ES2328100T3 - Kit de radiomarcaje y ensayo de union. - Google Patents
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Abstract
Un método para radiomarcar un anticuerpo conjugado con quelador con 90 Y para su administración a un paciente, que comprende: (i) mezclar un anticuerpo conjugado con quelador con una solución que contiene 90 Y para formar una mezcla; (ii) incubar la mezcla a una temperatura apropiada durante 10 minutos o menos para producir un anticuerpo radiomarcado, donde el anticuerpo radiomarcado tiene más del 95% de radioincorporación de modo que puede administrarse directamente a un paciente sin purificación adicional del 90 Y no incorporado; y (iii) diluir el anticuerpo radiomarcado en un tampón de formulación a una concentración apropiada para dicha administración a un paciente.
Description
Kit de radiomarcaje y ensayo de unión.
La presente descripción se refiere a ensayos de
unión de anticuerpos y kits de radiomarcaje, preparaciones
celulares liofilizadas, reactivos y protocolos para ensayar la
eficacia clínica de anticuerpos terapéuticos para el
tratamiento/formación de imágenes de tumores y células tumorales.
Específicamente, los kits de la presente descripción se usan para
preparar y evaluar conjugados de anticuerpos radiomarcados que se
usarán para el tratamiento y la formación de imágenes de tumores de
linfoma de células B marcando el antígeno superficial de células B
BP35 ("CD20").
Todas las publicaciones y solicitudes de patente
de este documento se incorporan por referencia en la misma medida
que si cada publicación individual o solicitud de patente estuviera
específica e individualmente indicada como incorporada por
referencia.
El sistema inmune de los vertebrados (por
ejemplo, los primates, que incluyen los seres humanos, simios,
monos, etc.) consta de varios órganos y tipos celulares que han
evolucionado hasta: reconocer de forma precisa y específica
microorganismos extraños ("antígenos") que invaden el
hospedador vertebrado; unirse específicamente a dichos
microorganismos extraños; y, eliminar/destruir dichos
microorganismos extraños. Los linfocitos, así como otros tipos de
células, son críticos para el sistema inmune. Los linfocitos se
producen en el timo, el bazo y la médula ósea (en adultos) y
representan aproximadamente el 30% de los glóbulos blancos totales
presentes en el sistema circulatorio de los seres humanos (en
adultos).
Hay dos sub-poblaciones
principales de linfocitos: células T y células B. Las células T son
responsables de la inmunidad mediada por células, mientras que las
células B son responsables de la producción de anticuerpos
(inmunidad humoral). Sin embargo, las células T y las células B
pueden considerarse como interdependientes - en una respuesta
inmune típica, las células T se activan cuando el receptor de
células T se une a fragmentos de un antígeno que se unió a las
glicoproteínas del complejo principal de histocompatibilidad
("MHC") sobre la superficie de una célula presentadora de
antígeno; dicha activación causa la liberación de mediadores
biológicos ("interleuquinas") que, en esencia, estimulan a las
células B a diferenciarse y producir anticuerpos
("inmunoglobulinas") contra el antígeno.
Cada célula B dentro el hospedador expresa un
anticuerpo diferente sobre su superficie, por tanto una célula B
expresará un anticuerpo específico para un antígeno, mientras que
otra célula B expresará un anticuerpo específico para un antígeno
diferente. Por consiguiente, las célula B son bastante diversas, y
esta diversidad es crítica para el sistema inmune. En seres
humanos, cada célula B puede producir una cantidad enorme de
moléculas de anticuerpo (es decir, aproximadamente de 10^{7} a
10^{8}). Dicha producción de anticuerpos muy típicamente cesa (o
disminuye sustancialmente) cuando el antígeno extraño se ha
neutralizado. Ocasionalmente, sin embargo, la proliferación de una
célula B particular continuará sin disminución; dicha proliferación
puede provocar un cáncer conocido como "linfoma de células
B".
Las células T y las células B comprenden ambas
proteínas de superficie celular que pueden utilizarse como
"marcadores" para la diferenciación e identificación. Uno de
dichos marcadores de células B humanas es el antígeno de
diferenciación restringido a linfocitos B humanos Bp35, mencionado
como "CD20". CD20 se expresa durante el desarrollo temprano de
células pre-B y permanece hasta la diferenciación de
células plasmáticas. Específicamente, la molécula CD20 puede
regular una etapa en el proceso de activación que es necesaria para
el inicio del ciclo celular y la diferenciación y habitualmente se
expresa a niveles muy elevados en células B neoplásicas
("tumorales"). CD20, por definición, está presente tanto en
células B "normales" como en células B "malignas", es
decir, aquellas células B cuya proliferación sin disminución puede
conducir a linfoma de células B. Por tanto, el antígeno de
superficie CD20 tiene el potencial de servir como candidato para
"marcar" linfomas de células B.
En esencia, dicho marcaje puede generalizarse
del siguiente modo: se inyectan anticuerpos específicos para el
antígeno de superficie CD20 de células B, por ejemplo, en un
paciente. Estos anticuerpos anti-CD20 se unen
específicamente al antígeno de superficie celular CD20
(ostensiblemente) tanto de células B normales como de células B
malignas; el anticuerpo anti-CD20 unido al antígeno
de superficie CD20 puede conducir a la destrucción y eliminación de
células B neoplásicas. Además, pueden conjugarse agentes químicos o
marcadores radiactivos que tienen el potencial de destruir el tumor
con el anticuerpo anti-CD20 de modo que el agente se
"suministre" específicamente a, por ejemplo, las células B
neoplásicas. Independientemente del enfoque, un objetivo principal
es destruir el tumor: el enfoque específico puede determinarse por
el anticuerpo anti-CD20 particular que se utiliza
y, por tanto, los enfoques disponibles para marcar el antígeno CD20
pueden variar considerablemente.
Por ejemplo, se ha informado de intentos en
dicho marcaje de antígeno superficial CD20. El anticuerpos
monoclonal murino (ratón) 1F5 (un anticuerpo
anti-CD20) se administró según se informa por
infusión intravenosa continua a pacientes con linfoma de células B.
Se requirieron, según se informa, niveles extremadamente elevados
(>2 gramos) de 1F5 para eliminar las células tumorales en
circulación, y los resultados se describieron como
"transitorios". Press et al., "Monoclonal Antibody
1F5 (Anti-CD20) Serotherapy of Human
B-Cell Lymphomas", Blood
69/2:584-591 (1987).
Un problema potencial con este enfoque es que
anticuerpos monoclonales no humanos (por ejemplo, anticuerpos
monoclonales murinos) típicamente carecen de funcionalidad efectora
humana, es decir, son incapaces, entre otras cosas, de mediar la
lisis dependiente del complemento o de lisar células diana humanas a
través de la toxicidad celular dependiente de anticuerpo o la
fagocitosis mediada por el receptor Fc. Además, los anticuerpos
monoclonales no humanos puede reconocerlos el hospedador humano como
una proteína extraña; por lo tanto, inyecciones repetidas de dichos
anticuerpos extraños pueden conducir a la inducción de respuestas
inmunes que conducen a reacciones de hipersensibilidad dañinas.
Para anticuerpos monoclonales de base murina, esto a menudo se
menciona como una respuesta de Anticuerpo Humano
Anti-Ratón, o respuesta "HAMA". Además, a estos
anticuerpos "extraños" puede atacarlos el sistema inmune del
hospedador de tal modo que se neutralicen, en efecto, antes de que
alcancen su sitio diana.
Los linfocitos y las células de linfoma son
sensibles de forma inherente a radioterapia. Por lo tanto, las
malignidades de células B son dianas atractivas para
radioinmunoterapia (RIT) por varias razones: la emisión local de
radiación ionizante de anticuerpos radiomarcados puede eliminar
células con o sin el antígeno diana (por ejemplo, CD20) en cercana
proximidad al anticuerpo unido al antígeno; la radiación penetrante,
es decir, emisores beta, puede obviar el problema de acceso
limitado al anticuerpo en tumores voluminosos o poli vascularizados;
y, la cantidad total de anticuerpo requerida puede reducirse. El
radionúclido emite partículas radiactivas que pueden dañar el ADN
celular hasta el punto en que los mecanismos de reparación celular
son incapaces de permitir que la célula continúe viviendo; por lo
tanto, si las células diana son tumores, el marcador radiactivo
elimina de forma beneficiosa las células tumorales. Los anticuerpos
radiomarcados, por definición, incluyen el uso de una sustancia
radiactiva que puede requerir la necesidad de precauciones tanto
para el pacientes (es decir, posible transplante de médula ósea)
como el asistente sanitario (es decir, la necesidad de ejercer un
elevado grado de precaución cuando se trabaja con
radiactividad).
Por lo tanto, un enfoque para mejorar la
capacidad de anticuerpos monoclonales murinos de realizar el
tratamiento de trastornos de células B ha sido conjugar un marcador
radiactivo con el anticuerpo de tal modo que el marcador o toxina
se localice en el sitio del tumor. También se han conjugado toxinas
(es decir, agentes quimioterapéuticos tales como doxorrxubicina o
mitomicina C) a anticuerpos. Véase, por ejemplo, la solicitud
publicada PCT WO 92/07466 (publicada el 14 de mayo de 1992).
Se han desarrollado anticuerpos
"quiméricos", es decir, anticuerpos que comprenden partes de
dos o más especies diferentes (por ejemplo, ratón y ser humano)
como una alternativa a los anticuerpos "conjugados". Se han
creado anticuerpo quiméricos de ratón/ser humano, y ha demostrado
mostrar las características de unión del anticuerpo de ratón
parental, y las funciones efectoras asociadas con la región
constante humana. Véase, por ejemplo, Cabilly et al.,
Patente de Estados Unidos 4.816.567; Shoemaker et al.,
Patente de Estados Unidos 4.978.745; Beavers et al., Patente
de Estados Unidos 4.975.369; y Boss et al., Patente de
Estados Unidos 4.816.397 todas las cuales se incorporan por
referencia en este documento. Generalmente estos anticuerpos
quiméricos se construyen preparando una biblioteca genómica de
genes a partir de ADN extraído de hibridomas murinos
pre-existentes. Nishimura et al. (1987)
Cancer Research 47: 999. La biblioteca se explora después para genes
de la región variable para las cadenas tanto pesada como ligera que
muestren los patrones de reordenamiento correctos de los fragmentos
de anticuerpos. Los genes clonados de la región variable después se
ligan en un vector de expresión que contiene casetes clonados del
gen apropiado de la región constante humana de cadena pesada o
ligera. Los genes quiméricos se expresan después en una línea
celular de elección, habitualmente una línea de mieloma murino.
Por ejemplo, Liu, A.Y., et al.,
"Production of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal
Antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent Biologic
Activity", J. Immun. 139/10:3521-3526 (1987),
describe un anticuerpo quimérico e ratón/ser humano dirigido contra
el antígeno CD20. Véase también, la Publicación PCT Nº WO 88/04936.
Sin embargo, no se proporciona información en cuanto a la
capacidad, eficacia o viabilidad de usar los anticuerpos quiméricos
de Liu para el tratamiento de trastornos de células B en la
referencia.
Se observa que ensayos funcionales in
vitro (por ejemplo, lisis dependiente del complemento
("CDC"); citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos
("ADCC"), etc.) no pueden predecir de forma inherente la
capacidad in vivo de ningún anticuerpo de destruir o
eliminar las células diana que expresan el antígeno específico.
Véase, por ejemplo, Robinson, R.D., et al., "Chimeric
mouse-human anti-carcinoma
antibodies that mediate different antitumor cell biological
activities", Hum. Antibod. Hybridomas, 2:84-93
(1991) (anticuerpo quimérico de ratón-ser humano
que tiene actividad ADCC indetectable). Por lo tanto, la eficacia
terapéutica potencial de los anticuerpos solamente puede evaluarse
realmente por experimentación in vivo.
Para este fin, las solicitudes en trámite junto
con la presente 08/475.813, 08/475.815 y 08/478.967, incorporadas
en este documento por referencia en su totalidad, describen
conjugados anti-CD20 radiomarcados para la
"formación de imágenes" diagnósticas de tumores de linfoma de
células B antes de la administración de anticuerpos terapéuticos.
El conjugado "In2B8" comprende un anticuerpo monoclonal murino,
2B8, específico para el antígeno CD20 humano, que está unido a
indio[111] (^{111}In) mediante un quelador bifuncional, es
decir, MX-DTPA (ácido
dietilenotriaminapentaacético), que comprende una mezcla 1:1 de
1-isotiocianatobencil-3-metil-DTPA
y
1-metil-3-isotiocianatobencil-DTPA.
El indio-[111] se selecciona como radionúclido diagnóstico porque
emite radiación gamma y encuentra uso previo como agente de
formación de imágenes.
Se conocen patentes que se refieren a queladores
y conjugados queladores en la técnica. Por ejemplo, la Patente de
Estados Unidos Nº 4.831.175 de Gansow se refiere a quelatos de ácido
dietilenotriaminapentaacético polisustituidos y conjugados
proteicos que contienen los mismos, y métodos para su preparación.
Las Patentes de Estados Unidos Nº 5.099.069, 5.246.692, 5.286.850,
y 5.124.471 de Gansow también se refieren a quelatos de DTPA
polisustituidos. Estas patentes se incorporan en este documento en
su totalidad.
El quelador bifuncional específico usado para
facilitar la quelación en la solicitudes 08/475.813, 08/475.815 y
08/478.967 se seleccionó ya que tiene elevada afinidad por metales
trivalentes, y proporciona proporciones aumentadas
tumor-a-no tumor, captación ósea
disminuida, y mayor retención in vivo del radionúclido en
sitios diana, es decir, sitios de tumor de linfoma de células B. Sin
embargo, se conocen otros queladores bifuncionales en la técnica y
también pueden ser beneficiosos en terapia tumoral.
También se describen en las solicitudes
08/475.813, 08/475.815 y 08/478.967 anticuerpos terapéuticos
radiomarcados para el marcaje y destrucción de linfomas de células
B y células tumorales. En particular, el conjugado Y2B8 comprende
el mismo anticuerpo monoclonal murino anti-CD20
humano, 2B8, unido a itrio-[90] (^{90}Y) mediante el mismo
quelador bifuncional. Este radionúclido se seleccionó para terapia
por varias razones. La vida media de 64 horas de ^{90}Y es
suficientemente larga para permitir la acumulación de anticuerpo por
el tumor y, a diferencia, por ejemplo, e ^{131}I, es un emisor
beta puro de elevada energía sin irradiación gamma acompañante en
su deterioro, con un intervalo de diámetros celulares de 100 a 1000.
La cantidad mínima de radiación penetrante permite la
administración a pacientes externos de anticuerpos marcados con
^{90}Y. Además, no es necesaria la internalización de anticuerpos
marcados para la eliminación celular, y la emisión local de
radiación ionizante debe ser letal para células tumorales
adyacentes que carecen del antígeno diana.
Como el radionúclido ^{90}Y se unió al
anticuerpo 2B8 usando la misma molécula queladora bifuncional
MX-DTPA, el conjugado Y2B8 tiene las mismas
ventajas analizadas anteriormente, por ejemplo, retención aumentada
de radionúclido en un sitio diana (tumor). Sin embargo, a
diferencia de ^{111}In, no puede usarse para propósitos de
formación de imágenes debido a la ausencia de radiación gamma
asociada con el mismo. Por tanto, puede usarse un radionúclido
diagnóstico de "formación de imágenes", tal como ^{111}In,
para determinar la localización y tamaño relativo de un tumor antes
de y/o después de la administración de anticuerpos quiméricos
terapéuticos o marcados con ^{90}Y para el propósito de reducción
del tumor. Además, un anticuerpo marcado con indio posibilita que
se haga una evaluación dosimétrica.
Dependiendo del uso pretendido del anticuerpo,
es decir, como un reactivo de diagnóstico o terapéutico, se conocen
otros radiomarcadores en la técnica y se han usado para propósitos
similares. Por ejemplo, los radionúclidos que se han usado en
diagnosis clínica incluyen ^{131}I, ^{125}I, ^{123}I,
^{99}Tc, ^{67}Ga, así como ^{111}In. Los anticuerpos también
se han marcado con una diversidad de radionúclidos para su uso
potenciar inmunoterapia dirigida (Peirersz et al. (1987) The
use of monoclonal antibody conjugates for the diagnosis and
treatment of cancer. Immunol. Cell Biol.
65:111-125). Estos radionúclidos incluyen ^{188}Re
y ^{186}Re así como ^{90}Y, y en menos medida ^{199}Au y
^{67}Cu. También se ha usado I-[131] para propósitos terapéuticos.
La Patente de Estados Unidos Nº 5.460.785 proporciona un listado de
dichos radioisótopos y se incorpora en este documento por
referencia.
Como se informa en las solicitudes en trámite
junto con la presente 08/475.813, 08/475.815 y 08/478.967 la
administración del conjugado Y2B8 radiomarcado, así como el
anticuerpo quimérico anti-CD20 no marcado, produjo
una reducción tumoral significativa en ratones que portaban un tumor
linfoblástico de células B. Además, ensayos clínicos en seres
humanos presentados en las mismas mostraron una eliminación
significativa de células B en pacientes con linfoma infudidos con
anticuerpo quimérico anti-CD20. De hecho,
recientemente se ha anunciado un 2B8 quimérico como el primer
anticuerpo monoclonal anti-cáncer aprobado por la
FDA de la nación con el nombre de Rituxan®. Por tanto, al menos un
anticuerpo quimérico anti-CD20 ha mostrado demostrar
eficacia terapéutica en el tratamiento de linfoma de células B.
Además, la Solicitud de Estados Unidos con Nº de
serie 08/475.813, incorporada en este documento por referencia,
describe la administración secuencial de Rituxan®, un
anti-CD20 quimérico, con anticuerpo monoclonal
murino tanto marcado con indio como marcado con itrio o con cada
uno de ellos. Aunque los anticuerpos radiomarcados usados en estas
terapias combinadas son anticuerpos murinos, el tratamiento inicial
con anti-CD20 quimérico elimina suficientemente la
población de células B de modo que se disminuya la respuesta HAMA,
facilitando de este modo un régimen terapéutico y de diagnóstico
combinado.
Por tanto, en este contexto de inmunoterapia
combinada, los anticuerpos murinos pueden encontrar utilidad
particular como reactivos de diagnóstico. Además, se ha mostrado en
la Solicitud de Estados Unidos 08/475.813 que una dosificación
terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD20
marcado con itrio después de la administración de Rituxan® es
suficiente para (a) eliminar cualquier célula B sanguínea periférica
restante no eliminada por el anticuerpo anti-CD20
quimérico; (b) comenzar la eliminación de células B desde los
nódulos linfáticos; o (c) comenzar la eliminación de células B
desde otros tejidos.
Por tanto, la conjugación de radiomarcadores con
anticuerpos terapéuticos contra el cáncer proporciona una
herramienta clínica valiosa que puede usarse para evaluar la
eficacia terapéutica potencial de dichos anticuerpos, crear
reactivos de diagnóstico para controlar el progreso del tratamiento,
y concebir reactivos terapéuticos adicionales que puedan usarse
para potenciar el potencial inicial de eliminación de tumores del
anticuerpo quimérico. Dada la eficacia demostrada de un anticuerpo
anti-CD20 en el tratamiento de linfoma no Hodgkin,
y la sensibilidad conocida de los linfocitos a la radiactividad,
sería muy ventajoso para dichos anticuerpos terapéuticos que
llegaran a estar disponibles en el mercado en forma de kit por el
cual pudieran modificarse fácilmente con un radiomarcador y
administrarse directamente al paciente en la situación clínica.
Aunque existen muchos métodos y reactivos para
conseguir el radiomarcaje de anticuerpos, de lo que se carece en la
técnica es de un vehículo adecuado para colocar estos reactivos en
la situación clínica, de un modo que puedan producirse fácilmente y
administrarse al paciente antes del deterioro significativo del
radiomarcador o la destrucción significativa del anticuerpo debido
a la existencia del radiomarcador. La ausencia de dicho medio
adecuado para comercializar esta tecnología valiosa podría deberse a
las malas eficacias de incorporación demostradas por algunos
protocolos de marcaje, y la posterior necesidad de purificar en
columna el reactivo después del procedimiento de radiomarcaje. La
demora en el desarrollo de dichos kits también puede deberse en
parte a la ausencia previa de accesibilidad a radioisótopos
comerciales puros que puedan usarse para generar de forma eficaz
productos marcados sin purificación posterior. Como alternativa,
quizá la razón de que dichos kits estén generalmente no disponibles
es la ausencia real de anticuerpos que hayan sido capaces de
conseguir la aprobación o la eficacia que Rituxan® ha conseguido
para el tratamiento de linfoma en pacientes humanos.
Por ejemplo, como se analiza en la Patente de
Estados Unidos 4.636.380, incorporada en este documento por
referencia, generalmente se ha creído en la comunidad científica que
para que un compuesto radiofarmacéutico encuentre utilidad clínica,
debe soportar un proceso de separación y purificación largo y
tedioso. De hecho, no sería deseable inyectar radiomarcador no
unido en el paciente. La necesidad de etapas de purificación
adicionales vuelve al proceso de radiomarcaje de anticuerpos en la
situación clínica en imposible, particularmente para doctores que
no tienen ni el equipo ni el tiempo para purificar sus propios
compuestos terapéuticos.
Además, las proteínas radiomarcadas pueden ser
inherentemente inestables, particularmente aquellas marcadas con
isótopos radiolíticos tales como ^{90}Y, que tienen tendencia a
causar daño al anticuerpo el tiempo que estén unidos al mismo en
cercana proximidad. A su vez, dicha radiolisis causa eficacia no
fiable del compuesto terapéutico debido a la pérdida de
radiomarcador y/o la unión reducida al antígeno diana, y puede
conducir a respuestas inmunes indeseadas dirigidas a la proteína
desnaturalizada. Todavía sin las instalaciones para marcar y
purificar los anticuerpos en el sitio, los médicos no han tenido
elección salvo solicitar anticuerpos terapéuticos ya marcados, u
obtenerlos marcados fuera del sitio en una instalación relacionada y
transportados después de marcarlos para la administración al
paciente. Todas estas manipulaciones agregan un tiempo muy preciado
entre el marcaje y la administración, contribuyendo de este modo a
la inestabilidad del compuesto terapéutico, disminuyendo al mismo
tiempo, de hecho, la utilidad de los kits de radiomarcaje en la
situación clínica.
Otros han intentado, de forma insatisfactoria,
desarrollar kits de radiomarcaje de anticuerpos que fueran
suficientemente competentes para prescindir de una etapa de
purificación diferente del anticuerpo. Por ejemplo, Cytogen
recientemente ha lanzado un kit comercial para radiomarcar un
anticuerpo monoclonal murino dirigido contra la glicoproteína
asociada a tumores TAG-72. Sin embargo, el
anticuerpo de Cytogen es particularmente poco susceptible a una
formulación de kit debido a la tendencia de desarrollar particulados
durante el almacenamiento que después deben eliminarse por una
etapa de filtración adicional. Además, el anticuerpo de Cytogen ha
causado reacciones adversas en los pacientes debido a respuestas
HAMA.
Otros han reivindicado haber desarrollado
protocolos de radiomarcaje que serían susceptibles al formato de
kit porque no se requeriría una etapa diferente de purificación
(Richardson et al. (1987) Optimization and batch production
of DTPA-labeled antibody kits for routine use in
111In immunoscintography. Nuc. Med. Commun.
8:347-356; Chinol and Hnatowich (1987)
Generator-produced yttrium-[90] for
radioimmunotherapy. J. Nucl. Med. 28(9):
1465-1470). Sin embargo, dichos protocolos no eran
capaces de conseguir el nivel de incorporación que se ha conseguido
en la presente invención usando los protocolos descritos en este
documento, que han provocado eficacias de incorporación de al menos
el 95%. Dicho nivel de incorporación proporciona el beneficio
añadido de seguridad aumentada, porque prácticamente no se
inyectará marcador sin unir en el paciente como resultado de la
baja radioincorporación.
Finalmente, el documento WO 94/11026 describe
métodos terapéuticos que implican la administración de anticuerpos
anti-CD20 radiomarcados. También se describen
métodos para preparar dichos anticuerpos radiomarcados.
Los protocolos incluidos en los kits de la
presente descripción permiten el rápido marcaje que puede realizarse
en aproximadamente media hora o en tan poco como cinco minutos
dependiendo del marcador. Además, los protocolos de kit de la
presente descripción tienen una eficacia de marcaje de más del 95%
prescindiendo de este modo de la necesidad de purificación
adicional. Prescindiendo de la necesidad de purificación adicional,
la vida media del radiomarcador y la integridad del anticuerpo se
reservan para el propósito terapéutico para el que está marcado.
La presente solicitud describe kits y métodos
adecuados por los cuales pueden radiomarcarse anticuerpos de
diagnóstico y terapéuticos y administrarse a un paciente de un modo
reproducible, fiable y conveniente. Los kits de la presente
descripción transforman el proceso de radiomarcaje de los
anticuerpos en un proceso normalizado, libre de problemas y
preocupaciones, que facilita enormemente los protocolos de
tratamiento de los pacientes. Los presentes kits proporcionan
ventajas sobre la técnica anterior porque se han determinado los
parámetros óptimos para marcar y administrar anticuerpos
terapéuticos o de diagnóstico, reduciendo de este modo el coste de
bienes. Como los kits descritos en este documento proporcionan los
parámetros óptimos de acuerdo con el marcador particular, el uso de
un kit diseñado para un marcador particular también minimizará la
canibalización, es decir, lo que sucede cuando se usa un kit
inapropiado para un marcador particular. Evitando la canibalización
también se proporciona a su vez una eficacia óptima de marcaje.
Además, los protocolos e ingredientes estériles, libres de
pirógenos incluidos con cada kit conllevan un proceso más fácil para
el usuario, ya que se obvian en ensayo de esterilidad y pirógenos y
la purificación post-marcaje de los reactivos.
\vskip1.000000\baselineskip
En base a la descripción que está contenida en
este documento, la presente invención proporciona, en un primer
aspecto, un método para radiomarcar un anticuerpo conjugado con
quelador con ^{90}Y para su administración a un paciente, que
comprende:
(i) mezclar un anticuerpo conjugado con quelador
con una solución que contiene ^{90}Y para formar una mezcla;
(ii) incubar la mezcla a una temperatura
apropiada durante 10 minutos o menos para producir un anticuerpo
radiomarcado, donde el anticuerpo radiomarcado tiene una
radioincorporación mayor del 95% de modo que puede administrarse
directamente a un paciente sin purificación adicional del ^{90}Y
no incorporado; y
(iii) diluir el anticuerpo radiomarcado en un
tampón de formulación a una concentración apropiada para dicha
administración a un paciente.
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto relacionado, la presente invención
proporciona un ensayo de unión para determinar el porcentaje de
unión de un anticuerpo radiomarcado a su célula diana, que
comprende:
(i) radiomarcar un anticuerpo de acuerdo con el
método del primer aspecto de la invención para producir un
anticuerpo radiomarcado;
(ii) mezclar e incubar al menos una alícuota del
anticuerpo radiomarcado con al menos una alícuota de células
positivas al antígeno;
(iii) mezclar e incubar al menos una alícuota
del anticuerpo radiomarcado idéntica a la alícuota de la etapa (ii)
con al menos una alícuota de tampón de dilución del mismo volumen
que la alícuota de células positivas al antígeno en la etapa (ii)
como control;
(iv) sedimentar las células por
centrifugación;
(v) medir la radiactividad en el sobrenadante de
las células sedimentadas y el control; y
(vi) comparar la cantidad de radiactividad en el
sobrenadante celular con la cantidad de radiactividad en el
control.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos aspectos de la presente invención, y
realizaciones de esos aspectos, se exponen en las reivindicaciones
adjuntas.
De forma más general, sin embargo, la presente
descripción describe un kit para radiomarcar un anticuerpo de
diagnóstico o terapéutico antes de su administración a un paciente,
que comprende al menos (i) un vial que contiene un anticuerpo
conjugado con quelador, (ii) un vial que contiene tampón de
formulación para estabilizar y administrar el anticuerpo
radiomarcado, y (iii) instrucciones para radiomarcar el anticuerpo,
donde dichos componentes de vial se suministra en una cantidad tal
y a una concentración tal que cuando se combinan con un
radiomarcador de suficiente pureza y actividad de acuerdo con las
instrucciones del kit, no se requiere purificación adicional del
anticuerpo marcado antes de su administración a dicho paciente.
Además, cuando se marca de acuerdo con las instrucciones del kit y
con un radioisótopo de suficiente pureza y actividad, dicha
incorporación de isótopo puede alcanzar niveles mayores del 95%, e
incluso tan elevados como del 98% o más elevados.
El anticuerpo incluido en el kit es más
preferiblemente un anticuerpo anti-CD20. El
anticuerpo se suministra en una forma por la cual está unido a un
quelador bifuncional. Preferiblemente, el anticuerpo está conjugado
con MX-DTPA, pero pueden usarse otros queladores
tales como DTPA conjugado con fenilo o bencilo,
ciclohexil-DTPA, derivados de EDTA y DOTA. Un
quelador de acuerdo con la presente invención puede ser cualquier
quelador que sea al menos bifuncional, es decir, que tenga al menos
dos sitios de unión (al menos un sitio para quelar un ión metálico
y al menos un sitio para acoplarse a un ligando proteico).
Dependiendo del anticuerpo usado, el anticuerpo
conjugado se suministra típicamente a una concentración de 0,5 a 30
mg/ml, más preferiblemente 2 mg/ml. El volumen de anticuerpo
conjugado dependerá de la concentración y la cantidad requerida
para el marcaje óptimo dependiendo del radiomarcador. Sin embargo,
el anticuerpo conjugado tiene que suministrarse en un volumen y
concentración tales que el volumen completo se añada al vial de
reacción usando una jeringa estéril y una técnica aséptica. Esto
permitirá una reproducibilidad aumentada y facilidad de uso. Todos
los reactivos de los kits descritos en este documento son estériles
y están libres de pirógenos, y están diseñados específicamente para
su simplicidad y rapidez para avanzar directamente desde el ensayo
del anticuerpo a su administración. Con algunos marcadores, puede
que no se requiera la necesidad de ensayar la eficacia de
marcaje.
Un componente particularmente ventajoso del kit
es el tampón de formulación para estabilizar frente a los efectos
de radiolisis y para administrar el anticuerpo conjugado
radiomarcado a un paciente. El tampón de formulación es un vehículo
farmacéuticamente aceptable que sirve como diluyente para el
anticuerpo marcado y también como tampón de administración. Aunque
puede usarse cualquier diluyente farmacéuticamente aceptable para
administrar anticuerpos terapéuticos o de diagnóstico al paciente,
el tampón de formulación de la presente descripción es
particularmente adecuado para administrar anticuerpos
radiomarcados.
Por ejemplo, el tampón de formulación de la
presente descripción comprende un radioprotector tal como albúmina
sérica humana (HSA) o ascorbato, que minimiza la radiolisis debida
al itrio, y en menor medida, indio. Se conocen otros
radioprotectores en la técnica y también podrían usarse en el tampón
de formulación de la presente descripción, es decir, aceptores de
radicales libres (fenol, sulfitos, glutatión, cisteína, ácido
gentísico, ácido nicotínico, palmitato de ascorbilo,
HOP(:O)H_{2}, glicerol, formaldehído sulfoxilato sódico,
Na_{2}S_{2}O_{5}, Na_{2}S_{2}O_{3}, y SO_{2},
etc.).
Debe apreciarse que, aunque generalmente se
emplean radioprotectores en el tampón de formulación para proteger
el anticuerpo de la radiolisis, puede ser posible realizar una
protección adicional incluyendo el radioprotector en el tampón de
reacción también. Generalmente eso no se ha hecho anteriormente, es
decir, con HSA, debido a la presencia de metales que impedirían el
proceso de marcaje. Sin embargo, puede ser posible "limpiar" la
HSA usando una resina quelante de tal modo que pudiera incluirse
también en el tampón de reacción. También puede necesitarse tratar
con ascorbato u otros radioprotectores para retirar metales
contaminantes.
El tampón de formulación de la presente
descripción también comprende un exceso de quelador sin conjugar.
El propósito de incluir quelador sin conjugar es que este quelador
sirve para eliminar cualquier radiomarcador no unido a proteínas en
el paciente, y realizar la excreción del radiomarcador reduciendo de
este modo la captación de isótopos "de acumulación ósea", es
decir, ^{90}Y, por los huesos del paciente. Por ejemplo, cuando
el anticuerpo del kit se conjuga a un quelador DTPA, el exceso de
DTPA o cualquier otro quelador puede incluirse en el tampón de
formulación. El tampón de formación también se suministra
preferiblemente en un volumen tal que los contenidos completos se
transfieran al vial de reacción. Como se ha analizado anteriormente,
esto provoca una facilidad aumentada de uso y reproducibilidad
porque no tienen que medirse y transferirse volúmenes exactos.
Un tampón de formulación preferido comprende
solución salina tamponada con fosfato o fisiológica, albúmina
sérica humana y DTPA. La albúmina sérica humana está preferiblemente
a una concentración entre aproximadamente el 1 y el 25% (p/v), y
más preferiblemente a una concentración de aproximadamente el 7,5%
(p/v). La concentración de DTPA es preferiblemente aproximadamente
1 mM. Puede usarse ascorbato como alternativa a la albúmina sérica
humana, y se usa típicamente a una concentración de aproximadamente
1 a 100 mg/ml. No obstante, puede usarse un intervalo más amplio de
concentraciones sin comprometer la seguridad del paciente.
El anticuerpo del kit de radiomarcaje se marca
fácilmente con un radioisótopo de elección mediante un quelador
bifuncional de acuerdo con los métodos de la presente descripción.
Por simplicidad adicional a este respecto, el kit de la presente
descripción también puede incluir un vial que contiene un tampón
para ajustar el pH de la solución de radioisótopo, y un vial de
reacción de vidrio estéril para realizar el marcaje y posteriormente
para resuspender el anticuerpo radiomarcado final en tampón de
formulación. Un vial de reacción de 10 ml típicamente es
suficiente, pero también pueden usarse viales capaces de albergar de
5 a 20 ml. El tampón es preferiblemente una solución de acetato
sódico de bajo contenido en metales a una concentración de 10 a 1000
mM, más preferiblemente 50 mM.
Un kit específico de la presente descripción
comprende el anticuerpo conjugado con MX-DTPA,
2B8-MX-DTPA. 2B8 es un anticuerpo
anti-CD20 que ha mostrado afectar a la eliminación
de células B después de su administración a pacientes con linfoma.
Sin embargo, debe ser evidente para los especialistas en la técnica
que el kit de radiomarcaje de la presente descripción puede
optimizarse para el radiomarcaje de otros anticuerpos
anti-CD20, o cualquier otro anticuerpo que se haya
conjugado con DTPA u otro quelador polivalente. El kit preferido de
la presente descripción puede comprender al menos (i) un vial que
contiene el anticuerpo 2B8 conjugado con MX-DTPA,
en solución o liofilizado (que requiere reconstitución); y (ii) un
vial que contiene tampón de formulación para administrar el
anticuerpo radiomarcado a un paciente. El kit preferido también
contendrá (iii) un tampón para ajustar el pH del isótopo, y (iv) un
vial de reacción. Como alternativa, y más preferiblemente, el tampón
se suministra en el vial de reacción, eliminado de este modo las
etapas de medir y transferir el tampón y aumentando la simplicidad,
la consistencia y la esterilidad de los componentes del kit. Sin
embargo, también se prevén otros casos, es decir, por los cuales se
añade el tampón al vial de isótopo primero, y después se transfiere
el isótopo tamponado al vial de reacción. En este caso, el vial de
reacción podría suministrarse con el volumen de anticuerpo
requerido. Como alternativa, el vial de isótopo/tampón podría
hacerse suficientemente grande para acomodar la adición del
conjugado de anticuerpo, es decir, directamente al vial del
proveedor. Esto eliminaría la necesidad del vial de reacción.
Como se ha descrito anteriormente, se incluye
otra configuración de kit preferida por la cual el propio vial de
reacción contiene el volumen requerido de anticuerpo conjugado (es
decir, 1 o 1,5 ml para ^{111}In y ^{90}Y, respectivamente). El
anticuerpo puede suministrarse en un tampón que proporcione el pH de
radiomarcaje apropiado de acuerdo con el isótopo deseado específico
(es decir, pH 3-6 para ^{111}In, pH
3-5 para ^{90}Y). Pueden usarse diferentes
tampones, dependiendo del isótopo (es decir, acetato sódico para
^{90}Y, citrato sódico para ^{111}In). El pH y la composición
del tampón también pueden variar dependiendo de la naturaleza del
ligando de unión a marcar (es decir, el marcaje de péptidos puede
permitir que se use <pH 3). Esencialmente después, el isótopo se
transferiría directamente al vial de reacción, como el tampón de
formulación. Limitando el uso del kit a dos etapas de transferencia
se aumentaría adicionalmente la reproducibilidad y simplicidad, y
se disminuirían adicionalmente las posibilidades de contaminación de
la esterilidad durante la manipulación de los componentes del
kit.
Los kits de radiomarcaje de la presente
descripción pueden comprender adicionalmente un vial de
radioisótopo, o puede solicitarse el radioisótopo por separado de
un proveedor apropiado. Los radioisótopos preferidos de la presente
descripción son cloruro de ^{111}In y cloruro de ^{90}Y en HCl
aunque los métodos descritos no se limitan a estos isótopos. Otros
radionúclidos que se han usado para aplicaciones de formación de
imágenes son conocidos en la técnica, es decir, como se describe en
las Patentes de Estados Unidos Nº 4.634.586, 5.460.785 y 5.766.571,
que se incorporan en este documento por referencia. El indio-[111]
es particularmente ventajoso para formar imágenes de tumores de
células B y los emisores beta tales como ^{90}Y son
particularmente útiles como agentes radioterapéuticos. No obstante,
pueden usarse otros radioisótopos adecuados para estos y otros
propósitos, es decir, emisores alfa, dependiendo del quelador usado
para la conjugación del anticuerpo.
Dada la eficacia demostrada de los regímenes
terapéuticos combinados descritos en la Solicitud de Estados Unidos
con Nº de serie 08/475.813, un kit adicional también incluirá un
vial diferente de anticuerpo quimérico, es decir, Rituxan®, a
administrar antes o después del anticuerpo anti-CD20
radiomarcado. Cuando el anticuerpo quimérico se administra antes
del anticuerpo radiomarcado, puede disminuirse significativamente la
respuesta HAMA que generalmente puede suceder en respuesta a la
administración de un anticuerpo anti-CD20 murino,
aumentando de este modo la utilidad terapéutica de anticuerpos
murinos radiomarcados. Además, cuando se emplea un anticuerpo
anti-CD20 quimérico para eliminar células B
circulantes, las posteriores imágenes diagnósticas conseguidas con
anticuerpos marcados con ^{111}In pueden ser mucho más claras.
También debe ser evidente que puede usarse tanto
un anticuerpo radiomarcado de diagnóstico como un anticuerpo
radiomarcado terapéutico juntos en un régimen terapéutico combinado.
A este respecto, el anticuerpo de diagnóstico puede usarse antes o
después del anticuerpo terapéutico para visualizar el tamaño del
tumor antes y después del tratamiento. En este caso, el kit de la
presente descripción puede incluir viales de tampón diferentes,
quizá codificados por color, formulados específicamente de acuerdo
con los requisitos de pH óptimos para radiomarcar anticuerpos con
los radioisótopos específicos a usar. Dicho sistema aseguraría que
se usa el tampón apropiado para cada marcador, y permitiría al
médico la misma facilidad en el radiomarcaje de dos anticuerpos que
si se hubieran adquirido dos kits. Dicho kit en efecto combina los
componentes de dos kits de radiomarcaje en uno.
Los componentes del kit de radiomarcaje de la
presente descripción se suministran a la concentración y pH
apropiados de modo que se mantenga fácilmente la esterilidad antes
de la administración del anticuerpo y existe poca necesidad de
tampones o medios adicionales. Sin embargo, debe ser evidente para
los especialistas en la técnica que pueden prepararse,
esterilizarse y ensayarse algunos reactivos en el sitio. Por tanto,
se prevén variaciones del kit de la presente descripción
dependiendo del presupuesto y preferencia del consumidor.
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El kit de radiomarcaje de la presente
descripción puede usarse en un método para radiomarcar un anticuerpo
conjugado con quelador para su administración a un paciente. De
acuerdo con la presente descripción, dicho método comprende, en
general,
(i) mezclar un anticuerpo conjugado con quelador
con una solución que contiene un radioisótopo;
(ii) incubar la mezcla durante un periodo
apropiado de tiempo a temperatura apropiada; y
(iii) diluir el anticuerpo marcado a una
concentración apropiada en tampón de formulación, de modo que el
anticuerpo radiomarcado pueda administrarse directamente a un
paciente sin purificación adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
Más preferiblemente, el anticuerpo es un
anticuerpo anti-CD20, y en particular, el anticuerpo
anti-CD20 puede ser 2B8. El anticuerpo puede estar
conjugado con cualquier quelador apropiado, es decir,
MX-DTPA, CHX-DTPA, fenil- o
bencil-DTPA, DOTA, derivados de EDTA, etc. Se
prefiere MX-DTPA. Se conocen en la técnica métodos
para realizar la conjugación del anticuerpo (Kozak et al.
(1989); Mirzadeh et al. (1990), Brachbiel et al.
(1986)).
En la presente invención se ha descubierto que
el método para radiomarcar un anticuerpo conjugado con quelador
funciona mejor cuando la solución que contiene el radiomarcador se
ajusta a un pH entre aproximadamente 3,0 y 6,0, y más
preferiblemente a aproximadamente 4,2 antes de mezclarse con el
anticuerpo conjugado con quelador. Se prefiere particularmente
acetato sódico de bajo contenido en metales para ajustar el pH,
aunque pueden usarse otros tampones. Preferiblemente, el acetato
sódico está a una concentración entre aproximadamente 10 y 1000
mM, y más preferiblemente 50 mM.
Cuando el radioisótopo es cloruro de ^{111}In,
la cantidad en volumen de cloruro de ^{111}In que debe usarse
para preparar una única dosis administrativa es típicamente
aproximadamente 5,5 mCi dividida por la concentración de
radiactividad en el momento del marcaje. Para la administración al
paciente, una dosis de diagnóstico típica de ^{111}In es de
aproximadamente 2 a 10 mCi. La cantidad de acetato sódico usada para
ajustar el pH varía dependiendo de la concentración de acetato
sódico y la solución vehículo del isótopo, y por lo tanto puede ser
bastante amplia. Cuando la concentración de acetato sódico es 50
mM, la cantidad necesaria para ajustar el pH es típicamente
aproximadamente 1,2 veces la cantidad en volumen de cloruro de
^{111}In usada aunque pueden usarse volúmenes más grandes. Debe
apreciarse que lo importante es la proporción de acetato sódico a
HCl, y la cantidad de acetato sódico usada cambiaría dependiendo de
la cantidad y concentración de HCl en el tampón. Después se mezcla
aproximadamente 1 ml de un anticuerpo conjugado con quelador a una
concentración de aproximadamente 2 mg/ml con la solución acetato de
radiomarcador, y la mezcla se incuba durante aproximadamente 30
minutos, o durante un tiempo suficiente para conseguir el marcaje
óptimo del anticuerpo. Dicho tiempo puede variar de aproximadamente
30 segundos a aproximadamente 60 minutos. Después se añade tampón
de formulación en una cantidad necesaria para conseguir un volumen
final total de aproximadamente 10 ml.
El tiempo óptimo requerido para marcar el
anticuerpo puede variar dependiendo del anticuerpo, el radiomarcador
particular y el conjugado particular empleado. Un factor subyacente
en la optimización del tiempo asignado para el radiomarcaje es la
proporción de quelador a anticuerpo del reactivo que se tiene que
marcar. Por ejemplo, la proporción de quelador a anticuerpo debe
ser suficientemente elevada para conseguir un nivel terapéuticamente
útil de incorporación, es decir, del 90 al 95% dependiendo del
radioisótopo, pero también debe ser no demasiado elevado para
comprometer la integridad estructural o inmunorreactividad del
anticuerpo. Esto requiere un cierto proceso de equilibrado que en
algunos casos puede conducir a un nivel inferior de quelador
conjugado y mayor tiempo de marcaje.
Por ejemplo, para 2B8 y MX-DTPA,
se ha descubierto que el marcaje puede conseguirse en cinco minutos
para ^{90}Y y en aproximadamente treinta minutos para ^{111}In
para conseguir el nivel deseado de radioincorporación, con una
proporción molar de sólo aproximadamente 11/2 a 1 de quelador a
anticuerpo. No fue necesario, por lo tanto, aumentar la proporción
de quelador a anticuerpo, porque se consiguió un nivel deseable de
radioincorporación. Además, no era ventajoso aumentar la cantidad
de quelador conjugado porque esto podría afectar a la
inmunorreactividad del anticuerpo. Dichos parámetros podrían
determinarse empíricamente para otros anticuerpos para el diseño de
kits tales como los descritos en la presente descripción.
Cuando el radioisótopo es cloruro de ^{90}Y,
la cantidad en volumen de cloruro de ^{90}Y usada para preparar
una única dosis administrativa típicamente varía de aproximadamente
10 a 50 mCi, y es preferiblemente aproximadamente 45 mCi, dividida
por la concentración de radiactividad en el momento del marcaje. La
cantidad de acetato sódico usada para ajustar el pH varía
dependiendo de la concentración de acetato sódico y la concentración
del vehículo del isótopo, y por lo tanto puede ser bastante amplia.
Cuando la concentración de acetato sódico es 50 mM y el ^{90}Y
se suministra en HCl 50 mM, la cantidad requerida para ajustar el
pH es típicamente aproximadamente 1,2 veces la cantidad en volumen
de cloruro de ^{90}Y usada. Después se mezclan aproximadamente 1,5
ml de un anticuerpo conjugado con quelador a una concentración de
aproximadamente 2 mg/ml con la solución acetato de radiomarcador, y
se incuban durante aproximadamente 5 minutos, o durante un tiempo
suficiente para conseguir el marcaje óptimo del anticuerpo. Dicho
tiempo puede variar de aproximadamente 30 segundo a aproximadamente
60 minutos. El tampón de formulación se añade en una cantidad
necesaria para conseguir un volumen final total de aproximadamente
10 ml.
Preferiblemente, el método de radiomarcaje de la
presente descripción se realiza usando el kit de radiomarcaje
descrito en este documento. Sin embargo, debe ser evidente para los
especialistas en la técnica que los componentes y condiciones
preferidos son simplemente directrices aceptables para practicar el
método de la presente descripción, y pueden alterarse en cierta
medida con optimización apropiada. Las condiciones de que alejan de
las preferidas pero que aún consiguen el propósito del método se
consideran dentro del alcance de la presente descripción.
El kit de radiomarcaje de la presente
descripción también puede suministrarse con reactivos adecuados para
verificar de forma adecuada la afinidad de unión del anticuerpo
después del radiomarcaje. En dicho caso, el kit de la descripción
también puede usarse para determinar el porcentaje de unión de un
anticuerpo radiomarcado a su célula diana antes de administrar el
anticuerpo a un paciente. En la presente invención también se ha
descubierto que el kit de ensayo de unión particular descrito puede
ser útil para ensayar la afinidad de cualquier anticuerpo para el
que generalmente no está disponible en antígeno purificado. Por
consiguiente, los componentes del ensayo de unión también pueden
venderse en forma de un kit diferente.
En general, un ensayo de unión y kit de
radiomarcaje comprende (i) al menos un vial de células liofilizadas
que expresan el antígeno que se reconoce por el anticuerpo del kit;
(ii) un vial que contiene anticuerpo conjugado con quelador; (iii)
un vial que contiene tampón de formulación, y (iv) instrucciones
para radiomarcar el anticuerpo de modo que el anticuerpo
radiomarcado pueda administrarse directamente a un paciente sin la
necesidad de posterior purificación. Como se ha descrito
anteriormente para el kit de radiomarcaje, este kit también puede
comprender un vial que contiene un tampón para ajustar el pH del
radioisótopo, y un vial de reacción de vidrio estéril.
Preferiblemente el tampón buffer es una solución de acetato sódico
de bajo contenido en metales a una concentración entre
aproximadamente 10 y 1000 mM, y el vial de reacción de vidrio
alberga un volumen de al menos 5 ml. El anticuerpo es
preferiblemente un anticuerpo anti-CD20, y el
quelador es preferiblemente MX-DTPA. Pueden usarse
otros queladores como se ha descrito previamente. El anticuerpo
conjugado preferido es 2B8-MX-DTPA,
aunque puede marcarse cualquier anticuerpo conjugado con quelador y
evaluarse su afinidad. El tampón de formulación es solución salina
tamponada con fosfato que comprende un radioprotector y quelador
sin conjugar como se ha descrito anteriormente, y puede estar
incluido o no el radioisótopo y es preferiblemente cloruro de
^{111}In o cloruro de ^{90}Y. Pueden usarse otros radioisótopos
dependiendo del quelador.
La diferencia entre el ensayo de unión/kit de
radiomarcaje y el kit de radiomarcaje descrito anteriormente es la
inclusión de células positivas al antígeno para que sirvan como
sustrato diana para ensayar la afinidad del anticuerpo. Cuando el
antígeno es CD20, las células CD20-positivas
preferidas son células SB (ATCC Nº CCL 120) pero puede usarse
cualquier célula CD20-positiva. El ensayo de unión y
kit de radiomarcaje pueden incluir adicionalmente células negativas
al antígeno para su uso como control negativo. Las células
CD20-negativas preferidas son células HSB (ATCC Nº
CCL 120.1) pero puede usarse cualquier célula
CD20-negativa.
Por supuesto, el kit de radiomarcaje y ensayo de
unión combinado puede comprender adicionalmente un vial de
anticuerpo anti-CD20 quimérico además del anticuerpo
a marcar para los propósitos de realizar un régimen terapéutico
combinado, o para eliminar las células B periféricas antes de la
formación de imágenes de diagnóstico. Dicho anticuerpo diferentes
es preferiblemente Rituxan®, pero puede ser cualquier anticuerpo que
haya demostrado realizar la eliminación de células tumorales. De
hecho, pueden combinarse dos tipo diferentes de anticuerpo en un
kit, es decir, anticuerpos dirigidos a dos antígenos diferentes de
células B, siempre que el régimen terapéutico combinado sirva para
marcar el mismo tipo de célula, es decir, el linfoma de células
B.
Como los componentes del kit pueden usarse para
marcar otros anticuerpos, pueden prepararse otras células para
ensayar la afinidad del anticuerpo dependiendo del antígeno diana.
Sin embargo, para anticuerpos anti-CD20, el ensayo
de unión y kit de radiomarcaje de la presente descripción es
particularmente adecuado para el entorno comercial porque las
células diana se proporcionan en forma liofilizada. Esto permite la
verificación de la eficacia del anticuerpo para proceder de forma
simple y sistemática, y anula la dificultad y los gastos implicados
en el mantenimiento de instalaciones de cultivo. Las células
liofilizadas generalmente se suministran en alícuotas entre 0,5 y
500 x 10^{6} células por vial de acuerdo con los métodos de la
descripción.
Es posible que instalaciones particulares
prefieran solicitar un anticuerpo que ya se haya radiomarcado, en
cuyo caso dicha instalación podría desear los reactivos del ensayo
de unión con el fin de garantizar que los anticuerpos retienen la
afinidad diana. En este caso, la presente descripción también
proporciona un kit de ensayo de unión para determinar el porcentaje
de unión de un anticuerpo radiomarcado a su célula diana. Dicho kit
incluye al menos un vial de células positivas al antígeno fijadas
y/o liofilizadas, y puede contener opcionalmente células negativas
al antígeno como se ha descrito anteriormente para el ensayo de
unión y kit de radiomarcaje. Además, debe ser evidente que
variaciones de dicho kit pueden incluir un anticuerpo de control sin
marcar para verificar la especificidad de unión del anticuerpo del
consumidor mediante un ensayo competitivo.
De nuevo, cuando el antígeno es CD20, las
células CD20-positivas son preferiblemente células
SB (ATCC Nº CCL 120) y las células CD20-negativas
son preferiblemente células HSB (ATCC Nº CCL 120.1), que se
suministran en forma liofilizada en alícuotas entre 0,5 y 50 x
10^{6} células. En este caso, el anticuerpo es preferiblemente un
conjugado MX-DTPA de 2B8 marcado con ^{111}In o
^{90}Y.
En vista de los kits adicionales descritos en
este documento, se debe enfatizar que una de las ventajas del kit
de radiomarcaje y método de la presente descripción es que no es
necesaria una etapa de purificación adicional, y el anticuerpo
radiomarcado puede administrarse directamente al paciente, ahorrando
de este modo un tiempo valioso y aumentando la estabilidad del
anticuerpo. Por lo tanto, se enfatiza que, aunque puede ser deseable
para el médico ensayar o verificar la especificidad y afinidad de
unión del anticuerpo radiomarcado antes de la administración, puede
prescindirse de dicho ensayo con radioisótopos particulares si la
estabilidad del anticuerpo y la inhibición de la radiolisis son
preocupaciones particulares, es decir, como con itrio.
Proporcionando kits por los cuales pueden ensayarse la afinidad y la
especificidad de unión, no se pretende sugerir de ningún modo que
dichos ensayos sean absolutamente necesarios en los métodos o kits
de la presente descripción. La opción para ensayar la validez del
anticuerpo es simplemente a elección del médico.
En la presente invención también se ha
descubierto que el método usado para preparar células fijadas y
liofilizadas para los kits de ensayo de unión de la presente
descripción es particularmente adecuado para preparar células para
kits comerciales. Las células pueden fijarse antes de la
liofilización para mejorar la estructura/estabilidad. En
particular, las células de la presente descripción demuestran
elevada reproducibilidad cuando se usan para los ensayos de unión
de anticuerpo.
En particular, la presente descripción incluye
un método para preparar células liofilizadas que comprende (i)
recoger células a una densidad celular de 0,5 a 2 x 10^{6} células
por ml por centrifugación; (ii) lavar las células al menos una vez
en una solución salina equilibrada, es decir, HBSS; (iii)
resuspender las células sedimentadas en un tampón de liofilización
que comprende una solución salina equilibrada que contiene proteína
vehículo y al menos un tipo de azúcar; (iv) dosificar una alícuota
de células resuspendidas en un tubo de microfuga o un vial de
vidrio; y (v) liofilizar las células 12-96 h y más
preferiblemente 24-72 h a aproximadamente
3,99-7,98 Pa (30-60 militor). El
método es particularmente adecuado para preparar células
liofilizadas cuando dichas células son células SB (ATCC Nº CCL 120)
o células HSB (ATCC Nº CCL 120.1), pero probablemente es aplicable
también a otros tipos celulares.
Preferiblemente, el tampón generalmente contiene
albúmina sérica bovina como proteína vehículo a una concentración
del 1% (p/v) y manitol a una concentración del 10%. Sin embargo,
pueden usarse posiblemente otras proteínas vehículo, es decir, HSA,
y otros azúcares. Las células se recogen por centrifugación a una
velocidad de aproximadamente 1300 rpm, y se añade la solución
salina HBSS (solución salina equilibrada de Hank). Las células
generalmente se resuspenden a una concentración de 50 X 10^{6}
células por ml. Sin embargo, debe ser evidente para los
especialistas en la técnica que las condiciones anteriores pueden
modificarse ligeramente sin comprometer significativamente la
viabilidad celular. Además, las condiciones anteriores puede
suplementarse por procedimientos adicionales diseñados para
optimizar el proceso para cantidades más grandes de células, por
ejemplo, diafiltración de flujo tangencial para el intercambio de
células en el tampón de liofilización.
Los kits de ensayo de unión de la presente
descripción pueden usarse en un ensayo para evaluar la afinidad de
unión de un anticuerpo radiomarcado. Dicho ensayo también es un
asunto de la presente descripción. Un ensayo de unión para
determinar el porcentaje de unión de un anticuerpo radiomarcado a su
célula diana comprende en general las siguientes etapas: (i)
mezclar al menos una alícuota de un anticuerpo radiomarcado con al
menos una alícuota de células positivas al antígeno; (ii) mezclar
al menos una alícuota de un anticuerpo radiomarcado idéntica a la
alícuota de la etapa (i) con al menos una alícuota de tampón de
dilución del mismo volumen que la alícuota de células positivas al
antígeno de la etapa (i) como control; (iii) sedimentar las células
por centrifugación; (iv) medir la radiactividad en el sobrenadante
de las células sedimentadas y el control; y (v) comparar la
cantidad de radiactividad en el sobrenadante celular con la cantidad
de radiactividad en el control.
Como los kits de radiomarcaje de la presente
descripción contienen opcionalmente cloruro de ^{111}In o cloruro
de ^{90}Y, el ensayo de unión de la presente descripción se
realiza típicamente con anticuerpos marcados con ^{111}In o
^{90}Y. Cuando ^{111}In es el radiomarcador, la radiactividad en
los tubos de ensayo se mide usando un contador gamma. Cuando
^{90}Y es el marcador, la radiactividad se mide usando un contador
de centelleo, aunque podría usarse un contador gamma.
Para el ensayo de unión de la presente
descripción, el anticuerpo preferido es un anticuerpo
anti-CD20, y el anticuerpo
anti-CD20 es preferiblemente 2B8, donde el
anticuerpo 2B8 se marca usando el kit de radiomarcaje de la
presente descripción. Sin embargo, puede ensayarse cualquier
anticuerpo radiomarcado con la condición de que estén disponibles
células que expresen el antígeno particular. Cuando CD20 es el
antígeno, las células preferidas para realizar el ensayo son
células SB (ATCC Nº CCL 120), sin embargo, el ensayo también puede
optimizarse y realizarse con cualquier anticuerpo radiomarcado y
célula diana apropiada.
El tampón de dilución usado para el ensayo debe
mantener la unión del anticuerpo, es decir, tampón fisiológico, que
contiene posiblemente una proteína vehículo, por ejemplo BSA, para
minimizar la unión no específica a las células. Aunque el tubo con
tampón de dilución sirve como control, puede incluirse un control
adicional en el ensayo usando células negativas al antígeno. En
este caso, el ensayo de unión comprende adicionalmente las
siguientes etapas: (i) mezclar al menos una alícuota de un
anticuerpo radiomarcado con al menos una alícuota de células
negativas al antígeno; (ii) sedimentar las células negativas al
antígeno por centrifugación; (iv) medir la radiactividad en el
sobrenadante de las células sedimentadas negativas al antígeno; y
(v) comparar la cantidad de radiactividad en el sobrenadante
celular negativo al antígeno con la cantidad de radiactividad en el
sobrenadante de las células positivas al antígeno y el control. La
comparación de la radiactividad obtenida de este tubo con el
control de tampón de dilución servirá como medición de la cantidad
de unión no específica a las células positivas al antígeno. Cuando
CD20 es el antígeno, y las células CD20-positivas
son células SB, las células CD20-negativas son
preferiblemente células HSB (ATCC Nº CCL 120.1).
Como se ha descrito anteriormente, las células
liofilizadas de la presente descripción proporcionan un patrón
simple, eficaz y reproducible para ensayar la eficacia de unión de
un anticuerpo radiomarcado. Por lo tanto, el ensayo de unión de la
presente descripción se realiza preferiblemente usando las células
liofilizadas incluidas en los kits de ensayo de unión de la
presente descripción. Además, los ensayos de radiomarcaje de la
presente descripción pueden combinarse con los ensayos de unión de
la presente descripción, donde el anticuerpo se marca primero por
el método de marcaje de un anticuerpo conjugado con quelador como se
describe en la presente descripción. Más preferiblemente, el ensayo
de unión de la presente descripción se realiza usando uno de los
ensayos de unión y kits de radiomarcaje descritos en este
documento.
Puede haber algunos casos donde debe ensayarse o
verificarse la afinidad de un anticuerpo pero no se ha unido un
radiomarcador. Por ejemplo, en ciertas circunstancias, es decir, en
la localización de problemas, puede ser ventajoso ensayar la
afinidad de unión de un anticuerpo antes de radiomarcarlo. Para
dicho caso, la presente descripción también incluye un ensayo de
unión competitiva para evaluar la afinidad de un anticuerpo de
ensayo por una célula diana, que comprende (i) preparar un
anticuerpo de control marcado con rutenio usando un anticuerpo
conocido específico para el mismo antígeno; (ii) incubar cantidades
crecientes de anticuerpo de ensayo y cantidades crecientes de
anticuerpo de control sin marcar con una concentración fija de
células diana y una cantidad traza de anticuerpo marcado con
rutenio donde cada concentración diferente de anticuerpo de ensayo y
cada concentración diferente de anticuerpo de control están en
tubos diferentes, respectivamente; (iii) determinar la cantidad de
unión en cada tubo de reacción en base a la
electroquimioluminescencia (ECL) relativa usando instrumentación
ORIGEN; y (iv) calcular el valor de afinidad promedio del anticuerpo
de ensayo. El valor de afinidad promedio puede calcularse a partir
de valores de EC50 y la concentración conocida del anticuerpo traza
usando el método de Muller (J. Immunological Methods (1980) 34:345)
o cualquier otro método apropiado. Debe observarse que este ensayo
también puede usarse para ensayar la afinidad de anticuerpos
radiomarcados, o cualquier anticuerpo para el que no puede
purificarse el antígeno y se requieren células como fuente de
antígeno. Las células fijadas, liofilizadas de la presente
descripción pueden usarse como células diana.
Cuando se realiza el ensayo de unión competitiva
de la presente descripción para ensayar la afinidad de anticuerpos
anti-CD20, el anticuerpo de control puede ser 2B8, o
cualquier otro anticuerpo anti-CD20 sin conjugar. El
anticuerpo de control puede ser un anticuerpo conjugado con
quelador. El anticuerpo de ensayo también puede ser un conjugado
con quelador del anticuerpo de control. Como alternativa, el
anticuerpo de ensayo puede ser otro anticuerpo
anti-CD20 cuya afinidad de unión a CD20 en
comparación con 2B8 sea de interés. Sin embargo, el ensayo puede
adaptarse para su uso con anticuerpos que tienen otras
especificidades siempre que esté disponible una célula diana
apropiada.
En el ensayo de unión competitiva de la presente
descripción, las células diana preferidas son células
CD20-positivas, más preferiblemente células SB
(ATCC Nº CCL 120), y son más preferiblemente células SB liofilizadas
resuspendidas preparadas de acuerdo con el método de la presente
descripción. También pueden usarse células liofilizadas usando
otros métodos o células fijadas. El anticuerpo marcado con rutenio
se prepara típicamente por un proceso que comprende incubar el
anticuerpo de control con quelador tris-bipiridina
del éster N-hidroxisuccinimida de rutenio (II)
(TAG-NHS), aunque también se prevén otros métodos
conocidos para marcar anticuerpos. Para el marcaje, el anticuerpo
de control y TAG-NHS se incuban preferiblemente a
una proporción molar de aproximadamente 1:15.
Estos y otros aspectos de la presente
descripción llegarán a entenderse claramente por referencia a las
siguientes figuras, ejemplos y descripción.
Habiendo dicho esto, debe mantenerse siempre en
mente que el asunto de la presente invención es el asunto que se
expone en las reivindicaciones adjuntas, proporcionándose en este
documento el resto de los aspectos de la presente descripción para
facilitar la comprensión de la presente invención y para poner la
presente invención en contexto.
Figura 1. Se comparó la inmunorreactividad de
2B8 nativo como anticuerpo anti-CD20 disponibles en
el mercado B1 (Coulter) y Leu 16 (Becton Dickinson) por competición
directa en un radioinmunoensayo usando B1 marcado con ^{125}I. Se
añadieron células SB positivas al antígeno (100.000) a cada pocillo
de placas de filtro V&P; se mezclaron 10 ng de B1 radiomarcado
con diversas concentraciones de agente de competición sin marcar y
la mezcla se añadió a las células. Los anticuerpos se incubaron con
las células durante una hora a temperatura ambiente; las
determinaciones se realizaron por triplicado. Posteriormente, los
pocillos se lavaron, se secaron y se determinó la radiactividad
asociada al filtro. Los datos mostrados se corrigieron para la
radiactividad de fondo y son la media de determinaciones por
triplicado.
Figura 2. Se analizaron cantidades crecientes de
2B8 sin conjugar para la unión a células B humanas (SB) usando
análisis FACS. Se hicieron comparaciones con un anticuerpo
monoclonal anti-CD20 disponible en el mercado (B1)
y con dos anticuerpos de isotipo irrelevante. Se usó
F(ab)'_{2} de cabra anti-IgG de
ratón-FITC como reactivo secundario. Los resultados
muestran que 2B8 es específico para el antígeno CD20 y que muestra
mayor unión que B1.
Figura 3. Se incubaron células B humanas (SB)
con cantidades crecientes de 2B8 marcado con ^{125}I. Se incubaron
muestras triplicadas durante una hora y se determinó la
radiactividad unida a las células después de la filtración para
recoger las células. El análisis de Scatchard permitió el cálculo de
una constante de afinidad aparente de 4,3 X 10^{-9} M.
Figura 4. Inmunorreactividad de 2B8 nativo,
2B8-MX-DTPA, y B1. El anticuerpo B1
se radiomarcó como se describe en la sección de Métodos. Se
mezclaron diez nanogramos de B1 radiomarcado con concentraciones
crecientes del competidor y la mezcla se añadió a pocillos de
placas de filtro V&P que contenían 100.000 células SB positivas
a antígeno cada uno; todas las determinaciones se realizaron por
triplicado. Después de una hora de incubación a temperatura
ambiente, los pocillos se lavaron extensivamente. Posteriormente, se
secaron los filtros y se determinó la radiactividad asociada por
recuento gamma; todos los valores se corrigieron para el fondo. Los
valores mostrados con las medias de determinaciones por
triplicado.
Figura 5. Se formuló el anticuerpo 2B8 a una
concentración final de 10 mg/ml en solución salina normal o solución
salina normal que contenía glicina-HCl 10 mM, pH
6,8. Después se colocaron series duplicadas de muestras en viales
cerrados a rosca, los viales se purgaron con nitrógeno, y después se
taparon. Las muestras después se incubaron a 4ºC o 30ºC durante 12
semanas; la inmunorreactividad de las muestras se evaluó
semanalmente. No se observó pérdida de inmunorreactividad con
ninguna de las muestras de 2B8 en todo el estudio de 12 semanas. Se
representan las inmunorreactividades en la semana 1 (Fig. 5A),
semana 6 (Fig. 5B) y semana 12 (Fig. 5C).
Figura 6. Ensayo de unión para la determinación
de la inmunorreactividad de
2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In
incubado en PBS, pH 7,4 que contenía 50 mg/ml de albúmina sérica
humana (48 h de incubación). Figura 6A) Se incubó una cantidad
constante de anticuerpo radiomarcado (5 ng/ml) con volúmenes
crecientes de células SB (20 x 10^{6} células/ml). La cantidad de
radiactividad (cpm) unida a las células se representó frente al
volumen de suspensión celular añadido. Figura 6B) Se representó la
radiactividad aplicada total sobre la radiactividad unida (AT/B).
La extrapolación lineal permitió el cálculo del punto de corte con
el eje y (0,997). El recíproco del punto de corte con el eje y X
100 produjo un valor de inmunorreactividad del 100% a exceso de
antígeno infinito.
Figura 7. Autorradiogramas obtenidos a partir de
análisis SDS-PAGE de
2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y
incubado a 4ºC en PBS, pH 7,4 que contenía 75 mg/ml de albúmina
sérica humana y DTPA 1 mM. En los tiempos indicados, las muestras
se sometieron a electroforesis en geles de
Tris-glicina al 4-20% usando
condiciones no reductoras, condiciones desnaturalizantes (SDS). Las
muestras se cargaron a 5 \mul (carriles 1, 2), 10 \mul (carriles
5, 6). Los geles se expusieron a una película de rayos x durante
aproximadamente 15 min. a temperatura ambiente y se
fotografiaron.
Figura 8. Exploración densitométrica del
autorradiograma a tiempo cero obtenido a partir del análisis
SDS-PAGE de
2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y
incubado a 4ºC en PBS, pH 7,4 que contenía 75 mg/ml de albúmina
sérica humana y DTPA 1 mM. La muestra se sometió a electroforesis
en un gel de Tris-glicina al 4-20%
usando condiciones no reductoras. Las muestras se cargaron a 5
\mul, 10 \mul, y 20 \mul en pocillos duplicados. El gel se
expuso a una película de rayos x durante aproximadamente 15 min. a
temperatura ambiente y se exploró uno de los carriles usando un
densitómetro. El área relativa del pico de conjugado radiomarcado
(nº 2) era del 96,2%.
Figura 9. Exploración densitométrica del
autorradiograma de 48 h obtenido a partir del análisis
SDS-PAGE de
2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y
incubado a 4ºC en PBS, pH 7,4 que contenía 75 mg/ml de albúmina
sérica humana y DTPA 1 mM. La muestra se sometió a electroforesis
en un gel de Tris-glicina al 4-20%
usando condiciones no reductoras. Las muestras se cargaron a 5
\mul, 10 \mul, y 20 \mul en pocillos duplicados. El gel se
expuso a una película de rayos x durante aproximadamente 15 min. a
temperatura ambiente y se exploró uno de los carriles usando un
densitómetro. El área relativa del pico del conjugado radiomarcado
(nº 2) era del 95,5%.
Figura 10. Autorradiogramas obtenidos a partir
del análisis SDS-PAGE de
2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In
incubado a 4ºC en PBS, pH 7,4 que contenía 50 mg/ml de albúmina
sérica humana. En los tiempos indicados, las muestras se sometieron
a electroforesis en geles de Tris-glicina al
4-20% usando condiciones no reductoras. Las
muestras se cargaron a 5 \mul (carriles 1, 2), 10 \mul
(carrilles 3, 4), y 20 \mul (carriles 5, 6). Los geles se
expusieron a una película de rayos x durante aproximadamente 15 min.
a temperatura ambiente y se fotografiaron. (Nota: El
autorradiograma de 48 h se obtuvo usando tamices de intensificación
que produjeron una señal más intensa en comparación con el
autorradiograma de tiempo cero).
Figura 11. Exploración densitométrica del
autorradiograma de tiempo cero obtenido a partir del análisis
SDS-PAGE de
2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In
incubado a 4ºC en PBS, pH 7,4 que contenía 50 mg/ml de albúmina
sérica humana. La muestra se sometió a electroforesis en un gel de
Tris-glicina al 4-20% en condiciones
no reductoras. La muestra se cargó a 5 \mul, 10 \mul, y 20
\mul en pocillos duplicados. El gel se expuso a una película de
rayos x durante aproximadamente 15 min. a temperatura ambiente y se
exploró uno de los carriles usando un densitómetro. El área
relativa del pico del conjugado radiomarcado (nº 3) era del
95,9%.
Figura 12. Exploración densitométrica del
autorradiograma de 48 h obtenido a partir del análisis
SDS-PAGE de
2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In
incubado a 4ºC en PBS, pH 7,4 que contenía 50 mg/ml de albúmina
sérica humana. La muestra se sometió a electroforesis en un gel de
Tris-glicina al 4-20% en condiciones
no reductoras. La muestra se cargó a 5 \mul, 10 \mul, y 20
\mul en pocillos duplicados. El gel se expuso a una película de
rayos x durante aproximadamente 15 min. a temperatura ambiente y se
exploró uno de los carriles usando un densitómetro. El área
relativa del conjugado radiomarcado era del 97,0% (área combinada de
los picos nº 2, 3, y 4).
Figura 13. Autorradiogramas obtenidos a partir
del análisis SDS-PAGE de
2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y
incubado a 37ºC en suero humano. En los tiempos indicados, las
muestras se sometieron a electroforesis en geles de
Tris-glicina al 4-20% usando
condiciones no reductoras. Las muestras se cargaron a 5 \mul
(carriles 1, 2), 10 \mul (carriles 3, 4), y 20 \mul (carriles
5, 6). Los geles se expusieron a una película de rayos x durante
aproximadamente 15 min. a temperatura ambiente y se
fotografiaron.
Figura 14. Exploración densitométrica del
autorradiograma de tiempo cero obtenido a partir del análisis
SDS-PAGE de
2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y
incubado a 37ºC en suero humano. La muestra se sometió a
electroforesis en un gel de Tris-glicina al
4-20% usando condiciones no reductoras. La muestra
se cargó a 5 \mul, 10 \mul, y 20 \mul en pocillos duplicados.
Los geles se expusieron a una película de rayos x durante
aproximadamente 15 min. a temperatura ambiente y se exploró uno de
los carriles usando un densitómetro. El área relativa del pico del
conjugado radiomarcado (nº 2) era del 97,9%.
Figura 15. Exploración densitométrica del
autorradiograma de 98 h obtenido a partir del análisis
SDS-PAGE de
2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y
incubado a 37ºC en suero humano. La muestra se sometió a
electroforesis en un gel de Tris-glicina al
4-20% usando condiciones no reductoras. La muestra
se cargó a 5 \mul, 10 \mul, y 20 \mul en pocillos duplicados.
Los geles se expusieron a una película de rayos x durante
aproximadamente 15 min. a temperatura ambiente y se exploró uno de
los carriles usando un densitómetro. El área relativa del pico del
conjugado radiomarcado (nº 2) era del 94,7%.
Figura 16. Autorradiogramas obtenidos a partir
del análisis SDS-PAGE de
2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In
incubado a 37ºC en suero humano. En los tiempos indicados, las
muestras se sometieron a electroforesis en geles de
Tris-glicina al 4-20% usando
condiciones no reductoras. Las muestras se cargaron a 5 \mul
(carriles 1, 2), 10 \mul (carriles 3, 4), y 20 \mul (carriles
5, 6). Los geles se expusieron a una película de rayos x durante
aproximadamente 16-20 h a temperatura ambiente y se
fotografiaron.
Figura 17. Exploración densitométrica del
autorradiograma de tiempo cero obtenido a partir del análisis
SDS-PAGE de
2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In
incubado a 37ºC en suero humano. La muestra se sometió a
electroforesis en un gel de Tris-glicina al
4-20% usando condiciones no reductoras. La muestra
se cargó a 5 \mul, 10 \mul, y 20 \mul en pocillos duplicados.
El gel se expuso a una película de rayos x durante aproximadamente
16-20 h a temperatura ambiente y se exploró uno de
los carriles usando un densitómetro. El área relativa del pico del
conjugado radiomarcado (nº 3) era del 95,3%.
Figura 18. Exploración densitométrica del
autorradiograma de 96 h obtenido a partir del análisis
SDS-PAGE de
2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In
incubado a 37ºC en suero humano. La muestra se sometió a
electroforesis en un gel de Tris-glicina al
4-20% usando condiciones no reductoras. La muestra
se cargó a 5 \mul, 10 \mul, y 20 \mul en pocillos duplicados.
El gel se expuso a una película de rayos x durante aproximadamente
16-20 h a temperatura ambiente y se exploró uno de
los carriles usando un densitómetro. El área relativa del pico del
conjugado radiomarcado (nº 3) era del 94,0%.
Figura 19. Se inyectó a monos cynomolgus por vía
intravenosa cada 48 horas para un total de siete inyecciones; se
muestran las cantidades administradas. Se determinaron los niveles
de células T y B circulantes por análisis FACS usando
anti-CD2 (células T), anti-IgG Mo
(2B8), anti-CD20 (Leu 16), y
anti-IgG humana (células B). No se observó efecto
sobre los niveles de células T en circulación. (Al Grupo V de
animales se le dio una única dosis).
Figura 20. La recuperación de los niveles de
células B circulantes en animales que recibieron 2B8 estuvo seguida
del análisis FACS usando los anticuerpos marcados de forma
fluorescente descritos en la breve descripción de la Fig. 19. Los
animales de los Grupos III y IV no se controlaron ya que se
sacrificaron en el día 13.
Figura 21. Se inyectó a monos cynomolgus por vía
intravenosa
^{89}Y-2B8-MX-DTPA
que se había preparado usando
2B8-MX-DTPA de calidad clínica. A
los animales se les dosificó cada 48 horas las cantidades mostradas
anteriormente para un total de siete dosis. En los días 0, 2, 7, 10
y 14 se extrajo sangre de los monos y se evaluaron para la química
sérica, la hematología y los niveles de células B circulantes (los
sueros del día 10 no se analizaron para el contenido de células B).
No se observaron anormalidades significativas diferentes al recuento
disminuido de linfocitos totales en todos los animales, excepto en
un individuo en el grupo II, durante el transcurso del estudio.
Figura 22. La eliminación de anticuerpo murino
anti-CD20 2B8 de los monos cynomolgus se determinó
por ELISA después de una única inyección de 10 mg/kg en el día
cero. Como se muestra en el panel A, el anticuerpo mostró un valor
\betat_{1/2} de aproximadamente 4,5 días. La eliminación del
anticuerpo 2B8 y su conjugado MX-DTPA de la
circulación de ratones BALB/c se muestran en el panel B. Se inyectó
a los ratones por vía intravenosa 25 \mug de 2B8 nativo o
conjugado y muestras sanguíneas tomadas en diversos tiempos hasta
264 horas después de la inyección; los sueros se analizaron
posteriormente por inmunoensayo enzimático usando células SB como
agente de captura. Los anticuerpos tanto nativos como conjugados
mostraron valores de eliminación de 8,75 días.
Figura 23. A veinte ratones BALB/c se inyectó a
cada uno 1,1 \muCi de conjugado radiomarcado (100 \mul)
formulado en PBS, pH 7,4, que contenía 50 mg/ml de HSA. Se
sacrificaron grupos de cinco ratones a 1, 24, 48, y 72 horas y
después se prepararon sangre y diversos tejidos y se analizaron para
la radiactividad asociada.
Figura 24. A veinte ratones BALB/c se inyectó a
cada uno por vía intravenosa aproximadamente 1,0 \muCi (en 100
\mul) de conjugado radiomarcado formulado en 1 X PBS, pH 7,4, que
contenía 75 mg/ml de albúmina sérica humana y DTPA 1 mM. Los
grupos de cinco ratones cada uno se sacrificaron a 1, 24, 48 y 72
horas y se preparó y analizó su sangre y diversos tejidos para la
radiactividad asociada.
Figura 25. Se inyectó por vía intravenosa a
ratones atímicos que albergan tumores de células B Ramos 24 \muCi
de
^{111}-In-2B8-MX-DTPA
y se sacrificaron grupos de tras ratones cada uno a 0, 24, 48 y 72
horas. Después de la preparación tisular y la determinación de la
radiactividad asociada, se determinaron los valores de porcentaje
de dosis inyectada por gramo de tejido y se representaron como se
muestra.
Figura 26. Ensayo de unión para la determinación
de la inmunorreactividad de
2B8-MX-DTPA de "mezclar y usar"
marcado con ^{90}Y incubado en PBS, pH 7,4 que contenía
50-75 mg/ml de albúmina sérica humana (48 h de
incubación). Panel A) Se incubó una cantidad constante de
anticuerpo marcado con ^{90}Y (aproximadamente 1 ng/ml) con
cantidades crecientes de células SB. La cantidad de radiactividad
(cpm) unida a las células se representó frente a la concentración
celular. Panel B) Se representó la radiactividad ^{90}Y aplicada
total sobre la radiactividad unida (AT/B). La extrapolación lineal
permitió el cálculo del punto de corte con el eje y (1,139). El
recíproco del punto de corte con el eje y X 100 produjo un valor de
inmunorreactividad del 87,9% a exceso de antígeno infinito. No se
observó unión con células CD20-negativas (HSB).
Figura 27. Autorradiogramas obtenidos a partir
del análisis SDS-PAGE de
2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y
incubado a 4ºC en PBS, pH 7,4 que contenía 75 mg/ml de albúmina
sérica humana y DTPA 1 mM. A los tiempos indicados, las muestras se
sometieron a electroforesis en geles de Tris-glicina
al 4-20% usando condiciones no reductoras,
condiciones desnaturalizantes (SDS). Las muestras se cargaron a 5
\mul (carriles 1, 2), 10 \mul (carriles 5, 6). Los geles se
expusieron a una película de rayos x durante aproximadamente 15 min.
a temperatura ambiente y se fotogra-
fiaron.
fiaron.
Figura 28. Exploración densitométrica del
autorradiograma de tiempo cero obtenido a partir del análisis
SDS-PAGE de
2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y
incubado a 4ºC en PBS, pH 7,4 que contenía 75 mg/ml de albúmina
sérica humana y DTPA 1 mM. La muestra se sometió a electroforesis
en un gel de Tris-glicina al 4-20%
usando condiciones no reductoras. Las muestras se cargaron a 5
\mul, 10 \mul, y 20 \mul en pocillos duplicados. El gel se
expuso a una película de rayos x durante aproximadamente 15 min. a
temperatura ambiente y se exploró uno de los carriles usando un
densitómetro. El área relativa del pico del conjugado radiomarcado
(nº 2) era del 96,1%.
Figura 29. Exploración densitométrica del
autorradiograma de 48 h obtenido a partir del análisis
SDS-PAGE de
2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y
incubado a 4ºC en PBS, pH 7,4 que contenía 75 mg/ml de albúmina
sérica humana y DTPA 1 mM. La muestra se sometió a electroforesis
en un gel de Tris-glicina al 4-20%
usando condiciones no reductoras. Las muestras se cargaron a 5
\mul, 10 \mul, y 20 \mul en pocillos duplicados. El gel se
expuso a una película de rayos x durante aproximadamente 15 min. a
temperatura ambiente y se exploró uno de los carriles usando un
densitómetro. El área relativa del pico del conjugado radiomarcado
(nº 2) era del 94,1%.
Figura 30. Autorradiogramas obtenidos a partir
del análisis SDS-PAGE de
2B8-MX-DTPA de "mezclar y usar"
marcado con ^{90}Y incubado a 37ºC en suero humano. A los tiempos
indicados, las muestras se sometieron a electroforesis en geles de
Tris-glicina al 4-20% usando
condiciones no reductoras. Las muestras se cargaron a 5 \mul
(carriles 1, 2), 10 \mul (carriles 3, 4), y 20 \mul (carriles
5, 6). Los geles se expusieron a una película de rayos x durante
aproximadamente 15 min. a temperatura ambiente y se
fotografiaron.
Figura 31. Exploración densitométrica del
autorradiograma de tiempo cero obtenido a partir del análisis
SDS-PAGE de
2B8-MX-DTPA de "mezclar y usar"
marcado con ^{90}Y incubado a 37ºC en suero humano. La muestra se
sometió a electroforesis en un gel de Tris-glicina
al 4-20% usando condiciones no reductoras. La
muestra se cargó a 5 \mul, 10 \mul, y 20 \mul en pocillos
duplicados. Los geles se expusieron a una película de rayos x
durante aproximadamente 15 min. a temperatura ambiente y se exploró
uno de los carriles usando un densitómetro. El área relativa del
pico del conjugado radiomarcado (nº 2) era del 89,1%.
Figura 32. Exploración densitométrica del
autorradiograma de 72 h obtenido a partir del análisis
SDS-PAGE de
2B8-MX-DTPA de "mezclar y usar"
marcado con ^{90}Y incubado a 37ºC en suero humano. La muestra se
sometió a electroforesis en un gel de Tris-glicina
al 4-20% usando condiciones no reductoras. La
muestra se cargó a 5 \mul, 10 \mul, y 20 \mul en pocillos
duplicados. Los geles se expusieron a una película de rayos x
durante aproximadamente 15 min. a temperatura ambiente y se exploró
uno de los carriles usando un densitómetro. El área relativa del
pico del conjugado radiomarcado (nº 2) era del 88,8%.
Figura 33. A veinte ratones BALB/c se inyectó a
cada uno por vía intravenosa 5 \muCi de
2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y
formulado en 1 X PBS, pH 7,4, que contenía 75 mg/ml de albúmina
sérica humana y DTPA 1 mM. Se sacrificaron grupos de cinco ratones
cada uno a 1, 24, 48 y 72 horas y se prepararon y analizaron su
sangre y diversos tejidos para la radiactividad asociada.
Figura 34. Se incubaron cantidades crecientes de
anticuerpo 2B8 derivado de CHO marcado con una concentración fija
de células B CD20-positivas recién recogidas (SB) o
células T CD20-negativas (HSB). La unión del
anticuerpo a las células se cuantificó usando análisis FACS usando
F(ab)'_{2} de cabra anti-IgG de
ratón-FITC como se describe en este documento. Se
hizo la comparación con un anticuerpo de isotipo irrelevante (S004).
Solamente el anticuerpo 2B8 derivado de CHO mostró algo de unión
apreciable a células SB CD20-positivas.
Figura 35. Se comparó la inmunorreactividad de
2B8 derivado de CHO con el anticuerpo parental
2B8-49 producido en una línea celular de hibridoma
por competición directa en un ensayo ORIGEN. Se incubaron cantidades
crecientes de anticuerpo con una cantidad fija de células B
CD20-positivas (SB) y una cantidad traza de CHO 2B8
marcado con rutenio. Después de incubación durante tres horas a
temperatura ambiente, se determinó la unión, expresada como
electroquimioluminescencia (ECL) relativa, usando el instrumento
ORIGEN como se describe en Materiales y Métodos. Los valores
representan las medias de determinaciones por duplicado. Se calculó
que las constantes de afinidad promedio para CHO 2B8 y
2B8-49 eran 1,3 X 10^{-10} M y 2,5 X 10^{-10} M,
respectivamente. Se incluyó un anticuerpo de isotipo irrelevante
(S004), para la comparación.
Figura 36. Se comparó la unión de conjugados
2B8-MX-DTPA preparados a partir de
2B8 derivado de CHO con el anticuerpo no conjugado por competición
directa en un ensayo ORIGEN. Los conjugados se prepararon por
incubación de 2B8 con MX-DTPA durante 8, 17, y 24 h
antes de la retirada del quelato sin reaccionar. Para la evaluación
de la unión, se incubaron los anticuerpos con una cantidad fija de
células B CD20-positivas (SB) y una cantidad traza
de CHO 2B8 marcado con rutenio. Después de incubación durante tres
horas a temperatura ambiente, se determinó la unión, expresada como
electroquimioluminescencia (ECL) relativa, usando el instrumento
ORIGEN como se describe en los Materiales y Métodos. Los valores
representan las medias de determinaciones duplicadas. Las
preparaciones de conjugado mostraron unión similar en comparación
con anticuerpo 2B8 sin conjugar.
Figura 37. A) Las células SB se lavaron y
resuspendieron a 90 X 10^{6} células/ml con tampón de dilución
(1X PBS, pH 7,4 que contenía albúmina sérica bovina al 1% (p/v)). Se
incubaron concentraciones crecientes de las células durante 3 h con
7,5 ng/ml de In2B8 preparado usando
2B8-MX-DTPA lote 0165A. B)
Representación doble inversa de la concentración celular frente a
la radiactividad unida/radiactividad total (B/AT). La
inmunorreactividad se calculó como 1/punto corte y X 100. Los
valores de inmunorreactividad y coeficiente de correlación (R) eran
el 80,6% y 0,981, respectivamente.
Figura 38. A) Se lavaron y resuspendieron
células SB a 90 X 10^{6} células/ml con tampón de dilución (1X
PBS, pH 7,4 que contenía albúmina sérica bovina al 1% (p/v)). Se
incubaron concentraciones crecientes de células durante 3 h con 2
ng/ml de Y2B8 preparado usando
2B8-MX-DTPA lote nº 0165A. B)
Representación doble inversa de la concentración celular frente a
la radiactividad unida/radiactividad total (B/AT). La
inmunorreactividad se calculó como 1/punto corte y X 100. Los
valores de inmunorreactividad y coeficiente de correlación (R) eran
el 72,2% y 0,999, respectivamente.
Salvo que se defina de otro modo, todos los
términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el
mismo significado que el comprendido habitualmente por un
especialista en la técnica a la que pertenece esta descripción y
esta invención. Aunque puede usarse cualquier método y material
similar o equivalente a los descritos en este documento en la
práctica o ensayo de la presente descripción, se describen los
métodos y materiales preferidos. Para propósitos de la presente
descripción, los siguientes términos se describen a
continuación:
de bajo contenido en metales - se refiere a
reactivos tratados para reducir la contaminación metálica a un
nivel que no afecte a la radioincorporación.
positivo a antígeno - significa que expresa
antígeno que se reconoce por un anticuerpo particular de la
descripción de tal modo que el anticuerpo sea capaz de unirse.
% de radioincorporación - se refiere a la
cantidad de radiomarcador a partir de una reacción de radiomarcaje
que se conjuga con el anticuerpo con relación a la cantidad total de
radiomarcador inicialmente añadida a la reacción.
% de unión - se refiere a la cantidad de
anticuerpo de una muestra que se une al antígeno diana, con o sin
especificidad.
% de inmunorreactividad o especificidad de unión
- se refiere a la cantidad de una muestra de anticuerpo que se une
al antígeno diana con especificidad.
anticuerpo de diagnóstico - se refiere a un
anticuerpo conjugado con un radiomarcador tal como ^{111}In que
puede realizar la formación de imágenes de diagnóstico de tumores y
células positivas al antígeno.
anticuerpo terapéutico - se refiere a un
anticuerpo conjugado con un radiomarcador de emisión alfa o beta
(tal como ^{90}Y) que puede realizar la eliminación celular cuando
está unido al antígeno diana.
Las líneas celulares humanas SB y HSB se
obtuvieron de la American Type Culture Collection y se cultivaron
en RPMI-1640 que contenía suero bovino fetal al 10%.
La Línea celular SB CD20-positiva es una línea
celular linfoblastoide B derivada de la capa
leuco-plaquetaria de sangre periférica de un
paciente con leucemia linfoblástica aguda (1). La línea celular HSB
negativa al antígeno es una Línea celular linfoblastoide T
desarrollada a partir de tumores inducidos en hámster sirios recién
nacidos (2). La línea celular de mieloma murino SP2/0 se mantuvo de
forma similar en RPMI-1640 que contenía suero bovino
fetal al 10%.
Los anticuerpos anti-CD20 B1 y
Leu 16 se adquirieron de Coulter Immunology y Becton/Dickinson,
respectivamente. Los anticuerpos de cabra anti-IgG
de ratón y anti-IgG humana marcados con ^{125}I se
obtuvieron de ICN.
El F(ab')2 de cabra anti-IgG de ratón se obtuvo de Cappel.
El F(ab')2 de cabra anti-IgG de ratón se obtuvo de Cappel.
Los adyuvantes completo e incompleto de Freund
se adquirieron de Sigma Chemical Company. El polietilenglicol,
concentrado HAT, y concentrado HT se obtuvieron todos de Boehringer
Mannheim. El isotiocianato de fluoresceína (FITC) se adquirió de
Sigma Chemical Company. El cloruro de indio-[111] y el cloruro de
^{90}Y se obtuvieron de Amersham o NEN Dupont. El cloruro de
itrio-[89] se adquirió de Aldrich Chemical Company. Todos los demás
reactivos se obtuvieron de fuentes convencionales.
Los reactivos usados para los protocolos de
conjugación y radiomarcaje se procesaron para retirar los iones de
metales pesados contaminantes que podrían competir con los
radioisótopos durante la etapa de radiomarcaje. Los reactivos se
procesaron típicamente pasando las soluciones a través de una
columna de resina de intercambio iónico Chelex 100 (BioRad
Industries) o por procesamiento por lotes mediante la adición de
Chelex 100 a una solución preparada. Se usó agua de bajo contenido
en metales, Milli-Q-purificada o
Agua para Irrigación (WFIr del inglés Water for Irrigation) para
todas las preparaciones y diluciones. Las soluciones sin metales se
filtraron a esterilidad y se recogieron en recipientes de plástico
estériles.
Se inmunizaron diez ratones BALB/c con 20
millones de células SB suspendidas en PBS que contenía adyuvante
completo de Freund. Las células se inyectaron tanto s.c. como i.p.
en múltiples sitios en el animal. Después de un periodo de reposo
de 2 semanas, se inyectó a los animales una segunda vez células SB
emulsionadas en adyuvante incompleto de Freund. Se realizaron
posteriores refuerzos de inmunización en un programa semanal con
células SB suspendidas en PBS. Los ratones se inmunizaron durante un
periodo de 6 semanas a 4 meses.
Se sacrificaron dos animales al mismo tiempo por
dislocación cervical y se retiraron sus bazos por fusión con el
mieloma murino SP2/0. Los animales se eligieron en base a la
capacidad de los sueros post-inmunes de inhibir de
forma eficaz la unión del anticuerpo anti-CD20
radiomarcado B1 de Coulter a células SB humanas. Tres días antes de
cada fusión, se les dio a los animales seleccionados una última
inyección intravenosa (vena de la cola) de 20 millones de células
SB en PBS. Después del sacrificio se retiraron los bazos en
condiciones asépticas y se fusionaron los esplenocitos con células
SP2/0 a una proporción de 5:1 (esplenocitos:SP2/0). Las células
fusionadas se lavaron en medio de cultivo tisular y se distribuyeron
en placas de 96 pocillos que contenían medio de selección HAT. Los
hibridomas se exploraron por radioinmunoensayo de inhibición usando
anticuerpo B1 de Coulter después de 10-14 días.
La exploración de híbridos que secretan
anticuerpos anti-CD20 se consiguió usando métodos de
radioinmunoensayo establecidos. En resumen, el anticuerpo
anti-CD20 B1 de Coulter se purificó por
cromatografía de afinidad por Proteína A. Se acoplaron cincuenta
microgramos de anticuerpo purificado a ^{125}I por oxidación breve
en presencia de Iodobeads (Pierce Chemical Co.), siguiendo el
procedimiento del fabricante. El anticuerpo radiomarcado se desaló
en resina amberlite y se almacenó en tampón de dilución (PBS, pH
7,4, que contenía gelatina al 0,2%, azida sódica al 0,02%, y BSA al
1,0%). Se colocaron diez nanogramos de anticuerpo radiomarcado en
cada pocillo de una placa de ensayo de filtro previamente bloqueada
(tampón de bloqueo: tampón de dilución que contenía FBS al 10%)
junto con 50 \mul de sobrenadante de hibridoma de los pocillos de
ensayo y 100.000 células SB suspendidas en 50 \mul de tampón de
dilución. La suspensión se incubó durante una hora a temperatura
ambiente. Las placas se lavaron minuciosamente con tampón de lavado
(PBS, pH 7,4, que contenía gelatina al 0,2% y azida sódica al
0,02%) en un colector de vacío V&P Scientific y los fondos de
filtro que contenían células SB atrapadas se transfirieron a un
contador gamma. Los pocillos que contenían solamente medio HAT y
anticuerpo B1 marcado se usaron como controles de fondo y pocillos
idénticos que contenían células SB se usaron como controles
positivos. Los controles de inhibición contenían B1 radiomarcado y
diversas cantidades de anticuerpo B1 sin marcar que variaban de 2
\mug a 2 ng.
Se realizaron estudios de citometría de flujo
preliminares con sobrenadantes de cultivos de hibridoma 2B8. Se
incubaron cien microlitros de sobrenadante de hibridoma con células
SB durante una hora a temperatura ambiente; se añadió un anticuerpo
secundario (F(ab')2 de cabra anti-IgG de
ratón; Cappel), usado a una dilución 1/400, posteriormente y se
continuó la incubación durante 1 hora en la oscuridad. Las células
se lavaron 5 veces. Los controles incluían células solamente (sin
anticuerpo primario o secundario) a partir de las cuales se
determinó la autofluorescencia, células con anticuerpo secundario
solamente para determinar la unión no específica y B1 conjugado con
isotiocianato de fluoresceína disponible en el mercado
(B1-FITC) para un control de la población CD20.
Para algunos experimentos, la fluoresceína se
acopló a anticuerpo 2B8 purificado a través de la reacción de los
grupos amino con isotiocianato de fluoresceína (FITC). En resumen,
se incubó el anticuerpo 2B8 (1,2 mg/ml) en tampón carbonato sódico
0,1 M, pH 9,5 con 150-200 \mug de FITC por mg de
proteína. La solución se incubó a temperatura ambiente durante 2
horas y el conjugado 2B8-FITC resultante se purificó
en una columna Sephadex G-25. Otros reactivos
usados en estos estudios tales como B1 y Leu 16 se adquirieron como
conjugados con fluoresceína directamente de Coulter o Becton
Dickinson.
Las células a analizar se recogieron y lavaron
tres veces con PBS que contenía BSA al 0,2% y azida sódica al 0,1%.
La viabilidad se determinó por exclusión de azul de tripano con un
requerimiento de viabilidad de >90%. Las concentraciones
celulares se ajustaron a 3 millones por ml con 50 \mul añadidos
por pocillo en placas de fondo en U de 96 pocillos. El anticuerpo
primario (50 \mul) se añadió a los pocillos apropiados y la
mezcla se incubó durante 30 min. a 1 h. a temperatura ambiente;
posteriormente las células se lavaron 5 veces con 200
\mul/pocillo de PBS que contenía BSA al 0,2% y azida sódica al
0,02%. Las células se centrifugaron en las placas a 1300 RPM
durante 1 min. en una centrífuga Sorvall y los sobrenadantes se
retiraron "golpeando" suavemente las placas. Se añadió el
anticuerpo secundario, si fuera necesario, y se incubó durante 30
min. a 1 h adicional a temperatura ambiente en la oscuridad;
después se lavaron los pocillos como anteriormente. Finalmente, se
añadieron 200 \mul de tampón de fijación (cloruro sódico 0,15 M
que contenía paraformaldehído al 1%, pH 7,4) a cada muestra y las
células tratadas se transfirieron a tubos de 12X75 mm para el
análisis.
Después de retirar el plasma, las células se
lavaron dos veces por centrifugación y resuspensión en HBSS. Se
añadió suero bovino fetal (2 ml) y se resuspendieron las células.
Después se distribuyeron cien microlitros de las células
resuspendidas a cada uno de los 6 tubos de centrífuga cónicos de 15
ml. Los anticuerpos monoclonales marcados de forma fluorescente se
añadieron del siguiente modo:
- Tubo nº 1:
- Murino anti-CD2-FITC (AMAC), 2,5 \mug/ml, 5 \mug;
- Tubo nº 2:
- Cabra anti-IGM humana-FITC (Fisher) 2,5 \mug/ml, 5 \mug;
- Tubo nº 3:
- Cabra anti-IgG de ratón-RPE (Fisher) 2,5 \mug/ml, 5 \mug;
- Tubo nº 4:
- Cabra anti-IgM humana-FITC + Cabra anti-IgG de ratón-RPE (absorbido), 2,5 \mug/ml, 5 \mug;
- Tubo nº 5:
- anti-CD20 humano-FITC (anti-Leu 16, Becton Dickinson), 5 \mug;
- Tubo nº 6:
- Células solamente (auto-fluorescencia).
Los anticuerpos marcados y las células se
centrifugaron durante 2 min. a 1500 rpm para mezclar las células y
los anticuerpos y las 6 muestras después se colocaron en hielo y se
incubaron durante 30 min. Posteriormente los tubos se retiraron del
hielo y se añadió tampón de lisis (precalentado a 37ºC) hasta un
volumen de 12 ml Las muestras después se incubaron durante 15 min.
a temperatura ambiente, se centrifugaron durante 5 min. a 4ºC a
1500 rpm, y se retiraron los sobrenadantes. Los sedimentos celulares
se lavaron después dos veces en tampón de marcaje (PBS que contenía
BSA al 1% y azida sódica al 0,05%).
Posteriormente las células se fijaron por la
adición de 0,5 ml de tampón de fijación (cloruro sódico 0,15 M, pH
7,4, que contenía paraformaldehído al 1%) por tubo y se analizaron
en un instrumento Becton Dickinson FACScan usando autocompensación
y precalibrado con perlas Calibrite. La fluorescencia verde de la
fluoresceína se midió en modo FL1 y la fluorescencia roja de la
ficoeritrina se midió en modo FL2. Los datos se expresaron en forma
log. Las poblaciones de linfocitos viables se identificaron
inicialmente por dispersión de luz directa frente a ángulo recto en
un mapa de bits de diagrama de puntos. La población de linfocitos
total se aisló después separando todos los demás casos. Las
mediciones de fluorescencia posteriores reflejaban solamente
aquellos casos específicos que existían dentro del área abierta.
Para estudios de farmacología/toxicología de
elevada dosis se determinaron los niveles de linfocitos antes del
estudio para cada mono cynomolgus y se usaron como valores
iniciales. El porcentaje de células T y B y las proporciones T:B se
calcularon y usaron como referencias de eliminación. La población de
células B antes de estudio se contó con anticuerpos Leu 16 y
anti-IgM humana.
Después de la inyección de 2B8 en los monos,
cuando el antígeno CD20 se saturó con 2B8, el porcentaje de células
B en la población total se aproximó usando anticuerpo de cabra
anti-IgM humana-FITC,
anti-IgG de ratón-RPE y la
población de tinción doble que contenía estos dos marcadores. La
población de tinción doble se usó para la cuantificación hasta que
se eliminó todo el 2B8 de la sangre periférica de los animales. El
porcentaje de células T en la población de linfocitos total se
estimó usando anti-CD2-FITC. Los
datos se promediaron a partir de tres mediciones de 10.000 casos
hechas con cada muestra. Las células de cada una de las muestras
sanguíneas designadas se evaluaron posteriormente, contando en cada
caso las subpoblaciones de células T y B dentro de la población de
linfocitos total. También se examinaron las proporciones T:B. Se
calculó la eliminación de células B como el porcentaje de reducción
de células B con relación a los niveles originales de células B
para cada mono individual.
\vskip1.000000\baselineskip
Un millón de células SB se dividió en dos partes
iguales después de yodación superficial con ^{125}I y Iodobeads
(Pierce Chemical Co.). Las células se lavaron repetidamente por
centrifugación hasta que los niveles de radiactividad en el
sobrenadante volvieron a ser los de fondo. Se añadieron cien
microgramos de anticuerpo 2B8 o B1 (Coulter Immunology) a cada una
de las dos muestras de células B marcadas. Los anticuerpos y las
células SB se incubaron durante una noche y después se lavaron tres
veces por centrifugación hasta que se retiró todo el anticuerpo no
unido. Los sedimentos celulares que contenían 2B8 y B1 unidos se
lisaron después y se extrajeron por la adición de detergente
NP-40 al 1% en Tris-HCl 0,1 M, pH
8,0, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 1 h. El
extracto se centrifugó en una microfuga a elevada velocidad durante
30 min. y los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos. Se
añadió proteína A-Sepharose (300 \mul) a cada tubo
y se sedimentó la resina por centrifugación. La proteína
A-Sepharose se lavó después 20 veces para retirar la
proteína yodada no unida específicamente. Cuando la proporción de
radiactividad perla-a-sobrenadante
alcanzó un valor de 100, se extrajo el sedimento con tampón de
muestra de SDS PAGE y se calentó a ebullición. Después de un periodo
de refrigeración, se añadieron aproximadamente 15.000 cpm de cada
uno de los extractos a los pocillos de un gel de poliacrilamida al
10%. Se añadió un patrón de bajo peso molecular
pre-teñido (BioRad Inc.) a un pocillo diferente y
se usó para estimar el peso molecular. Las proteínas se resolvieron
por electroforesis y el gel se secó y se expuso a una lámina de
película de rayos X durante 24 horas a -70ºC; posteriormente se
reveló la película y se analizó.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó 2B8 purificado para la afinidad
aparente por análisis de Scatchard. Se preparó 2B8 radiomarcado por
reacción con ^{125}I en presencia de Iodobeads. Después de retirar
el yodo libre, se incubó el anticuerpo radiomarcado en diversas
concentraciones, por duplicado, que variaban de 5000 ng por pocillo
a 35 ng/pocillo con 10.000 células SB. La cantidad de unión del
anticuerpo a las células se calculó a partir de la actividad
específica del 2B8 marcado con ^{125}I. La proporción de
anticuerpo unido/libre se representó frente a la concentración
molar del anticuerpo unido y se determinó la constante de afinidad
aparente a partir de la proporción de los puntos de corte en el eje
X e Y.
\vskip1.000000\baselineskip
Para algunos estudios
pre-clínicos, el ácido
1-isotiocianatobencil-3-metildietilenotriaminapentaacético
marcado con carbono-14 (MX-DTPA) lo
proporción el Dr. Otto Gansow del National Institute of Health en
forma de un sólido seco y se almacenó desecado a 4ºC protegido de
la luz. Se prepararon soluciones madre del quelato en agua
Milli-Q y se determinó la concentración evaluando la
radiactividad y usando la actividad específica del compuesto. Las
soluciones madre generalmente eran 2-5 mM y se
almacenaron a -70ºC en tubos de polipropileno. Para otros estudios,
se obtuvo MX-DTPA de Coulter Immunology en forma de
sal disódica en agua y se almacenó a -70ºC.
Además de usar reactivos libres de metales,
todas las manipulaciones de los reactivos se realizaron para
minimizar la posibilidad de contaminación con metales. Cuando era
posible, se usaron recipientes de plástico de polipropileno tales
como matraces, vasos de precipitados y cilindros graduados. Estos se
lavaron con Alconox y se aclararon exhaustivamente con agua
Milli-Q antes de su uso. Además, se usaron puntas de
pipeta libres de metales (BioRad) para manipular de forma precisa
pequeños volúmenes. Para manipular volúmenes más grandes de
reactivos, se usaron pipetas serológicas de plástico, estériles
(disponibles en tamaños de 1 a 25 ml). Las reacciones se realizaron
convenientemente en tubos de microfuga de polipropileno, con tapa a
rosca (Sardstedt Industries; capacidad de 1,5 ml) o tubos cónicos
de polipropileno (Costar; 15 ml y 50 \mul). Cuando se manipulaban
tubos de diálisis, se usaban guantes quirúrgicos desechables,
previamente aclarados con agua Milli-Q.
El anticuerpo murino anti-CD20
2B8 se purificó inicialmente a partir de líquido ascítico por
cromatografía con Proteína A y QAE. Para posteriores experimentos
2B8 se purificó de sobrenadantes del biorreactor de fibra hueca
usando el mismo proceso de purificación. El anticuerpo obtenido de
la fibra hueca ahora se ha remplazado para propósitos de
comercialización con el anticuerpo derivado de CHO descrito en el
Ejemplo 2.
El anticuerpo se preparó para conjugación
transfiriéndolo en bicina-NaOH 50 mM libre de
metales, pH 8,6, que contenía NaCl 150 mM, usando diálisis o
intercambio repetitivo de tampón. En algunos estudios, el
intercambio de tampón se realizó usando ultrafiltración repetitiva
con filtros de centrifugación (30.000 D MWCO) Centricon 30
(Amicon). En general, se añadieron 50-200 \mul de
proteína (10 mg/ml) a la unidad de filtro y se añadieron 2 ml de
tampón bicina. El filtro se centrifugó a 4ºC en un rotor Sorvall
SS-34 a 6.000 rpm durante 45 min. El volumen
retenido era de aproximadamente 50-100 \mul. Este
proceso se repitió dos veces con el mismo filtro. El producto
retenido se transfirió a un tubo con tapón a rosca de 1,5 ml de
polipropileno, se ensayó para las proteínas, se diluyó a 10,0 mg/ml
y se almacenó a 4ºC hasta que se usó para la conjugación. Para
algunos estudios, la proteína se transfirió en citrato sódico 50
mM, pH 5,5 que contenía NaCl 150 mM y azida sódica al 0,05% usando
el mismo protocolo descrito anteriormente.
La conjugación de 2B8 con
MX-DTPA se realizó en tubos de polipropileno a
temperatura ambiente. Las soluciones madre congeladas de
MX-DTPA se descongelaron inmediatamente antes de su
uso. Típicamente, se hicieron reaccionar 50-200
\mul de anticuerpo a 10 mg/ml con el quelato a una proporción
molar de quelato-a-proteína de 4:1.
Las reacciones se iniciaron añadiendo la solución madre de quelato y
mezclando suavemente; se dejó que procediera la conjugación durante
una noche, generalmente durante 14 a 20 h, a temperatura ambiente.
El quelato sin reaccionar se retiró del conjugado por diálisis o
ultrafiltración repetitiva, como se ha descrito anteriormente, en
solución salina normal libre de metales (0,9% p/v) que contenía
azida sódica al 0,05%. La concentración de proteína se ajustó a 10
mg/ml y se almacenó a 4ºC en un tubo de polipropileno hasta el
radiomarcaje.
La incorporación de quelato se determinó por
recuento de centelleo y comparando el valor obtenido con el
conjugado purificado a la actividad específica del quelato marcado
con carbono-[14]. Para estudios posteriores, en los que se usó
quelato no radiactivo obtenido de Coulter Immunology, la
incorporación de quelato se evaluó incubando el conjugado con un
exceso de una solución de vehículo radiactivo de ^{90}Y de
concentración y actividad específica conocidas.
En resumen, se preparó una solución madre de
cloruro de itrio de concentración conocida en HCl 0,05 N libre de
metales a la que se añadió ^{90}Y sin vehículo (sal cloruro). Se
analizó una alícuota de esta solución por recuento de centelleo
líquido para determinar una actividad específica precisa para este
reactivo. Se añadió un volumen del reactivo de cloruro de itrio
igual a 3 veces la cantidad de moles de quelato que se espera que
se unan al anticuerpo, típicamente 2 mol/mol de anticuerpo, a un
tubo de polipropileno, y el pH se ajustó a 4,0-4,5
con acetato sódico 2 M. El anticuerpo conjugado se añadió
posteriormente y la mezcla se incubó durante 15-30
min. a temperatura ambiente. La reacción se interrumpió añadiendo
EDTA 20 mM a una concentración final de 1 mM y el pH de la
solución se ajustó a aproximadamente pH 6 con acetato sódico 2
M.
Después de 5 min. de incubación se purificó el
volumen completo por cromatografía por exclusión de tamaño de alta
resolución como se describe a continuación. Las fracciones que
contenían la proteína eluida se combinaron, se determinó la
concentración de proteína, y se ensayó una alícuota para la
radiactividad. La incorporación de quelato se calculó usando la
actividad específica de la preparación de cloruro de ^{90}Y y la
concentración de proteína.
La inmunorreactividad de 2B8 conjugado se evaluó
usando ELISA de células completas. Se recogieron células SB en fase
semi-log del cultivo por centrifugación y se lavaron
dos veces con 1X HBSS. Las células se diluyeron a
1-2 X 10^{6} células/ml en HBSS y se hicieron
alícuotas en placas de microtitulación de poliestireno de 96
pocillos a 50.000-100.000 células/pocillo. Las
placas se secaron al vacío durante 2 h a 40-45ºC
para fijar las células al plástico. Las placas se almacenaron en
seco a -20ºC hasta que se usaron. Para el ensayo, las placas se
calentaron a temperatura ambiente inmediatamente antes de su uso,
después se bloquearon con 1X PBS, pH 7,2-7,4 que
contenía BSA al 1% (2 h). Las muestras para el ensayo se diluyeron
en 1X PBS/BSA al 1%, se aplicaron a placas y se diluyeron en serie
(1:2) en el mismo tampón. Después de incubar las placas durante 1 h
a temperatura ambiente, las placas se lavaron tres veces con 1X PBS.
Se añadió el anticuerpo secundario (conjugado de cabra
anti-IgGI de ratón-HRP específico)
(50 \mul) a los pocillos (dilución 1:1500 en 1X PBS/BSA al 1%) y
se incubó 1 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron cuatro
veces con 1X PBS seguido de la adición de solución de sustrato ABTS
(citrato sódico 50 mM, pH 4,5 que contenía ATBS al 0,01% y
H_{2}O_{2} al 0,001%). Las placas se leyeron a 405 nm después
de 15-30 min. de incubación. Se incluyeron células
HSB negativas al antígeno en los ensayos para controlar la unión no
específica. La inmunorreactividad del conjugado se calculó
representando los valores de absorbancia frente al factor de
dilución respectivo y comparando con los valores obtenidos usando
el anticuerpo nativo (que representa el 100% de inmunorreactividad)
ensayado en la misma placa. Se compararon varios valores en la
parte lineal del perfil de titulación y se determinó un valor
medio.
Para esta evaluación de 12 semanas de
estabilidad del anticuerpo y el conjugado, se formularon alícuotas
de anticuerpo 2B8 y 2B8-MX-DTPA en
solución salina normal o solución salina normal que contenía
glicina-HCl 10 mM, pH 6,8. Se incubaron series
duplicadas de muestras tanto a 4ºC como a 30ºC y las muestras se
ensayaron semanalmente usando los siguientes métodos:
SDS-PAGE (tanto reductora como no reductora),
inmunorreactividad por inmunoensayo enzimático de células completas
usando células SB (positivas al antígeno) o HSB (negativas al
antígeno) como captura, y electroforesis en gel por electroenfoque
isoeléctrico (intervalo de pH, 3-10). Además, la
eficacia de radiomarcaje del conjugado se evaluó en las semanas 4,
8, y 12 radiomarcando el conjugado con ^{90}Y y analizando el
producto por SDS-PAGE y análisis autorradiográfico.
Finalmente, en un estudio diferente, se radiomarcaron alícuotas de
2B8-MX-DTPA incubadas a 4ºC y 30ºC
durante 10 semanas con ^{111}In y se evaluaron en un estudio de
biodistribución en ratones BALB/c como se describe a
continuación.
Se realizaron estudios de inmunohistología tanto
con anticuerpos nativos como conjugados
(2B8-MX-DTPA) por IMPATH
Laboratories usando secciones de tejidos humanos fijados con
acetona. El anticuerpo se purificó a partir de sobrenadantes de
biorreactor de fibra hueca por cromatografía sobre proteína A y Q
Sepharose. El conjugado de calidad clínica se preparó usando
MX-DTPA de Coulter Immunology de acuerdo con el
protocolo descrito anteriormente.
Para algunos experimentos, se usó el protocolo
de ELISA de células completas usado para
2B8-MX-DTPA sin marcar. En
experimentos posteriores, se determinó la inmunorreactividad de
conjugados marcados con ^{111}In y ^{90}Y (cada uno preparado
en IDEC Pharmaceuticals o, como alternativa, en MPI Pharmacy
Services, Inc.) usando una versión modificada del ensayo de unión
de células completas descrito por Lindmo (3). En resumen, se
añadieron concentraciones crecientes de células SB positivas al
antígeno o células HSB negativas al antígeno, en fase
semi-log [20-30 X 10^{6}
células/ml en tampón de dilución (PBS, pH 7,4 que contenía BSA al
1%, gelatina al 0,1%, y azida sódica al 0,02%)] a series duplicadas
de tubos. El conjugado radiomarcado se diluyó a una concentración
final de anticuerpo de 1-5 ng/ml con tampón de
dilución y se añadieron 0,35 ml a cada tubo. Después de un periodo
de incubación de 75-90 min. a temperatura ambiente,
se sedimentaron las células por centrifugación y se recogieron los
sobrenadantes. La radiactividad restante en la fracción sobrenadante
se determinó con un contador gamma o de centelleo. Los datos se
representaron como el cociente de la radiactividad total añadida
dividida por la radiactividad asociada a las células, frente a la
inversa de la cantidad de células por tubo. El punto de corte del
eje y por tanto representa la fracción inmunorreactiva.
La estabilidad in vitro de
2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In y
^{90}Y se evaluó por incubación en suero humano a 37ºC durante 96
horas. El anticuerpo conjugado se preparó y se radiomarcó con
^{111}In (protocolo "mezclar y usar") o ^{90}Y como se ha
descrito anteriormente. Las actividades específicas de los
conjugados marcados con ^{111}In y ^{90}Y eran 2,5 y 14,6
mCi/mg, respectivamente; los conjugados radiomarcados se
suspendieron en tampón que contenía 75 mg/ml de albúmina sérica
humana (HSA) y DTPA 1 mM (conjugado marcado con itrio) o tampón
que contenía 50 mg/ml de HSA (conjugado marcado con indio). Los
conjugados radiomarcados se diluyeron 1:10 con suero humano normal
(no inactivado por calor) y se colocaron alícuotas de forma aséptica
en tubos tapados estériles; estos tubos después se incubaron a 37ºC
durante periodos de hasta 96 horas. A tiempos seleccionados se
retiraron muestras conjugadas y se analizaron por
SDS-PAGE no reductora en geles con gradiente del
4-20% seguido de autorradiografía, y por
cromatografía en capa fina instantánea.
El conjugado
2B8-MX-DTPA se radiomarcó con
^{111}In y se usó son purificación por HPLC (protocolo "mezclar
y usar"). El anticuerpo radiomarcado se diluyó en PBS y albúmina
sérica humana (HSA) añadidos a una concentración final de 50 mg/ml.
La actividad específica del conjugado radiomarcado formulado era de
2,2 mCi/mg. El conjugado formulado se incubó posteriormente a 4ºC
durante 48 horas y se analizaron las alícuotas a tiempo 0, 24 h y
48 horas usando SDS-PAGE no reductora en geles con
gradiente del 4-20% seguido de autorradiografía, y
por cromatografía en capa fina instantánea. La inmunorreactividad
en cada momento puntual se evaluó usando el ensayo de suspensión de
células completas descrito en la anterior sección 1.
El conjugado
2B8-MX-DTPA se radiomarcó con
^{90}Y y se purificó por cromatografía por exclusión de tamaño en
HPLC usando 1X PBS como tampón de elución. Las fracciones de
conjugado radiomarcado se combinaron y se añadieron albúmina sérica
humana y DTPA a concentraciones finales de 75 mg/ml y 1 mM,
respectivamente. La actividad específica del conjugado radiomarcado
formulado era de 14,6 mCi/mg. El conjugado formulado se incubó
posteriormente a 4ºC durante 48 horas y se analizaron alícuotas a
tiempo 0, 24 h y 48 horas usando SDS-PAGE no
reductora en geles con gradiente del 4-20% seguido
de autorradiografía, y cromatografía en capa fina instantánea. La
inmunorreactividad en cada momento puntual se evaluó usando el
ensayo de suspensión de células completas descrito en la anterior
sección 1.
El anticuerpo 2B8 se evaluó en un estudio de
farmacología de elevada dosis realizado según las regulaciones GLP
en el White Sands Research Center (Número de Estudio 920111). Se
usaron monos Macaca fascicularis (cynomolgus) adultos; cada
grupo de estudio constaba de un macho y una hembra. El anticuerpo se
inyectó por vía intravenosa cada 48 horas para un total de siete
inyecciones. El estudio constaba de cinco grupos: Grupo I (solución
salina); Grupo II (0,6 mg/kg); Grupo III (2,5 mg/kg); Grupo IV (10
mg/kg); y, Grupo V (10 mg/kg en el día 0 solamente).
Antes del inicio del estudio, se obtuvo sangre
de los 10 animales y se usó para determinar los fondos de reactivos
y las poblaciones iniciales de células B. Todas las muestras
sanguíneas posteriores se extrajeron antes de cada inyección de
anticuerpo. Los Grupos III y IV se sacrificaron en el día 13 para
una necropsia completa y la histopatología.
A los animales de los grupos I, II, y V se les
extrajo sangre en los días 0, 1, 3, 7, 13, 21, 37 y 52; se
extrajeron aproximadamente 5 ml de sangre completa en tubo
heparinizados. La sangre completa se mantuvo a 4ºC y se analizó en
24 horas. La sangre de cada animal se centrifugó a 2000 rpm durante
5 min. y se retiró el plasma sobrenadante para el ensayo de los
niveles séricos de 2B8 por RIA (véase el procedimiento de RIA para
métodos de ensayo específicos). El material sedimentado que contenía
PBL y RBC se resuspendió en FCS para el análisis FACS.
La vida media beta en suero promedio de 2B8 en
monos cynomolgus se determinó usando los animales del Grupo V
(anterior). Se diluyó anticuerpo de cabra anti-IgGI
de ratón (Fisher Scientific) a 2,0 \mug por ml en tampón borato
10 mM, pH 9,6, y se añadieron 50 \mul a cada pocillo de una placa
de 96 pocillos. Se dejó que el anticuerpo se uniera a la placa
durante una incubación de una noche a 4ºC, o durante 2 h a
temperatura ambiente. Cada placa se bloqueó durante 30 min. a
temperatura ambiente con 150 \mul por pocillo de PBS que contenía
BSA al 1%. Las placas se lavaron con agua destilada y se aplicaron
muestras séricas o plasmáticas por triplicado a pocillos
individuales a dilución inicial 1:100 seguido de diluciones en serie
1:2. Se añadió 2B8 purificado a suero pre-extraído
y se diluyó para su uso como una curva patrón que comienza con 0,5
mg/ml; las muestras se diluyeron 1:100 y después se diluyeron en
serie como con las otras muestras. Las placas se incubaron durante
1 h a temperatura ambiente y se lavaron 4 veces con agua destilada.
El reactivo secundario (anticuerpo de cabra
anti-IgGI de ratón-HRPO) se añadió
después a dilución 1:4000 y se incubó a temperatura ambiente
durante una hora adicional. Las placas se lavaron de nuevo en agua
destilada y se añadió 0,1 ml de sustrato peroxidasa que contenía
peróxido de hidrógeno. Se dejó que se desarrollara color de la
reacción durante 20 min.; posteriormente se determinó la
absorbancia a 405 nm usando un lector de microplaca ELISA. Los
resultados se representaron en \mug de anticuerpo por ml de
suero.
Además, se determinaron los valores
\betat_{1/2} de 2B8 y
2B8-MX-DTPA en ratones BALB/c. Se
descongeló 2B8 no conjugado almacenado a -70ºC en 1X PBS, pH
7,4/glicerol al 10%, se diluyó a 0,5 mg/ml y se filtró a
esterilidad. El anticuerpo conjugado se preparó siguiendo protocolos
convencionales pero con quelato marcado con carbono-[14]; la
incorporación de quelato era de 1,5 mol/mol de anticuerpo. El
conjugado purificado se diluyó a 0,5 mg/ml en solución salina
normal (0,9%), se filtró a esterilidad, y se almacenó a 4ºC con el
anticuerpo nativo hasta que se usó.
A ratones de seis a ocho semanas de edad se les
inyectó 100 \mul de anticuerpo 2B8 purificado a una concentración
de 250 \mug/ml. Posteriormente se extrajo sangre a los ratones por
punción retro-orbital en diversos momentos que
varían de 0 a 264 horas y se analizaron sus sueros para la presencia
de anticuerpo 2B8 nativo y conjugado por inmunoensayo enzimático de
células completas usando la línea de células B positiva al antígeno
SB como captura. Los datos resultantes se representaron como la
concentración de 2B8 o 2B8-MX-DTPA
frente al tiempo; a partir de estos resultados se generó una
representación de regresión lineal y se usó la pendiente para
determinar los valores \betat_{1/2}.
Se preparó
2B8-MX-DTPA que porta itrio-[89]
usando el protocolo descrito para la inserción de ^{90}Y, excepto
en que no se usó purificación por HPLC. El conjugado que porta
metales, no radiactivo se formuló en 1X PBS que contenía 75 mg/ml
de HSA y DTPA 1 mM y se evaluó en el estudio GLP número 920611 en
el White Sands Research Center. Se incluyeron un mono macho y uno
hembra en cada uno de los cuatro grupos. Se inyectó a los animales
por vía intravenosa cada 48 horas para un total de 7 inyecciones las
siguientes cantidades de fármaco: grupo 1 (solución salina); grupo
II (0,003 mg/kg); grupo III (0,03 mg/kg); y, grupo IV (0,3 mg/kg).
Se evaluó a los animales durante el estudio determinando los pesos
corporales y las temperaturas, el consumo de alimento y agua, la
eliminación, la química sérica, la hematología, el urianálisis, y
exámenes físicos. Se extrajo sangre a los animales de los grupos I
a IV antes de la infusión en los días 0, 2, 7, 10 y 14 y la sangre
se analizó para los niveles de células B circulantes por análisis
FACS.
En un estudio preliminar, se evaluó
2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In
para la biodistribución tisular en ratones BALB/c de seis a ocho
semanas de edad. El conjugado radiomarcado se preparó usando
2B8-MX-DTPA de calidad clínica
siguiendo el protocolo "mezclar y usar" descrito anteriormente.
La actividad específica del conjugado era de 2,3 mCi/mg y el
conjugado se formuló en PBS, pH 7,4 que contenía 50 mg/ml de HSA. Se
inyectó a los ratones por vía intravenosa 100 \mul de
2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In
(aproximadamente 21 \muCi) y se sacrificaron los grupos de tres
ratones por dislocación cervical a 0, 24, 48, y 72 horas. Después
del sacrificio, se retiraron la cola, el corazón, los pulmones, el
hígado, los riñones, el bazo, el músculo, y el fémur, se lavaron,
se pesaron; también se retiró una muestra de sangre para el
análisis. Se determinó la radiactividad asociada con cada muestra
por recuento gamma y posteriormente se determinó el porcentaje de
dosis inyectada por gramo de tejido. No se intentó descartar la
contribución a la actividad representada por la sangre asociada con
los órganos individuales.
En un protocolo diferente, se radiomarcaron
alícuotas de 2B8-MX-DTPA incubadas a
4ºC y 30ºC durante 10 semanas con ^{111}In a una actividad
específica de 2,1 mCi/mg para ambas preparaciones. Estos conjugados
se usaron después en estudios de biodistribución en ratones como se
ha descrito anteriormente.
Para determinaciones de dosimetría, se
radiomarcó 2B8-MX-DTPA con
^{111}In a una actividad específica de 2,3 mCi/mg y se inyectó
aproximadamente 1,1 \muCi en cada uno de los 20 ratones BALB/c.
Posteriormente, se sacrificaron los grupos de cinco ratones a 1,
24, 48 y 72 horas y se retiraron sus órganos y se prepararon para
el análisis. Además, se retiraron partes de la piel, el músculo y el
hueco y se procesaron para el análisis; también se recogieron la
orina y las heces y se analizaron para los momentos puntuales de
24-72 horas.
Usando un enfoque similar, también se radiomarcó
2B8-MX-DTPA con ^{90}Y y se evaluó
su distribución biológica en ratones BALB/c en un periodo de tiempo
de 72 horas. Después de la purificación por cromatografía por
exclusión de tamaño por HPLC, se inyectó a cuatro grupos de cinco
ratones cada uno por vía intravenosa aproximadamente 1 \muCi de
conjugado formulado clínicamente (actividad específica: 12,2
mCi/mg); posteriormente los grupos se sacrificaron a 1, 24, 48 y 72
horas y sus órganos y tejidos se analizaron como se ha descrito
anteriormente. La radiactividad asociada con cada muestra tisular
se determinó midiendo la energía bremsstrahlung con un contador de
centelleo gamma. Los valores de actividad se expresaron
posteriormente como porcentaje de dosis inyectada por gramo de
tejido o porcentaje de dosis inyectada por órgano. Aunque los
órganos y otros tejidos se aclararon repetidamente para retirar la
sangre superficial, no se prefundieron los órganos. Por tanto, los
valores de actividad de los órganos no descartaban la contribución a
la actividad representada por la sangre internamente asociada.
La localización de
2B8-MX-DTPA radiomarcado se
determinó en ratones atímicos que portan tumores de células B
Ramos. A ratones atímicos de seis a ocho semanas de edad se les
inyectó por vía subcutánea (costado trasero izquierdo) 0,1 ml de
RPMI-1640 que contenía 1,2 X 10^{7} células
tumorales Ramos que se habían adaptado previamente para crecer en
ratones atímicos. Los tumores surgieron en dos semanas y variaban en
peso de 0,07 a 1,1 gramos. Se inyectó a los ratones por vía
intravenosa 100 \mul de
2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In
(16,7 \muCi) y se sacrificaron los grupos de tres ratones por
dislocación cervical a 0, 24, 48, y 72 horas. Después del
sacrificio se retiraron la cola, el corazón, los pulmones, el
hígado, los riñones, el bazo, el músculo, el fémur, y el tumor, se
lavaron, se pesaron; también se retiró una muestra de sangre para el
análisis. La radiactividad asociada con cada muestra se determinó
por recuento gamma y se determinó el porcentaje de dosis inyectada
por gramo de tejido.
Usando los datos de biodistribución obtenidos
usando ratones BALB/c a los que se ha inyectado el
2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In
o ^{90}Y (Tablas 1-4 y 5-8), se
calculó la estimación de la dosis de radiación absorbida a partir
de la dosis de 1,0 mCi administrada a un paciente de 70 kg usando el
procedimiento formalizado por el Medical Internal Radiation Dose
(MIRD) Committee of the Society of Nuclear Medicine. Las vidas
medias biológicas de los conjugados radiomarcados se determinaron a
partir de los valores de dosis inyectada por órgano determinados a
partir de los datos de biodistribución para cada
radioinmunoconjugado. Para algunos tejidos, por ejemplo la sangre,
se supuso que el deterioro biológico del radioconjugado seguía un
modelo de dos compartimientos con un deterioro exponencial desde
estos compartimientos. Para otros tejidos, por ejemplo el hígado,
cuyos niveles de actividad permanecían casi constantes en todo el
estudio de biodistribución de 72 horas, se supuso que la vida media
biológica era muy larga y se le asignó un valor de 1000 horas.
Valores Medios \pm
SD
Valores Medios \pm
SD
\newpage
Valores Medios \pm
SD
\newpage
Valores Medios \pm
SD
\newpage
Valores Medios \pm
SD
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Valores Medios \pm
SD
\newpage
Valores Medios \pm
SD
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Valores Medios \pm
SD
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De un modo similar, se asignaron los demás
valores de vida media biológicos o se calcularon usando la ecuación
convencionales para calcular el t_{1/2} para un deterioro
exponencial. Una vez se hubieron determinado estos valores, se
determinaron las variables para T_{ue}, T_{e1}, T_{e2},
A_{1}, A_{2}, y A, enumeradas en las Tablas 9 y 10, para cada
conjugado radiomarcado usando las ecuaciones proporcionadas en la
parte superior de estas tablas (variables de salida). Estos
valores, así como los mostrados en las posteriores tablas, se
calcularon usando un programa escrito en la hoja de cálculo Symphony
(Lotus Development Corp.) por Mr. Phillip Hagan, MS, Nuclear
Medicine Service, VA Medical Center La Jolla, CA 92161.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
\newpage
Usando los valores de Actividad Acumulada Total
(A) de las Tablas 9 y 10, y los valores S proporcionados por el
MIRD Pamphlet Number 11 (Tablas 11 y 12, y 13 y 14), se determinaron
las estimaciones de dosis de radiación absorbida para cada uno de
los conjugados radiomarcados para los tejidos enumerados (Tablas 15,
16, 17 y 18). Al determinar las estimaciones de dosis de radiación
medias para el conjugado marcado con indio proporcionado en la
Tabla 19, se sumó la propia dosis de un órgano dado con la dosis
absorbida producida por la actividad en órganos o tejidos
adyacentes. Sin embargo, al calcular los valores estimados de dosis
de radiación atribuidos al conjugado marcado con itrio (Tabla 20),
ciertos valores están ausentes para los tejidos enumerados (por
ejemplo, glándulas suprarrenales). Esto se debe a la longitud de
paso más corta de la partícula \beta liberada, con relación a la
longitud de paso de la partícula \delta emitida, proporcionando
por tanto una contribución de actividad insignificante desde los
tejidos adyacentes, y a la ausencia de datos de biodistribución
primaria para estos tejidos.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Un total de nueve fusiones produjeron tres
hibridomas que producían anticuerpos que competían de forma eficaz
con el anticuerpo radiomarcado B1 de Coulter. En cada caso, el
hibridoma se expandió en una placa de 24 pocillos. Se isotiparon
los dos primeros anticuerpos aislados de las fusiones 3 y 4, y ambos
se identificaron como IgM. Se determinó que el tercer anticuerpo,
producido en la fusión 5 y denominado 2B8, era un isotipo IgGI kappa
y se seleccionó para estudios de conjugación. El clon 2B8.HII se
expandió y se colocó en almacenamiento a largo plazo en nitrógeno
líquido. El clon 2B8.HII se subclonó para producir el clon
2B8.HII.G3 y de nuevo para producir el clon 2B8.HII.G3.G9. Este
clon se expandió para estudio adicional y se purificó el anticuerpo
para cromatografía de afinidad a proteína A.
Los ensayos de competición usando 2B8, B1 y Leu
16 sin marcar y B1 de Coulter radiomarcado demostraron que 2B8 era
capaz de inhibir la unión de B1 a CD20 de forma más eficaz que
iguales concentraciones de B1 o Leu 16 (Fig. 1). Se obtuvieron
resultados similares (datos no mostrados) en un estudio de
competición usando 2B8 conjugado con FITC, B1 nativo y los
anticuerpos irrelevantes UPC-10 y
S-003 (isotipos IgG2a y 1, respectivamente).
La unión directa al antígeno celular CD20 por
los anticuerpos 2B8 y B1 se comparó por análisis FACS usando
células SB CD20-positivas y células HSB
CD20-negativas. Los resultados mostrados en la
Figura 2 indican que para cantidades comparables de anticuerpo, se
unía más 2B8 que B1 a las células SB. No se observó unión
significativa a células SB con los anticuerpos irrelevantes.
Solamente se observó la fluorescencia de fondo con algún reactivo
usado con células HSB. Estos resultados confirman la especificidad
de la interacción de 2B8 con el antígeno CD20 y sugieren que 2B8
puede tener mayor afinidad por el antígeno de superficie celular que
B1.
Para determinar la afinidad aparente de 2B8, se
radiomarcó el anticuerpo purificado con ^{125}I y se incubaron
concentraciones crecientes del anticuerpo marcado con células SB
positivas al antígeno; la radiactividad asociada a las células se
determinó después de un periodo de incubación de 1 hora (Fig. 3).
Los resultados sugieren que el anticuerpo 2B8 se une al antígeno
CD20 con una constante de afinidad aparente de 4,3 X 10^{-9}
M.
Estudios de citometría de flujo con linfocitos
de sangre periférica normal humana indicaron que 2B8 era específico
para células B y no reaccionaba con otros tipos de linfocitos (por
ejemplo, células T, monocitos, macrófagos). Se comparó 2B8 marcado
con FIAC con B1-FITC y Leu 16-FITC
usando la misma población de linfocitos humanos. Los resultados
mostrados en la Tabla 21 indican que 2B8 reaccionaba con
aproximadamente el 14 por ciento de los linfocitos de sangre
periférica frente a aproximadamente el 12 por ciento para Leu 16 y
el 11 por ciento para B1. La población de linfocitos basada en otro
marcador de linfocitos B (CD-19) estaba entre el 11
y el 14 por ciento. Finalmente, cuando se incubaron linfocitos de
sangre periférica humana con 2B8 y B1 o Leu 16 y después se
contrateñían con el marcado CD19 (Becton/Dickinson) la población de
tinción doble de linfocitos B era del 9 por ciento con 2B8, y del
10 por ciento con B1 o Leu 16. Estos resultados confirman la
similitud de estos reactivos.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
La inmunoprecipitación del antígeno celular CD20
radiomarcado por 2B8 o B1 provocó la precipitación de especies
proteicas dobles indistinguibles con pesos moleculares de
aproximadamente 33 y 35 KD (datos no mostrados).
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El conjugado
2B8-MX-DTPA se produjo haciendo
reaccionar el anticuerpo con un exceso molar 4:1 de ácido
isotiocianatobencil-3-metildietileno-triaminapentaacético
(4). Típicamente, se introdujeron 1-2 mol de
quelato MX-DTPA por mol de anticuerpo 2B8. Como se
muestra por los resultados presentados en la Fig. 4, el conjugado
2B8-MX-DTPA no mostrada pérdida
aparente en inmunorreactividad, con relación a 2B8 nativo, ya que
los anticuerpos 2B8 tanto nativos como conjugados mostraban perfiles
de inhibición de B1 casi idénticos; los valores de IC50 para 2B8 y
2B8-MX-DTPA eran aproximadamente 3 y
4 \mug/ml, respectivamente. Estos resultados se obtuvieron usando
anticuerpo B1 marcado con ^{125}I en un radioinmunoensayo de
células completas realizado usando células SB. Se obtuvieron
resultados similares usando 2B8 o
2B8-MX-DTPA como inhibidores de la
unión de 2B8 marcado con ^{125}I a células SB; tanto 2B8 como su
conjugado MX-DTPA inhibían la unión de
^{125}I-2B8 a células SB a concentraciones de
aproximadamente 3-4 \mug/ml (datos no
mostrados).
Para evaluar la estabilidad in vitro del
anticuerpo 2B8 nativo y el conjugado
2B8-MX-DTPA, se incubaron muestras
en solución salina normal o solución salina que contenía
glicina-HCl 10 mM, pH 6,8, a 4ºC y 30ºC durante 12
semanas y se ensayaron alícuotas semanalmente usando los siguientes
ensayos: inmunorreactividad por inmunoensayo enzimático de células
completas, SDS-PAGE en condiciones reductoras y no
reductoras, y electroforesis en gel por electroenfoque
isoeléctrico. Aunque los ensayos de inmunorreactividad no detectaron
pérdida de reconocimiento de antígeno por las muestras de
anticuerpo incubadas a cualquier temperatura (Figura 5), el
intervalo de enfoque isoeléctrico para el anticuerpo (pH
7,30-8,40 en la semana cero), que era estable a 4ºC,
no mostró una disminución de 0,2 unidades de pH a 30ºC después de
la semana seis (Tabla 22). Este resultado puede ser ambiguo, sin
embargo, ya que está en el límite del error experimental para el
ensayo.
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\vskip1.000000\baselineskip
Finalmente, usando SDS-PAGE no
reductora, las muestras de anticuerpo a 30ºC mostraron agregados de
elevado peso molecular después de la semana 1 (Tabla 23). Los
análisis densitométricos de los geles indicaron que los agregados
representaban entre el 8 y 17% de las muestras (Tabla 23). Sin
embargo, cuando se analizaron las muestras por
SDS-PAGE reductora, no se encontraron evidencias de
muestras de elevado peso molecular, lo que sugiere la formación de
agregados de anticuerpos covalentes a 30ºC. De nuevo, no se observó
pérdida de inmunorreactividad.
Durante el transcurso de este estudio de
estabilidad, también se ensayaron muestras de
2B8-MX-DTPA, incubadas tanto a 4ºC
como a 30ºC para la incorporación de radiometal usando ^{90}Y. Las
muestras ensayadas en las semanas 4, 8, y 12 incorporaron >90%
del ^{90}Y, independientemente de la temperatura de
incubación.
Finalmente, en un estudio diferente, se
radiomarcaron alícuotas de
2B8-MX-DTPA incubadas a 4ºC y 30ºC
durante 10 semanas con ^{111}In y se evaluó su biodistribución
tisular en ratones BALB/c. El conjugado de ambas temperaturas de
incubación produjo biodistribuciones similares (datos no mostrados).
Además, los resultados obtenidos fueron similares a los resultados
de biodistribución obtenidos en ratones BALB/c usando conjugado
marcado con ^{111}In almacenado a 4ºC (véase a continuación).
Se descubrió que los protocolos de radiomarcaje
tanto para ^{111}In como para ^{90}Y eran reproducibles.
Típicamente, se obtuvieron radioincorporaciones de >95% para
^{111}In y >90% para ^{90}Y. Las actividades específicas
para conjugados marcados con ^{111}In y ^{90}Y estaban
rutinariamente en el intervalo de 2-3 y
10-15 mCi/mg de anticuerpo, respectivamente. En
desarrollo inicial de los protocolos de radiomarcaje con ^{111}In
y ^{90}Y, se retiraron radioisótopos no complejados del
2B8-MX-DTPA radiomarcado usando
cromatografía de exclusión molecular por HPLC. En experimentos
posteriores, la purificación por HPLC del conjugado marcado con
indio se eliminó a causa de las elevadas radioincorporaciones
obtenidas (>95%) con este isótopo.
La inmunorreactividad de las preparaciones
marcadas con ^{111}In y ^{90}Y de
2B8-MX-DTPA se analizaron por el
método de Lindmo (3). Se descubrió que el
2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In
era 100% inmunorreactivo (Fig. 6), y se determinó que el conjugado
marcado con ^{90}Y era 60% inmunorreactivo (datos no
mostrados).
Los experimentos preliminares con el conjugado
marcado con ^{90}Y demostraron que sucedía una degradación
significativa del anticuerpo y pérdida de inmunorreactividad a
actividades específicas >10 mCi/mg de anticuerpo. Por lo tanto,
se desarrolló una formulación para minimizar los efectos de la
radiolisis. Aunque se evaluaron varios aceptores de radicales
libres de bajo peso molecular y se descubrió que eran eficaces, las
elevadas concentraciones de albúmina sérica humana (HSA) fueron las
más eficaces para conservar la integridad del anticuerpo y la
inmunorreactividad (Figuras 7-9).
El anticuerpo marcado con ^{90}Y se formuló en
1X PBS, pH 7,4 que contenía 75 mg/ml de HSA; también se añadió
ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA) a una concentración final
de 1 mM para asegurar que se quelaría cualquier ^{90}Y que
pudiera perderse del anticuerpo. Se evaluó la degradación de
2B8-MX-DTPA, radiomarcado a una
actividad específica de 14,6 mCi/mg a 0 y 48 horas usando
SDS-PAGE y autorradiografía. Las Figuras 8 y 9
muestran que el anticuerpo radiomarcado no mostraba degradación
significativa durante un periodo de 48 h cuando se incubaba a 4ºC.
El análisis usando cromatografía en capa fina instantánea mostró que
la pérdida de ^{90}Y era menor del 2% durante la incubación de 48
h (Tabla 24). La inmunorreactividad también era relativamente
constante al 60% (Tabla 24).
También se realizaron estudios de formulación
con el conjugado marcado con ^{111}In; la actividad específica
era de 2,2 mCi/mg. El anticuerpo radiomarcado se evaluó en 1X PBS,
pH 7,4 que contenía 50 mg/ml de HSA. La Figura 10 muestra
fotografías de los autorradiogramas para muestras de tiempo de
incubación cero y 48 h; los análisis densitométricos de los
autorradiogramas indican que no había degradación del anticuerpo
radiomarcado durante el transcurso del estudio (Figuras 11, 12). El
análisis por cromatografía en capa fina instantánea de las muestras
no demostró pérdida de ^{111}In (Tabla 25); además, la
inmunorreactividad se mantuvo a aproximadamente el 100% (Tabla
25).
Cuando se incubaba una preparación de
2B8-MX-DTPA formulada clínicamente,
radiomarcada con ^{90}Y a una actividad específica de 14,6
mCi/mg, durante 96 horas a 37ºC en suero humano y se analizaba por
SDS-PAGE no reductora y autorradiografía, se perdía
menos del 4% del radioisótopo durante el transcurso del periodo de
incubación. Las exploraciones densitométricas de los
autorradiogramas a tiempo cero y 96 h indicaron ausencia de
degradación significativa del conjugado radiomarcado (Figuras
13-15). Estos resultados se corroboraron por
análisis analíticos cromatográficos en capa fina de las muestras de
tiempo cero y 96 horas (Tabla 26). Tomados en conjunto, estos
resultados sugieren que el conjugado marcado con itrio es estable en
las condiciones usadas en este estudio. Se obtuvieron resultados
similares con el conjugado
2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In
(Figuras 16-18).
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En un estudio GLP realizado en el White Sands
Research Center (Número de Estudio 920111), a monos cynomolgus se
les dieron inyecciones intravenosas de diversas dosis de 2B8. Se
tomaron muestras de sangre antes de cada nueva inyección y la
sangre se proceso para la evaluación citométrica de flujo de las
poblaciones de linfocitos (Tabla 27).
\newpage
No se observaron efectos farmacológicos
significativos relacionados con la administración del anticuerpo
anti-CD20 2B8 en ningún parámetro clínico evaluado
durante o después del estudio. Asimismo, no observaron anormalidades
durante el análisis de las diversas muestras de histopatología
obtenidas de los animales de los grupos III y IV.
La duración del estudio fue de 14 días y los
animales se evaluaron durante el estudio en las siguientes
categorías: observaciones clínicas, pesos corporales, temperatura
corporal, ingesta de alimento y agua, eliminación de heces, química
sérica, hematología, urianálisis, y exámenes físicos. Además, a los
animales en cada grupo se les extrajo sangre en los días 0, 1, 7, y
13 y la sangre se analizó para los niveles de anticuerpos séricos
(2B8) y para los niveles de células T y B. En el día 13 se
sacrificaron los animales de los Grupos III y IV y se examinaron
tejidos seleccionados por microscopía óptica después de la
preparación de la muestra. Los tejidos evaluados fueron: corazón,
bazo, hígado, riñón, pulmón, corteza cerebral, médula espinal,
ganglio linfático, estómago, íleo, colon, músculo esquelético,
testículo/ovario, páncreas, y médula ósea.
Cuando se analizó la sangre de los animales
tratados para los niveles de células T y B circulantes, los animales
de los grupos II a V mostraban una pérdida >50% de células B
circulantes B en el día 13 (Fig. 19); la administración del
anticuerpo no tenía efecto en los niveles de células T (datos no
mostrados). Todos los grupos que recibieron 2B8 mostraron
saturación de células B y exceso de anticuerpo en el plasma (no
mostrado). Los animales del grupo V, que recibieron una única dosis
de 10,0 mg/kg de 2B8 también mostraron reducción en los niveles de
células B circulantes equivalentes a los observados en animales de
los otros grupos.
Los animales de los grupos I, II, y V se
examinaron en el día 52 (Fig. 20). Los niveles de células B
volvieron a >70% del normal en el día 38, excepto para un animal
del Grupo II (PRO804) y un animal del Grupo V (PR0716). Los niveles
de células B circulantes en estos animales permanecieron a
aproximadamente el 40% de los niveles normales después de 52
días.
Además de este estudio, se evaluaron los efectos
farmacotóxicos de
^{89}Y-2B8-MX-DTPA
en monos cynomolgus en un estudio GLP realizado en el White Sands
Research Center (Estudio Nº 920611). Se cargó conjugado de calidad
clínica con ^{89}Y no radiactivo. El conjugado que alberga itrio
se formuló en PBS pH 6,8, que contenía 75 mg/ml de albúmina sérica
humana y DTPA 1 mM (formulación clínica) y se administró por vía
intravenosa como se describe en la Sección Métodos.
Como se muestra por los resultados de la Figura
21, el 2B8-MX-DTPA marcado con
^{89}Y tenía poco efecto, si lo tenía, sobre las células B
circulantes en estos animales, independientemente de la dosis
administrada. Además, no se hallaron anormalidades significativas
diferentes a una eliminación general de los linfocitos
(20-43%), en ningún parámetro clínico evaluado,
incluyendo la química sérica, el urianálisis, los pesos y las
temperaturas corporales.
Como se ha descrito anteriormente, los animales
del grupo V del estudio GLP recibieron una única dosis de 10,0
mg/kg de 2B8. El análisis de regresión lineal de los datos sugiere
que el anticuerpo nativo se eliminaba de la circulación de estos
monos con un valor \beta t_{1/2} de aproximadamente 4,5 días. En
un estudio similar usando ratones BALB/c, se determinaron los
valores \beta t_{1/2} para 2B8 nativo y conjugado por análisis
de regresión lineal (no mostrada) en 8,75 días (Fig. 22). Estos
resultados sugieren que la conjugación de 2B8 no tenía efecto sobre
su eliminación de ratones BALB/c.
Realizando el experimento de biodistribución
preliminar descrito anteriormente (Sección 2d), se radiomarcó 2B8
conjugado con ^{111}In a una actividad específica de 2,3 mCi/mg y
se inyectó caso 1,1 \muCi en cada uno de veinte ratones BALB/c
para determinar la biodistribución del material radiomarcado.
Posteriormente, se sacrificaron los grupos de cinco ratones cada
uno a 1, 24, 48 y 72 horas y se retiraron sus órganos y una parte
de la piel, el músculo y el hueso y se procesaron para el análisis.
Además, se recogieron la orina y las heces y se analizaron para los
momentos puntuales de 24-72 horas. El nivel de
radiactividad en la sangre bajo desde el 40,3% de la dosis
inyectada por gramo a 1 hora hasta el 18,9% a 72 horas (Tablas
1-4; Fig. 23). Los valores para el corazón, riñón,
músculo y bazo permanecieron en el intervalo del
0,7-9,8% en todo el experimento. Los niveles de
radiactividad encontrados en los pulmones disminuyeron del 14,2% a 1
hora hasta el 7,6% a 72 horas; de forma similar la los valores
respectivos de dosis inyectada en el hígado por gramo fueron del
10,3% y el 9,9%. Estos datos se usaron para determinar las
estimaciones de dosis absorbida de radiación de
^{111}In-2B8-MX-DTPA
(Tabla 19).
La biodistribución de conjugado marcado con
^{90}Y, que tiene una actividad específica de 12,2 mCi/mg de
anticuerpo, se evaluó en ratones BALB/c. Se obtuvieron
radioincorporaciones de >90% y el anticuerpo radiomarcado se
purificó por HPLC. Se evaluó la deposición tisular de radiactividad
en los órganos principales, y la piel, el músculo, el hueso, y la
orina y las heces durante 72 horas y se expresaron como el
porcentaje de dosis inyectada/g de tejido. Los resultados mostrados
en las Tablas 5-8 y la Figura 24 demuestran que
aunque los niveles de radiactividad asociada con la sangre
disminuían desde aproximadamente el 39,2% de la dosis inyectada por
gramo a 1 hora hasta caso el 15,4% después de 72 horas; los niveles
de radiactividad asociada con la cola, el corazón, el riñón, el
músculo y el bazo permanecían casi constante al 10,2% o menos en
todo el transcurso del experimento. De forma importante, la
radiactividad asociada con el hueso variaba del 4,4% de la dosis
inyectada por gramo de hueso a 1 hora hasta el 3,2% a 72 horas.
Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que había poco itrio
libre asociado con el conjugado y que se liberaba poco radiometal
libre durante el transcurso del estudio. Estos datos se usaron para
determinar las estimaciones de dosis absorbida de radiación para
^{90}Y-2B8-MX-DTPA
(Tabla 20).
Para estudios de localización tumoral, se
preparó 2B8-MX-DTPA y se radiomarcó
con ^{111}In a una actividad específica de 2,7 mCi/mg.
Posteriormente se inyectaron cien microlitros de conjugado marcado
(aproximadamente 24 \muCi) en cada uno de los 12 ratones atímicos
que portaban tumores de células B Ramos. Los tumores variaban de
0,1 a 1,0 gramos. En los momentos puntuales 0, 24, 48, y 72 horas
después de la inyección, se retiraron 50 \mul de sangre por
punción retro-orbital, se sacrificaron a los ratones
por dislocación cervical, y se retiraron la cola, el corazón, los
pulmones, el hígado, el riñón, el bazo, el músculo, el fémur, y el
tumor. Después de procesar y pesar los tejidos, se determinó la
radiactividad asociada con cada muestra tisular usando un contador
gamma y los valores se expresaron como porcentaje de dosis inyectada
por gramo.
Los resultados (Fig. 25) demuestran que las
concentraciones en el tumor del
^{111}In-2B8-MX-DTPA
aumentaban regularmente en todo el transcurso del experimento. Se
acumuló el trece por ciento de la dosis inyectada en el tumor
después de 72 horas. Los niveles sanguíneos, en contraste, bajaron
durante el experimento desde más del 30% a tiempo cero hasta el 13%
a 72 horas. Todos los demás tejidos (excepto el músculo) contenían
entre el 1,3 y el 6,0% de la dosis inyectada por gramo de tejido al
final del experimento; el tejido muscular contenía aproximadamente
el 13% de la dosis inyectada por gramo.
Los datos de dosimetría resumidos derivados de
los estudios de biodistribución en ratones BALB/c normales y
presentados en las Tablas 19 y 20, para los conjugados marcados con
indio e itrio, respectivamente, están de acuerdo con los datos
presentados en la bibliografía cuando se comparan por milicurio de
dosis inyectada (5) y sugieren que los conjugados tanto marcados
con itrio como con indio de 2B8 pueden evaluar de forma segura para
la eficacia clínica en pacientes con linfoma.
Se administró a ratones y cobayas una única
dosis intraperitoneal de 2B8 (0,5 ml o 5,0 ml, respectivamente) y
se observaron durante siete días. No se detectaron signos patentes
de toxicidad.
Se evaluó la reactividad tisular del anticuerpo
monoclonal murino 2B8 usando un panel de 32 tejidos humanos
diferentes fijados con acetona. El anticuerpo 2B8 reacciona con el
antígeno anti-CD20 que tenía un patrón muy
restringido de distribución tisular, observándose solamente en un
subconjunto de células en tejidos linfoides incluyendo aquellos de
origen hematopoyético.
En el ganglio linfático, se observó
inmunorreactividad en una población de linfocitos B corticales
maduros así como células proliferantes en los centros germinales.
También se observó reactividad positiva en la sangre periférica,
las áreas de células B de las amígdalas, la pulpa blanca del bazo, y
con el 40-70% de los linfocitos medulares
encontrados en el timo. También se observó reactividad positiva en
los folículos de la lamina propria (Placas de Peyer) del intestino
grueso. Finalmente, agregados o células linfoides dispersadas en el
estroma de diversos órganos, incluyendo la vesícula, la mama, el
cuello del útero, el esófago, el pulmón, la glándula parótida, la
próstata, el intestino delgado, y el estómago, también eran
positivos con anticuerpo 2B8.
Se descubrió que todas las células epiteliales
simples, así como los epitelios estratificados y los epitelios
escamosos de diferentes órganos, eran no reactivos. Asimismo, no se
observó reactividad con células neuroectodérmicas, incluyendo las
del cerebro, la médula espinal y los nervios periféricos. También se
descubrió que los elementos mesenquimáticos, tales como las células
del músculo esquelético y liso, los fibroblastos, las células
endoteliales, y las células inflamatorias polimorfonucleares eran
negativos.
La reactividad tisular del conjugado
2B8-MX-DTPA se evaluó usando un
panel de dieciséis tejidos humanos que se habían fijado con
acetona. Como se ha demostrado previamente con el anticuerpo nativo,
el conjugado 2B8-MX-DTPA reconocía
el antígeno CD20 que mostraba un patrón de distribución altamente
restringido, encontrándose solamente en un subconjunto de células
de origen linfoide. En el ganglio linfático, se observó
inmunorreactividad en la población e células B. Se observó fuerte
reactividad en la pulpa blanca del bazo y en los linfocitos
medulares del timo. También se observó inmunorreactividad en
linfocitos dispersados en la vesícula, el corazón, el intestino
grueso, el hígado, el pulmón, y el útero, y se atribuyó a la
presencia de células inflamatorias presentes en estos tejidos. Como
se ha descrito con el anticuerpo nativo (anteriormente), no se
observó reactividad con células neuroectodérmicas o con elementos
mesenquimáticos.
El anticuerpo monoclonal murino
anti-CD20 2B8, producido por un clon con la misma
designación, muestra una afinidad por el antígeno CD20 de células B
que puede ser mayor que la observada para el anticuerpo B1, como se
determina por competición con anticuerpos de especificidad conocida
para el antígeno CD20, y por análisis de Scatchard. Además, los
datos de inmunoprecipitación sugieren que el antígeno precipitado
por 2B8 parece ser el mismo antígeno que el precipitado por B1, ya
que ambos anticuerpos precipitaban un doblete con pesos moleculares
relativos de 33 y 35 KD. El análisis citofluorográfico de la
especificidad del anticuerpo 2B8 para linfocitos de sangre
periférica demuestra que el anticuerpo reacciona específicamente con
células B y no ha mostrado reactividad con células T u otros tipos
de linfocitos. Finalmente, los datos de estabilidad preliminares
sugieren que el anticuerpo es estable a 30ºC durante 12 semanas sin
pérdida de inmunorreactividad.
Cuando se conjugaba el anticuerpo 2B8 con ácido
metilbencildietilenotriaminapentaacético (MX-DTPA),
casi no se observaba reducción en la inmunorreactividad, con
relación al anticuerpo nativo. Además, el radiomarcaje del
conjugado con ^{111}In o ^{90}Y producía conjugados marcados con
immunorreactividades del 100% y el 60%, respectivamente. Los
estudios de estabilidad de conjugados marcados con ^{111}In o
^{90}Y incubados en suero humano durante 96 horas a 37ºC
indicaron pérdida insignificante del radiometal durante el
transcurso del estudio, lo que sugiere que los conjugados serán
estables cuando se usen clínicamente.
Los estudios de localización tumoral en ratones
atímicos usando una preparación marcada con indio de
2B8-MX-DTPA mostraron cantidades
crecientes del conjugado unido a las células tumorales durante el
transcurso del experimento sin acumulaciones inusuales en otros
tejidos. Además, las estimaciones de dosimetría obtenidas de los
estudios de biodistribución están de acuerdo con los datos
publicados en la bibliografía. Finalmente, los estudios de
reactividad cruzada en tejidos humanos con los anticuerpos nativo y
conjugado indicaron que ambos anticuerpos reconocen un antígeno con
distribución tisular altamente restringida, que reaccionan solamente
con un subconjunto de células en tejidos linfoides, incluyendo
aquellos de origen hematopoyético. Tomados en conjunto, estos
resultados sugieren que la conjugación no alteraba la especificidad
tisular del anticuerpo, y que los conjugados son estables in
vivo y reconocen el antígeno CD20 presente en la superficie de
tumores producidos experimentalmente en ratones atímicos.
Cuando se usó 2B8 en un estudio de
farmacología/toxicología de elevada dosis, el anticuerpo no producía
efectos farmacotóxicos significativos en ningún parámetro evaluado,
durante o después del estudio. Asimismo, no se observaron
anormalidades durante el análisis de las diversas muestras
histopatológicas examinadas por microscopía óptica.
Sorprendentemente, todas las dosis del anticuerpo usadas producían
una eliminación pronunciada de las células B circulantes. Los
niveles de células B circulantes, sin embargo, volvían a niveles
casi normales una vez cesaba la administración del anticuerpo. En
el grupo de monos de dosis única (Grupo V) el anticuerpo nativo se
eliminaba de la circulación con un valor de \beta t_{1/2}
aparente de aproximadamente 4,5 días. De forma predecible, cuando
se realizó este estudio farmacocinético en ratones BALB/c, el
anticuerpo 2B8 se eliminaba con un valor de \beta t_{1/2} de
8,75 días. Por tanto, tomados en conjunto, estos datos sugieren que
el anticuerpo nativo también puede proporcionar algún efecto clínico
cuando se administra en forma de un adjunto a los conjugados
radiomarcados.
Globalmente estos datos indican que el
anticuerpo de elevada afinidad 2B8 y su conjugado
MX-DTPA muestran un patrón restringido de
reactividad en tejidos humanos. Además, en primates, el anticuerpo
nativo es no tóxico y produce eliminación transitoria de células B;
sin embargo, una vez se ha eliminado el anticuerpo de la circulación
los niveles de células B vuelven de forma razonablemente rápida.
Además, los conjugados 2B8-MX-DTPA
marcados con indio e itrio parecían estables in vitro, no
mostrando pérdida de radiometal durante incubación prolongada en
suero humano. Finalmente, las estimaciones de dosis de radiación
obtenidas de la biodistribución de
2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y o
^{111}In en ratones BALB/c están de acuerdo, por milicurio de
dosis inyectada, con las estimaciones de dosis obtenidas de los
estudios clínicos en seres humanos usando anticuerpos conjugados
anti-idiotipo compartido radiomarcados con estos
isótopos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha evaluado el anticuerpo monoclonal murino
anti-CD20 marcado con A^{90}Y (2B8) en un ensayo
clínico en Fase I para el tratamiento de linfoma de células B
reincidente. El protocolo original usado para la preparación del
anticuerpo marcado con itrio usaba una etapa de cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC) para la retirada del radioisótopo
no unido a proteína antes de su formulación y administración a
pacientes. Desafortunadamente, este proceso consume particularmente
mucho tiempo, provocando una exposición más larga del anticuerpo al
radioisótopo en un estado desprotegido. Esto provoca radiolisis
aumentada del anticuerpo con una disminución concomitante en la
inmunorreactividad. Además, el aspecto laborioso del proceso hace
difícil preparar más de una dosis por día en la radiofarmacia. La
simplificación del proceso agilizaría la aplicación en la clínica
como una alternativa a usar los Servicios de Farmacia NIPI como
radiofarmacia.
\newpage
Por consiguiente, se desarrolló un procedimiento
de radiomarcaje revisado, conocido como el método "mezclar y
usar", que obvia la necesidad de purificación por HPLC
manteniendo al mismo tiempo una elevada radioincorporación y una
retención mejorada de la inmunorreactividad. Los estudio de
estabilidad in vitro así como los estudios de
biodistribución en ratones mostraron que el anticuerpo radiomarcado
preparado usando el método "mezclar y usar" es comparable al
material producido usando el proceso de HPLC actual. Los resultados
de estos estudios pre-clínicos indican que este
nuevo protocolo "mezclar y usar" puede usarse para preparar
2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y
adecuado para su uso en ensayos clínicos.
Las líneas celulares linfoblásticas humanas SB
(CD20 positiva) y HSB (CD20 negativa) se obtuvieron de la American
Type Culture Collection y se mantuvieron en
RPM1-1640 que contenía suero bovino fetal al 10% y
estaba suplementado con glutamina.
El anticuerpo 2B8 se purificó por el
departamento de Fabricación a partir del sobrenadante del
biorreactor de fibra hueca usando protocolos descritos previamente
en el IND (BB-IND 4850/4851).
El cloruro de itrio-[90] se obtuvo de Amersham.
Todos los demás reactivos se obtuvieron de fuentes descritas en los
informes adjuntos citados a continuación. Los reactivos usados para
los protocolos de radiomarcaje se procesaron para retirar los iones
de metales pesados contaminantes que podrían competir con los
radioisótopos durante la etapa de radiomarcaje (véase la sección
Métodos). Los reactivos se fabricaron en condiciones GMP por el
departamento de Fabricación de IDEC siguiendo Registros de
Producción por Lotes.
El MX-DTPA de calidad clínica se
obtuvo de Coulter Immunology en forma de la sal disódica en agua y
se almacenó a -70ºC. El conjugado
(2B8-MX-DTPA) se preparó por el
departamento de Fabricación. Se usaron dos lotes diferentes de
conjugado en estos estudios; ambos se proporcionaron en solución
salina normal a 10 mg/ml. Los conjugados se cargaron en jeringas de
polipropileno de 2 ml estériles y se almacenaron a
2-8ºC.
Todas las manipulaciones de los reactivos se
realizaron para minimizar la posibilidad de contaminación por
metales. Se usaron recipientes de plástico de polipropileno o
poliestireno tales como matraces, vasos de precipitado y cilindros
graduados. Estos se lavaron con Alconox y se aclararon
exhaustivamente con agua Milli-Q o Agua para
Irrigación (WFIr) antes de su uso. Se usaron puntas de pipeta sin
metal (BioRad) para manipular de forma precisa pequeños volúmenes.
Volúmenes más grandes de reactivos se manipularon usando pipetas
serológicas de plástico, estériles. Las reacciones se realizaron
convenientemente en tubos de microfuga con tapón a rosca de 1,8 ml
hechos de polipropileno.
La radioincorporación se determinó usando
cromatografía en capa fina instantánea (ITLC) por triplicado de
acuerdo con SOP SP-13-008. En
general, el protocolo fue el siguiente: el conjugado radiomarcado se
diluyó 1:20 en 1X PBS que contenía DTPA 1 mM o EDTA 5 mM, después
se aplicó puntualmente 1 \mul en 1,5 cm desde un extremo de una
tira de 1 x 5 cm de papel ITLC SG (Gelman Sciences). El papel se
reveló usando acetato amónico al 10% en metanol:agua (1:1; v/v).
Las tiras se secaron, se cortaron a la mitad de forma transversal, y
se determinó la radiactividad asociada con cada sección por
recuento de centelleo. La radiactividad asociada con la mitad
inferior de la tira (radiactividad asociada a proteína) se expresó
como un porcentaje de la radiactividad total determinada sumando
los valores para las mitades tanto superior como inferior.
Los anticuerpos se radiomarcaron con cloruro de
^{90}Y sin vehículo proporcionado por Amersham en HCl 0,04 M. Se
transfirió una alícuota de radioisótopo (10-20
mCi/mg de anticuerpo) a un tubo de polipropileno y se añadió un
volumen 0,02X de acetato sódico 2 M libre de metal para ajustar la
solución a pH 3,6. Se añadió 2B8-NaDTPA (0,3 mg;
10,0 mg/ml en solución salina normal) inmediatamente y se agitó
suavemente la solución. La solución se comprobó con papel de pH
para verificar un pH de 3,8-4,1 y se incubó durante
5 min. La reacción se interrumpió transfiriendo la mezcla de
reacción a un tubo de polipropileno diferente que contenía 1 X PBS
con 75 mg/ml de albúmina sérica humana (HSA) y ácido
dietilenotriaminapentaacético (DTPA) 1 mM y se mezcló suavemente.
El anticuerpo radiomarcado se almacenó a 2-8ºC.
Las actividades específicas se determinaron
midiendo la radiactividad de una alícuota apropiada del conjugado
radiomarcado. Este valor se corrigió para la eficacia del contador,
relacionada con la concentración de proteína del conjugado,
determinada por la absorbancia a 280 nm y se expresó como mCi/mg de
proteína.
La inmunorreactividad del conjugado marcado con
^{90}Y se determinó usando SOP nº SP13-009 basado
en una versión modificada del ensayo de unión de células completas
descrito por Lindmo. Se añadieron concentraciones crecientes de
células SB CD20-positivas o células HSB
CD20-negativas en fase log, a series duplicadas de
tubos de polipropileno de 1,5 ml; volumen final de las células,
0,40 ml. El conjugado radiomarcado se diluyó a una concentración de
anticuerpo final de 1-2,5 ng/ml y se añadieron 0,35
ml a cada tubo. Después de una incubación de 90 min., las células
se sedimentaron por centrifugación y se recogieron los
sobrenadantes. La radiactividad restante en la fracción
sobrenadante se determinó con un contador de centelleo. Los datos se
representaron como el cociente de la radiactividad total añadida
dividido por la radiactividad asociada a las células frente a la
inversa de la cantidad de células por tubo. El punto de corte del
eje y representa la fracción inmunorreactiva.
El conjugado
2B8-MX-DTPA se radiomarcó con
^{90}Y y se formuló como se ha descrito en el protocolo "mezclar
y usar" proporcionado anteriormente. Se prepararon dos lotes de
conjugado radiomarcado; un lote se usó para evaluar la estabilidad
de radioincorporación y el otro lote se usó para evaluar la
retención de la inmunorreactividad. Los conjugados formulados se
incubaron a 4ºC durante 48 horas y se analizaron alícuotas a tiempo
0, 24 h y 48 horas usando SDS-PAGE no reductora y
autorradiografía. La inmunorreactividad en cada momento puntual se
evaluó usando el ensayo descrito anteriormente.
La estabilidad de
2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y se
evaluó por incubación en suero humano a 37ºC durante hasta 72
horas. El anticuerpo conjugado se radiomarcó con itrio-[90] y se
formuló como se ha descrito anteriormente. El conjugado
radiomarcado se diluyó 1:10 con suero humano normal (no inactivado
por calor) y se incubaron alícuotas en tubos de plástico a 37ºC. A
tiempos seleccionados, se retiraron muestras y se analizaron por
SDS-PAGE no reductora y autorradiografía.
2B8-MX-DTPA
marcado con itrio-[90] se evaluó para la biodistribución tisular en
ratones BALB/c de ocho a diez semanas de edad. El conjugado
radiomarcado se preparó y se formuló como se ha descrito
anteriormente. A los ratones se les inyectó por vía intravenosa 5
\muCi de 2B8-MX-DTPA marcado con
^{90}Y y se sacrificaron los grupos de cinco ratones a 1, 24, 48,
y 72 horas. Después del sacrificio, se retiraron la cola, el
corazón, los pulmones, el hígado, el riñón, el bazo, el músculo, el
fémur, se lavaron, se pesaron; también se retiró una muestra de
sangre y piel para el análisis. La radiactividad asociada con cada
muestra tisular se determinó midiendo la radiación bremsstrahlung
usando un contador gamma y se determinó el porcentaje de dosis
inyectada por gramo de tejido y el porcentaje de dosis inyectada
por órgano.
Los datos de biodistribución obtenidos usando
ratones a los que se ha inyectado
2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y se
usaron para calcular las estimaciones de las dosis de radiación
absorbidas a partir de una dosis de 1,0 mCi administrada a un
paciente de 70 kg. Las estimaciones se hicieron de acuerdo con
métodos adoptados por el Medical Internal Radiation Dose (MIRD)
Committee of the Society of Nuclear Medicine. Estos cálculos los
realizó Mr. Phillip Hagan, Nuclear Medicine Service, VA Medical
Center La Jolla, CA92161.
(Informe R&D de referencia titulado
``Validation of "Mix-and-Shoot"
Radiolabeling Protocol for the Preparation of Clinical Doses of
90Y-2B8-MX-DTPA;
autor, P. Chinn; fecha 22 de abril de 1994).
Los experimentos preliminares que evaluaban la
cinética de la reacción de radiomarcaje con
2B8-MX-DTPA y ^{90}Y mostraron
que a pH 3,6-4,0, el 95% del radioisótopo se
incorporó durante un tiempo de reacción de 5 a 10 min. La
reproducibilidad de esta radioincorporación (95,7% \pm 1,7%) se
confirmó posteriormente en un estudio de validación para el
protocolo de aumento en escala (Informe R&D de referencia
titulado ``Validation of
"Mix-and-Shoot" Radiolabeling
Protocol for the Preparation of Clinical Doses of
90Y-2B8-MX-DTPA;
autor, P. Chinn; fecha 22 de abril de 1994). La preparación de
2B8-MX-DTPA marcado ^{90}Y usando
este protocolo "mezclar y usar" dio un producto comparable al
producido con el método de HPLC (véase BB-IND
4850/4851). Se descubrió que el protocolo de radiomarcaje era
reproducible con actividades específicas que varían típicamente de
10 a 15 mCi/mg de anticuerpo.
La inmunorreactividad del
2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y
preparado usando este protocolo era típicamente mayor del 70%, en
comparación con el 55-60% observado para las
validaciones realizadas para el protocolo de HPLC (Figura 26). Esta
diferencia se debe probablemente a los efectos reducidos de la
radiolisis a causa del tiempo de incubación reducido con el
protocolo "mezclar y usar". Este resultado fue típico y, como
se analiza a continuación, era representativo de la validación
realizada para el protocolo de aumento en escala para preparar
dosis clínicas del conjugado radiomarcado.
Los experimentos preliminares con conjugado de
anticuerpo marcado con ^{90}Y sin proteger preparado usando el
proceso de HPLC demostraron que la radiolisis causaba degradación
significativa del anticuerpo y pérdida de inmunorreactividad. Por
lo tanto, se desarrolló un tampón de formulación para minimizar los
efectos de la radiolisis. La albúmina sérica humana (HSA) demostró
ser eficaz para minimizar la degradación del anticuerpo debido a la
radiolisis. Se hizo una evaluación con el conjugado radiomarcado
preparado con el método "mezclar y usar" para confirmar la
eficacia de la formulación para minimizar la radiolisis. El
anticuerpo marcado con ^{90}Y, radiomarcado a una actividad
específica de 14,5 mCi/mg de anticuerpo, se formuló en 1X PBS, pH
7,4 que contenía 75 mg/ml de HSA y DTPA 1 mM. La degradación del
conjugado 2B8-MX-DTPA se evaluó a 0,
24, y 48 horas usando SDS-PAGE y autorradiografía.
Las Figuras 2, 3, y 4 muestran que el conjugado radiomarcado no
mostraba degradación significativa durante un periodo de 48 h cuando
se incubaba a 4ºC. El análisis de cromatografía en capa fina
instantánea no mostró pérdida de ^{90}Y durante las 48 h de
incubación; estos resultados se corroboraron por
SDS-PAGE/análisis autorradiográfico (Tabla 28). La
inmunorreactividad también era relativamente constante a >88%
(Tabla 29).
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubó
2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y
formulado clínicamente a una actividad específica de 15,7 mCi/mg
durante 72 horas a 37ºC en suero humano. Las muestras analizadas por
SDS-PAGE no reductora y autorradiografía (Figura
30) no mostraron pérdida de radioisótopo durante el transcurso del
periodo de incubación (Tabla 30). Las exploraciones densitométricas
de los autorradiogramas a tiempo cero y 72 h indicaron ausencia de
degradación significativa del conjugado radiomarcado (Figuras 31 y
32). Estos resultados se corroboraron por análisis cromatográficos
en capa fina (Tabla 30). Debe observarse que la radioincorporación
para el anticuerpo usado en este estudio era inferior que la
obtenida en los estudios de validación del protocolo de marcaje.
Esta radioincorporación inferior se debía a la calidad reducida del
lote de cloruro de ^{90}Y usado para esta preparación particular
de anticuerpo radiomarcado. La radioincorporación inferior no alteró
la conclusión de que el conjugado marcado con itrio preparado con
el método "mezclar y usar" es estable en estas condiciones de
incubación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La biodistribución del conjugado marcado con
^{90}Y, con una actividad específica de 11,5 mCi/mg de anticuerpo
y una radioincorporación de >95%, se evaluó en ratones BALB/c. Se
evaluó la deposición de radiactividad en los tejidos para los
órganos principales, la piel, el músculo, el hueso, la orina y las
heces en 72 horas y se expresó como un porcentaje de dosis
inyectada por g de tejido y como un porcentaje de dosis inyectada
por órgano. Los resultados mostrados en las Tablas
31-34 y la Figura 33 muestran que los niveles de
radiactividad asociada con la sangre disminuía desde
aproximadamente el 43% de la dosis inyectada por gramo (% ID/g) a 1
hora hasta aproximadamente el 16% después de 72 horas; a 24 h y
después, los niveles de radiactividad asociada con el corazón, el
riñón, y el bazo permanecían casi constantes al
4-8%. Para el pulmón y el hígado, la radiactividad
disminuía desde el 10-12% a 1 h hasta el 8%-10% a 72
h. Para la piel, la radiactividad era relativamente constante a
aproximadamente el 3% de 24 h a 72 h. La radiactividad en el tracto
gastrointestinal era constante al 0,5-1% de 24 h a
72 h. La radiactividad para el músculo permanecía aproximadamente al
0,6% en todo el transcurso del estudio. La captación de
radiactividad por el fémur (hueso) permanecía a menos del 4% en
todos los momentos puntuales, lo que indica que la cantidad de
itrio libre en la preparación de conjugado era insignificante y que
se liberaba poco radiometal libre durante el transcurso del
estudio.
\vskip1.000000\baselineskip
Valores Medios \pm
SD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Valores Medios \pm
SD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Valores Medios \pm
SD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Valores Medios \pm
SD
Las dosis de radiación absorbidas para un ser
humano "normal" de 70 kg calculadas para el conjugado marcado
con ^{90}Y usando los datos de biodistribución en ratones (valores
de %ID/órgano de las Tablas 31-34) se presentan en
la Tabla 35. Estos resultados son comparables a los resultados
obtenidos previamente usando
2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y
preparado usando el método de radiomarcaje con HPLC.
Se preparó un total de diez lotes de validación
en MPI Pharmacy Services, Inc. Los resultados del ensayo en cada
lote se resumen en la Tabla 36. Se calculó el valor medio para cada
resultado de ensayo y se anotaron las desviaciones típicas cuando
era apropiado. Para evaluar la variabilidad del proceso debido a
diferentes tiempos de marcaje, se prepararon el lote nº 1 al nº 8
usando un tiempo de marcaje de 10 min.; el lote nº 9 y nº 10 se
prepararon usando un tiempo de reacción de 5 min. En base a los
resultados de ensayo para los diez lotes de validación, se
establecieron las especificaciones de salida. Las especificaciones
de salida se resumen en la Tabla 37.
El protocolo de radiomarcaje original para
preparar 2B8-MX-DTPA marcado con
^{90}Y utilizaba una etapa de purificación en HPLC
particularmente laboriosa y que consumía mucho tiempo para retirar
el ^{90}Y no unido a proteína de la preparación. Para simplificar
este proceso y hacerlo más susceptible a su uso en clínica, los
esfuerzos se dirigieron a eliminar la etapa de HPLC en favor de lo
que se ha llamado un protocolo "mezclar y usar". El objetivo
fue identificar las condiciones de radiomarcaje que producirían una
radioincorporación muy elevada del isótopo en el conjugado,
obviando de este modo la necesidad de la etapa de purificación. Se
descubrió que podía obtenerse >95% de radioincorporación a pH 3,6
con una incubación de cinco a diez minutos. Un beneficio adicional
de este protocolo era la retención aumentada de la
inmunorreactividad (>70%), supuestamente debido al tiempo de
exposición más corto del anticuerpo al radioisótopo de elevada
energía antes de la adición de albúmina sérica humana que
proporciona protección contra la radiolisis. Esta retención de
inmunorreactividad es superior a la previamente observada usando el
método de HPLC.
Los estudios de estabilidad con conjugado
marcado con ^{90}Y preparado usando el protocolo "mezclar y
usar" incubado en tampón de formulación (1X PBS que contenía 75
mg/ml de albúmina sérica humana y DTPA 1 mM) durante hasta 48 h a
4ºC mostraron ausencia de pérdida de radioisótopo y retención
completa de la inmunorreactividad. Los estudios de estabilidad
realizados con suero humano durante 72 horas a 37ºC también
indicaron pérdida mínima de radioisótopo. Estos resultados de
estabilidad son comparables con los previamente observados con
conjugado radiomarcado usando el protocolo de HPLC.
La biodistribución en ratones BALB/c usando
conjugado marcado con ^{90}Y preparado con el método "mezclar y
usar" indicó ausencia de deposición tisular inusual. Estos
resultados sugerían que el anticuerpo radiomarcado no se alteraba
significativamente para alterar drásticamente las características
in vivo del anticuerpo. Además, estos resultados son
comparables con los obtenidos previamente con el conjugado
radiomarcado preparado usando el método de radiomarcaje con HPLC
(véase BB-IND 4850/4851). Las estimaciones de
dosimetría para un ser humano "normal" de 70 kg calculadas a
partir de los datos de biodistribución para ratones están de acuerdo
con las obtenidas con conjugado radiomarcado usando el
procedimiento de HPLC (véase BB-IND 4850/4851).
Además, los resultados de dosimetría son comparables con los
resultados obtenidos para pacientes incluidos en un ensayo clínico
en curso (estudio IDEC nº 1315), cuando se comparan por milicurios
de dosis inyectada. Para seis pacientes en el estudio, los valores
medios (rads \pm SD) para el cuerpo completo, el corazón, el
hígado, y el bazo fueron 1,40 \pm 0,57, 10,50 \pm 4,68, 9,89
\pm 8,91, y 9,75 \pm 6,00, respectivamente.
Antes de aplicar el protocolo de marcaje
"mezclar y usar" para preparar
^{90}Y-2B8-MX-DTPA
de calidad clínica, fue necesario evaluar la reproducibilidad del
protocolo. Por lo tanto, se prepararon diez lotes de validación
usando diferentes lotes de cloruro de ^{90}Y. Para los diez lotes
preparados, los valores de inmunorreactividad obtenidos usando el
método "mezclar y usar" estaban en el intervalo del 60,6% al
93,3% con una media del 74,5% y una mediana del 72,1%. Esta
retención de la inmunorreactividad es significativamente mejor que
la de aproximadamente el 60% previamente obtenida usando el método
de HPLC actual (intervalo del 54,9% al 65,1%; media del 60,2%). La
radioincorporación promedio para los diez lotes fue del 95,7%
(intervalo del 93,5% al 97,5%). Este valor es comparable con el
observado previamente con el método de HPLC (intervalo del 91,7% al
93,7% y una media del 93,1%). Además, los resultados para
endotoxinas, concentración de anticuerpo, concentración de
radiactividad, actividad específica, radiactividad vial total,
concentración proteica total, pH, y esterilidad fueron comparables
para los diez lotes. Juntos, estos resultados confirmaron la
reproducibilidad del método "mezclar y usar". Además, se
evaluó la variabilidad del proceso debida a los diferentes tiempos
de marcaje realizando reacciones durante 5 y 10 minutos. Como no se
observaron diferencias significativas para los dos tiempos de
reacción, se decidió que se usaría el tiempo de incubación más
corto en el protocolo final.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha desarrollado un procedimiento de marcaje,
mencionado como el método "mezclar y usar", para la preparación
de dosis clínicas de 2B8-MX-DTPA
marcado con ^{90}Y que obvia la necesidad de la etapa de
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) actualmente usada
para la retirada de radioisótopo no unido a proteína. El protocolo
simplificado elimina esta etapa de purificación laboriosa
manteniendo al mismo tiempo un elevado nivel de radioincorporación
de isótopo (>95%) y retención mejorada de la inmunorreactividad
(>70%). Se descubrió que el conjugado radiomarcado formulado
clínicamente era estable in vitro cuando se incubaba a 4ºC
durante 48 horas en base a la retención de radioisótopo e
inmunorreactividad. Además, el conjugado radiomarcado era estable
cuando se incubaba en suero humano a 37ºC durante 72 horas. Los
estudios de biodistribución en ratones BALB/c demostraron ausencia
de deposición tisular inusual, incluyendo el hueso. Las estimaciones
de las dosis de radiación absorbidas para un ser humano
"normal" de 70 kg fueron comparables a las obtenidas en un
ensayo clínico en curso usando
2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y.
Los resultados de estos estudios mostraron que
2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y
producido usando el protocolo "mezclar y usar" era comparable
al preparado usando el proceso de HPLC convencional. La validación
del protocolo de aumento en escala para preparar conjugado
radiomarcado de calidad clínica mostró que el método era
reproducible y que el producto era comparable al producido usando
el método de HPLC actual. Los resultados de estos estudios
preclínicos indican que este nuevo protocolo "mezclar y usar"
puede usarse para preparar
2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y
adecuado para su uso en ensayos clínicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Un objetivo de la presente descripción era crear
protocolos para el kit de radiomarcaje para la preparación de
2B8-MX-DTPA marcado con ^{111}In y
^{90}Y (In2B8 e Y2B8, respectivamente) y establecer
especificaciones de salida para productos clínicos. Los protocolos
del kit de radiomarcaje son reproducibles con respecta a la
radioincorporación y la unión a células SB positivas al antígeno e
indican la idoneidad del kit de radiomarcaje para su uso en los
ensayos clínicos. Se recomienda que las especificaciones de salida
de In2B8 e Y2B8 para la radioincorporación y la unión se
establezcan a \geq95% y \geq70%, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Actualmente se está evaluando un anticuerpo
monoclonal murino anti-CD20 marcado con ^{90}Y
(Y2B8) en ensayos clínicos para el tratamiento de linfoma de
células B reincidente. El isótopo itrio carece de un componente
gamma que lo hace inadecuado para sistemas de formación de imágenes.
Por lo tanto, se usará 2B8-MX-DTPA
marcado con ^{111}In (In2B8) para evaluar la localización tumoral
y la dosimetría en los pacientes antes o después del tratamiento
con el compuesto terapéutico marcado con itrio. Los protocolos
usados actualmente para la preparación de Y2B8 y In2B8, conocidos
como métodos "mezclar y usar", producen anticuerpos
radiomarcados adecuados para estudios clínicos. Sin embargo, la
simplificación del proceso de marcaje agilizaría la preparación de
dosis en una situación
clínica.
clínica.
El nuevo kit de radiomarcaje está
preferiblemente compuesto por cuatro componentes: 1.)
2B8-MX-DTPA en solución salina
normal de bajo contenido en metales a 2 mg/ml, 2.) acetato sódico 50
mM usado para ajustar la solución de radioisótopo al pH de marcaje
apropiado, 3.) tampón de formulación (1X PBS, pH 7,4 que contiene
albúmina sérica humana al 7,5% y DTPA 1 mM), 4.) vial de vidrio de
10 ml vacío (vial de reacción). Todos los componentes se ensayan
para la esterilidad y ausencia de pirógenos.
Este informe resume la validación de este kit de
radiomarcaje que es simple y fácil de usar y que produce
anticuerpos radiomarcados con \geq95% de radioincorporación y
retención aceptable de la unión a células positivas al antígeno.
Las especificaciones de ensayo de salida se recomiendan para los
productos clínicos.
\global\parskip0.900000\baselineskip
1. 2B8-MX-DTPA,
IDEC; Lote nº 082395RM2
2. Acetato Sódico 50 mM, de bajo contenido en
metales, IDEC; Lote nº 082395RM3
3. Tampón de formulación (1X PBS, pH 7,4 que
contiene albúmina sérica humana al 7,5% (p/v) y DTPA 1 mM), IDEC,
Lote nº 082395RM1
4. Vial de reacción, 10 ml, IDEC
\vskip1.000000\baselineskip
1. Kit de Radioincorporación Biodex
Tec-Control, Cat: nº 151-770
2. Guantes: sin polvo
3. Jeringas de polipropileno estériles
4. Agujas de jeringa estériles
5. Tubos pequeños con cierre; 1,5 ml
\vskip1.000000\baselineskip
Los reactivos del kit se prepararon y se
cargaron en viales con tabique de vidrio. Los viales de borosilicato
de Tipo I (2 ó 10 ml) se aclararon con agua para inyección estéril
(WFI) y se esterilizaron en autoclave antes de la carga. Los
tabiques de goma de butilo se aclararon con WFI estéril y se
esterilizaron en autoclave antes de su uso. Los reactivos se
cargaron manualmente y se juntaron en una sala Class 100 y se
ensayaron para la pirogenicidad y esterilidad usando métodos
USP.
\vskip1.000000\baselineskip
Reactivos Adicionales:
1. Indio-[111]: sal cloruro, sin vehículo, en
HCl.
\vskip1.000000\baselineskip
Precauciones:
1. Todas las etapas se realizan preferiblemente
usando una técnica aséptica.
2. Los componentes del kit de radiomarcaje deben
dejarse llegar a temperatura ambiente antes de su uso.
3. El producto final debe administrarse al
paciente en 8 horas desde que se complete la siguiente etapa 9.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento:
1. El volumen de ^{111}InCl_{3} a añadir al
vial de reacción se calculó del siguiente modo:
- a.
- Concentración de radiactividad en el momento del radiomarcaje en mCi/ml:
- C_{0} = Concentración de radiactividad en el momento de la calibración (véase el Certificado de Análisis del fabricante).
\global\parskip1.000000\baselineskip
- \Deltat = Cambio en el tiempo (número positivo es después de la calibración, número negativo es antes de la calibración).
\hskip0.8cm
\vskip1.000000\baselineskip
- b.
- Volumen de ^{111}InCl_{3} a añadir al vial de reacción:
\vskip1.000000\baselineskip
2. El volumen de acetato sódico 50 mM a añadir
al vial de reacción se calculó del siguiente modo:
Volumen de
^{111}InCl_{3} añadido (Etapa Ib) X (1,2) = Volumen de acetato
sódico 50 mM a
añadir.
3. Los tabiques del vial de reacción y el vial
de acetato sódico 50 mM se limpiaron con alcohol. Usando una
jeringa de 1cc, se transfirió el volumen calculado de acetato sódico
50 mM (Etapa 2) al vial de reacción.
4. El tabique de la fuente de ^{111}InCl_{3}
se limpió con alcohol. El vial se perforó con una aguja equipada
con un filtro de 0,2 \mum estéril. Usando una jeringa de 1cc
estéril, se transfirió el volumen requerido (Etapa 1b) de
^{111}InCl_{3} al vial de reacción. El vial se mezcló
invirtiéndolo varias veces.
5. El tabique del vial de
2B8-MX-DTPA se limpió con alcohol.
Usando una jeringa de 1cc, se transfirió lentamente 1,0 ml de
2B8-MX-DTPA al vial de reacción. El
vial se mezcló invirtiéndolo varias veces.
6. La reacción se dejó proceder durante 30
minutos \pm 5 minutos a temperatura ambiente.
7. El volumen total de mezcla de reacción se
calculó añadiendo junto el volumen de ^{111}InCl_{3} añadido
(Etapa 4), el volumen de acetato sódico 50 mM añadido (Etapa 3) y
el volumen de 2B8-MX-DTPA añadido
(Etapa 5).
8. El volumen de tampón de formulación a añadir
al vial de reacción para obtener un volumen final de 10 ml se
calculó restando la cantidad total calculada en la etapa 7 de
10.
9. El vial del tampón de formulación se limpió
con alcohol y se perforó el vial. Debido a la viscosidad del tampón
de formulación, el vial de reacción se perforó usando una aguja
equipada con un filtro de jeringa de 0,2 \mum. Usando un jeringa
estéril de 10cc equipada con una aguja de calibre apropiado, el
volumen de tampón de formulación calculado en la Etapa 8 se
transfirió al vial de reacción. La aguja de perforación se retiró
del vial de reacción y el vial se mezcló invirtiéndolo varias
veces (Producto Final). Este vial se incubó al menos 5 minutos
antes de hacer el "Ensayo de Radioincorporación". El color de
la solución era ámbar y el vial estaba lleno, confirmando que se
había añadido el tampón de formulación.
10. Se midió la radiactividad total vial del
Producto Final usando el equipo de instrumentación apropiado para
la medición de ^{111}In.
11. El Producto Final se almacenó inmediatamente
a 2ºC-8ºC para el "Ensayo de Unión" y el
"Ensayo de Radioincorporación".
\vskip1.000000\baselineskip
1. Itrio-[90]: sal cloruro, sin vehículo, en
HCl.
\vskip1.000000\baselineskip
Precauciones:
1. Todas las etapas deben realizarse usando una
técnica aséptica.
2. Los componentes del kit de radiomarcaje deben
dejarse llegar a temperatura ambiente antes de su uso.
3. El producto final debe administrarse al
paciente en 8 horas desde que se complete la siguiente etapa 8.
\newpage
Procedimiento:
1. El volumen de ^{90}YCl_{3} a añadir al
vial de reacción se calculó del siguiente modo:
- a.
- Concentración de radiactividad en el momento del radiomarcaje:
- C_{0} = Concentración de radiactividad en el momento de la calibración (véase el Certificado de Análisis del fabricante).
- \Deltat = Cambio en el tiempo (número positivo es después de la calibración, número negativo es antes de la calibración).
\hskip0.5cm
\vskip1.000000\baselineskip
- b.
- Volumen de ^{90}YCl_{3} a añadir al vial de reacción:
\vskip1.000000\baselineskip
2. El volumen de acetato sódico 50 mM a añadir
al vial de reacción se calculó del siguiente modo:
- a.
- Para ^{90}YCl_{3} en HCl 0,040 M (Amersham):
Volumen de
^{90}YCl_{3} (Etapa 1b) x (0,8) = volumen de acetato sódico a
añadir
- b.
- Para ^{90}YCl_{3} en HCl 0,050 M (Nordion):
Volumen de
^{90}YCl_{3} (Etapa 1b) x (1,0) = volumen de acetato sódico a
añadir
3. Los tabiques del vial de reacción y el vial
de acetato sódico se limpiaron con alcohol. Usando una jeringa de 1
cc, se transfirió el volumen calculado (Etapa 1a o 1b) de acetato
sódico 50 mM (Etapa 2) al vial de reacción. El vial se mezcló
invirtiéndolo varias veces.
4. El tabique del vial de fuente de
^{90}YCl_{3} se limpió con alcohol. El vial se perforó con una
aguja equipada con un filtro de 0,2 \mum estéril. Usando una
jeringa estéril de 1 cc, se transfirió el volumen requerido (Etapa
1b) de ^{90}YCl_{3} al vial de reacción. El vial se mezcló
invirtiéndolo varias veces.
5. El tabique del vial de
2B8-MX-DTPA se limpió con alcohol.
Usando una jeringa estéril de 3 cc, se transfirieron 1,5 ml de
2B8-MX-DTPA al vial de reacción. El
vial se mezcló invirtiéndolo varias veces.
6. El volumen total de mezcla de reacción se
calculó añadiendo la cantidad de cloruro de Y-90
añadida (Etapa 4), más la cantidad de acetato sódico 50 mM añadida
(Etapa 3), más la cantidad de
2B8-MX-DTPA añadida (Etapa 5).
7. El volumen de tampón de formulación a añadir
al vial de reacción para obtener un volumen final de 10 ml restando
el volumen total de reacción calculado en la etapa 6 de 10.
8. El vial de tampón de formulación se limpió
con alcohol y se perforó el vial. Debido a la viscosidad del tampón
de formulación, se perforó el vial de reacción usando una aguja
equipada con un filtro de jeringa de 0,20 \mum. Usando una
jeringa estéril de 10 cc equipada con una aguja de calibre
apropiado, se transfirió el volumen de tampón de formulación
calculado en la Etapa 7, al vial de reacción. Se retiró la aguja de
perforación del vial de reacción y el vial se mezcló invirtiéndolo
varias veces (Producto Final). El vial se incubó al menos 5
minutos antes de hacer el "Ensaye de Radioincorporación". El
color de la solución era ámbar y el vial de reacción estaba lleno
confirmado de este modo que se había añadido el tampón de
formulación.
\newpage
9. La radiactividad total del vial de Producto
Final se midió usando el equipo de instrumentación apropiado para
la medición de ^{90}Y.
10. El Producto Final se almacenó inmediatamente
a 2ºC-8ºC hasta que se requirió para la
administración al paciente.
11. Ensayo de inmunorreactividad:
Usando una jeringa de 1 ml, se retiró
asépticamente 0,1 ml del vial de reacción y se transfirió a un tubo
con tapón de rosca de 1,5 ml diferente. El tubo se almacenó
inmediatamente a 2ºC-8ºC para el "Ensayo de
unión" y el "Ensayo de Radioincorporación".
La validación de los protocolos del kit de
radiomarcaje se realizó en IDEC Pharmaceuticals (San Diego, CA), MD
Anderson Health Center (Houston, TX). Mayo Clinic (Rochester, MN), y
City of Hope (Duarte, CA). Todos los componentes del kit,
incluyendo 2B8-MX-DTPA de calidad
clínica, se prepararon por IDEC Pharmaceuticals según las
condiciones GMP (Condiciones de Buena Fabricación de acuerdo con el
Código de Regulaciones Federales) y se determinó que estaban
estériles y libres de pirógenos.
Los anticuerpos radiomarcados se formularon con
1X PBS que contenía albúmina sérica humana al 7,5% (p/v) (HSA;
calidad clínica; Baxter-Hyland) y DTPA 1 mM. Los
resultados de los ensayos de salida realizados en cada lote de
validación se describen a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon seis lotes de validación cada uno
de In2B8 e Y2B8 por cinco operarios. Estos lotes se denominaron del
siguiente modo y se realizaron en las siguientes instalaciones:
In2B8:
nº 1: IDEC Pharmaceuticals
nº 2: IDEC Pharmaceuticals
nº 3: IDEC Pharmaceuticals
nº 4: MD Anderson Health Center
nº 5: Mayo Clinic
nº 6: City of Hope
\vskip1.000000\baselineskip
Y2B8:
nº 1: IDEC Pharmaceuticals
nº 2: IDEC Pharmaceuticals
nº 3: IDEC Pharmaceuticals
nº 4: MD Anderson Health Center
nº 5: Mayo Clinic
nº 6: City of Hope
\vskip1.000000\baselineskip
Las líneas celulares humanas SB
(CD20-positiva) y HSB
(CD20-negativa) se obtuvieron de la American Type
Culture Collection y se cultivaron en matraces en T usando
RPMI-1640 que contenía suero bovino fetal al 10%
suplementado con glutamina al 2%. Los cultivos se mantuvieron a
37ºC y CO_{2} al 5%. Las células se dividieron típicamente 1:2 en
días alternos y se recogieron a 0,5-2,5 x 10^{6}
células/ml y viabilidad >80%. Las concentraciones celulares se
determinaron usando un hemacitómetro y la viabilidad se determinó
por exclusión de azul de tripano.
\global\parskip0.920000\baselineskip
Las células se recogieron a temperatura ambiente
a una densidad celular de 0,5-2 X 10^{6}
células/ml por centrifugación (1300 rpm en una centrífuga Sorvall)
y se lavaron dos veces con 1X HBSS. Las células sedimentadas se
resuspendieron a 50 x 10^{6} células/ml en 1X HBSS que contenía
albúmina sérica bovina (BSA) al 1% (p/v) y manitol al 10% (p/v)
(tampón de liofilización), se distribuyeron 0,5 ml en tubos de
microfuga de polipropileno de 1,5 ml con juntas tóricas y se
almacenaron a -70ºC, y se liofilizaron durante una noche a
3,99-7,98 Pa (30-60 militor). Los
tubos de células liofilizadas se almacenaron desecadas a 2 - 8ºC y
se reconstituyeron en agua estéril para los ensayos; los tubos de
células liofilizadas en tubos de microfuga se almacenaron con
desecante.
\vskip1.000000\baselineskip
Los métodos analíticos usados para ensayar los
lotes de validación de In2B8 e Y2B8 se describen a continuación.
Los siguientes ensayos se realizaron para cada lote de
validación:
1. Ensayo de unión usando células SB
liofilizadas
2. Ensayo de Radioincorporación de Y2B8/In2B8
usando el Kit Biodex
\vskip1.000000\baselineskip
Cada operario evaluó el porcentaje de unión
usando células SB CD20 positivas liofilizadas de acuerdo con los
siguientes protocolos para In2B8 e Y2B8, respectivamente. Estos
ensayos proporcionan un método rápido y eficaz para confirmar que
el anticuerpo radiomarcado aún reconoce CD20 como antígeno. En una
clínica, también se evaluaron células HSB
CD20-negativas. Las células liofilizadas se
prepararon y almacenaron de acuerdo con el método anterior,
"Preparación de Células SB y HSB Liofilizadas".
\vskip1.000000\baselineskip
1.
Indio-[111]-2B8-MX-DTPA
2. Células SB liofilizadas; tres tubos que
contenían 25 X 10^{6} células/tubo.
3. Células HSB liofilizadas; tres tubos que
contenían 25 X 10^{6} células/tubo.
4. Agua para irrigación estéril o agua para
inyección estéril.
5. Tampón de dilución (1X PBS, pH 7,2 - 7,4 que
contenía Albúmina Sérica Bovina (BSA) al 1%, y Azida Sódica al
0,02% filtrado en 0,2 \mum y almacenado a temperatura
ambiente).
6. Tubos de ensayo de vidrio o plástico para
contar la radiactividad.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Se obtuvieron tres tubos de células SB y HSB
liofilizadas.
2. Se añadió un volumen de 0,50 ml de SWFI (agua
para inyección estéril) a cada tubo, y los tubos se agitaron con
vórtice hasta que se obtuvieron suspensiones homogéneas.
3. Cuatro tubos de microfuga de 1,5 ml vacíos. A
tres de los tubos se añadieron 0,50 ml de tampón de dilución, que
representan un control sin células.
4. Al otro tubo de microfuga de 1,5 ml, se le
añadieron 0,99 ml de tampón de dilución; este tubo se etiquetó
1:100.
5. Se obtuvo un tubo de polipropileno estéril de
50 ml con tapón y se añadieron 10 ml de tampón de dilución al
tubo.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Se obtuvo el anticuerpo radiomarcado
almacenado a 2ºC-8ºC.
2. Se extrajo un volumen de 0,01 ml con una P20
y se añadido al tubo de microfuga de 1,5 ml que contenía 0,99 ml de
tampón de dilución (dilución 1:100). Se aclaró la punta y se agitó
con vórtice suavemente el tubo para mezclarlo.
3. Se extrajo un volumen de 0,20 ml con una P200
del tubo de dilución 1:100 y se añadió al tubo cónico que contenía
10 ml de tampón de dilución. El tubo se mezcló minuciosamente.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Se añadió un volumen de 0,50 ml del
^{111}In2B8-MX-DTPA diluido a
todos los tubos.
2. Se apretaron los tapones en todos los tubos,
y se mezclaron los tubos de forma continua durante 60 minutos.
3. Después de 60 minutos de incubación a
temperatura ambiente, todos los tubos se centrifugaron durante 5
minutos a un mínimo de 2000 g.
4. Se transfirió un volumen de 0,75 ml de cada
sobrenadante a los tubos apropiados para el instrumento de
recuento.
5. Se contó la radiactividad de los tubos usando
un contador gamma, ajustando el fondo.
\vskip1.000000\baselineskip
Reactivos Adicionales:
1.
90Y2B8-MX-DTPA
2. Células SB liofilizadas
3. Agua para irrigación estéril o agua para
inyección estéril
4. Tampón de dilución (1X PBS, pH 7,2 - 7,4 que
contenía Albúmina Sérica Bovina (BSA) al 1%, y Azida Sódica al
0,02%)
\vskip1.000000\baselineskip
1. Se obtuvo el anticuerpo radiomarcado
almacenado a 2ºC-8ºC.
2. Se extrajo un volumen de 10 \mul con una
P20 y se añadió a un tubo de microfuga de 1,5 ml que contenía 990
\mul de tampón de dilución (dilución 1:100). Se aclaró la punta y
el tubo se agitó en vórtice ligeramente.
3. Se obtuvo un tubo de polipropileno estéril de
50 ml con tapón y se transfirieron 10 ml de tampón de dilución al
tubo, usando una pipeta serológica de 10 ml.
4. Se extrajo un volumen de 35 \mul con una
P200 del tubo de dilución 1:100 y se añadió al tubo cónico que
contenía 10 ml de tampón de dilución. Se mezclaron
minuciosamente.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Se obtuvieron tres tubos de células SB
liofilizadas.
2. Se añadió un volumen de 0,5 ml de SWFI a cada
tubo, y los tubos se agitaron con vórtice hasta que se obtuvo una
única suspensión celular.
3. Se obtuvieron tres tubo de microfuga de 1,5
ml vacíos; a tres de los tubos se añadieron 0,5 ml de tampón de
dilución se añadió, que representan un control sin células.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Se añadió un volumen de 0,5 ml del
^{90}Y2B8-MX-DTPA diluido a cada
tubo.
2. Los tubos se colocaron en una mezcladora de
tambor vertical durante 45 minutos, después de asegurarse que los
tapones estaban bien cerrados.
3. Después de 45 minutos de incubación a
temperatura ambiente, las células se sedimentaron por
microcentrifugación durante 5 minutos.
4. Se transfirió un volumen de 0,8 ml del
sobrenadante a viales de centelleo.
5. Se añadió cóctel de centelleo a cada
vial.
6. La cantidad de radiactividad en cada vial se
determinó usando un contador de centelleo, ajustando el fondo.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip1.000000\baselineskip
El porcentaje de radioincorporación se determinó
por cromatografía en capa fina instantánea (ITLC) usando el Kit
Radiocromatográfico Biodex Tec-Control de acuerdo
con el siguiente protocolo:
1. 2B8-MX-DTPA
radiomarcado con ^{111}In o ^{90}Y
2. Tubos para el recuento de tiras TLC
radiactivas
3. Tijeras
4. Jeringa estéril, 1 cc
5. Agujas estériles, 26G
6. Contador gamma o contador de centelleo
7. Pipeteador
\vskip1.000000\baselineskip
1. Primero debe leerse el Manual de
Funcionamiento Biodex completo.
2. Cada muestra radiomarcada se ensayó por
triplicado de acuerdo con las instrucciones del kit; se reveló una
tira por vial.
3. Para aplicar la muestra radiomarcada en la
tira de cromatografía, se usó un pipeteador para aplicar
puntualmente 1 \mul en le línea de origen. Como alternativa,
puede aplicarse una pequeña gota dosificada desde una aguja 26G
unida a una jeringa estéril de 1 cc.
4. Cada sección se contó para la actividad
usando el contador apropiado, es decir, un contador gamma para
^{111}In y un contador de centelleo para ^{90}Y, ajustando el
fondo.
5. Se siguieron las instrucciones de Biodex para
calcular el porcentaje de anticuerpo radiomarcado.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de ensayar cada lote de
validación de In2B8 o Y2B8 se resumen en las Tablas 38 y 39.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para simplificar los métodos de radiomarcaje
actuales para In2B8 e Y2B8, se desarrolló un kit de cuatro
componentes. Las concentraciones de acetato sódico y
2B8-MX-DTPA se redujeron a 50 mM y
2 mg/ml, respectivamente, para permitir transferencias de volúmenes
precisos usando jeringas. Todos los componentes de kit estaban
cargados preferiblemente en viales de tabiques de vidrio y se
ensayaron para la esterilidad y pirogenicidad por IDEC antes de su
liberación, eliminando de este modo la necesidad de realizar estos
ensayos e las clínicas. En el sitio, se realizaron todas las
manipulaciones de los reactivos usando jeringas y agujas estériles.
Por lo tanto, la adherencia de una técnica aséptica habitualmente
encontrada en un entorno de radiofarmacia asegura que los
anticuerpos radiomarcados y formulados son adecuados para la
administración al paciente.
La reproducibilidad y robustez de los protocolos
de radiomarcaje para In2B8 e Y2B8 se evaluó realizando varias
realizaciones de validación usando diferentes lotes de cada
radioisótopo. Para los seis lotes de validación de In2B8
preparados, la unión variaba del 82,1% al 86,8% con una media del
85,1%; los valores de radioincorporación fueron de aproximadamente
el 99% (intervalo del 98,3% al 99,4%). Para los seis lotes de
validación de Y2B8 preparados, el porcentaje de unión obtenido
estaba en el intervalo del 78,6% al 87,0% con una media del 82,3%.
Los valores de radioincorporación para Y2B8 promediaban el 98,8%
(intervalo del 96,3% al 99,5%). Juntos, estos resultados confirman
la reproducibilidad y robustez de los métodos del kit de
radiomarcaje para la preparación tanto de In2B8 como de Y2B8. En
base a estos resultados de validación, se recomienda que las
especificaciones de salida para la radioincorporación y la unión se
establezcan a \geq95% y \geq70%, respectivamente, tanto para
In2B8 como Y2B8.
Además, a causa de la facilidad aumentada de uso
y el potencial reducido errores durante la preparación, se
recomienda que el porcentaje de unión usando células
CD20-positivas liofilizadas y la radioincorporación
a usar se ensayen para la liberación de In2B8 e Y2B8 en los sitios
clínicos.
Para resumir, estos resultados en conjunto
indican que In2B8 e Y2B8 preparados usando el kit de radiomarcaje
son adecuados para su uso en la situación clínica. Además, para
ambos anticuerpos radiomarcados, las especificaciones de salida se
establecen reflejando los resultados de varias realizaciones de
validación por los cinco operarios diferentes.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El anticuerpo monoclonal murino
anti-CD20 denominado 2B8 se ha clonado en células en
CHO para producir una línea celular de elevada expresión. La
especificidad del anticuerpo derivado de CHO por células humanas
CD20-positivas se demostró por análisis FACS y
unión competitiva. Se observó unión insignificante a células T
humanas. La afinidad del anticuerpo por células
CD20-positivas se determinó a 1,3 X 10^{-10} M
usando un ensayo de unión competitiva. El anticuerpo se hizo
reaccionar con el agente quelante MX-DTPA para
formar un conjugado, 2B8-MX-DTPA,
con pérdida insignificante de inmunorreactividad (el valor de
afinidad era de 4,4 X 10^{-10} M). La conjugación óptima del
quelador, determinada midiendo la radioincorporación de ^{111}In,
se consiguió después de ocho horas de reacción. Los protocolos de
radiomarcaje para 2B8-MX-DTPA se
optimizaron para ^{90}Y o ^{111}In con respecto al pH y el
tiempo de incubación para asegurar la radioincorporación (\geq95%)
y la retención de inmunorreactividad (\geq70%) máximas. Las
especificaciones de salida para In2B8 e Y2B8 preparados usando
2B8-MX-DTPA derivado de CHO en
ensayos clínicos se recomendaron para la radioincorporación
(\geq95%) y la unión (\geq70%) a células humanas
CD20-positivas liofilizadas y reconstituidas.
Tomados en conjunto, estos resultados indican la idoneidad de
2B8-MX-DTPA derivado de CHO para su
uso en ensayos clínicos.
\vskip1.000000\baselineskip
El anticuerpo 2B8 previamente usado se produjo
en biorreactores de fibra hueca. Para reducir los costes de
fabricación de este anticuerpo, se ha clonado y expresado en células
CHO para producir una línea celular de producción de elevada
expresión. Este ejemplo describe los resultados de la
caracterización in vitro del anticuerpo 2B8 derivado de CHO,
el anticuerpo conjugado
(2B8-MX-DTPA), y los productos de
anticuerpo marcado con ^{90}Y y ^{111}In preparados usando los
protocolos del kit de radiomarcaje clínico.
\vskip1.000000\baselineskip
Las líneas celulares humanas SB
(CD20-positiva) y HSB
(CD20-negativa) se obtuvieron de la American Type
Culture Collection y se cultivaron en matraces en T usando
RPMI-1640 que contenía suero bovino fetal al 10%
suplementado con glutamina al 2%. Los cultivos se mantuvieron a
37ºC y CO_{2} al 5%. Las células se dividieron típicamente 1:2 en
días alternos y se recogieron a 0,5-2,5 x 10^{6}
células/ml y con viabilidad >80%. Las concentraciones celulares
se determinaron usando un hemacitómetro y la viabilidad se determinó
por exclusión de azul de tripano. La información específica sobre
los lotes de las células se registra en el Cuaderno nº 1553 y en la
carpeta titulada "Cell Activity Logbook 1995 & 1996"
autorizada por Ron Morena.
2B8 derivado de CHO se produjo según las
condiciones GMP en la instalación de fabricación de IDEC. El
anticuerpo se formuló en solución salina normal de bajo contenido
en metales a 11,5 mg/ml. Se determinó que los anticuerpos eran
homogéneos por SDS-PAGE.
2B8-MX-DTPA se produjo según las
condiciones GMP de acuerdo con PSBR-043 a partir de
2B8 derivado de CHO y se formuló en solución salina de bajo
contenido en metales a 2 mg/ml (Lotes nº 0165A y 0165B).
El cloruro de ^{111}In de calidad farmacéutica
se adquirió de Amersham (U.K.) o Ciclotron Products Inc. (Coral
Gables, FL). El cloruro de itrio[90] se obtuvo de Amersham
(U.K.), Nordion International (Kanatta, Canadá), o Pacific
Northwest National Laboratory (Richland, WA). El
MX-DTPA preparado según GMP se obtuvo de Hauser
Chemical (Boulder, CO). El ácido dietilenotriaminapentaacético
(DTPA) de calidad clínica se obtuvo de Heyl (Berlin, Alemania).
TAG-NHS se obtuvo de IGEN Inc. (Rockville, MD). Las
perlas de anti-CD19 murino se adquirieron de Dynal
Inc. (Lake Success, NY). El F(ab')_{2} de cabra
anti-ratón marcado con FITC se adquirió de Jackson
Immuno-
Research.
Research.
Los reactivos que requerían retirada de metales
pesados contaminantes se trataron por lotes con Chelex 100 (BioRad
Industries) o con Sepharose Quelante (Pharmacia) pasando las
soluciones a través de una columna. Las soluciones madre de bajo
contenido en metales se diluyeron con Agua para Irrigación Estéril
(SWFIr). Las soluciones se almacenaron en recipientes de plástico
estériles.
Los reactivos adicionales se describen a
continuación para métodos específicos.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Analizador Origen; IGEN Inc. Modelo nº
1100-1000; IDEC nº 1492
2. Contador de centelleo
Top-Count; Packard, Modelo nº A9912; IDEC nº
1329
3. Contador gamma; Isodata, Modelo nº
20-10; IDEC nº 0628
4. Kit Radiocromatográfico
Tec-Control, Biodex, Modelo nº
151-770
5. Liofilizador; Virtis, Modelo Freezemobile 12;
IDEC nº 0458
Se describen materiales y equipo adicionales
para métodos específicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células se cultivaron como se ha descrito
anteriormente y se recogieron a temperatura ambiente a una densidad
celular de 0,5-2 X 10^{6} células/ml por
centrifugación (1300 rpm en una centrífuga Sorvall) y se lavaron
dos veces con 1X HBSS. Las células sedimentadas se resuspendieron a
50 x 10^{6} células/ml en 1X HBSS que contenía albúmina sérica
bovina (BSA) al 1% (p/v) y manitol al 10% (p/v/) (tampón de
liofilización), se dosificaron 0,5 ml en tubos de microfuga de
polipropileno de 1,5 ml con juntas tóricas y se almacenaron a -70ºC,
y se liofilizaron durante una noche a 3,99-7,98 Pa
(30-60 militor). Los tubos de células liofilizadas
se almacenaron desecadas a 2-8ºC y se
reconstituyeron en agua estéril para los ensayos; los tubos de
células liofilizadas en tubos de microfuga se almacenaron con
desecante.
\vskip1.000000\baselineskip
La unión directa de anticuerpos a células B
humanas se determinó por citometría de flujo. Se incubaron
concentraciones crecientes de anticuerpo en 1X PBS, pH 7,2, que
contenía BSA al 1% (p/v) (tampón de unión) con 5 X 10^{6} células
CD20-positivas (SB) o CD20-negativas
(HSB) durante 30 min. en hielo. Las células se lavaron por
centrifugación, se resuspendieron en tampón de unión, y se
incubaron con F(ab')_{2} de cabra
anti-ratón marcado con FIAC durante 30 min. en
hielo. Después de incubación con el reactivo secundario, las células
se lavaron por centrifugación y se resuspendieron en 1X PBS que
contenía formaldehído al 1,1% (v/v) para fijar las células. La
intensidad de fluorescencia media se determinó usando citometría de
flujo.
\vskip1.000000\baselineskip
La inmunorreactividad de 2B8 y
2B8-MX-DTPA se determinó por unión
competitiva a células SB CD20-positivas usando el
método electroquimioluminescente ORIGEN (Leland y Powell). Se
recogieron células SB en fase log del cultivo y se lavaron dos
veces con 1X HBSS. Las células se diluyeron en 1X PBS pH 7,2 que
contenía albúmina sérica bovina al 1% (p/v). En algunos
experimentos, se usaron células liofilizadas después de su
reconstitución con agua estéril.
Se preparó anticuerpo indicador marcado con
rutenio incubado 2B8 derivado de CHO (lote nº 165) en 1X PBS, pH
7,2 con el quelador tris-bipiridina del éster
N-hidroxisuccinimida de rutenio (II)
(TAG-NHS) a una proporción molar 15:1 de
TAG-NHS a anticuerpo. Después de 1 h de incubación a
temperatura ambiente, protegido de la luz, la reacción se
interrumpió con glicina durante 10 min. Se retiró el TAG si
reaccionar por cromatografía por exclusión de tamaño usando una
columna Pharmacia PD-10 equilibrada con 1X PBS. La
concentración de proteína se determinó usando el ensayo de
proteínas de Bradford. La incorporación TAG se determinó midiendo la
absorbancia a 455 nm. La proporción molar de TAG a proteína se
calculó a 3,0.
Los ensayos se realizaron en tubos de
polipropileno de 12 X 75 mm. Se incubaron cantidades variables de
anticuerpo competidos (0,002 -17 \mug/ml) en 1X PBS, pH 7,2, que
contenía BSA al 1% (p/v) con 0,08 \mug/ml de 2B8 de CHO marcado
con TAG, 0,08 mg/ml de perlas anti-CD19, y 167.000
células/ml. Después de incubación a temperatura ambiente con mezcla
orbital durante 3 h, se determinó la electroquimioluminescencia
(ECL) relativa usando el instrumento ORIGEN. Los valores de ECL
medios se determinaron para muestras duplicadas y se representaron
frente a la concentración de anticuerpo competidos usando el
software Kaleidagraph. Para algunos experimentos, se presentó el
porcentaje de inhibición. Se ajustaron las curvas de competición y
se determinaron los calores de EC50 (concentración de anticuerpo
que da el 50% de la unión máxima) usando el siguiente programa de 4
parámetros:
y =
((m1-m4)/(1+(m0/m3)^{\wedge}m2))+m4;
m1=;m2=;m3=;m4=
m0 = variable
independiente
m1 = respuesta de señal cero en unidades de ECL
relativa
m2 = parámetro de curvatura
m3 = EC50 en \mug/ml
m4 = respuesta de señal máxima en unidades de
ECL relativa
Los valores de afinidad promedio se calcularon a
partir de los valores de EC50 y la concentración conocida del
anticuerpo indicador usando el método de Muller.
\vskip1.000000\baselineskip
El agente quelante, ácido
1-isotiocianatobencil-3-metildietilenotriamina-pentaacético
(MX-DTPA) se proporcionó en forma de un polvo seco
(ácido libre) y se almacenó desecado a -20ºC o -70ºC.
Aproximadamente 3 mg de anticuerpo 2B8 de CHO en solución salina
normal de bajo contenido en metales se ajustaron a pH 8,6 añadiendo
una décima parte del volumen de borato sódico 50 mM, pH 8,6. El
anticuerpo a 10-11 mg/ml se incubó a una proporción
molar 4:1 de MX-DTPA a proteína añadiendo
MX-DTPA disuelto en borato sódico 50 mM, pH 8,6.
Después de incubación a temperatura ambiente (2 a 24 h), se retiró
el quelador sin reaccionar del conjugado por diafiltración
repetitiva en solución salina normal de bajo contenido en metales
usando filtros de centrifugación Centricon 30.
\vskip1.000000\baselineskip
In2B8 se preparó usando el protocolo del kit de
radiomarcaje descrito en este documento. El anticuerpo se marcó a
una actividad específica de 3 mCi/mg y se formuló a 0,2 mg/ml. En
resumen, se transfirieron de 0,5 a 2 mCi de cloruro de ^{111}In a
un tubo de microfuga sin metales y se ajustaron a aproximadamente pH
4,2 usando un volumen 1,2X de acetato sódico 50 mM de bajo
contenido en metales. Se añadió
2B8-MX-DTPA a 2 mg/ml a la solución
de acetato de indio y después de incubación a temperatura ambiente
durante 30 min., se formuló el anticuerpo marcado a 0,2 mg/ml en 1X
PBS, pH 7,2 que contenía albúmina sérica humana al 7,5% (p/v) y DTPA
1 mM (concentración final del 4% al 6% de HSA). Todas las muestras
se ensayaron para la radioincorporación por triplicado; los valores
eran >95%.
Y2B8 también se preparó usando una versión a
pequeña escala del protocolo del kit de radiomarcaje descrito en el
Ejemplo 1. El anticuerpo se marcó a una actividad específica de 15
mCi/mg y se formuló a 0,3 mg/ml. En resumen, se transfirieron de
0,5 a 2 mCi de cloruro de ^{90}Y a un tubo de microfuga sin
metales y se ajustaron a aproximadamente pH 4,2 usando un volumen
1,2X de acetato sódico 50 mM de bajo contenido en metales. Se
añadió 2B8-MX-DTPA a 2 mg/ml a la
solución de acetato de ^{90}Y y después de incubación a
temperatura ambiente durante 5 min., se formuló el anticuerpo
marcado a 0,3 mg/ml en 1X PBS, pH 7,2 que contenía albúmina sérica
humana al 7,5% (p/v) y DTPA 1 mM (concentración final de HSA, del
4% al 6%). Todas las muestras se ensayaron para la
radioincorporación por triplicado; los valores eran >95%.
Las concentraciones de radiactividad de los
productos radiomarcados finales se calcularon en base a la cantidad
de radiactividad añadida a la mezcla de reacción y por referencia al
Certificado de Análisis para el radioisótopo. Las concentraciones
de anticuerpo de las mezclas de reacción inactivadas se calcularon a
partir de la cantidad conocida de anticuerpo añadido.
Para estudios de cinética de radiomarcaje que
evalúan en efecto del pH sobre la radioincorporación y la unión, el
pH de las mezclas de reacción se ajustó añadiendo cantidades
variables de acetato sódico 50 mM de bajo contenido en metales
(volumen 0,8 a 2,2X de la solución de radioisótopo).
\vskip1.000000\baselineskip
La cantidad de radiactividad asociada con los
conjugados (radioincorporación) en los productos finales o muestras
de incubación se determinó usando un kit disponible en el mercado
fabricado por Biodex (Kit Radiocromatográfico
Tec-Control; véase el Ejemplo 1). En general, se
aplicó 1 \mul de las muestras de ensayo por duplicado o
triplicado usando una micropipeta y se reveló de acuerdo con el
inserto de instrucciones Biodex. Se contaron las mitades de las
tiras para la radiactividad en tubos de vidrio usando un contador
gamma Isodata o un contador de centelleo Packard Top Count como se
describe a continuación. La incorporación de radiomarcador se
calculó dividiendo la cantidad de radiactividad en la mitad
superior de la tira por la radiactividad total encontrada en las
mitades tanto superior como inferior. Este valor se expresó como un
porcentaje y se determinó el valor medio.
\vskip1.000000\baselineskip
La inmunorreactividad se evaluó usando el método
de Lindmo et al. y como se ha descrito anteriormente en el
Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron los mismos protocolos descritos en
este documento para determinar la unión a células SB
CD20-positivas para In2B8 y Y2B8, respectivamente.
In2B8 e Y2B8 se prepararon y formularon como se ha descrito
anteriormente. Para el ensayo, se diluyeron muestras de In2B8 o
Y2B8 con tampón de dilución de ensayo (1X PBS, pH 7,2, que contenía
albúmina sérica bovina (BSA) al 1% (p/v) a 40 ng/ml y 11 ng/ml,
respectivamente).
Las células positivas al antígeno (SB) y
negativas al antígeno (HSB) se mantuvieron en RPMI 1640 suplementado
con suero de ternera fetal al 10% a 37ºC y CO_{2} al 5%. Las
células (viabilidad >90% determinada por exclusión de azul de
tripano) se recogieron a temperatura ambiente a una densidad celular
de 0,5 - 2 x 10^{6} células/ml por centrifugación (1300 rpm en
una centrífuga Sorvall) y se lavaron dos veces con 50 ml de HBSS
1X. Las células sedimentadas se resuspendieron a 50 x 10^{6}
células/ml en HBSS 1X pre-refigerado que contenía
albúmina sérica bovina (BSA) al 1% (p/v) y manitol al 10% (p/v/)
(tampón de liofilización). Las suspensiones celulares se
dosificaron en tubos de microfuga de polipropileno de 1,5 ml con
juntas tóricas a 50 X 10^{6} células/ml (0,5 ml por tubo) y se
liofilizaron durante una noche de 3,99 a 7,98 Pa (30 a 60 militor).
Las células liofilizadas se almacenaron desecadas a
2-8ºC y se reconstituyeron en agua estéril para los
ensayos.
Las células SB y HSB liofilizadas en tubos de
polipropileno de 1,5 ml se reconstituyeron a 50 X 10^{6}
células/ml usando agua estéril. Se añadieron In2B8 o Y2B8
liofilizados a las células, por triplicado, y se incubaron durante
45 a 60 min. con mezcla en tambor vertical a temperatura ambiente,
respectivamente. Después de la incubación, las células se
sedimentaron por centrifugación y se determinó la radiactividad
unida a las células contando las muestras en un contador gamma
Isodata o un contador de centelleo Packard Top Count como se
describe a continuación. La radiactividad unida (B) a las células
se calculó restando la radiactividad no unida (sobrenadante) de la
radiactividad total añadida. La radiactividad total se determinó a
partir de la radiactividad contada en tubos sin células. El
porcentaje de unión se calculó expresando los recuentos unidos como
un porcentaje de los recuentos totales.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de radioincorporación se contaron
durante 1 min. usando un contador gamma Isodata. El contador estaba
ajustado para una ventana de energía de 100-500 KeV
y el fondo se ajustó a cero inmediatamente antes de su uso para las
muestras usando ^{111}In. El contador gamma Isodata también se usó
para contar las tiras de ITLC que tenía ^{90}Y aplicado sobre las
mismas. Las ventanas de energía para la detección de la radiación
bremsstrahlung eran de 100-1000 KeV.
Para los ensayos de unión, se transfirieron
muestras de ^{90}Y a placas de 24 pocillos y cóctel MicroScint 40
y se contaron en un Packard Top Count durante 1 min. usando ajustes
de energía mínima y máxima. Las muestras de indio-[111] se contaron
durante 1 min. usando un contador gamma Isodata. El contado estaba
ajustado para ventanas de energía de 100-500 KeV y
el fondo se ajustaba a cero inmediatamente antes de su uso.
\vskip1.000000\baselineskip
Las especificaciones de salida para la
radioincorporación y la unión a células
CD20-positivas se establecieron preparando seis
dosis de In2B8 e Y2B8 usando dos lotes de
2B8-MX-DTPA de calidad clínica
(lotes nº 0219 y 0220) preparados de acuerdo con la presente
descripción y cargados según las condiciones GMP. Se realizaron
ensayos de liberación como se ha descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando análisis citométrico de flujo, se
demostró que 2B8 de CHO se une directamente a células SB
CD20-positivas sin unión a células HSB
CD20-negativas. (Figura 34). No se observó unión
significativa a células SB o HSB para un anticuerpo de isotipo
irrelevante (\gamma1\kappa) (S004).
La unión de 2B8 de CHO a células
CD20-positivas se evaluó en ensayos de competición
usando el sistema de detección quimioluminiscente ORIGEN. Se
incubaron células SB positivas al antígeno liofilizadas y
reconstituidas con cantidades crecientes de anticuerpo en presencia
de 2B8 de CHO marcado con indicador rutenio. Los resultados
mostraron que 2B8 CHO inhibe la unión a células
CD20-positivas al mismo grado que el anticuerpo
derivado de biorreactores de fibra hueca (2B8-49)
(Figura 35). Los valores de EC50 se determinaron gráficamente y se
usó el método de Muller (1980) para calcular los valores de
afinidad promedio. La afinidad de 2B8 de CHO se determinó a 1,3 X
10^{-10} M; el anticuerpo 2B8 derivado de biorreactores de fibra
hueca dio un valor de afinidad de 2,5 10^{-10} M. La unión no
específica fue insignificante como se demuestra por la ausencia de
competición con el anticuerpo de isotipo irrelevante, S004.
El conjugado 2B8
(2B8-MX-DTPA) se preparó usando un
protocolo similar al usado para el 2B8-49
previamente caracterizado. Se realizaron reacciones usando
aproximadamente 3 mg de anticuerpo y una proporción molar 4:1 de
quelador a anticuerpo. Se evaluaron los tiempos de incubación de 2,
4, 8, 17, y 24 h para determinar el tiempo de reacción que daba una
retención aceptable de la unión a células CD20 positivas y elevada
radioincorporación con ^{111}In. Las curvas de unión competitiva
que comparan 2B8 de CHO con conjugado
2B8-MX-DTPA de CHO reaccionado
durante 8-24 h eran similares, lo que indica que el
proceso de conjugación no alteraba significativamente la unión del
anticuerpo al antígeno CD20 (Figura 36). Usando los valores de EC50
determinados gráficamente (Figura 36), las constantes de afinidad
para los anticuerpos no conjugado y conjugado variaban de 2,3 X
10^{-10} M a 5,9 X 10^{-10} M (Tabla 40). La radioincorporación
era >95% para los tiempos de conjugación de 8 a 24 h (Tabla
30).
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2B8-MX-DTPA de
CHO marcado con Indio-[111] (In2B8) se preparó usando el protocolo
del kit de radiomarcaje a pequeña escala descrito previamente para
el anticuerpo derivado del biorreactor de fibra hueca (Ejemplo 1).
En resumen, el anticuerpo conjugado
(2B8-MX-DTPA derivado de CHO; lote
nº 0165A) se incubó con acetato de ^{111}In al pH indicado
durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las mezclas de reacción
se formularon con PBS, pH 7,2, que contenía albúmina sérica humana
al 7,5% (p/v) y DTPA 1 mM. Las muestras formuladas de In2B8 se
ensayaron para la radioincorporación usando cromatografía en capa
fina instantánea. La unión de In2B8 a células
CD20-positivas se determinó usando células SB
liofilizadas y reconstituidas. Para comparación, el conjugado
preparado a partir de anticuerpo producido por hibridoma
(2B8-49) se incubó con acetato de ^{111}In
durante 30 min. a pH 4,2 (condiciones previamente establecidas para
este anticuerpo).
Se realizaron estudios de cinética para
determinar las condiciones de marcaje que proporcionan la retención
máxima de unión a células CD20-positivas y elevada
radioincorporación (Tablas 41 y 42). El anticuerpo conjugado
(2B8-MX-DTPA derivado de CHO) se
incubó a temperatura ambiente con acetato de ^{111}In a pH 4,2
durante los tiempos indicados (Tabla 42).
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Los resultados demostraron que para el intervalo
de pH 3,0 a 4,6 y un tiempo de incubación de 30 min., se obtenía
>97% de radioincorporación del radioisótopo manteniendo al mismo
tiempo una unión a aproximadamente el 84%. Los valores de
radioincorporación y unión eran invariantes para los tiempos de
incubación de 15 a 45 min. para reacciones a pH 2,9 a 4,6 (Tabla
42). Los resultados eran comparables a los obtenidos usando el
anticuerpo 2B8-49 (Tablas 41 y 42).
El anticuerpo marcado con itrio-[90] se preparó
incubando el anticuerpo conjugado
(2B8-MX-DTPA derivado de CHO) con
acetato de ^{90}Y al pH indicado durante 5 minutos a temperatura
ambiente. Las mezclas de reacción se formularon en PBS, pH 7,2 que
contenía albúmina sérica humana al 7,5% (p/v) y DTPA 1 mM. Las
muestras formuladas de Y2B8 se ensayaron para la radioincorporación
usando cromatografía en capa fina instantánea. La unión de Y2B8 a
células CD20-positivas se determinó usando células
SB liofilizadas y reconstituidas. Para la comparación, se incubó el
conjugado preparado a partir de anticuerpo producido por hibridoma
(2B8-49) con acetato de ^{90}Y durante 5 min. a
pH 4,2 (condiciones previamente establecidas para este
anticuerpo).
Se realizaron estudios cinéticos similares para
evaluar la preparación del anticuerpo marcado con ^{90}Y (Y2B8).
Para reacciones de radiomarcaje en el intervalo de pH de 3,9 a 4,7 a
un tiempo de incubación de 5 min., La radioincorporación era
>96% con >80% de retención de la unión a células
CD20-positivas (Tabla 43). Se obtuvieron resultados
similares para tiempos de incubación de 3, 5, y 10 min. para el
intervalo de pH de 2,9 a 4,6 (Tabla 44). Después, se incubó el
anticuerpo conjugado (2B8-MX-DTPA
derivado de CHO) a temperatura ambiente con acetato de ^{90}Y a
pH 4,2 durante los tiempos indicados (Tabla 44). Los resultados
fueron comparables a los obtenidos usando el anticuerpo
2B8-49 (Tablas 43 y 44).
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Las inmunorreactividades para In2B8 e Y2B8
preparados a partir de CHO 2B8 se determinaron usando el método de
Lindmo et al. Se incubaron cantidades crecientes de células
SB CD20-positivas recién recogidas con una cantidad
fija de In2B8 o Y2B8 en condiciones de exceso de antígeno. El
análisis del diagrama recíproco de los datos de unión permitió
determinar inmunorreactividades del 80,6% y el 72,2% para In2B8 e
Y2B8, respectivamente (Figuras 37 y 38).
Se usaron dos lotes del kit de radiomarcaje de
In2B8/Y2B8 de calidad clínica para preparar seis lotes de In2B8 e
Y2B8. In2B8 e Y2B8 se prepararon usando versiones a pequeña escala
de los protocolos de radiomarcaje actualmente usados en los ensayos
clínicos. Cada lote de 2B8-MX-DTPA
radiomarcado se ensayó para la radioincorporación y la unión a
células humanas CD20-positivas (SB) y
CD20-negativas (HSB). Estos resultados se resumen en
las Tablas 45 y 46. Para los seis lotes de In2B8 preparados, la
radioincorporación variaba del 98,9% al 99,3% con una media del
99,1%. La unión a células CD20-positivas variaba del
81,9% al 85,1% con una media del 83,6%; la unión a células
CD20-negativas era <4%. Para los seis lotes de
Y2B8 preparados, la radioincorporación variaba del 97,4% al 98,7%
con una media del 98,2%. La unión a células
CD20-positivas variaba del 81,4% al 82,7% con una
media del 81,9%; la unión a células CD20-negativas
era <8%.
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El anticuerpo monoclonal murino
anti-CD20 (2B8) clonado y expresado en células CHO
(2B8 derivado de CHO) mantiene la especificidad por células humanas
CD20-positivas como se muestran por análisis FACS y
de unión competitiva. La unión a células T humanas era mínima. La
afinidad del anticuerpo por células humanas
CD20-positivas se determinó a 1,3 X 10^{-10} M
usando un ensayo de unión competitiva. Usando el mismo ensayo, el
anticuerpo 2B8 derivado de biorreactores de fibra hueca daba un
valor de afinidad de 2,5 X 10^{-10} M.
El anticuerpo 2B8 de CHO se hizo reaccionar con
MX-DTPA para formar un conjugado,
2B8-MX-DTPA, manteniendo al mismo
tiempo la retención de la inmunorreactividad. La incorporación
óptima de quelador se determinó midiendo la radioincorporación con
^{111}In y se consiguió después de ocho horas de incubación a
temperatura ambiente. Los protocolos de radiomarcaje para el
conjugado 2B8-MX-DTPA se optimizaron
para ^{90}Y o ^{111}In con respecto al pH y el tiempo de
incubación para asegurar la radioincorporación y retención de
inmunorreactividad máximas.
Los resultados de varias preparaciones de In2B8
e Y2B8 demuestran la reproducibilidad del protocolo de radiomarcaje
usado para preparar dosis clínicas. En base a estos resultados de
radiomarcaje, se sugiere que las especificaciones de salida para la
radioincorporación y la unión, usando células
CD20-positivas liofilizadas, se establezcan a
\geq95% y \geq70%, respectivamente. Tomados en conjunto, estos
resultados demuestran la comparabilidad de 2B8 derivado de CHO y
2B8-49 derivado de fibra hueca, e indican la
idoneidad del 2B8-MX-DTPA derivado
de CHO para su uso en ensayos clínicos.
Finalmente, la presente descripción describe un
procedimiento de marcaje, conocido como el método "mezclar y
usar", para la preparación de dosis clínicas de anticuerpos
radiomarcados que obvia la necesidad de la etapa de cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC) actualmente usada para la retirada
del radioisótopo no unido a proteína. El protocolo simplificado
elimina esta etapa de purificación laboriosa manteniendo al mismo
tiempo un elevado nivel de radioincorporación de isótopo (>95%) y
retención mejorada de inmunorreactividad (>70%). Se descubrió
que el conjugado radiomarcado formulado clínicamente era estable
in vitro cuando se incubaba a 4ºC durante 48 horas en base a
la retención de radioisótopo e inmunorreactividad. Además, el
conjugado radiomarcado era estable cuando se incubaba en suero
humano a 37ºC durante 72 horas. Los estudios de biodistribución en
ratones BALB/c demostraron ausencia de deposición tisular inusual, y
ausencia de acumulación significativa en el hueso. Las estimaciones
de las dosis absorbidas de radiación para un ser humano
"normal" de 70 kg eran comparables con las obtenidas en un
ensayo clínico en curso usando
2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y.
Los resultados de estos estudios mostraron que
2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y
producido usando el protocolo "mezclar y usar" era comparable
con el preparado usando el proceso de HPLC convencional. La
validación del protocolo de aumento en escala para preparar
conjugado radiomarcado de calidad clínica mostró que el método era
reproducible y que el producto era comparable con el producido
usando el método de HPLC actual. Los resultados de estos estudios
preclínicos indican que este nuevo protocolo "mezclar y usar"
puede usarse para preparar
2B8-MX-DTPA marcado con ^{90}Y
adecuado para su uso en ensayos
clínicos.
clínicos.
Cada una de las siguientes citas está
incorporada en este documento por referencia:
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Acute Lymphoblastic Leukemia in Hamsters, SB-2,
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2772.
Claims (27)
1. Un método para radiomarcar un anticuerpo
conjugado con quelador con ^{90}Y para su administración a un
paciente, que comprende:
(i) mezclar un anticuerpo conjugado con quelador
con una solución que contiene ^{90}Y para formar una mezcla;
(ii) incubar la mezcla a una temperatura
apropiada durante 10 minutos o menos para producir un anticuerpo
radiomarcado, donde el anticuerpo radiomarcado tiene más del 95% de
radioincorporación de modo que puede administrarse directamente a
un paciente sin purificación adicional del ^{90}Y no incorporado;
y
(iii) diluir el anticuerpo radiomarcado en un
tampón de formulación a una concentración apropiada para dicha
administración a un paciente.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que el anticuerpo conjugado con quelador comprende un
anticuerpo anti-CD20.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2,
en el que el anticuerpo anti-CD20 es
2B8-MX-DTPA.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en el que la solución que contiene
^{90}Y se ajusta a un pH de 3 a 6 antes de mezclarse con el
anticuerpo conjugado con quelador.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4,
en el que el pH se ajusta con una solución de acetato sódico de
bajo contenido en metales.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 5,
en el que la solución de acetato sódico está a una concentración de
10 a 1000 mM.
7. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, en el que la cantidad en volumen de
^{90}Y usada está entre 5 y 100 mCi dividida por la concentración
de radiactividad en el momento del marcaje.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7,
en el que la cantidad en volumen de ^{90}Y usada es de 45 mCi
dividida por la concentración de radiactividad en el momento del
marcaje.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 8,
en el que de 1 a 2 ml de anticuerpo conjugado con
MX-DTPA a una concentración de 0,5 a 30 mg/ml se
mezcla con la solución que contiene ^{90}Y.
10. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9, en el que el tampón de formulación se
añade en una cantidad necesaria para conseguir un volumen final
total de 10 ml a 50 ml.
11. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10, en el que el tampón de formulación
comprende una solución salina fisiológica, un radioprotector y
quelador no conjugado con proteína.
12. El método de acuerdo con la reivindicación
11, en el que el radioprotector es albúmina sérica humana (HSA),
ascorbato, ácido ascórbico, fenol, sulfitos, glutatión, cisteína,
ácido gentísico, ácido nicotínico, palmitato de ascorbilo,
HOP(:O)H_{2}, glicerol, formaldehído sulfoxilato sódico,
Na_{2}S_{2}O_{5}, Na_{2}S_{2}O_{3}, o SO_{2}.
13. El método de acuerdo con la reivindicación
12, en el que el radioprotector es HSA.
14. El método de acuerdo con la reivindicación
13, en el que la HSA está a una concentración del 1 al 25%
(p/v).
15. El método de acuerdo con la reivindicación
14, en el que la concentración de HSA es de aproximadamente el 7,5%
(p/v).
16. El método de acuerdo con la reivindicación
12, en el que el radioprotector es ascorbato.
17. El método de acuerdo con la reivindicación
16, en el que el ascorbato está a una concentración de 1 a 100
mg/ml.
18. El método de acuerdo con la reivindicación
11, en el que el quelador no conjugado con proteína es DTPA o
EDTA.
19. El método de acuerdo con la reivindicación
18, en el que la concentración de DTPA es aproximadamente 1
mM.
20. Un ensayo de unión para determinar el
porcentaje de unión de un anticuerpo radiomarcado a su célula diana,
que comprende:
(i) radiomarcar un anticuerpo de acuerdo con el
método de la reivindicación 1 para producir un anticuerpo
radiomarcado;
(ii) mezclar e incubar al menos una alícuota del
anticuerpo radiomarcado con al menos una alícuota de células
positivas al antígeno;
(iii) mezclar e incubar al menos una alícuota
del anticuerpo radiomarcado idéntica a la alícuota de la etapa (ii)
con al menos una alícuota de tampón de dilución del mismo volumen
que la alícuota de células positivas al antígeno de la etapa (ii)
como control;
(iv) sedimentar las células por
centrifugación;
(v) medir la radiactividad en el sobrenadante de
las células sedimentadas y el control; y
(vi) comparar la cantidad de radiactividad en el
sobrenadante celular con la cantidad de radiactividad en el
control.
21. El ensayo de unión de acuerdo con la
reivindicación 20, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo
anti-CD20.
22. El ensayo de unión de acuerdo con la
reivindicación 21, en el que el anticuerpo anti-CD20
es 2B8.
23. El ensayo de unión de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en el que dicho antígeno
es CD20.
24. El ensayo de unión de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en el que dichas células
positivas al antígeno son células SB (ATCC nº CCL120).
25. El ensayo de unión de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24 que comprende
adicionalmente:
(i) mezclar al menos una alícuota del anticuerpo
radiomarcado con al menos una alícuota de células negativas al
antígeno;
(ii) sedimentar las células negativas al
antígeno por centrifugación;
(iii) medir la radiactividad en el sobrenadante
de las células sedimentadas negativas al antígeno; y
(iv) comparar la cantidad de radiactividad en el
sobrenadante celular negativo al antígeno con la cantidad de
radiactividad en el sobrenadante del sobrenadante celular positivo
al antígeno y el control.
26. El ensayo de unión de acuerdo con la
reivindicación 25, en el que dichas células negativas al antígeno
son CD20-negativas.
27. El ensayo de unión de acuerdo con la
reivindicación 26, en el que dichas células
CD20-negativas son células HSB (ATCC nº
CCL120.1).
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