SK288096B6 - Method for radiolabeling chelator-conjugated antibody and binding assay - Google Patents

Abstract

It is described a method for radiolabeling a chelator- conjugated antibody with 111In for administration to a patient and a binding assay for testing the clinical efficacy to therapeutic antibody for the treatment/imaging of tumor and tumor cells. Making and evaluating radiolabeled antibody conjugates will be used for the treatment and imaging of B-cell lymphoma tumors by targeting the B cell surface antigen BP35 (CD20).

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka spôsobu rádioaktívneho značenia protilátky konjugovanej s chelatotvomým prostriedkom s ^U1ln na použitie na podávanie pacientovi a testovanie viazania (imunoesej) na testovanie klinickej účinnosti terapeutických protilátok na liečenie/zobrazovanie tumorov a tumorových buniek. Príprava a vyhodnotenie konjugátov protilátok značených rádionuklidmi slúži na liečenie a zobrazovanie B-bunkových lymfómov na základe cieleného zásahu antigénu BP35 („CD20“) povrchu B buniek.

Doterajší stav techniky

Všetky publikácie a patentové prihlášky, ktoré sa tu opisujú, sa zahrnujú formou odkazu v rovnakom rozsahu, ako keby sa každá jednotlivá publikácia alebo patentová prihláška konkrétne a jednotlivo citovala s požiadavkou zahrnutia formou odkazu.

Imunitný systém stavovcov (napríklad primátov, ktorí zahrnujú ľudí, ľudoopov, opice atď.) sa skladá z radu orgánov a bunkových typov, ktoré sa vyvinuli tak, aby presne a špecificky rozpoznávali cudzie mikroorganizmy („antigény“), ktoré napádajú hostiteľov zo skupiny stavovcov, aby špecificky viazali tieto cudzie mikroorganizmy, a aby eliminovali/ničili tieto cudzie mikroorganizmy. Lymfocyty, rovnako tak ako ďalšie typy buniek, majú kritický význam pre imunitný systém. Lymfocyty sa vytvárajú v týmuse, slezine a kostnej dreni (zrelé) a predstavujú asi 30 % z celkového počtu bielych krviniek prítomných v obehovom systéme ľudí (zrelých).

Existujú dve hlavné podskupiny lymfocytov: T bunky a B bunky. T bunky sú zodpovedné za imunitu sprostredkovanú bunkami, zatiaľ čo B bunky sú zodpovedné za tvorbu protilátok (humorálna imunita). Ale možno uvažovať o vzájomnej závislosti medzi T bunkami a B bunkami - pri typicky imunitnej odpovedi sa T bunky aktivujú pri väzbe receptorov T buniek na fragmenty antigénov, ktoré sa viažu na hlavné glykoproteíny histokompatibilného komplexu („MHC“) na povrchu bunky poskytujúcej antigén. Táto aktivácia spôsobuje uvoľňovanie biologických mediátorov („interleukínov“), ktoré v podstate stimulujú B bunky k ich diferenciácii a poskytujú protilátku („imunoglobulíny“) oproti tomuto antigénu.

Každá B bunka v organizme hostiteľa exprimuje na svojom povrchu inú protilátku, takže jedna B bunka bude exprimovať protilátku špecifickú pre jeden antigén, zatiaľ čo ďalšia B bunka bude exprimovať protilátku špecifickú pre iný antigén. V súlade s tým sú B bunky úplne rozmanité a táto rozmanitosť je pre imunitný systém zásadná. U ľudí môže každá B bunka tvoriť mimoriadne vysoký počet molekúl protilátok (to je asi 10⁷ až 10⁸). Táto tvorba protilátok väčšinou vymizne (alebo podstatne poklesne), keď sa cudzí antigén zničí. Prípadne však môže proliferácia danej B bunky pokračovať bez obmedzenia a táto proliferácia môže viesť ku karcinómu, ktorý sa nazýva „B bunkový lymfóm“.

T bunky a B bunky obsahujú proteíny bunkového povrchu, ktoré možno použiť ako „markery“ na diferenciáciu a identifikáciu. Jedným takým B bunkovým markerom je ľudský diferenciačný antigén Bp35, obmedzujúci sa na B lymfocyty, uvádzaný ako „CD20“. CD20 sa exprimuje v priebehu skorého pre-B bunkového rozvoja a pretrváva do diferenciácie plazmatických buniek. Molekula CD20 môže špecificky regulovať krok aktivačného procesu, ktorý sa požaduje na začatie bunkového cyklu a diferenciácia sa zvyčajne exprimuje pri veľmi vysokých hladinách neoplastických („tumorových“) buniek. CD20 je podľa definície prítomný na „normálnych“ B bunkách i „malígnych“ B bunkách, to jest na tých B bunkách, ktorých neobmedzená proliferácia môže viesť k B bunkovému lymfómu. Preto môže povrchový antigén CD20 slúžiť ako kandidát pre „cielený zásah“ B bunkových lymfómov.

V podstate možno takéto cielené pôsobenie všeobecne opísať nasledujúcim spôsobom: protilátky špecifické pre povrchový antigén B buniek CD20 sa napríklad podajú pacientovi injekčné. Tieto protilátky proti CD20 sa špecificky viažu na antigén bunkového povrchu CD20 normálnych a malígnych B buniek. Protilátka proti CD20 viazaná na povrchový antigén CD20 môže spôsobiť zničenie a vyčerpanie neoplastických B buniek. Navyše sa chemické prostriedky alebo rádioaktívne značky majúce možnosť zničiť tumor môžu pripájať k protilátke proti CD20, takže tento prostriedok sa špecificky „dodáva“ napríklad k neoplastickým B bunkám. Bez ohľadu na spôsob uskutočnenia je primárnym cieľom zničiť tumor. Tento špecifický spôsob sa môže určovať konkrétnou protilátkou proti CD20, ktorá sa použije, takže sa rôzne spôsoby cieleného zásahu antigénov CD20 môžu v širokom rozmedzí meniť.

Uvádzajú sa napríklad spôsoby cieleného zásahu povrchového antigénu CD20. Myšia monoklonálna protilátka 1F5 (protilátka proti CD20) sa podáva v nepretržitej intravenóznej infúzii pacientom s B bunkovým lymfómom. Údajne sa potrebujú mimoriadne vysoké hladiny (>2 g) 1F5 na vyčerpanie tumorových buniek v obehu a výsledky sa opisujú ako „prechodné“. Press a kol., „Monoclonal Antibody 1F5 (Anti-CD20) Serotherapy of Human B-Cell Lymphomas“, Blood 69/2, 584-591 (1987).

Možným problémom pri tomto spôsobe je skutočnosť, že iné ako ľudské monoklonálne protilátky (napríklad myšie monoklonálne protilátky) zvyčajne nemajú ľudské efektorové funkčné skupiny, to jest nedokážu

SK 288096 Β6 okrem iného sprostredkovať komplement-dependentný rozklad alebo rozkladať ľudské cieľové bunky prostredníctvom bunkovej toxicity alebo Fc-receptorom sprostredkované fagocytózy dependentné na protilátke. Ďalej môže človek ako hostiteľ rozpoznávať monoklonálne protilátky iného ako ľudského pôvodu ako cudzorodú bielkovinu. Preto môžu opakované injekcie takýchto cudzorodých protilátok spôsobovať vyvolanie imunitných odpovedí, ktoré vedú ku škodlivým reakciám z precitlivenosti. To sa v prípade myších monoklonálnych protilátok často opisuje ako odpoveď „Human Anti-Mouse Antibody“ (Ľudské protimyšie protilátky) alebo odpoveď „HAMA“. Navyše sa môžu tieto „cudzorodé“ protilátky atakovať imunitným systémom príjemcu, takže sa v podstate zničia pred dosiahnutím cieľového miesta.

Lymfocyty a bunky lymfómu sú vo svojej podstate citlivé na rádioterapiu. Preto sú B bunkové malignity atraktívnym cieľom pre rádioimunoterapiu (RIT) z niekoľkých dôvodov. Lokálna emisia ionizujúceho žiarenia protilátok značených rádionuklidmi môže usmrcovať bunky s cieľovým antigénom (napríklad CD20) alebo bez tohto antigénu v telesnej blízkosti protilátky viazanej na antigén. Tým sa môže vyriešiť problém obmedzeného prístupu prenikajúceho žiarenia beta k protilátke v objemných alebo polyvaskularizovaných tumoroch a môže sa znížiť celkové množstvo požadovanej protilátky. Rádionuklid emituje častice jadrového žiarenia, ktoré môžu poškodiť bunkovú deoxyribonukleovú kyselinu do tej miery, že bunkové reparačné mechanizmy už nie sú schopné umožniť ďalší život bunky. Preto, ak sú cieľovými bunkami tumory, môžu látky značené rádionuklidom výhodne usmrcovať tumorové bunky. Protilátky značené rádionuklidmi zahrnujú podľa definície použitie rádioaktívnej látky, pri ktorom sa môžu požadovať opatrenia pre pacienta (napríklad možnosť transplantácie kostnej drene) rovnako tak ako pre poskytovateľov zdravotnej starostlivosti (to je nutnosť vysokej miery opatrnosti pri práci s rádioaktívnymi látkami).

Preto jeden spôsob zlepšenia schopnosti myších monoklonálnych protilátok pri uplatnení liečby B-bunkových porúch spočíva v pripojení rádioaktívnej značky k protilátke takým spôsobom, že sa značka alebo toxín lokalizuje v mieste tumoru. Toxíny (napríklad chemoterapeutické prostriedky, ako je doxorubicín alebo mytomycín C) možno taktiež konjugovať s týmito protilátkami. Pozri napríklad prihlášku zverejnenú PTC WO 92/07466 (vydanú 14. mája 1992).

„Chimerické“ protilátky, to jest protilátky, ktoré obsahujú súčasti od dvoch alebo viacerých rôznych druhov (napríklad myš a človek) sa vyvíjajú ako alternatíva „konjugovaných“ protilátok. Myšie/ľudské chimerické protilátky, ktoré sa pripravujú, majú väzbové charakteristiky materskej myšej protilátky a efektorové funkcie zodpovedajú ľudskej konštantnej oblasti. Pozri napríklad Cabilly a kol., US patent č. 4 816 567, Shoemaker a kol., US patent č. 4 978 745, Beavers a kol., US patent č. 4 975 369 a Boss a kol., US patent č. 4 816 397, ktoré sa tu všetky zahrnujú formou odkazu. Všeobecne sa tieto chimerické protilátky tvoria prípravou genómovej génovej knižnice z deoxyribonukleovej kyseliny extrahovanej z vopred existujúcich myších hybridómov. Nishimura a kol., Cancer Research, 47, 999 (1987). Táto knižnica sa potom podrobí skríningu ohľadom génov variabilnej oblasti od ťažkých aj ľahkých reťazcov majúcich správne typy nového usporiadania fragmentu protilátky. Klonované gény variabilnej oblasti sa potom spájajú do vektora expresie obsahujúceho klonované kazety príslušného ľudského génu konštantnej oblasti s ťažkým alebo ľahkým reťazcom. Chimerické gény sa potom exprimujú vo zvolenej bunkovej línii, zvyčajne v línii myšieho myelómu.

Napríklad A. Y. Liu a kol., „Production of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent Biológie Activity“, J. Immun., 139/10, 3521-3526 (1987) opisuje myšiu/ľudskú chimerickú protilátku cielenú na antigén CD20. Pozri tiež publikáciu PCT č. WO 88/04936. Neposkytuje sa však žiadna informácia, pokiaľ ide o schopnosť, účinnosť alebo praktickú použiteľnosť chimerických protilátok podľa Liu pri liečení B-bunkových porúch.

Zaznamenáva sa, že funkčné analýzy in vitro (napríklad komplement- dependentná cytolýza („CDC“), bunková cytotoxicita závislá od protilátky („ADCC“) atď.) nemôžu samy osebe poskytnúť predpoveď schopnosti in vivo akejkoľvek protilátky ničiť alebo vyčerpávať cieľové bunky exprimujúce špecifický antigén. Pozri napríklad R. D. Robinson a kol., „Chimeric mouse-human anti-carcinoma antibodies that mediate different antitumor celí biological activities“, Hum. Antibod. Hybridas, 2, 84-93 (1991) (chimerická myšia-ľudská protilátka, ktorá nemá detekovateľnú aktivitu ADCC). Preto možno možnosť terapeutickej účinnosti protilátok hodnotiť len experimentmi in vivo.

Na tento účel súčasnej prihlášky 08/475 813, 08/475 815 a 08/478 967, ktoré sa tu zahrnujú formou odkazu v plnom znení, opisujú konjugáty proti CD20 značené rádionuklidmi pre diagnostické „zobrazovanie“ B-bunkových tumorov pred podaním terapeutickej protilátky. Konjugát „In2B8“ zahrnuje myšiu monoklonálnu protilátku 2B8 špecifickú pre ľudský antigén CD20, ktorá sa pripája k rádionuklidu ^1HIn bifunkčným chelatačným prostriedkom, to jest MX-DTPA (kyselina dietyléntriamínpentaoctová), ktorá obsahuje zmes 1 : 1 l-izotiokyanatobenzyl-3-metyl-DTPA a 1-metyl-3-izotiokyanatobenzyl-DTPA. ^H1In sa volí ako diagnostický rádionuklid, pretože je žiaričom gama, ktorého použitie na zobrazovacie účely je najbežnejšie.

Patenty, ktoré sa týkajú chelatačných prostriedkov a konjugátov chelatačných prostriedkov, sú v odbore známe. Napríklad US patent č. 4 831 175 Gansowa sa zameriava na polysubstituované cheláty kyseliny dietyléntriamínpentaoctovej a proteínové konjugáty, ktoré ich obsahujú a na spôsoby ich prípravy. US patenty č. 5 099 069, 5 246 692, 5 286 850 a 5 124 471 Gansowa sa tiež týkajú polysubstituovaných chelátov DTPA.

Tieto patenty sa tu zahrnujú v plnom znení.

Špecifický bifunkčný chelatačný prostriedok použitý na uľahčenie chelatácie v prihláškach 08/475 813, 08/475 815 a 08/478 967 sa zvolí z toho dôvodu, že má vysokú afinitu k trojmocným kovom a poskytuje zvýšené pomery medzi tumorovými a netumorovými bunkami, znížené vychytávanie v kostiach a zvýšenú retenciu rádionuklidu v cieľových miestach in vivo, to je v miestach B-bunkového lymfómu. Sú však v odbore známe aj ďalšie bifunkčné chelatačné prostriedky a môžu byť tiež prospešné pri terapii tumorov.

V prihláškach 08/475 813, 08/475 815 a 08/478 967 sa tiež opisujú terapeutické protilátky značené rádionuklidmi na cieľový zásah a deštrukciu B-bunkových lymfómov a tumorových buniek. Konkrétne konjugát Y2B8 zahrnuje rovnakú myšiu monoklonálnu protilátku proti ľudskému CD20, 2B8, pripojenú k rádionuklidu ⁹⁰Y prostredníctvom toho istého bifúnkčného chelatačného prostriedku. Tento rádionuklid sa zvolí na terapeutické použitie z niekoľkých dôvodov. Polčas 64 h rádionuklidu ⁹⁰Y je dostatočne dlhý, aby umožnil akumuláciu v tumore a na rozdiel od rádionuklidu ¹³ *1 je čistým žiaričom beta s vysokou energiou bez sprievodného žiarenia gama, s dosahom 100 až 1 000 priemerov bunky. Minimálne množstvo penetrujúceho žiarenia umožňuje podanie protilátok značených rádionuklidom ⁹⁰Y ambulantným pacientom. Ďalej sa nepožaduje intemalizácia značených protilátok na usmrtenie bunky a lokálna emisia ionizujúceho žiarenia by mala byť smrteľná pre okolité tumorové bunky, ktoré neobsahujú cieľový antigén.

Keďže rádionuklid ⁹⁰Y je pripojený k protilátke 2B8 prostredníctvom tej istej bifúnkčnej chelatačnej molekuly MX-DTPA, má konjugát Y2B8 rovnaké výhody, ktoré sa opisujú skôr, to jest zvýšenú retenciu rádionuklidu v mieste cieľa (tumoru). Ale na rozdiel od ^1HIn sa tento rádionuklid nemôže použiť s cieľom zobrazovania vzhľadom na to, že nie je žiaričom gama. Preto možno použiť diagnostický „zobrazovací“ rádionuklid, ako je ^1HIn na stanovenie lokalizácie a relatívneho rozmeru tumoru pred a/alebo po podaní terapeutických chimerických protilátok značených ⁹⁰Y na účely redukcie tumorov. Navyše umožňuje protilátka značená indiom dozimetrické vyhodnotenie.

V závislosti od zamýšľaného použitia protilátky, to jest ako diagnostického alebo terapeutického prostriedku, sú použiteľné ďalšie rádioaktívne nuklidy známe v odbore na podobné účely. Rádionuklidy použité v klinickej diagnóze zahrnujú napríklad ^l31I, ¹²⁵I, ¹²³1, ⁹⁹Tc, ⁶⁷Ga rovnako tak ako ^1HIn. Protilátky sa tiež značia radom rádionuklidov na možnosť použitia v cielenej imunoterapii (Peirersz a kol., „The use of monoclonal antibody conjugates for the diagnosis and treatment of cancer“, Immunol. Celí Biol., 65, 111-125 (1987)). Tieto rádionuklidy zahrnujú ¹⁸⁸Re a ¹⁸⁶Re rovnako tak ako ⁹⁹Y a v menšej miere ¹⁹⁹Au a ⁶⁷Cu. ¹³¹I sa používa na terapeutické účely. US patent č. 5 460 785 poskytuje zoznam týchto rádionuklidov, ktorý sa tu zahrnuje formou odkazu.

Ako sa uvádza v súčasných patentových prihláškach 08/475 813, 08/475 815 a 08/478 967, vedie podávanie konjugátu Y2B8 značeného rádionuklidom, rovnako tak ako neznačené chimerické protilátky proti CD20, k významnej redukcii tumoru pri myšiach s B-bunkovým lymfoblastickým tumorom. Navyše sa uvádzajú klinické štúdie na ľuďoch, ktoré vykazujú významné vyčerpanie B buniek u pacientov s lymfómom, ktorí dostávajú infuziu chimerickej protilátky proti CD20. 2B8 sa nedávno stala prvou monoklonálnou protilátkou proti rakovine schválenou FDA pod názvom Rituxan^R. Preto aspoň jedna chimerická protilátka proti CD20 má preukázanú terapeutickú účinnosť pri liečení B-bunkového lymfómu.

Ďalej US patentová prihláška s poradovým č. 08/475 813, ktorá sa tu zahrnuje formou odkazu, uverejňuje postupné podávanie Rituxanu^R, chimerické protilátky proti CD20, s myšou monoklonálnou protilátkou značenou buď rádionuklidom ytria, alebo rádionuklidom india. Aj keď sú protilátky značené rádionuklidmi použité pri týchto kombinovaných terapiách myšími protilátkami, vyčerpá počiatočné liečenie chimerickou protilátkou proti CD20 dostatočným spôsobom populáciu B-buniek, takže sa zníži odpoveď HAMA, čím sa uľahčí kombinovaný terapeutický a diagnostický spôsob.

Preto môžu v súvislosti s kombinovanou imunoterapiou nachádzať myšie protilátky zvláštne použitie ako diagnostické prostriedky. Ďalej sa ukazuje v US patentovej prihláške 08/475 813, že terapeuticky účinné dávky protilátky proti CD20 značené ytriom po podaní Rituxanu^R sú dostatočné (a) na vyčistenie periférnej krvi od zvyšných B-buniek, ktoré sa neodstránia chimerickou protilátkou proti CD20, (b) na vyčerpanie B-buniek z lymfatických uzlín alebo (c) na začatie odstraňovania B-buniek z ďalších tkanív.

Pripojenie rádioaktívnych značiek na nádorové terapeutické protilátky teda poskytuje cenný klinický prostriedok, ktorý je použiteľný na vyhodnotenie možnej terapeutickej účinnosti týchto protilátok, vytvorenie diagnostických prostriedkov na monitorovanie progresie liečby a návrh ďalších terapeutických prostriedkov, ktoré možno použiť na zvýšenie počiatočnej možnosti chimerickej protilátky pri usmrtení tumoru. Pri preukázanej účinnosti určitej protilátky proti CD20 pri liečení nehodgkinského lymfómu a známej citlivosti lymfocytov na rádioaktivitu by bolo vysoko výhodné získať terapeutické protilátky v komerčne dostupnej súprave, v ktorej by sa ľahko modifikovali rádioaktívnou značkou a podávali priamo pacientovi v klinickom usporiadaní.

Aj keď existuje mnoho spôsobov a prostriedkov na značenie protilátok rádionuklidmi, chýba vhodné vehikulum na použitie týchto prostriedkov v klinickom prostredí spôsobom, ktorý by umožnil ľahko prípravu a podanie pacientovi pred podstatným rozpadom rádionuklidu alebo podstatnou deštrukciou protilátky rádioak4 tívnym žiarením. Nedostatok takýchto vhodných prostriedkov na komerčné uplatnenie tejto užitočnej technológie môže vyplývať zo zlej účinnosti inkorporácie preukázanej pri niektorých známych spôsoboch značenia a následnej nutnosti purifikovať prostriedok na stĺpci po uskutočnení spôsobov značenia rádionuklidom. Oneskorenie vývoja týchto súprav môže tiež čiastočne vyplývať zo skoršieho nedostatku prístupnosti k čistým, komerčne dostupným rádionuklidom použiteľných na účinnú prípravu značených prípravkov bez ďalšej purifikácie. Alternatívne môže všeobecná nedostupnosť takých súprav vyplývať z nedostatku protilátok, ktoré by mohli dosahovať schválenie alebo účinnosť ako Rituxan^R pri liečení lymfómu u ľudí.

Ako sa napríklad diskutuje v US patente č. 4 636 380, ktorý sa tu zahrnuje formou odkazu, vo vedeckých kurzoch sa všeobecne uvažuje, že ak má niektoré rádiofarmakum dosiahnuť klinické použitie, musí sa podrobiť dlhému a ťažkému spôsobu separácie a purifikácie. Injekčné podanie nenaviazanej rádioaktívnej značky pacientovi by skutočne bolo nežiaduce. Potreba ďalších purifikačných krokov znamená nemožnosť spôsobu značenia protilátok rádioaktívnymi nuklidmi v klinickom prostredí, najmä pre lekárov, ktorí nemajú ani zariadenie ani čas na purifikáciu svojich vlastných terapeutických prostriedkov.

Navyše môžu byť proteíny značené rádionuklidmi samy osebe nestabilné, najmä tie, ktoré sú značené rádiolytickými rádionuklidmi, ako je ⁹⁰Y, ktoré poškodzujú protilátku tým viac, čím dlhšie sú pripojené v jej tesnej blízkosti. Ďalej táto rádiolýza spôsobuje nespoľahlivú účinnosť terapeutického prostriedku následkom straty rádioaktívnej značky a/alebo zníženej väzby na cieľový antigén a môže spôsobovať imunitné odpovede na denaturovaný proteín. Bez zariadenia na značenie a purifikáciu protilátok v mieste použitia nemajú klinici žiadnu inú možnosť voľby, ako objednať už značené terapeutické protilátky alebo ich značiť okrem miesta použitia v príslušnom zariadení a transportovať na podanie pacientovi. Všetky tieto manipulácie a časové obdobie medzi značením a podaním prispievajú k nestabilite terapeutického prostriedku a znižujú použiteľnosť súprav značených rádionuklidmi v klinickom prostredí.

Iní sa neúspešne snažili vyvinúť súpravy na značenie protilátok rádionuklidmi, ktoré by boli dostatočne dokonalé tak, aby sa predišlo zvláštnemu purifikačnému kroku. Cytogén napríklad nedávno poskytol komerčnú súpravu na značenie myšej monoklonálnej protilátky rádionuklidmi zameranej na glykoproteín TAG-72 súvisiacej s tumorom. Ale protilátka Cytogén je najmä nevhodná na formuláciu súpravy vzhľadom na vznik častíc v priebehu skladovania, ktoré sa musia ďalej odstraňovať ďalším filtračným krokom. Navyše protilátka cytogén spôsobuje nepriaznivé reakcie u pacientov následkom odpovedí HAMA.

Ďalší autori uvádzajú vývoj spôsobu značenia rádionuklidmi na použitie v súpravách, v ktorých nie je nevyhnutný ďalší purifikačný krok (Richardson a kol., „Optimization and batch production of DTPA-labeled antibody kits for routine use in ⁿⁱIn immunoscintography“, Nuc. Med. Commun., 8, 347-356 (1987), Chinol a Hnatowich, „Generator-produced yttrium-90 for rádioimmunotherapy“, J. Nucl. Med., 28(9), 1465-1470 (1987)). Tieto spôsoby však nie sú schopné dosiahnuť hladinu inkorporácie, ktoré dosahujú pôvodcovia tohto vynálezu s použitím spôsobov, ktoré sa tu opisujú, pri ktorých je účinnosť inkorporácie aspoň 95 %. Takáto hladina inkorporácie poskytuje ďalšiu výhodu zvýšenej bezpečnosti tým, že sa pacientovi nepodáva v injekcii žiadna neviazaná značka, ktorej prítomnosť by bola dôsledkom nízkej rádioinkorporácie.

K predmetnej problematike sa vzťahuje tiež rad ďalších článkov, z ktorých sa predovšetkým uvádza: J. K. Leland a M. J, J.Powell, Electrochem. Soc., 137, 3127 (1990); R. J. Muller, Immunological Methods, 34. 345 (1980); S. Mirzadeh, M. W. Brechbiel, R. W. Atcher a O. A. Gansow, Bioconjugate Chemistry, 1 (1), 59 (1990); a M. W. Brechbiel, O. A. Gansow, R. W. Atchr, J. Sclom, J. Esteban, D. E. Simpson a D. Colcher, 25, 2772 (1986), pričom každá z citácií sa tu zahŕňa formou odkazu.

Spôsoby použité v súpravách podľa tohto vynálezu umožňujú rýchle značenie, ktoré sa môže uplatniť zhruba v priebehu pol hodiny alebo iba 5 min. v závislosti od značky. Navyše spôsoby značenia podľa tohto vynálezu majú účinnosť značenia prevyšujúcu 95 %, čím sa predchádza nutnosti ďalšej purifikácie. Predídením nutnosti ďalšej purifikácie sa polčas rozpadu použitého rádionuklidu a integrita protilátky zachováva na terapeutické použitie, na ktoré bola táto protilátka značená.

Táto patentová prihláška opisuje vhodné súpravy a spôsoby, v ktorých možno diagnostické a terapeutické protilátky značiť rádionuklidom a podávať pacientovi reprodukovateľným spoľahlivým a vhodným spôsobom. Súpravy podľa tohto vynálezu prevádzajú spôsob značenia protilátok rádionuklidmi na prevedenie bez obáv a ťažkostí, ktoré značne uľahčuje spôsoby liečenia pacienta. Tieto súpravy poskytujú výhody oproti skoršiemu stavu v tom smere, že sa používajú stanovené optimálne parametre na značenie a podávanie terapeutických alebo diagnostických prostriedkov, čím sa znižujú náklady na tovar. Keďže súpravy, ktoré sa tu opisujú, poskytujú optimálne parametre podľa konkrétnej značky, použitie súpravy určenej na konkrétnu značku tiež minimalizuje kanibalizáciu, ktorá nastáva pri použití nevhodnej súpravy pre konkrétnu značku. Predchádzanie kanibalizácii ďalej poskytuje optimálnu účinnosť značenia. Ďalej spôsoby vyhotovenia a sterilné nepyrogénne zložky obsiahnuté v každej súprave zaisťujú lepšie použiteľný spôsob pre užívateľov, lebo predchádzajú sterilizácii, testovaniu na pyrogény a purifikácii po značení prostriedkov.

Podstata vynálezu

Predmetom tohto vynálezu je spôsob rádioaktívneho značenia protilátky konjugovanej s chelatotvomým prostriedkom s ^1HIn na použitie na podávanie pacientovi, ktorého podstata spočíva v tom, že zahrnuje:

(i) zmiešanie protilátky konjugovanej s bifúnkčným chelatotvomým prostriedkom s roztokom obsahujúcim ^1HIn za vytvorenia zmesi, (ii) inkubáciu zmesi pri vhodnej teplote počas asi 30 minút, na produkciu protilátky značenej rádionuklidom, kde táto protilátka značená rádionuklidom má inkorporáciu rádionuklidu väčšiu ako 95 % tak, že môže byť podávaná priamo pacientovi bez ďalšej purifikácie od neinkorporovaného ^1HIn, a (iii) zriedenie protilátky označenej rádionuklidom vo formulačnom pufri na príslušnú koncentráciu vhodnú na podávanie pacientovi.

Predmetom tohto vynálezu je tiež testovanie viazania na stanovenie percenta väzby protilátky značenej rádionuklidom s jej cieľovou bunkou, ktorého podstata spočíva v tom, že zahrnuje:

(i) značenie protilátky rádionuklidom podľa spôsobu opísaného skôr na produkciu protilátky značenej rádionuklidom, (ii) zmiešanie a inkubáciu aspoň jedného alikvotného podielu protilátky značenej rádionuklidom aspoň s jedným alikvotným podielom antigén-pozitívnych buniek, (iii) zmiešanie a inkubáciu aspoň jedného alikvotného podielu protilátky značenej rádionuklidom identického s alikvotným podielom v kroku (ii) aspoň s jedným alikvotným podielom zrieďovacieho pufra toho istého objemu ako je alikvotný podiel antigén-pozitívnych buniek v kroku (ii) ako kontrolou, (iv) peletovanie buniek centrifúgáciou, (v) meranie rádioaktivity v supematante peletovaných buniek a kontroly, a (vi) porovnanie rozsahu aktivity rádionuklidu v supematante buniek s množstvom rádioaktivity v kontrole.

Ďalej sa uvádzajú podrobnejšie údaje na osvetlenie predmetu vynálezu. Okrem toho sú uvedené informácie, ktoré majú dokresliť predmetný vynález v celej jeho šírke, a taktiež údaje slúžiace na porovnanie.

Tento vynález preto umožňuje získať súpravy na značenie diagnostickej alebo terapeutickej protilátky rádionuklidmi pred podaním pacientovi, obsahujúcu aspoň (i) fľaštičku obsahujúcu protilátku konjugovanú s chelatačným prostriedkom, (ii) fľaštičku obsahujúcu formulačný pufer na stabilizáciu a podávanie protilátky značenej rádionuklidom a (iii) inštrukcie na značenie protilátky rádionuklidom, pri ktorom sa opisované zložky fľaštičiek dodávajú v takom množstve a v takej koncentrácii, že pri ich spojení s rádioaktívnou značkou s dostatočnou Čistotou a aktivitou podľa inštrukcií pre súpravu nie je nutná žiadna purifikácia značenej protilátky pred podaním pacientovi. Navyše pri značení podľa inštrukcií pre súpravu a s použitím rádionuklidu s dostatočnou čistotou a aktivitou môže inkorporácia rádionuklidu dosiahnuť hladín vyšších ako 95 % a dokonca až 98 % alebo vyšších.

Protilátka obsiahnutá v súprave je najlepšie protilátkou proti CD20. Táto protilátka sa dodáva vo forme, v ktorej je pripojená na bifúnkčný chelatačný prostriedok. Prednostne je táto protilátka pripojená na MX-DTPA, ale možno použiť iné chelatačné prostriedky, ako je fenyl- alebo benzyl-konjugovaná ĎTPA, cyklohexyl-DTPA, deriváty EDTA a DOTA. Chelatačný prostriedok podľa tohto vynálezu môže byť akýkoľvek chelatačný prostriedok, ktorý je aspoň bifúnkčný, to jest ktorý má aspoň dve väzbové miesta (aspoň jedno miesto na chelatáciu kovového iónu a aspoň jedno miesto na pripojenie k proteínovému ligandu).

V závislosti od použitej protilátky sa konjugovaná protilátka zvyčajne dodáva s koncentráciou 0,5 až 30 mg/ml, prednostne 2 mg/ml. Objem konjugovanej protilátky závisí od koncentrácie a množstva požadovaného na optimálne značenie v závislosti od danej rádioaktívnej značky. Ale konjugovanú protilátku je treba dodávať v takom objeme a koncentrácii, aby sa celý objem dodal do reakčnej fľaštičky s použitím sterilnej injekčnej striekačky a aseptického spôsobu. To umožní zvýšenú reprodukovateľnosť a ľahkosť použitia. Všetky chemické prostriedky a súpravy, ktoré sa tu opisujú, sú sterilné a bez pyrogénov a sú špecificky navrhnuté pre ľahký a rýchly prechod od testovania protilátky k podaniu. Pre niektoré značky nie je nutné testovať účinnosť značenia.

Predovšetkým výhodnou zložkou súpravy je pufer na stabilizáciu oproti účinkom radiolýzy a na podanie konjugovanej protilátky značenej rádionuklidom pacientovi. Tento formulačný pufer je farmaceutický prijateľnou nosnou látkou, ktorá slúži ako zrieďovací prostriedok pre značenú protilátku a ako pufer na podanie. I keď možno na podanie terapeutických alebo diagnostických protilátok pacientovi použiť akýkoľvek farmaceutický prijateľný zrieďovací prostriedok, je formulačný pufer podľa tohto vynálezu najmä vhodný na podanie protilátok značených rádionuklidmi.

Pufer pre formuláciu podľa tohto vynálezu obsahuje rádioprotektívny prostriedok, ako je ľudský sérumalbumín (HSA) alebo askorbát, ktorý minimalizuje radiolýzu spôsobenú ytriom a v menšej miere indiom. V odbore sú známe ďalšie rádioprotektívne prostriedky a mohli by sa tiež použiť v pufri na formuláciu podľa tohto vynálezu, to sú látky zachytávajúce voľné radikály (fenol, sulfity, glutatión, cysteín, kyselina gentizová, kyselina nikotínová, askorbyl-palmitát, HOP(:O)H₂, glycerol, nátrium-formaldehydsulfoxylát, pyrosiričitan sodný, tiosíran sodný, oxid siričitý atď.).

Je treba poznamenať, že zatiaľ čo rádioprotektívne látky všeobecne vo formulačnom pufri na ochranu protilátky proti rádiolýze, možno tiež uplatniť ďalšiu ochranu použitím rádioprotektívneho prostriedku v reakčnom pufri. To sa skôr všeobecne neuskutočňovalo s HSA (ľudským sérumalbumínom) vzhľadom na prítomnosť kovov, ktoré by interferovali so spôsobom značenia. Ale ľudský sérumalbumín možno „vyčistiť“ s použitím chelatotvomej živice, ktorú možno tiež pridať do reakčného pufra. Askorbát a ďalšie rádioprotektívne prostriedky sa tiež môžu spracovať na odstránenie kontaminujúcich kovov.

Formulačný pufer podľa tohto vynálezu tiež obsahuje zvyšok nekonjugovaného chelatotvomého prostriedku. Účelom pridania nekonjugovaného chelatotvomého prostriedku je, aby tento prostriedok slúžil na vychytanie akejkoľvek neproteínovej rádioaktívnej značky v organizme pacienta a aby umožnil vylučovanie rádioaktívnej značky znižovaním vychytávania osteotropných rádionuklidov, to je ⁹⁰Y v kostiach pacienta. Pokiaľ sa napríklad protilátka v súprave konjuguje s chelatotvomým prostriedkom DTP A, možno do formulačného pufra zahrnúť zvyšok DTPA alebo akéhokoľvek ďalšieho chelatotvomého prostriedku. Formulačný pufer sa tiež prednostne dodáva v takom objeme, aby sa celkový obsah previedol do reakčnej fľaštičky. Ako sa diskutuje skôr, vedie to k uľahčeniu použitia a reprodukovateľnosti, lebo nie je treba merať a prevádzať presné objemy.

Preferovaný formulačný pufer zahrnuje fosfátom pufrovaný alebo fyziologický roztok, ľudský sérumalbumín a DTPA. Ľudský sérumalbumín je prednostne v koncentráciách zhruba medzi 1 a 25 % (hmotnosť/objem) a lepšie v koncentráciách zhruba 7,5 % (hmotnosť/objem). Koncentrácia DTPA je prednostne okolo 1 mM. Askorbát možno použiť ako alternatívu ľudského sérumalbumínu a zvyčajne sa používa pri koncentráciách zhruba 1 až 100 mg/ml, aj keď možno použiť širšie rozmedzie koncentrácií bez ohrozenia bezpečnosti pacienta.

Protilátka súpravy na značenie rádionuklidu sa ľahko značí zvoleným rádionuklidom prostredníctvom bifunkčného chelatotvomého činidla podľa spôsobov tohto vynálezu. V tomto smere môže pre jednoduchosť súprava podľa tohto vynálezu tiež zahrnovať fľaštičku obsahujúcu pufer na úpravu pH roztoku rádionuklidu a sterilnú sklenenú reakčnú nádobku na vyhotovenie značenia a následne na resuspendovanie konečnej protilátky značenej rádionuklidom vo formulačnom pufri. Obyčajne postačí reakčná fľaštička 10 ml, ale možno tiež použiť fľaštičky s obsahom 5 až 20 ml. Pufrom je prednostne roztok octanu sodného s nízkym obsahom kovov pri koncentrácii 10 až 1 000 mM, najlepšie 50 mM.

Konkrétna súprava podľa tohto vynálezu zahrnuje protilátku konjugovanú s MX-DTPA, 2B8-MX-DTPA. 2B8 je protilátka proti CD20, ktorá spôsobuje vyčerpanie T buniek pri podaní pacientom s lymfómom. Ale tým, ktorí majú skúsenosť v odbore, by malo byť zrejmé, že súpravu na značenie rádionuklidom podľa tohto vynálezu možno optimalizovať na značenie iných protilátok proti CD20 alebo akékoľvek iné protilátky, ktoré boli konjugované s DTPA alebo polyvalentným chelatotvomým prostriedkom. Preferovaná súprava podľa tohto vynálezu môže zahrnovať aspoň (i) fľaštičku obsahujúcu protilátku 2B8 konjugovanú s MX-DTPA, buď v roztoku, alebo lyofilizovanú (vyžadujúcu prevedenie do roztoku) a (ii) fľaštičku obsahujúcu formulačný pufer na podanie protilátky značenej rádionuklidom pacientovi. Preferovaná súprava bude tiež obsahovať (iii) pufer na úpravu pH roztoku rádionuklidu a (iv) reakčnú fľaštičku.

Alternatívne a ešte lepšie sa pufer dodáva v reakčnej fľaštičke, čím sa eliminujú kroky odmeriavania a prenášania pufra a zvyšuje sa jednoduchosť, konzistencia a sterilita zložiek súpravy. Uvažuje sa však aj o ďalších vyhotoveniach, pri ktorých sa pufer pridáva najskôr do fľaštičky s rádionuklidom, a potom sa pufrovaný roztok rádionuklidu prenáša do reakčnej fľaštičky. V tomto prípade sa reakčná fľaštička dodáva s požadovaným objemom protilátky. Alternatívne môže byť fľaštička s rádionuklidom/pufrom dostatočne veľká tak, aby pojala prídavok konjugátu protilátky, to jest priamo do fľaštičky dodávateľa. To by eliminovalo nutnosť reakčnej fľaštičky.

Ako sa opisuje skôr, zahrnuje sa ďalšia preferovaná konfigurácia súpravy, pri ktorej reakčná fľaštička samotná obsahuje požadovaný objem konjugovanej protilátky (to jest 1 alebo 1,5 ml pre rádionuklidy ^Ulln respektíve ⁹⁰Y). Protilátku možno dodávať v pufri, ktorý poskytuje príslušné pH na značenie rádionuklidom podľa špecificky požadovaného rádionuklidu (to jest pH 3 až 6 pre ^H1In, pH 3 až 5 pre Y). Možno použiť rôzne pufre v závislosti od rádionuklidu (to jest octan sodný pre ⁹⁰Y, citrát sodný pre ^1HIn). pH a zloženie pufra sa môže tiež meniť v závislosti od povahy väzbového ligandu, ktorý sa má značiť (to jest značenie peptidov sa môže uskutočňovať pri pH < 3). Potom by sa v podstate rádionuklid prenášal priamo do reakčnej nádobky namiesto formulačného pufra. Obmedzené použitie súpravy na dva kroky prenosu by ďalej zvýšilo reprodukovatefnosť a jednoduchosť a ďalej by znížilo možnosť kontaminácie sterility v priebehu zachádzania so zložkami súpravy.

Súpravy na značenie rádionuklidu podľa tohto vynálezu môžu ďalej obsahovať fľaštičku s rádionuklidom alebo možno rádionuklid objednať oddelene od príslušného dodávateľa. Preferovanými rádionuklidmi podľa tohto vynálezu sú ^1Hln vo forme chloridu a ⁹⁰Y vo forme chloridu v kyseline chlorovodíkovej, aj keď sa opisované spôsoby neobmedzujú len na tieto rádionuklidy. Ďalšie rádionuklidy, ktoré sa používajú v zobrazovacích aplikáciách, sú známe v odbore a opisujú sa v US patentoch č. 4 634 586, 5 460 785 a 5 766 571, ktoré sa tu zahrnujú formou odkazu. ^luIn je najmä výhodným rádionuklidom na zobrazovanie B-bunkových tumorov a žiariče beta, ako je ⁹⁰Y, sú najmä užitočné pre rádioterapeutické prostriedky. Možno však použiť aj ďalšie rádionuklidy vhodné na tieto alebo ďalšie účely, to jest žiariče alfa, v závislosti od chelatačného prostriedku na konjugáciu protilátky.

S vyskúšanou účinnosťou kombinovaných terapeutických protokolov opísaných v US prihláške poradové č. 08/475 813 bude ďalšie vyhotovenie súpravy zahrnovať oddelenú fľaštičku s chimerickou protilátkou, to jest Rituxan^R na podanie pred alebo po značenej protilátke proti CD20. Pri podaní chimerickej protilátky pred protilátkou značenou rádionuklidom možno významne znížiť odpoveď HAMA, ktorá môže všeobecne nastávať po podaní myšej protilátky proti CD20, čím sa zvýši terapeutická použiteľnosť myších protilátok značených rádionuklidom. Ďalej pri použití chimerickej protilátky proti CD20 na odstránenie B buniek z krvného obehu sú následné diagnostické zobrazenia získané s protilátkami značenými rádionuklidom ^U1ln oveľa jasnejšie.

Malo by tiež byť zrejmé, že diagnostická protilátka značená rádionuklidom aj terapeutická protilátka značená rádionuklidom sú použiteľné spoločne v kombinovanom terapeutickom protokole. Z tohto hľadiska možno použiť diagnostickú protilátku buď pred, alebo po terapeutickej protilátke na vizualizáciu veľkosti tumoru pred liečením a po liečení. V tomto prípade môže súbor podľa tohto vynálezu zahrnovať oddelenú prípadne farebne značenú fľaštičku s pufrom špecificky formulovaným podľa optimálnych požiadaviek na pH na značenie protilátok rádionuklidom pri použití konkrétnych rádionuklidov. Takýto systém by zaručoval použitie príslušného pufra pre každú značku a umožňoval by tiež klinikovi ľahké použitie značenia dvoch protilátok, ako je tomu pri zakúpení dvoch súprav. Takáto súprava v skutočnosti kombinuje dve zložky z dvoch súprav na značenie rádionuklidom do jednej súpravy.

Zložky na značenie súpravy rádionuklidom podľa tohto vynálezu sa dodávajú pri príslušných koncentráciách a pH takým spôsobom, že sa ľahko udržuje sterilita pred podaním protilátky a je tu málo požiadaviek na prídavné pufre alebo médiá. Ale tomu, kto má skúsenosť v odbore, by malo byť zrejmé, že možno rovnaké činidlá pripraviť, sterilizovať a testovať ohľadom sterility na pracovisku. Preto sa uvažuje o rôznych formách súpravy podľa tohto vynálezu v závislosti od rozpočtu a preferencií užívateľa.

Súprava na značenie rádionuklidom podľa tohto vynálezu sa môže použiť pri spôsobe značenia rádionuklidom protilátky konjugovanej s chelatotvorným prostriedkom na podávanie pacientovi. Podľa tohto vynálezu tento spôsob zahrnuje všeobecne (i) zmiešanie protilátky konjugovanej s chelatotvorným prostriedkom s roztokom obsahujúcim rádionuklid, (ii) inkubácia zmesi príslušne dlhý čas pri príslušnej teplote a (iii) zriedenie značenej protilátky na príslušnú koncentráciu vo formulačnom pufri tak, aby bolo možno podávať protilátku značenú rádionuklidom priamo pacientovi bez ďalšej purifikácie.

Najpreferovanejšou protilátkou je protilátka proti CD20 a najmä môže byť touto protilátkou proti CD20 protilátka 2B8. Túto protilátku možno konjugovať s akýmkoľvek vhodným chelatotvorným prostriedkom, to jest s MX-DTPA, CHX-DTPA, fenyl- alebo benzyl-DTPA, DOTA, deriváty EDTA atď., preferuje sa MX-DTPA. Spôsoby na uplatnenie konjugácie protilátky sú známe v odbore (Kozák a kol. (1989), Mirzadeh a kol. (1990), Brachbiel a kol. (1986)).

Pôvodcovia tohto vynálezu zisťujú, že spôsob značenia rádionuklidom protilátky konjugovanej s chelatotvomým prostriedkom je najľahšie uskutočniteľný, pokiaľ sa roztok obsahujúci rádioaktívnu značku upraví na pH zhruba medzi 3,0 a 6,0 ešte lepšie zhruba do 4,2, pred zmiešaním s protilátkou konjugovanou s chelatotvomým prostriedkom. Na úpravu pH sa najmä preferuje octan sodný s nízkym obsahom kovov, aj keď možno použiť aj iné pufre. Prednostne sa používa octan sodný pri koncentráciách medzi zhruba 10 a 1 000 mM a ešte lepšie 50 mM.

Keď je použitý rádionuklid ^H1In vo forme chloridu, je objem chloridu ^IHIn použitý na prípravu jednej dávky na podanie zvyčajne zhruba 203 MBq (5,5 mCi) delené koncentráciou rádioaktivity v čase značenia. Na podanie pacientovi je zvyčajná diagnostická dávka ^HIIn zhruba 74 až 370 MBq (2 až 10 mCi). Množstvo roztoku octanu sodného použitého na úpravu pH sa mení v závislosti od koncentrácie octanu sodného a zriedenia izotopického nosiča a môže byť preto veľmi široké. Pri koncentráciách octanu sodného 50 mM je množstvo požadované na úpravu pH zvyčajne 1,2-násobok objemu roztoku ^H1In vo forme chloridu, aj keď možno použiť i väčšie objemy. Je potrebné si uvedomiť, že pomer octanu sodného ku kyseline chlorovodíkovej je dôležitým faktorom a množstvá použitého roztoku octanu sodného sa menia v závislosti od množstva a koncentrácie kyseliny chlorovodíkovej v pufri. Potom sa zmieša zhruba 1 ml protilátky konjugovanej s chelatotvomým prostriedkom pri koncentrácii zhruba 2 mg/ml s acetátovým roztokom rádioaktívnej značky a zmes sa inkubuje zhruba počas 30 min. alebo čas dostatočný na dosiahnutie optimálneho značenia protilátky. Toto časové rozmedzie môže byť zhruba od 30 s do 60 min. Potom sa pridá formulačný pufer v množstve nevyhnutnom na dosiahnutie celkového konečného objemu zhruba 10 ml.

SK 288096 Β6

Optimálny čas požadovaný na značenie protilátky sa môže meniť v závislosti od protilátky, konkrétnej rádioaktívnej značky a konkrétneho použitého konjugátu. Faktorom ovplyvňujúcim optimalizáciu času na značenie rádionuklidom je pomer chelatotvomého prostriedku k protilátke, ktorá sa má značiť. Pomer chelatotvomého prostriedku k protilátke musí byť napríklad dostatočne vysoký na dosiahnutie terapeuticky použiteľných hladín inkorporácie, to je 90 až 95 % v závislosti od použitého rádionuklidu, ale nesmie byť príliš široký, aby sa neohrozila štruktúrna integrita a imunoreaktivita protilátky. To vyžaduje určitý vyrovnávací proces, ktorý môže v niektorých prípadoch viesť k nižšej hladine konjugovaného chelatotvomého prostriedku a na predĺženie času značenia.

Napríklad pre 2B8 a MX-DTPA sa zisťuje, že značenie možno uskutočniť v kratšom čase ako 5 min. pre ⁹⁰Y a zhruba v priebehu 30 min. pre ^1HIn s dosiahnutím požadovanej hladiny inkorporácie rádioaktívnej látky pri molámom pomere chelatotvomého prostriedku k protilátke len 1,5 : 1. Preto nie je treba zvyšovať pomer chelatotvomého prostriedku k protilátke, lebo sa dosahuje požadovaná hladina rádioinkorporácie. Navyše nie je výhodné zvyšovať množstvo konjugovaného chelatotvomého prostriedku, lebo by sa tak mohla ovplyvniť imunoreaktivita protilátky. Tieto parametre možno stanoviť empiricky pre ďalšie protilátky na návrh súprav, ako sú tie, ktoré sa opisujú v tomto vynáleze.

Pokiaľ je rádionuklidom ⁹⁰Y vo forme chloridu, je objem roztoku ⁹⁰Y vo forme chloridu použitý na prípravu jednej dávky na podanie zvyčajne v rozmedzí od zhruba 370 až 1850 MBq (10 až 50 mCi) a prednostne je zhruba 1665 MBq (45 mCi) delené koncentráciou rádioaktivity v čase značenia. Množstvo octanu sodného použité na úpravu pH sa mení v závislosti od koncentrácie octanu sodného a koncentrácie izotopického nosiča a môže byť preto veľmi široké. Pri koncentrácii octanu sodného 50 mM a ⁹⁰Y dodávanom v 50 mM roztoku kyseliny chlorovodíkovej je množstvo požadované na úpravu pH zvyčajne 1,2-násobok objemu použitého roztoku⁹⁰Y vo forme chloridu. Potom sa zhruba 1,5 ml protilátky konjugovanej s chelatotvomým prostriedkom s koncentráciou zhruba 2 mg/ml zmieša s acetátovým roztokom rádioaktívnej značky a inkubuje sa počas zhruba 5 min. alebo po dostatočný čas na dosiahnutie optimálneho značenia protilátky. Takýto čas môže byť v rozmedzí od zhruba 30 s do zhruba 60 min. Formulačný pufer sa pridáva v množstve nevyhnutnom na dosiahnutie celkového konečného objemu zhruba 10 ml.

Prednostne sa spôsob značenia rádionuklidom podľa tohto vynálezu robí s použitím súpravy na značenie rádionuklidom, ktorá sa tu opisuje. Ale tomu, kto má skúsenosti v odbore, by malo byť zrejmé, že preferované zložky a podmienky predstavujú len prijateľné vodidlo na uskutočnenie spôsobu podľa tohto vynálezu a môžu sa do určitej miery pozmeňovať s príslušnou optimalizáciou. Podmienky, ktoré sa odchyľujú od preferovaných podmienok, ale pokiaľ plnia účel tohto spôsobu, sa uvažujú v tom zmysle, že patria do obsahu tohto vynálezu.

Súprava na značenie rádionuklidmi podľa tohto vynálezu sa môže tiež dodávať s činidlami vhodnými pre ľahké overenie väzbovej afinity protilátky po značení rádioaktívnym nuklidom. V takom prípade možno tiež použiť súpravu podľa tohto vynálezu na stanovenie percenta väzby protilátky značenej rádionuklidom k jej cieľovej bunke pred podaním protilátky pacientovi. Pôvodcovia tohto vynálezu tiež zisťujú, že konkrétna súprava pre imunoesej, ktorá sa opisuje, môže byť použiteľná na testovanie afinity protilátky všeobecne, pre ktorú nie je k dispozícii purifikovaný antigén. V súlade s tým možno tiež predávať zložky pre imunoesej ako zvláštnu súpravu.

Všeobecne súprava na značenie rádioaktívnym nuklidom a imunoesej obsahuje (i) aspoň jednu fľaštičku lyofilizovaných buniek, ktoré exprimujú antigén, ktorý sa rozpoznáva protilátkou v súprave, (ii) fľaštičku obsahujúcu protilátku konjugovanú s chelatotvomým prostriedkom, (iii) fľaštičku obsahujúcu formulačný pufer a (iv) inštrukcie na značenie rádionuklidom protilátky takým spôsobom, že možno protilátku značenú rádionuklidom podávať priamo pacientovi bez nutnosti následnej purifikácie.

Ako sa opisuje skôr pre súpravu na značenie rádionuklidom, môže táto súprava tiež obsahovať fľaštičku obsahujúcu pufer na úpravu pH rádionuklidu a sterilnú sklenenú reakčnú fľaštičku. Prednostne je pufrom roztok octanu sodného s nízkym obsahom kovov s koncentráciou zhruba medzi 10 a 1 000 mM a sklenená reakčná fľaštička s obsahom aspoň 5 ml. Protilátka je prednostne protilátkou proti CD20 a chelatačným prostriedkom je prednostne MX-DTPA. Ostatné chelatotvomé prostriedky možno použiť, ako sa opisuje skôr. Preferovanou konjugovanou protilátkou je 2B8-MX-DTPA, aj keď je možné značiť akúkoľvek protilátku konjugovanú s chelatotvomým prostriedkom a vyhodnotiť jej afinitu. Formulačným pufrom je fyziologický roztok pufrovaný fosfátom obsahujúci rádioprotektívny prostriedok a nekonjugovaný chelatotvomý prostriedok, ako sa opisuje skôr a rádionuklid môže a nemusí byť v súprave a prednostne je týmto nuklidom ^HIIn alebo ⁹⁰Y vo forme chloridu. Možno použiť aj iné rádionuklidy v závislosti od použitého chelatotvomého prostriedku.

Rozdiel medzi súborom na imunoesej/značenie rádionuklidom a súborom na značenie rádionuklidom opísaným skôr je zahrnutie antigén-pozitívnych buniek, ktoré slúžia ako substrátový cieľ na testovanie afinity protilátky. Ak je antigénom CD20, sú preferovanými CD20-pozitívnymi bunkami SB bunky (ATCC # CCL

SK 288096 Β6

120), ale možno použiť akékoľvek CD20-pozitívne bunky. Súbor pre imunoesej a značenie rádionuklidom môže ďalej zahrnovať antigén-negatívne bunky na použitie ako negatívne kontroly. Preferovanými CD20-negatívnymi bunkami sú HSB bunky (ATCC # CCL 120.1), ale možno použiť akékoľvek CD20-negatívne bunky.

Kombinovaná súprava na značenie rádionuklidom a imunoesej môže však ďalej obsahovať fľaštičku chimerickej protilátky proti CD20 navyše k protilátke, ktorá sa má značiť, na uskutočnenie kombinovaného terapeutického protokolu alebo na odstránenie B buniek v krvnom obehu pred diagnostickým zobrazením. Takouto samostatnou protilátkou je prednostne Rituxan^R, ale môže ňou byť ktorákoľvek protilátka, ktorá dokáže usmrtiť tumorové bunky. Je skutočnosťou, že možno kombinovať dva rôzne typy protilátok v jednej súprave, to jest protilátky smerované na dva rôzne antigény B buniek, pokiaľ kombinovaný terapeutický protokol slúži na zásah rovnakého typu buniek, to jest B-bunkového lymfómu.

Len čo sa zložky súpravy majú použiť na značenie iných protilátok, možno pripraviť iné bunky na testovanie afinity protilátky v závislosti od cieľového antigénu. Ale pre protilátky proti CD20 sú imunoesej a súprava na značenie podľa tohto vynálezu najmä vhodné na komerčné účely v tom zmysle, že sa dodávajú cieľové bunky v lyofilizovanej forme. To umožňuje overenie účinnosti protilátky jednoduchým a systematickým spôsobom a odstraňuje problémy a výdaje súvisiace s udržovaním tkanivových kultúr. Lyofilizované bunky sa všeobecne dodávajú v alikvotoch medzi 0,5 a 500 x 10⁶ buniek na fľaštičku podľa spôsobu tohto vynálezu.

Je možné, že konkrétne zariadenia budú preferovať objednávanie protilátky, ktorá už bola značená a v tomto prípade môže takéto zariadenie požadovať činidlá na imunoesej na zaistenie skutočnosti, že protilátky uchovávajú cieľovú afinitu. V tomto prípade tento vynález tiež poskytuje imunoesej na stanovenie percenta väzby značenej protilátky na jej cieľové bunky. Táto súprava zahrnuje aspoň jednu fľaštičku fixovaných a/alebo lyofilizovaných antigén-pozitívnych buniek a môže prípadne obsahovať antigén-negatívne bunky, ako sa opisuje skôr, na imunoesej a na značenie súpravy. Navyše by malo byť zrejmé, že odchýlky takéhoto súboru môžu zahrnovať neznačenú kontrolnú protilátku na overenie špecifickosti väzby protilátky zákazníka kompetitívnou esejou.

Ak je antigénom CD20, sú CD20-pozitívnymi bunkami prednostne SB bunky (ATCC # CCL 120) a CD20-negatívnymi bunkami sú prednostne HSB bunky (ATCC # CCL 120.1), ktoré sa dodávajú v lyofilizovanej forme v alikvotoch medzi 0,5 až 50 x 10⁶ buniek. V tomto prípade je protilátkou prednostne konjugát MX-DTPA s 2B8 značený rádionuklidom ^H1In alebo ⁹⁰Y.

Z hľadiska ďalších vyhotovení súpravy, ktorá sa tu opisuje, je treba zdôrazniť, že jednou z výhod súpravy na značenie rádionuklidmi a spôsob podľa tohto vynálezu je skutočnosť, že nie je treba robiť žiadny ďalší purifikačný krok a protilátka značená rádionuklidom sa môže podávať priamo pacientovi, čím sa ušetrí cenný čas a zvýši sa stabilita protilátky. Preto sa zdôrazňuje, že aj keď môže kliník požadovať testovanie alebo verifikáciu väzbovej špecifickosti a afinity protilátky značenej rádionuklidom pred podaním, možno tento test uskutočniť s konkrétnymi rádionuklidmi, pokiaľ ide o stabilitu protilátky a inhibíciu rádiolýzy, napríklad s ytriom. Poskytnutím vyhotovenia súpravy, ktorou možno testovať väzbovú afinitu a špecifickosť, pôvodcovia tohto vynálezu v žiadnom prípade neuvažujú, že sa takéto testy absolútne požadujú pri spôsoboch a súpravách podľa tohto vynálezu. Možnosť testovania tejto validity protilátky je čisto na voľbe klinika.

Pôvodcovia tohto vynálezu tiež zisťujú, že spôsob použitý na prípravu fixovaných a lyofilizovaných buniek na imunoeseje podľa tohto vynálezu je najmä vhodný na prípravu buniek na komerčné súpravy. Bunky možno fixovať pred lyofilizáciou kvôli zlepšeniu štruktúry/stability. Bunky podľa tohto vynálezu majú najmä vysokú reprodukovateľnosť pri ich použití na imunoeseje protilátky.

Tento vynález zahrnuje najmä spôsob prípravy lyofilizovaných buniek obsahujúcich nasledujúce kroky (i) zbieranie buniek pri hustote buniek 0,5 až 2 x 10⁶ buniek na ml centrifugáciou, (ii) premytie buniek aspoň raz vyváženým roztokom soli, to je HBSS, (iii) resuspendovanie peletovaných buniek v lyofilizačnom pufri obsahujúcom vyvážený roztok soli obsahujúci nosný proteín a aspoň jeden typ cukru, (iv) pridelenie alikvotu resuspendovaných buniek do mikrocentrifugačnej skúmavky alebo sklenenej fľaštičky a (v) lyofilizácia buniek počas 12 až 96 h a prednostne 24 až 72 h pri tlaku zhruba 5,3 až 8 Pa. Tento spôsob je predovšetkým vhodný na prípravu lyofilizovaných buniek, pri ktorom sú týmito bunkami SB bunky (ATCC # CCL 120) alebo HSB bunky (ATCC # CCL 120.1), ale pravdepodobne je použiteľný aj pre iné typy buniek.

Pufer prednostne obsahuje bovinný sérumalbumín ako proteínový nosič pri koncentrácii 1 % (hmotnosť/objem) a manitol pri koncentrácii 10 %. Ale zrejme možno použiť iné proteínové nosiče, to jest HSA a iné cukry. Bunky sa získavajú centrifugáciou pri rýchlosti zhruba 1 300 min.'¹ a pridá sa roztok soli HBSS (Hankov vyvážený soľný roztok). Bunky sa všeobecne resuspendujú pri koncentrácii 50 x 10⁶ buniek na ml. Ale tomu, kto má skúsenosť v odbore, by malo byť zrejmé, že skôr opísané podmienky možno mierne modifikovať bez významného ohrozenia životnosti buniek. Navyše možno skôr opísané podmienky doplniť prí10

SK 288096 Β6 davnými spôsobmi navrhnutými na optimalizáciu procesu pre väčšie množstvo buniek, napríklad diafiltráciou s tangenciálnym tokom pre výmenu buniek do lyofilizačného pufra.

Súpravy rádioimunoesejí podľa tohto vynálezu možno použiť pri esejách na vyhodnotenie väzbovej afinity protilátky značenej rádionuklidom. Takáto esej je taktiež predmetom tohto vynálezu. Imunoesej na stanovenie percenta väzby protilátky značenej rádionuklidom s ich cieľovou bunkou zahrnuje všeobecne nasledujúce kroky:

(i) zmiešanie aspoň jedného alikvotu protilátky značeného rádionuklidom aspoň s jedným alikvotom antigén-pozitívnych buniek, (ii) zmiešanie aspoň jedného alikvotu protilátky značeného rádionuklidom identického s alikvotom kroku (i) aspoň s jedným alikvotom zried’ovacieho pufra rovnakého objemu, ako je objem alikvotu antigén-pozitívnych buniek v kroku (i) na kontrolné stanovenie, (iii) peletizácia buniek centrifúgáciou, (iv) zmeranie rádioaktivity v supematante peletovaných buniek a kontroly a (v) porovnanie rádioaktivity v bunkovom supematante s rádioaktivitou kontroly.

Pokiaľ súpravy na značenie rádionuklidmi podľa tohto vynálezu prípadne obsahujú ^1HIn vo forme chloridu alebo ^9ňY vo forme chloridu, uskutočňuje sa imunoesej podľa tohto vynálezu zvyčajne s protilátkami značenými ^1HIn alebo ⁹⁰Y. Pokiaľ je rádioaktívnou značkou ^H1In, meria sa aktivita v skúmavkách pre imunoesej čítačom gama. Pokiaľ je značkou ⁹⁰Y, meria sa aktivita s použitím scintilačného počítača, ale možno taktiež použiť čítač gama.

Pre imunoesej podľa tohto vynálezu je preferovanou protilátkou protilátka proti CD20 a protilátkou proti CD20 je prednostne 2B8 a táto protilátka 2B8 sa značí s použitím súpravy na značenie rádionuklidmi podľa tohto vynálezu. Možno však testovať akúkoľvek protilátku značenú rádionuklidmi s podmienkou, že sú k dispozícii bunky exprimujúce konkrétny antigén. Pokiaľ je týmto antigénom CD20, sú preferovanými bunkami pri uskutočňovaní eseje SB bunky (ATCC # CCL 120), ale esej sa tiež optimalizuje a uskutočňuje s akoukoľvek protilátkou značenou rádionuklidom a príslušnou cieľovou bunkou.

Zried’ovací pufer použitý pre esej by mal udržovať väzbu protilátky, to jest mal by sa použiť fyziologický pufer prípadne obsahujúci proteínový nosič, napríklad bovinný sérumalbumín na minimalizáciu nešpecifickej väzby s bunkami. Aj keď sa používa ako kontrola skúmavka so zrieďovacím pufŕom, možno použiť ďalšiu kontrolu pri eseji s antigén-negatívnymi bunkami. V tomto prípade imunoesej ďalej zahrnuje nasledujúce kroky:

(i) zmiešanie aspoň jedného alikvotu protilátky značenej rádionuklidom aspoň s jedným alikvotom antigén-negatívnych buniek, (ii) peletizácia antigén-negatívnych buniek centrifúgáciou, (iii) meranie rádioaktivity supematantu antigén-negatívnych peletovaných buniek a (iv) porovnanie množstva aktivity v antigén-negatívnom bunkovom supematante s množstvom rádioaktivity v supematante antigén-pozitívnych buniek a kontrolou.

Porovnanie rádioaktivity získanej z tejto skúmavky s kontrolou zried’ovacieho pufra poslúži ako meradlo množstva nešpecifickej väzby na antigén-pozitívne bunky. Pokiaľ je antigénom CD20 a CD20-pozitívnymi bunkami sú SB bunky, CD20 sú negatívnymi bunkami prednostne HSB bunky (ATCC # CCL 120.1).

Ako sa opisuje skôr, lyofilizované bunky podľa tohto vynálezu poskytujú jednoduchý, účinný a reprodukovateľný štandard na testovanie väzbovej účinnosti protilátky značenej rádionuklidom. Preto sa imunoesej podľa tohto vynálezu prednostne uskutočňuje s použitím lyofilizovaných buniek v súpravách pre imunoeseje podľa tohto vynálezu. Navyše sa môžu súbory na značenie rádionuklidom podľa tohto vynálezu kombinovať s imunoesejami podľa tohto vynálezu, ak sa protilátka najskôr značí spôsobom značenia protilátky konjugovanej s chelatotvomým prostriedkom, ako sa opisuje v tomto vynáleze. Najpreferovanejším spôsobom uskutočnenia imunoeseje podľa tohto vynálezu je použitie imunoeseje a súprav na značenie rádionuklidom, ako sa tu opisuje.

Môžu nastať určité prípady, pri ktorých je potrebné testovať alebo verifikovať afinitu protilátky, ale rádioaktívna značka dosiaľ nie je pripojená. Napríklad za určitých okolností, to jest pri zisťovaní príčiny problému, môže byť výhodné testovať väzbovú aktivitu protilátky pred značením rádionuklidom. V takom prípade tento vynález tiež zahrnuje kompetitívnu imunoesej na vyhodnotenie afinity testovacej protilátky k cieľovej bunke skladajúcej sa z nasledujúcich krokov (i) príprava kontrolnej protilátky značenej ruténiom použitím známej protilátky špecifickej pre ten istý antigén, (ii) inkubácia vzrastajúceho množstva skúšobnej protilátky a vzrastajúceho množstva neznačenej kontrolnej protilátky pri pevnej koncentrácii cieľových buniek a stopového množstva protilátky značenej ruténiom, pri ktorej sú každá oddelená koncentrácia skúšobnej protilátky a každá oddelená koncentrácia kontrolnej protilátky v jednotlivých skúmavkách, (iii) stanovenie väzby v každej reakčnej skúmavke na základe relatívnej elektrochemiluminiscencie (ECL) alebo prístrojom ORIGEN a

SK 288096 Β6 (iv) výpočet strednej hodnoty afinity skúšobnej protilátky.

Priemerná afinita sa môže vypočítať z hodnôt EC50 a známej koncentrácie stopovej protilátky s použitím spôsobu Mullera (J. Immunological Methods, 34, 345 (1980)) alebo iného príslušného spôsobu. Je potrebné poznamenať, že sa tento rozbor tiež môže použiť na testovanie afinity protilátok značených rádionuklidmi alebo akékoľvek protilátky, pre ktorú nemožno purifikovať antigén a ako zdroj antigénu sa požadujú bunky. Fixované, lyofilizované bunky podľa tohto vynálezu sa môžu použiť ako cieľové bunky.

Pri uskutočnení kompetitívnej imunoeseje podľa tohto vynálezu na testovanie aktivity protilátok proti CD20 môže byť kontrolnou protilátkou 2B8 alebo ktorákoľvek iná nekonjugovaná protilátka proti CD20. Kontrolnou protilátkou môže byť protilátka konjugovaná chelatotvomým prostriedkom. Skúšobnou protilátkou môže byť tiež konjugát kontrolnej protilátky s chelatotvomým prostriedkom. Alternatívne môže byť skúšobnou protilátkou iná protilátka proti CD20, ktorej väzbová afinita k CD20 sa má zisťovať v porovnaní s 2B8. Ale rozbor možno prispôsobiť na použitie s protilátkami, ktoré majú iné špecifickosti, pokiaľ sú k dispozícii príslušné cieľové bunky.

V kompetitívnej imunoeseji podľa tohto vynálezu sú preferovanými cieľovými bunkami CD20-pozitívne bunky, lepšie SB bunky (ATCC # CCL 120) a najlepšie resuspendované lyofilizované SB bunky pripravené podľa spôsobu tohto vynálezu. Bunky lyofilizované s použitím iných spôsobov alebo fixované bunky sú taktiež použiteľné. Protilátka značená ruténiom sa zvyčajne pripravuje spôsobom zahrnujúcim inkubáciu kontrolnej protilátky s N-hydroxysukcínimidesterom ruténium(II) tris-bipyridínového chelatotvomého prostriedku (TAG-NHS), aj keď sa taktiež uvažuje o iných známych spôsoboch značenia protilátok. Na značenie sa kontrolná protilátka a TAG-NHS prednostne inkubujú v molámom pomere zhruba 1 : 15.

Tieto a ďalšie aspekty tohto vynálezu možno objasniť odkazom na nasledujúce obrázky, príklady a opis vynálezu.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 znázorňuje porovnanie imunoreaktivity natívneho 2B8 s komerčne dostupnými protilátkami BI proti CD20 (Coulter) a Leu 16 (Becton Dickinson) priamou kompetenciou v rádioimunoeseji s použitím BI značenej ¹²⁵I.

Obrázok 2 znázorňuje analýzu FACS väzby 2B8 na antigén CD20 vyskytujúci sa na ľudských B-bunkách.

Obrázok 3 znázorňuje Scatchardovú analýzu väzby 2B8 na B-bunky.

Obrázok 4 znázorňuje inhibíciu protilátky BI oproti CD20 Mab značenej rádionuklidom neznačenou BI, 2B8 a 2B8 konjugovanou s MX-DTPA.

Obrázky 5A, 5B a 5C znázorňujú imunoreaktivitu 2B8 v priebehu inkubácie pri teplotách 4 °C a 30 °C v týždni imunoreaktivity 1,6 a 12.

Obrázky 6A a 6B znázorňujú väzbu 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ^H1ln na CD-20 pozitívnej ľudskej bunky.

Obrázky 7 až 9 uvádzajú porovnávacie údaje a znázorňujú stabilitu 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ⁹⁰Y v PBS obsahujúcom ľudský sérumalbumín a DTPA.

Obrázky 10 až 12 znázorňujú stabilitu in vitro 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ^HIIn vg PBS obsahujúcom ľudský sérumalbumín.

Obrázky 13 až 15 uvádzajú porovnávacie údaje a znázorňujú stabilitu in vitro 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ⁹⁰Y inkubovanej v ľudskom sére.

Obrázok 16 znázorňuje stabilitu in vitro 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ^1HIn v PBS obsahujúcom ľudský sérumalbumín.

Obrázky 17 a 18 znázorňujú stabilitu in vitro 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ^1HIn inkubovanej v ľudskom sére.

Obrázok 19 znázorňuje účinok infúzie 2B8 na hladiny B-lymfocitov pri opiciach Cynomolgus v dňoch 0 až 13.

Obrázok 20 znázorňuje obnovenie hladín B-buniek v krvnom obehu pri opiciach Cynomolgus, ktoré dostali injekciou myšie monoklonálne protilátky 2B8 oproti CD20.

Obrázok 21 znázorňuje účinok 2B8-MX-DTPA na B-bunky v krvnom obehu pri opiciach Cynomolgus.

Obrázok 22A znázorňuje clearanciu 2B8 pri opiciach Cynomolgus po jednom injekčnom podaní 10 mg/kg.

Obrázok 22B znázorňuje krvnú clearanciu 2B8, 2B8-MX-DTPA pri myšiach BALB/c.

Obrázok 23 znázorňuje biodistribúciu ^1HIn-2B8-MX-DTPA.

Obrázok 24 znázorňuje biodistribúciu ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA a je uvedený na porovnanie.

Obrázok 25 znázorňuje lokalizáciu tumoru pomocou ^1HIn-2B8-MX-DTPA.

Obrázky 26A a 26B obsahujú porovnávacie údaje a znázorňujú väzbu 2B8-MX-DTPA značenej rádio12 nuklidom ^9θΥ na CD20 pozitívne ľudské bunky.

Obrázky 27 až 29 obsahujú porovnávacie údaje a znázorňujú stabilitu in vitro 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ⁹⁰Y v PBS obsahujúcom ľudský sérumalbumín a DTPA.

Obrázky 30 až 32 obsahujú porovnávacie údaje a znázorňujú stabilitu in vitro 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ⁹⁰Y inkubovanej v ľudskom sére.

Obrázok 33 obsahuje porovnávacie údaje a znázorňuje biodistribúciu 2B8-MX- DTPA značenej rádionuklidom ⁹⁰Y pri myšiach.

Obrázok 34 znázorňuje priamu väzbu odvodenú od CHO k CD20 pozitívnym a CD20 negatívnym ľudským bunkám.

Obrázok 35 znázorňuje kompektívnu väzbu 2B8 odvodenú od CHO na CD 20 pozitívne ľudské bunky.

Obrázok 36 znázorňuje kompetitívnu väzbu 2B8 odvodenú od CHO a 2B8-MX-DTPA na CD20 pozitívne ľudské bunky.

Obrázky 37A a 37B znázorňujú väzbu In2B8 pripravenú z CHO 2B8-MX-DTPA k CD20 pozitívnym bunkám.

Obrázky 38A a 38B obsahujú porovnávacie údaje a znázorňujú väzbu Y2B8 pripravenú z CHO 2B8-MX-DTPA k CD 20 pozitívnym bunkám.

Ďalej sa uvádza podrobnejší opis vzťahujúci sa k jednotlivým obrázkom.

Obrázok 1. Imunoreaktivita natívneho 2B8 sa porovnáva s komerčne dostupnými protilátkami BI proti CD20 (Coulter) a Leu 16 (Becton Dickinson) priamou kompetíciou v rádioimunoeseji s použitím BI značenej ¹²⁵I. Antigén-pozitívne SB bunky (100 000) sa pridajú do každej jamky filtračných dosiek V&P, 10 ng BI značenej rádionuklidom sa zmieša s rôznymi koncentráciami neznačenej kompetitívnej látky a zmes sa pridá k bunkám. Protilátky sa inkubujú s bunkami počas 1 h pri teplote okolia. Stanovenia sa uskutočnia po trojiciach. Potom sa jamky premyjú, vysušia a stanoví sa aktivita na filtri. Znázornené údaje sú opravené na aktivitu pozadia a predstavujú priemery z trojíc stanovenia.

Obrázok 2. Vzrastajúce množstvá nekonjugovanej 2B8 sa analyzujú ohľadne väzby na ľudské B bunky (SB) s použitím analýzy FACS. Porovnanie sa uskutočňuje s komerčne dostupnou monoklonálnou protilátkou proti CD20 (BI) a s dvoma irelevantnými izotypickými protilátkami. Ako druhé činidlo sa použije kozia protilátka proti myšiemu IgG-FITC F(ab)'₂. Výsledky ukazujú, že 2B8 je špecifická pre antigén CD20 a má vyššiu väzbu ako B1.

Obrázok 3. Ľudské bunky (SB) sa inkubujú so vzrastajúcimi množstvami 2B8 značené rádionuklidom ¹²⁵I. Vzorky po trojiciach sa inkubujú počas jednej h a aktivita naviazaná na bunky sa stanoví po filtrácii, ktorou sa získavajú bunky. Scatchardova analýza umožňuje výpočet zdanlivej konštanty afinity 4, 3 x 10'⁹ M. Obrázok 4. Imunoreaktivita natívnej 2B8, 2B8-MX-DTPA a BI. Protilátka BI sa značí podľa opisu v oddiele Spôsoby uskutočnenia. 10 ng BI značenej rádionuklidom sa zmieša so vzrastajúcimi koncentráciami kompetitívnej látky a zmes sa pridá do jamiek na filtračných doskách V&P obsahujúcich každá 100 000 antigén-pozitívnych SB buniek. Všetky stanovenia sa uskutočňujú po trojiciach. Po 1 h inkubácie pri teplote miestnosti sa jamky dostatočne premyjú. Následne sa filtre vysušia a pripojená aktivita sa stanoví meraním početnosti impulzov aktivity gama. Všetky hodnoty sa korigujú na pozadí. Znázornené hodnoty sú stredné hodnoty z troch stanovení.

Obrázok 5. Protilátka 2B8 sa formuluje pri konečnej koncentrácii 10 mg/ml v normálnom fyziologickom roztoku alebo v normálnom fyziologickom roztoku obsahujúcom 10 mM glycínhydrochloridu s pH 6,8. Dvojité súbory vzoriek sa potom umiestnia do fľaštičiek so skrutkovým uzáverom, fľaštičky sa premyjú prúdom dusíka a uzavrú. Vzorky sa potom inkubujú pri teplote 4 °C alebo 30 °C počas 12 týždňov. Imunoreaktivita vzoriek sa hodnotí každý týždeň. Nepozoruje sa žiadna strata imunoreaktivity u žiadaného zo vzoriek 2B8 v priebehu 12-týždennej štúdie. Imunoreaktivita v týždni 1 (obrázok 5A), týždni 6 (obrázok 5B) a týždni 12 (obrázok 5C) sú znázornené na obrázkoch.

Obrázok 6. Imunoesej na stanovenie imunoreaktivity 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ^1HIn inkubovanej vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom s pH 7,4 obsahujúcom ľudský sérumalbumín s koncentráciou 50 mg/ml (inkubácia 48 h).

Obrázok 6A. Konštantné množstvo protilátky značenej rádionuklidom (5 ng/ml) sa inkubuje so vzrastajúcimi objemami SB buniek (20 x 10⁶ buniek/ml). Aktivita meraná ako početnosť impulzov (impulzy/min.) naviazaná na bunky sa vynáša proti objemu pridanej bunkovej suspenzie. Obrázok 6B. vynáša sa celková aplikovaná aktivita vzhľadom na naviazanú aktivitu (AT/B). Lineárna extrapolácia umožňuje výpočet úseku na osi y (0,997). Prevrátená hodnota úseku na osi y x 100 poskytuje imunoreaktivitu 100 % pri nekonečnom nadbytku antigénu.

Obrázok 7. Autorádiogramy získané z analýzy SDS-PAGE 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ’θΥ inkubovanej pri teplote 4 °C vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom s pH 7,4 obsahujúcom ľudský sérumalbumín s koncentráciou 75 mg/ml a DTPA s koncentráciou 1 mM. V daných časoch sa vzorky podrobia elektroforéze na 4 až 20 % Tris-glycínových géloch za neredukčných podmienok, denaturačných podmienok (SDS). Vzorky sa nanášajú v množstve 5 μί (dráhy 1, 2), 10 μί (dráhy 5, 6). Gély sa exponujú s rtg.

filmom počas zhruba 15 min. pri teplote okolia a fotografujú.

Obrázok 8. Denzitometrický záznam rádiogramu času nula získaného z analýzy SDS-PAGE 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ⁹⁰Y inkubovanej pri teplote 4 °C vo fyziologickom roztoku puffovanom fosfátom, pH 7,4, obsahujúcom ľudský sérumalbumín pri koncentrácii 75 mg/ml a DTPA pri koncentrácii 1 mM. Vzorka sa podrobí elektroforéze na 4 až 20 % Tris-glycínovom géli pri neredukčných podmienkach. Vzorky sa nanášajú v množstve 5 μΐ, 10 μΐ a 20 μΐ, každé množstvo do dvoch jamiek. Gél sa exponuje s rtg. filmom zhruba počas 15 min. pri teplote okolia a jedna z dráh sa sníma s použitím denzitometra. Relatívna plocha piku konjugátu značeného rádionuklidom (#2) je 96,2 %.

Obrázok 9. Denzitometrický záznam autorádiogramu získaný po čase 48 h na základe analýzy SDS-PAGE 2B8-MX-DTPA značenej ⁹⁰Y a inkubovanej pri teplote 4 °C vo fyziologickom roztoku pufŕovanom fosfátom, pH 7,4, obsahujúcom ľudský sérumalbumín pri koncentrácii 75 mg/ml a DTPA s koncentráciou 1 mM. Vzorka sa podrobí elektroforéze na 4 až 20 % Tris-glycínovom géli pri neredukčných podmienkach. Vzorky sa nanášajú v množstve 5 μΐ, 10 μΐ a 20 μΐ, každé množstvo do dvoch jamiek. Gél sa exponuje s rtg. filmom zhruba počas 15 min. pri teplote okolia a jedna z dráh sa sníma s použitím denzitometra. Relatívna plocha piku konjugátu značeného rádionuklidom (#2) je 95,5 %.

Obrázok 10. Autorádiogramy získané z analýzy SDS-PAGE 2B8-MX-DTPA značenej ^1HIn inkubovanej pri teplote 4 °C vo fyziologickom roztoku pufŕovanom fosfátom pri pH 7,4 obsahujúcom ľudský sérumalbumín s koncentráciou 50 mg/ml. V daných časoch sa vzorky podrobia elektroforéze na 4 až 20 % Tris-glycínových géloch pri neredukčných podmienkach. Vzorky sa nanášajú v množstve 5 μΐ (dráhy 1,2), 10 μΐ (dráhy 3, 4) a 20 μΐ (dráhy 5, 6). Gély sa exponujú s rtg. filmom počas zhruba 15 min. pri teplote okolia a fotografujú. (Poznámka: Autorádiogram po 48 h sa získa pri použití zosilňovacích štítov, ktoré poskytujú vyšší signál, v porovnaní s autorádiogramom času nula).

Obrázok 11. Denzitometrický záznam autorádiogramu času nula získaného z analýzy SDS-PAGE 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ^U1ln inkubovanej pri teplote 4 °C vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom, pH 7,4, obsahujúcom ľudský sérumalbumín s koncentráciou 50 mg/ml. Vzorka sa podrobí elektroforéze na 4 až 20 % Tris-glycínovom géli pri neredukčných podmienkach. Vzorky sa nanášajú v množstve 5 μΐ, 10 μΐ a 20 μΐ, každé množstvo do dvoch jamiek. Gél sa exponuje s rtg. filmom zhruba počas 15 min. pri teplote miestnosti a jedna z dráh sa sníma s použitím denzitometra. Relatívna plocha piku konjugátu značeného rádionuklidom (#3) je 95,9 %.

Obrázok 12. Denzitometrický záznam autorádiogramu času 48 h získaného z analýzy SDS-PAGE 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ^1HIn inkubovanej pri teplote 4 °C vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom, pH 7,4, obsahujúcom ľudský sérumalbumín s koncentráciou 50 mg/ml. Vzorka sa podrobí elektroforéze na 4 až 20 % Tris-glycínovom géli pri neredukčných podmienkach. Vzorka sa podrobí elektroforéze na 4 až 20 % Tris-glycínovom géli pri neredukčných podmienkach. Vzorka sa nanáša v množstve 5 μΐ 10 μΐ a 20 μΐ, každé množstvo do dvoch jamiek. Vzorka sa exponuje 5 rtg. filmom zhruba počas 15 min. pri teplote okolia a jedna z dráh sa sníma s použitím denzitometra. Relatívna plocha konjugátu značeného rádionuklidom je 97,0 % (kombinované plochy píkov #2, 3 a 4).

Obrázok 13. Autorádiogramy získané z analýzy SDS-PAGE 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ⁹⁰Y inkubovanej pri teplote 37 °C v ľudskom sére. Pri daných časoch sa vzorky podrobia elektroforéze na 4 až 20 % Tris-glycínových géloch pri neredukčných podmienkach. Vzorky sa nanášajú v množstvách 5 μΐ (dráhy 1,2), 10 μΐ (dráhy 3, 4) a 20 μΐ (dráhy 5, 6). Gély sa exponujú s rtg. filmom zhruba počas 15 minút pri teplote okolia a fotografujú.

Obrázok 14. Denzitometrický záznam autorádiogramu času nula získaného z analýzy SDS-PAGE 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ⁹⁰Y inkubovanej pri teplote 37 °C v ľudskom sére. Vzorka sa podrobí elektroforéze na 4 až 20 % Tris-glycínovom géli pri neredukčných podmienkach. Vzorka sa nanáša v množstvách 5 μΐ, 10 μΐ a 20 μΐ, každé množstvo do dvoch jamiek. Gély sa exponujú s rtg. filmom zhruba počas 15 min. pri teplote okolia a jedna z dráh sa sníma s použitím denzitometra. Relatívna plocha piku konjugátu značeného rádionuklidom (#2) je 97,9 %.

Obrázok 15. Denzitometrický záznam autorádiogramu času 98 h získaný z analýzy SDS-PAGE 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ⁹⁰Y inkubovanej pri teplote 37 °C v ľudskom sére. Vzorka sa podrobí elektroforéze na 4 až 20 % Tris-glycínovom géli pri neredukčných podmienkach. Vzorka sa nanáša v množstvách 5 μΐ, 10 μΐ a 20 μΐ, každé množstvo do dvoch jamiek. Gély sa exponujú s rtg. filmom zhruba počas 15 min. pri teplote okolia a jedna z dráh sa sníma s použitím denzitometra. Relatívna plocha piku konjugátu značeného rádionuklidom (#2) je 94,7 %.

Obrázok 16. Autorádiogramy získané z analýzy SDS-PAGE 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ^H1In inkubovanej pri teplote 37 °C v ľudskom sére. V daných časoch sa vzorky podrobia elektroforéze na 4 až 20 % Tris-glycínových géloch pri neredukčných podmienkach. Vzorky sa nanášajú v množstvách 5 μΐ (dráhy 1,2), 10 μΐ (dráhy 3, 4) a 20 μΐ (dráhy 5, 6). Gély sa exponujú s rtg. filmom zhruba počas 16 až 20 h pri teplote okolia a fotografujú.

Obrázok 17. Denzitometrický záznam autorádiogramu času nula získaného z analýzy SDS-PAGE 2B814

SK 288096 Β6

-MX-DTPA značenej rádionuklidom ^1HIn inkubovanej pri teplote 37 °C v ľudskom sére. Vzorka sa podrobí elektroforéze na 4 až 20 % Tris-glycínovom géli pri neredukčných podmienkach. Vzorka sa nanáša v množstvách 5 μΐ, 10 μΐ a 20 μΐ, každé množstvo do dvoch jamiek. Gély sa exponujú s rtg. filmom počas zhruba 16 až 20 h pri teplote okolia a jedna z dráh sa sníma s použitím denzitometra. Relatívna plocha piku konjugátu značeného rádionuklidom (#3) je 95,3 %.

Obrázok 18. Denzitometrický záznam autorádiogramu času 96 h získaný z analýzy SDS-PAGE 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ⁹⁰Y inkubovanej pri teplote 37 °C v ľudskom sére. Vzorka sa podrobí elektroforéze na 4 až 20 % Tris-glycínovom géli pri neredukčných podmienkach. Vzorka sa nanáša v množstvách 5 μΐ, 10 μΐ a 20 μΐ, každé množstvo do dvoch jamiek. Gély sa exponujú s rtg. filmom zhruba počas 16 až 20 h pri teplote okolia a jedna z dráh sa sníma s použitím denzitometra. Relatívna plocha piku konjugátu značeného rádionuklidom (#3) je 94,0 %.

Obrázok 19. Opice Cynomolgus dostanú intravenózne každých 48 h celkom 7 injekcií. Sú znázornené podané množstvá. Hladiny T-buniek a B-buniek v obehu sa stanovia analýzou FACS s použitím protilátok proti CD20 (T-bunky), proti Mo-IgG(2B8), proti CD20 (Leu 16) a proti ľudskému IgG (B-bunky). Hladiny T-buniek ostávajú neovplyvnené (Skupina zvierat V dostane jednu dávku).

Obrázok 20. Vyrovnanie hladín B-buniek v obehu pri zvieratách, ktoré dostávali 2B8 sledované analýzou FACS s použitím protilátok značených fluorescenčným prostriedkom opísaným stručne v opise obrázka 19. Zvieratá skupín III a IV sa nemonitorujú a usmrtia sa v deň 13.

Obrázok 21. Opice Cynomolgus dostávajú intravenózne 2B8-MX-DTPA značenú rádionuklidom ⁸⁹Y pripravenú s použitím 2B8-MX-DTPA na klinické použitie. Zvieratá dostanú dávky skôr opísaných množstiev každých 48 h, celkom 7 dávok. V dňoch 0, 2, 7, 10 a 14 sa po odbere krvi vyhodnotia sérové chemické a hematologické faktory a hladiny B-buniek v krvnom obehu (sérum dňa 10 sa nehodnotí ohľadne obsahu B-buniek). V priebehu štúdia sa nevyskytujú žiadne významné abnormality okrem zníženého počtu celkových lymfocytov pri všetkých zvieratách vynímajúc jedného zvieraťa v skupine II.

Obrázok 22. Clearancia myšej protilátky 2B8 proti CD20 z opíc Cynomolgus sa stanoví rozborom ELISA po jednej injekcii 10 mg/kg dňa nula. Ako ukazuje časť A, protilátka má hodnotu β t_1/2 zhruba 4,5 d. Clearancia protilátky 2B8 a jej konjugátu s MX-DTPA z krvného obehu myší BALB/c ukazuje časť B. Myši dostanú intravenózne 25 pg natívnej alebo konjugovanej 2B8 a vzorky krvi sa odoberajú v rôznych časoch až do času 264 h po injekcii. Séra sa potom analyzujú enzymatickou imunoesejou s použitím buniek SB ako vychytávacieho prostriedku. Natívne a konjugované protilátky majú hodnoty clearancie 8,75 d.

Obrázok 23. 20 myší BALB/c, každá dostane 40,7 kBq (1,1 pCi) konjugátu značeného rádionuklidom (100 μΐ) vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom s pH 7,4 s obsahom HSA 50 mg/ml. Skupiny po 5 zvieratách sa usmrtia v časoch 1, 24, 48 a 72 h, a potom sa pripraví krv a rôzne tkanivá a stanoví sa v nich pripojená aktivita.

Obrázok 24. 20 myší BALB/c, každá dostane intravenózne zhruba 37 kBq (1,0 pCi) (v 100 μΐ) značeného konjugátu v IX PBS, pH 7,4, s obsahom 75 mg/ml ľudského sérumalbumínu s obsahom 1 mM MDPA. Skupiny po piatich myšiach sa utratia v časoch 1, 24, 48 a 72 h, a potom sa pripraví krv a rôzne tkanivá a stanoví sa v nich pripojená aktivita.

Obrázok 25. Atymické myši s Ramosovými B-bunkovými tumormi dostanú intravenózne 888 kBq (24 pCi) 2B8-MX-DTPA značeného ^1HIn a skupiny po troch myšiach sa utratia v časoch 0, 24, 48 a 72 h. Po príprave tkaniva a stanovení pripojenej aktivity sa vyhodnotia percentá podanej dávky na g tkaniva a vynesú do grafú.

Obrázok 26. Imunoesej na stanovenie imunoreaktivity „mix-&-shoot“ 2B8-MX- DTPA značenej rádionuklidom ⁹⁰Y, inkubovanej v PBS pri pH 7,4 s obsahom 50 až 75 mg/ml ľudského sérumalbumínu (inkubácia 48 h). Časť A) Konštantné množstvo protilátky značenej ⁹⁰Y (zhruba 1 ng/ml) sa inkubuje s rastúcimi množstvami SB buniek. Aktivita vyjadrená ako početnosť impulzov (impulzy/min.) naviazaná na bunky sa vynáša oproti koncentrácii buniek. Časť B) Celková podaná aktivita ⁹⁰Y v porovnaní s naviazanou aktivitou (AT/B) sa vynáša do grafú. Lineárna extrapolácia umožňuje výpočet úseku na osi y (1,139). Prevrátená hodnota úseku na osi y x 100 poskytuje hodnotu imunoreaktivity 87,9 % pri nekonečnom zvyšku antigénu. Nedochádza k žiadnej väzbe s CD20 negatívnymi bunkami (HSB).

Obrázok 27. Autorádiogramy získané z analýzy SDS-PAGE 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ⁹⁰Y, inkubovanej pri teplote 4 °C vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom s pH 7,4 s obsahom 75 mg/ml ľudského sérumalbumínu a 1 mM DTPA. Pri udaných časoch sa vzorky podrobia elektroforéze na 4 až 20 % Tris-glycínových géloch pri neredukčných podmienkach, denaturačných podmienkach (SDS). Vzorky sa nanášajú v množstvách 5 μΐ (dráhy 1, 2), 10 μΐ (dráhy 5, 6). Gély sa exponujú s rtg. filmom zhruba počas 15 min. pri teplote okolia a fotografújú.

Obrázok 28. Denzitometrický záznam autorádiogramu času nula získaný z analýzy SDS-PAGE 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ⁹⁰Y, inkubovanej pri teplote 4 °C vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom pri pH 7,4 obsahujúcom koncentráciu 75 mg/ml ľudského sérumalbumínu a 1 mM DTPA. Vzorka sa podrobí elektroforéze na 4 až 20 % Tris-glycínovom géli pri neredukčných podmienkach. Vzorka sa nanáša v

SK 288096 Β6 množstvách 5 μΐ, 10 μΐ a 20 μΐ, každé množstvo do dvoch jamiek. Gél sa exponuje s rtg. filmom zhruba počas 15 min. pri teplote okolia a jedna z dráh sa sníma s použitím denzitometra. Relatívna plocha piku konjugátu značeného rádionuklidom (#2) je 96,1 %.

Obrázok 29. Denzitometrický záznam autorádiogramu času 48 h získaný z analýzy SDS-PAGE 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ⁹⁰Y, inkubovanej pri teplote 4 °C vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom pri pH 7,4 obsahujúcom koncentráciu 75 mg/ml ľudského sérumalbumínu a 1 mM DTPA. Vzorka sa podrobí elektroforéze na 4 a 20 % Tris-glycínovom géli pri neredukčných podmienkach. Vzorka sa nanáša v množstvách 5 μΐ, 10 μΐ a 20 μΐ, každé množstvo do dvoch jamiek. Gél sa exponuje s rtg. filmom zhruba počas 15 min. pri teplote okolia a jedna z dráh sa sníma s použitím denzitometra. Relatívna plocha piku konjugátu značeného rádionuklidom (#2) je 94,1 %.

Obrázok 30. Autorádiogramy získané z analýzy SDS-PAGE pre „mix-&-shoot“ protilátku 2B8-MX-DTPA značenú rádionuklidom ⁹⁰Y, inkubovanú pri teplote 37 °C v ľudskom sére. V udaných časoch sa vzorky podrobia elektroforéze na 4 až 20 % Tris- glycínových géloch pri neredukčných podmienkach. Vzorky sa nanášajú v množstvách 5 μΐ (dráhy 1, 2), 10 μΐ (dráhy 3, 4), 20 μΐ (dráhy 5, 6). Gély sa exponujú s rtg. filmom zhruba počas 15 min. pri teplote miestnosti a fotografujú.

Obrázok 31. Denzitometrický záznam autorádiogramu času nula získaný z analýzy SDS-PAGE pre „mix-&-shoot“ protilátku 2B8-MX-DTPA značenú rádionuklidom ⁹⁰Y, inkubovanú pri teplote 37 °C v ľudskom sére. Vzorky sa podrobia elektroforéze na 4 až 20 % Tris-glycínových géloch pri neredukčných podmienkach. Vzorky sa nanášajú v množstvách po 5 μΐ, 10 μΐ a 20 μΐ do dvoch jamiek. Gély sa exponujú s rtg. filmom zhruba počas 15 min. pri teplote okolia a jedna z dráh sa sníma denzitometrom. Relatívna plocha piku konjugátu značeného rádionuklidom (#2) je 89,1 %.

Obrázok 32. Denzitometrický záznam autorádiogramu času 72 h získaný z analýzy SDS-PAGE pre „mix-&-shoot“ protilátku 2B8-MX-DTPA značenú rádionuklidom ⁹⁰Y, inkubovanú pri teplote 37 °C v ľudskom sére. Vzorky sa podrobia elektroforéze na 4 až 20 % Tris-glycínových géloch pri neredukčných podmienkach. Vzorky sa nanášajú v množstvách 5 μΐ, 10 μΐ a 20 μΐ do dvoch jamiek. Gély sa exponujú s rtg. filmom zhruba počas 15 min. pri teplote okolia a jedna z dráh sa sníma denzitometrom. Relatívna plocha piku konjugátu značeného rádionuklidom (#2) je 88,8 %.

Obrázok 33. 20 myší BALB/c, každá dostane intravenózne 185 kBq (5 pCi) 2B8-MX-DTPA značenej ⁹⁰Y v 1 X PBS, pH 7,4 s obsahom 75 pg/ml ľudského sérumalbumínu a 1 mM DTPA. Skupiny po piatich zvieratách sa usmrtia v časoch 1, 24, 48 a 72 h a ich krv a rôzne tkanivá sa pripravia a analyzujú ohľadne pripojenej aktivity.

Obrázok 34. Vzrastajúce množstvá protilátky 2B8 odvodené od CHO a značené sa inkubujú spolu s pevnými koncentráciami čerstvo získaných CD20-pozitívnych B-buniek (SB) alebo CD20-negatívnych T-buniek (HSB). Protilátka naviazaná na bunky sa vyjadrí kvantitatívne s použitím analýzy FACS pomocou kozej protilátky proti myšiemu IgG-FITC F (ab)'₂, ako sa tu opisuje. Porovnanie sa uskutočňuje s irelevantnou izotypickou protilátkou (S004). Iba odvodenou od CHO. Protilátka 2B8 má zreteľnú väzbu na CD20-pozitívne SB bunky.

Obrázok 35. Imunoreaktivita 2B8 odvodená od CHO sa porovnáva s materskou protilátkou 2B8-49 vytváranou v bunkovej línii hybridómu priamou kompetíciou v eseji ORIGEN. Vzrastajúce množstvo protilátky sa inkubuje s pevnou koncentráciou CD20-pozitívnych B-buniek (SB) a stopovým množstvom CHO 2B8 značené ruténiom. Po inkubácii počas 3 h pri teplote miestnosti sa naviazané množstvo vyjadrené ako relatívna elektrochemiluminiscencia (ECL) stanoví pomocou prístroja ORIGEN, ako sa opisuje v oddiele Materiály a spôsob uskutočnenia, hodnoty predstavujú priemery z dvojíc stanovenia. Stredné afinitné konštanty pre CHO 2B8 a 2B8-49 sú podľa výpočtu 1,3 x 10'¹⁰ M respektíve 2,5 x 10’¹⁰. Na porovnanie sa používa irelevantná izotypická protilátka (S004).

Obrázok 36. Väzba konjugátov 2B8-MX-DTPA pripravených z 2B8 odvodenej od CHO sa porovnáva s nekonjugovanou protilátkou priamou kompetíciou v eseji ORIGEN. Konjugáty sa pripravia inkubáciou 2B8 s MX-DTPA počas 8, 17 a 24 h pred odstránením nezreagovaného chelátu. Na hodnotenie väzby sa protilátky inkubujú s pevnými koncentráciami CD20-pozitívnych B-buniek (SB) a stopovým množstvom CHO 2B8 značenej ruténiom. Po inkubácii počas 3 h pri teplote okolia sa stanoví väzba vyjadrená ako relatívna elektrochemiluminiscencia (ECL) s použitím prístroja ORIGEN, ako sa opisuje v oddiele Materiály a spôsoby uskutočnenia. Hodnoty predstavujú priemery z dvojíc stanovenia. Prípravky konjugátu majú podobnú väzbu v porovnaní s voľnou protilátkou 2B8.

Obrázok 37. A) SB bunky sa premyjú a resuspendujú na koncentráciu 90 x 10⁶ buniek/ml zried’ovacím pufrom (IX PBS, pH 7,4) obsahujúcom 1 % (hmotnosť/objem) bovinného sérumalbumínu. Vzrastajúca koncentrácia buniek sa inkubuje počas 3 h so 7,5 ng/ml In2B8, ktorá sa pripraví s použitím 2B8-MX-DTPA, šarža 0165A. B) Dvojito inverzné vynesenie koncentrácie buniek proti pomeru viazaná aktivita/celková aktivita (B/AT). Imunoreaktivita sa vypočíta ako úsek 1/y x 100. Zistené hodnoty imunoreaktivity a korelačného koeficientu (R) sú 80,6 % respektíve 0,981.

Obrázok 38. A) SB bunky sa premyjú a resuspendujú na koncentráciu 90 x 10⁶ buniek/ml zried’ovacím

SK 288096 Β6 pufrom (IX PBS, pH 7,4) s obsahom 1 % (hmotnosť/objem) bovinného sérumalbumínu. Vzrastajúce koncentrácie buniek sa inkubujú počas 3 h s 2 ng/ml Y2B8, ktoré sa pripravia s použitím 2B8-MX-DTPA, šarža # 0165A. B) Dvojito inverzné vynesenie bunkovej koncentrácie proti pomeru viazaná aktivita/celková aktivita (B/AT). Imunoreaktivita sa vypočíta ako úsek 1/y x 100. Zistené hodnoty imunoreaktivity a korelačného koeficientu (R) sú 72,2 % respektíve 0,999.

Nasleduje podrobný opis vynálezu.

Definície

Pokiaľ sa nedefinuje inak, majú všetky technické a vedecké pojmy rovnaký význam, ako je význam, ktorý zvyčajne chápe ten, kto má bežnú skúsenosť v odbore, ktorému tento vynález náleží. Aj keď možno v praxi alebo testovaní tohto vynálezu použiť akékoľvek spôsoby a materiály podobné alebo ekvivalentné tým, ktoré sa tu opisujú, opisované materiály a spôsoby sa preferujú. Na účely tohto vynálezu sa definujú neskôr nasledujúce pojmy.

S nízkym obsahom kovu - znamená činidlá spracované na zníženie kontaminácie kovom na hladinu, ktorá neovplyvňuje inkorporáciu rádioaktívneho nuklidu.

Antigén-pozitívny - znamená antigén, ktorý je rozpoznávaný konkrétnou protilátkou podľa tohto vynálezu takým spôsobom, že táto protilátka je schopná sa s ním viazať.

% rádioinkorporácie (inkorporácia rádionuklidu) - sa týka množstva rádioaktívnej značky z reakcie značenia rádionuklidom, ktorá sa konjuguje protilátkou, vztiahnutá na celkové množstvo rádioaktívnej značky pridanej na začiatku reakcie.

% väzby sa týka množstva protilátky zo vzorky, ktorá sa viaže na cieľový antigén, špecificky alebo nešpecifický.

% imunoreaktivity alebo špecifickosť väzby sa týka toho množstva vzorky protilátky, ktorý sa viaže na cieľový antigén špecificky.

Diagnostická protilátka sa týka protilátky konjugovanej s rádioaktívnou značkou, ako je rádionuklid ^U1ln, ktorá môže poskytnúť diagnostické zobrazenie tumorov a antigén-pozitívnych buniek.

Terapeutická protilátka sa týka protilátky konjugovanej s niektorým žiaričom alfa alebo beta (ako je ⁹⁰Y), ktorý môže uskutočniť usmrcovanie buniek pri väzbe na cieľový antigén.

Opis vynálezu

Preklinický vývoj myší monoklonálnej protilátky proti CD20, 2B8, konjugovanej 2B8, 2B8 značenej rádionuklidom ^1HIn a 2B8 značené rádionuklidom ⁹⁰Y

I. Materiály a spôsoby vývoja myšej monoklonálnej protilátky proti CD20, 2B8, konjugovanej 2B8-MX-DTPA, 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ^1HIn a⁹⁰Y MX-DTPA purifikovanej vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou

A. Materiály

1. Bunky

Ľudské bunkové línie SB a HSB sa získajú od American Type Culture Collection a pestujú sa v RPMI-1640 obsahujúcom 10 % fetálne bovinné sérum. CD20-pozitívna bunková línia SB je B lymfoblastoidná bunková línia odvodená od periférneho „buffý coat“ (tenká žltkastá vrstva leukocytov nad vrstvou červených krviniek v centrifúgovanej krvi) pacienta s akútnou lymfoblastickou leukémiou (R. A. Adams, A. Flowers a

B. J. Davis: Direct Implantation and Transplantation of Human Acute Lymphoblastic Leukémia in Hamsters, SB-2. Cancer Research, 28, 1121-1125 (1968). Antigén-negatívna bunková línia HSB je T-lymfoblastoidná bunková línia odvodená od tumorov indukovaných pri novorodených sýrskych škrečkoch (R. A. Adams: Formal Discussion: The Role of Transplantation in the Experimental Investigation of Human Leukémia and Lymphoma. Cancer Res., 27(1), 2479-2482 (1967). Bunková línia myšieho myelómu SP2/0 sa udržuje podobne v RPMI-1640 s obsahom 10 % fetálneho bovinného séra.

2. Protilátky

Protilátky BI a Leu 16 proti CD20 pochádzajú od Coulter Immunology respektíve Becton/Dickinson. Kozie protilátky proti myšiemu IgG a kozie protilátky proti ľudskému IgG značené ¹²⁵I sa získajú od ICN. Kozia F(ab')2 proti myšiemu IgG sa získa od Cappela.

3. Činidlá

Freundové úplné a neúplné adjuvantné látky sa získajú od Sigma Chemical Company. Polyetylénglykol, koncentrát HAT a HT pochádzajú napospol od Boehringer Mannheim. Fluoresceínizotiokyanát (FITC) pochádza od Sigma Chemical Company. Rádionuklid ^1HIn vo forme chloridu a rádionuklid ⁹⁰Y vo forme chloridu sa získa od Amersham alebo NEN Dupont. ⁸⁹Y vo forme chloridu sa získa od Aldrich Chemical Company. Všetky ostatné chemikálie pochádzajú zo štandardných zdrojov.

Chemikálie použité na konjugáciu a značenie rádionuklidom sa spracujú na odstránenie kontaminujúcich iónov ťažkých kovov, ktoré by konkurovali s rádioizotopmi v priebehu kroku značenia rádionuklidom. Che17

SK 288096 Β6 mikálie sa obyčajne spracovávajú prechodom roztokov stĺpcom iónomeniča Chelex 100 (Bio-Rad Industries) alebo šaržovým spracovaním prídavkom Chelex 100 k pripravenému roztoku. Voda s nízkym obsahom kovov buď „Milli-Q“, alebo „Water for Irrigation“ (WFIr) sa používa na všetky prípravky a všetky zriedenia. Roztoky neobsahujúce kovy sa podrobia sterilnej filtrácii a zhromažďujú sa v plastických nádobách.

B. Spôsoby uskutočnenia

1. Príprava a skríning supematantov hybridómu 2B8 pomocou rádioimunoeseje

Myši BALB/c sa imunizujú s 20 miliónmi SB buniek suspendovanými vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom s použitím Freundovho kompletného adjuvantného prostriedku. Bunky sa podávajú podkožné aj intraperitoneálne do viacerých miest zvieraťa. Po 2 týždňoch obdobia pokoja sa myšiam podávajú druhýkrát SB bunky emulgované vo Freundovom neúplnom adjuvantnom prostriedku. Následné zosilňovacie imunizačné injekcie sa podávajú na základe týždenného rozpisu s použitím SB buniek suspendovaných vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom. Myši sa imunizujú počas 6 týždňov až 4 mesiacov.

Vždy sa súčasne usmrcujú dve zvieratá cervikálnou dislokáciou a ich sleziny sa vyberú na fúziu s myším myelómom SP2/0. Zvieratá sa volia na základe schopnosti post-imunitného séra účinne inhibovať väzbu rádioaktívne značenej Coulter B1 protilátky proti CD20 s ľudskými SB bunkami. Tri dni pred každou fúziou sa zvolené zvieratá podrobia jednej poslednej intravenóznej (do chvostovej vény) injekcii 20 miliónov SB buniek v PBS. Pri usmrtení sa sleziny vyberú za aseptických podmienok a splenocyty sa podrobia fúzii s bunkami SP2/0 v pomere 5 : 1 (splenocyty: SP2/0). Bunky po fúzii sa premyjú médiom pre tkanivové kultúry a rozdelia do 96 jamiek obsahujúcich selekčné médiá HAT. Hybridómy sa podrobia skríningu inhibičnou rádioimunoesejou s použitím protilátky Coulter BI po 10 až 14 dňoch.

Skríning hybridómov vylučujúcich protilátku proti CD20 sa uskutoční s použitím zavedených spôsobov rádioimunoeseje. V stručnosti sa protilátka Coulter BI proti CD20 purifikuje Protein A afinitnou chromatografiou. 50 pg purifikovanej protilátky sa naviaže na rádionuklid ^1Ž5I rýchlou oxidáciou v prítomnosti prostriedku lodobeads (Pierce Chemical Co.) podľa návodu výrobcu. Značená protilátka sa zbaví soli na amberlitovej živici a uloží v zrieďovacom pufri (fyziologický roztok pufrovaný fosfátom, pH 7,4, s obsahom 0,2 % želatíny, 0,02 % azidu sodného a 1,0 % bovinného sérumalbumínu). 10 ng protilátky značenej rádionuklidom sa umiestni do každej jamky predbežne blokovanej filtračnej dosky (blokovací pufer: zrieďovací pufer obsahujúci 10 % fetálneho bovinného séra) spolu s 50 pl supematantu hybridómu z testovacích jamiek a 100 000 SB bunkami suspendovanými v 50 pl zrieďovacieho pufra. Suspenzia sa inkubuje počas 1 h pri teplote okolia. Dosky sa dôkladne premyjú premývacím pufrom (fyziologický roztok pufrovaný fosfátom, pH 7,4 s obsahom 0,2 % želatíny a 0,02 % azidu sodného) na vákuovom zbernom zariadení V&P Scientific a filtračné dná obsahujúce zachytené bunky sa prevedú na čítač gama. Jamky obsahujúce iba médiá HAT a značenú protilátku BI sa použijú ako kontroly pozadia a identické jamky obsahujúce SB bunky sa použijú ako kontroly pozadia a identické jamky obsahujúce SB bunky sa použijú ako pozitívne kontroly. Inhibičné kontroly obsahujú protilátku B1 značenú rádionuklidom a rôzne množstvá neznačenej protilátky B1 v rozmedzí od 2 pg do 2 ng.

2. Prietokovo cytometrické štúdie

a. Bunkové línie

Predbežné prietokovo cytometrické štúdie sa uskutočňujú so supematantmi z kultúr hybridómu 2B8. 100 pl supematantu hybridómu sa inkubuje s SB bunkami počas 1 h pri teplote okolia. Potom sa pridá sekundárna protilátka (kozia F(ab')2 oproti myšiemu IgG, Cappel) použitá pri zriedení 1/400 a inkubácia pokračuje v tme počas 1 h. Bunky sa premyjú 5x. Kontroly zahrnujú iba bunky (nie však primárnu alebo sekundárnu protilátku), pre ktoré sa stanoví autofluorescencia, bunky so sekundárnou protilátkou iba na stanovenie nešpecifickej väzby a komerčne dostupnou BI konjugovanou s fluoresceínizotiokyanátom (BI-FITC) na kontrolu populácie CD20.

Pri niektorých experimentoch sa fluoresceín kopuluje s purifikovanou protilátkou 2B8 reakciou aminoskupín s fluoresceínizotiokyanátom (FITC). V stručnosti sa inkubuje protilátka 2B8 (1,2 mg/ml) pri pH 9,5 v 0,1 M pufri uhličitanu sodného so 150 až 200 pg FITC na mg proteínu. Roztok sa inkubuje pri teplote miestnosti počas 2 h, výsledný konjugát 2B8-FITC sa purifikuje na stĺpci Sephadex G-25. Ostatné chemikálie použité v týchto štúdiách, ako je BI a Leu 16, sa získajú ako fluoresceínové konjugáty priamo od firmy Coulter alebo Becton Dickinson.

Bunky na analýzu sa odoberú a premyjú 3x fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom s obsahom 0,2 % bovinného sérumalbumínu a 0,1 % azidu sodného. Životnosť sa stanoví exklúziou trypánovej modrej s požiadavkou na životnosť >90 %. Bunkové koncentrácie sa upravia na 3 milióny na ml 50 μΐ pridanými na jamku do 96-jamkových misiek s dnom U. Primárna protilátka (50 μΐ) sa pridá k príslušným jamkám a zmes sa inkubuje počas 30 min. až 1 h pri teplote miestnosti. Potom sa bunky premyjú 5x fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom, 200 μΙ/jamka, s obsahom 0,2 % BSA a 0,02 % azidu sodného. Bunky sa centrifugujú v miskách pri frekvencii otáčania 1 300 min.’¹ v centrifúge Sorvall a supematanty sa jemne odstránia „klepnutím“ na misky. Druhá protilátka sa pridáva podľa potreby a inkubuje sa počas ďalších 30 min. až 1 h pri teplote okolia v tme. Misky sa potom premyjú ako vyššie. Nakoniec sa ku každej vzorke pridá 200 μΐ fixačného

SK 288096 Β6 pufra (0,15 M roztok chloridu sodného s obsahom 1 % paraformaldehydu pri pH 7,4) a spracované bunky sa prenesú do skúmaviek 12x75 mm na analýzu,

b. Celková krv opíc Cynomolgus

Po odstránení plazmy sa bunky premyjú 2x centrifúgácou a resuspendujú v HBSS. Pridá sa fetálne bovinné sérum (2 ml) a bunky sa resuspendujú. 100 μΐ resuspendovaných buniek sa potom pridá do každej zo 6 15ml kónických centrifúgačných skúmaviek. Fluorescenčné značené monoklonálne protilátky sa pridajú nasledujúcim spôsobom:

Skúmavka 1: myšia protilátka proti CD2-FITC (AMAC), 2,5 pg/ml, 5 pg.

Skúmavka 2: kozia protilátka proti ľudskému IGM-FITC (Fisher) 2,5 pg/ml, 5 pg.

Skúmavka 3: kozia protilátka proti myšiemu IgG-RPE (Fisher) 2,5 pg/ml, 5 pg.

Skúmavka 4: kozia protilátka proti myšiemu IgM-FITC + kozia protilátka oproti myšiemu IgG-RPE (absorbovaná) 2,5 pg/ml, 5 pg.

Skúmavka 5: protilátka proti ľudskému CD20-FITC (anti-Leu 16, Becton Dickinson) 5 pg.

Skúmavka 6: len bunky (autofluorescencia).

Značené protilátky a bunky sa centrifúgujú počas 2 min. pri frekvencii otáčania 1 500 min.'¹ na premiešanie buniek a protilátok a všetkých 6 vzoriek sa potom umiestni na ľad a inkubuje počas 30 min. Následne sa skúmavky odstránia z ľadu a pridá sa cytolytický pufer (predhriaty na 37 °C) na dosiahnutie objemu 12 ml. Vzorky sa potom inkubujú počas 15 min. pri teplote miestnosti, centrifúgujú počas 5 min. pri teplote 4 °C pri frekvencii otáčania 1 500 min.'¹ a supematanty sa odoberú. Bunkové pelety sa potom premyjú 2x značkovacím pufrom (fyziologický roztok pufrovaný fosfátom s obsahom 1 % bovinného sérumalbumínu a 0,05 % azidu sodného).

Následne sa bunky fixujú prídavkom 0,5 ml fixačného pufra (0,15 M roztok chloridu sodného, pH 7,4 s obsahom 1 % paraformaldehydu) na skúmavku a analyzujú sa na prístroji Becton Dickinson FACScan s použitím autokompenzácie a predbežnej kalibrácie prostriedkom Calibrite. Zelená fluorescencia fluoresceínu sa meria v režime FL1 a červená fluorescencia fykoereterínu sa meria v režime FL2. Údaje sa vyjadrujú v logaritmickej forme. Populácia životných lymfocytov sa najskôr identifikuje rozptylom svetla v pravom uhle k smeru vpred v dot plot bitmap. Celková populácia lymfocytov sa potom izoluje elimináciou všetkých ostatných prípadov.

Následné merania fluorescencie odrážajú len tie špecifické prípady, ktoré nastanú v rámci vymedzenej oblasti.

Pre štúdie farmakológie/toxikológie vysokých dávok sa stanovia predbežne hladiny lymfocytov pre každú opicu Cynomolgus a použijú sa ako východiskové hodnoty. Prítomnosť T buniek a B buniek a pomery T : B sa vypočítajú a použijú ako údaje o vyčerpaní. Populácia B buniek pred štúdiom sa vyhodnotí pomocou protilátok Leu 16 a protilátok oproti ľudskému IgM.

Po injekčnom podaní protilátky 2B8 opiciam, kedy sa antigén CD20 nasýti 2B8, sa percento B buniek v celkovej populácii aproximuje s použitím kozej protilátky proti ľudskému IgM-FITC, protilátky proti myšiemu IgG-RPE a dvojito označenej populácii obsahujúcej tieto dva markery. Dvojito označená populácia sa použije na kvantitatívne vyhodnotenie až do vyčistenia všetkých 2B8 z periférnej krvi zvierat. Percento T buniek v celkovej populácii lymfocytov sa určí s použitím protilátky proti CD20-FITC. Údaje sa získajú ako priemery z troch hodnôt, 10 000 meraní sa uskutoční s každou vzorkou. Bunky z každej z určených vzoriek krvi sa vyhodnotia následne s vyčíslením v každom prípade T-bunkových a B-bunkových populácií v rámci celkovej populácie lymfocytov. Skúmajú sa pomery T : B. Vyčerpanie B buniek sa vypočíta ako percento zníženia B buniek vzhľadom na pôvodné hladiny B buniek pre každú jednotlivú opicu.

3. Značenie rádioaktívnym jódom a imunoprecipitácia CD20

Sto miliónov SB buniek sa rozdelí na dve rovnaké časti po povrchovom jódovaní rádionuklidom ¹²⁵I a prostriedkom lodobeads (Pierce Chemical Co.). Bunky sa opakovane premyjú centrifúgáciou vykonávanou tak dlho, až sa hladiny rádioaktivity v supematante vrátia na hodnotu pozadia. 100 pg protilátky 2B8 alebo B1 (Coulter Immunology) sa pridá k obidvom vzorkám značených B buniek. Protilátky a SB bunky sa inkubujú cez noc, a potom sa premyjú trikrát centrifúgáciou tak, aby sa odstránila všetka voľná protilátka. Bunkové pelety obsahujúce viazané protilátky 2B8 a B1 sa potom podrobia cytolýze a extrahujú prídavkom 1 % detergentného prostriedku NP-40 v 0,01 M pufri Tris-HCl, pH 8,0, s následnou inkubáciou pri teplote miestnosti počas 1 h. Extrakt sa centrifúguje v mikrocentrifúge pri vysokej rýchlosti počas 30 min. a supematanty sa prenesú do nových skúmaviek. Pridá sa proteín A- sefaróza (300 pl) do každej skúmavky a živica sa peletuje centrifúgáciou. Potom sa proteín A-sefaróza premyje 20x na odstránenie nešpecifický viazaného jódovaného proteínu. Keď dosiahne pomer aktivity tuhej látky k supernatantu hodnotu 100, extrahuje sa peleta pufrom SDS PAGE a zahrieva sa k varu. Po ochladení sa pridáva množstvo extraktu s početnosťou impulzov zhruba 15 000 imp/min. do jamiek v 10 % polyakrylamidovom géli. Vopred značený nízkomolekulámy štandard (BioRadlnc.) sa pridáva do samostatnej jamky a použije sa na určenie molekulovej hmotnosti. Proteín sa rozdelí elektroforézou a gél sa vysuší a exponuje s rtg. filmom počas 24 h pri teplote - 70 °C. Potom sa film vyvolá a analyzuje.

SK 288096 Β6

4. Scatchardova analýza väzby 2B8

Purifikovaná 2B8 sa vyhodnotí ohľadom zdanlivej afinity Scatchardovou analýzou. 2B8 označená rádionuklidom sa pripraví reakciou s rádionuklidom ^l25I v prítomnosti prostriedku lodobeads. Po odstránení voľného jódu sa protilátka značená rádionuklidom jódu inkubuje pri rôznych koncentráciách po dvojiciach v rozmedzí od 5 000 ng/jamka do 35 ng/jamka s 10 000 SB bunkami. Miera väzby protilátky k bunkám sa vypočíta zo špecifickej aktivity protilátky 2B8 značenej rádionuklidom ^l25I. Pomer viazaná protilátka/voľná protilátka sa vynesie oproti molámej koncentrácii viazanej protilátky a zdanlivá konštanta afinity sa stanoví z pomeru úseku na osi X a Y.

5. Príprava 2B8-MX-DTPA

a. Zdroj MX-DTPA

Pre niektoré preklinické štúdie sa získa l-izotiokyanatobenzyl-3-metyidietyléntriamínpentaoctová kyselina (MX-DTPA) značená rádioaktívnym nuklidom uhlíka ^I4C vo forme tuhej látky podľa Dr. Otto Gansowa z National Inštitúte of Health a ukladá sa vo vysušenom stave pri teplote 4 °C, chránená pred svetlom. Zásobné roztoky chelátu sa pripravia vo vode Milli-Q a koncentrácia sa stanoví vyhodnotením aktivity a použitím špecifickej aktivity zlúčeniny. Zásobné roztoky majú všeobecne koncentráciu 2 až 5 mM a ukladajú sa pri teplote -70 °C v polypropylénových skúmavkách. Pre ďalšie štúdie sa získa MX-DTPA od Coulter Immunology vo forme dvojnásobnej soli vo vode a ukladá sa pri teplote -70 °C.

b. Udržiavanie podmienok prostredia bez kovov

Navyše k použitiu chemikálií bez kovov sa všetky manipulácie s chemikáliami uskutočňujú takým spôsobom, aby sa obmedzila možnosť kontaminácie kovom. Pokiaľ je to možné, používajú sa polypropylénové plastové nádobky, ako sú banky, kadičky a kalibrované valce. Tie sa premyjú prostriedkom Alconox a vyčerpávajúcim spôsobom sa opláchnu pred použitím vodou Milli-Q. Navyše sa používajú špičky pipiet (Bio-Rad) bez kovov na presné odmeranie malých objemov. Na spracovanie veľkých objemov alebo chemikálií sa používajú sterilné plastové sérologické pipety (možno dostať od 1 do 25 ml). Reakcie sa vhodným spôsobom uskutočňujú v polypropylénových mikrocentrifugačných skúmavkách so skrutkovým uzáverom (Sardstedt Industries, 1,5 ml) alebo polypropylénových kónických skúmavkách (Costar, 15 ml a 50 μΐ). Pri manipulácii s dialyzačnými rúrkami sa používajú chirurgické rukavice na jednorazové použitie vopred premyté vodou Milli-Q.

c. Príprava protilátky

Myšia protilátka 2B8 proti CD20 sa najskôr purifikuje z ascitov Proteín A a QAE chromatografiou. Pre ďalšie pokusy sa 2B8 purifikuje zo supernatantov bioreaktora s dutými vláknami s použitím rovnakého purifikačného spôsobu. Protilátka odvodená od dutých vlákien sa teraz nahradí na účely komercializácie protilátkou odvodenou od CHO opísanou v príklade 2.

Táto protilátka sa pripraví na konjugáciu prenesením do 50 mM roztoku bicín- NaOH bez kovov, pH 8,6, s prítomnosťou chloridu sodného s koncentráciou 150 mM s použitím dialýzy alebo opakovanej výmeny pufra. V niektorých štúdiách sa výmena pufra uskutočňuje s použitím opakovanej ultrafiltrácie s filtrami Centricon 30 (Amicon) (30000D MWCO). Všeobecne sa na filtračnú jednotku prenesie 50 až 200 μΐ proteínu (10 mg/ml) a 2 ml bicínového pufra. Filter sa centrifuguje pri teplote 4 °C v rotore Sorval SS-34 pri frekvencii otáčania 6 000 min.'¹ počas 45 min. Objem retencie je zhruba 50 až 100 μΐ. Tento krok sa opakuje dvakrát s tým istým filtrom. Zvyšná látka sa prenesie do polypropylénovej skúmavky so skrutkovým uzáverom s obsahom 1,5 ml, analyzuje sa na stanovenie proteínu, zriedi na 10,0 mg/ml a ukladá pri teplote 4 °C do použitia pre konjugáciu. Pre niektoré štúdie sa proteín prevádza do 50 mM roztoku citrátu sodného, pH 5,5, s obsahom chloridu sodného s koncentráciou 150 mM a azidu sodného s koncentráciou 0,05 % s použitím rovnakého spôsobu, ako sa opisuje skôr.

d. Spôsob konjugácie

Konjugácia 2B8 s MX-DTPA sa uskutočňuje v polypropylénových skúmavkách pri teplote okolia. Zmrazené zásobné roztoky MX-DTPA sa pred použitím nechajú roztopiť. Zvyčajne reaguje 50 až 200 μΐ protilátky pri koncentrácii 10 mg/ml s chelátom v molámom pomere chelát k proteínu 4:1. Reakcia sa začne prídavkom chelátového zásobného roztoku a jemným premiešaním. Konjugácia sa nechá prebiehať cez noc, všeobecne počas 14 až 20 h pri teplote okolia. Nezreagovaný chelát sa z konjugátu odstráni dialýzou alebo opakovanou ultrafiltráciou, ako sa opisuje skôr, do normálneho fyziologického roztoku bez kovov (0,9 % hmotnosť/objem) s obsahom 0,05 % azidu sodného. Koncentrácia proteínu sa upraví na 10 mg/ml a roztok sa ukladá pri teplote 4 °C v polypropylénovej skúmavke až do času značenia rádionuklidom.

e. Stanovenie inkorporácie chelátu

Inkorporácia chelátu sa stanoví scintilačným meraním početnosti impulzov a porovnaním hodnoty získanej s purifikovaným konjugátom so špecifickou aktivitou chelátu značeného rádionuklidom ¹⁴C. Pre ďalšie štúdie, v ktorých sa používa nerádioaktívny chelát získaný od Coulter Immunology, sa inkorporácia chelátu hodnotí inkubáciou konjugátu so zvyškom roztoku rádioaktívneho nosiča rádionuklidu ⁹⁰Y so známou koncentráciou a špecifickou aktivitou.

V stručnosti sa zásobný roztok chloridu ytritého so známou koncentráciou pripraví v 0,05 N roztoku ky20 seliny chlorovodíkovej bez kovov, ku ktorému sa pridá beznosičový rádionuklid ⁹⁰Y (vo forme chloridu). Alikvotný podiel tohto roztoku sa meria na scintilačnom počítači na stanovenie presnej špecifickej aktivity tejto látky. Predpokladaný objem chloridu ytritého na pripojenie k protilátke, ktorý sa rovná dvojnásobku počtu molov chelátu, zvyčajne 2 mol/mol protilátky, sa pridá do polypropylénovej skúmavky a pH sa upraví na 4,0 až 4,5 2M roztokom octanu sodného. Potom sa pridá konjugovaná protilátka a zmes sa inkubuje počas 15 až 30 minút pri teplote okolia. Reakcia sa ukončí prídavkom 20 mM roztoku EDTA do konečnej koncentrácie 1 mM a pH roztoku sa upraví zhruba na 6 2 M roztokom octanu sodného.

Po 5 min. inkubácie sa celý objem purifikuje vysokovýkonnou gélovou permeačnou chromatografiou, ako sa opisuje neskôr. Eluované frakcie obsahujúce proteín sa spoja, stanoví sa koncentrácia proteínu a meria sa aktivita alikvotu. Inkorporácia chelátu sa zisťuje s použitím špecifickej aktivity ⁹⁰Y vo forme chloridu a koncentrácie proteínu.

f. Imunoreaktivita 2B8-MX-DTPA

Imunoreaktivita konjugovanej 2B8 sa vyhodnotí na základe ELISA pre celkové bunky. SB bunky fázy Mid-log sa odoberajú z kultúry centrifugácie a premyjú dvakrát IX HBSS. Bunky sa zriedia na 1 až 2 x 10⁶ buniek/ml v HBSS a alikvoty sa nanesú do 96-jamkových polystyrénových mikrolitrových misiek v množstve 50 000 až 100 000 buniek/jamka. Misky sa sušia vo vákuu počas 2 h pri teplote 40 až 45 °C na fixáciu buniek k plastu. Misky sa ukladajú a sušia pri teplote -20 °C do času použitia. Na analýzu sa misky ohrejú na teplotu okolia bezprostredne pred použitím, potom sa blokujú IX PBS, pH 7,2 až 7,4 s obsahom 1 % bovinného sérumalbumínu (2 h). Vzorky na rozbor sa zriedia v IX PBS/1 % BSA, nanesú do misiek a sériovo zriedia (1:2) tým istým pufrom. Po inkubácii misiek počas 1 h pri teplote okolia sa premyjú trikrát IX PBS. Sekundárna protilátka (kozia HRP konjugovaná špecifická protilátka proti myšiemu IgGl) (50 μΐ) sa pridá do jamiek (zriedenie 1 : 1500 v IX PBS/1 % BSA) a uskutoční sa inkubácia počas 1 h pri teplote okolia. Misky sa premyjú 4x IX PBS s následným prídavkom roztoku substrátu ABTS (50 mM citrát sodný, pH 4,5, s obsahom 0,01 % ATBS a 0,001 % peroxidu vodíka). Misky sa odpočítajú pri vlnovej dĺžke 405 nm po inkubácii počas 15 až 30 min. Antigén-negatívné HSB bunky sa použijú v rozboroch na monitorovanie nešpecifickej väzby. Imunoreaktivita konjugátu sa vypočíta vynesením hodnôt absorbancie oproti príslušnému faktoru zriedenia a porovnaním týchto dvoch hodnôt získaných s použitím natívnej protilátky (predstavujú 100 % imunoreaktivitu) testovanej na tej istej miske. Niekoľko hodnôt na lineárnej časti titračného profilu sa porovnáva a stanoví sa stredná hodnota.

g. Stabilita natívnej 2B8 a 2B8-MX-DTPA in vitro

Pre toto 12-týždenné stanovenie stability protilátky a konjugátu sa formuluje protilátka 2B8 a 2B8-MX-DTPA buď v normálnom fyziologickom roztoku, alebo vo fyziologickom roztoku obsahujúcom glycínhydrochlorid s koncentráciou 10 mM, pH 6,8. Duplicitné súbory vzoriek sa inkubujú pri 4 °C a 30 °C a vzorky sa analyzujú týždenne s použitím nasledujúcich spôsobov: SDS-PAGE (redukčná aj neredukčná), imunoreaktivita na základe enzymatickej imunoeseje pre celkové bunky s použitím buď SB (antigén-pozitívnych), alebo HSB (antigén-negatívnych) buniek na zachytenie a izoelektrická fokusačná gélová elektroforéza (v rozmedzí pH 3 až 10). Navyše sa hodnotí účinnosť značenia rádionuklidom v týždňoch 4, 8 a 12 označením konjugátu rádionuklidom ⁹⁰Y a analýzou produktu spôsobom SDS-PAGE a autorádiografiou. Nakoniec sa v oddelenej štúdii inkubujú alikvoty 2B8-MX-DTPA pri teplotách 4 °C a 30 °C počas 10 týždňov, označia sa rádionuklidom ^luIn a vyhodnotia v biodistribučnej štúdii pri myšiach BALB/c, ako sa opisuje neskôr.

h. Imunohistologické štúdie

Imunohistologické štúdie s natívnou a konjugovanou (2B8-MX-DTPA) protilátkou sa uskutočňujú v laboratóriách IMAPATH s použitím rezov ľudských tkanív fixovaných acetónom. Protilátka sa purifikuje zo supematantov bioreaktora s dutými vláknami chromatografiou na proteín A a Q sefaróza. Konjugát kvality na klinické použitie sa pripraví pomocou MX-DTPA z Coulter Immunology podľa skôr opísaného spôsobu.

i. Imunoreaktivita 2B8-MX-DTPA označenej rádionuklidom in vitro

Na niektoré pokusy sa používa spôsob ELISA pre celkové bunky na neznačenú 2B8-MX-DTPA. V ďalších experimentoch sa stanoví imunoreaktivita konjugátov značených rádionuklidmi ^HIIn a ⁹⁰Y (každý sa pripraví v IDEC Pharmaceuticals alebo alternatívne v MPI Pharmacy Services, Inc.) s použitím modifikovanej verzie imunoeseje pre celkové bunky, ktorú opísali T. Lindmo, E. Boven, F. Cuttitta, J. Fedoroko a P. A. Bunn v J. Immunol. Methods, 72, 77 (1984). V stručnosti sa pridávajú do duplicitných súborov skúmaviek antigén-pozitívne SB bunky alebo antigén-negatívne HSB bunky (20 až 30 x 10⁶ buniek/ml v zrieďovacom pufri (fyziologický roztok pufrovaný fosfátom, pH 7,4 obsahujúcom 1 % BSA, 0,1 % želatíny a 0,02 % azidu sodného)). Konjugát značený rádionuklidom sa zriedi do konečnej koncentrácie protilátky 1 až 5 ng/ml zrieďovacím pufrom a do každej skúmavky sa pridá 0,35 ml. Po 75 až 90 min. inkubačného času pri teplote miestnosti sa bunky peletujú centrifugáciou a zbierajú sa supematanty. Rádioaktivita zostávajúca v supematantovej frakcii sa stanoví čítačom gama alebo scintilačným počítačom. Údaje sa vynesú ako kvocient celkovej pridanej aktivity delený aktivitou viazanou na bunky proti prevrátenej hodnote počtu buniek na skúmavku. Úsek na osi y teda predstavuje imunoreaktívnu frakciu.

j. Stabilita 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom v ľudskom sére in vitro

Stabilita in vitro 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidmi ^1HIn a ’θΥ sa vyhodnotí inkubáciou v ľudskom sére pri teplote 37 °C počas 96 h. Konjugovaná protilátka sa pripraví a označí rádionuklidom ^U1ln (spôsob „mix-and-shoot“) alebo rádionuklidom ⁹⁰Y, ako sa opisuje skôr. Špecifické aktivity značených konjugátov s rádionuklidmi ^1HIn a ’θΥ sú 92,5 respektíve 540 MBq/mg (2,5 respektíve 14,6 mCi/mg). Konjugáty označené rádionuklidom sa suspendujú v pufri obsahujúcom 75 mg/ml ľudského sérumalbumínu (HSA) a koncentráciu 1 mM DTPA (konjugát značený ytriom) alebo v pufri obsahujúcom 50 mg/ml HSA (konjugát značený indiom). Konjugáty značené rádionuklidmi sa zriedia 1:10 normálnym ľudským sérom (nie však tepelne inaktivovaným) a alikvoty sa umiestnia aseptický do sterilných skúmaviek so zátkami. Tieto skúmavky sa potom inkubujú pri teplote 37 °C počas až 96 h. Pri zvolených časoch sa vzorky konjugátov odstránia a analyzujú pri neredukčných podmienkach spôsobom SDS-PAGE v géloch s gradientom 4 až 20 % autorádiograficky a chromatografiou na vopred pripravenej tenkej vrstve.

k. Stabilita klinicky formulovanej protilátky 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ^1HIn in vitro

Konjugát 2B8-MX-DTPA sa značí rádionuklidom ^H1In a použije sa bez purifikácie HPLC (spôsob „mix-and-shoot“). Protilátka označená rádionuklidom sa zriedi do fyziologického roztoku pufrovaného fosfátom a pridá sa ľudský sérumalbumín (HSA) do konečnej koncentrácie 50 mg/ml. Špecifická aktivita formulovaného konjugátu značeného rádionuklidom je 81 MBq/mg (2,2 mCi/mg). Tento formulovaný konjugát sa následne inkubuje pri teplote 4 °C počas 48 h a alikvoty sa analyzujú v časoch 0, 24 a 48 h s použitím neredukčného spôsobu SDS-PAGE v 4 až 20 % géloch s následnou autorádiografiou a chromatografiou na vopred pripravenej tenkej vrstve. Imunoreaktivita sa pre každý čas vyhodnotí s použitím eseje suspenzie celkových buniek, ktorá sa opisuje v oddiele 1.

l. Stabilita klinicky formulovanej protilátky 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ⁹⁰Y in vitro

Konjugát 2B8-MX-DTPA sa značí rádionuklidom ⁹⁰Y a purifikuje vysokovýkonnou gélovou permeačnou chromatografiou s použitím IX PBS ako elučného pufra. Označené frakcie konjugátu sa spoja a pridá sa ľudský sérumalbumín a DTPA do konečnej koncentrácie 75 mg/ml respektíve 1 mM. Špecifická aktivita tohto formulovaného konjugátu označeného rádionuklidom je 540 MBq/mg (14,6 mCi/mg). Tento formulovaný konjugát sa následne inkubuje pri teplote 4 °C počas 48 h a alikvoty sa analyzujú v časoch 0, 24 a 48 h s použitím neredukčného spôsobu SDS-PAGE v 4 až 20 % géloch s následnou autorádiografiou a chromatografiou na vopred pripravenej tenkej vrstve. Imunoreaktivita v každom čase sa vyhodnotí s použitím eseje suspenzie celkových buniek opísanej v sekcii 1.

2. Štúdie na zvieratách

a. Štúdie farmakológie/toxikológie vysokých dávok s použitím 2B8 na primátoch

Protilátka 2B8 sa hodnotí v štúdii farmakológie vysokých dávok uskutočnenej za podmienok dobrej laboratórnej praxe vo White Sands Research Center (číslo štúdie 920111). Používajú sa dospelé opice Macaca Fascicularis (Cynomolgus); každá skupina sa skladá z jedného samca a jednej samice. Protilátka sa podávala intravenózne každých 48 h, celkom 7 injekcií. Štúdium zahrnovalo päť skupín: skupina I (fyziologický roztok), skupina 11 (0,6 mg/kg), skupina III (2>5 mg/kg), skupina IV (10 mg/kg) a skupina V (10 mg/kg len v deň 0).

Pred začatím štúdie sa všetkým 10 zvieratám odoberie krv na určenie pozadia látky a počiatočných B-bunkových populácií. Všetky následné vzorky krvi sa odoberajú pred každou injekciou protilátky. Skupiny III a IV sa utratia v deň 13 kvôli uskutočneniu úplnej pitvy a histopatológie.

Zvieratám v skupinách I, II a V sa odoberie krv v dňoch 0, 1, 3, 7, 13, 21, 37 a 52, zhruba 5 ml krvi do heparinizovaných skúmaviek. Celková krv sa udržuje pri teplote 42 °C a analyzuje v priebehu 24 h. Krv z každého zvieraťa sa centrifuguje pri frekvencii otáčania 2 000 min.'¹ počas 5 min. a plazma vo forme supernatantu sa odoberie na stanovenie hladín 2B8 v sére rádioimunoesejí (pozri vyhotovenie rádioimunoesejí ohľadne špecifických spôsobov esejí). Peletovaná látka obsahujúca PBL a RBC sa resuspenduje vo FCS na prevedenie analýzy FACS.

b. Farmakokinetické štúdie s 2B8 a 2B8-MX-DTPA

Stredný sérový polčas 2B8 pri opiciach Cynomolgus sa stanoví s použitím zvierat skupiny V (skôr). Kozie protimyšie IgGl (Fisher Scientific) sa zriedia na 2,0 pg na ml v 10 mM borátovom pufri, pH 9,6 a ku každej jamke v 96-jamkovej miske sa pridá 50 pl. Protilátka sa ponechá naviazať v priebehu inkubácie cez noc pri teplote 4 °C alebo počas 2 h pri teplote okolia. Každá miska sa blokuje počas 30 min. pri teplote okolia so 150 pl na jamku fyziologického roztoku pufrovaného fosfátom obsahujúceho 1 % bovinného sérumalbumínu. Misky sa premyjú destilovanou vodou a vzorky séra alebo plazmy sa nanesú po trojiciach do jednotlivých jamiek v počiatočnom zriedení 1 : 100 s následnými sériovými zriedeniami 1 : 2. Purifikovaná 2B8 sa pridá k vopred získaným séram a zriedi na získanie štandardnej krivky počínajúc od 0,5 mg/ml. Vzorky sa zriedia 1 : 100, a potom sa zriedia sériovo ako ostatné vzorky. Misky sa inkubujú počas 1 h pri teplote okolia a premyjú 4x destilovanou vodou. Potom sa pridá sekundárne činidlo (kozia protilátka proti myšiemu lgGlHRPO) v zriedení 1 : 4 000 a inkubuje sa pri teplote miestnosti počas ďalšej 1 h. Misky sa opäť premyjú v

SK 288096 Β6 destilovanej vode a pridá sa 0,1 ml peroxidázového substrátu obsahujúceho peroxid vodíka. Počas 20 min. sa nechá vyvíjať zafarbenie. Absorpcia sa potom stanoví pri vlnovej dĺžke 405 nm s použitím vyhodnocovacieho zariadenia ELISA. Výsledky sa vynášajú v pg protilátky na ml séra.

Navyše sa stanovia hodnoty β ti/₂ pre 2B8 a 2B8-MX-DTPA pri myšiach BALB/c. Nekonjugovaná 2B8 uložená pri teplote -70 °C v IX PBS, pH 7,4/10 % glycerolu sa nechá roztopiť, zriedi na 0,5 mg/ml a sterilné filtruje. Konjugovaná protilátka sa pripraví podľa štandardných protokolov, ale s chelátom značeným rádionuklidom ¹⁴C. Inkorporácia chelátu je 1,5 mol/mol protilátky. Purifikovaný konjugát sa zriedi na 0,5 mg/ml v normálnom fyziologickom roztoku (0,9 %), sterilné sa prefiltruje a uloží pri teplote 4 °C s natívnou protilátkou do použitia.

Myši staré 6 až 8 týždňov dostanú injekčné 100 μϊ purifikovanej protilátky 2B8 pri koncentrácii 250 pg/ml. Potom sa odoberie krv retroorbitálnou punkciou v rôznych časoch od 0 do 264 h a ich séra sa analyzujú ohľadne prítomnosti natívnej a konjugovanej protilátky 2B8 enzymatickou imunoesejou celkových buniek s použitím antigén-pozitívnych B-buniek línie SB na zachytenie. Výsledné údaje sa vynášajú ako koncentrácia 2B8 alebo 2B8-MX-DTPA oproti času. Z týchto výsledkov sa získa lineárne regresívne vynesenie a smernica sa použije na stanovenie hodnôt β ti/₂.

c. Farmakologické/toxikologické štúdie 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ⁸⁹Y pri opiciach Cynomolgus

Protilátka 2B8-MX-DTPA značená rádionuklidom ⁸⁹Y sa pripraví spôsobom opísaným na zavedenie ⁹⁰Y ale bez použitia purifikácie vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou. Nerádioaktívny konjugát s kovom sa pripraví v IX PBS obsahujúcom 75 mg/ml ľudského sérumalbumínu a 1 mM DTPA a hodnotí sa v štúdii dobrej laboratórnej praxe č. 920611 vo White Sands Research Center. Každá zo 4 skupín sa skladá z jedného samca a jednej samice. Zvieratám sa podá intravenózne každých 48 h celkom 7 injekcií s celkovými množstvami látky: skupina I (fyziologický roztok), skupina II (0,003 mg/kg), skupina III (0,03 mg/kg) a skupina IV (0,3 mg/kg). Zvieratá sa vyhodnotia v priebehu štúdia stanovením telesných hmotností a teplôt, spotreby vody a potravy, eliminácie, sérovej biochémie, hematológie, analýzy moču a telesnej prehliadky. Zvieratám v skupinách I až IV sa odoberie krv pred infúziou v dňoch 0, 2, 7, 10 a 14 a analyzuje sa ohľadne hladín B- buniek v obehu analýzou FACS.

d. Biologická distribúcia 2B8-MX-DTPA značená rádionuklidom

V predbežnej štúdii sa hodnotí 2B8-MX-DTPA značená rádionuklidom ^HIIn ohľadne biologickej distribúcie v tkanivách pri 6 až 8 týždňoch starých myšiach BALB/c. Konjugát označený rádionuklidom sa pripraví s použitím klinickej kvality 2B8-MX-DTPA po uskutočnení spôsobu „mix and shoot“ opísaného skôr. Špecifická aktivita konjugátu je 85 MBq/mg (2,3 mCi/mg) a konjugát sa formuluje vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom, pH 7,4, obsahujúcom 50 mg/ml HSA. Myšiam sa podáva intravenózne 100 pl 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ^luIn, zhruba 777 kBq (21 pCi) a skupiny troch myší sa utratia cervikálnou dislokáciou v časoch 0, 24, 48 a 72 h. Po utratení sa odoberie chvost, srdce, pľúca, pečeň, oblička, slezina, sval a femur. Taktiež sa odoberie na analýzu vzorka krvi. Aktivita každej vzorky sa stanoví meraním počtu impulzov žiarenia gama a stanoví sa percento injikovanej dávky na gram tkaniva. Nevynakladá sa žiadna snaha na odčítanie príspevku aktivity krvi obsiahnutej v jednotlivých orgánoch.

Vo zvláštnom pokuse sa inkubujú alikvoty protilátky 2B8-MX-DTPA pri teplote 4 °C a 30 °C počas 10 týždňov, keď sa obidva prípravky značia rádioaktívnym nuklidom ^1HIn do špecifickej aktivity 78 MBq/mg (2,1 mCi/mg). Konjugáty sa potom použijú pri štúdiách biologickej distribúcie pri myšiach, ako sa opisuje skôr.

Pre dozimetrické stanovenia sa značia 2B8-MX-DTPA rádionuklidom ^1HIn do špecifickej aktivity 85 MBq/mg (2,3 mCi/mg) a zhruba 41 MBq (1,1 pCi) sa podáva injekčné každej z 20 myší BALB/c. Následne sa skupiny po 5 myšiach utratia v časoch 1, 24, 48 a 72 h a ich orgány sa vyberú a pripravia na analýzu. Navyše sa vyberú podiely kože, svalu a kosti a spracujú na analýzu. Taktiež sa zbiera moč a stolica a analyzuje sa pre čas 24 až 72 h.

S použitím podobného prístupu sa tiež označí 2B8-MX-DTPA rádionuklidom ⁹⁰Y a biologická distribúcia sa hodnotí pri myšiach BALB/c v priebehu obdobia 72 h. Po purifikácii vysokovýkonnou kvapalinovou permeačnou chromatografiou sa 4 z 5 myší podáva intravenózne po 37 MBq (1 mCi) klinicky formulovaného konjugátu (špecifická aktivita 451 MBq/mg (12,2 mCi/mg)). Skupiny sa následne utratia v časoch 1, 24, 48 a 72 h a orgány a tkanivá sa analyzujú podľa opisu skôr. Aktivita každej vzorky tkaniva sa stanoví meraním energie brzdného žiarenia scintilačným čítačom gama. Hodnoty aktivity sa následne vyjadria ako percento podanej dávky na gram tkaniva alebo percento dávky na orgán. Orgány a ďalšie tkanivá sa opakovane oplachujú na odstránenie nadbytočnej krvi, ale nepodrobujú sa perfuzii. Preto hodnoty aktivity orgánu nie sú oprávnené na príspevok aktivity krvi prítomnej vnútri orgánu.

e. Lokalizácia 2B8-MX-DTPA značenej ^1HIn v tumore

Lokalizácia 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom sa stanoví pri atymických myšiach s Ramosovými B-bunkovými tumormi. Šesťtýždňové až osemtýždňové atymické myši sa injikujú podkožné (zadná časť ľavého boku) dávkou 0,1 ml RPMI-1640 obsahujúce 1,2 x 10⁷ buniek Ramosovho tumoru vopred adaptova23

SK 288096 Β6 ných na rast v organizme atymických myší. Tumory vznikajú v priebehu dvoch týždňov a ich hmotnosť je v rozmedzí 0,07 až 1,1 g. Myši dostanú intravenózne 100 μΐ 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ^1HIn, 618 kBq (16,7 pCi) a skupiny po troch myšiach sa utratia cervikálnou dislokáciou v časoch 0, 24, 48 a 72 h. Po utratení sa odoberie chvost, srdce, pľúca, pečeň, oblička, slezina, sval, femur a tumor, premyje, zváži a taktiež sa odoberie na analýzu vzorka krvi. Aktivita každej vzorky sa stanoví meraním početnosti impulzov gama a vyjadrí sa percento injikovanej dávky na gram tkaniva.

3. Dozimetrické výpočty

S použitím údajov o biologickej distribúcii pri myšiach BALB/c, ktoré dostali injekčné 2B8-MX-DTPA značenej ^H1In alebo ⁹⁰Y (tabuľky 1 až 4 a 5 až 8) sa vypočítajú odhady radiačnej dávky absorbovanej na základe aktivity 37 MBq (1,0 mCi) podanej pacientovi s hmotnosťou 70 kg s použitím spôsobu formalizovaného Medical Intemal Radiation Dose (MIRD) Committee of the Society of Nuclear Medicíne. Biologické polčasy konjugátov značených rádionuklidom sa stanovia z injikovanej dávky na orgán stanovené z údajov biologickej distribúcie pre každý rádioimunokonjugát. Pre niektoré tkanivá, napríklad krv, sa predpokladá, že biologický úbytok rádiokonjugátu sleduje dvojkompartmentový model s exponciálnym úbytkom z týchto kompartmentov. Pre ďalšie tkanivá, napríklad pečeň, ktorých hladiny aktivity zostávali zhruba konštantné v priebehu biodistribučnej štúdie počas 72 h, sa predpokladá, že biologický polčas je veľmi dlhý a prisudzuje sa mu hodnota 1 000 h.

Tabuľka 1

Distribúcia aktivity 1,0 h po intravenóznej injekcii ^ulIn-2B8-MX-DTPA pri normálnych BALB/c myšiach

Stredné hodnoty ± smerodajná odchýlka Vzorka Hmotnosť orgánu % podanej dávky/ % podanej dávky/ g g orgán

Krv	1,47 + 0,17	40,3 ± 5,32	58,4 + 3,1
Srdce	0,087 + 0,01	5,88 ± 0,76	0,51+0,05
Pľúca(2)	0,149 + 0,01	14,2+ 1,4	2,10 + 0,17
Oblička (1)	0,127 + 0,02	9,82 ± 0,86	1,22 + 0,12
Pečeň	1,06 + 0,20	10,32+ 1,58	10,76+ 1,93
Slezina	0,090 + 0,01	6,94+ 1,17	0,61 + 0,03
Sval	8,39 + 0,98	0,70 ± 0,25	5,67+ 1,35
Kosť	3,15 + 0,35	2,97 + 0,71	9,10+ 1,09
Koža	3,15 + 0,35	0,96 ± 0,29	3,0+ 1,12
GI trakt	2,58 + 0,31	6,10 + 2,00	7,80+1,80
Moč			-
Stolica			-
		Celkom	99,04 ± 4,8

Počet myší = 5

Stredná hmotnosť = 20,97 ± 2,46 g

Tabuľka 2

Distribúcia aktivity 24 h po intravenóznej injekcii ^ulIn-2B8-MX-DTPA pri normálnych BALB/c myšiach

Stredné hodnoty ± smerodajná odchýlka
Vzorka	Hmotnosť orgánu g	% podanej dávky/ g	% podanej dávky/ orgán
Krv	1,47 + 0,07	21,97+ 1,87	32,22+ 1,35
Srdce	0,128 + 0,03	4,02 ± 0,23	0,38 + 0,01
Pľúca (2)	0,152 + 0,02	7,90+ 1,61	1,20 + 0,18
Oblička (1)	0,128 + 0,01	5,94 ± 0,40	0,76 ± 0,04
Pečeň	1,11 + 0,10	10,08+ 1,83	11,20 + 2,23
Slezina	0,082 + 0,01	5,04 ± 0,75	0,40 ± 0,02

SK 288096 Β6

Vzorka	Hmotnosť orgánu g	% podanej dávky/ g	% podanej dávky/ orgán
Sval	8,41 ±0,38	1,24 ±0,05	10,44 ±0,76
Kosť	3,15 ±0,14	2,02 ± 0,33	6,31 ±0,81
Koža	3,15 ±0,14	3,75 ± 0,39	11,77 ± 1,09
GI trakt	2,91 ±0,27	4,50 ± 0,52	6,65 ± 0,56
Moč			0,98
Stolica			2,54
		Celkom	87,10 ± 1,68

Počet myší = 5

Stredná hmotnosť = 21,03 ± 0,94 g

Tabuľka 3

Distribúcia aktivity 48 h po intravenóznej injekcii ⁱⁿIn-2B8-MX-DTPA pri normálnych BALB/c myšiach

Stredné hodnoty ± smerodajná odchýlka
Vzorka	Hmotnosť orgánu g	% podanej dávky/ g	% podanej dávky/ orgán
Krv	1,45 ±0,13	22,41 ±3,95	31,90 ±2,89
Srdce	0,090 ±0,01	4,05 ± 0,94	0,36 ± 0,06
Pľúca (2)	0,155 ±0,02	8,45 ± 0,53	1,31 ±0,19
Oblička (1)	0,125 ±0,01	6,16± 1,15	0,76 ± 0,07
Pečeň	1,040 ±0,11	9,41 ±2,33	9,84 ±3,18
Slezina	0,082 ±0,01	5,32 ± 0,71	0,48 ±0,11
Sval	8,26 ± 0,77	1,42 ±0,58	11,62 ±4,67
Kosť	3,10 ±0,29	2,08 ±0,16	6,41 ±0,44
Koža	3,10 ±0,29	3,43 ± 0,59	10,54 ± 1,69
GI trakt	2,96 ± 0,20	5,05 ± 0,63	7,46 ± 0,60
Moč			1,46
Stolica			6,41
		Celkom	88,49 ± 6,87

Počet myší = 5

Stredná hmotnosť = 20,65 ± 1,93 g

Tabuľka 4

Distribúcia aktivity 72 h po intravenóznej injekcii ⁱⁿIn-2B8-MX-DTPA pri normálnych BALB/c myšiach 15

Stredné hodnoty ± smerodajná odchýlka

Vzorka	Hmotnosť orgánu g	% podanej dávky/ g	% podanej dávky/ orgán
Krv	1,52 ±0,06	18,97 ± 1,31	28,51 ±2,03
Srdce	0,094 ±0,01	3,71 ±0,31	0,35 ± 0,04
Pľúca (2)	0,161 ±0,01	7,60 ± 0,30	1,18 ±0,09
Oblička (1)	0,135 ±0,01	5,55 ± 0,53	0,76 ± 0,09
Pečeň	1,11 ±0,11	9,90 ± 1,77	11,00 ±2,03
Slezina	0,095 ±0,01	5,12 ±0,75	0,48 ± 0,04
Sval	8,58 ± 0,34	1,04 ±0,09	8,95 ± 0,68
Kosť	3,22 ±0,12	1,73 ±0,34	6,04 ±0,51
Koža	3,22 ±0,12	3,16 ±0,60	10,19 ±2,03
GI trakt	2,79 ±0,19	4,53 ± 0,83	6,37 ± 1,38

SK 288096 Β6

Vzorka Hmotnosť orgánu % podanej dávky/ % podanej dávky/

	g	g	orgán
Moč			2,49
Stolica			11,50
	Celkom		87,80 ± 4,79

Počet myší = 5

Stredná hmotnosť = 21,46 ± 0,84 g

Tabuľka 5

Distribúcia aktivity 1 h po intravenóznej injekcii ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA pri normálnych BALB/c myšiach Stredné hodnoty ± smerodajná odchýlka

Vzorka	Hmotnosť g	% podanej dávky/ g	% podanej dávky/ orgán
Krv	1,27 ±0,06	39,23 ± 2,45	49,77 ±1,72
Srdce	0,086 ±0,01	5,80 ± 0,84	0,50 ± 0,09
Pľúca (2)	0,137 ±0,01	12,11 ± 1,08	1,66 ±0,17
Oblička (1)	0,120 ±0,01	10,23 ± 1,30	1,15 ± 0,12
Pečeň	0,921 ±0,05	12,12 ± 1,72	11,17 ± 1,66
Slezina	0,080 ±0,01	9,27 ± 0,46	0,74 ± 0,07
Sval	7,27 ± 0,32	0,78 ±0,13	5,72 ± 1,05
Kosť	2,73 ±0,12	4,35 ± 0,39	11,89 ± 1,47
Koža	2,73 ±0,12	2,12 ±0,78	5,82 ± 2,24
GI trakt	2,22 ± 0,06	3,52 ± 1,12	4,22 ± 0,84
Moč			-
Stolica			-
		Celkom	94,85 ± 3,47

Počet myší = 5

Stredná hmotnosť = 26,17 ± 0,81 g

Tabuľka 6

Distribúcia aktivity 24 h po intravenóznej injekcii ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA pri normálnych BALB/c myšiach 15

Stredné hodnoty ± smerodajná odchýlka

Vzorka Hmotnosť % podanej dávky/ % podanej dávky/ orgán g 8

Krv	1,517 ±0,090	8,35 ± 2,547	12,83 ± 4,60
Srdce	0,092 ± 0,005	2,63 ±0,142	0,240 ± 0,006
Pľúca	0,141 ±0,005	4,56 ± 0,393	0,644 ± 0,047
Oblička	0,138 ±0,007	5,63 ± 0,222	0,779 ± 0,040
Pečeň	0,438 ± 0,098	5,22 ±0,335	2,259 ± 0,399
Slezina	0,081 ±0,003	4,23 ±0,180	0,345 ±0,011
Sval	8,668 ±0,514	0,976 ±0,164	8,55 ± 1,945
Kosť	3,246 ±0,186	1,326 ±0,102	4,289 ±0,154

Počet myší = 3

Stredná hmotnosť = 21,671 ± 1,11 g

Tabuľka 7

Distribúcia aktivity 48 h po intravenóznej injekcii ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA pri normálnych BALB/c myšiach

Stredné hodnoty ± smerodajná odchýlka Vzorka Hmotnosť orgánu % podanej dávky/ % podanej dávky/ g g orgán

Krv	1,33 ±0,06	17,34 ±2,0	23,03 ± 1,95
Srdce	0,088 ±0,01	3,56 ±0,31	0,31 ±0,04
Pľúca (2)	0,139 ±0,01	7,54 ± 0,88	1,05 ±0,15
Oblička (1)	0,122 ±0,01	6,53 ± 0,42	0,79 ±0,01
Pečeň	0,968 ± 0,04	9,05 ± 1,70	8,92 ± 1,57
Slezina	0,087 ±0,01	6,52 ± 1,13	0,57 ± 0,07
Sval	7,26 ± 0,36	1,05 ±0,18	8,01 ± 1,17
Kosť	2,86 ±0,14	3,34 ± 0,42	9,53 ± 1,08
Koža	2,86 ±0,14	4,13 ±0,76	11,75 ± 1,82
GI trakt	2,84 ±0,19	2,74 ± 0,34	3,80 ±0,30
Moč			4,29
Stolica			7,67
		Celkom	79,72 ± 3,23

Počet myší = 5

Stredná hmotnosť = 19,07 ±0,91 g

Tabuľka 8

Distribúcia aktivity 72 h po intravenóznej injekcii ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA pri normálnych BALB/c myšiach Stredné hodnoty ± smerodajná odchýlka

Vzorka	Hmotnosť g	% podanej dávky/ g	% podanej dávky/ orgán
Krv	1,35 ±0,02	15,40± 1,63	20,71 ±2,13
Srdce	0,088 ±0,01	3,12 ±0,24	0,28 ±0,01
Pľúca (2)	0,142 ±0,01	8,23 ± 1,05	1,17 ±0,20
Oblička (1)	0,123 ±0,01	6,45 ± 0,57	0,79 ± 0,07
Pečeň	0,02 ± 0,06	8,39 ± 1,04	8,58 ±1,31
Slezina	0,103 ±0,01	5,90 ± 1,19	0,59 ± 0,08
Sval	7,68 ±0,11	1,01 ±0,15	7,73 ± 1,05
Kosť	2,88 ± 0,05	3,20 ± 0,25	9,20 ±0,61
Koža	2,88 ± 0,05	3,97 ± 0,49	11,42 ± 1,36
GI trakt	2,86 ±0,18	2,90 ± 0,65	4,06 ± 0,93
Moč			3,00
Stolica			11,08
		Celkom	78,62 ± 2,63

Počet myší = 5

Stredná hmotnosť = 19,21 ± 0,27 g

Podobným spôsobom sa pridelia alebo vypočítajú ďalšie hodnoty biologického polčasu s použitím štan15 dardnej rovnice na výpočet t_1/2 na exponenciálny úbytok. Po stanovení týchto hodnôt sa stanovia premenné T_ue, T_ei, T_e2, Ai, A₂ a A, ktorých zoznam je v tabuľkách 9 a 10, pre každý konjugát značený rádionuklidom s použitím rovníc poskytnutých v hornej časti týchto tabuliek (výstupné premenné). Tieto hodnoty, rovnako tak ako hodnoty v následných tabuľkách, sa vypočítajú pomocou programu v Symphony spreadsheet (Lotus Development Corp.) Phillipa Hagana, MS, Nuclear Medicíne Service, VA Medical Center, LA, Jolla, CA

92161.

Tabuľka 9

Vstupné premenné Výstupné premenné

A0 = podaná dávka, Tue = efektívny polčas vychytávania Tel = efektívny polčas úniku prvej zložky

SK 288096 Β6

Tp = fyzikálny polčas rádionuklidu

Tu = biologický polčas vychytávania Tb 1 = biologický polčas úniku prvej zložky Tb2 = biologický polčas úniku druhej zložky fl = frakcia A0 s biologickým polčasom Tbl f2 = frakcia A0 s biologickým polčasom Tb2 S = stredná dávka/jednotková kumulovaná aktivita

Te2 “ efektívny polčas úniku druhej zložky

Al = kumulovaná aktivita prvej zložky

A2 = kumulovaná aktivita druhej zložky

A = celková kumulovaná aktivita

Tue = Tu * Tp/(Tu + Tp) Al-l,44*fl *A0*Tel* *(Tue/Tu)

Tel - Tbl * Tp/(Tbl + Tp) A2-l,44*f2*A0*Te2

Te2 = Tb2 *Tp/(Tb2 + Tp) A-Al + A2

Príklad: Al pre pečeň - 1,44 * 11,000 % * 1000 * 63,2 * 1,00 = 10007,5 pCi kumulovanej aktivity Tabuľka vstupných a výstupných hodnôt sa používa na vyhodnotenie kumulovanej aktivity (A)

	Tu (h)	fl	f2	Tbl (h)	Tb2 (h)	Tue (h)	Telí (h)	Tel2 (h)	Al (gCi-h)	A2 (úCi-h)	A (gCi-h)
Nadobličky	2.78E-04	0,000 %	0,00 %	1 000	0	2.78E-04	63,2	0,0	0,0	0,0	0
Obsah moč. mechúra	2.78E-04	1,000%	0,00 %	4	0	2,78E-04	3,8	0,0	54,4	0,0	54
Obsah žalúdku	2.78E-04	6,650 %	0,00 %	1,5	0	2,78E-04	1,5	0,0	140,5	0,0	141
Obsah tenkého čreva	2.78E-04	6,650 %	0,00 %	3,5	0	2,78E-04	3,3	0,0	318,6	0,0	319
Obsah hor. hrub. čreva	2,78E-04	6,650 %	0,00 %	4,5	0	2.78E-04	4,2	0,0	404,0	0,0	404
Obsah dol. hrub. čreva	2.78E-04	6,650 %	0,00 %	4,2	0	2.78E-04	4,0	0,0	378,6	0,0	379
Obličky	2,78E-04	1,220 %	0,00 %	35	0	2,78E-04	23,0	0,0	404,8	0,0	405
Pečeň	2.78E-04	11,000%	0,00 %	1 000	0	2.78E-04	63,2	0,0	10 007,5	0,0	10 008
Pľúca	2.78E-04	2,100%	1,20%	30	1 000	2,78E-04	20,8	63,2	627,9	1091,7	1 720
Ostat. tkanivá (celkom)	2.78E-04	0,000 %
Sval	2,78E-04	10,4000%	0,00 %	1 000	0	2,78E-04	63,2	0,0	9461,7	0,0	9462
Tukové tkanivo	2.78E-04	0,000 %	0,00 %	1 000	0	2,78E-04	63,2	0,0	0,0	0,0	0
Krv	2,78E-04	58,400 %	32,22 %	15	1 000	2,78E-04	12,3	63,2	10319,2	29313,1	39632
Mozog	2,78E-04	0,000 %	0,00 %	1 000	0	2.78E-04	63,2	0,0	0,0	0,0	0
Srdce	2,78E-04	0,510%	0,38 %	57	1 000	2,78E-04	30,9	63,2	226,9	345,7	573
Vaječníky	2,78E-04	0,000 %	0,00 %	1 000	0	2,78E-04	63,2	0,0	0,0	0,0	0
Podžalúdková žľaza	2,78E-04	0,000 %	0,00 %	1 000	0	2,78E-04	63,2	0,0	0,0	0,0	0
Kostra (celkom)	2,78E-04	0,000 %
Kortikálna kosť	2,78E-04	0,000 %	0,00 %	1 000	0	2.78E-04	63,2	0,0	0,0	0,0	0
Trabekuláma kosť	2,78E-04	9,100%	6,30 %	45	1 000	2,78E-04	27,0	63,2	3536,8	5731,6	9268
Kostná dreň (červ.)	2,78E-04	0,000 %	0,00 %	1 000	0	2,78E-04	63,2	0,0	0,0	0,0	0
Kostná dreň (žltá)	2.78E-04	0,000 %	0,00 %	1 000	0	2,78E-04	63,2	0,0	0,0	0,0	0
Chrupavka	2.78E-04	0,000 %	0,00 %	1 000	0	2,78E-04	63,2	0,0	0,0	0,0	0
Ostatné zložky	2.78E-04	0,000 %	0,00 %	1 000	0	2.78E-04	63,2	0,0	0,0	0,0	0
Koža	2,78E-04	11,770 %	0,00 %	1 000	0	2,78E-04	63,2	0,0	10708,1	0,0	10708
Slezina	2,78E-04	0,610%	0,40 %	39	1 000	2,78E-04	24,7	63,2	217,1	363,9	581
Semenníky	2,78E-04	0,000 %	0,00 %	1 000	0	2.78E-04	63,2	0,0	0,0	0,0	0
Štítna žľaza	2.78E-04	0,000 %	0,00 %	1 000	0	2,78E-04	63,2	0,0	0,0	0,0	0
Celé telo	2.78E-04	0,000 %	0,00 %	1 000

pCi = 37 kBq

Tabuľka 10

Vstupné premenné

A0 = podaná dávka, Tue = efektívny polčas vychytávania

Tp = fyzikálny polčas rádionuklidu

Tu = biologický polčas vychytávania

Tb 1 = biologický polčas úniku prvej zložky

Tb2 = biologický polčas úniku druhej zložky fl = frakcia A0 s biologickým polčasom Tbl f2 = frakcia A0 s biologickým polčasom Tb2 S = stredná dávka/jednotková kumulovaná aktivita

Výstupné premenné

Tel = efektívny polčas úniku prvej zložky

Te2 = efektívny polčas úniku druhej zložky

Al = kumulovaná aktivita prvej zložky

A2 = kumulovaná aktivita druhej zložky

A = celková kumulovaná aktivita

Tue = Tu * Tp/(Tu + Tp) Al-l,44*fl*A0*Tel * *(Tue/Tu)

Tel = Tbl * Tp/(Tbl + Tp) A2-l,44*f2*A0*Te2 Te2 = Tb2 * Tp/(Tb2 + Tp) A - Al + A2

Príklad: Al pre pečeň -1,44 * 9,000 % * 1000 * 60,2 * 1,00 = 7795,5 pCi kumulovanej aktivity Tabuľka vstupných a výstupných hodnôt sa používa na vyhodnotenie kumulovanej aktivity (A)

SK 288096 Β6

	Tu (h)	fl	f2	Tbl (h)	Tb2 (h)	Tue Telí (h) (h)	Tel2 (h)	Al (pCi-h)	A2 (gCi-h)	A (gCi-h)
Nadobličky	2,78E-04	0,000 %	0,00 %	1 000	0	2.78E-04 60,2	0,0	0,0	0,0	0
Obsah moč. mechúra	2,78E-04	1,000%	0,00 %	4	0	2,78E-04 3,8	0,0	54,4	0,0	54
Obsah žalúdka	2,78E-04	4,220 %	0,00 %	1,5	0	2,78E-04 1,5	0,0	89,1	0,0	89
Obsah tenkého čreva	2,78E-04	4,220 %	0,00 %	3,5	0	2,78E-04 3,3	0,0	201,7	0,0	202
Obsah hor. hr. čreva	2,78E-04	4,220 %	0,00 %	4,5	0	2,78E-04 4,2	0,0	255,5	0,0	255
Obsah dol. hr. čreva	2,78E-04	4,220 %	0,00 %	4,2	0	2,78E-04 3,9	0,0	239,5	0,0	240
Obličky	2,78E-04	1,150%	0,87 %	70	1 000	2,78E-04 33,4	60,2	553,6	753,6	1 307
Pečeň	2,78E-04	9,000 %	0,00 %	1 000	0	2,78E-04 60,2	0,0	7795,5	0,0	7 795
Pľúca	2,78E-04	1,200%	0,00 %	1 000	0	2,78E-04 60,2	0,0	1039,4	0,0	1 039
Ostat. tkanivá (celkom) 2,78E-04	0,000 %
Sval	2,78E-04	8,720 %	0,00 %	1 000	0	2,78E-04 60,2	0,0	7552,9	0,0	7 553
Tukové tkanivo	2,78E-04	0,000 %	0,00 %	1 000	0	2,78E-04 60,2	0,0	0,0	0,0	0
Krv	2,78E-04	49,770 %	25,90 %	13	1 000	2,78E-04 10,8	60,2	7743,9	22433,7	30 178
Mozog	2,78E-04	0,000 %	0,00 %	1 000	0	2,78E-04 60,2	0,0	0,0	0,0	0
Srdce	2,78E-04	0,500 %	0,36 %	51	1 000	2,78E-04 28,4	60,2	204,4	311,8	516
Vaječníky	2,78E-04	0,000 %	0,00 %	1 000	0	2,78E-04 60,2	0,0	0,0	0,0	0
Podžalúdková žľaza	2,78E-04	0,000 %	0,00 %	1 000	0	2.78E-04 60,2	0,0	0,0	0,0	0
Kostra (celkom)	2,78E-04	0,000 %
Kortikálna kosť	2,78E-04	0,000 %	0,00 %	1 000	0	2,78E-04 60,2	0,0	0,0	0,0	0
Trabekuláma koť	2.78E-04	11,890%	9,28 %	67	1 000	2,78E-04 32,7	60,2	5604,4	8038,0	13 642
Kostná dreň (čer.)	2,78E-04	0,000 %	0,00 %	1 000	0	2.78E-04 60,2	0,0	0,0	0,0	0
Kostná dreň (žltá	2,78E-04	0,000 %	0,00 %	1 000	0	2.78E-04 60,2	0,0	0,0	0,0	0
Chrupavka	2,78E-04	0,000 %	0,00 %	1 000	0	2,78E-04 60,2	0,0	0,0	0,0	0
Ostatné zložky	2,78E-04	0,000 %	0,00 %	1 000	0	2,78E-04 60,2	0,0	0,0	0,0	0
Koža	2,78E-04	15,600%	0,00 %	1 000	0	2,78E-04 60,2	0,0	13512,1	0,0	13 512
Slezina	2,78E-04	0,740 %	0,56 %	60	1 000	2,78E-04 31,0	60,2	330,0	485,1	815
Semenníky	2,78E-04	0,000 %	0,00 %	1 000	0	2,78E-04 60,2	0,0	0,0	0,0	0
Štítna žľaza	2,78E-04	0,000 %	0,00 %	1 000	0	2,78E-04 60,2	0,0	0,0	0,0	0
Celé telo	2,78E-04	0,000 %	0,00 %	1 000	0	2,78E-04 60,2	0,0	0,0	0,0	0

lpCi = 37 kBq

S použitím celkovej kumulovanej aktivity (A) z tabuliek 9 a 10 a hodnôt S z MIRD Pamphlet č. 11 (ta5 buľky 11 a 12 a 13 a 14) sa stanovia odhady absorbovanej dávky pre každý z konjugátov značených rádionuklidom pre tkanivá vymenované v zozname (tabuľky 15, 16, 17 a 18). Pri stanovení odhadov sumárnej radiačnej dávky pre konjugát značený rádionuklidom india v tabuľke 19 sa dávka samoabsorpcie žiarenia v danom orgáne sumuje s absorbovanou dávkou pochádzajúcou od aktivity v priľahlých orgánoch a tkanivách. Ale pri výpočte hodnôt odhadu radiačnej dávky prisúdenej konjugátu značenému ytriom (tabuľka 20) určitej hodnoty pre vymenované tkanivá chýbajú (napríklad nadobličky). To vyplýva z krátkej dráhy vypustenej častice β vzhľadom na dĺžku dráhy emitovaného kvanta gama a tým zanedbateľného príspevku aktivity z priľahlých tkanív a chýbajúcich údajov s biologickou distribúciou pre tieto tkanivá.

Tabuľka 11

Sumárna absorbovaná dávka na jednotku kumulovanej aktivity, (rad/pCi-h) pre ^IHIn, polčas 67,44 h

Orgány ako zdroje žiarenia

Nadobličky Obsah				Obličky Pečeň	Pľúca Ostatné
moč.		Črevný trakt		tkanivá
mechúra					(sval)
Cieľové orgány	Obsah	Obsah	Obsah	Obsah
	žalúdka	ten.	hor.	dol.
		čreva	hrub.	hrub.
			čreva	čreva

Nadobličky 7,4E-03 5,7E-07 7,3E-06 4,4E-06 2,8E-06 1.3E-06 3,4E-05 l,5E-05 7,6E-06 4,8E-06

Stena moč. mechúra 3,6E-07 4,5E-04 7,5E-07 8,0E-06 6,4E-06 2.0E-05 9.3E-07 5,2E-07 1.5E-07 5,5E-06

SK 288096 Β6

Nadobličky Obsah	Črevný trakt	Obličky	Pečeň	Pľúca	Ostatné tkanivá (sval)
Cieľové orgány	mechúra	Obsah žalúdka	Obsah ten. čreva	Obsah hor. hrub. čreva	Obsah dol. hrub. čreva
Kosť	5,2E-06 2,3E-06	2,3E-06	3,2E-06	2,9E-06	4,2E-06	3,7E-06	2,9E-06	3,8E-06	3,2E-06
GI (stena žalúdka)	8,8E-06 8.5E-07	3,4E-04	1,1E-O5	1.2E-05	5,4E-06	1.0E-05	5,8E-06	5,7E-06	4,3E-06
GI (tenké črevo)	2,5E-06 8,6E-06	7,9E-06	2,1E-O4	5,4E-05	3.OE-O5	8,6E-06	5.0E-06	6,1E-O7	4,8E-06
GI (stena hor. hr. čreva)	2.8E-06 6,9E-06	1,1E-O5	8,3E-05	3.3E-04	l,4E-05	8,6E-06	7.5E-06	7,4E-07	5,0E-06
GI (stena dol. hr. čreva)	7,1-07 2,2E-05	3.8E-06	2,4E-05	9,5E-06	4,7E-04	2,5E-06	7.3E-07	3,0E-07	5,2E-06
Obličky	3,7E-05 8,5E-07	1,1E-O5	9,2E-06	8,3E-06	2.8E-06	5,2E-04	l,2E-05	2,7E-06	4,4E-06
Pečeň	1.5E-05 6,3E-07	5,9 E-06	5,6E-06	7.8E-06	8.4E-07	l,2E-05	l,3E-04	7,7E-06	3,4E-06
Pľúca	7,6E-06 8,2E-08	5,2E-06	7.5E-07	8.3E-07	2,6E-07	2,5E-06	7,8E-06	l,4E-04	4,2E-06
Kostná dreň (červ.)	9.4E-06 5,3E-06	4.0E-06	Ι,ΙΕ-05	9,1 E-06	l,3E-05	9.6E-06	4,1 E-06	4,8E-06	5,3E-06
Ostatné tkanivá (sval)	4,8E-06 5,5E-06	4.3E-06	4,8E-06	4,5E-06	5,2E-06	4,4E-06	3,4E-06	4,4E-06	7,5E-06
Vaječníky	1.8E-06 2,3E-05	l,3E-06	3,3E-05	3,7E-05	6,4E-05	3,6E-06	l,4E-06	3,6E-07	6.3E-06
Podžalúdková žľaza	2,6E-05 8,6E-07	5,7E-05	6,1E-06	7,1 E-06	2,1 E-06	2,0E-05	l,2E-05	7.7E-06	5,7E-06
Koža	1.8E-06 l,7E-06	l,4E-06	l,4E-06	l,4E-06	l,6E-06	l,8E-06	l,6E-06	l,8E-06	2,5E-06
Slezina	2,0E-05 7,6E-07	3,1E-O5	4.6E-06	4.2E-06	2.4E-06	2,8E-05	2.8E-06	7,1 E-06	4,6E-06
Semenníky	l,4E-07 1.4E-05	1.8E-07	l,0E-06	9,8E-07	5,9E-06	3,4E-07	2,5E-07	3,9E-08	3,6E-06
Štítna žľaza	4,7E-07 l,2E-08	3,5E-07	6.9E-08	7,5E-08	2,7E-08	2,0E-07	6,2E-07	2,6E-06	4,3E-06
Maternica (netehotná)	5,8E-06 4,9E-05	2,4E-06	2,9E-05	1.5E-05	2,1E-O5	3,1 E-06	l,2E-06	2,8E-07	7,4E-06
Celé telo	6.6E-06 6,2E-06	6,1 E-06	7.3E-06	6,8E-06	6,9E-06	6,6E-06	6,6E-06	5,9E-06	5,6E-06

Odkaz-MIRD Pamphlet č. 11, str. 164 1 pCi = 37 kBq, 1 rad = 10’² Gy

Tabuľka 12

Sumárna absorbovaná dávka na jednotku kumulovanej aktivity, (rad/pCi-h) pre ^1HIn, polčas 67,44 h Orgány ako zdroje žiarenia

Cieľové orgány	Vaječníky Podžalúdková žľaza		Kostra		Koža	Slezina	Semenníky	Štítna Celé žľaza telo
			Červ. dreň	Kort. kosť	Trab. kosť
Nadobličky	1,1 E-06	2,6E-05	7.9E-06	3.9E-06	3,9E-06	2,4E-05	2,0E-05	l,4E-07	4,7E-07 7,0E-06
Stena moč. mechúra	2,1E-O5	4,7E-07	2.4E-06	1.5E-06	l,5E-06	l,6E-06	4.7E-07	1.5E-05	l,2E-08 6,9E-06
Kosť	3,8E-06	3,6E-06	l,2E-05	3,0E-05	2,6E-05	2,9E-06	2.9E-06	2,4E-06	2,6E-06 6,9E-06
GI (stena žalúdka)	2,4E-06	5.9E-05	3,2E-06	l,7E-06	1,1 E-06	1.7E-06	3.0E-05	l,5E-07	1.5E-07 7,1 E-06
GI (tenké črevo)	3.8E-05	5,5E-06	7,9E-06	2.3E-06	2,3E-06	1,5 E-06	4,2E-06	l,2E-06	4,2E-08 7,5E-06
GI (stena hor. hr. čre.)	3.7E-05	6,6E-06	6,4E-06	2,2E-06	2,2E-06	1.4E-06	3,8E-06	1,1 E-06	3.3E-08 7,0E-06
GI (stena dol. hr. čre.)	4,8E-05	l,7E-06	9.0E-06	3,2E-06	3.2E-06	l,5E-06	1.9E-06	8.3E-06	2,2E-08 6,7E-06
Obličky	2,9E-06	l,9E-05	6,8E-06	2.7E-06	2,7E-06	2.0E-06	2,8E-05	l,7E-07	1.2E-07 6.6E-06
Pečeň	l,7E-06	l,3E-05	2,9E-06	2,0E-06	2,0E-06	l,7E-06	3,0E-06	l,2E-07	3.5E-O7 6.5E-06
Pľúca	2.2E-07	7,6E-06	3,7E-06	3,0E-06	3,0E-06	1.9E-06	6,9E-06	3,4E-08	2.9E-06 5.9E-06
Kostná dreň (červ.)	l,3E-05	6.8E-06	7,5E-05	l,3E-05	2,6E-05	2.7E-06	4,4E-06	l,9E-06	2,9E-06 7,7E-06
Ostatné tkanivá (sval)	6,3E-06	5,7E-06	3,8E-06	3.2E-06	3,2E-06	2,5E-06	4,6E-06	3,6E-06	4,3E-06 5.6E-06
Vaječníky	1.0E-02	l,0E-06	7.7E-06	2,2E-06	2,2E-06	1,4 E-06	l,7E-06	0,0E+00	2,5E-08 7,0E-06
Podžalúdková žľaza	1.5E-06	l,6E-03	4,9E-06	3,1 E-06	3,1E-O6	l,7E-06	6,1E-O5	2,1E-O7	3,0E-07 7,8E-06
Koža	l,4E-06	l,3E-06	2.0E-06	2,3E-06	2,3E-06	3,7E-05	1,5 E-06	4,9E-06	2,5E-06 3,7E-06
Slezina	l,6E-06	6,2E-05	2.7E-06	2,0E-06	2,0E-06	l,7E-06	9,1E-O4	8,9E-08	3,5E-07 6.8E-06

Cieľové orgány	Vaječníky Podžalúdková žľaza		Kostra		Koža	Slezina	Semenníky	Štítna Celé žľaza telo
			Červ. dreň	Kort. kosť	Trab. kosť
Semenníky	Ο,ΟΕ+ΟΟ	2.1E-07	Ι,ΟΕ-06	l,9E-06	l,9E-06	3.4E-06	2.0E-07	3,6E-03	3,3E-09 4,9E-06
Štítna žľaza	2,5E-08	4,5E-07	2,2E-06	2,8E-06	2,8E-06	2,4E-06	3,4E-07	3,3E-09	5,8E-03 5,2E-06
Maternica (netehotná)	6,5E-05	l,9E-06	6,7E-06	1.8E-06	l,8E-06	1.2E-06	l,2E-06	0,0E+00	2.4E-08 7,8E-06
Celé telo	7.7E-06	7,5E-06	6.4E-06	5.9E-06	5,9E-06	3,8E-06	6,6E-06	5,6E-06	5,3E-06 5,8E-06

Odkaz-MIRD Pamphlet č. 11, str. 165 1 μθ = 37 kBq, 1 rad = 10’²Gy

Tabuľka 13

Sumárna absorbovaná dávka na jednotku kumulovanej aktivity, (rad/pCi-h) pre ⁹⁰Y, polčas 64 h Orgány ako zdroje žiarenia

Nadobličky Obsah moč. Črevný trakt Obličky Pečeň Pľúca Ostatné mechúra tkanivá

Cieľové orgány Obsah Obsah Obsah hor. Obsah dol. ^(sval)

	žalúdka	ten. čreva	hr. čreva	hr. čreva
Nadobličky	l,4E-01	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
Stena moč. mechúra	0,0	5,0E-03	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
Kosť	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
Gl (stena žalúdka)	0,0	0,0	4,0E-03	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
Gl (tenké črevo)	0,0	0,0	0,0	2,5E-03	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
Gl (stena hor. hr. čreva)	0,0	0,0	0,0	0,0	4,5E-03	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
Gl (stena dol. hr. čreva)	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	7.4E-03	0,0	0,0	0,0	0,0
Obličky	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	6,4E-03	0,0	0,0	0,0
Pečeň	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	1,1E-O3	0,0	0,0
Pľúca	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	2.0E-03	0,0
Kostná dreň (červ.)	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
Ostatné tkanivá (sval)	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	7,lE-05
Vaječníky	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
Podžalúdková žľaza	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
Koža	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
Slezina	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
Semenníky	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
Štítna žľaza	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
Maternica (netehotná)	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
Celé telo	2,8E-05	3,2E-06	8.5E-05	2,3E-05	1.4E-05	l,7E-05	2,8E-05 2.8E-05 2,8E-05 2,8E-05

Odkaz-MIRD Pamphelt č. 11, str. 144 1 pCi = 37 kBq, 1 rad = 10'² Gy Tabuľka 14

Sumárna absorbovaná dávka na jednotku kumulovanej aktivity, (rad/pCi-h) pre ⁹⁰Y, polčas 64 h Orgány ako zdroje žiarenia

	Vaječníky Podžalúdková	Kostra	Koža Slezina Semenníky Štítna Celé telo
Cieľové orgány	žľaza		žľaza
Červ.	Kort.	Trab.
	dreň	kosť	kosť

Nadobličky 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,8E-05

Stena moč. mechúra 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,8E-05

Cieľové orgány	Vaječníky I	’odžalúdková žľaza	Kostra	Koža	Slezina Semenník)	, Štítna žľaza	Celé telo
Červ. dreň	Kort. kosť	Trab. kosť
Kosť	0,0	0,0	1,1E-O4	4,0E-04	2,3E-04	0,0	0,0	0,0	0,0	2,8E-05
GI (stena žalúdka)	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	2,8E-05
GI (tenké črevo)	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	2,8E-05
GI (stena hor. hrub. čreva)	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	2.8E-05
GI (stena dol. hrub. čreva)	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	2.8E-05
Obličky	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	2.8E-05
Pečeň	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	2,8E-05
Pľúca	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	2,8E-05
Kostná dreň (červ.)	0,0	0,0	8,6E-04	3,3E-05	5,7E-04	0,0	0,0	0,0	0,0	2,8E-05
Ostatné tkanivá (sval)	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	2,8E-05
Vaječníky	1.8E-01	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	2,8E-05
Podžalúdková žľaza	0,0	2,0E-02	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	2,8E-05
Koža	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	7,6E-04	0,0	0,0	0,0	2,8E-05
Slezina	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	1,1E-O2	0,0	0,0	2,8E-05
Semenníky	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	5,7E-02	0,0	2.8E-05
Štítna žľaza	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	9,9E-02	2,8E-05
Maternica (netehotná)	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	2,8E-05
Celé telo	2,8E-05	2,8E-05	2,8E-05	2,8E-05	2,8E-05 2,8E-052,8E-05	2,8E-05	2,8E-05	2,8E-05

Odkaz-MIRD Pamphlet č. 11, str. 145 lpCi = 37 kBq, 1 rad = 10'² Gy

Tabuľka 15

Absorbovaná dávka žiarenia (rad = A * S) pre ^H1In, polčas 67,44 h Orgány ako zdroje žiarenia

Cieľové orgány	Nadobličky	Obsah moč. mechúra	Črevný trakt	Obličky	Pečeň	Pľúca	Ostatné tkanivá (sval)
Obsah žalúdka	Obsah ten. čreva	Obsah hor. hrub. čreva	Obsah dol. hrub. čreva
Nadobličky	0.0E+00	3,lE-05	l,0E-03	l,4E-03	1,1 E-03	4,9E-04	l,4E-02	l,5E-01	l,3E-02	2,4E-01
Stena moč. mechúra	Ο,ΟΕ+ΟΟ	2,4E-02	1,1E-O4	2,SE-03	2,6E-03	7,6E-03	3,8E-04	5,2E-03	2,6E-04	2,7E-01
GI (stena žalúdka)	0,0E+00	4,6E-05	4,8E-02	3,5E-03	2,2E-02	2,0E-03	4,0E-03	5,8E-02	9,8E-03	2,1E-O1
GI (tenké črevo)	0,0E+00	4,7E-04	1,1 E-03	6,7E-03	2,2E-02	1,1E-O2	3,5E-03	5,0E-02	l,0E-03	2,4E-01
GI (stena h. hr. čreva)	0,0E+00	3,8E-04	1.5E-03	2,6E-02	l,3E-01	5.3E-03	3,5E-03	7,5E-02	1,3E-O3	2,5E-01
GI (stena d. hr. čreva)	0,0E+00	1.2E-03	5,3E-04	7,6E-03	3,8E-03	l,8E-01	Ι,ΟΕ-03	7,3E-03	5,2E-04	2,6E-01
Obličky	0,0E+00	4,6E-05	l,5E-03	2,9E-03	3,4E-03	1,1 E-03	2,lE-01	l,2E-01	4.6E-03	2,2E-01
Pečeň	0,0E+00	3,4E-05	8,3E-04	l,8E-03	3,2E-03	3,2E-04	4,9E-03	l,3E+00	l,3E-02	l,7E-01
Pľúca	0,0E+00	4,5E-05	7,3E-04	2.4E-04	3,4E-04	9,8E-05	l,0E-03	7,8E-02	2,4E-01	2,1E-O1
Ostatné tkanivá
Sval	0,0E+00	3,0E-04	6,0E-04	l,5E-03	l,8E-03	2,0E-03	1.8E-03	3.4E-02	7,6E-03	3,7E-01
Tukové tkanivá	0,0E+00	3.0E-04	6,0E-04	l,5E-03	l,8E-03	2,0E-03	l,8E-03	3,4E-02	7,6E-03	3,7E-01
Krv	0,0E+00	3.0E-04	6,0E-04	1,5 E-03	Ι.8Ε-03	2,0E-03	1.8E-03	3,4E-02	7,6E-03	3,7E-01
Mozog	Ο,ΟΕ+ΟΟ	3,0E-04	6.0E-04	1.5E-03	l,8E-03	2.0E-03	I.8E-O3	3,4E-02	7,6E-03	3.7E-01
Srdce	Ο,ΟΕ+ΟΟ	4,1E-O5	4,4E-03	l,5E-03	l,7E-03	9.1E-04	1,1E-O2	2.8E-02	l,2E-02	3,7E-01

SK 288096 Β6

Nadobličky Obsah Črevný trakt Obličky Pečeň Pľúca Ostatné moč. tkanivá

Cieľové orgány	mechúra	Obsah žalúdka	Obsah ten. čreva	Obsah hor. hrub. čreva	Obsah dol. hrub. čreva	(sval)
Vaječníky	Ο,ΟΕ+ΟΟ	l,3E-03	l,8E-04	Ι,ΙΕ-02	l,5E-02	2,4E-02	2,4E-02	l,4E-02	6,2E-04	2,8E-04
Podžalúdková žľaza	Ο,ΟΕ+ΟΟ	4,7E-05	8,0E-03	l,9E-03	2,9E-03	8,0E-04	8,1 E-03	l,2E-01	l,3E-02	l,2E-01
Kostra
Kortikálna kosť	Ο,ΟΕ+ΟΟ	1.3E-04	3,2E-04	l,0E-03	l,2E-03	l,6E-03	l,5E-03	2,9E-02	6.5E-03	l,6E-01
Trabekuláma kosť	Ο,ΟΕ+ΟΟ	l,3E-04	3,2E-04	l,0E-03	l,2E-03	l,6E-03	l,5E-03	2,9E-02	6,5E-03	l,6E-01
Kostná dreň (červ.)	Ο,ΟΕ+ΟΟ	2,9E-04	5,6E-04	3,5E-03	3,7E-03	4.6E-03	3.9E-03	4,1E-O2	8,3E-03	2,6E-01
Kostná dreň (žltá)	Ο,ΟΕ+ΟΟ	2,9E-04	5.6E-04	3,5E-03	3,7E-03	4.9E-03	3,9E-03	4,1E-O2	8,3E-03	2,6E-01
Chrupavka	Ο,ΟΕ+ΟΟ	1.3E-04	3,2E-04	l,0E-03	l,2E-03	l,6E-03	l,5E-03	2,9E-02	6,5E-03	1.6E-01
Ostatné	Ο,ΟΕ+ΟΟ	l,3E-04	3,2E-04	l,0E-03	l,2E-03	l,6E-03	1.5E-03	2,9E-02	6,5E-03	1.6E-01
Koža	Ο,ΟΕ+ΟΟ	9,2E-05	2.0E-04	4,5E-04	5,7E-04	6,1E-O4	7,3E-04	l,6E-02	3,1 E-03	l,2E-01
Podžalúdková žľaza	Ο,ΟΕ+ΟΟ	4,1E-O5	4.4E-03	l,5E-03	l,7E-03	9,1E-O4	1,1E-O2	2,8E-02	l,2E-02	2,3E-01
Semenníky	Ο,ΟΕ+ΟΟ	7,6E-04	2,5E-05	3,2E-04	4,0E-04	2.2E-03	l,4E-03	2,5E-03	6.7E-05	1.8E-01
Štítna žľaza	Ο,ΟΕ+ΟΟ	6,5E-07	4,9E-05	2,2E-05	3.0E-05	l,0E-05	8,1E-O5	6,2E-03	4.5E-03	2,1E-O1
Maternica (netehotná)	Ο,ΟΕ+ΟΟ	3.4E-04	8,6E-04	2,3E-03	2,7E-03	2,6E-03	2,7E-03	6,6E-02	l,0E-02	3,7E-01
Celé telo	Ο,ΟΕ+ΟΟ	2,7E-03	3,4E-04	9,2E-03	6,1 E-03	8,0E-03	l,3E-03	l,2E-02	4.8E-04	2,8E-01

pCi = 37 kBq, 1 rad = 10'² Gy

Tabuľka 16

Absorbovaná dávka žiarenia (rad = A * S) pre ^H1In, polčas 67,44 h Orgány ako zdroje žiarenia

Vaječníky Podžalúdková Kostra Koža Slezina Semenníky Štítna Celé žľaza žľaza telo

Cieľové orgány dreň kosť kosť

Nadobličky	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ 3,6Ε+02 2,6Ε-02	1,2Ε-02	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ
Stena moč. mechúra	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ 1,4Ε-02	1.7Ε-02	2,7Ε-04	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ
GI (stena žalúdka)	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο.ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ 1,6Ε-02	1,8Ε-02	1,7Ε-02	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ
GI (tenké črevo)	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ 2.1Ε-02	1.6Ε-02	2,4Ε-03	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ
GI (stena h. hr. čreva)	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ 2,0Ε-02	1,5Ε-02	2,2Ε-03	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ
GI (stena d. hr. čreva)	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ 3.0Ε-02	1,6Ε-02	1,1Ε-03	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ
Obličky	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ 2,5Ε-02	2.1Ε-02	1,6Ε-02	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ
Pečeň	0.0E+00	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ 1,9Ε-02	1,8Ε-02	1,7Ε-03	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ
Pľúca	O.OE+OO	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ 2,8Ε-02	2.0Ε-02	4,0Ε-03	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ
Ostatné tkanivá Sval	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ 3.0Ε-02	2,7Ε-02	2.7Ε-03	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ
Tukové tkanivo	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ 3,0Ε-02	2,7Ε-02	2.7Ε-03	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ
Krv	0.0E+00	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ 3.0Ε-02	2,7Ε-02	2,7Ε-03	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ
Mozog	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ 3,0Ε-02	2,7Ε-02	2,7Ε-03	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ
Srdce	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ 3,0Ε-02	2,7Ε-02	2.7Ε-03	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ
Vaječníky	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ 2.0Ε-02	1,5Ε-02	9,9Ε-04	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ
Podžalúdková žľaza	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ 2,9Ε-02	1,8Ε-02	3,5Ε-02	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ
Kostra Kortikálna kosť	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ 2,4Ε-01	3,1Ε-02	1,7Ε-Ο3	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ
Trabekuláma kosť	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ 2,4Ε-01	3,1Ε-02	1.7Ε-03	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ
Kostná dreň (červ.)	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ 2,4Ε-01	2,9Ε-02	2,6Ε-03	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ

SK 288096 Β6

Kostná dreň (žltá)	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ 2,4E-01	2,9E-02	2,6E-03	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ
Chrupavka	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ 2,4E-01	3,1E-O2	l,7E-03	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ
Ostatné	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ 2,4E-01	3,1E-O2	1.7E-03	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ
Koža	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ 2.1E-02	4,0E-01	8,7E-04	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ
Slezina	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ l,9E-02	l,8E-02	5,3E-01	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ
Semenníky	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ l,8E-02	3,6E-02	l,2E-04	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ
Štítna žľaza	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ 2.6E-02	2.6E-02	2,0E-04	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ
Maternica (netehotná)	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ 1.7E-02	Ο,ΟΕ+ΟΟ	7,0E-04	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ
Celé telo	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ 5,5E-02	4,1E-O2	3,8E-03	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ

rad= 10'² Gy

Tabuľka 17

Absorbovaná dávka žiarenia (rad = A * S) na ⁹⁰Y, polčas 64 h

Orgány ako zdroje žiarenia

Cieľové orgány	Nadobličky	Obsah moč. mechúra	Črevný trakt	Obličky	Pečeň	Pľúca	Ostatné tkanivá (sval)
Obsah žalúdka	Obsah ten. čreva	Obsah hor. hr. čreva	Obsah dol. hr. čreva
Nadobličky	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Stena moč. mechúra	Ο,ΟΕ+ΟΟ	2,70Ε-01	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
GI (stena žalúdka)	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	3,6Ε-01	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
GI (tenké črevo)	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	5.0Ε-01	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
GI (stena h. hr. čreva)	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	1,1Ε+00	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
GI (stena d. hr. čreva)	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	1,8Ε+00	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Obličky	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	8,4Ε+00	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Pečeň	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	8,6Ε+00	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Pľúca Ostatné tkanivá	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	2,1Ε+00	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Sval	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	2,7Ε+00
Tukové tkanivo	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	2,7Ε+00
Krv	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	2,7Ε+00
Mozog	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	2,7Ε+00
Srdce	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	2,7Ε+00
Vaječníky	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Podžalúdková žľaza Kostra	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Kortikálna kosť	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Trabekuláma kosť	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Kostná dreň (červ.)	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Kostná dreň (žltá)	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Chrupavka	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Ostatné	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Koža	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Slezina	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Semenníky	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Štítna žľaza	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Maternica (netehotná)	Ο,ΟΕ+ΟΟ	1,7Ε-04	7,6Ε-03	4,6Ε-03	3,6Ε-03	4,ΙΕ-03	3,7Ε+02	2,2Ε+01	2,9Ε+02	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Celé telo	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ι,ΙΕ+ΟΟ

rad = 10'² Gy

Tabuľka 18

Absorbovaná dávka žiarenia (rad = A * S) na ⁹⁰Y, polčas 64 h

Orgány ako zdroje žiarenia

Cieľové orgány	Vaječníky	Podžalúd- ková žľaza	Kostra	Koža	Slezina	Semenníky	Štítna žľaza	Celé telo
Červ. dreň	Kort kosť.	Trab. kosť
Nadobličky	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Stena moč. mechúra	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
GI (stena žalúdka)	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
GI (tenké červo)	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
GI (stena h. hr. čreva)	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
GI (stena d. hr. čreva)	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Obličky	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Pečeň	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Pľúca Ostatné tkanivá	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Sval	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Tukové tkanivo	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Krv	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Mozog	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Srdce	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Vaječníky	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Podžalúdková žľaza Kostra	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Kortikálna kosť	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	3,1Ε+00	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Trabekuláma kosť	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	3,1Ε+00	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Kostná dreň (červ.)	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	7,8Ε+00	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Kostná dreň (žltá)	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	7,8Ε+00	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Chrupavka	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	3.1Ε+00	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Ostatné	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	3,1Ε+00	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Koža	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	1,0Ε+01	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Slezina	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	9,0Ε+00	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Semenníky	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Štítna žľaza	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Maternica (netehot.)	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ
Celé telo	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	3,8Ε-01	3,8Ε+00	2,3Ε-02	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ	Ο,ΟΕ+ΟΟ

rad= 10'²Gy

Tabuľka 19

Radiačné dozimetrické odhady vyplývajúce z pozadia protilátky 2B8-MX značenej rádionuklidom ^H1In jednotne rozložené v tele „štandardného človeka“ (70 kg) s použitím distribučných údajov pre zvieratá v priebehu 72 h po injekcii

Aktivita = 1000 pCi/dávka pre pacienta

	rad		rad
Nadobličky	0,493	Vaječníky	0,387
Stena močového mechúra	0,348	Pankreas	0,362
Žalúdočná stena	0,412	Kostra

Tenké črevo	0,434	Kortikálna kosť	0,474
Stena hor. hrub. čreva	0,533	Trabekuláma kosť	0,474
Stena dol. hrub. čreva	0,505	Dreň (červená)	0,602
Obličky	0,625	Dreň (žltá)	0,602
Pečeň	1,533	Chrupavka	0,474
Pľúca	0,582	Ostatné zložky	0,474
Ostatné tkanivá		Kosť	0,564
Sval		Slezina	0,854
Tukové tkanivo		Semenníky	0,239
Krv		Štítna žľaza	0,276
Mozog		Maternica (negravidná)	0,473
Srdce		Celé telo	0,417

Odkaz: A Scheme for Absorbed-dose Calculation for Biologically Distributed Radionuclides, MIRD J. of Nucl.

Med./Suppl. #1, 2/68

Výpočty vyhotovil s použitím Spreadsheet Template v Symphony (Lotus Development Corporation) a zostavil

Philip L. Hagan, MS

Nuclear Medicíne Service

V A Hospital

San Diego, CA 92161 pCi = 37 kBq, 1 rad = 10’² Gy

Tabuľka 20

Radiačné dozimetrické odhady vyplývajúce z podania protilátky 2B8-MX značenej rádionuklidom ⁹⁰Y jednotne rozložené v tele „štandardného človeka“ (70 kg) s použitím distribučných údajov pre zvieratá v priebehu 72 h po injekcii

Aktivita = 1 000 pCi/dávka pre pacienta

Nadobličky	rad 0,000	Vaječníky	rad 0,000
Stena močového mechúra	0,271	Pankreas	0,000
Žalúdočná stena	0,356	Kostra
Tenké črevo	0,504	Kortikálna kosť	3,138
Stena hor. hr. čreva	1,150	Trabekuláma kosť	3,138
Stena dol. hr. čreva	1,772	Dreň (červená)	7,776
Obličky	8,366	Dreň (žltá)	7,776
Pečeň	8,575	Chrupavka	3,138
Pľúca	2,079	Ostatné zložky	3,138
Ostatné tkanivá		Koža	10,269
Sval	2,716	Slezina	8,965
Tukové tkanivo	2,716	Semenníky	0,000
Krv	2,716	Štítna žľaza	0,000
Mozog	2,716	Maternica (negravidná)	0,304
Srdce	2,176	Celé telo	1,854

Odkaz: A Schéma for Absorbed-dose Calculation for Biologically Distributed Radionuclides, MIRD J. of Nucl. Med./Suppl. #1, 2/68

Výpočty vykonal s použitím Spreadsheet Template v Symphony (Lotus Development Corporation) a zostavil Philip I. Hagan, MS Nuclear Medicíne Service V A Hospital,

San Diego, Ca 92161 lpCi = 37kBq, 1 rad= 10'²Gy

SK 288096 Β6

1. II. Výsledky

A. Štúdie s protilátkami 2B8 a 2B8-MX-DTPA in vitro

1. Príprava a charakterizácia protilátky 2B8 proti CD20

Celkom 9 fúzií viedlo k trom hybridómom tvoriacim protilátky, ktoré účinne konkurovali s protilátkou BI Coulter značenou rádionuklidom. V každom prípade sa hybridóm preniesol na 24-jamkovú misku. Prvé dve protilátky izolované z fúzií 3 a 4 boli izotypizované a obidve boli identifikované ako IgM. Tretia protilátka získaná fúziou 5 a značená 2B8 bola stanovená ako IgGl kappa izotyp a použila sa na pokračujúce štúdie. Kloň 2B8.H11 sa expandoval a umiestnil na dlhodobé ukladanie do kvapalného dusíka. Kloň 2B8.H11 sa subklonuje na poskytnutie klonu 2B8.H11.G3 a ďalej na poskytnutie klonu 2B8-H11.G3.G9. Tento kloň sa expanduje na ďalšie štúdie a protilátka sa purifikuje protein A afinitnou chromatografiou.

Kompetitívna esej s použitím neznačenej 2B8, BI a Leu 16 a rádionuklidom značeným Coulter BI ukazuje, že 2B8 je schopná inhibovať väzbu BI na C20 účinnejšie ako rovnaké koncentrácie buď BI, alebo Leu 16 (obrázok 1). Podobné výsledky sa získajú (údaje sa tu neznázorňujú) v kompetitívnej štúdii s použitím FITC-konjugovanej 2B8, natívnej BI a irelevantných protilátok UPC-10 a S-003 (izotypy IgG 2a respektíve 1).

Priama väzba bunkového antigénu CD20 s protilátkami 2B8 a B1 sa porovnáva analýzou FACS s použitím CD-20-pozitívnych SB buniek a CD20-negatívnych HSB buniek. Výsledky na obrázku 2 ukazujú, že pre porovnateľné množstvá protilátky sa s SB bunkami viaže viac 2B8 ako BI. S irelevantnými protilátkami sa nepozoruje žiadna väzba na SB bunky. Pri použití HSB buniek sa pozoruje len fluorescencia pozadia. Tieto výsledky potvrdzujú špecifickosť interakcie 2B8 s antigénom CD20 a ukazujú, že 2B8 môže mať vyššiu afinitu k antigénu bunkového povrchu ako B1.

Na stanovenie zdanlivej afinity 2B8 sa purifikovaná protilátka značí rádionuklidom ¹²⁵I a vzrastajúce koncentrácie značenej protilátky sa inkubujú s antigén-pozitivnymi SB bunkami. Aktivita pripojená na bunky sa stanoví po 1 h inkubácie (obrázok 3). Výsledky ukazujú, že sa protilátka 2B8 viaže na antigén CD20 so zdanlivou konštantou afinity 4,3 x 10'⁹ M.

Prietoková cytometria s ľudskými normálnymi periférnymi krvnými lymfocytmi ukazuje, že 2B8 je špecifická pre B-bunky a nereaguje s inými typmi lymfocytov (napríklad T-bunkami, monocytmi, makrofágmi). 2B8 značená FITC sa porovnáva s BI-FITC a Leu 16-FITC s použitím tej istej populácie ľudských lymfocytov. Výsledky v tabuľke 21 ukazujú, že 2B8 reaguje zhruba so 14 % periférnych krvných lymfocytov v porovnaní zo zhruba 12 % v prípade Leu 16 a 11 % v prípade BI. Populácia lymfocytov založená na ďalšom B lymfocytovom markere (CD-19) bola medzi 11 a 14 %. Nakoniec, pokiaľ sa inkubujú ľudské periférne krvné lymfocyty s 2B8 a buď BI, alebo Leu 16, a potom označia spätne markerom CD19 (Bcton/Dickinson), je populácia dvojitého značenia B lymfocytov 9 % s 2B8 a 10 % s buď BI, alebo Leu 16. Tieto výsledky potvrdzujú podobnosť týchto látok.

Tabuľka 21

Porovnanie väzby 2B8 na ľudské periférne krvné lymfocyty s inými prostriedkami špecifickými na B- a T-lymfocyty

Marker protilátky

A. Jednoduché fluorescenčné značenie:

% vymedzených lymfocytov CD45

Žiadne (autofluorescencia) 0

BI-FITC (Coulter Immunology, lgG2a, k) 11

Leu 16-FITC (Becton Dickinson, IgGl, k) 12

2B8-FITC (EDEC, IgGl, k) 14

B72.3-FITC (IgGl, k irelevantnej kontrole) 4 anti-CD4-FITC (Coulter Immunology) 37 anti-CD3-FITC (Becton Dickinson) 59 anti-CD 19-RPE (Becton Dickinson) 11 anti-CD19-FITC (Becton Dickinson) 14

B. Dvojité fluorescenčné značenie:

B1 -FITC/anti CD 19-RPE 10

Leu 16-FITC/anti CD 19-RPE 10

2B8 FITC/anti CD 19-RPE 9 anti-CD 19 FITC/anti CD 19-RPE 13

A. Jednoduché fluorescenčné značenie: % vymedzených lymfocytov CD45

BI -FITC/anti Hu Ig RPE ÍÔ

2B8-FITC/anti Hu Ig RPE 10

B72.3-FITC/anti Hu Ig RPE 2

Leucogate Simultest 99

Imunoprecipitácia bunkového antigénu CD20 značeného rádionuklidom buď protilátkou 2B8, alebo protilátkou BI vedie k precipitácii nerozlíšiteľného dubletu proteínov s molekulovými hmotnosťami zhruba 33 a 35 kD (údaje sa neuvádzajú).

2. Tvorba a charakterizácia 2B8-MX-DTPA

Konjugát 2B8-MX-DTPA sa získava reakciou protilátky s molámym zvyškom 4 : 1 kyseliny izotiokyanátobenzyl-3-metyldietyléntriamínpentaoctovej (R. W. Kozák, A. Raubitschek, S. Mirzadeh, M. W. Brechbiel, R. Junghaus, O. A. Gansow a T. A. Waldmann, Cancer Res., 49, 2639-2644 (1989)). Zvyčajne sa použijú 1 až 2 moly chelátu MX-DTPA na mol protilátky 2B8. Ako ukazujú výsledky na obrázku 4, nevykazuje konjugát 2B8-MX-DTPA žiadnu zdanlivú stratu imunoreaktivity, oproti tomu natívne 2B8 vo forme natívnych aj konjugovaných protilátok 2B8 má virtuálne identické BI inhibičné profily. Hodnoty 1C50 pre 2B8 a 2B8-MX-DTPA sú zhruba 3 respektíve 4 pg/ml. Tieto výsledky možno získať s použitím protilátky B1 značenej rádionuklidom ¹²⁵I v celobunkovej rádioimunoeseji uskutočnené s SB bunkami. Podobné výsledky sa získajú s použitím 2B8 alebo 2B8-MX-DTPA ako inhibítorov väzby 2B8 značenej rádionuklidom ^l25l s SB bunkami. 2B8 aj konjugát s MX-DTPA inhibujú väzbu ¹²⁵I-2B8 s SB bunkami pri koncentráciách zhruba 3 až 4 pg/ml (údaje sa neuvádzajú).

Na vyhodnotenie stability in vitro natívnej protilátky 2B8 a konjugátu 2B8-MX- DTPA sa vzorky v normálnom fyziologickom roztoku alebo vo fyziologickom roztoku obsahujúcom 10 mM roztok glycínhydrochloridu, pH 6,8, inkubujú pri teplote 4 °C a 30 °C počas 12 týždňov a alikvóty sa týždenne analyzujú s použitím nasledujúcich esejí: imunoreaktivita celobunkovou enzýmovou imunoesejou, SDS-PAGE pri redukčných a neredukčných podmienkach a izoelektrická fokusačná gélová elektroforéza. Zatiaľ čo imunoeseje nedetekujú žiadnu stratu antigénu pre vzorky protilátky inkubovanej pri akejkoľvek teplote (obrázok 5), izoelektrické fokusačné rozmedzie pre protilátku (pH 7,30 až 8,40 v týždni nula), ktoré je stabilné pri teplote 4 °C, má pokles 0,2 pH pri 30 °C po týždni 6 (tabuľka 22). Tento výsledok však nemusí byť jednoznačný, lebo je na medzi experimentálnej chyby eseje.

Tabuľka 22

Súhrn údajov pl pre 2B8/2B8-MX-DTPA

Týždeň	2B8 4 Sal	2B8 30 Sal	2B8 4 Gly	2B8 30 Glyl	2B8-MX 4 Sal	2B8-MX 30 Sal	2B8-MX4Gly	2B8-MX 30 Gly
0	7,46-8,37		7,46-8,37		6,30-8,21		6,30-8,21
1	7,39-8,24	7,42-8,27	7,46-8,31	7,46-8,24	6,39-8,26	6,39-8,26	6,32-8,24	6,25-8,24
2	7,38-8,27	7,45-8,34	7,45-8,40	7,45-8,34	6,02-8,40	6,02-8,34	6,02-8,40	5,95-8,27
3	7,47-8,35	7,33-8,35	7,40-8,29	7,33-8,29	6,0-8,29	6,0-8,29	6,0-8,22	6,0-8,15
4	7,38-8,24	7,38-8,24	7,38-8,35	7,38-8,28	5,99-8,28	5,99-8,35	5,99-8,35	5,99-8,35
5	7,29-8,25	7,29-8,25	7,37-8,32	7,32-8,32	5,60-8,32	5,90-8,27	5,90-8,32	5,90-8,27
6	7,24-8,12	7,20-8,27	7,27-8,27	7,20-8,12	5,85-8,27	5,85-8,27	5,85-8,27	5,85-7,95
7	7,39-8,32	7,17-8,32	7,35-8,25	7,17-8,47	6,02-8,25		5,95-8,32	5,95-8,32
8	7,33-8,29	7,26-8,36	7,40-8,36		5,86-8,36	5,86-8,36	5,86-8,36	5,86-8,21
9	7,49-8,53	7,26-8,45	7,41-8,45	7,34-8,30	5,93-8,45	5,93-8,45	5,93-8,45	5,93-8,23
10	7,26-8,27	7,19-8,27	7,26-8,27	7,19-8,27	5,95-8,35	5,95-8,35	5,88-8,35	5,95-8,13
11	7,40-8,27	7,18-8,27	7,40-8,35	7,18-8,13	5,93-8,35	5,93-8,27	5,93-8,27	5,93-8,13
12	7,26-8,18	7,04-8,18	7,26-8,18	7,19-8,11	5,90-8,26	5,90-8,18	5,90-8,26	5,90-8,18

Vzorky natívnej 2B8 a 2B8-MX-DTPA sa formulujú v rôznych pufroch a inkubujú pri teplote 4 alebo 30 °C počas 12 týždňov. V priebehu tohto času sa vykonávajú rôzne rozbory vrátane stanovenia izoelektrického bodu. Hodnoty ukázané skôr udávajú rozmedzie izoelektrického bodu pre natívnu a konjugovanú protilátku inkubovanú pri každej teplote, pre každú formuláciu a pre každý z týchto 12 týždňov v priebehu tejto štúdie stability. Záhlavie znamená: 2B8 4 Sal - 2B8 inkubovaná pri teplote 4 °C vo fyziologickom roztoku, 2B8 30 Sal - 2B8 inkubovaná pri teplote 30 °C vo fyziologickom roztoku, 2B8 4 Gly - 2B8 inkubovaná pri teplote 4

SK 288096 Β6 °C v normálnom fyziologickom roztoku obsahujúcom 10 mM glycínu, 2B8-MX 30 Gly - 2B8 inkubovaná pri teplote 30 °C v normálnom fyziologickom roztoku obsahujúcom 10 mM glycínu, 2B8-MX 4 Sal - 2B8-MX-DTPA (konjugát) inkubovaný pri teplote 4 °C vo fyziologickom roztoku, 2B8-MX 30 Sal - konjugát inkubovaný pri teplote 30 °C vo fyziologickom roztoku, 2B8-MX 4 Gly - konjugát inkubovaný pri teplote 4 °C v normálnom fyziologickom roztoku s obsahom 10 mM glycínu a 2B8-MX 30 Gly - konjugát inkubovaný pri teplote 30 °C v normálnom roztoku s obsahom 10 mM glycínu.

Nakoniec pri použití neredukčnej SDS-PAGE majú vzorky protilátky pri 30 °C vysokomolekulárne agregáty po týždni 1 (tabuľka 23). Denzitometrické analýzy gélov ukazujú, že agregáty predstavujú 8 až 17 % vzoriek (tabuľka 23). Ale pokiaľ sa tieto vzorky analyzujú redukčnou SDS-PAGE, nenachádza sa žiadny preukaz vysokomolekulárnych látok, čo ukazuje na tvorbu kovalentných protilátkových agregátov pri teplote 30 °C. Opäť sa nepozoruje žiadna strata imunoreaktivity.

Tabuľka 23

Stabilita 2B8 in vitro

A. Denzitometrické záznamy neredukčných SDS gélov

Vzorka	Vysokomo- lekulárne	Percento
Monomér	Nízkomo- lekuláme
Referenčný údaj	0	100,00	0
12 týždňov/4 °C/fyz. rozt.	0	95,42	4,58
12 týždňov/4 °C/glycín	0	100,00	0
12 týždňov/30 °C/fyz. rozt.	7,63	83,34	9,03
12 týždňov/30 °C/glycín	16,70	72,11	11,18

B. Denzitometrické záznamy redukčných SDS gélov

Vzorka	Vysokomo- lekulárne	Percento Monomér	Nízkomo- lekuláme
Referenčný údaj	0	100,00	0
12 týždňov/30 °C/fyz. rozt.	0	100,00	0
12 týždňov/30 °C/glycín	0	10,00	0

V priebehu tejto stabilnej štúdie sa tiež testujú vzorky 2B8-MX-DTPA inkubované pri teplotách 4 °C a 30 °C ohľadne inkorporácie rádioaktívneho kovu s použitím rádionuklidu ⁹⁰Y. Vzorky sa analyzujú v týždňoch 4, 8 a 12, inkorporuje sa >90 % Y bez ohľadu na teplotu inkubácie.

Nakoniec sa v samostatnej štúdii alikvoty 2B8-MX-DTPA inkubované pri teplotách 4 °C a 30 °C počas 10 týždňov značia rádionuklidom ^HIIn a určuje sa ich biologická distribúcia v tkanivách pri myšiach BALB/c. Konjugát pri obidvoch inkubačných teplotách poskytuje podobné biologické distribúcie (hodnoty sa neuvádzajú). Navyše sú získané výsledky podobné výskumom biologickej distribúcie získaným pri myšiach BALB/c s konjugátom značeným rádionuklidom ^H1In pri teplote 4 °C (pozri neskôr).

Spôsoby značenia rádionuklidom sú reprodukovateľné tak pre ^1HIn ako pre ⁹⁰Y. Zvyčajne sa získa inkorporácia rádionuklidu > 95 % pre ^H1In a > 90 % pre ⁹⁰Y. Špecifické aktivity konjugátov značených rádionuklidmi ^H1In a ⁹⁰Y sú zvyčajne v rozmedzí 74 až 111, respektíve 370 až 555 MBq/mg protilátky. Pri počiatočnom vývoji spôsobov značenia rádionuklidmi ^1HIn a ⁹⁰Y sa rádionuklidmi, ktoré nie sú viazané vo forme komplexov, oddelia od 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom s použitím vysokovýkonnej kvapalinovej gélovej permeačnej chromatografie. V ďalších experimentoch sa purifikácia vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou eliminuje vzhľadom na vysoký podiel inkorporácie rádionuklidu (>95 %) získaného s týmto izotopom.

Imunoreaktivita prípravkov 2B8-MX-DTPA značených rádionuklidmi ^1HIn a ⁹⁰Y sa analyzuje spôsobom, ktorý opísali T. Lindmo, E. Boven, F. Cuttitta, J. Fedoroko a P. A. Bunn v J. Immunol. Methods, 72, 77 (1984)). 2B8-MX-DTPA značená rádionuklidom ^ulIn má 100 % imunoreaktivitu (obrázok 6) a konjugát značený rádionuklidom ⁹⁰Y má 60 % imunoreaktivitu (hodnoty sa neuvádzajú).

3. Charakterizácia 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidmi ⁱⁿIn a ⁹⁰Y

Predbežné experimenty s konjugátom značeným ⁹⁰Y preukazujú významnú degradáciu protilátky a stratu imunoreaktivity pri špecifických aktivitách vyšších ako 370 MBq/mg (10 mCi/mg) protilátky. Preto sa poskytuje zloženie minimalizujúce účinky radiolýzy. Bolo hodnotených mnoho účinných nízkomolekulámych prostriedkov na zachytenie voľných radikálov, ale najúčinnejšie na ochranu integrity protilátky a imunoreaktivity boli vysoké koncentrácie ľudského sérumalbumínu (HSA) (obrázky 7 až 9).

Protilátka značená rádionuklidom ⁹⁰Y sa pripravuje v IX PBS, pH 7,4, s obsahom 75 mg/ml HSA. Taktiež sa pridáva kyselina dietyléntriamínpentaoctová na dosiahnutie konečnej koncentrácie 1 mM, aby sa zaistilo, že akýkoľvek ⁹⁰Y oddelený od protilátky sa naviaže vo forme komplexu. Degradácia 2B8-MX-DTPA označenej na špecifickú aktivitu 540 MBq/mg (14,6 mCi/mg) sa hodnotí v časoch 0 a 48 h s použitím SDS-PAGE a autorádiografie. Obrázky 8 a 9 ukazujú, že protilátka označená rádionuklidom nemá žiadnu významnú degradáciu v priebehu 48 h pri inkubácii pri teplote 4 °C. Chromatografia s použitím vopred pripravenej tenkej vrstvy ukazuje, že strata ⁹⁰Y je nižšia ako 2 % v priebehu inkubácie počas 48 h (tabuľka 24). Imunoreaktivita bola taktiež relatívne konštantná, 60 % (tabuľka 24).

Tabuľka 24

Stabilita ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA pripravenej na klinické použitie

Čas (h pri 4 °C) Percento aktivity Percento pripojenej na konjugát imunoreaktivity

Ô 97/2 62

96,2 60

96,2 60

Označený konjugát [špecifická aktivita 540 MBq/mg (14,6 mCi/mg)] sa pripraví v PBS, pH 7,4 s obsahom 75 mg/ml ľudského sérumalbumínu a 1 mM DTPA a alikvoty sa inkubujú pri teplote 4 °C. Stabilita konjugátu sa analyzuje v časoch ukázaných SDS-PAGE a autorádiografiou, chromatografiou na vopred pripravenej tenkej vrstve a imunoesejou pre celé bunky. Výsledky ukazujú, že zhruba 96 % rádionuklidu kovu zostáva pripojených ku konjugátu po 48 h pri teplote 4 °C, a že imunoreaktivita protilátky zostáva konštantná, zhruba 60 %.

Štúdie zloženia sa tiež uskutočňujú pomocou konjugátu označeného rádionuklidom ⁱⁿIn. Špecifická aktivita je 81 MBq/mg (2,2 mCi/mg). Protilátka označená rádionuklidom sa vyhodnocuje v IX PBS, pH 7,4 s obsahom 50 mg/ml HSA. Obrázok 10 ukazuje fotografie autorádiogramov pre čas nula a 48 h inkubácie. Denzitometrická analýza autorádiogramov ukazuje, že nenastáva žiadna degradácia protilátky označenej rádionuklidom v priebehu štúdie (obrázky 11, 12). Chromatografická analýza vzoriek na vopred pripravenej tenkej vrstve nevykazuje žiadnu stratu rádionuklidu ^1HIn (tabuľka 25). Navyše sa udržuje imunoreaktivita zhruba 100 % (tabuľka 25).

Tabuľka 25

Stabilita ⁿⁱIn-2B8-MX-DTPA pripravenej na klinické použitie

Čas (h pri 4 °C)	Percento aktivity pripojenej na konjugát	Percento imunoreaktivity
0	94,0	105
24	96,5	104
48	96,0	100

Označený konjugát [špecifická aktivita 81 MBq/mg (2,2 mCi/mg)] sa pripraví v PBS, pH 7,4 s obsahom 50 mg/ml ľudského sérumalbumínu a alikvoty sa inkubujú pri teplote 4 °C. Stabilita konjugátu sa analyzuje SDS-PAGE a autorádiografiou, chromatografiou na vopred pripravenej tenkej vrstve a imunoesejou pre celé bunky. Výsledky ukazujú, že zhruba 96 % rádioaktívnej značky zostáva pripojených ku konjugátu po 48 h pri teplote 4 °C a že imunoreaktivita protilátky zostáva konštantná, zhruba 100 %.

Pri inkubácii klinického prípravku 2B8-MX-DTPA označeného rádionuklidom ⁹⁰Y na špecifickú aktivitu 540 MBq/mg (14,6 mCi/mg) počas 96 h pri teplote 37 °C v ľudskom sére a analýze za neredukujúcich podmienok SDS-PAGE a autorádiografiou sa ukazuje v priebehu času inkubácie strata rádionuklidu nižšej ako 4 %. Denzitometrické záznamy autorádiogramov v čase nula a 96 h neukazujú žiadnu významnú degradáciu konjugátu označeného rádionuklidom (obrázky 13 až 15). Tieto výsledky sa potvrdzujú chromatografickými analýzami na tenkej vrstve pre vzorky času nula a 96 h (tabuľka 26). Celkom tieto výsledky ukazujú, že konjugát označený ytriom je stabilný za podmienok použitých v tejto štúdii. Podobné výsledky sa získajú s kon40

SK 288096 Β6 jugátom 2B8-MX-DTPA označeným rádionuklidom ^H1In (obrázky 16 až 18).

Tabuľka 26

Analýza konjugátu ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA inkubovaného v ľudskom sére počas 96 h pri teplote 37 °C uskutoč5 nená chromatografiou na tenkej vrstve

Čas (h pri 37 °C) Percento aktivity pripojenej na konjugát

0	95,1
24	95,2
48	93,2
72	92,0
96	91,4

Vzorky ľudského séra obsahujúce ⁹⁰Y 2B8-MX-DTPA [špecifická aktivita 540 MBq/mg (14,6 mCi/mg)] sa analyzujú v časoch ukázaných nanesením 1 μΐ vzoriek zriedených 1 : 20 na chromatografické pruhy s vo10 pred pripravenou tenkou vrstvou, vzorky sa analyzujú po trojiciach. Chromatografické pruhy sa vyvíjajú vzostupnou chromatografiou v 10 % roztoku octanu amónneho v zmesi metanol: voda (1:1, objemový pomer), vysušia a rozrežú v polovici naprieč. Pripojená aktivita v spodnej a hornej polovici každého pruhu sa potom stanoví a vypočíta sa percento aktivity spojené s konjugátom (voľný rádioaktívny kov migruje s čelom rozpúšťadla, zatiaľ čo aktivita pripojená na proteín zostáva na počiatku). Udávajú sa priemery aktivity spojené s konjugátom pre každé stanovenie.

B. Štúdie na zvieratách

1. Farmakologické/toxikologické štúdie vysokých dávok s 2B8 a 2B8-MX-DTPA

Pri štúdiu dobrej laboratórnej praxe uskutočnenej vo White Sands Research Center (číslo štúdie 920111) sa opiciam Cynomolgus podávali intravenózne injekcie rôznych dávok 2B8. Vzorky krvi sa odoberajú pred každou novou injekciou a krv sa spracuje prietokovým cytometrickým hodnotením populácie lymfocytov (tabuľka 27).

Tabuľka 27

Populácia B buniek primátov stanovená prúdovou cytometriou po infúzii myšej monoklonálnej protilátky 2B8 proti CD20

	Zviera	Dávka	Deň	Bbunkya,b	% vyčerpania
Skupina 1	452	fyziol.	0	20,1	0
		roztok	1	18,3	9
			7	21,6	0
			13	14,6	27
			38	15,5	23
			52	18,6	7
	424	fyziol.	0	12,4	0
		roztok	1	11,6	6
			7	11,2	10
			13	8,4	32
			38	7,7	38
			52	13,1	0
Skupina 11	540	0,6 mg/kg	0	16,1	0
			1	7,1	54
			7	6,0	63
			13	5,7	65
			38	10,8	33

SK 288096 Β6

Zviera	Dávka	Deň	B bunky“’b
			52	14,4	11
	804	0,6 mg/kg	0	17,6	0
			1	8,3	53
			7	6,1	65
			13	6,6	62
			38	5,1	71
			52	5,2	68
Skupina III	701	2,5 mg/kg	0	21,6	0
			1	10,7	50
			7	3,0	86
			13	10,7	50
	754	2,5 mg/kg	0	19,9	0
			1	11,2	44
			7	10,5	47
			13	9,0	55
Skupina IV	782	10 mg/kg	0	15,9	0
			1	3,0	81
			7	3,5	78
			13	6,5	59
	164	10 mg/kg	0	17,7	0
			1	8,4	47
			7	7,9	50
			13	7,7	42
Skupina V	705	10 mg/kg	0	17,2	0
			1	5,2	70
			7	1,3	69
			13	8,2	52
			38	17,1	1
			52	13,3	22
	716	10 mg/kg	0	34,7	0
			1	18,6	46
			7	8,1	77
			13	3,5	90
			38	6,9	80
			52	9,2	61

“Percento celkových lymfocytov.

^bB-bunková populácia vyjadrená kvantitatívne dvoma prostriedkami markeru, antigénu proti myšiemu IGG-RPE a proti ľudskému IG-FITC (antigénu proti myšiemu IgG RPE detekuje 2B8 blokovanú CD20 a antigén proti ľudskému IgG FITC detekuje opičí B-bunkový povrchový Ig).

Zvieratá v skupinách I až IV dostávajú injekčné každých 48 h celkom 7 injekcií, zvieratá v skupine V dostávajú injekciu iba v deň 0. Zvieratá v skupinách III a IV sa utratia dňa 14.

V priebehu tejto štúdie ani po nej sa nezaznamenávajú žiadne významné farmakotoxické účinky na hodnotené klinické parametre súvisiace s podávaním protilátky 2B8 proti CD20. Podobne sa nezaznamenávajú 10 žiadne abnormality v priebehu analýzy rôznych histopatologických vzoriek získaných od zvierat v skupinách

III a IV.

Čas trvania štúdie je 14 d a v priebehu štúdie sa zvieratá hodnotia v nasledujúcich kategóriách: klinické pozorovania, telesná hmotnosť, telesná teplota, príjem vody a potravy, vylučovanie stolice, biochémia krvného séra, hematológia, analýza moču a telesné vyšetrenia. Navyše sa zvieratám v každej skupine odoberá krv v deň 0, 1, 7 a 13 a analyzuje sa ohľadne hladín sérovej protilátky (2B8) a hladín T-buniek a B-buniek. V deň 13 sa zvieratá v skupinách III a IV utratia a vybrané tkanivá sa skúmajú po príprave vzoriek optickou mikroskopiou. Hodnotené tkanivá sú: srdce, slezina, pečeň, obličky, pľúca, mozgová kôra, miecha, lymfatická uzlina, žalúdok, ileum, črevo, kostrový sval, semenníky/vaječníky, podžalúdková žľaza a kostná dreň.

Pri analýze krvi zvierat ohľadne hladín T-buniek a B-buniek v krvnom obehu majú zvieratá skupín II až

V väčšiu ako 50 % stratu B-buniek v obehu do dňa 13 (obrázok 19), podanie protilátky nemalo žiadny účinok na hladiny T-buniek (hodnoty sa neuvádzajú). Všetky skupiny dostávajúce protilátku 2B8 majú nasýtenie B-buniek a nadbytočnú protilátku v krvnej plazme (hodnota sa neuvádza). Zvieratá v skupine V, ktoré dostali jednu dávku 10,0 mg/kg protilátky 2B8, taktiež majú zníženie hladín B-buniek v obehu ekvivalentné zníženiu pri zvieratách v ostatných skupinách.

Zvieratá v skupinách I, II a V sa vyšetrujú do dňa 52 (obrázok 20). Hladiny B- buniek sa vrátia k viac ako 70 % normálneho stavu v deň 38 okrem jedného zvieraťa v skupine II (PR0804) a jedného zvieraťa v skupine

V (PR0716). Hladiny obehových B-buniek v týchto zvieratách zostávajú zhruba na 40 % normálnych hladín po 52 d.

Navyše k tejto štúdií sa farmakotoxické účinky ⁸⁹Y-2B8-MX-DTPA hodnotia pri opiciach Cynomolgus v štúdií dobrej laboratórnej praxe uskutočnenej vo White Sands Research Center (štúdie č. 920611). Konjugát kvality na klinické použitie sa viaže s nerádioaktívnym nuklidom ⁸⁹Y. Konjugát s ytriom sa formuluje vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom, pH 6,8, s obsahom 75 mg/ml ľudského sérumalbumínu a 1 mM DTPA (klinická formulácia) a podáva sa intravenózne, ako sa opisuje v oddiele Spôsoby uskutočnenia.

Ako ukazujú výsledky na obrázku 21, má 2B8-MX-DTPA označený ⁸⁹Y malý účinok alebo nemá žiadny účinok na cirkulujúce B-bunky pri týchto zvieratách bez ohľadu na podanú dávku. Navyše okrem všeobecného vyčerpania lymfocytov (20 až 43 %) nenastávajú žiadne významné abnormality klinických parametrov vrátane biochémie krvného séra, analýzy moču, telesnej hmotnosti a teploty.

2. Farmakologické štúdie s 2B8 a 2B8-MX-DTPA

Ako sa opisuje skôr, zvieratám v skupine V štúdie dobrej laboratórnej praxe sa podala jedna dávka 2B8, 10,0 mg/kg. Lineárna regresia výsledkov ukazuje, že natívna protilátka ubúda z obehu týchto opíc s polčasom zhruba 4,5 d. V podobnej štúdii s použitím myší BALB/c boli hodnoty polčasu natívne a konjugované 2B8 zistené lineárnou regresnou analýzou (údaje sa neuvádzajú) 8,75 d (obrázok 22). Tento výsledok ukazuje, že konjugácia 2B8 nemá žiadny účinok na jej clearanciu pri myšiach BALB/c.

3. Biologická distribúcia a štúdie lokalizácie tumoru s 2B8-MX-DTPA značenou rádionuklidom

Na základe predbežného pokusu biologickej distribúcie opísaného skôr (oddiel 2d) sa podáva injekčné konjugovaná 2B8 značená rádionuklidom ^1HIn do špecifickej aktivity 85 MBq/mg (2,3 mCi/mg). Zhruba 41 kBq (1,1 pCi) sa podáva injekčné každej z 12 myší BALB/c na stanovenie biologickej distribúcie látky označenej rádionuklidom. Následne sa skupiny po 5 zvieratách utratia v časoch 1, 24, 48 a 72 a ich orgány a časť kože, svalu a kosti sa vyberú a spracujú na analýzu. Navyše sa zbiera moč a stolica a analyzuje pre časy 24 až 72 h. Hladina rádioaktivity v krvi klesá zo 40,3 % podanej dávky na g v Čase 1 h na 18,9 % v čase 72 h (tabuľky laž 4, obrázok 23). Hodnoty pre srdce, obličku, sval a slezinu zostávajú v rozmedzí 0,7 až 9,8 % v priebehu druhého pokusu. Nájdené hladiny rádioaktivity v pľúcach klesajú zo 14,2 % v čase 1 h na 7,6 % v čase 72 h a podobne zodpovedajúce podiely injikovanej dávky na g pečeňového tkaniva klesajú z 10,3 na 9,9 %. Tieto hodnoty sa používajú pri stanovení odhadov absorbovanej radiačnej dávky od ⁱⁿIn-2B8-MX-DTPA (tabuľka 19).

Biologická distribúcia konjugátu značeného rádionuklidom ⁹⁰Y so špecifickou aktivitou 451 MBq/mg (12,2 mCi/mg) protilátky sa vyhodnocuje pri myšiach BALB/c. Získaná inkorporácia rádionuklidu je > 90 % a protilátka značená rádionuklidom sa purifikuje vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou. Tkanivová depozícia rádioaktivity sa meria v hlavných orgánoch a koži, svalu, kosti a moču a stolici v triebehu 72 h a vyjadruje sa ako percento injikovanej dávky/g tkaniva. Výsledky v tabuľkách 5 až 8 a na obrázku 24 ukazujú, že zatiaľ čo hladiny rádioaktivity súvisiace s krvou klesajú zo zhruba 39,2 % podanej dávky na g v čase 1 h na zhruba 15,4 % po 72 h, hladiny rádioaktivity súvisiacej s chvostom, srdcom, obličkou, svalom a slezinou zostávajú dostatočne konštantné na hodnote 10,2 % alebo menej v priebehu experimentu. Je dôležité, že aktivita kosti je v rozmedzí 1,4 % podanej dávky na g kosti v čase 1 h až 3,2 % v čase 72 h. Tieto výsledky v súhrne ukazujú, že konjugát obsahuje málo voľného ytria a že sa voľný rádioaktívny kov vylučuje v priebehu štúdie. Tieto výsledky sa používajú pri stanovení odhadov radiačnej absorbovanej dávky pre ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA (tabuľka 20).

Pre štúdie lokalizácie tumoru sa pripravuje 2B8-MX-DTPA značený rádionuklidom ^H1In so špecifickou aktivitou 100 MBq/mg (2,7 mCi/mg). Potom sa následne podá 100 μϊ značeného konjugátu [888 kBq (24 pCi)] injekčné každej z 12 atymických myší s Ramosovým B-bunkovým tumorom. Hmotnosť tumorov je v rozmedzí od 1 do 1,0 g. V časoch 0, 24, 48 a 72 h po injekcii sa odoberie 50 μΐ krvi retroorbitálnou punkciou, myši sa utratia cervikálnou dislokáciou a odoberie sa chvost, srdce, pľúca, pečeň, obličky, slezina, sval, femur a tumor. Po spracovaní a zvážení sa stanoví aktivita každej vzorky tkaniva s použitím čítača gama a hodnoty sa vyjadria ako percento podanej dávky na g.

Výsledky (obrázok 25) ukazujú, že koncentrácie ⁱⁿIn-2B8-MX-DTPA v tumore ustálené rastú v priebehu experimentu. 13 % podanej dávky sa akumuluje v tumore po 72 h. Oproti tomu hladiny v krvi klesajú v priebehu experimentu z viac ako 30 % v čase nula na 13 % v čase 72 h. Všetky ostatné tkanivá (okrem svalu) obsahujú medzi 1,3 a 6,0 % podanej dávky na g tkaniva ku koncu pokusu. Svalové tkanivo obsahuje zhruba 13 % podanej dávky na g.

C. Dozimetria

Súhrnné dozimetrické údaje získané zo štúdií biologickej distribúcie pri normálnych myšiach BALB/c sú v tabuľkách 19 a 20 pre konjugáty značené rádionuklidmi india a ytria a sú v zhode s údajmi v literatúre pri porovnaní vztiahnuté na jednotku podanej aktivity (B. A. Parker, S. E. Halpem, R. A. Miller, H. Hupf, D. L. Shawler, H. A. Collins, D. Amox, C. A. White a I. N. Royston, Eng. J. Med., v tlači) a ukazujú, že konjugáty 2B8 značené rádionuklidmi ytria a india možno bezpečne hodnotiť ohľadne klinickej účinnosti u pacientov s lymfómom.

D. Toxikológia

1. 2B8: skúška všeobecnej účinnosti pri jednej dávke

Myšiam a morčatám sa podáva jednotlivá intraperitoneálna dávka 2B8 (0,5 ml alebo 5,0 ml) a zvieratá sa pozorujú počas 7 d. Nedochádza k žiadnym známkam toxicity.

2. 2B8 a 2B8-MX-DTPA: imunohistologické štúdie na ľudských tkanivách

Reaktivita myšej monoklonálnej protilátky 2B8 sa hodnotí s použitím súboru 32 rôznych ľudských tkanív fixovaných acetónom. Protilátka 2B8 reaguje s antigénom proti CD20, ktorý má veľmi obmedzený typ tkanivovej distribúcie, takže ju možno pozorovať iba v podsúboroch buniek v lymfoidných tkanivách vrátane buniek hemopoetického pôvodu.

V lymfatickej uzline možno pozorovať imunoreaktivitu v populácii zrelých kortikálnych B-lymfocytov rovnako tak ako v proliferujúcich bunkách v zárodočných centrách. Pozitívnu reaktivitu možno tiež pozorovať v periférnej krvi, v oblastiach B- buniek mandlí, v bielej dreni sleziny a v 40 až 70 % medulárnych lymfocytov prítomných v týmuse. Pozitívnu reaktivitu možno tiež pozorovať vo folikuloch lamina propria (Peyerove ložiská) hrubého čreva. Napokon agregáty rozptýlených lymfoidných buniek v strome rôznych orgánov vrátane močového mechúra, mamy, maternicového krčka, pažeráka, pľúc, príušnej žľazy, prostaty, tenkého čreva a žalúdka vykazujú taktiež pozitivitu pri reakcii s protilátkou 2B8.

Všetky jednoduché bunky epitelu, rovnako tak ako bunky vrstveného epitelu a dlaždicového epitelu rôznych orgánov sú nereaktívne. Podobne sa nepozoruje žiadna reaktivita s neuroektodermálnymi bunkami vrátane buniek mozgu, miechy a periférnych nervov. Mezenchymálne elementy, ako sú bunky kostrového a hladkého svalstva, fibroblasty, bunky endotelu a polymorfonukleáme zápalové bunky, sú taktiež negatívne.

Tkanivová reaktivita konjugátu 2B8-MX-DTPA sa hodnotí s použitím súboru 16 ľudských tkanív fixovaných acetónom. Ako sa ukazuje skôr pre natívnu protilátku, rozpoznáva konjugát 2B8-MX-DTPA antigén CD20, ktorý má vysoko obmedzený typ distribúcie, takže sa nachádza iba v podsúbore buniek lymfoidného pôvodu. V lymfatickej uzline sa imunoreaktivita pozoruje pri B-bunkovej populácii. Silná reaktivita je v bielej dreni sleziny a v medulárnych lymfocytoch týmusu. Imunoreaktivita sa tiež pozoruje v rozptýlených lymfocytoch močového mechúra, srdca, hrubého čreva, pečene, pľúc a maternice a prisudzuje sa prítomnosti zápalových buniek prítomných v týchto tkanivách. Podobne, ako sa opisuje skôr pre natívnu protilátku, neprejavuje sa reaktivita pri neuroektodermálnych bunkách alebo mezenchymálnych bunkách.

III. Diskusia

Myšia monoklonálna protilátka 2B8 proti CD20 vytváraná klonom rovnakého určenia vykazuje afinitu k antigénu CD20 B-buniek, ktorá môže byť vyššia ako aktivita pozorovaná pre protilátku BI, ako možno stanoviť kompetíciou s protilátkami známej špecifickosti pre antigén CD20 a Scatchardou analýzou. Ďalej imunoprecipitačné výsledky ukazujú, že antigén precipitovaný protilátkou 2B8 je rovnakým antigénom ako antigén precipitovaný protilátkou BI, lebo obidve protilátky precipitujú dublet s relatívnou molekulovou hmotnosťou 33 a 35 kD. Cytofluorografická analýza špecifickosti protilátky 2B8 pre lymfocyty periférnej krvi ukazuje, že táto protilátka reaguje špecificky s B-bunkami a nevykazuje žiadnu reaktivitu s T-bunkami alebo inými typmi lymfocytov. Napokon predbežné údaje o stabilite ukazujú, že je táto protilátka stabilná pri teplote 30 °C počas 12 týždňov bez straty imunoreaktivity.

Ak sa protilátka 2B8 konjuguje s metylbenzyldietyléntriamínpentaoctovou kyselinou (MX-DTPA), nepozoruje sa žiadne zníženie imunoreaktivity v porovnaní s natívnou protilátkou. Ďalej značenie konjugátu s rádionuklidmi ⁱⁿIn a ⁹⁰Y poskytuje značené konjugáty s imunoreaktivitami 100 % respektíve 60 %. Štúdie sta44

SK 288096 Β6 bility konjugátov značených rádionuklidmi ^1HIn alebo ⁹⁰Y inkubovaných v ľudskom sére počas 96 h pri teplote 37 °C vykazujú zanedbateľnú stratu rádioaktívneho kovu v priebehu tejto štúdie, čo ukazuje, že tieto konjugáty zaručujú stabilitu pri klinickom použití.

Štúdia lokalizácie tumorov pri atymických myšiach s použitím prípravku 2B8-MX- DTPA značeného indiom ukazuje vzrastajúce množstvo konjugátu naviazaného na tumorové bunky v priebehu experimentu bez nezvyčajných akumulácií v iných tkanivách. Navyše sa získavajú dozimetrické odhady odvodené od biologickej distribúcie. Ďalej sú dozimetrické odhady odvodené od biologickej distribúcie v súlade s údajmi publikovanými v literatúre. Napokon štúdie skríženej reaktivity ľudského tkaniva s natívnymi a konjugovanými protilátkami ukazujú, že obidve protilátky rozpoznávajú antigén s vysoko obmedzenou tkanivovou distribúciou, takže reagujú iba so súborom buniek v lymfoidných tkanivách vrátane buniek hemopoetického pôvodu. V súhrne tieto výsledky ukazujú, že konjugácia nepozmeňuje tkanivovú špecifickosť protilátky a že konjugáty značené rádionuklidom sú stabilné in vivo a rozpoznávajú antigén CD20 prítomný na povrchu tumorov pestovaných experimentálne pri atymických myšiach.

Ak sa protilátka 2B8 použije pri štúdiu farmakológie/toxikológie vysokých dávok, nemá žiadne významné farmakotoxické účinky na žiadny z vyhodnocovaných parametrov ani v priebehu štúdie, ani po štúdii. Podobne sa nezaznamenávajú žiadne abnormality v priebehu analýzy rôznych histopatologických vzoriek skúmaných optickou mikroskopiou. Prekvapivo všetky použité dávky protilátky spôsobujú významné vyčerpanie B-buniek v krvnom obehu. Hladiny B-buniek v obehu sa však vracajú ku zhruba normálnym hodnotám pri vymiznutí podanej protilátky. V skupine opíc, ktoré dostali jednu dávku (skupina V), ubúda natívna protilátka z obehu s hodnotou β t_1/2 zhruba 4,5 d. Pri uskutočnení tejto farmakologickej štúdie pri myšiach BALB/c ubúda protilátka 2B8 s hodnotou β t_1/2 8,75 d. Celkovo teda tieto údaje ukazujú, že táto natívna protilátka môže tiež poskytnúť určitý klinický účinok pri podaní ako sprievodná zložka konjugátov značených rádionuklidom. Celkovo tieto údaje ukazujú, že protilátka 2B8 s vysokou afinitou a jej MX-DTPA konjugát majú obmedzený typ reaktivity ľudského tkaniva. Navyše u primátov je táto natívna protilátka netoxická a poskytuje prechodnú clearanciu B- buniek. Ale len čo sa protilátka odstráni z obehu, hladiny B-buniek sa dostatočne rýchlo obnovia. Navyše sú konjugáty 2B8-MX-DTPA značené indiom a ytriom stabilné in vitro a nemajú žiadnu stratu rádioaktívneho kovu v priebehu dlhodobej inkubácie v ľudskom krvnom sére. Konečné odhady radiačnej dávky odvodenej od biologickej distribúcie 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidmi ⁹⁰Y alebo ^1HIn pri myšiach BALB/c sú pri vyjadrení na jednotku podanej aktivity v súlade s dávkovými odhadmi odvodenými od ľudských klinických štúdií používajúcich konjugované protilátky značené týmito rádionuklidmi.

IV. Zhrnutie preklinického vývoja spôsobu značenia „mix-&-shoot“ pre prípravu ⁹⁰Y- 2B8-MX-DTPA

A. Úvod

Myšia monoklonálna protilátka (2B8) proti CD20 značená rádionuklidom ⁹⁰Y sa hodnotí vo fáze I klinickej skúšky na liečenie relapsu B-bunkového lymfómu. Pôvodný spôsob použitia na prípravu protilátky značenej ytriom používa vysokovýkonnú kvapalinovú chromatografiu na odstránenie rádionuklidu, ktorý nie je viazaný s proteínom, pred prípravou a podaním pacientom. Nanešťastie je tento krok predovšetkým časovo náročný a spôsobuje dlhú expozíciu protilátky rádionuklidu v nechránenom stave. To vedie ku zvýšenej radiolýze protilátky a poklesu imunoreaktivity. Navyše otázka prácnosti tohto spôsobu znamená ťažkost pri príprave viac ako jednej dávky rádiofarmaka denne. Zjednodušenie tohto spôsobu by umožnilo uskutočnenie na klinickom pracovisku ako alternatívu na použitie rádiofarmaceutických služieb NIPI Pharmacy Services.

V súlade s tým sa uskutočňuje spôsob značenia rádionuklidom nazývaný „mix- and-shoot“, ktorý predchádza nutnosti purifikácie vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou pri udržiavaní vysokého stupňa inkorporácie rádionuklidu a zlepšenie retencie imunoreaktivity. Štúdie stability in vitro rovnako tak ako štúdie biologickej distribúcie pri myšiach ukazujú, že protilátka značená rádionuklidom spôsobom „mix-and-shoot“ je porovnateľná s látkou získanou s použitím súčasného spôsobu vysokovýkonnej kvapalinovej chromatografie. Výsledky týchto preklinických štúdií ukazujú, že tento nový spôsob „mix-&-shoot“ možno použiť na prípravu 2B8-MX-DTPA značenej ⁹⁰Y vhodnej na použitie v klinických skúškach.

B. Materiály a spôsoby uskutočnenia

Materiály

1. Bunky

Lymfoblastické bunkové línie SB (CD20 pozitívne) a HSB (CD20 negatívne) pochádzajú od American Type Culture Colection a udržujú sa v RPMI-1640 s obsahom 10 % fetálneho bovinného séra s prídavkom glutamínu.

2. Protilátky

Protilátka 2B8 sa purifikuje vo výrobnom oddelení zo supematantu z bioreaktora s dutými vláknami s použitím spôsobov skôr opísaných v IND (BB-IND 4850/4851).

SK 288096 Β6

3. Ďalšie chemické prostriedky ⁹⁰Y vo forme chloridu pochádza z Amershamu. Všetky ostatné chemikálie pochádzajú zo zdrojov opísaných v pripojených správach citovaných neskôr. Chemikálie použité na spôsoby značenia rádionuklidom sú spracované na odstránenie kontaminujúcich iónov ťažkých kovov, ktoré by konkurovali s rádionuklidmi v priebehu stupňa značenia (pozri oddiel Spôsoby uskutočnenia). Chemikálie sa vyrábajú za podmienok dobrej výrobnej praxe vo výrobnom oddelení IDEC podľa zavedených záznamov o vsádzkovej produkcii.

Spôsoby uskutočnenia

1. Príprava 2B8-D4X-DTPA

MX-DTPA kvality na klinické použitie pochádza od Coulter Immunology vo forme dvoj sodnej soli vo vode a uchováva sa pri teplote -70 °C. Konjugát (2B8-MX-DTPA) sa pripraví vo výrobnom oddelení. V týchto štúdiách sa používajú dve rôzne šarže konjugátu, obidve v normálnom fyziologickom roztoku pri koncentrácii 10 mg/ml. Konjugáty sa plnia do sterilných polypropylénových injekčných striekačiek s obsahom 2 ml a ukladajú pri teplotách 2 až 8 °C.

2. Udržiavanie podmienok bez prítomnosti kovov

Všetky spracovania chemikálií sa uskutočňujú tak, aby sa minimalizovala možnosť kontaminácie kovom. Používajú sa polypropylénové alebo polystyrénové plastové nádoby, ako sú banky, kadičky a kalibrované valce. Tie sa premyjú prostriedkom Alconox a dostatočne vypláchnu vodou Milli-Q alebo Water for Irrigation (WFIr) pred použitím. Pri presnom meraní malých objemov sa používajú špičky pipiet neobsahujúce kov (BioRad). Väčšie objemy chemikálií sa spracovávajú s použitím sterilných plastových serologických pipiet. Reakcie sa vhodným spôsobom uskutočňujú v mikrocentrifúgačných skúmavkách s obsahom 1,8 ml zhotovených z polypropylénu so skrutkovým uzáverom.

3. Stanovenie inkorporácie rádionuklidu

Inkorporácia rádionuklidu sa stanoví s použitím chromatografie na vopred pripravenej tenkej vrstve (ITLC) po trojiciach od každej vzorky podľa SOP SP-13-008. Všeobecne sa tento spôsob uskutočňuje nasledujúcim spôsobom: konjugát značený rádionuklidom sa zriedi 1 : 20 v IX PBS s obsahom 1 mM DTPA alebo 5 mM EDTA a potom sa nanesie 1 μΐ 1,5 cm od jedného konca pásu 1 x 5 cm papieru ITLC SG (Gelman Sciences). Tento papier sa vyvíja s použitím 10 % octanu amónneho v zmesi metanol: voda (1 : 1, objemový pomer). Pásy sa vysušia, prerežú v polovici naprieč a rádioaktivita každej časti sa stanoví scintilačným počítačom. Rádioaktivita zodpovedajúcej spodnej polovici pásu (rádioaktivita pripojená k proteínu) sa vyjadrí v percentách celkovej aktivity stanovenej ako súčet hodnôt pre vrchné a horné polovice.

4. Spôsob „mix-and-shoot“ pre 2B8-MX-DTPA značenú rádionuklidom ⁹®Y.

Protilátky sa označia beznosičovým rádionuklidom ⁹⁰Y vo forme chloridu od Amersham v 0,04 M roztoku kyseliny chlorovodíkovej. Alikvot rádionuklidu (370 až 740 MBq/mg protilátky) sa prenesie do polypropylénovej rúrky a pridá sa 0,02-násobok objemu 2 M roztoku octanu sodného bez kovu na úpravu pH roztoku na 3,6. Ihneď sa pridá 2B8-NDTPA (0,3 mg, 10,0 mg/ml v normálnom fyziologickom roztoku) a roztok sa jemne zamieša. pH roztoku sa overí papierikom na kontrolu pH v rozmedzí 3,8 až 4,1 a inkubuje sa počas 5 min. Reakcia sa ukončí prenosom reakčnej zmesi do samostatnej polyetylénovej skúmavky s obsahom IX PBS so 75 mg/ml ľudského sérumalbumínu (HSA) a 1 mM kyseliny dietyléntriamínpentaoctovej (DTPA) a jemne sa zamieša. Protilátka značená rádionuklidom sa ukladá pri teplotách 2 až 8 °C.

Špecifické aktivity sa stanovia meraním aktivity príslušného alikvotu konjugátu značeného rádionuklidom. Táto hodnota sa opraví na účinnosť čítača, vztiahne sa ku koncentrácii proteínu konjugátu stanovenej absorbanciou pri vlnovej dĺžke 280 nm a vyjadrí sa v MBq/mg (mCi/mg) proteínov.

5. Imunoreaktivita ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA in vitro

Imunoreaktivita konjugátu značeného rádionuklidom ⁹⁰Y sa stanoví s použitím SOP SP 13-009 na základe modifikovanej verzie celobunkovej imunoeseje opísanej Lindmoom. Vzrastajúce koncentrácie CD20-pozitívnych SB buniek alebo CD20- negatívnych HSB buniek v log fáze sa pridávajú k duplicitným súborom polypropylénových skúmaviek s obsahom 1,5 ml. Konečný objem buniek je 0,40 ml. Konjugát značený rádionuklidom sa zriedi na konečnú koncentráciu protilátky 1 až 2,5 ng/ml a do každej skúmavky sa pridá 0,35 ml. Po 90 min. inkubácie sa bunky peletujú centrifugáciou a zbierajú sa supematanty. Zvyšná rádioaktivita vo frakcii supematantu sa stanoví scintilačným počítačom. Údaje sa vynášajú ako kvocient celkovej pridanej aktivity delenej aktivitou pripojenou na bunky proti prevrátenej hodnote počtu buniek na skúmavku. Úsek na osi y predstavuje imunoreaktívnu frakciu.

6. Stabilita ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA pripraveného na klinické použitie in vitro

Konjugát 2B8-MX-DTPA sa označí rádionuklidom ⁹⁰Y a pripraví sa podľa spôsobu „mix-&-shoot“ opísaného skôr. Pripravia sa dve šarže značeného konjugátu. Jedna šarža sa použije na vyhodnotenie stability inkorporácie rádionuklidu a druhá šarža sa použije na vyhodnotenie retencie imunoreaktivity. Pripravené konjugáty sa inkubujú pri teplote 4 °C počas 48 h a alikvoty sa analyzujú v časoch 0, 24 h a 48 h s použitím neredukčnej SDS-PAGE a autorádiografie. Imunoreaktivita v každom čase sa vyhodnotí s použitím eseje opísanej skôr.

SK 288096 Β6

7. Stabilita in vitro ⁹⁰Y-2B8-NTX-DTPA v ľudskom sére

Stabilita 2B8-NTX-DTPA značená rádionuklidom ⁹⁰Y sa vyhodnotí inkubáciou v ľudskom sére pri teplote 37 °C počas 72 h. Konjugovaná protilátka sa označí rádionuklidom ⁹⁰Y a pripraví sa podľa opisu skôr. Konjugát označený rádionuklidom sa zriedi 1:10 normálnym ľudským sérom (nie však tepelne inaktivovaným) a alikvoty sa inkubujú v plastových skúmavkách pri teplote 37 °C. Vo vybraných časoch sa vzorky odoberú a analyzujú neredukčnou SDS-PAGE a autorádiografiou.

8. Biologická distribúcia ⁹⁰Y 2B8-MX-DTPA

2B8-MX-DTPA značená rádionuklidom ⁹⁰Y sa vyhodnocuje ohľadne biologickej distribúcie v priebehu 8 až 10 týždňov na myšiach BALB/c. Konjugát značený rádionuklidom sa pripraví, ako sa opisuje skôr. Myšiam sa podáva intravenózne 185 kBq (5 pCi) 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ⁹⁰Y a skupiny po 5 myšiach sa utratia v časoch 1,24,48 a 72 h. Po utratení sa odoberie chvost, srdce, pľúca, pečeň, obličky, slezina, sval, femur, premyje sa a zváži. Na analýzu sa tiež odoberie vzorka krvi a kože. Rádioaktivita každej vzorky tkaniva sa stanoví meraním brzdného zariadenia s použitím čítača gama a stanoví sa percento z podanej dávky na g tkaniva a percento z podanej dávky na orgán.

9. Dozimetria

Údaje o biologickej distribúcii získané na základe aplikácie myšiam 2B8-MX- DTPA značenej rádioaktívnym nuklidom ⁹⁰Y sa používajú na výpočet odhadov absorbovaných radiačných dávok pre aktivitu 37 MBq (1,0 mCi) podanú pacientovi s hmotnosťou 70 kg. Odhady sa uskutočnia spôsobmi prijatými výborom Medical International Radiation dose Committee (MIRD) Spoločnosti nukleárnej medicíny. Tieto výpočty uskutočnil pán Phillip Hagan, Nuclear Medicíne Service, VA Medical Center, LaJolla, CA 92161.

10. Validácia spôsobu prípravy klinických dávok Y-2B8-MX-DTPA (Odkaz na správu R&D s názvom „Validation of „Mix-and-Shoot“ Radiolabeling Protocol for the Preparation of Clinical Doses of ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA“, autor P. Chinn, vydané 22. apríla 1994).

C. Výsledky

1. Príprava 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ⁹⁰Y spôsobom „Mix-&-Shoot“

Predbežné pokusy hodnotiace kinetiku reakcie značkovania rádionuklidom s 2B8-MX-DTPA a ⁹⁰Y ukazujú, že pri pH 3,6 až 4,0 sa inkorporuje 95 % rádionuklidu v priebehu reakčného času 5 až 10 min. Reprodukovateľnosť tejto rádioinkorporácie (95,7 % ± 1,7 %) sa následne overuje vo validačnej štúdii (Reference R&D report „Validation of „Mix-and-Shoot“ Radiolabeling Protocol for the Preparation of Clinical Doses of ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA“, autor P.Chinn, vyšlo 22. apríla 1994). Príprava 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ⁹⁰Y týmto spôsobom „mix-and-shoot“ poskytuje produkt porovnateľný s produktom pripraveným spôsobom vysokovýkonnej kvapalinovej chromatografie (pozri BB-1ND 4850/4851). Spôsob rádioaktívneho značenia je reprodukovateľný pri špecifických aktivitách zvyčajne v rozmedzí 370 až 555 MBq/mg (10 až 15 mCi/mg) protilátky.

Imunoreaktivita 2B8-MX-DTPA značená rádionuklidom ⁹⁰Y pripravená týmto spôsobom je zvyčajne vyššia ako 70 % oproti 55 až 60 % pozorovaným pri validáciách spôsobu uskutočneného s použitím vysokovýkonnej kvapalinovej chromatografie (obrázok 26). Tento rozdiel pravdepodobne vyplýva zo znížených účinkov radiolýzy vďaka skrátenému času inkubácie pri spôsobe „mix-and-shoot“. Tento výsledok je typický a ako sa diskutuje neskôr, je reprezentatívny pre validáciu spôsobov na prípravu klinických dávok konjugátu značeného rádionuklidom vo väčšom meradle.

2. Stabilita in vitro 2B8-MX-DTPA značeného ⁹⁰Y

Predbežné pokusy s nechráneným konjugátom protilátky značeným rádionuklidom ⁹⁰Y s použitím spôsobu vysokovýkonnej kvapalinovej chromatografie ukazuje, že rádiolýza spôsobuje významnú degradáciu protilátky a stratu imunoreaktivity. Preto sa vyvíja formulačný pufer pre minimalizáciu účinkov rádiolýzy. Ľudský sérumalbumín (HSA) je účinný pri minimalizácii degradácie protilátky rádiolýzou. Uskutočňuje sa vyhodnotenie s konjugátom označeným rádionuklidom pripraveným spôsobom „mix-&-shoot“ na overenie účinnosti formulácie pri minimalizácii rádiolýzy. Protilátka značená rádionuklidom ⁹⁰Y so špecifickou aktivitou 536 MBq/mg (14,5 mCi/mg) protilátky sa pripravuje v pufri IX PBS, pH 7,4, s obsahom 75 mg/ml ľudského sérumalbumínu a 1 mM DTPA. Degradácia konjugátu 2B8-MX-DTPA sa hodnotí v časoch 0, 24 a 48 h s použitím spôsobu SDS-PAGE a autorádiografie. Obrázky 2, 3 a 4 ukazujú, že konjugát značený rádionuklidom nevykazuje významnú degradáciu v priebehu 48 h pri inkubácii pri teplote 4 °C. Chromatografia na vopred pripravenej tenkej vrstve nevykazuje žiadnu stratu ⁹⁰Y v priebehu inkubácie počas 48 h. Tieto výsledky sa potvrdzujú spôsobom SDS- PAGE/autorádiografickou analýzou (tabuľka 28). Imunoreaktivita je tiež relatívne konštantná, > 88 % (tabuľka 29).

Tabuľka 28

Stabilita konjugátu ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA pripraveného spôsobom „Mix-&-shoot“ v PBS obsahujúcom ľudský sérumalbumín a DTPA

SK 288096 Β6

Tabuľka 29

Imunoreaktivita prípravku ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA pripraveného spôsobom „mix-&-shoot“ v PBS obsahujúcom ľudský sérumalbumín a DTPA

Čas (h)	Percento aktivity pripojenej na konjugát
ITLC	SDS/PAGE
0	92,9	96,0
24	95,5	95,4
48	91,3	94,6

Čas (h pri 4 °C) Percento imunoreaktivity

Ô 8Ť9

88,5

90,4

Klinicky formulovaný konjugát 2B8-MX-DTPA značený ⁹⁰Y so špecifickou aktivitou 581 MBq/mg (15,7 mCi/mg) sa inkubuje počas 72 h pri teplote 37 °C v ľudskom sére. Vzorky sa analyzujú neredukčnou SDS-PAGE a autorádiografiou (obrázok 30) a nevykazujú žiadnu stratu rádionuklidu v priebehu inkubácie (tabuľka 30). Denzitometrické záznamy autorádiogramov v časoch 0 a 72 h neukazujú žiadnu významnú degradáciu konjugátu značeného rádionuklidom (obrázky 31 a 32). Tieto výsledky sú overené chromatografickými analýzami uskutočnenými na tenkej vrstve (tabuľka 30). Je treba poznamenať, že rádioinkorporácia pre protilátku použitú v tejto štúdii je nižšia ako tá, ktorá sa získa vo validačných štúdiách spôsobu značenia. Táto nižšia inkorporácia rádionuklidu zodpovedá zníženej kvalite šarže rádionuklidu ⁹⁰Y vo forme chloridu použitej na túto danú prípravu protilátky značenej rádionuklidom. Nižšia inkorporácia rádionuklidu nepozmeňuje záver, že konjugát značený ytriom pripravený spôsobom „mix-and-shoot“ je stabilný pri týchto inkubačných podmienkach.

Tabuľka 30

Stabilita konjugátu ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA inkubovaného v ľudskom sére

Čas (h pri 37 °C)	Percento aktivity pripojenej na konjugát
ITLC	SDS-PAGE/autorádiografia
0	85,7	88,8
24	76,4	90,0
72	87,6	88,7

Vzorky ľudského séra obsahujúce ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA [špecifická aktivita 581 MBq/mg (15,7 mCi/mg)] sa analyzujú ohľadne viazaného rádionuklidu⁹⁰Y v ukázaných časoch s použitím prúžkov na chromatografiu na vopred pripravenej tenkej vrstve a spôsoby SDS-PAGE/autorádiografie.

3. Štúdie biologickej distribúcie s konjugátom 2B8-MX-DTPA značeným rádionuklidom ⁹⁰Y

Biologická distribúcia konjugátu značeného rádionuklidom ⁹⁰Y so špecifickou aktivitou 425 MBq/mg (11,5 mCi/mg) protilátky a inkorporácia rádionuklidu >95 % sa hodnotí na myšiach BALB/c. Uloženie rádioaktivity v tkanivách sa hodnotí pre hlavné orgány, kožu, sval, kosť, moč a stolicu v priebehu 72 h a vyjadruje sa ako percento podaného množstva na g tkaniva a percento podaného množstva na orgán. Výsledky znázornené v tabuľkách 31 až 34 a na obrázku 33 ukazujú, že hladiny aktivity v krvi klesajú zhruba zo 43 % podanej aktivity na g (% ID/g) v čase 1 h na zhruba 16 % po 72 h. V čase 24 h a neskôr zostávajú hladiny aktivity v srdci, obličke a slezine dostatočne konštantné, 4 až 8 %. Pre pľúca a pečeň aktivita klesá z 10 až 12 % po 1 h na 8 až 10 % po 72 h. Pre kožu je aktivita relatívne konštantná, zhruba 3 % medzi 24 h a 72 h. Aktivita gastrointestinálneho traktuje konštantná, 0,5 až 1 % medzi 24 h a 72 h. Aktivita svalu zostáva zhruba 0,6 % v priebehu celej štúdie. Vychytávanie aktivity vo femure (kosti) zostáva nižšie ako 4 % vo všetkých časoch, čo ukazuje, že množstvo voľného ytria v prípravku konjugátu je nepatrné a že sa v priebehu štúdie odštepuje málo voľného rádioaktívneho kovu.

Tabuľka 31

Distribúcia aktivity 1,0 h po intravenóznej injekcii ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA pri normálnych myšiach BALB/c

Stredné hodnoty ± smerodajná odchýlka

Vzorka	Hmotnosť orgánu g	% ID/ g	% ID/ orgán
Krv	1,37 ±0,053	42,74 ± 0,78	58,52 ± 1,74
Srdce	0,101 ±0,01	8,03 ± 3,33	0,82 ±0,37
Pľúca (2)	0,126 ±0,01	12,44 ±0,94	1,56 ±0,05
Oblička (1)	0,129 ±0,01	7,81 ± 1,24	0,997 ±0,10
Pečeň	0,899 ± 0,07	10,08 ± 1,28	9,01 ±0,52
Slezina	0,077 ± 0,004	10,74 ±0,96	0,823 ± 0,04
Sval	7,83 ± 0,28	0,44 ± 0,08	3,43 ±0,51
Kosť	2,94 ±0,11	3,44 ± 0,57	10,11 ± 1,80
Koža	2,94 ±0,11	1,46 ±0,58	4,24 ± 1,57
GI trakt	2,33 ±0,08	1,02 ±0,19	2,36 ± 0,36
Moč	-	-	-
Stolica	-	-	-
		Celkom	94,66 ± 3,47

Počet myší = 3

Stredná hmotnosť = 19,58 g ± 0,71 g

Tabuľka 32

Distribúcia aktivity 24 h po intravenóznej injekcii ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA pri normálnych myšiach BALB/c

Stredné hodnoty ± smerodajná odchýlka Vzorka Hmotnosť orgánu % ID/ % ID/ g g orgán

Krv	1,55 ±0,12	19,77 ±2,42	30,77 ± 6,04
Srdce	0,105 ±0,01	4,44 ± 0,55	0,47 ± 0,08
Pľúca (2)	0,127 ±0,02	8,78 ± 1,61	1,11 ±0,21
Oblička (1)	0,139 ±0,01	5,02 ± 0,52	0,69 ±0,05
Pečeň	0,966 ± 0,09	8,62 ± 2,73	8,20 ± 1,97
Slezina	0,083 ±0,01	6,75 ± 1,27	0,55 ± 0,064
Sval	8,83 ± 0,69	0,692 ±0,01	6,12 ±0,52
Kosť	3,31 ±0,26	2,24 ±0,31	7,47 ± 1,53
Koža	3,31 ±0,26	3,33 ± 0,76	10,88 ± 1,76
GI trakt	2,89 ± 0,43	0,73 ± 0,9	1,02 ±0,05
Moč	-	-	2,31
Stolica	-	-	1,23
		Celkom	73,52 ±6,18%

Počet myší = 3

Stredná hmotnosť = 22,09 g ± 1,73 g

Tabuľka 33

Distribúcia aktivity 48 h po intravenóznej injekcii ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA pri normálnych myšiach BALB/c

Stredné hodnoty ± smerodajná odchýlka

Vzorka	Hmotnosť orgánu	% ID/	% ID/
	g	g	orgán
Krv	1,50 ±0,14	14,97 ± 5,77	22,53 ± 8,48
Srdce	0,104 ±0,01	3,99 ± 1,43	0,415 ±0,16
Pľúca (2)	0,122 ±0,02	8,41 ± 1,57	1,04 ±0,31

Vzorka	Hmotnosť orgánu g	% ID/ g	% ID/ orgán
Oblička (1)	0,124 ±0,01	3,99 ± 1,62	0,49 ±0,19
Pečeň	0,966 ±0,13	6,12 ±3,21	5,69 ± 2,25
Slezina	0,079 ±0,01	6,05 ± 2,38	0,46 ±0,16
Sval	8,59 ± 0,82	0,54 ±0,19	4,67 ± 1,67
Kosť	3,22 ±0,31	2,07 ± 0,84	6,65 ± 2,56
Koža	3,22 ±0,31	2,30 ± 0,70	7,34 ± 1,95
GI trakt	2,63 ± 0,40	0,652 ± 0,30	1,67 ±0,64
Moč	-	-	2,83
Stolica	-	-	2,06
		Celkom	57,28 ± 17,60

Počet myší = 3

Stredná hmotnosť = 21,48 g ± 2,05 g

Tabuľka 34

Distribúcia aktivity 72 h po intravenóznej injekcii ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA pri normálnych myšiach BALB/c Stredné hodnoty ± smerodajná odchýlka

Vzorka	Hmotnosť orgánu g	% ID/ g	% ID/ orgán
Krv	1,45 ±0,07	15,87 ±4,81	23,14 ±7,26
Srdce	0,093 ±0,01	4,16 ± 1,27	0,392 ±0,13
Pľúca (2)	0,123 ±0,02	10,67 ± 3,79	1,30 ±0,45
Oblička (1)	0,123 ±0,01	4,79 ± 1,03	0,596 ±0,16
Pečeň	0,876 ± 0,07	7,26 ± 1,79	6,39 ± 1,76
Slezina	0,081 ±0,01	7,37 ± 2,34	0,584 ±0,16
Sval	8,30 ±0,39	0,67 ±0,13	5,58 ± 1,22
Kosť	3,11 ±0,15	2,58 ±0,51	8,05 ± 1,76
Koža	3,11 ± 0,15	3,09 ± 0,82	9,66 ± 2,68
GI trakt	2,59 ± 0,20	0,79 ±0,18	2,05 ± 0,53
Moč	-	-	3,56
Stolica	-	-	2,82
		Celkom	65,47 ± 14,0

Počet myší = 3

Stredná hmotnosť = 20,76 g ± 0,97 g

4. Dozimetria

Radiačné absorbované dávky pre „štandardného človeka“ s hmotnosťou 70 kg vypočítané pre konjugát značený rádionuklidom ⁹⁰Y s použitím údajov o biologickej distribúcii pri myšiach (% ID/orgán v tabuľkách

31 až 34) sa udávajú v tabuľke 35. Tieto výsledky sú porovnateľné s výsledkami získanými skôr s konjugátom 2B8-MX-DTPA značeným rádionuklidom ⁹⁰Y a pripraveným s použitím spôsobu značenia s vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou.

Tabuľka 35

Radiačné dozimetrické odhady vyplývajúce z podania protilátky 2B8-MX značenej rádionuklidom ⁹⁰Y jednotne rozložené v tele štandardného človeka (70 kg) a založené na údajoch o distribúcii u zvierat v priebehu 72 h po injekcii

Množstvo aktivity =

Nadobličky

100 pCi/dávka na pacienta rad rad

0,534 Vaječníky 0,534

SK 288096 Β6

Množstvo aktivity =	100 pCi/dávka na pacienta
Žlčový mechúr	rad 0,534	Podžalúdková žľaza	rad 0,534
Žalúdočná stena	0,534	Kostra
Tenké črevo	1,158	Kortikálna kosť	1,466
Stena hor. hrub. čreva	1,657	Trabekuláma kosť	1,466
Stena dol. hrub. čreva	2,380	Dreň (červená)	4,452
Obličky	7,015	Dreň (žltá)	2,096
Pečeň	7,149	Chrupavka	1,466
Pľúca	2,157	Ostatné zložky	1,466
Ostatné tkanivá		Koža	6,603
Sval	2,646	Slezina	4,973
Tukové tkanivo	2,646	Semenníky	0,534
Krv	2,646	Štítna žľaza	0,534
Mozog	2,112	Maternica (negravidná)	0,767
Srdce	2,646	Celé telo	1,755

Odkaz: A Scheme for Absorbed-dose Calculation for Biologically Distributed Radionuclides, MIRD J. of Nucl. Med./Suppl., 1, 2/68

Výpočty uskutočnené s použitím Spreadsheet Template v Symphony (Lotus Development Corporation) a 5 zostavené Phillip L. Haganom, MS, Nuclear Medicíne Service, VA Hospital, San Diego, CA 92161 pCi = 37 kBq, 1 rad = 10'² Gy

5. Validácia spôsobu prípravy klinických dávok konjugátu 2B8-MX-DTPA značeného rádionuklidom ⁹⁰Y Celkom desať šarží na validáciu pripravených v MPI Pharmacy Services, Inc. Výsledok testovania každej šarže sa zhŕňa v tabuľke 36. Stredná hodnota každého výsledku sa vypočíta a udávajú sa štandardné odchýlky 10 tam, kde je to vhodné. Na hodnotenie variability tohto spôsobu následkom rôznych časov značenia sa pripravia šarže 1 až 8 s použitím času značenia 10 min., šarže 9 a 10 s použitím času značenia 5 min. Na základe výsledkov skúšky pre 10 validačných šarží sa určujú špecifikácie na vypustenie výrobku. Špecifikácie na vypustenie sa zhrňujú v tabuľke 37.

Tabuľka 36

Analýza výsledkov pre 10 validačných šarží ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA pripravených spôsobom „mix-&-shoot“

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	stred. hodn.
% imunoreaktivity	72,8	93,3	71,7	70,2	60,6	68,2	79,5	72,4	88,2	68,5	74,5 ± 9,8
endotoxin (Eu/ml)	<0,125	<0,125	<0,125	<0,125	<0,125	<0,25	<0,25	<0,25	<0,125	<0,125	<0,162 + 0,06
% rádioinkorporácie	97,5	97,0	93,5	96,0	94,7	94,9	95,9	96,5	97,5	93,5	95,7+1,4
kone. protilátky	0,122	0,102	0,088	0,128	0,134	0,119	0,093	0,088	0,111	0,096	0,108 + 0,017
(mg/ml) aktivita (pCi/ml)	1,22	1,22	0,98	1,26	1,51	1,55	1,06	0,98	1,28	1,02	1,21+0,21
äpec. akt. (mCi/kg)	10,0	12,0	11,2	9,8	11,3	13,0	11,3	11,1	11,5	10,5	11,2 + 0,9

mCi = 37 MBq

Tabuľka 37

Špecifikácia pre vypustenie konjugátu ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA pripraveného spôsobom “mix-&-shooť‘

Skúška Špecifikácia Spôsob

Imunoreaktivita	> 60 %	RIA
Endotoxin	< 5 EU/ml	LAL
Inkorporácia rad. značky	> 90 %	ITLC
Kone. protilátky	0,075-0,150 mg/ml	A280
Kone. Aktivity*	> 6,0 mCi/ml	kalibrácia dávky
Špec. aktivita*	> 9,0 mCi/mg	A280/kalib.
	protilátky	dávky

SK 288096 Β6

Skúška	Špecifikácia	Spôsob
Celk. aktivita fľaštičky1	> 6,0 mCi	kalibrácia dávky
PH	6,0 až 8,0	pH papierik
Celková kone. proteínu	65 až 85 mg/ml	A280
Test na sterilitu	spĺňa	CFR610.12

‘(kalibrácia času nula) 1 mCi = 37 MBq

D. Diskusia

Pôvodný spôsob značenia rádionuklidom na prípravu ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA používa predovšetkým prácny a časovo náročný purifikačný krok vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou na odstránenie voľného rádionuklidu ⁹⁰Y z prípravku. Na zjednodušenie tohto spôsobu a jeho lepšiu uskutočniteľnosť pri použití na klinickom pracovisku sa venovalo úsilie eliminácii kroku vysokovýkonnej kvapalinovej chromatografie v prospech spôsobu nazývaného „mix-&-shooť‘. Cieľom je identifikovať podmienky značenia rádionuklidom, ktoré by viedli k veľmi vysokej inkorporácii rádionuklidu do konjugátu, čím sa obchádza potreba purifikačného kroku. Zisťuje sa, že viac ako 95 % rádioinkorporáciu možno dosiahnuť pri pH 3,6 inkubáciou počas 5 až 10 min. Ďalšia výhoda tohto spôsobuje zvýšená retencia imunoreaktivity (väčšia ako 70 %), pravdepodobne následkom kratšieho času expozície protilátky vysokoenergetickému rádionuklidu pred prídavkom ľudského sérumalbumínu, ktorý poskytuje ochranu proti rádiolýze. Táto retencia imunoreaktivity je výhodná oproti retencii pozorovanej skôr s použitím spôsobu vysokovýkonnej kvapalinovej chromatografie.

Štúdie stability s konjugátom značeným rádionuklidom ⁹⁰Y s použitím spôsobu „mix-&-shoot“ a inkubovaným vo formulačnom pufri (1XPBS s obsahom 75 mg/ml ľudského sérumalbumínu a 1 mM DTPA) počas 48 h pri teplote 4 °C nevykazujú žiadnu stratu rádionuklidu a vykazujú úplnú retenciu imunoreaktivity. Štúdie stability uskutočňované s ľudským sérom počas 72 h pri teplote 37 °C taktiež ukazujú na minimálnu stratu rádionuklidu. Tieto výsledky stability sú porovnateľné s hodnotami pozorovanými skôr s konjugátom značeným spôsobom s použitím vysokovýkonnej kvapalinovej chromatografie.

Biologická distribúcia pri myšiach BALB/c s použitím konjugátu značeného rádionuklidom ⁹⁰Y pripraveného spôsobom „mix-&-shoot“ neukazuje žiadne nezvyčajné ukladanie v tkanivách. Tieto výsledky ukazujú, že táto protilátka značená rádionuklidom sa významne nepozmeňuje tak, aby sa dramaticky ovplyvňovali charakteristiky protilátky in vivo. Výsledky sú tiež porovnateľné s výsledkami získanými skôr s konjugátom značeným rádionuklidom s použitím spôsobu značenia s vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou (pozri BB-IND 4850/4851). Dozimetrické odhady pre „štandardného“ človeka s hmotnosťou 70 kg vypočítané z údajov biologickej distribúcie pre myši sú v súlade s hodnotami získanými s konjugátom značeným rádionuklidom s použitím spôsobu vysokovýkonnej kvapalinovej chromatografie (pozri BB-IND 4850/4851). Navyše sú tieto dozimetrické výsledky porovnateľné s výsledkami získanými pre pacientov zúčastňujúcich sa klinickej štúdie (IDEC štúdia č. 1315) pri vztiahnutí na jednotku podanej aktivity. Pre šesť pacientov v tejto štúdii sú stredné hodnoty (rad ± smerodajná odchýlka) pre celé telo, srdce, pečeň a slezinu 1,40 ± 0,57, 10,50 ± 4,68, 9,89 ±8,91, respektíve 9,75 ± 6,00(1 rad = 10'²Gy).

Pred uskutočnením spôsobu značenia „mix-&-shoot“ na prípravu ⁹⁰Y-2B8-MX- DTPA kvality na klinické použitie je treba vyhodnotiť reprodukovateľnosť protokolu. Preto sa pripraví validačná šarža s použitím rôznych šarží chloridu rádionuklidu ⁹®Y. Pre týchto 10 pripravených šarží sa hodnoty imunoreaktivity získajú s použitím spôsobu „mix-&-shoot“ v rozmedzí 60,6 % až 93,3 % so strednou hodnotou 74,5 % a mediánom

72.1 %. Táto retencia imunoreaktivity je významne lepšia ako zhruba 60 % získaných skôr s použitím bežného spôsobu s vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou (rozmedzie 54,9 % až 65,1 %, stredná hodnota

60.2 %). Priemerná rádioinkorporácia pre 10 šarží je 95,7 % (rozmedzie 93,5 % až 97,5 %). Táto hodnota je porovnateľná so skôr získanou hodnotou pre spôsob s vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou (rozmedzie 91,7 % až 93,7 % a stredná hodnota 93,1 %). Výsledky ohľadne endotoxínu, koncentrácie protilátky, koncentrácie aktivity, špecifickej aktivity, celkovej aktivity fľaštičky, celkovej koncentrácie proteínu, pH a sterility sú pre týchto desať šarží porovnateľné. Súhrn týchto výsledkov potvrdzuje reprodukovateľnosť spôsobu „mix-&-shoot“. Navyše sa hodnotila reprodukovateľnosť tohto spôsobu vzhľadom na rôzne časy značenia uskutočnením reakcií v priebehu 5 a 10 min. Keďže neboli zaznamenané pre tieto dva reakčné časy žiadané významné diferencie, možno rozhodnúť o použití kratšieho inkubačného času v konečnom protokole.

E. Súhrn

Pôvodcovia tohto vynálezu vyvinuli spôsob značenia nazývaný spôsobom „mix-&-shoot“ na prípravu klinických dávok konjugátu 2B8-MX-DTPA značeného rádionuklidom ⁹⁰Y, ktorý obchádza nutnosť v súčasnej dobe používaného kroku vysokovýkonnej kvapalinovej chromatografie na odstránenie voľného rádionuklidu. Tento zjednodušený spôsob eliminuje tento prácny purifikačný krok pri udržiavaní vysokej hladiny inkorporácie rádionuklidu (>95 %) a zlepšenej retencie imunoreaktivity (>70 %). Tento klinicky formulovaný

SK 288096 Β6 konjugát značený rádionuklidom je stabilný in vitro pri inkubácii pri teplote 4 °C počas 48 h na základe retencie rádionuklidu a imunoreaktivity. Navyše je tento konjugát stabilný pri inkubácii v ľudskom krvnom sére pri teplote 37 °C počas 72 h. Štúdie biologickej distribúcie pri myšiach BALBC/c neukazujú žiadne nezvyčajné ukladanie v tkanivách vrátane kostí. Odhady radiačných absorbovaných dávok pre „štandardného“ človeka s hmotnosťou 70 kg sa porovnávajú s údajmi získanými v klinickej štúdii s použitím konjugátu 2B8-MX-DTPA značeného rádionuklidom ⁹⁰Y. Výsledky týchto štúdií ukazujú, že konjugát 2B8-MX-DTPA značený rádionuklidom ⁹⁰Y získaný spôsobom „mix-&-shoot“ je porovnateľným prípravkom získaným s použitím konvenčného spôsobu s vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou. Validácia spôsobu na použitie vo väčšom meradle na prípravu konjugátu značeného rádionuklidom kvality na klinické použitie ukazuje, že tento spôsob je reprodukovateľný a že tento prípravok je porovnateľný s prípravkom získaným s použitím bežného spôsobu s vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou. Výsledky týchto preklinických štúdií ukazujú, že tento nový spôsob „mix-&-shoot“ možno použiť na prípravu konjugátu 2B8-MX-DTPA značeného rádionuklidom ⁹⁰Y na použitie v klinických skúškach.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Podrobný opis výhodných uskutočnení

Príklad 1. Inkorporácia rádionuklidu - súpravy a eseje

I. Súhrn

Jedným zo zámerov tohto vynálezu je poskytnúť spôsoby značenia súpravy rádionuklidom na prípravu konjugátu 2B8-MX-DTPA značeného rádionuklidom ^1HIn a ⁹⁰Y (In2B8 respektíve Y2B8) a stanoviť špecifikáciu na vypustenie týchto klinických prípravkov. Spôsoby značenia súprav rádionuklidom sú reprodukovateľné vzhľadom na inkorporáciu rádionuklidu a väzby antigén-pozitívnych SB buniek a ukazujú na vhodnosť súprav na značenie rádionuklidom na použitie v týchto klinických skúškach. Odporúča sa, aby špecifikácie na vypustenie boli pre In2B8 a Y2B8 > 95 %, respektíve > 70 % inkorporácie nuklidu a väzby.

II. Úvod

Myšia monoklonálna protilátka (Y2B8) proti CD20 značená rádionuklidom ⁹⁰Y sa v súčasnej dobe hodnotí v klinických skúškach na liečenie relapsu B-bunkového lymfómu. Rádionuklid ytria nemá zložku gama, takže je nevhodný na zobrazovacie systémy. Preto sa na hodnotenie lokalizácie tumoru a dozimetrie u pacientov pred alebo po liečení s terapeutickým prostriedkom značeným ytriom používa konjugát 2B8-MX-DTPA (In2B8) značený rádionuklidom ^H1In. V súčasnej dobe sa používajú spôsoby prípravy Y2B8 a In2B8 nazývané ako spôsoby „mix-&-shoot“ a poskytujú protilátky značené rádionuklidom vhodné na klinické štúdie. Ale zjednodušenie spôsobu značenia by znamenalo možnosť prípravy dávky na klinickom pracovisku.

Nová súprava na značenie rádionuklidom sa prednostne skladá zo 4 zložiek:

(1) 2B8-MX-DTPA vo fyziologickom roztoku s nízkym obsahom kovov, 2 mg/ml, (2) 50 mM roztok octanu sodného používaný na úpravu roztoku rádionuklidu na pH 3 vhodné na značenie, (3) formulačný pufer (IX PBS, pH 7,4, obsahujúci 7,5 % ľudského sérumalbumínu a 1 mM DTPA), (4) prázdna sklenená fľaštička s obsahom 10 ml (reakčná fľaštička). Všetky zložky sa testujú ohľadne sterility a neprítomnosti pyrogénov.

Táto správa zahrnuje validáciu tejto súpravy na značenie rádionuklidom, ktorú možno jednoducho a ľahko používať, a ktorá poskytuje protilátky značené rádionuklidmi s inkorporáciou rádionuklidov > 95 % a s prijateľným zachovaním väzby na antigén-pozitívne bunky. Odporúča sa vypustenie skúšobných špecifikácií na klinické produkty.

III. Materiály a spôsoby inkorporácie rádionuklidov

A. Prostriedky v súprave na značenie rádionuklidmi

1. 2B8-MX-DTPA, IDEC, šarža # 082395RM2

2. 50 mM roztok octanu sodného s nízkym obsahom kovov, IDEC, šarža # 082395RM3

3. Formulačný pufer (IX PBS, pH 7,4, obsahujúci 7,5 % (hmotnosť/objem) ľudského sérumalbumínu a 1 mM DTPA), IDEC, šarža # 082395RM1

4. Reakčná fľaštička 10 ml, IDEC

B. Materiály a zariadenia

1. Súprava na kontrolu inkorporácie rádionuklidu Biodex Tec-Control Radioincorporation Kit, Cat# 151-770.

2. Rukavice: bez prášku.

3. Sterilné polypropylénové injekčné striekačky.

4. Sterilné ihly na injekčné striekačky.

SK 288096 Β6

5. Malé skúmavky s uzáverom, 1,5 ml.

C. Spôsoby uskutočnenia

1. Príprava Y2B8 a In2B8 s použitím súpravy na značenie rádionuklidmi

Prostriedky v súprave sa pripravia a plnia do sklenených fľaštičiek so zátkou. Borosilikátové fľaštičky typu I (2 alebo 10 ml) sa prepláchnu sterilnou vodou do injekcií (WFI) a pred plnením sa autoklávujú. Butylkaučukové zátky sa opláchnu sterilnou vodou do injekcií a pred použitím sa autoklávujú. Použité látky sa plnia ručne a zalemujú v miestnosti triedy 100 a testujú ohľadne prítomnosti pyrogénov a sterility s použitím spôsobov USP.

a. Príprava In2B8 Prostriedky

1. Rádionuklid ^H1In vo forme chloridu, beznosičový, v kyseline chlorovodíkovej.

Upozornenie:

1. Všetky kroky sa prednostne uskutočňujú s použitím aseptických spôsobov.

2. Zložky súprav na značenie rádionuklidu je treba pred použitím temperovať na teplotu miestnosti.

3. Konečný produkt je treba podávať pacientovi v priebehu 8 h od ukončenia kroku 9 neskôr.

Spôsob značenia In2B8

Spôsob uskutočnenia

1. Objem roztoku ⁱⁿInCI₃ sa pridá do reakčnej nádobky podľa nasledujúceho výpočtu:

a. Koncentrácia rádioaktivity v čase značenia rádionuklidom v mCi/ml (1 mCi = 37 MBq).

C„ = koncentrácia rádioaktivity v čase kalibrácie (pozri výrobcovo osvedčenie o analýze).

Δ t = zmena času (pozitívna hodnota je po kalibrácii, negatívna hodnota pred kalibráciou).

Koncentrácia rádioaktivity v čase značenia =

C„ e 0,0103 (At)

b. Objem ⁿⁱInCI₃, ktorý sa pridáva do reakčnej fľaštičky

203 MBq (5,5 mCi)

- = objem pridávaný do koncentrácia rádioaktivity reakčnej fľaštičky v čase značenia

2. Objem 50 mM roztoku octanu sodného na pridanie do reakčnej fľaštičky sa vypočíta nasledujúcim spôsobom:

Pridaný objem ⁿⁱInCI₃ (krok lb) x (1,2) = objem 50 mM octanu sodného na pridanie.

3. Zátka reakčnej fľaštičky a fľaštička na 50 mM octanu sodného sa vytrú alkoholom. Do reakčnej fľaštičky sa prevedie pomocou injekčnej striekačky s obsahom 1 ml vypočítaný objem 50 mM roztoku octanu sodného (krok 2).

4. Zátka fľaštičky s ⁿⁱInCI3 sa utrie alkoholom. Fľaštička sa odvzdušní ihlou vybavenou sterilným filtrom 0,2 pm. S použitím sterilnej injekčnej striekačky sa požadovaný objem (krok lb) roztoku ^luInCI3 prenesie do reakčnej fľaštičky. Fľaštička sa niekoľkokrát zamieša prevrátením.

5. Zátka fľaštičky 2B8-MX-DTPA sa utrie alkoholom. S použitím injekčnej striekačky s obsahom 1 ml sa do reakčnej fľaštičky pomaly prenesie 1,0 ml 2B8-MX- DTPA. Fľaštička sa mieša tým, že sa niekoľkokrát prevráti.

6. Reakcia sa nechá prebiehať počas 30 min. ± 5 min. pri teplote okolia.

7. Celkový objem reakčnej zmesi sa vypočíta spočítaním objemu ⁱⁿInCl₃ na pridanie (krok 4), objemu 50 mM roztoku octanu sodného na pridanie (krok 3) a objemu 2B8-MX-DTPA na pridanie (krok 5).

8. Do reakčnej fľaštičky sa pridá objem formulačného pufra na získanie konečného objemu 10 ml, vypočítaný odčítaním celkového vypočítaného množstva v kroku 7 od 10.

9. Fľaštička s formulačným pufrom sa utrie alkoholom a odvzdušní sa. Vzhľadom na viskozitu formulačného pufra sa fľaštička odvzdušňuje s použitím ihly vybavenej filtrom ns injekčné striekačky 0,2 pm. S použitím sterilnej injekčnej striekačky s objemom 10 ml vybavenej príslušnou ihlou na odmeriavanie sa do reakčnej fľaštičky prenesie objem formulačného pufra vypočítaný v kroku 8. Odvzdušňovacia ihla sa z reakčnej fľaštičky odstráni a fľaštička sa premieša niekoľkonásobným prevrátením (konečný produkt). Táto fľaštička sa inkubuje počas aspoň 5 min. pred uskutočnením „Eseje inkorporácie rádionuklidu“. Zafarbenie roztoku je jantárové a fľaštička je plná, čo potvrdzuje pridanie formulačného pufra.

10. Celková aktivita fľaštičky s konečným produktom sa zmeria s použitím príslušnej meracej súpravy na meranie rádionuklidu ^H1In.

11. Konečný produkt sa ihneď uloží pri teplote 2 °C až 8 °C pre „Imunoesej“ a „Esej inkorporácie rádionuklidov“.

SK 288096 Β6

b. Príprava Y2B8

Prídavné prostriedky:

1. Rádionuklid ⁹⁰Y vo forme chloridu, beznosičový, v kyseline chlorovodíkovej.

Upozornenie:

1. Všetky kroky je treba uskutočňovať aseptickým spôsobom.

2. Súčasti súpravy na značenie rádionuklidom je treba pred použitím temperovať na teplotu miestnosti.

3. Produkt je treba podávať pacientovi v priebehu 8 h od ukončenia kroku 8 neskôr.

Spôsob značenia Y2B8 rádionuklidom

1. Objem roztoku ⁹⁰YCI₃ na pridanie do reakčnej fľaštičky sa vypočíta nasledujúcim spôsobom: a. Koncentrácia rádioaktivity v čase značenia rádionuklidom:

C_o = koncentrácia rádioaktivity v čase kalibrácie (pozri výrobcovo osvedčenie o analýze).

Δ t = zmena času (pozitívna hodnota je po kalibrácii, negatívna hodnota pred kalibráciou). Koncentrácia rádioaktivity v čase značenia =

C_{o e}0,0108 (At)

b. Objem ⁹⁰YCI₃, ktorý sa pridáva do reakčnej fľaštičky 1665 MBq (45 mCi)

- = objem pridávaný do koncentrácia rádioaktivity reakčnej fľaštičky v čase značenia

2. Objem 50 mM octanu sodného pridávaný do reakčnej fľaštičky sa vypočíta nasledujúcim spôsobom:

a. Pre ^9OYC1₃ v 0,040 M roztoku kyseliny chlorovodíkovej (Amersham):

Objem roztoku ⁹⁰YCI₃ (krok lb) x (0,8) = objem pridávaného octanu sodného.

b. Pre ⁹⁰YCI₃ v 0,050 M roztoku kyseliny chlorovodíkovej (Nordion):

Objem ⁹⁰YCI₃ (krok lb) x (1,0) = objem roztoku octanu sodného na pridanie.

3. Zátky reakčnej fľaštičky a fľaštičky s roztokom octanu sodného sa vytrú alkoholom. S použitím injekčnej striekačky s obsahom 1 ml sa do reakčnej fľaštičky prenesie vypočítaný objem (krok la alebo lb) 50 mM roztoku octanu sodného (krok 2). Fľaštička sa zamieša niekoľkonásobným prevrátením.

4. Zátka fľaštičky s roztokom rádionuklidu ^9OYCI3 sa utrie alkoholom. Prepichne sa ihlou, ktorá má sterilný filter 0,2 μιη. S použitím sterilnej injekčnej striekačky 1 ml sa nasaje požadovaný objem (krok lb) ⁹⁰YCI3 na prenesenie do reakčnej fľaštičky. Fľaštička sa zamieša niekoľkonásobným prevrátením.

5. Zátka fľaštičky 2B8-MX-DTPA sa utrie alkoholom. S použitím injekčnej striekačky s obsahom 3 ml sa prenesie 1,5 ml roztoku 2B8-MX-DTPA do reakčnej fľaštičky. Fľaštička sa zamieša niekoľkonásobným prevrátením.

6. Celkový objem reakčnej zmesi sa vypočíta ako súčet množstva pridaného roztoku ⁹⁰Y vo forme chloridu (krok 4), množstva pridaného 50 mM roztoku octanu sodného (krok 3) a množstva pridaného 2B8-MX-DTPA (krok 5).

7. Objem formulačného pufra na pridanie do reakčnej nádobky na získanie konečného objemu 10 ml sa vypočíta odčítaním celkového reakčného objemu vypočítaného v kroku 6 od 10.

8. Fľaštička s formulačným pufrom sa utrie alkoholom a odvzdušní sa. Vzhľadom na viskozitu formulačného pufra sa použije ihla vybavená filtrom na injekčné striekačky 0,20 pm. S použitím sterilnej striekačky s obsahom 10 ml vybavenej príslušnou ihlou na odmeriavanie sa objem formulačného pufra vypočítaný v kroku 7 prenesie do reakčnej fľaštičky. Odvzdušňovacia ihla sa z reakčnej fľaštičky odstráni a fľaštička sa zamieša niekoľkonásobným prevrátením (konečný produkt). Fľaštička sa pred uskutočnením eseje inkorporácie rádionuklidu inkubuje aspoň počas 5 min. Zafarbenie roztoku je jantárové a reakčná fľaštička je plná, čím možno overiť pridanie reakčného pufra.

9. Celková aktivita fľaštičky s konečným produktom sa zmeria s použitím príslušného prístroja na meranie rádionuklidu ⁹⁰Y.

10. Konečný produkt sa ihneď uloží pri teplote 2 °C až 8 °C do času použitia pre podanie pacientovi.

11. Testovanie imunoreaktivity:

S použitím injekčnej striekačky s obsahom 1 ml sa z reakčnej fľaštičky odoberie aseptický objem 0,1 ml a prenesie sa do samostatnej skúmavky so skrutkovacím uzáverom 1,5 ml. Táto skúmavka sa ihneď uloží pri teplote 2 °C až 8 °C na použitie pri „Imunoeseji“ a „Eseji inkorporácie rádionuklidu“.

Validácia spôsobov značenia súpravy rádionuklidom sa uskutočňuje v IDEC Pharmaceuticals (San Diego, CA), MD Anderson Health Center (Houston, TX), Mayo Clinic (Rochester, MN) a City of Hope (Duarte, CA). Všetky súčasti súpravy vrátane 2B8-MX-DTPA kvality na klinické použitie sa pripravia za podmienok

SK 288096 Β6 dobrej výrobnej praxe IDEC Pharmaceuticals (Good Manufacturing Conditions according to the Code od Federal Regulations) a stanoví sa sterilita a neprítomnosť pyrogénov.

Protilátky značené rádionuklidom sa formulujú v IX PBS s obsahom 7,5 % (hmotnosť/objem) ľudského sérumalbumínu (HSA, kvality na klinické použitie, Baxter- Hyland) a 1 mM roztoku DTPA. Výsledky skúšky na vypustenie výrobku uskutočnené pri každej validačnej šarži sa opisujú neskôr.

Šesť validačných šarži, každá s In2B8 a Y2B8, pripraví päť operátorov. Tieto šarže sa označia nasledujúcim spôsobom a testujú v nasledujúcich zariadeniach:

In2B8:

# 1: IDEC Pharmaceuticals #2: IDEC Pharmaceuticals #3: IDEC Pharmaceuticals #4: MD Anderson Health Center #5: Mayo Clinic #6: City of Hope

Y2B8 # 1: IDEC Pharmaceuticals #2: IDEC Pharmaceuticals #3: IDEC Pharmaceuticals #4: MD Anderson Health Center #5: Mayo Clinic #6: City of Hope

2. Príprava lyofilizovaných SB buniek a HSB buniek

Ľudské bunkové línie SB (CD20-pozitívne) a HSB (CD20-negatívne) sa získajú od American Type Culture Collection a pestujú v T-bankách s použitím RPMI-16040 s obsahom 10 % fetálneho bovinného séra s dodatkom 2 % glutamínu. Kultúry sa udržujú pri teplote 37 °C v prítomnosti 5 % oxidu uhličitého. Bunky sa zvyčajne delia 1 : 2 každý deň a zbierajú pri množstve 0,5 až 2,5 x 10⁶ buniek/ml a životnosti >80 %. Bunkové koncentrácie sa stanovia s použitím hemocytometra a životnosť sa stanoví vylučovaním trypánovej modrej·

Bunky sa zbierajú pri teplote okolia a bunkovej hustote 0,5 až 2 x 10⁶ buniek/ml centrifugáciou (1 300 min'¹, v Sorvalovej centrifúge) a premyjú sa dvakrát IX HBSS. Peletované bunky sa resuspendujú na koncentráciu 50 x 10⁶ buniek/ml v IX HBSS obsahujúcom 1 % (hmotnosť/objemom) bovinného sérumalbumínu (BSA) a 10 % (hmotnosť/objemom) manitolu (lyofilizačný pufer), 0,5 ml sa prideľuje do polypropylénových mikrocentrifugačných skúmaviek s obsahom 1,5 ml vybavených tesniacim O-krúžkom a ukladajú sa pri teplote -70 °C a lyofilizujú cez noc pri tlaku 4 až 8 Pa. Skúmavky s lyofilizovanými bunkami sa ukladajú vysušené pri teplote 2 až 8 °C a pre eseje sa rekonštituujú sterilnou vodou. Skúmavky s lyofilizovanými bunkami sa ukladajú s vysúšacím prostriedkom.

3. Analytické eseje

Analytické spôsoby používané pre validačné šarže In2B8 a Y2B8 sa opisujú neskôr. S každou validačnou šaržou sa uskutočňujú nasledujúce validácie:

1. Imunoesej s použitím lyofilizovaných SB buniek

2. Esej inkorporácie rádionuklidu do Y2B8/In2B8 s použitím súpravy Biodex Kit

а. Imunoesej

Väzbu v percentách vyhodnotí každý operátor s použitím lyofilizovaných CD20 pozitívnych SB buniek podľa nasledujúcich spôsobov pre In2B8 a Y2B8. Tieto eseje poskytujú rýchly a účinný spôsob overenia toho, že protilátka značená rádionuklidom stále rozpoznáva CD20 ako antigén. Na jednom klinickom pracovisku sa tiež hodnotia CD20-negatívne HSB bunky. Lyofilizované bunky sa pripravia a ukladajú podľa opísaného spôsobu „Príprava lyofilizovaných SB a HSB buniek“.

1. Imunoesej In2B8

Prídavné prostriedky:

1.^1Hln-MX-DTPA.

2. Lyofilizované SB bunky, tri skúmavky obsahujúce 25 x 10⁶ buniek/skúmavka.

3. Lyofilizované HSB bunky, tri skúmavky obsahujúce 25 x 10⁶ buniek/skúmavka.

4. Sterilná voda na irigáciu alebo sterilná voda do injekcií.

5. Zrieďovací pufer IX PBS, pH 7,2 až 7,4 s obsahom 1 % bovinného sérumalbumínu (BSA) a 0,02 % azidu sodného, filtrovaný filtrom 0,2 pm a ukladanie pri teplote miestnosti.

б. Sklenené alebo plastové skúmavky na meranie početnosti impulzov.

SK 288096 Β6

Spôsob uskutočnenia

Usporiadanie eseje (nerádioaktívna časť)

1. Získajú sa tri skúmavky s lyofilizovanými SB a HSB bunkami.

2. Do každej skúmavky sa pridá 0,50 ml SWFI (sterilná voda do injekcií) a skúmavky sa miešajú vírivým pohybom do získania homogénnych suspenzií.

3. Štyri prázdne mikrocentrifugačné skúmavky obsahu 1,5 ml. Do troch zo skúmaviek sa pridá 0,50 ml zried’ovacieho pufra predstavujúceho kontrolu bez buniek.

4. Do ďalšej mikrocentrifugačnej skúmavky s obsahom 1,5 ml sa pridá 0,909 ml zried’ovacieho pufra a táto skúmavka sa označí 1 : 100.

5. Sterilná propylénová skúmavka s obsahom 50 ml sa vybaví uzáverom a pridá sa do nej 10 ml zrieďovacieho pufra.

Usporiadanie eseje (rádioaktívna časť)

1. Získa sa protilátka značená rádionuklidom ukladaná pri teplote 2 °C až 8 °C.

2. Objem 0,01 ml sa odoberie pomocou P20 a pridá sa do 1,5 ml mikrocentrifugačnej skúmavky obsahujúcej 0,99 ml zried’ovacieho pufra (zriedený 1 : 100). Špička sa opláchne a skúmavka sa jemne mieša vírivým pohybom.

3. Objem 0,20 ml sa nasaje pomocou P200 zo skúmavky so zriedením 1 : 100 a pridá sa do kónickej skúmavky obsahujúcej 10 ml zried’ovacieho pufra. Skúmavka sa dôkladne premieša.

Spôsob uskutočnenia eseje

1. Do všetkých skúmaviek sa pridá objem 0,50 ml zriedeného konjugátu ⁿⁱIn2B8-MX-DTPA.

2. Uzávery sa bezpečne utiahnu vo všetkých skúmavkách a skúmavky sa premiešavajú nepretržite počas 60 min.

3. Po 60 min. inkubácie pri teplote okolia sa všetky skúmavky centrifugujú počas 5 min., aspoň pri 2 000 g·

4. Objem 0,75 ml každého supematantu sa prenesie do skúmaviek príslušných pre prístroj na meranie početnosti impulzov.

5. Rádioaktivita v skúmavkách sa meria s použitím čítača gama s opravou na pozadí.

ii. Imunoesej Y2B8

Prídavné prostriedky

1.⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA

2. Lyofilizované SB bunky

3. Sterilná voda na irigáciu alebo sterilná voda do injekcií

4. Zrieďovací pufer IX PBS, pH 7,2 až 7,4 s obsahom 1 % bovinného sérumalbumínu (BSA) a 0,02 % azidu sodného

Spôsob uskutočnenia:

Príprava vzorky protilátky značenej rádionuklidom

1. Získa sa protilátka značená rádionuklidom ukladaná pri teplotách 2 °C až 8 °C.

2. Nasaje sa objem 10 μΐ pomocou P20 a pridá sa do mikrocentrifugačnej skúmavky obsahu 1,5 ml obsahujúcej 990 μΐ zried’ovacieho pufra (zriedený 1 : 100). Špička sa opláchne a skúmavka sa mierne mieša vírivým pohybom.

3. Použije sa sterilná polypropylénová skúmavka s obsahom 50 ml s uzáverom a pridá sa do nej 10 ml zrieďovacieho pufra s použitím serologickej pipety 10 ml.

4. Nasaje sa objem 35 μΐ pomocou P200 zo skúmavky so zriedením 1 : 100 a pridá sa do kónickej skúmavky obsahujúcej 10 ml zried’ovacieho pufra. Dôkladne sa premieša.

Príprava lyofilizovaných buniek

1. Získajú sa tri skúmavky lyofilizovaných SB buniek.

2. Do každej skúmavky sa pridá objem 0,5 ml sterilnej vody do injekcií (SWFI) a skúmavky sa miešajú vírivým pohybom do získania jednotlivých bunkových suspenzií.

3. Použijú sa tri prázdne mikrocentrifugačné skúmavky s obsahom 1,5 ml. Do týchto troch skúmaviek sa pridá zrieďovací pufer predstavujúci kontrolu bez buniek.

Spôsob uskutočnenia eseje

1. Objem 0,5 ml zriedeného konjugátu ⁹⁰Y-2B8-MX-DTPA sa pridá do každej skúmavky.

2. Skúmavky sa umiestnia do miešačky na čas 45 min. na overenie, že sú uzávery bezpečne utiahnuté.

3. Po 45 min. inkubácie pri teplote okolia sa bunky peletujú mikrocentrifugáciou počas 5 min.

SK 288096 Β6

4. Objem supematantu 0,8 ml sa prenesie do scintilačných fľaštičiek.

5. Pridá sa scintilátor do každej fľaštičky.

6. Aktivita v každej fľaštičke sa stanoví s použitím scintilačného čítača s korekciou na pozadie.

b. Esej rádioinkorporácie

Percento inkorporovaného rádionuklidu sa stanoví chromatografiou na vopred pripravenej tenkej vrstve s použitím súpravy Biodex Tec-Control Radiochromatographic Kit podľa nasledujúceho spôsobu uskutočnenia.

Prídavné prostriedky a zariadenia:

1. Konjugát 2B8-MX-DTPA značený rádionuklidmi ^1HIn alebo ⁹⁰Y.

2. Skúmavky na meranie početnosti impulzov rádioaktívnych pásov z chromatografie na tenkej vrstve.

3. Nožnice.

4. Sterilná injekčná striekačka, 1 ml.

5. Sterilné ihly, 26G.

6. Čítač gama alebo scintilačný počítač.

7. Pipetovacie zariadenie.

Spôsob uskutočnenia:

1. Najskôr je treba prečítať celú príručku Biodex Operation Manual.

2. Každá vzorka značená rádionuklidom sa testuje trikrát podľa inštrukcií súpravy, vyvíja sa jeden pás na fľaštičku.

3. Na nanesenie vzorky označenej rádionuklidom na chromatografický pás sa použije pipetovacie zariadenie a nanesie sa 1 μΐ na čiaru štartu. Alternatívne sa malá kvapka nanáša z ihly 26G pripojenej ku sterilnej striekačke 1 ml.

4. Zmeria sa početnosť impulzov každej sekcie s použitím príslušného čítača, napríklad čítača gama pre ^H1In a scintilačného čítača pre ⁹⁰Y s korekciou na pH.

5. Dodržujú sa inštrukcie na výpočet percenta protilátky značenej rádionuklidom.

IV. Výsledky

Výsledky testovania každej validačnej šarže In2B8 alebo Y2B8 sa zhrňujú v tabuľkách 38 a 39.

Tabuľka 38

Validácia výsledkov na vypúšťanie prípravku Y2B8

Číslo šarže	% rádioinkorporácie	% väzby
1	99,5	78,6
2	99,3	87,0
3	99,4	85,9
4	99,2	81,8
5	99,2	79,6
6	96,3	80,8

Stredná hodnota = 98,8 Stredná hodnota = 82,3

Smerodajná odchýlka = 1,24 Smerodajná odchýlka = 3,4 % CV = 1,25 % CV = 4,2 %

Tabuľka 39

Validácia výsledkov na vypúšťanie prípravku In2B8

Číslo šarže % rádioinkorporácie % väzby

1	99,4	86,2
2	98,7	86,8
3	99,3	85,8
4	98,3	86,7
5	99,0	82,1
6	96,3	83,0

SK 288096 Β6

Stredná hodnota = 99,0 Stredná hodnota = 85,2

Smerodajná odchýlka = 0,43 Smerodajná odchýlka = 2,06 % CV = 0,45 % CV = 2,42 %

V. Diskusia a závery

Na zjednodušenie súčasných spôsobov značenia rádionuklidom pre In2B8 a Y2B8 bola vyvinutá štvorzložková súprava. Koncentrácia octanu sodného a 2B8-MX- DTPA sa znižujú na 50 mM respektíve 2 mg/ml na umožnenie prenosu presných objemov s použitím injekčných striekačiek. Všetky zložky súpravy sa prednostne plnia do sklenených fľaštičiek so zátkou a testujú ohľadne sterility a pyrogenity spôsobom IDEC pred vypustením, čím sa eliminuje nutnosť uskutočnenia týchto testov na klinických pracoviskách. Na pracovisku sa všetky manipulácie s reakčným prostriedkom uskutočňujú s použitím sterilných striekačiek a ihiel. Preto dodržanie aseptických spôsobov bežne uskutočnených v rádiofarmaceutickom prostredí zaručuje, že protilátky značené rádionuklidom a formulované sú vhodné na podanie pacientom.

Reprodukovateľnosť a kompaktnosť spôsobov uskutočnenia značenia rádionuklidom pre In2B8 a Y2B8 sa hodnotí uskutočnením niekoľkých validácií s použitím rôznych šarží každého rádionuklidu. Pre šesť validačných šarží pripravených In2B8 je väzba v rozmedzí od 82,1 % do 86,8 % s priemerom 85,1 %, hodnoty inkorporácie rádionuklidu sú zhruba 99 % (rozmedzie 98,3 % až 99,4 %). Pre šesť validačných šarží pripravených Y2B8 je percento väzby v rozmedzí od 78,6 % do 87,0 %, priemer 82,3 %. Hodnoty inkorporácie rádionuklidu pre Y2B8 sú v priemere 98,8 % (rozmedzie od 96,3 % do 99,5 %). Tieto výsledky v súhrne overujú reprodukovateľnosť a kompaktnosť spôsobov značenia súprav rádionuklidom na prípravu obidvoch protilátok In2B8 a Y2B8. Na základe týchto validačných výsledkov sa odporúča stanoviť špecifikácie na vypúšťanie prípravku ohľadne rádioinkorporácie a väzby ako > 95 respektíve > 70 % pre In2B8 a Y2B8.

Navyše vzhľadom na zvýšenú ľahkosť použitia a zníženej možnosti chýb v priebehu prípravy sa odporúča použiť na klinických pracoviskách lyofilizované CD20- pozitívne bunky na overenie percenta väzby a inkorporácie rádionuklidu.

V súhrne všetky tieto výsledky ukazujú, že In2B8 a Y2B8 pripravené s použitím súpravy na značenie rádionuklidom sú vhodné na použitie v klinickom prostredí. Navyše sa zisťujú pre obidve protilátky značené rádionuklidom špecifikácie na vypustenie odrážajúce výsledky niekoľkých validácií uskutočnených piatimi rôznymi operátormi.

Príklad 2

Inkorporácia rádionuklidu a väzba - súpravy a eseje

I. Súhrn

Myšia monoklonálna protilátka proti CD20 značená 2B8 sa klonuje v bunkách CHO za získania vysoko expresnej bunkovej línie. Špecifickosť protilátky odvodenej od CHO pre CD20-pozitívne ľudské bunky sa demonštruje analýzou FACS a kompetitívnou väzbou. Väzba na ľudské T-bunky je zanedbateľná. Afinita protilátky k CD20-pozitívnym bunkám sa stanoví kompetitívnou imunoesejou a je 1,3 x 10¹⁰ M. Protilátka reaguje s chelatotvorným prostriedkom MX-DTPA za vytvorenia konjugátu 2B8-MX-DTPA so zanedbateľnou stratou imunoreaktivity (hodnota afinity 4,4 x 10¹⁰ M). Optimálna konjugácia chelatotvomého prostriedku, ako sa stanoví meraním inkorporácie rádionuklidu ^H1In, sa dosahuje po 6 h reakcie. Spôsoby značenia rádionuklidom konjugátu 2B8-MX-DTPA sa optimalizujú pre ⁹⁰Y alebo ^U1ln vzhľadom na pH a inkubačný čas na zaistenie maximálnej inkorporácie rádionuklidu (> 95 %) a retencie imunoreaktivity (> 75 %). Špecifikácie na vypustenie prípravkov In2B8 a Y2B8 s použitím 2B8-MX-DTPA odvodeného od CHO v klinických skúškach sa odporúčajú ako > 95 % pre inkorporáciu rádionuklidu a > 75 % pre väzbu na lyofilizované a rekonštituované CD20-pozitívne ľudské bunky. Celkom tieto výsledky ukazujú na vhodnosť 2B8-MX-DTPA odvodeného od CHO na použitie v klinických skúškach.

II. Úvod

Protilátka 2B8 používaná skôr sa pripravuje v bioreaktoroch s dutými vláknami. Na zníženie výrobných nákladov sa táto protilátka klonuje a exprimuje v bunkách CHO za získania vysokoexpresnej produkčnej bunkovej línie. Tento príklad opisuje výsledky charakterizácie in vitro protilátky odvodenej od CHO 2B8 a konjugovanej protilátky (2B8-MX-DTPA) a prípravkov značených rádionuklidmi ⁹⁰Y a ^H1In získaných s použitím klinických spôsobov značenia súprav rádionuklidom.

III. Materiály a spôsoby uskutočnenia

A. Reakčné prostriedky

Ľudské bunkové línie SB (CD20-pozitívne) a HSB (CD20-negatívne) sa získajú od American Type Culture Collection a pestujú v T-bankách s použitím RPMI-1640 obsahujúceho 10 % fetálneho bovinného séra s prídavkom 2 % glutamínu. Kultúry sa udržujú pri teplote 37 °C v prítomnosti 5 % oxidu uhličitého. Bunky sa zvyčajne delia 1 : 2 každý druhý deň a zbierajú pri hodnote 0,5 až 2,5 x 10⁶ buniek/ml a životnosti > 80 %.

Koncentrácia buniek sa stanoví s použitím hemocytometra a životnosť sa stanoví vylučovaním trypánovej modrej. Špecifické údaje o šaržiach buniek sa zaznamenávajú v Notebook # 1553 a v zarad’ovači nazývanom „Celí Activity Logbook 1995 & 1996“, autor Ron Morena.

2B8 odvodená od CHO sa pripravuje za podmienok dobrej výrobnej praxe vo výrobnom zariadení IDEC. Protilátka sa formuluje v normálnom fyziologickom roztoku s nízkym obsahom soli pri koncentrácii 11,5 mg/ml. Homogenita protilátok sa stanovuje spôsobom SDS-PAGE. Konjugát 2B8-MX-DTPA sa pripravuje za podmienok dobrej laboratórnej praxe podľa PSBR-043 z 2B8 odvodenej od CHO a formuluje sa vo fyziologickom roztoku s nízkym obsahom kovov pri koncentrácii 2 mg/ml (šarže 0165A a 0165B).

^ulIn vo forme chloridu inditého kvality na farmaceutické použitie sa získa od Amersham (U.K.) alebo Cyclotron Products Inc. (Coral Gables, FL). ⁹⁰Y vo forme chloridu ytritého sa získa od Amersham (U.K.), Nordion International (Kanatta, Canada) alebo Pacific Northwest National Laboratory (Richland, WA). MX-DTPA pripravený za podmienok dobrej výrobnej praxe sa získa od Hauser Chemical (Boulder, CO). Vápenatotrisodná soľ kyseliny dietyléntriamínpentaoctovej (DTPA) sa získa od Heal (Berlín, Nemecko). TAG-NHS sa získa od 1GEN Inc. (Rockville, MD). Myšia protilátka proti CD 19 sa získa od Dynal Inc. (Lake Success, NY). Kozia protilátka proti myšej F(ab')₂ označená FITC sa získa od Jackson ImmunoResearch.

Reakčné prostriedky vyžadujúce odstránenie kontaminácie ťažkými kovmi sa spracujú vsádzkovým spôsobom s Chelex 100 (BioRad Industries) alebo s chelatotvomou sefarózou (Pharmacia) prechodom roztokov stĺpcom. Zásobné roztoky s nízkym obsahom kovov sa zriedia sterilnou vodou na irigácie (SWFIr). Roztoky sa ukladajú v sterilných plastových nádobách.

Ďalšie reakčné prostriedky sa opisujú neskôr pre konkrétne spôsoby.

B. Materiály a zariadenia

1. Originál Analyzer, IGEN Inc. Model # 1100-1000, IDEC# 1492

2. Scintilačný počítač Top-Count, Packard, Model # A9912, IDEC #1329

3. Čítač gama, Isodata, Model #20-10, IDEC #0628

4. Súprava Tec-Control Radiochromatographic Kit, Biodex, Model #151-770

5. Lyofilizačné zariadenia, Virtis, Model Freezemobile 12, IDEC #0458.

Ďalšie látky a zariadenia sa opisujú pre konkrétne spôsoby.

C. Spôsoby uskutočnenia

1. Príprava lyofilizovaných SB a HSB buniek

Bunky sa pestujú, ako sa opisuje skôr, a zbierajú sa pri teplote okolia, pri hustote buniek 0,5 až 2 x 10⁶ buniek/ml centrifugáciou (frekvencia otáčania 1 300 min'¹ v Sorvallovej centrifúge) a premyjú sa dvakrát IX HBSS. Peletované bunky sa resuspendujú na koncentráciu 50 x 10⁶ buniek/ml v IX HBSS s obsahom 1% (hmotnosť/objem) bovinného sérumalbumínu (BSA) a 10 % (hmotnosť/objem) manitolu (lyofilizačný pufer), po 0,5 ml sa pridá do polypropylénových mikrocentrifugačných skúmaviek s obsahom 1,5 ml s tesniacim O-krúžkom a tieto skúmavky sa uskladňujú pri teplote -70 °C a lyofilizujú sa cez noc pri tlaku 4 až 8 Pa. Skúmavky s lyofilizovanými bunkami sa ukladajú vysušené pri teplotách 2 až 8 °C a rekonštituujú sa pre eseje v sterilnej vode. Skúmavky s bunkami lyofilizovanými v mikrocentrifugačných skúmavkách sa uchovávajú spolu s vysúšacím prostriedkom.

2. Imunoesej FACS

Priama väzba protilátok na ľudské B-bunky sa stanoví prietokovou cytometriou. Vzrastajúce koncentrácie protilátky sa inkubujú v IX PBS, pH 7,2, s obsahom 1 % (hmotnosť/objem) bovinného sérumalbumínu (väzbový pufer) s 5 x 10⁶ CD20-pozitívnymi (SB) alebo CD20-negatívnymi (HSB) bunkami počas 30 min. na ľade. Bunky sa premyjú centrifugáciou, resuspendujú vo väzbovom pufri a inkubujú s kozou protilátkou proti myšej F(ab')₂ označenej FITC počas 30 min. na ľade. Po inkubácii so sekundárnym reakčným prostriedkom sa bunky premyjú centrifugáciou a resuspendujú v IX PBS s obsahom 1,1 objemových % formaldehydu na fixáciu buniek. Stredná hodnota intenzity fluorescencie sa stanoví prietokovou cytometriou.

3. Kompetitívne imunoeseje

Imunoreaktivita 2B8 a 2B8-MX-DTPA sa stanoví kompetitívnou väzbou na CD20-pozitívne SB bunky s použitím elektrochemiluminiscenčného spôsobu Origen (Leland a Powell). SB-bunky v log-fáze sa zbierajú z kultúry a premyjú dvakrát IX HBSS. Bunky sa zriedia v IX PBS, pH 7,2, s obsahom 1 % (hmotnosť/objem) bovinného sérumalbumínu. V niektorých experimentoch sa použijú lyofilizované bunky po rekonštitúcii sterilnou vodou.

Indikátorová protilátka označená ruténiom sa pripraví inkubáciou 2B8 odvodenej od CHO (šarža 165) v IX PBS, pH 7,2, s N-hydroxysukcínimidesterom ruténia(II) tris-bipyridínového chelatotvomého prostriedku (TAG-NHS) pri molámom pomere TAG-NHS k protilátke 15 : 1. Po 1 h inkubácii pri teplote okolia s ochranou proti svetlu sa reakcia ukončí glycínom v priebehu 10 min. Nezreagovaný TAG sa odstráni permeačnou chromatografiou s použitím stĺpca Pharmacia PD-10 v rovnováhe s IX PBS. Koncentrácia proteínu sa stanoví Bradfordovou proteínovou esejou. Inkorporácia TAG sa stanoví meraním absorbancie pri vlnovej dĺžke

SK 288096 Β6

455 nm. Vypočítaný molárny pomer TAG k proteínu je 3,0.

Eseje sa uskutočnia v polypropylénových skúmavkách 12 x 75 mm. Rôzne množstvá kompetitívnej protilátky (0,002 až 17 pg/ml) sa inkubujú v IX PBS, pH 7,2, s obsahom 1 % (hmotnosť/objem) BSA s 0,08 pg/ml CHO 2B8 značenej TAG, 0,08 mg/ml protilátky proti CD19 a 167 000 buniek/ml. Po inkubácii pri teplote okolia s orbitálnym miešaním počas 3 h sa stanoví relatívna elektrochemiluminiscencia (ECL) s použitím prístroja ORIGEN. Stredné hodnoty ECL sa stanovia pre dvojice vzoriek a vynesú proti koncentrácii kompetitívnej protilátky s použitím softvéru Kaleidagraph. Pre niektoré experimenty sa vynáša percento inhibície. Krivky kompetície sa prekladajú a hodnoty EC 50 (koncentrácie protilátky poskytujúce 50 % maximálnu väzbu) sa stanovia s použitím nasledujúceho štvorparametrového programu:

y = [(ml-m4) / (1+ (mO / m3) m2] + m4, ml=, m2=, m3, m4= mO = nezávislá premenná ml = odpoveď nulového signálu v relatívnych jednotkách ECL m2 = parameter zakrivenia m3 = EC50 v pg/ml m4 = odpoveď maximálneho signálu v relatívnych jednotkách ECL

Priemerné hodnoty afinity sa vypočítajú z hodnôt EC50 a známej koncentrácie stopovej protilátky s použitím Mullerovho spôsobu.

4. Príprava 2B8-MX-DTPA

Chelatotvomý prostriedok, l-izotiokyanatobenzyl-3-metyldietyléntriamín-pentaoctová kyselina (MX-DTPA) sa používa vo forme suchého prášku (voľná kyselina) a ukladá sa vysušená pri teplotách -20 °C alebo -70 °C. Zhruba 3 mg protilátky CHO 2B8 v normálnom fyziologickom roztoku s nízkym obsahom kovov sa upravia na pH 8,6 prídavkom jednej desatiny objemu 50 mM boritanu sodného, pH 8,6. Protilátka s koncentráciou 10 až 11 mg/ml sa inkubuje pri molárnom pomere MX-DTPA k proteínu 4 : 1 prídavkom MX-DTPA rozpusteného v 50 mM roztoku boritanu sodného, pH 8,6. Po inkubácii pri teplote okolia (2 až 24 h) sa nezreagovaný chelatotvomý prostriedok odstráni z konjugátu opakovanou diafiltráciou v normálnom fyziologickom roztoku s nízkym obsahom kovov s použitím rotačných filtrov Centricon 30.

5. Príprava In2B8 a Y2B8

In2B8 sa pripraví s použitím spôsobov značenia súpravy rádionuklidom, ako sa tu opisuje. Protilátka sa označí na špecifickú aktivitu 111 MBq/mg (3 mCi/mg) a formuluje sa do 0,2 mg/ml. V stručnosti sa prevedie 18 až 74 MBq rádionuklidu ^H1In vo forme chloridu do mikrocentrifúgačnej skúmavky bez kovov a upraví sa na pH 4,2 s použitím 1,2-násobku objemu 50 mM roztoku octanu sodného s nízkym obsahom kovov. Pridá sa 2B8-MX-DTPA s koncentráciou 2 mg/ml k roztoku octanu inditého a po inkubácii pri teplote okolia počas 30 min. sa značená protilátka formuluje do 0,2 mg/ml v IX PBS, pH 7,2, s obsahom 7,5 % (hmotnosť/objem) ľudského sérumalbumínu a 1 mM DTPA (konečná koncentrácia HSA 4 % až 6 %). Všetky vzorky sa testujú ohľadne inkorporácie rádionuklidu po trojiciach. Výsledky ukazujú hodnotu >95 %.

Y2B8 sa taktiež pripraví v malom meradle súpravy na značenie rádionuklidom opísané v príklade 1. Protilátka sa označí na špecifickú aktivitu 555 MBq/mg (15 mCi/mg) a formuluje do 0,3 mg/ml. V stručnosti sa 18 až 74 MBq rádionuklidu ⁹⁰Y vo forme chloridu prenesie do mikrocentrifúgačnej skúmavky bez kovov a upraví na pH 4,2 s použitím 1,2-násobku 50 mM roztoku octanu sodného s nízkym obsahom kovov. Pridá sa 2B8-MX-DTPA pri 2 mg/ml k acetátovému roztoku ⁹⁰Y a po inkubácii pri teplote okolia počas 5 min. sa značená protilátka formuluje do 0,3 mg/ml v IX PBS, pH 7,2, s obsahom 7,5 % (hmotnosť/objem) ľudského sérumalbumínu a 1 mM DTPA (konečná koncentrácia HSA, 4 % až 6 %). Všetky vzorky sa testujú ohľadne inkorporácie rádionuklidu po trojiciach, nájdené hodnoty sú >95 %.

Koncentrácie rádioaktivity finálnych produktov značených rádionuklidom sa vypočítajú na základe pridanej aktivity k reakčnej zmesi a s odkazom na Osvedčenie o analýze rádionuklidov. Koncentrácie protilátky v konečných reakčných zmesiach sa vypočítajú zo známeho množstva pridanej protilátky.

Pre kinetické štúdie značenia rádionuklidmi vyhodnocujúce účinok pH na inkorporáciu nuklidu a väzbu sa upravuje pH reakčnej zmesi. Prídavkom rôznych množstiev 50 mM roztoku octanu sodného s nízkym obsahom kovov (0,8-násobok až 2,2-násobok objemu roztoku rádionuklidu).

6. Stanovenie inkorporácie rádionuklidu pre In2B8 a Y2B8

Množstvo rádioaktivity pripojené ku konjugátu (inkorporácia rádionuklidu) v konečných produktoch alebo inkubačných vzorkách sa stanoví s použitím komerčne dostupnej súpravy pripravenej Biodex (Tec-Control Radiochromatographic Kit, pozri príklad 1). Všeobecne sa aplikuje 1 pl skúšobných vzoriek vo dvojiciach alebo trojiciach s použitím mikropipetovacieho zariadenia a vyvíjajú sa podľa prílohy inštrukcií Biodex. Polovice pásu sa použijú na meranie početnosti impulzov v sklenených skúmavkách s použitím čítača gama Isodata alebo scintilačného počítača Packard Top Count, ako sa opisuje neskôr. Inkorporácia rádioaktívnej značky sa vypočíta delením aktivity v hornej polovici pásu celkovou aktivitou v obidvoch poloviciach. Táto hodnota sa vyjadrí ako percento a stanoví sa priemer.

7. Stanovenie imunoreaktivity ln2B8 a Y2B8

Imunoreaktivita sa hodnotí spôsobom Lindmoa a kol., ako sa opisuje skôr v príklade 1.

8. Priama imunoesej pre In2B8 a Y2B8

SK 288096 Β6

Rovnaké spôsoby, ako sa opisujú tu, sa používajú na stanovenie väzby In2B8 na CD20-pozitívne SB bunky. In2B8 a Y2B8 sa pripravia a formulujú, ako sa opisuje skôr. Pre eseje sa vzorky In2B8 alebo Y2B8 zriedia zrieďovacím pufrom pre eseje (IX PBS, pH 7,2, s obsahom 1 % (hmotnosť/objem) bovinného sérumalbumínu (BSA) na 40 ng/ml respektíve 11 ng/ml.

Antigén-pozitívne (SB) a antigén-negatívne (HBS) bunky sa udržujú v RPMI 1640 s prídavkom 10 % fetálneho teľacieho séra pri teplote 37 °C a v prítomnosti 5 % oxidu uhličitého. Bunky (životnosť > 90 % podľa stanovenia vylučovania trypánovej modrej) sa zbierajú pri teplote okolia a hustote buniek 0,5 až 2 x 10⁶ buniek/ml centrifugáciou (pri frekvencii otáčania 1 300 min'¹ v Sorvallovej centrifúge) a premyjú sa dvakrát 50 ml IX HBSS. Peletované bunky sa resuspendujú na 50 x 10⁶ buniek/ml vo vopred ochladenom IX HBSS s obsahom 1 % (hmotnosť/objem) bovinného sérumalbumínu (BSA) a 10 % (hmotnosť/objem) manitolu (lyofilizačný pufer). Bunkové suspenzie sa rozdeľujú do polypropylénových mikrocentrifugačných skúmaviek s obsahom 1,5 ml s tesniacim O-krúžkom pri koncentrácii 50 x 10⁶ buniek/ml (0,5 ml na skúmavku) a lyofilizujú sa cez noc pri tlaku 4 až 8 Pa. Lyofilizované bunky sa uchovávajú vysušené pri teplote 2 °C až 8 °C a rekonštitujú sa sterilnou vodou pre eseje.

Lyofilizované SB a HBS bunky v polypropylénových skúmavkách obsahu 1,5 ml sa rekonštitujú sterilnou vodou na 50 x 10⁶ buniek/ml. Zriedené In2B8 alebo Y2B8 sa pridajú k bunkám po trojiciach a inkubujú sa počas 45 až 60 min. za miešania pri teplote miestnosti. Po inkubácii sa bunky peletujú centrifugáciou a aktivita viazaná na bunky sa stanoví meraním počestnosti impulzov vzoriek v Isodata Gamma Counter alebo Packard Top Count scintillation counter, ako sa opisuje neskôr. Aktivita viazaná na bunky (B) sa vypočíta odčítaním neviazanej aktivity (supematantu) od celkovej pridanej aktivity. Celková aktivita sa stanoví na základe merania početnosti impulzov v skúmavkách bez buniek. Percento väzby sa vypočíta vyjadrením neviazanej početnosti impulzov ako percento celkovej početnosti impulzov.

9. Meranie aktivity

Vzorky na inkorporáciu rádionuklidu sa merajú počas 1 min. s použitím čítača Isodata gamma counter. Tento čítač sa nastaví na energetické okno 100 až 500 keV a pozadie sa upraví na nulu bezprostredne pred použitím vzoriek s ^U1ln. Používa sa tiež čítač gama Isodata na meranie pásu ITLC s nanesením ⁹⁰Y. Energetické okná na detekciu brzdného žiarenia sú 100 až 1 000 keV.

Pre imunoeseje sa vzorky ⁹⁰Y prenesú na 24-jamkové misky a pridá sa scintilátor MicroScint 40 a vzorky sa merajú na Packard ToCount počas 1 min. s nastavením minimálnej a maximálnej energie. Vzorky ^H1In sa merajú počas 1 min. s použitím čítača gama Isodata. Tento čítač sa nastaví na energetické okno 100 až 500 keV a pozadie sa nastaví na nulu bezprostredne pred použitím.

10. Špecifikácia na vypustenie prídavku pre klinické dávky In2B8 a Y2B8

Špecifikácie na vypustenie týkajúce sa inkorporácie rádionuklidu a väzby na CD20-pozitívne bunky sa stanovia prípravou šiestich dávok každej z protilátok In2B8 a Y2B8 s použitím dvoch šarží 2B8-MX-DTPA s kvalitou na klinické použitie (šarža 0219 a 0220) pripravených podľa tohto vynálezu a plnených za podmienok dobrej výrobnej praxe. Eseje na vypustenie prípravkov sa uskutočňujú podľa opisu skôr.

IV. Výsledky

A. Charakterizácia 2B8 odvodených od CHO

S použitím prietokovej cytometrie sa preukazuje, že sa CHO 2B8 viaže priamo s CD20-pozitívnymi SB bunkami bez väzby na CD20-negatívne HSB bunky (obrázok 34). Nezaznamenáva sa žiadna významná väzba na irelevantnú izotypickú (gama 1 K) protilátku (SOO4).

Väzba CHO 2B8 na CD20-pozitívne bunky sa vyhodnocuje v kompetitívnej eseji s použitím chemiluminiscenčného detekčného systému ORIGEN. Lyofilizované a rekonštituované antigén-pozitívne SB bunky sa inkubujú so vzrastajúcimi množstvami protilátky v prítomnosti CHO 2B8 značenej ruténiom. Výsledky ukazujú, že CHO 2B8 inhibuje väzbu na CD20-pozitívne bunky v rovnakej miere ako protilátka získaná z reaktora s dutými vláknami (2B8-49) (obrázok 35). Hodnoty EC50 sa stanovia graficky a spôsobom podľa Mullera (1980) použitým na výpočet stredných hodnôt afinity. Stanovená afinita CHO 2B8 je 1,3 x 10'*° M, protilátka 2B8 získaná z bioreaktora s dutými vláknami poskytuje hodnotu afinity 2,5 x 10'*° M. Nešpecifická väzba je zanedbateľná, ako preukazuje nedostatok kompetície s irelevantnou izotopickou protilátkou SOO4.

B. Charakterizácia 2B8-MX-DTPA odvodená od CHO

Konjugát 2B8 (2B8-MX-DTPA) sa pripraví s použitím spôsobu podobnému spôsobu použitému na skôr charakterizovanú 2B8-49. Reakcie sa uskutočňujú s použitím zhruba 3 mg protilátky pri molámom pomere chelatotvomého prostriedku k protilátke 4:1. Hodnotia sa inkubačné časy 2, 4, 8, 17 a 24 h na stanovenie reakčného času poskytujúceho prijateľnú retenciu väzby na CD20-pozitívne bunky a vysokú inkorporáciu rádionuklidu ^1HIn. Kompetitívne väzbové krivky porovnávajúce CHO 2B8 s konjugátom CHO 2B8-MX-DTPA pri reakcii počas 8 až 24 h sú podobné, čo ukazuje, že konjugačný proces neovplyvňuje významne väzbu protilátky na antigén CD20 (obrázok 36). S použitím hodnôt EC50 stanovených graficky (obrázok 36) sa zisťujú afinitné konštanty na nekonjugované a konjugované protilátky v rozmedzí 2,3 x 10'¹⁰ M až 5,9 x

SK 288096 Β6

10'^1θ M (tabuľka 40). Inkorporácia rádionuklidu je vyššia ako 95 % pre konjugačné časy 8 až 24 h (tabuľka 30).

Tabuľka 40

Účinok reakčného času konjugácie na inkorporáciu rádionuklidu a imunoreaktivitu CHO 2B8-MX-DTPA

Čas inkubácie	Inkorporácia rádionuklidu	Afinita
(h)	(%)	(M)
0	ND	2,3 x 10''°
2	83,5	ND
4	90,5	ND
8	96,1	5,9x10·'°
17	97,3	5,9 x IO’10
24	98,8	4,4 x IO'10
C. Charakterizácia In2B8 a Y2B8 pripravené z 2B8-MX-DTPA odvodenej od CHO
Konjugovaná protilátka značená 1	In CHO 2B8-MX-DTPA (In2B8) sa pripraví s použitím spôsobu sú-
pravý na značenie rádionuklidom v malom množstve skôr opísaného pre protilátku získanú z bioreaktora s
dutými vláknami (príklad 1). V stručnosti sa protilátka (2B8-MX-DTPA odvodená od CHO, šarže 0165A)

inkubuje s 'in vo forme acetátu pri určenom pH počas 30 min. pri teplote miestnosti. Reakčná zmes sa formuluje s fyziologickým roztokom puíŕovaným fosfátom, pH 7,2, s obsahom 7,5 % (hmotnosť/objem) ľudského sérumalbumínu a 1 mM DTPA. Formulované roztoky ln2B8 sa kontrolujú ohľadne inkorporácie rá-

dionuklidu s použitím chromatografie na vopred pripravenej tenkej vrstve. Väzba ln2B8 na CD20-pozitívne bunky sa určí s použitím lyofilizovaných a rekonštruovaných SB buniek. Na porovnanie sa inkubuje konjugát pripravený z protilátky vytvorenej hybridómom (2B8-49) s 'in vo forme acetátu počas 30 min. pri pH 4,2
(podmienky stanovené skôr na túto protilátku).
Uskutočnia sa kinetické štúdie na stanovenie podmienok značenia zaisťujúce maximálnu retenciu väzby s
CD20-pozitívnymi bunkami a vysokou inkorporáciou rádionuklidu (tabuľky 41 a 42). Konjugovaná protilátka (2B8-MX-DTPA odvodená od CHO) sa inkubuje pri teplote miestnosti s '“in vo forme acetátu pri pH 4,2
v časoch určených v tabuľke 42.
Tabuľka 41
Kinetika značenia In2B8 rádionuklidom: účinok pH na inkorporáciu rádionuklidu a väzbu na CD20-pozitívne
bunky
pH reakcie	Rádioinkorporácia (%)	Väzba(%)
3,0	97,7	85,3
3,7	98,5	83,9
4,0	98,6	84,1
4,3	98,0	84,0
4,6	98,9	83,4
Kontrola (2B8-49)	99,3	86,5
Tabuľka 42
Kinetika značenia In2B8 rádionuklidom: účinok času inkubácie na inkorporáciu rádionuklidu a väzbu na
CD20-pozitívne bunky
Čas inkubácie (min.)	Rádioinkorporácia (%)	Väzba (%)
pH 2,9: 15	97,2	85,3
30	99,1	85,2
45	97,2	84,8
pH 4,6: 15	99,0	87,2
30	97,2	86,8
45	99,4	86,3
Kontrola (2B8-49)	99,4	87,8

Výsledky ukazujúce, že pre rozmedzie pH 3,0 až 4,6 a čas inkubácie 30 min. sa dosahuje >97 % inkorporácie rádionuklidu pri zachovaní väzby zhruba 84 %. Hodnoty inkorporácie rádionuklidu a väzby sú invariantné pre inkubačný čas 15 až 45 min. a pH 2,9 až 4,6 (tabuľka 42). Výsledky sú porovnateľné s výsledkami získanými pri použití protilátky 2B8-49 (tabuľky 41 a 42).

SK 288096 Β6

Protilátka značená rádionuklidom ⁹⁰Y sa pripravuje inkubáciou konjugovanej protilátky (2B8-MX-DTPA odvodená od CHO) s rádionuklidom ⁹⁰Y vo forme acetátu pri určenom pH počas 5 min. pri teplote okolia. Reakčné zmesi sa formulujú vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom, pH 7,2, s obsahom 7,5 % (hmotnosť/objem) ľudského sérumalbumínu a 1 mM DTPA. Formulované vzorky Y2B8 sa kontrolujú ohľadne inkorporácie rádionuklidu s použitím chromatografie na vopred pripravenej tenkej vrstve. Väzba Y2B8 na CD20-pozitívne bunky sa stanovuje s použitím lyofilizovaných a rekonštruovaných SB buniek. Na porovnanie sa inkubuje konjugát pripravený z protilátky tvorený hybridómom (2B8-49) s rádionuklidom ⁹⁰Y vo forme acetátu počas 5 min. pri pH 4,2 (podmienky skôr určené pre túto protilátku).

Uskutočňujú sa podobné kinetické štúdie na hodnotenie prípravy protilátky značenej ⁹⁰Y (Y2B8). Pre reakcie značenia v rozmedzí pH 3,9 až 4,7 počas inkubácie 5 min. je inkorporácia rádionuklidu >96 % s >80 % zachovania väzby na CD20-pozitívne bunky (tabuľka 43). Podobné výsledky možno získať pre inkubačné časy 3, 5 a 10 min. pre rozmedzie pH 2,9 až 4,6 (tabuľka 44). Potom sa konjugovaná protilátka (2B8-MX-DTPA odvodená od CHO) inkubuje pri teplote okolia s ⁹⁰Y vo forme acetátu pri pH 4,2 v časoch ukázaných v tabuľke 44. Výsledky sú porovnateľné s výsledkami získanými s použitím protilátky 2B8-49 (tabuľky 43 a 44).

Tabuľka 43

Kinetika značenia Y2B8 rádionuklidom: účinok pH na inkorporáciu rádionuklidu a väzbu na CD20-pozitívne bunky

pH reakcie	Rádioinkorporácia (%)	Väzba (%)
3,9	98,4	80,7
4,2	97,8	81,0
4,4	96,1	80,0
4,6	97,0	80,2
4,7	97,4	80,6
Kontrola (2B8-49)	99,3	82,6

Tabuľka 44

Kinetika značenia Y2B8 rádionuklidom: účinok času inkubácie na inkorporáciu rádionuklidu a väzbu na CD20-pozitívne bunky

Čas inkubácie (min.)	Rádioinkorporácia (%)	Väzba (%)
pH 3,9: 3	97,0	82,0
5	98,9	82,1
10	99,2	82,3
pH 4,7: 3	97,2	82,5
5	96,7	81,8
10	97,6	81,5
Kontrola (2B8-49)	99,2	84,2

Imunoreaktivity pre In2B8 a Y2B8 pripravené z CHO 2B8 sa stanovujú s použitím spôsobu autorov Lindmo a kol. Vzrastajúce množstvá čerstvo zbieraných CD20- pozitívnych SB buniek sa inkubujú s pevným množstvom In2B8 alebo Y2B8 za podmienok nadbytku antigénu. Analýza vynesenia prevrátenej hodnoty údajov väzby poskytuje imunoreaktivity 80,6 % a 72,2 % pre In2B8 respektíve Y2B8 (obrázky 37 a 38).

D. Špecifikácia na vypustenie produktu pre In2B8 a Y2B8 odvodená od CHO

Používajú sa dve šarže súprav na značenie rádionuklidom In2B8/Y2B8 na klinické použitie na prípravu šiestich dávok In2B8 a Y2B8. In2B8 a Y2B8 sa pripravia s použitím verzií spôsobov značenia rádionuklidom v malom meradle, používaných v súčasnosti v klinických skúškach. Každá šarža 2B8-MX-DTPA značená rádionuklidom sa testuje ohľadne rádioinkorporácie a väzby na CD20-pozitívne (SB) a CD20-negatívne (HSB) ľudské bunky. Tieto výsledky sa zhrňujú v tabuľkách 45 a 46. Pre šesť dávok In2B8, ktoré sa pripravia, je inkorporácia rádionuklidu od 98,9 % do 99,3 % so strednou hodnotou 99,1 %. Väzba na CD20-pozitívne bunky je v rozmedzí 81,9 % až 85,1 % so strednou hodnotou 83,6 %, väzba na CD20-negatívne bunky je <4 %. Pre šesť dávok Y2B8, ktoré sa pripravia, je rádioinkorporácia v rozmedzí 97,4 % až 98,7 % so strednou hodnotou 98,2 %. Väzba na CD20-pozitívne bunky je v rozmedzí 81,4 % až 82,7 % so strednou hodnotou 81,9 %, väzba na CD20-negatívne bunky je <8 %.

Tabuľka 45

Výsledky analýzy pre In2B8 odvodenú od CHO s použitím návodu súpravy na značenie rádionuklidom

SK 288096 Β6

Väzba (%)

Stanovenie	Rádioinkorporácia (%)	SB bunky	HSB bunky
1 (šarža 0219)	99,1	81,9	2,8
2 (šarža 0219)	99,3	83,2	2,8
3 (šarža 0219)	99,2	83,6	3,7
4 (šarža 0220)	99,0	83,8	2,6
5 (šarža 0220)	98,9	84,1	2,6
6 (šarža 0220)	98,9	85,1	3,3

Priemer = 99,1 % Priemer = 83,6 % Priemer = 2,9 %

Smerod. odch. = 0,2 % Smerod. odch. = 1,1 % Smerod. odch. = 0,4 %

Tabuľka 46

Výsledky analýzy pre Y2B8 odvodenú od CHO s použitím návodu súpravy na značenie rádionuklidom Väzby (%)

Stanovenie	Rádioinkorporácia (%)	SB bunky	HSB bunky
1 (šarža 0219)	98,7	82,1	7,4
2 (šarža 0219)	98,6	82,7	0,7
3 (šarža 0219)	98,3	82,2	7,2
4 (šarža 0220)	97,4	81,8	1,7
5 (šarža 0220)	97,6	81,4	2,2
6 (šarža 0220)	98,4	81,4	1,1

Priemer = 98,2 % Priemer = 81,9% Priemer = 3,4 %

Smerod. odch. = 0,5 % Smerod. odch. = 0,5 % Smerod. odch. = 3,1%

V. Diskusia a závery

Myšia monoklonálna protilátka (2B8) proti myšiemu CD20 klonovaná a exprimovaná v CHO bunkách (2B8 odvodená od CHO) udržuje špecifickosť pre CD20-pozitívne ľudské bunky, ako ukazujú spôsoby FACS a kompetitívne imunoeseje. Väzba na ľudské T bunky je minimálna. Afinita protilátky k ľudským CD20-pozitívnym bunkám zistená kompetitívnou imunoesejou je 1,3 x 10'^1θ M. Použitím tej istej eseje možno stanoviť pre protilátku 2B8 odvodenú od bioreaktorov s dutými vláknami hodnotu afinity 2,5 x 10‘¹⁰ M.

Protilátka CHO 2B8 reaguje s MX-DTPA za vytvorenia konjugátu 2B8-MX-DTPA pri zachovaní vhodnej retencie imunoreaktivity. Optimálna inkorporácia chelatotvomého prostriedku sa určí meraním inkorporácie rádionuklidu so ^U1ln a dosahuje sa po 8 h inkubácie pri teplote okolia. Spôsoby značenia konjugátu 2B8-MX-DTPA rádionuklidom sa optimalizujú pre ⁹⁰Y alebo ^U1ln vzhľadom na pH a čas inkubácie na zaistenie maximálnej inkorporácie rádionuklidu a retencie imunoreaktivity.

Výsledky niekoľkých príprav In2B8 a Y2B8 ukazujú na reprodukovateľnosť spôsobu značenia rádionuklidom použitého na prípravu klinických dávok. Na základe týchto výsledkov značenia rádionuklidom sa uvažuje, že špecifikácie na vypúšťanie prípravku získaného s použitím lyofilizovaných CD20-pozitívnych buniek sú pre inkorporáciu rádionuklidu a väzbu > 95 %, respektíve > 70. V súhrne tieto výsledky ukazujú na porovnateľnosť 2B8 odvodenej od CHO a 2B8-49 a ukazujú na vhodnosť 2B8-MX-DTPA odvodenej od CHO na použitie v klinických skúškach.

Napokon tento vynález opisuje spôsob značenia nazývaný ako spôsob „mix-and-shoot“ na prípravu klinických dávok protilátok značených rádionuklidom, ktorý predchádza nutnosti súčasne používaného kroku vysokovýkonnej kvapalinovej chromatografie na odstránenie rádionuklidu, ktorý nie je viazaný na proteíny. Tento zjednodušený spôsob eliminuje tento prácny purifikačný krok pri udržaní vysokej úrovne inkorporácie rádionuklidu (> 95 %) a zlepšenej retencie imunoreaktivity (> 70 %). Klinicky formulovaný konjugát značený rádionuklidom je stabilný in vitro pri inkubácii pri teplote 4 °C počas 48 h, ako ukazujú hodnoty retencie rádionuklidu a imunoreaktivity. Navyše je tento konjugát značený rádionuklidom stabilný pri konjugácii v ľudskom sére pri teplote 37 °C počas 72 h. Štúdie biologickej distribúcie neukazujú žiadne nezvyčajné ukladanie v tkanivách a žiadnu významnú akumuláciu v kosti. Odhady radiačnej absorbovanej dávky pre „štandardného“ človeka s hmotnosťou 70 kg sú porovnateľné s hodnotami získanými v pokračujúcej klinickej skúške s použitím 2B8-MX-DTPA značenej rádionuklidom ⁹⁰Y. Výsledky týchto štúdií ukazujú, že 2B8-MX-DTPA značená rádionuklidom ⁹⁰Y získaná spôsobom „mix-&-shoot“ je porovnateľná s protilátkou pripravenou konvenčným spôsobom s použitím vysokovýkonnej kvapalinovej chromatografie. Validácia spôsobu na prípravu konjugátu značeného rádionuklidom na klinické použitie ukazuje, že tento spôsob je reprodukovateľný a prípravok je porovnateľný s prípravkom získaným súčasným spôsobom s použitím vysokovýkonnej kvapalinovej chromatografie. Výsledky týchto preklinických štúdií ukazujú, že tento nový spôsob „mix-&-shoot“ možno použiť na prípravu 2B8-MX-DTPA značenej ⁹⁰Y vhodnej na použitie v klinických skúškach.

Claims (27)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob rádioaktívneho značenia protilátky konjugovanej s chelatačným činidlom s ^H1In na použitie na podávanie pacientovi, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:

   (i) zmiešanie protilátky konjugovanej s bifunkčným chelatačným prostriedkom s roztokom obsahujúcim ^1HIn za vytvorenia zmesi, (ii) inkubáciu zmesi pri vhodnej teplote počas 30 minút, na produkciu protilátky značenej rádionuklidom, kde táto protilátka značená rádionuklidom má inkorporáciu rádionuklidu väčšiu ako 95 % tak, že môže byť podávaná priamo pacientovi bez ďalšej purifikácie od neinkorporovaného ^H1In, a (iii) zriedenie protilátky označenej rádionuklidom vo formulačnom pufri na príslušnú koncentráciu vhodnú na podávanie pacientovi.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci latačným prostriedkom je protilátka proti CD20.
3. 3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci -MX-DTPA.
4. 4. Spôsob podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 3, sa tým, že touto protilátkou konjugo vaňou s ches a tým, že touto protilátkou proti CD20 je 2B8vyznačujúci sa tým, že sa roztok obsaTn pred zmiešaním s protilátkou konjugovanou s chelatačným prostriedkom upravuje na pH medzi 3 hujúci a 5.
5. 5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že sa pH upravuje roztokom octanu sodného s nízkym obsahom kovu.
6. 6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že octan sodný v roztoku má koncentráciu medzi 10 a 1 000 mM.
7. 7. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že objemové množstvo použitého ^1HIn je medzi 12,28 x 10⁹ Bq (4 a 6 mCi) delené koncentráciou rádioaktivity v čase značenia.
8. 8. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že objemové množstvo použitého ^1HIn je 16,885 x 10⁹ Bq (5,5 mCi) delené koncentráciou rádioaktivity v čase značenia.
9. 9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že sa 1 ml protilátky konjugovanej s MX-DTPA s koncentráciou medzi 0,5 a 30 mg/ml zmieša s roztokom obsahujúcom ^H1In.
10. 10. Spôsob podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 9, vyznačujúci sa tým, že sa pridáva formulačný pufer v množstve nevyhnutnom na dosiahnutie celkového konečného objemu medzi 10 ml a 50 ml.
11. 11. Spôsob podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že formulačný pufer obsahuje fyziologický roztok, rádioprotektívny prostriedok a chelatačný prostriedok nekonjugovaný s proteínom.
12. 12. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že rádioprotektívny m prostriedkom je ľudský sérumalbumín (HSA), askorbát, kyselina askorbová, fenol, sulfity, glutatión, cysteín, kyselina gentisová, kyselina nikotínová, askorbylpalmitát, HOP(:O)H₂, glycerol, sodná soľ formaldehydsulfoxylátu, Na₂S₂O₅, Na₂S₂O₃ alebo SO₂.
13. 13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že rádioprotektívnym prostriedkom je HSA.
14. 14. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že HSA má koncentráciu medzi 1 a 25 % (hmotn./obj.).
15. 15. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že koncentrácia HSA je 7,5 % (hmotn./obj.).
16. 16. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že rádioprotektívnym prostriedkom je askorbát.
17. 17. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že askorbát má koncentráciu medzi 1 a 100 mg/ml.
18. 18. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že chelatačným prostriedkom nekonjugovaným s proteínom je DTPA alebo EDTA.
19. 19. Spôsob podľa nároku 18, vyznačujúci sa tým, že koncentrácia DTPA je lmM.
20. 20. Testovanie viazania na stanovenie percenta väzby protilátky značenej rádionuklidom s jej cieľovou bunkou, vyznačujúce sa tým, že zahrnuje:

    (i) značenie protilátky rádionuklidom podľa spôsobu z nároku 1 na produkciu protilátky značenej rádionuklidom, (ii) zmiešanie a inkubáciu aspoň jedného alikvotného podielu protilátky značenej rádionuklidom aspoň s jedným alikvotným podielom antigén-pozitívnych buniek,

    SK 288096 Β6 vyznačujúce sa tým, že sa tým, že týmito antigén- pozi(iii) zmiešanie a inkubáciu aspoň jedného alikvotného podielu protilátky značenej rádionuklidom identického s alikvotným podielom v kroku (ii) aspoň s jedným alikvotným podielom zried’ovacieho pufra toho istého objemu ako je alikvotný podiel antigén-pozitívnych buniek v kroku (ii) ako kontrolou, (iv) peletovanie buniek centrifugáciou, (v) meranie rádioaktivity v supematante peletovaných buniek a kontroly, a (vi) porovnanie množstva rádioaktivity v supematante buniek s množstvom rádioaktivity v kontrole.
21. 21. Testovanie viazania podľa nároku 20, vyznačujúce sa tým, že touto protilátkou je protilátka proti CD20.
22. 22. Testovanie viazania podľa nároku 21, vyznačujúce sa tým, že touto protilátkou proti CD20je2B8.
23. 23. Testovanie viazania podľa akéhokoľvek z nárokov 20 až 22, týmto antigénom je CD20.
24. 24. Testovanie viazania podľa nároku 23, vyznačujúce tívnymi bunkami sú SB bunky, uložené pod prírastkovým číslom ATCC # CCL 120.
25. 25. Testovanie viazania podľa akéhokoľvek z nárokov 20 až 24, vyznačujúce sa tým, že ďalej zahrnuje:

    (i) zmiešanie aspoň jedného alikvotného podielu rádionuklidom značenej protilátky aspoň s jedným alikvotným podielom antigén-negatívnych buniek, (ii) peletizáciu antigén-negatívnych buniek centrifugáciou, (iii) meranie aktivity rádionuklidu v supematante antigén-negatívnych peletovaných buniek a (iv) porovnanie množstva rádioaktivity v supematante antigén-negatívnych buniek s množstvom rádioaktivity v supematante antigén-pozitívnych buniek supematantu a kontrolou.
26. 26. Testovanie viazania podľa nároku 25, vyznačujúce sa tým, že týmito antigén- negatívnymi bunkami sú CD20-negatívne bunky.
27. 27. Testovanie viazania podľa nároku 26, vyznačujúce sa tým, že tieto CD20-negatívne bunky sú HSB bunky, uložené pod príraskovým číslom ATCC # CCL 120.1.