CN116390943A - 工程化乙型肝炎病毒中和抗体和其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开部分涉及抗体和其抗原结合片段，所述抗体和其抗原结合片段可以与乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抗原环区结合，并且任选地可以中和乙型肝炎病毒(HBV)感染，以及进一步任选地丁型肝炎病毒(HDV)感染。本公开的抗体和抗原结合片段具有有利的生产特性，例如与参考抗体或抗原结合片段相比，在转化的宿主细胞中聚集体形成更少和/或生产滴度得以提高。本公开还涉及包括抗原结合片段的融合蛋白，并且涉及编码此类抗体、抗原结合片段和融合蛋白的核酸和产生此类抗体、抗原结合片段和融合蛋白的细胞。另外，本公开涉及本公开的抗体、抗原结合片段、融合蛋白以及相关的多核苷酸、载体、宿主细胞和组合物在诊断、预防和治疗乙型肝炎和丁型肝炎中的用途。还提供了组合疗法，所述组合疗法包括：(i)抗体或抗原结合片段；以及(ii)作为HBV基因表达抑制剂和/或降低HBV抗原负荷的药剂。

Description

工程化乙型肝炎病毒中和抗体和其用途
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并且特此通过引用并入本说明书中。包括序列表的文本文件的名称为930485.414WO_SEQUENCE_LISTING.txt。文本文件为101KB，创建于2021年6月22日，并通过EFS-Web以电子方式提交。
背景技术
乙型肝炎病毒导致潜在危及生命的急性和慢性肝感染。急性乙型肝炎的特征是有或没有症状、有发生暴发性肝炎的风险的病毒血症(Liang TJ,Block TM,McMahon BJ,Ghany MG,Urban S,Guo JT,Locarnini S,Zoulim F,Chang KM,Lok AS.乙型肝炎目前和未来疗法：从发现到治愈(Present and future therapies of hepatitis B:Fromdiscovery to cure)，《肝病学(Hepatology)》2015年8月3日.doi:10.1002/hep.28025.[电子版先于印刷版])。尽管自1982年以来就有可用的针对乙型肝炎的有效疫苗，但WHO报道，仍有2.4亿人慢性感染乙型肝炎，并且每年有超过780,000人死于乙型肝炎并发症。大约三分之一的慢性乙型肝炎(CHB)患者患有肝硬化、肝功能衰竭和肝细胞癌，每年导致600,000人死亡(Liang TJ,Block TM,McMahon BJ,Ghany MG,Urban S,Guo JT,Locarnini S,Zoulim F,Chang KM,Lok AS.乙型肝炎目前和未来疗法：从发现到治愈,《肝病学》2015年8月3日.doi:10.1002/hep.28025.[电子版先于印刷版])。
对于感染HBV的患者，可能由于共同感染或重复感染HDV而出现严重并发症。根据WHO，丁型肝炎感染全世界约1500万人。HDV被视为亚病毒卫星，因为其仅可在存在HBV的情况下传播。HDV为已知的最小动物病毒(40nm)之一，由此其基因组仅为1.6kb并且编码S和LHDAg。HDV基因组复制所需的所有其它蛋白质(包括RNA聚合酶)由宿主细胞提供，并且HDV包膜由HBV提供。当引入到受纳细胞中时，HDV RNA基因组复制HDV编码的蛋白质的多个拷贝并且与其缔合，以组装核糖核蛋白(RNP)复合物。RNP由HBV包膜蛋白从细胞中导出，所述HBV包膜蛋白能够组装脂蛋白囊泡，所述脂蛋白囊泡在分泌之前出芽到前高尔基体隔室的内腔中。此外，HBV包膜蛋白还提供将HDV靶向到未感染细胞的机制，由此确保HDV传播。
由HDV引起的并发症包括在急性感染中发生肝衰竭的可能性更大并迅速发展为肝硬化，在慢性感染中患肝癌的机会增加。结合乙型肝炎病毒，丁型肝炎在所有肝炎感染中的死亡率最高，为20％(Fattovich G，Giustina G,Christensen E,Pantalena M,Zagni I,Realdi G,Schalm SW.丁型肝炎病毒感染对代偿期乙型肝硬化发病率和死亡率的影响(Influence of hepatitis delta virus infection on morbidity and mortality incompensated cirrhosis type B)《肠道(Gut)》.2000年3月；46(3):420-6)。慢性HDV感染的唯一批准疗法为干扰素-α。然而，用干扰素-α治疗HDV相对低效且耐受不良。用干扰素-α治疗导致四分之一的患者在治疗后六个月产生持续的病毒学应答。此外，核苷(酸)类似物(NA)已在丁型肝炎中进行广泛测试，但其似乎无效。使用NA与干扰素的组合治疗也被证明是令人失望的(Zaigham Abbas,Minaam Abbas,丁型肝炎管理：需要新型治疗选项(Management of hepatitis delta:Need for novel therapeutic Options)《世界胃肠病学杂志(World J Gastroenterol.)》2015年8月28日；21(32):9461-9465)。
因此，需要新的治疗选择，如针对乙型肝炎和/或丁型肝炎感染的具有中和活性的新疗法。
附图说明
本文提供的附图旨在更详细地说明本公开中包括的主题。附图并不旨在以任何方式限制本公开。
图1示出了通过抗HBV抗体“HBC34-v35-GAALIE-MLNS”(rIgG1m17,1)与HBsAg的结合(左)和HBV感染的中和(右)，所述抗体包括如SEQ ID NO:38所示的VH和如SEQ ID NO:57所示的VL，以及在Fc中的突变G236A、A330L、I332E、M428L和N434S。左边示出了不同浓度的抗体与十种((A)-(J))基因型的HBsAg的结合。中和通过HBsAg浓度(IU/ml)和HBeAg指数进行测量，如所指示的。HBC34-v35-GAALIE-MLNS以皮摩尔亲和力与HBsAg的保守构象表位结合并且有效中和10种HBV基因型。
图2提供了尺寸排阻色谱法(SEC)数据，所述数据示出了在一周室温温育后经纯化的HBC34-v35-GAALIE-MLNS和HBC34-v35-MLNS(与HBC34-v35-GAALIE-MLNS的不同在于不包括G236A、A330L和I332E Fc突变)IgG(大约75mg/mL)中存在的高分子量物种。在图表的右上角处的嵌入图中示出了最大峰值。
图3提供了尺寸排阻色谱法(SEC)数据，所述数据示出了随时间推移经纯化的HBC34-v35 Fab中的高分子量物种。在图表的右上角处的嵌入图中示出了最大峰值。
图4示出了HBC34-v35 IgG(上行小图)和Fab(下行小图)的单体(中间小图)和富集的二聚体(右小图)与HBsAg的结合，如通过表面等离子体共振(SPR)所测量的。左边是示出了通过IgG和Fab与HBsAg的结合的示意图。所使用的HBsAg浓度如图形键中所指示的。
图5A和图5B示出了(A)展示分离的HBC34-v35重组Fab二聚体的制备型SEC数据(左峰)和(B)Fab二聚体的结晶。
图6A和图6B示出了(A)分离的HBC34-v35重组Fab单体的制备型SEC数据和(B)Fab单体的结晶。
图7提供了(左)涉及抗体CDR的二聚体形成的示意图和(右)示出HBC34-v35Fab二聚体的飘带模型。
图8展示了(右)VL-VL相互作用涉及HBC34-v35中的二聚体形成和(左)总结L-CDR2内的相互作用。
图9提供了L-CDR2和轻链框架区中的HBC34-v35 Fab-Fab相互作用的另一个图示。
图10提供了(左)二聚体中的HBC34-v35 Fab和(右)Fab单体的构象的图示。
图11A-11C示出了通过从HBC34-v35工程化的变体Fab(所述变体在图11A中示为“L-CDR2 GL Fab”并且在本文中也称为HBC34-v36)的二聚化减少，其中与HBC34-v35Fab相比，三个L-CDR2残基回复突变为种系序列。(A)在第0天和第5-7天，通过绝对尺寸排阻色谱法(aSEC)确定的经纯化的Fab中的二聚体百分比。(B)在第0天，受压的L-CDR2 GL Fab样品的SEC分析。(C)在第5天，受压的L-CDR2 GL Fab样品的SEC分析。
图12示出了通过ELISA测定的HBC34-v35和HBC34-v36与HBsAg的结合。抗体表达为具有野生型Fc的IgG1(同种异型G1m17,1)。
图13示出了通过HBC34-v35和HBC34-v36对HBV基因型D感染的体外中和。抗体表达为具有野生型Fc的IgG1(同种异型G1m17,1)。中和是如通过表达HBsAg(左)或HBeAg(右)的靶细胞的百分比所测量的。N＝1个实验。
图14A-14E示出了额外的抗体HBC34-v37-HBC34-v50(来自CHO细胞的未纯化的上清液)与HBsAg的结合，如通过ELISA所测定的。经纯化的HBC34-v35作为对照包括在内。抗体表达为具有野生型Fc的IgG1(同种异型G1m17,1)。计算的EC50值在每个图表的下方示出。
图15示出了通过本公开的HBC34-v35和某些抗体的HBV基因型D的中和，HBeAg作为病毒读数。每个mAb的计算的EC50值在右边示出。HBC34-v35(经纯化的IgG和上清液)和HBC34-v36(经纯化的IgG)用作对照。
图16A-16D提供了尺寸排阻色谱法(SEC)数据，所述数据示出了在32天的过程中本公开的HBC34-v35和九种经纯化的变体抗体中存在的高分子量物种(HMWS)。HBC34-v35和变体抗体浓缩到大约25mg/mL并且在不同温度下进行温育。在第-1天、第0天、第5天、第15天和第32天通过SEC评估HMWS。第-1天样品在浓缩前进行评估。在实验过程中，抗体组合物在4℃(图16A)、25℃(图16B)或40℃(图16C)下进行温育。在40℃下温育32天之后的HMWS频率总结于图16D。
图17A-17J示出了通过HBC34-v35、HBC34-v40、HBC34-v44、HBC34-v45和HBC34-v50与十种((A)-(J))基因型的HBsAg的结合，如通过FACS所测定的。数据报告为相对于抗体浓度(ng/ml)的平均荧光强度(MFI)。模拟染色作为阴性对照包括在内。
图18A-18K示出了通过HBC34-v35、HBC34-v40、HBC34-v44、HBC34-v45和HBC34-v50与HBsAg-基因型D和十种HBsAg-基因型D突变体的结合，如通过FACS所测定的。数据报告为相对于抗体浓度(ng/ml)的平均荧光强度(MFI)。模拟染色作为阴性对照包括在内。
图19示出了通过HBC34-v35、HBC34-v40、HBC34-v44、HBC34-v45和HBC34-v50转染产生的抗体滴度。评估了5ml规模和100ml规模转染系统两者，其中100ml系统以一式两份或一式三份进行了测试。示出了来自单独5ml规模和100ml规模测试的抗体滴度，以及来自100ml规模测试的平均滴度(以mg/L为单位报告)。
图20示出了反映HBC34-v35(图形键中的“HBC35”)、HBC34-v40(“HBC40”)、HBC34-v44(“HBC44”)、HBC34-v45(“HBC45”)和HBC34-v50(“HBC50”)的热稳定性的SEC数据。在HMWS定量之前，将抗体浓缩到25mg/ml并且在40℃下温育四天。
图21A-21C、22A-22C和23A-23C示出了被选择用于工程化以减少HBC34-v35中所见的聚集的轻链氨基酸残基。图21A、22A和23A示出了被选择用于工程化的HBC34-v35的轻链CDR2残基。图21B、22B和23B示出了被选择用于工程化的框架残基。图21C、22C和23C示出了变体抗体的部分VL序列的序列比对。
具体实施方式
本公开涉及乙型肝炎病毒(HBV)和丁型肝炎病毒(HDV)的免疫疗法的领域。所公开的结合蛋白(例如，抗体、抗原结合片段和融合蛋白)能够与位于HBV包膜蛋白(HBsAg)的S结构域的抗原环区中的表位结合、能够中和HBV感染并且在一些实施方式中能够中和HDV感染。
本公开的结合蛋白具有有利的生产特性(例如，抗体二聚体的形成减少和/或在宿主细胞中的产生增加)，如与PCT公开第WO 2020/132091号中公开的包括“HBC34-v35”的CDR以及任选地VH和VL的参考抗HBV抗体相比。简而言之，HBC34-v35抗体具有良好的结合和中和特性，但如本文所公开的，可以在抗体产生/纯化过程中通过轻链间相互作用形成抗体二聚体。与HBC34-v35抗体单体相比，HBC34-v35二聚体与HBsAg结合的能力降低。减少二聚体的形成可以改善例如抗体(或抗原结合片段)产生的效率和抗体(或抗原结合片段)的剂量的效力。
在某些实施方式中，本公开的结合蛋白可以与任何或所有已知HBsAg基因型以及HBsAg变体结合，并且可以中和HBV感染以及HDV感染。在某些实施方式中，与HBC34-v35相比，本公开的结合蛋白可以以类似或甚至增加的效力结合和/或可以中和HBV和/或HDV。
本文还提供编码此类结合蛋白的核酸和表达此类结合蛋白的宿主细胞。另外，本公开提供了使用本文所述的结合蛋白诊断、预防和治疗疾病以及在筛查方法中的方法。
例如，根据本说明书的抗体、抗原结合片段和融合蛋白的实施方式可以用于预防、治疗、或减弱或诊断HBV和HDV的方法中。在特定实施方式中，本文所述的抗体、抗原结合片段和融合蛋白与乙型肝炎病毒表面抗原的两种或更多种不同基因型结合，并且与乙型肝炎病毒表面抗原的两种或更多种不同感染性突变体结合。在具体实施方式中，本文所述的抗体、抗原结合片段和融合蛋白与乙型肝炎病毒表面抗原的所有已知基因型结合，并且与乙型肝炎病毒表面抗原的所有已知感染性突变体结合。
本公开还提供了一种治疗有需要的受试者的慢性HBV感染的方法，所述方法包括：向所述受试者施用抗HBV抗体或抗原结合片段与降低HBV抗原负荷的药剂的组合。本公开还提供了一种治疗有需要的受试者的慢性HBV感染的方法，所述方法包括：向所述受试者施用抗HBV抗体或抗原结合片段与HBV基因表达抑制剂的组合。
在本文所述的一些方法、供使用的组合物或用途中，所述降低HBV抗原负荷的药剂或所述HBV基因表达抑制剂是RNAi药剂(例如，siRNA，如HBV001、或HBV002或HBV003)。
在更加详细地阐述本公开之前，提供本文要使用的某些术语的定义可能有助于理解本公开。贯穿本公开阐述额外的定义。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语的含义与本领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。
在整个本公开中，除非上下文另有要求，否则术语“包含(comprise)”及其变体，如“包含(comprises/comprising)”与例如“具有(having/has)”、“包括(including/includes)”等同义使用，并且所述术语应被理解为暗示包括所述成员、比率、整数(在适当情况下包括其的一部分；例如，整数的十分之一和百分之一)、浓度或步骤，但不排除任何其它未说明的成员、比率、整数、浓度或步骤。除非另外指示，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应被理解为包括所列举的范围内的任何整数值并且适当时包括其分数(如整数的十分之一和百分之一)。而且，除非另外指示，否则本文所列举的关于如聚合物亚基、大小或厚度等任何物理特征的任何数字范围应被理解为包括所列举的范围内的任何整数。
术语“基本上由…组成(consisting essentially of)”不等效于“包括/包含(comprising)”，并且是指权利要求的指定材料或步骤，或指那些不实质上影响所要求的主题的基本特性的材料或步骤。例如，当结构域、区、模块或蛋白质的氨基酸序列包括延伸、缺失、突变或其组合(例如，在氨基末端或羧基末端或结构域之间的氨基酸)时，蛋白质结构域、区或模块(例如，结合结构域)或蛋白质“基本上由特定氨基酸序列组成”，所述延伸、缺失、突变或其组合结合贡献结构域、区、模块或蛋白质长度的至多20％(例如，至多15％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％))，并且不会显著影响(即，不使活性降低超过50％，如不超过40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％)结构域、区、模块或蛋白质的活性(例如，结合蛋白的靶结合亲和力)。
另外，应当理解，本申请公开了衍生自本文所述的结构和取代基的各种组合的单个化合物或化合物组，其程度与设定每种化合物或化合物组单个阐述的程度相同。因此，特定结构或特定取代基的选择在本公开的范围内。
除非本文另外指示或明显与上下文相矛盾，否则在描述本公开的上下文中(包括在权利要求的上下文中)使用术语“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”以及类似指示物应被理解为涵盖单数和复数两者。替代方案(例如，“或”)的使用应当被理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。本文中对值的范围的叙述旨在充当一种单独指代落入所述范围内的每个单独的值的简化方法。除非本文另外指明，否则将每个单独的值并入本公开中，就好像每个单独的值是在本文中单独引用的一样。本说明书中的任何语言都不应被解释为将任何未要求保护的要素指示为是实践本文公开的主题所必不可少的。
词语“基本上”不排除“完全”；例如，“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。在某些实施方式中，“基本上”是指与参考组合物、方法或用途相比，本公开的组合物、方法或用途的给定量、效果或活性，并且描述所述量、效果或活性的减少不超过50％，如不超过参考组合物、方法或用途的量、效果或活性的40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％或更少。
除非另外指示，否则如本文所使用的，术语“约(about)”意指所指示的范围、数值或结构的±20％。在某些实施方式中，“约”包括±15％、±10％或±5％。
“任选(optional)”或“任选地(optionally)”意指随后所描述的要素、组分、事件或情形可发生或可不发生，且所述描述包括其中所述要素、组分、事件或情形发生的情况以及其中所述要素、组分、事件或情形不发生的情况。
如本文所使用的，“氨基酸(amino acid)”是指天然存在的或合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸以及后续被修饰的氨基酸，例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但是保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的通式化学结构不同的结构，但是以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。
如本文所使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”以及这些术语的变型是指包括由(普通或经修饰的)肽键彼此接合的至少两个氨基酸的分子。因此，蛋白质或多肽包括氨基酸残基的聚合物。例如，肽、多肽或蛋白质可以包括多个氨基酸或由其构成，所述氨基酸选自由遗传密码所定义的20种氨基酸或氨基酸类似物或模拟物，所述氨基酸或氨基酸类似物或模拟物各自通过肽键彼此连接。肽、多肽或蛋白质可以包括L-氨基酸和/或D-氨基酸(或其类似物或模拟物)或由其构成。术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”还包括“肽模拟物”，所述肽模拟物被定义为含有非肽结构元件的肽类似物，所述肽能够模拟或拮抗天然亲本肽的生物作用。在某些实施方式中，肽模拟物缺少如易酶促切割的肽键的特性。
除这些氨基酸之外，肽、多肽或蛋白质可以包括除遗传密码所定义的20种氨基酸外的氨基酸，或其可以由除遗传密码所定义的20种氨基酸外的氨基酸构成。在某些实施方式中，本公开的上下文中的肽、多肽或蛋白质可以包括由自然过程(如翻译后成熟过程)或由化学过程(例如，合成过程)修饰的氨基酸，所述过程是本领域已知的并且包括本文所描述的过程。此类修饰可以出现在多肽中的任何地方；例如，在肽骨架中；在氨基酸链中；或在羧基末端或氨基末端处。肽或多肽可以是支链的，如在泛素化之后，或可以是环状的，有或没有分支。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”还包括经修饰的肽、多肽和蛋白质。例如，肽、多肽或蛋白质修饰可以包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价固定、脂质或脂质衍生物的共价固定、磷脂酰肌醇的共价固定、共价或非共价交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、包括聚乙二醇化的糖基化、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解过程、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒酰化、硫酸化、氨基酸添加，如精氨酰化，或泛素化。此类修饰已在文献中进行了描述(参见《蛋白质结构和分子特性(ProteinsStructure and Molecular Properties)》(1993)第2版,T.E.Creighton，纽约；《蛋白质的翻译后共价修饰(Post-translational Covalent Modifications of Proteins)》(1983)B.C.Johnson编辑,纽约学术出版社(Academic Press,New York)；Seifter等人(1990)蛋白质修饰和非蛋白质辅因子分析(Analysis for protein modifications and nonproteincofactors),《酶学方法(Meth.Enzymol.)》182:626-646以及Rattan等人,(1992)蛋白质合成：翻译后修饰和老化(Protein Synthesis:Post-translational Modifications andAging),《纽约科学院年报(Ann NY Acad Sci)》,663:48-62)。因此，术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”可以包括例如脂肽、脂蛋白、糖肽、糖蛋白等。还设想了本公开的蛋白质、肽和多肽的变体。在某些实施方式中，变体蛋白质、肽和多肽包括与如本文所描述的定义或参考氨基酸序列的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同的氨基酸序列或由其组成。
如本文所使用的，“(多)肽”和“蛋白质”可以关于氨基酸残基的聚合物(如由肽键连接的多个氨基酸单体)互换使用。
“核酸分子”、或“多核苷酸”或“核酸”是指包括共价连接的核苷酸的聚合化合物，所述聚合化合物可以由天然亚基(例如，嘌呤或嘧啶碱基)或非天然亚基(例如，吗啉环)构成。嘌呤碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤，并且嘧啶碱基包括尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶。核酸单体可以通过磷酸二酯键或此类连接的类似物连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代苯胺磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)、氨基磷酸酯等。
核酸分子包括聚核糖核酸(RNA)、聚脱氧核糖核酸(DNA)，所述DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA，其中的任一个可以是单链或双链的。如果是单链的，则核酸分子可以是编码链或非编码链(反义链)。还设想了microRNA、siRNA、病毒基因组RNA和合成RNA。多核苷酸(包括寡核苷酸)和其片段可以例如通过聚合酶链反应(PCR)或通过体外翻译产生，或者通过连接、切割、核酸内切酶作用或核酸外切酶作用中的任一者产生。
编码氨基酸序列的核酸分子包括编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。核苷酸序列的一些形式还可以包括内含子，其程度使得内含子可以通过共转录或转录后机制去除。由于遗传密码的冗余或简并或通过剪接或两者，不同的核苷酸序列可能编码相同的氨基酸序列。
还设想了本公开的核酸分子的变体。变体核酸分子与本文所述的定义或参考多核苷酸的核酸分子至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同，或者在约65-68℃下0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠或在约42℃下0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50％甲酰胺的严格杂交条件下与多核苷酸杂交。核酸分子变体保留编码融合蛋白或其结合结构域的能力，所述融合蛋白或其结合结构域具有本文所描述的功能，如特异性结合靶分子。
如本文所使用的，术语“序列变体”是指与参考序列相比具有一个或多个改变的任何序列，其中参考序列是任何公开的序列和/或“序列表和SEQ ID编号(序列表)”中列出的序列。因此，术语“序列变体”包括核苷酸序列变体和氨基酸序列变体。在某些实施方式中，在核苷酸序列的上下文中的序列变体，参考序列也是核苷酸序列，而在氨基酸序列的上下文中的序列变体的某些实施方式中，参考序列也是氨基酸序列。如本文所使用的，“序列变体”可以与参考序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
“序列同一性百分比(Percent sequence identity)”是指如通过比较序列所确定的两个或多个序列之间的关系。用于确定序列同一性的方法可以被设计成给出所比较序列之间的最佳匹配。例如，可以出于最优比较目的比对序列(例如可以在第一氨基酸和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入空位以进行最优比对)。此外，出于比较目的，可以忽略非同源序列。除非另外指示，否则本文所引用的序列同一性百分比基于参考序列的长度计算。用于确定序列同一性和相似性的方法可以在公开可用的计算机程序中找到。序列比对和同一性百分比计算可以使用BLAST程序(例如，BLAST 2.0、BLASTP、BLASTN或BLASTX)进行。可以在Altschul等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25:3389-3402，1997中找到BLAST程序中使用的数学算法。在本公开的上下文中，应当理解，在使用序列分析软件进行分析的情况下，分析的结果基于所引用的程序的“默认值”。“默认值”意指软件首次初始化时最初加载的值或参数的任何集合。
核酸(核苷酸)序列的上下文中的“序列变体”具有改变的序列，其中参考序列中的一个或多个核苷酸缺失或取代，或者一个或多个核苷酸被插入到参考核苷酸序列的序列中。核苷酸在本文中通过标准单字母名称(A、C、G或T)表示。由于遗传密码的简并性，核苷酸序列的“序列变体”可能使相应参考氨基酸序列(即氨基酸“序列变体”)改变或不改变。在某些实施方式中，核苷酸序列变体不产生氨基酸序列变体(例如，沉默突变)。在一些实施方式中，设想了引起一个或多个“非沉默”突变的核苷酸序列变体。在一些实施方式中，本公开的核苷酸序列变体对与参考氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列进行编码。如本文所公开的核苷酸和氨基酸序列还指参考或野生型核苷酸或氨基酸序列的密码子优化形式。在本文所述的任何实施方式中，本公开的多核苷酸可以针对含有多核苷酸的宿主细胞进行密码子优化。密码子优化可以使用已知的技术和工具进行，例如，使用
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OptimumGeneTM工具或GeneArt基因合成工具(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))。密码子优化的序列包括部分密码子优化的序列(即，至少一个密码子被优化以在宿主细胞中表达)和完全密码子优化的序列。
在氨基酸序列的上下文中的“序列变体”具有改变的序列，其中与参考氨基酸序列相比，一个或多个氨基酸被缺失、取代或插入。作为改变的结果，此类序列变体具有与参考氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少具有94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。例如，每100个参考序列的氨基酸，具有不超过10个改变(即缺失、插入或取代的任何组合)的变体序列与参考序列“至少90％相同”。
“保守取代(conservative substitution)”是指不显著影响或改变特定蛋白质的结合特性的氨基酸取代。通常，保守取代是其中取代的氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的取代。保守取代包括在以下组之一中发现的取代：组1：丙氨酸(Ala或A)、甘氨酸(Gly或G)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)；组2：天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或Z)；组3：天冬酰胺(Asn或N)、谷氨酰胺(Gln或Q)；组4：精氨酸(Arg或R)、赖氨酸(Lys或K)、组氨酸(His或H)；组5：异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、缬氨酸(Val或V)；以及组6：苯丙氨酸(Phe或F)、酪氨酸(Tyr或Y)、色氨酸(Trp或W)。额外地或可替代地，氨基酸可以根据类似功能、化学结构或组成(例如，酸性、碱性、脂肪族、芳香族或含硫)分成保守取代组。例如，出于取代的目的，脂肪族分组可以包括Gly、Ala、Val、Leu以及Ile。其它保守取代组包括：含硫的：Met和半胱氨酸(Cys或C)；酸性的：Asp、Glu、Asn和Gln；小脂肪族、非极性或略有极性的残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；极性带负电荷的残基和其酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；极性带正电荷的残基：His、Arg和Lys；大脂肪族、非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；以及大芳香族残基：Phe、Tyr和Trp。额外的信息可以在Creighton(1984)《蛋白质(Proteins)》,W.H.弗里曼出版社和公司(W.H.Freeman and Company)中找到。
氨基酸序列插入可以包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括将氨基酸序列的N末端或C末端与报告分子或酶融合。
一般来说，序列变体中的改变不消除或显著降低相应参考序列的所需功能。例如，优选的是，与具有参考序列(或由其编码)的抗体或抗原结合片段相比，本公开的变体序列不显著降低或消除抗体或其抗原结合片段的序列与相同表位结合以充分中和HBV和HDV的感染的功能，和/或不引起或增加抗体二聚体的形成，和/或不在宿主细胞中以较低的滴度产生。
如本文所使用的，“源自”指定核酸、肽、多肽或蛋白质的核酸序列或氨基酸序列是指核酸、肽、多肽或蛋白质的来源。源自特定序列的核酸序列或氨基酸序列可以具有与其源自的序列或其一部分基本上相同的氨基酸序列，其中“基本上相同”包括如上文所定义的序列变体。源自特定肽或蛋白质的核酸序列或氨基酸序列可以源自特定肽或蛋白质中的对应结构域。在此上下文中，“对应”是指具有相同所关注功能或特性。例如，“胞外结构域”对应于(另一种蛋白质的)的另一个“胞外结构域”，或者“跨膜结构域”对应于(另一种蛋白质的)另一个“跨膜结构域”。因此，本领域普通技术人员可容易地鉴定肽、蛋白质和核酸的“对应”部分。同样地，“源自”另一个(例如，“源”)序列的序列可以由本领域普通技术人员鉴定为在源序列中具有其来源。
源自另一个核酸、肽、多肽或蛋白质的核酸序列或氨基酸序列可以与(其源自的)起始核酸、肽、多肽或蛋白质相同。然而，源自另一个核酸、肽、多肽或蛋白质的核酸序列或氨基酸序列还可以具有相对于(其源自的)起始核酸、肽、多肽或蛋白质的一个或多个突变，具体地，源自另一个核酸、肽、多肽或蛋白质的核酸序列或氨基酸序列可以为(其源自的)起始核酸、肽、多肽或蛋白质的如上文所描述的功能序列变体。例如，在肽/蛋白质中，一个或多个氨基酸残基可以被其它氨基酸残基取代，或者可能发生一个或多个氨基酸残基插入或缺失。
如本文所使用的，术语“突变”涉及核酸序列和/或氨基酸序列相较于参考序列的变化，例如对应基因组、野生型或参考序列。突变，例如与参考基因组序列相比，可以是例如(天然存在的)体细胞突变、自发突变、诱导突变(例如，由酶、化学物质或辐射诱导)、或通过定点诱变(用于在核酸序列和/或氨基酸序列中进行特定和有意改变的分子生物学方法)获得的突变。因此，术语“突变(mutation)”或“突变(mutating)”应理解为还包括物理上进行或诱导突变，例如在核酸序列中或在氨基酸序列中。突变包括一个或多个核苷酸或氨基酸的取代、缺失和/或插入以及若干连续核苷酸或氨基酸的倒位。为了实现氨基酸序列中的突变，可以将突变引入到编码所述氨基酸序列的核苷酸序列中以便表达(重组)突变多肽。可以例如通过改变(例如，通过定点诱变)编码一个氨基酸的核酸分子的密码子(例如，通过改变其中一个、两个或三个核苷酸碱基)以提供编码不同氨基酸或编码相同氨基酸的密码子，或通过合成序列变体来实现突变。
“功能变体(functional variant)”是指与本公开的亲本或参考化合物在结构上相似或基本结构上相似但在组成上略有不同(例如，一个碱基、原子或官能团不同、被添加或被去除)的多肽或多核苷酸，使得多肽或经编码的多肽能够以至少50％的效率，优选地至少55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％的亲本多肽活性水平执行亲本多肽的至少一种功能。换句话说，当本公开的多肽或经编码的多肽的功能变体在所选的测定中与亲本或参考多肽相比显示出不超过50％的性能降低时，如用于测量结合亲和力的测定(例如，测量缔合(Ka)或解离(KD)常数的
Figure BDA0004086126640000131
或四聚体染色)，所述功能变体具有“类似结合”、“类似亲和力”或“类似活性”。
如本文所使用的，“功能部分”或“功能片段”是指仅包括亲本或参考化合物的结构域、部分或片段的多肽或多核苷酸，并且多肽或经编码的多肽保留与亲本或参考化合物的结构域、部分或片段相关的至少50％的活性，优选地至少55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％的亲本多肽活性水平，或提供生物学益处(例如，效应子功能)。当本公开的多肽或经编码多肽的“功能部分”或“功能片段”在所选的测定中与亲本或参考多肽相比显示出不超过50％的性能降低(优选地不超过20％或10％，或在亲和力方面与亲本或参考相比不超过对数差异)时，所述功能部分或片段具有“相似结合”或“相似活性”。
术语“分离的(isolated)”意指将材料从其原始环境(例如，如果其天然存在的话，天然环境)中去除。例如，活动物中存在的天然存在的核酸或多肽不是分离的，但与天然系统中的一些或全部共存材料分离的相同核酸或多肽是分离的。此类核酸可以是载体的一部分和/或此类核酸或多肽可以是组合物(例如，细胞裂解物)的一部分，并且仍然是分离的，因为此类载体或组合物不是所述核酸或多肽的天然环境的一部分。在一些实施方式中，“分离的”可以描述人体外的抗体、抗原结合片段、融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或组合物。
术语“基因”意指参与产生多肽链的DNA或RNA区段；在某些情况下，所述基因包括编码区之前和之后的区(例如，5'未翻译区(UTR)和3'UTR)以及单独编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
在将核酸分子插入到细胞中的情况下，术语“引入”意指“转染”、或“转化”或“转导”，并且包括提及将核酸分子并入到真核或原核细胞中，其中所述核酸分子可以并入到细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子或瞬时表达(例如，经转染的mRNA)。
如本文所使用的，术语“重组”(例如，重组抗体、重组蛋白、重组核酸等)是指通过重组方式制备、表达、产生或分离并且非天然存在的任何分子(抗体、蛋白质、核酸等)。“重组”可以与“工程化”或“非天然”同义使用，并且可以指包括至少一种遗传改变或已通过引入外源核酸分子修饰的生物体、微生物、细胞、核酸分子或载体，其中此类改变或修饰通过基因工程(即人为干预)引入。遗传改变包括例如引入编码蛋白质、融合蛋白或酶的可表达的核酸分子的修饰、或其它核酸分子添加、缺失、取代或细胞的遗传物质的其它功能破坏。额外的修饰包括例如非编码调节区，其中修饰改变多核苷酸、基因或操纵子的表达。
如本文所使用的，“异源”或“非内源”或“外源”是指对宿主细胞或受试者而言不是天然的任何基因、蛋白质、化合物、核酸分子或活性，或对宿主细胞或受试者而言是天然的已改变的任何基因、蛋白质、化合物、核酸分子或活性。异源、非内源或外源包括已经突变或以其它方式改变的基因、蛋白质、化合物或核酸分子，使得结构、活性或两者在天然与改变的基因、蛋白质、化合物或核酸分子之间不同。在某些实施方式中，异源、非内源或外源基因、蛋白质或核酸分子对于宿主细胞或受试者可能不是内源的，而是通过缀合、转化、转染、电穿孔等将编码此类基因、蛋白质或核酸分子的核酸添加到宿主细胞中，其中添加的核酸分子可以整合到宿主细胞基因组中或者可以作为染色体外遗传物质(例如，作为质粒或其它自我复制载体)存在。术语“同源(homologous)”或“同源物(homolog)”是指发现于或衍生自宿主细胞、物种或菌株的基因、蛋白质、化合物、核酸分子或活性。例如，编码多肽的异源或外源多核苷酸或基因可以与天然多核苷酸或基因同源并且编码同源多肽或活性，但是多核苷酸或多肽可以具有改变的结构、序列、表达水平或其任何组合。非内源多核苷酸或基因以及经编码的多肽或活性可以来自相同物种、不同物种或其组合。
如本文所使用的，术语“内源”或“天然”是指通常存在于宿主细胞或受试者中的多核苷酸、基因、蛋白质、化合物、分子或活性。
如本文所使用的，术语“表达(expression)”是指基于如基因等核酸分子的编码序列产生多肽的过程。过程可以包括转录、转录后控制、转录后修饰、翻译、翻译后控制、翻译后修饰或其任何组合。表达的核酸分子通常可操作地与表达控制序列(例如，启动子)连接。
术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上两个或更多个核酸分子的缔合，使得一者的功能受另一者影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，编码序列在启动子的转录控制之下)时，所述启动子与所述编码序列可操作地连接。“未连接(Unlinked)”意指相关遗传元件彼此不紧密相关并且一者的功能不影响另一者。
如本文所描述的，多于一种异源核酸分子可以作为单独的核酸分子、作为多个单独控制的基因、作为多顺反子核酸分子、作为编码蛋白质(例如，抗体的重链)的单个核酸分子或其任何组合引入宿主细胞。当两种或更多种异源核酸分子引入宿主细胞时，应当理解，两种或更多种异源核酸分子可以作为单个核酸分子(例如，在单个载体上)引入、在单独的载体上引入、在单个位点或多个位点整合于宿主染色体中或其任何组合。所引用的异源核酸分子或蛋白质活性的数量是指编码核酸分子的数量或蛋白质活性的数量，而非引入宿主细胞的单独的核酸分子的数量。
如本文所使用的，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有此类命名均包括子代。因此，术语“转化体”和“经转化的细胞”和“宿主细胞”包括原代受试者细胞和源自其的培养物，而不考虑转移的数量。还应理解，由于有意或无意突变，所有子代可能在DNA含量方面不完全相同。包括具有与针对最初转化的细胞中筛选的功能、表型或生物活性相同或基本上相同的功能、表型或生物活性的变体子代。在期望不同的命名的情况下，从上下文将显而易见。
术语“构建体”是指包含重组核酸分子(或者，如果上下文明确指出，本公开的融合蛋白)的任何多核苷酸。
在某些实施方式中，本公开的多核苷酸可以可操作地与载体的某些元件连接。例如，实现多核苷酸序列所连接的编码序列的表达和加工所需的所述多核苷酸序列可以可操作地连接。表达控制序列可以包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效RNA加工信号，如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及可能增强蛋白质分泌的序列。如果表达控制序列与所关注基因和以反式作用或隔一定距离作用以控制所关注基因的表达控制序列邻接，则所述表达控制序列可以可操作地连接。
抗体和抗原结合片段
本公开的实施方式包括抗体和其抗原结合片段，所述抗体和其抗原结合片段能够与HBsAg的抗原环区结合(HBsAg和抗原环区在此处进一步详细描述)，并且任选地，能够中和由基因型D、A、B、C、E、F、G、H、I或J或其任何组合的乙型肝炎病毒(HBV)引起的感染；即这些基因型中的任何一个、任何两个、任何三个、任何四个、任何五个、任何六个、任何七个、任何八个、任何九个或所有十个基因型。如本文进一步讨论的，本公开的抗体和抗原结合片段具有其它优点，包括例如但不限于有利于在宿主细胞中产生的特性以及降低形成不希望的聚集体(如二聚体)的倾向。
如本文所使用的，并且除非上下文另有明确说明，否则“抗体”是指包括通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的完整抗体(尽管应理解，缺少轻链的重链抗体仍通常涵盖在术语“抗体”中，尽管本公开的优选实施方式包括VH和VL两者，并且在一些实施方式中，包括重链和轻链两者)，以及具有或保留与完整抗体识别的抗原靶分子结合的能力的完整抗体的任何抗原结合部分或片段，例如scFv、Fab或F(ab')2片段。因此，本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和其功能(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))以及单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。所述术语涵盖基因工程化和/或以其它方式修饰的免疫球蛋白形式，如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体和异缀合抗体、多特异性(例如，双特异性)抗体、双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体、串联双scFv、串联三scFv以及本领域已知的其它抗体形式。除非另有说明，否则术语“抗体”应被理解为涵盖其功能抗体片段。术语“抗体”还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或其亚类的抗体，包括IgG和其亚类(IgG1、IgG2、IgG2、IgG4)、IgM、IgE、IgA和IgD。
如本文所使用的，在抗体的上下文中，术语“抗原结合片段”、“片段”和“抗体片段”可互换使用以指代保留抗体的抗原结合活性的本公开的抗体的任何片段。抗体片段的实例包括但不限于单链抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。
人抗体是已知的(例如，van Dijk,M.A.和van de Winkel,J.G.,《化学生物学的最新观点(Curr Opin Chem Biol.)》5(2001)368-374)。人抗体可以在转基因动物(例如，小鼠)中产生，所述转基因动物在免疫时能够在不存在内源性免疫球蛋白的情况下产生人抗体的完整库或选择。人种系免疫球蛋白基因阵列在此类种系突变小鼠中的转移将导致在抗原激发时产生人抗体(参见例如Jakobovits,A.等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》90(1993)2551-2555；Jakobovits，A.等人《自然(Nature)》362(1993)255-258；Bruggemann,M.等人《年度免疫学(Year Immunol.)》7(1993)3340)。人抗体还可以在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom,H.R.和Winter,G.,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》227(1992)381(-388)；Marks,J.D.等人,《分子生物学杂志)》222(1991)581-597)。Cole等人和Boerner等人的技术还可用于制备人单克隆抗体(Cole等人,《单克隆抗体与癌症疗法(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)》,艾伦R利斯公司(AlanR.Liss),第77页(1985)；以及Boerner等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》147(1991)86-95)。人单克隆抗体可以通过使用经改进的EBV-B细胞永生化来制备，如Traggiai E,Becker S,Subbarao K,Kolesnikova L,Uematsu Y,Gismondo MR,Murphy BR,Rappuoli R,Lanzavecchia A.(2004)：一种由记忆B细胞制备人单克隆抗体的有效方法：强效中和SARS冠状病毒(An efficient method to make human monoclonal antibodies from memoryB cells:potent neutralization of SARS coronavirus)《自然医学(Nat Med.)》10(8):871-5所述。如本文所使用的，术语“人抗体”还包括此类抗体，所述抗体例如在可变区或恒定区中被修饰以产生根据本公开的抗体和抗体片段的特性。
根据本公开的抗体可以属于任何同种型(例如，IgA、IgG、IgM、IgE、IgD；即包括α、γ、μ、ε或δ重链)。例如，在IgG同种型内，抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。在具体实施方式中，本公开的抗体是IgG1抗体。本文所提供的抗体或抗原结合片段可以包括κ或λ轻链。优选地，抗体或抗原结合片段可以包括λ轻链。在某些实施方式中，本文所述的HBsAg特异性抗体属于IgG同种型(例如，IgG1M,17 1同种异型)，并且可以阻断HBV和HBsAg从感染细胞中释放。因此，在某些实施方式中，根据本说明书的抗体可以细胞内结合并且由此阻断HBV病毒粒子和HBsAg的释放。
术语“VL”或“VL”和“VH”或“VH”分别指来自抗体轻链和抗体重链的可变区(也称为可变结构域)；通常，这些区直接参与抗体或抗原结合片段与抗原的结合。VL(以及CL或轻链)可以是κ(kappa)类(本文中也称为“VK”)或λ(lambda)类。可变结合区包括已知为“互补决定区”(CDR)和“框架区”(FR)的离散子区。术语“互补决定区”和“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，并且是指抗体可变区内的氨基酸序列，通常，其共同将抗原特异性和/或结合亲和力赋予抗体，其中连续CDR(即，CDR1和CDR2、CDR2和CDR3)在一级氨基酸序列中由框架区彼此分隔。每个可变区有三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3；LCDR1、LCDR2、LCDR3；也分别被称为CDRH和CDRL)。在某些实施方式中，抗体VH包括如下四个FR和三个CDR：FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4；并且抗体VL包括如下四个FR和三个CDR：FR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4。通常，VH和VL一起通过其相应的CDR形成抗原结合位点，尽管应理解，在一些情况下，结合位点可以包括CDR中的一个、两个、三个、四个或五个或由其形成，所述CDR可以安置在VH中、在VL中或两者中。
在某些实施方式中，可变区的抗体CDR和氨基酸编号根据由化学计算组(“CCG”)开发的系统；例如，使用分子操作环境(MOE)软件(www.chemcomp.com)。
在某些实施方式中，可变区的抗体CDR和氨基酸编号根据IMGT编号方案(参见例如Lefranc等人，《发展与比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》27:55，2003)。
可以使用抗原受体编号和受体分类(ANARCI)软件工具注释等效残基位置并比较不同的分子(2016，《生物信息学(Bioinformatics)》15:298-300)。
如本文所使用的，CDR的“变体”是指具有至多1-3个氨基酸取代、缺失或其组合的CDR序列的功能变体(如本文所提供的)。
在某些实施方式中，本公开提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括：(i)重链可变区(VH)，在所述VH中包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列、SEQID NO:35或SEQ ID NO:36的氨基酸序列，和SEQ ID NO:37的氨基酸序列；以及(ii)轻链可变区(VL)，在所述VL中包括SEQ ID NO:41、40、42和43中的任一者的氨基酸序列、如SEQ IDNO:49、44-48和50-53中的任一者所示的氨基酸序列以及如SEQ ID NO:55或56所示的氨基酸序列，
其中任选地，所述VL包括与SEQ ID NO:58有关的R60N取代突变、R60A取代突变、R60K取代突变、S64A取代突变、I74A取代突变或其任何组合，并且其中所述取代突变的氨基酸编号如SEQ ID NO:58所示，并且仍进一步任选地，其中所述VL不包括与SEQ ID NO:58有关的任何另外的突变，
并且其中所述抗体或其抗原结合片段能够与HBsAg的抗原环区结合，并且任选地，能够中和由基因型D、A、B、C、E、F、G、H、I或J或其任何组合的乙型肝炎病毒(HBV)引起的感染。
在一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包括：
(i)在所述VH中，分别如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、45和55所示的氨基酸序列；(ii)在所述VH中，如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、46和55所示的氨基酸序列；(iii)在所述VH中，分别如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、47和55所示的氨基酸序列；(iv)在所述VH中，分别如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、48和55所示的氨基酸序列；(v)在所述VH中，分别如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、49和55所示的氨基酸序列；(vi)在所述VH中，分别如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、50和55所示的氨基酸序列；(vii)在所述VH中，分别如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、51和55所示的氨基酸序列；(viii)在所述VH中，分别如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、52和55所示的氨基酸序列；或者(ix)在所述VH中，分别如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、53和55所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本公开提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括：(i)重链可变区(VH)，所述VH包括如EQ ID NO:34所示的CDRH1氨基酸序列、如SEQ ID NO:35或36所示的CDRH2氨基酸序列以及如SEQ ID NO:37所示的CDRH3氨基酸序列；以及(ii)轻链可变区(VL)，所述VL包括SEQ ID NO:40-43中的任一者中所示的CDRL1氨基酸序列、如SEQ ID NO:45-53中的任一者所示的CDRL2氨基酸序列以及如SEQ ID NO:55或56所示的CDRL3氨基酸序列，其中所述CDR根据CCG，其中所述抗体或其抗原结合片段能够与HBsAg的抗原环区结合并且能够中和由基因型D、A、B、C、E、F、G、H、I或J或其任何组合的乙型肝炎病毒(HBV)引起的感染。
在某些实施方式中，所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列如以下所示：(i)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、45和55；(ii)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、46和55；(iii)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、47和55；(iv)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、48和55；(v)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、49和55；(vi)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、50和55；(vii)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、51和55；(viii)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、52和55；或(ix)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、53和55；其中CDR根据CCG。
表1提供了某些抗体的CDR氨基酸SEQ ID NO，其中CDR是根据CCG定义的。
表1：某些抗体的CDR(CCG编号)氨基酸SEQ ID NO
抗体 CDRH1 CDRH2 CDRH3 CDRL1 CDRL2 CDRL3
HBC34-v35 34 35 37 41 44 55
HBC34-v36 34 35 37 41 45 55
HBC34-v37 34 35 37 41 46 55
HBC34-v38 34 35 37 41 47 55
HBC34-v39 34 35 37 41 48 55
HBC34-v40 34 35 37 41 49 55
HBC34-v41 34 35 37 41 50 55
HBC34-v42 34 35 37 41 51 55
HBC34-v43 34 35 37 41 52 55
HBC34-v44 34 35 37 41 53 55
HBC34-v45 34 35 37 41 44 55
HBC34-v46 34 35 37 41 44 55
HBC34-v47 34 35 37 41 51 55
HBC34-v48 34 35 37 41 44 55
HBC34-v49 34 35 37 41 51 55
HBC34-v50 34 35 37 41 44 55
在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段包括以下的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3：HBC34-v36；HBC34-v37；HBC34-v38；HBC34-v39；HBC34-v40；HBC34-v41；HBC34-v42；HBC34-v43；HBC34-v44；HBC34-v45；HBC34-v46；HBC34-v47；HBC34-v48；HBC34-v49；或HBC34-v50，其中CDR根据CCG，任选地，其中所述VL进一步包括与SEQ ID NO:58有关的R60N取代突变、R60A取代突变、R60K取代突变、S64A取代突变、I74A取代突变或其任何组合，并且其中所述取代突变的氨基酸编号如SEQ ID NO:58所示，并且进一步任选地，其中所述VL不包括与SEQ ID NO:58有关的任何其它突变。
表2提供了某些抗体的CDR氨基酸SEQ ID NO，其中CDR是根据IMGT定义的(公开了CDRH2和CDRL2的短版本和长版本)。
表2：某些抗体的CDR(IMGT编号)氨基酸SEQ ID NO
Figure BDA0004086126640000211
在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段包括以下的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3：HBC34-v36；HBC34-v37；HBC34-v38；HBC34-v39；HBC34-v40；HBC34-v41；HBC34-v42；HBC34-v43；HBC34-v44；HBC34-v45；HBC34-v46；HBC34-v47；HBC34-v48；HBC34-v49；或HBC34-v50，其中CDR根据IMGT，任选地，其中所述VL进一步包括与SEQ ID NO:58有关的R60N取代突变、R60A取代突变、R60K取代突变、S64A取代突变、I74A取代突变或其任何组合，并且其中所述取代突变的氨基酸编号如SEQ ID NO:58所示，并且进一步任选地，其中所述VL不包括与SEQ ID NO:58有关的任何其它突变。
表3提供了某些抗体的VH和VL氨基酸SEQ ID NO。
表3：某些抗体的VH和VL氨基酸SEQ ID NO
Figure BDA0004086126640000212
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Figure BDA0004086126640000221
在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段包括以下的VH和VL氨基酸序列：HBC34-v36；HBC34-v37；HBC34-v38；HBC34-v39；HBC34-v40；HBC34-v41；HBC34-v42；HBC34-v43；HBC34-v44；HBC34-v45；HBC34-v46；HBC34-v47；HBC34-v48；HBC34-v49；或HBC34-v50。
在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段包括重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中：(i)所述VH包括与以下中所示的氨基酸序列具有至少90％(即，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％或其间任何非整数值)同一性的氨基酸序列或由其组成：SEQ ID NO:38或39；和/或(ii)所述VL包括与以下中的任一者中所示的氨基酸序列具有至少90％(即，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％或其间任何非整数值)同一性的氨基酸序列或由其组成：SEQ ID NO:58-66、69、71或72。在特定实施方式中，所述VH和所述VL包括与以下中所示的氨基酸序列具有至少90％(即，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或其间任何非整数值)同一性的氨基酸序列或由其组成：(i)分别为SEQ ID NO:38和58；(ii)分别为SEQ ID NO:38和59；(iii)分别为SEQ ID NO:38和60；(iv)分别为SEQ ID NO:38和61；(v)分别为SEQ ID NO:38和62；(vi)分别为SEQ ID NO:38和63；(vii)分别为SEQ ID NO:38和64；(viii)分别为SEQID NO:38和65；(ix)分别为SEQ ID NO:38和66；(x)分别为SEQ ID NO:38和71；或(xi)分别为SEQ ID NO:38和72。作为非限制性实例，在某些实施方式中，所述VH包括与SEQ ID NO:38具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且所述VL包括与SEQ ID NO:62具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述VH包括SEQ ID NO:38或39中所示的氨基酸序列或由其组成；和/或所述VL包括SEQ ID NO:58-66、69、71或72中的任一者所示的氨基酸序列或由其组成。在特定实施方式中，所述VH和所述VL包括以下中所示的氨基酸序列或由其组成：(i)分别为SEQ ID NO:38和58；(ii)分别为SEQ ID NO:38和59；(iii)分别为SEQ ID NO:38和60；(iv)分别为SEQ ID NO:38和61；(v)分别为SEQ ID NO:38和62；(vi)分别为SEQ ID NO:38和63；(vii)分别为SEQ ID NO:38和64；(viii)分别为SEQ ID NO:38和65；(ix)分别为SEQ IDNO:38和66；(x)分别为SEQ ID NO:38和71；或(xi)分别为SEQ ID NO:38和72。
在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段包括VH和VL，所述VH包括SEQ ID NO:38中所示的氨基酸序列或由其组成，所述VL包括SEQ ID NO:58-72中的任一者所示的氨基酸序列或由其组成。
在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段包括VH和VL，所述VH包括SEQ ID NO:38中所示的氨基酸序列或由其组成，所述VL包括SEQ ID NO:59-72中的任一者所示的氨基酸序列或由其组成。
另一方面，本公开提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括：重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中所述VH和所述VL包括以下中所示的氨基酸序列或由以下组成：(i)分别为SEQ ID NO:38和67；或(ii)分别为SEQ ID NO:38和68，其中所述抗体或其抗原结合片段能够与HBsAg的抗原环区结合并且能够中和由基因型D、A、B、C、E、F、G、H、I或J或其任何组合的乙型肝炎病毒(HBV)引起的感染。
还提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括如SEQ ID NO:38或39的VH和SEQ ID NO:57-72中的任一者所示的VL变体，所述VL变体包括以下突变中的任何一个或多个突变(在框架区3中，如通过CCG编号所确定的)：R60A、R60N、R60K、S64A、I74A。在某些另外的实施方式中，(分别)与SEQ ID NO:57-72相比，VL变体不包括任何另外的突变。
还提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括如SEQ ID NO:38的VH和SEQ ID NO:57-72中的任一者所示的VL变体，所述VL变体包括Q78、D81或两者处的取代突变(例如，保守氨基酸取代或种系编码氨基酸的突变)(CCG编号)。
还提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括如SEQ ID NO:39的VH和SEQ ID NO:57-72中的任一者所示的VL变体，所述VL变体包括Q78、D81或两者处的取代突变(例如，保守氨基酸取代或种系编码氨基酸的突变)(CCG编号)。
如本文进一步讨论的，本公开的抗体和抗原结合片段形成聚集体(例如，二聚体)的倾向降低，和/或在宿主细胞中的产生改善(例如，更高的滴度)，和/或与本文所公开的参考抗体相比，具有相似或基本上相同或甚至改善的以下各项：与HbsAg的结合；HBV中和；和/或热稳定性。
应理解，“参考”抗体或抗原结合片段是指分别与主题抗体或抗原结合片段相同的抗体或抗原结合片段，经鉴定或枚举的特征除外(例如，CDR和/或可变区框架序列的差异)。在一些实施方式中，参考抗体包括SEQ ID NO:34、35、37、41、44和55中分别所示的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，并且任选地包括SEQ ID NO:38中所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:57中所示的VL氨基酸序列。
作为非限制性实例，本公开的抗体或抗原结合片段可以是IgG1同种型并且包括野生型IgG1 Fc部分，并且参考抗体或抗原结合片段包括分别如SEQ ID NO:34、35、37、41、44和55所示的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，并且任选地包括SEQ ID NO:38中所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:57中所示的VL氨基酸序列，并且是IgG1同种型，并且包括野生型IgG1 Fc部分。应进一步理解的是，当在某些条件下将本公开的抗体或抗原结合片段与参考抗体或抗原结合片段进行比较时，除非另有明确说明，否则所述条件(例如，起始材料的量、温度、缓冲液、宿主细胞系的身份、培养条件、相关时间段的持续时间、编码多核苷酸的密码子优化等)将在本公开的分子与参考分子之间相同，或在条件允许的情况下尽可能接近相同(例如，两种抗体的氨基酸序列可能相差一个或多个氨基酸，但将在其它方面相同，并且将由相当的多核苷酸编码(例如，每种抗体都可以由相应的密码子优化的多核苷酸编码))。
作为非限制性实例，与参考抗体或抗原结合片段相比，本公开的抗体和抗原结合片段分别产生较少的聚集体(例如，以抗体:抗体二聚体、抗体:抗原结合片段二聚体或抗原结合片段:抗原结合片段二聚体的形式)，和/或在宿主细胞中具有更高的生产滴度。
在这种情况下，二聚体是包括两个抗体或抗原结合片段分子(例如，抗体:抗体二聚体、Fab:Fab二聚体或抗体:Fab二聚体)的复合物或聚集体。如本文进一步讨论的，在这种情况下，二聚化不同于抗体重链与轻链组分之间或两个抗体重链多肽之间的典型缔合，所述典型缔合发生在完整的四聚体抗体、Fv或Fab的形成过程中，并且可能涉及两个单体之间的缔合。因此，应理解，在本发明的上下文中，“二聚体”或不是指抗体重链与抗体轻链的缔合，以提供包括功能性Fab的半抗体，并且也不包括抗体的两个重链的缔合(例如，铰链-铰链和Fc-Fc)或VH-VL缔合(例如通过二硫键发生的缔合)，如在Fv或在Fab中。
在某些实施方式中，二聚体由两个离散抗体或抗原结合片段分子的VL之间的缔合形成。由离散抗体分子的两个VL的缔合形成的二聚体的图示示于本发明的图7中。例如，此类二聚化可以降低其中包括的抗体或抗原结合片段分子中的一者或两者的结合价和/或结合亲和力和/或亲合力和/或中和效力。通常，包括多个抗体或抗原结合片段的组合物中的此类二聚体的存在的增加降低了组合物的整体结合和/或中和效力。
抗体或抗原结合片段二聚体可以使用已知的技术，例如尺寸排阻色谱法进行鉴定。二聚体的分子量将高于其每个单独(单体)亚基的分子量，并且通常将等于或近似于其每个单独亚基的分子量之和。例如，同源二聚体(即，其包括两个在其氨基酸序列上相同或基本上相同的抗体分子)的分子量通常将为其每个单体亚基的分子量的约两倍。例如，典型的人IgG1免疫球蛋白分子的分子量为约150千道尔顿(例如，两条重链中的每一条重约50千道尔顿，并且两条轻链中的每一条重约25千道尔顿)，并且包括两个此类免疫球蛋白分子的二聚体的分子量将为约300千道尔顿。当然，应理解，一种抗体可以与具有相同通用结构和同种型的不同抗体具有略微或略有不同的分子量，例如，至少部分地由于相应氨基酸序列的任何差异。
作为另一个非限制性实例，抗体分子的分子量可以介于140千道尔顿与160千道尔顿之间，并且包括两个抗体分子的抗体二聚体的分子量可以介于280千道尔顿与320千道尔顿之间。二聚体可以被称为“高分子量物种”或“HMWS”。
可以使用例如绝对尺寸排阻色谱法(aSEC)评估包括多个抗体(和/或抗原结合片段)分子的组合物或样品中二聚体的存在。组合物或样品中二聚体的量可以表示为在组合物或样品中包含在二聚体中的总抗体或抗原结合片段分子的百分比。举例说明，对于包括12％二聚体的抗体组合物，样品中88％的总抗体分子作为单体存在。
在本公开的任何实施方式中，在包括多个抗体或抗原结合片段(即，多个抗体或抗原结合片段分子)的样品中，当样品已在约40℃下温育约120小时至约168小时时，所述多个中的少于12％、11％或更少、10％或更少、9％或更少、8％或更少、7％或更少、6％或更少、5％或更少、4％或更少、3％或更少或2％或更少包括在二聚体中，其中任选地，通过绝对尺寸排阻色谱法确定二聚体的存在。
在本公开的任何实施方式中，与温育多个参考抗体或抗原结合片段分子相比，温育多个本公开的抗体或抗原结合片段分子使二聚体形成减少，其中参考抗体或抗原结合片段包括分别如SEQ ID NO:34、35、37、41、44和55所示的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，并且任选地包括SEQ ID NO:38中所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:57中所示的VL氨基酸序列，并且其中任选地，通过绝对尺寸排阻色谱法确定抗体二聚体的存在。此类参考抗体或抗原结合片段(例如，Fv、Fab)可以形成二聚体，在一些实施方式中，所述二聚体共同包括样品中的抗体或抗原结合片段分子的大于2％、3％或更多、4％或更多、5％或更多、6％或更多、7％或更多、8％或更多、9％或更多、10％或更多、11％或更多或至多12％(例如，当在约40℃下温育约120小时至约168小时时)。换句话说，在一些实施方式中，至多12％或更多的参考抗体或抗原结合片段分子包括在二聚体中，而较少百分比(优选地2％或更少)的本公开的抗体或抗原结合片段分子包括在二聚体中。
在一些实施方式中，与参考抗体相比，在以下条件下本公开的抗体或抗原结合片段形成更低量的二聚体，和/或以减少的频率和/或以样品或组合物中总抗体或抗原结合片段分子的更低百分比形成二聚体(例如，如使用尺寸排阻色谱法确定的)：(i)在4℃下温育5天、15天和/或32天；(ii)在25℃下温育5天、15天和/或32天；和/或(iii)在40℃下温育5天、15天和/或32天，其中所述参考抗体或抗原结合片段包括分别如SEQ ID NO:34、35、37、41、44和55所示的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，并且任选地包括SEQ ID NO:38中所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:57中所示的VL氨基酸序列。
在一些实施方式中，在组合物中包含在二聚体中的本公开的抗体或抗原结合片段分子的百分比分别是在组合物中包含在二聚体中的参考抗体分子的百分比的少于4/5、少于3/4、少于1/2、少于1/3、少于1/4、少于1/5、少于1/6、少于1/7、少于1/8、少于1/9或少于1/10。作为非限制性实例，在40℃下温育32天(768小时)后，组合物中22％或更多的参考抗体分子可以包括在二聚体中，而组合物中本公开的抗体或抗原结合片段分子的17％或更少、16％或更少、15％或更低、14％或更低、13％或更低、12％或更低、11％或更低、10％或更低、9％或更少、8％或更少、7％或更低、6％或更少、5％或更少、4％或更少、3％或更少或2％或更少分别包括在二聚体中。
在一些实施方式中，相较于用编码参考抗体或抗原结合片段的多核苷酸转染的参考宿主细胞，用编码本公开的抗体或抗原结合片段的多核苷酸转染的宿主细胞(例如，CHO细胞，如ExpiCHO细胞)分别提供了1.5倍或更多倍、2倍或更多倍、3倍或更多倍或4倍或更多倍的抗体或抗原结合片段的量(例如，以mg/mL为单位作为浓度进行测量)，其中参考抗体或抗原结合片段包括分别如SEQ ID NO:34、35、37、41、44和55所示的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，并且任选地包括SEQ ID NO:38中所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:57中所示的VL氨基酸序列。
在一些实施方式中，与在参考转染细胞中产生的参考抗体或抗原结合片段相比，本公开的抗体或其抗原结合片段以更高的滴度在转染细胞中产生，其中参考抗体或抗原结合片段包括分别如SEQ ID NO:34、35、37、41、44和55所示的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，并且任选地包括SEQ ID NO:38中所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:57中所示的VL氨基酸序列。
在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段以一定滴度在转染细胞中产生，所述滴度是参考抗体或抗原结合片段产生的滴度的至少1.5倍、至少2倍、至少3倍或至少4倍，其中参考抗体或抗原结合片段包括分别如SEQ ID NO:34、35、37、41、44和55所示的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，并且任选地包括SEQID NO:38中所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:57中所示的VL氨基酸序列。
在本公开的任何实施方式中，所述抗体或抗原结合片段能够以3.5或更小、约3.2或更小、小于3.0、小于2.5、小于2.0、小于1.5或小于1.0的EC50(ng/ml)与HBsAg(例如，亚型adw的HBsAg)结合。在一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段能够以小于3.5、小于3.4、小于3.3、小于3.2、小于3.1、小于3.0、小于2.9、小于2.8、小于2.7、小于2.6、小于2.5、小于2.4、小于2.3、小于2.1、小于2.0、小于1.9、小于1.8、小于1.7、小于1.6、小于1.5、小于1.4、小于1.3、小于1.2、小于1.1或小于1.0的EC50(ng/ml)与HBsAg(例如，亚型adw的HBsAg)结合。在一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段能够以介于0.9与2.0之间、或介于0.9与1.9之间、或介于0.9与1.8之间、或介于0.9与1.7之间、或介于0.9与1.6之间、或介于0.9与1.5之间、或介于0.9与1.4之间、或介于0.9与1.3之间、或介于0.9与1.2之间、或介于0.9与1.1之间、或介于0.9与1.0之间、或介于1.0与2.0之间的EC50(ng/ml)与HBsAg(例如，亚型adw的HBsAg)结合。在某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段能够以2.0或更小的EC50(ng/ml)与HBsAg(例如，亚型adw的HBsAg)结合。在一些实施方式中，结合EC50通过ELISA(例如，直接抗原结合ELISA测定，通过使用Graphpad prism拟合曲线来确定结合曲线)确定。
在本公开的任何实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段能够以小于20ng/ml，优选地15ng/ml或更小，更优选地10ng/mL或更小的感染中和EC50中和乙型肝炎病毒感染。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段能够以18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8或7ng/mL的感染中和EC50中和乙型肝炎病毒感染。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段能够以比参考抗体或抗原结合片段的感染中和EC50更低的感染中和EC50(使用同一测定)中和乙型肝炎病毒感染，所述参考抗体或抗原结合片段包括分别如SEQ ID NO:34、35、37、41、44和55所示的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，并且任选地包括SEQ ID NO:38中所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:57中所示的VL氨基酸序列。在一些实施方式中，感染中和EC50在温育经培养细胞(例如，经分化的HepaRG细胞)后在存在或不存在待测抗体的情况下使用固定量的HBV确定。在此类实施方式中，温育可以在例如37℃下进行持续16小时。所述温育可以在培养基(例如补充有4％ PEG 8000的培养基)中进行。温育之后，可以对细胞进行洗涤并且进一步培养。为了测量病毒感染性，可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)确定分泌到培养上清液中的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和/或乙型肝炎e抗原(HBeAg)的水平，例如感染后第7天至第11天。可以将来自经处理细胞的HBsAg和/或HBeAg的水平与未经处理细胞的水平进行比较，以确定中和的存在和程度。
“Fv”是包括完整抗原识别和抗原结合位点的小抗体片段。此片段通常由紧密地非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。然而，即使单个可变结构域(或包括仅三个对抗原具有特异性的CDR的Fv的一半)可以具有识别并结合抗原的能力，但通常亲和力低于完整结合位点。
“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”，是包括连接成单个多肽链的VH抗体结构域和VL抗体结构域的抗体片段。在一些实施方式中，scFv多肽包括安置于VH结构域与VL结构域之间并且连接所述结构域的多肽接头，所述多肽接头使scFv能够保留或形成抗原结合的期望结构。此类肽接头可以使用本领域众所周知的标准技术并入到融合多肽中。额外地或可替代地，Fv可以具有在VH与VL之间形成并稳定VH和VL的二硫键。关于scFv的综述，参见《单克隆抗体药理学(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)》中的Pluckthun,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,纽约的斯普林格出版社(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)；Borrebaeck 1995,参见下文。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段包括scFv，所述scFv包括VH结构域、VL结构域和将VH结构域与VL结构域连接的肽接头。在特定实施方式中，scFv包括通过肽接头与VL结构域连接的VH结构域，所述VH结构域可以处于VH-接头-VL朝向或处于VL-接头-VH朝向。本公开的任何scFv可以被工程化，使得VL结构域的C末端通过短肽序列与VH结构域的N末端连接，反之亦然(即，(N)VL(C)-接头-(N)VH(C)或(N)VH(C)-接头-(N)VL(C))。可替代地，在一些实施方式中，接头可以与VH结构域、VL结构域或两者的N末端部分或末端连接。
可以例如基于以下来选择肽接头序列：(1)其能够采用灵活的扩展构象；(2)其不能或缺乏采用可以与第一多肽和第二多肽上和/或靶分子上的功能性表位相互作用的次级结构的能力；和/或(3)缺乏或相对缺乏可能与多肽和/或靶分子发生反应的疏水残基或带电残基。有关接头设计的其它考虑因素(例如，长度)可以包括构象或构象范围，其中VH和VL可以形成功能性抗原结合位点。在某些实施方式中，肽接头序列包括例如Gly、Asn和Ser残基。其它近中性的氨基酸，如Thr和Ala，也可以包括在接头序列中。可以有效用作接头的其它氨基酸序列包括在Maratea等人,《基因(Gene)》40:39 46(1985)；Murphy等人,《美国国家科学院院刊》83:8258 8262(1986)；美国专利第4,935,233号和美国专利第4,751,180号中所公开的氨基酸序列。接头的其它说明性和非限制性实例可以包括例如Chaudhary等人,《美国国家科学院院刊》87:1066-1070(1990)以及Bird等人,《科学(Science)》242:423-426(1988))中所公开的接头以及串联连接的四个甘氨酸残基的五聚体，当以单次迭代或重复1次至5次或更多次或更多存在时，所述系列的C末端甘氨酸与单个丝氨酸连接。可以使用任何合适的接头，并且通常长度可以为约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、15个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个氨基酸，或长度少于约200个氨基酸，并且优选地将包括柔性结构(可以为通过接头连接的两个区、结构域、基序、片段或模块之间的构象运动提供灵活性和空间)，并且优选地将具有生物学惰性和/或在人中具有低免疫原性风险。
可以使用本文所公开的VH和VL序列的任何组合或者CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3序列的任何组合来构建scFv。在一些实施方式中，例如当第一多肽和第二多肽具有可以用于将功能性结构域分开并防止空间干扰的非必需N末端氨基酸区时，不需要接头序列。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段包括轻链恒定区(或其部分或片段)、重链恒定区(或其部分或片段)或两者。术语“CL”是指“免疫球蛋白轻链恒定区”或“轻链恒定区”，即来自抗体轻链的恒定区。术语“CH”是指“免疫球蛋白重链恒定区”或“重链恒定区”，取决于抗体同种型，其可进一步分为CH1、CH2和CH3(IgA、IgD、IgG)或CH1、CH2、CH3和CH4结构域(IgE、IgM)。本文进一步描述抗体重链的Fc区。在本公开的任何实施方式中，本公开的抗体或抗原结合片段包括CL、CH1、CH2和CH3中的任何一者或多者。在某些实施方式中，CL包括与SEQ ID NO:79的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，CH1-CH2-CH3包括与SEQ IDNO:73或其变体的氨基酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，所述变体包括以下氨基酸取代中的一个或多个(EU编号)：G236A；A330L；I332E；M428L；N434S。在本文中其它地方描述了Fc部分。
应当理解的是，例如，在哺乳动物细胞系中的产生可以去除抗体重链的一个或多个C末端赖氨酸(参见例如Liu等人,mAb 6(5):1145-1154(2014))。因此，本公开的抗体或抗原结合片段可以包括重链、CH1-CH3、CH3或Fc多肽，其中存在或不存在C末端残基；换句话说，涵盖了其中重链、CH1-CH3或Fc部分的C末端残基不是赖氨酸的实施方式以及赖氨酸是C末端残基的实施方式。在某些实施方式中，组合物包含多种本公开的抗体和/或抗原结合片段，其中一种或多种抗体或抗原结合片段不包括重链、CH1-CH3或Fc部分的C末端处的赖氨酸残基，并且其中一种或多种抗体或抗原结合片段包括重链、CH1-CH3或Fc部分的C末端处的赖氨酸残基。
“Fab”(片段抗原结合)是抗体与抗原结合的部分并且包括通过链间二硫键与轻链连接的重链的可变区和CH1。每个Fab片段关于抗原结合是单价的，即，其具有单个抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单个大F(ab')2片段，其大致对应于具有二价抗原结合活性的两个二硫键连接的Fab片段并且仍然能够交联抗原。Fab和F(ab')2两者均为“抗原结合片段”的实例。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在CH1结构域的羧基末端处具有额外的少量残基，所述结构域包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH在本文中是对其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基团的Fab'的名称。F(ab')2抗体片段最初是作为其间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对产生的。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。Fab片段可以例如通过肽接头连接以形成单链Fab，在本文中也称为“scFab”。在这些实施方式中，天然Fab中存在的链间二硫键可能不存在，并且接头完全或部分用于在单个多肽链中连接(link/connect)Fab片段。重链衍生的Fab片段(例如包括VH+CH1或“Fd”、由其组成或基本上由其组成)和轻链衍生的Fab片段(例如包括VL+CL、由其组成或基本上由其组成)可以以任何排列连接以形成scFab。例如，可以根据(重链Fab片段-接头-轻链Fab片段)或(轻链Fab片段-接头-重链Fab片段)以N末端至C末端的方向排列scFab。本文中进一步详细论述用于scFab的肽接头和示例性接头序列。
在本公开的任何实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括人抗体、单克隆抗体、经纯化的抗体、单链抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。
可以通过包括用如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等酶消化和/或通过化学还原切割二硫键的方法从抗体中获得本文所描述的抗体的片段。可替代地，可以通过克隆并表达重链或轻链序列的一部分来获得抗体的片段。本公开涵盖源自如本文所述的抗体的重链和轻链的单链Fv片段(scFv)，所述scFv包括例如包含来自根据本说明书的抗体的CDR(以及任选地可变区)的scFv、重链或轻链单体和二聚体(即，VH-VL二聚体、HC-LC二聚体、HC-HC二聚体)、单结构域重链抗体、单结构域轻链抗体以及单链抗体，其中重链和轻链可变结构域或区通过肽接头接合。
在某些实施方式中，根据本公开的抗体或其抗原结合片段包括经纯化的抗体、单克隆抗体、单链抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。
在实施方式中，本公开的抗体和抗原结合片段可以是多特异性的(例如，双特异性的、三特异性的、四特异性的等)，并且可以以如本文所公开的任何多特异性形式提供。在某些实施方式中，本公开的抗体或抗原结合片段为多特异性抗体，如双特异性或三特异性抗体。在例如Spiess等人，《分子免疫学(Mol.Immunol.)》67(2):95(2015)和Brinkmann和Kontermann，mAb 9(2):182-212(2017)中公开了双特异性抗体的形式，这些双特异性形式以及其制备方法通过引用并入本文中并且包括例如双特异性T细胞衔接子(BiTE)、DART、杵臼(Knobs-Into-Holes，KIH)组合件、scFv-CH3-KIH组合件、KIH普通轻链抗体、TandAb、三联体、TriBi微抗体、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab')2-scFv2、四价HCab、胞内抗体、CrossMab、双作用Fab(DAF)(二合一或四合一)、DutaMab、DT-IgG、电荷对、Fab-臂交换、SEED体、Triomab、LUZ-Y组合体、Fcab、κλ体、正交Fab、DVD-IgG、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、Zy体和DVI-IgG(四合一)。双特异性或多特异性抗体可以包括本公开的HBV和/或HDV特异性结合结构域与本公开的另一个HBV和/或HDV特异性结合结构域的组合，或与和HBV和/或HDV特异性结合(例如，在相同或不同表位处)的不同结合结构域的组合，或与和不同抗原特异性结合的结合结构域的组合。
本公开的抗体片段可以赋予单价或多价相互作用并且包括于如上文所描述的多种结构中。例如，可以合成scFv分子以产生三价“三功能抗体”或四价“四功能抗体”。scFv分子可以包括产生二价微抗体的Fc区结构域。另外，本公开的序列可以是多特异性分子的组分，其中本公开的序列靶向本公开的表位并且分子的其它区与其它靶标结合。示例性分子包括但不限于双特异性Fab2、三特异性Fab3、双特异性scFv和双功能抗体(Holliger和Hudson,2005,《自然生物技术(Nature Biotechnology)》9:1126-1136)。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段(如本文所描述的那些，包括但不限于scFv)可以包括能够与如本文所描述的抗原特异性结合的融合蛋白中。
如本文所使用的，“融合蛋白”是指在单链中具有至少两个不同结构域或基序的蛋白质，其中在蛋白质中，结构域或基序并非天然发现在一起或呈给定排列。编码融合蛋白的多核苷酸可以使用PCR、重组工程化等构建，或者可以合成此类融合蛋白。
在一些实施方式中，融合蛋白能够在宿主细胞，例如T细胞、NK细胞或NK-T细胞的表面处表达。在某些实施方式中，融合蛋白包括：(i)包含抗体或其抗原结合片段(例如，scFv)的胞外组分；(ii)跨膜组分(例如，来自CD4、CD8、CD27、CD28或其功能性变体或部分或其任何组合的跨膜结构域)；以及(iii)包含来自共刺激蛋白的信号传导结构域或其功能性变体或部分的细胞内成分(例如，来自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、CD2、CD5、ICAM-1(CD54)、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、GITR、CD30、CD40、BAFF-R、HVEM、LIGHT、MKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、与CD83特异性结合的配体或其功能性变体或其任何组合的信号传导结构域)和/或效应子结构域(例如，来自CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD79A、CD79B、CARD11、DAP10、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、HVEM、ICOS、Lck、LAG3、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、Wnt、ROR2、Ryk、SLAMF1、Slp76、pTα、TCRα、TCRβ、TRIM、Zap70、PTCH2或其任何组合)。
在某些实施方式中，包括抗体或抗原结合片段的融合蛋白包括嵌合抗原受体分子(CAR)，所述CAR可以在用于细胞免疫疗法的宿主细胞(如T细胞、NK细胞或NK-T细胞)的细胞表面上表达。CAR分子和设计原则描述于例如：Sadelain等人,《癌症发现(CancerDiscov.)》，3(4):388(2013)；Harris和Kranz,《药物学研究进展(TrendsPharmacol.Sci.)》,37(3):220(2016)；Stone等人,《癌症免疫与免疫疗法(CancerImmunol.Immunother.)》,63(11):1163(2014)；Xu等人,2018《肿瘤标靶(Oncotarget)》9:13991；Androulla等人,2018《当代药物生物技术(Curr.Pharm.Biotechnol.)》第19卷(2018年4月)；Wu等人,2016《生物疗法专家评论(Expert Opin.Biol.Ther.)》16:1469；以及Ren等人,2017《蛋白质细胞(Protein Cell)》8:634，所述CAR分子、CAR设计和CAR设计原则以全文引用的方式并入本文。
贯穿本公开，抗体、其抗原结合片段和融合蛋白可以单独或共同地(例如，以任何组合)被称为“结合蛋白”。
根据本公开的结合蛋白可以以经纯化的形式提供。例如，抗体可以存在于基本上不含其它多肽的组合物中，例如，其中少于90％(按重量计)、通常少于60％和更通常少于50％的组合物由其它多肽构成。
根据本公开的结合蛋白可以在人和/或非人(或异源)宿主中具有免疫原性；例如，在小鼠中。例如，抗体可以具有独特位(idiotope)，所述独特位在非人宿主中具有免疫原性，但在人宿主中不具有免疫原性。供人使用的本公开的抗体包括通常不从如小鼠、山羊、兔、大鼠、非灵长类哺乳动物等宿主中分离，并且在一些情况下，不通过人源化或从异种小鼠中获得的抗体。本文还考虑了所公开抗体的变体形式，其被工程化以降低已知或潜在的免疫原性和/或其它潜在的可能性，或赋予非人动物，如小鼠中所需的抗体结构和/或功能性(例如，在小鼠中，“鼠源化”抗体，其中一个或多个人氨基酸残基、序列或基序被具有降低或消除的免疫原性或其它可能性或具有所需结构和/或功能的残基、序列或基序替代；例如，用于使用小鼠的模型研究)。
如本文所使用的，“中和抗体”(或抗原结合片段或融合蛋白)是可以中和(即预防、抑制、降低、阻碍或干扰)病原体在宿主(例如，宿主生物体或宿主细胞)中引发和/或持续感染的能力的抗体。术语“中和抗体(neutralizing antibody)”或“中和的抗体(an antibodythat neutralizes/antibodies that neutralize)”在本文中可互换使用。这些抗体可以单独使用或组合使用(例如，两种或更多种本公开的抗体组合使用，或本公开的抗体与另一种药剂组合使用，所述另一种药剂可以是或可以不是抗体药剂，包括能够中和HBV B和/或HBV D感染的抗体)，在适当调配后作为与主动疫苗接种相关的预防或治疗剂，作为诊断工具或作为如本文所述的生产工具。因此，本公开的抗体或抗原结合片段能够中和由HBV、HDV或两者引起的感染。
如本文所使用的，“特异性结合”或“对...具有特异性”是指结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)或结合结构域与靶分子的缔合或联合，其亲和力或Ka(即特定结合相互作用的平衡缔合常数，单位为1/M)等于或大于105M-1(其等于这一缔合反应的缔合速率[Kon]与解离速率[Koff]的比率)，而不与样品中的任何其它分子或组分显著缔合或联合。结合蛋白或结合结构域可以分类为“高亲和力”结合蛋白或结合结构域或“低亲和力”结合蛋白或结合结构域。“高亲和力”结合蛋白或结合结构域是指Ka为至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1或至少1013M-1的结合蛋白或结合结构域。“低亲和力”结合蛋白或结合结构域是指Ka为高达107M-1、高达106M-1或高达105M-1的结合蛋白或结合结构域。可替代地，亲和力可以被定义为特定结合相互作用的平衡解离常数(Kd)，以M为单位(例如，10-5M至10-13M)。术语“结合”和“特异性结合”以及类似参考不涵盖非特异性粘附。
在通过例如450nm处的光密度或通过流式细胞术等进行成像的情况下，结合蛋白的结合可以使用适当的测定来确定或评估，例如表面等离子共振(SPR)方法，例如BiacoreTM系统；动力学排除测定，如
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以及生物层干涉测量法(例如，使用/>
Figure BDA0004086126640000351
Octet平台)；等温滴定量热法(ITC)等、抗原结合ELISA(例如直接或间接)。
在某些实施方式中，根据本公开的结合蛋白可以与HBsAg的抗原环区结合。乙型肝炎病毒的包膜一般包括三种“HBV包膜蛋白”(也称为“HBsAg”、“乙型肝炎表面抗原”)：S蛋白(针对“小”，也称为S-HBsAg)、M蛋白(针对“中”，也称为M-HBsAg)和L蛋白(针对“大”，也称为L-HBsAg)。S-HBsAg、M-HBsAg和L-HBsAg共享相同C末端(也称为“S结构域”，226个氨基酸)，其对应于S蛋白(S-HBsAg)并且对于病毒组装和感染性至关重要。S-HBsAg、M-HBsAg和L-HBsAg在内质网(ER)中合成，组装并且通过高尔基体设备以颗粒形式分泌。S结构域包括四个预测跨膜(TM)结构域，由此S结构域的N末端以及C末端两者都暴露于内腔。跨膜结构域TM1和TM2都被认为是共翻译蛋白整合到ER膜中必需的，并且跨膜结构域TM3和TM4位于S结构域的C末端三分之一处。HBsAg的“抗原环区”位于HBsAg的S结构域的预测TM3与TM4跨膜结构域之间，由此抗原环区包括S结构域的氨基酸101-172，总共包括226个氨基酸(SalisseJ.和Sureau C.,2009,《病毒学杂志(Journal of Virology)》83:9321-9328)。感染性的决定簇驻留于HBV包膜蛋白的抗原环区中。具体地，HBsAg的119与125之间的残基含有CXXC基序，所述基序被视为对于HBV和HDV的感染性很重要(Jaoude GA,Sureau C,《病毒学杂志》,2005；79:10460-6)。
当本文提及HbsAg的S结构域的氨基酸序列中的位置时，此类位置参考如SEQ IDNO:3(以下所示)中阐述的氨基酸序列或其天然或人工序列变体得到。
MENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPTCPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTTAQGTSMYPSCCCTKPSDGN CTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSPFLPLLPIFFCLWVYI
(SEQ ID NO:3；氨基酸101-172用下划线示出)
例如，表述“S结构域的氨基酸101-172”是指来自如SEQ ID NO:3所示的多肽的位置101-172的氨基酸残基。然而，本领域技术人员应理解，突变或变异(包括但不限于取代、缺失和/或添加，例如本文所述的不同基因型的HBsAg或不同的HBsAg突变体)可能自然发生在HBsAg的S结构域的氨基酸序列中或人工引入到HBsAg的S结构域的氨基酸序列中，而不影响其生物学特性。因此，如本文所使用的，术语“HBsAg的S结构域”涵盖所有此类多肽，包括例如SEQ ID NO:3的多肽和其天然或人工突变体。此外，当本文描述了HBsAg的S结构域的序列片段时(例如，HBsAg的S结构域的氨基酸101-172或氨基酸120-130)，其不仅包括SEQ IDNO:3的对应序列片段，而且还包括其天然或人工变体的对应序列片段。例如，短语“来自HBsAg的S结构域的位置101-172的氨基酸残基”涵盖来自SEQ ID NO:3的位置101-172的氨基酸残基以及其突变体(天然或人工突变体)的对应片段。如本文所使用的，短语“对应序列片段”和“对应片段”是指当序列经受优化比对，即对序列进行比对以获得最高同一性百分比时，位于序列相同位置的片段。
M蛋白(M-HBsAg)对应于由称为“前S2”的55个氨基酸的N末端结构域延伸的S蛋白。L蛋白(L-HBsAg)对应于由称为“前S1”(基因型D)的108个氨基酸的N末端结构域延伸的M蛋白。L蛋白的前S1和前S2结构域可以存在于病毒颗粒的内表面处(在ER的胞浆侧上)并且被认为在病毒组装中起至关重要的作用，或存在于外表面上(在ER的内腔侧上)，可用于与靶细胞相互作用并且对于病毒感染性很重要。此外，HBV表面蛋白(HBsAg)不仅并入到病毒粒子包膜中，而且还可以从ER-高尔基体中间隔室膜自发地出芽，以形成通过分泌从细胞释放的空“亚病毒颗粒(SVP)”。
在一些实施方式中，结合蛋白与HBsAg的抗原环区结合，并且能够与所有S-HBsAg、M-HBsAg和L-HBsAg结合。
在一些实施方式中，结合蛋白中和由乙型肝炎病毒和丁型肝炎病毒引起的感染。在一些实施方式中，结合蛋白降低乙型肝炎病毒和丁型肝炎病毒的病毒感染性。
为了研究和定量实验室中的病毒感染性(或“中和”)，可以利用标准“中和测定”。对于中和测定，动物病毒通常在细胞和/或细胞系中传播。可以使用中和测定，其中在存在(或不存在)待测试的抗体(或抗原结合片段或融合蛋白)的情况下，将经培养的细胞与固定量的HBV或HDV一起温育。在此类测定中，可以使用分泌到细胞培养上清液中的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)或乙型肝炎e抗原(HBeAg)的水平和/或可以评估HBcAg染色以提供读数。例如，对于HDV，可以评估δ抗原免疫荧光染色。
在HBV中和测定的特定实施方式中，在存在或不存在待测试的抗体的情况下，将经培养的细胞(例如HepaRG细胞，如分化的HepaRG细胞)与固定量的HBV一起温育。在此类实施方式中，温育可以在例如37℃下进行持续16小时。所述温育可以在培养基(例如补充有4％PEG 8000的培养基)中进行。温育之后，可以对细胞进行洗涤并且进一步培养。为了测量病毒感染性，可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)确定分泌到培养上清液中的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和/或乙型肝炎e抗原(HBeAg)的水平，例如感染后第7天至第11天。另外，可以在免疫荧光测定中评估HBcAg染色。在HDV中和测定的实施方式中，可以使用与HBV基本上相同的测定，不同之处在于可以使用来自HDV载体的血清作为分化的HepaRg细胞上的HDV感染接种物(而不是HBV)。对于检测，可以使用δ抗原免疫荧光染色作为读数。
本公开的结合蛋白的实施方式具有高中和效力。在某些实施方式中，50％中和乙型肝炎病毒(HBV)和丁型肝炎病毒(HDV)所需的如本文所述的抗体的浓度为例如约10μg/ml或更低。在其它实施方式中，50％中和HBV和HDV所需的结合蛋白的浓度为约5μg/ml。在其它实施方式中，50％中和HBV和HDV所需的如本文所述的结合蛋白的浓度为约1μg/ml。在仍其它实施方式中，50％中和HBV和HDV所需的结合蛋白的浓度为约750ng/ml。在又另外的实施方式中，50％中和HBV和HDV所需的如本文所述的结合蛋白的浓度为500ng/ml或更低。在此类实施方式中，50％中和HBV和HDV所需的如本文所述的结合蛋白的浓度可以选自450ng/ml或更低、400ng/ml或更低、350ng/ml或更低、300ng/ml或更低、250ng/ml或更低、200ng/ml或更低、175ng/ml或更低、150ng/ml或更低、125ng/ml或更低、100ng/ml或更低、90ng/ml或更低、80ng/ml或更低、70ng/ml或更低、60ng/ml或更低、50ng/ml或更低、或小于20ng/ml，优选地15ng/ml或更低、更优选地10ng/ml或更低，如7ng/ml或更低。
可以中和HBV和HDV两者的根据本公开的结合蛋白可用于预防和治疗乙型肝炎和丁型肝炎。HDV感染通常与HBV感染同时发生或在其之后发生(例如，在不存在HBV的情况下接种HDV不引起丁型肝炎，因为HDV需要HBV支持其自身复制)，并且通常在慢性HBV载体中观察到丁型肝炎。
所公开的结合蛋白的实施方式促进HBsAg和HBV的清除。在特定实施方式中，结合蛋白促进HBV和乙型肝炎病毒亚病毒颗粒(SVP)两者的清除。可以通过测量例如血液样品(例如，来自乙型肝炎患者的血液样品)中的HBsAg的水平来评估HBsAg或亚病毒颗粒的清除。类似地，可以通过测量例如血液样品(例如，来自乙型肝炎患者的血液样品)中的HBV水平来评估HBV的清除。
在感染HBV的患者血清中，除感染性颗粒(HBV)之外，通常存在过量(通常1,000倍至100,000倍)的仅由HBV包膜蛋白(HBsAg)构成的呈相对较小球体和具有可变长度的细丝的形式的空亚病毒颗粒(SVP)。已示出亚病毒颗粒可显著增强HBV的细胞内病毒复制和基因表达(Bruns M.等人1998《病毒学杂志》72(2):1462-1468)。这也与包括HBV的血清的感染性的情况有关，因为感染性不仅取决于病毒的数量，而且还取决于SVP的数量(Bruns M.等人1998《病毒学杂志》72(2):1462-1468)。此外，过量的亚病毒颗粒可以通过吸收中和抗体充当诱饵并且因此延迟感染的清除。在一些情况下，实现乙型肝炎表面抗原(HBsAg)损失被视为治疗的理想终点和治愈慢性乙型肝炎(CHB)的最接近结果。
本公开的结合蛋白的实施方式可以促进HbsAg的清除。在某些实施方式中，结合蛋白可以促进乙型肝炎病毒亚病毒颗粒的清除。在一些实施方式中，结合蛋白可以用于治疗慢性乙型肝炎。
在本公开的任何实施方式中，本公开的结合蛋白能够与选自HBsAg基因型A、B、C、D、E、F、G、H、I和J或其任何组合的基因型的HBsAg结合。
在某些实施方式中，本公开的结合蛋白能够与HBsAg基因型A、B、C、D、E、F、G、H、I和J中的任何1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种结合。不同HBsAg基因型的实例包括以下：GenBank登录号J02203(HBV-D，ayw3)；GenBank登录号FJ899792.1(HBV-D，adw2)；GenBank登录号AM282986(HBV-A)；GenBank登录号D23678(HBV-B1日本)；GenBank登录号AB117758(HBV-C1柬埔寨)；GenBank登录号AB205192(HBV-E加纳)；GenBank登录号X69798(HBV-F4巴西)；GenBank登录号AF160501(HBV-G美国)；GenBank登录号AY090454(HBV-H尼加拉瓜)；GenBank登录号AF241409(HBV-I越南)；以及GenBank登录号AB486012(HBV-J婆罗洲)。本文中描述了不同基因型的HBsAg的S结构域的抗原环区的示例性氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:5-15)。
在一些实施方式中，结合蛋白能够与10种HBsAg基因型A、B、C、D、E、F、G、H、I和J中的一种或多种，并且在一些情况下至少6种结合。在某些实施方式中，结合蛋白能够与10种HBsAg基因型A、B、C、D、E、F、G、H、I和J中的至少8种结合。在一些实施方式中，结合蛋白能够与10种HBsAg基因型A、B、C、D、E、F、G、H、I和J中的全部10种结合。根据基因组序列，HBV分化为若干种基因型。迄今为止，已定义HBV基因组的八种众所周知的基因型(A-H)。此外，还已经鉴定了两种其它基因型I和J(Sunbul M.,2014,《世界胃肠病学杂志(World JGastroenterol)》20(18):5427-5434。已知基因型影响疾病进展，并且已确定基因型之间响应于抗病毒治疗的差异。
在一些实施方式中，根据本公开的结合蛋白能够与在抗原环区中具有突变的HBsAg突变体中的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种或18种结合，其中此类突变体选自以下中的一个或多个：HBsAg Y100C/P120T、HBsAg P120T、HBsAg P120T/S143L、HBsAg C121S、HBsAg R122D、HBsAg R122I、HBsAgT123N、HBsAg Q129H、HBsAg Q129L、HBsAg M133H、HBsAg M133L、HBsAg M133T、HBsAgK141E、HBsAg P142S、HBsAg S143K、HBsAg D144A、HBsAg G145R和HBsAg N146A。这些突变体是基于HBsAg基因型D的S结构域的天然存在的突变体，GenBank登录号FJ899792(SEQ IDNO:4)。本文中指出的每个突变体中的突变氨基酸残基以名称指示。
SEQ ID NO:4：
MENVTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPTCPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGN CTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSTLSPFLPLLPIFFCLWVYI
(抗原环区，即氨基酸101-172用下划线示出)。
SEQ ID NO:16-33中示出了不同突变体的HBsAg的S结构域的抗原环区的氨基酸序列。
在某些实施方式中，如本文所公开的结合蛋白能够与选自以下的感染性HBsAg突变体中的一个或多个以及在一些情况下至少12个结合：HBsAg Y100C/P120T、HBsAg P120T、HBsAg P120T/S143L、HBsAg C121S、HBsAg R122D、HBsAg R122I、HBsAg T123N、HBsAgQ129H、HBsAg Q129L、HBsAg M133H、HBsAg M133L、HBsAg M133T、HBsAg K141E、HBsAgP142S、HBsAg S143K、HBsAg D144A、HBsAg G145R和HBsAg N146A。在一些此类实施方式中，结合蛋白能够与选自以下的至少15种感染性HBsAg突变体结合：HBsAg Y100C/P120T、HBsAgP120T、HBsAg P120T/S143L、HBsAg C121S、HBsAg R122D、HBsAg R122I、HBsAg T123N、HBsAgQ129H、HBsAg Q129L、HBsAg M133H、HBsAg M133L、HBsAg M133T、HBsAg K141E、HBsAgP142S、HBsAg S143K、HBsAg D144A、HBsAg G145R以及HBsAg N146A。在一些实施方式中，结合蛋白能够与以下感染性HBsAg突变体中的每一个结合：HBsAg Y100C/P120T；HBsAgP120T；HBsAg P120T/S143L；HBsAg C121S；HBsAg R122D；HBsAg R122I；HBsAg T123N；HBsAgQ129H；HBsAg Q129L；HBsAg M133H；HBsAg M133L；HBsAg M133T；HBsAg K141E；HBsAgP142S；HBsAg S143K；HBsAg D144A；HBsAg G145R；以及HBsAg N146A。
在某些实施方式中，结合蛋白(例如，包括抗体或其抗原结合片段)能够降低患有HBV感染的哺乳动物中HBV DNA的血清浓度。在某些实施方式中，结合蛋白能够降低患有HBV感染的哺乳动物中HBsAg的血清浓度。在某些实施方式中，结合蛋白能够降低患有HBV感染的哺乳动物中HBeAg的血清浓度。在某些实施方式中，结合蛋白能够降低患有HBV感染的哺乳动物中HBcrAg的血清浓度。在一些实施方式中，在单次施用结合蛋白之后，结合蛋白能够降低哺乳动物中HBV DNA、HBsAg、HBeAg和/或HBcrAg的血清浓度持续约10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或更多天。
术语“表位”或“抗原表位”包括由同源结合分子(如免疫球蛋白、嵌合抗原受体或其它结合分子、结构域或蛋白质)识别且特异性结合的任何分子、结构、氨基酸序列或蛋白质决定簇。表位决定簇通常包括如氨基酸或糖侧链等分子的化学活性表面分组，并且可以具有特异性三维结构特性以及特异性电荷特性。
在一些实施方式中，结合蛋白能够与包括HbsAg抗原环区的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个氨基酸的表位结合。在某些实施方式中，结合蛋白能够与选自HbsAg的S结构域的氨基酸115-133、HbsAg的S结构域的氨基酸120-133或HbsAg的S结构域的氨基酸120-130的至少两个氨基酸结合。在某些实施方式中，结合蛋白能够与选自HbsAg的S结构域的氨基酸115-133、HbsAg的S结构域的氨基酸120-133或HbsAg的S结构域的氨基酸120-130的至少三个氨基酸结合。在一些实施方式中，结合蛋白能够与选自HbsAg的S结构域的氨基酸115-133、HbsAg的S结构域的氨基酸120-133或HbsAg的S结构域的氨基酸120-130的至少四个氨基酸结合。如本文所使用的，氨基酸的位置(例如，115-133、120-133、120-130)是指如上所述的HBsAg的S结构域，其存在于所有三种HBV包膜蛋白S-HBsAg、M-HBsAg和L-HBsAg中，由此S-HBsAg通常对应于HbsAg的S结构域。
如本文在表位的上下文中使用的术语“由...形成”是指结合蛋白结合的表位可以是线性的(连续的)或构象的(不连续的)。线性或顺序表位是由抗体根据其氨基酸的线性序列或一级结构识别的表位。构象表位可以根据三维形状和蛋白质结构识别。因此，如果表位是线性表位并且包括位于选自HBsAg的S结构域的氨基酸位置115-133或氨基酸位置120-133的多于一个氨基酸，则表位所包括的氨基酸可以位于一级结构的相邻位置(例如为氨基酸序列中的连续氨基酸)。在构象表位(3D结构)的情况下，氨基酸序列通常形成3D结构作为表位，并且因此形成表位的氨基酸可能位于或可能不位于一级结构的相邻位置(即，可能或可能不是氨基酸序列中的连续氨基酸)。
在某些实施方式中，结合蛋白所结合的表位是构象表位。在一些实施方式中，结合蛋白与包括HBsAg的抗原环区的至少两个氨基酸的表位结合，其中所述至少两个氨基酸选自HbsAg的S结构域的氨基酸120-133或选自氨基酸120-130，并且其中所述至少两个氨基酸不位于(一级结构的)相邻位置。在某些实施方式中，结合蛋白与包括HBsAg抗原环区的至少三个氨基酸的表位结合，其中所述至少三个氨基酸选自HbsAg的S结构域的氨基酸120-133或选自氨基酸120-130，并且其中所述三个氨基酸中的至少两个氨基酸不位于(一级结构的)相邻位置。在一些实施方式中，结合蛋白与包括HBsAg抗原环区的至少四个氨基酸的表位结合，其中至少四个氨基酸选自HbsAg的S结构域的氨基酸120-133或氨基酸120-130，并且其中四个氨基酸中的至少两个氨基酸不位于(一级结构的)相邻位置。
本公开的抗体、抗原结合片段或融合蛋白所结合的不位于一级结构的相邻位置中的氨基酸(即形成表位的氨基酸)在一些情况下被一个或多个氨基酸隔开，所述抗体、抗原结合片段或融合蛋白不与所述一个或多个氨基酸结合。在一些实施方式中，至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个氨基酸可以位于表位所包括的不位于相邻位置的两个氨基酸之间。
在某些实施方式中，结合蛋白与至少包括HBsAg的S结构域的氨基酸P120、C121、R122和C124的表位结合。在其它实施方式中，本公开的结合蛋白与包括如SEQ ID NO:115所示的氨基酸序列的表位结合：
PCRXC
其中X是任何氨基酸或不是氨基酸；X是任何氨基酸；X是T、Y、R、S或F；X是T、Y或R；或者X是T或R。
在其它实施方式中，本公开的结合蛋白与包括如SEQ ID NO:107所示的氨基酸序列的表位结合：
TGPCRTC
或与SEQ ID NO:107共享至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列结合。
在其它实施方式中，本公开的结合蛋白与包括如SEQ ID NO:112所示的氨基酸序列的表位结合：
STTSTGPCRTC
或与SEQ ID NO:112共享至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列结合。
在某些实施方式中，本公开的结合蛋白与包括氨基酸序列的表位结合，所述氨基酸序列至少包括HBsAg的S结构域的氨基酸145-151：
GNCTCIP
(SEQ ID NO:108)。
在仍其它实施方式中，本公开的结合蛋白与包括如SEQ ID NO:107所示的氨基酸序列和如SEQ ID NO:108所示的氨基酸序列的表位结合。
在其它实施方式中，本公开的结合蛋白与包括如SEQ ID NO:112所示的氨基酸序列和/或如SEQ ID NO:114所示的氨基酸序列的表位结合。
如上所述，本公开的结合蛋白所结合的表位可以是线性的(连续的)或构象的(不连续的)。在一些实施方式中，本公开的结合蛋白与构象表位结合，并且在某些此类实施方式中，构象表位仅在非还原条件下存在。
在某些实施方式中，本公开的结合蛋白与线性表位结合。在某些此类实施方式中，线性表位在非还原条件和还原条件两者下存在。
在特定实施方式中，本公开的结合蛋白与由如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列形成的HBsAg的抗原环中的表位结合：
X1 X2 X3 TC X4 X5 X6A X7G
其中X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7可以是任何氨基酸(SEQ ID NO:1)。
在一些实施方式中，X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7是氨基酸，与SEQ ID NO:3的氨基酸120-130相比，所述氨基酸被保守取代。在一些实施方式中，X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7是氨基酸，与SEQ ID NO:5-33中的任一者的氨基酸20-30相比，所述氨基酸被保守取代。
在具体实施方式中，SEQ ID NO:1X1中的X1是小氨基酸。如本文所使用的，“小”氨基酸是指选自下组的任何氨基酸：丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及缬氨酸。在某些此类实施方式中，X1是脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸。
在某些实施方式中，SEQ ID NO:1X2中的X2是小氨基酸。在某些实施方式中，X2可以选自半胱氨酸或苏氨酸。
在一些实施方式中，SEQ ID NO:1的X3是带电氨基酸或脂肪族氨基酸。如本文所使用的，“带电”氨基酸是指选自下组的任何氨基酸：精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸。如本文所使用的，“脂肪族”氨基酸是指选自下组的任何氨基酸：丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸。在某些实施方式中，X3选自精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或异亮氨酸。
在一些实施方式中，SEQ ID NO:1的X4是小氨基酸和/或疏水性氨基酸。如本文所使用的，“疏水性”氨基酸是指选自下组的任何氨基酸：丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和甘氨酸。在某些实施方式中，X4选自甲硫氨酸或苏氨酸。
在一些实施方式中，SEQ ID NO:1X5中的X5是小氨基酸和/或疏水性氨基酸。在某些实施方式中，X5选自苏氨酸、丙氨酸或异亮氨酸。
在一些实施方式中，SEQ ID NO:1X6中的X6是小氨基酸和/或疏水性氨基酸。在某些实施方式中，X6选自苏氨酸、脯氨酸或亮氨酸。
在一些实施方式中，SEQ ID NO:1的X7是极性氨基酸或脂肪族氨基酸。如本文所使用的，“极性”氨基酸是指选自下组的任何氨基酸：天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸。在某些此类实施方式中，X7为谷氨酰胺、组氨酸或亮氨酸。
在一些实施方式中，根据本公开的结合蛋白与由如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列形成的HBsAg的抗原环中的表位结合：
X1 X2 X3 TC X4 X5 X6A X7G
其中
X1是P、T或S，
X2是C或S；
X3是R、K、D或I，
X4是M或T，
X5是T、A或I，
X6是T、P或L，并且
X7是Q、H或L
(SEQ ID NO:2)。
关于由如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列形成的表位，应注意，如本文所使用的术语“由...形成”并非意指暗示所公开的结合蛋白必定与SEQ ID NO:1或2的每个和每一个氨基酸结合。具体地，结合蛋白可以仅与SEQ ID NO:1或2的氨基酸中的一些氨基酸结合，由此其它氨基酸残基可以充当“间隔物”。
在特定实施方式中，根据本公开的结合蛋白与由选自下表4中所示的SEQ ID NO:5-33的氨基酸序列的一个或多个、两个或多个、三个或多个、或四个或多个氨基酸形成的HBsAg的抗原环中的表位结合。
在一些实施方式中，根据本公开的结合蛋白与具有根据下表4中所示的SEQ IDNO:5-33中的任何一者或多者的氨基酸序列的HBsAg的抗原环区结合或与其序列变体结合。在某些实施方式中，根据本公开的结合蛋白与具有根据下表4中所示的SEQ ID NO:5-33中的任何一者的氨基酸序列的HBsAg的所有抗原环变体结合。
表4：如本文所使用的不同基因型和突变体的HBsAg的S结构域的抗原环区的氨基酸序列(HBsAg的S结构域的残基101-172，仅SEQ ID NO:16为例外，所述SEQ ID NO:16是指HBsAg的S结构域的残基100-172以便包括重要突变)。
Figure BDA0004086126640000441
/>
Figure BDA0004086126640000451
/>
Figure BDA0004086126640000461
Fc部分
在一些实施方式中，本公开的结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)包括Fc部分(也称为Fc多肽)。在某些实施方式中，Fc部分可以源自人来源，例如来自人IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4，或源自另一Ig类别或同种型。在具体实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括源自人IgG1的Fc部分。在特定实施方式中，Fc部分包括或源自IgG1m17,1(IgHG1*01)同种异型(例如，包括相对于其的一个或多个突变)。
如本文所使用的，术语“Fc部分”是指包括免疫球蛋白重链的部分、由其组成、基本上由其组成或源自其的序列，所述部分起始于正好在木瓜蛋白酶切割位点上游的铰链区(例如天然IgG中通过EU编号的残基216，考虑到重链恒定区的第一残基为114)并终止于免疫球蛋白重链的C末端。因此，Fc部分可以为完整Fc部分或其一部分(例如，结构域)。在某些实施方式中，完整Fc部分包括铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域(例如，EU氨基酸位置216-446)。如本文所注释的，额外的赖氨酸残基(K)有时存在于Fc部分的极端C末端，但通常从成熟抗体切割。Fc部分内的氨基酸位置已经根据Kabat的EU编号系统进行编号，参见例如Kabat等人,“免疫学上感兴趣的蛋白质序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)”，美国卫生与人类服务部(U.S.Dept.Health and Human Services),1983和1987。Fc部分的氨基酸位置也可以根据IMGT编号系统(包括C结构域的唯一编号和外显子编号)和Kabat编号系统进行编号。
在一些实施方式中，Fc部分包括以下中的至少一个：铰链(例如，上部、中间和/或下部铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域或其变体、部分或片段。在一些实施方式中，Fc部分至少包括铰链结构域、CH2结构域或CH3结构域。在另外的实施方式中，Fc部分为完整Fc部分。SEQ ID NO:73中提供了人IgG1同种型的示例性Fc部分的氨基酸序列。相对于天然存在的Fc部分，Fc部分还可以包括一个或多个氨基酸插入、缺失或取代。例如，铰链结构域、CH2结构域或CH3结构域中的至少一个或其一部分可以缺失。例如，Fc部分可以包括以下或由以下组成：(i)与CH2结构域(或其一部分)融合的铰链结构域(或其一部分)；(ii)与CH3结构域(或其一部分)融合的铰链结构域(或其一部分)；(iii)与CH3结构域(或其一部分)融合的CH2结构域(或其一部分)；(iv)铰链结构域(或其一部分)；(v)CH2结构域(或其一部分)；或(vi)CH3结构域或其一部分。
本公开的Fc部分可以被修饰，使得其与天然存在的免疫球蛋白分子的完整Fc部分的氨基酸序列不同，同时保留或增强天然存在的Fc部分赋予的至少一种所需功能，和/或降低天然存在的Fc部分的不需要的功能。此类功能包括例如Fc受体(FcR)结合、抗体半衰期调控(例如，通过与FcRn结合)、ADCC功能、蛋白A结合、蛋白G结合和补体结合。本领域中已描述了与此类功能有关的天然存在的Fc部分的部分。
例如，为了激活补体级联，当免疫球蛋白分子附接到抗原靶标时，C1q蛋白复合物可以与至少两个IgG1分子或一个IgM分子结合(Ward,E.S.和Ghetie,V.,《免疫学疗法(Ther.Immunol.)》2(1995)77-94)。Burton,D.R.(《分子免疫学》22(1985)161-206)描述了包括氨基酸残基318至337的重链区参与补体固定。Duncan,A.R.和Winter,G.(《自然》332(1988)738-740)使用定点诱变报道了Glu318、Lys320和Lys322形成与C1q的结合位点。Glu318、Lys320和Lys 322残基在C1q结合中的作用通过包括这些残基的短合成肽抑制补体介导的裂解的能力得到证实。
例如，FcR结合可以通过(抗体的)Fc部分与Fc受体(FcR)的相互作用介导，FcR是包括造血细胞的细胞上的特化细胞表面受体。Fc受体属于免疫球蛋白超家族，并且示出介导通过免疫复合物的吞噬作用清除抗体涂覆的病原体以及通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC；Van de Winkel,J.G.和Anderson,C.L.,《白细胞生物学杂志(J.Leukoc.Biol.)》49(1991)511-524)裂解涂覆有对应抗体的红细胞和各种其它细胞靶标(例如，肿瘤细胞)两者。FcR由其对免疫球蛋白类别的特异性定义；IgG抗体的Fc受体被称为FcγR，IgE抗体的Fc受体被称为FcεR，IgA抗体的Fc受体被称为FcαR等，并且新生儿Fc受体被称为FcRn。例如Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.《免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol.)》9(1991)457-492；Capel,P.J.等人,《免疫方法(Immunomethods)》4(1994)25-34；de Haas,M.等人,《实验室临床医学杂志(J Lab.Clin.Med.)》126(1995)330-341；以及Gessner,J.E.等人,《血液学年鉴(Ann.Hematol.)》76(1998)231-248中描述了Fc受体结合。
天然IgG抗体(FcγR)的Fc结构域与受体的交联触发了多种效应子功能，包括吞噬作用、抗体依赖性细胞毒性和炎性介体释放，以及免疫复合物清除和抗体产生调节。本文考虑了提供受体(例如，FcγR)交联的Fc部分。在人类中，迄今为止已对以下三类FcγR进行表征：(i)FcγRI(CD64)，其以高亲和力结合单体IgG，并在巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达；(ii)FcγRII(CD32)，其以中到低亲和力结合复合IgG，广泛表达(尤其在白细胞上)，被认为是抗体介导免疫的核心参与者，并且可以分为FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIC，在免疫系统中发挥不同的功能，但以相似的低亲和力与IgG-Fc结合，并且这些受体的胞外结构域高度同源；以及(iii)FcγRIII(CD16)，其以中到低亲和力结合IgG，并且已发现其有两种形式：FcγRIIIA，其已在NK细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞以及一些单核细胞和T细胞上发现，并且被认为可介导ADCC；以及在中性粒细胞上高度表达的FcγRIIIB。
FcγRIIA在许多参与杀伤的细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞)上发现并且被认为激活杀伤过程。FcγRIIB被认为在抑制过程中发挥作用并在B细胞、巨噬细胞以及肥大细胞和嗜酸性粒细胞上发现。重要的是，已表明75％的所有FcγRIIB存在于肝脏中(Ganesan,L.P.等人,2012:“肝窦内皮上的FcγRIIb清除小免疫复合物(FcγRIIb on liversinusoidal endothelium clears small immune complexes),”《免疫学杂志》189:4981-4988)。FcγRIIB在肝窦内皮(称为LSEC)上和肝脏中的Kupffer细胞中大量表达，并且LSEC是清除小免疫复合物的主要部位(Ganesan,L.P.等人,2012:肝窦内皮上的FcγRIIb清除小免疫复合物,《免疫学杂志》189:4981-4988)。
在一些实施方式中，本文公开的抗体和其抗原结合片段包括用于与FcγRIIb结合的Fc部分，具体地Fc区，例如IgG型抗体。此外，可以通过引入突变S267E和L328F来使Fc部分工程化以增强FcγRIIB结合，如Chu,S.Y.等人,2008:通过CD19和FcγRIIb与Fc工程化的抗体的共连接抑制原代人B细胞的B细胞受体介导的激活(Inhibition of B cell receptor-mediated activation of primary human B cells by coengagement of CD19 andFcgammaRIIb with Fc-engineered antibodies),《分子免疫学》45,3926-3933所述。因此，可以增强免疫复合物的清除(Chu,S.等人,2014:黑猩猩中IgE的加速清除由Xmab7195(即一种Fc工程化抗体)介导，对抑制性受体FcγRIIb具有增强的亲和力(Accelerated Clearanceof IgE In Chimpanzees Is Mediated By Xmab7195,An Fc-Engineered Antibody WithEnhanced Affinity For Inhibitory Receptor FcγRIIb)《美国呼吸道与危重症监护医学杂志(Am J Respir Crit)》，美国胸科学会国际会议摘要)。在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段包括具有突变S267E和L328F的工程化Fc部分，具体地如Chu,S.Y.等人,2008:通过CD19和FcγRIIb与Fc工程化的抗体的共连接抑制原代人B细胞的B细胞受体介导的激活,《分子免疫学》45,3926-3933所述。
在B细胞上，FcγRIIB似乎起到抑制进一步免疫球蛋白产生和同种型切换为例如IgE类的作用。在巨噬细胞上，FcγRIIB被认为抑制通过FcγRIIA介导的吞噬作用。在嗜酸性粒细胞和肥大细胞上，B形式可以通过IgE与其独立的受体结合帮助抑止这些细胞的激活。
关于FcγRI结合，E233-G236、P238、D265、N297、A327和P329中的至少一种的天然IgG中的修饰可以降低与FcγRI的结合。被取代为对应位置IgG1和IgG4的位置233-236处的IgG2残基将IgG1和IgG4与FcγRI的结合降低103倍，并消除了人单核细胞对抗体致敏红细胞的反应(Armour,K.L.等人,《欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)》,29(1999)2613-2624)。
关于FcγRII结合，发现对FcγRIIA的结合降低，例如，对于E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292和K414中的至少一种的IgG突变。
人FcγRIIA的两种等位基因形式是以高亲和力与IgG1 Fc结合的“H131”变体以及以低亲和力与IgG1 Fc结合的“R131”变体。参见例如Bruhns等人,《血液(Blood)》113:3716-3725(2009)。
关于FcγRIII结合，发现与FcγRIIIA的结合降低，例如，对于E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338和D376中的至少一种的突变。在Shields,R.L.等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》276(2001)6591-6604中描述了人IgG1上Fc受体的结合位点的作图、上述突变位点以及用于测量与FcγRI和FcγRIIA结合的方法。
人FcγRIIIA的两种等位基因形式是以低亲和力与IgG1 Fc结合的“F158”变体以及以高亲和力与IgG1 Fc结合的“V158”变体。参见例如Bruhns等人,《血液》113:3716-3725(2009)。
关于与FcγRII的结合，天然IgG Fc的两个区似乎参与了FcγRII与IgG之间的相互作用，即(i)IgG Fc的下铰链位点，特别是氨基酸残基L,L,G,G(234–237，EU编号)，和(ii)IgG Fc的CH2结构域的相邻区，特别是与下铰链区相邻的上CH2结构域中的环和链，例如在P331的区中(Wines,B.D.等人,《免疫学杂志》2000；164:5313–5318)。此外，FcγRI似乎与IgGFc上的相同位点结合，而FcRn和蛋白A与IgG Fc上的不同位点结合，所述位点似乎位于CH2-CH3界面(Wines,B.D.等人,《免疫学杂志》2000；164:5313–5318)。
还考虑了增加本公开的Fc部分与(即，一种或多种)Fcγ受体的结合亲和力的突变(例如，与包括不包含突变的Fcγ受体的参考Fc部分或抗体相比)。参见例如Delillo和Ravetch,《细胞(Cell)》161(5):1035-1045(2015)和Ahmed等人,《结构生物学杂志(J.Struc.Biol.)》194(1):78(2016)，其Fc突变和技术通过引用并入本文中。
在本文公开的任何实施方式中，结合蛋白可以包括(例如，IgG1或IgG1衍生的)Fc部分，所述Fc部分包括选自以下的突变(EU编号)：G236A；S239D；A330L和I332E；或包括其任意两种或更多种的组合；例如S239D/I332E；S239D/A330L/I332E；G236A/S239D/I332E；G236A/A330L/I332E(本文也称为“GAALIE”)；或G236A/S239D/A330L/I332E。在一些实施方式中，Fc部分不包括S239D。在一些实施方式中，Fc部分包括在位置239处的天然丝氨酸。
在某些实施方式中，Fc部分可以包括参与与FcRn结合的结合的Fc部分的至少一部分或由其组成。在某些实施方式中，Fc部分包括一个或多个氨基酸修饰，其改善对FcRn的结合亲和力(例如，增强与FcRn的结合)(例如，在pH为约6.0时)，并且在一些实施方式中，由此延长包括Fc部分的分子的体内半衰期(例如，与在其它方面相同但不包括修饰的参考Fc部分或抗体相比)。在某些实施方式中，Fc部分包括或源自IgG Fc，并且半衰期延长突变包括以下中的任何一个或多个：M428L；N434S；N434H；N434A；N434S；M252Y；S254T；T256E；T250Q；P257I；Q311I；D376V；T307A；E380A(EU编号)。在某些实施方式中，半衰期延长突变包括M428L/N434S(在本文中也称为“MLNS”)。在某些实施方式中，半衰期延长突变包括M252Y/S254T/T256E。在某些实施方式中，半衰期延长突变包括T250Q/M428L。在某些实施方式中，半衰期延长突变包括P257I/Q311I。在某些实施方式中，半衰期延长突变包括P257I/N434H。在某些实施方式中，半衰期延长突变包括D376V/N434H。在某些实施方式中，半衰期延长突变包括T307A/E380A/N434A。
在一些实施方式中，结合蛋白包括Fc部分，所述Fc部分包括取代突变M428L/N434S。在一些实施方式中，结合蛋白包括包含取代突变G236A/A330L/I332E的Fc部分。在某些实施方式中，结合蛋白包括(例如，IgG)Fc部分，所述Fc部分包括G236A突变、A330L突变和I332E突变(GAALIE)，并且不包括S239D突变(例如在位置239处包括天然S)。在特定实施方式中，结合蛋白包括包含以下取代突变的Fc部分：M428L/N434S和G236A/A330L/I332E，并且任选地不包括S239D(例如，可以包括位置329处的天然S)。在某些实施方式中，结合蛋白包括包含以下取代突变的Fc部分：M428L/N434S和G236A/S239D/A330L/I332E。在某些另外的实施方式中，结合蛋白包括Fc部分中的取代突变，其中取代突变由以下组成或基本上由以下组成：M428L/N434S、G236A/S239D/A330L/I332E或G236A/S239D/A330L/I332E/M428L/N434S。
在任何本公开的实施方式中，本公开的结合蛋白包括包含GAALIE突变的Fc部分，并且与参考多肽(即，可以是结合蛋白的多肽，所述多肽包括不包含GAALIE突变的Fc部分)相比，所述结合蛋白增强与人FcγRIIa和/或人FcγRIIIa的结合。
在某些实施方式中，参考多肽包括Fc部分，所述Fc部分为野生型Fc部分(例如，相同同种型的Fc部分)，或在取代突变不是或不包括GAALIE的条件下，为包括一个或多个取代突变(或插入或缺失)的Fc部分。在某些实施方式中，参考多肽不包括已知或认为影响与人FcγRIIa和/或与人FcγRIIIa结合的取代突变。
可以使用本领域已知的方法确定或检测多肽之间的结合，如Fc部分(或包括其的结合蛋白)与人Fcγ受体(如人FcγRIIA、人FcγRIIIA或人FcγRIIB)或补体蛋白(如C1q)之间的结合。例如，根据制造商的说明书，可以使用
Figure BDA0004086126640000511
RED96(美国加利福尼亚州弗里蒙特ForteBio公司(ForteBio,Fremont,California USA))仪器进行生物层干涉法(BLI)测定，以确定所关注的第一多肽(例如，包括GAALIE突变的Fc部分)与被捕获在传感器基板上的所关注的第二多肽(例如，FcγRIIA(H131)、FcγRIIA(R131)、FcγRIIIA(F158)、FcγRIIIA(V158)或FcγRIIb)之间的实时缔合和解离。
在某些实施方式中，结合蛋白包括包含GAALIE突变的Fc部分，并且与包括不包含GAALIE突变的Fc部分的参考多肽相比，所述抗体或其抗原结合片段增强与人FcγRIIA(H131)、人FcγRIIA(R131)、人FcγRIIIA(F158)、人FcγRIIIA(V158)或其任何组合的结合。在某些实施方式中，通过相对于BLI测定中的参考结合蛋白的信号偏移中(例如，以下中的一项或多项：更高的峰值信号；更高的缔合速率；更慢的解离速率；更大的曲线下面积))的增加来确定增强的结合。在某些实施方式中，BLI测定包括使用Octet(R)RED96(美国加利福尼亚州弗里蒙特ForteBio公司)仪器。在另外的实施方式中，BLI测定包括捕获到抗五标签传感器上并暴露于结合蛋白的标记的人FcγR。在一些实施方式中，结合蛋白包括IgG Fab，并且BLI测定进一步包括在存在抗IgG Fab结合片段的情况下将所捕获的人FcγR暴露于结合蛋白以通过Fab片段交联结合蛋白。
在某些实施方式中，结合蛋白包括包含GAALIE突变的Fc部分，并且与参考多肽相比，增强了与人FcγRIIA(H131)、人FcγRIIA(R131)、人FcγRIIIA(F158)和/或人FcγRIIIA(V158)的结合，其中在BLI测定中，增强的结合可以包括信号偏移(纳米)，所述信号偏移是使用参考结合蛋白观察到的信号偏移的1.5倍、2倍、2.5倍、3倍或更多倍。
在某些实施方式中，结合蛋白包括包含GAALIE突变的Fc部分，并且与参考多肽相比，增强了与人FcγRIIA(H131)、人FcγRIIA(R131)、人FcγRIIIA(F158)和人FcγRIIIA(V158)的结合。
在本公开的任何实施方式中，结合蛋白包括包含GAALIE突变的Fc部分，并且与参考多肽相比，降低了与人FcγRIIB的结合。在某些实施方式中，结合蛋白包括包含GAALIE突变的Fc部分，并且不与人FcγRIIB结合，如例如通过在BLI测定中不存在相较于基线的统计学上显著的信号偏移的情况而确定的。
在本公开的任何实施方式中，结合蛋白包括包含GAALIE突变的Fc部分，并且与参考多肽相比，与人C1q(补体蛋白)的结合减弱。在某些实施方式中，结合蛋白包括包含GAALIE突变的Fc部分，并且不与人C1q结合，如通过在BLI测定中不存在相较于基线的统计学上显著的信号偏移的情况而确定的。
在本公开的任何实施方式中，结合蛋白包括包含GAALIE突变的Fc部分，并且与参考多肽(即，可以是HBsAg特异性结合蛋白的多肽，所述多肽包括不包含GAALIE突变的Fc部分)相比，在更大程度上激活人FcγRIIA、人FcγRIIIA或两者。在某些实施方式中，参考多肽包括Fc部分，所述Fc部分为野生型Fc部分，或在取代突变不是GAALIE的条件下包括一个或多个取代突变。
可以使用本领域已知的方法确定或检测人FcγR的激活。例如，充分验证的可商购获得的生物报告基因测定涉及在存在Jurkat效应细胞(普洛麦格公司(Promega)；目录号：G9798)的情况下将HBsAg特异性结合蛋白与重组HBsAg(Engerix B，葛兰素史克公司(GlaxoSmithKline))一起温育，稳定地表达(i)所关注的FcγR和(ii)在NFAT应答元件的控制下的萤火虫荧光素酶报告基因。Fc与细胞表面表达的FcγR的结合驱动NFAT介导的荧光素酶报告基因的表达。然后，根据制造商的说明书，使用Bio-Glo-TM荧光素酶测定试剂(普洛麦格公司)用光度计(例如，伯腾公司(Bio-Tek))测量发光。通过应用以下公式，激活表示为背景上相对发光单位(RLU)的平均值：(结合蛋白(例如，mAb)浓度[x]下的RLU-背景的RLU)。
在某些实施方式中，结合蛋白包括包含GAALIE突变的Fc部分，与参考多肽相比，在更大程度上激活FcγRIIA(H131)、人FcγRIIA(R131)、人FcγRIIIA(F158)和/或人FcγRIIIA(V158)。在某些实施方式中，更大程度的激活是指较高峰值发光和/或较大发光曲线下面积，如使用如本文所描述的发光生物报告基因测定所确定的。在某些实施方式中，结合蛋白包括包含GAALIE突变的Fc部分，并且与参考多肽相比，在更大程度上激活人FcγRIIA(H131)、人FcγRIIA(R131)和人FcγRIIIA(F158)，其中较大程度的激活包括峰值RLU，所述峰值RLU是使用参考结合蛋白观察到的峰值RLU的1.5倍、2倍、2.5倍、3倍或更多倍。
在本公开的任何实施方式中，结合蛋白包括包含GAALIE突变的Fc部分，不激活人FcγRIIB，如通过在如上所述的发光生物报告基因测定中不存在统计学上显著的和/或可测量的RLU所确定的。
在本公开的任何实施方式中，结合蛋白包括包含GAALIE突变的Fc部分，并且在存在HBsAg的情况下，相较于参考多肽在更大程度上激活人自然杀伤(NK)细胞。在某些实施方式中，NK细胞的激活通过CD107a表达(例如，通过流式细胞术)确定。在某些实施方式中，NK细胞包括包含V158/V158纯合、F158/F158纯合或V158/F158杂合FcγRIIIa基因型的细胞。
应当理解，包括根据本公开的包含GAALIE突变的Fc部分的任何结合蛋白可以执行或拥有本文所述的任何一个或多个特征；例如，与参考多肽相比增强与人FcγRIIA和/或人FcγRIIIA的结合；与参考多肽相比减少与人FcγRIIB的结合(和/或不与人FcγRIIB结合)；与参考多肽相比减少与人C1q的结合(和/或不与人C1q结合)；与参考多肽相比在更大程度地激活FcγRIIA、人FcγRIIIA或两者；不激活人FcγRIIB；和/或在存在HBsAg的情况下与参考多肽(例如，对HBsAg具有特异性并包括不包含GAALIE突变的Fc部分的抗体)相比在更大程度地激活人自然杀伤(NK)细胞。
在某些实施方式中，本公开的结合蛋白包括包含GAALIE突变的Fc部分并且：(i)与包括不包含G236A/A330L/I332E的Fc部分的参考多肽相比，与人FcγRIIA、人FcγRIIIA或两者的结合增强，其中人FcγRIIA任选地是H131或R131，和/或人FcγRIIIA任选地是F158或V158；(ii)与包括不包含G236A/A330L/I332E的Fc部分的参考多肽相比，与人FcγRIIB的结合降低；(iii)不与人FcγRIIB结合；(iv)与包括不包含G236A/A330L/I332E的Fc部分的参考多肽相比，与人C1q的结合降低；(v)不与人C1q结合；(vi)与包括不包含G236A/A330L/I332E的Fc部分的参考多肽相比，在更大程度地激活FcγRIIA、人FcγRIIIA或两者，其中人FcγRIIA任选地是H131或R131，和/或人FcγRIIIA任选地是F158或V158；(vii)不激活人FcγRIIB；(viii)与包括不包含G236A/A330L/I332E的Fc部分的参考多肽相比，在存在HBsAg的情况下，在更大程度地激活人自然杀伤(NK)细胞，其中参考多肽任选地是与HB Ag结合的抗体，任选地，HBsAg(ix)能够与HBsAg变体结合，所述HBsAg变体包括HBsAg-Y100C/P120T、HBsAg-P120T、HBsAg-P120S/S143L、HBsAg-C121S、HBsAg-R122D、HBsAg-R122I、HBsAg-T123N、HBsAg-Q129H、HBsAg-Q129L、HBsAg-M133H、HBsAg-M133L、HBsAg-M133T、HBsAg-K141E、HBsAg-P142S、HBsAg-S143K、HBsAg-D144A、HBsAg-G145R、HBsAg-N146A或其任何组合；(x)与和HBsAg结合并且包括不包括G236A/A330L/I332E的Fc部分的参考抗体或抗原结合片段相比，与HBsAg变体的结合改善，所述HBsAg变体包括HBsAg-Y100C/P120T、HBsAg-P120T、HBsAg-P120S/S143L、HBsAg-C121S、HBsAg-R122D、HBsAg-R122I、HBsAg-T123N、HBsAg-Q129H、HBsAg-Q129L、HBsAg-M133H、HBsAg-M133L、HBsAg-M133T、HBsAg-K141E、HBsAg-P142S、HBsAg-S143K、HBsAg-D144A、HBsAg-G145R、HBsAg-N146A或其任何组合。
可替代地或额外地，本公开的结合蛋白的Fc部分可以包括本领域已知的蛋白A结合所需的至少一部分；和/或本公开的抗体的Fc部分至少包括本领域已知的蛋白G结合所需的Fc分子的部分。在一些实施方式中，保留的功能包括HBsAg和HBVg的清除。因此，在某些实施方式中，Fc部分包括本领域已知的FcγR结合所需的至少一部分。如上所述，Fc部分因此可以至少包括：(i)天然IgG Fc的下铰链位点，具体地是氨基酸残基L、L、G、G(234-237，EU编号)；以及(ii)天然IgG Fc的CH2结构域的相邻区，具体地是上部CH2结构域中与下部铰链区相邻的环和链，例如在P331区中，例如在P331周围的天然IgG Fc的上部CH2结构域中的至少3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的区，例如在天然IgG Fc的氨基酸320与340(EU编号)之间。
在一些实施方式中，根据本公开的结合蛋白包括Fc区。如本文所使用的，术语“Fc区”是指由抗体重链的两个或更多个Fc部分形成的免疫球蛋白的部分。例如，Fc区可以是单体或“单链”Fc区(即scFc区)。单链Fc区包括在单一多肽链内连接(例如，在单一连续核酸序列中编码)的Fc部分。WO 2008/143954 A2中公开了示例性scFc区，并且其以引用的方式并入本文中。Fc区可以是或包括二聚体Fc区；应当理解，二聚体Fc区与不期望的(例如，抗体:抗体、抗体:抗原结合片段或抗原结合片段:抗原结合片段)二聚体不同，如上文所描述和说明的，在一个实施方式中，在图7中。在某些优选的实施方式中，抗体或抗原结合片段包括二聚体Fc区，同时产生很少的包括抗体或包括抗原结合片段的二聚体。
“二聚体Fc区”或“dcFc”是指由两条独立免疫球蛋白重链的Fc部分形成的二聚体。二聚体Fc区可以是两个相同Fc部分的同源二聚体(例如，天然存在的免疫球蛋白的Fc区)或两个不相同Fc部分的异源二聚体(例如，二聚体Fc区的一个Fc单体包括至少一个不存在于另一个Fc单体中的氨基酸修饰(例如，取代、缺失、插入或化学修饰)，或者一个Fc单体与另一者相比可能截短)。
本公开的Fc部分可以包括相同或不同类别和/或亚类的Fc序列或区。例如，Fc部分可以源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类的免疫球蛋白(例如，人免疫球蛋白)或源自其任何组合。在某些实施方式中，Fc区的Fc部分属于相同类别和亚类。然而，Fc区(或Fc区的一个和或多个Fc部分)也可以是嵌合的，由此嵌合Fc区可以包括源自不同免疫球蛋白类别和/或亚类的Fc部分。例如，二聚体或单链Fc区的Fc部分中的至少两个可以来自不同免疫球蛋白类别和/或亚类。在某些实施方式中，二聚体Fc区可以包括来自两种或更多种不同同种型或亚类的序列；例如，SEED体(“链交换工程化结构域(strand-exchange engineered domains)”)，参见Davis等人,《蛋白质工程设计与选择(Protein Eng.Des.Sel.)》23(4):195(2010)。
另外地或可替代地，嵌合Fc区可以包括一个或多个嵌合Fc部分。例如，嵌合Fc区或部分可以包括一个或多个源自第一亚类(例如，IgG1、IgG2或IgG3亚类)的免疫球蛋白的部分，而Fc区或部分的其余部分属于不同亚类。例如，Fc多肽的Fc区或部分可以包括源自第一亚类(例如，IgG1、IgG2或IgG4亚类)的免疫球蛋白的CH2和/或CH3结构域以及来自第二亚类(例如，IgG3亚类)的免疫球蛋白的铰链区。例如，Fc区或部分可以包括源自第一亚类(例如，IgG4亚类)的免疫球蛋白的铰链和/或CH2结构域以及来自第二亚类(例如，IgG1、IgG2或IgG3亚类)的免疫球蛋白的CH3结构域。例如，嵌合Fc区可以包括来自第一亚类(例如，IgG4亚类)的免疫球蛋白的Fc部分(例如，完整Fc部分)以及来自第二亚类(例如，IgG1、IgG2或IgG3亚类)的免疫球蛋白的Fc部分。例如，Fc区或部分可以包括来自IgG4免疫球蛋白的CH2结构域和来自IgG1免疫球蛋白的CH3结构域。例如，Fc区或部分可以包括来自IgG4分子的CH1结构域和CH2结构域以及来自IgG1分子的CH3结构域。例如，Fc区或部分可以包括来自特定抗体亚类的CH2结构域的一部分，例如CH2结构域的EU位置292-340。例如，Fc区或部分可以包括源自IgG4部分的CH2的氨基酸位置292-340和源自IgG1部分的CH2的其余部分(可替代地，CH2的292-340可以源自IgG1部分并且CH2的其余部分源自IgG4部分)。
还应理解，本公开的任何抗体、抗原结合片段或Fc区或部分可以属于任何同种异型和/或单倍型。例如，人免疫球蛋白G同种异型包括Jefferis和LeFranc,mAb 1(4):1-7(2009)中公开的同种异型，所述同种异型(包括G1m(1(a)；2(x)；3(f)；和17(z))；G2m(23(n))；G3m(21(g1)；28(g5)；11(b0)；5(b2)；13(b3)；14(b4)；10(b5)；15(s)；16(t)；6(c3)；24(c5)；26(u)；和27(v))；A2m(1和2)；以及Km(1；2；和3)和单倍型以及所产生的氨基酸序列和其组合通过引用并入本文。在某些实施方式中，本公开的抗体、抗原结合片段或Fc区或部分包括IgG1同种异型g1m17,k1。
此外，Fc区或部分可以(额外地或可替代地)例如包括嵌合铰链区。例如，可以得出嵌合铰链，例如部分来自IgG1、IgG2或IgG4分子(例如，上部和下部中间铰链序列)并且部分来自IgG3分子(例如，中间铰链序列)。在另一个实例中，Fc区或部分可以包括部分源自IgG1分子并且部分源自IgG4分子的嵌合铰链。在另一个实例中，嵌合铰链可以包括来自IgG4分子的上部和下部铰链结构域以及来自IgG1分子的中间铰链结构域。此类嵌合铰链可以例如通过在IgG4铰链区的中间铰链结构域中的EU位置228处引入脯氨酸取代(Ser228Pro)而获得。在另一个实施方式中，嵌合铰链可以包括EU位置233-236处的氨基酸，来自IgG2抗体和/或Ser228Pro突变，其中铰链的剩余氨基酸来自IgG4抗体(例如，序列ESKYGPPCPPCPAPPVAGP(SEQ ID NO:74)的嵌合铰链)。US 2005/0163783A1中描述了可以用于根据本公开的抗体的Fc部分中的另外嵌合铰链。
在本文所公开的结合蛋白的一些实施方式中，Fc部分或Fc区包括源自人免疫球蛋白序列的氨基酸序列(例如，源自来自人IgG分子的Fc区或Fc部分)或由其组成。然而，多肽可以包括来自另一哺乳动物物种的一个或多个氨基酸。例如，灵长类动物Fc部分或灵长类动物结合位点可以包括于主题多肽中。可替代地，一个或多个鼠类氨基酸可以存在于Fc部分或Fc区中。
在一些实施方式中，提供了一种抗体，其包括：重链(HC)，所述HC包括SEQ ID NO:75中所示的氨基酸序列或由其组成，任选地C末端赖氨酸被去除；以及轻链(LC)，其中所述LC包括以下或由以下组成：(i)SEQ ID NO:58-72中的任一者中所示的VL氨基酸序列；以及(ii)SEQ ID NO:79中所示的CL氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种抗体，其包括：重链(HC)，所述HC包括SEQ ID NO:76中所示的氨基酸序列或由其组成，任选地C末端赖氨酸被去除；以及轻链(LC)，其中所述LC包括以下或由以下组成：(i)SEQ ID NO:58-72中的任一者中所示的VL氨基酸序列；以及(ii)SEQ ID NO:79中所示的CL氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种抗体，其包括：重链(HC)，所述HC包括SEQ ID NO:77中所示的氨基酸序列或由其组成，任选地C末端赖氨酸被去除；以及轻链(LC)，其中所述LC包括以下或由以下组成：(i)SEQ ID NO:58-72中的任一者中所示的VL氨基酸序列；以及(ii)SEQ ID NO:79中所示的CL氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种抗体，其包括：重链(HC)，所述HC包括SEQ ID NO:78中所示的氨基酸序列或由其组成，任选地C末端赖氨酸被去除；以及轻链(LC)，其中所述LC包括以下或由以下组成：(i)SEQ ID NO:58-72中的任一者中所示的VL氨基酸序列；以及(ii)SEQ ID NO:79中所示的CL氨基酸序列。
核酸分子/多核苷酸
另一方面，本公开提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括编码根据本公开的抗体、抗原结合片段或融合蛋白的多核苷酸。应当理解，例如，第一核酸分子可以编码抗体的重链，并且第二核酸分子可以编码抗体的轻链；这些第一核酸分子和第二核酸分子仍可以被称为编码抗体的“多核苷酸”或“核酸分子”。换句话说，多核苷酸或核酸分子包括实施方式，其中抗体或抗原结合片段的部分(例如，链)由单独的核酸分子和/或由核酸分子的单独部分编码。示例性多核苷酸序列提供于SEQ ID NO:80-99中。在一些实施方式中，编码抗体重链的多核苷酸包括SEQ ID NO:81中所示的多核苷酸序列或由其组成，并且编码抗体VL或LC的多核苷酸包括SEQ ID NO:85-99中的任一者中所示的多核苷酸序列。在其它实施方式中，编码抗体重链的多核苷酸包括SEQ ID NO:83中所示的多核苷酸序列或由其组成，并且编码抗体VL或LC的多核苷酸包括SEQ ID NO:85-99中的任一者中所示的多核苷酸序列。在仍其它实施方式中，编码抗体重链的多核苷酸包括SEQ ID NO:84中所示的多核苷酸序列或由其组成，并且编码抗体VL或LC的多核苷酸包括SEQ ID NO:85-99中的任一者中所示的多核苷酸序列。
由于遗传密码的冗余，本公开还包括这些核酸序列的序列变体以及具体地是编码相同氨基酸序列的此类序列变体。
在某些实施方式中，多核苷酸或核酸分子包括与SEQ ID NO:80-99中的任一者的核苷酸序列共享至少50％(即，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列被密码子优化以由宿主细胞表达。
在特定实施方式中，根据本公开的核酸分子包括如SEQ ID NO:80-99中的任一者所示的核酸序列或由其组成。
在某些实施方式中，多核苷酸包括与SEQ ID NO:81中所示的氨基酸序列具有至少50％同一性的VH编码核苷酸序列以及与SEQ ID NO:85-97中的任一者中所示的氨基酸序列具有至少50％同一性的VL编码核苷酸序列。
在本公开的任何实施方式中，多核苷酸可以包括如SEQ ID NO:84所示的VH-CH1-铰链-CH2-CH3-编码核苷酸序列。在一些实施方式中，多核苷酸包括与SEQ ID NO:98或99中所示的氨基酸序列具有至少50％同一性的CL编码核苷酸序列。
载体
本公开的范围内进一步包括载体，例如包括根据本公开的核酸分子的表达载体。
术语“载体”是指包括核酸分子的构建体。在本公开的上下文中的载体适合于并入或携带所需核酸序列。此类载体可以是储存载体、表达载体、克隆载体、转移载体等。储存载体是允许方便地储存核酸分子的载体。因此，载体可以包括对应于例如根据本说明书的所需抗体或其抗体片段的序列。
如本文所使用的，“表达载体”是指含有核酸分子的DNA构建体，所述核酸分子可操作地连接到能够实现核酸分子在合适宿主中的表达的合适控制序列。此类控制序列包括影响转录的启动子(例如，异源启动子)、控制此类转录的任选的操纵子序列、编码合适mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录与翻译终止的序列。促成所关注的核酸分子转录的表达载体的任何元件对载体而言可以是异源的。载体可以是质粒、噬菌体颗粒、病毒或仅仅是潜在基因组插入物。一旦载体转化到适合宿主中，所述载体就可以独立于宿主基因组复制和作用，或在一些情况下可以整合到基因组本身中。在本说明书中，“质粒”、“表达质粒”、“病毒”和“载体”通常可互换地使用。
克隆载体通常为包括克隆位点的载体，所述克隆位点可以用于将核酸序列并入到载体中。克隆载体可以是例如质粒载体或噬菌体载体。
转移载体可以是适合于将核酸分子转移到细胞或生物体中的载体，例如病毒载体。在本公开的上下文中，载体可以是例如RNA载体或DNA载体。载体可以是DNA分子。例如，本申请意义上的载体包括克隆位点、选择标志物(如抗生素耐药性因子)和适合于载体倍增的序列(如复制起点)。
在某些实施方式中，载体包括质粒载体或病毒载体(例如，慢病毒载体或γ-逆转录病毒载体)。病毒载体包括逆转录病毒；腺病毒；细小病毒(例如，腺相关病毒)；冠状病毒；负链RNA病毒，如正粘病毒(例如，流感病毒)、弹状病毒(例如，狂犬病和水疱性口炎病毒)、副粘病毒(例如，麻疹和仙台病毒(Sendai))；正链RNA病毒，如小核糖核酸病毒和α病毒；以及双链DNA病毒，包括腺病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒1和2型、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)、巨细胞病毒)和痘病毒(例如，牛痘、鸡痘和金丝雀痘)。其它病毒包括例如诺沃克病毒(Norwalk virus)、披膜病毒(togavirus)、黄病毒(flavivirus)、呼肠孤病毒(reoviruses)、乳多空病毒(papovavirus)、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括禽白血病-肉瘤、哺乳动物C型病毒、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV基团、慢病毒、泡沫病毒(Coffin,J.M.,逆转录病毒科：病毒和其复制(Retroviridae:The viruses and theirreplication),《基础病毒学(Fundamental Virology)》,第三版,B.N.Fields等人编辑,费城利平科特-雷文出版社(Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia)，1996)。
“逆转录病毒”为具有RNA基因组的病毒，所述RNA基因组使用逆转录酶逆转录成DNA，随后逆转录的DNA并入宿主细胞基因组中。“γ逆转录病毒”是指逆转录病毒科的一个属。γ逆转录病毒的实例包括小鼠干细胞病毒、鼠类白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒和禽网状内皮组织增生病毒。
“慢病毒载体”包括用于基因递送的基于HIV的慢病毒载体，其可以为整合或非整合的，具有相对大的包装容量，并且可以转导一系列不同细胞类型。慢病毒载体通常在将三种(包装、包膜和转移)或更多种质粒瞬时转染到生产细胞中之后产生。类似于HIV，慢病毒载体通过病毒表面糖蛋白与细胞表面上受体的相互作用进入靶细胞。在进入时，病毒RNA经历逆转录，其由病毒逆转录酶复合物介导。逆转录的产物是双链线性病毒DNA，其是病毒整合到受感染细胞DNA中的底物。
在某些实施方式中，病毒载体可以是γ逆转录病毒，例如，莫洛尼鼠类白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，MLV)衍生载体。在其它实施方式中，病毒载体可以是更复杂的逆转录病毒衍生载体，例如，慢病毒衍生载体。HIV-1衍生载体属于此类别。其它实例包括衍生自HIV-2、FIV、马传染性贫血病毒、SIV和梅迪-维斯纳(Maedi-Visna)病毒(绵羊慢病毒)的慢病毒载体。使用逆转录病毒和慢病毒载体以及包装细胞来用包括转基因的病毒颗粒转导哺乳动物宿主细胞的方法是本领域已知的并且已经在例如以下文献中描述：美国专利8,119,772；Walchli等人,《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》6:327930,2011；Zhao等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》174:4415,2005；Engels等人,《人类基因疗法(Hum.GeneTher.)》14:1155,2003；Frecha等人,《分子疗法(Mol.Ther.)》18:1748,2010；以及Verhoeyen等人,《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》506:97,2009。逆转录病毒和慢病毒载体构建体和表达系统也可商购获得。其它病毒载体也可以用于多核苷酸递送，包括DNA病毒载体，包括例如基于腺病毒的载体和基于腺相关病毒(AAV)的载体；衍生自单纯疱疹病毒(HSV)的载体，包括扩增子载体、复制缺陷型HSV和减毒HSV(Krisky等人,《基因疗法(GeneTher.)》5:1517,1998)。
可以与本公开的组合物和方法一起使用的其它载体包括衍生自杆状病毒和α-病毒的载体(Jolly,D J.1999.新兴病毒载体(Emerging Viral Vectors.)Friedmann T.编辑,《人类基因疗法的发展(The Development of Human Gene Therapy.)》第209-40页,纽约：冷泉港实验室(New York:Cold Spring Harbor Lab)或质粒载体(如睡美人或其它转座子载体)。
当病毒载体基因组包括要在宿主细胞中作为独立的转录物表达的多种多核苷酸时，病毒载体还可以包括两种(或更多种)转录物之间的额外的序列，从而允许双顺反子或多顺反子表达。用于病毒载体的此类序列的实例包括内部核糖体进入位点(IRES)、弗林蛋白酶切割位点、病毒2A肽或其任何组合。
本文进一步描述质粒载体，包括用于直接向受试者施用的基于DNA的抗体或抗原结合片段编码质粒载体。
细胞
在另外的方面，本公开还提供了表达根据本公开的抗体、抗原结合片段或融合蛋白的细胞(也称为“宿主细胞”)；或包括根据本公开的载体或多核苷酸的细胞。
此类细胞的实例包括但不限于真核细胞(例如，酵母细胞)、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞以及原核细胞(包括大肠杆菌(E.coli))。在一些实施方式中，细胞是哺乳动物细胞。在某些此类实施方式中，细胞是哺乳动物细胞系，如CHO细胞(例如，DHFR-CHO细胞(Urlaub等人,《美国国家科学院院刊》77:4216(1980),CHO-KSV,ExpiCHO)、人胚肾细胞(例如，HEK293T细胞)、PER.C6细胞、Y0细胞、Sp2/0细胞。NS0细胞、人肝细胞，例如Hepa RG细胞、骨髓瘤细胞或杂交瘤细胞。哺乳动物宿主细胞系的其它实例包括：小鼠支持细胞(例如，TM4细胞)；SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系；小仓鼠肾细胞(BHK)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；猴肾细胞(CV1)；人宫颈癌细胞(HELA)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；犬肾细胞(MDCK；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞；MRC5细胞；以及FS4细胞。适用于抗体产生的哺乳动物宿主细胞系还包括在例如Yazaki和Wu,《分子生物学方法》，第248卷(B.K.C.Lo编辑，新泽西州托托瓦的胡玛纳出版社(Humana Press,Totowa,N.J.),第255-268页(2003)中描述的哺乳动物宿主细胞系。
在某些实施方式中，宿主细胞是原核细胞，如大肠杆菌。肽在如大肠杆菌等原核细胞中的表达是公认的(参见例如Pluckthun,A.《生物/技术(Bio/Technology)》9:545-551(1991))。例如，抗体可以在细菌中产生，具体地在不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如美国专利第5,648,237号；第5,789,199号；以及第5,840,523号。
可用于表达本公开的结合蛋白的昆虫细胞是所属领域已知的，并且包括例如草地贪夜蛾Sf9细胞(Spodoptera frugipera Sf9 cell)、粉纹夜蛾BTI-TN5B1-4细胞(Trichoplusia ni BTI-TN5B1-4 cell)和草地贪夜蛾SfSWT01“MimicTM”细胞(Spodopterafrugipera SfSWT01“MimicTM”cells)。参见例如Palmberger等人,《生物技术杂志(J.Biotechnol.)》153(3-4):160-166(2011)。已经鉴定了许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于草地贪夜蛾细胞的转染。
真核微生物(如丝状真菌或酵母)也是用于克隆或表达蛋白质编码载体的合适宿主，并且包括具有“人源化”糖基化通路的真菌和酵母菌株，从而产生具有部分或完全人糖基化型态的抗体。参见Gerngross,《自然生物技术》22:1409-1414(2004)；Li等人,《自然生物技术》24:210-215(2006)。
植物细胞也可以用作表达本公开的结合蛋白的宿主。例如，PLANTIBODIESTM技术(在例如美国专利第5,959,177号；第6,040,498号；第6,420,548号；第7,125,978号；以及第6,417,429号中描述)采用转基因植物来产生抗体。
在一些实施方式中，融合蛋白由免疫细胞，例如T细胞、NK细胞或NK-T细胞或其任何亚型在细胞表面处表达。
与本公开相容的任何蛋白质表达系统均可以用于产生所公开的结合蛋白。合适的表达系统包括在《基因表达系统(Gene Expression Systems)》,学术出版社(AcademicPress),编辑Fernandez等人,1999中描述的转基因动物。
在特定实施方式中，可以用根据本说明书的载体与表达载体转染细胞。术语“转染”是指将核酸分子，如DNA或RNA(例如，mRNA)分子引入细胞，如真核细胞中。在本说明书的上下文中，术语“转染”涵盖技术人员已知的用于将核酸分子引入到细胞(如真核细胞，包括哺乳动物细胞)中的任何方法。此类方法涵盖例如电穿孔、脂转染(例如，基于阳离子脂质和/或脂质体)、磷酸钙沉淀、基于纳米颗粒的转染、基于病毒的转染或基于阳离子聚合物(如DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺等)的转染。在某些实施方式中，引入是非病毒的。
此外，本公开的细胞可以用根据本说明书的载体稳定或瞬时转染，例如以表达根据本说明书的抗体或其抗原结合片段。在此类实施方式中，用如本文所描述的编码结合蛋白的载体稳定转染细胞。可替代地，可以用根据本公开的编码根据本说明书的结合蛋白的载体瞬时转染细胞。在本公开的任何实施方式中，多核苷酸对宿主细胞来说可以是异源的。
在相关方面，本公开提供用于产生抗体、抗原结合片段或融合蛋白的方法，其中所述方法包括在足以产生抗体、抗原结合片段或融合蛋白的条件下培养本公开的宿主细胞，并且持续足以产生抗体、抗原结合片段或融合蛋白的时间。
因此，本公开还提供异源表达本公开的抗体、抗原结合片段或融合蛋白的重组宿主细胞。例如，细胞可以是与完全或部分获得抗体的物种不同的物种(例如，表达人抗体或工程化人抗体的CHO细胞)。在一些实施方式中，宿主细胞的细胞类型在自然界中不表达抗体或抗原结合片段。此外，宿主细胞可以对不以结合蛋白的天然状态存在(或不以亲本结合蛋白的工程化或衍生的结合蛋白的天然状态存在)的所述结合蛋白赋予翻译后修饰(PTM；例如，糖基化或岩藻糖基化)。此类PTM可以引起功能差异(例如，降低的免疫原性)。因此，由如本文所公开的宿主细胞产生的本公开的结合蛋白可以包括一种或多种翻译后修饰，所述翻译后修饰不同于其呈天然状态的结合蛋白或亲本结合蛋白(例如，由CHO细胞产生的人抗体可以包括与从人分离和/或由天然人B细胞或血浆细胞产生的抗体不同的翻译后修饰)。
抗体、抗原结合片段和融合蛋白的任选的另外特征
本公开的抗体、抗原结合片段和融合蛋白可以例如与用于递送到治疗部位的药物偶联或与可检测标记偶联以促进包括所关注的细胞的部位成像。用于将抗体与药物和可检测标记偶联的方法是本领域众所周知的，使用可检测标记成像的方法也是如此。标记的抗体可以用于采用各种标记的各种测定中。可以通过将可检测物质附接到抗体来促进对本公开的抗体(或抗原结合片段或融合蛋白)与HBsAg上(尤其是HBsAg的抗原环区上)的所关注的表位之间抗体-抗原复合物形成的检测。合适的检测手段包括使用标记，如放射性核素、酶、辅酶、荧光剂、化学发光剂、色原、酶底物或辅因子、酶抑制剂、辅基复合物、自由基、颗粒、染料等。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例是鲁米诺(luminol)；合适的生物发光材料的实例包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白；并且合适的放射性材料的实例包括125I、131I、35S或3H。此类标记的试剂可以用于多种众所周知的测定，如放射免疫测定、酶免疫测定(例如，ELISA)、荧光免疫测定等。根据本公开的标记的抗体、抗原结合片段和融合蛋白因此可以用于例如如US 3,766,162；US 3,791,932；US 3,817,837；和US 4,233,402中所描述的此类测定。
根据本公开的抗体、抗原结合片段或融合蛋白可以与治疗部分缀合，如细胞毒素、治疗剂或放射性金属离子或放射性同位素。放射性同位素的实例包括但不限于I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212、Bi-213、Pd-109、Tc-99、In-111等。此类缀合物可以用于修饰给定的生物应答；药物部分不应被解释为限于典型的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白质或多肽。此类蛋白质可以包括例如毒素，如相思子毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素。
将此类治疗部分与抗体缀合的技术是众所周知的。参见例如Arnon等人(1985)“用于在癌症疗法中免疫靶向药物的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies ForImmunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy)”,《单克隆抗体和癌症疗法(MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy)》，Reisfeld等人编辑(Alan R.Liss公司(Alan R.Liss，Inc.))，第243-256页；Hellstrom等人编辑(1987)“用于药物递送的抗体(Antibodies ForDrug Delivery)”,《受控药物递送(Controlled Drug Delivery)》,Robinson等人(编辑)(第2版；马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.)),第623-653页；Thorpe(1985)“癌症疗法中的细胞毒性剂的抗体载体：综述(Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents InCancer Therapy:AReview)”，《单克隆抗体84：生物学和临床应用(MonoclonalAntibodies'84:Biological and Clinical Applications)》；Pinchera等人编辑,第475-506页(意大利米兰的伊迪特丽斯·库尔蒂斯出版社(Editrice Kurtis,Milano,Italy),1985)；“放射性标记抗体在癌症疗法中的治疗用途的分析、结果和未来展望(Analysis,Results,and Future Prospective of the Therapeutic Use of RadiolabeledAntibody in Cancer Therapy)”,《用于癌症检测和疗法的单克隆抗体(MonoclonalAntibodies for Cancer Detection and Therapy)》；Baldwin等人编辑(纽约的学术出版社(Academic Press,New York),1985),第303-316页；以及Thorpe等人(1982)《免疫学综述(Immunol.Rev.)》62:119-158。
可替代地，抗体、抗体片段或融合蛋白可以与第二抗体或其抗体片段(或第二融合蛋白)缀合以形成如US 4,676,980中所述的异源缀合物。此外，可以在标记与描述的抗体之间使用接头，例如，如US 4,831,175中所述。抗体、抗原结合片段和融合蛋白可以用放射性碘、铟、钇或本领域已知的其它放射性粒子直接标记，例如，如US 5,595,721中所述。治疗可以由用同时或随后施用的缀合和非缀合抗体、抗原结合片段和/或融合蛋白进行的治疗的组合组成，例如，如WO00/52031；WO00/52473中所述。
如本文所述的抗体、抗原结合片段和融合蛋白也可以附接到固相载体。另外，本公开的抗体、其功能性抗体片段或融合蛋白可以通过共价缀合到聚合物进行化学修饰，以例如延长其循环半衰期。聚合物的实例以及用于将其附接到肽的方法示于US 4,766,106；US4,179,337；US 4,495,285和US 4,609,546。在一些实施方式中，聚合物可以选自聚氧乙烯化多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室温下易溶于水，并且具有通式：R(O-CH2-CH2)nO-R，其中R可以是氢或保护基团，如烷基或烷醇基团。在某些实施方式中，保护基团可以具有1个至8个碳。例如，保护基团可以是甲基。符号n为正整数。在一个实施方式中，n介于1与1,000之间。在另一个实施方式中，n介于2与500之间。在一些实施方式中，PEG的平均分子量选自介于1,000与40,000之间、介于2,000与20,000之间以及介于3,000与12,000之间。此外，PEG可以具有至少一个羟基，例如所述PEG可以具有末端羟基。例如，其为被激活以与抑制剂上的游离氨基反应的末端羟基。然而，应理解，可以改变反应性基团的类型和量以实现本说明书的共价缀合的PEG/抗体。
水溶性聚氧乙烯化多元醇也可以在本文所描述的抗体和抗原结合片段的上下文中使用。其包括聚氧乙烯化山梨糖醇、聚氧乙烯化葡萄糖、聚氧乙烯化甘油(POG)等。在一个实施方式中，使用POG。在不受任何理论束缚的情况下，因为聚氧乙烯化甘油的甘油主链是例如动物和人中天然存在的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯中的相同主链，所以这一分支在身体中不一定被视为外来剂。POG的分子量可以与PEG的分子量处于相同范围内。可以用于增长循环半衰期的另一药物递送系统是脂质体。制备脂质体递送系统的方法是本领域技术人员已知的。其它药物递送系统是本领域已知的并且在例如Poznansky等人(1980)和Poznansky(1984)的参考文献中进行描述。
本公开的抗体、抗原结合片段和融合蛋白可以呈纯化形式提供。通常，抗体、抗原结合片段或融合蛋白将存在于基本上不含其它多肽的组合物中，例如，其中组合物的小于90％(按重量计)、通常小于60％和更通常小于50％由其它多肽构成。
本公开的抗体、融合蛋白或抗原结合片段可以在非人(或异源)宿主(例如，小鼠)中具有免疫原性。具体而言，抗体、抗原结合片段或融合蛋白可能具有在非人宿主中具有免疫原性但在人宿主中不具有免疫原性的独特位。具体地，供人使用的本公开的此类分子包括不能容易地从宿主(例如，小鼠、山羊、兔、大鼠、非灵长类哺乳动物等)中分离并且通常不能通过人源化或从异种小鼠中获得的分子。
抗体、抗原结合片段和融合蛋白的产生
根据本公开的抗体、抗原结合片段和融合蛋白可以通过本领域已知的任何方法制备。例如，用于使用杂交瘤技术制备单克隆抗体的一般方法是众所周知的(Kohler,G.和Milstein,C.,1975；Kozbar等人,1983)。在一个实施方式中，使用WO2004/076677中描述的EBV永生化方法。
在一个实施方式中，使用WO 2004/076677中描述的方法产生抗体。在此类方法中，产生抗体的B细胞用EBV和多克隆B细胞激活剂转化。可以在转化步骤期间任选地添加细胞生长和分化的额外的刺激剂以进一步增强效率。这些刺激剂可以是细胞因子，如IL-2和IL-15。一方面，在永生化步骤期间添加IL-2以进一步提高永生化效率，但其使用不是必需的。然后，可以使用本领域已知的方法以及从其中分离的抗体培养使用这些方法产生的永生化B细胞。
WO 2010/046775中描述了另一种用于产生抗体的方法。在此类方法中，以有限的数量培养浆细胞，或者在微孔培养板中作为单个浆细胞进行培养。可以从浆细胞培养物中分离抗体。此外，可以从浆细胞培养物中提取RNA，并且可以使用本领域已知的方法进行PCR。抗体的VH区和VL区可以通过RT-PCR(逆转录酶PCR)进行扩增，测序并克隆到表达载体中，所述表达载体然后转染到HEK293T细胞或其它宿主细胞中。核酸在表达载体中的克隆、宿主细胞转染、经转染的宿主细胞的培养和所产生的抗体的分离可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行。
如果需要，可以使用过滤、离心和各种色谱方法(如HPLC或亲和色谱)进一步纯化抗体。用于纯化抗体(例如，单克隆抗体)的技术，包括用于产生药物级抗体的技术是本领域众所周知的。
分子生物学的标准技术可以用于制备编码本说明书的抗体、抗原结合片段或融合蛋白的DNA序列。可以使用寡核苷酸合成技术完全或部分合成所需DNA序列。可以适当地使用定点诱变和聚合酶链反应(PCR)技术。
任何适合的宿主细胞/载体系统均可以用于表达编码本公开的抗体或融合蛋白分子或其片段的DNA序列。细菌(例如，大肠杆菌)和其它微生物系统可以部分用于表达抗体片段，如Fab和F(ab')2片段，并且尤其是Fv片段和单链抗体片段，例如单链Fv。真核(例如，哺乳动物)宿主细胞表达系统可以用于产生较大抗体分子，包括完整抗体分子。合适的哺乳动物宿主细胞包括但不限于本文所公开的示例性宿主细胞和细胞系。
本公开还提供一种用于产生根据本公开的抗体、抗原结合片段或融合蛋白分子的方法，所述方法包括在适合于从编码本说明书的抗体分子的DNA表达蛋白质的条件下培养包括编码本公开的核酸的载体的宿主细胞，并且分离抗体分子。
抗体分子或抗体片段可以仅包括重链或轻链多肽，在这种情况下，仅需要使用重链或轻链多肽编码序列来转染宿主细胞。为了产生包括重链和轻链两者的产物，细胞系可以用两种载体转染，第一载体编码轻链多肽，并且第二载体编码重链多肽。可替代地，可以使用单一载体，载体包括编码轻链和重链多肽的序列。
可替代地，根据本公开的抗体、抗原结合片段和融合蛋白可以通过以下产生：(i)在宿主细胞中表达根据本公开的核酸序列，例如通过使用根据本说明书的载体；以及(ii)分离经表达的所需产物。另外，所述方法可以包括(iii)纯化所分离的抗体、抗原结合片段或融合蛋白。可以筛选经转化的B细胞和所培养的浆细胞用于那些产生所需特异性或功能的抗体、抗原结合片段或融合蛋白的细胞。
可以通过任何免疫测定(例如，ELISA)、通过对组织或细胞(包括经转染的细胞)进行染色、通过中和测定或通过本领域已知的用于鉴定所需特异性或功能的多种其它方法之一进行筛选。测定可以基于对一种或多种抗原的简单识别来选择，或者可以额外基于所需功能来选择，以例如选择中和抗体而非仅仅抗原结合抗体、选择可以改变靶向细胞的特性(如其信号传导级联、其形状、其生长速率、其影响其它细胞的能力、其对其它细胞或其它试剂或条件变化的影响的应答、其分化状态等)的抗体。
然后可以由阳性转化的B细胞培养物产生单独转化的B细胞克隆。用于从阳性细胞混合物中分离单独克隆的克隆步骤可以使用有限稀释、显微操纵、通过细胞分选进行的单细胞沉积或本领域已知的另一种方法进行。
可以使用本领域已知的方法在HEK293T细胞或其它已知的宿主细胞中分离、克隆和表达来自经培养的浆细胞的核酸。
本文所描述的永生化B细胞克隆或经转染的宿主细胞可以以多种方式使用，例如作为单克隆抗体的来源、作为编码所关注的单克隆抗体的核酸(DNA或mRNA)的来源、用于研究等。
HBV蛋白表达抑制剂和递送系统
本公开还提供了用于组合疗法方法的HBV蛋白表达抑制剂和用于治疗HBV的组合物，其中组合疗法包括如本文所提供的结合蛋白。在某些实施方式中，HBV基因表达抑制剂是RNAi药剂。如本文所使用的，术语“RNA干扰剂”或“RNAi药剂”是指包括如本文所定义的术语的RNA并且通过RNA诱导的沉默复合物(RISC)通路介导RNA转录物的靶向切割的药剂。在一些实施方式中，如本文所述的RNAi药剂影响HBV基因表达的抑制。
一方面，RNA干扰剂包括单链RNA，所述单链RNA与靶RNA序列相互作用以引导靶RNA的切割。不希望受特定理论的束缚，引入到植物和无脊椎动物细胞中的长双链RNA(dsRNA)通过称为Dicer的III型核酸内切酶分解为siRNA(Sharp等人,《基因与发育(Genes Dev.)》15:485(2001))。Dicer，即核糖核酸酶-III样酶使用特性两个碱基3'突出端将dsRNA加工成19-23个碱基对短干扰RNA(siRNA)(Bernstein等人,《自然》409:363(2001))。然后将siRNA掺入到RNA诱导的沉默复合物(RISC)，其中一种或多种解旋酶解开siRNA双链体，从而使互补的反义链能够指导靶标识别(Nykanen等人,《细胞》107:309(2001))。在与适当靶mRNA结合后，RISC内的一种或多种核酸内切酶切割靶标以诱导沉默(Elbashir等人,《基因与发育》15:188(2001))。因此，一方面，本文描述的技术涉及单链RNA，所述单链RNA促进RISC复合物的形成以实现靶基因的沉默。
术语“沉默”、“抑制...的表达(inhibit the expression of)”、“下调...的表达”、“抑制...的表达(suppress the expression of)”等，只要其指的是HBV基因，本文中就是指HBV基因表达的至少部分减少，表现为HBV mRNA的量减少，所述HBV mRNA可以从转录HBV基因的第一细胞或细胞组中分离或检测到，并且已经用HBV基因表达的抑制剂处理，使得与第二细胞或细胞组相比，HBV基因的表达被抑制，所述第二细胞或细胞组与第一细胞或细胞组基本上相同但已经或未被如此处理(对照细胞)。抑制程度可以例如作为对照细胞中mRNA表达的程度减去经处理细胞中mRNA表达的程度的差值测量。可替代地，抑制程度可以根据与HBV基因表达功能相关的参数的减少给出，例如，由HBV基因编码的蛋白质的量或显示某种表型(例如，HBV感染表型，如HBV感染)、HBV蛋白表达(如乙型肝炎表面抗原HBsAg)或反映HBV基因表达的细胞基因表达变化(例如，Smc5/6表达和定位)的细胞数量。抑制程度也可以使用被工程化以表达反映HBV RNA表达的报告基因的细胞来测量。原则上，HBV基因沉默可以在任何表达HBV基因的细胞(例如，HBV感染的细胞或被工程化以表达HBV基因的细胞)中并通过任何适当的测定来确定。
通过细胞或细胞群表达的HBV RNA的水平或循环HBV RNA的水平可以使用本领域已知的任何用于评估mRNA表达的方法来确定，如国际申请公开第WO 2016/077321A1号和美国专利申请第US2017/0349900A1号的实施例2中提供的rtPCR方法，所述国际申请公开和美国专利申请通过引用并入本文。在一些实施方式中，样品中HBV基因(例如，总HBV RNA、HBV转录物，例如，HBV 3.5kb转录物)的表达水平通过检测转录的多核苷酸或其部分，例如，HBV基因的RNA来确定。可以使用RNA提取技术从细胞中提取RNA，包括例如使用酸酚/异硫氰酸胍提取(RNAzol B；生物起源公司(Biogenesis))、RNeasy RNA制备试剂盒
Figure BDA0004086126640000691
或PAXgene(瑞士的PreAnalytix)。利用核糖核酸杂交的典型测定形式包括核连续测定、RT-PCR、RNase保护测定(Melton等人,《核酸研究》12:7035)、northern印迹、原位杂交和微阵列分析。可以使用国际申请公开第WO 2012/177906A1号和美国专利申请第US2014/0275211A1号中描述的方法检测循环HBV mRNA，所述国际申请公开和美国专利申请通过引用并入本文。
如本文所使用的，“靶序列”是指在HBV基因转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包括作为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。序列的靶部分将至少足够长以充当在所述部分处或附近进行RNAi定向的切割的底物。例如，靶序列的长度通常将为9-36个核苷酸，例如，长度为15-30个核苷酸，包括其间的所有子范围。作为非限制性实例，靶序列可以为15-30个核苷酸、15-26个核苷酸、15-23个核苷酸、15-22个核苷酸、15-21个核苷酸、15-20个核苷酸、15-19个核苷酸、15-18个核苷酸、15-17个核苷酸、18-30个核苷酸、18-26个核苷酸、18-23个核苷酸、18-22个核苷酸、18-21个核苷酸、18-20个核苷酸、19-30个核苷酸、19-26个核苷酸、19-23个核苷酸、19-22个核苷酸、19-21个核苷酸、19-20个核苷酸、20-30个核苷酸、20-26个核苷酸、20-25个核苷酸、20-24个核苷酸、20-23个核苷酸、20-22个核苷酸、20-21个核苷酸、21-30个核苷酸、21-26个核苷酸、21-25个核苷酸、21-24个核苷酸、21-23个核苷酸或21-22个核苷酸。
如本文所使用的，术语“包括序列的链”是指包括核苷酸链的寡核苷酸，所述核苷酸链通过使用标准核苷酸命名法指代的序列描述。
如本文所使用的，并且除非另外指明，否则术语“互补”当用于相对于第二核苷酸序列描述第一核苷酸序列时是指包括第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包括第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并且形成双链体结构的能力，如技术人员将理解的。例如，此类条件可以是严格条件，其中严格条件可以包括：400mM NaCl，40mMPIPES pH 6.4，1mM EDTA，50℃或70℃持续12-16个小时，随后洗涤。可以应用其它条件，如生物体内部可能遇到的生理学上相关的条件。技术人员将能够根据杂交核苷酸的最终应用确定最适合于两个序列的互补性测试的条件集。
RNAi药剂内(例如，如本文所述的siRNA内)的互补序列包括包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包括第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一个或两个核苷酸序列的全长上的碱基配对。此类序列在本文中可以被称为彼此“完全互补”。然而，当第一序列在本文中被称为相对于第二序列“基本上互补”时，这两个序列可以是完全互补的，或者其可以形成一个或多个，但通常不超过5个、4个、3个或2个杂交后错配的碱基对用于至多30个碱基对的双链体，同时保留在与其最终应用最相关的条件下杂交的能力，例如通过RISC通路抑制基因表达。然而，在两个寡核苷酸被设计以在杂交时形成一个或多个单链突出端的情况下，此类突出端不应视为相对于互补性的确定的错配。例如，包括一个长度为21个核苷酸的寡核苷酸和另一个长度为23个核苷酸的寡核苷酸的siRNA，其中较长的寡核苷酸包括与较短的寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列，仍可以被称为出于本文所述的目的“完全互补”。
如本文所使用的，“互补”序列还可以包括非沃森-克里克碱基对(non-Watson-Crick base pair)和/或由非天然和经修饰的核苷酸形成的碱基对，或完全由其形成，只要满足关于其杂交能力的以上要求即可。此类非沃森-克里克碱基对包括但不限于G:U摆动碱基配对或胡斯坦碱基配对(Hoogstein base pairing)。
在本文中术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”可以相对于siRNA的正义链与反义链之间或RNAi药剂的反义链与靶序列之间的碱基匹配使用，如根据其使用的上下文所理解的。
如本文所使用的，与信使RNA(mRNA)的至少部分“基本上互补”的多核苷酸是指与所关注的mRNA(例如，编码HBV蛋白的mRNA)的连续部分基本上互补的多核苷酸。例如，如果序列与HBV mRNA的不间断部分基本上互补，那么多核苷酸与HBV mRNA的至少一部分互补。
a.siRNA
在一些实施方式中，RNAi药剂包括siRNA。如本文所使用的，术语“siRNA”是指包括具有杂交双链体区的RNA分子或分子复合物的RNAi，所述杂交双链体区包括两条反平行且基本上互补的核酸链，所述核酸链将被称为具有相对于靶RNA的“正义”和“反义”朝向。双链体区可以具有任何允许通过RISC通路特异性降解所需靶RNA的长度，但通常长度范围将为9至36个碱基对，例如长度为15-30个碱基对。考虑到介于9个与36个碱基对之间的双链体，所述双链体可以具有在此范围内的任何长度，例如9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个或36个以及其之间的任何子范围，包括但不限于15-30个碱基对，15-26个碱基对、15-23个碱基对、15-22个碱基对、15-21个碱基对、15-20个碱基对、15-19个碱基对、15-18个碱基对、15-17个碱基对、18-30个碱基对、18-26个碱基对、18-23个碱基对、18-22个碱基对、18-21个碱基对、18-20个碱基对、19-30个碱基对、19-26个碱基对、19-23个碱基对、19-22个碱基对、19-21个碱基对、19-20个碱基对、20-30个碱基对、20-26个碱基对、20-25个碱基对、20-24个碱基对、20-23个碱基对、20-22个碱基对、20-21个碱基对、21-30个碱基对、21-26个碱基对、21-25个碱基对、21-24个碱基对、21-23个碱基对和21-22个碱基对。通过用Dicer和类似酶处理在细胞中产生的siRNA的长度通常在19-22个碱基对的范围内。术语“双链RNA”或“dsRNA”在本文中也同义地用于指代如上所述的siRNA。
siRNA的双链体区的一条链包括与靶RNA的区基本上互补的序列。形成双链体结构的两条链可以来自具有至少一个自身互补区的单一RNA分子，或可以由两个或更多个单独的RNA分子形成。当双链体区由单个分子的两条链形成时，所述分子可以具有由介于一条链的3'末端与形成双链体结构的相应另一条链的5'末端之间的单链核苷酸链(本文中被称为“发夹环”)分隔的双链体区。发夹环可以包括至少一个未配对核苷酸；在一些实施方式中，发夹环可以包括至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少23个或更多个未配对核苷酸。在siRNA的两条基本上互补的链由单独的RNA分子构成的情况下，那些分子不必但可以共价连接。当两条链通过除发夹环以外的方式共价连接时，连接结构被称为“接头”。
术语“反义链”或“引导链”是指RNAi药剂(例如，siRNA)的链，所述链包括与靶序列基本上互补的区。如本文所使用的，术语“互补区”是指反义链上与如本文所定义的序列(例如，靶序列)基本上互补的区。在互补区与靶序列不完全互补的情况下，错配可以处于分子的内部或末端区中。
通常，最容许的错配处于末端区中，例如，在5'和/或3'末端的5个、4个、3个或2个核苷酸内。
如本文所使用的，术语“正义链”或“随从链”是指包括与如本文所定义的术语的反义链的区基本上互补的区的RNAi链。
另一方面，药剂是单链反义RNA分子。反义RNA分子可以具有与靶标互补的15-30个核苷酸。例如，反义RNA分子可以具有来自本文公开的反义序列之一的至少15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或更多个连续核苷酸的序列。
技术人员将认识到，术语“RNA分子”或“核糖核酸分子”不仅涵盖在自然界中表达或发现的RNA分子，还涵盖包括如本文所述的或本领域已知的一种或多种核糖核苷酸/核糖核苷类似物或衍生物的RNA的类似物和衍生物。严格地说，“核糖核苷”包括核苷碱基和核糖，并且“核糖核苷酸”是具有一个、两个或三个磷酸盐部分的核糖核苷。然而，术语“核糖核苷”和“核糖核苷酸”可以被认为与如本文所使用的等效。RNA可以在核碱基结构中或在核糖-磷酸主链结构中被修饰，例如，如下文更详细描述的。然而，包括核糖核苷类似物或衍生物的siRNA分子保留形成双链体的能力。作为非限制性实例，RNA分子还可以包括至少一种修饰的核糖核苷，包括但不限于2'-O-甲基修饰的核苷、包括5'硫代磷酸酯基团的核苷、与胆甾醇基衍生物或正十二烷酸双癸酰胺基团连接的末端核苷、锁定核苷、脱碱基核苷、2'-脱氧-2'-氟代修饰的核苷、2'-氨基修饰的核苷、2'-烷基修饰的核苷、吗啉代核苷、氨基磷酸酯、或包括核苷的非天然碱基或其任何组合。可替代地，RNA分子可以包括至少两个经修饰的核糖核苷，至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个或更多个、至多为siRNA分子的整个长度。对于RNA分子中的此类多个经修饰的核糖核苷中的每一个，修饰不必相同。在一些实施方式中，预期在本文所述的方法和组合物中使用的经修饰的RNA是肽核酸(PNA)，所述PNA具有形成所需双链体结构的能力并且允许或介导靶RNA通过RISC通路的特异性降解。
在一些实施方式中，经修饰的核糖核苷包括脱氧核糖核苷。例如，RNAi药剂可以包括一种或多种脱氧核苷，包括例如脱氧核苷突出端或siRNA双链部分内的一种或多种脱氧核苷。然而，如本文所使用的，术语“RNAi药剂”不包括完整的DNA分子。
如本文所使用的，术语“核苷酸突出端”是指从RNAi药剂(例如，siRNA)的双链体结构突出的至少一个未配对的核苷酸。例如，当siRNA的一条链的3'末端延伸超过另一条链的5'末端时，反之亦然，则存在核苷酸突出端。siRNA可以包括至少一个核苷酸的突出端；可替代地，突出端可以包括至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸、至少五个核苷酸或更多。核苷酸突出端可以包括以下或由以下组成：核苷酸/核苷类似物，包括脱氧核苷酸/核苷。突出端可以在正义链、反义链或其任何组合上。此外，突出端的核苷酸可以存在于siRNA的反义链或正义链的5'末端、3'末端或两个末端上。
在一些实施方式中，siRNA的反义链在3'末端和/或5'末端处具有1-10个核苷酸突出端。在一些实施方式中，siRNA的正义链在3'末端和/或5'末端处具有1-10个核苷酸突出端。在一些其它实施方式中，突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸盐替代。
在一些实施方式中，siRNA的至少一个末端具有1至4个、通常1或2个核苷酸的单链核苷酸突出端。具有至少一个核苷酸突出端的siRNA相对于其平末端对应物可以具有出乎意料的优异抑制特性。
如本文所使用的，关于siRNA的术语“平端”或“平末端”是指在siRNA的给定末端处没有未配对的核苷酸或核苷酸类似物，即没有核苷酸突出端。siRNA的一个末端或两个末端可以是平端的。当siRNA的两个末端都是平端的时，所述siRNA被称为“平末端”。“平末端”siRNA是两端均为平端的siRNA，即在分子的任一端处都没有核苷酸突出端。最常见的此类分子将在其整个长度上是双链的。
在某些实施方式中，本文所述的组合疗法包括一种或多种抑制HBV基因表达的RNAi药剂。在一些实施方式中，RNAi药剂包括用于抑制哺乳动物中(例如，感染HBV的人中)的HBV基因的表达的短干扰核糖核酸(siRNA)分子，其中siRNA包括具有互补区的反义链，所述互补区与在HBV基因表达中形成的mRNA的至少一部分互补，并且其中互补区的长度为30个核苷酸或更少，通常长度为19-24个核苷酸，并且其中siRNA在与表达HBV基因的细胞接触时抑制HBV基因的表达至少10％，如通过例如PCR或基于分支DNA(bDNA)的方法或通过基于蛋白质的方法，如通过蛋白质印迹所测定的。HBV基因在细胞培养物中的表达或作为HBV基因表达替代物(例如，Smc5/6)的细胞基因的表达，如在COS细胞、HeLa细胞、原代肝细胞、HepG2细胞、原代培养细胞或在来自受试者的生物样品中，可以通过测量HBV mRNA水平进行测定，如通过bDNA或TaqMan测定，或通过测量蛋白质水平，如通过使用例如蛋白质印迹或流式细胞术技术进行的免疫荧光分析。
siRNA包括两条互补并且在将使用siRNA的条件下杂交以形成双链体结构的RNA链。siRNA的一条链(反义链)包括与靶序列基本上互补且通常完全互补的互补区。靶序列可以源自在HBV基因表达期间形成的mRNA的序列。另一条链(正义链)包括与反义链互补的区，使得两条链在适当条件下组合时杂交并形成双链体结构。通常，双链体结构的长度介于15与30个碱基对之间(包含端值)，更通常介于18与25个碱基对之间(包含端值)，还更通常介于19与24个碱基对之间(包含端值)，并且最通常介于19与21个碱基对之间(包含端值)。类似地，与靶序列互补的区的长度介于15与30个核苷酸之间(包含端值)，更通常介于18与25个核苷酸之间(包含端值)，还更通常介于19与24个核苷酸之间(包含端值)，并且最通常介于19与21个核苷酸之间(包含端值)。在一些实施方式中，siRNA的长度介于15个与20个核苷酸之间(包含端值)，并且在其它实施方式中，siRNA的长度介于25个与30个核苷酸之间(包含端值)。如普通技术人员将认识到的，靶向切割的RNA的靶向区通常将是较大RNA分子的部分，通常是mRNA分子。在相关情况下，mRNA靶标的“部分”是mRNA靶标的连续序列，其长度足以成为RNAi定向切割(即通过RISC通路切割)的底物。在一些情况下，具有短至9个碱基对的双链体的siRNA可以介导RNAi定向的RNA切割。靶标的长度最通常将为至少15个核苷酸。在某些实施方式中，靶标的长度为15-30个核苷酸。
本领域技术人员还将认识到，双链体区是siRNA的主要功能性部分，例如9至36个，例如15-30个碱基对的双链体区。因此，在一些实施方式中，在其被加工成靶向所需RNA进行切割的例如15-30个碱基对的功能性双链体的程度上，具有大于30个碱基对的双链体区的RNA分子或RNA分子复合物是siRNA。因此，普通技术人员然后将认识到，在一些实施方式中，miRNA是siRNA。在一些其它实施方式中，siRNA不是天然存在的miRNA。在一些实施方式中，可用于靶向HBV基因表达的RNAi药剂不是通过切割较大的双链RNA而在靶细胞中产生的。
如本文所述的siRNA可以通过本领域已知的标准方法合成，例如通过使用自动DNA合成仪，如可从例如应用生物系统公司的生物搜索(Biosearch,Applied Biosystems,Inc.)商购获得。
在一些实施方式中，RNAi药剂包括靶向并抑制HBV mRNA表达的siRNA。在一些实施方式中，RNAi药剂包括siRNA，所述siRNA靶向并抑制由根据NCBI参考序列NC_003977.2(GenBank登录号GI:21326584)(SEQ ID NO:116)的HBV基因组编码的mRNA的表达。HBV基因组的转录产生多顺反子重叠RNA，并且因此在一些实施方式中，靶向单个HBV基因的组合疗法的siRNA可以引起大部分或所有HBV转录物表达的显著抑制。在一些实施方式中，siRNA的mRNA靶标可以是由以下编码的mRNA：P基因，NC_003977.1的核苷酸2309-3182和1-1625；S基因(编码L、M和S蛋白)，NC_003977的核苷酸2850-3182和1-837；X蛋白，NC_003977的核苷酸1376-1840；和/或C基因，NC_003977的核苷酸1816-2454。
在一些实施方式中，siRNA靶向并抑制由HBV的X基因编码的mRNA的表达。在一些实施方式中，RNAi药剂或siRNA靶向由包括序列GTGTGCACTTCGCTTCAC(SEQ ID NO:117)的HBV基因组的部分编码的mRNA，所述mRNA对应于NC_003977.2的核苷酸1579-1597(GenBank登录号GI:21326584)(SEQ ID NO:116)。
在仍另外的实施方式中，siRNA具有包括5'-GUGUGCACUUCGCUUCACA-3'(SEQ IDNO:118)的正义链和包括5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3'(SEQ ID NO:119)的反义链。
在某些实施方式中，HBV基因表达抑制剂包括包含正义链和反义链的siRNA，其中所述正义链包括SEQ ID NO:118或与SEQ ID NO:118相差不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个核苷酸的序列；并且其中所述反义链包括SEQ ID NO:119或与SEQ ID NO:119相差不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个核苷酸的序列。
一方面，siRNA将包括至少两个核苷酸序列，即正义序列和反义序列，由此：正义序列包括SEQ ID NO:118，并且对应的反义序列包括SEQ ID NO:119。在这方面，两个序列中的一个序列与两个序列中的另一个序列互补，其中所述序列中的一个序列与在HBV基因表达中产生的mRNA序列基本上互补。如此，在这方面，siRNA将包括两个寡核苷酸，其中一个寡核苷酸被描述为正义链，并且第二寡核苷酸被描述为正义链的对应反义链。如本文中其它地方所描述且如本领域已知的，siRNA的互补序列相对于位于单独寡核苷酸上还可以作为单一核酸分子的自身互补区被包括在内。
在仍另外的实施方式中，siRNA具有包括5'-GGUGGACUUCUCUCAAUUUUA-3'(SEQ IDNO:120)的正义链和包括5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3'(SEQ ID NO:121)的反义链。
在某些实施方式中，HBV基因表达抑制剂包括包含正义链和反义链的siRNA，其中所述正义链包括SEQ ID NO:120或与SEQ ID NO:120相差不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个核苷酸的序列；并且其中所述反义链包括SEQ ID NO:121或与SEQ ID NO:121相差不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个核苷酸的序列。
一方面，siRNA将包括至少两个核苷酸序列，即正义序列和反义序列，由此：正义序列包括SEQ ID NO:120，并且对应的反义序列包括SEQ ID NO:121。在这方面，两个序列中的一个序列与两个序列中的另一个序列互补，其中所述序列中的一个序列与在HBV基因表达中产生的mRNA序列基本上互补。如此，在这方面，siRNA将包括两个寡核苷酸，其中一个寡核苷酸被描述为正义链，并且第二寡核苷酸被描述为正义链的对应反义链。如本文中其它地方所描述且如本领域已知的，siRNA的互补序列相对于位于单独寡核苷酸上还可以作为单一核酸分子的自身互补区被包括在内。
技术人员充分了解，具有介于20个与23个碱基对之间，但具体地21个碱基对的双链体结构的siRNA被誉为在诱导RNA干扰方面特别有效(Elbashir等人,EMBO 20:6877-88(2001))。然而，其它人发现更短或更长的RNA双链体结构也可能有效。在上述实施方式中，本文所述的siRNA可以包括至少一条长度为最少21个核苷酸的链。在一些实施方式中，与上述siRNA相比，具有SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120或SEQ ID NO:121的序列之一的较短双链体在一个末端或两个末端上仅减去几个核苷酸也是同样有效的。因此，根据本文所述的技术设想到具有来自SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:119中的一者或两者的至少15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个连续核苷酸的部分序列的siRNA，并且其抑制HBV基因的表达的能力与包括完整序列的siRNA抑制相差不超过5％、10％、15％、20％、25％或30％。此外，根据本文所述的技术设想到，在本公开内具有来自SEQ ID NO:120和SEQID NO:121中的一者或两者的至少15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个连续核苷酸的部分序列的siRNA，并且其抑制HBV基因的表达的能力与包括完整序列的siRNA抑制相差不超过5％、10％、15％、20％、25％或30％。
另外，本文中提供的siRNA鉴定HBV基因转录物中易受RISC介导的切割的位点。如此，本文描述的技术的特征进一步在于靶向此类序列之一的RNAi药剂。如本文所使用的，如果RNAi促进转录物在所述特定位点内任何位置的切割，则RNAi药剂被称为靶向RNA转录物的特定位点内。在一些实施方式中，RNAi药剂包括来自SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:119的一个或两个序列的至少15个连续核苷酸，所述连续核苷酸与取自与HBV基因中的选定序列相邻的区的额外的核苷酸序列偶联。在一些实施方式中，RNAi药剂包括来自SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121的一个或两个序列的至少15个连续核苷酸，所述连续核苷酸与取自与HBV基因中的选定序列相邻的区的额外的核苷酸序列偶联。
虽然靶序列的长度通常为15-30个核苷酸，但此范围内特定序列对引导任何给定靶RNA切割的适用性存在很大差异。本文中所示的各种软件包和指南为任何给定基因靶标的最佳靶序列的鉴定提供了指导，但也可以采用经验方法，其中给定大小的“窗口”或“掩码”(作为非限制性实例，21个核苷酸)按字面意义或象征意义(包括例如计算机模拟)放置在靶RNA序列上，以鉴定在可以用作靶序列的大小范围内的序列。通过将序列“窗口”逐步移动到位于初始靶序列位置的上游或下游的一个核苷酸，可以鉴定下一个潜在的靶序列，直到鉴定到针对所选的任何给定靶标大小的完整的可能序列集。与系统合成和所鉴定的序列的测试(使用如本文所述或如本领域已知的测定)结合以鉴定那些表现最佳的序列的此过程可以鉴定那些在用RNAi药剂靶向时介导最佳靶基因表达抑制的RNA序列。预期抑制效率的进一步优化可以通过逐步“走窗”位于给定序列上游或下游的一个核苷酸来实现，以鉴定具有相同或更好抑制特性的序列。
此外，预期对于所鉴定的任何序列，例如，SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ IDNO:120或SEQ ID NO:121，可以通过系统地添加或去除核苷酸以产生更长或更短的序列并测试这些序列和通过从所述点开始将靶RNA向上或向下走窗更长或更短大小产生的序列来实现进一步优化。同样，将这种产生新候选靶标的方法与如本领域已知或如本文所述的抑制测定中基于这些靶标序列测试RNAi药剂的有效性相结合可以使抑制效率进一步提高。此外，可以通过例如引入如本文所述或本领域已知的修饰核苷酸、添加或改变突出端或本领域已知和/或本文讨论的其它修饰来调整此类优化的序列以进一步优化分子(例如，增加血清稳定性或循环半衰期、增加热稳定性、增强跨膜递送、靶向特定位置或细胞类型、增加与沉默途径酶的相互作用、增加从核内体的释放等)作为表达抑制剂。
如本文所述的RNAi药剂可以包括与靶序列的一个或多个错配。在一些实施方式中，如本文所述的RNAi药剂包括不超过3个错配。在一些实施方式中，如果RNAi药剂的反义链包括与靶序列的错配，则错配区域不位于互补区的中心。在特定实施方式中，如果RNAi药剂的反义链包括与靶序列的错配，则错配被限制在距互补区的5'或3'末端的最后5个核苷酸内。例如，对于与HBV基因区互补的23个核苷酸RNAi药剂RNA链，RNA链在中央13个核苷酸内可能不包括任何错配。本文所述的方法或本领域已知的方法可以用于确定包括与靶序列的错配的RNAi药剂是否有效抑制HBV基因的表达。考虑具有错配的RNAi药剂在抑制HBV基因表达方面的功效很重要，特别是在已知HBV基因中的特定互补区具有多态性序列变异的情况下。
b.化学修饰的RNAi药剂
在一些实施方式中，RNAi药剂的RNA(例如，siRNA)被化学修饰以增强稳定性或其它有益特性。以本文描述的技术为特征的核酸可以通过本领域公认的方法合成和/或修饰，例如“核酸化学中的当前实验方案(Current protocols in nucleic acid chemistry),”Beaucage,S.L等人(Edrs.),美国纽约的约翰&威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.,NewYork,NY,USA)中描述的方法，所述方法通过引用并入本文。
修饰包括例如(a)末端修饰，例如5'末端修饰(磷酸化、缀合、反向连接等)、3'末端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)，(b)碱基修饰，例如，用稳定碱基、去稳定碱基或与扩展的伙伴库碱基配对的碱基替换、去除碱基(无碱基核苷酸)或缀合的碱基，(c)糖修饰(例如，在2'位置或4'位置处)或糖的置换，以及(d)主链修饰，包括磷酸二酯键的修饰或置换。可用于本文描述的实施方式的RNA化合物的具体实例包括但不限于含有经修饰的主链或不含天然核苷间键的RNA。除此之外，具有经修饰的主链的RNA包括在主链中不具有磷原子的那些RNA。出于本说明书的目的，并且如本领域中有时提及的，在其核苷间主链中不具有磷原子的经修饰的RNA也可以被视为寡核苷。在具体实施方式中，经修饰的RNA将在其核苷间主链中具有磷原子。
不需要均匀地修饰给定化合物中的所有位置，并且事实上，可以将上述修饰中的多于一个修饰并入单一化合物中或甚至RNAi药剂内的单个核苷处。本文所述的技术还包括作为嵌合化合物的RNAi药剂化合物。在本公开的上下文中，“嵌合”RNAi药剂化合物或“嵌合体”是RNAi药剂化合物，如siRNA，所述RNAi药剂化合物包括两个或更多个化学上不同的区，每个区由至少一个单体单元构成，即在siRNA化合物的情况下的核苷酸。这些RNAi药剂通常包括至少一个区，其中RNA被修饰以赋予RNAi药剂增加的对核酸酶降解的抗性、增加的细胞摄取和/或增加的对靶核酸的结合亲和力。RNAi药剂的额外的区可以作为能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂交体的酶的底物。举例来说，RNase H是细胞核酸内切酶，所述细胞核酸内切酶切割RNA:DNA双链体的RNA链。因此，RNase H的激活使RNA靶标切割，由此大大增强RNAi药剂抑制基因表达的效率。因此，与杂交到同一靶标区的硫代磷酸脱氧siRNA相比，当使用嵌合siRNA时，使用更短的RNAi药剂通常可以获得相当的结果。可以通过凝胶电泳和必要时本领域已知的相关核酸杂交技术常规检测RNA靶标的切割。
经修饰的RNA主链包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酸胺酯)、硫代羰基磷酰胺酯、硫代羰基烷基膦酸酯、硫代羰基烷基磷酸三酯、以及具有正常3'-5'键的硼烷磷酸酯、这些酯的2'-5'连接类似物、以及具有反向极性的那些酯，其中相邻对的核苷单位以3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'连接；也包括了各种盐、混合盐和游离酸形式。
教导上述含磷键的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利第3,687,808号；第4,469,863号；第4,476,301号；第5,023,243号；第5,177,195号；第5,188,897号；第5,264,423号；第5,276,019号；第5,278,302号；第5,286,717号；第5,321,131号；第5,399,676号；第5,405,939号；第5,453,496号；第5,455,233号；第5,466,677号；第5,476,925号；第5,519,126号；第5,536,821号；第5,541,316号；第5,550,111号；第5,563,253号；第5,571,799号；第5,587,361号；第5,625,050号；第6,028,188号；第6,124,445号；第6,160,109号；第6,169,170号；第6,172,209号；第6,239,265号；第6,277,603号；第6,326,199号；第6,346,614号；第6,444,423号；第6,531,590号；第6,534,639号；第6,608,035号；第6,683,167号；第6,858,715号；第6,867,294号；第6,878,805号；第7,015,315号；第7,041,816号；第7,273,933号；7,321,029号；以及美国专利RE39464；所述专利中的每一个都通过引用并入本文。
其中不包括磷原子的经修饰的RNA主链具有由以下形成的主链：短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键。这些包括具有吗啉代键的那些(部分地由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；和其它具有混合的N、O、S和CH2组分部分的主链。
教导上述寡核苷的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利第5,034,506号；第5,166,315号；第5,185,444号；第5,214,134号；第5,216,141号；第5,235,033号；第5,64,562号；第5,264,564号；第5,405,938号；第5,434,257号；第5,466,677号；第5,470,967号；第5,489,677号；第5,541,307号；第5,561,225号；第5,596,086号；第5,602,240号；第5,608,046号；第5,610,289号；第5,618,704号；第5,623,070号；第5,663,312号；第5,633,360号；第5,677,437号；以及第5,677,439号；所述专利中的每一个都通过引用并入本文用于与此类制备方法相关的教导。
在其它实施方式中，考虑将合适的RNA模拟物用于RNAi药剂，其中核苷酸单元的糖和核苷间键，即主链被新基团替换。维持碱基单元以与适当的核酸靶化合物杂交。一种此类寡聚化合物(即已示出具有极佳杂交特性的RNA模拟物)被称作肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，RNA的糖主链被含酰胺的主链替代，尤其是氨基乙基甘氨酸主链。核碱基被保留并且直接或间接地与主链的酰胺部分的氮杂氮原子结合。教导PNA化合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利第5,539,082号；第5,714,331号；和第5,719,262；所述专利中的每一个都出于与此类制备方法相关的教导通过引用并入本文。PNA化合物的另外的教导可以在例如Nielsen等人(《科学》,254:1497-1500(1991))中找到。
以本文所述的技术为特征的一些实施方式包括具有硫代磷酸酯主链的RNA和具有杂原子主链的寡核苷，并且具体地-CH2-NH-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-[称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链]、美国专利第5,489,677号的-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-N(CH3)-CH2-CH2-[其中天然磷酸二酯主链表示为-O-P-O-CH2-]以及美国专利第5,602,240号中的酰胺主链。在一些实施方式中，本文所特写的RNA具有美国专利第5,034,506号的吗啉代主链结构。
经修饰的RNA还可以包括一个或多个经取代的糖部分。本文所特写的RNAi药剂(例如，siRNA)可以包括在2'位置处的以下各项之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基；其中烷基、烯基和炔基可以是经取代或未经取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。示例性合适的修饰包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m为1至约10。在其它实施方式中，siRNA包括位于2'位置处的以下各项之一：C1至C10低级烷基、经取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、聚烷氨基、经取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报道基团、嵌入子、用于改善RNAi药剂的药代动力学特性的基团、或用于改善RNAi药剂的药效动力学特性的基团以及具有相似特性的其它取代基。在一些实施方式中，修饰包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O-CH2CH2OCH3，也称为2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin等人,《瑞士化学学报(Helv.Chim.Acta)》78:486-504(1995))，即烷氧基-烷氧基基团。另一个示例性修饰是2'-二甲基氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也被称为2'-DMAOE，以及2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也被称为2*-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2*-DMAEOE)，即2*-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2。
其它示例性修饰包括2'-甲氧基(2'-OCH3)、2'-氨基丙氧基(2-OCH2CH2CH2NH2)和2'-氟代(2'-F)。类似修饰也可以在RNAi药剂的RNA上的其它位置处进行，具体地，3'末端核苷酸上的糖的3'位置处或2'-5'连接的siRNA以及5'末端核苷酸的5'位置中。RNAi药剂还可以具有糖模拟物，如替代戊呋喃糖基糖的环丁基部分。
教导此类经修饰的糖结构的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利第4,981,957号；第5,118,800号；第5,319,080号；第5,359,044号；第5,393,878号；第5,446,137号；第5,466,786号；第5,514,785号；第5,519,134号；第5,567,811号；第5,576,427号；第5,591,722号；第5,597,909号；第5,610,300号；第5,627,053号；第5,639,873号；第5,646,265号；第5,658,873号；第5,670,633号；以及第5,700，920号；所述专利中的每一个都出于与此类制备方法相关的教导通过引用并入本文。
RNAi药剂还可以包括核碱基(在本领域中通常被简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所使用的，“未经修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核碱基包括其它合成和天然核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤基、8-氨基、8-硫基、8-硫烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤基，具体地5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。另外的核碱基包括美国专利第3,687,808号中公开的核碱基；生物化学、生物技术和医学中的经修饰的核苷(Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine)(Herdewijn,P.编辑Wiley-VCH,(2008))中公开的核碱基；聚合物科学与工程化简明百科全书(The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering)(第858-859页，Kroschwitz,J.L,编辑.约翰&威利父子公司(1990))中公开的核碱基；Englisch等人(《应用化学(Angewandte Chemie)》,国际版本,30,613(1991))中公开的核碱基，以及由Sanghvi,Y.S.(第15章，《dsRNA研究与应用(dsRNA Research and Applications)》,第289-302页,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编辑,CRC出版社(1993))中公开的核碱基。这些核碱基中的某些核碱基尤其可用于增加以本文所描述的技术为特征的寡聚化合物的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经示出5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编辑，《dsRNA研究与应用》,CRC出版社，波卡拉顿，第276-278页(1993))，并且是示例性碱基取代，甚至更具体地在与2-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。
教导上述某些经修饰的核碱基以及其它经修饰的核碱基的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利第3,687，808号；美国专利第4，845,205号；第5,130,30号；第5,134,066号；第5,175,273号；第5,367,066号；第5,432,272号；第5,457,187号；第5,459,255号；第5,484,908号；第5,502,177号；第5,525,711号；第5,552,540号；第5,587,469号；第5,594,121号；第5,596,091号；第5,614,617号；第5,681,941号；第5,750,692号；第6,015,886号；第6,147,200号；第6,166,197号；第6,222,025号；第6,235,887号；第6,380,368号；第6,528,640号；第6,639,062号；第6,617,438号；第7,045,610号；第7,427,672号；以及第7,495,088号；所述专利中的每一个都出于与此类制备方法相关的教导通过引用并入本文。
还可以修饰RNAi药剂的RNA以包括一种或多种锁定核酸(LNA)。锁定核酸是具有经修饰的核糖部分的核苷酸，其中核糖部分包括连接2'和4'碳的额外桥。这种结构有效地将核糖“锁定”在3'-内结构构象中。已示出向siRNA添加锁定核酸增加了siRNA在血清中的稳定性，并减少脱靶效应(Elmen,J.等人,《核酸研究(Nucleic Acids Research)》33(1):439-47(2005)；Mook,O.R.等人,《分子癌症疗法(Mol Cane Ther)》6(3):833-43(2007)；Grunweller,A.等人,《核酸研究》31(12):3185-93(2003))。
教导锁定核酸核苷酸的制备的代表性美国专利包括但不限于以下：美国专利第6,268,490号；
第6,670,461号；第6,794,499号；第6,998,484号；第7,053,207号；第7,084,125号；以及第7,399,845号；所述专利中的每一个都出于与此类制备方法相关的教导通过引用并入本文。
在某些实施方式中，组合疗法包括被修饰以包括一种或多种腺苷-乙二醇核酸(“GNA”)的siRNA。腺苷-GNA的描述可以在例如Zhang等人(JACS 127(12):4174–75(2005))中找到。
在一些实施方式中，本公开提供了方法和相关组合物，其中RNAi是包括具有一个或多个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列的siRNA。表5中提供了如本文所使用的经修饰的核酸序列中的核苷酸单体的缩写。
表5：用于经修饰的核酸序列表示的核苷酸单体的缩写。应当理解，除非另有说明，否则这些单体当存在于寡核苷酸中时通过5'-3'-磷酸二酯键相互连接。
Figure BDA0004086126640000831
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在一些实施方式中，HBV基因表达抑制剂包括siRNA，其中siRNA具有包括5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96 -3'(SEQ ID NO:122)的正义链和包括5'-usGfsugaAfgCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(SEQ ID NO:123)的反义链。
在仍另外的实施方式中，siRNA具有包括5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3'(SEQ ID NO:124)的正义链和包括5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(SEQ IDNO:125)的反义链。
在某些实施方式中，HBV基因表达抑制剂包括包含正义链和反义链的siRNA，其中正义链包括SEQ ID NO:122或SEQ ID NO:124或分别与SEQ ID NO:122或SEQ ID NO:124相差不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个核苷酸的序列。
在某些实施方式中，HBV基因表达抑制剂包括包含正义链和反义链的siRNA，其中反义链包括SEQ ID NO:123或SEQ ID NO:125或分别与SEQ ID NO:123或SEQ ID NO:125相差不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个核苷酸的序列。
在一些实施方式中，HBV基因表达抑制剂包括siRNA，其中siRNA具有包括5'-gsgsuggaCfuUfCfUfcucaAfUfuuuaL96-3'(SEQ ID NO:126)的正义链和包括5'-usAfsaaaUfuGfAfgagaAfgUfccaccsasc-3'(SEQ ID NO:127)的反义链。
在某些实施方式中，HBV基因表达抑制剂包括包含正义链和反义链的siRNA，其中正义链包括SEQ ID NO:126或与SEQ ID NO:126相差不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个核苷酸的序列。
c.配体缀合的RNAi药剂
在一些实施方式中，RNAi药剂包括涉及将一种或多种配体、部分或缀合物与RNA化学连接的修饰，所述修饰增强RNAi药剂的活性、细胞分布或细胞摄取。此类部分包括但不限于：脂质部分，如胆固醇部分(Letsinger等人,《美国国家科学院院刊》86:6553-56(1989))；胆酸(Manoharan等人,《生物有机与药物化学快报(Biorg.Med.Chem.Let.)》4:1053-60(1994))；硫醚，例如，己基-S-三苯基甲硫醇(Manoharan等人,《纽约科学院年鉴(Ann.N.Y.Acad.Sci.)》660:306-9(1992)；Manoharan等人,《生物有机与药物化学快报》3:2765-70(1993))；硫代胆固醇(Oberhauser等人,《核酸研究》20:533-38(1992))；脂肪族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人,《欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J)》10:1111-18(1991)；Kabanov等人,《FEBS快报(FEBS Lett.)》259:327-30(1990)；Svinarchuk等人,《生物化学(Biochimie)》75:49-54(1993))；磷脂，例如，二十六烷基-rac-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-膦酸酯(Manoharan等人,《四面体快报(Tetrahedron Lett.)》36:3651-54(1995)；Shea等人,《核酸研究》18:3777-83(1990))；多胺或聚乙二醇链(Manoharan等人,《核苷和核苷酸(Nucleosides&Nucleotides)》14:969-73(1995))；或金刚烷乙酸(Manoharan等人,《四面体快报》36:3651-54(1995))；棕榈基部分(Mishra等人,《生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)》1264:229-37(1995))；或十八胺或己基氨基-羰基氧基胆固醇部分(Crooke等人,《药理和实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)》277:923-37(1996))。
在一些实施方式中，配体改变其掺入的RNAi药剂的分布、靶向或寿命。在一些实施方式中，例如，与不存在此类配体的物种相比，配体为选定靶标(例如，分子、细胞或细胞类型)、区室(例如，细胞或器官区室、组织、器官或身体区)提供增强的亲和力。在此类实施方式中，配体将不参与双链体核酸中的双链体配对。
配体可以包括天然存在的物质，如蛋白质(例如，人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如，葡聚糖、支链淀粉、几丁质、壳聚糖、菊粉、环糊精或透明质酸)；或脂质。配体也可以是重组分子或合成分子，如合成聚合物，例如合成聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括聚氨基酸，即聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚膦嗪。多胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、多胺、假肽-多胺、拟肽多胺、树枝状多胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、多胺的季盐或α螺旋肽。
配体还可以包括靶向基团，例如细胞或组织靶向剂，例如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如与特定细胞类型(如肝细胞)结合的抗体。靶向基团可以是促甲状腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性剂蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化多氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸酯、聚谷氨酸酯、聚天冬氨酸酯、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素B12、维生素A、生物素或RGD肽或RGD肽模拟物。配体的其它实例包括染料、嵌入剂(例如，吖啶)、交联剂(例如，补骨脂烯、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、德克萨斯卟啉(texaphyrin)、扩环卟啉(Sapphyrin))、多环芳香族烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如，EDTA)、亲脂性分子(例如，胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-0(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、03-(油酰基)石胆酸、03-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、肽缀合物(例如，触角足突变肽、Tat肽)、烷化剂、磷酸盐、氨基、巯基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、经取代的烷基、放射性标记的标志物、酶、半抗原(例如，生物素)、转运/吸收促进剂(例如，阿司匹林(aspirin)、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环化合物的Eu3+络合物)、二硝基苯基、HRP和AP。
配体可以是蛋白质(例如，糖蛋白)或肽(例如，对共配体具有特异性亲和力的分子)或抗体(例如，与特定细胞类型，如肝细胞结合的抗体)。配体还可以包括激素和激素受体。配体还可以包括非肽物质，如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖和多价岩藻糖。配体可以是例如脂多糖、p38 MAP激酶的激活剂或NF-KB的激活剂。
配体可以是物质，例如药物，其可以例如通过破坏细胞的细胞骨架，例如通过破坏细胞的微管、微丝和/或中间丝来增加RNAi药剂摄取到细胞中。药物可以是例如分类单元(taxon)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、细胞松弛素(cytochalasin)、诺考达唑(nocodazole)、杰斯内酯(japlakinolide)、拉春库林A(latrunculin A)、毒伞素(phalloidin)、斯文赫利A(swinholide A)、印丹诺辛(indanocine)或麦司文(myoservin)。
另一方面，配体是被靶细胞(例如，肝细胞)摄取的部分，例如维生素。示例性维生素包括维生素A、E和K。包括的其它示例性维生素是B族维生素，例如叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛或被靶细胞(如肝细胞)摄取的其它维生素或营养素。还包括HSA和低密度脂蛋白(LDL)。
在一些实施方式中，附接到如本文所述的RNAi药剂的配体充当药代动力学(PK)调节剂。如本文所使用的，“PK调节剂”指药代动力学调节剂。PK调节剂包括亲脂物、胆汁酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白结合剂、PEG、维生素等。示例性PK调节剂包括但不限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生(naproxen)、布洛芬(ibuprofen)、维生素E、生物素等。还已知包括许多硫代磷酸酯键的与血清蛋白结合的寡核苷酸，因此在主链中包括多个硫代磷酸酯键的短寡核苷酸(例如，具有约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸)也适于本文描述的技术作为配体(例如，作为PK调节配体)。此外，与血清成分(例如，血清蛋白)结合的适体也适于用作本文所述的实施方式中的PK调节配体。
(i)脂质缀合物.在一些实施方式中，配体或缀合物是脂质或基于脂质的分子。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加对偶联物降解的抗性，(b)增加靶向或转运到靶细胞或细胞膜中，和/或(c)可以用于调节与血清蛋白，例如HSA的结合。此类脂质或基于脂质的分子可以与血清蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)结合。HSA结合配体允许缀合物分布到靶组织，例如身体的非肾靶组织。例如，靶组织可以是肝，包括肝的实质细胞。可以与HSA结合的其它分子也可以用作配体。例如，可以使用萘普辛(neproxin)或阿司匹林。
基于脂质的配体可以用于抑制(例如，控制)缀合物与靶组织的结合。例如，更强地与HSA结合的脂质或基于脂质的配体将较不可能被靶向到肾脏，并且因此较不可能从身体清除。较不强烈地与HSA结合的脂质或基于脂质的配体可以用于将缀合物靶向到肾脏。
在一些实施方式中，基于脂质的配体与HSA结合。基于脂质的配体可以以足够的亲和力与HSA结合，使得缀合物将分布到非肾组织。在某些特定实施方式中，HSA-配体结合是可逆的。
在一些其它实施方式中，基于脂质的配体微弱地或根本不与HSA结合，使得缀合物将分布到肾脏。靶向到肾细胞的其它部分也可以代替基于脂质的配体或除其之外使用。
(ii)细胞渗透肽和药剂.另一方面，配体是细胞渗透剂，如螺旋细胞渗透剂。在一些实施方式中，药剂为两亲性的。示例性药剂为肽，如tat或触角足突变肽。如果药剂为肽，那么其可以被修饰，包括肽基模拟物、反演体、非肽或假肽键和使用D-氨基酸。在一些实施方式中，螺旋剂为α-螺旋剂。在某些特定实施方式中，螺旋剂具有亲脂性和疏脂性相。
“细胞渗透肽”能够渗透细胞，例如微生物细胞(如细菌或真菌细胞)或哺乳动物细胞(如人细胞)。微生物细胞渗透肽可以是例如α-螺旋线性肽(例如，LL-37或Ceropin PI)、含二硫键的肽(例如，α-防御素、β-防御素或细菌素)或仅含有一个或两个主要氨基酸的肽(例如，PR-39或吲哚西丁(indolicidin))。
配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(在本文中也称为寡肽模拟物)是能够折叠成类似于天然肽的所定义三维结构的分子。肽和肽模拟物与RNAi药剂的附接可能影响RNAi的药代动力学分布，如通过增强细胞识别和吸收。肽或肽模拟物部分的长度可以为约5-50个氨基酸，例如约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个氨基酸长。
肽或肽模拟物可以是例如细胞渗透肽、阳离子肽、两亲肽或疏水肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树状体肽、约束肽或交联肽。在另一个替代方案中，肽部分可以包括疏水性膜易位序列(MTS)。示例性疏水性含MTS肽是具有氨基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO:128)的RFGF。含疏水性MTS的RFGF类似物(例如，氨基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO:129))也可以是靶向部分。肽部分可以是“递送”肽，所述肽可以携带包括肽、寡核苷酸和蛋白质在内的大极性分子穿过细胞膜。例如，已发现来自HIV Tat蛋白(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:130)和果蝇触角足突变蛋白(RQIKIWFQNRRMKWK(SEQ IDNO:131))的序列能够充当递送肽。肽或肽模拟物可以由DNA的随机序列编码，如从噬菌体展示文库或一珠一化合物(OBOC)组合文库中鉴定的肽(Lam等人,《自然》354:82-84(1991))。
细胞渗透肽还可以包括核定位信号(NLS)。例如，细胞渗透肽可以是二分两亲性肽，如MPG，其衍生自HIV-1gp41的融合肽结构域和SV40大T抗原的NLS(Simeoni等人,《核酸研究》31:2717-24(2003))。
(iii)碳水化合物缀合物.在一些实施方式中，本文所述的RNAi药剂寡核苷酸进一步包括碳水化合物缀合物。碳水化合物缀合物对于核酸的体内递送以及适于体内治疗用途的组合物而言可能是有利的。如本文所使用的，“碳水化合物”是指化合物，所述化合物是碳水化合物，所述碳水化合物本身由一个或多个单糖单元构成，所述单糖单元具有至少6个碳原子(可以是直链、支链或环状)，其中氧、氮或硫原子与每个碳原子结合；或是具有碳水化合物部分作为其部分的化合物，所述碳水化合物部分由一个或多个单糖单元构成，每个单糖单元具有至少六个碳原子(可以是直链、支链或环状)，其中氧、氮或硫原子与每个碳原子结合。代表性碳水化合物包括糖(单糖、二糖、三糖和包括约4-9个单糖单元的寡糖)和多糖，如淀粉、糖原、纤维素和多糖胶。具体的单糖包括C5及以上(在一些实施方式中，C5-C8)糖；并且二糖和三糖包括具有两个或三个单糖单元(在一些实施方式中，C5-C8)的糖。
在一些实施方式中，碳水化合物缀合物选自下组：
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Figure BDA0004086126640000931
用于本文所描述的实施方式中的另一代表性碳水化合物缀合物包括但不限于：
Figure BDA0004086126640000941
(式XXII)，其中当X或Y中的一个是寡核苷酸时，另一个是氢。
在一些实施方式中，碳水化合物缀合物进一步包括另一配体，如但不限于PK调节剂、胞内体裂解配体(endosomolytic ligand)或细胞渗透肽。
(iv)接头.在一些实施方式中，本文所述的缀合物可以通过各种接头附接到RNAi药剂寡核苷酸，所述接头可以是可切割的或不可切割的。
术语“接头”或“连接基团”意指连接化合物的两个部分的有机部分。接头通常包括直接键或原子，如氧或硫；单元，如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH；或原子链，如但不限于经取代的或未经取代的烷基、经取代的或未经取代的烯基、经取代的或未经取代的炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环烷基、杂环烯基、杂环炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳烷基、烷基芳烯基、烷基芳炔基、烯基芳烷基、烯基芳烯基、烯基芳炔基、炔基芳烷基、炔基芳烯基、炔基芳炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环烷基、烷基杂环烯基、烷基杂环炔基、烯基杂环烷基、烯基杂环烯基、烯基杂环炔基、炔基杂环烷基、炔基杂环烯基、炔基杂环炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基和炔基杂芳基，所述一个或多个亚甲基可以被以下中断或封端：O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、经取代的或未经取代的芳基、经取代的或未经取代的杂芳基或经取代的或未经取代的杂环基；其中R8是氢、酰基、脂肪族或经取代的脂肪族。在某些实施方式中，接头介于1-24个原子之间、介于4-24个原子之间、介于6-18个原子之间、介于8-18个原子之间或介于8-16个原子之间。
可切割连接基团是在细胞外部充分稳定的连接基团，但其在进入靶细胞之后切割以释放接头保持在一起的两个部分。在某些实施方式中，可切割连接基团在靶细胞中或在第一参考条件下(其可以例如被选择以模拟或代表细胞内条件)的切割是在受试者的血液中或在第二参考条件下(其可以例如被选择以模拟或代表在血液或血清中发现的条件)的切割的至少10倍或至少100倍。
可切割连接基团易受切割剂(例如，pH、氧化还原电位或降解分子的存在)影响。一般来说，切割剂在细胞内部比在血清或血液中更普遍，或以更高的水平或活性找到。此类降解剂的实例包括：针对特定底物选择的或不具有底物特异性的氧化还原剂，包括例如存在于细胞中的氧化或还原酶或还原剂，如硫醇，所述氧化或还原酶或还原剂可以通过还原降解氧化还原可切割连接基团；酯酶；可以产生酸性环境的核内体或药剂，例如，产生pH为五或更低的核内体或药剂；可以通过充当广义酸、肽酶(其可以是底物特异性的)和磷酸酶来水解或降解酸可切割连接基团的酶。可切割键基团，如二硫键可能对pH敏感。人血清的pH为7.4，而细胞内pH的平均值略低，范围为约7.1-7.3。核内体具有更酸性的pH，范围为5.5-6.0，并且溶酶体具有甚至更酸性的pH，为约5.0。一些接头将具有可切割连接基团，所述连接基团在特定pH下切割，由此从细胞内的配体释放阳离子脂质，或释放到细胞的所需区室中。
接头可以包括可由特定酶切割的可切割连接基团。并入到接头中的可切割连接基团的类型可以取决于所靶向的细胞。例如，肝脏靶向配体可以通过包括酯基的接头与阳离子脂质连接。肝细胞富含酯酶，并且因此接头在肝细胞中将比在非富含酯酶的细胞类型中更高效地切割。其它富含酯酶的细胞类型包括肺、肾皮质和睾丸中的细胞。
当靶向富含肽酶的细胞类型，如肝细胞和滑膜细胞时，可以使用含有肽键的接头。
一般来说，可以通过测试降解剂(或条件)切割候选连接基团的能力来评价候选可切割连接基团的适合性。还可能期望测试候选可切割连接基团抵抗在血液中或当与其它非靶组织接触时切割的能力。因此，可以确定第一条件与第二条件之间对切割的相对易感性，其中选择第一条件以指示靶细胞中的切割，并且选择第二条件以指示其它组织或生物流体，例如血液或血清中的切割。评价可以在无细胞系统、在细胞、在细胞培养物、在器官或组织培养物或在整只动物中进行。在无细胞或培养条件下进行初始评价并且通过在整只动物中进一步评价来确认可以是有用的。在某些实施方式中，有用的候选化合物在细胞中(或在被选择以模拟细胞内条件的体外条件下)的切割是在血液或血清中(或在被选择以模拟细胞外条件的体外条件下)的切割的至少2倍、至少4倍、至少10倍或至少100倍。
一类可切割连接基团是在还原或氧化下切割的氧化还原可切割连接基团。还原性可切割连接基团的实例是二硫化物连接基团(-S-S-)。为了确定候选可切割连接基团是否是合适的“还原性可切割连接基团”，或者例如是否适合与特定RNAi部分和特定靶向剂一起使用，可以参考本文所述的方法。例如，可以通过使用本领域已知的试剂与二硫苏糖醇(DTT)或其它还原剂一起温育来评估候选物，这模拟将在细胞(例如，靶细胞)中观察到的切割速率。候选物还可以在被选择以模拟血液或血清条件的条件下评价。在一些实施方式中，候选化合物在血液中被切割至多10％。在某些实施方式中，有用的候选化合物在细胞中(或在被选择以模拟细胞内条件的体外条件下)的降解是在血液中(或在被选择以模拟细胞外条件的体外条件下)的降解的至少2倍、至少4倍、至少10倍或至少100倍。候选化合物的切割速率可以使用标准酶动力学测定在被选择以模拟细胞内介质的条件下确定并且与被选择以模拟细胞外介质的条件进行比较。
基于磷酸酯的可切割连接基团通过使磷酸酯基团降解或水解的药剂切割。细胞中使磷酸酯基团切割的药剂的实例为细胞中的酶，如磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的实例为-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。在某些实施方式中，基于磷酸酯的连接基团选自：-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(0)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-Ρ(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-和-O-P(S)(H)-S-。在特定实施方式中，磷酸酯连接基团为-O-P(O)(OH)-O-。可以使用与上文所描述的方法类似的方法来评价这些候选物。
酸可切割连接基团为在酸性条件下切割的连接基团。在一些实施方式中，酸可切割连接基团在pH为约6.5或更低(例如，约6.0、5.5、5.0或更低)的酸性环境中或通过可以充当广义酸的药剂(如酶)被切割。在细胞中，特定低pH细胞器，如核内体和溶酶体可以提供酸可切割连接基团的切割环境。酸可切割连接基团的实例包括但不限于腙、酯和氨基酸的酯。酸可切割基团可以具有通式-C＝N-、C(O)O或-OC(O)。在一些实施方式中，附接到酯的氧的碳(烷氧基)为芳基、经取代的烷基或叔烷基，如二甲基戊基或叔丁基。可以使用与上文所描述的方法类似的方法来评价这些候选物。
基于酯的可切割连接基团通过细胞中的酶，如酯酶和酰胺酶切割。基于酯的可切割连接基团的实例包括但不限于亚烷基、亚烯基和亚炔基的酯。酯可切割连接基团具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。可以使用与上文所描述的方法类似的方法来评价这些候选物。
基于肽的可切割连接基团通过细胞中的酶，如肽酶和蛋白酶切割。基于肽的可切割连接基团是在氨基酸之间形成以产生寡肽(例如，二肽、三肽等)和多肽的肽键。基于肽的可切割基团不包括酰胺基(-C(O)NH-)。酰胺基可以在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键是在氨基酸之间形成以产生肽和蛋白质的特殊类型的酰胺键。基于肽的切割基团通常限于在产生肽和蛋白质的氨基酸之间形成的肽键(即酰胺键)并且不包括整个酰胺官能团。基于肽的可切割连接基团具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA和RB为两个相邻氨基酸的R基团。可以使用与上文所描述的方法类似的方法来评价这些候选物。
具有接头的代表性碳水化合物缀合物包括但不限于：
Figure BDA0004086126640000971
/>
Figure BDA0004086126640000981
/>
Figure BDA0004086126640000991
其中当X或Y中的一个是寡核苷酸时，另一个是氢。
在组合物和方法的某些实施方式中，配体为通过二价或三价分支接头附接的一个或多个“GalNAc”(N-乙酰基半乳糖胺)衍生物。例如，在一些实施方式中，siRNA与如下结构中所示的GalNAc配体缀合：
Figure BDA0004086126640000992
其中X为O或S。
在一些实施方式中，siRNA的正义链通过如下结构中所示的接头与附接在正义链的3'末端处的配体缀合：
Figure BDA0004086126640001001
其中X为O或S。
在一些实施方式中，组合疗法包括与二价或三价分支接头缀合的siRNA，所述接头选自式(XXXI)-(XXXIV)中的任一者所示的结构的组：
Figure BDA0004086126640001002
其中：
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B和q5C在每次出现时独立地表示0-20，并且其中重复单元可以相同或不同；
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B和T5C在每次不出现时各自独立，为CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B和Q5C在每次不出现时独立，为亚烷基或经取代的亚烷基，其中一个或多个亚甲基可以被以下中的一个或多个中断或终止：O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R')＝C(R”)、C≡C或C(O)；
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B和R5C在每次不出现时各自独立，为NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH＝N-O、
Figure BDA0004086126640001011
或杂环基；
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B和L5C表示配体，即在每次出现时各自独立，为单糖(如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖；并且Ra是H或氨基酸侧链。三价缀合的GalNAc衍生物特别适用于与RNAi药剂一起使用以抑制靶基因的表达，如式(XXXIV)的表达：
Figure BDA0004086126640001012
其中L5A、L5B和L5C代表单糖，如GalNAc衍生物。
适合的缀合GalNAc衍生物的二价和三价分支接头基团的实例包括但不限于上文所提及的式I、式VI、式X、式IX和式XII的结构。
教导RNA缀合物的制备的代表性美国专利包括美国专利第4,828,979号；第4,948,882号；第5,218,105号；第5,525,465号；第5,541,313号；第5,545,730号；第5,552,538号；第5,578,717号；第5,580,731号；第5,591,584号；第5,109,124号；第5,118,802号；第5,138,045号；第5,414,077号；第5,486,603号；第5,512,439号；第5,578,718号；第5,608,046号；第4,587,044号；第4,605,735号；第4,667,025号；第4,762,779号；第4,789,737号；第4,824,941号；第4,835,263号；第4,876,335号；第4,904,582号；第4,958,013号；第5,082,830号；第5,112,963号；第5,214,136号；第5,082,830号；第5,112,963号；第5,214,136号；第5,245,022号；第5,254,469号；第5,258,506号；第5,262,536号；第5,272,250号；第5,292,873号；第5,317,098号；第5,371,241号；第5,391,723号；第5,416,203号；第5,451,463号；第5,510,475号；第5,512,667号；第5,514,785号；第5,565,552号；第5,567,810号；第5,574,142号；第5,585,481号；第5,587,371号；第5,595,726号；第5,597,696号；第5,599,923号；第5,599,928号；和第5,688,941号；第6,294,664号；第6,320,017号；第6,576,752号；第6,783,931号；第6,900,297号；以及第7,037,646号；所述专利中的每一个都出于与此类制备方法相关的教导通过引用并入本文。
在某些情况下，RNAi药剂的RNA可以被非配体基团修饰。许多非配体分子已与RNAi药剂缀合以增强RNAi药剂的活性、细胞分布或细胞摄取，并且进行此类缀合的程序可在科学文献中获得。此类非配体部分包括脂质部分，如胆固醇(Kubo,T.等人,《生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)》365(1):54-61(2007)；Letsinger等人,《美国国家科学院院刊》86:6553(1989))；胆酸(Manoharan等人,《生物有机与药物化学快报》4:1053(1994))；硫醚，例如，己基-S-三苯基甲硫醇(Manoharan等人,《纽约科学院年鉴》660:306(1992)；Manoharan等人,《生物有机与药物化学快报》3:2765(1993))；硫代胆固醇(Oberhauser等人,《核酸研究》20:533(1992))；脂肪族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人,《欧洲分子生物学组织杂志》10:111(1991)；Kabanov等人,《FEBS快报》259:327(1990)；Svinarchuk等人,《生物化学》75:49(1993))；磷脂，例如二十六烷基-rac-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等人,《四面体快报》36:3651(1995)；Shea等人,《核酸研究》18:3777(1990))；多胺或聚乙二醇链(Manoharan等人,《核苷和核苷酸》14:969(1995))；或金刚烷乙酸(Manoharan等人,《四面体快报》36:3651(1195))；棕榈基部分(Mishra等人,《生物化学与生物物理学学报》1264:229(1995))；或十八胺或己基氨基-羰基氧基胆固醇部分(Crooke等人,《药理和实验治疗学杂志)》277:923(1996))。
典型的缀合方案涉及合成在序列的一个或多个位置处具有氨基接头的RNA。随后使用适当偶联试剂或激活试剂使氨基与所缀合的分子反应。缀合反应可以在RNA仍与固相载体结合的情况下或在RNA切割之后在溶液相中进行。通过HPLC纯化RNA缀合物通常产生纯缀合物。
d.RNAi药剂递送
当提及RNAi药剂时，“引入到细胞中”意指促进或影响摄入或吸收到细胞中，如本领域技术人员所理解的。
RNAi药剂的吸收或摄取可以通过无辅助的扩散或活性细胞过程发生，或通过辅助剂或装置发生。此术语的含义不仅限于体外细胞；RNAi药剂也可以“引入到细胞中”，其中细胞是活生物体的一部分。在这种情况下，引入到细胞中将包括递送到生物体。例如，对于体内递送，可以将RNAi药剂注射到组织部位中或全身施用。体内递送也可以通过β-葡聚糖递送系统进行，如美国专利第5，032,401号和第5，607,677号，以及美国公开第2005/0281781号中描述的那些，所述专利出于与此类递送方法相关的教导通过引用并入本文。体外引入到细胞中包括本领域已知的方法，如电穿孔和脂转染。另外的方法在下文中描述或在本领域中是已知的。
可以以多种不同方式实现RNAi药剂向有需要的受试者的递送。体内递送可以通过向受试者施用包含RNAi药剂(例如，siRNA)的组合物直接进行。可替代地，递送可以通过施用一种或多种编码和引导RNAi药剂表达的载体间接进行。下文将进一步讨论这些替代方案。
通常，任何递送核酸分子的方法都可以适于与RNAi药剂一起使用(参见例如，Akhtar S.和Julian RL.,《细胞生物学趋势(Trends Cell.Biol.)》2(5):139-44(1992)和WO94/02595，所述文献出于与此类递送方法相关的教导通过引用并入)。在体内成功递送RNAi药剂时特别重要的三个因素：(a)所递送分子的生物稳定性；(2)防止非特异性效应；以及(3)所递送分子在靶组织中的累积。可以通过局部施用，例如通过直接注射或植入到组织(作为非限制性实例，肿瘤)中或局部施用制剂来最小化RNAi药剂的非特异性效应。对治疗位点的局部施用使药剂的局部浓度最大化，限制药剂暴露于全身组织，所述全身组织可能被药剂伤害或可能降解药剂，并允许施用较低的总剂量的RNAi药剂。若干研究表明，当局部施用RNAi药剂时，基因产物的成功敲降。例如，在食蟹猴中通过玻璃体内注射(Tolentino,M.J.等人,《视网膜(Retina)》24:132-38(2004))和在小鼠中通过视网膜下注射(Reich,S.J.等人,《分子视觉(Mol.Vis.)》9:210-16(2003))眼内递送VEGF siRNA均示出在年龄相关性黄斑变性的实验模型中预防新生血管形成。另外，在小鼠中直接瘤内注射siRNA减小了肿瘤体积(Pille,J.等人,《分子疗法(Mol.Ther.)》11:267-74(2005))并且可以延长荷瘤小鼠的存活期(Kim,W.J.等人,《分子疗法)》14:343-50(2006)；Li,S.等人,《分子疗法)》15:515-23(2007))。还示出通过直接注射局部递送到CNS(Dorn,G.等人,《核酸(NucleicAcids)》32:e49(2004)；Tan，P.H.等人，《基因疗法》12:59-66(2005)；Makimura，H.等人，《BMC神经科学(BMC Neurosci)》3:18(2002)；Shishkina,G.T.等人,《神经科学(Neuroscience)》129:521-28(2004)；Thakker,E.R.等人《美国国家科学院院刊》101:17270-75(2004)；Akaneya,Y.等人,《神经生理学杂志(J.Neurophysiol.)》93:594-602(2005))并通过鼻内施用到肺部(Howard,K.A.等人,《分子疗法)》14:476-84(2006)；Zhang,X.等人,《生物化学杂志》279:10677-84(2004)；Bitko,V.等人,《自然医学(Nat.Med.)》11:50-55(2005))的RNA干扰的成功。为了全身地施用RNAi药剂以治疗疾病，可以修饰RNA或可替代地使用药物递送系统递送；这两种方法都用于防止siRNA在体内被内切和外切核酸酶快速降解。RNA或药物载体的修饰也可以允许RNAi药剂组合物靶向靶组织并避免不希望的脱靶效应。RNAi药剂可以通过与亲脂性基团(如胆固醇)的化学缀合进行修饰，以增强细胞摄取并防止降解。例如，将针对与亲脂性胆固醇部分缀合的ApoB的RNAi药剂全身注射到小鼠体内，并且引起肝脏和空肠两者中apoB mRNA的敲低(Soutschek,J.等人,《自然》432:173-78(2004))。在一些其它实施方式中，可以使用药物递送系统(如纳米颗粒、树状物、聚合物、脂质体或阳离子递送系统)递送RNAi药剂。带正电荷的阳离子递送系统通常促进(带负电荷的)RNAi药剂的结合并且在带负电荷的细胞膜处增强相互作用以允许细胞高效地摄取RNAi药剂。阳离子脂质、树状物或聚合物可以与RNAi结合或被诱导以形成包裹RNAi药剂的囊泡或胶束(参见例如Kim,S,H.等人,《控制释放杂志(Journal of ControlledRelease)》129(2):107-16(2008))。当全身施用时，囊泡或胶束的形成进一步防止RNAi药剂的降解。用于制备和施用阳离子RNAi药剂复合物的方法完全在本领域技术人员的能力范围内(参见例如Sorensen,D.R.等人,《分子生物学杂志》327:761-66(2003)；Verma,U.N.等人,《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》9:1291-1300(2003)；Arnold,A.S.等人,《高血压杂志(J.Hypertens.)》25:197-205(2007)；所述方法通过引用并入本文)。可用于RNAi药剂的全身递送的药物递送系统的一些非限制性实例包括DOTAP(Sorensen,D.R.等人(2003),同上；Verma,U.N.等人,(2003),同上)；Oligofectamine，“固体核酸脂质颗粒”(Zimmermann,T.S.等人《自然》441:111-14(2006))；心磷脂(Chien,P.Y.等人《癌症基因疗法(Cancer GeneTher.)》12:321-28(2005)；Pal,A.等人,《国际肿瘤学杂志(Int J.Oncol.)》26:1087-91(2005))；聚乙烯亚胺(Bonnet,M.E.等人,《药学研究(Pharm.Res.)》25(12):2972-82；Aigner,A.,《生物医学和生物技术杂志(J.Biomed.Biotechnol.)》2006(4):71659(2006))；Arg-Gly-Asp(RGD)肽(Liu,S.,《分子药物学(Mol.Pharm.)》3:472-487(2006))；以及聚酰胺胺(Tomalia,D.A.等人,《生化学会汇刊(Biochem.Soc.Trans.)》35:61-7(2007)；Yoo,H.等人,《药物学研究(Pharm.Res.)》16:1799-1804(1999))。
如本文所使用的，术语“SNALP”是指稳定的核酸-脂质颗粒。SNALP代表包被减少的水性内部的脂质囊泡，所述脂质囊泡包括核酸，如RNAi药剂或转录RNAi药剂的质粒。SNALP描述于例如美国专利申请公开第US2006/0240093号和第US2007/0135372号以及国际申请公开第WO 2009/082817号中。这些申请出于与SNALP相关的教导通过引用并入本文。
在一些实施方式中，RNAi与环糊精形成用于全身施用的复合物。RNAi和环糊精的施用方法和药物组合物可以在美国专利第7,427,605号中找到，所述专利出于与此类组合物和方法相关的教导通过引用并入本文。在一些实施方式中，编码RNAi的基因由表达载体编码和表达。载体的实例和其在递送RNAi中的用途描述于美国专利申请第US2017/0349900A1号中，所述实例通过引用并入本文。
e.RNAi药剂的药物组合物和调配物
在一些实施方式中，本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含如本文所述的RNAi药剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。包含RNAi药剂的药物组合物可用于组合疗法以治疗受试者的HBV感染或降低HBV病毒载量。此类药物组合物基于递送模式调配。例如，可以调配组合物以通过肠胃外递送，例如通过静脉内(IV)递送全身施用，或用于直接递送到脑实质，例如通过输注到脑中，如通过连续泵输注。
在一些情况下，“药学上可接受的载体”或“赋形剂”是药学上可接受的溶剂、悬浮剂或任何其它用于将一种或多种核酸递送到动物的药理学惰性媒剂。赋形剂可以是液体的或固体的并且在考虑计划的施用方式的情况下被选择，以便在与核酸和给定药物组合物的其它组分组合时提供期望的体积、一致性等。典型的药学上可接受的载体或赋形剂包括但不限于结合剂(例如，预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖和其它糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯、磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石、硅石、胶体二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠)；崩解剂(例如，淀粉、羧基乙酸淀粉钠)；以及润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)。
在一些实施方式中，适于非肠胃外施用的不与核酸发生有害反应的药学上可接受的有机或无机赋形剂也可以用于调配本公开的组合物。适合的药学上可接受的载体包括但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等。
在某些情况下，用于局部施用核酸的调配物可以包括无菌和非无菌水溶液、普通溶剂(如醇)中的非水溶液或核酸在液体或固体油基中的溶液。所述溶液还可以包括缓冲液、稀释剂和其它合适的添加剂。可以使用适于非肠胃外施用的不与核酸发生有害反应的药学上可接受的有机或无机赋形剂。
适合的药学上可接受的赋形剂包括但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等。
在一些实施方式中，包含本文所述的RNAi药剂的药物组合物以足以抑制HBV基因表达的剂量施用。通常，RNAi药剂的合适的剂量将在每天0.001毫克至200.0毫克每千克体重接受者的范围内，并且更通常地，在每天1mg至50mg每千克体重的范围内。例如，siRNA可以以每单个剂量0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg或50mg/kg施用。药物组合物可以每天施用一次，或者RNAi药剂可以全天以适当的间隔以两次、三次或更多次亚剂量施用，或者甚至使用连续输注或通过控制释放调配物递送。在所述情况下，每个亚剂量中包括的RNAi药剂必须对应地更小，以达到每日总剂量。剂量单位也可以混合用于在若干天内递送，例如，使用常规的缓释调配物，所述调配物在若干天的时间段内提供RNAi的缓释。缓释调配物在本领域中是众所周知的，并且具体地可用于在特定位点处递送药剂，如可以与本文所描述的技术的药剂一起使用。在此实施方式中，剂量单位包括日剂量的对应倍数。
单个剂量对HBV基因表达水平的影响可能是持久的，使得后续剂量的施用间隔不超过3天、4天或5天，或不超过1周、2周、3周或4周。
本领域技术人员将理解，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时间安排，这些因素包括但不限于疾病或病症的严重性、之前的治疗、所述受试者的总体健康和/或年龄以及存在的其它疾病。此外，用治疗有效量的组合物对受试者进行的治疗可以包括单次治疗或系列治疗。如本文中其它地方所述，可以使用常规方法或基于使用适当动物模型的体内测试来估计本文所述的技术涵盖的单一RNAi药剂的有效剂量和体内半衰期。
小鼠模型可用于研究HBV感染，并且此类模型可以用于RNAi的体内测试并且用于确定有效降低HBV基因表达的剂量。
在一些实施方式中，本文所述的药物组合物和调配物的施用可以是局部的(例如，通过透皮贴剂)、肺部的(例如，通过吸入或吹入粉末或气雾剂，包括通过雾化器)；气管内的；鼻内的；表皮和透皮的；口服的；或肠胃外的。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内和肌内注射或输注；皮下施用(例如，通过植入装置)；或颅内施用(例如，通过实质内、鞘内或脑室内施用)。
在某些实施方式中，通过皮下递送如本文所公开的用于治疗HBV的组合疗法中使用的RNAi药剂。
在一些实施方式中，可以以靶向特定组织，如肝脏(例如，肝脏的肝细胞)的方式递送RNAi药剂。
用于局部施用的药物组合物和调配物可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体以及粉末。常规的药物载体、水性基质、粉末或油性基质、增稠剂等可以是必要的或期望的。带涂层的避孕套、手套等也可以是有用的。合适的局部调配物包括其中以本文所述的技术为特征的RNA与局部递送剂，如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合的调配物。合适的脂质和脂质体包括中性的(例如，二油酰磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、负性的(例如，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子的(例如，二油酰四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。RNAi药剂可以被封装在脂质体中或者可以与其形成复合物，具体地与阳离子脂质体。可替代地，RNAi药剂可以与脂质复合，具体地与阳离子脂质复合。合适的脂肪酸和酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、二十烷酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或C1-20烷基酯(例如，肉豆蔻酸异丙酯IPM)、甘油单酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。局部调配物的实例详细描述于美国专利第6,747，014号，所述专利出于与此类局部调配物相关的教导通过引用并入本文。
囊泡，如脂质体，可以用于递送本文公开的RNAi药剂的调配物中；此类调配物可以具有期望的特性，如特异性和作用持续时间。如本文所使用的，术语“脂质体”是指由排列成一个或多个球形双层的两亲性脂质构成的囊泡。
脂质体为具有由亲脂性材料形成的膜和水性内部的单层或多层囊泡。水性部分包括待递送的组合物。阳离子脂质体可以具有能够与细胞壁融合的优势。非阳离子脂质体尽管不能一样有效地与细胞壁融合，但可以被体内巨噬细胞吸收。制备脂质体调配物的重要考虑因素是脂质表面电荷、囊泡大小和脂质体的水性体积。
在一些实施方式中，脂质体递送可以具有以下有利特性：高度可变形且能够穿过皮肤中的细孔；生物相容性和生物降解性；能够结合多种水溶性和脂溶性药物；能够保护封装在其内部区室中的药物免于代谢和降解(Rosoff,《药物剂型(Pharmaceutical DosageForms)》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),纽约的马塞尔·德克尔公司,第1卷，第245页(1998))；对于局部递送，减少与所施用药物的高全身吸收相关的副作用；增加所施用药物在所需靶标处的累积；以及能够将各种亲水性和疏水性药物施用到皮肤中；以及能够向皮肤递送包括高分子量核酸、镇痛剂、抗体和激素的药剂。
脂质体分为两个广泛的类别。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，其与带负电荷的核酸分子相互作用以形成稳定的复合物。带正电荷的DNA/脂质体复合物与带负电荷的细胞表面结合并且内化于核内体中。由于核内体内的酸性pH，脂质体破裂，从而将其内含物释放到细胞质中(Wang等人,《生物化学与生物物理研究通讯》147,980-985(1987))。
对pH敏感的或带负电荷的脂质体截留核酸而不是与其复合。由于DNA和脂质两者均带有类似的电荷，所以会出现排斥而非复合物形成。然而，一些DNA截留于这些脂质体的水性内部。对pH敏感的脂质体已被用于将核酸递送到培养中的细胞单层(例如，Zhou等人,《控制释放杂志》19，269-74(1992))。
在一些实施方式中，脂质体组合物由磷脂酰胆碱(PC)形成，例如大豆PC和鸡蛋PC。在一些实施方式中，脂质体组合物包括除了天然来源的磷脂酰胆碱之外的磷脂。中性脂质体组合物例如可以由二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)形成。阴离子脂质体组合物可以由二肉豆蔻酰磷脂酰甘油形成，而阴离子融合脂质体可以由二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成。在仍其它实施方式中，脂质体组合物由磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物形成。
在一些实施方式中，脂质体药物调配物被局部递送到皮肤。
在一些实施方式中，本文所述的组合疗法中使用的RNAi药剂被完全包封在脂质调配物中，例如以形成SPLP、pSPLP、SNALP或其它核酸-脂质颗粒。如本文所使用的，术语“SNALP”是指稳定的核酸-脂质颗粒，包括SPLP。如本文所使用的，术语“SPLP”是指包括封装在脂质囊泡内的质粒DNA的核酸-脂质颗粒。SNALP和SPLP通常包括阳离子脂质、非阳离子脂质和防止颗粒聚集的脂质(例如，PEG-脂质缀合物)。SNALP和SPLP可以用于全身应用，因为其在静脉内(i.v.)注射后表现出延长的循环寿命并在远隔位点(例如，与施用位点物理分离的位点)累积。SPLP包括“pSPLP”，其包括如国际申请公开第WO 00/03683号中所示的包封的缩合剂-核酸复合物。本文描述的技术的颗粒的平均直径通常为约50nm至约150nm，更典型地约60nm至约130nm，更典型地约70nm至约110nm，以及最典型地约70nm至约90nm，并且基本上是无毒的。另外，在一些实施方式中，核酸当存在于核酸-脂质颗粒中时在水溶液中抵抗核酸酶的降解。核酸-脂质颗粒和相关的制备方法公开于例如美国专利第5,976,567号；第5,981,501号；第6,534,484号；第6,586,410号；第6,815,432号；以及国际申请公开第WO96/40964号。
在一些实施方式中，RNAi药剂通过脂质体或其它脂质调配物递送，其中脂质与药物之比(质量/质量比)(例如，脂质与siRNA之比)在约1:1至约50:1、约1:1至约25:1、约3:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1、或约6:1至约9:1的范围内。
包含抗体、抗原结合片段、融合蛋白、多核苷酸、载体和/或宿主细胞的药物组合物
本公开还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含根据本公开的抗体、抗原结合片段或融合蛋白、根据本公开的核酸、根据本公开的载体和/或根据本公开的细胞。在某些实施方式中，药物组合物进一步包含HBV蛋白表达抑制剂和递送系统(例如，RNAi药剂)。
药物组合物还可以包含药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。尽管载体或赋形剂可以促进施用，但其自身不应诱导对接受组合物的个体有害的抗体产生。其也不应具有毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和无活性病毒颗粒。一般来说，根据本公开的药物组合物中的药学上可接受的载体可以是活性组分或非活性组分。
可以使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐(如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐)或有机酸盐(如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐)。
药物组合物中的药学上可接受的载体可以另外包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，在此类组合物中可以存在辅助物质，如润湿剂或乳化剂或pH缓冲物质。此类载体使药物组合物能够调配成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液和悬浮液以供受试者摄取。
本公开的药物组合物可以以各种形式制备。例如，组合物可以制备为注射剂，作为液体溶液或悬浮液。也可以制备适于在注射前溶解或悬浮在液体媒剂中的固体形式(例如，冻干组合物，类似于SynagisTM和HerceptinTM，用于用含有防腐剂的无菌水重构)。可以制备用于局部施用的组合物，例如呈软膏、乳膏或粉末形式。组合物可以制备用于口服施用，例如呈片剂或胶囊形式、呈喷雾剂形式或呈糖浆(任选地调味)形式。组合物可以制备用于肺部施用，例如呈使用细粉或喷雾剂的吸入器形式。组合物可以制备为栓剂或子宫托。组合物可以制备用于鼻、耳或眼部施用，例如呈滴剂形式。组合物可以呈试剂盒形式，其设计成使得组合的组合物恰好在向受试者施用之前重构。例如，冻干抗体可以以具有无菌水或无菌缓冲液的试剂盒形式提供。
在特定实施方式中，根据本公开的组合物中的活性成分为抗体分子、抗体片段或其变体或衍生物，具体地说，组合物中的活性成分为如本文所描述的抗体、抗体片段、融合蛋白或其变体和衍生物。如此，其可以易于在胃肠道中降解。因此，如果组合物通过使用胃肠道的途径施用，则组合物可以包含保护抗体免于降解但一旦由胃肠道吸收就释放抗体的药剂。
药学上可接受的载体的全面讨论可在Gennaro(2000)《雷明顿：药物科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》,第20版,ISBN:0683306472中获得。
本公开的药物组合物的pH可以介于5.5与8.5之间，并且在一些实施方式中，其可以介于6与8之间。在其它实施方式中，如本文所描述的药物组合物的pH可以为约7。可以通过使用缓冲液来维持pH。组合物可以为无菌和/或无热原质的。组合物可以相对于人等渗。在某些实施方式中，本公开的药物组合物在气密密封容器中供应。
在本公开的范围内是以多种施用形式存在的组合物；所述形式包括但不限于适于肠胃外施用的形式，例如通过注射或输注，例如通过团注注射或连续输注。当产品用于注射或输注时，其可以在油性或水性媒剂中采取悬浮液、溶液或乳液的形式，并且其可以包括调配剂，如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，抗体分子可以呈干燥形式，以在使用之前用适当无菌液体重构。媒剂通常理解为适于储存、运输和/或施用化合物，如药学活性化合物，具体地根据本说明书的抗体的材料。例如，媒剂可以是适于储存、运输和/或施用药学活性化合物，具体地根据本说明书的抗体的生理学上可接受的液体。一旦被调配，本公开的组合物可以直接施用于受试者。在一个实施方式中，组合物适于向哺乳动物，例如人受试者施用。
本文所描述的药物组合物可以通过任何数量的途径施用，包括但不限于口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、腹膜内、鞘内、心室内、透皮、经皮、局部、皮下、鼻内、肠内、舌下、阴道内或直肠途径。也可以使用无针注射器来施用本说明书的药物组合物。在特定实施方式中，药物组合物可以制备用于口服施用(例如作为片剂、胶囊等)、用于局部施用或作为注射剂，例如作为液体溶液或悬浮液。也可以使用适于在注射之前溶解或悬浮在液体媒剂中的固体形式，例如，药物组合物呈冻干形式。
对于注射，例如静脉内、皮肤或皮下注射或在痛苦部位处注射，活性成分可以呈肠道外可接受的水溶液的形式提供，所述水溶液是无热原的并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。根据需要可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。
组合物可以呈固体或液体形式。在一些实施方式中，载体是颗粒状的，使得组合物例如呈片剂或散剂形式。载体可以是液体，同时组合物是例如口服油、可注射液体或适用于例如吸入施用的气雾剂。当打算口服施用时，药物组合物优选为固体或液体形式，其中半固体、半液体、悬浮液和凝胶形式包括在本文视为固体或液体的形式中。
作为用于口服施用的固体组合物，药物组合物可以调配成散剂、颗粒、压缩片剂、丸剂、胶囊、口嚼锭、粉片等。此类固体组合物通常包括一种或多种惰性稀释剂或可食用载体。另外，可能存在以下中的一项或多项：如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶等粘合剂；如淀粉、乳糖或糊精等赋形剂；如海藻酸、海藻酸钠、Primogel、玉米淀粉等崩解剂；如硬脂酸镁或Sterotex等润滑剂；如胶体二氧化硅等助流剂；如蔗糖或糖精等甜味剂；如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味品等调味剂；以及着色剂。当组合物呈胶囊(例如明胶胶囊)形式时，除以上类型的物质以外，其可以包括如聚乙二醇或油等液体载体。
组合物可以呈液体形式，例如，酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。作为两个实例，液体可以口服或通过注射递送。当旨在用于口服施用时，除本发明的化合物以外，优选组合物包括甜味剂、防腐剂、染料/着色剂以及香味增强剂中的一种或多种。在旨在通过注射施用的组合物中，可以包括表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲液、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。
液体药物组合物，无论其是溶液、悬浮液还是其它类似形式，都可以包含一种或多种以下佐剂：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液，优选地生理盐水、林格氏溶液(Ringer'ssolution)、等渗氯化钠；固定油，如可以用作溶剂或悬浮介质的合成单甘油酯或二甘油酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐、或磷酸盐；以及用于张度调节的药剂，如氯化钠或右旋糖。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。生理盐水是优选佐剂。可注射药物组合物优选是无菌的。
旨在用于肠胃外或口服施用的液体组合物应包括一定量的如本文所公开的抗体或抗原结合片段，从而将获得合适剂量。通常，此量为组合物中抗体或抗原结合片段的至少0.01％。当旨在用于口服施用时，此量可以在组合物重量的0.1至约70％之间变化。某些口服药物组合物包括约4％至约75％的抗体或抗原结合片段。在某些实施方式中，制备根据本发明的药物组合物和制剂，使得在稀释之前，肠胃外剂量单位包括0.01重量％至10重量％的抗体或抗原结合片段。
组合物可以旨在用于局部施用，在这种情况下，载体可以适当地包括溶液、乳液、软膏或凝胶基质。例如，基质可以包括以下中的一种或多种：矿脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、如水和醇等稀释剂、以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可以存在于用于局部施用的组合物中。如果旨在用于经皮施用，则组合物可以包括经皮贴片或离子电渗疗法装置。药物组合物可以旨在以例如栓剂形式用于直肠施用，栓剂将在直肠中融化并且释放药物。用于经直肠施用的组合物可以包括油性基质作为适合的无刺激性赋形剂。此类基质包括但不限于羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。
组合物可以包含修改固体或液体剂量单位的物理形式的多种材料。例如，组合物可以包括围绕活性成分形成包衣壳的材料。形成包衣壳的材料通常是惰性的，并且可以选自例如糖、虫胶以及其它肠溶包衣剂。可替代地，活性成分可以包裹在明胶胶囊中。呈固体或液体形式的组合物可以包括与本公开的抗体或抗原结合片段结合并且由此帮助递送化合物的试剂。可以起这一作用的合适试剂包括单克隆或多克隆抗体、一种或多种蛋白质或脂质体。组合物可以基本上由可以气雾剂形式施用的剂量单位组成。术语气雾剂用于表示范围从胶体性质的系统到由加压包装组成的系统的各种系统。递送可以通过液化或压缩气体或通过分配活性成分的合适的泵系统进行。气雾剂可以单相、双相或三相系统递送，以便递送活性成分。气雾剂的递送包括必要的容器、活化剂、阀门、子容器等，其可共同形成试剂盒。本领域的普通技术人员无需过多的实验就可以确定优选的气溶胶。
应当理解，本公开的组合物还涵盖如本文所描述的多核苷酸的载体分子(例如，脂质纳米颗粒、纳米级递送平台等)。
在某些实施方式中，组合物包含包括第一质粒的第一载体和包括第二质粒的第二载体，其中第一质粒包括编码重链、VH或VH+CH的多核苷酸，并且第二质粒包括编码抗体或其抗原结合片段的同源轻链、VL或VL+CL的多核苷酸。在某些实施方式中，组合物包含与合适递送媒剂或载体偶联的多核苷酸(例如，mRNA)。用于向人受试者施用的示例性媒剂或载体包括脂质或脂质衍生的递送媒剂，如脂质体、固体脂质纳米颗粒、油性悬浮液、亚微米脂质乳剂、脂质微泡、反脂质胶束、耳蜗脂质体、脂质微管、脂质微圆柱体、或脂质纳米颗粒(LNP)或纳米级平台(参见例如Li等人,《威利跨学科评论：纳米医学与纳米生物技术(Wilery Interdiscip Rev.Nanomed Nanobiotechnol.)》11(2):e1530(2019))。用于设计适当的mRNA和调配mRNA-LNP并递送其的原理、试剂和技术描述于例如Pardi等人(《控制释放杂志》217345-351(2015))；Thess等人(《分子疗法》)23:1456-1464(2015))；Thran等人(《EMBO分子医学(EMBO Mol Med)》9(10):1434-1448(2017)；Kose等人(《科学免疫学(Sci.Immunol.)》4eaaw6647(2019)；以及Sabnis等人(《分子疗法》26:1509-1519(2018))，这些技术包括封端、密码子优化、核苷修饰、mRNA纯化、将mRNA并入稳定的脂质纳米颗粒中(例如，可电离的阳离子脂质/磷脂酰胆碱/胆固醇/PEG-脂质；可电离的脂质:二硬脂酰PC:胆固醇:聚乙二醇脂质)和其皮下、肌内、皮内、静脉内、腹膜内和气管内施用，通过引用并入本文。
药物组合物可以通过制药领域熟知的方法制备。例如，可以通过将包括如本文所描述的抗体、其抗原结合片段或其它组合物以及任选地盐、缓冲液和/或稳定剂中的一者或多者的组合物与无菌蒸馏水组合从而形成溶液来制备旨在通过注射施用的组合物。可以添加表面活性剂以促进形成均匀溶液或悬浮液。表面活性剂是与肽化合物非共价相互作用以便促进抗体或其抗原结合片段在水性递送系统中的溶解或均匀悬浮的化合物。
无论是要给予个体的根据本公开的多肽、肽或核酸分子、细胞或其它药学上有用的化合物，通常以“预防有效量”、或“治疗有效量”或“有效量”施用(视情况而定)，这足以显示对个体的益处(例如，改善临床结果；减轻或缓解与疾病相关的症状；减少症状的发生；提高生活质量；更长的无病状态；缩小疾病范围；稳定疾病状态；延迟疾病进展；缓解；存活；或以统计学上显著的方式延长的存活率)。当提及独自施用的单独的活性成分时，治疗有效量是指所述成分或独自表达所述成分的细胞的效果。当提及组合时，治疗有效量是指活性成分或组合的辅助活性成分与表达产生治疗效果的活性成分的细胞的组合量，无论连续、依序还是同时施用。
以有效量(例如，治疗SARS-CoV-2感染)施用组合物，所述有效量将根据多种因素而变化，包括所用特定化合物的活性；化合物的代谢稳定性和作用时长；受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用模式和时间；排泄率；药物组合；特定病症或病状的严重程度；以及经受疗法的受试者。在某些实施方式中，在施用根据本公开的调配物和方法的疗法后，与安慰剂治疗的或其它合适的对照受试者相比，测试受试者将表现出与所治疗的疾病或病症相关的一种或多种症状减少约10％至约99％。
一般来说，抗体或抗原结合片段的治疗有效日剂量(对于70kg哺乳动物)为约0.001mg/kg(即，0.07mg)至约100mg/kg(即，7.0g)；优选地，治疗有效剂量(对于70kg哺乳动物)为约0.01mg/kg(即，0.7mg)至约50mg/kg(即，3.5g)；更优选地，治疗有效剂量(对于70kg哺乳动物)为约1mg/kg(即，70mg)至约25mg/kg(即，1.75g)。本文提供了抗体或抗原结合片段的其它剂量。
对于本公开的多核苷酸、载体、宿主细胞和相关组合物，治疗有效剂量可以不同于抗体或抗原结合片段。
所施用的实际量以及施用的速率和时程将取决于正在治疗的疾病的性质和严重程度。对于注射，根据本公开的药物组合物可以例如在预填充注射器中提供。
如本文所公开的药物组合物还可以以任何口服可接受剂型口服施用，包括但不限于胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。在用于口服使用的片剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加了润滑剂，如硬脂酸镁。对于呈胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当要求口服使用的水性悬浮液时，将活性成分，即如上所定义的本发明的转运子货物缀合分子与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要，还可以加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。
根据本说明书的药物组合物还可以局部施用，尤其是在治疗靶标包括易于通过局部施涂接近的区域或器官时，例如，包括皮肤或任何其它可接近的上皮组织的疾病。用于这些区域或器官中的每一个的适当的局部调配物是易于制备的。对于局部施涂，药物组合物可以合适软膏的形式调配，所述合适软膏包括悬浮或溶解于一种或多种载体中的本发明的药物组合物，尤其是其如上文所定义的组分。用于局部施用的载体包括但不限于矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡以及水。可替代地，药物组合物可以合适洗剂或乳膏的形式调配。在本说明书的上下文中，适合的载体包括但不限于矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
剂量可以相对于体重表示。因此，以[g、mg或其它单位]/kg(或g、mg等)表示的剂量通常是指[g、mg或其它单位]“每kg(或g、mg等)体重”，即使未明确提及术语“体重(bodyweight)”或“体重(body weight)”也是如此。
在特定实施方式中，以单个剂量，例如每日、每周或每月剂量，药物组合物中抗体或其抗原结合片段的量不超过1g。在某些此类实施方式中，单个剂量不超过选自500mg、250mg、100mg和50mg的剂量。本文提供了剂量的另外的实施方式。
在某些实施方式中，方法包括向受试者施用2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次抗体、抗原结合片段、多核苷酸、载体、宿主细胞或组合物。
在某些实施方式中，方法包括多次向受试者施用抗体、抗原结合片段或组合物，其中第二或连续施用分别在第一或前一施用之后约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约24小时、约48小时、约74小时、约96小时或更长时间进行。
在某些实施方式中，方法包括在受试者之前施用抗体、抗原结合片段、多核苷酸、载体、宿主细胞或组合物至少一次。
包括本公开的抗体、抗原结合片段、多核苷酸、载体、宿主细胞或组合物的组合物也可以在施用一种或多种其它治疗剂的同时、之前或之后施用。此类组合疗法可以包括施用包括本发明的化合物和一种或多种额外的活性剂的单个药物剂量调配物，以及施用包括呈自身独立剂量调配物的本公开的抗体或抗原结合片段和每种活性剂的组合物。例如，如本文所描述的抗体或其抗原结合片段和其它活性剂可以以单个口服剂量组合物形式(如片剂或胶囊)向患者一起施用，或每种药剂以独立口服剂量调配物形式施用。类似地，如本文所描述的抗体或抗原结合片段和其它活性剂可以以单个肠胃外剂量组合物(如在盐水溶液或其它生理学上可接受的溶液中)向受试者一起施用，或每种药剂以独立肠胃外剂量调配物形式施用。当使用独立剂量调配物时，包括抗体或抗原结合片段和一种或多种额外的活性剂的组合物可以基本上在同一时间(即，同时)施用或在交错时间分别(即，依序和以任何次序)施用；组合疗法应理解为包括所有这些方案。
在一些实施方式中，如本文所述的组合物或试剂盒进一步包括：(i)聚合酶抑制剂，其中聚合酶抑制剂任选地包括拉米夫定(Lamivudine)、阿德福韦(Adefovir)、恩替卡韦(Entecavir)、替比夫定(Telbivudine)、替诺福韦(Tenofovir)或其任何组合；(ii)干扰素，其中干扰素任选地包括IFNβ和/或IFNα；(iii)检查点抑制剂，其中检查点抑制剂任选地包括抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段和/或抗CTLA4抗体或其抗原结合片段；(iv)刺激性免疫检查点分子的激动剂；或(v)(i)-(iv)的任何组合。在一些实施方式中，试剂盒包括如本文所描述的组合物或组合，并且进一步包括使用组件预防、治疗、减轻和/或诊断乙型肝炎感染和/或丁型肝炎感染的说明书。
在某些实施方式中，本公开的组合物(例如，抗体、抗原结合片段、宿主细胞、核酸、载体或药物组合物)与PD-1抑制剂组合使用，例如PD-1特异性抗体或其结合片段，如匹地利珠单抗(pidilizumab)、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、MEDI0680(以前被称为AMP-514)、AMP-224、BMS-936558或其任何组合。在某些实施方式中，本公开的组合物与PD-L1特异性抗体或其结合片段组合使用，如BMS-936559、度伐单抗(durvalumab)(MEDI4736)、阿特珠单抗(atezolizumab)(RG7446)、阿维鲁单抗(avelumab)(MSB0010718C)、MPDL3280A或其任何组合。在某些实施方式中，本公开的组合物与LAG3抑制剂组合使用，如LAG525、IMP321、IMP701、9H12、BMS-986016或其任何组合。在某些实施方式中，本公开的组合物与CTLA4抑制剂组合使用。在特定实施方式中，本公开的组合物与CTLA4特异性抗体或其结合片段组合使用，如伊匹单抗(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、CTLA4-Ig融合蛋白(例如，阿巴西普(abatacept)、贝拉西普(belatacept))或其任何组合。在某些实施方式中，本公开的组合物与B7-H3特异性抗体或其结合片段组合使用，如依诺珠单抗(enoblituzumab，MGA271)、376.96或两者。抗B7-H3抗体结合片段可以是scFv或其融合蛋白，如例如Dangaj等人,《癌症研究(Cancer Res.)》73:4820,2013以及美国专利第9,574,000号和PCT专利公开第WO/201640724A1号和第WO 2013/025779A1号中描述的融合蛋白。在某些实施方式中，本公开的组合物与CD244抑制剂组合使用。在某些实施方式中，本公开的组合物与BLTA、HVEM、CD160或其任何组合的抑制剂组合使用。例如PCT公开第WO 2010/084158号中描述了抗CD-160抗体。在某些实施方式中，本公开的组合物与TIM3抑制剂组合使用。在某些实施方式中，本公开的组合物与Gal9抑制剂组合使用。在某些实施方式中，本公开的组合物与腺苷信号传导抑制剂(如诱饵腺苷受体)组合使用。在某些实施方式中，本公开的组合物与A2aR抑制剂组合使用。在某些实施方式中，本公开的组合物与KIR抑制剂，如利鲁单抗(lirilumab，BMS-986015)组合使用。在某些实施方式中，本公开的组合物与抑制性细胞因子(通常是除TGFβ以外的细胞因子)或Treg发育或活性的抑制剂组合使用。在某些实施方式中，本公开的组合物与IDO抑制剂组合使用，如左旋-1-甲基色氨酸、艾卡哚司他(epacadostat)(INCB024360；Liu等人,《血液》115:3520-30,2010)、依布硒啉(ebselen)(Terentis等人,《生物化学》49:591-600,2010)、吲哚莫德(Indoximod)、NLG919(Mautino等人,美国癌症研究协会2013年第104届年会(AmericanAssociation for Cancer Research 104th Annual Meeting 2013)；2013年4月6日-10日)、1-甲基-色氨酸(1-MT)-替拉扎明或其任何组合。在某些实施方式中，本公开的组合物与精氨酸酶抑制剂组合使用，如N(ω)-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)、N-ω-羟基-nor-l-精氨酸(nor-NOHA)、L-NOHA、2(S)-氨基-6-二羟硼基己酸(ABH)、S-(2-二羟硼基乙基)-L-半胱氨酸(BEC)或其任何组合。在某些实施方式中，本公开的组合物与VISTA抑制剂组合使用，如CA-170(马萨诸塞州列克星敦市居里公司(Curis,Lexington,Mass.))。在某些实施方式中，本公开的组合物与TIGIT抑制剂(例如，COM902(加拿大安大略多伦多Compugen公司(Compugen,Toronto,Ontario Canada))、CD155抑制剂(例如，COM701(Compugen))或两者组合使用。在某些实施方式中，本公开的组合物与PVRIG、PVRL2或两者的抑制剂组合使用。例如PCT公开第WO 2016/134333号中描述了抗PVRIG抗体。例如PCT公开第WO 2017/021526号中描述了抗PVRL2抗体。在某些实施方式中，本公开的组合物与LAIR1抑制剂组合使用。在某些实施方式中，本公开的组合物与CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5或其任何组合的抑制剂组合使用。
在某些实施方式中，本公开的组合物与增加刺激性免疫检查点分子的活性的药剂(即，激动剂)组合使用。例如，本公开的组合物可以与CD137(4-1BB)激动剂(如乌瑞芦单抗(urelumab))、CD134(OX-40)激动剂(如MEDI6469、MEDI6383或MEDI0562)、来那度胺(lenalidomide)、泊马度胺(pomalidomide)、CD27激动剂(如CDX-1127)、CD28激动剂(如TGN1412、CD80或CD86)、CD40激动剂(例如，CP-870,893、rhuCD40L或SGN-40)、CD122激动剂(例如，IL-2)、GITR激动剂(例如，PCT专利公开第WO 2016/054638号中描述的人源化单克隆抗体)、ICOS(CD278)激动剂(例如，GSK3359609、mAb 88.2、JTX-2011、Icos 145-1、Icos314-8或其任何组合)组合使用。
在本文公开的任何实施方式中，方法可以包括单独或以任何组合施用本公开的组合物与刺激性免疫检查点分子的一种或多种激动剂，包括上述中的任何一种。
根据本公开的抗体、抗原结合片段或融合蛋白可以作为额外的活性组分存在于相同药物组合物中，或者根据本公开的抗体、抗原结合片段或融合蛋白可以包括在第一药物组合物中，并且额外的活性组分可以包括在不同于第一药物组合物的第二药物组合物中。
用途
在另外的方面，本公开提供了使用抗体、抗原结合片段、融合蛋白、核酸、载体、细胞、药物组合物、组合(例如，本公开的抗体或抗原结合片段与本公开的HBV蛋白表达抑制剂和递送系统(例如，RNAi药剂)的组合)或根据本公开的试剂盒用于：(i)预防、治疗或减轻乙型肝炎和/或丁型肝炎；或(ii)诊断乙型肝炎和/或丁型肝炎(例如，在人受试者中)的方法。
诊断(例如，体外、离体)的方法可以包括使抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或融合蛋白与样品接触。此类样品可以从受试者分离，例如从例如鼻道、窦腔、唾液腺、肺、肝、胰、肾、耳、眼、胎盘、消化道、心脏、卵巢、垂体、肾上腺、甲状腺、脑、皮肤或血液获取的分离组织样品。诊断方法还可以包括检测抗原/抗体或抗原/融合蛋白复合物，具体地在使抗体、抗体片段或融合蛋白与样品接触之后。此类检测步骤通常在工作台上进行，即不与人体或动物体有任何接触。检测方法的实例是本领域的技术人员众所周知并且包括例如ELISA(酶联免疫吸附测定)。
本公开还提供了(i)根据本公开的抗体、抗体片段、融合蛋白或其变体和衍生物，(ii)根据本公开的宿主细胞(其可以是永生化B细胞)，(iii)根据本公开的核酸或载体，(iv)本公开的药物组合物或(v)组合(例如，本公开的抗体或抗原结合片段与本公开的HBV蛋白表达抑制剂和递送系统(例如，RNAi药剂)的组合)在(a)制备用于预防、治疗或减轻乙型肝炎和/或丁型肝炎的药物或用于(b)诊断乙型肝炎和/或丁型肝炎中的用途。
如本文所使用的，术语“疾病”旨在通常是同义词，并且与术语“病症”和“病状”(如医学病状)可互换地使用，因为所有均反映人或动物身体或其部分之一的使正常功能受损，通常表现为明显的体征和症状，并且导致人或动物的生命持续时间或生活质量降低。
如本文所使用的，提及“治疗”受试者或患者旨在包括预防(prevention/prophylaxis)、减弱、改善以及疗法，并且是指对受试者的疾病、病症或病状的医疗管理。治疗益处可以包括改善临床结果；减轻或缓解与疾病相关的症状；减少症状的发生；提高生活质量；更长的无病状态；减轻疾病的程度；稳定疾病状态；延缓疾病进展；缓解；存活；延长存活率；或其任何组合。术语“受试者”或“患者”在本文中可互换使用以意指所有哺乳动物，包括人。受试者的实例包括人、牛、狗、猫、马、山羊、绵羊、猪和兔子。在某些实施方式中，患者是人。受试者可以是男性或女性，并且可以处于任何合适的年龄，包括婴儿、少年、青少年、成人和老年受试者。
本公开还提供了根据本公开的抗体、抗原结合片段或融合蛋白、根据本公开的核酸、根据本公开的载体、根据本公开的细胞、根据的药物组合物和/或组合(例如，本公开的抗体或抗原结合片段与本公开的HBV蛋白表达抑制剂和递送系统(例如，RNAi药剂)的组合)用作预防或治疗乙型肝炎和/或丁型肝炎的药物。还提供了本公开的抗体、抗原结合片段或融合蛋白在制备用于治疗受试者和/或诊断受试者的药物中的用途。还提供了用于治疗受试者(例如，人受试者)的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的如本文所述的组合物或组合。在一些实施方式中，所述受试者可以是人。一种检查治疗性治疗的功效的方式涉及在施用组合物之后监测疾病症状。治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。
在一个实施方式中，向需要此类治疗的受试者施用根据本公开的抗体、抗原结合片段、融合蛋白、宿主细胞(例如，表达融合蛋白的永生化B细胞克隆、或T细胞、NK-T细胞或NK细胞)、药物组合物或组合。此类受试者包括但不限于具体地有风险患上或易感乙型肝炎和/或丁型肝炎的受试者。
根据本公开的抗体、抗原结合片段、融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞、药物组合物和其组合也可以用于试剂盒中以预防、治疗、减弱和/或诊断乙型肝炎和/或丁型肝炎。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括使用组件预防、治疗、减轻和/或诊断乙型肝炎感染和/或丁型肝炎感染的说明书。此外，HBsAg抗原环区中能够如本文所述结合本公开的抗体、抗原结合片段或融合蛋白的表位可以用于试剂盒中以通过检测保护性抗HBV抗体的存在或确定其滴度来监测应用程序的功效。
在某些实施方式中，本公开的组合物或试剂盒进一步包括：聚合酶抑制剂，其中所述聚合酶抑制剂任选地包括拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦或其任何组合；(ii)干扰素，其中所述干扰素任选地包括IFNβ和/或IFNα；(iii)检查点抑制剂，其中所述检查点抑制剂任选地包括抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段和/或抗CTLA4抗体或其抗原结合片段；(iv)刺激性免疫检查点分子的激动剂；或(x)(viii)-(xii)的任何组合。
在一些实施方式中，根据本公开的抗体、抗原结合片段或融合蛋白、根据本公开的核酸、根据本公开的载体、根据本公开的细胞、根据本公开的药物组合物和/或本公开的组合(例如，本公开的抗体或抗原结合片段与本公开的HBV蛋白表达抑制剂和递送系统(例如，RNAi药剂)的组合)用于治疗或减轻慢性乙型肝炎感染。
在特定实施方式中，根据本公开的抗体、抗原结合片段或融合蛋白：(i)中和HBV感染，(ii)与L-HBsAg(大HBV包膜蛋白，其存在于感染性HBV颗粒中)结合，由此防止HBV的传播，(iii)与S-HBsAg结合，由此促进亚病毒颗粒(SVP)的清除和/或(iv)可以诱导血清转化，即对病毒的主动免疫应答。
在特定实施方式中，根据本公开的抗体、抗原结合片段或融合蛋白、根据本公开的核酸、根据本公开的载体、根据本公开的细胞或根据本公开的药物组合物可以用于预防肝移植后乙型肝炎(再)感染，具体地用于乙型肝炎诱导的肝衰竭。
在另外的实施方式中，根据本公开的抗体、其抗原结合片段或融合蛋白、根据本公开的核酸、根据本文提供的描述的载体、根据本公开的细胞、根据本公开的药物组合物和/或组合(例如，本公开的抗体或抗原结合片段与本公开的HBV蛋白表达抑制剂和递送系统(例如，RNAi药剂)的组合)可以用于预防(prevention/prophylaxis)未经免疫的受试者的乙型肝炎。这例如是在(假设)意外暴露于HBV的情况下(暴露后预防)。术语“未经免疫的受试者”包括未曾接受疫苗接种并且因此未经免疫的受试者以及在疫苗接种之后未显示免疫应答(例如，没有可测量的抗乙型肝炎抗体)的受试者。
在一些实施方式中，根据本公开的抗体、抗原结合片段或融合蛋白、根据本公开的核酸、根据本公开的载体、根据本公开的细胞、根据本公开的药物组合物或本公开的组合(例如，本公开的抗体或抗原结合片段与本公开的HBV蛋白表达抑制剂和递送系统(例如，RNAi药剂)的组合)用于预防血液透析患者的乙型肝炎。
在一些实施方式中，根据本公开的抗体、抗原结合片段或融合蛋白、根据本公开的核酸、根据本公开的载体、根据本公开的细胞、根据本公开的药物组合物或本公开的组合(例如，本公开的抗体或抗原结合片段与本公开的HBV蛋白表达抑制剂和递送系统(例如，RNAi药剂)的组合)用于预防新生儿的乙型肝炎。在此类实施方式中，根据本公开的抗体或其抗原结合片段、根据本公开的核酸、根据本公开的载体、根据本公开的细胞、根据本公开的药物组合物或本公开的组合(例如，本公开的抗体或抗原结合片段与本公开的HBV蛋白表达抑制剂和递送系统(例如，RNAi药剂)的组合)可以在出生时或出生后尽快施用。可以重复所述施用，直到疫苗接种之后血清转化为止。
此外，本公开还提供了根据本公开的抗体、抗原结合片段或融合蛋白、根据本公开的核酸、根据本公开的载体、根据本公开的细胞或根据本公开的药物组合物在诊断(例如，体外、离体或体内)乙型肝炎和/或丁型肝炎中的用途。
此外，提供了根据本公开的抗体、抗原结合片段或融合蛋白、根据本公开的核酸、根据本公开的载体、根据本公开的细胞或根据本公开的药物组合物在确定分离的血液样品是否感染乙型肝炎病毒和/或丁型肝炎病毒中的用途。
如上文所描述，诊断方法可以包括使抗体、抗体片段或融合蛋白与样品接触。此类样品可以从受试者分离，例如从例如鼻道、窦腔、唾液腺、肺、肝、胰、肾、耳、眼、胎盘、消化道、心脏、卵巢、垂体、肾上腺、甲状腺、脑、皮肤或血液获取的分离组织样品。诊断方法还可以包括检测抗原/抗体复合物，尤其在将抗体或抗体片段与样品接触之后。此类检测步骤通常在工作台上进行，即不与人体或动物体有任何接触。检测方法的实例是本领域的技术人员众所周知并且包括例如ELISA(酶联免疫吸附测定)。
本公开还提供了一种治疗、预防和/或减轻受试者的乙型肝炎和/或丁型肝炎的方法，其中所述方法包括向受试者施用根据本公开的抗体、抗原结合片段或融合蛋白、根据本公开的核酸、根据本公开的载体、根据本公开的细胞、根据本公开的药物组合物和/或本公开的组合(例如，本公开的抗体或抗原结合片段与本公开的HBV蛋白表达抑制剂和递送系统(例如，RNAi药剂)的组合)。在某些实施方式中，方法进一步包括向所述受试者施用以下中的一种或多种：(vii)聚合酶抑制剂，其中所述聚合酶抑制剂任选地包括拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦或其任何组合；(viii)干扰素，其中所述干扰素任选地包括IFNβ和/或IFNα；(ix)检查点抑制剂，其中所述检查点抑制剂任选地包括抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段和/或抗CTLA4抗体或其抗原结合片段；(x)刺激性免疫检查点分子的激动剂；或(xi)(vii)-(x)的任何组合。
在一些实施方式中，乙型肝炎感染是慢性乙型肝炎感染。在一些实施方式中，受试者已接受肝移植。在一些实施方式中，受试者没有针对乙型肝炎进行免疫。在某些实施方式中，受试者是新生儿。在一些实施方式中，受试者正在经历血液透析或已经历血液透析。
本公开还提供了一种治疗已接受肝移植的受试者的方法，所述方法包括向已接受肝移植的受试者施用有效量的根据本公开的抗体、抗原结合片段或融合蛋白、根据本公开的核酸、根据本公开的载体、根据本公开的细胞、根据本公开的药物组合物和/或本公开的组合(例如，本公开的抗体或抗原结合片段与本公开的HBV蛋白表达抑制剂和递送系统(例如，RNAi药剂)的组合)。
本文还提供了用于检测抗乙型肝炎和/或抗丁型肝炎疫苗中呈正确构象的表位的存在或不存在的方法，其中所述方法包括：(i)使疫苗与本公开中的任一者的抗体、抗原结合片段或融合蛋白接触；以及(ii)确定是否已经形成包括抗原和抗体、或包括抗原和抗原结合片段、或包括抗原和融合蛋白的复合物。
如本文所使用的，术语“疫苗”通常理解为提供至少一种抗原，如免疫原的预防性或治疗性材料。抗原或免疫原可以源自适于疫苗接种的任何材料。例如，抗原或免疫原可以源自病原体，如源自细菌颗粒、病毒颗粒、肿瘤(包括实体瘤或液体瘤)或其它癌组织。抗原或免疫原刺激身体的适应性免疫系统以提供适应性免疫应答。在某些实施方式中，“抗原”或“免疫原”是指可以被免疫系统识别(例如，通过适应性免疫系统)并且能够触发抗原特异性免疫应答(例如，通过形成抗体和/或抗原特异性T细胞作为适应性免疫应答的一部分)的物质。在一些实施方式中，抗原可以是或可以包括可以由MHC复合物(例如，MHC I类；MHC II类)呈递给T细胞的肽或蛋白质。在某些实施方式中，抗原包括HBV和/或HBD抗原；例如，HBsAg抗原。
本公开的一些实施方式提供了治疗有需要的受试者的慢性HBV感染或HBV相关疾病的方法，所述方法包括：(i)向受试者施用降低HBV抗原负荷的药剂；以及(ii)向受试者施用抗HBV抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，降低HBV抗原负荷的药剂在抗HBV抗体或其抗原结合片段之前施用。在某些实施方式中，在抗HBV抗体或其抗原结合片段之前施用降低HBV抗原负荷的药剂使在施用抗HBV抗体或其抗原结合片段时病毒负荷降低。在某些实施方式中，组合疗法的抗HBV抗体或其抗原结合片段的治疗有效量小于当尚未向受试者施用降低HBV抗原负荷的药剂时(例如，当抗HBV抗体或其抗原结合片段作为单一疗法单独施用时)递送的抗HBV抗体或其抗原结合片段的治疗有效量。在一些实施方式中，降低HBV抗原负荷的药剂是抑制HBV转录物表达的RNAi药剂(例如，siRNA)。
在某些实施方式中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的慢性HBV感染或HBV相关疾病的方法，所述方法包括：向受试者施用降低HBV抗原负荷的药剂；以及向受试者施用抗HBV抗体或其抗原结合片段；并且进一步包括测量在施用降低HBV抗原负荷的药剂之前和之后存在于来自受试者的血液样品中的HBsAg的量，其中HBsAg的降低表明至少一种HBV基因的表达降低。
在某些实施方式中，本公开提供了一种降低HBV抗原负荷的药剂，所述药剂用于治疗受试者的慢性HBV感染或HBV相关疾病，其中随后向受试者施用抗HBV抗体或其抗原结合片段。在某些其它实施方式中，本公开提供了一种抗HBV抗体或其抗原结合片段，所述抗HBV抗体或其抗原结合片段用于治疗受试者的慢性HBV感染或HBV相关疾病，并且先前已向所述受试者施用降低HBV抗原负荷的药剂。在另外的实施方式中，在施用降低HBV抗原负荷的药剂后，至少一种HBV基因的表达降低，并且当所述至少一种HBV基因表达降低时，向受试者施用抗HBV抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，本公开提供了降低HBV抗原负荷的药剂和/或抗HBV抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗慢性HBV感染或HBV相关疾病的药物中的用途。
本公开的一些实施方式提供了治疗有需要的受试者的慢性HBV感染或HBV相关疾病的方法，所述方法包括：(i)向受试者施用HBV基因表达抑制剂；以及(ii)向受试者施用抗HBV抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，HBV基因表达抑制剂在抗HBV抗体之前施用。在某些实施方式中，在抗HBV抗体或其抗原结合片段之前施用HBV基因表达抑制剂导致在施用抗HBV抗体时病毒载量降低。在某些实施方式中，组合疗法的抗HBV抗体的治疗有效量小于当尚未向受试者施用HBV基因表达抑制剂时(例如，当抗HBV抗体或其抗原结合片段作为单一疗法单独施用时)递送的抗HBV抗体或其抗原结合片段的治疗有效量。
在某些实施方式中，在施用HBV基因表达抑制剂后，至少一种HBV基因的表达降低，并且当所述至少一种HBV基因表达降低时，向受试者施用抗HBV抗体或其抗原结合片段。在特定实施方式中，所述至少一种HBV基因是HBV X基因和/或HBsAg。
在某些实施方式中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的慢性HBV感染或HBV相关疾病的方法，所述方法包括：向受试者施用HBV基因表达抑制剂；以及向受试者施用抗HBV抗体或其抗原结合片段；并且进一步包括测量在施用HBV表达抑制剂之前和之后存在于来自受试者的血液样品中的HBsAg的量，其中HBsAg的降低表明至少一种HBV基因的表达降低。
在某些实施方式中，本公开提供了一种HBV基因表达抑制剂，所述HBV基因表达抑制剂用于治疗受试者的慢性HBV感染或HBV相关疾病，其中随后向受试者施用抗HBV抗体或其抗原结合片段。在某些其它实施方式中，本公开提供了一种抗HBV抗体或其抗原结合片段，所述抗HBV抗体或其抗原结合片段用于治疗受试者的慢性HBV感染或HBV相关疾病，并且所述受试者先前已被施用基因表达抑制剂。在另外的实施方式中，在施用HBV基因表达抑制剂后，至少一种HBV基因的表达降低，并且当所述至少一种HBV基因的表达降低时，向受试者施用抗HBV抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，本公开提供了HBV基因表达抑制剂和/或抗HBV抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗慢性HBV感染或HBV相关疾病的药物中的用途。
在上述方法、供使用的组合物或用于制备的用途中的任何一种中，所述方法和组合物可以用于治疗慢性HBV感染。
在某些实施方式中，HBV基因表达抑制剂以单个剂量、两个剂量、三个剂量、四个剂量或五个剂量施用。在某些特定实施方式中，HBV基因表达抑制剂的至少第一剂量在施用抗HBV抗体或其抗原结合片段之前施用。
在某些实施方式中，HBV基因表达抑制剂以单个剂量、两个剂量、三个剂量、四个剂量或五个剂量、六个剂量、七个剂量或八个剂量施用。可以例如每天两次、每天一次、每两天、每三天、每周两次、每周一次、每隔一周、每四周或每月一次施用一个或多个剂量。
在某些实施方式中，施用抗HBV抗体或其抗原结合片段包括每周两次、每周一次、每隔一周、每两周或每月一次施用抗HBV抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，施用抗HBV抗体或其抗原结合片段包括施用至少两个剂量的治疗有效量的抗HBV抗体或其抗原结合片段。在某些另外的实施方式中，至少两个剂量以每周两次、每周一次、每隔一周、每两周或每月一次进行施用。
在某些实施方式中，在施用HBV基因表达抑制剂后至少1周开始施用抗HBV抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，在施用HBV基因表达抑制剂后2周开始施用抗HBV抗体。在某些实施方式中，在施用HBV基因表达抑制剂后8周开始施用抗HBV抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，抗HBV抗体或其抗原结合片段和HBV基因表达抑制剂各自皮下施用。
在上述方法、供使用的组合物或用于制备的用途的特定实施方式中，抗HBV抗体或其抗原结合片段可以识别HBV基因型A、B、C、D、E、F、G、H、I、和J。
在上述方法、供使用的组合物或用于制备的用途的特定实施方式中，抗HBV抗体或其抗原结合片段可以是人抗体或其抗原结合片段；单克隆抗体或其抗原结合片段；或双特异性抗体或其抗原结合片段，其具有针对HBsAg的第一特异性和刺激免疫效应子的第二特异性(例如，刺激细胞毒性或疫苗效应的第二特异性)。在本文公开的上述方法、供使用的组合物或用于制备的用途的某些其它实施方式中，抗HBV抗体是单克隆抗体。
在上述方法、供使用的组合物或用于制备的用途的特定实施方式中，抗HBV抗体或其抗原结合片段包括如本文所公开的HBC34的非天然变体。例如，在某些实施方式中，抗HBV抗体(i)重链可变区(VH)，所述VH包括如SEQ ID NO:34所示的CDRH1氨基酸序列、如SEQ IDNO:35或36所示的CDRH2氨基酸序列以及如SEQ ID NO:37所示的CDRH3氨基酸序列；以及(ii)轻链可变区(VL)，所述VL包括SEQ ID NO:40-43中的任一者中所示的CDRL1氨基酸序列、如SEQ ID NO:45-53中的任一者所示的CDRL2氨基酸序列以及如SEQ ID NO:55或56所示的CDRL3氨基酸序列，其中所述CDR根据CCG编号系统进行确定，并且其中所述抗体或其抗原结合片段能够与HBsAg的抗原环区结合，并且能够中和由基因型D、A、B、C、E、F、G、H、I或J或其任何组合的乙型肝炎病毒(HBV)引起的感染。
在某些实施方式中，所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列如以下所示：(i)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、45和55；(ii)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、46和55；(iii)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、47和55；(iv)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、48和55；(v)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、49和55；(vi)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、50和55；(vii)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、51和55；(viii)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、52和55；或(ix)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、53和55。
在某些另外的实施方式中，抗体或抗原结合片段包括重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中：(i)所述VH包括与以下中所示的氨基酸序列具有至少90％(即，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％或其间任何非整数值)同一性的氨基酸序列或由其组成：SEQ ID NO:38或39；和/或(ii)所述VL包括与以下中的任一者中所示的氨基酸序列具有至少90％(即，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％或其间任何非整数值)同一性的氨基酸序列或由其组成：SEQ ID NO:58-66、69、71或72。
在一些实施方式中，所述VH包括SEQ ID NO:38或39中所示的氨基酸序列或由其组成；和/或所述VL包括SEQ ID NO:58-66、69、71或72中的任一者所示的氨基酸序列或由其组成。
在特定实施方式中，所述VH和所述VL包括以下中所示的氨基酸序列或由其组成：(i)分别为SEQ ID NO:38和58；(ii)分别为SEQ ID NO:38和59；(iii)分别为SEQ ID NO:38和60；(iv)分别为SEQ ID NO:38和61；(v)分别为SEQ ID NO:38和62；(vi)分别为SEQ IDNO:38和63；(vii)分别为SEQ ID NO:38和64；(viii)分别为SEQ ID NO:38和65；(ix)分别为SEQ ID NO:38和66；(x)分别为SEQ ID NO:38和71；或(xi)分别为SEQ ID NO:38和72。
另一方面，本公开提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括：重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中所述VH和所述VL包括以下中所示的氨基酸序列或由以下组成：(i)分别为SEQ ID NO:38和67；或(ii)分别为SEQ ID NO:38和68，其中所述抗体或其抗原结合片段能够与HBsAg的抗原环区结合并且能够中和由基因型D、A、B、C、E、F、G、H、I或J或其任何组合的乙型肝炎病毒(HBV)引起的感染。
还提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括如SEQ ID NO:38或39所示的VH和SEQ ID NO:57-72中的任一者的VL变体，所述VL变体包括在框架区3中分别与SEQ ID NO:57-72有关的以下突变中的任何一个或多个突变，如通过CCG编号所确定的：R60A、R60N、R60K、S64A、I74A。在一些实施方式中，变体中不包括分别与SEQ ID NO:57-72有关的另外的突变。
还提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括如SEQ ID NO:38或39所示的VH和SEQ ID NO:57-72中的任一者的VL变体，所述VL变体包括Q78、D81或两者处的取代突变(例如，保守氨基酸取代或种系编码氨基酸的突变)。在一些实施方式中，变体中不包括分别与SEQ ID NO:57-72有关的另外的突变。
在本公开的任何实施方式中，在包括多个抗体或抗原结合片段的样品中，当样品已在约40℃下温育约120小时至约168小时时，所述多个中的少于12％、11％或更少、10％或更少、9％或更少、8％或更少、7％或更少、6％或更少、5％或更少、4％或更少、3％或更少或2％或更少包括在抗体二聚体中，其中任选地，通过绝对尺寸排阻色谱法确定抗体二聚体的存在。如本文所使用的，抗体二聚体或多聚体是包括本公开的两个或更多个抗体或抗原结合片段(例如，抗体:抗体二聚体、Fab:Fab二聚体或抗体:Fab二聚体)的复合物。
在某些实施方式中，抗HBV抗体或抗原结合片段的治疗有效量小于当尚未向受试者施用HBV基因表达抑制剂时递送的抗HBV抗体或抗原结合片段的治疗有效量。例如，与单独施用抗HBV抗体或抗原结合片段相比，组合疗法可以降低抗HBV抗体或抗原结合片段的有效剂量。
在某些实施方式中，抗HBV抗体或抗原结合片段以至少两个单独的剂量施用。在特定实施方式中，至少两个剂量以每周两次、每周一次、每隔一周、每两周或每月一次进行施用。
在某些实施方式中，受试者是人，并且施用治疗有效量的抗HBV抗体；其中治疗有效量为约3mg/kg至约30mg/kg。
在上述方法、供使用的组合物或用于制备的用途的特定实施方式中，抑制剂是抑制HBV转录物表达的RNAi药剂。在一些实施方式中，HBV转录物表达的抑制通过rtPCR测量。在一些实施方式中，HBV转录物表达的抑制通过如通过ELISA测量的蛋白质水平的降低来测量。
在某些实施方式中，RNAi药剂包括形成双链区的正义链和反义链，其中正义链包括与SEQ ID NO:116的核苷酸1579-1597相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。在某些实施方式中，RNAi药剂包括正义链和反义链，其中正义链包括SEQ ID NO:116的核苷酸1579-1597。
在上述方法、供使用的组合物或用于制备的用途的特定实施方式中，RNAi药剂中的至少一条链可以包括至少1个核苷酸或至少2个核苷酸的3'突出端。
在上述方法、供使用的组合物或用于制备的用途的特定实施方式中，RNAi药剂的双链区的长度可以为15-30个核苷酸对；长度为17-23个核苷酸对；长度为17-25个核苷酸对；长度为23-27个核苷酸对；长度为19-21个核苷酸对；或长度为21-23个核苷酸对。
在上述方法、供使用的组合物或用于制备的用途的特定实施方式中，RNAi药剂的每条链可以为15-30个核苷酸或19-30个核苷酸。
在上述方法、供使用的组合物或用于制备的用途的特定实施方式中，RNAi药剂是siRNA。在特定实施方式中，siRNA抑制HBV转录物的表达，所述HBV转录物编码HBsAg蛋白、HBcAg蛋白和HBx蛋白或HBV DNA聚合酶蛋白。在某些实施方式中，siRNA与由以下编码的靶标的至少15个连续核苷酸结合：P基因，NC_003977.2的核苷酸2309-3182和1-1625；S基因(编码L、M和S蛋白)，NC_003977.2的核苷酸2850-3182和1-837；HBx，NC_003977.2的核苷酸1376-1840；或C基因，NC_003977.2的核苷酸1816-2454。
在上述方法、供使用的组合物或用于制备的用途的特定实施方式中，RNAi药剂是siRNA，并且siRNA的反义链包括5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3'(SEQ ID NO:119)的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸或19个连续核苷酸。在一些实施方式中，siRNA的反义链包括5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3'(SEQ ID NO:119)的核苷酸序列。在一些实施方式中，反义链由5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3'(SEQ ID NO:119)的核苷酸序列组成。在一些实施方式中，siRNA的正义链包括5'-GUGUGCACUUCGCUUCACA-3'(SEQ ID NO:118)的核苷酸序列。在一些实施方式中，siRNA的正义链由5'-GUGUGCACUUCGCUUCACA-3'(SEQ ID NO:118)的核苷酸序列组成。
在上述方法、供使用的组合物或用于制备的用途的特定实施方式中，RNAi药剂是siRNA，并且siRNA的反义链包括5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3'(SEQ ID NO:121)的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸或19个连续核苷酸。在一些实施方式中，siRNA的反义链包括5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3(SEQ ID NO:121)的核苷酸序列。在一些实施方式中，反义链由5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3'(SEQ ID NO:121)的核苷酸序列组成。在一些实施方式中，siRNA的正义链包括5'-GGUGGACUUCUCUCAAUUUUA -3'(SEQ ID NO:120)的核苷酸序列。在一些实施方式中，siRNA的正义链由5'-GGUGGACUUCUCUCAAUUUUA-3'(SEQ ID NO:120)的核苷酸序列组成。
在上述方法、供使用的组合物或用于制备的用途的特定实施方式中，RNAi药剂是siRNA，其中所述正义链的基本上所有核苷酸和所述反义链的基本上所有核苷酸都是经修饰的核苷酸，并且其中所述正义链与附接在3'末端处的配体缀合。在具体实施方式中，配体是通过单价接头、二价分支接头或三价分支接头附接的一种或多种GalNAc衍生物。在某些实施方式中，通过接头附接的GalNAc衍生物是或包括：
Figure BDA0004086126640001291
在特定实施方式中，siRNA与配体缀合，如下图所示(即，通过接头附接的GalNAc衍生物是)：
Figure BDA0004086126640001301
其中X为O或S。
在上述方法、供使用的组合物或在制造中的用途的特定实施方式中，RNAi药剂是siRNA，其中siRNA的至少一个核苷酸是经修饰的核苷酸，其包括脱氧核苷酸、3'-末端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰核苷酸、锁定核苷酸、解锁核苷酸、构象限制的核苷酸、限制乙基核苷酸，无碱基核苷酸、2'-氨基修饰核苷酸、2'-O-烯丙基修饰核苷酸、2'-C-烷基修饰核苷酸、2'-羟基修饰核苷酸、2'-甲氧基乙基修饰核苷酸，2'-O-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包括核苷酸的非天然碱基、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-脱水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包括硫代磷酸酯基团的核苷酸、包括甲基磷酸酯基团的核苷酸、包括5'-磷酸酯的核苷酸、腺苷-乙二醇核酸或包括5'-磷酸模拟物的核苷酸。在某些实施方式中，所述siRNA包括磷酸酯主链修饰、2'核糖修饰、5'三磷酸酯修饰或GalNAc缀合修饰。在某些实施方式中，磷酸酯主链修饰包括硫代磷酸酯键。在某些实施方式中，2'核糖修饰包括氟或-O-甲基取代。
在上述方法、供使用的组合物或用于制备的用途的特定实施方式中，RNAi药剂是具有包括5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96 -3'(SEQ ID NO:122)的正义链和包括5'-usGfsugaAfgCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(SEQ ID NO:123)的反义链的siRNA，
其中a、c、g和u分别是2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯、2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯、2'-O-甲基鸟苷-3'-磷酸酯和2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯；
Af、Cf、Gf和Uf分别是2'-氟腺苷-3'-磷酸酯、2'-氟胞苷-3'-磷酸酯、2'-氟鸟苷-3'-磷酸酯和2'-氟尿苷-3'-磷酸酯；
s是硫代磷酸酯键；并且
L96是N-[三(GalNAc-烷基)-酰胺基癸酰基)]-4-羟脯氨醇。
在上述方法、供使用的组合物或用于制备的用途的特定实施方式中，RNAi药剂是具有包括5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96 -3'(SEQ ID NO:124)的正义链和包括5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(SEQ ID NO:125)的反义链的siRNA。
其中a、c、g和u分别是2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯、2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯、2'-O-甲基鸟苷-3'-磷酸酯和2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯；
Af、Cf、Gf和Uf分别是2'-氟腺苷-3'-磷酸酯、2'-氟胞苷-3'-磷酸酯、2'-氟鸟苷-3'-磷酸酯和2'-氟尿苷-3'-磷酸酯；
(Agn)为腺苷-乙二醇核酸(GNA)；
s是硫代磷酸酯键；并且
L96是N-[三(GalNAc-烷基)-酰胺基癸酰基)]-4-羟脯氨醇。
在上述方法、供使用的组合物或用于制备的用途的特定实施方式中，RNAi药剂是具有包括5'-gsgsuggaCfuUfCfUfcucaAfUfuuuaL96 -3'(SEQ ID NO:126)的正义链和包括5'-usAfsaaaUfuGfAfgagaAfgUfccaccsasc-3'(SEQ ID NO:127)的反义链的siRNA，
其中a、c、g和u分别是2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯、2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯、2'-O-甲基鸟苷-3'-磷酸酯和2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯；
Af、Cf、Gf和Uf分别是2'-氟腺苷-3'-磷酸酯、2'-氟胞苷-3'-磷酸酯、2'-氟鸟苷-3'-磷酸酯和2'-氟尿苷-3'-磷酸酯；
s是硫代磷酸酯键；并且
L96是N-[三(GalNAc-烷基)-酰胺基癸酰基)]-4-羟脯氨醇。
在上述方法、供使用的组合物或用于制备的用途的特定实施方式中，受试者是人，并且向受试者施用治疗有效量的RNAi或siRNA；并且其中RNAi或siRNA的有效量为约1mg/kg至约8mg/kg。
在本文公开的方法、供使用的组合物或用途的一些实施方式中，向受试者每天两次、每天一次、每两天、每三天、每周两次、每周一次、每隔一周、每四周或每月一次施用siRNA。在一些实施方式中，其中向受试者每四周施用siRNA。
在某些实施方式中，所述方法包括将两种HBV基因表达抑制剂与抗HBV抗体一起施用。两种HBV基因表达抑制剂可以是两种siRNA，如靶向不同HBV基因的两种siRNA。两种不同的HBV基因可以例如是HBsAg和HBV X。可以同时施用两种HBV基因表达抑制剂。在某些实施方式中，施用各自定向到HBV基因的两个siRNA，并且第一siRNA具有包括SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:123或SEQ ID NO:125的反义链；并且第二siRNA包括具有正义链的siRNA，所述siRNA包含SEQ ID NO:116的核苷酸2850-3182中的至少15个连续核苷酸。在某些实施方式中，施用各自定向到HBV基因的两个siRNA，并且第一siRNA具有包括SEQ ID NO:121或SEQID NO:127的反义链，并且第二siRNA包括具有正义链的siRNA，所述siRNA包含SEQ ID NO:116的核苷酸2850-3182中的至少15个连续核苷酸。在某些实施方式中，施用各自定向到HBV基因的两个siRNA，并且第一siRNA具有包括SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:123或SEQ ID NO:125的反义链，并且第二siRNA具有包括SEQ ID NO:121或SEQ ID NO:127的反义链。在某些实施方式中，所述第一siRNA具有包括SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:122或SEQ ID NO:124的正义链；并且所述第二siRNA具有包括SEQ ID NO:120或SEQ ID NO:126的正义链。
在某些实施方式中，抗HBV抗体和HBV基因表达抑制剂表现出协同治疗效果。术语“协同”用于描述两种或更多种活性剂的组合效果大于每种相应活性剂的单独效果的总和。因此，当两种或更多种药剂的组合效果引起活性或过程的“协同抑制”时，意指所述活性或过程的抑制大于每种相应活性剂的抑制效应的总和。术语“协同治疗效果”指用两种或更多种疗法的组合观察到的治疗效果，其中治疗效果(如通过许多参数中的任何一个测量的)大于用相应个体疗法观察到的单独治疗效果的总和。
在一些实施方式中，将靶向HBV mRNA的RNAi药剂施用于患有HBV感染和/或HBV相关疾病的受试者，使得例如在受试者的细胞、组织、血液或体液中的一种或多种HBV基因的表达、HBV ccc DNA水平、HBV抗原水平、HBV病毒载量水平、ALT和/或AST降低至少约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、62％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或以上。
在一些实施方式中，将靶向HBV mRNA的RNAi药剂施用于患有HBV感染和/或HBV相关疾病的受试者，并将HBV基因表达抑制至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或约100％，即低于测定的检测水平。
在一些实施方式中，根据本公开的组合疗法包括施用核苷(酸)类似物作为第三组分。如本文所使用的，术语“核苷(酸)类似物”(或“聚合酶抑制剂”或“逆转录酶抑制剂”)是DNA复制抑制剂，其在结构上类似于核苷酸或核苷，并特异性地抑制HBV cccDNA的复制并且不会显著抑制宿主(例如，人)DNA的复制。所述抑制剂包括富马酸替诺福韦二吡呋酯(tenofovir disoproxil fumarate，TDF)、替诺福韦艾拉酚胺(tenofovir alafenamide，TAF)、拉米夫定、阿德福韦酯(adefovir dipivoxil)、恩替卡韦(ETV)、替比夫定、AGX-1009、恩曲他滨(emtricitabine，FTC)、克拉夫定(clevudine)、利托那韦(ritonavir)、福韦酯(dipivoxil)、洛布卡韦(lobucavir)、泛昔洛韦(famvir)、N-乙酰基-半胱氨酸(NAC)、PC1323、theradigm-HBV、胸腺肽-α以及更昔洛韦(ganciclovir)、贝西福韦(besifovir，ANA-380/LB-80380)和替诺福韦酯(tenofovir-exalidex，TLX/CMX157)。在某些实施方式中，核苷(酸)类似物是恩替卡韦(ETV)。核苷(酸)类似物可从许多来源商购获得，并根据其标签指示(例如，通常以特定剂量口服施用)或由熟练的从业者确定用于治疗HBV的本文提供的方法中。
抗HBV抗体或HBV基因表达抑制剂可以存在于与第三活性成分或抗HBV抗体、HBV基因表达抑制剂相同的药物组合物中，并且第三活性成分存在于三种不同的药物组合物中。此类不同药物组合物可以组合/同时或在不同时间或在不同位置(例如，身体的不同部分)施用。
本公开还提供以下实施方式：
实施方式1.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括：(i)重链可变区(VH)，在所述VH中包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的氨基酸序列，和SEQ ID NO:37的氨基酸序列；以及(ii)轻链可变区(VL)，在所述VL中包括SEQ ID NO:41、40、42和43中的任一者的氨基酸序列、如SEQ ID NO:49、44-48和50-53中的任一者所示的氨基酸序列和如SEQ ID NO:55或56所示的氨基酸序列，
其中任选地，所述VL包括与SEQ ID NO:58有关的R60N取代突变、R60A取代突变、R60K取代突变、S64A取代突变、I74A取代突变或其任何组合，并且其中所述取代突变的氨基酸编号如SEQ ID NO:58所示，并且仍进一步任选地，其中所述VL不包括与SEQ ID NO:58有关的任何另外的突变，并且其中所述抗体或其抗原结合片段能够与HBsAg的抗原环区结合，并且任选地，能够中和由基因型D、A、B、C、E、F、G、H、I或J或其任何组合的乙型肝炎病毒(HBV)引起的感染。
实施方式2.根据实施方式1所述的抗体或抗原结合片段，其包括：(i)在所述VH中，分别如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、49和55所示的氨基酸序列；(ii)在所述VH中，如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、46和55所示的氨基酸序列；(iii)在所述VH中，分别如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、47和55所示的氨基酸序列；(iv)在所述VH中，分别如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、48和55所示的氨基酸序列；(v)在所述VH中，分别如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、45和55所示的氨基酸序列；(vi)在所述VH中，分别如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、50和55所示的氨基酸序列；(vii)在所述VH中，分别如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、51和55所示的氨基酸序列；(viii)在所述VH中，分别如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、52和55所示的氨基酸序列；或者(ix)在所述VH中，分别如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、53和55所示的氨基酸序列。
实施方式3.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括：(i)重链可变区(VH)，所述VH包括如SEQ ID NO:34所示的CDRH1氨基酸序列、如SEQ ID NO:35或36所示的CDRH2氨基酸序列，和如SEQ ID NO:37所示的CDRH3氨基酸序列；以及(ii)轻链可变区(VL)，所述VL包括如SEQ ID NO:40-43中的任一者所示的CDRL1氨基酸序列、如SEQ IDNO:49、44-48和50-53中的任一者所示的CDRL2氨基酸序列，和如SEQ ID NO:55或56所示的CDRL3氨基酸序列，其中CDR是根据CCG编号系统定义的，并且其中所述抗体或其抗原结合片段能够与HBsAg的抗原环区结合，并且任选地，能够中和由基因型D、A、B、C、E、F、G、H、I或J或其任何组合的乙型肝炎病毒(HBV)引起的感染，条件是所述抗体或抗原结合片段不包括分别如SEQ ID NO:34、35、37、41、44和45所示的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。
实施方式4.根据实施方式3所述的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列如以下所示：(i)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、49和55；(ii)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、46和55；(iii)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、47和55；(iv)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、48和55；(v)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、45和55；(vi)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、50和55；(vii)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、51和55；(viii)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、52和55；(ix)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、53和55；或(x)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、44和55。
实施方式5.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH和所述VL包括分别如以下所示的CDRH1、CDRH2、CDRH3和CDRL1、CDRL2、CDRL3：HBC34-v40；HBC34-v36；HBC34-v37；HBC34-v38；HBC34-v39；HBC34-v41；HBC34-v42；HBC34-v43；HBC34-v44；HBC34-v45；HBC34-v46；HBC34-v47；HBC34-v48；HBC34-v49；或HBC34-v50，
其中所述CDR是根据IMGT编号定义的，任选地，其中所述VL进一步包括与SEQ IDNO:58有关的R60N取代突变、R60A取代突变、R60K取代突变、S64A取代突变、I74A取代突变或其任何组合，并且其中所述取代突变的氨基酸编号如SEQ ID NO:58所示，并且进一步任选地，其中所述VL不包括与SEQ ID NO:58有关的任何另外的突变。
实施方式6.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH和所述VL包括分别如以下所示的CDRH1、CDRH2、CDRH3和CDRL1、CDRL2、CDRL3：HBC34-v40；HBC34-v36；HBC34-v37；HBC34-v38；HBC34-v39；HBC34-v41；HBC34-v42；HBC34-v43；HBC34-v44；HBC34-v45；HBC34-v46；HBC34-v47；HBC34-v48；HBC34-v49；或HBC34-v50，
其中所述CDR是根据CCG编号定义的，任选地，其中所述VL进一步包括与SEQ IDNO:58有关的R60N取代突变、R60A取代突变、R60K取代突变、S64A取代突变、I74A取代突变或其任何组合，并且其中所述取代突变的氨基酸编号如SEQ ID NO:58所示，并且进一步任选地，其中所述VL不包括与SEQ ID NO:58有关的任何其它突变。
实施方式7.根据实施方式1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中：(i)所述VH包括与以下中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或由其组成：SEQID NO:38或39；和/或(ii)所述VL包括与以下中的任一者中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或由其组成：SEQ ID NO:62、58-61、63-66、69、71和72。
实施方式8.根据实施方式1至7中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中：(i)所述VH包括与以下中所示的氨基酸序列具有至少90％(即，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％或其间任何非整数值)同一性的氨基酸序列或由其组成：SEQ ID NO:38或39；和/或(ii)所述VL包括与SEQ ID NO:62、58-61、63-66、69、71和72中的任一者中所示的氨基酸序列具有至少90％(即，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％或其间任何非整数值)同一性的氨基酸序列或由其组成。
实施方式9.根据实施方式1至8中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述VH和所述VL包括与以下中所示的氨基酸序列具有至少90％(即，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或其间任何非整数值)同一性的氨基酸序列或由其组成：(i)分别为SEQ ID NO:38和62；(ii)分别为SEQ ID NO:38和59；(iii)分别为SEQ ID NO:38和60；(iv)分别为SEQ ID NO:38和61；(v)分别为SEQ ID NO:38和58；(vi)分别为SEQ ID NO:38和63；(vii)分别为SEQ ID NO:38和64；(viii)分别为SEQ ID NO:38和65；(ix)分别为SEQ IDNO:38和66；(x)分别为SEQ ID NO:38和71；或(xi)分别为SEQ ID NO:38和72。
实施方式10.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包括SEQ ID NO:38或39的氨基酸序列或由其组成，所述VL包括SEQ ID NO:62、57-61和63-72中的任一者的变体，其中所述变体包括以下突变中的任何一个或多个突变：R60A；R60N；R60K；S64A；和I74A，并且其中任选地，所述VL变体不包括分别相对于SEQ ID NO:62、57-61和63-72的任何另外的突变。
实施方式11.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包括SEQ ID NO:38或39的氨基酸序列或由其组成，所述VL包括SEQ ID NO:62、57-61和63-72中的任一者的变体，其中所述变体包括在Q78、D81或两者处的取代突变(例如，保守氨基酸取代，或种系编码的氨基酸的突变)，并且其中任选地，所述VL变体不包括分别相对于SEQ ID NO:62、57-61和63-72的任何另外的突变。
实施方式12.根据实施方式1至9中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中：所述VH包括SEQ ID NO:38或39中所示的氨基酸序列或由其组成；和/或所述VL包括SEQ ID NO:62、58-61、63-66、69、71或72中的任一者中所示的氨基酸序列或由其组成。
实施方式13.根据实施方式1至9和12中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述VH和所述VL包括以下中所示的氨基酸序列或由其组成：(i)分别为SEQ ID NO:38和62；(ii)分别为SEQ ID NO:38和59；(iii)分别为SEQ ID NO:38和60；(iv)分别为SEQ ID NO:38和61；(v)分别为SEQ ID NO:38和58；(vi)分别为SEQ ID NO:38和63；(vii)分别为SEQ IDNO:38和64；(viii)分别为SEQ ID NO:38和65；(ix)分别为SEQ ID NO:38和66；(x)分别为SEQ ID NO:38和71；或(xi)分别为SEQ ID NO:38和72。
实施方式14.一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH和所述VL包括以下中所示的氨基酸序列或由其组成：(i)分别为SEQ ID NO:38和62；(ii)分别为SEQ ID NO:38和66；(iii)分别为SEQ ID NO:38和67；(iv)分别为SEQ ID NO:38和68；或(v)分别为SEQ ID NO:38和72，
其中所述抗体或其抗原结合片段能够与HBsAg的抗原环区结合并且能够中和由基因型D、A、B、C、E、F、G、H、I或J或其任何组合的乙型肝炎病毒(HBV)引起的感染。
实施方式15.根据实施方式1至14中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其能够中和由丁型肝炎病毒(HDV)引起的感染。
实施方式16.根据实施方式1至15中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中在包括多个所述抗体或抗原结合片段的样品中，当所述样品已在约40℃下温育持续约120小时至约168小时时，包括所述多个中的少于12％、11％或更少、10％或更少、9％或更少、8％或更少、7％或更少、6％或更少、5％或更少、4％或更少、3％或更少或2％或更少包含在二聚体中，其中任选地，通过绝对尺寸排阻色谱法确定二聚体的存在。
实施方式17.根据实施方式1至16中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中与温育多个参考抗体或抗原结合片段相比，温育多个所述抗体或抗原结合片段使二聚体形成减少，
其中所述参考抗体或抗原结合片段包括分别如SEQ ID NO:34、35、37、41、44和55所示的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，并且任选地包括SEQ ID NO:38中所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:57中所示的VL氨基酸序列，
并且其中任选地，通过绝对尺寸排阻色谱法确定抗体二聚体的存在。
实施方式18.根据实施方式1至17中任一项所述的抗体或抗原结合片段，与参考抗体相比，在以下条件下所述抗体或抗原结合片段形成更低量的二聚体，和/或以减少的频率和/或以样品或组合物中总抗体或抗原结合片段分子的更低百分比形成二聚体，
(i)在4℃下温育5天、15天和/或32天；
(ii)在25℃下温育5天、15天和/或32天；和/或
(iii)在40℃下温育5天、15天和/或32天，
其中所述参考抗体或抗原结合片段包括分别如SEQ ID NO:34、35、37、41、44和55所示的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，并且任选地包括SEQ ID NO:38中所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:57中所示的VL氨基酸序列。
实施方式19.根据实施方式1至18中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中在组合物中包含在二聚体中的抗体或抗原结合片段分子的百分比分别是在组合物中包含在二聚体中的参考抗体分子的百分比的少于4/5、少于3/4、少于1/2、少于1/3、少于1/4、少于1/5、少于1/6、少于1/7、少于1/8、少于1/9或少于1/10。
实施方式20.根据实施方式1至19中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中相较于用编码参考抗体或抗原结合片段的多核苷酸转染的参考宿主细胞，用编码所述抗体或抗原结合片段的多核苷酸转染的宿主细胞分别提供了1.5倍或更多倍、2倍或更多倍、3倍或更多倍或4倍或更多倍的抗体或抗原结合片段的量，其中所述参考抗体或抗原结合片段包括分别如SEQ ID NO:34、35、37、41、44和55所示的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，并且任选地包括SEQ ID NO:38中所示的VH氨基酸序列和SEQ IDNO:57中所示的VL氨基酸序列。
实施方式21.根据实施方式1至20中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中与在参考转染细胞中产生的参考抗体或抗原结合片段相比，所述抗体或其抗原结合片段以更高的滴度在转染细胞中产生，其中所述参考抗体或抗原结合片段包括分别如SEQ ID NO:34、35、37、41、44和55所示的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，并且任选地包括SEQ ID NO:38中所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:57中所示的VL氨基酸序列。
实施方式22.根据实施方式1至21中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以一定滴度在转染细胞中产生，所述滴度是参考抗体或抗原结合片段产生的滴度的至少1.5倍、至少2倍、至少3倍或至少4倍，其中所述参考抗体或抗原结合片段包括分别如SEQ ID NO:34、35、37、41、44和55所示的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，并且任选地包括SEQ ID NO:38中所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:57中所示的VL氨基酸序列。
实施方式23.根据实施方式1至22中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够以约3.2或更小、小于3.0、小于2.5、小于2.0、小于1.5或小于1.0的EC50(ng/ml)与HBsAg(adw)结合。
实施方式24.根据实施方式1至23中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够以小于3.5、小于3.4、小于3.3、小于3.2、小于3.1、小于3.0、小于2.9、小于2.8、小于2.7、小于2.6、小于2.5、小于2.4、小于2.3、小于2.1、小于2.0、小于1.9、小于1.8、小于1.7、小于1.6、小于1.5、小于1.4、小于1.3、小于1.2、小于1.1或小于1.0的EC50(ng/ml)与HBsAg(例如，亚型adw的HBsAg)结合。
实施方式25.根据实施方式1至24中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够以介于0.9与2.0之间、或介于0.9与1.9之间、或介于0.9与1.8之间、或介于0.9与1.7之间、或介于0.9与1.6之间、或介于0.9与1.5之间、或介于0.9与1.4之间、或介于0.9与1.3之间、或介于0.9与1.2之间、或介于0.9与1.1之间、或介于0.9与1.0之间、或介于1.0与2.0之间的EC50(ng/ml)与HBsAg(例如，亚型adw的HBsAg)结合。
实施方式26.根据实施方式1至25中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够以2.0或更小的EC50(ng/ml)与HBsAg(adw)结合。
实施方式27.根据实施方式1至26中任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段具有小于20ng/ml，优选地15ng/ml或更小，更优选地10ng/mL或更小的乙型肝炎病毒感染中和EC50。
实施方式28.根据实施方式1至27中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够以18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8或7ng/mL的感染中和EC50中和乙型肝炎病毒感染。
实施方式29.根据实施方式1至28中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够以比参考抗体或抗原结合片段的感染中和EC50更低的感染中和EC50来中和乙型肝炎病毒感染，所述参考抗体或抗原结合片段包括分别如SEQ ID NO:34、35、37、41、44和55所示的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，并且任选地包括SEQ ID NO:38中所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:57中所示的VL氨基酸序列。
实施方式30.根据实施方式1至29任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括人抗体、单克隆抗体、经纯化的抗体、单链抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。
实施方式31.根据实施方式1至30任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是多特异性抗体或抗原结合片段。
实施方式32.根据实施方式1至31中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是双特异性抗体或抗原结合片段。
实施方式33.根据实施方式1至32中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或所述抗原结合片段包含Fc部分。
实施方式34.根据实施方式33所述的抗体或抗原结合片段，其中与不包括所述突变的参考Fc部分相比，所述Fc部分包括增强与FcRn的结合的突变。
实施方式35.根据实施方式33或34所述的抗体或抗原结合片段，其中与不包括所述突变的参考Fc部分相比，所述Fc部分包括增强与FcγR，优选地FcγRIIA和/或FcγRIIIA结合的突变。
实施方式36.根据实施方式33至35中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述Fc部分是IgG同种型，如IgG1，或源自IgG同种型，如IgG1。
实施方式37.根据实施方式33至36中任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括或源自Ig G1m17,1(IgHG1*01)。
实施方式38.根据实施方式34至37中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述增强与FcRn的结合的突变包括：(i)M428L/N434S；(ii)M252Y/S254T/T256E；(iii)T250Q/M428L；(iv)P257I/Q311I；(v)P257I/N434H；(vi)D376V/N434H；(vii)T307A/E380A/N434A；或(viii)(i)至(vii)的任何组合，其中所述Fc部分的氨基酸编号是根据EU编号系统的。
实施方式39.根据实施方式38所述的抗体或抗原结合片段，其中所述增强与FcRn结合的突变包括M428L/N434S。
实施方式40.根据实施方式35至39中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述增强与FcγR的结合的突变包括：S239D；I332E；A330L；G236A；或其任何组合，其中所述Fc部分的氨基酸编号是根据EU编号系统的。
实施方式41.根据实施方式40所述的抗体或抗原结合片段，其中所述增强与FcγR的结合的突变包括：(i)S239D/I332E；(ii)S239D/A330L/I332E；(iii)G236A/S239D/I332E；或(iv)G236A/A330L/I332E。
实施方式42.根据实施方式40或41所述的抗体或抗原结合片段，其中所述增强与FcγR的结合的突变包括G236A/A330L/I332E或由其组成，并且任选地，其中所述抗体或抗原结合片段不包括S239D，并且其中所述抗体或抗原结合片段进一步任选地包括在位置239处的天然S。
实施方式43.根据实施方式33至42中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述Fc部分包括以下氨基酸取代突变：M428L；N434S；G236A；A330L；以及I332E，并且任选地不包括S239D。
实施方式44.根据实施方式1至43中任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括轻链恒定区(CL)，所述CL包括与SEQ ID NO:79的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
实施方式45.根据实施方式1至44中任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括CH1-CH2-CH3，所述CH1-CH2-CH3包括与SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其变体或由其组成，所述变体包括以下氨基酸取代中的一个或多个(EU编号)：G236A；A330L；I332E；M428L；N434S。
实施方式46.根据实施方式45所述的抗体或抗原结合片段，其中所述CH1-CH2-CH3的C末端赖氨酸被去除。
实施方式47.一种抗体，其包括：重链(HC)，所述HC包括SEQ ID NO:75中所示的氨基酸序列或由其组成，任选地C末端赖氨酸被去除；以及轻链(LC)，其中所述LC包括以下或由以下组成：(i)SEQ ID NO:62、58-61和63-72中的任一者中所示的VL氨基酸序列；以及(ii)SEQ ID NO:79中所示的CL氨基酸序列。
实施方式48.根据实施方式47所述的抗体，其中所述LC包括SEQ ID NO:62、66、67和72中的任一者中所示的VL氨基酸序列。
实施方式49.一种抗体，其包括：重链(HC)，所述HC包括SEQ ID NO:76中所示的氨基酸序列或由其组成，任选地C末端赖氨酸被去除；以及轻链(LC)，其中所述LC包括以下或由以下组成：(i)SEQ ID NO:62、58-61和63-72中的任一者中所示的VL氨基酸序列；以及(ii)SEQ ID NO:79中所示的CL氨基酸序列。
实施方式50.根据实施方式49所述的抗体，其中所述LC包括SEQ ID NO:62、66、67和72中的任一者中所示的VL氨基酸序列。
实施方式51.一种抗体，其包括：重链(HC)，所述HC包括SEQ ID NO:77中所示的氨基酸序列或由其组成，任选地C末端赖氨酸被去除；以及轻链(LC)，其中所述LC包括以下或由以下组成：(i)SEQ ID NO:62、58-61和63-72中的任一者中所示的VL氨基酸序列；以及(ii)SEQ ID NO:79中所示的CL氨基酸序列。
实施方式52.根据实施方式51所述的抗体，其中所述LC包括SEQ ID NO:62、66、67和72中的任一者中所示的VL氨基酸序列。
实施方式53.一种抗体，其包括：重链(HC)，所述HC包括SEQ ID NO:78中所示的氨基酸序列或由其组成，任选地C末端赖氨酸被去除；以及轻链(LC)，其中所述LC包括以下或由以下组成：(i)SEQ ID NO:62、58-61和63-72中的任一者中所示的VL氨基酸序列；以及(ii)SEQ ID NO:79中所示的CL氨基酸序列。
实施方式54.根据实施方式53所述的抗体，其中所述LC包括SEQ ID NO:62、66、67和72中的任一者中所示的VL氨基酸序列。
实施方式55.根据实施方式1至54中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或所述抗原结合片段能够与选自HBsAg基因型A、B、C、D、E、F、G、H、I和J或其任何组合的基因型的HBsAg结合。
实施方式56.根据实施方式1至55中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够降低患有HBV感染的哺乳动物中HBV DNA的血清浓度。
实施方式57.根据实施方式1至56中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够降低患有HBV感染的哺乳动物中HBsAg的血清浓度。
实施方式58.根据实施方式1至57中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够降低患有HBV感染的哺乳动物中HBeAg的血清浓度。
实施方式59.根据实施方式1至58中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够降低患有HBV感染的哺乳动物中HBcrAg的血清浓度。
实施方式60.一种多核苷酸，其包括编码根据实施方式1至59中任一项所述的抗体或抗原结合片段的核苷酸序列。
实施方式61.一种多核苷酸，其编码根据实施方式1至59中任一项所述的抗体或抗原结合片段的轻链可变区(VL)，以及任选地轻链恒定区(CL)。
实施方式62.根据实施方式61所述的多核苷酸，其中编码所述抗体或所述抗原结合片段的所述核苷酸序列被密码子优化以在宿主细胞中表达。
实施方式63.根据实施方式62所述的多核苷酸，其包括与如SEQ ID NO:89、85-88和90-99中的任一者所示的核苷酸序列具有至少50％同一性的核苷酸序列。
实施方式64.根据实施方式60至63中任一项所述的多核苷酸，其包括：(i)SEQ IDNO:81或SEQ ID NO:82中所示的多核苷酸序列；以及(ii)SEQ ID NO:89、85-88和90-99中的任何一者或多者中所示的多核苷酸序列。
实施方式65.根据实施方式60至63中任一项所述的多核苷酸，其包括：(i)SEQ IDNO:83中所示的多核苷酸序列；以及(ii)SEQ ID NO:89、85-88和90-99中的任何一者或多者中所示的多核苷酸序列。
实施方式66.根据实施方式60至63中任一项所述的多核苷酸，其包括：(i)SEQ IDNO:84中所示的多核苷酸序列；以及(ii)SEQ ID NO:89、85-88和90-99中的任何一者或多者中所示的多核苷酸序列。
实施方式67.一种载体，其包括根据实施方式60至66中任一项所述的多核苷酸。
实施方式68.根据实施方式67所述的载体，其中所述载体包括慢病毒载体或逆转录病毒载体。
实施方式69.一种宿主细胞，其包括根据实施方式60至66中任一项所述的多核苷酸和/或根据实施方式67或68所述的载体。
实施方式70.一种药物组合物，其包含：(i)根据实施方式1至59中任一项所述的抗体或抗原结合片段；(ii)根据实施方式60至66中任一项所述的多核苷酸；(iii)根据实施方式67或68所述的载体；(iv)根据实施方式69所述的宿主细胞；或(v)(i)-(iv)的任何组合，以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
实施方式71.一种试剂盒，其包括：
(a)选自以下的组分：(i)根据实施方式1至59中任一项所述的抗体或抗原结合片段；(ii)根据实施方式60至66中任一项所述的多核苷酸；(iii)根据实施方式67或68所述的载体；
(iv)根据实施方式69所述的宿主细胞；(v)根据实施方式70所述的药物组合物；或(vi)(i)-(vi)的任何组合；以及
(b)(1)使用所述组分来预防、治疗、减轻和/或诊断乙型肝炎感染和/或丁型肝炎感染的说明书和/或(2)用于向受试者施用所述组分的工具，如注射器。
实施方式72.根据实施方式70所述的药物组合物或根据实施方式71所述的试剂盒，其进一步包括：(i)聚合酶抑制剂，其中所述聚合酶抑制剂任选地包括拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦或其任何组合；(ii)干扰素，其中所述干扰素任选地包括IFNβ和/或IFNα；(iii)检查点抑制剂，其中所述检查点抑制剂任选地包括抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段和/或抗CTLA4抗体或其抗原结合片段；(iv)刺激性免疫检查点分子的激动剂；或(x)(i)-(iv)的任何组合。
实施方式73.根据实施方式72所述的组合物或试剂盒，其中所述聚合酶抑制剂包含拉米夫定。
实施方式74.一种产生根据实施方式1至59中任一项所述的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括在足以产生所述抗体或抗原结合片段的条件下培养根据实施方式69所述的宿主细胞，并且持续足以产生所述抗体或抗原结合片段的时间。
实施方式75.一种(i)根据实施方式1至59中任一项所述的抗体或抗原结合片段；(ii)根据实施方式60至66中任一项所述的多核苷酸；(iii)根据实施方式67或68所述的载体；(iv)根据实施方式69所述的宿主细胞；和/或(v)根据实施方式70、72或73所述的药物组合物在制备用于预防、治疗、减轻和/或诊断受试者的乙型肝炎感染和/或丁型肝炎感染的药物中的用途。
实施方式76.一种治疗、预防和/或减轻受试者的乙型肝炎和/或丁型肝炎感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的：(i)根据实施方式1至59中任一项所述的抗体或抗原结合片段；(ii)根据实施方式60至66中任一项所述的多核苷酸；(iii)根据实施方式67或68所述的载体；(iv)根据实施方式69所述的宿主细胞；和/或(v)根据实施方式70、72或73所述的药物组合物。
实施方式77.根据实施方式76所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用以下中的一种或多种：(vi)聚合酶抑制剂，其中所述聚合酶抑制剂任选地包括拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦或其任何组合；(vii)干扰素，其中所述干扰素任选地包括IFNβ和/或IFNα；(viii)检查点抑制剂，其中所述检查点抑制剂任选地包括抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段和/或抗CTLA4抗体或其抗原结合片段；(ix)刺激性免疫检查点分子的激动剂；或(x)(vi)-(ix)的任何组合。
实施方式78.根据实施方式76或77所述的方法，其中所述乙型肝炎感染是慢性乙型肝炎感染。
实施方式79.根据实施方式76至78中任一项所述的方法，其中所述受试者已接受肝移植。
实施方式80.根据实施方式76至79中任一项所述的方法，其中所述受试者未针对乙型肝炎进行免疫。
实施方式81.根据实施方式76至80中任一项所述的方法，其中所述受试者是新生儿。
实施方式82.根据实施方式76至81中任一项所述的方法，其中所述受试者正在经历或已经经历血液透析。
实施方式83.根据实施方式76至82中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用单剂量的包含所述抗体或抗原结合片段的药物组合物。
实施方式84.根据实施方式83所述的方法，其中所述药物组合物的所述单剂量包括范围为2至18mg/kg(受试者体重)的所述抗体。
实施方式85.根据实施方式83或84所述的方法，其中所述药物组合物的所述单剂量包括至多6mg、至多10mg、至多15mg、至多18mg、至多25mg、至多30mg、至多35mg、至多40mg、至多45mg、至多50mg、至多55mg、至多60mg、至多75mg、至多90mg、至多300mg、至多900mg或至多3000mg的所述抗体，
或者其中所述药物组合物的所述单剂量包括范围为1mg至3000mg、或范围为5mg至3000mg、或范围为10mg至3000mg、或范围为25mg至3000mg、或范围为30mg至3000mg、或范围为50mg至3000mg、或范围为60mg至3000mg、或范围为75mg至3000mg、或范围为90mg至3000mg、或范围为100mg至3000mg、或范围为150mg至3000mg、或范围为200mg至3000mg、或范围为300mg至3000mg、或范围为500mg至3000mg、或范围为750mg至3000mg、或范围为900mg至3000mg、或范围为1500mg至3000mg、或范围为2000mg至3000mg的量的所述抗体，
或者其中所述药物组合物的所述单剂量包括范围为1mg至900mg、或范围为5mg至900mg、或范围为10mg至900mg、或范围为25mg至900mg、或范围为30mg至900mg、或范围为50mg至900mg、或范围为60mg至900mg、或范围为75mg至900mg、或范围为90mg至900mg、或范围为100mg至900mg、或范围为150mg至900mg、或范围为200mg至900mg、或范围为300mg至900mg、或范围为500mg至900mg、或范围为750mg至900mg的量的所述抗体，
或者其中所述药物组合物的所述单剂量包括范围为1mg至500mg、或范围为5mg至500mg、或范围为10mg至500mg、或范围为25mg至500mg、或范围为30mg至500mg、或范围为50mg至500mg、或范围为60mg至500mg、或范围为75mg至500mg、或范围为90mg至500mg、或范围为100mg至500mg、或范围为150mg至500mg、或范围为200mg至500mg、或范围为300mg至500mg或范围为400mg至500mg的量的所述抗体，
或者其中所述药物组合物的所述单剂量包括范围为1mg至300mg、或范围为5mg至300mg、或范围为10mg至300mg、或范围为25mg至300mg、或范围为30mg至300mg、或范围为50mg至300mg、或范围为60mg至300mg、或范围为75mg至300mg、或范围为90mg至300mg、或范围为100mg至300mg、或范围为150mg至300mg、或范围为200mg至300mg的量的所述抗体，
或者其中所述药物组合物的所述单剂量包括范围为1mg至200mg、或范围为5mg至200mg、或范围为10mg至200mg、或范围为25mg至200mg、或范围为30mg至200mg、或范围为50mg至200mg、或范围为60mg至200mg、或范围为75mg至200mg、或范围为90mg至200mg、或范围为100mg至200mg、或范围为150mg至200mg的量的所述抗体，
或者其中所述药物组合物的所述单剂量包括范围为1mg至100mg、或范围为5mg至100mg、或范围为10mg至100mg、或范围为25mg至100mg、或范围为30mg至100mg、或范围为50mg至100mg、或范围为60mg至100mg、或范围为75mg至100mg、或范围为75mg至100mg、或范围为90mg至100mg的量的所述抗体，
或者其中所述药物组合物的所述单剂量包括范围为1mg至25mg、或范围为5mg至25mg、或范围为10mg至25mg、或范围为15mg至25mg、或范围为20mg至25mg的量的所述抗体，
或者其中所述药物组合物的所述单剂量包括范围为1mg至50mg、或范围为1mg至25mg、或范围为5mg至50mg、或范围为5mg至25mg、或范围为10至50mg、或范围为10至25mg、或范围为1至15mg、或范围为5mg至15mg、或范围为10mg至15mg的量的所述抗体，或者其中所述药物组合物的所述单剂量包括1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg、160mg、165mg、170mg、175mg、180mg、185mg、190mg、195mg、200mg、205mg、210mg、215mg、220mg、225mg、230mg、235mg、240mg、245mg、250mg、255mg、260mg、265mg、270mg、275mg、280mg、285mg、290mg、295mg、300mg、305mg、310mg、315mg、320mg、325mg、330mg、335mg、340mg、345mg、350mg、355mg、360mg、365mg、370mg、375mg、380mg、385mg、390mg、395mg、400mg、405mg、410mg、415mg、420mg、425mg、430mg、435mg、440mg、445mg、450mg、455mg、460mg、465mg、470mg、475mg、480mg、485mg、490mg、495mg、500mg、505mg、510mg、515mg、520mg、525mg、530mg、535mg、540mg、545mg、550mg、555mg、560mg、565mg、570mg、575mg、580mg、585mg、590mg、595mg、600mg、605mg、610mg、615mg、620mg、625mg、630mg、635mg、640mg、645mg、650mg、655mg、660mg、665mg、670mg、675mg、680mg、685mg、690mg、695mg、700mg、705mg、710mg、715mg、720mg、725mg、730mg、735mg、740mg、745mg、750mg、755mg、760mg、765mg、770mg、775mg、780mg、785mg、790mg、795mg、800mg、805mg、810mg、815mg、820mg、825mg、830mg、835mg、840mg、845mg、850mg、855mg、860mg、865mg、870mg、875mg、880mg、885mg、890mg、895mg、900mg、905mg、910mg、915mg、920mg、925mg、930mg、935mg、940mg、945mg、950mg、955mg、960mg、965mg、970mg、975mg、980mg、985mg、990mg、995mg或1000mg或更多的所述抗体，
或者其中所述药物组合物的所述单剂量包括少于3000mg、少于2500mg、少于2000mg、少于1500mg、少于1000mg、少于900mg、少于500mg、少于300mg、少于200mg、少于100mg、少于90mg、少于75mg、少于50mg、少于25mg或少于10mg，但多于1mg、多于2mg、多于3mg、多于4mg或多于5mg的量的所述抗体。
实施方式86.根据实施方式83至85中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的所述单剂量包含浓度在100mg/mL至200mg/mL的范围内的所述抗体，如100mg/mL、110mg/mL、120mg/mL、130mg/mL、140mg/mL、150mg/mL、160mg/mL、170mg/mL、180mg/mL、190mg/mL或200mg/mL，优选地150mg/mL。
实施方式87.根据实施方式83至86中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的所述单剂量包含约75mg的所述抗体。
实施方式88.根据实施方式83至87中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的所述单剂量包含约90mg的所述抗体。
实施方式89.根据实施方式83至88中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的所述单剂量包含至多300mg的所述抗体。
实施方式90.根据实施方式83至89中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的所述单剂量包含至多900mg的所述抗体。
实施方式91.根据实施方式83至90中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的所述单剂量包含至多3,000mg的所述抗体。
实施方式92.根据实施方式83至91中任一项所述的方法，其中所述方法包括通过皮下注射施用所述单剂量，任选地其中所述单剂量包括6mg的所述抗体或18mg的所述抗体或由其组成。
实施方式93.根据实施方式83至92中任一项所述的方法，其中所述方法包括通过静脉内注射施用所述单剂量。
实施方式94.根据实施方式83至93中任一项所述的方法，其中所述药物组合物进一步包含水，任选地USP水。
实施方式95.根据实施方式83至94中任一项所述的方法，其中所述药物组合物进一步包含组氨酸，任选地在所述药物组合物中浓度范围为10mM至40mM，如20mM。
实施方式96.根据实施方式83至95中任一项所述的方法，其中所述药物组合物进一步包含二糖，如蔗糖，任选地5％、6％、7％、8％或9％，优选地约7％(w/v)。
实施方式97.根据实施方式83至96中任一项所述的方法，其中所述药物组合物进一步包含表面活性剂或三嵌段共聚物，任选地聚山梨醇酯或泊洛沙姆-188，优选地聚山梨醇酯80(PS80)，其中任选地所述聚山梨醇酯或泊洛沙姆-188存在范围为0.01％至0.05％(w/v)，优选地0.02％(w/v)。
实施方式98.根据实施方式83至97中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的pH在5.8至6.2的范围内、在5.9至6.1的范围内，或为5.8、5.9、6.0、6.1或6.2。
实施方式99.根据实施方式98所述的方法，其中所述药物组合物包含：
(i)150mg/mL的所述抗体；
(ii)USP水；
(iii)20mM组氨酸；
(iv)7％蔗糖；以及
(v)0.02％ PS80，
其中所述药物组合物的pH为6。
实施方式100.根据实施方式83至99中任一项所述的方法，其中所述受试者是成人。
实施方式101.根据实施方式100所述的方法，其中所述受试者的年龄范围为18岁至65岁。
实施方式102.根据实施方式83至101中任一项所述的方法，其中所述受试者的体重为40kg至125kg，和/或所述受试者的体质指数(BMI)为18至35kg/m2。
实施方式103.根据实施方式83至102中任一项所述的方法，其中所述受试者患有慢性HBV感染；例如，由2次血清HBsAg、HBV DNA和/或HBeAg阳性定义，其中所述2次相隔至少6个月。
实施方式104.根据实施方式83至103中任一项所述的方法，其中所述受试者未患有肝硬化。
实施方式105.根据实施方式104所述的方法，其中不存在肝硬化由以下确定：
Fibroscan评估(例如，在施用所述药物组合物的所述单剂量之前6个月内)；或
肝活检(例如，在施用所述药物组合物的所述单剂量之前12个月内)，
其中优选地不存在肝硬化由不存在Metavir F3纤维化或不存在F4肝硬化来确定。
实施方式106.根据实施方式83至105中任一项所述的方法，其中在施用所述单剂量之前，所述受试者已经任选地在120天内，进一步任选地在60天内接受核苷(酸)逆转录酶抑制剂(NRTI)。
实施方式107.根据实施方式106所述的方法，其中所述NRTI包括以下中的一种或多种：替诺福韦；替诺福韦二吡呋酯(例如，富马酸替诺福韦二吡呋酯)；替诺福韦艾拉酚胺；恩替卡韦；拉米夫定；阿德福韦；以及阿德福韦酯。
实施方式108.根据实施方式83至107中任一项所述的方法，其中在施用所述单剂量之前不超过28天，所述受试者的血清HBV DNA浓度低于100IU/mL。
实施方式109.根据实施方式83至108中任一项所述的方法，其中在施用所述单剂量之前，所述受试者的血清HBsAg浓度低于3,000IU/mL，并且任选地，在施用所述单剂量之前，所述受试者的血清HBsAg浓度低于1,000IU/mL。
实施方式110.根据实施方式83至109中任一项所述的方法，其中在施用所述单剂量之前不超过28天，所述受试者的血清HBsAg浓度高于或等于3,000IU/mL，并且任选地，在施用所述单剂量之前不超过28天，所述受试者的血清HBsAg浓度高于或等于1,000IU/mL。
实施方式111.根据实施方式83至110中任一项所述的方法，其中在施用所述单剂量之前不超过28天，所述受试者对HB e抗原(HBeAg)呈阴性。
实施方式112.根据实施方式83至111中任一项所述的方法，其中在施用所述单剂量之前不超过28天，所述受试者对抗HB抗体呈阴性。
实施方式113.根据实施方式83至112中任一项所述的方法，其中在施用所述单剂量之前：
(i)所述受试者未患纤维化和/或未患肝硬化；和/或
(ii)所述受试者的丙氨酸转氨酶(ALT)<2x正常上限(ULN)。
实施方式114.根据实施方式83至113中任一项所述的方法，其中与在施用所述单剂量之前0天至28天所述受试者的血清HBsAg(例如，血清中HBsAg的浓度，例如使用雅培公司ARCHITECT测定确定的)相比，在施用所述单剂量之后56天所述受试者的所述血清HBsAg减少>2倍。
实施方式115.根据实施方式83至114中任一项所述的方法，其中在施用所述单剂量之后(例如，在施用所述单剂量之后56天)，
(i)与参考受试者相比，所述受试者的HBV的肝内传播减少或不太严重；和/或
(ii)所述受试者包括针对HBV的适应性免疫应答。
实施方式116.根据实施方式83至115中任一项所述的方法，其中所述受试者是男性。
实施方式117.根据实施方式83至115中任一项所述的方法，其中所述受试者是女性。
实施方式118.一种药物组合物，其包含浓度范围为100mg/mL至200mg/mL，如100mg/mL、110mg/mL、120mg/mL、130mg/mL、140mg/mL、150mg/mL、160mg/mL、170mg/mL、180mg/mL、190mg/mL或200mg/mL，优选地150mg/mL的根据实施方式1至59中任一项所述的抗体或抗原结合片段，
以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
实施方式119.根据实施方式118所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含至多6mg、至多18mg、至多75mg、至多90mg、至多300mg、至多900mg或至多3000mg的所述抗体。
实施方式120.根据实施方式118或119所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含约75mg的所述抗体。
实施方式121.根据实施方式118或119所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含约90mg的所述抗体。
实施方式122.根据实施方式118或119所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含约300mg的所述抗体。
实施方式123.根据实施方式118或119所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含约900mg的所述抗体。
实施方式124.根据实施方式118或119所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含约3,000mg的所述抗体。
实施方式125.根据实施方式118至124中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含水，任选地USP水。
实施方式126.根据实施方式118至125中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含组氨酸，任选地在所述药物组合物中浓度为10mM至40mM，如20mM。
实施方式127.根据实施方式118至126中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含二糖，如蔗糖，任选地以5％、6％、7％、8％或9％，优选地约7％(w/v)。
实施方式128.根据实施方式118至127中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含表面活性剂，任选地聚山梨醇酯，优选地聚山梨醇酯80(PS80)，其中任选地所述聚山梨醇酯以0.01％至0.05％(w/v)的范围，优选地0.02％(w/v)存在。
实施方式129.根据实施方式118至128中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH在5.8至6.2的范围内、在5.9至6.1的范围内，或为5.8、5.9、6.0、6.1或6.2。
实施方式130.根据实施方式118至129中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含：
(i)150mg/mL的所述抗体；
(ii)USP水；
(iii)20mM组氨酸；
(iv)7％蔗糖；以及
(v)0.02％ PS80，
其中所述药物组合物的pH为6。
实施方式131.根据实施方式83至117中任一项所述的方法，其中在施用所述单剂量之后，相较于基线，所述受试者的血清HBsAg减少了1.0log10 IU/mL、1.5log10 IU/mL或更多，其中任选地，在施用所述单剂量之后，所述减少持续1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天或更多天。
实施方式132.根据实施方式83至117和131中任一项所述的方法，其中在施用所述单剂量之后，相较于基线，所述受试者的血清HBsAg减少持续至少8天、至少15天、至少22天或至少29天。
实施方式133.一种用于体外诊断乙型肝炎和/或丁型肝炎感染的方法，所述方法包括：
(i)使来自受试者的样品与根据实施方式1至59中任一项所述的抗体或抗原结合片段接触；以及
(ii)检测复合物，所述复合物包括抗原和所述抗体，或包括抗原和所述抗原结合片段。
实施方式134.根据实施方式133所述的方法，其中所述样品包括从所述受试者中分离的血液。
实施方式135.一种用于检测抗乙型肝炎和/或抗丁型肝炎疫苗中呈正确构象的表位的存在或不存在的方法，所述方法包括：
(i)使所述疫苗与根据实施方式1至59中任一项所述的抗体或抗原结合片段接触；以及
(ii)确定包括抗原和所述抗体或包括抗原和所述抗原结合片段的复合物是否已经形成。
实施方式136.根据实施方式1至59中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中
(i)与包括不包含G236A/A330L/I332E的Fc部分的参考多肽相比，所述抗体或抗原结合片段增强与人FcγRIIA、人FcγRIIIA或两者的结合，其中所述人FcγRIIA任选地为H131或R131，和/或所述人FcγRIIIA任选地为F158或V158；
(ii)与包括不包含G236A/A330L/I332E的Fc部分的参考多肽相比，所述抗体或抗原结合片段降低与人FcγRIIB的结合；
(iii)所述抗体或抗原结合片段不与人FcγRIIB结合；
(iv)与包括不包含G236A/A330L/I332E的Fc部分的参考多肽相比，所述抗体或抗原结合片段降低与人C1q的结合；
(v)所述抗体或抗原结合片段不与人C1q结合；(vi)与包括不包含G236A/A330L/I332E的Fc部分的参考多肽相比，所述抗体或抗原结合片段在更大程度上激活FcγRIIA、人FcγRIIIA或两者，其中所述人FcγRIIA任选地为H131或R131，和/或所述人FcγRIIIA任选地为F158或V158；
(vii)所述抗体或抗原结合片段不激活人FcγRIIB；
(viii)在存在HBsAg的情况下，与包括不包含G236A/A330L/I332E的Fc部分的参考多肽相比，所述抗体或抗原结合片段在更大程度上激活人自然杀伤(NK)细胞，其中所述参考多肽任选地是与HB Ag，任选地HBsAg结合的抗体；
(ix)所述抗体或抗原结合片段能够与HBsAg变体结合，所述HBsAg变体包括HBsAg-Y100C/P120T、HBsAg-P120T、HBsAg-P120S/S143L、HBsAg-C121S、HBsAg-R122D、HBsAg-R122I、HBsAg-T123N、HBsAg-Q129H、HBsAg-Q129L、HBsAg-M133H、HBsAg-M133L、HBsAg-M133T、HBsAg-K141E、HBsAg-P142S、HBsAg-S143K、HBsAg-D144A、HBsAg-G145R、HBsAg-N146A或其任何组合；和/或(x)与和HBsAg结合并且包括不包含G236A/A330L/I332E的Fc部分的参考抗体或抗原结合片段相比，所述抗体或抗原结合片段改善了与HBsAg变体的结合，所述HBsAg变体包括HBsAg-Y100C/P120T、HBsAg-P120T、HBsAg-P120S/S143L、HBsAg-C121S、HBsAg-R122D、HBsAg-R122I、HBsAg-T123N、HBsAg-Q129H、HBsAg-Q129L、HBsAg-M133H、HBsAg-M133L、HBsAg-M133T、HBsAg-K141E、HBsAg-P142S、HBsAg-S143K、HBsAg-D144A、HBsAg-G145R、HBsAg-N146A或其任何组合。
实施方式137.一种治疗有需要的受试者的慢性HBV感染的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用降低HBV抗原负荷的药剂；以及
向所述受试者施用实施方式1至59中任一项的抗HBV抗体。
实施方式138.一种治疗有需要的受试者的慢性HBV感染的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用HBV基因表达抑制剂；以及
向所述受试者施用实施方式1至59中任一项的抗HBV抗体。
实施方式139.根据实施方式137或138所述的方法，其中RNAi药剂包括形成双链区的正义链和反义链，其中所述正义链包括与SEQ ID NO:116的核苷酸1579-1597相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
实施方式140.根据实施方式137至139中任一项所述的方法，其中所述RNAi药剂包括正义链和反义链，其中所述正义链包括SEQ ID NO:116的核苷酸1579-1597。
实施方式141.根据实施方式137至140中任一项所述的方法，其中所述RNAi药剂中的至少一个链包括至少1个核苷酸的3'突出端。
实施方式142.根据实施方式137至140中任一项所述的方法，其中所述RNAi药剂中的至少一个链包括至少2个核苷酸的3'突出端。
实施方式143.根据实施方式137至142中任一项所述的方法，其中所述RNAi药剂中的所述双链区的长度为15至30个核苷酸对。
实施方式144.根据实施方式137至142中任一项所述的方法，其中所述RNAi药剂中的所述双链区的长度为17至23个核苷酸对。
实施方式145.根据实施方式137至142中任一项所述的方法，其中所述RNAi药剂中的所述双链区的长度为17至25个核苷酸对。
实施方式146.根据实施方式137至142中任一项所述的方法，其中所述RNAi药剂中的所述双链区的长度为23至27个核苷酸对。
实施方式147.根据实施方式137至142中任一项所述的方法，其中所述RNAi药剂中的所述双链区的长度为19至21个核苷酸对。
实施方式148.根据实施方式137至142中任一项所述的方法，其中所述RNAi药剂中的所述双链区的长度为21至23个核苷酸对。
实施方式149.根据实施方式137至142中任一项所述的方法，其中所述RNAi药剂中的每条链具有15至30个核苷酸。
实施方式150.根据实施方式137至142中任一项所述的方法，其中所述RNAi药剂中的每条链具有19至30个核苷酸。
实施方式151.根据实施方式137至150中任一项所述的方法，其中所述RNAi药剂是siRNA。
实施方式152.根据实施方式151所述的方法，其中所述siRNA抑制HBV转录物的表达，所述HBV转录物编码HBsAg蛋白、HBcAg蛋白和HBx蛋白或HBV DNA聚合酶蛋白。
实施方式153.根据实施方式151或实施方式152所述的方法，其中所述siRNA与由以下编码的靶标的至少15个连续核苷酸结合：P基因，NC_003977.2的核苷酸2309-3182和1-1625；S基因(编码L、M和S蛋白)，NC_003977.2的核苷酸2850-3182和1-837；HBx，NC_003977.2的核苷酸1376-1840；或C基因，NC_003977.2的核苷酸1816-2454。
实施方式154.根据实施方式151或实施方式152所述的方法，其中所述siRNA的所述反义链包括5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3'(SEQ ID NO:119)的核苷酸序列中的至少15个连续核苷酸。
实施方式155.根据实施方式151或152所述的方法，其中所述siRNA的所述反义链包括5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3'(SEQ ID NO:119)的核苷酸序列中的至少19个连续核苷酸。
实施方式156.根据实施方式151或152所述的方法，其中所述siRNA的所述反义链包括5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3'(SEQ ID NO:119)的核苷酸序列。
实施方式157.根据实施方式151或152所述的方法，其中所述siRNA的所述反义链由5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3'(SEQ ID NO:119)的核苷酸序列组成。
实施方式158.根据实施方式154至157中任一项所述的方法，其中所述siRNA的所述正义链包括5'-GUGUGCACUUCGCUUCACA-3'(SEQ ID NO:118)的核苷酸序列。
实施方式159.根据实施方式154至157中任一项所述的方法，其中所述siRNA的所述正义链由5'-GUGUGCACUUCGCUUCACA-3'(SEQ ID NO:118)的核苷酸序列组成。
实施方式160.根据实施方式151或152所述的方法，其中所述siRNA的所述反义链包括5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3'(SEQ ID NO:121)的核苷酸序列中的至少15个连续核苷酸。
实施方式161.根据实施方式151或152所述的方法，其中所述siRNA的所述反义链包括5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3'(SEQ ID NO:121)的核苷酸序列中的至少19个连续核苷酸。
实施方式162.根据实施方式151或152所述的方法，其中所述siRNA的所述反义链包括5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3'(SEQ ID NO:121)的核苷酸序列。
实施方式163.根据实施方式151或152所述的方法，其中所述siRNA的所述反义链由5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3'(SEQ ID NO:121)的核苷酸序列组成。
实施方式164.根据实施方式154至157中任一项所述的方法，其中所述siRNA的所述正义链包括5'-GGUGGACUUCUCUCAAUUUUA-3'(SEQ ID NO:120)的核苷酸序列。
实施方式165.根据实施方式154至157中任一项所述的方法、供使用的组合物或用途，其中所述siRNA的所述正义链由5'-GGUGGACUUCUCUCAAUUUUA-3'(SEQ ID NO:120)的核苷酸序列组成。
实施方式166.根据实施方式151至165中任一项所述的方法，其中所述正义链的基本上所有核苷酸和所述反义链的基本上所有核苷酸都是经修饰的核苷酸，并且
其中所述正义链与附接在3'末端处的配体缀合。
实施方式167.根据实施方式166所述的方法，其中所述配体是通过单价接头、二价分支接头或三价分支接头附接的一种或多种GalNAc衍生物。
实施方式168.根据实施方式166或167所述的方法，其中所述配体是
Figure BDA0004086126640001591
实施方式169.根据实施方式168所述的方法，其中所述siRNA与如下结构中所示的配体缀合：
Figure BDA0004086126640001592
其中X为O或S。
实施方式170.根据实施方式151至169中任一项所述的方法，其中所述siRNA中的至少一个核苷酸是经修饰的核苷酸，所述经修饰的核苷酸包括脱氧核苷酸、3'末端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、锁定核苷酸、解锁核苷酸、构象限制性核苷酸、约束乙基核苷酸、非碱性核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、2'-C-烷基修饰的核苷酸、2'-羟基修饰的核苷酸、2'-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包括核苷酸的非天然碱基、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-脱水己醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包括硫代磷酸酯基的核苷酸、包括甲基膦酸酯基的核苷酸、包括5'-磷酸酯的核苷酸、腺苷-乙二醇核酸或包括5'-磷酸酯模拟物的核苷酸。
实施方式171.根据实施方式151至169中任一项所述的方法，其中所述siRNA包括磷酸酯主链修饰、2'核糖修饰、5'三磷酸酯修饰或GalNAc缀合修饰。
实施方式172.根据实施方式171所述的方法，其中所述磷酸酯主链修饰包含硫代磷酸酯键。
实施方式173.根据实施方式171或实施方式172所述的方法，其中所述2'核糖修饰包括氟代或-O-甲基取代。
实施方式174.根据实施方式151至159和166至173中任一项所述的方法，其中所述siRNA具有包括5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96 -3'(SEQ ID NO:122)的正义链和包括5'-usGfsugaAfgCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(SEQ ID NO:123)的反义链，
其中a、c、g和u分别是2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯、2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯、2'-O-甲基鸟苷-3'-磷酸酯和2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯；
Af、Cf、Gf和Uf分别是2'-氟腺苷-3'-磷酸酯、2'-氟胞苷-3'-磷酸酯、2'-氟鸟苷-3'-磷酸酯和2'-氟尿苷-3'-磷酸酯；
s是硫代磷酸酯键；并且
L96是N-[三(GalNAc-烷基)-酰胺基癸酰基)]-4-羟脯氨醇。
实施方式175.根据实施方式151至159和166至173中任一项所述的方法，其中所述siRNA具有包括5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96 -3'(SEQ ID NO:124)的正义链和包括5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(SEQ ID NO:125)的反义链，
其中a、c、g和u分别是2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯、2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯、2'-O-甲基鸟苷-3'-磷酸酯和2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯；
Af、Cf、Gf和Uf分别是2'-氟腺苷-3'-磷酸酯、2'-氟胞苷-3'-磷酸酯、2'-氟鸟苷-3'-磷酸酯和2'-氟尿苷-3'-磷酸酯；
(Agn)为腺苷-乙二醇核酸(GNA)；
s是硫代磷酸酯键；并且
L96是N-[三(GalNAc-烷基)-酰胺基癸酰基)]-4-羟脯氨醇。
实施方式176.根据实施方式151至153和160至173中任一项所述的方法、供使用的组合物或用途，其中所述siRNA具有包括5'-gsgsuggaCfuUfCfUfcucaAfUfuuuaL96 -3'(SEQID NO:126)的正义链和包括5'-usAfsaaaUfuGfAfgagaAfgUfccaccsasc-3'(SEQ ID NO:127)的反义链，
其中a、c、g和u分别是2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯、2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯、2'-O-甲基鸟苷-3'-磷酸酯和2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯；
Af、Cf、Gf和Uf分别是2'-氟腺苷-3'-磷酸酯、2'-氟胞苷-3'-磷酸酯、2'-氟鸟苷-3'-磷酸酯和2'-氟尿苷-3'-磷酸酯；
s是硫代磷酸酯键；并且
L96是N-[三(GalNAc-烷基)-酰胺基癸酰基)]-4-羟脯氨醇。
实施方式177.根据实施方式137至176中任一项所述的方法，其中所述受试者是人，并且向所述受试者施用治疗有效量的RNAi药剂或siRNA；并且其中所述RNAi药剂或siRNA的所述有效量为约1mg/kg至约8mg/kg。
实施方式178.根据实施方式137至177中任一项所述的方法，其中向所述受试者每日两次、每日一次、每两天一次、每三天一次、每周两次、每周一次、每隔一周一次、每四周一次或每月一次施用所述RNAi药剂或siRNA。
实施方式179.根据实施方式137至177中任一项所述的方法，其中每四周一次向所述受试者施用所述RNAi药剂或siRNA。
实施方式180.根据实施方式151至179中任一项所述的方法，其中施用各自定向到HBV基因的两个siRNA，并且第一siRNA具有包括SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120或SEQ IDNO:126的反义链；并且第二siRNA包括具有正义链的siRNA，所述siRNA包含SEQ ID NO:116的核苷酸2850-3182中的至少15个连续核苷酸。
实施方式181.根据实施方式151至179中任一项所述的方法，其中施用定向到HBV基因的两个siRNA，其中所述两个siRNA包括：定向到HBV X基因的siRNA和定向到HBV S基因的siRNA。
实施方式182.根据实施方式151至179中任一项所述的方法，其中施用各自定向到HBV基因的两个siRNA，并且第一siRNA具有包括SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:123或SEQ IDNO:125的反义链，并且第二siRNA具有包括SEQ ID NO:121或SEQ ID NO:127的反义链。
实施方式183.根据实施方式181所述的方法，其中所述第一siRNA具有包括SEQ IDNO:118、SEQ ID NO:122或SEQ ID NO:124的正义链；并且所述第二siRNA具有包括SEQ IDNO:120或SEQ ID NO:126的正义链。
实施方式184.根据实施方式179至183中任一项所述的方法，其中同时施用所述两个siRNA。
实施方式185.根据实施方式137至184中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述受试者施用核苷(酸)类似物，或者其中所述受试者还被施用核苷(酸)类似物。
实施方式186.根据实施方式185所述的方法、供使用的组合物或用途，其中所述核苷(酸)类似物是富马酸替诺福韦二吡呋酯(TDF)、替诺福韦艾拉酚胺(TAF)、拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦(ETV)、替比夫定、AGX-1009、恩曲他滨(FTC)、克拉夫定、利托那韦、福韦酯、洛布卡韦、泛昔洛韦、N-乙酰基-半胱氨酸(NAC)、PC1323、theradigm-HBV、胸腺肽-α以及更昔洛韦、贝西福韦(ANA-380/LB-80380)或替诺福韦酯(TLX/CMX157)。
在一些情况下，参考实施方式或实施例描述或列出本文提供的抗体、抗原结合片段、融合蛋白、核酸、细胞、组合物、组合、用途和方法的要素。然而，应理解，本文所描述的实施例和实施方式可以各种方式组合以创建额外的实施方式。
实施例
在下文中，呈现了说明本公开的各个实施方式和方面的特定实施例。然而，本公开的范围不受本文所描述的具体实施方式的限制。
实施例1：通过抗HBV抗体形成二聚体
PCT公开第WO 2017/060504号中公开了抗HBV抗体。工程化抗HBV抗体“HBC34-v7”尤其产生了抗体“HBC34-v35”(PCT公开第WO 2020/132091号)，所述抗体具有分别如SEQ IDNO:38和57所示的VH和VL氨基酸序列。HBC34-v35以皮摩尔亲和力与HBsAg结合，并有效中和十(10)种HBV基因型和丁型肝炎病毒，从而与保守构象表位结合。图1中示出了HBC34-v35的代表性结合和中和数据(表示为IgG1并且包括Fc突变G236A、A330L、I332E、M428L和N434S(EU编号；统称为“GAALIE-MLNS”或“GAALIE+MLNS”或“MLNS-GAALIE”或“MLNS+GAALIE”))。
HBC34-v35在宿主细胞系中表达为重组IgG(同种异型G1m17,1)，由上清液纯化并调配用于施用。调配物在温育1周后的尺寸排阻色谱法分析显示对应于抗体单体(即包括两条重链和两条轻链的单个抗体分子)的峰值和对应于抗体二聚体的高分子量物种(即，由两个单一抗体分子形成的聚集体)(图2)。
假设二聚体形成是通过Fab-Fab相互作用介导的，并且重组Fab也应二聚化。尺寸排阻色谱法用于纯化富集的IgG二聚体和Fab二聚体。图3示出了Fab二聚体分数随时间推移缓慢增加；二聚体形成动力学也随温度增加(数据未显示)。
已经描述了Fab二聚化的不同模式(参见例如Plath等人MAb 8(5):928-940(2016))。根据Fab二聚化的模式，Fab将保留或失去结合抗原的能力。例如，IgG二聚体预计可能失去最多50％的结合能力，而四个Fab中的两个不受影响。如图4所示，HBC34-v35二聚体(全长IgG或Fab)减少了与HBsAg的结合，如通过表面等离子共振(SPR；在表面上捕获的单体和二聚体抗体的数量相似(按质量计))所确定的，与涉及CDR的二聚化一致。
接下来，进行HBC34-v35 rFab二聚体或单体的结晶。rFab二聚体通过制备型尺寸排阻色谱法分离(图5A)。在室温下设置3x 96个条件(浓度：5.5mg/ml)。在三种不同的条件下获得了晶体，但衍射很差并且是多结晶的。新一轮的温育和结晶优化产生高质量的衍射(图5B)。对于rFab单体，使用制备型尺寸排阻色谱法进行纯化(图6A)。在40℃下温育后获得的材料没有产生晶体(在室温下3个托盘，5mg/mL或9mg/mL)。第二批单体在没有温育步骤的情况下制备；晶体在4℃而不是室温下形成(各4个托盘，2种浓度)(图6B)。Fab二聚体晶体结构分析表明，二聚化涉及L-CDR2(图7-9)，以二聚体形式存在的Fab具有相似的构象，并且L-CDR2在单体与二聚体之间发生构象变化(图10)。鉴定到L-CDR2与框架残基之间的潜在相互作用。
实施例2：二聚体形成减少的工程化抗体
与种系序列相比，HBC34-v35包括在轻链中的若干个突变，包括在L-CDR2中。L-CDR2中存在并被认为参与Fab-Fab相互作用的三个相邻氨基酸被回复为种系以产生另外的变体抗体HBC34-v36。在单独的实验中，将HBC34-v35和HBC34-v36 Fab(>10mg/mL)在40℃下温育持续5-7天，并通过绝对尺寸排阻色谱法(aSEC)评估二聚体百分比。如图11A所示，种系序列的回复显著降低了二聚化。3mg/mL的HBC34-v36全长IgG在40℃下2周后没有二聚化(数据未显示)。
实施例3：通过抗体进行的结合和体外中和
比较了HBC34-v35和HBC34-v36结合HBsAg和中和HBV感染的能力。通过ELISA评估结合，并且示出HBC34-v36具有与HBC34-v35相似的结合活性(分别为EC50＝0.7ng/mL对0.6ng/mL，图12)。通过测量表达NTCP的HBV感染的HepG2细胞的细胞培养上清液中的HBeAg(基因型D)的水平来评估中和作用。图13中示出了数据，并且表明HBC34-v36对HBV基因型D的中和作用是HBC34-v35对HBV基因型D的中和作用的大约1/3。对于这些实验，抗体包括野生型IgG1 Fc。
实施例4：额外的工程化抗体的设计和测试
使用HBC34-v36作为起点，产生了在L-CDR2和/或框架序列中相对于HBC34-v35具有突变的额外的工程化变体抗体。这些变体被称为HBC34-v37-HBC34-v50。表6中提供了来自各种抗体的轻链可变区序列，以及针对HBC34-v35的突变汇总。如表6所示的CDR序列和氨基酸残基编号是根据化学计算组(chemcomp.com)开发的系统的。
表6：HBC34抗体的VL氨基酸序列
Figure BDA0004086126640001641
/>
Figure BDA0004086126640001651
使用如本文所述的测定测试HBC34-v37-HBC34-v50的HBsAg结合和HBV中和活性。图14A-14E中提供了来自结合测定的结果，并且示出与HBC34-v35相比，除HBC34-v47和HBC34-v48之外的所有被测的变体抗体具有相似或甚至更强的结合。HBC34-v47和HBC34-v48的生产产率也很低，并且没有被选择以供进一步测试。图15中提供了来自中和测定的结果，并示出与HBC34-v35相比，若干种抗体(HBC34-v40-HBC34-v46、HBC34-v49和HBC34-v50)具有相似或甚至改进的中和活性(EC50)。HBC34-v36-HBC34-v39具有较弱的中和活性。
实施例5：某些工程化抗体的纯化
在不同温度下温育32天时程后，对工程化变体抗体的聚集体形成进行评估。九种HBC34-v35抗体变体和亲本HBC34-v35在宿主细胞系中表达为重组IgG(同种异型G1m17,1)并由上清液纯化。抗体在产生后一周后收到，并浓缩到25mg/ml。尺寸排阻色谱法(SEC)分析用于监测第-1天、第0天、第5天、第15天和第32天对应于抗体二聚体的高分子量物种(HMWS)。第-1天样品在浓缩前进行评估。在32天分析过程中，抗体组合物在4℃(图16A)、25℃(图16B)或40℃(图16C)下进行温育。图16D中示出了在40℃下温育32天后的HMWS频率汇总。四种变体抗体(-v40、-v44、-v45、-v50)表现出低HMWS产生(图16D)并被选择用于进一步研究。
实施例6：通过某些工程化抗体进行的结合和体外中和
通过FACS测试了HBC34-v40、HBC34-v44、HBC34-v45和HBC34-v50与来自十种((A)-(J))基因型的HBsAg的结合。HBC34-v35作为参考包括在内。所有被测的变体都与HBsAg结合，其中HBC34-v40显示出最有效的结合(图17A-17J)。通过FACS测试了HBC34-v40、HBC34-v44、HBC34-v45和HBC34-v50与十个HBsAg基因型D突变体的结合。HBC34-v35作为参考包括在内。所有工程化变体与HBsAg结合(图18A-18K)。
实施例7：某些工程化抗体的产生
测量HBC34-v35、HBC34-v40、HBC34-v44、HBC34-v45和HBC34-v50的抗体滴度以评估宿主细胞的生产力。抗体在宿主细胞系中表达为重组IgG(同种异型G1m17,1)，并由上清液纯化。评估了5ml规模和100ml规模转染系统两者，其中100ml系统以一式两份或一式三份进行了测试。图19中示出了来自单独5ml规模和100ml规模测试的抗体滴度以及来自100ml规模测试的平均滴度。
实施例8：某些工程化抗体的热稳定性
HBC34-v35、HBC34-v40、HBC34-v44、HBC34-v45和HBC34-v50在宿主细胞系中表达为重组IgG(同种异型G1m17,1)并由上清液纯化。将抗体浓缩到25mg/ml并且在40℃下温育四天。使用尺寸排阻色谱法分析以在第4天定量对应于抗体二聚体的高分子量物种(HMWS)，如图20所示。只有HBC34-v35在4天后显示出显著的HMWS。
实施例9：参与形成抗体二聚体的轻链氨基酸分析
结构研究鉴定了HBC34-v35 VL区中参与形成抗体:抗体二聚体的氨基酸残基的数量。图21A、22A和23A中展示了两个HBC34-v35抗体分子(本文中为“抗体分子1”和“抗体分子2”)的轻链残基之间的相互作用，其中：E49(抗体分子1)与S64和K51(抗体分子2)相互作用；V50(抗体分子1)与V50(抗体分子2)相互作用；K51(抗体分子1)与E49(抗体分子2)相互作用；并且S64(抗体分子1)与E49(抗体分子2)相互作用。图21B、22B和23B中展示了两种HBC34-v35抗体的其它轻链氨基酸之间的相互作用，其中：R60(抗体分子1)与D81和Q78(抗体分子2)相互作用；F61(抗体1)与I74(抗体分子2)相互作用；I74(抗体分子1)与F61(抗体分子2)相互作用；Q78(抗体分子1)与R60(抗体分子2)相互作用；并且D81(抗体分子1)与R60(抗体分子2)相互作用。
四种工程化抗体HBC34-v40、HBC34-v44、HBC34-v45和HBC34-v50被确定具有低聚集倾向，同时维持有效结合。
与亲本HBC34-v35相比，HBC34-v40包括L-CDR2(CCG编号)中的E49Q、V50D和K51S突变，如图21C所示。这些突变从疏水相互作用变为静电排斥和盐桥的丢失，即使丢失单独盐桥不足以减少聚集(与包括E49Q和K51S突变但不包括V50D的HBC34-v41相比，并且参见图16D)。
与HBC34-v35相比，HBC34-v44包括L-CDR2中的E49A突变，如图22C所示。这种突变导致盐桥丢失。
HBC34-v45和HBC34-v50包括相对于HBC34-v35在R60处的框架突变，如图23C所示。HBC34-v45和HBC34-v50中的R60N和R60K突变分别减少了二聚体形成。HBC34-v46中的R60A突变在减少二聚体形成方面效果较差(参见图16D)。
序列和SEQ ID编号表(序列表)：
Figure BDA0004086126640001671
/>
Figure BDA0004086126640001681
/>
Figure BDA0004086126640001691
/>
Figure BDA0004086126640001701
/>
Figure BDA0004086126640001711
/>
Figure BDA0004086126640001721
/>
Figure BDA0004086126640001731
/>
Figure BDA0004086126640001741
/>
Figure BDA0004086126640001751
/>
Figure BDA0004086126640001761
/>
Figure BDA0004086126640001771
/>
Figure BDA0004086126640001781
/>
Figure BDA0004086126640001791
/>
Figure BDA0004086126640001801
/>
Figure BDA0004086126640001811
/>
Figure BDA0004086126640001821
可以将上文所描述的各个实施方式进行组合以提供进一步实施方式。在本说明书中引用的和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物以全文引用的方式并入本文中。如果需要，可以修改实施方式的各方面，以采用各种专利、申请和出版物的概念来提供又进一步的实施方式。
于2020年6月24日提交的美国临时申请63/043,692以全文引用的方式并入本文中。
鉴于以上详细描述，可以对实施方式做出这些和其它改变。通常，在以下权利要求中，所用术语不应被解释为将权利要求限于本说明书和权利要求中所公开的特定实施方式，而应被解释为包括所有可能的实施方式以及这些权利要求所有权获得的等效物的全部范围。相应地，权利要求书并不受到本公开的限制。
序列表
<110> 维尔生物科技有限公司
胡默波斯生物医学公司
<120> 工程化乙型肝炎病毒中和抗体和其用途
<130> 930485.414WO
<140> PCT
<141> 2021-06-23
<150> US 63/043,692
<151> 2020-06-24
<160> 173
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(11)
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<400> 1
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<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<221> VARIANT
<222> 1
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<220>
<221> VARIANT
<222> 2
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<220>
<221> VARIANT
<222> 3
<223> Xaa = R, K, D or I
<220>
<221> VARIANT
<222> 6
<223> Xaa = M or T
<220>
<221> VARIANT
<222> 7
<223> Xaa = T, A or I
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)...(8)
<223> Xaa = T, P or L
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)...(10)
<223> Xaa = Q, H or L
<400> 2
Xaa Xaa Xaa Thr Cys Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Gly
1 5 10
<210> 3
<211> 226
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> S domain of HBsAg (GenBank acc.
no. J02203)
<400> 3
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1 5 10 15
Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu
20 25 30
Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys
35 40 45
Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser
50 55 60
Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe
65 70 75 80
Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val
85 90 95
Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly
100 105 110
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala
115 120 125
Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp
130 135 140
Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys
145 150 155 160
Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu
165 170 175
Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu
180 185 190
Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile
195 200 205
Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val
210 215 220
Tyr Ile
225
<210> 4
<211> 226
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> S domain of HBsAg (GenBank acc.
no. FJ899792)
<400> 4
Met Glu Asn Val Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln
1 5 10 15
Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu
20 25 30
Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys
35 40 45
Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser
50 55 60
Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe
65 70 75 80
Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val
85 90 95
Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly
100 105 110
Ser Ser Thr Thr Gly Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala
115 120 125
Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp
130 135 140
Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys
145 150 155 160
Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu
165 170 175
Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu
180 185 190
Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Thr
195 200 205
Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val
210 215 220
Tyr Ile
225
<210> 5
<211> 72
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> J02203 (D, ayw3)
<400> 5
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20 25 30
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Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu
50 55 60
Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp
65 70
<210> 6
<211> 72
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> FJ899792 (D, adw2)
<400> 6
Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr
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Gly Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser
20 25 30
Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr
35 40 45
Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu
50 55 60
Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp
65 70
<210> 7
<211> 72
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> AM282986 (A)
<400> 7
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1 5 10 15
Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser
20 25 30
Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr
35 40 45
Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu
50 55 60
Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp
65 70
<210> 8
<211> 72
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
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<223> D23678 (B1)
<400> 8
Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr
1 5 10 15
Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser
20 25 30
Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr
35 40 45
Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu
50 55 60
Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp
65 70
<210> 9
<211> 72
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> AB117758 (C1)
<400> 9
Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr
1 5 10 15
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20 25 30
Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr
35 40 45
Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu
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Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp
65 70
<210> 10
<211> 72
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> AB205192 (E)
<400> 10
Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr
1 5 10 15
Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Leu Ala Gln Gly Thr Ser
20 25 30
Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Ser Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr
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Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu
50 55 60
Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp
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<210> 11
<211> 72
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> X69798 (F4)
<400> 11
Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Ser Thr Thr Thr
1 5 10 15
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20 25 30
Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Ser Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr
35 40 45
Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Leu Gly Lys Tyr Leu Trp Glu
50 55 60
Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp
65 70
<210> 12
<211> 72
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> AF160501 (G)
<400> 12
Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr
1 5 10 15
Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser
20 25 30
Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr
35 40 45
Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu
50 55 60
Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp
65 70
<210> 13
<211> 72
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
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<400> 13
Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Ser Thr Thr Thr
1 5 10 15
Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Leu Ala Gln Gly Thr Ser
20 25 30
Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr
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Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Tyr Leu Trp Glu
50 55 60
Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp
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<210> 14
<211> 72
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> AF241409 (I)
<400> 14
Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr
1 5 10 15
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20 25 30
Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr
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Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu
50 55 60
Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp
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<210> 15
<211> 72
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> AB486012 (J)
<400> 15
Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Ser Thr Thr Thr
1 5 10 15
Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Ile Thr Ala Gln Gly Thr Ser
20 25 30
Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr
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Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Phe Leu Trp Glu
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Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp
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<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> HBsAg Y100C/P120T
<400> 16
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1 5 10 15
Thr Gly Thr Gly Thr Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr
20 25 30
Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys
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Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp
50 55 60
Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp
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<210> 17
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<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> HBsAg P120T
<400> 17
Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr
1 5 10 15
Gly Thr Gly Thr Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser
20 25 30
Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr
35 40 45
Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu
50 55 60
Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp
65 70
<210> 18
<211> 72
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> HBsAg P120T/S143L
<400> 18
Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr
1 5 10 15
Gly Thr Gly Thr Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser
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Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Leu Asp Gly Asn Cys Thr
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<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> HBsAg C121S
<400> 19
Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr
1 5 10 15
Gly Thr Gly Pro Ser Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser
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Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu
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<211> 72
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> HBsAg R122D
<400> 20
Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr
1 5 10 15
Gly Thr Gly Pro Cys Asp Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser
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<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> HBsAg R122I
<400> 21
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<211> 72
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> HBsAg T123N
<400> 22
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<210> 23
<211> 72
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> HBsAg Q129H
<400> 23
Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr
1 5 10 15
Gly Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala His Gly Thr Ser
20 25 30
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Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu
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Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp
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<210> 24
<211> 72
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> HBsAg Q129L
<400> 24
Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr
1 5 10 15
Gly Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Leu Gly Thr Ser
20 25 30
Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr
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Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu
50 55 60
Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp
65 70
<210> 25
<211> 72
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> HBsAg M133H
<400> 25
Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr
1 5 10 15
Gly Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser
20 25 30
His Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr
35 40 45
Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu
50 55 60
Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp
65 70
<210> 26
<211> 72
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> HBsAg M133L
<400> 26
Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr
1 5 10 15
Gly Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser
20 25 30
Leu Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr
35 40 45
Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu
50 55 60
Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp
65 70
<210> 27
<211> 72
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> HBsAg M133T
<400> 27
Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr
1 5 10 15
Gly Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser
20 25 30
Thr Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr
35 40 45
Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu
50 55 60
Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp
65 70
<210> 28
<211> 72
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> HBsAg K141E
<400> 28
Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr
1 5 10 15
Gly Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser
20 25 30
Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Glu Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr
35 40 45
Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu
50 55 60
Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp
65 70
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<211> 72
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> HBsAg P142S
<400> 29
Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr
1 5 10 15
Gly Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser
20 25 30
Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Ser Ser Asp Gly Asn Cys Thr
35 40 45
Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu
50 55 60
Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp
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<211> 72
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> HBsAg S143K
<400> 30
Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr
1 5 10 15
Gly Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser
20 25 30
Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Lys Asp Gly Asn Cys Thr
35 40 45
Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu
50 55 60
Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp
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<210> 31
<211> 72
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> HBsAg D144A
<400> 31
Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr
1 5 10 15
Gly Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser
20 25 30
Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Ala Gly Asn Cys Thr
35 40 45
Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu
50 55 60
Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp
65 70
<210> 32
<211> 72
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> HBsAg G145R
<400> 32
Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr
1 5 10 15
Gly Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser
20 25 30
Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Arg Asn Cys Thr
35 40 45
Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu
50 55 60
Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp
65 70
<210> 33
<211> 72
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<223> HBsAg N146A
<400> 33
Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr
1 5 10 15
Gly Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser
20 25 30
Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Ala Cys Thr
35 40 45
Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu
50 55 60
Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp
65 70
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34 Ab CDRH1 aa
<400> 34
Gly Arg Ile Phe Arg Ser Phe Tyr Met Ser
1 5 10
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34 Ab CDRH2 aa
<400> 35
Thr Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Leu Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34 Ab CDRH2_2 aa
<400> 36
Asn Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Leu Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34 Ab CDRH3 aa
<400> 37
Trp Ser Gly Asn Ser Gly Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 38
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34 VH_1
<400> 38
Glu Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Trp Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Leu Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Thr Thr Val Ser Val Ser Ser
115
<210> 39
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34 VH_2
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Leu Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Trp Ser Gly Asn Ser Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34, -v7, -v31, -v32 CDRL1 aa
<400> 40
Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Lys Asn Val Cys
1 5 10
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 41
Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Lys Asn Val Ala
1 5 10
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 42
Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Lys Asn Val Ser
1 5 10
<210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 43
Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Lys Asn Ala Cys
1 5 10
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34, -v7, -v23, -v31-v33,
-v35, -v45, -v46, -v48 CDRL2 aa
<400> 44
Glu Val Lys Tyr Arg Pro Ser
1 5
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 45
Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v37 CDRL2 aa
<400> 46
Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 47
Gln Val Ser Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v39 CDRL2 aa
<400> 48
Gln Asp Asp Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v40 CDRL2 aa
<400> 49
Gln Asp Ser Tyr Arg Pro Ser
1 5
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v41 CDRL2 aa
<400> 50
Gln Val Ser Tyr Arg Pro Ser
1 5
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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CDRL2 aa
<400> 51
Glu Val Ser Tyr Arg Pro Ser
1 5
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v43 CDRL2 aa
<400> 52
Gln Val Lys Tyr Arg Pro Ser
1 5
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v44 CDRL2 aa
<400> 53
Ala Val Lys Tyr Arg Pro Ser
1 5
<210> 54
<400> 54
000
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v7, -v23, -v32, -v33,
-v35-v50 CDRL3 aa
<400> 55
Gln Thr Phe Asp Ser Thr Thr Val Val
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34, -v31 CDRL3 aa
<400> 56
Gln Thr Trp Asp Ser Thr Thr Val Val
1 5
<210> 57
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v35 VL aa
<400> 57
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Ser Ile Pro Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Lys Asn Val
20 25 30
Ala Trp Phe Gln His Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Glu Val Lys Tyr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys Gln Thr Phe Asp Ser Thr Thr Val Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 58
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v36 VL aa
<400> 58
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Ser Ile Pro Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Lys Asn Val
20 25 30
Ala Trp Phe Gln His Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys Gln Thr Phe Asp Ser Thr Thr Val Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 59
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v37 VL aa
<400> 59
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Ser Ile Pro Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Lys Asn Val
20 25 30
Ala Trp Phe Gln His Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys Gln Thr Phe Asp Ser Thr Thr Val Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 60
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v38 VL aa
<400> 60
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Ser Ile Pro Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Lys Asn Val
20 25 30
Ala Trp Phe Gln His Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys Gln Thr Phe Asp Ser Thr Thr Val Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 61
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v39 VL aa
<400> 61
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Ser Ile Pro Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Lys Asn Val
20 25 30
Ala Trp Phe Gln His Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Lys Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys Gln Thr Phe Asp Ser Thr Thr Val Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 62
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v40 VL aa
<400> 62
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Ser Ile Pro Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Lys Asn Val
20 25 30
Ala Trp Phe Gln His Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Ser Tyr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys Gln Thr Phe Asp Ser Thr Thr Val Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 63
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v41 VL aa
<400> 63
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Ser Ile Pro Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Lys Asn Val
20 25 30
Ala Trp Phe Gln His Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Val Ser Tyr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys Gln Thr Phe Asp Ser Thr Thr Val Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 64
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v42 VL aa
<400> 64
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Ser Ile Pro Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Lys Asn Val
20 25 30
Ala Trp Phe Gln His Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Glu Val Ser Tyr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys Gln Thr Phe Asp Ser Thr Thr Val Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 65
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v43 VL aa
<400> 65
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Ser Ile Pro Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Lys Asn Val
20 25 30
Ala Trp Phe Gln His Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Val Lys Tyr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys Gln Thr Phe Asp Ser Thr Thr Val Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 66
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v44 VL aa
<400> 66
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Ser Ile Pro Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Lys Asn Val
20 25 30
Ala Trp Phe Gln His Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Ala Val Lys Tyr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys Gln Thr Phe Asp Ser Thr Thr Val Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 67
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v45 VL aa
<400> 67
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Ser Ile Pro Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Lys Asn Val
20 25 30
Ala Trp Phe Gln His Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Glu Val Lys Tyr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Asn Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys Gln Thr Phe Asp Ser Thr Thr Val Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 68
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v46 VL aa
<400> 68
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Ser Ile Pro Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Lys Asn Val
20 25 30
Ala Trp Phe Gln His Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Glu Val Lys Tyr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Ala Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys Gln Thr Phe Asp Ser Thr Thr Val Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 69
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v47 VL aa
<400> 69
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Ser Ile Pro Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Lys Asn Val
20 25 30
Ala Trp Phe Gln His Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Glu Val Ser Tyr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Asn Phe Ser Gly Ala
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105
<210> 70
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v48 VL aa
<400> 70
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Ser Ile Pro Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Lys Asn Val
20 25 30
Ala Trp Phe Gln His Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Glu Val Lys Tyr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Asn Phe Ser Gly Ala
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ala Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys Gln Thr Phe Asp Ser Thr Thr Val Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 71
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v49 VL aa
<400> 71
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Ser Ile Pro Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Lys Asn Val
20 25 30
Ala Trp Phe Gln His Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Glu Val Ser Tyr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys Gln Thr Phe Asp Ser Thr Thr Val Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 72
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v50 VL aa
<400> 72
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Ser Ile Pro Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Lys Asn Val
20 25 30
Ala Trp Phe Gln His Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Glu Val Lys Tyr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Lys Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys Gln Thr Phe Asp Ser Thr Thr Val Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 73
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> IgGI - WT hIgG1 Fc
<400> 73
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 74
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic Chimeric hinge sequence
<400> 74
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro
<210> 75
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HC of HBC34-v35-50 MLNS-GAALIE
(g1M17, 1)
<400> 75
Glu Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Trp Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Leu Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Trp Ser Gly Asn Ser Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu
420 425 430
Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 76
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HC of HBC34-v35-50 MLNS (g1M17,
1)
<400> 76
Glu Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Trp Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Leu Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Trp Ser Gly Asn Ser Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu
420 425 430
Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 77
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v35-50 HC with GAALIE
mutation in hIgG1 Fc
<400> 77
Glu Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Trp Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Leu Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Trp Ser Gly Asn Ser Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 78
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-V35-50 HC (wild-type)
<400> 78
Glu Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Trp Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Leu Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Trp Ser Gly Asn Ser Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 79
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC antibody light chain
constant region
<400> 79
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 80
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34 VH nuc
<400> 80
gaactgcagc tggtggagtc tgggggaggc tgggtccagc cgggggggtc ccagagactg 60
tcctgtgcag cctctggacg catctttaga agtttttaca tgagctgggt ccgccaggcc 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccact ataaaccaag atggaagtga gaaattatat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactattt 240
ctgcaaatga acaacctgag agtcgaggac acggccgttt attactgcgc ggcttggagc 300
ggcaatagtg ggggtatgga cgtctggggc caggggacca cggtctccgt ctcctca 357
<210> 81
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v35-v50 VH (nuc)
<400> 81
gaggtgcagc tggtggaatc cggcggggga ctggtgcagc ctggcggctc actgagactg 60
agctgtgcag cttctggaag aatcttcaga tctttttaca tgagttgggt gagacaggct 120
cctgggaagg gactggagtg ggtcgcaaac atcaatcagg acggatcaga aaagctgtat 180
gtggatagcg tcaaaggcag gttcactatt tcccgcgaca acgccaaaaa ttctctgttt 240
ctgcagatga acaatctgcg ggtggaggat accgctgtct actattgtgc agcctggtct 300
ggcaacagtg gaggcatgga cgtgtgggga cagggaacca cagtgacagt cagctcc 357
<210> 82
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34 wt VH codon optimized
<400> 82
gaactgcagc tggtcgaatc aggaggaggg tgggtccagc ccggagggag ccagagactg 60
tcttgtgccg catcagggag gatcttcagg agcttctaca tgtcctgggt gcgccaggca 120
ccaggcaagg gactggagtg ggtcgccacc atcaaccagg acggatctga aaagctgtat 180
gtggatagtg tcaaaggccg gttcacaatt agcagagaca acgctaaaaa ttctctgttt 240
ctgcagatga acaatctgcg agtggaggat accgccgtct actattgcgc cgcttggtct 300
ggcaacagcg gcgggatgga tgtctggggg cagggcacaa cagtgagcgt ctcttcc 357
<210> 83
<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-V35-50 CH1-hinge-CH2-CH3
(codon-optimized)
<400> 83
gcctccacaa agggcccaag cgtgtttcca ctggctccct cttccaagtc tacctccggc 60
ggcacagccg ctctgggatg tctggtgaag gattacttcc cagagcccgt gaccgtgtct 120
tggaactccg gcgccctgac cagcggagtg catacatttc cagctgtgct gcagagctct 180
ggcctgtact ctctgtccag cgtggtgacc gtgccctctt ccagcctggg cacccagaca 240
tatatctgca acgtgaatca caagccaagc aatacaaagg tggacaagaa ggtggagccc 300
aagtcttgtg ataagaccca tacatgccct ccatgtccag ctccagagct gctgggcggc 360
ccaagcgtgt tcctgtttcc acccaagcct aaggataccc tgatgatctc cagaaccccc 420
gaggtgacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggatc ctgaggtgaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgct aagaccaagc ccagggagga gcagtacaac 540
tctacctatc gggtggtgtc cgtgctgaca gtgctgcacc aggattggct gaacggcaag 600
gagtataagt gcaaggtgtc taataaggcc ctgcccgctc ctatcgagaa gaccatctcc 660
aaggccaagg gccagcctag agagccacag gtgtacacac tgcctccatc tcgcgatgag 720
ctgaccaaga accaggtgtc cctgacatgt ctggtgaagg gcttctatcc ttccgacatc 780
gctgtggagt gggagagcaa tggccagcca gagaacaatt acaagaccac accccctgtg 840
ctggacagcg atggctcttt ctttctgtat agcaagctga ccgtggacaa gtctcgctgg 900
cagcagggca acgtgtttag ctgttctgtg atgcatgagg ccctgcacaa tcattataca 960
cagaagtccc tgagcctgtc tcctggcaag 990
<210> 84
<211> 1417
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v35-50
VH-CH1-hinge-CH2-CH3 (codon-optimized)
<400> 84
gagctgcagc tggtggagtc cggcggcggc tgggtgcagc ctggcggctc ccagaggctg 60
agctgtgccg cttctggcag gatcttccgg tccttttaca tgtcttgggt gcggcaggct 120
ccaggcaagg gcctggagtg ggtggctacc atcaaccagg acggctccga gaagctgtat 180
gtggatagcg tgaagggcag attcacaatc tctcgcgaca acgccaagaa ctccctgttt 240
ctgcagatga acaatctgag ggtggaggat accgccgtgt actattgcgc cgcttggtct 300
ggcaatagcg gcggcatgga cgtgtgggga cagggcacca ccgtgtccgt gtccagcgcc 360
tccacaaagg gcccaagcgt gtttccactg gctccctctt ccaagtctac ctccggcggc 420
acagccgctc tgggatgtct ggtgaaggat tacttcccag agcccgtgac cgtgtcttgg 480
aactccggcg ccctgaccag cggagtgcat acatttccag ctgtgctgca gagctctggc 540
ctgtactctc tgtccagcgt ggtgaccgtg ccctcttcca gcctgggcac ccagacatat 600
atctgcaacg tgaatcacaa gccaagcaat acaaaggtgg acaagaaggt ggagcccaag 660
tcttgtgata agacccatac atgccctcca tgtccagctc cagagctgct gggcggccca 720
agcgtgttcc tgtttccacc caagcctaag gataccctga tgatctccag aacccccgag 780
gtgacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaggatcctg aggtgaagtt caactggtac 840
gtggacggcg tggaggtgca taatgctaag accaagccca gggaggagca gtacaactct 900
acctatcggg tggtgtccgt gctgacagtg ctgcaccagg attggctgaa cggcaaggag 960
tataagtgca aggtgtctaa taaggccctg cccgctccta tcgagaagac catctccaag 1020
gccaagggcc agcctagaga gccacaggtg tacacactgc ctccatctcg cgatgagctg 1080
accaagaacc aggtgtccct gacatgtctg gtgaagggct tctatccttc cgacatcgct 1140
gtggagtggg agagcaatgg ccagccagag aacaattaca agaccacacc ccctgtgctg 1200
gacagcgatg gctctttctt tctgtatagc aagctgaccg tggacaagtc tcgctggcag 1260
cagggcaacg tgtttagctg ttctgtgatg catgaggccc tgcacaatca ttatacacag 1320
aagtccctga gcctgtctcc tggcaagtga tgaggtaccg tgcgacggcc ggcaagcccc 1380
cgctccccgg gctctcgcgg tcgtacgagg aaagctt 1417
<210> 85
<211> 344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v36 VL nt
<400> 85
agctgacaca gcccccttcc gtgtccgtgt cccctggaca gaccgtgtcc atcccatgca 60
gcggcgacaa gctgggcaac aagaacgtgg cctggtttca gcataagcct ggccagtccc 120
ccgtgctggt catctaccag gactccaaga ggcccagcgg catccctgag cggttctctg 180
gctccaacag cggcaataca gccaccctga caatctctgg cacacaggct atggacgagg 240
ccgcttattt ctgccagacc tttgattcca ccacagtggt gttcggcggc ggcaccagac 300
tgacagtgct gggtcagccc aaggctgccc cctcggtcac tctg 344
<210> 86
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v37 VL nt
<400> 86
tcctacgagc tgacacagcc accttccgtg agcgtgtctc caggacagac cgtgtccatc 60
ccttgcagcg gcgacaagct gggcaacaag aatgtggcct ggttccagca caagccaggc 120
cagtcccccg tgctggtcat ctacgaggat tctaagaggc cttccggcat cccagagcgg 180
ttttccggca gcaactctgg caataccgcc acactgacca tcagcggcac acaggctatg 240
gacgaggccg cttatttctg tcagaccttt gattctacca cagtggtgtt cggcggcggc 300
acaaggctga ccgtgctg 318
<210> 87
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v38 VL nt
<400> 87
tcctacgagc tgacacagcc accttccgtg agcgtgtctc caggacagac cgtgtccatc 60
ccttgcagcg gcgacaagct gggcaacaag aatgtggcct ggttccagca caagccaggc 120
cagtcccccg tgctggtcat ctaccaggtg tctaagaggc cttccggcat cccagagcgg 180
ttttccggca gcaactctgg caataccgcc acactgacca tcagcggcac acaggctatg 240
gacgaggccg cttatttctg tcagaccttt gattctacca cagtggtgtt cggcggcggc 300
acaaggctga ccgtgctg 318
<210> 88
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v39 VL nt
<400> 88
tcctacgagc tgacacagcc accttccgtg agcgtgtctc caggacagac cgtgtccatc 60
ccttgcagcg gcgacaagct gggcaacaag aatgtggcct ggttccagca caagccaggc 120
cagtcccccg tgctggtcat ctaccaggat aagaagaggc cttccggcat cccagagcgg 180
ttttccggca gcaactctgg caataccgcc acactgacca tcagcggcac acaggctatg 240
gacgaggccg cttatttctg tcagaccttt gattctacca cagtggtgtt cggcggcggc 300
acaaggctga ccgtgctg 318
<210> 89
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v40 VL nt
<400> 89
tcctacgagc tgacacagcc accttccgtg agcgtgtctc caggacagac cgtgtccatc 60
ccttgcagcg gcgacaagct gggcaacaag aatgtggcct ggttccagca caagccaggc 120
cagtcccccg tgctggtcat ctaccaggat tcttataggc cttccggcat cccagagcgg 180
ttttccggca gcaactctgg caataccgcc acactgacca tcagcggcac acaggctatg 240
gacgaggccg cttatttctg tcagaccttt gattctacca cagtggtgtt cggcggcggc 300
acaaggctga ccgtgctg 318
<210> 90
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v41 VL nt
<400> 90
tcctacgagc tgacacagcc accttccgtg agcgtgtctc caggacagac cgtgtccatc 60
ccttgcagcg gcgacaagct gggcaacaag aatgtggcct ggttccagca caagccaggc 120
cagtcccccg tgctggtcat ctaccaggtg tcttataggc cttccggcat cccagagcgg 180
ttttccggca gcaactctgg caataccgcc acactgacca tcagcggcac acaggctatg 240
gacgaggccg cttatttctg tcagaccttt gattctacca cagtggtgtt cggcggcggc 300
acaaggctga ccgtgctg 318
<210> 91
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v42 VL nt
<400> 91
tcttacgagc tgacacagcc accttccgtg agcgtgtctc caggacagac cgtgtccatc 60
ccttgcagcg gcgacaagct gggcaacaag aatgtggcct ggttccagca caagccaggc 120
cagtcccccg tgctggtcat ctacgaggtg tcttataggc cttccggcat cccagagcgg 180
tttagcggcg ccaactctgg caataccgct acactgacca tctccggcac acaggctatg 240
gacgaggccg cttatttctg tcagaccttt gatagcacca cagtggtgtt cggcggcggc 300
acaaggctga ccgtgctg 318
<210> 92
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v43 VL nt
<400> 92
tcctacgagc tgacacagcc accttccgtg agcgtgtctc caggacagac cgtgtccatc 60
ccttgcagcg gcgacaagct gggcaacaag aatgtggcct ggttccagca caagccaggc 120
cagtcccccg tgctggtcat ctaccaggtg aagtataggc cttccggcat cccagagcgg 180
ttttccggca gcaactctgg caataccgcc acactgacca tcagcggcac acaggctatg 240
gacgaggccg cttatttctg tcagaccttt gattctacca cagtggtgtt cggcggcggc 300
acaaggctga ccgtgctg 318
<210> 93
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v44 VL nt
<400> 93
tcctacgagc tgacacagcc accttccgtg agcgtgtctc caggacagac cgtgtccatc 60
ccttgcagcg gcgacaagct gggcaacaag aatgtggcct ggttccagca caagccaggc 120
cagtcccccg tgctggtcat ctacgctgtg aagtataggc cttccggcat cccagagcgg 180
ttttccggca gcaactctgg caataccgcc acactgacca tcagcggcac acaggctatg 240
gacgaggccg cttatttctg tcagaccttt gattctacca cagtggtgtt cggcggcggc 300
acaaggctga ccgtgctg 318
<210> 94
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v45 VL nt
<400> 94
tcctacgagc tgacacagcc accttccgtg agcgtgtctc caggacagac cgtgtccatc 60
ccttgcagcg gcgacaagct gggcaacaag aatgtggcct ggttccagca caagccaggc 120
cagtcccccg tgctggtcat ctacgaggtg aagtataggc cttccggcat cccagagaac 180
ttttccggca gcaactctgg caataccgcc acactgacca tcagcggcac acaggctatg 240
gacgaggccg cttatttctg tcagaccttt gattctacca cagtggtgtt cggaggagga 300
acaaggctga ccgtgctg 318
<210> 95
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v46 VL nt
<400> 95
tcctacgagc tgacacagcc accttccgtg agcgtgtctc caggacagac cgtgtccatc 60
ccttgcagcg gcgacaagct gggcaacaag aatgtggcct ggttccagca caagccaggc 120
cagtcccccg tgctggtcat ctacgaggtg aagtataggc cttccggcat cccagaggct 180
ttttccggca gcaactctgg caataccgcc acactgacca tcagcggcac acaggctatg 240
gacgaggccg cttatttctg tcagaccttt gattctacca cagtggtgtt cggaggagga 300
acaaggctga ccgtgctg 318
<210> 96
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v49 VL nt
<400> 96
tcctacgagc tgacacagcc accttccgtg agcgtgtctc caggacagac cgtgtccatc 60
ccttgcagcg gcgacaagct gggcaacaag aatgtggcct ggttccagca caagccaggc 120
cagtcccccg tgctggtcat ctacgaggtg tcttataggc cttccggcat cccagagcgg 180
ttttccggca gcaactctgg caataccgcc acactgacca tcagcggcac acaggctatg 240
gacgaggccg cttatttctg tcagaccttt gattctacca cagtggtgtt cggcggcggc 300
acaaggctga ccgtgctg 318
<210> 97
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v50 VL nt
<400> 97
tcctacgagc tgacacagcc accttccgtg agcgtgtctc caggacagac cgtgtccatc 60
ccttgcagcg gcgacaagct gggcaacaag aatgtggcct ggttccagca caagccaggc 120
cagtcccccg tgctggtcat ctacgaggtg aagtataggc cttccggcat cccagagaag 180
ttttccggca gcaactctgg caataccgcc acactgacca tcagcggcac acaggctatg 240
gacgaggccg cttatttctg tcagaccttt gattctacca cagtggtgtt cggaggagga 300
acaaggctga ccgtgctg 318
<210> 98
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-V35-50 CL
(codon-optimized)_1
<400> 98
ggacagccaa aggctgctcc atctgtgacc ctgtttccac cctcttccga ggagctgcag 60
gccaacaagg ccaccctggt gtgcctgatc tctgacttct accctggagc tgtgacagtg 120
gcttggaagg ctgatagctc tcccgtgaag gctggcgtgg agacaacaac ccctagcaag 180
cagtctaaca ataagtacgc cgcttccagc tatctgtctc tgacaccaga gcagtggaag 240
tcccaccgct cttattcctg ccaggtgacc catgagggca gcaccgtgga gaagacagtg 300
gcccccaccg agtgttct 318
<210> 99
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-V35-50 CL
(codon-optimized)_2
<400> 99
ggacagccaa aggctgctcc atctgtgacc ctgtttccac cctcttccga ggagctgcag 60
gccaacaagg ccaccctggt gtgcctgatc tctgacttct accctggagc tgtgacagtg 120
gcttggaagg ctgatagctc tcccgtgaag gctggcgtgg agacaacaac ccctagcaag 180
cagtctaaca ataagtacgc cgcttccagc tatctgtctc tgacaccaga gcagtggaag 240
tcccaccgct cttattcctg ccaggtgacc catgagggca gcaccgtgga gaagacagtg 300
gcccccaccg agtgttct 318
<210> 100
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(33)
<223> Xaa = Cys
<400> 100
Xaa Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met Thr
1 5 10 15
Xaa Pro Ser Asp Gly Asn Ala Thr Ala Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp
20 25 30
Xaa
<210> 101
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 101
Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala Gln Gly
1 5 10 15
<210> 102
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 102
Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser
1 5 10 15
Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met Thr Thr
20 25
<210> 103
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(33)
<223> Xaa = Cys
<400> 103
Xaa Ser Met Tyr Pro Ser Ala Ser Ala Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn
1 5 10 15
Xaa Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala Gln Gly Thr Ser
20 25 30
Xaa
<210> 104
<211> 11
<212> PRT
<213> Heptatits B Virus
<220>
<223> amino acids 120 - 130 of the S domain of HBsAg
(HBV-D J02203
<400> 104
Pro Cys Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala Gln Gly
1 5 10
<210> 105
<211> 11
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<221> VARIANT
<222> 3
<223> Xaa = R or K
<220>
<221> VARIANT
<222> 6
<223> Xaa = M or T
<220>
<221> VARIANT
<222> 7
<223> Xaa = T or I
<220>
<221> VARIANT
<222> 8
<223> Xaa = T, P, or L
<400> 105
Pro Cys Xaa Thr Cys Xaa Xaa Xaa Ala Gln Gly
1 5 10
<210> 106
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic linker
<400> 106
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 107
<211> 7
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 107
Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys
1 5
<210> 108
<211> 7
<212> PRT
<213> Heptatits B Virus
<400> 108
Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro
1 5
<210> 109
<211> 25
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<221> MOD_RES
<222> 2, 21, 24
<223> coupled to acetamidomethyl
<400> 109
Cys Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Cys Ser Thr Thr
1 5 10 15
Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Cys
20 25
<210> 110
<211> 28
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4,6,24,27
<223> coupled to acetamidomethyl
<400> 110
Cys Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Cys
1 5 10 15
Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Cys
20 25
<210> 111
<211> 17
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<221> MOD_RES
<222> 13, 16
<223> coupled to acetamidomethyl
<400> 111
Cys Gly Gly Gly Cys Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys
1 5 10 15
Cys
<210> 112
<211> 11
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 112
Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys
1 5 10
<210> 113
<211> 15
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 113
Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Cys
1 5 10 15
<210> 114
<211> 14
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 114
Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe
1 5 10
<210> 115
<211> 5
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(5)
<223> Xaa = Any Amino Acid
<400> 115
Pro Cys Arg Xaa Cys
1 5
<210> 116
<211> 3182
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 116
aattccacaa ccttccacca aactctgcaa gatcccagag tgagaggcct gtatttccct 60
gctggtggct ccagttcagg aacagtaaac cctgttctga ctactgcctc tcccttatcg 120
tcaatcttct cgaggattgg ggaccctgcg ctgaacatgg agaacatcac atcaggattc 180
ctaggacccc ttctcgtgtt acaggcgggg tttttcttgt tgacaagaat cctcacaata 240
ccgcagagtc tagactcgtg gtggacttct ctcaattttc tagggggaac taccgtgtgt 300
cttggccaaa attcgcagtc cccaacctcc aatcactcac caacctcttg tcctccaact 360
tgtcctggtt atcgctggat gtgtctgcgg cgttttatca tcttcctctt catcctgctg 420
ctatgcctca tcttcttgtt ggttcttctg gactatcaag gtatgttgcc cgtttgtcct 480
ctaattccag gatcctcaac aaccagcacg ggaccatgcc ggacctgcat gactactgct 540
caaggaacct ctatgtatcc ctcctgttgc tgtaccaaac cttcggacgg aaattgcacc 600
tgtattccca tcccatcatc ctgggctttc ggaaaattcc tatgggagtg ggcctcagcc 660
cgtttctcct ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc 720
actgtttggc tttcagttat atggatgatg tggtattggg ggccaagtct gtacagcatc 780
ttgagtccct ttttaccgct gttaccaatt ttcttttgtc tttgggtata catttaaacc 840
ctaacaaaac aaagagatgg ggttactctc taaattttat gggttatgtc attggatgtt 900
atgggtcctt gccacaagaa cacatcatac aaaaaatcaa agaatgtttt agaaaacttc 960
ctattaacag gcctattgat tggaaagtat gtcaacgaat tgtgggtctt ttgggttttg 1020
ctgccccttt tacacaatgt ggttatcctg cgttgatgcc tttgtatgca tgtattcaat 1080
ctaagcaggc tttcactttc tcgccaactt acaaggcctt tctgtgtaaa caatacctga 1140
acctttaccc cgttgcccgg caacggccag gtctgtgcca agtgtttgct gacgcaaccc 1200
ccactggctg gggcttggtc atgggccatc agcgcatgcg tggaaccttt tcggctcctc 1260
tgccgatcca tactgcggaa ctcctagccg cttgttttgc tcgcagcagg tctggagcaa 1320
acattatcgg gactgataac tctgttgtcc tatcccgcaa atatacatcg tttccatggc 1380
tgctaggctg tgctgccaac tggatcctgc gcgggacgtc ctttgtttac gtcccgtcgg 1440
cgctgaatcc tgcggacgac ccttctcggg gtcgcttggg actctctcgt ccccttctcc 1500
gtctgccgtt ccgaccgacc acggggcgca cctctcttta cgcggactcc ccgtctgtgc 1560
cttctcatct gccggaccgt gtgcacttcg cttcacctct gcacgtcgca tggagaccac 1620
cgtgaacgcc caccaaatat tgcccaaggt cttacataag aggactcttg gactctcagc 1680
aatgtcaacg accgaccttg aggcatactt caaagactgt ttgtttaaag actgggagga 1740
gttgggggag gagattaggt taaaggtctt tgtactagga ggctgtaggc ataaattggt 1800
ctgcgcacca gcaccatgca actttttcac ctctgcctaa tcatctcttg ttcatgtcct 1860
actgttcaag cctccaagct gtgccttggg tggctttggg gcatggacat cgacccttat 1920
aaagaatttg gagctactgt ggagttactc tcgtttttgc cttctgactt ctttccttca 1980
gtacgagatc ttctagatac cgcctcagct ctgtatcggg aagccttaga gtctcctgag 2040
cattgttcac ctcaccatac tgcactcagg caagcaattc tttgctgggg ggaactaatg 2100
actctagcta cctgggtggg tgttaatttg gaagatccag cgtctagaga cctagtagtc 2160
agttatgtca acactaatat gggcctaaag ttcaggcaac tcttgtggtt tcacatttct 2220
tgtctcactt ttggaagaga aacagttata gagtatttgg tgtctttcgg agtgtggatt 2280
cgcactcctc cagcttatag accaccaaat gcccctatcc tatcaacact tccggagact 2340
actgttgtta gacgacgagg caggtcccct agaagaagaa ctccctcgcc tcgcagacga 2400
aggtctcaat cgccgcgtcg cagaagatct caatctcggg aatctcaatg ttagtattcc 2460
ttggactcat aaggtgggga actttactgg gctttattct tctactgtac ctgtctttaa 2520
tcctcattgg aaaacaccat cttttcctaa tatacattta caccaagaca ttatcaaaaa 2580
atgtgaacag tttgtaggcc cactcacagt taatgagaaa agaagattgc aattgattat 2640
gcctgccagg ttttatccaa aggttaccaa atatttacca ttggataagg gtattaaacc 2700
ttattatcca gaacatctag ttaatcatta cttccaaact agacactatt tacacactct 2760
atggaaggcg ggtatattat ataagagaga aacaacacat agcgcctcat tttgtgggtc 2820
accatattct tgggaacaag atctacagca tggggcagaa tctttccacc agcaatcctc 2880
tgggattctt tcccgaccac cagttggatc cagccttcag agcaaacacc gcaaatccag 2940
attgggactt caatcccaac aaggacacct ggccagacgc caacaaggta ggagctggag 3000
cattcgggct gggtttcacc ccaccgcacg gaggcctttt ggggtggagc cctcaggctc 3060
agggcatact acaaactttg ccagcaaatc cgcctcctgc ctccaccaat cgccagtcag 3120
gaaggcagcc taccccgctg tctccacctt tgagaaacac tcatcctcag gccatgcagt 3180
gg 3182
<210> 117
<211> 3215
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 117
ctccacaaca ttccaccaag ctctgctaga tcccagagtg aggggcctat attttcctgc 60
tggtggctcc agttccggaa cagtaaaccc tgttccgact actgcctcac ccatatcgtc 120
aatcttctcg aggactgggg accctgcacc gaacatggag agcacaacat caggattcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaagaatcc tcacaatacc 240
acagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggagcac ccacgtgtcc 300
tggccaaaat tcgcagtccc caacctccaa tcactcacca acctcttgtc ctccaacttg 360
tcctggctat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcata ttcctcttca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ctaccaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
acttccagga acatcaacta ccagcacggg accatgcaga acctgcacga ttcctgctca 540
aggaacctct atgtttccct cttgttgctg tacaaaacct tcggacggaa actgcacttg 600
tattcccatc ccatcatcct gggctttcgc aagattccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcctgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720
tgtttggctt tcagctatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acaacatctt 780
gagtcccttt ttacctctat taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttgaaccct 840
aataaaacca aacgttgggg ctactccctt aacttcatgg gatatgtaat tggaagttgg 900
ggtactttac cgcaggaaca tattgtacaa aaactcaagc aatgttttcg aaaattgcct 960
gtaaatagac ctattgattg gaaagtatgt caaagaattg tgggtctttt gggctttgct 1020
gcccctttta cacaatgtgg ctatcctgcc ttgatgcctt tatatgcatg tatacaatct 1080
aagcaggctt tcactttctc gccaacttac aaggcctttc tgtgtaaaca atatctaaac 1140
ctttaccccg ttgcccggca acggtcaggt ctctgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
acgggttggg gcttggccat aggccatcgg cgcatgcgtg gaacctttgt ggctcctctg 1260
ccgatccata ctgcggaact cctagcagct tgttttgctc gcagccggtc tggagcgaaa 1320
cttatcggaa ccgacaactc agttgtcctc tctcggaaat acacctcctt tccatggctg 1380
ctaggctgtg ctgccaactg gatcctgcgc gggacgtcct ttgtctacgt cccgtcggcg 1440
ctgaatcccg cggacgaccc gtctcggggc cgtttgggcc tctaccgtcc ccttcttcat 1500
ctgccgttcc ggccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggtctcccc gtctgtgcct 1560
tctcatctgc cggaccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgtagcatg gagaccaccg 1620
tgaacgccca ccaggtcttg cccaaggtct tacacaagag gactcttgga ctctcagcaa 1680
tgtcaacgac cgaccttgag gcatacttca aagactgttt gtttaaagac tgggaggagt 1740
tgggggagga gattaggtta aaggtctttg tactaggagg ctgtaggcat aaattggtct 1800
gttcaccagc accatgcaac tttttcccct ctgcctaatc atctcatgtt catgtcctac 1860
tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccgtataa 1920
agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct tctgacttct ttccttctat 1980
tcgagatctc ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag gccttagagt ctccggaaca 2040
ttgttcacct caccatacag cactcaggca agctattctg tgttggggtg agttgatgaa 2100
tctggccacc tgggtgggaa gtaatttgga agacccagca tccagggaat tagtagtcag 2160
ctatgtcaat gttaatatgg gcctaaaaat tagacaacta ttgtggtttc acatttcctg 2220
ccttactttt ggaagagaaa ctgtccttga gtatttggtg tcttttggag tgtggattcg 2280
cactcctccc gcttacagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 2340
tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag 2400
gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa tctcaatgtt agtatccctt 2460
ggactcataa ggtgggaaac tttactgggc tttattcttc tactgtacct gtctttaatc 2520
ctgattggaa aactccctcc tttcctcaca ttcatttaca ggaggacatt attaatagat 2580
gtcaacaata tgtgggccct ctgacagtta atgaaaaaag gagattaaaa ttaattatgc 2640
ctgctaggtt ctatcctaac cttaccaaat atttgccctt ggacaaaggc attaaaccgt 2700
attatcctga atatgcagtt aatcattact tcaaaactag gcattattta catactctgt 2760
ggaaggctgg cattctatat aagagagaaa ctacacgcag cgcctcattt tgtgggtcac 2820
catattcttg ggaacaagag ctacagcatg ggaggttggt cttccaaacc tcgacaaggc 2880
atggggacga atctttctgt tcccaatcct ctgggattct ttcccgatca ccagttggac 2940
cctgcgttcg gagccaactc aaacaatcca gattgggact tcaaccccaa caaggatcac 3000
tggccagagg caaatcaggt aggagcggga gcatttggtc cagggttcac cccaccacac 3060
ggaggccttt tggggtggag ccctcaggct cagggcatat tgacaacact gccagcagca 3120
cctcctcctg cctccaccaa tcggcagtca ggaagacagc ctactcccat ctctccacct 3180
ctaagagaca gtcatcctca ggccatgcag tggaa 3215
<210> 118
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBV001 sense
<400> 118
gugugcacuu cgcuucaca 19
<210> 119
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBV001 antisense
<400> 119
ugugaagcga agugcacacu u 21
<210> 120
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBV003 sense
<400> 120
gguggacuuc ucucaauuuu a 21
<210> 121
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBV003 antisense
<400> 121
uaaaauugag agaaguccac cac 23
<210> 122
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBV002v2 sense
<400> 122
gugugcacuu cgcuucaca 19
<210> 123
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBV002v2 antisense
<400> 123
ugugaagcga agugcacacu u 21
<210> 124
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBV002v1 sense
<400> 124
gugugcacuu cgcuucaca 19
<210> 125
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBV002v1 antisense
<400> 125
ugugaagcga agugcacacu u 21
<210> 126
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence No. 126 sense
<400> 126
gguggacuuc ucucaauuuu a 21
<210> 127
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence No. 127 antisense
<400> 127
uaaaauugag agaaguccac cac 23
<210> 128
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence RFGF
<400> 128
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
1 5 10 15
<210> 129
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence RFGF analogue
<400> 129
Ala Ala Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 130
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HIV Tat protein
<400> 130
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1 5 10
<210> 131
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence Drosophila Antennapedia protein
<400> 131
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys
1 5 10 15
<210> 132
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence CDR framework
<400> 132
Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Glu Val Lys Tyr Arg Pro Ser
1 5 10 15
Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn
20 25
<210> 133
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence CDR framework
<400> 133
Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr
1 5 10 15
Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala
20 25 30
<210> 134
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34
<400> 134
Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Glu Val Lys Tyr Arg Pro Ser
1 5 10 15
Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr
20 25 30
Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys
35 40 45
<210> 135
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence GL L2
<400> 135
Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser
1 5 10 15
Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr
20 25 30
Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys
35 40 45
<210> 136
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence v36 + Q49E
<400> 136
Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser
1 5 10 15
Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr
20 25 30
Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys
35 40 45
<210> 137
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence v36 + D50V
<400> 137
Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Val Ser Lys Arg Pro Ser
1 5 10 15
Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr
20 25 30
Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys
35 40 45
<210> 138
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence v36 + S51K
<400> 138
Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Lys Lys Arg Pro Ser
1 5 10 15
Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr
20 25 30
Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys
35 40 45
<210> 139
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence v36 + K52Y
<400> 139
Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp Ser Tyr Arg Pro Ser
1 5 10 15
Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr
20 25 30
Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys
35 40 45
<210> 140
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence v36 + D50V + K52Y
<400> 140
Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Val Ser Tyr Arg Pro Ser
1 5 10 15
Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr
20 25 30
Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys
35 40 45
<210> 141
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34 +K51S + S64A
<400> 141
Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Glu Val Ser Tyr Arg Pro Ser
1 5 10 15
Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr
20 25 30
Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys
35 40 45
<210> 142
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34 +E49Q
<400> 142
Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Val Lys Tyr Arg Pro Ser
1 5 10 15
Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr
20 25 30
Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys
35 40 45
<210> 143
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34 +E49A
<400> 143
Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Ala Val Lys Tyr Arg Pro Ser
1 5 10 15
Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr
20 25 30
Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys
35 40 45
<210> 144
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34 +R60N
<400> 144
Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Glu Val Lys Tyr Arg Pro Ser
1 5 10 15
Gly Ile Pro Glu Asn Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr
20 25 30
Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys
35 40 45
<210> 145
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34 +R60A
<400> 145
Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Glu Val Lys Tyr Arg Pro Ser
1 5 10 15
Gly Ile Pro Glu Ala Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr
20 25 30
Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys
35 40 45
<210> 146
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34 +K51S + S64A + R60N +
I74A
<400> 146
Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Glu Val Ser Tyr Arg Pro Ser
1 5 10 15
Gly Ile Pro Glu Asn Phe Ser Gly Ala Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr
20 25 30
Leu Thr Ala Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys
35 40 45
<210> 147
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34 +R60N + S64A + I74A
<400> 147
Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Glu Val Lys Tyr Arg Pro Ser
1 5 10 15
Gly Ile Pro Glu Asn Phe Ser Gly Ala Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr
20 25 30
Leu Thr Ala Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys
35 40 45
<210> 148
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34 +K51S
<400> 148
Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Glu Val Ser Tyr Arg Pro Ser
1 5 10 15
Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr
20 25 30
Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys
35 40 45
<210> 149
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34 + R60K
<400> 149
Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Glu Val Lys Tyr Arg Pro Ser
1 5 10 15
Gly Ile Pro Glu Lys Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr
20 25 30
Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Ala Tyr Phe Cys
35 40 45
<210> 150
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence CDRH1 (IMGT)
<400> 150
Gly Arg Ile Phe Arg Ser Phe Tyr
1 5
<210> 151
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence CDRH2 - short (IMGT)
<400> 151
Gln Asp Gly Ser Glu Lys
1 5
<210> 152
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence CDRH2 - long (IMGT)
<400> 152
Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys
1 5
<210> 153
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence CDRH3 (IMGT)
<400> 153
Ala Ala Trp Ser Gly Asn Ser Gly Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 154
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence CDRL1 (IMGT)
<400> 154
Lys Leu Gly Asn Lys Asn
1 5
<210> 155
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v35, -v45, -v46, -v48
CDRL2 - short
<400> 155
Glu Val Lys
1
<210> 156
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v36, -v40 CDRL2 - short
(IMGT)
<400> 156
Gln Asp Ser
1
<210> 157
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v37 CDRL2 - short (IMGT)
<400> 157
Glu Asp Ser
1
<210> 158
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v38, -v41, CDRL2 - short
(IMGT)
<400> 158
Gln Val Ser
1
<210> 159
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v39 CDRL2 - short (IMGT)
<400> 159
Gln Asp Lys
1
<210> 160
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v42, -v47, -v49, -v50
CDRL2 - short (IMGT)
<400> 160
Glu Val Ser
1
<210> 161
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v43 CDRL2 - short (IMGT)
<400> 161
Gln Val Lys
1
<210> 162
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v44 CDRL2 - short (IMGT)
<400> 162
Ala Val Lys
1
<210> 163
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v35, -v45, -v46,
-v48
CDRL2 - long
<400> 163
Val Ile Tyr Glu Val Lys Tyr Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 164
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v36 CDRL2 - long (IMGT)
<400> 164
Val Ile Tyr Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 165
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v37 CDRL2 - long (IMGT)
<400> 165
Val Ile Tyr Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 166
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v38 CDRL2 - long (IMGT)
<400> 166
Val Ile Tyr Gln Val Ser Lys Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 167
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v39 CDRL2 - long (IMGT)
<400> 167
Val Ile Tyr Gln Asp Lys Lys Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 168
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v40 CDRL2 - long (IMGT)
<400> 168
Val Ile Tyr Gln Asp Ser Tyr Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 169
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v41 CDRL2 - long (IMGT)
<400> 169
Val Ile Tyr Gln Val Ser Tyr Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 170
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v42, -v47, -v49, -v50
CDRL2 - long
<400> 170
Val Ile Tyr Glu Val Ser Tyr Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 171
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v43 CDRL2 - long (IMGT)
<400> 171
Val Ile Tyr Gln Val Lys Tyr Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 172
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v44 CDRL2 - long (IMGT)
<400> 172
Val Ile Tyr Ala Val Lys Tyr Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 173
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic sequence HBC34-v35-v50 CDRL3 (IMGT)
<400> 173
Gln Thr Phe Asp Ser Thr Thr Val Val
1 5

Claims (186)

1.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括：
(i)重链可变区(VH)，在所述VH中包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的氨基酸序列，和SEQ ID NO:37的氨基酸序列；以及
(ii)轻链可变区(VL)，在所述VL中包括SEQ ID NO:41、40、42和43中的任一者的氨基酸序列、如SEQ ID NO:49、44-48和50-53中的任一者所示的氨基酸序列，和如SEQ ID NO:55或56所示的氨基酸序列，
其中任选地，所述VL包括与SEQ ID NO:58有关的R60N取代突变、R60A取代突变、R60K取代突变、S64A取代突变、I74A取代突变或其任何组合，并且其中所述取代突变的氨基酸编号如SEQ ID NO:58所示，并且仍进一步任选地，其中所述VL不包括与SEQ ID NO:58有关的任何另外的突变，
并且其中所述抗体或其抗原结合片段能够与HBsAg的抗原环区结合，并且任选地，能够中和由基因型D、A、B、C、E、F、G、H、I或J或其任何组合的乙型肝炎病毒(HBV)引起的感染。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其包括：
(i)在所述VH中，分别如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、49和55所示的氨基酸序列；
(ii)在所述VH中，如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、46和55所示的氨基酸序列；
(iii)在所述VH中，分别如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、47和55所示的氨基酸序列；
(iv)在所述VH中，分别如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、48和55所示的氨基酸序列；
(v)在所述VH中，分别如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、45和55所示的氨基酸序列；
(vi)在所述VH中，分别如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、50和55所示的氨基酸序列；
(vii)在所述VH中，分别如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、51和55所示的氨基酸序列；
(viii)在所述VH中，分别如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、52和55所示的氨基酸序列；或者
(ix)在所述VH中，分别如SEQ ID NO:34、35和37所示的氨基酸序列，以及在所述VL中，分别如SEQ ID NO:41、53和55所示的氨基酸序列。
3.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括：
(i)重链可变区(VH)，所述VH包括如SEQ ID NO:34所示的CDRH1氨基酸序列、如SEQ IDNO:35或36所示的CDRH2氨基酸序列和如SEQ ID NO:37所示的CDRH3氨基酸序列；以及
(ii)轻链可变区(VL)，所述VL包括如SEQ ID NO:40-43中的任一者所示的CDRL1氨基酸序列、如SEQ ID NO:49、44-48和50-53中的任一者所示的CDRL2氨基酸序列和如SEQ ID NO:55或56所示的CDRL3氨基酸序列，
其中CDR是根据CCG编号系统定义的，并且
其中所述抗体或其抗原结合片段能够与HBsAg的抗原环区结合，并且任选地，能够中和由基因型D、A、B、C、E、F、G、H、I或J或其任何组合的乙型肝炎病毒(HBV)引起的感染，条件是所述抗体或抗原结合片段不包括分别如SEQ ID NO:34、35、37、41、44和45所示的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列如以下所示：
(i)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、49和55；
(ii)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、46和55；
(iii)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、47和55；
(iv)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、48和55；
(v)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、45和55；
(vi)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、50和55；
(vii)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、51和55；
(viii)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、52和55；
(ix)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、53和55；或
(x)分别为SEQ ID NO:34、35、37、41、44和55。
5.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH和所述VL分别包括CDRH1、CDRH2、CDRH3和CDRL1、CDRL2、CDRL3，如以下所示：HBC34-v40；HBC34-v36；HBC34-v37；HBC34-v38；HBC34-v39；HBC34-v41；HBC34-v42；HBC34-v43；HBC34-v44；HBC34-v45；HBC34-v46；HBC34-v47；HBC34-v48；HBC34-v49；或HBC34-v50，
其中所述CDR是根据IMGT编号定义的，任选地，其中所述VL进一步包括与SEQ ID NO:58有关的R60N取代突变、R60A取代突变、R60K取代突变、S64A取代突变、I74A取代突变或其任何组合，并且其中所述取代突变的氨基酸编号如SEQID NO:58所示，并且进一步任选地，其中所述VL不包括与SEQ ID NO:58有关的任何另外的突变。
6.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH和所述VL分别包括如以下所示的CDRH1、CDRH2、CDRH3和CDRL1、CDRL2、CDRL3：HBC34-v40；HBC34-v36；HBC34-v37；HBC34-v38；HBC34-v39；HBC34-v41；HBC34-v42；HBC34-v43；HBC34-v44；HBC34-v45；HBC34-v46；HBC34-v47；HBC34-v48；HBC34-v49；或HBC34-v50，
其中所述CDR是根据CCG编号定义的，任选地，其中所述VL进一步包括与SEQ ID NO:58有关的R60N取代突变、R60A取代突变、R60K取代突变、S64A取代突变、I74A取代突变或其任何组合，并且其中所述取代突变的氨基酸编号如SEQID NO:58所示，并且进一步任选地，其中所述VL不包括与SEQ ID NO:58有关的任何其它突变。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中：
(i)所述VH包括与以下中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或由其组成：SEQ ID NO:38或39；和/或
(ii)所述VL包括与以下中的任一者中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或由其组成：SEQ ID NO:62、58-61、63-66、69、71和72。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中：
(i)所述VH包括与SEQ ID NO:38或39中所示的氨基酸序列具有至少90％(即，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％或其间任何非整数值)同一性的氨基酸序列或由其组成；和/或
(ii)所述VL包括与SEQ ID NO:62、58-61、63-66、69、71和72中的任一者中所示的氨基酸序列具有至少90％(即，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％或其间任何非整数值)同一性的氨基酸序列或由其组成。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述VH和所述VL包括与以下中所示的氨基酸序列具有至少90％(即，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或其间任何非整数值)同一性的氨基酸序列或由其组成：(i)分别为SEQ IDNO:38和62；(ii)分别为SEQ ID NO:38和59；(iii)分别为SEQ ID NO:38和60；(iv)分别为SEQ ID NO:38和61；(v)分别为SEQ ID NO:38和58；(vi)分别为SEQ ID NO:38和63；(vii)分别为SEQ ID NO:38和64；(viii)分别为SEQ ID NO:38和65；(ix)分别为SEQ ID NO:38和66；(x)分别为SEQ ID NO:38和71；或(xi)分别为SEQ ID NO:38和72。
10.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包括SEQ ID NO:38或39的氨基酸序列或由其组成，所述VL包括SEQID NO:62、57-61和63-72中的任一者的变体，其中所述变体包括以下突变中的任何一个或多个突变：R60A；R60N；R60K；S64A；和I74A，并且其中任选地，所述VL变体不包括分别相对于SEQ ID NO:62、57-61和63-72的任何另外的突变。
11.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包括SEQ ID NO:38或39的氨基酸序列或由其组成，所述VL包括SEQID NO:62、57-61和63-72中的任一者的变体，其中所述变体包括在Q78、D81或两者处的取代突变(例如，保守氨基酸取代，或种系编码的氨基酸的突变)，并且其中任选地，所述VL变体不包括分别相对于SEQ ID NO:62、57-61和63-72的任何另外的突变。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中：所述VH包括SEQ IDNO:38或39中所示的氨基酸序列或由其组成；和/或所述VL包括SEQ ID NO:62、58-61、63-66、69、71或72中的任一者中所示的氨基酸序列或由其组成。
13.根据权利要求1至9和12中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述VH和所述VL包括以下中所示的氨基酸序列或由其组成：
(i)分别为SEQ ID NO:38和62；
(ii)分别为SEQ ID NO:38和59；
(iii)分别为SEQ ID NO:38和60；
(iv)分别为SEQ ID NO:38和61；
(v)分别为SEQ ID NO:38和58；
(vi)分别为SEQ ID NO:38和63；
(vii)分别为SEQ ID NO:38和64；
(viii)分别为SEQ ID NO:38和65；
(ix)分别为SEQ ID NO:38和66；
(x)分别为SEQ ID NO:38和71；或
(xi)分别为SEQ ID NO:38和72。
14.一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH和所述VL包括以下中所示的氨基酸序列或由其组成：
(i)分别为SEQ ID NO:38和62；
(ii)分别为SEQ ID NO:38和66；
(iii)分别为SEQ ID NO:38和67；
(iv)分别为SEQ ID NO:38和68；或
(v)分别为SEQ ID NO:38和72；
其中所述抗体或其抗原结合片段能够与HBsAg的抗原环区结合并且能够中和由基因型D、A、B、C、E、F、G、H、I或J或其任何组合的乙型肝炎病毒(HBV)引起的感染。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其能够中和由丁型肝炎病毒(HDV)引起的感染。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中在包括多个所述抗体或抗原结合片段的样品中，当所述样品已在约40℃下温育持续约120小时至约168小时时，所述多个中的少于12％、11％或更少、10％或更少、9％或更少、8％或更少、7％或更少、6％或更少、5％或更少、4％或更少、3％或更少或2％或更少是包含在二聚体中，其中任选地，通过绝对尺寸排阻色谱法确定二聚体的存在。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中与温育多个参考抗体或抗原结合片段相比，温育多个所述抗体或抗原结合片段使二聚体形成减少，
其中所述参考抗体或抗原结合片段包括分别如SEQ ID NO:34、35、37、41、44和55中所示的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，并且任选地包括SEQ ID NO:38中所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:57中所示的VL氨基酸序列，
并且其中任选地，通过绝对尺寸排阻色谱法确定抗体二聚体的存在。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的抗体或抗原结合片段，与参考抗体相比，在以下条件下所述抗体或抗原结合片段形成更低量的二聚体，和/或以减少的频率和/或以样品或组合物中总抗体或抗原结合片段分子的更低百分比形成二聚体，
(i)在4℃下温育5天、15天和/或32天；
(ii)在25℃下温育5天、15天和/或32天；和/或
(iii)在40℃下温育5天、15天和/或32天，
其中所述参考抗体或抗原结合片段包括分别如SEQ ID NO:34、35、37、41、44和55中所示的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，并且任选地包括SEQ ID NO:38中所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:57中所示的VL氨基酸序列。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中在组合物中包含在二聚体中的抗体或抗原结合片段分子的百分比分别是在组合物中包含在二聚体中的参考抗体分子的百分比的少于4/5、少于3/4、少于1/2、少于1/3、少于1/4、少于1/5、少于1/6、少于1/7、少于1/8、少于1/9或少于1/10。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中相较于用编码参考抗体或抗原结合片段的多核苷酸转染的参考宿主细胞，用编码所述抗体或抗原结合片段的多核苷酸转染的宿主细胞分别提供了1.5倍或更多倍、2倍或更多倍、3倍或更多倍或4倍或更多倍的抗体或抗原结合片段的量，其中所述参考抗体或抗原结合片段包括分别如SEQ IDNO:34、35、37、41、44和55中所示的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，并且任选地包括SEQ ID NO:38中所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:57中所示的VL氨基酸序列。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中与在参考转染细胞中产生的参考抗体或抗原结合片段相比，所述抗体或其抗原结合片段以更高的滴度在转染细胞中产生，其中所述参考抗体或抗原结合片段包括分别如SEQ ID NO:34、35、37、41、44和55中所示的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，并且任选地包括SEQ ID NO:38中所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:57中所示的VL氨基酸序列。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以一定滴度在转染细胞中产生，所述滴度是产生参考抗体或抗原结合片段的滴度的至少1.5倍、至少2倍、至少3倍或至少4倍，其中所述参考抗体或抗原结合片段包括分别如SEQ ID NO:34、35、37、41、44和55中所示的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，并且任选地包括SEQ ID NO:38中所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:57中所示的VL氨基酸序列。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够以约3.2或更小、小于3.0、小于2.5、小于2.0、小于1.5或小于1.0的EC50(ng/ml)与HBsAg(adw)结合。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够以小于3.5、小于3.4、小于3.3、小于3.2、小于3.1、小于3.0、小于2.9、小于2.8、小于2.7、小于2.6、小于2.5、小于2.4、小于2.3、小于2.1、小于2.0、小于1.9、小于1.8、小于1.7、小于1.6、小于1.5、小于1.4、小于1.3、小于1.2、小于1.1或小于1.0的EC50(ng/ml)与HBsAg(例如，亚型adw的HBsAg)结合。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够以介于0.9与2.0之间、或介于0.9与1.9之间、或介于0.9与1.8之间、或介于0.9与1.7之间、或介于0.9与1.6之间、或介于0.9与1.5之间、或介于0.9与1.4之间、或介于0.9与1.3之间、或介于0.9与1.2之间、或介于0.9与1.1之间、或介于0.9与1.0之间、或介于1.0与2.0之间的EC50(ng/ml)与HBsAg(例如，亚型adw的HBsAg)结合。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够以2.0或更小的EC50(ng/ml)与HBsAg(adw)结合。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段具有小于20ng/ml，优选地15ng/ml或更小，更优选地10ng/mL或更小的乙型肝炎病毒感染中和EC50。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够以18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8或7ng/mL的感染中和EC50中和乙型肝炎病毒感染。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够以比参考抗体或抗原结合片段的感染中和EC50更低的感染中和EC50来中和乙型肝炎病毒感染，所述参考抗体或抗原结合片段包括分别如SEQ ID NO:34、35、37、41、44和55中所示的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，并且任选地包括SEQ ID NO:38中所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:57中所示的VL氨基酸序列。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括人抗体、单克隆抗体、纯化抗体、单链抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是多特异性抗体或抗原结合片段。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是双特异性抗体或抗原结合片段。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或所述抗原结合片段包括Fc部分。
34.根据权利要求33所述的抗体或抗原结合片段，其中与不包括所述突变的参考Fc部分相比，所述Fc部分包括增强与FcRn的结合的突变。
35.根据权利要求33或34所述的抗体或抗原结合片段，其中与不包括所述突变的参考Fc部分相比，所述Fc部分包括增强与FcγR，优选地FcγRIIA和/或FcγRIIIA结合的突变。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述Fc部分是IgG同种型，如IgG1，或源自IgG同种型，如IgG1。
37.根据权利要求33至36中任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括或源自Ig G1m17,1(IgHG1*01)。
38.根据权利要求34至37中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述增强与FcRn的结合的突变包括：
(i)M428L/N434S；
(ii)M252Y/S254T/T256E；
(iii)T250Q/M428L；
(iv)P257I/Q311I；
(v)P257I/N434H；
(vi)D376V/N434H；
(vii)T307A/E380A/N434A；或
(viii)(i)至(vii)的任何组合，
其中所述Fc部分的氨基酸编号是根据EU编号系统的。
39.根据权利要求38所述的抗体或抗原结合片段，其中所述增强与FcRn的结合的突变包括M428L/N434S。
40.根据权利要求35至39中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述增强与FcγR的结合的突变包括：S239D；I332E；A330L；G236A；或其任何组合，其中所述Fc部分的氨基酸编号是根据EU编号系统的。
41.根据权利要求40所述的抗体或抗原结合片段，其中所述增强与FcγR的结合的突变包括：
(i)S239D/I332E；
(ii)S239D/A330L/I332E；
(iii)G236A/S239D/I332E；或
(iv)G236A/A330L/I332E。
42.根据权利要求40或41所述的抗体或抗原结合片段，其中所述增强与FcγR的结合的突变包括G236A/A330L/I332E或由其组成，并且任选地，其中所述抗体或抗原结合片段不包括S239D，并且其中所述抗体或抗原结合片段进一步任选地包括在位置239处的天然S。
43.根据权利要求33至42中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述Fc部分包括以下氨基酸取代突变：M428L；N434S；G236A；A330L；以及I332E，并且任选地不包括S239D。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括轻链恒定区(CL)，所述CL包括与SEQ ID NO:79的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括CH1-CH2-CH3，所述CH1-CH2-CH3包括与SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列或其变体或由其组成，所述变体包括以下氨基酸取代中的一个或多个(EU编号)：G236A；A330L；I332E；M428L；N434S。
46.根据权利要求45所述的抗体或抗原结合片段，其中所述CH1-CH2-CH3的C末端赖氨酸被去除。
47.一种抗体，其包括：重链(HC)，所述HC包括SEQ ID NO:75中所示的氨基酸序列或由其组成，任选地C末端赖氨酸被去除；以及轻链(LC)，其中所述LC包括以下或由以下组成：(i)SEQ ID NO:62、58-61和63-72中的任一者中所示的VL氨基酸序列；以及(ii)SEQ ID NO:79中所示的CL氨基酸序列。
48.根据权利要求47所述的抗体，其中所述LC包括SEQ ID NO:62、66、67和72中的任一者中所示的VL氨基酸序列。
49.一种抗体，其包括：重链(HC)，所述HC包括SEQ ID NO:76中所示的氨基酸序列或由其组成，任选地C末端赖氨酸被去除；以及轻链(LC)，其中所述LC包括以下或由以下组成：(i)SEQ ID NO:62、58-61和63-72中的任一者中所示的VL氨基酸序列；以及(ii)SEQ ID NO:79中所示的CL氨基酸序列。
50.根据权利要求49所述的抗体，其中所述LC包括SEQ ID NO:62、66、67和72中的任一者中所示的VL氨基酸序列。
51.一种抗体，其包括：重链(HC)，所述HC包括SEQ ID NO:77中所示的氨基酸序列或由其组成，任选地C末端赖氨酸被去除；以及轻链(LC)，其中所述LC包括以下或由以下组成：(i)SEQ ID NO:62、58-61和63-72中的任一者中所示的VL氨基酸序列；以及(ii)SEQ ID NO:79中所示的CL氨基酸序列。
52.根据权利要求51所述的抗体，其中所述LC包括SEQ ID NO:62、66、67和72中的任一者中所示的VL氨基酸序列。
53.一种抗体，其包括：重链(HC)，所述HC包括SEQ ID NO:78中所示的氨基酸序列或由其组成，任选地C末端赖氨酸被去除；以及轻链(LC)，其中所述LC包括以下或由以下组成：(i)SEQ ID NO:62、58-61和63-72中的任一者中所示的VL氨基酸序列；以及(ii)SEQ ID NO:79中所示的CL氨基酸序列。
54.根据权利要求53所述的抗体，其中所述LC包括SEQ ID NO:62、66、67和72中的任一者中所示的VL氨基酸序列。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或所述抗原结合片段能够与选自HBsAg基因型A、B、C、D、E、F、G、H、I和J或其任何组合的基因型的HBsAg结合。
56.根据权利要求1至55中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够降低患有HBV感染的哺乳动物中HBV DNA的血清浓度。
57.根据权利要求1至56中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够降低患有HBV感染的哺乳动物中HBsAg的血清浓度。
58.根据权利要求1至57中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够降低患有HBV感染的哺乳动物中HBeAg的血清浓度。
59.根据权利要求1至58中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够降低患有HBV感染的哺乳动物中HBcrAg的血清浓度。
60.一种多核苷酸，其包括编码根据权利要求1至59中任一项所述的抗体或抗原结合片段的核苷酸序列。
61.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至59中任一项所述的抗体或抗原结合片段的轻链可变区(VL)，以及任选地轻链恒定结构域(CL)。
62.根据权利要求60或61所述的多核苷酸，其中编码所述抗体或所述抗原结合片段的所述核苷酸序列被密码子优化以在宿主细胞中表达。
63.根据权利要求62所述的多核苷酸，其包括与如SEQ ID NO:89、85-88和90-99中的任一者所示的核苷酸序列具有至少50％同一性的核苷酸序列。
64.根据权利要求60至63中任一项所述的多核苷酸，其包括：(i)SEQ ID NO:81或SEQID NO:82中所示的多核苷酸序列；以及(ii)SEQ ID NO:89、85-88和90-99中的任何一者或多者中所示的多核苷酸序列。
65.根据权利要求60至63中任一项所述的多核苷酸，其包括：(i)SEQ ID NO:83中所示的多核苷酸序列；以及(ii)SEQ ID NO:89、85-88和90-99中的任何一者或多者中所示的多核苷酸序列。
66.根据权利要求60至63中任一项所述的多核苷酸，其包括：(i)SEQ ID NO:84中所示的多核苷酸序列；以及(ii)SEQ ID NO:89、85-88和90-99中的任何一者或多者中所示的多核苷酸序列。
67.一种载体，其包括根据权利要求60至66中任一项所述的多核苷酸。
68.根据权利要求67所述的载体，其中所述载体包括慢病毒载体或逆转录病毒载体。
69.一种宿主细胞，其包括根据权利要求60至66中任一项所述的多核苷酸和/或根据权利要求67或68所述的载体。
70.一种药物组合物，其包含：
(i)根据权利要求1至59中任一项所述的抗体或抗原结合片段；
(ii)根据权利要求60至66中任一项所述的多核苷酸；
(iii)根据权利要求67或68所述的载体；
(iv)根据权利要求69所述的宿主细胞；或
(v)(i)-(iv)的任何组合，
以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
71.一种试剂盒，其包括：
(a)选自以下的组分：
(i)根据权利要求1至59中任一项所述的抗体或抗原结合片段；
(ii)根据权利要求60至66中任一项所述的多核苷酸；
(iii)根据权利要求67或68所述的载体；
(iv)根据权利要求69所述的宿主细胞；
(v)根据权利要求70所述的药物组合物；或
(vi)(i)-(vi)的任何组合；以及
(b)(1)使用所述组分来预防、治疗、减轻和/或诊断乙型肝炎感染和/或丁型肝炎感染的说明书和/或(2)用于向受试者施用所述组分的工具，如注射器。
72.根据权利要求70所述的药物组合物或根据权利要求71所述的试剂盒，其进一步包括：
(i)聚合酶抑制剂，其中所述聚合酶抑制剂任选地包括拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦或其任何组合；
(ii)干扰素，其中所述干扰素任选地包括IFNβ和/或IFNα；
(iii)检查点抑制剂，其中所述检查点抑制剂任选地包括抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段和/或抗CTLA4抗体或其抗原结合片段；
(iv)刺激性免疫检查点分子的激动剂；或
(v)(i)-(iv)的任何组合。
73.根据权利要求72所述的组合物或试剂盒，其中所述聚合酶抑制剂包含拉米夫定。
74.一种产生根据权利要求1至59中任一项所述的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括在足以产生所述抗体或抗原结合片段的条件下培养根据权利要求69所述的宿主细胞，并且持续足以产生所述抗体或抗原结合片段的时间。
75.一种(i)根据权利要求1至59中任一项所述的抗体或抗原结合片段；(ii)根据权利要求60至66中任一项所述的多核苷酸；(iii)根据权利要求67或68所述的载体；(iv)根据权利要求69所述的宿主细胞；和/或(v)根据权利要求70、72或73所述的药物组合物在制备用于预防、治疗、减轻和/或诊断受试者的乙型肝炎感染和/或丁型肝炎感染的药物中的用途。
76.一种治疗、预防和/或减轻受试者的乙型肝炎和/或丁型肝炎感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的：(i)根据权利要求1至59中任一项所述的抗体或抗原结合片段；(ii)根据权利要求60至66中任一项所述的多核苷酸；(iii)根据权利要求67或68所述的载体；(iv)根据权利要求69所述的宿主细胞；和/或(v)根据权利要求70、72或73所述的药物组合物。
77.根据权利要求76所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用以下中的一种或多种：(vi)聚合酶抑制剂，其中所述聚合酶抑制剂任选地包括拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦或其任何组合；(vii)干扰素，其中所述干扰素任选地包括IFNβ和/或IFNα；(viii)检查点抑制剂，其中所述检查点抑制剂任选地包括抗PD-1抗体或其抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段和/或抗CTLA4抗体或其抗原结合片段；(ix)刺激性免疫检查点分子的激动剂；或(x)(vi)-(ix)的任何组合。
78.根据权利要求76或77所述的方法，其中所述乙型肝炎感染是慢性乙型肝炎感染。
79.根据权利要求76至78中任一项所述的方法，其中所述受试者已接受肝移植。
80.根据权利要求76至79中任一项所述的方法，其中所述受试者未针对乙型肝炎进行免疫。
81.根据权利要求76至80中任一项所述的方法，其中所述受试者是新生儿。
82.根据权利要求76至81中任一项所述的方法，其中所述受试者正在经历或已经经历血液透析。
83.根据权利要求76至82中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用单剂量的包含所述抗体或抗原结合片段的药物组合物。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述药物组合物的所述单剂量包括范围为2至18mg/kg(受试者体重)的所述抗体。
85.根据权利要求83或84所述的方法，其中所述药物组合物的所述单剂量包括至多6mg、至多10mg、至多15mg、至多18mg、至多25mg、至多30mg、至多35mg、至多40mg、至多45mg、至多50mg、至多55mg、至多60mg、至多75mg、至多90mg、至多300mg、至多900mg或至多3000mg的所述抗体，
或者其中所述药物组合物的所述单剂量包括范围为1mg至3000mg、或范围为5mg至3000mg、或范围为10mg至3000mg、或范围为25mg至3000mg、或范围为30mg至3000mg、或范围为50mg至3000mg、或范围为60mg至3000mg、或范围为75mg至3000mg、或范围为90mg至3000mg、或范围为100mg至3000mg、或范围为150mg至3000mg、或范围为200mg至3000mg、或范围为300mg至3000mg、或范围为500mg至3000mg、或范围为750mg至3000mg、或范围为900mg至3000mg、或范围为1500mg至3000mg、或范围为2000mg至3000mg的量的所述抗体，
或者其中所述药物组合物的所述单剂量包括范围为1mg至900mg、或范围为5mg至900mg、或范围为10mg至900mg、或范围为25mg至900mg、或范围为30mg至900mg、或范围为50mg至900mg、或范围为60mg至900mg、或范围为75mg至900mg、或范围为90mg至900mg、或范围为100mg至900mg、或范围为150mg至900mg、或范围为200mg至900mg、或范围为300mg至900mg、或范围为500mg至900mg、或范围为750mg至900mg的量的所述抗体，
或者其中所述药物组合物的所述单剂量包括范围为1mg至500mg、或范围为5mg至500mg、或范围为10mg至500mg、或范围为25mg至500mg、或范围为30mg至500mg、或范围为50mg至500mg、或范围为60mg至500mg、或范围为75mg至500mg、或范围为90mg至500mg、或范围为100mg至500mg、或范围为150mg至500mg、或范围为200mg至500mg、或范围为300mg至500mg或范围为400mg至500mg的量的所述抗体，
或者其中所述药物组合物的所述单剂量包括范围为1mg至300mg、或范围为5mg至300mg、或范围为10mg至300mg、或范围为25mg至300mg、或范围为30mg至300mg、或范围为50mg至300mg、或范围为60mg至300mg、或范围为75mg至300mg、或范围为90mg至300mg、或范围为100mg至300mg、或范围为150mg至300mg、或范围为200mg至300mg的量的所述抗体，
或者其中所述药物组合物的所述单剂量包括范围为1mg至200mg、或范围为5mg至200mg、或范围为10mg至200mg、或范围为25mg至200mg、或范围为30mg至200mg、或范围为50mg至200mg、或范围为60mg至200mg、或范围为75mg至200mg、或范围为90mg至200mg、或范围为100mg至200mg、或范围为150mg至200mg的量的所述抗体，
或者其中所述药物组合物的所述单剂量包括范围为1mg至100mg、或范围为5mg至100mg、或范围为10mg至100mg、或范围为25mg至100mg、或范围为30mg至100mg、或范围为50mg至100mg、或范围为60mg至100mg、或范围为75mg至100mg、或范围为75mg至100mg、或范围为90mg至100mg的量的所述抗体，
或者其中所述药物组合物的所述单剂量包括范围为1mg至25mg、或范围为5mg至25mg、或范围为10mg至25mg、或范围为15mg至25mg、或范围为20mg至25mg的量的所述抗体，
或者其中所述药物组合物的所述单剂量包括范围为1mg至50mg、或范围为1mg至25mg、或范围为5mg至50mg、或范围为5mg至25mg、或范围为10至50mg、或范围为10至25mg、或范围为1至15mg、或范围为5mg至15mg、或范围为10mg至15mg的量的所述抗体，或者其中所述药物组合物的所述单剂量包括1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg、160mg、165mg、170mg、175mg、180mg、185mg、190mg、195mg、200mg、205mg、210mg、215mg、220mg、225mg、230mg、235mg、240mg、245mg、250mg、255mg、260mg、265mg、270mg、275mg、280mg、285mg、290mg、295mg、300mg、305mg、310mg、315mg、320mg、325mg、330mg、335mg、340mg、345mg、350mg、355mg、360mg、365mg、370mg、375mg、380mg、385mg、390mg、395mg、400mg、405mg、410mg、415mg、420mg、425mg、430mg、435mg、440mg、445mg、450mg、455mg、460mg、465mg、470mg、475mg、480mg、485mg、490mg、495mg、500mg、505mg、510mg、515mg、520mg、525mg、530mg、535mg、540mg、545mg、550mg、555mg、560mg、565mg、570mg、575mg、580mg、585mg、590mg、595mg、600mg、605mg、610mg、615mg、620mg、625mg、630mg、635mg、640mg、645mg、650mg、655mg、660mg、665mg、670mg、675mg、680mg、685mg、690mg、695mg、700mg、705mg、710mg、715mg、720mg、725mg、730mg、735mg、740mg、745mg、750mg、755mg、760mg、765mg、770mg、775mg、780mg、785mg、790mg、795mg、800mg、805mg、810mg、815mg、820mg、825mg、830mg、835mg、840mg、845mg、850mg、855mg、860mg、865mg、870mg、875mg、880mg、885mg、890mg、895mg、900mg、905mg、910mg、915mg、920mg、925mg、930mg、935mg、940mg、945mg、950mg、955mg、960mg、965mg、970mg、975mg、980mg、985mg、990mg、995mg或1000mg或更多的所述抗体，
或者其中所述药物组合物的所述单剂量包括少于3000mg、少于2500mg、少于2000mg、少于1500mg、少于1000mg、少于900mg、少于500mg、少于300mg、少于200mg、少于100mg、少于90mg、少于75mg、少于50mg、少于25mg或少于10mg，但多于1mg、多于2mg、多于3mg、多于4mg或多于5mg的量的所述抗体。
86.根据权利要求83至85中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的所述单剂量包括浓度在100mg/mL至200mg/mL的范围内，如100mg/mL、110mg/mL、120mg/mL、130mg/mL、140mg/mL、150mg/mL、160mg/mL、170mg/mL、180mg/mL、190mg/mL或200mg/mL，优选地150mg/mL的所述抗体。
87.根据权利要求83至86中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的所述单剂量包括约75mg的所述抗体。
88.根据权利要求83至87中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的所述单剂量包括约90mg的所述抗体。
89.根据权利要求83至88中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的所述单剂量包括至多300mg的所述抗体。
90.根据权利要求83至89中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的所述单剂量包括至多900mg的所述抗体。
91.根据权利要求83至90中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的所述单剂量包括至多3,000mg的所述抗体。
92.根据权利要求83至91中任一项所述的方法，其中所述方法包括通过皮下注射施用所述单剂量，任选地其中所述单剂量包括6mg的所述抗体或18mg的所述抗体或由其组成。
93.根据权利要求83至92中任一项所述的方法，其中所述方法包括通过静脉内注射施用所述单剂量。
94.根据权利要求83至93中任一项所述的方法，其中所述药物组合物进一步包含水，任选地USP水。
95.根据权利要求83至94中任一项所述的方法，其中所述药物组合物进一步包含组氨酸，任选地在所述药物组合物中浓度范围为10mM至40mM，如20mM。
96.根据权利要求83至95中任一项所述的方法，其中所述药物组合物进一步包含二糖，如蔗糖，任选地以5％、6％、7％、8％或9％，优选地约7％(w/v)。
97.根据权利要求83至96中任一项所述的方法，其中所述药物组合物进一步包含表面活性剂或三嵌段共聚物，任选地聚山梨醇酯或泊洛沙姆-188，优选地聚山梨醇酯80(PS80)，其中任选地所述聚山梨醇酯或泊洛沙姆-188以0.01％至0.05％(w/v)的范围，优选地0.02％(w/v)存在。
98.根据权利要求83至97中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的pH在5.8至6.2的范围内、在5.9至6.1的范围内，或为5.8、为5.9、为6.0、为6.1或为6.2。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述药物组合物包含：
(i)150mg/mL的所述抗体；
(ii)USP水；
(iii)20mM组氨酸；
(iv)7％蔗糖；以及
(v)0.02％PS80，
其中所述药物组合物的pH为6。
100.根据权利要求83至99中任一项所述的方法，其中所述受试者是成人。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述受试者的年龄范围为18岁至65岁。
102.根据权利要求83至101中任一项所述的方法，其中所述受试者的体重为40kg至125kg，和/或所述受试者的体质指数(BMI)为18至35kg/m2。
103.根据权利要求83至102中任一项所述的方法，其中所述受试者患有慢性HBV感染；例如，由2次血清HBsAg、HBV DNA和/或HBeAg阳性定义，其中所述2次相隔至少6个月。
104.根据权利要求83至103中任一项所述的方法，其中所述受试者未患有肝硬化。
105.根据权利要求104所述的方法，其中不存在肝硬化由以下确定：
Fibroscan评估(例如，在施用所述药物组合物的所述单剂量之前6个月内)；或
肝活检(例如，在施用所述药物组合物的所述单剂量之前12个月内)，
其中优选地不存在肝硬化由不存在Metavir F3纤维化或不存在F4肝硬化来确定。
106.根据权利要求83至105中任一项所述的方法，其中在施用所述单剂量之前，所述受试者已经任选地在120天内，进一步任选地在60天内接受核苷(酸)逆转录酶抑制剂(NRTI)。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述NRTI包括以下中的一种或多种：替诺福韦；替诺福韦二吡呋酯(例如，富马酸替诺福韦二吡呋酯)；替诺福韦艾拉酚胺；恩替卡韦；拉米夫定；阿德福韦；以及阿德福韦酯。
108.根据权利要求83至107中任一项所述的方法，其中在施用所述单剂量之前不超过28天，所述受试者的血清HBV DNA浓度低于100IU/mL。
109.根据权利要求83至108中任一项所述的方法，其中在施用所述单剂量之前，所述受试者的血清HBsAg浓度低于3,000IU/mL，并且任选地，在施用所述单剂量之前，所述受试者的血清HBsAg浓度低于1,000IU/mL。
110.根据权利要求83至109中任一项所述的方法，其中在施用所述单剂量之前不超过28天，所述受试者的血清HBsAg浓度高于或等于3,000IU/mL，并且任选地，在施用所述单剂量之前不超过28天，所述受试者的血清HBsAg浓度高于或等于1,000IU/mL。
111.根据权利要求83至110中任一项所述的方法，其中在施用所述单剂量之前不超过28天，所述受试者对HBe抗原(HBeAg)呈阴性。
112.根据权利要求83至111中任一项所述的方法，其中在施用所述单剂量之前不超过28天，所述受试者对抗HB抗体呈阴性。
113.根据权利要求83至112中任一项所述的方法，其中在施用所述单剂量之前：
(i)所述受试者未患纤维化和/或未患肝硬化；和/或
(ii)所述受试者的丙氨酸转氨酶(ALT)<2x正常上限(ULN)。
114.根据权利要求83至113中任一项所述的方法，其中与在施用所述单剂量之前0天至28天所述受试者的血清HBsAg(例如，血清中HBsAg的浓度，例如，如使用雅培公司ARCHITECT测定所确定的)相比，在施用所述单剂量之后56天，所述受试者的所述血清HBsAg减少>2倍。
115.根据权利要求83至114中任一项所述的方法，其中在施用所述单剂量之后(例如，在施用所述单剂量之后56天)：
(i)与参考受试者相比，所述受试者的HBV的肝内传播减少或不太严重；和/或
(ii)所述受试者包括针对HBV的适应性免疫应答。
116.根据权利要求83至115中任一项所述的方法，其中所述受试者是男性。
117.根据权利要求83至115中任一项所述的方法，其中所述受试者是女性。
118.一种药物组合物，其包含浓度范围为100mg/mL至200mg/mL，如100mg/mL、110mg/mL、120mg/mL、130mg/mL、140mg/mL、150mg/mL、160mg/mL、170mg/mL、180mg/mL、190mg/mL或200mg/mL，优选地150mg/mL的根据权利要求1至59中任一项所述的抗体或抗原结合片段，
以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
119.根据权利要求118所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含至多6mg、至多18mg、至多75mg、至多90mg、至多300mg、至多900mg或至多3000mg的所述抗体。
120.根据权利要求118或119所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含约75mg的所述抗体。
121.根据权利要求118或119所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含约90mg的所述抗体。
122.根据权利要求118或119所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含约300mg的所述抗体。
123.根据权利要求118或119所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含约900mg的所述抗体。
124.根据权利要求118或119所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含约3,000mg的所述抗体。
125.根据权利要求118至124中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含水，任选地USP水。
126.根据权利要求118至125中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含组氨酸，任选地在所述药物组合物中浓度为10mM至40mM，如20mM。
127.根据权利要求118至126中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含二糖，如蔗糖，任选地以5％、6％、7％、8％或9％，优选地约7％(w/v)。
128.根据权利要求118至127中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含表面活性剂，任选地聚山梨醇酯，优选地聚山梨醇酯80(PS80)，其中任选地所述聚山梨醇酯以0.01％至0.05％(w/v)的范围，优选地0.02％(w/v)存在。
129.根据权利要求118至128中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH在5.8至6.2的范围内、在5.9至6.1的范围内，或为5.8、为5.9、为6.0、为6.1或为6.2。
130.根据权利要求118至129中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含：
(i)150mg/mL的所述抗体；
(ii)USP水；
(iii)20mM组氨酸；
(iv)7％蔗糖；以及
(v)0.02％PS80，
其中所述药物组合物的pH为6。
131.根据权利要求83至117中任一项所述的方法，其中在施用所述单剂量之后，相较于基线，所述受试者的血清HBsAg减少了1.0log10 IU/mL、1.5log10 IU/mL或更多，其中任选地，在施用所述单剂量之后，所述减少持续1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天或更多天。
132.根据权利要求83至117和131中任一项所述的方法，其中在施用所述单剂量之后，相较于基线，所述受试者的血清HBsAg减少持续至少8天、至少15天、至少22天或至少29天。
133.一种用于体外诊断乙型肝炎和/或丁型肝炎感染的方法，所述方法包括：
(i)使来自受试者的样品与根据权利要求1至59中任一项所述的抗体或抗原结合片段接触；以及
(ii)检测复合物，所述复合物包括抗原和所述抗体，或包括抗原和所述抗原结合片段。
134.根据权利要求133所述的方法，其中所述样品包括从所述受试者中分离的血液。
135.一种用于检测抗乙型肝炎和/或抗丁型肝炎疫苗中呈正确构象的表位的存在或不存在的方法，所述方法包括：
(i)使所述疫苗与根据权利要求1至59中任一项所述的抗体或抗原结合片段接触；以及
(ii)确定包括抗原和所述抗体或包括抗原和所述抗原结合片段的复合物是否已经形成。
136.根据权利要求1至59中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中：
(i)与包括不包含G236A/A330L/I332E的Fc部分的参考多肽相比，所述抗体或抗原结合片段增强与人FcγRIIA、人FcγRIIIA或两者的结合，其中所述人FcγRIIA任选地为H131或R131，和/或所述人FcγRIIIA任选地为F158或V158；
(ii)与包括不包含G236A/A330L/I332E的Fc部分的参考多肽相比，所述抗体或抗原结合片段降低与人FcγRIIB的结合；
(iii)所述抗体或抗原结合片段不与人FcγRIIB结合；
(iv)与包括不包含G236A/A330L/I332E的Fc部分的参考多肽相比，所述抗体或抗原结合片段降低与人C1q的结合；
(v)所述抗体或抗原结合片段不与人C1q结合；(vi)与包括不包含G236A/A330L/I332E的Fc部分的参考多肽相比，所述抗体或抗原结合片段在更大程度上激活FcγRIIA、人FcγRIIIA或两者，其中所述人FcγRIIA任选地为H131或R131，和/或所述人FcγRIIIA任选地为F158或V158；
(vii)所述抗体或抗原结合片段不激活人FcγRIIB；
(viii)在存在HBsAg的情况下，与包括不包含G236A/A330L/I332E的Fc部分的参考多肽相比，所述抗体或抗原结合片段在更大程度上激活人自然杀伤(NK)细胞，其中所述参考多肽任选地是与HB Ag，任选地HBsAg结合的抗体；
(ix)所述抗体或抗原结合片段能够与HBsAg变体结合，所述HBsAg变体包括HBsAg-Y100C/P120T、HBsAg-P120T、HBsAg-P120S/S143L、HBsAg-C121S、HBsAg-R122D、HBsAg-R122I、HBsAg-T123N、HBsAg-Q129H、HBsAg-Q129L、HBsAg-M133H、HBsAg-M133L、HBsAg-M133T、HBsAg-K141E、HBsAg-P142S、HBsAg-S143K、HBsAg-D144A、HBsAg-G145R、HBsAg-N146A或其任何组合；和/或(x)与和HBsAg结合并且包括不包含G236A/A330L/I332E的Fc部分的参考抗体或抗原结合片段相比，所述抗体或抗原结合片段改善了与HBsAg变体的结合，所述HBsAg变体包括HBsAg-Y100C/P120T、HBsAg-P120T、HBsAg-P120S/S143L、HBsAg-C121S、HBsAg-R122D、HBsAg-R122I、HBsAg-T123N、HBsAg-Q129H、HBsAg-Q129L、HBsAg-M133H、HBsAg-M133L、HBsAg-M133T、HBsAg-K141E、HBsAg-P142S、HBsAg-S143K、HBsAg-D144A、HBsAg-G145R、HBsAg-N146A或其任何组合。
137.一种治疗有需要的受试者的慢性HBV感染的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用降低HBV抗原负荷的药剂；以及
向所述受试者施用权利要求1至59中任一项的抗HBV抗体。
138.一种治疗有需要的受试者的慢性HBV感染的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用HBV基因表达抑制剂；以及
向所述受试者施用权利要求1至59中任一项的抗HBV抗体。
139.根据权利要求137或138所述的方法，其中RNAi药剂包括形成双链区的正义链和反义链，其中所述正义链包括与SEQ ID NO:116的核苷酸1579-1597相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
140.根据权利要求137至139中任一项所述的方法，其中所述RNAi药剂包括正义链和反义链，其中所述正义链包括SEQ ID NO:116的核苷酸1579-1597。
141.根据权利要求137至140中任一项所述的方法，其中所述RNAi药剂中的至少一个链包括至少1个核苷酸的3'突出端。
142.根据权利要求137至140中任一项所述的方法，其中所述RNAi药剂中的至少一个链包括至少2个核苷酸的3'突出端。
143.根据权利要求137至142中任一项所述的方法，其中所述RNAi药剂中的所述双链区的长度为15至30个核苷酸对。
144.根据权利要求137至142中任一项所述的方法，其中所述RNAi药剂中的所述双链区的长度为17至23个核苷酸对。
145.根据权利要求137至142中任一项所述的方法，其中所述RNAi药剂中的所述双链区的长度为17至25个核苷酸对。
146.根据权利要求137至142中任一项所述的方法，其中所述RNAi药剂中的所述双链区的长度为23至27个核苷酸对。
147.根据权利要求137至142中任一项所述的方法，其中所述RNAi药剂中的所述双链区的长度为19至21个核苷酸对。
148.根据权利要求137至142中任一项所述的方法，其中所述RNAi药剂中的所述双链区的长度为21至23个核苷酸对。
149.根据权利要求137至142中任一项所述的方法，其中所述RNAi药剂中的每条链具有15至30个核苷酸。
150.根据权利要求137至142中任一项所述的方法，其中所述RNAi药剂中的每条链具有19至30个核苷酸。
151.根据权利要求137至150中任一项所述的方法，其中所述RNAi药剂是siRNA。
152.根据权利要求151所述的方法，其中所述siRNA抑制HBV转录物的表达，所述HBV转录物编码HBsAg蛋白、HBcAg蛋白和HBx蛋白或HBV DNA聚合酶蛋白。
153.根据权利要求151或权利要求152所述的方法，其中所述siRNA与由以下编码的靶标的至少15个连续核苷酸结合：P基因，NC_003977.2的核苷酸2309-3182和1-1625；S基因(编码L、M和S蛋白)，NC_003977.2的核苷酸2850-3182和1-837；HBx，NC_003977.2的核苷酸1376-1840；或C基因，NC_003977.2的核苷酸1816-2454。
154.根据权利要求151或权利要求152所述的方法，其中所述siRNA的所述反义链包括5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3'(SEQ ID NO:119)的核苷酸序列中的至少15个连续核苷酸。
155.根据权利要求151或152所述的方法，其中所述siRNA的所述反义链包括5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3'(SEQ ID NO:119)的核苷酸序列中的至少19个连续核苷酸。
156.根据权利要求151或152所述的方法，其中所述siRNA的所述反义链包括5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3'(SEQ ID NO:119)的核苷酸序列。
157.根据权利要求151或152所述的方法，其中所述siRNA的所述反义链由5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3'(SEQ ID NO:119)的核苷酸序列组成。
158.根据权利要求154至157中任一项所述的方法，其中所述siRNA的所述正义链包括5'-GUGUGCACUUCGCUUCACA -3'(SEQ ID NO:118)的核苷酸序列。
159.根据权利要求154至157中任一项所述的方法，其中所述siRNA的所述正义链由5'-GUGUGCACUUCGCUUCACA -3'(SEQ ID NO:118)的核苷酸序列组成。
160.根据权利要求151或152所述的方法，其中所述siRNA的所述反义链包括5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3'(SEQ ID NO:121)的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。
161.根据权利要求151或152所述的方法，其中所述siRNA的所述反义链包括5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3'(SEQ ID NO:121)的核苷酸序列的至少19个连续核苷酸。
162.根据权利要求151或152所述的方法，其中所述siRNA的所述反义链包括5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3'(SEQ ID NO:121)的核苷酸序列。
163.根据权利要求151或152所述的方法，其中所述siRNA的所述反义链由5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC-3'(SEQ ID NO:121)的核苷酸序列组成。
164.根据权利要求154至157中任一项所述的方法，其中所述siRNA的所述正义链包括5'-GGUGGACUUCUCUCAAUUUUA -3'(SEQ ID NO:120)的核苷酸序列。
165.根据权利要求154至157中任一项所述的方法、供使用的组合物或用途，其中所述siRNA的所述正义链由5'-GGUGGACUUCUCUCAAUUUUA -3'(SEQ ID NO:120)的核苷酸序列组成。
166.根据权利要求151至165中任一项所述的方法，其中所述正义链的基本上所有核苷酸和所述反义链的基本上所有核苷酸都是经修饰的核苷酸，并且
其中所述正义链与附接在3'末端处的配体缀合。
167.根据权利要求166所述的方法，其中所述配体是通过单价接头、二价分支接头或三价分支接头附接的一种或多种GalNAc衍生物。
168.根据权利要求166或167所述的方法，其中所述配体是
Figure FDA0004086126630000271
169.根据权利要求168所述的方法，其中所述siRNA与如下结构中所示的配体缀合：
Figure FDA0004086126630000272
其中X为O或S。
170.根据权利要求151至169中任一项所述的方法，其中所述siRNA中的至少一个核苷酸是经修饰的核苷酸，所述经修饰的核苷酸包括脱氧核苷酸、3'末端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、锁定核苷酸、解锁核苷酸、构象限制性核苷酸、约束乙基核苷酸、非碱性核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、2'-C-烷基修饰的核苷酸、2'-羟基修饰的核苷酸、2'-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包括核苷酸的非天然碱基、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-脱水己醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包括硫代磷酸酯基的核苷酸、包括甲基膦酸酯基的核苷酸、包括5'-磷酸酯的核苷酸、腺苷-乙二醇核酸或包括5'-磷酸酯模拟物的核苷酸。
171.根据权利要求151至169中任一项所述的方法，其中所述siRNA包括磷酸酯主链修饰、2'核糖修饰、5'三磷酸酯修饰或GalNAc缀合修饰。
172.根据权利要求171所述的方法，其中所述磷酸酯主链修饰包含硫代磷酸酯键。
173.根据权利要求171或权利要求172所述的方法，其中所述2'核糖修饰包括氟代或-O-甲基取代。
174.根据权利要求151至159和166至173中任一项所述的方法，其中所述siRNA具有包括5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3'(SEQ ID NO:122)的正义链和包括5'-usGfsugaAfgCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(SEQ ID NO:123)的反义链，
其中a、c、g和u分别是2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯、2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯、2'-O-甲基鸟苷-3'-磷酸酯和2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯；
Af、Cf、Gf和Uf分别是2'-氟腺苷-3'-磷酸酯、2'-氟胞苷-3'-磷酸酯、2'-氟鸟苷-3'-磷酸酯和2'-氟尿苷-3'-磷酸酯；
s是硫代磷酸酯键；并且
L96是N-[三(GalNAc-烷基)-酰胺基癸酰基)]-4-羟脯氨醇。
175.根据权利要求151至159和166至173中任一项所述的方法，其中所述siRNA具有包括5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3'(SEQ ID NO:124)的正义链和包括5'-usGfsuga(Agn)gCfGfaaguGfcAfcacsusu-3'(SEQ ID NO:125)的反义链，
其中a、c、g和u分别是2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯、2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯、2'-O-甲基鸟苷-3'-磷酸酯和2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯；
Af、Cf、Gf和Uf分别是2'-氟腺苷-3'-磷酸酯、2'-氟胞苷-3'-磷酸酯、2'-氟鸟苷-3'-磷酸酯和2'-氟尿苷-3'-磷酸酯；
(Agn)为腺苷-乙二醇核酸(GNA)；
s是硫代磷酸酯键；并且
L96是N-[三(GalNAc-烷基)-酰胺基癸酰基)]-4-羟脯氨醇。
176.根据权利要求151至153和160至173中任一项所述的方法、供使用的组合物或用途，其中所述siRNA具有包括5'-gsgsuggaCfuUfCfUfcucaAfUfuuuaL96-3'(SEQ ID NO:126)的正义链和包括5'-usAfsaaaUfuGfAfgagaAfgUfccaccsasc-3'(SEQ ID NO:127)的反义链，
其中a、c、g和u分别是2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯、2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯、2'-O-甲基鸟苷-3'-磷酸酯和2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯；
Af、Cf、Gf和Uf分别是2'-氟腺苷-3'-磷酸酯、2'-氟胞苷-3'-磷酸酯、2'-氟鸟苷-3'-磷酸酯和2'-氟尿苷-3'-磷酸酯；
s是硫代磷酸酯键；并且
L96是N-[三(GalNAc-烷基)-酰胺基癸酰基)]-4-羟脯氨醇。
177.根据权利要求137至176中任一项所述的方法，其中所述受试者是人，并且向所述受试者施用治疗有效量的RNAi药剂或siRNA；并且其中所述RNAi药剂或siRNA的所述有效量为约1mg/kg至约8mg/kg。
178.根据权利要求137至177中任一项所述的方法，其中向所述受试者每日两次、每日一次、每两天一次、每三天一次、每周两次、每周一次、每隔一周一次、每四周一次或每月一次施用所述RNAi药剂或siRNA。
179.根据权利要求137至177中任一项所述的方法，其中每四周一次向所述受试者施用所述RNAi药剂或siRNA。
180.根据权利要求151至179中任一项所述的方法，其中施用各自定向到HBV基因的两个siRNA，并且第一siRNA具有包括SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120或SEQ ID NO:126的反义链；并且第二siRNA包括具有正义链的siRNA，所述siRNA包含SEQ ID NO:116的核苷酸2850-3182中的至少15个连续核苷酸。
181.根据权利要求151至179中任一项所述的方法，其中施用定向到HBV基因的两个siRNA，其中所述两个siRNA包括：定向到HBV X基因的siRNA和定向到HBV S基因的siRNA。
182.根据权利要求151至179中任一项所述的方法，其中施用各自定向到HBV基因的两个siRNA，并且第一siRNA具有包括SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:123或SEQ ID NO:125的反义链，并且第二siRNA具有包括SEQ ID NO:121或SEQ ID NO:127的反义链。
183.根据权利要求181所述的方法，其中所述第一siRNA具有包括SEQ ID NO:118、SEQID NO:122或SEQ ID NO:124的正义链；并且所述第二siRNA具有包括SEQ ID NO:120或SEQID NO:126的正义链。
184.根据权利要求179至183中任一项所述的方法，其中同时施用所述两个siRNA。
185.根据权利要求137至184中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述受试者施用核苷(酸)类似物，或者其中所述受试者还被施用核苷(酸)类似物。
186.根据权利要求185所述的方法、供使用的组合物或用途，其中所述核苷(酸)类似物是富马酸替诺福韦二吡呋酯(TDF)、替诺福韦艾拉酚胺(TAF)、拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦(ETV)、替比夫定、AGX-1009、恩曲他滨(FTC)、克拉夫定、利托那韦、福韦酯、洛布卡韦、泛昔洛韦、N-乙酰基-半胱氨酸(NAC)、PC1323、theradigm-HBV、胸腺肽-α以及更昔洛韦、贝西福韦(ANA-380/LB-80380)或替诺福韦酯(TLX/CMX157)。
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