ES2961791T3 - Anticuerpos que neutralizan el virus de la hepatitis B y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

La presente divulgación se refiere a anticuerpos, y a fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que pueden unirse a la región del bucle antigénico del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y pueden neutralizar la infección tanto del virus de la hepatitis B (VHB) como del virus de la hepatitis delta (HDV). La presente divulgación también se refiere a epítopos a los que se unen los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno, así como a proteínas de fusión que comprenden los fragmentos de unión a antígeno, y a ácidos nucleicos que codifican células que producen dichos anticuerpos y fragmentos de anticuerpo. Además, la presente divulgación se refiere al uso de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la presente divulgación en el diagnóstico, profilaxis y tratamiento de la hepatitis B y la hepatitis D. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos que neutralizan el virus de la hepatitis B y usos de los mismos

Declaración relativa a la lista de secuencias

El Listado de Secuencias asociado a esta solicitud se proporciona en formato texto en lugar de copia en papel.

La presente descripción se refiere al campo de la inmunoterapia para el virus de la hepatitis B (HBV) y contra el virus de la hepatitis delta (HDV), y a sus usos. Las proteínas de unión anti-hepatitis B aquí descritas, por ejemplo anticuerpos y sus fragmentos de unión a antígeno, son capaces de unirse a un epítopo ubicado en la región del bucle antigénico del dominio S de las proteínas de la envoltura del HBV (HBsAg). Tales proteínas de unión anti-hepatitis B pueden unirse a cualquiera o todos los genotipos de HBsAg conocidos, así como a variantes de HBsAg, y pueden neutralizar la infección por HBV. También se proporcionan aquí ácidos nucleicos que codifican y células huésped que expresan las proteínas de unión. Además, la presente descripción proporciona métodos de uso de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo aquí descritos en el diagnóstico, la profilaxis y el tratamiento de enfermedades, así como en métodos de cribado.

A modo de antecedente, el HBV consiste en (i) una envoltura que contiene tres proteínas de superficie relacionadas (antígeno de superficie de hepatitis B, HBsAg) y lípidos y (ii) una nucleocápside icosaédrica que encierra el genoma del ADN viral y ADN polimerasa. La cápside del HBV se forma en el citosol de la célula infectada durante el empaquetamiento de un complejo de replicación del pregenoma de ARN y adquiere la capacidad de emerger durante la síntesis del genoma de ADN viral por transcripción inversa del pregenoma en el lumen de la partícula. Las tres proteínas de envoltura del HBV, S-HBsAg, M-HBsAg y L-HBsAg, forman un pliegue transmembrana complejo en el retículo endoplásmico y forman homo y heterodímeros unidos por disulfuro. Durante la emergencia en una membrana intracelular, un dominio lineal corto en la región preS citosólica interactúa con los sitios de unión en la superficie de la cápside. Posteriormente, los viriones se secretan a la sangre. Además, las proteínas de superficie pueden emerger en ausencia de cápsides y formar partículas subvirales (SVP), que también se secretan en un exceso de 3 4 log sobre los viriones. Un alto nivel de HBsAg puede agotar la respuesta de las células T específicas de HBsAg y se propone como un factor importante para la inmunotolerancia viral en pacientes con hepatitis B crónica (C<h>B) (Chisari FV, Isogawa M, Wieland SF, Pathologie Biologie, 2010; 58: 258-66).

El virus de la hepatitis B causa infecciones hepáticas agudas y crónicas potencialmente mortales. La hepatitis B aguda se caracteriza por viremia, con o sin síntomas, con riesgo de aparición de hepatitis fulminante (Liang TJ, Block TM, McMahon BJ, Ghany MG, Urban S, Guo JT, Locarnini S, Zoulim F, Chang KM, Lok AS. Present and future therapies of hepatitis B: From discovery a cure. Hepatology. 2015 Aug 3. doi: 10.1002/hep.28025. [Publicación electrónica antes de impresión]). A pesar de que una vacuna eficaz contra la hepatitis B está disponible desde 1982, la OMS informa que 240 millones de personas están infectadas de forma crónica de hepatitis B y más de 780.000 personas mueren cada año debido a complicaciones de la hepatitis B. Aproximadamente un tercio de los pacientes con hepatitis B crónica (HBC) desarrollan cirrosis, insuficiencia hepática y carcinoma hepatocelular, lo que representa 600.000 muertes al año (Liang TJ, Block TM, McMahon BJ, Ghany MG, Urban S, Guo JT, Locarnini S, Zoulim F, Chang KM, Lok AS. Present and future therapies of hepatitis B: From discovery a cure. Hepatology. 2015 Aug 3. doi: 10.1002/hep.28025. [Publicación electrónica antes de impresión]).

En pacientes infectados por HBV pueden desarrollarse complicaciones graves como resultado de la coinfección o sobreinfección por VHD. De acuerdo con la OMS, la hepatitis D infecta a unos 15 millones de personas en todo el mundo. El HDV se considera un satélite subviral porque solo puede propagarse en presencia del HBV. El HDV es uno de los virus animales más pequeños conocidos (40 nm), por lo que su genoma es de solo 1,6 kb y codifica para para S y L de HDAg. Todas las demás proteínas necesarias para la replicación del genoma del HDV, incluyendo la ARN polimerasa, son proporcionadas por la célula huésped y la envoltura del HDV la proporciona el HBV. Cuando se introduce en células permisivas, el ARN genómico de HDV se replica y se asocia con múltiples copias de las proteínas codificadas por HDV para ensamblar un complejo de ribonucleoproteína (RNP). El RNP es exportado desde la célula por las proteínas de la envoltura del HBV, que son capaces de ensamblar vesículas de lipoproteínas que emergen en el lumen de un compartimento pre-Golgi antes de ser secretadas. Además, las proteínas de la envoltura del HBV también proporcionan un mecanismo para dirigir el HDV a una célula no infectada, asegurando así la propagación del HDV.

Las complicaciones causadas por HDV incluyen una mayor probabilidad de sufrir insuficiencia hepática en infecciones agudas y una progresión rápida a cirrosis hepática, con una mayor probabilidad de desarrollar cáncer de hígado en infecciones crónicas. En combinación con el virus de la hepatitis B, la hepatitis D tiene la tasa de mortalidad más alta de todas las infecciones por hepatitis, con un 20% (Fattovich G, Giustina G, Christensen E, Pantalena M, Zagni I, Realdi G, Schalm SW. Influence of hepatitis delta virus infection on morbidity and mortality in compensated cirrhosis type B. Gut. 2000 Mar;46(3):420-6). La única terapia aprobada para la infección crónica por HDV es el interferón alfa. Sin embargo, el tratamiento de HDV con interferón alfa es relativamente ineficaz y no es bien tolerado. El tratamiento con interferón alfa resulta en una respuesta virológica sostenida seis meses después del tratamiento en una cuarta parte de los pacientes. Además, los análogos de nucleósidos/nucleótidos (NA) se han probado ampliamente en la hepatitis delta, pero parecen ser ineficaces. El tratamiento combinado usando NA con interferón también resultó decepcionante (Zaigham Abbas, Minaam Abbas Management of hepatitis delta: Need for novel therapeutic Options. World J Gastroenterol 2015 August 28; 21(32): 9461-9465). En consecuencia, se necesitan nuevas opciones terapéuticas.

Las solicitudes WO2017059878 y WO2017060504 describen un anticuerpo anti-HBsAg denominado HBC34. Furman et al. (The AAPS Journal; 17(1): 111-120) describe que los residuos de cisteína en las proteínas terapéuticas pueden conllevar riesgos.

Sumario de la invención

El objeto de la invención está definido por las reivindicaciones adjuntas.

La descripción técnica expuesta a continuación en algunos aspecto puede ir más allá del alcance de las reivindicaciones. Los elementos de la descripción que no entran dentro del alcance de las reivindicaciones se proporcionan únicamente a título informativo. Ocasionalmente, el texto puede hablar de una "realización" con respecto a aspectos que podrían aplicarse a todas las proteínas de la descripción y no solo al objeto reivindicado. Aun así, no forman parte de la invención los elementos que no entran dentro del alcance de las reivindicaciones.

Breve Descripción de las Figuras

Las figuras aquí proporcionadas están destinadas a ilustrar la materia incluida en la presente invención con más detalle. Las figuras no pretenden limitar la invención de ninguna manera.

Figura 1: muestra la unión de HBC34-V7 y dos anticuerpos diseñados de la presente descripción ("HBC34-V34"; "HBC34-V35"), en las concentraciones indicadas, a HBsAg adw (panel superior) y HBsAg adr (panel inferior), según se determina mediante ensayos ELISA directos basados en antígenos. Todos los anticuerpos se produjeron como IgG1 (g1m17, 1 alotipo).

Figuras 2A-2K: muestran la unión de HBC34-V7, HBC34-V34 y HBC34-V35 a todos los genotipos de HBsAg conocidos ((A)-(J)), respectivamente) y al control simulado (K). Se usaron secuencias representativas del genotipo que representan el bucle externo antigénico de HBsAg, tal como se muestra en el Ejemplo 5 de la publicación PCT N° WO 2017/060504. La tinción se llevó a cabo con FACS. Las concentraciones de anticuerpos fueron las indicadas en el eje X de las gráficas.

Figuras 3A-3V: muestran la uniónin vitro(3A-3R) y la neutralización (3S-3V) de ciertos anticuerpos HBC para HBsAg. Las figuras 3A y 3B muestran la unión de HBC34-V7 y HBC34-V35 con regiones Fc tipo salvaje o variantes a HBsAg adw en un ensayo ELISA directo basado en antígenos (2 experimentos; los datos del "Experimento 1" se muestran en la figura 3A y los datos del "Experimento 2" se muestran en la figura 3B). Las curvas de unión a antígeno se muestran en el panel superior de cada figura. Los valores EC50 (determinados por ajuste de curvas usando el prisma Graphpad) se muestran en el panel central de cada figura. La unión a placas no revestidas (control) se muestra en el panel inferior de cada figura. Regiones Fc: "HBC34v7" y "HBC34-V35" = Fc tipo salvaje; "HBC34-V35-MLNS" = Fc con M428L/N434S. "HBC34-V35-MLNS-GAALIE" = Fc con M428L/N434S/G236A/A330L/I332E. Se ensayaron tres lotes de HBC34-V35. Se ensayaron dos lotes de HBC34-V35-MLNS y dos lotes de HBC34-v35-MLNS-GAALIE. Se usó un lote de HBC34-V7. Las figuras 3C-3H muestran la unión de HBC34-V35, HBC34-V35-MLNS y HBC34-V35-MLNS-GAALIE a células Expi293 que expresan HBsAg de los diez genotipos de HBV conocidos o al control simulado. La unión se determinó mediante citometría de flujo. Los datos se expresan como intensidad de fluorescencia media (eje Y) de las poblaciones transfectadas como se define mediante la separación de la señal obtenida con células transfectadas de forma simulada. Para cada HbsAg, se ensayaron diluciones seriadas de los tres elementos de prueba (12 puntos, 1 en 3, comenzando desde 10 pg/ml). Las figuras 3I-3R muestran la unión de HBC34-V35, HBC34-V35-MLNS y HBC34-V35-MLNS-GAALIE a células Expi293 que expresan HBsAg de diecinueve (19) variantes de HBsAg o control simulado. La unión se determinó mediante citometría de flujo. Los datos se expresan como intensidad de fluorescencia media de las poblaciones transfectadas, tal como se define mediante la separación de la señal obtenida con células transfectadas de forma simulada. Para cada HBsAg, se ensayaron diluciones seriadas de los tres elementos de prueba (12 puntos, 1 en 3, comenzando desde 10 |jg/ml). La concentración de anticuerpo era la mostrada en el eje X. Las figuras 3S y 3U muestran la capacidad neutralizante de los anticuerpos HBC indicados contra el genotipo D del HBV según se evaluó midiendo los niveles de HBsAg (arriba) y HbeAg (abajo) en el sobrenadante de cultivo celular de células HepG2 infectadas con HBVD que expresan NTCP. Los datos representan las medias ± DE de uno de los dos experimentos independientes. Las figuras 3T y 3V muestran los valores EC50. La media geométrica y el intervalo (entre paréntesis) de los valores de EC50 se determinaron a partir de dos experimentos independientes.

Figura 4: muestra la neutralización (valor EC50), por HBC34-V35-MLNS-GAALIE, de genotipos de HBV individuales usando un sistema de pseudotipado de HDV.

Figuras 5-8: muestran el efecto de HBC34-V35 sobre los niveles de HBAg en suero en un modelo de ratón de infección por HBVin vivo.Se trasplantaron ratones SCID infectados con el genotipo C del HBV con hepatocitos humanos primarios y se les administró HBC34-V35 a 1, 5 o 15 mg/kg, o PBS (control), tal como se describe en el Ejemplo 5. La figura 5 muestra la concentración de ADN de HBV en suero antes y después del tratamiento. La figura 6 muestra la concentración sérica de HBsAg antes y después del tratamiento. La figura 7 muestra la concentración sérica de HBeAg antes y después del tratamiento. La figura 8 muestra la concentración sérica de HBcrAg antes y después del tratamiento. "Tmt" = Tratamiento.

Figuras 9A-9F: muestran la unión de HBC34-V35-MLNS y HBC34-V35-MLNS-GAALIE a FcR humanos. (A-E) Unión a F<cy>R, de acuerdo con lo evaluado por interferometría de biocapa (BLI). F<cy>R humanos marcados con His ((A) FcYRIIa alelo H131; (B) FcYRIIa alelo R131; (C) FcyRIIIa alelo F158; (D) FcYRIIIa alelo V158; (E) FcYRIIb) a 2 pg/ml se capturaron en sensores anti-penta-His durante 6 minutos. A continuación, los sensores cargados con FcyR se expusieron durante 5 minutos a una solución de tampón cinético (pH 7,1) que contenía 2 pg/ml de cada mAb (parte izquierda de la gráfica) en presencia de 1 pg/ml de affiniPure F(ab')2 Fragmento IgG antihumano de cabra, fragmento F(ab')2 específico (para entrecruzar mAb humanos a través del fragmento Fab), seguido de un paso de disociación en el mismo tampón durante 4 minutos más (parte derecha de la gráfica). Los perfiles de asociación y disociación se midieron en tiempo real como cambio en el patrón de interferencia usando Octet® RED96 (FortéBio). (F) Uniónin vitrode anticuerpos HBC34 a FcRn a diferentes pH, según se determina mediante interferometría de biocapa (BLI). El punto de tiempo 0 segundos representa el cambio del tampón de línea base al tampón que contiene anticuerpos. El punto de tiempo de 300 segundos (línea vertical de puntos) representa el cambio a tampón en blanco al pH correspondiente. Las curvas indican perfiles de asociación y disociación de cambio en los patrones de interferencia.

Figura 10: muestra la unión de HBC34-V35-MLNS y HBC34-V35-MLNS-GAALIE a C1q humano, medida por Octet®. Se usaron sensores anti-Fab humano (CH1) para capturar, a través del fragmento Fab, la IgG1 completa de los mAb HBC34v35-MLNS y HBC34-V35-MLNS-GAALIE a 10 pg/ml durante 10 minutos. A continuación, los sensores cargados con IgG se expusieron durante 4 minutos a una solución de yampón cinético (pH 7,1) que contenía 3 pg/ml de C1q humano purificado (parte izquierda de la gráfica), seguido de un paso de disociación en el mismo tampón durante 4 minutos más (parte derecha de la gráfica). Los perfiles de asociación y disociación se midieron en tiempo real como cambio en el patrón de interferencia usando Octet® RED96 (FortéBio).

Figuras 11A y 11B: muestran la activaciónin vitrode FcYRIIIa humano usando la activación ligada a receptor de un indicador de luciferasa mediado por NFAT en células Jurkat manipuladas. La activación de FcYRIIIa se probó usando un ensayo biológico validado disponible comercialmente, donde se emplea HBsAg recombinante (Engerix B) como antígeno objetivo. Se incubaron diluciones en serie de HBC34-V35-MLNS y HBC34-V35-MLNS-G<a>A<l>IE y un mAb de control (Ctr) con 0,2 pg/ml de HBsAg a 37 °C durante 25 min. Las células efectoras Jurkat (Promega) que expresan el alelo FcYRIIIa de baja afinidad F158 (A) o el alelo FcYRIIIa de alta afinidad V158 (B) se resuspendieron en tampón de ensayo y luego se añadieron a las placas de ensayo. Después de incubación a 37 °C durante 24 horas, se añadió el reactivo de ensayo de luciferasa Bio-Glo-TM (Promega) y se cuantificó la luminiscencia usando un luminómetro (Bio-Tek).

Figuras 12A y 12B: muestran la activaciónin vitrode FcYRIIa humano usando la activación ligada a receptor de un indicador de luciferasa mediado por NFAT en células Jurkat manipuladas. La activación de FcYRIIa humano se determinó usando un ensayo biológico validado disponible comercialmente, donde se empleó HBsAg recombinante (Engerix B) como antígeno objetivo. Se incubaron diluciones en serie de HBC34v35-MLNS y HBC34-V35-MLNS-GAALIE y un mAb de control (Ctr) con 2 pg/ml (A) o 0,2 pg/ml (B) de HBsAg a 37 °C durante 25 min. Las células efectoras Jurkat (Promega) que expresan el alelo H131 de alta afinidad de FcYRIIa se resuspendieron en tampón de ensayo y luego se añadieron a las placas de ensayo. Después de incubación a 37 °C durante 23 horas, se añadió el reactivo de ensayo de luciferasa Bio-Glo-TM (Promega) y se cuantificó la luminiscencia usando un luminómetro (Bio-Tek).

Figuras 13A-13B: muestran la activaciónin vitrode FcYRIIb humano usando la activación unida a receptor de un indicador de luciferasa mediado por NFAT en células Jurkat manipuladas. La activación de FcYRIIb humano se probó usando un ensayo biológico validado disponible comercialmente, donde se emplea HBsAg recombinante (Engerix B) como antígeno objetivo. Se incubaron diluciones en serie de HBC34-V35-MLNS y HBC34-V35-MLNS-GAALIE y un mAb de control (Ctr) con 1 pg/ml de HBsAg a 37 °C durante 15 min. Las células efectoras Jurkat (Promega) que expresan FcYRIIb se resuspendieron en tampón de ensayo y luego se añadieron a placas de ensayo. Después de incubación a 37 °C durante 20 horas, se añadió el reactivo de ensayo de luciferasa Bio-Glo-TM (Promega) y se cuantificó la luminiscencia usando un luminómetro (Bio-Tek). En la figura 13B, el mAb de control de la figura 13A se denomina "Ctr mAbl". Un segundo mAb de control, denominado "Ctr mAb2", es una versión de HBC34-V35 que incluye IgG1 Fc con las siguientes mutaciones que mejoran la unión a FcYRIIb: G237D/P238D/H268D/P271G/A330R (Mimoto et al., Prot Eng Des Sel 26 (10): 589-598 (2013)).

Figuras 14A y 14B: muestran la destrucciónin vitrode células de hepatoma humano PLC/PRF/5 por células NK primarias humanas en presencia de HBC34-V35-MLNS y HBC34-V35-MLNS-GAALIE. (A) La ADCC se probó usando células NK recién aisladas de un donante previamente genotipadas para expresar FcYRIIIa (F/V) de afinidad alta (V158) y baja (F158) heterocigótica. Se agregaron diluciones en serie de HBC34-V35, HBC34-V35-MLNS, HBC34-V35-MLNS-GAALIE, mAb anti-HBV 17.1.41 y un mAb de control a la línea celular de hepatoma secretor de HBsAg PLC/PRF/5 (también denominadas células de Alexander). Se incubaron células PLC/PRF/5 junto con los anticuerpos a temperatura ambiente durante 10 min. Se añadieron células NK a placas de ensayo (relación de células efectoras a células objetivo 10:1) y se incubaron a 37 °C durante 4 horas. La muerte celular se determinó midiendo la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH). (B) Tinción de células de hepatoma humano PLC/PRF/5 mediante mAb HBC34-V35 y 17.1.41 según se evaluó mediante citometría de flujo. Las células se lavaron extensamente, se fijaron con formaldehído (4%) o se fijaron y permeabilizaron (saponina al 0,5%) antes de teñir con diferentes concentraciones de mAb HBC34-V35 y 17.1.41. La unión de estos mAb humanos (en el caso de HBC34-V35, humanos manipulados) se detectó mediante citometría de flujo usando un anticuerpo específico de fragmento Fcy de fragmento Fcy de Alexa Fluor® 647 AffiniPure F(ab')2.

Figuras 15A y 15B: muestran la activaciónin vitrode células NK humanas primarias en presencia de HBC34-V35-MLNS y HBC34-V35-MLNS-GAALIE y HBsAg. La activación de las células NK se ensayó usando células recién aisladas de dos donantes previamente genotipificados para expresar (A) homocigoto de afinidad alta (V158) o (B) de baja (F158) FcYRIIIa. Se incubaron diluciones en serie de mAb HBC34-V35, HBC34-V35-M<l>NS-<g>A<a>L<i>E y HBC34<v>35-L<a>L<a>con células NK durante 4 horas. La activación de las células NK se midió mediante citometría de flujo mediante la tinción de las células NK con mAb anti-CD107a, como marcador funcional para la identificación de la actividad de las células NK. CD107a, también conocido como LAMP-1, es un marcador de desgranulación de células NK.

Figura 16: muestra los resultados de estudios de interacción de fármacosin vitroentre HBC34-V35-MLNS-GAALIE y Entecavir (ETV, por sus siglas en inglés), inhibidor de la polimerasa/transcriptasa inversa.

Descripción Detallada

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos aquí empleados tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica.

A lo largo de esta descripción, a menos que el contexto requiera lo contrario, el término "comprenden" y variaciones del mismo, tales como "comprende" y "que comprende", se usa como sinónimo de, por ejemplo, "que tiene", "tiene", "que incluye", "incluye" o similares, y se entenderá que implica la inclusión de un miembro, proporción, número entero (incluyendo, cuando sea apropiado, una fracción del mismo; por ejemplo una décima y una centésima partes de un número entero), concentración o paso, pero no la exclusión de ningún otro miembro, relación, número entero, concentración o paso no especificado. Cualquier intervalo de concentración, intervalo de porcentaje, intervalo de proporción o intervalo de números enteros debe entenderse que incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo mencionado y, cuando sea apropiado, fracciones del mismo (tal como una décima y una centésima parte de un número entero), a menos que se indique de otra forma. Además, debe entenderse que cualquier intervalo de números citado aquí en relación con cualquier característica física, tal como subunidades de polímero, tamaño o grosor, incluye cualquier número entero dentro del intervalo mencionado, a menos que se indique lo contrario. El término "consiste en" se refiere a una modalidad del término "comprende" en la que se excluye cualquier otro miembro, número entero o paso no indicado. En el contexto de la presente descripción, el término "comprende" abarca el término "consiste en". El término "que consiste esencialmente en" no es equivalente a "que comprende" y se refiere a los materiales o etapas especificados de una reivindicación o a aquellos que no afectan materialmente a las características básicas de una materia objeto reivindicada.

Además, debe entenderse que los compuestos individuales, o grupos de compuestos, derivados de las diversas combinaciones de las estructuras y sustituyentes aquí descritos se describen en la presente solicitud en la misma medida que si cada compuesto o grupo de compuestos se expusiera individualmente. Por tanto, la selección de estructuras particulares o sustituyentes particulares está dentro del alcance de la presente descripción.

Los términos "un" y "una" y "el/la" y referencias similares usadas en el contexto de la descripción de la invención (incluso en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique aquí lo contrario o sea claramente contradicho por el contexto. Debe entenderse que el uso de la alternativa (por ejemplo, "o") significa una, ambas o cualquier combinación de las alternativas. La cita de intervalos de valores en el presente documento está destinada a servir como método abreviado para hacer referencia individualmente a cada valor individual que se encuentre dentro del intervalo. A menos que se indique aquí lo contrario, cada valor individual se incorpora a la descripción como si se recitara aquí individualmente. Ningún lenguaje en la descripción debe interpretarse en el sentido de que indique cualquier elemento no reivindicado como esencial para la práctica de la materia que aquí se describe.

La palabra "esencialmente" no excluye "completamente"; por ejemplo, una composición que está "esencialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. el término "esencialmente" se refiere a una cantidad, efecto o actividad dados de una composición, método o uso de la presente descripción en comparación al de una composición, método o uso de referencia, y describe una reducción en la cantidad, efecto o actividad de no más del 50%, tal como no más del 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% o 1%, o menos, de la cantidad, efecto o actividad de la composición, método o uso de referencia.

Tal como se usa aquí, el término "aproximadamente" significa ± 20% del intervalo, valor o estructura indicados, a menos que se indique lo contrario.

"Opcional" u "opcionalmente" significa que el elemento, componente, evento o circunstancia descrito posteriormente puede ocurrir o no y que la descripción incluye instancias donde que ocurre el elemento, componente, evento o circunstancia e instancias en las que no.

El término "enfermedad" tal como se usa aquí pretende ser generalmente sinónimo y se usa indistintamente con los términos "trastorno" y "condición" (tal como en condición médica), ya que todos reflejan una condición anormal del cuerpo humano o animal o de una de sus partes que deteriora el funcionamiento normal, se manifiesta típicamente por signos y síntomas distintivos y hace que el ser humano o animal afectado tenga una duración o calidad de vida reducida.

Tal como se usa aquí, la referencia a "tratamiento" de un sujeto o paciente pretende incluir prevención, profilaxis, atenuación, mejora y terapia. Los beneficios del tratamiento incluyen un mejor resultado clínico; disminución o alivio de los síntomas asociados con una enfermedad; disminución de la aparición de síntomas; mejor calidad de vida; estado libre de enfermedad más prolongado; disminución de la extensión de la enfermedad; estabilización del estado de enfermedad; retraso de la progresión de la enfermedad; remisión; supervivencia; supervivencia prolongada; o cualquier combinación de los mismos. Los términos "sujeto" o "paciente" se usan aquí indistintamente para significar todos los mamíferos, incluyendo seres humanos. Los ejemplos de sujetos incluyen humanos, vacas, perros, gatos, caballos, cabras, ovejas, cerdos y conejos. En una realización, el paciente es un ser humano.

Tal como se usa aquí, "aminoácido" se refiere a aminoácidos sintéticos y de origen natural, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son los codificados por el código genético, así como aminoácidos modificados posteriormente, por ejemplo hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido natural, es decir, un carbono a unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo homoserina, norleucina, metionina sulfóxido, metionina metil sulfonio. Los análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo norleucina) o esqueletos peptídicos modificados, pero retienen la misma estructura química básica de un aminoácido natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura diferente a la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de manera similar a un aminoácido natural.

Tal como se usa aquí, los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" y variaciones de estos términos se refieren a una molécula que comprende al menos dos aminoácidos unidos entre sí por un enlace peptídico (normal o modificado). Por ejemplo, un péptido, polipéptido o proteína puede comprender o estar compuesto por una pluralidad de aminoácidos seleccionados de los 20 aminoácidos definidos por el código genético o un aminoácido análogo o mimético, cada uno de los cuales está unido al menos a otro por un enlace péptido.

Un péptido, polipéptido o proteína puede comprender o estar compuesto por L-aminoácidos y/o D-aminoácidos (o análogos o miméticos de los mismos). Los términos "péptido", "polipéptido", "proteína" también incluyen "peptidomiméticos", que se definen como análogos de péptidos que contienen elementos estructurales no peptídicos, siendo tales péptidos capaces de imitar o antagonizar las acciones biológicas de un péptido original natural. En ciertos aspectos, un peptidomimético carece de características tales como enlaces peptídicos enzimáticamente escindibles.

Un péptido, polipéptido o proteína puede comprender aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos definidos por el código genético, además de estos aminoácidos, o puede estar compuesto por aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos definidos por el código genético. En ciertos aspectos, un péptido, polipéptido o proteína en el contexto de la presente descripción puede comprender aminoácidos que están modificados por procesos naturales, tales como procesos de maduración postraduccional, o por procesos químicos (por ejemplo procesos sintéticos), que son conocidos en la técnica e incluyen los aquí descritos. Tales modificaciones pueden aparecer en cualquier parte del polipéptido; por ejemplo en el esqueleto peptídico; en la cadena de aminoácidos; o en los extremos carboxi-terminal o amino-terminal. Un péptido o polipéptido puede estar ramificado, tal como después de ubiquitinación, o puede ser cíclico, con o sin ramificación. Los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" también incluyen péptidos, polipéptidos y proteínas modificados. Por ejemplo, las modificaciones de péptidos, polipéptidos o proteínas pueden incluir acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, fijación covalente de un nucleótido o de un derivado de nucleótido, fijación covalente de un lípido o de un derivado lipídico, fijación covalente de un fosfatidilinositol, reticulación covalente o no covalente, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, glicosilación incluyendo pegilación, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesos proteolíticos, fosforilación, prenilación, racemización, seneilación, sulfatación, adición de aminoácidos como arginilación o ubiquitinación. Tales modificaciones se han descrito en la bibliografía (véase Proteins Structure and Molecular Properties (1993) 2nd Ed., T. E. Creighton, Nueva York; Post-translational Covalent Modifications of Proteins (1983) B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York; Seifter et al. (1990) Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol. 182: 626-646 and Rattan et al., (1992) Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci, 663: 48-62). En consecuencia, los términos "péptido", "polipéptido", "proteína" pueden incluir, por ejemplo, lipopéptidos, lipoproteínas, glicopéptidos, glicoproteínas y similares. También se contemplan variantes de proteínas, péptidos y polipéptidos de esta descripción. En ciertos aspectos, las variantes de proteínas, péptidos y polipéptidos comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 99,9% idéntica a una secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos definida o de referencia como se describe aquí. Como se usa aquí, "(poli)péptido" y "proteína" se pueden usar indistintamente en referencia a un polímero de residuos aminoácido, tal como una pluralidad de monómeros de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos.

"Molécula de ácido nucleico" o "polinucleótido" o "ácido nucleico" se refiere a un compuesto polimérico que incluye nucleótidos unidos covalentemente, que pueden estar formados por subunidades naturales (por ejemplo bases de purina o pirimidina) o subunidades no naturales (por ejemplo anillo de morfolina). Las bases de purina incluyen adenina, guanina, hipoxantina y xantina y las bases de pirimidina incluyen uracilo, timina y citosina. Los monómeros de ácido nucleico pueden unirse mediante enlaces fosfodiéster o análogos de tales enlaces. Los análogos de enlaces fosfodiéster incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato o similares.

Las moléculas de ácido nucleico incluyen ácido polirribonucleico (ARN), ácido polidesoxirribonucleico (ADN), incluyendo ADNc, ADN genómico y a Dn sintético, cualquiera de los cuales puede ser monocatenario o bicatenario. Si es de una hebra, la molécula de ácido nucleico puede ser la hebra codificante o no codificante (hebra antisentido). Los polinucleótidos (incluidos los oligonucleótidos) y sus fragmentos pueden generarse, por ejemplo, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o mediante traducciónin vitro,o generarse mediante ligación, escisión, acción de endonucleasa o acción de exonucleasa.

Una molécula de ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos incluye todas las secuencias de nucleótidos que codifican para la misma secuencia de aminoácidos. Algunas versiones de las secuencias de nucleótidos también pueden incluir intrón o intrones en la medida en que el intrón o intrones se puedan suprimir mediante mecanismos de cotranscripción o postranscripción. Diferentes secuencias de nucleótidos pueden codificar la misma secuencia de aminoácidos como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, o por empalme, o ambos.

También se contemplan variantes de moléculas de ácido nucleico de esta descripción. Las variantes de moléculas de ácido nucleico son al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 99,9% idénticas a una molécula de ácido nucleico de una molécula de ácido nucleico de un polinucleótido definido o de referencia como se describe aquí, o se hibridan con un polinucleótido en condiciones rigurosas de hibridación de cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M a aproximadamente 65-68 °C o cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M y formamida al 50% a aproximadamente 42 °C. Las variantes de moléculas de ácido nucleico conservan la capacidad de codificar una proteína de fusión o un dominio de unión de la misma que tiene una funcionalidad descrita en el presente documento, tal como la unión específica de una molécula diana.

Tal como se usa aquí, el término "variante de secuencia" se refiere a cualquier secuencia que tenga una o más alteraciones en comparación con una secuencia de referencia, siendo una secuencia de referencia cualquier secuencia publicada y/o una secuencia citada en la "Tabla de secuencias y Números SEQ ID" (listado de secuencias), es decir, SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 139. Así, el término" variante de secuencia" incluye variantes de secuencia de nucleótidos y variantes de secuencia de aminoácidos. En ciertos aspectos, una secuencia variante en el contexto de una secuencia de nucleótidos, la secuencia de referencia también es una secuencia de nucleótidos, mientras que, en ciertos aspectos, para una secuencia variante en el contexto de una secuencia de aminoácidos, la secuencia de referencia también es una secuencia de aminoácidos. Una "variante de secuencia" como se usa aquí puede ser al menos un 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% idéntica a la secuencia de referencia.

El "porcentaje de identidad de secuencia" se refiere a una relación entre dos o más secuencias, según se determina comparando las secuencias. Pueden diseñarse métodos para determinar la identidad de secuencia para proporcionar la mejor coincidencia entre las secuencias que se comparan. Por ejemplo, las secuencias se pueden alinear con fines de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir espacios en uno o ambos de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos para una alineación óptima). Además, las secuencias no homólogas pueden descartarse con fines de comparación. El porcentaje de identidad de secuencia al que se hace referencia en este documento se calcula sobre la longitud de la secuencia de referencia, a menos que se indique lo contrario. Los métodos para determinar la identidad y similitud de secuencias se pueden encontrar en programas informáticos disponibles públicamente. Las alineaciones de secuencia y los cálculos de identidad porcentual se pueden llevar a cabo usando un programa BLAST (por ejemplo BLAST 2.0. BLASTP, b La STN o BlAs TX). El algoritmo matemático usado en los programas BLAST se puede encontrar en Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997. Dentro del contexto de esta descripción, se entenderá que cuando se usa software de análisis de secuencias para el análisis, los resultados del análisis se basan en los "valores predeterminados" del programa al que se hace referencia. "Valores predeterminados" significa cualquier conjunto de valores o parámetros que originalmente se cargan con el software cuando se inicializa por primera vez.

Una "variante de secuencia" en el contexto de una secuencia de ácido nucleico (nucleótido) tiene una secuencia alterada en la que uno o más de los nucleótidos de la secuencia de referencia se suprimen o sustituyen, o se insertan uno o más nucleótidos en la secuencia de la secuencia de nucleótidos de referencia. Los nucleótidos se denominan aquí con la designación estándar de una letra (A, C, G o T). Debido a la degeneración del código genético, una "variante de secuencia" de una secuencia de nucleótidos puede resultar en un cambio en la secuencia de aminoácidos de referencia respectiva, es decir, en una "variante de secuencia" de aminoácidos o no. En algunas realizaciones, una variante de secuencia de nucleótidos no resulta en una variante de secuencia de aminoácidos (por ejemplo, una mutación silenciosa). En algunas realizaciones, se contempla una variante de secuencia de nucleótidos que resulta en una o más mutaciones "no silenciosas". En algunas realizaciones, una variante de secuencia de nucleótidos de la presente descripción codifica para una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos tal como se describen aquí también se refieren a versiones optimizadas por codones de una secuencia de nucleótidos o aminoácidos de referencia o de tipo salvaje. En cualquiera de las realizaciones aquí descritas, un polinucleótido de la presente invención puede optimizarse por codones para una célula huésped que contenga el polinucleótido (véase, por ejemplo, Scholten et al., Clin. Immunol. 119: 135-145 (2006). La optimización en codones se puede llevar a cabo usando técnicas y herramientas conocidas, por ejemplo la herramienta GenScript® OptimumGene™ o la herramienta GeneArt Gene Synthesis Tool (Thermo Fisher Scientific). Las secuencias optimizadas en codones incluyen secuencias que están parcialmente optimizadas en codones (es decir, al menos un codón optimizado para la expresión en la célula huésped) y aquellos que están completamente optimizadas en codones.

Una "variante de secuencia" en el contexto de una secuencia de aminoácidos tiene una secuencia alterada donde uno o más de los aminoácidos se suprimen, sustituyen o insertan en comparación con una secuencia de aminoácidos de referencia. Como resultado de las alteraciones, la variante de secuencia tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos un 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de referencia. Por ejemplo, por 100 aminoácidos de la secuencia de referencia, una secuencia variante que no tiene más de 10 alteraciones, es decir, cualquier combinación de supresiones, inserciones o sustituciones, es "al menos 90% idéntica" a la secuencia de referencia.

"Sustitución conservadora" se refiere a sustituciones de aminoácidos que no afectan ni alteran significativamente las características de unión de una proteína particular. Generalmente, las sustituciones conservadoras son aquellas en las que un residuo aminoácido sustituido se reemplaza por un residuo aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las sustituciones conservadoras incluyen una sustitución de uno de los siguientes grupos: Grupo 1: Alanina (Ala o A), Glicina (Gly o G), Serina (Ser o S), Treonina (Thr o T); Grupo 2: ácido aspártico (Asp o D), ácido glutámico (Glu o Z); Grupo 3: Asparagina (Asn o N), Glutamina (Gln o Q); Grupo 4: Arginina (Arg o R), Lisina (Lys o K), Histidina (His o H); Grupo 5: Isoleucina (Ile o I), Leucina (Leu o L), Metionina (Met o M), Valina (Val o V); y Grupo 6: Fenilalanina (Phe o F), Tirosina (Tyr o Y), Triptófano (Trp o W). Adicional o alternativamente, los aminoácidos se pueden agrupar en grupos de sustitución conservativos por función, estructura química o composición similar (por ejemplo ácido, básico, alifático, aromático o que contiene azufre). Por ejemplo, una agrupación alifática puede incluir, con fines de sustitución, Gly, Ala, Val, Leu e Ile. Otros grupos de sustituciones conservativas incluyen: que contienen azufre: Met y Cisteína (Cys o C); ácido: Asp, Glu, Asn y Gln; pequeños residuos alifáticos, apolares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro y Gly; residuos polares cargados negativamente y sus amidas: Asp, Asn, Glu y Gln; residuos polares cargados positivamente: His, Arg y Lys; grandes residuos alifáticos no polares: Met, Leu, Ile, Val y Cys; y grandes residuos aromáticos: Phe, Tyr y Trp. Puede encontrarse información adicional en Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company.

Las inserciones de secuencias de aminoácidos pueden incluir fusiones amino-terminales y/o carboxiterminales que varíen en longitud desde un residuo a polipéptidos de cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos únicos o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen la fusión al extremo N-terminal o C-terminal de una secuencia de aminoácidos con una molécula reporter o una enzima.

En general, las alteraciones en las variantes de secuencia no anulan ni reducen significativamente una funcionalidad deseada de la secuencia de referencia respectiva. Por ejemplo, se prefiere que una secuencia variante de la presente descripción no reduzca significativamente o anule completamente la funcionalidad de una secuencia de un anticuerpo, o de un fragmento de unión a antígeno del mismo, para unirse al mismo epítopo y/o para neutralizar lo suficiente la infección por HBV y HDV en comparación con el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno que tenga (o codifique para) la secuencia de referencia. Puede encontrarse una guía para determinar qué nucleótidos y residuos de aminoácidos, respectivamente, pueden sustituirse, insertarse o suprimirse sin abolir una estructura o funcionalidad deseada usando, por ejemplo, programas informáticos conocidos.

Tal como se usa aquí, una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos "derivada" de un ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína designado se refiere al origen del ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína. Una secuencia de ácido nucleico o secuencia de aminoácidos que se deriva de una secuencia particular puede tener una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a esa secuencia, o a una porción de la misma, de la cual se deriva, por lo que "esencialmente idéntica" incluye variantes de secuencia como se definió anteriormente. Una secuencia de ácido nucleico o secuencia de aminoácidos que se deriva de un péptido o proteína particular puede derivarse del dominio correspondiente del péptido o proteína particular. En este contexto, "correspondiente" se refiere a que posee una misma funcionalidad o característica de interés. Por ejemplo, un "dominio extracelular" corresponde a otro "dominio extracelular" (de otra proteína) o un "dominio transmembrana" corresponde a otro "dominio transmembrana" (de otra proteína). Por tanto, las partes "correspondientes" de péptidos, proteínas y ácidos nucleicos son fácilmente identificables para un experto en la técnica. Asimismo, una secuencia "derivada de" otra secuencia (por ejemplo "fuente") puede ser identificada por un experto en la técnica como teniendo su origen en la secuencia fuente.

Una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos derivada de otro ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína puede ser idéntica al ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína de partida (del cual se deriva). Sin embargo, una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos derivada de otro ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína también puede tener una o más mutaciones con respecto al ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína de partida (del cual se deriva); en particular, una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos derivada de otro ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína puede ser una variante de secuencia funcional como se describió anteriormente del ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína de partida (del cual se deriva). Por ejemplo, en un péptido/proteína, uno o más residuos de aminoácidos pueden haberse sustituido por otros residuos de aminoácidos o pueden producirse una o más inserciones o supresiones de residuos de aminoácido.

Tal como se usa aquí, el término "mutación" se refiere a un cambio en una secuencia de ácido nucleico y/o en una secuencia de aminoácidos en comparación con una secuencia de referencia, por ejemplo una secuencia genómica, de tipo salvaje o de referencia correspondiente. Una mutación, por ejemplo, en comparación con una secuencia genómica de referencia, puede ser, por ejemplo, una mutación somática (de origen natural), una mutación espontánea, una mutación inducida, por ejemplo inducida por enzimas, sustancias químicas o radiación, o una mutación obtenida por mutagénesis dirigida a sitio (métodos de biología molecular para llevar a cabo cambios específicos e intencionales en la secuencia de ácidos nucleicos y/o en la secuencia de aminoácidos). Por tanto, se entenderá que los términos "mutación" o "mutante" también incluyen hacer o inducir físicamente una mutación, por ejemplo en una secuencia de ácido nucleico o en una secuencia de aminoácidos. Una mutación incluye la sustitución, supresión e inserción de uno o más nucleótidos o aminoácidos, así como la inversión de varios nucleótidos o aminoácidos sucesivos. Para lograr una mutación en una secuencia de aminoácidos, se puede introducir una mutación en la secuencia de nucleótidos que codifique para la secuencia de aminoácidos con el fin de expresar un polipéptido mutado (recombinante). Se puede lograr una mutación, por ejemplo, alterando (por ejemplo mediante mutagénesis dirigida a sitio) un codón (por ejemplo alterando una, dos o tres bases de nucleótidos del mismo) de una molécula de ácido nucleico que codifique para un aminoácido con el fin de proporcionar un codón que codifique para un aminoácido diferente o que codifique para un mismo aminoácido o sintetizando una variante de secuencia.

El término "introducido" en el contexto de insertar una molécula de ácido nucleico en una célula significa "transfección", o "transformación" o "transducción" e incluye una referencia a la incorporación de una molécula de ácido nucleico en una célula eucariota o procariota, pudiendo incorporarse la molécula de ácido nucleico en el genoma de una célula (por ejemplo cromosoma, plásmido, plástido o ADN mitocondrial), convertirse en un replicón autónomo o expresarse transitoriamente (por ejemplo ARNm transfectado).

El término "recombinante", tal como se usa aquí (por ejemplo un anticuerpo recombinante, una proteína recombinante, un ácido nucleico recombinante o similar) se refiere a cualquier molécula (anticuerpo, proteína, ácido nucleico o similar) que se prepara, expresa, creado o aislado por medios recombinantes y que no es de origen natural. "Recombinante" puede usarse como sinónimo de "diseñado" o "no natural" y puede referirse a un organismo, microorganismo, célula, molécula de ácido nucleico o vector que incluye al menos una alteración genética o se ha modificado mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico exógeno, donde las alteraciones o modificaciones se introducen mediante ingeniería genética (es decir por intervención humana). Las alteraciones genéticas incluyen, por ejemplo, modificaciones que introducen moléculas de ácido nucleico expresable que codifican para proteínas, proteínas de fusión o enzimas u otras adiciones, supresiones, sustituciones de moléculas de ácido nucleico u otras alteraciones funcionales del material genético de una célula. Las modificaciones incluyen, por ejemplo, regiones reguladoras no codificantes donde las modificaciones alteran la expresión de un polinucleótido, gen u operón.

Tal como se usa aquí, "heterólogo" o "no endógeno" o "exógeno" se refiere a cualquier gen, proteína, compuesto, molécula de ácido nucleico o actividad que no es nativa de una célula huésped o sujeto, o cualquier gen, proteína, compuesto, molécula de ácido nucleico o actividad nativa de una célula huésped o sujeto que ha sido alterado. Heterólogo, no endógeno o exógeno incluye genes, proteínas, compuestos o moléculas de ácido nucleico que han sido mutados o alterados de otra manera de modo que la estructura, la actividad o ambas son diferentes entre los genes, proteínas, compuestos o moléculas de ácido nucleico nativos y los alterados. En algunos casos, los genes, proteínas o moléculas de ácido nucleico heterólogos, no endógenos o exógenos pueden no ser endógenos a una célula huésped o sujeto, pero, en su lugar, se pueden haber añadido tales ácidos nucleicos que codifiquen para los genes, proteínas o moléculas de ácido nucleico a una célula huésped por conjugación, transformación, transfección, electroporación o similar, pudiendo integrarse la molécula de ácido nucleico agregada en el genoma de una célula huésped o pudiendo existir como material genético extracromosómico (por ejemplo como un plásmido u otro vector). El término "homología" u "homólogo" se refiere a un gen, proteína, compuesto, molécula de ácido nucleico o actividad encontrada o derivada de una célula, especie o cepa huésped. Por ejemplo, un polinucleótido o gen heterólogo o exógeno que codifique para un polipéptido puede ser homólogo a un polinucleótido o gen nativo y codificar para una actividad o polipéptido homólogo, pero el polinucleótido o polipéptido puede tener una estructura, secuencia, nivel de expresión o cualquier combinación de los mismos alterados. Un polinucleótido o gen no endógeno, así como el polipéptido o actividad codificados, pueden ser de la misma especie, de una especie diferente o una combinación de ambos.

Tal como se usa aquí, el término "endógeno" o "nativo" se refiere a un polinucleótido, gen, proteína, compuesto, molécula o actividad que normalmente está presente en una célula huésped o en un sujeto.

Tal como se usa aquí, los términos "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se usan indistintamente y todas estas designaciones incluyen la progenie. Por tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula sujeto primaria y los cultivos derivados de la misma, sin tener en cuenta el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser exactamente idéntica en contenido de ADN debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie variante que tiene la misma o esencialmente la misma función, fenotipo o actividad biológica que la que se seleccionó en la célula originalmente transformada. Cuando se pretendan designaciones distintas, quedará claro por el contexto.

La presente descripción proporciona, en parte, anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y proteínas de fusión que son capaces de neutralizar los virus de la hepatitis B y de la hepatitis delta. Los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y proteínas de fusión de acuerdo con la presente descripción pueden usarse en métodos para prevenir, tratar o atenuar o diagnosticar el HBV y el VHD. En aspectos particulares, los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y proteínas de fusión aquí descritos se unen a dos o más genotipos diferentes del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B y a dos o más mutantes infecciosos diferentes del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B. En aspectos específicos, los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y proteínas de fusión aquí descritos se unen a todos los genotipos conocidos del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B y a todos los mutantes infecciosos conocidos del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B.

Anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno

En un aspecto, la presente descripción proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que es capaz de unirse a la región del bucle antigénico de HBsAg y es capaz de neutralizar la infección con el virus de la hepatitis B y el virus de la hepatitis delta.

Tal como se usa aquí, y a menos que el contexto indique claramente lo contrario, "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo intacto que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro (aunque se entenderá que los anticuerpos de cadena pesada, que carecen de cadenas ligeras, todavía están incluidos en el término "anticuerpo"), así como cualquier porción de unión a antígeno o fragmento de un anticuerpo intacto que tenga o conserve la capacidad de unirse a la molécula diana de antígeno reconocida por el anticuerpo intacto, por ejemplo un fragmento scFv, Fab o F(ab')2. Así, el término "anticuerpo" se utiliza aquí en el sentido más amplio e incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, incluidos anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpos funcionales (de unión a antígeno) de los mismos, incluyendo fragmentos de unión a antígeno (Fab), fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab', fragmentos Fv, fragmentos de IgG recombinante (rIgG), fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla, incluidos fragmentos variables de cadena sencilla (scFv) y fragmentos de anticuerpos de dominio único (por ejemplo SdAb, sdFv, nanocuerpo). El término abarca formas de inmunoglobulinas modificadas por ingeniería genética y/o de otro modo, tales como intracuerpos, pepticuerpos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos completamente humanos, anticuerpos humanizados y anticuerpos heteroconjugados, multiespecíficos, por ejemplo biespecíficos, anticuerpos, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos, di-scFv en tándem, tri-scFv en tándem. A menos que se indique lo contrario, debe entenderse que el término "anticuerpo" engloba fragmentos de anticuerpos funcionales del mismo. El término también abarca anticuerpos intactos o de longitud completa, incluyendo anticuerpos de cualquier clase o subclase de los mismos, que incluyen IgG y subclases de los mismos, IgM, IgE, IgA e IgD.

Tal como se usa aquí, los términos "fragmento de unión a antígeno", "fragmento" y "fragmento de anticuerpo" se usan indistintamente para referirse a cualquier fragmento de un anticuerpo de la descripción que conserva la actividad de unión a antígeno del anticuerpo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo monocatenario, Fab, Fab', F(ab')2, Fv o scFv.

Son conocidos los anticuerpos humanos (por ejemplo, van Dijk, M. A. y van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). Los anticuerpos humanos se pueden producir en animales transgénicos (por ejemplo ratones) que sean capaces de producir, tras inmunización, un repertorio completo o una selección de anticuerpos humanos sin que se produzca inmunoglobulina endógena. La transferencia de la matriz de genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana en tales ratones mutantes de la línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición al antígeno (véase, por ejemplo, Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A. et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M. et al., Year Immunol. 7 (1993) 3340). Los anticuerpos humanos también se pueden producir en bibliotecas de presentación de fagos (Hoogenboom, HR y Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J. D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). Las técnicas de Cole et al. y Boerner et al. también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); y Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Los anticuerpos monoclonales humanos se pueden preparar usando una inmortalización mejorada de células EBV-B como se describe en Traggiai E, Becker S, Subbarao K, Kolesnikova L, Uematsu Y, Gismondo MR, Murphy BR, Rappuoli R, Lanzavecchia A. (2004): An efficient method a make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10(8):871-5. El término "anticuerpo humano" como se usa aquí también comprende tales anticuerpos que están modificados, por ejemplo en la región variable, para generar propiedades de acuerdo con los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la presente descripción.

Tal como se usa aquí, el término "región variable" (región variable de una cadena ligera (VL), región variable de una cadena pesada (VH)) denota cada polipéptido de región variable del par de cadenas ligeras y pesadas que, en la mayoría de los casos, participa directamente en la unión del anticuerpo al antígeno.

Los anticuerpos de acuerdo con la presente descripción pueden ser de cualquier isotipo (por ejemplo IgA, IgG, IgM, IgE, IgD; es decir, que comprenden una cadena pesada a, y, M, £ o 8). Dentro del isotipo IgG, por ejemplo, los anticuerpos pueden ser de la subclase IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En realizaciones específicas, un anticuerpo de la presente descripción es un anticuerpo IgG1. Los anticuerpos o los fragmentos de unión a antígeno proporcionados aquí pueden incluir una cadena ligera<k>o A. En ciertos aspectos, los anticuerpos específicos de HBsAg aquí descritos son del isotipo IgG y pueden bloquear la liberación de HBV y HBsAg de las células infectadas. Por consiguiente, en ciertos aspectos, un anticuerpo de acuerdo con la presente descripción puede unirse intracelularmente y bloquear así la liberación de viriones de HBV y HBsAg.

Los términos "VL" y "VH" se refieren a la región de unión variable de una cadena ligera y pesada de un anticuerpo, respectivamente. Las regiones de unión variable están formadas por subregiones discretas y bien definidas conocidas como "regiones determinantes de complementariedad" (CDR) y "regiones marco" (FR). Los términos "región determinante de complementariedad" y "CDR" son sinónimos de "región hipervariable" o "HVR" y se sabe en la técnica que se refieren a secuencias de aminoácidos dentro de TCR o regiones variables de anticuerpos que confieren especificidad antigénica y/o afinidad de unión y están separados por secuencia marco. En general, hay tres CDR en cada región variable de una proteína de unión a inmunoglobulina; por ejemplo, para los anticuerpos, las regiones VH y VL comprenden seis CDR HCDR1, HCDR2, HCDR3; LCDR1, LCDR2, LCDR3; también denominadas aquí CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3, respectivamente). Como se usa en este documento, una "variante" de una CDR se refiere a una variante funcional de una secuencia de CDR que tiene hasta 1-3 sustituciones, supresiones, o sus combinaciones, de aminoácidos.

Las secuencias de inmunoglobulina se pueden alinear con un esquema de numeración (por ejemplo, Kabat, EU, International Immunogenetics Information System (IMGT) y Aho), que puede permitir que posiciones equivalentes de residuos sean anotadas y comparadas en diferentes moléculas mediante la herramienta de software de numeración y clasificación de receptores de antígenos (ANARCI) (2016, Bioinformatics 15: 298-300). Se entenderá que, en ciertos aspectos, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente descripción puede comprender toda o parte de una cadena pesada (HC), una cadena ligera (LC) o ambas. Por ejemplo, un monómero de anticuerpo IgG intacto de longitud completa incluye típicamente una VH, una CH1, una CH2, una CH3, una VL y una CL. Los componentes Fc se describen más detalladamente en el presente documento. En ciertos aspectos, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente descripción comprende una CDRHl, una CDRH2, una CDRH3, una CDRL1, una CDRL2 y una CDRL3 de acuerdo con cualquiera de las secuencias de VH y VL aquí descritas, respectivamente.

La Tabla 1: muestra las secuencias de aminoácidos de regiones variables de cadena pesada (VH), regiones variables de cadena ligera (VL), CDR, cadenas pesadas (HC) y cadenas ligeras (LC) de ciertos anticuerpos ilustrativos de acuerdo con la presente descripción:

Los fragmentos de los anticuerpos aquí descritos pueden obtenerse a partir de los anticuerpos mediante métodos que incluyen digestión con enzimas, tal como pepsina o papaína, y/o por escisión de enlaces disulfuro mediante reducción química. Alternativamente, se pueden obtener fragmentos de los anticuerpos mediante clonación y expresión de parte de las secuencias de las cadenas pesadas o ligeras. La presente descripción abarca fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv) derivados de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo como se describe aquí, incluyendo, por ejemplo, un scFv que comprende las CDR de un anticuerpo de acuerdo con la presente descripción, monómeros de cadena pesada o ligera y dímeros, anticuerpos de cadena pesada de dominio único, anticuerpos de cadena ligera de dominio único, así como anticuerpos de cadena sencilla en los que los dominios variables de cadena pesada y ligera están unidos por un enlazador peptídico.

En ciertos aspectos ilustrativos, un anticuerpo de acuerdo con la presente descripción, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende un anticuerpo purificado, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monocatenario, Fab, Fab', F(ab')2, Fv o scFv.

Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de la presente descripción pueden ser multiespecíficos (por ejemplo biespecíficos, interespecíficos, tetraespecíficos o similares) y pueden proporcionarse en cualquier formato multiespecífico, tal como se describe aquí. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente descripción es un anticuerpo multiespecífico, tal como un anticuerpo biespecífico o triespecífico. Los formatos para anticuerpos biespecíficos se describen en, por ejemplo, Spiess et al., Mol. Immunol. 67 (2): 95 (2015) y en Brinkmann y Kontermann, mAbs 9 (2): 182-212 (2017), por ejemplo acopladores de células T biespecíficos (BiTE), DART, ensambles Knobs-Into-Holes (KIH), ensambles scFv-CH3-KIH, anticuerpos de cadena ligera común KIH, TandAbs, cuerpos triples, minicuerpos TriBi, Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2-scFv2, HCabs tetravalentes, intracuerpos, CrossMabs, Fab de doble acción (DAF) (dos en uno o cuatro en uno), DutaMab, DT-IgG, pares de carga, intercambio de brazos Fab, SEEDbodies, Triomabs, ensambles LUZ-Y, Fcabs, KÁ-cuerpos, Fab ortogonales, DVD-IgG, IgG(H)-scFv, scFv-(H)IgG, IgG(L)-scFv, scFv-(L)IgG, IgG(L, H)-Fv, IgG(H)-V, V(H)-IgG, IgG(L)-V, V(L)-IgG, KIHIgG-scFab, 2scFv-IgG, IgG-2scFv, scFv4-Ig, Zybody y DVI-IgG (cuatro en uno). Un anticuerpo biespecífico o multiespecífico puede comprender un dominio de unión específico de HBV y/o HDV de la presente descripción en combinación con otro dominio de unión específico de HBV y/o HDV de la presente descripción o en combinación con un dominio de unión diferente que se une específicamente a HBV y/o HDV (por ejemplo en un epítopo igual o diferente) o con un dominio de unión que se une específicamente a un antígeno diferente.

Los fragmentos de anticuerpo de la descripción pueden impartir interacciones monovalentes o multivalentes y estar contenidos en una variedad de estructuras como se describe anteriormente. Por ejemplo, las moléculas scFv pueden sintetizarse para crear un "triacuerpo" trivalente o un "tetracuerpo" tetravalente. Las moléculas scFv pueden incluir un dominio de la región Fc, dando como resultado minicuerpos bivalentes. Además, las secuencias de la descripción pueden ser un componente de moléculas multiespecíficas donde las secuencias de la descripción se dirijan a los epítopos de la descripción y otras regiones de la molécula se unan a otros dianas. Moléculas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, Fab2 biespecífico, Fab3 triespecífico, scFv biespecífico y diacuerpos (Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotechnology 9: 1126-1136).

Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos tales como los aquí descritos, incluyendo, pero sin limitarse a scFv, pueden estar comprendidos en una proteína de fusión que es capaz de unirse específicamente a un antígeno como se describe aquí. Tal como se usa en el presente documento, "proteína de fusión" se refiere a una proteína que, en una sola cadena, tiene al menos dos dominios o motivos distintos, donde los dominios o motivos no se encuentran naturalmente juntos, o en la disposición dada, en una proteína. Puede construirse un polinucleótido que codifique para una proteína de fusión usando PCR, manipularse por ingeniería recombinante o similares, o pueden sintetizarse tales proteínas de fusión.

En algunas realizaciones, una proteína de fusión es capaz de expresarse en la superficie de una célula huésped, por ejemplo una célula T, una célula NK o una célula NK-T. En ciertos aspectos, una proteína de fusión comprende (i) un componente extracelular que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo un scFv); (ii) un componente transmembrana (por ejemplo un dominio transmembrana de c D4, CD8, CD27, CD28, o una variante funcional o una porción del mismo, o cualquier combinación de los mismos); y (iii) un componente intracelular que comprende un dominio de señalización de una proteína coestimuladora, o una variante funcional o parte de la misma (por ejemplo un dominio de señalización de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), CD2, CD5, ICAM-1 (CD54), LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), GITR, CD30, CD40, BAFF-R, HVEM, LIGHT, MKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, un ligando que se una específicamente con CD83, o una variante funcional del mismo, o cualquier combinación de los mismos), y/o un dominio efector (por ejemplo de CD3e, CD38, CD3Z, CD25, CD79A, CD79B, CARD11, DAP10, FcRa, FcRp, F<c>R<y>, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, Wnt, ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTa, TCRa, TCRp, TRIM, Zap70, PTCH2 o cualquier combinación de los mismos).

En ciertos aspectos, una proteína de fusión que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno comprende una molécula receptora de antígeno quimérico (CAR) que puede expresarse en la superficie celular de una célula huésped tal como una célula T, una célula n K o una célula NK-T para su uso en una inmunoterapia celular. Las moléculas CAR y los principios de diseño se describen, por ejemplo, en: Sadelain et al., Cancer Discov., 3(4):388 (2013); Harris and Kranz, Trends Pharmacol. Sci., 37(3):220 (2016); Stone et al., Cáncer Immunol. Immunother., 63(11):1163 (2014); Xu et al., 2018 Oncotarget 9:13991; Androulla et al., 2018 Curr. Pharm. Biotechnol. Volumen 19 (April 2018); Wu et al., 2016 Expert Opin. Biol. Ther. 16:1469; Ren et al., 2017 Protein Cell 8:634.

A lo largo de esta descripción, los anticuerpos, los fragmentos de unión a antígeno de los mismos y las proteínas de fusión pueden denominarse individual o colectivamente (por ejemplo en cualquier combinación) como "proteínas de unión".

Las proteínas de unión de acuerdo con la presente descripción se pueden proporcionar en forma purificada. Por ejemplo, un anticuerpo puede estar presente en una composición que esté esencialmente libre de otros polipéptidos, por ejemplo donde menos del 90% (en peso), normalmente menos del 60% y más habitualmente menos del 50% de la composición se componga de otros polipéptidos.

Las proteínas de unión de acuerdo con la presente descripción pueden ser inmunogénicas en anfitriones humanos y/o no humanos (o heterólogos), por ejemplo en ratones. Por ejemplo, un anticuerpo puede tener un idiotipo que sea inmunogénico en anfitriones no humanos pero no en un anfitrión humano. Los anticuerpos de la descripción para uso humano incluyen aquellos que no se aíslan típicamente de anfitriones tales como ratones, cabras, conejos, ratas, mamíferos no primates o similares y en algunos casos no se obtienen por humanización o de xeno-ratones. También se contemplan aquí formas variantes de los anticuerpos descritos que se diseñan para reducir la inmunogenicidad conocida o potencial y/u otras posibles desventajas o para conferir una estructura y/o funcionalidad deseada del anticuerpo en un animal no humano, tal como como un ratón (por ejemplo un anticuerpo "murinizado" donde uno o más residuos, secuencias o motivos de aminoácidos humanos se reemplazan por un residuo, secuencia o motivo que tiene inmunogenicidad reducida o abrogada u otro riesgo, o tiene una estructura deseada y/o función, en un ratón; por ejemplo, para estudios de modelos usando un ratón).

Las secuencias de aminoácidos de anticuerpos murinizados ilustrativos de la presente descripción se proporcionan en la Tabla 2

Tal como se usa aquí, un "anticuerpo neutralizante" (o un fragmento de unión a antígeno o proteína de fusión) es aquel que puede neutralizar, es decir, prevenir, inhibir, reducir, impedir o interferir con la capacidad de un patógeno de iniciar y/o perpetuar una infección en un anfitrión (por ejemplo un organismo anfitrión o una célula huésped). Los términos "anticuerpo neutralizante" y "un anticuerpo que neutraliza" o "anticuerpos que neutralizan" se usan aquí indistintamente. Estos anticuerpos se pueden usar solos o en combinación (por ejemplo dos o más de los anticuerpos descritos en combinación o un anticuerpo de la presente descripción en combinación con otro agente, que puede ser o no un agente de anticuerpo, incluyendo un anticuerpo que es capaz de neutralizar una infección por HBV B y/o D), tal como agentes profilácticos o terapéuticos en una formulación apropiada, en asociación con una vacunación activa, como herramienta de diagnóstico o como herramienta de producción como se describe aquí.

Tal como se usa aquí, "se une específicamente" o "específico para" se refiere a una asociación o unión de una proteína de unión (por ejemplo un anticuerpo un o fragmento de unión a antígeno del mismo) o un dominio de unión a una molécula diana con una afinidad o Ka (es decir, una constante de asociación de equilibrio de una interacción de unión particular en unidades 1/M) igual o superior a 105 M-1 (que es igual a la relación entre la tasa de activación [Kon] y la tasa de desactivación [Koff] para esta reacción de asociación), sin asociarse ni unirse significativamente a ninguna otra molécula o componente en una muestra. Las proteínas de unión o los dominios de unión se pueden clasificar como proteínas de unión o dominios de unión de "alta afinidad" o como proteínas de unión o dominios de unión de "baja afinidad". Las proteínas de unión o dominios de unión de "alta afinidad" se refieren a aquellas proteínas de unión o dominios de unión que tienen una Ka de al menos 107 M-1, al menos 108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 1010 M-1, al menos 1011 M-1, al menos 1012 M-1, o al menos 1013 M-1. Las proteínas de unión o dominios de unión de "baja afinidad" se refieren a aquellas proteínas de unión o dominios de unión que tienen una Ka de hasta 107 M-1, hasta 106 M-1 o hasta 105 M-1. Alternativamente, la afinidad puede definirse como una constante de disociación de equilibrio (Kd) de una interacción de unión particular con unidades M (por ejemplo 10-5 M a 10-13 M). Los términos "unión" y "se une específicamente" y referencias similares no abarcan la adherencia no específica.

La unión de una proteína de unión se puede determinar o evaluar usando un ensayo apropiado, tal como, por ejemplo, métodos de resonancia de plasma superficial (SPR), por ejemplo un sistema Biacore™; ensayos de exclusión cinética tales como KinExA®; e interferometría BioLayer (por ejemplo usando la plataforma ForteBio® Octet); calorimetría de titulación isotérmica (ITC) o similares, ELISA de unión a antígeno (por ejemplo directo o indirecto) con formación de imágenes por, por ejemplo, densidad óptica a 450 nm, o por citometría de flujo, o similares.

En determinadas realizaciones, las proteínas de unión de acuerdo con la presente descripción pueden unirse a la región del bucle antigénico de HBsAg. La envoltura del virus de la hepatitis B generalmente contiene tres "proteínas de envoltura de HBV" (también conocidas como "HBsAg", "antígeno de superficie de la hepatitis B"): proteína S (por "small”, también conocida como S-HBsAg), proteína M (por "middle", también denominada M-HBsAg) y proteína L (para "large", también denominada L-HBsAg). S-HBsAg, M-HBsAg y L-HBsAg comparten el mismo extremo C-terminal (también denominado "dominio S", 226 aminoácidos), que corresponde a la proteína S (S-HBsAg) y que es crucial para el ensamblaje e infectividad del virus. S-HBsAg, M-HBsAg y L-HBsAg se sintetizan en el retículo endoplásmico (RE), se ensamblan y se secretan como partículas a través del aparato de Golgi. El dominio S comprende cuatro dominios transmembrana (TM) predichos, por lo que tanto el extremo N-terminal como el C-terminal del dominio S están expuestos al lumen. Se cree que los dominios transmembrana TM1 y TM2 son necesarios para la integración de la proteína cotraduccional en la membrana del RE y los dominios transmembrana TM3 y TM4 están ubicados en el tercio C-terminal del dominio S. La "región del bucle antigénico" de HBsAg se encuentra entre los dominios transmembrana TM3 y TM4 predichos del dominio S de HBsAg, por lo que la región del bucle antigénico comprende los aminoácidos 101-172 del dominio S, que contiene 226 aminoácidos en total (Salisse J. y Sureau C., 2009, Journal of Virology 83: 9321-9328). Un determinante de la infectividad reside en la región del bucle antigénico de las proteínas de la envoltura del HBV. En particular, los residuos entre 119 y 125 de HBsAg contienen un motivo CXXC, que se considera importante para la infectividad de HBV y HDV (Jaoude GA, Sureau C, Journal of Virology, 2005; 79: 10460-6).

Cuando se hace referencia aquí a las posiciones en la secuencia de aminoácidos del dominio S de HbsAg, las posiciones se refieren a la secuencia de aminoácidos tal como se establece en la SEQ ID NO: 3 (mostrada a continuación) o a variantes de secuencia naturales o artificiales de la misma.

MENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPTCPG YRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTTAQGTSMYPSCCCTKPSD GNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSPFL PLLPIFFCLWVYI

(SEQ ID NO: 3; los aminoácidos 101-172 se muestran subrayados)

Por ejemplo, la expresión "aminoácidos 101 -172 del dominio S" se refiere a los residuos de aminoácidos de las posiciones 101 -172 del polipéptido de acuerdo con la SEQ ID NO: 3. Sin embargo, el experto en la técnica entiende que pueden producirse mutaciones o variaciones (incluyendo, pero sin limitarse a, sustitución, supresión y/o adición, por ejemplo HBsAg de un genotipo diferente o un mutante de HBsAg diferente como se describe aquí) de forma natural en la secuencia de aminoácidos del dominio S de HBsAg o artificialmente en la secuencia de aminoácidos del dominio S del HBsAg sin afectar a sus propiedades biológicas. Por tanto, tal como se usa aquí, el término "dominio S de HBsAg" abarca todos estos polipéptidos que incluyen, por ejemplo, el polipéptido de acuerdo con la SEQ ID NO: 3 y sus mutantes naturales o artificiales. Además, cuando aquí se describen fragmentos de secuencia del dominio S de HBsAg (por ejemplo los aminoácidos 101-172 o los aminoácidos 120-130 del dominio S de HBsAg), no solo se incluyen los fragmentos de secuencia correspondientes de la SEQ ID NO: 3, sino también los correspondientes fragmentos de secuencia de sus mutantes naturales o artificiales. Por ejemplo, la frase "residuos de aminoácidos de las posiciones 101 -172 del dominio S de HBsAg" abarca residuos de aminoácidos de las posiciones 101 - 172 de la SEQ ID NO: 3 y fragmentos correspondientes de sus mutantes (mutantes naturales o artificiales). Tal como se usa aquí, las frases "fragmentos de secuencia correspondientes" y "fragmentos correspondientes" se refieren a fragmentos que están ubicados en posiciones de secuencia iguales cuando las secuencias se someten a un alineamiento optimizado, estop es, cuando las secuencias se alinean para obtener un porcentaje más alto de identidad.

La proteína M (M-HBsAg) corresponde a la proteína S extendida mediante un dominio N-terminal de 55 aminoácidos llamado "pre-S2". La proteína L (L-HBsAg) corresponde a la proteína M extendida mediante un dominio N-terminal de 108 aminoácidos llamado "pre-S1" (genotipo D). Los dominios pre-S1 y pre-S2 de la proteína L pueden estar presentes en la cara interna de las partículas virales (en el lado citoplásmico del RE) y se cree que juegan un papel crucial en el ensamblaje del virus, o en la cara exterior (en el lado luminal del RE), disponible para la interacción con las células diana e importante para la infectividad viral. Además, las proteínas de superficie del HBV (HBsAg) no solo se incorporan a las envolturas del virión, sino que también pueden brotar espontáneamente de las membranas del compartimento intermedio ER-Golgi para formar "partículas subvirales" (SVP) vacías que se liberan de la célula por secreción.

En algunos aspectos, un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno o una proteína de fusión se une a la región del bucle antigénico de HBsAg y es capaz de unirse a todos los S-HBsAg, M-HBsAg y L-HBsAg.

En algunos aspectos, un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno o una proteína de fusión neutraliza la infección por el virus de la hepatitis B y el virus de la hepatitis delta. En algunos aspectos, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, reduce la infectividad viral del virus de la hepatitis B y del virus de la hepatitis delta.

Para estudiar y cuantificar la infectividad (o "neutralización") del virus en el laboratorio, se pueden usar "ensayos de neutralización" estándar. Para un ensayo de neutralización, se propagan virus animales típicamente en células y/o líneas celulares. Puede usarse un ensayo de neutralización donde las células cultivadas se incuban con una cantidad fija de HBV o HDV en presencia (o ausencia) del anticuerpo (o del fragmento de unión a antígeno o de la proteína de fusión) a ensayar. En tal ensayo, se pueden usar los niveles de antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) o antígeno e de la hepatitis B (HBeAg) secretados en el sobrenadante del cultivo celular y/o se puede evaluar la tinción de HBcAg para proporcionar una lectura. Para HDV, por ejemplo, puede evaluarse la tinción por inmunofluorescencia del antígeno delta.

En una realización particular de un ensayo de neutralización del HBV, se incuban células cultivadas, por ejemplo células HepaRG, tales como células HepaRG diferenciadas, con una cantidad fija de HBV en presencia o ausencia del anticuerpo a analizar. En tal realización, la incubación se puede llevar a cabo, por ejemplo, durante 16 horas a 37 °C. Esa incubación se puede llevar a cabo en un medio (por ejemplo complementado con 4% de PEG 8000). Después de la incubación, las células se pueden lavar y seguir cultivando. Para medir la infectividad del virus, los niveles de antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y del antígeno e de la hepatitis B (HBeAg) secretados en el sobrenadante del cultivo, por ejemplo desde el día 7 hasta el día 11 después de la infección, puede determinarse mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Además, la tinción de HBcAg se puede evaluar en un ensayo de inmunofluorescencia. En una realización de un ensayo de neutralización de HDV, se puede usar esencialmente el mismo ensayo que para el HBV, con la diferencia de que se pueden usar sueros de portadores de HDV como inóculo de infección de HDV en células HepaRg diferenciadas (en lugar de HBV). Para la detección, la tinción por inmunofluorescencia del antígeno delta puede usarse como una lectura.

Las realizaciones de las proteínas de unión de la descripción tienen una alta potencia neutralizante. En determinadas realizaciones, la concentración de un anticuerpo como se describe aquí requerida para la neutralización al 50% del virus de la hepatitis B (HBV) y del virus de la hepatitis delta (VHD) es, por ejemplo, de aproximadamente 10 pg/ml o menos. En otras realizaciones, la concentración de una proteína de unión requerida para la neutralización al 50% de HBV y HDV es de aproximadamente 5 pg/ml. En otras realizaciones, la concentración de una proteína de unión como se describe aquí requerida para la neutralización del 50% de HBV y HDV es de aproximadamente 1 pg/ml. En aún otras realizaciones, la concentración de proteína de unión requerida para la neutralización al 50% de HBV y HDV es de aproximadamente 750 ng/ml. En otras realizaciones más, la concentración de proteína de unión como la descrita en el presente documento requerida para la neutralización del 50% de HBV y HDV es 500 ng/ml o menos. En tales realizaciones, la concentración de proteína de unión aquí descrita requerida para la neutralización del 50% de HBV y HDV puede seleccionarse de 450 ng/ml o menos, 400 ng/ml o menos, 350 ng/ml o menos, 300 ng/ml o menos, 250 ng/ml o menos, 200 ng/ml o menos, 175 ng/ml o menos, 150 ng/ml o menos, 125 ng/ml o menos, 100 ng/ml o menos, 90 ng/ml o menos, 80 ng/ml o menos, 70 ng/ml o menos, 60 ng/ml o menos o 50 ng/ml o menos.

Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de acuerdo con la presente descripción que pueden neutralizar tanto el HBV como el VHD son útiles en la prevención y el tratamiento de la hepatitis B y la hepatitis D. La infección por VHD ocurre típicamente simultáneamente con o después de la infección por HBV (por ejemplo la inoculación con HDV en ausencia de HBV no causa hepatitis D, ya que HDV requiere el apoyo del h Bv para su propia replicación) y la hepatitis D se observa típicamente en portadores crónicos de HBV.

Las realizaciones de las proteínas de unión aquí descritas promueven la supresión de HBsAg y HBV. En realizaciones particulares, las proteínas de unión promueven la supresión tanto de HBV como de partículas subvirales del virus de la hepatitis B (SVP). El aclaramiento de HBsAg o de partículas subvirales puede evaluarse midiendo el nivel de HBsAg, por ejemplo en una muestra de sangre, por ejemplo de un paciente con hepatitis B. De manera similar, el aclaramiento del HBV puede evaluarse midiendo el nivel de HBV, por ejemplo en una muestra de sangre, por ejemplo de un paciente con hepatitis B.

En el suero de los pacientes infectados por HBV, además de partículas infecciosas (HBV), suele haber un exceso (típicamente de 1.000 a 100.000 veces) de partículas subvirales (SVP) vacías, compuestas únicamente por proteínas de la envoltura de HBV (HBsAg), en forma de esferas relativamente pequeñas y filamentos de longitud variable. Se ha demostrado que las partículas subvirales mejoran fuertemente la replicación viral intracelular y la expresión génica del HBV (Bruns M. et al. 1998 J Virol 72 (2): 1462-1468). Esto también es relevante en el contexto de la infectividad de sueros que contienen HBV, ya que la infectividad depende no solo del número de virus sino también del número de SVP (Bruns M. et al. 1998 J Virol 72 (2): 1462-1468). Además, un exceso de partículas subvirales puede servir como señuelo absorbiendo anticuerpos neutralizantes y, por tanto, retrasando la supresión de la infección. El logro de la pérdida del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) se considera en algunos casos como un criterio de valoración ideal del tratamiento y el resultado más cercano para curar la hepatitis B crónica (HBC).

Las realizaciones de las proteínas de unión de la presente descripción pueden promover la supresión de HbsAg. En determinadas realizaciones, las proteínas de unión pueden promover la supresión de partículas subvirales del virus de la hepatitis B. En algunas realizaciones, las proteínas de unión se pueden usar para tratar la hepatitis B crónica.

En cualquiera de las realizaciones aquí descritas, una proteína de unión de la presente descripción es capaz de unirse a un HBsAg de un genotipo seleccionado de los genotipos A, B, C, D, E, F, G, H, I y J de HBsAg, o cualquier combinación de los mismos.

En determinadas realizaciones, las proteínas de unión de la presente descripción son capaces de unirse a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de los genotipos A, B, C, D, E, F de HBsAg, G, H, I y J. Ejemplos de diferentes genotipos de HBsAg incluyen los siguientes: número de registro en GenBank J02203 (HBV-D, ayw3); número de registro en GenBank FJ899792.1 (HBV-D, adw2); número de registro en GenBank AM282986 (HBV-A); número de registro en GenBank D23678 (HBV-B1 Japón); número de registro en GenBank AB117758 (HBV-C1 Camboya); número de registro en GenBank AB205192 (HBV-E Ghana); número de registro en GenBank X69798 (HBV-F4 Brasil); número de registro en GenBank AF160501 (HbV-G USA); número de registro en GenBank AY090454 (HBV-H Nicaragua); número de registro en de GenBank AF241409 (HBV-I Vietnam); y número de registro en GenBank AB486012 (HBV-J Borneo). Aquí se describen ejemplos de secuencias de aminoácidos de la región de bucle antigénico del dominio S de HBsAg de diferentes genotipos (por ejemplo las SEQ ID NO: 5 -15).

En algunas realizaciones, una proteína de unión es capaz de unirse a uno o más, y en algunos casos al menos a 6 de los 10 genotipos A, B, C, D, E, F, G, H, I y J de HBsAg. En determinadas realizaciones, una proteína de unión es capaz de unirse a al menos 8 de los 10 genotipos A, B, C, D, E, F, G, H, I y J de HBsAg. En algunas realizaciones, una proteína de unión es capaz de unión a los 10 genotipos A, B, C, D, E, F, G, H, I y J de HBsAg. El HBV se diferencia en varios genotipos, de acuerdo con la secuencia del genoma. Hasta la fecha, se han definido ocho genotipos bien conocidos (A-H) del genoma del HBV. Además, también se han identificado otros dos genotipos, I y J (Sunbul M., 2014, World J Gastroenterol 20 (18): 5427-5434). Se sabe que el genotipo afecta la progresión de la enfermedad y se han determinado las diferencias entre los genotipos en respuesta al tratamiento antiviral.

En algunas realizaciones, una proteína de unión de acuerdo con la presente descripción es capaz de unirse a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 de los mutantes de HBsAg que tienen mutaciones en la región del bucle antigénico, donde los mutantes se seleccionan de uno o más de HBsAg Y100C/P120T, HBsAg P120T, HBsAg P120T/S143L, HBsAg C121S, HBsAg R122D, HBsAg R122I, HBsAg T123N, HBsAg Q129H, HBsAg Q129L, HBsAg M133H, HBsAg M133L, HBsAg M133T, HBsAg K141E, HBsAg P142S, HBsAg S143K, HBsAg D144A, HBsAg G145R y HBsAg N146A. Estos mutantes son mutantes de origen natural basados en del dominio S del genotipo D de HBsAg, número de registro en Genbank FJ899792 (SEQ ID NO: 4). El (los) residuo(s) de aminoácido mutado en cada uno de los mutantes aquí citados se indican en el nombre.

SEQ ID NO: 4:

MENVTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPTCPG YRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSD GNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSTLSPFL PLLPIFFCLWVYI

(la región del bucle antigénico, es decir, los aminoácidos 101-172, se muestra subrayada).

Las secuencias de aminoácidos de la región del bucle antigénico del dominio S de HBsAg de diferentes mutantes se muestran en las SEQ ID NO: 16 - 33.

En ciertas realizaciones, una proteína de unión como se describe aquí es capaz de unirse a uno o más, y en algunos casos al menos a 12 mutantes de HBsAg infecciosos seleccionados de HBsAg Y100C/P120T, HBsAg P120T, HBsAg P120T/S143L, HBsAg C121S, HBsAg R122D, HBsAg R122I, HBsAg T123N, HBsAg Q129H, HBsAg Q129L, HBsAg M133H, HBsAg M133L, HBsAg M133T, HBsAg K141E, HBsAg P142S, HBsAg S143K, HBsAg D144A, HBsAg G145R y HBsAg N146A. En algunas de estas realizaciones, una proteína de unión es capaz de unirse a al menos 15 mutantes de HBsAg infecciosos seleccionados de HBsAg Y100C/P120T, HBsAg P120T, HBsAg P120T/S143L, HBsAg C121S, HBsAg R122D, HBsAg R122I, HBsAg T123N, HBsAg Q129H, HBsAg Q129L, HBsAg M133H, HBsAg M133L, HBsAg M133T, HBsAg K141E, HBsAg P142S, HBsAg S143K, HBsAg D144A, HBsAg G145R y HBsAg N146A. En algunas realizaciones, una proteína de unión es capaz de unirse a cada uno de los siguientes mutantes de HBsAg infecciosos: HBsAg Y100C/P120T; HBsAg P120T; HBsAg P120T/S143L; HBsAg C121S; HBsAg R122D; HBsAg R122I; HBsAg T123N; HBsAg Q129H; HBsAg Q129L; HBsAg M133H; HBsAg M133L; HBsAg M133T; HBsAg K141E; HBsAg P142S; HBsAg S143K; HBsAg D144A; HBsAg G145R; y HBsAg N146A.

En determinadas realizaciones, la proteína de unión (por ejemplo incluyendo un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo) es capaz de reducir la concentración sérica de ADN de HBV en un mamífero que tenga una infección por HBV. En determinadas realizaciones, la proteína de unión es capaz de reducir la concentración sérica de HBsAg en un mamífero que tenga una infección por HBV. En determinadas realizaciones, la proteína de unión es capaz de reducir la concentración sérica de HBeAg en un mamífero que tenga una infección por HBV. En determinadas realizaciones, la proteína de unión es capaz de reducir la concentración sérica de HBcrAg en un mamífero que tenga una infección por HBV. En algunas realizaciones, la proteína de unión es capaz de reducir la concentración sérica de ADN del HBV, HBsAg, HBeAg y/o HBcrAg en el mamífero durante aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más días después de una sola administración de la proteína de unión.

El término "epítopo" o "epítopo antigénico" incluye cualquier molécula, estructura, secuencia de aminoácidos o determinante de proteína que es reconocido y se une específicamente a una molécula de unión análoga, tal como una inmunoglobulina, un receptor de antígeno quimérico u otra molécula de unión, dominio o proteína. Los determinantes epitópicos generalmente contienen agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.

En algunas realizaciones, una proteína de unión es capaz de unirse a un epítopo que comprenda al menos uno, al menos dos, al menos tres o al menos cuatro aminoácidos de la región del bucle antigénico de HbsAg. En determinadas realizaciones, una proteína de unión es capaz de unirse al menos a dos aminoácidos seleccionados entre los aminoácidos 115-133 del dominio S de HbsAg, los aminoácidos 120-133 del dominio S de HbsAg o los aminoácidos 120-130 del dominio S de HbsAg. En determinadas realizaciones, una proteína de unión es capaz de unirse al menos a tres aminoácidos seleccionados entre los aminoácidos 115-133 del dominio S de HbsAg, los aminoácidos 120-133 del dominio S de HbsAg o los aminoácidos 120 130 del dominio S de HbsAg. En algunas realizaciones, una proteína de unión es capaz de unirse al menos a cuatro aminoácidos seleccionados entre los aminoácidos 115-133 del dominio S de HbsAg, los aminoácidos 120-133 del dominio S de HbsAg o los aminoácidos 120-130 del dominio S de HbsAg. Como se usa aquí, la posición de los aminoácidos (por ejemplo 115-133, 120-133, 120-130) se refiere al dominio S de HBsAg como se describió anteriormente que está presente en las tres proteínas de envoltura del HBV S-HBsAg, M-HBsAg y L-HBsAg, por lo que S-HBsAg corresponde típicamente al dominio S de HBsAg.

El término "formado por", tal como se usa aquí, en el contexto de un epítopo, significa que el epítopo al que se une la proteína de unión puede ser lineal (continuo) o conformacional (discontinuo). Un epítopo lineal o secuencial es un epítopo que es reconocido por un anticuerpo de acuerdo con su secuencia lineal de aminoácidos o estructura primaria. Un epítopo conformacional puede reconocerse de acuerdo con una forma tridimensional y una estructura proteica. En consecuencia, si el epítopo es un epítopo lineal y comprende más de un aminoácido ubicado en posiciones seleccionadas de las posiciones de aminoácido 115-133 o de las posiciones de aminoácido 120-133 del dominio S de HBsAg, los aminoácidos comprendidos por el epítopo pueden estar ubicados en posiciones adyacentes de la estructura primaria (por ejemplo son aminoácidos consecutivos en la secuencia de aminoácidos). En el caso de un epítopo conformacional (estructura 3D), la secuencia de aminoácidos típicamente forma una estructura 3D como epítopo y, por tanto, los aminoácidos que forman el epítopo pueden estar o no localizados en posiciones adyacentes de la estructura primaria (es decir, tal vez pueden no ser aminoácidos consecutivos en la secuencia de aminoácidos).

En determinadas realizaciones, un epítopo al que se une una proteína de unión es un epítopo conformacional. En algunas realizaciones, una proteína de unión se une a un epítopo que comprende al menos dos aminoácidos de la región del bucle antigénico de HBsAg, donde los al menos dos aminoácidos se seleccionan entre los aminoácidos 120-133 o entre los aminoácidos 120-130 del dominio S de HbsAg, y donde los al menos dos aminoácidos no se encuentran en posiciones adyacentes (de la estructura primaria). En ciertas realizaciones, una proteína de unión se une a un epítopo que comprende al menos tres aminoácidos de la región del bucle antigénico de HBsAg, donde los al menos tres aminoácidos se seleccionan entre los aminoácidos 120-133 o entre los aminoácidos 120-130 del dominio S de HbsAg, y donde al menos dos de los tres aminoácidos no se encuentran en posiciones adyacentes (de la estructura primaria). En algunas realizaciones, una proteína de unión se une a un epítopo que comprende al menos cuatro aminoácidos de la región del bucle antigénico de HBsAg, donde los al menos cuatro aminoácidos se seleccionan entre los aminoácidos 120-133 o entre los aminoácidos 120-130 del dominio S de HbsAg, y donde al menos dos de los cuatro aminoácidos no se encuentran en posiciones adyacentes (de la estructura primaria).

Los aminoácidos a los que se une un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o proteína de fusión aquí descritos (es decir, los aminoácidos que forman el epítopo) que no se encuentran en posiciones adyacentes de la estructura primaria en algunos casos están separados por uno o más aminoácidos a los que no se une el anticuerpo, el fragmento de unión a antígeno o la proteína de fusión. En algunas realizaciones, al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco aminoácidos pueden estar localizados entre dos de los aminoácidos no situados en posiciones adyacentes comprendidas por el epítopo.

En determinadas realizaciones, una proteína de unión se une a un epítopo que comprende al menos los aminoácidos P120, C121, R122 y C124 del dominio S de HBsAg. En otras realizaciones, una proteína de unión de la presente descripción se une a un epítopo que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 88:

PCRXC

donde X es cualquier aminoácido o ningún aminoácido; X es cualquier aminoácido; X es T, Y, R, S o F; X es T, Y o R; o X es T o R.

En otras realizaciones, una proteína de unión de la presente descripción se une a un epítopo que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 80:

TGPCRTC

o a una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 80.

En otras realizaciones, una proteína de unión de la presente descripción se une a un epítopo que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 85:

STTSTGPCRTC

o a una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 85.

En determinadas realizaciones, una proteína de unión de la presente descripción se une a un epítopo que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos los aminoácidos 145-151 del dominio S de HBsAg:

GNCTCIP

(SEQ ID NO: 81).

En otras realizaciones más, una proteína de unión de la presente descripción se une a un epítopo que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 80 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 81.

En otras realizaciones, una proteína de unión de la presente descripción se une a un epítopo que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 85 y/o una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 87.

Como se describió anteriormente, un epítopo al que se une una proteína de unión de la presente descripción puede ser lineal (continua) o conformacional (discontinua). En algunas realizaciones, una proteína de unión de la descripción se une a un epítopo conformacional y en ciertas de tales realizaciones, el epítopo conformacional está presente solo en condiciones no reductoras.

En determinadas realizaciones, la proteína de unión de la presente descripción se une a un epítopo lineal. En ciertas de tales realizaciones, el epítopo lineal está presente tanto en condiciones no reductoras como en condiciones reductoras.

En realizaciones particulares, una proteína de unión de la presente descripción se une a un epítopo en el bucle antigénico de HBsAg formado por una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1: X1 X2 X3 TC X4 X5 XaA X7G

donde X1, X2, X3, X4, X5, X6 y X7 pueden ser cualquier aminoácido (SEC. ID NO.: 1).

En algunas realizaciones, X1, X2, X3, X4, X5, X6 y X7 son aminoácidos que están sustituidos de forma conservadora en comparación con los aminoácidos 120-130 de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, X1, X2, X3, X4, X5, X6 y X7 son aminoácidos que están sustituidos de forma conservadora en comparación con los aminoácidos 20-30 de cualquiera de las SEQ ID NO: 5-33.

En realizaciones específicas, Xi de la SEQ ID NO: 1, Xi es un aminoácido pequeño. Un aminoácido "pequeño", tal como se usa aquí, se refiere a cualquier aminoácido seleccionado del grupo consistente en alanina, ácido aspártico, asparagina, cisteína, glicina, prolina, serina, treonina y valina. En ciertas de tales realizaciones, X1 es prolina, serina o treonina.

En determinadas realizaciones, X2 de la SEQ ID NO: 1, X2 es un aminoácido pequeño. En determinadas realizaciones, X2 puede seleccionarse entre cisteína o treonina.

En algunas realizaciones, X3 de la SEQ ID NO: 1 es un aminoácido cargado o un aminoácido alifático. Un aminoácido "cargado", tal como se usa aquí, se refiere a cualquier aminoácido seleccionado del grupo consistente en arginina, lisina, ácido aspártico, ácido glutámico e histidina. Un aminoácido "alifático", tal como se usa aquí, se refiere a cualquier aminoácido seleccionado del grupo consistente en alanina, glicina, isoleucina, leucina y valina. En determinadas realizaciones, X3 se selecciona de arginina, lisina, ácido aspártico o isoleucina.

En algunas realizaciones, X4 de la SEQ ID NO: 1 es un aminoácido pequeño y/o un aminoácido hidrófobo. Un aminoácido "hidrófobo", tal como se usa aquí, se refiere a cualquier aminoácido seleccionado del grupo consistente en alanina, isoleucina, leucina, fenilalanina, valina, triptófano, tirosina, metionina, prolina y glicina. En determinadas realizaciones, X4 se selecciona de metionina o treonina.

En algunas realizaciones, X5 de la SEQ ID NO: 1, X5 es un aminoácido pequeño y/o un aminoácido hidrófobo. En determinadas realizaciones, X5 se selecciona de treonina, alanina o isoleucina.

En algunas realizaciones, X6 de la SEQ ID NO: 1, X6 es un aminoácido pequeño y/o un aminoácido hidrófobo. En determinadas realizaciones, X6 se selecciona de treonina, prolina o leucina.

En algunas realizaciones, X7 de la SEQ ID NO: 1 es un aminoácido polar o un aminoácido alifático. Un aminoácido "polar", tal como se usa aquí, se refiere a cualquier aminoácido seleccionado del grupo consistente en ácido aspártico, asparagina, arginina, ácido glutámico, histidina, lisina, glutamina, triptófano, tirosina, serina y treonina. En ciertas de tales realizaciones, X7 es glutamina, histidina o leucina.

En algunas realizaciones, la proteína de unión de acuerdo con la presente descripción se une a un epítopo en el bucle antigénico de HBsAg formado por una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2:

X1 X2 X3 TC X4 X5 XaA X7G

donde

X1 es P, T o S,

X2 es C o S,

X3 es R, K, D o I,

X4 es M o T,

X5 es T, A o I,

X6 es T, P o L, y

X7 es Q, H o L

(SEC. ID NO.: 2).

Con respecto a los epítopos formados por las secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 1 o 2 , se observa que el término "formado por" como se usa aquí no pretende implicar que una proteína de unión descrita se una necesariamente a todos y cada aminoácido de las SEQ ID NO: 1 o 2. En particular, una proteína de unión puede unirse solo a algunos de los aminoácidos de las SEQ ID NO: 1 o 2, por lo que otros residuos de aminoácidos pueden actuar como "separadores".

En realizaciones particulares, una proteína de unión de acuerdo con la presente descripción se une a un epítopo en el bucle antigénico de HBsAg formado por uno o más, dos o más, tres o más, o cuatro o más aminoácidos de una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 5 - 33 mostradas a continuación en la Tabla 3.

En algunas realizaciones, la proteína de unión de acuerdo con la presente descripción se une a una región de bucle antigénico de HBsAg que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una cualquiera o más de las SEQ ID NO: 5-33 mostradas a continuación en la Tabla 3 o a una variante de secuencia de las mismas. En determinadas realizaciones, una proteína de unión de acuerdo con la presente descripción se une a todas las variantes de bucle antigénico de HBsAg que tienen una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 5-33 mostradas a continuación en la Tabla 3.

Tabla 3: Secuencias de aminoácidos de ejemplo de la región del bucle antigénico del dominio S de HBsAg (residuos 101-172 del dominio S de HBsAg, excepto la SEQ ID NO: 16, que se refiere a los residuos 100 172 del dominio S de HBsAg para incluir la mutación relevante) de diferentes genotipos y mutantes aquí empleados:

En ciertos aspectos, la presente descripción proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende: (i) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene al menos un 90% (es decir, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más) de identidad con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 41 o 67; y (ii) una región variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 42; 59; 65; 89, 90 o 111-120, siempre que el aminoácido en la posición 40 de VL de acuerdo con la numeración IMGT no sea cisteína, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a la región del bucle antigénico de HBsAg y neutraliza la infección por el virus de la hepatitis B y el virus de la hepatitis delta.

En otros aspectos, (i) VH tiene al menos un 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 41 o 67; y/o (ii) VL tiene al menos un 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 42, 59, 65, 89, 90 o 111-120.

En determinadas realizaciones, el aminoácido en la posición 40 de VL es alanina. En otros aspectos, el aminoácido en la posición 40 de VL es serina. En otras aspectos más, el aminoácido en la posición 40 de VL es glicina.

En cualquiera de los aspectos aquí descritos, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno puede comprender las secuencias de c Dr H1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de acuerdo con las SEQ ID NO: (i) 34-36, 37, 38 y 40, respectivamente; (ii) 34, 66, 36, 37, 38 y 40, respectivamente; (iii) 34-36, 37, 39 y 40, respectivamente; (iv) 34, 66, 36, 37, 39 y 40, respectivamente; (v) 34-36, 37, 38 y 58, respectivamente; (vi) 34, 66, 36, 37, 38 y 58, respectivamente; (vii) 34-36, 37, 39 y 58, respectivamente; o (vii) 34, 66, 36, 37, 39 y 58, respectivamente.

En algunas realizaciones, la VL del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 89. En algunos aspectos, la VL del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 90. En otros aspectos, la VL del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 111-120. En determinadas realizaciones, VH comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 41. En otros aspectos, VH comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 67.

En realizaciones particulares, la VH comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 41 y la VL comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 89. En otros aspectos, la VH comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 41 y la VL comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 90. En ciertos aspectos, la VH comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 41 y la VL comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 111-120. En otros aspectos, la VH comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 67 y la VL comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 89, 90 y 111-120.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende: (i) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 95; y (ii) una región variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 96, donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une a la región del bucle antigénico de HBsAg y neutraliza la infección por el virus de la hepatitis B y el virus de la hepatitis delta.

En otros aspectos, (i) la VH tiene al menos un 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 95; y/o (ii) la VL tiene al menos un 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 96.

En ciertos aspectos, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno comprende secuencias de CDRH1, CDRH2, Cd Rh 3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de acuerdo con las SEQ ID NO: 97-102, respectivamente.

En aspectos particulares, la VH comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 95 y la VL comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 96.

Resto Fc

En algunas realizaciones, una proteína de unión (por ejemplo un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo) de la presente descripción comprende un resto Fc. En ciertos aspectos, el resto Fc puede derivar de origen humano, por ejemplo de IgG1, IgG2, IgG3 y/o IgG4 humanas, o de otra clase o isotipo de Ig. En realizaciones específicas, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno pueden comprender un resto Fc derivado de IgG1 humana.

Tal como se usa aquí, el término "resto Fc" se refiere a una secuencia que comprende, consiste, consiste esencialmente en o deriva de una porción de una cadena pesada de inmunoglobulina que comienza en la región bisagra justo aguas arriba del sitio de escisión de papaína (por ejemplo residuo 216 en IgG nativa, tomando el primer residuo de la región constante de la cadena pesada como 114) y terminando en el extremo C-terminal de la cadena pesada de inmunoglobulina. En consecuencia, un resto Fc puede ser un resto Fc completo o una parte (por ejemplo un dominio) del mismo. En determinadas realizaciones, un resto Fc completo comprende un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 (por ejemplo posiciones de aminoácidos EU 216-446). A veces está presente un residuo de lisina adicional (K) en el extremo C-terminal del resto Fc, pero a menudo se escinde de un anticuerpo maduro. Las posiciones de los aminoácidos dentro de un resto Fc se numeran de acuerdo con el sistema de numeración de la UE de Kabat, véase, por ejemplo, Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U.S. Dept. Health and Human Services, 1983 y 1987. Las posiciones de aminoácido de un resto Fc también se pueden numerar de acuerdo con el sistema de numeración IMGT (incluida la numeración única para el dominio C y la numeración del exón) y el sistema de numeración de Kabat.

En algunos aspectos, un resto Fc comprende al menos uno de: un dominio de bisagra (por ejemplo región bisagra superior, media y/o inferior), un dominio CH2, un dominio CH3 o una variante, porción o fragmento del mismo. En algunos aspectos, un resto Fc comprende al menos dominio bisagra, un dominio CH2 o un dominio CH3. En otras realizaciones, el resto Fc es un resto Fc completo. La secuencia de aminoácidos de un resto Fc de ejemplo del isotipo IgG1 humano se proporciona en la SEQ ID NO: 137. El resto Fc también puede comprender una o más inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos con respecto a un resto Fc de origen natural. Por ejemplo, se puede suprimir al menos uno de un dominio bisagra, un dominio CH2 o un dominio CH3 o una porción de los mismos. Por ejemplo, un resto Fc puede comprender o consistir en: (i) dominio bisagra (o una porción del mismo) fusionado a un dominio CH2 (o a una porción del mismo), (ii) un dominio bisagra (o una porción del mismo) fusionado a un dominio CH3 (o a una porción del mismo), (iii) un dominio CH2 (o una porción del mismo) fusionado a un dominio CH3 (o a una porción del mismo), (iv) un dominio bisagra (o una porción del mismo), (v) un dominio CH2 (o una porción del mismo) o (vi) un dominio CH3 o una porción del mismo.

Un resto Fc de la presente descripción puede modificarse de manera que varíe en la secuencia de aminoácidos del resto Fc completo de una molécula de inmunoglobulina natural, mientras que conserva o potencia al menos una función deseable conferida por el resto Fc natural y/o reducir una función no deseada de un resto Fc de origen natural. Las funciones incluyen, por ejemplo, unión al receptor Fc (FcR), modulación de la vida media del anticuerpo (por ejemplo mediante unión a FcRn), función ADCC, unión a proteína A, unión a proteína G y unión al complemento. En la técnica se han descrito porciones de restos Fc de origen natural que están implicados en tales funciones.

Por ejemplo, para activar la cascada del complemento, el complejo proteico C1q puede unirse al menos a dos moléculas de IgG1 o una molécula de IgM cuando la al menos una molécula de inmunoglobulina está unida a la diana antigénica (Ward, E. S. y Ghetie, V., Ther. Immunol. 2 (1995) 77 - 94). Burton, D. R., describió (Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206) que la región de la cadena pesada que comprende los residuos de aminoácidos 318 a 337 está implicada en la fijación del complemento. Duncan, A. R. y Winter, G. (Nature 332 (1988) 738-740), usando mutagénesis dirigida al sitio, reportaron que Glu318, Lys320 y Lys322 forman el sitio de unión a C1q. El papel de los residuos Glu318, Lys320 y Lys 322 en la unión de C1q se confirmó por la capacidad de un péptido sintético corto que contiene estos residuos de inhibir la lisis mediada por el complemento.

Por ejemplo, la unión de FcR puede estar mediada por la interacción del resto Fc (de un anticuerpo) con receptores Fc (FcR), que son receptores de superficie celular especializados en células, incluyendo células hematopoyéticas. Los receptores Fc pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas y se ha demostrado que median tanto en la supresión de patógenos recubiertos de anticuerpos mediante fagocitosis de complejos inmunes como en la lisis de eritrocitos y otros objetivos celulares (por ejemplo células tumorales) recubiertos con el anticuerpo correspondiente, vía citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC; Van de Winkel, J. G. y Anderson, C. L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524). Los FcR se definen por su especificidad para las clases de inmunoglobulinas; los receptores Fc para anticuerpos IgG se denominan F<cy>R, para IgE como F<ce>R, para IgA como FcaR y así sucesivamente y los receptores Fc neonatales se denominan FcRn. La unión al receptor Fc se describe, por ejemplo, en Ravetch, J. V. y Kinet, J. P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P. J. et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M. et al., J Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341; y Gessner, J. E. et al., Ann. Hematol.

76 (1998) 231-248.

La reticulación de los receptores por el dominio Fc de los anticuerpos IgG nativos (FcyR) desencadena una amplia variedad de funciones efectoras que incluyen fagocitosis, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y liberación de mediadores inflamatorios, así como la supresión de complejos inmunitarios y la regulación de la producción de anticuerpos. Se contemplan aquí restos Fc que proporcionan reticulación de receptores (por ejemplo F<cy>R). En humanos, hasta la fecha se han caracterizado tres clases de F<cy>R, que son: (i) FcyRI (CD64), que se une a IgG monomérica con alta afinidad y se expresa en macrófagos, monocitos, neutrófilos y eosinófilos; (ii) FcyRII (CD32), que se une a IgG complejado con afinidad media a baja, se expresa ampliamente, en particular en leucocitos, se cree que es un actor central en la inmunidad mediada por anticuerpos, y que se puede dividir en FcyRIIA, FcyRIIB y FcyRIIC, que llevan a cabo diferentes funciones en el sistema inmunológico, pero se unen con una afinidad baja similar a la IgG-Fc, y los ectodominios de estos receptores son altamente homólogos; y (iii) F<cy>RIII (CD16), que se une a IgG con afinidad media a baja y se ha encontrado en dos formas: F<cy>RIIIA, que se ha encontrado en células NK, macrófagos, eosinófilos y algunos monocitos y células T, y se cree que median ADCC; y FcyRIIIB, que se expresa altamente en neutrófilos.

FcyRIIA se encuentra en muchas células involucradas en la muerte (por ejemplo macrófagos, monocitos, neutrófilos) y parece ser capaz de activar el proceso de muerte. FcyRIIB parece desempeñar un papel en los procesos inhibidores y se encuentra en células B, macrófagos y en mastocitos y eosinófilos. Es importante destacar que se ha demostrado que el 75% de todo el F<cy>RIIB se encuentra en el hígado (Ganesan, L. P. et al., 2012: “FcYRIIb on liver sinusoidal endothelium clears small immune complexes,” Journal of Immunology 189: 4981-4988). FcyRIIB se expresa abundantemente en el endotelio sinusoidal hepático, llamado LSEC, y en las células de Kupffer del hígado y las LSEC son el sitio principal de supresión de pequeños complejos inmunes (Ganesan, L. P. et al., 2012: FcYRIIb on liver sinusoidal endothelium clears small immune complexes. Journal of Immunology 189: 4981-4988).

En algunas realizaciones, los anticuerpos aquí descritos y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden un resto Fc para unirse a FcYRIIb, en particular una región Fc, tal como, por ejemplo, anticuerpos de tipo IgG. Además, es posible manipular la fracción Fc para mejorar la unión de FcyRIIB mediante la introducción de las mutaciones S267E y L328F, tal como se describe en Chu, S. Y. et al., 2008: Inhibition of B cell receptor-mediated activation of primary human B cells by coengagement of CD19 and FcgammaRIIb with Fc-engineered antibodies. Molecular Immunology 45, 3926-3933. Así, se puede mejorar la depuración de los complejos inmunes (Chu, S., et al., 2014: Accelerated Clearance of IgE In Chimpanzees Is Mediated By Xmab7195, An Fc-Engineered Antibody With Enhanced Affinity For Inhibitory Receptor FcYRIIb. Am J Respir Crit, American Thoracic Society International Conference Abstracts). En algunos aspectos, los anticuerpos de la presente descripción, o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos, comprenden un resto Fc modificado por ingeniería genética con las mutaciones S267E y L328F, en particular como se describe en Chu, S. Y. et al., 2008: Inhibition of B cell receptor-mediated activation of primary human B cells by coengagement of CD19 and FcgammaRIIb with Fc-engineered antibodies. Molecular Immunology 45, 3926-3933.

En las células B, F<cy>RIIB parece funcionar para suprimir más la producción de inmunoglobulina y el cambio de isotipo, por ejemplo a la clase IgE. En los macrófagos, se cree que FcyRIIB inhibe la fagocitosis mediada por F<cy>RIIA. En eosinófilos y mastocitos, la forma B puede ayudar a suprimir la activación de estas células mediante la unión de IgE a su receptor separado.

Con respecto a la unión de FcyRI, la modificación en IgG nativa de al menos uno de E233-G236, P238, D265, N297, A327 y P329 reduce la unión a F<cy>RI. Los residuos de IgG2 en las posiciones 233-236, sustituidos en las posiciones correspondientes IgG1 e IgG4, reducen la unión de IgG1 e IgG4 a FcyRI en 103 veces y suprimen la respuesta de los monocitos humanos a los glóbulos rojos sensibilizados con anticuerpos (Armour, KL, et al. Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624).

Con respecto a la unión de F<cy>RII, se encuentra una unión reducida para F<cy>RIIA, por ejemplo, para la mutación de IgG de al menos uno de E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292 y K414.

Dos formas alélicas de F<cy>RIIA humana son la variante "H131", que se une a IgG1 Fc con alta afinidad, y la variante "R131", que se une a IgG1 Fc con baja afinidad. Véase, por ejemplo, Bruhns et al., Blood 113: 3716-3725 (2009).

Con respecto a la unión de F<cy>RIII, se encuentra una unión reducida a F<cy>RIIIA, por ejemplo, para la mutación de al menos uno de E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 y D376. El mapeo de los sitios de unión en IgG1 humana para receptores Fc, los sitios de mutación mencionados anteriormente y los métodos para medir la unión a FcyRI y FcyRIIA, se describen en Shields, R. L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604.

Dos formas alélicas de FcyRIIIA humano son la variante "F158", que se une a IgG1 Fc con baja afinidad, y la variante "V158", que se une a IgG1 Fc con alta afinidad. Véase, por ejemplo, Bruhns et al., Blood 113: 3716-3725 (2009).

Con respecto a la unión a F<cy>RII, dos regiones de IgG Fc nativa parecen estar involucradas en interacciones entre FcyRIIs e IgG, a saber (i) el sitio bisagra inferior de IgG Fc, en particular los residuos de aminoácido L, L, G, G (234-237, Numeración UE), y (ii) la región adyacente del dominio CH2 de IgG Fc, en particular un bucle y hebras en el dominio CH2 superior adyacente a la región bisagra inferior, por ejemplo, en una región de P331 (Wines, B.D., et al., J. Immunol. 2000; 164: 5313 - 5318). Además, F<cy>RI parece unirse al mismo sitio en IgG Fc, mientras que FcRn y Proteína A se unen a un sitio diferente en IgG Fc, que parece estar en la interfaz CH2-CH3 (Wines, B. D., et al., J. Immunol. 2000; 164: 5313 - 5318).

También se contemplan mutaciones que aumentan la afinidad de unión de un resto Fc de la presente descripción a un (es decir, uno o más) receptor Fcy (por ejemplo, en comparación con un resto Fc de referencia o anticuerpo que contiene el mismo que no comprende la mutación (s)). Véase, por ejemplo, Delillo y Ravetch, Cell 161 (5): 1035-1045 (2015) y Ahmed et al., J. Struc. Biol. 194 (1): 78 (2016).

En cualquiera de los aspectos aquí descritos, una proteína de unión puede comprender un resto Fc que comprende una mutación seleccionada de G236A; S239D; A330L; y I332E; o una combinación que comprende dos o más de las mismos, por ejemplo S239D/I332E; S239D/A330L/I332E; G236A/S239D/I332E; G236A/A330L/I332E (también denominada aquí "GAALIE"); o G236A/S239D/A330L/I332E. En algunas realizaciones, el resto Fc no comprende S239D.

En ciertos aspectos, el resto Fc puede comprender o consistir en al menos una porción de un resto Fc que está implicado en la unión a la unión de FcRn. En ciertos aspectos, el resto Fc comprende una o más modificaciones de aminoácidos que mejoran la afinidad de unión por (por ejemplo, mejoran la unión a) FcRn (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 6,0) y, en algunos aspectos, prolongan así la vida mediain vivode una molécula que comprende el resto Fc (por ejemplo, en comparación con un resto Fc de referencia o un anticuerpo que, por lo demás, es el mismo pero que no comprende la modificación o modificaciones). En ciertos aspectos, el resto Fc comprende o se deriva de un Fc de IgG y una mutación que prolonga la vida media comprende uno cualquiera o más de: M428L; N434S; N434H; N434A; N434S; M252<y>; S254T; T256E; T250Q; P257I Q311I; D376V; T307A; E380A (numeración de la UE). En determinados aspectos, una mutación que prolonga la vida media comprende M428L/N434S (también denominada aquí "MLNS"). En determinadas realizaciones, una mutación que prolonga la vida media comprende M252Y/S254T/T256E. En ciertos aspectos, una mutación que prolonga la vida media comprende T250Q/M428L. En cierros aspectos, una mutación que prolonga la vida media comprende P257I/Q311I. En determinados aspectos, una mutación que prolonga la vida media comprende P257I/N434H. En ciertos aspectos, una mutación que prolonga la vida media comprende D376V/N434H. En determinados aspectos, una mutación que prolonga la vida media comprende<t>307A/E380A/N434A.

En algunas realizaciones, una proteína de unión incluye un resto Fc que comprende las mutaciones de sustitución M428L/N434S. En algunas realizaciones, una proteína de unión incluye un resto Fc que comprende las mutaciones de sustitución G236A/A330L/I332E.

En determinadas realizaciones, una proteína de unión incluye un resto Fc (por ejemplo IgG) que comprende una mutación G236A, una mutación A330L y una mutación I332E (GAALIE) y no comprende una mutación S239D (por ejemplo comprende una S nativa en la posición 239).

En aspectos particulares, una proteína de unión incluye un resto Fc que comprende las mutaciones de sustitución: M428L/N434S y G236A/A330L/I332E, y opcionalmente no comprende S239D. En ciertos aspectos, una proteína de unión incluye un resto Fc que comprende las mutaciones de sustitución: M428L/N434S y G236A/S239D/A330L/I332E.

En determinados aspectos, una proteína de unión de la presente descripción comprende: CDR y/o un dominio variable y/o una cadena pesada y/o una cadena ligera de acuerdo con cualquiera de los ejemplos de anticuerpos anti-HBV aquí descritos y/o en la publicación PCT WO 2017/060504 (incluyendo los anticuerpos HBC34, HBC34-V7, HBC34-V23, HBC34-V31, HBC34-V32, HBC34-V33, HBC34-V34, HBC34-V35, (incluyendo las variantes aquí descritas de anticuerpos HBC que comprenden una mutación de sustitución en la posición 40 de la cadena ligera (por ejemplo, una sustitución de una cisteína nativa por una alanina, una serina o similar) y HBC24); y un resto Fc que comprende una mutación G236A, una mutación A330L y un I332E (GAALIE), donde el resto Fc opcionalmente comprende además una mutación M428L/N434S (MLNS). En determinadas realizaciones, el resto Fc no comprende S239D.

En ciertos aspectos, una proteína de unión comprende: una secuencia de aminoácidos de CDRH1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 34, una secuencia de aminoácidos de CDRH2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 35 o 66, una secuencia de aminoácidos de CDRH3 de acuerdo con la SEQ ID NO: 36, una secuencia de aminoácidos de CDRL1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 37, una secuencia de aminoácidos de CDRL2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 38 o 39 y una secuencia de aminoácidos de CDRL3 de acuerdo con la SEQ ID NO: 58 o 40; y un resto Fc que comprende una mutación GAALIE. En ciertos aspectos, el resto Fc no comprende una mutación S239d . En ciertos aspectos, el resto Fc comprende además una mutación MLNS.

En determinados aspectos, una proteína de unión comprende: una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada (VH) de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 41 o 67 y una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera (VL) de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 42, 59, 65, 89, 90 y 111-120; y un resto Fc que comprende una mutación GAALIE. En ciertos aspectos, el resto Fc comprende además una mutación MLNS.

En ciertos aspectos, una proteína de unión comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 138 o 91 o 92 y/o una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 93 o 94. En determinadas realizaciones, una proteína de unión comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 91 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID NO: 93. En ciertos aspectos, una proteína de unión comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 91 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID NO: 94. En ciertos aspectos, una proteína de unión comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 92 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID NO: 93. En determinados aspectos, una proteína de unión comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 92 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID NO: 94.

En determinados aspectos, una proteína de unión comprende: una secuencia de aminoácidos de CDRH1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 97, una secuencia de aminoácidos de CDRH2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 98, una secuencia de aminoácidos de CDRH3 de acuerdo con la SEQ ID NO: 99, una secuencia de aminoácidos de CDRL1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 100, una secuencia de aminoácidos de CDRL2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 100 y secuencia de aminoácidos de CDRL3 de acuerdo con la SEQ ID NO: 102; y un resto Fc que comprende una mutación GAALIE. En ciertos aspectos, el resto Fc comprende además una mutación MLNS.

En ciertos aspectos, una proteína de unión comprende: una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada (VH) de acuerdo con la SEQ ID NO: 95 y una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera (VL) de acuerdo con la SEQ ID NO: 96; y un resto Fc que comprende una mutación GAALIE. En determinados aspectos, el resto Fc comprende además una mutación MLNS.

En cualquiera de las realizaciones aquí descritas, una proteína de unión de la presente descripción incluye un resto Fc que comprende una mutación GAALIE y tiene una unión mejorada a un FcYRIIa humano y/o un FcYRIIIa humano en comparación con un polipéptido de referencia (es decir, un polipéptido, que puede ser una proteína de unión, que incluye un resto Fc que no comprende la mutación GAALIE).

En ciertas realizaciones, el polipéptido de referencia incluye un resto Fc que es un resto Fc tipo salvaje (por ejemplo del mismo isotipo) o es un resto Fc que comprende una o más mutaciones de sustitución (o inserción o supresión), siempre que la mutación de sustitución no sea o no comprenda GAALIE. En determinados aspectos, una proteína de unión comprende el anticuerpo HBC34-V35 con una mutación GAALIE (y opcionalmente otras mutaciones de sustitución, por ejemplo MLNS), y un polipéptido de referencia es HBC34-V35 (incluyendo un resto Fc tipo salvaje). En determinadas realizaciones, el polipéptido de referencia no comprende una mutación de sustitución que se sabe o se cree que afecta la unión a un FcYRIIa humano y/o a un FcYRIIIa humano.

La unión entre polipéptidos, tal como la unión entre un resto Fc (o una proteína de unión que comprende el mismo) y un receptor F<cy>humano, tal como F<cy>RIIA humano, F<cy>RIIIA humano o Fc F<cy>RIIB humano, o una proteína del complemento, tal como C1q, puede determinarse o detectarse usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede llevar a cabo un ensayo de interferometría de biocapa (BLI) con un instrumento Octet® RED96 (ForteBio, Fremont, California, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para determinar la asociación y disociación en tiempo real entre un primer polipéptido de interés (por ejemplo HBC34v35 comprendiendo una mutación GAALIE) y un segundo polipéptido de interés (por ejemplo un F<cy>RIIA (H131), un F<cy>RIIA (R131), un F<cy>RIIIA (F158), un F<cy>RIIIA (V158) o un FcYRIIb) que es capturado en un sustrato sensor.

En determinadas realizaciones, una proteína de unión incluye un resto Fc que comprende una mutación GAALIE y tiene una unión mejorada a un FcyRIIA humano (H131), un FcyRIIA humano (R131), un FcyRIIIA humano (F158), un F<cy>RIIIA humano (V158), o cualquier combinación de los mismos, en comparación con un polipéptido de referencia que incluye un resto Fc que no comprende la mutación GAALIE. En ciertas realizaciones, la unión mejorada se determina mediante un aumento (por ejemplo, uno o más de: una señal de pico más alta; una mayor tasa de asociación; una tasa más lenta de disociación; un área mayor bajo la curva) en el cambio de señal frente a la proteína de unión de referencia en un ensayo BLI. En determinadas realizaciones, el ensayo BLI comprende el uso de un instrumento Octet® RED96 (ForteBio, Fremont, California, EE. UU.). En realizaciones adicionales, el ensayo BLI comprende un FcyR humano marcado capturado en un sensor anti-penta-etiqueta y expuesto a la proteína de unión. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende un Fab de IgG y el ensayo BLI comprende además exponer el F<cy>R humano capturado a la proteína de unión en presencia de un fragmento de unión de Fab anti-IgG para reticular las proteínas de unión a través del fragmento Fab.

En determinadas realizaciones, una proteína de unión incluye un resto Fc que comprende una mutación GAALIE y tiene una unión mejorada a un FcyRIIA humano (H131), un FcyRIIA humano (R131), un FcyRIIIA humano (F158) y/o un FcyRIIIA humano (V158) en comparación con un polipéptido de referencia, donde la unión mejorada puede comprender un cambio de señal (nanómetros) en un ensayo BLI de 1,5, 2, 2,5, 3 o más veces mayor que el cambio de señal observado usando la proteína de unión de referencia.

En determinadas realizaciones, una proteína de unión incluye un resto Fc que comprende una mutación GAALIE y tiene una unión mejorada a un F<cy>RIIA humano (H131), un F<cy>RIIA humano (R131), un F<cy>RIIIA humano (F158) y un FcyRIIIA humano (V158), en comparación con un polipéptido de referencia.

En cualquiera de las realizaciones aquí descritas, una proteína de unión incluye un resto Fc que comprende una mutación GAALIE y tiene una unión reducida a un FcyRIIB humano, en comparación con un polipéptido de referencia. En determinadas realizaciones, una proteína de unión incluye un resto Fc que comprende una mutación GAALIE y no se une a un FcyRIIB humano, según se determina, por ejemplo, por la ausencia de un cambio de señal estadísticamente significativo frente a la línea base en un ensayo BLI.

En cualquiera de los aspectos aquí descritos, una proteína de unión incluye un resto Fc que comprende una mutación GAALIE y tiene una unión reducida a una C1q humana (proteína del complemento), en comparación con un polipéptido de referencia. En ciertos aspectos, una proteína de unión incluye un resto Fc que comprende una mutación GAALIE y no se une a una C1q humana, de acuerdo con lo determinado por la ausencia de un cambio de señal estadísticamente significativo frente a la línea de base en un ensayo BLI.

En cualquiera de las realizaciones aquí descritas, una proteína de unión incluye un resto Fc que comprende una mutación GAALIE y activa un FcyRIIA humano, un FcyRIIIA humano o ambos, en mayor grado que un polipéptido de referencia (es decir, un polipéptido que puede ser una proteína de unión específica de HbsAg, que incluya un resto Fc que no comprenda la mutación GAALIE). En determinadas realizaciones, el polipéptido de referencia incluye un resto Fc que es un resto Fc tipo salvaje o que comprende una o más mutaciones de sustitución, siempre que la mutación de sustitución no sea GAALIE. En determinados aspectos, una proteína de unión comprende el anticuerpo HBC34-V35 con una mutación GAALIE (y opcionalmente otras mutaciones de sustitución, tal como, por ejemplo, MLNS), y un polipéptido de referencia es HBC34-V35 con un resto Fc tipo salvaje. La activación de un FcyR humano se puede determinar o detectar usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ensayo biológico comercialmente disponible y bien validado implica la incubación de una proteína de unión específica de HBsAg con un HBsAg recombinante (Engerix B, GlaxoSmithKline) en presencia de células efectoras Jurkat (Promega; Cat. No: G9798) que expresan de manera estable (i) un FcyR de interés y (ii) un indicador de luciferasa de luciérnaga bajo el control de un elemento de respuesta NFAT. La unión de Fc a F<cy>R expresado en la superficie celular impulsa la expresión mediada por NFAT del gen indicador de luciferasa. A continuación, se mide la luminiscencia con un luminómetro (por ejemplo Bio-Tek) usando el reactivo de ensayo de luciferasa Bio-Glo-™ (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La activación se expresa como el promedio de unidades de luminiscencia relativa (RLU) sobre el fondo aplicando la siguiente fórmula: (<r>L<u>a concentración [x] de proteína de unión (por ejemplo, mAbs) - RLU de fondo).

En determinadas realizaciones, una proteína de unión incluye un resto Fc que comprende una mutación GAALIE que activa un FcyRIIA humano (H131), un FcyRIIA humano (R131), un FcyRIIIA humano (F158) y/o un F<cy>RIIIA humano (V158) en mayor grado que un polipéptido de referencia. En ciertas realizaciones, un mayor grado de activación se refiere a un pico de luminiscencia más alto y/o un área bajo la curva de luminiscencia mayor, según se determina usando un ensayo de luminiscencia bioreporter como se describe aquí. En ciertas realizaciones, una proteína de unión incluye un resto Fc que comprende una mutación GAALIE y activa un F<cy>RIIA (H131) humano, un F<cy>RIIA (<r>131) humano y un F<cy>RIIIA (F158) humano en mayor grado que un polipéptido de referencia, comprendiendo el mayor grado de activación un pico de RLU que es 1,5, 2, 2,5, 3 o más veces mayor que el pico de RLU observado usando la proteína de unión de referencia.

En cualquiera de las realizaciones aquí descritas, una proteína de unión incluye un resto Fc que comprende una mutación GAALIE que no activa un F<cy>RIIB humano, según se determina por la ausencia de un RLU estadísticamente significativo y/o medible en un ensayo de bioindicador de luminiscencia como se describió anteriormente.

En cualquiera de las realizaciones aquí descritas, una proteína de unión incluye un resto Fc que comprende una mutación GAALIE y activa una célula asesina natural humana (NK) en presencia de HBsAg en mayor grado que un polipéptido de referencia. En determinadas realizaciones, la activación de una célula NK se determina mediante la expresión de CD107a (por ejemplo mediante citometría de flujo). En determinadas realizaciones, la célula Nk comprende una célula que comprende un genotipo FcYRIIIa homocigoto V158/V158, homocigoto F158/F158 o heterocigoto V158/F158.

Se apreciará que cualquier proteína de unión que incluya un resto Fc que comprenda una mutación GAALIE de acuerdo con la presente descripción puede llevar a cabo o poseer una o más de las características aquí descritas; por ejemplo, unión potenciada a un F<cy>RIIA humano y/o un F<cy>RIIIA humano en comparación con un polipéptido de referencia; unión reducida a un F<cy>RIIB humano en comparación con un polipéptido de referencia (y/o sin unión a un FcyRIIB humano); unión reducida a un C1q humano en comparación con un polipéptido de referencia (y/o sin unión a un C1q humano); activa un F<cy>RIIA, un F<cy>RIIIA humano, o ambos, en mayor grado que un polipéptido de referencia; no activa un F<cy>RIIB humano; y/o activa una célula asesina natural (NK) humana en presencia de HBsAg en mayor grado que un polipéptido de referencia (por ejemplo un anticuerpo que es específico para HBsAg e incluye un resto Fc que no comprende una mutación GAALIE).

En ciertos aspectos, una proteína de unión de la presente descripción incluye un resto Fc que comprende una mutación GAALIE y: (i) tiene una unión mejorada a un F<cy>RIIA humano, un F<cy>RIIIA humano, o ambos, en comparación con un polipéptido de referencia que incluye un resto Fc que no comprende G236A/A330L/I332E, donde el FcyRIIA humano es opcionalmente H131 o R131, y/o el FcyRIIIA humano es opcionalmente F158 o V158; (ii) tiene una unión reducida a un F<cy>RIIB humano, en comparación con un polipéptido de referencia que incluye un resto Fc que no comprende G236A/A330L/I332E; (iii) no se une a un FcyRIIB humano; (iv) tiene una unión reducida a un C1q humano, en comparación con un polipéptido de referencia que incluye un resto Fc que no comprende G236A/A330L/I332E; (v) no se une a un C1q humano; (vi) activa un FcyRIIA, un FcyRIIIA humano, o ambos, en mayor grado que un polipéptido de referencia que incluye un resto Fc que no comprende G236A/A330L/I332E, donde el FcyRIIA humano es opcionalmente H131 o R131, y/o el FcyRIIIA humano es opcionalmente F158 o V158; (vii) no activa un FcyRIIB humano; (viii) activa una célula asesina natural (NK) humana en presencia de HBsAg en mayor grado que un polipéptido de referencia que incluye un resto Fc que no comprende G236A/A330L/I332E, donde el polipéptido de referencia es opcionalmente un anticuerpo que se une a un HB Ag, opcionalmente un HBsAg; (ix) tiene una EC50 de HBsAg de aproximadamente 12,75 ng/ml a aproximadamente 19,9 ng/ml, o de aproximadamente 12,75 ng/ml a aproximadamente 12,84 ng/ml, o aproximadamente 12,79 ng/ml, o de aproximadamente 16,22 ng/ml a aproximadamente 19,9 ng/ml, o aproximadamente 17,97 ng/ml, y/o (b) tiene una EC50 de HBeAg de aproximadamente 10,78 ng/ml a aproximadamente 13,72 ng/ml, o de aproximadamente 10,78 ng/ml a aproximadamente 10,93 ng/ml, o aproximadamente 10,85 ng/ml, o de aproximadamente 11,59 ng/ml a aproximadamente 13,72 ng/ml, o aproximadamente 12,61 ng/ml, donde el HBV es opcionalmente el Genotipo D de HBV, y donde la EC50 se determina opcionalmentein vitromidiendo el HBsAg o HBeAg, respectivamente, secretado por células HepG2 que sobreexpresan NTCP e infectadas con HBV el día 7 después de la administración del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno a células HepG2; (x) tiene una EC50 de HBsAg de aproximadamente 10,43 ng/ml a aproximadamente 22,41 ng/ml, o de aproximadamente 13,81 ng/ml a aproximadamente 16,56 ng/ml, o aproximadamente 15,12 ng/ml, o de aproximadamente 12,24 ng/ml a aproximadamente 22,41 ng/ml, o aproximadamente 16,56 ng/ml, o de aproximadamente 10,43 ng/ml a aproximadamente 20,08 ng/ml, o aproximadamente 14,47 ng/ml, y/o (b) tiene una EC50 de HBeAg de aproximadamente 10,39 ng/ml a aproximadamente 13,99 ng/ml, o de aproximadamente 10,63 ng/ml a aproximadamente 10,66 ng/ml, o aproximadamente 10,64 ng/ml, o de aproximadamente 10,39 ng/ml a aproximadamente 10,60 ng/ml, o aproximadamente 10,49 ng/ml, o de aproximadamente 13,25 ng/ml a aproximadamente 13,99 ng/ml, o aproximadamente 13,61 ng/ml, donde el HBV es opcionalmente del genotipo D del HBV y donde la EC50 se determina opcionalmentein vitromidiendo el HBsAg o el HBeAg, respectivamente, secretado por células HepG2 sobreexpresando NTCP e infectado con el HBV, el día 7 después de la administración del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno a células HepG2; (xi) es capaz de unirse a una variante de HBsAg que comprende HBsAg-Y100C/P120T, HBsAg-P120T, HBsAg-P120S/S143L, HBsAg-C121S, HBsAg-R122D, HBsAg-R122I, HBsAg-T123N, HBsAg-Q129H, HBsAg-Q129L, HBsAg-M133H, HBsAg-M133L, HBsAg-M133T, HBsAg-K141E, HBsAg-P142S, HBsAg-S143K, HBsAg-D144A, HBsAg-G145R, HBsAg-N146A, o cualquier combinación de los mismos; (xii) tiene una unión mejorada a una variante de HBsAg que comprende HBsAg-Y100C/P120T, HBsAg-P120T, HBsAg-P120S/S143L, HBsAg-C121S, HBsAg-R122D, HBsAg-R122I, HBsAg-T123N, HBsAg-Q129H, HBsAg-Q129L, HBsAg-M133H, HBsAg-M133L, HBsAg-M133T, HBsAg-K141E, HBsAg-P142S, HBsAg-S143K, HBsAg-D144A, HBsAg-G145R, HBsAg-N146A, en comparación con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de referencia que se une a HBsAg y que incluye un resto Fc que no comprende G236A/A330L/I332E; y/o (xiii) es capaz de neutralizar (a) un HBV de genotipo A con una EC50 de aproximadamente 2,34 ng/ml; (b) un HBV de genotipo B con una EC50 de aproximadamente 2,22 ng/ml; (c) un HBV de genotipo C con una EC50 de aproximadamente 0,92 ng/ml; (d) un HBV de genotipo D con una EC50 de aproximadamente 1.10 ng/ml; (e) un HBV de genotipo E con una EC50 de aproximadamente 1,12 ng/ml; (f) un HBV de genotipo F con una EC50 de aproximadamente 1,93 ng/ml; (g) un HBV de genotipo G con una EC50 de aproximadamente 1,43 ng/ml; y/o (h) un HBV de genotipo H con una EC50 de aproximadamente 1,93 ng/ml, donde la EC50 se determina opcionalmente usando un HDV recombinante diseñado para expresar un HBsAg del genotipo de HBV.

Alternativa o adicionalmente, el resto Fc de una proteína de unión de la descripción puede comprender al menos una porción conocida en la técnica que se requiere para la unión de la Proteína A; y/o el resto Fc de un anticuerpo de la descripción comprende al menos la porción de una molécula de Fc conocida en la técnica que se requiere para la unión a proteína G. En algunas realizaciones, una función retenida comprende el aclaramiento de HBsAg y HBVg. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, un resto Fc comprende al menos una parte conocida en la técnica que se requiere para la unión de F<cy>R. Como se indicó anteriormente, un resto Fc puede comprender así al menos (i) el sitio bisagra inferior de la IgG Fc nativa, en particular los residuos de aminoácidos L, L, G, G (234 - 237, numeración UE), y (ii) la región adyacente del dominio CH2 de la IgG Fc nativa, en particular un bucle y hebras del dominio CH2 superior adyacente a la región bisagra inferior, por ejemplo en una región de P331, por ejemplo una región de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos consecutivos en el dominio CH2 superior de la IgG Fc nativa alrededor de P331, por ejemplo entre los aminoácidos 320 y 340 (numeración UE) de la IgG Fc nativa.

En algunas realizaciones, una proteína de unión de acuerdo con la presente descripción comprende una región Fc. Tal como se usa aquí, el término "región Fc" se refiere a la porción de una inmunoglobulina formada por dos o más restos Fc de cadenas pesadas de anticuerpos. Por ejemplo, una región Fc puede ser una región Fc monomérica o de "cadena única" (es decir una región scFc). Las regiones Fc monocatenarias están compuestas por restos Fc unidos dentro de una sola cadena polipeptídica (por ejemplo codificados en una sola secuencia contigua de ácido nucleico). Regiones scFc ilustrativas se describen en el documento WO 2008/143954 A2.

La región Fc puede ser o comprender una región Fc dimérica. Una "región Fc dimérica" o "dcFc" se refiere al dímero formado por los restos Fc de dos cadenas pesadas de inmunoglobulina separadas. La región Fc dimérica puede ser un homodímero de dos restos Fc idénticos (por ejemplo una región Fc de una inmunoglobulina natural) o un heterodímero de dos restos Fc no idénticos (por ejemplo un monómero Fc de la región Fc dimérica comprende al menos una modificación de aminoácidos (por ejemplo, sustitución, supresión, inserción o modificación química) que no está presente en el otro monómero Fc, o un monómero Fc puede estar truncado en comparación con el otro).

Aspectos particulares incluyen aquellos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que tienen una cadena pesada (por ejemplo VH-bisagra-CH1-CH2-CH3) de acuerdo con la SEQ ID NO: 91 o SEQ ID NO: 92 o SEQ ID NO: 138, y aquellos con una cadena ligera (es decir, VL-CL) de acuerdo con la SEQ ID NO: 93 o SEQ ID NO: 94. En determinadas realizaciones, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 91 y una cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID NO: 93. En otros aspectos, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 92 y una cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID NO: 94. En otros aspectos, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 91 y una cadena ligera de acuerdo con la SEQ Id NO: 94. En otros aspectos, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 92 y una cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID NO: 93. En algunos aspectos, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende o consiste en una cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 129. En algunos aspectos, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende o consiste en una cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 138, y opcionalmente una cadena ligera de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 93 o 94. Estas secuencias se proporcionan en el Listado de Secuencias.

Los restos Fc aquí descritos pueden comprender secuencias o regiones Fc de la misma o diferente clase y/o subclase. Por ejemplo, los restos Fc pueden derivarse de una inmunoglobulina (por ejemplo una inmunoglobulina humana) de una subclase IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, o de cualquier combinación de las mismas. En determinadas realizaciones, los restos Fc de la región Fc son de la misma clase y subclase. Sin embargo, la región Fc (o uno o más restos Fc de una región Fc) también puede ser quimérica, por lo que una región Fc quimérica puede comprender restos Fc derivados de diferentes clases y/o subclases de inmunoglobulinas. Por ejemplo, al menos dos de los restos Fc de una región Fc dimérica o monocatenaria pueden ser de diferentes clases y/o subclases de inmunoglobulinas. En determinadas realizaciones, una región Fc dimérica puede comprender secuencias de dos o más isotipos o subclases diferentes; por ejemplo un SEEDbody ("dominios modificados por ingeniería de intercambio de cadenas"), véase Davis et al., Protein Eng. Des. Sel. 23 (4): 195 (2010).

Adicional o alternativamente, las regiones Fc quiméricas pueden comprender uno o más restos Fc quiméricos. Por ejemplo, la región o resto Fc quimérico puede comprender una o más porciones derivadas de una inmunoglobulina de una primera subclase (por ejemplo una subclase IgG1, IgG2 o IgG3) mientras que el resto de la región o resto Fc sea de una subclase diferente. Por ejemplo, una región Fc o resto de un polipéptido Fc puede comprender un dominio CH2 y/o CH3 derivado de una inmunoglobulina de una primera subclase (por ejemplo una subclase IgG1, IgG2 o IgG4) y una región bisagra de una inmunoglobulina de una segunda subclase (por ejemplo una subclase IgG3). Por ejemplo, la región o resto Fc puede comprender una bisagra y/o dominio CH2 derivado de una inmunoglobulina de una primera subclase (por ejemplo, una subclase IgG4) y un dominio CH3 de una inmunoglobulina de una segunda subclase (por ejemplo una IgG1, IgG2, o subclase IgG3). Por ejemplo, la región Fc quimérica puede comprender un resto Fc (por ejemplo un resto Fc completo) de una inmunoglobulina para una primera subclase (por ejemplo una subclase IgG4) y un resto Fc de una inmunoglobulina de una segunda subclase (por ejemplo una subclase IgG1, IgG2 o IgG3). Por ejemplo, la región o resto Fc puede comprender un dominio CH2 de una inmunoglobulina IgG4 y un dominio CH3 de una inmunoglobulina IgG1. Por ejemplo, la región o resto Fc puede comprender un dominio CH1 y un dominio CH2 de una molécula de IgG4 y un dominio CH3 de una molécula de IgG1. Por ejemplo, la región o resto Fc puede comprender una porción de un dominio CH2 de una subclase particular de anticuerpo, por ejemplo, las posiciones EU 292-340 de un dominio CH2. Por ejemplo, una región o resto Fc puede comprender los aminoácidos en las posiciones 292-340 de CH2 derivados de un resto IgG4 y el resto de CH2 derivado de un resto IgG1 (alternativamente, 292-340 de CH2 pueden derivarse de un resto IgG1 y el resto de CH2 derivado de un resto IgG4).

También se apreciará que cualquier anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o región Fc o resto de la presente descripción puede ser de cualquier alotipo y/o haplotipo. Por ejemplo, los alotipos de inmunoglobulina G humana incluyen los descritos en Jefferis y LeFranc, mAbs 1 (4): 1-7 (2009), tales alotipos (incluyendo G1m (1(a); 2(x); 3(f); y 17(z)); G2m (23(n)); G3m (21(g1); 28(g5); 11(b0); 5(b2); 13(b3); 14(b4); 10(b5); 15(s); 16(t); 6(c3); 24(c5); 26(u); y 27(v)); A2m (1 y 2); y Km (1; 2; y 3) y los haplotipos, y las secuencias de aminoácidos resultantes, y combinaciones de ellos. En ciertos aspectos, un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno o una región Fc o resto de la presente descripción comprende un alotipo de IgG1 g1m17, k1.

Además, una región o resto Fc puede comprender (adicional o alternativamente), por ejemplo, una región bisagra quimérica. Por ejemplo, la bisagra quimérica puede derivarse, por ejemplo, en parte, de una molécula de IgG1, IgG2 o IgG4 (por ejemplo una secuencia bisagra media superior e inferior) y, en parte, de una molécula de IgG3 (por ejemplo una secuencia bisagra media). En otro ejemplo, una región o resto Fc puede comprender una bisagra quimérica derivada, en parte, de una molécula de IgG1 y, en parte, de una molécula de IgG4. En otro ejemplo, la bisagra quimérica puede comprender dominios de bisagra superior e inferior de una molécula de IgG4 y un dominio bisagra media de una molécula de IgG1. Tal bisagra quimérica se puede hacer, por ejemplo, introduciendo una sustitución de prolina (Ser228Pro) en la posición 228 de EU en el dominio de bisagra central de una región bisagra de IgG4. En otra realización, la bisagra quimérica puede comprender aminoácidos en las posiciones EU 233-236 que son de un anticuerpo IgG2 y/o la mutación Ser228Pro, siendo los aminoácidos restantes de la bisagra de un anticuerpo IgG4 (por ejemplo una bisagra quimérica de secuencia ESKYGPPCPPCPAPPVAGP). En el documento US 2005/0163783 A1 se describen otras bisagras quiméricas que pueden usarse en el resto Fc del anticuerpo de acuerdo con la presente descripción.

En algunas realizaciones de las proteínas de unión aquí descritas, el resto Fc o la región Fc comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de inmunoglobulina humana (por ejemplo de una región Fc o resto Fc de una molécula de IgG humana). Sin embargo, los polipéptidos pueden comprender uno o más aminoácidos de otra especie de mamífero. Por ejemplo, se puede incluir un resto Fc de primate o un sitio de unión de primate en los polipéptidos diana. Como alternativa, pueden estar presentes uno o más aminoácidos murinos en el resto Fc o en la región Fc.

Molécula de ácido nucleico

En otro aspecto, la descripción proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica para un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o proteína de fusión de acuerdo con la presente descripción.

Tabla 4: muestra secuencias de nucleótidos que codifican para VH, VL, CH, CL, HC y LC de ejemplo de acuerdo con la presente descripción.

Debido a la redundancia del código genético, la presente descripción también comprende variantes de secuencia de estas secuencias de ácido nucleico y, en particular, aquellas variantes de secuencia que codifican para las mismas secuencias de aminoácidos.

En ciertos aspectos, un polinucleótido o una molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que comparte al menos un 80% de identidad con la secuencia de nucleótidos de acuerdo con cualquiera de las s Eq ID NO: 103-110 y 130-136, donde la secuencia de nucleótidos tiene codones optimizados para su expresión por una célula huésped.

En aspectos particulares, una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente descripción comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 103-110 y 130-136.

En determinadas realizaciones, un polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para VH de acuerdo con la SEQ ID NO: 103 y una secuencia de nucleótidos que codifica para VL de acuerdo con la SEQ ID NO: 105. En otros aspectos, un polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para VH de acuerdo con la SEQ ID NO: 103 y una secuencia de nucleótidos que codifica para VL de acuerdo con la SEQ ID NO: 104. En otros aspectos, un polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para VH de acuerdo con la SEQ ID NO: 108 y una secuencia de nucleótidos que codifica para VL de acuerdo con la SEQ ID NO: 109.

También se proporcionan aquí polinucleótidos que codifican para un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, donde el polinucleótido comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica para VH de acuerdo con la SEQ ID NO: 103 y una secuencia de nucleótidos que codifica para VL de acuerdo con la SEQ ID NO: 110, uniéndose el anticuerpo codificado o el fragmento de unión a antígeno a la región del bucle antigénico de HBsAg y neutralizando la infección por el virus de la hepatitis B y el virus de la hepatitis delta.

En cualquiera de los aspectos aquí descritos, un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifique para CH1-bisagra-CH2-CH3 de acuerdo con la<s>E<q>ID NO: 130 y/o puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifique para HC (VH-CH1-bisagra-CH3-CH3) de acuerdo con la SEQ ID NO: 131. En algunos aspectos, un polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para CL de acuerdo con la SEQ ID NO: 132 y/o comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para LC (VL-CL) de acuerdo con la SEQ ID NO: 133. En otros aspectos, un polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para CL de acuerdo con la SEQ ID NO: 134 y/o comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para LC (VL-CL) de acuerdo con la SEQ ID NO: 135 o SEQ ID NO: 136.

Vectores

También se incluyen dentro del alcance de la descripción vectores, por ejemplo vectores de expresión, que comprenden una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente descripción.

El término "vector" se refiere a un constructo que comprende una molécula de ácido nucleico. Un vector en el contexto de la presente descripción es adecuado para incorporar o albergar una secuencia de ácido nucleico deseada. Tales vectores pueden ser vectores de almacenamiento, vectores de expresión, vectores de clonación, vectores de transferencia, etc. Un vector de almacenamiento es un vector que permite el almacenamiento conveniente de una molécula de ácido nucleico. Por tanto, el vector puede comprender, por ejemplo, una secuencia correspondiente a un anticuerpo deseado o fragmento de anticuerpo del mismo de acuerdo con la presente descripción.

Como se usa aquí, "vector de expresión" se refiere a un constructo de ADN que contiene una molécula de ácido nucleico que está operativamente unida a una secuencia de control adecuada capaz de efectuar la expresión de la molécula de ácido nucleico en un anfitrión adecuado. Las secuencias de control incluyen un promotor (por ejemplo un promotor heterólogo) para la transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica para sitios de unión de ribosomas de ARNm adecuados y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y traducción. Cualquiera de los elementos de un vector de expresión que contribuyen a la transcripción de una molécula de ácido nucleico de interés puede ser heterólogo del vector. El vector puede ser un plásmido, una partícula de fago, un virus o simplemente un potencial inserto genómico. Una vez transformado en un anfitrión adecuado, el vector puede replicarse y funcionar independientemente del genoma del anfitrión o, en algunos casos, puede integrarse en el genoma mismo. En la presente descripción, "plásmido", "plásmido de expresión", "virus" y "vector" a menudo se usan indistintamente.

Un vector de clonación es típicamente un vector que contiene un sitio de clonación, que puede usarse para incorporar secuencias de ácido nucleico en el vector. Un vector de clonación puede ser, por ejemplo, un vector plasmídico o un vector bacteriófago.

Un vector de transferencia puede ser un vector adecuado para transferir moléculas de ácido nucleico a células u organismos, por ejemplo vectores virales. Un vector en el contexto de la presente descripción puede ser, por ejemplo, un vector de ARN o un vector de ADN. Un vector puede ser una molécula de ADN. Por ejemplo, un vector en el sentido de la presente solicitud comprende un sitio de clonación, un marcador de selección, tal como un factor de resistencia a antibióticos, y una secuencia adecuada para la multiplicación del vector, tal como un origen de replicación. En algunas realizaciones, un vector en el contexto de la presente solicitud es un vector plásmido. En ciertas de tales realizaciones, un vector comprende un vector lentiviral o un vector retroviral.

Células

En un aspecto adicional, la presente descripción también proporciona una célula (también denominada "célula huésped") que expresa un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno o una proteína de fusión de acuerdo con la presente descripción, o que comprende un vector o polinucleótido de acuerdo con la presente descripción.

Ejemplos de tales células incluyen, pero no se limitan a, células eucariotas, por ejemplo células de levadura, células animales, células de insectos, células vegetales; y células procariotas, incluyendo E. coli. En algunas realizaciones, las células son células de mamífero. En ciertas de tales realizaciones, las células son una línea celular de mamífero, tal como células CHO (por ejemplo células DHFR-CHO (Urlaub et al., PNAS 77: 4216 (1980), CHO-KSV), células renales embrionarias humanas (por ejemplo HEK293T células), células PER.C6, células Y0, células Sp2/0, células NS0, células hepáticas humanas, por ejemplo células Hepa RG, células de mieloma o células de hibridoma. Otros ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos incluyen células de sertoli de ratón (por ejemplo células TM4); línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); células de riñón de cría de hámster (BHK); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de riñón de mono (CV1); células de carcinoma cervical humano (HELA); células de pulmón (W138); células de hígado humano (Hep G2); células de riñón canino (MDCK; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A); tumor mamario de ratón (M<m>T 060562); células TRI; células MRC 5; y células FS4. Líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos también incluyen las descritas en, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (BKC Lo, ed., Humana Press, Totow a, N.J.), pp. 255-268 (2003).

En determinadas realizaciones, una célula huésped es una célula procariota, tal como E. coli. La expresión de péptidos en células procarióticas como E. coli está bien establecida (véase, por ejemplo, Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991). Por ejemplo, los anticuerpos pueden producirse en bacterias, en particular cuando la glicosilación y la función efectora de Fc no son necesarias para la expresión de fragmentos de anticuerpos y polipéptidos en bacterias; ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses N°.

5.648.237, 5.789.199 y 5.840.523.

Células de insectos útiles que expresan una proteína de unión de la presente descripción son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, célulasSpodoptera frugiperaSf9, célulasTrichoplusiani BTI-TN5B1-4 y célulasSpodoptera frugiperaSfSWT01 “Mimic™”. Ver, por ejemplo, Palmberger et al., J. Biotechnol. 153 (3-4): 160-166 (2011). Se han identificado numerosas cepas baculovirales que pueden usarse junto con células de insectos, en particular para la transfección de células deSpodoptera frugiperda.

Los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras también son anfitriones adecuados para clonar o expresar vectores que codifiquen para proteínas e incluyen cepas de hongos y levaduras con vías de glicosilación "humanizadas", lo que da como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glicosilación parcial o totalmente humano. Véase Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004); Li et al., Nat. Biotech. 24: 210 - 215 (2006).

Las células vegetales también se pueden usar como anfitriones para expresar una proteína de unión de la presente descripción. Por ejemplo, la tecnología PLANTIBODIES™ (descrita, por ejemplo, en las patentes estadounidenses N°. 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429) emplea plantas transgénicas para producir anticuerpos.

En algunas realizaciones, una proteína de fusión es expresada en la superficie de una célula por una célula inmunitaria, por ejemplo una célula T, célula NK o célula NK-T, o cualquier subtipo de las mismas.

Puede usarse cualquier sistema de expresión de proteínas compatible con la descripción para producir las proteínas de unión descritas. Sistemas de expresión adecuados incluyen los animales transgénicos descritos en Gene Expression Systems, Academic Press, eds. Fernandez et al., 1999.

En realizaciones particulares, la célula puede transfectarse con un vector de acuerdo con la presente descripción con un vector de expresión. El término "transfección" se refiere a la introducción de moléculas de ácido nucleico, tales como moléculas de ADN o ARN (por ejemplo ARNm), en células, tal como en células eucariotas. En el contexto de la presente descripción, el término "transfección" abarca cualquier método conocido por el experto para introducir moléculas de ácido nucleico en células, tal como en células eucariotas, incluso en células de mamíferos. Los métodos abarcan, por ejemplo, electroporación, lipofección, por ejemplo a base de lípidos catiónicos y/o liposomas, precipitación con fosfato de calcio, transfección basada en nanopartículas, transfección a base de virus o transfección a base de polímeros catiónicos, tales como DEAE-dextrano o polietilenimina, etc. En determinadas realizaciones, la introducción no es viral.

Además, las células de la presente descripción se pueden transfectar de forma estable o transitoria con el vector de acuerdo con la presente descripción, por ejemplo para expresar un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente descripción. En tales realizaciones, las células se transfectan de manera estable con el vector como se describe aquí que codifica para una proteína de unión. Alternativamente, las células se pueden transfectar transitoriamente con un vector de acuerdo con la presente descripción que codifique para una proteína de unión de acuerdo con la presente descripción. En cualquiera de las realizaciones aquí descritas, un polinucleótido puede ser heterólogo de la célula huésped.

En un aspecto relacionado, la presente descripción proporciona métodos para producir un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno o una proteína de fusión, donde los métodos comprenden cultivar una célula huésped de la presente descripción en condiciones y durante un tiempo suficiente para producir el anticuerpo, el fragmento de unión a antígeno o la proteína de fusión.

Por consiguiente, la presente descripción también proporciona células huésped recombinantes que expresan heterólogamente un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno o una proteína de fusión de la presente descripción. Por ejemplo, la célula puede ser de una especie diferente a la especie de la que se obtuvo total o parcialmente el anticuerpo (por ejemplo células CHO que expresen un anticuerpo humano o un anticuerpo humano modificado por ingeniería genética). En algunas realizaciones, el tipo celular de la célula huésped no expresa el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno en la naturaleza. Además, la célula huésped puede impartir una modificación postraduccional (PTM; por ejemplo glicosilación o fucosilación) en el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que no está presente en un estado nativo del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno (o en un estado nativo de un anticuerpo parental a partir del cual se diseña o deriva el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno). Tal PTM puede resultar en una diferencia funcional (por ejemplo inmunogenicidad reducida). En consecuencia, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente descripción que es producido por una célula huésped como se describe aquí puede incluir una o más modificaciones postraduccionales que sean distintas del anticuerpo (o anticuerpo progenitor) en su estado nativo (por ejemplo un anticuerpo humano producido por una célula CHO puede comprender una modificación más postraduccional que sea distinta del anticuerpo cuando se aísla del ser humano y/o se produce por la célula B humana nativa o la célula plasmática).

Características adicionales opcionales de los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno o proteínas de fusión

Los anticuerpos, los fragmentos de unión a antígeno y las proteínas de fusión de la descripción pueden acoplarse, por ejemplo, a un fármaco para su administración a un sitio de tratamiento o acoplarse a un marcador detectable para facilitar la formación de imágenes de un sitio que comprende células de interés. Los métodos para acoplar anticuerpos a fármacos y marcadores detectables son bien conocidos en la técnica, al igual que los métodos para imagenología usando marcadores detectables. Los anticuerpos marcados se pueden emplear en una amplia variedad de ensayos, empleando una amplia variedad de marcadores. La detección de la formación de un complejo anticuerpo-antígeno entre un anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno o proteína de fusión) de la descripción y un epítopo de interés en HBsAg, en particular en la región del bucle antigénico de HBsAg, puede facilitarse uniendo una sustancia al anticuerpo. Los medios de detección adecuados incluyen el uso de marcadores tales como radionúclidos, enzimas, coenzimas, fluorescentes, quimioluminiscentes, cromógenos, sustratos o cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, complejos de grupos protésicos, radicales libres, partículas, colorantes y similares. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos protésicos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina, fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente es luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 35S o 3H. Los reactivos marcados pueden usarse en diversos ensayos bien conocidos, tales como radioinmunoensayos, inmunoensayos enzimáticos, por ejemplo ELISA, inmunoensayos fluorescentes y similares. Por tanto, los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y proteínas de fusión marcados de acuerdo con la presente descripción pueden usarse en tales ensayos, por ejemplo tal como se describe en los documentos US 3.766.162, US 3.791.932, US 3.817.837 y US 4.233.402.

Un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o proteína de fusión de acuerdo con la presente descripción se puede conjugar con un resto terapéutico, tal como una citotoxina, un agente terapéutico o un ion metálico radiactivo o radioisótopo. Ejemplos de radioisótopos incluyen, entre otros, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, Bi-213, Pd-109, Tc-99, In-111 y similares. Tales conjugados de anticuerpos pueden usarse para modificar una respuesta biológica dada; el resto de fármaco no debe interpretarse como limitado a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina diftérica.

Las técnicas para conjugar tal resto terapéutico con anticuerpos son bien conocidas. Véase, por ejemplo, Arnon et al. (1985) "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pp. 243-256; ed. Hellstrom et al. (1987) "Antibodies for Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2d ed; Marcel Dekker, Inc.), pp. 623-653; Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera et al. pp. 475-506 (Editrice Kurtis, Milano, Italy, 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al. (Academic Press, New York, 1985), pp. 303-316; y Thorpe et al. (1982) Immunol. Rev.

62:119-158.

Alternativamente, se puede conjugar un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o proteína de fusión con un segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo (o segunda proteína de fusión) para formar un heteroconjugado como se describe en el documento US 4.676.980. Además, se pueden usar enlazadores entre los marcadores y los anticuerpos de la descripción, por ejemplo tal como se describe en el documento US 4.831.175. Los anticuerpos, los fragmentos de unión a antígeno y las proteínas de fusión pueden marcarse directamente con yodo radiactivo, indio, itrio u otra partícula radiactiva conocida en la técnica, por ejemplo tal como se describe en el documento US 5.595.721. El tratamiento puede consistir en una combinación de tratamiento con anticuerpos conjugados y no conjugados, fragmentos de unión a antígeno y/o proteínas de fusión, administrados simultánea o posteriormente, por ejemplo tal como se describe en el documento WO00/52031; WO00/52473.

Los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y proteínas de fusión como se describen aquí también pueden unirse a un soporte sólido. Además, los anticuerpos de la presente descripción, los fragmentos de anticuerpo funcionales de los mismos o las proteínas de fusión pueden modificarse químicamente mediante conjugación covalente con un polímero para, por ejemplo, aumentar su vida media circulante. Ejemplos de polímeros y métodos para unirlos a péptidos se muestran en los documentos US 4.766.106, US 4.179.337, US 4.495.285 y US 4.609.546. En algunas realizaciones, los polímeros se pueden seleccionar entre polioles polioxietilados y polietilenglicol (PEG). El PEG es soluble en agua a temperatura ambiente y tiene la fórmula general: R(O-CH2-CH2)nO-R, donde R puede ser hidrógeno o un grupo protector tal como un grupo alquilo o alcanol. En determinadas realizaciones, el grupo protector puede tener entre 1 y 8 carbonos. Por ejemplo, el grupo protector puede ser metilo. El símbolo n es un número entero positivo. En una realización, n está entre 1 y 1.000. En otra realización, n está entre 2 y 500. En algunas realizaciones, el PEG tiene un peso molecular medio seleccionado entre 1.000 y 40.000, entre 2.000 y 20.000 y entre 3.000 y 12.000. Además, el PEG puede tener al menos grupo hidroxilo, por ejemplo el PEG puede tener un grupo hidroxilo terminal. Por ejemplo, es el grupo hidroxilo terminal el que se activa para reaccionar con un grupo amino libre en el inhibidor. Sin embargo, se entenderá que el tipo y la cantidad de grupos reactivos pueden variar para conseguir un PEG/anticuerpo conjugado covalentemente de la presente descripción.

Los polioles polioxietilados solubles en agua también se pueden usar en el contexto de los anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos aquí descritos. Éstos incluyen sorbitol polioxietilado, glucosa polioxietilada, glicerol polioxietilado (POG) y similares. En una modalidad, se usa POG. Sin referirse a ninguna teoría, debido a que el esqueleto glicerol del glicerol polioxietilado es el mismo esqueleto que se encuentra naturalmente en, por ejemplo, animales y humanos en mono, di, triglicéridos, esta ramificación no necesariamente se consideraría un agente extraño en el cuerpo. El POG puede tener un peso molecular en el mismo intervalo que el PEG. Otro sistema de administración de fármacos que se puede usar para aumentar la vida media circulatoria es el liposoma. Los expertos en la técnica conocen métodos para preparar sistemas de administración de liposomas. En la técnica se conocen otros sistemas de administración de fármacos y se describen, por ejemplo, en el documento Poznansky et al. (1980) y Poznansky (1984).

Los anticuerpos, los fragmentos de unión a antígeno y las proteínas de fusión de la descripción pueden proporcionarse en forma purificada. Normalmente, el anticuerpo, el fragmento de unión o la proteína de fusión estarán presentes en una composición que está esencialmente libre de otros polipéptidos, por ejemplo cuando menos de 90% (en peso), normalmente menos de 60% y más habitualmente menos de 50% de la composición está formada por otros polipéptidos.

Los anticuerpos, las proteínas de fusión o los fragmentos de unión a antígeno de la descripción pueden ser inmunogénicos en huéspedes no humanos (o heterólogos), por ejemplo en ratones. En particular, los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno o proteínas de fusión pueden tener un idiotipo que sea inmunogénico en anfitriones no humanos, pero no en un anfitrión humano. En particular, tales moléculas de la descripción para uso humano incluyen aquellas que no pueden aislarse fácilmente de huéspedes tales como ratones, cabras, conejos, ratas, mamíferos no primates, etc. y generalmente no pueden obtenerse por humanización o de xeno-ratones.

Producción de anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y proteínas de fusión

Los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y proteínas de fusión de acuerdo con la descripción se pueden preparar mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la metodología general para fabricar anticuerpos monoclonales usando tecnología de hibridomas es bien conocida (Kohler, G. y Milstein, C., 1975; Kozbar et al. 1983). En un aspecto, se usa el método alternativo de inmortalización de EBV descrito en el documento WO2004/076677.

En un aspecto, los anticuerpos se producen usando un método descrito en WO 2004/076677. En tales métodos, las células B que producen el anticuerpo se transforman con EBV y un activador de células B policlonal. Pueden añadirse opcionalmente estimulantes del crecimiento y diferenciación celular adicionales durante la etapa de transformación para mejorar aún más la eficacia. Estos estimulantes pueden ser citocinas como IL 2 e IL-15. En un aspecto, se agrega IL-2 durante la etapa de inmortalización para mejorar aún más la eficiencia de la inmortalización, pero su uso no es esencial. Las células B inmortalizadas producidas usando estos métodos pueden cultivarse luego usando métodos conocidos en la técnica y los anticuerpos ser aislados de las mismas.

Otro método para producir anticuerpos se describe en el documento WO 2010/046775. En tal método, las células plasmáticas se cultivan en cantidades limitadas o como células plasmáticas individuales en placas de cultivo de micropocillos. Los anticuerpos pueden aislarse de los cultivos de células plasmáticas. Además, de los cultivos de células plasmáticas, se puede extraer ARN y se puede llevar a cabo la PCR usando métodos conocidos en la técnica. Las regiones VH y VL de los anticuerpos pueden amplificarse mediante RT-PCR (PCR con transcriptasa inversa), secuenciarse y clonarse en un vector de expresión que luego se transfecta en células HEK293T u otras células huésped. La clonación de ácido nucleico en vectores de expresión, la transfección de células huésped, el cultivo de las células huésped transfectadas y el aislamiento del anticuerpo producido pueden llevarse a cabo usando cualquier método conocido por el experto en la técnica.

Los anticuerpos pueden purificarse más, si se desea, usando filtración, centrifugación y varios métodos cromatográficos, como HPLC o cromatografía de afinidad. Las técnicas para la purificación de anticuerpos, por ejemplo anticuerpos monoclonales, incluidas las técnicas para producir anticuerpos de calidad farmacéutica, son bien conocidas en la técnica.

Pueden usarse técnicas estándar de biología molecular para preparar secuencias de ADN que codifiquen los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o proteínas de fusión de la presente descripción. Las secuencias de ADN deseadas se pueden sintetizar completamente o en parte usando técnicas de síntesis de oligonucleótidos. Se pueden usar técnicas de mutagénesis dirigida a sitio y reacción en cadena de la polimerasa (PCR), según sea apropiado.

Puede usarse cualquier sistema célula huésped/vector adecuado para la expresión de las secuencias de ADN que codifican para el anticuerpo o las moléculas de proteína de fusión de la presente descripción o fragmentos de los mismos. Se pueden usar bacterias, por ejemplo E. coli, y otros sistemas microbianos, en parte, para la expresión de fragmentos de anticuerpos, tales como fragmentos Fab y F(ab')2, y especialmente fragmentos Fv y fragmentos de anticuerpos monocatenarios, por ejemplo Fv de una sola cadena. Pueden usarse sistemas de expresión de células huésped eucariotas, por ejemplo de mamíferos, para la producción de moléculas de anticuerpos más grandes, incluidas moléculas de anticuerpos completas. Células huésped de mamífero adecuadas incluyen, pero no se limitan a, aquellas células y líneas celulares huésped ilustrativas aquí descritas.

La presente descripción también proporciona un proceso para la producción de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o molécula de proteína de fusión de acuerdo con la presente descripción, que comprende cultivar una célula huésped que comprende un vector que codifica para un ácido nucleico de la presente descripción en condiciones adecuadas para la expresión de proteína a partir de ADN que codifique para la molécula de anticuerpo de la presente descripción y aislando la molécula de anticuerpo.

Una molécula de anticuerpo o un fragmento de anticuerpo puede comprender sólo un polipéptido de cadena pesada o ligera, en cuyo caso sólo se necesita usar una secuencia codificante de polipéptido de cadena pesada o de cadena ligera para transfectar las células huésped. Para la producción de productos que comprenden tanto cadenas pesadas como ligeras, la línea celular puede transfectarse con dos vectores, un primer vector que codifique para un polipéptido de cadena ligera y un segundo vector que codifique para un polipéptido de cadena pesada. Como alternativa, se puede usar un solo vector, incluyendo el vector secuencias que codifican para polipéptidos de cadena ligera y cadena pesada.

Alternativamente, los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y proteínas de fusión de acuerdo con la descripción pueden producirse (i) expresando una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la descripción en una célula huésped, por ejemplo empleando un vector de acuerdo con la presente descripción, y (ii) aislar el producto deseado expresado. Además, el método puede incluir (iii) purificar el anticuerpo aislado, el fragmento de unión a antígeno o la proteína de fusión. Las células B transformadas y las células plasmáticas cultivadas pueden seleccionarse para determinar aquellas que producen anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno o proteínas de fusión de la especificidad o función deseada.

El cribado puede llevarse a cabo mediante cualquier inmunoensayo, por ejemplo ELISA, mediante tinción de tejidos o células (incluidas las células transfectadas), mediante ensayo de neutralización o mediante uno de diversos otros métodos conocidos en la técnica para identificar la especificidad o función deseadas. El ensayo puede seleccionar sobre la base del reconocimiento simple de uno o más antígenos o sobre la base adicional de una función deseada, por ejemplo para seleccionar anticuerpos neutralizantes en lugar de solo anticuerpos que se unen al antígeno, para seleccionar anticuerpos que pueden cambiar las características de las células diana, tales como sus cascadas de señalización, su forma, su tasa de crecimiento, su capacidad de influir en otras células, su respuesta a la influencia de otras células o de otros reactivos, o por un cambio en las condiciones, su estado de diferenciación, o similares.

A continuación, se pueden producir clones de células B transformadas individuales a partir del cultivo de células B transformadas positivas. La etapa de clonación para separar clones individuales de la mezcla de células positivas puede llevarse a cabo usando dilución limitante, micromanipulación, deposición de células individuales por clasificación de células u otro método conocido en la técnica.

El ácido nucleico de las células plasmáticas cultivadas puede aislarse, clonarse y expresarse en células HEK293T u otras células huésped conocidas usando métodos conocidos en la técnica.

Los clones de células B inmortalizados o las células huésped transfectadas aquí descritas se pueden usar de varias maneras, por ejemplo como fuente de anticuerpos monoclonales, como fuente de ácido nucleico (ADN o ARNm) que codifique para un anticuerpo monoclonal de interés, para investigación, etc.

Composiciones farmacéuticas

La presente descripción también proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno o una proteína de fusión de acuerdo con la presente descripción, un ácido nucleico de acuerdo con la presente descripción, un vector de acuerdo con la presente descripción y/o una célula de acuerdo con la presente descripción.

Las composiciones farmacéuticas también pueden contener un vehículo, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable. Aunque el vehículo o excipiente puede facilitar la administración, no debe inducir por sí mismo la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que reciba la composición. Tampoco debería ser tóxico. Vehículos adecuados pueden ser macromoléculas grandes, de metabolización lenta, tales como proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas virales inactivas. En general, los vehículos farmacéuticamente aceptables en una composición farmacéutica de acuerdo con la presente descripción pueden ser componentes activos o componentes inactivos.

Pueden usarse sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo sales de ácidos inorgánicos, como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables en una composición farmacéutica pueden contener además líquidos como agua, solución salina, glicerol y etanol. Además, en tales composiciones pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias amortiguadoras del pH. Los vehículos permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como tabletas, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas y suspensiones, para su ingestión por parte del sujeto.

Las composiciones farmacéuticas de la descripción se pueden preparar de diversas formas. Por ejemplo, las composiciones se pueden preparar como inyectables, tal como soluciones o suspensiones líquidas. También se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección (por ejemplo una composición liofilizada, tipo Synagis™ y Herceptin™, para reconstitución con agua estéril que contenga un conservante). La composición se puede preparar para la administración tópica, por ejemplo como un ungüento, crema o polvo. La composición se puede preparar para la administración oral, por ejemplo como una tableta o cápsula, como un aerosol o como un jarabe (opcionalmente aromatizado). La composición se puede preparar para la administración pulmonar, por ejemplo como inhalador, usando un polvo fino o un aerosol. La composición se puede preparar como supositorio o pesario. La composición se puede preparar para la administración nasal, auditiva u ocular, por ejemplo en forma de gotas. La composición puede estar en forma de kit, diseñado de manera que una composición combinada se reconstituya justo antes de la administración a un sujeto. Por ejemplo, se puede proporcionar un anticuerpo liofilizado en forma de kit con agua estéril o un tampón estéril.

En realizaciones particulares, el ingrediente activo en una composición de acuerdo con la presente descripción es una molécula de anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o variante o derivado del mismo, en particular el ingrediente activo en la composición es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una proteína de fusión o variantes y derivados de los mismos como se describen aquí. Así, puede ser susceptible de degradación en el tracto gastrointestinal. Por tanto, si la composición se va a administrar por una vía que use el tracto gastrointestinal, la composición puede contener agentes que protejan al anticuerpo de la degradación, pero que lo liberen una vez haya sido absorbido por el tracto gastrointestinal.

Una discusión detallada de los vehículos farmacéuticamente aceptables se encuentra disponible en Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 2oa edición, ISBN: 0683306472.

Las composiciones farmacéuticas de la descripción pueden tener un pH entre 5,5 y 8,5 y, en algunas realizaciones, éste puede estar entre 6 y 8. En otras realizaciones, el pH de una composición farmacéutica como se describe aquí puede ser de aproximadamente 7. El pH puede mantenerse empleando un tampón. La composición puede ser estéril y/o libre de pirógenos. La composición puede ser isotónica con respecto a los humanos. En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la descripción se suministran en recipientes herméticamente sellados.

Dentro del alcance de la descripción están las composiciones presentes en varias formas de administración; las formas incluyen, pero no se limitan a, aquellas adecuadas para la administración parenteral, por ejemplo mediante inyección o infusión, por ejemplo mediante inyección en bolo o infusión continua. Cuando el producto sea para inyección o infusión, puede adoptar la forma de una suspensión, solución o emulsión en un vehículo oleoso o acuoso y puede contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, conservantes, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, la molécula de anticuerpo puede estar en forma seca para ser reconstituida antes de su uso con un líquido estéril apropiado. Se entiende típicamente que un vehículo es un material adecuado para almacenar, transportar y/o administrar un compuesto, tal como un compuesto farmacéuticamente activo, en particular los anticuerpos de acuerdo con la presente descripción. Por ejemplo, el vehículo puede ser un líquido fisiológicamente aceptable adecuado para almacenar, transportar y/o administrar un compuesto farmacéuticamente activo, en particular los anticuerpos de acuerdo con la presente descripción. Una vez formuladas, las composiciones de la presente descripción se pueden administrar directamente al sujeto. En una realización, las composiciones están adaptadas para su administración a mamíferos, por ejemplo seres humanos.

Las composiciones farmacéuticas aquí descritas se pueden administrar por cualquier número de rutas que incluyen, pero no se limitan a, oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea, tópica, subcutánea, intranasal, enteral, vías sublingual, intravaginal o rectal. También se pueden usar hipoespráis para administrar las composiciones farmacéuticas de la descripción. En realizaciones específicas, la composición farmacéutica se puede preparar para la administración oral, por ejemplo como tabletas, cápsulas y similares, para la administración tópica o como inyectables, por ejemplo como soluciones o suspensiones líquidas. También se pueden usar formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección, por ejemplo cuando la composición farmacéutica está en forma liofilizada.

Para la inyección, por ejemplo inyección intravenosa, cutánea o subcutánea o inyección en el sitio de la aflicción, el ingrediente activo puede proporcionarse en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable libre de pirógenos y con un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Pueden incluirse conservantes, estabilizadores, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, según se requiera.

Si se trata de un polipéptido, péptido o molécula de ácido nucleico, célula u otro compuesto farmacéuticamente útil de acuerdo con la presente descripción que se va a administrar a un individuo, la administración es generalmente en una "cantidad profilácticamente eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "cantidad eficaz" (según sea el caso), que sea suficiente para mostrar un beneficio para el individuo (por ejemplo mejor resultado clínico; disminución o alivio de los síntomas asociados con una enfermedad; disminución de la aparición de síntomas; mejora de la calidad de vida; estado libre de enfermedad más prolongado; disminución de la extensión de la enfermedad, estabilización del estado de la enfermedad; retraso en la progresión de la enfermedad; remisión; supervivencia; o supervivencia prolongada de una manera estadísticamente significativa). La cantidad real administrada y la velocidad y la duración de la administración dependerán de la naturaleza y gravedad de lo que se esté tratando. Para inyección, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente descripción se puede proporcionar, por ejemplo, en una jeringa precargada.

Las composiciones farmacéuticas aquí descritas también se pueden administrar vía oral en cualquier forma de dosificación aceptable por vía oral, incluyendo, entre otras, cápsulas, tabletas, suspensiones o soluciones acuosas. En el caso de las tabletas para uso oral, los vehículos comúnmente usados incluyen lactosa y almidón de maíz. También se añaden típicamente agentes lubricantes, como estearato de magnesio. Para la administración oral en forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando se requieren suspensiones acuosas para uso oral, el ingrediente activo, es decir, la molécula de conjugado de carga transportadora de la invención como se define arriba, se combina con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, también se pueden añadir ciertos agentes edulcorantes, aromatizantes o colorantes.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente descripción también se pueden administrar vía tópica, especialmente cuando el objetivo del tratamiento incluye áreas u órganos fácilmente accesibles mediante aplicación tópica, por ejemplo incluyendo enfermedades de la piel o de cualquier otro tejido epitelial accesible. Se preparan fácilmente formulaciones tópicas adecuadas para cada una de estas áreas u órganos. Para aplicaciones tópicas, la composición farmacéutica se puede formular en una pomada adecuada que contenga la composición farmacéutica de la invención, en particular sus componentes como se definieron anteriormente, suspendidos o disueltos en uno o más vehículos. Los vehículos para la administración tópica incluyen, pero no se limitan a, aceites minerales, vaselina líquida, vaselina blanca, propilenglicol, polioxietileno, compuesto de polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Como alternativa, la composición farmacéutica se puede formular en una loción o crema adecuada. En el contexto de la presente descripción, los vehículos adecuados incluyen, pero no se limitan a, aceite mineral, monoestearato de sorbitano, polisorbato 60, cera de cetil ésteres, alcohol cetearílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua.

Las dosis pueden expresarse en relación con el peso corporal. Por tanto, una dosis que se expresa como [g, mg u otra unidad]/kg (o g, mg, etc.) generalmente se refiere a [g, mg u otra unidad] "por kg (o g, mg, etc.) de peso corporal", incluso si el término "peso corporal" no se menciona explícitamente.

En realizaciones específicas, en una sola dosis, por ejemplo, una dosis diaria, semanal o mensual, la cantidad del anticuerpo o de fragmento de unión a antígeno del mismo en la composición farmacéutica no excede de 1 g. En ciertas de tales realizaciones, la dosis única no excede una dosis seleccionada entre 500 mg, 250 mg, 100 mg y 50 mg.

En algunas realizaciones, una composición o kit como los aquí descritos comprende además (i) un inhibidor de la polimerasa, donde el inhibidor de la polimerasa comprende opcionalmente Lamivudina, Adefovir, Entecavir, Telbivudina, Tenofovir o cualquier combinación de los mismos; (ii) un interferón, donde el interferón comprende opcionalmente IFNbeta y/o IFNalfa; (iii) un inhibidor de punto de control, donde el inhibidor de punto de control comprende opcionalmente un anticuerpo anti-PD-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo anti-PD-L1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y/o un anticuerpo anti-CTLA4 o un fragmento de unión a del mismo; (iv) un agonista de una molécula de punto de control inmunitario estimulante; o (v) cualquier combinación de (i)-(iv). En algunas realizaciones, un kit comprende una composición o combinación como se describe aquí y además instrucciones para usar el componente para prevenir, tratar, atenuar y/o diagnosticar una infección por hepatitis B y/o una infección por hepatitis D.

En determinadas realizaciones, se usa una composición de la presente descripción (por ejemplo anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, célula huésped, ácido nucleico, vector o composición farmacéutica) en combinación con un inhibidor de PD-1, por ejemplo un anticuerpo específico de PD-1 o un fragmento de unión del mismo, tal como pidilizumab, nivolumab, pembrolizumab, MEDI0680 (anteriormente AMP-514), AMP-224, BMS-936558 o cualquier combinación de los mismos.

En determinadas realizaciones, se usa una composición de la presente descripción en combinación con un anticuerpo específico de PD-L1 o de un fragmento de unión del mismo, tal como BMS-936559, durvalumab (MEDI4736), atezolizumab (RG7446), avelumab (MSB0010718C), MPDL3280A o cualquier combinación de los mismos.

En ciertas realizaciones, una composición de la presente descripción se usa en combinación con un inhibidor de LAG3, tal como LAG525, IMP321, IMP701, 9H12, BMS-986016 o cualquier combinación de los mismos.

En ciertas realizaciones, se usa una composición de la presente descripción en combinación con un inhibidor de CTLA4. En realizaciones particulares, una composición de la presente descripción se usa en combinación con un anticuerpo específico de CTLA4 o un fragmento de unión del mismo, tal como ipilimumab, tremelimumab, proteínas de fusión CTLA4-Ig (por ejemplo abatacept, belatacept), o cualquier combinación de los mismos.

En determinadas realizaciones, se usa una composición de la presente descripción en combinación con un anticuerpo específico de B7-H3 o un fragmento de unión del mismo, tal como enoblituzumab (MGA271), 376.96 o ambos. Un fragmento de unión de anticuerpo B7-H3 puede ser un scFv o una proteína de fusión del mismo, tal como se describe, por ejemplo, en Dangaj et al., Cancer Res. 73: 4820, 2013, así como los descritos en la patente de EE.UU. N°. 9.574.000 y las publicaciones de patente PCT. WO/201640724A1 y WO 2013/025779A1.

En ciertas realizaciones, se usa una composición de la presente descripción en combinación con un inhibidor de CD244.

En determinadas realizaciones, se usa una composición de la presente descripción en combinación con un inhibidor de BLTA, HVEM, CD160 o cualquier combinación de los mismos. Los anticuerpos anti CD-160 se describen, por ejemplo, en la publicación PCT WO 2010/084158.

En ciertas realizaciones, se usa una composición de la presente descripción en combinación con un inhibidor de TIM3.

En ciertas realizaciones, se usa una composición de la presente descripción en combinación con un inhibidor de Gal9.

En ciertas realizaciones, se usa una composición de la presente descripción en combinación con un inhibidor de la señalización de adenosina, tal como un receptor de adenosina señuelo.

En determinadas realizaciones, se usa una composición de la presente descripción en combinación con un inhibidor de A2aR.

En determinadas realizaciones, se usa una composición de la presente descripción en combinación con un inhibidor de KIR, tal como lirilumab (BMS-986015).

En determinadas realizaciones, una composición de la presente descripción se usa en combinación con un inhibidor de una citocina inhibidora (típicamente una citoquina distinta de TGFp) o desarrollo o actividad de Treg.

En ciertas realizaciones, se usa una composición de la presente descripción en combinación con un inhibidor de IDO, tal como levo-1-metil-triptófano, epacadostat (INCB024360; Liu et al., Blood 115:3520-30, 2010), ebselen (Terentis et al., Biochem. 49:591-60o, 2010), indoximod, NLG919 (Mautino et al., American Association for Cancer Research 104th Annual Meeting 2013; Apr 6-10, 2013), 1 -metil-triptófano (1-MT)-tira-pazamina, o cualquier combinación de los mismos.

En ciertas realizaciones, una composición de la presente descripción se usa en combinación con un inhibidor de arginasa, tal como metil éster de N (omega)-Nitro-L-arginina (L-NAME), N-omega-hidroxi-norl-arginina (nor-NOHA), L-NOHA, ácido 2(S)-amino-6-boronohexanoico (ABH), S-(2-boronoetil)-L-cisteína (BEC) o cualquier combinación de los mismos.

En ciertas realizaciones, se usa una composición de la presente descripción en combinación con un inhibidor de VISTA, tal como CA-170 (Curis, Lexington, Mass.).

En determinadas realizaciones, se usa una composición de la presente descripción en combinación con un inhibidor de TIGIT tal como, por ejemplo, COM902 (Compugen, Toronto, Ontario Canadá), un inhibidor de CD155, tal como, por ejemplo, COM701 (Compugen), o ambos.

En determinadas realizaciones, se usa una composición de la presente descripción en combinación con un inhibidor de PVRIG, PVRL2 o ambos. Los anticuerpos anti-PVRIG se describen, por ejemplo, en la publicación de PCTWO 2016/134333. Los anticuerpos anti-PVRL2 se describen, por ejemplo, en la publicación de PCTWO 2017/021526.

En ciertas realizaciones, se usa una composición de la presente descripción en combinación con un inhibidor de LAIR1.

En determinadas realizaciones, se usa una composición de la presente descripción en combinación con un inhibidor de CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5 o cualquier combinación de los mismos.

En ciertas realizaciones, se usa una composición de la presente descripción en combinación con un agente que aumenta la actividad (es decir, es un agonista) de una molécula estimuladora del punto de control inmunológico. Por ejemplo, una composición de la presente descripción se puede usar en combinación con un agonista de CD137 (4-1BB) (tal como urelumab), un agonista de CD134 (OX-40) (tal como MEDI6469, MEDI6383 o MEDI0562), lenalidomida, pomalidomida, un agonista de CD27 (tal como CDX-1127), un agonista de CD28 (tal como TGN1412, CD80 o CD86), un agonista de CD40 (tal como CP-870.893, rhuCD40L o SGN-40), un agonista de CD122 (tal como IL-2), un agonista de GITR (tal como los anticuerpos monoclonales humanizados descritos en la publicación de patente PCT WO 2016/054638), un agonista de ICOS (CD278) (tal como GSK3359609, mAb 88.2, JTX-2011, Icos 145-1, Icos 314-8 o cualquier combinación de los mismos). En cualquiera de las realizaciones aquí descritas, un método puede comprender administrar una composición de la presente descripción con uno o más agonistas de una molécula de punto de control inmunitario estimulante, incluyendo cualquiera de los anteriores, individualmente o en cualquier combinación.

Un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno o una proteína de fusión de acuerdo con la presente descripción puede estar presente en la misma composición farmacéutica que el componente activo adicional o el anticuerpo, el fragmento de unión a antígeno o la proteína de fusión de acuerdo con la presente descripción puede incluirse en una primera composición farmacéutica y el componente activo adicional pueden incluirse en una segunda composición farmacéutica diferente de la primera composición farmacéutica.

Usos

En otro aspecto, la presente descripción proporciona métodos para el uso de un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno, una proteína de fusión, un ácido nucleico, un vector, una célula o una composición farmacéutica o kit de acuerdo con la presente descripción en i) la profilaxis, el tratamiento o la atenuación de la hepatitis B y/o la hepatitis D; o (ii) en el diagnóstico de hepatitis B y/o de la hepatitis D (por ejemplo en un sujeto humano).

Los métodos de diagnóstico (por ejemploin vitro, ex vivo)pueden incluir poner en contacto un anticuerpo, fragmento de anticuerpo (por ejemplo un fragmento de unión a antígeno) o una proteína de fusión con una muestra. Tales muestras pueden aislarse de un sujeto, por ejemplo una muestra de tejido aislada tomada de, por ejemplo, conductos nasales, cavidades sinusales, glándulas salivales, pulmón, hígado, páncreas, riñón, oído, ojo, placenta, tracto digestivo, corazón, ovarios, pituitaria, suprarrenales, tiroides, cerebro, piel o sangre. Los métodos de diagnóstico también pueden incluir detectar un complejo antígeno/anticuerpo o antígeno/proteína de fusión, en particular después del contacto de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o proteína de fusión con una muestra. Este paso de detección se realiza típicamente en el banco, es decir, sin contacto con el cuerpo humano o animal. Son bien conocidos ejemplos de métodos de detección por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas).

La descripción también proporciona el uso de (i) un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una proteína de fusión o variantes y derivados de los mismos de acuerdo con la descripción, (ii) una célula huésped (que puede ser una célula B inmortalizada) de acuerdo con la descripción, (iii) un ácido nucleico o un vector de acuerdo con la presente descripción o (iv) una composición farmacéutica de la descripción en (a) la fabricación de un medicamento para la prevención, tratamiento o atenuación de la hepatitis B y/o hepatitis D o (b) para el diagnóstico de hepatitis B y/o hepatitis D.

La descripción también proporciona un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno o una proteína de fusión de acuerdo con la presente descripción, un ácido nucleico de acuerdo con la presente descripción, un vector de acuerdo con la presente descripción, una célula de acuerdo con la presente descripción o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente descripción para su uso como medicamento para la prevención o el tratamiento de la hepatitis B y/o la hepatitis D. También proporciona el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o proteína de fusión de la descripción en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o diagnóstico de un sujeto. También proporciona un método para tratar a un sujeto (por ejemplo un sujeto humano), que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición como la aquí descrita. En algunas realizaciones, el sujeto puede ser un ser humano. Una forma de comprobar la eficacia del tratamiento terapéutico implica monitorizar los síntomas de la enfermedad después de la administración de la composición. El tratamiento puede ser un programa de dosis única o un programa multidosis.

En una modalidad, un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, proteína de fusión, célula huésped (por ejemplo clon de célula B inmortalizada o célula T, célula NK-T o célula NK que expresa una proteína de fusión), o la composición farmacéutica de acuerdo con la descripción se administra a un sujeto que necesite el tratamiento. Tal sujeto incluye, pero no se limita a, uno que está particularmente en riesgo o es susceptible a la hepatitis B y/o hepatitis D.

Los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, proteínas de fusión, polinucleótidos, vectores, células huésped, composiciones farmacéuticas y sus combinaciones de acuerdo con la presente descripción también pueden usarse en un kit para la prevención, tratamiento, atenuación y/o diagnóstico de hepatitis B y/o hepatitis D. En algunas realizaciones, un kit comprende además instrucciones para usar el componente para prevenir, tratar, atenuar y/o diagnosticar una infección por hepatitis B y/o una infección por hepatitis D. Además, el epítopo en la región del bucle antigénico de HBsAg, que es capaz de unirse a un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o proteína de fusión de la descripción como se describe aquí puede usarse en un kit para monitorear la eficacia de los procedimientos de aplicación mediante la detección de la presencia o la determinación del título de anticuerpos protectores anti-HBV.

En determinadas realizaciones, una composición o un kit de esta descripción comprende además: un inhibidor de la polimerasa, donde el inhibidor de la polimerasa comprende opcionalmente Lamivudina, Adefovir, Entecavir, Telbivudina, Tenofovir o cualquier combinación de los mismos; (ii) un interferón, donde el interferón comprende opcionalmente IFNbeta y/o IFNalfa; (iii) un inhibidor de punto de control, donde el inhibidor de punto de control comprende opcionalmente un anticuerpo anti-PD-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo anti-PD-L1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y/o un anticuerpo anti-CTLA4 o un fragmento de unión a antígeno del mismo; (iv) un agonista de una molécula de punto de control inmunitario estimulante; o (v) cualquier combinación de (viii)-(xii).

En algunas realizaciones, un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno o una proteína de fusión de acuerdo con la presente descripción, un ácido nucleico de acuerdo con la presente descripción, el vector de acuerdo con la presente descripción, la célula de acuerdo con la presente descripción o la composición farmacéutica de acuerdo con a la presente descripción se usa en el tratamiento o la atenuación de la infección crónica por hepatitis B.

En realizaciones particulares, un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno o una proteína de fusión de acuerdo con la presente descripción (i) neutraliza la infección por HBV, (ii) se une a L-HBsAg (la proteína grande de la envoltura del HBV, presente en las partículas infecciosas de HBV), evitando así la propagación del HBV, (iii) se une a S-HBsAg, promoviendo así la supresión de partículas subvirales (SVP) y/o (iv) puede inducir la seroconversión, es decir, una respuesta inmune activa al virus.

En realizaciones particulares, el anticuerpo, el fragmento de unión a antígeno o la proteína de fusión de acuerdo con la presente descripción, un ácido nucleico de acuerdo con la presente descripción, un vector de acuerdo con la presente descripción, una célula de acuerdo con la presente descripción o una composición farmacéutica de acuerdo con la presente descripción pueden usarse en la prevención de la (re)infección por hepatitis B después de un trasplante de hígado, en particular para la insuficiencia hepática inducida por hepatitis B.

En realizaciones adicionales, un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno del mismo o una proteína de fusión de acuerdo con la presente descripción, un ácido nucleico de acuerdo con la presente descripción, un vector de acuerdo con la presente descripción, una célula de acuerdo con la presente descripción o una composición farmacéutica de acuerdo con la presente descripción pueden usarse en la prevención/profilaxis de la hepatitis B en sujetos no inmunizados. Esto es, por ejemplo, en caso de (supuesta) exposición accidental al HBV (profilaxis posterior a la exposición). El término "sujetos no inmunizados" incluye sujetos que nunca recibieron una vacuna y, por tanto, no están inmunizados y sujetos que no mostraron una respuesta inmune (por ejemplo anticuerpos anti-hepatitis B no medibles) después de la vacunación.

En algunas realizaciones, un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno o una proteína de fusión de acuerdo con la presente descripción, el ácido nucleico de acuerdo con la presente descripción, un vector de acuerdo con la presente descripción, una célula de acuerdo con la presente descripción o una composición farmacéutica de acuerdo con la presente descripción se usan en la profilaxis de la hepatitis B en pacientes hemodializados.

En algunas realizaciones, un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno o una proteína de fusión de acuerdo con la presente descripción, un ácido nucleico de acuerdo con la presente descripción, un vector de acuerdo con la presente descripción, una célula de acuerdo con la presente descripción o una composición farmacéutica de acuerdo con la presente descripción se usan en la prevención de la hepatitis B en un recién nacido. En tales realizaciones, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente descripción, un ácido nucleico de acuerdo con la presente descripción, un vector de acuerdo con la presente descripción, una célula de acuerdo con la presente descripción o una composición farmacéutica de acuerdo con la presente descripción pueden administrarse al nacer o tan pronto como sea posible después del nacimiento. La administración puede repetirse hasta la seroconversión después de la vacunación.

Además, la presente descripción también proporciona el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o proteína de fusión de acuerdo con la presente descripción, un ácido nucleico de acuerdo con la presente descripción, un vector de acuerdo con la presente descripción, una célula de acuerdo con la presente descripción o una composición farmacéutica de acuerdo con la presente descripción en el diagnóstico (por ejemploin vitro, ex vivooin vivo)de la hepatitis B y/o la hepatitis D.

Además, se proporciona el uso de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o proteína de fusión de acuerdo con la presente descripción, un ácido nucleico de acuerdo con la presente descripción, un vector de acuerdo con la presente descripción, una célula de acuerdo con la presente descripción o una composición farmacéutica de acuerdo con la presente descripción para determinar si una muestra de sangre aislada está infectada con el virus de la hepatitis B y/o el virus de la hepatitis delta.

Como se describió anteriormente, los métodos de diagnóstico pueden incluir poner en contacto un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o proteína de fusión con una muestra. Tales muestras pueden aislarse de un sujeto, por ejemplo una muestra de tejido aislada tomada de, por ejemplo, conductos nasales, cavidades sinusales, glándulas salivales, pulmón, hígado, páncreas, riñón, oído, ojo, placenta, tracto digestivo, corazón, ovarios, pituitaria, suprarrenales, tiroides, cerebro, piel o sangre. Los métodos de diagnóstico también pueden incluir la detección de un complejo antígeno/anticuerpo, en particular después del contacto de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo con una muestra. Este paso de detección se realiza típicamente en el banco, es decir, sin contacto con el cuerpo humano o animal. Los ejemplos de métodos de detección son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas).

La presente descripción también proporciona un método para tratar, prevenir y/o atenuar la hepatitis B y/o la hepatitis D en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o proteína de fusión de acuerdo con la presente descripción, un ácido nucleico de acuerdo con la presente descripción, un vector de acuerdo con la presente descripción, una célula de acuerdo con la presente descripción o una composición farmacéutica de acuerdo con la presente descripción. En ciertos aspectos, un método comprende además administrar al sujeto uno o más de: (vii) un inhibidor de la polimerasa, donde el inhibidor de la polimerasa comprende opcionalmente Lamivudina, Adefovir, Entecavir, Telbivudina, Tenofovir o cualquier combinación de los mismos; (viii) un interferón, donde el interferón comprende opcionalmente IFNbeta y/o IFNalfa; (ix) un inhibidor de punto de control, donde el inhibidor de punto de control comprende opcionalmente un anticuerpo anti-PD-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo anti-PD-L1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y/o un anticuerpo anti-CTLA4 o unión a antígeno fragmento del mismo; (x) un agonista de una molécula de punto de control inmunitario estimulante; o (xi) cualquier combinación de (vii)-(x).

En algunas realizaciones, la infección por hepatitis B es una infección crónica por hepatitis B. En algunas realizaciones, el sujeto ha recibido un trasplante de hígado. En algunas realizaciones, el sujeto no está inmunizado contra la hepatitis B. En ciertas realizaciones, el sujeto es un recién nacido. En algunas realizaciones, el sujeto se somete o se ha sometido a hemodiálisis.

La presente descripción también proporciona un método para tratar a un sujeto que ha recibido un trasplante de hígado que comprende administrar al sujeto que ha recibido el trasplante de hígado una cantidad eficaz de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o proteína de fusión de acuerdo con la presente descripción, un ácido nucleico de acuerdo con la presente descripción, un vector de acuerdo con la presente descripción, una célula de acuerdo con la presente descripción o una composición farmacéutica de acuerdo con la presente descripción.

También se proporcionan aquí métodos para detectar la presencia o ausencia de un epítopo en una conformación correcta en una vacuna anti-hepatitis-B y/o anti-hepatitis-D, comprendiendo los métodos: (i) poner en contacto la vacuna con un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o proteína de fusión cualesquiera de la presente descripción; y (ii) determinar si se ha formado un complejo que comprenda un antígeno y el anticuerpo, o que comprenda un antígeno y el fragmento de unión a antígeno, o que comprenda un antígeno y la proteína de fusión.

El término "vacuna" tal como se usa aquí se entiende típicamente como un material profiláctico o terapéutico que proporciona al menos un antígeno, tal como un inmunógeno. El antígeno o inmunógeno puede derivarse de cualquier material adecuado para la vacunación. Por ejemplo, el antígeno o inmunógeno puede derivarse de un patógeno, tal como de partículas bacterianas, virales, de un tumor (incluido un tumor sólido o líquido) u otro tejido canceroso. El antígeno o inmunógeno estimula el sistema inmunológico adaptativo del cuerpo para proporcionar una respuesta inmunitaria adaptativa. En ciertas realizaciones, un "antígeno" o un "inmunógeno" se refiere a una sustancia que puede ser reconocida por el sistema inmunológico, por ejemplo por el sistema inmune adaptativo, y que es capaz de desencadenar una respuesta inmune específica de antígeno, por ejemplo mediante la formación de anticuerpos y/o células T específicas de antígeno, como parte de una respuesta inmune adaptativa. En algunas realizaciones, un antígeno puede ser o puede comprender un péptido o proteína que puede ser presentado por un complejo MHC (por ejemplo MHC clase I; MHC clase II) a las células T. En determinadas realizaciones, el antígeno comprende un antígeno de HBV y/o HBD, por ejemplo un antígeno HBsAg.

En algunos casos, los elementos de los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, proteínas de fusión, ácidos nucleicos, células, composiciones, usos y métodos aquí proporcionados se describen o enumeran con referencia a realizaciones o ejemplos. Sin embargo, debe entenderse que los ejemplos y realizaciones descritos en el presente documento pueden combinarse de diversas formas para crear realizaciones adicionales.

Ejemplos

A continuación, se presentan ejemplos particulares que ilustran diversas realizaciones y aspectos de la descripción.

Ejemplo 1: Generación y ensayo de anticuerpos diseñados

El análisis de algunas variantes del anticuerpo HBC34 de la publicación PCT WO 2017/060504 reveló un aminoácido cisteína en la posición 40 (numeración IMGT) en la región variable de la cadena ligera que no está emparejado y representa un riesgo potencial. Sin desear estar ligados a la teoría, los residuos de cisteína no apareados son potencialmente reactivos y pueden desencadenar potencialmente la agregación a través de la formación de disulfuro intramolecular o de disulfuro intermolecular. Se diseñaron variantes de HBC34-V7 (WO 2017/060504) en las que el aminoácido cisteína en la posición 40 de la región variable de la cadena ligera se sustituyó con una serina (generando así "HBC34-V34") o con una alanina (generando así "HBC34-V35"). Las secuencias de nucleótidos que codifican para estos anticuerpos variantes adicionales se optimizaron por codón y los anticuerpos se expresaron como IgG1 (g1m17, alotipo 1) en células ExpiCHOTM (ThermoFisher). Las secuencias de nucleótidos con codón optimizado que codifican para los dominios VH y VL de HBC34-V35 se proporcionan en las SEQ ID NO: 103 y 104, respectivamente.

La capacidad de HBC34-V34 y HBC34-V35 para unirse al antígeno se investigó usando un ELISA de unión directa a antígeno. Se usó HBC34-V7 como comparador. Como se muestra en la figura 1, tanto HBC34-V34 como HBC34-V35 se unieron eficazmente a dos antígenos HBsAg recombinantes ("adw", panel superior; "adr", panel inferior) y HBC34-V35 tenía una unión muy similar a la parental HBC34- V7.

Se examinaron los anticuerpos variantes para determinar su unión a todos los genotipos de HBsAg conocidos (figuras 2A-2J). Brevemente, se transfectaron células epiteliales humanas (células Hep2) con plásmidos que expresan el HBsAg de cada uno de los 10 genotipos A, B, C, D, E, F, G, H, I y J del HBV. Todos los anticuerpos se ensayaron a varias concentraciones para la tinción de células permeabilizadas transitoriamente transfectadas. Dos días después de la transfección, se recolectaron las células Hep2, se fijaron y se permeabilizaron con saponina para inmunotinción con HBC34 y las cinco variantes seleccionadas. Se incluyó HBC34-V7 como comparador. La unión de los anticuerpos a las células transfectadas se analizó usando un Becton Dickinson FACSCanto2TM (BD Biosciences) con el software FlowJo (TreeStar). Como se muestra en las figuras 2A-2J, HBC34-V34 y HBC34-V35 reconocieron los 10 genotipos de HBV HBsAg. HBC34-V35 mostró una tinción algo más fuerte que HBC34-V34.

Estos datos muestran que las variantes de anticuerpos HBC34-V34 y HBC34-V35 reconocen y se unen ampliamente a HBsAG a niveles comparables a HBC34-V7.

Ejemplo 2: Los anticuerpos anti-HBsAg con regiones Fc modificadas se unen eficazmente al antígeno

Las modificaciones en la región Fc pueden proporcionar ventajas a un anticuerpo terapéutico. HBC34-V35 se expresó como IgG1 con Fc tipo salvaje o con Fc que contiene una mutación "MLNS" (M428L/N434S) o con Fc que contiene MLNS en combinación con una mutación "GAALIE" (G239A/A330L/I332E). Se ensayó la unión de cada constructo a HBsAg recombinante (adw) en dos experimentos ELISA de unión a antígeno separados. Se probaron tres (3) lotes de HBC34-v35 (Fc tipo salvaje). Se probaron dos (2) lotes de HBC34-V35-MLNS y dos (2) lotes de HBC34-V35-MLNS-G<a>A<l>IE. Se probó HBC34v7 (un lote) como comparador.

Como se muestra en las figuras 3A y 3B, las mutaciones Fc introducidas no afectaron la actividad de unión al antígeno de HBC34-V35. Los valores de EC50 variaron algo entre los diversos constructos y los dos experimentos y en general fueron bajos.

Se evaluó la unión de HBC34-V35 con mutaciones MLNS o MLNS y GAALIE a células EXPI293 que expresan genotipos de HBsAg (figuras 2A-2J) o variantes de HBsAg. Se usó HBC34-V35 con IgG1 Fc tipo salvaje como comparador. Los datos que muestran la unión a genotipos de HBsAg se muestran en las figuras 3C-3H. Los datos que muestran la unión a variantes de HBsAg se muestran en las figuras 3I-3R.

Ejemplo 3: Actividad de neutralizaciónin vitrode anticuerpos

Se comparó la capacidad neutralizante de HBC34, HBC34-V35, HBC34-V35-MLNS y HBC34-V35-MLNS-GAALIE midiendo los niveles de HBsAg (figura 3A) y HBeAg (figura 3B) en el sobrenadante del cultivo celular de células HepG2 infectadas con HBV que expresaban NTCP. Los datos se muestran en las figuras 3S-3V y representan las medias ± DE de uno de los dos experimentos independientes.

Ejemplo 4: Capacidad de neutralización pan-genotipo de HBC34-V35 MLNS-GAALIE evaluada en un pseudosistema de HDV

Para confirmar la amplitud de la neutralización de HBC34-V35-MLNS-GAALIE frente al virus del HBV, se llevaron a cabo ensayos de neutralización con HBC34-V35-MLNS-GAALIE frente a ocho genotipos de HBV humanos prevalentes. Se empleó un sistemain vitroque aprovecha el virus de la hepatitis D (HDV) diseñado para expresar HBV HBsAg que representa diferentes genotipos. En resumen, tanto el HBV como el HDV comparten las mismas proteínas de envoltura, su vía de entrada viral a través de proteoglicanos de heparán sulfato y NTCP es idéntica y el HDV puede usarse como sistema modelo para estudiar la entrada viral mediada por HBsAg (Tu 2018; Lempp 2016). Además, el HDV se puede envolver/pseudotipificar con HBsAg de diferentes genotipos de HBV y posteriormente usarse en estudios de infección (Freitas 2014).

HBC34-V35-MLNS-GAALIE mostró capacidad neutralizante para todos los genotipos probados con valores de EC50 similares, que van de 0,92 ng/ml (genotipo C) a 2,34 ng/ml (genotipo A). Estos resultados muestran que HBC34-V35-MLNS-GAALIE es capaz de neutralizar virus infecciosos portadores de HBsAg de los ocho genotipos de HBV ensayados, apoyando la actividad de neutralización pan-genotípicain vivode HBC34-V35-MLNS-GAALIE (figura 4).

Ejemplo 5: Supresión de antígenos HB e inhibición de la entrada viral en un modeloin vivo

Se usó un ratón inmunodeficiente que tenía hepatocitos humanos trasplantados para probar la eficacia de los anticuerpos anti-HBV de la presente descripción de suprimir HBsAg. Brevemente, se trasplantaron hepatocitos humanos primarios en ratones SCID para los que previamente se habían destruido enzimáticamente hepatocitos de ratón. Los ratones eran deficientes en células T y B. Este modelo es útil para estudiar la infección por HBV, incluida la entrada, la propagación, la regulación del ADNccc, las respuestas inmunitarias intrínsecas de los hepatocitos y la integración viral en el genoma del anfitrión.

Los ratones se inocularon mediante inyección en la vena de la cola con HBV, genotipo C, a 1,0x107 genomas virales por ratón en el día -28. Tratamientos en el día 0 después de la medición inicial del HBV. A los ratones infectados con HBV (n = 4 por grupo de tratamiento) se les administró PBS (control) o HBC34-V35 (1, 5 o 15 mg/kg i.p., 2x/semana). Los anticuerpos se murinizaron con la excepción de las regiones Fab de unión a antígeno.

Se recolectaron muestras de plasma y suero periódicamente a lo largo del estudio y se midieron las cargas virales, el ADN del HBV (por PCR) y el Ag h B (HBsAg, HBeAg, HBcrAg). Los ratones se sacrificaron en la semana 6.

Como se muestra en las figuras 5-8, el tratamiento con la dosis más alta probada de HBC34-V35 redujo la carga viral y la entrada viral en los hepatocitos.

Ejemplo 6: Estudios de función efectorain vitro

Se llevaron a cabo estudiosin vitropara examinar la capacidad de los anticuerpos HBC34 con Fc modificado para: (1) unirse a FcR humanos y complementar; (2) activar FcYRIIa, FcYRIlb y FcYRIIIa; y (3) promover la ADCC y activar las células asesinas naturales (NK) humanas. Los artículos de ensayo, las líneas celulares y los reactivos usados se describen en las Tablas 5-7, a continuación. En este ejemplo se usan las siguientes abreviaturas: GLP = buenas prácticas de laboratorio; ADCC = citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos; ADCP = fagocitosis celular dependiente de anticuerpos; Fc = fragmento cristalizable; HBsAg = antígeno de superficie de la hepatitis B; mAb = anticuerpo monoclonal; PBS = solución salina tamponada con fosfato; UHpL-SEC = cromatografía de exclusión por tamaño de líquidos de ultra alto rendimiento; ATCC = Colección Americana de Tipos de Cultivos; F<cy>R<s>= receptor (es) de Fc gamma; células CHO = células de ovario de hámster chino; RLU = unidades de luminiscencia relativa; BLI = interferometría de biocapa.

Tabla 5. Artículos de ensa o

Tabla 6. Líneas celulares

Tabla 7. Otros reactivos

Procedimientos experimentales

Medida de la unión a receptores Fc humanos

La unión de HBC34-V35-MLNS y HBC34-V35-MLNS-GAALIE a F<cy>R humanos se midió en un instrumento Octet® (BLI, interferometría de biocapa; FortéBio). Brevemente, los FcyR humanos marcados con His (alelo H131 de FcYRIIa, alelo R131 de FcYRIIa, alelo F158 de FcYRIlAa, alelo V158 de FcYRIIIa y FcYRIIb) a 2 |jg/ml se capturaron en sensores anti-penta-His durante 6 minutos. Los sensores cargados con F<cy>R se expusieron luego durante 4 minutos a una solución de tampón cinético (pH 7,1) que contenía 2 jg/m l de cada mAb en presencia de 1 jg/m l de affiniPure F(ab')2 Fragmento de IgG antihumano de cabra, F(ab')2 específico del fragmento (para reticular mAb humanos a través del fragmento Fab), seguido de un paso de disociación en el mismo tampón durante 4 minutos adicionales (parte derecha de la gráfica). Los perfiles de asociación y disociación se midieron en tiempo real como cambio en el patrón de interferencia usando un Octet® RED96 (FortéBio). La unión de HBC34-V35-MLNS-GAALIE, HBC34-V35-MLNS o HBC34-V35 en solución a FcRn humano inmovilizado se midió mediante Octet en tiempo real a pH = 6,0 o pH = 7,4.

Medida de la unión a la proteína C1q del complemento humano

La unión de HBC34-V35-MLNS y HBC34-V35-MLNS-GAALIE al complemento humano se midió en un instrumento Octet® (BLI, interferometría de biocapa; FortéBio). Brevemente, se usaron sensores anti-Fab humano (específicos de CH1) para capturar, a través del fragmento Fab, la IgG1 completa de los mAb HBC34-V35-MLNS y HBC34-V35-MLNS-GAALIE a 10 jg/m l durante 10 minutos. A continuación, los sensores cargados con IgG se expusieron durante 4 minutos a una solución de tampón cinético (pH 7,1) que contenía 3 jg/m l de C1q humano purificado (parte izquierda de la gráfica), seguido de un paso de disociación en el mismo tampón durante 4 minutos más (parte derecha de la gráfica). Los perfiles de asociación y disociación se midieron en tiempo real como cambio en el patrón de interferencia usando un Octet® RED96 (FortéBio).

Preparación de células NK humanas a partir de sangre completa

Se asilaron en el momento células NK de sangre completa con EDTA usando el kit de aislamiento MACSxpress® NK siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se mezcló sangre anticoagulada en un tubo de 50 ml con 15 ml del cóctel de aislamiento NK y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente usando un rotador a aproximadamente 12 rondas por minuto. A continuación, el tubo se colocó en el campo magnético del separador MACSxpress® durante 15 minutos. Las células marcadas magnéticamente se adhieren a la pared del tubo mientras que los eritrocitos agregados se sedimentan en el fondo. A continuación, se recogieron las células NK objetivo del sobrenadante mientras el tubo todavía estaba dentro del Separador MACSxpress®. Las células NK se centrifugaron, se trataron con agua destilada para suprimir los eritrocitos residuales, se centrifugaron de nuevo y finalmente se resuspendieron en medio AIM-V.

Determinación de la muerte de células NK dependientes de anticuerpos

Se diluyeron MAb en serie 10 veces en medio AIM-V de 100 jg/m l a 0,001 jg/ml. Se añadieron células diana (pLC/PRF/5; MacNab, et al., British Journal of Cancer, 34 (5), 1976) en una placa de 384 pocillos de fondo redondo a 7,5 x 103 células/pocillo en 23 jl, luego se añadieron anticuerpos diluidos en serie a cada pocillo (23 j l por pocillo) y la mezcla anticuerpo/célula se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de incubación, se añadieron células NK humanas a una densidad celular de 7,5x104/pocillo en 23 pl, produciendo una relación efector:diana de 10:1. También se incluyeron pocillos de control que se usaron para medir la lisis máxima (que contenía células diana con 23 j l de Triton x-100 al 3%) y la lisis espontánea (que contenía células diana y células efectoras sin anticuerpo). Las placas se incubaron durante 4 horas a 37°C con 5% de CO2. La muerte celular se determinó midiendo la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) usando un kit de detección de LDH de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las placas se centrifugaron durante 4 minutos a 400xg y se transfirieron 35 j l de sobrenadante a una placa plana de 384 pocillos. Se preparó el reactivo LDH y se añadieron 35 j l a cada pocillo. Usando un protocolo cinético, se midió la absorbancia a 490 nm y 650 nm una vez cada 2 minutos durante 8 minutos. El porcentaje de lisis específica se determinó aplicando la siguiente fórmula: (liberación específica - liberación espontánea)/(liberación máxima - liberación espontánea) x 100.

Determinación de la activación de células NK dependiente de anticuerpos

La activación de células NK primarias se ensayó usando células recién aisladas de dos donantes que habían sido previamente genotipificados para expresar FcYRIIIa de afinidad alta (alelo V158) o baja (alelo F158) homocigota. Se incubaron diluciones en serie de mAb (diluidas en serie 10 veces en medio AIM-V de 100 |jg/ml a 0,0001 jg/m l) con células NK durante 4 horas. La activación de las células NK se midió mediante citometría de flujo mediante la tinción de las células NK con mAb anti-CD107a (anti-CD107 PE, BioLegend®, usado diluido 1/35) como marcador funcional para la actividad de las células NK.

Determinación de la activación dependiente de anticuerpos de FcYRIIIa humano

HBC34-V35-MLNS y HBC34-V35-MLNS-GAALIE se diluyeron en serie 4 veces en tampón de ensayo ADCC de 5 jg /m l a 0,076 jg/ml. Se añadió el antígeno objetivo (HBsAg de Engerix B, Glaxo SmithKline) en una placa blanca de 96 pocillos de fondo plano a 0,6 jg/m l en 25 jl, luego se añadieron anticuerpos diluidos en serie a cada pocillo (25 j l por pocillo) y el anticuerpo/mezcla de células se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células efectoras para el bioensayo de ADCC se descongelaron y se añadieron a una densidad celular de 7,5 x 104/pocillo en 25 pl (la concentración final de HBsAg fue 0,2 pg/ml). También se incluyeron pocillos de control que se usaron para medir la activación independiente del anticuerpo (que contenía HBsAg y células efectoras, pero no anticuerpo) y la luminiscencia espontánea de la placa (pocillos que contenían únicamente el tampón de ensayo ADCC). Las placas se incubaron durante 24 horas a 37°C con 5% de CO2. La activación de FcYRIIIa humano (variantes V158 o F158) en este bioensayo da como resultado la expresión mediada por<n>F<a>T del gen indicador de luciferasa. La luminiscencia se midió con un luminómetro usando el reactivo de ensayo de luciferasa Bio-Glo-™ de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos (es decir, activación específica de FcYRIIIa) se expresan como el promedio de unidades de luminiscencia relativa (RLU) sobre el fondo aplicando la siguiente fórmula: (RLU a concentración x de mAbs - RLU de fondo).

Determinación de la activación dependiente de anticuerpos de FcYRIIa humano

HBC34-V35-MLNS y HBC34-V35-MLNS-GAALIE se diluyeron en serie 5 veces en tampón de ensayo ADCP de 50 jg/m l a 0,00013 jg/ml. Se añadió el antígeno objetivo (HBsAg de Engerix B) en una placa blanca de 96 pocillos de fondo plano a 0,6 o 6 jg/m l en 25 jl, luego se añadieron anticuerpos diluidos en serie a cada pocillo (25 j l por pocillo) y el antígeno/anticuerpo se incubó durante 25 minutos a temperatura ambiente. Las células efectoras para el bioensayo de activación de FcYRIIa se descongelaron y se añadieron a una densidad celular de 50,0 x 104/pocillo en 25 j l (la concentración final de HBsAg fue 0,2 o 2 jg/ml, respectivamente). También se incluyeron pocillos de control que se usaron para medir la activación independiente del anticuerpo (que contenía HBsAg y células efectoras, pero no anticuerpo) y la luminiscencia espontánea de la placa (pocillos que contenían únicamente el tampón de ensayo ADCP). Las placas se incubaron durante 23 horas a 37°C con 5% de CO2. La activación de FcYRIIa humano (variantes H131) en este bioensayo da como resultado la expresión mediada por NFAT del gen indicador de luciferasa. La luminiscencia se midió con un luminómetro usando el reactivo de ensayo de luciferasa Bio-Glo-™ de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos (es decir, activación específica de FcYRIIa) se expresan como el promedio de unidades de luminiscencia relativa (RLU, por sus siglas en inglés) sobre el fondo aplicando la siguiente fórmula: (RLU a concentración [x] de mAbs - RLU de fondo).

Determinación de la activación dependiente de anticuerpos de FcYRIIb humano

HBC34-V35-MLNS y HBC34-V35-MLNS-GAALIE se diluyeron en serie 5 veces en tampón de ensayo ADCP de 100 jg /m l a 0,00026 jg/m l. Se añadió el antígeno objetivo (HBsAg de Engerix B) en una placa blanca de 96 pocillos de fondo plano a 3 jg/m l en 25 j l , luego se añadieron anticuerpos diluidos en serie a cada pocillo (25 j l por pocillo) y el antígeno/anticuerpo se incubados durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células efectoras para el bioensayo de activación de FcYRIIb se descongelaron y se añadieron a una densidad celular de 75,0 x 104/pocillo en 25 j l (la concentración final de HBsAg fue de 1 jg/ml). También se incluyeron pocillos de control que se usaron para medir la activación independiente del anticuerpo (que contenían HBsAg y células efectoras, pero no anticuerpo) y la luminiscencia espontánea de la placa (pocillos que contenían únicamente el tampón de ensayo ADCP). Las placas se incubaron durante 20 horas a 37°C con 5% de CO2. La activación de FcYRIIb humano en este bioensayo da como resultado la expresión mediada por NFAT del gen indicador de luciferasa. La luminiscencia se midió con un luminómetro usando el reactivo de ensayo de luciferasa Bio-Glo-™ de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos (es decir, activación específica de FcYRIIb) se expresan como el promedio de unidades de luminiscencia relativa (RLU) sobre el fondo aplicando la siguiente fórmula: (RLU a concentración [x] de mAbs - RLU de fondo).

Determinación de la unión del anticuerpo a la línea celular de hepatoma humano PLC/PRF/5

Células PLC/PRF/5 se tripsinizaron durante 5 min a 37°C, se transfirieron a 7 ml de medio de cultivo, se centrifugaron a 400 x g, 4 min, 4°C y se lavaron extensamente a 4°C en PBS. Algunas células se fijaron con formaldehído al 4% (20 minutos a 4°C); otros se fijaron y luego se permeabilizaron con tampón de permeabilización (20 minutos a 4°C). El pellet celular se resuspendió en 2,64 ml de tampón de lavado (células fijas) o tampón de permeabilización (células fijas y permanentes) (Tabla 7) y se dispensó a 200 pl/pocillo en placas de fondo redondo de 96 pocillos (correspondientes a 100.000 células/pocillo). La placa se centrifugó a 400 g, 4 min, 4°C. Se añadieron diluciones en serie 1:5 de 5 puntos de los anticuerpos de prueba a partir de una concentración final de 10 pg/ml a los pocillos que contenían células y se incubaron durante 30 minutos en hielo. Después de 2 lavados a 4°C, 400xg, 4 min en tampón de lavado (células fijas) o tampón de permeabilización (células fijas y permanentes), se añadieron 50 pl/pocillo de anticuerpo secundario marcado con Alexa Fluor® 647 (Tabla 7) a las células y se incubó durante 20 min en hielo. Las células se lavaron 2 veces más con tampón de lavado (células fijas) o tampón de permeabilización (células fijas y permanentes), se resuspendieron en 200 pl/pocillo de tampón de lavado (células fijas) o de permeabilización (células fijas y permanentes) y se cuantificó señal (MFI, intensidad media de fluorescencia) con un citofluorímetro (BD FACScanto™ II).

Resultados

Los mecanismos antivirales directos son importantes para neutralizar el HBVin vivo.Los mecanismos de acción indirectos dependientes de Fc mediados por la interacción de la región Fc con los receptores Fc gamma (FcyR) en las células inmunes también pueden tener contribuciones importantes para la eficaciain vivoy para mediar en las respuestas inmunitarias endógenas. Los mecanismos dependientes de F<cy>R se pueden evaluarin vitromidiendo la unión a FcyR, así como en la activación dependiente de anticuerpos de FcyR humanos (Hsieh, Y.-T., et al., Journal of Immunological Methods, 441 (C), 56- 66. doi.org/10.1016/j.jim.2016.12.002). La capacidad del anticuerpo para unirse a FcRn y complementar son otros factores de interés.

En un conjunto de experimentos, HBC34-V35-MLNS y HBC34-V35-MLNS-GAALIE se compararon uno al lado del otro para determinar su capacidad para unirse al conjunto completo de FcyR humanos (alelos FcYRIIIa V158 y F158, alelos FcYRIIa H131 y R131 y FcYRIIb) usando interferometría de biocapa (BLI Octet® System, ForteBio). Como se muestra en las figuras 9A-9E, Fc portando las mutaciones MLNS-GAALIE tiene interacciones alteradas con FcyR; específicamente, Fc que lleva ambas mutaciones, en oposición a Fc que lleva MLNS solo, tiene una unión mejorada a FcYRIIIa y FcYRIIa, y una unión reducida a FcYRIIb.

Como se muestra en la figura 9F, los anticuerpos que llevan la mutación MLNS Fc han aumentado la unión a FcRn a pH 6,0 en relación con el anticuerpo con Fc tipo salvaje, pero poca o ninguna unión medible a FcRn a pH 7,4, que es comparable al anticuerpo con Fc tipo salvaje Fc.

Además, se suprimió la unión de HBC34-V35-MLNS-GAALIE a C1q, según se midió mediante interferometría de biocapa (figura 10).

También se ensayó la capacidad de HBC34-V35-MLNS y HBC34-V35-MLNS-GAALIE para activar FcYRIIIa y FcYRIIa humanos usando bioensayos a base de células reporter. Estos ensayos usan células Jurkat diseñadas con un indicador de luciferasa mediado por NFAT para reflejar la activación de los FcyRs humanos. Mientras que HBC34-V35-MLNS activó mal o no activó FcYRIIIa y FcYRIIa humanos en presencia de HBsAg, HBC34-V35-MLNS-GAALIE mostró una activación dependiente de la dosis de todos los FcyRs ensayados (figuras 11A, 11B, 12A-12B). HBC34-V35-MLNS-GAALIE no activó FcYRIIb, incluso cuando se probó a 100 pg/ml (figuras 13A-13B).

La actividad de ADCC también se midió usando células asesinas naturales (NK) aisladas de células mononucleares de sangre periférica humana de un donante que había sido previamente genotipado para expresar FcYRIIIa (F/V) de afinidad alta (V158) y baja (F158) heterocigótica. Se usaron células NK aisladas para medir la destrucción de la línea celular de hepatoma PLC/PR/5 luego de la exposición a HBC34-V35; HBC34-V35-MLNS; HBC34-V35-MLNS-GAALIE; u otro mAb (17.1.41, dirigido a otro epítopo en el bucle antigénico del HBsAg; véase Eren, R., et al., Hepatology, doi.org/10.1053/jhep.2000.9632; Galun, E., et al., Hepatología, doi.org/10.1053/jhep.2002.31867). No se observó la muerte en presencia de los mAb específicos de HBsAg HBC34-V35, HBC34-V35-MLNS, HBC34-V35-MLNS-GAALIE y 17.1.41 (figura 14A). La falta observada de muerte dependiente de anticuerpos de células PLC/PR/5 podría estar relacionada con la mala expresión de HBsAg en la superficie de estas células (figura 14B), lo cual, sin desear estar ligados a la teoría, puede no ser suficiente para desencadenar la muerte por las células NK. Por el contrario, se detectaron niveles altos de HBsAg con HBC34v35 y 17.1.41 cuando las células PLC/PR/5 se fijaron y permeabilizaron, lo que indica que la mayor parte del HBsAg se encuentra intracelularmente o en formas secretadas (es decir, partículas subvirales) (figura 14B).

También se examinó la activación de células NK humanas primarias (V/F) en presencia de HBC34v35-MLNS o HBC34-V35-MLNS-GAALIE y HBsAg usando mAb anti-CD107a. Los datos se muestran en las figuras 15A y 15B.

Estos datosin vitromuestran que las proteínas de unión específicas de HBV de la presente descripción que llevan la mutación GAALIE Fc se unen y activan FcYRIIa y FcYRIIIa de activación de baja afinidad más eficazmente que el anticuerpo parental no GAALIE Fc. Las proteínas de unión que llevan GAALIE tampoco se unen ni activan el FcYRIIb inhibidor de baja afinidad. Las proteínas de unión que llevan GAALIE tampoco se unen a C1q. Además, las proteínas de unión que llevan GAALIE no promueven la ADCC en las células de hepatoma, pero activan las células NK humanas en presencia de HBsAg soluble. La introducción de la mutación MLNS aumenta la unión a FcRn a pH 6,0.

Ejemplo 7: Estudioin vitrode la interacción fármaco-fármaco entre HBC34-V35-MLNS-GAALIE y un inhibidor de Pol/RT

Se llevó a cabo un estudioin vitropara identificar posibles efectos de la combinación de HBC34-V35-MLNS-GAALIE con el inhibidor de pol/RT del HBV Entecavir (ETV). Los efectos de la combinaciónin vitrose determinaron usando HBC34-V35-MLNS-GAALIE y ETV en células HepG2.2.15 en un formato de tablero de ajedrez. Los niveles de HBsAg y ADN del HBV se usaron como lecturas y los datos se analizaron para determinar los efectos de combinación usando MacSynergy II (uab.edu/medicine/peds/macsynergy). Para la normalización, los valores obtenidos de las células HepG2.2.15 no tratadas se usaron como controles positivos, mientras que el medio de cultivo de tejidos se usó como control negativo. Se usaron gráficos de sinergia al 99% de confianza para los informes. Los datos se muestran en la figura 16. Los gráficos de sinergia para ambas lecturas muestran un efecto aditivo de HBC34-V35-MLNS-GAALIE con ETVin vitro.En particular, no se observó antagonismo. Estos datos respaldan el uso de análogos de nucleósidos en combinación con HBC34-V35-MLNS-GAALIE en un entorno clínico.

Ejemplo 8: Identificación y caracterización del anticuerpo monoclonal humano HBC24

Se aisló un anticuerpo monoclonal humano anti-HBV de una manera similar a la descrita en Traggiai E. et al., 2004, Nat Med 10 (8): 871-5 de un paciente humano. El anticuerpo se caracterizó determinando las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de sus regiones variables y las regiones determinantes de complementariedad (CDR) en las mismas y se denominó "HBC24". Por consiguiente, HBC24 es un anticuerpo monoclonal completamente humano de tipo IgG1 que tiene las secuencias CDR, VH y VL como se muestra anteriormente en la Tabla 3. En la Tabla 4 se proporcionan ejemplos de secuencias de nucleótidos que codifican para VH y VL de HBC24.

Ejemplo 9: Generación de variantes germinadas de HBC24 y pruebas funcionales

Se analiza HBC24 para detectar la presencia de mutaciones somáticas en las regiones variables en relación con la secuencia de la línea germinal. Las mutaciones somáticas identificadas se revierten a la secuencia de la línea germinal para producir variantes de HBC24. Se ensayan HBC24 y variantes para la unión(in vitro)y neutralización(in vitro; in vivo)de los serotipos de HBV y HBD usando ensayos como se describe aquí.

Ejemplo 10: Introducción de modificaciones de Fc a HBC24 y variantes

Se producen más variantes de HBC24 que contienen las mutaciones MLNS y GAALIE en ambos monómeros Fc. Las secuencias de aminoácidos de HC de variantes seleccionadas se proporcionan en las SEQ ID NO: 121 y 122. Se examinan las variantes para: (1) uniónin vitroal antígeno; (2) neutralizaciónin vitrode serotipos de HBV usando ensayos como se describen aquí.

TABLA DE SECUENCIAS Y NÚMEROS DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIAS (LISTADO DE SECUENCIAS):

Las diversas realizaciones descritas anteriormente se pueden combinar para proporcionar otras realizaciones. Los aspectos de las realizaciones pueden modificarse, si es necesario, para emplear conceptos de las diversas patentes, aplicaciones y publicaciones para proporcionar aún más realizaciones.

Estos y otros cambios se pueden llevar a cabo en las realizaciones a la luz de la descripción detallada anteriormente.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   I. Un anticuerpo aislado que une HBsAg que comprende:

   (i) una cadena pesada (HC) que comprende la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 91; y (ii) una cadena ligera (LC) que comprende la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 93.
2. 2. El anticuerpo según la reivindicación 1, donde el anticuerpo es capaz de unir un HBsAg de un genotipo seleccionado de los genotipos HBsAg A, B, C, D, E, F, G, H, I y J, o cualquier combinación de los mismos.
3. 3. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, donde el anticuerpo es capaz de reducir una concentración sérica de ADN del virus de la hepatitis B (HBV) en un mamífero que tiene una infección por HBV.
4. 4. El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el anticuerpo es capaz de reducir una concentración sérica de HBsAg en un mamífero que tiene una infección por HBV.
5. 5. El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el anticuerpo es capaz de reducir una concentración sérica de HBeAg en un mamífero que tiene una infección por HBV.
6. 6. El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el anticuerpo es capaz de reducir una
7. 7. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, opcionalmente donde la secuencia de nucleótidos está optimizada en codón para la expresión en una célula huésped.
8. 8. El polinucleótido según la reivindicación 7, que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia de nucleótidos de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 105, o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica para VH de acuerdo con la SEQ ID NO: 103 y una secuencia de nucleótidos que codifica para VL de acuerdo con la SEQ ID NO: 105.
9. 9. Un vector que comprende el polinucleótido de las reivindicaciones 7 u 8, opcionalmente el vector comprende un vector lentiviral o un vector retroviral.
10. 10. Una célula huésped que comprende un polinucleótido heterólogo de la reivindicación 7 u 8.
11. I I . Una composición farmacéutica que comprende:

    (i) el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6;

    (ii) el polinucleótido de la reivindicación 7 u 8;

    (iii) el vector según la reivindicación 9;

    (iv) la célula huésped de la reivindicación 10; o

    (v) cualquier combinación de (i)-(iv);

    y un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
12. 12. Un método para producir el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 10 en condiciones y durante un tiempo suficiente para producir el anticuerpo.
13. 13. El (i) anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6; (ii) el polinucleótido de la reivindicación 7 u 8; (iii) el vector de la reivindicación 9; (iv) la célula huésped de la reivindicación 10; y/o (v) la composición farmacéutica de la reivindicación 11, para su uso en un método para tratar, prevenir y/o atenuar una infección por hepatitis B y/o hepatitis D en un sujeto, comprendiendo la administración al sujeto de una cantidad efectiva de (i), (ii), (iii), (iv) o (v).
14. 14. El (i) anticuerpo; (ii) el polinucleótido; (iii) el vector; (iv) la célula huésped; y/o (v) la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 13, que comprende además administrar al sujeto uno o más de: (vi) un inhibidor de la polimerasa, donde el inhibidor de la polimerasa comprende opcionalmente Lamivudina, Adefovir, Entecavir, Telbivudina, Tenofovir o cualquier combinación de los mismos; (vii) un interferón, donde el interferón comprende opcionalmente IFNbeta y/o IFNalfa; (viii) un inhibidor de punto de control, donde el inhibidor de punto de control comprende opcionalmente un anticuerpo anti-PD-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo anti-PD-LI o un fragmento de unión a antígeno del mismo y/o un anticuerpo anti-CTLA4 o un fragmento de unión a antígeno del mismo; (ix) un agonista de una molécula de punto de control inmunitario estimulante; o (x) cualquier combinación de (vi)-(ix).
15. 15. El (i) anticuerpo; (ii) el polinucleótido; (iii) el vector; (iv) la célula huésped; y/o (v) la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 13 o 14, donde la infección por hepatitis B es una infección por hepatitis B crónica y/o el sujeto ha recibido un trasplante de hígado, el sujeto no está inmunizado contra la hepatitis B, el sujeto es un recién nacido y/o el sujeto se está sometiendo o se ha sometido a hemodiálisis.