BR112021012094A2

BR112021012094A2 - Anticorpos isolados, proteína de fusão, polinucleotídeos isolados, vetor, célula hospedeira, composição farmacêutica, kit, método de produção, usos, métodos de tratamento, prevenção e/ou atenuação, de diagnóstico in vitro e para detectar a presença ou ausência de um epítopo

Info

Publication number: BR112021012094A2
Application number: BR112021012094-7A
Authority: BR
Inventors: Davide Corti
Original assignee: Humabs Biomed Sa
Priority date: 2018-12-19
Filing date: 2019-12-18
Publication date: 2021-08-31
Also published as: JP2022514940A; ZA202104213B; TW202039547A; SG11202106483WA; AU2019403245A1; IL284044A; CA3121004A1; EP3898668A2; PL3898668T3; US20220127336A1; EP4292659A3; CN118108836A; ES2961791T3; DK3898668T3; WO2020132091A9; FI3898668T3; EP4292659A2; CN113544148B; WO2020132091A2; EP3898668B1

Abstract

anticorpos isolados, proteína de fusão, polinucleotídeos isolados, vetor, célula hospedeira, composição farmacêutica, kit, método de produção, usos, métodos de tratamento, prevenção e/ou atenuação, de diagnóstico in vitro e para detectar a presença ou ausência de um epítopo. a presente divulgação refere-se a anticorpos, e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que podem se ligar à região de alça antigênica do antígeno de superfície da hepatite b (hbsag) e podem neutralizar a infecção do vírus da hepatite b (hbv) e do vírus da hepatite delta (hdv). a presente divulgação também se refere a epítopos aos quais os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno se ligam, bem como às proteínas de fusão que compreendem os fragmentos de ligação ao antígeno, ácidos nucleicos que codificam, e células que produzem tais anticorpos e fragmentos de anticorpos. além disso, a presente divulgação refere-se ao uso dos anticorpos e fragmentos de anticorpos da presente divulgação no diagnóstico, profilaxia e tratamento da hepatite b e hepatite d.

Description

“ANTICORPOS ISOLADOS, PROTEÍNA DE FUSÃO, POLINUCLEOTÍDEOS ISOLADOS, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, KIT, MÉTODO DE PRODUÇÃO, USOS, MÉTODOS DE TRATAMENTO, PREVENÇÃO E/OU ATENUAÇÃO, DE DIAGNÓSTICO IN VITRO E PARA DETECTAR A PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE UM EPÍTOPO” DECLARAÇÃO SOBRE A LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[001] A Listagem de Sequências associada com o presente pedido é fornecida no formato de texto, em vez de uma cópia em papel, e é integralmente incorporada ao relatório descritivo por referência. O nome do arquivo de texto que contém a Listagem de Sequência é 930485_402WO_SEQUENCE_LISTING.txt. O arquivo de texto tem 109 KB, foi criado em 16 de dezembro de 2019 e está sendo enviado eletronicamente via EFS-Web.

[002] A presente invenção refere-se ao campo de imunoterapia para o vírus da hepatite B (HBV) e contra o vírus da hepatite delta (HDV) e usos desta. As proteínas de ligação anti-hepatite B descritas na presente invenção, por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, ligam-se a um epítopo localizado na região da alça antigênica do domínio S das proteínas de envelope do HBV (HBsAg). Em certos exemplos de realização, as proteínas de ligação anti-hepatite B podem se ligar a qualquer um ou todos os genótipos de HBsAg conhecidos, bem como variantes de HBsAg e podem neutralizar a infecção pelo HBV. Os ácidos nucleicos que codificam, e células hospedeiras que expressam tais proteínas de ligação também são fornecidos na presente invenção. Além disso, a presente divulgação fornece métodos de uso dos anticorpos e fragmentos de anticorpos aqui descritos no diagnóstico, profilaxia, e tratamento de doenças, assim como em métodos de rastreio/triagem.

[003] A título de anterioridade, o vírus da hepatite B (HBV) consiste em (i) um envelope que contém três proteínas de superfície relacionadas (antígeno de superfície da hepatite B, HBsAg) e lipídios e (ii) um nucleocapsídeo icosaédrico (que envolve o genoma do DNA viral e a DNA polimerase. A cápside do HBV é formada no citosol da célula infectada durante o empacotamento de um complexo de replicação pré-genômico de RNA e adquire a capacidade de surgir durante síntese genômica de DNA viral por meio de transcrição reversa do pré-genoma no lúmen da partícula. As três proteínas do envelope do HBV, S–HBsAg, M–HBsAg e L–HBsAg, formam uma dobra transmembrana complexa no retículo endoplasmático e formam homo- e heterodímeros ligados por dissulfeto. Durante o surgimento de uma membrana intracelular, um domínio linear curto na região pré-S citosólica interage com os sítios de ligação na superfície da cápside. Os vírions são subsequentemente secretados no sangue. Além disso, as proteínas na superfície podem surgir na ausência de cápsides e formar partículas subvirais (SVP’s) as quais também são secretadas em mais de 3-4 log em relação aos vírions. O alto nível de HBsAg pode esgotar a resposta de células T específicas para HBsAg e é proposto como um fator importante para imunotolerância viral em pacientes com hepatite B crônica (Chronic Hepatitis B - CHB) (Chisari F.V., Isogawa M., Wieland S.F., Pathologie Biologie, 2010; 58: 258-66).

[004] O vírus da hepatite B causa infecções hepáticas agudas e crônicas potencialmente fatais. A hepatite B aguda é caracterizada por viremia, com ou sem sintomas, com risco de ocorrência de hepatite fulminante (Liang TJ, Block TM, McMahon BJ, Ghany MG, Urban S, Guo JT, Locarnini S, Zoulim F, Chang KM, Lok AS. Present and future therapies of hepatitis B: From discovery to cure. Hepatology. 3 a agosto de 2015. doi: 10.1002/hep.28025. [Epub antes da impressão]). Apesar de uma vacina eficaz contra a hepatite B estar disponível desde 1982, a OMS informa que 240 milhões de pessoas estão cronicamente infectadas com hepatite B e mais de 780.000 pessoas morrem todos os anos em virtude de complicações da hepatite B.

Aproximadamente um terço dos pacientes com hepatite B crônica (CHB) desenvolve cirrose, insuficiência hepática e carcinoma hepatocelular, representando 600 mil mortes por ano (Liang TJ, Block TM, McMahon BJ, Ghany MG, Urban S, Guo JT, Locarnini S, Zoulim F, Chang KM, Lok AS.

Present and future therapies of hepatitis B: From discovery to cure. Hepatology.

3 de Agosto de 2015. doi: 10.1002/hep.28025 [Epub antes da impressão]).

[005] Para pacientes infectados com HBV, complicações ainda mais graves podem ocorrer quando há coinfecção ou superinfecção com vírus da hepatite delta (HDV). De acordo com a OMS, a hepatite D infecta cerca de 15 milhões de pessoas em todo o mundo. O HDV é considerado um satélite subviral porque ele pode se propagar apenas na presença de HBV. O HDV é um dos menores vírus animais (40 nm), de modo que seu genoma tem apenas 1,6 kb e codifica S- e L- HDAg. Todas as outras proteínas necessárias para a replicação do genoma de HDV, incluindo a RNA polimerase, são fornecidas pela célula hospedeira e o envelope do HDV é fornecido pelo HBV. Quando introduzido em células permissivas, o genoma de RNA do HDV replica e se associa a múltiplas cópias das proteínas codificadas pelo HDV para montar um complexo de ribonucleoproteína (RNP). A RNP é exportada da célula pelas proteínas do envelope do HBV, as quais são capazes de montar vesículas de lipoproteínas que surgem no lúmen de um compartimento pré-Golgi antes de serem secretadas. Além disso, as proteínas do envelope do HBV também fornecem um mecanismo para o direcionamento do HDV para uma célula não infectada, assegurando, deste modo, a disseminação do HDV.

[006] As complicações causadas pelo HDV incluem uma maior probabilidade de experimentar insuficiência hepática em infecções agudas e uma progressão rápida para cirrose hepática, com maior chance de desenvolver câncer de fígado em infecções crônicas. Em associação com o vírus da hepatite B, a hepatite D tem a maior taxa de mortalidade de todas as infecções por hepatite, em torno de 20% (Fattovich G, Giustina G, Christensen E, Pantalena M, Zagni I, Realdi G, Schalm SW. Influence of hepatitis delta virus infection on morbidity and mortality in compensated cirrhosis type B. Gut. Março de 2000; 46(3): 420-6). A única terapia aprovada para infecção crônica pelo HDV é o interferon alfa. No entanto, o tratamento de infecções por HDV com interferon alfa é relativamente ineficiente e não é bem tolerado. O tratamento com interferon alfa resulta em resposta virológica sustentada seis meses após o tratamento em um quarto dos pacientes. Além disso, análogos de nucleosídeos (NAs) foram amplamente testados na hepatite delta, mas parecem ser ineficazes. O tratamento combinado com NAs e interferon também provou ser decepcionante e, portanto, há necessidade de novas opções terapêuticas (Zaigham Abbas, Minaam Abbas Management of hepatitis delta: Need for novel therapeutic Options. World J Gastroenterol; 28 de agosto de 2015; 21(32): 9461-9465). Assim, novas opções terapêuticas são necessárias.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[007] As figuras fornecidas no presente documento se destinam a ilustrar a matéria incluída na presente divulgação em mais detalhes. A Figuras não pretendem, de forma alguma, limitar a divulgação.

[008] A Figura 1 mostra a ligação de HBC34–V 7 e dois anticorpos manipulados da presente divulgação (“HBC34–V34”; “HBC34–V35”) nas concentrações indicadas para HBsAg adw (painel superior) e HBsAg adr (painel inferior), conforme determinado em ensaios ELISA diretos baseados em antígeno. Todos os anticorpos foram produzidos como IgG1 (g1m17, alótipo 1).

[009] As Figuras 2A–2K mostram a ligação de HBC34–V7, HBC34–V34 e HBC34–V35 a todos os genótipos de HBsAg conhecidos ((A)– (J), respectivamente) e ao controle simulado (mock) (K). Foram utilizadas sequências representativas de genótipo representando a alça externa antigênica de HBsAg, como mostrado no Exemplo 5 da Publicação PCT WO 2017/060504. A coloração foi realizada por FACS. As concentrações de anticorpos foram àquelas indicadas no eixo x dos gráficos.

[010] As Figuras 3A–3V mostram a ligação in vitro (3A–3R) e neutralização (3S–3V) de certos anticorpos HBC para HBsAg. As Figuras 3A e 3B mostram a ligação de HBC34–V 7 e HBC34–V35 com regiões Fc tipo selvagens ou variantes para HBsAg adw em um ensaio ELISA direto baseado em antígeno (2 experimentos, os dados do “Experimento 1” é mostrado na Figura 3A, e os dados da “Experimento 2” são mostrados na Figura 3B). As curvas de ligação ao antígeno são mostradas no painel superior de cada Figura. Os valores de EC50 (determinados pelo ajuste das curvas usando o programa Graphpad prism) são mostrados no painel do meio de cada Figura. A ligação em placas não revestidas (controle) é mostrada no painel inferior de cada Figura. As regiões Fc: “HBC34v7” e “HBC34-V35” = Fc tipo selvagem; “HBC34-V35-MLNS” = Fc com M428L/N434S. “HBC34-V35-MLNS-GAALIE” = Fc com M428L/N434S/G236A/A330L/I332E. Foram testados três lotes de HBC34-V35. Foram testados dois lotes de HBC34-V35-MLNS, e dois lotes de HBC34-v35-MLNS-GAALIE. Um lote de HBC34-V7 foi utilizado. As Figuras 3C– 3H mostram a ligação de HBC34–V35, HBC34–V35–MLNS e HBC34–V35– MLNS–GAALIE às células Expi293 que expressam HBsAg de todos os dez genótipos de HBV conhecidos ou controle simulado (mock). A ligação foi determinada por citometria de fluxo. Os dados são expressos como a intensidade média de fluorescência (eixo y) das populações transfectadas, conforme definido pela exclusão do sinal obtido com células falsamente transfectadas. Para cada HbsAg, foram testadas diluições em série dos três artigos teste (12 pontos, 1 em 3, começando com 10 μg/mL). As Figuras 3I–3R mostram a ligação de HBC34–V35, HBC34–V35–MLNS e HBC34–V35–MLNS–

GAALIE às células Expi293 que expressam HBsAg de dezenove (19) variantes de HBsAg ou controle simulado (mock). A ligação foi determinada por citometria de fluxo. Os dados são expressos como a intensidade média de fluorescência das populações transfectadas, conforme definido pela exclusão do sinal obtido com células falsamente transfectadas. Para cada HBsAg, foram testadas diluições em série dos três artigos teste (12 pontos, 1 em 3, começando com 10 μg/mL). A concentração de anticorpos foi conforme mostrado no eixo x. As Figuras 3S e 3U mostram a capacidade neutralizante dos anticorpos HBC indicados contra o HBV genótipo D avaliada pela medição dos níveis de HBsAg (topo) e HbeAg (inferior) no sobrenadante de cultura de células HepG2 expressando NTCP infectadas com HBVD. Os dados representam as médias ± DP de um de dois experimentos independentes. As Figuras 3T e 3V mostram valores de EC50. A média geométrica e o intervalo (entre parênteses) dos valores de EC50 foram determinados a partir de dois experimentos independentes.

[011] A Figura 4 mostra a neutralização (valor de EC50), por HBC34–V35–MLNS–GAALIE, de genótipos de HBV individuais usando um sistema de pseudotipagem de HDV.

[012] As Figuras 5–8 mostram o efeito de HBC34–V35 nos níveis séricos de HBAg em um modelo de camundongo in vivo de infecção por HBV.

Camundongos SCID infectados com o genótipo C de HBV foram transplantados com hepatócitos humanos primários e tratados com HBC34– V35 a 1, 5 ou 15 mg/kg, ou PBS (controle), conforme descrito no Exemplo 5. A Figura 5 mostra a concentração de DNA de HBV no soro antes e depois do tratamento. A Figura 6 mostra a concentração de HBsAg no soro antes e após o tratamento. A Figura 7 mostra a concentração de HBeAg no soro antes e depois do tratamento. A Figura 8 mostra a concentração de HBcrAg no soro antes e depois do tratamento. “Tmt” = Tratamento.

[013] As Figuras 9A–9F mostram ligação de HBC34–V35–H L N S e HBC34–V35–MLNS–GAALIE ao FcRs humano. (A) - (E) Ligação aos FcγRs avaliada por interferometria de biocamada (BLI). Os FcγRs humanos marcados com His (His-tagged) ((A) FcγRIIa alelo H131; (B) FcγRIIa alelo R131; (C) FcγRIIIa alelo F158; (D) FcγRIIIa alelo V158; (E) FcγRIIb) a 2 µg/mL foram capturados em sensores anti-penta–His por 6 minutos. Os sensores carregados com FcγR foram então expostos por 5 minutos a uma solução de tampão cinético (pH 7,1) contendo 2 µg/mL de cada mAb (parte esquerda do gráfico) na presença de 1 µg/mL de Fragmento affiniPure F(ab’)2 de cabra anti- IgG humana, fragmento F(ab’)2 específico (para reticular mAbs humanos através do fragmento Fab), seguido por uma etapa de dissociação no mesmo tampão por 4 minutos adicionais (parte direita do gráfico). Os perfis de associação e dissociação foram medidos em tempo real como mudança no padrão de interferência usando um Octet® RED96 (FortéBio). (F) Ligação in vitro de anticorpos HBC34 para FcRn em diferentes pHs, conforme determinado usando interferometria de biocamada (BLI). O ponto de tempo de 0 segundos representa a mudança do tampão da linha de base para o tampão contendo anticorpos. O ponto de tempo 300 segundos (linha vertical pontilhada) representa a mudança para o tampão em branco no pH correspondente. As curvas indicam perfis de associação e dissociação de mudança nos padrões de interferência.

[014] A Figura 10 mostra ligação de HBC34–V35–MLNS e HBC34–V35–MLNS–GAALIE ao C1q humano, tal como medido por Octeto ®.

Os sensores anti-Fab humano (CH1) foram usados para capturar, através do fragmento Fab, a IgG1 completa de mAbs HBC34v35–MLNS e HBC34–V35– MLNS–GAALIE a 10 µg/mL por 10 minutos. Sensores carregados com IgG foram então expostos por 4 minutos a uma solução de tampão cinético (pH 7,1) contendo 3 µg/mL de C1q humano purificado (parte esquerda do gráfico),

seguido por uma etapa de dissociação no mesmo tampão por mais 4 minutos (parte direita do gráfico). Os perfis de associação e dissociação foram medidos em tempo real como mudança no padrão de interferência usando um Octet ® RED96 (FortéBio).

[015] As Figuras 11A e 11B mostram a ativação in vitro de FcγRIIIa humano usando a ativação ligada ao receptor de um repórter de Luciferase mediado por NFAT em células Jurkat modificadas. A ativação de FcγRIIIa foi testada usando um ensaio de biorreportador validado, disponível comercialmente, no qual HBsAg recombinante (Engerix B) é usado como antígeno alvo. Diluições em série de HBC34–V35–MLNS e HBC34–V35– MLNS–GAALIE e um mAb controle (CTR) foram incubadas com 0,2 μg/mL de HBsAg, a 37ºC durante 25 min. As células efetoras Jurkat (Promega) que expressam o alelo de baixa afinidade FcγRIIIa F158 (A) ou o alelo de alta afinidade FcγRIIIa V158 (B) foram ressuspensas em tampão de ensaio e depois adicionadas às placas de ensaio. Após incubação a 37ºC por 24 horas, o reagente do kit Bio-Glo® Luciferase Assay (Promega) foi adicionado, e a luminescência foi quantificada usando luminômetro (Bio-Tek).

[016] As Figuras 12A e 12B mostram a ativação in vitro de FcγRIIa humano usando a ativação ligada ao receptor de um repórter de Luciferase mediado por NFAT em células Jurkat modificadas. A ativação de FcγRIIa humano foi determinada usando um ensaio de biorreportador validado, disponível comercialmente, no qual HBsAg recombinante (Engerix B) foi usado como antígeno alvo. Diluições em série de HBC34v35–MLNS e HBC34–V35– MLNS–GAALIE e um mAb de controle (Ctr) foram incubadas com 2 µg/mL (A) ou 0,2 µg/mL (B) de HBsAg a 37ºC por 25 min. Células efetoras Jurkat (Promega) que expressam um alelo de alta afinidade H131 de FcγRII foram ressuspensas em tampão de ensaio e depois adicionadas às placas de ensaio.

Após incubação a 37ºC por 23 horas, o reagente do kit Bio-Glo® Luciferase

Assay (Promega) foi adicionado, e a luminescência foi quantificada usando luminômetro (Bio-Tek).

[017] As Figuras 13A–13B mostram a ativação in vitro de FcγRIIb humano usando a ativação ligada ao receptor de um repórter de Luciferase mediado por NFAT em células Jurkat modificadas. A ativação de FcγRIIb humano foi testada usando um ensaio de biorreportador validado, disponível comercialmente, no qual HBsAg recombinante (Engerix B) é usado como antígeno alvo. Diluições em série de HBC34–V35–MLNS e HBC34–V35– MLNS–GAALIE e um mAb controle (Ctr) foram incubadas com 1 μg/mL de HBsAg, a 37ºC durante 15 min. As células efetoras Jurkat (Promega) que expressam FcγRIIb foram ressuspensas em tampão de ensaio e depois adicionadas às placas de ensaio. Após incubação a 37ºC por 20 horas, o reagente do kit Bio-Glo® Luciferase Assay (Promega) foi adicionado, e a luminescência foi quantificada usando luminômetro (Bio-Tek). Na Figura 13B, o mAb de controle da Figura 13A é designado “Ctr mAb1”. Um segundo mAb de controle, designado “Ctr mAb2”, é uma versão de HBC34–V35 incluindo Fc de IgG1 com as seguintes mutações que aumentam a ligação ao FcγRIIb: G237D/P238D/H268D/P271G/A330R (Mimoto et al., Prot Eng Des Sel. 26 (10): 589–598 (2013)).

[018] As Figuras 14A e 14B mostram a morte in vitro de células de hepatoma humano PLC/PRF/5 por células NK primárias humanas na presença de HBC34–V35–MLNS e HBC34–V35–MLNS–GAALIE. (A) A ADCC foi testada usando células NK isoladas recém-coletadas de um doador previamente genotipado para expressar FcγRIIIa (F/V) de afinidade heterozigótica alta (V158) e baixa (F158). Diluições em série de HBC34–V35, HBC34–V35–MLNS, HBC34–V35–MLNS–GAALIE, mAb anti-HBV 17.1.41, e um mAb controle foram adicionadas às linhagens de células de hepatoma PLC/PRF/5 que secretam HBsAg (também conhecidas como células de

Alexander). As células PLC/PRF/5 foram incubadas juntamente com anticorpos à temperatura ambiente durante 10 min. As células NK foram adicionadas às placas de ensaio (proporção de células efetoras para células alvo de 10:1) e incubadas a 37ºC por 4 horas. A morte celular foi determinada medindo a liberação de lactato desidrogenase (LDH). (B) Coloração de células de hepatoma humano PLC/PRF/5 por HBC34–V35 e mAbs 17.1.41 foi avaliada por citometria de fluxo. As células foram extensivamente lavadas, fixadas com formaldeído (4%) ou fixadas e permeabilizadas (saponina 0,5%) antes da coloração com diferentes concentrações de HBC34–V35 e mAbs 17.1.41. A ligação destes mAbs humanos (no caso de HBC34–V35, humano modificado) foi detectada por citometria de fluxo usando um fragmento F(ab’)2 de cabra Anti-IgG Humana conjugado com Alexa Fluor® 647 - AffiniPure, anticorpo específico para o fragmento Fcγ.

[019] As Figuras 15A e 15B mostram a ativação in vitro de células NK primárias humanas na presença de HBC34–V35–MLNS e HBC34– V35–MLNS–GAALIE e HBsAg. A ativação de células NK foi testada utilizando células frescas isoladas a partir de dois doadores previamente genotipados que expressam (A) alta (V158) ou (B) baixa (F158) afinidade a FcγRIIIa homozigótica. Diluições em série mAbs HBC34–V35, HBC34–V35–MLNS– GAALIE, e HBC34v35–LALA foram incubadas com células NK durante 4 horas.

A ativação de células NK foi medida por citometria de fluxo por coloração das células NK com mAb anti-CD107a, como um marcador funcional para a identificação da atividade de células NK: CD107a, também conhecido como LAMP–1, é um marcador para desgranulação de células NK.

[020] A Figura 16 mostra resultados in vitro de estudos de interação medicamentosa entre HBC34–V35–MLNS–GAALIE e inibidor da polimerase/transcriptase reversa Entecavir (ETV).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[021] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente têm o mesmo significado que é comumente compreendido por um técnico hábil no assunto.

[022] Ao longo do presente relatório descritivo, a menos que o contexto exija o contrário, o termo “compreender”, e variações, tais como “compreende” e “compreendendo”, é utilizado como sinônimo de, por exemplo, “possuir”, “ter”, “incluir”, ou termos semelhantes, e será entendido como implicando a inclusão de um membro declarado, proporção, número inteiro (incluindo, quando apropriado, uma fração do mesmo; por exemplo, um décimo e um centésimo de um número inteiro), concentração ou etapa, mas não a exclusão de qualquer outro membro, proporção, número inteiro, concentração ou etapa não declarado. Qualquer faixa de concentração, faixa de porcentagem, faixa de razão ou faixa de número inteiro deve ser entendida de modo a incluir o valor de qualquer número inteiro dentro da faixa citada e, quando apropriado, frações da mesma (como um décimo e um centésimo de um número inteiro), a menos que indicado de outra forma. Além disso, qualquer intervalo de número citado no presente documento relacionado a qualquer característica física, tal como subunidades de polímero, tamanho ou espessura, deve ser entendido como incluindo qualquer número inteiro dentro do intervalo citado, a menos que indicado de outra forma. O termo “consiste em” refere-se a um exemplo de realização do termo “compreende“, em que qualquer outro membro, inteiro ou etapa não citado é excluído. No contexto da presente invenção, o termo “compreender” abrange o termo “consistir em”. O termo “consistindo essencialmente em” não é equivalente a “compreendendo” e refere-se aos materiais ou etapas especificados de uma reivindicação, ou àqueles que não afetam materialmente as características básicas de uma matéria reivindicado.

[023] Além disso, deve ser entendido que os compostos individuais, ou grupos de compostos, derivados de várias combinações das estruturas e substituintes descritos na presente invenção, são descritos pelo presente pedido de patente na mesma extensão como se cada composto ou grupo de compostos fosse individualmente estabelecido. Assim, a seleção de estruturas específicas ou substituintes específicos está dentro do escopo da presente divulgação.

[024] Os termos “a/o” e “um/uma” e referências similares usadas no contexto da descrição da presente divulgação (incluindo no contexto das reivindicações) devem ser interpretados com termos que abrangem tanto o singular como o plural, a menos que indicado de outra forma neste documento ou claramente contradito pelo contexto. O uso da alternativa (por exemplo, “ou”) deve ser entendido como significando uma, ambas ou qualquer combinação das alternativas. A recitação de intervalos de valores na presente invenção é destinada a servir como um método abreviado de se referir individualmente a cada valor separado dentro do intervalo. A menos que de outro modo indicado na presente invenção, cada valor individual é incorporado na presente divulgação como se fosse individualmente recitado no presente.

Nenhuma expressão ou linguagem no presente relatório descritivo deverá ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da matéria divulgada na presente invenção.

[025] A palavra “substancialmente” não exclui “completamente”, por exemplo, uma composição que é “substancialmente isenta” de Y pode ser completamente isenta de Y. Em certos exemplos de realização, “substancialmente” refere-se a uma determinada quantidade, efeito ou atividade de uma composição, método ou uso da presente divulgação como em comparação com aquela de uma composição, método ou uso de referência e descreve uma redução na quantidade, efeito ou atividade de não mais que

50%, tal como não mais que 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, ou 1%, ou menos, da quantidade, efeito, ou atividade da composição de referência, método ou uso.

[026] Conforme usado no presente documento, o termo “cerca de” significa ± 20% da faixa, valor ou estrutura indicada, a menos que indicado de outra forma.

[027] “Opcional” ou “opcionalmente” significa que o elemento, componente, evento ou circunstância subsequentemente descrito pode ou não ocorrer, e que a descrição inclui casos em que o elemento, componente, evento ou circunstância ocorre e instâncias em que eles não ocorrem.

[028] O termo “doença”, tal como utilizado na presente invenção, destina-se a ser geralmente sinônimo e é usado indistintamente com os termos “distúrbio” e “condição” (como na condição médica), em que todos refletem uma condição anormal do corpo humano ou animal ou de uma de suas partes que prejudica o funcionamento normal, geralmente se manifesta por sinais e sintomas distintivos e faz com que o ser humano ou animal afetado tenha uma duração ou qualidade de vida reduzida.

[029] Conforme usado na presente invenção, referência a “tratamento” de um indivíduo ou paciente destina-se a incluir prevenção, profilaxia, atenuação, melhora e terapia. Os benefícios do tratamento incluem melhora do resultado clínico; diminuição ou alívio dos sintomas associados a uma doença; diminuição da ocorrência de sintomas; melhoria da qualidade de vida; mais tempo livre de doença; diminuição da extensão da doença; estabilização do estado da doença; atraso na progressão da doença; remissão; sobrevida; sobrevida prolongada; ou qualquer combinação dos mesmos. Os termos “sujeito” ou “paciente” são usados indistintamente na presente invenção para significar todos os mamíferos, incluindo humanos. Exemplos de assuntos incluem humanos, vacas, cães, gatos, cavalos, cabras, ovelhas, porcos e coelhos. Em um exemplo de realização, o paciente é um humano.

[030] Conforme utilizado na presente invenção, “aminoácido” refere-se a aminoácidos de ocorrência natural e sintéticos, bem como análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que funcionam de uma maneira semelhante aos aminoácidos de ocorrência natural. Os aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético, bem como aqueles aminoácidos que são posteriormente modificados, por exemplo, hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato e O-fosfoserina. Análogos de aminoácidos referem-se a compostos que têm a mesma estrutura química básica de um aminoácido de ocorrência natural, ou seja, um carbono α que está ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino e um grupo R, por exemplo, homosserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfônio.

Esses análogos têm grupos R modificados (por exemplo, norleucina) ou estruturas peptídicas modificadas, mas mantêm a mesma estrutura química básica de um aminoácido de ocorrência natural. Os miméticos de aminoácidos referem-se a compostos químicos que têm uma estrutura diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funcionam de maneira semelhante a um aminoácido de ocorrência natural.

[031] Conforme utilizado na presente invenção, os termos “peptídeo”, e “proteína” e variações destes termos, referem-se a uma molécula que compreende pelo menos dois aminoácidos ligados entre si por uma ligação peptídica (normal ou modificada). Por exemplo, um peptídeo, polipeptídeo ou proteína pode compreender ou ser composto por uma pluralidade de aminoácidos selecionados a partir dos 20 aminoácidos definidos pelo código genético ou um análogo de aminoácido ou mimético, cada um sendo ligado a pelo menos outro peptídeo de ligação. Um peptídeo, polipeptídeo ou proteína pode compreender ou ser composto por L-aminoácidos e/ou D-aminoácidos (ou seus análogos ou miméticos). Os termos “peptídeo”, “polipeptídeo”,

“proteína” incluem “peptidomiméticos”, que são definidos como análogos de peptídeos contendo elementos estruturais não peptídicos, cujos peptídeos são capazes de imitar ou antagonizar a(s) ação(ões) biológica(s) de um peptídeo natural parental. Em certos exemplos de realização, um peptidomimético carece de características, como ligações peptídicas cindíveis enzimaticamente.

[032] Um peptídeo, polipeptídeo ou proteína pode compreender aminoácidos diferentes dos 20 aminoácidos definidos pelo código genético, além destes aminoácidos, ou pode ser composto de aminoácidos diferentes dos 20 aminoácidos definidos pelo código genético. Em certos exemplos de realização, um peptídeo, polipeptídeo ou proteína no contexto da presente divulgação pode compreender aminoácidos que são modificados por processos naturais, tais como processos de maturação pós-tradução, ou por processos químicos (por exemplo, processos sintéticos), que são conhecidos no estado da técnica e incluem aqueles descritos na presente invenção. Essas modificações podem aparecer em qualquer parte do polipeptídeo; por exemplo, no esqueleto do peptídeo; na cadeia de aminoácidos; ou nas extremidades do carboxi– ou amino–terminal. Um peptídeo ou polipeptídeo pode ser ramificado, como após uma ubiquitinação, ou pode ser cíclico, com ou sem ramificação. Os termos “peptídeo”, “polipeptídeo”, e “proteína” incluem também peptídeos, polipeptídeos e proteínas modificados. Por exemplo, modificações de peptídeos, polipeptídeos ou proteínas podem incluir acetilação, acilação, ADP- ribosilação, amidação, fixação covalente de um nucleotídeo ou um derivado de nucleotídeo, fixação covalente de um lipídio ou um derivado lipídico, fixação covalente de um fosfatidil inositol, ligação cruzada covalente ou não covalente, ciclização, formação de ligações de dissulfeto, desmetilação, glicosilação, incluindo peguilação, hidroxilação, iodação, metilação, miristoilação, oxidação, processos proteolíticos, fosforilação, prenilação, racemização, seneloilação, sulfatação, adição de aminoácidos, tal como arginilação ou ubiquitinação. Tais modificações são completamente detalhadas na literatura (Proteins Structure and Molecular Properties (1993) 2ª Ed., T. E. Creighton, Nova Iorque; Posttranslational Covalent Modifications of Proteins (1983) B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nova Iorque; Seifter et al. (1990) Analysis For Protein Modifications and Nonprotein Cofactors, Meth. Enzymol. 182: 626646 e Rattan et al., (1 992) Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci, 663: 48–62). Consequentemente, os termos “peptídeo”, “polipeptídeo” e “proteína” incluem, de preferência, por exemplo, lipopeptídeos, lipoproteínas, glicopeptídeos, glicoproteínas e similares. Variantes de proteínas, peptídeos e polipeptídeos da presente divulgação também são contemplados. Em certos exemplos de realização, as proteínas, peptídeos e polipeptídeos variantes compreendem ou consistem em uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% idêntica a uma sequência de aminoácidos de uma sequência de aminoácidos definida ou de referência, tal como descrita na presente invenção.

[033] Conforme usado na presente invenção, os termos “(poli)peptídeo” e “proteína” podem ser usados de maneira alternada e referem- se a um polímero de resíduos de aminoácidos, tal como uma pluralidade de monômeros de aminoácidos ligados por ligações peptídicas.

[034] As expressões “molécula de ácido nucleico” ou “polinucleotídeo”, ou “ácido nucleico” referem-se a um composto polimérico incluindo nucleotídeos ligados de forma covalente, que pode ser composta de subunidades naturais (por exemplo, Bases de purina ou pirimidina) ou subunidades não naturais (por exemplo., anel de morfolina). As bases de purina incluem adenina, guanina, hipoxantina e xantina, e as bases de pirimidina incluem uracila, timina e citosina. Os monômeros de ácido nucleico podem ser ligados por ligações fosfodiéster ou análogos de tais ligações.

Análogos de ligações fosfodiéster incluem fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato ou semelhantes.

[035] As moléculas de ácido nucleico incluem ácido polirribonucleico (RNA), ácido polidesoxirribonucleico (DNA), que inclui cDNA, DNA genômico e DNA sintético, qualquer um dos quais pode ser de fita simples ou dupla. Se for de fita simples, a molécula de ácido nucleico pode ser a fita codificante ou não codificante (fita antissenso). Os polinucleotídeos (incluindo oligonucleotídeos) e seus fragmentos podem ser gerados, por exemplo, por reação em cadeia da polimerase (PCR) ou por tradução in vitro, ou gerados por qualquer ligação, cisão, ação de endonuclease ou ação de exonuclease.

[036] Uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos inclui todas as sequências de nucleotídeos que codificam a mesma sequência de aminoácidos. Algumas versões das sequências de nucleotídeos também podem incluir íntron(s) na medida em que o(s) íntron(s) podem ser removidos por meio de mecanismos de co- ou pós- transcrição. Sequências de nucleotídeos diferentes podem codificar a mesma sequência de aminoácidos resultante da redundância ou degenerescência do código genético, ou através de processamento, ou ambos.

[037] As moléculas de ácido nucleico variantes da presente divulgação também são contempladas. As moléculas de ácido nucleico variantes são pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% idênticas a uma molécula de ácido nucleico de uma molécula de ácido nucleico definida ou de um polinucleotídeo de referência ou aqui descrito, ou hibridizam com um polinucleotídeo sob condições de hibridização rigorosas (estringentes) de cloreto de sódio 0,015M, citrato de sódio 0,0015M a cerca de 65–68ºC ou cloreto de sódio 0,015M, citrato de sódio 0,0015M e formamida 50% a cerca de 42ºC. As moléculas de ácido nucleico variantes retêm a capacidade de codificar uma proteína de fusão ou um domínio de ligação da mesma tendo uma funcionalidade aqui descrita, tal como ligar especificamente a uma molécula alvo.

[038] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “sequência variante” refere-se a qualquer sequência possuindo um ou mais alterações em comparação com uma sequência de referência, em que uma sequência de referência é qualquer sequência publicada e/ou listada na “Tabela de Sequências e SEQ ID NO” (listagem de sequências), isto é, SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 139. Assim, o termo “sequência variante” inclui formas variantes de sequências nucleotídicas e variantes de sequências de aminoácidos. Em certos exemplos de realização, uma sequência variante no contexto de uma sequência de nucleotídeos, a sequência de referência também é uma sequência de nucleotídeos, ao passo que em certos exemplos de realização para uma sequência variante no contexto de uma sequência de aminoácidos, a sequência de referência também é uma sequência de aminoácidos. Uma “sequência variante”, tal como utilizada na presente invenção, pode ser pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência de referência.

[039] “Porcentagem de identidade de sequência” refere-se a uma relação entre duas ou mais sequências, conforme determinado pela comparação de sequências. Os métodos para determinar a identidade de sequência podem ser concebidos para fornecer a melhor correspondência entre as sequências que estão sendo comparadas. Por exemplo, as sequências podem ser alinhadas para fins de comparação ideal (por exemplo, lacunas (gaps) podem ser introduzidas em um ou ambos de um primeiro e um segundo aminoácido ou sequência de ácido nucleico para o alinhamento ideal).

Além disso, as sequências não homólogas podem ser desconsideradas para fins de comparação. A porcentagem de identidade de sequência referida na presente invenção é calculada ao longo do comprimento da sequência de referência, a menos que indicado de outra forma. Os métodos para determinar a identidade de sequência e similaridade podem ser encontrados em programas de computador disponíveis publicamente. Os alinhamentos de sequência e os cálculos de porcentagem de identidade podem ser realizados usando um programa BLAST (por exemplo, BLAST 2.0, BLASTP, BLASTN ou BLASTX). O algoritmo matemático usado nos programas BLAST pode ser encontrado em Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402, 1997. No contexto da presente divulgação, será compreendido que onde o software de análise de sequência é usado para análise, os resultados de análise são baseados nos “valores padrão” do programa referenciado. “Valores padrão” (pré-definidos) significa qualquer conjunto de valores ou parâmetros que carregam originalmente com o software quando inicializado pela primeira vez.

[040] Uma “sequência variante”, no contexto de uma sequência de ácidos nucleicos (nucleotídeos), tem uma sequência alterada na qual um ou mais dos nucleotídeos na sequência de referência são deletados ou substituídos; ou um ou mais nucleotídeos são inseridos na sequência de nucleotídeos de referência. Os nucleotídeos são aqui citados pela designação padrão de uma letra (A, C, G ou T). Em virtude da degeneração do código genético, uma “sequência variante” de uma sequência de nucleotídeos pode resultar em uma alteração na respectiva sequência de aminoácidos de referência, isto é, em uma “sequência variante” de aminoácidos ou não. Em certos exemplos de realização, As sequências nucleotídicas variantes não resultam em uma sequência de aminoácidos variante (por exemplo, mutação silenciosa). Em alguns exemplos de realização, é contemplada uma sequência variante de nucleotídeos que resulta em uma ou mais mutações “não silenciosas”. Em alguns exemplos de realização, uma sequência nucleotídica variante da presente divulgação codifica uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de referência. As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos, como àqueles aqui divulgadas, referem-se também a versões códon-otimizadas de uma sequência de nucleotídeos ou de aminoácidos de referência ou tipo selvagem. Em qualquer um dos exemplos de realização aqui descritos, um polinucleotídeo da presente divulgação pode ser códon-otimizado para uma célula hospedeira contendo o polinucleotídeo (consulte, por exemplo, Scholten et al., Clin. Immunol. 119: 135–145 (2006). A códon-otimização pode ser realizada usando técnicas e ferramentas conhecidas, por exemplo, usando a ferramenta GenScript® OptimumGene® ou a GeneArt Gene Synthesis Tool (Thermo Fisher Scientific). As sequências códon-otimizadas incluem sequências parcialmente códon-otimizadas (ou seja, pelo menos um códon é otimizado para expressão na célula hospedeira) e aquelas que são totalmente códon-otimizadas.

[041] Uma “sequência variante”, no contexto de uma sequência de aminoácidos, tem uma sequência alterada na qual um ou mais dos aminoácidos são deletados, substituídos ou inseridos em comparação com a sequência de aminoácidos de referência. Como um resultado das alterações, tal sequência variante tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de referência. Por exemplo, por 100 aminoácidos da sequência de referência, uma sequência variante tem não mais do que 10 alterações, isto é,

qualquer combinação de deleções, inserções ou substituições, é “pelo menos 90% idêntica” à sequência de referência.

[042] Uma “substituição conservadora” refere-se a substituições de aminoácidos que não afetam significativamente ou alteram as características de ligação de uma determinada proteína. Geralmente, as substituições conservadoras são aquelas em que um resíduo de aminoácido substituído é substituído por um resíduo de aminoácido possuindo uma cadeia lateral semelhante. As substituições conservadoras incluem uma substituição encontrada em um dos seguintes grupos: Grupo 1: Alanina (Ala ou A), Glicina (Gly ou Gli ou G), Serina (Ser ou S), Treonina (Thr ou Tre ou T); Grupo 2: ácido aspártico (Asp ou D), ácido glutâmico (Glu ou Z); Grupo 3: Asparagina (Asn ou N), Glutamina (Gln ou Q); Grupo 4: Arginina (Arg ou R), Lisina (Lys ou Lis ou K), Histidina (His ou H); Grupo 5: Isoleucina (Ile ou I), Leucina (Leu ou L), Metionina (Met ou M), Valina (Val ou V); e Grupo 6: Fenilalanina (Phe ou Fen ou F), Tirosina (Tyr ou Tir ou Y), Triptofano (Trp ou W). Adicionalmente ou alternativamente, os aminoácidos podem ser agrupados em grupos de substituição conservadora por função semelhante, estrutura química ou composição (por exemplo, ácido, básico, alifático, aromático ou contendo enxofre). Por exemplo, um agrupamento alifático pode incluir, para fins de substituição, Gly, Ala, Val, Leu e Ile. Outros grupos de substituições conservadoras incluem: contendo enxofre: Met e Cisteína (Cis ou C); ácidos: Asp, Glu, Asn e Gln; pequenos resíduos alifáticos, não polares ou ligeiramente polares: Ala, Ser, Tre, Pro e Gli; resíduos polares carregados negativamente e suas amidas: Asp, Asn, Glu e Gln; resíduos polares carregados positivamente: His, Arg e Lis; grandes resíduos alifáticos, não polares: Met, Leu, Ile, Val e Cis; e grandes resíduos aromáticos: Phe, Tir e Trp. Informações adicionais podem ser encontradas em Creighton (1984) Proteins, WH Freeman & Company.

[043] As inserções de sequências de aminoácidos podem incluir:

fusões carbóxi- e/ou amino-terminais que variam de comprimento desde um resíduo, até polipeptídeos que possuem cem ou mais resíduos, bem como inserções intrasequenciais de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos.

Exemplos de inserções terminais incluem a fusão C- ou N-terminal de uma sequência de aminoácidos a uma molécula repórter ou enzima.

[044] Em geral, as alterações nas sequências variantes não anulam ou reduzem significativamente uma funcionalidade desejada da respectiva sequência de referência. Por exemplo, é preferido que uma sequência variante da presente divulgação não reduza significativamente ou anule completamente a funcionalidade de uma sequência de anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para se ligar ao mesmo epítopo e/ou para neutralizar suficientemente a infecção de HBV e HDV em comparação com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno possuindo (ou codificado) pela sequência de referência. A orientação na determinação de quais nucleotídeos e resíduos de aminoácidos, respectivamente, podem ser substituídos, inseridos ou deletados sem abolir uma estrutura ou funcionalidade desejada, pode ser encontrada usando, por exemplo, programas de computador conhecidos.

[045] Conforme usado na presente invenção, uma sequência de ácido nucleico ou uma sequência de aminoácidos “derivada de” um ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo ou proteína designada refere-se à origem do ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Uma sequência de ácido nucleico ou sequência de aminoácidos que é derivada de uma sequência particular pode ter uma sequência de aminoácidos que é essencialmente idêntica àquela sequência ou uma porção da mesma, a partir da qual é derivada, de modo que a expressão “essencialmente idêntica” inclui sequências variantes conforme definido acima. Uma sequência de ácido nucleico ou sequência de aminoácidos que é derivada de um determinado peptídeo ou proteína, pode ser derivada do domínio correspondente no peptídeo ou proteína particular. Nesse contexto, “correspondente” refere-se à posse de uma mesma funcionalidade ou característica de interesse. Por exemplo, um “domínio extracelular” corresponde a outro “domínio extracelular” (de outra proteína), ou um “domínio transmembranar” corresponde a outro “domínio transmembranar” (de outra proteína). As partes “correspondentes” de peptídeos, proteínas e ácidos nucleicos são assim facilmente identificáveis para um especialista na técnica. Da mesma forma, uma sequência “derivada de” outra (por exemplo, “fonte”) sequência pode ser identificada por um perito no assunto como tendo a sua origem na sequência fonte.

[046] Uma sequência de ácidos nucleicos ou uma sequência de aminoácidos derivada de outro ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo ou proteína pode ser idêntica ao ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo ou proteína inicial (da qual ela é derivada). No entanto, uma sequência de ácidos nucleicos ou uma sequência de aminoácidos derivada de outro ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo ou proteína também pode ter uma ou mais mutações em relação ao ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo ou proteína inicial (da qual ela é derivada), em particular uma sequência de ácidos nucleicos ou uma sequência de aminoácidos derivada de outro ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo ou proteína pode ser uma sequência variante funcional, conforme descrito acima, do ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo ou proteína inicial (da qual ela é derivada). Por exemplo, em um peptídeo/proteína, um ou mais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos por outros resíduos de aminoácidos ou podem ocorrer uma ou mais inserções ou deleções de resíduos de aminoácidos.

[047] Conforme usado aqui, o termo “mutação” se refere a uma alteração na sequência de ácidos nucleicos e/ou na sequência de aminoácidos em comparação com uma sequência de referência, por exemplo, uma sequência genômica, tipo selvagem ou de referência correspondente. Uma mutação, por exemplo, em comparação com uma sequência genômica, pode ser, por exemplo, uma mutação somática (de ocorrência natural), uma mutação espontânea, uma mutação induzida, por exemplo, induzida por enzimas, substâncias químicas ou radiação, ou uma mutação obtida por meio de mutagênese sítio dirigida (métodos de biologia molecular para fazer alterações específicas e intencionais na sequência de ácidos nucleicos e/ou na sequência de aminoácidos). Assim, os termos “mutação” ou “mutante” devem ser entendidos como incluindo também a realização física de uma mutação, por exemplo, em uma sequência de ácidos nucleicos ou em uma sequência de aminoácidos. Uma mutação inclui substituição, deleção e inserção de um ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, bem como inversão de vários nucleotídeos ou aminoácidos sucessivos. Para alcançar uma mutação em uma sequência de aminoácidos, de preferência, uma mutação pode ser introduzida na sequência de nucleotídeos que codifica a referida sequência de aminoácidos, de modo a expressar um polipeptídeo mutado (recombinante). Uma mutação pode ser conseguida, por exemplo, através de alteração (por exemplo, por meio de mutagênese sítio–dirigida) de um códon (por exemplo, alternando uma, duas ou três bases de nucleotídeos no referido códon) de uma molécula de ácido nucleico que codifica um aminoácido para resultar em um códon que codifica um aminoácido diferente, ou que codifica um mesmo aminoácido, ou sintetizando uma variante de sequência.

[048] O termo “introduzido” no contexto da inserção de uma molécula de ácido nucleico em uma célula, significa “transfecção”, ou “transformação” ou “transdução” e inclui referência à incorporação de uma molécula de ácido nucleico em uma célula eucariótica ou procariótica em que a molécula de ácido nucleico pode ser incorporada ao genoma de uma célula (por exemplo, cromossomo, plasmídeo, plastídeo ou DNA mitocondrial),

convertida em um replicon autônomo ou pode ser expressa transitoriamente (por exemplo, mRNA transfectado).

[049] O termo “recombinante”, conforme usado na presente invenção (por exemplo, um anticorpo recombinante, uma proteína recombinante, um ácido nucleico recombinante e similares), refere-se a qualquer molécula (anticorpo, proteína, ácido nucleico e similares) que é preparada, expressa, criada ou isolada por meios recombinantes e que não ocorre de forma natural. “Recombinante” pode ser usado como sinônimo de “manipulado”, “modificado”, “projetado” ou “não natural” e pode referir-se a um organismo, microrganismo, célula, molécula de ácido nucleico ou vetor que inclui pelo menos uma alteração genética ou foi modificada pela introdução de uma molécula de ácido nucleico exógena, em que tais alterações ou modificações são introduzidas por engenharia genética (ou seja, intervenção humana). As alterações genéticas incluem, por exemplo, modificações que introduzem moléculas de ácido nucleico que podem ser expressas que codificam proteínas, proteínas de fusão ou enzimas, ou outras adições, deleções, substituições de moléculas de ácido nucleico ou outra perturbação funcional do material genético de uma célula. As modificações adicionais incluem, por exemplo, regiões reguladoras não codificantes nas quais as modificações alteram a expressão de um polinucleotídeo, gene ou operon.

[050] Conforme utilizado na presente invenção, “heterólogo” ou “não endógeno” ou “exógeno” refere-se a qualquer gene, proteína, composto, molécula de ácido nucleico ou atividade que não seja nativa de uma célula hospedeira ou um sujeito, ou qualquer gene, proteína, composto, molécula de ácido nucleico ou atividade nativa para uma célula hospedeira ou um sujeito que foi alterado. Os termos heterólogo, não endógeno ou exógeno incluem genes, proteínas, compostos ou moléculas de ácido nucleico que foram mutados ou alterados de modo que a estrutura, atividade ou ambos sejam diferentes entre os genes, proteínas, compostos ou moléculas de ácido nucleico nativos e alterados. Em certos exemplos de realização, genes, proteínas ou moléculas de ácido nucleico heterólogos, não endógenos ou exógenos podem não ser endógenos a uma célula hospedeira ou um sujeito, mas, em vez disso, ácidos nucleicos que codificam tais genes, proteínas ou moléculas de ácido nucleico podem ter sido adicionados a uma célula hospedeira por conjugação, transformação, transfecção, eletroporação ou técnicas semelhantes, em que a molécula de ácido nucleico adicionada pode se integrar em um genoma de célula hospedeira ou pode existir como material genético extracromossômico (por exemplo, como um plasmídeo ou outro vetor autorreplicante). O termo “homólogo” refere-se a um gene, proteína, composto, molécula de ácido nucleico ou atividade encontrada em ou derivada de uma célula, espécie ou cepa hospedeira. Por exemplo, um polinucleotídeo ou gene heterólogo ou exógeno que codifica um polipeptídeo pode ser homólogo a um polinucleotídeo ou gene nativo e codificar um polipeptídeo ou atividade homóloga, mas o polinucleotídeo ou polipeptídeo pode ter uma alteração na estrutura, sequência, nível de expressão ou qualquer combinação dos mesmos. Um polinucleotídeo ou gene não endógeno, bem como o polipeptídeo codificado ou atividade, pode ser da mesma espécie, de uma espécie diferente ou de uma combinação dos mesmos.

[051] Conforme usado na presente invenção, o termo “endógeno” ou “nativo” refere-se a um polinucleotídeo, gene, proteína, composto, molécula ou atividade que está normalmente presente em uma célula hospedeira ou sujeito.

[052] Conforme usado no presente, as expressões “célula”, “linhagem celular” e “cultura de células” são usadas indistintamente para todas as designações e incluem as progênies destas. Desse modo, as palavras “transformantes” e “células transformadas” incluem a célula primária em questão e as culturas derivadas desta, sem levar em conta o número de transferências. Deve se compreender também que toda progênie pode não ser exatamente idêntica quanto ao conteúdo de DNA, devido a mutações deliberadas ou acidentais. A progênie variante que tem a mesma ou substancialmente a mesma função, fenótipo ou atividade biológica como rastreada na célula originalmente transformada está incluída. Onde designações distintas são pretendidas, isto será evidente a partir do contexto.

[053] A presente divulgação fornece, em parte, anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno e proteínas de fusão que são capazes de neutralizar os vírus da hepatite B e da hepatite delta. Exemplos de realização de anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno, e as proteínas de fusão de acordo com a presente descrição podem ser utilizados em métodos para a prevenção, tratamento, atenuação ou diagnóstico de HBV e HDV. Em exemplos de realização específicos, os anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno e proteínas de fusão aqui descritos ligam-se a dois ou mais genótipos diferentes do antígeno de superfície do vírus da hepatite B e a dois ou mais mutantes infecciosos diferentes do antígeno de superfície do vírus da hepatite B. Em exemplos de realização específicos, os anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno e proteínas de fusão descritos ligam-se a todos os genótipos conhecidos do antígeno de superfície do vírus da hepatite B e a todos os mutantes infecciosos conhecidos do antígeno de superfície do vírus da hepatite B.

ANTICORPOS E FRAGMENTOS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO

[054] Em um primeiro aspecto, a presente invenção provê um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que se liga à região da alça antigênica de HBsAg e é capaz de neutralizar a infecção pelo vírus da hepatite B e vírus da hepatite delta.

[055] Conforme utilizado na presente invenção, e a menos que o contexto indique claramente o contrário, “anticorpo” refere-se a um anticorpo intacto compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfídicas (embora deva ser entendido que anticorpos de cadeias pesadas, que não possuem cadeias leves, sejam abrangidos pelo termo “anticorpo”), bem como qualquer porção de ligação ao antígeno ou fragmento de um anticorpo intacto que tem ou retém a capacidade de se ligar à molécula alvo do antígeno reconhecida pelo anticorpo intacto, tal como, por exemplo, um fragmento scFv, Fab ou F(ab’)2. Assim, o termo “anticorpo” é usado na presente invenção no sentido mais amplo e inclui anticorpos policlonais e monoclonais, incluindo anticorpos intactos e fragmentos de anticorpos funcionais (ligação ao antígeno), incluindo fragmentos de ligação ao antígeno (Fab), fragmentos F(ab’)2, fragmentos Fab', fragmentos Fv, fragmentos de IgG recombinante (rIgG), fragmentos de anticorpos de cadeia única, incluindo fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) e fragmentos de anticorpos de domínio único (por exemplo, sdAb, sdFv, nanocorpo (nanobody)). O termo abrange formas geneticamente modificadas e/ou modificadas de imunoglobulinas, como intracorpos, peptídicorpos, anticorpos quiméricos, anticorpos totalmente humanos, anticorpos humanizados e anticorpos heteroconjugados, anticorpos multiespecíficos, por exemplo, anticorpos biespecíficos, diacorpos (diabodies), triacorpos (triabodies) e tetracorpos (tetrabodies), di-scFv em tandem, tri-scFv em tandem. A menos que indicado de outra forma, o termo “anticorpo” deve ser entendido como abrangendo seus fragmentos de anticorpos funcionais. O termo também abrange anticorpos intactos ou de comprimento total, incluindo anticorpos de qualquer classe ou subclasse dos mesmos, incluindo IgG e suas subclasses, IgM, IgE, IgA e IgD.

[056] Conforme utilizado na presente invenção, os termos “fragmento de ligao ao “antígeno”, “fragmento” e “fragmento de anticorpo” são utilizados indiferentemente para se referir a qualquer fragmento de um anticorpo da divulgação que retém a atividade de ligação ao antígeno do anticorpo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a, um anticorpo de cadeia única, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv ou scFv.

[057] Anticorpos humanos são bem conhecidos no estado da técnica (van Dijk, M. A. e van de Winkel, J. C., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368374). Os anticorpos humanos podem ser produzidos em animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, mediante a imunização, de produzir um repertório completo ou uma seleção de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. A transferência do arranjo gênico da imunoglobulina da linhagem germinal humana em tais camundongos de linhagem germinal mutante irá resultar na produção de anticorpos humanos após o desafio antigênico (vide, por exemplo, Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555;.

Jakobovits, A., et al, Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al, Tear Immunol.7 (1993) 3340). Anticorpos humanos podem também ser produzidos em bibliotecas de apresentação em fago (Hoogenboom, H. R. e Winter, G., Mol. Biol. 227 (1992) 381–388; Marks, J. D. et al., Mol. Biol. 222 (1991) 581– 597). As técnicas de Cole, et al., e Boerner et al., também estão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole, et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985); e Boerner, P., et al, J. Immunol.147 (1991) 86-95). De preferência, anticorpos monoclonais humanos são preparados usando imortalização de células de EBV–B aprimoradas, conforme descrito em Traggiai E., Becker S., Subbarao K., Kolesnikova L., Uematsu Y., Gismondo M.R., Murphy B.R., Rappuoli R., Lanzavecchia A. (2004): An Efficient Method To Make Human Monoclonal Antibodies From Memory B Cells: Potent Neutralization of SARS Coronavirus.

Nat Med. 10(8): 871-5. O termo “anticorpo humano”, conforme usado aqui,

também compreende aqueles anticorpos os quais são modificados, por exemplo, na região variável, para gerar as propriedades de acordo com a invenção, conforme descrito na presente divulgação.

[058] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “região variável” (região variável de uma cadeia leve (VL), região variável de uma cadeia pesada (VH)) indica cada um dos pares de cadeias leves e pesadas, o qual está diretamente envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno.

[059] Os anticorpos de acordo com a presente divulgação podem ser de qualquer isotipo (por exemplo, IgA, IgG, de Ig. H, IgE, IgD, ou seja, compreendendo uma cadeia pesada α, γ, μ, ɛ, ou δ). Dentro do isotipo IgG, por exemplo, os anticorpos podem ser da subclasse IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em exemplos de realização específicos, um anticorpo da presente divulgação é um anticorpo IgG1. Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno aqui fornecidos podem incluir uma cadeia leve κ ou λ. Em certos exemplos de realização, os anticorpos específicos de HBsAg descritos na presente invenção são do isotipo IgG e podem bloquear a liberação de HBV e HBsAg das células infectadas. Consequentemente, em determinados exemplos de realização, um anticorpo de acordo com a presente descrição pode ligar-se intracelularmente e, assim, bloquear a liberação de vírions de HBV e HBsAg.

[060] Os termos “VL” e “VH” referem-se à região de ligação variável de uma cadeia leve e pesada de anticorpo, respectivamente. As regiões de ligação variáveis são constituídas por sub-regiões discretas e bem definidas conhecidas como “regiões determinantes de complementaridade” (CDRs, do inglês complementarity determining regions) e “regiões estruturais” (FRs, do inglês Framework Regions). Os termos “região determinante de complementaridade” e “CDR” são sinônimos de “região hipervariável” ou “HVR” e são conhecidos na técnica por se referirem a sequências de aminoácidos dentro de TCR ou regiões variáveis de anticorpo, que conferem especificidade e/ou afinidade de ligação ao antígeno e são separados pela sequência estrutural (framework). Em geral, existem três CDRs em cada região variável de uma proteína de ligação imunoglobulina; por exemplo, para anticorpos, as regiões VH e VL compreendem seis CDRs HCDR1, HCDR2, HCDR3; LCDR1, LCDR2, LCDR3; também referidas na presente invenção como CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 e CDRL3, respectivamente. Conforme usado na presente invenção, uma “variante” de uma CDR refere-se a uma variante funcional de uma sequência CDR possuindo de 1 a 3 substituições, deleções ou combinações de aminoácidos.

[061] As sequências de imunoglobulina podem ser alinhadas a um esquema de numeração (por exemplo, Kabat, EU, International Immunogenetics Information System (IMGT) e Aho), que pode permitir que posições de resíduos equivalentes sejam anotadas e que diferentes moléculas sejam comparadas usando a ferramenta de software ANARCI (Antigen receptor Numbering And Receptor Classification) (2016, Bioinformatics 15: 298–300).

Será entendido que em certos exemplos de realização, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente divulgação pode compreender a totalidade ou parte de uma cadeia pesada (HC), cadeia leve (LC) ou ambas.

Por exemplo, um monômero de anticorpo IgG intacto de comprimento total inclui tipicamente uma VH, CH1, CH2, CH3, VL e CL. Os componentes Fc são descritos em mais detalhes na presente invenção. Em certos exemplos de realização, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente divulgação compreende uma CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de acordo com qualquer uma das sequências VH e VL presentemente divulgadas, respectivamente.

[062] A Tabela 1 mostra as sequências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada (VH), regiões variáveis da cadeia leve (VL), CDRs, cadeias pesadas (HC) e cadeias leves (LC) de alguns dos anticorpos exemplares de acordo com a presente divulgação.

TABELA 1 Descrição da sequência SEQ Sequência de aminoácidos de anticorpos ID NO: HBC34-V35 VH; 41 ELQLVESGGGWVQPGGSQRLSCA HBC34-V34 VH; ASGRIFRSFYMSWVRQAPGKGLE HBC23-LC40A VH; WVATINQDGSEKLYVDSVKGRFTIS HBC23-LC40S VH; RDNAKNSLFLQMNNLRVEDTAVYY HBC34-LC40A VH; CAAWSGNSGGMDVWGQGTTVSV HBC34-LC40S VH SS HBC34v31_LC40A VH 67 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA HBC34v31_LC40S VH SGRIFRSFYMSWVRQAPGKGLEW HBC34v32_LC40A VH VANINQDGSEKLYVDSVKGRFTISR HBC34v32_LC40S VH DNAKNSLFLQMNNLRVEDTAVYYC HBC34v33_LC40A VH AAWSGNSGGMDVWGQGTTVTVSS HBC34v32_LC40S VH HBC34-V35 VL 89 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGD

KLGNKNVAWFQHKPGQSPVLVIYE VKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTI SGTQAMDEAAYFCQTFDSTTVVFG

GGTRLTVL HBC34-V34 VL 90 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGD

KLGNKNVSWFQHKPGQSPVLVIYE VKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTI SGTQAMDEAAYFCQTFDSTTVVFG

GGTRLTVL HBC34-V23-VL _C40S 110 SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGD

KLGNKNASWYQQKPGQSPVLVIYE VKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTI SGTQAMDEADYYCQTFDSTTVVFG

GGTKLTVL HBC34-V23-VL _C40A 111 SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGD

Descrição da sequência SEQ Sequência de aminoácidos de anticorpos ID NO:

KLGNKNAAWYQQKPGQSPVLVIYE VKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTI SGTQAMDEADYYCQTFDSTTVVFG

GGTKLTVL HBC34-V31-VL _C40S 112 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGD

KLGNKNVSWFQHKPGQSPVLVIYE VKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTI SGTQAMDEAAYFCQTWDSTTVVF

GGGTRLTVL HBC34-V31-VL_C40A 113 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGD

KLGNKNVAWFQHKPGQSPVLVIYE VKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTI SGTQAMDEAAYFCQTWDSTTVVF

GGGTRLTVL HBC34-V32-VL_C40S 114 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGD

KLGNKNVSWFQHKPGQSPVLVIYE VKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTI SGTQAMDEAAYFCQTFDSTTVVFG

GGTRLTVL HBC34-V32-VL _C40A 115 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGD

KLGNKNVAWFQHKPGQSPVLVIYE VKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTI SGTQAMDEAAYFCQTFDSTTVVFG

GGTRLTVL HBC34-V33-VL_C40S 116 SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGD

KLGNKNASWYQQKPGQSPVLVIYE VKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTI SGTQAMDEADYYCQTFDSTTVVFG

GGTKLTVL HBC34-V33-VL _C40A 117 SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGD

Descrição da sequência SEQ Sequência de aminoácidos de anticorpos ID NO:

KLGNKNAAWYQQKPGQSPVLVIYE VKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTI SGTQAMDEADYYCQTFDSTTVVFG

GGTKLTVL HBC34-VL_C40S 118 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGD

KLGNKNVSWFQHKPGQSPVLVIYE VKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTI SGTQAMDEAAYFCQTWDSTTVVF

GGGTRLTVL HBC34-VL_C40A 119 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGD

KLGNKNVAWFQHKPGQSPVLVIYE VKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTI SGTQAMDEAAYFCQTWDSTTVVF

GGGTRLTVL HBC34-V35 CDRH1; 34 GRIFRSFY HBC34-V34 CDRH1; HBC34-V23_LC40S CDRH1; HBC34-V23_LC40A CDRH1; HBC34-V31_LC40S CDRH1; HBC34-V31_LC40A CDRH1; HBC34-V32_LC40S CDRH1; HBC34-V32_LC40A CDRH1; HBC34-V33_LC40S CDRH1;

Descrição da sequência SEQ Sequência de aminoácidos de anticorpos ID NO: HBC34-V33_LC40A CDRH1; HBC34_LC40S CDRH1; HBC34_LC40A CDRH1 HBC34-V35 CDRH2; 35 NQDGSEK HBC34-V34 CDRH2; HBC34-V23_LC40S CDRH2; HBC34-V23_LC40A CDRH2; HBC34-V31_LC40S CDRH2; HBC34-V31_LC40A CDRH2; HBC34-V32_LC40S CDRH2; HBC34-V32_LC40A CDRH2; HBC34-V33_LC40S CDRH2; HBC34-V33_LC40A CDRH2; HBC34_LC40S CDRH2; HBC34_LC40A CDRH2 (CDRH2 curta) HBC34-V35 CDRH2; 66 INQDGSEK HBC34-V34 CDRH2; HBC34-V23_LC40S CDRH2; HBC34-V23_LC40A

Descrição da sequência SEQ Sequência de aminoácidos de anticorpos ID NO: CDRH2; HBC34-V31_LC40S CDRH2; HBC34-V31_LC40A CDRH2; HBC34-V32_LC40S CDRH2; HBC34-V32_LC40A CDRH2; HBC34-V33_LC40S CDRH2; HBC34-V33_LC40A CDRH2; HBC34_LC40S CDRH2; HBC34_LC40A CDRH2 (CDRH2 longa) HBC34-V35 CDRH3; 36 AAWSGNSGGMDV HBC34-V34 CDRH3; HBC34-V23_LC40S CDRH3; HBC34-V23_LC40A CDRH3; HBC34-V31_LC40S CDRH3; HBC34-V31_LC40A CDRH3; HBC34-V32_LC40S CDRH3; HBC34-V32_LC40A CDRH3;

Descrição da sequência SEQ Sequência de aminoácidos de anticorpos ID NO: HBC34-V33_LC40S CDRH3; HBC34-V33_LC40A CDRH3; HBC34_LC40S CDRH3; HBC34_LC40A CDRH3 HBC34-V35 CDRL1; 37 KLGNKN HBC34-V34 CDRL1; HBC34-V23_LC40S CDRL1; HBC34-V23_LC40A CDRL1; HBC34-V31_LC40S CDRL1; HBC34-V31_LC40A CDRL1; HBC34-V32_LC40S CDRL1; HBC34-V32_LC40A CDRL1; HBC34-V33_LC40S CDRL1; HBC34-V33_LC40A CDRL1; HBC34_LC40S CDRL1; HBC34_LC40A CDRL1 HBC34-V35 CDRL2; 38 EVK HBC34-V34 CDRL2; HBC34-V23_LC40S CDRL2;

Descrição da sequência SEQ Sequência de aminoácidos de anticorpos ID NO: HBC34-V23_LC40A CDRL2; HBC34-V31_LC40S CDRL2; HBC34-V31_LC40A CDRL2; HBC34-V32_LC40S CDRL2; HBC34-V32_LC40A CDRL2; HBC34-V33_LC40S CDRL2; HBC34-V33_LC40A CDRL2; HBC34_LC40S CDRL2; HBC34_LC40A CDRL2 (CDRL2 curta) HBC34-V35 CDRL2; 39 VIYEVKYRP HBC34-V34 CDRL2; HBC34-V23_LC40S CDRL2; HBC34-V23_LC40A CDRL2; HBC34-V31_LC40S CDRL2; HBC34-V31_LC40A CDRL2; HBC34-V32_LC40S CDRL2; HBC34-V32_LC40A

Descrição da sequência SEQ Sequência de aminoácidos de anticorpos ID NO: CDRL2; HBC34-V33_LC40S CDRL2; HBC34-V33_LC40A CDRL2; HBC34_LC40S CDRL2; HBC34_LC40A CDRL2 (LCDR2 longa) HBC34-V35 CDRL3; 58 QTFDSTTVV HBC34-V34 CDRL3; HBC34-V23_LC40S CDRL3; HBC34-V23_LC40A CDRL3; HBC34-V32_LC40S CDRL3; HBC34-V32_LC40A CDRL3; HBC34-V33_LC40S CDRL3; HBC34-V33_LC40A CDRL3; HBC34_LC40S CDRL3; 40 QTWDSTTVV HBC34_LC40A CDRL3; HBC34-V31_LC40S CDRL3; HBC34-V31_LC40A CDRL3; HC de HBC34-V35-MLNS- 91 ELQLVESGGGWVQPGGSQRLSCA GAALIE e HBC34-V34- ASGRIFRSFYMSWVRQAPGKGLE

Descrição da sequência SEQ Sequência de aminoácidos de anticorpos ID NO: MLNS-GAALIE (g1M17, 1) WVATINQDGSEKLYVDSVKGRFTIS

RDNAKNSLFLQMNNLRVEDTAVYY CAAWSGNSGGMDVWGQGTTVSV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLAGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEAL

HSHYTQKSLSLSPGK HC de HBC34-V35-MLNS e 92 ELQLVESGGGWVQPGGSQRLSCA HBC34-V34-MLNS ASGRIFRSFYMSWVRQAPGKGLE

WVATINQDGSEKLYVDSVKGRFTIS RDNAKNSLFLQMNNLRVEDTAVYY CAAWSGNSGGMDVWGQGTTVSV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH

Descrição da sequência SEQ Sequência de aminoácidos de anticorpos ID NO:

QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEAL

HSHYTQKSLSLSPGK LC de HBC34-V35 93 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGD

KLGNKNVAWFQHKPGQSPVLVIYE VKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTI SGTQAMDEAAYFCQTFDSTTVVFG GGTRLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSE ELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAW KADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKY AASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVT

HEGSTVEKTVAPTECS LC de HBC34-V34 94 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGD

KLGNKNVSWFQHKPGQSPVLVIYE VKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTI SGTQAMDEAAYFCQTFDSTTVVFG GGTRLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSE ELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAW KADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKY AASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVT

HEGSTVEKTVAPTECS HBC24 VH 95 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAA

SGSTFTKYAMSWVRQAPGKGLEW VASISGSVPGFGIDTYYADSVKGRF TISRDTSKNTLYLQMNSLRAEDTAL YYCAKDVGVIGSYYYYAMDVWGQ GTAVTVSS

Descrição da sequência SEQ Sequência de aminoácidos de anticorpos ID NO: HBC24 VL 96 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRA

SQGLSSSYLAWYQQKPGQAPRLLI YSASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTL TISRLEPEDFAVYYCQQYAYSPRW

TFGQGTKVEIK HBC24 CDRH1 97 GSTFTKYA HBC24 CDRH2 98 ISGSVPGF HBC24 CDRH3 99 LYYCAKDVGVIGSYYYYAMDV HBC24 CDRL1 100 QGLSSSY HBC24 CDRL2 101 SAS HBC24 CDRL3 102 QQYAYSPRWT HBC34-V7, 129 ELQLVESGGGWVQPGGSQRLSCA HBC34-V34, ASGRIFRSFYMSWVRQAPGKGLE HBC34-V35 WVATINQDGSEKLYVDSVKGRFTIS HC (VH-hinge-CH1-CH2- RDNAKNSLFLQMNNLRVEDTAVYY CH3) (tipo selvagem) CAAWSGNSGGMDVWGQGTTVSV

SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGK

Descrição da sequência SEQ Sequência de aminoácidos de anticorpos ID NO: hIgG1 Fc WT 137 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR

TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS

VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK HBC34-V7, 138 ELQLVESGGGWVQPGGSQRLSCA HBC34-V23,

ASGRIFRSFYMSWVRQAPGKGLE HBC34-V34, HBC34-V35, WVATINQDGSEKLYVDSVKGRFTIS HBC34_C40S,

RDNAKNSLFLQMNNLRVEDTAVYY HBC34_C40A, HBC34-V23_C40S, CAAWSGNSGGMDVWGQGTTVSV HBC34-V23_C40A

SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA HC com mutação GAALIE

ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT em hIgG1 Fc

SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLAGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGK

[063] Os fragmentos dos anticorpos descritos na presente invenção podem ser obtidos a partir dos anticorpos por métodos que incluam a digestão com enzimas, como pepsina ou papaína, e/ou por clivagem das ligações de dissulfeto por redução química. Alternativamente, os fragmentos dos anticorpos podem ser obtidos por clonagem e expressão de parte das sequências das cadeias pesadas ou leves. A presente divulgação abrange fragmentos Fv de cadeia única (scFv) derivados das cadeias pesadas e leves de um anticorpo conforme descrito na presente invenção, incluindo, por exemplo, um scFv compreendendo as CDRs de um anticorpo de acordo com a presente descrição, monômeros e dímeros de cadeia pesada ou leve, anticorpos de cadeia pesada de domínio único, anticorpos de cadeia leve de domínio único, bem como anticorpos de cadeia única, em que os domínios variáveis de cadeia pesada e leve são unidos por um ligante peptídico.

[064] Em certos exemplos de realização, um anticorpo de acordo com a presente divulgação, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende um anticorpo purificado, um anticorpo monoclonal, um anticorpo de cadeia única, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv ou scFv.

[065] Os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno da presente divulgação podem, nos exemplos de realização, ser multiespecíficos (por exemplo, biespecífico, triespecífico, tetraespecífico ou semelhantes) e podem ser fornecidos em qualquer formato multiespecífico, conforme divulgado no presente documento. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente divulgação é um anticorpo multiespecífico, como um anticorpo biespecífico ou triespecífico. Os formatos para anticorpos biespecíficos são divulgados em, por exemplo, Spiess et al., Mol. Immunol. 67(2):95 (2015), e em Brinkmann e Kontermann, mAbs 9(2):182- 212 (2017), cujos formatos biespecíficos e métodos de fazer os mesmos são incorporados ao presente por referência e incluem, por exemplo, e incluem, por exemplo, Bispecific T cell Engagers (BiTEs), DARTs, construções Knobs-Into- Holes (KIH), scFv-CH3-KIH, anticorpos de cadeia leve comum KIH, TandAbs,

corpos triplos (Triple Bodies), minicorpos TriBi (TriBi Minibodies), Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2-scFv2, HCabs tetravalentes, intracorpos (Intrabodies), CrossMabs, Fabs de ação dupla (Dual Action Fabs, DAFs) (doi em um or quatro em um), DutaMabs, DT-IgG, pares de carga, Fab com troca de braço, SEEDbodies, Triomabs, montagens LUZ-Y, Fcabs, κλ-bodies, Fabs ortogonais, DVD-IgGs, IgG(H)-scFv, scFv-(H)IgG, IgG(L)-scFv, scFv-(L)IgG, IgG(L,H)-Fv, IgG(H)-V, V(H)-IgG, IgG(L)-V, V(L)-IgG, KIH IgG-scFab, 2scFv- IgG, IgG-2scFv, scFv4-Ig, Zybody, e DVI-IgG (quatro em um). Um anticorpo biespecífico ou multiespecífico pode compreender um domínio de ligação específico de HBV e/ou HDV da presente divulgação em combinação com outro domínio de ligação específico de HBV e/ou HDV da presente divulgação, ou em combinação com um domínio de ligação diferente que se liga especificamente ao HBV e/ou HDV (por exemplo, no mesmo epítopo ou em um epítopo diferente), ou com um domínio de ligação que se liga especificamente a um antígeno diferente.

[066] Os fragmentos de anticorpos da presente divulgação podem transmitir interações monovalentes ou multivalentes e podem estar contidos em uma variedade de estruturas, conforme descrito acima. Por exemplo, as moléculas scFv podem ser sintetizadas para criar um “triacorpo” (triabody) trivalente ou um “tetracorpo” (tetrabody) tetravalente. As moléculas de scFv podem incluir um domínio da região Fc resultando em minicorpos (minibody) bivalentes. Além disso, as sequências da divulgação podem ser um componente de moléculas multiespecíficas nas quais as sequências da divulgação têm como alvo os epítopos da divulgação e outras regiões da molécula se ligam a outros alvos. Moléculas exemplares incluem, mas não estão limitadas a, Fab2 biespecífico, Fab3 triespecífico, scFv biespecífico e diacorpos (Holliger e Hudson, 2005, Nature Biotechnology 9: 1126–1136).

[067] Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, tais como aqueles descritos na presente invenção, incluindo, mas não se limitando a scFv, podem, em certos exemplos de realização, ser compreendidos em uma proteína de fusão que é capaz de se ligar especificamente a um antígeno, conforme descrito na presente invenção.

Conforme utilizado na presente invenção, “proteína de fusão” refere-se a uma proteína que, em uma única cadeia, tem pelo menos dois domínios ou motivos distintos, em que os domínios ou motivos não são encontrados naturalmente juntos, ou em um determinado arranjo, em uma proteína. Um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão pode ser construído usando PCR, manipulado de forma recombinante ou de modo similar, ou tais proteínas de fusão podem ser sintetizadas.

[068] Em alguns exemplos de realização, uma proteína de fusão é capaz de se expressar em uma superfície de uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula T, célula NK ou célula NK-T. Em certos exemplos de realização, uma proteína de fusão compreende (i) um componente extracelular que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, um scFv); (ii) um componente transmembranar (por exemplo, um domínio transmembranar de CD4, CD8, CD27, CD28 ou uma variante funcional ou porção do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos); e (iii) um componente intracelular compreendendo um domínio de sinalização de uma proteína coestimuladora, ou uma variante funcional ou porção desta (por exemplo, um domínio de sinalização de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), CD2, CD5, ICAM-1 (CD54), LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), GITR, CD30, CD40, BAFF-R, HVEM, LIGHT, MKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, um ligante que se liga especificamente ao CD83, ou uma variante funcional do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos) e/ou um domínio efetor (por exemplo, de CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD25, CD79A, CD79B, CARD11, DAP10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT,

LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, Wnt, ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTα, TCRα, TCRβ, TRIM, Zap70, PTCH2, ou qualquer combinação dos mesmos).

[069] Em alguns exemplos de realização, uma proteína de fusão compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma molécula de receptor de antígeno quimérico (CAR), que pode ser expressa em uma superfície celular de uma célula hospedeira, como uma célula T, uma célula NK ou uma célula NK-T para uso na imunoterapia celular.

Moléculas CAR e princípios de design das mesmas são descritos, por exemplo, em: Sadelain et al., Cancer Discov., 3 (4): 388 (2013); Harris e Kranz, Trends Pharmacol. Sci., 37 (3): 220 (2016); Stone et al., Cancer Immunol.

Immunother., 63 (11): 1163 (2014); Xu et al., 2018 Oncotarget 9: 13991; Androulla et al., 2018 Curr. Pharm. Biotechnol. Volume 19 (abril de 2018); Wu et al., 2016 Expert Opin. Biol. Ther. 16: 1469; Ren et al., 2017 Protein Cell 8: 634; tais moléculas CAR, desings de CARs, e princípios de desings de CARs são integralmente incorporados ao presente por referência.

[070] Ao longo da presente divulgação, anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, e as proteínas de fusão podem, individualmente ou coletivamente, (por exemplo, em qualquer combinação) ser referidos como “proteínas de ligação”.

[071] As proteínas de ligação de acordo com a presente divulgação podem ser fornecidas na forma purificada. Por exemplo, um anticorpo pode estar presente em uma composição que é substancialmente livre de outros polipeptídeos, por exemplo, onde menos de 90% (em peso), geralmente menos de 60% e mais geralmente menos de 50% da composição é constituída de outros polipeptídeos.

[072] As proteínas de ligação de acordo com a presente invenção podem ser imunogênicas em hospedeiros humanos e/ou não humanos (ou heterólogos), por exemplo, em camundongos. Por exemplo, um anticorpo pode ter um idiotipo que é imunogênico em hospedeiros não humanos, mas não em um hospedeiro humano. Os anticorpos da invenção para uso humano incluem aqueles que não podem ser facilmente isolados a partir de hospedeiros tais como camundongos, cabras, coelhos, ratos, mamíferos não primatas, etc., e não podem ser, em geral, obtidos por meio de humanização ou a partir de xenocamundongos. Também são contempladas no presente documento formas variantes dos anticorpos divulgados, que são projetadas de modo a reduzir a imunogenicidade conhecida ou potencial e/ou outras desvantagens potenciais, ou para conferir uma estrutura desejada e/ou funcionalidade do anticorpo em um animal não humano, tal como um rato (por exemplo, um anticorpo “murinizado” onde um ou mais resíduos de aminoácidos humanos, sequência ou motivo é(são) substituído(s) por um resíduo, sequência ou motivo que reduz ou anula a imunogenicidade ou outra desvantagem, ou tem uma estrutura desejada e/ou função, em um camundongo; por exemplo, para estudos em modelos usando um camundongo).

[073] As sequências de aminoácidos de anticorpos murinizados exemplares da presente divulgação são fornecidas na Tabela 2.

TABELA 2 Descrição da sequência de SEQ ID Sequência de aminoácidos anticorpo NO. murinizada HBC34-V7-mu 122 ELQLVESGGGWVQPGGSQRLSCAASGRIF (IgG2a) HC RSFYMSWVRQAPGKGLEWVATINQDGSEK

LYVDSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNNLRV EDTAVYYCAAWSGNSGGMDVWGQGTTVS VSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGC LVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVL

Descrição da sequência de SEQ ID Sequência de aminoácidos anticorpo NO. murinizada

QSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPA SSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLG GPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSE DDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYN STLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKD LPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEM TKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTE LNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWV

ERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK HBC34-V7-mu 123 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGDKLGNK (IgG2a) LC NVCWFQHKPGQSPVLVIYEVKYRPSGIPER

FSGSNSGNTATLTISGTQAMDEAAYFCQTF DSTTVVFGGGTRLTVLGQPKSSPSVTLFPP SSEELETNKATLVCTITDFYPGVVTVDWKVD GTPVTQGMETTQPSKQSNNKYMASSYLTLT ARAWERHSSYSCQVTHEGHTVEKSLSRAD

CS HBC34-V35-mu 124 ELQLVESGGGWVQPGGSQRLSCAASGRIF (IgG2a) HC RSFYMSWVRQAPGKGLEWVATINQDGSEK

LYVDSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNNLRV EDTAVYYCAAWSGNSGGMDVWGQGTTVS VSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGC LVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVL QSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPA SSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLG GPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSE DDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYN STLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKD

LPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEM TKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTE LNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWV

ERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK HBC34-V35-mu 125 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGDKLGNK (IgG2a) LC NVAWFQHKPGQSPVLVIYEVKYRPSGIPER

CS HBC24-mu 126 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFT (IgG2a) HC KYAMSWVRQAPGKGLEWVASISGSVPGFGI

DTYYADSVKGRFTISRDTSKNTLYLQMNSLR AEDTALYYCAKDVGVIGSYYYYAMDVWGQ GTAVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSS VTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHT FPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCN VAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPA PNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVV DVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHRE DYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVN NKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPE EEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNG KTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKK NWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRT PGK

Descrição da sequência de SEQ ID Sequência de aminoácidos anticorpo NO. murinizada HBC24-mu 127 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQGLSS (IgG2a) LC SYLAWYQQKPGQAPRLLIYSASTRATGIPDR

FSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYA YSPRWTFGQGTKVEIKADAAPTVSIFPPSSE QLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGS ERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTK DEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNE C

[074] Conforme usado na presente invenção, um “anticorpo neutralizante” (ou fragmento de ligação ao antígeno ou proteína de fusão) é aquele que pode neutralizar, isto é, prevenir, inibir, reduzir, impedir ou interferir, a capacidade de um patógeno de iniciar e/ou perpetuar uma infecção em um hospedeiro (por exemplo, organismo hospedeiro ou célula hospedeira). Os termos “anticorpo neutralizante” e “um anticorpo que neutraliza” ou “anticorpos que neutralizam” são usados na presente invenção de forma alternada. Estes anticorpos podem ser usados individualmente, ou em combinação (por exemplo, dois ou mais dos anticorpos divulgados na presente invenção em uma combinação, ou um anticorpo da presente divulgação em combinação com outro agente, que pode ou não ser um agente de anticorpo, incluindo um anticorpo que é capaz de neutralizar uma infecção por HBV B e/ou D), como agentes profiláticos ou terapêuticos mediante formulação apropriada, em associação com vacinação ativa, como uma ferramenta de diagnóstico ou como uma ferramenta de produção conforme descrito na presente invenção.

[075] Conforme utilizado na presente invenção, “liga-se especificamente” ou “específico para” refere-se a uma associação ou união de uma proteína de ligação (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) ou um domínio de ligação a uma molécula alvo com uma afinidade ou Ka (ou seja, uma constante de equilíbrio de associação de uma interação de ligação particular com unidades de 1/M) igual ou superior a 105 M-1 (que é igual à razão entre a taxa de associação [K on] e a taxa de dissociação [Koff] para esta reação de associação), embora não se associe significativamente ou se una a quaisquer outras moléculas ou componentes em uma amostra. As proteínas de ligação ou domínios de ligação podem ser classificados como proteínas de ligação ou domínios de ligação de “alta afinidade” ou como proteínas de ligação ou domínios de ligação de “baixa afinidade”. Proteínas de ligação ou domínios de ligação de “alta afinidade” referem-se às proteínas de ligação ou domínios de ligação com uma K a de pelo menos 107 M-1, pelo menos 108 M-1, pelo menos 109 M-1, pelo menos 1010 M-1, pelo menos 1011 M-1, pelo menos 1012 M-1, ou pelo menos 1013 M-1. As proteínas de ligação de “baixa afinidade” ou domínios de ligação referem-se às proteínas de ligação ou domínios de ligação com uma Ka de até 10 7 M-1, até 106 M-1 ou até 105 M-1. Alternativamente, a afinidade pode ser definida como uma constante de equilíbrio de dissociação (Kd) de uma interação de ligação particular com unidades em M (por exemplo, 10-5 M a 10-13 M). Os termos “ligação” e “ligação específica” e referências semelhantes não abrangem a adesão não específica.

[076] A ligação de uma proteína de ligação pode ser determinada ou avaliada usando um ensaio apropriado, como, por exemplo, métodos de ressonância plasmônica de superfície (SPR), por exemplo, um sistema Biacore®; ensaios de exclusão cinética como KinExA®; e interferometria de biocamada (por exemplo, usando a plataforma ForteBio® Octet); calorimetria de titulação isotérmica (ITC), ou semelhante, um ensaio ELISA de ligação ao antígeno (por exemplo, direto ou indireto) com imagem por, por exemplo,

densidade óptica a 450 nm, ou por citometria de fluxo, ou semelhantes.

[077] Em certos exemplos de realização, as proteínas de ligação de acordo com a presente divulgação podem se ligar à região de alça antigênica de HBsAg. O envelope do vírus da hepatite B geralmente contém três “proteínas do envelope do HBV” (também conhecidas como “HBsAg”, “antígeno de superfície da hepatite B”): proteína S (para “pequena” (do inglês small), também conhecida como S–HBsAg), proteína M (para “média”, também conhecida como M–HBsAg) e proteína L (para “grande” (do inglês large), também conhecida como L–HBsAg). S–HBsAg, M–HBsAg e L–HBsAg compartilham a mesma extremidade C-terminal (também referida como “domínio S”, 226 aminoácidos), que corresponde à proteína S (S–HBsAg) e que é crucial para a montagem e infectividade do vírus. S–HBsAg, M–HBsAg e L–HBsAg são sintetizados no retículo endoplasmático (RE), montados e secretados como partículas através do aparelho de Golgi. O domínio S compreende quatro domínios transmembranares (TM) previstos, de modo que tanto o N-terminal como o C-terminal do domínio S são expostos ao lúmen. Os domínios transmembranares TM1 e TM2 são ambos considerados necessários para a integração cotraducional da proteína na membrana ER e os domínios transmembranares TM3 e TM4 estão localizados no terço C-terminal do domínio S. A “região de alça antigênica” do HBsAg está localizada entre os domínios transmembranaresTM3 eTM4 previstas do domínio S do HBsAg, em que a região de alça antigênica compreende aminoácidos 101–172 do domínio S, que contém 226 aminoácidos no total (Salisse J. e Sureau C., 2009, Journal of Virology 83: 9321–9328). Um determinante da infecciosidade reside na região da alça antigênica das proteínas do envelope do HBV. Em particular, os resíduos entre 119 e 125 do HBsAg contêm um motivo CXXC, que é considerado importante para a infecciosidade de HBV e HDV (Jaoude GA, Sureau C, Journal of Virology, 2005; 79: 10460–6).

[078] Quando as posições na sequência de aminoácidos do domínio S do HbsAg são referidas na presente invenção, tais posições são feitas com referência à sequência de aminoácidos definida adiante na SEQ ID NO: 3 (mostrada abaixo) ou com referência às variantes da sequência natural ou artificial das mesmas:

MENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGT TVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPTCPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDY QGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTTAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIP SSWAFGKFLWEWASARFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGP

SLYSILSPFLPLLPIFFCLWVYI (SEQ ID NO: 3; os aminoácidos 101–172 são mostrados sublinhados).

[079] Por exemplo, a expressão “aminoácidos 101–172 do domínio S” refere-se aos resíduos de aminoácidos das posições 101–172 do polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 3. No entanto, uma pessoa perita no assunto compreende que as mutações ou variações (incluindo, mas não se limitando a, substituição, deleção e/ou adição, por exemplo, HBsAg de um genótipo diferente ou um mutante de HBsAg diferente, conforme descrito na presente invenção) podem ocorrer naturalmente na sequência de aminoácidos do domínio S de HBsAg ou ser introduzido artificialmente na sequência de aminoácidos do domínio S de HBsAg sem afetar suas propriedades biológicas.

Portanto, conforme utilizado no presente, o termo “domínio S de HBsAg” abrange todos esses polipeptídeos incluindo, por exemplo, o polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 3 e seus mutantes naturais ou artificiais. Além disso, quando fragmentos de sequência do domínio S de HBsAg são descritos neste documento (por exemplo, aminoácidos 101–172 ou aminoácidos 120–130 do domínio S de HBsAg), eles incluem não apenas os fragmentos de sequência correspondentes de SEQ ID NO: 3, mas também os fragmentos de sequência correspondentes de seus mutantes naturais ou artificiais. Por exemplo, a frase

“resíduos de aminoácidos das posições 101–172 do domínio S de HBsAg” abrange resíduos de aminoácidos das posições 101–172 da SEQ ID NO: 3 e os fragmentos correspondentes de seus mutantes (mutantes naturais ou artificiais). Conforme utilizado na presente invenção, as frases “fragmentos de sequência correspondentes” e “fragmentos correspondentes” referem-se a fragmentos que estão localizados em posições iguais de sequências quando as sequências são submetidas a um alinhamento otimizado, nomeadamente, as sequências são alinhadas para obter uma percentagem mais elevada de identidade.

[080] A proteína M (M–HBsAg) corresponde à proteína S estendida por um domínio N–terminal de 55 aminoácidos denominado “pré– S2”. A proteína L (L–HBsAg) corresponde à proteína M estendida por um domínio N-terminal de 108 aminoácidos denominado “pré-S1” (genótipo D). Os domínios pré–S1 e pré–S2 da proteína L podem estar presente na face interna de partículas virais (no lado citoplasmático do ER), exercendo um papel crucial na montagem de vírus, ou sobre a face externa (no lado luminal do ER), disponível para a interação com células alvo e necessária para infectividade viral. Além disso, as proteínas na superfície de HBV (HBsAgs) são incorporadas não apenas em envelopes de vírions, mas também surgem espontaneamente a partir de membranas do compartimento intermediário do ER–Golgi para formar “partículas subvirais” (SVPs) vazias, as quais são liberadas a partir da célula através de secreção.

[081] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou proteína de fusão liga-se à região da alça antigênica de HBsAg, e é capaz de se ligar às três proteínas S–HBsAg, M– HBsAg e L–HBsAg.

[082] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, ou proteína de fusão, neutraliza a infecção pelo vírus da hepatite B e o vírus da hepatite delta. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, reduz a infectividade viral do vírus da hepatite B e do vírus da hepatite delta.

[083] Para estudar e quantificar a infectividade do vírus (ou “neutralização”) em laboratório, vários ensaios de “neutralização” padrão podem ser utilizados. Para um ensaio de neutralização, vírus animais são, tipicamente, propagados em células e/ou linhagens de células. Pode ser utilizado um ensaio de neutralização no qual as células cultivadas são incubadas com uma quantidade fixa de HBV ou HDV na presença (ou ausência) do anticorpo (ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou proteína de fusão) a ser testado. Nesse ensaio, os níveis de antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg) ou antígeno e da hepatite B (HBeAg) secretados no sobrenadante da cultura de células podem ser usados e/ou a coloração com HBcAg pode ser avaliada para fornecer uma leitura. Para HDV, por exemplo, a coloração por imunofluorescência de antígeno delta pode ser avaliada.

[084] Em um exemplo de realização preferido de um ensaio de neutralização de HBV, células cultivadas, por exemplo, células HepaRG, em particular células HepaRG diferenciadas, são incubadas com uma quantidade fixa de HBV na presença ou ausência do anticorpo a ser testado. Em tal exemplo de realização, a incubação pode ser realizada, por exemplo, durante 16 horas a 37ºC. Essa incubação pode ser realizada em um meio (por exemplo, suplementado com 4% de PEG 8000). Após a incubação, as células podem ser lavadas e posteriormente cultivadas. Para medir a infecciosidade do vírus, os níveis de antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg) e antígeno e da hepatite B (HBeAg) secretados no sobrenadante da cultura, por exemplo, do dia 7 ao dia 11 pós-infecção, podem ser determinados por ensaio imunossorvente ligado à enzima (EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay - ELISA). Além disso, a coloração com HBcAg pode ser avaliada em um ensaio de imunofluorescência. Em um exemplo de realização de um ensaio de neutralização de HDV, essencialmente o mesmo ensaio para HBV pode ser usado, com a diferença de que soros de portadores de HDV podem ser usados como inóculo de infecção de HDV em células HepaRg diferenciadas (em vez de HBV). Para a detecção, a coloração de imunofluorescência com antígeno delta pode ser usada como uma leitura.

[085] Exemplos de realização das proteínas de ligação da presente divulgação têm elevada potência neutralizante. Em certos exemplos de realização, a concentração de um anticorpo conforme descrito na presente invenção necessária para 50% de neutralização do vírus da hepatite B (HBV) e vírus da hepatite delta (HDV), é, por exemplo, cerca de 10 μg/mL ou menos.

Em outros exemplos de realização, a concentração de uma proteína de ligação necessária para 50% de neutralização de HBV e HDV é de cerca de 5 µg/mL.

Em outros exemplos de realização, a concentração de uma proteína de ligação, conforme descrito no presente documento, necessária para 50% de neutralização de HBV e HDV é de cerca de 1 µg/mL. Em outros exemplos de realização, a concentração de uma proteína de ligação necessária para 50% de neutralização de HBV e HDV é de cerca de 750 ng/mL. Ainda em outros exemplos de realização, a concentração de uma proteína de ligação, conforme descrito neste documento, necessária para 50% de neutralização de HBV e HDV é de 500 ng/mL ou menos. Em tais exemplos de realização, a concentração de uma proteína de ligação, conforme descrito neste documento, necessária para 50% de neutralização de HBV e HDV pode ser selecionada a partir de 450 ng/mL ou menos, 400 ng/mL ou menos, 350 ng/mL ou menos, 300 ng/mL ou menos, 250 ng/mL ou menos, 200 ng/mL ou menos, 175 ng/mL ou menos, 150 ng/mL ou menos, 125 ng/mL ou menos, 100 ng/mL ou menos,

90 ng/mL ou menos, 80 ng/mL ou menos, 70 ng/mL ou menos, 60 ng/mL ou menos ou 50 ng/mL ou menos.

[086] Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno de acordo com a presente divulgação, que podem neutralizar tanto HBV quanto HDV, são úteis na prevenção e tratamento da hepatite B e hepatite D. A infecção com HDV tipicamente ocorre simultaneamente com ou subsequente à infecção por HBV (por exemplo, a inoculação com HDV na ausência de HBV não causa hepatite D uma vez que o HDV requer o suporte do HBV para a sua própria replicação) e a hepatite D é tipicamente observida em portadores HBV crônicos.

[087] Exemplos de realização das proteínas de ligação divulgadas promovem depuração de HBsAg e HBV. Em exemplos de realização específicos, as proteínas de ligação promovem a remoção de HBV e partículas subvirais de vírus da hepatite B (SVPs). A depuração de HBsAg ou de partículas subvirais pode ser avaliada medindo o nível de HBsAg, por exemplo, em uma amostra de sangue, por exemplo, de um paciente com hepatite B. Da mesma forma, a depuração do HBV pode ser avaliada medindo o nível de HBV, por exemplo, em uma amostra de sangue, por exemplo, de um paciente com hepatite B.

[088] No soro de pacientes infectados com HBV, além de partículas infecciosas (HBV), normalmente há um excesso (tipicamente 1000 a 100000 vezes) de partículas subvirais (SVPs) vazias compostas unicamente de proteínas do envelope de HBV (HBsAg) na forma de esferas relativamente menores e filamentos de comprimento variável. Foi mostrado que as partículas subvirais aumentam fortemente a expressão de genes virais e a replicação intracelular de HBV (Bruns M. et al. 1998, J. Virol. 72 (2): 14621468). Isto também é importante no contexto da infectividade de soros que contém o HBV, uma vez que a infectividade depende não apenas do número de vírus, mas também do número de SVP's (Bruns M. et al. 1998, J. Virol. 72 (2): 1462– 1468). Além disso, um excesso de partículas subvirais pode servir como um chamariz através de absorção de anticorpos neutralizantes e, portanto, retardar a deleção da infecção. Tipicamente, a obtenção de perda do antígeno na superfície da hepatite B (HBsAg) é, assim, considerada como sendo um parâmetro ideal de tratamento e o resultado mais próximo para curar a hepatite B crônica (CHB).

[089] Os exemplos de realização de proteínas de ligação da presente divulgação podem promover a depuração de HbsAg. Em certos exemplos de realização, as proteínas de ligação podem promover a deleção de partículas subvirais de vírus da hepatite B. Em alguns exemplos de realização, as proteínas de ligação podem ser utilizadas para tratar a hepatite B crônica.

[090] Em qualquer um dos exemplos de realização divulgados na presente invenção, uma proteína de ligação da presente divulgação é capaz de se ligar a um HBsAg de um genótipo selecionado a partir dos genótipos A, B, C, D, E, F, G, H, I e J de HBsAg, ou qualquer combinação dos mesmos.

[091] Em certos exemplos de realização, ligação das proteínas da presente divulgação são capazes de ligar a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 AgHBs de genótipos A, B, C, D, E, F, G, H, I e J. Exemplos de diferentes genótipos de HBsAg incluem os seguintes: número de acesso do GenBank número de acesso do GenBank J02203 (HBV-D, ayw3); número de acesso do GenBank FJ899792.1 (HBV-D, adw2); número de acesso do GenBank AM282986 (HBV-A); número de acesso do GenBank D23678 (HBV-B1 Japão); número de acesso do GenBank AB117758 (HBV-C1 Cambodia); número de acesso do GenBank AB205192 (HBV-E Gana); número de acesso do GenBank X69798 (HBV-F4 Brasil); número de acesso do GenBank AF160501 (HBV-G EUA); número de acesso do GenBank AY090454 (HBV-H Nicarágua); número de acesso do GenBank AF241409 (HBV-I Vietnam); e número de acesso do

GenBank AB486012 (HBV-J Borneo). As sequências de aminoácido exemplares da região da alça antigênica do domínio S de HBsAg de diferentes genótipos estão aqui descritas (por exemplo, SEQ ID NOs: 5 – 15).

[092] Em alguns exemplos de realização, uma proteína de ligação é capaz de se ligar a um ou mais, e em alguns casos, pelo menos 6 dos 10 genótipos de HBsAg; A, B, C, D, E, F, G, H, I e J. Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação é capaz de se ligar a pelo menos 8 dos 10 genótipos de HBsAg; A, B, C, D, E, F, G, H, I e J. Em alguns exemplos de realização, uma proteína de ligação é capaz de se ligar a todos os 10 genótipos de HBsAg; A, B, C, D, E, F, G, H, I e J. O HBV é diferenciado em vários genótipos, de acordo com a sequência do genoma. Até o momento, oito genótipos bem conhecidos (A–H) do genoma do HBV foram definidos. Além disso, dois outros genótipos, I e J, também foram identificados (Sunbul M., 2014, World J Gastroenterol 20(18): 5427–5434). O genótipo é conhecido por afetar a progressão da doença e as diferenças entre os genótipos em resposta ao tratamento antiviral foram determinadas.

[093] Em alguns exemplos de realização, uma proteína de ligação de acordo com a presente divulgação é capaz de se ligar a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 dos mutantes de HBsAg com mutações na região de alça antigênica, em que tais mutantes são selecionados a partir de um ou mais dentre HBsAg Y100C/P120T, HBsAg P120T, HBsAg P120T/S143L, HBsAg C121S, HBsAg R122D, HBsAg R122I, HBsAg T123N, HBsAg Q129H, HBsAg Q129L, HBsAg M133H, HBsAg M133L, HBsAg M133T, HBsAg K141E, HBsAg P142S, HBsAg S143K, HBsAg D144A, HBsAg G145R e HBsAg N146A. Estes mutantes são mutantes de ocorrência natural com base no domínio S do Genótipo D de HBsAg, nº de acesso do Genbank: FJ899792 (SEQ ID NO: 4). O(s) resíduo(s) de aminoácido(s) mutado(s) em cada um dos mutantes aqui mencionados é(são) indicado(s) no nome:

SEQ ID NO: 4:

MENVTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGT TVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPTCPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDY QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIP SSWAFGKFLWEWASARFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGP

SLYSTLSPFLPLLPIFFCLWVYI (região da alça antigênica, ou seja, os aminoácidos 101–172, é mostrada sublinhada).

[094] As sequências de aminoácidos da região da alça antigênica do domínio S de HBsAg de diferentes mutantes são mostradas nas SEQ ID NOs: 16 – 33.

[095] Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação como divulgada na presente invenção é capaz de se ligar a um ou mais, e em alguns casos, pelo menos 12 mutantes infecciosos de HBsAg selecionados a partir de HBsAg Y100C/P120T, HBsAg P120T, HBsAg P120T/S143L, HBsAg C121S, HBsAg R122D, HBsAg R122I, HBsAg T123N, HBsAg Q129H, HBsAg Q129L, HBsAg M133H, HBsAg M133L, HBsAg M133T, HBsAg K141E, HBsAg P142S, HBsAg S143K, HBsAg D144A, HBsAg G145R e HBsAg N146A Em alguns exemplos de realização, uma proteína de ligação é capaz de se ligar a pelo menos 15 mutantes infecciosos de HBsAg selecionados a partir de HBsAg Y100C/P120T, HBsAg P120T, HBsAg P120T/S143L, HBsAg C121S, HBsAg R122D, HBsAg R122I, HBsAg T123N, HBsAg Q129H, HBsAg Q129L, HBsAg M133H, HBsAg M133L, HBsAg M133T, HBsAg K141E, HBsAg P142S, HBsAg S143K, HBsAg D144A, HBsAg G145R e HBsAg N146A Em alguns exemplos de realização, uma proteína de ligação é capaz de se ligar a cada um dos seguintes mutantes infecciosos de HBsAg: HBsAg Y100C/P120T; HBsAg P120T; HBsAg P120T/S143L; HBsAg C121S; HBsAg R122D; HBsAg R122I; HBsAg T123N; HBsAg Q129H; HBsAg Q129L; HBsAg M133H; HBsAg M133L;

HBsAg M133T; HBsAg K141E; HBsAg P142S; HBsAg S143K; HBsAg D144A; HBsAg G145R e HBsAg N146A.

[096] Em certos exemplos de realização, a proteína de ligação (por exemplo, incluindo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) é capaz de reduzir uma concentração sérica de DNA de HBV em um mamífero com infecção por HBV. Em certos exemplos de realização, a proteína de ligação é capaz de reduzir uma concentração sérica de HBsAg em um mamífero com infecção por HBV. Em certos exemplos de realização, a proteína de ligação é capaz de reduzir uma concentração sérica de HBeAg em um mamífero com infecção por HBV. Em certos exemplos de realização, a proteína de ligação é capaz de reduzir uma concentração sérica de HBcrAg em um mamífero com infecção por HBV. Em alguns exemplos de realização, a proteína de ligação é capaz de reduzir a concentração sérica de DNA HBV, HBsAg, HBeAg e/ou HBcrAg no mamífero por cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais dias após uma única administração da proteína de ligação.

[097] O termo “epítopo” ou “epítopo antigênico” inclui qualquer molécula, estrutura, sequência de aminoácidos ou determinante de proteína que é reconhecido e especificamente ligado por uma molécula de ligação cognata, tal como uma imunoglobulina, receptor de antígeno quimérico ou outra molécula de ligação, domínio ou proteína. Os determinantes epitópicos geralmente contêm agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e, podem ter características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas.

[098] Em alguns exemplos de realização, uma proteína de ligação é capaz de se ligar a um epítopo compreendendo pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três ou pelo menos quatro aminoácidos da região de alça antigênica de HbsAg. Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação é capaz de se ligar a pelo menos dois aminoácidos selecionados dos aminoácidos 115–133 do domínio S de HbsAg, aminoácidos 120–133 do domínio S de HbsAg ou aminoácidos 120–130 do Domínio S de HbsAg. Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação é capaz de se ligar a pelo menos três aminoácidos selecionados dos aminoácidos 115–133 do domínio S de HbsAg, aminoácidos 120–133 do domínio S de HbsAg ou aminoácidos 120–130 do Domínio S de HbsAg. Em alguns exemplos de realização, uma proteína de ligação é capaz de se ligar a pelo menos quatro aminoácidos selecionados dos aminoácidos 115–133 do domínio S de HbsAg, aminoácidos 120–133 do domínio S de HbsAg ou aminoácidos 120–130 do Domínio S de HbsAg. Conforme utilizado na presente invenção, a posição dos aminoácidos s (por exemplo, 115–133, 120–133, 120–130) refere-se ao domínio S de HBsAg como descrito acima, que está presente em todas as três proteínas do envelope de HBV, S–HBsAg, M –HBsAg e L–HBsAg, de modo que S–HBsAg normalmente corresponde ao domínio S de HBsAg.

[099] O termo “formado por”, conforme usado aqui no contexto de um epítopo, significa que o epítopo ao qual o anticorpo da invenção, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, se liga pode ser linear (contínuo) ou conformacional (descontínuo). Um epítopo linear ou sequencial é um epítopo que é reconhecido por anticorpos por sua sequência linear de aminoácidos ou estrutura primária. Em contraste, um epítopo conformacional tem uma forma tridimensional e estrutura proteica específicas.

Consequentemente, se o epítopo é um epítopo linear e compreende mais de um aminoácido localizado nas posições selecionadas a partir das posições de aminoácidos 115–133, de preferência selecionadas a partir das posições de aminoácidos 120–133 do domínio S de HBsAg, os aminoácidos compreendidos pelo epítopo estão, tipicamente, localizados em posições adjacentes da estrutura primária (isto é, aminoácidos consecutivos na sequência de aminoácidos). No caso de um epítopo conformacional (estrutura 3D), em contraste, a sequência de aminoácidos forma, tipicamente, uma estrutura 3D como epítopo e, assim, os aminoácidos que formam o epítopo podem estar ou não estar localizados em posições adjacentes da estrutura primária (isto é, talvez sejam aminoácidos consecutivos ou não na sequência de aminoácidos).

[100] Em certos exemplos de realização, um epítopo ao qual uma proteína de ligação se liga é um epítopo conformacional. Em alguns exemplos de realização, uma ligação de proteína se liga a um epítopo que compreende pelo menos dois aminoácidos da região da alça antigênica de HBsAg, em que os pelo menos dois amino ácidos são selecionados a partir dos aminoácidos 120–133 ou a partir dos aminoácidos 120–130, do domínio S de HbsAg, e em que os pelo menos dois aminoácidos não estão localizados em posições adjacentes (da estrutura primária). Em certos exemplos de realização, uma ligação de proteína se liga a um epítopo que compreende pelo menos três aminoácidos da região da alça antigênica de HBsAg, em que os pelo menos três amino ácidos são selecionados a partir dos aminoácidos 120–133 ou a partir dos aminoácidos 120–130, do domínio S de HbsAg, e em que pelo menos dois de três aminoácidos não estão localizados em posições adjacentes (da estrutura primária). Em alguns exemplos de realização, uma ligação de proteína se liga a um epítopo que compreende pelo menos quatro aminoácidos da região da alça antigênica de HBsAg, em que os pelo menos quatro amino ácidos são selecionados a partir dos aminoácidos 120–133 ou a partir dos aminoácidos 120–130, do domínio S de HbsAg, e em que os pelo menos dois dos quatro aminoácidos não estão localizados em posições adjacentes (da estrutura primária).

[101] Os aminoácidos nos quais o anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou proteína de fusão atualmente divulgado se liga (ou seja,

os aminoácidos que formam o epítopo), que não estão localizados em posições adjacentes da estrutura primária, estão em alguns casos espaçados por um ou mais aminoácidos, aos quais o anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou proteína de fusão não se ligam. Em alguns exemplos de realização, pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco aminoácidos podem estar localizados entre dois dos aminoácidos não localizados em posições adjacentes compreendidas pelo epítopo.

[102] Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação liga-se a um epítopo compreendendo pelo menos os aminoácidos P120, C121, R122 e C124 do domínio S de HBsAg. Em outros exemplos de realização, uma proteína de ligação da presente divulgação liga-se a um epítopo compreendendo uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 88:

PCRXC em que X é qualquer aminoácido ou nenhum aminoácido; de preferência X é qualquer aminoácido; mais preferivelmente X é T, Y, R, S ou F; ainda mais preferivelmente X é T, Y ou R; ou X é T ou R.

[103] Em outros exemplos de realização, uma proteína de ligação da presente divulgação liga-se a um epítopo compreendendo uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 80:

TGPCRTC ou a uma sequência de aminoácidos compartilhando pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 80.

[104] Em outros exemplos de realização, uma proteína de ligação da presente divulgação liga-se a um epítopo compreendendo uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 85:

STTSTGPCRTC ou a uma sequência de aminoácidos compartilhando pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 85.

[105] Em certos exemplos de realização, a proteína de ligação da presente invenção liga-se a um epítopo que compreende uma sequência de aminoácidos que compreende pelo menos os aminoácidos 145–151 do domínio S de HBsAg:

GNCTCIP (SEQ ID NO: 81).

[106] Em outros exemplos de realização, a proteína de ligação da presente invenção, se liga a um epítopo que compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 80 e uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 81.

[107] Em outros exemplos de realização, a proteína de ligação da presente invenção, se liga a um epítopo que compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 85 e/ou uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 87.

[108] Conforme descrito acima, o epítopo ao qual a proteína de ligação da presente divulgação se liga pode ser linear (contínuo) ou conformacional (descontínuo). Em alguns exemplos de realização, a proteína de ligação da presente invenção liga-se a um epítopo conformacional, mais preferivelmente o epítopo conformacional está presente apenas sob condições não redutoras.

[109] Em certos exemplos de realização, a proteína de ligação da presente divulgação liga-se a um epítopo linear. Em certos exemplos de realização, o epítopo linear está presente tanto em condições não redutoras quanto em condições redutoras.

[110] Em exemplos de realização específicos, uma proteína de ligação da presente divulgação se liga a um epítopo na alça antigênica de HBsAg formado por uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1: X1 X2 X3 TC X4 X5 X6A X7G em que X1, X2, X3, X4, X5, X6 e X7 pode ser qualquer aminoácido (SEQ ID NO: 1).

[111] Em alguns exemplos de realização, X1, X2, X3, X4, X5, X6 e X7 são aminoácidos, que são substituídos de forma conservadora em comparação com os aminoácidos 120–130 da SEQ ID NO: 3. Em alguns exemplos de realização, X1, X2, X3, X4, X5, X6 e X7 são aminoácidos, que são substituídos de forma conservadora em comparação com os aminoácidos 20– 30 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 5-33.

[112] Em exemplos de realização específicos, X1 da SEQ ID NO: 1 X1 é um aminoácido pequeno. Um aminoácido “pequeno”, conforme utilizado no presente, refere-se a qualquer aminoácido selecionado a partir o grupo que consiste em alanina, ácido aspártico, asparagina, cisteína, glicina, prolina, serina, treonina e valina. Em certos exemplos de realização, X 1 é prolina, serina ou treonina.

[113] Em certos exemplos de realização, X2 da SEQ ID NO: 1 X2 é um aminoácido pequeno. Em certos exemplos de realização, X 2 pode ser selecionado de cisteína ou treonina.

[114] Em alguns exemplos de realização, X3 da SEQ ID NO: 1 é um aminoácido carregado ou um aminoácido alifático. Um aminoácido “carregado”, conforme utilizado no presente, refere-se a qualquer aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em arginina, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico e histidina. Um aminoácido “alifático”, tal como utilizado na presente invenção, refere-se a qualquer aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina, isoleucina, leucina, e valina. Em certos exemplos de realização, X3 é selecionado a partir de arginina, lisina, ácido aspártico ou isoleucina.

[115] Em alguns exemplos de realização, X4 da SEQ ID NO: 1 é um aminoácido pequeno e/ou um aminoácido hidrofóbico. Um aminoácido “hidrofóbico”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a qualquer aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, isoleucina, leucina, fenilalanina, valina, triptofano, tirosina, metionina, prolina e glicina. Em alguns exemplos de realização, X4 é selecionado a partir de metionina ou treonina.

[116] Em alguns exemplos de realização, X5 da SEQ ID NO: 1 é um aminoácido pequeno e/ou um aminoácido hidrofóbico. Em certos exemplos de realização, X5 é selecionado de treonina, alanina ou isoleucina.

[117] Em alguns exemplos de realização, X6 da SEQ ID NO: 1 X6 é um aminoácido pequeno e/ou um aminoácido hidrofóbico. Em certos exemplos de realização, X6 é selecionado a parti de treonina, prolina ou leucina.

[118] Em alguns exemplos de realização, X7 da SEQ ID NO: 1 é um aminoácido polar ou um aminoácido alifático. Um aminoácido “polar”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a qualquer aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em ácido aspártico, asparagina, arginina, ácido glutâmico, histidina, lisina, glutamina, triptofano, tirosina, serina e treonina. Em certos exemplos de realização, X 7 é glutamina, histidina ou leucina.

[119] Em alguns exemplos de realização, uma proteína de ligação de acordo com a presente divulgação liga-se a um epítopo na alça antigênica de HBsAg formada por uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 2: X1 X2 X3 TC X4 X5 X6A X7G em que: X1 é P, T ou S, X2 é C ou S, X3 é R, K, D ou I, X4 é M ou T, X5 é T, A ou I, X6 é T, P ou L, e X7 é Q, H ou L, (SEQ ID NO: 2).

[120] Com relação aos epítopos preferidos formados pelas sequências de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 1 ou 2, deve ser observado que o termo “formado por”, conforme usado no presente, em particular, não se destina a implicar que o anticorpo se liga necessariamente a todo e cada aminoácido de SEQ ID NO: 1 ou 2. Em particular, uma proteína de ligação pode se ligar apenas a alguns dos aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou 2, de modo que os outros resíduos de aminoácidos podem simplesmente atuar como “espaçadores”.

[121] Em exemplos de realização específicos, uma proteína de ligação da presente invenção liga-se a um epítopo na alça antigênica de HBsAg formado por um ou mais, por dois ou mais, por três ou mais ou por quatro ou mais aminoácidos de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das SEQ ID NOs: 5 - 33 mostradas abaixo na Tabela 3.

[122] Em exemplos de realização específicos, uma proteína de ligação da presente invenção liga-se a uma região da alça antigênica de HBsAg que tem uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs 5 - 33 mostradas abaixo na Tabela 3 ou uma sequência variante das mesmas. Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação da presente invenção liga-se a todas as variantes da alça antigênica de

HBsAg que têm uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 - 33 mostradas abaixo na Tabela 3.

[123] Tabela 3: Exemplos de sequências de aminoácidos da região da alça antigênica do domínio S de HBsAg (resíduos 101–172 do domínio S de HBsAg com exceção de SEQ ID NO: 16, a qual se refere aos resíduos 100–172 do domínio S de HBsAg para incluir a mutação relevante) dos diferentes genótipos e mutantes conforme usado na presente invenção.

TABELA 3 Nome SEQ ID NO. Sequência de aminoácidos J02203 (D, QGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTTAQ ayw3) 5 GTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAF

GKFLWEWASARFSW FJ899792 (D, QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTC adw2) TTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGNC 6

TCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFS

W AM282986 QGMLPVCPLIPGTTTTSTGPCKTCTTPAQ (A) 7 GNSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAF

AKYLWEWASVRFSW D23678 (B1) QGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCKTCTTPAQ 8 GTSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAF

AKYLWEWASVRFSW AB117758 (C1) QGMLPVCPLLPGTSTTSTGPCKTCTIPAQ 9 GTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAF

ARFLWEWASVRFSW AB205192 (E) QGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCTTLAQ 10 GTSMFPSCCCSKPSDGNCTCIPIPSSWAF

GKFLWEWASARFSW X69798 (F4) QGMLPVCPLLPGSTTTSTGPCKTCTTLAQ 11 GTSMFPSCCCSKPSDGNCTCIPIPSSWAL

GKYLWEWASARFSW

Nome SEQ ID NO. Sequência de aminoácidos AF160501 (G) QGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCKTCTTPAQ 12 GNSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAF

AKYLWEWASVRFSW AY090454 (H) QGMLPVCPLLPGSTTTSTGPCKTCTTLAQ 13

GTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAF

GKYLWEWASARFSW AF241409 (I) QGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCKTCTTPAQ 14 GNSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAF

AKYLWEWASARFSW AB486012 (J) QGMLPVCPLLPGSTTTSTGPCRTCTITAQ 15 GTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAF

AKFLWEWASVRFSW HBsAg CQGMLPVCPLIPGSSTTGTGTCRTCTTPA Y100C/P120T 16 QGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWA

FGKFLWEWASARFSW HBsAg P120T QGMLPVCPLIPGSSTTGTGTCRTCTTPAQ 17 GTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAF

GKFLWEWASARFSW HBsAg QGMLPVCPLIPGSSTTGTGTCRTCTTPAQ P120T/S143L 18 GTSMYPSCCCTKPLDGNCTCIPIPSSWAF

GKFLWEWASARFSW HBsAg C121S QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPSRTCTTPAQ 19 GTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAF

GKFLWEWASARFSW HBsAg R122D QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCDTCTTPAQ 20 GTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAF

GKFLWEWASARFSW HBsAg R122I QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCITCTTPAQG 21 TSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFG

KFLWEWASARFSW HBsAg T123N 22 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRNCTTPAQ

Nome SEQ ID NO. Sequência de aminoácidos

GTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAF

GKFLWEWASARFSW HBsAg Q129H QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAH 23 GTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAF

GKFLWEWASARFSW HBsAg Q129L QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAL 24 GTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAF

GKFLWEWASARFSW HBsAg M133H QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQ 25 GTSHYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAF

GKFLWEWASARFSW HBsAg M133L QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQ 26 GTSLYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAF

GKFLWEWASARFSW HBsAg M133T QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQ 27 GTSTYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAF

GKFLWEWASARFSW HBsAg K141E QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQ 28 GTSMYPSCCCTEPSDGNCTCIPIPSSWAF

GKFLWEWASARFSW HBsAg P142S QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQ 29 GTSMYPSCCCTKSSDGNCTCIPIPSSWAF

GKFLWEWASARFSW HBsAg S143K QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQ 30 GTSMYPSCCCTKPKDGNCTCIPIPSSWAF

GKFLWEWASARFSW HBsAg D144A QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQ 31 GTSMYPSCCCTKPSAGNCTCIPIPSSWAF

GKFLWEWASARFSW HBsAg G145R QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQ 32

GTSMYPSCCCTKPSDRNCTCIPIPSSWAF

Nome SEQ ID NO. Sequência de aminoácidos

GKFLWEWASARFSW HBsAg N146A QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQ 33 GTSMYPSCCCTKPSDGACTCIPIPSSWAF

GKFLWEWASARFSW

[124] Em determinados aspectos, a presente divulgação provê um anticorpo isolado, ou fragmento de ligação a um antígeno, compreendendo: (i) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende pelo menos 90% (isto é, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade com a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 41 ou 67; e (ii) uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 42; 59; 65; 89, 90 ou 111–120, desde que o aminoácido na posição 40 da VL de acordo com a numeração IMGT não seja uma cisteína, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga à região da alça antigênica de HBsAg e neutraliza a infecção pelo vírus da hepatite B e o vírus da hepatite delta.

[125] Em exemplos de realização adicionais, (i) a VH compreende pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 41 ou 67; e/ou (ii) a VL compreende pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 42, 59, 65, 89, 90 ou 111–120.

[126] Em certos exemplos de realização, o aminoácido na posição 40 da VL é alanina. Em certos exemplos de realização, o aminoácido na posição 40 da VL é serina. Ainda em outro exemplo de realização, o aminoácido na posição 40 da VL é glicina.

[127] Em qualquer um dos exemplos de realização aqui divulgados, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode compreender sequências de CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de acordo com as SEQ ID NOs: (i) 34–36, 37, 38 e 40, respectivamente; (ii) 34, 66, 36, 37, 38 e 40, respectivamente; (iii) 34–36, 37, 39 e 40, respectivamente; (iv) 34, 66, 36, 37, 39 e 40, respectivamente; (v) 34– 36, 37, 38 e 58, respectivamente; (vi) 34, 66, 36, 37, 38 e 58, respectivamente; (vii) 34–36, 37, 39 e 58, respectivamente; ou (vii) 34, 66, 36, 37, 39 e 58, respectivamente.

[128] Em alguns exemplos de realização, a VL do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 89. Em alguns exemplos de realização, a VL do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 90.

Em outros exemplos de realização, a VL do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 111–120. Em certos exemplos de realização, a VH compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 41. Em outros exemplos de realização, a VH compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 67.

[129] Em exemplos de realização particulares, a VH compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 41 e a VL compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 89. Em outros exemplos de realização particulares, a VH compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 41 e a VL compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 90. Em certos exemplos de realização, a VH compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 41 e a VL compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 111–120. Em outros exemplos de realização, a VH compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 67 e a VL compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 89, 90 e 111–120.

[130] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: (i) uma região variável de cadeia pesada (V H) compreendendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 95; e (ii) uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 96, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo liga-se à região de alça antigênica de HBsAg e neutraliza infecção pelo vírus da hepatite B e vírus da hepatite delta.

[131] Em outros exemplos de realização, (i) a VH compreende pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 95; e/ou (ii) a VL compreende pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 96.

[132] Em certos exemplos de realização, o anticorpo ou antígeno de ligação fragmento compreende as sequências CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de acordo com as SEQ ID NOs: 97–102, respectivamente.

[133] Em exemplos de realização particulares, a VH compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 95 e a VL compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 96.

PORÇÃO FC

[134] Em alguns exemplos de realização, uma proteína de ligação (por exemplo, anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) da presente divulgação compreende uma porção Fc. Em certos exemplos de realização, a porção Fc pode ser derivada de origem humana, por exemplo, de IgG1, IgG2, IgG3 e/ou IgG4 humana, ou de outra classe de Ig ou isotipo. Em exemplos de realização específicos, um anticorpo ou os fragmentos de ligação do antígeno pode compreender uma porção Fc derivada de IgG1 humana.

[135] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “porção Fc” refere-se a uma sequência derivada da porção de uma cadeia pesada de imunoglobulina que começa na região de dobradiça imediatamente a montante do sítio de clivagem de papaína (por exemplo, resíduo 216 na IgG nativa, tomando o primeiro resíduo da pesada região constante da cadeia como sendo 114) e terminando na extremidade C–terminal da cadeia pesada de imunoglobulina. Consequentemente, uma porção Fc pode ser uma porção Fc completa ou uma parte (por exemplo, um domínio) da mesma. Em certos exemplos de realização, uma porção Fc completa compreende pelo menos um domínio de dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3 (por exemplo, posições de aminoácidos EU 216–446). Um resíduo de lisina adicional (K) está, algumas vezes, presente na extremidade C–terminal da porção Fc, porém, muitas vezes, ele é clivado de um anticorpo maduro. Cada uma das posições de aminoácidos dentro de uma porção Fc foi numerada de acordo com o sistema de numeração EU de Kabat; consulte, por exemplo, Kabat et al. em “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, U.S. Dept. Health and Human Services, 1983 e 1987. As posições de aminoácidos de uma porção Fc também podem ser numeradas de acordo com o sistema de numeração IMGT (incluindo numeração única para a numeração de C-domínio e éxon) e o sistema de numeração de Kabat.

[136] Em alguns exemplos de realização, uma porção Fc compreende pelo menos um dentre: uma dobradiça (por exemplo, região de dobradiça superior, mediana e/ou inferior), um domínio CH2, um domínio CH3, ou uma variante, porção ou um fragmento dos mesmos. Em alguns exemplos de realização, uma porção Fc compreende pelo menos um domínio de dobradiça, um domínio CH2 ou um domínio CH3. Em exemplos de realização adicionais, a porção Fc é uma porção Fc completa. A sequência de aminoácidos de uma porção Fc exemplar do isotipo IgG1 humano é fornecida na SEQ ID NO: 137. A porção Fc também pode compreender uma ou mais inserções, deleções ou substituições de aminoácidos em relação a uma porção Fc de ocorrência natural. Por exemplo, pelo menos um domínio de dobradiça, domínio CH2, ou o domínio CH3, ou uma porção da mesma, pode ser suprimido. Por exemplo, uma porção Fc pode compreender ou consistir em: (i) domínio de dobradiça (ou uma parte dele) fundido a um domínio CH2 (ou uma parte dele), (ii) um domínio de dobradiça (ou uma parte dele) fundido a um Domínio CH3 (ou uma parte dele), (iii) um domínio CH2 (ou uma parte dele) fundido a um domínio CH3 (ou uma parte dele), (iv) um domínio dobradiça (ou uma parte dele), (v) um domínio CH2 (ou parte dele), ou (vi) um domínio CH3 ou uma parte dele.

[137] Uma porção Fc da presente divulgação pode ser modificada de modo que varie na sequência de aminoácidos da porção Fc completa de uma molécula de imunoglobulina de ocorrência natural, enquanto retém ou aumenta pelo menos uma função desejável conferida pela porção Fc de ocorrência natural, e/ou reduz uma função indesejada de uma porção Fc de ocorrência natural. Tais funções incluem, por exemplo, ligação ao receptor Fc (FcR), modulação da meia-vida do anticorpo (por exemplo, por ligação ao FcRn), função ADCC, ligação à proteína A, ligação à proteína G e ligação ao complemento. Partes de porções Fc de ocorrência natural que estão envolvidas com tais funções foram descritas no estado técnica.

[138] Por exemplo, para ativar a cascata do complemento, o complexo de proteína C1q pode se ligar a pelo menos duas moléculas de IgG1 ou uma molécula de IgM quando a(s) molécula(s) de imunoglobulina está(ão) ligada(s) ao alvo antigênico (Ward, E.S. e Ghetie, V., Ther. Immunol. 2 (1995) 77–94). Burton, D.R., descreveu (Mol. Immunol. 22 (1985) 161–206) que a região da cadeia pesada compreendendo os resíduos de aminoácidos 318 a 337 está envolvida na fixação do complemento. Duncan, A.R. e Winter, G.

(Nature 332 (1988) 738–740), usando mutagênese sítio-dirigida, relataram que Glu318, Lys320 e Lys322 formam o sítio de ligação ao C1q. O papel dos resíduos Glu318, Lys320 e Lys 322 na ligação de C1q foi confirmado pela capacidade de um pequeno peptídeo sintético contendo esses resíduos de inibir a lise mediada pelo complemento.

[139] Por exemplo, a ligação de FcR pode ser mediada pela interação da porção Fc (de um anticorpo) com receptores de Fc (FcR), os quais são receptores de superfície de células especializadas, incluindo células hematopoiéticas. Os receptores de Fc pertencem à superfamília das imunoglobulinas e foi mostrado que medeiam a remoção de patógenos revestidos com anticorpos por fagocitose de complexos imunes, e a lise de eritrócitos e vários outros alvos celulares (por exemplo, células tumorais) revestidas com o anticorpo correspondente, via citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC; Van de Winkel, J.G. e Anderson, C.

L., Leukoc Biol 49 (1991) 511524). Os FcRs são definidos por sua especificidade pelas classes de imunoglobulinas; receptores de Fc para anticorpos de IgG são referidos como FcγR, para IgE como FcεR, para IgA como FcαR e assim por diante e os receptores Fc neonatal são referidos como FcRn. A ligação ao receptor de Fc é descrita, por exemplo, em Ravetch, J.V. e Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457–492; Capel, P.J. et al., Immunomethods 4 (1994) 2534; de Haas, M. et al., Lab. Clin. Med. 126 (1995)

330–341; e Gessner, J.E. et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231–248.

[140] A ligação cruzada de receptores pelo domínio Fc de anticorpos de IgG nativa (FcγR) desencadeia uma ampla variedade de funções efetoras, incluindo fagocitose, citotoxicidade celular dependente de anticorpo e liberação de mediadores inflamatórios, bem como a depuração do complexo imune e regulação da produção de anticorpos. Consequentemente, porções Fc que permitem a ligação cruzada de receptores (FcγR) são preferidas. Em seres humanos, três classes de FcγR foram caracterizadas, as quais são: (i) FcγRI (CD64), que se liga à IgG monomérica com elevada afinidade e é expressa em macrófagos, monócitos, neutrófilos e eosinófilos; (ii) FcγRII (CD32), que se liga à IgG em complexo com afinidade baixa a média e é amplamente expresso, em particular, em leucócitos, e é conhecido por exercer um papel central na imunidade mediada por anticorpos e pode ser dividido em FcγRIIA, FcγRIIB e FcγRIIC, os quais desempenham diferentes funções no sistema imune, mas se ligam com baixa afinidade similar ao IgG–Fc, e os ectodomínios destes receptores são altamente homólogos; e (iii) FcγRIII (CD16), que se liga à IgG com uma afinidade baixa a média e existe na forma de dois tipos: FcγRIIIA encontrado em células NK, macrófagos, eosinófilos e alguns monócitos e células T e media ADCC, e FcγRIIIB, o qual é altamente expresso sobre neutrófilos.

[141] O FcγRIIA é encontrado em muitas células envolvidas na destruição (por exemplo, macrófagos, monócitos, neutrófilos) e parece ser capaz de ativar o processo de morte. FcγRIIB parece desempenhar um papel nos processos inibidores e é encontrado em células B, macrófagos e em mastócitos e eosinófilos. De modo importante, 75% de todos os FcγRIIB são encontrados no fígado (Ganesan, L.P. et al. 2012: FcγRIIb on Liver Sinusoidal Endothelium Clears Small Immune Complexes. Journal of Immunology 189: 4981–4988). O FcγRIIB é abundantemente expresso no endotélio sinusoidal do fígado, denominado LSEC e, em células de Kupffer no fígado; e o LSEC é o principal local de depuração de pequenos complexos imunes (Ganesan, L.P. et al. 2012: FcγRIIb on Liver Sinusoidal Endothelium Clears Small Immune Complexes. Journal of Immunology 189: 4981–4988).

[142] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos divulgados na presente invenção e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, compreendem uma porção Fc para se ligar ao FcγRIIb, em particular uma região Fc tal como, por exemplo, anticorpos de tipo IgG. Além disso, é possível manipular a porção Fc para aumentar a ligação ao FcγRIIB pela introdução de mutações S267E e L328F, conforme descrito por Chu, S.Y. et al., 2008: Inhibition of B Cell ReceptorMediated Activation of Primary Human B Cells by Coengagement of CD19 and FcgammaRIIb with FcEngineered Antibodies. Molecular Immunology 45, 3926–3933. Deste modo, a deleção de complexos imunes pode ser aumentada (Chu, S. et al. 2014: Accelerated Clearance of IgE In Chimpanzees Is Mediated By Xmab7195, An FcEngineered Antibody With Enhanced Affinity For Inhibitory Receptor FcγRIIb. Am J. Respir.

Crit., American Thoracic Society International Conference Abstracts). Em alguns exemplos de realização, os anticorpos da presente divulgação, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendem uma porção Fc modificada com as mutações S267E e L328F, em particular conforme descrito por Chu, S.Y. et al., 2008: Inhibition of B Cell ReceptorMediated Activation of Primary Human B Cells by Coengagement of CD19 and FcgammaRIIb with FcEngineered Antibodies. Molecular Immunology 45, 3926–3933.

[143] Sobre células B, o FcγRIIB parece funcionar suprimindo ainda mais a produção de imunoglobulina e troca de isotipo, por exemplo, para a classe IgE. Em macrófagos, o FcγRIIB atua inibindo a fagocitose mediada através de FcγRIIA. Em eosinófilos e mastócitos, a forma B pode auxiliar a suprimir a ativação destas células pela ligação de IgE ao seu receptor separado.

[144] Em relação à ligação ao FcγRI, a modificação na IgG nativa de pelo menos um dentre E233–G236, P238, D265, N297, A327 e P329 reduz a ligação ao FcγRI. Os resíduos de IgG2 nas posições 233–236, substituídos em IgG1 e IgG4, reduzem a ligação ao FcγRI em 103 vezes e eliminam a resposta de monócitos humanos contra glóbulos vermelhos sensibilizados com anticorpo (Armour, K. L, et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613–2624).

[145] Em relação à ligação ao FcγRII, ligação reduzida ao FcγRIIA é encontrada para mutação em IgG de pelo menos um dentre E233– G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292 e K414.

[146] Duas formas alélicas de FcγRIIA humano são a variante “H131”, que se liga a Fc de IgG1 com alta afinidade, e a variante “R131”, que se liga a Fc de IgG1 com baixa afinidade. Veja, por exemplo, Bruhns et al., Blood 113: 3716–3725 (2009).

[147] Em relação à ligação ao FcγRIII, ligação reduzida ao FcγRIIIA é encontrada, por exemplo, através de mutação de pelo menos um dentre E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 e D376. O mapeamento dos sítios de ligação na IgG1 humana para receptores de Fc, os sítios de mutação mencionados acima e métodos para medição da ligação ao FcγRI e FcγRIIA são descritos em Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591–6604.

[148] Duas formas alélicas de FcγRIIIA humano são a variante “F158”, que se liga a Fc de IgG1 com baixa afinidade, e a variante “V158”, que se liga a Fc de IgG1 com alta afinidade. Veja, por exemplo, Bruhns et al., Blood 113: 3716–3725 (2009).

[149] Em relação particular à ligação ao FcγRII, duas regiões Fc de IgG nativa parecem ser críticas para interações de FcγRII e IgG, principalmente (i) o sítio da dobradiça inferior de Fc de IgG, em particular, os resíduos de aminoácidos L, L, G, G (234–237, numeração EU) e (ii) a região adjacente do domínio CH2 de Fc de IgG, em particular uma alça e fitas no domínio CH2 superior adjacente à região de dobradiça inferior, por exemplo, em uma região de P331 (Wines, B.D. et al., J. Immunol. 2000; 164: 5313– 5318). Além disso, FcγRI parece se ligar ao mesmo sítio em Fc de IgG, enquanto que o FcRn e Proteína A se ligam a um sítio diferente na Fc de IgG, que parece estar na interface CH2–CH3 (Wines, B.D. et al., J. Immunol. 2000; 164: 5313–5318).

[150] Também estão contempladas as mutações que aumentam a afinidade de ligação de uma porção Fc da presente divulgação a um (isto é, um ou mais) receptor Fcγ (por exemplo, em comparação com uma porção Fc de referência ou anticorpo contendo o mesmo que não compreende a(s) mutação(ões)). Consulte, por exemplo, Delillo e Ravetch, Cell 161 (5): 1035– 1045 (2015) e Ahmed et al., J. Struc. Biol. 194 (1): 78 (2016), cujas mutações em Fc e técnicas são incorporadas ao presente documento por referência.

[151] Em qualquer um dos exemplos de realização divulgados na presente invenção, uma proteína de ligação pode compreender uma porção Fc compreendendo uma mutação selecionada a partir de G236A; S239D; A330L; e I332E; ou um combinação compreendendo quaisquer duas ou mais dessas mutações; por exemplo, S239D/I332E; S239D/A330L/I332E; G236A/S239D/I332E; G236A/A330L/I332E (também referido aqui como “GAALIE”); ou G236A/S239D/A330L/I332E. Em alguns exemplos de realização, a porção Fc não compreende S239D.

[152] Em certos exemplos de realização, a porção Fc pode compreender ou consistir em pelo menos uma porção de uma porção Fc que está envolvida na ligação à ligação FcRn. Em certos exemplos de realização, a porção Fc compreende uma ou mais modificações de aminoácidos que melhoram a afinidade de ligação para (por exemplo, aumentar a ligação a)

FcRn (por exemplo, em um pH de cerca de 6,0) e, em alguns exemplos de realização, estendem assim a meia-vida in vivo de uma molécula que compreende a porção Fc (por exemplo, em comparação com uma porção Fc de referência ou anticorpo que é o mesmo, mas que não compreende a(s) modificação(ões)). Em certos exemplos de realização, a porção Fc compreende ou é derivada de um Fc de IgG e uma mutação de prolongamento da meia-vida compreende qualquer um ou mais dentre: M428L; N434S; N434H; N434A; N434S; M252Y; S254T; T256E; T250Q; P257I Q311I; D376V; T307A; E380A (numeração EU). Em certos exemplos de realização, uma mutação que prolonga a meia-vida compreende M428L/N434S (também referida neste documento como “MLNS”). Em certos exemplos de realização, uma mutação que prolonga a meia-vida compreende M252Y/S254T/T256E. Em certos exemplos de realização, uma mutação que prolonga a meia-vida compreende T250Q/M428L. Em certos exemplos de realização, uma mutação que prolonga a meia-vida compreende P257I/Q311I. Em certos exemplos de realização, uma mutação que prolonga a meia-vida compreende P257I/N434H.

Em certos exemplos de realização, uma mutação que prolonga a meia-vida compreende D376V/N434H. Em certos exemplos de realização, uma mutação que prolonga a meia-vida compreende T307A/E380A/N434A.

[153] Em alguns exemplos de realização, uma proteína de ligação inclui uma porção Fc que compreende as substituições M428L/N434S.

Em alguns exemplos de realização, uma proteína de ligação inclui uma porção Fc que compreende as substituições G236A/A330L/I332E. Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação inclui uma porção Fc (por exemplo, de IgG) que compreende uma mutação G236A, uma mutação A330L e uma mutação I332E (GAALIE) e não compreende uma mutação S239D (por exemplo, compreende um S nativo na posição 239). Em exemplos de realização específicos, uma proteína de ligação inclui uma fração Fc que compreende as mutações de substituição: M428L/N434S e G236A/A330L/I332E e, opcionalmente, não compreende S239D. Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação inclui uma porção Fc que compreende as mutações de substituição: M428L/N434S e G236A/S239D/A330L/I332E.

[154] Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação da presente divulgação compreende: CDRs e/ou um domínio variável e/ou uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve de acordo com qualquer um dos anticorpos anti-HBV exemplares divulgados no presente documento e/ou na Publicação PCT WO 2017/060504 (incluindo os anticorpos HBC34, HBC34-V7, HBC34-V23, HBC34-V31, HBC34-V32, HBC34-V33, HBC34-V34, HBC34-V35 (incluindo as formas variantes aqui divulgadas de anticorpos HBC que compreendem uma mutação de substituição na posição 40 na cadeia leve (por exemplo, uma substituição de uma cisteína nativa por uma alanina, uma serina ou semelhantes) e HBC24); e uma porção Fc compreendendo uma mutação G236A, uma mutação A330L, e uma mutação I332E (GAALIE), na qual a porção Fc, opcionalmente, compreende ainda uma mutação M428L/N434S (MLNS). Em certos exemplos de realização, a porção Fc não compreende S239D.

[155] Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação compreende: uma sequência de aminoácidos de CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 34, uma sequência de aminoácidos de CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 35 ou 66, uma sequência de aminoácidos de CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 36, uma sequência de ácido de CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 37, uma sequência de ácido de CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 38 ou 39, e sequência de aminoácidos de CDRL3 de acordo com SEQ ID NO: 58 ou 40; e uma porção Fc compreendendo uma mutação GAALIE. Em certos exemplos de realização, a porção Fc não compreende uma mutação S239D.

Em certos exemplos de realização, a porção Fc compreende ainda uma mutação MLNS.

[156] Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação compreende: uma sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada (VH) de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 41 ou 67 e uma sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve (V L) de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 42, 59, 65, 89, 90 e 111–120; e uma porção Fc compreendendo uma mutação GAALIE. Em certos exemplos de realização, a porção Fc compreende ainda uma mutação MLNS.

[157] Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 138 ou 91 ou 92 e/ou uma sequência de aminoácidos de cadeia leve de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 93 ou 94. Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 91 e uma sequência de aminoácidos de cadeia leve de acordo com SEQ ID NOs: 93. Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 91 e uma sequência de aminoácidos de cadeia leve de acordo com SEQ ID NOs:

94. Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 92 e uma sequência de aminoácidos de cadeia leve de acordo com SEQ ID NOs: 93. Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 92 e uma sequência de aminoácidos de cadeia leve de acordo com SEQ ID NOs: 94.

[158] Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação compreende: uma sequência de aminoácidos de CDRH1 de acordo com a SEQ

ID NO: 97, uma sequência de aminoácidos de CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 98, uma sequência de aminoácidos de CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 99, uma sequência de ácido de CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 100, uma sequência de ácido de CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 100, e sequência de aminoácidos de CDRL3 de acordo com SEQ ID NO: 102; e uma porção Fc compreendendo uma mutação GAALIE. Em certos exemplos de realização, a porção Fc compreende ainda uma mutação MLNS.

[159] Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação compreende: uma sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada (VH) de acordo com a SEQ ID NO: 95 e uma sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve (VL) de acordo com SEQ ID N O: 96; e uma porção Fc compreendendo uma mutação GAALIE. Em certos exemplos de realização, a porção Fc compreende ainda uma mutação MLNS.

[160] Em qualquer um dos exemplos de realização divulgados na presente invenão, uma proteína de ligação da presente divulgação inclui uma porção Fc compreendendo uma mutação GAALIE e tem ligação a um FcγRIIa humano e/ou um FcγRIIIa humano aumentada em comparação com um polipeptídeo de referência (ou seja, um polipeptídeo, que pode ser uma proteína de ligação, que incluem uma unidade Fc que não compreende a mutação GAALIE).

[161] Em certos exemplos de realização, o polipeptídeo de referência inclui uma porção Fc que é uma porção Fc tipo selvagem (por exemplo, do mesmo isotipo) ou é uma porção Fc que compreende uma ou mais mutações de substituição (ou inserção ou deleção), desde que a substituição mutação não seja ou não compreenda GAALIE. Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação compreende anticorpo HBC34–V35 com uma mutação GAALIE (e opcionalmente outras mutações de substituição, como, por exemplo, MLNS), e um polipeptídeo de referência é

HBC34–V35 (incluindo uma porção Fc tipo selvagem). Em certos exemplos de realização, o polipeptídeo de referência não compreende uma mutação de substituição que é conhecida ou acredita-se que afete a ligação a um FcγRIIa humano e/ou um FcγRIIIa humano.

[162] A ligação entre polipeptídeos, tal como ligação entre uma porção Fc (ou uma proteína de ligação compreendendo a mesma) e um Receptor Fcγ humano, tal como FcγRII A humano, FcγRIII A humano, ou Fc FcγRII B humano, ou uma proteína do complemento, como C1q, pode ser determinada ou detectada usando métodos conhecidos no estado da técnica.

Por exemplo, um ensaio de interferometria de biocamada (BLI) pode ser realizado utilizando um instrumento Octeto® RED96 (ForteBio, Fremont, Califórnia, EUA) de acordo com as instruções do fabricante para determinar associação em tempo real e a dissociação entre um primeiro polipeptídeo de interesse (por exemplo, HBC34v35 compreendendo uma mutação GAALIE) e um segundo polipeptídeo de interesse (por exemplo, FcγRII A (H131), FcγRIIA (R131), FcγRIIIA (F158), FcγRIIIA (V158), ou FcγRIIb) que é capturado em um substrato sensor.

[163] Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação inclui uma porção Fc compreendendo uma mutação GAALIE e aumentou a ligação a um FcγRIIA humano (H131), FcγRIIA humano (R131), FcγRIIIA humano (F158), FcγRIIIA humano (V158), ou qualquer combinação dos mesmos, em comparação com um polipeptídeo de referência que inclui uma porção Fc que não compreende a mutação GAALIE. Em certos exemplos de realização, a ligação reforçada é determinada por um aumento (por exemplo, um ou mais dentre: um sinal de pico mais alto; uma taxa maior de associação; uma taxa mais lenta de dissociação; uma área maior sob a curva) no deslocamento do sinal em relação à proteína de ligação de referência em um ensaio BLI. Em certos exemplos de realização, o ensaio BLI compreende o uso do instrumento Octet®RED96 (ForteBio, Fremont, Califórnia USA). Em outros exemplos de realização, o ensaio BLI compreende um FcγR humano marcado capturado em um sensor anti-penta-tag e exposto à proteína de ligação. Em alguns exemplos de realização, a proteína de ligação compreende um Fab de IgG e o ensaio BLI compreende ainda expor o FcγR humano capturado à proteína de ligação na presença de um fragmento de ligação Fab anti-IgG para reticular as proteínas de ligação através do fragmento Fab.

[164] Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação inclui uma porção Fc que compreende uma mutação GAALIE e tem ligação aumentada a um FcγRIIA humano (H131), FcγRIIA humano (R131), FcγRIIIA humano (F158) e/ou FcγRIIIA (V158) humano em comparação com um polipeptídeo de referência, em que a ligação aumentada pode compreender um deslocamento de sinal (nanômeros) em um ensaio BLI que é 1,5, 2, 2,5, 3 ou mais vezes maior do que deslocamento de sinal observado usando a proteína de ligação de referência.

[165] Em alguns exemplos de realização, uma proteína de ligação inclui uma porção Fc compreendendo uma mutação GAALIE e ligação aumentada a um FcγRIIA humano (H131), FcγRIIA humano (R131), FcγRIIIA (F158) humano e FcγRIIIA humano (V158), em comparação com um polipeptídeo de referência.

[166] Em qualquer um dos exemplos de realização aqui divulgados, uma proteína de ligação inclui uma porção Fc que compreende uma mutação GAALIE e tem uma ligação reduzida ao FcγRIIB humano, em comparação com um polipeptídeo de referência. Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação inclui uma porção Fc compreendendo uma mutação GAALIE e não se liga a um FcγRII B humano, conforme determinado, por exemplo, pela ausência de um deslocamento de sinal estatisticamente significativa em relação à linha basal em um ensaio BLI.

[167] Em qualquer um dos exemplos de realização aqui divulgados, uma proteína de ligação inclui uma porção Fc que compreende uma mutação GAALIE e tem uma ligação reduzida ao C1q humano (proteína do complemento), em comparação com um polipeptídeo de referência. Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação inclui uma porção Fc compreendendo uma mutação GAALIE e não se liga ao C1q humano, conforme determinado pela ausência de um deslocamento de sinal estatisticamente significativa em relação à linha basal em um ensaio BLI.

[168] Em qualquer um dos exemplos de realização divulgado, uma proteína de ligação inclui uma porção Fc compreendendo uma mutação GAALIE e ativa um FcγRIIA humano, um FcγRIIIA humano, ou ambos, em um grau maior do que um polipeptídeo de referência. (isto é, um polipeptídeo, que pode ser uma proteína de ligação específica para HbsAg, que inclui uma porção Fc que não compreende a mutação GAALIE). Em certos exemplos de realização, o polipeptídeo de referência inclui uma porção Fc que é uma porção Fc tipo selvagem ou que compreende uma ou mais mutações de substituição, desde que a mutação de substituição não seja GAALIE. Em certos exemplos de realização, uma proteína de ligação compreende anticorpo HBC34–V35 com uma mutação GAALIE (e opcionalmente outras mutações de substituição, como, por exemplo, MLNS), e um polipeptídeo de referência é HBC34–V35 com uma porção Fc tipo selvagem.

[169] A ativação de um FcγR humano pode ser determinada ou detectada utilizando métodos conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, um ensaio de biorrepóter comercialmente disponível e bem validado envolve a incubação de uma proteína de ligação específica para HBsAg com um HBsAg recombinante (Engerix B, GlaxoSmithKline) na presença de células efetoras Jurkat (Promega; Cat. No: G9798) expressando estavelmente (i) um FcγR de interesse e (ii) luciferase de vaga-lume repórter sob o controle de um elemento de resposta NFAT. A ligação de Fc ao FcγR expresso na superfície celular leva a expressão mediada por NFAT do gene repórter da luciferase. A luminescência é então medida com um luminômetro (por exemplo, Bio-Tek) usando o reagente do ensaio Bio-Glo-® Luciferase Assay (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. A ativação é expressa como a média das unidades de luminescência relativa (RLU) sobre o fundo aplicando a seguinte fórmula: (RLU na concentração [x] da proteína de ligação (por exemplo, mAbs) – RLU do fundo).

[170] Em alguns exemplos de realização, uma proteína de ligação inclui uma porção Fc compreendendo uma mutação GAALIE ativa um FcγRIIA humano (H131), FcγRIIA humano (R131), FcγRIIIA humano (F158) e/ou FcγRIIIA humano (V158) em um grau maior do que um polipeptídeo de referência. Em certos exemplos de realização, um grau de ativação maior refere-se a um pico de luminescência mais alto e/ou uma área sob a curva da luminescência maior, conforme determinado usando um ensaio de luminescência biorrepórter conforme descrito na presente invenção. Em alguns exemplos de realização, uma proteína de ligação inclui uma porção Fc compreendendo uma mutação GAALIE e ativa um FcγRIIA humano (H131), um FcγRIIA humano (R131) e um FcγRIIIA (F158) humano em um maior grau do que um polipeptídeo de referência, em que o maior grau de ativação compreende a um pico de RLU que é 1,5, 2, 2,5, 3, ou mais vezes maior do que o pico de RLU observado utilizando a proteína de ligação de referência.

[171] Em qualquer um dos exemplos de realização aqui divulgados, uma proteína de ligação inclui uma porção Fc compreendendo uma mutação GAALIE que não ativa um FcγRIIB humano, conforme determinado pela ausência de RLU estatisticamente significativa e/ou mensurável em um ensaio de luminescência biorrepórter, conforme descrito acima.

[172] Em qualquer um dos exemplos de realização aqui divulgados, uma proteína de ligação inclui uma porção Fc compreendendo uma mutação GAALIE e ativa uma célula assassina natural (NK, do inglês natural killer) na presença de HBsAg em um grau maior do que um polipeptídeo de referência. Em certos exemplos de realização, a ativação de uma célula NK é determinada pela expressão de CD107a (por exemplo, por citometria de fluxo).

Em certos exemplos de realização, a célula NK compreende uma célula NK que tem um genótipo homozigótico V158/V158, um genótipo homozigótico F158/F158, ou um genótipo heterozigótico V158/F158 de FcγRIIIa.

[173] Será compreendido que qualquer proteína de ligação incluindo uma porção Fc compreendendo uma mutação GAALIE de acordo com a presente divulgação pode realizar ou possuir qualquer uma ou mais das características aqui descritas; por exemplo, ligação aumentada a um FcγRIIA humano e/ou FcγRIIIA humano em comparação com um polipeptídeo de referência; ligação reduzida a um FcγRIIB humano em comparação com um polipeptídeo de referência (e/ou nenhuma ligação a um FcγRIIB humano); ligação reduzida ao C1q humano em comparação com um polipeptídeo de referência (e/ou não a ligação a um C1q humano); ativação de FcγRIIA, FcγRIIIA humano, ou ambos, em um grau maior do que um polipeptídeo de referência; não ativação de um FcγRIIB humano; e/ou ativação de uma células natural killer (NK) humana na presença de HBsAg em um grau maior do que um polipeptídeo de referência (por exemplo, um anticorpo que é específico para HBsAg e inclui uma porção Fc que não compreende uma mutação GAALIE).

[174] Em alguns exemplos de realização, uma proteína de ligação da presente divulgação inclui uma porção Fc compreendendo uma mutação GAALIE e: (i) tem ligação aumentada para FcγRIIA humano, FcγRIIIA humano ou ambos, em comparação com um polipeptídeo de referência que inclui uma porção Fc que não compreende G236A/A330L/I332E, em que o

FcγRIIA humano é opcionalmente H131 ou R131 e/ou o FcγRIIIA humano é opcionalmente F158 ou V158; (ii) tem ligação aumentada para um FcγRIIB humano, em comparação com um polipeptídeo de referência que inclui uma porção Fc que não compreende G236A/A330L/I332E; (iii) não se liga a um

FcγRIIB humano; (iv) tem ligação reduzida a um C1q humano, em comparação com um polipeptídeo de referência que inclui uma porção Fc que não compreende G236A/A330L/I332E; (v) não se liga ao C1q humano; (vi) ativa um

FcγRIIA, um FcγRIIIA humano, ou ambos, em maior grau do que um polipeptídeo de referência que inclui uma porção Fc que não compreende

G236A/A330L/I332E, em que o FcγRIIA humano é opcionalmente H131 ou

R131 e/ou o FcγRIIIA humano é opcionalmente F158 ou V158; (vii) não ativa um FcγRIIB humano; (viii) ativa uma células natural killer (NK) humana na presença de HBsAg em um grau maior do que um polipeptídeo de referência que inclui uma porção Fc que não compreende G236A/A330L/I332E, em que o polipeptídeo de referência é opcionalmente um anticorpo que se liga a um

HBAg, opcionalmente um HBsAg; (ix) tem um EC50 HBsAg de cerca de 12,75 ng/mL a cerca de 19,9 ng/mL, ou de cerca de 12,75 ng/mL a cerca de 12,84 ng/mL, ou cerca de 12,79 ng/mL, ou de cerca de 16,22 ng/mL a cerca de 19,9 ng/mL, ou cerca de 17,97 ng/mL, e/ou (b) tem um EC50 HBeAg de cerca de

10,78 ng/mL a cerca de 13,72 ng/mL, ou de cerca de 10,78 ng/mL a cerca de

10,93 ng/mL, ou cerca de 10,85 ng/mL, ou de cerca de 11,59 ng/mL a cerca de

13,72 ng/mL, ou cerca de 12,61 ng/mL, em que o HBV é opcionalmente HBV

Genótipo D, e em que o valor de EC50 é opcionalmente determinado in vitro medindo HBsAg ou HBeAg, respectivamente, secretado por células HepG2 superexpressando NTCP e infectadas com o HBV, no dia 7 após a administração do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno às células HepG2; (x) tem um EC50 HBsAg de cerca de 10,43 ng/mL a cerca de 22,41 ng/mL, ou cerca de 13,81 ng/mL a cerca de 16,56 ng/mL, ou cerca de 15,12 ng/mL, ou de cerca de 12,24 ng/mL a cerca de 22,41 ng/mL, ou cerca de 16,56 ng/mL, ou de cerca de 10,43 ng/mL a cerca de 20,08 ng/mL, ou cerca de 14,47 ng/mL, e/ou (b) tem um EC50 HBeAg de cerca de 10,39 ng/mL a cerca de 13,99 ng/mL, ou de cerca de 10,63 ng/mL a cerca de 10,66 ng/mL, ou cerca de 10,64 ng/mL, ou de cerca de 10,39 ng/mL a cerca de 10,60 ng/mL, ou cerca de 10,49 ng/mL, ou de cerca de 13,25 ng/mL a cerca de 13,99 ng/mL, ou cerca de 13,61 ng/mL, em que o HBV é opcionalmente HBV Genótipo D, e em que o EC 50 é opcionalmente determinado in vitro medindo HBsAg ou HBeAg,

respectivamente, secretado por células HepG2 superexpressando NTCP e infectadas com o HBV, no dia 7 após a administração do anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno às células HepG2; (xi) é capaz de se ligar a uma variante de HBsAg que compreende HBsAg-Y100C/P120T, HBsAg-

P120T, HBsAg-P120S/S143L, HBsAg-C121S, HBsAg-R122D, HBsAg-R122I,

HBsAg-T123N, HBsAg-Q129H, HBsAg-Q129L, HBsAg-M133H, HBsAg-M133L,

HBsAg-M133T, HBsAg-K141E, HBsAg-P142S, HBsAg-S143K, HBsAg-D144A,

HBsAg-G145R, HBsAg-N146A, ou qualquer combinação dos mesmos; (xii) tem ligação aumentada a uma variante de HBsAg que compreende HBsAg-

Y100C/P120T, HBsAg-P120T, HBsAg-P120S/S143L, HBsAg-C121S, HBsAg-

R122D, HBsAg-R122I, HBsAg-T123N, HBsAg-Q129H, HBsAg-Q129L, HBsAg-

M133H, HBsAg-M133L, HBsAg-M133T, HBsAg-K141E, HBsAg-P142S, HBsAg-

S143K, HBsAg-D144A, HBsAg-G145R, HBsAg-N146A, ou qualquer combinação destes; em comparação com um anticorpo de referência ou fragmento de ligação de antígeno que se liga ao HBsAg e que inclui uma porção Fc que não inclui o G236A/A330L/I332E; e/ou (xiii) é capaz de neutralizar (a) um HBV de genótipo A com um EC50 de cerca de 2,34 ng/mL; (b)

um VHB do genótipo B com um EC50 de cerca de 2,22 ng/mL; (c) um VHB do genótipo C com um EC50 de cerca de 0,92 ng/mL; (d) um VHB do genótipo D com um EC50 de cerca de 1,10 ng/mL; (e) um VHB do genótipo E com um EC 50 de cerca de 1,12 ng/mL; (f) um VHB do genótipo F com um EC50 de cerca de 1,93 ng/mL; (g) um VHB do genótipo G com um EC50 de cerca de 1,43 ng/mL; e/ou (h) um HBV do genótipo H com um EC50 de cerca de 1,93 ng/mL, em que o EC50 é opcionalmente determinado usando um HDV recombinante concebido para expressar um HBsAg do genótipo HBV.

[175] Alternativamente ou adicionalmente, a porção Fc de uma proteína de ligação da divulgação pode compreender pelo menos uma porção conhecida no estado da técnica como sendo necessária para a ligação da Proteína A; e/ou a porção Fc de um anticorpo da divulgação compreende pelo menos a porção de uma molécula Fc conhecida no estado da técnica como sendo necessária para a ligação da proteína G. Em alguns exemplos de realização, uma função retida compreende a depuração de HBsAg e HBVg.

Consequentemente, em certos exemplos de realização, uma porção Fc compreende pelo menos uma porção conhecida no estado da técnica como sendo necessária para a ligação de FcγR. Conforme descrito acima, uma fração Fc pode compreender assim (i) o sítio de dobradiça inferior de Fc de IgG nativa, em particular os resíduos de aminoácidos L, L, G, G (234–237, numeração EU) e (ii) a região adjacente do domínio CH2 de Fc de IgG nativa, em particular uma alça e filamentos no domínio CH2 superior adjacente à região de dobradiça inferior, por exemplo, em uma região de P331, por exemplo, uma região de pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos consecutivos no domínio CH2 superior de Fc de IgG nativa em torno de P331, por exemplo, entre os aminoácidos 320 e 340 (numeração EU) de Fc de IgG nativa.

[176] Em alguns exemplos de realização, uma proteína de ligação de acordo com a presente divulgação compreende uma região Fc. Conforme utilizado na presente invenção, o termo “região Fc” refere-se à porção de uma imunoglobulina formada por duas ou mais porções Fc de cadeias pesadas de anticorpo. Por exemplo, uma região Fc pode ser monomérica ou região Fc “de cadeia única” (isto é, uma região scFc). As regiões Fc de cadeia única são compostas por porções Fc ligadas dentro de uma única cadeia polipeptídica (por exemplo, codificada em uma única sequência de ácido nucleico contígua). As regiões scFc exemplares são divulgadas no documento WO 2008/143954 A2 e são incorporadas ao presente por referência. A região Fc pode ser ou compreender uma região Fc dimérica.

Uma “região Fc dimérica” ou “dcFc” refere-se ao dímero formado pelas porções Fc de duas cadeias pesadas de imunoglobulina separadas. A região Fc dimérica pode ser um homodímero de duas frações Fc idênticas (por exemplo, uma região Fc de uma imunoglobulina de ocorrência natural) ou um heterodímero de duas frações Fc não idênticas (por exemplo, um monômero Fc da região Fc dimérica compreende pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, substituição, deleção, inserção ou modificação química) que não está presente no outro monômero Fc, ou um monômero Fc pode ser truncado em comparação ao outro).

[177] Exemplos de realização específicos incluem os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno possuindo uma cadeia pesada (por exemplo, VH–dobradiça- CH1–CH2–CH3), de acordo com a SEQ ID NO: 91 ou SEQ ID NO: 92 ou SEQ ID NO: 138, e aqueles que têm uma cadeia leve (ou seja, VL–CL) de acordo com a SEQ ID NO: 93 ou SEQ ID NO: 94. Em certos exemplos de realização, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 91 e uma cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 93. Em outros exemplos de realização, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 92 e uma cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 94. Em outros exemplos de realização, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 91 e uma cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO:

94. Em outros exemplos de realização, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 92 e uma cadeia leve de acordo com a SEQ ID NO: 93. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende ou consiste em uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 129. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende ou consiste em uma cadeia pesada de acordo com a SEQ ID NO: 138 e, opcionalmente, uma cadeia leve de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 93 ou 94. Essas sequências são fornecidas na Listagem de Sequências.

[178] As porções Fc aqui divulgadas podem compreender sequências Fc ou regiões da mesma ou diferentes classe e/ou subclasses. Por exemplo, as porções Fc podem ser derivadas de uma imunoglobulina (por exemplo, uma imunoglobulina humana) de uma subclasse IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, ou de qualquer combinação das mesmas. Em certos exemplos de realização, as porções Fc da região Fc são da mesma classe e subclasse. No entanto, a região Fc (ou uma ou mais porções Fc de uma região Fc) também pode ser quimérica, em que uma região Fc quimérica pode compreender porções Fc derivadas de diferentes classes e/ou subclasses de imunoglobulina.

Por exemplo, pelo menos duas das porções Fc de uma região Fc dimérica ou de cadeia única podem ser de diferentes classes e/ou subclasses de imunoglobulina. Em certos exemplos de realização, uma região Fc dimérica pode compreender sequências de dois ou mais isotipos ou subclasses diferentes; por exemplo, um SEEDbody (“strand-exchange engineered domains”), consulte Davis et al., Protein Eng. Des. Sel. 23 (4): 195 (2010).

[179] Adicionalmente ou alternativamente, as regiões Fc quiméricas podem compreender uma ou mais porções Fc quiméricas. Por exemplo, a região ou porção Fc quimérica pode compreender uma ou mais porções derivadas de uma imunoglobulina de uma primeira subclasse (por exemplo, subclasse IgG1, IgG2 ou IgG3) enquanto o restante da região Fc ou porção é de uma subclasse diferente. Por exemplo, uma região Fc ou porção de um polipeptídeo Fc pode compreender um domínio CH2 e/ou CH3 derivado de uma imunoglobulina de uma primeira subclasse (por exemplo, uma subclasse IgG1, IgG2 ou IgG4) e uma região dobradiça de uma imunoglobulina de um segundo subclasse (por exemplo, uma subclasse IgG3). Por exemplo, a região Fc ou porção pode compreender uma dobradiça e/ou domínio CH2 derivado de uma imunoglobulina de uma primeira subclasse (por exemplo, uma subclasse IgG4) e um domínio CH3 de uma imunoglobulina de uma segunda subclasse (por exemplo, uma subclasse IgG1, IgG2 ou IgG3). Por exemplo, a região Fc quimérica pode compreender uma porção Fc (por exemplo, uma porção Fc completa) de uma imunoglobulina para uma primeira subclasse (por exemplo, de uma subclasse IgG4) e uma porção Fc de uma imunoglobulina de uma segunda subclasse (por exemplo, de uma Subclasse IgG1, IgG2 ou IgG3).

Por exemplo, a região ou porção Fc pode compreender um domínio CH2 de uma imunoglobulina IgG4 e um domínio CH3 de uma imunoglobulina IgG1. Por exemplo, a região ou porção Fc pode compreender um domínio CH1 e um domínio CH2 de uma molécula de IgG4 e um domínio CH3 de uma molécula de IgG1. Por exemplo, a região ou porção Fc pode compreender uma porção de um domínio CH2 de uma determinada subclasse de anticorpo, por exemplo, posições EU 292–340 de um domínio CH2. Por exemplo, uma região Fc ou fração pode compreender aminoácidos nas posições 292–340 de CH2 derivados de uma fração IgG4 e o restante da CH2 derivado de uma fração IgG1 (alternativamente, 292–340 de CH2 pode ser derivado de uma fração IgG1 e o restante de CH2 derivado de uma porção de IgG4).

[180] Também será apreciado que qualquer anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou região ou porção Fc da presente divulgação pode ser de qualquer alótipo e/ou haplótipo. Por exemplo, alótipos de imunoglobulina G humana incluem aqueles divulgados em Jefferis e LeFranc, mAbs 1 (4): 1–7 (2009), cujos alótipos (incluindo G1m (1(a); 2(x); 3(f); e 17(z)); G2m (23(n)); G3m (21(g1); 28(g5); 11(b0); 5(b2); 13(b3); 14(b4); 10(b5); 15(s); 16(t); 6(c3); 24(c5); 26(u); e 27(v)); A2m (1 e 2); e Km (1; 2; e 3) e haplótipos e sequências de aminoácidos resultantes, e combinações dos mesmos, são incorporados ao presente por referência. Em certos exemplos de realização, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou região ou porção Fc da presente divulgação compreende um alótipo IgG1 g1m17, k1.

[181] Além disso, uma região ou porção Fc pode (adicionalmente ou alternativamente) compreender, por exemplo, uma região de dobradiça quimérica. Por exemplo, a dobradiça quimérica pode ser derivada, por exemplo, em parte, de uma molécula de IgG1, IgG2 ou IgG4 (por exemplo, uma sequência de dobradiça média superior e inferior) e, em parte, de uma molécula de IgG3 (por exemplo, uma sequência de dobradiça média). Em outro exemplo, uma região Fc ou fração pode compreender uma dobradiça quimérica derivada, em parte, de uma molécula de IgG1 e, em parte, de uma molécula de IgG4. Em outro exemplo, a dobradiça quimérica pode compreender domínios de dobradiça superior e inferior de uma molécula de IgG4 e um domínio de dobradiça médio de uma molécula de IgG1. Essa dobradiça quimérica pode ser feita, por exemplo, pela introdução de uma substituição de prolina (Ser228Pro) na posição EU 228 no domínio de dobradiça médio de uma região de dobradiça de IgG4. Em outro exemplo de realização, a dobradiça quimérica pode compreender aminoácidos nas posições EU 233–236 de um anticorpo IgG2 e/ou a mutação Ser228Pro, em que os aminoácidos restantes da dobradiça são de um anticorpo IgG4 (por exemplo, uma dobradiça quimérica de sequência ESKYGPPCPPCPAPPVAGP). Outras regiões de dobradiça quiméricas que podem ser usadas na porção Fc do anticorpo de acordo com a presente divulgação estão descritas no documento US 2005/0163783 A1.

[182] Em alguns exemplos de realização das proteínas de ligação divulgadas na presente invenção, a porção Fc, ou a região Fc, compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos derivada de uma sequência de imunoglobulina humana (por exemplo, a partir de uma região Fc ou porção Fc de uma molécula de IgG humana). Entretanto, os polipeptídeos podem compreender um ou mais aminoácidos de outra espécie de mamífero.

Por exemplo, uma porção Fc de primata ou um sítio de ligação de primata podem ser incluídos nos polipeptídeos em questão. Alternativamente, um ou mais aminoácidos murinos podem estar presentes na porção Fc ou na região Fc.

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO

[183] Em outro aspecto, a divulgação fornece uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que codifica um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou proteína de fusão de acordo com a presente divulgação.

[184] A Tabela 4 mostra sequências de nucleotídeos que codificam VH–, VL–, CH–, CL–-, HC - e LC exemplares de acordo com a presente divulgação: Tabela 4. Descrição da

SEQ sequência de ácido Sequência nucleotídica ID NO: nucleico de anticorpo VH de HBC34-V7, GAGCTGCAGCTGGTGGAGTCCGGCGG HBC34-V35, e HBC34- CGGCTGGGTGCAGCCTGGCGGCTCCC V34 AGAGGCTGAGCTGTGCCGCTTCTGGCA 103

GGATCTTCCGGTCCTTTTACATGTCTTG (códon-otimizado)

GGTGCGGCAGGCTCCAGGCAAGGGCC TGGAGTGGGTGGCTACCATCAACCAGG

Descrição da

SEQ sequência de ácido Sequência nucleotídica ID NO: nucleico de anticorpo

ACGGCTCCGAGAAGCTGTATGTGGATA GCGTGAAGGGCAGATTCACAATCTCTC GCGACAACGCCAAGAACTCCCTGTTTCT GCAGATGAACAATCTGAGGGTGGAGGA TACCGCCGTGTACTATTGCGCCGCTTG GTCTGGCAATAGCGGCGGCATGGACGT GTGGGGACAGGGCACCACCGTGTCCGT

GTCCAGC HBC34-V34 VL AGCTACGAGCTGACACAGCCCCCTTCC (códon-otimizado) GTGTCCGTGTCCCCTGGACAGACCGTG

TCCATCCCATGCAGCGGCGACAAGCTG GGCAACAAGAACGTGTCCTGGTTTCAG CATAAGCCTGGCCAGTCCCCCGTGCTG

GTCATCTACGAGGTGAAGTATAGGCCC 104

AGCGGCATCCCTGAGCGGTTCTCTGGC TCCAACAGCGGCAATACAGCCACCCTG ACAATCTCTGGCACACAGGCTATGGAC GAGGCCGCTTATTTCTGCCAGACCTTTG ATTCCACCACAGTGGTGTTCGGCGGCG

GCACCAGACTGACAGTGCTG HBC34-V35 VL AGCTACGAGCTGACACAGCCCCCTTCC (códon-otimizado) GTGTCCGTGTCCCCTGGACAGACCGTG

TCCATCCCATGCAGCGGCGACAAGCTG GGCAACAAGAACGTGGCCTGGTTTCAG CATAAGCCTGGCCAGTCCCCCGTGCTG

GTCATCTACGAGGTGAAGTATAGGCCC 105

AGCGGCATCCCTGAGCGGTTCTCTGGC TCCAACAGCGGCAATACAGCCACCCTG ACAATCTCTGGCACACAGGCTATGGAC GAGGCCGCTTATTTCTGCCAGACCTTTG ATTCCACCACAGTGGTGTTCGGCGGCG GCACCAGACTGACAGTGCTG

Descrição da

SEQ sequência de ácido Sequência nucleotídica ID NO: nucleico de anticorpo HBC34-V7 VL AGCTACGAGCTGACACAGCCCCCTTCC (códon-otimizado) GTGTCCGTGTCCCCTGGACAGACCGTG

TCCATCCCATGCAGCGGCGACAAGCTG GGCAACAAGAACGTGTGCTGGTTTCAG CATAAGCCTGGCCAGTCCCCCGTGCTG

GTCATCTACGAGGTGAAGTATAGGCCC 110

GCACCAGACTGACAGTGCTG HBC24 VH gaggtgcagttgttggagtctgggggaggcttggtacagc (tipo selvagem) ctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctGGAT CCACTTTTACCAAATATGCCatgagctgggtc cgtcaggctccagggaaggggctggagtgggtcgcaag tATTAGTGGAAGTgttcctggttttGGTATTGAC 106 ACAtactacgcagactccgttaagggccggttcaccatct ccagagacacttccaagaacaccctgtatctgcaaatga acagcctgagagccgaggacacggccttatattactgtG

CGAAAGATGTCGGGGTTATCGGGTCAT ACTATTACTACGCTATGGACGTCtggggtc aa HBC24 VL aaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctcc (tipo selvagem) aggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtCAG GGTCTTAGCAGCAGTTACttagcctggtacca gcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatAG 107 TGCGTCCaccagggccactggcatcccagacaggtt cagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatc agcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtCA

ACAGTATGCTTACTCACCTCGGTGGAC Gttcggccaagggaccaaggtggagatcaaac

Descrição da

SEQ sequência de ácido Sequência nucleotídica ID NO: nucleico de anticorpo HBC24 VH GAGGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGCGG (códon-otimizado) CGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCTCCC

TGAGGCTGTCTTGCGCCGCCTCTGGCA GCACCTTCACAAAGTATGCAATGTCTTG GGTGCGCCAGGCACCAGGCAAGGGCC TGGAGTGGGTGGCCTCCATCTCTGGCA

GCGTGCCTGGCTTCGGCATCGACACCT 108 ACTATGCCGATTCCGTGAAGGGCCGGT

TTACAATCAGCAGAGACACCTCCAAGAA CACACTGTATCTGCAGATGAATTCTCTG CGGGCCGAGGACACCGCCCTGTACTAT TGTGCCAAGGATGTGGGCGTGATCGGC AGCTACTATTACTATGCAATGGACGTGT GGGGACAGGGAACAGCAGTGACAGTGA

GCTCC HBC24 VL GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTGGC (códon-otimizado) ACACTGTCCCTGTCCCCTGGAGAGAGA

GCCACCCTGTCCTGCAGAGCCTCTCAG GGCCTGAGCTCCTCTTACCTGGCCTGG TATCAGCAGAAGCCTGGACAGGCCCCT

CGGCTGCTGATCTACTCTGCCTCCACC 109 AGAGCAACAGGCATTCCTGACCGCTTC

TCCGGATCTGGAAGCGGCACAGACTTC ACCCTGACAATCAGCCGGCTGGAGCCT GAGGACTTCGCCGTGTACTATTGTCAG CAGTACGCCTATTCCCCAAGGTGGACC TTTGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATC

AAG HBC34-V7, HBC34- GCCTCCACAAAGGGCCCAAGCGTGTTT V34, HBC34-V35 CCACTGGCTCCCTCTTCCAAGTCTACCT 130 CH1-dobradiça-CH2- CCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGATGTC

TGGTGAAGGATTACTTCCCAGAGCCCG

Descrição da

SEQ sequência de ácido Sequência nucleotídica ID NO: nucleico de anticorpo CH3 (códon-otimizado) TGACCGTGTCTTGGAACTCCGGCGCCC

TGACCAGCGGAGTGCATACATTTCCAG CTGTGCTGCAGAGCTCTGGCCTGTACT CTCTGTCCAGCGTGGTGACCGTGCCCT CTTCCAGCCTGGGCACCCAGACATATAT CTGCAACGTGAATCACAAGCCAAGCAAT ACAAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCC AAGTCTTGTGATAAGACCCATACATGCC CTCCATGTCCAGCTCCAGAGCTGCTGG GCGGCCCAAGCGTGTTCCTGTTTCCAC CCAAGCCTAAGGATACCCTGATGATCTC CAGAACCCCCGAGGTGACATGCGTGGT GGTGGACGTGAGCCACGAGGATCCTGA GGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGG CGTGGAGGTGCATAATGCTAAGACCAA GCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCTAC CTATCGGGTGGTGTCCGTGCTGACAGT GCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAA GGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAATAAG GCCCTGCCCGCTCCTATCGAGAAGACC ATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGA GAGCCACAGGTGTACACACTGCCTCCA TCTCGCGATGAGCTGACCAAGAACCAG GTGTCCCTGACATGTCTGGTGAAGGGC TTCTATCCTTCCGACATCGCTGTGGAGT GGGAGAGCAATGGCCAGCCAGAGAACA ATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGG ACAGCGATGGCTCTTTCTTTCTGTATAG CAAGCTGACCGTGGACAAGTCTCGCTG GCAGCAGGGCAACGTGTTTAGCTGTTC TGTGATGCATGAGGCCCTGCACAATCAT TATACACAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTC

Descrição da

SEQ sequência de ácido Sequência nucleotídica ID NO: nucleico de anticorpo

CTGGCAAG HBC34-V7, HBC34- GAGCTGCAGCTGGTGGAGTCCGGCGG V34, HBC34-V35 CGGCTGGGTGCAGCCTGGCGGCTCCC HC (VH-CH1- AGAGGCTGAGCTGTGCCGCTTCTGGCA

GGATCTTCCGGTCCTTTTACATGTCTTG dobradiça-CH2-CH3)

GGTGCGGCAGGCTCCAGGCAAGGGCC (códon-otimizado)

TGGAGTGGGTGGCTACCATCAACCAGG ACGGCTCCGAGAAGCTGTATGTGGATA GCGTGAAGGGCAGATTCACAATCTCTC GCGACAACGCCAAGAACTCCCTGTTTCT GCAGATGAACAATCTGAGGGTGGAGGA TACCGCCGTGTACTATTGCGCCGCTTG GTCTGGCAATAGCGGCGGCATGGACGT GTGGGGACAGGGCACCACCGTGTCCGT GTCCAGCGCCTCCACAAAGGGCCCAAG

CGTGTTTCCACTGGCTCCCTCTTCCAAG 131 TCTACCTCCGGCGGCACAGCCGCTCTG

GGATGTCTGGTGAAGGATTACTTCCCA GAGCCCGTGACCGTGTCTTGGAACTCC GGCGCCCTGACCAGCGGAGTGCATACA TTTCCAGCTGTGCTGCAGAGCTCTGGC CTGTACTCTCTGTCCAGCGTGGTGACC GTGCCCTCTTCCAGCCTGGGCACCCAG ACATATATCTGCAACGTGAATCACAAGC CAAGCAATACAAAGGTGGACAAGAAGG TGGAGCCCAAGTCTTGTGATAAGACCC ATACATGCCCTCCATGTCCAGCTCCAGA GCTGCTGGGCGGCCCAAGCGTGTTCCT GTTTCCACCCAAGCCTAAGGATACCCTG ATGATCTCCAGAACCCCCGAGGTGACA TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAG GATCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTAC

Descrição da

SEQ sequência de ácido Sequência nucleotídica ID NO: nucleico de anticorpo

GTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCT AAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTAC AACTCTACCTATCGGGTGGTGTCCGTG CTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTG AACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTG TCTAATAAGGCCCTGCCCGCTCCTATCG AGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCC AGCCTAGAGAGCCACAGGTGTACACAC TGCCTCCATCTCGCGATGAGCTGACCA AGAACCAGGTGTCCCTGACATGTCTGG TGAAGGGCTTCTATCCTTCCGACATCGC TGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCC AGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCT GTGCTGGACAGCGATGGCTCTTTCTTTC TGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGT CTCGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTTA GCTGTTCTGTGATGCATGAGGCCCTGC ACAATCATTATACACAGAAGTCCCTGAG CCTGTCTCCTGGCAAGTGATGAGGTAC CGTGCGACGGCCGGCAAGCCCCCGCT CCCCGGGCTCTCGCGGTCGTACGAGGA

AAGCTT HBC34-V7 CL GGACAGCCAAAGGCTGCTCCATCTGTG (códon-otimizado) ACCCTGTTTCCACCCTCTTCCGAGGAG

CTGCAGGCCAACAAGGCCACCCTGGTG TGCCTGATCTCTGACTTCTACCCTGGAG

CTGTGACAGTGGCTTGGAAGGCTGATA 132

GCTCTCCCGTGAAGGCTGGCGTGGAGA CAACAACCCCTAGCAAGCAGTCTAACAA TAAGTACGCCGCTTCCAGCTATCTGTCT CTGACACCAGAGCAGTGGAAGTCCCAC CGCTCTTATTCCTGCCAGGTGACCCATG

Descrição da

SEQ sequência de ácido Sequência nucleotídica ID NO: nucleico de anticorpo

AGGGCAGCACCGTGGAGAAGACAGTG

GCCCCCACCGAGTGTTCT HBC34-V7 LC AGCTACGAGCTGACACAGCCCCCTTCC (VL-CL) (códon- GTGTCCGTGTCCCCTGGACAGACCGTG otimizado) TCCATCCCATGCAGCGGCGACAAGCTG

GGCAACAAGAACGTGTGCTGGTTTCAG CATAAGCCTGGCCAGTCCCCCGTGCTG GTCATCTACGAGGTGAAGTATAGGCCC AGCGGCATCCCTGAGCGGTTCTCTGGC TCCAACAGCGGCAATACAGCCACCCTG ACAATCTCTGGCACACAGGCTATGGAC GAGGCCGCTTATTTCTGCCAGACCTTTG ATTCCACCACAGTGGTGTTCGGCGGCG

GCACCAGACTGACAGTGCTGGGACAGC 133

CAAAGGCTGCTCCATCTGTGACCCTGTT TCCACCCTCTTCCGAGGAGCTGCAGGC CAACAAGGCCACCCTGGTGTGCCTGAT CTCTGACTTCTACCCTGGAGCTGTGACA GTGGCTTGGAAGGCTGATAGCTCTCCC GTGAAGGCTGGCGTGGAGACAACAACC CCTAGCAAGCAGTCTAACAATAAGTACG CCGCTTCCAGCTATCTGTCTCTGACACC AGAGCAGTGGAAGTCCCACCGCTCTTA TTCCTGCCAGGTGACCCATGAGGGCAG CACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCCAC

CGAGTGTTCT HBC34-V34, HBC34- GGACAGCCAAAGGCTGCTCCATCTGTG V35 ACCCTGTTTCCACCCTCTTCCGAGGAG

CL

CTGCAGGCCAACAAGGCCACCCTGGTG (códon-otimizado) 134

TGCCTGATCTCTGACTTCTACCCTGGAG CTGTGACAGTGGCTTGGAAGGCTGATA GCTCTCCCGTGAAGGCTGGCGTGGAGA

Descrição da

SEQ sequência de ácido Sequência nucleotídica ID NO: nucleico de anticorpo

CAACAACCCCTAGCAAGCAGTCTAACAA TAAGTACGCCGCTTCCAGCTATCTGTCT CTGACACCAGAGCAGTGGAAGTCCCAC CGCTCTTATTCCTGCCAGGTGACCCATG AGGGCAGCACCGTGGAGAAGACAGTG

GCCCCCACCGAGTGTTCT HBC34-V34 LC AGCTACGAGCTGACACAGCCCCCTTCC (VL-CL) GTGTCCGTGTCCCCTGGACAGACCGTG (códon-otimizado) TCCATCCCATGCAGCGGCGACAAGCTG

GGCAACAAGAACGTGTCCTGGTTTCAG CATAAGCCTGGCCAGTCCCCCGTGCTG GTCATCTACGAGGTGAAGTATAGGCCC AGCGGCATCCCTGAGCGGTTCTCTGGC TCCAACAGCGGCAATACAGCCACCCTG ACAATCTCTGGCACACAGGCTATGGAC GAGGCCGCTTATTTCTGCCAGACCTTTG ATTCCACCACAGTGGTGTTCGGCGGCG

GCACCAGACTGACAGTGCTGGGACAGC 135

CGAGTGTTCT HBC34-V35 LC AGCTACGAGCTGACACAGCCCCCTTCC 136

GTGTCCGTGTCCCCTGGACAGACCGTG

Descrição da

SEQ sequência de ácido Sequência nucleotídica ID NO: nucleico de anticorpo (VL-CL) (códon- TCCATCCCATGCAGCGGCGACAAGCTG otimizado) GGCAACAAGAACGTGGCCTGGTTTCAG

CATAAGCCTGGCCAGTCCCCCGTGCTG GTCATCTACGAGGTGAAGTATAGGCCC AGCGGCATCCCTGAGCGGTTCTCTGGC TCCAACAGCGGCAATACAGCCACCCTG ACAATCTCTGGCACACAGGCTATGGAC GAGGCCGCTTATTTCTGCCAGACCTTTG ATTCCACCACAGTGGTGTTCGGCGGCG GCACCAGACTGACAGTGCTGGGACAGC CAAAGGCTGCTCCATCTGTGACCCTGTT TCCACCCTCTTCCGAGGAGCTGCAGGC CAACAAGGCCACCCTGGTGTGCCTGAT CTCTGACTTCTACCCTGGAGCTGTGACA GTGGCTTGGAAGGCTGATAGCTCTCCC GTGAAGGCTGGCGTGGAGACAACAACC CCTAGCAAGCAGTCTAACAATAAGTACG CCGCTTCCAGCTATCTGTCTCTGACACC AGAGCAGTGGAAGTCCCACCGCTCTTA TTCCTGCCAGGTGACCCATGAGGGCAG CACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCCAC CGAGTGTTCT

[185] Devido à redundância do código genético, a presente divulgação também compreende variantes de sequência dessas sequências de ácido nucleico e, em particular, tais variantes de sequência, que codificam as mesmas sequências de aminoácidos.

[186] Em certos exemplos de realização, um polinucleotídeo ou molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos compartilhando pelo menos 80% de identidade com a sequência nucleotídica de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 103–110 e 130–136, em que a sequência nucleotídica é o códon-otimizada para expressão por uma célula hospedeira.

[187] Em exemplos de realização específicos, uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente divulgação compreende ou consiste de uma sequência de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 103–110 e 130–136.

[188] Em certos exemplos de realização, um polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a VH de acordo com a SEQ ID NO: 103 e uma sequência de nucleotídeos que codifica a V L de acordo com a SEQ ID NO: 105. Em outros exemplos de realização, um polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a V H de acordo com a SEQ ID NO: 103 e uma sequência de nucleotídeos que codifica a VL de acordo com a SEQ ID NO: 104. Em outros exemplos de realização, um polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a VH de acordo com a SEQ ID NO: 108 e uma sequência de nucleotídeos que codifica a VL de acordo com a SEQ ID NO: 109.

[189] Também são fornecidos aqui polinucleotídeos que codificam um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, em que o polinucleotídeo compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos que codifica a VH de acordo com a SEQ ID NO: 103 e uma sequência de nucleotídeos que codifica a VL de acordo com a SEQ ID NO: 110, em que o anticorpo codificado ou antígeno de ligação se liga ao fragmento da região de alça antigênica de AgsHB e neutraliza a infecção pelo vírus da hepatite B e vírus da hepatite delta.

[190] Em qualquer um dos exemplos de realização divulgados, um polinucleotídeo pode compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica CH1–dobradiça-CH2–CH3 de acordo com a SEQ ID NO: 130, e/ou compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica HC (VH-CH1–

dobradiça-CH3–CH3) de acordo com a SEQ ID NO: 131. Em alguns exemplos de realização, um polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica CL de acordo com a SEQ ID NO: 132 e/ou compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica LC (VL-CL) de acordo com a SEQ ID NO: 133. Em outros exemplos de realização, um polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica CL de acordo com a SEQ ID NO: 134 e/ou compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica LC (VL-CL) de acordo com a SEQ ID NO: 135 ou SEQ ID NO: 136.

VETORES

[191] São adicionalmente incluídos no escopo da invenção os vetores, por exemplo, vetores de expressão, que compreendem uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção.

[192] O termo “vetor” refere-se a uma construção compreendendo uma molécula de ácido nucleico. Um vetor, no contexto da presente invenção, é adequado para incorporar ou abrigar uma sequência de ácidos nucleicos desejada. Tais vetores podem ser vetores de armazenamento, vetores de expressão, vetores de clonagem, vetores de transferência etc. Um vetor de armazenamento é um vetor que permite o armazenamento conveniente de uma molécula de ácido nucleico. Assim, o vetor pode compreender uma sequência que corresponde, por exemplo, a um anticorpo ou fragmento de anticorpo desejado de acordo com a presente invenção.

[193] Conforme utilizado na presente invenção, “vetor de expressão” refere-se a uma construção de DNA contendo uma molécula de ácido nucleico que está operacionalmente ligada a uma sequência de controle adequada capaz de efetuar a expressão da molécula de ácido nucleico em um hospedeiro adequado. Essas sequências de controle incluem um promotor (por exemplo, um promotor heterólogo) para efetuar a transcrição, uma sequência operadora opcional para controlar essa transcrição, uma sequência que codifica sítios de ligação do mRNA ao ribossomo adequados e sequências que controlam o término da transcrição e tradução. Qualquer um dos elementos de um vetor de expressão que contribui para a transcrição de uma molécula de ácido nucleico de interesse pode ser heterólogo para o vetor. O vetor pode ser um plasmídeo, uma partícula de fago, um vírus ou simplesmente uma inserção genômica potencial. Uma vez transformado em um hospedeiro adequado, o vetor pode se replicar e funcionar independentemente do genoma do hospedeiro ou pode, em alguns casos, integrar-se ao próprio genoma. Nos presente relatório descritivo, “plasmídeo”, “plasmídeo de expressão”, “vírus” e “vetor” são frequentemente usados de forma indistinta.

[194] Um vetor de clonagem é tipicamente um vetor que contém um sítio de clonagem, que pode ser usado para incorporar sequências de ácido nucleico no vetor. Um vetor de clonagem pode ser, por exemplo, um vetor plasmidial ou um vetor de bacteriófago.

[195] Um vetor de transferência pode ser um vetor que é adequado para transferir moléculas de ácido nucleico para células ou organismos, por exemplo, vetores virais. Um vetor no contexto da presente divulgação pode ser, por exemplo, um vetor de RNA ou um vetor de DNA. Um vetor pode ser uma molécula de DNA. Por exemplo, um vetor no sentido do presente pedido compreende um sítio de clonagem, um marcador de seleção, tal como um fator de resistência a antibióticos, e uma sequência adequada para a multiplicação do vetor, como uma origem de replicação. Em alguns exemplos de realização, um vetor no contexto do presente pedido é um vetor plasmidial. Em alguns desses exemplos de realização, um vetor compreende um vetor lentiviral ou um vetor retroviral.

CÉLULAS

[196] Em outro aspecto, a presente divulgação também fornece uma célula (também referida como “célula hospedeira”) que expressa um anticorpo, fragmento de ligação a antígeno, ou proteína de fusão de acordo com a presente invenção; e/ou que compreende um vetor ou polinucleotídeo de acordo com a presente invenção.

[197] Exemplos de tais células incluem, mas não estão limitados a, células eucarióticas, por exemplo, células de levedura, células animais, células de inseto, células vegetais; e células procarióticas, incluindo E. coli. Em alguns exemplos de realização, as células são células de mamíferos. Em certos exemplos de realização, as células são uma linhagem de células de mamífero, como células CHO (por exemplo, células DHFR-CHO (Urlaub et al., PNAS 77: 4216 (1980), CHO-KSV), células renais embrionárias humanas (por exemplo, células HEK293T), células PER.C6, células Y0, células Sp2/0, células NS0, células de fígado humano, por exemplo, células Hepa RG, células de mieloma ou células de hibridoma. Outros exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos incluem células de Sertoli de camundongo (por exemplo, células TM4); linagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); células de rim de filhotes de hamster (BHK); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células de rim de macaco (CV1); células de carcinoma cervical humano (HELA); células pulmonares humanas (W138); células hepáticas humanas (Hep G2); células renais caninas (MDCK; células hepáticas de rato búfalo (BRL 3A); de tumor mamário de camundongo (MMT 060562); células TRI; células MRC 5; e células FS4. As linhagens de células hospedeiras de mamíferos adequadas para a produção de anticorpos também incluem aquelas descritas em, por exemplo, em Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (BKC Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), págs.

255–268 (2003).

[198] Em certos exemplos de realização, uma célula hospedeira é uma célula procariótica, tal como uma E. coli. A expressão de peptídeos em células procarióticas, como E. coli, está bem estabelecida (consulte, por exemplo, Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545–551 (1991). Por exemplo, os anticorpos podem ser produzidos em bactérias, em particular quando a glicosilação e a função efetora do Fc não são necessárias. Para a expressão de fragmentos de anticorpos e polipeptídeos em bactérias, consulte, por exemplo, as Patentes US 5.648.237; US 5.789.199; e US 5.840.523.

[199] As células de inseto úteis que expressam uma proteína de ligação da presente divulgação são conhecidas no estado da técnica e incluem, por exemplo, células Sf9 de Spodoptera frugipera, células de BTI-TN5B1–4 de Trichoplusia ni e células SfSWT01 “Mimic®” de Spodoptera frugipera. Consulte, por exemplo, Palmberger et al., J. Biotechnol. 153 (3–4): 160–166 (2011).

Foram identificadas diversas cepas de baculovírus que podem ser utilizadas juntamente com células de insetos, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.

[200] Os micróbios eucarióticos como fungos filamentosos ou leveduras também são hospedeiros adequados para clonagem ou expressão de vetores que codificam proteínas, e incluem cepas de fungos e leveduras com vias de glicosilação “humanizadas”, resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcial ou totalmente humano.

Consulte Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409–1414 (2004); Li et al., Nat. Biotech.

24: 210–215 (2006).

[201] As células vegetais também podem ser utilizadas como hospedeiros para a expressão de uma proteína de ligação da presente divulgação. Por exemplo, a tecnologia PLANTIBODIES® (descrita, por exemplo, nas Patentes US 5.959.177; US 6.040.498; US 6.420.548; US 7.125.978; e US

6.417.429) emprega plantas transgênicas para produzir anticorpos.

[202] Em alguns exemplos de realização, uma proteína de fusão é expressa em uma superfície celular por uma célula imune, por exemplo, uma célula T, célula NK ou célula NK-T, ou qualquer subtipo das mesmas.

[203] Qualquer sistema de expressão de proteína compatível com a divulgação pode ser usado para produzir as proteínas de ligação divulgadas. Os sistemas de expressão adequados incluem animais transgênicos descritos em Gene Expression Systems, Academic Press, eds.

Fernandez et al., 1999.

[204] Em exemplos de realização específicos, a célula pode ser transfectada com um vetor de acordo com a presente descrição com um vetor de expressão. O termo “transfecção” se refere à introdução de moléculas de ácido nucleico, tais como moléculas de DNA ou RNA (por exemplo, mRNA), em células, tais como células eucariotas. No contexto da presente invenção, o termo “transfecção” abrange qualquer método conhecido por aqueles versados na técnica para a introdução de moléculas de ácido nucleico em células, como em células eucariotas, tais como células de mamífero. Tais métodos abrangem, por exemplo, eletroporação, lipofecção, por exemplo, baseado em lipídios catiônicos e/ou lipossomas, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção baseada em nanopartículas, transfecção baseada em vírus ou transfecção baseada em polímeros catiônicos, tais como DEAE–dextrano ou polietilenimina, etc. De preferência, a introdução não é viral.

[205] Além disso, as células da presente divulgação podem ser transfectadas de forma estável ou transitória com o vetor de acordo com a presente descrição, por exemplo, para expressar um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a presente descrição. Em tais exemplos de realização, as células são transfectadas de forma estável com o vetor, conforme descrito no presente documento, que codifica uma proteína de ligação. Alternativamente, as células podem ser transfectadas de forma transitória com um vetor de acordo com a presente divulgação que codifica uma proteína de ligação de acordo com a presente descrição. Em qualquer um dos exemplos de realização aqui divulgados, um polinucleotídeo pode ser heterólogo para a célula hospedeira.

[206] Em um aspecto relacionado, a presente divulgação fornece métodos para a produção de um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou proteína de fusão, em que os métodos compreendem a cultura de uma célula hospedeira da presente divulgação sob condições e por um tempo suficiente para produzir o anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou proteína de fusão.

[207] Consequentemente, a presente divulgação também fornece células hospedeiras recombinantes que expressam de forma heteróloga um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou proteína de fusão da presente divulgação. Por exemplo, a célula pode ser de uma espécie que é diferente da espécie da qual o anticorpo foi total ou parcialmente obtido (por exemplo, células CHO que expressam um anticorpo humano ou um anticorpo humano modificado). Em alguns exemplos de realização, o tipo de célula da célula hospedeira não expressa o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno na natureza. Além disso, a célula hospedeira pode conferir uma modificação pós-tradução (PTM, por exemplo, glicosilação ou fucosilação) no anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que não está presente em um estado nativo do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (ou em um estado nativo de um anticorpo parental a partir do qual o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno foi projetado ou derivado). Tal PTM pode resultar em uma diferença funcional (por exemplo, imunogenicidade reduzida).

Consequentemente, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente divulgação que é produzido por uma célula hospedeira, conforme divulgado neste documento, pode incluir uma ou mais modificações pós- tradução que são distintas do anticorpo (ou anticorpo parental) em seu estado nativo (por exemplo, um anticorpo humano produzido por uma célula CHO pode compreender uma modificação mais pós-tradução que é distinta do anticorpo quando isolado do ser humano e/ou produzido pela célula B humana nativa ou célula plasmática.

CARACTERÍSTICAS ADICIONAIS OPCIONAIS DOS ANTICORPOS, FRAGMENTOS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO OU PROTEÍNAS DE FUSÃO.

[208] Os anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno e proteínas de fusão da divulgação podem ser acoplados, por exemplo, a um fármaco para entrega a um local de tratamento ou acoplados a um marcador detectável para facilitar a imagiologia de um local compreendendo células de interesse. Os métodos para acoplar anticorpos a fármacos e marcadores detectáveis são bem conhecidos no estado da técnica, assim como os métodos de geração de imagens usando marcadores detectáveis. Os anticorpos marcados podem ser usados em uma ampla variedade de ensaios, empregando uma ampla variedade de marcadores. A detecção da formação de um complexo anticorpo-antígeno entre um anticorpo (ou fragmento de ligação ao antígeno ou proteína de fusão) da divulgação e um epítopo de interesse em HBsAg, em particular na região de alça antigênica de HBsAg, pode ser facilitada anexando uma substância detectável ao anticorpo. Os meios de detecção adequados incluem o uso de marcadores, tais como radionuclídeos, enzimas, coenzimas, fluorescentes, quimioluminescentes, cromógenos, substratos enzimáticos ou cofatores, inibidores de enzimas, complexos de grupos protéticos, radicais livres, partículas, corantes e semelhantes. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, β- galactosidase ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupos prostéticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina de fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente é o luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina e aequorina; e exemplos de material radioativo adequado incluem 125I, 131I, 35S ou 3H. Esses reagentes marcados podem ser usados em uma variedade de ensaios bem conhecidos, tais como radioimunoensaios, imunoensaios enzimáticos, por exemplo, ELISA, imunoensaios fluorescentes e semelhantes. Os anticorpos marcados, fragmentos de ligação ao antígeno e proteínas de fusão de acordo com a presente divulgação podem ser usados em tais ensaios, por exemplo, conforme descrito nas patentes US 3.766.162; US

3.791.932; US 3.817.837; e US 4.233.402.

[209] Um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou proteína de fusão de acordo com a presente divulgação pode ser conjugado a uma fração terapêutica, como uma citotoxina, um agente terapêutico ou um íon de metal radioativo ou radioisótopo. Exemplos de radioisótopos incluem, mas não estão limitados a, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, Bi-213, Pd-109, Tc-99, In-111 e semelhantes. Esses conjugados de anticorpos podem ser usados para modificar uma determinada resposta biológica; a porção de fármaco não deve ser interpretada como limitada a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção fármaco pode ser uma proteína ou polipeptídeo possuindo uma atividade biológica desejada.

Essas proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina, tais como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas ou toxina da difteria.

[210] As técnicas para conjugar tal porção terapêutica com anticorpos são bem conhecidas. Consulte, por exemplo, Arnon et al. (1985) “Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy” em Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), págs. 243-256; ed. Hellstrom et al. (1987) “Antibodies for Drug Delivery”, em Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2ª ed; Marcel Dekker, Inc.), págs. 623-653; Thorpe (1985) “Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review,” em Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical

Applications, ed. Pinchera et al. págs. 475-506 (Editrice Kurtis, Milano, Italy, 1985); “Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy”, em Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al. (Academic Press, New York, 1985), págs. 303-316; e Thorpe et al. (1982) Immunol. Rev. 62:119-158.

[211] Alternativamente, um anticorpo, ou fragmento de anticorpo do mesmo, pode ser conjugado com um segundo anticorpo, ou fragmento de anticorpo do mesmo, para formar um heteroconjugado de anticorpo, conforme descrito no documento US 4.676.980. Além disso, podem ser usados ligantes entre os marcadores e os anticorpos da invenção, por exemplo, conforme descrito no documento US 4.831.175. Anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos podem ser marcados diretamente com iodo radioativo, índio, ítrio ou outra partícula radioativa conhecida na técnica, por exemplo, conforme descrito no documento US 5.595.721. O tratamento pode consistir em uma combinação de tratamento com anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno e/ou proteínas de fusão conjugados e não conjugados administrados simultânea ou subsequentemente, por exemplo, conforme descrito nos documentosWO 00/52031; WO 00/52473.

[212] Os anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno e/ou proteínas de fusão da invenção também podem ser fixados a um suporte sólido. Adicionalmente, os anticorpos da invenção, ou fragmentos de anticorpos funcionais destes, ou proteínas de fusão, podem ser quimicamente modificados por meio de conjugação covalente a um polímero, por exemplo, para aumentar sua meia–vida em circulação. Exemplos de polímeros e métodos para anexá- los a peptídeos são mostrados nos documentos US 4.766.106; US 4.179.337; US 4.495.285 e US 4.609.546. Em alguns exemplos de realização, os polímeros podem ser selecionados a partir de polióis polioxietilados e polietileno glicol (PEG). O PEG é solúvel em água em temperatura ambiente e tem a fórmula geral: R(OCH2CH2)nOR, em que R pode ser hidrogênio, ou um grupo de proteção, tal como um grupo alquila ou alcanol. Em certos exemplos de realização, o grupo protetor pode ter entre 1 e 8 carbonos. Por exemplo, o grupo protetor é metila. O símbolo n é um número inteiro positivo. Em um exemplo de realização, n está entre 1 e 1.000. Em outro exemplo de realização, n está entre 2 e 500. Em alguns exemplos de realização, o PEG tem um peso molecular médio entre 1.000 e 40.000, mais preferivelmente o PEG tem um peso molecular entre 2.000 e 20.000, ainda mais preferivelmente o PEG tem um peso molecular entre 3.000 e 12.000. Além disso, o PEG pode ter pelo menos um grupo hidróxi, por exemplo, o PEG pode ter um grupo hidróxi terminal. Por exemplo, o grupo hidróxi terminal é ativado para reagir com um grupo amino livre no inibidor. Contudo, deve ser entendido que o tipo e a quantidade dos grupos reativos podem ser variados para se obter um conjugado de PEG/anticorpo covalente da presente invenção.

[213] Polióis polioxietilados solúveis em água também podem ser utilizados no contexto dos anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno descritos na presente invenção. Eles incluem sorbitol polioxietilado, glicose polioxietilada, glicerol polioxietilado (POG) e similares. Em um exemplo de realização, POG é utilizado. Sem estar preso por qualquer teoria, uma vez que a estrutura central de glicerol do glicerol polioxietilado é a mesma estrutura que ocorre naturalmente, por exemplo, em animais e seres humanos em mono, di, triglicerídeos, tal ramificação não seria necessariamente vista como um agente estranho no corpo. O POG pode ter um peso molecular na mesma faixa que o PEG. Outro sistema de entrega de fármacos que pode ser usado para aumentar a meia-vida na circulação é o lipossoma. Os métodos de preparação de sistemas de entrega por lipossomas são conhecidos por aqueles versados na técnica. Outros sistemas de entrega de fármacos são conhecidos no estado da técnica e são descritos, por exemplo, nas referências Poznansky et al.

(1980) e Poznansky (1984).

[214] Os anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno e/ou proteínas de fusão da invenção podem ser fornecidos na forma purificada.

Tipicamente, o anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno e/ou proteína de fusão estará presente em uma composição que é substancialmente isenta de outros polipeptídeos, por exemplo, menos de 90% (em peso), usualmente menos de 60% e, mais frequentemente, menos de 50% da composição são constituídos por outros polipeptídeos.

[215] Os anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno e/ou proteínas de fusão da invenção podem ser imunogênicos em hospedeiros não humanos (ou heterólogos), por exemplo, em camundongos. Em particular, os anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno e/ou proteínas de fusão podem ter um idiotipo que é imunogênico em hospedeiros não humanos, mas não em um hospedeiro humano. Em particular, as moléculas da presente invenção para uso humano incluem aquelas que não podem ser facilmente isolados de hospedeiros tais como camundongos, cabras, coelhos, ratos, mamíferos não primatas, etc. e, em geral, não podem ser obtidos por meio da humanização ou a partir de xenocamundongos.

PRODUÇÃO DE ANTICORPOS, FRAGMENTOS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO E PROTEÍNAS DE FUSÃO

[216] Os anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno e/ou proteínas de fusão de acordo com a invenção podem ser preparados por meio de qualquer método conhecido no estado da técnica. Por exemplo, a metodologia geral para produzir anticorpos monoclonais usando a tecnologia de hibridoma é bem conhecida (Kohler, G. e Milstein, C., 1975, Kozbar et al., 1983). Em um exemplo de realização, é usado o método alternativo de imortalização de EBV descrito no documento WO2004/076677.

[217] Em um exemplo de realização, os anticorpos são produzidos pelo uso do método descrito no documento WO 2004/076677.

Neste método, células B que produzem o anticorpo da invenção são transformadas com EBV e um ativador de células B policlonais. Estimulantes adicionais de crescimento celular e de diferenciação podem ser opcionalmente adicionados durante a etapa de transformação para melhorar ainda mais a eficiência. Estes estimulantes podem ser citocinas, tais como IL-2 e IL-15. Em um aspecto, a IL-2 é adicionada durante a etapa de imortalização para melhorar ainda mais a eficiência da imortalização, mas seu uso não é essencial. As células B imortalizadas produzidas usando estes métodos podem, então, ser cultivadas usando métodos conhecidos no estado da técnica e os anticorpos podem ser isolados a partir das mesmas.

[218] Outro método para produzir anticorpos é descrito no documento WO 2010/046775. Neste método, células plasmáticas são cultivadas em números limitados, ou como células plasmáticas únicas, em placas de cultura com microcavidades. Os anticorpos podem ser isolados das culturas de células plasmáticas. Além disso, a partir das culturas de células plasmáticas, o RNA pode ser extraído e PCR pode ser realizada usando métodos conhecidos no estado da técnica. As regiões V H e VL dos anticorpos podem ser amplificadas por RT–PCR (PCR com transcriptase reversa), sequenciadas e clonadas em um vetor de expressão que é, então, transfectado em células HEK293T ou outras células hospedeiras. A clonagem de ácido nucleico em vetores de expressão, a transfecção de células hospedeiras, a cultura das células hospedeiras transfectadas e o isolamento do anticorpo produzido podem ser realizados usando qualquer método conhecido por aqueles versados na técnica.

[219] Os anticorpos podem ser adicionalmente purificados, se desejado, usando filtração, centrifugação e vários métodos cromatográficos, tais como HPLC ou cromatografia de afinidade. Métodos para a purificação de anticorpos, por exemplo, anticorpos monoclonais, incluindo métodos para a produção de anticorpos de grau farmacêutico, são bem conhecidos no estado da técnica.

[220] As técnicas padrão de biologia molecular podem ser usadas para preparar sequências de DNA que codificam os anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno e/ou proteínas de fusão da presente invenção. As sequências de DNA desejadas podem ser sintetizadas parcial ou completamente usando técnicas de síntese de oligonucleotídeos. As técnicas de mutagênese sítio–dirigida e reação em cadeia de polimerase (PCR) podem ser usadas, conforme apropriado.

[221] Qualquer sistema de célula hospedeira/vetor adequado pode ser usado para expressão das sequências de DNA que codificam as moléculas de anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou proteína de fusão da presente invenção ou fragmentos destes. Sistemas bacterianos, por exemplo, E. coli, e outros sistemas microbianos podem ser usados, em parte, para a expressão de fragmentos de anticorpos, tais como fragmentos Fab e F(ab')2, e especialmente fragmentos Fv e fragmentos de anticorpos de cadeia única, por exemplo, Fvs com cadeia única. Sistemas de expressão de célula hospedeira eucariotas, por exemplo, de mamífero, podem ser usados para a produção de moléculas de anticorpo maiores, incluindo moléculas de anticorpo completas. As células hospedeiras de mamífero adequadas incluem, mas não se limitam, àquelas células hospedeiras e linhagens de células exemplarmente divulgadas na presente invenção.

[222] A presente invenção também fornece um processo para a produção de uma molécula de anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou proteína de fusão de acordo com a presente invenção que compreende cultivar uma célula hospedeira que compreende um vetor que codifica um ácido nucleico da presente invenção sob condições adequadas para expressão de proteína a partir do DNA que codifica a molécula de anticorpo da presente descrição, e isolamento da molécula de anticorpo.

[223] A molécula de anticorpo ou do fragmento de anticorpo pode compreender apenas um polipeptídeo de cadeia pesada ou leve, caso no qual apenas uma sequência de codificação polipeptídica de cadeia leve ou cadeia pesada tem de ser usada para transfectar as células hospedeiras. Para a produção dos produtos que compreendem tanto as cadeias pesada como leve, a linhagem de células pode ser transfectada com dois vetores, um primeiro vetor que codifica um polipeptídeo de cadeia leve e um segundo vetor que codifica um polipeptídeo de cadeia pesada. Alternativamente, um único vetor pode ser usado, o vetor incluindo as sequências que codificam polipeptídeos de cadeia leve e de cadeia pesada.

[224] Alternativamente, os anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno e proteínas de fusão de acordo com a invenção podem ser produzidos por: (i) expressão de uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com a invenção em uma célula hospedeira, por exemplo, usando um vetor de acordo com a presente invenção, e (ii) isolamento do produto de anticorpo expresso. Além disso, o método pode incluir (iii) purificar o anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou proteína de fusão isolado. As células B transformadas e células plasmáticas cultivadas podem ser rastreadas/triadas quanto aos anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno ou proteínas de fusão que produzem a especificidade ou função desejada.

[225] A etapa de triagem pode ser realizada por meio de qualquer imunoensaio, por exemplo, ELISA, através de coloração de tecidos ou células (incluindo células transfectadas), através de ensaio de neutralização ou por um de um determinado número de outros métodos conhecidos no estado da técnica para a identificação de especificidade ou função desejada. O ensaio pode ser selecionado com base no reconhecimento simples de um ou mais antígenos, ou pode ser selecionado com base adicional em uma função desejada, por exemplo, para selecionar anticorpos neutralizantes, em vez de anticorpos de ligação a antígeno apenas, para selecionar anticorpos que podem mudar as características das células alvo, tais como suas cascatas de sinalização, sua forma, sua taxa de crescimento, sua capacidade de influenciar outras células, sua resposta à influência de outras células ou outros reagentes ou por uma alteração das condições, seu estado de diferenciação, e etc.

[226] Os clones de células B transformadas individuais podem, então, ser produzidos a partir de cultura de células B transformadas positivas.

A etapa de clonagem para a separação de clones individuais a partir da mistura de células positivas pode ser realizada usando diluição limitante, micromanipulação, deposição de células individuais por meio de separação de células ou por outro método conhecido no estado da técnica.

[227] O ácido nucleico proveniente das células plasmáticas cultivadas pode ser isolado, clonado e expresso em células HEK293T ou outras células hospedeiras conhecidas usando métodos conhecidos no estado da técnica.

[228] Os clones de células B imortalizadas ou células hospedeiras transfectadas da presente invenção podem ser usados de várias maneiras, por exemplo, como uma fonte de anticorpos monoclonais, como uma fonte de ácido nucleico (DNA ou mRNA) que codifica um anticorpo monoclonal de interesse, para investigação, e etc.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[229] A invenção também fornece uma composição que compreende um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou proteína de fusão, de acordo com a presente divulgação, um ácido nucleico de acordo com a presente divulgação, um vetor de acordo com a presente divulgação e/ou uma célula de acordo com a presente divulgação.

[230] A composição farmacêutica também pode conter um veículo, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Ainda que o veículo ou excipiente possa facilitar a administração, ele não deve induzir à produção de anticorpos prejudiciais ao indivíduo que recebe a composição. Ele também não deve ser tóxico. Os veículos adequados podem ser macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas, tais como proteínas, polipeptídeos, lipossomas, polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos e partículas de vírus inativos. Em geral, os veículos farmaceuticamente aceitáveis em uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção podem ser componentes ativos ou componentes inativos.

[231] Como sais farmaceuticamente aceitáveis, podem ser usados, por exemplo, sais de ácidos minerais, tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos e sulfatos, ou sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos e benzoatos.

[232] Os veículos farmaceuticamente aceitáveis em uma composição farmacêutica podem, adicionalmente, conter líquidos, como água, solução salina, glicerol e etanol. Adicionalmente, substâncias auxiliares, como agentes umectantes ou emulsificantes ou substâncias para tamponamento do pH, podem estar presentes em tais composições. Tais veículos permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas e suspensões, para ingestão pelo indivíduo.

[233] As composições farmacêuticas da invenção podem ser preparadas em várias formas. Por exemplo, as composições podem ser preparadas como injetáveis, quer como soluções ou suspensões líquidas. Formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em veículos líquidos antes de injeção também podem ser preparadas (por exemplo, uma composição liofilizada, similar à Synagis® e Herceptin®, para reconstituição com água estéril que contém um conservante). A composição pode ser preparada para administração tópica, por exemplo, como uma pomada, creme ou pó. A composição pode ser preparada para administração oral, por exemplo, como um comprimido ou cápsula, como um spray ou como um xarope (opcionalmente aromatizado). A composição pode ser preparada para administração pulmonar, por exemplo, como um inalador, usando um pó fino ou um spray. A composição pode ser preparada como um supositório ou pessário.

A composição pode ser preparada para administração nasal, aural ou ocular, por exemplo, administração como colírios. A composição pode estar na forma de um kit, de modo que uma composição combinada seja reconstituída imediatamente antes de administração a um sujeito. Por exemplo, um anticorpo liofilizado pode ser fornecido na forma de um kit com água estéril ou um tampão estéril.

[234] Em exemplos de realização específicos, o ingrediente ativo na composição da presente invenção é uma molécula de anticorpo, um fragmento de anticorpo ou variantes e derivados do mesmo, em particular o ingrediente ativo na composição é um anticorpo, um fragmento de anticorpo, ou proteína de fusão, ou variantes e derivados dos mesmos, conforme definidos na presente invenção. Como tal, ele pode ser suscetível à degradação no trato gastrointestinal. Assim, se a composição deve ser administrada por uma via que usa o trato gastrointestinal, a composição pode conter agentes que protegem o anticorpo contra degradação, mas que liberam o anticorpo uma vez que ele tenha sido absorvido a partir do trato gastrointestinal.

[235] Uma discussão aprofundada de veículos farmaceuticamente aceitáveis está disponível em Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ª edição, ISBN: 0683306472.

[236] As composições farmacêuticas da invenção têm, em geral,

um pH entre 5,5 e 8,5 e em alguns exemplos de realização, o pH pode estar compreendido entre 6 e 8. Em outros exemplos de realização, o pH da composição farmacêutica descrita na presente invenção é de aproximadamente 7. O pH pode ser mantido mediante uso de um tampão. A composição pode ser estéril e/ou isenta de pirógenos. A composição pode ser isotônica em relação aos seres humanos. Em um exemplo de realização, as composições farmacêuticas da invenção são fornecidas em recipientes hermeticamente fechados.

[237] Dentro do escopo da invenção estão composições presentes em várias formas de administração; cujas formas incluem, porém sem limitações, formas adequadas para administração parenteral, por exemplo, por injeção ou infusão, por exemplo, por meio de injeção em bolus ou infusão contínua. Quando o produto é para injeção ou infusão, ele pode tomar a forma de uma suspensão, solução ou emulsão em um veículo oleoso ou aquoso e pode conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, conservantes, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, a molécula de anticorpo pode estar na forma seca para reconstituição antes de uso com um líquido estéril apropriado. Um veículo é, normalmente, entendido como sendo um material que é adequado para armazenar, transportar e/ou administrar um composto, tal como um composto farmaceuticamente ativo, em particular os anticorpos de acordo com a presente invenção. Por exemplo, o veículo pode ser um líquido fisiologicamente aceitável o qual é adequado para armazenamento, transporte e/ou administração de um composto farmaceuticamente ativo, em particular os anticorpos de acordo com a presente invenção. Uma vez formuladas, as composições da invenção podem ser administradas diretamente ao sujeito. Em um exemplo de realização, as composições são adaptadas para administração a mamíferos, por exemplo, em humanos.

[238] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas através de qualquer variedade de vias incluindo, porém sem limitações, oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutânea, tópica, subcutânea, intranasal, entérica, sublingual, intravaginal ou retal. Os hiposprays também podem ser usados para administrar as composições farmacêuticas da invenção. Em exemplos de realização específicos, a composição farmacêutica pode ser preparada para administração oral, por exemplo, como comprimidos, cápsulas e similares, para administração tópica ou como injetáveis, por exemplo, como soluções ou suspensões líquidas. As formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em veículos líquidos antes de injeção também são preferidas, por exemplo, quando a composição farmacêutica está em uma forma liofilizada.

[239] Para injeção, por exemplo, injeção intravenosa, cutânea ou subcutânea, ou injeção no local afetado, o ingrediente ativo estará, de preferência, na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável que é isenta de pirógenos e tem um pH, isotonicidade e estabilidade adequados.

Conservantes, estabilizantes, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos podem ser incluídos, conforme necessário.

[240] Quer seja um polipeptídeo, peptídeo ou molécula de ácido nucleico, outro composto farmaceuticamente útil de acordo com a presente invenção que está sendo fornecido a um indivíduo, a administração é, preferencialmente, em uma “quantidade profilaticamente eficaz” ou uma “quantidade terapeuticamente eficaz” (conforme possa ser o caso), sendo esta suficiente para conferir um benefício ao indivíduo (por exemplo, melhora do resultado clínico; diminuição ou alívio dos sintomas associados a uma doença; diminuição da ocorrência de sintomas; melhora da qualidade de vida; maior estado livre de doença; diminuição da extensão da doença, estabilização do estado da doença; retardo na progressão da doença; remissão; sobrevida; ou sobrevida prolongada de maneira estatisticamente significativa). A quantidade real administrada e a taxa e curso da administração dependerão da natureza e gravidade do que está sendo tratado. Para injeção, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser fornecida, por exemplo, em uma seringa pré-carregada.

[241] As composições farmacêuticas conforme divulgadas na presente invenção também podem ser administradas por via oral em qualquer forma de dosagem oralmente aceitável incluindo, mas não se limitando a, cápsulas, comprimidos, suspensões ou soluções aquosas. No caso de comprimidos para uso oral, os veículos comumente usados incluem lactose e amido de milho. Agentes lubrificantes, tal como estearato de magnésio, também são tipicamente adicionados. Para administração oral em uma forma de cápsula, diluentes úteis incluem lactose e amido de milho seco. Quando são necessárias suspensões aquosas para uso oral, o ingrediente ativo, isto é, a molécula de conjugado/veículo da invenção, conforme definido acima, é combinado com agentes emulsificantes e agentes de suspensão. Se desejado, também podem ser adicionados determinados agentes edulcorantes, aromatizantes ou colorantes.

[242] A composição farmacêutica da invenção também pode ser administrada topicamente, especialmente quando o alvo de tratamento inclui áreas ou órgãos facilmente acessíveis por meio de aplicação tópica, por exemplo, incluindo doenças da pele ou qualquer outro tecido epitelial acessível.

As formulações tópicas adequadas são facilmente preparadas para cada uma destas áreas ou órgãos. Para aplicações tópicas, a composição farmacêutica da invenção pode ser formulada em uma pomada adequada, a qual contém a composição farmacêutica da invenção, em particular seus componentes conforme definido acima, suspensos ou dissolvidos em um ou mais veículos.

Os veículos para administração tópica incluem, porém sem limitações, óleo mineral, petrolato líquido, petrolato branco, propileno glicol, polioxietileno, composto de polioxipropileno, cera emulsificante e água. Alternativamente, a composição farmacêutica da invenção pode ser formulada em uma loção ou creme adequado. No contexto da presente invenção, veículos adequados incluem, porém sem limitações, óleo mineral, monoestearato de sorbitano, polissorbato 60, cera de ésteres cetílicos, álcool cetearílico, 2–octildodecanol, álcool benzílico e água.

[243] As doses podem ser expressas em relação ao peso corporal. Assim, uma dose que é expressa como [g, mg ou outra unidade]/kg (ou g, mg etc.) geralmente e refere-se a [g, mg ou outra unidade] “por kg (ou g, mg etc.) de peso corporal”, mesmo que o termo “peso corporal” não esteja explicitamente mencionado.

[244] Em exemplos de realização específicos, em uma dose única, por exemplo, uma dose diária, semanal ou mensal, a quantidade do anticorpo, ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, na composição farmacêutica não excede 1 g. Em certos exemplos de realização, a dose única não excede uma dose selecionada a partir de 500 mg, 250 mg, 100 mg e 50 mg.

[245] Em alguns exemplos de realização, uma composição ou kit conforme descrito na presente invenção compreende ainda; (i) um inibidor de polimerase, em que o inibidor da polimerase compreende opcionalmente Lamivudina, Adefovir, Entecavir, Telbivudina, Tenofovir ou qualquer combinação dos mesmos; (ii) um interferon, em que o interferon opcionalmente compreende IFN–beta e/ou IFN–alfa; (iii) um inibidor de ponto de checagem (checkpoint), em que o inibidor de ponto de checagem compreende opcionalmente um anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e/ou um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; (iv) um agonista de uma molécula de ponto de verificação imunoestimulante; ou (v) qualquer combinação de (i) a (iv) acima. Em alguns exemplos de realização, um kit inclui uma composição ou combinação, tal como descrito na presente invenção, e inclui ainda instruções de uso do componente para prevenir, tratar, atenuar e/ou diagnosticar uma infecção por hepatite B e/ou uma infecção por hepatite D.

[246] Em certos exemplos de realização, uma composição da presente divulgação (por exemplo, anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, célula hospedeira, ácido nucleico, vetor ou composição farmacêutica) é usada em combinação com um inibidor de PD-1, por exemplo, um anticorpo específico para PD-1 ou fragmento de ligação do mesmo, tal como pidilizumabe, nivolumabe, pembrolizumabe, MEDI0680 (anteriormente AMP- 514), AMP-224, BMS-936558 ou qualquer combinação dos mesmos.

[247] Em certos exemplos de realização, uma composição da presente divulgação é usada em combinação com um anticorpo específico para PD-L1 ou fragmento de ligação do mesmo, tal como BMS-936559, durvalumabe (MEDI4736), atezolizumabe (RG7446), avelumabe (MSB0010718C), MPDL3280A, ou qualquer combinação dos mesmos.

[248] Em certos exemplos de realização, uma composição da presente divulgação é usada em combinação com um inibidor de LAG3, como LAG525, IMP321, IMP701, 9H12, BMS-986016 ou qualquer combinação dos mesmos.

[249] Em certos exemplos de realização, uma composição da presente divulgação é usada em combinação com um inibidor de CTLA4. Em exemplos de realização particulares, uma composição da presente divulgação é usada em combinação com um anticorpo específico de CTLA4 ou fragmento de ligação do mesmo, tal como ipilimumabe, tremelimumabe, proteínas de fusão CTLA4–Ig (por exemplo, abatacept, belatacept) ou qualquer combinação dos mesmos.

[250] Em certos exemplos de realização, uma composição da presente divulgação é usada em combinação com um anticorpo específico B7– H3 ou fragmento de ligação do mesmo, tal como enoblituzumabe (MGA271), 376,96 ou ambos. Um fragmento de ligação ao anticorpo B7–H3 pode ser um scFv ou proteína de fusão deste, como descrito em, por exemplo, Dangaj et al., Cancer Res. 73: 4820, 2013, bem como aqueles descritos na Patente US

9.574.000 e Publicações de Patente PCT WO/201640724A1 e WO 2013/025779A1.

[251] Em certos exemplos de realização, uma composição da presente divulgação é usada em combinação com um inibidor de CD244.

[252] Em certos exemplos de realização, uma composição da presente divulgação é usada em combinação com um inibidor de BLTA, HVEM, CD160 ou qualquer combinação dos mesmos. Os anticorpos anti CD-160 são descritos, por exemplo, na Publicação PCT: WO 2010/084158.

[253] Em certos exemplos de realização, uma composição da presente divulgação é usada em combinação com um inibidor de TIM3.

[254] Em certos exemplos de realização, uma composição da presente divulgação é usada em combinação com um inibidor de Gal9.

[255] Em certos exemplos de realização, uma composição da presente divulgação é usada em combinação com um inibidor de sinalização de adenosina, tal como um receptor de adenosina chamariz (decoy).

[256] Em certos exemplos de realização, uma composição da presente divulgação é usada em combinação com um inibidor de A2aR.

[257] Em certos exemplos de realização, uma composição da presente divulgação é usada em combinação com um inibidor de KIR, como lirilumabe (BMS-986015).

[258] Em certos exemplos de realização, uma composição da presente divulgação é usada em combinação com um inibidor de uma citocina inibidora (tipicamente, uma citocina diferente de TGFβ) ou desenvolvimento ou atividade de Treg.

[259] Em certos exemplos de realização, uma composição da presente divulgação é usada em combinação com um inibidor de IDO, como levo-1–metil triptofano, epacadostat (INCB024360; Liu et al., Blood 115: 3520– 30, 2010), ebselen (Terentis et al., Biochem. 49: 591–600, 2010), indoximod, NLG919 (Mautino et al., American Association for Cancer Research 104th Annual Meeting 2013; 6 a 10 de abril de 2013), 1–metil-triptofano (1–MT) -tira- pazamina, ou qualquer combinação dos mesmos.

[260] Em certos exemplos de realização, uma composição da presente divulgação é usada em combinação com um inibidor de arginase, tal como éster metílico de N(ômega)-Nitro-L-arginina (L-NAME), N-ômega-hidroxi- nor-l-arginina (nor-NOHA), L-NOHA, ácido 2(S)-amino-6–boronohexanóico (ABH), S-(2–boronoetil)-L-citaína (BEC) ou qualquer combinação dos mesmos.

[261] Em certos exemplos de realização, uma composição da presente divulgação é usada em combinação com um inibidor de VISTA, como CA-170 (Curis, Lexington, Mass.).

[262] Em certos exemplos de realização, uma composição da presente divulgação é usada em combinação com um inibidor de TIGIT, como, por exemplo, COM902 (Compugen, Toronto, Ontario Canadá), um inibidor de CD155, como, por exemplo, COM701 (Compugen) ou ambos.

[263] Em alguns exemplos de realização, uma composição da presente divulgação é usada em combinação com um inibidor de PVRIG, PVRL2 ou ambos. Os anticorpos anti-PVRIG são descritos, por exemplo, na Publicação PCT WO 2016/134333. Os anticorpos anti-PVRL2 são descritos, por exemplo, na Publicação PCT WO 2017/021526.

[264] Em certos exemplos de realização, uma composição da presente divulgação é usada em combinação com um inibidor LAIR1.

[265] Em certos exemplos de realização, uma composição da presente divulgação é usada em combinação com um inibidor de CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5 ou qualquer combinação dos mesmos.

[266] Em certos exemplos de realização, uma composição da presente divulgação é usada em combinação com um agente que aumenta a atividade (isto é, é um agonista) de uma molécula de ponto de verificação imunológico estimulador. Por exemplo, uma composição da presente divulgação pode ser usada em combinação com um agonista de CD137 (4– 1BB) (tal como, por exemplo, urelumabe), um agonista de CD134 (OX-40) (tal como, por exemplo, MEDI6469, MEDI6383 ou MEDI0562), lenalidomida, pomalidomida, um agonista de CD27 (como, por exemplo, CDX-1127), um agonista de CD28 (como, por exemplo, TGN1412, CD80 ou CD86), um agonista de CD40 (como, por exemplo, CP-870.893, rhuCD40L ou SGN-40), um agonista de CD122 (tal como, por exemplo, IL-2) um agonista de GITR (tal como, por exemplo, anticorpos monoclonais humanizados descritos na Publicação de Patente PCT WO 2016/054638), um agonista de ICOS (CD278) (tal como, por exemplo, GSK3359609, mAb 88.2, JTX-2011, Icos 145–1, Icos 314–8 ou qualquer combinação dos mesmos). Em qualquer um dos exemplos de realização divulgados na presente invenção, um método pode compreender a administração de uma composição da presente divulgação com um ou mais agonistas de uma molécula de ponto de verificação imunológico estimulador, incluindo qualquer um dos anteriores, individualmente ou em qualquer combinação.

[267] Um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou proteína de fusão de acordo com a presente divulgação pode estar presente na mesma composição farmacêutica que o componente ativo adicional ou, o anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou proteína de fusão de acordo com a presente divulgação pode ser incluído em uma primeira composição farmacêutica e o componente ativo adicional pode ser incluído em uma segunda composição farmacêutica diferente da primeira composição farmacêutica.

USOS

[268] Em outro aspecto, a presente invenção provê métodos para o uso de um anticorpo, um fragmento de ligação ao antígeno, uma proteína de fusão, um ácido nucleico, um vetor, uma célula ou uma composição farmacêutica ou kit de acordo com a presente invenção na (i) profilaxia, tratamento ou atenuação da hepatite B e/ou hepatite D; ou no (ii) diagnóstico da hepatite B e/ou hepatite D (por exemplo, em um sujeito humano).

[269] Os métodos diagnósticos (por exemplo, in vitro, ex vitro) podem incluir contatar um anticorpo, ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) ou proteína de fusão com uma amostra.

Essas amostras podem ser isoladas de um sujeito, por exemplo, uma amostra de tecido isolada retirada de, por exemplo, passagens nasais, cavidades sinusais, glândulas salivares, pulmão, fígado, pâncreas, rim, ouvido, olho, placenta, trato alimentar, coração, ovários, hipófise, suprarrenais, tireoide, cérebro, pele ou sangue. Os métodos de diagnóstico também podem incluir a detecção de um complexo antígeno/anticorpo ou antígeno/proteína de fusão, em particular após o contato de um anticorpo, fragmento de anticorpo ou proteína de fusão com uma amostra. Essa etapa de detecção é normalmente realizada na bancada, ou seja, sem qualquer contato com o corpo humano ou animal. Os exemplos de métodos de detecção são bem conhecidos pelos especialistas na técnica e incluem, por exemplo, ELISA (ensaio imunoadsorvente enzima-associado).

[270] A divulgação também provê o uso de (i) um anticorpo, fragmento de anticorpo, proteína de fusão ou variantes e derivados dos mesmos de acordo com a divulgação, (ii) célula hospedeira (que pode ser uma célula B imortalizada) de acordo com a divulgação, (iii) um ácido nucleico ou um vetor de acordo com a presente divulgação ou (iv) uma composição farmacêutica da divulgação na (a) fabricação de um medicamento para a prevenção, tratamento ou atenuação da hepatite B e/ou hepatite D; ou para (b) o diagnóstico da hepatite B e/ou hepatite D.

[271] A divulgação também provê um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou proteína de fusão de acordo com a presente divulgação, um ácido nucleico de acordo com a presente divulgação, um vetor de acordo com a presente divulgação, uma célula de acordo com a presente divulgação ou a composição farmacêutica de acordo com a presente divulgação para uso como um medicamento para a prevenção ou tratamento da hepatite B e/ou hepatite D. A invenção também fornece o uso de um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou proteína de fusão da divulgação na fabricação de um medicamento para o tratamento de um sujeito e/ou diagnóstico em um sujeito.

Ela também fornece um método para tratar um sujeito (por exemplo, um sujeito humano), compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de uma composição descrita na presente invenção. Em alguns exemplos de realização, o sujeito pode ser um humano. Uma forma de verificar a eficácia do tratamento terapêutico envolve monitorar os sintomas da doença após a administração da composição. O tratamento pode ser um esquema de dose única ou um esquema de múltiplas doses.

[272] Em um exemplo de realização, um anticorpo, fragmento de anticorpo, proteína de fusão, célula hospedeira (por exemplo, clone de células B imortalizadas, ou de células T, células NK-T, ou células NK que expressam uma proteína de fusão), ou composição farmacêutica de acordo com a presente divulgação é administrado a um sujeito com necessidade de tal tratamento. Tal sujeito inclui, mas não está limitado a, um sujeito que está particularmente em risco, ou que é susceptível de ter hepatite B e/ou hepatite D.

[273] Os anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno, proteínas de fusão, polinucleotídeos, vetores, células hospedeiras, composições farmacêuticas e combinações dos mesmos, de acordo com a presente divulgação também podem ser usados em um kit para a prevenção, tratamento, atenuação e/ou diagnóstico da hepatite B e/ou hepatite D. Em alguns exemplos de realização, um kit compreende ainda instruções para o uso do componente para prevenir, tratar, atenuar e/ou diagnosticar uma infecção por hepatite B e/ou uma infecção por hepatite D. Além disso, o epítopo na região da alça antigênica de HBsAg, que é capaz de se ligar a um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou proteína de fusão da divulgação, conforme descrito neste documento, pode ser usado em um kit para monitorar a eficácia dos procedimentos de aplicação detectando a presença ou determinando o título de anticorpos anti-HBV protetores.

[274] Em certos exemplos de realização, uma composição ou um kit da presente divulgação compreende ainda: um inibidor da polimerase, em que o inibidor da polimerase compreende opcionalmente Lamivudina, Adefovir, Entecavir, Telbivudina, Tenofovir ou qualquer combinação dos mesmos; (ii) um interferon, em que o interferon compreende opcionalmente IFN–beta e/ou IFN– alfa; (iii) um inibidor do ponto de checagem (checkpoint) imunológico, em que o inibidor do ponto de checagem imunológico compreende opcionalmente um anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e/ou um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; (iv) um agonista de uma molécula de ponto de verificação imunoestimulante; ou (v) qualquer combinação de (viii) - (xii).

[275] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo, um fragmento de ligação ao antígeno ou proteína de fusão de acordo com a presente divulgação, um ácido nucleico de acordo com a presente divulgação, o vetor de acordo com a presente divulgação, a célula de acordo com a presente divulgação ou a composição farmacêutica de acordo com a presente divulgação é usado no tratamento ou atenuação da infecção por hepatite B crônica.

[276] Em exemplos de realização específicos, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou proteína de fusão de acordo com a presente divulgação (i) neutraliza a infecção por HBV, (ii) liga-se a L–HBsAg (proteína do envelope de HBV grande, que está presente em partículas infecciosas de HBV), evitando assim a propagação do HBV, (iii) liga-se ao S– HBsAg, promovendo assim a deleção das partículas subvirais (SVP) e/ou (iv) pode induzir a soroconversão, ou seja, uma resposta imune ativa ao vírus.

[277] Em exemplos de realização específicos, o anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou proteína de fusão de acordo com a presente divulgação, um ácido nucleico de acordo com a presente divulgação, um vetor de acordo com a presente divulgação, uma célula de acordo com a presente divulgação, ou uma composição farmacêutica de acordo com a presente divulgação, podem ser utilizados na prevenção da (re)infecção por hepatite B após o transplante de fígado, em particular, para a insuficiência hepática induzida por hepatite B.

[278] Em exemplos de realização adicionais, um anticorpo, antígeno, fragmento de ligação do mesmo, ou a proteína de fusão de acordo com a presente divulgação, um ácido nucleico de acordo com a presente divulgação, um vetor de acordo com a presente divulgação, uma célula de acordo com a presente divulgação, ou uma composição farmacêutica de acordo com a presente divulgação, pode ser usado na prevenção/profilaxia da hepatite B em indivíduos não imunizados. Isto é, por exemplo, no caso de (uma presumível) exposição acidental ao HBV (profilaxia pós-exposição). O termo “sujeitos não imunizados” inclui sujeitos que nunca receberam uma vacinação e, portanto, não estão imunizados, e sujeitos que não mostraram uma resposta imune (por exemplo, nenhum anticorpo anti-hepatite B mensurável) após a vacinação.

[279] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou proteína de fusão de acordo com a presente divulgação, o ácido nucleico de acordo com a presente divulgação, um vetor de acordo com a presente divulgação, uma célula de acordo com a presente divulgação, ou uma composição farmacêutica de acordo a presente divulgação, é usado na profilaxia da hepatite B em pacientes hemodialisados.

[280] Em alguns exemplos de realização, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou proteína de fusão de acordo com a presente divulgação, o ácido nucleico de acordo com a presente divulgação, um vetor de acordo com a presente divulgação, uma célula de acordo com a presente divulgação, ou uma composição farmacêutica de acordo a presente divulgação, é usado na prevenção da hepatite B em recém-nascidos. Em tais exemplos de realização, um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a presente divulgação, um ácido nucleico de acordo com a presente divulgação, um vetor de acordo com a presente divulgação, uma célula de acordo com a presente divulgação ou uma composição farmacêutica de acordo com a presente divulgação pode ser administrada no nascimento ou assim que possível após o nascimento. A administração pode ser repetida até a soroconversão após a vacinação.

[281] Além disso, a presente divulgação também fornece o uso de um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou proteína de fusão de acordo com a presente divulgação, um ácido nucleico de acordo com a presente divulgação, um vetor de acordo com a presente divulgação, uma célula de acordo com a presente divulgação ou uma composição farmacêutica de acordo com a presente divulgação, no diagnóstico (por exemplo, in vitro, ex vivo, ou in vivo) da hepatite B e/ou hepatite D.

[282] Além disso, é fornecido o uso de um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou proteína de fusão de acordo com a presente divulgação, um ácido nucleico de acordo com a presente divulgação, um vetor de acordo com a presente divulgação, uma célula de acordo com a presente divulgação ou uma composição farmacêutica de acordo com a presente divulgação para determinar se uma amostra de sangue isolada está infectada com o vírus da hepatite B e/ou o vírus da hepatite delta.

[283] Conforme descrito acima, os métodos de diagnóstico podem incluir o contato de um anticorpo, fragmento de anticorpo ou proteína de fusão com uma amostra. Essas amostras podem ser isoladas de um sujeito, por exemplo, uma amostra de tecido isolada retirada de, por exemplo, passagens nasais, cavidades sinusais, glândulas salivares, pulmão, fígado, pâncreas, rim, ouvido, olho, placenta, trato alimentar, coração, ovários, hipófise, suprarrenais, tireoide, cérebro, pele ou sangue. Os métodos de diagnóstico também podem incluir a detecção de um complexo antígeno/anticorpo, em particular após o contato de um anticorpo ou fragmento de anticorpo com uma amostra. Essa etapa de detecção é normalmente realizada na bancada, ou seja, sem qualquer contato com o corpo humano ou animal. Os exemplos de métodos de detecção são bem conhecidos pelos especialistas na técnica e incluem, por exemplo, ELISA (ensaio imunoadsorvente enzima-associado).

[284] A presente divulgação também fornece um método de tratamento, prevenção e/ou atenuando a hepatite B e/ou hepatite D em um sujeito, em que o método compreende a administração ao sujeito um anticorpo, antígeno, fragmento de ligação, ou proteína de fusão de acordo com a presente divulgação, um ácido nucleico de acordo com a presente divulgação, um vetor de acordo com a presente divulgação, uma célula de acordo com a presente divulgação ou uma composição farmacêutica de acordo com a presente divulgação. Em certos exemplos de realização, um método compreende ainda a administração ao sujeito de um ou mais dentre: (vii) um inibidor da polimerase, em que o inibidor da polimerase compreende opcionalmente Lamivudina, Adefovir, Entecavir, Telbivudina, Tenofovir ou qualquer combinação dos mesmos; (viii) um interferon, em que o interferon compreende opcionalmente IFN–beta e/ou IFN–alfa; (ix) um inibidor do ponto de checagem (checkpoint) imunológico, em que o inibidor do ponto de checagem imunológico compreende opcionalmente um anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e/ou um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; (x) um agonista de uma molécula de ponto de verificação imunológico estimulador; ou (xi) qualquer combinação de (vii) – (x).

[285] Em alguns exemplos de realização, a infecção por hepatite B é uma infecção por hepatite B crônica. Em alguns exemplos de realização, o sujeito recebeu um transplante de fígado. Em alguns exemplos de realização, o sujeito não é imunizado contra a hepatite B. Em alguns exemplos de realização, o sujeito é um recém-nascido. Em alguns exemplos de realização, o sujeito está fazendo ou foi submetido à hemodiálise.

[286] A presente divulgação também fornece um método de tratamento de um indivíduo que recebeu um transplante de fígado, compreendendo a administração ao sujeito que recebeu o transplante de fígado de uma quantidade eficaz de um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou proteína de fusão de acordo com a presente divulgação, um ácido nucleico de acordo com a presente divulgação, um vetor de acordo com a presente divulgação, uma célula de acordo com a presente divulgação ou uma composição farmacêutica de acordo com a presente divulgação.

[287] Também são fornecidos métodos para detectar a presença ou ausência de um epítopo em uma conformação correta em uma vacina anti-hepatite- B e/ou anti-hepatite D, em que os métodos compreendem: (i) contatar a vacina com um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou proteína de fusão de qualquer um da presente divulgação; e (ii) determinar se um complexo compreendendo um antígeno e o anticorpo, ou compreendendo um antígeno e o fragmento de ligação ao antígeno, ou compreendendo um antígeno e a proteína de fusão, foi formado.

[288] O termo “vacina”, conforme usado aqui é, tipicamente, entendido como sendo um material profilático ou terapêutico que fornece pelo menos um antígeno, de preferência um imunógeno. O antígeno ou imunógeno pode ser derivado de qualquer material que seja adequado para vacinação. Por exemplo, o antígeno ou imunógeno pode ser derivado de um patógeno, tal como bactérias ou partículas virais, etc., ou de um tumor (incluindo um tumor sólido ou líquido) ou outro tecido canceroso. O antígeno ou imunógeno estimula o sistema imune adaptativo do corpo para fornecer uma resposta imune adaptativa. Em certos exemplos de realização, um “antígeno” ou um “imunógeno” refere-se, tipicamente, a uma substância que pode ser reconhecida pelo sistema imune, por exemplo, pelo sistema imune adaptativo, e que é capaz de desencadear uma resposta imune antígeno-específica, por exemplo, através de formação de anticorpos e/ou células T específicas para antígeno como parte de uma resposta imune adaptativa. Em alguns exemplos de realização, um antígeno pode ser ou pode compreender um peptídeo ou proteína que pode ser apresentada pelo complexo MHC (por exemplo, MHC classe I; MHC classe II) às células T. Em certos exemplos de realização, o antígeno compreende um antígeno HBV e/ou HBD; por exemplo, um antígeno HBsAg.

[289] Em alguns casos, os elementos dos anticorpos, fragmentos de anticorpos, proteínas de fusão, ácidos nucleicos, células, composições, usos e métodos fornecidos neste documento são descritos ou listados com referência a exemplos de realização ou exemplos. No entanto, deve ser entendido que os exemplos e realizações descritos na presente invenção podem ser combinados de várias maneiras para criar exemplos de realização adicionais.

EXEMPLOS

[290] A seguir, são apresentados exemplos específicos que ilustram vários exemplos de realização e aspectos da invenção. No entanto, a presente invenção não deve ter o seu escopo limitado pelos exemplos de realização específicos aqui descritos.

EXEMPLO 1

GERAÇÃO E TESTE DE ANTICORPOS MANIPULADOS

[291] A análise de alguns variantes de anticorpo HBC34 da Publicação PCT WO 2017/060504 revela um aminoácido cisteína na posição 40 (numeração IMGT) na região variável de cadeia leve que não é pareado e representa uma potencial desvantagem. Sem desejar se limitar pela teoria, os resíduos de cisteína pareados são potencialmente reativos e podem potencialmente desencadear a agregação por meio de embaralhamento intramolecular ou formação de ligações de dissulfeto intermoleculares. Variantes de HBC34–V7 (documento WO 2017/060504) foram projetadas de modo que o aminoácido cisteína na posição 40 da região variável de cadeia leve foi substituído por uma serina (gerando assim “HBC34–V34”) ou por uma alanina (gerando assim “HBC34–V35”). As sequências nucleotídicas que codificam esses anticorpos variantes adicionais foram códon- otimizadas e os anticorpos foram expressos como IgG1 (g1m17, alótipo 1) em células ExpiCHO® (ThermoFisher). As sequência nucleotídicas códon-otimizadas que codificam os domínios VH e VL de HBC34–V35 são fornecidas nas SEQ ID NOs: 103 e 104, respectivamente.

[292] A capacidade de HBC34–V34 e HBC34–V35 de se ligar ao antígeno foi investigada usando um ensaio ELISA de ligação direta ao antígeno.

HBC34–V7 foi usado como um comparador. Conforme mostrado na Figura 1, HBC34–V34 e HBC34–V35 ligam-se efetivamente a dois antígenos HBsAg recombinantes (“adw”, painel superior; “adr”, painel inferior) e HBC34–V35 teve ligação muito semelhante ao HBC34–V7 parental.

[293] Os anticorpos variantes foram examinados quanto à ligação a todos os genótipos HBsAg conhecidos ((A) - (J)). Resumidamente, células epiteliais humanas (células Hep2) foram transfectadas com plasmídeos que expressam o HBsAg de cada um dos 10 genótipos de HBV: A, B, C, D, E, F, G, H, I e J. Todos os anticorpos foram testados em múltiplas concentrações para coloração de células permeabilizadas transfectadas transitoriamente. Dois dias após a transfecção, as células Hep2 foram coletadas, fixadas e permeabilizadas com saponina para imunocoloração com HBC34 e as cinco variantes selecionadas. HBC34–V7 foi incluído como um comparador. A ligação de anticorpos às células transfectadas foi analisada usando um instrumento Becton Dickinson FACSCanto2® (BD Biosciences) com software FlowJo (TreeStar). Conforme mostrado nas Figuras 2A - 2J, HBC34–V34 e HBC34–V35 reconheceram todos os 10 genótipos HBsAg de HBV. HBC34–V35 mostrou uma coloração um pouco mais forte do que HBC34– V34.

[294] Estes dados mostram que os anticorpos variantes HBC34– V34 e V35–HBC34 reconhecem amplamente e se ligam ao HBsAg em níveis comparáveis ao HBC34–V7.

EXEMPLO 2 ANTICORPOS ANTI–HBSAG COM REGIÕES FC MODIFICADAS LIGAM-SE DE FORMA

EFICIENTE AO ANTÍGENO

[295] Modificações na região Fc podem proporcionar vantagens de um anticorpo terapêutico. HBC34–V35 foi expresso como IgG1 com Fc tipo selvagem, ou com Fc com uma mutação “MLNS” (M428L/N434S) ou com Fc contendo MLNS em combinação com uma mutação “GAALIE”

(G239A/A330L/I332E). Cada construção foi testada quanto à ligação a HBsAg (adw) recombinante em dois experimentos separados de ELISA de ligação ao antígeno. Três (3) lotes de HBC34–v35 (Fc tipo selvagem) foram testados. Dois (2) lotes de HBC34–V35–MLNS e dois (2) lotes de HBC34–V35–MLNS- GAALIE foram testados. HBC34v7 (um lote) foi testado como um comparador.

[296] Conforme mostrado nas Figuras 3A e 3B, as mutações introduzidas em Fc não afetaram a atividade de ligação ao antígeno de HBC34–V35. Os valores EC50 variaram um pouco entre as diferentes construções e os dois experimentos e foram geralmente baixos.

[297] A ligação de HBC34–V35 com MLNS ou mutações MLNS e GAALIE em EXPI293 células que expressam genótipos HBsAg (A) - (J) ou HBsAg variante foi avaliada. HBC34–V35 com Fc de IgG1 tipo selvagem foi usado como um comparador. Os dados que mostram a ligação aos genótipos de HBsAg são mostrados nas Figuras 3C- 3H. Os dados que mostram a ligação aos HBsAgs variantes estão nas Figuras 3I-3R.

EXEMPLO 3

ATIVIDADE DE NEUTRALIZAÇÃO IN VITRO DE ANTICORPOS

[298] A capacidade de neutralização de HBC34, HBC34–V35, HBC34–V35–MLNS e HBC34–V35–MLNS–GAALIE foi comparada medindo os níveis de HBsAg (A) e HBeAg (B) no sobrenadante da cultura de células HepG2 que expressam NTCP infectadas com HBV. Os dados são mostrados nas Figuras 3S - 3 V e representam as médias ± DP de um de dois experimentos independentes.

EXEMPLO 4 CAPACIDADE DE NEUTRALIZAÇÃO DO PAN-GENÓTIPO DE HBC34–V35 MLNS–

GAALIE AVALIADA EM UM PSEUDOSISTEMA HDV

[299] Para confirmar a amplitude da neutralização de HBC34– V35–MLNS–GAALIE contra o vírus HBV, os ensaios de neutralização foram conduzidos com HBC34–V35–MLNS–GAALIE contra oito genótipos de HBV humanos prevalentes. Foi utilizado um sistema in vitro que tira vantagem do vírus da hepatite D (HDV) projetado para expressar HBV HBsAg representando diferentes genótipos. Resumidamente, como ambos os vírus, HBV e HDV, compartilham as mesmas proteínas do envelope, suas vias de entrada viral através de proteoglicanos de sulfato de heparano e NTCP são idênticas, e o HDV pode ser usado como um sistema modelo para o estudo da entrada viral mediada por HBsAg (Tu 2018; Lempp 2016). Além disso, o HDV pode ser envelopado/pseudotipado com HBsAg de diferentes genótipos de HBV e, subsequentemente, ser usado em estudos de infecção (Freitas 2014).

[300] HBC34–V35–MLNS–GAALIE apresentou capacidade neutralizante para todos os genótipos testados com valores de EC 50 semelhantes, variando de 0,92 ng/mL (genótipo C) a 2,34 ng/mL (genótipo A).

Estes resultados mostram que HBC34–V35–MLNS–GAALIE é capaz de neutralizar vírus infeccioso contendo HBsAg de todos os oito genótipos de HBV testados, apoiando a atividade de neutralização pan-genotípica in vivo de HBC34–V35–MLNS–GAALIE (Figura 4).

EXEMPLO 5

DEPURAÇÃO DE ANTÍGENOS DE HB E INIBIÇÃO DA ENTRADA VIRAL EM UM MODELO IN VIVO

[301] Um camundongo imunodeficiente com hepatócitos humanos transplantados foi usado para testar a eficácia dos anticorpos anti- HBV da presente divulgação na deleção de HBsAg. Resumidamente, hepatócitos humanos primários foram transplantados em camundongos SCID nos quais os hepatócitos de camundongo foram previamente destruídos enzimaticamente. Os camundongos eram deficientes de células T e B. Este modelo é útil para estudar a infecção por HBV, incluindo entrada, disseminação, regulação de cccDNA, respostas imunes intrínsecas de hepatócitos e integração viral no genoma do hospedeiro.

[302] Os camundongos foram inoculados por meio de injeção na veia caudal com HBV, genótipo C, em 1,0X107 genomas virais por camundongo no Dia 28. Os tratamentos foram no Dia 0 após a medição inicial de HBV. Os camundongos infectados com HBV (n = 4 por grupo de tratamento) foram administrados com PBS (controle) ou HBC34–V35 (1, 5 ou 15 mg/kg i.p., 2x/semana). Os anticorpos foram murinizados com exceção das regiões Fab de ligação ao antígeno.

[303] Amostras de plasma e soro foram coletadas periodicamente ao longo do estudo, e as cargas virais, DNA de HBV (por PCR) e HB Ag (HBsAg, HBeAg, HBcrAg) foram medidos. Os camundongos foram sacrificados na semana 6.

[304] Conforme mostrado nas Figuras 5-8, o tratamento com a dose testada mais alta de HBC34–V35 reduziu a carga viral e a entrada do vírus nos hepatócitos.

EXEMPLO 6

ESTUDOS DE FUNÇÃO EFETORA IN VITRO

[305] Os estudos in vitro foram realizados para examinar a capacidade dos anticorpos HBC34 com Fc modificada em: (1) se ligar ao FcR humano e ao sistema complemento; (2) ativar FcγRIIa, FcγRIIb e FcγRIIIa; e (3) promover ADCC e ativar células Natural Killer (NK) humanas. Artigos de teste, as linhagens de células, e os reagentes utilizados foram tal como descrito nas Tabelas 5 – 7, abaixo. As seguintes abreviaturas são usadas neste exemplo: GLP = Boas Práticas Clínicas; ADCC = Citotoxicidade celular dependente de anticorpos; ADCP = Fagocitose celular dependente de anticorpos; Fc = Fragmento cristalizável; HBsAg = Antígeno de Superfície da Hepatite B; mAb = anticorpo monoclonal; PBS = solução salina tamponada com fosfato; UHPL-SEC = cromatografia líquida de ultra-alto desempenho e de exclusão por tamanho; ATCC = Coleção Americana De Culturas e Depósitos; FcγRs = receptor(es) Fc gama; Células CHO = células de ovário de hamster chinês; RLU = unidades de luminescência relativa; BLI = interferometria de biocamada.

TABELA 5

ARTIGOS DE TESTE Artigo de Teste HBC34–V35–MLNS • Isotipo • IgG1λ • Peso molecular relativo • ≈150 kDa • Concentração • 3,47 mg/mL • Fonte • Interna • Condições de manuseio e • 4ºC em armazenamento de curto armazenamento prazo, -80ºC em armazenamento de longo prazo • Tampão de formulação • PBS, pH 7,2 Artigo de Teste HBC34–V35–MLNS–GAALIE • Isotipo • IgG1λ • Peso molecular relativo • ≈150 kDa • Concentração • 2,1 mg/mL/0,86 mg/mL • Fonte • Interna • Condições de manuseio e • 4ºC em armazenamento de curto armazenamento prazo, -80ºC em armazenamento de longo prazo • Tampão de formulação • PBS, pH 7,2 Artigo de Teste HBC34–V35–LALA • Isotipo • I gG 1λ • Peso molecular relativo • ≈150 kDa • Concentração • 1,2 mg/mL • Fonte • Interna • Condições de manuseio e • 4ºC em armazenamento de curto armazenamento prazo, -80ºC em armazenamento de longo prazo • Tampão de formulação • PBS, pH 7,2 Artigo de Teste mAb 17.1.41 • Isotipo • IgG1κ • Peso molecular relativo • ≈150 kDa • Concentração • 4,4 mg/mL • Fonte • Interna • Condições de manuseio e • 4ºC em armazenamento de curto armazenamento prazo, -80ºC em armazenamento de longo prazo • Tampão de formulação • PBS, pH 7,2

TABELA 6

LINHAGENS DE CÉLULAS Linhagem de células PLC/PRF/5 • Número do catálogo • nº 4325–FC-050 • Concentração • 100 µg/mL • Fonte • R&D Systems, linhagem de células de mieloma de camundongo, derivada de NS0, com um marcador 6His tag C-terminal • Estabilidade • Estável a -20 a 80ºC • Condições de manuseio e • Armazenar a -80ºC até o uso, 1 mês, armazenamento 2 a 8ºC em condições estéreis após a reconstituição • Tampão de formulação • PBS Linhagem de células Jurkat-FcγRIIIA (F158) • Origem do tecido • Linhagem de células imortalizadas de linfócitos T humanos; Células Jurkat que expressam de forma estável o receptor FcγRIIIa, variante F158 (baixa afinidade) e um elemento de resposta NFAT que direciona a expressão da luciferase de vaga- lume como células efetoras • Fonte • Promega (Cat. Nº.: G9798) • Meio de ensaio • RPMI1640 suplementado com 4% de soro com baixo teor de IgG Linhagem de células Jurkat-FcγRIIIA (V158) • Tecido o rigin • Linhagem de células imortalizadas de linfócitos T humanos; Células Jurkat expressando de forma estável o receptor FcγRIIIa, variante V158 (alta afinidade) e um elemento de resposta NFAT que direciona a expressão da luciferase de vaga-lume como células efetoras • Fonte • Promega (Cat. Nº.: G7018) • Meio de ensaio • RPMI1640 suplementado com 4% de soro com baixo teor de IgG Linhagem de células Jurkat-FcγRIIA (H131) • Origem do tecido • Linhagem de células imortalizadas de linfócitos T humanos; Células Jurkat que expressam de forma estável o receptor FcγRIIa, a variante H131 (alta afinidade) e um elemento de resposta NFAT que direciona a expressão da luciferase de vaga- lume como células efetoras • Fonte • Promega (Cat. Nº.: G9995) • Meio de ensaio • RPMI1640 suplementado com 4% de soro bovino fetal com baixo teor de IgG Linhagem de células Jurkat-FcγRIIB • Origem do tecido • Linhagem de células imortalizadas de linfócitos T humanos; Células Jurkat que expressam de forma estável o receptor FcγRIIb e um elemento de resposta NFAT que direciona a expressão da luciferase de vaga-lume como células efetoras • Fonte • Promega (Cat. Nº.: CS1781E02)

• Meio de ensaio • RPMI1640 suplementado com 4% de soro bovino fetal com baixo teor de IgG Linhagem de células Células NK humanas isoladas a fresco • Origem do tecido • Sangue total (EDTA) do doador HM_WB019 (genotipado para FcgRIIIa F/V), purificado com o kit de isolamento MACSxpress® NK Isolation Kit da Miltenyi Biotec (nº 130–098–185) • Fonte • Interna • Meio de ensaio • AIM–V • Meio de crescimento • RPMI1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal com baixo teor de IgG, Glutamax • Condições de crescimento • 37ºC, 5% de CO2 Linhagem de células Células NK humanas isoladas a fresco • Origem do tecido • Sangue total (EDTA) do doador HM_W B002 (genotipado para FcgRIIIa V/V), purificado com o kit de isolamento MACSxpress® NK Isolation Kit da Miltenyi Biotec (nº 130–098–185) • Fonte • Interna • Meio de ensaio • AIM–V • Meio de crescimento • RPMI1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal com baixo teor de IgG, Glutamax • Condições de crescimento • 37ºC, 5% de CO2 Linhagem de células Células NK humanas isoladas a fresco • Origem do tecido • Sangue total (EDTA) do doador HM_WB018 (genotipado para FcgRIIIa F/F), purificado com o kit de isolamento MACSxpress® NK Isolation Kit da Miltenyi Biotec (nº 130–098–185) • Fonte • Interna • Meio de ensaio • AIM–V • Meio de crescimento • RPMI1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal com baixo teor de IgG, Glutamax • Condições de crescimento • 37ºC, 5% de CO2 TABELA 7

OUTROS REAGENTES Reagente FcγRIIIa humano recombinante (V158) • Número do catálogo • nº 4325–FC-050 • Concentração • 100 µg/mL • Fonte • R&D Systems, linhagem de células de mieloma de camundongo, derivada de NS0, com um marcador 6His-tag C-terminal • Estabilidade • Estável a -20 a 80ºC • Condições de manuseio e • Armazenar a -80ºC até o uso, 1 mês, armazenamento 2 a 8ºC sob condições estéreis após a reconstituição • Tampão de formulação • PBS Reagente FcγRIIIa humano recombinante (F158) • Número do catálogo • 10389–H08H • Concentração • 200 µg/mL (quando reconstituído)

• Fonte • Sino Biological, Derivado de HEK293, com um 6His–tag C-terminal • Estabilidade • Estável a -20 a 80ºC • Condições de manuseio e • Armazenar a -80ºC até o uso armazenamento • Tampão de formulação • PBS Reagente FcγRIIa humano recombinante (H131) • Número do catálogo • 10374–H08C1 • Concentração • 200 µg/mL (quando reconstituído) • Fonte • Sino Biological, Derivado de CHO, com um 6His-tag C-terminal • Estabilidade • Estável a -20 a 80ºC • Condições de manuseio e • Armazenar a -80ºC até o uso armazenamento • Tampão de formulação • PBS Reagente FcγRIIa humano recombinante (H131) • Número do catálogo • 10374–H08B • Concentração • 200 µg/mL (quando reconstituído) • Fonte • Sino Biological, derivado de células de inseto, com um 6His-tag C-terminal • Estabilidade • Estável a -20 a 80ºC • Condições de manuseio e • Armazenar a -80ºC até o uso armazenamento • Tampão de formulação • PBS Reagente FcγRIIb humano recombinante • Número do catálogo • 10259–H08C • Concentração • 200 µg/mL (quando reconstituído) • Fonte • Sino Biological, Derivado de CHO, com um 6His-tag C-terminal • Estabilidade • Estável a -20 a 80ºC • Condições de manuseio e • Armazenar a -80ºC até o uso armazenamento Reagente Componente C1q do complemento humano • Número do catálogo • 204873 • Concentração • 1,17 mg/mL • Fonte • Sigma-Aldrich, preparado a partir de soro humano • Estabilidade • Estável a -80ºC • Condições de manuseio e • Armazenar a -80ºC até o uso armazenamento • Tampão de formulação • HEPES 10 mM com NaCl a 0,3 M, pH 7,2 Reagente Fonte PBS Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Suíça Meio AIM–V Gibco Meio Ham's F-12K Gibco Kit de isolamento MACSxpress® NK Isolation Miltenyi Biotec GmbH, Alemanha Kit Kit de detecção de citotoxicidade (LDH) Roche Diagnostics GmbH, Suíça Placas de fundo redondo de 96 poços Corning Placas de fundo plano branco de 96 poços PerkinElmer Placas de fundo redondo de 384 poços Corning Placas de fundo plano de 384 poços Corning Espectrofotômetro Bio-Tek

Meio RMPI Gibco Meio DMEM de alto teor de glicose com Bioconcept glutamina estável SBF GE Healthcare Glutamax Gibco Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol Gibco Programa estatístico Prism7 Software Graph Pad Software, Inc., La Jolla, CA Triton X-100 Sigma Tampão de ensaio de ADCC Promega Reagente de ensaio da luciferase Bio-Glo-® Promega Bioensaio de ADCC Promega Tampão de lavagem PBS, 1% de SBF Solução de formaldeído, conc. 37% Sigma (Cat. Nº.: F1635–500ML) Saponina Sigma (Cat. Nº.: S7900–100G) Tampão de permeabilização 0,5% saponina, PBS, 1% SBF Anticorpo secundário - Alexa Fluor®647 Fragmento de cabra AffiniPure F(ab’)2 Anti- IgG humana, específico para o fragmento Fcγ (Jackson ImmunoResearch, Cat. Nº.: 109–606–098) Anticorpo anti-CD107 PE secundário PE anti-CD107 (BioLegend, Cat. Nº.: 328608, Clone H4A3, IgG1 de camundongo, capa (kappa))

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS MEDIÇÃO DA LIGAÇÃO AOS RECEPTORES FC HUMANOS

[306] A ligação de HBC34–V35–MLNS e HBC34–V35–MLNS– GAALIE aos FcγRs humanos foi medida em um instrumento Octet ® (BLI, interferometria de biocamada; FortéBio). Resumidamente, FcγRs humanos marcado com His (his-tagged) (FcγRIIa alelo H131, FcγRIIa alelo R131, FcγRIIAa alelo F158, FcγRIIIa alelo V158 e FcγRIIb) a 2 µg/mL foram capturados em sensores anti-penta-His por 6 minutos. Os sensores carregados com FcγR foram então expostos por 4 minutos a uma solução de tampão cinético (pH 7,1) contendo 2 µg/mL de cada mAb na presença de 1 µg/mL de Fragmento affiniPure F(ab’)2 de cabra anti-IgG humana, fragmento F(ab’)2– específico (para reticular mAbs humanos através do fragmento Fab), seguido por uma etapa de dissociação no mesmo tampão por 4 minutos adicionais (parte direita do gráfico). Os perfis de associação e dissociação foram medidos em tempo real como mudança no padrão de interferência usando um Octet ® RED96 (FortéBio). A ligação de HBC34–V35–MLNS–GAALIE, HBC34–V35– MLNS ou HBC34–V35 em solução ao FcRn humano imobilizado foi medida por

Octet® em tempo real, em pH = 6,0 ou pH = 7,4.

MEDIÇÃO DA LIGAÇÃO À PROTEÍNA C1Q DO SISTEMA COMPLEMENTO HUMANO

[307] A ligação de HBC34–V35–MLNS e HBC34–V35–MLNS– GAALIE a uma proteína do sistema complemento humano foi medida em um instrumento Octet® (BLI, interferometria de biocamada; FortéBio).

Resumidamente, sensores anti-Fab humano (específico para CH1) foram usados para capturar, através do fragmento Fab, o IgG1 completo de HBC34– V35–MLNS e mAbs HBC34–V35–MLNS–GAALIE a 10 µg/mL por 10 minutos.

Sensores carregados com IgG foram então expostos por 4 minutos a uma solução de tampão cinético (pH 7,1) contendo 3 µg/mL de C1q humano purificado (parte esquerda do gráfico), seguido por uma etapa de dissociação no mesmo tampão por mais 4 minutos (parte direita do gráfico). Os perfis de associação e dissociação foram medidos em tempo real como mudança no padrão de interferência usando um Octet® RED96 (FortéBio).

PREPARAÇÃO DE CÉLULAS NK HUMANAS A PARTIR DO SANGUE TOTAL

[308] Células NK foram isoladas a fresco a partir de sangue total coletado com EDTA usando o kit de isolamento de células NK MACSxpress® seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, o sangue anticoagulado foi misturado em um tubo de 50 mL com 15 mL do coquetel de isolamento NK e incubado por 5 minutos em temperatura ambiente usando um rotador a aproximadamente 12 s por minuto. O tubo foi então colocado no campo magnético do Separador MACSxpress® por 15 minutos. As células magneticamente marcadas aderem à parede do tubo enquanto os eritrócitos agregados sedimentam para o fundo. As células NK alvo foram então coetadas a partir do sobrenadante enquanto o tubo ainda estava dentro do MACSxpress® Separator. As células NK foram novamente centrifugadas, tratadas com água destilada para remover eritrócitos residuais, centrifugadas novamente e finalmente ressuspensas em meio AIM–V.

DETERMINAÇÃO DA DESTRUIÇÃO DE CÉLUAS ALVO POR CÉLULAS NK DEPENDENTE DE ANTICORPO

[309] Os MAbs foram diluídos em série 10 vezes em meio AIM–V de 100 µg/mL a 0,001 µg/mL. As células alvo (PLC/PRF/5;. MacNab, et al, British Journal of Cancer, 34 (5), 1976) foram adicionadas em placas de fundo redondo de 384 poços a 7,5 x 103 células/poço em 23 μL, em seguida os anticorpos diluídos em série foram adicionados a cada poço (23 µl por poço), e a mistura de anticorpo/célula foi incubada por 10 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, as células NK humanas foram adicionadas a uma densidade celular de 7,5 x 104/poço em 23 µL, produzindo uma razão de células efetoras para células alvo de 10:1. Também foram incluídos poços de controle que foram usados para medir a lise máxima (contendo células alvo com 23 µL de Triton x-100 a 3%) e lise espontânea (contendo células alvo e células efetoras sem anticorpo). As placas foram incubadas durante 4 horas a 37ºC com 5% de CO2. A morte celular foi determinada medindo a liberação de lactato desidrogenase (LDH) usando um kit de detecção de LDH de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as placas foram centrifugadas durante 4 minutos a 400 x g e 35 µL de sobrenadante foram transferidos para uma placa de fundo plano de 384 poços. O reagente de LDH foi preparado e 35 µL foram adicionados a cada poço. Usando um protocolo cinético, a absorbância a 490 nm e 650 nm foi medida uma vez a cada 2 minutos por 8 minutos. A percentagem de lise específica foi determinada aplicando a seguinte fórmula: (liberação específica - liberação espontânea) / (liberação máxima - liberação espontânea) x 100.

DETERMINAÇÃO DA ATIVAÇÃO DE CÉLULAS NK DEPENDENTE DE ANTICORPO

[310] A ativação de células NK primárias foi testada usando células isoladas a fresco de dois doadores que foram previamente genotipados para expressar FcγRIIIa de afinidade homozigótica alta (alelo V158) ou baixa

(alelo F158). Diluições em série de mAbs (diluídas em série 10 vezes em meio AIM–V de 100 µg/mL a 0,0001 µg/mL) foram incubadas com células NK durante 4 horas. A ativação das células NK foi medida por citometria de fluxo, pela coloração das células NK com mAb anti-CD107a (anti-CD107 PE, BioLegend®, usado diluído 1/35) como um marcador funcional para a atividade de células NK.

DETERMINAÇÃO DA ATIVAÇÃO DE FCΓRIIIA HUMANO DEPENDENTE DE ANTICORPO

[311] HBC34–V35–MLNS e HBC34–V35–MLNS–GAALIE foram diluídos em série 4 vezes em tampão de ensaio de ADCC de 5 µg/mL a 0,076 µg/mL. O antígeno alvo (HBsAg da Engerix B, Glaxo SmithKline) foi adicionado em uma placa de 96 poços de fundos planos brancos a 0,6 µg/mL em 25 µl, em seguida, os anticorpos diluídos em série foram adicionados a cada poço (25 µL por poço), e o anticorpo/mistura de células foi incubado durante 10 minutos à temperatura ambiente. As células efetoras para o Bioensaio de ADCC foram descongeladas e adicionadas a uma densidade celular de 7,5 x 104 /poço em 25 μL (concentração final de HBsAg foi de 0,2 μg/mL). Os poços de controle também foram incluídos, os quais foram usados para medir a ativação independente de anticorpos (contendo HBsAg e células efetoras, mas nenhum anticorpo) e a luminescência espontânea da placa (poços contendo apenas o tampão de ensaio de ADCC). As placas foram incubadas durante 24 horas a 37ºC com 5% de CO2. A ativação de FcγRIIIa humano (variantes V158 ou F158) neste bioensaio resulta na expressão mediada por NFAT do gene repórter da luciferase. A luminescência foi medida com um luminômetro usando o reagente de ensaio Bio-Glo-® Luciferase Assay Reagent de acordo com as instruções do fabricante. Os dados (ou seja, ativação específica de FcγRIIIA) são expressos como a média de unidades de luminescência relativa (RLU) sobre o fundo, aplicando a seguinte fórmula: (RLU na concentração x de mAb x - RLU de fundo).

DETERMINAÇÃO DA ATIVAÇÃO DE FCΓRIIA HUMANO DEPENDENTE DE ANTICORPO

[312] HBC34–V35–MLNS e HBC34–V35–MLNS–GAALIE foram diluídos em série 5 vezes em tampão de ensaio de ADCP de 50 µg/mL a 0,00013 µg/mL. O antígeno alvo (HBsAg da Engerix B, Glaxo SmithKline) foi adicionado em uma placa de 96 poços de fundos planos brancos a 0,6 ou 6 µg/mL em 25 µl, em seguida, os anticorpos diluídos em série foram adicionados a cada poço (25 µL por poço), e o antígeno/anticorpo foi incubado durante 25 minutos à temperatura ambiente. As células efetoras para o bioensaio ativação de FcγRIIa foram descongeladas e adicionadas a uma densidade de células de 50,0 x 104 /poço em 25 μL (concentração final de HBsAg foi de 0,2 ou 2 μg/mL, respectivamente). Os poços de controle também foram incluídos, os quais foram usados para medir a ativação independente de anticorpos (contendo HBsAg e células efetoras, mas nenhum anticorpo) e a luminescência espontânea da placa (poços contendo apenas o tampão de ensaio de ADCP). As placas foram incubadas durante 23 horas a 37ºC com 5% de CO2. A ativação de FcγRIIa humano (variantes H131) neste bioensaio resulta na expressão mediada por NFAT do gene repórter da luciferase. A luminescência foi medida com um luminômetro usando o reagente de ensaio Bio-Glo-® Luciferase Assay Reagent de acordo com as instruções do fabricante. Os dados (ou seja, ativação específica de FcγRIIa) são expressos como a média de unidades de luminescência relativa (RLU) sobre o fundo pela aplicação da seguinte fórmula: (RLU na concentração [x] de mAb x – RLU de fundo).

DETERMINAÇÃO DA ATIVAÇÃO DE FCΓRIIB HUMANO DEPENDENTE DE ANTICORPO

[313] HBC34–V35–MLNS e HBC34–V35–MLNS–GAALIE foram diluídos em série 5 vezes em tampão de ensaio de ADCP de 100 µg/ml a 0,00026 µg/mL. O antígeno alvo (HBsAg da Engerix B, Glaxo SmithKline) foi adicionado em uma placa de 96 poços de fundos planos brancos a 3 µg/mL em

25 µl, em seguida, os anticorpos diluídos em série foram adicionados a cada poço (25 µL por poço), e o antígeno/anticorpo foi incubado durante 15 minutos à temperatura ambiente. As células efetoras para o Bioensaio de ativação de FcγRIIb foram descongeladas e adicionadas a uma densidade celular de 75,0 x 104 /poço em 25 μL (a concentração final de HBsAg foi de 1 μg/mL). Os poços de controle também foram incluídos, os quais foram usados para medir a ativação independente de anticorpos (contendo HBsAg e células efetoras, mas nenhum anticorpo) e a luminescência espontânea da placa (poços contendo apenas o tampão de ensaio de ADCP). As placas foram incubadas durante 20 horas a 37ºC com 5% de CO2. A ativação de FcγRIIb humano neste bioensaio resulta na expressão mediada por NFAT do gene repórter da luciferase. A luminescência foi medida com um luminômetro usando o reagente de ensaio Bio-Glo-® Luciferase Assay Reagent de acordo com as instruções do fabricante. Os dados (ou seja, ativação específica de FcγRIIb) são expressos como a média de unidades de luminescência relativa (RLU) sobre o fundo pela aplicação da seguinte fórmula: (RLU na concentração [x] de mAb x – RLU de fundo).

DETERMINAÇÃO DA LIGAÇÃO DO ANTICORPO À LINHAGEM DE CÉLULAS DE HEPATOMA HUMANO PLC/PRF/5

[314] As células PLC/PRF/5 foram tratadas com tripsina durante 5 min a 37ºC, transferidas em 7 mL de meio de crescimento, centrifugadas a 400 x g, por 4 min. a 4ºC, e lavadas extensivamente a 4ºC em PBS. Algumas células foram fixadas com formaldeído a 4% (20 minutos a 4ºC); outras foram fixadas e depois permeabilizadas com tampão de permeabilização (20 minutos a 4ºC). O sedimento celular foi ressuspenso em 2,64 mL de tampão de lavagem (células fixadas) ou tampão de permeabilização (células fixadas e permeabilizadas) (Tabela 7) e dispensadas a 200 µL/poço em placas de 96 poços com fundos redondos (correspondendo a 100.000 células/poço). A placa foi centrifugada a 400 g, 4 min, 4ºC. Diluições em série de 5 pontos (1:5) dos anticorpos de teste a partir de uma concentração final de 10 µg/mL foram adicionadas aos poços contendo células e incubadas por 30 minutos em gelo.

Após 2 lavagens a 4ºC, 400 x g, 4 min em tampão de lavagem (células fixadas) ou tampão de permeabilização (células fixadas e permeabilizadas), 50 µL/poço de anticorpo secundário marcado com Alexa Fluor®647 (Tabela 7) foram adicionados às células que foram incubadas por 20 min em gelo. As células foram lavadas mais 2 vezes com tampão de lavagem (células fixas) ou tampão de permeabilização (células fixadas e permeabilizadas), ressuspensas em 200 µL/poço de tampão de lavagem (células fixadas) ou tampão de permeabilização (células fixadas e permeabilizadas) e o sinal (MFI, média da intensidade de fluorescência) foi quantificado com citofluorímetro (BD FACSCanto® II).

RESULTADOS

[315] Os mecanismos antivirais diretos são importantes para neutralização do HBV in vivo. Os mecanismos de ação indiretos, dependentes de Fc, mediados pela interação da região Fc com receptores Fc gama (FcγRs) em células imunes também podem ter contribuições importantes para a eficácia in vivo e para mediar respostas imunes endógenas. Os mecanismos dependentes de FcγR podem ser avaliados in vitro medindo a ligação aos FcγRs, bem como na ativação dependente de anticorpos de FcγRs humanos (Hsieh, Y.-T., et al., Journal of Immunological Methods, 441 (C), 56-66.

doi.org/10.1016/j.jim.2016.12.002). A capacidade do anticorpo de se ligar ao FcRn e ao complemento são outros fatores de interesse.

[316] Em um conjunto de experimentos, HBC34–V35–MLNS e HBC34–V35–MLNS–GAALIE foram comparados lado a lado quanto à capacidade de se ligar ao conjunto completo de FcγRs humanos (alelos FcγRIIIa V158 e F158, FcγRIIA H131 e alelos R131, e FcγRIIB) usando interferometria de biocamada (BLI Octeto® System, ForteBio). Conforme mostrado nas Figuras 9A - 9E, Fc que carregam as mutações MLNS–GAALIE alteraram as interações com FcγRs; especificamente, porções Fc contendo estas duas mutações, diferentemente de porções Fc que contém apenas MLNS, possuem ligação aumentada ao FcγRIIIa e FcγRIIA, e ligação reduzida ao FcγRIIB.

[317] Conforme mostrados na Figura 9F, anticorpos portadores Fc com a mutação MLNS possuem ligação aumentada ao FcRn em pH 6,0 em relação ao anticorpo com Fc tipo selvagem, mas pouca ou nenhuma de ligação mensurável ao FcRn em pH 7,4, o que é comparável ao anticorpo com Fc tipo selvagem.

[318] Além disso, a ligação de HBC34–V35–MLNS–GAALIE ao C1q do complemento foi abolida, conforme medido por interferometria de biocamada (Figura 10).

[319] HBC34–V35–MLNS e HBC34–V35–MLNS–GAALIE também foram testados quanto à sua capacidade de ativar FcγRIIIa e FcγRIIa humanos usando bioensaios repórter baseados em células. Estes ensaios utilizam células Jurkat manipuladas com uma luciferase repórter mediada por NFAT para refletir a ativação de FcγRs humanos. Enquanto HBC34–V35– MLNS mal ativou ou não ativou FcγRIIIa e FcγRIIa humanos na presença de HBsAg, HBC34–V35–MLNS–GAALIE mostrou ativação dose-dependente de todos os FcγRs testados (Figuras 11A, 11B, 12A-12B). O HBC34–V35–MLNS– GAALIE não ativou o FcγRIIB, mesmo quando testado a 100 μg/mL (Figuras 13A-13B).

[320] A atividade ADCC também foi medida usando células natural killer (NK) isoladas de células mononucleares de sangue periférico humano de um doador que foi previamente genotipado e que expressa heterozigose (F/V) de FcγRIIIa de alta (V158) e baixa (F158) afinidade. As células NK isoladas foram utilizadas para medir a morte da linhagem de células de hepatoma PLC/PR/5 após exposição a HBC34–V35; HBC34–V35–MLNS; HBC34–V35–MLNS–GAALIE; ou outro mAb (17.1.41, direcionado a outro epítopo na alça antigênica do HBsAg; conulte Eren, R., et al., Hepatology, doi.org/10.1053/jhep.2000.9632; Galun, E., et al., Hepatology, doi.org/10.1053/jhep.2002.31867). A morte celular na presença de mAbs específicos para HBsAg HBC34–V35, HBC34–V35–MLNS, HBC34–V35– MLNS–GAALIE e 17.1.41 não foi observada (Figura 14A). A ausência de morte dependente de anticorpos observada das células PLC/PR/5 pode estar relacionada à expressão pobre de HBsAg na superfície dessas células (Figura 14B), que, sem desejar se limitar pela teoria, pode não ser suficiente para desencadear a morte pelas células NK. Por outro lado, altos níveis de HBsAg foram detectados com HBC34v35 e 17.1.41 quando as células PLC/PR/5 foram fixadas e permeabilizadas, indicando que a maior parte do HBsAg encontra-se intracelularmente ou na forma secretada (ou seja, como partículas subvirais) (Figura 14B).

[321] A ativação de células NK humanas primárias (V/F) na presença de HBC34v35–MLNS ou HBC34–V35–MLNS–GAALIE e HBsAg também foi examinada usando mAb anti-CD107a. Os dados são mostrados nas Figuras 15A e 15B.

[322] Estes dados in vitro mostram que as proteínas de ligação específicas para HBV da presente divulgação com a mutação GAALIE em Fc ligam-se e ativam FcγRIIa e FcγRIIIA com baixa afinidade ativação de forma mais eficaz do que o anticorpo parental Fc não GAALIE. As proteínas de ligação com GAALIE também não se ligam ou ativam FcγRIIb inibidor de baixa afinidade. As proteínas de ligação com GAALIE também não se ligam ao C1q. Além disso, as proteínas de ligação com GAALIE não promovem a ADCC em células de hepatoma, mas ativam células NK humanas na presença de HBsAg solúvel. A introdução da mutação MLNS aumenta a ligação ao FcRn em pH 6,0.

EXEMPLO 7 ESTUDO IN VITRO DA INTERAÇÃO FÁRMACO-FÁRMACO ENTRE HBC34–V35–MLNS– GAALIE E UM INIBIDOR POL/RT

[323] Um estudo in vitro foi realizado para identificar possíveis efeitos da combinação de HBC34–V35–MLNS–GAALIE com o inibidor de pol/RT de HBV, entecavir (ETV). Os efeitos da combinação in vitro foram determinados usando HBC34–V35–MLNS–GAALIE e ETV em células HepG2.2.15 em um formato de tabuleiro de xadrez. Os níveis de DNA de HBV e HBsAg foram usados como leituras e os dados foram analisados para efeitos de combinação usando o MacSynergy II (uab.edu/medicine/peds/macsynergy).

Para normalização, os valores obtidos de células HepG2.2.15 não tratadas foram usados como controles positivos, enquanto o meio de cultura de tecidos foi usado como controle negativo. Os gráficos do Synergy com 99% de confiança foram usados para relatórios. Os dados são mostrados na Figura 16.

Os gráficos do Synergy para ambas as leituras mostram um efeito aditivo in vitro do HBC34–V35–MLNS–GAALIE com ETV. De forma notável, nenhum antagonismo foi observado. Esses dados suportam o uso de análogos de nucleosídeoos em combinação com HBC34–V35–MLNS–GAALIE em um ambiente clínico.

EXEMPLO 8 IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO ANTICORPO MONOCLONAL HBC24 HUMANO

[324] Um anticorpo monoclonal humano anti-HBV foi isolado de um modo semelhante ao descrito em Traggiai E. et al., 2004, Nat Med 10 (8): 871–5 a partir de um paciente humano. O anticorpo foi caracterizado pela determinação das sequências de nucleotídeos e aminoácidos de suas regiões variáveis e regiões determinantes de complementaridade (CDRs), e foi denominado “HBC24”. Consequentemente, o HBC24 é um anticorpo monoclonal totalmente humano do tipo IgG1 possuindo as sequências CDR, V H e VL mostradas acima na Tabela 3. Sequências de nucleotídeos exemplares que codificam a VH e VL do HBC24 são fornecidas na Tabela 4.

EXEMPLO 9 GERAÇÃO DE VARIANTES DE LINHAGEM GERMINATIVA DE HBC24 E TESTE FUNCIONAL

[325] O HBC24 é analisado quanto à presença de mutações somáticas nas regiões variáveis em relação à sequência da linhagem germinativa. As mutações somáticas identificadas são revertidas para a sequência da linhagem germinativa para produzir variantes HBC24. HBC24 e variantes são testados para ligação (in vitro) e neutralização (in vitro; in vivo) dos sorotipos de HBV e HBD usando os ensaios descritos na presente invenção.

EXEMPLO 10 INTRODUÇÃO DE MODIFICAÇÕES DE FC PARA HBC24 E VARIANTES

[326] São produzidos outros variantes de HBC24 que contêm as mutações MLNS e GAALIE em ambos os monômeros de Fc. As sequências de aminoácidos de HC dos variantes selecionados são fornecidas nas SEQ ID NOs: 121 e 122. Os variantes são examinados quanto a: (1) ligação in vitro ao antígeno; (2) neutralização in vitro de sorotipos de HBV usando os ensaios descritos na presente invenção.

TABELA DE SEQUÊNCIAS E SEQ ID NO (LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS):

SEQ ID Sequência Observações

NO 1 X1 X2 X3 TC X4 X5 X6A X7G epítopo em que X1, X2, X3, X4, X5, X6 e X7 podem ser qualquer aminoácido

SEQ ID Sequência Observações

NO 2 X1 X2 X3 TC X4 X5 X6A X7G em que X1 é P, T ou S, X2 é C ou S, X3 é R, K, D ou I, X4 é M ou T, X5 é T, A ou I, X6 é T, P ou L, e X7 é Q, H ou L. 3 MENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLG Domínio S de HBsAg GTTVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPTCPGYRWMCLRRFIIFL (Nº de acesso FILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTT GenBank: J02203)

AQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWAS ARFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLY

SILSPFLPLLPIFFCLWVYI 4 MENVTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFL Domínio S de HBsAg GGTTVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPTCPGYRWMCLRRFII (Nº de acesso FLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTT GenBank: FJ899792)

PAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWA SARFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSL

YSTLSPFLPLLPIFFCLWVYI 5 QGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTTAQGTSMYPSCCCT J02203 (D, ayw3)

KPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW 6 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCT FJ899792 (D, adw2)

KPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW 7 QGMLPVCPLIPGTTTTSTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTK AM282986 (A)

PSDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSW 8 QGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFPSCCCTK D23678 (B1)

PTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSW 9 QGMLPVCPLLPGTSTTSTGPCKTCTIPAQGTSMFPSCCCTK AB117758 (C1)

PSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSW 10 QGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCTTLAQGTSMFPSCCCSK AB205192 (E)

PSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW

SEQ ID Sequência Observações

NO 11 QGMLPVCPLLPGSTTTSTGPCKTCTTLAQGTSMFPSCCCS X69798 (F4)

KPSDGNCTCIPIPSSWALGKYLWEWASARFSW 12 QGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCKTCTTPAQGNSMYPSCCCT AF160501 (G)

KPSDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSW 13 QGMLPVCPLLPGSTTTSTGPCKTCTTLAQGTSMFPSCCCT AY090454 (H)

KPSDGNCTCIPIPSSWAFGKYLWEWASARFSW 14 QGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCKTCTTPAQGNSMYPSCCCT AF241409 (I)

KPSDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASARFSW 15 QGMLPVCPLLPGSTTTSTGPCRTCTITAQGTSMFPSCCCTK AB486012 (J)

PSDGNCTCIPIPSSWAFAKFLWEWASVRFSW 16 CQGMLPVCPLIPGSSTTGTGTCRTCTTPAQGTSMYPSCCC HBsAg Y100C/P120T

TKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW 17 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGTCRTCTTPAQGTSMYPSCCCT HBsAg P120T

KPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW 18 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGTCRTCTTPAQGTSMYPSCCCT HBsAg P120T/S143L

KPLDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW 19 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPSRTCTTPAQGTSMYPSCCCT HBsAg C121S

KPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW 20 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCDTCTTPAQGTSMYPSCCCT HBsAg R122D

KPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW 21 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCITCTTPAQGTSMYPSCCCTK HBsAg R122I

PSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW 22 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRNCTTPAQGTSMYPSCCCT HBsAg T123N

KPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW 23 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAHGTSMYPSCCCT HBsAg Q129H

KPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW 24 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPALGTSMYPSCCCTK HBsAg Q129L

PSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW 25 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSHYPSCCCT HBsAg M133H

KPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW 26 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSLYPSCCCTK HBsAg M133L

PSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW

SEQ ID Sequência Observações

NO 27 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSTYPSCCCTK HBsAg M133T

PSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW 28 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCT HBsAg K141E

EPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW 29 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCT HBsAg P142S

KSSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW 30 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCT HBsAg S143K

KPKDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW 31 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCT HBsAg D144A

KPSAGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW 32 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCT HBsAg G145R

KPSDRNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW 33 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCT HBsAg N146A

KPSDGACTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW 34 GRIFRSFY HBC34 CDRH1 aa 35 NQDGSEK HBC34 CDRH2 aa 36 AAWSGNSGGMDV HBC34 CDRH3 aa 37 KLGNKN HBC34 CDRL1 aa 38 EVK HBC34 CDRL2 aa 39 VIYEVKYRP HBC34 CDRL2 long aa 40 QTWDSTTVV HBC34 CDRL3 aa 41 ELQLVESGGGWVQPGGSQRLSCAASGRIFRSFYMSWVRQ HBC34, HBC34-V7, APGKGLEWVATINQDGSEKLYVDSVKGRFTISRDNAKNSLF HBC34-V34, HBC34- LQMNNLRVEDTAVYYCAAWSGNSGGMDVWGQGTTVSVS V35 VH aa

S 42 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGDKLGNKNVCWFQHKPG HBC34 VL aa

QSPVLVIYEVKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDE

AAYFCQTWDSTTVVFGGGTRLTVL 43 GGACGCATCTTTAGAAGTTTTTAC HBC34 CDRH1 nuc 44 ATAAACCAAGATGGAAGTGAGAAA HBC34 CDRH2 nuc 45 GCGGCTTGGAGCGGCAATAGTGGGGGTATGGACGTC HBC34 CDRH3 nuc

SEQ ID Sequência Observações

NO 46 AAATTGGGGAATAAAAAT HBC34 CDRL1 nuc 47 GAGGTTAAA HBC34 CDRL2 nuc 48 gtcatctatGAGGTTAAAtaccgcccc HBC34 CDRL2 long nuc 49 CAGACGTGGGACAGCACCACTGTGGTG HBC34 CDRL3 nuc 50 GAACTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTGGGTCCA HBC34 VH nuc

GCCGGGGGGGTCCCAGAGACTGTCCTGTGCAGCCTCTG GACGCATCTTTAGAAGTTTTTACATGAGCTGGGTCCGCC AGGCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACTATA AACCAAGATGGAAGTGAGAAATTATATGTGGACTCTGTGA AGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACT CACTATTTCTGCAAATGAACAACCTGAGAGTCGAGGACA CGGCCGTTTATTACTGCGCGGCTTGGAGCGGCAATAGTG GGGGTATGGACGTCTGGGGCCAGGGGACCACGGTCTCC

GTCTCCTCA 51 TCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCC HBC34 VL nuc

CCAGGACAGACAGTCAGCATCCCCTGCTCTGGAGATAAA TTGGGGAATAAAAATGTTTGCTGGTTTCAGCATAAGCCAG GCCAGTCCCCTGTGTTGGTCATCTATGAGGTTAAATACC GCCCCTCGGGGATTCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACT CTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAG GCTATGGATGAGGCTGCCTATTTCTGTCAGACGTGGGAC AGCACCACTGTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAGGCTGAC

CGTCCTA 52 XGSSTTSTGPCRTCMTXPSDGNATAIPIPSSWX peptídeo em que os resíduos codificados como X foram substituídos com Cisteínas 53 TSTGPCRTCMTTAQG peptídeo 54 GMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTT peptídeo

SEQ ID Sequência Observações

NO 55 XSMYPSASATKPSDGNXTGPCRTCMTTAQGTSX peptídeo em que os resíduos codificados como X foram substituídos com Cisteínas 56 PCRTCMTTAQG aminoácidos 120 – 130 do domínio S de HBsAg (HBV-D J02203 57 PCX1TCX2X3X4AQG, epítopo em que X1 é R ou K, X2 é M ou T, X3 é T ou I, e X4 é T, P ou L 58 QTFDSTTVV HBC34-V7 CDRL3 e HBC34-V23 CDRL3 (aa) 59 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGDKLGNKNVCWFQHKPG HBC34-V7 VL

QSPVLVIYEVKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDE

AAYFCQTFDSTTVVFGGGTRLTVL 60 AAGCTGGGGAACAAAAAT HBC34-V7 CDRL1 e HBC-V23 CDRL1 (nuc) 61 GAGGTGAAA HBC34-V7 CDRL2 e HBC34v23 CDRL2 nuc 62 GTCATCTACGAGGTGAAATATCGGCCT HBC34-V7 CDRL2 long e CDRL2 HBC34-V23 long nuc

SEQ ID Sequência Observações

NO 63 CAGACATTCGATTCCACCACAGTGGTC CDRL3 HBC34-V7 e CDRL3 HBC34-V23 nuc 64 TCTTACGAGCTGACACAGCCACCTAGCGTGTCCGTCTCT HBC34-V7, HBC34- CCAGGACAGACCGTGTCCATCCCTTGCTCTGGCGACAAG V34, e HBC34-V35 VL CTGGGGAACAAAAATGTCTGTTGGTTCCAGCACAAGCCA nuc

GGGCAGAGTCCCGTGCTGGTCATCTACGAGGTGAAATAT CGGCCTTCAGGAATTCCAGAACGGTTCAGCGGATCAAAC AGCGGCAATACTGCAACCCTGACAATTAGCGGGACCCAG GCCATGGACGAAGCCGCTTATTTCTGCCAGACATTCGAT TCCACCACAGTGGTCTTTGGCGGGGGAACTAGGCTGAC

CGTGCTG 65 SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGNKNACWYQQKPG HBC34-V23 VL aa

QSPVLVIYEVKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDE

ADYYCQTFDSTTVVFGGGTKLTVL 66 INQDGSEK HBC34wt CDRH2 aa 67 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFRSFYMSWVRQA HBC34-V31, HBC34- PGKGLEWVANINQDGSEKLYVDSVKGRFTISRDNAKNSLFL V32 e HBC34-V33 VH

QMNNLRVEDTAVYYCAAWSGNSGGMDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID Sequência Observações

NO 68 GAGGTGCAGCTGGTGGAATCCGGCGGGGGACTGGTGCA HBC34-V31, HBC34- GCCTGGCGGCTCACTGAGACTGAGCTGTGCAGCTTCTG V32 e HBC34-V33 VH GAAGAATCTTCAGATCTTTTTACATGAGTTGGGTGAGACA (nuc)

GGCTCCTGGGAAGGGACTGGAGTGGGTCGCAAACATCA ATCAGGACGGATCAGAAAAGCTGTATGTGGATAGCGTCA AAGGCAGGTTCACTATTTCCCGCGACAACGCCAAAAATT CTCTGTTTCTGCAGATGAACAATCTGCGGGTGGAGGATA CCGCTGTCTACTATTGTGCAGCCTGGTCTGGCAACAGTG GAGGCATGGACGTGTGGGGACAGGGAACCACAGTGACA

GTCAGCTCC 69 TCTTACGAGCTGACACAGCCCCCTAGCGTGTCCGTCTCT HBC34-V23 VL nuc

CCAGGCCAGACAGCATCCATCACTTGCTCTGGCGACAAG CTGGGGAACAAAAATGCCTGTTGGTATCAGCAGAAGCCA GGGCAGAGTCCCGTGCTGGTCATCTACGAGGTGAAATAT CGGCCTTCAGGAATTCCAGAAAGATTCAGTGGATCAAAC AGCGGCAATACTGCTACCCTGACAATTAGCGGGACCCAG GCCATGGACGAAGCTGATTACTATTGCCAGACATTCGATT CCACCACAGTGGTCTTTGGCGGGGGAACTAAGCTGACC GTGCTG

SEQ ID Sequência Observações

NO 70 GAACTGCAGCTGGTCGAATCAGGAGGAGGGTGGGTCCA HBC34 wt GCCCGGAGGGAGCCAGAGACTGTCTTGTGCCGCATCAG VH códon-otimizado

GGAGGATCTTCAGGAGCTTCTACATGTCCTGGGTGCGCC AGGCACCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTCGCCACCATC AACCAGGACGGATCTGAAAAGCTGTATGTGGATAGTGTC AAAGGCCGGTTCACAATTAGCAGAGACAACGCTAAAAAT TCTCTGTTTCTGCAGATGAACAATCTGCGAGTGGAGGAT ACCGCCGTCTACTATTGCGCCGCTTGGTCTGGCAACAGC GGCGGGATGGATGTCTGGGGGCAGGGCACAACAGTGAG

CGTCTCTTCC 71 TCATACGAACTGACTCAGCCTCCCTCCGTCTCCGTCTCA HBC34 wt VL códon- CCTGGACAGACCGTCTCAATCCCCTGCTCCGGCGATAAA otimizado

CTGGGCAACAAGAACGTGTGCTGGTTCCAGCACAAACCC GGACAGAGTCCTGTGCTGGTCATCTACGAGGTCAAGTAT CGGCCAAGCGGCATTCCCGAAAGATTCAGCGGCTCCAA CTCTGGGAATACCGCAACACTGACTATCTCTGGAACCCA GGCAATGGACGAGGCAGCTTACTTTTGCCAGACTTGGGA TTCAACTACTGTCGTGTTCGGCGGCGGAACTAGACTGAC

TGTCCTG 72 GGGAGGATCTTCAGGAGCTTCTAC HBC34 wt CDRH1 códon-otimizado 73 ATCAACCAGGACGGATCTGAAAAG HBC34 wt CDRH2 códon-otimizado 74 GCCGCTTGGTCTGGCAACAGCGGCGGGATGGATGTC HBC34 wt CDRH3 códon-otimizado 75 AAACTGGGCAACAAGAAC HBC34 wt CDRL1 códon-otimizado 76 GAGGTCAAG HBC34 wt CDRL2 códon-otimizado 77 GTCATCTACGAGGTCAAGTATCGGCCA HBC34 wt CDRL2 long códon-otimizado 78 CAGACTTGGGATTCAACTACTGTCGTG HBC34 wt CDRL3 códon-otimizado

SEQ ID Sequência Observações

NO 79 GGSGG ligante 80 TGPCRTC epítopo 81 GNCTCIP epítopo 82 CCIPIPSSWAFGCSTTSTGPCRTCC epítopo mimético em que em particular as cisteínas nas posições 2, 21, e 24 descontínuo são acopladas a acetamidometila. 83 CGNCTCIPIPSSWAFCSTTSTGPCRTCC epítopo mimético em que em particular as cisteínas nas posições 4, 6, 24, e 27 descontínuo são acopladas a acetamidometila. 84 CGGGCSTTSTGPCRTCC epítopo de alça em que, em particular as cisteínas nas posições 13 e 16 são mimético acopladas a acetamidometila. 85 STTSTGPCRTC epítopo 86 GNCTCIPIPSSWAFC epítopo 87 GNCTCIPIPSSWAF epítopo 88 PCRXC epítopo 89 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGDKLGNKNVAWFQHKPG HBC34-V35 VL

QSPVLVIYEVKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDE AAYFCQTFDSTTVVFGGGTRLTVL

SEQ ID Sequência Observações

NO 90 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGDKLGNKNVSWFQHKPG HBC34-V34 VL

QSPVLVIYEVKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDE

AAYFCQTFDSTTVVFGGGTRLTVL 91 ELQLVESGGGWVQPGGSQRLSCAASGRIFRSFYMSWVRQ HC de HBC34-V35- APGKGLEWVATINQDGSEKLYVDSVKGRFTISRDNAKNSLF MLNS-GAALIE e LQMNNLRVEDTAVYYCAAWSGNSGGMDVWGQGTTVSVS HBC34-V34-MLNS- SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS GAALIE (g1M17, 1)

WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLAGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSL

SLSPGK 92 ELQLVESGGGWVQPGGSQRLSCAASGRIFRSFYMSWVRQ HC de HBC34-V35- APGKGLEWVATINQDGSEKLYVDSVKGRFTISRDNAKNSLF MLNS e HBC34-V34- LQMNNLRVEDTAVYYCAAWSGNSGGMDVWGQGTTVSVS MLNS (g1M17, 1)

SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLS PGK

SEQ ID Sequência Observações

NO 93 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGDKLGNKNVAWFQHKPG LC de HBC34-V35

QSPVLVIYEVKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDE AAYFCQTFDSTTVVFGGGTRLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSE ELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTP SKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEK

TVAPTECS 94 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGDKLGNKNVSWFQHKPG LC de HBC34-V34

TVAPTECS 95 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTKYAMSWVRQA HBC24 VH

PGKGLEWVASISGSVPGFGIDTYYADSVKGRFTISRDTSKN TLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDVGVIGSYYYYAMDVWGQG

TAVTVSS 96 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQGLSSSYLAWYQQKP HBC24 VL

GQAPRLLIYSASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPED

FAVYYCQQYAYSPRWTFGQGTKVEIK 97 GSTFTKYA CDRH1 de HBC24 98 ISGSVPGF CDRH2 de HBC24 99 LYYCAKDVGVIGSYYYYAMDV CDRH3 de HBC24 100 QGLSSSY CDRL1 de HBC24 101 SAS CDRL2 de HBC24 102 QQYAYSPRWT CDRL3 de HBC24

SEQ ID Sequência Observações

NO 103 gagctgcagctggtggagtccggcggcggctgggtgcagcctggcggctcccaga VH de HBC34-V7, ggctgagctgtgccgcttctggcaggatcttccggtccttttacatgtcttgggtgcggc HBC34-V35, e HBC34- aggctccaggcaagggcctggagtgggtggctaccatcaaccaggacggctccg V34 (códon-otimizado) agaagctgtatgtggatagcgtgaagggcagattcacaatctctcgcgacaacgcc aagaactccctgtttctgcagatgaacaatctgagggtggaggataccgccgtgtac tattgcgccgcttggtctggcaatagcggcggcatggacgtgtggggacagggcac caccgtgtccgtgtccagc 104 agctacgagctgacacagcccccttccgtgtccgtgtcccctggacagaccgtgtcc HBC34-V34 VL atcccatgcagcggcgacaagctgggcaacaagaacgtgtcctggtttcagcataa (códon-otimizado) gcctggccagtcccccgtgctggtcatctacgaggtgaagtataggcccagcggca tccctgagcggttctctggctccaacagcggcaatacagccaccctgacaatctctg gcacacaggctatggacgaggccgcttatttctgccagacctttgattccaccacagt ggtgttcggcggcggcaccagactgacagtgctg 105 agctacgagctgacacagcccccttccgtgtccgtgtcccctggacagaccgtgtcc HBC34-V35 VL (códon- atcccatgcagcggcgacaagctgggcaacaagaacgtggcctggtttcagcata otimizado) agcctggccagtcccccgtgctggtcatctacgaggtgaagtataggcccagcggc atccctgagcggttctctggctccaacagcggcaatacagccaccctgacaatctct ggcacacaggctatggacgaggccgcttatttctgccagacctttgattccaccaca gtggtgttcggcggcggcaccagactgacagtgctg

SEQ ID Sequência Observações

NO 106 gaggtgcagttgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgaga HBC24 VH (tipo ctctcctgtgcagcctctGGATCCACTTTTACCAAATATGCCatgagct selvagem) gggtccgtcaggctccagggaaggggctggagtgggtcgcaagtATTAGTGG AAGTgttcctggttttGGTATTGACACAtactacgcagactccgttaagggc cggttcaccatctccagagacacttccaagaacaccctgtatctgcaaatgaacagc ctgagagccgaggacacggccttatattactgtGCGAAAGATGTCGGGG TTATCGGGTCATACTATTACTACGCTATGGACGTCtggggtc aa 107 aaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccac HBC24 VL (tipo cctctcctgcagggccagtCAGGGTCTTAGCAGCAGTTACttagcctg selvagem) gtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatAGTGCGTCC accagggccactggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagactt cactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtCAACA GTATGCTTACTCACCTCGGTGGACGttcggccaagggaccaaggt ggagatcaaac

SEQ ID Sequência Observações

NO 108 GAGGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCA HBC24 VH (códon- GCCCGGCGGCTCCCTGAGGCTGTCTTGCGCCGCCTCTG otimizado)

GCAGCACCTTCACAAAGTATGCAATGTCTTGGGTGCGCC AGGCACCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCTCCATC TCTGGCAGCGTGCCTGGCTTCGGCATCGACACCTACTAT GCCGATTCCGTGAAGGGCCGGTTTACAATCAGCAGAGAC ACCTCCAAGAACACACTGTATCTGCAGATGAATTCTCTGC GGGCCGAGGACACCGCCCTGTACTATTGTGCCAAGGAT GTGGGCGTGATCGGCAGCTACTATTACTATGCAATGGAC

GTGTGGGGACAGGGAACAGCAGTGACAGTGAGCTCC 109 GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTGGCACACTGTCCCTG HBC24 VL (códon- TCCCCTGGAGAGAGAGCCACCCTGTCCTGCAGAGCCTCT otimizado)

CAGGGCCTGAGCTCCTCTTACCTGGCCTGGTATCAGCAG AAGCCTGGACAGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACTCTGCC TCCACCAGAGCAACAGGCATTCCTGACCGCTTCTCCGGA TCTGGAAGCGGCACAGACTTCACCCTGACAATCAGCCGG CTGGAGCCTGAGGACTTCGCCGTGTACTATTGTCAGCAG TACGCCTATTCCCCAAGGTGGACCTTTGGCCAGGGCACA

AAGGTGGAGATCAAG 110 agctacgagctgacacagcccccttccgtgtccgtgtcccctggacagaccgtgtcc HBC34-V7 VL (códon- atcccatgcagcggcgacaagctgggcaacaagaacgtgtgctggtttcagcataa otimizado) gcctggccagtcccccgtgctggtcatctacgaggtgaagtataggcccagcggca tccctgagcggttctctggctccaacagcggcaatacagccaccctgacaatctctg gcacacaggctatggacgaggccgcttatttctgccagacctttgattccaccacagt ggtgttcggcggcggcaccagactgacagtgctg 111 SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGNKNASWYQQKPG HBC34-V23-L_C40S

QSPVLVIYEVKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDE ADYYCQTFDSTTVVFGGGTKLTVL

SEQ ID Sequência Observações

NO 112 SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGNKNAAWYQQKPG HBC34-V23-L_C40A

QSPVLVIYEVKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDE

ADYYCQTFDSTTVVFGGGTKLTVL 113 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGDKLGNKNVSWFQHKPG HBC34-V31-L_C40S

QSPVLVIYEVKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDE

AAYFCQTWDSTTVVFGGGTRLTVL 114 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGDKLGNKNVAWFQHKPG HBC34-V31-L_C40A

QSPVLVIYEVKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDE

AAYFCQTWDSTTVVFGGGTRLTVL 115 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGDKLGNKNVSWFQHKPG HBC34-V32-L_C40S

QSPVLVIYEVKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDE

AAYFCQTFDSTTVVFGGGTRLTVL 116 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGDKLGNKNVAWFQHKPG HBC34-V32-L_C40A

QSPVLVIYEVKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDE

AAYFCQTWDSTTVVFGGGTRLTVL 117 SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGNKNASWYQQKPG HBC34-V33-L_C40S

QSPVLVIYEVKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDE

ADYYCQTFDSTTVVFGGGTKLTVL 118 SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGNKNAAWYQQKPG HBC34-V33-L_C40A

QSPVLVIYEVKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDE

ADYYCQTFDSTTVVFGGGTKLTVL 119 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGDKLGNKNVSWFQHKPG HBC34-L_C40S

QSPVLVIYEVKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDE AAYFCQTWDSTTVVFGGGTRLTVL

SEQ ID Sequência Observações

NO 120 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGDKLGNKNVAWFQHKPG HBC34-L_C40A

QSPVLVIYEVKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDE

AAYFCQTWDSTTVVFGGGTRLTVL 121 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTKYAMSWVRQA HBC24-MLNS

PGKGLEWVASISGSVPGFGIDTYYADSVKGRFTISRDTSKN TLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDVGVIGSYYYYAMDVWGQG TAVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHY TQKSLSLSPGK

SEQ ID Sequência Observações

NO 122 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTKYAMSWVRQA HBC24-MLNS-GAALIE

PGKGLEWVASISGSVPGFGIDTYYADSVKGRFTISRDTSKN TLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDVGVIGSYYYYAMDVWGQG TAVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHY

TQKSLSLSPGK 123 ELQLVESGGGWVQPGGSQRLSCAASGRIFRSFYMSWVRQ HBC34-V7-mu (IgG2a)

APGKGLEWVATINQDGSEKLYVDSVKGRFTISRDNAKNSLF HC LQMNNLRVEDTAVYYCAAWSGNSGGMDVWGQGTTVSVS SAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLT WNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSIT CNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPS VFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNV EVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCK VNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQV TLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSY FMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRT PGK

SEQ ID Sequência Observações

NO 124 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGDKLGNKNVCWFQHKPG HBC34-V7-mu (IgG2a)

QSPVLVIYEVKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDE LC AAYFCQTFDSTTVVFGGGTRLTVLGQPKSSPSVTLFPPSSE ELETNKATLVCTITDFYPGVVTVDWKVDGTPVTQGMETTQP SKQSNNKYMASSYLTLTARAWERHSSYSCQVTHEGHTVEK

SLSRADCS 125 ELQLVESGGGWVQPGGSQRLSCAASGRIFRSFYMSWVRQ HBC34-V35-mu APGKGLEWVATINQDGSEKLYVDSVKGRFTISRDNAKNSLF (IgG2a) HC

LQMNNLRVEDTAVYYCAAWSGNSGGMDVWGQGTTVSVS SAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLT WNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSIT CNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPS VFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNV EVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCK VNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQV TLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSY FMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRT PGK

SEQ ID Sequência Observações

NO 126 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGDKLGNKNVAWFQHKPG HBC34-V35-mu QSPVLVIYEVKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDE (IgG2a) LC

AAYFCQTFDSTTVVFGGGTRLTVLGQPKSSPSVTLFPPSSE ELETNKATLVCTITDFYPGVVTVDWKVDGTPVTQGMETTQP SKQSNNKYMASSYLTLTARAWERHSSYSCQVTHEGHTVEK

SLSRADCS 127 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTKYAMSWVRQA HBC24-mu (IgG2a) HC

PGKGLEWVASISGSVPGFGIDTYYADSVKGRFTISRDTSKN TLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDVGVIGSYYYYAMDVWGQG TAVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFP EPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTW PSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNL LGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISW FVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGK EFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMT KKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDS DGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKS FSRTPGK

SEQ ID Sequência Observações

NO 128 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQGLSSSYLAWYQQKP HBC24-mu (IgG2a) LC

GQAPRLLIYSASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPED FAVYYCQQYAYSPRWTFGQGTKVEIKADAAPTVSIFPPSSE QLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSW TDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSP

IVKSFNRNEC 129 ELQLVESGGGWVQPGGSQRLSCAASGRIFRSFYMSWVRQ HBC34-V7, HBC34- APGKGLEWVATINQDGSEKLYVDSVKGRFTISRDNAKNSLF V34, HBC34-V35 LQMNNLRVEDTAVYYCAAWSGNSGGMDVWGQGTTVSVS HC (tipo selvagem)

SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK

SEQ ID Sequência Observações

NO 130 GCCTCCACAAAGGGCCCAAGCGTGTTTCCACTGGCTCCC HBC34-V7, HBC34- TCTTCCAAGTCTACCTCCGGCGGCACAGCCGCTCTGGGA V34, HBC34-V35 CH1- TGTCTGGTGAAGGATTACTTCCCAGAGCCCGTGACCGTG dobradiça-CH2-CH3 TCTTGGAACTCCGGCGCCCTGACCAGCGGAGTGCATACA (códon-otimizado)

TTTCCAGCTGTGCTGCAGAGCTCTGGCCTGTACTCTCTG TCCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCTTCCAGCCTGGGCAC CCAGACATATATCTGCAACGTGAATCACAAGCCAAGCAAT ACAAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGTCTTGTGAT AAGACCCATACATGCCCTCCATGTCCAGCTCCAGAGCTG CTGGGCGGCCCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCT AAGGATACCCTGATGATCTCCAGAACCCCCGAGGTGACA TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGATCCTGAGGT GAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAA TGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCTAC CTATCGGGTGGTGTCCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGG ATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTA ATAAGGCCCTGCCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCCA AGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCACAGGTGTACACA CTGCCTCCATCTCGCGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTG TCCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTCTATCCTTCCGAC ATCGCTGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCAGAGAA CAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGACAGCGATGG CTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCT CGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTTAGCTGTTCTGTGATG CATGAGGCCCTGCACAATCATTATACACAGAAGTCCCTG AGCCTGTCTCCTGGCAAG

SEQ ID Sequência Observações

NO 131 GAGCTGCAGCTGGTGGAGTCCGGCGGCGGCTGGGTGCAGCCTGGCGG HBC34-V7, HBC34-

CTCCCAGAGGCTGAGCTGTGCCGCTTCTGGCAGGATCTTCCGGTCCTTT V34, HBC34-V35 VH-

TACATGTCTTGGGTGCGGCAGGCTCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTG CH1-dobradiça-CH2-

GCTACCATCAACCAGGACGGCTCCGAGAAGCTGTATGTGGATAGCGTG AAGGGCAGATTCACAATCTCTCGCGACAACGCCAAGAACTCCCTGTTTC CH3 (códon-otimizado)

TGCAGATGAACAATCTGAGGGTGGAGGATACCGCCGTGTACTATTGCGC CGCTTGGTCTGGCAATAGCGGCGGCATGGACGTGTGGGGACAGGGCA CCACCGTGTCCGTGTCCAGCGCCTCCACAAAGGGCCCAAGCGTGTTTC CACTGGCTCCCTCTTCCAAGTCTACCTCCGGCGGCACAGCCGCTCTGG GATGTCTGGTGAAGGATTACTTCCCAGAGCCCGTGACCGTGTCTTGGAA CTCCGGCGCCCTGACCAGCGGAGTGCATACATTTCCAGCTGTGCTGCA GAGCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCTTCC AGCCTGGGCACCCAGACATATATCTGCAACGTGAATCACAAGCCAAGCA ATACAAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGTCTTGTGATAAGACCCA TACATGCCCTCCATGTCCAGCTCCAGAGCTGCTGGGCGGCCCAAGCGT GTTCCTGTTTCCACCCAAGCCTAAGGATACCCTGATGATCTCCAGAACC CCCGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGATCCTGAG GTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCTAAGA CCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCTACCTATCGGGTGGTGTCCG TGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGT GCAAGGTGTCTAATAAGGCCCTGCCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTC CAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCACAGGTGTACACACTGCCTCC ATCTCGCGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACATGTCTGGTG AAGGGCTTCTATCCTTCCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGAGCAATGGC CAGCCAGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGACAGCGATG GCTCTTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCTCGCTGGCA GCAGGGCAACGTGTTTAGCTGTTCTGTGATGCATGAGGCCCTGCACAAT CATTATACACAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCTGGCAAGTGATGAGGTA CCGTGCGACGGCCGGCAAGCCCCCGCTCCCCGGGCTCTCGCGGTCGT

ACGAGGAAAGCTT 132 GGACAGCCAAAGGCTGCTCCATCTGTGACCCTGTTTCCA HBC34-V7 CL (códon- CCCTCTTCCGAGGAGCTGCAGGCCAACAAGGCCACCCT otimizado)

GGTGTGCCTGATCTCTGACTTCTACCCTGGAGCTGTGAC AGTGGCTTGGAAGGCTGATAGCTCTCCCGTGAAGGCTG GCGTGGAGACAACAACCCCTAGCAAGCAGTCTAACAATA AGTACGCCGCTTCCAGCTATCTGTCTCTGACACCAGAGC AGTGGAAGTCCCACCGCTCTTATTCCTGCCAGGTGACCC ATGAGGGCAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCCACC GAGTGTTCT

SEQ ID Sequência Observações

NO 133 AGCTACGAGCTGACACAGCCCCCTTCCGTGTCCGTGTCC HBC34-V7 LC (VL-CL) CCTGGACAGACCGTGTCCATCCCATGCAGCGGCGACAA (códon-otimizado)

GCTGGGCAACAAGAACGTGTGCTGGTTTCAGCATAAGCC TGGCCAGTCCCCCGTGCTGGTCATCTACGAGGTGAAGTA TAGGCCCAGCGGCATCCCTGAGCGGTTCTCTGGCTCCAA CAGCGGCAATACAGCCACCCTGACAATCTCTGGCACACA GGCTATGGACGAGGCCGCTTATTTCTGCCAGACCTTTGA TTCCACCACAGTGGTGTTCGGCGGCGGCACCAGACTGA CAGTGCTGGGACAGCCAAAGGCTGCTCCATCTGTGACCC TGTTTCCACCCTCTTCCGAGGAGCTGCAGGCCAACAAGG CCACCCTGGTGTGCCTGATCTCTGACTTCTACCCTGGAG CTGTGACAGTGGCTTGGAAGGCTGATAGCTCTCCCGTGA AGGCTGGCGTGGAGACAACAACCCCTAGCAAGCAGTCTA ACAATAAGTACGCCGCTTCCAGCTATCTGTCTCTGACACC AGAGCAGTGGAAGTCCCACCGCTCTTATTCCTGCCAGGT GACCCATGAGGGCAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCC CCACCGAGTGTTCT

SEQ ID Sequência Observações

NO 134 GGACAGCCAAAGGCTGCTCCATCTGTGACCCTGTTTCCA HBC34-V34, HBC34- CCCTCTTCCGAGGAGCTGCAGGCCAACAAGGCCACCCT V35 GGTGTGCCTGATCTCTGACTTCTACCCTGGAGCTGTGAC CL (códon-otimizado)

AGTGGCTTGGAAGGCTGATAGCTCTCCCGTGAAGGCTG GCGTGGAGACAACAACCCCTAGCAAGCAGTCTAACAATA AGTACGCCGCTTCCAGCTATCTGTCTCTGACACCAGAGC AGTGGAAGTCCCACCGCTCTTATTCCTGCCAGGTGACCC ATGAGGGCAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCCACC

GAGTGTTCT 135 AGCTACGAGCTGACACAGCCCCCTTCCGTGTCCGTGTCC HBC34-V34 LC (VL- CCTGGACAGACCGTGTCCATCCCATGCAGCGGCGACAA CL) (códon-otimizado)

GCTGGGCAACAAGAACGTGTCCTGGTTTCAGCATAAGCC TGGCCAGTCCCCCGTGCTGGTCATCTACGAGGTGAAGTA TAGGCCCAGCGGCATCCCTGAGCGGTTCTCTGGCTCCAA CAGCGGCAATACAGCCACCCTGACAATCTCTGGCACACA GGCTATGGACGAGGCCGCTTATTTCTGCCAGACCTTTGA TTCCACCACAGTGGTGTTCGGCGGCGGCACCAGACTGA CAGTGCTGGGACAGCCAAAGGCTGCTCCATCTGTGACCC TGTTTCCACCCTCTTCCGAGGAGCTGCAGGCCAACAAGG CCACCCTGGTGTGCCTGATCTCTGACTTCTACCCTGGAG CTGTGACAGTGGCTTGGAAGGCTGATAGCTCTCCCGTGA AGGCTGGCGTGGAGACAACAACCCCTAGCAAGCAGTCTA ACAATAAGTACGCCGCTTCCAGCTATCTGTCTCTGACACC AGAGCAGTGGAAGTCCCACCGCTCTTATTCCTGCCAGGT GACCCATGAGGGCAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCC CCACCGAGTGTTCT

SEQ ID Sequência Observações

NO 136 AGCTACGAGCTGACACAGCCCCCTTCCGTGTCCGTGTCC HBC34-V35 LC (VL- CCTGGACAGACCGTGTCCATCCCATGCAGCGGCGACAA CL) (códon-otimizado)

GCTGGGCAACAAGAACGTGGCCTGGTTTCAGCATAAGCC TGGCCAGTCCCCCGTGCTGGTCATCTACGAGGTGAAGTA TAGGCCCAGCGGCATCCCTGAGCGGTTCTCTGGCTCCAA CAGCGGCAATACAGCCACCCTGACAATCTCTGGCACACA GGCTATGGACGAGGCCGCTTATTTCTGCCAGACCTTTGA TTCCACCACAGTGGTGTTCGGCGGCGGCACCAGACTGA CAGTGCTGGGACAGCCAAAGGCTGCTCCATCTGTGACCC TGTTTCCACCCTCTTCCGAGGAGCTGCAGGCCAACAAGG CCACCCTGGTGTGCCTGATCTCTGACTTCTACCCTGGAG CTGTGACAGTGGCTTGGAAGGCTGATAGCTCTCCCGTGA AGGCTGGCGTGGAGACAACAACCCCTAGCAAGCAGTCTA ACAATAAGTACGCCGCTTCCAGCTATCTGTCTCTGACACC AGAGCAGTGGAAGTCCCACCGCTCTTATTCCTGCCAGGT GACCCATGAGGGCAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCC

CCACCGAGTGTTCT 137 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP WT hIgG1 Fc

EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID Sequência Observações

NO 138 ELQLVESGGGWVQPGGSQRLSCAASGRIFRSFYMSWVRQ HBC34, APGKGLEWVATINQDGSEKLYVDSVKGRFTISRDNAKNSLF HBC34-V7, LQMNNLRVEDTAVYYCAAWSGNSGGMDVWGQGTTVSVS HBC34-V23, SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS HBC34-V34, WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY HBC34-V35, ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLAGPS HBC34_C40S, VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD HBC34_C40A, GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK HBC34-V23_C40S, CKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN HBC34-V23_C40A QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD HC com mutação GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL GAALIE em hIgG1 Fc

SLSPGK 139 ESKYGPPCPPCPAPPVAGP Sequência de dobradiça quimérica

[327] Os vários exemplos de realização descritos acima podem ser combinados para fornecer outros exemplos de realização. Todas as patentes Norte-Americanas, publicações de pedidos de patentes Norte- Americanos, pedidos de patentes Norte-Americanos, patentes estrangeiras, pedidos de patentes estrangeiros e publicações não patenteadas referidas no presente relatório descritivo e/ou listadas na Folha de Dados do Pedido são integralmente incorporados ao presente pedido por referência. Aspectos dos exemplos de realização podem ser modificados, se necessário, para empregar conceitos das diversas patentes, pedidos e publicações para fornecer ainda outros exemplos de realização.

[328] O Pedido Provisório US 62/782,274, depositado em 19 de dezembro de 2018 e o Pedido Provisório US 62/860,085, depositado em 11 de junho de 2019 são integralmente incorporados ao presente pedido por referência.

[329] Estas e outras alterações podem ser feitas aos exemplos de realização à luz da descrição detalhada fornecida acima.

Em geral, nas reivindicações a seguir, os termos utilizados não devem ser interpretados com limitantes das reivindicações aos exemplos de realização específicos divulgados no relatório descritivo e nas reivindicações, mas devem ser interpretados de modo a incluir todos os exemplos de realização possíveis juntamente com o escopo completo de equivalentes aos quais tais reivindicações têm direito.

Consequentemente, as reivindicações não são limitadas pela divulgação.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. ANTICORPO ISOLADO, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender: (i) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 41; e (ii) uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das sequências de SEQ ID NOs: 59, 89, ou 90, desde que o aminoácido na posição 40 da VL de acordo com a numeração IMGT não seja uma cisteína, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga à região da alça antigênica de HBsAg e neutraliza a infecção por vírus da hepatite B e vírus da hepatite delta.

2. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado: (i) pela VH compreender pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 41; e/ou (ii) pela VL compreender pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 59, 89 ou 90.

3. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo aminoácido na posição 40 da VL ser alanina.

4. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo aminoácido na posição 40 da VL ser serina.

5. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo aminoácido na posição 40 da VL ser glicina.

6. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por compreender as sequências de CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 e CDRL3, de acordo com as SEQ ID NOs: (i) 34-36, 37, 38 e 40, respectivamente; (ii) 34, 66, 36, 37, 38, e 40, respectivamente; (iii) 34-36, 37, 39, e 40, respectivamente; (iv) 34, 66, 36, 37, 39, e 40, respectivamente; (v) 34-36, 37, 38, e 58, respectivamente; (vi) 34, 66, 36, 37, 38, e 58, respectivamente; (vii) 34-36, 37, 39, e 58, respectivamente; ou (vii) 34, 66, 36, 37, 39, e 58, respectivamente.

7. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 6, caracterizado pela VL compreender ou consistir na sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 89.

8. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 4 ou 6, caracterizado pela VL compreender ou consistir na sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 90.

9. ANTICORPO isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela VH compreender ou consistir na sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 41.

10. ANTICORPO isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, 6, 7 ou 9 caracterizado pela V H compreender ou consistir na sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 41; e pela V L compreender ou consistir na sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 89.

11. ANTICORPO isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 4, 6, 8, ou 9, caracterizado pela V H compreender ou consistir na sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 41; e pela VL compreender ou consistir na sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 90.

12. ANTICORPO ISOLADO, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender: (i) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 95; e (ii) uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 96, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga à região da alça antigênica de HBsAg e neutraliza a infecção por vírus da hepatite B e vírus da hepatite delta.

13. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado: (i) pela VH compreender pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 95; e/ou (ii) pela VL compreender pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 96.

14. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 13, caracterizado por compreender as sequências de CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de acordo com as SEQ ID NOs: 97–102, respectivamente.

15. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo anticorpo, ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreender um anticorpo humano, um anticorpo monoclonal, um anticorpo purificado, um anticorpo de cadeia única, um Fab, um Fab’, um F(ab’)2, um Fv ou um scFv.

16. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno ser um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, multiespecífico.

17. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno ser um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, biespecífico.

18. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreender uma porção Fc.

19. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pela porção Fc compreender uma mutação que aumenta a ligação ao FcRn em comparação com uma porção Fc de referência que não compreende a mutação.

20. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 ou 19, caracterizado pela porção Fc compreender uma mutação que aumenta a ligação a um FcγR, de preferência um FcγRIIA ou FcγRIIIA, em comparação com uma porção Fc de referência que não compreende a mutação.

21. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizado pela porção Fc ser uma porção Fc do isotipo IgG ou é derivada de um isotipo IgG.

22. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado pela mutação que aumenta a ligação ao FcRn compreender: M428L; N434S; N434H; N434A; N434S; M252Y; S254T; T256E; T250Q; P257I; Q311I; D376V; T307A; E380A; ou qualquer combinação das mesmas.

23. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pela mutação que aumenta a ligação ao FcRn compreender: (i) M428L/N434S; (ii) M252Y/S254T/T256E; (iii) T250Q/M428L; (iv) P257I/Q311I; (v) P257I/N434H; (vi) D376V/N434H; (vii) T307A/E380A/N434A; ou (viii) qualquer combinação de (i) - (vii).

24. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pela mutação que aumenta a ligação ao FcRn compreender M428L/N434S.

25. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 24, caracterizado pela mutação que aumenta a ligação a um FcγR compreender S239D; I332E; A330L; G236A; ou qualquer combinação das mesmas.

26. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pela mutação que aumenta a ligação a um FcγR compreender:

(i) S239D/I332E; (ii) S239D/A330L/I332E; (iii) G236A/S239D/I332E; ou (iv) G236A/A330L/I332E.

27. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 ou 26, caracterizado pela mutação que aumenta a ligação a um FcγR compreender ou consistir em G236A/A330L/I332E e, opcionalmente, não compreender S239D.

28. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 27, caracterizado pela porção Fc compreender as mutações de substituição de aminoácidos: M428L; N434S; G236A; A330L; e I332E, e opcionalmente não compreender S239D.

29. ANTICORPO ISOLADO, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender: (i) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 41; e (ii) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 89, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga à região da alça antigênica de HBsAg e neutraliza a infecção por vírus da hepatite B e vírus da hepatite delta.

30. ANTICORPO ISOLADO, ou um fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por compreender ainda uma porção Fc.

31. ANTICORPO ISOLADO, ou um fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pela porção Fc ser derivada de um isotipo IgG e compreender as mutações de substituição M428L e N434S.

32. ANTICORPO ISOLADO, ou um fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, caracterizado pela porção Fc ser derivada de um isotipo IgG e compreender as mutações de substituição G236A, A330L e I332E e, opcionalmente, não compreender uma mutação S239D.

33. ANTICORPO ISOLADO, ou um fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pela porção Fc compreender as mutações de substituição M428L, N434S, G236A, A330L e I332E.

34. ANTICORPO ISOLADO, ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 e 15 a 33, caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos da cadeia pesada (HC) de acordo com a SEQ ID NO: 91 ou 138.

35. ANTICORPO ISOLADO, ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 e 15 a 31, caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos da cadeia pesada (HC) de acordo com a SEQ ID NO: 92.

36. ANTICORPO ISOLADO, ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, 6, 7, 9, 10, e 15 a 35, caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos da cadeia leve (LC) de acordo com a SEQ ID NO: 93.

37. ANTICORPO ISOLADO, ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 4, 6, 8, 11, e 15 a 28, caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos da cadeia leve (LC) de acordo com a SEQ ID NO: 94.

38. ANTICORPO ISOLADO, ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 34 ou 36, caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos da HC de acordo com a SEQ ID NO:

91 e a sequência de aminoácidos da LC de acordo com a SEQ ID NO: 93.

39. ANTICORPO ISOLADO, ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 35 ou 37, caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos da HC de acordo com a SEQ ID NO: 92 e a sequência de aminoácidos da LC de acordo com a SEQ ID NO: 94.

40. ANTICORPO ISOLADO, ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 34 ou 37, caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos da HC de acordo com a SEQ ID NO: 91 e a sequência de aminoácidos da LC de acordo com a SEQ ID NO: 94.

41. ANTICORPO ISOLADO, ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 35 ou 36, caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos da HC de acordo com a SEQ ID NO: 92 e a sequência de aminoácidos da LC de acordo com a SEQ ID NO: 93.

42. ANTICORPO ISOLADO, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender: (i) uma cadeia pesada (HC) compreendendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 91; e (ii) uma cadeia leve (LC) compreendendo a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 93, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga à região da alça antigênica de HBsAg e neutraliza a infecção por vírus da hepatite B e vírus da hepatite delta.

43. ANTICORPO ISOLADO, ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno ser capaz de se ligar a um HBsAg de um genótipo selecionado a partir dos genótipos A, B, C, D, E, F, G, H, I e J de HBsAg, ou qualquer combinação dos mesmos.

44. ANTICORPO ISOLADO, ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno ser capaz de reduzir a concentração sérica de DNA de HBV em um mamífero com infecção por HBV.

45. ANTICORPO ISOLADO, ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno ser capaz de reduzir a concentração sérica de HBsAg em um mamífero com infecção por HBV.

46. ANTICORPO ISOLADO, ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 45, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno ser capaz de reduzir a concentração sérica de HBeAg em um mamífero com infecção por HBV.

47. ANTICORPO ISOLADO, ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 46, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno ser capaz de reduzir a concentração sérica de HBcrAg em um mamífero com infecção por HBV.

48. PROTEÍNA DE FUSÃO, caracterizada por compreender: (i) um componente extracelular que compreende o fragmento de ligação ao antígeno, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47; (ii) um domínio transmembranar; e (iii) um componente intracelular compreendendo um domínio efetor ou uma variante funcional ou porção do mesmo, e opcionalmente compreendendo um domínio de sinalização de uma proteína coestimuladora ou uma variante funcional ou porção da mesma.

49. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 48, caracterizada pelo fragmento de ligação ao antígeno compreender um scFv que compreende um domínio variável de cadeia pesada (V H) e/ou um domínio variável de cadeia leve (VL).

50. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo scFv compreender um ligante peptídico.

51. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 50, caracterizada pelo scFv ter uma orientação VL–ligante–VH.

52. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 50, caracterizada pelo scFv ter uma orientação VH–ligante–VL.

53. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 52, caracterizada pelo domínio transmembranar compreender um domínio transmembranar de CD4, CD8, CD27 ou CD28.

54. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 53, caracterizada pelo componente intracelular compreender um domínio efetor de CD3ζ.

55. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 54, caracterizada pelo componente intracelular compreender ainda um domínio de sinalização de um ou dois dentre 4–1BB (CD137), CD28, OX40, (CD134), ICOS (CD278), CD27, CD2, CD5, ICAM-1 (CD54), LFA-1 (CD11a/CD18), GITR, CD30, CD40, BAFF-R, HVEM, LIGHT, MKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7–H3 e um ligante que se liga especificamente ao CD83.

56. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 55, caracterizada por compreender um receptor de antígeno quimérico (CAR).

57. POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, caracterizado por compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo,

fragmento de ligação ao antígeno, ou a proteína de fusão definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 56.

58. POLINUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pela sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou proteína de fusão ser códon-otimizada para a expressão em uma célula hospedeira.

59. POLINUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 57 ou 58, caracterizado por compreender uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 80% de identidade com a sequência de nucleotídeos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 103-110 e 130-136.

60. POLINUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado por compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica uma VH de acordo com a SEQ ID NO: 103, e uma sequência de nucleotídeos que codifica uma VL de acordo com a SEQ ID NO: 105.

61. POLINUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado por compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica uma VH de acordo com a SEQ ID NO: 103, e uma sequência de nucleotídeos que codifica uma VL de acordo com a SEQ ID NO: 104.

62. POLINUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado por compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica uma VH de acordo com a SEQ ID NO: 108, e uma sequência de nucleotídeos que codifica uma VL de acordo com a SEQ ID NO: 109.

63. POLINUCLEOTÍDEO que codifica um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica uma V H de acordo com a SEQ ID NO: 103 e uma sequência de nucleotídeos que codifica uma V L de acordo com a SEQ ID NO: 110, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno codificado liga-se à região da alça antigênica do HBsAg e neutraliza a infecção pelo vírus da hepatite B e vírus da hepatite delta.

64. VETOR, caracterizado por compreender o polinucleotídeo definido em qualquer uma das reivindicações 57 a 63.

65. VETOR, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado por compreender um vetor lentiviral ou vetor retroviral.

66. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizada por compreender um polinucleotídeo heterólogo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 57 a 63.

67. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender: (i) o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47; (ii) a proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicação 48 a 56; (iii) o polinucleotídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 57 a 63; (iv) o vetor conforme definido na reivindicação 64 ou 65; (v) a célula hospedeira conforme definida na reivindicação 66; ou (vi) qualquer combinação de (i) - (v).

68. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 67, caracterizada por compreender ainda excipientes, diluentes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.

69. KIT, caracterizado por compreender: (a) um componente selecionado a partir: (i) do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47; (ii) da proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 48 a 56; (iii) do polinucleotídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 57 a 63; (iv) do vetor conforme definido na reivindicação 64 ou 65; (v) da célula hospedeira conforme definida na reivindicação 66; (vi) da composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 67 ou 68; ou (vii) qualquer combinação de (i) - (vi); e (b) instruções para o uso do componente para prevenir, tratar, atenuar e/ou diagnosticar uma infecção por hepatite B e/ou uma infecção por hepatite D.

70. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 67 ou 68, ou o kit de acordo com a reivindicação 69, caracterizada por compreender adicionalmente: (i) um inibidor da polimerase, em que o inibidor da polimerase compreende opcionalmente Lamivudina, Adefovir, Entecavir, Telbivudina, Tenofovir ou qualquer combinação dos mesmos; (ii) um interferon, em que o interferon compreende opcionalmente IFN–beta e/ou IFN–alfa; (iii) um inibidor de ponto de verificação imunológico, em que o inibidor de ponto de verificação compreende opcionalmente um anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e/ou um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; (iv) um agonista de uma molécula de ponto de verificação imunológico estimuladora; ou (v) qualquer combinação de (i) - (iv).

71. COMPOSIÇÃO ou kit, conforme definido na reivindicação 70, caracterizado pelo inibidor da polimerase compreender lamivudina.

72. MÉTODO DE PRODUÇÃO do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47, ou da proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 48 a 56, caracterizado por compreender o cultivo da célula hospedeira definida na revindicação 66 sob condições e durante um tempo suficiente para produzir o anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou proteína de fusão.

73. USO de: (i) o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47; (ii) a proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 48 a 56; (iii) o polinucleotídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 57 a 63; (iv) o vetor conforme definido na reivindicação 64 ou 65; (v) a célula hospedeira conforme definida na reivindicação 66; e/ou (vi) a composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 67 ou 68, caracterizado pelo uso ser para a fabricação de um medicamento para prevenir, tratar, atenuar e/ou diagnosticar uma infecção da hepatite B e/ou uma infecção da hepatite D em um sujeito.

74. MÉTODO DE TRATAMENTO, PREVENÇÃO E/OU ATENUAÇÃO de uma infecção por hepatite B e/ou hepatite D em um sujeito, caracterizado por compreender a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz: (i) do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47; (ii) da proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 48 a 56; (iii) do polinucleotídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 57 a 63; (iv) do vetor conforme definido na reivindicação 64 ou 65; (v) da célula hospedeira conforme definida na reivindicação 66; e/ou (vi) da composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 67 ou 68.

75. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado por compreender ainda a administração ao sujeito de um ou mais dentre: (vii) um inibidor da polimerase, em que o inibidor da polimerase compreende opcionalmente Lamivudina, Adefovir, Entecavir, Telbivudina, Tenofovir ou qualquer combinação dos mesmos; (viii) um interferon, em que o interferon compreende opcionalmente IFN–beta e/ou IFN–alfa; (ix) um inibidor do ponto de checagem (checkpoint) imunológico, em que o inibidor do ponto de checagem imunológico compreende opcionalmente um anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e/ou um anticorpo anti-CTLA4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; (x) um agonista de uma molécula de ponto de verificação imunológico estimuladora; ou (xi) qualquer combinação de (vii) – (x).

76. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 ou 75, caracterizado pela infecção por hepatite B ser uma infecção por hepatite B crônica.

77. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 76, caracterizado pelo sujeito ter recebido um transplante de fígado.

78. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 77, caracterizado pelo sujeito não estar imunizado contra a hepatite B.

79. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 78, caracterizado pelo sujeito ser um recém-nascido.

80. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 79, caracterizado pelo sujeito estar sendo ou ter sido submetido à hemodiálise.

81. MÉTODO DE DIAGNÓSTICO IN VITRO de uma infecção por hepatite B e/ou hepatite D, caracterizado por compreender:

(i) o contato de uma amostra de um sujeito com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47, ou com uma proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicação 48 a 56; e (ii) a detecção de um complexo que compreende um antígeno e o anticorpo, ou que compreende um antígeno e o fragmento de ligação ao antígeno, ou a detecção de um complexo que compreende um antígeno e a proteína de fusão.

82. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pela amostra compreender sangue isolado do sujeito.

83. MÉTODO PARA DETECTAR A PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE UM EPÍTOPO em uma conformação correta em uma vacina anti-hepatite B e/ou anti-hepatite D, caracterizado por compreender: (i) o contato da vacina com (a) um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47 e/ou (b) uma proteína de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 48 a 56; e (ii) a etapa de determinar se um complexo compreendendo um antígeno e o anticorpo, ou compreendendo um antígeno e o fragmento de ligação ao antígeno, ou compreendendo um antígeno e a proteína de fusão, foi formado.

84. ANTICORPO ISOLADO, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender: (i) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência de aminoácidos CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 34, uma sequência de aminoácidos CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 35 ou 66, uma sequência de aminoácidos CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 36;

(ii) uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 37, uma sequência de aminoácidos CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 38 ou 39, e uma sequência de aminoácidos CDRL3 de acordo com a SEQ ID NO: 58 ou 40; e (iii) uma porção Fc, em que a porção Fc compreende G236A/A330L/I332E.

85. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pela porção Fc não compreender S239D.

86. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 ou 85, caracterizado pela porção Fc compreender ainda M428L/N434S.

87. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a 86, caracterizado pela V H compreender ou consistir na sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 41 ou 67; e pela V L compreender ou consistir na sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 42, 59, 65, 89, 90 e 111–120.

88. ANTICORPO ISOLADO, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado por compreender: (i) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência de aminoácidos CDRH1 de acordo com a SEQ ID NO: 97, uma sequência de aminoácidos CDRH2 de acordo com a SEQ ID NO: 98, uma sequência de aminoácidos CDRH3 de acordo com a SEQ ID NO: 99; (ii) uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos CDRL1 de acordo com a SEQ ID NO: 100, uma sequência de aminoácidos CDRL2 de acordo com a SEQ ID NO: 100, e uma sequência de aminoácidos CDRL3 de acordo com a SEQ ID NO: 102; e (iii) uma porção Fc, em que a porção Fc compreende G236A/A330L/I332E.

89. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pela porção Fc não compreender S239D.

90. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 ou 89, caracterizado pela porção Fc compreender ainda M428L/N434S.

91. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 a 90, caracterizado pela VH compreender ou consistir na sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 95; e pela VL compreender ou consistir na sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 96.

92. ANTICORPO ou fragmento de ligação ao antígeno, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47 e 84 a 91, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno: (i) ter ligação aumentada para um FcγRIIA humano, um FcγRIIIA humano, ou ambos, quando comparado com um polipeptídeo de referência que inclui uma porção Fc que não compreende G236A/A330L/I332E, em que o FcγRIIA humano é opcionalmente H131 ou R131, e/ou o FcγRIIIA humano é opcionalmente F158 ou V158; (ii) ter ligação reduzida a um FcγRIIB humano, em comparação com um polipeptídeo de referência que inclui uma porção Fc que não compreende G236A/A330L/I332E; (iii) não se ligar a um FcγRIIB humano; (iv) ter ligação reduzida a um componente C1q humano, em comparação com um polipeptídeo de referência que inclui uma porção Fc que não compreende G236A/A330L/I332E;

(v) não se ligar ao componente C1q humano;

(vi) ativar um FcγRIIA, um FcγRIIIA humano, ou ambos, em um grau maior do que um polipeptídeo de referência que inclui uma porção Fc que não compreende G236A/A330L/I332E, em que o FcγRIIA humano é opcionalmente H131 ou R131 e/ou o FcγRIIIA humano é opcionalmente F158 ou V158;

(vii) não ativar um FcγRIIB humano;

(viii) ativar uma célula natural killer (NK) humana na presença de HBsAg em um grau maior do que um polipeptídeo de referência que inclui uma porção Fc que não compreende G236A/A330L/I332E, em que o polipeptídeo de referência é, opcionalmente, um anticorpo que se liga a um HB

Ag, opcionalmente um HBsAg;

(ix) ter um EC50 de HBsAg a partir de cerca de 12,75 ng/mL a cerca de 19,9 ng/mL, ou de cerca de 12,75 ng/mL a cerca de 12,84 ng/mL, ou cerca de 12,79 ng/mL, ou de cerca de 16,22 ng/mL a cerca de 19,9 ng/mL, ou cerca de 17,97 ng/mL, e/ou (b) ter um EC50 de HBeAg de cerca de 10,78 ng/mL a cerca de 13,72 ng/mL, ou de cerca de 10,78 ng/mL a cerca de 10,93 ng/mL,

ou cerca de 10,85 ng/mL, ou cerca de 11,59 ng/mL a cerca de 13,72 ng/mL, ou cerca de 12,61 ng/mL, em que o HBV é opcionalmente HBV Genótipo D, e em que o valor de EC50 é opcionalmente determinado in vitro medindo HBsAg ou

HBeAg, respectivamente, secretado por células HepG2 superexpressando

NTCP e infectadas com o HBV, no dia 7 após a administração do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno às células HepG2;

(x) ter um EC50 de HBsAg a partir de cerca de 10,43 ng/mL a cerca de 22,41 ng/mL, ou de cerca de 13,81 ng/mL a cerca de 16,56 ng/mL, ou de cerca de 15,12 ng/mL, ou a partir de cerca de 12,24 ng/mL a cerca de 22,41 ng/mL, ou cerca de 16,56 ng/mL, ou a partir de cerca de 10,43 ng/mL a cerca de 20,08 ng/mL, ou cerca de 14,47 ng/mL, e/ou (b) ter um EC50 de HBeAg a partir de cerca de 10,39 ng/mL a cerca de 13,99 ng/mL, ou a partir de cerca de

10,63 ng/mL a cerca de 10,66 ng/mL, ou cerca de 10,64 ng/mL, ou a partir de cerca de 10,39 ng/mL a cerca de 10,60 ng/mL, ou cerca de 10,49 ng/mL, ou a partir de cerca de 13,25 ng/mL a cerca de 13,99 ng/mL, ou cerca de 13,61 ng/mL, em que o HBV é opcionalmente HBV Genótipo D, e em que o valor de

EC50 é opcionalmente determinado in vitro medindo HBsAg ou HBeAg,

respectivamente, secretado por células HepG2 superexpressando NTCP e infectadas com o HBV, no dia 7 após a administração do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno às células HepG2;

(xi) ser capaz de se ligar a um HBsAg variante compreendendo

HBsAg-Y100C/P120T, HBsAg-P120T, HBsAg-P120S/S143L, HBsAg-C121S,

HBsAg-R122D, HBsAg-R122I, HBsAg-T123N, HBsAg-Q129H, HBsAg-Q129L,

HBsAg-M133H, HBsAg-M133L, HBsAg-M133T, HBsAg-K141E, HBsAg-P142S,

HBsAg-S143K, HBsAg-D144A, HBsAg-G145R, HBsAg-N146A ou qualquer combinação dos mesmos;

(xii) ter ligação melhorada a um HBsAg variante compreendendo HBsAg-Y100C/P120T, HBsAg-P120T, HBsAg-P120S/S143L,

HBsAg-C121S, HBsAg-R122D, HBsAg-R122I, HBsAg-T123N, HBsAg-Q129H,

HBsAg-Q129L, HBsAg-M133H, HBsAg-M133L, HBsAg-M133T, HBsAg-K141E,

HBsAg-P142S, HBsAg-S143K, HBsAg-D144A, HBsAg-G145R, HBsAg-N146A,

ou qualquer combinação dos mesmos, em comparação com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de referência que se liga ao HBsAg e que inclui uma porção Fc que não compreende G236A/A330L/I332E; e/ou

(xiii) ser capaz de neutralizar (a) um HBV de genótipo A com um valor EC50 de cerca de 2,34 ng/mL; (b) um HBV de genótipo B com um valor EC50 de cerca de 2,22 ng/mL; (c) um HBV de genótipo C com um valor EC 50 de cerca de 0,92 ng/mL; (d) um HBV de genótipo D com um valor EC50 de cerca de 1,10 ng/mL; (e) um HBV de genótipo E com um valor EC 50 de cerca de 1,12 ng/mL; (f) um HBV de genótipo F com um valor EC50 de cerca de 1,93 ng/mL;

(g) um HBV de genótipo G com um valor EC50 de cerca de 1,43 ng/mL; e/ou (h)

um HBV de genótipo H com um valor EC50 de cerca de 1,93 ng/mL, em que o valor de EC50 é opcionalmente determinado usando um HDV recombinante manipulado para expressar um HBsAg do genótipo de HBV.