8
El anticuerpo 2B8 se evaluó en un estudio de farmacología de elevada dosis realizado según las regulaciones GLP en el White Sands Research Center (Número de Estudio 920111). Se usaron monos Macaca fascicularis (cynomolgus) adultos; cada grupo de estudio constaba de un macho y una hembra. El anticuerpo se inyectó por vía intravenosa cada 48 horas para un total de siete inyecciones. El estudio constaba de cinco grupos: Grupo I (solución salina); Grupo II (0,6 mg/kg); Grupo III (2,5 mg/kg); Grupo IV (10 mg/kg); y, Grupo V (10 mg/kg en el día 0 solamente).
Antes del inicio del estudio, se obtuvo sangre de los 10 animales y se usó para determinar los fondos de reactivos y las poblaciones iniciales de células B. Todas las muestras sanguíneas posteriores se extrajeron antes de cada inyección de anticuerpo. Los Grupos III y IV se sacrificaron en el día 13 para una necropsia completa y la histopatología.
A los animales de los grupos I, II, y V se les extrajo sangre en los días 0, 1, 3, 7, 13, 21, 37 y 52; se extrajeron aproximadamente 5 ml de sangre completa en tubo heparinizados. La sangre completa se mantuvo a 4ºC y se analizó en 24 horas. La sangre de cada animal se centrifugó a 2000 rpm durante 5 min. y se retiró el plasma sobrenadante para el ensayo de los niveles séricos de 2B8 por RIA (véase el procedimiento de RIA para métodos de ensayo específicos). El material sedimentado que contenía PBL y RBC se resuspendió en FCS para el análisis FACS.
b. Estudios Farmacocinéticos con 2B8 y 2B8-MX-DTPA
La vida media beta en suero promedio de 2B8 en monos cynomolgus se determinó usando los animales del Grupo V (anterior). Se diluyó anticuerpo de cabra anti-IgGI de ratón (Fisher Scientific) a 2,0 \mug por ml en tampón borato 10 mM, pH 9,6, y se añadieron 50 \mul a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Se dejó que el anticuerpo se uniera a la placa durante una incubación de una noche a 4ºC, o durante 2 h a temperatura ambiente. Cada placa se bloqueó durante 30 min. a temperatura ambiente con 150 \mul por pocillo de PBS que contenía BSA al 1%. Las placas se lavaron con agua destilada y se aplicaron muestras séricas o plasmáticas por triplicado a pocillos individuales a dilución inicial 1:100 seguido de diluciones en serie 1:2. Se añadió 2B8 purificado a suero pre-extraído y se diluyó para su uso como una curva patrón que comienza con 0,5 mg/ml; las muestras se diluyeron 1:100 y después se diluyeron en serie como con las otras muestras. Las placas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente y se lavaron 4 veces con agua destilada. El reactivo secundario (anticuerpo de cabra anti-IgGI de ratón-HRPO) se añadió después a dilución 1:4000 y se incubó a temperatura ambiente durante una hora adicional. Las placas se lavaron de nuevo en agua destilada y se añadió 0,1 ml de sustrato peroxidasa que contenía peróxido de hidrógeno. Se dejó que se desarrollara color de la reacción durante 20 min.; posteriormente se determinó la absorbancia a 405 nm usando un lector de microplaca ELISA. Los resultados se representaron en \mug de anticuerpo por ml de suero.
Además, se determinaron los valores \betat_{1/2} de 2B8 y 2B8-MX-DTPA en ratones BALB/c. Se descongeló 2B8 no conjugado almacenado a -70ºC en 1X PBS, pH 7,4/glicerol al 10%, se diluyó a 0,5 mg/ml y se filtró a esterilidad. El anticuerpo conjugado se preparó siguiendo protocolos convencionales pero con quelato marcado con carbono-[14]; la incorporación de quelato era de 1,5 mol/mol de anticuerpo. El conjugado purificado se diluyó a 0,5 mg/ml en solución salina normal (0,9%), se filtró a esterilidad, y se almacenó a 4ºC con el anticuerpo nativo hasta que se usó.
A ratones de seis a ocho semanas de edad se les inyectó 100 \mul de anticuerpo 2B8 purificado a una concentración de 250 \mug/ml. Posteriormente se extrajo sangre a los ratones por punción retro-orbital en diversos momentos que varían de 0 a 264 horas y se analizaron sus sueros para la presencia de anticuerpo 2B8 nativo y conjugado por inmunoensayo enzimático de células completas usando la línea de células B positiva al antígeno SB como captura. Los datos resultantes se representaron como la concentración de 2B8 o 2B8-MX-DTPA frente al tiempo; a partir de estos resultados se generó una representación de regresión lineal y se usó la pendiente para determinar los valores \betat_{1/2}.
c. Estudio de Farmacología/Toxicología de [89]-Y-2B8-MX-DTPA en Monos Cynomolgus
Se preparó 2B8-MX-DTPA que porta itrio-[89] usando el protocolo descrito para la inserción de ^{90}Y, excepto en que no se usó purificación por HPLC. El conjugado que porta metales, no radiactivo se formuló en 1X PBS que contenía 75 mg/ml de HSA y DTPA 1 mM y se evaluó en el estudio GLP número 920611 en el White Sands Research Center. Se incluyeron un mono macho y uno hembra en cada uno de los cuatro grupos. Se inyectó a los animales por vía intravenosa cada 48 horas para un total de 7 inyecciones las siguientes cantidades de fármaco: grupo 1 (solución salina); grupo II (0,003 mg/kg); grupo III (0,03 mg/kg); y, grupo IV (0,3 mg/kg). Se evaluó a los animales durante el estudio determinando los pesos corporales y las temperaturas, el consumo de alimento y agua, la eliminación, la química sérica, la hematología, el urianálisis, y exámenes físicos. Se extrajo sangre a los animales de los grupos I a IV antes de la infusión en los días 0, 2, 7, 10 y 14 y la sangre se analizó para los niveles de células B circulantes por análisis FACS.
d. Biodistribución de 2B8-MX-DTPA Radiomarcado
En un estudio preliminar, se evaluó 2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In para la biodistribución tisular en ratones BALB/c de seis a ocho semanas de edad. El conjugado radiomarcado se preparó usando 2B8-MX-DTPA de calidad clínica siguiendo el protocolo "mezclar y usar" descrito anteriormente. La actividad específica del conjugado era de 2,3 mCi/mg y el conjugado se formuló en PBS, pH 7,4 que contenía 50 mg/ml de HSA. Se inyectó a los ratones por vía intravenosa 100 \mul de 2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In (aproximadamente 21 \muCi) y se sacrificaron los grupos de tres ratones por dislocación cervical a 0, 24, 48, y 72 horas. Después del sacrificio, se retiraron la cola, el corazón, los pulmones, el hígado, los riñones, el bazo, el músculo, y el fémur, se lavaron, se pesaron; también se retiró una muestra de sangre para el análisis. Se determinó la radiactividad asociada con cada muestra por recuento gamma y posteriormente se determinó el porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido. No se intentó descartar la contribución a la actividad representada por la sangre asociada con los órganos individuales.
En un protocolo diferente, se radiomarcaron alícuotas de 2B8-MX-DTPA incubadas a 4ºC y 30ºC durante 10 semanas con ^{111}In a una actividad específica de 2,1 mCi/mg para ambas preparaciones. Estos conjugados se usaron después en estudios de biodistribución en ratones como se ha descrito anteriormente.
Para determinaciones de dosimetría, se radiomarcó 2B8-MX-DTPA con ^{111}In a una actividad específica de 2,3 mCi/mg y se inyectó aproximadamente 1,1 \muCi en cada uno de los 20 ratones BALB/c. Posteriormente, se sacrificaron los grupos de cinco ratones a 1, 24, 48 y 72 horas y se retiraron sus órganos y se prepararon para el análisis. Además, se retiraron partes de la piel, el músculo y el hueco y se procesaron para el análisis; también se recogieron la orina y las heces y se analizaron para los momentos puntuales de 24-72 horas.
Usando un enfoque similar, también se radiomarcó 2B8-MX-DTPA con ^{90}Y y se evaluó su distribución biológica en ratones BALB/c en un periodo de tiempo de 72 horas. Después de la purificación por cromatografía por exclusión de tamaño por HPLC, se inyectó a cuatro grupos de cinco ratones cada uno por vía intravenosa aproximadamente 1 \muCi de conjugado formulado clínicamente (actividad específica: 12,2 mCi/mg); posteriormente los grupos se sacrificaron a 1, 24, 48 y 72 horas y sus órganos y tejidos se analizaron como se ha descrito anteriormente. La radiactividad asociada con cada muestra tisular se determinó midiendo la energía bremsstrahlung con un contador de centelleo gamma. Los valores de actividad se expresaron posteriormente como porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido o porcentaje de dosis inyectada por órgano. Aunque los órganos y otros tejidos se aclararon repetidamente para retirar la sangre superficial, no se prefundieron los órganos. Por tanto, los valores de actividad de los órganos no descartaban la contribución a la actividad representada por la sangre internamente asociada.
e. Localización Tumoral de 2B8-MX- DTPA Marcado con ^{111}In
La localización de 2B8-MX-DTPA radiomarcado se determinó en ratones atímicos que portan tumores de células B Ramos. A ratones atímicos de seis a ocho semanas de edad se les inyectó por vía subcutánea (costado trasero izquierdo) 0,1 ml de RPMI-1640 que contenía 1,2 X 10^{7} células tumorales Ramos que se habían adaptado previamente para crecer en ratones atímicos. Los tumores surgieron en dos semanas y variaban en peso de 0,07 a 1,1 gramos. Se inyectó a los ratones por vía intravenosa 100 \mul de 2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In (16,7 \muCi) y se sacrificaron los grupos de tres ratones por dislocación cervical a 0, 24, 48, y 72 horas. Después del sacrificio se retiraron la cola, el corazón, los pulmones, el hígado, los riñones, el bazo, el músculo, el fémur, y el tumor, se lavaron, se pesaron; también se retiró una muestra de sangre para el análisis. La radiactividad asociada con cada muestra se determinó por recuento gamma y se determinó el porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido.
3. Cálculos de Dosimetría
Usando los datos de biodistribución obtenidos usando ratones BALB/c a los que se ha inyectado el 2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In o ^{90}Y (Tablas 1-4 y 5-8), se calculó la estimación de la dosis de radiación absorbida a partir de la dosis de 1,0 mCi administrada a un paciente de 70 kg usando el procedimiento formalizado por el Medical Internal Radiation Dose (MIRD) Committee of the Society of Nuclear Medicine. Las vidas medias biológicas de los conjugados radiomarcados se determinaron a partir de los valores de dosis inyectada por órgano determinados a partir de los datos de biodistribución para cada radioinmunoconjugado. Para algunos tejidos, por ejemplo la sangre, se supuso que el deterioro biológico del radioconjugado seguía un modelo de dos compartimientos con un deterioro exponencial desde estos compartimientos. Para otros tejidos, por ejemplo el hígado, cuyos niveles de actividad permanecían casi constantes en todo el estudio de biodistribución de 72 horas, se supuso que la vida media biológica era muy larga y se le asignó un valor de 1000 horas.
TABLA 1 Distribución de Actividad 1,0 Hora Después de Inyección I.V. de ^{111}In-2B8-MX-DTPA en Ratones BALB/c Normales
Valores Medios \pm SD
1
TABLA 2 Distribución de Actividad 24 Horas Después de Inyección I.V. de ^{111}In-2B8-MX-DTPA en Ratones BALB/c Normales
Valores Medios \pm SD
2
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TABLA 3 Distribución de Actividad 48 Horas Después de Inyección I.V. de ^{111}In-2B8-MX-DTPA en Ratones BALB/c Normales
Valores Medios \pm SD
4
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TABLA 4 Distribución de Actividad 72 Horas Después de Inyección I.V. de ^{111}In-2B8-MX-DTPA en Ratones BALB/c Normales
Valores Medios \pm SD
5
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TABLA 5 Distribución de Actividad 1,0 Hora Después de Inyección I.V. de ^{90}Y-2B8-MX-DTPA en Ratones BALB/c Normales
Valores Medios \pm SD
6
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TABLA 6 Distribución de Actividad 24 Horas Después de Inyección I.V. de ^{90}Y-2B8-MX-DTPA en Ratones BALB/c Normales
Valores Medios \pm SD
700
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TABLA 7 Distribución de Actividad 48 Horas Después de Inyección I.V. de ^{90}Y-2B8-MX-DTPA en Ratones BALB/c Normales
Valores Medios \pm SD
8
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TABLA 8 Distribución de Actividad 72 Horas Después de Inyección I.V. de ^{90}Y-2B8-MX-DTPA en Ratones BALB/c Normales
Valores Medios \pm SD
10
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De un modo similar, se asignaron los demás valores de vida media biológicos o se calcularon usando la ecuación convencionales para calcular el t_{1/2} para un deterioro exponencial. Una vez se hubieron determinado estos valores, se determinaron las variables para T_{ue}, T_{e1}, T_{e2}, A_{1}, A_{2}, y A, enumeradas en las Tablas 9 y 10, para cada conjugado radiomarcado usando las ecuaciones proporcionadas en la parte superior de estas tablas (variables de salida). Estos valores, así como los mostrados en las posteriores tablas, se calcularon usando un programa escrito en la hoja de cálculo Symphony (Lotus Development Corp.) por Mr. Phillip Hagan, MS, Nuclear Medicine Service, VA Medical Center La Jolla, CA 92161.
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(Tabla pasa a página siguiente)
11
12
14
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15
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Usando los valores de Actividad Acumulada Total (A) de las Tablas 9 y 10, y los valores S proporcionados por el MIRD Pamphlet Number 11 (Tablas 11 y 12, y 13 y 14), se determinaron las estimaciones de dosis de radiación absorbida para cada uno de los conjugados radiomarcados para los tejidos enumerados (Tablas 15, 16, 17 y 18). Al determinar las estimaciones de dosis de radiación medias para el conjugado marcado con indio proporcionado en la Tabla 19, se sumó la propia dosis de un órgano dado con la dosis absorbida producida por la actividad en órganos o tejidos adyacentes. Sin embargo, al calcular los valores estimados de dosis de radiación atribuidos al conjugado marcado con itrio (Tabla 20), ciertos valores están ausentes para los tejidos enumerados (por ejemplo, glándulas suprarrenales). Esto se debe a la longitud de paso más corta de la partícula \beta liberada, con relación a la longitud de paso de la partícula \delta emitida, proporcionando por tanto una contribución de actividad insignificante desde los tejidos adyacentes, y a la ausencia de datos de biodistribución primaria para estos tejidos.
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(Tabla pasa a página siguiente)
17
19
21
23
25
26
27
28
29
30
31
32
TABLA 19
33
TABLA 20
34
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II. Resultados A. Estudios In Vitro Con 2B8 y 2B8-MX-DTPA 1. Producción y Caracterización del Anticuerpo Anti-CD20 2B8
Un total de nueve fusiones produjeron tres hibridomas que producían anticuerpos que competían de forma eficaz con el anticuerpo radiomarcado B1 de Coulter. En cada caso, el hibridoma se expandió en una placa de 24 pocillos. Se isotiparon los dos primeros anticuerpos aislados de las fusiones 3 y 4, y ambos se identificaron como IgM. Se determinó que el tercer anticuerpo, producido en la fusión 5 y denominado 2B8, era un isotipo IgGI kappa y se seleccionó para estudios de conjugación. El clon 2B8.HII se expandió y se colocó en almacenamiento a largo plazo en nitrógeno líquido. El clon 2B8.HII se subclonó para producir el clon 2B8.HII.G3 y de nuevo para producir el clon 2B8.HII.G3.G9. Este clon se expandió para estudio adicional y se purificó el anticuerpo para cromatografía de afinidad a proteína A.
Los ensayos de competición usando 2B8, B1 y Leu 16 sin marcar y B1 de Coulter radiomarcado demostraron que 2B8 era capaz de inhibir la unión de B1 a CD20 de forma más eficaz que iguales concentraciones de B1 o Leu 16 (Fig. 1). Se obtuvieron resultados similares (datos no mostrados) en un estudio de competición usando 2B8 conjugado con FITC, B1 nativo y los anticuerpos irrelevantes UPC-10 y S-003 (isotipos IgG2a y 1, respectivamente).
La unión directa al antígeno celular CD20 por los anticuerpos 2B8 y B1 se comparó por análisis FACS usando células SB CD20-positivas y células HSB CD20-negativas. Los resultados mostrados en la Figura 2 indican que para cantidades comparables de anticuerpo, se unía más 2B8 que B1 a las células SB. No se observó unión significativa a células SB con los anticuerpos irrelevantes. Solamente se observó la fluorescencia de fondo con algún reactivo usado con células HSB. Estos resultados confirman la especificidad de la interacción de 2B8 con el antígeno CD20 y sugieren que 2B8 puede tener mayor afinidad por el antígeno de superficie celular que B1.
Para determinar la afinidad aparente de 2B8, se radiomarcó el anticuerpo purificado con ^{125}I y se incubaron concentraciones crecientes del anticuerpo marcado con células SB positivas al antígeno; la radiactividad asociada a las células se determinó después de un periodo de incubación de 1 hora (Fig. 3). Los resultados sugieren que el anticuerpo 2B8 se une al antígeno CD20 con una constante de afinidad aparente de 4,3 X 10^{-9} M.
Estudios de citometría de flujo con linfocitos de sangre periférica normal humana indicaron que 2B8 era específico para células B y no reaccionaba con otros tipos de linfocitos (por ejemplo, células T, monocitos, macrófagos). Se comparó 2B8 marcado con FIAC con B1-FITC y Leu 16-FITC usando la misma población de linfocitos humanos. Los resultados mostrados en la Tabla 21 indican que 2B8 reaccionaba con aproximadamente el 14 por ciento de los linfocitos de sangre periférica frente a aproximadamente el 12 por ciento para Leu 16 y el 11 por ciento para B1. La población de linfocitos basada en otro marcador de linfocitos B (CD-19) estaba entre el 11 y el 14 por ciento. Finalmente, cuando se incubaron linfocitos de sangre periférica humana con 2B8 y B1 o Leu 16 y después se contrateñían con el marcado CD19 (Becton/Dickinson) la población de tinción doble de linfocitos B era del 9 por ciento con 2B8, y del 10 por ciento con B1 o Leu 16. Estos resultados confirman la similitud de estos reactivos.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 21 Comparación de la Unión de 2B8 a Linfocitos de Sangre Periférica Humana con otros Reactivos Específicos de Linfocitos B y T
36
La inmunoprecipitación del antígeno celular CD20 radiomarcado por 2B8 o B1 provocó la precipitación de especies proteicas dobles indistinguibles con pesos moleculares de aproximadamente 33 y 35 KD (datos no mostrados).
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2. Producción y Caracterización de 2B8-MX-DTPA
El conjugado 2B8-MX-DTPA se produjo haciendo reaccionar el anticuerpo con un exceso molar 4:1 de ácido isotiocianatobencil-3-metildietileno-triaminapentaacético (4). Típicamente, se introdujeron 1-2 mol de quelato MX-DTPA por mol de anticuerpo 2B8. Como se muestra por los resultados presentados en la Fig. 4, el conjugado 2B8-MX-DTPA no mostrada pérdida aparente en inmunorreactividad, con relación a 2B8 nativo, ya que los anticuerpos 2B8 tanto nativos como conjugados mostraban perfiles de inhibición de B1 casi idénticos; los valores de IC50 para 2B8 y 2B8-MX-DTPA eran aproximadamente 3 y 4 \mug/ml, respectivamente. Estos resultados se obtuvieron usando anticuerpo B1 marcado con ^{125}I en un radioinmunoensayo de células completas realizado usando células SB. Se obtuvieron resultados similares usando 2B8 o 2B8-MX-DTPA como inhibidores de la unión de 2B8 marcado con ^{125}I a células SB; tanto 2B8 como su conjugado MX-DTPA inhibían la unión de ^{125}I-2B8 a células SB a concentraciones de aproximadamente 3-4 \mug/ml (datos no mostrados).
Para evaluar la estabilidad in vitro del anticuerpo 2B8 nativo y el conjugado 2B8-MX-DTPA, se incubaron muestras en solución salina normal o solución salina que contenía glicina-HCl 10 mM, pH 6,8, a 4ºC y 30ºC durante 12 semanas y se ensayaron alícuotas semanalmente usando los siguientes ensayos: inmunorreactividad por inmunoensayo enzimático de células completas, SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras, y electroforesis en gel por electroenfoque isoeléctrico. Aunque los ensayos de inmunorreactividad no detectaron pérdida de reconocimiento de antígeno por las muestras de anticuerpo incubadas a cualquier temperatura (Figura 5), el intervalo de enfoque isoeléctrico para el anticuerpo (pH 7,30-8,40 en la semana cero), que era estable a 4ºC, no mostró una disminución de 0,2 unidades de pH a 30ºC después de la semana seis (Tabla 22). Este resultado puede ser ambiguo, sin embargo, ya que está en el límite del error experimental para el ensayo.
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TABLA 22
37
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Finalmente, usando SDS-PAGE no reductora, las muestras de anticuerpo a 30ºC mostraron agregados de elevado peso molecular después de la semana 1 (Tabla 23). Los análisis densitométricos de los geles indicaron que los agregados representaban entre el 8 y 17% de las muestras (Tabla 23). Sin embargo, cuando se analizaron las muestras por SDS-PAGE reductora, no se encontraron evidencias de muestras de elevado peso molecular, lo que sugiere la formación de agregados de anticuerpos covalentes a 30ºC. De nuevo, no se observó pérdida de inmunorreactividad.
TABLA 23
39
Durante el transcurso de este estudio de estabilidad, también se ensayaron muestras de 2B8-MX-DTPA, incubadas tanto a 4ºC como a 30ºC para la incorporación de radiometal usando ^{90}Y. Las muestras ensayadas en las semanas 4, 8, y 12 incorporaron >90% del ^{90}Y, independientemente de la temperatura de incubación.
Finalmente, en un estudio diferente, se radiomarcaron alícuotas de 2B8-MX-DTPA incubadas a 4ºC y 30ºC durante 10 semanas con ^{111}In y se evaluó su biodistribución tisular en ratones BALB/c. El conjugado de ambas temperaturas de incubación produjo biodistribuciones similares (datos no mostrados). Además, los resultados obtenidos fueron similares a los resultados de biodistribución obtenidos en ratones BALB/c usando conjugado marcado con ^{111}In almacenado a 4ºC (véase a continuación).
Se descubrió que los protocolos de radiomarcaje tanto para ^{111}In como para ^{90}Y eran reproducibles. Típicamente, se obtuvieron radioincorporaciones de >95% para ^{111}In y >90% para ^{90}Y. Las actividades específicas para conjugados marcados con ^{111}In y ^{90}Y estaban rutinariamente en el intervalo de 2-3 y 10-15 mCi/mg de anticuerpo, respectivamente. En desarrollo inicial de los protocolos de radiomarcaje con ^{111}In y ^{90}Y, se retiraron radioisótopos no complejados del 2B8-MX-DTPA radiomarcado usando cromatografía de exclusión molecular por HPLC. En experimentos posteriores, la purificación por HPLC del conjugado marcado con indio se eliminó a causa de las elevadas radioincorporaciones obtenidas (>95%) con este isótopo.
La inmunorreactividad de las preparaciones marcadas con ^{111}In y ^{90}Y de 2B8-MX-DTPA se analizaron por el método de Lindmo (3). Se descubrió que el 2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In era 100% inmunorreactivo (Fig. 6), y se determinó que el conjugado marcado con ^{90}Y era 60% inmunorreactivo (datos no mostrados).
3. Caracterización de 2B8-MX-DTPA Marcado con ^{111}In y ^{90}Y
Los experimentos preliminares con el conjugado marcado con ^{90}Y demostraron que sucedía una degradación significativa del anticuerpo y pérdida de inmunorreactividad a actividades específicas >10 mCi/mg de anticuerpo. Por lo tanto, se desarrolló una formulación para minimizar los efectos de la radiolisis. Aunque se evaluaron varios aceptores de radicales libres de bajo peso molecular y se descubrió que eran eficaces, las elevadas concentraciones de albúmina sérica humana (HSA) fueron las más eficaces para conservar la integridad del anticuerpo y la inmunorreactividad (Figuras 7-9).
El anticuerpo marcado con ^{90}Y se formuló en 1X PBS, pH 7,4 que contenía 75 mg/ml de HSA; también se añadió ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA) a una concentración final de 1 mM para asegurar que se quelaría cualquier ^{90}Y que pudiera perderse del anticuerpo. Se evaluó la degradación de 2B8-MX-DTPA, radiomarcado a una actividad específica de 14,6 mCi/mg a 0 y 48 horas usando SDS-PAGE y autorradiografía. Las Figuras 8 y 9 muestran que el anticuerpo radiomarcado no mostraba degradación significativa durante un periodo de 48 h cuando se incubaba a 4ºC. El análisis usando cromatografía en capa fina instantánea mostró que la pérdida de ^{90}Y era menor del 2% durante la incubación de 48 h (Tabla 24). La inmunorreactividad también era relativamente constante al 60% (Tabla 24).
TABLA 24 Estabilidad de ^{90}Y-2B8-MX-DTPA Formulado Clínicamente
41
También se realizaron estudios de formulación con el conjugado marcado con ^{111}In; la actividad específica era de 2,2 mCi/mg. El anticuerpo radiomarcado se evaluó en 1X PBS, pH 7,4 que contenía 50 mg/ml de HSA. La Figura 10 muestra fotografías de los autorradiogramas para muestras de tiempo de incubación cero y 48 h; los análisis densitométricos de los autorradiogramas indican que no había degradación del anticuerpo radiomarcado durante el transcurso del estudio (Figuras 11, 12). El análisis por cromatografía en capa fina instantánea de las muestras no demostró pérdida de ^{111}In (Tabla 25); además, la inmunorreactividad se mantuvo a aproximadamente el 100% (Tabla 25).
TABLA 25 Estabilidad de ^{111}In-2B8-MX-DTPA Formulado Clínicamente
43
Cuando se incubaba una preparación de 2B8-MX-DTPA formulada clínicamente, radiomarcada con ^{90}Y a una actividad específica de 14,6 mCi/mg, durante 96 horas a 37ºC en suero humano y se analizaba por SDS-PAGE no reductora y autorradiografía, se perdía menos del 4% del radioisótopo durante el transcurso del periodo de incubación. Las exploraciones densitométricas de los autorradiogramas a tiempo cero y 96 h indicaron ausencia de degradación significativa del conjugado radiomarcado (Figuras 13-15). Estos resultados se corroboraron por análisis analíticos cromatográficos en capa fina de las muestras de tiempo cero y 96 horas (Tabla 26). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que el conjugado marcado con itrio es estable en las condiciones usadas en este estudio. Se obtuvieron resultados similares con el conjugado 2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In (Figuras 16-18).
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TABLA 26 Análisis Analítico Cromatográfico en Capa Fina de Conjugado ^{90}Y-2B8-Mx-DTPA Incubado en Suero Humano durante 96 Horas a 37ºC
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B. Estudios en Animales 1. Estudios de Farmacología/Toxicología de Elevada Dosis con 2B8 y 2B8-MX-DTPA
En un estudio GLP realizado en el White Sands Research Center (Número de Estudio 920111), a monos cynomolgus se les dieron inyecciones intravenosas de diversas dosis de 2B8. Se tomaron muestras de sangre antes de cada nueva inyección y la sangre se proceso para la evaluación citométrica de flujo de las poblaciones de linfocitos (Tabla 27).
TABLA 27
45
46
\newpage
No se observaron efectos farmacológicos significativos relacionados con la administración del anticuerpo anti-CD20 2B8 en ningún parámetro clínico evaluado durante o después del estudio. Asimismo, no observaron anormalidades durante el análisis de las diversas muestras de histopatología obtenidas de los animales de los grupos III y IV.
La duración del estudio fue de 14 días y los animales se evaluaron durante el estudio en las siguientes categorías: observaciones clínicas, pesos corporales, temperatura corporal, ingesta de alimento y agua, eliminación de heces, química sérica, hematología, urianálisis, y exámenes físicos. Además, a los animales en cada grupo se les extrajo sangre en los días 0, 1, 7, y 13 y la sangre se analizó para los niveles de anticuerpos séricos (2B8) y para los niveles de células T y B. En el día 13 se sacrificaron los animales de los Grupos III y IV y se examinaron tejidos seleccionados por microscopía óptica después de la preparación de la muestra. Los tejidos evaluados fueron: corazón, bazo, hígado, riñón, pulmón, corteza cerebral, médula espinal, ganglio linfático, estómago, íleo, colon, músculo esquelético, testículo/ovario, páncreas, y médula ósea.
Cuando se analizó la sangre de los animales tratados para los niveles de células T y B circulantes, los animales de los grupos II a V mostraban una pérdida >50% de células B circulantes B en el día 13 (Fig. 19); la administración del anticuerpo no tenía efecto en los niveles de células T (datos no mostrados). Todos los grupos que recibieron 2B8 mostraron saturación de células B y exceso de anticuerpo en el plasma (no mostrado). Los animales del grupo V, que recibieron una única dosis de 10,0 mg/kg de 2B8 también mostraron reducción en los niveles de células B circulantes equivalentes a los observados en animales de los otros grupos.
Los animales de los grupos I, II, y V se examinaron en el día 52 (Fig. 20). Los niveles de células B volvieron a >70% del normal en el día 38, excepto para un animal del Grupo II (PRO804) y un animal del Grupo V (PR0716). Los niveles de células B circulantes en estos animales permanecieron a aproximadamente el 40% de los niveles normales después de 52 días.
Además de este estudio, se evaluaron los efectos farmacotóxicos de ^{89}Y-2B8-MX-DTPA en monos cynomolgus en un estudio GLP realizado en el White Sands Research Center (Estudio Nº 920611). Se cargó conjugado de calidad clínica con ^{89}Y no radiactivo. El conjugado que alberga itrio se formuló en PBS pH 6,8, que contenía 75 mg/ml de albúmina sérica humana y DTPA 1 mM (formulación clínica) y se administró por vía intravenosa como se describe en la Sección Métodos.
Como se muestra por los resultados de la Figura 21, el 2B8-MX-DTPA marcado con ^{89}Y tenía poco efecto, si lo tenía, sobre las células B circulantes en estos animales, independientemente de la dosis administrada. Además, no se hallaron anormalidades significativas diferentes a una eliminación general de los linfocitos (20-43%), en ningún parámetro clínico evaluado, incluyendo la química sérica, el urianálisis, los pesos y las temperaturas corporales.
2. Estudios Farmacocinéticas con 2B8 y 2B8-MX-DTPA
Como se ha descrito anteriormente, los animales del grupo V del estudio GLP recibieron una única dosis de 10,0 mg/kg de 2B8. El análisis de regresión lineal de los datos sugiere que el anticuerpo nativo se eliminaba de la circulación de estos monos con un valor \beta t_{1/2} de aproximadamente 4,5 días. En un estudio similar usando ratones BALB/c, se determinaron los valores \beta t_{1/2} para 2B8 nativo y conjugado por análisis de regresión lineal (no mostrada) en 8,75 días (Fig. 22). Estos resultados sugieren que la conjugación de 2B8 no tenía efecto sobre su eliminación de ratones BALB/c.
3. Estudios de Biodistribución y Localización Tumoral con 2B8-MX-DTPA Radiomarcado
Realizando el experimento de biodistribución preliminar descrito anteriormente (Sección 2d), se radiomarcó 2B8 conjugado con ^{111}In a una actividad específica de 2,3 mCi/mg y se inyectó caso 1,1 \muCi en cada uno de veinte ratones BALB/c para determinar la biodistribución del material radiomarcado. Posteriormente, se sacrificaron los grupos de cinco ratones cada uno a 1, 24, 48 y 72 horas y se retiraron sus órganos y una parte de la piel, el músculo y el hueso y se procesaron para el análisis. Además, se recogieron la orina y las heces y se analizaron para los momentos puntuales de 24-72 horas. El nivel de radiactividad en la sangre bajo desde el 40,3% de la dosis inyectada por gramo a 1 hora hasta el 18,9% a 72 horas (Tablas 1-4; Fig. 23). Los valores para el corazón, riñón, músculo y bazo permanecieron en el intervalo del 0,7-9,8% en todo el experimento. Los niveles de radiactividad encontrados en los pulmones disminuyeron del 14,2% a 1 hora hasta el 7,6% a 72 horas; de forma similar la los valores respectivos de dosis inyectada en el hígado por gramo fueron del 10,3% y el 9,9%. Estos datos se usaron para determinar las estimaciones de dosis absorbida de radiación de ^{111}In-2B8-MX-DTPA (Tabla 19).
La biodistribución de conjugado marcado con ^{90}Y, que tiene una actividad específica de 12,2 mCi/mg de anticuerpo, se evaluó en ratones BALB/c. Se obtuvieron radioincorporaciones de >90% y el anticuerpo radiomarcado se purificó por HPLC. Se evaluó la deposición tisular de radiactividad en los órganos principales, y la piel, el músculo, el hueso, y la orina y las heces durante 72 horas y se expresaron como el porcentaje de dosis inyectada/g de tejido. Los resultados mostrados en las Tablas 5-8 y la Figura 24 demuestran que aunque los niveles de radiactividad asociada con la sangre disminuían desde aproximadamente el 39,2% de la dosis inyectada por gramo a 1 hora hasta caso el 15,4% después de 72 horas; los niveles de radiactividad asociada con la cola, el corazón, el riñón, el músculo y el bazo permanecían casi constante al 10,2% o menos en todo el transcurso del experimento. De forma importante, la radiactividad asociada con el hueso variaba del 4,4% de la dosis inyectada por gramo de hueso a 1 hora hasta el 3,2% a 72 horas. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que había poco itrio libre asociado con el conjugado y que se liberaba poco radiometal libre durante el transcurso del estudio. Estos datos se usaron para determinar las estimaciones de dosis absorbida de radiación para ^{90}Y-2B8-MX-DTPA (Tabla 20).
Para estudios de localización tumoral, se preparó 2B8-MX-DTPA y se radiomarcó con ^{111}In a una actividad específica de 2,7 mCi/mg. Posteriormente se inyectaron cien microlitros de conjugado marcado (aproximadamente 24 \muCi) en cada uno de los 12 ratones atímicos que portaban tumores de células B Ramos. Los tumores variaban de 0,1 a 1,0 gramos. En los momentos puntuales 0, 24, 48, y 72 horas después de la inyección, se retiraron 50 \mul de sangre por punción retro-orbital, se sacrificaron a los ratones por dislocación cervical, y se retiraron la cola, el corazón, los pulmones, el hígado, el riñón, el bazo, el músculo, el fémur, y el tumor. Después de procesar y pesar los tejidos, se determinó la radiactividad asociada con cada muestra tisular usando un contador gamma y los valores se expresaron como porcentaje de dosis inyectada por gramo.
Los resultados (Fig. 25) demuestran que las concentraciones en el tumor del ^{111}In-2B8-MX-DTPA aumentaban regularmente en todo el transcurso del experimento. Se acumuló el trece por ciento de la dosis inyectada en el tumor después de 72 horas. Los niveles sanguíneos, en contraste, bajaron durante el experimento desde más del 30% a tiempo cero hasta el 13% a 72 horas. Todos los demás tejidos (excepto el músculo) contenían entre el 1,3 y el 6,0% de la dosis inyectada por gramo de tejido al final del experimento; el tejido muscular contenía aproximadamente el 13% de la dosis inyectada por gramo.
C. Dosimetría
Los datos de dosimetría resumidos derivados de los estudios de biodistribución en ratones BALB/c normales y presentados en las Tablas 19 y 20, para los conjugados marcados con indio e itrio, respectivamente, están de acuerdo con los datos presentados en la bibliografía cuando se comparan por milicurio de dosis inyectada (5) y sugieren que los conjugados tanto marcados con itrio como con indio de 2B8 pueden evaluar de forma segura para la eficacia clínica en pacientes con linfoma.
D. Toxicología 1. 2B8: Ensayo de Seguridad General de Dosis Única
Se administró a ratones y cobayas una única dosis intraperitoneal de 2B8 (0,5 ml o 5,0 ml, respectivamente) y se observaron durante siete días. No se detectaron signos patentes de toxicidad.
2. 2B8 y 2B8-MX-DTPA: Estudios de Inmunohistología con Tejidos Humanos
Se evaluó la reactividad tisular del anticuerpo monoclonal murino 2B8 usando un panel de 32 tejidos humanos diferentes fijados con acetona. El anticuerpo 2B8 reacciona con el antígeno anti-CD20 que tenía un patrón muy restringido de distribución tisular, observándose solamente en un subconjunto de células en tejidos linfoides incluyendo aquellos de origen hematopoyético.
En el ganglio linfático, se observó inmunorreactividad en una población de linfocitos B corticales maduros así como células proliferantes en los centros germinales. También se observó reactividad positiva en la sangre periférica, las áreas de células B de las amígdalas, la pulpa blanca del bazo, y con el 40-70% de los linfocitos medulares encontrados en el timo. También se observó reactividad positiva en los folículos de la lamina propria (Placas de Peyer) del intestino grueso. Finalmente, agregados o células linfoides dispersadas en el estroma de diversos órganos, incluyendo la vesícula, la mama, el cuello del útero, el esófago, el pulmón, la glándula parótida, la próstata, el intestino delgado, y el estómago, también eran positivos con anticuerpo 2B8.
Se descubrió que todas las células epiteliales simples, así como los epitelios estratificados y los epitelios escamosos de diferentes órganos, eran no reactivos. Asimismo, no se observó reactividad con células neuroectodérmicas, incluyendo las del cerebro, la médula espinal y los nervios periféricos. También se descubrió que los elementos mesenquimáticos, tales como las células del músculo esquelético y liso, los fibroblastos, las células endoteliales, y las células inflamatorias polimorfonucleares eran negativos.
La reactividad tisular del conjugado 2B8-MX-DTPA se evaluó usando un panel de dieciséis tejidos humanos que se habían fijado con acetona. Como se ha demostrado previamente con el anticuerpo nativo, el conjugado 2B8-MX-DTPA reconocía el antígeno CD20 que mostraba un patrón de distribución altamente restringido, encontrándose solamente en un subconjunto de células de origen linfoide. En el ganglio linfático, se observó inmunorreactividad en la población e células B. Se observó fuerte reactividad en la pulpa blanca del bazo y en los linfocitos medulares del timo. También se observó inmunorreactividad en linfocitos dispersados en la vesícula, el corazón, el intestino grueso, el hígado, el pulmón, y el útero, y se atribuyó a la presencia de células inflamatorias presentes en estos tejidos. Como se ha descrito con el anticuerpo nativo (anteriormente), no se observó reactividad con células neuroectodérmicas o con elementos mesenquimáticos.
III. Discusión
El anticuerpo monoclonal murino anti-CD20 2B8, producido por un clon con la misma designación, muestra una afinidad por el antígeno CD20 de células B que puede ser mayor que la observada para el anticuerpo B1, como se determina por competición con anticuerpos de especificidad conocida para el antígeno CD20, y por análisis de Scatchard. Además, los datos de inmunoprecipitación sugieren que el antígeno precipitado por 2B8 parece ser el mismo antígeno que el precipitado por B1, ya que ambos anticuerpos precipitaban un doblete con pesos moleculares relativos de 33 y 35 KD. El análisis citofluorográfico de la especificidad del anticuerpo 2B8 para linfocitos de sangre periférica demuestra que el anticuerpo reacciona específicamente con células B y no ha mostrado reactividad con células T u otros tipos de linfocitos. Finalmente, los datos de estabilidad preliminares sugieren que el anticuerpo es estable a 30ºC durante 12 semanas sin pérdida de inmunorreactividad.
Cuando se conjugaba el anticuerpo 2B8 con ácido metilbencildietilenotriaminapentaacético (MX-DTPA), casi no se observaba reducción en la inmunorreactividad, con relación al anticuerpo nativo. Además, el radiomarcaje del conjugado con ^{111}In o ^{90}Y producía conjugados marcados con immunorreactividades del 100% y el 60%, respectivamente. Los estudios de estabilidad de conjugados marcados con ^{111}In o ^{90}Y incubados en suero humano durante 96 horas a 37ºC indicaron pérdida insignificante del radiometal durante el transcurso del estudio, lo que sugiere que los conjugados serán estables cuando se usen clínicamente.
Los estudios de localización tumoral en ratones atímicos usando una preparación marcada con indio de 2B8-MX-DTPA mostraron cantidades crecientes del conjugado unido a las células tumorales durante el transcurso del experimento sin acumulaciones inusuales en otros tejidos. Además, las estimaciones de dosimetría obtenidas de los estudios de biodistribución están de acuerdo con los datos publicados en la bibliografía. Finalmente, los estudios de reactividad cruzada en tejidos humanos con los anticuerpos nativo y conjugado indicaron que ambos anticuerpos reconocen un antígeno con distribución tisular altamente restringida, que reaccionan solamente con un subconjunto de células en tejidos linfoides, incluyendo aquellos de origen hematopoyético. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la conjugación no alteraba la especificidad tisular del anticuerpo, y que los conjugados son estables in vivo y reconocen el antígeno CD20 presente en la superficie de tumores producidos experimentalmente en ratones atímicos.
Cuando se usó 2B8 en un estudio de farmacología/toxicología de elevada dosis, el anticuerpo no producía efectos farmacotóxicos significativos en ningún parámetro evaluado, durante o después del estudio. Asimismo, no se observaron anormalidades durante el análisis de las diversas muestras histopatológicas examinadas por microscopía óptica. Sorprendentemente, todas las dosis del anticuerpo usadas producían una eliminación pronunciada de las células B circulantes. Los niveles de células B circulantes, sin embargo, volvían a niveles casi normales una vez cesaba la administración del anticuerpo. En el grupo de monos de dosis única (Grupo V) el anticuerpo nativo se eliminaba de la circulación con un valor de \beta t_{1/2} aparente de aproximadamente 4,5 días. De forma predecible, cuando se realizó este estudio farmacocinético en ratones BALB/c, el anticuerpo 2B8 se eliminaba con un valor de \beta t_{1/2} de 8,75 días. Por tanto, tomados en conjunto, estos datos sugieren que el anticuerpo nativo también puede proporcionar algún efecto clínico cuando se administra en forma de un adjunto a los conjugados radiomarcados.
Globalmente estos datos indican que el anticuerpo de elevada afinidad 2B8 y su conjugado MX-DTPA muestran un patrón restringido de reactividad en tejidos humanos. Además, en primates, el anticuerpo nativo es no tóxico y produce eliminación transitoria de células B; sin embargo, una vez se ha eliminado el anticuerpo de la circulación los niveles de células B vuelven de forma razonablemente rápida. Además, los conjugados 2B8-MX-DTPA marcados con indio e itrio parecían estables in vitro, no mostrando pérdida de radiometal durante incubación prolongada en suero humano. Finalmente, las estimaciones de dosis de radiación obtenidas de la biodistribución de 2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y o ^{111}In en ratones BALB/c están de acuerdo, por milicurio de dosis inyectada, con las estimaciones de dosis obtenidas de los estudios clínicos en seres humanos usando anticuerpos conjugados anti-idiotipo compartido radiomarcados con estos isótopos.
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IV. Sumario de desarrollo pre-clínico del protocolo de radiomarcaje "mezclar y usar" para la preparación de ^{90}Y-2B8-MX-DTPA A. Introducción
Se ha evaluado el anticuerpo monoclonal murino anti-CD20 marcado con A^{90}Y (2B8) en un ensayo clínico en Fase I para el tratamiento de linfoma de células B reincidente. El protocolo original usado para la preparación del anticuerpo marcado con itrio usaba una etapa de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para la retirada del radioisótopo no unido a proteína antes de su formulación y administración a pacientes. Desafortunadamente, este proceso consume particularmente mucho tiempo, provocando una exposición más larga del anticuerpo al radioisótopo en un estado desprotegido. Esto provoca radiolisis aumentada del anticuerpo con una disminución concomitante en la inmunorreactividad. Además, el aspecto laborioso del proceso hace difícil preparar más de una dosis por día en la radiofarmacia. La simplificación del proceso agilizaría la aplicación en la clínica como una alternativa a usar los Servicios de Farmacia NIPI como radiofarmacia.
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Por consiguiente, se desarrolló un procedimiento de radiomarcaje revisado, conocido como el método "mezclar y usar", que obvia la necesidad de purificación por HPLC manteniendo al mismo tiempo una elevada radioincorporación y una retención mejorada de la inmunorreactividad. Los estudio de estabilidad in vitro así como los estudios de biodistribución en ratones mostraron que el anticuerpo radiomarcado preparado usando el método "mezclar y usar" es comparable al material producido usando el proceso de HPLC actual. Los resultados de estos estudios pre-clínicos indican que este nuevo protocolo "mezclar y usar" puede usarse para preparar 2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y adecuado para su uso en ensayos clínicos.
B. Materiales y Métodos Materiales 1. Células
Las líneas celulares linfoblásticas humanas SB (CD20 positiva) y HSB (CD20 negativa) se obtuvieron de la American Type Culture Collection y se mantuvieron en RPM1-1640 que contenía suero bovino fetal al 10% y estaba suplementado con glutamina.
2. Anticuerpos
El anticuerpo 2B8 se purificó por el departamento de Fabricación a partir del sobrenadante del biorreactor de fibra hueca usando protocolos descritos previamente en el IND (BB-IND 4850/4851).
3. Reactivos Adicionales
El cloruro de itrio-[90] se obtuvo de Amersham. Todos los demás reactivos se obtuvieron de fuentes descritas en los informes adjuntos citados a continuación. Los reactivos usados para los protocolos de radiomarcaje se procesaron para retirar los iones de metales pesados contaminantes que podrían competir con los radioisótopos durante la etapa de radiomarcaje (véase la sección Métodos). Los reactivos se fabricaron en condiciones GMP por el departamento de Fabricación de IDEC siguiendo Registros de Producción por Lotes.
Métodos 1. Preparación de 2B8-D4X-DTPA
El MX-DTPA de calidad clínica se obtuvo de Coulter Immunology en forma de la sal disódica en agua y se almacenó a -70ºC. El conjugado (2B8-MX-DTPA) se preparó por el departamento de Fabricación. Se usaron dos lotes diferentes de conjugado en estos estudios; ambos se proporcionaron en solución salina normal a 10 mg/ml. Los conjugados se cargaron en jeringas de polipropileno de 2 ml estériles y se almacenaron a 2-8ºC.
2. Mantenimiento de Condiciones Libres de Metal
Todas las manipulaciones de los reactivos se realizaron para minimizar la posibilidad de contaminación por metales. Se usaron recipientes de plástico de polipropileno o poliestireno tales como matraces, vasos de precipitado y cilindros graduados. Estos se lavaron con Alconox y se aclararon exhaustivamente con agua Milli-Q o Agua para Irrigación (WFIr) antes de su uso. Se usaron puntas de pipeta sin metal (BioRad) para manipular de forma precisa pequeños volúmenes. Volúmenes más grandes de reactivos se manipularon usando pipetas serológicas de plástico, estériles. Las reacciones se realizaron convenientemente en tubos de microfuga con tapón a rosca de 1,8 ml hechos de polipropileno.
3. Determinación de la Radioincorporación
La radioincorporación se determinó usando cromatografía en capa fina instantánea (ITLC) por triplicado de acuerdo con SOP SP-13-008. En general, el protocolo fue el siguiente: el conjugado radiomarcado se diluyó 1:20 en 1X PBS que contenía DTPA 1 mM o EDTA 5 mM, después se aplicó puntualmente 1 \mul en 1,5 cm desde un extremo de una tira de 1 x 5 cm de papel ITLC SG (Gelman Sciences). El papel se reveló usando acetato amónico al 10% en metanol:agua (1:1; v/v). Las tiras se secaron, se cortaron a la mitad de forma transversal, y se determinó la radiactividad asociada con cada sección por recuento de centelleo. La radiactividad asociada con la mitad inferior de la tira (radiactividad asociada a proteína) se expresó como un porcentaje de la radiactividad total determinada sumando los valores para las mitades tanto superior como inferior.
4. Protocolo "Mezclar y Usar" para 2B8-MX-DTPA Marcado con Itrio-[90]
Los anticuerpos se radiomarcaron con cloruro de ^{90}Y sin vehículo proporcionado por Amersham en HCl 0,04 M. Se transfirió una alícuota de radioisótopo (10-20 mCi/mg de anticuerpo) a un tubo de polipropileno y se añadió un volumen 0,02X de acetato sódico 2 M libre de metal para ajustar la solución a pH 3,6. Se añadió 2B8-NaDTPA (0,3 mg; 10,0 mg/ml en solución salina normal) inmediatamente y se agitó suavemente la solución. La solución se comprobó con papel de pH para verificar un pH de 3,8-4,1 y se incubó durante 5 min. La reacción se interrumpió transfiriendo la mezcla de reacción a un tubo de polipropileno diferente que contenía 1 X PBS con 75 mg/ml de albúmina sérica humana (HSA) y ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA) 1 mM y se mezcló suavemente. El anticuerpo radiomarcado se almacenó a 2-8ºC.
Las actividades específicas se determinaron midiendo la radiactividad de una alícuota apropiada del conjugado radiomarcado. Este valor se corrigió para la eficacia del contador, relacionada con la concentración de proteína del conjugado, determinada por la absorbancia a 280 nm y se expresó como mCi/mg de proteína.
5. Inmunorreactividad In Vitro de Itrio-[90]-2B8-MX-DTPA
La inmunorreactividad del conjugado marcado con ^{90}Y se determinó usando SOP nº SP13-009 basado en una versión modificada del ensayo de unión de células completas descrito por Lindmo. Se añadieron concentraciones crecientes de células SB CD20-positivas o células HSB CD20-negativas en fase log, a series duplicadas de tubos de polipropileno de 1,5 ml; volumen final de las células, 0,40 ml. El conjugado radiomarcado se diluyó a una concentración de anticuerpo final de 1-2,5 ng/ml y se añadieron 0,35 ml a cada tubo. Después de una incubación de 90 min., las células se sedimentaron por centrifugación y se recogieron los sobrenadantes. La radiactividad restante en la fracción sobrenadante se determinó con un contador de centelleo. Los datos se representaron como el cociente de la radiactividad total añadida dividido por la radiactividad asociada a las células frente a la inversa de la cantidad de células por tubo. El punto de corte del eje y representa la fracción inmunorreactiva.
6. Estabilidad In Vitro de Itrio-[90]-2B8-MX-DTPA Formulado Clínicamente
El conjugado 2B8-MX-DTPA se radiomarcó con ^{90}Y y se formuló como se ha descrito en el protocolo "mezclar y usar" proporcionado anteriormente. Se prepararon dos lotes de conjugado radiomarcado; un lote se usó para evaluar la estabilidad de radioincorporación y el otro lote se usó para evaluar la retención de la inmunorreactividad. Los conjugados formulados se incubaron a 4ºC durante 48 horas y se analizaron alícuotas a tiempo 0, 24 h y 48 horas usando SDS-PAGE no reductora y autorradiografía. La inmunorreactividad en cada momento puntual se evaluó usando el ensayo descrito anteriormente.
7. Estabilidad In Vitro de Itrio-[90]-2B8-MX-DTPA en Suero Humano
La estabilidad de 2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y se evaluó por incubación en suero humano a 37ºC durante hasta 72 horas. El anticuerpo conjugado se radiomarcó con itrio-[90] y se formuló como se ha descrito anteriormente. El conjugado radiomarcado se diluyó 1:10 con suero humano normal (no inactivado por calor) y se incubaron alícuotas en tubos de plástico a 37ºC. A tiempos seleccionados, se retiraron muestras y se analizaron por SDS-PAGE no reductora y autorradiografía.
8. Biodistribución de Itrio-[90]-2B8-MX-DTPA
2B8-MX-DTPA marcado con itrio-[90] se evaluó para la biodistribución tisular en ratones BALB/c de ocho a diez semanas de edad. El conjugado radiomarcado se preparó y se formuló como se ha descrito anteriormente. A los ratones se les inyectó por vía intravenosa 5 \muCi de 2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y y se sacrificaron los grupos de cinco ratones a 1, 24, 48, y 72 horas. Después del sacrificio, se retiraron la cola, el corazón, los pulmones, el hígado, el riñón, el bazo, el músculo, el fémur, se lavaron, se pesaron; también se retiró una muestra de sangre y piel para el análisis. La radiactividad asociada con cada muestra tisular se determinó midiendo la radiación bremsstrahlung usando un contador gamma y se determinó el porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido y el porcentaje de dosis inyectada por órgano.
9. Dosimetría
Los datos de biodistribución obtenidos usando ratones a los que se ha inyectado 2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y se usaron para calcular las estimaciones de las dosis de radiación absorbidas a partir de una dosis de 1,0 mCi administrada a un paciente de 70 kg. Las estimaciones se hicieron de acuerdo con métodos adoptados por el Medical Internal Radiation Dose (MIRD) Committee of the Society of Nuclear Medicine. Estos cálculos los realizó Mr. Phillip Hagan, Nuclear Medicine Service, VA Medical Center La Jolla, CA92161.
10. Validación del Protocolo para la Preparación de Dosis Clínicas de Itrio-[90]-2B8-MX-DTPA
(Informe R&D de referencia titulado ``Validation of "Mix-and-Shoot" Radiolabeling Protocol for the Preparation of Clinical Doses of 90Y-2B8-MX-DTPA; autor, P. Chinn; fecha 22 de abril de 1994).
C. Resultados 1. Preparación de 2B8-MX-DTPA Marcado con Itrio-[90] Usando el Protocolo "Mezclar y Usar"
Los experimentos preliminares que evaluaban la cinética de la reacción de radiomarcaje con 2B8-MX-DTPA y ^{90}Y mostraron que a pH 3,6-4,0, el 95% del radioisótopo se incorporó durante un tiempo de reacción de 5 a 10 min. La reproducibilidad de esta radioincorporación (95,7% \pm 1,7%) se confirmó posteriormente en un estudio de validación para el protocolo de aumento en escala (Informe R&D de referencia titulado ``Validation of "Mix-and-Shoot" Radiolabeling Protocol for the Preparation of Clinical Doses of 90Y-2B8-MX-DTPA; autor, P. Chinn; fecha 22 de abril de 1994). La preparación de 2B8-MX-DTPA marcado ^{90}Y usando este protocolo "mezclar y usar" dio un producto comparable al producido con el método de HPLC (véase BB-IND 4850/4851). Se descubrió que el protocolo de radiomarcaje era reproducible con actividades específicas que varían típicamente de 10 a 15 mCi/mg de anticuerpo.
La inmunorreactividad del 2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y preparado usando este protocolo era típicamente mayor del 70%, en comparación con el 55-60% observado para las validaciones realizadas para el protocolo de HPLC (Figura 26). Esta diferencia se debe probablemente a los efectos reducidos de la radiolisis a causa del tiempo de incubación reducido con el protocolo "mezclar y usar". Este resultado fue típico y, como se analiza a continuación, era representativo de la validación realizada para el protocolo de aumento en escala para preparar dosis clínicas del conjugado radiomarcado.
2. Estabilidad In vitro de 2B8-MX-DTPA Marcado con ^{90}Y
Los experimentos preliminares con conjugado de anticuerpo marcado con ^{90}Y sin proteger preparado usando el proceso de HPLC demostraron que la radiolisis causaba degradación significativa del anticuerpo y pérdida de inmunorreactividad. Por lo tanto, se desarrolló un tampón de formulación para minimizar los efectos de la radiolisis. La albúmina sérica humana (HSA) demostró ser eficaz para minimizar la degradación del anticuerpo debido a la radiolisis. Se hizo una evaluación con el conjugado radiomarcado preparado con el método "mezclar y usar" para confirmar la eficacia de la formulación para minimizar la radiolisis. El anticuerpo marcado con ^{90}Y, radiomarcado a una actividad específica de 14,5 mCi/mg de anticuerpo, se formuló en 1X PBS, pH 7,4 que contenía 75 mg/ml de HSA y DTPA 1 mM. La degradación del conjugado 2B8-MX-DTPA se evaluó a 0, 24, y 48 horas usando SDS-PAGE y autorradiografía. Las Figuras 2, 3, y 4 muestran que el conjugado radiomarcado no mostraba degradación significativa durante un periodo de 48 h cuando se incubaba a 4ºC. El análisis de cromatografía en capa fina instantánea no mostró pérdida de ^{90}Y durante las 48 h de incubación; estos resultados se corroboraron por SDS-PAGE/análisis autorradiográfico (Tabla 28). La inmunorreactividad también era relativamente constante a >88% (Tabla 29).
TABLA 28 Estabilidad de ^{90}Y-2B8-MX-DTPA "Mezclar y Usar" en PBS que Contenía Albúmina Sérica Humana y DTPA
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TABLA 29 Inmunorreactividad de ^{90}Y-2B8-MX-DTPA "Mezclar y Usar" en PBS que Contenía Albúmina Sérica Humana y DTPA
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Se incubó 2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y formulado clínicamente a una actividad específica de 15,7 mCi/mg durante 72 horas a 37ºC en suero humano. Las muestras analizadas por SDS-PAGE no reductora y autorradiografía (Figura 30) no mostraron pérdida de radioisótopo durante el transcurso del periodo de incubación (Tabla 30). Las exploraciones densitométricas de los autorradiogramas a tiempo cero y 72 h indicaron ausencia de degradación significativa del conjugado radiomarcado (Figuras 31 y 32). Estos resultados se corroboraron por análisis cromatográficos en capa fina (Tabla 30). Debe observarse que la radioincorporación para el anticuerpo usado en este estudio era inferior que la obtenida en los estudios de validación del protocolo de marcaje. Esta radioincorporación inferior se debía a la calidad reducida del lote de cloruro de ^{90}Y usado para esta preparación particular de anticuerpo radiomarcado. La radioincorporación inferior no alteró la conclusión de que el conjugado marcado con itrio preparado con el método "mezclar y usar" es estable en estas condiciones de incubación.
TABLA 30 Estabilidad de Conjugado ^{90}Y-2B8-MX-DTPA Incubado en Suero Humano
49
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3. Estudios de Biodistribución con Itrio-[90]-2B8-MX-DTPA
La biodistribución del conjugado marcado con ^{90}Y, con una actividad específica de 11,5 mCi/mg de anticuerpo y una radioincorporación de >95%, se evaluó en ratones BALB/c. Se evaluó la deposición de radiactividad en los tejidos para los órganos principales, la piel, el músculo, el hueso, la orina y las heces en 72 horas y se expresó como un porcentaje de dosis inyectada por g de tejido y como un porcentaje de dosis inyectada por órgano. Los resultados mostrados en las Tablas 31-34 y la Figura 33 muestran que los niveles de radiactividad asociada con la sangre disminuía desde aproximadamente el 43% de la dosis inyectada por gramo (% ID/g) a 1 hora hasta aproximadamente el 16% después de 72 horas; a 24 h y después, los niveles de radiactividad asociada con el corazón, el riñón, y el bazo permanecían casi constantes al 4-8%. Para el pulmón y el hígado, la radiactividad disminuía desde el 10-12% a 1 h hasta el 8%-10% a 72 h. Para la piel, la radiactividad era relativamente constante a aproximadamente el 3% de 24 h a 72 h. La radiactividad en el tracto gastrointestinal era constante al 0,5-1% de 24 h a 72 h. La radiactividad para el músculo permanecía aproximadamente al 0,6% en todo el transcurso del estudio. La captación de radiactividad por el fémur (hueso) permanecía a menos del 4% en todos los momentos puntuales, lo que indica que la cantidad de itrio libre en la preparación de conjugado era insignificante y que se liberaba poco radiometal libre durante el transcurso del estudio.
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TABLA 31 Distribución de la Actividad 1,0 Hora Después de Inyección I.V. de ^{90}Y-2B8-MX-DTPA en Ratones BALB/c Normales
Valores Medios \pm SD
50
51
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TABLA 32 Distribución de la Actividad 24 Horas Después de Inyección I.V. de ^{90}Y-2B8-MX-DTPA en Ratones BALB/c Normales
Valores Medios \pm SD
52
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TABLA 33 Distribución de la Actividad 48 Horas Después de Inyección I.V. de ^{90}Y-2B8-MX-DTPA en Ratones BALB/c Normales
Valores Medios \pm SD
53
54
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TABLA 34 Distribución de la Actividad 72 Horas Después de Inyección I.V. de ^{90}Y-2B8-MX-DTPA en Ratones BALB/c Normales
Valores Medios \pm SD
55
4. Dosimetría
Las dosis de radiación absorbidas para un ser humano "normal" de 70 kg calculadas para el conjugado marcado con ^{90}Y usando los datos de biodistribución en ratones (valores de %ID/órgano de las Tablas 31-34) se presentan en la Tabla 35. Estos resultados son comparables a los resultados obtenidos previamente usando 2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y preparado usando el método de radiomarcaje con HPLC.
TABLA 35
56
5. Validación del Protocolo para la Preparación de Dosis Clínicas de Itrio-[90]-2B8-MX-DTPA
Se preparó un total de diez lotes de validación en MPI Pharmacy Services, Inc. Los resultados del ensayo en cada lote se resumen en la Tabla 36. Se calculó el valor medio para cada resultado de ensayo y se anotaron las desviaciones típicas cuando era apropiado. Para evaluar la variabilidad del proceso debido a diferentes tiempos de marcaje, se prepararon el lote nº 1 al nº 8 usando un tiempo de marcaje de 10 min.; el lote nº 9 y nº 10 se prepararon usando un tiempo de reacción de 5 min. En base a los resultados de ensayo para los diez lotes de validación, se establecieron las especificaciones de salida. Las especificaciones de salida se resumen en la Tabla 37.
57
TABLA 37 Especificaciones de Salida para 2B8-MX-DTPA Marcado con ^{90}Y Preparado Usando el Protocolo "Mezcla y Usar"
58
D. Discusión
El protocolo de radiomarcaje original para preparar 2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y utilizaba una etapa de purificación en HPLC particularmente laboriosa y que consumía mucho tiempo para retirar el ^{90}Y no unido a proteína de la preparación. Para simplificar este proceso y hacerlo más susceptible a su uso en clínica, los esfuerzos se dirigieron a eliminar la etapa de HPLC en favor de lo que se ha llamado un protocolo "mezclar y usar". El objetivo fue identificar las condiciones de radiomarcaje que producirían una radioincorporación muy elevada del isótopo en el conjugado, obviando de este modo la necesidad de la etapa de purificación. Se descubrió que podía obtenerse >95% de radioincorporación a pH 3,6 con una incubación de cinco a diez minutos. Un beneficio adicional de este protocolo era la retención aumentada de la inmunorreactividad (>70%), supuestamente debido al tiempo de exposición más corto del anticuerpo al radioisótopo de elevada energía antes de la adición de albúmina sérica humana que proporciona protección contra la radiolisis. Esta retención de inmunorreactividad es superior a la previamente observada usando el método de HPLC.
Los estudios de estabilidad con conjugado marcado con ^{90}Y preparado usando el protocolo "mezclar y usar" incubado en tampón de formulación (1X PBS que contenía 75 mg/ml de albúmina sérica humana y DTPA 1 mM) durante hasta 48 h a 4ºC mostraron ausencia de pérdida de radioisótopo y retención completa de la inmunorreactividad. Los estudios de estabilidad realizados con suero humano durante 72 horas a 37ºC también indicaron pérdida mínima de radioisótopo. Estos resultados de estabilidad son comparables con los previamente observados con conjugado radiomarcado usando el protocolo de HPLC.
La biodistribución en ratones BALB/c usando conjugado marcado con ^{90}Y preparado con el método "mezclar y usar" indicó ausencia de deposición tisular inusual. Estos resultados sugerían que el anticuerpo radiomarcado no se alteraba significativamente para alterar drásticamente las características in vivo del anticuerpo. Además, estos resultados son comparables con los obtenidos previamente con el conjugado radiomarcado preparado usando el método de radiomarcaje con HPLC (véase BB-IND 4850/4851). Las estimaciones de dosimetría para un ser humano "normal" de 70 kg calculadas a partir de los datos de biodistribución para ratones están de acuerdo con las obtenidas con conjugado radiomarcado usando el procedimiento de HPLC (véase BB-IND 4850/4851). Además, los resultados de dosimetría son comparables con los resultados obtenidos para pacientes incluidos en un ensayo clínico en curso (estudio IDEC nº 1315), cuando se comparan por milicurios de dosis inyectada. Para seis pacientes en el estudio, los valores medios (rads \pm SD) para el cuerpo completo, el corazón, el hígado, y el bazo fueron 1,40 \pm 0,57, 10,50 \pm 4,68, 9,89 \pm 8,91, y 9,75 \pm 6,00, respectivamente.
Antes de aplicar el protocolo de marcaje "mezclar y usar" para preparar ^{90}Y-2B8-MX-DTPA de calidad clínica, fue necesario evaluar la reproducibilidad del protocolo. Por lo tanto, se prepararon diez lotes de validación usando diferentes lotes de cloruro de ^{90}Y. Para los diez lotes preparados, los valores de inmunorreactividad obtenidos usando el método "mezclar y usar" estaban en el intervalo del 60,6% al 93,3% con una media del 74,5% y una mediana del 72,1%. Esta retención de la inmunorreactividad es significativamente mejor que la de aproximadamente el 60% previamente obtenida usando el método de HPLC actual (intervalo del 54,9% al 65,1%; media del 60,2%). La radioincorporación promedio para los diez lotes fue del 95,7% (intervalo del 93,5% al 97,5%). Este valor es comparable con el observado previamente con el método de HPLC (intervalo del 91,7% al 93,7% y una media del 93,1%). Además, los resultados para endotoxinas, concentración de anticuerpo, concentración de radiactividad, actividad específica, radiactividad vial total, concentración proteica total, pH, y esterilidad fueron comparables para los diez lotes. Juntos, estos resultados confirmaron la reproducibilidad del método "mezclar y usar". Además, se evaluó la variabilidad del proceso debida a los diferentes tiempos de marcaje realizando reacciones durante 5 y 10 minutos. Como no se observaron diferencias significativas para los dos tiempos de reacción, se decidió que se usaría el tiempo de incubación más corto en el protocolo final.
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E. Sumario
Se ha desarrollado un procedimiento de marcaje, mencionado como el método "mezclar y usar", para la preparación de dosis clínicas de 2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y que obvia la necesidad de la etapa de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) actualmente usada para la retirada de radioisótopo no unido a proteína. El protocolo simplificado elimina esta etapa de purificación laboriosa manteniendo al mismo tiempo un elevado nivel de radioincorporación de isótopo (>95%) y retención mejorada de la inmunorreactividad (>70%). Se descubrió que el conjugado radiomarcado formulado clínicamente era estable in vitro cuando se incubaba a 4ºC durante 48 horas en base a la retención de radioisótopo e inmunorreactividad. Además, el conjugado radiomarcado era estable cuando se incubaba en suero humano a 37ºC durante 72 horas. Los estudios de biodistribución en ratones BALB/c demostraron ausencia de deposición tisular inusual, incluyendo el hueso. Las estimaciones de las dosis de radiación absorbidas para un ser humano "normal" de 70 kg fueron comparables a las obtenidas en un ensayo clínico en curso usando 2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y. Los resultados de estos estudios mostraron que 2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y producido usando el protocolo "mezclar y usar" era comparable al preparado usando el proceso de HPLC convencional. La validación del protocolo de aumento en escala para preparar conjugado radiomarcado de calidad clínica mostró que el método era reproducible y que el producto era comparable al producido usando el método de HPLC actual. Los resultados de estos estudios preclínicos indican que este nuevo protocolo "mezclar y usar" puede usarse para preparar 2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y adecuado para su uso en ensayos clínicos.
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Descripción detallada
Ejemplo 1
Radioincorporación - Kits y Ensayos I. Sumario
Un objetivo de la presente descripción era crear protocolos para el kit de radiomarcaje para la preparación de 2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In y ^{90}Y (In2B8 e Y2B8, respectivamente) y establecer especificaciones de salida para productos clínicos. Los protocolos del kit de radiomarcaje son reproducibles con respecta a la radioincorporación y la unión a células SB positivas al antígeno e indican la idoneidad del kit de radiomarcaje para su uso en los ensayos clínicos. Se recomienda que las especificaciones de salida de In2B8 e Y2B8 para la radioincorporación y la unión se establezcan a \geq95% y \geq70%, respectivamente.
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II. Introducción
Actualmente se está evaluando un anticuerpo monoclonal murino anti-CD20 marcado con ^{90}Y (Y2B8) en ensayos clínicos para el tratamiento de linfoma de células B reincidente. El isótopo itrio carece de un componente gamma que lo hace inadecuado para sistemas de formación de imágenes. Por lo tanto, se usará 2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In (In2B8) para evaluar la localización tumoral y la dosimetría en los pacientes antes o después del tratamiento con el compuesto terapéutico marcado con itrio. Los protocolos usados actualmente para la preparación de Y2B8 y In2B8, conocidos como métodos "mezclar y usar", producen anticuerpos radiomarcados adecuados para estudios clínicos. Sin embargo, la simplificación del proceso de marcaje agilizaría la preparación de dosis en una situación
clínica.
El nuevo kit de radiomarcaje está preferiblemente compuesto por cuatro componentes: 1.) 2B8-MX-DTPA en solución salina normal de bajo contenido en metales a 2 mg/ml, 2.) acetato sódico 50 mM usado para ajustar la solución de radioisótopo al pH de marcaje apropiado, 3.) tampón de formulación (1X PBS, pH 7,4 que contiene albúmina sérica humana al 7,5% y DTPA 1 mM), 4.) vial de vidrio de 10 ml vacío (vial de reacción). Todos los componentes se ensayan para la esterilidad y ausencia de pirógenos.
Este informe resume la validación de este kit de radiomarcaje que es simple y fácil de usar y que produce anticuerpos radiomarcados con \geq95% de radioincorporación y retención aceptable de la unión a células positivas al antígeno. Las especificaciones de ensayo de salida se recomiendan para los productos clínicos.
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III. Materiales y Métodos para Radioincorporación A. Reactivos en el Kit de Radiomarcaje
1. 2B8-MX-DTPA, IDEC; Lote nº 082395RM2
2. Acetato Sódico 50 mM, de bajo contenido en metales, IDEC; Lote nº 082395RM3
3. Tampón de formulación (1X PBS, pH 7,4 que contiene albúmina sérica humana al 7,5% (p/v) y DTPA 1 mM), IDEC, Lote nº 082395RM1
4. Vial de reacción, 10 ml, IDEC
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B. Materiales y Equipo
1. Kit de Radioincorporación Biodex Tec-Control, Cat: nº 151-770
2. Guantes: sin polvo
3. Jeringas de polipropileno estériles
4. Agujas de jeringa estériles
5. Tubos pequeños con cierre; 1,5 ml
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C. Métodos 1. Preparación de Y2B8 e In2B8 Usando el Kit de Radiomarcaje
Los reactivos del kit se prepararon y se cargaron en viales con tabique de vidrio. Los viales de borosilicato de Tipo I (2 ó 10 ml) se aclararon con agua para inyección estéril (WFI) y se esterilizaron en autoclave antes de la carga. Los tabiques de goma de butilo se aclararon con WFI estéril y se esterilizaron en autoclave antes de su uso. Los reactivos se cargaron manualmente y se juntaron en una sala Class 100 y se ensayaron para la pirogenicidad y esterilidad usando métodos USP.
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a. Preparación de In2B8
Reactivos Adicionales:
1. Indio-[111]: sal cloruro, sin vehículo, en HCl.
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Precauciones:
1. Todas las etapas se realizan preferiblemente usando una técnica aséptica.
2. Los componentes del kit de radiomarcaje deben dejarse llegar a temperatura ambiente antes de su uso.
3. El producto final debe administrarse al paciente en 8 horas desde que se complete la siguiente etapa 9.
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Protocolo de radiomarcaje de In2B8
Procedimiento:
1. El volumen de ^{111}InCl_{3} a añadir al vial de reacción se calculó del siguiente modo:
a.
Concentración de radiactividad en el momento del radiomarcaje en mCi/ml:
C_{0} = Concentración de radiactividad en el momento de la calibración (véase el Certificado de Análisis del fabricante).
\global\parskip1.000000\baselineskip
\Deltat = Cambio en el tiempo (número positivo es después de la calibración, número negativo es antes de la calibración).
\hskip0.8cm
59
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b.
Volumen de ^{111}InCl_{3} a añadir al vial de reacción:
60
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2. El volumen de acetato sódico 50 mM a añadir al vial de reacción se calculó del siguiente modo:
Volumen de ^{111}InCl_{3} añadido (Etapa Ib) X (1,2) = Volumen de acetato sódico 50 mM a añadir.
3. Los tabiques del vial de reacción y el vial de acetato sódico 50 mM se limpiaron con alcohol. Usando una jeringa de 1cc, se transfirió el volumen calculado de acetato sódico 50 mM (Etapa 2) al vial de reacción.
4. El tabique de la fuente de ^{111}InCl_{3} se limpió con alcohol. El vial se perforó con una aguja equipada con un filtro de 0,2 \mum estéril. Usando una jeringa de 1cc estéril, se transfirió el volumen requerido (Etapa 1b) de ^{111}InCl_{3} al vial de reacción. El vial se mezcló invirtiéndolo varias veces.
5. El tabique del vial de 2B8-MX-DTPA se limpió con alcohol. Usando una jeringa de 1cc, se transfirió lentamente 1,0 ml de 2B8-MX-DTPA al vial de reacción. El vial se mezcló invirtiéndolo varias veces.
6. La reacción se dejó proceder durante 30 minutos \pm 5 minutos a temperatura ambiente.
7. El volumen total de mezcla de reacción se calculó añadiendo junto el volumen de ^{111}InCl_{3} añadido (Etapa 4), el volumen de acetato sódico 50 mM añadido (Etapa 3) y el volumen de 2B8-MX-DTPA añadido (Etapa 5).
8. El volumen de tampón de formulación a añadir al vial de reacción para obtener un volumen final de 10 ml se calculó restando la cantidad total calculada en la etapa 7 de 10.
9. El vial del tampón de formulación se limpió con alcohol y se perforó el vial. Debido a la viscosidad del tampón de formulación, el vial de reacción se perforó usando una aguja equipada con un filtro de jeringa de 0,2 \mum. Usando un jeringa estéril de 10cc equipada con una aguja de calibre apropiado, el volumen de tampón de formulación calculado en la Etapa 8 se transfirió al vial de reacción. La aguja de perforación se retiró del vial de reacción y el vial se mezcló invirtiéndolo varias veces (Producto Final). Este vial se incubó al menos 5 minutos antes de hacer el "Ensayo de Radioincorporación". El color de la solución era ámbar y el vial estaba lleno, confirmando que se había añadido el tampón de formulación.
10. Se midió la radiactividad total vial del Producto Final usando el equipo de instrumentación apropiado para la medición de ^{111}In.
11. El Producto Final se almacenó inmediatamente a 2ºC-8ºC para el "Ensayo de Unión" y el "Ensayo de Radioincorporación".
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b. Preparación de Y2B8 Reactivos Adicionales:
1. Itrio-[90]: sal cloruro, sin vehículo, en HCl.
\vskip1.000000\baselineskip
Precauciones:
1. Todas las etapas deben realizarse usando una técnica aséptica.
2. Los componentes del kit de radiomarcaje deben dejarse llegar a temperatura ambiente antes de su uso.
3. El producto final debe administrarse al paciente en 8 horas desde que se complete la siguiente etapa 8.
\newpage
Protocolo de radiomarcaje de Y2B8
Procedimiento:
1. El volumen de ^{90}YCl_{3} a añadir al vial de reacción se calculó del siguiente modo:
a.
Concentración de radiactividad en el momento del radiomarcaje:
C_{0} = Concentración de radiactividad en el momento de la calibración (véase el Certificado de Análisis del fabricante).
\Deltat = Cambio en el tiempo (número positivo es después de la calibración, número negativo es antes de la calibración).
\hskip0.5cm
61
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b.
Volumen de ^{90}YCl_{3} a añadir al vial de reacción:
62
\vskip1.000000\baselineskip
2. El volumen de acetato sódico 50 mM a añadir al vial de reacción se calculó del siguiente modo:
a.
Para ^{90}YCl_{3} en HCl 0,040 M (Amersham):
Volumen de ^{90}YCl_{3} (Etapa 1b) x (0,8) = volumen de acetato sódico a añadir
b.
Para ^{90}YCl_{3} en HCl 0,050 M (Nordion):
Volumen de ^{90}YCl_{3} (Etapa 1b) x (1,0) = volumen de acetato sódico a añadir
3. Los tabiques del vial de reacción y el vial de acetato sódico se limpiaron con alcohol. Usando una jeringa de 1 cc, se transfirió el volumen calculado (Etapa 1a o 1b) de acetato sódico 50 mM (Etapa 2) al vial de reacción. El vial se mezcló invirtiéndolo varias veces.
4. El tabique del vial de fuente de ^{90}YCl_{3} se limpió con alcohol. El vial se perforó con una aguja equipada con un filtro de 0,2 \mum estéril. Usando una jeringa estéril de 1 cc, se transfirió el volumen requerido (Etapa 1b) de ^{90}YCl_{3} al vial de reacción. El vial se mezcló invirtiéndolo varias veces.
5. El tabique del vial de 2B8-MX-DTPA se limpió con alcohol. Usando una jeringa estéril de 3 cc, se transfirieron 1,5 ml de 2B8-MX-DTPA al vial de reacción. El vial se mezcló invirtiéndolo varias veces.
6. El volumen total de mezcla de reacción se calculó añadiendo la cantidad de cloruro de Y-90 añadida (Etapa 4), más la cantidad de acetato sódico 50 mM añadida (Etapa 3), más la cantidad de 2B8-MX-DTPA añadida (Etapa 5).
7. El volumen de tampón de formulación a añadir al vial de reacción para obtener un volumen final de 10 ml restando el volumen total de reacción calculado en la etapa 6 de 10.
8. El vial de tampón de formulación se limpió con alcohol y se perforó el vial. Debido a la viscosidad del tampón de formulación, se perforó el vial de reacción usando una aguja equipada con un filtro de jeringa de 0,20 \mum. Usando una jeringa estéril de 10 cc equipada con una aguja de calibre apropiado, se transfirió el volumen de tampón de formulación calculado en la Etapa 7, al vial de reacción. Se retiró la aguja de perforación del vial de reacción y el vial se mezcló invirtiéndolo varias veces (Producto Final). El vial se incubó al menos 5 minutos antes de hacer el "Ensaye de Radioincorporación". El color de la solución era ámbar y el vial de reacción estaba lleno confirmado de este modo que se había añadido el tampón de formulación.
\newpage
9. La radiactividad total del vial de Producto Final se midió usando el equipo de instrumentación apropiado para la medición de ^{90}Y.
10. El Producto Final se almacenó inmediatamente a 2ºC-8ºC hasta que se requirió para la administración al paciente.
11. Ensayo de inmunorreactividad:
Usando una jeringa de 1 ml, se retiró asépticamente 0,1 ml del vial de reacción y se transfirió a un tubo con tapón de rosca de 1,5 ml diferente. El tubo se almacenó inmediatamente a 2ºC-8ºC para el "Ensayo de unión" y el "Ensayo de Radioincorporación".
La validación de los protocolos del kit de radiomarcaje se realizó en IDEC Pharmaceuticals (San Diego, CA), MD Anderson Health Center (Houston, TX). Mayo Clinic (Rochester, MN), y City of Hope (Duarte, CA). Todos los componentes del kit, incluyendo 2B8-MX-DTPA de calidad clínica, se prepararon por IDEC Pharmaceuticals según las condiciones GMP (Condiciones de Buena Fabricación de acuerdo con el Código de Regulaciones Federales) y se determinó que estaban estériles y libres de pirógenos.
Los anticuerpos radiomarcados se formularon con 1X PBS que contenía albúmina sérica humana al 7,5% (p/v) (HSA; calidad clínica; Baxter-Hyland) y DTPA 1 mM. Los resultados de los ensayos de salida realizados en cada lote de validación se describen a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon seis lotes de validación cada uno de In2B8 e Y2B8 por cinco operarios. Estos lotes se denominaron del siguiente modo y se realizaron en las siguientes instalaciones:
In2B8:
nº 1: IDEC Pharmaceuticals
nº 2: IDEC Pharmaceuticals
nº 3: IDEC Pharmaceuticals
nº 4: MD Anderson Health Center
nº 5: Mayo Clinic
nº 6: City of Hope
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Y2B8:
nº 1: IDEC Pharmaceuticals
nº 2: IDEC Pharmaceuticals
nº 3: IDEC Pharmaceuticals
nº 4: MD Anderson Health Center
nº 5: Mayo Clinic
nº 6: City of Hope
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2. Preparación de Células SB y HSB Liofilizadas
Las líneas celulares humanas SB (CD20-positiva) y HSB (CD20-negativa) se obtuvieron de la American Type Culture Collection y se cultivaron en matraces en T usando RPMI-1640 que contenía suero bovino fetal al 10% suplementado con glutamina al 2%. Los cultivos se mantuvieron a 37ºC y CO_{2} al 5%. Las células se dividieron típicamente 1:2 en días alternos y se recogieron a 0,5-2,5 x 10^{6} células/ml y viabilidad >80%. Las concentraciones celulares se determinaron usando un hemacitómetro y la viabilidad se determinó por exclusión de azul de tripano.
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Las células se recogieron a temperatura ambiente a una densidad celular de 0,5-2 X 10^{6} células/ml por centrifugación (1300 rpm en una centrífuga Sorvall) y se lavaron dos veces con 1X HBSS. Las células sedimentadas se resuspendieron a 50 x 10^{6} células/ml en 1X HBSS que contenía albúmina sérica bovina (BSA) al 1% (p/v) y manitol al 10% (p/v) (tampón de liofilización), se distribuyeron 0,5 ml en tubos de microfuga de polipropileno de 1,5 ml con juntas tóricas y se almacenaron a -70ºC, y se liofilizaron durante una noche a 3,99-7,98 Pa (30-60 militor). Los tubos de células liofilizadas se almacenaron desecadas a 2 - 8ºC y se reconstituyeron en agua estéril para los ensayos; los tubos de células liofilizadas en tubos de microfuga se almacenaron con desecante.
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3. Ensayos Analíticos
Los métodos analíticos usados para ensayar los lotes de validación de In2B8 e Y2B8 se describen a continuación. Los siguientes ensayos se realizaron para cada lote de validación:
1. Ensayo de unión usando células SB liofilizadas
2. Ensayo de Radioincorporación de Y2B8/In2B8 usando el Kit Biodex
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a. Ensayos de Unión
Cada operario evaluó el porcentaje de unión usando células SB CD20 positivas liofilizadas de acuerdo con los siguientes protocolos para In2B8 e Y2B8, respectivamente. Estos ensayos proporcionan un método rápido y eficaz para confirmar que el anticuerpo radiomarcado aún reconoce CD20 como antígeno. En una clínica, también se evaluaron células HSB CD20-negativas. Las células liofilizadas se prepararon y almacenaron de acuerdo con el método anterior, "Preparación de Células SB y HSB Liofilizadas".
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i. Ensayo de Unión de In2B8 Reactivos Adicionales:
1. Indio-[111]-2B8-MX-DTPA
2. Células SB liofilizadas; tres tubos que contenían 25 X 10^{6} células/tubo.
3. Células HSB liofilizadas; tres tubos que contenían 25 X 10^{6} células/tubo.
4. Agua para irrigación estéril o agua para inyección estéril.
5. Tampón de dilución (1X PBS, pH 7,2 - 7,4 que contenía Albúmina Sérica Bovina (BSA) al 1%, y Azida Sódica al 0,02% filtrado en 0,2 \mum y almacenado a temperatura ambiente).
6. Tubos de ensayo de vidrio o plástico para contar la radiactividad.
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Procedimiento: Preparación del ensayo (parte no radiactiva)
1. Se obtuvieron tres tubos de células SB y HSB liofilizadas.
2. Se añadió un volumen de 0,50 ml de SWFI (agua para inyección estéril) a cada tubo, y los tubos se agitaron con vórtice hasta que se obtuvieron suspensiones homogéneas.
3. Cuatro tubos de microfuga de 1,5 ml vacíos. A tres de los tubos se añadieron 0,50 ml de tampón de dilución, que representan un control sin células.
4. Al otro tubo de microfuga de 1,5 ml, se le añadieron 0,99 ml de tampón de dilución; este tubo se etiquetó 1:100.
5. Se obtuvo un tubo de polipropileno estéril de 50 ml con tapón y se añadieron 10 ml de tampón de dilución al tubo.
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Preparación del ensayo (parte radiactiva)
1. Se obtuvo el anticuerpo radiomarcado almacenado a 2ºC-8ºC.
2. Se extrajo un volumen de 0,01 ml con una P20 y se añadido al tubo de microfuga de 1,5 ml que contenía 0,99 ml de tampón de dilución (dilución 1:100). Se aclaró la punta y se agitó con vórtice suavemente el tubo para mezclarlo.
3. Se extrajo un volumen de 0,20 ml con una P200 del tubo de dilución 1:100 y se añadió al tubo cónico que contenía 10 ml de tampón de dilución. El tubo se mezcló minuciosamente.
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Protocolo de Ensayo
1. Se añadió un volumen de 0,50 ml del ^{111}In2B8-MX-DTPA diluido a todos los tubos.
2. Se apretaron los tapones en todos los tubos, y se mezclaron los tubos de forma continua durante 60 minutos.
3. Después de 60 minutos de incubación a temperatura ambiente, todos los tubos se centrifugaron durante 5 minutos a un mínimo de 2000 g.
4. Se transfirió un volumen de 0,75 ml de cada sobrenadante a los tubos apropiados para el instrumento de recuento.
5. Se contó la radiactividad de los tubos usando un contador gamma, ajustando el fondo.
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ii. Ensayo de Unión de Y2B8
Reactivos Adicionales:
1. 90Y2B8-MX-DTPA
2. Células SB liofilizadas
3. Agua para irrigación estéril o agua para inyección estéril
4. Tampón de dilución (1X PBS, pH 7,2 - 7,4 que contenía Albúmina Sérica Bovina (BSA) al 1%, y Azida Sódica al 0,02%)
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Procedimiento: Preparación de la muestra de anticuerpo radiomarcado
1. Se obtuvo el anticuerpo radiomarcado almacenado a 2ºC-8ºC.
2. Se extrajo un volumen de 10 \mul con una P20 y se añadió a un tubo de microfuga de 1,5 ml que contenía 990 \mul de tampón de dilución (dilución 1:100). Se aclaró la punta y el tubo se agitó en vórtice ligeramente.
3. Se obtuvo un tubo de polipropileno estéril de 50 ml con tapón y se transfirieron 10 ml de tampón de dilución al tubo, usando una pipeta serológica de 10 ml.
4. Se extrajo un volumen de 35 \mul con una P200 del tubo de dilución 1:100 y se añadió al tubo cónico que contenía 10 ml de tampón de dilución. Se mezclaron minuciosamente.
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Preparación Celular Liofilizada
1. Se obtuvieron tres tubos de células SB liofilizadas.
2. Se añadió un volumen de 0,5 ml de SWFI a cada tubo, y los tubos se agitaron con vórtice hasta que se obtuvo una única suspensión celular.
3. Se obtuvieron tres tubo de microfuga de 1,5 ml vacíos; a tres de los tubos se añadieron 0,5 ml de tampón de dilución se añadió, que representan un control sin células.
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Protocolo de Ensayo
1. Se añadió un volumen de 0,5 ml del ^{90}Y2B8-MX-DTPA diluido a cada tubo.
2. Los tubos se colocaron en una mezcladora de tambor vertical durante 45 minutos, después de asegurarse que los tapones estaban bien cerrados.
3. Después de 45 minutos de incubación a temperatura ambiente, las células se sedimentaron por microcentrifugación durante 5 minutos.
4. Se transfirió un volumen de 0,8 ml del sobrenadante a viales de centelleo.
5. Se añadió cóctel de centelleo a cada vial.
6. La cantidad de radiactividad en cada vial se determinó usando un contador de centelleo, ajustando el fondo.
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b. Ensayo de Radioincorporación
El porcentaje de radioincorporación se determinó por cromatografía en capa fina instantánea (ITLC) usando el Kit Radiocromatográfico Biodex Tec-Control de acuerdo con el siguiente protocolo:
Materiales y Equipo Adicionales:
1. 2B8-MX-DTPA radiomarcado con ^{111}In o ^{90}Y
2. Tubos para el recuento de tiras TLC radiactivas
3. Tijeras
4. Jeringa estéril, 1 cc
5. Agujas estériles, 26G
6. Contador gamma o contador de centelleo
7. Pipeteador
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Procedimiento:
1. Primero debe leerse el Manual de Funcionamiento Biodex completo.
2. Cada muestra radiomarcada se ensayó por triplicado de acuerdo con las instrucciones del kit; se reveló una tira por vial.
3. Para aplicar la muestra radiomarcada en la tira de cromatografía, se usó un pipeteador para aplicar puntualmente 1 \mul en le línea de origen. Como alternativa, puede aplicarse una pequeña gota dosificada desde una aguja 26G unida a una jeringa estéril de 1 cc.
4. Cada sección se contó para la actividad usando el contador apropiado, es decir, un contador gamma para ^{111}In y un contador de centelleo para ^{90}Y, ajustando el fondo.
5. Se siguieron las instrucciones de Biodex para calcular el porcentaje de anticuerpo radiomarcado.
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IV. Resultados
Los resultados de ensayar cada lote de validación de In2B8 o Y2B8 se resumen en las Tablas 38 y 39.
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TABLA 38 Resultados del Ensayo de Liberación para Validación de Y2B8
63
TABLA 39 Resultados del Ensayo de Liberación para Lotes de Validación de In2B8
64
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V. Discusión y Conclusiones
Para simplificar los métodos de radiomarcaje actuales para In2B8 e Y2B8, se desarrolló un kit de cuatro componentes. Las concentraciones de acetato sódico y 2B8-MX-DTPA se redujeron a 50 mM y 2 mg/ml, respectivamente, para permitir transferencias de volúmenes precisos usando jeringas. Todos los componentes de kit estaban cargados preferiblemente en viales de tabiques de vidrio y se ensayaron para la esterilidad y pirogenicidad por IDEC antes de su liberación, eliminando de este modo la necesidad de realizar estos ensayos e las clínicas. En el sitio, se realizaron todas las manipulaciones de los reactivos usando jeringas y agujas estériles. Por lo tanto, la adherencia de una técnica aséptica habitualmente encontrada en un entorno de radiofarmacia asegura que los anticuerpos radiomarcados y formulados son adecuados para la administración al paciente.
La reproducibilidad y robustez de los protocolos de radiomarcaje para In2B8 e Y2B8 se evaluó realizando varias realizaciones de validación usando diferentes lotes de cada radioisótopo. Para los seis lotes de validación de In2B8 preparados, la unión variaba del 82,1% al 86,8% con una media del 85,1%; los valores de radioincorporación fueron de aproximadamente el 99% (intervalo del 98,3% al 99,4%). Para los seis lotes de validación de Y2B8 preparados, el porcentaje de unión obtenido estaba en el intervalo del 78,6% al 87,0% con una media del 82,3%. Los valores de radioincorporación para Y2B8 promediaban el 98,8% (intervalo del 96,3% al 99,5%). Juntos, estos resultados confirman la reproducibilidad y robustez de los métodos del kit de radiomarcaje para la preparación tanto de In2B8 como de Y2B8. En base a estos resultados de validación, se recomienda que las especificaciones de salida para la radioincorporación y la unión se establezcan a \geq95% y \geq70%, respectivamente, tanto para In2B8 como Y2B8.
Además, a causa de la facilidad aumentada de uso y el potencial reducido errores durante la preparación, se recomienda que el porcentaje de unión usando células CD20-positivas liofilizadas y la radioincorporación a usar se ensayen para la liberación de In2B8 e Y2B8 en los sitios clínicos.
Para resumir, estos resultados en conjunto indican que In2B8 e Y2B8 preparados usando el kit de radiomarcaje son adecuados para su uso en la situación clínica. Además, para ambos anticuerpos radiomarcados, las especificaciones de salida se establecen reflejando los resultados de varias realizaciones de validación por los cinco operarios diferentes.
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Ejemplo 2
Radioincorporación y Unión - Kits y Ensayos I. Sumario
El anticuerpo monoclonal murino anti-CD20 denominado 2B8 se ha clonado en células en CHO para producir una línea celular de elevada expresión. La especificidad del anticuerpo derivado de CHO por células humanas CD20-positivas se demostró por análisis FACS y unión competitiva. Se observó unión insignificante a células T humanas. La afinidad del anticuerpo por células CD20-positivas se determinó a 1,3 X 10^{-10} M usando un ensayo de unión competitiva. El anticuerpo se hizo reaccionar con el agente quelante MX-DTPA para formar un conjugado, 2B8-MX-DTPA, con pérdida insignificante de inmunorreactividad (el valor de afinidad era de 4,4 X 10^{-10} M). La conjugación óptima del quelador, determinada midiendo la radioincorporación de ^{111}In, se consiguió después de ocho horas de reacción. Los protocolos de radiomarcaje para 2B8-MX-DTPA se optimizaron para ^{90}Y o ^{111}In con respecto al pH y el tiempo de incubación para asegurar la radioincorporación (\geq95%) y la retención de inmunorreactividad (\geq70%) máximas. Las especificaciones de salida para In2B8 e Y2B8 preparados usando 2B8-MX-DTPA derivado de CHO en ensayos clínicos se recomendaron para la radioincorporación (\geq95%) y la unión (\geq70%) a células humanas CD20-positivas liofilizadas y reconstituidas. Tomados en conjunto, estos resultados indican la idoneidad de 2B8-MX-DTPA derivado de CHO para su uso en ensayos clínicos.
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II. Introducción
El anticuerpo 2B8 previamente usado se produjo en biorreactores de fibra hueca. Para reducir los costes de fabricación de este anticuerpo, se ha clonado y expresado en células CHO para producir una línea celular de producción de elevada expresión. Este ejemplo describe los resultados de la caracterización in vitro del anticuerpo 2B8 derivado de CHO, el anticuerpo conjugado (2B8-MX-DTPA), y los productos de anticuerpo marcado con ^{90}Y y ^{111}In preparados usando los protocolos del kit de radiomarcaje clínico.
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III. Materiales y Métodos A. Reactivos
Las líneas celulares humanas SB (CD20-positiva) y HSB (CD20-negativa) se obtuvieron de la American Type Culture Collection y se cultivaron en matraces en T usando RPMI-1640 que contenía suero bovino fetal al 10% suplementado con glutamina al 2%. Los cultivos se mantuvieron a 37ºC y CO_{2} al 5%. Las células se dividieron típicamente 1:2 en días alternos y se recogieron a 0,5-2,5 x 10^{6} células/ml y con viabilidad >80%. Las concentraciones celulares se determinaron usando un hemacitómetro y la viabilidad se determinó por exclusión de azul de tripano. La información específica sobre los lotes de las células se registra en el Cuaderno nº 1553 y en la carpeta titulada "Cell Activity Logbook 1995 & 1996" autorizada por Ron Morena.
2B8 derivado de CHO se produjo según las condiciones GMP en la instalación de fabricación de IDEC. El anticuerpo se formuló en solución salina normal de bajo contenido en metales a 11,5 mg/ml. Se determinó que los anticuerpos eran homogéneos por SDS-PAGE. 2B8-MX-DTPA se produjo según las condiciones GMP de acuerdo con PSBR-043 a partir de 2B8 derivado de CHO y se formuló en solución salina de bajo contenido en metales a 2 mg/ml (Lotes nº 0165A y 0165B).
El cloruro de ^{111}In de calidad farmacéutica se adquirió de Amersham (U.K.) o Ciclotron Products Inc. (Coral Gables, FL). El cloruro de itrio[90] se obtuvo de Amersham (U.K.), Nordion International (Kanatta, Canadá), o Pacific Northwest National Laboratory (Richland, WA). El MX-DTPA preparado según GMP se obtuvo de Hauser Chemical (Boulder, CO). El ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA) de calidad clínica se obtuvo de Heyl (Berlin, Alemania). TAG-NHS se obtuvo de IGEN Inc. (Rockville, MD). Las perlas de anti-CD19 murino se adquirieron de Dynal Inc. (Lake Success, NY). El F(ab')_{2} de cabra anti-ratón marcado con FITC se adquirió de Jackson Immuno-
Research.
Los reactivos que requerían retirada de metales pesados contaminantes se trataron por lotes con Chelex 100 (BioRad Industries) o con Sepharose Quelante (Pharmacia) pasando las soluciones a través de una columna. Las soluciones madre de bajo contenido en metales se diluyeron con Agua para Irrigación Estéril (SWFIr). Las soluciones se almacenaron en recipientes de plástico estériles.
Los reactivos adicionales se describen a continuación para métodos específicos.
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B. Materiales y Equipo
1. Analizador Origen; IGEN Inc. Modelo nº 1100-1000; IDEC nº 1492
2. Contador de centelleo Top-Count; Packard, Modelo nº A9912; IDEC nº 1329
3. Contador gamma; Isodata, Modelo nº 20-10; IDEC nº 0628
4. Kit Radiocromatográfico Tec-Control, Biodex, Modelo nº 151-770
5. Liofilizador; Virtis, Modelo Freezemobile 12; IDEC nº 0458
Se describen materiales y equipo adicionales para métodos específicos.
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C. Métodos 1. Preparación de Células SB y HSB Liofilizadas
Las células se cultivaron como se ha descrito anteriormente y se recogieron a temperatura ambiente a una densidad celular de 0,5-2 X 10^{6} células/ml por centrifugación (1300 rpm en una centrífuga Sorvall) y se lavaron dos veces con 1X HBSS. Las células sedimentadas se resuspendieron a 50 x 10^{6} células/ml en 1X HBSS que contenía albúmina sérica bovina (BSA) al 1% (p/v) y manitol al 10% (p/v/) (tampón de liofilización), se dosificaron 0,5 ml en tubos de microfuga de polipropileno de 1,5 ml con juntas tóricas y se almacenaron a -70ºC, y se liofilizaron durante una noche a 3,99-7,98 Pa (30-60 militor). Los tubos de células liofilizadas se almacenaron desecadas a 2-8ºC y se reconstituyeron en agua estéril para los ensayos; los tubos de células liofilizadas en tubos de microfuga se almacenaron con desecante.
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2. Análisis de Unión FACS
La unión directa de anticuerpos a células B humanas se determinó por citometría de flujo. Se incubaron concentraciones crecientes de anticuerpo en 1X PBS, pH 7,2, que contenía BSA al 1% (p/v) (tampón de unión) con 5 X 10^{6} células CD20-positivas (SB) o CD20-negativas (HSB) durante 30 min. en hielo. Las células se lavaron por centrifugación, se resuspendieron en tampón de unión, y se incubaron con F(ab')_{2} de cabra anti-ratón marcado con FIAC durante 30 min. en hielo. Después de incubación con el reactivo secundario, las células se lavaron por centrifugación y se resuspendieron en 1X PBS que contenía formaldehído al 1,1% (v/v) para fijar las células. La intensidad de fluorescencia media se determinó usando citometría de flujo.
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3. Ensayos de Unión Competitiva
La inmunorreactividad de 2B8 y 2B8-MX-DTPA se determinó por unión competitiva a células SB CD20-positivas usando el método electroquimioluminescente ORIGEN (Leland y Powell). Se recogieron células SB en fase log del cultivo y se lavaron dos veces con 1X HBSS. Las células se diluyeron en 1X PBS pH 7,2 que contenía albúmina sérica bovina al 1% (p/v). En algunos experimentos, se usaron células liofilizadas después de su reconstitución con agua estéril.
Se preparó anticuerpo indicador marcado con rutenio incubado 2B8 derivado de CHO (lote nº 165) en 1X PBS, pH 7,2 con el quelador tris-bipiridina del éster N-hidroxisuccinimida de rutenio (II) (TAG-NHS) a una proporción molar 15:1 de TAG-NHS a anticuerpo. Después de 1 h de incubación a temperatura ambiente, protegido de la luz, la reacción se interrumpió con glicina durante 10 min. Se retiró el TAG si reaccionar por cromatografía por exclusión de tamaño usando una columna Pharmacia PD-10 equilibrada con 1X PBS. La concentración de proteína se determinó usando el ensayo de proteínas de Bradford. La incorporación TAG se determinó midiendo la absorbancia a 455 nm. La proporción molar de TAG a proteína se calculó a 3,0.
Los ensayos se realizaron en tubos de polipropileno de 12 X 75 mm. Se incubaron cantidades variables de anticuerpo competidos (0,002 -17 \mug/ml) en 1X PBS, pH 7,2, que contenía BSA al 1% (p/v) con 0,08 \mug/ml de 2B8 de CHO marcado con TAG, 0,08 mg/ml de perlas anti-CD19, y 167.000 células/ml. Después de incubación a temperatura ambiente con mezcla orbital durante 3 h, se determinó la electroquimioluminescencia (ECL) relativa usando el instrumento ORIGEN. Los valores de ECL medios se determinaron para muestras duplicadas y se representaron frente a la concentración de anticuerpo competidos usando el software Kaleidagraph. Para algunos experimentos, se presentó el porcentaje de inhibición. Se ajustaron las curvas de competición y se determinaron los calores de EC50 (concentración de anticuerpo que da el 50% de la unión máxima) usando el siguiente programa de 4 parámetros:
y = ((m1-m4)/(1+(m0/m3)^{\wedge}m2))+m4; m1=;m2=;m3=;m4=
m0 = variable independiente
m1 = respuesta de señal cero en unidades de ECL relativa
m2 = parámetro de curvatura
m3 = EC50 en \mug/ml
m4 = respuesta de señal máxima en unidades de ECL relativa
Los valores de afinidad promedio se calcularon a partir de los valores de EC50 y la concentración conocida del anticuerpo indicador usando el método de Muller.
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4. Preparación de 2B8-MX-DTPA
El agente quelante, ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilenotriamina-pentaacético (MX-DTPA) se proporcionó en forma de un polvo seco (ácido libre) y se almacenó desecado a -20ºC o -70ºC. Aproximadamente 3 mg de anticuerpo 2B8 de CHO en solución salina normal de bajo contenido en metales se ajustaron a pH 8,6 añadiendo una décima parte del volumen de borato sódico 50 mM, pH 8,6. El anticuerpo a 10-11 mg/ml se incubó a una proporción molar 4:1 de MX-DTPA a proteína añadiendo MX-DTPA disuelto en borato sódico 50 mM, pH 8,6. Después de incubación a temperatura ambiente (2 a 24 h), se retiró el quelador sin reaccionar del conjugado por diafiltración repetitiva en solución salina normal de bajo contenido en metales usando filtros de centrifugación Centricon 30.
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5. Preparación de In2B8 e Y2B8
In2B8 se preparó usando el protocolo del kit de radiomarcaje descrito en este documento. El anticuerpo se marcó a una actividad específica de 3 mCi/mg y se formuló a 0,2 mg/ml. En resumen, se transfirieron de 0,5 a 2 mCi de cloruro de ^{111}In a un tubo de microfuga sin metales y se ajustaron a aproximadamente pH 4,2 usando un volumen 1,2X de acetato sódico 50 mM de bajo contenido en metales. Se añadió 2B8-MX-DTPA a 2 mg/ml a la solución de acetato de indio y después de incubación a temperatura ambiente durante 30 min., se formuló el anticuerpo marcado a 0,2 mg/ml en 1X PBS, pH 7,2 que contenía albúmina sérica humana al 7,5% (p/v) y DTPA 1 mM (concentración final del 4% al 6% de HSA). Todas las muestras se ensayaron para la radioincorporación por triplicado; los valores eran >95%.
Y2B8 también se preparó usando una versión a pequeña escala del protocolo del kit de radiomarcaje descrito en el Ejemplo 1. El anticuerpo se marcó a una actividad específica de 15 mCi/mg y se formuló a 0,3 mg/ml. En resumen, se transfirieron de 0,5 a 2 mCi de cloruro de ^{90}Y a un tubo de microfuga sin metales y se ajustaron a aproximadamente pH 4,2 usando un volumen 1,2X de acetato sódico 50 mM de bajo contenido en metales. Se añadió 2B8-MX-DTPA a 2 mg/ml a la solución de acetato de ^{90}Y y después de incubación a temperatura ambiente durante 5 min., se formuló el anticuerpo marcado a 0,3 mg/ml en 1X PBS, pH 7,2 que contenía albúmina sérica humana al 7,5% (p/v) y DTPA 1 mM (concentración final de HSA, del 4% al 6%). Todas las muestras se ensayaron para la radioincorporación por triplicado; los valores eran >95%.
Las concentraciones de radiactividad de los productos radiomarcados finales se calcularon en base a la cantidad de radiactividad añadida a la mezcla de reacción y por referencia al Certificado de Análisis para el radioisótopo. Las concentraciones de anticuerpo de las mezclas de reacción inactivadas se calcularon a partir de la cantidad conocida de anticuerpo añadido.
Para estudios de cinética de radiomarcaje que evalúan en efecto del pH sobre la radioincorporación y la unión, el pH de las mezclas de reacción se ajustó añadiendo cantidades variables de acetato sódico 50 mM de bajo contenido en metales (volumen 0,8 a 2,2X de la solución de radioisótopo).
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6. Determinación de la Radioincorporación para In2B8 e Y2B8
La cantidad de radiactividad asociada con los conjugados (radioincorporación) en los productos finales o muestras de incubación se determinó usando un kit disponible en el mercado fabricado por Biodex (Kit Radiocromatográfico Tec-Control; véase el Ejemplo 1). En general, se aplicó 1 \mul de las muestras de ensayo por duplicado o triplicado usando una micropipeta y se reveló de acuerdo con el inserto de instrucciones Biodex. Se contaron las mitades de las tiras para la radiactividad en tubos de vidrio usando un contador gamma Isodata o un contador de centelleo Packard Top Count como se describe a continuación. La incorporación de radiomarcador se calculó dividiendo la cantidad de radiactividad en la mitad superior de la tira por la radiactividad total encontrada en las mitades tanto superior como inferior. Este valor se expresó como un porcentaje y se determinó el valor medio.
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7. Determinación de Inmunorreactividad de In2B8 e Y2B8
La inmunorreactividad se evaluó usando el método de Lindmo et al. y como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1.
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8. Ensayo de Unión Directa para In2B8 e Y2B8
Se usaron los mismos protocolos descritos en este documento para determinar la unión a células SB CD20-positivas para In2B8 y Y2B8, respectivamente. In2B8 e Y2B8 se prepararon y formularon como se ha descrito anteriormente. Para el ensayo, se diluyeron muestras de In2B8 o Y2B8 con tampón de dilución de ensayo (1X PBS, pH 7,2, que contenía albúmina sérica bovina (BSA) al 1% (p/v) a 40 ng/ml y 11 ng/ml, respectivamente).
Las células positivas al antígeno (SB) y negativas al antígeno (HSB) se mantuvieron en RPMI 1640 suplementado con suero de ternera fetal al 10% a 37ºC y CO_{2} al 5%. Las células (viabilidad >90% determinada por exclusión de azul de tripano) se recogieron a temperatura ambiente a una densidad celular de 0,5 - 2 x 10^{6} células/ml por centrifugación (1300 rpm en una centrífuga Sorvall) y se lavaron dos veces con 50 ml de HBSS 1X. Las células sedimentadas se resuspendieron a 50 x 10^{6} células/ml en HBSS 1X pre-refigerado que contenía albúmina sérica bovina (BSA) al 1% (p/v) y manitol al 10% (p/v/) (tampón de liofilización). Las suspensiones celulares se dosificaron en tubos de microfuga de polipropileno de 1,5 ml con juntas tóricas a 50 X 10^{6} células/ml (0,5 ml por tubo) y se liofilizaron durante una noche de 3,99 a 7,98 Pa (30 a 60 militor). Las células liofilizadas se almacenaron desecadas a 2-8ºC y se reconstituyeron en agua estéril para los ensayos.
Las células SB y HSB liofilizadas en tubos de polipropileno de 1,5 ml se reconstituyeron a 50 X 10^{6} células/ml usando agua estéril. Se añadieron In2B8 o Y2B8 liofilizados a las células, por triplicado, y se incubaron durante 45 a 60 min. con mezcla en tambor vertical a temperatura ambiente, respectivamente. Después de la incubación, las células se sedimentaron por centrifugación y se determinó la radiactividad unida a las células contando las muestras en un contador gamma Isodata o un contador de centelleo Packard Top Count como se describe a continuación. La radiactividad unida (B) a las células se calculó restando la radiactividad no unida (sobrenadante) de la radiactividad total añadida. La radiactividad total se determinó a partir de la radiactividad contada en tubos sin células. El porcentaje de unión se calculó expresando los recuentos unidos como un porcentaje de los recuentos totales.
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9. Medición de Radiactividad
Las muestras de radioincorporación se contaron durante 1 min. usando un contador gamma Isodata. El contador estaba ajustado para una ventana de energía de 100-500 KeV y el fondo se ajustó a cero inmediatamente antes de su uso para las muestras usando ^{111}In. El contador gamma Isodata también se usó para contar las tiras de ITLC que tenía ^{90}Y aplicado sobre las mismas. Las ventanas de energía para la detección de la radiación bremsstrahlung eran de 100-1000 KeV.
Para los ensayos de unión, se transfirieron muestras de ^{90}Y a placas de 24 pocillos y cóctel MicroScint 40 y se contaron en un Packard Top Count durante 1 min. usando ajustes de energía mínima y máxima. Las muestras de indio-[111] se contaron durante 1 min. usando un contador gamma Isodata. El contado estaba ajustado para ventanas de energía de 100-500 KeV y el fondo se ajustaba a cero inmediatamente antes de su uso.
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10. Especificaciones de Salida para Dosis Clínicas de In2B8 e Y2B8
Las especificaciones de salida para la radioincorporación y la unión a células CD20-positivas se establecieron preparando seis dosis de In2B8 e Y2B8 usando dos lotes de 2B8-MX-DTPA de calidad clínica (lotes nº 0219 y 0220) preparados de acuerdo con la presente descripción y cargados según las condiciones GMP. Se realizaron ensayos de liberación como se ha descrito anteriormente.
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IV. Resultados A. Caracterización de 2B8 Derivado de CHO
Usando análisis citométrico de flujo, se demostró que 2B8 de CHO se une directamente a células SB CD20-positivas sin unión a células HSB CD20-negativas. (Figura 34). No se observó unión significativa a células SB o HSB para un anticuerpo de isotipo irrelevante (\gamma1\kappa) (S004).
La unión de 2B8 de CHO a células CD20-positivas se evaluó en ensayos de competición usando el sistema de detección quimioluminiscente ORIGEN. Se incubaron células SB positivas al antígeno liofilizadas y reconstituidas con cantidades crecientes de anticuerpo en presencia de 2B8 de CHO marcado con indicador rutenio. Los resultados mostraron que 2B8 CHO inhibe la unión a células CD20-positivas al mismo grado que el anticuerpo derivado de biorreactores de fibra hueca (2B8-49) (Figura 35). Los valores de EC50 se determinaron gráficamente y se usó el método de Muller (1980) para calcular los valores de afinidad promedio. La afinidad de 2B8 de CHO se determinó a 1,3 X 10^{-10} M; el anticuerpo 2B8 derivado de biorreactores de fibra hueca dio un valor de afinidad de 2,5 10^{-10} M. La unión no específica fue insignificante como se demuestra por la ausencia de competición con el anticuerpo de isotipo irrelevante, S004.
B. Caracterización de 2B8-MX-DTPA Derivado de CHO
El conjugado 2B8 (2B8-MX-DTPA) se preparó usando un protocolo similar al usado para el 2B8-49 previamente caracterizado. Se realizaron reacciones usando aproximadamente 3 mg de anticuerpo y una proporción molar 4:1 de quelador a anticuerpo. Se evaluaron los tiempos de incubación de 2, 4, 8, 17, y 24 h para determinar el tiempo de reacción que daba una retención aceptable de la unión a células CD20 positivas y elevada radioincorporación con ^{111}In. Las curvas de unión competitiva que comparan 2B8 de CHO con conjugado 2B8-MX-DTPA de CHO reaccionado durante 8-24 h eran similares, lo que indica que el proceso de conjugación no alteraba significativamente la unión del anticuerpo al antígeno CD20 (Figura 36). Usando los valores de EC50 determinados gráficamente (Figura 36), las constantes de afinidad para los anticuerpos no conjugado y conjugado variaban de 2,3 X 10^{-10} M a 5,9 X 10^{-10} M (Tabla 40). La radioincorporación era >95% para los tiempos de conjugación de 8 a 24 h (Tabla 30).
TABLA 40 Efecto del Tiempo de Reacción de Conjugación sobre la Radioincorporación e inmunorreactividad de 2B8-MX-DTPA de CHO
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C. Caracterización de In2B8 e Y2B8 Preparados a Partir de 2B8-MX-DTPA Derivado de CHO
2B8-MX-DTPA de CHO marcado con Indio-[111] (In2B8) se preparó usando el protocolo del kit de radiomarcaje a pequeña escala descrito previamente para el anticuerpo derivado del biorreactor de fibra hueca (Ejemplo 1). En resumen, el anticuerpo conjugado (2B8-MX-DTPA derivado de CHO; lote nº 0165A) se incubó con acetato de ^{111}In al pH indicado durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las mezclas de reacción se formularon con PBS, pH 7,2, que contenía albúmina sérica humana al 7,5% (p/v) y DTPA 1 mM. Las muestras formuladas de In2B8 se ensayaron para la radioincorporación usando cromatografía en capa fina instantánea. La unión de In2B8 a células CD20-positivas se determinó usando células SB liofilizadas y reconstituidas. Para comparación, el conjugado preparado a partir de anticuerpo producido por hibridoma (2B8-49) se incubó con acetato de ^{111}In durante 30 min. a pH 4,2 (condiciones previamente establecidas para este anticuerpo).
Se realizaron estudios de cinética para determinar las condiciones de marcaje que proporcionan la retención máxima de unión a células CD20-positivas y elevada radioincorporación (Tablas 41 y 42). El anticuerpo conjugado (2B8-MX-DTPA derivado de CHO) se incubó a temperatura ambiente con acetato de ^{111}In a pH 4,2 durante los tiempos indicados (Tabla 42).
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TABLA 41 Cinética de Radiomarcaje de In2B8: Efecto del pH sobre la Radioincorporación y la Unión a Células CD20-Positivas
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TABLA 42 Cinética de Radiomarcaje de In2B8: Efecto del Tiempo de Incubación sobre la Radioincorporación y la Unión a Células CD20-Positivas
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Los resultados demostraron que para el intervalo de pH 3,0 a 4,6 y un tiempo de incubación de 30 min., se obtenía >97% de radioincorporación del radioisótopo manteniendo al mismo tiempo una unión a aproximadamente el 84%. Los valores de radioincorporación y unión eran invariantes para los tiempos de incubación de 15 a 45 min. para reacciones a pH 2,9 a 4,6 (Tabla 42). Los resultados eran comparables a los obtenidos usando el anticuerpo 2B8-49 (Tablas 41 y 42).
El anticuerpo marcado con itrio-[90] se preparó incubando el anticuerpo conjugado (2B8-MX-DTPA derivado de CHO) con acetato de ^{90}Y al pH indicado durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las mezclas de reacción se formularon en PBS, pH 7,2 que contenía albúmina sérica humana al 7,5% (p/v) y DTPA 1 mM. Las muestras formuladas de Y2B8 se ensayaron para la radioincorporación usando cromatografía en capa fina instantánea. La unión de Y2B8 a células CD20-positivas se determinó usando células SB liofilizadas y reconstituidas. Para la comparación, se incubó el conjugado preparado a partir de anticuerpo producido por hibridoma (2B8-49) con acetato de ^{90}Y durante 5 min. a pH 4,2 (condiciones previamente establecidas para este anticuerpo).
Se realizaron estudios cinéticos similares para evaluar la preparación del anticuerpo marcado con ^{90}Y (Y2B8). Para reacciones de radiomarcaje en el intervalo de pH de 3,9 a 4,7 a un tiempo de incubación de 5 min., La radioincorporación era >96% con >80% de retención de la unión a células CD20-positivas (Tabla 43). Se obtuvieron resultados similares para tiempos de incubación de 3, 5, y 10 min. para el intervalo de pH de 2,9 a 4,6 (Tabla 44). Después, se incubó el anticuerpo conjugado (2B8-MX-DTPA derivado de CHO) a temperatura ambiente con acetato de ^{90}Y a pH 4,2 durante los tiempos indicados (Tabla 44). Los resultados fueron comparables a los obtenidos usando el anticuerpo 2B8-49 (Tablas 43 y 44).
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TABLA 41 Cinética de Radiomarcaje de Y2B8: Efecto del pH sobre la Radioincorporación y la Unión a Células CD20-Positivas
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TABLA 42 Cinética de Radiomarcaje de Y2B8: Efecto del Tiempo de Incubación sobre la Radioincorporación y la Unión a Células CD20-Positivas
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Las inmunorreactividades para In2B8 e Y2B8 preparados a partir de CHO 2B8 se determinaron usando el método de Lindmo et al. Se incubaron cantidades crecientes de células SB CD20-positivas recién recogidas con una cantidad fija de In2B8 o Y2B8 en condiciones de exceso de antígeno. El análisis del diagrama recíproco de los datos de unión permitió determinar inmunorreactividades del 80,6% y el 72,2% para In2B8 e Y2B8, respectivamente (Figuras 37 y 38).
D. Especificaciones de Salida para In2B8 e Y2B8 derivados de CHO
Se usaron dos lotes del kit de radiomarcaje de In2B8/Y2B8 de calidad clínica para preparar seis lotes de In2B8 e Y2B8. In2B8 e Y2B8 se prepararon usando versiones a pequeña escala de los protocolos de radiomarcaje actualmente usados en los ensayos clínicos. Cada lote de 2B8-MX-DTPA radiomarcado se ensayó para la radioincorporación y la unión a células humanas CD20-positivas (SB) y CD20-negativas (HSB). Estos resultados se resumen en las Tablas 45 y 46. Para los seis lotes de In2B8 preparados, la radioincorporación variaba del 98,9% al 99,3% con una media del 99,1%. La unión a células CD20-positivas variaba del 81,9% al 85,1% con una media del 83,6%; la unión a células CD20-negativas era <4%. Para los seis lotes de Y2B8 preparados, la radioincorporación variaba del 97,4% al 98,7% con una media del 98,2%. La unión a células CD20-positivas variaba del 81,4% al 82,7% con una media del 81,9%; la unión a células CD20-negativas era <8%.
TABLA 45 Resultados del Ensayo de Liberación para In2B8 Derivado de CHO Preparado Usando el Protocolo del Kit de Radiomarcaje
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TABLA 46 Resultados del Ensayo de Liberación para Y2B8 Derivado de CHO Preparado Usando el Protocolo del Kit de Radiomarcaje
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V. Discusión y Conclusiones
El anticuerpo monoclonal murino anti-CD20 (2B8) clonado y expresado en células CHO (2B8 derivado de CHO) mantiene la especificidad por células humanas CD20-positivas como se muestran por análisis FACS y de unión competitiva. La unión a células T humanas era mínima. La afinidad del anticuerpo por células humanas CD20-positivas se determinó a 1,3 X 10^{-10} M usando un ensayo de unión competitiva. Usando el mismo ensayo, el anticuerpo 2B8 derivado de biorreactores de fibra hueca daba un valor de afinidad de 2,5 X 10^{-10} M.
El anticuerpo 2B8 de CHO se hizo reaccionar con MX-DTPA para formar un conjugado, 2B8-MX-DTPA, manteniendo al mismo tiempo la retención de la inmunorreactividad. La incorporación óptima de quelador se determinó midiendo la radioincorporación con ^{111}In y se consiguió después de ocho horas de incubación a temperatura ambiente. Los protocolos de radiomarcaje para el conjugado 2B8-MX-DTPA se optimizaron para ^{90}Y o ^{111}In con respecto al pH y el tiempo de incubación para asegurar la radioincorporación y retención de inmunorreactividad máximas.
Los resultados de varias preparaciones de In2B8 e Y2B8 demuestran la reproducibilidad del protocolo de radiomarcaje usado para preparar dosis clínicas. En base a estos resultados de radiomarcaje, se sugiere que las especificaciones de salida para la radioincorporación y la unión, usando células CD20-positivas liofilizadas, se establezcan a \geq95% y \geq70%, respectivamente. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran la comparabilidad de 2B8 derivado de CHO y 2B8-49 derivado de fibra hueca, e indican la idoneidad del 2B8-MX-DTPA derivado de CHO para su uso en ensayos clínicos.
Finalmente, la presente descripción describe un procedimiento de marcaje, conocido como el método "mezclar y usar", para la preparación de dosis clínicas de anticuerpos radiomarcados que obvia la necesidad de la etapa de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) actualmente usada para la retirada del radioisótopo no unido a proteína. El protocolo simplificado elimina esta etapa de purificación laboriosa manteniendo al mismo tiempo un elevado nivel de radioincorporación de isótopo (>95%) y retención mejorada de inmunorreactividad (>70%). Se descubrió que el conjugado radiomarcado formulado clínicamente era estable in vitro cuando se incubaba a 4ºC durante 48 horas en base a la retención de radioisótopo e inmunorreactividad. Además, el conjugado radiomarcado era estable cuando se incubaba en suero humano a 37ºC durante 72 horas. Los estudios de biodistribución en ratones BALB/c demostraron ausencia de deposición tisular inusual, y ausencia de acumulación significativa en el hueso. Las estimaciones de las dosis absorbidas de radiación para un ser humano "normal" de 70 kg eran comparables con las obtenidas en un ensayo clínico en curso usando 2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y. Los resultados de estos estudios mostraron que 2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y producido usando el protocolo "mezclar y usar" era comparable con el preparado usando el proceso de HPLC convencional. La validación del protocolo de aumento en escala para preparar conjugado radiomarcado de calidad clínica mostró que el método era reproducible y que el producto era comparable con el producido usando el método de HPLC actual. Los resultados de estos estudios preclínicos indican que este nuevo protocolo "mezclar y usar" puede usarse para preparar 2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y adecuado para su uso en ensayos
clínicos.
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Claims (27)

1. Un método para radiomarcar un anticuerpo conjugado con quelador con ^{90}Y para su administración a un paciente, que comprende:
(i) mezclar un anticuerpo conjugado con quelador con una solución que contiene ^{90}Y para formar una mezcla;
(ii) incubar la mezcla a una temperatura apropiada durante 10 minutos o menos para producir un anticuerpo radiomarcado, donde el anticuerpo radiomarcado tiene más del 95% de radioincorporación de modo que puede administrarse directamente a un paciente sin purificación adicional del ^{90}Y no incorporado; y
(iii) diluir el anticuerpo radiomarcado en un tampón de formulación a una concentración apropiada para dicha administración a un paciente.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo conjugado con quelador comprende un anticuerpo anti-CD20.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el anticuerpo anti-CD20 es 2B8-MX-DTPA.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la solución que contiene ^{90}Y se ajusta a un pH de 3 a 6 antes de mezclarse con el anticuerpo conjugado con quelador.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el pH se ajusta con una solución de acetato sódico de bajo contenido en metales.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la solución de acetato sódico está a una concentración de 10 a 1000 mM.
7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la cantidad en volumen de ^{90}Y usada está entre 5 y 100 mCi dividida por la concentración de radiactividad en el momento del marcaje.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la cantidad en volumen de ^{90}Y usada es de 45 mCi dividida por la concentración de radiactividad en el momento del marcaje.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en el que de 1 a 2 ml de anticuerpo conjugado con MX-DTPA a una concentración de 0,5 a 30 mg/ml se mezcla con la solución que contiene ^{90}Y.
10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el tampón de formulación se añade en una cantidad necesaria para conseguir un volumen final total de 10 ml a 50 ml.
11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el tampón de formulación comprende una solución salina fisiológica, un radioprotector y quelador no conjugado con proteína.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el radioprotector es albúmina sérica humana (HSA), ascorbato, ácido ascórbico, fenol, sulfitos, glutatión, cisteína, ácido gentísico, ácido nicotínico, palmitato de ascorbilo, HOP(:O)H_{2}, glicerol, formaldehído sulfoxilato sódico, Na_{2}S_{2}O_{5}, Na_{2}S_{2}O_{3}, o SO_{2}.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el radioprotector es HSA.
14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la HSA está a una concentración del 1 al 25% (p/v).
15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la concentración de HSA es de aproximadamente el 7,5% (p/v).
16. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el radioprotector es ascorbato.
17. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el ascorbato está a una concentración de 1 a 100 mg/ml.
18. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el quelador no conjugado con proteína es DTPA o EDTA.
19. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en el que la concentración de DTPA es aproximadamente 1 mM.
20. Un ensayo de unión para determinar el porcentaje de unión de un anticuerpo radiomarcado a su célula diana, que comprende:
(i) radiomarcar un anticuerpo de acuerdo con el método de la reivindicación 1 para producir un anticuerpo radiomarcado;
(ii) mezclar e incubar al menos una alícuota del anticuerpo radiomarcado con al menos una alícuota de células positivas al antígeno;
(iii) mezclar e incubar al menos una alícuota del anticuerpo radiomarcado idéntica a la alícuota de la etapa (ii) con al menos una alícuota de tampón de dilución del mismo volumen que la alícuota de células positivas al antígeno de la etapa (ii) como control;
(iv) sedimentar las células por centrifugación;
(v) medir la radiactividad en el sobrenadante de las células sedimentadas y el control; y
(vi) comparar la cantidad de radiactividad en el sobrenadante celular con la cantidad de radiactividad en el control.
21. El ensayo de unión de acuerdo con la reivindicación 20, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo anti-CD20.
22. El ensayo de unión de acuerdo con la reivindicación 21, en el que el anticuerpo anti-CD20 es 2B8.
23. El ensayo de unión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en el que dicho antígeno es CD20.
24. El ensayo de unión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en el que dichas células positivas al antígeno son células SB (ATCC nº CCL120).
25. El ensayo de unión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24 que comprende adicionalmente:
(i) mezclar al menos una alícuota del anticuerpo radiomarcado con al menos una alícuota de células negativas al antígeno;
(ii) sedimentar las células negativas al antígeno por centrifugación;
(iii) medir la radiactividad en el sobrenadante de las células sedimentadas negativas al antígeno; y
(iv) comparar la cantidad de radiactividad en el sobrenadante celular negativo al antígeno con la cantidad de radiactividad en el sobrenadante del sobrenadante celular positivo al antígeno y el control.
26. El ensayo de unión de acuerdo con la reivindicación 25, en el que dichas células negativas al antígeno son CD20-negativas.
27. El ensayo de unión de acuerdo con la reivindicación 26, en el que dichas células CD20-negativas son células HSB (ATCC nº CCL120.1).
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