PT2112512E - Kit de radiomarcação e análise de ligação - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

KIT DE RADIOMARCAÇÃO E ANÁLISE DE LIGAÇÃO

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Campo da Invenção A presente divulgação refere-se a análises de ligação de anticorpos e kits de radiomarcação, preparações de células liofilizadas, reagentes e protocolos para verificar a eficácia clinica de anticorpos terapêuticos para o tratamento/imagem de tumores e células tumorais. Especificamente, os kits da presente divulgação são usados para produzir e avaliar anticorpos radiomarcados conjugados, que serão utilizados para o tratamento e imagem de tumores linfoma de célula-B pelo direccionamento do antigeno de superfície da Célula B BP35 ("CD20"). 2 . Estado da Técnica

Todas as publicações e pedidos de patente aqui referidos estão incorporados a título de referência na mesma medida como se cada publicação ou pedido de patente individual estivesse específica e individualmente indicado como incorporado a título de referência. 0 sistema imunológico dos vertebrados (por exemplo, primatas, que inclui humanos, macacos, etc.) consiste em vários tipos de órgãos e células que evoluíram a ponto de: reconhecer precisa e especificamente microrganismos estranhos ("antígenos") que invadem o hospedeiro vertebrado; especificamente ligar-se aos referidos microrganismos estranhos; e eliminar/destruir estes microrganismos estranhos.

Os linfócitos, bem como outros tipos de células, são de importância vital para o sistema imunológico. Os linfócitos são produzidos no timo, baço e medula óssea (adultos) e representam cerca de 30% do total de leucócitos presentes no sistema circulatório humano (adultos). Há duas subpopulações principais de linfócitos: células T e células B. As células T são responsáveis pela imunidade mediada por célula, enquanto as células B são responsáveis pela produção de anticorpos (imunidade humoral). Contudo, as células T e as células B podem ser consideradas interdependentes - numa resposta imune típica, as células T são activadas quando o receptor da célula T se liga a fragmentos de um antigeno que se liga a glicoproteínas do complexo de histocompatibilidade principal ("MHC") na superfície de uma célula que apresenta antigeno; a referida activação provoca a liberação de mediadores biológicos ("interleucinas") que, em essência, estimulam as células B para diferenciar e produzir anticorpos ("imunoglobulinas") contra o antigeno.

Cada célula B no hospedeiro expressa um anticorpo diferente na sua superfície. Portanto, uma célula B expressará um anticorpo específico para um antigeno, enquanto outra célula B expressará um anticorpo específico para um antigeno diferente. Assim, as células B são bastante diversas e esta diversidade tem importância vital para o sistema imunológico. Nos seres humanos, cada célula B pode produzir um número enorme de moléculas de anticorpos (p. ex., cerca de 107 a 108) . Tal produção de anticorpos muito tipicamente cessa (ou decresce substancialmente) quando o antigeno estranho é neutralizado. Contudo, ocasionalmente, a proliferação de uma determinada célula B continuará sem decrescimento; a referida proliferação pode resultar num cancro denominado "linfoma de célula B".

Tanto as células T como as células B compreendem proteínas de superfície celular que podem ser utilizadas como "marcadores" para diferenciação e identificação. Um destes marcadores de célula B humana é o antígeno de diferenciação restrito ao linfócito B humano BP35, denominado "CD20." 0 CD20 é expresso na fase inicial do desenvolvimento da pré-célula B e permanece até à diferenciação do plasma celular. Especificamente, a molécula CD20 pode regular uma etapa no processo de activação que é requerida para a iniciação do ciclo e diferenciação celular e usualmente é expressa em níveis muito altos em células B neoplásicas (tumorais) CD20, por definição, está presente tanto em células B "normais" como em células B "malignas", isto é, as células B cuja proliferação sem decrescimento pode levar a um linfoma de célula B. Portanto, o antígeno de superfície CD20 tem o potencial de servir como candidato para "direccionamento" de linfoma de células B.

Em essência, o referido direccionamento pode ser generalizado como se segue: anticorpos específicos ao antígeno de superfície CD20 de células B, p. ex., são injectados num paciente. Estes anticorpos anti-CD20 ligam-se especificamente (ostensivamente) ao antígeno de superfície celular CD20 de células B, tanto normais como malignas; o anticorpo anti-CD20 ligado ao antígeno de superfície CD20 pode levar ao extermínio e depleção de Células B neoplásicas. Além disso, agentes químicos ou marcações radioactivas com o potencial de destruir o tumor podem ser conjugados com o anticorpo anti-CD20, de modo que o agente seja especificamente "entregue", p. ex., às células B neoplásicas. Qualquer que seja a abordagem, um objectivo primário consiste em destruir o tumor: a abordagem específica pode ser determinada pelo anticorpo particular anti-CD20 utilizado e, portanto, as abordagens disponíveis para direccionar o antígeno CD20 podem variar consideravelmente.

Por exemplo, foram relatadas tentativas do referido direccionamento do Antígeno de superfície CD20. 0 anticorpo monoclonal murino (rato) 1F5 (um anticorpo anti-CD20) foi supostamente administrado por infusão intravenosa contínua a pacientes de linfoma de célula B. Níveis extremamente altos (>2 gramas) de 1F5 foram supostamente exigidos para consumir células tumorais circulantes e os resultados foram descritos como sendo "transitórios". Press et ai., "Monoclonal Antibody 1F5 (Anti-CD20) Serotherapy of Human B-Cell Lymphomas," Blood 69/2:584-591 (1987).

Um problema potencial com esta abordagem é que os anticorpos monoclonais não-humanos (p. ex., anticorpos monoclonais murinos), tipicamente, não possuem a funcionalidade da resposta humana, isto é, não têm capacidade para, entre outras, mediar lises dependentes de complemento ou de provocar a lise de células-alvo humanas por meio de toxicidade celular dependente de anticorpo ou fagocitose mediada por receptor Fc. Além disso, anticorpos monoclonais não-humanos podem ser reconhecidos pelo hospedeiro humano como uma proteína estranha; portanto, a injecção repetida dos referidos anticorpos estranhos pode levar à indução de respostas imunes conduzindo a reacções prejudiciais de hipersensibilidade. Para anticorpos monoclonais de murino, frequentemente, faz-se referência a isto como resposta de Human Anti-Mouse Antibody, ou resposta "HAMA". Além disso, estes anticorpos "estranhos" podem ser atacados pelo sistema imunológico do hospedeiro, de modo que sejam, com efeito, neutralizados antes de atingir o sitio de seu alvo.

Linfócitos e células linfoma são inerentemente sensíveis à radioterapia. Portanto, as malignidades de célula B são alvos atraentes para radioimunoterapia (RIT) por diversas razões: a emissão local de radiação ionizante de anticorpos radiomarcados pode matar células com ou sem o antígeno alvo (p. ex., CD20) demasiado próximas do anticorpo ligado ao antígeno; a radiação penetrante, isto é, beta emissores, pode obviar o problema do acesso limitado ao anticorpo em tumores volumosos ou polivascularizados; e, a quantidade total de anticorpos exigida pode ser reduzida. 0 radionuclídeo emite partículas radioactivas que podem lesar o ADN celular até ao ponto dos mecanismos de regeneração celular deixarem de conseguir manter a célula viva; portanto, se as células alvo forem tumores, a marcação radioactiva mata beneficamente as células tumorais. Os anticorpos radiomarcados, por definição, incluem o uso de uma substância radioactiva que pode exigir precauções tanto para o paciente (isto é, possível transplante de medula óssea) como para o seu prestador de cuidados de saúde (isto é, a necessidade de exercer um alto grau de precaução ao trabalhar com radioactividade).

Portanto, uma abordagem para melhorar a capacidade dos anticorpos monoclonais murinos para efectuar o tratamento de distúrbios de célula-B tem sido conjugar uma marcação radioactiva ao anticorpo, de modo que a marcação ou toxina seja localizada no sítio do tumor. As toxinas (isto é, agentes quimioterapêuticos tais como a doxorrubicina ou mitomicina C) também têm sido conjugadas aos anticorpos. Ver, por exemplo, o pedido PCT publicado de WO 92/07466 (publicado em 14/05/1992).

Anticorpos "quiméricos", isto é, anticorpos que compreendem aliquotas de duas ou mais espécies diferentes (p. ex., rato e humano) foram desenvolvidos como alternativa para anticorpos "conjugados". Anticorpos quiméricos rato/humano foram criados e exibiram as caracteristicas de ligação do anticorpo parental de rato e funções efectoras associadas com a região constante humana. Ver p. ex., Cabilly et ai.. Patente US 4,816,567; Shoemaker et ai., Patente US 4,978,745; Beavers et ai., Patente US 4,975,369; e Boss et ai., Patente US 4,816,397, todas aqui incorporadas a titulo de referência. Geralmente, estes anticorpos quiméricos são construídos através da preparação de uma biblioteca genómica de genes do ADN extraído de hibridomas murinos preexistentes. Nishimura et ai, (1987) Câncer Research 47: 999. A biblioteca é então mapeada em busca de genes de região variável de cadeias, tanto pesadas como leves, que exibam os padrões correctos de rearranjo dos fragmentos de anticorpo. Os genes da região variável clonada são então ligados num vector de expressão que contém cassetes clonadas da cadeia pesada ou leve de gene da região constante humana. Os genes quiméricos são então expressos numa linha de célula de escolha, usualmente uma linha de mieloma murino.

Por exemplo, Liu, A.Y., et ai., "Production of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent Biologic Activity", J. Immun. 139/10:3521-3526 (1987), descreve um anticorpo quimérico rato/humano dirigido contra o antígeno CD20. Ver também, Publicação PCT No. WO 88/04936. Contudo, nenhuma informação é fornecida quanto à capacidade, eficácia ou praticidade de usar os anticorpos quiméricos de Liu para o tratamento de distúrbios da célula B na referência.

Observa-se que em análises funcionais in vitro (p. ex., lise dependente de complemento ("CDC"); citotoxicidade dependente de anticorpo celular ("ADCC"), etc.) não se pode inerentemente predizer a capacidade in vivo que qualquer anticorpo tem para destruir ou consumir células alvo expressando o antígeno específico. Ver, por exemplo, Robinson. R.D., et ai., "Chimeric mouse-human anti-carcinoma antibodies that mediate different antitumor cell biological activities", Hum. Antibod. Hybridomas, 2:84-93 (1991) (anticorpos quiméricos rato-humano com actividade ADCC indetectável). Portanto, a eficácia terapêutica potencial de anticorpos só pode ser realmente avaliada através de experimentação in vivo.

Para esta finalidade, pedidos co-pendentes 08/475,813, 08/475,815 e 08/478,967, aqui incorporados na sua integralidade, a título de referência, revelam conjugados anti-CD20 radiomarcados para "imagens" para diagnóstico de tumores linfoma de célula B antes da administração de anticorpo terapêutico. O conjugado "In2B8" compreende um anticorpo monoclonal murino, 2B8, específico do Antígeno humano CD20, que se liga ao índio (111] (U1ln) por via de um quelante bifuncional, isto é, MX-DTPA (ácido dietilenotriaminopentacético), que compreende uma mistura de 1:1 de 1-isotiocianato de benzila-3-metil-DTPA e 1-metil-3-isotiocianato de benzila-DTPA. O índio-[111] é seleccionado como um radionuclfdeo de diagnóstico porque emite radiação gama e tem antecedentes de uso como agente de imagem.

Patentes referentes a quelantes e conjugados de quelante são conhecidas na técnica. Por exemplo, a Patente U.S. No. 4,831,175 de Gansow refere-se a quelatos polissubstituídos do ácido dietilenotriaminopentacético e conjugados de proteína que o contêm e processos para a sua preparação. As Patentes U.S. Nos. 5,099,069, 5,246,692, 5,286,850 e 5,124,471 de Gansow referem-se também a quelatos DTPA polissubstituídos. Estas patentes são aqui incorporadas na sua integralidade. O quelante bifuncional específico usado para facilitar a quelação nos pedidos 08/475.813, 08/475.815 e 08/478.967 foi seleccionado por possuir alta afinidade por metais trivalentes e fornece taxas elevadas de tumor-para-não-tumor, reduzida absorção óssea e maior retenção in vivo de radionuclídeo em sítios alvo, isto é, sítios tumorais linfomas de célula B. Contudo, outros quelantes bifuncionais são conhecidos na técnica e também podem ser benéficos na terapia de tumores.

Também são revelados nos pedidos c.813, 08/475.815 e 08/478.967 anticorpos terapêuticos radiomarcados para o direccionamento e destruição de linfomas de célula B e células tumorais. Em particular, o conjugado Y2B8 compreende o mesmo anticorpo anti-humano CD20 monoclonal murino, 2B8, ligado ao ítrio-[90] (90Y) por via do mesmo quelante bifuncional. Este radionuclídeo foi seleccionado para terapia por diversas razões. A semi-vida de 64 horas de 90Y é suficientemente longa para permitir a acumulação de anticorpos pelo tumor e, ao contrario de p. ex. I, e um beta emissor puro de alto nível de energia sem irradiação gama acompanhante na sua decomposição, com diâmetros de células que vão de 100 a 1000. A quantidade mínima de radiação penetrante permite a administração de anticorpos marcados com 90Y a pacientes ambulatórios. Além disso, a internalização de anticorpos marcados não é exigida para matar células e a emissão local de radiação ionizante deve ser letal para células tumorais adjacentes sem o antígeno alvo.

Dado que o radionuclídeo 90Y foi ligado ao anticorpo 2B8 usando a mesma molécula quelantea bifuncional MX-DTPA, o conjugado Y2B8 possui as mesmas vantagens discutidas acima, nomeadamente, retenção aumentada de radionuclídeo no sítio alvo (tumor). Contudo, ao contrário de 211Ιη, não pode ser usado para fins de imagem médica devido à falta de radiação gama associada. Portanto, um radionuclídeo de imagem para diagnóstico, como ο 211In, pode ser usado para determinar a localização e as dimensões relativas de um tumor antes e/ou após a administração de anticorpos quiméricos terapêuticos ou marcados com 90Y para fins de redução tumoral. Além disso, o anticorpo marcado com índio permite a avaliação dosimétrica.

Dependendo do uso pretendido do anticorpo, isto é, como reagente para diagnóstico ou terapêutico, outros radiomarcadores são conhecidos na técnica e foram utilizados para finalidades similares. Por exemplo, entre os radionuclídeos que foram usados em diagnóstico clínico incluem-se 131I, 125I, 123I, 99Tc, 67Ga, bem como U1ln. Os anticorpos também foram marcados com uma variedade de radionuclídeos para uso potencial em imunoterapia direccionada (Peirersz et ai, (1987) . 0 uso de anticorpos monoclonais conjugados para o diagnóstico e tratamento do cancro. Immunol. Cell Biol. 65: 211-125) . Estes radionuclídeos incluem 188Re e 186Re bem como 90Y e, em menor proporção 199Au e 67Cu. I—[131] também tem sido usado para fins terapêuticos. A patente U.S. No. 5,460,785 fornece uma lista destes radioisótopos e foi incorporada aqui a título de referência.

Conforme relatado nos pedidos co-pendentes 08/475,813, 08/475,815 e 08/478,967, a administração do conjugado radiomarcado Y2B8, bem como o anticorpo quimérico não marcado anti-CD20, resultou em significativa redução tumoral em ratos portadores de tumor linfoblástico de célula B. Além disso, ensaios clínicos humanos ali relatados apresentaram significativa depleção de célula B em pacientes de linfoma que receberam o anticorpo quimérico anti-CD20. Na realidade, o quimérico 2B8 foi recentemente anunciado como o primeiro anticorpo monoclonal anti-cancro dos EUA, aprovado pela FDA com o nome de Rituxan®. Portanto, pelo menos um anticorpo quimérico anti-CD20 demonstrou comprovada eficácia terapêutica no tratamento de linfoma de célula B.

Além disso, o pedido US Número de série 08/475,813, aqui incorporado a título de referência, revela a administração sequencial de Rituxan®, um anticorpo quimérico monoclonal murino anti-CD20, marcado com índio, com ítrio ou com ambos. Embora os anticorpos radiomarcados usados nestas terapias combinadas sejam anticorpos murinos, o tratamento inicial com anti-CD20 quimérico consome suficientemente a população de células B de modo que a resposta HAMA diminui, facilitando assim uma terapêutica combinada e regime de diagnóstico.

Portanto, neste contexto de imunoterapia combinada, os anticorpos murinos podem ter particular utilidade como reagentes de diagnóstico. Além disso, no pedido US 08/475.813 foi demonstrado que uma dosagem terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD20 marcado com ítrio após a administração de Rituxan® é suficiente para (a) remover quaisquer células B periféricas sanguíneas remanescentes não removidas pelo anticorpo quimérico anti-CD20; (b) iniciar a depleção de célula B dos nódulos linfáticos; ou (c) iniciar a depleção de célula B de outros tecidos.

Portanto, a conjugação de radiomarcadores para anticorpos terapêuticos de cancro fornece uma valiosa ferramenta clinica que pode ser usada para avaliar a eficácia terapêutica potencial destes anticorpos, criar reagentes de diagnóstico para monitorar o progresso do tratamento e desenvolver mais reagentes terapêuticos que possam ser usados para aumentar o potencial de destruição de tumor inicial do anticorpo quimérico. Dada a comprovada eficácia de um anticorpo anti-CD20 no tratamento de linfoma não-Hodgkin e a conhecida sensibilidade de linfócitos à radioactividade, seria altamente vantajoso se os referidos anticorpos terapêuticos fossem disponibilizados comercialmente em forma de kits, pelos quais pudessem ser prontamente modificados com um radiomarcador e administrados directamente ao paciente numa clinica.

Embora existam muitos métodos e reagentes para realizar a radiomarcação de anticorpos, o que falta na técnica é um veiculo conveniente para colocar estes reagentes num ambiente de clinica, de forma que possam ser facilmente produzidos e administrados ao paciente antes que ocorra decomposição significativa do radiomarcador ou destruição significativa do anticorpo devida ao radiomarcador. A falta do referido meio conveniente para comercializar esta valiosa tecnologia pode dever-se ã má incorporação de eficácias demonstradas por alguns protocolos de marcação conhecidos e a subsequente necessidade de purificar o reagente após o procedimento de radiomarcação. A demora no desenvolvimento dos referidos kits, também se pode dever em parte à prévia falta de acessibilidade a radioisótopos comerciais puros que possam ser usados para gerar produtos marcados eficientemente sem a subsequente purificação. Por outro lado, talvez a razão pela qual estes kits, geralmente, não estão disponíveis seja a falta real de anticorpos capazes de atingir a aprovação ou a eficácia que o Rituxan® obteve para o tratamento de linfoma em pacientes humanos.

Por exemplo, tal como comentado na Patente US 4,636,380, aqui incorporada a título de referência, geralmente acredita-se na comunidade científica que para um radiofármaco chegar a ter utilidade clínica, é preciso que este passe antes por um processo longo e tedioso de separação e purificação. Na verdade, injectar radiomarcadores não ligados no paciente seria indesejável. A necessidade de mais etapas de purificação impossibilita o processo de radiomarcação de anticorpos numa clínica, particularmente para médicos que não disponham nem do equipamento nem de tempo para purificar os seus próprios medicamentos.

Além disso, proteínas radiomarcadas podem ser inerentemente instáveis, particularmente as marcadas com isótopos radiolíticos como o 90Y, que têm tendência para lesar o anticorpo, quanto mais tempo ficarem ligados a este por proximidade. Por sua vez, esta radiólise causa eficácia não confiável do medicamento devido à perda do radiomarcador e/ou à reduzida ligação ao antígeno alvo e pode levar a respostas imunes indesejadas dirigidas à proteína desnaturada. Todavia, sem as facilidades para marcar e purificar os anticorpos no sítio, os clínicos não tiveram outra opção senão encomendar anticorpos terapêuticos já marcados, ou mandar marcá-los fora do sítio em instalações relacionadas e voltar a transportá-los após a marcação para a administração ao paciente. Todas estas manipulações acrescentam um tempo precioso ao período entre a marcação e a administração, contribuindo assim para a instabilidade do medicamento e, ao mesmo tempo, reduzindo efectivamente a utilidade dos kits de radiomarcação no ambiente de uma clinica.

Outros tentaram sem sucesso desenvolver kits de radiomarcação de anticorpo que seriam suficientemente proficientes para ultrapassar uma etapa separada de purificação do anticorpo. Por exemplo, a Cytogen lançou recentemente um kit comercial para radiomarcação de um anticorpo monoclonal murino dirigido à glicoproteina TAG-72 associada a tumor. Contudo, o anticorpo da Cytogen é particularmente refractário para uma formulação de kit, por causa da tendência para desenvolver partículas durante o armazenamento, as quais precisam de ser removidas depois, através de uma etapa de filtração. Além do mais, o anticorpo da Cytogen provocou reacções adversas em pacientes por causa de uma resposta HAMA.

Outros proclamaram ter desenvolvido protocolos de radiomarcação que aceitariam o formato de kit pelo facto de não ser exigida uma etapa de purificação separada (Richardson et ai. (1987). A optimização e produção de lotes de kits de anticorpos marcados com DTPA para uso de rotina em imunocintilograf ia 11ΣΙη. Nuc. Med. Commun. 8: 347-356; Chinol and Hnatowich (1987) Generator-produced yttrium-[90] for radioimmunotherapy. J. Nucl. Med. 28(9): 1465-1470). Contudo, os referidos protocolos não puderam atingir o nível de incorporação que os presentes inventores atingiram utilizando os protocolos aqui revelados, que resultaram na incorporação de eficácias de pelo menos 95%. O referido nível de incorporação fornece o beneficio adicional de maior segurança, pelo facto de virtualmente nenhuma marcação não ligada ser injectada no paciente como resultado de baixa radioincorporação.

Os protocolos incluídos nos kits da presente divulgação permitem rápida marcação que pode ser efectuada em aproximadamente meia hora ou apenas cinco minutos dependendo da marcação. Além disso, os protocolos do kit da presente divulgação apresentam uma eficácia de marcação de 95%, dispensando assim a necessidade de mais purificação. Por dispensar a necessidade de mais purificação, a meia-vida do radiomarcador e a integridade do anticorpo fica reservada para o propósito terapêutico para o qual foi marcado. 0 presente pedido revela kits convenientes e métodos pelos quais anticorpos para diagnóstico e terapêuticos podem ser radiomarcados e administrados a um paciente de forma reproduzível, confiável e conveniente. Os kits da presente divulgação transformam o processo de radiomarcação de anticorpos num processo padronizado sem inconveniências nem preocupações, o que facilita grandemente os protocolos de tratamento de pacientes. Os presentes kits oferecem vantagens sobre o estado da técnica porque os óptimos parâmetros para marcação e administração de anticorpos terapêuticos ou para diagnóstico foram determinados, reduzindo assim o custo dos produtos. Uma vez que os kits aqui descritos oferecem os óptimos parâmetros de acordo com a marcação particular, o uso de um kit projectado para uma determinada marcação também minimiza a canibalização, isto é, que ocorre quando um kit inapropriado é usado para uma marcação particular. Evitar a canibalização por sua vez também fornece óptima eficiência de marcação. Além do mais, os protocolos e os ingredientes estéreis e isentos de pirogénio incluídos em cada kit tornam o processo mais fácil de usar, uma vez que a esterilidade, o teste de pirogénio e a purificação pós- marcação dos reagentes são obviados. 3. Resumo da invenção

Com base na divulgação aqui contida, a presente invenção provê, um processo para radiomarcação de um anticorpo conjugado a um quelante com inIn para administração a um paciente, que abrange: (i) mistura de um anticorpo conjugado a um quelante com uma solução contendo ηιΙη para formar a mistura; (ii) incubação da mistura a uma temperatura apropriada, durante 30 minutos para produzir um anticorpo radiomarcado, onde o anticorpo radiomarcado possui mais de 95% de radioincorporação; e (iii) diluição do anticorpo radiomarcado num tampão de formulação a uma concentração apropriada para a referida administração a um paciente, que possa ser administrada diretamente no paciente sem purificação adicional por parte de não incorporado 111In, em que o tampão de formulação compreende compreende solução salina tamponada com fosfato ou solução salina fisiológica e um radioprotector quelante não conjugado. A presente invenção, e formas de realização da mesma são definidas nas reivindicações anexas.

Mais geralmente, contudo, a presente divulgação descreve um kit para radiomarcação de um anticorpo para diagnóstico ou terapêutico antes da administração a um pacientecompreendendo pelo menos (i) um frasco contendo um anticorpo conjugado a um quelante, (ii) um frasco contendo o tampão de formulação para estabilizar e administrar os anticorpos radiomarcados e, (iii) instruções para a radiomarcação do anticorpo, onde os componentes do referido frasco são fornecidos numa quantidade e a uma concentração tal que quando forem combinados com um radiomarcador de suficiente pureza e actividade de acordo com as instruções do kit, nenhuma purificação adicional do anticorpo marcado é exigida antes da administração ao referido paciente. Além disso, quando marcado de acordo com as instruções do kit e com um radioisótopo de suficiente pureza e actividade, a incorporação do referido isótopo pode atingir níveis além de 95% e até 98 % ou mais. 0 anticorpo incluído no kit é muito preferencialmente um anticorpo anti-CD20. 0 anticorpo é fornecido numa forma pela qual é ligado a um quelante bifuncional. Preferencialmente, o anticorpo é conjugado a MX-DTPA, mas podem ser usados outros quelantes, tais como DTPA conjugado a fenila ou benzila, ciclohexila-DTPA, derivados de EDTA e DOTA. De acordo com a presente invenção, um quelante pode ser qualquer quelante que seja pelo menos bifuncional, isto é, que possua pelo menos dois sítios de ligação (pelo menos um sítio para quelar um ião metálico e pelo menos um sítio para acoplar a uma proteína ligante).

Dependendo do anticorpo usado, o anticorpo conjugado é tipicamente fornecido numa concentração de 0,5 para 30 mg/ml, mais preferencialmente 2 mg/ml. O volume de anticorpo conjugado dependerá da concentração e da quantidade exigida para a óptima marcação dependendo do radiomarcador. Contudo, o anticorpo conjugado deve ser fornecido num volume e concentração tais que todo o volume será adicionado ao frasco da reacção, utilizando uma seringa esterilizada e técnica asséptica. Isto proporcionará aumento da reprodutibilidade e facilidade de uso. Todos os reagentes dos kits revelados agui são estéreis e isentos de pirogénio e foram especificamente desenhados de modo a apresentar simplicidade e rapidez ao avançar directamente do ensaio de anticorpo para a administração. Com algumas marcações, a necessidade de testar a eficiência da marcação pode não ser exigida.

Um componente particularmente vantajoso do kit é o tampão de formulação para estabilizar contra os efeitos de radiólise e administrar o anticorpo conjugado radiomarcado a um paciente. 0 tampão de formulação é um excipiente farmaceuticamente aceitável gue serve tanto como diluente para o anticorpo marcado como de tampão de administração. Embora gualguer diluente farmaceuticamente aceitável possa ser usado para administrar anticorpos terapêuticos ao paciente ou para diagnóstico do mesmo, o tampão de formulação da presente divulgação é particularmente adeguado para a administração de anticorpos radiomarcados.

Por exemplo, o tampão de formulação da presente divulgação compreende um radioprotector, tal como a albumina sérica humana (HSA) ou o ascorbato, gue minimiza a radiólise devido ao itrio e, num grau menor, ao indio. Outros radioprotectores são conhecidos na técnica e podem também ser usados no tampão de formulação da presente divulgação, isto é, destruidores de radicais livres (fenol, sulfatos, glutationa, cisteina, ácido gentisico, ácido nicotinico, palmitato de ascorbila, HOP(:O)H2, glicerol, formaldeido sulfoxilato sódico, Na2S2O5, Na2S2O3 e S02, etc.).

Observe-se que, embora os radioprotectores sejam geralmente empregados no tampão de formulação para protegerem o anticorpo de radiólise, é possível que ofereçam mais protecção por incluírem igualmente o radioprotector no tampão de reacção. Isto geralmente não foi feito antes, isto é, com HSA, devido à presença de metais que interferem no processo de marcação. Contudo, é possível "limpar" o HSA utilizando uma resina quelante tal, que também possa ser incluída no tampão de reacção. 0 ascorbato ou outros radioprotectores também podem precisar de tratamento para remoção de metais contaminantes. 0 tampão de formulação da presente divulgação também compreende quelante não conjugado em excesso. A finalidade de incluir quelante não conjugado é que este quelante serve para consumir qualquer radiomarcador não ligado à proteína no paciente e efectua a excreção do radiomarcador reduzindo assim a absorção dos isótopos "pesquisadores de ossos", isto é, 90Y, pelos ossos do paciente. Por exemplo, quando o anticorpo do kit está conjugado a um quelante DTPA, a DTPA em excesso ou qualquer outro quelante pode estar incluído no tampão da formulação. 0 tampão da formulação também é preferencialmente fornecido num volume tal, que todo o teor é transferido para o frasco da reacção. Conforme comentado acima, isto resulta numa maior facilidade de uso e reprodutibilidade porque não é necessário medir e transferir os volumes exactos. 0 tampão de formulação preferido compreende fosfato tamponado ou salina fisiológica, albumina sérica humana e DTPA. A albumina sérica humana é preferencialmente a uma concentração de entre 1 a 25% (p/v) e mais preferencialmente na concentração de cerca de 7,5% (p/v). A concentração de DTPA é preferencialmente cerca de 1 mM. 0 ascorbato pode ser usado como uma alternativa para a albumina sérica humana e é tipicamente usado numa concentração de cerca de 1 a 100 mg/ml. No entanto, é possível usar uma gama mais ampla de concentrações sem comprometer a segurança do paciente. O anticorpo do kit de radiomarcação é prontamente marcado com um radioisótopo de opção por via de um guelante bifuncional de acordo com os métodos da presente divulgação. Para maior simplicidade a este respeito, o kit da presente divulgação também pode incluir um frasco contendo um tampão para ajustar o pH da solução do radioisótopo e um frasco de vidro esterilizado da reacção para realizar a marcação e subseguentemente para ressuspender os anticorpos finais radiomarcados no tampão da formulação. Um frasco de 10 ml de reacção costuma ser suficiente, mas frascos capazes de conter 5 a 20 ml também podem ser usados. O tampão é preferencialmente uma solução de acetato de sódio de baixo teor metálico numa concentração de 10 a 1000 mM, mais preferencialmente 50 mM. O kit específico da presente divulgação compreende o anticorpo conjugado MX-DTPA, 2B8-MX-DTPA. 2B8 é um anticorpo anti-CD20 que tem demonstrado afectar a depleção de célula B após a administração a pacientes de linfoma. Contudo, deve ficar claro para os versados na técnica que o kit de radiomarcação da presente divulgação pode ser optimizado para a radiomarcação de outros anticorpos anti-CD20s, ou qualquer outro anticorpo que tenha sido conjugado a DTPA ou outro quelante polivalente. O kit preferido da presente divulgação pode compreender pelo menos (i) um frasco contendo o anticorpo conjugado 2B8 MX-DTPA, tanto em solução como liofilizado (requerendo reconstituição); e um frasco contendo o tampão de formulação para administrar os anticorpos radiomarcados a um paciente. O kit preferido também conterá (iii) um tampão para ajustar o pH do isótopo e (iv) um frasco da reacção. Por outro lado e, de preferência, o tampão é fornecido no frasco da reacção, eliminando assim as etapas de medir e transferir o tampão e aumentando a simplicidade, consistência e esterilidade dos componentes do kit. Contudo, outras instâncias são também visadas, isto é, em que o tampão é adicionado primeiro ao frasco do isótopo e, o isótopo tamponado é então transferido para o frasco da reacção. Neste caso, o frasco da reacção pode ser fornecido com o volume de anticorpo exigido. Por outro lado, o frasco do isótopo/tampão pode ser fabricado suficientemente grande para acomodar a adição do anticorpo conjugado, isto é, directamente para o frasco do fornecedor. Isto eliminaria a necessidade do frasco da reacção.

Conforme se descreve acima, outra configuração preferida do kit está circunscrita, segundo a qual o frasco da reacção em si contém o volume exigido de anticorpo conjugado (isto é, 1 ou 1,5 ml mL para ηιΙη e 90Y, respectivamente) . 0 anticorpo pode ser fornecido num tampão que fornece o pH apropriado para a radiomarcação de acordo com o isótopo especifico desejado (isto é, pH 3-6 para 111In, pH 3-5 para 90Y) . Diferentes tampões podem ser usados, dependendo do isótopo (isto é, acetato de sódio para 90Y, citrato de sódio para inIn) . 0 pH e a composição do tampão também podem variar dependendo da natureza do ligante a ser marcado (isto é, peptideos de marcação podem permitir o uso de <pH3). Essencialmente então, o isótopo será transferido directamente para o frasco da reacção, como seria o tampão da formulação. Limitar o uso do kit a duas etapas de transferência aumentaria mais a reprodutibilidade e simplicidade e reduziria mais a possibilidade de contaminação da esterilidade durante a manipulação dos componentes do kit.

Os kits de radiomarcação da presente divulgação podem ainda compreender um frasco de radioisótopo, ou o radioisótopo pode ser encomendado separadamente a um fornecedor apropriado. Os radioisótopos preferidos da presente divulgação são o cloreto de ηιΙη e o cloreto de 90Y em HCI embora os métodos revelados não estejam limitados a estes isótopos. Outros radionuclideos gue foram usados para aplicações de imagem médica são conhecidos na técnica, isto é, conforme descrito na Patente U.S. Nos. 4,634,586, 5,460,785 e 5,766,571 gue estão agui incorporadas a titulo de referência. O índio-[111] é particularmente vantajoso para imagens de tumores de célula B e beta emissores, tais como 90Y gue são particularmente úteis como agentes radioterapêuticos. Embora outros radioisótopos adeguados para estes e outros fins, isto é, alfa emissores, possam ser usados dependendo do guelante usado para conjugação de anticorpo.

Dada a eficácia comprovada dos antígenos de célula B conforme revelado no pedido U.S. Número de série 08/475,813, outro kit também inclui frasco separados de anticorpo quimérico, isto é, Rituxan®, a ser administrado antes ou depois do anticorpo radiomarcado anti-CD20. Quando o anticorpo quimérico é administrado antes dos anticorpos radiomarcados, a resposta HAMA que deve geralmente ocorrer em resposta à administração de um anticorpo murino anti-CD20 pode ser significativamente reduzida, diminuindo assim a utilidade terapêutica dos anticorpos murinos radiomarcados. Além disso, quando o quimérico anti-CD20 é empregado para remover células B circulantes, as subsequentes imagens para diagnóstico obtidas com anticorpos marcados com inIn podem ser muito mais claras.

Também deve ser aparente que, tanto anticorpos radiomarcados para diagnóstico como anticorpos terapêuticos radiomarcados podem ser usados juntamente num regime terapêutico combinado. A este respeito, o anticorpo de diagnóstico pode ser usado tanto antes como após o anticorpo terapêutico para visualizar o tamanho de um tumor antes e após o tratamento. Neste caso, o kit da presente divulgação pode incluir frascos separados, talvez codificados por cor e frascos de tampão especificamente formulado de acordo com as exigências de óptimo pH para radiomarcação de anticorpos com os radioisótopos específicos a utilizar. Tal sistema garantiria que o tampão apropriado foi usado para cada marcação e permitiria ao clínico a mesma facilidade na radiomarcação de dois anticorpos como se dois kits tivessem sido comprados. 0 referido kit combina com efeito os componentes de dois kits de radiomarcação em um.

Os componentes do kit de radiomarcação da presente divulgação são fornecidos na concentração e pH apropriados de modo que a esterilização é prontamente mantida antes da administração do anticorpo e há pouca necessidade de mais tampões ou meios. Contudo, deve ser aparente para os versados na técnica que alguns dos reagentes podem ser preparados, esterilizados e testados quanto à esterilidade no sítio. Portanto, variações do kit da presente divulgação são contempladas dependendo do orçamento e das preferências do consumidor. 0 kit de radiomarcação da presente divulgação pode ser usado num processo de radiomarcação de um anticorpo conjugado a um quelante para administração a um paciente. De acordo com a presente divulgação, o referido processo compreende, em geral, (i) mistura de um anticorpo conjugado a um quelante com a solução contendo um radioisótopo; (ii) incubação da mistura numa quantidade apropriada de tempo à temperatura apropriada; e (iii) diluição do anticorpo marcado até uma concentração apropriada na formulação do tampão, de modo que os anticorpos radiomarcados possam ser administrados directamente a um paciente sem mais purificação.

De preferência o anticorpo é um anticorpo anti-CD20 e, em particular, o anticorpo anti-CD20 pode ser 2B8. 0 anticorpo pode ser conjugado a qualquer quelante apropriado, isto é, MX-DTPA, CHX-DTPA, fenila- ou benzila-DTPA, DOTA, derivados de EDTA, etc. 0 MX-DTPA é preferido. Métodos para afectar a conjugação de anticorpo são conhecidos na técnica (Kozak et ai. (1989); Mirzadeh et ai. (1990), Brachbiel et ai. (1986)).

Os presentes inventores descobriram que o método de radiomarcação de um anticorpo conjugado com um quelante funciona melhor quando a solução que contém o radiomarcador está ajustada para um pH entre cerca de 3,0 e 6,0 e de preferência para cerca de 4,2 antes de ser misturado com o anticorpo conjugado com um quelante. O acetato de sódio com baixo teor de metal é particularmente preferido para ajustar o pH, embora outros tampões possam ser utilizados. Preferencialmente, o acetato de sódio deverá estar numa concentração de entre cerca de 10 e 1000 mM e, de preferência 50 mM.

Quando o radioisótopo é cloreto de 111In, a quantidade em volume de cloreto de 211Ιη que deve ser usado para preparar uma dose de administração única é tipicamente cerca de 5,5 mCi dividida pela concentração de radioactividade quando da marcação. Para administração ao paciente, a dose típica de 111In para diagnóstico é cerca de 2 a 10 mCi. A quantidade de acetato de sódio usado para ajustar o pH varia dependendo da concentração de acetato de sódio e da solução transportadora do isótopo e portanto, pode ser bem alta. Quando a concentração de acetato de sódio é de 50 mM, a quantidade exigida para ajustar o pH é tipicamente cerca de vezes a quantidade em volume de cloreto de 211Ιη usado, embora possam usar-se volumes maiores. Observe-se que a razão de acetato de sódio para HCI é o que importa e a quantidade de acetato de sódio usado muda dependendo da quantidade e concentração de HCI no tampão. Cerca de 1 ml de um anticorpo conjugado com um quelante na concentração de cerca de 2 mg/ml é misturado então com a solução de acetato do radiomarcador e a mistura é incubada durante cerca de 30 minutos, ou durante o tempo suficiente para atingir a óptima marcação do anticorpo. Esse tempo pode variar entre cerca de 30 segundos e cerca de 60 minutos. O tampão de formulação é adicionado então na quantidade necessária para atingir um volume final total de cerca de 10 ml. O tempo óptimo exigido para a marcação do anticorpo pode variar dependendo do anticorpo, do radiomarcador particular e do conjugado particular empregado. Um factor subjacente na optimização do tempo alocado para a radiomarcação é a proporção de quelante para anticorpo do reagente por marcar. Por exemplo, a proporção de quelante para anticorpo deve ser suficientemente alta para atingir um nível de incorporação terapeuticamente útil, isto é, 90 a 95% dependendo do radioisótopo, mas também não pode ser demasiado alta ao ponto da integridade estrutural ou imunorreactividade do anticorpo ficar comprometida. Isto requer um certo processo de equilíbrio que em alguns casos pode levar a um nível mais baixo de quelante conjugado e maior tempo de marcação.

Por exemplo, para 2B8 e MX-DTPA, descobriu-se que a marcação pode ser realizada em menos de cinco minutos para 90Y e em cerca de trinta minutos para o 911In atingir o desejado nível de radioincorporação, com apenas cerca de 1 e meio para 1 molar de taxa de quelante para anticorpo. Não foi necessário, portanto, aumentar a proporção de quelante para anticorpo, porque o nível desejável de radioincorporação foi atingido. Além do mais, não foi vantajoso aumentar a quantidade de quelante conjugado porque isto poderia realizar a imunorreactividade do anticorpo. Estes parâmetros podem ser empiricamente determinados para outros anticorpos para o projecto de kits, tais como os descritos na presente divulgação.

Quando o radioisótopo é cloreto de 90Y, a quantidade em volume de cloreto de 90Y usado para preparar uma dose de administração única, tipicamente vai de cerca de 10 a 50 mCi e é preferencialmente cerca de 45 mCi, divididos pela concentração de radioactividade na altura da marcação. A quantidade de acetato de sódio usada para ajustar o pH varia dependendo da concentração de acetato de sódio e da concentração de veículo de isótopo e pode, portanto, ser bem alta. Quando a concentração de acetato de sódio é de 50 mM e o 90Y é fornecido em 50 mM HCI, a quantidade exigida para ajustar o pH é tipicamente cerca de 1,2 vezes a quantidade em volume de cloreto de 90Y usado. Cerca de 1,5 ml de um anticorpo conjugado a um quelante na concentração de cerca de 2 mg/ml é então misturado com a solução de acetato do radiomarcador e incubado durante cerca de 5 minutos, ou durante o tempo suficiente para alcançar óptima marcação do anticorpo. O referido tempo pode ir de cerca de 30 segundos a cerca de 60 minutos. O tampão de formulação é adicionado numa quantidade necessária para alcançar um volume final total de cerca de 10 ml.

Preferencialmente, o processo de radiomarcação da presente divulgação é realizado usando o kit de radiomarcação aqui descrito. Contudo, deve ficar claro aos versados na técnica que os componentes e condições preferidos são meras directrizes aceitáveis para praticar o método da presente divulgação e podem ser alterados até certo ponto com optimização apropriada. As condições que se afastam das preferidas, mas que ainda realizam o propósito do processo são consideradas dentro do escopo da presente divulgação. O kit de radiomarcação da presente divulgação também pode ser fornecido com reagentes adequados para verificar convenientemente a afinidade de ligação do anticorpo após a radiomarcação. Neste caso, o kit da divulgação também pode ser usado para determinar a percentagem de ligação de um anticorpo radiomarcado à sua célula alvo antes da administração do anticorpo a um paciente. Os presentes inventores também descobriram que o kit de análise particular de ligação revelado pode ser útil para testar a afinidade de qualquer anticorpo, para o qual geralmente não há antigeno purificado disponível. Por conseguinte, a análise de ligação de componentes também pode ser vendida como um kit separado.

Em geral, a análise de ligação e o kit de radiomarcação compreende (i) pelo menos um frasco de células liofilizadas que expressa o antigeno reconhecido pelo anticorpo no kit; um frasco contendo anticorpo conjugado com um quelante; (iii) um frasco contendo tampão de formulação, e instruções para radiomarcação do anticorpo, de modo que os anticorpos radiomarcados possam ser administrados directamente a um paciente sem a necessidade de subsequente purificação. Conforme descrito acima para o kit de radiomarcação, este kit também pode compreender um frasco contendo um tampão para ajustar o pH do radioisótopo e um frasco de vidro estéril da reacção. Preferencialmente, o tampão é uma solução de acetato de sódio com baixo teor metálico numa concentração de entre cerca de 10 e 1000 mM e o frasco de vidro da reacção contém um volume de pelo menos 5 ml. O anticorpo é preferencialmente um anticorpo anti-CD20 e o quelante é preferencialmente MX-DTPA. Outros quelantes podem ser usados conforme descrito acima. O anticorpo conjugado preferido é 2B8-MX-DTPA, embora qualquer anticorpo conjugado com um quelante possa ser marcado e sua afinidade avaliada. O tampão de formulação é fosfato salino tamponado compreendendo um radioprotector e quelante não conjugado conforme descrito acima e o radioisótopo pode ou não ser incluído e é preferencialmente cloreto de mIn ou cloreto de 90Y. Outros radioisótopos podem ser usados, dependendo do quelante. A diferença entre o kit de análise de ligação/de radiomarcação e o kit de radiomarcação descrita acima é a inclusão de células positivas para um antígeno para servir como substrato alvo para testar a afinidade do anticorpo. Quando o antígeno for CD20, as células positivas para CD20 preferidas são células SB (ATCC # CCL 120), mas quaisquer células positivas para CD20 podem ser usadas. A análise de ligação e o kit de radiomarcação podem ainda incluir células negativas para um antígeno para uso como controlo negativo. As células negativas para CD20 referidas são Células HSB (ATCC # CCL 120,1), mas quaisquer células negativas para CD20 podem ser usadas.

Obviamente, o kit de radiomarcação e a análise da ligação combinada podem ainda compreender um frasco de anticorpo quimérico anti-CD20 além do anticorpo a ser marcado para os fins de efectuar um regime terapêutico combinado, ou para remover células B periféricas antes da imagem para diagnóstico. 0 referido anticorpo separado é preferencialmente Rituxan®, mas pode ser qualquer anticorpo que demonstre matar a célula tumoral. Na realidade, dois tipos diferentes de anticorpos podem ser combinados num kit, isto é, anticorpos direccionados a dois antigenos de célula B diferentes, desde que o antigeno de célula B sirva de alvo para o mesmo tipo de célula, isto é, o linfoma de célula B.

Justamente porque os componentes do kit podem ser usados para etiquetar outros anticorpos, outras células para testar a afinidade do anticorpo podem ser preparadas dependendo do antigeno alvo. Contudo, para anticorpos anti-CD20, a análise de ligação e o kit de radiomarcação da presente divulgação é particularmente adequado para uso comercial pelo facto de que as células-alvo são fornecidas em forma liofilizada. Isto permite a verificação da eficácia do anticorpo para proceder de forma simples e sistemática e nega a inconveniência e despesa envolvida na manutenção de instalações para cultura de tecidos. As células liofilizadas são geralmente fornecidas em aliquotas de células entre 0,5 e 500 X 106 por frasco, de acordo com os processos da divulgação. É possível que instalações particulares prefiram encomendar anticorpos já radiomarcados, em cujo caso a referida instalação deve desejar a análise de ligação de reagentes para garantir que os anticorpos retenham afinidade com o alvo. Neste caso, a presente divulgação também fornece um kit de análise de ligação para determinar a percentagem de ligação de um anticorpo radiomarcado com a sua célula-alvo. O referido kit inclui pelo menos um frasco de células fixadas e/ou liofilizadas positivas para um antigeno e pode opcionalmente conter células negativas para um antigeno conforme descrito acima para o kit de análise de ligação e radiomarcação. Além disso, deve ficar aparente que variações do referido kit podem incluir um anticorpo de controlo não marcado para verificar a especificidade de ligação do anticorpo do consumidor, através de uma análise competitiva.

Novamente, quando o antigeno é CD20, as células positivas para CD20 são preferencialmente células SB (ATCC # CCL 120) e as células negativas para CD20 são preferencialmente células HSB (ATCC # CCL120,l), que são fornecidas em forma liofilizada em aliquotas de células entre 0,5 e 50 X 106 . Neste caso, o anticorpo é preferencialmente um DTPA conjugado com MX de 2B8 marcado com ηιΙη ou 90Y.

Em vista dos kits adicionais aqui revelados, cumpre destacar que uma das vantagens do kit de radiomarcação e processo da presente divulgação é que não são necessárias mais etapas de purificação e os anticorpos radiomarcados podem ser administrados directamente ao paciente, economizando assim tempo valioso e aumentando a estabilidade do anticorpo. Portanto, destaca-se que, apesar de poder ser desejável para o clinico testar ou verificar a especificidade e afinidade de ligação dos anticorpos radiomarcados antes da administração, o referido teste pode ser predeterminado com radioisótopos particulares se a estabilidade do anticorpo e a inibição da radiólise forem preocupações particulares, isto é, como com o itrio. Ao prover kits pelos quais a afinidade e especificidade de ligação pode ser testada, os presentes inventores de modo algum sugerem que os referidos testes sejam absolutamente exigidos nos métodos ou kits da presente divulgação. A opção de testar a referida validade do anticorpo é puramente a critério do clinico.

Os presentes inventores também descobriram que o processo usado para preparar células fixadas e liofilizadas para kits de análise de ligação da presente divulgação é particularmente adequado para preparar células para kits comerciais. As células podem ser fixadas antes da liofilização para melhorar a estrutura/estabilidade. Em particular, as células da presente divulgação demonstram alta reprodutibilidade quando usadas para análises de ligação de anticorpos.

Em particular, a presente divulgação inclui um método de preparar células liofilizadas compreendendo (i) a colheita de células com a densidade de 0,5 a 2 X 106 células por ml por centrifugação; (11) a lavagem das células pelo menos uma vez numa solução salina equilibrada, isto é, HBSS; (iii) a ressuspensão de células peletizadas numa liofilização com tampão compreendendo uma solução salina equilibrada contendo proteína transportadora e pelo menos um tipo de açúcar; (iv) a dispensação de alíquota de células ressuspensas num tubo Microfuge ou num frasco de vidro; e (v) a liofilização de células 12-96h e mais preferencialmente 24-72h a cerca de 30-60 militor. O método é particularmente adequado para preparar células liofilizadas em que as referidas células são células SB (ATCC # CCL 120) ou células HSB (ATCC # CCL 120.1), mas também é provavelmente aplicável a outros tipos de célula.

Preferencialmente, o tampão geralmente contém albumina de soro bovino como a proteína transportadora numa concentração de 1% (w/v) e manitol a uma concentração de 10%. Contudo, concebivelmente outras proteínas transportadoras, isto é, HSA e outros açúcares podem ser usados. As células são colhidas por centrifugação a uma velocidade de cerca de 1300 RPM e a solução salina de HBSS (solução salina equilibrada de Hank) é adicionada. As células são geralmente ressuspensas a uma concentração de 50 X 106 células por ml. Contudo, deve ser aparente para os peritos da técnica que as condições acima podem ser ligeiramente modificadas sem comprometer significativamente a viabilidade da célula. Além do mais, as condições acima podem ser suplementadas por mais procedimentos designados para optimizar o processo para quantidades maiores de células, p. ex. , diafiltração tangencial do fluxo para trocar células na liofilização com tampão.

Os kits de análise de ligação da presente divulgação podem ser usados numa análise para avaliar a afinidade de ligação de um anticorpo radiomarcado. A referida análise é também objecto da presente divulgação. A análise de ligação para determinar a percentagem de ligação de um anticorpo radiomarcado à sua célula alvo compreende em geral as seguintes etapas: (i) a mistura de pelo menos uma aliquota de um anticorpo radiomarcado com pelo menos uma aliquota de células positivas para um antigeno; (ii) a mistura de pelo menos uma aliquota de um anticorpo radiomarcado idêntica à aliquota da etapa (i) com pelo menos uma aliquota de tampão de diluição no mesmo volume da aliquota de células positivas para um antigeno na etapa (i) como controlo; a peletização de células por centrifugação; (iv) a medição da radioactividade no sobrenadante das células peletizadas e o controlo; e (v) a comparação da quantidade de radioactividade no sobrenadante da célula com a quantidade de radioactividade no controlo.

Justamente porque os kits de radiomarcação da presente divulgação opcionalmente contêm cloreto de inIn ou cloreto de 90Y, a análise de ligação da presente divulgação é tipicamente realizada com anticorpos marcados com niIn ou 90Y. Quando 911In é o radiomarcador, a radioact ividade nos tubos de análise é medida utilizando um contador gama. Quando 90Y é o marcador, a radioactividade é medida utilizando um contador de cintilação, embora um contador gama possa ser usado.

Para a análise de ligação da presente divulgação, o anticorpo preferido é um anticorpo anti-CD20 e o anticorpo anti-CD20 é preferencialmente 2B8, onde o anticorpo 2B8 é marcado utilizando o kit de radiomarcação da presente divulgação. Contudo, quaisquer anticorpos radiomarcados podem ser testados desde que células expressando o antigeno particular estejam disponíveis. Quando CD20 é o antigeno as células preferidas para realizar a análise são células SB (ATCC # CCL 120), mas a análise também pode ser optimizada e realizada com quaisquer anticorpos radiomarcados e a célula-alvo apropriada. O tampão de diluição usado para a análise deve manter a ligação do anticorpo, isto é, tampão fisiológico, possivelmente contendo uma proteína transportadora, p. ex. BSA, para minimizar a ligação não específica a células. Embora o tubo com tampão de diluição sirva como controlo, mais um controlo pode ser incluído na análise, utilizando células negativas para um antigeno. Neste caso, a análise de ligação compreende ainda as seguintes etapas: (i) a mistura de pelo menos uma alíquota de um anticorpo radiomarcado com pelo menos uma alíquota de células negativas para um antigeno; (ii) a peletização de células negativas para um antigeno por centrifugação; (iv) a medição da radioactividade no sobrenadante das células peletizadas negativas para um antígeno; e (v) a comparação da quantidade de radioactividade no sobrenadante de células negativas para um antígeno para uma quantidade de radioactividade no sobrenadante de células positivas para um antígeno e sobrenadante do controlo. A comparação da radioactividade obtida deste tubo com o tampão de diluição do controlo servirá como medida da quantidade de ligação não específica a células positivas para um antígeno. Quando CD20 é o antígeno e as células positivas para CD20 são células SB, as células negativas para CD20 são preferencialmente células HSB (ATCC # CCL 120,1) .

Conforme descrito acima, as células liofilizadas da presente divulgação fornecem um padrão simples, eficiente e reproduzível para testar a eficácia de ligação de um anticorpo radiomarcado. Portanto, a análise de ligação da presente divulgação é preferencialmente realizada utilizando as células liofilizadas incluídas nos kits de análise de ligação da presente divulgação. Além disso, as análises de radiomarcação da presente divulgação podem ser combinadas com as análises de ligação da presente divulgação, onde o anticorpo é primeiramente marcado pelo processo de marcação de um anticorpo conjugado a um quelante, conforme descrito na presente divulgação. De preferência, a análise de ligação da presente divulgação é realizada utilizando uma das análises de ligação e kits de radiomarcação aqui descritos.

Pode haver algumas instâncias em que a afinidade de um anticorpo possa ser testada ou verificada sem um radiomarcador ligado. Por exemplo, sob certas circunstâncias, isto é, pesquisa de falhas, pode ser vantajoso testar a afinidade de ligação de um anticorpo antes da radiomarcação. Para tal caso, a presente divulgação também incorpora uma análise de ligação competitiva para avaliar a afinidade de um anticorpo de ensaio a uma célula alvo, compreendendo (i) a preparação de um anticorpo de controlo marcado com ruténio usando um anticorpo especifico conhecido para o mesmo antigeno; (ii) a incubação de quantidades aumentadas de anticorpo de ensaio e quantidades aumentadas de um anticorpo de controlo não marcado com uma concentração fixa de células alvo e uma quantidade para rastreio de anticorpo marcado com ruténio onde cada concentração separada de anticorpo de ensaio e cada concentração separada de anticorpo de controlo ficam em tubos separados, respectivamente; (iii) a determinação da quantidade de ligação em cada tubo de reacção com base em electroquimiluminescência relativa (ECL) utilizando instrumentação ORIGEN; e (iv) o cálculo do valor médio de afinidade do anticorpo de ensaio. 0 valor médio de afinidade pode ser calculado a partir dos valores EC50 e a concentração conhecida de um anticorpo de rastreio utilizando o método de Muller (J. Immunological Methods (1980) 34:345) ou qualquer outro método apropriado. Observe-se que esta análise também pode ser usada para testar a afinidade de anticorpos radiomarcados, ou qualquer anticorpo para o qual o antigeno não possa ser purificado e células sejam exigidas como fonte de antigeno. As células liofilizadas fixas da presente divulgação podem ser usadas como células alvo.

Quando a análise de ligação competitiva da presente divulgação for realizada para testar a afinidade de anticorpos anti-CD20, o anticorpo de controlo pode ser 2B8, ou qualquer outro anticorpo anti-CD20 não conjugado, o anticorpo de controlo pode ser um anticorpo conjugado com um quelante. O anticorpo de teste também pode ser um conjugado quelante do anticorpo de controlo. Por outro lado, o anticorpo de teste pode ser outro anticorpo anti-CD20 cuja afinidade de ligação com CD20, em comparação com 2B8 seja de interesse. No entanto, a análise pode ser adaptada para uso com anticorpos que possuem outras especificidades desde que uma célula alvo adequada esteja disponível.

Na análise de ligação competitiva da presente divulgação, as células alvo preferidas são células positivas para CD20, de preferência células SB (ATCC # CCL 120) e são de preferências células SB liofilizadas de acordo com o método da presente divulgação. Células liofilizadas utilizando outros métodos ou células fixadas também podem ser utilizadas. O anticorpo marcado com ruténio é tipicamente preparado por um processo que inclui incubar o anticorpo de controlo com N hidroxissuccinimida éster de ruténio (II) quelante tris-bipiridina (TAG-SNS), embora outros métodos conhecidos de marcação de anticorpos também sejam contemplados. Para a marcação, o anticorpo e a TAG-NHS são preferencialmente incubados à razão de aproximadamente 1:15 molar.

Estes e outros aspectos da presente divulgação serão claramente compreendidos por referência às seguintes figuras, exemplos e descrição.

Dito isto, deve-se ter sempre em mente que o objectivo da presente invenção é o assunto que está definido dentro das reivindicações apensas, com os demais aspectos da presente divulgação sendo aqui fornecidos, a fim de facilitar a compreensão da presente invenção e de modo a contextualizar a presente invenção. 4. Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1. A imunorreactividade de 2B8 nativos foi comparada com a de anticorpos BI (Coulter) anti-CD20 comercialmente disponíveis e Leu 16 (Becton Dickinson), por competição directa num radioimune ensaio utilizando BI marcado com 125I. Células SB positivas para antígeno (100, 000) foram adicionadas a cada poço de placas de filtro V &amp; P; 10 ng de BI radiomarcado foi misturado com diversas concentrações de competição não marcada e a mistura adicionada às células. Os anticorpos foram incubados com as células durante uma hora à temperatura ambiente; as determinações foram realizadas em triplicado. Subsequentemente, os poços foram lavados, secados e a radioactividade associada ao filtro foi determinada. Os dados apresentados foram corrigidos para a radioact ividade de fundo e são os meios para as determinações em triplicado.

Figura 2. Quantidades crescentes de 2B8 não conjugado foram analisadas quanto a ligação com células B humanas (SB), com utilização de análise FACS. Foram feitas comparações com um anticorpo monoclonal (Bl) anti-CD20 comercialmente disponível e com dois anticorpos isótipos irrelevantes. Cabra anti-rato IgG-FITC F (ab) '2 foi usado como reagente secundário. Os resultados mostram que 2B8 é específico para o antígeno CD20 e que este apresenta maior ligação do que Bl.

Figura 3. Células B (SB) humanas foram incubadas com quantidades crescentes de 2B8 marcado com 125I. Amostras em triplicado foram incubadas durante uma hora e a radioactividade vinculada à célula foi determinada após filtração para colectar células. A análise de Scatchard permitiu o cálculo de uma afinidade constante aparente de x ICC9 M.

Figura 4. Imunorreactividade de 2B8, 2B8-MX-DTPA e BI nativos. 0 anticorpo BI foi radiomarcado, conforme descrito na secção de Métodos. Dez nanogramas de BI radiomarcado foram misturadas com concentrações crescentes do concorrente e a mistura adicionada aos poços de placas de filtro V &amp; P contendo 100,000 células SB positivas para antigeno cada; todas as determinações foram realizadas em triplicado. Após uma hora de incubação à temperatura ambiente, os poços foram lavados extensivamente. Subseguentemente, os filtros foram secados e a radioactividade associada determinada pela contagem gama; todos os valores foram corrigidos para o fundo. Os valores apresentados são a média das três determinações em triplicado.

Figura 5. O Anticorpo 2B8 foi formulado em uma concentração final de lOmg/ml em soro fisiológico ou soro fisiológico contendo 10 mM glicina-HCl, pH 6,8. Conjuntos duplicados de amostras foram então colocados em frascos de tampa roscada, os frascos purgados com nitrogénio e depois fechados. As amostras foram então incubadas a 4 °C ou 30 °C durante 12 semanas, a imunorreactividade das amostras foi avaliada semanalmente. Não se observou gualguer perda de imunorreactividade em nenhuma das amostras 2B8 ao longo de todo o estudo de 12 semanas. As imunorreactividades na semana 1 (Fig. 5A), semana 6 (Fig. 5B) e 12 a semana (Fig. 5C) estão representadas.

Figura 6. Análise de ligação para determinação da imunorreactividade de 2B8-MX-DTPA marcado com ηιΙη incubado em PBS, pH 7,4 contendo 50 mg/ml de albumina humana (48 h de incubação) . Figura 6A) . Uma guantidade constante de anticorpo radiomarcado (5 ng/ml) foi incubada com volumes cada vez maiores de células SB (20 x 106 células/ml) . A quantidade de radioactividade (cpm) vinculada às células foi traçada contra o volume da suspensão celular adicionado. Figura 6B) A radioactividade total aplicada sobre a radioactividade de ligação (AT/B) foi traçada. A extrapolação linear permitiu o cálculo do intercepto-y (0,997). O reciproco do intercepto-y X 100 produziu um valor de imunorreactividade 100% a excesso infinito de antigeno.

Figura 7. Autorradiogramas obtidos a partir de análise SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado a 90Y incubado a 4 2C em PBS, pH 7,4 contendo 75 mg/ml de albumina sérica humana e 1 mM DTPA. Nas horas indicadas, as amostras foram submetidas à electroforese em géis 4-20% Tris-glicina utilizando condições não redutoras, condições desnaturantes (SDS). As amostras foram carregadas em 5 pL (tiras 1, 2), 10 pL (tiras 5, 6) . Os géis foram expostos ao filme de raios-X durante aproximadamente 15 minutos à temperatura ambiente e fotografados.

Figura 8. Varredura densitométrica de autorradiograma de tempo zero obtido a partir de análise de SDS-PAGE marcado a 90Y 2B8-MX-DTPA incubadas a 4 °C em PBS, pH contendo 75 mg/ml de albumina sérica humana e 1 mM DTPA. A amostra foi submetida a electroforese em gel 4/20% Tris-glicina utilizando condições não redutoras. As amostras foram carregadas a 5 pL, 10 pL e 20 pL em poços duplicados. O gel foi exposto a filme de raios-X durante aproximadamente 15 minutos à temperatura ambiente e uma das faixas foi digitalizada usando um densitómetro. A área relativa do pico radiomarcado conjugado (#2) foi 96,2%.

Figura 9. Varredura densitométrica de 48 h de autorradiograma obtido a partir de análise SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado a 90Y incubado a 4 2C em PBS, pH 7,4 contendo 7,4 mg/ml de albumina sérica humana e 75 mM DTPA. A amostra foi submetida a electroforese em gel 4/20% Tris-glicina usando condições não redutoras. As amostras foram carregadas a 5 pL, 10 pL e 20 pL em poços duplicados. O gel foi exposto a filme de raios-X durante aproximadamente 15 minutos à temperatura ambiente e uma das faixas foi digitalizada utilizando um densitómetro. A área relativa do pico radiomarcado conjugado (#2) foi de 95,5%.

Figura 10. Autorradiogramas obtidos a partir de análise SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado a ηιΙη incubado a 4 2C em PBS, pH 7,4 contendo 50 mg/ml de albumina sérica humana. Nas horas indicadas, as amostras foram submetidas à electroforese em géis 4-20% Tris-glicina utilizando condições não redutoras. As amostras foram carregadas em 5 pL (faixas 1, 2), 10 pL (faixas 3, 4) e 20 pL (faixas 5, 6) . Os géis foram expostos a filme de raios-X durante aproximadamente 15 minutos à temperatura ambiente e fotografados. (Nota: 0 autorradiograma de 48 h foi obtido com utilização de ecrãs de intensificação, resultando num sinal mais intenso em comparação com o autorradiograma de tempo zero).

Figura 11. Autorradiograma de varredura densitométrica de tempo zero obtido a partir de análise SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado a 191Ιη incubado a 4 °C em PBS, pH contendo 50 mg/ml de albumina sérica humana. A amostra foi submetida a electroforese em gel 4/20% Tris- glicina usando condições não redutoras. A amostra foi carregada a 5 pL, 10 pL e 20 pL em poços duplicados. O gel foi exposto a filme de raios-X durante aproximadamente 15 minutos à temperatura ambiente e uma das faixas digitalizada utilizando um densitómetro. A área relativa do pico radiomarcado conjugado (#3) foi de 95,9%.

Figura 12. Varredura densitométrica de 48 h de autorradiograma obtido a partir de análise SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado a ηιΙη incubado a 4 2C em PBS, pH contendo 50 mg/ml de albumina sérica humana. A amostra foi submetida a electroforese em gel 4/20% Tris- glicina sob condições não redutoras. A amostra foi carregada a 5 pL, 10 pL e 20 pL em poços duplicados. O gel foi exposto a filme de raios-X durante aproximadamente 15 minutos à temperatura ambiente e uma das faixas digitalizada utilizando um densitómetro. A área relativa do conjugado radiomarcado foi 97,0% (combinadas as áreas dos picos #2, 3 e 4).

Figura 13. Autorradiogramas obtidos a partir de análise SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado a 90Y incubado a 37 °C em soro humano. Nas horas indicadas, as amostras foram submetidas à electroforese em géis 4-20% Tris-glicina utilizando condições não redutoras. As amostras foram carregadas em 5 pL (faixas 1, 2), 10 pL (faixas 3, 4), e 20 pL (faixas 5, 6). Os géis foram expostos a filme de raios-X durante aproximadamente 15 minutos à temperatura ambiente e fotografados.

Figura 14. Autorradiograma de varredura densitométrica de tempo zero obtido de análise SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado a 90Y incubado a 37°C em soro humano. A amostra foi submetida a electroforese em gel 4/20% Tris-glicina usando condições não redutoras. A amostra foi carregada a 5 pL, 10 pL e 20 pL em poços duplicados. Os géis foram expostos a filme de raios-X durante aproximadamente 15 minutos à temperatura ambiente e uma das faixas foi digitalizada utilizando um densitómetro. A área relativa do pico radiomarcado conjugado (#2) foi de 97,9%.

Figura 15. Varredura densitométrica de 98 h de autorradiograma obtido a partir de análise SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado a 90Y incubado a 37 °C em PBS, pH contendo mg/ml de albumina sérica humana. A amostra foi submetida a electroforese em gel 4/20% Tris-glicina utilizando condições não redutoras. A amostra foi carregada a 5 pL, 10 pL e 20 pL em poços duplicados. Os géis foram expostos a filme de raios-X durante aproximadamente 15 minutos à temperatura ambiente e uma das faixas foi digitalizada utilizando um densitómetro. A área relativa do pico radiomarcado conjugado (#2) foi de 94,7%.

Figura 16. Autorradiogramas obtidos a partir de análise SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado a ηιΙη incubado a 37 °C em soro humano. Nas horas indicadas, as amostras foram submetidas a electroforese em géis 4-20% Tris-glicina utilizando condições não redutoras. As amostras foram carregadas em 5 pL (faixas 1, 2), 10 pL (faixas 3, 4), e 20 pL (faixas 5, 6). Os géis foram expostos ao filme de raios-X durante cerca de 16-20 horas à temperatura ambiente e fotografados.

Figura 17. Autorradiograma de varredura densitométrica de tempo zero obtido a partir de análise SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado a ηιΙη incubado a 37 °C em soro humano. A amostra foi submetida a electroforese em gel 4/20% Tris-glicina utilizando condições não redutoras. A amostra foi carregada a 5 pL, 10 pL e 20 pL em poços duplicados. O gel foi exposto a filme de raios-X durante cerca de 16-20 horas à temperatura ambiente e uma das faixas foi digitalizada utilizando um densitómetro. A área relativa do pico radiomarcado conjugado (#3) foi de 95,3%.

Figura 18. Autorradiograma de varredura densitométrica de 96 h obtido a partir de análise SDS-PAGE de 2B8-MX- DTPA marcado a ηιΙη incubado a 37 °C em soro humano. A amostra foi submetida a electroforese em gel 4/20% Tris-glicina com utilização de condições não redutoras. A amostra foi carregada a 5 pL, 10 pL e 20 pL em poços duplicados. O gel foi exposto a filme de raios-X durante cerca de 16-20 horas à temperatura ambiente e uma das faixas foi digitalizada utilizando um densitómetro. A área relativa do pico radiomarcado conjugado (#3) foi de 94,0%.

Figura 19. Macacos Cynomolgus foram injectados por via intravenosa a cada 48 horas num total de sete injecções; as guantidades administradas são mostradas. Níveis circulantes de células T e B foram determinados por análise FACS usando anti-CD2 (célula T) , o anti-Mo-IgG (2B8), anti-CD20 (Leu 16) e anti-humano-IgG (célula B) . Não se observou gualguer efeito sobre os níveis de circulação das células T. (Animais do Grupo V receberam uma dose única).

Figura 20. A recuperação dos níveis de circulação de células B em animais que receberam 2B8 foi seguida por análise FACS com utilização dos anticorpos marcados com substância fluorescente descritos na breve descrição da figura 19. Os animais dos Grupos III e IV não foram monitorados, uma vez que foram sacrificados no dia 13.

Figura 21. Macacos Cynomolgus foram injectados por via intravenosa com 89Y-2B8-MX-DTPA que tinha sido preparada utilizando 2B8-MX-DTPA de grau clínico. Os animais foram doseados a cada 48 horas, com as quantidades indicadas acima para um total de sete doses. Nos dias 0, 2, 7, 10 e 14 os macacos foram sangrados e avaliados quanto às químicas da hematologia do soro e aos níveis de circulação de células B (os soros do dia 10 não foram analisados quanto ao teor de células B) . Para além da contagem total de linfócitos diminuída em todos os animais, com excepção de um indivíduo no grupo II, nenhuma anormalidade significativa foi observada durante o curso do estudo.

Figura 22. A depuração de anticorpos murinos 2B8 anti-CD20 em macacos Cynomolgus foi determinada por ELISA após uma única injecção de 10 mg/kg no dia zero. Como mostrado no painel A, o anticorpo mostrou em β t v2 valor de aproximadamente 4,5 dias. A depuração do anticorpo 2B8 e o seu conjugado MX-DTPA da circulação de ratos BALB/c são mostrados no painel B. Os ratos foram injectados por via intravenosa com 25 pL de 2B8 nativas ou conjugadas e amostras de sangue colhidas em diferentes momentos até 264 horas após a injecção; os soros foram subsequentemente analisados pelo ensaio imunoenzimático com utilização de células SB como agente de captura. Tanto os anticorpos nativos como os conjugados exibiram valores de apuramento de 8,75 dias.

Figura 23. Vinte ratos BALB/c foram injectados com 1,1 pCi cada do conjugado radiomarcado (100 pL) formulado em PBS, pH 7,4, contendo 50 mg/ml de HSA. Grupos de cinco ratos foram sacrificados em cada 1, 24, 48 e 72 horas e, em seguida, sangue e vários tecidos preparados e analisados quanto a radioactividade associada.

Figura 24. Vinte ratos BALB/c foram injectados por via intravenosa cada um com cerca de 1,0 pCi (em 100 pl) de conjugado radiomarcado formulado em 1 X PBS, pH 7,4, contendo 75 mg/ml de albumina sérica humana e 1 m MDPA. Grupos de cinco ratos foram sacrificados em cada 1, 24, e Ί2, horas e o seu sangue e vários tecidos preparados e analisados quanto a radioactividade associada.

Figura 25. Ratos atimicos portadores de tumores de células B Ramos foram injectados por via intravenosa com pCi de 911-In-2B8 MX-DTPA e grupos de três ratos cada foram sacrificados em 0, 24, 48 e 72 horas. Após a preparação dos tecidos e determinação da radioactividade associada, os valores da dose percentual injectada por grama de tecido foram determinados e tabulados conforme mostrado.

Figura 26. Análise de ligação para determinação da imunorreactividade de 2B8-MX-DTPA "misturar-e-injectar" marcada a 90Y incubados em PBS, pH 7,4 contendo 50-75 mg/ml de albumina sérica humana (incubação de 48 h). Painel A) Uma quantidade constante de anticorpos marcados a 90Y (cerca de 1 ng/ml) foram incubados com quantidades crescentes de células SB. A quantidade de radioactividade (cpm) vinculada às células foi traçada contra a concentração de células. Painel B) A radioactividade total de 90Y aplicada sobre a radioactividade de ligação (A/B) foi traçada. A extrapolação linear permitiu o cálculo do intercepto-y (1,139). O reciproco do intercepto-y X 100 gerou um valor de imunorreactividade de 87,9% no excesso de antigeno infinito. Não se observou ligação com células negativas para o CD20 (HSB).

Figura 27. Autorradiogramas obtidos a partir de análise SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado a 90Y incubadas a 4 2C em PBS, pH 7,4 contendo 75 mg/ml de albumina sérica humana e 1 mM DTPA. Nas horas indicadas, as amostras foram submetidas a electroforese em géis 4-20% Tris- glicina utilizando condições não redutoras, condições desnaturantes (SDS). As amostras foram carregadas em 5 pL (faixas 1,2), 10 pL (faixas 5, 6) . Os géis foram expostos ao filme de raios-X durante aproximadamente 15 minutos à temperatura ambiente e fotografados.

Figura 28. Autorradiograma de varredura densitométrica de tempo zero obtido a partir da análise SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcada a 90Y incubadas a 4 °C em PBS, pH contendo 75 mg/ml de albumina sérica humana e 1 mM DTPA. A amostra foi submetida a electroforese em gel 4- 20% Tris-glicina usando condições não redutoras. As amostras foram carregadas a 5 pL, 10 pL e 20 pL em poços duplicados. O gel foi exposto a filme de raios-X durante aproximadamente 15 minutos à temperatura ambiente e uma das faixas foi digitalizada utilizando um densitómetro. A área relativa do pico radiomarcado conjugado (#2) foi de 96,1%.

Figura 29. Varredura densitométrica de 48 h de autorradiograma obtido a partir de análise SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA marcado a 90Y incubado a 4 2C em PBS, pH 7,4 contendo 75 mg/ml de albumina sérica humana e 1 mM DTPA. A amostra foi submetida a electroforese em gel 4-20% Tris-glicina usando condições não redutoras. As amostras foram carregadas a 5 pL, 10 pL e 20 pL em poços duplicados. O gel foi exposto a filme de raios-X durante aproximadamente 15 minutos à temperatura ambiente e uma das faixas foi digitalizada utilizando um densitómetro. A área relativa do pico radiomarcado conjugado (#2) foi de 94,1 %.

Figura 30. Autorradiogramas obtidos a partir de análise SDS-PAGE de "misturar-e-injectar" 2B8-MX-DTPA marcado a 90Y incubado a 37 °C em soro humano. Nas horas indicadas, as amostras foram submetidas à electroforese em géis 4-20% Tris-glicina utilizando condições não redutoras. As amostras foram carregadas em 5 pL (faixas 2), 10 pL (faixas 3, 4) e 20 pL (faixas 5, 6) . Os géis foram expostos ao filme de raios-X durante aproximadamente 15 minutos à temperatura ambiente e fotografados.

Figura 31. Autorradiograma de varredura densitométrica de tempo zero obtido a partir de análise SDS-PAGE de "misturar-e-injectar" 2B8-MX-DTPA marcado a 90Y incubado a 37 °C em soro humano. A amostra foi submetida a electroforese em gel 4-20% Tris-giicina utilizando condições não redutoras. A amostra foi carregada a 5 pL, 10 pL, e 20 pL em duplicado. Géis foram expostos a filme de raios-X durante aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente e uma das faixas foi digitalizada utilizando um densitómetro. A área relativa do pico radiomarcado conjugado (#2) foi de 89.1 %.

Figura 32. Autorradiograma de varredura densitométrica de 72 h obtido a partir de análise SDS-PAGE de 2B8-MX- DTPA marcado a 90Y incubado a 37 °C em soro humano. A amostra sofreu electroforese em um gel 4-20% Tris-giicina utilizando condições não redutoras. A amostra foi carregada a 5 pi, 10 \il e 20 \il em poços duplicados. Os géis foram expostos a filme de raios-X durante aproximadamente 15 minutos à temperatura ambiente e uma das faixas foi digitalizada utilizando um densitómetro. A área relativa do pico radiomarcado conjugado (#2) foi de 88,8%.

Figura 33. Vinte ratos BALB/c foram injectados por via intravenosa com 5 2B8-MX-DTPA cada marcada a pCi 90Y formuladas em 1 X PBS, pH 7,4, contendo 75 mg/ml de albumina sérica humana e 1 mM DTPA. Grupos de cinco ratos foram sacrificados em cada 1, 24, 48 e 72 horas e o seu sangue e vários tecidos preparados e analisados quanto a radioactividade associada.

Figura 34. Quantidades cada vez maiores de anticorpos 2B8 derivados de CHO marcados foram incubadas com uma concentração fixa de células B recentemente colhidas positivas para CD20 (SB) ou células-T negativas para CD20 (HSB) . A ligação de anticorpos com as células foi guantificada utilizando análise FACS utilizando cabra anti-rato IgG-FITC F(ab)'2 como agui se descreve. A comparação foi feita para um anticorpo irrelevante isótipo (S004) . Apenas o anticorpo 2B8 derivado de CHO mostrou alguma ligação sensível com células SB positivas para CD20.

Figura 35. A imunorreactividade de 2B8 derivadas de CHO foi comparada com o anticorpo 2B8-49-pai produzido numa linha celular de hibridoma pela concorrência directa de uma análise ORIGEN. Quantidades cada vez maiores de anticorpos foram incubadas com uma concentração fixa de células-B positivas para CD20(SB) e uma guantidade residual de CHO 2B8 marcada a ruténio. Após a incubação de três horas à temperatura ambiente, a ligação, expressa como electroguimioluminescência relativa (DCE), foi determinada utilizando o instrumento ORIGEN conforme descrito em Materiais e Métodos. Os valores representam a média de determinações duplicadas. Constantes de afinidade média de CHO 2B8 e 2B8-49 foram calculadas como sendo 1,3 x 1CT10 M e 2,5 X 1CT10 M, 40 respectivamente. Um anticorpo irrelevante isótipo (S004), foi incluído para comparação.

Figura 36. A ligação dos conjugados 2B8-MX-DTPA preparados a partir de derivados de CHO 2B8 foi comparada com os anticorpos não conjugados pela competição directa numa análise ORIGEN. Os conjugados foram preparados pela incubação do 2B8 com MX-DTPA para 8, 17 e 24 h antes da remoção de quelato não reagido. Para a avaliação da ligação, anticorpos foram incubados com uma concentração fixa de células-B positivas para CD20 (SB) e uma quantidade residual de CHO 2B8 marcada a ruténio. Após a incubação de três horas à temperatura ambiente, a ligação, expressa como electroquimioluminescência relativa (DCE), foi determinada utilizando o instrumento ORIGEN conforme descrito em Materiais e Métodos. Os valores representam a média de determinações duplicadas. Preparações conjugadas apresentaram ligação semelhante comparada ao anticorpo não conjugado 2B8.

Figura 37. A) As células SB foram lavadas e ressuspensas a 90 X 106 células/ml com tampão de diluição (IX PBS, pH contendo 1% (p/v) de albumina de soro bovino. Concentrações crescentes de células foram incubadas durante 3 h, com 7,5 ng/ml In2B8 preparadas usando 2B8- MX-DTPA lote 0165A. B) Traçado duplo-inverso da concentração de células vs. radioactividade de ligação/radioactividade total (B/AT). A imunorreactividade foi calculada como 1/intercepto-y x 100. Os valores da imunorreactividade e do coeficiente de correlação (R) foram 80,6% e 0,981, respectivamente.

Figura 38. A) Células SB foram lavadas e ressuspensas a 90 X 106 células/ml com tampão de diluição (IX PBS, pH contendo 1% (p/v) de albumina de soro bovino. Concentrações cada vez maiores de células foram incubadas durante 3 h, com 2 ng/ml preparado Y2B8 utilizando 2B8- MX-DTPA lote # 0165A. B) Traçado duplo-inverso da concentração de células vs radioactividade de ligação/radioactividade total (B/A). A imunorreactividade foi calculada como 1/intercepto-y x 100. Os valores da imunorreactividade e do coeficiente de correlação (R) 41 foram 72,2% e 0,999, respectivamente. 5. Descrição Detalhada

Definições

Salvo se definido de outra forma, todas as técnicas e termos científicos aqui empregados têm o mesmo significado conforme é normalmente compreendido por alguém medianamente versado na técnica a que pertencem esta divulgação e esta invenção. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser utilizados na prática ou ensaio da presente divulgação, os métodos e materiais preferenciais estão descritos. Para efeitos da presente divulgação, os seguintes termos são definidos abaixo.

Baixo teor de metal - refere-se a reagentes tratados para reduzir a contaminação metálica a um nível que não provoque impacto na radioincorporação.

Positivo para antígeno - significa que exprime antígeno reconhecido por anticorpo específico da divulgação, de tal maneira que o anticorpo é capaz de ligação. % de radioincorporação - refere-se à quantidade de radiomarcação de uma reacção radiomarcadora que está conjugada com o anticorpo em relação à quantidade total de radiomarcação inicialmente adicionada à reacção. % de ligação - refere-se à quantidade de anticorpos a partir de uma amostra que se liga ao antígeno alvo, com ou sem especificidade. % de imunorreactividade ou especificidade de ligação refere-se à quantidade de uma amostra de anticorpo que se liga ao antígeno alvo com especificidade.

Anticorpos de diagnóstico - refere-se a um anticorpo conjugado com uma radiomarcação, tal como niI capaz de efectuar imagem para diagnóstico de tumores e células positivas para o antigeno.

Anticorpos terapêuticos - refere-se a um anticorpo conjugado com um radiomarcador emissor alfa ou beta (como 90Y) , que pode matar células quando ligado ao antigeno alvo.

Desenvolvimento Pré-clínico de Anticorpo Anti-CD20 Monoclónico de Rato 2B8, Conjugado 2B8-MXDTPA, ulIn e 90-marcado

I. Materiais e Métodos de Desenvolvimento de Anticorpo Anti-CD20 Monoclónico de Rato 2B8, Conjugado 2B8-MXDTPA, 11:LIn-marcado 2B8-MX-DTPA e HPLC-purifiçado 90y-MX-DTPA A. Materiais 1. Células

As linhas celulares humanas SB e HSB foram obtidas da American Type Culture Collection e cultivadas em RPMI-1640 contendo soro bovino fetal a 10%. A linha de célula SB CD20-positiva é uma linha de célula B linfoblastóide adquirida da camada leuco-plaquetária (buffy coat) do sangue periférico de um paciente com leucemia linfoblástica aguda (1) . A linha de célula negativa de antigeno HSB está na linha de célula linfoblastóide desenvolvida a partir de tumores induzidos em hamsteres sírios recém-nascidos (2). A linha de célula de mieloma de rato SP2/0 foi mantida de forma similar em RPMI-1640 contendo soro bovino fetal a 10%. 2. Anticorpos

Os anticorpos anti-CD20 BI e Leu 16 foram comprados à Coulter Immunology e à Becton/Dickinson, respectivamente. O 125 anti-rato de cabra 1-marcado IgG e anticorpos anti-humano de cabra IgG foram obtidos da ICN. Cabra F(ab')2 anti-rato IgG foi obtido da Cappel. 3. Reagentes

Os adjuvantes completos e incompletos de Freund foram comprados à Sigma Chemical Company. Polietileno glicol, concentrado HAT e concentrado HT foram obtidos da Mannheim Boehringer. Isotiocianato de fluoresceina (FITC) foi comprado à Sigma Chemical Company. O cloreto de índio-[111] e o cloreto de 90Y foram obtidos da Amersham ou NEN Dupont. O cloreto de ítrio-[89] foi comprado à Aldrich Chemical Company. Todos os outros reagentes foram obtidos de fontes padrão.

Os reagentes usados para conjugação e protocolos de radiomarcação foram processados para retirar a contaminação de iões de metal pesado que podem competir com os isótopos radioactivos durante a etapa de radiomarcação. Os reagentes foram processados tipicamente passando as soluções por uma coluna de resina de troca de ião Chelex 100 (BioRad Industries) ou processamento de lote por adição de Chelex 100 a uma solução preparada. Água com baixo teor de metal, quer seja Milli-Q-purified ou Água para Irrigação (WFlr) foi usada para preparações e diluições. As soluções sem metal foram filtradas e esterilizadas e colectadas em recipientes plásticos estéreis. B. Métodos 1. Produção e Classificação dos Sobrenadantes de Hibridomas 2B8 por RIA,

Dez ratos BALB/c foram imunizados com 20 milhões de células SB suspensas no PBS contendo o adjuvante completo Freunds. As células foram injectadas com s.c e i.p em vários locais no animal. Depois de um período de descanso de 2 semanas os ratos foram injectados uma segunda vez com células SB emulsifiçadas em adjuvante incompleto de Freund. Intensificadores de imunização subsequentes foram executados em um cronograma semanal com células SB suspensas no PBS. Os ratos foram imunizados para o período de 6 semanas a 4 meses.

Dois animais de cada vez foram sacrificados por deslocação cervical e seus baços foram retirados para fusão com o mieloma de rato SP2/0. Os animais foram escolhidos com base na capacidade de soros pós-imunes de inibir efectivamente a ligação de anticorpos radiomarcados Coulter BI anti-CD20 para células humanas SB. Três dias antes de cada fusão os animais seleccionados receberam uma última injecção intravenosa (veia da cauda) de 20 milhões de células SB em PBS. No sacrifício os baços foram retirados em condições assépticas e os esplenócitos foram fundidos com células SP2/0 numa proporção de 5:1 (esplenócitos: SP2/0). As células fundidas foram lavadas em meios de cultura de tecido e distribuídas por placas de 96 poços contendo meios de selecção HAT. Os hibridomas foram classificados por inibição de análise de radioimunidade usando o anticorpo Coulter BI depois de 10-14 dias. A classificação de híbridos que secretam anticorpos anti-CD20 foi realizada usando métodos estabelecidos de análise de radioimunidade. Resumidamente, o anticorpo Coulter BI anti-CD20 foi purificado por cromatografia de afinidade em Proteína A. Cinquenta microgramas de anticorpos purificados foram ligadas a 125I por uma breve oxidação na presença de Iodobeads (Pierce Chemical Co), segundo o procedimento indicado pelo fabricante. 0 anticorpo radiomarcado foi dessalinizado em resina amberlite e armazenado em tampão de diluição (PBS, pH 7,4, contendo 0,2% de gelatina, 0,02% de azida de sódio e 1,0% de BSA). Dez nanogramas de anticorpo radiomarcado foram colocadas em cada poço de placa de ensaio com filtro previamente bloqueado (tampão de bloqueio: tampão de diluição contendo 10% de FBS) juntamente com 50 pL de sobrenadante de hibridoma de poços de teste e 100,000 células SB suspensas em 50 pL de tampão de diluição. A suspensão foi incubada durante uma hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas completamente com tampão de lavagem (PBS, pH 7,4, contendo 0,2% de gelatina e 0,02% de azida de sódio) num distribuidor de vácuo V&amp;P Científico e os fundos dos filtros contendo células SB presas foram transferidos para um contador gama. Os poços contendo apenas meios HAT e anticorpos marcados Bi foram usados como controlos de antecedentes e poços idênticos contendo células SB foram usados como controlos positivos. Os controlos de inibição continham Bi radiomarcado e várias quantidades de anticorpo Bi não marcado entre 2 pL e 2 ng. 2. Estudos de Citometria de Fluxo. a. Linhas de Célula

Estudos preliminares de citometria de fluxo foram executados com sobrenadantes de culturas de hibridoma 2B8.

Cem microlitros de sobrenadante de hibridoma foram incubados com células SB durante uma hora à temperatura ambiente; um anticorpo secundário (cabra F (ab') 2 anti-rato IgG; Cappel), usado a uma diluição de 1/400 foi acrescentado subsequentemente e a incubação continuou durante 1 hora no escuro. As células foram lavadas 5 vezes. Os controlos incluíram apenas células (não anticorpos primários ou secundários) das quais foi determinada a autofluorescência, células com anticorpo secundário apenas para determinar ligação não-específica e comercialmente disponível conjugado Bi com isotiocianato de fluoresceína (Bl-FITC) para um controlo de populações CD20.

Para alguns ensaios, a fluoresceína foi ligada a um anticorpo purificado 2B8 através da reacção de amino grupos com isotiocianato de fluoresceína (FITC). Resumidamente, o anticorpo 2B8 (1,2 mg/ml) foi incubado em pH 9,5, tampão de carbonato de sódio de O,1M com 150-200 pg FITC por mg de proteína. A solução foi incubada em temperatura ambiente durante 2 horas e o conjugado 2B8-FITC resultante foi purificado numa coluna Sephadex G-25. Outros reagentes usados nesses estudos como Bi e Leu 16 foram comprados como conjugados de fluoresceína directamente da Coulter ou da Becton Dickinson.

As células a analisar foram colhidas e lavadas três vezes com PBS contendo 0,2% de BSA e 0,1% de azida de sódio. A viabilidade foi determinada pela exclusão de azul tripan com uma exigência de viabilidade de >90%. As concentrações de célula foram ajustadas a 3 milhões por ml com 50 μΐ acrescentado por poço em 96 placas de poços fundo em U. O anticorpo primário (50 μΐ) foi acrescentado aos poços apropriados e a mistura foi incubada durante 30 minutos a 1 h à temperatura ambiente; subsequentemente as células foram lavadas 5 vezes com 200 μΐ/poço de PBS contendo 0,2% de BSA e 0,02% de azida de sódio. As células foram centrifugadas nas placas a 1300 RPM durante 1 minuto e numa centrifugadora Sorvall e os sobrenadantes foram retirados batendo ao de leve nas placas. O anticorpo secundário, se necessário, foi acrescentado e incubado durante mais 30 minutos a 1 h à temperatura ambiente no escuro; depois os poços foram lavados como indicado acima. Finalmente, 200 μΐ de tampão de fixação (cloreto de sódio de 0,15M contendo 1% de paraformaldeido, pH 7,4) foi acrescentada a cada amostra e as células tratadas foram transferidas para tubos para análise de 12X75 mm. b. Sangue Inteiro de Macacos Cynomolgus.

Depois de retirar o plasma, as células foram lavadas duas vezes por centrifugação e ressuspensão em HBSS. Soro fetal bovino (2 ml) foi acrescentado e as células foram ressuspensas. Cem microlitros de células ressuspensas foram depois distribuídos por cada um dos 6 tubos cónicos de centrifugadora de 15 ml. Anticorpos monoclónicos marcados fluorescentemente foram acrescentados como se segue:

Tubo no. 1: AntÍ-CD2-FITC de murino (AMAC), 2,5 pg/ml, 5 yg;

Tubo no. 2: Anti-humano de cabra IGM-FITC (Fisher) 2,5 yg /ml, 5 yg;

Tubo no. 3: Anti-rato de cabra IgG-RPE (Fisher) 2,5 pg/ml, 5 yg;

Tubo no. 4: Anti-humano de cabra IgM-FITC + Anti-rato de

Cabra IgG-RPE (absorvido), 2.5 pg/ml, 5 yg;

Tubo no. 5: Anti-humano CD20-FITC (anti-Leu 16, Becton

Dickinson), 5 yg;

Tubo no. 6: Apenas células (autofluorescência).

Os anticorpos e células marcados foram centrifugados durante 2 minutos a 1500 RPM para misturar células e anticorpos e as 6 amostras foram então colocadas em gelo e incubadas durante 30 minutos. Subsequentemente os tubos foram retirados do gelo e o tampão de lise (pré-aquecido a 37°C) foi acrescentado para um volume de 12 ml. As amostras foram então incubadas durante 15 minutos à temperatura ambiente, centrifugadas durante 5 minuto a 4 2C a 1500 rpm e os sobrenadantes foram retirados. Os granulados de células foram lavados duas vezes em tampão de marcação (PBS contendo 1% de BSA e 0,05% de azida de sódio).

Subsequentemente as células foram fixadas pela adição de 0,5 ml de tampão de fixação (0,15M de cloreto de sódio, pH 7,4, contendo 1% de paraformaldeído) por tubo e analisado num instrumento FACScan Becton Dickinson usando auto-compensação e pré-ecalibração com partículas (beads) Calibrite. A fluorescência verde de fluoresceína foi medida no modo FL1 e a fluorescência vermelha de ficoeritrina foi medida no modo FL2. Os dados foram expressos em forma de registo. Populações viáveis de linfócitos foram inicialmente identificadas espalhando um ângulo de luz para frente vs. recto num mapa de marcação de pontos em bitmap. A população total de linfócitos foi então isolada separando todos os outros eventos. Medições de fluorescência subsequentes reflectiram apenas os eventos específicos que ocorreram dentro da área separada.

Para estudos de farmacologia/toxicologia de doses elevadas os níveis de linfócito pré-estudo foram determinados para cada macaco cynomolgus e usados como valores de base. A percentagem de células T e B e as proalíquotas T:B foram calculadas e usadas como referências para a depleção. O pré-estudo de população de célula B foi enumerado com Leu 16 e anticorpos IgM anti-humano.

Depois da injecção de 2B8 nos macacos, quando o antígeno CD20 foi saturado com 2B8, a percentagem de células B na população total foi aproximada usando anti-humano de cabra IgM-FITC, anti-rato IgG-RPE e a população de coloração dupla contendo esses dois marcadores. A população de coloração dupla foi usada para quantitação até todos os 2B8 serem depurados do sangue periférico dos animais. A percentagem de células T na população geral de linfócitos foi calculada usando anti-CD2-FITC. Os dados foram calculados com base na média de três medições de 10.000 eventos feitas com cada amostra. As células de cada uma das amostras de sangue indicadas foram avaliadas subsequentemente, enumerando em cada caso as subpopulações de células T e B dentro da população total de linfócitos. As proaliquotas T:B também foram examinadas. A depleção de células B foi calculada como a percentagem da redução de células B relativa aos níveis originais de célula B para cada macaco individual. 3. Radioiodação e Imunoprecipitação de CD20.

Cem milhões de células SB foram divididas em duas partes iguais depois da íodmação de superfície com I e Iodobeads (Pierce Chemical Co). As células foram lavadas repetidamente por centrifugação até os níveis de radioactividade no sobrenadante voltarem aos antecedentes. Cem microgramas de anticorpos 2B8 ou BI (Coulter Immunology) foram acrescentados às duas amostras de células B marcadas. Os anticorpos e as células SB foram incubados durante a noite e depois lavados três vezes por centrifugação até que todos os anticorpos não ligados forrem retirados. Os granulados de célula contendo ligações de 2B8 e BI foram então Usados e extraídos por adição de 1 % de NP-40 de detergente em 0,1 M de Tris-HCI, pH 8,0, seguido por incubação à temperatura ambiente durante 1 h. O extracto foi centrifugado numa microcentrífuga a alta velocidade durante 30 minutos e os sobrenadantes foram transferidos para novos tubos. A proteína A-Sefarose (300 pL) foi acrescentada a cada tubo e a resina foi peletizada por centrifugação. A proteína A-Sefarose foi então lavada vezes para retirar proteína iodinada não especificamente ligada. Quando a proporção de radioactividade de conta-para-sobrenadante alcançou um valor de 100, o granulado foi extraído com o tampão de amostra SDS PAGE e aquecido até ferver. Depois de arrefecer, aproximadamente 15.000 cpm de cada um dos extractos foram acrescentados a poços de 10% de gel de poliacrilamida. Um baixo peso molecular de padrão pré-colorido (BioRad Inc.) foi acrescentado a um poço separado e usado para uma estimativa do peso molecular. As proteínas foram resolvidas por electroforese e o gel foi secado e exposto a uma folha de filme de raio-X durante 24 horas a -70 °C; subsequentemente o filme foi desenvolvido e analisado. 4. Análise de Scatchard de Ligação 2B8 Ο 2B8 purificado foi avaliado para afinidade evidente pela análise de Scatchard. Ο 2B8 radiomarcado foi preparado por reacção com 125I na presença de lodobeads. Depois de remoção do iodo livre o anticorpo radiomarcado foi incubado em várias concentrações, em duplicado, variando de 5000 ng por poço a 35 ng/poço com 10, 000 células SB. A quantidade de ligação de anticorpo para células foi calculada da actividade específica do 2B8 marcado a 125I. A proporção de anticorpos ligados/livres foi traçada contra a concentração molar do anticorpo ligado e a afinidade evidente constante foi determinada a partir da proporção de intercepções dos eixos X e Y.

5. Preparação de 2B8-MX-DTPA

a. Fonte de MX-DTPA

Para alguns estudos pré-clínicos, o ácido 1- isotio-cianatobenzil-3-metildietilenotriaminapentaacético marcado com carbono-14 (MX-DTPA) foi fornecido como um sólido seco pelo Dr. Otto Gansow no Instituto Nacional da Saúde e armazenado dessecado a 4 2C protegido da luz. Soluções armazenadas de quelato foram preparadas em água Milli-Q e a concentração foi determinada avaliando a radioactividade e usando a actividade especifica do composto. As soluções armazenadas geralmente eram de 2-5 mM e foram armazenadas a -70 °C em tubos de polipropileno. Para outros estudos, o MX-DTPA foi obtido da Coulter Immunology como sal dissódico em água e armazenado a - 70 °C. b. Manutenção de Condições Isentas de Metal

Além do uso de reagentes isentos de metal, todas as manipulações de reagentes foram executadas para minimizar a possibilidade de contaminação por metal. Quando possível foram usados recipientes de plástico de polipropileno como frascos, provetas e cilindros graduados. Estes foram lavados com Alconox e exaustivamente enxaguados com água Milli-Q antes da utilização. Além do mais, pontas de pipeta isentas de metal (BioRad) foram usadas para manipular pequenos volumes com precisão. Para manipular volumes maiores de reagentes, foram usadas pipetas serológicas estéreis plásticas (disponíveis em tamanhos de 1 a 25 ml) . As reacções foram executadas de forma adequada em tubos de polipropileno de topo roscado de microcentrifuga (Sardstedt Industries; capacidade de 1,5 ml) ou tubos cónicos de polipropileno (Costar; 15 ml e 50 μΐ) . Quando a tubulação de diálise foi manipulada, foram usadas luvas cirúrgicas descartáveis previamente enxaguadas com água Milli-Q. c. Preparação de Anticorpo O anticorpo 2B8 de murino anti-CD20 foi purificado inicialmente de ascites por cromatografia de Proteína A e QAE. Para ensaios posteriores ο 2B8 foi purificado de sobrenadantes de bioreactores de fibras ocas usando o mesmo processo de purificação. O anticorpo derivado de fibras ocas foi substituído para fins de comercialização pelo anticorpo derivado de CHO descrito no Exemplo 2. O anticorpo foi preparado para conjugação transferindo-o para bicina-NaOH de 50 mM isenta de metal, pH 8,6, contendo 150 mM de NaCI, usando diálise ou troca de tampão repetitiva. Em alguns estudos, a troca de tampão foi efectuada usando ultrafiltração repetitiva com os filtros de rotação Centricon 30 (Amicon) (30,000D MWCO). Em geral, 50-200 pL de proteína (10 mg/ml) foi acrescentada à unidade com filtro e foi acrescentado 2 ml de tampão de bicina. O filtro foi centrifugado a 4 2C num rotor Sorvai SS-34 a RPM durante 45 minutos. O volume de concentrado foi aproximadamente 50-100 pL. Este processo foi repetido duas vezes com o mesmo filtro. O concentrado foi transferido para um tubo de topo roscado de polipropileno de 1,5 ml, testado para proteína, diluído para 10,0 mg/ml e armazenado a 4 2C até ser usado para conjugação. Para alguns estudos, a proteína foi transferida para 50 mM de citrato de sódio, pH 5,5 contendo 150 mM de NaCI e 0,05% de azida de sódio usando o mesmo protocolo descrito acima. d. Protocolo de Conjugação A conjugação de 2B8 com MX-DTPA foi executada em tubos de polipropileno à temperatura ambiente. Soluções armazenadas de MX-DTPA congeladas foram descongeladas imediatamente antes do uso. Tipicamente, 50-200 pL de anticorpo a 10 mg/ml foi reagido com quelato a uma proporção molar de quelato-para-proteina de 4:1. As reacções foram iniciadas acrescentando a solução armazenada de quelato e misturando suavemente; a conjugação foi permitida durante a noite, geralmente durante 14 a 20 h, à temperatura ambiente. 0 quelato não reagido foi retirado do conjugado por diálise ou ultrafiltração repetitiva, como descrito acima, em solução salina normal sem metal (0,9% p/v) contendo 0,05% de azida de sódio. A concentração de proteína foi ajustada para 10 mg/ml e armazenada a 4 2C num tubo de polipropileno até ser radiomarcada. e. Determinação de Incorporação de Quelato A incorporação de quelato foi determinada pela contagem de cintilação e comparando o valor obtido com o conjugado purificado à actividade específica do quelato marcado com carbono-[14]. Para estudos posteriores, nos quais foi usado o quelato não radioactivo obtido da Coulter lmmunology, a incorporação de quelato foi avaliada incubando o conjugado com um excesso de solução de transporte radioactiva de 90Y de concentração conhecida e actividade específica.

Resumidamente, uma solução armazenada de cloreto de ítrio de concentração conhecida foi preparada em 0,05 N HCI sem metal à qual foi acrescentado 90Y sem transportador (cloreto de sódio). Uma parte desta solução foi analisada pela contagem de cintilação líquida para determinar uma actividade específica exacta deste reagente. Um volume de reagente de cloreto de ítrio igual a 3 vezes o número de moléculas grama (mol) de quelato que se espera que esteja ligado ao anticorpo, tipicamente anticorpos de 2 mol/mol, foi acrescentado ao tubo de polipropileno e o pH foi ajustado para 4,0-4,5 com 2 M de acetato de sódio. O anticorpo conjugado foi acrescentado subsequentemente e a mistura foi incubada durante 15-30 minutos à temperatura ambiente. A reacção foi extinta acrescentando 20 mM EDTA a uma concentração final de 1 mM e o pH da solução foi ajustado para aproximadamente pH 6 com 2M de acetato de sódio.

Depois de uma incubação de 5 minutos o volume inteiro foi purificado por cromatografia de exclusão de tamanho de alto desempenho como descrito abaixo. As fracções contendo proteínas eluídas foram combinadas, a concentração de proteína foi determinada e uma parte foi testada para radioactividade. A incorporação de quelato foi calculada usando a actividade específica da preparação de cloreto 90Y e a concentração de proteína.

f. Imunorreactividade de 2B8-MX-DTPA A imunorreactividade do conjugado 2B8 foi avaliada usando uma célula inteira ELISA. Células SB de fase de registo médio foram colhidas de culturas por centrifugação e lavadas duas vezes com IX HBSS. As células foram diluídas para 1-2 X 106 células/ml em HBSS e divididas por placas de microlitro de poliestireno de 96 poços a 50,000-100.000 células/poço. As placas foram secadas sob vácuo durante 2h a 40-45°C para fixar as células ao plástico. As placas foram armazenadas secas a -20°C até serem usadas. Para ensaio, as placas foram aquecidas para a temperatura ambiente imediatamente antes do uso, depois bloqueadas com IX PBS, pH 7,2-7,4 contendo 1% de BSA (2 h). As amostras de ensaio foram diluídas em IX % de PBS/1 BSA, aplicadas a placas e diluídas em série (1:2) no mesmo tampão. Depois de incubar placas durante 1 h à temperatura ambiente, as placas foram lavadas três vezes com IX PBS. 0 anticorpo secundário (anti-rato de cabra HRP IgGI-específico conjugado) (50 pL) foi acrescentado a poços (1:1500 diluição em IX % de PBS/1 BSA) e incubado durante lh à temperatura ambiente. As placas foram lavadas quatro vezes com IX PBS seguido da adição de solução de substrato ABTS (50 mM de citrato de sódio, pH 4,5 contendo 0,01 % de ATBS e 0,001 % de H2O2). As placas foram lidas a 405 nm depois de 15-30 minutos de incubação. As células negativas para um antígeno HSB foram incluídas em ensaios para controlar a ligação não específica. A imunorreactividade do conjugado foi calculada traçando os valores de absorbância contra o respectivo factor de diluição e comparando esses a valores obtidos usando anticorpos nativos (representando 100% de imunorreactividade) testados na mesma placa. Vários valores na parte linear do perfil de titulação foram comparados e foi determinado um valor médio.

g. Estabilidade In Vitro de Nativo 2B8 e 2B8-MX-DTPA

Para esta avaliação de 12 semanas de estabilidade de anticorpo e conjugado, alíquotas de anticorpo 2B8 e 2B8-MX-DTPA foram formuladas em solução salina normal ou solução salina normal contendo 10 mM de glicina-HCI, pH 6,8. Conjuntos duplicados de amostras foram incubados a 4 °C e a 30 °C e as amostras foram testadas semanalmente usando os seguintes métodos: SDS-PAG E (redução e não redução), imunorreactividade por imunoensaio de enzima de célula inteira usando células SB (antígeno positivo) ou HSB (antígeno negativo) como captura e electroforese de foco de gel isoeléctrico (amplitude de pH, 3-10). Além disso, a eficiência de radiomarcação do conjugado foi avaliada nas semanas 4, 8, e 12 por radiomarcação do conjugado com 90Y e analisando o produto por SDS-PAGE e análise auto-radiográfica. Finalmente, num estudo separado, aliquotas de 2B8-MXDTPA incubadas a 4°C e 30°C durante 10 semanas foram radiomarcadas com inIn e avaliadas num estudo de biodistribuição em ratos BALB/c como descrito abaixo. h. Estudos de Imuno-histologia.

Estudos de imuno-histologia com anticorpos naturais e conjugados (2B8-MX-DTPA) foram executados por Laboratórios IMPATH usando secções de tecidos humanos fixados com acetona. O anticorpo foi purificado de sobrenadantes de bioreactores de fibras ocas por cromatografia em proteina A e Q Sefarose. O grau clinico conjugado foi preparado usando MX-DTPA da Coulter Immunology segundo o protocolo descrito acima. i. Imunorreactividade_In_Vitro_de_2B8-MX- DTPARadiomarcado.

Para alguns ensaios, foi usado o protocolo de ELISA para célula inteira usado para 2B8-MX-DTPA não marcado. Em ensaios posteriores, a imunorreactividade de conjugados com os marcadores 911In e 90Y (cada um preparado por IDEC Pharmaceuticals ou, alternativamente, por MPI Pharmacy Services, Inc.) foi determinada usando uma versão modificada do ensaio de ligação em célula inteira descrito por Lindmo (3). Resumidamente, aumentando as concentrações da fase de registo a meio, células de antigeno positivo SB ou células de antigeno negativo HSB [20-30 X 106 células/ml em tampão de diluição (PBS, pH 7,4 contendo 1% de BSA, 0,1% de gelatina e 0,02% de azida de sódio)] foram acrescentadas a conjuntos de tubos em duplicado. O conjugado radiomarcado foi diluído para uma concentração final de anticorpo de 1-5 ng/ml com tampão de diluição e 0,35 ml foi acrescentado a cada tubo. Depois de um período de incubação de 75-90 minutos à temperatura ambiente as células foram peletizadas por centrifugação e os sobrenadantes foram colhidos. A radioactividade permanecendo na fracção sobrenadante foi determinada com contador de cintilação gama. Os dados foram traçados como o guociente de radioactividade total acrescentada dividido pela radioactividade associada por célula, contra o inverso do número de células por tubo. O intercepto no eixo y representa assim a fracção de imunorreactividade. j. Estabilidade In Vitro de 2B8-MX-DTPA Radiomarcado em Soro Humano. A estabilidade in vitro de 2B8-MX-DTPA com os marcadores ηιΙη e 90Y foi avaliada pela incubação no soro humano a 37°C durante 96 horas. O anticorpo conjugado foi preparado e radiomarcado com 911In (protocolo de "misturar-e-injectar") ou 90Y como descrito acima. As actividades específicas de conjugados com os marcadores 911In e 90Y foram de 2,5 e 14,6 mCi/mg, respectivamente; os conjugados radiomarcados foram suspensos no tampão contendo 75 mg/ml de albumina sérica humana (HSA) e 1 mM de DTPA (conjugado marcado com ítrio) ou tampão contendo 50 mg/ml de HSA (conjugado marcado com índio). Os conjugados radiomarcados foram diluídos a 1:10 com soro humano normal (não inactivado por calor) e as alíguotas foram colocadas assépticamente em tubos tapados estéreis; estes tubos foram então incubados a 37 °C durante períodos de até 96 horas.

Em momentos seleccionados as amostras de conjugados foram retiradas e analisadas por SDS-PAGE não redutor em géis de gradiente de 4-20% seguidos por auto-radiografia e por cromatografia de camada fina imediata. k. Estabilidade In Vitro de 2B8-MX-DTPA 11]Ίη Clinicamente Formulado. O 2B8-MX-DTPA conjugado foi radiomarcado com ηιΙη e usado sem purificação HPLC (protocolo de "misturar-e-injectar") . O anticorpo radiomarcado foi diluído em PBS e albumina sérica humana (HSA) acrescentada a uma concentração final de 50 mg/ml. A actividade específica do conjugado radiomarcado formulado foi de 2,2 mCi/mg. O conjugado formulado foi subsequentemente incubado a 4°C durante 48 horas e as alíquotas foram analisadas a 0, 24 h e 48 horas usando SDS-PAGE não redutor em géis de gradiente de 4-20% seguidos de autoradiografiae de cromatografia de camada fina imediata. A imunorreactividade a cada momento foi avaliada usando o ensaio de suspensão de célula inteira descrito na secção 1 acima. l. Estabilidade In Vitro de 288-MX-DTPA 90Y Clinicamente Formulado. 0 2B8-MX-DTPA conjugado foi radiomarcado com 90Y e purificado por cromatografia de exclusão de tamanho em HPLC usando IX PBS como tampão de eluição. As fracções de conjugado radiomarcado foram agrupadas e acrescentou-se albumina sérica humana e DTPA em concentrações finais de 75 mg/ml e 1 mM, respectivamente. A actividade específica do conjugado radiomarcado formulado foi de 14,6 mCi/mg. O conjugado formulado foi subsequentemente incubado a 4°C durante 48 horas e as alíquotas foram analisadas a 0, 24 h e 48 horas usando SDS-PAGE não redutor em géis de gradiente de 4-20% seguidos de autoradiografia e de cromatografia de camada fina imediata. A imunorreactividade a cada momento foi avaliada usando o ensaio de suspensão de célula inteira descrito na secção 1 acima. 2. Estudos em Animais. a. Estudo de Farmacoloqia/Toxicologia de Dose Elevada em Primata Usando 2B8. O anticorpo 2B8 foi avaliado num estudo de farmacologia de dose elevada realizado sob os regulamentos de GLP no White Sands Research Center (Número de Estudo 920111) . Macacos adultos Macaca fascicularis (Cynomolgus) foram usados; cada grupo do estudo era composto por um macho e uma fêmea. O anticorpo foi injectado intravenosamente a cada 48 horas com sete injecções ao todo. O estudo constou de cinco grupos: Grupo 1 (salina); Grupo II (0,6 mg/kg); Grupo III (2,5 mg/kg); Grupo IV (10 mg/kg); e Grupo V (10 mg/kg apenas no dia 0).

Antes do inicio do estudo, foi colhido sangue dos 10 animais e usado para determinar antecedentes de reagente e populações de células B iniciais. Todas as amostras de sangue subsequentes foram retiradas antes de cada injecção de anticorpo. Os Grupos III e IV foram sacrificados no dia para necropsia e histopatologia completa.

Os animais nos grupos I, II, e V foram sangrados dias 0, 1, 3, 7, 13, 21, 37 e 52; aproximadamente 5 ml de sangue inteiro foi colhido em tubos heparinizados. O sangue inteiro foi armazenado a 4°C e analisado dentro de 24 horas. 0 sangue de cada animal foi centrifugado a 2000 RPM durante 5 minutos e o plasma sobrenadante foi retirado para ensaio de niveis de soro 2B8 por RIA (ver o procedimento RIA para métodos de ensaio específicos). O material peletizado contendo PBLs e RBCs foi ressuspenso em FCS para análise FACS. b. Estudos de Farmacocinética com 2B8 e 2B8-MX-DTPA. A meia vida média de beta soro 2B8 em macacos Cynomolgus foi determinada usando animais do Grupo V (acima). O anti-rato de cabra IgGI (Fisher Scientific) foi diluído para 2,0 pg por ml em 10 mM de tampão de borato, pH 9,6 e 50 pL foi acrescentado a cada poço de uma das placas de 96 poços. O anticorpo pôde ligar-se à placa durante uma incubação durante a noite a 4 °C, ou durante 2 h à temperatura ambiente. Cada placa foi bloqueada durante 30 minutos à temperatura ambiente com 150 pL por poço de PBS contendo 1% de BSA. As placas foram lavadas com água destilada e foram aplicadas em triplicado amostras de soro ou plasma a poços individuais a uma diluição inicial de 1:100 seguida de diluições em série de 1:2. Ο 2B8 purificado foi acrescentado a soros pré-sangrados e diluído para uso como uma curva padrão começando com 0,5 mg/ml; as amostras foram diluídas a 1:100 e depois diluídas em série, como as outras amostras. As placas foram incubadas durante 1 h à temperatura ambiente e lavadas 4 vezes com água destilada. O reagente secundário (anti-rato de cabra IgGI-HRPO) foi então acrescentado a uma diluição de 1:4000 e incubado à temperatura ambiente durante uma hora adicional. As placas foram lavadas novamente em água destilada e foi acrescentado 0,1 ml de substrato de peroxidase contendo peróxido de hidrogénio. Foi permitido que a cor se desenvolvesse a partir da reacção durante 20 minutos; a absorbância foi subsequentemente determinada a 405 nm usando um leitor de microplacas ELISA. Os resultados foram traçados em yg de anticorpo por ml de soro.

Além do mais, os valores β t!/2 de 2B8 e 2B8-MX-DTPA foram determinados em ratos BALB/c. Ο 2B8 não conjugado foi armazenado a -70 °C em IX PBS, pH 7,4/10% de glicerol foi descongelado, diluido para 0,5 mg/ml e filtrado estéril. O anticorpo conjugado foi preparado seguindo protocolos padrão, mas com quelato marcado com carbono-[14]; a incorporação de quelato foi anticorpo de 1,5 mol/mol. O conjugado purificado foi diluido para 0,5 mg/ml em solução salina normal (0,9%), filtrado estéril e armazenado a 4°C com o anticorpo nativo até ser usado.

Ratos de seis a oito semanas de idade foram injectados com 100 pL de anticorpo purificado 2B8 a uma concentração de 250 pg/ml. Os ratos foram subsequentemente sangrados por punção retro-orbital a várias horas, entre 0 e 264 horas e os seus soros foram analisados para a presença de anticorpo nativo e conjugado 2B8 por imunoensaio enzimático de célula inteira usando a linha SB de célula B de antigeno positivo como captura. Os dados resultantes foram traçados como a concentração de 2B8 ou 2B8-MXDTPA em relação ao tempo; destes resultados gerou-se um ponto da recta da regressão linear e a inclinação foi usada para determinar os valores de β ti/2. c. Estudo de Farmacologia/Toxicologia de [89]-Y-2B8-MX-DTPA em Macacos Cynomolgus. O 2B8-MX-DTPA com itrio-[89] foi preparado usando o protocolo descrito para inserção de 90Y, com excepção de que a purificação HPLC não foi usada. O conjugado não radioactivo com metal foi formulado a IX PBS contendo 75 mg/ml de HSA e 1 mM de DTPA e avaliado no estudo de GLP, número 920611 no White Sands Research Center. Um macaco macho e um macaco fêmea foram incluídos em cada um dos quatro grupos. Os animais foram injectados intravenosamente a cada 48 horas com um total de 7 injecções com as seguintes quantidades de preparado: Grupo 1 (solução salina); Grupo II (0,003 mg/kg) ; Grupo III (0,03 mg/kg) ; e Grupo IV (0,3 mg/kg). Os animais foram avaliados durante o estudo, determinando-se pesos e temperaturas corporais, consumo de alimentos e água, eliminação, químicas de soro, hematologia, análise da urina e exames físicos. Os animais nos grupos I a IV foram sangrados antes da infusão nos dias 0, 2, 7, 10 e 14 e o sangue foi analisado para níveis de circulação de célula B por análises FACS. d. Biodistribuição de 2B8-MX-DTPA Radiomarcado

Num estudo preliminar o 2B8-MX-DTPA marcado com inIn foi avaliado para biodistribuição de tecido em ratos BALB/c de seis a oito a semanas de idade. O conjugado radiomarcado foi preparado usando o 2B8-MX-DTPA de grau clínico segundo o protocolo de "misturar-e-injectar" descrito acima. A actividade específica do conjugado foi 2,3 mCi/mg e o conjugado foi formulado em PBS, pH 7,4 contendo 50mg/ml de HSA. Os ratos foram injectados intravenosamente com 100 pL de 2B8-MX-DTPA marcado com ηιΙη (aproximadamente 21 pCi) e grupos de três ratos foram sacrificados por deslocação cervical a 0, 24, 48 e 72 horas. Depois do sacrifício a cauda, coração, pulmões, fígado, rim, baço, músculo e fémur foram extraídos, lavados e pesados; uma amostra de sangue também foi colhida para análise. A radioactividade associada a cada espécimen foi determinada pela contagem gama e a percentagem de dose injectada por grama de tecido foi subsequentemente determinada. Não foi feita nenhuma tentativa para descontar a contribuição de actividade representada pelo sangue associado a órgãos individuais.

Num protocolo separado, aliquotas de 2B8-MX-DTPA incubadas a 4 2 e 30 °C durante 10 semanas foram radiomarcadas com ηιΙη para uma actividade especifica de 2,1 mCi/mg para as duas preparações. Estes conjugados foram então usados em estudos de biodistribuição em ratos como descrito acima.

Para determinações de dosimetria, o 2B8-MX-DTPA foi radiomarcado com 911In para uma actividade especifica de 2,3 mCi/mg e aproximadamente 1,1 pCi foi injectado em cada um dos 20 ratos BALB/c. Subsequentemente, grupos de cinco ratos foram sacrificados a 1, 24, 48 e 72 horas e os seus órgãos foram retirados e preparados para análise. Além disso, partes de pele, músculo e osso foram retirados e processados para análise; a urina e as fezes também foram colhidas e analisadas em momentos durante um período de 24-72 horas.

Usando uma abordagem semelhante, o 2B8-MX-DTPA também foi radiomarcado com 90Y e sua distribuição biológica foi avaliada em ratos BALB/c durante um período de tempo de 72 horas. Depois da purificação por cromatografia de exclusão de tamanho HPLC, quatro grupos de cinco ratos foram injectados intravenosamente com aproximadamente pCi de conjugado clinicamente formulado (actividade específica: mCi/mg); os grupos foram subsequentemente sacrificados a 1, 24, 48 e 72 horas e seus órgãos e tecidos foram analisados como descrito acima. A radioactividade associada a cada espécimen de tecido foi determinada medindo a energia bremstrahlung com um contador de cintilação gama. Os valores de actividade foram subsequentemente expressos como a percentagem de dose injectada por grama de tecido ou percentagem de dose injectada por órgão. Apesar dos órgãos e outros tecidos terem sido enxaguados repetidamente para retirar o sangue da superfície, os órgãos não foram aspergidos. Por conseguinte, os valores de actividade de órgão não foram descontados da contribuição de actividade representada pelo sangue internamente associado. e. Localização de Tumor de 2B8-MX-DTPA Marcado com 111In A localização do 2B8-MX-DTPA radiomarcado foi determinada em ratos atímicos com tumores Ramos em células B. Ratos atímicos com seis a oito semanas foram injectados subcutaneamente (flanco traseiro esquerdo) com 0,1 ml de RPMI-1640 contendo 1,2 X 107 células de tumor Ramos que tinham sido anteriormente adaptadas para crescimento em ratos atímicos. Os tumores surgiram dentro de duas semanas e variaram em peso de 0,07 a 1,1 gramas. Os ratos foram injectados intravenosamente com 100 μΐ de 2B8-MX-DTPA marcado com niIn (16,7 μθί) e grupos de três ratos foram sacrificados por deslocação cervical a 0, 24, 48 e 72 horas. Depois do sacrifício a cauda, coração, pulmões, fígado, rim, baço, músculo, fémur e o tumor foram extraídos, lavados e pesados; uma amostra de sangue também foi colhida para análise. A radioactividade associada a cada espécimen foi determinada por contagem gama e foi determinada a percentagem de dose injectada por grama de tecido. 3. Cálculos de Dosimetria

Usando os dados de biodistribuição obtidos com ratos BALB/c injectados com 2B8- MX-DTPA marcado com 711TIn ou 90Y (Tabelas 1-4 e 5-8), estimativas sobre a dose de radiação

absorvida de uma dose de 1,0 mCi administrada a um paciente com 70 kg foram calculadas usando a abordagem formalizada pela Medicai Internai Radiation Dose (MIRD) Committee of the Society of Nuclear Medicine. As meias-vidas biológicas dos conjugados radiomarcados foram determinadas a aprtir dos valores de dose injectada por órgão determinados a partir dos dados de biodistribuição de cada radioimunoconjugado. Para alguns tecidos, p. ex. o sangue foi assumido que a decadência biológica do radioconjugado seguiu um modelo de dois compartimentos com uma decadência exponencial desses compartimentos. Para outros tecidos, p. ex. o fígado, cujos níveis de actividade permaneceram aproximadamente constantes ao longo das 72 horas do estudo de biodistribuição, foi assumido que a meia-vida biológica foi muito longa e foi-lhe atribuído um valor de 1000 horas.

Tabela 1

Distribuição de Actividade 1.0 Hora Após Injecção IV de 11:LIn-2B8-MX—DTPA em Ratos Normais BALB/c

Valores Médios ± DP

No. de ratos = 5

Peso Médio = 20,97 + 2,46 gramas

Tabela 2

Distribuição de Actividade 24 Horas Após Injecção IV de inln-2B8-MX-DTPA em Ratos Normais BALB/c

Valores Médios ± DP

No. de ratos = 5

Peso Médio = 21,03 + 0,94 gramas

Tabela 3

Distribuição de Actividade 48 Horas Após Injecção IV de 11:LIn-2B8-MX—DTPA em Ratos Normais BALB/c

Valores Médios ± DP

No. de ratos = 5

Peso Médio = 20,65 ± 1,93 gramas

Tabela 4

Distribuição de Actividade 72 Horas Após Injecção IV de 11:LIn-2B8-MX-DTPA em Ratos Normais BALB/c

Valores Médios ± DP

No. de ratos = 5

Peso Médio = 21.46 ± 0,84 gramas

Tabela 5

Distribuição de Actividade 24 Horas Após Injecção IV de 90Y-2b8-MX-dta em Ratos Normais BALB/c

Valores Médios ± DP

No. de ratos = 5

Peso Médio = 18,17 ± 0,81 gramas

Tabela 6

Distribuição de Actividade 24 Horas Após Injecção IV de 90Y-2b8-MX-dta em Ratos Normais BALB/c

Valores Médios ± DP

No. de ratos = 3

Peso Médio = 21,671 ± 1,11 gramas

Tabela 7

Distribuição de Actividade 48 Horas Após Injecção IV de 90y. -2B8-MX-DTA em Ratos Normais BALB/c

Valores Médios ± DP

No. de ratos = 5

Peso Médio = 19.07 ± 0.91

Tabela 8

Distribuição de Actividade 72 Horas Após Injecção IV de 90Y-2B8-MX-DTPA em Ratos Normais BALB/c

Valores Médios ± DP

Amostra Peso do % ID / % ID por

No. de ratos = 5

Peso Médio = 19,21 ± 0,27 gramas

De forma similar, os outros valores de meia-vida biológica foram atribuídos ou calculados utilizando a equação-padrão para cálculo do ty2 para uma decomposição exponencial. Assim que estes valores tinham sido determinados, as variáveis para Tue, Tel, Te2, A2, A2, e A, listadas nas

Tabelas 9 e 10, foram determinadas para cada conjugado radiomarcado usando as equações fornecidas no cimo dessas Tabelas (variáveis de output). Estes valores, bem como aqueles mostrados nas tabelas subsequentes, foram calculados por um programa escrito em folha de cálculo Symphony (Lotus Development Corp.) por Phillip Hagan, MS, Nuclear Medicine Service, VA Medicai Center, La Jolla, CA 92161.

Tabela 9 VARIÁVEIS DE ENTRADA (INPOT) VARIÁVEIS DE SAÍDA (OUTPUT) AO = Dose administrada

Tp = Semi-vida fisica do radionuclídeo Tue = Semi- período de absorção efectiva

Tu = Semi-período de absorção biológica Tel = Semi-período de desaparição efectiva

Tbl = Desaparição biológica semi-periodo do primeiro do primeiro componente componente Te2 = Semi-periodo de desaparição efectiva

Tb2 = Desaparição biológica semi-periodo do segundo do segundo componente componente Al = Actividade acumulada do primeiro componente fl = Fracção de AO com semi-periodo biológico de Tbl A2 = Actividade acumulada do segundo componente f2 = Fracção de AO com semi-periodo biológico de Tb2 A = Actividade acumulada total S = Actividade Acumulada de dose média/unidade Tue = Tu * Tp /(Tu + Tp) Al-1,44*fl*A0*Tel*(Tue/Tu)

Tel = Tbl * Tp (Tbl + Tp) A2-1,44*f2*A0*Te2 Te2 = Tb2 * Tp/(Tb2 + Tp) A -Al + A2

Exemplo: Al PARA FÍGADO - 1, 44 * 11, 0001 * 1000 * 63,2 * 1,00 = 10007, 5 microcuries de actividade acumulada TABELA DE VALORES DE ENTRADA E SAÍDA USADOS PARA AVALIAR A ACTIVIDADE ACUMULADA (A)

Tu fl f2 Tbl Tb2 Tue Tel Te2 Al A2 A (h) (h) (h) (h) (h) (h) (uCl-h) (uCl-h) uCl-h) SUPRA-RENAIS 2,78E-04 0,000¾ 0,00¾ 1000 0 2,78E-04 63,2 0,0 0,0 0 CONTEÚDO 2,78E-04 1,000¾ 0,00¾ 4 0 2, 78E-04 3, 8 0, 0 54, 4 0, 0 54

BEXIGA CONTEÚDO 2,78E-04 6,650¾ 0,00¾ 1,5 0 2,78E-04 1,5 0,0 140,5 0,0 141

ESTOMAGO CONTEÚDO INT, 2,78E-04 6,650¾ 0,00¾ 3,5 0 2,78E-04 3,3 0,0 318,6 0,0 319

SM CONTEÚDO ULI 2,78E-04 6,650¾ 0,00¾ 4,5 0 2,78E-04 4,2 0,0 404,0 0,0 404 CONTEÚDO LLI 2,78E-04 6,650¾ 0,00¾ 4,2 0 2,78E-04 4,0 0,0 378,6 0,0 379 RIM 2,78E-04 1,220¾ 0,00¾ 35 0 2,78E-04 23,0 0,0 404,3 0,0 405 FÍGADO 2,78E-04 11,000¾ 0,00¾ 1000 0 2,78E-04 63,2 0,0 10007,5 0,0 10003 PULMÕES 2,78E-04 2,100¾ 1,20¾ 30 1000 2,78E-04 20,3 0,0 627,9 1091,7 1720 OUTROS 2,78E-04 0,000¾

TECIDOS (TOTAL) MÚSCULO 2,78E-04 10,400¾ 0,00¾ 1000 0 2,78E-04 63,2 0,0 9461,7 0,0 9462 ADIPOSO 2,78E-04 0,000¾ 0,00¾ 1000 0 2, 78E-04 63, 2 0, 0 0, 0 0, 0 0 SANGUE 2,78E-04 58,400¾ 32,22¾ 15 1000 2,78E-04 12,3 63,2 10319,2 29313,1 39632 CÉREBRO 2,78E-04 0,000¾ 0,00¾ 1000 0 2, 78E-04 63, 2 0, 0 0, 0 0, 0 0 CORAÇÃO 2,78E-04 0,510¾ 0,38¾ 57 1000 2,78E-04 30,9 63,2 226,9 345,7 573 OVÁRIOS 2,78E-04 0,000¾ 0,00¾ 1000 0 2,78E-04 63,2 0,0 0,0 0,0 0 PÂNCREAS 2,78E-04 0,000¾ 0,00¾ 1000 0 2, 78E-04 63, 2 0, 0 0, 0 0, 0 0 ESQUELETO 2,78E-04 0,000¾ 0,00¾ 1000 (TOTAL) OSSOCORTICAL 2,78E-04 0,000¾ 6,30¾ 45 0 2, 78E-04 63, 2 0, 0 0, 0 0, 0 0 OSSO 2,78E-04 9,100¾ 0,00¾ 1000 1000 2,78E-04 27,0 63,2 3536,8 5731,6 9268

TRABECULAR MEDULA 2,78E-04 0,000¾ 0,00¾ 1000 0 2, 78E-04 63, 2 0, 0 0, 0 0, 0 0 (avermelhado) MEDULA 2,78E-04 0,000¾ 0,00¾ 1000 0 2, 78E-04 63, 2 0, 0 0, 0 0, 0 0 (amarelada) CARTILAGEM 2,78E-04 0,000¾ 0,00¾ 1000 0 2,78E-04 63,2 0,0 0,0 0,0 0 OUTR, 2,78E-04 0,000¾ 0,00¾ 1000 0 2,78E-04 63,2 0,0 0,0 0,0 0 CONSTIT, PELE 2,78E-04 11,770¾ 0,40¾ 39 0 2,78E-04 63,2 0,0 10708,1 0,0 10708 BAÇO 2,78E-04 0,610¾ 0,00¾ 1000 1000 2,78E-04 24,7 63,2 217,1 363,9 531 TESTÍCULOS 2,78E-04 0,000¾ 0,00¾ 1000 0 2,78E-04 63,2 0,0 0,0 0,0 0 TIRÓIDE 2,78E-04 0,000¾ 0,00¾ 1000 0 2, 78E-04 63, 2 0, 0 0, 0 0, 0 0 CORPO TOTAL 2,78E-04 0,000¾ 0,00¾ 1000

Tabela 10 VARIÁVEIS DE ENTRADA (INPDT) VARIÁVEIS DE SAÍDA (ODTPDT) AO = Dose administrada

Tp = Semi-vida fisica do radionuclídeo Tue = Semi- período de absorção efectiva

Tu = Semi-período de absorção biológica Tel = Semi-período de desaparição efectiva

Tbl = Desaparição biológica semi-periodo do primeiro do primeiro componente componente Te2 = Semi-periodo de desaparição efectiva

Tb2 = Desaparição biológica semi-periodo do segundo do segundo componente componente Al = Actividade acumulada do primeiro componente fl = Fracção de AO com semi-periodo biológico de Tbl A2 = Actividade acumulada do segundo componente f2 = Fracção de AO com semi-periodo biológico de Tb2 A = Actividade acumulada total S = Actividade Acumulada de dose média/unidade Tue = Tu * Tp /(Tu + Tp) Al-1,44*fl*A0*Tel*(Tue/Tu)

Tel = Tbl * Tp (Tbl + Tp) A2-1,44*f2*A0*Te2 Te2 = Tb2 * Tp/(Tb2 + Tp) A - Al + A2

Exemplo: Al PARA FÍGADO - 1, 44 * 11, 0001 * 1000 * 63,2 * 1,00 = 10007, 5 microcuries de actividade acumulada TABELA DE VALORES DE ENTRADA E SAÍDA USADOS PARA AVALIAR A ACTIVIDADE ACUMULADA (A)

Tu fl f2 Tbl Tb2 Tue Tel Te2 Al A2 A (h) (h) (h) (h) (h) (h) (uCl-h) (uCl-h) uCl-h) SUPRA-RENAIS 2,78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2,78E-04 60,2 0,0 0,0 0,0 0 CONTEÚDO 2,78E-04 1,000% 0,00% 4 0 2, 78E-04 3, 8 0, 0 54, 2 0, 0 54

BEXIGA CONTEÚDO 2,78E-04 4,220% 0,00% 1,5 0 2, 78E-04 1,5 0, 0 89, 1 0, 0 89

ESTOMAGO CONTEÚDO INT, 2,78E-04 4,220% 0,00% 3,5 0 2,78E-04 3,3 0,0 201,7 0,0 202

SM CONTEÚDO ULI 2,78E-04 4,220% 0,00% 4,5 0 2,78E-04 4,2 0,0 255,5 0,0 255 CONTEÚDO LLI 2,78E-04 4,220% 0,00% 4,2 0 2,78E-04 3,9 0,0 239,5 0,0 240 RIM 2,78E-04 1,150% 0,87% 70 1000 2,78E-04 33,4 60,2 553,6 753,6 1307 FÍGADO 2,78E-04 9,000% 0,00% 1000 0 2,78E-04 60,2 0,0 7795,5 0,0 7795 PULMÕES 2,78E-04 1,200% 0,00% 1000 0 2,78E-04 60,2 0,0 1039,4 0,0 1039 OUTROS 2,78E-04 0,000%

TECIDOS (TOTAL) MÚSCULO 2,78E-04 8,720% 0,00% 1000 0 2,78E-04 60,2 0,0 7552,9 0,0 7553 ADIPOSO 2,78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2, 78E-04 60, 2 0, 0 0, 0 0, 0 0 SANGUE 2,78E-04 49,770% 25,90% 13 1000 2,78E-04 10,8 60,2 7743,9 22433,7 30178 CÉREBRO 2,78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2, 78E-04 60, 2 0, 0 0, 0 0, 0 0 CORAÇÃO 2,78E-04 0,500% 0,36% 51 1000 2,78E-04 28,4 60,2 204,4 311,8 516 OVÁRIOS 2,78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2,78E-04 60,2 0,0 0,0 0,0 0 PÂNCREAS 2,78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2, 78E-04 60, 2 0, 0 0, 0 0, 0 0 ESQUELETO 2,78E-04 0,000% (TOTAL) OSSOCORTICAL 2,78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2, 78E-04 60, 2 0, 0 0, 0 0, 0 0 OSSO 2,78E-04 11,890% 9,28% 67 1000 2,78E-04 32,7 60,2 5604,4 8038,0 13642

TRABECULAR MEDULA 2,78E-04 0,000¾ 0,00¾ 1000 0 2, 78E-04 60, 2 0, 0 0, 0 0, 0 0 (avermelhado) MEDULA 2,78E-04 0,000¾ 0,00¾ 1000 0 2, 78E-04 60, 2 0, 0 0, 0 0, 0 0 (amarelada) CARTILAGEM 2,78E-04 0,000¾ 0,00¾ 1000 0 2,78E-04 60,2 0,0 0,0 0,0 0 OUTR, 2,78E-04 0,000¾ 0,00¾ 1000 0 2,78E-04 60,2 0,0 0,0 0,0 0 CONSTIT, PELE 2,78E-04 15,600¾ 0,00¾ 1000 0 2,78E-04 60,2 0,0 13512,1 0,0 13512 BAÇO 2,78E-04 0,740¾ 0,56¾ 60 1000 2,78E-04 31,0 60,2 330,0 435,1 315 TESTÍCULOS 2,78E-04 0,000¾ 0,00¾ 1000 0 2,78E-04 60,2 0,0 0,0 0,0 0 TIRÓIDE 2,78E-04 0,000¾ 0,00¾ 1000 0 2,78E-04 60,2 0,0 0,0 0,0 0 CORPO TOTAL 2,78E-04 0,000¾ 0,00¾ 1000 0 2,78E-04 60,2 0,0 0,0 0,0 0

Utilizando os valores (A) de Actividade Acumulada Total das Tabelas 9 e 10, e os valores S fornecidos pelo Panfleto MIRD Número 11 (Tabelas 11 e 12, e 13 e 14) as estimativas de dosagens absorvidas pela radiação foram determinadas para cada conjugado radiomarcado para os tecidos listados (Tabelas 15, 16, 17 e 18) .

Nadeterminação das estimativas de dosagens de radiação sumárias para o conjugado marcado com Índio fornecido na Tabela 19, a auto-dose de um dado órgão foi somada com a dose absorvida produzida pela actividade em órgãos ou tecidos adjacentes. Contudo, ao calcular os valores de estimativas de doses de radiação atribuídos ao conjugado marcado com ítrio (Tabela 20), certos valores estão ausentes para os tecidos listados (por exemplo, supra- renais) . Isso é devido a comprimento mais curto da via da partícula (3 liberada, em relação ao comprimento da via da partícula 5 emitida, deste modo, propiciando uma contribuição de actividade insignificante dos tecidos adjacentes e à ausência dos dados primários de biodistribuição para estes tecidos.

Tabela 19

Estimativas de Dosimetria de Radiação Resultante da Administração de 2B8-MX Marcado com indio-[111 ]Uniformemente Distribuída em Homem Padrão (70Kq) e com Base nos Dados de

Distribuição Animal Durante 72 Horas após Injeção

Ref: Esquema para Calcular a Dose Absorvida para

Radionuclídeos Distribuídos Biologicamente, MIRD J. of Nucl. Med./ Suppl. #1,

Cálculos Realizados Usando um Modelo de Folha de Cálculo em Symphony (Lotus Development Corporation) e criada por

Phillip L. Hagan,

Nuclear Medicine Service VA Hospital

San Diego, CA 92161

Tabela 20

Estimativas de Dosimetria de Radiação Resultante da Administração de 2B8-MX Marcado com ÍTRIO-[90] Uniformemente Distribuída em Homem Padrão (70 Kg) e com Base em Dados de Distribuição Animal Sobre 72 horas Após Injeção

Ref: Esquema para Calcular a Dose Absorvida para

Radionuclídeos Distribuídos Biologicamente, MIRD J. of Nucl. Med./Suppl. #1, 2/68 Cálculos Realizados Usando um Modelo de Folha de Cálculo por

Phillip L. Haqan, MS

Nuclear Medicine Service VA Hospital

San Diego, CA 92161 1. II. Resultados

A. Estudos In Vitro com 2b8 e 2B8-MX-DTPA 1. Produção e Caracterização do Anticorpo Anti-CD20 2B8

Um total de nove fusões resultou em três hibridomas produzindo anticorpos que competiram eficazmente com o anticorpo radiomarcado Coulter BI. Em cada caso, o hibridoma foi expandido por uma placa com 24 poços. Os primeiros dois anticorpos isolados das fusões 3 e 4 foram considerados isótipos e ambos identificados como IgM. 0 terceiro anticorpo, produzido na fusão 5 e designado 2B8, foi determinado como sendo um isótipo kappa IgGI e foi seleccionado para estudos posteriores. 0 clone 2B8.HII foi expandido e armazenado a longo prazo em nitrogénio líquido. 0 clone 2B8.H11 foi subclonado para produzir o clone 2B8.HII.G3. e novamente para produzir o clone 2Β8.HlI.G3.G9 . Este clone foi expandido para estudo adicional e o anticorpo foi purificado por cromatografia de afinidade em proteína A.

Ensaios de concorrência utilizando 2B8, BI e Leu 16 não marcados e Coulter BI radiomarcados demonstraram que 2B8 foi capaz de inibir a ligação de BI a CD20 mais eficazmente do que concentrações iguais de BI ou Leu 16 (Fig. 1) . Resultados similares foram obtidos (dados não mostrados) num estudo de concorrência utilizando 2B8 de FITC-conjugado BI nativo e os anticorpos irrelevantes UPC-10 e S-003 (isótipos IgG 2A e 1, respectivamente). A ligação directa ao antígeno celular CD20 pelos anticorpos 2B8 e BI foi comparada pela análise FACS usando as células SB CD2O-positivas e HSB CD20- negativas. Os resultados mostrados na Figura 2 indicam que para quantidades comparáveis de anticorpos, maior quantidade de 2B8 do que de BI foi ligada às células SB. Nenhuma aglutinação significativa às células SB foi observada com os anticorpos irrelevantes. Somente a fluorescência de fundo foi observada com qualquer reagente usado com as células HSB. Estes resultados confirmam a especificidade da interacção de 2B8 com o antigeno CD20 e sugere que 2B8 pode ter maior afinidade para o antigeno de superfície da célula do que BI.

Para determinar a afinidade aparente de 2B8, o anticorpo purificado foi radiomarcado com 1251 e concentrações crescentes do anticorpo marcado foram incubadas com células SB antígeno-positivas; a radioactividade associada às células foi determinada após um período de incubação de 1 hora (Fig. 3). Os resultados sugerem que o anticorpo 2B8 se liga ao antigeno CD20 com uma constante de afinidade

aparente de 4,3 X 10 9 M.

Estudos de citometria de fluxo com linfócitos de sangue periférico normal humano indicaram que 2B8 era especifico para células-B e não reagiu com outros tipos de linfócitos (por exemplo, células_T, monócitos, macrófagos) . 0 2B8 marcado com FITC foi comparado com Bl-FITC e Leu 16-FITC usando a mesma população de linfócitos humanos. Os resultados mostrados na Tabela indicam que 2B8 reagiu com aproximadamente 14 por cento dos linfócitos do sangue periférico contra aproximadamente 12 por cento para Leu 16 e 11 por cento para BI. A população de linfócitos com base em outro marcador de linfócitos B (CD-19) situou-se entre 11 e 14 por cento. Finalmente, quando os linfócitos do sangue periférico humano foram incubados 2B8 e BI ou Leu 16 e, depois, coloridos novamente com o marcador CD19 (Becton/Dickinson), a população de coloração dupla de linfócitos B foi de 9 por cento com 2B8 e 10 por cento com BI ou Leu 16. Estes resultados confirmam a similaridade destes reagentes.

Tabela 21

Comparação de Ligação de 2B8 a Linfócitos de Sangue Periférico Humano com outros Reagentes Específicos de Linfócitos B e T

Marcador de Anticorpos

A imunoprecipitação do antigeno CD20 celular radiomarcado quer por 2B8 ou BI resultou na precipitação de espécies de proteínas duplas indistinguíveis com pesos moleculares de aproximadamente 33 e 35 KD (dados não exibidos).

2. Produção e Caracterização do 2B8-.MX-DTPA

0 conjugado 2B8-MX-DTPA foi produzido pela reacção do anticorpo com um excesso molar de 4:1 de ácido isotiociana-tobenzil-3-metildietileno-triaminepentaacético (4). Normalmente, 1-2 mol de quelato MX-DTPA foram introduzidos por mol do anticorpo 2B8. Conforme mostrado pelos resultados apresentados na Fig. 4, o conjugado 2B8-MX-DTPA não exibiu nenhuma perda aparente na imunorreactividade, vis a vis 2B8 nativo, conforme ambos os anticorpos 2B8 nativos e conjugados exibiram perfis de inibição de BI virtualmente idênticos; os valores de IC50 para 2B8 e 2B8-MX-DTPA foram de aproximadamente 3 e 4 pg/ml, respectivamente. Estes resultados foram obtidos usando anticorpo BI marcado-I125 num radioimunoensaio de célula total realizado utilizando células SB. Resultados semelhantes foram obtidos utilizando 2B8 ou 2B8-MX-DTPA como inibidores de 2B8 marcado com 1251 ligando-se a células SB; ambos 2B8 e o seu conjugado MX-DTPA inibiram a aglutinação de 1251-2B8 às células SB a concentrações de aproximadamente 3-4 pg/ml (dados não mostrados).

Para avaliar a estabilidade in vitro do anticorpo 2B8 nativo e do conjugado 2B8-.MX-DTPA, amostras em solução salina normal ou solução salina contendo 10 mM de glicina-HCI, pH 6,8, foram incubadas a 40 e 30 °C durante 12 semanas e aliquotas foram ensaiadas semanalmente usando os seguintes ensaios: imunorreactividade por imunoensaio de enzimas em célula total, SDS-PAGE sob condições redutoras e não redutoras, e electroforese de gel de foco isoeléctrico. Enquanto os ensaios de imunorreactividade não detectaram nenhuma perda de reconhecimento de antigenos por amostras de anticorpos incubadas sob qualquer das duas temperaturas citadas (Figura 5) , a faixa de foco isoeléctrico para o anticorpo (pH 7,30-8,40 na semana zero), que estava estável a 4 2C, de facto exibiu uma diminuição da unidade de 0,2 pH a 30 °C após a semana seis (Tabela 22) . No entanto, este resultado pode ser equivoco, já que está no limite do erro experimental para o ensaio.

Tabela 22 2B8/2B8-MX—DTPA pl Sumário

Amostras de 2B8 nativo e 2B8-MX-DTPA foram formuladas em diferentes tampões e incubadas a 40 ou 30 °C durante 12 semanas. Durante este período, realizaram- se vários ensaios, incluindo determinações de ponto isoeléctrico. Os valores mostrados acima mostram a faixa de pontos isoeléctricos para o anticorpo nativo e conjugado incubado a cada temperatura, em cada formulação e para cada uma das doze semanas durante o estudo de estabilidade. Os títulos representam: 2B8 4 SAL, 2B8 incubado a 4 2C em solução salina; 2B8 30 SAL, 2B8 incubado a 30°C em solução salina; 2B8 4 GLY, 2B8 incubado a 4 2C em solução salina normal contendo 10 mM de glicina; 2B8 30 GLY, 2B8 incubado a 30°C em solução salina normal contendo lOmM de glicina; 2B8-MX 4 SAL; 2B8-MX-DTPA (conjugado) incubado a 4 2C em solução salina; 2B8-MX 30 SAL, conjugado incubado a 30 °C em

solução salina; 2B8-MX 4'GLY, conjugado incubado a 4 2C em solução salina normal contendo 10 mM de glicina; e, 2B8-MX 30 GLY, conjugado incubado a 30°C em solução salina normal contendo 10 mM de glicina.

Finalmente, usando SDS-PAGE não redutor, as amostras do anticorpo a 30°C exibiram agregados de alto peso molecular após a semana 1 (Tabela 23) . Análises densitométricas dos géis indicaram que os agregados representaram entre 8 e 17% das amostras (Tabela 23). No entanto, quando estas amostras foram analisadas pelo SDS-PAGE redutor, nenhuma evidência das espécies de alto peso molecular foi encontrada, sugerindo a formação de agregados de anticorpo covalentes a 30°C. Mais uma vez, não foi observada nenhuma perda da imunorreactividade.

Tabela 23

Estabilidade In Vitro de 2B8 A. Varredura Desensitométrica de Géis SDS Redutores

B. Varredura Desensitométrica de Géis SDS Redutores

Durante o curso deste estudo de estabilidade, amostras de 2B8-MX-DTPA, incubadas a ambas temperaturas de 4 2 e 30 °C também foram testadas quanto à incorporação radiometálica utilizando 90Y. Amostras ensaiadas nas semanas 4, 8, e 12 incorporaram >90% do 90Y, independentemente da temperatura da incubação.

Finalmente, num estudo separado, aliquotas de 2B8-MX-DTPA incubadas a 4 2 e 30 2C durante 10 semanas foram radiomarcadas com 911In e a sua biodistribuição de tecido avaliado em ratos BALB/c. O conjugado de ambas as temperaturas de incubação produziu biodistribuições similares (dados não mostrados). Além disso, os resultados obtidos foram similares aos resultados da biodistribuição obtidos em ratos BALB/c utilizando conjudado marcado com ml armazenado a 4 2C (ver abaixo).

Os protocolos de radiomarcação para ambos 911In e 90Y demonstraram ser reproduzíveis. Normalmente, radioincorporações de >95% para 911In e de >90% para 90Y foram obtidas. Actividades específicas para conjugados marcados com niIn e 90Y situaram-se rotineiramente na faixa de anticorpo de 2-3 e 10-15 mCi/mg, respectivamente. No desenvolvimento inicial dos protocolos de radiomarcação 911I- e 90Y, radioisótopos não complexos foram removidos do 2B8-MX-DTPA radiomarcado, usando cromatografia de permeação de gel HPLC. Em experiências posteriores, a purificação do HPLC do conjugado marcado com índio foi eliminada devido às altas radioincorporações obtidas (>95%) com este isótopo. A imunorreactividade das preparações marcadas com ηιΙη e 90Y de 2B8-MX-DTPA foram analisadas pelo método Lindmo (3). 0 2B8-MX-DTPA marcado com inln demonstrou ser 100% imunorreativo (Fig. 6), e o conjugado marcado com 90Y demonstrou ser 60% imunorreativo (dados não mostrados).

3. Caracterização de 2B8-MX-DTPA marcado com 911I e 90Y

Experiências preliminares com o conjugado marcado com 90Y demonstraram que a significativa degradação do anticorpo e a perda da imunorreactividade ocorreram com > 10 mCi/mg de anticorpo em actividades especificas. Portanto, foi desenvolvida uma formulação para minimizar os efeitos da radiólise. Enquanto inúmeros destruidores de radicais livres de peso molecular baixo foram avaliados e demonstraram ser eficazes, altas concentrações de albumina sérica humano (HSA) foram as mais eficazes na preservação da integridade e imunorreactividade do anticorpo. (Figuras 7-9) . O anticorpo marcado com 90Y foi formulado em IX PBS, pH 7,4 contendo 75 mg/ml de HSA; Ácido dietilenetriaminopentacético (DTPA) foi também adicionado a uma concentração final de 1 mM para assegurar que qualquer 90Y que possa estar perdido do anticorpo fosse quelado. A degradação do 2B8-MX-DTPA, radiomarcado para uma actividade específica de 14,6 mCi/mg foi avaliada a 0 e 48 horas usando SDS-PAGE e auto-radiografia. As figuras 8 e 9 mostram que o anticorpo radiomarcado não exibiu nenhuma degradação significativa durante um período de 48 h quando incubado a 4 2C. A análise usando cromatografia de camada

fina instantânea mostrou que a perda do 90Y foi menor do que 2% durante a incubação de 48 h (Tabela 24). A imunorreactividade foi também relativamente constante em 60% (Tabela 24).

O conjugado radiomarcado (actividade especifica de 14,6 mCi/mg) foi formulado em PBS, pH 7,4, contendo 7 5 mg/ml de albumina sérica humana e 1 MM DTPA e aliquotas incubadas a 4 2C. A estabilidade do conjugado foi analisada nas horas mostradas pelo SDS-PAGE e pela auto-radiografia, pela cromatografia de camada fina instantânea e pelo ensaio de aglutinação de célula total. Os resultados mostram que aproximadamente 96% do radiometal permaneceram associados com o conjugado após 48 horas a 4 2C e que a imunorreactividade do anticorpo permaneceu constante em aproximadamente 60%.

Estudos da formulação também foram realizados com o conjugado marcado com ηιΙη; a actividade especifica foi de mCi/mg. O anticorpo radiomarcado foi avaliado em IX PBS, pH 7,4 contendo 50 mg/ml de HSA. A figura 10 mostra fotografias dos auto-radiogramas para amostras em incubação na hora zero e em 48 h; a análise densitométrica dos auto-radiogramas indicam que não houve degradação do anticorpo

radiomarcado durante o curso do estudo (Figuras 11, 12) . A análise de cromatografia de camada fina instantânea das amostras não exibiu nenhuma perda de ηιΙη (Tabela 25); além disso, a imunorreactividade foi mantida em aproximadamente 100% (Tabela 25).

O conjugado radiomarcado (actividade especifica de mCi/mg) foi formulado em PBS, pH 7,4, contendo mg/ml de albumina sérica humana e aliquotas incubadas a 4 2C. A estabilidade do conjugado foi analisada por SDS-PAGE e auto-radiografia, por cromatografia de camada fina instantânea e pelo ensaio de aglutinação de célula total. Os resultados mostram que aproximadamente 96% do radiomarcador estava retido com o conjugado após 48 horas a 4 2C, e que a imunorreact ividade do anticorpo permaneceu constante em 100%.

Quando uma preparação clinicamente formulada do 2B8-MX-DTPA, radiomarcado com 90Y para uma actividade especifica de 14.6 mCi/mg, foi incubada por 96 horas a 37°C em soro humano e analisada pelo SDS-PAGE não redutor e por auto-radiografia, menos de 4% do radioisótopo foi perdido durante o curso do período de incubação. As varreduras densitométricas dos auto-radiogramas na hora zero e a 96 h não indicaram nenhuma degradação significativa do conjugado

radiomarcado (Figuras 13-15) . Estes resultados foram corroborados pelas análises cromatográficas de camada fina analíticas das amostras na hora zero e a 96 horas (Tabela 26) . Estes resultados tomados em conjunto sugerem que o conjugado marcado com ítrio é estável sob as condições usadas neste estudo. Resultados similares foram obtidos com o conjugado 2B8-MX-DTPA marcado com ηιΙη (Figuras 16-18) .

Tabela 26

Análise Cromatográfica de Camada Fina Analítica de 90Y-2B8-MX—DTPA Conjugado Incubado em Soro Humano durante 96 Horas a 37°C

Amostras de soro humano contendo 90Y-2B8-MX-DTPA (actividade especifica de 14,6 mCi/mg) foram analisadas nas horas mostradas pela marcação 1 μΐ de uma diluição de 1:20 das amostras em tiras de cromatográfia de camada fina instantânea; as amostras foram analisadas em triplicado. As tiras de cromatográfia foram desenvolvidas pela cromatográfia ascendente em 10% de acetato de amónio em metanol: água (1:1; v/v), secas e cortadas ao meio transversalmente. A radioactividade associada com as metades superiores e inferiores de cada tira foi então determinada e foi calculado o percentual de radioactividade associada ao conjugado. (O radiometal livre migra com a frente do solvente enquanto a radioactividade associada à

proteína permanece na origem.) . As médias de cada determinação da radioactividade associada ao conjugado são mostradas. B. Estudos com Animais

1. Estudos de Farmacologia/Toxicologia de Doses Elevadas com 2B8 e 2B8-MX-DTPA

Num estudo de GLP realizado no White Sands Research Center (Estudo Número 920111) , macacos Cynomolgus receberam injecções intravenosas de várias doses de 2B8. As amostras de sangue foram colhidas antes de cada nova injecção e o sangue foi processado para a avaliação citométrica das populações de linfócitos (Tabela 27) .

Tabela 27

Populações de Células B de Primatas Determinadas por Citometria de Fluxo, Após Infusão de Anticorpos 2B8 Monoclonal

aPercentual de linfócitos totais. A população de células bB quantificada pelos reagentes a marcadores de coloração dupla anti rato IGG-RPE + anti-humano IG-FITC (anti rato IgG RPE detecta 2B8 bloqueado CD20 e anti-humano IgG FITC que deteta superfície de célula de macaco B Ig)

Animais em grupos I através IV foram injetados todas as 48 h num total de sete injeções; animais em grupo V foram injetados uma vez no dia 0. Os animais nos Grupos III e IV foram sacrificados no dia 14.

Nenhum efeito farmacotóxico significante relacionado com a administração do anticorpo anti-CD20 2B8 foi observado em qualquer parâmetro clínico avaliado durante ou depois do estudo. Da mesma forma nenhuma anormalidade foi observada durante a análise de vários espécimes de histopatologia obtidos de animais dos grupos III e IV. A duração do estudo foi de 14 dias e os animais foram avaliados durante o estudo nas seguintes categorias: observação clinica, peso corporal, temperatura corporal, tomada de alimentos e água, eliminação fecal, guimicas de soro, hematologia, análise da urina e exames físicos. Adicionalmente, os animais em cada grupo foram sangrados nos dias 0, 1, 7 e 13 e o sangue foi analisado para níveis de anticorpo de soro (2B8) e para níveis de célula T e B. No dia 13 os animais dos Grupos III e IV foram sacrificados e os tecidos seleccionados foram examinados por microscopia de luz depois da preparação do espécimen. Os tecidos avaliados foram: coração, baço, fígado, rim, pulmão, córtex cerebral, espinal medula, nodo linfático, estômago, íleo, cólon, músculo-esguelético, testículo/ovário, pâncreas e medula óssea.

Quando o sangue de animais tratados foi analisado para níveis de circulação de células T e B, animais dos grupos II até V exibiram uma perda de >50% de células B circulantes até ao dia 13 (Fig. 19); a administração do anticorpo não teve nenhum efeito nos níveis de célula T (dados não mostrados). Todos os grupos recebendo 2B8 mostraram saturação de células B e excesso de anticorpos no plasma (não mostrado). Os animais no grupo V, gue receberam uma dose de 10,0 mg/kg única de 2B8, também exibiram redução de níveis de circulação de célula B eguivalente ao observado em animais de outros grupos.

Os animais dos grupos I, II e V foram examinados até ao dia 52 (Fig. 20) . Os níveis de células B voltaram a > 70% do normal no dia 38, excepto um animal do Grupo II (PRO804) e um animal do Grupo V (PR0716) . Os níveis de circulação de células B nesses animais permaneceram em aproximadamente 40% dos níveis normais depois de 52 dias.

Além deste estudo, os efeitos farmacotóxicos de 89Y-2B8-MX-DTPA foram avaliados em macacos Cynomolgus num estudo de GLP executado no White Sands Research Center (Estudo n. 920611). O grau clínico do conjugado foi carregado com 89Y não radioactivo. O conjugado portador de ítrio foi formulado em PBS pH 6, 8, contendo 75 mg/ml de albumina sérica humana e 1 mM de DTPA (formulação clinica) e administrado de maneira intravenosa como descrito na secção Métodos.

Como mostrado pelos resultados na Figura 21, o 2B8-MX-DTPA marcado com 89Y teve pouco, se é que teve, efeito na circulação de células B nesses animais, independente da dose administrada. Além disso, a não ser uma depleção geral de linfócitos (20-43%), não foi encontrada nenhuma anormalidade significativa em qualquer parâmetro clínico avaliado, inclusive química sérica, análise de urina, peso corporal e temperaturas.

2. Estudos de Farmacocinética com 2B8 e 2B8-MX-DTPA

Como descrito acima, os animais no grupo V do estudo de GLP receberam uma dose única de 10,0 mg/kg de 2B8. A análise de regressão linear dos dados sugere que o anticorpo nativo foi depurado da circulação desses macacos com um valor ((Sti/2 de aproximadamente 4,5 dias. Num estudo semelhante usando ratos BALB/c, os valores (Pti/2 de 2B8 nativo e conjugado foram determinados por análise de regressão linear (não mostrado) de 8,75 dias (Fig. 22). Estes resultados sugerem que a conjugação de 2B8 não teve efeito na sua depuração ratos BALB/c. 3. Estudos de Biodistribuição e Localização de Tumor com 2Β8- MX-DTPA Radiomarcado

Com base na experiência de biodistribuição preliminar descrita acima (Secção 2d) , o conjugado 2B8 foi radiomarcado com 911Ιη para uma actividade especifica de 2,3 mCi/mg e aproximadamente 1,1 pCi foi injectado em cada um dos vinte ratos BALB/c para determinar a biodistribuição do material radiomarcado. Subsequentemente, grupos de cinco ratos foram sacrificados a 1, 24, 48 e 72 horas e os seus órgãos e uma porção de pele, músculo e osso foram retirados e preparados para análise. Além disso, foram colhidas urina e fezes e analisadas para os momentos em 24-72 horas. 0 nivel de radioactividade no sangue diminuiu de 40,3% da dose injectada por grama em a 1 hora para 18,9% a 72 horas (Tabelas 1-4; Fig. 23) . Os valores para o coração, rim, músculo e baço permaneceram na faixa de 0,7-9,8% durante todo a experiência. Os níveis de radioactividade encontrados nos pulmões diminuíram de 14,2% a 1 hora para 7,6% a 72 horas; do mesmo modo a respectiva dose injectada no fígado por valores de grama foi 10,3% e 9,9%. Esses dados foram usados para determinar as estimativas de de dose de radiação absorvida de ulIn-2B8-MX-DTPA (Tabela 19). A biodistribuição de conjugado marcado com 90Y, com actividade específica de anticorpo 12,2 mCi/mg, foi avaliada em ratos BALB/c. Radioincorporações de> 90% foram obtidas e o anticorpo radiomarcado foi purificado por HPLC. O depósito de radioactividade no tecido foi avaliado nos órgãos principais e na pele, músculo, osso e urina e fezes durante 72 horas e expresso como percentagem de dose injectada/g de tecido. Os resultados mostrados nas Tabelas 5-8 e Figura 24 mostram que enquanto os níveis de radioactividade associada ao sangue diminuiu de aproximadamente 39,2% de dose injectada por grama a 1 hora para aproximadamente 15,4% depois de 72 horas; os níveis de radioactividade associados à cauda, coração, rim, músculo e baço permaneceram regularmente constantes a 10,2% ou menos durante o curso da experiência. Mais importante, a radioact ividade associada ao osso variou de 4,4% da dose injectada por grama de osso a 1 hora para 3,2% a 72 horas. Conjuntamente, esses resultados sugerem que pouco ítrio livre estava associado com o conjugado e que pouco radiometal livre foi liberado durante o curso do estudo. Estes dados foram usados para determinar as estimativas de radiação absorvida para 90Y-2B8-MX-DTPA (Tabela 20).

Para estudos de localização de tumor, 2B8-MX-DTPA foi preparado e radiomarcado com 911In numa actividade específica de 2,7 mCi/mg. Cem microlitros de conjugado marcado (aproximadamente 24 pCi) foram subsequentemente injectados em cada um dos 12 ratos atímicos com tumores Ramos de célula B. Os tumores variavam de peso entre 0,1 a 1,0 gramas. Em dados momentos a 0, 24, 48 e 72 horas depois da injecção, 50 μΐ de sangue foi retirado por punção retro-orbital, os ratos foram sacrificados por deslocação cervical e a cauda, coração, pulmões, fígado, rim, baço, músculo, fémur e o tumor foram retirados. Depois do processamento e pesagem dos tecidos, a radioactividade associada a cada espécimen de tecido foi determinada usando um contador gama e os valores expressos como percentagem de dose injectada por grama.

Os resultados (Fig. 25) demonstram que as concentrações de tumor do 111In-2B8-MX-DTPA aumentaram de forma constante durante todo o curso da experiência. Treze por cento da dose injectada acumulou-se no tumor depois de 72 horas. Os níveis de sangue, por contraste, diminuíram durante a experiência em mais de 30% no tempo zero para 13% a 72 horas. Todos os outros tecidos (excepto músculo) continham entre 1,3 e 6,0% da dose injectada por grama de tecido até no fim da experiência; o tecido do músculo continha aproximadamente 13% da dose injectada por grama. C. Dosimetria O sumário de dados de dosimetria derivou de estudos de biodistribuição em ratos BALB/c normais e apresentado nas Tabelas 19 e 20, para os conjugados marcados com indio e itrio, respectivamente, está de acordo com dados apresentados na literatura quando comparado por milicurie de dose injectada (5) e sugerem que ambos os conjugados de 2B8 marcados com itrio e indio podem ser avaliados com segurança para eficácia clinica em pacientes de linfoma. D. Toxicologia 1. 2B8: Teste de Segurança Geral de Dose Única.

Ratos e porquinhos-da-índia receberam uma dose única intraperitoneal de 2B8 (0,5 ml ou 5,0 ml, respectivamente) e foram observados durante sete dias. Não foi detectado nenhum sinal evidente de toxicidade. 2. 2B8 e 2B8-MX-DTPA: Estudos de Imunohistologia com Tecidos Humanos. A reactividade de tecido do anticorpo monoclonal murino 2B8 foi avaliada usando um painel de 32 tecidos humanos diferentes fixados com acetona. O anticorpo 2B8 reage com o antígeno anti-CD20 que teve um padrão muito restrito de distribuição de tecido, sendo observado apenas num subconjunto de células em tecidos linfóides incluindo os de origem hematopoiética.

No nodo linfático, a imunorreactividade foi observada numa população de linfócitos B corticais maduros bem como sob a forma de células proliferando em centros germinais. A reactividade positiva também foi observada no sangue periférico, áreas de célula B das amígdalas, polpa branca do baço e com 40-70% dos linfócitos medulares encontrados no timo. A reactividade positiva também foi vista nos folículos de lâmina própria (Peyer's Patches) do intestino grosso. Finalmente, as células linfócitas agregadas ou espalhadas no estroma de vários órgãos, inclusive bexiga, peito, cerviz, esófago, pulmão, parótidas, próstata, intestino delgado e estômago, também foram positivas com o anticorpo 2B8.

Todas as células epiteliais simples, bem como os epitélios estratificados e os epitélios escamosos de órgãos diferentes, mostram ser não reactivas. De forma semelhante nenhuma reactividade foi vista com células neuroectodérmicas, inclusive as do cérebro, da espinal medula e nervos periféricos. Elementos mesenquimatosos, tais como células de músculo esqueléticas e lisas, fibroblastoses, células endoteliais e células inflamatórias polimorfonucleares também foram detectados como negativos. A reactividade de tecido do conjugado 2B8-MX-DTPA foi avaliada usando um painel de dezasseis tecidos humanos fixados com acetona. Como anteriormente demonstrado com o anticorpo nativo, o conjugado 2B8-MX-DTPA reconheceu o antígeno CD20 que exibiu um padrão altamente restrito de distribuição, sendo encontrado apenas num subconjunto de células de origem linfóide. No nodo linfático, a imunorreactividade foi observada na população de células B. Foi observada forte reactividade na polpa branca do baço e nos linfócitos medulares do timo. A imunorreactividade também foi observada em linfócitos espalhados na bexiga, coração, intestino grosso, fígado, pulmão e útero e foi atribuída à presença de células inflamatórias presentes nesses tecidos. Como descrito em relação ao anticorpo nativo (acima), não foi observada nenhuma reactividade com células neuroectodérmicas ou com elementos mesenguimatosos. III. Discussão 0 anticorpo anti-CD20 monoclonal murino 2B8, produzido por um clone com a mesma designação, expõe uma afinidade por antígenos CD20 de célula B gue pode ser maior do gue a observada para o anticorpo Bi, como determinado por competição com anticorpos de especificidade conhecida para o antigeno CD20 e por análise de Scatchard. Além disso, dados de imunoprecipitação sugerem gue o antigeno precipitado por 2B8 parece ser o mesmo antigeno precipitado por Bi, já que ambos os anticorpos precipitam um par com pesos moleculares relativos de 33 e 35 KD. A análise citofluorográfica da especificidade do anticorpo 2B8 para linfócitos de sangue periférico demonstra gue o anticorpo reage especif icamente com células B e não tem nenhuma reactividade demonstrada com células T ou outros tipos de linfócitos. Finalmente, dados preliminares de estabilidade sugerem gue o anticorpo seja estável a 30°C durante 12 semanas sem perda de imunorreactividade.

Quando o anticorpo 2B8 foi conjugado ao ácido dietilenotriaminopentacético metil benzil (MX-DTPA), virtualmente não foi observada nenhuma redução de imunorreactividade relativa ao anticorpo nativo. Além disso, a radiomarcação do conjugado guer com inIn ou 90Y produziu conjugados marcados com imunorreactividades de 100% e 60%, respectivamente. Estudos de estabilidade dos conjugados marcados com 911In ou 90Y incubados em soro humano durante 96 horas a 37 °C indicaram a perda mínima de radiometal durante o curso do estudo, sugerindo gue os conjugados serão estáveis quando usados clinicamente.

Os estudos de localização de tumor em ratos atímicos usando uma preparação de 2B8-MX-DTPA marcado com índio mostraram que quantidades crescentes de conjugado se prendem às células de tumor durante o curso da experiência sem acumulações excepcionais em outros tecidos. Além disso, estimativas de dosimetria derivadas de estudos de biodistribuição estão de acordo com dados publicados na literatura. Finalmente, estudos de reactividade cruzada de tecido humano com anticorpos nativos e conjugados indicaram que ambos os anticorpos reconhecem um antigeno com distribuição de tecido altamente restrito, reagindo apenas ao subconjunto de células em tecidos linfóides, inclusive os de origem hematopoiética. Juntos, esses resultados sugerem que a conjugação não alterou a especificidade de tecido do anticorpo e que os conjugados radiomarcados são estáveis in vivo e reconhecem o antigeno CD20 presente na superfície de tumores produzidos experimentalmente em ratos atímicos.

Quando 2B8 foi usado num estudo de farmacologia/toxicologia de dose elevada, o anticorpo não produziu efeitos farmacotóxicos significativos em qualquer parâmetro avaliado, durante ou a seguir ao estudo. Da mesma forma não se observaram nenhumas anormalidades durante a análise de vários espécimes de histopatologia examinados por microscopia de luz. Surpreendentemente, todas as doses de anticorpo usadas produziram a depleção marcada de células B circulantes. No entanto, os níveis de circulação de célula B voltaram a níveis aproximadamente normais, assim que a administração do anticorpo cessou. No grupo de dose única de macacos (Grupo V) o anticorpo nativo foi depurado da circulação com um valor aparente β ti/2 de aproximadamente 4,5 dias. Previsivelmente, quando este estudo de farmacocinética foi executado em ratos BALB/c o anticorpo 2B8 foi depurado com um valor β t!/2 de 8,75 dias. Assim, conjuntamente, estes dados sugerem que o anticorpo nativo também pode fornecer algum efeito clínico quando administrado como suplemento aos conjugados radiomarcados.

Em geral nossos dados indicam que a alta afinidade do anticorpo 2B8 e do seu conjugado MX-DTPA exibem um padrão restrito de reactividade de tecido humano. Aliás, em primatas, o anticorpo nativo é não tóxico e produz uma depuração transitória de células B; contudo, uma vez que o anticorpo é depurado da circulação, os níveis de Célula B voltam de forma razoavelmente rápida. Além disso, os conjugados 2B8-MX-DTPA marcados com índio e ítrio parecem estáveis in vitro, exibindo nenhuma perda de radiometal durante a incubação prolongada em soro humano. Finalmente, estimativas de dose de radiação derivadas da biodistribuição de 2B8-MX-DTPA marcados com 911In ou 90Y em ratos BALB/c concordam, por milicurie de dose injectada, com as estimativas de dose derivadas de estudos clínicos humanos usando anticorpos conjugados idiótipos anti-compartilhados radiomarcados com estes isótopos.

IV. RESUMO DE DESENVOLVIMENTO PRÉ-CLÍNICO DE PROTOCOLO "MISTURAR-E-INJECTAR" DE RADIOMARCAÇÃO PARA PREPARAÇÃO DE 90Y-2B8-MX-DTPA A. Introdução

Um anticorpo monoclonal murino anti-CD20 (2B8) marcado com 90Y foi avaliado num ensaio clinico de Fase I para o tratamento de linfoma de célula B recaído. 0 protocolo original usado para a preparação do anticorpo marcado com ítrio usou uma etapa de cromatograf ia líquida de alto desempenho (HPLC) para a remoção do radioisótopo sem ligação a proteínas, antes da formulação e administração a pacientes. Infelizmente, este processo é particularmente moroso, causando uma exposição mais longa do anticorpo ao radioisótopo num estado desprotegido. Isto causa uma radiólose aumentada do anticorpo com uma redução concomitante de imunorreactividade. Adicionalmente, o aspecto trabalhoso do processo torna difícil preparar mais de uma dose por dia na radiof armácia. A simplificação do processo apressaria a implementação nos locais clínicos como uma alternativa ao uso dos Serviços de Farmácia NIPI como uma radiofarmácia.

Consequentemente foi desenvolvido um procedimento de radiomarcação revisado, chamado método de "misturar-e-injectar", que remove a necessidade de purificação de HPLC mantendo uma alta radioincorporação e melhor retenção de imunorreactividade. Estudos de estabilidade in vitro bem como estudos de biodistribuição em ratos mostraram que anticorpos radiomarcados preparados usando o método de "misturar-e- injectar" são comparáveis ao material produzido usando o processo HPLC actual. Os resultados destes estudos pré- clínicos indicam que este novo protocolo "misturar-e-injectar" pode ser usado para preparar 2B8-MX-DTPA marcado com 90Y adequado para uso em ensaios clínicos. B. Materiais e Métodos

Materiais 1. Células

As linhas celulares SB linfoblásticas humanas (CD20 positivo) e HSB (CD20 negativo) foram obtidas da American Type Culture Collection e mantidas em RPMI-1640 contendo soro bovino fetal a 10% e complementado com glutamina. 2. Anticorpos O anticorpo 2B8 foi purificado pelo departamento de Fabricação de sobrenadante de bioreactor de fibras ocas usando protocolos anteriormente descritos no IND (BB-IND 4850/4851) 3. Reagentes Adicionais

Cloreto de itrio-[90] foi obtido de Amersham. Todos os outros reagentes foram obtidos de fontes descritas nos relatórios anexos citados abaixo. Os reagentes usados para protocolos de radiomarcação foram processados para retirar a contaminação de iões de metal pesado que podem competir com os radioisótopos durante a etapa de radiomarcação (ver a secção de Métodos). Os reagentes foram feitos sob condições de GMP pelo departamento de Fabricação da IDEC's segundo os Registos de Produção de Lote estabelecidos. Métodos

1. Preparação de 2B8-D4X-DTPA O MX-DTPA de grau clinico foi obtido da Coulter lmmunology, como o sal dissódico em água e armazenado a -70°C. O conjugado (2B8-MX-DTPA) foi preparado pelo departamento de

Fabricação. Dois lotes diferentes de conjugados foram usados nestes estudos; ambos foram armazenados em solução salina normal a 10 mg/ml. Os conjugados foram introduzidos em seringas de 2 ml estéreis de polipropileno e armazenados a 2-8 2C. 2. Manutenção de Condições Isentas de Metal

Todas as manipulações de reagentes foram realizadas para minimizar a possibilidade de contaminação por metal. Foram usados recipientes de plástico de polipropileno ou polistireno, tais como frascos, provetas e cilindros graduados. Estes foram lavados com Alconox e exaustivamente enxaguados com água Milli-Q ou Água para Irrigação (Wflr), antes do uso. Pontas de pipeta isentas de metal (BioRad) foram usadas para manipular pequenos volumes com precisão. Volumes maiores de reagentes foram manipulados usando pipetas serológicas estéreis plásticas. As reacções foram executadas de forma adequada em tubos de 1,8 ml de topo roscado de polipropileno para microcentrifuga. 3. Determinação de Radioincorporação A radioincorporação foi determinada usando a cromatografia de camada fina imediata (ITLC) em triplicado segundo o SOP SP-13-008. Em geral, o protocolo foi como se segue: o conjugado radiomarcado foi diluído 1:20 em IX PBS contendo 1 mM de DTPA ou 5 mM de EDTA, então 1 traçado μ-L de 1.5 cm de uma extremidade de uma tira de 1 x 5 cm de papel ITLC SG (Gelman Sciences). O papel foi desenvolvido usando 10% de acetato de amónio em metanol: água (1:1; v/v) . As tiras foram secadas, cortadas ao meio transversalmente e a radioactividade associada a cada secção foi determinada por contagem de cintilação. A radioactividade associada à metade de baixo da tira (radioactividade associada por proteína) foi expressa como uma percentagem da radioactividade total, determinada somando os valores das metades de cima e de baixo. 4. Protocolo "misturar-e-injectar" para 2B8-MX-DTPA marcado com ítrio-[90]

Os anticorpos foram radiomarcados com cloreto de ítrio 90Y sem transportador fornecido por Amersham em 0,04 M HCI. Uma parte do radioisótopo (anticorpo 10-20 mCi/mg) foi transferida para um tubo de polipropileno e 0,02X o volume de acetato de sódio de 2 M isento de metal foi acrescentado para ajustar a solução para pH 3,6. 2B8-NaDTPA (0,3 mg; 10,0 mg/ml em solução salina normal) foi acrescentado imediatamente e a solução foi misturada suavemente. A solução foi verificada com papel de pH para verificar um pH de 3,8-4,1 e incubada durante 5 minutos. A reacção foi extinta transferindo a mistura de reacção para um tubo de polipropileno separado contendo 1XPBS com 75 mg/ml de albumina sérica humana (HSA) e mM de ácido dietilenotriaminapentacético (DTPA) e misturado suavemente. O anticorpo radiomarcado foi armazenado a 2-8°C.

As actividades específicas foram determinadas medindo a radioactividade de uma alíguota apropriada do conjugado radiomarcado. Este valor foi corrigido para a contra eficiência, relacionada com a concentração de proteína do conjugado, determinada por absorbância a 280 nm e expressa como mCi/mg de proteínas.

5. Imunorreactividade In Vitro de ítrio-[90]-2B8-MX-DTPA A imunorreactividade de conjugado marcado com 90Y foi determinada usando SOP #SP13-009 com base numa versão modificada do ensaio de ligação de célula inteira descrito por Lindmo. Aumentando as concentrações de fase de registo, células SB CD20-positivas ou células HSB CD20-negativas foram acrescentadas a conjuntos duplicados de tubos de polipropileno de 1,5 ml; volume final de células, 0,40 ml. O conjugado radiomarcado foi diluído para uma concentração final de anticorpo de 1-2,5 ng/ml e 0,35 ml foi acrescentado a cada tubo. Depois de uma incubação de 90 minutos, as células foram peletizadas por centrifugação e o sobrenadante foi colhido. A radioactividade restante na fracção sobrenadante foi determinada com um contador de cintilação. Os dados foram traçados como o guociente de radioactividade total acrescentada dividido pela radioactividade associada por célula, contra o inverso do número de células por tubo. O intercepto no eixo y representa a fracção de imunorreactividade. 6. Estabilidade In Vitro de ítrio-[90]-2B8-MX-DTPA Clinicamente Formulado O conjugado 2B8-MX-DTPA foi radiomarcado com 90Y e formulado como descrito no protocolo "misturar-e-injectar" fornecido acima. Dois lotes de conjugados radiomarcados foram preparados; um lote foi usado para avaliar a estabilidade de radioincorporação e o outro lote foi usado para avaliar a retenção de imunorreactividade. Os conjugados formulados foram incubados a 4°C durante 48 horas e alíguotas foram analisadas nos momentos 0, 24 h e 48 horas usando SDS-PAGE não redutor e auto-radiografia. A imunorreactividade em cada ponto foi avaliada usando o ensaio descrito acima. 7. Estabilidade In Vitro de ítrio-[90]-2B8-NTX-DTPA em

Soro Humano A estabilidade de 2B8-MX-DTPA marcado com 90Y foi avaliada pela incubação em soro humano a 37 °C até 72 horas. 0 anticorpo conjugado foi radiomarcado com itrio-[90] e formulado como descrito acima. 0 conjugado radiomarcado foi diluído a 1:10 com soro humano normal (não inactivado com calor) e alíquotas incubadas em tubos plásticos a 37 °C. Em momentos seleccionados, as amostras foram retiradas e analisadas por SDS-PAGE não redutor e auto-radiografia.

8 . Biodistribuição de ítrio-[ 90 ]-2B8-MX-DTPA O 2B8-MX-DTPA marcado com ítrio-[90] foi avaliado para biodistribuição de tecido em ratos BALB/c de oito a dez semanas de idade. O conjugado radiomarcado foi preparado e formulado como descrito acima. Os ratos foram injectados intravenosamente com 5pCi de 2B8-MX-DTPA com marcador 90Y e grupos de cinco ratos foram sacrificados a 1, 24, 48, e 72 horas. Depois do sacrifício a cauda, coração, pulmões, fígado, rim, baço, músculo e fémur foram extraídos, lavados e pesados; uma amostra de sangue também foi colhida para análise. A radioactividade associada a cada amostra de tecido foi determinada medindo a radiação bremstrahlung usando um contador gama e a percentagem de dose injectada por grama de tecido e percentagem de dose injectada por órgão determinado. 9. Dosimetria

Dados de biodistribuição obtidos usando ratos injectados com 2B8-MX-DTPA marcado com 90Y foram usados para calcular estimativas das doses de radiação absorvidas de uma dose de mCi administrada a um paciente de 70 kg. As estimativas foram feitas segundo os métodos adoptados pelo Medicai Internai Radiation Dose (MIRD) Committee of the Society of Nuclear Medecine. Estes cálculos foram executados por Phillip Hagan, Nuclear Medecine Service, VA Medicai Center, La Jolla, CA 92161.

10. Validação do Protocolo de Preparação de Doses Clinicas de ítrio-[90]-2B8-MX-DTPA (Relatório de referência de R&amp;D intitulado "Validação de Protocolo "Misturar-e-Injectar" de Radiomarcação para a Preparação de Doses Clinicas de 90Y-2B8-MX-DTPA"; autor, P. Chinn; data de 22 de Abril de 1994). C. Resultados 1. Preparação de 2B8-MX-DTPA Marcado com ítrio-[90] Usando o Protocolo "Misturar-e-Injectar"

Experiências preliminares avaliando a cinética da reacção de radiomarcação com 2B8-MX-DTPA e 90Y mostraram que ao pH 3,6- 4,0, 95% do radioisótopo foi incorporado durante um tempo de reacção de 5 a 10 minutos. A reprodut ibilidade desta radioincorporação (95,7% ± 1,7%) foi subsequentemente confirmada num estudo de validação do protocolo de escala (Relatório de referência de R&amp;D, intitulado "Validação do Protocolo "Misturar-e-Injectar" de Radiomarcação para a Preparação de Doses Clínicas de 90Y-2B8-MX-DTPA"; autor, P. Chinn; data de 22 de Abril de 1994) . A preparação de 2B8-MX- DTPA marcado com 90Y usando este protocolo "misturar-e-injectar" deu um produto comparável ao produzido com o método HPLC (ver BB-IND 4850/4851) . O protocolo de radiomarcação mostrou ser reprodutível com actividades específicas tipicamente nos limites de 10 a 15 mCi/mg de anticorpo . A imunorreactividade de 2B8-MX-DTPA marcado com 90Y preparado usando este protocolo foi tipicamente superior a 70%, comparado com os 55-60% observados para as validações feitas para o protocolo HPLC (Figura 26) . Esta diferença provavelmente deve-se aos efeitos reduzidos de radiólise por causa do tempo de incubação reduzido do protocolo "misturar- e-injectar". Este resultado foi típico e, como discutido abaixo, foi representativo das operações de validação de escala de protocolo para preparar doses clínicas do conjugado radiomarcado.

2. Estabilidade In Vitro de 2B8-MX-DTPA Marcado com 9C1Y

Experiências preliminares com conjugado anticorpo desprotegido marcado com 90Y preparado usando o processo HPLC mostraram que a radiólise causou a degradação significativa do anticorpo e a perda de imunorreactividade. Por isso, foi desenvolvido um tampão de formulação para minimizar os efeitos de radiólise. A albumina sérica humana (HSA) mostrou ser eficaz na redução ao mínimo de degradação do anticorpo devida a radiólise. Uma avaliação foi feita com o conjugado radiomarcado preparado com o método de "misturar-e-injectar" para confirmar a eficácia da formulação na redução da radiólise ao mínimo. O anticorpo marcado com 90Y, radiomarcado para uma actividade específica de 14,5 mCi/mg anticorpo, foi formulado em IX PBS, pH 7,4 contendo 7 5 mg/ml de HSA e 1 mM de DTPA. A degradação do conjugado 2B8-MX-DTPA foi avaliada a 24 e 48 horas usando SDS-PAGE e auto-radiografia. As figuras 2, 3 e 4 mostram que o conjugado radiomarcado não exibiu nenhuma degradação significativa num período de 48 h quando incubado a 4 2C. A análise de cromatografia de camada fina

imediata não mostrou nenhuma perda de 90Y durante a incubação de 48 h; esses resultados foram corroborados pela análise SDS-PAGE/auto-radiográfica (Tabela 28). A imunorreactividade também foi relativamente constante a > 88% (Tabela 29).

Tabela 28

Estabilidade de "Misturar-e-lnjectar" 90Y-2B8-MX-DTPA em PBS

Contendo Albumina Sérica Humana e DTPA

Percentagem de conjugados-Radioactividade associada

Tempo (h) ITLC SDS/PÁGINA 0 92, 9 96,0 24 95,5 95,4 48 91,3 94,6

Tabela 29

Imunorreactividade de "Misturar-e-Injectar" 90Y-2B8-MX-DTPA em PBS Contendo Albumina Sérica Humana e DTPA

Percentagem

Tempo (Horas a 4 aC) Imunoreactividade ~Õ 87, 9 24 88,5 48 90,4

Um 2B8-MX-DTPA marcado com 90Y clinicamente formulado a uma actividade especifica de 15,7 mCi/mg foi incubado durante 72 horas em 37 °C em soro humano. As amostras analisadas por SDS-PAGE não redutor e auto-radiografia (Figura 30) não mostraram perda de radioisótopo durante o curso do período de incubação (Tabela 30). Varreduras densiométricas dos autoradiogramas no tempo zero e 72 h não indicaram nenhuma degradação significativa do conjugado radiomarcado (Figuras 31 e 32) . Estes resultados foram corroborados pelas análises cromatográficas de camada fina (Tabela 30) . Deve ser observado que a radioincorporação do anticorpo usado neste estudo foi mais baixa do que a obtida nos estudos de validação de protocolo de marcação. Esta incorporação de rádio mais baixa deveu-se à qualidade reduzida do lote de cloreto 90Y, usado para esta preparação especifica de anticorpo radiomarcado. A radioincorporação mais baixa não alterou a conclusão de que o conjugado marcado com itrio preparado com o método de "misturar-e-injectar" é estável sob estas condições de incubação.

Tabela 30

Estabilidade do Conjugado 90Y-2B8-MX-DTPA Incubado em Soro Humano

Percentagem de Conjugado

Tempo (Horas a 37 2C) associado de radioactividade ITLC SDS- PÁGINA/Autoradiografia 0 85,7 88,8 24 76,4 90,0 72 87,6 88,7

Amostras de soro humano contendo 90Y-2B8-MX-DTPA (actividade especifica de 15,7 mCi/mg) foram analisadas para 90Y nas vezes mostradas usando tiras de cromatografia de camadas finas instantâneas e SDS-PÁGINA/Autoradiografia.

3. Estudos de Biodistribuição com itrio-[90] 2B8-MX-DTPA

A biodistribuição do conjugado marcado com 90Y, com uma actividade específica de anticorpo 11,5 mCi/mg e uma radioincorporação de > 95% foi avaliada em ratos BALB/c. 0 depósito de radioactividade nos tecidos foi avaliado nos órgãos principais, pele, músculo, osso, urina e fezes durante 72 horas e expresso como percentagem de dose injectada por gr de tecido e como percentagem de dose injectada por órgão. Os resultados mostrados nas Tabelas 31-34 e Figura 33 mostram que os níveis da radioactividade associados ao sangue diminuíram aproximadamente em 43% de dose injectada por grama (% ID/g) a 1 hora para aproximadamente 16% depois de 72 horas; a 24 h e depois, os níveis de radioactividade associada ao coração, rim e baço permaneceram regularmente constantes a 4-8%. Para os pulmões e fígado, a radioactividade diminuiu de 10-12% a 1 h para 8%—10% a 72 h. Para a pele, a radioact ividade foi relativamente constante em aproximadamente 3% de 24 h até 72 h. A radioactividade no trato gastrointestinal foi constante em 0,5-1% de 24 h a 72 A radioactividade do músculo permaneceu aproximadamente 6% durante todo o curso de estudo. A absorção da radioactividade pelo fémur (osso) permaneceu abaixo de 4% em todos os momentos, indicando que a quantidade de ítrio livre na preparação do conjugado era insignificante e que pouco radiometal livre foi liberado durante o curso do estudo.

Tabela 31

N2 de ratos = 3

Peso médio = 19,58 gramas ± 0,71 grama

Tabela 32

Distribuição de Actividade 24 Horas após Injecção IV de 90Y 2B8-MX-DTPA em Ratos BALB/c Normais

Valores: Médios ± DP

N2 de ratos = 3

Peso médio = 22,09 gramas ± 1,73 grama

Tabela 33

Distribuição de Actividade 48 Horas após Injecção IV. de 9θγ—2B8—MX—DTPA em Ratos BALB/c Normais

Valores Médios ± DP

N2 de ratos = 3

Peso médio = 21,48 gramas ± 2,05 gramas

Tabela 34

Distribuição de Actividade 72 Horas após Injecção IV. de 9θγ—2B8—MX—DTPA em Ratos BALB/c Normais

Valores Médios ± DP

N2 de ratos = 3

Peso médio = 20,76 gramas ± 0,97 gramas

As doses de radiação absorvidas para um ser humano de 70 kg "padrão" calculadas para o conjugado marcado com 90Y usando os dados de biodistribuição de rato (valores de %ID/órgão nas Tabelas 31-34) são apresentadas na Tabela 35. Esses resultados são comparáveis a resultados obtidos anteriormente usando 2B8-MX-DTPA marcado com 90Y preparado com o método HPLC de radiomarcação.

Tabela 35

Estimativas de Dosimetria Administração de 2B8-MX de Radiação Resultantes da Marcado com ítrio-[90] Uniformemente Distribuída em Meio Padrão (70kg) e Baseado em Dados de Distribuição de Dados Durante 72 Horas Após Injecção

5. Validação do Protocolo de Preparação de Doses Clínicas de ítrio-[90]-2B8-MX-DTPA

Um número total de dez lotes de validação foi preparado em MPI Pharmacy Services, Inc. Os resultados do teste em cada lote estão resumidos na Tabela 36. O valor médio de cada resultado de teste foi calculado e os desvios padrão foram observados onde apropriado. Para avaliar a variabilidade do processo devido a momentos de marcação diferentes, o lote η2 1 até ao n2 8 foram preparados usando um tempo de marcação de 10 minutos; o lote n2 9 e o n2 10 foram preparados usando um tempo de reacção de 5 minutos. Com base nos resultados do teste para os dez lotes de validação, foram estabelecidas as especificações para divulgação. As especificações para divulgação estão resumidas na Tabela 37.

Tabela 37

Especificações de Divulgação para 2B8-MX-DTPA Marcado com 90 Y Preparado Usando o Protocolo "Misturar-e-Injectar"

D. Discussão

0 protocolo original de radiomarcação para preparar 2B8-MX-DTPA marcado com 90Y usava uma etapa de purificação HPLC particularmente moroso e trabalhoso para retirar a não-proteína ligada ao 90Y da preparação. Para simplificar este processo e torná-lo mais receptivo para uso no local clínico, foram envidados esforços para eliminar a etapa de HPLC a favor do que foi denominado um protocolo de "misturar-e-injectar". 0 objectivo foi identificar condições de radiomarcação que resultariam numa radioincorporação muito elevada do isótopo no conjugado, obviando assim a necessidade da etapa de purificação. Foi descoberto que >95% de radioincorporação pode obter-se a pH 3,6 com uma incubação de cinco a dez minutos. Um beneficio adicional deste protocolo foi a maior retenção de imunorreactividade (> 70%), presumivelmente devido ao tempo de exposição mais curto do anticorpo ao radioisótopo de alta energia antes da adição de albumina sérica humana que fornece protecção contra radiólise. Esta retenção de imunorreactividade é superior à observada anteriormente usando o método de HPLC.

Estudos de estabilidade com o conjugado marcado com 90Y preparado usando o protocolo de "misturar-e-injectar" incubado em tampão de formulação (1XPBS contendo 75 mg/ml de albumina sérica humana e 1 mM de DTPA) até 48 h a 4 2C não mostrou perda de radioisótopo e retenção completa de imunorreactividade. Estudos de estabilidade conduzidos com soro humano durante 72 horas a 37°C também indicaram perda mínima de radioisótopo. Estes resultados de estabilidade são comparáveis aos anteriormente observados com conjugado A biodistribuição em ratos BALB/c usando conjugado marcado com 90Y preparado com o método de "misturar-e-injectar" não indicou nenhum depósito de tecido invulgar. Estes resultados sugeriram que o anticorpo radiomarcado não foi alterado significativamente, de modo a afectar dramaticamente as características in vivo do anticorpo. Estes resultados também são comparáveis aos obtidos anteriormente usando o conjugado radiomarcado preparado usando o método HPLC de radiomarcação (ver BB-IND 4850/4851) . As estimativas de dosimetria para um ser humano de 70 kg "padrão" calculadas a partir dos dados de biodistribuição de ratos estão de acordo com as obtidas com conjugado radiomarcado usando o procedimento HPLC (ver BB-IND 4850/4851). Adicionalmente, os resultados de dosimetria são comparáveis a resultados obtidos para pacientesregistados num ensaio clínico em curso (estudo de IDEC no. 1315), quando comparado por milicurie de dose injectada. Para seis pacientes no estudo, os valores médios (rads ± DP) para o corpo inteiro, coração, fígado e baço foram de 1,40 ± 0,57, 10,50 ± 4,68, 9,89 ± 8,91 e 9,75 ± 6,00, respectivamente.

Antes de implementar o protocolo de marcação "misturar-e-injectar" para preparar o grau clínico de 90Y-2B8-MX-DTPA, foi necessário avaliar a capacidade de reprodutibilidade do protocolo. Por conseguinte, foram preparados dez lotes de validação usando diferentes lotes de cloreto de ítrio 90Y. Para os dez lotes preparados, os valores de imunorreactividade obtidos usando o método de "misturar-e-injectar" estiveram entre 60,6% e 93,3% com uma média de 74,5% e um valor mediano de 72,1%. Esta retenção de imunorreactividade é significativamente melhor do que a de aproximadamente 60% anteriormente obtida usando o método de HPLC actual (faixa de 54,9% a 65,1%; valor mediano de 60,2%). A radioincorporação média para os dez lotes foi de 95,7% (faixa de 93,5% a 97,5%). Este valor é comparável ao anteriormente observado com o método de HPLC (faixa de 91,7% a 93,7% e valor mediano de 93,1%) . Além disso, os resultados de endotoxina, concentração de anticorpo, concentração de radioactividade, actividade específica, radioactividade total de frasco, concentração total de proteína, pH e esterilidade foram comparáveis para os dez lotes. Conjuntamente, estes resultados confirmaram a reprodutibilidade do método de "misturar-e-injectar". Além do mais, avaliámos a variabilidade do processo devido a diferentes tempos de marcação executando reacções durante 5 e 10 minutos. Como não se observaram nenhumas diferenças significativas para os dois tempos de reacção, foi decidido que o tempo de incubação mais curto seria usado no protocolo final. E. Sumário

Desenvolvemos um procedimento de marcação, chamado método de "misturar-e-injectar", para a preparação de doses clínicas de 2B8-MX-DTPA marcado com 90Y removendo a necessidade da etapa actualmente usada de cromatografia liquida de alto desempenho (HPLC) para retirar o radioisótopo não ligado a proteína. 0 protocolo simplificado elimina esta trabalhosa etapa de purificação mantendo um alto nível de incorporação de radioisótopo (> 95%) e melhora a retenção de imunorreactividade (> 70%) . O conjugado radiomarcado clinicamente formulado foi descoberto como estável in vitro quando incubado a 4 2C durante 48 horas com base na retenção do radioisótopo e imunorreactividade. Adicionalmente, o conjugado radiomarcado era estável quando incubado no soro humano a 31 °C durante 72 horas. Os estudos de biodistribuição em ratos BALB/c não demonstraram nenhum depósito de tecido invulgar, inclusive no osso. Estimativas de doses absorvidas de radiação para um ser humano de 70 kg "padrão" foram comparáveis às obtidas num ensaio clínico em curso usando 2B8-MX-DTPA marcado com 90Y. Os resultados destes estudos mostraram que o 2B8-MX-DTPA marcado com 90Y produzido usando o protocolo de "misturar-e-injectar" era comparável ao preparado usando o processo de HPLC convencional. A validação de escala do protocolo para preparar o grau clínico de conjugado radiomarcado mostrou que o método era reprodutível e que o produto era comparável ao produzido usando o método de HPLC actual. Os resultados destes estudos pré-clínicos indicam que este novo protocolo de "misturar-e-injectar" pode ser usado para preparar 2B8-MX-DTPA marcado com 90Y adequado para uso em ensaios clínicos.

Descrição Detalhada

Exemplo 1. Radioincorporação - Kits e Análises I. Sumário

Um objectivo da presente divulgação foi conceber protocolos de kits de radiomarcação para preparação de 2B8-MX-DTPA marcado com niIn e 90Y (In2B8 e Y2B8, respectivamente) e estabelecer especificações de divulgação de produtos clínicos. Os protocolos dos kits de radiomarcação são reprodutíveis em relação à radioincorporação e ligação a células SB de antígeno positivo e indicam a adeguação do kit de radiomarcação para uso em ensaios clínicos. Recomenda-se gue as especificações de divulgação de In2B8 e Y2B8 para radioincorporação e ligação sejam estabelecidas a >95% e >70%, respectivamente. II. Introdução

Um anticorpo monoclonal murino anti-CD20 marcado com 90Y (Y2B8) está a ser actualmente avaliado em ensaios clínicos para o tratamento de linfoma reincidente de célula B. O isótopo ítrio não tem um componente gama o gue o torna indesejável para sistemas de imagem. Por isso, o 2B8-MX-DTPA (In2B8) marcado com 911In será usado para avaliar a localização do tumor e a dosimetria em pacientes antes ou depois do tratamento com o terapêutico marcado com ítrio. Os protocolos usados actualmente para a preparação de Y2B8 e In2B8, chamados métodos de "misturar-e-injectar", produzem anticorpos radiomarcados adeguados para estudos clínicos. Contudo, a simplificação do processo de marcação aceleraria a preparação da dose num local clínico. 0 novo kit de radiomarcação é de preferência composto por quatro componentes: 1.) 2B8-MX-DTPA em solução salina normal de baixo teor de metal a 2 mg/ml, 2.) 50 mM de acetato de sódio usado para ajustar a solução de radioisótopo para marcação de pH apropriada, 3.) tampão de formulação (IX PBS, pH 7,4 contendo 7,5% de albumina sérica humana e 1 mM de DTPA) , 4.) frasco de vidro vazio de 10 ml (frasco de reacção). Todos os componentes são testados para serem estéreis e apirogénicos.

Este relatório resume a validação deste kit de radiomarcação simples e fácil de usar e que produz anticorpos radiomarcados com>95% de radioincorporação e retenção aceitável de ligação a células de antígeno positivo. Recomendam-se as especificações de divulgação de teste para os produtos clínicos. III. Materiais e Métodos para Radioincorporação A. Reagentes no Kit de Radiomarcação 1. 2B8-MX-DTPA, IDEC; Lote no. 082395RM2 2. 50 mM de Acetato de Sódio, de baixo teor de metal, IDEC; Lote no. 082395RM3 3. Tampão de formulação (IX PBS, pH 7,4 contendo 7,5% (p/v) de albumina sérica humana e lmM de DTPA), IDEC, Lote no. 082395RM1

4. Frasco de reacção, 10 ml, IDEC B. Materiais e Equipamento 1. Kit de Radioincorporação Biodex Tec-Control, Cat: no. 151-770 2. Luvas : sem pó 3. Seringas de polipropileno estéreis 4. Agulhas de seringa estéreis 5. Pequenos tubos com tampa; 1,5 ml C. Métodos 1. Preparação de Y2B8 e In2b8 Usando o Kit de Radiomarcação

Os reagentes do kit foram preparados e introduzidos em frascos de vidro com septo. Frascos tipo I de borosilicato (2 ou 10 ml) foram enxaguados com água estérill para injecção (WFI) e passaram por autoclave antes do enchimento. Os septos de borracha de butilo foram enxaguados com WFI estéril e passaram por autoclave antes do uso. Os reagentes foram manualmente enchidos e dobrados numa sala de Classe 100 e testados para pirogenicidade e esterilidade usando métodos de USP. a. Preparação de In2B8

Reagentes Adicionais: indio-[lll]: cloreto de sódio, sem transportador, em HCI.

Precauções: 1. De preferência, todos as etapas são executadas usando técnicas assépticas. 2. Deve permitir-se que os componentes do kit de radiomarcação estejam à temperatura ambiente antes do uso. 3. O produto final deve ser administrado ao paciente dentro de 8 horas depois de concluir-se a etapa 9 abaixo.

Protocolo de radiomarcação de In2B8

Procedimento 0 volume de 111InCl3 para acrescentar ao frasco de reacção foi calculado como se segue: a. Concentração de radioactividade no momento de radiomarcação em mCi/mi: Co= Concentração de radioactividade no momento da calibragem (ver Certificado de Análise do fabricante).

At = Modificação no tempo (número positivo é pós-calibragem, número negativo é pré-calibragem).

Concentração de Radioactividade no momento de marcação = Co e0.0103 (At) b. Volume de 111InC13 para acrescentar ao frasco de reacção: 5.5mCi_= Volume a acrescentar ao frasco de reacção

Concentração de Radioactividade no momento de marcação 2. 0 volume de acetato de sódio de 50 mM a ser acrescentado ao frasco de reacção foi calculado como se segue:

Volume de ulInC13 acrescentado (Etapa lb) X (1.2) = -

Volume de 50 mM de acetato de sódio a ser acrescentado.

3. Os septos do frasco de reacção e o frasco de 50 mM de acetato de sódio foram esfregados com álcool. Usando uma seringa de 1 centímetro cúbico, o volume calculado de 50 mM de acetato de sódio (Etapa 2) foi transferido para o frasco de reacção. 4. septo de 111lnCÍ3 fonte foi esfregado com álcool. 0 frasco foi retirado com uma agulha ajustada com filtro estéril 0.2. Usando uma seringa esterilizada 1 centímetro cúbico, o volume necessário (Etapa lb) de 111InC13 foi transferido para o frasco de reacção. O frasco foi misturado invertendo-se várias vezes. 5. O septo do frasco de 2B8-MX-DTPA foi esfregado com álcool. Usando uma seringa de 1 centímetro cúbico, 1,0 ml de 2B8-MX-DTPA foi lentamente transferido para o frasco de reacção. O frasco foi misturado invertendo-se várias vezes. 6. Permitiu-se que a reacção continuasse durante 30 minutos ± 5 minutos à temperatura ambiente. 7. O volume total da mistura de reacção foi calculado acrescentando o volume de 111InCÍ3 acrescentado (Etapa 4), o volume de 50 mM de acetato de sódio acrescentado (Etapa 3) e o volume de 2B8-MX-DTPA acrescentado (Etapa 5). 8. O volume do tampão de formulação para acrescentar ao frasco de reacção para obter um volume final de 10 ml foi calculado subtraindo a soma total calculada na etapa 7 de 10 . 9. O frasco do tampão de formulação foi esfregado com álcool e o frasco foi retirado. Devido à viscosidade do tampão de formulação, o frasco de reacção foi retirado usando uma agulha ajustada com um filtro de seringa de 2 pm. Usando uma seringa esterilizada de 10 centímetros cúbicos ajustada com uma agulha de calibre apropriado, o volume do tampão de formulação calculado na etapa 8 foi transferido para o frasco de reacção. A agulha de abertura foi retirada do frasco de reacção e o frasco foi misturado invertendo-se várias vezes (Produto Final). Este frasco foi incubado pelo menos 5 minutos antes da realização do "Ensaio de Radioincorporação". A cor da solução era âmbar e o frasco estava cheio, confirmando que o tampão de formulação fora acrescentada. 10. A radioactividade total do frasco de Produto Final foi medida usando o conjunto de instrumentação apropriado para medição de 111In. 11. Produto Final foi armazenado imediatamente a 2-8 2C para "Ensaio de Ligação" e "Ensaio de Radioincorporação". c. Preparação de Y2B8 Reagentes Adicionais: 1. ítrio-[90]: cloreto de sódio, sem transportador, em HCI.

Precauções: 1. Todas as etapas devem ser executadas usando técnica asséptica. 2. Deve permitir-se que componentes do conjunto de radiomarcação estejam à temperatura ambiente antes do uso. 3. O produto deve ser administrado ao paciente dentro de 8 horas depois de concluir-se a etapa 8 abaixo.

Protocolo de radiomarcação do Y2B8 1. O volume de 9OYC13 para acrescentar ao frasco de reacção foi calculado como se segue: a. concentração de radioactividade no momento da radiomarcação:

Co = Concentração de radioactividade no momento de calibragem (ver o Certificado de Análise do fabricante).

At = Modificação no tempo (o número positivo é pós-calibragem, o número negativo é pré- calibragem).

Concentração de Radioactividade no momento de marcação = Co e0,0103(At) b. O volume de 90YC13 para acrescentar ao frasco de reacção: 4 5 mCi_= Volume acrescentado ao frasco de reacção

Concentração de Radioactividade no momento de marcação 2. O volume de acetato de sódio de 50 mM a acrescentar ao frasco de reacção foi calculado como se segue: a. Para 90pCl3 em 0, 040 M HCI (Amersham):

Volume 90YCl3 (Etapa lb) X (0.8) = - Volume de acetato de sódio a acrescentar b. Para 90YCl3em 0,050 M HCI (Nordion):

Volume 9OYCI3 (Etapa lb) X (1.0) = - Volume de acetato de sódio a acrescentar 3. Os septos do frasco de reacção e o frasco de acetato de sódio foram esfregados com álcool. Usando uma seringa de 1 centímetro cúbico o volume calculado (Etapa la ou lb) de 50 mM de acetato de sódio (Etapa 2) foi transferido para o frasco de reacção. O frasco foi misturado invertendo-se várias vezes . 4. 0 septo do frasco de 90pCl3 fonte foi esfregado com álcool. 0 frasco foi retirado com uma agulha ajustada com filtro estéril 0.2. Usando uma seringa esterilizada de 1 centímetro cúbico, foi retirado o volume necessário (Etapa 1 b) de 90YC13 transferido para o frasco de reacção. O frasco foi misturado invertendo-se várias vezes. 5. O septo do frasco de 2B8-MX-DTPA foi esfregado com álcool. Usando uma seringa estéril de 3 centímetros cúbico, 1,5 ml de 2B8-MXDTPA foi transferido para o frasco de reacção. O frasco foi misturado invertendo-se várias vezes. 6. O volume total da mistura de reacção foi calculado acrescentando a guantidade de cloreto Y-90 acrescentado (Etapa 4), mais a quantidade de 50 mM de acetato de sódio acrescentado (Etapa 3) e a quantidade de 2B8-MX-DTPA acrescentado (Etapa 5). 7. O volume do tampão de formulação para acrescentar ao frasco de reacção para obter um volume final de 10 ml foi calculado subtraindo o volume total da reacção calculada na etapa 6 de 10. 8. O frasco de tampão de formulação foi lavado com álcool e o frasco foi ventilado. Devido à viscosidade do tampão de formulação, o frasco de reacção foi retirado usando uma agulha ajustada com um filtro de seringa de 0,20 ym. Usando uma seringa estéril de 10 centímetros cúbicos ajustada com uma agulha de calibre apropriado, o volume do tampão de formulação calculado na Etapa 7 foi transferido para o frasco de reacção. A agulha de abertura foi retirada do frasco de reacção e o frasco foi misturado invertendo-se várias vezes (Produto Final). Este frasco foi incubado pelo menos 5 minutos antes da realização do "Ensaio de Radioincorporação". A cor da solução é âmbar e o frasco estava cheio, confirmando assim que o tampão de formulação fora acrescentado. 9. A radioactividade total do frasco de Produto Final foi medida usando o conjunto de instrumentação apropriado para medição de 90Y. 10. O Produto Final foi imediatamente armazenado a 2° -8°C até necessário para administração ao paciente. 11. Teste de imunorreactividade:

Usando uma seringa de 1 mL, 0,1 mL foi retirado de forma asséptica do frasco de reacção e transferido para um tubo separado de topo roscado de 1,5 ml. O tubo foi armazenado imediatamente a 2-8 2C para "Ensaio de Ligação" e "Ensaio de Radioincorporação". A validação dos protocolos do kit de radiomarcação foi executada em IDEC Pharmaceuticals (San Diego, CA), MD Anderson Health Center (Houston, TX). Mayo Clinic (Rochester, MN) e City of Hope (Duarte, CA) . Todos os componentes do kit, inclusive 2B8-MX-DTPA de grau clinico, foram preparados por IDEC Pharmaceuticals em condições GMP (Condições de Boa Fabricação segundo o Código de Regulamentos Federais) e determinados como sendo estéreis e apirogénicos.

Os anticorpos radiomarcados foram formulados com IX PBS contendo 7,5% (p/v) de albumina sérica humana (HSA; grau clinico; Baxter-Hpland) e lmM de DTPA. Os resultados dos testes de divulgação realizados em cada lote de validação estão descritos abaixo.

Seis lotes de validação cada de In2B8 e Y2B8 foram preparados por cinco operadores. Estes lotes foram indicados como se segue e realizados nas seguintes instalações:

In2B8: #1: IDEC Pharmaceuticals #2: IDEC Pharmaceuticals #3: IDEC Pharmaceuticals #4: MD Anderson Health Center #5: Mayo Clinic #6: City of Hope Y2B8: #1: IDEC Pharmaceuticals #2: IDEC Pharmaceuticals #3: IDEC Pharmaceuticals #4: MD Anderson Health Center #5: Mayo Clinic #6: City of Hope

2. Preparação de Células Liofilizadas SB e HSB

As linhas celulares humanas SB (CD20 positivo) e HSB (CD20 negativo;) foram obtidas da American Type Culture Collection cultivadas em frascos T usando RPMI-1640 contendo 10% de soro bovino fetal complementado com 2% de glutamina. As culturas foram mantidas a 37 °C e 5% de CO2. As células eram tipicamente divididas 1:2 dia sim dia não e colhidas em 0.5-2.5 x 106 células/mL e a viabilidade > 80%.

As concentrações de células foram determinadas usando um hemacitómetro e a viabilidade foi determinada por exclusão de azul tripan.

As células foram colhidas à temperatura ambiente a uma densidade de célula de 0.5-2 X 106 células/mL por centrifugação (1300 RPM numa centrifugadora Sorvall) e lavadas duas vezes com IX HBSS. As células peletizadas foram ressuspensas a 50 x 106 células/ml em IX HBSS contendo 1% (p/v) de albumina sérica bovina (BSA) e 10% (p/v/) de manitol (tampão de liofilização), 0,5 ml dispensados em tubos de microcentrifuga de polipropileno de 1,5 ml com gaxetas de anel em o e armazenadas a - 70°C e liofilizadas durante a noite em 30 - 60 militros. Os tubos de células liofilizadas foram armazenados dessecados em 2-8 2C e reconstituídos em água estéril para ensaios; os tubos de células liofilizadas em tubos de microcentrifuga foram armazenados com dessecante. 3. Ensaios Analíticos

Os métodos analíticos usados para testar a validação de lotes de In2B8 e Y2B8 descrevem-se abaixo. Os seguintes ensaios foram executados para a validação de cada lote: 1. Ensaio de Ligação usando células SB liofilizadas 2. Ensaio de Radioincorporação de Y2B8/In2B8 usando o Kit Biodex a. Ensaios de Ligação A percentagem de ligação foi avaliada por cada operador usando células SB positivas liofilizadas CD20 segundo os protocolos seguintes para In2B8 e Y2B8, respectivamente.

Esses ensaios fornecem um método rápido e eficiente para confirmação de que o anticorpo radiomarcado ainda reconhece CD20 como um antigeno. Num local clinico, as células HSB CD2O-negativas também foram avaliadas. As células liofilizadas foram preparadas e armazenadas segundo o método supracitado, "Preparação de Células Liofilizadas SB e HSB". i. Ensaio de Ligação de In2B8

Reagentes adicionais:

1. indio- [111]-2B8-MX-DTPA 2. Células SB liofilizadas; três tubos contendo 25 X 106 células/tubo. 3. Células HSB liofilizadas; três tubos contendo 25 X 106 células/tubo. 4. Água estéril para irrigação ou água estéril para injecção. 5. Tampão de diluição (IX PBS, pH 7,2 - 7,4 contendo 1% de Albumina Sérica Bovina (BSA) e 0,02% de azida sódica 2 pm filtrado e armazenado à temperatura ambiente. 6. Tubos de teste de vidro ou plástico para contar a radioactividade.

Procedimento:

Organização de ensaio (parte não radioactiva) 1. Três tubos de células SB e HSB liofilizadas foram obtidos. 2. Um volume de 0,50 mL de SWFI (água estéril para injecção) foi acrescentado a cada tubo, e os tubos foram girados até à obtenção de uma suspensão homogénea.

3. Quatro tubos de microcentrifuga de 1,5 ml vazios. A três dos tubos de 0.,0 ml foi acrescentado o tampão de diluição, representando um controlo sem células. 4. Aos outros tubos de microcentri fuga de 1,5 ml, foi acrescentado 99 ml do tampão de diluição; este tubo foi marcado 1:100. 5. Um tubo de polipropileno estéril de 50 ml com tampa foi obtido e foi acrescentado ao tubo 10 ml do tampão de diluição.

Organização de ensaio (parte radioactiva) 1. O anticorpo radiomarcado armazenado a 2-8°C foi obtido. 2. Um volume de 0,01 ml foi retirado com um P20 e acrescentado ao tubo de microcentrifuga de 1,5 ml contendo 0,99 ml de tampão de diluição (diluição 1:100) . A ponta foi enxaguada e o tubo foi girado suavemente para misturar. 3. Um volume 0,20 ml foi retirado com P200 do tubo de diluição 1:100 e acrescentado ao tubo cónico contendo 10 ml do tampão de diluição. O tubo foi misturado completamente.

Protocolo de Ensaio 1. Um volume de 0,50 ml do mIn2B8-MX-DTPA diluído foi acrescentado a todos os tubos. 2. As tampas foram apertadas com segurança em todos os tubos e os tubos foram misturados continuamente durante 60 minutos. 3. Depois da incubação de 60 minutos à temperatura ambiente, todos os tubos foram centrífugados durante 5 minutos no mínimo de 2000 g. 4. um volume de 0,75 ml de cada sobrenadante foi transferido para os tubos apropriados para o instrumento de contagem. 5. A radioactividade nos tubos foi contada usando um contador gama, ajustado para os antecedentes. ii. Ensaio de Ligação de Y2B8

Reagentes Adicionais

1. 90Y2B8-MX-DTPA 2. Células SB Liofilizadas 3. Água estéril para irrigação ou água estéril para injecção 4. Tampão de diluição (IX PBS, pH 7,2 - 7,4 contendo 1% de Albumina Sérica Bovina (BSA) e 0.02% de azida sódica).

Procedimento:

Amostra preparatória de anticorpo radiomarcado 1. anticorpo radiomarcado armazenado em 2-8°C foi obtido. 2. Um volume de 10 μΐ foi retirado com um P20 e acrescentado ao tubo de microcentrifuga de 1,5 ml contendo 990 μΐ de tampão de diluição (diluição 1:100). A ponta foi lavada e o tubo foi girado ligeiramente. 3. Um tubo de polipropileno esterilizado de 50 ml com tampa foi obtido e 10 ml do tampão de diluição foram acrescentados ao tubo usando uma pipeta serológica de 10 ml. 4. Um volume de 35 μΐ foi retirado com um P200 do tubo de diluição 1:1

Preparação de Célula Liofilizada 1. Três tubos de células SB liofilizadas foram obtidos. 2. Um volume de 0,5 ml de SWFI foi acrescentado a cada tubo e os tubos foram girados até à obtenção de suspensões homogéneas de célula única. 3. Três tubos vazios de microcentrifuga de 1.5 ml foram obtidos; a três dos tubos, foi acrescentado 0,5 ml do tampão de diluição, representando um controlo sem células.

Protocolo de Ensaio 1. Um volume de 0,5 ml do 99Y2B8-MX-DTPA diluído foi acrescentado a cada tubo. 2. Os tubos foram colocados na extremidade do misturador durante 45 minutos, depois de verificar que as tampas estavam apertadas com segurança. 3. Depois de incubação de 45 minutos à temperatura ambiente, as células foram peletizadas por microcentrifugação durante 5 minutos. 4. Um volume de 0,8 ml do sobrenadante foi transferido para frascos de cintilação. 5. A mistura de cintilação foi acrescentada a cada frasco. 6. A quantidade de radioactividade em cada frasco foi determinada usando um contador de cintilação, ajustado para os antecedentes. b. Ensaio de Radioincorporação A percentagem de radioincorporação foi determinada por cromatografia de camada fina imediata (ITLC) usando o Kit Radiocromatográfico TecControl Biodex, segundo o seguinte protocolo:

Materiais e Equipamento Adicionais:

1. 2B8-MX-DTPA radiomarcado com 111In-ou 90Y 2. Tubos para contar tiras TLC radioactivas 3. Tesoura 4. Seringa estéril, 1 centímetro cúbico

5. Agulhas estéreis, 26G 6. Contador gama ou contador de cintilação 7. Pipetor

Procedimento: 1. Primeiro deve ler-se todo o Manual de Operação Biodex. 2. Cada amostra radiomarcada em triplicado foi testada segundo as instruções do kit; uma tira por frasco foi desenvolvida. 3. Para marcar a amostra radiomarcado na tira de cromatografia, foi usado um pipetor para marcar 1 μΐ na linha de origem. Alternativamente, uma pequena gota dispensada de uma agulha 26G ligada a uma seringa estéril de 1 centímetro cúbico pode ser marcada. 4. Cada secção foi contada para actividade usando o contador apropriado, isto é, contador gama para niIn e contador de cintilação para 90Y, ajustado para os antecedentes. 5. As instruções Biodex para calcular a percentagem do anticorpo radiomarcado foram seguidas. IV. Resultados

Os resultados do teste de cada lote de validação de ln2B8 ou Y2B8 são resumidos nas Tabelas 38 e 39.

Tabela 38. Divulgação do Teste para Validação de Y2B8

Na do Lote % Radioincorporação &amp; Ligação 99, 5 78,6 99, 3 87,0 3 99, 4 85,9 4 99, 2 81,8 5 99, 2 79,6 6 96,3 80,8 Média = 98,8 Média = 82,3 Desvio Padrão =

Desvio Padrão = 1,24 3,4 %CV = 1,25 &amp; CV = 4,2 %

Tabela 39. Resultados de Divulgação do Teste para Validação dos Lotes de In2B8 N2 do Lote % Radioincorporação &amp; Ligação 1 99, 4 86,2 2 98,7 86,8 3 99, 3 85,8 4 98,3 86,7 5 99, 0 82,1 6 99, 3 83,0 Média = 99,0 Média = 85,2 Desvio Padrão =

Desvio Padrão = 0,43 2,6 % CV = 0,45 % CV = 2,42 % V. Discussão e Conclusões

Para simplificar os actuais métodos de radiomarcação para In2B8 e Y2B8, foi desenvolvido um kit de quatro componentes. As concentrações de acetato de sódio e 2B8-MX-DTPA foram reduzidas a 50 mM e 2 mg/mL, respectivamente, para permitir transferências de volume exactas usando seringas. Todos os componentes do kit foram preferivelmente introduzidos em frascos de septo de vidro e testados para esterilidade e pirogenicidade pela IDEC antes da divulgação, eliminando assim a necessidade desses testes serem executados nos locais clínicos. No local, todas as manipulações de reagente são realizadas usando seringa e agulhas estéreis. Por isso, realizar as técnicas assépticas normalmente realizadas num ambiente de radiofarmácia assegura que os anticorpos formulados e radiomarcado são adequados para administração ao paciente. A reprodutibilidade e a robustez dos protocolos de radiomarcação para In2B8 e Y2B8 foram avaliadas executando várias operações de validação usando lotes diferentes de cada radioisótopo. Para os seis lotes de validação de In2B8 preparados, a ligação variou de 82.1% a 86.8% com uma média de 85.1%; os valores de radioincorporação foram aproximadamente 99% (faixa de 98.3% a 99.4%) . Para os seis lotes de validação de Y2B8 preparados, a percentagem de ligação obtida situou-se entre 78.6% a 87.0% com uma média de 82.3%. Os valores de radioincorporação de Y2B8 tiveram a média de 98.8% (faixa de 96.3% a 99.5%). Conjuntamente, estes resultados confirmam a reprodutibilidade e a robustez dos métodos do kit de radiomarcação para a preparação de In2B8 e de Y2B8. Com base nestes resultados de validação, recomenda-se que as especificações de divulgação de radioincorporação e ligação sejam estabelecidas em >95% e >70%, respectivamente, tanto para In2B8 como para Y2B8.

Além disso, devido ao aumento da facilidade de uso e menor potencial de erros durante a preparação, recomenda-se que a percentagem de ligação usando células CD2O-positivas liofilizadas e radioincorporação seja usada para divulgar o teste In2B8 e Y2B8 nos locais clínicos.

Resumindo, estes resultados em conjunto indicam que In2B8 e Y2B8 preparados usando o kit de radiomarcação são adequados para uso no ambiente clínico. Adicionalmente, para ambos os anticorpos radiomarcados, as especificações de divulgação são estabelecidas reflectindo os resultados de várias operações de validação por cinco operadores diferentes.

Exemplo 2. Radioincorporação e Ligação - Kits e Ensaios I. Sumário 0 anticorpo monoclonal murino anti-CD20 chamado 2B8 foi clonado em células CHO para produzir uma linha celular de alta expressão. A especificidade do anticorpo derivado de CHO de células humanas CD2O-positivas foi demonstrada por análise FACS e ligação competitiva. Uma ligação insignificante foi observada para as células T humanas. A afinidade do anticorpo para células CD20-positivas foi determinada como sendo 1.3 X 1O_10 M usando um ensaio de ligação competitivo. 0 anticorpo foi reagido com o agente guelante MX-DTPA para formar um conjugado, 2B8-MX-DTPA, com perda mínima de imunorreactividade (valor de afinidade de 4,4 X 1CT10 Μ. A melhor conjugação de guelato, como determinado medindo a radioincorporação de 111In, foi alcançada depois de uma reacção de oito horas. Os protocolos de radiomarcação para 2B8-MX-DTPA foram optimizados para 90Y ou 911In em relação ao pH e tempo de incubação para assegurar uma radioincorporação máxima (>95%) e retenção da imunorreactividade (>70%) . As especificações de divulgação de In2B8 e Y2B8 preparados usando 2B8-MX-DTPA derivado de CHO em ensaios clínicos foram recomendados para radioincorporação (>95%) e ligação para células humanas CD2O-positivas liofilizadas e reconstituídas (>70%). Conjuntamente, estes resultados indicam a adeguação de 2B8-MX-DTPA derivado de CHO para uso em ensaios clínicos. II. Introdução 0 anticorpo 2B8 usado anteriormente foi produzido em bioreactores de fibras ocas. Para reduzir os custos de fabricação deste anticorpo, este foi clonado e expresso em células CHO para produzir uma linha de produção celular de alta expressão. Este exemplo descreve os resultados na caracterização in vitro do anticorpo 2B8 derivado de CHO, do anticorpo conjugado (2B8-MX-DTPA) e dos produtos de anticorpo marcado com 90Y e 119Ιη, preparados usando os protocolos do kit de radiomarcação clinico. III. Materiais e Métodos A. Reagentes

As linhas celulares humanas SB (CD20-positivo) e HSB (CD20-negativo;) foram obtidas da American Type Culture Collection cultivadas em frascos T usando RPMI-1640 contendo 10% de soro bovino fetal 10% complementado com 2% de glutamina. As culturas foram mantidas a 37 °C e 5% de CO2 · As células eram tipicamente divididas 1:2 dia sim, dia não e colhidas em 0,5-2,5 x 106 células/mL e a viabilidade> 80%. As concentrações de célula foram determinadas usando um hemacitómetro e a viabilidade foi determinada por exclusão de azul tripan. A informação especifica sobre lotes de células está registada no Notebook # 1553 e no dossier intitulado "Cell Activity Logbook 1955 &amp; 1956" [Livro de Registo de Actividade de Células 1995 e 1996], da autoria de Ron Morena. Ο 2B8 derivado de CHO foi produzido sob condições GMP na instalação de fabricação da IDEC. O anticorpo foi formulado em solução salina normal de baixo teor de metal a 11,5 mg/ml. Os anticorpos foram determinados como sendo homogéneos por SDS-PAGE. 0 2B8-MX-DTPA foi produzido sob condições GMP segundo PSBR-043 de 2B8 derivado de CHO e formulado em solução salina de baixo teor de metal em 2 mg/mL (Lotes # 0165A e 0165B). 0 cloreto ηιΙη de grau farmacêutico foi comprado à Amersham (U.K.) ou a Cyclotron Products Inc. (Coral Gables, FL) . 0 cloreto de itrio [90] foi obtido da Amersham (Reino Unido), de Nordion Internacional (Kanatta, Canadá), ou do Pacific Northwest National Laboratory (Richland, WA) . 0 MX-DTPA preparado sob GMP foi obtido de Hauser Chemical (Boulder, CO). 0 cálcio de grau clinico trissódio ácido dietilenotriaminapentacético (DTPA) foi obtido de Hepl (Berlim, Alemanha) . TAG-NHS foi obtido de IGEN Inc. (Rockville, MD) as contas Murine anti-CD19 foram compradas à Dynal Inc. (Lake Success, NY). O anti-rato de cabra FITC-marcado F(ab')2 foi comprado à Jackson ImmunoResearch.

Os reagentes que precisam da remoção de metais pesados contaminantes foram tratados por lote com Chelex 100 (BioRad Industries) ou com Chelating Sepharose (Pharmacia) passando as soluções através de uma coluna. As soluções de stock de baixo teor de metal foram diluídas com Água Estéril para Irrigação (SWFIr) . As soluções foram armazenadas em recipientes plásticos estéreis.

Os reagentes adicionais descrevem-se abaixo para métodos específicos. B. Materiais e Equipamento 1. Analisador Origen; IGEN Inc. Modelo #1100-1000; IDEC #1492 2. Contador de cintilação superior; Packard, Modelo #A9912; IDEC #1329 3. Contador gama; Isodata, Modelo # 20-10; IDEC #0628 4. Kit Radiocromatográfico Tec-control, Biodex, Modelo #151-770 5. Liofilizante; Virtis, Modelo Freezemobile 12; IDEC #0458

Materiais e equipamento adicionais descrevem-se em relação a métodos específicos. C. Métodos

1. Reparação de Células Liofilizadas SB e HSB

As células foram cultivadas como descrito acima e colhidas à temperatura ambiente a uma densidade de célula de 0.5-2 X 106 células/mL por centrifugação (1300 RPM numa centrifugadora Sorvall) e lavadas duas vezes com IX HBSS. As células peletizadas foram ressuspensas a 50 x 106 células/mL em IX HBSS contendo 1% (p/v) de albumina sérica bovina (BSA) e 10% (p/v/) de manitol (tampão de liofilização), 0,5 mL dispensados em tubos de microcentrifuga de polipropileno de 1,5 mL com gaxetas de anel em o e armazenadas a - 70°C e liofilizadas durante a noite em 30 - 60 militros. Os tubos de células liofilizadas foram armazenados dessecados a 2-8 2C e reconstituídos em água estéril para ensaios; os tubos de células liofilizadas em tubos de microcentrifuga foram armazenados com dessecante.

2. Análise de Ligação FACS A ligação directa de anticorpos a células B humanas foi determinada por citometria de fluxo. As concentrações crescentes do anticorpo foram incubadas em IX PBS, pH 7,2, contendo 1% (p/v) de BSA (tampão de ligação) com 5 X 106células CD20-positivas (SB) ou CD2O-negativas (HSB) durante 30 minutos em gelo. As células foram lavadas por centrifugação, ressuspensas no tampão de ligação e incubadas com anti-rato de cabra FITC-marcado F(ab')2 durante 30 minutos em gelo. Depois da incubação com o reagente secundário, as células foram lavadas por centrifugação e ressuspensas em IX PBS contendo 1.1 %, (v/v) de formaldeido para fixar as células. A intensidade de fluorescência média foi determinada usando citometria de fluxo. 3. Análise de Ligação Competitiva A imunorreactividade de 2B8 e 2B8-MX-DTPA foi determinada por ligação competitiva em células SB CD2O-positivas usando o método ORIGEN electroguimiluminescente (Leland e Powell). As células SB de log-phase (fase de registo) foram colhidas da cultura e lavadas duas vezes com IX HBSS. As células foram diluídas em IX PBS pH 7,2 contendo 1% (p/v) de albumina sérica bovina. Em algumas experiências, as células liofilizadas foram usadas depois da reconstituição com água estéril.

O anticorpo de rasto marcado com ruténio foi preparado incubando 2B8 derivado de CHO (lote #165) em IX PBS, pH 7.2 com éster N-hidroxisucinimida de ruténio (II) guelato de tris-bipiridina (TAG-NHS) numa proporção molar 15:1 de TAG-NHS para anticorpo. Depois de 1 h de incubação á temperatura ambiente, protegida da luz, a reacção foi extinta com glicina durante 10 minutos. A TAG não reagida foi retirada por cromatografia de exclusão de tamanho usando uma coluna Pharmacia PD-10 equilibrada com IX PBS. A concentração de proteína foi determinada usando o ensaio de proteína Bradford. A incorporação de TAG foi determinada medindo a absorbância em 455 nm. A proporção molar da TAG para a proteína foi calculada como sendo 3.0.

Foram executados ensaios em tubos de polipropileno de 12 X 75 mm. Várias quantidades de anticorpos competitivos (0.002 - 17 ug/mL) foram incubados em IX PBS, pH 7,2, contendo 1% (p/v) de BSA com 0,08 ug/mL de 2B8 de CHO marcado com TAG, contas anti-CD19 de 0,08 mg/mL e 167.000 células/mL. Depois da incubação em temperatura ambiente com mistura orbital durante 3h, a electroquimiluminescência relativa (ECL) foi determinada usando o instrumento ORIGEN. Valores médios ECL foram determinados a partir de amostras duplicadas e traçadas contra a concentração de anticorpo competitivo usando o software Kaleidagraph. Para algumas experiências, a percentagem de inibição foi traçada. Curvas de competição foram ajustadas e os valores EC 50 (concentração de anticorpo dando uma ligação máxima de 50%) foram determinados usando o seguinte programa de 4 parâmetros: . y = ((ml-m4)/(1+(mO/m3)Am2))+m4; ml=;m2=;m3=;m4= mO = variável independente ml = resposta de sinal zero em unidades ECL relativas

m2 = parâmetro de curvatura m3 = EC50 em ug/mL m4 = resposta de sinal máximo em unidades ECL relativas

Os valores de afinidade médios foram calculados a partir de valores EC50 e a concentração conhecida do anticorpo foi marcada usando o método Muller.

4. Preparação de 2B8-MX-DTPA 0 agente quelante, ácido l-isotiocianatobenzil-3-metildietilenotriaminapentacético (MX-DTPA) foi fornecido como um pó seco (sem ácido) e armazenado dessecado a -20° ou -7 0 °C. Aproximadamente 3 mg de anticorpo 2B8 CHO em solução salina normal com baixo teor de metal foram ajustados ao pH 8.6 acrescentando um volume de um décimo de 50 mm de borato de sódio, pH 8.6. O anticorpo em 10-11 mg/mL foi incubado a uma proporção molar de 4:1 MX-DTPA para proteína acrescentando MX-DTPA dissolvido em 50 mm de borato de sódio, pH 8.6. Depois da incubação à temperatura ambiente (2 a 24 h) , o quelato que não reagiu foi retirado do conjugado por filtração repetitiva em solução salina normal com baixo teor de metal usando filtros rotativos

Centricon 30. 5. Preparação de In2B8 e Y2B8 O In2B8 foi preparado usando o protocolo do kit de radiomarcação como descrito aqui. O anticorpo foi etiquetado a uma actividade específica de 3 mCi/mg e formulado a 0.2 mg/mL. Resumidamente, 0.5 a 2 mCi de cloreto de U1ln foi transferido para um tubo de microcentrífuga sem metal e ajustado para aproximadamente pH 4.2 usando um 1.2X volume de 50 mm de acetato de sódio de baixo teor de metal. O 2B8-MX-DTPA a 2 mg/mL foi acrescentado à solução de acetato de índio e depois de incubação à temperatura ambiente durante 30 minutos o anticorpo marcado foi formulado para 0.2 mg/mL em IX PBS, pH 7.2 contendo 7.5% (p/v) de albumina sérica humana e lmm de DTPA (concentração final de HSA, 4% a 6%) . Todas as amostras foram testadas para radioincorporação em triplicado; os valores foram >95%. Ο Y2B8 também foi preparado usando uma versão em pequena escala do protocolo do kit de radiomarcação descrito no Exemplo 1. 0 anticorpo foi marcado a uma actividade especifica de 15 mCi/mg e formulado a 0.3 mg/mL. Resumidamente, 0.5 a 2 mCi de cloreto de 90Y foi transferido para um tubo de microcentrífuga sem metal e ajustado em aproximadamente pH 4.2 usando um 1.2X volume de 50 mm de acetato de sódio de baixo teor de metal. O 2B8-MX-DTPA em 2 mg/mL foi acrescentado à solução de acetato 90Y e depois de incubação à temperatura ambiente durante 5 minutos o anticorpo marcado foi formulado para 0.3 mg/mL em IX PBS, pH 7.2 contendo 7.5% (p/v) de albumina sérica humana e 1 mM de DTPA (concentração final de HSA, 4% a 6%). Todas as amostras foram testadas para radioincorporação em triplicado; valores>95%.

As concentrações de radioactividade do produto radiomarcado final foram calculadas com base na quantidade de radioactividade acrescentada à mistura de reacção e quanto ao Certificado da Análise do radioisótopo. A concentração de anticorpo das misturas de reacção extintas foi calculada a partir da quantidade conhecida do anticorpo acrescentado.

Para estudos cinéticos de radiomarcação avaliando o efeito de pH em radioincorporação e ligação, o pH das misturas de reacção foi ajustado acrescentando quantidades variadas de 50 mm de acetato de sódio de baixo teor de metal (0.8 a 2.2X de volume da solução de radioisótopo). 6. Determinação de Radioincorporação para In2B8 e Y2B8 A quantidade de radioactividade associada com os conjugados (radioincorporação) nos produtos finais ou amostras de incubação foi determinada usando um kit comercialmente disponível fabricado por Biodex (Kit Radiocromatográfico

Tec-control; ver o Exemplo 1). Em geral, 1 pL das amostras de teste é aplicada em duplicado ou triplicado usando uma micropipeta e é desenvolvida segundo o folheto informativo da Biodex. As metades das tiras foram contadas para radioactividade em tubos de vidro usando um contador gama Isodata ou contador de cintilação superior Packard como descrito abaixo. A incorporação de radiomarcador foi calculada dividindo a quantidade de radioactividade na metade superior da tira pela radioactividade total encontrada nas metades superior e inferior. Este valor foi expresso como uma percentagem e o valor médio determinado. 7. Determinação de imunorreactividade de In2B8 e Y2B8 A imunorreactividade foi avaliada usando o método Lindmo et al como descrito acima no Exemplo 1. 8. Ensaio de Ligação Directa para In2B8 e Y2B8

Os mesmos protocolos descritos aqui foram usados para determinar a ligação em células SB CD2O-positivas de In2B8 e Y2B8, respectivamente. In2B8 e Y2B8 foram preparados e formulados como descrito acima. Para ensaio, as amostras de In2B8 ou Y2B8 foram diluídas com tampão de diluição de ensaio (1XPBS, pH 7,2, contendo 1% (p/v) de albumina sérica bovina (BSA) para 40 ng/mL e 11 ng/mL, respectivamente.

As células de antigeno positivo (SB) e antigeno negativo (HSB) foram mantidas em RPMI 1640 complementado com soro de feto de bezerro de 10% a 37°C e C02 de 5%. As células (viabilidade>90% como determinado pela exclusão de azul tripan) foram colhidas à temperatura ambiente numa densidade de célula de 0.5 - 2 x 106 células/mL por centrifugação (1300 RPM numa centrifugadora Sorvall) e lavadas duas vezes com 50 mL IX HBSS. As células peletizadas foram ressuspensas em 50 x 106 células/mL em pré-arrefecido IX HBSS contendo 1% (p/v) de albumina sérica bovina (BSA) e 10% (p/v/) de manitol (tampão de liofilização). As suspensões de célula foram dispensadas em tubos de microcentri fuga de polipropileno de 1.5 mL com gaxetas de anel em o a 50 X 106 células/mL (0.5 mL por tubo) e liofilizadas durante a noite em 30 a 60 millitros. As células liofilizadas foram armazenadas dessecadas em 2-8 °C e reconstituídas em água estéril para ensaios.

As células liofilizadas SB e HSB em tubos de polipropileno de 1,5 mL foram reconstituídas a 50 X 106 células/mL usando água estéril. In2B8 ou Y2B8 diluído foram acrescentados às células, em triplicado, e incubados durante 45 a 60 minutos com mistura de uma extremidade a outra em temperatura ambiente, respectivamente. Depois da incubação, as células foram peletizadas por centrifugação e a radioactividade de ligação de células foi determinada contando as amostras num Contador Gama Isodata ou contador de cintilação Packard como descrito abaixo. A ligação de reactividade (B) para células foi calculada subtraindo a radioactividade solta (sobrenadante) da radioactividade total acrescentada. A radioactividade total foi determinada a partir de tubos contados da radioactividade sem células. A percentagem de ligação foi calculada exprimindo as contas ligadas como uma percentagem das contagens totais. 9. Medição de Radioactividade

As amostras de radioincorporação foram contadas durante 1 minuto usando um contador gama Isodata. O contador foi configurado para janelas de energia de 100-500 KeV e o histórico foi ajustado para zero imediatamente antes do uso para amostras usando 111In. 0 contador gama Isodata também foi usado para contar tiras de ITLC com 90Y traçado. As janelas de energia para detecção de radiação bremstrulung foram 100 - 1000 KeV.

Para ensaios obrigatórios, amostras de 90Y foram transferidas para 24 placas de poços e mistura MicroScint 40 e contadas num contador Packard durante 1 minuto usando configurações de energia mínimas e máximas. Amostras de índio-[111] foram contadas durante 1 minuto usando um contador gama Isodata. O contador foi configurado para janelas de energia de 100-500 KeV e o histórico foi ajustado a zero imediatamente antes do uso. 10. Especificações de Divulgação de Doses Clinicas de In2B8 e Y2B8

As especificações de divulgação de radioincorporação e ligação para células CD20-positivas foram estabelecidas preparando seis doses cada de In2B8 e Y2B8 usando dois lotes de grau clinico 2B8-MX-DTPA (lotes # 0219 e 0220) preparados segundo a presente divulgação e preenchidos sob condições GMP. Os ensaios de divilgação foram realizados como descrito acima. IV. Resultados

A. Caracterização do 2B8 derivado de CHO

Usando análise de fluxo citométrico, foi demonstrado que o 2B8 CHO se liga directamente a células SB CD20-positivas sem se ligar a células HSB CD20-negativas. (Figura 34). Não foi observada nenhuma ligação significativa a células SB ou HSB para um isótipo de anticorpo inaplicável (γΙΚ) (S004) . A ligação de 2B8 CHO a células CD2O-positivas foi avaliada em ensaios de competição usando o sistema de detecção ORIGEN químiluminescente. As células liofilizadas e SB positivas de antigeno reconstituídas foram incubadas com aumento de quantidades de anticorpo na presença de rastreador 2B8 CHO marcado com ruténio. Os resultados mostraram que 2B8 CHO inibe a ligação a células CD20-positivas da mesma forma que o anticorpo derivado de bioreactores de fibras ocas (2B8-49) (Figura 35). Os valores de EC50 foram determinados graficamente e o método de Muller (1980) foi usado para calcular a afinidade média de valores. A afinidade de 2B8 CHO foi determinada como sendo 1.3 X 1O_10 Μ; o anticorpo 2B8 derivado de bioreactores de fibras ocas teve um valor de afinidade de 2,5 1O_10 Μ. A ligação não-específica foi irrelevante como demonstrado pela falta de competição com o isótipo de anticorpo inaplicável, S004.

B. Caracterização de 2B8-MX-DTPA derivado de CHO O conjugado 2B8 (2B8-MX-DTPA) foi preparado usando um protocolo semelhante ao usado para ο 2B8-49 anteriormente caracterizado. As reacções foram executadas usando aproximadamente 3 mg do anticorpo e uma proporção molar de 4:1 de quelato para anticorpo. Os tempos de incubação de 2, 8, 17, e 24 h foram avaliados para determinar o tempo de reacção dando retenção aceitável de ligação a células positivas CD20 e radioincorporação elevada com 111In. Curvas de ligação competitivas comparando 2B8 CHO a 2B8-MX-DTPA CHO conjugado reagiram durante 8 - 24 h de forma similar, indicando que o processo de conjugação não alterou de forma significativa a ligação do anticorpo ao antigeno CD20 (Figura 36) . Usando valores de EC 50 determinados

graficamente (Figura 36) , as constantes de afinidade dos anticorpos não conjugados e conjugados variaram de 2.3 1CT 10M X a 5.9 X 1CT10 M (Tabela 40) . A Radioincorporação era de > 95% durante os tempos de conjugação de 8 a 24 h (Tabela 30).

C. Caracterização de In2B8 e Y2B8 Preparado de 2B8-MX-DTPA derivado de CHO O 2B8-MX-DTPA CHO marcado com índio-[111] (In2B8) foi preparado usando o protocolo do kit de radiomarcação usando a pequena escala anteriormente descrita para anticorpo de bioreactor derivado de fibras ocas (Exemplo 1). Resumidamente, o anticorpo conjugado (2B8-MX-DTPA derivado de CHO; lote # 0165A) foi incubado com ηιΙη de acetato no pH indicado durante 30 minutos à temperatura ambiente. As misturas de reacção foram formuladas com PBS, pH 7.2, contendo 7.5% (p/v) de albumina sérica humana e lmm de DTPA. As amostras formuladas de In2B8 foram testadas para radioincorporação usando cromatografia de camada fina imediata. A ligação de In2B8 para células CD2O-positivas

foi determinada usando células SB liofilizadas e reconstituídas. Para comparação, o conjugado preparado a partir de anticorpo produzido por hibridoma (2B8-49) foi incubado com ηιΙη acetato durante 30 minutos em pH 4.2 (condições anteriormente estabelecidas para este anticorpo).

Estudos de cinética foram executados para determinar condições de marcação que fornecem uma retenção máxima da ligação a células CD2O-positivas e radioincorporação elevada (Tabelas 41 e 42). O anticorpo conjugado (2B8-MX-DTPA derivado de CHO) foi incubado à temperatura ambiente com acetato niIn em pH 4,2 durante os momentos indicados (Tabela 42).

Tabela 42. Cinética de Radiomarcação In2B8: Efeito do Tempo de Incubação em Radioincorporação e Ligação a Células Positivas CD20

Os resultados demonstraram isto para a faixa de pH 3.0 a e um período de incubação de 30 minutos > 97% de a radioincorporação de radioisótopo foi realizada mantendo a ligação a aproximadamente 84%. A radioincorporação e os valores de ligação foram invariáveis durante os momentos de incubação de 15 a 45 minutos para reacções em pH 2.9 a 4.6 (Tabela 42). Os resultados foram comparáveis com os obtidos usando anticorpos de 2B8-49 (Tabelas 41 e 42). O anticorpo marcado com ítrio-[90] foi preparado incubando o anticorpo conjugado (2B8-MX-DTPA derivado de CHO) com acetato 90Y no pH indicado durante 5 minutos à temperatura ambiente. As misturas de reacção foram formuladas com PBS, pH 7,2, contendo 7.5% (p/v) de albumina sérica humana e lmm de DTPA. As amostras formuladas de Y2B8 foram testadas para radioincorporação usando cromatografia de camada fina imediata. A ligação de Y2B8 para células CD20-positivas foi determinado usando células SB liofilizadas e reconstituídas. Para comparação, o conjugado preparado a partir de anticorpo produzido por hibridoma (2B8-49) foi incubado com acetato 90Y acetato durante 5 minutos em pH (condições anteriormente estabelecidas para este anticorpo).

Estudos cinéticos semelhantes foram executados para avaliar

a preparação de anticorpo marcado com 90Y (Y2B8). Para reacções de radiomarcação na variedade de pH 3,9 a 4,7 durante um tempo de incubação de 5 minutos, a radioincorporação foi de >96% com retenção de >80% de ligação para células CD20-positivas (Tabela 43). Resultados semelhantes foram obtidos durante períodos de incubação de 5 e 10 minutos para a faixa de pH 2,9 a 4,6 (Tabela 44). Então, o anticorpo conjugado (2B8-MX-DTPA derivado de CHO) foi incubado à temperatura ambiente com acetato 90Y em pH durante os tempos indicados (Tabela 44) . Os resultados foram comparáveis aos obtidos usando o anticorpo 2B8-4 9 (Tabelas 43 e 44) .

Tabela 43. Cinética de Radiomarcação In2B8: Efeito do pH em Radioincorporação and Ligação a Células Positivas CD20

Tabela 44. Cinética de Radiomarcação In2B8: Efeito do Tempo de Incubação em Radioincorporação e Ligação a Células Positivas-CD20

Imunorreactividades de In2B8 e Y2B8 preparados de 2B8 CHO foram determinadas usando o método de Lindmo et al. Quantidades crescentes de células SB CD2O-positivas recentemente colhidas foram incubadas com uma quantidade fixa de In2B8 ou Y2B8 em condições de excesso de antigeno. A análise reciproca de marcação dos dados de ligação permitiu que imunorreactividades de 80.6% e 72.2% para In2B8 e Y2B8, respectivamente, fossem determinadas (Figuras 37 e 38).

D. Especificações de Divulgação de In2B8 e Y2B8 derivado de CHO

Dois lotes de grau clinico In2B8/Y2B8 de radiomarcação foram usados para preparar seis lotes cada de In2B8 e Y2B8. O In2B8 e Y2B8 foram preparados usando as versões em pequena escala dos protocolos de radiomarcação actualmente usados nos ensaios clínicos. Cada lote de 2B8-MX-DTPA radiomarcado foi testado para radioincorporação e ligação a CD20-positivo (SB) e células humanas CD2O-negativas (HSB). Estes resultados estão resumidos nas Tabelas 45 e 46. Para os seis lotes de In2B8 preparados, a radioincorporação variou de 98,9% a 99.3% com média de 99,1%. A ligação a células CD2O-positivas variou de 81,9% a 85,1% com média de 83,6%; a ligação a células CD20- negativas foi <4%. Para os seis lotes de Y2B8 preparados, a radioincorporação variou de 97,4% a 98,7% com média de 98,2%. A ligação a células

CD2O-positivas variou de 81,4% a 82,7% com uma média de 81,9%; a ligação a células CD20- negativas foi <8%.

Tabela 45. Resultados dos Testes de Divulgação para ln2B8 Derivado de CHO Preparado Usando o Protocolo do Kit de Radiomarcação

Média = 99,1 % Média=83,6 % Média = 2,9% SD=0,2 % SD=1,1% SD=0,4%

Tabela 46. Resultados dos Testes de Divulgação para ln2B8 Derivado de CHO Preparado Usando o Protocolo do Kit de Radiomarcação

V. Discussões e Conclusões 0 anti-CD2o anticorpo monoclonal murino (2B8) clonado e expresso em células CHO (2B8 derivado de CHO) mantém a especificidade de células humanas CD20-positivas como mostrado por FACS e análise competitiva de ligação. A ligação a células T humanas foi mínima. A afinidade do anticorpo para células CD2O-positivas foi determinada como sendo 1.3 X 1O_10 M usando um ensaio de ligação competitivo. Usando o mesmo ensaio, o anticorpo 2B8 derivado de bioreactores de fibras ocas deu um valor de afinidade de 2.5 1Ο_10 Μ X. o anticorpo 2B8 CHO foi reagido com MX-DTPA para formar um conjugado, 2B8-MX-DTPA, mantendo a retenção conveniente de imunorreactividade. A melhor incorporação de quelato foi determinada medindo a radioincorporação com ηιΙη e foi alcançada depois da incubação durante oito horas à temperatura ambiente. Protocolos de radiomarcação do conjugado 2B8-MX-DTPA foram optimizados para 90Y ou niIn em relação ao pH e tempo de incubação para assegurar a radioincorporação máxima e a retenção de imunorreactividade.

Os resultados de várias preparações de In2B8 e Y2B8 demonstram a reprodutibilidade do protocolo de radiomarcação usado para preparar doses clínicas. Com base nesses resultados de radiomarcação, sugere-se que as especificações de divulgação para radioincorporação e ligação, usando células CD20-positivas liofilizadas, sejam estabelecidas em >95% e >70%, respectivamente.

Conjuntamente, estes resultados mostram a comparabilidade de 2B8 derivado de CHO e 2B8-49 derivado por fibras ocas e indicam a adequação do 2B8-MX-DTPA derivado de CHO para uso em ensaios clínicos.

Finalmente, a presente divulgação descreve um procedimento de marcação, chamado de método de "misturar-e-injectar", para a preparação de doses clínicas de anticorpos radiomarcados que remove a necessidade da etapa actualmente usada de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) para retirar o radioisótopo não ligado a proteína. 0 protocolo simplificado elimina esta etapa trabalhosa de purificação mantendo um alto nível de incorporação de radioisótopo (> 95%) e melhora a retenção de imunorreactividade (> 70%). O conjugado radiomarcado clinicamente formulado foi descoberto como estável in vitro quando incubado a 4 o C durante 4 8 horas com base na retenção do radioisótopo e imunorreactividade. Além disso, o conjugado radiomarcado era estável quando incubado no soro humano a 37 °C durante 72 horas. Os estudos de biodistribuição em ratos BALB/c não demonstraram nenhum depósito de tecido invulgar e nenhuma acumulação significativa no osso. Estimativas de doses absorvidas de radiação para um ser humano de 70 kg "padrão" foram comparáveis às obtidas usando o teste clínico contínuo de 2B8-MX-DTPA marcado com 90Y. Os resultados desses estudos mostraram que 2B8-MX-DTPA marcado com 90Y produzido usando o protocolo de "misturar-e-injectar" foram comparáveis aos preparados usando o processo HPLC convencional. A validação do protocolo de escala para preparar o grau clínico de conjugado radiomarcado mostrou que o método pode ser reproduzido e que o produto era comparável ao produzido usando o método de HPLC actual. Os resultados destes estudos pré-clínicos indicam que este novo protocolo de "misturar-e-injectar" pode ser usado para preparar 2B8-MX-DTPA marcado com 90Y adequado para uso em testes clínicos.

Bibliografia

As citações indicadas a seguir são incorporadas por referência: 1. Adams, R.A., Flowers, A., and Davis, B.J. Direct Implantation and Transplantation of Human Acute Lymphoblastic Leukemia in amsters, SB-2. Câncer Research 28: 1121-1125, 1968. 2. Adams, R.A. Formal Discussion: The Role of

Transplantation in the Experimental Investigation of Human Leukemia and Lymphoma. Câncer Res. 27(1) : 24 7 9— 2482, 1967. 3. Lindmo, T., Boven, E., Cuttitta, F., Fedoroko, J., and Bunn, P.A., J. Immunol. Methods, 72: 77- 1984. 4. Kozak, R.W., Raubitschek, A., Mirzadeh, S., Brechbiel, M.W., Junghaus, R., Gansow, O.A., and Waldmann, T.A. Câncer Res. (1989) 49:2639-2644. 5. Parker, B.A., Halpern, S.E., Miller, R.A., Hupf, H., Shawler, D.L., Collins, H.A., Amox, D., White, C.A. and Royston, I. N. Eng. J. Med., submitted. 6. Leland, J.K. and Powell, M.J. J. (1990) Electrochem. Soc. 137, 3127. 7. Mu 1 ler, R. J. Immunological Methods (1980) 34, 345. 8. Mirzadeh, S., Brechbiel, M.W., Atcher, R.W. and Gansow, O.A. (1990) Bioconjugate Chemistry 1(1), 59. 9. Brechbiel, M.W., Gansow, O.A., Atcher, R.W., Sclom, J., Esteban, J., Simpson, D.E. and Colcher, D. (1986) 25, 2772.

Lisboa, 5 de Janeiro de 2015

Claims (18)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Processo de radiomarcação de um anticorpo conjugado a um quelante com ηιΙη para administração a um pacientecompreendendo: (i) misturar um anticorpo conjugado a um quelante com uma solução contendo inIn para formar uma mistura; (ii) incubar a mistura a uma temperatura apropriada durante cerca de 30 minutos para produzir um anticorpo radiomarcado, em que o anticorpo radiomarcado possuimais de 95% de radioincorporação; e (iii) diluir o anticorpo radiomarcado num tampão de formulação para uma concentração apropriada para a administração a um paciente, que pode ser administrado diretamente ao paciente sem purificação adicional do 211Ιη não incorporado, em que o tampão de formulação compreende fosfato salino tamponado ou solução salina fisiológica, um radioprotector e quelante não conjugado.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1 em que o anticorpo conjugado a um quelante compreende um anticorpo anti-CD20 .
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 2 em que o anticorpo anti-CD20 é 2B8-MX-DTPA.
4. 4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em que a solução que contém ηιΙη éajustadaa um pH entre 3 a 5 antes de ser misturada com o anticorpo conjugado a um quelante.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 4 em que o pH é ajustado com uma solução de acetato de sódio com baixo teor de metal.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 5 em que a solução de acetato de sódio se encontra numa concentração de 10 a 1000 mM.
7. 7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 em que a quantidade em volume de inIn usada encontra-se entre 5 e 100 mCi dividida pela concentração de radioactividade quando da marcação.
8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 7 caracterizado pelo facto de a quantidade em volume de 211Ιη usada ser cerca de 5,5 mCi dividida pela concentração de radioactividade aquando da marcação.
9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 8 em que cerca de 1 ml de anticorpo conjugado de MX-DTPA a uma concentração de de cerca de 0,5 a 30 mg/ml é misturado com a solução que contém 111In.
10. 10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações da 1 à 9 em que o tampão de formulação é adicionado,numa quantidade necessária, para atingir um volume final total de 10 ml a 50 ml.
11. 11. Processo de acordo com a reivindicação 10 em que o radioprotector é albumina sérica humana (HSA), um ascorbato, ácido ascórbico, fenol, sulfactos, glutinosa, cisteina, ácido gentísico, ácido nicotínico, palmitato de ascorbila, HOP(:0)H2, glicerol, formaldeido sulfoxilato de sódio, Na2S2O5, Na2S203, ou SO2. 12
12. 12. Processo de acordo com a reivindicação 11 em que o radioprotector é HSA.
13. 13. Processo de acordo com a reivindicação 12 em que o HSA se encontra numa concentração de 1 a 25% (w/v).
14. 14. Processo de acordo com a reivindicação 13 em que a concentração de HSA é de cerca de 7.5% (p/v).
15. 15. Processo de acordo com a reivindicação 11 em que o radioprotector é um ascorbato.
16. 16. Processo de acordo com a reivindicação 15 em que o ascorbato encontra-se numa concentração de 1 a 100 mg/ml.
17. 17. Processo de acordo com a reivindicação 10 em que o quelante não conjugado é DTPA.
18. 18. Processo de acordo com a reivindicação 17 em que a concentração de DTPA é de cerca de 1 mM. Lisboa, 5 de Janeiro de 2015