UA78484C2 - Method of radioactive marking of cd 20 antibody - Google Patents

Description

21. Спосіб за п. 20, який відрізняється тим, що 22. Спосіб за п. 7, який відрізняється тим, що суміш інкубують протягом часу, що становить 5 радіопротектор являє собою альбумін сироватки хвилин або менше. людини, а некон'югований комплексон являє со- бою ОТРА.

Даний винахід має відношення до аналізів зв'- ремої В-клітини буде продовжуватись без послаб- язування антитіл та комплектів введення радіоак- лення; така проліферація може призводити до тивних ізотопів, приготування ліофілізованих клі- раку, який називають "В-клітинна лімфома". тин, реагентів та протоколів тестування клінічної Як Т клітини, так і В-клітини, містять клітинні ефективності терапевтичних антитіл для оброб- поверхневі протеїни, які можуть бути використані ки/відображення пухлин та клітин пухлин. Більш як "маркери" для їх диференціювання та ідентифі- конкретно, комплекти даного винаходу використо- кації. Одним таким маркером В-клітини людини є вуються для створення і оцінки кон'югатів мічених рестриктований до В лімфоцитів антиген дифере- антитіл, які будуть використані для обробки та нціювання людини Вр35, позначений як "СО20". відображення пухлин В-клітинної лімфоми мето- СО20 з'являється під час раннього розвитку пре-В дом цільового зв'язування поверхневого антигену клітини і зберігається до стану диференціації пла-

В-клітин ВРЗ5 ("СО0207"). зматичної клітини. Більш конкретно, молекула

Всі наведені тут публікації та заявки на патен- СО20 може регулювати етап процесу активації, ти включені як посилання в такому ж обсязі, як який є необхідним для ініціювання клітинного цик- кожна індивідуальна публікація або заявка на па- лу та диференціювання, і зазвичай експресується тент була б конкретно та індивідуально включена в дуже великій кількості в неопластичних ("пухлин- як посилання. них") В-клітинах. СО20, за визначенням, є присут-

Імунна система хребетних (наприклад, прима- нім як в "нормальних" В-клітинах, так і в "злоякіс- тів, включаючи людей, людиноподібних мавп, про- них" В-клітинах, тобто в тих В-клітинах, чия сто мавп та інших) складається з ряду органів та неослаблена проліферація може призвести до В- типіВ-клітин, які розвинулись для того, щоб: точно і клітинної лімфоми. Таким чином, поверхневий специфічно розпізнавати чужорідні мікроорганізми антиген СО20 є ймовірним кандидатом для цільо- ("антиген"), які вражають хребетну істоту - хазяїна; вого зв'язування В-клітинних лімфом. специфічно зв'язувати такі чужорідні мікроорганіз- Власне кажучи, таке цільове зв'язування може ми; та виводити/руйнувати такі чужорідні мікроор- бути узагальнено наступним чином: антитіла, спе- ганізми. Лімфоцити виробляються в тимусі, селе- цифічні до поверхневого антигену СО20 В-клітин, зінці та кістковому мозку (дорослих) «| наприклад, вводяться пацієнту. Ці анти-СО20 ан- представляють близько 3090 від всіх білих клітин титіла специфічно зв'язуються з клітинним повер- крові, присутніх в кровоносній системі людини (до- хневим антигеном СО20 (очевидно) як нормаль- рослої). них, так і злоякісних В-клітин; анти-СО20 антитіла,

Існують дві основні субпопуляції лімфоцитів: Т зв'язані з поверхневим антигеном СО20, можуть клітини та В-клітини. Т клітини відповідають за привести до знищення та зменшення кількості клітинний імунітет, в той час як В-клітини відпові- неопластичних В-клітин. Додатково, хімічні реак- дають за продукцію антитіл (гуморальний імуні- тиви або радіоактивні мітки, які мають можливість тет). Однак Т клітини та В-клітини можна розгля- знищення пухлини, можуть бути кон'юговані з ан- дати як взаємозалежні - в типовій імунній відповіді ти-СО020 антитілом таким чином, що агент специ-

Т клітини активуються, коли рецептор Т клітини фічно доставляється в, наприклад, неопластичні зв'язується з фрагментами антигену, які зв'язані з В-клітини. Незалежно від підходу, головною метою глікопротеїнами головного комплексу гістосумісно- є знищення пухлини: конкретний підхід може бути сті (ГКГ) на поверхні клітини, що представляє ан- визначений окремим анти-СО20 антитілом, яке тиген; така активація є причиною вивільнення біо- використовується, і, таким чином, можливі підходи логічних медіаторів ("інтерлейкінів"), які, власне до цільового зв'язування СО20 антигену можуть кажучи, стимулюють В-клітини до диференціюван- значно відрізнятись. ня та продукування антитіла ("імуноглобулінів") Наприклад, спроби такого цільового зв'язуван- проти антигену. ня поверхневого антигену СО20 наведені в літера-

Кожна В-клітина в організмі містить на своїй турі. Як повідомлено в літературі, моноклональне поверхні специфічне антитіло, таким чином, одна антитіло 15 миші (антитіло проти анти-СО20)

В-клітина буде містити антитіло, специфічне до вводили хворим на В-клітинну лімфому способом одного антигену, в той час як інша В-клітина буде безперервного внутрішньовенного введення. Як містити антитіло, специфічне до іншого антигену. було повідомлено, надзвичайно високі рівні (22

Таким чином, В-клітини є досить різними і ця від- грамів) ТЕ5 були потрібні для того, щоб пухлині мінність є критичною для імунної системи. У лю- клітини в кровообігу вичерпалися, і результати дини кожна В-клітина може виробляти величезну були описані як "нестійкі". |Рге55 еї а!., "Мопосіопаї кількість молекул антитіл (близько 107-108). Таке Апійроду ТЕ5 (Апіі-СО20) Зегоїпегару ої Нитап В- продукування антитіл найчастіше типово припиня- Се! Гутрпотазв," Віоса 69/2:584-591 (1987)|. ється (або значно зменшується), коли чужорідний Потенційною проблемою цього підходу є факт, антиген знищений. Однак іноді проліферація ок- що не людським моноклональним антитілам (на-

приклад, мишачим моноклональним антитілам) шляхом приготування геномної генної бібліотеки з типово не вистачає людської ефекторної функціо- ДНК екстрагованої з існуючої мишачої гібридоми, нальності, тобто, вони не здатні, між іншим, опо- ІМізпітига єї аї. (1987) Сапсег Везеагсі 47: 999). середкувати комплемент-залежний лізис або руй- Після цього бібліотека перевіряється на наявність нувати людські цільові клітини через антитіло- варіабельних ділянок генів важких та легких лан- залежну клітинну токсичність або через фаготицоз, цюгів, які проявляють правильні типи перебудови опосередкований Ес-рецептором. Більш того, не фрагментів антитіл. Після цього клоновані варіа- людські моноклональні антитіла можуть бути роз- бельні ділянки генів вшиваються у вектор експре- пізнані людським організмом як чужорідний білок; сії, який містить клоновані касети людського гену тому повторні ін'єкції таких чужорідних антитіл константної ділянки відповідного важкого або лег- можуть призвести до індукції імунної відповіді, яка кого ланцюгу. Потім химерні гени експресують в веде до шкідливої реакції гіперчутливості. У випа- обрану клітинну лінію, звичайно в лінію мишачої дку мишачих моноклональних антитіл це часто мієломи. називають Людською відповіддю на Анти-Мишачі Наприклад, (Сім, А.У., еї а!Ї., "Ргодисіоп ої а

Антитіла або "ЛАМА" відповіддю. На додаток, ці Моизе-Нитап СпПітегіс Мопосіопа! Апіроду ю "чужорідні" антитіла можуть бути атаковані імун- СО20 мйп Роїепі Ес-Оерепаеєпі Віоіодіс Асіїмну", у. ною системою організму таким чином, що вони Ітітип. 139/10:3521-3526 (1987)), описує химерне дійсно нейтралізуються раніше, ніж досягають сво- антитіло людина/миша, спрямоване проти антиге- їх цільових ділянок. ну СО020, |Див. також РСТ Рибіїсайоп Мо. М/О

Лімфоцити та клітини лімфоми по суті чутливі 88/04936)|. Однак це посилання не забезпечує ін- до радіотерапії. Тому злоякісні В-клітини є прива- формацією щодо здатності, ефективності або бливими цілями для радіоімунотерапії (РМТ) з практичних сторін використання химерних антитіл кількох причин: локальна емісія іонізуючої радіації Ми для лікування В-клітинних захворювань. мічених антитіл може вбивати клітини з або без Необхідно помітити, що функціональні аналізи цільового антигену (тобто СО20) в близькому су- іп міо (наприклад, комплемент-залежний лізис сідстві з антитілом, зв'язаним з антигеном; прони- ("КЗЛ"); антитіло-залежна клітинна цитотоксичність каюча радіація, тобто бета-випромінювачі, можуть (АЗКЦ")) не можуть, по суті, пророкувати здатність усунути проблему обмеженого доступу антитіл в будь-якого антитіла іп мімо руйнувати або вичерпу- великі або поліваскуляризовані пухлини; і загаль- вати цільові клітини, що експресують специфічний на кількість необхідних антитіл може бути змен- антиген. (Див., наприклад, Коріпзоп, К.О., еї аї., шена. Радіонукліди емітують радіоактивні частин- "Спітегпс тоиве-питап апії-сагсіпота апійроаієв ки, які можуть пошкодити клітинну ДНК до стану, Шаг теаййіасеє айегепі апі-вштог сеї! бБіоіодіса! коли клітинні відновлювальні механізми не можуть асіїміев, Нит. Апіїбоа. Нургідотав, 2:84-93 дозволити клітині продовжувати жити; тому, якщо (1991)) (химерні антитіла людина-миша, які мають цільовими клітинами є пухлини, то радіоактивні АЗКЦ активність, що не виявляється). Тому потен- мітки успішно вбивають пухлинні клітини. Мічені ційна терапевтична ефективність антитіл може антитіла, за визначенням, включають використан- бути, безсумнівно, оцінена тільки експериментом ня радіоактивних речовин, які можуть вимагати їп мімо. необхідність запобіжних заходів як для хворого З цією метою заявки, що розглядаються, (тобто можлива трансплантація кісткового мозку), І08/475,813, 08/475,815 та 08/478,967|, наведені так і для медичного працівника (тобто необхідність тут як посилання в усій повноті, описують мічені виконання суворих заходів безпеки при роботі з анти-СО20 кон'югати для діагностичного "відобра- радіоактивними речовинами). ження" пухлин В-клітинної лімфоми перед викори-

Тому підхід до поліпшення здатності мишачих станням терапевтичних антитіл. "Іп288" кон'югат моноклональних антитіл здійснювати лікування містить мишаче моноклональне антитіло 288, спе- захворювань В-клітин повинен включати кон'юга- цифічне до людського антигену СО20О, яке приєд- цію радіоактивної мітки до антитіла так, щоб ця нане до індію (111) (п) через біфункціональний мітка або токсин були локалізовані в місці пухлини. комплексон, тобто МХ-ДТПК (діетилентриамінпен-

Токсини (тобто хіміотерапевтичні агенти, такі як таоцтова кислота), який містить суміш 1:1 1- доксорубіцин або мітоміцин С) також повинні бути ізотіоціанатобензил-З-метил-ДТОК і /1-метил-3- кон'юговані з антитілами. (Див., наприклад, опублі- ізотіоціанатобензил-ДТПК. Індій-(111)| вибраний як ковану заявку РСТ УМО 92/07466 (опубліковано 14 діагностичний радіонуклід тому, що він випромінює

Травня 1992). гамма-випромінювання і знаходить першочергове "Химерні" антитіла, тобто антитіла, які містять використання як агент, що проявляє. частини з двох або більше різних видів (напри- Патенти, які мають відношення до комплексо- клад, миші та людини), були розроблені як альте- нів і кон'югатів комплексонів, відомі в галузі. На- рнатива "кон'югованим" антитілам. Були створені приклад, (Ш.5. Раїепі Мо. 4,831,175, Сапзом/, на- химерні антитіла миша/людина і показано, що во- правлений на хелати полізаміщеної ни проявляють характеристики зв'язування вихід- діетилентриамінпентаоцтової кислоти та білкові них мишачих антитіл і ефекторні функції, асоційо- кон'югати, які містять цю кислоту, та способи їх вані з константною ділянкою людських антитіл. приготування. |О.5. Раїепі Мо5. 5,099,069,

Див., наприклад, Сарійу сеї аї, |Ц.5. Раїепі 5,246,692, 5,286,850, апа 5,124,471, сапзом/| також 4,816,567; 5поетакег єї а!., 0.5. Раїепі 4,978,745; відносяться до хелатів полізаміщеної ДТПК. Ці

Веамегз еї аї., ОШО.5. Раїепі 4,975,369; та Во55 еї аї., патенти наведені тут в їх повноті.

Ц.5. Раїепі 4,816,397, які всі включені тут як поси- Специфічний біфункціональний комплексон, лання). Загалом, ці химерні антитіла конструюють використаний для полегшення хелатоутворення в заявках (08/475,813, 08/475,815 та 08/478,9671, був Як повідомлено в заявках, що розглядаються, вибраний тому, що він має високу спорідненість до (08/475,813, 08/475,815 і 08/478,967|, використання тривалентних металів і забезпечує підвищене зна- міченого кон'югату 288, так само як неміченого чення співвідношення пухлина-не пухлина, змен- химерного анти-СО20 антитіла, приводило до зна- шене поглинання кісткою та велике втримання чного зменшення пухлини у мишей, які мали В- радіонукліду іп мімо на цільових ділянках, тобто клітинну лімфобластну пухлину. Крім того, клінічні ділянках пухлини В-клітинної лімфоми. Однак в випробування на людині показали значне змен- галузі відомі інші біфункціональні комплексони, і шення В-клітин у хворих на лімфому, яким вводи- вони можуть бути успішно використані в терапії ли химерні анти-СО20 антитіла. Фактично, химер- пухлин. не 288 нещодавно було оголошено першим

Мічені терапевтичні антитіла для цільового національним затвердженим ЕОА анти-раковим зв'язування і руйнування В-клітинних лімфом та моноклональним оантитілом з найменуванням пухлинних клітин описані також в заявках ВішхапФ. Таким чином, було показано, що при-

І08/475,813, 08/475,815 та 08/478,967|, Зокрема, наймні одне химерне анти-СО20 антитіло проде-

У288 кон'югат містить таке ж мишаче моноклона- монструвало терапевтичну ефективність в ліку- льне антитіло 288 проти СО20 людини, приєднане ванні В-клітинної лімфоми. до ітрію-(90) (30) за допомогою такого ж біфункці- На додаток, (у заявці США, серійний Мо. онального комплексону. Цей радіонуклід був виб- 08/475,813|, наведеній тут як посилання, описуєть- раний для терапії з деяких причин. Період напів- ся послідовне використання ВйихапФ, химерного розпаду У, 64 години, є достатньо довгим для анти-СО20, з обома або з кожним індій-міченим акумуляції антитіла пухлиною і, на відміну, напри- або ітрій-мченим мишачими моноклональними клад, від "11, він є чистим бета-випромінювачем антитілами. Хоча мічені антитіла, використані в цій високої енергії яка не супроводжується гамма- комбінованій терапії, є мишачими антитілами, по- випромінюванням при його розпаді в області від чаткова обробка химерними анти-СО20 значно 100 до 1000 діаметрів клітини. Мінімальна кількість зменшує популяцію В-клітин так, що ЛАМА відпо- проникаючого випромінювання дозволяє амбула- відь знижується, таким чином сприяючи комбіно- торне використання Зоу-мічених антитіл. Більш ваному терапевтичному і діагностичному режиму. того, інтерналізація мічених антитіл не є необхід- Таким чином, в цьому контексті комбінованої ною для того, щоб вбити клітину, і локальна емісія імунотерапії, мишачі антитіла можуть знайти вико- іонізуючої радіації буде летальною для сусідніх ристання як діагностичні реагенти. Крім того, в пухлинних клітин, які мають нестачу цільового ан- ІЗаявці США 08/475,813| було показано, що тера- тигену. певтично ефективне дозування ітрій-міченого ан-

Тому що 0 радіонуклід був приєднаний до ти-СО20 антитіла, яке слідує за використанням антитіла 288 з використанням такої ж молекули ВішхапФ,), є достатнім для (а) очистки будь-яких В-

МХ-ДТПК біфункціонального комплексону, кон'ю- клітин периферійної крові, які залишились не очи- гат 288 має такі ж самі переваги, як розглянуті щеними химерним анти-СО20 антитілом; (б) поча- вище, наприклад, підвищене утримання радіонук- тку спустошення лімфовузлів щодо В-клітин; або ліду в цільовій ділянці (пухлині). Однак, на відміну (в) початку спустошення інших тканин щодо В- від "п, він не може бути використаний для цілей клітин. відображення з-за відсутності гамма- Таким чином, сполучення радіоміток з ракови- випромінювання, асоційованого з цим процесом. ми терапевтичними антитілами забезпечує цінний

Таким чином, діагностичний радіонуклід "відобра- клінічний інструмент, який може бути використа- ження", такий як "п, може бути використаний для ний для оцінки потенційної терапевтичної ефекти- визначення розташування ! відносного розміру вності таких антитіл, для створення діагностичних пухлини до і/або наступного використання терапе- реагентів для контролю прогресу лікування, і для втичних химерних або Зоу-мічених антитіл з метою розробки додаткових терапевтичних реагентів, які зменшення пухлини. На додаток, індій-мічені анти- можуть бути використані для посилення початко- тла дають можливість виконати дозиметричну вого потенціалу химерного антитіла до знищення оцінку. пухлини. За умов доведеної ефективності анти-

В залежності від запланованого використання сСО20 антитіла в лікуванні лімфоми, що не є лім- антитіл, тобто як діагностичного або терапевтич- фомою Ходжкіна, і відомої чутливості лімфоцитів ного реагенту, в галузі відомі ії використовуються до радіоактивності, було б великою перевагою, для схожих цілей інші радіомітки. Наприклад, ра- щоб такі терапевтичні антитіла стали комерційно діонукліди, які використовують в клінічному діагно- доступними у вигляді комплекту, за допомогою зі, включають 7314, 1254, 1234, 99Тс, 67(за, так само як якого вони можуть бути легко модифіковані радіо- "п. Антитіла також мітять різними радіонукліда- мітками і використані прямо для хворого в клініч- ми для потенційного використання в цільовій іму- них умовах. нотерапії |Реїгег5; еї а). (1987) Те иве ої Хоча існує багато методів та реагентів для ви- топосіопаї! апіроду сопіидасев юг (Пе аіадпозів апа конання радіомічення антитіл, в галузі все ж не ігеаїтепі ої сапсег. Іттипої. Сеї! Віо!. 65: 111-125). вистачає зручних носіїв для розміщення цих реа-

Ці радіонукліди включають "З8Ке і ї86ре, а також гентів в клінічних умовах таким шляхом, щоб вони зоу, і в меншій мірі "29Ау ї 67Си. 1-11311 також вико- могли бути легко отримані і введені хворому до ристовують для терапевтичних цілей. У (Патенті того, як відбудеться значний розпад радіомітки

США Мо. 5,460,785), наведеному тут як посилання, або значне руйнування антитіла з-за радіомітки. надано перелік таких радіоізотопів. Нестача таких зручних засобів комерціалізації цієї цінної технології можлива завдяки поганій ефекти-

вності зв'язування, яку продемонстрували деякі Сепегаюг-ргодисей укпшт-І90) тг відомі протоколи мічення і необхідність наступної гадіоїттипоїйегару. 9. МисіІ. Мей. 28(9): 1465- очистки реагентів на колонці після процедури ра- 1470). Однак у таких протоколах не було досягнуто діомічення. Затримка в розробці таких комплектів такого рівня зв'язування, якого автори винаходу також може частково спричинятися завдяки недо- досягли, використовуючи описані тут протоколи, ступності у минулому чистих комерційних радіоізо- які включають ефективність зв'язування принаймні топів, які могли бути використані для створення 9595. Такий рівень зв'язування забезпечує додат- ефективно мічених продуктів, що не потребують кову перевагу щодо підвищення безпеки, яка поля- наступної очистки. Альтернативно, можливою при- гає в тому, що завдяки низькому зв'язуванню ра- чиною загальної недоступності таких комплектів є діонукліду незв'язана мітка фактично не буде недостатня кількість антитіл, що були здатні дося- введена пацієнту. гти визнання або ефективності, якої ЕйихапФ до- Згідно з протоколами, включеними в комплек- сяг в лікуванні лімфоми у хворих людей. ти даного винаходу, можна проводити швидке мі-

Наприклад, як описано в (Патенті США чення, яке може бути проведено приблизно за 4,636,380)Ї, який наведений тут як посилання, в півгодини або, в залежності від мітки, всього за 5 науковому товаристві існувала загальна думка, що хвилин. Більш того, протоколи комплекту даного для клінічного використання радіопрепарату він винаходу мають ефективність мічення більше повинен бути підданий тривалому та кропіткому 9595, таким чином, не виникає потреби в подаль- процесу розділення та очищення. Дійсно, введен- шому очищенні. Без необхідності подальшої очис- ня хворому незв'язаного радіоміченого препарату тки, період напіврозпаду радіомітки і неушкодже- було б не бажаним. Необхідність додаткового ета- ність антитіла зберігаються для досягнення тої пу очищення робить процес радіомічення антитіл в терапевтичної мети, для якої воно було мічене. клінічних умовах неможливим, особливо для ліка- У даному винаході описані зручні комплекти і рів, які не мають ні обладнання, ні часу очищати їх способи, за допомогою яких діагностичні і терапе- власні ліки. втичні антитіла можуть бути мічені радіоактивною

Більш того, радіомічені білки, по суті, можуть міткою і введені пацієнту відтворюваним, надійним бути нестабільними, особливо мічені радіолітич- і зручним способом. Комплекти даного винаходу ними ізотопами, такими як ЗУ, які мають тенден- трансформують процес радіомічення антитіл в цію викликати пошкодження антитіла тим більше, безперешкодний, надійний, стандартизований чим довше вони знаходяться з ним в близькому процес, який значно полегшує протоколи ліку- сусідстві. В свою чергу, такий радіоліз стає причи- вання хворого. Даний комплект має переваги над ною ненадійної ефективності препарату через попередніми, які полягають в тому, що були ви- втрати радіомітки і/або зменшеного зв'язку з ці- значені оптимальні параметри мічення і терапев- льовим антигеном і може призвести до небажаної тичного та діагностичного введення, таким чином імунної відповіді, спрямованої до денатурованого зменшуючи вартість виробів. Завдяки тому, що білку. Дотепер, клініцисти без обладнання для описаний тут комплект забезпечує оптимальні па- мічення і очищення антитіл на місці не мають ін- раметри, відповідні індивідуальній мітці, викорис- шого вибору, аніж замовляти вже мічені терапев- тання комплекту, розробленого для індивідуальної тичні антитіла, або мітити їх поза клінікою на від- мітки, буде також зводити до мінімуму розукомп- повідному обладнанні і транспортувати для лектування, яке відбувається, коли невідповідний введення пацієнту. Всі ці маніпуляції додають до- комплект використовується для індивідуальної рогоцінний час до періоду між міченням та вве- мітки. Уникнення розукомплектування, в свою чер- денням препарату, таким чином сприяючи неста- гу, також забезпечує оптимальну ефективність більності препарату, і насправді зменшуючи мічення. Більш того, протоколи і стерильні апіро- корисність комплектів для радіомічення в клінічних генні речовини, включені в кожний комплект, спри- умовах. яють зручнішому для використання процесу, тому

Інші безуспішно намагались розробити ком- що тестування стерильності, пірогенності та очи- плекти для радіомічення антитіл, які були б доста- щення реагентів після мічення непотрібні. тньо досконалими, щоб відмовитись від окремого Даний винахід включає комплект для мічення етапу очищення антитіл. Наприклад, Суїдеп не- радіоактивною міткою діагностичних або терапев- щодавно випустив комерційний комплект для ра- тичних антитіл перед їх введенням пацієнту, який діомічення мишачих моноклональних антитіл, містить принаймні (і) пляшечку, яка містить ком- спрямований на пухлина-асоційований глікопроте- плексон-кон'юговане антитіло, (ії) пляшечку, яка їн ТАО-72, Однак антитіло Суїодеп в певній мірі не містить підібраний буфер для стабілізації та вве- відповідає рецептурі комплекту через тенденцію дення радіоміченого антитіла, і (ії) інструкції для до створення мікрочастинок під час зберігання мічення антитіла, де названі компоненти в пляше- повинні бути видалені на етапі додаткової фільт- чках поставляються в таких кількостях і таких кон- рації. Більш того, антитіло Суїодеп викликало у центраціях, що коли вони поєднуються з радіоак- пацієнтів шкідливу реакцію через ЛАМА відповідь. тивною міткою достатньої чистоти і активності,

Інші заявили про розробку протоколів радіомі- відповідно до інструкцій комплекту, то подальша чення, які можливо перетворити в формат компле- очистка міченого антитіла не потрібна перед вве- кту, в якому окремий етап очистки буде непотріб- денням названому пацієнту. Більш того, коли ан- ний (Кіспагазоп еї аї. (1987) Оріїтіганоп апа Баїсн титіло мітили відповідно до інструкцій комплекту і з ргодисійоп ої ОТРА-Іабеїєйд апіїроду Кіїв ог гошіпе радіоіїзотопом достатньої чистоти і активності, то иве іп 7 о іттиповзсіпіодгарпу. Мис. Мед. таке зв'язування ізотопу може сягати рівнів вище,

Соттип. 8: 347-356; Спіпо! апа Нпаюм/існ (1987) ніж 9595 і навіть до 9895 або вище.

Найкраще, якщо антитіло, включене в ком- можуть також потребувати обробки для видалення плект, є анти-СО20 антитілом. Антитіло поставля- забруднюючих металів. ється в формі, де воно є приєднаним до біфункці- Підібраний буфер даного винаходу також міс- онального комплексону. Краще, коли антитіло тить надлишок некон'югованого комплексону. Ме- зв'язано з МХ-ДТПК, але можуть бути використані тою включення некон'югованого комплексону є те, інші комплексони, такі як феніл- або бензил- що цей комплексон служить для поглинання будь- кон'юговані ДТПК, циклогексил-ДТПК, похідні яких не зв'язаних с білком радіоміток у пацієнта і

ЕОТА і СОТА. Згідно з даним винаходом, комплек- впливати на виділення радіоміток, таким чином соном може бути будь-який комплексон, який є зменшуючи накопичення у кістках пацієнта "остео- принаймні біфункціональним, тобто який має при- тропних" ізотопів, тобто 0у, Наприклад, коли ан- наймні два місця зв'язування (принаймні одне міс- титіло комплекту кон'юговане з ДТПК комплексо- це для утворення комплексу з іоном металу і при- ном, надлишок ДТПК або будь-якого іншого наймні одне місце для з'єднання з білковим комплексону може бути включений в підібраний лігандом). буфер. Підібраний буфер також найкраще постав-

В залежності від використаного антитіла, кон'- ляти в такому об'ємі, щоб весь вміст був перене- юговане антитіло типово поставляється в концен- сений в реакційну пляшечку. Як обговорювалось трації від 0,5 до ЗОмг/мл, найкраще 2мг/мл. Об'єм вище, це призводить до підвищеної легкості вико- кон'югованого антитіла буде залежати від концен- ристання і відтворюваності через те, що точні об'- трації і кількості, які необхідні для оптимального єми не треба відмірювати і переносити. мічення в залежності від радіомітки. Однак кон'ю- Найкращій підібраний буфер містить забуфе- говане антитіло повинно поставлятись в такому рений фосфатом або фізіологічний сольовий роз- об'ємі і концентрації, щоб весь об'єм був доданий чин, людський сироватковий альбумін і ДТПК. до реакційної пляшечки, використовуючи стериль- Кращою концентрацією людського сироваткового ний шприц і асептичну техніку. Це буде передба- альбуміну є від приблизно 195 до 2590 (вага/об'єм), чати підвищену відтворюваність і легкість викорис- і найкращою - приблизно 7,595 (вага/об'єм). Най- тання. Всі реагенти комплекту, описані тут, є кращою концентрацією ДТПК є приблизно 1ммМ. стерильними, апірогенними і спеціально спроекто- Аскорбат може бути використаний як альтернати- вані для простоти і швидкості в просуванні прямо ва людському сироватковому альбуміну і типово від тестування антитіла до введення. З деякими використовується в концентрації приблизно від 1 мітками необхідність тестування ефективності мі- до 100мг/мл. Хоча може бути використаний більш чення може бути непотрібною. широкий діапазон концентрацій без компромісу

Особливо сприятливим компонентом комплек- щодо безпеки пацієнта. ту є підібраний буфер для стабілізації проти ефек- Антитіло комплекту радіомічення легко мітить- тів радіолізу і введення мічених кон'югованих ан- ся обраним радіоактивним ізотопом за допомогою титіл пацієнту. Підібраний буфер Є біфункціонального комплексону відповідно до спо- фармацевтично прийнятним носієм, який служить собів даного винаходу. В цьому контексті, для по- як розчинником для міченого антитіла, так і буфе- дальшого спрощення комплект даного винаходу ром введення. Хоча будь-який фармацевтично може також включати пляшечку, яка містить буфер прийнятний розчинник може бути використаний для регулювання рН розчину радіоізотопу, і стери- для введення терапевтичних або діагностичних льну скляну реакційну пляшечку для виконання антитіл пацієнту, підібраний буфер даного винахо- мічення і після цього для поміщення остаточно ду є особливо підходящим для введення мічених міченого антитіла в підібраний буфер. Типово до- радіоактивною міткою антитіл. статньо реакційної пляшечки об'ємом 10мл, але

Наприклад, підібраний буфер даного винаходу також можуть бути використані пляшечки, які вмі- містить радіопротектор, такий як людський сиро- щають від 5 до 20мл. Найкращій буфер - це роз- ватковий альбумін (ЛСА) або аскорбат, який міні- чин ацетату натрію з низьким вмістом металу в мізує радіоліз від ітрію і в меншій мірі від індію. концентрації від 10 до 1000мММ, найкраще 50мМ.

Інші радіопротектори, відомі в галузі, тобто погли- Конкретний комплект даного винаходу містить начі вільних радикалів (феноли, сульфіти, глута- антитіло, кон'юговане з МХ-ДТПК, 288-МХ-ДТПК. тіон, цистеїн, гентизинова кислота, нікотинова кис- 288 - це анти-СО20 антитіло, яке виявило вплив лота, аскорбіл пальмітат, НОРСО)Н», гліцерин, на вичерпання В-клітин при введенні хворим на натрій формальдегід сульфоксилат, Маг5205, лімфому. Однак, спеціалісту повинно бути очевид-

Маг52Оз, і 50», та інше) також можуть бути вико- ним те, що комплект радіомічення даного винахо- ристані в підібраному буфері даного винаходу. ду може бути оптимізований для радіомічення ін-

Слід зазначити, що в той час, як радіопротек- ших анти-СО20 антитіл або будь-якого іншого тори звичайно використовуються в підібраному антитіла, яке було кон'юговано з ДТПК або іншим буфері для захисту антитіл від радіолізу, можливо, полівалентним комплексоном. Найкращий ком- що можна буде впливати на подальший захист плект даного винаходу може містити принаймні (і) включенням радіопротектору також в реакційний пляшечку, яка містить МХ-ДТПК-кон'юговане 288 буфер. Взагалі цього раніше не робили, напри- антитіло, в розчині або ліофілізоване (потребує клад, з ЛСА, через присутність металів, які будуть розведення); і (ії) пляшечку, яка містить підібраний перешкоджати процесу мічення. Однак використо- буфер для введення радіоміченого антитіла паціє- вуючи хелатні смоли, можливо "очистити" ЛСА так, нту. Найкращий комплект буде також містити (ії) щоб ЛСА міг би бути включеним також і в реакцій- буфер для регулювання рн ізотопу і (ім) реакційну ний буфер. Аскорбат або інші радіопротектори пляшечку. Альтернативно, ще краще, якщо буфер поставляється в реакційній пляшечці, таким чином уникаючи етапу відмірювання і переносу буферу і стичні образи (зображення), отримані з Іп- підвищуючи простоту, послідовність і стерильність міченими антитілами, можуть бути більш чіткими. компонентів комплекту. Однак, можна собі уявити Також очевидно, що як діагностичне радіомі- інші втілення винаходу, тобто де буфер спочатку чене антитіло, так і терапевтичне радіомічене ан- додають до ізотопної пляшечки і тоді ізотоп з бу- титіло, можуть бути використані разом в комбіно- фером переноситься до реакційної пляшечки. В ваному терапевтичному режимі. В цьому випадку, цьому випадку реакційна пляшечка може бути по- діагностичне антитіло може бути використано до ставлена з необхідним об'ємом антитіла. Альтер- або після терапевтичного антитіла для візуалізації нативно, пляшечка ізотоп/буфер може бути зроб- розміру пухлини до і після лікування. В цьому ви- лена достатньо великою для того, щоб постачати падку комплект даного винаходу може включати додаток кон'югату антитіла, тобто прямо до пля- окремі, можливо кодовані різними кольорами, шечки постачальника. Це дозволило би виключити пляшечки з індивідуально підібраними буферами необхідність реакційної пляшечки. відповідно до вимог оптимального рН для радіомі-

Як описано вище, інша найкраща конфігурація чення антитіл індивідуальними ізотопами, які не- комплекту здійснюється так, що реакційна пляше- обхідно використати. Така система давала би га- чка сама по собі містить необхідний об'єм кон'юго- рантію, що підходящий буфер був використаний ваного антитіла (тобто, 1 або 1,5мл для "п і 9оу, для кожної мітки і надавала би клініцисту однакову відповідно). Антитіло може бути поставлено в бу- легкість в радіоміченні двох антитіл, як якби були фері, що забезпечує підходяще рН радіомічення куплені два комплекти. Такий комплект по ефекти- відповідно до індивідуального бажаного ізотопу вності поєднує компоненти двох комплектів в (тобто, рН 3-6 для "п, рН 3-5 для 20У). В залеж- один. ності від ізотопу, можуть бути використані різні Компоненти комплекту радіомічення даного буфери (тобто, ацетат натрію для У, цитрат на- винаходу поставляються в підходящих концентра- трію для ""|п). Склад і рН буферу можуть також ціях і рН, так що стерильність легко підтримується змінюватись в залежності від природи ліганду зв'я- до введення антитіла і існує невелика потреба в зування, в який необхідно ввести мітку (тобто, мі- додаткових буферах або середовищах. Однак, чення пептидів може дозволяти використання «рн спеціалісту повинно бути очевидно, що деякі реа- 3). Тоді по суті ізотоп переносився би прямо до генти можуть бути приготовані, стерилізовані і тес- реакційної пляшечки, як і підібраний буфер. Об- товані на стерильність на місці. Таким чином, мо- меження використання комплекту двома етапами жна уявити варіації комплекту винаходу в переносу додатково збільшило би відтвореність і залежності від бюджету та переваг споживача. простоту та додатково зменшило би шанс забруд- Комплект радіомічення даного винаходу може нення стерильних препаратів під час маніпуляції бути використаний в методі радіомічення комплек- компонентами комплекту. сон-кон'югованих антитіл для введення пацієнту.

Комплекти радіомічення даного винаходу мо- Відповідно до даного винаходу, такий метод, зага- жуть додатково містити пляшечку радіоізотопу, лом, включає (Ї) змішування комплексон- або радіоїзотоп може бути замовлений окремо від кон'югованих антитіл з розчином, який містить ра- підходящого постачальника. Кращими радіоізото- діоіїзотоп; (ії) витримка суміші потрібний час при пами даного винаходу є "п хлорид і 29У хлорид в відповідній температурі; і (її) розведення міченого

НСІ, хоча розкриті методи не обмежені цими ізото- антитіла до відповідної концентрації в підібраному пами. Інші радіонукліди, що були використані з буфері, такому що радіомічене антитіло може бути метою відображення пухлин, відомі в галузі, тобто, прямо введено пацієнту без подальшої очистки. як описано в (Патенті США Мо5. 4,634,586, Найкраще, коли антитіло - це анти-СО20 анти- 5,460,785 і 5,766,571|, які наведені тут як посилан- тіло, і зокрема, анти-СО20 антитіло може бути 288, ня. Індій-И111| має особливі переваги при відобра- Антитіло може бути кон'юговане з будь-яким під- женні В-клітинних пухлин, і бета-емітери, такі як ходящим комплексоном, тобто, МХ-ДТПК, СНХ- зо, є особливо корисні в якості радіотерапевтич- ДТПК, феніл- або бензил-ДТПК, ООТА, ЕОТА похі- них агентів. Хоча інші радіоіїзотопи зручні для цих дними, та ін. МХ-ДТПК є найкращим. Методи або інших цілей, тобто, альфа-емітери, можуть впливу на кон'югацію антитіла відомі в галузі бути використані в залежності від комплексону, ЇКогак еї аї. (1989); Міг/аденй е! а). (1990), Вгаснбрієї використаного для кон'югації антитіла. еї а. (1986)).

За умови доведеної ефективності комбінова- Автори винаходу винайшли, що метод ра- них терапевтичних режимів, розкритих в ІЗаявці діомічення комплексон-кон'югованого антитіла

США Зегіа! Мо. 08/475,813)|, подальше втілення працює найкраще там, де розчин, який містить комплекту буде також включати окрему пляшечку радіомітку, має рН, встановлене між, приблизно, химерного антитіла, тобто, КйихапФ, яке буде 3,0 і 6,0, найкраще 4,2, перед змішуванням з ком- введено до або після радіоміченого анти-СО20 плексон-кон'югованим антитілом. Найкращим для антитіла. Коли химерне антитіло вводиться до регулювання рн є ацетат натрію з низьким вмістом радіоміченого антитіла, ЛАМА відповідь, яка зага- металу. Найкраща концентрація ацетату натрію лом може відбуватися у відповідь на введення знаходиться в діапазоні між 10 та 1000мММ, най- мишачого анти-СО20 антитіла, може бути значно краще 50мММ. зменшена, таким чином підвищуючи терапевтичну Коли радіоїзотопом є "п хлорид, то об'ємна корисність радіомічених мишачих антитіл. Більш кількість "Іп хлориду, яку слід використати для того, коли химерні анти-СО020 застосовуються для приготування однієї дози для введення, є типово видалення циркулюючих В-клітин, наступні діагно- приблизно 5,5мКі, поділене на концентрацію ра- діоактивності під час мічення. Типова діагностична доза "п для введення пацієнту складає приблиз- об'ємної кількості використаного 90У хлориду. Тоді но від 2 до 10мкКі. Кількість ацетату натрію, вико- приблизно 1,5мл комплексон-кон'югованого анти- ристаного для регулювання рН, відрізняється в тіла в концентрації приблизно 2мг/мл змішують з залежності від концентрації ацетату натрію і роз- ацетатним розчином радіомітки, і суміш витриму- чину носію ізотопу, і може, таким чином, знаходи- ють приблизно 5 хвилин або час, достатній для тись в широкому інтервалі. Коли концентрація досягнення оптимального мічення антитіла. Цей ацетату натрію є 50мМ, кількість, потрібна для час може знаходитись в діапазоні від 30 секунд до регулювання рн, складає типово 1,2 об'ємної кіль- 60 хвилин. Тоді додають підібраний буфер в кіль- кості "ПІп хлориду, хоча можуть бути використані кості, необхідній для досягнення загального кінце- більші об'єми. Слід розуміти, що відношення кіль- вого об'єму 10мл. костей ацетату натрію та НСІ є дуже важливою Найкраще метод радіомічення винаходу вико- величиною, і кількість ацетату натрію буде зміню- нується при використанні описаного тут комплекту ватися в залежності від кількості і концентрації НСІ радіомічення. Однак, для спеціаліста в галузі по- в буфері. Тоді приблизно їімл комплексон- винно бути очевидним, що найкращі компоненти і кон'югованого антитіла в концентрації приблизно умови - це тільки прийнятні керуючи принципи ви- 2мг/мл змішують з ацетатним розчином радіомітки користання способу винаходу, і вони можуть бути і суміш витримують приблизно 30 хвилин або час, змінені до деякої міри відповідною оптимізацією. достатній для досягнення оптимального мічення Умови, які відхиляються від найкращих умов, але антитіла. Цей час може знаходитись в діапазоні все ще досягають цілі способу, розглядаються як від 30 секунд до 60 хвилин. Тоді додають підібра- ті, що знаходяться в межах винаходу. ний буфер в кількості, необхідній для досягнення Комплект радіомічення даного винаходу може загального кінцевого об'єму 10мл. також поставлятись з реагентами, підходящими

Оптимальний час, необхідний для мічення ан- для зручної перевірки спорідненості зв'язування титіла, може змінюватись в залежності від викори- антитіла після радіомічення. В такому випадку станих антитіла, індивідуальної радіомітки і індиві- комплект винаходу також може бути використаний дуального кон'югату. Головним фактором для визначення відсотку зв'язування радіоміченого оптимізації часу, виділеного для радіомічення, є антитіла з його цільовою клітиною перед введен- співвідношення комплексону і антитіла в реагенті, ням антитіла пацієнту. Автори винаходу також ви- який повинен бути міченим. Наприклад, відношен- значили, що конкретний описаний комплект аналі- ня комплексону до антитіла повинне бути достат- зу зв'язування може бути корисним для тестування ньо великим для досягнення терапевтично корис- спорідненості будь-якого антитіла, для якого, зага- ного рівня з'єднання, тобто від 90 до 95905, в лом, нема в наявності очищеного антигену. Відпо- залежності від радіоїзотопу, але в той же час не відно, компоненти аналізу зв'язування можуть бути повинно бути настільки великим, щоб піддавати також продані як окремий комплект. загрозі структурну цілісність або імунореактивність Взагалі, комплект радіомічення і аналізу зв'я- антитіла. Це потребує певного врівноваження зування містить (ї) принаймні одну пляшечку ліо- процесу, що в деяких випадках може вести до філізованих клітин, які експресують антиген, який знижених рівнів кон'югованого комплексону і біль- розпізнається антитілом комплекту; (ії) пляшечку, шого часу мічення. яка містить комплексон-кон'юговане антитіло; (її)

Наприклад, для 288 і МХ-ДТПК було показано, пляшечку, яка містить підібраний буфер, і (ім) такі що мічення може бути закінчено протягом п'яти інструкції з радіомічення антитіла, що радіомічене хвилин для Оу і протягом 30 хвилин для "п для антитіло може бути введено прямо пацієнту без досягнення бажаного рівня з'єднання ізотопу при необхідності наступного очищення. Як і описаний молярному співвідношенні комплексону до антиті- вище комплект радіомічення, цей комплект також ла лише від 17» до 1. Таким чином, нема потреби може включати пляшечку, яка містить буфер для збільшувати співвідношення комплексону до анти- регулювання рН радіоіїзотопу і стерильну скляну тіла, тому що був досягнутий бажаний рівень зв'я- реакційну пляшечку. Найкращим буфером є роз- зування ізотопу. Більш того, не було ніяких пере- чин ацетату натрію з низьким вмістом металу з ваг в збільшенні кількості кон'югованого концентрацією між приблизно 10 і 1000МмМ, і скля- комплексону, тому що це могло вплинути на іму- на реакційна пляшечка, що вміщує об'єм принайм- нореактивність антитіла. Такі параметри можуть ні змл. Найкращим антитілом є анти-СО20 антиті- бути визначені емпірично для інших антитіл при ло, і найкращим комплексоном є МХ-ДТПК. розробці комплектів, таких як комплект, описаний Можуть бути використані інші комплексони, як в даному винаході. описано раніше. Найкращим кон'югованим антиті-

Коли радіоіїзотопом є 90 хлорид, то об'ємна лом є 288-МХ-ДТПК, хоча може бути мічене будь- кількість У хлориду, яку слід використати для яке комплексон-кон'юговане антитіло і визначена приготування однієї дози для введення, є типово його спорідненість. Підібраний буфер - це забуфе- приблизно від 10 до 50мКі, найкраще 45мкКі, яку рений фосфатом сольовий розчин, який містить поділено на концентрацію радіоактивності під час радіопротектор і некон'югований комплексон, як мічення. Кількість ацетату натрію, використаного описано вище, і радіоїзотоп може бути або може для регулювання рнН, відрізняється в залежності не бути включеним, і найкращими ізотопами є "п від концентрації ацетату натрію і розчину носію хлорид або у хлорид. В залежності від комплек- ізотопу, і може, таким чином, знаходитись в широ- сону можуть бути використані інші радіоізотопи. кому інтервалі. Коли концентрація ацетату натрію Різниця між комплектом аналізу зв'язуван- є 5ОММ, і 0у поставляється в 50мМ НСІ, кількість, ня/радіомічення і комплектом радіомічення, який потрібна для регулювання рн, складає типово 1,2 описаний вище, є включення антиген-позитивних клітин, які служать як цільовий субстрат для тесту- З точки зору розкритих тут додаткових втілень вання спорідненості антитіла. Коли антигеном є комплекту, слід наголосити, що однією з переваг

СО20, то найкращими СО20-позитивними клітина- комплекту радіомічення і способу даного винаходу ми є ЗВ клітини (АТОС Ж СС 120), але можуть є те, що подальший етап очистки є непотрібним і бути використані будь-які СО20-позитивні клітини, радіомічене антитіло може бути введено прямо комплект аналізу зв'язування і радіомічення може пацієнту, таким чином зберігається цінний час і в подальшому включати антиген-негативні клітини збільшується стабільність антитіла. Внаслідок цьо- для використання в якості негативного контролю. го слід підкреслити, що поки для клініцистів може

Найкращими СО20-негативними клітинами є НЗВ бути бажаним тестувати або перевіряти специфіч- клітини (АТОС Ж СС 120,1), але можуть бути ви- ність зв'язування і спорідненість радіомічених ан- користані будь-які СО20-негативні клітини. титіл перед введенням, такий тест може бути не-

Зрозуміло, що комплект радіомічення і аналізу минучім з індивідуальними ізотопами, якщо зв'язування може в подальшому містити пляшечку стабільність антитіла і інгібування радіолізу є дуже химерного анти-СО20 антитіла на додаток до ан- важливими, так само, як з ітрієм. Забезпечуючи титіла, яке необхідно мітити, з метою посилення втілення комплекту, де спорідненість зв'язування і комбінованого терапевтичного режиму, або для специфічність можна тестувати, автори винаходу кліренсу периферійних В-клітин перед отриманням ніяким чином не припускають, що такі тести абсо- діагностичного зображення. Таким окремим най- лютно необхідні в способах або комплектах вина- кращим антитілом є КйихапФф), але може бути будь- ходу. Можливість тестувати такі важливі парамет- яке антитіло, яке показало ефективне знищення ри антитіл в цілому залежить від вибору пухлинних клітин. Фактично, два різні типи антитіл клініциста. можна об'єднати в один комплект, тобто антитіла, Автори винаходу також визначили, що спосіб, спрямовані до двох різних антигенів В-клітини, за використаний для приготування фіксованих та умови, що комбінований терапевтичний режим ліофілізованих клітин для комплектів аналізу зв'я- спрямований на один тип клітин, тобто В-клітинну зування даного винаходу є особливо зручним для лімфому. приготування клітин для комерційних комплектів.

Так само, як компоненти комплекту можна ви- Клітини можуть бути фіксовані до ліофілізації для користати для мічення інших антитіл, інші клітини покращення структури/стабільності. Зокрема, клі- для тестування спорідненості антитіла можна при- тини даного винаходу демонструють високу відт- готувати в залежності від цільового антигену. Од- ворюваність, коли використовуються для аналізів нак для анти-СО20 антитіл, комплект аналізу зв'я- зв'язування антитіла. зування і радіомічення цього винаходу є особливо Зокрема, даний винахід включає спосіб приго- підходящим для комерційного набору, в якому тування ліофілізованих клітин, який включає (ії) цільові клітини поставляються в ліофілізованій збір клітин центрифугуванням при щільності клітин формі. Це дозволяє виконувати контроль ефекти- від 0,5 до 2х105 клітин на мл; (її) відмивку клітин вності антитіла просто і систематично і уникнути принаймні один раз в збалансованому сольовому труднощів та витрат на підтримання лабораторій розчині, тобто, НВ55; (ії) повторне суспендування культур тканин. Загалом, ліофілізовані клітини зібраних клітин в буфері ліофілізації, який містить поставляються в аліквотах між 0,5 і 500х106 клітин збалансований сольовий розчин, білок носій і при- на пляшечку, відповідно до способів винаходу. наймні один тип цукру; (їм) розподіл аліквот повто-

Можливо, що конкретна лабораторія буде від- рно суспендованих клітин в пробірку мікроцентри- давати перевагу замовленню антитіл, які вже були фуги або скляну пляшечку; і (м) ліофілізація клітин радіомічені, в такому випадку такій лабораторії 12-96 годин і найкраще 24-72 години при 30- потрібні реагенти аналізу зв'язування для того, бОомілітор. Спосіб є особливо зручним для приго- щоб мати впевненість, що антитіла зберігають тування ліофілізованих клітин, де названі клітини - цільову спорідненість. В цьому випадку, даний це ЗВ клітини (АТОС Ж СС 120) або Н5В клітини винахід також передбачає комплект аналізу зв'я- (АТСС й СС 1201), але може бути придатним зування для визначення відсотку зв'язування ра- також для інших типів В-клітин. діомічених антитіл з їх цільовою клітиною. Такий Найкращій буфер, загалом, містить бичачий комплект включає принаймні одну пляшечку фік- сироватковий альбумін, як білок - носій, в концент- сованих і/або ліофілізованих антиген-позитивних рації 195 (вага/об'єм), і маніт в концентрації 1095. клітин і може не обов'язково містити антиген- Однак, ймовірно, можливе використання інших негативні клітини, як описано вище для комплекту білків-носіїв, тобто ЛСА, і інших цукрів. Клітини аналізу зв'язування і радіомічення. Більш того, збирають центрифугуванням при швидкості приб- очевидно, варіанти такого комплекту можуть лизно 1300 обертів на хвилину, і додають сольо- включати немічене контрольне антитіло для пере- вий розчин НВ5О5 (збалансований сольовий роз- вірки специфічності зв'язування антитіла спожива- чин Хенка). Загалом клітини повторно ча методом конкурентного аналізу. суспендують в концентрації 50х106 клітин на мл.

Знову, коли антиген - це СО20, то найкращі Однак для спеціаліста в галузі очевидно, що наве-

СО20-позитивні клітини - це 5В клітини (АТСС й дені вище умови можуть бути злегка модифікова-

СС 120), а найкращі СО20-негативні клітини - це ними без значного компромісу щодо життєздатно-

НЗВ клітини (АТСС Ж ССІ 120.1), які поставляють- сті клітин. Більш того, наведені вище умови ся в ліофілізованій формі в аліквотах між 0,5 і можуть бути доповнені додатковими процедурами,

БОх105 клітин. В цьому випадку найкращим антиті- розробленими для оптимізації процесу для біль- лом є МХ-ДТПК кон'югат 288, мічений "п або чоу, ших кількостей клітин, наприклад, діафільтрацією в тангенціальному потоці для переведення клітин то найкращими СО20-негативними клітинами є в буфер ліофілізації. НЗВ клітини (АТСС Я СС. 120,1).

Комплект аналізу зв'язування даного винаходу Як описано вище, ліофілізовані клітини даного може бути використаний в аналізі для визначення винаходу забезпечують простий, ефективний і спорідненості зв'язування радіоміченого антитіла. відтворюваний стандарт тестування ефективності

Такий аналіз також є предметом даного винаходу. зв'язування радіомічених антитіл. Отже, аналіз

Аналіз зв'язування для визначення відсотку зв'язу- зв'язування даного винаходу найкраще виконуєть- вання радіоміченого антитіла з його цільовою клі- ся, використовуючи ліофілізовані клітини, включені тинною загалом містить наступні етапи: (ї) змішу- в комплект аналізу зв'язування даного винаходу. вання принаймні однієї аліквоти радіоміченого Додатково, аналізи радіомічення даного винаходу антитіла з принаймні однією аліквотою антиген- можна комбінувати з аналізами зв'язування даного позитивних клітин; (її) змішування принаймні однієї винаходу, де антитіло спочатку мітиться способом аліквоти радіоміченого антитіла, ідентичного алік- мічення комплексон-кон'югованого антитіла, як воті етапу (ї), з принаймні однією аліквотою буфе- описано в даному винаході. Ще краще аналіз зв'я- ру розведення такого ж об'єму, як аліквота анти- зування даного винаходу виконувати, використо- ген-позитивних клітин в етапі (ї) як контроль; (її) вуючи один з описаних тут комплектів аналізу зв'я- збирання клітин центрифугуванням; (ім) вимірю- зування і радіомічення. вання радіоактивності в надосадовій рідині зібра- Можуть існувати деякі приклади, коли спорід- них клітин і контролю; і (м) порівняння кількості неність антитіл слід тестувати і перевіряти, але радіоактивності В-клітинній надосадовій рідині з радіомітка ще не була приєднана. Наприклад, за кількістю радіоактивності в контролі. деяких обставин може бути корисним тестувати

Оскільки комплекти радіомічення даного вина- спорідненість зв'язування антитіла перед радіомі- ходу звичайно містять 1111п хлорид або ЗУ хлорид, ченням. Для такого випадку даний винахід також аналіз зв'язування даного винаходу типово вико- здійснює конкурентний аналіз зв'язування для оці- нується з антитілами, міченими 71Іп або зу, Коли нки спорідненості зв'язування антитіла, що тесту- міткою є "п, радіоактивність в пробірках аналізу ють, з цільовою клітиною, який містить (і) приготу- вимірюють за допомогою гамма-лічильника. Коли вання рутеній-міченого контрольного антитіла, міткою є 90У, радіоактивність вимірюють за допо- використовуючи відоме антитіло, специфічне до могою сцинтиляційного лічильника, хоча можна такого ж антигену; (ії) витримка зростаючих кілько- використати і гамма-лічильник. стей тест-антитіла і зростаючих кількостей неміче-

Для аналізу зв'язування даного винаходу най- ного контрольного антитіла з фіксованою концент- кращим антитілом є анти-СО20 антитіло, і найкра- рацією цільових клітин і слідовими кількостями щим анти-СО020 антитілом є 288, де антитіло 288 рутеній-міченого антитіла, де кожна окрема конце- мітиться використовуючи комплект радіомічення нтрація тест-антитіла і кожна окрема концентрація даного винаходу. Однак, будь-яке радіомічене контрольного антитіла знаходяться в окремих антитіло може бути тестовано за умов наявності пробірках, відповідно; (ії) визначення кількості клітин, які експресують специфічний антиген. Коли зв'язування в кожній реакційній пробірці, основане

СО20 є антигеном, то найкращими клітинами для на відносній електрохемілюмінесценції (ЕХЛ), ви- виконання аналізу є 5В клітини (АТСС Ж СС 1290), користовуючи апаратуру ОКІСЕМ; і (ім) обчислен- однак, аналіз також може бути оптимізованим і ня середньої величини спорідненості тест- виконуватись з будь-яким радіоміченими антиті- антитіла. Середня величина спорідненості може лом і відповідною цільовою клітиною. бути обчислена з величин ЕС5О і відомих концент-

Буфер розведення, використаний для аналізу, рацій слідового антитіла, використовуючи спосіб повинен підтримувати зв'язування антитіла, тобто Мюллера (МшиїПег) І9. Іттипоїіодіса! Меїшйоаз (1980) фізіологічний буфер, який можливо містить білок- 34:345| або будь-який інший підходящий спосіб. носій, наприклад, БСА, для мінімізації неспецифіч- Слід відмітити, що цей аналіз також може бути ного зв'язування з клітинами. Хоча пробірка з бу- використаний для тестування спорідненості ра- фером розведення служить як контроль, додатко- діомічених антитіл або будь-якого антитіла, для вий контроль з використанням антиген-негативних якого антиген не може бути очищений і клітини клітин може бути включеним в аналіз. В цьому необхідні як джерело антигену. Фіксовані, ліофілі- випадку аналіз зв'язування містить додатково на- зовані клітини даного винаходу можуть бути вико- ступні етапи: (ї) змішування принаймні однієї алік- ристані як цільові клітини. воти радіоміченого антитіла з принаймні однією Коли виконується конкурентний аналіз зв'язу- аліквотою антиген-негативних позитивних клітин; вання даного винаходу для тестування спорідне- (ї) збирання антиген-негативних клітин центрифу- ності анти-СО20 антитіл, контрольним антитілом гуванням; (ім) вимірювання радіоактивності в на- може бути 288 або будь-яке інше некон'юговане досадовій рідині зібраних антиген-негативних клі- анти-СО20 антитіло. Контрольне антитіло може тин; ї (м) порівняння кількості радіоактивності в бути комплексон-кон'югованим антитілом. Тест- антиген-негативній клітинній надосадовій рідині з антитіло також може бути комплексон-кон'югатом кількістю радіоактивності в антиген-позитивній контрольного антитіла. Альтернативно, тест- клітинній надосадовій рідині і в контролі. Порів- антитіло може бути іншим анти-СО20 антитілом, няння радіоактивності, отриманої з цієї пробірки, з чия спорідненість зв'язування з СО20 є цікавою в контрольним буфером розведення, буде служити порівнянні з 288, Однак аналіз може бути адапто- як міра кількості неспецифічного зв'язування з ан- ваним для використання з антитілами, які мають тиген-позитивними клітинами. Коли СО20 є анти- інші специфічності, за умов наявності підходящої геном і СО20-позитивними клітинами є 5В клітини, цільової клітини.

В конкурентному аналізі зв'язування даного чині, який містив 10мММ гліцин-НСІ, рН 6,8, Потім винаходу кращими цільовими клітинами є СО20- подвійний набір зразків помістили в пляшечки з позитивні клітини, найкращими 5В клітини, (АТОС гвинтовими кришечками, пляшечки продули азо- й СС 120), і найкращими є повторно суспендовані том і закрили. Потім зразки інкубували 12 тижнів ліофілізовані 5В клітини, приготовані відповідно до при температурі 4"С або 30"С; імунореактивність способу даного винаходу. Клітини, ліофілізовані за зразків оцінювали раз на тиждень. Не спостеріга- допомогою інших способів, або фіксовані клітини лося втрати імунореактивності жодним з зразків також можуть бути використані. Рутеній-мічене 288 протягом 12-тижневого вивчення. На малюнку антитіло типово готують за допомогою процесу, зображені імунореактивності для 1 (Фіг.5А), 6 який включає витримку контрольного антитіла з М- (Фіг.5Б) і 12 (Фіг.5В) тижнів. гідроксисукцинімідним ефіром рутеній (ІІ) тріс- Фігура 6. Аналіз зв'язування для визначення біпіридин комплексону (ТАО-МН5), хоча, також, імунореактивності 1 п-міченого 288-МХ-ДТПК, можна собі уявити інший відомий спосіб мічення інкубованого в РВ5, рН 7,4, який містить 5Омг/мл антитіл. З метою мічення контрольне антитіло і людського сироваткового альбуміну (48-годинна

ТАС-МНО краще витримувати при молярному інкубація). співвідношенні 1:15. Фігура б6А. Незмінну кількість радіоміченого

Ці та інші аспекти даного винаходу будуть антитіла (Знг/мл) інкубували з зростаючими об'є- краще зрозумілі з наведених далі малюнків, прик- мами 5В клітин (20х10бклітин/мл). Кількість радіо- ладів та опису винаходу. активності (срт, р/хв), зв'язаної з клітинами, ви-

Фігура 1. Імунореактивність природного 288 креслювали проти об'єму доданої суспензії клітин. порівнювали з комерційно наявними анти-СО20 Фігура 6Б. На малюнку зображено відношення антитілами ВІ (Сошкег) і Геи 16 (Весіоп Оіскіп5оп) загальної взятої радіоактивності до зв'язаної ра- способом прямої конкуренції в радіоїмунному ана- діоактивності (АТ/В). Лінійна екстраполяція дозво- лізі, використовуючи 725І-мічений ВІ. Антиген- лила обчислити перетинання осі у (0,997). Обер- позитивні 5В клітини (100,000) додавали до кожної нене число перетинання осі у Х 100 дало величину лунки фільтрових планшетів УР; 1Онг радіоміче- імунореактивності 10095 при нескінченному над- ного В1 змішували з різними концентраціями немі- лишку антигену. ченого конкуренту і суміш додавали до клітин. Ан- Фігура 7. Ауторадіограми, отримані з 505- титіла інкубували з клітинами одну годину при РАСЕ аналізу оу-міченого 288-МХ-ДТПК, інкубо- кімнатній температурі; визначення проводили три- ваного при 4"С в РВ5, рН 74, який містить 75мг/мл чі. Після цього лунки відмивали, сушили і визнача- людського сироваткового альбуміну і їмММ ДТПК. В ли фільтр-асоційовану радіоактивність. Наведені показаний час зразки піддавали електрофорезу в дані коригували щодо радіоактивного фону і брали 4-20905 тріс-гліциновому гелі, використовуючи не- середнє арифметичне трьох вимірювань. відновлюючі умови, денатуруючі умови (505).

Фігура 2. Зростаючі кількості некон'югованих Зразки наносили по 5мкл (треки 1, 2) і 10мкл (тре- 288 аналізували на зв'язування з людськими В- ки 5, 6). Гелі експонували до рентгенівської плівки клітинами (5В) використовуючи РАС5 аналіз. По- приблизно 15 хвилин при кімнатній температурі та рівняння робили з комерційно наявним анти-СО20 фотографували. моноклональним антитілом (ВІ) і з двома антиті- Фігура 8. Денситометричне сканування ауто- лами стороннього ізотипу. Цапиний анти-мишачий радіограми нульового часу, отриманої з 505-

ІДа-РІТС (аб) використовували як вторинний РАСЕ аналізу ЗУ-міченого 288-МХ-ДТПК, інкубо- реагент. Результати показують, що 288 є специфі- ваного при 4"С в РВБ, рН 7,4, який містить 75мг/мл чним до СО20 антигену і що воно проявляє більше людського сироваткового альбуміну і їмМ ДТПК. зв'язування, ніж В1. Зразки піддавали електрофорезу в 4-20905 тріс-

Фігура 3. Людські В-клітини (58) інкубували зі гліциновому гелі, використовуючи невідновлюючі зростаючими кількостями 725І-міченого 288, Три умови. Зразки наносили по 5мкл, 1Омкл і 20мкл в зразки інкубували одну годину і визначали радіса- подвійні лунки. Гель експонували до рентгенівської ктивність, зв'язану з клітинами після фільтрації плівки приблизно 15 хвилин при кімнатній темпе- для збору клітин. Аналіз Скетчарда дозволив об- ратурі і один з треків сканували, використовуючи числити уявну константу спорідненості 4,3х109М. денситометр. Відносна площа піку радіоміченого

Фігура 4. Імунореактивність природних 288, кон'югату (22) дорівнювала 96,2905. 288-МХ-ДТПК і В1. Антитіло ВІ мітили, як описано Фігура 9. Денситометричне сканування ауто- в розділі "Способи". Десять нанограм радіомічено- радіограми 48 годин, отриманої з 505-РАСЕ ана- го ВІ змішували зі зростаючими концентраціями лізу 0уУ-міченого 288-МХ-ДТПК, інкубованого при конкуренту і суміш додавали в лунки фільтрових 4"С в РВ5, рН 7,4, який містить 75мг/мл людського пластин МаР, які містили 100,000 антиген- сироваткового альбуміну і їмМ ДТПК. Зразок під- позитивних ЗВ клітин кожна; всі вимірювання про- давали електрофорезу в 4-2095 тріс-гліциновому водили тричі. Після однієї години інкубації при кім- гелі, використовуючи невідновлюючі умови. Зразки натній температурі клітини ретельно відмивали. наносили по 5мкл, 10мкл і 20мкл в подвійні лунки.

Після цього фільтри сушили і асоційовану радіоак- Гель експонували до рентгенівської плівки приб- тивність вимірювали гамма-лічильником; всі вели- лизно 15 хвилин при кімнатній температурі і один з чини коригували щодо фону. Наведені величини є треків сканували, використовуючи денситометр. середнім арифметичним з трьох вимірювань. Відносна площа піку радіоміченого кон'югату (42)

Фігура 5. Антитіло 288 було взято в кінцевій дорівнювала 95,590. концентрації 10мг/мл в нормальному фізіологічно- Фігура 10. Ауторадіограми, отримані з 505- му розчині або в нормальному фізіологічному роз- РАСЕ аналізу ИІп-міченого 288-МХ-ДТПК, інкубо-

ваного при 4"С в РВ5, рН 7 4, який містить 50мг/мл понували до рентгенівської плівки приблизно 15 людського сироваткового альбуміну. В показаний хвилин при кімнатній температурі і один з треків час зразки піддавали електрофорезу в 4-2095 тріс- сканували, використовуючи денситометр. Віднос- гліциновому гелі, використовуючи невідновлюючі на площа піку радіоміченого кон'югату (42) дорів- умови. Зразки наносили по 5мкл (треки 1, 2), нювала 94,7905. 10мкл (треки 3, 4) і 20мкл (треки 5, 6). Гелі експо- Фігура 16. Ауторадіограми отримані з 505- нували до рентгенівської плівки приблизно 15 хви- РАСЕ аналізу ""!|Іп-міченого 288-МХ-ДТПК інкубо- лин при кімнатній температурі і фотографували. ваного при 37"С в людській сироватці. В показаний (Примітка: Ауторадіограму 48 годин отримували час зразки піддавали електрофорезу в 4-2095 тріс- використовуючи посилюючий екран, що дає більш гліциновому гелі, використовуючи невідновлюючі інтенсивний сигнал порівняно з ауторадіограмою умови. Зразки наносили по 5мкл (треки 1, 2), нульового часу.) 10мкл (треки 3, 4) і 20мкл (треки 5, 6). Гелі експо-

Фігура 11. Денситометричне сканування ауто- нували до рентгенівської плівки приблизно 16-20 радіограми нульового часу, отриманої з 5О5- годин при кімнатній температурі і фотографували.

РАСЕ аналізу ""|п-міченого 288-МХ-ДТПК, інкубо- Фігура 17. Денситометричне сканування ауто- ваного при 4"С в РВ5, рН 74, який містить 5О0мг/мл радіограми нульового часу, отриманої з 5О5- людського сироваткового альбуміну. Зразок підда- РАСЕ аналізу /ПІп-міченого 288-МХ-ДТПК, інкубо- вали електрофорезу в 4-2095 тріс-гліциновому ваного при 37"С в людській сироватці. Зразок під- гелі, використовуючи невідновлюючі умови. Зразки давали електрофорезу в 4-2095 тріс-гліциновому наносили по 5мкл, 10мкл і 20мкл в подвійні лунки. гелі, використовуючи невідновлюючі умови. Зразки

Гель експонували до рентгенівської плівки приб- наносили по 5мкл, 1Омкл і 20мкл в подвійні лунки. лизно 15 хвилин при кімнатній температурі і один з Гель експонували до рентгенівської плівки приб- треків сканували, використовуючи денситометр. лизно 16-20 годин при кімнатній температурі і один

Відносна площа піку радіоміченого кон'югату (Ж3) з треків сканували, використовуючи денситометр. дорівнювала 95,9905. Відносна площа піку радіоміченого кон'югату (Ж3)

Фігура 12. Денситометричне сканування ауто- дорівнювала 95,390. радіограми 48 годин, отриманої з 505-РАСЕ ана- Фігура 18. Денситометричне сканування ауто- лізу "ПІп-міченого 288-МХ-ДТПК, інкубованого при радіограми 96 годин, отриманої з ХО5-РАСЕ ана- 4"С в РВ5, рН 7,4, який містить 5ХОмг/мл людського лізу "ПІп-міченого 288-МХ-ДТПК, інкубованого при сироваткового альбуміну. Зразок піддавали елект- 37"С в людській сироватці. Зразок піддавали елек- рофорезу в 4-2095 тріс-гліциновому гелі, викорис- трофорезу в 4-2095 тріс-гліциновому гелі, викорис- товуючи невідновлюючі умови. Зразки наносили товуючи невідновлюючі умови. Зразки наносили по 5мкл, 1О0мкл і 20мкл в подвійні лунки. Гель екс- по 5мкл, 1Омкл і 20мкл в подвійні лунки. Гель екс- понували до рентгенівської плівки приблизно 15 понували до рентгенівської плівки приблизно 16-20 хвилин при кімнатній температурі і один з треків годин при кімнатній температурі і один з треків сканували, використовуючи денситометр. Віднос- сканували, використовуючи денситометр. Віднос- на площа радіоміченого кон'югату дорівнювала на площа піку радіоміченого кон'югату (Ж3) дорів- 97,09 (об'єднані площі піків 22, З і 4). нювала 94,095.

Фігура 13. Ауторадіограми, отримані з 505- Фігура 19. Яванським макакам робили ін'єкції

РАСЕ аналізу зоу-міченого 288-МХ-ДТПК інкубо- внутрішньовенно кожні 48 годин, всього сім ін'єк- ваного при 37"С в людській сироватці. В показаний цій; введені кількості наведені на Фігурі. Рівні цир- час зразки піддавали електрофорезу в 4-2095 тріс- кулюючих Т- і В-клітин визначали ГАС5 аналізом, гліциновому гелі, використовуючи невідновлюючі використовуючи анти-СРАІ (Т-клітина), анти-Мо-Ідс умови. Зразки наносили по 5мкл (треки 1, 2), (288), анти-СО20 (Геиц 16) і анти-людський-Ідсо (В- 10мкл (треки 3, 4) і 20мкл (треки 5, 6). Гелі експо- клітина). Не спостерігали ніякого впливу на рівні нували до рентгенівської плівки приблизно 15 хви- циркулюючих Т-клітин. (Група тварин М отримала лин при кімнатній температурі і фотографували. одну дозу).

Фігура 14. Денситометричне сканування ауто- Фігура 20. За відновленням рівнів циркулюю- радіограми нульового часу, отриманої з 505- чих В-клітин у тварин, які отримали 288, спостері-

РАСЕ аналізу 0у-міченого 288-МХ-ДТПК, інкубо- гали за допомогою ГАС5 аналізу, використовуючи ваного при 37"С в людській сироватці. Зразки під- антитіла, мічені флуоресцентними мітками, корот- давали електрофорезу в 4-2095 тріс-гліциновому ко описані в описі до Фіг.19, Тварин у групах І і ІМ гелі, використовуючи невідновлюючі умови. Зразки не спостерігалось тому, що їх умертвили на 13 наносили по 5мкл, 10мкл і 20мкл в подвійні лунки. день.

Гель експонували до рентгенівської плівки приб- Фігура 21. Яванським макакам робили внутрі- лизно 15 хвилин при кімнатній температурі і один з шньовенні ін'єкції 899У-288-МХ-ДТПК, який приготу- треків сканували, використовуючи денситометр. вали, використовуючи 288-МХ-ДТПК клінічної яко-

Відносна площа піку радіоміченого кон'югату (2) сті. Тварини отримували дозу кожні 48 годин в дорівнювала 97,9905. кількостях, наведених вище для семи доз. На 0, 2,

Фігура 15. Денситометричне сканування ауто- 7, 10 ї 14 дні мавпам пускали кров і оцінювали хі- радіограми 98 годин, отриманої з 5О5-РАСЕ ана- мічну гематологію сироватки і рівні циркулюючих лізу Зоу-міченого 288-МХ-ДТПК, інкубованого при В-клітин (на 10 день сироватки не аналізували на 37"С в людській сироватці. Зразок піддавали елек- вміст В-клітин). Окрім зменшення загальної кілько- трофорезу в 4-2095 тріс-гліциновому гелі, викорис- сті лімфоцитів у всіх тварин, виключаючи одну товуючи невідновлюючі умови. Зразки наносили тварину в групі Ії, під час експерименту ніяких зна- по 5мкл, 1Омкл і 20мкл в подвійні лунки. Гель екс- чних відхилень від норми не відмічали.

Фігура 22. Методом ЕГІЗА, який слідував за ки 5, 6). Гелі експонували до рентгенівської плівки однократною ін'єкцією 1Омг/кг в нульовий день, приблизно 15 хвилин при кімнатній температурі і вивчали кліренс мишачих анти-СО20 антитіл 288 з фотографували. яванських макак. Як показано на Ффіг.22А, антитіло Фігура 28. Денситометричне сканування ауто- показало Д г» величину приблизно через 4,5 дня. радіограми нульового часу, отриманої з 505-

Кліренс 288 антитіла і його МХ-ДТПК кон'югату із РАСЕ аналізу 0У-міченого 288-МХ-ДТПК, інкубо- кровообігу мишей ВАЇВ/с показаний на Ффіг.22Б. ваного при 4"С в РВ5, рН 7,4, який містить 75мг/мл

Мишам внутрішньовенно робили ін'єкцію 25мкг людського сироваткового альбуміну і їмМ ДТПК. природного або кон'югованого 288 і протягом 264 Зразки піддавали електрофорезу в 4-2095 тріс- годин після ін'єкції брали зразки крові в різні відріз- гліциновому гелі, використовуючи невідновлюючі ки часу; потім сироватку аналізували імуноферме- умови. Зразки наносили по 5мкл, 1Омкл і 20мкл в нтним аналізом, використовуючи ЗВ клітини в яко- подвійні лунки. Гель експонували до рентгенівської сті агенту захвату. Як природне, так і кон'юговане плівки приблизно 15 хвилин при кімнатній темпе- антитіло показали величини кліренсу 8,75 днів. ратурі і один з треків сканували, використовуючи

Фігура 23. Кожна з двадцяти ВА! В/с мишей денситометр. Відносна площа піку радіоміченого отримувала ін'єкцію 1,1мкКі радіоміченого кон'юга- кон'югату (22) дорівнювала 96,1905. ту (100мл), розчиненого в РВ5, рН 7,4, який міс- Фігура 29. Денситометричне сканування ауто- тить 5О0мг/мл ЛСА. Групи, кожна з п'яти мишей, радіограми 48 годин, отриманої з 505-РАСЕ ана- були вбиті на 1, 24, 48 і 72 години і потім кров і лізу 0уУ-міченого 288-МХ-ДТПК, інкубованого при різні тканини приготували і аналізували на асоці- 4"С в РВБ, рН 7,4, який містить 75мг/мл людського йовану радіоактивність. сироваткового альбуміну і 1М ДТПК. Зразок підда-

Фігура 24. Кожна з двадцяти ВАЇ В/с мишей вали електрофорезу в 4-2095 тріс-гліциновому отримувала внутрішньовенно ін'єкцію приблизно гелі, використовуючи невідновлюючі умови. Зразки 1,0мкКі (в 100мл) радіоміченого кон'югату, розчи- наносили по 5мкл, 1Омкл і 20мкл в подвійні лунки. неного в 1 Х РВ5, рН 7,4, який містить 75мг/мл Гель експонували до рентгенівської плівки приб- людського сироваткового альбуміну і їмМ МДПК. лизно 15 хвилин при кімнатній температурі і один з

Групи, кожна з п'яти мишей, були вбиті через 1, 24, треків сканували, використовуючи денситометр. 48 і 72 години, і потім їх кров і різні тканини приго- Відносна площа піку радіоміченого кон'югату (42) тували і аналізували на асоційовану радіоактив- дорівнювала 94,1965. ність. Фігура 30. Ауторадіограми, отримані з 505-

Фігура 25. Безтимусні миші, які мають В- РАСЕ аналізу «тіхав5поої» Зу-міченого 288-МХ- клітинні пухлини Катов, отримували внутрішньо- ДТПК, інкубованого при 37"С в людській сироватці. венно ін'єкцію 24 мкКі И711п-288-МХ-ДТПК і групи, В показаний час зразки піддавали електрофорезу кожна з трьох мишей, були вбиті через 0, 24, 48 і в 4-2095 тріс-гліциновому гелі, використовуючи 72 години. Після приготування тканини і визначен- невідновлюючі умови. Зразки наносили по 5мкл ня асоційованої радіоактивності величини відсотка (треки 1, 2), 10мкл (треки 3, 4) і 20мкл (треки 5, 6). введеної дози на грам тканини були визначені та Гелі експонували до рентгенівської плівки прибли- побудовано вказану криву. зно 15 хвилин при кімнатній температурі і фотог-

Фігура 26. Аналіз зв'язування для визначення рафували. імунореактивності "тіхезпоої" («змішай-і1- Фігура 31. Денситометричне сканування ауто- отримай») Зоу-міченої 288-МХ-ДТПК системи, ін- радіограми нульового часу, отриманої з 505- кубованої в РВ5, рН 7,4, яка містить 50-75мг/мл РАСЕ аналізу «тіха5поої» З0Уу-міченого 288-МХ- людського сироваткового альбуміну (інкубація 48 ДТПК, інкубованого при 37"С в людській сироватці. годин). Зразки піддавали електрофорезу в 4-2095 тріс-

Панель А. Незмінну кількість З0У-міченого ан- гліциновому гелі, використовуючи невідновлюючі титіла (приблизно нг/мл) інкубували із зростаю- умови. Зразки наносили по 5мкл, 1Омкл і 20мкл в чими кількостями ЗВ клітин. Кількість радіоактив- подвійні лунки. Гель експонували до рентгенівської ності (р/хв.), зв'язаної з клітинами, відкладали на плівки приблизно 15 хвилин при кімнатній темпе- графіку як функцію концентрації клітин. ратурі і один з треків сканували, використовуючи

Панель Б. Загальна введена радіоактивність денситометр. Відносна площа піку радіоміченого зу була представлена в залежності від зв'язаної кон'югату (22) дорівнювала 89,1905. радіоактивності (АТ/В). Лінійна екстраполяція до- Фігура 32. Денситометричне сканування ауто- зволила обчислити точку перетину з віссю У радіограми 72 годин, отриманої з БХО5-РАСЕ ана- (1,139). Обернене значення У в точці перетину Х лізу «тіха5поої» З0у-міченого 288-МХ-ДТПК, інку- 100 дає величину імунореактивності 87,995 при бованого при 37"С в людській сироватці. Зразок нескінченному надлишку антигену. Ніякого зв'язу- піддавали електрофорезу в 4-20905 тріс- вання не спостерігали з СО20-негативними кліти- гліциновому гелі, використовуючи невідновлюючі нами (НЗВ). умови. Зразки наносили по 5мкл, 1О0мкл і 20мкл в

Фігура 27. Ауторадіограми, отримані з 505- подвійні лунки. Гель експонували до рентгенівської

РАСЕ аналізу зоу-міченого 288-МХ-ДТПК, інкубо- плівки приблизно 15 хвилин при кімнатній темпе- ваного при 4"С в РВ5, рН 7,4, який містить 75мг/мл ратурі і один з треків сканували, використовуючи людського сироваткового альбуміну і їмММ ДТПК. В денситометр. Відносна площа піку радіоміченого показаний час зразки піддавали електрофорезу в кон'югату (22) дорівнювала 88,895. 4-2095 тріс-гліциновому гелі, використовуючи не- Фігура 33. Кожна з двадцяти ВАГ В/с мишей відновлюючі умови, денатуруючі умови (505). отримувала внутрішньовенно ін'єкцію Б5мкКі З0у-

Зразки наносили по 5мкл (треки 1, 2) і 10мкл (тре- міченого 288-МХ-ДТПК, розчиненого в 1 Х РВ5, рн

7 4, який містить 75мг/мл людського сироваткового га/об'єм) бичачого сироваткового альбуміну). Зро- альбуміну і їмМ МДПК. Групи, кожна з п'яти ми- стаючі концентрації клітин інкубували З години з шей, були вбиті через 1, 24, 48 і 72 години і потім 2нг/мл М288, який приготували, використовуючи їх кров і різні тканини приготували і аналізували на 288-МХ-ДТПК, партія Ж 0165А. Б. Графік в подвій- асоційовану радіоактивність. них обернених координатах концентрації клітин від

Фігура 34. Зростаючі кількості СНО-похідних зв'язаної радіоактивності/загальної радіоактивнос- мічених антитіл 288 інкубували з фіксованою кон- ті (В/АТ). Імунореактивність була обчислена як центрацією свіже-зібраних СО20-позитивних В- обернене значення М у точці перетину Х клітин (ЗВ) або СО20-негативних Т-клітин (Н5В). 100значення обчислена як 1/у-перетин Х 100, Ве-

Кількість антитіл, які зв'язані з клітинами, оцінюва- личини імунореактивності і коефіцієнту кореляції ли, використовуючи РАС5 аналіз, використовуючи (Кк) дорівнювали 72,25 і 0,999, відповідно. цапиний анти-мишачий ІдДО-РІТС Е(аб)», як описа- Визначення но тут. Порівняння робили з антитілом сторонньо- Якщо не вказано інше, всі технічні і наукові те- го ізотипу (5004). Тільки СНО-похідні антитіла 288 рміни, які використані тут, мають таке ж саме зна- показали помітне зв'язування з СО20-позитивними чення, як звичайно розуміє кваліфікована в галузі

ЗВ клітинами. людина, який підходить цей винахід. Хоча будь-які

Фігура 35. Імунореактивність. СНО-похідних способи і матеріали, схожі або еквівалентні описа- 288 порівнювали з 2888-49 батьківськім антитілом, ним тут способам, можуть бути використані в яке виробляється в гібридомній клітинній лінії, практиці або тестуванні даного винаході, але кра- способом прямої конкуренції в аналізі ОКІСЕМ. щі способи і матеріали описані тут. Для цілей да-

Зростаючі кількості антитіла інкубували з фіксова- ного винаходу, нижче визначені наступні терміни. ною концентрацією СО20-позитивних В-клітин (58) низький вміст металу - відноситься до реаген- і слідовими кількостями рутеній-міченого СНО 288. тів, оброблених з метою зменшення забруднення

Після інкубації протягом трьох годин при кімнатній металом до рівня, який не впливає на приєднання температурі, зв'язування, виражене як відносна радіомітки. електрохемілюмінесценція (ЕХЛ), визначали, ви- антиген-позитивний - означає експресію анти- користовуючи прибор ОКІСЕМ, як описано в роз- гену, який розпізнається специфічним антитілом ділі Матеріали і Способи. Значення є середнім винаходу таким чином, що антитіло здатне до зв'- арифметичним двох вимірів. Обчислені середні язування. константи спорідненості для СНО 288 і 2888-49 до приєднання радіомітки - відноситься до кі- дорівнювали 1,3х1079М і 2,5х1079М, відповідно. лькості радіомітки з реакції радіомічення, яка зв'я-

Порівняння робили з антитілом стороннього ізоти- зується з антитілом, по відношенню до сумарної пу (5004). кількості радіомітки, спочатку доданої до реакції.

Фігура 36. Зв'язування 288-МХ-ДТПК кон'юга- Фо зв'язування - відноситься до кількості анти- тів, які приготували з СНО-похідних 288, порівню- тіла із зразка, яка зв'язується з цільовим антиге- вали з некон'югованим антитілом способом прямої ном, з або без специфічності. конкуренції в аналізі ОКІСЕМ. Кон'югати готували 95 імунореактивності або специфічність зв'язу- інкубацією 288 з МХ-ДТПК 8, 17 і 24 години перед вання - відноситься до такої кількості зразка анти- видаленням хелату, який не прореагував. Для тіла, яка специфічно зв'язується з цільовим анти- аналізу зв'язування антитіла інкубували з фіксова- тілом. ними концентраціями СО20-позитивних В-клітин діагностичне антитіло - відноситься до антиті- (5В) і слідовими кількостями рутеній-міченого СНО ла, кон'югованого з радіоміткою, такою як 11, яке 288, Після інкубації протягом трьох годин при кім- може виконувати діагностичну візуалізацію пухлин натній температурі, зв'язування, виражене як від- і антиген-позитивних клітин. носна електрохемілюмінесценція (ЕХЛ), визнача- терапевтичне антитіло - відноситься до анти- ли, використовуючи прибор ОКІСЕМ, як описано в тіла, кон'югованого З альфа-або бета- розділі Матеріали і Способи. Значення є середнім випромінюючою радіоміткою (такою як 90), яке арифметичним з двох вимірів. Препарати кон'юга- може виконувати знищення клітин, коли воно зв'я- тів показали схоже зв'язування в порівнянні з не- зано з цільовим антигеном. кон'югованим антитілом 288. Доклінічна розробка мишачих моноклональних

Фігура 37. А. Клітини 5В відмивали і повторно анти-СО20 антитіл 288, кон'югованих 288,111|п- і суспендували до 90х10єклітин/мл в буфері розве- зоу-мічених 288 дення (1Х РВ5, рН 7,4, який містить 195 (ва- Ї. Матеріали і способи для розробки мишачих га/об'єм) бичачого сироваткового альбуміну). Зро- моноклональних анти-СО20 антитіл 288, кон'юга- стаючі концентрації клітин інкубували З години з тів 288-МХ-ДТПК, ""Чп-мічених 288-МХ-ДТПК і 7,Бнг/мл Іп288, який приготували, використовуючи очищених НРІ-С з2у-МХ-ДТПК 288-МХ-ДТПК партія 0165А. Б. Графік в подвійних А. Матеріали. обернених координатах концентрації клітин від 1. Клітини. зв'язаної радіоактивності/загальної радіоактивнос- Людські клітинні лінії ЗВ і НЗВ отримали з ті (В/АТ). Імунореактивність була обчислена як Американської Колекції Типів Культур (Атегісап обернене значення У у точці перетину Х 100. Ве- Туре Сийиге СоПесіоп) і вирощували на КРМІ- личини імунореактивності і коефіцієнту кореляції 1640, яка містила 1095 ембріональної бичачої си- (ЕР) дорівнювали 80,695 і 0,981, відповідно. роватки. СО20-позитивна клітинна лінія 5В - це В

Фігура 38. А. Клітини 5В відмивали і повторно лімфобластоїдна клітинна лінія, похідна з світлого суспендували до 90х10єклітин/мл в буфері розве- шару згустку периферійної крові пацієнтів з гост- дення (1Х РВ5, рН 7,4, який містить 195 (ва- рою лімфобластичною лейкемією (1). Антиген-

негативна клітинна лінія НОВ - це Т лімфобластої- лізом, використовуючи Сошіег В1 антитіло після дна клітинна лінія, отримана від новонароджених 10-14 днів. сірійських хом'яків (2). Мишача мієломна клітинна Перевірка гібридів, які виділяли анти-СО20 ан- лінія 5Р2/О підтримувалась на КРМІ-1640, яка міс- титіло, виконували, використовуючи прийняті спо- тила 1095 ембріональної бичачої сироватки. соби радіоіїмунологічного аналізу. Коротко, Соишнег 2. Антитіла. ВІ анти-Сй20 антитіло очищали афінною хромато-

Анти- СО20 антитіла ВІ і Геи 16 отримували графією на Білку А. П'ятдесят мікрограм очищено- від Сошнег Іттипоіоду та Весіоп/Оіскіпзоп, відпо- го антитіла з'єднували з 125) коротким окисленням відно. 125|-мічені цапині анти-мишачі до та цапині в присутності іодореадз (Ріегсе Спетіса! Со.), ви- анти-людські (ДО антитіла отримували від ІСМ. конуючи процедури виробника. Радіомічене анти-

Цапині Е(ар)2 анти-мишачих до отримували від тіло було знесолене на амберлітовій смолі та збе-

Сарреї!. рігалося в буфері розведення (РВ5, рН 7,4, який 3. Реагенти. містить 0,295 желатину, 0,0295 азиду натрію і 1,095

Повні та неповні ад'юванти Фройнда купували ВЗА). Десять нанограм радіоміченого антитіла у Зідта СПпетіса! Сотрапу. Поліетиленгліколь, поміщали в кожну лунку попередньо блокованого

НАТ концентрат і НТ концентрат отримували від планшету для аналізу на фільтрах (буфер, що

Воепгіпдег Мапппеїйт. Флуоресцеїн ізотіоціанат блокує: буфер розведення, який містить 1095 ЕВ5) (РІТС) купували у Зідта Спетіса! Сотрапу. Індій- разом з 50мкл супернатанту гібридоми із тестових 111) хлорид і 9З0М хлорид отримували від лунок і 100000 5В клітин, суспендованих в 50мкл

Атегзпат або МЕМ Оиропі. Ітрій-(89| хлорид купу- буферу розведення. Суспензію інкубували одну вали у Айідгісп Спетіса! Сотрапу. Всі інші реагенти годину при кімнатній температурі. Планшети ре- отримували із стандартних джерел. тельно відмивали буфером для промивання (РВ5,

Реагенти, використані для кон'югації і прото- рН 7,4, який містить 0,290 желатину і 0,0295 азиду колів радіомічення, обробляли з метою видалення натрію), на вакуумному пристрої фірми МЕР забруднення іонами важких металів, які можуть зсіепійс і фільтри, які містили захоплені 5В кліти- конкурувати з радіоїзотопами під час етапу ра- ни, переносили в гамма-лічильник. Лунки, які міс- діомічення. Типово реагенти обробляли, пропус- тили тільки середовище НАТ і мічене ВІ антитіло, каючи розчин через колонку іонообмінної смоли використовували як фоновий контроль, і ідентичні

Спеїех 100 (ВіоКкай Іпдизігіеєз) або в періодичному лунки, які містили 5В клітини, використовували як процесі способом додавання Спеїех 100 до розчи- позитивний контроль. Контролі інгібування містили ну, який приготували. Для всіх приготувань і роз- радіомічене ВІ і різні кількості неміченого В1 анти- чинів використовували або Міїїї-С-очищену або тіла в діапазоні від 2мкг до 2нг.

УМагег ог Іггідайоп (М/РІ) воду з низьким вмістом 2. Вивчення способом проточної цитометрії. металу. Розчини, вільні від металу, стерилізували а. Клітинні лінії. фільтруванням і збирали в стерильні пластикові Попередні дослідження способом проточної контейнери. цитометрії виконували з супернатантами з культур

Б. Способи гібридоми 288, Сто мікролітрів супернатанту гіб- 1. Отримання і перевірка супернатантів гібри- ридоми інкубували з 5В клітинами одну годину при доми 288 методом КІА. кімнатній температурі; після цього додавали вто-

Десять ВАЇ В/с мишей імунізували 20 мільйо- ринне антитіло (Б(ар)2 цапиних анти-мишачих нами ЗВ клітин, суспендованих в РВ5, який містив І3о; Сарреї), яке використовували в розведенні повний ад'ювант Фройнда. Клітини вводили як 1/400, і інкубацію продовжували одну години в підшкірно, так і внутрішньочеревно, в декількох темряві. Клітини промивали 5 разів. Контрольні місцях на тілі тварини. Після 2 тижнів періоду по- зразки включали тільки клітини (без первинного кою мишам другий раз вводили ЗВ клітини, емуль- або вторинного антитіла), за допомогою яких ви- говані в неповному ад'юванті Фройнда. Посилюючі значали аутофлуоресценцію, клітини тільки з вто- послідовні імунізації виконували щотижня ЗВ клі- ринним антитілом для визначення неспецифічного тинами, суспендованими в РВ5. Мишей імунізува- зв'язування і комерційно наявні флуоресцеїн ізоті- ли протягом періоду від 6 тижнів до 4 місяців. оціанат-кон'юговані ВІ (В1-РІТС) для контролю

Двох тварин зразу умертвляли способом цер- СО20 популяції. вікальної дислокації та їх селезінки видаляли для Для деяких експериментів флуоресцеїн зв'я- злиття з мишачою мієломою ЗР2/0. Тварин обира- зували з очищеним антитілом 288 реакцією аміно- ли, базуючись на здатності пост-імунної сироватки груп з флуоресцеїн ізотіоціанатом (РІТС). Коротко, ефективно інгібувати зв'язування радіоміченого антитіло 288 (1,2мг/мл) інкубували в 0,1М натрій

Соцнег ВІ анти-СО20 антитіла з людськими ЗВ карбонатному буфері рН 9,5 з 150-200мкг РІТС на клітинами. За три дні до кожного злиття обрані мг білку. Розчин інкубували 2 години при кімнатній тварини отримували одну останню ін'єкцію внутрі- температурі і отриманий кон'югат 288-РІТС очи- шньовенно (хвостова вена) 20 мільйонів ЗВ клітин щали на колонці зЗерпадех 0-25, Інші реагенти, в РВ5. По смерті тварин селезінки видаляли за використані в цьому досліджені, такі якВ1 і Ге 16, антисептичних умов і спленоцити зливали з 5Р2/0 купували у Сошег або Весіоп ОісКкіпзоп у вигляді клітинами в співвідношенні 5:11 (спленоцити: кон'югатів рлуоресцеїну.

ЗР2/0). Злиті клітини відмивали в середовищі для Клітини, які необхідно аналізувати, збирали і культур тканин і розподіляли в 96-лункові пласти- промивали три рази РВ5, який містив 0,295 БСА і ни, які містили селективне середовище НАТ. Гіб- 0,190 азиду натрію. Життєздатність визначали за ридоми перевіряли інгібіторним радіоїмунним ана- допомогою виключення трипанового синього за вимоги життєздатності 29095. Концентрації клітин доводили до Змлн/мл і додавали по 50мкл на лун- дій. Отримані в результаті флуоресцентні вимірю- ку в 96-лункові планшети з О-подібним дном. Пер- вання відбивали тільки такі специфічні події, які винне антитіло (5ХОмкл) додавали до відповідних мали місце у вибраній області. лунок і суміш інкубували від 30 хвилин до 1 години Для вивчення фармакології/токсикології висо- при кімнатній температурі; після цього клітини ких доз, визначали попередні (до експерименту) промивали 5 разів 200мкл/лунка РВ5, який містив рівні лімфоцитів для кожної мавпи і використову- 0,295 БСА і 0,0295 азиду натрію. Планшети з кліти- вали як величини вихідних рівнів. Обчислювали нами центрифугували при 1300 обертів на хвилину відсотки Т- і В-клітин і Т:В співвідношення та вико- 1 хвилину в центрифузі Зогмаї! і супернатанти ви- ристовували їх як точки відліку для вичерпання. даляли обережним "нахилом" планшетів. Якщо Попередня популяція (до експерименту) В-клітин необхідно, додавали вторинне антитіло і додатко- була перелічена з Ге! 16 і антитілами проти люд- во інкубували від 30 хвилин до 1 години при кімна- ських ІЗМ. тній температурі в темряві; потім клітини промива- Після ін'єкцій мавпам 288, коли СО20 антиген ли як описано вище. Нарешті, 200мкл фіксуючого був насичений 288, відсоток В-клітин в загальній буферу (0,15М хлориду натрію, який містив 195 популяції оцінювали використовуючи цапині анти- параформальдегіду, рН 7,4) додавали до кожного людський ІДМ-РІТС, анти-мишачі ІДО-КРЕ і по- зразку і оброблені клітини переносили в 12х75мМмМ двійно забарвлену популяцію, яка містила обидва пробірки для аналізу. ці маркери. Подвійно забарвлену популяцію вико- б. Кров яванських макак у цілому ристовували для кількісного аналізу, поки всі 288

Після видалення плазми клітини промивали не були видалені з периферійної крові тварин. двічі центрифугуванням і повторним суспендуван- Відсоток Т-клітин в загальній популяції лімфоцитів ням в НВЗ5. Додавали ембріональну бичачу сиро- оцінювали, використовуючи анти-СО2-РІТС. Обчи- ватку (2мл) і клітини знову суспендували. Після слювали середнє з вимірювань трьох зразків, цього сто мікролітрів суспендованих клітин помі- 10000 вимірювань було зроблено для кожного щали в кожну з 6 15-мл конічних центрифужних зразку. Клітини з кожного з обраних зразків крові пробірок. Флуоресцентно-мічені моноклональні оцінювали, відповідно, перелічуванням в кожному антитіла додавали за наступною схемою: випадку субпопуляцій Т- і В-клітин в загальній по-

Пробірка Ме 1: Мишачі антн-СОр2-РІТтС пуляції лімфоцитів. Також перевіряли співвідно- (АМАС), 2,5мМКг/мл, 5МмКкГ; шення Т:В. Зменшення кількості В-клітин обчис-

Пробірка Мо 2: Цапині анти-людські ІЗМ-РІТС лювали як відсоток зменшення В-клітин по (Різпег), 2,5мкг/мл, 5мкгГ; відношенню до початкових рівнів В-клітин для ко-

Пробірка Мо 3: Цапині анти-мишачі ІдО-АРЕ жЖної мавпи. (Різпег), 2,5мкг/мл, 5МмКкгГ; 3. Мічення радіоактивним йодом та імунопре-

Пробірка Мо 4: Цапині анти-людські ІДМ-РІТО -- ципітація СО20, Сто мільйонів ЗВ клітин поділили

Цапині анти-мишачі Ідс-КРЕ (абсорбовані), на дві рівні частини після поверхневого мічення 2,5мкг/мл, 5мКкг; йодом з 125) і йодованими кульками (Іодореавдв5)

Пробірка Мо 5: Анти-людські СО20-РІТС (анти- (Ріегсе Спетіса! Со.). Клітини промивали багаток-

Ї ем 16, Весіюоп ОісКіпзоп), 5мкг; ратно центрифугуванням, поки рівні радіоактивно-

Пробірка Ме 6: Тільки клітини (аутофлуоресце- сті в супернатанті не повернулись до фону. Сто нція). мікрограм 288 або В1 (Сошег Іттипо!іоду) антитіл

Мічені антитіла і клітини центрифугували дві додавали до будь-якого з двох зразків мічених В- хвилини при 1500об/хв для перемішування клітин і клітин. Антитіла і ЗВ клітини інкубували протягом антитіл і після цього всі 6 зразків поміщали на лід і ночі і після цього промивали три рази центрифугу- інкубували ЗОхв. Потім пробірки забирали із льоду ванням, поки всі незв'язані антитіла не були вида- і додавали буфер лізису (попередньо підігрітий до лені. Клітинні осади, які містили зв'язані 288 і В1, 37"С) до об'єму 12мл. Після цього зразки інкубу- потім були розкладені і екстраговані додаванням вали 15хв. при кімнатній температурі, центрифугу- 195 детергенту МР-40 в 0,1М тріс-НСІ, рН 8,0, з вали 5хв. 1500об/хв. при 4"С і видаляли суперна- наступним інкубуванням при кімнатній температурі тант. Потім осади клітин промивали двічі в буфері одну годину. Екстракт центрифугували в мікроцен- мічення (РВ5, який містить 1950 БСА і 0,0595 азиду трифузі 30хв. на високій швидкості і супернатант натрію). переносили в нові пробірки. Білок А-Сефарозу

Далі клітини фіксували додаванням 0,5мл фік- (З00мкл) додавали до кожної пробірки і осаджува- суючого буферу (0,15М хлориду натрію, рН 7,4, ли центрифугуванням. Потім білок А-Сефарозу який містить 195 параформальдегіду) до кожної промивали 20 разів для видалення неспецифічно пробірки і аналізували на приборі Весіоп Оіскізоп зв'язаного білку, міченого йодом. Коли відношення

ЕАСбсап, використовуючи аутокомпенсацію і по- радіоактивності кулька - супернатант досягало переднє калібрування за допомогою калібруваль- величини 100, концентрат екстрагували буфером них кульок. Зелену флуоресценцію від флуоресце- зразку 505 РАСЕ і нагрівали до кипіння. Після

Тїну вимірювали в режимі ГІ/1, а червону охолодження приблизно 1500Ор/хв. кожного з екс- флуоресценцію від фікоеритрину вимірювали в трактів додавали до лунки 1095 поліакриламідного режимі РІ 2. Дані подавали в логарифмічній формі. гелю. Попередньо пофарбований стандарт низької

Спочатку життєздатні популяції лімфоцитів іден- молекулярної ваги (Віокай Іпс.) додавали до ок- тифікували в координатах прямого світлорозсію- ремої лунки і використовували для оцінки молеку- вання проти світлорозсіяння під прямим кутом на лярної ваги. Білки були розділені електрофорезом точковому графіку. Загальна популяція лімфоцитів і гель сушили та експонували до рентгенівської була потім ізольована відсіканням всіх інших по-

плівки 24 години при -70"С; після чого плівку про- 8,6, який містив 150мММ Масі, використовуючи діа- являли і аналізували. ліз або підсилювали, використовуючи багаторазо- 4. Аналіз зв'язування 288 методом Скетчарда ву ультрафільтрацію за допомогою фільтрів для

Уявну спорідненість очищеного 288 оцінювали центрифугування (30,0000 МУУСО) Сепігісоп 30 шляхом аналізу Скетчарда. Радіомічене 288 при- (Атісоп). Загалом, 50-200мкл білку (10мг/мл) до- готували реакцією з 125| в присутності йодованих давали до фільтрувального елементу і додавали кульок. Після видалення вільного йоду радіоміче- 2мл біціновогое буферу. Фільтри центрифугували не антитіло інкубували в різних концентраціях, в при 4"С на БогмаІ! 55-34 роторі при 6,000об/хв. двох повторах, від 500Онг на лунку до З5нг/лунка з протягом 45хв. Об'єм, який зберігався, складав 10,000 58 клітинами. Кількість зв'язаного з кліти- приблизно 50-100мкл. Цей процес повторювали нами антитіла обчислювали з специфічної актив- двічі з тим же самим фільтром. Об'єм, який збері- ності 125|-міченого 288, Співвідношення зв'яза- гався, переносили в 1,5мл поліпропіленову пробір- не/вільне антитіло представляли як графік ку з гвинтовою кришечкою, перевіряли на білок, залежності від молярної концентрації зв'язаного розводили до 10,Омг/мл і зберігали при 4"С перед антитіла і уявну константу спорідненості визнача- використанням для кон'югації. Для деяких дослі- ли з співвідношення перетинів з Х і У осями. джень білок переносили в 50мМ цитрат натрію, рн 5. Приготування 288-МХ-ДТПК а. Джерело МХ- 5,5, який містив 150мМ Масі і 0,0595 азиду натрію, дтПк використовуючи протокол, описаний вище, г. Про-

Для деяких доклінічних досліджень мічена ву- токол кон'югації. глецем-14 1-ізотіоціанатобензил-3- Кон'югацію 288 з МХ-ДТПК виконували в полі- метилдіетилентриамінпентаоцтова кислота (МХ- пропіленових пробірках при кімнатній температурі.

ДТПК) була надана у вигляді сухої твердої речо- Заморожені вихідні розчини МХ-ДТПК були розмо- вини доктором Отто Гансов (ОЦо Сапзому) з Націо- рожені безпосередньо перед використанням. Ти- нального Інституту Здоров'я і зберігалась зневод- пово, 50-200мкл антитіла в концентрації 1Омг/мл неною при 4"С та захищеною від світла. Вихідні реагували з хелатом (комплексоном) при моляр- розчини хелату готували на воді, яку очищали ному співвідношенні хелат:білок 4:1, Реакції ініці-

МІ-О, ії концентрацію визначали, оцінюючи радіо- ювали додаванням вихідного розчину хелату і активність і використовуючи специфічну активність обережним перемішуванням; кон'югація продов- речовини. Вихідні розчини загалом мали концент- жувалась протягом ночі, загалом від 14 до 20 го- рацію 2-5мМ і зберігались при -707С в поліпропі- дин при кімнатній температурі. Хелат, який не ленових пробірках. Для інших досліджень МХ- прореагував, видаляли з кон'югату діалізом або

ДТПК отримували від СошГКег Іттипоїоду у вигляді багаторазовою ультрафільтрацією, як описано двохнатрієвої солі в воді і зберігали при -707С. вище, в вільний від металу нормальний сольовий б. Підтримування вільних від металу умов. розчин (0,990 вага/об'єм), який містив 0,0595 азиду

На додаток до використання реагентів, вільних натрію. Концентрацію білку доводили до 10мг/мл і від металу, всі маніпуляції з реагентами виконува- зберігали до радіомічення в поліпропіленовій про- ли таким чином, щоб звести до мінімуму можли- бірці при 4"С. вість забруднення металом. Коли це можливо, д. Визначення приєднання хелату. використовували поліпропіленові пластикові кон- Приєднання хелату визначали сцинтиляційним тейнери, такі як колби, стакани і мірні циліндри. лічильником і порівнянням величини, отриманої з

Перед використанням вони були промиті АїЇсопох і очищеним кон'югатом, з питомою активністю хела- ретельно промиті водою, яку очищали Мії-0О. На ту, міченого вуглецем-14. Для подальших дослі- додаток, для точної маніпуляції маленькими об'є- джень, в яких використовували нерадіоактивний мами використовували вільні від металу наконеч- хелат, отриманий від Сошнег Іттипоїоду, приєд- ники піпеток (Віокайд). Для маніпуляції більшими нання хелату оцінювали інкубуванням кон'югату з об'ємами реагентів використовували стерильні надлишком радіоактивного розчину-носія ЗУ відо- пластикові серологічні піпетки (наявні розміри від 1 мої концентрації і питомої активності. до 25мл). Реакції було зручно виконувати в поліп- Коротко, вихідний розчин хлориду ітрію відо- ропіленових пробірках для мікроцентрифуги з гви- мої концентрації готували в вільній від металу нтовою кришечкою (загавзіейді Іпаивігіе5; місткість 0,05М НОСІ, до якої додавали вільний від носія У 1,5мл) або в поліпропіленових конічних пробірках (хлориста сіль). Аліквоту цього розчину аналізува- (Совіаг; 15мл і 5О0мкл). При маніпулюванні пробір- ли рідинним сцинтиляційним лічильником для ви- ками для діалізу одягали одноразові хірургічні ру- значення точної питомої активності цього реаген- кавички, попередньо промиті водою, яку очищали ту. Об'єм реагенту хлориду ітрію рівний

МІї-О. трьохкратній кількості молів хелату, який буде в. Приготування антитіла. приєднаний до антитіла, типово 2моля/моль анти-

Мишаче анти-СО20 антитіло 288 спочатку тіла, додавали в поліпропіленову пробірку і рн очищали із асцитів Білком А і ОАЕ хроматогра- доводили до 4,0-4,5 2М ацетатом натрію. Після фією. Для подальших експериментів 288 очищали цього додавали кон'юговане антитіло і суміш інку- із супернатантів біореактору пустотілих волокон, бували 15-30хв. при кімнатній температурі. Реак- використовуючи схожий процес очищення. Тепер цію зупиняли додаванням 20мММ ЕОТА до кінцевої антитіла, отримані на пустотілих волокнах, заміне- концентрації 1мМ і рН розчину доводили до приб- ні з метою комерціалізації СНО-похідними антиті- лизно рН 6 2М ацетатом натрію. лами, яки описані в Прикладі 2, Після 5хв. інкубації весь об'єм очищали висо-

Для кон'югації антитіло готували переносом коефективною гель-хроматографією, як описано його в вільний від металу 50мМ бБісіпе-Мчаон, рн нижче. Елюйовані фракції, які містять білок, зби-

рали, визначали концентрацію білку і аліквоту оці- Імуногістологічні дослідження як з природни- нювали на радіоактивність. Приєднання хелату ми, так і з кон'югованими (288-МХ-ДТПК) антиті- обчислювали використовуючи питому активність лами виконувались ІМРАТН І арогаюгіе5, викорис- препарату хлориду Оу і концентрацію білку. товуючи розрізи тканин людини, фіксовані е. Імунореактивність 288-МХ-ДТПК. ацетоном. Антитіла очищали із супернатантів біо-

Імунореактивність кон'югованого 288 оцінюва- реактору пустотілих волокон хроматографією на ли, використовуючи суцільно-клітинний ЕГІЗА. ЗВ білку А ії 0 БЗерпагозе. Кон'югат клінічної якості клітини середини логарифмічного росту виділяли з готували, використовуючи МХ-ДТПК від Сошцег культури центрифугуванням і промивали двічі 1Х Іттипоїоду, відповідно до протоколу, описаного

НВО. Клітини були розбавлені в НВ5О5 до 1- вище. 2гх10бклітин/мл, розподілені в 96 лункові полісти- 3. Імунореактивність радіоміченого 288-МХ- рольні мікролітрові планшети в кількості 50,000- ДТПК Іп Міго. 100 00Оклітин/лунка. Планшети сушили в вакуумі 2 Для деяких експериментів використовували години при 40-45"7С для фіксації клітин на пласти- протокол суцільно-клітинного ЕГІЗА, використаний ку. Планшети зберігались сухими при -20"С до для неміченого 288-МХ-ДТПК. В пізніших експе- використання. Безпосередньо перед використан- риментах імунореактивність "по і з0У-мічених ням для аналізу планшети нагрівали до кімнатної кон'югатів (кожний готували в ІЕС температури, і після цього блокували 1Х РВ5, рн РПпагтасешісаіє або, оальтернативно, в МРІ 7,2-1 4, який містив 195 БСА (2 години). Зразки для РПпагтасу зЗегмісев5, Іпс.) визначали, використовую- аналізу розчиняли в їХ РВБЗ/195 БСА, поміщали на чи модифіковану версію суцільно-клітинного ана- планшети і серійно розчиняли (1:2) в такому ж бу- лізу зв'язування, описану Гіпіто (3). Коротко, зро- фері. Після інкубації протягом 1 години при кімна- стаючі концентрації антиген-позитивних ЗВ клітин тній температурі планшети промивали тричі в 1Х або антиген-негативних НЗВ клітин середини ло-

РВ5. Вторинне антитіло (цапиний анти-мишачий гарифмічного росту (20-3Ох109клітин/мл в буфері

ІдД21-специфічний НЕР кон'югат) (5Омкл) додавали розведення ІРВ5, рН 7,4, який містив 1956 БСА, до лунок (1:1500 розведення в 1Х РВЗ/1 95 БСА) і 0,190 желатину і 0,029 азиду натрію)| додавали до інкубували 1 годину при кімнатній температурі. подвійного набору пробірок. Радіомічений кон'югат

Планшети промивали чотири рази в 1Х РВ5З з на- розбавляли до кінцевої концентрації антитіла 1- ступним додаванням розчину субстрату АВТ 5Знг/мл буфером розведення і 0,35мл додавали до (50ММ цитрат натрію, рН 4,5, який містив 0,019 кожної пробірки. Після періоду інкубації 75-90хв.

АТВ5 і 0,00195 НгО»2). Планшети зчитували після при кімнатній температурі клітини осаджували 15-30хв. інкубації при довжині хвилі 405нм. Анти- центрифугуванням і супернатанти збирали. Радіо- ген-негативні НЗВ клітини включили в аналіз для активність, яка залишилась в фракції супернатан- контролю неспецифічного зв'язування. Імунореак- ту, визначали гамма- або сцинтиляційним лічиль- тивність кон'югату обчислювали побудовою графі- ником. Дані представляли на графіку як частку від ку величин поглинання проти відповідного фактору загальної доданої радіоактивності, поділеної на розведення і порівнянням цих величин з величи- радіоактивність, зв'язану клітинами, в залежності нами, отриманими, використовуючи природне ан- від оберненої кількості клітин на пробірку. Значен- титіло (яке репрезентує 10095 імунореактивність), ня у точці перетину з віссю У, таким чином, репре- яке тестували на тому ж планшеті. Порівнювали зентує величину імунореактивності. кілька величин на лінійній частині профілю титру- и. Іп Міо Стабільність радіоміченого 288-МХ- вання і визначали середню величину. ДТПК в сироватці людини. є. Стабільність природного 288 і 288-МХ- Стабільність іп міо "Чр- ії зоу-міченого 288-

МДТПК Іп Міто МХ-ДТПК оцінювали інкубацією в сироватці люди-

Для оцінки стабільності антитіла і кон'югату ни при 37"С протягом 96 годин. Кон'юговане анти- протягом 12 тижнів, аліквоти антитіла 288 і 288- тіло готували і мітили "п (протокол "тіха5поої")

МХ-ДТПК розчиняли або в нормальному сольово- або з0у, як описано вище. Питома активність 711|п- му розчині або в нормальному сольовому розчині, і зоу-міченого кон'югатів складала 2,5 і 14,6мКі/мг, який містив 10мММ гліцин-НСЇІ, рН 6,8. Подвійні на- відповідно; радіомічені кон'югати суспендували в бори зразків інкубували як при 4, так і при З0"С і буфері, який містив 75мг/мл людського сироватко- зразки оцінювали щотижня, використовуючи на- вого альбуміну (ЛСА) і їмМ ДТПК (ітрій-мічений ступні методи: 5БО5-РАСЕ (відновлюючі і невідно- кон'югат), або буфері, який містив 5Омг/мл ЛСА влюючі умови), імунореактивність методом суціль- (індій-мічений кон'югат). Радіомічені кон'югати ро- но-клітинного імуноферментного аналізу, збавляли 1:10 нормальною сироваткою людини використовуючи 5В (антиген-позитивні) або НОВ (не інактивованою теплом) і аліквоти поміщали в (антиген-негативні) клітини як захват, і ізоелект- стерильні пробірки с кришечками в асептичних рофокусування в гелі (рН діапазон, 3-10). На дода- умовах; після цього ці пробірки інкубували при ток, ефективність радіомічення кон'югату оцінюва- 37"С протягом періоду до 96 годин. В обрані пері- ли на 4, 8 і 12 тижні радіоміченням кон'югату У оди часу зразки кон'югатів видаляли і аналізували аналізуючи продукт методом 505-РАСЕ і аутора- методом невідновлюючого 5О5-РАСЕ в 4-20965 діографічним аналізом. Нарешті, в окремому дос- градієнтному гелі з наступною авторадіографією і лідженні, аліквоти 288-МХ-ДТПК, які інкубували миттєвою хроматографією в тонкому шарі. при 4? ї 30"С протягом 10 тижнів, мітили радіоізо- і. іп Міко стабільність 1111п-288-МХ-ДТПК кліні- топом "п і оцінювали в дослідженні біорозподі- чного складу. лення в ВАСВ/с мишах, як описано нижче. Кон'югат 288-МХ-ДТПК мітили радіоізотопом ж. Імуногістологічні дослідження. 1114 Її використовували без очищення методом

НРГС (протокол «тіха5поої»). Радіомічене антиті- мишачий дос! (Різпег Зсіепійс) розводили до ло розводили в РВ5 і додавали людський сирова- 2,0мкг на мл в 10мМ боратному буфері, рН 9,6, і тковий альбумін (ЛСА) до кінцевої концентрації 5Омкл додавали до кожної лунки 96б-лункового 5Омг/мл. Питома активність клінічного радіоміче- планшету. Антитіло залишали зв'язуватись з ного кон'югату складала 2 2мКі/мг. Клінічний кон'ю- планшетом протягом нічної інкубації при 4"С, або гат інкубували при 4"С протягом 48 годин і алікво- 2 годин при кімнатній температурі. Кожний план- ти аналізували в періоди часу 0, 24 і 48 годин, шет блокували ЗОхв. при кімнатній температурі використовуючи невідновлюючий ЗО5-РАСЕ в 4- 150мкл на лунку РВ5, який містив 195 БСА. План- 2095 градієнтному гелі з наступною авторадіогра- шети промивали дистильованою водою і зразки фією і миттєвою хроматографією в тонкому шарі. сироватки або плазми в трьох повторах розміщали

Імунореактивність в кожний відрізок часу оцінюва- в індивідуальних лунках в початковому розведенні ли, використовуючи аналіз суцільно-клітинної су- 1:100, з наступним послідовним розведенням 1:2. спензії, описаний в розділі 1 вище, ї. Іп Міо стабі- Очищений 288 додавали до неімунної сироватки і льність 0у-288-МХ-ДТПК клінічного складу. розводили для використання в якості стандартної

Кон'югат 288-МХ-ДТПК мітили радіоізотопом кривої починаючи з 0,5мг/мл; зразки розводили зоу | очищали хроматографією за виключенням по 1:100 і потім послідовно розводили як і інші зразки. розміру на НРІС, використовуючи 1Х РВ5 як бу- Планшети інкубували 1 годину при кімнатній тем- фер елюювання. Фракції радіоміченого кон'югату пературі і промивали 4 рази дистильованою во- збирали і додавали людський сироватковий аль- дою. Після цього додавали вторинний реагент бумін і ДТПК до кінцевих концентрацій 75мг/мл і (цапиний анти-мишачій ІДСІ-НКРО) в розведенні 1мМ, відповідно. Питома активність клінічного ра- 1:4000 ї інкубували при кімнатній температурі до- діоміченого кон'югату складала 14,бмКі/мг. Клініч- даткову годину. Планшети знову промивали дис- ний кон'югат інкубували при 4"С протягом 48 годин тильованою водою і додавали 0,їмл субстрату і аліквоти аналізували в періоди часу 0, 24 і 48 пероксидази, який містив перекис водню. Реакцію годин, використовуючи невідновлюючий 505- проводили 20хв для проявлення кольору; погли-

РАСЕ в 4-2095 градієнтному гелі з наступною ав- нання визначали на довжині хвилі 405нм, викорис- торадіографією і миттєвою хроматографією в тон- товуючи зчитувач ЕГІЗА для мікропланшетів. Ре- кому шарі. Імунореактивність в кожний відрізок зультати представляли в мкг антитіла на мл часу оцінювали, використовуючи аналіз суцільно- сироватки. клітинної суспензії, описаний в розділі 1 вище. На додаток, визначали величини В ї5 288 і 2. Дослідження на тваринах. 288-МХ-ДТПК у ВАГ В/с мишей. Некон'югований а. Дослідження фармакології/токсикології ве- 288, який зберігали при -70"С в 1їХ РВ5, рн ликих доз 288 на приматах. 7,А/1095 гліцерині, нагрівали, розводили до

Антитіло 288 оцінювали в дослідженні фарма- О,5мг/мл і фільтрували в стерильних умовах. Кон'- кології великих доз, яке виконувалось по правилам юговане антитіло готували за стандартними про-

СІ Р в М/пйе Запах Кезеагсп Сепіег (Номер Дослі- токолами, але з хелатом, міченим вуглецем (141; дження 920111). Були використані дорослі мавпи інкорпорування хелату становило 1,5моля на моль

Яванських макак; кожна досліджувана група скла- антитіла. Очищений кон'югат розводили до далась з одного самця і однієї самки. Антитіло О,5мг/мл в нормальному фізіологічному розчині, вводили внутрішньовенно кожні 48 годин, загалом фільтрували в стерильних умовах і до викорис- 7 ін'єкцій. Досліджували п'ять груп: Група І (сольо- тання зберігали з природним антитілом при 47с. вий розчин); Група І! (0,бмг/кг); Група ПІ (2,5мг/кг); Мишам, віком від 6 до 8 тижнів, робили ін'єкції

Група ІМ (1Омг/ку); і Група М (ІОмг/кг тільки в по 100мкл очищеного антитіла 288 в концентрації день 0). 250мкг/мл. Згодом у мишей брали кров ретро-

Перед началом дослідження була взята кров у очною пункцією в різні інтервали часу від 0 до 264 всіх 10 тварин і використана для визначення фона годин і їх сироватку аналізували на присутність реагентів і початкової популяції В-клітин. Всі на- природного і кон'югованого антитіла 288 суцільно- ступні зразки крові брались перед кожною ін'єкцією клітинним імуноферментним аналізом, використо- антитіла. Групи ПІ ї ІМ умертвили на 13 день для вуючи антиген-позитивну В-клітинну лінію ЗВ як повного розтину і гістопатології. захват. Отримані результати викреслювали як

У тварини в групах І, ІІ і М брали кров на 0, 1,3, концентрації 288 або 288-МХ-ДТПК проти часу; з 7, 13, 21, 37 і 52 дні; приблизно 5мл цілісної крові цих результатів отримували графік лінійної регре- було взято в гепаринізовану пробірку. Цілісну кров сії і нахил використовували для визначення вели- тримали при 4"С і аналізували протягом 24 годин. чин В їх.

Кров кожної тварини центрифугували 5хв. при в. Дослідження Фармакології/токсикології (891- 2000о06./хв. і супернатантна плазма видалялась Уу-288-МХ-ДТПК у Яванського макака. для аналізу рівнів 288 в сироватці методом КІА 288-МХ-ДТПК, яке несе Ігрій-І(89|, готували, (Див. процедуру КІА для методів специфічного використовуючи протокол, описаний для введення аналізу). Концентрований матеріал, який містив зоу, виключаючи те, що не використовували НРІ С

РВІ 5 та КВС5, повторно суспендували в ЕС5 для очистку. Нерадіоактивний кон'югат, який ніс метал,

ЕАСЗ аналізу. приготували в 1Х РВ5, який містив 75мг/мл ЛСА і б. Дослідження фармакокінетики 288 і 288- 1мМ ДТПК і оцінювали в досліджені СІ Р. номер

МХх-ДтТПК. 920611 в Уу/пйе бапа5х Кезеагсп Сепіег. Одного

Середню величину бета-напіврозпаду 288 у самця і одну самку мавпи включили в кожну з чо- сироватці Яванських макак визначали, використо- тирьох груп. Тваринам робили ін'єкції внутрішньо- вуючи тварин Групи М (Див. вище). Цапиний анти- венно кожні 48 годин, загалом 7 ін'єкцій, з наступ-

ними кількостями препарату: група І (фізіологічний та їх органи і тканини аналізували, як описано ви- розчин); група І! (0,00Змг/кг); група ІП! (0,0Змг/кг); і ще. Радіоактивність, зв'язану з кожним зразком група ІМ (0,Змг/кг). Стан тварин протягом дослі- тканини, визначали вимірюванням енергії гальмів- дження оцінювали, визначаючи вагу і температуру ного випромінювання гамма-сцинтиляційним лічи- тіла, споживання води і їжі, виділення, хімію сиро- льником. Величини активності виражали як відсо- ваток, гематологію, аналіз сечі і фізичні кондиції. У ток введеної дози на грам тканини або відсоток тварин в групах з І по ІМ брали кров перед ін'єкці- введеної дози на орган. В той час, як органи і тка- єю на 0, 2, 7, 10 і 14 дні, і кров аналізували на рівні нини були багатократно промиті для видалення циркулюючих В-клітин ЕАС5 аналізом. зовнішньої крові, перфузію органів не робили. Та- г. Біорозподілення радіоміченого 288-МХ- ким чином, величини активності органів не врахо- дтПк. вують вклад активності, яку репрезентує внутріш-

В попередньому дослідженні оцінювали 7111п- ньо асоційована кров, д. Пухлинна локалізація мічений 288-МХ-ДТПК на біорозподілення в тка- 11Іп-міченого 288-МХ-ДТПК. нинах ВАСВ/сС мишей віком від шести до восьми Локалізацію радіоміченого 288-МХ-ДТПК ви- тижнів. Радіомічений кон'югат готували, викорис- значали на бестимусних мишах, які несуть В- товуючи 288-МХ-ДТПК клінічної якості за протоко- клітинні пухлини Катов5. Бестимусні миші віком від лом «тіхб5поої», який описаний вище. Питома шести до восьми тижнів отримували підшкірно активність кон'югату становила 2,ЗмкКі/мг і кон'югат ін'єкцію (лівий задній бік) О0,їмл КРМІ-1640, яка розчинили в РВ5, рН 7,4, який містив 5Омг/мл містила 1,2х107 клітин пухлини Ратозв, які були

ЛСА. Мишам робили ін'єкції внутрішньовенно попередньо адаптовані для росту у бестимусних 100мл ""п-міченого 288-МХ-ДТПК (приблизно мишей. Пухлини росли два тижні і мали вагу від 21мКі) і групи з трьох мишей вбивали способом 0,07 до 1,1 грамів. Миші отримували ін'єкцію внут- цервікальноїх дислокації через 0, 24, 48, і 72 годи- рішньовенно 100мкл ""Іп-міченого 288-МХ-ДТПК ни. Після смерті хвіст, серце, легені, печінку, нир- (16, 7мкКі) і групи з трьох мишей умертвили спосо- ки, селезінку, м'язи і стегно видаляли, промивали, бом церві кальної дислокації через 0, 24, 48, і 72 зважували; також брали для аналізу зразок крові. години. Після смерті хвіст, серце, легені, печінку,

Радіоактивність, зв'язану з кожним зразком, визна- нирки, селезінку, м'язи і стегно видаляли, проми- чали гамма-лічильником і визначали відсоток вве- вали, зважували; також брали для аналізу зразок деної дози на грам тканин. Не робили спроб вра- крові. Радіоактивність, зв'язану з кожним зразком, хувати вклад активності, яку представляла кров, визначали гамма-лічильником і визначали відсоток асоційована з індивідуальними органами. введеної дози на грам тканин.

В окремому протоколі аліквоти 288-МХ-ДТПК, 3. Дозиметричні обчислення. які інкубували при 4" ії 30"С 10 тижнів, мітили ра- Використовуючи дані біорозподілення, одер- діоактивним ізотопом "п до питомої активності жані з використанням ВА! В/с мишей, які отримали 2,1мКі/мг для обох препаратів. Потім ці кон'югати ін'єкцію або /Л|Іп або З0у-мічених 288-МХ-ДТПК використовували в дослідженні біорозподілення у (Таблиці 1-4 і 5-8), оцінки дози радіації, абсорбо- мишей, як описано вище. ваної з дози в 1,0мКі, введеної пацієнту вагою

Для дозиметричних досліджень 288-МХ-ДТПК 7Оокг, були обчислені, використовуючи підхід, фор- мітили радіоактивним ізотопом "п до питомої малізований Медичним комітетом по внутрішнім активності 2,3мКі/мг і приблизно 1,1мкКі вводили дозам опромінення Товариства Ядерної Медицини кожній з 20 ВАГ В/с мишей. Потім членів груп, кож- (Меадіса! Іпіегпа! Надіайоп Розе (МІВО) Соттінеє на з п'яти мишей, вбивали через 1, 24, 48 і 72 го- ої Ше Босієїу ої Мисієеаг Медісіпе). Біологічний пе- дини і їх органи видаляли та готували для аналізу. ріод напіврозпаду радіомічених кон'югатів визна-

На додаток, частини шкіри, м'язів і кісток були ви- чали з величин введених доз на орган, визначених далені і оброблені для аналізу; сечу і фекалії та- з даних біорозподілення для кожного радіоімуно- кож збирали і аналізували в точках часу 24-72 го- кон'югата. Для деяких тканин, наприклад, крові, дини. припускали, що біологічний розклад радіокон'юга-

Використовуючи схожий підхід, 288-МХ-ДТПК ту відповідає моделі двох комірок з експонентним також мітили радіоактивним ізотопом ЗУ і його розкладом з цих комірок. Для інших тканин, напри- біологічне розподілення оцінювали у ВАГ! В/с ми- клад, печінки, чиї рівні активності залишались шей через період часу 72 години. Після очистки майже незмінними протягом 72 годин дослідження

НРГІС хроматографією за виключенням по розміру, біорозподілення, припускали, що біологічний пері- чотири групи по п'ять мишей отримали внутріш- од напіврозпаду був дуже великим і йому встано- ньовенно ін'єкції приблизно 1мкКі кон'югату клініч- вили значення 1000 годин. ної рецептури (питома активність: 12,2мКі/мг); члени групи були вбиті через 1, 24, 48 і 72 години

Таблиця 1

Розподіл активності через 1,0 годину після В. В. введення 11111-288-МХ-ДТПК у нормальних ВА! В/с мишей.

Середнє значення 5 СВ 1,47:017 40,325,32 ВАЗИ 0,0870,01 5,8820,76 0,5120,05 0,14950,01 14,251,4 2,1020,17

Нирка (1) 0,12720,02 9,8220,86 1,222012 1,06:20,20 10,3221,58 10,76541,93 0,09050,01 6,94421,17 0,6120,03 8,3920,98 0,70-0,25 5,6741,35 3,1520,35 2,9720,71 9,1021,09 3,15ж0,35 0,9620,29 3,051,12 2,5850,31 6,10ж22,00 7,8021,80 бечаї/ НН

Фекали С! 1111 Разом/.7/7/:З | 99,044,8

Кількість мишей : 5

Середня вага - 20,9752,46грам

Таблиця 2

Розподіл активності через 24 години після В. В. введення 1ИИ111-288-МХ-ДТПК у нормальних ВАЇ-В/с мишей.

Середнє значення 5 СВ 1,4750,07 21,9741,87 32,2231,35 0,128:50,03 4,0220,23 0,38:20,01

Легені (2) 0,15220,02 7,9021,61 1,202018

Нирка (1) 0,12820,01 5,9420,40 0,76-0,04 111-010 10,0821,83 11,2052,23 0,08250,01 5,0420,75 0,4020,02 8,41:20,38 1,2420,05 10,44-0,76 3,1530,14 2,0250,33 6,31-20,81 3,15:20,14 3,7520,39 11,7741,09 2,9150,27 4,5020,52 6,65:20,56 бечаї///////ЇС1Г111г111овЙ

Фекалли ЇЙ 11111111 Разом//7/7/: | 87.10371,68

Кількість мишей : 5

Середня вага - 21,0320,94грам

Таблиця З

Розподіл активності через 48 години після В. В. введення 1ИИ111-288-МХ-ДТПКу нормальних ВАГ В/с мишей. Середнє значення їх СВ 1,4520 13 22,4153,95 31,9022,89 0,09050,01 4,05:20,94 0,36:20,06

Легені (2) 0,15520,02 8,4520,53 1,3120,19 0,125:0,01 6,1621,15 0,7620,07 1,04020,11 9,412,33 9,8423,18 0,08220,01 5,3250,71 0,4850,11

Продовження таблиці З 8,2650,77 1,4220,58 11,6244,67 3,1020,29 2,0820,16 6,4110,44 3,1040,29 3,4320,59 10,5421,69 2,96:0,20 5,05:20,63 7,4620,60 бечаї///////С/ Їж

Фекалли/////Ї7С1Г1111ГвниЙЙ 11111111 Разом//7/7/: | 88,4926,87

Кількість мишей : 5

Середня вага - 20,65:21,9Зграм

Таблиця 4

Розподіл активності через 72 години після В. В. введення "ИИ111-288-МХ-ДТПКу нормальних ВА! В/с мишей.

Середнє значення 5 СВ 1,52520,06 18,9721,31 28,5142,03 0,0940,01 3,7150,31 0,35:20,04

Легені (2) 0,16150,01 7,6020,30 1,18:20,09

Нирка (1) 0,13520,01 5,5520,53 0,76-0,09 1,1120,11 9,9041,77 11,00522,03 0,095:50,01 5,1220,75 0,48:20,04 8,5850,34 1,0440,09 8,95-0,68 3,2250,12 1,7320,34 6,0450,51 3,2250,12 3,1620,60 10,19542,03 2,1940,19 4,5320,83 6,3711,38 бечаї//////С/ ЇЙ

Фекалі/////Ї! СС 11,50 1111 Разом/.7/7/:З | 87,8054,79

Кількість мишей : 5

Середня вага - 21,46:20,84грам

Таблиця 5

Розподіл активності через 1,0 години після В. В. введення 9у-288-МХ-ДТПК у нормальних ВАЇ В/с мишей.

Середнє значення зх СВ 1,27:0,06 39,2322,45 49,7721,72 0,086:50,01 5,80-0,84 0,5020,09

Легені (2) 0,13720,01 12,11541,08 1,6620,17 0,12050,01 10,2321,30 1,15:40,12 0,92150,05 12,1221,72 11,1741,66 0,08020,01 9,2720,46 0,74-40,07 7,2150,32 0,7850,13 5,7231,05 2,71350,12 4,35:20,39 11,89541,47 2,13:0,12 2,1220,78 5,8222,24 2,22:10,06 3,5241,12 4,22:50,84 бечаї/////Г!Т

Фекали 17111111 1111 Разом/.7/7/:З | 94,8543,47

Кількість мишей : 5

Середня вага - 18,17520,81грам

Таблиця 6

Розподіл активності через 24 години після В. В. введення 0у-288-МХ-ДТПК у нормальних ВА! В/с мишей.

Середнє значення 5 СВ 1,51720,090 8,3522,547 12,8354,60 0,09220,005 2,8320,142 0,240-0,006 0,1410,005 4,5620,393 0,644-40,047

Нирка (1) 0,138:20,007 5,6330,222 0,77920,040 0,438-0,098 5,2220,335 2,25920,399 0,081-0,003 4,2350,180 0,345-0,011 8,66850,514 0,97620,164 8,5541,945 3,246-40,186 1,32620,102 4,28950,154

Кількість мишей - З

Середня вага - 21,6715341,11грам

Таблиця 7

Розподіл активності через 48 годин після В. В. введення 9у-288-МХ-ДТПК у нормальних ВАГ В/с мишей.

Середнє значення 5 СВ 1,33:20,06 17,3442,0 23,0341,95 0,088:50,01 3,5620,31 0,3120,04

Легені (2) 0,13920,01 7,5420,88 1,05:20,15

Нирка (1) 0,12220,01 6,5340,42 0,7950,01 0,96850,04 9,0541,70 8,9241,57 0,0870,01 6,5221,13 0,5720,07 7,26:20,36 1,05:20,18 8,0121,17 2,86:20,14 3,3420,42 9,5341,08 2,86:0,14 4,1320,76 11,75341,82 2:84-0,19 2,71420,34 3,8020,30 бечаї////// ЇЙ

Фекали ОЇ 77777717 11111111 Разом//7/7/: | 19,7223,23

Кількість мишей : 5

Середня вага - 19,0720,91грам

Таблиця 8

Розподіл активності через 72 години після В. В. введення уУ-288-МХ-ДТПК у нормальних ВА! В/с мишей.

Середнє значення 5 СВ 1,35:20,02 15,4021,63 20,7142,13 0,08850,01 3,12520,24 0,28:50,01

Легені (2) 0,14220,01 8,2321,05 1,1720,20

Нирка (1) 0,12320,01 6,4540,57 0,79540,07 0,02:20,06 8,3941,04 8,5821,31 0,10350,01 5,9041,19 0,5920,08 7,6850,11 1,0150,15 7,7341,05 2,88:20,05 3,2050,25 9,2020,61 2,88:20,05 3,97-0,49 11,4231,36 2,86:0,18 2,9020,65 4,06:0,93 бечаї//////// ЇЇ -1111111117111111111з00

Фекалі.////Ї77777777711171-11111Г 11,08 1111 Разом/.7/7/:З | 78,6252,63

Кількість мишей - 5

Середня вага - 19,21250,27грам

Схожим способом призначали або обчислю- таблиць (вихідні змінні). Ці величини, а також ті, вали інші величини біологічних періодів напівроз- що наведені в наступних таблицях, обчислювали, паду, використовуючи стандартні рівняння для використовуючи програму, написану в електрон- обчислення ій для експонентного розпаду. Коли ній таблиці Бутрпопу 5ргеадзпееї (І ош5 ці величини були визначені, змінні Тие, Те, Тег, Ач, Оемеіюртепі Согр.) Мг. РАйЇр Надап, М5, Мисієаг

А», і А, перелічені в Таблицях 9 і 10, визначали Меадісіпе бегуісе, МА Медіса! Сепіег, Га доПа, СА для кожного радіоміченого кон'югату, використо- 92161. вуючи рівняння, наведені в верхній частині цих

Таблиця З

Вхідні змінні Вихідні змінні

ДО х Введена доза Те х Ефективний напівперіод поглинання 0 Теї: Ефективний напівперіод зникчення першого компоненту

Тв: Фізичний період напіврозпаду радіснукліду Те? х Ефективний напівперіод зниквення другого компоненту

Ти 2 Біологічний напівнеріод поглинання А х Кумульована активність першого компоненту

ТВ з Біологічний напівгеріод зникнення першого компоненту Да Кумульована активність другого компоненту тва х Біологічний напівперіод зникнення друкого хомпоненту А - Загальна ' кумульована активність 7 хх Частина Аб з біологічним напівперіодом ТБ Твех Ти ТрАДтТи Тв) АТ АНА Та т (Туе/то) 2 я Частина ДО з біологічним напівперіодом ТЬ2 Тете ТЬТр АТ ж Тр) Аг Аа АОТе?

З х Середня ДозаЮдиницю Кумульовакої Активності Тед» ТБ2 Тр ДТ ж ТруА- ді КА?

Приклад: Ай для лечінки - 14 1100096 1600632 100 - 100075 мікрокюрі кумульованої активності

Таблиця вхідних та вихідних величин, які використані для оцінки кумульованої активності (АХ тв и 2 тв Тв2 Тиг Теї Те? А да А (годин) Фу (У) ук) (уко) (Укна

Надниркова запоза 2,78Е-04 боро О0бро5 000 о 2,78Е-04 532 00 по по о

Вміст міхура 2.78Е- 04 100095 00095 4 0 2.78Е-04 3,8 00 00544 00 Ба

Вміст шлунну 2,78Е-Щ04 бБ5Б5ОМ 00096 1,5 о 2,78БЕ-04 1,5 00 4405 00 141

Вміст тонкого 2.78Е-ОЯ б,5О5 0035 35 о 82.78БЕ-04 3,5 00 зіва 00 З19 кишечнику

Вміст ВТЄ 2,78Е-04 бо оО0095 45 0 279-004 42 бо 4040 00 4304

Вміст НТК 2788-04 665095 0005 0 2.78Е-04 40 00 зва 00 375

Нирки 2578-04 12205 00095 35 о 2718Е-04 230 0 48 бо 305

Печінка 27804 1100095 00095 00 о 2,804 ба 00 100075 0,0 т1обо8

Легені 2,18ВЕ-О4 гло гою 30 то00 2.78Е04 208 632 6279 091,7 1720

Інші тканиніРазом) 278504 00005

ЗВІК- Верхня частиналовстого ишечнику. НІК Нижня частинасловстого кишечнику.їдД 00000010 ти и ї2. Тр ть Те Теї Те2 А! Аг А (годин) (гі т) (гд (б) УК (УК) (укіто

Мгязи 2789-04 040095 00095 000 2,78Е-04 532 00 84617 00 баб

Жирова тканина 28-04 ОО ро моб о 2,78Е-04 532 00 00 00 0

Кров 2.78Б-0О4 БВАООЗВ 352295 15 Т000 2,78Е- 04 12,3 5359 10319,2 293131 39632

Мозок 2578-04 боро 000 000 о 2.78Е-04 532 00 00 ІеКеЇ 9)

Серце 2.28Б-04 0 Б5іОб5 бав'я 57 Т000 2758-04 30,5 832 926,8 3457 573

Яєчники 2,78Е-04 пО0О95 об 1000 0 2,18Е-04 832 0 00 0,0 й

Підшлункова залоза 2,78Е-04 000095 00095 1000 9 218ЕЯ 632 00 00 90 в;

Кістяк (Разом) 2.18Б-04 ОО трубчаста кістка 2.18Е-04 00095 00096 1000 0 2,18Е-04 832 0000 оо о

Зрілакістковасканина 2,78БЕ-04А 8510095 63095 45 Т000 2,786Е-04 270 632 55388 57316 9568

Кістковий мозок 27804 бО0О5 000956 1000 о г,.78Е-04 632 00 00 бо о (Червоний!

Кістковий мозок2,78Е-04 опо оо ОО о 2,78Е-04 632 00 00 бо о (Жовтий)

Хрящі 2,704 00095 оо 3000 о 2.78Е-04 6532 00 00 до о

Інші складові 2,78Е-О4 000096 0095 7000 0 28-04 53525 00 по 00 8)

Шкіра 2,78Е-ЙйА 11,770и 00095 1000 0 2,78Е-04 8532 00 10708 00 юто8 бСепезінка 2 8Е-0ЯА ОБ Ю5 ОА 35 1000 2,78Е-04 24,7 638 217,1 358,95 581

Яєчка 2,79Е-04 000095 00056 7000 50 27804 532 00 по бо 0

Щитовидна запоза 2785-04 ОО 00096 1000 0 2 78Е- 04 832 00 00 00 9)

Тіпо разом 2 18Е-ї04 00055 00095 00

Табпиця 10

Вхідні змінні. Вихідні змівні до х Введена доза Ге х Ефективний напівлеріод поглинання о Теї х Ефективний напівнеріод зникнення першого компоненту

Тр: Фізичний період наліврозпаду радіонукліду Тед х Ефективний напівперіод зникнення другого компоненту

Ти: Біблогічний напівперіод поглинання АТ х Кумульована активність першого компоненту т61 х Бюдлогічний напівперіюд зникнення першого компоненту да х Кумульована активність другого хомпоненту тво « Біологічний напівперіод зникнення другого компоненту А х Загальна кумульована активність сх Частина ДО з біологічним напівперіодом Тр Тче з Ти ТрДти тру АЗК АОС Те Тв т2 х Частина ДО з біологічним нагівперіодом 152 Тет- ТБ" ТрАТЬї ктТрудо-1 ст тАСТТе?г « Середня Дозайодиницю Кумульованої Активності Те? т Тра є Тр ДТ? тру А- А Аг

Приклад: АТ дпя печінки - 1,44 5 9,00075 3000 60, 1,00 хх 7 795,5 мікрокюрі кумульованої активності

Таблиця вхідних та-вихідних величин, які використані для оцінки кумульованої активності (А) ти ЕІ ї2 ТВ1 0то2 пе Теї Тег А да А (годин) (г) ВШ) (г (у (ук) (УКГ) (УКГ

Надвиркова залоза 2.78Е-04А 000005 Ор. 00 о 2,78Е-04 02 00 00 0, о

Вміст міхура: 7,78БЕ-04 00095 0009 А о 2578-04 3,8 оо 5 оо ЗА

Вміст шлунку 218 0А 42095 00096 1,5 ЕВ) 2,78Е-04 15 по 881 по 85

Вміст тонкого 2578-04 48209 00095 3,5 0 2,.782Е-04 3,3 00 2057 00 202 кишечнику міст ВТК" 2,78Е-04 492095 000 45 о 2,78Е-04 42 00 255500 м

Вміст НИК" 7,75Е-04 422095 00095 А 0 2,78Е-04 3,9 оо 2355 Фо 240

Нирки 2.7а-0Я 115095 0879 70 Т000 2,78Е-04 334 602 556 753,6 3307

Печінка 2,78Е-04 50009 00055 1000 о 2, 18Е04 502 00 77955 00 7795

Легені 278504 ЗЛО 1209 30 7000 2,78Е-04 208 532 8279 01091,7 1720

Інші тканин(Разом) 2.78Е-04А 00005 "ВТК -- Верхня частина товстого кишечнику. "НТК -- Нижня частина товстого кишечнику т ти и 2 ті Тв2 Тве Те! Те» лі Аз А (гедин) (т) (гг) (укіс) (укіс) (УКег)

Мгязи 2.78Е-04 872095 соб 00 о 8-04 502 00 75528 00 7БаЗ

Жирова тканина 278Б-04 00095 000 000 0 2.78Е-04 602 00 00 оо 0

Кров 285Е-А 4977095 25,0 13 1000 2,78Е-0Ж 108 602 7743,95 82435,7 30178

Мозок 2.ТВЕ-04 п,00095 соб обо а 2.78БЕ-904 602 00 00 0 0

Серце 2.78Е-04 050095 03695 51 1000 27804 284 802 2044 3118 516

Яєчники 2,78Е-04 п0036 0,0095 00 о 27804 602 00 00 оо (8)

Підшлункова залоза 2,78Е-04 боб боб 000 о 278Е 04 8502 00 00 00 в

Кістяк (Разом) 2,786-04 0.000565

Трубчаста кістка тТ,78Е-04 0000956 00095 00 0 278-204 602 00 60 оо 0

Зріла кісткова тканина 2,78Е-04 11,89095 9,2895 57 1000 8,78Е-0й4 32,7 602 58044 8ОЗВО 13842

Кістковий мозок 2,78Е-04 оо 0096 1000 о 2.18Е-04 602 00 ДЦ Цо00 бо о (Червоний)

Кістковий мозок 2,78Е-04 ооО0б5 ОО 000 0 2,78Е-04 602 090 00 0,0 о (Жовтий)

Хрящі 2.78Е-04 оо пор 00 2,75Е- 04 602 00 бо 00 0

Інші складові 2.73Е-04 попозв бор 00 о 2 78-04 6502 00 00 00 ЕЙ)

Шкіра 2.78Е-04 Т560095 0,0096 1000 0 2.18Е-04 602 060 13512190 13512

Сепезінка 2,78Е04 О,74036 0,565 ба 1000 87804 310 602 3300 48571 815 лечка 2,1 8Е-0А обо ФО 00 о 2718-04 502 0000 0,0 ЕВ)

Щитовидна залоза 2,78Е-04 ооо 00095 000 о 28-04 502 00 00 00 В) тло разом 2578-04 ооо 0095 1000 2,78Е-04 60,95 00 00 бо о

Використовуючи значення Загальної Куму- обчисленнях величин оцінки доз радіації, які ха- льованої Активності (А) з Таблиць 9 і 10, значен- рактеризували ітрій-мічений кон'югат (Таблиця ня 5, які надані МІЕО Ратрпіеї Митрбег 11 (Таб- 20), для перелічених тканин (наприклад, наднир- лиці 11 ї 12, 13 і 14), оцінки адсорбованої дози кова залоза) відсутні деякі величини. Це відбува- радіації визначали для кожного радіоміченого лось через коротшу довжину пробігу вивільненої кон'югату для перелічених тканин (Таблиці 15, 16, частинки 13, по відношенню до довжини пробігу 17 ї 18). В визначеннях оцінок сумарної дози ра- емітованої д частинки, і тому забезпечується не- діації для індій-міченого кон'югату, перелічених в значний вклад активності від прилягаючих тка-

Таблиці 19, дозу даного органу підсумовували з нин, і через відсутність первинних даних біороз- адсорбованою дозою, яка генерована активністю поділення для цих тканин. в прилягаючих органах або тканинах. Однак в

Таблиця 1

С. адсеорбована доза на одиницю кумульованої активності, (КАФЛІСЇУНІ івдій-41131 період напіврозпаду 57,44 тодин.

ПТ рани джерела.їД 01001011

Органи-цілі Надниркова Вміст Кишковий Тракт Нирки Печінка Легені івші залоза міхура Тканими (М'язи)

Шпунок Зі вк НК птн ОВМЄТ ВМІСТ ВМС 08000

Надниркова запоза 74-03 57-07 7,306 44-08 9,8Б-0О86 153-906 34:05 35-05 766-065 4,8Б-0б

Стінка міхуру 36-07 4А5Б-04 75Б-07 8006-06 54-06 2006-05 93-07 52-07 15-07 ББЕ-Ов

Кістки ЗІБ ОВ 0 23Б-Об 2,3Б-05 32-05 2,905 4,2Е-08 37-06 259-065 ЗВЕчОб 32-06

СІїСтінкашлунку) 8,8Е-О6 0 8,5Б-07 34-04 45-05 Т2Б-О5 546-068 БОБ-0О5 58Б-085 5,7Е-06 436-065 сі(5) 22-06 88Е-0О6 79-05 21-04 54Б-0О5 306-005 86-06 50-06 6,107 48-08

Сг(Стінка ВТК) 2,9Б-06 69-06 01-05 8,3Е-05 53,3Е-04 14-05 8БЕ-ОЄ 7,5Е-0О6 74-07 50-08 сі(Слінка НТК 71-07 0 2,2Б-05 38Б-06 24-05 8.5БЕОб АСЕ-04 256-065 7,3Б.07 3,0Е-07 52Е-06

Органи-джерела

Органи-ціпі Надниркова Вміст Кишковий Тракт Нирки Печінка Легені інші зхнюза міхура Тканини (М'язи)

Шлунок 80000 ВККС

Вміст Вміст Вміст Вміст

Нирки ЗЕ ДБ 8Б5Б-0? 1-05 БО 836-085 285506 52-04 3,2Е-05 9,700 44-06

Печінка 1,5Е-05 83-07 59-06 56-06 7,8Б-08 84Б-07 42-05 1,304 77-06 34-06

Легені 78Б-ОБ 82Б-0О6 596-065 7,56-07 83-07 26607 2,508 78-06 Тая 426

Кістковий мозок 94-06 53-06 4,0Б-06 1,1Е-05 8,1Е-06 1,3Б-05 90-06 41Е-06 А8Е-0О6 53-06 (Червоний)

Ін. Тк. (М'язи) 28Е-О6 5,5Е-0О6 4,3Е-06 4,8Е-06 45-06 52Б-06 «44-06 ЗАБЕ-ОВ 4АБ ОВ 75606

Яєчники 18Е-06 2,3Е-05 13-06 33-05 37-05 64Б- 05 36Б-О68 46-06 36-07 6,3Е-06

Підшлункова 28-05 86-07 57Е-0О5 81-05 7,18Е-06 5,іБ-0О8 206-085 32Б-05 7,706 57-06 запоза

Шкіра 3,86 5765-06 14Б-Об 44-06 4-06 еБ-Об 18-06 66-06 18-06 25Б-06

Селезінка 20-05 7,807 З 1Е-О5 «4ББОБ 42606 24-06 28Е-05 2,8Е-О6 7-06 «4,5Б-05

Яєечка 1407 14-05 49Е-07 1,05-06 98687 59-06 34-07 2,507 398 8-06

Щитовидна 4,7Е-07 19-08 35-07 69Б-08 75-08 2,76-08 20-07 6,207 2,6Е-06 «35-06 залоза па а а

Органи-джерела

Органи-цілі Надвниркова Вміст Кишковий Тракт Нирки Печінка Легені ння залоза міхура Тканини (М'язи)

Шлунок 951 вк нтк к НИ Й Вміст Вміст Вміст Вміст Шо

Матка(МОоМмОвМО) 586-065 4ЖОБЕ-0О5 284БЕ-06 2,905 7,5Б-05 21205 З1БЕ-0О8 12-05 2986-07 74-06

Тло разом бББЕ-0О6 ОО БОЕ-О6Б б, 16-06 7,3Е-06 б8Е-0О6 8,56-06б 6606 686-068 5ОБ-ОБ 56-06

Посилання - МІБО РАМРНІ ЕТ МО. 11, 0. 164

Таблица 12 б. адсорбована доза на одиницю кумульованої активності, (КАРЛІСІ-Н)

Індій НИ період напіврозпаду 7,44 годин.

ПЛ браниджерела,їД 00000

Фргзниців о Яєчнини Підшлує 3330333 Мевко 33333 Шкирв белезн Яєчка Шиюви пло кова ч:юстк. Зріпа ТтТрубчас. ка дна Разом залоза Мозок о кістк. кістка залоза ши 200 й виш 5: тканина Й Й нн

Надниркова залоза 1,185-06 2,6Е-05 7,906 З3ОБ-085 36-08 28-08 20-05 АБО? АЛТЕЯ? т,ОБ-ОВ стінка міхура 21-05 4-0 8-06 5-06 7156-08 766-088 47-07 1,5Б-05 32-08 5,96-08

Кістки 38Е-06 36Б-0О8 52-05 30-05 265-005 2,38-00 5.9Б-0ОБ 24-05 2,8Е-06 6,5Б-06

С (Стінкашлунку) 24-06 5ОБ-О5 32-06 7-08 ТЛЕб БИБ-О6 305-055 БЕ 15-07 ЛЕВ 515) ЗВЕ-05 5Б5Е-ОБ 79-06 2,3Е-О6 23-06 15-06 4,2Б-0О8 12-06 42-08 7 55-06

ОріСтінка ВТК) 3,705 ВбБЕОЄ баБ-ОбБ 2,206 22-06 14БЕ-0О6 З8ВБ-08 1512-08 33-08 70Б-06

СііСтінка НТХУ 458Б-0О5 4576-06 9,0Б-06 3265-06 3206 15Б-0О6 9Б-0б 8ЗБЕ-ОБ 2,2Б-08 57-06

Нирки 29-05 19-05 68-06 2,706 27-06 2065-06 28-05 1,7Б-07 1,2Б-07 68-08

Печінка 17606 53-05 2,906 20-06 20-06 107БОВ 306-085 42-07 3.5Б-й7 6Б5БЕ-ОВ

Пегені 22-07 УБЕО6 З37БЕ-06 30-06 306-065 196-006 6,9Е-06 34Е-08 5,9Е-0О6 59Е-О6

Кістковий мозок 3БЕ-05 БЗБ ОВ 7,505 3Б-05 26Б-іЙ45 тв 44 16-06 296-066 77-06 (Червоний)

Ін. ТК. (М'язи) 6.ЗЕ-06 5,7Е-06 3,8Б-06 32Е-06 3,2БЕ-06 2,8Е-0О6 4,6Е-06 3656-05 4,3Е-06 5,6Е-О6

Органи-джерела т

Органи-цілі Яєчники Підшлун. 00 Юстяко 00 Шкра Селезін Яєчка ШЩитови Тіло кова УЧ, Кістк. Зріла Трубчас. ка дна Разом

Запоза Мозок -кістк. кістка залоза пишна и ни а і СИ І В В І В

Яєчники 1506-02 105506 77-06 22606 с еБ-Об 14-06 175-065 00600 2,56-08 70-06

Підшлункова залоза 15-05 1,5БЕ-035 49-06 31606 3,106 15-06 аБ-О5 2.1Б-07 З,ОБ-07 7,8Е-06

Шкіра 1АЕ-О6 43Б-Об 206-065 2,306 236-055 37-05 ЗЕ ОО 45-09 2,55-06 З/7ЕЛВ

Селезінка 16Е-06 б2Б-05 2;7Б-О6 20-06 906-065 1,7Е-О6 95,1Б-04 89-08 35-07 6.8Б-О6

Яечка О0БЕО0 21-07 106-038 3096-06 19Б-0О6 ЗАЕ-ОБ 20-07 36-03 33-09 4,5Б-06

Щитовидна залоза 2,5Б-0О8 45БЕ-07 22-08 2,8Е-йб6 28-06 2,46-06 34-07 З3БЕ-09 58-03 5206

Матка (МОМОКУСІ 55-05 1Е-Об 8 7БОВ 8-06 38-06 1026-08 12-06 ООБО0 2546-08 7,8Е-06

Тіло разом 7.ТЕ-О6 75Е-О6 64-06 59-05 59-06 38-05 бОБЕ-О6 85,6Б-06 БЗБ-0О6 5,8Е-О8

Посипавння - МІКО РАМРНЬЕТ МО. 11,6. 185

Таблиця 13 б. адсорбована доза на одиницю кумульованої активності, (КАБІН)

Іерій-1901 період напіврозпаду 64 годин.

ПП Ораниджерелаї 00000000

Органи-цілі Надниркова Вміст Кишковий Тракт Нирки Печінка Легені інші залоза міхуру Тканини (М'язи)

Шлунок ЗІ вк нтк спот 220200202МЮТ Вміст Вміст обме

Наднаркова залоза 14-01 90 оо 00 оо 90 по 0 00 0о

Стінка міхура 0,6 БЕЗ 0 00 до по по 00 по 0

Кістки 00 Ка) бо ее до що 0 0,0 Тед бо

СІ (Стінка шпунку) 0,0 0 4-3 Фо оо оо оо 0 0,0 оо ее 00 по 0,0 25Е-03 00 оо 00 ва 00 по

Сі(Стінка8ІК)У 06 по бо 00 4А5Е-О3 00 о 00 00 00

Сі(Стінка НТКУ 00 мед; Ге) 00 бо 743 00 о 0 по

Нирки оо бо бо бо 0 о ва4Б-03 00 00 оо

Печінка бо опо 0,0 бо оо 0,0 0,0 11Б-О3 00 од

Легені 0 0 00 0 оо бо ОО бо 2750-0203 0,0

Кістковий мозок 9,0 9,0 о да 0 (АК. 0,0 до 00 90 (Червоний)

Й | Й Органи-джерела Й | | ШИ

Органи-цілі Надниркова. Вміст Кишковий Тракт Мирки Печінка Легені іні запоза міхуру Тканини (М'язи)

Шпунок 5і вт НТК пошко сні п пп 222000 ВМіОТ ВМТ 0 бміт Вміст їм. Тк. (М'ЯЗИ) 0,о до по бо оо 00 00 0,0 0 7, 1Е-05

Яєчники 0 а оо Год) по оо бо оо оо оо

Підшлункова залоза 0,0 0,0 0,0 00 бо по 00 0,0 0,о 0,0

Шкіра бо бо по 90 00 00 0, бо 00 бо

Селезінка па 0 па по оо по 0 по спа оо

Яєчка 0,0 ІК) Ів) 0,0 бо бо 0 б що по

Щитовидна залоза. 00 о по 00 0,0 бо 0, 00 по ва

Матка (МОМОКУЄІ 0,0 00 0 об по 00 00 ба 00 0,0

Тіло разом 2.8Е-05 32-06 85-05 2,3Е-065 ТАБЕ-О5 1157-05 2,8Е-05 28-05 28-05 258Е-05

Посилання - МІКО РАМРНІЕТ МО. 11, С. 144

Табпиця 14

С. здсорбована доза на одиницю кумульованої активності (КАПЛШОІ-Н)

Ітрій-Ї901 період напіврозпаду 54 годин.

Органи-джерена

Органи-цілі Яєчники Підшлпув кістяк Шкіра Сбелезін Яєчка ІЩитови Тіло кова я. Кстк. Зріпа Трубчас. ка -дна Разом залоза Мозок о -кістк. кістка запоза нн Аа а А А А Ко о АННА ОНА Он

Надниркова залоза 0,0 00 по бо 00 00 0 бо 00 ?,ВЕ-ОБ

Стінка міхура оо до бо 0,0 бо по 0 0,0 до 2,8Е-О5

Кістки во 00 1,1ЕЕ-ї04 40-04 2,3Б-04 00 Фа оо Тед 2.8Е-05

ЗІ (Стінка шлунку) 0,0 00 до бо 0,0 90 00 оо ба 2,8Е-05 опе 00 по бо 00 00 оо 00 0о 00 2,ВЕ-05 бі(Стінка ВТК) 00 0 оо 0 00 о по 0,0 бо 2,8Е-0З

СОі(Стнка НТК) 0 вка) 0,0 о 0,0 оо о 0о бо -.8Б-05

Нирки бо 00 00 бо оо о бо до оо 28-05

Печінка 0 до оо оо 0, оо бо бо оо 2,ВЕ:О5

Легені о 0о 00 0,0 бо по по 00 бо 2,8Е-О5

Кістковий мозок 00 по 86Е-0О4 336-005 57Б-04 00 бо 00 оо 2,8Е-05 (Червоний)

Ін. Тк. (М'язи) бо по бо до 00 00 по бо Тек) 2,8Е-05 нин 7 Вргани-джерела тт

Органи-цілі Яєчники Підцілун кістяк Шкіра Селезін Яєчка Щитови Тіло кова УЧ. Кістк. Зріла Трубчає. ка дна разом залоза Мозок -кістк. кістка залоза

Шо тканина ши

Яєчники 1,8Е-01 6,0 бо бо до по 0,0 оо до 28-06

Підшпункова залоза д 00 7002 00 опо бо по 0, 0,0 08 2,805

Шкіра бо бо ра бо 00 7.,БЕ-04 Ой 00 0,0 28-05

Селезінка 0 по 0 по по 0,0 ТЕ-02 00 0,0 2,ВЕ-ОВ

Яєчка 00 оо оо бо 00 0о 00 5ТЕОа 00 2.81Е-05

Щитовидна залоза 00 да бо 00 00 по па о 98-02 2,8Б-05

Матка (МОМОКУЄСУ фо 0,0 до 00 по бо 0, 0,0 0 2.8Е-05

Тіло разом 28-05 28-05 28-05 28Б-05 2,805 285 286-005 2,8Е-05 2,8Б-05 9,805

Посилання - МІВО РАМРНІЕТ МО. 11, С. 145

Таблиця 15

Адсорбована доза радіаці (КА х А 5

Індій ПТЇ період напіврозпаду 67,44 години.

Пт аниджерелаї 000000

Органи-цілі Надниркова Вміст Кишковий Тракт Нирки Печінка Легені Інші залоза міхура Тканини (М'язи)

Шпунок 5000 ВІКО ОНКО СС

Бміст Вміст Вміст міст

Надниркова залоза. ООБНЮ ЗлЛЕБ 0603 1АБОЗ 3.1Е-ОЗ АОБ-0О4 АБО ЗБЕ 43095 2АБ

Стівка міхура ООєвО0 2АЕНЮ 11-04 2,5Б-023 2,6Б-0О3 76-03 ЗВБЕ-04 52503 26-04 02,70

Спі/Стінкашлункуу ОБО 465-305 48Б-02 35-03 2,2Б-02 9,0Б-03 40-03 58-02 9803 21-03 -5О Ов 47-04 11Е-0О3 67-03 92-02 1,1Е-02 З БЕ-ОЗ 50-02 1006-03 Дав с(Стінка ВТЮ Обоє 38БЕ-04 56-03 26-02 13БЕ-0ОЇ 53Е-03 З ББ-0ОЗ 7,502 15303 2,51

Сгі(СтінкаНТЮ 006400 7126-03 53-04 76-03 38Б-03 18БЕ-01 1ОБ-ОЗ 73-03 БОБ 5бЕ-0

Нирки ОО 485Е-95 7,5Б-03 5896-03 34-03 1,1Е-Ш03 2.16-01 12Е-01 46-33 2526-01

Печінка 0ОБНОЮ ЗАЕ-0О5 8,304 18-03 32-03 32Е-04 4996-03 100 403-095 7-01

Легені 0ОЕО0 45-08 73-04 24БЕЗОЯ З4Б.04 98-05 БОБ-О3 7,8Б-02 254Б-01 0216-01

Інші Тканини

М'язи ОО З0ОБ-04 80БЕ-04 1,5Б-0О3 8-03 2,0Е-О3 18-03 34-02 7,0Б-03 37-01

Органи-джерела

Органи-цілі Надниркова Вміст Кишковий Тракт Нирки Печінка Легені Інші залоза міхура: Ткавини (М'язи)

Шлунок Зі вк НТК

Вміст Вміст Вміст Вміст Й

Жирова тканина ОО ЗОБ-04 6бОБ-04 15-03 18-03 206-003 Т8Б-03 ЗАБ.О2 жББ- ОЗ ЗЕ

Кров О,ОБ0О0 30-04 6,0Е-04 1,5Е03 182-093 20-03 1,8Б-03 54-02 76-03 3,701

Мозок С.ОБчО0 3,0Б-04 60-04 1,5Е-03 186-003 20-03 ВЕ-03 34-09 76-03 ЗЕ

Серце ООН 8,1Е-05 АЯЕ-03 156-033 1,7Е-0О3 9,1Е-04 12-02 28-02 125-025 ЗЛЕ

Яєчники ОСОБОЮ 1,3Б-03 18-04 18-02 БаБ-02 24-02 105-035 14-02 62-04 286-011

Підшлункова залоза ООБ00 47-05 8006-03 19-03 2,9БЕ-03 8,0Б-04 8, Б-ОЗ 72-01 1036-02 126401 кістяк

Зриа кісткова ОБО 13-04 52-41 0ОБ-0О3 1,9БЕ-О3 16-03 15-03 2,902 65,5Б-93 1166-01 тканина

Трубчаста кістка ООЕО0 1.3Е-04 32Б-0О4 1Б-ОЗ 2-03 156-503 1.08 296-002 656-035 1766-01

Кістковий мозок ООЕО0 29-04 56-04 35-03 37-03 46-03 3902-03 4,15-02 8ЗБЕ-0О3 26-01 (Червоний)

Кістковий мозок ОБО 2,9Е-04 56-04 35-03 37-03 48-03 3,903 41-02 83Е-03 3266-01 (Жовтий)

Хрящі ОЕО0 1,3Е-04 32-04 10-03 12-03 156-003 1,5БЕ-03 2596-02 8656-03 45-01

Інші складові ОБОЄ 123Б-04 ЗБ -04 46-03 1522-03 1.5Б-03 1,5Е-3О3 2,902 85-03 166-071

Шкіра І СБ 8205 20Б 0445604 5,7Б-04 61-04 7,304 6Е-02 З1Е-035 1,2Б-01

Органи-джерела ШІ

Органи-цілі Надниркова Вміст Кишковий Тракт Нирки Печінха Легені Інші залоза міхура Тканини (М'язи)

Ффілуною 500 ВІКО НКО С

Биіст Вміст Вміст Вміст

Селезінка бООЕЗОЮ 4-05 4 АБ-0ОЗ 1156-03 1,703 9-04 1,162 2,8Б-02. 4,2Б-02 2,3Е-01

Яєчка пОєВО0 7, ОЖ 2-05 32-04 40-04 2,2БЕ-03 1-04 25-03 87-05 ВЕ

Шитовидназалоза 00600 5,БЕ-07 4096-05 2,2Б-05 50Б-0О5 1006-05 81-05 62-03 45-03 9516-01

Матка(мМОоМОвМО ООБОО ЗАБ-ОА 86Е-04 2,36-03 2,7Е-0О3 2БЕ-ОЗ 2,7Е-0О3 865602 0-02 З їБ-01

Тіло разом ОО о 8,7Б.03 3404 8.26-0 б 15-03 8003 3-3 12-02 4АВЕ-0О4 28-01

Таблиця 16

Адесорбована доза радіаці (КА З А З)

Їндій ПЗ І період напіврозпаду 67,44 години.

Органи-джерела

Органи-цілі Яєчники Підшпун Кістяк Шкіра Сепезінк Яєчка Шитовид Тіпо кова УЧ. Кістк. Зріла Трубчає. а ма Разом запоза Мозок кістю; кістка залоза птн пт потоп птн ВИНА подо п в

Надниркова запоза 0000 0Оєб00 00ЕО0 О0БНО0 36-02 8-6ББЕ-02 126-302 0ОоєНюЮ пов О0Б00

Стінка міхура ооЕнОС 0ОБО0 поко 0ОБзО 14602 07-09. 2,7Е-04 ОБО ОБО 0000

СІ (Стінказупунку) О0ЕО0 ОБО 00ОБнНОЮ О0ОєНОЮ 18-02 18-02 1,7БЕ-02 боб ОБОВ 050600

СІ (5) ООБО0 бОєзЗО0 0065300 006300 2,1Б-Д02 166-302 24ЕОЗ 006400 ООБНЮ ОБО

Сі(СтічкаВтТК) 0000 боЄвО0 ООБО0 бОБНЮ 206-802 155Е-02 2,2Б-03. 0О6МО0 ООБО0 О,ОєЖОЮ

Органи-цілі Яєчники Підшпу Кістяк Шкіра Сепезн Яєчка ШЩитови ТЛ (С нкова М. Кістк. Зріла Трубчас. ка дна Разом звлоза Мозок кістк. кістка запоза панна ни А а а Аа а а а а а В а а ОО В і іх ЗП НО ОВО о

БІ (Стінка НТК) ОЕНЮ соб бо О0 Об 30-02 16602 1116-03 бОБО0О 00БбчзО0 ОО

Нирки ООЕОО ФО ООЕНО0 ОБО 25-05 216-092 16-02 00600 000 ОО

Печінка О0єч0О0О ОЕОВ 0ОБНОЮ боОєбОюЮ 39Е-02 1,86-02 4, 7Е- 3 ЗОБєз0О0 ОБ жОб' ОБОВ

Пегені оОБєНЮ ООБНЮ ООБО0 ОБО 2856-02 2,06-02 40-03 00600 00ЕО0 0оєО0

Іншії Тканини

М'язи ООєОЮ О0БЕНЮ ОО ОБО 30-02 2,702 2,7Е-0З 0ОБлОЮ 006300 0600

Жирова тканина сОовєНОЮ ООБЮЮ бОєОЮ пОЕО0 3ОБ-02 2,7Е-02 2,7Е-03 00600 00600 ОСОБ Об

Кров спОоєтО ООбОо бОоЕнОЮО ООоБО 506-092 27-02 2,76-03 00600 бокове О

Мозок пОБбНО 0ОоБО0 0О0єО0 006 О0 30-02 9,7Б-02 2,7Е-03 050600 ОДЕНОС ОБО

Пп оаниджерена,ї 00001110

Органи-цілі Яєчники. Підшву Кістяк Шкіра Селезін Яєчка Щитови. Тіло нкова УЧ. Кістк. Зріпа Трубчаб; ка дна Разом залоза Мозок кістю. кістка залоза деп пото З ЗЛ Я МН

Серце ОбЕО ОБО ОБО боБРОО 36-02 27-02 27603 00600 0 0єзОб0 ОДЕНОЮ

Яєчники соб 00600000 0 ОБєОЮ 206-302 71,5Е-02 8,9Е-04 00Б6О0 ОБО ООЕО0

Підшпункова залоза 06 ОБО ОБО 000ЕНОЮ 2,9Е-й? 1,86-02 35БЕ-0О2 0ОБЯО0 0065300 0 0єО0

Кістяк

Зріла кісткова тканина О0ОЕО0 ОО 0ОоєОО ОБО 2А4Б-0О13 З1Е-02 1,7Е-03 ОО БОБ НЮ ООЄвОЮ

Трубчаста кістка ООБНОЮ ОБО 0ОБНОО ОБО 9248-03 ,1Б-02 17-05 0,600 0,06 ОЮ ЕКО

Кістковий мозок 0О,0Е-00 ООБЕО0 О0ОЕО0 ОБО 24Б-ОТ 2,9Б-02 28603 ООЕО0 б ОєкОВ ООН (Червоний)

Кістковий мозок ЦО НЮ пон ООоЄМЮю ооо БОР 29602 56-03 0060 ОБО ОБО (Жовтий)

Хрящі побнНю сооБКОО ОБО 0ОБНО 2 АБО 3,16-02 47е-03 ОБО 00600 00600

Органи-джерела

Органи-ціві Яєчники Підшлу Кістяк Шкіра Селезн Яєчка 0 Щитови Тіло. нкова Ч.Кістко Зріла Трубчаб. ка дна Разом залоза Мозок кістк. кістка залоза тканина

Інші складові о ОоЕНОЮ ОБО боб С ОєЕНОС 246-001 3,1Б-02 176-053 О0ЕМО0 060 пОоєЖоо

ІШикра п 0єч00 ОБО 00600 0ООБбО0 216-002: 406-011 8.7Е-04 0бЕзО0 ОБЖ С ОЄЖО0

Селезінка 0О0ЕО0О 00Е00 00600 ОБО 1,9Е-02 1186-02 5,3Е-01 00200 ОБО п ОоЄєюОЮ

Явчка О0ОЕз0О ООФЕО0О ФОєНОЮ ОБО 1,8Е-02 38602 7,2Е-04 0.065400 0,0БОЮ 0,000

Щитовидна залоза ОоБНЮ ПОБНЮ ООєОЮ ОБО 205-092 2,5БЕ-02 2,0Е-04 О0БО0 ОБОВ ДЕНО

Матка (НОМОВУЄ) бо боєО поєНОЮ ООБбОЮ 1576-02 ООБбО0 7-04 0ОБЄЮюЮ ОБО ОБО

Тіло разом пОоєО Обоє ОО ОбОбОЮМ 55-02 4116-02 3З8БЕ-0О3 ООЕ0О0 0ОЕОЮ 0ОєОЮ

Таблиця 17

Адсорбована доза радіаці (КА хх А В)

Ітрій 190) перюд напіврозпаду 64 години,

ПП Ораниджерела.ї 00100000

Органи-цілі Наднирк Вміст Кишковий Тракт Нирки Печінка Летенкі Інші ова міхура Тканини залоза (М'язи)

Шлунок Зі БІК нтк пит птн ВМІСТ Вміст ВМІСТ нн

Надниркова запоза бОєНЮ 00600 0060 боЕОО О0єМО0 ООЕнО0 0обнОО ООєНОВ б ОєНОЮ 0ОєОВ

Стінка міхура ООєО0 2 7Е-ОЯ бОЕНЮ ООБвО0 поБбО0 обоє 0оєбєМОг обо ово 0 оБ00

ФІ (Стінка шпунку) ОБО пОєвО0 ЗБОЇ поБНОО 0оБєнКО0 ооєНЮю 0ОБбВОО о 0єЕО0 0О0БО0 0оєнОо0

Зн(ВІ бОЕОЮ пДОєнОВ боєМОЮ 5ОБ-0О1 0оЕОЮ Обоє боб 0 бЕО0 ОБ 00 Обоє

СІ (Стінка ВТК) посюо 0оЄНОО ООБбНюЮ 0ОБЮ ТЕО оОєОЮ 006єНЮ обо о ОвєнОЮ 006

СІ (Стінка НЕЮ ОБО ООєЕнОО 00300 60060 ООБНОО 1,8Е00 00300 00Бє00 0000 боб о

ПП оріанидджерела.ї 00000

Органи-цілі Наднирко Вміст Кишковий Тракт Нирки Печінка Легені Інші вазалоза міхура Тканиви (М'язи)

Шлунок Зі 00 ВТКО 0 НКО СС тт ето о СТ 0 ВМІСТ ВМТ ВМС нот

Нирки ОФБНЮ 0ОБОО 0000 000 бОБНО0 ФОБОЮ В8аБЕО0 ОБО ООєМОЮ 0 0Е500

Печінка пОБКО0 00600 0 з0О0 ОоБО0 бо обЕРОЮ ОбЕОЮ В БЕЖО0 О0ЕО0 0 Оєз00

Легені сОєЕОЮ 0ОБзОЮ ООЕНОВ ОО бОоСвоО0 ОБО ОБО ОоЕКОЮ 2 1ЕНОЇ ООЕО0

Інші Тканини

М'язи ОО ОО бОєО0 боОєОС бос ОобКО0 сОоЄєОО ОоОєзО0 ОоєКОЮ ОБО 5.7ЕЖ00

Жирова тканина 0ОєчНО0 ООБєЕНО0 ОбОєЮОЮ 0ОЄО0й 0 ОєМОЮ ООє»О0 0ОБє-00 00єНОЮ б ОБНЮ 2 7Е00

Кров ООЕНОО бОБОЮ ООБєОЮ 0ОБзО0 пОБаО0 0оБ6О0 0ОоБАОЮ бОЄМОЮ ОБО 257ЕО0

Мозок пОоєНЮ 0пОБєМОО 0обО0 0оєО ООЄО0 бОоєЄвО0 бно боб боЄвОВ ЕН

Серце пОоБНОЮ ОБО ОБО 0оЄ00 бОБКО0 00ОБбО б оЄжО0 0 ОєО0 ОБ О0 2,700

Органи-ціяі Наднирко Вміст Кишковий Тракт Нирки Печінка Легені Зніні ва залоза міхура Тканини (М'язи)

Шлунок 5000000 ВТК 00ОНТК

Вміст Вміст Вміст Вміст

Яєчники ОКО пОоЄО0 ОБО 006ЄО0 0ОБО0 бОЄОЮ ОБО 000 000 ОБ 00

Підшлункова залоза 0000 ОБО Обов ООЕєНО0 О0бЕО0 ООБО0 ОБО ОБО 09600 0 б,оБєжОЮ

Кістяк

Зріла кісткова 0.0ЕКО0 ОБО ОБО ОБО 0ОєЕО0 006500 0бЕЖО0 б 0ЄнО0 ОБ ОЮ ОБО тканина

Трубчаста кістка ООЕНЮ ОЕМ ООЕОО бООєМОЮ 6ОєО0 900 0ОєОЮ ОБО 0 ОєЕЖОЮ о ОєЕНО0

Кістковий мозок бо бо ООєнО0 ООєО0 ООєМОЮ СОЄМОЮ 0єнО0 ОБО ОБО 0000 (Червоний)

Кістковий мозок СО ОЕВОО 0ОБзО0 ООН ОБО соЄОЮ бОБбО0 ОО о ОєОО 0 ОєМОЇ ОБО (Жовтий)

Хрящі ОобЕО0 О00б6з00 06 ОБО оБО0 боб ОБО 0ОБЄОЮ 0ОєзО0 ООБОЮ

Інші складові БоОЄєОЮ ОО ОНКО О0ЕнОЮ ОКО боб пОобюО0 О0єЕО0 0,0 Ом

ОО раниджерела.їДЦ 00000000

Органи-цілі Наднирко Вміст Кишковий Тракт Нирки Печінка Легені Інші ва залоза міхура Тканини (М'язи)

Шлунок 8000 ВКО00ОНКОС0С в Вміст Вміст Вміст Вміст вн "Шкіра бОБ ОС 00300 0000 ОБО ОБО 000 0,0Б00 000 0000 00600

Селезінка боєМНОС 0Оє» ОС 0000 ОосєЮОО ООєКО0 Боб 006НЮ ОБО 00БНОО 0,000

Явчка дєНОО боєО0 0060 ОБОВ ОБО 0.0є00 0ОБЗ00 ОО оєНОЮ пОБєО0 обо

ІШЩитовидназапозв 0ОБОЮ боєНОЮ О0ЕКОО ОбЕКОВ ОБО пов ООБНО ООєМО0 об ООєНЮ

Матка(МОоМОВУРІ ООЕЖО0 1704 76Б-0О3 45-03 З6БЕ-03 Я ТЕЗ ЗИ 02 2 2Б-ОТ 9,96-02 0000

Тіло разом О.О» ОО б зЗ0О0 ООєОЮ ОБО 0 ОєЮОО ОбЕМОЮ б0оБНЮ 0ОЄНОС ОБО 1,00

Таблиця 18

Адсорбована доза радіації (КАО х А 5)

Ітрій 90); період вапінрозпаду 64 години.

Органи-джерела

Органи-цілі Яєчники /Підшлун Кістяк Шкіра Селезінк Яєчка Щитовид Тіло кова УЧ. Кістк. Зріла / Трубчабс. а на Разом залоза Мозок кістк. кістка запоза сої дп 00 поп шо 000 ТКВНИНАИ

Надниркова залоза 0,060 ОоОБЕО0 ОБО ОБО ОБО 00600 ОБО 0 ОБО Осо ОБО

Стінка міхура О,ОЕ0 ООЕМО0 006 О0 ОБОВ ОБ 00 ОБО 0 ОО ОБО ООБО0 ОО

Оі(Стінка шлунку) ОБО 00600 00ОєЕ0О0 О0Еч0О0 00ОЄО0 боб обо 9 ОЕзО0 00єЕ00 оо ЄюКОВ ее б ОєО0 ооЕО0 б0ОБєНОО ОКО ОБО ООєКО0 ОЕОЮ ООєЕОО ООЕнО0 ОБО (і (СтічкавткК) Ого ОЕМОЮ 0,0БО0 О0БОО бОБНОЮ 0ОБ00 0ОБЖОО О0ОєЖО0 000 ОБО с(Стнкантю 0 бок ООЕОО 0ОЄОЮ Об ОБО 0ЛЕг00 0 0ОєНО0 о оєОв 0 ОєОЮ обо

Нирки б ОєжО0 0,600 0ОЕНОЮ 0ОєзО0 БОЮ 00600 0,000 0000 ОБО ОБ О0

Печінка ООєНОЮ обо пОБНЮ обо 00Б6О ФОБнОЮ о ОєчнО0 ЄМО 0ОБНОЮ ОБО

Легені бОоєНОЮ ОБО ОБО ООБО0 ООоБНОЮ бОБОЮ 0 ОєО0 ОБО ОВО 060

Інші Тканини

По ріаниджерела.їД 000000 "Органи-цілі Яєчники Підшпун Кістяк 00 Шкіра Селезінк Яєчка Щитовид пло кова Я. Кістк. «Зріла Трубчас. а на Разом залоза Мозок кістк. кістка залоза

І тканина о

М'язи сОоБО0 бОБО0 0000 О0Бо0 боб о0ОБєо0 боб ОБО ОБОВ бОБзО0

Жирова: тканина 0000 бОєОЮ 0 0б00 0 0ЕО0 бОБєО0О 00600 ОБО ОбЕнОЮ ОБ бОЄНЮ

Кров ООєзО0 бОБЖОЮ 0ОєзОС ОБО ООБМОЮ 0ОБ6ОО ОБО бо 00 06

Мозок о0оЄєО0Ю бо ОБО БОєО0 пою ОБОВ ОБОВ ОБО. 0,000. ОБО

Серце ОБО ПОЕМОЮ О0ЕнО0 ООєвО0 б ОЕНО0 пОєОО боб ОБО поєОЮ 0,00

Яечники О.оєОС ОБ 0О0 00БНОЮ 00600 0,000 0ОБОЮ ОоБОЮ ОБО 00БОЮ 006300

Підвлункова запоза ОБО0 0000 ОюєОЮ ОБ 00 бо ОБО боб ОбЕОЮ ОБО бно

Кістяк .

Зріла кісткова 0006500 ОО ОЛЕзО0 ООєтОп З ЕєО0 бОЄз00 О0єч0О0 боБєнОМ бо дою тканина

Трубчаста кістка бе ооо ОБЖ0О0 0,000 З ЕО0 0ОєЖОО ОКО 006400 00Ез00О О0ЕО6

Кістковий мозок ООєОЮ бо 00600 0ОєнО0 7,800 ОБО ООЕОО боєнОЮ поєЮЮ ОО (Червоний)

Кістковий мозок 0000 ОБО 006» 00 0 ОБнОо0 78 боБбнО0 0О0єз»ОВ ОБО ОДБ О0 0 ОБЖ (жовтий) хрящі обо п.ОБО0 ООєЖОЮ боБОЮ З ЛЕЗО бобОЮ боєОЮ боЄюОЮ 00БєЮ ОБО

Іншіскладові 0 ООБ00 0ОБЖО0 0000 0,000 З,Е200 0ОБНОЮ бОБОЇ 0.ОБНОЮ 0000 0,200

ЩІ | Органи-джерела

Зргани-цілі 000 Яєчники бідшлун о 00000 Кістяко 000 Шкіра Оелезні- Яєчка Щитовид Тіло кова У. Кістк. Зріла Тврубчаб. ка на Разом залоза Мозок кістк. кістка залоза тканина шк

Шкіра ООЕНО ОО бОБєОЮ ОБО ОБО ОБОЇ ООЄєОЮ СОєО0 ОЮЕНОЮ бю

Сепезінка 0000 ООБнОО 0ОБО0 0ОБз00 боБОЮ боєМОЮ ЯОБОЮ дО ОО ООБОЮ 00БНОЮ

Яечка 0,0БО0 бОБбО0 0ОєНОЮ бОєНОО боБОо осЕОЮ ОО єнОЮ б ОвКО0 0 ОєвО0 ОБО їЦитовидна боб боєОЮ бОоєОО 00ОБб400 ОБО ОБОЄ боб ОБО ООН обо запоза

Матка(ОоМмевмОо) ООН ФОвРО0 бою бОБєОЮ Обоє боОєоОо ОО б ОБО 0 Ооє»ОЇС ООБО0

Тіло разом ОО ООБМО0 00500 000 38БЕ-01 ЗБОЇ 23Е-02 00600 боб 0Оєз00

Таблиця 19

Результати оцінки дози радіації з введеного Індій-(111| міченого 288-МХ, рівномірнорозподіленого в стан- дартній людині (7Окг), і на основі даних розподілення у тварин через 72 години після ін'єкції

Кількість активності -1000 мікроКюрі/Доза пацієнту

Рад Рад

Надниркова залоза 0,493 Яєчники 0,387

Стінка міхуру 0,348 Підшлункова залоза 0,362

Стінка шлунку 0,412 Кістяк

Тонкий кишечник 0,434 Зріла кісткова тканина 0,474

Стінка ВТК 0,533 Трубчаста кістка 0,474

Стінка НТК 0,505 Кістковий мозок (Червоний) 0,602

Нирки 0,625 Кістковий мозок (Жовтий) 0,602

Печінка 1,533 Хрящі 0,474

Легені 0,582 Інші складові 0,474

Інші тканини Шкіра 0,564

М'язи Селезінка 0,854

Жирова тканина Яєчка 0,239

Кров Щитовидна залоза 0,276

Мозок Матка (МОМОКМО) 0,473

Серце Тіло разом 0,417

Посилання: А Зспета їог Арзхогрей-дозе СаІсшайоп (ог Віоіодісапу Різільшеа Вадіописіїде5, МІВО У. ої мисі. Меа./Зиррі. 1, 2/68

Обчислення виконували, використовуючи шаблон електронної таблиці Зутрпопу (Гоїш5 ЮОемеІортепі

Согрогаїйоп), який створив РПйір С. Надап, М5 Мисіеаг Медісіпе бЗегмісе МА Нозріїа! Зап Оієдо, СА 92161

Таблиця 20

Результати оцінки дози радіації з введеного Ітрій-І90| міченого 288-МХ, рівномірно розподіленого в станда- ртній людині (7Окг), і на основі даних розподілення у тварин через 72 години після ін'єкції

Кількість активності -1000 мікроКюрі/Доза пацієнту

Рад Рад

Надниркова залоза 0,000 Яєчники 0,000

Стінка міхуру 0,271 Підшлункова залоза 0,000

Стінка шлунку 0,356 Кістяк

Тонкий кишечник 0,504 Зріла кісткова тканина 3,138

Стінка ВТК 1,150 Трубчаста кістка 3,138

Стінка НТК 1,772 Кістковий мозок (Червоний) 7,776

Нирки 8,366 Кістковий мозок (Жовтий) 7,776

Печінка 8,575 Хрящі 3,138

Легені 2,079 Інші складові 3138

Інші тканини Шкіра 10,269

М'язи 2,716 Селезінка 8,965

Жирова тканина 2,716 Яєчка 0,000

Кров 2,716 Щитовидна залоза 0,000

Мозок 2,716 Матка (МОМОРМО) 0,304

Серце 2,176 Тіло разом 1,854

Посилання: А Зспета їог Арзогреа-дозе СаІсшайоп (ог Віоіодісапу Різільшеа Вадіописіїде5, МІВО У. ої

Мисі. Меа./Зи,иррі. Я, 2/68

Обчислення виконували, використовуючи шаблон електронної таблиці Зутрпопу (Гоїш5 ЮОемеІортепі

Согрогацйоп), який створив РпПйіїр Г. Надап, М5 Мисіеаг Меадісіпе Ззегмісе МА Нозріа! Зап Оіедо, СА 92161 1. 1. Результати терігали тільки фонову флуоресценцію з будь-

А. Іп Міо Дослідження 288 і 288-МХ-ДТПК яким реагентом, який використовували з Н5В клі- 1. Продукування і характеризування анти- тинами. Ці результати підтверджують специфіч-

СО020 антитіла 288 Всього дев'ять злиттів дали в ність взаємодії 288 з антигеном СО20 і припуска- результаті три гібридоми, які продукували антиті- ють, що 288 може мати більш високу ла, що ефективно конкурували з радіоміченим спорідненість до клітинного поверхневого антиге- антитілом Соцшіег ВІ, В кожному випадку гібридо- ну, ніж В1. му розсіювали в 24-лунковий планшет. У перших Для визначення уявної спорідненості 288, двох антитіл, виділених з злиттів З та 4, було ви- очищене антитіло мітили радіоізотопом "725| і зрос- значено ізотип і обидва були ідентифіковані як таючі концентрації міченого антитіла інкубували з

І9М. Третє антитіло, отримане в злитті 5 і позначе- антиген-позитивними 5В клітинами; радіоактив- не 288, було визначено як ІдДС1 каппа ізотип і було ність, асоційовану з клітинами, визначали після 1 обрано для подальших досліджень. Клон 288, Н11 години періоду інкубації (Фіг.3). Результати пока- розмножили і помістили на тривале зберігання в зують, що антитіло 288 зв'язується з антигеном рідкий азот. Клон 288,811 був субклонований з СО20 з константою уявної спорідненості 4,3х109М. метою отримання клону 288,НІ11,53, і знову для Дослідження методом проточної цитометрії отримання клону 288, НІ1, 3, 59. Цей клон роз- людських нормальних лімфоцитів периферійної множили для подальших досліджень і антитіло крові показали, що 288 було специфічним до В- очищали афінною хроматографією на білку А. клітин і не реагувало з іншими типами лімфоцитів

Конкурентний аналіз з використанням неміче- (наприклад, Т-клітинами, моноцитами, макрофа- ного 288, ВІ, Гей 16 і радіоміченого Сошнег В1 гами). РІТСО-мічене 288 порівнювали з В1-РІТС і продемонстрував, що 288 було здатне інгібувати Ї ем 16-РІТС, використовуючи таку ж саму популя- зв'язування ВІ з СО20 більш ефективно, ніж рівні цію людських лімфоцитів. Результати, наведені в концентрації як ВІ, так і Геи 16 (Фіг.1). Схожі ре- Таблиці 21, показують, що 288 реагувало з приб- зультати отримали (дані не показані) в дослі- лизно 14 відсотками лімфоцитів периферійної кро- дженні конкуренції, використовуючи РІТо- ві проти приблизно 12 відсотків для Геиц 16 і 11 кон'юговане 288, природний ВІ1 і невідповідні ан- відсотків для В1. Популяція лімфоцитів, основана титіла ЮШРО-10 ї 5-003 (дО 2а і 1 ізотипи, відповід- на іншому маркері В лімфоцитів (СО-19), була но). (мала величини) між 11 і 14 відсотків. Нарешті,

Пряме зв'язування з клітинним антигеном коли людські лімфоцити периферійної крові інку-

СО20 антитіл 288 і В1 порівнювали ГАС5 аналі- бували з 288 і В1 або Ге 16, і потім порахували зом, використовуючи СО20-позитивні 5В клітини і пофарбовані клітини з маркером СО019

СО20-негативні НОВ клітини. Результати, пред- (Весіоп/ріскіпзоп), подвійно пофарбована популя- ставлені на Ффіг.2, показують, що для порівнянних ція В лімфоцитів складала 9 відсотків з 288 і 10 кількостей антитіл більше 288 ніж В1 було зв'язано відсотків з В1 або Геи 16. Ці результати підтвер- з ЗВ клітинами. Спостерігали незначне зв'язуван- джують схожість цих реагентів. ня 5В клітин з невідповідними антитілами. Спос-

Таблиця М моль антитіла 288. Як показано результатами,

Зв'язування ХКУ з поюдськими лікфецнівма периферійної кра падіяняно представленими на фіг.4, кон'югат 288-МХ-ДТПК з ядвннних ІВ» Т-лікафоцих спеивічниюх роятенути. не показує видимої втрати імунореактивності по вве Аетмтітя відношенню до природного 288, тому що обидва

М антитіла 288, природне і кон'юговане, показують лкбачесфрадоуюання: 00000 Біуак сту лоитивних міф фактично ідентичні профілі інгібування В1; вели- в Щ т чини ІС50 для 288 і 288-МХ-ОТРА були приблиз-

Нанва ізутофраувесцюних о но З і 4мкг/мл, відповідно. Ці результати були

ВКНО (Соцвх дкстатову. Вус Ю "и отримані, використовуючи 725І-мічене антитіло В1

МЕ НКТ фбесіок Гісхювст, ЩИКЮ т в суцільно-клітинному радіоімунному аналізі, який

ЗВО ЕТО КОКО, БЮ В виконували, використовуючи 5В клітини. Схожі

ВРРЛРЄЄ ОК вади контрню Я результати отримали, використовуючи 288 або зни іКоонн плчеоуу | З 288-МХ-ДТП К, як ін гібітори зв'язуван ня 125|- псих Виова рн, т міченого 288 з 5В клітинами; як 288, так і його яти Во КЕ фосюв вес В МХ-ДТПК кон'югат, інгібували зв'язування "251-288 нт С ЕНТО (бески ОК Квот Щі з 5В клітинами в концентраціях приблизно 3-

Б. Пахвідня фарпуваннх 4мкг/мл (дані не показані). шо нн Для оцінки стабільності іп міо природне 288

Відтеев сов ВВЕ | за антитіло ії 288-МХ-ДТПК кон'югат, зразки в нор- ідо таки СОУКЕЕ Не мальному сольовому розчині або сольовому роз-

ЗВ КЕтесает СОУ ДЕЕ . 4 чині, який містив 10мММ гліцин-НСЇІ, рН 6,8, інкубу- вн СІ КЕ ЕМ анти СО й в вали при 47 і 307С 12 тижнів і аліквоти оцінювали взчкітстянтк Ви МЕРЕ це щотижня, використовуючи наступні аналізи: іму-

ІВЕИанти Не в РЕ 3 нореактивність суцільно-клітинним імунофермен-

ВТЕ З ЕІТОВНно Не в ЕРЕ 2 тним аналізом, 50О5-РАСЕ при відновлюючих і

Модотха перемрад ха пойкоцта позмюсвее 5а невідновлюючих умовах, і ізоелектрофокусуван-

ЗичяваВ | ня. В той час, як аналізи імунореактивності не виявили втрат в розпізнаванні антигену зразками

Імунопреципітація радіоміченого клітинного антитіл, інкубованих при будь-якій температурі антигену СО20 288 або В1 давала в результаті (Фігура 5), діапазон ізоелектрофокусування для преципітацію нерозрізненних видів дублетних антитіла (рН 7,30-8,40 на нульовий тиждень), яке білків з молекулярною вагою приблизно 33 і 35кД було стабільне при 4"С, показав зменшення на (дані не показані). 0,2 одиниці рН при 30"С після шостого тижня 2. Продукування і охарактеризування 288- (Таблиця 22). Однак цей результат може бути

Мх-дтТПкК сумнівним, тому що він знаходиться в межах екс-

Кон'югат 288-МХ-ДТПК отримували реакцією периментальної помилки для аналізу. антитіла з 4:71 молярним надлишком ізотіоціана- тобензил-3-метилдіетилен-триамінпентаоцтової кислоти (4). Типово, 1-2молі хелату вводили на

Таблиця 22 пумаврне рі гнав ДТИК

ЗЧиждень 2884 БА 2830 БА оВВЯ СУ ВВ ЗОЇ оВАМХА БА На МХ ЗОБА оВВМХЯ СУ ОВ МХЗОСЕХ 74683700 ий 000000 1 798,24 742-827 7 АБ-ВЗ1 7АБ-824 5,39-8,26 БО 2в 6б,32-9,24 525-824 ? 738-827 745-834 745-8АО 745-834 602-840 б,02-8;34 502-840 55-82?

З 747-835 7,33-Я5 740-829 7,3382а 60828 6.0-8,29 5.0-8,22 бо-ял15

А 7,38-8,24 7,38-8,24 7,38-8,35 738-828 5еВОВ 5,88-8,35 5 ЯЩ-8,35 5,99-8,35, 5 728-825 7,295-8,25 7,37-В32 7,37-8,32 5,80-8,32 580-827 5.80-5;32 590-827 6 трава 70 тет Вот 720-812 585-857 58827 585-827 585-795 7 7т,39-8,32 717-8,32. 7,35-8,25 7,17-847 6,02-8,25 5,95-8,32 585-832 8 7,33-8,29 7,26-8,38 7,40-8,38 5.86-8,35 5.86-8,36 5,86-8;36 58-81 8 7.А9-8,53 726-845 741-845 734830 553-845 583-845 в Вя-8А5 5,93-8,23 725-827 719-827 728-827 7.19-8,27 5еБВ 5 595-835 5.88-8,35 55-13 ч 740-827 7,18-8,27 7,20-8,35 7,18-8,13 5,93-8,35 593-827 5,93-8,27 5.93-8;13 12 725-818 7-8 728-818 7189-5811 5,90-8,28 5,80-8;18 5,80-8,26 Б.В вра природнога ВЕ На МИХ пт Були приготовлені я різних биререх Пюбувались при Яб або ЗАТ ТУ покті Протагом чеого нерієду виконували рігні аналізи, включаючи визначення ізоелектричної точки. Величини, показані зище. лохазують діапазон ізбелектоичної точки для природного і кон'ютгованого. антитіла, інкубованого при хожній. температурі, в кожному складі і для кожного З дванадцяти тижнів доспідження стабільності. сСхорзчання: позначають; 2884 ЗА. 288, інкубований пре 4 с в фізівлогічному розчині: га о ЗА. 288, інкубаванний при ЗО в фізіологічному розчині, 258 «ХУ, ВВ, ічкубаваний при 40 а фізюплогчному розчмяі, який містив 10 мМ гліцину; 288 30 ЗУ, 288, інкубований при. З0 С. в фізіопогічному розчині, який містив 10 ММ гліцину; 2Б8-МХ 4. БА: 288-.

МХ-ДТПК хон'югат), інкубований при 47 е'фізюлогічному розчині; 238-МХ 30 ЗА. 7ВВА-МХ-ДТЛК кон'югат, інкубованих при З07Є в фізіологічному розчині; 2В8-МХ. 4 в шок мобований при б в фізіологічному розчині який містив 10 ММ гліцину; Г288-МХ 30 СУ, кон'югат, інкубований при ЗО: в фізіологічному розчині,

Нарешті, використовуючи нередуковану 505- за допомогою редукованої БО5-РАСЕ, ознак мо-

РАСЕ, зразки антитіла при 30"С через тиждень лекул високої молекулярної ваги, які б свідчили показували агрегати високої молекулярної ваги про формування ковалентних агрегатів антитіла (Таблиця 23). Денситометричний аналіз гелів при 30"С, знайдено не було. Втрат імунологічної показав, що агрегати були у від 8 до 1795 зразків реактивності знову не спостерігали. (Таблиця 23). Проте, коли ці зразки аналізували

Таблиця 23

Стабільність Іп Міго 288

Еталон. 171111лово люшншення ГО 11006 12 тижд/4"С/гліцин 100,00 0 12 тижд/30"С/гліцин 16,70 72,11 11,18

Еталон. 171111лобов пише 11 15 Її 12 тижд/30"С/гліцин 10,00

Під час дослідження цієї стабільності зразки 11Іпд 288-МХ-ДТОК має 10095 імунореактивність 288-МХ-ДТПА, які витримували як при 4"С, так і (Фіг.б), а мічений У 288-МХ-ДТПК, як було визна- при 30"С, досліджували також за допомогою уве- чено, має 6095 імунореактивність (дані не наведе- дення радіоактивного металу, використовуючи 90У, но).

Зразки, що аналізували після 4, 8 та 12 тижнів, 3. Характеристика мічених "п та ЗУ 288-МХ- містили 290965 зу незалежно від температури інку- дток бації. Попередні експерименти з міченим ЗУ кон'ю-

Нарешті, в окремому дослідженні, водяні роз- гатом показали, що при питомій активності чини 288-МХ-ДТПА, що витримували протягом 10 »10мКі/мг антитіла має місце значне руйнування тижнів при 4"С та при 30"С, мітили радіоактивним антитіла та втрата імунологічної реактивності. Че- ізотопом "п ої оцінювали їх розподіл у тканині рез це, для того, щоб мінімізувати вплив радіолізу, мишей лінії ВАГ А/с. Кон'югат від обох температур- було підібрано склад. Хоча був оцінений ряд низь- них інкубацій давав подібний розподіл (дані не комолекулярних вільнорадикальних очисників та наведено). До того ж, отримані результати були встановлено, що вони є ефективними, високі кон- подібними до результатів біорозподілу, отриманих центрації людського сироваткового альбуміну для мишей лінії ВАГ А/с при використанні міченого (ЛСА) були значно ефективнішими для збережен- ізотопом "п кон'югату, який зберігали при 4С ня цілісності та імунореактивності антитіла (Фігури (див. нижче). 7-9).

Було виявлено, що протоколи мічення радіоа- Мічене 930 антитіло уводили до складу 1Х ктивним ізотопом для обох ізотопів "п та М є РВ5, рН 7,4, що містила 75мг/мл ЛСА; додавали відтворюваними. Зазвичай, вміст радіоізотопів також діетилентриамінпентаоцтову кислоту (ДТПК) отримували 29595 для "п та 29095 для ЗУ, Пи- до кінцевої концентрації ТММ, щоб упевнитись, що тома активність для кон'югатів мічених 111п та у будь-який Оу, що може бути втрачений антитілом, зазвичай була в діапазоні від 2-3 до 10-15мКі/мг був би зв'язаний хелатним комплексом. Розпад антитіла, відповідно. На початковій стадії розробки 288-МХ-ДТПК, міченого до питомої активності протоколів мічення ізотопами "1Іп та 0У незв'язані 14 бмКі/мг, оцінювали через 0 та 48 годин, викори- радіоїзотопи видаляли з міченого 288-МХ-ДТПК, стовуючи 505-РАСЕ та авторадіографію. На Фігу- використовуючи РХВР гель-проникну хроматогра- рах 8 та 9 показано, що радіомічене антитіло не фію. В наступних експериментах, хроматографічне виявило значного розпаду впродовж 48-годиного очищення міченого індієм кон'югату виключали, періоду при витримці при 4"С. Аналіз з викорис- через високе радіоінкорпорування (295905), яке танням миттєвої тонкошарової хроматографії по- отримували із цими ізотопом. казав, що втрати У складають менш ніж 295 про-

Імунологічну реактивність мічених "п та у тягом 48-годинної витримки (Таблиця 24). препаратів 288-МХ-ДТПК аналізували за допомо- Імунореактивність також залишалась відносно гою методу Гіпато (3). Встановили, що мічений сталою на рівні 6095 (Таблиця 24).

Таблиця 24

Стабільність підібраного за клінічних умов складу 9у-288-МХ-ДТПК 0г1111197а1111111111111111111111111111162сСс1С шижинннинши: ин шишшшш 481 Ї11111111111111111111119в6а111111111111111111Ї1111111111160сс7сСсСсш у

Мічений кон'югат (питома активність Дослідження складу виконували також з кон'ю- 14 бмКі/мг) уводили до складу РВ5, рН 7,4, що гатом, міченим /!1|1п; питома активність становила містила 75мг/мл ЛСА та ТММ ДТПК, і водний роз- 2,2мМКі/мг. Радіомічене антитіло оцінювали в 1Х чин витримували при 4"С. Стабільність кон'югату РВ5, рН 7,4, що містила 50мг/мЛ ЛСА. На фігурі 10 аналізували у зазначений час за допомогою 505- наведено фотографії авторадіограм для зразків

РАСЕ та авторадіографії, миттєвої тонкошарової нульової та 48-годинної витримки; денсиметрич- хроматографії та за допомогою суцільно- ний аналіз авторадіограм показує, що впродовж клітинного аналізу зв'язування. Результати пока- експерименту розпаду міченого антитіла не було зали, що приблизно 9695 радіометалу залишаєть- (Фігури 11, 12). Миттєвий тонкошаровий хроматог- ся зв'язаним з кон'югатом після 48 годин при 4?С, рафічний аналіз зразків не показав втрат "Чп та що імунореактивність антитіла залишається (Таблиця 25); до того ж, імунореактивність підтри- сталою приблизно на рівні 60905. мувалась приблизно на рівні 10095 (Таблиця 25).

Таблиця 25

Стабільність підібраного за клінічних умов складу 11111-288-МХ-ДТПК нини нини шини пиши нини ни ш с: шили ПИЛИ Ге по

Мічений кон'югат (питома активність 2,2мКі/мг) ДТПК, радіомічений 99 до питомої активності уводили до складу РВ5, рН 7,4, що містила 14 бмКі/мг, витримували протягом 96 годин при 50Омг/мл людського сироваткового альбуміну, і во- 37"С в людській сироватці та аналізували за до- дний розчин витримували при 4"С. Стабільність помогою нерудукованого 505-РАСЕ та авторадіо- кон'югату аналізували за допомогою 505-РАСЕ та графії. Денситометричне сканування авторадіо- авторадіографії, миттєвої тонкошарової хроматог- грам при нульовому часі та після 96 годин не рафії та за допомогою суцільно-клітинного аналізу показало значного розпаду міченого кон'югату (фі- зв'язування. Результати показали, що приблизно гури 13-15). Ці результати були підтверджені ана- 9695 радіометалу залишається зв'язаним з кон'ю- літичним тонкошаровим хроматографічним аналі- гатом після 48 годин при 4"С, та що імунореактив- зом зразків нульової та 96-годинної інкубації ність антитіла залишається сталою приблизно на (Таблиця 26). Узяти разом, ці результати підтвер- рівні 100905. джують, що мічений ітрієм кон'югат є стабільним

Менш ніж 495 радіоіїзотопу було втрачено за умов, які використовували в цьому дослідженні. впродовж періоду витримки (інкубаційного періо- Подібні результати були отримані з кон'югатом ду), коли хімічно-складений препарат 288-МХ- 288-МХ-ДТПК, міченим "п (Фігура 16-18).

Таблиця 26

Аналітичний тонкошаровий хроматографічний аналіз кон'югату зоу-288-МХ-ДТПК, інкубованого в людській сироватці протягом 96 годин при 372С нн"НнИ?ІИВІЕПШЄЕИТХОВТВООЛОВТЛЛОООВВВВВВВВВВВОТХ НІНІ 96111114

Зразки людської сироватки, що містили З0у- зразки аналізували тричі. Хроматографічні смужки 288-МХ-ДТПК (питома активність 14 бмкКі/мг), ана- обробляли за допомогою висхідної хроматографії лізували у зазначений час за допомогою нанесен- в 1095 розчині ацетату амонію у суміші мета- ня краплями 1дл розбавлених 1:20 зразків на сму- нол:вода (1:1; об/0б), сушили та різали навпіл жки для миттєвої тонкошарової хроматографії; хрест-навхрест. Потім визначали радіоактивність,

асоційовану з верхньою та нижньою половинками 1. Високо-дозові фармакологічні/токсикологічні кожної смужки, та обчислювали радіоактивність дослідження з 288 та 288-МХ-ДТПК кон'югатом у відсотках. (Вільний радіометал мігрує В СГ Р дослідженні, виконаному в УУпнце Запаз з фронтом розчинника, тоді як радіоактивність, Кезеагсп Сепіег (Дослідження номер 920111), асоційована з білком, залишається на початково- яванським макакам були зроблені внутрішньовенні му рівні.) Для кожного визначення радіоактивності, ін'єкції різних доз 288. Зразки крові відбирали пе- пов'язаної з кон'югатом, наведені середні зна- ред кожною новою ін'єкцію і кров готували для чення. оцінки кількості лімфоцитів способом проточної

Б. Дослідження на тваринах. цитометрії (Таблиця 27).

Таблиця 27

Кількість В-клітин примата, визначена за допомогою проточної цитометрії, після уведення анти-СО20 мишачого моноклонального антитіла 288

Тварина Ж Доза День В клітини 26 до Зменшення 1 2 З 4 5 (5)

Група 1 452 Сольовий (9) 20,1 (9) розчин 1 18,3 9 7 21,6 (0) 13 14,6 27

З8 15,5 23 52 18,6 7 424 Сольовий 0 12,4 0 розчин 1 11,6 б 7 11,2 10 13 8,4 32 38 7,7 38 52 15,1 0

Група ІІ 54АО0 о, бмг/кг 0 16,1 0 1 71 54 7 6,0 63 13 5,7 65

З8 10,8 33 52 14,4 11 804 о, бмг/кг 0 17,6 0 1 8,3 53 7 6,1 65 13 6,6 62

З8 51 71 52 5,2 68

Група ЇЇ 701 2,5Мг/КГг 0 21,6 0 1 10,7 50 7 3,0 86 13 10,7 50 754 2,5Мг/КГг 0 19,9 0 1 11,2 44 7 10,5 47 13 9,0 55

Група ІМ 782 10мг/кг (9) 15,9 1 3,0 81 7 3,5 78 13 6,5 59 164 10мг/кг (9) 17,7 (9) 1 8,4 47 7 7,9 50 13 7,7 42

Продовження таблиці 27

Група М 705 10мг/кг (9) 17,2 (9) 1 5.2 70 7 1,3 69 13 8.2 52

З8 17,1 1 52 13,3 22 716 10мг/кг 0 34,7 0 1 18,6 46 7 81 77 13 3,5 90

З8 6,9 80 52 9,2 61 а Відсоток від загальної кількості лімфоцитів. 6 Кількість В-клітин підраховували за допомогою маркерних реагентів подвійного забарвлення та миша- чої ІСО-КЕРЕ «ж антилюдської ІС-РІТС (антимишача Ідс ЕРЕ виявляє 288, блоковану СО20, а антилюд- ська дО РІТС виявляє поверхневу Ід мавпячих В-клітини)

Тваринам з груп І-ІМ ін'єкції робили кожні 48 цих тварин після 52 днів залишався приблизно на годин і загальна кількість ін'єкції становила сім; рівні 4095 від нормального рівня. тваринам з групи М ін'єкцію робили зразу (у пер- На додаток до цього дослідження, була оціне- ший день). Тварин з Груп ІІЇ та ІМ умертвляли на на фармакологічна дія 9у-288-МХ-ДТПК у явансь- 14 день. ких макак в СІ Р дослідженні, виконаному в М/пйе

Не було помічено значної фармакологічної дії, зЗапа5 Кезеагоп Сепіег (Дослідження номер пов'язаної із застосуванням анти-СО20 антитіла 920611). Кон'югат клінічної якості заряджали нера- 288, на будь-який з клінічних параметрів, які оці- діоактивним 90У. Кон'югат, який містив ітрій, дода- нювали під час або після дослідження. Так само, вали в РВ5 з рН 6,8, що містить 75мг/мл людсько- не було помічено порушень під час аналізу зразків го сироваткового альбуміну, та мМ ДдтпПкК з різною гістопатологією, отриманих від тварин з (клінічного складу), та уводили у вену, як описано

Груп ІІІ та ІМ. в розділі "Способи".

Термін дослідження склав 14 днів і під час до- Як свідчать результати на Фігурі 21, мічений слідження тварин було оцінено такі категорії: кліні- зоу 288-МХ-ДТПК мав незначний, якщо мав, ефект чні обстеження, вага тіла, температура тіла, спо- на циркулюючі В-клітини в цих тваринах, не див- живання їжі та води, фекальні виділення, хімічний лячись на уведену дозу. До того ж, було виявлено аналіз сироватки, гематологія, аналіз сечі та фізи- відмінне від загального зменшення лімфоцитів чні дослідження. Додатково, у тварин з кожної гру- (20-43905) та не були виявлено значних відхилень в пи на, 1, 7 та 13 дні забирали кров й проводили будь-якому з оцінених параметрів, включаючи хі- аналіз оцінки рівня вмісту сироваткового антитіла мічний склад сироватки, аналіз сечі, вагу та тем- (288) та рівня Т- і В-клітин. На 13 день тварин з пературу тіла.

Груп ІІ та ІМ умертвляли, а відібрані тканини після 2. Фармакокінетичні дослідження з 288 і 288- приготування препаратів обстежували за допомо- Мх-дтТПК гою оптичного мікроскопу. Досліджували тканини Як описано вище, тварини з групи М СІ Р дос- серця, селезінки, печінки, нирки, легенів, кори го- лідження отримали одиничну дозу в 1Омг/кг 288. ловного мозку, спинного мозку, лімфатичного вуз- Лінійно-регресійний аналіз даних підтверджує, що ла, шлунку, клубової кишки, ободової кишки, ске- природне антитіло виділяли з циркуляції цих мавп летного м'язу, яєчка / яєчника, підшлункової із значенням 13 р 2 приблизно 4,5 дні. В подібно- залози і кістковий мозок. му дослідженні, використовуючи лінію мишей

Аналіз рівня циркулюючих Т та В-клітин в крові ВА! В/с, значення Д і» для природного та кон'юго- від тварин, підданих лікуванню, показав, що через ваного 288, що було визначено за допомогою лі- 13 днів тварини в Групах з ІІ по М втрачали 25090 нійно-регресійного аналізу (не показано), складає циркулюючих В-клітин (Фіг.19); уведення антитіла 8,75 днів (Фіг.22). Ці результати підтверджують, не впливало на рівень Т-клітин (дані не наведені). що кон'югація 288 не впливає на свій кліренс з

У тварин з Групи М, яким уводили одиничну дозу мишачої лінії ВА! В/с. 10мг/кг 288, також виявляли скорочення рівня цир- 3. Дослідження біорозподілу та локалізації пу- кулюючих В-клітин, еквівалентне такому, що спос- хлини за допомогою міченого 288-МХ-ДТПК терігали у тварин з інших груп. Спираючись на попередній експеримент з біо-

Тварин з груп І, ІЇ та М обстежували через 52 розподілу, що описаний вище (Розділ 2д), кон'югат дні (Фіг.20). Рівень В-клітин знову піднімався до 288 маркували радіоіїзотопом "п до рівня пито- рівня 27095 від звичайного через 38 днів, за винят- мої 123 активності 2,3мКі/мг та для того щоб ви- ком однієї тваринки з Групи Ії (РКОВО4) та однієї з значити біорозподіл міченого матеріалу, приблиз-

Групи М (РКО716). Рівень циркулюючих В-клітин у но 1,1мкКі уводили кожний з двадцяти мишей лінії

ВАГ В/с. Потім групи з п'яти мишей умертвляли містили від 1,390 до 6,095 уведеної дози на грам через 1, 24, 48 та 72 години та їхні органи та час- тканини; м'язова тканина містила приблизно 13905 тину шкіри, м'язів та кісток видаляли й готували уведеної дози на грам. для аналізу. На додаток, збирали урину та фекалії В. Дозиметрія та проводили аналіз протягом 24-72 годин. Рівень Сумарні дозиметричні дані, що відрізняються радіоактивності в крові падав з 40,395 уведеної від результатів біорозподільчих досліджень зви- дози на грам на 1 годину до 18,9 95 на 72 годину чайних мишей лінії ВАГ В/с й наведені в Таблицях (Таблиці 1-4; Фіг.23). Впродовж експерименту зна- 19 в 20 для мічених індієм та ітрієм кон'югатів, від- чення для серця, нирок, м'язів та селезінки зали- повідно, узгоджуються з представленими в літера- шалось в діапазоні 0,7-9,895. Рівень радіоактивно- турі даними, коли порівнювати на мілікюрі уведе- сті, виявлений у легенях, зменшувався з 14,2965 на ної дози (5), й підтверджують, що як мічені ітрієм, першій годині до 7,695 на 72 годині; так само і від- так і мічені індієм кон'югати 288 можуть бути на- повідний рівень уведеної дози на грам зменшував- дійно оцінені щодо клінічної ефективності у хворих ся й у печінці з 10,39 до 9,995. Ці дані використо- на лімфому. вували при визначенні оцінки радіації поглинутої Г. Токсикологія дози 11111-288-МХ-ДТПК (Таблиця 19). 1. 288: Тест загальної надійності одиничної

Біорозподілення міченого 90 кон'югату, що дози. має питому активність 12,2мКі/мг, оцінювали на Мишам та піддослідним кроликам уводили мишах лінії ВАВІ /є. Було отримано радіовключан- одиничну внутрішньочеревну дозу 288 (0,5мл або ня 29095 і радіомічені антитіла очищали за допо- 5,О0мл, відповідно) й спостерігали протягом семи могою РХВР. Накопичення радіоактивності в тка- днів. Явних слідів токсичності не виявили. нинах оцінювали в головних органах та шкірі, 2. 288 та 288-МХ-ДТПК: Імунологічні дослі- м'язах, кістках, а також в сечі та фекаліях через 72 дження з тканинами людини. години і представляли як відсоток уведеної дози/г Реакцію тканини мишачого моноклонального тканини. Результати, що наведені в Таблицях 5-8 антитіла 288 оцінювали, використовуючи планшет та на Фігурі 24, показують, що тоді, коли рівень з 32 різними людськими тканинами, фіксованими в радіоактивності у крові падає з приблизно 39,2905 ацетоні. Антитіло 288 реагує з антигеном анти- уведеної дози на грам після 1 години до приблиз- СО20, який має дуже обмежену структуру тканин- но 15,495 після 72 годин, рівень радіоактивності у ного розподілення, яку спостерігали тільки у підг- хвості, серці, нирках, м'язах та селезінці залиша- рупі клітин в лімфоїдних тканинах, включаючи клі- ється до певної міри сталим на рівні 10,295 або тини гематопоетичного походження. менше впродовж перебігу всього експерименту. Імунореактивність в лімфатичному вузлі спос-

Важливим є те, що рівень радіоактивності в кістках терігали на популяції дозрілих коркових В- коливався в межах від 4,495 уведеної дози на грам лімфоцитів, а також проліферуючих клітин в цент- кісток після 1 години до 3,2 після 72 годин. Узяті рах розмноження. Позитивну реактивність спосте- разом, ці результати підтверджують, що невелика рігали також в периферійній крові, областях В- кількість вільного ітрію зв'язана з кон'югатом, і що клітин мигдалеподібної залози, білій пульпі селезі- невелика кількість вільного радіометалу вивільню- нки та для 40-7095 медулярних лімфоцитів, знай- ється під час дослідження. Ці дані використовува- дених у вилочковій залозі. Позитивна реактивність ли при визначенні оцінки радіації поглинутої дози була також помічена у фолікулах Іатіпа ргоргіа з0у-288-МХ-ДТПК (Таблиця 20). (Пієрові бляшки - Реуег5 Раїспев) товстої кишки.

Для дослідження локалізації пухлини готували Нарешті, агрегати або окремі лімфоїдні клітини в 288-МХ-ДТПК радіомічений "п до рівня питомої стромі різних органів, включаючи сечовий міхур, активності 2,7мСі/мг. Сто мікролітрів міченого молочні залози, шию, стравохід, легені, привушну кон'югату (приблизно 24 сі) уводили потів кожній з залозу, простату, тонкий кишечник та шлунок, ма- 12 атимічних (аїШутіс) мишей, які були носіями ли також позитивну реактивність на антитіло 288. пухлин, спричинених Като5 В-клітинами. Вага Як було виявлено, всі прості епітеліальні клі- пухлини коливалась в межах від 0,1 до 1,0 грама. тини, а також стратифікований епітелій та сквамо-

Через певні проміжки часу після ін'єкції, 0, 24, 48 зний епітелій різних органів є нереактивними. Так та 72 години, за допомогою ретро-орбітальної пун- само реактивність не була помічена для нейроек- кції відбирали 5Омкл крові, мишей умертвляли тодермальних клітин, включаючи клітини мозку, способом цервікальної дислокації й видаляли спинного мозку та периферійної нервової системи. хвіст, серце, легені, печінку, нирки, селезінку, м'я- Мезенхімальні елементи, такі як клітини м'язів зи, стегно й пухлину. Після обробки та зважування скелету та гладких м'язів, фібробласти, епітеліа- тканин, використовуючи лічильник гама-часток, льні клітини та поліморфноядерні запальні кліти- визначали рівень радіоактивності в кожному виді ни, як виявилося, є негативними (не мають реак- тканини, а значення представляли як відсоток тивності). уведеної дози на грам. Тканинну реактивність кон'югату 288-МХ-ДТПК

Результати (Фіг.25) показують, що концентра- оцінювали, використовуючи панель з шістнадця- ція 288-МХ-ДТПК в тканинах незмінно збільшува- тьма зразками людської тканини, які були фіксова- лась протягом експерименту. Після 72 годин три- ні в ацетоні. Як раніше продемонстровано на при- дцять відсотків уведеної дози акумулювалось в родних антитілах, кон'югат 288-МХ-ДТПК пухлині. Рівень в крові, навпаки, знижувався про- розпізнавав антиген СО20, який показував дуже тягом експерименту від більш ніж 3095 при нульо- обмежену картину розподілу, будучи виявленим вому часі до 1395 після 72 годин. Всі інші тканини тільки на підмножині клітин лімфоїдного похо- (за винятком м'язових) на кінець експерименту дження. В лімфатичних вузлах імунореактивність спостерігали тільки у популяції В-клітин. Була по- При використанні великих доз 288 під час фа- мітна сильна реактивність в білій пульпі селезінки рмакологічного/ токсикологічного дослідження ан- та в медулярних лімфоцитах вилочкової залози. титіло не спричиняло значного фармакологічно-

Імунореактивність також спостерігали у окремих го/токсичного ефекту на будь-який з оцінюваних лімфоцитів сечового міхура, серця, товстої кишки, параметрів, як під час, так і після дослідження. Так печінки, легенів та матки та була віднесена на ра- само не було помічено порушень під час аналізу хунок запальних клітин, що є присутніми в цих тка- різних гістопатологічних видів, які досліджували за нинах. Як описано вище для природного антитіла, допомогою оптичної мікроскопії. Несподівано всі реактивності не спостерігали для нейроектодер- дози антитіла, які використовували, давали поміт- мальних клітин або для мезенхімальних елемен- не зменшення циркулюючих В-клітин. Проте рівень тів. циркулюючих В-клітин, що зменшувався, поверта-

ПШ. Обговорення вся до приблизно нормального рівня після того, як

Мишаче моноклональне антитіло анти-СО20, уведення антитіла припинялося. В групі мавп, що яке отримували за допомогою клону з тим самим отримали одиничну дозу (Група М), природне ан- позначенням, показує спорідненість до антигена титіло видаляли з циркуляції із уявною величиною

С020 В-клітини, яка може бути вищою за таку, що ВД (2 приблизно 4,5 днів. Як і очікувалося, коли ці спостерігали для антитіла ВІ, як визначили за до- фармакокінетичні дослідження виконували на ми- помогою порівняння з антитілами відомої специфі- шах лінії ВАГВ/с, антитіло 288 виводили із вели- чності для антигена СО20, та за допомогою аналі- чиною р 12 8,75 днів. Таким чином, ці дані дово- зу Скетчарда. Крім цього, дані імунопреципітації дять, що природне антитіло також може підтверджують, що антиген, виділений завдяки забезпечити певний клінічний ефект, коли уво- 288, мабуть, є таким самим антигеном, як і ген, диться як додаток до міченого кон'югату. виділений завдяки ВІ, через те, що обидва антиті- Всі дані авторів свідчать про те, що висока ла виділяли дублет з відносною молекулярною спорідненість антитіла 288 та кон'югату МХ-ДТПК вагою 33 ії З5КД. Цитофлюорографічний аналіз демонструє обмежений характер реактивності специфічності антитіла 288 для лімфоцитів пери- людської тканини. Крім цього, у приматів природне ферійної крові показує, що антитіло специфічно антитіло є нетоксичним і продукує короткочасний взаємодіє з В-клітинами та не показав реактивнос- кліренс В-клітин; проте після того, як антитіло зві- ті для Т-клітин або інших типів лімфоцитів. Нареш- льняється від циркуляції, рівень В-клітин віднов- ті, попередні дані із стабільності підтверджують, люється доволі швидко. що антитіло є стабільним при 30"С протягом 12 На додаток, мічені індієм та ітрієм кон'югати тижнів без втрати імунореактивності. 288-МХ-ДТПК з'являлись стабільно іп мйго без

При з'єднанні антитіла 288 з метилбен- втрат радіометалу впродовж більш тривалої інку- зил(діетилентриамінпентаоцтовою) кислотою (МХ- бації в людський сироватці. Нарешті, оцінки дози

ДТПК) практично не спостерігали зменшення іму- радіації, які отримували на підставі біорозподілу нореактивності відносно природного антитіла. мічених З9уУ або /П|Іп 288-МХ-ДТПК у мишей лінії

Більш того, радіомаркування кон'югату або "п ВА! В/с, узгоджуються, на мілікюрі уведеної дози, з або З0у, давало кон'югати з імунореактивністю оцінками дози, які отримали на підставі даних клі- 10095 та 6095 відповідно. Дослідження стабільності нічних досліджень людини з використанням сполу- мічених "п або З0У кон'югатів, витриманих в чених антитіл неподільного ідіотипу, мічених цими людській сироватці протягом 96 годин при 37"С, ізотопами. показали незначну втрату радіометалу в ході екс- ЇМ. Короткий виклад протоколу доклінічного перименту, підтверджуючи, що кон'югати будуть розвитку радіомаркування "тіх-4-5поої" ("змішай- стабільними під час клінічного застосування. та-отримай) для приготування у-288-МХ-ДТПК

Дослідження з локалізації пухлини у атимічних А. Вступ мишей, при застосуванні міченого індієм препара- Мічене З0у мишаче моноклональне антитіло ту 288-МХ-ДТПК, показали, що збільшення кілько- анти-СО20 (288) оцінювали в клінічних випробу- сті кон'югату, зв'язаного з клітинами пухлини в ході ваннях Фази 1 для лікування рецидиву В-клітинної експерименту, відбувається без незвичайного на- лімфоми. Основний протокол, який використову- копичення в інших тканинах. Крім цього, дозимет- вали для приготування міченого ітрієм антитіла, ричні оцінки, які отримували на основі дослідження використовував етап рідинної хроматографії висо- біорозподілу, узгоджуються з опублікованими в кої роздільної здатності (РХВР) для видалення літературі даними. Нарешті, дослідження перехре- зв'язаного без участі протеїну радіоізотопу перед сної реактивності людської тканини з природними тим, як підібрати склад та увести його пацієнтам. та кон'югованими антитілами, показали, що обид- На жаль, цей процес є дуже тривалим та призво- ва антитіла розпізнають антиген з сильно обмеже- дить до більш тривалої дії радіоізотопу на антитіло ним розподілом тканин, реагуючи тільки з підмно- в незахищеному стані. Це призводить до збільше- жиною клітин в лімфоїдних тканинах, включно з ного радіолізу антитіла з супутнім зменшенням тканинами гематопоетичного походження. Узяті імунореактивності. На додаток, трудомісткий бік разом, ці результати доводять, що кон'югація не процесу робить його важким для приготування змінювала тканинної специфічності антитіла, і що більш ніж одної дози на день в радіофармації. радіомічені кон'югати є стабільними іп мімо й розпі- Спрощення процесу прискорило б впровадження у знають антиген СО20, присутній на поверхні пух- клінічних умовах, як альтернативи, використання лин, індукованих дослідним шляхом в атимічних МІРІ Рпагтасу Бегуісез (Аптечних Служб) як ра- мишах. діофармації.

Відповідно, було розроблено модифіковану 1,8мл поліпропіленових трубах мікроцентрифуги, процедуру маркування, названу як «тіха5поої» що загвинчувались пробкою. спосіб, і яка усуває потребу для РХВР очистки, 3. Визначення радіоінкорпорування одночасно підтримуючи високий рівень уведення Радіоінкорпорування визначали, тричі викори- радіоіїзотопів та поліпшену здатність зберігати іму- стовуючи миттєву тонкошарову хроматографію нореактивність. Дослідження стабільності іп мікго, а (МТШХ) у відповідності до ТОР 5Р-13-008. Зага- також дослідження з біорозподілу в мишах пока- лом, протокол був таким: радіомічений кон'югат зали, що радіомічене антитіло, яке приготували, розводили 1:20 в 1Х РВ5, який містив мМ ДТПК використовуючи спосіб «тіхе5поої», є порівнюва- або 5мММ ЕДТК, потім порції в їІмкл краплями на- ним з матеріалом, отриманим з використанням носили за 1,5см від одного краю смужки розміром сучасного процесу РХВР очищення. Результати 1х5 см з 50 паперу для МТШХ (Сеїтап 5сіепсе). цих доклінічних досліджень вказують на те, що цей Папір обробляли, використовуючи 1095 ацетат новий "тіх-5-5п0о0ї" протокол можна застосовувати амонію в суміші метанол:вода (1:1, об/об). Смужки для приготування міченого у 288-МХ-ДТПК, при- сушили, різали навпіл і за допомогою сцинтиля- датного для використання в клінічних випробуван- ційного підрахунку визначали радіоактивність кож- нях. ної частини. Радіоактивність нижньої половини

Б. Матеріали і способи Матеріали смужки (радіоактивність білка) виражали як відсо- 1. Клітини ток від загальної радіоактивності, яку визначали

Лінії людських лімфобластичних клітин ЗВ через додавання значень як для нижньої, так і (СО020 позитивні) та НЗВ (С020 негативні) отриму- верхньої половинок. вали з Атегісап Туре Сийиге СоПесійп та зберіга- 4. Протокол «тіхе5Ппоої» для міченого ітрієм- ли в КРМІ-1640, який містить 1095 зародкової би- (901 288-МХ-ДТПК чачої сироватки й доповненого глютаміном. Антитіла радіомітили вільним від носія хлори- 2. Антитіла дом 9У, який постачався Атегзпат в 0,04М НСІ.

Антитіло 288 очищали за допомогою Вироб- Аліквота радіоіїзотопу (10-20мКі/мг антитіла) помі- ничого відділу із супернатанту біореактора на пус- щали у пропіленову трубку й 0,02Х об'єм вільного тотілих волокнах, використовуючи раніше описа- від металу 2М ацетату натрію додавали для того, ний в ІМО (ВВ-ІМО 4850/4851) протокол. щоб довести розчин до рН 3,6. Додавали миттєво

З. Додаткові реагенти 28в8-мадтпк (0,Змг; 10,О0мг/мл в нормальному со-

Хлорид ітрію-І90| отримували від Атегзпат. льовому розчині) й розчин обережно перемішува-

Всі інші реагенти отримували з джерел, описаних в ли. Розчин перевіряли рН папером щоб перекона- цитованих нижче повідомленнях. Реагенти, які тись, що значення рН є 3,8-41, і витримували 5 використовували для протоколів уведення радіоа- хвилин. Реакцію зупиняли, переносячи реакційну ктивних ізотопів, обробляли з метою видалення суміш в окрему поліпропіленову трубку, яка місти- сторонніх іонів важких металів, які могли б конку- ла 1ХРВ5 з 75мг/мл людського сироваткового рувати з радіоізотопами на стадії уведення радіоа- альбуміну (ЛСА) і 1мММ діетилентриамінопентаоц- ктивних ізотопів (див. розділ Способи). Реагенти тової кислоти (ДТПК) та обережно перемішували. виробляли за умов ОМР за допомогою Виробничо- Радіомічене антитіло зберігали при 2-86. го відділу (Мапиїасіигіпд дераптепО) І ОЕС, до- Питому активність визначали, вимірюючи ра- тримуючись встановлених Ваїсп / Ргодисійоп діоактивність відповідної аліквоти міченого кон'ю-

Весогав. гату. Це значення коригували для оберненої ефек-

Способи тивності, пов'язаної з концентрацією білка в 1. Приготування 288-РАХ-ДТПК кон'югаті, яку визначали за допомогою поглинання

МХ-ДТПК клінічної якості отримували від при 280нм й виражали як мКі/мг білка.

Соцпіег Іттипоіоду як динатрієву сіль у воді й 5. Імунореактивність іп міо ітрій-(90|-288-МХ- зберігали при - 70"С. Кон'югат (288-МХ-ДТПК) го- дтПк тували за допомогою Виробничого відділу. В цих Імунореактивність міченого 90 кон'югату ви- дослідженнях використовували дві різні партії значали, використовуючи БОР Ф5РІ13-009, осно- кон'югату; обидві постачались в нормальному со- ваний на модифікованій версії суцільно-клітинного льовому розчині при 1Омг/мл. Кон'югат набирали в аналізу зв'язування, описаний І іпато. Збільшуючи стерильні 2-х мл поліпропіленові шприци й збері- концентрацію логарифмічної фази, СО-позитивних гали при 2-86. 5В клітини або СО-негативних Н5ЗВ клітини дода- 2. Дотримання умов невикористання металу вали для подвоєння множин з 1,5мл-х поліпропі-

При виконанні маніпуляції з реагентами мінімі- ленових трубок; кінцевий об'єм клітин є 40мл. Ра- зували можливість металевого забруднення. З діомічений кон'югат розводили до кінцевої цією метою використовували поліпропіленові або концентрації 1-2,5нг/мг й додавали в кожну трубку. полістирольні пластикові контейнери, такі як кол- Після 90-хвилинного витримування клітини оса- би, лабораторні склянки та градуйовані циліндри. джували за допомогою центрифугування, а супер-

Перед використанням їх мили АїЇсопох й інтенсив- натант збирали. Залишкову радіоактивність фрак- но промивали водою Міїйї-О або водою для іригації ції супернатанту визначали сцинтиляційним (ВДІ) (Магег тог Іггідайоп - М/РІ). Для точних мані- лічильником. Дані представляли у вигляді графіка пуляцій з маленькими об'ємами для піпеток вико- залежності показника загальної доданої радіоак- ристовували наконечники (Віокед), які не містять тивності, поділеної на радіоактивність клітин, від металу. З великими об'ємами реагентів маніпуля- оберненої величини кількості клітин на пробірку. ції виконували, використовуючи стерильні пласти- Відтинок на осі Х представляє імунореактивну кові серологічні піпетки. Реакції легко проводили в фракцію.

6. Стабільність іп міїго підібраного за клінічних В. Результати умов складу ітрій-І90)-288-МХ-ДТПК 1. Приготування міченого ітрієм-(90| 288-МХ-

Кон'югат 288-МХ-ДТПК радіомітили за допо- ДТПК з використанням протоколу «тіха5поої» могою З0у й підбирали склад так, як описано в Попередні експерименти з оцінки кінетики реа- протоколі "тіха5поої", наведеному вище. Було кцій мічення радіоактивним ізотопом з 288-МХ- приготовлено дві партії міченого кон'югату: одну ДТПК та 90у показали, що при рН 3,6-4,0, 9595 ра- партію використовували для оцінювання стабіль- діоїзотопу приєднувалось протягом 5-10 хвилин ності радіоінкорпорації, а другу партію використо- протікання реакції. Відтворювання цієї радіоінкор- вували для оцінки утримання радіоактивності. Пі- порації (95,795541,790) потім була підтверджена дібрані склади кон'югатів витримували при 4" даними неупередженого аналізу для розширеного протягом 48 годин, а аліквоти аналізували через протоколу (Посилання на доповідь КУО, озаглав- часові проміжки 0, 24 та 48 годин, використовуючи лену "Затвердження протоколу мічення радіоакти- нередукційну 505-РАСЕ та авторадіографію. Іму- вним ізотопом «тіх5поої» для приготування клі- нореактивність через кожний часовий проміжок нічних доз З0у-288-МХ-ДТПК; автор, Р.Спіпп; Дата: аналізували, використовуючи кількісний аналіз, 22 квітня 1994). Приготування міченого ітрієм-|90) описаний вище. 288-МХ-ДТПК з використанням цього протоколу 7. Стабільність іп міо ітрій-(901-288-МХ-ДТПК "тіх-45-5по00ї" давало продукт, який можна отриму- у людській сироватці вати за допомогою методу РХВР Ідив. ВВ-ІМО

Стабільність міченого ізотопом у 288-МХ- 4850/4851|. Було встановлено, що протокол ра-

ДТПК оцінювали за допомогою витримки в людсь- діомічення здатний відтворювати питому актив- кій сироватці при 37"С протягом 72 годин. Сполу- ність, що зазвичай коливається в інтервалі від 10 чене антитіло радіомітили ітрієм-І90| і підбирали до 15мКі/мг антитіла. склад як описано вище. Радіомічений кон'югат Імунореактивність міченого у 288-МХ-ДТПК розводили 1:10 звичайною людською сироваткою й приготовленого з використанням цього протоко- (не активованою температурою), а аліквоти ви- лу зазвичай становила більш ніж 7095 порівняно з тримували в пластикових трубках при 37"С. У за- 55-60905, які спостерігали під час процедури пере- значений час зразки видаляли й аналізували за вірки достовірності протоколу РХВР (Фігура 26). допомогою нередукційної 5В5-РАСЕ та авторадіо- Ця відмінність можливо є наслідком знижених графії. ефектів радіолізу завдяки скороченому часу інку- 8. Біорозподіл ітрій-І901-288-МХ-ДТПК бації за протоколом "тіх-5-5Ппоої". Ці результати

Біорозподіл в тканині міченого ізотопом у були типовими і, про що йдеться нижче, є зразком 288-МХ-ДТПК оцінювали на мишах (лінії ВАСВ/с) процедури перевірки для розширеного протоколу віком від восьми до десяти тижнів. Радіомічений приготування клінічних доз радіоміченого кон'ю- кон'югат готували та підбирали склад за методи- гату. кою, описаною вище. У вени мишам уводили 5мкКі 2. Стабільність іп мйго міченого У 288-МХ- міченого ізотопом У 288-МХ-ДТПК і групи з п'яти дтк мишей умертвляли через 1, 24, 48 та 72 години. Попередні експерименти з незахищеним міче-

Після смерті видаляли хвіст, серце, легені, печін- ним 90 кон'югатом, який отримували за допомо- ку, нирки, селезінку, м'язи, стегно, промивали та гою методу РХВР, показали, що радіоліз призво- зважували їх; для аналізів брали також зразки див до значного розпаду антитіла та втрат крові та шкіри. Радіоактивність кожного виду тка- імунореактивності. Через це з метою мінімізувати нини визначали, вимірюючи за допомогою лічиль- ефект радіолізу було розроблено склад буферу. ника гама-часток гальмівне випромінювання, і ви- Було показано, що людський сироватковий альбу- значали відсоток уведеної дози на грам тканини та мін (ЛСА) є ефективним засобом мінімізації руйну- відсоток уведеної дози на орган. вання антитіла, викликаного радіолізом. Оцінку 9. Дозиметрія проводили на радіоміченому кон'югаті, отримано-

Дані з біорозподілу, отримані при уведені ми- му методом "тіх-4-5поо0ї", для того, щоб підтвер- шам міченого ізотопом у 288-МХ-ДТПК, викорис- дити ефективність складу для мінімізації радіолізу. товували для обчислення оцінки дози радіації, Мічене 90У антитіло, радіомічене до питомої акти- отриманої від дози в 1мкКі, уведеної пацієнту вагою вності 14,5мКі/мг антитіла, складали в 1Х РВ5, рн 7Окг. Оцінку проводили у відповідності до методів, 7,4, який містив 75мг/мл ЛСА та їмМ ДТПК. Де- адаптованих Медісаї! Іпіегпа! Кадіакйоп бозе (МІКО) градацію кон'югату 288-МХ-ДТПК оцінювали після

Сотютійеєе Товариства з ядерної медицини 0, 24 та 48 годин, використовуючи 505-РАСЕ та (Зосієїу ої Мисієваг Медісіпе). Ці обчислення були авторадіографію. На Фігурах 2, З та 4 показано, що виконані паном Філіпом Хаганом, Мисіеаг Медісіпе радіомічений кон'югат не демонструє значного

Зегмісе, МА теадіса! Сепіег, І а доПа, СА 92161. розпаду протягом 48-годинного періоду, коли ви- 10. Затвердження (легалізація) протоколу при- тримувався при 4"С. Миттєвий тонкошаровий хро- готування клінічних доз ітрій-І90І-288-МХ-ДТПК матографічний аналіз не показав втрат ЗУ впро- (Посилання на доповідь КУО, що має назву довж 48-годинного витримування; ці результати "Затвердження протоколу мічення радіоактивним було підтверджено за допомогою /505- ізотопом «тіхе5поої» для приготування клінічних РАСЕ/авторадіографічного аналізу (Таблиця 28). доз З0у-288-МХ-ДТПК; автор, Р.Спіпп; Дата: 22 Імунореактивність також залишалась відносно квітня 1994). сталою й складала 28895 (Таблиця 29).

Таблиця 28

Стабільність 0уУ 288-МХ-ДТПК отриманого за протоколом "Міх-4-5ПпПоої" в РВ5, який містить людський сироватковий альбумін і ДТІПК ни жининннши нини нини

Таблиця 29

Імунореактивність у 288-МХ-ДТПК отриманого за протоколом "Міх-4-5ПпПоої" в РВ5, який містить людський сироватковий альбумін і ДТІПК

Імунореактивність 11118791

Складений за клінічних умов, мічений У 288- зауважити, що радіоінкорпорування антитіла, яке

МХ-ДТПК зі питомою активністю 15,7мКі/мг витри- використовували в цьому досліджені, було нижчим мували протягом 72 годин при 37"С в людській за таке, що отримували в дослідженнях з перевір- сироватці. Зразки, які аналізували за допомогою ки достовірності протоколу мічення. Цей нижчий нескороченої БХО5-РАСЕ та авторадіографії (Фігу- рівень радіоінкорпорування був наслідком нижчої ра 30), не показали втрат радіоізотопу впродовж якості партії хлориду ЗОМ, який використовували часу витримування (Таблиця 30). Денситометричні саме для цього приготування міченого антитіла. сканування авторадіограм при нульовому часі ви- Нижчій рівень радіоіїнкорпорування не дозволяв тримки та при 72 годинах не показали значного висновувати, що мічений ітрієм кон'югат, отрима- розпаду міченого кон'югату (Фігури 31 та 32). Ці ний за методом «тіхб5Ппоої», є стабільним за цих результати було підтверджено тонкошаровим умов інкубації. хроматографічним аналізом (Таблиця 30). Слід

Таблиця 30

Стабільність кон'югату 9у-288-МХ-ДТПК, витриманого в людській сироватці й 01111111 857111111171 11111111 88811111 2241117 171111111111117641171 17111111 8900111111111

Зразки людської сироватки, що містять З0у- що рівень радіоактивності крові після першого ча- 288-МХ-ДТПК (спечифічна активність15,7мКі/мг), су зменшується від приблизно 43905 уведеної дози аналізували для незв'язаного білком 90У після за- на грам (95УД/г) до приблизно 1695 після 72 годин; значеного часу, використовуючи смужки для мит- після 24 годин і більше, рівень радіоактивності в тєвої тонкошарової хроматографії та 505- серці, нирці та селезінці залишався майже сталим

РАСЕ/авторадіографію. на рівні 4-895. Для легень та печінки радіоактив- 3. Вивчення біорозподілу з ітрієм-І90| 288-МХ- ність зменшувалася від 10-1295 після 1 години до дтПк 8-1095 після 72 годин. Для шкіри радіоактивність

Біорозподіл міченого 90У кон'югату зі питомою була відносно сталою, приблизно на рівні 3905 після активністю 11,5мКі/мг антитіла та рівнем радіоін- 24 або 72 годин. Радіоактивність в м'язах залиша- корпоруванням 29595, оцінювали на мишах лінії лась приблизно 0,695 впродовж усього ходу дослі-

ВАГ В/с. місцезнаходження радіоактивності в тка- дження. Поглинання радіоактивності стегном (кіст- нинах оцінювали для головних органів, шкіри, м'я- кою) залишалось на рівні, меншому за 4905 після зів, кісток, сечі та фекалій після 72 годин й вира- всіх часових відтинків, вказуючи те, що кількість жали у відсотках уведеної дози на г тканини та у вільного ітрію у зразку кон'югату була незначною і відсотках уведеної дози на орган. Результати, на- що невелика кількість радіометалу виділялася під ведені в таблицях 31-34 та Фігурі 33, показують, час ходу дослідження.

Таблиця 31

Розподіл активності після 1 години М. Уведення у-288-МХ-ДТПК звичайним мишам лінії ВАСВ/с

Середні значення хз СВ (середньоквадратичне відхилення)

Грам Грам Грам беча.їд///// ЇЇ

Фекалі//// ЇЇ 77777717 нІн:6ШіІ ІВ ОВ ТТ ИН В Ех У ДИН

Кількість мишей - З

Середня вага - 19,58 грамів 5 0,71 грамів

Таблиця 32

Розподіл активності після 24 години ІМ. Уведення у-288-МХ-ДТПК звичайним мишам лінії ВАГ. В/с

Середні значення хз СВ (середньоквадратичне відхилення)

Грам Грам Грам бечаїд///// ЇЇ гг

Фекалі//// | 77777771

С 111111111111Сума.//// | 7 тзбгабиво

Кількість мишей - З

Середня вага - 22,09 51,73 грамів

Таблиця 33

Розподіл активності після 48 години Г.М. Уведення у-288-МХ-ДТПК звичайним мишам лінії ВАГ. В/с

Середні значення хз СВ (середньоквадратичне відхилення)

Грам Грам Грам

Продовження таблиці 33

Пет ЕОМ ООН НО НН НО: х УНН

Фекалі//// |! 77777777 С1111111112о6вб1

С 11111111111сума////// | 7 572витво

Кількість мишей - З

Середня вага - 21,48 52,05 грамів

Таблиця 34

Розподіл активності після 72 години Г.М. Уведення 20у-288-МХ-ДТПК звичайним мишам лінії ВАГ. В/с

Середні значення хз СВ (середньоквадратичне відхилення)

Грам Грам Грам бечаї/////// ОЇ 77777717 535561

Фекали/////Ї 77777717

С 1111111111111сума////// | б5атило

Кількість мишей - З

Середня вага - 20,76 5 0,97 грамів 4. Дозиметрія наведено в Таблиці 35. Ці результати можуть

Поглинуті дози радіації для "стандартної" бути порівняні з результатами, отриманими рані- людини вагою 7Окг, обчислені для міченого У ше з використанням міченого У 288-МХ-ДТПК, кон'югату з використанням даних з біорозподілу у який приготували, використовуючи спосіб мічення мишей (значення у 95 УД/орган в Таблиці 31-34), радіоактивним ізотопом РХВР.

Таблиця 35

Дозиметричні оцінки радіації, отримані на даних уведення міченого ітрієм-І99| 288-МХ, рівномірно розподі- леного в стандартній людині (7Окг) та на даних розподілення в тварині після 72 після ін'єкції 11111111 рад | 77777777777С7ЄЮЄЮЄЮЄєНХ«6 Т.1111171| радо

Аагепаїв 0,534 Яєчники 0,534

Стінка міхура 0,534 Підщлункова залоза 0,534

Стінка шлунка 0,534 Скелет

Тонка кишка 1158 Трубчата кістка 1,466

Стінка ОЇ. кишки 1,657 Трабекулярна кістка 1,466

Стінка СІ. кишки 2,380 Мозок (червоний) 4,452

Нирки 7,015 Мозок (жовтий) 2,096

Легені 2,157 Інші складові 1,466

Інші тканини Шкіра 6,603

М'язи 2,646 Селезінка 4,973 тваринний жир 2,546 Яєчка 0,534

Кров 2,646 Щитовидна залоза 0,534

Мозок 2112 Матка (Мопдгма) 0,767

Серце 2,646 Все тіло 1,755

Посилання: схема обчислення поглинутої дози для біологічно розподілених радіонуклідів, МІКО У. ої

Мисі. Мейа./Зи!иррі. 41, 2/68, обчислення, виконані з використанням Зргеадзпеєеї Тетріайе іп Зутрпопу (Соїш5 ОемеІортепі Согрогайоп) та створені РпйЇїр С. Надап, М5, Мисіеаг Медісіпе Зегмісе, МА Нозрінаї,

Зап Оієдо, СА 92161 4. Протокол перевірки достовірності приготу- лень. Для того щоб оцінити достовірність процесу вання клінічної дози ітрію-І90І-288-МХ-ДТПК внаслідок різниці у часі мічення, партії від Ме1 до

Загалом десять партій для перевірки досто- Мо8 готували, використовуючи 10-хвилинний час вірності було приготовлено в МРІ РПагтасу мічення; партії Ме9 та 10 готували, використовую- зегмісе5, пс. Результати тестування по кожній чи час реакції, рівний 5хв. На основі результатів партії зведені в Таблиці 36. Обчислювали серед- тесту для десяти партій для перевірки достовір- нє значення для кожного результату тесту й зна- ності були створені специфікації вивільнення. чення відповідних середньоквадратичних відхи- Специфікації вивільнення наведено в Таблиці 37.

Таблиця 36

Результати аналізу партій для перевірки достовірності міченого у 288-МХ-ДТПК, приготовленого з використанням "Міх-5-5поої" обімунореактивність | 72,8 | 93,3 | 71,7 | 702 | 606 | 682) 79,5 | 724 | 88,2 | 68,5 | 745598 радіоїнкорпорування | 97,5 | 97,0 | 93,5 | 96,0 | 94,7 9491 9591965) 97,5 | 93,5 | 957514

СпецифаАкт.(мКумгу | 100 | 120 | 112 | 9,8 | 113 |1350| 113111 | 115 | 10,7 | 120,9 кт ПНЯ ПНЯ ПНЯ ПОН ПОН КОЛОН КОНЯ КОНЯ КОНЯ КОКОН КОХ

Таблиця 37

Специфікації вивільнення для міченого у 288-МХ-ДТПК, отримані з використанням протоколу "Міх-5-5поої" 1 (калібрування часу початку відліку)

Г. Обговорення колу було збільшене утримування імунореактив-

Вихідний протокол мічення радіоактивним ності (27095), можливо внаслідок коротшого часу ізотопом для приготування міченого у 288-МХ- піддавання антитіла дії радіоїзотопу високої ене-

ДТПК для видалення з препарату не зв'язаного ргії перед додаванням людського сироваткового білком 29У використовував, зокрема, трудомісткий альбуміну, який забезпечує захист проти радіолі- та довготривалий етап очистки за допомогою зу. Це утримування імунореактивності є більшим

РХВР. З метою спрощення цього процесу та його за раніш отримане з використанням методу доступності для використання в клінічних умовах, РХВР. зусилля було спрямовано на вилучення стадії Вивчення стабільності міченого 20У кон'югату,

РХВР на користь отак званого протоколу який був приготовлений з використанням прото- «тіха5поої». Метою було ідентифікувати умови колу «тіха5Ппоої» й витриманий в буфері підібра- мічення радіоактивним ізотопом, які б могли при- ного складу (ІХРВ5, який містить 75мг/мл людсь- водити до дуже високого радіоінкорпорування кого сироваткового альбуміну і їмМ ДТтТПК) ізотопу в кон'югат, уникаючи у такий спосіб пот- протягом 48 годин при 4"С, не показало втрат реби у стадії очистки. Було встановлено, що радіоїзотопу і показало повне утримання імуно- »9595 радіоінкорпорування могло б бути отрима- реактивності. Дослідження стабільності, які про- но при рН 3,6 при витримуванні від п'яти до деся- водили з людською сироваткою протягом 72 го- ти хвилин. Додатковою перевагою цього прото- дин при 37"С , також показали мінімальну втрату радіоізотопу. Ці результати зі стабільності можуть ває потребу у стадії рідинної хроматографії висо- бути порівняними з раніш отриманими для кон'ю- кого розділення (РХВР), що використовується гату, який радіомітили з використанням протоко- зараз для вилучення не зв'язаного білком радіоі- лу РХВР. зотопу. Спрощений протокол вилучає цю трудо-

Біорозподіл на мишах лінії ВАГ! В/с з викорис- містку стадію очищення, в той же час підтримую- танням міченого ЗУ кон'югату, отриманого за чи високий рівень інкорпорування радіоізотопів допомогою методу "тіх-апа-5поої", не показав (29595) та поліпшене утримування імунореактив- незвичайного місцезнаходження в тканинах. Ці ності (27095). Було виявлено, що радіомічений результати підтвердили, що радіомічене антитіло кон'югат підібраного за клінічних умов складу є не змінювалося такою мірою, щоб суттєво впли- стабільним іп міо, при витримування при 4"С вати на характеристики антитіла іп мімо. Ці ре- протягом 48 годин, за рівнем утримування радіоі- зультати можуть також бути порівняні з отрима- зотопу та імунореактивності. До того ж, радіомі- ними раніше при дослідженні з радіоміченим чений кон'югат залишався стабільним, після ви- кон'югатом, приготовленим з використанням для тримування в людській сироватці при 37"7С радіомічення методу РХВР |див. ВВ-ІМО протягом 72 годин. Дослідження з біорозподілу 4850/4851). Дозиметричні оцінки для "стандарт- на мишах лінії ВАГ В/с не показали незвичайного ної" людини вагою 7Окг, розраховані на основі накопичення в тканинах, включаючи кісткову. даних з біорозподілу для мишей узгоджуються з Оцінка поглинутих доз радіації в "стандартному" даними, отриманими на кон'югаті з використан- (72кг) тілі людини могла бути порівняною з отри- ням процедури РХВР Ідив. ВВ-ІМО 4850/48511. До маною в активних (оп-доіпд) клінічних випробу- того ж, результати дозиметрії можуть бути порів- ваннях з використанням міченого у 288-МХ- няними з результатами, що отримано для білків, ДТПК. Результати цих досліджень показали, що залучених до активних клінічних досліджень мічений У 288-МХ-ДТПК, отриманий з викорис- (ІЕС дослідження Ж1315), якщо порівнювати на танням протоколу «тіх5Ппоої» міг бути порівня- мілікюрі уведеної дози. В дослідженні на шістьох ний з отриманим за допомогою традиційного пацієнтах середні значення (радаСВ) для тіла в процесу РХВР. Достовірність розширеного прото- цілому, серця, печінки та селезінки становили колу приготування придатного для застосування 1,4020,57, 10,5034,68, 9,8958,91 та 9,7556,00 від- в клінічних умовах міченого кон'югату показала, повідно. що спосіб забезпечує відтворюваність і що про-

Перед впровадженням протоколу мічення дукт може бути порівняний з таким, що отримали, "тіх-апа-5поої" при приготуванні придатного до використовуючи загальнозастосовуваний метод клінічних умов у-288-МХ-ДТПК, було потрібно РХВР. Ці результати доклінічних досліджень по- оцінити відтворюваність протоколу. Через це, казують, що цей новий «тіхе5поої» протокол використовуючи різні партії хлориду ЗУ, було може бути використаний для приготування міче- приготовлено 10 партій зразків для перевірки ного зу 288-МХ-ДТПК, придатного для застосу- достовірності. Для десяти приготовлених партій вання в клінічних випробуваннях. значення імунореактивності, отримані з викорис- Приклад 1. Радіоінкорпорування - комплект танням "тіх-апа-5поої", знаходились в діапазоні обладнання й аналіз. від 60,69 до 93,390 із середнім значенням 74,590 Ї. Резюме та медіаною 72,195. Це утримання імунореактив- Метою даного винаходу була розробка про- ності є значно кращим за приблизно 6095, яке токолів комплекту мічення радіоактивним ізото- отримували раніше, використовуючи теперішній пом для приготування мічених "п та 90 288- метод РХВР (в діапазоні від 54,99 до 65,190; се- МХ-ДТПК (Іп288 та Уу288 відповідно) та визначи- реднє значення 60,295). Середнє значення інкор- ти специфікацію виходу для клінічних продуктів. порування для десяти партій становило 95,95 (в Протоколи комплекту мічення радіоактивним ізо- діапазоні від 93,595 до 97,590). Це значення може топом являлися відтворюваними стосовно радіо- бути порівняно з раніш отриманим за допомогою інкорпорування та зв'язування з антиген- методу РХВР (в діапазоні від 91,795 до 93,790 та позитивними ЗВ клітинами і показують придат- середнім значенням 91,395). Для десяти партій ність комплекту мічення радіоактивним ізотопом також могли бути порівняні результати з ендоток- для використання в клінічних випробуваннях. сину, концентрації антитіла, концентрації радіоа- Рекомендується, щоб норми виходу "п та 90у ктивності, питомої активності, загальної радіоак- для радіоіїнкорпорування та зв'язування були тивності тари, загальної концентрації білка, рН та затвердженими на рівні 29595 та 27095 відпо- стерильності. Разом ці результати підтвердили відно. відтворюваність методу «тіхУ5Ппоої». До того ж, ІІ. Вступ автори оцінювали варіативність процесу внаслі- Мічене 90уУ мишаче моноклональне антитіло док різного часу мічення, проводячи реакцію антиСО20 (уУ288) легко оцінюється в клінічних впродовж 5 та 10 хвилин. Через те що не було випробуваннях лікування рецидиву В-клітинної помічено суттєвої відмінності для двох реакцій лімфоми. Ізотоп ітрію має брак гама-компоненту, різної тривалості, було вирішено, що в кінцевому що робить його непридатним для системи візуа- протоколі належить використовувати коротший лізації Через це мічений "Мп 288-МХ-ДТПК час витримування. (Іп288) буде використовуватися для аналізу ло-

Д. Резюме калізації пухлини та дозиметрії у пацієнтів до або

Автори розробили процедуру мічення, яка після лікування міченим ітрієм препаратом. Про- має назву «тіху5поої» метод, для приготування токол, що використовується тепер для приготу- клінічних доз міченого ЗУ 288-МХ-ДТПК, яка усу- вання Іп288 та М288, і називається методом

«тіха5поої», дає радіомічені антитіла, що прида- 3. Кінцевий продукт належить увести пацієнту тні для клінічних досліджень. Проте, спрощення протягом 8 годин заключної 9 стадії, про яку йде- процесу мічення прискорило б приготування дози ться нижче. в клінічних умовах. Протокол мічення радіоактивним ізотопом

Новий комплект мічення радіоактивним ізо- Іп288 топом переважно складається з чотирьох компо- Процедура нентів: 1) 288-МХ-ДТПК в нормальному з низьким 1. Об'єм ""ЧпСіз, який додавали в реакційну вмістом металу сольовому розчині при 2мг/мл; 2) пляшечку, обчислювали як наведено нижче: 5ОММ ацетату натрію, який використовується для а. Концентрацію радіоактивності після часу забезпечення розчину радіоіїзотопу придатним мічення радіоактивним ізотопом в мКі/мл: для мічення рн; 3) підібраний буфер (1Х РВ5, рн Со-концентрація радіоактивність під час калібру- 7,4, який містить людський сироватковий альбу- вання (див. Сертифікат аналізу виробника). мін та 1мМ ДТПК); 4) пусту 10мл скляну пляшечку діезміна в часі (позитивне значення-після ка- (реакційну пляшечку). Всі компоненти, які випро- лібрування, негативне значення-перед калібру- буються, мають бути стерильними й не містити ванням). пірогену. й й й Концентрація радіоактивностіпід час радіомічення - --0

Це повідомлення підсумовує придатність соото3(А) цього комплекту мічення радіоактивним ізотопом, який є простим у використанні, і який забезпечує вихід радіомічених антитіл з рівнем радіоінкорпо- б. Об'єм ""псСіз, який додавали в реакційну рування 29595 та придатне утримування зв'язку з пляшечку: антиген-позитивними клітинами. Для клінічних сн МКС об'єм для додавання вреакційну пробірку продуктів рекомендується тестування норм ви- Концетраці я радіоактивності під час мічення ходу.

ПІ. Матеріали й способи для інкорпорування ' й я,

А. Реагенти, які входять до комплекту мічен- 2. Об'єм в ЗОмл ацетату натрію, який слід до- ня радіоактивним ізотопом давати в реакційну пляшечку обчислювали як 1. 288-МХ-ДТПР, ІЕС; партія (лот) 2 наведено нижче: . !

О823958М2 Об'єм ""псСіз, який додали (Стадія 16) Х (1,2) 2. 50ММ ацетат натрію, з низькім містом ме- - об'єм 50ММ ацетату натрію, який слід додати. талу, ІОЕС; партія 2 082395ЕМ3 З. Перегородку реакційної пляшечки й пля- 3. Вибір складу буфера (1Х РВЕ, рН 7,4, який шечку для 50ММ ацетату протирали спиртом. ' 1 1 1 я 1 місить 7,595 (м/06) людського сироваткового аль- Використовуючи ! со шприц, обчислений об'єм буміну і ТММ ДТПЮ), ІЕС, партія 2 0823958МІ ацетату натрію (Стадія 2) переносили в реакційну 4. Реакційна пляшечка, 1Омл, ІЕС пляшечку. 1

Б. Матеріали й обладнання 4. Перегородку джерела ІпСІз протирали 1. Комплект радіоінкорпорування Віодех Тес- спиртом, пляшечку продували через голку, обла-

Сопігої, ІОЕС: Кат. Ж 151-770 днану стерильним фільтром 0,2мкм. Використо- 2 Рукавички: без порошку вуючи ї1сс стерильний шприц, потрібний об'єм 3. Стерильні поліпропіленові шприци (Стадія 16) псів переносили до реакційної 4, Стерильний зайвий шприц пляшечки. Вміст пляшечки перемішували пере- 5. Невеликі трубочки з корками; 1,5мл кидаючи її декілька разів.

В. Способи 5. Перегородку пляшечки для 288-МХ-ДТПК 1. Приготування Іп288 та У288, з викорис- протирали спиртом. Використовуючи 1сс шприц, танням набору мічення радіоактивним ізотопом мл 288-МХ-ДТК повільно переносили до реак:

Реагенти комплекту готували й заливали в ційної пляшечки, Вміст пляшечки перемішували скляні пляшечки з перегородкою (мембраною). Перо Веакція тоивала равний ом 30 15

Пляшечки (2 або 10мл) з боросилікатного скла ' й пвочій. Меса М. хвилин

Тип 1 промивали стерильною водою для ін'єкції хвитин зага точу Об'єм вах ск суміші обчис (ВДІ) й перед заповненням витримували в авток- й Ггальний м реакційної УмМіші 1 чис лаві. Перегородку з бутилкаучуку промивали сте- (стадія 4 БОММ а рату папою семи. зе рильною ВДІ й перед використовуванням витри- С МХ Діл с а ц 5 ту натрію (Стадія 3) т мували в автоклаві. Реагенти заливали вручну й 8. об ( о дія 5). б сш. затискали в боксі Класу 100 й перевіряли на піро- а й ак пІДІ пвх уфера, пимання кін. генність й стерильність, використовуючи методи вати в р кціину пляшечку для отримання кінце-

ОБР вого об'єму в 10мл, обчислювали, віднімаючи а Приготування Іп288 загальну кількість, обчислену в стадії 7, від 10.

Додаткові реагенти: 9. Пляшечку для підібраного буфера проти- 1. Індій-(1111: хлорид, вільний від носія, в НСІ. рали спиртом й продували. Через в'язкість підіб-

Застереження: ! ! раного буфера, реакційну пляшечку продували, 1. Всі стадії виконувались переважно з вико- використовуючи голку, обладнану стерильним ристанням асептичних методик. фільтром О,2им. Використовуючи 10сс стериль- 2. Компоненти комплекту мічення радіоакти- ний шприц разом з голкою відповідного діаметра вним ізотопом перед використанням мають мати (стандарту) об'єм підібраного буфера, обчисле- кімнатну температуру ний на Стадії 8, переносили до реакційної пля- шечки. Вентиляційну голку видаляли з реакційної пляшечки, а Вміст пляшечки перемішували пере- вуючи їсс стерильний шприц, потрібний об'єм кидаючи її декілька разів (Кінцевий продукт). Цю (Стадія 16) оУСіІз переносили до реакційної пля- пляшечку перед проведенням "Аналізу радіоінко- шечки. Вміст пляшечки перемішували, перекида- рпорування" витримували принаймні 5 хвилин. ючи її декілька разів.

Розчин мав колір бурштину а пляшечка була пов- 5. Перегородку пляшечки для 288-МХ-ДТПК на, підтверджуючи, що підібраний буфер був до- протирали спиртом. Використовуючи Зсс шприц, даним. 1,5мл 288-МХ-ДТПК повільно переносили до ре- 10. Загальну радіоактивність кінцевого про- акційної пляшечки. Вміст пляшечки перемішува- дукту вимірювали, використовуючи відповідний ли, перекидаючи її декілька разів. інструментальний набір для вимірювання 7111п. 6. Загальний об'єм реакційної суміші обчис- 11. Кінцевий продукт миттєво віддавали на лювали, складаючи разом додану кількість хло- зберігання при 27-8"С для "Аналізу зв'язування" риду У-90 (Стадія 4), додані 50мМ ацетату натрію та "Аналізу радіоінкорпорації". (Стадія 3) та додану кількість 288-МХ-ДТПК б. Приготування 208 (Стадія 5).

Додаткові реагенти: 7. Об'єм підібраного буфера, якій слід дода- 1. Ітрій-І901|. хлорид, вільний від носія, в НОСІ. вати в реакційну пляшечку для отримання кінце-

Застереження: вого об'єму в 10мл, обчислювали, віднімаючи 1. Всі стадії виконувались переважно з вико- загальну кількість, обчислену в стадії 6, від 10. ристанням асептичних методик. 8. Пляшечку для підібраного буфера проти- 2. Компоненти комплекту мічення радіоакти- рали спиртом й продували. Через в'язкість підіб- вним ізотопом перед використанням мають мати раного буфера, реакційну пляшечку продували, кімнатну температуру. використовуючи голку, обладнану стерильним

З. Продукт належить увести пацієнту протя- фільтром 0,20мкм. Використовуючи 10сс стери- гом 8 годин заключної стадії 8, про яку йдеться льний шприц разом з голкою відповідного діаме- нижче. тра (стандарту) об'єм підібраного буфера, обчис-

Протокол мічення радіоактивним ізотопом лений на Стадії 7, переносили до реакційної

Іп288 пляшечки. Вентиляційну голку видаляли з реак- 1. Об'єм з0уСіІз, який додавали в реакційну ційної пляшечки, а вміст пляшечки перемішували, пляшечку, обчислювали як наведено нижче: перекидаючи її декілька разів (Кінцевий продукт). а. Концентрація радіоактивності після часу Цю пляшечку перед проведенням "Аналізу радіо- мічення радіоактивним ізотопом: інкорпорування" витримували принаймні 5 хви-

Со:-концентрація радіоактивність під час калібру- лин. Розчин мав колір бурштину, а пляшечка бу- вання (див. Сертифікат аналізу виробника). ла повна, тим самим підтверджуючи, що дієзміна в часі (позитивне значення-після ка- підібраний буфер був доданий. лібрування, негативне значення-перед калібру- 9. Загальну радіоактивність кінцевого продук- ванням). ту вимірювали, використовуючи відповідний ін-

Концентрація радіоактивностіпід час радіомічення ----60 струментальний набір для вимірювання зу. соотов(лІ) 10. Кінцевий продукт миттєво віддавали на зберігання при 27-8"С для "Аналізу зв'язування" та "Аналізу радіоінкорпорації". б. Об'єм З0уСіІз, який додавали в реакційну 11. Тестування на імунореактивність: пляшечку: Використовуючи шприц на мл, за асептич- о дартс ост пітеств б ем для додавання в реакційну пробірку них умов відбирали 0,1мл з реакційної пляшечки та переносили в окрему 1,5мл трубку, яка загвин- чується. Трубку миттєво передавали для збері- 2. Об'єм в 5Омл ацетату натрію, який слід до- напів ад аці звязування та давати в реакційну пляшечку обчислювали як Атестація протоколу комплекту мічення ра- наведено нижче: : : , діоактивним ізотопом була виконана в ІЕС а. Для юусів У 0,040М Неї (дтегзпату; Рпагтасешіса!5 (Сан-Дієго, Каліфорнія),

Об'єм "УсСіз (Стадія 16)х(0,8) - об'єм 50ММ Апдегзоп Неаййп Сепієг (Х'юстон, Техас), Мауо ацетату натрію, який сліддодати. - Сіїпіс (Рочестер, Мен) та Сйу ої Норе (Дуарте, б. Для 7Сів у 0,050М Не! (Могаїоп);: , Каліфорнія). Всі компоненти комплекту, включно

Об'єм УСів, який додали (Стадія з 288-МХ-ДТПК для клінічного використовування, 16)х(1,0)-об'єм 50ММ ацетату натрію, який слід було приготовлено ІЕС Рпагтасеціїса!5 за умов додати. шк Й СМР (Соой тапигасішйгіпд Сопайіопв, які відпові-

З. Перегородку реакційної пляшечки й пля- дали Соде ОЇ Редега! Редшіайопв5) та перевірено шечку для 50ММ ацетату протирали спиртом. на стерильність та відсутність пірогену. Радіомі-

Використовуючи їсс шприц, обчислений об'єм чені антитіла сполучали з 1Х РВ5, який містив (Стадія Та або 16) 50ММ ацетату натрію (Стадія 7,595 (м/о0б) людського сироваткового альбуміну 2) переносили в реакційну пляшечку. Вміст пля- (ЛСА; для клінічного застосування; Вахіег-Нуїапа) шечки перемішували, перекидаючи її декілька та 1ММ ДТПК. Результати тестів для випуску но- разів. вої продукції, виконаних по кожній атестаційній 4. Перегородку джерела 99УСіІз протирали партії, описані нижче. спиртом. Пляшечку продували через голку, обла- По шість атестаційних партій з Іп288 та 288 днану стерильним фільтром 0,2мкм. Використо- були приготовлені п'ятьма операторами. Ці пар-

тій позначали, як наведено нижче, й виготовляли зберігали у відповідності із вищезгаданою мето- в нижченаведених установах: дикою "Приготування ліофілізованих ЗВ та НОВ

Іп288: клітин".

Я: ЕС РНаптасецшісаї!5 і. Аналіз зв'язування Іп288. Додаткові реаге-

Я2: І(ОЕС Рпаптасецшісаї!5 нти:

Я3: ІЕС РНагтасеціїса!в5 1. Індій-І111)-288-МХ-ДТПК яА: МО Апаєгзоп Неайй Сепіег 2. Ліофілізовані ЗВ клітини; три пробірки, що 5: Мауо Сіїпіс містять 25х 10бклітин/пробірку. яв: Спу ої Норе З. Ліофілізовані НОВ клітини; три пробірки,

У2гва: що містять 25х 10бклітин/пробірку.

Я:ЛОЕС Рпаптасешісаї!5 4. Стерильна вода для промивань або стери-

Я2: І(ОЕС Рпаптасецшісаї!5 льна вода для ін'єкцій. 73: ІЕС РНагтасеційса!5 5. Буфер для розбавлення (їх РВ5, рН 7,2- 4: МО Апдегзоп Неайй Сепіег 7,4, що містить 195 бичачого сироваткового аль- 5: Мауо Сіїпіс буміну (БСА) та 0,0295 азиду натрію 0,2мкм) фі- яв: Сну ої Норе льтрували та зберігали при кімнатній температу- 2. Приготування клітин, ліофілізованих ЗВ та рі. нЗв 6. Скляні або пластикові дослідні пробірки

Лінії людських клітин 5В (СО20-позитивних) для підрахунку радіоактивності. ти Нв (СО20-негативних) отримували від Процедура:

Атегісап Туре Сийиге СоПесіоп та культивували Схема досліду (не радіоактивна частина) у Т-колбах, використовуючи ЕРМІ-1640, який міс- 1. Було отримано три пробірки з ліофілізова- тить 1095 ембріональної сироватки бика, допов- ними 5В та Н5В клітинами. неної 295 глутаміну. Культури тримали при 377С 2. До кожної пробірки був доданий 50мл СВДІ та 5956 СО». Клітини зазвичай ділили 1:2 кожний (стерильна вода для ін'єкцій) і пробірки оберта- другий день та відбирали 0,5-2,5х105 клітин/мл із лись доти, доки не отримували гомогенної су- життєздатністю 28095. Концентрацію клітин ви- спензії. значали гемацитометром, а життєздатність ви- 3. Чотири порожні пробірки для мікроцентри- значали за допомогою виключення трипанового фугування по 1,5мл. У три пробірки заливали по синього. О,5О0мл буферу для розбавлення, і вони являли

Клітини збирали при температурі оточуючого собою контрольні, без клітин, зразки. середовища при щільності клітин //-0,5- 4. В іншу пробірку на 1,5мл було додано 2х10бклітин/мл за допомогою центрифугування 0,99мл буферу для розбавлення; ця пробірка (1300 грт у центрифузі Зогмаї!) та двічі промива- була помічена 1:100. ли ЇХ НВ5З5. Осаджені клітини суспендували по- 5. Брали стерильну поліпропіленову пробірку вторно до 50х109 клітин/мл у 1Х НВ55, що містив на 5Омл з кришкою і додавали в неї 10мл бу- 195 (м/0б) бичачого сироваткового альбуміну фера. (БСА) та 1095 (м/об) манітолу (ліофілізаційний Схема досліду (радіоактивна частина) буфер), О0,5мл розподіляли у 1,5мл поліпропіле- 1. Отримували радіомічене антитіло, що збе- нових пробірках для мікроцентрифугування з о- рігали при 27-86. кільцевими прокладками та зберігали при -707С й 2. 0,01мл відбирали з Р20 і додавали у пробі- ліофілізували протягом ночі при 30-6Омілітор. рку для мікроцентрифугування, що містила

Пробірки з ліофілізованими клітинами зберігали 0,99мл буферу для розбавлення (розведення висушеними при 2-8"С, а для аналізу відновлю- 1:100). Верхівка була промита і пробірку обереж- вали у стерильній воді; пробірки з ліофілізовани- но обертали для утворення суміші. ми клітинами у пробірках для мікроцентрифугу- 3. 0,20мл були відібрані з Р200 з пробірки з вання зберігали з десикантом (осушувачем). розведенням 1:100 та додані до конічної пробір- 3. Аналітичний аналіз ки, що містила їОмл буфера для розбавлення.

Аналітичні методи, використані для перевірки Вміст пробірки ретельно перемішували. атестаційних партій Іп288 та У288, описані ниж- Протокол аналізу че. Для кожної атестаційної партії були виконані 1. 0,50мл розбавленого ""|Іп288-МХ-ДТПК такі кількісні аналізи: додавали в усі пробірки. 1. Аналіз зв'язування з використанням ліофі- 2. Кришки були надійно закриті на всіх пробі- лізованих 5В клітин. 2. Аналіз радіоінкорпоруван- рках, і вміст пробірок безперервно перемішував- ня Іп2в8ху288 з використанням комплекту ся протягом 60 хвилин.

Віодех. 3. Після 60-хвилинної інкубації при темпера- а. Аналітичне зв'язування турі оточуючого середовища, всі пробірки

Відсоткове зв'язування було оцінене кожним центрифугували протягом 5 хвилин при 2000 4 оператором, використовуючи ліофілізовані СО2О мінімум. позитивні 5В клітини відповідно до нижченаведе- 4. 0,75мл кожного супернатанту переносили у них протоколів для Іп288 та 288, відповідно. Ці пробірки, які є підходящими для лічильного об- аналізи забезпечують швидкий та дієвий спосіб ладнання. підтвердження того, що радіомічені антитіла все 5. Радіоактивність у пробірках підраховували ще розпізнають СО20 як антиген. На одному клі- за допомогою лічильника гамма-часток з ураху- нічному місці оцінювали також СО20-негативні ванням фону.

НЗВ клітини. Ліофілізовані клітини готували та і. Аналіз зв'язування 288. Додаткові реаге- 4. 0, вмл кожного супернатанту переносили у нти: пробірки для сцинтиляції. 1. зоу-288-МХ-ДТПК 5. Сцинтиляційний коктейль додавали у кож- 2. Ліофілізовані ЗВ клітини ну пробірку. 3. Стерильна вода для промивань або стери- 6. Рівень радіоактивності у кожній пробірці льна вода для ін'єкцій. визначали, використовуючи сцинтиляційний лічи- 4. Буфер для розбавлення (1Х РВ5, рн 7,2- льник з урахуванням фону. 7,4, що містить 195 бичачого сироваткового аль- б. Аналіз радіоінкорпорування буміну (БСА) та 0,0295 азиду натрію) Відсоток радіоінкорпорування визначали за

Процедура: допомогою миттєвої тонкошарової рідинної хро-

Приготування зразка міченого антитіла матографії (ТШРХ), використовуючи радіохрома- 1. Отримували радіомічене антитіло, що збе- тографічний комплект Віодех Тес-Сопігої, який рігали при 27-876. відповідав нижченаведеному протоколу: Додат- 2. 10мкл відбирали з Р20 і додавали у пробі- кові матеріали й обладнання: рку 1,5мл для мікроцентрифугування, яка містила 1. Радіомічений "Чп- або з9у-МХ-ДТПК 0,990мкл буферу для розбавлення (розведення 2. Пробірки для підрахунку радіоактивних 1:100). Верхівка була промита і пробірку обереж- смужок ТРХ но обертали для утворення суміші. 3. Пінцети

З. Отримували 50мл стерильну поліпропіле- 4. Стерильний шприц, 1сс нову пробірку з кришкою й, використовуючи 10мл 5. Стерильні голки, 260 серологічну піпетку, додавали в неї 10мл буфера 6. Лічильник гама-випромінювання або сцин- для розбавлення. тиляційний лічильник 4. З5мкл були відібрані з Р200 з пробірки з 7. Піпетка розведенням 1:100 та додані в конічну пробірку, Процедура: що містила 10мл буфера для розбавлення. Вміст 1. Спочатку слід прочитати Інструкцію по ро- пробірки ретельно перемішували. боті з комплектом Віодех.

Приготування ліофілізованої клітини 2. Кожний радіомічений зразок тричі випро- 1. Було отримано три пробірки з ліофілізова- бували у відповідності до інструкцій по роботі з ними ЗВ клітинами. комплектом; проявляли одну смужка на ампулу. 2. До кожної пробірки був доданий 5Омл СВДІ З. Для нанесення крапель міченого зразка на і пробірки обертались доти, доки не отримували хроматографічну смужку використовували піпет- єдиної клітинної суспензії. ку, щоб нанести 1мкл на початок лінії. Як альтер- 3. Отримували три порожніх пробірки для мі- натива, можна було нанести одну маленьку кра- кроцентрифугування по 1,5мл; у три пробірки плю, видавлену з 260 голки, прилаштованої до заливали по О0,5мл буферу для розбавлення, і стерильного 1сс шприца. вони являли собою контрольні, без клітин, зра- 4. Обчислювали рівень радіації кожної секції, ки. використовуючи відповідний лічильник, тобто

Протокол аналізу лічильник гама часток для "ІМ та сцинтиляцій- 1. 0,50мл розбавленого 2уУ288-МХ-ДТПК до- ний лічильник для У, налаштовуючись на фон. давали в усі пробірки. 5. Для обчислення відсотку міченого антитіла 2. Після перевірки, чи кришки на всіх пробір- застосовували інструкції Віодех. ках щільно закриті, пробірки переносили на дно ЇМ. Результати міксера на 45 хвилин. Результати тестування кожної перевірочної 3. Після 45-хвилинної інкубації при темпера- партії Іп288 та 288 наведені в Таблицях 38 та турі оточуючого середовища, всі клітини осаджу- 39. вали за допомогою мікроцентрифугування протя- гом 5 хвилин.

Таблиця 38

Результати аналізу виходу (вивільнення) для перевірки 288 пишних ши ти: пили (Середне-98,8 |(Середоє2823 -:/ (17777711

Середньоквадратичне відхилення-1,2490 Середньоквадратичне відхилення-3,4

КВ-1,2590 КВ-4,296

КВ - коефіцієнт варіації

Таблиця 39

Результати аналізу виходу для перевірки Іп288 5111171111111111111111990111111171111111111111111111вМ11 шишижиншшш хни шини нин

Середнє - 99,0 Середнє - 85,2

Середньоквадратичне відхилення-0,4 390 Середньоквадратичне відхилення-2,0690

Кв-0,4590 Кв-2,4290

М. Обговорення і висновки Підсумовуючи, зазначимо, що разом узяті, ці

З метою спрощення методів мічення радіоак- результати вказують на те, що Іп288 і 288, при- тивним ізотопом для Іп288 та 288 було розроб- готовлені з використанням набору мічення радіо- лено чотирикомпонентний комплект. Для того активним ізотопом, є придатними для викорис- щоб забезпечити точне транспортування об'ємів, тання в клінічних умовах. До того ж, норматив використовуючи шприци, концентрацію ацетату виходу для обох радіомічених антитіл встанов- натрію та 288-МХ-ДТПК скорочували до 50мМ та люється на підставі результатів декількох переві- 2мг/мл відповідно. Всі компоненти комплекту пе- рочних прогонів, виконаних п'ятьма різними опе- реважно заливали в скляні пляшечки з перегоро- раторами. дками та перед вивільненням перевіряли на сте- Приклад 2. Радіоіїнкорпорування та зв'язу- рильність та пірогенність за допомогою ІЕС, вання - комплекти та аналізи таким чином усуваючи потребу у цих випробу- Ї. Резюме. ваннях, які мають буди виконані в клінічних міс- Мишаче анти-СО0О20 моноклональне антитіло, цях. На місці всі маніпуляції з реагентами вико- позначене 288, були клоновано в СНО клітинах нуються, використовуючи стерильні шприци та щоб отримати клітинну лінію високої експресії. голки. Через це суворе дотримання асептичних Специфічність похідних від СНО клітин для технологічних прийомів, на яких зазвичай базу- СОг20-позитивних людських клітин була продемо- ється радіофармацевтичне виробництво, гаран- нстрована за допомогою аналізу РАС й конку- тує, що радіомічені та винайдені антитіла є при- рентного зв'язування. Незначне зв'язування спо- датними для уведення пацієнту. стерігали для людських Т-клітин. Спорідненість

Відтворюваність та складність протоколів мі- антитіла для СО20-позитивних клітин, як було чення радіоактивним ізотопом для Іп288 та 288 визначено, використовуючи аналіз конкурентного оцінювали за допомогою виконання декількох зв'язування, становить 1,3х1079М. Для того щоб перевірочних прогонів з використанням різних утворити кон'югат, 288-МХ-ДТПК, з незначними партій кожного радіоіїзотопу. Для шести перевіро- втратами імунореактивності (значення спорідне- чних партій приготовленого Іп2В8, зв'язування ності було 4,4х1079М), проводили реакцію анти- коливалось в діапазоні від 82,195 до 868905 із се- тіла з агентом МХ-ДТПК, утворюючи хелати. Оп- реднім значенням 85,195; значення радіоінкорпо- тимальне хелатне сполучення, як визначали за рування для Іп288 становило приблизно 9995 допомогою вимірювання радіоінкорпорування (діапазон від 98,3 до 99,490). Для шести переві- 171рп, досягали після восьмигодинної реакції. З рочних партій приготовленого 288, отриманий метою гарантування максимального радіоінкор- відсоток зв'язування лежав в діапазоні від 78,690 порування (29095) та утримання імунореактивно- до 87,095 із середнім значенням 82,395. Середнє сті (27095), протокол мічення радіоактивним ізо- значення радіоінкорпорування для у289 стано- топом для 288-МХ-ДТПК був оптимізований для вило приблизно 98,895 (діапазон від 96,3 до зу та 17Іп стосовно рН та тривалості інкубації. 99,590). Разом ці результати підтверджують відт- Нормативи виходу для Іп288 та У288, які приго- ворюваність та складність способів з використан- тували, використовуючи похідні від СНО 288-МХ- ням комплекту мічення радіоактивним ізотопом ДТПК в клінічних випробуваннях, рекомендували для приготування як Іп2В8, так і М288. На основі для радіоінкорпорування (29595), а для зв'язу- цих результатів перевірки рекомендується, щоб вання з ліофілізованими та відтвореними СО20- норми виходу для радіоінкорпорування та зв'язу- позитивними людськими клітинами (270965). Узяти вання встановлювалися на рівні 29595 та 27090 разом, ці результати вказують на придатність відповідно, як для Іп2В8, так і для 288. похідного від СНО 288-МХ-ДТІПК для викорис-

До того ж, через значно полегшене викорис- тання в клінічних випробуваннях. тання та зменшення можливостей помилки під І. Вступ час приготування, рекомендується, щоб відсотко- Антитіло 288, яке використовували раніше, ві рівні зв'язування при використанні ліофілізова- отримували в біореакторах на пустотілих волок- них СО20-позитивних клітин і радіоінкорпоруван- нах. З метою скоротити виробничі витрати на це ня використовувались для тесту виходу Іп2В8 і антитіло, його клонували й експресували в СНО

У288 в клінічних умовах.

клітинах, щоб отримати лінію клітин, що продуку- 4. Радіохроматографічний комплект Тес- ють високу експресію. В цьому прикладі наведено Сопігої, Віодех, модель Ме151-770 результати характеристики іп міо похідного від 5. Ліофілізатор; Міпі5, модель Егеезтобіїе 12;

СНО 288 антитіла, сполученого антитіла (288- ІЕС 20458

МХ-ДТПК) та мічених М та 17|п продуктів анти- Опис додаткових реагентів подається нижче тіла, виготовлених з використанням протоколів для спеціальних способів. комплекту мічення радіоактивним ізотопом. В. Способи

ПІ. Матеріали і способи 1. Приготування клітин, ліофілізованих ЗВ та а. Реагенти нев

Лінії людських клітин 5В (СО20-позитивних) Клітин культивували, як описано вище, й від- ти НВ (СО020-негативних) отримували від бирали при кімнатній температурі при щільності

Атегісап Туре Сийиге СоПесіоп та культивували клітин 0,5-2,5х1Обклітин/мл за допомогою у Т-колбах, використовуючи ЕРМІ-1640, який міс- центрифугування (1300 грт у центрифузі Зогмаї|) тить 1095 ембріональної сироватки бика допов- та двічі промивали 1Х НВ55. Осаджені клітини неної 295 глютаміну. Культури тримали при 377 суспендували повторно до 50х10бклітин/мл у 1Х та 595 СО». Клітини зазвичай ділили 1:2 кожний НВ5ББ, що містив 195 (м/об) бичачого сироватко- другий день та відбирали при /0,5- вого альбуміну (БСА) та 1095 (м/об) манітолу (лі- 2,5х10бклітин/мл та життєздатністю 28095. Конце- офілізаційний буфер), 0,5мл розподіляли у 1,5мМл нтрацію клітин визначали гемацитометром, а поліпропіленових пробірках для мікроцентрифу- життєздатність визначали за допомогою виклю- гування з о-кільцевими прокладками та зберігали чення трипанового синього. Спеціальна інфор- при -707С й ліофілізували протягом ночі при 30- мація про партії клітин записується в зошит бОоміліторр. Пробірки з ліофілізованими клітинами

Мо1553 та в прошиту книгу з назвою "Сеї! Асіїмну зберігали висушеними при 2-8"С, а для аналізу

Годроок 1995 8, 1996", складену Коп Могепа. відновлювали у стерильній воді; пробірки з ліо-

Похідне від СНО 288 продукували за умов філізованими клітинами у пробірках для мікроце-

СМР у виробничих приміщеннях ІЕС. Антитіло нтрифугування зберігали з десикантом. виготовляли в нормальному сольовому розчині з 2. Аналіз зв'язування ЕАС5 низьким вмістом металів 11,5мг/мл. За допомо- Прямий зв'язок антитіл з людськими В- гою 505-РАСЕ було визначено, що антитіла є клітинами визначали за допомогою проточної гомогенними. 288-МХ-ДТПК продукували за умов цитометрії. Антитіла при збільшенні концентрації

ОМР у відповідності до РОВК-043 з похідного від витримували протягом 30 хвилин на льоду в 1Х

СНО 288 й виробленого в сольовому розчині з РВ5, рн 72, який містить 195 (м/об) БСА (зв'язу- низьким вмістом металів 2мг/мл (Партії Ме165А і вальний буфер) з 5х109 СО20-позитивними (58) 01658). або СО20-негативними (Н5ЗВ) клітинами. Клітини

Хлорид "п фармацевтичної якості купували промивали за допомогою центрифугування, по-

Атегзпат (Ш.К.) або Сусіоїгоп Ргодисів Іпс. (Согаї вторно суспендували в зв'язувальному буфері та

Саріе5, РІ). Хлорид ітрію|90| одержували від витримували протягом 30 хвилин на льоду з поз-

Атегзпат (Ш.К.), Могайоп Іпіегайопаї! (Капайа, наченим БІТС козячим анти-мишачим Е(аб)».

Канада), або Расіїс Могіпжмевзі Майопаї! ІГарогаїогу Після інкубації з додатковими реагентами клітини (кіспіапа, УМА). МХ-ДТПК, виготовлений за умов промивали центрифугуванням та повторно су-

СМР, одержували від Наизег Спетіса! (Вошіаег, спендували в 1Х РВ5, який містив 1,195 (об/об)

СО). Клінічної якості кальцій тринатрій диети- формальдегіду, щоб зафіксувати клітини. лентриамінопентаоцтову кислоту (ДТПК) одержу- 3. Аналіз конкурентного зв'язування вали від Неуї (Вепіп, Септапу - Берлін, Німеччи- Імунореактивність 288 та 288-МХ-ДТПК ви- на) ТАб-МНЗ одержували від СЕМ пс. значали за допомогою конкурентного зв'язування (Коскміїе, МО). Мишачі анти-СО19 кульки купува- до СО20-позитивних клітин, використовуючи ли у Бупаї Іпс. (Гаке зиссе55, МУ). Козячу анти- ОВІСЕМ електрохемолюмінесцентний метод мишачу (аб), позначену РІТС, купували у (еіапа апа Ромуєї). 5В клітини логарифмічної

ЧУасквоп ІттипоНезеагсі. фази відбирали від культури й двічі промивали

Реагенти, які потребували видалення супут- 1Х НВ55. Клітини розводили в 1ТХ РВ5 рН 72, ніх важких металів, партіями піддавали обробці який містив 195 (м/об) бичачого сироваткового

Спеіех 100 (Віокай Іпдизнієв) або Спеїайпо альбуміну. В деяких експериментах ліофілізовані зерпагозе (Рпаптасіа), пропускаючи розчини клітини використовували після відновлення сте- крізь колонку. Стандартні розчини з низьким вміс- рильною водою. том металів розводили стерильною водою для Мічене рутенієвим радіоіндикатором антитіло промивання (СВП). Розчини зберігали в стериль- готували за допомогою інкубації похідних від них пластикових контейнерах. СНО 288 (партія Ме165) в ІХРВ5, 7,2 рН, з М-

Опис додаткових реагентів подається нижче гідроксисукцинамідним ефіром рутенійового (Ії) для спеціальних способів. трис-біпіридинового комплексона (ТАС-МНО) при

Б. Матеріали й обладнання мольному співвідношенні ТАС-МНО - антитіло 1. Аналізатор Огідеп; ІЕМ пс. Модель 15:1. Після годинної інкубації при температурі 1100-1000; ІПЕСЯ1492 оточуючого середовища, захищеного від світла, 2. Сцинтиляційний лічильник Тор-Сопцпі; реакцію зупиняли за допомогою гліцину протягом

Раскага, модель ЖА9912; ІЕС 1329 10 хвилин. ТАС, що не прореагував, видаляли за

З. Лічильник гама-часток; Ізодаїа, модель допомогою хроматографії з відбором за розмі- я20-10; ІЕС 20628 ром, використовуючи колонку Рпаптасіа РО-10,

яку врівноважували 1Х РВ5. Концентрацію білка чуючій температурі протягом 30 хвилин мічене визначали, використовуючи Вгайтга білковий антитіло виробляли до 0,2мг/мл в 1Х РВ5, рН 7,2, аналіз. Інкорпорацію ТАС визначали за допомо- що містив 7,595 (м/0б) людського антисироватко- гою вимірювання поглинання при 455нм. Обчис- вого альбуміну та мМ ДТПК (від 4905 до 695 кін- лене молярне співвідношення ТАС та білка скла- цевої концентрації ЛСА). Дослідження з радіоін- ло 3,0. корпорування для всіх зразків проводили тричі;

Аналіз проводили в 12х75мм поліпропілено- значення склало 29595. вих пробірках. Різні кількості конкуруючого анти- Уу288 також готували, використовуючи лабо- тіла (0,002-17мкг/мл) витримували 1Х РВ5, рн раторний варіант протоколу комплекту мічення 7,2, який містив 195 (м/об) БСА з 0,0вмкг/мл СНО радіоактивним ізотопом, описаний в Прикладі 1. 288, міченого ТАС, 0,08мг/мл анти-СО 19 кульки, Антитіло позначали при питомій активності та 16700Оклітин/мл. Після інкубації при темпера- 15мКі/мг й виготовляли до 0,Змг/мл. Коротко, від турі оточуючого середовища та при круговому 0,5 до 2мКі хлориду У переносили у вільну від перемішуванні протягом Зг, відносну електрохе- металу пробірку для мікроцентрифуги та викори- молюмінесценцію (ЕХЛ) визначали, використо- стовуючи 1,2Х об'єм 50мММ низько-металевого вуючи прилад ОВІСЕМ. Отримували середнє ацетату натрію, доводили рН приблизно до 4,2. значення ЕХЛ для двох зразків та будували гра- 288-МХ-ДТПК при 2мг/мл додавали до розчину фік в залежності від концентрації конкуруючих ацетату ЗУ після інкубації при оточуючій темпе- антитіл, використовуючи програмний пакет ратурі протягом 5 хвилин, мічене антитіло вироб-

КаїІеідадгарі. Для деяких експериментів будували ляли до 0,Змг/мл в 1Х РВ5, рН 7,2, що містив залежність відсотка інгібування. Конкуруючі криві 7,595 (м/об) людського антисироваткового альбу- підганяли й визначали значення ЕС 50 (концент- міну та 1мМ ДТПК (від 490 до 695 кінцевої концен- рація антитіла, що дає 5095 максимального зв'я- трації ЛСА). Дослідження з радіоінкорпорування зування), використовуючи нижченаведену про- для всіх зразків проводили тричі; значення скла- граму з чотирьох параметрів: ло 295965.

У ((т'і -та)/1--(тО/т3)"тг2))--т4; Концентрацію радіоактивності кінцевих ра- ті х;т2:;тЗ3:;т4а-тОо-незалежна змінна діомічених продуктів обчислювали за кількістю т! відгук на нульовий сигнал радіації, уведеної у реакційну суміш, та за допо- т2г-параметр кривизни могою посилання на Сертифікат Аналізу радіоі- тЗ3-ЕС50 в мкг/мл зотопу. Концентрацію антитіла в реакційній сумі- пл4-відгук на максимальний сигнал у віднос- ші, в якій зупинена реакція, обчислювали, них одиницях ЕХЛ виходячи з відомої кількості доданого антитіла.

Середнє значення спорідненості обчислюва- Для досліджень кінетики мічення радіоактив- ли із значень ЕС5О та відомої концентрації міче- ним ізотопом, що проводились з метою оцінити ного антитіла, використовуючи метод Мюллера вплив рН на радіоінкорпорування та зв'язування, (Миїеп). рН реакційної суміші підбирали, додаючи різну 4. Приготування 288-МХ-ДТПК кількість низько-металевого 50ММ ацетату натрію

Хелатний агент, 1-ізотіоціанатобензил-3- (від 0,8 до 2,2Х об'єм розчину ізотопу). метилдіетилентриамінопентаоцтова кислота, 6. Визначення радіоінкорпорування Іп288 та постачалась як сухий порошок (вільний від кис- чагвв лоти) й зберігався зневодненим при -20" або - Рівень радіоактивності кон'югату (радіоінкор- 70"С. Приблизно Змг антитіла СНО 288 в норма- порування) в кінцевих продуктах або інкубаційних льному сольовому розчині з низьким вмістом ме- зразках визначали, використовуючи наявний у талів доводили до рН 8,6, додаючи одну десяту продажу комплект, вироблений Віодех (Тес- об'єму 50мММ борату натрію, рН 8,6. Антитіло при Сопіго! Надіоспготаїодгарпіс Кії - радіохроматог- 10-11мг/мл витримували при молярному співвід- рафічний комплект; див. Приклад 1). Зазвичай ношенні МХ-ДТПК до білка 41, додаючи розчи- використовували 2 чи З 1мкл зразка для випро- нений в 50мММ бораті натрію МХ-ДТПК; рн 8,6. бування, використовуючи мікропіпетку, й оброб-

Після інкубації при температурі оточуючого сере- ляли відповідно до вкладеної інструкції Віодех. довища (від 2 до 4 годин), комплексон, що не Половинки смужок використовували для оцінки прореагував, видаляли з кон'югату за допомогою радіоактивності в скляних пробірках, використо- багаторазової діафільтрації в нормальний з низь- вуючи гама лічильник Ізодаїа або сцинтиляційний кими вмістом металу сольовий розчин, викорис- лічильник Раскага Тор Сошпі, як описано нижче. товуючи фільтри для центрифугування Сепігісоп Інкорпорування радіомітки рахували, ділячи кіль- 30. кість радіоактивності у верхній частині половинки 5. Приготування Іп2В8 та 288 смужки на загальну радіоактивність, виявлену як

Іп288 готували, використовуючи протокол у верхній, так і у нижній половинках. Цю величину комплекту мічення радіоактивним ізотопом, як представляли у відсотках та як середнє значен- було описано. Антитіло мітили при питомій акти- ня, що визначали. вності ЗмКі/мг й виробляли до 2мг/мл. Коротко, 7. Визначення імунореактивності Іп288 та від 0,5 до 2мКі хлориду "п переносили у вільну ч2гвзв від металу пробірку для мікроцентрифуги та ви- Імунореактивність аналізували, використову- користовуючи 1,2Х об'єм 50мММ /низько- ючи метод Гіпдто та ін., та як описано вище у металевого ацетату натрію, доводили рН приб- Прикладі 1. лизно до 4,2. 288-МХ-ДТПК при 2мг/мл додавали 8. Прямий аналіз зв'язування до розчину ацетату індію і після інкубації при ото- Такий самий протокол, що описаний тут, ви-

користовували для визначення сполучення із мальні установки енергії. Кількість імпульсів для

СО20-позитивними ЗВ клітинами Іп288 та М288, зразків індію-(111| підраховували протягом хви- відповідно. Іп288 та у288 готували та виробляли, лини, використовуючи гама лічильник Іізодаца. як описано вище. Для аналізу, зразки Іп288 або Лічильник встановлювали для реєстрації випро-

У28в8 розбавляли буфером розведення для ана- мінювання (каналу дискримінації) 100-500КевВ, а лізу (ІХРВ5, рН 7.2, що містить 195 (м/об) бича- фонові значення встановлювались на нуль перед чого сироваткового альбуміну (БСА) до 4Онг/мл самим дослідженням зразка. та 11нг/мл, відповідно. 10. Норми виходу для клінічних доз Іп288 та

Антиген-позитивні (5В) та антиген-негативні чагвв (НЗВ) клітини тримали у КРМІ1640, доповненому Норми виходу для радіоінкорпорування та 1095 сироватки зародку теляти при 37"С та 5965 зв'язування з СО20-позитивними клітинами вста-

Со». Клітини (із життєздатністю 29095, яку визна- новлювали за допомогою приготування шести чали за допомогою включення трипану голубого) доз кожного з Іп288 та 288, використовуючи дві збирали при оточуючій температурі при густині партії 288-МХ-ДТПК клінічної якості (Партії (щільності) 0,5-2х1Обклітин/мл за допомогою Ме0219 та 0220), які були приготовленими у від- центрифугування (1300 грт на центрифузі повідності до даного винаходу й заповнені за

БогмаїІ) та двічі промивали 5О0мл 1Х НВ55. Гра- ОМР умов. Аналіз виходу виконували, як описано нульовані клітини суспендували до вище.

Б5Ох10бклітин/мл у попередньо охолодженому 1 ІМ. Результати

НВ55, який містив 195 (м/об) бичачому сироват- А. Характеристика похідного від СНО2В8 ковому альбуміні (БСА) та 1095 (м/об/) маніті (бу- Використовуючи проточний цитометричний фер для ліофілізації). Клітинні суспензії розлива- аналіз, було продемонстровано, СНО 288 зв'язу- ли в 1,5мл поліпропіленові пробірки для ється (сполучається) безпосередньо з СО20- мікроцентрифугування з о-кільцевими проклад- позитивними ЗВ клітинами без зв'язування з ками при 50х10бклітин/мл (0,5мл на пробірку) та СОр20-негативними НЗВ клітинами (Фігура 34). ліофілізували протягом ночі при 30 до 60 міліот. Для ізотопного (уїк) антитіла (5004), що не сто-

Ліофілізовані клітини зберігали зневодненими 2- сується даного винаходу, не було помічено знач- 8"С та відновлювали в стерильній воді для ана- ного зв'язування з 5В або НВ клітинами. лізу. Зв'язування СНО 288 з СО20-позитивними

Ліофілізовані 5В та НЗВ клітини в 1,5мл по- клітинами оцінювали в конкуруючому аналізі, ліпропіленових пробірках відновлювали до використовуючи хемілюмінесцентну систему ви-

БОх1Обклітин/мл, використовуючи стерильну во- явлення ОКІСЕМ. Ліофілізовані та відновлені ду. Розбавлені Іп288 та 288 додавали до клітин антиген-позитивні 5В клітини витримували із збі- за три рази й витримували протягом від 45 до 60 льшенням кількості Бї антитіла за присутності хвилин, змішуючи перекиданням пробірки з дон- індикатору (мітки, трасера) міченого рутенієм ця на корок, при оточуючій температурі. Після СНО 288. Результати показали, що СНО 288 інкубації клітини за допомогою центрифугування інгібує зв'язування із СО20-позитивними клітина- гранулювали й визначали рівень радіоактивності ми в такій же мірі, що и антитіло, що походить з клітин, рахуючи використовуючи гама лічильник біореактора на пустотілих волокнах (288-49) (Фі-

Іводаа або сцинтиляційний лічильник Раскага гура 35). Величини ЕС50 визначали у графічний

Тор Соцпі, як описано нижче. Радіоактивність спосіб, а метод Мюлера (Миїег) (1980) середніх зв'язку з клітинами обчислювали (В) з клітинами, значень спорідненості. Визначено, що спорідне- віднімаючи незв'язану радіоактивність (суперна- ність для СНО 288 становить 1,3х1072М; похідне тант) від загальної радіоактивності, що додавали. з біореактора на пустотілих волокнах антитіло

Загальний рівень радіоактивності обчислювали 288 виявило значення спорідненості 2,5 1079М. за радіоактивністю, яку визначили для пробірок Неспецифічне зв'язування було незначним, на без клітин. Відсоток зв'язування обчислювали, що вказувала відсутність конкуренції з ізотопним представляючи кількість імпульсів зв'язків у від- антитілом (5004), що не стосується даного вина- сотках від загальної кількості імпульсів. ходу. 9. Вимірювання радіоактивності Б. Характеристика похідного від СНО 288-

Кількість імпульсів радіоінкорпорованих зраз- Мх-дтТПК ків підраховували протягом хвилини, використо- Кон'югат 288 (288-МХ-ДТПК) готували, вико- вуючи гама лічильник Ізодаїа. Лічильник встано- ристовуючи протокол, подібний до такого, що влювали для реєстрації випромінювання (каналу використовували для раніш охарактеризованого дискримінації) 100-500КеВ, а фонові значення 288-49. Реакції проводили, використовуючи при- встановлювались на нуль перед самим дослі- близно Змг антитіла та молярне співвідношення дженням зразка, використовуючи "п. Лічильник комплексону та антитіла 4:1. Оцінювали час інку-

Іводаїа використовували також для підрахунку бації 2, 4, 8, 17, та 24год., щоб визначити час ре- кількості імпульсів від смужок МТРХ, що мали акції, який дає придатне утримування зв'язку з нанесений на них ЗУ, Смуга реєстрації випромі- СО20-позитивними клітинами та високий рівень нювання для виявлення гальмівного випроміню- радіоінкорпорування "п. Криві конкурентного вання була 100-1000КевВ. зв'язування, що порівнюють СНО 288 з кон'юга-

Для аналізу зв'язування зразки У переноси- том СНО 288-МХ-ДТПК, що реагував протягом 8- ли на 24-лункові планшети та суміш Місгобсіпі 40 24 годин, були подібними, вказуючи на те, що і підраховували кількість імпульсів в Раскага процес кон'югації не змінює суттєво зв'язування

ТорсСошпі, використовуючи мінімальні та макси- антитіла до антигену СО20 (Фігура 36). Викорис-

товуючи значення ЕС 50, визначені графічно (Ффі- від 2,3х1079М до 5,9х1079М (Таблиця 40). Радіо- гура 36), сталі спорідненості для некон'югованих інкорпорування склало 29595 для часу кон'югації та кон'югованих антитіл, змінювали в діапазоні від 8 до 24 год. (Таблиця 30).

Таблиця 40

Вплив тривалості реакції кон'югації на радіоінкорпорування та імунореактивність СНО 288-МХ-ДТПК 01111111117111111111111мо11111111111111111111»з3хо1 811111111111711111111111еви1111111111111111111111 Бех

В. Характеристика Іп288 і 288, виготовле- позитивними клітинами визначали, використову- них з похідного від СНО 288-МХ-ДТПК ючи ліофілізовані й відновлені 5В клітини. Для

Позначені індієм-(111| СНО 288-МХ-Ії Ма порівняння кон'югат, приготовлений з антитіла (Іп288) готували, використовуючи лабораторний (2888-49), отриманого з гібридоми (гібридних клі- протокол комплекту мічення радіоактивним ізото- тин селезінки), витримували з ацетатом "п про- пом, раніше описаний для антитіла, похідного з тягом 30 хвилин при рН 4,2 (умови, раніше вста- біореактора на пустотілих волокнах (Приклад 1). новлені для цього антитіла).

Коротко, кон'юговане антитіло (похідне від СНО Кінетичні дослідження виконували з метою 288-МХ-ДТПК; партія Ме0165А) витримували з визначити умови мічення, які забезпечують мак- ацетатом "п при зазначеному рН протягом 30 симальне утримання зв'язку з СО20-позитивними хвилин при оточуючій температурі. Реакційну клітинами та високе радіоінкорпорування (Табли- суміш змішували (обробляли) з РВ5, рН 7,2, який ці 41 та 42). Кон'юговане антитіло (похідне від містив 7,595 (м/0б) людського сироваткового аль- сно 288-МХ-ДТПК) витримували при оточуючій буміну і їмМ ДТПК. Радіоінкорпорування зразків температурі з ацетатом "!11п при рН 4,2 протягом

Іп288 аналізували, використовуючи миттєву тон- зазначеного часу (Таблиця 42). кошарову хроматографію. Зв'язок 288 з СО20-

Таблиця 41

Кінетика мічення радіоактивним ізотопом

Іп288: вплив рН на радіоінкорпорування і зв'язування з СО20-Розійїме клітин

Таблиця 42

Кінетика мічення радіоактивним ізотопом

Іп288: вплив тривалості інкубації на радіоінкорпорування і зв'язування з СО20-Розійїме клітин

РНЯЄ 777777777717171717171711511711111111111111111199601111111111171111111111872

Результати показали, що для діапазону рн на рівні 8495. Значення радіоінкорпорування та від 3,0 до 4,6 та часу витримки 30 хвилин, дося- зв'язування були незмінними для часу інкубації гали радіоінкорпорування ізотопів на рівні 297905 в від 15 до 45 хвилин для реакцій при рН від 2,9 до той же час підтримуючи зв'язування приблизно 4,6 (Таблиця 42). Результати можна було порів-

няти з результатами, отриманими при викорис- ла). танні антитіла 288-49 (Таблиці 41 та 42). Подібні кінетичні дослідження виконували з

Антитіло, мічене ітрієм-(90| готували, витри- метою оцінки приготування міченого 90у антитіла муючи кон'юговане антитіло (похідне від СНО (у288). Для реакцій мічення радіоактивним ізото- 288-МХ-ДТПК) з ацетатом У при зазначеному пом в діапазону рН від 3,9 до 4,7 при часі інкуба- рН протягом 5 хвилин при оточуючій температурі. ції 5 хвилин, радіоіїнкорпорування становило

Реакційну суміш обробляли в РВ5, рН 7,2, який »9695 з 28090 утриманням зв'язування з СО20- містив 7,595 (м/0б) людського сироваткового аль- позитивними клітинами (Таблиця 43). Подібні буміну і їмМ ДТПК. Оброблені зразки 288 ана- результати було отримано для часу інкубації 3, 5 лізували на радіоінкорпорування, використовую- та 10 хвилин для діапазону рН від 2,9 до 4,6 чи миттєву тонкошарову хроматографію. (Таблиця 44). Потім кон'юговане антитіло (похід-

Зв'язування М288 з СО20-позитивними клітина- не від СНО 288-МХ-ДТПК) витримували при ото- мивизначали, використовуючи ліофілізовані та чуючій температурі з ацетатом У при рН 42 відновлені 5В клітини. Для порівняння кон'югат, протягом зазначеного часу (Таблиця 44). Резуль- приготовлений з антитіла (288-49), отриманого з тати можна було порівняти з результатами, гибридоми (гібридних клітин селезінки), витриму- отриманими при використанні антитіла 288-49 вали з ацетатом 99 протягом 5 хвилин при рН (Таблиці 43 та 44). 4,2 (умови, раніше встановлені для цього антиті-

Таблиця 43

Кінетика мічення радіоактивним ізотопом У288: вплив рН на радіоінкорпорування і зв'язування з СО2О-Розійме клітин

Таблиця 44

Кінетика мічення радіоактивним ізотопом У288: вплив тривалості інкубації на радіоінкорпорування і зв'язування з СО20-позитивних клітин

Імунореактивність для Іп288 та 288, приго- зв'язування з СО20-позитивними клітинами (58) товлених з СНО 288 визначали, використовуючи та СО20-негативними (Н5ЗВ) людськими клітина- метод Гіпато та ін. Зростаючу кількість свіжозіб- ми. Ці результати підсумовані в Таблицях 45 та раних СО20-позитивних 5В клітин витримували з 46. Для шести приготовлених партій Іп288 зна- фіксованою кількістю Іп288 або у288 за умовах чення радіоінкорпорування знаходилося в інтер- надлишку антигену. Аналіз обернених графіків валі від 98,995 до 99,390 із середнім значенням залежностей даних зв'язування показав імуноре- 99,1905. Значення зв'язування з СО20-позитивним. активність 80,695 та 72,295о для Іп288 і 288, від- клітинами знаходилися в інтервалі від 81,995 до повідно (Фігури 37 та 38). 85,195 із середнім значенням 83,690; значення

Г. Норми виходу похідних від СНО Іп2В8 та зв'язування з СО20-негативними клітинами ста- чагвв новило «495. Для шести приготовлених партій

Дві партії клінічної якості комплектів мічення Уу288, значення радіоінкорпорації знаходилося в радіоактивним ізотопом Іп288/7288 використову- інтервалі від 97,495 до 98,790 із середнім значен- вали для приготування шести партій кожного з ням 98,295. Значення зв'язування з СО20-

Іп288 та 288. Іп288 та 288 готували з викорис- позитивним клітинами знаходились в інтервалі танням лабораторного варіанту протоколу ком- від 81,495 до 82,7905 із середнім значенням 81,990; плекту, який зараз використовується в клінічних значення зв'язування з СО20-негативними кліти- випробуваннях. Кожну партію міченого 288-МХ- нами становило «8905.

ДТПК випробували на радіоінкорпорування та

Таблиця 45

Результати аналізу виходу для похідного від СНО Іп2В8, приготовленого з використанням протоколу комплекту мічення радіоактивним ізотопом

Зв'язування (90 йа(Партіяйог20)ї | ///рюьлсл950777777111711111111838871711111111111261 11111111 |Середнет9995 |Середнєт83,696 Середнєв2,996.//-:/У// 11111111 |сквогою 7 |ск-тмоє 7 скноЯю 777771

Таблиця 46

Результати аналізу виходу для похідного від СНО У288, приготовленого з використанням протоколу комплекту мічення радіоактивним ізотопом

Зв'язування (90 11111111 |Середнєт98,295 |Середнєт8ї,996 |Середнєє34т6/-/:/КО: 11111111 |скеово 77777 |скнов 7 |скезит 7771

М. Дискусія та висновки радіоінкорпорування й зв'язування, з використан-

АпІН-С020 мишаче мрноклональне антитіло ням ліофілізованих СО20-позитивних клітин, ма- (288), клоноване й експресоване в СНО клітинах ють бути встановлені на рівні 9595 та 7090 відпо- (похідне від СНО 288) підтримує специфічність відно. Разом узяті, ці результати демонструють для СО20-позитивних людських клітин, як пока- можливість порівняти похідне від СНО 288 та зано за допомогою ЕАСЗ5 та аналізу конкурентно- похідне з біореактора на пустотілих волокнах го зв'язування. Зв'язування з людськими Т- 288-49, й вказують на придатність для викорис- клітинами було мінімальним. Використовуючи тання в клінічних випробуваннях похідного від аналіз конкурентного зв'язування, визначили, що сно 288-МХ-ДТПК. спорідненість антитіла для людських СО20- Нарешті, у цьому винаході представлено позитивних клітин становить 1,3х1079М. Викорис- процедуру мічення, що має назву спосіб "тіх-апа- товуючи той же аналіз, антитіло 288, отримане з зпоої", для приготування клінічних доз радіоміче- біореактора на пустотілих волокнах, дало зна- них антитіл, яка уникає потреби у стадії видален- чення спорідненості 2,5х1079М. ня за допомогою рідинної хроматографії високої

Для того, щоб сформувати кон'югат 288-МХ- розрізнювальності (РХВР), що використовується

ДТПК, одночасно зберігаючи придатний рівень сьогодні, незв'язаних білком радіоізотопів. Спро- імунореактивності, проводили реакцію антитіла щений протокол усуває цю трудомістку стадію

СНО 288 з МХ-ДТПК. Оптимальну інкорпорацію очищення, підтримуючи в той же час високий комплексону визначали, вимірюючи рівень радіо- рівень інкорпорації радіоіїзотопу (29595) та пок- інкорпорування "п, та отримували після вось- ращує утримання імунореактивності (»7090). мигодинної витримки при оточуючій температурі. Спираючись на дані з утримання радіоізотопу й

Протокол мічення радіоактивним ізотопом для імунореактивності, було виявлено, що підібраний кон'югату 288-МХ-ДТПК був оптимізували для У за клінічних умов радіомічений кон'югат, залиша- або "п у відношенні рН та часу інкубації, щоб ється стабільним іп міго після витримування при гарантувати максимальне радіоінкорпорування та 47С протягом 48 годин. До того ж, радіомічений утримання імунореактивності. кон'югат залишався стабільним, будучи витрима-

Результати по декількох препаратах Іп288 та ним в людській сироватці при 377"С протягом 72 у288 показують відтворюваність протоколу мі- годин. Дослідження біорозподілу на лінії мишей чення радіоактивним ізотопом, який використо- ВАЇ.В/с не показали незвичайного тканинного вують для приготування клінічних доз. На основі відкладання та значного накопичення в кістках. цих результатів мічення радіоактивним ізотопом Оцінки рівня радіації поглинутої дози "стандарт- отримано підтвердження, що норми виходу для ною" людиною вагою 70кг можна було порівнюва-

ти з дозами, отриманими в поточних клінічних 2. Адатв, Н.А. ЕРопта! Оівсиввіоп: Те Воїє ої випробуваннях, з використанням мічених у 288- Тгапзріапіайоп іп (пе Ехреїтепіа! Іпиевіїдайоп ої

МХ-ДТПК. Результати цих досліджень показали, Нитап Іеєикетіа апа Гутрпота. Сапсег Рез. що мічений У 288-МХ-ДТПК, отриманий з вико- 270): 2479-2482, 1967. ристанням протоколу "тіх-апа-зпоої", можна було З. Гіпато, Т., Вомеп, Е., Синіна, Р., Редогоко, »-., порівняти з отриманим з використанням звичай- апа Випп, Р.А., 9. Іттипої. Меїподавв, 72: 77 1984. ного методу РХВР. Перевірка розширеного про- 4. Ко;ак, К.М/.,, Каишбіїзспек, А., Мігладей, 5., токолу для приготування міченого кон'югату кліні- Вгеспбієї, М.МУ., Удипопацв», А., Сапзому, О.А., апа чної якості показала, що спосіб є відтворюваним Мадтапп, Т.А. Сапсег Вез. (1989) 49:2639-2644. та що продукт може бути порівнянним з таким, 5. Рагкег, В.А., НаІрет, 5.Е., МіПег, В.А., Нирі, Н., що виробляють, використовуючи прийнятий сьо- Зпаміег, О.Г., СоїІп5, Н.А., Атох, О., М/пйе, С.А. годні метод РХВР. Результати цих доклінічних апа Ноузюп, І. М. Епоа. 9. Меа., зиртіцеа. досліджень показують, що новий "тіх-5-5поої" б. Іеїапа, 9.К. апа РомеїІ, М.). 9. (1990) протокол може бути використаним для приготу- ЕІесігоспет. бос. 137, 3127. вання міченого 20у 288-МХ-ДТПК, придатного для 7. МшПег, В. 9. Іттипоіодіса! Меїпоаз (1980) 34, використання в клінічних випробуваннях. 345.

Посилання 8. Міггаден, 5., Вгеспбієї!ї, М.МУ/., Аіспег, В.М. апа

Кожне з нижченаведених літературних дже- Сапзом, О.А. (1990) Віосопіцдаєе Спетівігу 1(1), рел відповідає наведеним в тексті посиланням. 59. 1. Адатв, К.А., Ріоуег5, А., апа Оаміз, ВО. Оігесі 9. Вгеспрій, М.МУ., (запзому, О.А., Аїспег, АМУ.,

Ітріапіайоп апа Тгаперіапіайоп ої Нитап Асціе Зсіот, 9., Евіерап, 9., Зітрзоп, О.Е. апа Соіснег,

І утрпобіавіїй І еикетіа іп Натвієег5, 58-2. Сапсег 0. (1986)25, 2772.

Везеагсй 28:1121-1125,1968.

ФІГ. 2 й

Фіг. ЕАС5 анапіз зв'язування 288 з СО20 антигеном, к присутнім на людських В-клітинах вот че 5 вою х 4 Ф (З х ! Б 400 З

ПУ 60 вал Ф є в і іт гі

Я / З 300

ЖЕО ; В Ів

Ж о а 200 і - і - - . 264 ! т гі о їй | . - 5 ль я г х 1005 ; на і р вен й 0- й а ес . З 0 Я- х В но о в! 5 10 15

А 1 10 100 ооо 10000 Е : З до,

Антитіпо, нгіпунка т Антизіво, закгіми

І ! : --988 -ж- В1(Соикег) -9- 81 (Сошеї) еф Гей 16 (В/Ю) -- дб -и- 25800) -- ОК г. 4 інбувайня здізмічвного 81 овитесОдО МАХ

ФІГ. З веміченим ві. зва НМХ-ДТЛК ков'югованню 256

Анапіз Скетчарда зв'язування 288.3 Б-клітинами

Во Ї - : | х ї

Зо І 5 ва- в Кві ші «7 ше : ач й З за НЕ Щі хо 20 ий 1 -й

Е її Геї ек ще хх ній З.

В ; 5 0 ки пе й і 5о07о З що: : мя к | Б г 4 і чо но а 0. б. інгібітор, мкл 80 400 120 140 --- ЗВВМАТ РА 29040 50 ; І ВЕ

Зв'язані, нім жир ВІ (Со

ФГ. БА «ЧЕ я пернореактинність ТВА прозятем інкубації пря 4 імунореантивнійть ЗВУ протягом інкубації при 4 і м зЗис

Млувораактивністе СИ, 2В8-МХДТИК тиву» ї | й імунорсактивність ВИ. ХВВ-МЖДТОК, тиждень 6 фідер 4 се б ореттттджя ов ЖИВ Он Мово | ей Ї 4 СВ, че о а АФ. рочки од й сни ок шк пннідмию МОВО

Е ав ща | жен Фа За Фа. подхию ук я УВА. розчин і м Ї -я-йнн ВАДУ з ов й КЕ ляже ЛЮУ ЯУ йо. ровеме і ие | МД ХО а . 4

У ва я, сеж- ВВ Ф 4 рот вве су щ мив терня ЗАМКА ВА 5 ва ож нн ВВЕ у я й І плов ДВК Ж БВ: « я терня ВВ х Ком 1 и зби ВНАУ 4 МУ пл ; ле тей ЗВВЯАХ ЗО ЗИ ов ; тенвнся МАМ ОКНМУУ ЗЕ перу в дер ченнйкнне ЗВВАВХК ЗУ а Й у шини нн Ши оо ре

Ко 1 Я за че стуку возі: ник тн

І ; ; І Кг: Кк 3 ча

АВімнкунамі АВ іа «ВГ. А

Фіг. вв Зв'язування о Чр-мічаного ВХ ДІЛК з бО-29 й позитивними пишщеськими хлітвнами

Наунсрезиуизність ЯВИ протягом інкубація при і зе во

Плунсрезитианісте ХА, 28-Х ДТИК, тиждень 12 3 дз

ПО х 12 " де 3 -50 ІЗ 48 дя вет ОВС - г , й КЕ, еко ей М оба й «5. розхик Ж Я х ов зай ення ПД. ЗВА У до. їксахе г «й е ой яння ВВА ДЖ ГУ 5. . я 98 Бай нан ВВ Оу. х ча свй -яь- ВИХ За Ж 23 З . 98 де сн ЗВАМХ Ба г «т сен ЗВ СЮ п ; ве 1 --- ВХ ох ХЕ ек: МНН бо ан виваяанн 00 ог 04 ов 08 ке. 4 1 та й вв інкпма) Об'єм крітин (м)

ФГ.

Стабільність п? Уйго "У-мізоного 2В8-МИХ-ДТПК в РЕ, яки містить пюдський сироватковий альбумін і ДТПК й 123455 нн 190

Час нуль : і й Що ям ОВ МХ-ОТвА,

Фіг. вв

Зв'язування Неоміченого ЗВЯ-МХ-ДТИК з Со-2о позитвеиними прздськими клітинами І й да - зн КВН На В дення 7 ронт барвника 4.5 осевктакнаети 4 | Ї ши -80 у 2Б8-МХ-ЮТРА

Ехо 25- 4Всгодив: шкі с, е | ще нс З 85 2 1.55

Кк: у с х : : о 2 4 В В 16 її 15 І

МО 'єм ктян імя я й мах й " Френт бараника

ФГ. Я г, 9

Стабітьність й Мйго "у-міченого ЗВ8-МХ-ЦТИХ в РЕ, Стабільність і Мо -міченого ЗВ4-МХ.-ДТИК в РЕ, яки містить людський сироватковий альбумін і ДТНК який містить пююдський сироватковий апибумів і ДЕТДК зав, 2 2.480 | 2

Й квот вом ва-мхоютеА я і . 5 | . ! | В. !

Ж я . «ХХ Е | ! х 5

Е-Я й х ;

Кк ГУ - Б

Ж Фронт Баряника. Фрону бзреника ! 1 ! 1 . 7 ї : о І чи ОМ о о сс : с вниом ПО. ооо оосососі ново я щодо ово зво ккаоо 25.09 й Що най

Відстянь (ма) Відетань (Мі

ФГ. ТВ анг

Стабільність Лю Мт "а-міченога 2БЗ-МХ-ДТИК к

Стабільність Її» Уйо "Чалерюнога 2ВЗХ ТНК в БВ, який містить людський сироватковий зльяувій

ВХ, який містить людський скровзткавий злобу 123358 зва, З епі аввинавнь ' і Ї знов ! .

Рок ооо вою ооо ВИ ро чом ОТ Н Ні ноздадиєя -

Чень 17 . | зВЕМСУВ інв МОтвА

Й Аж й ! Я

ЕЕ

! СЕ . | я. і ге 1 - Фронт бареника є кінні ніна лавававлававввноя й

Б о слину ЕЕ

Кн Її АЧіковвахотвА Бі 8 садині : і МИ: ; | ! і | ! Фронтбарваниви , Я й 4

Н і дів и и со сс ен 55.00 145.00 - Шроку барвиикау Відстань (м) т ФІГ. 15

Стабільність з МИо У-міченого УВ8-АК-ДТИК,

У інкувеваного я людській сироватці .

Стабільність йо Мнга реміченаго 2В8ЛаХ-ДТИК а

РВ5, який містить людський сиренатковий альбумін . 123458 й ГО ЯбуовадахоютвА 4,323 З Час нуль ої ККУ й

Та евб-МХ ТВА

Щ . 3-й К

Ко с. о « Фронту бараниха в НЯ

Кк ї.

КУ і 5 м -50 у РВЕ МХТРА

Збгодені: , У Ки ик же

А

Фронт барвника - 7. І 0,300 Баслотвннеке ; КОН НКо оо огсовмювк юю ооо но І - Фрону барвника , Відстань (ма) . Ї. лооюнотетнтнсостнютюттнння ка

ФІ «ФІГ. 15

Стабільність в Мо Зудіченно 288-мх-ДтпК, М Й Й інкубовавого в пюдській сиронаучі " Стабізьність б Мито усвічнного 2ВЯ-Х ДТП, інкубованого в пзодеокій сироватці 28 2 2205 ! з

За щ щй ' шу з катнікотек-

Гі / І

ГУ г

Е Е гі в т | а

Е х

Ж Е

Ж й

Р авронт баряника «Фронт баровика

Я. в ;

На оче пиши чи чи: - ше нин заю БВ тясю. -. 18000

І ЕНдезань рамі Відстань (мою) г. 36 Фіг.

Стваільність іт Мені "темі зввжхдтик Стабільність й о Уйто "Ча-міченого 288-МХ-ДТПК, таситьність га плеча ДК в - й м

Р, який містить пюденкий сироватковий альбумін Інкубаованого з людській киропатці «1 123458 ла | З рис і ги Що 0 «МЧо-аве мк отеА М .звВаМХ ТВА

Час нуль: ще . й ж .

Е т . ж у и е и г: м х в ; - Фронт барвника к

Ж у я виш х в с ехо « - )

ГЦ нчоовамкютеА 5

Явгодин КО З УУИМНИЮ -- 2 , Фронт барвника Я я ; й чия о НН не 0493 ведемо нн рун 100.00 І 17 «Фронт барвника Відетань (мм)

ФІГ. В І г. В і чі Бапнив о вливання 288 она рівні Бопікнфоцитів У

Стабільність б» Міга ""Ча-міченого 258 МХ-АДТИК, яванських макак, день й - день 12 інкубованого в людській сироватці 120 нини 275 Кі 100 дитя -йз-- РЕОЯЖО ОВ 3, розхик т . и па совно РВОЗІЄ Го Фіх дозчем ї во дО РАС) вбито

НИ ів-2в8-МХАОТРА х во сте РВОВОЕ І пксякік ве ) Е сн РНОТОЄ ПАХ (пріо) ї «іш Ск вом (річн, з й жо 2 що ш. х | а 5 1 їв з І й " Час (дні а ї2о - «6 5 гЗ т г. й м-н РВОЯ5 (Дема. позма; 5 тю о --- Ада то розчин 5 ! х 80 Ше зн РЕОТЯАИ іфіхеко

Е Б во деко ун РАОЗБМІМ пеосмско

Ж ; в понти -ь- РНОМІБІМЕ бабло

Ка 43 І Ши ллкррня НОТ М 18, оімгкгї

Франт барвника Е І з. 4 Ж зо - ко 0480 УСНО зіставлення Й НН Мк о здо 170.00 о 5 їй ЩЕ

Відстань (мам Час (дні)

ФІ. го

Віднавленния вівнів цирнувютючих В-изітин у макак, нкі «г. 23 дтримани ін'єкцію мешачого моноклонального анти»

СО2В вититіча 288 Бплив 288-МХ-ДТИК на циркулютнані В-клітини у маках 150 Ж ВВ

Н є ЗИ м ї Ж о фоодння- ВНД Фіз розчи а її й то Ж ре кі се кож ї дах боучнк 8 тан РЕОЄВЕ 3 4 іх, ваучни х Во вини ук вар З. х м -- РКО ЛВ 23 кх розчини

ЩЕ рен ТТ БВОВЮН ожіжню ооо о стяк РВОТІУ жу секс т ва р се лей РВОЖОВЦ(Ю веіжико рай о йони де ко

В Я и опе А шли дез -- РВОКО дух іно

РУ щи тт РАОБОЄ ватною жо я я -- РЕОВОЮ побутерко

ЩА що і й й ям ВЕОТВ м Ку Х чо : 7 я-ь- ВО ща іміик

ШІ ; ш З б теж РЕДЕВЯ бетонною 7 Е В нє я в зей ВЕЖ сдхюукії

Ї грн

Й ре ртвттрутртеткукннь І фронт рт а 30 25 33 40 50 Бо й т 20

І чаю (дні здасідні

ФІГ. 22А . Фіг. 2265

Кліренс 288 з Яванських макак після єдиної ін'єкції 10 мргікг ; Клірене крові 288, 288-МХ-ДТИК з ВАМ Вс мишей г .

З

Е 200 1-9 Е Зо сн . . - Б -- 988

Е з -- ь ЗВАМХ-ОТРА 8 і РО | й вк т 100 В ! , 2 Кк яко й о й шо 40-13 з : я - я, й : й се а і: ж г м Й с Е --. ц і ! я о г

ЕЕ 0 в 10 15 Об - ЖЕ в) о 290 300.

Ж мас (дні)

Я Час (години) . ФІ.

В. 2

Бізрахподілення 155 31 а-яВВ МДЕ вБіорозподінення (зору ва ТИ : 5а опе нстесвовенеетнннанення ЩО пр ннттоототнтотттониннтня узи | І

Е 43-х І: і ' х док га 305 ик хро х ра ект « Тр ок: 5 Я дерче р 4 М Серце я За й ТЗ Пегвя Е ЇХ люті з мя Б СО низ

Е БУ січні г 20 " 5 лючінкя

КО пке г. КЗ йпзлехнох х І |! ; сбинезінкия що ОЙ БУ М'яз и | м'я ! | З са з І щу г В І ділуканю- З 13 ! й, я в Міпунхояох

ННЯ я у я - 2аШЖжоюхЯ Уржет, Я НИ З до Кай, В кМвгй тИЗКІ й ще п це а - 1 . Й ий

І 5 Бл Но їй ЕОБИЖ За Я, В ше Же у щ. БК) в МИ КИ НИ Є о ВБІЯ я 1 ща «8 її і 74 «В то - Че, годин | Час, годин. й

ФІГ. 25

Пухлинна покалізація ПЯТп-га8-аХхдтК ФІГ. 26А 4а- з нечітка - - Зв'язування ""У-міченого 2Б8-МХ-ДТИК з бр-20 т | позитивними пюдськими клітинами

РИ зо ; зни Хеов 100

ІЗ Е Серие : | й ї 1 | ЕВ Логені во в БО пеню

А М чТУМ 5 1 ТЯ бепезінка 50 : Не пяза Гео! . Стмно 5 » й | В ше 404 51 пе - І. о В їх Ге - 4 НІ: Най лий я 8 20 І а ї. и Ма Я у з ЗНАЙ й й «НЕ а - б 24 «В ТЕ 0 5 10 15 20

Чат, годин Об'єм кпітин (млин ма мл) 5 тадвн ФІ. У

Стайоцнать йт Мт б -кдчаного ЗБА-ЯКДІНК в РЕ, який міститю пзденинй сираматкавий зпобумн і ДТ

ФІГ. 266

І ав

Зв'язування "У-міченого 288-МХ-ДТИК з с0О-20 Час нуль при" -0 ухзвв-МКАМРК позитивними людськими клітинами ; Що 22 а Кл ер ; 24 ух їх 1139, Кезацагей: 994 і Дек КЕ ехе 2.00 БОМ. С в ВК Я 18 | пн ШИЯ в 1.8 що 1 Ой й бусвемхотьА 133 8» 0 (4283- ! о 0 10 2030 49 50 60 70 80 90100 ше

Л/Концентрація клітин (мл) І ВОМ ОС рвонт барвника РУ)

ЯНГ. 28 ФІГ. 28 о, Стабільність ій Мито 4-міченого ЗВ8-МХ-ДТПК в ЕВ,

Стабільність дю Міно "у хміченого 288-МХ-ДТИК в Рв, який містить людський сироватковий альбумів і ДТИК яЯкиН містить пюдський сироваткивий апьбумів ДТ злаг Е: 2284 з 80 у ВХ ЮРА ! 50 у-288-МХ ТРА. 1) ді І і ж й ї | ї в

Е

З Ж і о г. ро г, 5 | Е х й щ З ХЕ . х г

Е ! о

Е | е ву й ще з ! ї - ї х , 2 г: 0298 ; ее ча 0322 есе пн анна ; песня вее оо Ой ко 150,00

Відстань Пак) Відстань (мим)

ЯНГ, За ФГ. Зі

Стабічьнівть бо Мго уоміненого ЗВЯ-МХ ДК, Стабільність Мб Мйла у-міченого ЗБЕ ДТНИК, інкубаваного я годеький окрхмиУці інкубоканога в людський сироватці , влив 4 пили Ж у-гна-МХ ТРА В , ОНИ БО ува отв

Час пул Я нн сю мжух с й ше Е їй ре ох х : шу Е

ИЙ сосбронт баранина 70) З

В . ! х з

Миші 80 У ЗВВУЯ Ж ОТРА Ей | і

Та одини | ве ; Ех

Що З і ! . Ук: ! 0283 с рн вро тс ! ше | вх оо 180ю

Ї почне двеввквявнннюсі 7 фронт бараника СУ) Відстань (мм) «ВГ. 35 Я, 43

Стабільнішть ой Мібе уміченц г з : ; І | І інкубовзинога п'людський сироватиі то яв МдтиК, Еіорозподільния Сулмізаниго 2ВЯМКСДТИХ у мінией 1881, 4 5: пет у гваакИтРА А І

І 4 ! М хр ві | ї ПО) сево

З і ї - Н Ями я ! 1 за4 ща ная

ШЕ ОК Печінен ві - Н К Н ща Ганяуіння хо ЕЕ мя:

Е Н ! ; Е що . БУ стек й | ж ше

С і | Бо дк» х | гі Е й сконюнеай пох

КЕ І 1051; | І: ши і і ТЕ а В ! і ї Не зи

ГА 1 з ЕХ З в. й в..Я.-

Блю по Й

Бідстянь імомх Ме, подив

ФІГ. 35

Конкурентне зв'язування СНО-похідних 288 з 2020»

ФІГ. 34 позитивними людськими клітинами

Пряме зв'язування СНО-похідних 288 з СсО20- -- СНО 288 позитивними ої СОгб-неєативними людськими --- 28849 клітинами --- 504 4 й 1000 6 су ! «о . - 4 че що

КЗ і - 510 с а ИН ДИ щ т . х га 2 У ж ; а х 4

Те 2 шо 410 ;

Ф Еш 2 Бе р я-Е- СНО 288 проти ЗВ клітин 5 4 о . я З 19 е ї -у- - 5004 проти ЗВ клітин З хе

Як а пенідн- СНО 288 проти НЗВ кпітин в 4 не

Ф 40 -8 ш 210 зу ра т о - х

Е о--о о з б з а я " а в 5 5 1 | о і ; о то 20 зо 0001 001 о 1 10 100

Концентрація антитіл (мке/мп) Концентрація антитіл" (МКгіМл)

Фіг. 36

Конкурентне зв'язування СНО-похідних 288 ії 288-МХ-

ДдтпКзсО20-позитизними людськими клітинами : о 288-МХ-ДТИК; 8 годин -к- зв8 -шО нн; 2В8В-МХ-ДТЛІС 17 годин ФІГ. 37А -- -МХ-ДТПК; 24 ж - ЯввМхд подмни Зв'язування (288, яке приготували з СНО 288-МХ.- 100 ДТПК, з СО20-позитивними клітинами во ож 100 /в - бо и, во рани х и г М

І щ ж 80 5,

Е у Ек 80 : - Го г 20 р ГАЇ й т 20 о ол 1 10 100 010. 20 30 40 50 60

Концентрація антитіл (мкгімл) Концентрація клітин (х 107 клітин/мп) «ФІГ. З8А

ФІГ. 376

Зв'язування Іл288, яке приготували з НО 2858-МХ»

Зв'язування іп288, яке приготувани з СНО 288-МХ- / ДОК, з Сб20-позитивними кпітинами

ДТПК, з СО20-позитивними клітинами 400 2.5 | 90 ух 1.2404 4 0.0093925х К 099061 во з 2 - - 705 - ово до - їж ж 40 т 30 «а . в га 05 10 в й Гери не тер є - і " 0 10 20 30 40 50 60 0 и 20 Зо до БО І Й в.

Зюб'єм концентрації клітин Концевтрація клітин (х 10" клітинімп)

Фіг. 3656

Зв'язування п2858, яке приготували 3 СНО 288-МІХ-

ДТИК, з СО20-позитивними клітинами 6 ; 1 ух 13854 О0473ОХх В х 0.809909 5 4

З ж з 2 1 : е о 20 «0. 60 80 100

НОб'єм концентрації клітин

Комп'ютерна верстка 0. Гапоненко Підписне Тираж 26 прим.

Міністерство освіти і науки України

Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна

ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601