JP7498714B2 - Ｂ型肝炎ウイルスを中和する抗体およびその使用 - Google Patents

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Description

配列表に関する記載
本出願に関連する配列表を、紙書類に変えてテキスト形式で提出し、それにより、本明細書に引用により包含させる。配列表を含むテキストファイルの名称は930485_402WO_SEQUENCE_LISTING.txtである。該テキストファイルは１０９KBであり、２０１９年１２月１６日に作成し、ＥＦＳ－Ｗｅｂにより電子的に提出する。
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)およびデルタ型肝炎ウイルス(ＨＤＶ)に対する免疫療法およびその使用に関する。ここに記載する抗Ｂ型肝炎結合タンパク質、例えば、抗体およびその抗原結合フラグメントは、ＨＢＶエンベロープタンパク質のＳドメインの抗原性ループ領域(ＨＢｓＡｇ)に位置するエピトープに結合できる。ある実施態様において、抗Ｂ型肝炎結合タンパク質は既知ＨＢｓＡｇ遺伝子型の何れかまたは全ておよびＨＢｓＡｇバリアントに結合でき、ＨＢＶ感染を中和できる。このような結合タンパク質をコードする核酸およびそれを発現する宿主細胞もここで提供される。さらに、本発明は、疾患の診断、予防および処置ならびにスクリーニング方法において、ここに記載する抗体および抗体フラグメントを使用する方法を提供する。
背景として、ＨＢＶは、(ｉ)３個の関連表面タンパク質(Ｂ型肝炎表面抗原、ＨＢｓＡｇ)および脂質を含むエンベロープおよび(ii)ウイルスＤＮＡゲノムおよびＤＮＡポリメラーゼを封入する正二十面体ヌクレオカプシドからなる。ＨＢＶカプシドは、ＲＮＡプレゲノム複製複合体パッケージング中に感染細胞のサイトゾルで形成され、粒子内腔におけるプレゲノムの逆転写により、ウイルスＤＮＡゲノム合成中に出芽する能力を獲得する。３個のＨＢＶエンベロープタンパク質Ｓ－ＨＢｓＡｇ、Ｍ－ＨＢｓＡｇおよびＬ－ＨＢｓＡｇは、小胞体で複合体膜貫通折り畳みの形を取り、ジスルフィド結合ホモおよびヘテロ二量体を形成する。細胞内膜での出芽中、細胞質ｐｒｅＳ領域の短直鎖状ドメインは、カプシド表面の結合部位と相互作用する。ビリオンは、その後血中に分泌される。さらに、表面タンパク質はカプシドの非存在下で出芽でき、サブウイルス粒子(ＳＶＰ)を形成し、またビリオンより３～４ｌｏｇ過剰で分泌される。高レベルのＨＢｓＡｇはＨＢｓＡｇ特異的Ｔ細胞応答を疲弊させ得て、慢性Ｂ型肝炎(ＣＨＢ)患者におけるウイルス免疫寛容の重要な因子として提唱されている(Chisari FV, Isogawa M, Wieland SF, Pathologie Biologie, 2010;58:258-66)。
Ｂ型肝炎ウイルスは、命を脅かす危険のある急性および慢性の肝感染症を引き起こす。急性Ｂ型肝炎は症状を伴うまたは伴わないウイルス血症と、劇症肝炎発生のリスクにより特徴づけられる(Liang TJ, Block TM, McMahon BJ, Ghany MG, Urban S, Guo JT, Locarnini S, Zoulim F, Chang KM, Lok AS. Present and future therapies of hepatitis B: From discovery to cure. Hepatology. 2015 Aug 3. doi: 10.1002/hep.28025。[印刷前電子版])。１９８２年以降Ｂ型肝炎に対する効果的なワクチンが利用可能となっているにも関わらず、ＷＨＯの報告によると、２億４千万人がＢ型肝炎に慢性的に感染し、毎年７８万を超える人々がＢ型肝炎合併症により死亡する。慢性Ｂ型肝炎(ＣＨＢ)患者の約１／３が硬変、肝不全および肝細胞癌を発症し、年間６０万人の死亡の原因である(Liang TJ, Block TM, McMahon BJ, Ghany MG, Urban S, Guo JT, Locarnini S, Zoulim F, Chang KM, Lok AS. Present and future therapies of hepatitis B: From discovery to cure. Hepatology. 2015 Aug 3. doi: 10.1002/hep.28025。[印刷前電子版])。
ＨＢＶ感染患者について、ＨＤＶの同時感染または重複感染の結果として、重度合併症が発症し得る。ＷＨＯによると、世界で約１５００万人がＤ型肝炎に感染する。ＨＤＶは、ＨＢＶの存在下でのみ増殖できるため、サブウイルスサテライトと考えられる。ＨＤＶは、最小既知動物ウイルスの一つであり(４０nm)、そのためにそのゲノムはわずか１.６kbであり、ＳおよびＬ ＨＤＡｇをコードする。ＲＮＡポリメラーゼを含むＨＤＶのゲノム複製に必要な全ての他のタンパク質は宿主細胞により提供され、ＨＤＶエンベロープはＨＢＶにより提供される。許容状態細胞に導入されたとき、ＨＤＶ ＲＮＡゲノムは複製し、複数コピーのＨＤＶコード化タンパク質に結合して、リボヌクレオタンパク質(ＲＮＰ)複合体を構築する。ＲＮＰは、ＨＢＶエンベロープタンパク質により細胞から排出され、これは分泌前にプレゴルジ区画の内腔で出芽するリポタンパク質小胞を集合させることができる。さらに、ＨＢＶエンベロープタンパク質はＨＤＶを非感染細胞にターゲティングさせる機構も提供し、それにより確実にＨＤＶを拡散させる。
ＨＤＶが原因の合併症は、急性感染における肝不全を経験する高い可能性および肝硬変への急速な進行と、慢性感染における肝癌の発症の割合の増加を含む。Ｂ型肝炎ウイルスと組み合わせて、Ｄ型肝炎は、全肝炎感染症で最高の致死率２０％である(Fattovich G, Giustina G, Christensen E, Pantalena M, Zagni I, Realdi G, Schalm SW. Influence of hepatitis delta virus infection on morbidity and mortality in compensated cirrhosis type B. Gut. 2000 Mar;46(3):420-6)。慢性ＨＤＶ感染で唯一承認されている治療はインターフェロン－アルファである。しかしながら、インターフェロン－アルファでのＨＤＶの処置は比較的非効率的であり、忍容性が良好ではない。インターフェロン－アルファでの処置は、患者の１／４で、処置後６か月間持続性ウイルス学的応答をもたらす。また、ヌクレオシ(チ)ドアナログ(ＮＡ)がデルタ型肝炎で広く試験されているが、向こうであると考えられる。ＮＡとインターフェロンの組み合わせ処置もまた期待外れであることが判明した(Zaigham Abbas, Minaam Abbas Management of hepatitis delta: Need for novel therapeutic Options. World J Gastroenterol 2015 August 28; 21(32): 9461-9465)。したがって、新しい治療選択肢が必要である。
ここに提供する図は、本発明に包含される主題を、より詳細に説明することを意図する。図は、本開示をいかなる方法によっても限定することを意図しない。
図１は、直接抗原ベースのＥＬＩＳＡアッセイで決定して、記載する濃度でのＨＢＣ３４－Ｖ７および本発明の２個の操作された抗体(「ＨＢＣ３４－Ｖ３４」；「ＨＢＣ３４－Ｖ３５」)のＨＢｓＡｇ ａｄｗ(上部パネル)およびＨＢｓＡｇ ａｄｒ(下部パネル)への結合を示す。全抗体はＩｇＧ１として産生した(ｇ１ｍ１７、１アロタイプ)。
図２Ａ～２Ｋは、ＨＢＣ３４－Ｖ７、ＨＢＣ３４－Ｖ３４およびＨＢＣ３４－Ｖ３５の知られる全てのＨＢｓＡｇ遺伝子型(それぞれ(Ａ)～(Ｊ))および模擬対照(Ｋ)への結合を示す。ＰＣＴ公報ＷＯ２０１７／０６０５０４の実施例５に示される、ＨＢｓＡｇ抗原性外側ループを表す遺伝子型代表的配列を使用した。ＦＡＣＳにより染色を実施した。抗体濃度は、グラフのｘ軸に示すとおりであった。
図３Ａ～３Ｖは、あるＨＢＣ抗体のＨＢｓＡｇへのインビトロ結合(３Ａ～３Ｒ)および中和(３Ｓ～３Ｖ)を示す。図３Ａおよび３Ｂは、直接抗原ベースのＥＬＩＳＡアッセイにおける、野生型またはバリアントＦｃ領域を有するＨＢＣ３４－Ｖ７およびＨＢＣ３４－Ｖ３５のＨＢｓＡｇ ａｄｗへの結合を示す(２つの実験；「実験１」のデータを図３Ａに示し、「実験２」のデータを図３Ｂに示す)。抗原結合曲線を各図の上部パネルに示す。ＥＣ５０値(Graphpad prismを使用する曲線のフィッティングにより決定)を、各図の中央パネルに示す。非被覆プレート(対照)への結合を、各図の下部パネルに示す。Ｆｃ領域：「ＨＢＣ３４ｖ７」および「ＨＢＣ３４－Ｖ３５」＝野生型Ｆｃ；「ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ」＝Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを有するＦｃ。「ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥ」＝Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ／Ｇ２３６Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅを有するＦｃ。３ロットのＨＢＣ３４－Ｖ３５を試験した。２ロットのＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳおよび２ロットのＨＢＣ３４－ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥを試験した。１ロットのＨＢＣ３４－Ｖ７を使用した。図３Ｃ～３Ｈは、全１０個の知られるＨＢＶ遺伝子型または模擬対照からのＨＢｓＡｇを発現するＥｘｐｉ２９３細胞へのＨＢＣ３４－Ｖ３５、ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳおよびＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥの結合を示す。結合をフローサイトメトリーにより決定した。データを、模擬トランスフェクト細胞で得たシグナルのゲートアウトにより定義した、トランスフェクト集団の平均蛍光強度(ｙ軸)として表す。各ＨｂｓＡｇについて、３個の試験品の連続希釈を試験した(１２点、１対３、１０μg／mlから開始)。図３Ｉ～３Ｒは、１９個のＨＢｓＡｇバリアントまたは模擬対照からのＨＢｓＡｇを発現するＥｘｐｉ２９３細胞へのＨＢＣ３４－Ｖ３５、ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳおよびＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥの結合を示す。結合をフローサイトメトリーにより決定した。データを、模擬トランスフェクト細胞で得たシグナルのゲートアウトにより定義した、トランスフェクト集団の平均蛍光強度として表す。各ＨｂｓＡｇについて、３個の試験品の連続希釈を試験した(１２点、１対３、１０μg／mlから開始)。抗体濃度はｘ軸に示すとおりであった。図３Ｓおよび３Ｕは、ＮＴＣＰを発現するＨＢＶＤ感染ＨｅｐＧ２細胞の細胞培養上清におけるＨＢｓＡｇ(上部)およびＨｂｅＡｇ(下部)のレベルの測定により評価して、ＨＢＶ遺伝子型Ｄに対する示すＨＢＣ抗体の中和能を示す。データは、２つの独立した実験の一つの平均±ＳＤを表す。図３Ｔおよび３ＶはＥＣ５０値を示す。ＥＣ５０値の幾何平均および範囲(カッコ内)は、２つの独立した実験から決定した。
図４は、ＨＤＶシュードタイピングシステムを使用する個々のＨＢＶ遺伝子型の、ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥによる中和(ＥＣ５０値)を示す。
図５～８は、ＨＢＶ感染のインビボマウスモデルにおける血清ＨＢＡｇレベルに対するＨＢＣ３４－Ｖ３５の効果を示す。実施例５に記載のとおり、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ感染ＳＣＩＤマウスに初代ヒト肝細胞を移植し、１mg／kg、５mg／kgもしくは１５mg／kgのＨＢＣ３４－Ｖ３５またはＰＢＳ(対照)を投与した。図５は、処置前後の血清ＨＢＶ ＤＮＡ濃度を示す。
図６は、処置前後の血清ＨＢｓＡｇ濃度を示す。
図７は、処置前後の血清ＨＢｅＡｇ濃度を示す。
図８は、処置前後の血清ＨＢｃｒＡｇ濃度を示す。「Ｔｍｔ」＝処置。
図９Ａ～９Ｆは、ヒトＦｃＲへのＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳおよびＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥの結合を示す。(Ａ)～(Ｅ)バイオレイヤー干渉法(ＢＬＩ)により評価したＦｃγＲへの結合。２μg／mlのＨｉｓタグ付ヒトＦｃγＲ((Ａ)ＦｃγＲIIａアレルＨ１３１；(Ｂ)ＦｃγＲIIａアレルＲ１３１；(Ｃ)ＦｃγＲIIIａアレルＦ１５８；(Ｄ)ＦｃγＲIIIａアレルＶ１５８；(Ｅ)ＦｃγＲIIｂ)を、抗ペンタ－Ｈｉｓセンサーで６分間捕捉した。次いでＦｃγＲ負荷センサーを、１μg／mlのaffiniPure F(ａｂ')2フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ(ａｂ')2フラグメント特異的(Ｆａｂフラグメントを介してヒトｍＡｂを交差架橋ため)存在下、２μg／mlの各ｍＡｂを含む動態緩衝液(ｐＨ７.１)の溶液に５分間曝し(プロットの左部分)、さらに４分間同じ緩衝液での解離段階が続いた(プロットの右部分)。結合および解離プロファイルを、Ｏｃｔｅｔ(登録商標)RED96(ＦｏｒｔｅＢｉｏ)を使用して干渉パターンの変化としてリアルタイムで測定した。(Ｆ)バイオレイヤー干渉法(ＢＬＩ)を使用して決定した、種々のｐＨでのＨＢＣ３４抗体のＦｃＲｎへのインビトロ結合。時点０秒は、ベースライン緩衝液から抗体含有緩衝液への切り替えを表す。時点３００秒(縦の破線)は、対応するｐＨでのブランク緩衝液への切り替えを表す。曲線は、干渉パターンの変化における結合および解離プロファイルを示す。
図１０は、Ｏｃｔｅｔ(登録商標)により測定した、ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳおよびＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥのヒトＣ１ｑへの結合を示す。抗ヒトＦａｂ(ＣＨ１)センサーを、１０μg／mlで１０分間、ＨＢＣ３４ｖ３５－ＭＬＮＳおよびＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥ ｍＡｂの完全ＩｇＧ１をＦａｂフラグメントを介して捕捉するために使用した。次いで、ＩｇＧ負荷センサーを、３μg／mlの精製ヒトＣ１ｑを含む動力学緩衝液(ｐＨ７.１)の溶液に４分間曝し(プロットの左部分)、さらに４分間同じ緩衝液での解離段階が続いた(プロットの右部分)。結合および解離プロファイルを、Ｏｃｔｅｔ(登録商標)RED96(ＦｏｒｔｅＢｉｏ)を使用して干渉パターンの変化としてリアルタイムで測定した。
図１１Ａおよび１１Ｂは、操作されたJurkat細胞におけるＮＦＡＴ介在ルシフェラーゼレポーターの受容体結合活性化を使用するヒトＦｃγＲIIIａのインビトロ活性化を示す。ＦｃγＲIIIａ活性化を、組み換えＨＢｓＡｇ(Engerix B)を標的抗原として使用する、検証された、市販のバイオレポーターアッセイを使用して試験した。ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳおよびＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥおよび対照(Ｃｔｒ)ｍＡｂの連続希釈を、３７℃で２５分間、０.２μg／mlのＨＢｓＡｇとインキュベートした。ＦｃγＲIIIａ低親和性アレルＦ１５８(Ａ)またはＦｃγＲIIIａ高親和性アレルＶ１５８(Ｂ)を発現するJurkatエフェクター細胞(Promega)をアッセイ緩衝液に再懸濁し、次いでアッセイプレートに加えた。３７℃で２４時間インキュベーション後、Ｂｉｏ－ＧｌｏTMルシフェラーゼアッセイ試薬(Promega)を加え、発光をルミノメーター(Bio-Tek)を使用して定量した。
図１２Ａおよび１２Ｂは、操作されたJurkat細胞におけるＮＦＡＴ介在ルシフェラーゼレポーターの受容体結合活性化を使用するヒトＦｃγＲIIａのインビトロ活性化を示す。ヒトＦｃγＲIIａの活性化を、組み換えＨＢｓＡｇ(Engerix B)を標的抗原として使用する、検証された、市販のバイオレポーターアッセイを使用して試験した。ＨＢＣ３４ｖ３５－ＭＬＮＳおよびＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥおよび対照ｍＡｂ(Ｃｔｒ)の連続希釈を、２μg／ml(Ａ)または０.２μg／ml(Ｂ)のＨＢｓＡｇと、３７℃で２５分間インキュベートした。ＦｃγＲIIａ高親和性アレルＨ１３１を発現するJurkatエフェクター細胞(Promega)をアッセイ緩衝液に再懸濁し、次いでアッセイプレートに加えた。３７℃で２３時間インキュベーション後、Ｂｉｏ－ＧｌｏTMルシフェラーゼアッセイ試薬(Promega)を加え、発光をルミノメーター(Bio-Tek)を使用して定量した。
図１３Ａ～１３Ｂは、操作されたJurkat細胞におけるＮＦＡＴ介在ルシフェラーゼレポーターの受容体結合活性化を使用するヒトＦｃγＲIIｂのインビトロ活性化を示す。ヒトＦｃγＲIIｂの活性化を、組み換えＨＢｓＡｇ(Engerix B)を標的抗原として使用する、検証された、市販のバイオレポーターアッセイを使用して試験した。ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳおよびＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥおよび対照ｍＡｂ(Ｃｔｒ)の連続希釈を、１μg／mlのＨＢｓＡｇと３７℃で１５分間インキュベートした。ＦｃγＲIIｂを発現するJurkatエフェクター細胞(Promega)をアッセイ緩衝液に再懸濁し、次いでアッセイプレートに加えた。３７℃で２０時間インキュベーション後、Ｂｉｏ－ＧｌｏTMルシフェラーゼアッセイ試薬(Promega)を加え、発光をルミノメーター(Bio-Tek)を使用して定量した。図１３Ｂにおいて、図１３Ａからの対照ｍＡｂを「Ｃｔｒ ｍＡｂ１」と指定する。「Ｃｔｒ ｍＡｂ２」と指定した第二対照ｍＡｂは、ＦｃγＲIIｂへの結合を増強するＧ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒの変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃを含むＨＢＣ３４－Ｖ３５の異形である(Mimoto et al., Prot Eng Des Sel. 26(10):589-598 (2013))。
図１４Ａおよび１４Ｂは、ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳおよびＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥ存在下、ヒト初代ＮＫ細胞によるＰＬＣ／ＰＲＦ／５ヒト肝細胞癌細胞のインビトロ死滅を示す。(Ａ)ＡＤＣＣを、ヘテロ接合型高(Ｖ１５８)および低(Ｆ１５８)親和性ＦｃγＲIIIａ(Ｆ／Ｖ)発現について先に遺伝子型同定された１ドナーから新たに単離したＮＫ細胞を使用して、試験した。ＨＢＣ３４－Ｖ３５、ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ、ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥ、抗ＨＢＶ ｍＡｂ １７.１.４１および対照ｍＡｂの連続希釈を、ＨＢｓＡｇ分泌肝細胞癌細胞株ＰＬＣ／ＰＲＦ／５(Alexander細胞とも称する)に加えた。ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を、抗体と室温で１０分間インキュベートした。ＮＫ細胞をアッセイプレートに加え(エフェクター細胞対標的細胞比１０：１)、３７℃で４時間インキュベートした。細胞死を、乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)放出の測定により決定した。(Ｂ)フローサイトメトリーにより評価した、ＨＢＣ３４－Ｖ３５および１７.１.４１ ｍＡｂによるＰＬＣ／ＰＲＦ／５ヒト肝細胞癌細胞の染色。細胞を徹底的に洗浄し、ホルムアルデヒド(４％)で固定しまたは固定および透過処理(サポニン０.５％)した後、種々の濃度のＨＢＣ３４－Ｖ３５および１７.１.４１ ｍＡｂで染色した。これらヒト(ＨＢＣ３４－Ｖ３５の場合、操作されたヒト)ｍＡｂの結合を、Alexa Fluor(登録商標)６４７ AffiniPure F(ａｂ')2フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的抗体を使用するフローサイトメトリーにより検出した。
図１５Ａおよび１５Ｂは、ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳおよびＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥおよびＨＢｓＡｇ存在下の初代ヒトＮＫ細胞のインビトロ活性化を示す。ＮＫ細胞の活性化を、(Ａ)ホモ接合型高(Ｖ１５８)または(Ｂ)低(Ｆ１５８)親和性ＦｃγＲIIIａ発現について先に遺伝子型同定された２ドナーから新たに単離した細胞を使用して、試験した。ＨＢＣ３４－Ｖ３５、ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥおよびＨＢＣ３４ｖ３５－ＬＡＬＡ ｍＡｂの連続希釈を、ＮＫ細胞と４時間インキュベートした。ＮＫ細胞の活性化を、ＮＫ細胞活性同定のための機能的マーカーとして抗ＣＤ１０７ａ ｍＡｂでＮＫ細胞を染色することにより、フローサイトメトリーで測定した。ＬＡＭＰ－１としても知られるＣＤ１０７ａは、ＮＫ細胞の脱顆粒のマーカーである。
図１６は、ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥとポリメラーゼ／逆転写酵素阻害剤エンテカビル(ＥＴＶ)のインビトロ薬物相互作用試験結果を示す。
詳細な記載
特に断らない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、当業者により共通して理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書をとおして、他の解釈が必要でない限り、用語「含む」およびその異形、例えば「含み」および「含んで」は、例えば「有する」、「有し」、「包含する」、「包含し」などと同義に使用され、記載されるメンバー、比率、整数(適切な場合、その分数、例えば、整数の１／１０および１／１００を含む)、濃度または工程を含むことが含意されるが、あらゆる他の記載されていないメンバー、比率、整数、濃度または工程の排除しないことは理解される。あらゆる濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲または整数範囲は、特に断らない限り、言及される範囲内のあらゆる整数値および、適切であるとき、その分数(例えば、整数の１／１０および１／１００)を含むと理解される。また、ポリマーサブユニット、サイズまたは厚さなどの何らかの物理的特性に関連してここに記載する全ての数値範囲は、特に断らない限り、記載する範囲のあらゆる整数を含むと理解される。用語「からなる」は、あらゆる記載他の記載されていないメンバー、整数または工程が除外される、用語「含む」の１実施態様をいう。本開示において、用語「含む」は、用語「からなる」を含む。用語「から本質的になる」は「含む」と同意義ではなく、請求された特定の物質または工程または請求される主題の基本的特徴に実質的に影響しないものをいう。
さらに、ここに記載する構造および置換基の種々の組み合わせ由来の個々の化合物または化合物群は、各化合物または化合物群が個々に示されているのと同程度に本出願により開示される。故に、特定の構造または特定の置換基の選択は、本発明の範囲内である。
本発明の記載(特許請求の範囲を含む)において使用される「ある」および「該」および類似用語は、ここで特に断らない限りまたはここでの記載に明らかに反しない限り、単数および複数両者にわたると解釈されるべきである。選択肢(例えば、「または」)の使用は、これら選択肢の一つ、両方または何らかの組み合わせを意味すると理解されるべきである。ここでの値の範囲の記載は、該範囲内に入る各別々の値を個々に記載する省略法として働くことが意図される。ここで特に断らない限り、各個々の値は、それが独立してここに記載されているかのように本開示に包含される。本明細書におけるあらゆる用語は、ここに開示する主題の実施に必須であるとして何らかの請求されていない要素を示すとして解釈されるべきではない。
用語「実質的に」は「完全に」を除外せず、例えば、Ｙが「実質的にない」組成物は、Ｙが完全になくてよい。ある実施態様において、「実質的に」は、対照組成物、方法または使用と比較した本発明の組成物、方法または使用のある量、効果または活性をいい、対照組成物、方法または使用の量、効果または活性の５０％を超えない、例えば４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％または１％またはそれ未満を超えない量、効果または活性の減少をいう。
ここで使用する用語「約」は、特に断らない限り、記載する範囲、値または構造の±２０％をいう。
「所望による」または「所望により」は、その後に記載される要素、成分、事象または状況があってもなくてもよいことを意味し、本記載は、該要素、成分、事象または状況がある場合およびそれらがない場合を含む。
ここで使用する用語「疾患」は、用語「障害」および「状態」(医学的状態におけるような)と、全てがヒトまたは動物身体またはその一部の、正常機能を障害し、一般に特徴的な徴候および症状を発症し、罹患したヒトまたは動物の寿命を縮めるかまたはクオリティ・オブ・ライフを低減する異常状態を反映する点で、一般に同義であり、相互交換可能に使用される。
ここで使用する対象または患者の「処置」の記載は、防止、予防、衰弱、改善および治療を含むことを意図する。処置の利益は、臨床結果の改善；疾患に付随する症状の低減または軽減；症状の発症の減少；クオリティ・オブ・ライフ改善；無疾患状態延長；疾患の程度の低減；疾患状態の安定化；疾患進行遅延；寛解；生存；生存延長；またはこれらの何らかの組み合わせを含む。
用語「対象」または「患者」は、ヒトを含む全ての哺乳動物を意味するようにここで相互交換可能に使用される。対象の例は、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタおよびウサギを含む。ある実施態様において、患者はヒトである。
ここで使用する「アミノ酸」は、天然に存在するおよび合成のアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と類似の方法で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによりコードされたもの、ならびに後に修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタミン酸およびＯ－ホスホセリンである。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素に結合したα炭素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムをいう。このようなアナログは、修飾Ｒ基(例えば、ノルロイシン)または修飾ペプチド主鎖を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的化学構造と異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸に類似する方法で機能する、化学化合物をいう。
ここで使用する用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」およびこれらの用語の異形は、互いに(通常または修飾)ペプチド結合により結合した少なくとも２個のアミノ酸を含む分子をいう。例えば、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、各々ペプチド結合により少なくとも１個の他のものに結合された、遺伝子コードにより規定される２０アミノ酸またはアミノ酸アナログもしくは模倣体から選択される、複数のアミノ酸を含み得るまたはそれからなり得る。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、Ｌ－アミノ酸および／またはＤ－アミノ酸(またはそのアナログもしくは模倣体)を含み得るまたはそれからなり得る。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」はまた、非ペプチド性構造要素を含むペプチドアナログとして定義される、「ペプチド模倣体」も含み、このペプチドは天然親ペプチドの生物学的作用を模倣するまたは拮抗することができる。ある実施態様において、ペプチド模倣体は、酵素により切断しやすいペプチド結合などの特徴を欠く。
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、遺伝子コードにより規定される２０アミノ酸以外のアミノ酸を、これらアミノ酸に加えて含んでよくまたは遺伝子コードにより規定される２０アミノ酸以外のアミノ酸からなり得る。ある実施態様において、本開示におけるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、当業者に知られ、ここに記載されるものを含む、翻訳後成熟過程などの天然過程または化学過程(例えば、合成過程)により修飾されたアミノ酸を含み得る。このような修飾は、ポリペプチドのどの場所、例えば、ペプチド骨格中；アミノ酸鎖中；またはカルボキシ末端またはアミノ末端で起きてもよい。ペプチドまたはポリペプチドは、ユビキチン化後のように分岐していてよくまたは分岐を伴いまたは伴わずに環状であってよい。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」はまた修飾ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を含む。例えば、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボース化、アミド化、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合固定、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合固定、ホスファチジルイノシトールの共有結合固定、共有結合または非共有結合架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、ペグ化を含むグリコシル化、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解過程、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セネロイル化(seneloylation)、硫酸化、アルギニル化などのアミノ酸付加またはユビキチン化を含み得る。このような修飾は、文献に記載されている(Proteins Structure and Molecular Properties (1993) 2nd Ed., T. E. Creighton, New York; Post-translational Covalent Modifications of Proteins (1983) B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York; Seifter et al. (1990) Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol. 182: 626-646およびRattan et al., (1992) Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci, 663: 48-62参照)。よって、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」は、例えばリポペプチド、リポタンパク質、糖ペプチド、糖タンパク質などを含み得る。本開示のタンパク質、ペプチドおよびポリペプチドのバリアントもまた考慮される。ある実施態様において、バリアントタンパク質、ペプチドおよびポリペプチドは、ここに記載する規定または対照アミノ酸配列のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９.９％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
ここで使用する「(ポリ)ペプチド」および「タンパク質」は、ペプチド結合により結合した複数のアミノ酸モノマーなどの、アミノ酸残基のポリマーに関して、相互交換可能に使用され得る。
「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、天然サブユニット(例えば、プリンまたはピリミジン塩基)または非天然サブユニット(例えば、モルホリン環)からなり得る共有結合により結合したヌクレオチドを含む、重合体化合物をいう。プリン塩基は、アデニン、グアニン、ヒポキサンチンおよびキサンチンを含み、ピリミジン塩基はウラシル、チミンおよびシトシンを含む。核酸モノマーはホスホジエステル結合またはそのような結合のアナログにより結合され得る。ホスホジエステル結合のアナログは、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート、ホスホロアニリダート、ホスホロアミダートなどを含む。
核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含むポリリボ核酸(ＲＮＡ)、ポリデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)を含み、これらいずれも一本鎖でも二本鎖でもよい。一本鎖であるならば、核酸分子はコード鎖または非コード(アンチセンス)鎖であり得る。ポリヌクレオチド(オリゴヌクレオチドを含む)およびそのフラグメントは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)またはインビトロ翻訳により産生できまたはライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用またはエキソヌクレアーゼ作用の何れかにより産生できる。
アミノ酸配列をコードする核酸分子は、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列のいくつかのバージョンは、またイントロンが同時転写または転写後機構を介して除去され得る限り、該イントロンも含み得る。異なるヌクレオチド配列が、遺伝子コードの重複性もしくは縮重またはスプライシングまたは両者の結果として、同じアミノ酸配列をコードし得る。
本開示の核酸分子のバリアントもまた考慮される。バリアント核酸分子は、ここに記載する規定または対照ポリヌクレオチドの核酸分子と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９.９％同一であるか約６５～６８℃で０.０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０.００１５Ｍ クエン酸ナトリウムまたは約４２℃で０.０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０.００１５Ｍ クエン酸ナトリウムおよび５０％ホルムアミドのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ポリヌクレオチドとハイブリダイズする。核酸分子バリアントは、標的分子への特異的結合など、ここに記載する機能性を有する融合タンパク質またはその結合ドメインをコードする能力を保持する。
ここで使用する用語「配列バリアント」は、対照配列と比較して１以上の改変を有するあらゆる配列をいい、ここで、対照配列は何らかの公開された配列および／または「配列および配列番号の表」(配列表)に列記の配列、すなわち配列番号１～配列番号１３９の何れかである。故に、用語「配列バリアント」は、ヌクレオチド配列バリアントおよびアミノ酸配列バリアントを含む。ある実施態様において、ヌクレオチド配列における配列バリアントについて、対照配列もまたヌクレオチド配列であり、一方、アミノ酸配列における配列バリアントについてのある実施態様において、対照配列もまたアミノ酸配列である。ここで使用する「配列バリアント」は、対照配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり得る。
「パーセント配列同一性」は、配列の比較により決定される、２以上の配列間の関連性をいう。配列同一性を決定する方法は、比較する配列間の最高マッチが得られるように設計され得る。例えば、配列を、最適比較目的で整列させ得る(例えば、最適アライメントのために第一および第二アミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを挿入し得る)。さらに、比較目的で非相同配列を無視し得る。ここでいうパーセント配列同一性は、特に断らない限り、対照配列の長さにわたり計算される。配列同一性および類似性を決定する方法は、公になっているコンピュータープログラムに見られ得る。配列アライメントおよびパーセント同一性計算は、ＢＬＡＳＴプログラム(例えば、ＢＬＡＳＴ ２.０、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＸ)を使用して、実施され得る。ＢＬＡＳＴプログラムで使用する数学的アルゴリズムは、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997に見ることができる。本開示で、配列分析ソフトウェアを分析に使用したとき、分析結果は、当該プログラムの「デフォルト値」に基づくことは理解される。「デフォルト値」は、最初に初期化したときにソフトウェアでもともとロードされている何れかの値またはパラメータのセットをいう。
核酸(ヌクレオチド)配列における「配列バリアント」は、対照配列におけるヌクレオチドの１以上が欠失もしくは置換されているまたは１以上のヌクレオチドが対照ヌクレオチド配列の配列に挿入されている、改変配列を有する。ヌクレオチドは、ここでは標準一文字表記(Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ)で述べる。遺伝子コードの縮重により、ヌクレオチド配列の「配列バリアント」は、各対照アミノ酸配列、すなわちアミノ酸「配列バリアント」を変化させるかまたは変化させないことがある。ある実施態様において、ヌクレオチド配列バリアントはアミノ酸配列バリアントをもたらさない(例えば、サイレント変異)。ある実施態様において、１以上の「非サイレント」変異をもたらすヌクレオチド配列バリアントが考えられる。ある実施態様において、本発明のヌクレオチド配列バリアントは、対照アミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をコードする。ここに開示するヌクレオチドおよびアミノ配列はまた対照または野生型ヌクレオチドまたはアミノ酸配列のコドン最適化バージョンをいう。ここに記載する実施態様の何れにおいても、本発明のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドを含む宿主細胞のためにコドン最適化され得る(例えば、Scholten et al., Clin. Immunol. 119:135-145 (2006)参照)。コドン最適化は、既知技術およびツールを使用して、例えば、GenScript(登録商標)OptimumGeneTMツールまたはGeneArt Gene Synthesis Tool(Thermo Fisher Scientific)を使用して、実施され得る。コドン最適化配列は、部分的にコドン最適化された(すなわち、少なくとも１コドンが宿主細胞における発現のために最適化される)および完全にコドン最適化された配列を含む。
アミノ酸配列における「配列バリアント」は、対照アミノ酸配列と比較して１以上のアミノ酸が欠失、置換または挿入されている改変配列を有する。改変の結果として、このような配列バリアントは、対照アミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する。例えば、対照配列の１００アミノ酸あたり、１０を超えない改変、すなわち欠失、挿入または置換の何れかの組み合わせを有するバリアント配列は、対照配列と「少なくとも９０％同一」である。
「保存的置換」は、特定のタンパク質の結合特性に顕著に影響しないまたは変えないアミノ酸置換をいう。一般に、保存的置換は、置換アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。保存的置換は、次のグループの一つに見られる置換を含む：グループ１：アラニン(ＡｌａまたはＡ)、グリシン(ＧｌｙまたはＧ)、セリン(ＳｅｒまたはＳ)、スレオニン(ＴｈｒまたはＴ)；グループ２：アスパラギン酸(ＡｓｐまたはＤ)、グルタミン酸(ＧｌｕまたはＺ)；グループ３：アスパラギン(ＡｓｎまたはＮ)、グルタミン(ＧｌｎまたはＱ)；グループ４：アルギニン(ＡｒｇまたはＲ)、リシン(ＬｙｓまたはＫ)、ヒスチジン(ＨｉｓまたはＨ)；グループ５：イソロイシン(ＩｌｅまたはＩ)、ロイシン(ＬｅｕまたはＬ)、メチオニン(ＭｅｔまたはＭ)、バリン(ＶａｌまたはＶ)；およびグループ６：フェニルアラニン(ＰｈｅまたはＦ)、チロシン(ＴｙｒまたはＹ)、トリプトファン(ＴｒｐまたはＷ)。これに加えてまたはこれとは別に、アミノ酸は、類似の機能、化学構造または組成(例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族または硫黄含有)による保存的置換グループにグループ分けされ得る。例えば、脂肪族グループ分けは、置換の目的で、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅを含み得る。他の保存的置換グループは、硫黄含有：Ｍｅｔおよびシステイン(ＣｙｓまたはＣ)；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｓｎおよびＧｌｎ；小脂肪族、非極性または僅かに極性残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＰｒｏおよびＧｌｙ；極性、負荷電残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎ；極性、正荷電残基：Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓ；大脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＣｙｓ；および大芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐを含む。さらなる情報は、Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Companyに見ることができる。
アミノ酸配列挿入は、１残基～１００以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合ならびに１または複数アミノ酸残基の配列内挿入を含み得る。末端挿入の例は、アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端へのレポーター分子または酵素の融合を含む。
一般に、配列バリアントにおける改変は、各対照配列の所望の機能性を消失させないかまたは顕著に低減しない。例えば、本発明のバリアント配列が、対照配列を有する(またはそれによりコードされる)抗体または抗原結合フラグメントと比較して、ＨＢＶおよびＨＤＶの同じエピトープに結合するおよび／または感染を中和する抗体またはその抗原結合フラグメントの配列の機能性を顕著に低減しないかまたは完全に抑止しないのが好ましい。それぞれどのヌクレオチドおよびアミノ酸残基が、所望の構造または機能性を消失させることなく置換、挿入または欠失させ得るかを決定する際の指針は、例えば、既知コンピュータープログラムにより判明し得る。
ここで使用する指定された核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質「に由来する」核酸配列またはアミノ酸配列は、該核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の起源をいう。特定の配列由来の核酸配列またはアミノ酸配列は、それが由来する配列またはその一部と本質的に同一であるアミノ酸配列を有し得て、そのために「本質的に同一」は、上に定義した配列バリアントを含む。特定のペプチドまたはタンパク質由来の核酸配列またはアミノ酸配列は、特定のペプチドまたはタンパク質における対応するドメインに由来し得る。この明細書の記載で、「対応する」は、興味ある同じ機能性または特徴の所有をいう。例えば、「細胞外ドメイン」は他の「細胞外ドメイン」(他のタンパク質の)に対応しまたは「膜貫通ドメイン」は他の「膜貫通ドメイン」(他のタンパク質の)に対応する。ペプチド、タンパク質および核酸の「対応する」部分は、故に、当業者には容易に同定され得る。同様に、他の(例えば、「源」)配列「由来の」配列は、源配列をその起源とするとして当業者には容易に同定され得る。
他の核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質由来の核酸配列またはアミノ酸配列は、出発核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質(それらが由来する)と同一であり得る。しかしながら、他の核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質由来の核酸配列またはアミノ酸配列はまた出発核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質(それらが由来する)に比して１以上の変異も有し得て、特に他の核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質由来の核酸配列またはアミノ酸配列は、出発核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質(それらが由来する)の上記のような機能的配列バリアントであり得る。例えば、ペプチド／タンパク質において、１以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換してよくまたは１以上のアミノ酸残基挿入または欠失が生じ得る。
ここで使用する用語「変異」は、対照配列、例えば対応するゲノム、野生型または対照配列と比較した核酸配列および／またはアミノ酸配列における変化に関する。例えば対照ゲノム配列と比較した変異は、例えば、(自然に生ずる)体細胞変異、自発的変異、誘導変異、例えば酵素、化学物質または照射により誘導または部位特異的変異誘発(核酸配列および／またはアミノ酸配列に特異的および意図的変化を作るための分子生物学的方法)により得た変異であり得る。故に、用語「変異」または「変異させる」は、例えば、核酸配列またはアミノ酸配列に変異を物理的に惹起または誘導することもまた含むと理解される。変異は、１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の置換、欠失および挿入ならびに数連続ヌクレオチドまたはアミノ酸の反転を含む。アミノ酸配列で変異を達成するために、変異を、(組み換え)変異ポリペプチドを発現させるために、該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に導入し得る。変異は、例えば、異なるアミノ酸または同じアミノ酸をコードするコドンを提供するために、あるアミノ酸をコードする核酸分子(例えば、その中の１、２または３ヌクレオチド塩基の変更により)のコドンの変更により(例えば、部位特異的変異誘発により)または配列バリアントの合成により達成され得る。
細胞への核酸分子挿入における用語「導入」は、「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、真核生物または原核生物細胞への核酸分子への取り込みの言及を含み、ここで、核酸分子は細胞のゲノム(例えば、染色体、プラスミド、プラスチドまたはミトコンドリアＤＮＡ)に取り込まれ、自律レプリコンに変換されるかまたは一過性に発現される(例えば、トランスフェクトｍＲＮＡ)。
ここで使用する用語「組み換え」(例えば組み換え抗体、組み換えタンパク質、組み換え核酸など)は、組み換え手段により調製、発現、作製または単離され、天然に存在しない、あらゆる分子(抗体、タンパク質、核酸など)をいう。「組み換え」は「操作された」または「非天然」と同義的に使用でき、少なくとも１つの遺伝子変異を含むかまたは外因性核酸分子の導入により修飾されており、このような改変または修飾が遺伝子操作(すなわち、ヒト介入)により導入されている、生物、微生物、細胞、核酸分子またはベクターをいい得る。遺伝子変異は、例えば、タンパク質、融合タンパク質または酵素をコードする発現可能核酸分子を導入する修飾または他の核酸分子付加、欠失、置換または細胞の遺伝物質の他の機能破壊を含む。さらなる修飾は、例えば、該修飾がポリヌクレオチド、遺伝子またはオペロンの発現を変える、非コード制御領域を含む。
ここで使用する「異種」または「非内因性」または「外因性」は、宿主細胞または対象に特有ではないあらゆる遺伝子、タンパク質、化合物、核酸分子または活性または改変されている宿主細胞または対象に特有のあらゆる遺伝子、タンパク質、化合物、核酸分子または活性をいう。異種、非内因性または外因性は、構造、活性または両者が天然および改変遺伝子、タンパク質、化合物または核酸分子間で異なるように変異または他に改変されている、遺伝子、タンパク質、化合物または核酸分子をいう。ある実施態様において、異種、非内因性または外因性遺伝子、タンパク質または核酸分子は宿主細胞または対象に内因性ではない可能性があるが、その代わりそのような遺伝子、タンパク質または核酸分子をコードする核酸が、コンジュゲーション、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションなどにより宿主細胞に付加され得て、ここで、該付加核酸分子が宿主細胞ゲノムに統合され得るかまたは染色体外遺伝物質(例えば、プラスミドまたは他の自己複製ベクター)として存在し得る。用語「相同」または「ホモログ」は、宿主細胞、種または株に見られるまたはそれに由来する遺伝子、タンパク質、化合物、核酸分子または活性をいう。例えば、ポリペプチドをコードする異種または外因性ポリヌクレオチドまたは遺伝子は、天然ポリヌクレオチドまたは遺伝子と相同であり、相同ポリペプチドまたは活性をコードするが、該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、改変された構造、配列、発現レベルまたはこれらの何らかの組み合わせを有し得る。非内因性ポリヌクレオチドまたは遺伝子およびコードされるポリペプチドまたは活性は、同じ種、異なる種またはそれらの組み合わせに由来し得る。
ここで使用する用語「内因性」または「天然」は、宿主細胞または対象に通常存在するポリヌクレオチド、遺伝子、タンパク質、化合物、分子または活性をいう。
ここで使用する用語「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は、相互交換可能に使用され、全てのこのような呼称は子孫を含む。故に、用語「形質転換体」および「形質転換細胞」は、初代対象細胞および継代数を問わずそれ由来の培養物を含む。また全ての子孫は、計画的または偶発的変異によりＤＮＡ内容物が厳密に同一ではないかもしれないことは理解される。元来の形質転換細胞でスクリーニングされたのと同じまたは実質的に同じ機能、表現型または生物学的活性を有するバリアント子孫が含まれる。これと異なる指定が意図されているならば、その記載から明らかである。
本発明は、一部、Ｂ型肝炎およびデルタ型肝炎ウイルスを中和できる抗体、抗原結合フラグメントおよび融合タンパク質を提供する。本記載による抗体、抗原結合フラグメントおよび融合タンパク質の実施態様は、ＨＢＶおよびＨＤＶの予防、処置もしくは減弱または診断に使用され得る。具体的実施態様において、ここに記載する抗体、抗原結合フラグメントおよび融合タンパク質は、２以上の異なるＢ型肝炎ウイルス表面抗原の遺伝子型および２以上の異なるＢ型肝炎ウイルス表面抗原の感染性変異体に結合する。特定の実施態様において、ここに記載する抗体、抗原結合フラグメントおよび融合タンパク質は、知られている全てのＢ型肝炎ウイルス表面抗原の遺伝子型および知られている全てのＢ型肝炎ウイルス表面抗原の感染性変異体に結合する。
抗体および抗原結合フラグメント
ある態様において、本発明は、ＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域に結合でき、Ｂ型肝炎ウイルスおよびデルタ型肝炎ウイルスの感染を中和できる、単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
異なる意図が明示されない限り、ここで使用する「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２個の重(Ｈ)鎖および２個の軽(Ｌ)鎖を含むインタクト抗体(軽鎖を欠く重鎖抗体は、なお用語「抗体」に包含されると理解されるが)ならびに、例えば、ｓｃＦｖ、ＦａｂまたはＦ(ａｂ')２フラグメントなどの、インタクト抗体により認識される抗原標的分子に結合する能力を有するまたは保持するインタクト抗体の何らかの抗原結合部分またはフラグメントをいう。故に、ここでの用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、インタクト抗体およびその機能的(抗原結合)抗体フラグメント(フラグメント抗原結合(Ｆａｂ)フラグメント、Ｆ(ａｂ')２フラグメント、Ｆａｂ'フラグメント、Ｆｖフラグメント、組み換えＩｇＧ(ｒＩｇＧ)フラグメント、一本鎖抗体フラグメント(一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)を含む)および単一ドメイン抗体(例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ)フラグメントを含む)を含む、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含む。本用語は、遺伝子操作されたおよび／または他に修飾された形態の免疫グロブリン、例えば、イントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体およびヘテロコンジュゲート抗体、多特異的、例えば、二特異的、抗体、二重特異性抗体、トリアボディおよびテトラボディ、タンデム二ｓｃＦｖ、タンデム三ｓｃＦｖを包含する。特に断らない限り、用語「抗体」は、その機能的抗体フラグメントを含むと理解されるべきである。本用語はまたＩｇＧおよびそのサブクラス、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＤを含む、あらゆるクラスまたはそのサブクラスの抗体を含む、インタクトまたは完全長抗体を包含する。
ここで使用する用語「抗原結合フラグメント」、「フラグメント」および「抗体フラグメント」は、本発明の抗体の抗原結合活性を維持する、該抗体のあらゆるフラグメントをいうために、相互交換可能に使用される。抗体フラグメントの例は、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、ＦｖまたはｓｃＦｖを含むが、これらに限定されない。
ヒト抗体は既知である(例えば、van Dijk, M. A., and van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374)。ヒト抗体は、免疫化により、内因性免疫グロブリン産生なしにヒト抗体の完全レパートリーまたはセレクションを産生できる、トランスジェニック動物(例えば、マウス)で産生され得る。このような生殖細胞系変異体マウスにおけるヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの伝達は、抗原負荷により、ヒト抗体の産生をもたらす(例えば、Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 3340参照)。ヒト抗体はまたファージディスプレーライプラリーでも産生され得る(Hoogenboom, H. R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J. D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597)。Cole et al. およびBoerner et al. の技術もまたヒトモノクローナル抗体の製造に利用可能である(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985);およびBoerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95)。ヒトモノクローナル抗体は、Traggiai E, Becker S, Subbarao K, Kolesnikova L, Uematsu Y, Gismondo MR, Murphy BR, Rappuoli R, Lanzavecchia A. (2004): An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10(8):871-5に記載のＥＢＶ－Ｂ細胞不死化の改善法を使用して製造され得る。ここで使用する用語「ヒト抗体」はまた本発明の抗体および抗体フラグメントに一致する性質を発現するように、例えば、可変領域が修飾されている抗体を含む。
ここで使用する用語「可変領域」(軽鎖可変領域(ＶＬ)、重鎖可変領域(ＶＨ))は、ほとんどの場合、抗体の抗原への結合に直接関与する、軽鎖および重鎖の対の各可変領域ポリペプチドを意味する。
本発明の抗体は、あらゆるアイソタイプ(例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ；すなわち、α、γ、μ、εまたはδ重鎖を含む)であり得る。ＩｇＧアイソタイプ内で、例えば、抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブクラスであり得る。特定の実施態様において、本発明の抗体はＩｇＧ１抗体である。ここに提供される抗体または抗原結合フラグメントは、κまたはλ軽鎖を含み得る。ある実施態様において、ここに記載するＨＢｓＡｇ特異的抗体はＩｇＧアイソタイプのものであり、感染細胞からのＨＢＶおよびＨＢｓＡｇの放出を阻止し得る。よって、ある実施態様において、本発明の抗体は、ＨＢＶビリオンおよびＨＢｓＡｇに細胞内で結合し、それにより放出を阻止し得る。
用語「ＶＬ」および「ＶＨ」は、それぞれ抗体軽鎖および重鎖の可変結合領域をいう。可変結合領域は、「相補性決定領域」(ＣＤＲ)および「フレームワーク領域」(ＦＲ)として知られる、分離した、明確に定義された小領域からなる。用語「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」は「超可変領域」または「ＨＶＲ」と同義であり、抗原特異性および／または結合親和性を付与し、フレームワーク配列により半刺される、ＴＣＲまたは抗体可変領域内のアミノ酸配列をいうことが当分野で知られる。一般に、免疫グロブリン結合タンパク質の各可変領域には３個のＣＤＲがある；例えば、抗体について、ＶＨおよびＶＬ領域は６個のＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３；ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む(またここではそれぞれＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３その称される)。ここで使用するＣＤＲの「バリアント」は、１～３までのアミノ酸置換、欠失またはそれらの組み合わせを有するＣＤＲ配列の機能的バリアントをいう。
免疫グロブリン配列は、ナンバリングスキーム(例えば、Kabat、ＥＵ、International Immunogenetics Information System(ＩＭＧＴ)およびＡｈｏ)によりアラインでき、等価残基位置のアノテートを可能とし、比較すべき異なる分子について、Antigen receptor Numbering And Receptor Classification(ＡＮＡＲＣＩ)ソフトウェアツール(2016, Bioinformatics 15:298-300)の使用を可能とすることができる。ある実施態様において、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、重鎖(ＨＣ)、軽鎖(ＬＣ)または両者の全てもしくは一部を含み得ることは理解される。例えば、完全長インタクトＩｇＧ抗体モノマーは、一般にＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＬおよびＣＬを含む。Ｆｃ成分をここでさらに記載する。ある実施態様において、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、それぞれ、ここに開示するＶＨおよびＶＬ配列の何れかに従う、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む。
ここに記載する抗体のフラグメントは、抗体から、ペプシンまたはパパインなどの酵素での消化を含む方法および／またはジスルフィド結合の化学還元による開裂により得ることができる。あるいは、抗体のフラグメントを、重鎖または軽鎖の配列の一部のクローニングおよび発現により得ることができる。本発明は、例えば、本発明の抗体からのＣＤＲを含むｓｃＦｖ、重鎖もしくは軽鎖単量体および二量体、単一ドメイン重鎖抗体、単一ドメイン軽鎖抗体ならびに重鎖および軽鎖可変ドメインがペプチドリンカーにより結合されている一本鎖抗体を含む、ここに記載する抗体の重鎖および軽鎖に由来する一本鎖Ｆｖフラグメント(ｓｃＦｖ)を包含する。
ある実施態様において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、精製抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、ＦｖまたはｓｃＦｖを含む。
本発明の抗体および抗原結合フラグメントは、ある実施態様において、多特異的(例えば、二特異的、三特異的、四特異的など)であってよく、ここに開示するあらゆる多特異的形態で提供される。ある実施態様において、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、二特異的または三特異的抗体などの多特異的抗体である。二特異的抗体の形態は、例えば、Spiess et al., Mol. Immunol. 67(2):95 (2015)およびBrinkmann and Kontermann, mAbs 9(2):182-212 (2017)に開示され、その二特異的形態およびその製造方法を引用により本明細書に包含させ、例えば、二特異的Ｔ細胞エンゲージャー(ＢｉＴＥｓ)、ＤＡＲＴｓ、ノブ・イントゥ・ホール(ＫＩＨ)アセンブリー、ｓｃＦｖ－ＣＨ３－ＫＩＨアセンブリー、ＫＩＨ共通軽鎖抗体、ＴａｎｄＡｂｓ、トリプルボディ、ＴｒｉＢｉミニボディ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＣＨ－ＣＬ－ｓｃＦｖ、Ｆ(ａｂ')２－ｓｃＦｖ２、四価ＨＣａｂｓ、イントラボディ、ＣｒｏｓｓＭａｂｓ、二相作用Ｆａｂｓ(ＤＡＦｓ)(ツー・イン・ワンまたはフォー・イン・ワン)、ＤｕｔａＭａｂｓ、ＤＴ－ＩｇＧ、電荷対形成、Ｆａｂアーム交換、ＳＥＥＤｂｏｄｙ、Ｔｒｉｏｍａｂｓ、ＬＵＺ－Ｙアセンブリー、Ｆｃａｂｓ、κλ体、直交Ｆａｂｓ、ＤＶＤ－ＩｇＧｓ、ＩｇＧ(Ｈ)－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－(Ｈ)ＩｇＧ、ＩｇＧ(Ｌ)－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－(Ｌ)ＩｇＧ、ＩｇＧ(Ｌ,Ｈ)－Ｆｖ、ＩｇＧ(Ｈ)－Ｖ、Ｖ(Ｈ)－ＩｇＧ、ＩｇＧ(Ｌ)－Ｖ、Ｖ(Ｌ)－ＩｇＧ、ＫＩＨ ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、ＩｇＧ－２ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ４－Ｉｇ、ＺｙｂｏｄｙおよびＤＶＩ－ＩｇＧ(フォー・イン・ワン)を含む。二特異的または多特異的抗体は、本発明のＨＢＶおよび／またはＨＤＶ特異的結合ドメインを、本発明の他のＨＢＶおよび／またはＨＤＶ特異的結合ドメインと組み合わせてまたはＨＢＶおよび／またはＨＤＶ(例えば、同じまたは異なるエピトープ)に特異的に結合する異なる結合ドメインもしくは異なる抗原に特異的に結合する結合ドメインと組み合わせて含み得る。
本発明の抗体フラグメントは、単価または多価相互作用を付与でき、上記の多様な構造で含まれ得る。例えば、ｓｃＦｖ分子は三価「トリアボディ」または四価「テトラボディ」を作るように合成され得る。ｓｃＦｖ分子は、二価ミニボディをもたらすＦｃ領域のドメインを含み得る。さらに、本開示の配列は、本開示の配列が本開示のエピトープを標的とし、分子の他の領域が他の標的に結合する、多特異的分子の成分であり得る。分子の例は、二特異的Ｆａｂ２、三特異的Ｆａｂ３、二特異的ｓｃＦｖおよび二重特異性抗体を含むが、これらに限定されない(Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology 9: 1126-1136)。
ｓｃＦｖを含むが、これに限定されない、ここに記載するような抗体またはその抗原結合フラグメントは、ある実施態様において、ここに記載する抗原に特異的に結合できる融合タンパク質に含まれ得る。ここで使用する「融合タンパク質」は、一本鎖において、少なくとも２つの異なるドメインまたはモチーフを有し、該ドメインまたはモチーフが、タンパク質で天然では一緒または所定の配置で見られない、タンパク質をいう。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、ＰＣＲを使用して、組み換えにより操作してなどで構築できまたはこのような融合タンパク質を合成できる。
ある実施態様において、融合タンパク質は、宿主細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫ－Ｔ細胞表面で発現できる。ある実施態様において、融合タンパク質は、(ｉ)抗体またはその抗原結合フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)を含む細胞外成分；(ii)膜貫通成分(例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８またはその機能的バリアントもしくは一部またはこれらの何らかの組み合わせからの膜貫通ドメイン)；および(iii)共刺激タンパク質またはその機能的バリアントもしくは一部からのシグナル伝達(例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＯＸ４０(ＣＤ１３４)、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１(ＣＤ５４)、ＬＦＡ－１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＭＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合できるリガンドまたはその機能的バリアントまたはこれらの何らかの組み合わせからのシグナル伝達ドメイン)および／またはエフェクタードメイン(例えば、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２５、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＡＲＤ１１、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、Ｌｃｋ、ＬＡＧ３、ＬＡＴ、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、Ｗｎｔ、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、ＳＬＡＭＦ１、Ｓｌｐ７６、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＲＩＭ、Ｚａｐ７０、ＰＴＣＨ２またはこれらの何らかの組み合わせから)を含む細胞内成分を含む。
ある実施態様において、抗体または抗原結合フラグメントを含む融合タンパク質は、細胞免疫療法に使用するためのＴ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫ－Ｔ細胞などの宿主細胞の細胞表面に発現され得るキメラ抗原受容体分子(ＣＡＲ)を含む。ＣＡＲ分子および設計の原則は、例えばSadelain et al., Cancer Discov., 3(4):388 (2013); Harris and Kranz, Trends Pharmacol. Sci., 37(3):220 (2016); Stone et al., Cancer Immunol. Immunother., 63(11):1163 (2014); Xu et al., 2018 Oncotarget 9:13991; Androulla et al., 2018 Curr. Pharm. Biotechnol. Volume 19 (April 2018); Wu et al., 2016 Expert Opin. Biol. Ther. 16:1469; Ren et al., 2017 Protein Cell 8:634に記載され、そのＣＡＲ分子、ＣＡＲ設計およびＣＡＲ設計原則を、引用によりその全体として本明細書に包含させる。
本明細書をとおして、抗体、その抗原結合フラグメントおよび融合タンパク質は、個々にまたは集合的に(例えば、何れかの組み合わせで)「結合タンパク質」と称され得る。
本発明の結合タンパク質は、精製形態で提供され得る。例えば、抗体は、例えば、組成物の９０％(重量)未満、一般には６０％未満およびより一般には５０％未満が他のポリペプチドから成る、他のポリペプチドが実質的にない組成物に存在し得る。
本発明の結合タンパク質は、ヒトおよび／または非ヒト(または異種)宿主、例えば、マウスで免疫原性であり得る。例えば、抗体は非ヒト宿主で免疫原性であるが、ヒト宿主では免疫原性ではないイディオトープを有し得る。ヒト使用のための本発明の抗体は、一般にマウス、ヤギ、ウサギ、ラット、非霊長類哺乳動物などなどの宿主から単離されず、ある場合、ヒト化によりまたはxeno-miceから得られない。またここで考慮されるのは、既知のまたは潜在的免疫原性および／または他の潜在的責任を低減するためまたはマウスなどの非ヒト動物における抗体の所望の構造および／または機能性を付与するために操作された(例えば、ヒトアミノ酸残基、配列またはモチーフの１以上が、マウスにおける免疫原性または他の傾向が低減または抑止されたまたは所望の構造および／または機能を有する残基、配列またはモチーフに置き換えられている、「マウス化」抗体；例えば、マウスを使用するモデル研究のため)、本開示の抗体のバリアント形態である。
本発明のマウス化抗体の例のアミノ酸配列を表２に提供する。
ここで使用する「中和抗体」(または抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質)は、宿主(例えば、宿主生物または宿主細胞)における感染を開始および／または永続化する病原体の能力を中和、すなわち、予防、阻止、低減、邪魔または妨害できるものである。用語「中和抗体」および「中和するある抗体」または「中和する抗体」は、ここでは、相互交換可能に使用される。これらの抗体は、ここに記載するとおり、適切な製剤化により、予防または治療剤として、能動的ワクチン接種と組み合わせて、診断ツールまたは生産ツールとして、単独でまたは組み合わせて(例えば、ここに開示する２以上の抗体の組み合わせまたは本発明の抗体とＨＢＶ Ｂおよび／またはＤ感染の中和ができる抗体を含む、抗体剤であってもなくてもよい他の薬剤の組み合わせ)使用できる。
ここで使用する「特異的に結合する」または「特異的」は、サンプル中のあらゆる他の分子または成分と顕著に結合または連合することなく、１０５Ｍ－１(これはこの結合反応のオンレート[Ｋｏｎ]対オフレート[Ｋｏｆｆ]比に等しい)以上の親和性またはＫａ(すなわち、１／Ｍ単位での特定の結合相互作用の平衡結合定数)での結合タンパク質(例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント)または結合ドメインの標的分子への結合または連合をいう。結合タンパク質または結合ドメインは「高親和性」結合タンパク質または結合ドメインまたは「低親和性」結合タンパク質または結合ドメインとして分類され得る。「高親和性」結合タンパク質または結合ドメインは、少なくとも１０７Ｍ－１、少なくとも１０８Ｍ－１、少なくとも１０９Ｍ－１、少なくとも１０１０Ｍ－１、少なくとも１０１１Ｍ－１、少なくとも１０１２Ｍ－１または少なくとも１０１３Ｍ－１のＫａを有する結合タンパク質または結合ドメインをいう。「低親和性」結合タンパク質または結合ドメインは、１０７Ｍ－１まで、１０６Ｍ－１までまたは１０５Ｍ－１までのＫａを有する結合タンパク質または結合ドメインをいう。あるいは、親和性は、単位Ｍで、特定の結合相互作用の平衡解離定数(Ｋｄ)として定義され得る(例えば、１０－５Ｍ～１０－１３Ｍ)。用語「結合」および「特異的に結合」および類似の記載は、非特異的接着を含まない。
結合タンパク質の結合は、例えば、表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)方法、例えば、ＢｉａｃｏｒｅTM系；ＫｉｎＥｘＡ(登録商標)などの結合平衡除外法；およびバイオレイヤー干渉法(例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ(登録商標)Ｏｃｔｅｔプラットフォーム使用)；等温滴定カロリメトリー(ＩＴＣ)など、例えば、４５０nmでの光学密度で造影する、抗原結合ＥＬＩＳＡ(例えば、直接または間接)またはフローサイトメトリーなどのような、適切なアッセイを使用して決定または評価され得る。
ある実施態様において、本発明の結合タンパク質は、ＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域に結合できる。Ｂ型肝炎ウイルスのエンベロープは、一般に、Ｓタンパク質(「小」、またＳ－ＨＢｓＡｇとも称される)、Ｍタンパク質(「中」、またＭ－ＨＢｓＡｇとも称される)およびＬタンパク質(「大」、またＬ－ＨＢｓＡｇとも称される)の３個の「ＨＢＶエンベロープタンパク質」(また「ＨＢｓＡｇ」、「Ｂ型肝炎表面抗原」としても知られる)を含む。Ｓ－ＨＢｓＡｇ、Ｍ－ＨＢｓＡｇおよびＬ－ＨＢｓＡｇは、同じＣ末端端を共有し(また「Ｓドメイン」とも称される、２２６アミノ酸)、これはＳタンパク質(Ｓ－ＨＢｓＡｇ)に対応し、ウイルス集合および感染性に重要である。Ｓ－ＨＢｓＡｇ、Ｍ－ＨＢｓＡｇおよびＬ－ＨＢｓＡｇは小胞体(ＥＲ)で合成され、集合し、ゴルジ体を介して粒子として分泌される。Ｓドメインは、４個の予測膜貫通(ＴＭ)ドメインを含み、そのためにＳドメインのＮ末端およびＣ末端両者が内腔に曝される。ＴＭ１およびＴＭ２の膜貫通ドメインはいずれもＥＲ膜への同時翻訳タンパク質組込みに必要であると考えられ、膜貫通ドメインＴＭ３およびＴＭ４はＳドメインのＣ末端から３分の１に位置する。ＨＢｓＡｇの「抗原性ループ領域」は、ＨＢｓＡｇのＳドメインの予測ＴＭ３とＴＭ４膜貫通ドメインの間に位置し、そのために抗原性ループ領域は、計２２６アミノ酸を含むＳドメインのアミノ酸１０１～１７２を構成する(Salisse J. and Sureau C., 2009, Journal of Virology 83: 9321-9328)。感染性の決定基は、ＨＢＶエンベロープタンパク質の抗原性ループ領域にある。特に、ＨＢｓＡｇの１１９～１２５の残基はＣＸＸＣモチーフを含み、これは、ＨＢＶおよびＨＤＶの感染性に重要であると考えられている(Jaoude GA, Sureau C, Journal of Virology, 2005;79:10460-6)。
ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸配列の位置に言及するとき、このような位置は配列番号３(下に示す)に示すアミノ酸配列またはその天然もしくは人工配列バリアントを引用する。
MENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPTCPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTTAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSPFLPLLPIFFCLWVYI(配列番号３；アミノ酸１０１～１７２は下線で示す)
例えば、「Ｓドメインのアミノ酸１０１～１７２」なる表現は、配列番号３のポリペプチドの１０１～１７２位のアミノ酸残基をいう。しかしながら、当業者は、変異または変種(置換、欠失および／または付加を含むが、これに限定されず、例えば、ここに記載する異なる遺伝子型のＨＢｓＡｇまたは異なるＨＢｓＡｇ変異体)は、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸配列に自然に生じ得るかまたはその生物学的性質に影響することなくＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸配列に人工的に導入され得る。それ故に、ここで使用する用語「ＨＢｓＡｇのＳドメイン」は、例えば、配列番号３のポリペプチドおよびその天然または人工変異体を含む、全てのこのようなポリペプチドを含む。さらに、ＨＢｓＡｇのＳドメインの配列フラグメントがここで記載されるとき(例えばＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１０１～１７２またはアミノ酸１２０～１３０)、配列番号３の対応する配列フラグメントだけでなく、その天然または人工変異体の対応する配列フラグメントも含む。例えば、用語「ＨＢｓＡｇのＳドメインの１０１～１７２位のアミノ酸残基」は、配列番号３の位置１０１～１７２のアミノ酸残基およびその変異体(天然または人工変異体)の対応するフラグメントを含む。ここで使用する用語「対応する配列フラグメント」および「対応するフラグメント」は、配列が最適化アライメントに付された、すなわち、配列が最高パーセンテージの同一性を得るためにアラインされたときの、配列の等しい位置に存在するフラグメントをいう。
Ｍタンパク質(Ｍ－ＨＢｓＡｇ)は、「プレＳ２」と称されるＮ末端ドメインの５５アミノ酸にわたるＳタンパク質に対応する。Ｌタンパク質(Ｌ－ＨＢｓＡｇ)は、「プレＳ１」(遺伝子型Ｄ)と称するＮ末端ドメインの１０８アミノ酸にわたるＭタンパク質に対応する。Ｌタンパク質のプレＳ１およびプレＳ２ドメインは、ウイルス粒子の内面(ＥＲの細胞質側)に存在し、ウイルス集合に重要な役割を有すると考えられ、または外面(ＥＲの管腔側)に存在し、標的細胞との相互作用に使用可能であり、ウイルス感染性に重要であるいずれかであり得る。さらに、ＨＢＶ表面タンパク質(ＨＢｓＡｇ)は、ビリオンエンベロープに含まれるだけでなく、ＥＲ－ゴルジ中間区画膜から自発的に出芽して、分泌により細胞から放出される空の「サブウイルス粒子」(ＳＶＰ)を形成する。
ある実施態様において、抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質はＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域に結合し、Ｓ－ＨＢｓＡｇ、Ｍ－ＨＢｓＡｇおよびＬ－ＨＢｓＡｇの全てに結合できる。
ある実施態様において、抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルスおよびデルタ型肝炎ウイルスの感染を中和する。ある実施態様において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｂ型肝炎ウイルスおよびデルタ型肝炎ウイルスのウイルス感染性を減少させる。
研究室でウイルス感染性(または「中和」)を研究および定量するために、標準「中和アッセイ」が利用され得る。中和アッセイのために、動物ウイルスは、一般に細胞および／または細胞株で増やされる。培養細胞が試験する抗体(または抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質)の存在下(または非存在下)で固定量のＨＢＶまたはＨＤＶとインキュベートされる、中和アッセイが使用され得る。このようなアッセイにおいて、細胞培養上清に分泌されるＢ型肝炎表面抗原(ＨＢｓＡｇ)またはＢ型肝炎ｅ抗原(ＨＢｅＡｇ)のレベルを使用できおよび／またはＨＢｃＡｇ染色を読み出し情報を提供するために評価し得る。ＨＤＶについて、例えば、デルタ抗原免疫蛍光染色が評価され得る。
ＨＢＶ中和アッセイの特定の実施態様において、培養細胞、例えば分化ＨｅｐａＲＧ細胞などのＨｅｐａＲＧ細胞を、試験する抗体の存在下または非存在下で固定量のＨＢＶとインキュベートする。このような実施態様において、インキュベーションを、例えば、１６時間、３７℃で実施し得る。そのインキュベーションを、培地(例えば４％ＰＥＧ ８０００添加)中で実施し得る。インキュベーション後、細胞を洗浄し、さらに培養し得る。ウイルス感染性を測定するために、例えば感染後７日目～１１日目、培養上清に分泌されるＢ型肝炎表面抗原(ＨＢｓＡｇ)およびＢ型肝炎ｅ抗原(ＨＢｅＡｇ)のレベルを、酵素結合免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)により決定し得る。さらに、ＨＢｃＡｇ染色を免疫蛍光アッセイで評価し得る。ＨＤＶ中和アッセイの実施態様において、分化ＨｅｐａＲｇ細胞の(ＨＢＶの代わりに)ＨＤＶ感染接種材料として、ＨＤＶキャリアからの血清が使用され得るとの差異以外、ＨＢＶと本質的に同じアッセイを使用できる。検出について、デルタ抗原免疫蛍光染色が、読み出し情報として使用され得る。
本発明の結合タンパク質の実施態様は、高中和能を有する。ある実施態様において、Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)およびデルタ型肝炎ウイルス(ＨＤＶ)の５０％中和に必要なここに記載する抗体の濃度は、例えば、約１０μg／ml以下である。他の実施態様において、ＨＢＶおよびＨＤＶの５０％中和に必要な結合タンパク質濃度は約５μg／mlである。他の実施態様において、ＨＢＶおよびＨＤＶの５０％中和に必要なここに記載する結合タンパク質の濃度は約１μg／mlである。さらに他の実施態様において、ＨＢＶおよびＨＤＶの５０％中和に必要な結合タンパク質の濃度は約７５０ng／mlである。なおさらなる実施態様において、ＨＢＶおよびＨＤＶの５０％中和に必要なここに記載する結合タンパク質の濃度は５００ng／ml以下である。このような実施態様において、ＨＢＶおよびＨＤＶの５０％中和に必要なここに記載する結合タンパク質の濃度は、４５０ng／ml以下、４００ng／ml以下、３５０ng／ml以下、３００ng／ml以下、２５０ng／ml以下、２００ng／ml以下、１７５ng／ml以下、１５０ng／ml以下、１２５ng／ml以下、１００ng／ml以下、９０ng／ml以下、８０ng／ml以下、７０ng／ml以下、６０ng／ml以下または５０ng／ml以下から選択され得る。
ＨＢＶおよびＨＤＶの両者を中和できる本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、Ｂ型肝炎およびＤ型肝炎の予防および処置に有用である。ＨＤＶによる感染は、一般にＨＢＶによる感染と同時またはその後に起こり(例えば、ＨＢＶ非存在下でのＨＤＶ接種は、ＨＤＶがそれら自身の複製にＨＢＶの支持を必要とするため、Ｄ型肝炎を生じない)、Ｄ型肝炎は一般に慢性ＨＢＶキャリアで観察される。
開示する結合タンパク質の実施態様は、ＨＢｓＡｇおよびＨＢＶの排除を促進する。具体的実施態様において、結合タンパク質は、ＨＢＶおよびＢ型肝炎ウイルスのサブウイルス粒子(ＳＶＰ)両者の排除を促進する。ＨＢｓＡｇまたはサブウイルス粒子の排除は、例えば、Ｂ型肝炎患者からの、例えば、血液サンプルにおける、ＨＢｓＡｇのレベルを測定することにより評価し得る。同様に、ＨＢＶの排除は、例えば、Ｂ型肝炎患者からの、例えば、血液サンプルにおける、ＨＢＶのレベルの測定により評価し得る。
ＨＢＶで感染した患者の血清において、感染性粒子(ＨＢＶ)に加えて、比較的小型の球体および種々の長さの線維の形のＨＢＶエンベロープタンパク質(ＨＢｓＡｇ)のみからなる、空のサブウイルス粒子(ＳＶＰ)が一般に過剰(一般に１,０００～１００,０００倍)にある。サブウイルス粒子は、ＨＢＶの細胞内ウイルス複製および遺伝子発現を強く増強することが示されている(Bruns M. et al. 1998 J Virol 72(2): 1462-1468)。これは、感染性がウイルス数だけでなく、ＳＶＰ数にも依存するため、ＨＢＶを含む血清の感染性にまた関連する(Bruns M. et al. 1998 J Virol 72(2): 1462-1468)。さらに、過剰のサブウイルス粒子は、中和抗体吸収によりデコイとして作用でき、それ故に感染の排除を遅延させる。Ｂ型肝炎表面抗原(ＨＢｓＡｇ)喪失の達成は、ある場合処置の理想的エンドポイントであり、慢性Ｂ型肝炎(ＣＨＢ)治癒に最も近いアウトカムと考えられる。
本発明の結合タンパク質の実施態様は、ＨｂｓＡｇの排除を促進し得る。ある実施態様において、結合タンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルスのサブウイルス粒子の排除を促進し得る。ある実施態様において、結合タンパク質は、慢性Ｂ型肝炎処置に使用され得る。
ここに開示する何れの実施態様においても、本発明の結合タンパク質は、ＨＢｓＡｇ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩおよびＪまたはこれらの何らかの組み合わせから選択される遺伝子型のＨＢｓＡｇに結合できる。
ある実施態様において、本発明の結合タンパク質は、ＨＢｓＡｇ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩおよびＪの１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種または１０種に結合できる。種々のＨＢｓＡｇ遺伝子型の例は、次のものを含む：GenBank accession number J02203 (HBV-D, ayw3); GenBank accession number FJ899792.1 (HBV-D, adw2); GenBank accession number AM282986 (HBV-A); GenBank accession number D23678 (HBV-B1 Japan); GenBank accession number AB117758 (HBV-C1 Cambodia); GenBank accession number AB205192 (HBV-E Ghana); GenBank accession number X69798 (HBV-F4 Brazil); GenBank accession number AF160501 (HBV-G USA); GenBank accession number AY090454 (HBV-H Nicaragua); GenBank accession number AF241409 (HBV-I Vietnam);およびGenBank accession number AB486012 (HBV-J Borneo)。種々の遺伝子型のＨＢｓＡｇのＳドメインの抗原性ループ領域のアミノ酸配列の例をここに記載する(例えば、配列番号５～１５)。
ある実施態様において、結合タンパク質は、１０種のＨＢｓＡｇ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩおよびＪの１以上のおよびある場合少なくとも６種に結合できる。ある実施態様において、結合タンパク質は、１０種のＨＢｓＡｇ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩおよびＪ中少なくとも８種に結合できる。ある実施態様において、結合タンパク質は、１０種のＨＢｓＡｇ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩおよびＪの全１０種に結合できる。ＨＢＶは、ゲノム配列により数遺伝子型に分化する。今日まで、８種の周知遺伝子型(Ａ～Ｈ)のＨＢＶゲノムが定義されている。さらに、他の２種の遺伝子型、ＩおよびＪもまた同定されている(Sunbul M., 2014, World J Gastroenterol 20(18): 5427-5434)。遺伝子型は疾患の進行に影響することが知られ、遺伝子型間で、抗ウイルス処置に対する応答の差が決定されている。
ある実施態様において、本発明の結合タンパク質は、抗原性ループ領域に変異を有するＨＢｓＡｇ変異体の１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種または１８種に結合でき、このような変異体は、ＨＢｓＡｇ Ｙ１００Ｃ／Ｐ１２０Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１２０Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１２０Ｔ／Ｓ１４３Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｃ１２１Ｓ、ＨＢｓＡｇ Ｒ１２２Ｄ、ＨＢｓＡｇ Ｒ１２２Ｉ、ＨＢｓＡｇ Ｔ１２３Ｎ、ＨＢｓＡｇ Ｑ１２９Ｈ、ＨＢｓＡｇ Ｑ１２９Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｈ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｋ１４１Ｅ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１４２Ｓ、ＨＢｓＡｇ Ｓ１４３Ｋ、ＨＢｓＡｇ Ｄ１４４Ａ、ＨＢｓＡｇ Ｇ１４５ＲおよびＨＢｓＡｇ Ｎ１４６Ａの１以上から選択される。これらの変異体は、Genbank accession no. FJ899792(配列番号４)の遺伝子型ＤのＨＢｓＡｇのＳドメインに基づき、天然に存在する変異体である。各変異体の変異アミノ酸残基は、ここでは、名称により示す。
配列番号４：
MENVTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPTCPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSTLSPFLPLLPIFFCLWVYI
(抗原性ループ領域、すなわちアミノ酸１０１～１７２は下線で示す)。
種々の変異体のＨＢｓＡｇのＳドメインの抗原性ループ領域のアミノ酸配列を、配列番号１６～３３で示す。
ある実施態様において、ここに開示する結合タンパク質は、ＨＢｓＡｇ Ｙ１００Ｃ／Ｐ１２０Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１２０Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１２０Ｔ／Ｓ１４３Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｃ１２１Ｓ、ＨＢｓＡｇ Ｒ１２２Ｄ、ＨＢｓＡｇ Ｒ１２２Ｉ、ＨＢｓＡｇ Ｔ１２３Ｎ、ＨＢｓＡｇ Ｑ１２９Ｈ、ＨＢｓＡｇ Ｑ１２９Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｈ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｋ１４１Ｅ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１４２Ｓ、ＨＢｓＡｇ Ｓ１４３Ｋ、ＨＢｓＡｇ Ｄ１４４Ａ、ＨＢｓＡｇ Ｇ１４５ＲおよびＨＢｓＡｇ Ｎ１４６Ａから選択される１種以上のおよびある場合少なくとも１２種の感染性ＨＢｓＡｇ変異体に結合できる。あるこのような実施態様において、結合タンパク質は、ＨＢｓＡｇ Ｙ１００Ｃ／Ｐ１２０Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１２０Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１２０Ｔ／Ｓ１４３Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｃ１２１Ｓ、ＨＢｓＡｇ Ｒ１２２Ｄ、ＨＢｓＡｇ Ｒ１２２Ｉ、ＨＢｓＡｇ Ｔ１２３Ｎ、ＨＢｓＡｇ Ｑ１２９Ｈ、ＨＢｓＡｇ Ｑ１２９Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｈ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｋ１４１Ｅ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１４２Ｓ、ＨＢｓＡｇ Ｓ１４３Ｋ、ＨＢｓＡｇ Ｄ１４４Ａ、ＨＢｓＡｇ Ｇ１４５ＲおよびＨＢｓＡｇ Ｎ１４６Ａから選択される少なくとも１５種の感染性ＨＢｓＡｇ変異体に結合できる。ある実施態様において、結合タンパク質は、次のＨＢｓＡｇ Ｙ１００Ｃ／Ｐ１２０Ｔ；ＨＢｓＡｇ Ｐ１２０Ｔ；ＨＢｓＡｇ Ｐ１２０Ｔ／Ｓ１４３Ｌ；ＨＢｓＡｇ Ｃ１２１Ｓ；ＨＢｓＡｇ Ｒ１２２Ｄ；ＨＢｓＡｇ Ｒ１２２Ｉ；ＨＢｓＡｇ Ｔ１２３Ｎ；ＨＢｓＡｇ Ｑ１２９Ｈ；ＨＢｓＡｇ Ｑ１２９Ｌ；ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｈ；ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｌ；ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｔ；ＨＢｓＡｇ Ｋ１４１Ｅ；ＨＢｓＡｇ Ｐ１４２Ｓ；ＨＢｓＡｇ Ｓ１４３Ｋ；ＨＢｓＡｇ Ｄ１４４Ａ；ＨＢｓＡｇ Ｇ１４５Ｒ；およびＨＢｓＡｇ Ｎ１４６Ａの感染性ＨＢｓＡｇ変異体の各々に結合できる。
ある実施態様において、結合タンパク質(例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む)は、ＨＢＶ感染を有する哺乳動物におけるＨＢＶ ＤＮＡの血清濃度を低減できる。ある実施態様において、結合タンパク質は、ＨＢＶ感染を有する哺乳動物におけるＨＢｓＡｇの血清濃度を低減できる。ある実施態様において、結合タンパク質は、ＨＢＶ感染を有する哺乳動物におけるＨＢｅＡｇの血清濃度を低減できる。ある実施態様において、結合タンパク質は、ＨＢＶ感染を有する哺乳動物におけるＨＢｃｒＡｇの血清濃度を低減できる。ある実施態様において、結合タンパク質は、哺乳動物におけるＨＢＶ ＤＮＡ、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇおよび／またはＨＢｃｒＡｇの血清濃度を、結合タンパク質単回投与後約１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間またはそれ以上低減できる。
用語「エピトープ」または「抗原性エピトープ」は、免疫グロブリン、キメラ抗原受容体または他の結合分子、ドメインまたはタンパク質などの、同族結合分子により認識され、特異的に結合される、あらゆる分子、構造、アミノ酸配列またはタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、一般にアミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面集団を含み、特異的三次構造特性および特異的電荷特性を有し得る。
ある実施態様において、結合タンパク質は、ＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つのアミノ酸を含むエピトープに結合できる。ある実施態様において、結合タンパク質は、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１１５～１３３、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１２０～１３３またはＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１２０～１３０から選択される少なくとも２つのアミノ酸に結合できる。ある実施態様において、結合タンパク質は、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１１５～１３３、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１２０～１３３またはＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１２０～１３０から選択される少なくとも３つのアミノ酸に結合できる。ある実施態様において、結合タンパク質は、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１１５～１３３、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１２０～１３３またはＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１２０～１３０から選択される少なくとも４つのアミノ酸に結合できる。ここで使用するアミノ酸の位置(例えば１１５～１３３、１２０～１３３、１２０～１３０)は、上記ＨＢｓＡｇのＳドメインを言い、これは、全３つのＨＢＶエンベロープタンパク質Ｓ－ＨＢｓＡｇ、Ｍ－ＨＢｓＡｇおよびＬ－ＨＢｓＡｇに存在し、そのためにＳ－ＨＢｓＡｇは一般にＨＢｓＡｇのＳドメインに対応する。
エピトープにおいてここで使用する用語「形成される」は、結合タンパク質が結合するエピトープが、直線状(連続的)または立体構造的(不連続)であり得ることを意味する。直線状または連続的エピトープは、抗体にそのアミノ酸の直線状配列または一次構造により認識されるエピトープである。立体構造的エピトープは、三次元形状およびタンパク質構造により認識され得る。よって、エピトープが直線状エピトープであり、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸位置１１５～１３３またはアミノ酸位置１２０～１３３から選択される位置に１を超えるアミノ酸を含むならば、該エピトープを構成するアミノ酸は、一次構造の隣接位置に位置し得る(例えば、アミノ酸配列における連続的アミノ酸である)。立体構造的エピトープ(３Ｄ構造)の場合、アミノ酸配列は、一般にエピトープとして３Ｄ構造を形成し、故に、該エピトープを形成するアミノ酸は、一次構造の隣接位置に位置していても、していなくてもよい(すなわちアミノ酸配列における連続的アミノ酸であってもなくてもよい)。
ある実施態様において、結合タンパク質が結合するエピトープは立体構造的エピトープである。ある実施態様において、結合タンパク質は、ＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域の少なくとも２つのアミノ酸を含むエピトープに結合し、ここで、少なくとも２つのアミノ酸は、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１２０～１３３またはアミノ酸１２０～１３０から選択され、ここで、少なくとも２つのアミノ酸は、(一次構造の)隣接位置に位置しない。ある実施態様において、結合タンパク質は、ＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域の少なくとも３つのアミノ酸を含むエピトープに結合し、ここで、少なくとも３つのアミノ酸は、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１２０～１３３またはアミノ酸１２０～１３０から選択され、ここで、３つのアミノ酸中少なくとも２つは、(一次構造の)隣接位置に位置しない。ある実施態様において、結合タンパク質は、ＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域の少なくとも４つのアミノ酸を含むエピトープに結合し、ここで、少なくとも４つのアミノ酸は、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１２０～１３３またはアミノ酸１２０～１３０から選択され、ここで、４つのアミノ酸中少なくとも２つは、(一次構造の)隣接位置に位置しない。
一次構造の隣接位置に位置しないここに開示する抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質が結合するアミノ酸(すなわちエピトープを形成するアミノ酸)は、ある場合、抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質が結合しない１以上のアミノ酸により空間的に離される。ある実施態様において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つのアミノ酸が、該エピトープに含まれる隣接位置に位置しないアミノ酸の間に位置し得る。
ある実施態様において、結合タンパク質は、ＨＢｓＡｇのＳドメインの少なくともアミノ酸Ｐ１２０、Ｃ１２１、Ｒ１２２およびＣ１２４を含むエピトープに結合する。他の実施態様において、本発明の結合タンパク質は、配列番号８８
ＰＣＲＸＣ
〔ここで、Ｘは任意のアミノ酸であるかまたはアミノ酸がない；Ｘは任意のアミノ酸である；ＸはＴ、Ｙ、Ｒ、ＳまたはＦである；ＸはＴ、ＹまたはＲである；またはＸはＴまたはＲである。〕
のアミノ酸配列を含む、エピトープに結合する。
他の実施態様において、本発明の結合タンパク質は、配列番号８０
ＴＧＰＣＲＴＣ
のアミノ酸配列または配列番号８０と少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むエピトープに結合する。
他の実施態様において、本発明の結合タンパク質は、配列番号８５
ＳＴＴＳＴＧＰＣＲＴＣ
のアミノ酸配列または配列番号８５と少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むエピトープに結合する。
ある実施態様において、本発明の結合タンパク質は、ＨＢｓＡｇのＳドメインの少なくともアミノ酸１４５～１５１
ＧＮＣＴＣＩＰ
(配列番号８１)
のアミノ酸配列を含むエピトープに結合する。
さらに他の実施態様において、本発明の結合タンパク質は、配列番号８０のアミノ酸配列および配列番号８１のアミノ酸配列を含むエピトープに結合する。
他の実施態様において、本発明の結合タンパク質は、配列番号８５のアミノ酸配列および／または配列番号８７のアミノ酸配列を含むエピトープに結合する。
上記のとおり、本発明の結合タンパク質が結合するエピトープは、直線状(連続的)または立体構造的(不連続)であり得る。ある実施態様において、本発明の結合タンパク質は、立体構造的エピトープに結合し、あるこのような実施態様において、立体構造的エピトープは非還元条件下でのみ存在する。
ある実施態様において、本発明の結合タンパク質は、直線状エピトープに結合する。あるこのような実施態様において、直線状エピトープは非還元条件および還元条件両者下に存在する。
具体的実施態様において、本発明の結合タンパク質は、配列番号１
Ｘ１ Ｘ２ Ｘ３ ＴＣ Ｘ４ Ｘ５ Ｘ６Ａ Ｘ７Ｇ
〔ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は任意のアミノ酸であり得る。〕
(配列番号１)
のアミノ酸配列により形成された、ＨＢｓＡｇの抗原性ループにおけるエピトープに結合する。
ある実施態様において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、配列番号３のアミノ酸１２０～１３０と比較して、保存的に置換されたアミノ酸である。ある実施態様において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、配列番号５～３３の何れかのアミノ酸２０～３０と比較して、保存的に置換されたアミノ酸である。
特定の実施態様において、配列番号１のＸ１は小アミノ酸である。ここで使用する「小」アミノ酸は、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グリシン、プロリン、セリン、スレオニンおよびバリンからなる群から選択される何れかのアミノ酸をいう。あるこのような実施態様において、Ｘ１はプロリン、セリンまたはスレオニンである。
ある実施態様において、配列番号１のＸ２は小アミノ酸である。ある実施態様において、Ｘ２はシステインまたはスレオニンから選択され得る。
ある実施態様において、配列番号１のＸ３は荷電アミノ酸または脂肪族アミノ酸である。ここで使用する「荷電」アミノ酸は、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸およびヒスチジンからなる群から選択される何れかのアミノ酸をいう。ここで使用する「脂肪族」アミノ酸は、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群から選択される何れかのアミノ酸をいう。ある実施態様において、Ｘ３はアルギニン、リシン、アスパラギン酸またはイソロイシンから選択される。
ある実施態様において、配列番号１のＸ４は小アミノ酸および／または疎水性アミノ酸である。ここで使用する「疎水性」アミノ酸は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、バリン、トリプトファン、チロシン、メチオニン、プロリンおよびグリシンからなる群から選択される何れかのアミノ酸をいう。ある実施態様において、Ｘ４はメチオニンまたはスレオニンから選択される。
ある実施態様において、配列番号１のＸ５は小アミノ酸および／または疎水性アミノ酸。ある実施態様において、Ｘ５はスレオニン、アラニンまたはイソロイシンから選択される。
ある実施態様において、配列番号１のＸ６は小アミノ酸および／または疎水性アミノ酸。ある実施態様において、Ｘ６はスレオニン、プロリンまたはロイシンから選択される。
ある実施態様において、配列番号１のＸ７は極性アミノ酸または脂肪族アミノ酸である。ここで使用する「極性」アミノ酸は、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、グルタミン、トリプトファン、チロシン、セリンおよびスレオニンからなる群から選択される何れかのアミノ酸をいう。あるこのような実施態様において、Ｘ７はグルタミン、ヒスチジンまたはロイシンである。
ある実施態様において、本発明の結合タンパク質は、配列番号２
Ｘ１ Ｘ２ Ｘ３ ＴＣ Ｘ４ Ｘ５ Ｘ６Ａ Ｘ７Ｇ
〔ここで、Ｘ１はＰ、ＴまたはＳであり、
Ｘ２はＣまたはＳであり、
Ｘ３はＲ、Ｋ、ＤまたはＩであり、
Ｘ４はＭまたはＴであり、
Ｘ５はＴ、ＡまたはＩであり、
Ｘ６はＴ、ＰまたはＬであり、そして
Ｘ７はＱ、ＨまたはＬである。〕
(配列番号２)
のアミノ酸配列により形成されるＨＢｓＡｇの抗原性ループにおけるエピトープに結合する。
配列番号１または２のアミノ酸配列により形成されるエピトープに関して、ここで使用する用語「形成される」は、開示の結合タンパク質が必ず配列番号１または２の各および全アミノ酸に結合することを含意することを意図しないことは注意すべきである。特に、結合タンパク質は、配列番号１または２のアミノ酸の一部とのみ結合でき、そのために他のアミノ酸残基は「スペーサー」として働き得る。
具体的実施態様において、本発明の結合タンパク質は、下表３に示す配列番号５～３３から選択されるアミノ酸配列の１以上、２以上、３以上または４以上のアミノ酸により形成されるＨＢｓＡｇの抗原性ループにおけるエピトープに結合する。
ある実施態様において、本発明の結合タンパク質は、下表３に示す配列番号５～３３の何れか１以上のアミノ酸配列を有するＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域またはその配列バリアントに結合する。ある実施態様において、本発明の結合タンパク質は、下表３に示す配列番号５～３３の何れかのアミノ酸配列を有するＨＢｓＡｇの抗原性ループバリアントのすべてに結合する。
ある態様において、本発明は、(ｉ)配列番号４１または６７のアミノ酸配列と少なくとも９０％(すなわち、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上)同一性を含む重鎖可変領域(ＶＨ)；および(ii)配列番号４２、５９、６５、８９、９０または１１１～１２０の何れかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性と含む軽鎖可変領域(ＶＬ)であるが、ただし、ＩＭＧＴナンバリングによるＶＬの４０位のアミノ酸はシステインではないＶＬを含む単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、該抗体またはその抗原結合フラグメントはＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域に結合し、Ｂ型肝炎ウイルスおよびデルタ型肝炎ウイルスの感染を中和する。
さらなる実施態様において、(ｉ)ＶＨは配列番号４１または６７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一性を含む；および／または(ii)ＶＬは配列番号４２、５９、６５、８９、９０または１１１～１２０の何れかのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一性を含む。
ある実施態様において、ＶＬの４０位のアミノ酸はアラニンである。他の実施態様において、ＶＬの４０位のアミノ酸はセリンである。さらに他の実施態様において、ＶＬの４０位のアミノ酸はグリシンである。
ここに開示する実施態様の何れにおいても、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号(ｉ)それぞれ３４～３６、３７、３８および４０；(ii)それぞれ３４、６６、３６、３７、３８および４０；(iii)それぞれ３４～３６、３７、３９および４０；(iv)それぞれ３４、６６、３６、３７、３９および４０；(ｖ)それぞれ３４～３６、３７、３８および５８；(vi)それぞれ３４、６６、３６、３７、３８および５８；(vii)それぞれ３４～３６、３７、３９および５８；または(vii)それぞれ３４、６６、３６、３７、３９および５８のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３配列を含み得る。
ある実施態様において、抗体または抗原結合フラグメントのＶＬは、配列番号８９のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。ある実施態様において、抗体または抗原結合フラグメントのＶＬは、配列番号９０のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。他の実施態様において、抗体または抗原結合フラグメントのＶＬは、配列番号１１１～１２０のアミノ酸配列の何れかを含むまたはそれからなる。ある実施態様において、ＶＨは、配列番号４１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。他の実施態様において、ＶＨは、配列番号６７のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
具体的実施態様において、ＶＨは、配列番号４１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなり、そしてＶＬは、配列番号８９のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。他の実施態様において、ＶＨは、配列番号４１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなり、そしてＶＬは、配列番号９０のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。ある実施態様において、ＶＨは、配列番号４１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなり、そしてＶＬは、配列番号１１１～１２０のアミノ酸配列の何れかを含むまたはそれからなる。他の実施態様において、ＶＨは、配列番号６７のアミノ酸配列を含むまたはそれからなり、そしてＶＬは、配列番号８９、９０および１１１～１２０の何れかのアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
他の態様において、本発明は、(ｉ)配列番号９５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を含む重鎖可変領域(ＶＨ)；および(ii)配列番号９６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を含む軽鎖可変領域(ＶＬ)を含む単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、該抗体またはその抗原結合フラグメントはＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域に結合し、Ｂ型肝炎ウイルスおよびデルタ型肝炎ウイルスの感染を中和する。
さらなる実施態様において、(ｉ)ＶＨは配列番号９５のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一性を含む；および／または(ii)ＶＬは配列番号９６のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一性を含む。
ある実施態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号９７～１０２のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３配列を含む。
具体的実施態様において、ＶＨは、配列番号９５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなり、そしてＶＬは、配列番号９６のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
Ｆｃ部分
ある実施態様において、本発明の結合タンパク質(例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント)はＦｃ部分を含む。ある実施態様において、Ｆｃ部分はヒト起源、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３および／またはＩｇＧ４または他のＩｇクラスまたはアイソタイプに由来し得る。特定の実施態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、ヒトＩｇＧ１由来のＦｃ部分を含み得る。
ここで使用する用語「Ｆｃ部分」は、パパイン開裂部位のすぐ上流のヒンジ領域(例えば、重鎖定常領域の第一残基を１１４として、天然ＩｇＧにおける残基２１６)から始まり、免疫グロブリン重鎖のＣ末端で終わる、免疫グロブリン重鎖の部分を含む、それからなる、それから本質的になるまたはそれに由来する配列をいう。よって、Ｆｃ部分は、完全Ｆｃ部分またはその一部(例えば、ドメイン)であり得る。ある実施態様において、完全Ｆｃ部分は、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン(例えば、ＥＵアミノ酸位置２１６～４４６)を含む。さらなるリシン残基(Ｋ)は、Ｆｃ部分の最遠Ｃ末端に存在することもあるが、しばしば成熟抗体から開裂されている。Ｆｃ部分内のアミノ酸位置は、ＫａｂａｔのＥＵナンバリングシステムにより番号付けされており、例えば、Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U.S. Dept. Health and Human Services, 1983 and 1987を参照のこと。Ｆｃ部分のアミノ酸位置はまたＩＭＧＴナンバリングシステム(Ｃドメインおよびエクソンナンバリングのための独特のナンバリングを含む)およびＫａｂａｔナンバリングシステムによっても番号付けされ得る。
ある実施態様において、Ｆｃ部分は、ヒンジ(例えば、上部、中央部および／または下部ヒンジ領域)ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインそのバリアント、部分もしくはフラグメントの少なくとも１つを含む。ある実施態様において、Ｆｃ部分は少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインを含む。さらなる実施態様において、Ｆｃ部分は完全Ｆｃ部分である。ヒトＩｇＧ１アイソタイプの例示的Ｆｃ部分のアミノ酸配列は配列番号１３７に提供される。Ｆｃ部分は、また天然に存在するＦｃ部分に対して１以上のアミノ酸挿入、欠失または置換を含み得る。例えば、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインまたはその一部の少なくとも１つは欠失し得る。例えば、Ｆｃ部分は、(ｉ)ＣＨ２ドメイン(またはその一部)に融合したヒンジドメイン(またはその一部)、(ii)ＣＨ３ドメイン(またはその一部)に融合したヒンジドメイン(またはその一部)、(iii)ＣＨ３ドメイン(またはその一部)に融合したＣＨ２ドメイン(またはその一部)、(iv)ヒンジドメイン(またはその一部)、(ｖ)ＣＨ２ドメイン(またはその一部)または(vi)ＣＨ３ドメインまたはその一部を含むかまたはこれからなってよい。
本発明のＦｃ部分は、天然に存在するＦｃ部分により付与される少なくとも１つの所望の機能の維持または増強および／または天然に存在するＦｃ部分の望まない機能の低減をしながら、天然に存在する免疫グロブリン分子の完全Ｆｃ部分からアミノ酸配列が変わるように、修飾し得る。このような機能は、例えば、Ｆｃ受容体(ＦｃＲ)結合、抗体半減期調節(例えば、ＦｃＲｎへの結合による)、ＡＤＣＣ機能、プロテインＡ結合、プロテインＧ結合および補体結合を含む。天然に存在するＦｃ部分のこのような機能に関与する部分は、文献に記載されている。
例えば、補体カスケードを活性化するために、Ｃ１ｑタンパク質複合体は、免疫グロブリン分子が抗原性標的に結合するとき、少なくとも２分子のＩｇＧ１または１分子のＩｇＭに結合できる(Ward, E. S., and Ghetie, V., Ther. Immunol. 2 (1995) 77-94)。Burton, D. R.(Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206)は、アミノ酸残基３１８～３３７を含む重鎖領域は、補体結合に関与することを記載する。Duncan, A. R., and Winter, G. (Nature 332 (1988) 738-740)は、部位特異的変異誘発を使用して、Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０およびＬｙｓ３２２がＣ１ｑへの結合部位を形成すると報告する。Ｃ１ｑの結合におけるＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０およびＬｙｓ ３２２残基の役割は、これら残基を含む短合成ペプチドが補体介在性溶解を阻害できるとの能力により確認された。
例えば、ＦｃＲ結合は、Ｆｃ部分(抗体の)と、造血細胞を含む細胞上の専門化細胞表面受容体であるＦｃ受容体(ＦｃＲ)の相互作用を介在できる。Ｆｃ受容体は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、免疫複合体の食作用による抗体被覆病原体の除去ならびに対応する抗体で被覆された赤血球および種々の他の細胞標的(例えば腫瘍細胞)の抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)を介する溶解の両者に介在ことが示されている(Van de Winkel, J. G., and Anderson, C. L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524)。ＦｃＲは、免疫グロブリンクラスへの特異性により定義される；ＩｇＧ抗体に対するＦｃ受容体はＦｃγＲと称し、ＩｇＥはＦｃεＲ、ＩｇＡはＦｃαＲなどと称し、新生児Ｆｃ受容体はＦｃＲｎと称する。Ｆｃ受容体結合は、例えばRavetch, J. V., and Kinet, J. P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P. J., et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M., et al., J Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341; and Gessner, J. E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248に記載される。
天然ＩｇＧ抗体のＦｃドメイン(ＦｃγＲ)による受容体の架橋結合は、食作用、抗体依存性細胞傷害および炎症メディエーターの放出を含む多種多様なエフェクター機能ならびに免疫複合体排除および抗体産生制御を誘発する。受容体の架橋結合を提供するＦｃ部分(例えば、ＦｃγＲ)がここで考慮される。ヒトにおいて、３クラスのＦｃγＲが今日までに特徴づけされており、それは、(ｉ)高親和性で単量体ＩｇＧに結合し、マクロファージ、単球、好中球および好酸球に発現されるＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)；(ii)中～低親和性で複合化ＩｇＧに結合し、広範に、特に白血球で発現され、抗体介在免疫の中心的プレーヤーであると考えられ、免疫系で異なる機能を発揮するが、ＩｇＧ－Ｆｃに類似する低親和性で結合し、これら受容体のエクトドメインは高度に相同である、ＦｃγＲIIＡ、ＦｃγＲIIＢおよびＦｃγＲIIＣに分割できるＦｃγＲII(ＣＤ３２)；および(iii)中～低親和性でＩｇＧに結合し、ＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球および一部単球およびＴ細胞に見られ、ＡＤＣＣに介在すると考えられるＦｃγＲIIIＡおよび好中球に高度に発現されるＦｃγＲIIIＢの２形態でみられるＦｃγＲIII(ＣＤ１６)である。
ＦｃγＲIIＡは、殺細胞に関与する多くの細胞(例えばマクロファージ、単球、好中球)でみられ、殺細胞過程を活性化できると考えられる。ＦｃγＲIIＢは阻害性過程に役割を有すると考えられ、Ｂ細胞、マクロファージおよび肥満細胞および好酸球に見られる。重要なことに、全ＦｃγＲIIＢの７５％が肝臓でみられることが示されている(Ganesan, L. P. et al., 2012: “FcγRIIb on liver sinusoidal endothelium clears small immune complexes,” Journal of Immunology 189: 4981-4988)。ＦｃγＲIIＢは、ＬＳＥＣと称される肝臓類洞内皮に豊富に発現され、肝臓におけるクッパー細胞で、ＬＳＥＣは小免疫複合体排除の主要な部位である(Ganesan, L. P. et al., 2012: FcγRIIb on liver sinusoidal endothelium clears small immune complexes. Journal of Immunology 189: 4981-4988)。
ある実施態様において、ここに開示する抗体およびその抗原結合フラグメントは、例えばＩｇＧタイプ抗体などの、ＦｃγＲIIｂ、特にＦｃ領域に結合するためのＦｃ部分を含む。さらに、Chu, S. Y. et al., 2008: Inhibition of B cell receptor-mediated activation of primary human B cells by coengagement of CD19 and FcgammaRIIb with Fc-engineered antibodies. Molecular Immunology 45, 3926-3933に記載のとおり、変異Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆの導入によりＦｃγＲIIＢ結合を増強するように、Ｆｃ部分を操作することが可能である。それにより、免疫複合体の排除が増強され得る(Chu, S., et al., 2014: Accelerated Clearance of IgE In Chimpanzees Is Mediated By Xmab7195, An Fc-Engineered Antibody With Enhanced Affinity For Inhibitory Receptor FcγRIIb. Am J Respir Crit, American Thoracic Society International Conference Abstracts)。ある実施態様において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、特に、Chu, S. Y. et al., 2008: Inhibition of B cell receptor-mediated activation of primary human B cells by coengagement of CD19 and FcgammaRIIb with Fc-engineered antibodies. Molecular Immunology 45, 3926-3933に記載のとおりの、変異Ｓ２６７ＥおよびＬ３２８Ｆを有する操作されたＦｃ部分を含む。
Ｂ細胞で、ＦｃγＲIIＢはさらなる免疫グロブリン産生および、例えば、ＩｇＥクラスへの、アイソタイプスイッチングを抑制するよう機能と考えられる。マクロファージで、ＦｃγＲIIＢは、ＦｃγＲIIＡを介して介在される食作用を阻害すると考えられる。好酸球および肥満細胞で、Ｂ形態はその別々の受容体へのＩｇＥ結合を介して、これらの細胞の活性化抑制を助け得る。
ＦｃγＲＩ結合について、天然ＩｇＧにおけるＥ２３３－Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７およびＰ３２９の少なくとも１つの修飾が、ＦｃγＲＩへの結合を低減する。ＩｇＧ２残基の２３３～２３６位は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４の対応する位置に置換されて導入されて、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４のＦｃγＲＩへの結合を１０３倍低減し、抗体感作赤血球に対するヒト単球応答を排除する(Armour, K. L., et al. Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624)。
ＦｃγＲII結合に関して、例えば、ＩｇＧについて、Ｅ２３３－Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｒ２９２およびＫ４１４の少なくとも１つの変異によりＦｃγＲIIＡへの結合の低減が見られる。
ヒトＦｃγＲIIＡの２個の対立形質は、高親和性でＩｇＧ１ Ｆｃに結合する「Ｈ１３１」バリアントおよび低親和性でＩｇＧ１ Ｆｃに結合する「Ｒ１３１」バリアントである。例えば、Bruhns et al., Blood 113:3716-3725 (2009)参照。
ＦｃγＲIII結合に関して、例えば、Ｅ２３３－Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｓ２３９、Ｅ２６９、Ｅ２９３、Ｙ２９６、Ｖ３０３、Ａ３２７、Ｋ３３８およびＤ３７６の少なくとも１つの変異で、ＦｃγＲIIIＡへの結合の低減が見られる。Ｆｃ受容体についてのヒトＩｇＧ１上の結合部位のマッピング、上記変異部位およびＦｃγＲＩおよびＦｃγＲIIＡへの結合を測定する方法は、Shields, R. L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604に記載される。
ヒトＦｃγＲIIIＡの２個の対立形質は、低親和性でＩｇＧ１ Ｆｃに結合する「Ｆ１５８」バリアントおよび高親和性でＩｇＧ１ Ｆｃに結合する「Ｖ１５８」バリアントである。例えば、Bruhns et al., Blood 113:3716-3725 (2009)参照。
ＦｃγＲIIへの結合に関して、天然ＩｇＧ Ｆｃの２領域、すなわち(ｉ)ＩｇＧ Ｆｃの下部ヒンジ部位、特にアミノ酸残基Ｌ、Ｌ、Ｇ、Ｇ(２３４～２３７、ＥＵナンバリング)および(ii)ＩｇＧ ＦｃのＣＨ２ドメインの隣接領域、特に、例えばＰ３３１の領域における、下部ヒンジ領域に隣接する上部ＣＨ２ドメインにおけるループおよび鎖がＦｃγＲIIとＩｇＧの相互作用に関与すると考えられる(Wines, B.D., et al., J. Immunol. 2000; 164: 5313-5318)。さらに、ＦｃγＲＩは、ＩｇＧ Ｆｃ上の同じ部位に結合すると考えられ、一方ＦｃＲｎおよびプロテインＡはＣＨ２－ＣＨ３境界面であると考えられるＩｇＧ Ｆｃ上の異なる位置に結合する(Wines, B.D., et al., J. Immunol. 2000; 164: 5313-5318)。
また考慮されるのは、本発明のＦｃ部分のある(すなわち、１以上の)Ｆｃγ受容体への結合親和性を増強させる変異である(例えば、変異を含まないそれを含む対照Ｆｃ部分または抗体と比較して)。例えば、Ｆｃ変異および技術を引用により本明細書に包含させる、Delillo and Ravetch, Cell 161(5):1035-1045 (2015) and Ahmed et al., J. Struc. Biol. 194(1):78 (2016)参照。
ここに開示する実施態様の何れにおいても、結合タンパク質は、Ｇ２３６Ａ；Ｓ２３９Ｄ；Ａ３３０Ｌ；およびＩ３３２Ｅ；またはこれらの何れか２以上を含む組み合わせ；例えば、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ；Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ；Ｇ２３６Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ(またここでは「ＧＡＡＬＩＥ」と称する)；またはＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅから選択される変異を含むＦｃ部分を含み得る。ある実施態様において、Ｆｃ部分はＳ２３９Ｄを含まない。
ある実施態様において、Ｆｃ部分は、Ｆｃ部分のＦｃＲｎ結合への結合に関与する部分の少なくとも一部を含むまたはそれからものであり得る。ある実施態様において、Ｆｃ部分は、ＦｃＲｎ(例えば、約６.０のｐＨで)への結合親和性を改善する(例えば、結合を増強する)１以上のアミノ酸修飾を含み、ある実施態様において、それによりＦｃ部分を含む分子のインビボ半減期が延長される(例えば、修飾を含まない以外、同じである対照Ｆｃ部分または抗体と比較して)。ある実施態様において、Ｆｃ部分はＩｇＧ Ｆｃを含むまたはそれ由来であり、半減期延長変異は、Ｍ４２８Ｌ；Ｎ４３４Ｓ；Ｎ４３４Ｈ；Ｎ４３４Ａ；Ｎ４３４Ｓ；Ｍ２５２Ｙ；Ｓ２５４Ｔ；Ｔ２５６Ｅ；Ｔ２５０Ｑ；Ｐ２５７Ｉ；Ｑ３１１Ｉ；Ｄ３７６Ｖ；Ｔ３０７Ａ；Ｅ３８０Ａ(ＥＵナンバリング)の何れか１以上を含む。ある実施態様において、半減期延長変異は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ(またここでは「ＭＬＮＳ」と称する)を含む。ある実施態様において、半減期延長変異は、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含む。ある実施態様において、半減期延長変異は、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌを含む。ある実施態様において、半減期延長変異は、Ｐ２５７Ｉ／Ｑ３１１Ｉを含む。ある実施態様において、半減期延長変異は、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈを含む。ある実施態様において、半減期延長変異は、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈを含む。ある実施態様において、半減期延長変異は、Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａを含む。
ある実施態様において、結合タンパク質は、置換変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含むＦｃ部分を含む。ある実施態様において、結合タンパク質は、置換変異Ｇ２３６Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅを含むＦｃ部分を含む。ある実施態様において、結合タンパク質は、Ｇ２３６Ａ変異、Ａ３３０Ｌ変異およびＩ３３２Ｅ変異(ＧＡＡＬＩＥ)を含み、Ｓ２３９Ｄ変異を含まない(例えば、ＩｇＧ)Ｆｃ部分を含む(例えば、２３９位に天然Ｓを含む)。具体的実施態様において、結合タンパク質は、置換変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＳおよびＧ２３６Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅを含み、所望によりＳ２３９Ｄを含まないＦｃ部分を含む。ある実施態様において、結合タンパク質は置換変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＳおよびＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅを含むＦｃ部分を含む。
ある実施態様において、本発明の結合タンパク質は、ここに開示する例示的抗ＨＢＶ抗体の何れかおよび／またはＰＣＴ公報ＷＯ２０１７／０６０５０４(抗体ＨＢＣ３４、ＨＢＣ３４－Ｖ７、ＨＢＣ３４－Ｖ２３、ＨＢＣ３４－Ｖ３１、ＨＢＣ３４－Ｖ３２、ＨＢＣ３４－Ｖ３３、ＨＢＣ３４－Ｖ３４、ＨＢＣ３４－Ｖ３５を含む)(軽鎖の４０位に置換変異を含むＨＢＣ抗体のここに開示するバリアント(例えば、天然システインのアラニン、セリンなどでの置換)およびＨＢＣ２４を含む)のＣＤＲおよび／または可変ドメインおよび／または重鎖および／または軽鎖；およびＧ２３６Ａ変異、Ａ３３０Ｌ変異およびＩ３３２Ｅ(ＧＡＡＬＩＥ)変異を含むＦｃ部分を含み、ここで、Ｆｃ部分は、所望によりＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ(ＭＬＮＳ)変異をさらに含むある実施態様において、Ｆｃ部分はＳ２３９Ｄを含まない。
ある実施態様において、結合タンパク質は、配列番号３４のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号３５または６６のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、配列番号３６のＣＤＲＨ３アミノ酸配列、配列番号３７のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号３８または３９のＣＤＲＬ２アミノ酸配列および配列番号５８または４０のＣＤＲＬ３アミノ酸配列；およびＧＡＡＬＩＥ変異を含むＦｃ部分を含む。ある実施態様において、Ｆｃ部分Ｓ２３９Ｄ変異を含まない。ある実施態様において、Ｆｃ部分はさらにＭＬＮＳ変異を含む。
ある実施態様において、結合タンパク質は、配列番号４１または６７の重鎖可変ドメイン(ＶＨ)アミノ酸配列および配列番号４２、５９、６５、８９、９０および１１１～１２０の何れかの軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)アミノ酸配列；およびＧＡＡＬＩＥ変異を含むＦｃ部分を含む。ある実施態様において、Ｆｃ部分はさらにＭＬＮＳ変異を含む。
ある実施態様において、結合タンパク質は、配列番号１３８または９１または９２の重鎖アミノ酸配列および／または配列番号９３または９４の軽鎖アミノ酸配列を含む。ある実施態様において、結合タンパク質は、配列番号９１の重鎖アミノ酸配列および配列番号９３の軽鎖アミノ酸配列を含む。ある実施態様において、結合タンパク質は、配列番号９１の重鎖アミノ酸配列および配列番号９４の軽鎖アミノ酸配列を含む。ある実施態様において、結合タンパク質は、配列番号９２の重鎖アミノ酸配列および配列番号９３の軽鎖アミノ酸配列を含む。ある実施態様において、結合タンパク質は、配列番号９２の重鎖アミノ酸配列および配列番号９４の軽鎖アミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、結合タンパク質は、配列番号９７のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号９８のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、配列番号９９のＣＤＲＨ３アミノ酸配列、配列番号１００のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号１００のＣＤＲＬ２酸配列および配列番号１０２のＣＤＲＬ３アミノ酸配列；およびＧＡＡＬＩＥ変異を含むＦｃ部分を含む。ある実施態様において、Ｆｃ部分はさらにＭＬＮＳ変異を含む。
ある実施態様において、結合タンパク質は、配列番号９５の重鎖可変ドメイン(ＶＨ)アミノ酸配列および配列番号９６の軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)アミノ酸配列；およびＧＡＡＬＩＥ変異を含むＦｃ部分を含む。ある実施態様において、Ｆｃ部分はさらにＭＬＮＳ変異を含む。
ここに開示する何れの実施態様においても、本発明の結合タンパク質はＧＡＡＬＩＥ変異を含むＦｃ部分を含み、対照ポリペプチド(すなわち、ＧＡＡＬＩＥ変異を含まないＦｃ部分を含む結合タンパク質であり得るポリペプチド)に比して、ヒトＦｃγＲIIａおよび／またはヒトＦｃγＲIIIａへの結合が増強している。
ある実施態様において、対照ポリペプチドは、野生型Ｆｃ部分であるＦｃ部分(例えば、同じアイソタイプの)を含むまたは１以上の置換変異(または挿入または欠失)を含むＦｃ部分であるが、ただし、置換変異はＧＡＡＬＩＥではないまたはそれを含まない。ある実施態様において、結合タンパク質は、ＧＡＡＬＩＥ変異(および所望により、例えば、ＭＬＮＳなどの、他の置換変異)を有するＨＢＣ３４－Ｖ３５抗体であり、対照ポリペプチドはＨＢＣ３４－Ｖ３５(野生型Ｆｃ部分を含む)を含む。ある実施態様において、対照ポリペプチドは、ヒトＦｃγＲIIａおよび／またはヒトＦｃγＲIIIａへの結合に影響することが知られるまたは考えられる置換変異を含まない。
Ｆｃ部分(またはそれを含む結合タンパク質)とヒトＦｃγ受容体、例えばヒトＦｃγＲIIＡ、ヒトＦｃγＲIIIＡまたはヒトＦｃ ＦｃγＲIIＢまたは補体タンパク質、例えばＣ１ｑの間の結合などのポリペプチド間の結合は、当分野で知られる方法を使用して決定または検出され得る。例えば、バイオレイヤー干渉法(ＢＬＩ)アッセイを、製造業者の指示に従いＯｃｔｅｔ(登録商標)RED96(ForteBio, Fremont, California USA)装置を使用して実施して、目的の第一ポリペプチド(例えば、ＧＡＡＬＩＥ変異を含むＨＢＣ３４ｖ３５)と、センサー基盤上に捕捉される目的の第二ポリペプチド(例えば、ＦｃγＲIIＡ(Ｈ１３１)、ＦｃγＲIIＡ(Ｒ１３１)、ＦｃγＲIIIＡ(Ｆ１５８)、ＦｃγＲIIIＡ(Ｖ１５８)またはＦｃγＲIIｂ)間のリアルタイム結合および解離を決定することができる。
ある実施態様において、結合タンパク質はＧＡＡＬＩＥ変異を含むＦｃ部分を含み、ＧＡＡＬＩＥ変異を含まないＦｃ部分を含む対照ポリペプチドと比較して、ヒトＦｃγＲIIＡ(Ｈ１３１)、ヒトＦｃγＲIIＡ(Ｒ１３１)、ヒトＦｃγＲIIIＡ(Ｆ１５８)、ヒトＦｃγＲIIIＡ(Ｖ１５８)またはこれらの何らかの組み合わせへの結合が増強されている。ある実施態様において、増強された結合は、ＢＬＩアッセイにおける対照結合タンパク質に対するシグナルシフトの増加(例えば、高いピークシグナル；大きい結合速度；遅い解離速度；大きな曲線下面積の１以上)により決定される。ある実施態様において、ＢＬＩアッセイは、Ｏｃｔｅｔ(Ｒ)ＲＥＤ９６(ForteBio, Fremont, California USA)装置の使用を含む。さらなる実施態様において、ＢＬＩアッセイは、抗ペンタタグセンサーに捕捉され、結合タンパク質に暴露されるタグ付ヒトＦｃγＲを含む。ある実施態様において、結合タンパク質はＩｇＧ Ｆａｂを含み、ＢＬＩアッセイは、さらにＦａｂフラグメントを介して結合タンパク質を架橋するための抗ＩｇＧ Ｆａｂ結合フラグメント存在下、捕捉ヒトＦｃγＲを結合タンパク質に曝すことを含む。
ある実施態様において、結合タンパク質はＧＡＡＬＩＥ変異を含むＦｃ部分を含み、対照ポリペプチドと比較してヒトＦｃγＲIIＡ(Ｈ１３１)、ヒトＦｃγＲIIＡ(Ｒ１３１)、ヒトＦｃγＲIIIＡ(Ｆ１５８)および／またはヒトＦｃγＲIIIＡ(Ｖ１５８)への結合が増強されており、ここで、増強された結合は、対照結合タンパク質を使用して観察されるシグナルシフトより１.５倍、２倍、２.５倍、３倍以上のＢＬＩアッセイにおけるシグナルシフト(ナノメートル)を含み得る。
ある実施態様において、結合タンパク質はＧＡＡＬＩＥ変異を含むＦｃ部分を含み、対照ポリペプチドと比較して、ヒトＦｃγＲIIＡ(Ｈ１３１)、ヒトＦｃγＲIIＡ(Ｒ１３１)、ヒトＦｃγＲIIIＡ(Ｆ１５８)およびヒトＦｃγＲIIIＡ(Ｖ１５８)への結合が増強されている。
ここに開示する何れの実施態様においても、結合タンパク質はＧＡＡＬＩＥ変異を含むＦｃ部分を含み、対照ポリペプチドに比して、ヒトＦｃγＲIIＢへの結合が低減している。ある実施態様において、結合タンパク質はＧＡＡＬＩＥ変異を含むＦｃ部分を含み、例えば、ＢＬＩアッセイにおけるベースラインに対する統計学的に有意なシグナルシフトがないことにより決定されるとおり、ヒトＦｃγＲIIＢに結合しない。
ここに開示する何れの実施態様においても、結合タンパク質はＧＡＡＬＩＥ変異を含むＦｃ部分を含み、対照ポリペプチドに比して、ヒトＣ１ｑ(補体タンパク質)への結合が低減している。ある実施態様において、結合タンパク質はＧＡＡＬＩＥ変異を含むＦｃ部分を含み、ＢＬＩアッセイにおけるベースラインに対する統計学的に有意なシグナルシフトがないことにより決定されるとおり、ヒトＣ１ｑに結合しない。
ここに開示する何れの実施態様においても、結合タンパク質はＧＡＡＬＩＥ変異を含むＦｃ部分を含み、対照ポリペプチド(すなわち、ＧＡＡＬＩＥ変異を含まないＦｃ部分を含むＨｂｓＡｇ特異的結合タンパク質であり得るポリペプチド)より大きな程度までヒトＦｃγＲIIＡ、ヒトＦｃγＲIIIＡまたは両者を活性化させる。ある実施態様において、対照ポリペプチドは、野生型Ｆｃ部分であるまたは１以上の置換変異(ただし、該置換変異はＧＡＡＬＩＥではない)を含むＦｃ部分を含む。ある実施態様において、結合タンパク質は、ＧＡＡＬＩＥ変異(および所望により、例えば、ＭＬＮＳなどの、他の置換変異)を有するＨＢＣ３４－Ｖ３５抗体を含み、対照ポリペプチドは野生型Ｆｃ部分を有するＨＢＣ３４－Ｖ３５である。
ヒトＦｃγＲの活性化は、当分野で知られる方法を使用して決定または検出できる。例えば、十分に検証された、市販のバイオレポーターアッセイは、ＮＦＡＴ応答要素制御下、(ｉ)目的のＦｃγＲおよび(ii)ホタルルシフェラーゼレポーターを安定に発現するJurkatエフェクター細胞(Promega; Cat. no: G9798)の存在下、ＨＢｓＡｇ特異的結合タンパク質と組み換えＨＢｓＡｇ(Engerix B, GlaxoSmithKline)をインキュベートすることを含む。Ｆｃの細胞表面発現ＦｃγＲへの結合は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のＮＦＡＴ介在発現をもたらす。次いで、発光を製造業社の指示に従い、Bio-GloTMルシフェラーゼアッセイ試薬(Promega)を使用するルミノメーター(例えば、Bio-Tek)で測定する。活性化は、次の式を適用させることにより、バックグラウンドを超える相対的発光単位(ＲＬＵ)の平均として表す：(結合タンパク質(例えば、ｍＡｂｓ)の濃度[ｘ]でのＲＬＵ－バックグラウンドのＲＬＵ)。
ある実施態様において、結合タンパク質はＧＡＡＬＩＥ変異を含むＦｃ部分を含み、対照ポリペプチドより大きな程度までヒトＦｃγＲIIＡ(Ｈ１３１)、ヒトＦｃγＲIIＡ(Ｒ１３１)、ヒトＦｃγＲIIIＡ(Ｆ１５８)および／またはヒトＦｃγＲIIIＡ(Ｖ１５８)を活性化する。ある実施態様において、大きな程度の活性化は、ここに記載する発光バイオレポーターアッセイを使用して決定して、高いピーク発光および／または大きな曲線下発光面積を含む。ある実施態様において、結合タンパク質はＧＡＡＬＩＥ変異を含むＦｃ部分を含み、対照ポリペプチドより大きな程度までヒトＦｃγＲIIＡ(Ｈ１３１)、ヒトＦｃγＲIIＡ(Ｒ１３１)およびヒトＦｃγＲIIIＡ(Ｆ１５８)を活性化し、ここで、大きな程度の活性化は、対照結合タンパク質を使用して観察されるピークＲＬＵより１.５倍、２倍、２.５倍、３倍またはそれ以上大きなピークＲＬＵを含む。
ここに開示する何れの実施態様においても、結合タンパク質は、ＧＡＡＬＩＥ変異を含むＦｃ部分を含み、上記のとおり発光バイオレポーターアッセイにおいて統計学的に有意なおよび／または測定可能なＲＬＵがないことにより決定されるとおり、ヒトＦｃγＲIIＢを活性化しない。
ここに開示する何れの実施態様においても、結合タンパク質はＧＡＡＬＩＥ変異を含むＦｃ部分を含み、ＨＢｓＡｇの存在下、対照ポリペプチドより大きな程度までヒトナチュラルキラー(ＮＫ)細胞を活性化する。ある実施態様において、ＮＫ細胞の活性化は、Ｄ１０７ａ発現(例えば、フローサイトメトリーによる)により決定される。ある実施態様において、ＮＫ細胞は、Ｖ１５８／Ｖ１５８ホモ接合型、Ｆ１５８／Ｆ１５８ホモ接合型またはＶ１５８／Ｆ１５８ヘテロ接合型ＦｃγＲIIIａ遺伝子型を含む細胞を含む。
本発明のＧＡＡＬＩＥ変異を含むＦｃ部分を含むあらゆる結合タンパク質は、ここに記載する１以上の特性例えば、対照ポリペプチドに比して増強されたヒトＦｃγＲIIＡおよび／またはヒトＦｃγＲIIIＡへの結合；対照ポリペプチドに比して低減されたヒトＦｃγＲIIＢへの結合(および／またはヒトＦｃγＲIIＢに結合しない)；対照ポリペプチドに比して低減されたヒトＣ１ｑへの結合(および／またはヒトＣ１ｑに結合しない)；対照ポリペプチドより大きな程度までＦｃγＲIIＡ、ヒトＦｃγＲIIIＡまたは両者を活性化；ヒトＦｃγＲIIＢを活性化しない；および／または対照ポリペプチド(例えば、ＨＢｓＡｇに特異的であり、ＧＡＡＬＩＥ変異を含まないＦｃ部分を含む抗体)より大きな程度まで、ＨＢｓＡｇの存在下ヒトナチュラルキラー(ＮＫ)細胞を活性化の何れかを実施するまたは保有することができることは認識される。
ある実施態様において、本発明の結合タンパク質は、ＧＡＡＬＩＥ変異を含むＦｃ部分を含み、(ｉ)Ｇ２３６Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅを含まないＦｃ部分を含む対照ポリペプチドを比較して、ヒトＦｃγＲIIＡ、ヒトＦｃγＲIIIＡまたは両者への結合が増強されており、ここで、ヒトＦｃγＲIIＡは所望によりＨ１３１またはＲ１３１であるおよび／またはヒトＦｃγＲIIIＡは所望によりＦ１５８またはＶ１５８である；(ii)Ｇ２３６Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅを含まない対照ポリペプチドに比して、ヒトＦｃγＲIIＢへの結合が低減されている；(iii)ヒトＦｃγＲIIＢに結合しない；(iv)Ｇ２３６Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅを含まない対照ポリペプチドに比して、ヒトＣ１ｑへの結合が低減されている；(ｖ)ヒトＣ１ｑに結合しない；(vi)Ｇ２３６Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅを含まないＦｃ部分を含む対照ポリペプチドより大きな程度までＦｃγＲIIＡ、ヒトＦｃγＲIIIＡまたは両者を活性化し、ここで、ヒトＦｃγＲIIＡは所望によりＨ１３１またはＲ１３１であるおよび／またはヒトＦｃγＲIIIＡは所望によりＦ１５８またはＶ１５８である；(vii)ヒトＦｃγＲIIＢを活性化しない；(viii)Ｇ２３６Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅを含まないＦｃ部分を含む対照ポリペプチドより大きな程度まで、ＨＢｓＡｇの存在下ヒトナチュラルキラー(ＮＫ)細胞を活性化し、ここで、対照ポリペプチドは所望によりＨＢ Ａｇ、所望によりＨＢｓＡｇに結合する抗体である；(ix)(ａ)約１２.７５ng／mL～約１９.９ng／mLまたは約１２.７５ng／mL～約１２.８４ng／mLまたは約１２.７９ng／mLまたは約１６.２２ng／mL～約１９.９ng／mLまたは約１７.９７ng／mLのＨＢｓＡｇ ＥＣ５０を有するおよび／または(ｂ)約１０.７８ng／mL～約１３.７２ng／mLまたは約１０.７８ng／mL～約１０.９３ng／mLまたは約１０.８５ng／mLまたは約１１.５９ng／mL～約１３.７２ng／mLまたは約１２.６１ng／mLのＨＢｅＡｇ ＥＣ５０を有し、ここで、ＨＢＶは所望によりＨＢＶ遺伝子型Ｄであり、ＥＣ５０は、所望により、ＮＴＣＰを過発現し、ＨＢＶで感染させたＨｅｐＧ２細胞により、ＨｅｐＧ２細胞への抗体または抗原結合フラグメント投与後７日目に分泌されるＨＢｓＡｇまたはＨＢｅＡｇそれぞれの測定により、インビトロで決定される；(ｘ)(ａ)約１０.４３ng／mL～約２２.４１ng／mLまたは約１３.８１ng／mL～約１６.５６ng／mLまたは約１５.１２ng／mLまたは約１２.２４ng／mL～約２２.４１ng／mLまたは約１６.５６ng／mLまたは約１０.４３ng／mL～約２０.０８ng／mLまたは約１４.４７ng／mLのＨＢｓＡｇ ＥＣ５０を有するおよび／または(ｂ)約１０.３９ng／mL～約１３.９９ng／mLまたは約１０.６３ng／mL～約１０.６６ng／mLまたは約１０.６４ng／mLまたは約１０.３９ng／mL～約１０.６０ng／mLまたは約１０.４９ng／mLまたは約１３.２５ng／mL～約１３.９９ng／mLまたは約１３.６１ng／mLのＨＢｅＡｇ ＥＣ５０を有し、ここで、ＨＢＶは所望によりＨＢＶ遺伝子型Ｄであり、ＥＣ５０は、所望により、ＮＴＣＰを過発現し、ＨＢＶで感染させたＨｅｐＧ２細胞により、ＨｅｐＧ２細胞への抗体または抗原結合フラグメント投与後７日目に分泌されるＨＢｓＡｇまたはＨＢｅＡｇそれぞれの測定により、インビトロで決定される；(xi)ＨＢｓＡｇ－Ｙ１００Ｃ／Ｐ１２０Ｔ、ＨＢｓＡｇ－Ｐ１２０Ｔ、ＨＢｓＡｇ－Ｐ１２０Ｓ／Ｓ１４３Ｌ、ＨＢｓＡｇ－Ｃ１２１Ｓ、ＨＢｓＡｇ－Ｒ１２２Ｄ、ＨＢｓＡｇ－Ｒ１２２Ｉ、ＨＢｓＡｇ－Ｔ１２３Ｎ、ＨＢｓＡｇ－Ｑ１２９Ｈ、ＨＢｓＡｇ－Ｑ１２９Ｌ、ＨＢｓＡｇ－Ｍ１３３Ｈ、ＨＢｓＡｇ－Ｍ１３３Ｌ、ＨＢｓＡｇ－Ｍ１３３Ｔ、ＨＢｓＡｇ－Ｋ１４１Ｅ、ＨＢｓＡｇ－Ｐ１４２Ｓ、ＨＢｓＡｇ－Ｓ１４３Ｋ、ＨＢｓＡｇ－Ｄ１４４Ａ、ＨＢｓＡｇ－Ｇ１４５Ｒ、ＨＢｓＡｇ－Ｎ１４６Ａまたはこれらの何らかの組み合わせを含むＨＢｓＡｇバリアントに結合できる；(xii)ＨＢｓＡｇに結合し、Ｇ２３６Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅを含まないＦｃ部分を含む対照抗体または抗原結合フラグメントに比して、ＨＢｓＡｇ－Ｙ１００Ｃ／Ｐ１２０Ｔ、ＨＢｓＡｇ－Ｐ１２０Ｔ、ＨＢｓＡｇ－Ｐ１２０Ｓ／Ｓ１４３Ｌ、ＨＢｓＡｇ－Ｃ１２１Ｓ、ＨＢｓＡｇ－Ｒ１２２Ｄ、ＨＢｓＡｇ－Ｒ１２２Ｉ、ＨＢｓＡｇ－Ｔ１２３Ｎ、ＨＢｓＡｇ－Ｑ１２９Ｈ、ＨＢｓＡｇ－Ｑ１２９Ｌ、ＨＢｓＡｇ－Ｍ１３３Ｈ、ＨＢｓＡｇ－Ｍ１３３Ｌ、ＨＢｓＡｇ－Ｍ１３３Ｔ、ＨＢｓＡｇ－Ｋ１４１Ｅ、ＨＢｓＡｇ－Ｐ１４２Ｓ、ＨＢｓＡｇ－Ｓ１４３Ｋ、ＨＢｓＡｇ－Ｄ１４４Ａ、ＨＢｓＡｇ－Ｇ１４５Ｒ、ＨＢｓＡｇ－Ｎ１４６Ａまたはこれらの何らかの組み合わせを含むＨＢｓＡｇバリアントへの結合が改善している；および／または(xiii)(ａ)約２.３４ng／mLのＥＣ５０で遺伝子型ＡのＨＢＶ；(ｂ)約２.２２ng／mLのＥＣ５０で遺伝子型ＢのＨＢＶ；(ｃ)約０.９２ng／mLのＥＣ５０で遺伝子型ＣのＨＢＶ；(ｄ)約１.１０ng／mLのＥＣ５０で遺伝子型ＤのＨＢＶ；(ｅ)約１.１２ng／mLのＥＣ５０で遺伝子型ＥのＨＢＶ；(ｆ)約１.９３ng／mLのＥＣ５０で遺伝子型ＦのＨＢＶ；(ｇ)約１.４３ng／mLのＥＣ５０で遺伝子型ＧのＨＢＶ；および／または(ｈ)約１.９３ng／mLのＥＣ５０で遺伝子型ＨのＨＢＶを中和でき、ここで、ＥＣ５０は、所望により該ＨＢＶ遺伝子型のＨＢｓＡｇを発現するよう操作された組み換えＨＤＶを使用して決定される。
これとは別にまたはこれに加えて、本発明の結合タンパク質のＦｃ部分は、プロテインＡ結合に必要であることが当分野で知られる部分を少なくとも含み得る；および／または本発明の抗体のＦｃ部分はプロテインＧ結合に必要であることが知られるＦｃ分子の部分を少なくとも含む。ある実施態様において、保持された機能は、ＨＢｓＡｇおよびＨＢＶｇの排除を含む。よって、ある実施態様において、Ｆｃ部分は、ＦｃγＲ結合に必要であることが当分野で知られる部分を少なくとも含む。上記のとおり、Ｆｃ部分は、故に、少なくとも(ｉ)天然ＩｇＧ Ｆｃの下部ヒンジ部位、特にアミノ酸残基Ｌ、Ｌ、Ｇ、Ｇ(２３４～２３７、ＥＵナンバリング)および(ii)天然ＩｇＧ ＦｃのＣＨ２ドメインの隣接領域、特に下部ヒンジ領域に隣接した上部ＣＨ２ドメインにおけるループおよび鎖、例えばＰ３３１の領域、例えばＰ３３１周囲の天然ＩｇＧの上部ＣＨ２ドメインにおける少なくとも３、４、５、６、７、８、９または１０連続的アミノ酸の領域、例えば天然ＩｇＧ Ｆｃのアミノ酸３２０～３４０(ＥＵナンバリング)を含み得る。
ある実施態様において、本発明の結合タンパク質は、Ｆｃ領域を含む。ここで使用する用語「Ｆｃ領域」は、抗体重鎖の２以上のＦｃ部分により形成される、免疫グロブリンの部分をいう。例えば、Ｆｃ領域は、単量体または「一本鎖」Ｆｃ領域(すなわち、ｓｃＦｃ領域)であり得る。一本鎖Ｆｃ領域は、単一ポリペプチド鎖内に結合されたＦｃ部分からなり得る(例えば、単一連続核酸配列でコード)。ｓｃＦｃ領域の例はＷＯ２００８／１４３９５４Ａ２に開示され、引用により本明細書に包含させる。Ｆｃ領域は二量体Ｆｃ領域であり得るまたはそれを含み得る。「二量体Ｆｃ領域」または「ｄｃＦｃ」は、２つの別々の免疫グロブリン重鎖のＦｃ部分により形成された二量体をいう。二量体Ｆｃ領域は、２つの同一Ｆｃ部分(例えば、天然に存在する免疫グロブリンのＦｃ領域)のホモ二量体または２つの非同一Ｆｃ部分(例えば、二量体Ｆｃ領域の一方のＦｃモノマーは、他方のＦｃモノマーに存在しない少なくとも１つのアミノ酸修飾(例えば、置換、欠失、挿入または化学修飾)を含むまたは一方のＦｃモノマーは他方と比較して切断されていてよい)ヘテロ二量体であり得る。
特定の実施態様は、配列番号９１または配列番号９２または配列番号１３８の重鎖(例えば、ＶＨ－ヒンジ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３)を有するおよび配列番号９３または配列番号９４の軽鎖(すなわち、ＶＬ－ＣＬ)を有する抗体および抗原結合フラグメントを含む。ある実施態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号９１の重鎖および配列番号９３の軽鎖を含む。他の実施態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号９２の重鎖および配列番号９４の軽鎖を含む。他の実施態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号９１の重鎖および配列番号９４の軽鎖を含む。他の実施態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号９２の重鎖および配列番号９３の軽鎖を含む。ある実施態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１２９の重鎖を含むまたはそれからなる。ある実施態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１３８の重鎖および所望により配列番号９３または９４の何れかの軽鎖を含むまたはそれからなる。これらの配列は配列表に提供される。
ここに開示するＦｃ部分は、同じまたは異なるクラスおよび／またはサブクラスのＦｃ配列または領域を含み得る。例えば、Ｆｃ部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリン(例えば、ヒト免疫グロブリン)またはこれらの何らかの組み合わせに由来し得る。ある実施態様において、Ｆｃ領域のＦｃ部分は同じクラスおよびサブクラスである。しかしながら、Ｆｃ領域(またはＦｃ領域の１以上のＦｃ部分)はまたキメラであってよく、そのためにキメラＦｃ領域は異なる免疫グロブリンクラスおよび／またはサブクラス由来のＦｃ部分を含み得る。例えば、二量体のＦｃ部分の少なくとも２つまたは一本鎖Ｆｃ領域は、異なる免疫グロブリンクラスおよび／またはサブクラスからであり得る。ある実施態様において、二量体Ｆｃ領域は、２以上の異なるアイソタイプまたはサブクラスからの配列を含み得る；例えば、ＳＥＥＤｂｏｄｙ(「鎖交換操作されたドメイン」)、Davis et al., Protein Eng. Des. Sel. 23(4):195 (2010)参照。
これに加えてまたはこれとは別に、キメラＦｃ領域は、１以上のキメラＦｃ部分を含み得る。例えば、キメラＦｃ領域または部分は、第一サブクラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３サブクラス)の免疫グロブリン由来の１以上の部分を含み得て、一方、Ｆｃ領域または部分の残りは異なるサブクラスのものである。例えば、ＦｃポリペプチドのＦｃ領域または部分は、第一サブクラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４サブクラス)の免疫グロブリン由来のＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインおよび第二サブクラス(例えば、ＩｇＧ３サブクラス)の免疫グロブリン由来のヒンジ領域を含み得る。例えば、Ｆｃ領域または部分は、第一サブクラス(例えば、ＩｇＧ４サブクラス)の免疫グロブリン由来のヒンジおよび／またはＣＨ２ドメインおよび第二サブクラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３サブクラス)の免疫グロブリン由来のＣＨ３ドメインを含み得る。例えば、キメラＦｃ領域は、第一サブクラス(例えば、ＩｇＧ４サブクラス)の免疫グロブリン由来のＦｃ部分(例えば、完全Ｆｃ部分)および第二サブクラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３サブクラス)の免疫グロブリン由来のＦｃ部分を含み得る。例えば、Ｆｃ領域または部分は、ＩｇＧ４免疫グロブリン由来のＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ１免疫グロブリン由来のＣＨ３ドメインを含み得る。例えば、Ｆｃ領域または部分は、ＩｇＧ４分子由来のＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメインならびにＩｇＧ１分子由来のＣＨ３ドメインを含み得る。例えば、Ｆｃ領域または部分は、抗体の特定のサブクラスからのＣＨ２ドメインの一部、例えば、ＣＨ２ドメインのＥＵ位置２９２～３４０を含み得る。例えば、Ｆｃ領域または部分は、ＩｇＧ４部分由来のＣＨ２の位置２９２～３４０のアミノ酸およびＩｇＧ１部分由来のＣＨ２の残り部分を含み得る(あるいは、ＣＨ２の２９２～３４０はＩｇＧ１部分であり、ＣＨ２の残り部分はＩｇＧ４部分由来であり得る)。
本発明のあらゆる抗体、抗原結合フラグメントまたはＦｃ領域または部分は、如何なるアロタイプおよび／またはハプロタイプであってもよいこともまた認識される。例えば、ヒト免疫グロブリンＧアロタイプはJefferis and LeFranc, mAbs 1(4):1-7 (2009)に開示のものを含み、そのアロタイプ(Ｇ１ｍ(１(ａ)；２(ｘ)；３(ｆ)；および１７(ｚ))；Ｇ２ｍ(２３(ｎ))；Ｇ３ｍ(２１(ｇ１)；２８(ｇ５)；１１(ｂ０)；５(ｂ２)；１３(ｂ３)；１４(ｂ４)；１０(ｂ５)；１５(ｓ)；１６(ｔ)；６(ｃ３)；２４(ｃ５)；２６(ｕ)；および２７(ｖ))；Ａ２ｍ(１および２)；およびＫｍ(１；２；および３)およびハプロタイプおよび得られるアミノ酸配列およびそれらの組み合わせは、引用により本明細書に包含させる。ある実施態様において、本発明の抗体、抗原結合フラグメントまたはＦｃ領域または部分は、ＩｇＧ１アロタイプｇ１ｍ１７、ｋ１を含む。
さらに、Ｆｃ領域または部分は、(これに加えてまたはこれとは別に)例えばキメラヒンジ領域を含み得る。例えば、キメラヒンジは、例えば一部、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４分子(例えば、上部および下部中央部ヒンジ配列)に由来し、一部、ＩｇＧ３分子(例えば、中央部ヒンジ配列)に由来し得る。他の例においてＦｃ領域または部分は、一部、ＩｇＧ１分子一部、ＩｇＧ４分子由来のキメラヒンジを含み得る。他の例においてキメラヒンジは、ＩｇＧ４分子由来の上部および下部ヒンジドメインおよびＩｇＧ１分子由来の中央部ヒンジドメインを含み得る。このようなキメラヒンジは、例えば、ＩｇＧ４ヒンジ領域の中央部ヒンジドメインにおけるＥＵ位置にプロリン置換(Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ)を導入することにより製造され得る。他の実施態様において、キメラヒンジは、ＥＵ位置２３３～２３６にＩｇＧ２抗体由来および／またはＳｅｒ２２８Ｐｒｏ変異のアミノ酸を含んでよく、ここで、ヒンジの残りのアミノ酸はＩｇＧ４抗体由来である(例えば、配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰのキメラヒンジ)。本発明の抗体のＦｃ部分において使用され得るさらなるキメラヒンジは、ＵＳ２００５／０１６３７８３Ａ１に記載される。
ここに開示する結合タンパク質のある実施態様において、Ｆｃ部分またはＦｃ領域は、ヒト免疫グロブリン配列由来(例えば、ヒトＩｇＧ分子のＦｃ領域またはＦｃ部分由来)のアミノ酸配列を含むまたはこれからなる。しかしながら、ポリペプチドは、他の哺乳動物種からの１以上のアミノ酸を含み得る。例えば、霊長類Ｆｃ部分または霊長類結合部位が対象ポリペプチドに含まれ得る。あるいは、１以上のマウスアミノ酸がＦｃ部分またはＦｃ領域に存在し得る。
核酸分子
他の態様において、本発明は、本発明の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子を提供する。
遺伝子コードの重複性により、本発明はまたこれら核酸配列の配列バリアント、特に同じアミノ酸配列をコードするこのような配列バリアントも含む。
ある実施態様において、ポリヌクレオチドまたは核酸分子は、配列番号１０３～１１０および１３０～１３６の何れかのヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一性を共有するヌクレオチド配列を含み、ここで、ヌクレオチド配列は宿主細胞による発現のためにコドン最適化されている。
具体的実施態様において、本発明の核酸分子は、配列番号１０３～１１０および１３０～１３６の何れかの核酸配列を含むまたはこれからなる。
ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１０３のＶＨコード化ヌクレオチド配列および配列番号１０５のＶＬコード化ヌクレオチド配列を含む。他の実施態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１０３のＶＨコード化ヌクレオチド配列および配列番号１０４のＶＬコード化ヌクレオチド配列を含む。他の実施態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１０８のＶＨコード化ヌクレオチド配列および配列番号１０９のＶＬコード化ヌクレオチド配列を含む。
またここで提供されるのは、抗体または抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドであり、ここで、ポリヌクレオチドは配列番号１０３のＶＨコード化ヌクレオチド配列および配列番号１１０のＶＬコード化ヌクレオチド配列を含みまたはそれからなり、ここで、コードされる抗体または抗原結合フラグメントはＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域に結合し、Ｂ型肝炎ウイルスおよびデルタ型肝炎ウイルスの感染を中和する。
ここに開示する何れの実施態様においても、ポリヌクレオチドは配列番号１３０のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３コード化ヌクレオチド配列および／または配列番号１３１のＨＣ(ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ３－ＣＨ３)コード化ヌクレオチド配列を含み得る。ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１３２のＣＬコード化ヌクレオチド配列および／または配列番号１３３のＬＣ(ＶＬ－ＣＬ)コード化ヌクレオチド配列を含む。他の実施態様において、ポリヌクレオチドは配列番号１３４のＣＬコード化ヌクレオチド配列および／または配列番号１３５または配列番号１３６のＬＣ(ＶＬ－ＣＬ)コード化ヌクレオチド配列を含む。
ベクター
さらに本発明の範囲内に含まれるのは、本発明の核酸分子を含むベクター、例えば、発現ベクターである。
用語「ベクター」は、核酸分子を含む構築物をいう。ベクターは、本開示において所望の核酸配列の組み込みまたは担持に適する。このようなベクターは、保存ベクター、発現ベクター、クローニングベクター、伝達ベクターなどであり得る。保存ベクターは、核酸分子の便利な保存を可能にするベクターである。故に、ベクターは、例えば、所望の本発明の抗体またはその抗体フラグメントに対応する配列を含み得る。
ここで使用する「発現ベクター」は、適当な宿主で核酸分子の発現を実施できる適当な制御配列に操作可能に結合した核酸分子を含むＤＮＡ構築物をいう。このような制御配列は、転写を実施するプロモーター(例えば、異種プロモーター)、所望によるこのような転写を制御するためのオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列および転写および翻訳の停止を制御する配列を含む。目的の核酸分子の転写に寄与する発現ベクターの何れの要素も、ベクターに異種であり得る。ベクターはプラスミド、ファージ粒子、ウイルスまたは単に潜在的ゲノムインサートであり得る。適当な宿主に形質転換されたら、ベクターは、宿主ゲノムと無関係に複製および機能でき、ある場合、ゲノム自体に統合され得る。本明細書において、「プラスミド」、「発現プラスミド」、「ウイルス」および「ベクター」はしばしば相互交換可能に使用される。
クローニングベクターは、一般にベクターへの核酸配列取り込みに使用され得るクローニング部位を含む、ベクターである。クローニングベクターは、例えば、プラスミドベクターまたはバクテリオファージベクターであり得る。
伝達ベクターは、核酸分子の細胞または生物への伝達に適するベクター、例えば、ウイルスベクターであり得る。ベクターは、本開示において、例えば、ＲＮＡベクターまたはＤＮＡベクターであり得る。ベクターはＤＮＡ分子であり得る。例えば、本出願の意味でのベクターは、クローニング部位、抗生物質耐性因子などのセレクションマーカーおよび複製起点などベクターの増殖に適する配列を含む。ある実施態様において、本出願の状況におけるベクターはプラスミドベクターである。あるこのような実施態様において、ベクターはレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを含む。
細胞
さらなる態様において、本発明はまた本発明の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質を発現するまたは本発明のベクターまたはポリヌクレオチドを含む、細胞(また「宿主細胞」とも称する)も提供する。
このような細胞の例は、真核生物細胞、例えば、酵母細胞、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞；および大腸菌を含む原核生物細胞を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、細胞は哺乳動物細胞である。あるこのような実施態様において、細胞は、ＣＨＯ細胞(例えば、ＤＨＦＲ－ ＣＨＯ細胞(Urlaub et al., PNAS 77:4216 (1980)、ＣＨＯ－ＫＳＶ)、ヒト胚腎臓細胞(例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞)、ＰＥＲ.Ｃ６細胞、Ｙ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ヒト肝臓細胞、例えばＨｅｐａ ＲＧ細胞、骨髄腫細胞またはハイブリドーマ細胞などの哺乳動物細胞株である。哺乳動物宿主細胞株の他の例は、マウスセルトリ細胞(例えば、ＴＭ４細胞)；ＳＶ４０で形質転換したサル腎臓ＣＶ１株(ＣＯＳ－７)；ベビーハムスター腎臓細胞(ＢＨＫ)；アフリカミドリザル腎臓細胞(ＶＥＲＯ－７６)；サル腎臓細胞(ＣＶ１)；ヒト子宮頸癌腫細胞(ＨＥＬＡ)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８)；ヒト肝臓細胞(Ｈｅｐ Ｇ２)；イヌ腎臓細胞(ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞(ＢＲＬ ３Ａ)；マウス乳房腫瘍(ＭＭＴ ０６０５６２)；ＴＲＩ細胞；ＭＲＣ ５細胞；およびＦＳ４細胞を含む。抗体産生に適する哺乳動物宿主細胞株はまた、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J.), pp. 255-268 (2003)に記載のものを含む。
ある実施態様において、宿主細胞は大腸菌などの原核生物細胞である。大腸菌などの原核生物細胞におけるペプチドの発現は、十分に確立されている(例えば、Pluckthun, A. Bio/Technology 9:545-551 (1991)参照)。例えば、抗体を、特にグリコシル化およびＦｃエフェクター機能が不要であるとき、細菌で産生し得る。細菌における抗体フラグメントおよびポリペプチドの発現について、例えば、米国特許５,６４８,２３７；５,７８９,１９９；および５,８４０,５２３を参照のこと。
本発明の結合タンパク質を発現するのに有用な昆虫細胞は当分野で知られ、例えば、スポドプテラ・フルギペルダＳｆ９細胞、トリコプルシア・ニＢＴＩ－ＴＮ５Ｂ１－４細胞およびスポドプテラ・フルギペルダＳｆＳＷＴ０「ＭｉｍｉｃTM」細胞を含む。例えば、Palmberger et al., J. Biotechnol. 153(3-4):160-166 (2011)参照。昆虫細胞と関連して、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞トランスフェクションのために使用され得る多数のバキュロウイルス株が同定されている。
糸状菌または酵母などの真核生物微生物もまたタンパク質コード化ベクターのクローニングまたは発現に適当な宿主であり、部分的にまたは完全にヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生に至る、「ヒト化」グリコシル化経路を有する真菌および酵母株を含む。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004); Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)参照。
植物細胞もまた本発明の結合タンパク質の発現のための宿主として利用され得る。例えば、PLANTIBODIESTMテクノロジー(例えば、米国特許５,９５９,１７７；６,０４０,４９８；６,４２０,５４８；７,１２５,９７８；および６,４１７,４２９に記載)は、抗体産生のためにトランスジェニック植物を使用する。
ある実施態様において、融合タンパク質は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫ－Ｔ細胞またはこれらの何らかのサブタイプにより細胞表面で発現される。
本発明と適合するあらゆるタンパク質発現系を、開示する結合タンパク質の産生に使用し得る。適当な発現系は、Gene Expression Systems, Academic Press, eds. Fernandez et al., 1999に記載のトランスジェニック動物を含む。
具体的実施態様において、細胞を、本発明のベクターで、トランスフェクトし得る。用語「トランスフェクション」は、真核生物細胞などの細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)分子などの核酸分子の導入をいう。本明細書において、用語「トランスフェクション」は、哺乳動物細胞を含む真核生物細胞などの細胞への核酸分子の導入に関して当業者に知られるあらゆる方法を包含する。このような方法は、例えば、エレクトロポレーション、例えば、カチオン性脂質および／またはリポソームに基づくリポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ナノ粒子ベースのトランスフェクション、ウイルスベースのトランスフェクションまたはＤＥＡＥ－デキストランもしくはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーに基づくトランスフェクションなどを含む。ある実施態様において、導入は非ウイルス性である。
さらに、本発明の細胞は、本発明により、例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントを発現するために、本発明のベクターで安定にまたは一過性にトランスフェクトされ得る。このような実施態様において、細胞は、結合タンパク質をコードする、ここに記載するベクターで安定にトランスフェクトされる。あるいは、細胞は、本発明の結合タンパク質をコードする本発明のベクターで一過性にトランスフェクトされる。ここに開示する何れの実施態様においても、ポリヌクレオチドは宿主細胞に対して異種であり得る。
関連する態様において、本発明は、抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質を産生する方法であって、該抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質の産生に十分な条件下かつ時間本発明の宿主細胞を培養することを含む、方法を提供する。
よって、本発明はまた本発明の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質を異種性に発現する組み換え宿主細胞を提供する。例えば、細胞は、抗体が完全または部分的に得られた種(例えば、ヒト抗体または操作されたヒト抗体を発現するＣＨＯ細胞)と異なる種のものであり得る。ある実施態様において、宿主細胞の細胞型は、本来抗体または抗原結合フラグメントを発現しない。さらに、宿主細胞は、天然状態の抗体または抗原結合フラグメント(または抗体または抗原結合フラグメントが操作されたまたは誘導された親抗体の天然状態)では存在しない翻訳後修飾(ＰＴＭ；例えば、グリコシル化またはフコシル化)を抗体または抗原結合フラグメントに付与し得る。このようなＰＴＭは、機能的差異(例えば、免疫原性低減)をもたらし得る。よって、ここに開示する宿主細胞により産生される本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、その天然状態の抗体(または親抗体)と異なる１以上の翻訳後修飾を含み得る(例えば、ＣＨＯ細胞により産生されるヒト抗体は、ヒトから単離されたときおよび／または天然ヒトＢ細胞または形質細胞により産生されたときと異なって、より多くの翻訳後修飾を含み得る)。
抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質の所望によるさらなる特性
本発明の抗体、抗原結合フラグメントおよび融合タンパク質は、例えば、処置部位への送達のために、薬物に結合されまたは目的の細胞を含む部位の造影を容易にするために検出可能ラベルと結合されることが可能である。薬物および検出可能ラベルを抗体に結合する方法は、検出可能ラベルを使用する造影法におけると同様、当分野で周知である。標識抗体を、多種多様なラベルを用いて、多種多様なアッセイに用い得る。本発明の抗体(または抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質)とＨＢｓＡｇ、特にＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域上の目的のエピトープ間の抗体－抗原複合体形成の検出は、検出可能物質の抗体への結合により容易にされ得る。適当な検出手段は、放射性核種、酵素、コエンザイム、蛍光剤、化学発光剤、色素原、酵素基質または補因子、酵素阻害剤、補欠分子族複合体、フリーラジカル、粒子、色素などのラベルの使用を含む。適当な酵素の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを含む；適当な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含む；適当な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライドまたはフィコエリスリンを含む；発光物質の例はルミノールである；生物発光物質の例はルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびイクオリンを含む；そして適当な放射性物質の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを含む。このような標識剤を、放射免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、蛍光免疫アッセイなどの多様な周知アッセイで用い得る。本発明の標識抗体、抗原結合フラグメントおよび融合タンパク質は、例えばＵＳ３,７６６,１６２；ＵＳ３,７９１,９３２；ＵＳ３,８１７,８３７；およびＵＳ４,２３３,４０２に記載のアッセイにおいて用いられ得る。
本発明の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質を、細胞毒、治療剤または放射性金属イオンなどの治療部分または放射性同位体とコンジュゲートし得る。放射性同位体の例は、Ｉ－１３１、Ｉ－１２３、Ｉ－１２５、Ｙ－９０、Ｒｅ－１８８、Ｒｅ－１８６、Ａｔ－２１１、Ｃｕ－６７、Ｂｉ－２１２、Ｂｉ－２１３、Ｐｄ－１０９、Ｔｃ－９９、Ｉｎ－１１１などを含むが、これらに限定されない。このような抗体コンジュゲートは、ある生物学的応答を修飾するために使用され得る；薬物部分は、古典的化学療法剤に限定されると解釈されるべきでない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。このようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素またはジフテリア毒素などの毒素を含み得る。
このような治療部分を抗体にコンジュゲートするための技術は周知である。例えば、Arnon et al. (1985) "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy, " in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pp. 243-256; ed. Hellstrom et al. (1987) "Antibodies for Drug Delivery, " in Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2d ed; Marcel Dekker, Inc.), pp. 623-653; Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera et al. pp. 475-506 (Editrice Kurtis, Milano, Italy, 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al. (Academic Press, New York, 1985), pp. 303-316;およびThorpe et al. (1982) Immunol. Rev. 62:119-158参照。
あるいは、ＵＳ４,６７６,９８０に記載のとおり、抗体、抗体フラグメントまたは融合タンパク質を、第二抗体またはその抗体フラグメント(または第二融合タンパク質)とコンジュゲートして、ヘテロコンジュゲートを形成し得る。さらに、例えば、ＵＳ４,８３１,１７５に記載のとおり、ラベルと本発明の抗体の間にリンカーを使用し得る。抗体、抗原結合フラグメントおよび融合タンパク質を、例えば、ＵＳ５,５９５,７２１に記載音とおり、放射性ヨウ素、インジウム、イットリウムまたは当分野で知られる他の放射性粒子で直接標識し得る。処置は、例えば、ＷＯ００／５２０３１；ＷＯ００／５２４７３に記載のとおり、同時またはその後投与される、コンジュゲートされたおよびコンジュゲートされていない抗体、抗原結合フラグメントおよび／または融合タンパク質との処置の組み合わせからなり得る。
ここに記載する抗体、抗原結合フラグメントおよび融合タンパク質を、固体支持体にも結合し得る。さらに、本発明の抗体、その機能的抗体フラグメントまたは融合タンパク質を、例えば、循環半減期を延長するために、ポリマーへの共有結合によるコンジュゲーションにより、化学修飾し得る。ポリマーおよびそれをペプチドに結合させる方法は、ＵＳ４,７６６,１０６；ＵＳ４,１７９,３３７；ＵＳ４,４９５,２８５およびＵＳ４,６０９,５４６に示される。ある実施態様において、ポリマーは、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール(ＰＥＧ)から選択され得る。ＰＥＧは、室温で水に可溶性であり、一般的式：Ｒ(Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２)ｎＯ－Ｒ(式中、Ｒは水素またはアルキル基もしくはアルカノール基などの保護基であり得る)を有する。ある実施態様において、保護基は１～８個の炭素を有し得る。例えば、保護基はメチルであり得る。記号ｎは正の整数である。ある実施態様において、ｎは１～１,０００である。他の実施態様において、ｎは２～５００である。ある実施態様において、ＰＥＧは、１,０００～４０,０００、２,０００～２０,０００および３,０００～１２,０００から選択される平均分子量を有する。さらに、ＰＥＧは少なくとも１つのヒドロキシ基を有してよく、例えば、ＰＥＧは末端ヒドロキシ基を有し得る。例えば、阻害剤上の離アミノ基と反応するよう活性化されるのは、該末端ヒドロキシ基である。しかしながら、反応性基のタイプおよび量は、共有結合によりコンジュゲートされたＰＥＧ／本発明の抗体を達成するために変わり得ることは理解される。
水可溶性ポリオキシエチル化ポリオールもまたここに記載する抗体および抗原結合フラグメントにおいて利用され得る。ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール(ＰＯＧ)などを含む。ある実施態様において、ＰＯＧが使用される。理論には拘束されないが、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール主鎖が、例えば、動物およびヒトにおけるモノ、ジ、トリグセリドで天然に存在するのと同じ主鎖であるため、この分岐は、体内で必ずしも異物とみなされない。ＰＯＧは、ＰＥＧと同じ範囲の分子量を有し得る。循環減期延長に使用できる他の薬物送達系はリポソームである。リポソーム送達系を調製する方法は当業者に知られる。他の薬物送達系は当分野で知られ、例えば、Poznansky et al. (1980) and Poznansky (1984)に記載される。
本発明の抗体、抗原結合フラグメントおよび融合タンパク質は、精製形態で提供され得る。一般に、抗体、結合フラグメントまたは融合タンパク質は、例えば、組成物の９０％(重量)未満、通常６０％未満およびより一般には５０％未満が他のポリペプチドから成る、他のポリペプチドが実質的にない組成物に存在し得る。
本発明の抗体、融合タンパク質または抗原結合フラグメントは、非ヒト(または異種)宿主、例えば、マウスで免疫原性であり得る。特に、抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質は、非ヒト宿主で免疫原性であるが、ヒト宿主では免疫原性ではないイディオトープを有し得る。特に、ヒト使用のためのこのような本発明の分子は、マウス、ヤギ、ウサギ、ラット、非霊長類哺乳動物などの宿主から容易に単離されず、一般にヒト化によりまたはxeno-miceから得られない。
抗体、抗原結合フラグメントおよび融合タンパク質の産生
本発明の抗体、抗原結合フラグメントおよび融合タンパク質は、当分野で知られる何れの方法によっても製造され得る。例えば、ハイブリドーマテクノロジーを使用してモノクローナル抗体を製造する一般的方法は周知である(Kohler, G. and Milstein, C., 1975; Kozbar et al. 1983)。ある実施態様において、ＷＯ２００４／０７６６７７に記載される別のＥＢＶ不死化方法が使用される。
ある実施態様において、抗体は、ＷＯ２００４／０７６６７７に記載される方法を使用して産生される。このような方法において、抗体を産生するＢ細胞は、ＥＢＶおよびポリクローナルＢ細胞アクティベーターで形質転換される。細胞増殖および分化のさらなる刺激因子が、さらに効率を上げるために、所望により形質転換工程中に加えられ得る。これらの刺激因子は、ＩＬ－２およびＩＬ－１５などのサイトカインであり得る。ある態様において、ＩＬ－２は、さらに不死化効率を上げるために不死化工程中に加えられるが、その使用は必須ではない。次いで、これら方法を使用して産生された不死化Ｂ細胞を、当分野で知られる方法を使用して培養し、培養物から抗体が単離され得る。
抗体を産生するための他の方法がＷＯ２０１０／０４６７７５に記載される。このような方法において、形質細胞は、マイクロウェル培養プレートで限られた数でまたは単一形質細胞として培養される。抗体を、該形質細胞培養物から単離し得る。さらに、形質細胞培養物から、当分野で知られる方法を使用してＲＮＡが抽出でき、そしてＰＣＲが実施できる。抗体のＶＨおよびＶＬ領域は、ＲＴ－ＰＣＲ(逆転写酵素ＰＣＲ)により増幅され、配列決定され、発現ベクターにクローン化され、次いで、これがＨＥＫ２９３Ｔ細胞または他の宿主細胞にトランスフェクトされ得る。発現ベクターにおける核酸のクローニング、宿主細胞のトランスフェクション、トランスフェクト宿主細胞の培養および産生された抗体の単離は、当業者に知られるあらゆる方法を使用して、実施され得る。
抗体を、所望により、濾過、遠心分離ならびにＨＰＬＣまたは親和性クロマトグラフィーなどの種々のクロマトグラフィー方法を使用して、さらに精製し得る。医薬グレード抗体を産生するための技術を含む、抗体、例えば、モノクローナル抗体を精製するための技術は、当分野で周知である。
分子生物学の標準技術を使用して、本発明の抗体、抗体フラグメントまたは融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を調製し得る。所望のＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成技術を使用して、完全にまたは一部合成され得る。部位特異的変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)技術必要に応じて使用され得る。
あらゆる適当な宿主細胞／ベクター系を、本発明の抗体または融合タンパク質分子またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列の発現のために使用し得る。細菌、例えば大腸菌および他の微生物系を、一部、ＦａｂおよびＦ(ａｂ')２フラグメントおよび特にＦｖフラグメントおよび一本鎖抗体フラグメント、例えば、一本鎖Ｆｖｓなどの抗体フラグメントの発現のために使用し得る。真核生物、例えば、哺乳動物、宿主細胞発現系を、完全抗体分子を含む大型抗体分子の産生のために使用し得る。適当な哺乳動物宿主細胞は、ここで例示した宿主細胞および開示した細胞株を含むが、これらに限定されない。
本発明はまた本発明の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質分子を産生する方法であって、本発明の核酸をコードするベクターを含む宿主細胞を、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからのタンパク質の発現に適する条件下で培養し、該抗体分子を単離することを含む、方法を提供する。
抗体分子または抗体フラグメントは、重鎖または軽鎖ポリペプチドのみを含んでよく、重鎖または軽鎖ポリペプチドコード配列のみを、宿主細胞のトランスフェクトに使用する必要がある。重鎖および軽鎖両者を含む産物の産生のために、細胞株を、軽鎖ポリペプチドをコードする第一ベクターおよび重鎖ポリペプチドをコードする第二ベクターの２つのベクターでトランスフェクトできる。あるいは、単一ベクターが使用でき、ベクターは軽鎖および重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む。
あるいは、本発明の抗体、抗原結合フラグメントおよび融合タンパク質を、(ｉ)例えば、本発明のベクターを使用することにより、宿主細胞で本発明の核酸配列を発現させ、(ii)発現された所望の産物を単離することにより産生し得る。さらに、方法は、(iii)単離された抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質の精製を含む。形質転換Ｂ細胞および培養形質細胞を、所望の特異性または機能の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質を産生するものについてスクリーニングし得る。
スクリーニングは、何らかの免疫アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、組織または細胞(トランスフェクト細胞を含む)の染色、中和アッセイまたは所望の特異性または機能の同定について当分野で知られる多数の他の方法の一つを使用して、実施し得る。アッセイは、１以上の抗原単純な認識に基づき選択できまたは例えば、単なる抗原結合抗体ではなく中和抗体を選択する、シグナル伝達カスケード、形態、増殖速度、他の細胞に影響を与える能力、他の細胞もしくは他の反応物による影響または状態の変化への応答、分化状態などの、標的細胞の特徴を変えることができる抗体を選択するための、所望の機能にさらに基づき選択できる。
次いで、個々の形質転換されたＢ細胞クローンは、陽性形質転換Ｂ細胞培養物から産生され得る。陽性細胞混合物から個々のクローンを分離するためのクローニング工程は、限界希釈、顕微操作、細胞選別による単一細胞沈着または当分野で知られる他の方法を使用して、実施され得る。
培養形質細胞からの核酸を、当分野で知られる方法を使用して単離し、クローン化し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞または他の既知宿主細胞で発現させ得る。
ここに記載する不死化Ｂ細胞クローンまたはトランスフェクト宿主細胞は、種々の方法で、例えば、研究目的でのモノクローナル抗体供給源として、目的のモノクローナル抗体をコードする核酸(ＤＮＡまたはｍＲＮＡ)の供給源として、使用し得る。
医薬組成物
本発明はまた本発明の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質、本発明の核酸、本発明のベクターおよび／または本発明の細胞を含む、医薬組成物も提供する。
医薬組成物はまた薬学的に許容される担体、希釈剤および／または添加物も含み得る。担体または添加物は投与を容易にし得るが、それ自体組成物を受ける個体に危険な抗体の産生を誘導してはならない。また毒性であってはならない。適当な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活化ウイルス粒子などの大きな、ゆっくり代謝される高分子であり得る。一般に、本発明の医薬組成物における薬学的に許容される担体は、活性成分でも不活性成分でもよい。
薬学的に許容される塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩および硫酸塩などの鉱酸塩または酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩などの有機酸の塩が使用され得る。
医薬組成物における薬学的に許容される担体は、さらに水、食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体を含み得る。さらに、湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝物質などの補助的物質がこのような組成物に存在し得る。このような担体により、医薬組成物は、対象が摂取するための錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤および懸濁液剤に製剤化できる。
本発明の医薬組成物は、種々の形態で調製され得る。例えば、組成物は、溶液または懸濁液として注射用に製造され得る。注射前に液体媒体に溶解または懸濁するのに適する固体形態もまた調製され得る(例えば、防腐剤を含む無菌水に再構成するための、シナジスTMおよびハーセプチンTMに類似する凍結乾燥組成物)。組成物を、例えば、軟膏剤、クリーム剤または散剤として局所投与用に調製し得る。組成物を、例えば、錠剤またはカプセル剤、噴霧剤またはシロップ剤(所望により風味付けした)として、経口投与用に調製し得る。組成物を、例えば、微粉またはスプレーによる、吸入器を使用する肺投与用に製剤し得る。組成物を、坐薬またはペッサリーとして調製し得る。組成物を、例えば、滴剤として、経鼻、耳または眼投与用に調製し得る。組成物は、組み合わされた組成物が、対象への投与直前に再構成されるよう設計されたキットの形態であり得る。例えば、凍結乾燥抗体を、無菌水または無菌緩衝液と共にキット形態で提供得る。
具体的実施態様において、本発明の組成物における活性成分は、抗体分子、抗体フラグメントまたはそのバリアントもしくは誘導体であり、特に組成物中の活性成分は、ここに記載する、抗体、抗体フラグメント、融合タンパク質またはそのバリアントおよび誘導体である。それ自体は、消化管での消化に感受性であり得る。故に、組成物が消化管を利用する経路により投与されるならば、組成物は、抗体を分解から保護するが、消化管から吸収されたら、抗体を放出する薬剤を含み得る。
薬学的に許容される担体の綿密な記載は、Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, ISBN: 0683306472で利用可能である。
本発明の医薬組成物は、５.５～８.５のｐＨを有し得て、ある実施態様において、これは６～８であり得る。他の実施態様において、ここに記載する医薬組成物のｐＨは約７であり得る。ｐＨは、緩衝液の使用により維持され得る。組成物は無菌および／またはパイロジェン・フリーであり得る。組成物は、ヒトに対して等張であり得る。ある実施態様において、本発明の医薬組成物は、密封容器で提供される。
数投与形態で提供される組成物は本発明の範囲内である；これら形態は、例えば、注射または点滴、例えばボーラス注射または連続的点滴による非経腸投与に適する形態を含むが、これらに限定されない。製品が注射または点滴用であるとき、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液またはエマルジョンの形態であり得るかまたは懸濁剤、防腐剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤用薬剤を含み得る。あるいは、抗体分子は、使用前に適切な無菌液体で再構成するための乾燥形態であり得る。媒体は、一般に薬学的活性化合物などの化合物、特に本発明の抗体の保管、輸送および／または投与に適する物質と理解される。例えば、媒体は、薬学的活性化合物、特に本発明の抗体の保管、輸送および／または投与に適する生理学的に許容される液体であり得る。製剤化されたら、本発明の組成物を、対象に直接投与できる。ある実施態様において、組成物を、哺乳動物、例えば、ヒト対象への投与に適合させる。
ここに記載する医薬組成物を、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、腹腔内、髄腔内、脳室内、経皮、経皮、局所、皮下、鼻腔内、経腸、舌下、膣内または直腸経路を含むが、これらに限定されない任意の数の経路により投与し得る。皮下噴射器もまた本発明の医薬組成物の投与に使用され得る。特定の実施態様において、医薬組成物を、例えば錠剤、カプセル剤などとして経口投与用に、局所投与用にまたは注射剤として、例えば液体溶液剤または懸濁液剤として調製し得る。注射前に液体媒体に溶解または懸濁するのに適する固体形態も使用でき、例えば医薬組成物は凍結乾燥形態である。
注射、例えば静脈内、皮膚または皮下注射または罹患部位への注射のために、活性成分を、パイロジェン・フリーであり、適当なｐＨ、等張性および安定性を有する非経腸的許容される水溶液の形で提供され得る。防腐剤、安定化剤、緩衝液、抗酸化剤および／または他の添加剤が、必要に応じて含まれ得る。
個体に投与されるのが本発明のポリペプチド、ペプチドまたは核酸分子、細胞または他の薬学的に有用な化合物であるかにかかわらず、投与は一般に「予防有効量」または「治療有効量」または「有効量」(場合によって)であり、これは、個体が利益(例えば、臨床結果改善；疾患に付随する症状の低減または軽減；症状の発症の減少；クオリティ・オブ・ライフ改善；無疾患状態延長；疾患の程度の低減、疾患状態安定化；疾患進行遅延；寛解；生存；または統計学的に有意な方式での生存延長)を示すのに十分である。投与される実際の量および割合および投与のタイムコースは処置されるものの性質および重症度による。注射について、本発明の医薬組成物は、例えばプレフィルドシリンジに提供され得る。
ここに開示する医薬組成物はまた、カプセル剤、錠剤、水性懸濁液剤または液剤を含むが、これらに限定されない何れかの経口により許容される剤形で経口投与され得る。経口使用のための錠剤の場合、一般に使用される担体は、ラクトースおよびトウモロコシデンプンを含む。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤もまた一般に加えられる。カプセル形態での経口投与のために、有用な希釈剤はラクトースおよび乾燥トウモロコシデンプンを含む。経口使用のための水性懸濁液が必要であるとき、活性成分、すなわち上に定義する本発明のトランスポーターカーゴコンジュゲート分子を、乳化剤および懸濁化剤と合わせる。所望により、ある甘味剤、風味剤または着色剤もまた加えられ得る。
本発明の医薬組成物は、また、特に処置標的が、例えば、皮膚または他の何らかの到達可能な上皮組織の疾患を含む、局所適用により容易に到達可能な領域または臓器を含むとき、局所的に投与できる。適当な局所製剤は、これら領域または臓器の各々のために容易に調整される。局所適用のために、医薬組成物は、本発明医薬組成物、特に１以上の担体に懸濁または溶解した上に定義した成分を含む適当な軟膏剤に製剤できる。局所投与のための担体は、鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化蝋および水を含むが、これらに限定されない。あるいは、医薬組成物を、適当なローション剤またはクリーム剤に製剤できる。本明細書において、適当な担体は、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステル蝋、セテアリルアルコール、２－オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水を含むが、これらに限定されない。
用量は、体重に関連して表し得る。故に、[ｇ、mgまたは他の単位]／kg(またはｇ、mgなど)としてあらわされる用量は、用語「体重」が明記されていなくても、通常「体重kg(またはｇ、mgなど)」あたりの[ｇ、mgまたは他の単位]をいう。
特定の実施態様において、単回用量、例えば毎日、毎週または毎月用量において、医薬組成物における抗体またはその抗原結合フラグメントの量は１ｇを超えない。あるこのような実施態様において、単回用量は、５００mg、２５０mg、１００mgおよび５０mgから選択される用量を超えない。
ある実施態様において、ここに記載する組成物またはキットは、さらに(ｉ)所望によりラミブジン、アデフォビル、エンテカビル、テルビブジン、テノフォビルまたはこれらの何らかの組み合わせを含むポリメラーゼ阻害剤；(ii)所望によりＩＦＮベータおよび／またはＩＦＮアルファを含むインターフェロン；(iii)所望により抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよび／または抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメントを含むチェックポイント阻害剤；(iv)刺激性免疫チェックポイント分子のアゴニスト；または(ｖ)(ｉ)～(iv)の何らかの組み合わせを含む。ある実施態様において、キットは、ここに記載する組成物または組み合わせを含み、さらにＢ型肝炎感染および／またはＤ型肝炎感染の予防、処置、減弱および／または診断のために該成分を使用するための指示を含む。
ある実施態様において、本発明の組成物(例えば、抗体、抗原結合フラグメント、宿主細胞、核酸、ベクターまたは医薬組成物)は、ピディリズマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ＭＥＤＩ０６８０(以前はＡＭＰ－５１４)、ＡＭＰ－２２４、ＢＭＳ－９３６５５８またはこれらの何らかの組み合わせなどのＰＤ－１阻害剤、例えばＰＤ－１特異的抗体またはその結合フラグメントと組み合わせて使用される。
ある実施態様において、本発明の組成物は、ＢＭＳ－９３６５５９、デュルバルマブ(ＭＥＤＩ４７３６)、アテゾリズマブ(ＲＧ７４４６)、アベルマブ(ＭＳＢ００１０７１８Ｃ)、ＭＰＤＬ３２８０Ａまたはこれらの何らかの組み合わせなどのＰＤ－Ｌ１特異的抗体またはその結合フラグメントと組み合わせて使用される。
ある実施態様において、本発明の組成物は、ＬＡＧ５２５、ＩＭＰ３２１、ＩＭＰ７０１、９Ｈ１２、ＢＭＳ－９８６０１６またはこれらの何らかの組み合わせなどのＬＡＧ３阻害剤と組み合わせて使用される。
ある実施態様において、本発明の組成物は、ＣＴＬＡ４阻害剤と組み合わせて使用される。具体的実施態様において、本発明の組成物は、イピリムマブ、トレメリムマブ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ融合タンパク質(例えば、アバタセプト、ベラタセプト)またはこれらの何らかの組み合わせなどのＣＴＬＡ４特異的抗体またはその結合フラグメントと組み合わせて使用される。
ある実施態様において、本発明の組成物は、エノブリツズマブ(ＭＧＡ２７１)、３７６.９６または両者などのＢ７－Ｈ３特異的抗体またはその結合フラグメントと組み合わせて使用される。Ｂ７－Ｈ３抗体結合フラグメントは、例えば、Dangaj et al., Cancer Res. 73:4820, 2013に記載されているとおり、ｓｃＦｖまたはその融合タンパク質ならびに米国特許９,５７４,０００およびＰＣＴ特許公開ＷＯ／２０１６４０７２４Ａ１およびＷＯ２０１３／０２５７７９Ａ１に記載のものであり得る。
ある実施態様において、本発明の組成物は、ＣＤ２４４阻害剤と組み合わせて使用される。
ある実施態様において、本発明の組成物は、ＢＬＴＡ、ＨＶＥＭ、ＣＤ１６０またはこれらの何らかの組み合わせの阻害剤と組み合わせて使用される。抗ＣＤ－１６０抗体は、例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ２０１０／０８４１５８に記載される。
ある実施態様において、本発明の組成物は、ＴＩＭ３阻害剤と組み合わせて使用される。
ある実施態様において、本発明の組成物は、Ｇａｌ９阻害剤と組み合わせて使用される。
ある実施態様において、本発明の組成物は、デコイアデノシン受容体などのアデノシンシグナル伝達阻害剤と組み合わせて使用される。
ある実施態様において、本発明の組成物は、Ａ２ａＲ阻害剤と組み合わせて使用される。
ある実施態様において、本発明の組成物は、リリルマブ(ＢＭＳ－９８６０１５)などのＫＩＲ阻害剤と組み合わせて使用される。
ある実施態様において、本発明の組成物は、阻害性サイトカイン(一般に、ＴＧＦβ以外のサイトカイン)またはＴｒｅｇ発達または活性の阻害剤と組み合わせて使用される。
ある実施態様において、本発明の組成物は、ｌｅｖｏ－１－メチルトリプトファン、エパカドスタット(INCB024360; Liu et al., Blood 115:3520-30, 2010)、エブセレン(Terentis et al. , Biochem. 49:591-600, 2010)、インドキシモド、ＮＬＧ９１９(Mautino et al., American Association for Cancer Research 104th Annual Meeting 2013; Apr 6-10, 2013)、１－メチル－トリプトファン(１－ＭＴ)－チラパザミンまたはこれらの何らかの組み合わせなどのＩＤＯ阻害剤と組み合わせて使用される。
ある実施態様において、本発明の組成物は、Ｎ(オメガ)－ニトロ－Ｌ－アルギニンメチルエステル(Ｌ－ＮＡＭＥ)、Ｎ－オメガ－ヒドロキシ－ノル－ｌ－アルギニン(ｎｏｒ－ＮＯＨＡ)、Ｌ－ＮＯＨＡ、２(Ｓ)－アミノ－６－ボロノヘキサン酸(ＡＢＨ)、Ｓ－(２－ボロノエチル)－Ｌ－システイン(ＢＥＣ)またはこれらの何らかの組み合わせなどのアルギナーゼ阻害剤と組み合わせて使用される。
ある実施態様において、本発明の組成物は、ＣＡ－１７０(Curis, Lexington, Mass.)などのＶＩＳＴＡ阻害剤と組み合わせて使用される。
ある実施態様において、本発明の組成物は、例えば、ＣＯＭ９０２(Compugen, Toronto, Ontario Canada)などのＴＩＧＩＴ阻害剤、例えば、ＣＯＭ７０１(Compugen)などのＣＤ１５５阻害剤または両者と組み合わせて使用される。
ある実施態様において、本発明の組成物は、ＰＶＲＩＧ、ＰＶＲＬ２または両者の阻害剤と組み合わせて使用される。抗ＰＶＲＩＧ抗体は、例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ２０１６／１３４３３３に記載される。抗ＰＶＲＬ２抗体は、例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ２０１７／０２１５２６に記載される。
ある実施態様において、本発明の組成物は、ＬＡＩＲ１阻害剤と組み合わせて使用される。
ある実施態様において、本発明の組成物は、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ－５またはこれらの何らかの組み合わせの阻害剤と組み合わせて使用される。
ある実施態様において、本発明の組成物は、刺激免疫チェックポイント分子の活性を増加させる(すなわち、アゴニスト)と組み合わせて使用される。例えば、本発明の組成物は、ＣＤ１３７(４－１ＢＢ)アゴニスト(例えば、ウレルマブ)、ＣＤ１３４(ＯＸ－４０)アゴニスト(例えば、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ６３８３またはＭＥＤＩ０５６２)、レナリドマイド、ポマリドミド、ＣＤ２７アゴニスト(例えば、ＣＤＸ－１１２７)、ＣＤ２８アゴニスト(例えば、ＴＧＮ１４１２、ＣＤ８０またはＣＤ８６)、ＣＤ４０アゴニスト(例えば、ＣＰ－８７０,８９３、ｒｈｕＣＤ４０ＬまたはＳＧＮ－４０)、ＣＤ１２２アゴニスト(例えば、ＩＬ－２)、ＧＩＴＲアゴニスト(例えば、ＰＣＴ特許公報ＷＯ２０１６／０５４６３８に記載のヒト化モノクローナル抗体)、ＩＣＯＳアゴニスト(ＣＤ２７８)(例えば、ＧＳＫ３３５９６０９、ｍＡｂ８８.２、ＪＴＸ－２０１１、Ｉｃｏｓ１４５－１、Ｉｃｏｓ３１４－８またはこれらの何らかの組み合わせ)と組み合わせて使用され得る。ここに開示する実施態様の何れにおいても、方法は、前記の何れかを、単独でまたは何らかの組み合わせで含む、１以上の刺激性免疫チェックポイント分子のアゴニストと共に本発明の組成物を投与することを含む。
本発明の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質は、さらなる活性成分と同じ医薬組成物に存在できまたは、本発明の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質は第一医薬組成物に入れられてよく、さらなる活性成分は、第一医薬組成物と異なる第二医薬組成物に入れられてよい。
使用
さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体、抗原結合フラグメント、融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞または医薬組成物またはキットを、(ｉ)Ｂ型肝炎および／またはＤ型肝炎の予防、処置または衰弱；または(ii)Ｂ型肝炎および／またはＤ型肝炎の診断(例えば、ヒト対象における)において使用する方法を提供する。
診断方法(例えば、インビトロ、エクスビボ)は、抗体、抗体フラグメント(例えば、抗原結合フラグメント)または融合タンパク質とサンプルを接触させることを含む。このようなサンプルは、対象から単離でき、例えば、鼻孔、鼻腔、唾液腺、肺、肝臓、膵臓、腎臓、耳、眼、胎盤、消化管、心臓、卵巣、下垂体、副腎、甲状腺、脳、皮膚または血液から採取した、例えば単離組織サンプルである。診断方法はまた、特に抗体、抗体フラグメントまたは融合タンパク質とサンプルの接触後の抗原／抗体または抗原／融合タンパク質複合体の検出を含む。このような検出工程は、一般に試験室で、すなわちヒトまたは動物身体と何ら接触することなく実施される。検出方法の例は当業者に周知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫吸着測定法)を含む。
本発明はまた、(ｉ)本発明の抗体、抗体フラグメント、融合タンパク質またはそのバリアントおよび誘導体、(ii)本発明の宿主細胞(不死化Ｂ細胞であり得る)、(iii)本発明の核酸またはベクターまたは(iv)本発明の医薬組成物の、(ａ)Ｂ型肝炎および／またはＤ型肝炎の予防、処置または衰弱または(ｂ)Ｂ型肝炎および／またはＤ型肝炎の診断用医薬の製造における使用も提供する。
本発明はまたＢ型肝炎および／またはＤ型肝炎の予防または処置用医薬として使用するための本発明の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の細胞または本発明の医薬組成物も提供する。対象の処置および／または対象の診断用医薬の製造における、本発明の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質の使用も提供される。対象(例えば、ヒト対象)を処置する方法であって、対象に有効量のここに記載する組成物を投与することを含む、方法も提供される。ある実施態様において、対象はヒトであり得る。治療処置の有効性を確認する一つの方法は、組成物投与後の疾患症状のモニタリングを含む。処置は、単回投与スケジュールまたは多回投与スケジュールであり得る。
ある実施態様において、本発明の抗体、抗体フラグメント、融合タンパク質、宿主細胞(例えば、融合タンパク質を発現する不死化Ｂ細胞クローンまたはＴ細胞、ＮＫ－Ｔ細胞またはＮＫ細胞)または医薬組成物は、このような処置を必要とする対象に投与される。このような対象は、特にＢ型肝炎および／またはＤ型肝炎のリスクがあるまたは易感染性であるものを含むが、これらに限定されない。
本発明の抗体、抗原結合フラグメント、融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、医薬組成物およびこれらの組み合わせをまたＢ型肝炎および／またはＤ型肝炎の予防、処置、衰弱および／または診断のキットに使用し得る。ある実施態様において、キットは、さらにＢ型肝炎感染および／またはＤ型肝炎感染の予防、処置、減弱および／または診断のために該成分を使用するための指示を含む。さらに、ここに記載のとおり、本発明の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質と結合できるＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域におけるエピトープを、保護的抗ＨＢＶ抗体の存在の検出または力価決定により、適用法の有効性をモニタリングするためのキットに使用できる。
ある実施態様において、本発明の組成物またはキットは、さらに(ｉ)所望によりラミブジン、アデフォビル、エンテカビル、テルビブジン、テノフォビルまたはこれらの何らかの組み合わせを含むポリメラーゼ阻害剤；(ii)所望によりＩＦＮベータおよび／またはＩＦＮアルファを含むインターフェロン；(iii)所望により抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよび／または抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメントを含むチェックポイント阻害剤；(iv)刺激性免疫チェックポイント分子のアゴニスト；または(ｖ)(viii)～(xii)の何らかの組み合わせを含む。
ある実施態様において、本発明の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の細胞または本発明の医薬組成物を、慢性Ｂ型肝炎感染の処置または減弱に使用する。
具体的実施態様において、本発明の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質は、(ｉ)ＨＢＶ感染を中和する、(ii)Ｌ－ＨＢｓＡｇ(感染性ＨＢＶ粒子に存在する大ＨＢＶエンベロープタンパク質)と結合し、それによりＨＢＶの拡散を予防する、(iii)Ｓ－ＨＢｓＡｇに結合し、それによりサブウイルス粒子(ＳＶＰ)の排除を促進するおよび／または(iv)血清転換、すなわち該ウイルスに対する活性免疫応答を誘導できる。
具体的実施態様において、本発明の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の細胞または本発明の医薬組成物は、特にＢ型肝炎誘導肝不全について、肝移植後のＢ型肝炎(再)感染予防に使用され得る。
さらなる実施態様において、本発明の抗体、その抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質、本発明の核酸、ここに提供する本発明のベクター、本発明の細胞または本発明の医薬組成物は、非免疫化対象におけるＢ型肝炎の防止／予防に使用され得る。これは、例えば、ＨＢＶへの(推定の)偶発的暴露(暴露後予防)の場合における。用語「非免疫化対象」は、ワクチン接種を全く受けておらず、故に、免疫化されていない対象およびワクチン接種後免疫応答を示さない(例えば、測定可能な抗Ｂ型肝炎抗体がない)対象を含む。
ある実施態様において、本発明の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の細胞または本発明の医薬組成物を、血液透析患者におけるＢ型肝炎の予防に使用する。
ある実施態様において、本発明の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の細胞または本発明の医薬組成物を、新生児のＢ型肝炎の予防に使用する。このような実施態様において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の細胞または本発明の医薬組成物を、出生時または出生後できる限りすぐに投与し得る。投与を、ワクチン接種後血清転換まで反復し得る。
さらに、本発明はまたＢ型肝炎および／またはＤ型肝炎の診断(例えばインビトロ、エクスビボまたはインビボ)における本発明の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の細胞または本発明の医薬組成物の使用を提供する。
さらに、単離血液サンプルがＢ型肝炎ウイルスおよび／またはデルタ型肝炎ウイルスに感染しているか否かの決定における、本発明の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の細胞または本発明の医薬組成物の使用が提供される。
上記のとおり、診断方法は、抗体、抗体フラグメントまたは融合タンパク質とサンプルを接触させることを含み得る。このようなサンプルは対象から単離でき、例えば、鼻孔、鼻腔、唾液腺、唾液腺、肺、肝臓、膵臓、腎臓、耳、眼、胎盤、消化管、心臓、卵巣、下垂体、副腎、甲状腺、脳、皮膚または血液から採取した、例えば単離サンプルである。診断方法はまた、特に抗体または抗体フラグメントとサンプルの接触後の抗原／抗体複合体の検出を含む。このような検出工程は、一般に試験室で、すなわちヒトまたは動物身体と何ら接触することなく実施される。検出方法の例は当業者に周知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫吸着測定法)を含む。
本発明はまた対象におけるＢ型肝炎および／またはＤ型肝炎を処置、予防および／または減弱する方法を提供し、ここで、該方法は、対象に本発明の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の細胞または本発明の医薬組成物を投与することを含む。ある実施態様において、方法は、さらに対象に(vii)所望によりラミブジン、アデフォビル、エンテカビル、テルビブジン、テノフォビルまたはこれらの何らかの組み合わせを含むポリメラーゼ阻害剤；(viii)所望によりＩＦＮベータおよび／またはＩＦＮアルファを含むインターフェロン；(ix)所望により抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよび／または抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメントを含むチェックポイント阻害剤；(ｘ)刺激性免疫チェックポイント分子のアゴニスト；または(xi)(vii)～(ｘ)の何らかの組み合わせの１以上を投与することを含む。
ある実施態様において、Ｂ型肝炎感染は慢性Ｂ型肝炎感染である。ある実施態様において、対象は肝移植を受けている。ある実施態様において、対象は、Ｂ型肝炎に対して免疫化されていない。ある実施態様において、対象は新生児である。ある実施態様において、対象は血液透析を受けるまたは受けている。
本発明はまた肝移植を受けた対象に有効量の本発明の抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の細胞または本発明の医薬組成物を投与することを含む、肝移植を受けた対象を処置する方法を提供する。
またここで提供されるのは、抗Ｂ型肝炎および／または抗Ｄ型肝炎ワクチンに正しい立体構造でエピトープが存在するかしないかを検出する方法であって、該方法は、(ｉ)ワクチンと本発明の何れかの抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質を接触させ；および(ii)抗原と抗体を含むまたは抗原と抗原結合フラグメントを含むまたは抗原と融合タンパク質を含む複合体が形成されているかを決定することを含む。
ここで使用する用語「ワクチン」は、一般に免疫原などの少なくとも１つの抗原を提供する予防または治療物質であると理解される。抗原または免疫原は、ワクチン接種に適するあらゆる物質に由来し得る。例えば、抗原または免疫原は、細菌粒子、ウイルス粒子、腫瘍(固形または液体腫瘍を含む)または他の癌性組織などの病原体由来であり得る。抗原または免疫原は、適応免疫応答を提供するよう体の適応免疫系を刺激する。ある実施態様において、「抗原」または「免疫原」は、免疫系により、例えば適応免疫系により認識され、例えば、適応免疫応答の一部として抗体および／または抗原特異的Ｔ細胞の形成により、抗原特異的免疫応答を駆動できる物質をいう。ある実施態様において、抗原は、Ｔ細胞にＭＨＣ複合体(例えば、ＭＨＣクラスＩ；ＭＨＣクラスII)により提示され得る、ペプチドまたはタンパク質であり得るかまたはそれを含み得る。ある実施態様において、抗原は、ＨＢＶおよび／またはＨＢＤ抗原；例えば、ＨＢｓＡｇ抗原を含む。
ある場合、ここで提供される抗体、抗体フラグメント、融合タンパク質、核酸、細胞、組成物、使用および方法の要素は、実施態様または実施例を参照して記載されるかまたは列記される。しかしながら、ここに記載する実施例および実施態様は、さらなる実施態様を作るために、種々の方法で組み合わせられ得ることは理解される。
次に、本発明の種々の実施態様および態様を説明する特定の実施例を示す。しかしながら、本発明は、ここに記載する特定の実施態様に範囲が限定されない。
実施例１：操作された抗体の産生および試験
ＰＣＴＷＯ２０１７／０６０５０４からのいくつかのＨＢＣ３４抗体バリアントの分析により、軽鎖可変領域における４０位のシステインアミノ酸(ＩＭＧＴナンバリング)が、不対であり、易罹患性の可能性を示した。理論に拘束されることを意図しないが、不対システイン残基は反応性である可能性があり、潜在的に分子内混乱または分子間ジスルフィド形成を介して凝集を誘発し得る。ＨＢＣ３４－Ｖ７のバリアント(ＷＯ２０１７／０６０５０４)を、軽鎖可変領域における４０位のシステインアミノ酸をセリン(これにより「ＨＢＣ３４－Ｖ３４」を産生)またはアラニン(これにより「ＨＢＣ３４－Ｖ３５」を産生)で置換することにより変換した。これらのさらなるバリアント抗体をコードするヌクレオチド配列をコドン最適化し、抗体をＥｘｐｉＣＨＯTM細胞(ThermoFisher)でＩｇＧ１(ｇ１ｍ１７、１アロタイプ)として発現させた。ＨＢＣ３４－Ｖ３５のＶＨおよびＶＬドメインをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号１０３および１０４として提供する。
ＨＢＣ３４－Ｖ３４およびＨＢＣ３４－Ｖ３５が抗原に結合する能力を、直接抗原結合ＥＬＩＳＡを使用して試験した。ＨＢＣ３４－Ｖ７を比較対照として使用した。図１に示すとおり、ＨＢＣ３４－Ｖ３４およびＨＢＣ３４－Ｖ３５両者は、２つの組み換えＨＢｓＡｇ抗原(「ａｄｗ」、上部パネル；「ａｄｒ」、下部パネル)に有効結合し、ＨＢＣ３４－Ｖ３５は、親ＨＢＣ３４－Ｖ７に極めて類似する結合性を有した。
バリアント抗体を、すべての既知ＨＢｓＡｇ遺伝子型((Ａ)～(Ｊ))との結合について試験した。簡潔には、ヒト上皮性細胞(Ｈｅｐ２細胞)を、１０種のＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩおよびＪの各々のＨＢｓＡｇを発現するプラスミドでトランスフェクトした。全抗体を、複数濃度で、一過性にトランスフェクトした透過性細胞の染色について試験した。トランスフェクション２日後、Ｈｅｐ２細胞を集め、固定し、ＨＢＣ３４および５つの選択バリアントでの免疫染色のためにサポニンで透過処理した。ＨＢＣ３４－Ｖ７をコンパレーターとして含めた。トランスフェクト細胞への抗体の結合を、Becton Dickinson FACSCanto2TM(BD Biosciences)とＦｌｏｗＪｏソフトウェア(TreeStar)を使用して分析した。図２Ａ～２Ｊに示すとおり、ＨＢＣ３４－Ｖ３４およびＨＢＣ３４－Ｖ３５は、全１０種のＨＢＶ ＨＢｓＡｇ遺伝子型を認識した。ＨＢＣ３４－Ｖ３５は、ＨＢＣ３４－Ｖ３４より幾分強い染色を示した。
これらのデータは、抗体バリアントＨＢＣ３４－Ｖ３４およびＨＢＣ３４－Ｖ３５が、ＨＢＣ３４－Ｖ７と同等レベルでＨＢｓＡＧを広く認識し、結合することを示す。
実施例２：修飾Ｆｃ領域を有する抗ＨＢｓＡｇ抗体は、効率的に抗原に結合する
Ｆｃ領域における修飾は、治療抗体に利点を提供し得る。ＨＢＣ３４－Ｖ３５を、野生型Ｆｃまたは「ＭＬＮＳ」変異(Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ)を含むＦｃもしくはＭＬＮＳと「ＧＡＡＬＩＥ」変異の組み合わせ(Ｇ２３９Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ)を含むＦｃと共にＩｇＧ１として発現させた。各構築物を、２つの別々の抗原結合ＥＬＩＳＡ実験で組み換えＨＢｓＡｇ(ａｄｗ)との結合について試験した。３ロットのＨＢＣ３４－ｖ３５(野生型Ｆｃ)を試験した。２ロットのＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳおよび２ロットのＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥを試験した。ＨＢＣ３４ｖ７(１ロット)をコンパレーターとして試験した。
図３Ａおよび３Ｂに示すとおり、導入したＦｃ変異は、ＨＢＣ３４－Ｖ３５の抗原結合活性に影響しなかった。各構築物および２つの実験間でＥＣ５０値はいくらか変わり、一般に低値であった。
ＭＬＮＳまたはＭＬＮＳおよびＧＡＡＬＩＥ変異を有するＨＢＣ３４－Ｖ３５とＨＢｓＡｇ遺伝子型(Ａ)～(Ｊ)またはＨＢｓＡｇバリアントを発現するＥＸＰＩ２９３細胞の結合を評価した。野生型ＩｇＧ１ Ｆｃを有するＨＢＣ３４－Ｖ３５をコンパレーターとして使用した。ＨＢｓＡｇ遺伝子型への結合を示すデータを図３Ｃ～３Ｈに示す。ＨＢｓＡｇバリアントへの結合を示すデータを図３Ｉ～３Ｒに示す。
実施例３：抗体のインビトロ中和活性
ＨＢＣ３４、ＨＢＣ３４－Ｖ３５、ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳおよびＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥの中和能を、ＮＴＣＰを発現するＨＢＶ感染ＨｅｐＧ２細胞の細胞培養上清におけるＨＢｓＡｇ(Ａ)およびＨＢｅＡｇ(Ｂ)のレベルの測定により比較した。データを図３Ｓ～３Ｖに示し、２つの独立した実験の一方からの平均±ＳＤを表す。
実施例４：ＨＤＶシュードシステムで評価したＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥの汎遺伝子型中和能
ＨＢＶウイルスに対するＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥの中和の幅広さを確認するために、中和アッセイを、ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥを用いて、８種の優勢なヒトＨＢＶ遺伝子型に対して実施した。種々の遺伝子型を表すＨＢＶ ＨＢｓＡｇを発現するよう操作されたＤ型肝炎ウイルス(ＨＤＶ)を利用するインビトロ系を用いた。簡潔には、ＨＢＶおよびＨＤＶ両者が同じエンベロープタンパク質を共有するため、ヘパラン硫酸プロテオグリカンおよびＮＴＣＰを経るそれらウイルス侵入経路は同一であり、ＨＤＶをＨＢｓＡｇ介在ウイルス侵入試験のモデル系として使用できる(Tu 2018; Lempp 2016)。さらに、ＨＤＶは、異なるＨＢＶ遺伝子型のＨＢｓＡｇでエンベロープ被包／シュードタイプ化され、その後感染試験に使用され得る(Freitas 2014)。
ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥは、０.９２ng／mL(遺伝子型Ｃ)～２.３４ng／mL(遺伝子型Ａ)の範囲の類似のＥＣ５０値で試験した全遺伝子型に対する中和能を示した。これらの結果は、ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥが試験した全８種のＨＢＶ遺伝子型からのＨＢｓＡｇを担持する感染性ウイルスを中和できることを示し、ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥのインビボ汎遺伝子型中和活性を支持する(図４)。
実施例５：インビボモデルにおけるＨＢ抗原の排除およびウイルス侵入阻害
移植されたヒト肝細胞を有する免疫欠損マウスを使用して、抗ＨＢＶ本発明の抗体のＨＢｓＡｇ排除における有効性を試験した。簡潔には、初代ヒト肝細胞をマウス肝細胞が予め酵素で破壊されているＳＣＩＤマウスに移植した。マウスはＴ細胞およびＢ細胞欠損であった。このモデルは、侵入、伝播、ｃｃｃＤＮＡ制御、肝細胞内因性免疫応答および宿主ゲノムへのウイルス組込みを含むＨＢＶ感染の試験に有用である。
マウスに－２８日目にマウスあたり１.０×１０７ウイルスゲノムでＨＢＶ、遺伝子型Ｃを尾静脈注射により接種した。ＨＢＶの最初の処置後、０日目の処置をした。ＨＢＶ感染マウス(ｎ＝４／処置群)に、ＰＢＳ(対照)またはＨＢＣ３４－Ｖ３５(１mg／kg、５mg／kgまたは１５mg／kg ｉ.ｐ.、２×／週)を投与した。抗体を、抗原結合Ｆａｂ領域以外マウス化した。
血漿および血清サンプルを試験およびウイルス負荷中定期的に集め、ＨＢＶ ＤＮＡ(ＰＣＲ)およびＨＢ Ａｇ(ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｃｒＡｇ)を測定した。マウスを６週目に屠殺した。
図５～８に示すとおり、試験した最高用量のＨＢＣ３４－Ｖ３５での処置は、ウイルス負荷および肝細胞へのウイルス侵入を低減した。
実施例６：インビトロエフェクター機能試験
(１)ヒトＦｃＲおよび補体に結合する；(２)ＦｃγＲIIａ、ＦｃγＲIIｂおよびＦｃγＲIIIａを活性化する；および(３)ＡＤＣＣを促進し、ヒトナチュラルキラー(ＮＫ)細胞を活性化するための修飾Ｆｃを有するＨＢＣ３４抗体の能力を試験するために、インビトロ試験を実施した。使用した試験品、細胞株および試薬を下表５～７に記載する。本実施例では次の略語を使用する。ＧＬＰ＝優良試験所規則；ＡＤＣＣ＝抗体依存性細胞傷害；ＡＤＣＰ＝抗体依存性細胞貪食；Ｆｃ＝結晶性フラグメント；ＨＢｓＡｇ＝Ｂ型肝炎表面抗原；ｍＡｂ＝モノクローナル抗体；ＰＢＳ＝リン酸緩衝化食塩水；ＵＨＰＬ－ＳＥＣ＝Ｕ超高速液体サイズ排除クロマトグラフィー；ＡＴＣＣ＝アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関；ＦｃγＲ＝Ｆｃガンマ受容体；ＣＨＯ細胞＝チャイニーズハムスター卵巣細胞；ＲＬＵ＝相対的発光単位；ＢＬＩ＝バイオレイヤー干渉法。






実験法
ヒトＦｃ受容体への結合の測定
ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳおよびＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥのヒトＦｃγＲへの結合を、Ｏｃｔｅｔ(登録商標)装置(ＢＬＩ、バイオレイヤー干渉法；ＦｏｒｔｅＢｉｏ)で測定した。簡潔には、Ｈｉｓタグ付ヒトＦｃγＲ(ＦｃγＲIIａアレルＨ１３１、ＦｃγＲIIａアレルＲ１３１、ＦｃγＲIIＡａアレルＦ１５８、ＦｃγＲIIIａアレルＶ１５８およびＦｃγＲIIｂ)を、２μg／mlで抗ペンタ－Ｈｉｓセンサーに６分間捕捉させた。次いで、ＦｃγＲ負荷センサーを１μg／mlのaffiniPure F(ａｂ')2フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ(ａｂ')2フラグメント特異的(Ｆａｂフラグメントを介してヒトｍＡｂを交差架橋するため)存在下、２μg／mlの各ｍＡｂを含む動態緩衝液(ｐＨ７.１)の溶液に４分間曝し、さらに４分間同じ緩衝液での解離段階が続いた(プロットの右部分)。結合および解離プロファイルを、Ｏｃｔｅｔ(登録商標)RED96(ＦｏｒｔｅＢｉｏ)を使用して干渉パターンの変化としてリアルタイムで測定した。溶液中のＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥ、ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳまたはＨＢＣ３４－Ｖ３５の固定化ヒトＦｃＲｎへの結合を、Ｏｃｔｅｔで、ｐＨ＝６.０またはｐＨ＝７.４でリアルタイムで測定した。
ヒト補体タンパク質Ｃ１ｑへの結合の測定
ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳおよびＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥのヒト補体への結合を、Ｏｃｔｅｔ(登録商標)装置(ＢＬＩ、バイオレイヤー干渉法；ＦｏｒｔｅＢｉｏ)で測定した。簡潔には、抗ヒトＦａｂ(ＣＨ１特異的)センサーを使用して、Ｆａｂフラグメントを介して、ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳおよびＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥ ｍＡｂの完全ＩｇＧ１を、１０μg／mlで１０分間捕捉させた。次いで、ＩｇＧ負荷センサーを、３μg／mlの精製ヒトＣ１ｑを含む動力学緩衝液(ｐＨ７.１)の溶液に４分間曝し(プロットの左部分)、さらに４分間同じ緩衝液での解離段階が続いた(プロットの右部分)。結合および解離プロファイルを、Ｏｃｔｅｔ(登録商標)RED96(ＦｏｒｔｅＢｉｏ)を使用して干渉パターンの変化としてリアルタイムで測定した。
全血からのヒトＮＫ細胞の調製
ＮＫ細胞を、製造者の指示に従い、MACSxpress(登録商標)ＮＫ単離キットを使用して全ＥＤＴ血液から新たに単離した。簡潔には、抗凝固血液を５０mlチューブで１５mlのＮＫ単離カクテルと混合し、５分間、室温で、約１２回転／分でローテータを使用して、インキュベートした。次いで、チューブを、１５分間、MACSxpress(登録商標)Separatorの磁場に入れた。磁気標識された細胞はチューブの壁に付着し、一方、凝集赤血球は底に沈降した。次いで、チューブは、なおMACSxpress(登録商標)Separator内で、標的ＮＫ細胞を上清から集めた。ＮＫ細胞を遠心分離し、蒸留水で処理して、残存赤血球を除去し、再び遠心分離し、最後にＡＩＭ－Ｖ培地に再懸濁した。
抗体依存性ＮＫ細胞による殺細胞の決定
ｍＡｂを、ＡＩＭ－Ｖ培地で１００μg／mlから０.００１μg／mlまで１０倍連続希釈した。標的細胞(ＰＬＣ／ＰＲＦ／５；MacNab, et al., British Journal of Cancer, 34(5), 1976)を、丸底３８４ウェルプレートに２３μl中７.５×１０３細胞／ウェルで加え、次いで連続希釈抗体を各ウェルに加え(２３μl／ウェル)、抗体／細胞混合物を１０分間、室温でインキュベートした。インキュベーション後、ヒトＮＫ細胞を、２３μl中７.５×１０４／ウェルの細胞密度で加え、エフェクター対標的比を１０：１とした。最大溶解(標的細胞と２３μlの３％Ｔｒｉｔｏｎ ｘ－１００含有)および自発的溶解(抗体を含まず、標的細胞およびエフェクター細胞含有)を測定するために使用する対照ウェルもまた含んだ。プレートを、４時間、３７℃で５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞死を、製造者の指示に従い、ＬＤＨ検出キットを使用して、乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)放出の測定により決定した。すなわち、プレートを４分間、４００×ｇで遠心分離し、３５μlの上清を平らな３８４ウェルプレートに移した。ＬＤＨ試薬を調製し、３５μlを各ウェルに加えた動態学的プロトコールを使用して、４９０nmおよび６５０nmでの吸光度 を、８分間、２分毎に１回測定した。パーセント特異的溶解を、次の式の適用により決定した：(特異的放出－自発的放出)／(最大放出－自発的放出)×１００。
抗体依存性ＮＫ細胞活性化の決定
初代ＮＫ細胞の活性化を、ホモ接合型高(Ｖ１５８アレル)または低(Ｆ１５８アレル)親和性ＦｃγＲIIIａを発現することが先に遺伝子型同定された２ドナーからの新たに単離した細胞を使用して、試験した。ｍＡｂの連続希釈物(ＡＩＭ－Ｖ培地で１００μg／mlから０.０００１μg／mlまで１０倍連続希釈)をＮＫ細胞と４時間インキュベートした。ＮＫ細胞の活性化を、ＮＫ細胞活性の機能的マーカーとしての抗ＣＤ１０７ａ ｍＡｂ(抗ＣＤ１０７ ＰＥ、BioLegend(登録商標)、１／３５希釈で使用)を用いて、ＮＫ細胞を染色することにより、フローサイトメトリーで測定した。
ヒトＦｃγＲIIIａの抗体依存性活性化の決定
ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳおよびＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥを、ＡＤＣＣアッセイ緩衝液で５μg／mlから０.０７６μg／mlまで４倍連続希釈した。標的抗原(Engerix B, Glaxo SmithKlineからのＨＢｓＡｇ)を、２５μl中０.６μg／mlで白色平底９６ウェルプレートに加え、次いで連続希釈抗体を各ウェルに加え(２５μl／ウェル)および抗体／細胞混合物を１０分間、室温でインキュベートした。ＡＤＣＣバイオアッセイのためのエフェクター細胞を解凍し、２５μl中７.５×１０４／ウェルの細胞密度で加えた(最終ＨＢｓＡｇ濃度は０.２μg／mlであった)。抗体非依存的活性化(ＨＢｓＡｇおよびエフェクター細胞を含むが、抗体を含まない)およびプレートの自発的発光(ＡＤＣＣアッセイ緩衝液のみを含むウェル)を測定するために使用する対照ウェルもまた含んだ。プレートを、２４時間、３７℃で５％ＣＯ２でインキュベートした。このバイオアッセイにおけるヒトＦｃγＲIIIａ(Ｖ１５８またはＦ１５８バリアント)の活性化は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のＮＦＡＴ介在発現をもたらした。発光を、製造者の指示に従い、Ｂｉｏ－ＧｌｏTMルシフェラーゼアッセイ試薬を使用して、ルミノメーターで測定した。データ(すなわち、特異的ＦｃγＲIIIａ活性化)を、次の式を適用して、バックグラウンドを超える相対的発光単位(ＲＬＵ)の平均として表す：(ＭＡｂの濃度ｘ時のＲＬＵ－バックグラウンドのＲＬＵ)。
ヒトＦｃγＲIIａの抗体依存性活性化の決定
ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳおよびＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥを、ＡＤＣＰアッセイ緩衝液で５０μg／mlから０.０００１３μg／mlまで５倍連続希釈した。標的抗原(Engerix BからのＨＢｓＡｇ)を、白色平底９６ウェルプレートに２５μl中０.６μg／mlまたは６μg／mlで加え、次いで連続希釈抗体を各ウェルに加え(２５μl／ウェル)、抗原／抗体を２５分間、室温でインキュベートした。ＦｃγＲIIａ活性化バイオアッセイのためのエフェクター細胞を解凍し、２５μl中５０.０×１０４／ウェルの細胞密度で加えた(最終ＨＢｓＡｇ濃度はそれぞれ０.２μg／mlまたは２μg／mlであった)。抗体非依存的活性化(ＨＢｓＡｇおよびエフェクター細胞を含むが、抗体を含まない)およびプレートの自発的発光(ＡＤＣＰアッセイ緩衝液のみを含むウェル)の測定に使用する対照ウェルもまた含んだ。プレートを、２３時間、３７℃で５％ＣＯ２でインキュベートした。このバイオアッセイにおけるヒトＦｃγＲIIａ(Ｈ１３１バリアント)の活性化は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のＮＦＡＴ介在発現をもたらした。発光を、製造者の指示に従い、Ｂｉｏ－ＧｌｏTMルシフェラーゼアッセイ試薬を使用して、ルミノメーターで測定した。データ(すなわち、特異的ＦｃγＲIIａ活性化)を、次の式を適用して、バックグラウンドを超える相対的発光単位(ＲＬＵ)の平均として表す：(濃度[ｘ]時のｍＡｂのＲＬＵ－バックグラウンドのＲＬＵ)。
ヒトＦｃγＲIIｂの抗体依存性活性化の決定
ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳおよびＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥを、ＡＤＣＰアッセイ緩衝液で１００μg／mlから０.０００２６μg／mlまで５倍連続希釈した。標的抗原(Engerix BからのＨＢｓＡｇ)を、白色平底９６ウェルプレートに２５μl中３μg／mlで加え、次いで連続希釈抗体を各ウェルに加え(２５μl／ウェル)、抗原／抗体を１５分間、室温でインキュベートした。ＦｃγＲIIｂ活性化バイオアッセイのためのエフェクター細胞を解凍し、２５μl中、７５.０×１０４／ウェルの細胞密度で加えた(最終ＨＢｓＡｇ濃度は１μg／mlであった)。抗体非依存的活性化(ＨＢｓＡｇおよびエフェクター細胞を含むが、抗体を含まない)およびプレートの自発的発光(ＡＤＣＰアッセイ緩衝液のみを含むウェル)の測定に使用する対照ウェルもまた含んだ。プレートを、２０時間、３７℃で５％ＣＯ２でインキュベートした。このバイオアッセイにおけるヒトＦｃγＲIIｂの活性化は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のＮＦＡＴ介在発現をもたらした。発光を、製造者の指示に従い、Ｂｉｏ－ＧｌｏTMルシフェラーゼアッセイ試薬を使用して、ルミノメーターで測定した。データ(すなわち、特異的ＦｃγＲIIｂ活性化)を、次の式を適用して、バックグラウンドを超える相対的発光単位(ＲＬＵ)の平均として表す：(濃度[ｘ]時のｍＡｂのＲＬＵ－バックグラウンドのＲＬＵ)。
ヒト肝細胞癌細胞株ＰＬＣ／ＰＲＦ／５への抗体結合の決定
ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を５分間、３７℃でトリプシン処理し、７ml増殖培地に移し、４００×ｇ、４分間、４℃で遠心分離し、４℃でＰＢＳ中徹底的に洗浄した。一部細胞を４％ホルムアルデヒドで固定した(２０分間、４℃)；その他を固定し、次いで透過処理緩衝液で透過処理した(２０分間、４℃)。細胞ペレットを２.６４mlの洗浄緩衝液(固定細胞)または透過処理緩衝液(固定および透過細胞)(表７)に再懸濁し、９６ウェル丸底プレートに２００μl／ウェルで分配した(１００'０００細胞／ウェルに対応)。プレートを、４００ｇ、４分間、４℃で遠心分離した。１０μg／mlの最終濃度から開始する試験抗体の連続１：５ ５点希釈物を、細胞含有ウェルに加え、３０分間、氷上でインキュベートした。洗浄緩衝液(固定細胞)または透過処理緩衝液(固定および透過細胞)で４℃、４００×ｇ、４分間の２回洗浄後、５０μl／ウェルのAlexa Fluor(登録商標)６４７標識二次抗体(表７)を細胞に加え、２０分間、氷上でインキュベートした。細胞を洗浄緩衝液(固定細胞)または透過処理緩衝液(固定および透過細胞)でさらに２回洗浄し、２００μl／ウェルの洗浄緩衝液(固定細胞)または透過処理緩衝液(固定および透過細胞)に再懸濁し、シグナル(ＭＦＩ、平均蛍光強度)をサイトフルオロメーター(BD FACSCantoTM II)で定量した。
結果
インビボでのＨＢＶ中和のために、直接的抗ウイルス機構が重要である。Ｆｃ領域と免疫細胞上のＦｃガンマ受容体(ＦｃγＲ)の相互作用が介在する間接的Ｆｃ依存性作用機構もまたインビボ有効性および内因性免疫応答介在に重要な貢献を果たし得る。ＦｃγＲ依存性機構は、ＦｃγＲへの結合の測定によりインビトロでおよびヒトＦｃγＲの抗体依存性活性化において評価され得る(Hsieh, Y.-T., et al., Journal of Immunological Methods, 441(C), 56-66. doi.org/10.1016/j.jim.2016.12.002)。抗体がＦｃＲｎおよび補体に結合する能力は、他の興味深い因子である。
一連の実験において、ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳおよびＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥを、バイオレイヤー干渉法(BLI Octet(登録商標)System、ForteBio)を使用して、ヒトＦｃγＲの完全セット(ＦｃγＲIIIａ Ｖ１５８およびＦ１５８アレル、ＦｃγＲIIａ Ｈ１３１およびＲ１３１アレルおよびＦｃγＲIIｂ)に結合する能力について対照比較した。図９Ａ～９Ｅに示すとおり、ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥ変異を担持するＦｃは、ＦｃγＲとの相互作用が改変されている；具体的に、これら変異の両者を担持するＦｃは、ＭＬＮＳ単独を担持するＦｃとは逆に、ＦｃγＲIIIａおよびＦｃγＲIIａへの結合が増強され、ＦｃγＲIIｂへの結合が減少している。
図９Ｆに示すとおり、ＭＬＮＳ Ｆｃ変異を担持する抗体は、ｐＨ６.０で野生型Ｆｃを有する抗体と比較して、ＦｃＲｎへの結合が増加しているが、ｐＨ７.４で、ＦｃＲｎに対する結合は殆どないか、測定不可能であり、野生型Ｆｃを有する抗体と同等である。
また、ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥのＣ１ｑへの結合は、バイオレイヤー干渉法により測定して、消失した(図１０)。
ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳおよびＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥをまた細胞ベースのレポーターバイオアッセイを使用して、ヒトＦｃγＲIIIａおよびＦｃγＲIIａを活性化する能力についてもまた試験した。これらのアッセイは、ヒトＦｃγＲの活性化を反映するように、ＮＦＡＴ介在ルシフェラーゼレポーターで操作されたJurkat細胞を使用する。ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳは、ＨＢｓＡｇ存在下で、ヒトＦｃγＲIIIａおよびＦｃγＲIIａをわずかに活性化させるかまたは活性化させず、一方、ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥは、試験した全ＦｃγＲの用量依存性活性化を示した(図１１Ａ、１１Ｂ、１２Ａ～１２Ｂ)。ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥは、１００μg／mlで試験しても、ＦｃγＲIIｂを活性化しなかった(図１３Ａ～１３Ｂ)。
ＡＤＣＣ活性をまたヘテロ接合型高(Ｖ１５８)および低(Ｆ１５８)親和性ＦｃγＲIIIａ(Ｆ／Ｖ)を発現することが先に遺伝子型同定された１ドナーのヒト末梢血液単核細胞から単離した、ナチュラルキラー細胞(ＮＫ)を使用して、測定した。単離ＮＫ細胞を使用して、ＨＢＣ３４－Ｖ３５；ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ；ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥ；または他のｍＡｂ(１７.１.４１、ＨＢｓＡｇの抗原性ループ上の他のエピトープを標的；Eren, R., et al., Hepatology, doi.org/10.1053/jhep.2000.9632;Galun, E., et al., Hepatology, doi.org/10.1053/jhep.2002.31867参照)への暴露による肝細胞癌細胞株ＰＬＣ／ＰＲ／５の死滅を測定した。ＨＢｓＡｇ特異的ｍＡｂ ＨＢＣ３４－Ｖ３５、ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ、ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥおよび１７.１.４１存在下の死滅は観察されなかった(図１４Ａ)。観察されたＰＬＣ／ＰＲ／５細胞の抗体依存性死滅の欠如は、理論に拘束されることを願わないが、ＮＫ細胞による死滅の誘導には不十分であり得る、これら細胞の表面上へのＨＢｓＡｇの不十分な発現に関連する(図１４Ｂ)。逆に、ＰＬＣ／ＰＲ／５細胞を固定し、透過性処理したとき、ＨＢＣ３４ｖ３５および１７.１.４１で高レベルのＨＢｓＡｇが検出され、ＨＢｓＡｇの大部分が細胞内にまたは分泌形態で(すなわちサブウイルス粒子)でみられることを示す(図１４Ｂ)。
ＨＢＣ３４ｖ３５－ＭＬＮＳまたはＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥおよびＨＢｓＡｇ存在下の初代ヒトＮＫ細胞(Ｖ／Ｆ)の活性化をまた抗ＣＤ１０７ａ ｍＡｂを使用して試験した。データを図１５Ａおよび１５Ｂに示す。
これらのインビトロデータは、ＧＡＡＬＩＥ Ｆｃ変異を担持する本発明のＨＢＶ特異的結合タンパク質が、低親和性活性化ＦｃγＲIIａおよびＦｃγＲIIIａを、非ＧＡＡＬＩＥ Ｆｃ親抗体よりも効率的に結合し、活性化することを示す。ＧＡＡＬＩＥ担持結合タンパク質はまた低親和性阻害性ＦｃγＲIIｂに結合せず、活性化しない。ＧＡＡＬＩＥ担持結合タンパク質はまたＣ１ｑに結合しない。さらに、ＧＡＡＬＩＥ担持結合タンパク質は、肝細胞癌細胞のＡＤＣＣを促進しないが、可溶性ＨＢｓＡｇ存在下で、ヒトＮＫ細胞を活性化する。ＭＬＮＳ変異の導入は、ｐＨ６.０でＦｃＲｎへの結合を増加させる。
実施例７：ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥとＰｏｌ／ＲＴ阻害剤間の薬物－薬物相互作用のインビトロ試験
ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥとＨＢＶ ｐｏｌ／ＲＴ阻害剤エンテカビル(ＥＴＶ)の組み合わせ効果の可能性を同定するために、インビトロ試験を実施した。インビトロ組み合わせ効果を、チェッカーボード形態でＨｅｐＧ２.２.１５細胞中ＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥおよびＥＴＶを使用して、実施した。ＨＢｓＡｇおよびＨＢＶ ＤＮＡレベルを読み出しとして使用し、データをMacSynergy II(uab.edu/medicine/peds/macsynergy)を使用して、組み合わせ効果について分析した。正規化のために、未処理ＨｅｐＧ２.２.１５細胞から得た値を陽性対照として使用し、組織培養培地を陰性対照として使用した。９９％信頼での相乗作用プロットを報告のために使用した。データを図１６に示す。両者の読み出し情報の相乗作用プロットは、インビトロでＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥとＥＴＶの相加効果を示す。顕著に、拮抗作用は観察されなかった。これらのデータは、臨床現場におけるヌクレオシドアナログとＨＢＣ３４－Ｖ３５－ＭＬＮＳ－ＧＡＡＬＩＥの組み合わせの使用を支持する。
実施例８：ヒトモノクローナル抗体ＨＢＣ２４の同定および特徴づけ
抗ＨＢＶヒトモノクローナル抗体を、ヒト患者からTraggiai E. et al., 2004, NatMed 10(8): 871-5に記載するのに類似する方法で単離した。抗体を、その可変領域および相補性決定領域(ＣＤＲ)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の決定により特徴づけし、「ＨＢＣ２４」と名付けた。よって、ＨＢＣ２４は、上の表３に示すＣＤＲ、ＶＨおよびＶＬ配列を有するＩｇＧ１型完全ヒトモノクローナル抗体である。ＨＢＣ２４のＶＨおよびＶＬをコードするヌクレオチド配列の例は、表４に提供される。
実施例９：ＨＢＣ２４の生殖系列化バリアントの産生および機能的試験
ＨＢＣ２４を、生殖細胞系配列に対する可変領域における体細胞変異の存在について分析する。同定された体細胞変異を生殖細胞系配列に戻して、ＨＢＣ２４バリアントを産生する。ＨＢＣ２４およびバリアントを、ここに記載するアッセイを使用して、ＨＢＶおよびＨＢＤ血清型の結合(インビトロ)および中和(インビトロ；インビボ)について試験する。
実施例１０：ＨＢＣ２４およびバリアントへのＦｃ修飾の導入
両ＦｃモノマーにＭＬＮＳおよびＧＡＡＬＩＥ変異を含むさらなるＨＢＣ２４バリアントを産生する。選択したバリアントのＨＣアミノ酸配列を配列番号１２１および１２２に示す。バリアントを、ここに記載するアッセイを使用して、(１)抗原へのインビトロ結合；(２)ＨＢＶ血清型のインビトロ中和について試験する。
上記の種々の実施態様は、さらなる実施態様を提供するために組み合わせ得る。本明細書に引用されるおよび／または出願データシートに列記される米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は、全体として引用により本明細書に包含させる。実施態様の各態様は、さらなる実施態様を提供するために、種々の特許、出願および刊行物の概念を用いるために、必要であれば、修飾され得る。
２０１８年１２月１９日出願の米国仮出願６２／７８２,２７４および２０１９年６月１１日出願の米国仮出願６２／８６０,０８５は、引用により、全体として本明細書に包含させる。
これらおよび他の変化を、上記説明に照らして、実施態様に付し得る。一般に、次の特許請求の範囲において、使用される用語は、明細書および特許請求の範囲に開示される特異的実施態様に特許請求の範囲を限定すると解釈してはならず、むしろ、全ての可能な実施態様と共に、このような特許請求の範囲が権利を与えられるものの均等物の完全範囲を含むと解釈されるべきである。よって、特許請求の範囲は、開示により限定されない。

Claims (21)

  1. （ｉ）配列番号９１のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）；および
    （ｉｉ）配列番号９３のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）
    を含む、ＨＢｓＡｇに結合する単離抗体。
  2. 抗体がＨＢｓＡｇ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩおよびＪまたはこれらの何れかの組み合わせから選択される遺伝子型のＨＢｓＡｇに結合できる、請求項１の抗体。
  3. 抗体がＢ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)感染を有する哺乳動物におけるＨＢＶ ＤＮＡの血清濃度を低減できる、請求項１または２の抗体。
  4. 抗体がＨＢＶ感染を有する哺乳動物におけるＨＢｓＡｇの血清濃度を低減できる、請求項１～３の何れかの抗体。
  5. 抗体がＨＢＶ感染を有する哺乳動物におけるＨＢｅＡｇの血清濃度を低減できる、請求項１～４の何れかの抗体。
  6. 抗体がＨＢＶ感染を有する哺乳動物におけるＨＢｃｒＡｇの血清濃度を低減できる、請求項１～５の何れかの抗体。
  7. 請求項１～６の何れかの抗体をコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチドであって、所望により、該ヌクレオチド配列が宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、単離ポリヌクレオチド。
  8. （ｉ）配列番号１０３および配列番号１０５の何れかのヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一性を有するヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号１０３のＶＨコード化ヌクレオチド配列、および配列番号１０５のＶＬコード化ヌクレオチド配列を含む、請求項７のポリヌクレオチド。
  9. 請求項７または８のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  10. ベクターがレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを含む、請求項９のベクター。
  11. 請求項７または８の異種ポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
  12. （ｉ）請求項１～６の何れかの抗体；
    （ｉｉ）請求項７または８のポリヌクレオチド；
    （ｉｉｉ）請求項９または１０のベクター；
    （ｉｖ）請求項１１の宿主細胞；または
    （ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）の何れかの組み合わせ
    および薬学的に許容される添加物、希釈剤または担体
    を含む、医薬組成物。
  13. （ａ）
    （ｉ）請求項１～６の何れかの抗体；
    （ｉｉ）請求項７または８のポリヌクレオチド；
    （ｉｉｉ）請求項９または１０のベクター；
    （ｉｖ）請求項１１の宿主細胞；
    （ｖ）請求項１２の医薬組成物；または
    （ｖｉ）（ｉ）～（ｖ）の何れかの組み合わせ
    から選択される成分；および
    （ｂ）Ｂ型肝炎感染および／またはＤ型肝炎感染の予防、処置、減弱および／または診断のために該成分を使用するための指示
    を含む、キット。
  14. （ｉ）所望によりラミブジン、アデフォビル、エンテカビル、テルビブジン、テノフォビルまたはこれらの何れかの組み合わせを含むポリメラーゼ阻害剤；
    （ｉｉ）所望によりＩＦＮベータおよび／またはＩＦＮアルファを含むインターフェロン（ｉｉｉ）所望により抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよび／または抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメントを含むチェックポイント阻害剤；
    （ｉｖ）刺激性免疫チェックポイント分子のアゴニスト；または
    （ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）の何れかの組み合わせ
    をさらに含む、請求項１２の医薬組成物または請求項１３のキット。
  15. 請求項１１の宿主細胞を、抗体の産生に十分な条件下かつ時間培養することを含む、請求項１～６の何れかの抗体を産生する方法。
  16. 対象におけるＢ型肝炎ウイルス感染および／またはＤ型肝炎ウイルス感染を予防、処置、減弱および／または診断することにおける使用のための、（ｉ）請求項１～６の何れかの抗体；（ｉｉ）請求項７または８のポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）請求項９または１０のベクター；（ｉｖ）請求項１１の宿主細胞；および／または（ｖ）請求項１２の医薬組成物。
  17. 請求項１６の使用のための抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、および／または医薬組成物であって、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、および／または医薬組成物は、一緒に投与されるものである、および／または対象は以下：
    （ｖ）所望によりラミブジン、アデフォビル、エンテカビル、テルビブジン、テノフォビルまたはこれらの何れかの組み合わせを含むポリメラーゼ阻害剤；（ｖｉ）所望によりＩＦＮベータおよび／またはＩＦＮアルファを含むインターフェロン；（ｖｉｉ）所望により抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合フラグメント、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントおよび／または抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメントを含むチェックポイント阻害剤；（ｖｉｉｉ）刺激性免疫チェックポイント分子のアゴニスト；または（ｉｘ）（ｖ）～（ｖｉｉｉ）の何れかの組み合わせ
    の１以上を受けている、または受けるものである、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、および／または医薬組成物。
  18. 請求項１６または１７の使用のための抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、および／または医薬組成物であって、Ｂ型肝炎感染が慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染である；および／または対象が肝移植を受けている、対象がＢ型肝炎ウイルスに対して免疫化されていない、対象が新生児である、および／または対象が血液透析を受けるまたは受けている、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、および／または医薬組成物。
  19. Ｂ型肝炎ウイルスをインビトロで検出する方法であって、
    （ｉ）サンプルと請求項１～６の何れかの抗体を接触させ；そして
    （ｉｉ）抗原と抗体を含む複合体を検出する
    ことを含む、方法。
  20. サンプルが対象から単離した血液を含む、請求項１９の方法。
  21. 抗Ｂ型肝炎ウイルスおよび／または抗Ｄ型肝炎ウイルスワクチンに正しい立体構造でエピトープが存在するかしないかを検出する方法であって、
    （ｉ）ワクチンと請求項１～６の何れかの抗体を接触させ；そして
    （ｉｉ）抗原と抗体を含むまたは抗原と抗原結合フラグメントを含むまたは抗原と融合タンパク質を含む複合体が形成されているかを決定する
    ことを含む、方法。
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